KR20230006558A

KR20230006558A - 신규한 안키린 반복 결합 단백질 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20230006558A
Application number: KR1020227042265A
Authority: KR
Inventors: 파트리크 암슈투츠; 팔레리 페리네 칼라브로; 마르첼 발저
Original assignee: 몰리큘라 파트너스 아게
Priority date: 2020-05-06
Filing date: 2021-05-06
Publication date: 2023-01-10
Also published as: WO2021224686A1; AU2021267411A1; TW202208404A; JP2023525518A; US11466062B2; CR20220618A; CL2022003044A1; IL297940A; EP4146691A1; PE20231074A1; CN115916815A; MX2022013945A; US20210347835A1; BR112022022456A2; CO2022016595A2; CA3176845A1; US20220235103A1

Abstract

본 발명은 코로나바이러스 스파이크 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 하나 이상의 디자인된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질, 이러한 단백질을 코딩하는 핵산, 이러한 단백질 또는 핵산을 포함하는 제약 조성물, 및 코로나바이러스 질환, 특히 SARS-CoV-2에 의해 유발된 질환의 치료에서의 이러한 단백질, 핵산 또는 제약 조성물의 용도에 관한 것이다.

Description

신규한 안키린 반복 결합 단백질 및 그의 용도

28 내지 32 kb의 포지티브-가닥 RNA 게놈을 갖는 코로나비리다에(Coronaviridae)는 가장 큰 외피 RNA 바이러스이다. 코로나바이러스는 많은 포유류 및 조류 종을 감염시킨다. 이들은 호흡기, 간, 위장, 및 신경계의 다양한 급성 및 만성 질환의 원인이 된다. 통상적 감기는 경증 형태의 코로나바이러스 감염의 일례이다. 2003년 사스(SARS) 발병 및 2012년 메르스(MERS) 발병은 둘 다 코로나바이러스에 의해 유발되었다. SARS-CoV-2 (2019-nCoV라고도 불림)는 COVID-19를 유발하는 바이러스 균주이다.

코로나바이러스는 스파이크 단백질, 외피 단백질, 막 단백질, 및 뉴클레오캡시드 단백질로 알려진 4개의 구조 단백질을 갖는다. 스파이크 단백질은 세포 진입을 담당하는 바이러스 막 단백질이다.

코로나바이러스는 조밀하게 당화된 스파이크 단백질을 사용하여 숙주 세포로의 진입을 얻는다. 스파이크 단백질은 3개의 서브유닛으로 이루어지고 바이러스 막을 숙주 세포 막과 융합시키기 위해 상당한 구조적 재배열을 겪는 준안정 예비융합 형태로 존재하는 삼량체 클래스 I 융합 단백질이다. 이 과정은 S1 서브유닛이 숙주 세포 수용체에 결합할 때 촉발된다. 수용체 결합은 예비융합 삼량체를 탈안정화시켜, S1 서브유닛의 발산 및 S2 서브유닛의 안정적인 융합-후 형태로의 전환을 초래한다. 숙주 세포 수용체에 관여하기 위해, S1의 수용체-결합 도메인 (RBD)은 수용체 결합의 결정인자를 일시적으로 숨기거나 노출시키는 힌지-유사 형태적 이동을 겪는다. 이들 두 상태는 "다운" 형태 및 "업" 형태로서 언급되며, 여기서 다운은 수용체-접근불가 상태에 상응하고 업은 덜 안정적인 것으로 생각되는 수용체 접근가능 상태에 상응한다. 스파이크 단백질이 "업" 형태에 있으면, 숙주 세포 내의 안지오텐신-전환 효소 2 (ACE2) 수용체에 대한 결합이 일어나, 바이러스가 세포 내로 들어갈 수 있다. "업" 형태로의 스파이크 단백질의 "활성화"는 스파이크 단백질을 개방함으로써 작용하는 푸린 또는 TMPRSS2와 같은 효소에 의해 수행될 수 있으며, 이는 뉴클레오캡시드 단백질이 바이러스 캡시드로부터 세포 내로 들어갈 수 있게 하여, 감염을 초래한다.

세포가 코로나바이러스로 감염되면, 면역계 (또는 치료적 작용제)가 감염되지 않은 세포를 손상시키지 않으면서 바이러스-감염 세포만 표적화하여야 하기 때문에 치료 옵션이 더 어려워진다. 스파이크 단백질의 필수적 기능으로 인해, 이는 항체-매개 중화의 표적을 나타낸다. 따라서, 코로나바이러스 치료법에 대한 한 가지 접근은 스파이크 단백질을 중화시킴으로써 세포에 대한 바이러스의 결합을 억제하여, 세포의 감염을 방지하는 것이다.

DARPin® 단백질은 유전적으로 조작된 안키린 반복 단백질이며, 이는 항체 모방 단백질과 같이 기능할 수 있으며, 전형적으로 고도 특이적 및 고-친화도 표적 결합을 나타낸다. DARPin® 단백질은 하나 이상의 디자인된 안키린 반복 도메인을 포함한다. 디자인된 안키린 반복 도메인은 천연 안키린 반복 단백질로부터 유래되고, 각각의 디자인된 안키린 반복 도메인은 전형적으로 높은 특이성 및 친화도로 표적 단백질에 결합한다. DARPin® 단백질은, 그의 높은 특이성, 안정성, 효력 및 친화도로 인해, 또한 단일-, 이중- 또는 다중-특이적 단백질을 생성하기 위한 포맷화에 있어 그의 유연성으로 인해, 폭넓게 다양한 임상 응용을 위한 매력적인 치료적 작용제이다. 예를 들어, WO 2011/135067은 암 및 노화-관련 황반 변성과 같은 안질환을 포함한 다른 병리학적 상태의 치료에서의 사용을 위한 DARPin® 단백질을 기재한다. DARPin®은 Molecular Partners AG가 소유한 등록 상표이다.

본 발명의 기초가 되는 기술적 문제는 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2에 대한 결합 특이성을 갖는 하나 이상의 디자인된 안키린 반복 도메인을 포함하는 신규한 재조합 결합 단백질을 식별하는 것이다. 이러한 재조합 결합 단백질은 세포에 대한 코로나바이러스의 결합을 억제하고 세포의 바이러스 감염을 방지하기 위해 유용할 수 있다. 이러한 재조합 결합 단백질 및 이러한 단백질을 포함하는 제약 조성물은 추가로, 코로나바이러스 질환, 예컨대 SARS-CoV-2에 의해 유발되는 코로나바이러스 질환의 방지, 치료 또는 진단 방법에, 및/또는 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2의 검출 방법에 유용할 수 있다.

발명의 요약

본원에 제공되는 개시내용에 기초하여, 당업자는 단지 일상적 실험을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 구체적 구현예에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 구현예 (E)에 포함되도록 의도된다.

1. 제1 구현예에서, 본 발명은, 제1 안키린 반복 도메인을 포함하며, 여기서 상기 제1 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 11, 76, 77 및 85로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

1a. 구현예 1a에서, 본 발명은, 제1 안키린 반복 도메인을 포함하며, 여기서 상기 제1 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

1b. 구현예 1b에서, 본 발명은, 제1 안키린 반복 도메인을 포함하며, 여기서 상기 제1 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 11, 76 및 77로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

2. 제2 구현예에서, 본 발명은, 상기 제1 안키린 반복 도메인이 서열 번호 1 내지 11, 76, 77 및 85로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 구현예 1에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

2a. 구현예 2a에서, 본 발명은, 상기 제1 안키린 반복 도메인이 서열 번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 구현예 1a에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

2b. 구현예 2b에서, 본 발명은, 상기 제1 안키린 반복 도메인이 서열 번호 1 내지 11, 76 및 77로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 구현예 1b에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

3. 제3 구현예에서, 본 발명은, 상기 제1 안키린 반복 도메인이 서열 번호 1 내지 11, 76, 77 및 85로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 구현예 1에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

3a. 구현예 3a에서, 본 발명은, 상기 제1 안키린 반복 도메인이 서열 번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 구현예 1a에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

3b. 구현예 3b에서, 본 발명은, 상기 제1 안키린 반복 도메인이 서열 번호 1 내지 11, 76 및 77로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 구현예 1b에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

4. 제4 구현예에서, 본 발명은, 제2 안키린 반복 도메인을 추가로 포함하며, 여기서 상기 제2 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 11, 76, 77 및 85로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

4a. 구현예 4a에서, 본 발명은, 제2 안키린 반복 도메인을 추가로 포함하며, 여기서 상기 제2 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 구현예 1a, 2a 또는 3a 중 어느 하나에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

4b. 구현예 4b에서, 본 발명은, 제2 안키린 반복 도메인을 추가로 포함하며, 여기서 상기 제2 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 11, 76 및 77로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 구현예 1b, 2b 또는 3b 중 어느 하나에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

5. 제5 구현예에서, 본 발명은, 상기 제2 안키린 반복 도메인이 서열 번호 1 내지 11, 76, 77 및 85로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 구현예 4에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

5a. 구현예 5a에서, 본 발명은, 상기 제2 안키린 반복 도메인이 서열 번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 구현예 4a에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

5b. 구현예 5b에서, 본 발명은, 상기 제2 안키린 반복 도메인이, 서열 번호 1 내지 11, 76 및 77로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 구현예 4b에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

6. 제6 구현예에서, 본 발명은, 상기 제2 안키린 반복 도메인이 서열 번호 1 내지 11, 76, 77 및 85로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 구현예 4에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

6a. 구현예 6a에서, 본 발명은, 상기 제2 안키린 반복 도메인이 서열 번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 구현예 4a에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

6b. 구현예 6b에서, 본 발명은, 제2 안키린 반복 도메인이 서열 번호 1 내지 11, 76 및 77로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 구현예 4b에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

7. 제4 구현예에서, 본 발명은, 제3 안키린 반복 도메인을 추가로 포함하며, 여기서 상기 제3 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 11, 76, 77 및 85로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 구현예 4 내지 6 중 어느 하나에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

7a. 구현예 7a에서, 본 발명은, 제3 안키린 반복 도메인을 추가로 포함하며, 여기서 상기 제3 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 구현예 4a, 5a 또는 6a 중 어느 하나에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

7b. 구현예 7b에서, 본 발명은, 제3 안키린 반복 도메인을 추가로 포함하며, 여기서 상기 제3 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 11, 76 및 77로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 구현예 4b, 5b 또는 6b 중 어느 하나에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

8. 제8 구현예에서, 본 발명은, 상기 제3 안키린 반복 도메인이 서열 번호 1 내지 11, 76, 77 및 85로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 구현예 7에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

8a. 구현예 8a에서, 본 발명은, 상기 제3 안키린 반복 도메인이 서열 번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 구현예 7a에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

8b. 구현예 8b에서, 본 발명은, 상기 제3 안키린 반복 도메인이 서열 번호 1 내지 11, 76 및 77로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 구현예 7b에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

9. 제9 구현예에서, 본 발명은, 상기 제3 안키린 반복 도메인이 서열 번호 1 내지 11, 76, 77 및 85로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 구현예 7에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

9a. 구현예 9a에서, 본 발명은, 상기 제3 안키린 반복 도메인이 서열 번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 구현예 7a에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

9b. 구현예 9b에서, 본 발명은, 제3 안키린 반복 도메인이 서열 번호 1 내지 11, 76 및 77로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 구현예 7b에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

10. 제10 구현예에서, 본 발명은, 상기 제1, 제2 및 제3 안키린 반복 도메인이, 하기와 같이, 아미노산 서열을 포함하고 N-말단으로부터 C-말단까지 배열되는 것인, 구현예 7, 7a 또는 7b에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다:

(i) 서열 번호 6, 1 및 3과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;

(ii) 서열 번호 4, 2 및 1과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;

(iii) 서열 번호 4, 6 및 3과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;

(iv) 서열 번호 6, 3 및 6과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;

(v) 서열 번호 7, 3 및 6과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;

(vi) 서열 번호 8, 4 및 1과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;

(vii) 서열 번호 3, 6 및 7과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;

(viii) 서열 번호 4, 1 및 8과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;

(ix) 서열 번호 3, 6 및 9와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;

(x) 서열 번호 9, 3 및 6과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;

(xi) 서열 번호 1, 6 및 9와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;

(xii) 서열 번호 9, 6 및 1과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;

(xiii) 서열 번호 6, 9 및 10과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;

(xiv) 서열 번호 3, 9 및 11과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;

(xv) 서열 번호 10, 9 및 6과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;

(xvi) 서열 번호 11, 9 및 3과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;

(xvii) 서열 번호 5, 1 및 3과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;

(xviii) 서열 번호 1, 2 및 5와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;

(xix) 서열 번호 3, 5 및 6과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;

(xx) 서열 번호 6, 3 및 5와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;

(xxi) 서열 번호 7, 3 및 5와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;

(xxii) 서열 번호 8, 5 및 6과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;

(xxiii) 서열 번호 6, 10 및 11과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;

(xxiv) 서열 번호 3, 10 및 10과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;

(xxv) 서열 번호 5, 6 및 9와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;

(xxvi) 서열 번호 9, 3 및 5와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;

(xxvii) 서열 번호 9, 6 및 5와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;

(xxviii) 서열 번호 5, 9 및 10과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;

(xxix) 서열 번호 6, 9 및 11과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;

(xxx) 서열 번호 10, 9 및 5와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;

(xxxi) 서열 번호 11, 9 및 6과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;

(xxxii) 서열 번호 3, 76 및 77과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는

(xxxiii) 서열 번호 3, 85 및 77과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.

10a. 구현예 10a에서, 본 발명은 구현예 10 (xx)에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

10b. 구현예 10b에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 68과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

10c. 구현예 10c에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 68과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

10d. 구현예 10d에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

10e. 구현예 10e에서, 본 발명은, 구현예 10 (xxviii)에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

10f. 구현예 10f에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 69와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

10g. 구현예 10g에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 69와 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

10h. 구현예 10h에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 69의 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

10i. 구현예 10i에서, 본 발명은, 구현예 10 (xxxii)에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

10j. 구현예 10j에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 79와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

10k. 구현예 10k에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 상기 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 79와 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

10l. 구현예 10l에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 79의 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

10m. 구현예 10m에서, 본 발명은, 구현예 10 (xxxiii)에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

10n. 구현예 10n에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 89 내지 91로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

10o. 구현예 10o에서, 본 발명은, 폴리펩티드르 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 89 내지 91로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

10p. 구현예 10p에서, 본 발명은, 폴리펩티드르 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 89 내지 91로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

11. 제11 구현예에서, 본 발명은, 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합하는 구현예 1 내지 10p 중 어느 하나에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

12. 제12 구현예에서, 본 발명은, 상기 스파이크 단백질이 SARS-CoV-2 스파이크 단백질인, 구현예 11에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

13. 제13 구현예에서, 본 발명은, 상기 제1, 제2 및/또는 제3 안키린 반복 도메인이 약 100 nM 이하의 해리 상수 (K_D)로 상기 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합하는 것인, 구현예 11 및 12 중 어느 하나에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

14. 제14 구현예에서, 본 발명은, 적어도 하나의 안키린 반복 도메인을 포함하며, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 약 100 nM 이하의 해리 상수 (K_D)로 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합하는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

15. 제15 구현예에서, 본 발명은, 적어도 하나의 혈청 알부민 결합 도메인을 추가로 포함하는 임의의 상기 구현예에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

16. 제16 구현예에서, 본 발명은, 상기 혈청 알부민 결합 도메인이 서열 번호: 47-49로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 구현예 15에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

16a. 구현예 16a에서, 본 발명은, 적어도 약 30시간, 바람직하게는 적어도 약 35시간, 적어도 약 40시간, 또는 적어도 약 45시간의 마우스에서의 말기 반감기를 갖는 구현예 15 및 16 중 어느 하나에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

17. 제17 구현예에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 12-42, 75, 84, 87 및 88로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

17a. 구현예 17a에서, 본 발명은 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 31과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

17b. 구현예 17b에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 39과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

17c. 구현예 17c에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 75와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

17d. 구현예 17d에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 84와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

17e. 구현예 17e에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 87과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

17f. 구현예 17f에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 88과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

17g. 구현예 17g에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 12-42로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

17h. 구현예 17h에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 12-42 및 75로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

18. 제18 구현예에서, 본 발명은, 상기 폴리펩티드가 서열 번호: 12-42, 75, 84, 87 및 88로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 구현예 17에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

18a. 구현예 18a에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 31과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

18b. 구현예 18b에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 39와 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

18c. 구현예 18c에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 75와 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

18d. 구현예 18d에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 84와 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

18e. 구현예 18e에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 87과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

18f. 구현예 18f에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 88과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

18g. 구현예 18g에서, 본 발명은, 상기 폴리펩티드가 서열 번호: 12-42로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 구현예 17g에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

18h. 구현예 18h에서, 본 발명은, 상기 폴리펩티드가 서열 번호: 12-42 및 75로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 구현예 17h에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

19. 제19 구현예에서, 본 발명은, 상기 폴리펩티드가 서열 번호: 12-42, 75, 84, 87 및 88로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인, 구현예 17에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

19a. 구현예 19a에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 31의 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

19b. 구현예 19b에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

19c. 구현예 19c에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 75의 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

19d. 구현예 19d에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

19e. 구현예 19e에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 87의 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

19f. 구현예 19f에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 88의 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

19g. 구현예 19g에서, 본 발명은, 상기 폴리펩티드가 서열 번호: 12-42로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인, 구현예 17g에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

19h. 구현예 19h에서, 본 발명은, 상기 폴리펩티드가 서열 번호: 12-42 및 75로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인, 구현예 17h에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

20. 제20 구현예에서, 본 발명은, 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합하는 구현예 17 내지 19h 중 어느 하나에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

21. 제21 구현예에서, 본 발명은, 상기 스파이크 단백질이 SARS-CoV-2 스파이크 단백질인, 구현예 20에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

22. 제22 구현예에서, 본 발명은, 약 100 nM 이하의 해리 상수 (K_D)로 상기 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합하는 구현예 20 및 21 중 어느 하나에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

23. 제23 구현예에서, 본 발명은, 코로나바이러스에 의한 세포의 감염을 억제할 수 있는 구현예 1 내지 22 중 어느 하나에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

24. 제24 구현예에서, 본 발명은, SARS-CoV-2에 의한 세포의 감염을 억제할 수 있는 구현예 1 내지 22 중 어느 하나에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

25. 제25 구현예에서, 본 발명은 구현예 1 내지 24 중 어느 하나에 따른 재조합 결합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

25a. 구현예 25a에서, 본 발명은, 서열 번호 70 또는 서열 번호 70과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진, 상기 구현예 중 하나에 따른 재조합 결합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

25b. 구현예 25b에서, 본 발명은, 서열 번호 71 또는 서열 번호 71과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진, 상기 구현예 중 하나에 따른 재조합 결합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

25c. 구현예 25c에서, 본 발명은, 서열 번호 72 또는 서열 번호 72와 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진, 상기 구현예 중 하나에 따른 재조합 결합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

25d. 구현예 25d에서, 본 발명은, 서열 번호 73 또는 서열 번호 73과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진, 상기 구현예 중 하나에 따른 재조합 결합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

25e. 구현예 25e에서, 본 발명은, 서열 번호 74 또는 서열 번호 74와 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진, 상기 구현예 중 하나에 따른 재조합 결합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

25f. 구현예 25f에서, 본 발명은, 서열 번호 80 또는 서열 번호 80과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진, 상기 구현예 중 하나에 따른 재조합 결합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

25g. 구현예 25g에서, 본 발명은, 서열 번호 81 또는 서열 번호 81과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진, 상기 구현예 중 하나에 따른 재조합 결합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

25h. 구현예 25h에서, 본 발명은, 서열 번호 82 또는 서열 번호 82와 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진, 상기 구현예 중 하나에 따른 재조합 결합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

25i. 구현예 25i에서, 본 발명은, 서열 번호 83 또는 서열 번호 83과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진, 상기 구현예 중 하나에 따른 재조합 결합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

25j. 구현예 25j에서, 본 발명은, 서열 번호 78 또는 서열 번호 78과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진, 상기 구현예 중 하나에 따른 재조합 결합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

25k. 구현예 25k에서, 본 발명은, 서열 번호 86 또는 서열 번호 86과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진, 상기 구현예 중 하나에 따른 재조합 결합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

25l. 구현예 25l에서, 본 발명은, 서열 번호 92 또는 서열 번호 92와 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진, 상기 구현예 중 하나에 따른 재조합 결합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

25m. 구현예 25m에서, 본 발명은, 서열 번호 93 또는 서열 번호 93과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진, 상기 구현예 중 하나에 따른 재조합 결합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

25n. 구현예 25n에서, 본 발명은, 서열 번호 94 또는 서열 번호 94와 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진, 상기 구현예 중 하나에 따른 재조합 결합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

25o. 구현예 25o에서, 본 발명은, 서열 번호 95 또는 서열 번호 95와 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진, 상기 구현예 중 하나에 따른 재조합 결합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

26. 제26 구현예에서, 본 발명은 구현예 25 내지 25o 중 어느 하나의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.

27. 제27 구현예에서, 본 발명은, 구현예 26의 숙주 세포를 재조합 결합 단백질이 발현되는 조건 하에 배양하는 것을 포함하는, 구현예 1 내지 24 중 어느 하나에 따른 재조합 결합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.

28. 제28 구현예에서, 본 발명은, 구현예 1 내지 24 중 어느 하나의 결합 단백질 또는 구현예 25 내지 25o 중 어느 하나의 핵산, 및 제약상 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.

29. 제29 구현예에서, 본 발명은, 유효량의, 구현예 1 내지 24 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 결합 단백질, 또는 구현예 25 내지 25o 중 어느 하나의 핵산, 또는 구현예 28에 따른 제약 조성물을, 코로나바이러스 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 코로나바이러스 감염의 치료 방법에 관한 것이다.

29a. 구현예 29a에서, 본 발명은, 치료적 치료 방법인 구현예 29에 따른 치료 방법에 관한 것이다.

29b. 구현예 29b에서, 본 발명은, 예방적 치료 방법인 구현예 29에 따른 치료 방법에 관한 것이다.

29c. 구현예 29c에서, 본 발명은, 유효량의, 구현예 1 내지 24 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 결합 단백질, 또는 구현예 25 내지 25o 중 어느 하나의 핵산, 또는 구현예 28에 따른 제약 조성물을 코로나바이러스 감염의 방지를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 코로나바이러스 감염의 방지 방법에 관한 것이다.

29d. 구현예 29d에서, 본 발명은, 대상체에서의 코로나바이러스 감염의 진단 방법에서의 사용을 위한, 구현예 1 내지 24 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 결합 단백질, 또는 구현예 25 내지 25o 중 어느 하나의 핵산, 또는 구현예 28에 따른 제약 조성물에 관한 것이다.

29e. 구현예 29e에서, 본 발명은, 시험관내 또는 생체외에서 대상체로부터의 샘플을 구현예 1 내지 24 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 결합 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 대상체에서의 코로나바이러스 감염의 진단 방법에 관한 것이다.

29f. 구현예 29f에서, 본 발명은

a) 대상체로부터 샘플을 얻는 단계;

b) 상기 샘플을 구현예 1 내지 24 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 결합 단백질과 접촉시키는 단계; 및

c) 코로나바이러스 감염의 존재를 검출하는 단계

를 포함하는, 대상체에서의 코로나바이러스 감염의 검출 방법에 관한 것이다.

29g. 구현예 29g에서, 본 발명은, 대상체에서 코로나바이러스 감염의 치료 또는 방지에서의 사용을 위한, 구현예 1 내지 24 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 결합 단백질, 또는 구현예 25 내지 25o 중 어느 하나의 핵산, 또는 구현예 28에 따른 제약 조성물에 관한 것이다.

30. 제30 구현예에서, 본 발명은, 코로나바이러스 감염이 SARS-CoV-2에 의해 유발되는 것인, 구현예 29 내지 29g 중 어느 하나에 따른 방법에 관한 것이다.

31. 제31 구현예에서, 본 발명은, 상기 대상체가 인간인, 구현예 29, 29a, 29b, 29c, 29e, 29f, 29g 및 30 중 어느 하나에 따른 방법, 또는 구현예 29d에 따른 용도에 관한 것이다.

도 1: 상이한 안키린 반복 단백질 (DARPin® 단백질)에 대한 제안된 결합 부위를 보여주는 2019-nCoV 스파이크 단백질 프로모터.
도 2: 다운 형태의 2019-nCoV 스파이크 단백질 프로모터.
도 3: 상승된 hACE2 결합 부위를 보여주는, 업 형태의 2019-nCoV 스파이크 단백질 프로모터. hACE2는 스파이크 단백질의 업 형태에 결합되지만 다운 형태에는 결합되지 않는 것으로 생각된다.
도 4: hACE2 결합 부위, S1/S2 절단 부위 및 S2' 절단 부위의 위치를 나타내는, 2019-nCoV 스파이크 단백질 프로모터. 분자 성숙 동안, 스파이크 단백질은 삼량체화되고 S1/S2 부위에서 절단된다. 이는 비-공유 복합체로서 막에서 나타난다. 막 융합을 위해서는 스파이크 단백질의 수용체-결합 및 단백질분해 프로세싱의 협조 작용이 요구된다. 형태 전환을 위한 초기 에너지 장벽이 필수적이다. 이론에 의해 얽매이길 원하지는 않으며, 이 에너지 장벽은 (i) hACE2 수용체에 대한 결합; 및 (ii) S2' 부위에서 단백질분해 프라이밍에 의해 극복된다. 숙주 세포 표면에서 ACE2와의 상호작용은 S2' 부위의 절단을 촉발하는 것으로 믿어진다. 이 절단은 광범위한 비가역적 형태 변화를 통해 막 융합을 위해 단백질을 활성화하기 위해 제안되었다.
도 5: 스파이크 단백질에 결합하는 단일 안키린 반복 도메인을 포함하는 다양한 재조합 결합 단백질 (단일-도메인 및 단일-파라토프 DARPin® 결합 단백질) 100 nM에서의 SARS-CoV-2 VSV 유사타입 바이러스 억제. 보다 짧은 막대는 보다 강한 바이러스 억제를 나타낸다.
도 6: 스파이크 단백질에 결합하는 단일 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질 (단일-도메인 및 단일-파라토프 DARPin® 결합 단백질)의 대표적인 SPR (표면 플라즈몬 공명) 추적.
도 7: 스파이크 단백질에 결합하는 3개의 안키린 반복 도메인을 포함하는 다양한 재조합 결합 단백질 (다중-도메인 및 다중-파라토프 DARPin® 결합 단백질) 100 nM에서의 SARS-CoV-2 VSV 유사타입 바이러스 억제. 보다 짧은 막대는 보다 강한 바이러스 억제를 나타낸다.
도 8: 스파이크 단백질에 결합하는 3개의 안키린 반복 도메인을 포함하는 다양한 재조합 결합 단백질 (다중-도메인 및 다중-파라토프 DARPin® 결합 단백질) 1 nM에서의 SARS-CoV-2 VSV 유사타입 바이러스 억제. 보다 짧은 막대는 보다 강한 바이러스 억제를 나타낸다.
도 9a-c: 스파이크 단백질에 결합하는 단일 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질의 대표적인 SPR (표면 플라즈몬 공명) 추적. 4 또는 5개 농도 SPR 핏팅 곡선은 이들 단일-도메인, 단일-파라토프 DARPin® 결합 단백질의 높은 결합 친화도 (예: 두자릿수 pM 범위)를 확인시켜준다. 도 9c에서, 상부 패널은 서열 번호: 9를 나타내고, 하부 패널은 서열 번호: 10을 나타낸다.
도 10: GFP-라벨링된 VSV 유사타입 SARS-CoV-2 바이러스로 감염된 GFP 포지티브 베로(Vero) E06 세포를 보여주는 형광 현미경검사 이미지. DARPin® 작제물 ALE043 (서열 번호: 25) 및 vS07_M101E04는 웰 1 (100 nM 농도) 및 웰 6 (3.125 nM)에서 임의의 감염된 세포를 나타내지 않지만, 이소타입 네가티브 대조군 (his-태깅된 MP0250)에 대하여 웰 1 및 6에서는 가시적인 GFP-라벨링된 VSV 유사타입 SARS-CoV-2 바이러스로의 베로 E06 세포의 감염이 있다. 웰 12에서의 보다 낮은 DARPin® 단백질 농도 (0.049 nM)에서는 감염된 베로 E06 세포 (GFP 포지티브)가 모든 작제물에서 가시적이다.
도 11: 다중-도메인 DARPin® 결합 단백질에 의한 VSV 유사타입 SARS-CoV-2 바이러스의 중화. 시험된 작제물의 명칭 (ALE030, ALE031 등)이 도에 나타나 있다.
도 12: 다중-도메인 DARPin® 결합 단백질에 의한 VSV 유사타입 SARS-CoV-2 바이러스의 중화. 시험된 작제물의 명칭 (ALE030, ALE033 등)이 도에 나타나 있다.
도 13: 0.0064 내지 100 nm의 각 희석 값에 대한 3중 웰 및 대조군 웰 및 연부 주위의 경계 대역을 갖는 실시예 4에서 사용된 시험 플레이트의 맵.
도 14a-f: 실시예 4로부터 얻어진 시험 플레이트의 사진.
도 15a-b: ALE033의 특성화 (표 5, 샘플 3 참조). 도 15a는 코로나바이러스 스파이크 단백질에 대한 높은 친화도 결합을 보여주는 SPR (표면 플라즈몬 공명) 추적. 시간에 따라 표적 결합의 손실이 관찰되지 않았다. 도 15b는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 프로파일 (몰 질량 vs 시간)을 나타낸다. 응집물 또는 올리고머가 관찰되지 않았다. CD (원형 이색성) 스펙트럼 (제공되지 않음) 상에서 85℃까지 언폴딩이 검출가능하지 않았다.
도 16: ALE030에 대한 SPR (표면 플라즈몬 공명) 추적 (표 5, 샘플 1 참조).
도 17: ALE038에 대한 SPR (표면 플라즈몬 공명) 추적 (표 5, 샘플 7 참조).
도 18a-d: 실시예 5로부터 얻어진 시험 플레이트의 사진.
도 19: CellTiter-Glo® 발광 세포 생존능 검정 (Promega)으로 측정된 세포 보호, 실시예 7 참조.
도 20: 바이올렛 크리스탈 염색 후 얻어진 시험 플레이트의 사진, 실시예 8 참조.
도 21a-c: CellTiter-Glo® 발광 세포 생존능 검정 (Promega)으로 측정된 세포 보호, 실시예 8 참조.
도 22a-b: (A) SARS-CoV-2의 스파이크 엑토도메인 (회색)에 결합된 ALE049의 분자 모델 (황색: HSA-결합 도메인; 시안, 청색 및 마젠타: RBD-결합 도메인). (B) SARS-CoV-2의 스파이크 엑토도메인 (회색)에 결합된 ALE058의 분자 모델 (황색: HSA-결합 도메인; 청색: RBD-결합 도메인; 녹색: S1-NTD-결합 도메인; 적색: S2-결합 도메인).
도 23: 다중-특이적 결합 단백질 ALE049 및 ALE058로의 SARS-CoV-2 VSV 유사타입 바이러스의 중화, 실시예 8 참조.
도 24: 실시예 9에서 사용된 ELISA 방법.
도 25: ALE033, ALE048 및 ALE049에 대한 평균 혈청 농도 데이터, 실시예 9 참조.
도 26a-e: 방지적 시리아 골드 햄스터 모델에서 SARS-CoV-2 감염 치료에서의 ALE049의 효능, 실시예 10 참조.
도 27: 제4일에 찍은 햄스터 폐 조직의 대표적 조직병리학 현미경검사 사진. 좌측 패널: 1600 μg ALE049로 치료된 동물의 건강한 햄스터 폐 조직 (그룹 1); 우측 패널: 위약 주사를 수용한 동물의 병든 폐 조직 (그룹 4).
도 28: 실시예 11 및 12에서 평가된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 돌연변이의 구조적 시각화. a) 청색 구체로 시각화된 유사바이러스 중화 검정에서 분석된 모든 잔기를 갖는 완전한 삼량체 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 표시. ALE049 및 ALE109에 통합된 개별 DARPin® 도메인에 대한 결합 영역은 청색 (RBD), 녹색 (NTD), 및 적색 (S2)으로 채색되어 있음; b) UK B.1.1.7에서 최초로 식별된 변이체 (del69-70, del145, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H)를 나타내는 단량체 스파이크 단백질 구조; c) 남아프리카 B.1.351에서 최초로 식별된 변이체 (D80A, D215G, E484K, N501Y, A701V)를 나타내는 단량체 스파이크 단백질 구조. PDB 파일 6xcn을 PyMol 버전 2.1.1로 도를 생성하는 데 사용하였다 (Schr

dinger, LLC). 모든 돌연변이를 시각화하기 위해, 루프 518-520, 676-689, 811-813 및 cryo-EM 구조에서 누락된 NTD 도메인의 영역을, NTD 도메인에 대한 템플레이트로서 PDB 파일 6zge를 사용하여 BIOVIA Discovery Studio 소프트웨어에 포함된 MODELLER (BIOVIA, Dassault Syst

mes, BIOVIA Discovery Studio 2021)로 모델링하였다.
도 29: (a) 녹아웃 실험을 위해 생성된 ALE109 작제물의 시각적 표시. 각각의 녹아웃(k.o.) 작제물에 대해, 지시된 SARS-CoV-2 결합 DARPin® 도메인을 비-결합 DARPin® 도메인으로 교체하였다. HSA: HSA-결합 DARPin® 도메인, RBD: RBD-결합 DARPin® 도메인, NTD: NTD-결합 DARPin® 도메인, S2: S2-결합 DARPin® 도메인, 실시예 11 참조. (b) 야생형 스파이크 단백질을 발현하는 VSV-SARS-CoV-2 유사바이러스에 대한 ALE109 및 k.o. 작제물의 중화 프로파일. (c) 상부 패널: SARS-CoV-2 (100 pfu)-매개된 세포변성 효과에 대한 DARPin® 분자의 보호 효과. ALE109 또는 k.o. 작제물에 의해 부여된 세포 보호의 백분율이 도시되어 있다. Cell Titer-Glo를 사용하는 세포 생존능 검정에서 세포내 ATP 수준을 측정함으로써 인큐베이션 3일 후에 세포 보호를 결정하였다. 하부 패널: 실시간 RT-PCR에 의해 정량화되고 ALE109 또는 k.o. 작제물의 양이 증가함에 따른 100 pfu SARS-CoV-2에 노출된 베로 E6 세포의 상청액 중에 존재하는 바이러스 게놈 당량의 백분율로서 표현된 SARS-CoV-2 바이러스 복제의 억제. (d) 분석된 작제물의 IC₅₀/EC₅₀값 및 효력 순위.
도 30: 실시예 12의 절차의 개략적 표시.
도 31: 실시예 12에서 관찰된 세포변성 효과를 나타내는 표. DARPin® 결합 단백질 R1b는 이 도에서 RBD-2라 불림.
도 32: 다중-도메인 DARPin® 결합 단백질에 의한 VSV 유사타입 SARS-CoV-2 바이러스의 중화. 시험된 작제물의 명칭 (ALE049, ALE058 등)이 도에 나타나 있다.
도 33: 1 mg/kg의 투여 후 BALB/c 마우스에서의 ALE058의 평균 혈청 농도-시간 프로파일.
도 34: 1 mg/kg의 투여 후 BALB/c 마우스에서의 ALE109, ALE126, ALE129, 및 ALE133의 평균 혈청 농도-시간 프로파일.
도 35. 개략적 연구 개요. 체중 및 온도를 매일 측정하고, 각 그룹에 대해 3마리의 동물로부터 면봉, 혈액 및 조직을 수집하였고, 이를 각각 제3일 및 제5일에 안락사시켰다.
도 36. 제0일부터 제5일까지의 시간 경과에 따른 모든 5개 연구 그룹의 체중 측정의 평균 및 SEM.
도 37a 내지 37d: 각각의 시점에 대하여 3마리의 동물의, 제3일 (a) 및 제5일 (b)의 폐 균질물의 생바이러스 적정에 의한, 또한 제3일 (c) 및 제5일 (d)의 폐에서의 게놈 카피의 qPCR 측정에 의한 바이러스 정량화.
도 38a 내지 38d: 염증 징후 (a), 영향 받은 혈관 (b), 폐포 (c) 또는 기관지 (d)에 대한 4개의 카테고리로 그룹화된 평균 조직병리학 점수의 합계.

발명의 상세한 설명

개요

코로나바이러스 스파이크 단백질, 특히 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 하나 이상의 디자인된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질이 본원에 개시된다. 또한, 결합 단백질을 코딩하는 핵산, 결합 단백질 또는 핵산을 포함하는 제약 조성물, 및 결합 단백질, 핵산, 또는 제약 조성물의 사용 방법이 개시된다.

본 발명에 따른 재조합 결합 단백질은 하나 이상의 결합 부위에서 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합함으로써 바이러스를 중화시킨다. 이들 결합 부위를 도 1에 나타내었다. 하나의 구현예에서, 재조합 결합 단백질은 스파이크 단백질 상의 3개의 부위에 결합한다.

이론에 의해 얽매이길 원하지는 않으며, 본 발명의 디자인된 안키린 반복 단백질은 (i) 수용체 결합의 억제; (ii) 스파이크 단백질 형태적 변화의 알로스테릭 억제 제공; 및/또는 (iii) 스파이크 단백질 활성화에 필요한 프로테아제 부위 차단에 의해 작용하는 것으로 믿어진다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 디자인된 안키린 반복 도메인 1 (DARPin® 1)은 안지오텐신-전환 효소 2 (ACE2) 수용체 결합 차단에 의해 작용하는 것으로 이해된다. 디자인된 안키린 반복 도메인 1 및 2 (DARPin® 1 및 2)는 추가로, 스파이크 단백질의 형태적 변화를 방지하여, 스파이크 단백질을 닫힌 구성으로 효과적으로 락킹함으로써 작용하는 것으로 이해된다. 디자인된 안키린 반복 도메인 3 (DARPin® 3)은, 형태적 변화를 추가로 억제하고 프로테아제 결합을 차단하는 것으로 이해된다. 이들 디자인된 안키린 반복 도메인은 개별 단백질로서 스파이크 단백질에 결합하고/거나 이를 억제할 수 있다. 다중-특이적 단백질은, 다중-도메인에 의한 다중-에피토프 표적화에 의해, 스파이크 단백질의 훨씬 더 강력한 중화를 제공하고, 탈출 돌연변이의 가능성을 최소화하는 것으로 믿어진다.

기재된 디자인된 안키린 반복 단백질의 추가의 이점은, 이들이 Fc-매개된 대식세포 또는 보체 활성화의 결핍으로 인한 급성 폐 염증 (ALI)의 발병을 감소시킬 수 있다는 점이다 (하기 문헌에 기재됨: Liu et al., JCI Insight, 2019 4(4):e123158). 디자인된 안키린 반복 단백질은 또한 모노클로날 항체로는 접근가능하지 않은 에피토프를 다룰 수 있다.

기재된 디자인된 안키린 반복 단백질에 대한 추가의 이점은, 이들이 낮은 면역원성 가능성을 갖고 표적 이탈 효과를 갖지 않는다는 점이다. DARPin® 후보물은 또한 빠른 저비용 및 고수율 제조 및 4℃에서 최대 수년의 저장-수명을 포함한 유리한 개발 특성을 나타낸다.

정의

본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학적 및 기술적 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 또한, 문맥에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수형 용어는 복수를 포함하고, 복수형 용어는 단수를 포함한다. 일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용된 명명법 및 이들의 기술은 당업계에서 널리 공지되어 있고 통상적으로 사용되는 것들이다.

용어 "포함하는", "갖는", "포함한" 및 "함유하는"은 달리 언급되지 않는 한 개방형 용어로서 해석되어야 한다. 본 발명의 측면이 특징을 "포함하는" 것으로 기재되는 경우, 구현예는 또한 그 특징으로 "이루어진" 또는 "본질적으로 이루어진" 것으로 고려된다. 본원에서 제공되는 임의의 및 모든 예, 또는 예시적 언어 (예: "예컨대")의 사용은, 단지 개시내용을 보다 잘 나타내도록 의도되며, 달리 청구되지 않는 한 개시내용의 범위에 대한 제한을 부여하지 않는다. 어떠한 명세서의 언어도, 임의의 청구되지 않은 요소가 개시내용의 실행을 위해 필수적임을 나타내는 것으로 해석되지 않아야 한다. 작업 실시예에서, 또는 달리 지시된 경우를 제외하고는, 본원에서 사용되는 성분 또는 반응 조건의 양을 표현하는 모든 수는, 용어 "약"이 관련 기술분야의 숙련자에 의해 해석되는 바와 같이, 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "약"은, 달리 언급되지 않는 한, 주어진 수치의 ± 10%와 동등하다.

본원에서 값의 범위의 언급은, 본원에서 달리 지시하지 않는 한, 단지 범위 및 각각의 종점 내에 속하는 각각의 별도의 값을 개별적으로 지칭하는 속기 방법으로서 제공되도록 의도되며, 각각의 별도의 값 및 종점은 이것이 개별적으로 본원에서 언급되는 것과 같이 명세서에 포함된다.

용어 "핵산" 또는 "핵산 분자"는, 단일 가닥 또는 이중 가닥인, 리보핵산 (RNA) 또는 데옥시리보핵산 (DNA) 분자일 수 있는 폴리뉴클레오티드 분자를 지칭하며, DNA 또는 RNA의 변형된 및 인공 형태를 포함한다. 핵산 분자는 단리된 형태로 존재하거나 재조합 핵산 분자 또는 벡터 중에 포함될 수 있다.

본 발명의 문맥에서, 용어 "단백질"은 폴리펩티드를 포함하는 분자를 지칭하며, 여기서 폴리펩티드의 적어도 부분은 단일 폴리펩티드 사슬 내 및/또는 다수의 폴리펩티드 사슬 사이의 2차, 3차, 및/또는 4차 구조를 형성함으로써 정의된 3-차원 배열을 갖거나 획득할 수 있다. 단백질이 2개 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 경우, 개별 폴리펩티드 사슬은, 예를 들어, 2개의 폴리펩티드 사이의 디술피드 결합에 의해, 비-공유 또는 공유 연결될 수 있다. 2차 및/또는 3차 구조를 형성함으로써 정의된 3-차원 배열을 개별적으로 갖거나 획득할 수 있는 단백질의 부분은 "단백질 도메인"이라 불린다. 이러한 단백질 도메인은 당업계의 숙련된 실무자에게 널리 공지되어 있다.

재조합 단백질, 재조합 폴리펩티드 등에서 사용되는 바와 같이 용어 "재조합"은, 상기 단백질 또는 폴리펩티드가 당업계의 숙련된 실무자에게 널리 공지된 재조합 DNA 기술의 사용에 의해 생성됨을 의미한다. 예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 DNA 분자 (예를 들어, 유전자 합성에 의해 생성됨)는 박테리아 발현 플라스미드 (예: pQE30, QIAgen), 효모 발현 플라스미드, 포유류 발현 플라스미드, 또는 식물 발현 플라스미드, 또는 시험관내 발현이 가능한 DNA로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 이러한 재조합 박테리아 발현 플라스미드가 적절한 박테리아 (예: 대장균(Escherichia coli))에 삽입되면, 이들 박테리아는 이 재조합 DNA에 의해 코딩되는 폴리펩티드(들)를 생성할 수 있다. 상응하게 생성된 폴리펩티드 또는 단백질은 재조합 폴리펩티드 또는 재조합 단백질이라 불린다.

본 발명의 문맥에서, 용어 "결합 단백질"은 결합 도메인을 포함하는 단백질을 지칭한다. 결합 단백질은 또한 2, 3, 4, 5개 이상의 결합 도메인을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 결합 단백질은 재조합 결합 단백질이다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 결합 단백질은 코로나바이러스 스파이크 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함한다.

용어 "표적"은 개별 분자, 예컨대 핵산 분자, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질, 탄수화물, 또는 이러한 개별 분자의 임의의 부분을 포함한 임의의 다른 자연 발생 분자, 또는 이러한 분자 둘 이상의 복합체, 또는 전체 세포 또는 조직 샘플, 또는 임의의 비-자연 화합물을 지칭한다. 바람직하게는, 표적은 자연 발생 또는 비-자연 폴리펩티드 또는 단백질, 또는 화학적 변형, 예를 들어, 자연 발생 또는 비-자연 인산화, 아세틸화, 또는 메틸화를 함유하는 폴리펩티드 또는 단백질이다.

본 발명의 문맥에서, 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합을 통해 연결된 다수의, 즉 2개 이상의 아미노산의 사슬로 이루어진 분자에 관한 것이다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 펩티드 결합을 통해 연결된 8개 초과의 아미노산으로 이루어진다. 용어 "폴리펩티드"는 또한, 시스테인의 S-S 브릿지에 의해 함께 연결된 아미노산의 다수의 사슬을 포함한다. 폴리펩티드는 당업자에게 널리 공지되어 있다.

특허 출원 WO2002/020565 및 문헌 [Forrer et al., 2003 (Forrer, P., Stumpp, M.T., Binz, H.K., Pl

ckthun, A., 2003. FEBS Letters 539, 2-6)]은, 반복 단백질 특징 및 반복 도메인 특징, 기술 및 응용에 대한 일반적 설명을 함유한다. 용어 "반복 단백질"은 하나 이상의 반복 도메인을 포함하는 단백질을 지칭한다. 바람직하게는, 반복 단백질은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 반복 도메인을 포함한다. 또한, 상기 반복 단백질은 추가의 비-반복 단백질 도메인, 폴리펩티드 택 및/또는 펩티드 링커를 포함할 수 있다. 반복 도메인은 결합 도메인일 수 있다.

용어 "반복 도메인"은 구조 단위로서 2개 이상의 연속적인 반복 모듈을 포함하는 단백질 도메인을 지칭하며, 여기서 상기 반복 모듈은 구조적 및 서열 상동성을 갖는다. 바람직하게는, 반복 도메인은 또한 N-말단 및/또는 C-말단 캡핑 모듈을 포함한다. 명확성을 위해, 캡핑 모듈은 반복 모듈일 수 있다. 이러한 반복 도메인, 반복 모듈, 및 캡핑 모듈, 서열 모티프, 뿐만 아니라 구조적 상동성 및 서열 상동성은 안키린 반복 도메인 (Binz et al., J. Mol. Biol. 332, 489-503, 2003; Binz et al., Nature Biotech. 22(5): 575-582 (2004); WO2002/020565; WO2012/069655), 류신-풍부 반복 도메인 (WO2002/020565), 테트라트리코펩티드 반복 도메인 (Main, E.R., Xiong, Y., Cocco, M.J., D'Andrea, L., Regan, L., Structure 11(5), 497-508, 2003), 및 아르마딜로 반복 도메인 (WO2009/040338)의 예로부터 당업계의 실무자에게 널리 공지되어 있다. 또한, 이러한 반복 도메인은 모든 반복 아미노산 서열이 개별 도메인 (예를 들어 피브로넥틴의 FN3 도메인)을 형성할 수 있는 반복 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 상이함이 당업계의 실무자에게 널리 공지되어 있다.

용어 "안키린 반복 도메인"은 구조 단위로서 2개 이상의 연속적인 안키린 반복 모듈을 포함하는 반복 도메인을 지칭하며, 여기서 상기 안키린 반복 모듈은 구조적 및 서열 상동성을 갖는다.

디자인된 반복 단백질, 디자인된 반복 도메인 등에서 사용되는 바와 같이 용어 "디자인된"은, 각각 이러한 반복 단백질 및 반복 도메인이 인공의 것이며 자연에서 발생하지 않는 특성을 지칭한다. 본 발명의 결합 단백질은 디자인된 반복 단백질이고, 이들은 적어도 하나의 디자인된 반복 도메인을 포함한다. 바람직하게는, 디자인된 반복 도메인은 디자인된 안키린 반복 도메인이다.

용어 "표적 상호작용 잔기"는 표적과의 직접적 상호작용에 기여하는 반복 모듈의 아미노산 잔기를 지칭한다.

용어 "프레임워크 잔기" 또는 "프레임워크 위치"는 폴딩 토폴로지에 기여하는, 즉 상기 반복 모듈의 폴드에 기여하거나 이웃 모듈과의 상호작용에 기여하는 반복 모듈의 아미노산 잔기를 지칭한다. 이러한 기여는 반복 모듈 내의 다른 잔기와의 상호작용, 또는 α-나선 또는 β-시트에서 나타나는 바와 같은 폴리펩티드 백본 형태에 대한 영향, 또는 선형 폴리펩티드 또는 루프를 형성하는 아미노산 신축에서의 참여일 수 있다.

이러한 프레임워크 및 표적 상호작용 잔기는 물리화학적 방법, 예컨대 X선 결정학, NMR 및/또는 CD 분광학에 의해, 또는 구조 생물학 및/또는 생물정보학에서의 실무자에게 널리 공지되어 있는 공지된 및 관련된 구조적 정보와의 비교에 의해 얻어진 구조적 데이터의 분석에 의해 식별될 수 있다.

용어 "반복 모듈"은, 원래 자연 발생 반복 단백질의 반복 단위로부터 유래된 디자인된 반복 도메인의 반복 아미노산 서열 및 구조적 단위를 지칭한다. 반복 도메인에 포함된 각각의 반복 모듈은 자연 발생 반복 단백질의 패밀리 또는 서브패밀리, 바람직하게는 안키린 반복 단백질의 패밀리의 하나 이상의 반복 단위로부터 유래된다. 또한, 반복 도메인에 포함된 각각의 반복 모듈은, 동일한 표적 특이성을 갖고, 예를 들어 실시예 1에 기재된 바와 같은, 표적 상의 선택된 반복 도메인으로부터 얻어진 상동 반복 모듈로부터 추론된 "반복 서열 모티프"를 포함할 수 있다.

따라서, 용어 "안키린 반복 모듈"은, 원래 자연 발생 안키린 반복 단백질의 반복 단위로부터 유래된 반복 모듈을 지칭한다. 안키린 반복 단백질은 당업자에게 널리 공지되어 있다.

반복 모듈은 표적-특이적 반복 도메인 선택 목적상 라이브러리에서 랜덤화되지 않은 아미노산 잔기를 갖는 위치 ("비-랜덤화된 위치" 또는 "고정된 위치"가 본원에서 상호교환가능하게 사용됨) 및 표적-특이적 반복 도메인 선택 목적상 라이브러리에서 랜덤화된 아미노산 잔기를 갖는 위치 ("랜덤화된 위치")를 포함할 수 있다. 비-랜덤화된 위치는 프레임워크 잔기를 포함한다. 랜덤화된 위치는 표적 상호작용 잔기를 포함한다. "랜덤화되었음"은 2개 이상의 아미노산이 반복 모듈의 아미노산 위치에서 허용되었으며, 예를 들어, 여기서는 통상적인 20개의 자연 발생 아미노산 중 임의의 것이 허용되었거나, 또는 20개의 자연 발생 아미노산의 대부분, 예컨대 시스테인 이외의 아미노산, 또는 글리신, 시스테인 및 프롤린 이외의 아미노산이 허용되었음을 의미한다.

용어 "반복 서열 모티프"는 하나 이상의 반복 모듈로부터 추론된 아미노산 서열을 지칭한다. 바람직하게는, 상기 반복 모듈은 동일한 표적에 대한 결합 특이성을 갖는 반복 도메인으로부터의 것이다. 이러한 반복 서열 모티프는 프레임워크 잔기 위치 및 표적 상호작용 잔기 위치를 포함한다. 상기 프레임워크 잔기 위치는 반복 모듈의 프레임워크 잔기의 위치에 상응한다. 마찬가지로, 상기 표적 상호작용 잔기 위치는 반복 모듈의 표적 상호작용 잔기의 위치에 상응한다. 반복 서열 모티프는 비-랜덤화된 위치 및 랜덤화된 위치를 포함한다.

용어 "반복 단위"는 하나 이상의 자연 발생 단백질의 서열 모티프를 포함하는 아미노산 서열을 지칭하며, 여기서 상기 "반복 단위"는 다수의 카피에서 나타나고, 단백질의 폴드를 결정하는 모든 상기 모티프에 공통적인 정의된 폴딩 토폴로지를 나타낸다. 이러한 반복 단위의 예는 류신-풍부 반복 단위, 안키린 반복 단위, 아르마딜로 반복 단위, 테트라트리코펩티드 반복 단위, HEAT 반복 단위, 및 류신-풍부 변이체 반복 단위를 포함한다.

용어 "안키린 반복 도메인"은, 원래 자연 발생 안키린 반복 단백질의 반복 단위로부터 유래된, 적어도 하나의 안키린 반복 모티프를 포함하는 도메인을 지칭한다. 일반적으로, 안키린 반복 모티프는 루프에 의해 분리된 2개의 알파 나선을 형성하는 약 33개의 잔기를 포함한다. 안키린 반복 단백질은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 국제 특허 공개 번호 WO 2002/020565, WO 2010/060748, WO 2011/135067, WO 2012/069654, WO 2012/069655, WO 2014/001442, WO 2014/191574, WO 2014/083208, WO 2016/156596, 및 WO 2018/054971을 참조하며, 이들 모두 그 전체가 참조로 포함된다. 안키린 반복 도메인은 임의로 적절한 캡핑 모듈을 추가로 포함한다.

안키린 반복 도메인은, 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여, 임의로 반감기 연장 도메인을 갖는, 본 개시내용에 따른 보다 큰 안키린 반복 단백질로 모듈식 조립될 수 있다 (예를 들어, 하기 문헌 참조: Forrer, P., et al., FEBS letters 539, 2-6, 2003, WO 2012/069655, WO 2002/020565).

안키린 반복 도메인은, 이것이 대안적 표적 (예: 세포 또는 물질)과 반응하거나 회합하는 것보다 특정 표적 (예: 세포 또는 물질)과 보다 빈번하게, 보다 빠르게, 보다 큰 지속기간으로 및/또는 보다 큰 친화도로 반응하거나 회합하는 경우, 표적에 "특이적으로 결합" 또는 "우선적으로 결합" (본원에서 상호교환가능하게 사용됨)한다. 예를 들어, 코로나바이러스 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 안키린 반복 도메인은, 이것이 다른 비-코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합력(avidity)으로, 더 빠르게, 및/또는 더 큰 지속기간으로 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합하는 안키린 반복 도메인이다. 이 정의를 읽음으로써, 예를 들어, 제1 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 안키린 반복 도메인은 제2 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있거나 그렇지 않을 수 있음이 또한 이해된다. 이에 따라, "특이적 결합"은 배타적 결합을 반드시 요구하지는 않는다 (이를 포함할 수는 있음). 일반적으로, 지정된 검정 조건 하에, 안키린 반복 도메인은 특정 표적 분자에 우선적으로 결합하고 시험 샘플 중에 존재하는 다른 성분에는 유의한 양으로 결합하지 않는다.

다양한 검정 포맷을 사용하여 관심 분자에 특이적으로 결합하는 안키린 반복 도메인을 선택하거나 특성화할 수 있다. 예를 들어, 고체-상 ELISA 면역검정, 면역침전, BIAcore™ (GE Healthcare, 미국 뉴욕주 피스카타웨이), 형광-활성화 세포 선별 (FACS), Octet™ (ForteBio, Inc., 미국 캘리포니아주 멘로 파크) 및 웨스턴 블롯(Western blot) 분석이 표적과 특이적으로 반응하는 안키린 반복 도메인의 식별에 사용될 수 있는 많은 검정에 포함된다. 전형적으로, 특이적 또는 선택적 반응은 백그라운드 신호 또는 잡음의 적어도 2배이고 보다 전형적으로는 백그라운드의 10배 초과일 것이다. 더욱 더 구체적으로, 안키린 반복 도메인은 평형 해리 상수 (K_D) 값이 < 1 μM, 예컨대 < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 100 pM, < 10 pM, 또는 < 1 pM일 때 표적에 "특이적으로 결합"한다고 언급된다.

K_D 값은 종종 결합 친화도로서 언급된다. 결합 친화도는 하나의 결합 파트너의 접촉 잔기(들)와 그의 결합 파트너의 접촉 잔기(들) 사이의 비-공유 상호작용의 총 합계의 강도를 측정한다. 달리 지시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 바와 같이, 결합 친화도는 결합 쌍 또는 결합 파트너의 구성원 사이의 1:1 상호작용을 나타내는 결합 친화도를 지칭한다. 하나의 결합 파트너에 대하여 2개의 결합 도메인을 포함하는 결합 단백질의 경우, 결합 친화도는 결합 단백질과 결합 파트너 사이의 1:2 상호작용을 나타내는 결합 친화도를 지칭할 수 있다.

결합 친화도의 다양한 측정 방법이 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 목적상 이들 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 예시되는 바와 같이, 결합 친화도는 K_D 값으로서 표현될 수 있고, 이는 특정 안키린 반복 도메인 및 그의 결합 표적의 해리 속도를 지칭한다. K_D는, 회합 속도, 또는 "온-레이트(on-rate) (K_on)"에 대한, "오프-레이트(off-rate) (K_off)"라고도 불리는 해리 속도의 비율이다. 따라서, K_D는 K_off/K_on과 같고 몰 농도 (M)로 표현되며, K_D가 작을수록 결합의 친화도가 강하다.

K_D 값은 임의의 적합한 방법을 사용하여 결정될 수 있다. K_D의 하나의 예시적 측정 방법은 표면 플라즈몬 공명 (SPR)이다 (예를 들어, 하기 문헌 참조: Nguyen et al. Sensors (Basel). 2015 May 5; 15(5):10481-510). K_D 값은 BIACORE® 시스템 등의 바이오센서 시스템을 사용하여 SPR에 의해 측정될 수 있다. BIAcore 동역학 분석은 그 표면 상에 고정화된 분자 (예: 에피토프 결합 도메인을 포함하는 분자)를 갖는 칩으로부터의 항원의 결합 및 해리를 분석하는 것을 포함한다. 단백질의 K_D를 결정하는 또 다른 방법은 바이오-층 간섭계측의 사용에 의한 것이다 (예를 들어, 하기 문헌 참조: Shah et al. J Vis Exp. 2014; (84): 51383). K_D 값은 OCTET® 기술 (Octet QKe 시스템, ForteBio)을 사용하여 측정될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, Sapidyne Instruments (미국 아이다호주 보이시)로부터 입수가능한 KinExA® (역학적 배제 검정) 검정이 사용될 수도 있다. 2개의 결합 파트너 사이의 결합 친화도의 평가에 적합한 임의의 방법이 본원에 포함된다. 표면 플라즈몬 공명 (SPR)이 특히 바람직하다. 가장 바람직하게는, K_D 값이 PBS 중에서 SPR에 의해 결정된다.

용어 "PBS"는 137 mM NaCl, 10 mM 포스페이트 및 2.7 mM KCl을 함유하고 7.4의 pH를 갖는 인산염 완충 수용액을 의미한다.

용어 "치료" 뿐만 아니라 그와 관련된 단어는 반드시 100% 또는 완전한 치유를 암시하지는 않는다. 그보다는, 당업자가 잠재적 이익 또는 치료적 효과를 갖는 것으로 인식하는 다양한 치료 정도가 존재한다. 이와 관련하여, 본원에 기재된 코로나바이러스 감염의 치료 방법은 임의의 양 또는 임의의 수준의 치료를 제공할 수 있다. 또한, 본 개시내용의 방법에 의해 제공되는 치료는 하나 이상의 병태 또는 증상의 치료 (즉, 그로부터의 경감)를 포함할 수 있다. 예시적 측면에서, 방법은 대상체의 생존율을 증가시키는 방식으로 치료한다. 용어 "치료"는 예방적 (방지적) 치료를 또한 포함한다.

임의의 주어진 질환 또는 병태에서 치료적 반응은 그 질환 또는 병태에 대해 특이적인 표준화된 반응 기준에 의해 결정될 수 있다. 치료법을 받는 대상체는 질환과 관련된 증상에서의 개선의 유익한 효과를 경험할 수 있다.

코로나바이러스 스파이크 단백질을 표적화하는 재조합 결합 단백질

코로나바이러스 스파이크 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 1, 2, 3개 또는 그 초과의 디자인된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질이 본원에 기재된다. 바람직한 구현예에서, 이러한 재조합 결합 단백질은 코로나바이러스 스파이크 단백질 상의 2, 3개 또는 그 초과의 상이한 에피토프를 표적화하는 코로나바이러스 스파이크 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 2, 3개 또는 그 초과의 디자인된 안키린 반복 도메인을 포함한다.

디자인된 안키린 반복 모티프 또는 모듈을 포함하는 기재된 재조합 결합 단백질, 또는 그의 결합 도메인은 또한 본원에서 DARPin® 단백질로서 언급된다. 하기 문헌 참조: Stumpp et al., Curr Opin Drug Discov Devel. 10(2): 153-9 (2007); 및 Binz et al., Nature Biotech. 22(5): 575-582 (2004). DARPin® 단백질은 표적 단백질에 대한 높은 특이성 및 높은 결합 친화도를 갖는 항체 모방체로서 고려될 수 있다. 일반적으로, DARPin® 단백질은 적어도 하나의 안키린 반복 도메인, 예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 초과의 안키린 반복 도메인을 포함한다.

본원에 기재된 안키린 반복 도메인은 일반적으로 구조를 제공하는 코어 스캐폴드, 및 표적에 결합하는 표적 결합 잔기를 포함한다. 구조적 코어는 보존된 아미노산 잔기를 포함하고, 표적 결합 표면은 표적에 따라 상이한 아미노산 잔기를 포함한다.

국제 특허 공개 번호 WO 2002/020565 및 문헌 [Binz et al., Nature Biotech. 22(5): 575-582 (2004)]은 표적에 특이적으로 결합하는 단백질의 선택/스크리닝에 사용될 수 있는 안키린 반복 단백질의 라이브러리를 기재한다. 이러한 라이브러리의 제조 방법이 또한 제공된다.

다수의 안키린 반복 도메인이 연결되어 (공유 결합 또는 비-공유 회합을 통해) 이중특이적 또는 다중-특이적 분자를 형성할 수 있다. 하나의 이러한 분자가 도 1에 나타나 있으며, 여기서는 3개의 별도의 코로나바이러스 스파이크 단백질 결합 도메인이 연결되어 다중-특이적 분자를 형성한다. 링커는 3개의 결합 도메인을 연합시키는 파선으로 나타나 있다.

코로나바이러스 스파이크 단백질

상기에 기재된 바와 같이, 코로나바이러스 스파이크 단백질은 매력적인 치료적 표적이다. 코로나바이러스 스파이크 단백질의 중화는 포유류 세포의 감염을 방지하여 코로나바이러스 질환이 개체에서 장악하는 것을 중단시킬 수 있다. 본 발명에 따른 재조합 결합 단백질은 포유류 코로나바이러스에 대해 특이적이다. 바람직하게는, 디자인된 안키린 반복 단백질은 마우스, 래트, 개, 토끼, 원숭이 또는 인간 기원의 코로나바이러스에 대해 특이적이다. 보다 바람직하게는, 디자인된 안키린 반복 단백질은 인간 기원의 코로나바이러스에 대해 특이적이다. 코로나바이러스 SARS-CoV-2가 가장 바람직하다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "SARS-CoV-2"는 야생형 바이러스 (예컨대 COVID-19 팬데믹의 시작시 감염된 인간에서 나타난 SARS-CoV-2) 및 그의 돌연변이 형태 또는 변이체 둘 다를 포함한다. 하나의 구현예에서, 용어 "SARS-CoV-2"는 야생형 및 특정 변이체 B.1.1.7 (소위 "UK 변이체") 및 B.1.351 (소위 "남아프리카 변이체")을 포함한다.

본원에 기재된 재조합 결합 단백질은 코로나바이러스 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 안키린 반복 도메인을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 결합 단백질은 코로나바이러스 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 2, 3개 또는 그 초과의 안키린 반복 도메인을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 결합 단백질은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 1, 2, 3개 또는 그 초과의 안키린 반복 도메인을 포함한다.

코로나바이러스 스파이크 단백질 상의 본 개시내용에서의 관심 표적 도메인은 수용체 결합 도메인 (RBD 도메인); S1 NTD 도메인; 및 S2 도메인을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이들 도메인은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 하기 문헌 참조: Wrapp et al., Science 367, 1260-1263 (2020)).

코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합하는 본 발명에 따른 안키린 반복 도메인이 표 1에 제공되어 있다:

표 1

따라서, 하나의 구현예에서, 본 발명은, 제1 안키린 반복 도메인을 포함하며, 여기서 상기 제1 안키린 반복 도메인은 상기 표 1에 나타낸 바와 같은 서열 번호 1 내지 11, 76, 77 및 85로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

하나의 구현예에서, 본 발명은, 제1 안키린 반복 도메인을 포함하며, 여기서 상기 제1 안키린 반복 도메인은 상기 표 1에 나타낸 바와 같은 서열 번호 1 내지 11, 76, 77 및 85로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명은, 제1 안키린 반복 도메인을 포함하며, 여기서 상기 제1 안키린 반복 도메인은 상기 표 1에 나타낸 바와 같은 서열 번호 1 내지 11, 76 및 77로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명은, 제1 안키린 반복 도메인을 포함하며, 여기서 상기 제1 안키린 반복 도메인은 상기 표 1에 나타낸 바와 같은 서열 번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

하나의 구현예에서, 본 발명은, 제1 안키린 반복 도메인을 포함하며, 여기서 상기 제1 안키린 반복 도메인은 상기 표 1에 나타낸 바와 같은 서열 번호 1 내지 11, 76, 77 및 85로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

표 1에 열거된 안키린 반복 도메인은 임의의 방식으로 조합되어 이중-특이적 또는 다중-특이적 분자를 제공할 수 있다. 제1, 제2 및 제3 안키린 반복 도메인은 동일한 서열을 가질 수 있다. 제1, 제2 및 제3 안키린 반복 도메인은 상이한 서열을 가질 수 있다.

따라서, 하나의 구현예에서, 본 발명은, 제2 안키린 반복 도메인을 추가로 포함하며, 여기서 상기 제2 안키린 반복 도메인은 상기 표 1에 나타낸 바와 같은 서열 번호 1 내지 11, 76, 77 및 85로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

하나의 구현예에서, 본 발명은, 제2 안키린 반복 도메인을 포함하며, 여기서 상기 제2 안키린 반복 도메인은 상기 표 1에 나타낸 바와 같은 서열 번호 1 내지 11, 76, 77 및 85로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명은, 제2 안키린 반복 도메인을 포함하며, 여기서 상기 제2 안키린 반복 도메인은 상기 표 1에 나타낸 바와 같은 서열 번호 1 내지 11, 76 및 77로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명은, 제2 안키린 반복 도메인을 포함하며, 여기서 상기 제2 안키린 반복 도메인은 상기 표 1에 나타낸 바와 같은 서열 번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

하나의 구현예에서, 본 발명은, 제2 안키린 반복 도메인을 포함하며, 여기서 상기 제2 안키린 반복 도메인은 상기 표 1에 나타낸 바와 같은 서열 번호 1 내지 11, 76, 77 및 85로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

하나의 구현예에서, 본 발명은, 제3 안키린 반복 도메인을 추가로 포함하며, 여기서 상기 제3 안키린 반복 도메인은 상기 표 1에 나타낸 바와 같은 서열 번호 1 내지 11, 76, 77 및 85로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 상기에 정의된 바와 같은 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

하나의 구현예에서, 본 발명은, 제3 안키린 반복 도메인을 추가로 포함하며, 여기서 상기 제3 안키린 반복 도메인은 상기 표 1에 나타낸 바와 같은 서열 번호 1 내지 11, 76, 77 및 85로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 상기에 정의된 바와 같은 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명은, 제3 안키린 반복 도메인을 추가로 포함하며, 여기서 상기 제3 안키린 반복 도메인은 상기 표 1에 나타낸 바와 같은 서열 번호 1 내지 11, 76 및 77로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 상기에 정의된 바와 같은 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명은, 제3 안키린 반복 도메인을 추가로 포함하며, 여기서 상기 제3 안키린 반복 도메인은 상기 표 1에 나타낸 바와 같은 서열 번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 상기에 정의된 바와 같은 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

하나의 구현예에서, 본 발명은, 제3 안키린 반복 도메인을 추가로 포함하며, 여기서 상기 제3 안키린 반복 도메인은 상기 표 1에 나타낸 바와 같은 서열 번호 1 내지 11, 76, 77 및 85로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 상기에 정의된 바와 같은 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

본 발명은 추가로, 하기와 같이, 아미노산 서열을 갖고 N-말단으로부터 C-말단까지 배열되는 제1, 제2 및 제3 안키린 반복 도메인의 특정 조합에 관한 것이다:

하나의 구현예에서, 본 발명은 상기에 열거된 바와 같은 구현예 (xx)에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 추가의 구현예에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 68과 적어도 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 또 다른 구현예에서, 재조합 결합 단백질은 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 갖는다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 상기에 열거된 바와 같은 구현예 (xxviii)에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 추가의 구현예에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드 서열 번호: 69와 적어도 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 또 다른 구현예에서, 재조합 결합 단백질은 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 69의 아미노산 서열을 갖는다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 상기에 열거된 바와 같은 (xxxii)에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 추가의 구현예에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 79와 적어도 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 또 다른 구현예에서, 재조합 결합 단백질은 폴리펩티를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 79의 아미노산 서열을 갖는다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 상기에 열거된 바와 같은 (xxxiii)에 따른 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 추가의 구현예에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 89 내지 91로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 또 다른 구현예에서, 재조합 결합 단백질은 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 89 내지 91로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.

또 다른 구현예에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합한다. 또 다른 구현예에서, 스파이크 단백질은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질이다.

또 다른 구현예에서, 적어도 하나의 안키린 반복 도메인을 포함하는 본 발명의 재조합 결합 단백질은 약 100 nM 이하의 결합 친화도 (K_D)로 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합한다. 또 다른 구현예에서, 스파이크 단백질은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질이다.

또 다른 구현예에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 제1, 제2 및/또는 제3 안키린 반복 도메인을 포함하고, 상기 제1, 제2 및/또는 제3 안키린 반복 도메인은 약 100 nM 이하의 결합 친화도 (K_D)로 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합한다. 또 다른 구현예에서, 스파이크 단백질은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질이다.

예시적 구현예에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 하기의, 또는 그 미만의 K_D 값으로 코로나바이러스 스파이크 단백질, 바람직하게는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 결합한다: 약 100 nM; 약 50 nM, 약 40 nM, 약 30 nM, 약 20 nM, 약 10 nM, 약 5 nM, 약 2 nM, 약 1 nM, 약 900 pM, 약 800 pM, 약 700 pM, 약 600 pM, 약 500 pM, 약 400 pM, 약 300 pM, 약 250 pM, 약 200 pM, 약 150 pM, 약 100 pM, 약 50 pM, 약 40 pM, 약 30 pM, 약 25 pM, 약 20 pM, 약 15 pM, 약 10 pM, 약 5 pM, 또는 약 1 pM. 하나의 예시적 구현예에서, 재조합 결합 단백질은 약 10 nM 이하의 K_D 값으로 코로나바이러스 스파이크 단백질, 바람직하게는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 결합한다. 또 다른 예시적 구현예에서, 재조합 결합 단백질은 약 1 nM 이하의 K_D 값으로 코로나바이러스 스파이크 단백질, 바람직하게는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 결합한다.

특정 구현예에서, 코로나바이러스 스파이크 단백질은 인간 코로나바이러스 스파이크 단백질이다. 특정 구현예에서, 코로나바이러스 스파이크 단백질은 인간 SARS-CoV-2 스파이크 단백질이다.

특정 구현예에서, 재조합 결합 단백질은 적어도 하나의 인간 혈청 알부민 결합 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 구현예에서, 적어도 하나의 인간 혈청 알부민 도메인은 N-말단, C-말단, 또는 이들 둘 다에 위치할 수 있다.

특정 구현예에서, 혈청 알부민 결합 도메인은 서열 번호: 47-49로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 혈청 알부민 결합 도메인은 서열 번호: 47과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

추가의 구현예에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은, 적어도 약 30시간, 바람직하게는 적어도 약 35시간, 보다 바람직하게는 적어도 약 40시간, 또한 보다 바람직하게는 적어도 약 45시간의 마우스에서의 말기 반감기를 갖는다. 상기 말기 반감기는 바람직하게는 실시예 9에 기재된 바와 같이 Balb/c 마우스에서 결정된다.

안키린 반복 도메인의 특히 바람직한 조합이 표 2에 열거되어 있으며, 여기서 H는 인간 혈청 알부민을 나타내고 R3b, R2a 등은 상기 표 1에 정의된 바와 같다:

표 2

또 다른 구현예에서, 본 발명은 폴리펩티드를 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것으로, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 12-42, 75, 84, 87 및 88로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합한다. 하나의 구현예에서, 상기 스파이크 단백질은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질이다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 약 100 nM 이하의 결합 친화도 (K_D)로 상기 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 폴리펩티드를 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것으로, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 12-42, 75, 84, 87 및 88로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 폴리펩티드를 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것으로, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 12-42 및 75로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 폴리펩티드를 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것으로, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 12-42로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합한다. 하나의 구현예에서, 상기 스파이크 단백질은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질이다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 약 100 nM 이하의 결합 친화도 (K_D)로 상기 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 폴리펩티드를 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것으로, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 12-42, 75, 84, 87 및 88로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합한다. 하나의 구현예에서, 상기 스파이크 단백질은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질이다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 약 100 nM 이하의 결합 친화도 (K_D)로 상기 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 코로나바이러스에 의한 세포의 감염을 억제할 수 있는 본원에 기재된 바와 같은 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 SARS-CoV-2에 의한 세포의 감염을 억제할 수 있는 본원에 기재된 바와 같은 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 폴리펩티드를 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것으로, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 31과 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 재조합 결합 단백질은 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 31의 아미노산 서열을 갖는다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합한다. 하나의 구현예에서, 상기 스파이크 단백질은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질이다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 약 100 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 1 nM 이하, 약 100 pM 이하, 또는 약 10 pM 이하, 또는 약 1 pM 이하의 결합 친화도 (K_D)로 상기 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 약 1 nM 이하의 결합 친화도 (K_D)로 상기 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 적어도 약 20시간, 적어도 약 25시간, 적어도 약 30시간, 적어도 약 35시간, 적어도 약 40시간, 또는 적어도 약 45시간의 마우스에서의 말기 반감기를 갖는다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 적어도 약 40시간의 마우스에서의 말기 반감기를 갖는다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 50℃ 초과, 60℃ 초과, 70℃ 초과, 또는 80℃ 초과의 Tm을 가지며 높은 열 안정성을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 60℃ 초과의 Tm을 가지며 높은 열 안정성을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 또는 0.5 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2 VSV 유사바이러스의 바이러스 진입을 억제한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 1 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2 VSV 유사바이러스의 바이러스 진입을 억제한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 또는 0.1 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2의 바이러스 진입을 억제한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 1 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2의 바이러스 진입을 억제한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 아미노산 서열, 결합 친화도, 말기 반감기, 열 안정성, SARS-CoV-2 VSV 유사바이러스 억제의 IC₅₀ 및 SARS-CoV-2 억제의 IC₅₀과 관련된 본 단락에 열거된 특성으로부터 선택된 2, 3, 4, 5 또는 6개의 특성의 조합을 갖는다. 하나의 예시적 구현예에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 31과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고/거나, 여기서 상기 결합 단백질은 약 1 nM 이하의 결합 친화도 (K_D)로 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 결합하고/거나, 여기서 상기 결합 단백질은 적어도 약 40시간의 마우스에서의 말기 반감기를 갖고/거나, 여기서 상기 결합 단백질은 60℃ 초과의 Tm을 가지며 높은 열 안정성을 나타내고/거나, 여기서 상기 결합 단백질은 1 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2 VSV 유사바이러스의 바이러스 진입을 억제하고/거나, 여기서 상기 결합 단백질은 1 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2의 바이러스 진입을 억제하는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 39와 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 또 다른 구현예에서, 재조합 결합 단백질은 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 갖는다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합한다. 하나의 구현예에서, 상기 스파이크 단백질은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질이다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 약 100 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 1 nM 이하, 약 100 pM 이하, 약 10 pM 이하, 또는 약 1 pM 이하의 결합 친화도 (K_D)로 상기 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 약 1 nM 이하의 결합 친화도 (K_D)로 상기 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 적어도 약 20시간, 적어도 약 25시간, 적어도 약 30시간, 적어도 약 35시간, 적어도 약 40시간, 또는 적어도 약 45시간의 마우스에서의 말기 반감기를 갖는다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 적어도 약 20시간의 마우스에서의 말기 반감기를 갖는다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 50℃ 초과, 60℃ 초과, 70℃ 초과, 또는 80℃ 초과의 Tm을 가지며 높은 열 안정성을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 60℃ 초과의 Tm을 가지며 높은 열 안정성을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 또는 0.5 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2 VSV 유사바이러스의 바이러스 진입을 억제한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 1 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2 VSV 유사바이러스의 바이러스 진입을 억제한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 또는 0.4 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2의 바이러스 진입을 억제한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 1 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2의 바이러스 진입을 억제한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 아미노산 서열, 결합 친화도, 말기 반감기, 열 안정성, SARS-CoV-2 VSV 유사바이러스 억제의 IC₅₀ 및 SARS-CoV-2 억제의 IC₅₀과 관련된 본 단락에 열거된 특성으로부터 선택된 2, 3, 4, 5 또는 6개의 특성의 조합을 갖는다. 하나의 예시적 구현예에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 39와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고/거나, 여기서 상기 결합 단백질은 약 1 nM 이하의 결합 친화도 (K_D)로 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 결합하고/거나, 여기서 상기 결합 단백질은 적어도 약 20시간의 마우스에서의 말기 반감기를 갖고/거나, 여기서 상기 결합 단백질은 60℃ 초과의 Tm을 가지며 높은 열 안정성을 나타내고/거나, 여기서 상기 결합 단백질은 1 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2 VSV 유사바이러스의 바이러스 진입을 억제하고/거나, 여기서 상기 결합 단백질은 1 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2의 바이러스 진입을 억제하는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 75와 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 또 다른 구현예에서, 재조합 결합 단백질은 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 75의 아미노산 서열을 갖는다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합한다. 하나의 구현예에서, 상기 스파이크 단백질은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질이다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 약 100 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 1 nM 이하, 약 100 pM 이하, 약 10 pM 이하, 또는 약 1 pM 이하의 결합 친화도 (K_D)로 상기 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 적어도 약 20시간, 적어도 약 25시간, 적어도 약 30시간, 적어도 약 35시간, 적어도 약 40시간, 또는 적어도 약 45시간의 마우스에서의 말기 반감기를 갖는다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 적어도 약 30시간의 마우스에서의 말기 반감기를 갖는다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 약 1 nM 이하의 결합 친화도 (K_D)로 상기 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 50℃ 초과, 60℃ 초과, 70℃ 초과, 또는 80℃ 초과의 Tm을 가지며 높은 열 안정성을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 60℃ 초과의 Tm을 가지며 높은 열 안정성을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 또는 0.5 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2 VSV 유사바이러스의 바이러스 진입을 억제한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 1 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2 VSV 유사바이러스의 바이러스 진입을 억제한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 또는 0.4 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2의 바이러스 진입을 억제한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 1 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2의 바이러스 진입을 억제한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 아미노산 서열, 결합 친화도, 말기 반감기, 열 안정성, SARS-CoV-2 VSV 유사바이러스 억제의 IC₅₀ 및 SARS-CoV-2 억제의 IC₅₀과 관련된 본 단락에 열거된 특성으로부터 선택된 2, 3, 4, 5 또는 6개의 특성의 조합을 갖는다. 하나의 예시적 구현예에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 75와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고/거나, 여기서 상기 결합 단백질은 약 1 nM 이하의 결합 친화도 (K_D)로 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 결합하고/거나, 여기서 상기 결합 단백질은 적어도 약 30시간의 마우스에서의 말기 반감기를 갖고/거나, 여기서 상기 결합 단백질은 60℃ 초과의 Tm을 가지며 높은 열 안정성을 나타내고/거나, 여기서 상기 결합 단백질은 1 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2 VSV 유사바이러스의 바이러스 진입을 억제하고/거나, 여기서 상기 결합 단백질은 1 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2의 바이러스 진입을 억제하는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 재폴리펩티드는 서열 번호: 84와 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 또 다른 구현예에서, 재조합 결합 단백질은 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 갖는다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합한다. 하나의 구현예에서, 상기 스파이크 단백질은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질이다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 약 100 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 1 nM 이하, 약 100 pM 이하, 약 10 pM 이하, 또는 약 1 pM 이하의 결합 친화도 (K_D)로 상기 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 적어도 약 20시간, 적어도 약 25시간, 적어도 약 30시간, 적어도 약 35시간, 적어도 약 40시간, 또는 적어도 약 45시간의 마우스에서의 말기 반감기를 갖는다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 적어도 약 40시간의 마우스에서의 말기 반감기를 갖는다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 약 1 nM 이하의 결합 친화도 (K_D)로 상기 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 50℃ 초과, 60℃ 초과, 70℃ 초과, 또는 80℃ 초과의 Tm을 가지며 높은 열 안정성을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 60℃ 초과의 Tm을 가지며 높은 열 안정성을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 또는 0.5 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2 VSV 유사바이러스의 바이러스 진입을 억제한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 1 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2 VSV 유사바이러스의 바이러스 진입을 억제한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 또는 0.4 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2의 바이러스 진입을 억제한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 1 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2의 바이러스 진입을 억제한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 아미노산 서열, 결합 친화도, 말기 반감기, 열 안정성, SARS-CoV-2 VSV 유사바이러스 억제의 IC₅₀ 및 SARS-CoV-2 억제의 IC₅₀과 관련된 본 단락에 열거된 특성으로부터 선택된 2, 3, 4, 5 또는 6개의 특성의 조합을 갖는다. 하나의 예시적 구현예에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 84와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고/거나, 여기서 상기 결합 단백질은 약 1 nM 이하의 결합 친화도 (K_D)로 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 결합하고/거나, 여기서 상기 결합 단백질은 적어도 약 40시간의 마우스에서의 말기 반감기를 갖고/거나, 여기서 상기 결합 단백질은 60℃ 초과의 Tm을 가지며 높은 열 안정성을 나타내고/거나, 여기서 상기 결합 단백질은 1 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2 VSV 유사바이러스의 바이러스 진입을 억제하고/거나, 여기서 상기 결합 단백질은 1 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2의 바이러스 진입을 억제하는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 87과 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 또 다른 구현예에서, 재조합 결합 단백질은 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 87의 아미노산 서열을 갖는다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합한다. 하나의 구현예에서, 상기 스파이크 단백질은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질이다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 약 100 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 1 nM 이하, 약 100 pM 이하, 약 10 pM 이하, 또는 약 1 pM 이하의 결합 친화도 (K_D)로 상기 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 적어도 약 20시간, 적어도 약 25시간, 적어도 약 30시간, 적어도 약 35시간, 적어도 약 40시간, 또는 적어도 약 45시간의 마우스에서의 말기 반감기를 갖는다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 적어도 약 35시간의 마우스에서의 말기 반감기를 갖는다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 약 1 nM 이하의 결합 친화도 (K_D)로 상기 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 50℃ 초과, 60℃ 초과, 70℃ 초과, 또는 80℃ 초과의 Tm을 가지며 높은 열 안정성을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 60℃ 초과의 Tm을 가지며 높은 열 안정성을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 또는 0.5 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2 VSV 유사바이러스의 바이러스 진입을 억제한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 1 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2 VSV 유사바이러스의 바이러스 진입을 억제한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 또는 0.4 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2의 바이러스 진입을 억제한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 1 nM 이하의 C₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2의 바이러스 진입을 억제한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 아미노산 서열, 결합 친화도, 말기 반감기, 열 안정성, SARS-CoV-2 VSV 유사바이러스 억제의 IC₅₀ 및 SARS-CoV-2 억제의 IC₅₀과 관련된 본 단락에 열거된 특성으로부터 선택된 2, 3, 4, 5 또는 6개의 특성의 조합을 갖는다. 하나의 예시적 구현예에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 87과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고/거나, 여기서 상기 결합 단백질은 약 1 nM 이하의 결합 친화도 (K_D)로 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 결합하고/거나, 여기서 상기 결합 단백질은 적어도 약 35시간의 마우스에서의 말기 반감기를 갖고/거나, 여기서 상기 결합 단백질은 60℃ 초과의 Tm을 가지며 높은 열 안정성을 나타내고/거나, 여기서 상기 결합 단백질은 1 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2 VSV 유사바이러스의 바이러스 진입을 억제하고/거나, 여기서 상기 결합 단백질은 1 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2의 바이러스 진입을 억제하는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 88과 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 또 다른 구현예에서, 재조합 결합 단백질은 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 88의 아미노산 서열을 갖는다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합한다. 하나의 구현예에서, 상기 스파이크 단백질은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질이다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 약 100 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 1 nM 이하, 약 100 pM 이하, 약 10 pM 이하, 또는 약 1 pM 이하의 결합 친화도 (K_D)로 상기 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 적어도 약 20시간, 적어도 약 25시간, 적어도 약 30시간, 적어도 약 35시간, 적어도 약 40시간, 또는 적어도 약 45시간의 마우스에서의 말기 반감기를 갖는다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 적어도 약 40시간의 마우스에서의 말기 반감기를 갖는다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 약 1 nM 이하의 결합 친화도 (K_D)로 상기 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 50℃ 초과, 60℃ 초과, 70℃ 초과, 또는 80℃ 초과의 Tm을 가지며 높은 열 안정성을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 60℃ 초과의 Tm을 가지며 높은 열 안정성을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 또는 0.5 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2 VSV 유사바이러스의 바이러스 진입을 억제한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 1 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2 VSV 유사바이러스의 바이러스 진입을 억제한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 또는 0.4 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2의 바이러스 진입을 억제한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 1 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2의 바이러스 진입을 억제한다. 하나의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 아미노산 서열, 결합 친화도, 말기 반감기, 열 안정성, SARS-CoV-2 VSV 유사바이러스 억제의 IC₅₀ 및 SARS-CoV-2 억제의 IC₅₀과 관련된 본 단락에 열거된 특성으로부터 선택된 2, 3, 4, 5 또는 6개의 특성의 조합을 갖는다. 하나의 예시적 구현예에서, 본 발명은, 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 88과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고/거나, 여기서 상기 결합 단백질은 약 1 nM 이하의 결합 친화도 (K_D)로 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 결합하고/거나, 여기서 상기 결합 단백질은 적어도 약 40시간의 마우스에서의 말기 반감기를 갖고/거나, 여기서 상기 결합 단백질은 60℃ 초과의 Tm을 가지며 높은 열 안정성을 나타고/거나, 여기서 상기 결합 단백질은 1 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2 VSV 유사바이러스의 바이러스 진입을 억제하고/거나, 여기서 상기 결합 단백질은 1 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 베로E6 세포에서 SARS-CoV-2의 바이러스 진입을 억제하는 것인, 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

반감기 연장 모이어티

"반감기 연장 모이어티"는, 반감기 연장 모이어티를 갖지 않는 동일한 단백질에 비해, 본원에 기재된 재조합 결합 단백질의 생체내 혈청 반감기를 연장시킨다. 반감기 연장 모이어티의 예는 폴리히스티딘, Glu-Glu, 글루타티온 S 트랜스퍼라제 (GST), 티오레독신, 단백질 A, 단백질 G, 면역글로불린 도메인, 말토스 결합 단백질 (MBP), 인간 혈청 알부민 (HSA) 결합 도메인, 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 모이어티는 글루타티온 S 트랜스퍼라제 (GST), 단백질 A, 단백질 G, 면역글로불린 도메인, 인간 혈청 알부민 (HSA) 결합 도메인, 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 결합 단백질은 본원에서 또한 "혈청 알부민 결합 도메인"으로서 언급되는 혈청 알부민 (예컨대 바람직하게는 인간 혈청 알부민)에 특이적으로 결합하는 안키린 반복 도메인을 포함한다. 본원에 기재된 재조합 결합 단백질은 또한 하나 초과의 혈청 알부민 결합 도메인, 예를 들어, 2 또는 3개 또는 그 초과의 혈청 알부민 결합 도메인을 포함할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 재조합 결합 단백질은 제1 및 제2 혈청 알부민 결합 도메인, 또는 제1, 제2 및 제3 혈청 알부민 결합 도메인을 포함할 수 있다. 하기에 제공되는 구현예는 이러한 제1 혈청 알부민 결합 도메인, 제2 혈청 알부민 결합 도메인, 및/또는 제3 혈청 알부민 결합 도메인을 기재한다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 반감기 연장 모이어티는 서열 번호: 47 내지 49 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 혈청 알부민 결합 도메인을 포함한다. 예시적 구현예에서, 본원에 기재된 반감기 연장 모이어티는 서열 번호: 47 내지 49 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 반감기 연장 모이어티는 서열 번호: 47과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 예시적 구현예에서, 본원에 기재된 반감기 연장 모이어티는 서열 번호: 47과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서는, 2개 이상의 혈청 알부민 결합 도메인이 바람직하다. 일부 구현예에서, 2개의 혈청 알부민 결합 도메인은 N-말단에 위치한다. 예시적 구현예에서, 재조합 결합 단백질은, N-말단으로부터 C-말단까지 하기의 것들을 포함한다: (i) 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 안키린 반복 도메인; (ii) 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 안키린 반복 도메인; 및 (iii) 코로나바이러스 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 안키린 반복 도메인. 특정 구현예에서, N-말단 혈청 알부민 결합 도메인 (또한 본원애서 혈청 알부민 결합 도메인 1로서 언급됨)은 서열 번호: 47과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 혈청 알부민 결합 도메인 (또한 본원에서 혈청 알부민 결합 도메인 2로서 언급됨)은 서열 번호: 47과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 반감기 연장 모이어티는 면역글로불린 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 도메인은 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 하기 공지된 중쇄 이소타입 중 어느 하나로부터 유래된다: IgG (γ), IgM (μ), IgD (δ), IgE (ε), 또는 IgA (α). 일부 구현예에서, Fc 도메인은 하기 공지된 중쇄 이소타입 또는 서브타입 중 어느 하나로부터 유래된다: IgG₁(γ1), IgG₂(γ2), IgG₃(γ3), IgG₄(γ4), IgA₁(α1), IgA₂(α2). 일부 구현예에서, Fc 도메인은 인간 IgG₁의 Fc 도메인이다.

일부 구현예에서, Fc 도메인은 Fc 도메인의 중단되지 않은 네이티브 서열 (즉, 야생형 서열)을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 Fc 도메인은 변경된 생물학적 활성을 초래하는 변이체 Fc 도메인을 포함한다. 예를 들어, 적어도 하나의 점 돌연변이 또는 결실이 Fc 도메인에 도입되어 이펙터 활성을 감소시키거나 제거하고/거나 (예: 국제 특허 공개 번호 WO 2005/063815), 재조합 결합 단백질의 생성 동안 균질성을 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 인간 IgG₁의 Fc 도메인이고 하기 이펙터-널(null) 치환 중 하나 이상을 포함한다: L234A, L235A, 및 G237A (Eu 넘버링). 일부 구현예에서, Fc 도메인은 인간 IgG1의 C-말단 위치에 위치하는 리신 (즉, Eu 넘버링에 의해 K447)을 포함하지 않는다. 리신의 부재는 재조합 결합 단백질의 생성 동안 균질성을 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 C-말단 위치에 위치하는 리신 (K447, Eu 넘버링)을 포함한다.

안키린 반복 도메인

일부 구현예에서는, 서열 번호: 1 내지 11, 47, 76, 77 및 85의 서열과 관련하여 본 발명의 재조합 결합 단백질의 임의의 안키린 반복 도메인에서 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 구현예에서는, 서열 번호: 1 내지 11, 47, 76, 77 및 85의 서열과 관련하여 5개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 구현예에서는, 서열 번호: 1 내지 11, 47, 76, 77 및 85의 서열과 관련하여 4개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 구현예에서는, 서열 번호: 1 내지 11, 47, 76, 77 및 85의 서열과 관련하여 3개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 구현예에서는, 서열 번호: 1 내지 11, 47, 76, 77 및 85의 서열과 관련하여 2개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 구현예에서는, 서열 번호: 1 내지 11, 47, 76, 77 및 85의 서열과 관련하여 1개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 구현예에서, 치환(들)은, 서열 번호: 1 내지 11, 47, 76, 77 및 85의 서열을 포함하는 단백질의 K_D 값에 비해, K_D 값을 1000배 초과, 100배 초과, 또는 10배 초과만큼 변화시키지 않는다. 특정 구현예에서, 치환은 표 3에 따른 보존적 치환이다. 특정 구현예에서, 치환은 안키린 반복 도메인의 구조적 코어 잔기 외부에서, 예를 들어 알파-나선을 연결하는 베타 루프에서 이루어진다.

표 3. 아미노산 치환

특정 구현예에서, 치환은 안키린 반복 도메인의 구조적 코어 잔기 내에서 이루어진다. 예를 들어, 안키린 도메인은 하기 공통 서열을 포함할 수 있다: DxxGxTPLHLAxxxGxxxlVxVLLxxGADVNAx (서열 번호: 50), 여기서 "x"는 임의의 아미노산임 (바람직하게는 시스테인, 글리신, 또는 프롤린이 아님); 또는 DxxGxTPLHLAAxxGHLEIVEVLLKzGADVNAx (서열 번호: 51), 여기서 "x"는 임의의 아미노산임 (바람직하게는 시스테인, 글리신, 또는 프롤린이 아님), 또한 "z"는 아스파라긴, 히스티딘, 또는 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택됨. 하나의 구현예에서, 치환은 "x"로 지정된 잔기에 대하여 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 치환은 "x"로 지정된 잔기 외부에서 이루어진다.

추가로, 본 발명의 재조합 결합 단백질의 임의의 안키린 반복 도메인의 두번째 최종 위치는 "A" 또는 "L"일 수 있고/거나, 최종 위치는 "A" 또는 "N"일 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 각각의 안키린 반복 도메인은 서열 번호: 1 내지 11, 47, 76, 77 및 85 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 임의로 두번째 최종 위치에서의 A는 L로 치환되고/거나 최종 위치에서의 A는 N으로 치환된다. 예시적 구현예에서, 각각의 스파이크 단백질 결합 도메인은 서열 번호: 1 내지 11, 47, 76, 77 및 85 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 임의로 두번째 최종 위치에서의 A는 L로 치환되고/거나 최종 위치에서의 A는 N으로 치환된다. 또한, 본 발명의 결합 단백질에 포함된 임의의 안키린 반복 도메인의 서열은 임의로 그의 N-말단에, G, S, 또는 GS를 포함할 수 있다 (하기 참조).

추가로, 본 발명의 재조합 결합 단백질에 포함된 각각의 안키린 반복 도메인은 임의로 그의 N-말단에 "G", "S", 또는 "GS" 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 각각의 안키린 반복 도메인은 서열 번호: 1 내지 11, 47, 76, 77 및 85 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그의 N-말단에 GS (예를 들어, 서열 번호: 1 내지 11, 47, 76, 77 및 85에서와 같음) 또는 GS 대신에 단지 G 또는 S를 추가로 포함한다.

특정 구현예에서, 재조합 결합 단백질과 그의 표적 (스파이크 단백질 또는 혈청 알부민) 사이의 친화되는 K_D로 기재된다. 예시적 구현예에서, K_D는 약 10^-1 M 이하, 약 10^-2 M 이하, 약 10^-3 M 이하, 약 10^-4 M 이하, 약 10^-5 M 이하, 약 10^-6 M 이하, 약 10^-7 M 이하, 약 10^-8 M 이하, 약 10^-9 M 이하, 약 10^-10 M 이하, 약 10^-11 M 이하, 약 10^-12 M 이하, 약 10^-13 M 이하, 약 10^-14 M 이하, 약 10^-5 M 내지 약 10^-15 M, 약 10^-6 M 내지 약 10^-15 M, 약 10^-7 M 내지 약 10^-15 M, 약 10^-8 M 내지 약 10^-15 M, 약 10^-9 M 내지 약 10^-15 M, 약 10^-10 M 내지 약 10^-15 M, 약 10^-5 M 내지 약 10^-14 M, 약 10^-6 M 내지 약 10^-14 M, 약 10^-7 M 내지 약 10^-14 M, 약 10^-8 M 내지 약 10^-14 M, 약 10^-9 M 내지 약 10^-14 M, 약 10^-10 M 내지 약 10^-14 M, 약 10^-5 M 내지 약 10^-13 M, 약 10^-6 M 내지 약 10^-13 M, 약 10^-7 M 내지 약 10^-13 M, 약 10^-8 M 내지 약 10^-13 M, 약 10^-9 M 내지 약 10^-13 M, 또는 약 10^-10 M 내지 약 10^-13 M이다.

예시적 구현예에서, 재조합 결합 단백질은 하기의, 또는 그 미만의 K_D 값으로 스파이크 단백질 또는 혈청 알부민에 결합한다: 약 900 nM, 약 800 nM, 약 700 nM, 약 600 nM, 약 500 nM, 약 400 nM, 약 300 nM, 약 250 nM, 약 200 nM, 약 150 nM, 약 100 nM, 약 50 nM, 약 40 nM, 약 30 nM, 약 20 nM, 약 10 nM, 약 5 nM, 약 2 nM, 약 1 nM, 약 900 pM, 약 800 pM, 약 700 pM, 약 600 pM, 약 500 pM, 약 400 pM, 약 300 pM, 약 200 pM, 약 100 pM, 약 10 pM, 또는 약 1 pM. 하나의 예시적 구현예에서, 재조합 결합 단백질은 100 nM 이하의 K_D 값으로 스파이크 단백질 또는 혈청 알부민에 결합한다. 또 다른 예시적 구현예에서, 재조합 결합 단백질은 10 nM 이하의 K_D 값으로 스파이크 단백질 또는 혈청 알부민에 결합한다.

링커

본원에 기재된 재조합 결합 단백질은 링커를 포함할 수 있다. "링커"는 2개의 별도의 엔티티(entity) (예를 들어 도 1에 나타낸 바와 같은 DARPin® 1 및 DARPin 2®)를 서로에게 결합시키고 2개의 엔티티가 이들이 그의 각각의 표적에 결합할 수 있는 형태를 달성할 수 있도록 이들 사이에 간격 및 유연성을 제공할 수 있는 분자 또는 분자의 그룹이다. 단백질 링커가 특히 바람직하고, 이들은 당업계에 널리 공지된 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 재조합 결합 단백질의 성분으로서 발현될 수 있다.

안키린 반복 도메인은, 예를 들어, 디술피드 결합, 폴리펩티드 결합 또는 가교제에 의해, 공유적으로; 또는 비-공유적으로 연결되어, 이종이량체 단백질을 생성할 수 있다. 재조합 결합 단백질은 코로나바이러스 스파이크 결합 도메인, 및 임의적 반감기 연장 모이어티 사이의 링커를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 링커는 펩티딜 링커이다. 일부 구현예에서, 펩티딜 링커는 약 1 내지 50개의 아미노산 잔기를 포함한다. 예시적 링커는, 예를 들어, 글리신 풍부 펩티드; 글리신 및 세린을 포함하는 펩티드; 서열 [Gly-Gly-Ser]_n을 갖는 펩티드 (여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6임); 또는 서열 [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]_n (서열 번호: 54)을 갖는 펩티드 (여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6임)를 포함한다. 글리신 풍부 펩티드 링커는 펩티드 링커를 포함하며, 여기서 잔기의 적어도 25%는 글리신이다. 글리신 풍부 펩티드 링커는 당업계에 널리 공지되어 있다 (예: Chichili et al. Protein Sci. 2013 February; 22(2): 153-167).

일부 구현예에서, 펩티딜 링커는 프롤린-트레오닌 풍부 펩티드 링커이다. 예시적 구현예에서, 링커는 서열 번호: 52의 프롤린-트레오닌 풍부 펩티드 링커이다. 또 다른 예시적 구현예에서, 링커는 서열 번호: 53의 프롤린-트레오닌 풍부 펩티드 링커이다.

일부 구현예에서, 링커는 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함한다. 보다 긴 프롤린-트레오닌 풍부 펩티드 링커의 예는 서열 번호: 84 및 88에 나타나 있다.

N-말단 및 C-말단 캡핑 서열

본원에 개시된 재조합 결합 단백질의 안키린 반복 도메인은 N-말단 또는 C-말단 캡핑 서열을 포함할 수 있다. 캡핑 서열은 안키린 반복 서열 모티프(들)의 N- 또는 C-말단에 융합된 추가의 폴리펩티드 서열을 지칭하며, 여기서 상기 캡핑 서열은 안키린 반복 서열 모티프(들)와 긴밀한 3차 상호작용 (즉, 3차 구조 상호작용)을 형성하고, 이로써 측면에서 안키린 반복 도메인의 소수성 코어를 용매에 대한 노출로부터 차폐하는 캡을 제공한다.

N- 및/또는 C-말단 캡핑 서열은, 반복 단위에 인접한 자연 발생 반복 단백질에서 나타나는 캡핑 단위 또는 다른 구조적 단위로부터 유래될 수 있다. 캡핑 서열의 예가 국제 특허 공개 번호 WO 2002/020565 및 WO 2012/069655, 미국 특허 공개 번호 US 2013/0296221, 및 문헌 [Interlandi et al., J Mol Biol. 2008 Jan 18;375(3):837-54]에 기재되어 있다. N-말단 안키린 캡핑 모듈 (즉, N-말단 캡핑 반복)의 예는 서열 번호: 55 내지 57이고, 안키린 C-말단 캡핑 모듈 (즉, C-말단 캡핑 반복)의 예는 서열 번호: 58을 포함한다.

핵산 & 방법

하나의 구현예에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 재조합 결합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 상기 구현예 중 하나에 따른 재조합 결합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이며, 여기서 상기 핵산은 서열 번호 70 또는 서열 번호 70과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 상기 구현예 중 하나에 따른 재조합 결합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이며, 여기서 상기 핵산은 서열 번호 71 또는 서열 번호 71과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 상기 구현예 중 하나에 따른 재조합 결합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이며, 여기서 상기 핵산은 서열 번호 72 또는 서열 번호 72와 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 상기 구현예 중 하나에 따른 재조합 결합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이며, 여기서 상기 핵산은 서열 번호 73 또는 서열 번호 73과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 상기 구현예 중 하나에 따른 재조합 결합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이며, 여기서 상기 핵산은 서열 번호 74 또는 서열 번호 74와 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 상기 구현예 중 하나에 따른 재조합 결합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이며, 여기서 상기 핵산은 서열 번호 80 또는 서열 번호 80과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 상기 구현예 중 하나에 따른 재조합 결합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이며, 여기서 상기 핵산은 서열 번호 81 또는 서열 번호 81과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 상기 구현예 중 하나에 따른 재조합 결합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이며, 여기서 상기 핵산은 서열 번호 82 또는 서열 번호 82와 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 상기 구현예 중 하나에 따른 재조합 결합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이며, 여기서 상기 핵산은 서열 번호 83 또는 서열 번호 83과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 상기 구현예 중 하나에 따른 재조합 결합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이며, 여기서 상기 핵산은 서열 번호 78 또는 서열 번호 78과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 상기 구현예 중 하나에 따른 재조합 결합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이며, 여기서 상기 핵산은 서열 번호 86 또는 서열 번호 86과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 상기 구현예 중 하나에 따른 재조합 결합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이며, 여기서 상기 핵산은 서열 번호 92 또는 서열 번호 92와 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 상기 구현예 중 하나에 따른 재조합 결합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이며, 여기서 상기 핵산은 서열 번호 93 또는 서열 번호 93과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 상기 구현예 중 하나에 따른 재조합 결합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이며, 여기서 상기 핵산은 서열 번호 94 또는 서열 번호 94와 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 상기 구현예 중 하나에 따른 재조합 결합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이며, 여기서 상기 핵산은 서열 번호 95 또는 서열 번호 95와 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진다.

본 발명은 추가로, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, 상기 벡터는 발현 벡터이다.

본 발명은 추가로, 상기 핵산 분자 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.

하나의 구현예에서, 본 발명은, 본원에 정의된 숙주 세포를 상기 재조합 결합 단백질이 발현되는 조건 하에 배양하는 것을 포함하는, 본원에 정의된 바와 같은 재조합 결합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.

조성물, 용도 및 치료 방법

본원에 기재된 재조합 결합 단백질은 코로나바이러스로 감염된 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 대상체는 코로나바이러스 SARS-CoV-2로 감염되어 있다.

따라서, 하나의 구현예에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 결합 단백질 또는 핵산 및 제약상 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.

제약 조성물은 제약상 허용가능한 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함할 수 있다. 표준 제약 담체는 인산염 완충 식염수 용액, 물, 에멀젼, 예컨대 오일/물 또는 물/오일 에멀젼, 및 다양한 유형의 습윤제를 포함한다.

제약 조성물은 예를 들어 하기를 포함한 임의의 제약상 허용가능한 성분을 포함할 수 있다: 산성화제, 첨가제, 흡착제, 에어로졸 추진제, 공기 치환제, 알칼리화제, 케이킹방지제, 항응고제, 항미생물 보존제, 항산화제, 방부제, 염기, 결합제, 완충제, 킬레이팅제, 코팅제, 착색제, 건조제, 세제, 희석제, 소독제, 붕해제, 분산제, 용해 향상제, 염료, 진정제, 유화제, 에멀젼 안정화제, 충전제, 필름 형성제, 향미 향상제, 착향제, 유동 향상제, 겔화제, 과립화제, 보습제, 윤활제, 점막접착제, 연고 베이스, 연고, 유성 비히클, 유기 염기, 향정 베이스, 안료, 가소제, 연마제, 보존제, 봉쇄제, 피부 침투제, 가용화제, 용매, 안정화제, 좌약 베이스, 표면 활성제, 계면활성제, 현탁제, 감미제, 치료적 작용제, 증점제, 긴장제, 점도-증가제, 물-흡수제, 물-혼화성 공용매, 물 연화제, 또는 습윤제. 예를 들어, 하기 문헌 참조: the Handbook of Pharmaceutical Excipients, Third Edition, A. H. Kibbe (Pharmaceutical Press, London, UK, 2000) (그 전체가 참조로 포함됨). Remington's Pharmaceutical Sciences, Sixteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980) (그 전체가 참조로 포함됨).

생리학상 상용성인 pH를 달성하도록 제약 조성물을 제제화할 수 있다. 일부 구현예에서, 제약 조성물의 pH는, 예를 들어, 약 4 또는 약 5 내지 약 8.0, 또는 약 4.5 내지 약 7.5, 또는 약 5.0 내지 약 7.5일 수 있다. 예시적 구현예에서, 제약 조성물의 pH는 5.5 내지 7.5이다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은, 유효량의, 본원에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 결합 단백질, 또는 본원에 정의된 바와 같은 핵산, 또는 본원에 정의된 바와 같은 제약 조성물을, 코로나바이러스 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 코로나바이러스 감염의 치료 방법에 관한 것이다. 대상체는, 치료 방법 투여시, 상이한 중증도로, 코로나바이러스 감염과 관련된 증상 중 임의의 것을 나타내고 있을 수 있다.

일부 구현예에서는, 치료 방법의 단일 투여로 충분할 수 있다. 다른 구현예에서는, 반복 투여가 필수적일 수 있다. 대상체의 연령 및 일반적 건강, 뿐만 아니라 대상체의 코로나바이러스 감염의 상태 및 코로나바이러스 감염과 관련된 증상의 중증도 등의 다양한 인자가 투여 횟수 및 빈도수에 영향을 줄 것이다.

일부 구현예에서, 방법은 예방적 방법, 즉 대상체에서의 코로나바이러스 감염의 방지 방법이다. 이러한 방법에서는, 유효량의, 본원에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 결합 단백질, 또는 본원에 정의된 바와 같은 핵산, 또는 본원에 정의된 바와 같은 제약 조성물을 대상체에게 투여한다. 전형적으로, 대상체는, 예방적 방법 투여시, 코로나바이러스 감염과 관련된 증상 중 임의의 것을 나타내지 않을 것이다.

일부 구현예에서는, 예방적 방법의 단일 투여로 충분할 수 있다. 다른 구현예에서는, 반복 투여가 필수적일 수 있다. 대상체의 연령 및 일반적 건강, 뿐만 아니라 대상체의 코로나바이러스에 대한 노출 위험 등의 다양한 인자가 투여 횟수 및 빈도수에 영향을 줄 것이다.

특정 구현예에서, 코로나바이러스 감염은 SARS-CoV-2에 의해 유발된다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다.

본원에 기재된 결합 단백질은 임의의 적합한 투여 경로, 예컨대 비경구, 비내, 경구, 폐, 국소, 질, 또는 직장 투여를 통해 대상체에게 투여될 수 있다. 비경구 투여에 적합한 제제는, 항산화제, 완충제, 정균제, 및 제제를 의도된 수용자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성, 등장성 멸균 주사 용액, 및 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제, 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다. 추가의 상세사항에 대하여, 하기 문헌 참조: Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J. B. Lippincott Company, Philadelphia, PA, Banker and Chalmers, eds., pages 238-250 (1982), 및 ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4th ed., pages 622-630 (1986)).

본원에 기재된 결합 단백질은 또 다른 치료적 작용제, 예컨대 진통제와 조합되어 사용될 수 있다. 각각의 치료적 작용제는 동시에 (예를 들어, 동일한 의약 중에서 또는 같은 시간에), 병행하여 (즉, 임의의 순서로 하나 직후에 다른 하나가 투여되는 별도의 의약 중에서) 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여될 수 있다. 순차적 투여는, 조합 치료법에서의 치료적 작용제가 상이한 투여 형태인 (예를 들어, 하나의 작용제는 정제 또는 캡슐이고 또 다른 작용제는 멸균 액체인) 및/또는 상이한 투여 스케쥴로 투여되는, 예를 들어 진통제가 적어도 매일 투여되고 생물치료제가 보다 덜 빈번히 투여되는, 예컨대 매주 1회 또는 2주에 1회 투여되는 경우에 유용할 수 있다.

검출 또는 진단 방법

하나의 구현예에서, 본 발명은 대상체에서의 코로나바이러스 감염의 진단 방법에서의 사용을 위한 본원에 기재된 적어도 하나의 결합 단백질에 관한 것이다.

하나의 구현예에서, 본 발명은, 시험관내 또는 생체외에서 대상체로부터의 샘플을 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 결합 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 대상체에서의 코로나바이러스 감염의 진단 방법에 관한 것이다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 대상체에서의 코로나바이러스의 검출 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

a) 대상체로부터 샘플을 얻는 단계;

b) 상기 샘플을 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 결합 단백질과 접촉시키는 단계; 및

c) 코로나바이러스의 존재를 검출하는 단계.

상기 방법 및 용도에서, 샘플은 체액, 예컨대 혈액, 뇌척수액, 혈장 또는 소변으로부터 얻을 수 있다. 샘플은 또한 점액 (예컨대 비강, 구인두 또는 질 면봉법을 통해)으로부터 얻을 수 있거나 고체 조직 샘플 (예를 들어, 생검으로부터의)일 수 있다.

샘플은 이들 방법 중 임의의 것에서의 사용 전에 저장될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 상기 방법에서의 사용 전에 적합한 기간 동안 극저온 동결에 적용될 수 있다.

상기 방법 및 용도에서, 대상체는, 상이한 중증도로, 코로나바이러스 감염과 관련된 증상을 나타내고 있을 수 있다. 대안적으로, 대상체는 무증상일 수 있다. 방법 및 용도는 또한 사망 원인을 조사하기 위해 비-생존 대상체로부터 얻은 샘플 상에서 수행될 수 있다.

실시예

하기에 개시된 출발 물질 및 시약은 당업자에게 공지되어 있고/거나, 상업적으로 입수가능하고/거나, 널리 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있다.

물질

화학물질은 Sigma-Aldrich (USA)로부터 구입하였다. 올리고뉴클레오티드는 Microsynth (스위스)로부터의 것이다. 달리 언급되지 않는 한, DNA 폴리머라제, 제한 효소 및 완충제는 New England Biolabs (USA) 또는 Fermentas/Thermo Fisher Scientific (USA)로부터의 것이다. 유도성 대장균 발현 균주, 예를 들어, 대장균 XL1-블루 (Stratagene, USA) 또는 BL21 (Novagen, USA)을 클로닝 및 단백질 생성에 사용하였다.

분자 생물학

달리 언급되지 않는 한, 방법은 공지된 프로토콜에 따라 수행하였다 (예를 들어, 하기 문헌 참조: Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1989, New York).

세포 및 바이러스

ATCC (미국 20110 버지니아주 머내서스)로부터 구입한 베로 E6 세포 (아프리카 녹색 원숭이 신장 세포, ATCC® CRL-1586™)를 CO₂ 없이 37℃에서 10% FBS 및 보충물 (2mM L-글루타민, 비-필수 아미노산 및 100 U/ml 페니실린 100 μg/ml 스트렙토마이신 및 HEPES, 모두 독일 베를린의 Biochrom으로부터의 것)를 함유하는 세포 배양 배지 DMEM (FG0445) 중에서 패시징하였다. SARS-CoV-2 (2019-nCoV/IDF0372/2020)를 2% FBS 및 보충물을 함유하는 MEM (2%-FBS-MEM) 중에서 37℃에서 베로 E6 세포에서 전파시켰다. 바이러스를 실험 지속 기간 동안 비-통기 플라스크, 또는 실링 호일 (Biorad, 마이크로시일 B-필름, MSB 1001)로 덮인 24 웰-, 또는 96 웰-플레이트 내에서 CO₂ 없이 배양하였다.

디자인된 안키린 반복 단백질 라이브러리

디자인된 안키린 반복 단백질 라이브러리의 생성 방법은 예를 들어 하기 문헌에 기재되어 있다: 미국 특허 번호 7,417,130; Binz et al. 2003, loc. cit.; Binz et al. 2004, loc. cit. 이러한 방법에 의해 랜덤화된 안키린 반복 모듈 및/또는 랜덤화된 캡핑 모듈을 갖는 디자인된 안키린 반복 단백질 라이브러리를 작제할 수 있다. 예를 들어, 그에 따라 이러한 라이브러리를 고정된 N-말단 캡핑 모듈 또는 랜덤화된 N-말단 캡핑 모듈, 하나 이상의 랜덤화된 반복 모듈, 및 고정된 C-말단 캡핑 모듈 또는 랜덤화된 C-말단 캡핑 모듈에 기초하여 조립할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 라이브러리를 반복 또는 캡핑 모듈의 랜덤화된 위치에서 아미노산 C, G, M, N (G 잔기의 앞에) 및 P 중 임의의 것을 갖지 않도록 조립한다.

또한, 이러한 라이브러리 내의 이러한 랜덤화된 모듈은 랜덤화된 아미노산 위치와 추가의 폴리펩티드 루프 삽입을 포함할 수 있다. 이러한 폴리펩티드 루프 삽입의 예는 항체의 상보성 결정 영역 (CDR) 루프 라이브러리 또는 드 노보(de novo) 생성된 펩티드 라이브러리이다. 예를 들어, 이러한 루프 삽입은 지침으로서 인간 리보뉴클레아제 L의 N-말단 안키린 반복 도메인의 구조를 사용하여 디자인될 수 있다 (Tanaka, N., Nakanishi, M, Kusakabe, Y, Goto, Y., Kitade, Y, Nakamura, K.T., EMBO J. 23(30), 3929-3938, 2004). 10개의 아미노산이 2개의 안키린 반복의 경계에 가깝게 존재하는 베타-턴에 삽입된 이 안키린 반복 도메인과 유사하게, 안키린 반복 단백질 라이브러리는 안키린 반복 도메인의 하나 이상의 베타-턴에 삽입된 가변 길이 (예: 1 내지 20개 아미노산)의 랜덤화된 루프 (고정 및 랜덤화된 위치를 가짐)를 함유할 수 있다.

안키린 반복 단백질 라이브러리의 임의의 이러한 N-말단 캡핑 모듈은 바람직하게는 RILLAA, RILLKA 및 RELLKA 모티프 (예를 들어, 서열 번호: 55에서 위치 21 내지 26에 존재함)를 갖고, 안키린 반복 단백질 라이브러리의 임의의 이러한 C-말단 캡핑 모듈은 바람직하게는 KLN, KLA 또는 KAA 모티프 (예를 들어, 서열 번호: 58에서 최종 3개의 아미노산에 존재함)를 갖는다.

이러한 안키린 반복 단백질 라이브러리의 디자인은 표적과 상호작용하는 안키린 반복 도메인의 공지된 구조에 의해 안내될 수 있다. 그의 단백질 데이터 뱅크 (PDB) 고유 수탁 또는 식별 코드 (PDB-ID)에 의해 식별되는, 이러한 구조의 예는, 1WDY, 3V31, 3V30, 3V2X, 3V2O, 3UXG, 3TWQ-3TWX, 1N11, 1S70 및 2ZGD이다.

N2C 및 N3C 디자인된 안키린 반복 단백질 라이브러리 등의 디자인된 안키린 반복 단백질 라이브러리의 예가 기재되었다 (미국 특허 번호 7,417,130; Binz et al. 2003, loc. cit.; Binz et al. 2004, loc. cit.). N2C 및 N3C에서의 숫자는 N-말단과 C-말단 캡핑 모듈 사이에 존재하는 랜덤화된 반복 모듈의 수를 기재한다.

반복 단위 및 모듈 내부의 위치를 정의하기 위해 사용되는 명명법은 안키린 반복 모듈 및 안키린 반복 단위의 경계가 1개의 아미노산 위치만큼 이동되는 변형과 함께 문헌 [Binz et al. 2004, loc. cit.]에 기초한다. 예를 들어, 문헌 [Binz et al. 2004 (loc. cit.)]의 안키린 반복 모듈의 위치 1은 본 개시내용의 안키린 반복 모듈의 위치 2에 상응하고, 결과적으로 문헌 [Binz et al. 2004, loc. cit.]의 안키린 반복 모듈의 위치 33은 본 개시내용의 다음 안키린 반복 모듈의 위치 1에 상응한다.

실시예 1 : SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질의 선택

요약

리보솜 디스플레이 (Hanes, J. and Pl

ckthun, A., PNAS 94, 4937-42, 1997)를 사용하여, SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 상이한 도메인 (RBD 도메인; S1 NTD 도메인; S2 도메인)에 대한 결합 특이성을 갖는 다수의 안키린 반복 도메인을, 구체적 조건 및 추가의 선택해제 단계와 함께, 문헌 [Binz et al. 2004 (loc. cit.)]에 의해 기재된 것과 유사한 방식으로 DARPin® 라이브러리로부터 선택하였다. 재조합 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 표적 도메인을 향한 선택된 클론의 결합 및 특이성을 대장균 미정제(crude) 추출물 균질 시간 분해 형광 (HTRF)에 의해 평가하였고, 이는 다수의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 특이적 결합 단백질이 성공적으로 선택되었음을 나타낸다. 예를 들어, 서열 번호: 1 내지 11의 안키린 반복 도메인은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 선택된 결합 단백질의 아미노산 서열을 구성한다.

표적 및 선택 물질으로서의 스파이크 단백질 도메인

스파이크 단백질 도메인을 표적 및 선택 물질로서 사용하였다. 선택에 사용된 단백질은 SARS-CoV-2 S 단백질 엑토도메인 (SARS2-Secto-d72-GCN4-Streptag), SARS-Cov-2 S 단백질 (S1+S2 ECT, His-태그; Sinobiological 40589-V08B1), Bio-COVID-19_S1 단백질_His_Avitag (Acro Biosystems), SARS2-S1-Flag-3Streptag, COVID-19_S_단백질_RBD_Fc (Acro Biosystems), 및 SARS2-S1B-2Streptag을 포함하였다. 이러한 표적 단백질을 서열 번호: 43 내지 45 및 59 내지 67의 폴리펩티드로부터 선택하였다. 단백질을 표준 방법을 사용하여 비오티닐화하였다.

리보솜 디스플레이에 의한 SARS-CoV-2 스파이크 단백질-특이적 안키린 반복 단백질의 선택

디자인된 안키린 반복 단백질 라이브러리 (N2C 및 N3C)를 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 단편에 대한 리보솜 디스플레이 선택에 사용하였다 (하기 문헌 참조: Binz et al., Nat Biotechnol 22, 575-582 (2004); Zahnd et al., Nat Methods 4, 269-279 (2007); Hanes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 14130-14135 (1998)).

표적 및 라이브러리 당 4개의 선택 라운드를 수행하였다. 선택의 4개 라운드는, 라운드 1부터 라운드 4까지 선택 압력을 증가시키기 위해 표적 농도 감소 및 세척 엄격도를 증가를 사용하여, 표준 리보솜 디스플레이 선택을 사용하였다 (Binz et al. 2004, loc. cit.). 각각의 선택 라운드 후 역전사 (RT)-PCR 사이클의 수를 계속 감소시켜, 결합제의 풍부화로 인해 수율을 조정하였다. 이어서, 12개의 생성 풀(pool)을 결합제 스크리닝에 적용하였다.

선택된 클론은 미정제 추출물 HTRF에 의해 나타나는 바와 같이 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 RBD, S2 및 S1-NTD 도메인에 특이적으로 결합함

용액 중의 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 RBD, S2 및 S1-NTD 도메인에 특이적으로 결합하는 개별적으로 선택된 안키린 반복 단백질을 표준 프로토콜을 사용하여 안키린 반복 단백질-발현 대장균 세포의 미정제 추출물을 사용하는 균질 시간 분해 형광 (HTRF) 검정에 의해 식별하였다. 리보솜 디스플레이에 의해 선택된 안키린 반복 단백질 클론을 pQE30 (Qiagen) 발현 벡터의 유도체로 클로닝하고, 대장균 XL1-블루 (Stratagene)로 형질전환하고, LB-아가 (1% 글루코스 및 50 μg/ml 암피실린 함유) 상에 플레이팅하고, 이어서 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 단일 콜로니를 165 μl 성장 배지 (1% 글루코스 및 50 μg/ml 암피실린을 함유하는 LB)를 함유하는 96 웰 플레이트 내에 집어넣고 (단일 웰 내에 각각의 클론), 800 rpm으로 진탕시키며 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 50 μg/ml 암피실린을 함유하는 150 μl의 신선한 LB 배지를 신선한 96-딥-웰 플레이트 내에서 8.5 μl의 밤새 배양물로 접종하였다. 37℃에서 850 rpm으로 120분 동안 인큐베이션 후, 발현을 IPTG (0.5 mM 최종 농도)로 유도하고 6시간 동안 계속하였다. 세포를 플레이트의 원심분리에 의해 수확하고, 상청액을 폐기하고, 펠릿을 -20℃에서 밤새 동결시킨 후 8.5 μl μl B-PERII (Thermo Scientific) 중에 재현탁시키고, 진탕시키며 (600 rpm) 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 160 μl PBS를 첨가하고, 세포 파편을 원심분리 (15 min 동안 3220 g)에 의해 제거하였다.

각각의 용균된 클론의 추출물을 20 nM (최종 농도) 비오티닐화된 스파이크 단백질 도메인과 함께 PBSTB (0.1% Tween 20® 및 0.2% (w/v) BSA로 보충된 PBS, pH 7.4) 중의 1:200 희석액 (최종 농도), 항-6His-D2 HTRF 항체 - FRET 수용체 컨쥬게이트 (Cisbio)의 1:400 (최종 농도) 및 항-strep-Tb 항체 FRET 공여체 컨쥬게이트 (Cisbio, 프랑스)의 1:400 (최종 농도)으로서 384-웰 플레이트의 웰에 적용하고 4℃에서 120분 동안 인큐베이션하였다. HTRF를 340 nm 여기 파장 및 백그라운드 형광 검출을 위한 620 ±10 nm 방출 필터 및 특이적 결합에 대한 형광 신호 검출을 위한 665 ±10 nm 방출 필터를 사용하여 Tecan M1000 상에서 판독하였다.

각각의 용균된 클론의 추출물을 비오티닐화된 스파이크 단백질 도메인에 대한 결합에 대하여 시험하여, 스파이크 단백질에 대한 특이적 결합을 평가하였다.

결합 단백질의 추가 분석 및 선택

총 909개의 결합제 및 억제제를 식별하였다. 결합 프로파일에 기초하여, 96-웰 포맷에서 발현되도록 360개의 후보물을 선택하고, DNA 시퀀싱과 병행하여 균질성을 위해 정제하였다. 후보물을 크기 배제 크로마토그래피, Sypro-오렌지 열 안정성 평가 (하기 문헌 참조: Niesen et al., Nat Protoc 2, 2212-2221, (2007)), ProteOn 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 표적 친화도 평가, ELISA, hACE2-경쟁 HTRF 실험, SDS-PAGE, 및/또는 SARS-CoV-2 유사타입 바이러스 억제 검정에 의해 생물리학적으로 특성화하였다. 이들 데이터에 기초하여, RBD, S1-NTD 또는 S2 도메인에 결합하는 11개의 후보물 (서열 번호: 1 내지 11)을 추가 분석을 위해 선택하였다. 이 분석은 또한, 신규한 작용 방식을 탐구하고, 억제 효력, 에피토프 및 표적 다양성, 서열 다양성, 및/또는 생물리학적 특성을 결정하는, 다중-도메인 포맷의 31개 조합 (서열 번호: 12 내지 42)을 포함하였다. 다중-도메인 작제물을 이전에 기재된 바와 같이 (하기 문헌 참조: Binz, H. K. et al. MAbs 9, 1262-1269, (2017)) Gibson 조립을 사용하여 제조하였다. 본 발명의 결합 단백질을 정제 또는 검출 용이성을 위해 그의 N-말단에 His-태그를 갖도록 발현시키고 (서열 번호: 46) 하기에 기재되는 실험에서 이 His-태깅된 형태로 시험하였다.

추가의 결합 단백질의 조작

초기에 식별된 결합 단백질의 추가 개발을 위해, 개선된 특성, 예컨대 증가된 표적 단백질에 대한 친화도 및/또는 감소된 표적 단백질로부터의 오프-레이트 또는 마우스에서의 개선된 약동학적 특징을 갖는 결합 도메인을 다양한 방법을 사용하여 생성하였다. 하나의 접근에서, 초기에 식별된 결합 단백질 ("모체(parental)" 결합 단백질)을 친화도 성숙을 위한 적합한 출발점으로서 선택하였다. 친화도 성숙 절차는 출발점으로서 사용된 안키린 반복 도메인의 각각의 랜덤화된 위치의 포화 돌연변이유발을 수반하였다. 친화도 성숙 절차에 의해 생성된 서열을 경쟁 HTRF에 의해 보다 낮은 오프-레이트에 대하여 스크리닝하였다. 이로써 식별된 유익한 돌연변이를 단백질 조작에 의해 결합 단백질에서 조합하였다. 친화도 성숙되고 조작된 결합 단백질의 결합 특성을 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 검증하였다. 또 다른 접근에서, 안키린 반복 도메인의 N-말단 및/또는 C-말단 캡핑 모듈에서 특정 아미노산 잔기를 변경시켜, 안키린 반복 도메인 및 안키린 반복 도메인을 포함하는 단백질의 연장된 말기 반감기를 포함한, 개선된 약동학적 특성을 달성하였다. 이러한 변경된 아미노산 잔기는 대부분 표면 노출 잔기였다 (예를 들어, PCT/EP2020/085855 참조).

하나의 예에서, 소수성을 감소시키고/거나 그의 표적에 대한 결합 친화도를 증가시키고/거나 그로부터의 오프-레이트를 감소시키기 위해, 안키린 반복 도메인 vS07_08F10 (서열 번호: 9)에서 다수의 돌연변이를 도입함으로써, SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 S1-NTD 도메인에 대하여 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인, 즉 vS07_08F10v27 (서열 번호: 76) 및 vS07_08F10v47 (서열 번호: 85)을 생성하였다. 소수성의 감소 (예를 들어, N-말단 및 C-말단 캡핑 모듈에서의 잔기 변경에 의한 것)는 SEC에 의해 검출된 임의의 다량체화의 양을 감소시키고/거나, 점도를 감소시키고/거나, 마우스에서의 약동학적 특성을 개선시켰다. 여러 돌연변이된 잔기를 "모체" 결합 단백질에 대한 단일 부위 돌연변이유발 접근을 사용하여 친화도 성숙 과정에서 식별하였고, 이로써 변성된 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 모든 20개 아미노산에 대하여 잠재적 결합 잔기를 랜덤화하였다. 개개의 변이체를 경쟁 HTRF 스크리닝을 사용함으로써 개선된 오프-레이트에 대하여 시험하였다. 일부 개별 돌연변이는 적어도 2 내지 3배까지 HTRF 신호를 증가시켰다. 예로서, vS07_08F10v47에서 나타난 돌연변이 (서열 번호: 85)는 하기를 포함한다:

IR1_V11T: 제1 내부 반복 모듈에서, 개선된 오프-레이트를 나타내는 HTRF 경쟁 검정에서의 2 내지 3배 더 높은 신호에 기초하여 위치 11에서의 발린을 트레오닌으로 돌연변이시킴;

IR2_S3K: 제2 내부 반복 모듈에서, 개선된 오프-레이트를 나타내는 HTRF 경쟁 검정에서의 1.5 내지 2배 더 높은 신호에 기초하여 위치 3에서의 세린을 리신으로 돌연변이시킴;

IR2_I4V: 제2 내부 반복 모듈에서, 개선된 오프-레이트 및 모체 단백질에 비해 감소된 단백질의 다량체화를 나타내는 HTRF 경쟁 검정에서의 1.5 내지 2배 더 높은 신호에 기초하여 위치 4에서의 이소류신을 발린으로 돌연변이시킴;

IR2_R14Q: 제2 내부 반복 모듈에서, 개선된 오프-레이트를 나타내는 HTRF 경쟁 검정에서의 >3배 더 높은 신호에 기초하여 위치 14에서의 아르기닌을 글루타민으로 돌연변이시킴;

IR2_V15S: 제2 내부 반복 모듈에서, 개선된 오프-레이트를 나타내는 HTRF 경쟁 검정에서의 1.5 내지 2배 더 높은 신호에 기초하여 위치 15에서의 발린을 세린으로 돌연변이시킴;

C_W3V: C-말단 캡핑 모듈에서, 개선된 오프-레이트 및 모체 단백질에 비해 감소된 단백질의 다량체화를 나타내는 HTRF 경쟁 검정에서의 1.2 내지 1.5배 더 높은 신호에 기초하여 위치 3에서의 트립토판을 발린으로 돌연변이시킴;

C_I4V: C-말단 캡핑 모듈에서, 개선된 오프-레이트를 나타내는 HTRF 경쟁 검정에서의 2 내지 3배 더 높은 신호에 기초하여 위치 4에서의 이소류신을 발린으로 돌연변이시킴; 또한

C_I6V: C-말단 캡핑 모듈에서, 개선된 오프-레이트를 나타내는 HTRF 경쟁 검정에서의 2 내지 3배 더 높은 신호에 기초하여 위치 6에서의 이소류신을 발린으로 돌연변이시킴.

또 다른 예에서, 안키린 반복 도메인 vS07_14G03 (서열 번호: 10)에서 다수의 돌연변이를 도입함으로써 개선된 특성을 갖는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 S2 도메인에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인, 즉 서열 번호: 77의 안키린 반복 도메인을 생성하였다.

조작된 결합 단백질, 예컨대 서열 번호: 76, 77 및 85를, 서열 번호: 1 내지 11에 대하여 상기에 기재된 것과 유사하게 생물리학적으로 특성화하였다. 또한, 서열 번호: 12 내지 42에 대하여 상기에 기재된 것과 유사하게, 신규한 작용 방식을 탐구하고, 억제 효력, 에피토프 및 표적 다양성, 서열 다양성, 및/또는 생물리학적 특성을 결정하는, 이러한 조작된 결합 도메인 중 하나 이상을 포함하는 다중-도메인 포맷의 조합 (예: 서열 번호: 75, 84, 87 및 88)을 생성하였다.

실시예 2 : SPR 결합 검정

표면 플라즈몬 공명 (SPR) 검정을 사용하여 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질에 대한 본 발명의 결합 단백질의 결합 친화도를 결정하였다.

실행 완충제로서 PBS-T (0.005% Tween20)와 Bio-Rad ProteOn XPR36 기기를 사용하여 모든 SPR 데이터를 생성하였다. Bio-Rad 매뉴얼에 따라 새로운 뉴트라비딘 센서 칩 (NLC)을 공기-초기화하고 컨디셔닝하였다.

단일-도메인 DARPin 단백질: 내부에서 화학적으로 비오티닐화된 (리신을 통해) SARS-CoV-2 스파이크 단백질 (Sino Biologics, cat. 40589-V08B1, Lot MF14MA0701)을 ~3400 RU (30ug/ml, 30ul/min, 300s)로 포획하였다. 2개의 완충제 주입 (100ul/min, 60s) 후 2개의 12.5mM NaOH 재생 단계 (100ul/min, 18s)를 제1 주입 전에 적용하였다. 단일-도메인 DARPin 단백질을 회합 및 해리를 위해 100ul/min으로 180s 동안 주입하고 (50/16.7/5.6/1.9/0.6nM로 (또는 서열 번호: 9 및 10에 대하여 16.7/5.6/1.9/0.6nM으로)) 3600s 동안 (100ul/min으로) 기록하였다. 리간드를 12.5mM NaOH 펄스 (100ul/min, 18s)로 재생시켰다. 데이터를 빈 표면 및 완충제 주입에 대하여 이중 참조하고 1:1 랭뮤어(Langmuir) 모델에 따라 핏팅하였다.

다중-도메인 DARPin 단백질: 내부에서 화학적으로 비오티닐화된 (리신을 통해) SARS-CoV-2 (COVID-19) S 단백질 RBD (cat. SPD-C5255, lot. BV3539b-203FF1-203K)를 ~1000 RU (775ng/ml, 30ul/min, 300s)로 포획하였다. 2개의 완충제 주입 (100ul/min, 60s) 후 2개의 12.5mM NaOH 재생 단계 (100ul/min, 18s)를 제1 주입 전에 적용하였다. 25nM의 하나의 단일 농도의 각각의 다중-도메인 DARPin 작제물 (예를 들어, ALE033, ALE030, ALE038, ALE049, ALE058 포함)을 회합 및 해리를 위해 100ul/min으로 180s 동안 주입하고 36000s 동안 (100ul/min으로) 기록하였다. 데이터를 빈 표면 및 완충제 주입에 대하여 이중 참조하였다. 결합력 증가로 인해, 측정 시간 동안 유의한 해리가 기록될 수 없다.

SPR 검정의 예시적 결과가 도 6, 9a-c, 15a, 16 및 17 및 표 4에 나타나 있다. 또한 실시예 4 참조.

서열 번호 1-11에 따른 안키린 반복 도메인을, SPR (달리 언급되지 않는 한 다중 추적)을 사용하여 특정 코로나바이러스 스파이크 단백질 도메인에 대한 그의 결합 친화도에 대하여 시험하였다. 추가로, 본원 실시예에 기재된 방법, 예컨대 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 열 안정성 측정 (Tm), 및 SARS-CoV-2 VSV 유사바이러스 중화 검정을 사용하여, 다른 생물리학적 및 기능적 특성을 또한 시험하였다.

결과가 도 9a-c 및 하기 표 4a 및 4b에 제공되어 있다:

*단일 추적

표 4a

표 4b

서열 번호: 1 내지 8은, 표적 물질로서 bio-RBD Fc Acro (서열 번호: 45) 및 bio-S1 Acro (서열 번호: 43) 사용시, SPR (단일 추적)에 의해 표 4a에 나타낸 바와 같이 유사한 친화도로 스파이크 단백질의 RBD 도메인 또는 S1 도메인에 결합하는 것으로 나타났다. 서열 번호: 9는, 표적 물질로서 bio-S1 Acro (서열 번호: 43) 사용시, 2.0E-08 M의 K_D로 스파이크 단백질의 S1 도메인에 결합하는 것으로 나타났다 (단일 추적). 서열 번호: 9 및 서열 번호: 10은, 표적 물질로서 S 엑토 U (서열 번호: 61) 사용시, 각각 1.2E-09 M 및 7.9E-10 M의 K_D로 스파이크 단백질의 엑토-도메인에 결합하는 것으로 나타났다 (도 9c 참조). 서열 번호: 76은 서열 번호: 9에 대해 관찰된 것과 대략 동일한 K_D로 스파이크 단백질의 S1 도메인 또는 엑토-도메인에 결합하는 것으로 나타났으며, 서열 번호: 85는 서열 번호: 9 또는 서열 번호: 76보다 훨씬 더 높은 결합 친화도 (즉, 더 낮은 K_D)로 스파이크 단백질의 S1 도메인 또는 엑토-도메인에 결합하는 것으로 나타났다. 서열 번호: 10, 11 및 77은, 예를 들어 HTRF 검정에 의해, 스파이크 단백질의 S2 도메인에 결합하는 것으로 나타났다. 표 4b는, 크기 배제 크로마토그래피에서 서열 번호: 3, 5, 6, 9 및 10 각각이 단량체였음을 보여준다. 또한, SARS-CoV-2 VSV 유사바이러스에 대하여 시험시 높은 열 안정성 (>85℃) 및 나노몰 범위 (예: <2 nM)의 IC₅₀ 값이 여러 서열 번호에 대하여 나타난다.

다중-도메인 DARPin 단백질의 경우, 결합력 증가로 인해 측정 시간 동안 유의한 해리가 기록될 수 없었다 (예를 들어, 도 15a, 16 및 17 참조). 다중-도메인 단백질의 겉보기 친화도 (예를 들어 ALE049 및 ALE058의 것 포함)는 SPR의 한계를 넘었고, 이는 pM 미만 표적 친화도를 나타낸다 (데이터는 나타내지 않음).

실시예 3: 기능 스크리닝

본 실시예는 SARS-CoV-2 VSV 유사타입 바이러스 검정을 사용한 단일-도메인 및 다중 도메인 단백질의 기능 스크리닝을 기재한다. 이 검정의 결과가 도 5 내지 8에 제공되어 있다.

수포성 구내염 바이러스 (VSV) 유사바이러스 검정 (psVSV)을 사용하여 감염 억제를 평가하였고, 여기서는 VSV의 당단백질을 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 및 반딧불이 루시퍼라제 (LUC)로 태깅된 SARS-CoV-2 스파이크 당단백질의 우한(Wuhan) 변이체로 대체하였다. EGFP 및 LUC 활성의 단순 정량화에 의해 1 nM, 10 nM, 또는 100 nM의 후보물의 첨가 후 감염의 억제를 측정하였다 (하기 문헌 참조: Torriani, G. et al., Virology 531, 57-68 (2019)).

도 5 및 7은, 각각 스파이크 단백질 상의 단일 부위에 결합하는 (단일-도메인 DARPin® 단백질), 또한 스파이크 단백질 상의 3개의 도메인에 결합하는 (다중-도메인 DARPin® 단백질) 100 nM의 다양한 재조합 결합 단백질에서의 유사타입 SARS-CoV-2 바이러스 억제를 나타낸다. 보다 짧은 막대는 보다 강한 바이러스 억제를 나타낸다. 도 8은 도 7의 반복이되 1 nM에서의 것이다. 도 6은 단일-도메인 재조합 결합 단백질의 대표적 SPR 추적을 나타낸다. 이 데이터는, 출원인이 나노몰 미만의 항바이러스 활성을 갖는 다중-도메인 DARPin® 단백질의 구조를 빠르게 확립할 수 있었음을 보여준다. 재조합 결합 단백질의 보다 합리적인 디자인은 효력을 추가로 증가시켰다.

실시예 4: SARS-CoV-2 VSV 유사바이러스 (PsV nCoV)를 사용한 중화 검정

세포

9개의 Costar 3610, 투명 바닥, 백색 플레이트 내에 플레이팅된 베로 E6

유사 SARS-CoV-2 (PsV nCoV)

2000 IU/웰 (25 μL)

80'000 IU/mL = 8 * 10⁴IU/mL

4000 IU/웰로 1.6 *10⁵ IU/mL 제조

플레이트 당 100 *35 μL. 4 mL의 바이러스 x 8 플레이트 =32 mL 제조.

약 1 * 10⁶ IU/mL로 C15 얻음

6 ml 스톡을 26 mL 배지 2%FCS (소 태아 혈청)로. 총 32 mL

재조합 결합 단백질

*네가티브 대조군; ** 포지티브 대조군

표 5: 샘플

인간 혈청 알부민

인간 혈청 알부민 (HSA)의 3.0 mM 스톡 용액을 사용하여 HSA의 10 μM 용액을 제조하였다.

이 용액에 대한 배지는 DMEM (둘베코 변형 이글 배지) 2% FCS (소 태아 혈청) 및 20 μM HEPES 완충 용액 (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산)을 포함하였다.

샘플 희석액

2배 희석액을 제조하였다. 각각의 희석액을 1 부피 (PsV nCoV)와 혼합하였다.

샘플 1-14: 20 μM의 스톡

100 nM의 300 μL (4중, 4 x 70 μL)

희석액 1: /1/10:

15 μl의 스톡 20 μM + 135 μL PBS 최종 conc. 2 μM을 얻음

희석액 2: 1/20:

15 μl의 희석액 1 + 20 μM HSA를 함유하는 285 μL 드 미유(de milieu) DMEM 2% FCS 얻음.

최종 conc. 100 nM

네가티브 대조군:

희석액 1 neg 대조군.

희석액 1: /1/16.5:

10 μl의 스톡 167 μM + 157 μL PBS 최종 conc. 10 μM 얻음

희석액 2: 1/10:

15 μl의 스톡 10 μM + 135 μL PBS 최종 conc. 1 μM 얻음

희석액 3: /1/10:

30 μl의 희석액 2 + 20 μM HSA를 갖는 270 μL 드 미유 DMEM 2% FCS 얻음.

포지티브 대조군:

100 nM로 300 μL (4중, 4 x 70 μL) 제조

희석액 1: /1/10:

15 μl의 스톡 10 μM + 135 μL PBS 최종 conc. 1 μM 얻음

희석액 2: 1/10:

30 μl의 희석액 1 + 20 μM HSA를 갖는 270 μL 드 미유 DMEM 2% FCS 얻음.

최종 conc. 100 nM

제조

V-바닥 플레이트

샘플의 초기 1/10 희석액 제조. 4 x 70 μl = 280 μl의 부피가 필요. 2% FCS 및 10 mM HEPES를 함유하는 300 μl 배지 제조, 및

70 μl를 4중 샘플에 분포

V-바닥 플레이트에서 2배 희석 수행

방법 & 결과

1 부피 (35 μl)의 PsV nCOV를 각각의 웰에 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 50 μl/웰로 감염시키고 다시 37℃에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 접종물을 제거하고, 150 μl 배지 2% FCS를 첨가한 후 37℃에서 16시간 동안 최종 인큐베이션하였다. 최종 인큐베이션 기간 후, 검정을 중단하고 도립 형광 현미경을 사용하여 감염된 세포 (EGFP+)를 적절한 희석액에서 카운팅하였다. 세포의 고정은 필요하지 않았다. 이어서 루시퍼라제 검정을 수행하였다. 세포 배지의 부분을 제거하고 (150 μl 중 100 μl), 50 μl의 Glow (PROMEGA)를 각각의 웰에 첨가하였다. 대략 1 sec 동안 Berthold® TriStar LB941 광도계를 사용하여 결과를 판독하였다. 소프트웨어 Graph Pad Prism 7을 사용하여 데이터를 분석하였고, 결과가 표 6에 제공되어 있다:

표 6

샘플 1-14는 1.5 nM 미만, 또한 대부분에 경우에 0.7 nM 미만의 IC₅₀을 나타내며, 유사-SARS-CoV-2의 강력한 억제제인 것으로 나타났다. 샘플 2 및 11이, 0.1 nM 미만의 IC₅₀을 가지며 특히 강력하였다. 도 5는 GFP-라벨링된 VSV 유사타입 SARS-CoV-2 바이러스로 감염된 GFP 포지티브 베로 E06 세포를 나타내는 형광 현미경검사 이미지를 나타낸다. 도 5에서의 ALE043은 상기 표 6에서의 샘플 번호 12에 상응한다. ACO268 및 vS07_M101E04는 각각 네가티브 및 포지티브 대조군이다.

도 11은 SARS-CoV-2 VSV 유사타입 바이러스의 중화를 나타낸다.

도 12는 샘플 1 (ALE030), 4 (ALE033), 9 (ALE038), 13 (ALE042) 및 14 (ALE043)의 SARS-CoV-2 VSV 유사타입 바이러스의 중화를 나타낸다. 포지티브 대조군이 또한 포함된다 (vS07_M101E04).

도 11 및 12에서, 후보물의 적정은 50nM - 50pM (2배 희석)이었다. 10μM의 HSA의 존재는 검정에 영향을 주는 것으로 보이지 않았다 (HSA-결합제가 없는 대조군 M101E04 참조). 결과는 반감기 연장된 다중-도메인 작제물이 약 100pM의 IC₅₀ 값을 갖는 PsV nCoV의 강력한 억제제임을 입증한다.

실시예 5: 바이러스 중화 활성; DARPin® 단백질의 미세적정 검정 (개방 세포 시스템)

본 실시예에서는, 샘플을 SARS-CoV-2 바이러스 샘플 (즉, 유사바이러스가 아님)에 대하여 시험하였다. 하기 표 8에 기재된 화합물의 샘플을 100 nM, 20 nM, 4 nM, 0.8 nM, 0.16 nM, 0.032 nM 및 0.0064 nM의 희석액으로 제조하였다.

표 8

하기 대조군 샘플을 또한 제조하였다:

항체 포지티브 혈청 (환자로부터): 1:100, 1:500, 1: 2500, 1:625, ...

항체 네가티브 혈청: 1:100, 1:500, 1: 2500, 1:625, ...

네가티브 대조군 DARPin 단백질: ACO268, HSA-결합 DARPin 단백질

ACE2

바이러스 역 적정

배지: MEM, 2% FCS, L-Glut, NEAA, Neo, Pen Add: 10 μM HSA (인간 혈청 알부민) 희석 스톡 1:300

검정 수행 전날, 시험할 화합물 2개 당 컨플루언트(confluent) 베로E6 세포 (개방 시스템)로 96-웰 플레이트를 준비하였다. 모든 시험을 3중으로 수행하였다. 도 13은 시험 플레이트의 맵을 나타내고, 이는 연부 주위의 경계 대역 및 0.0064 내지 100 nm의 각각의 희석 값에 대한 3중 웰, 및 대조군 웰을 갖는다.

샘플을 2% FCS (소 태아 혈청) 및 10 μM HSA (인간 혈청 알부민)를 함유하는 1 ml 배지 중에 100 nM로 희석하였다. 2% FCS 및 10 μM HSA를 함유하는 100 μl 배지를 라인 4-11에서 모든 웰에 첨가하였다. 100 μl의 희석된 시험 화합물 또는 대조군 (100 nM)을 라인 2에 첨가하고, 125 μl를 라인 3에 첨가하였다. 라인 3으로부터 출발하여, 혈청을 라인 10까지 상단 행의 25 μl를 하단 행과 혼합함으로써 (매회, 피펫으로 위아래로 5회 액체를 옮겨 웰을 완전히 혼합함) 1:5로 연속 희석하였다.

MEM, 2% FCS, 10 μM HSA 중에서 1000 TCID50/ml로 (TCID50은 50% 조직 배양 감염 용량임) 플레이트 당 6 ml의 바이러스 현탁액을 제조하였다. 100 μl 바이러스 현탁액 (100 TCID50)을 라인 3-10의 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 1h 동안 인큐베이션하였다. 이어서 베로E6 세포를 함유하는 96 웰 플레이트로부터 배지를 제거하였다. 200 μl의 시험 화합물/바이러스 혼합물을 세포를 갖는 96 웰 플레이트로 옮기고, 플레이트를 37℃에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 이어서 CPE를 현미경 및 크리스탈 바이올렛 염색에 의해 결정하였다.

실시예 4의 결과가 도 14a 내지 14f에 나타나 있다. 청색 착색 세포는 100% 활성을 나타내고; 무색 세포는 활성이 없음을 나타낸다. 명백히 입증되는 바와 같이, 32 pM까지 세포의 거의 완전한 보호가 있었고, 이는 본 발명의 재조합 결합 단백질이 코로나바이러스 스파이크 단백질, 또한 구체적으로 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 매우 강력한 억제제임을 보여준다.

실시예 6: 바이러스 중화 활성; DARPin® 단백질의 미세적정 검정 (개방 세포 시스템)

본 실시예에서는, 안키린 반복 결합 도메인을 SARS-CoV-2 바이러스에 대하여 시험하였다. 하기 표 9에 기재된 안키린 반복 결합 도메인의 샘플을 200 nM, 100 nM, 20 nM, 2 nM 및 0.2 nM의 희석액으로 제조하였다.

표 9

하기 대조군 샘플을 또한 제조하였다:

ACE2 100 nM, 20 nM, 4 nM, 0.8 nM, 0.16 nM

바이러스 역 적정

사용된 물질: 비오티닐화된 인간 ACE-2 Fc, Acro Biosystems (cat# AC2-H82F9)

검정 수행 전날, 시험할 화합물 2개 당 컨플루언트 베로E6 세포 (개방 시스템)로 96-웰 플레이트를 준비하였다. 모든 시험을 4중으로 수행하였다. 도 13에 따르면 각각의 96-웰 플레이트는 경계 대역, 및 이어서 200 nm부터 0.2 nM까지 상이한 농도 웰의 행을 포함하였다.

샘플을 2% FCS (소 태아 혈청) 및 10 μM HSA (인간 혈청 알부민)을 함유하는 1 ml 배지 중에서 200 nM로 희석하였다. 2% FCS 및 10 μM HSA를 함유하는 100 μl 배지를 모든 웰에 첨가하였다. 지시된 농도의 ACE2를 사용하여 유사한 방식으로 ACE2 대조군 웰을 준비하였다.

MEM, 2% FCS, 10 μM HSA 중에서 1000 TCID50/ml로 플레이트 당 10 ml의 바이러스 현탁액을 제조하였다. 100 μl 바이러스 현탁액 (100 TCID50)을, 플레이트의 연부에서의 웰 (즉, 경계 웰)을 제외한 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 37℃에서 1h 동안 인큐베이션하였다. 이어서 베로E6 세포를 함유하는 96 웰 플레이트로부터 배지를 제거하였다. 200 μl의 시험 화합물/바이러스 혼합물을 세포를 갖는 96 웰 플레이트로 옮기고, 플레이트를 실링하고 37℃에서 2-3일 동안 인큐베이션하였다. 이어서 CPE를 현미경 및 메틸 블루 염색에 의해 결정하였다.

실시예 5의 결과가 도 18a 내지 18d에 나타나 있다. 청색 착색 세포는 100% 활성을 나타내고; 무색 세포는 활성이 없음을 나타낸다. 명백히 입증되는 바와 같이, 20 nM 또는 심지어 그 미만까지 세포의 완전한 또는 거의 완전한 보호가 있었고, 이는 본 발명의 재조합 결합 단백질이 코로나바이러스 스파이크 단백질, 또한 구체적으로 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 매우 강력한 억제제임을 보여준다. 구체적으로, vS07_12C06에 대해 2 nM까지, vS07_29B10 및 vS07_23E04에 대해 20 nM까지, 또한 vS07_19G10에 대해 100 nM까지 (20 nM에서 거의 완전한 보호를 가짐) 완전한 보호가 관찰되었다. vS07_14G03에 대해서는, 2 내지 200 nM에서 부분적 보호가 관찰되었다.

실시예 7: 바이러스 중화 활성; 낮은 농도 범위에서의 DARPin® 단백질의 적정

본 발명의 재조합 결합 단백질이 살아 있는 SARS-CoV-2로의 세포의 감염을 억제하는 능력을 추가로 조사하기 위해, i) Promega로부터의 CellTiter-Glo® 및 ii) 크리스탈 바이올렛 염색으로 베로 E06 세포의 세포 생존능을 측정하는 2개의 별개의 검정을 수행하였다. 시험된 샘플이 표 10에 열거되어 있고, 결과는 도 19에 나타나 있다.

표 10

모든 샘플을 20 μM 스톡으로 제공하였고, 초기에 10 μM HSA를 함유하는 2% FCS 배지 중에서 800 pM, 400 pM, 200 pM, 100 pM, 50 pM, 25 pM, 12.5 pM, 6.25 pM, 및 3.125 pM으로 희석하였고, 이어서 바이러스 현탁액으로 추가로 1:2 희석하였다.

제조

시험 전날 2개의 화합물 당 80% 컨플루언트 베로E6 세포 (개방 시스템)로 96-웰 플레이트를 준비하였다 (화합물을 3중으로 시험하였음).

화합물을 2% FCS 및 10 μM HSA를 함유하는 1 ml MEM 배지 중에서 800 pM으로 희석하였다.

모든 화합물을 2% FCS 및 10 μM HSA를 함유하는 100 μl MEM 배지 중에서 100 μl 희석 화합물을 혼합함으로써 1:2로 연속 희석하였다.

시험에서 경계 효과를 피하기 위해 경계 웰을 무함유 (단지 세포 및 배지)로 유지하였다.

세포에 대한 화합물의 비특이적 효과를 식별하기 위해, 단지 화합물 및 세포를 갖는 대조군 라인을 예상하였다 (대조군; 라인 2).

라인 3부터 9까지 화합물을 200 pM 내지 3.125 pM으로 1:2로 연속 희석하였다.

라인 10 및 11에서 2% FCS 및 10 μM HSA를 함유하는 MEM 배지를 바이러스 대조군 및 세포 대조군에 대하여 첨가하였다.

시험 절차

플레이트 레이아웃은 도 13에 나타낸 바와 같은 레이아웃과 유사하였지만, 화합물 농도는 상기에 지시되어 있다.

2% FCS 및 10 μM HSA를 함유하는 MEM 배지 중의 SARS-CoV-2 (2019-nCoV/IDF0372/2020)의 1000 TCID50/ml를 갖는 바이러스 현탁액 (플레이트 당 10 ml).

100 μl의 바이러스 현탁액 (100 TCID50)을 라인 3-10의 각각의 웰에 첨가하고, 배지를 모든 다른 웰에 첨가하였다.

플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.

80% 컨플루언트 베로E6 세포를 함유하는 96 웰 플레이트로부터 배지를 제거하고 200 μl의 시험 화합물/바이러스 혼합물을 세포를 갖는 96 웰 플레이트에 첨가하였다.

배양물을 37℃에서 3일 동안 인큐베이션하였다.

qPCR에 의한 바이러스 게놈 카피의 분석을 위해: 100 μl 상청액을 400 μl AVL 완충제 + 400 μl 100% EtOH 중에서 불활성화시키고 -> 불활성화 상청액을 BSL3 lab으로부터 유출시켰다.

세포 생존능 결정을 위해: 100 ul CellTiter-Glo® (Promega) 기질을 제조하고 제조업체 프로토콜에 따라 첨가하고, 플레이트를 2 min 동안 진탕시키고 형광 레드를 GloMax® (Promega)에서 분석하였다.

결과

CellTiter-Glo® 발광 생존능 검정에 의한 시험의 결과가 도 19에 제공되어 있다. VK: 바이러스 대조군; ZK: 세포 대조군. 대략 25 pM의 시험 화합물에서 베로 E06 세포의 완전한 보호가 관찰되었다. 세포의 완전한 보호가 ALE033, ALE042 및 ALE048에 대하여 25 pM까지 관찰되었다. ALE049, ALE053 및 ALE058에 대해서는 보호가 다소 덜 효율적이었지만, 또한 이들 화합물에 대해 25 pM에서 세포의 적어도 부분적 보호가 관찰되었다. 결론적으로, 본 발명의 다중-도메인 결합 단백질은 피코몰 농도에서 SARS-CoV-2에 의한 세포의 감염을 억제할 수 있다.

실시예 8: 서열 번호: 31 (ALE049) 또는 서열 번호: 39 (ALE058)를 포함하는 다중-특이적 결합 단백질의 추가의 특성화

서열 번호: 31 또는 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 다중-특이적 결합 단백질의 추가의 특성화는 SDS-PAGE (결과: 분해 없이 완전히 무손상 크기; 데이터는 나타내지 않음), 질량 분광측정 (결과: 예상 분자량; 데이터는 나타내지 않음), 크기 배제 크로마토그래피와 커플링된 정적 광 산란, 원형 이색성, 저장 안정성 (결과: 60℃에서 1주 동안 안정적; 데이터는 나타내지 않음), 혈청 안정성 (결과: 1주 동안 혈청 중에서 37℃에서 안정적; 데이터는 나타내지 않음), 표면 플라즈몬 공명, SARS-CoV-2 유사타입 바이러스 억제 검정, 생바이러스 억제 검정, 마우스 약동학 분석 (실시예 9 참조), 및 햄스터 효능 모델 (실시예 10 참조)을 포함하였다.

실험 방법 및 결과

원형 이색성

큐벳에 삽입된 모니터 센서를 갖는 1 cm 경로길이 큐벳 (Hellma)을 사용하여 Jasco J-815로 원형 이색성 측정을 수행하였다. 222 nm에서의 MRE가 20℃부터 90℃까지의 온도 램프 (가열 및 냉각)에 걸쳐 이어졌다. 20℃에서의 가변 온도 측정 전후에 190-250 nm의 스펙트럼을 얻었다. 단백질을 PBS 중의 0.25 μM에서 측정하였다.

표면 플라즈몬 공명 친화도 결정

SPR 검정을 사용하여 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질에 대한 다중-특이적 결합 단백질의 결합 친화도를 결정하였다. SPR 실험을 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행하였다.

SARS-CoV-2 VSV 유사타입 바이러스 검정

결합 단백질을 SARS-CoV-2 VSV 유사타입 바이러스 검정에서 억제 효력에 대하여 평가하였다. 이 검정은, 예를 들어 실시예 3 및 4에 상세히 기재된 바와 같이 수행하였다.

SARS-CoV-2 생바이러스 검정

결합 단백질을, 실시예 5에 기재된 것과 유사하게, SARS-CoV-2 바이러스 검정에서 억제 효력에 대하여 평가하였다. 요약하면, 결합 단백질을, 10 μM HSA (인간 혈청 알부민)이 첨가된, 배지: MEM, 2% FCS, L-Glut, NEAA, Neo, Pen을 사용하여 (희석 스톡 1:300), 하기에 기재되는 바와 같은 96-웰 플레이트에서 100 nM, 20 nM, 4 nM, 0.8 nM, 0.16 nM, 0.032 nM 및 0.0064 nM의 희석액으로 제조하였다. 모든 시험을 3중으로 수행하였다. 검정 수행 전날, 시험할 화합물 2개 당 컨플루언트 베로E6 세포 (개방 시스템)로 96-웰 플레이트를 준비하였다. 시험 플레이트를 도 13에 나타낸 것과 유사하게 디자인하였고, 이는 연부 주위의 경계 대역 및 0.0032 nM 내지 50 nM의 각각의 최종 희석 값에 대하여 3중 웰, 및 대조군 웰을 갖는다. 샘플을 2% FCS (소 태아 혈청) 및 10 μM HSA (인간 혈청 알부민)를 함유하는 1 ml 배지 중에서 100 nM로 희석하였다 (상기 참조). 2% FCS 및 10 μM HSA를 함유하는 100 μl 배지를 라인 4-11에서 모든 웰에 첨가하였다. 100 μl의 희석된 시험 화합물 또는 대조군 (100 nM)을 라인 2에 첨가하고, 125 μl를 라인 3에 첨가하였다. 라인 3으로부터 출발하여, 혈청을 라인 10까지 상단 행의 25 μl를 하단 행과 혼합함으로써 (매회, 피펫으로 위아래로 5회 액체를 옮겨 웰을 완전히 혼합함) 1:5로 연속 희석하였다. MEM, 2% FCS, 10 μM HSA 중에서 1'000 TCID50/ml로 플레이트 당 6 ml의 바이러스 현탁액을 제조하였다. 100 μl 바이러스 현탁액 (100 TCID50)을 레인 3-10의 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 1h 동안 인큐베이션하였다. 이어서 베로E6 세포를 함유하는 96 웰 플레이트로부터 배지를 제거하였다. 200 μl의 시험 화합물/바이러스 혼합물을 세포를 갖는 96 웰 플레이트로 옮기고, 37℃에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 이어서 현미경 및 크리스탈 바이올렛 염색에 의해 세포변성 효과를 결정하였고, 여기서 청색 착색 세포는 100% 활성을 나타내고, 무색 세포는 활성이 없음을 나타내고 (도 20 참조), 또는 대안적으로, CellTiter-Glo® 발광 세포 생존능 검정을 사용하였다 (Promega; 도 21a-c 참조). 후자의 경우, 1'000, 10'000, 또는 100'000 TCID50을 사용하였다.

도 20에서 명백히 입증되는 바와 같이, ALE049 및 ALE058 둘 다에 대하여 0.08 nM까지 세포의 완전한 또는 거의 완전한 보호가 있었고, 이는 본 발명의 재조합 결합 단백질이 코로나바이러스 스파이크 단백질, 또한 구체적으로 SARS-CoV-2 스파이크 단백질, 또한 코로나바이러스, 또한 구체적으로 SARS-CoV-2에 의한 세포 감염의 매우 강력한 억제제임을 보여준다. 상응하는 결과가 도 21a-c에 나타나 있고, 이들 또한 ALE049 및 ALE058 둘 다에 대하여 강력한 억제를 입증한다. 이들 검정에서 효율적인 억제를 달성하기 위해 필요한 재조합 결합 단백질의 정확한 농도는 사용된 바이러스 로드에 따라 달라졌다. ALE049 및 ALE058 둘 다에 대하여, 피코몰 범위에서 SARS-CoV-2의 강력한 억제가 관찰되었고, ALE049에 대해서는 50 pM까지였다. ALE049 및 ALE058에 대한 IC₅₀ 값이 하기 표 11에 나타나 있다. 바이러스 억제의 이들 값은 지금까지 보고된 가장 강력한 SARS-CoV-2 억제를 나타낸다.

약물 후보물의 분자 모델

ALE049에 대한 분자 모델 (도 22a)을 극저온 전자 현미경검사 데이터에 기초하여 구축하였다 (데이터는 나타내지 않음). 제1 단계에서, 결합 도메인 #2의 모델 구조를 생성하였다. 공통 디자인된 안키린 반복 도메인 PDB:2xee를 템플레이트로서 사용하였다. 돌연변이를 고정된 백본을 갖는 RosettaRemodel로 도입하고, 구조를 RosettaRelax로 개량하였다. 반경 0.3Å을 갖는 RosettaCluster를 사용하여 40개의 개량된 구조를 클러스터링하고, 가장 큰 클러스터로부터의 최저-에너지 모델이 최종 모델로서 제공되었다. 이어서 이 모델을 사용하여 스파이크 단백질 및 도메인 #2의 복합 구조로부터 생성된 관찰된 전자 밀도에 도메인 #2를 핏팅하여, 도메인 #2:RBD의 삼량체의 좌표를 갖는 PDB 파일을 생성하였다. 이 삼량체 모델을 도 22a에 나타낸 바와 같이 스파이크 엑토도메인에 결합된 ALE049의 개념적 모델링을 위한 입력 구조로 사용하였다. 유사하게, ALE058에 대한 분자 모델을 또한 구축하였다 (도 22b). ALE058에 대한 이 모델은 극저온 전자 현미경검사 데이터 뿐만 아니라 S2 결합 도메인에 대한 개략적 구조 예측에 기초한다.

서열 번호: 31 (ALE049) 또는 서열 번호: 39 (ALE058)의 아미노산 서열을 포함하는 다중-특이적 결합 단백질은 각각 전신 반감기 연장을 위한 2개의 임상적으로 검증된 혈청 알부민-결합 도메인에 C-말단 융합된 3개의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 결합제의 조합을 포함한다. 생성된 5-도메인 단백질을 발현시키고, 정제하고, 생물리학적 특성, 표적 친화도, 및 바이러스 억제와 관련하여 상세하게 특성화하였다. 다중-특이적 결합 단백질은 대장균의 세포질에서 높은 수준으로 가용성 형태로 발현되었다. 정제된 단백질은 단량체이고, 원형 이색성에 의해 평가시 높은 열 안정성 (Tm > 88℃) 및 가역적 언폴딩을 나타내고, 60℃에서 가속화된 저장 안정성 검정에서 높은 안정성을 나타낸다 (데이터는 나타내지 않음). 이들의 겉보기 친화도는 SPR의 한계를 넘었고, 이는 pM 미만 표적 친화도를 나타낸다 (데이터는 나타내지 않음). psVSV 검정에서, 다중-특이적 결합 단백질은 3 pM 내지 138 pM 또는 0.24 ng/ml 내지 11.04 ng/ml 범위의 IC₅₀ 값으로 바이러스 진입을 억제하였다 (표 11, 도 23 참조). psVSV 검정 결과는 생바이러스 검정 결과와 잘 상관되었고, 여기서는 25 pM 내지 100 pM 또는 2 ng/ml 내지 8 ng/ml의 농도에서 감염 억제가 관찰되었다 (표 11, 도 21a-c 참조).

*LV: 생바이러스 세포변성 효과 검정

표 11

도 23은 추가로, 스파이크 단백질의 RBD 도메인의 존재 하에 시험된 본 발명의 재조합 결합 단백질에 의한 SARS-CoV-2 VSV 유사바이러스의 중화를 나타낸다. 도 23은, RBD 도메인이 3개의 RBD 결합 도메인을 함유하는 ALE049와 강하게 경쟁하지만, 1개의 RBD 결합 도메인, 1개의 S1-NTD 결합 도메인 및 1개의 S2 결합 도메인을 함유하는 ALE058과는 그렇지 않음을 보여준다. ALE049는 단리된 RBD-도메인와 경쟁시 효력을 잃었지만, ALE058에서의 단일 RBD-결합제의 경쟁은 ALE058의 효력에 대한 유의한 영향이 없었다. 이론에 의해 얽매이길 원하지는 않으며, 이 데이터는, ALE049 및 ALE058이 상이한 작용 방식에 의해 SARS-CoV-2를 억제함을 확인시켜주는 것으로 보인다. ALE049는 RBD/ACE-2 상호작용의 중화에 강하게 의존하는 것으로 보이지만, ALE058은 RBD/ACE-2 상호작용의 중화를 넘어 분자의 S1-NTD-S2 아암(arm)의 독립적인 중화 효력을 또한 활용하는 다중-방식 결합 및 다양화된 작용 방식을 나타내는 것으로 보인다. 따라서, 도 23에 나타낸 데이터에 기초하여, ALE049 및 ALE058은, 도 22에 나타낸 2개의 분자의 분자 모델과 일치하는, 상이한 작용 방식을 갖는 것으로 보인다.

본 발명의 결합 단백질에 대하여 관찰된 이러한 높은 효력은, 감염 개시시 매우 낮은 바이러스 역가가 고려되는 SARS-CoV-2 치료 및 예방에서의 사용에 있어 핵심적이다. 중요하게는, 가장 풍부한 SARS-CoV-2 혈청형의 여러 스파이크 단백질 변이체가 다중-특이적 결합 단백질에 의해 높은 효력으로 차단되었으며 (표 12 참조), 이는 바이러스 탈출에 대한 강건성 및 현재의 팬데믹 및 잠재적으로 또한 미래의 팬데믹에서 예방적 치료에서의 사용 가능성을 나타낸다. 마우스 실험에서는, 시험된 최고 용량 (50 mg/kg, i.v.)까지 유해 이벤트가 관찰되지 않았다.

표 12: SARS-CoV-2 스파이크 단백질 변이체의 억제 효력 (IC₅₀, [10^-12M])

실시예 9: 마우스에서의 본 발명의 다중-특이적 결합 단백질의 약동학 분석

마우스에서의 본 발명의 다중-특이적 재조합 결합 단백질의 약동학 (PK) 특징을 평가하기 위해 PK 연구를 수행하였다. 이러한 PK 특징은 동물 약동학 연구에서, 독성학 연구에서 또는 인간 임상 시험에서 본 발명의 다중-특이적 결합 단백질의 용량 예측을 위해 유용하다.

조사된 본 발명의 다중-특이적 결합 단백질은 - N-말단으로부터 C-말단까지 - 2개의 HSA-특이적 결합 도메인, 그 후 3개의 스파이크 단백질-특이적 결합 도메인을 포함한다 (표 2 참조). HSA-특이적 결합 도메인은 마우스의 혈청 알부민에 대하여 교차-반응성이다.

이 PK 연구를 위해, 나이브(naive) 암컷 BALB/c 마우스는 1 mg/kg의 화합물의 표적 용량 수준으로 단일 정맥내 볼루스 주사를 수용하였다. 화합물 투여 후 5 min 내지 165 h의 여러 시점에 혈액 샘플을 수집하였다. 혈청 농도를 ELISA-기반 분석 방법으로 결정하였다.

6 h 이후로부터 농도-시간 프로파일은 최종 샘플링 시점인 165 h까지 대략 단일-지수 감소와 유사한 혈청 농도의 느리고 꾸준한 감소를 나타낸다. 농도 시간 프로파일로부터 비-구획 분석을 사용하여 약동학 파라미터를 결정하였다.

하기 다중-특이적 결합 단백질을 본 실시예에서 시험하였다:

표 13

생체내 동물 실험

시험 항목을 건강한 암컷 BALB/c 마우스 (시험 항목 당 6마리 마우스)에게 꼬리 정맥으로의 단일 정맥내 볼루스 주사로 투여하였다. 표적 용량 수준은 1 mg/kg이었다. 각각의 화합물의 연구를 위해, 6마리의 마우스를 동일한 수의 동물을 갖는 2개 그룹으로 분할하였다. 약동학 조사를 위해, 각각의 마우스로부터 혈청 샘플 4개를 5 min, 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h 및 165 h의 시점에 복재 정맥으로부터 수집하였다. 각각의 샘플링 시간에 대한 개별 동물의 할당은 미리 정해진 체계에 따랐다. 혈액을 실온에서 대략 30 min 동안 유지하여 응고시킨 후 원심분리하였다 (5 min/12000g/4℃). 그 후 혈청을 동결시키고 분석까지 -20℃에 저장하였다. 생체내 실험에서 주요 문제 및 약물-관련 부작용은 보고되지 않았다.

ELISA 방법

검출을 용이하게 하기 위해, 시험된 결합 단백질 중에 존재하는 N-말단 His-태그 및 포획을 위한 항-DARPin® 항체 1-1-1에 의해 인식된 DARPin® 모이어티의 공통 에피토프를 사용하여 다중-특이적 결합 단백질의 혈청 농도 측정을 위해 ELISA 방법 (도 24 참조)을 사용하였다. 도 24에 나타낸 ELISA 셋업 체계 (결합 단백질 예로서 ALE049를 나타냄)는, 혈청 샘플에서 DARPin® 스캐폴드 에피토프를 통해 다중-특이적 결합 단백질을 포획하는, 토끼 항-DARPin® 항체 1-1-1에 결합하는, ELISA 플레이트 상에 고정화된 모노클로날 염소 항-토끼-IgG를 사용한다. 포획된 DARPin® 분자를 마우스 항-RGS-His-IgG-HRP 컨쥬게이트를 사용하여 검출한다. aSA: 항 혈청 알부민, aRBD: 항 수용체 결합 도메인 (RBD)

시험 절차

웰 당 100 μL의, PBS 중의 10 nmol/L 폴리클로날 염소 항-토끼 IgG 항체 (Ab18)를 4℃에서 밤새 NUNC Maxisorb ELISA 플레이트 상에 코팅하였다. 웰 당 5회의 300 μL PBST (0.1% Tween20으로 보충된 PBS)로의 세척 후, 웰을 Heidolph Titramax 1000 진탕기 (450 rpm) 상에서 실온 (RT)에서 1 h 동안 0.25% 카세인으로 보충된 300 μL PBST (PBST-C)로 블록킹하였다. 플레이트를 상기에 기재된 바와 같이 세척하였다. 웰 당 100 μL의, PBST-C 중의 5 nmol/L 토끼 항-DARPin® 1-1-1 항체를 첨가하고, 플레이트를 1 h 동안 궤도 진탕 (450 rpm) 하에 RT (22℃)에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 상기에 기재된 바와 같이 세척하였다.

웰 당 100 μL의 희석된 혈청 샘플 (1:20 - 1:312500, 1:5 희석 단계에서), 다중-특이적 결합 단백질 품질 제어 샘플 (100, 10 및 1 nmol/L) 또는 PBST-C (최종 혈청 농도 1 % (초기 1:20 희석 최종 혈청 농도 5%)를 제공하도록 나이브 마우스 혈청으로 보충됨) 중에 희석된 다중-특이적 결합 단백질 표준 곡선 샘플 (0 및 50 - 0.001 nmol/L, 1:3 희석 단계에서)을, 450 rpm으로 진탕시키며, RT에서 2 h 동안 적용하였다. 플레이트를 상기에 기재된 바와 같이 세척하였다.

이어서 웰을 PBST-C 중의 100 μL 뮤린 항-RGS-His-HRP IgG (Ab06) 1:2000과 인큐베이션하고 RT에서, 450 rpm으로 1 h 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 상기에 기재된 바와 같이 세척하였다. ELISA를 5분 동안 웰 당 100 μL의 TMB 기질 용액을 사용하여 전개하고 웰 당 100 μL의 1 mol/L H₂SO₄의 첨가에 의해 중단시켰다. 450 nm에서의 흡광도와 620 nm에서의 흡광도 사이의 차를 계산하였다. 샘플을 2개의 상이한 플레이트 상에서 2중으로 측정하였다.

기지의 농도의 품질 제어 샘플을 측정에 포함시켜 검정의 성능을 모니터링하였다.

Certara로부터의 Phoenix WinNonlin^TM 8.0 프로그램을 사용하여 약동학 데이터 분석을 수행하였다. 정맥내 볼루스 주사를 통해 투여된 동물의 평균 농도-시간 데이터에 기초한 연구의 약동학 파라미터의 계산을 비-구획 분석 (NCA 모델 200-202, IV 볼루스, 선형 사다리꼴 선형 내삽)으로 수행하였다.

계산된 약동학 파라미터는 적어도 하기를 포함하였다: AUCinf_pred, AUClast, AUC_%extrapol, AUC_%Back_Ext_pred, Cmax, Tmax, Cl_pred, Vss_pred, t1/2 (HL_람다_z)

결과가 표 14 및 도 25에 나타나 있다:

표 14

결과 및 결론

단일-지수 제거 단계에서, ALE033, ALE048 및 ALE049의 혈청 농도는 각각 45.8 h, 50.8 h 및 49.6 h의 반감기 값을 가지며 감소하였다. ALE033, ALE048 및 ALE049의 클리어런스는 각각 0.00094, 0.00091 및 0.00081 L/(h*kg)으로 결정되었고, ALE033, ALE048 및 ALE049의 분포 부피 (Vss)는 각각 0.058, 0.063 및 0.055 L/kg으로 계산되었다. Vss에 대하여 결정된 값은, ALE033, ALE048 및 ALE049가 모노클로날 항체와 유사하게 동물의 전신 순환에 주로 국한됨을 나타낸다.

결론적으로, 1 mg/kg의 용량 수준으로의 정맥내 투여 후, 본 발명의 3개의 시험된 다중-특이적 결합 단백질은 마우스에서 알부민의 반감기 범위의 전신 반감기를 나타낸다. 마우스 및 인간에서의 알부민의 반감기 뿐만 아니라 이전 데이터 (Binz et al., MAbs 9, 1262-1269 (2017))를 고려하여, 인간에서의 ALE049의 말기 반감기는 약 3주로 추정될 것으로 예상된다. 인간에서의 ALE033 및 ALE048의 말기 반감기도 유사하게 추정될 것으로 예상된다.

실시예 10: 시리아 햄스터에서의 SARS-CoV-2 억제 효능 실험

ALE049의 효능을 SARS-CoV-2 감염의 방지적 치료의 시리아 햄스터 모델에서 추가로 평가하였다.

시리아 햄스터를 각각 6마리의 암컷 동물의 4개 그룹으로 나누었다. 그룹을 맹검 방식으로 16 μg, 160 μg, 또는 1600 μg의, 서열 번호: 31의 아미노산 서열을 갖는 다중-특이적 결합 단백질 또는 위약으로 치료하였다. 치료 주사 (i.p., 복강내)를 5x10⁴ TCID50 (100 μl 중)의 SARS-CoV-2 (BetaCoV/Munich/BavPat1/2020)로의 동물의 비내 감염 (제0일) 24 h 전 (제-1일)에 수행하였다. 제-2일에, 체중을 측정하고, 혈액을 채취하고, 최초 인후 면봉법을 수행하였다. 동물을 제4일에 안락사시키고, 조직을 채취하고, 육안 병리학(gross pathology)을 수행하였다. 인후 면봉을 바이러스 수송 배지에서 매일 수집하고, 분취하고, 저장하였다. 부검시, 육안 병리학을 수행하였다. 폐엽을 검사하고, 등쪽 뷰로부터 영향 받은 폐 조직의 백분율의 추정을 수행하였다. 좌측 폐엽 및 비갑개(nasal turbinate)는 조직병리학을 위해 10% 중성 완충 포르말린 중에 보존하였다. 이들 조직의 우측을 균질화하고 Taqman PCR 및 바이러스 적정에 적용하였다. 추가로, 다른 장기를 수집하였다. 조직 샘플을 바이러스학 분석을 위해 동결시키고, 칭량하고, 감염 배지에서 균질화시키고, 적정 전에 잠시 원심분리하였다. 모든 동물에서 폐 및 비갑개에 대하여 조직병리학을 수행하였다. 10% 포르말린으로의 고정 후, 좌측 폐 및 좌측 비갑개로부터의 섹션을 파라핀 내에 포매하고, 조직 섹션을 조직 검사를 위해 H&E에 의해 염색하였다. 바이러스학 분석을 위해, 4중의 10배 연속 희석액을 사용하여 베로 E6의 컨플루언트 층에서 바이러스 역가를 결정하였다. 이를 위해, 샘플 (인후 면봉 및 조직 균질물)의 연속 희석액을 제조하고, 37℃에서 1 h 동안 베로 E6 단층 상에서 인큐베이션하였다. 베로 E6 단층을 세척하고, 37℃에서 4-6일 동안 인큐베이션하고, 그 후 플레이트를 WST8로 점수화하였다. 스피어만-카버(Spearman-Karber) 방법을 사용하여 바이러스 역가 (TCID50)를 계산하였다. 판독은 체중, 폐 병변, 바이러스 역가, 및 조직병리학의 관찰을 포함하였다.

조직병리학

10% 중성-완충 포르말린으로의 고정 후, 좌측 폐, 좌측 비갑개 및 기관의 섹션을 파라핀 내에 포매하였다. 조직 섹션을 조직병리학 평가를 위해 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색하였다. 폐포염 및 폐포 손상 정도가 각각 0%; 1-25%; 26-50% 또는 >50%로 추정되는 경우, 0, 1, 2 또는 3의 반-정량적 점수가 주어졌다. 폐의 염증의 정도 및 중증도에 대한 누적 점수는 동물 당 폐포염의 총점을 제공하였다 (표 15, 컬럼 "정도 + 중증도의 합계" 참조). 폐포염, 세기관지염, 및 기관지염의 중증도에 대하여, 각각 존재하는 염증성 세포가 없는, 거의 없는, 중간 정도 수인 또는 많은 경우, 0, 1, 2 또는 3의 반-정량적 점수가 주어졌다. 폐포 부종, 폐포 출혈, 및 타입 II 폐세포 과형성의 존재에 대하여, 각각 이들의 부재 또는 존재에 따라 0 또는 1의 점수가 주어졌다. 표 16에서, 폐포 부종, 폐포 출혈, 및 타입 II 폐세포 과형성의 존재는 수치 점수 대신에 "예" 및 "아니오"로 나타내었다.

판독은 체중, 폐 병변, 바이러스 역가, 및 조직병리학 관찰을 포함하였다. 1600 μg 용량에서, ALE049는 폐에서 바이러스 역가의 현저한 감소를 나타내었다 (도 26a). 모델이 높은 동물간 변동성을 나타내었지만, 바이러스 역가의 용량-의존적 감소 (도 26a), 거시적으로 결정된 폐 병변의 용량-의존적 감소 (도 26b), 및 체중 감소의 용량-의존적 감소 (도 26c)의 추세가 관찰되었고, 이는 160 μg 뿐만 아니라 1600 μg 용량이 항-바이러스 활성을 나타내었음을 나타낸다. 인후 면봉법에서의 바이러스 역가는 추가로, 1600 μg 용량, 및 보다 적은 정도로 160 μg 용량이, 감염-후 4일 시간 동안 인후에서 바이러스 역가를 억제하고/거나 바이러스 역가의 감소를 가속화하였음을 보여준다 (도 26d). 비갑개에서의 바이러스 역가 (도 26e) 및 조직병리학 데이터 (표 15 및 16, 도 27)는 1600 μg 용량이 가장 강한 항-바이러스 보호 효과를 가졌음을 확인시켜주었다. 이들 고무적인 초기 발견에 기초하여, 추가의 동물 실험이 진행 중이다.

표 15. 조직병리학 결과 (1)

표 16. 조직병리학 결과 (2)

실시예 11: SARS-CoV-2 변이체 억제 효능 실험

SARS-CoV-2 변이체 B.1.1.7 ("UK 변이체") 및 B.1.351 ("남아프리카 변이체")에 대하여, 뿐만 아니라 스파이크 단백질에서 단일 돌연변이를 갖는 SARS-CoV-2 변이체에 대하여 ALE049 (서열 번호: 31) 및 ALE109 (서열 번호: 75)의 효능을 평가하였다.

SARS-CoV-2의 스파이크 단백질은 인간 ACE2 수용체에 대한 결합을 통해 세포 진입을 매개한다. SARS-CoV-2는 또한 비-영장류 숙주, 예컨대 고양이 및 밍크를 감염시킬 수 있다 (Oude Munnink et al., 2021, Science 371, 172-177). 다중-숙주 생활방식의 난잡성은 종종 바이러스의 그의 새로운 숙주에 대한 초기의 아직 최적 미만의 적응의 지표이다. 이는 내재된 동적 가소성 및 추가의 인간 적응 가능성을 시사한다. 스파이크 단백질에서의 수용체-결합 도메인(RBD)은 ACE2와의 인터페이스를 형성한다. 부위 돌연변이유발 스캐닝 및 구조 분석은 아미노산 잔기, 예컨대 L455, F456, A475, F486, F490 및 Q493이 이 상호작용을 위해 중요함을 드러내었다 (Yan et al., 2020, Science 367, 1444-1448; Yi et al., 2020, Cell Mol Immunol 17, 621-630). 특히, 단일 아미노산 치환 N439R, L452K, N470T, E484P, Q498Y 및 N501T는 인간 ACE2에 대한 친화도를 증가시키는 것으로 나타났다 (Yi et al., 2020, loc. cit.). 이들 실험 결과와 일치하게, 돌연변이 N439K 및 돌연변이 N501Y가 촉진된 수용체 결합 및 증가된 투과성과 관련하여 빠르게 확산되는 SARS-CoV2 스파이크 변이체에서 나타났다 (Thomson et al., 2021, Cell, https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.01.037). RBD 도메인 또한 면역원성이며, 다른 잔기 중에서도, K444, E484, 및 F486이 중화 항체의 결합에 중요한 것으로 나타났다 (Ku et al., 2021, Nat Commun 12, 469).

본 실시예에서, 본 발명자들은 ALE049 및 ALE109의 중화 능력에 대한 스파이크 단백질의 선택된 돌연변이의 영향을 분석하였다 (도 28).

His-태깅된 1가 RBD 결합제, ALE049, ALE109 및 ALE109의 도메인 녹아웃 변이체의 생성

실시예 1 및 및 왈서(Walser) 등의 문헌 (2020)에 기재된 바와 같이 선택되고 클로닝된 안키린 반복 단백질 작제물 (bioRxiv preprint doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.25.256339)을 대장균 BL21 세포에서 형질전환하고, LB-아가 (1% 글루코스 및 50 μg/ml 암피실린 함유) 상에서 플레이팅하고, 이어서 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 각각의 작제물에 대하여, 단일 콜로니를 TB 배지 (1% 글루코스 및 50 μg/ml 암피실린 함유)에 집어넣고, 230 rpm으로 진탕시키며 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 신선한 TB 배지 (50 μg/ml 암피실린 함유)를 1:20의 밤새 배양물로 접종하고 37℃에서 230 rpm으로 인큐베이션하였다. OD600 = 1.1에서 IPTG (0.5mM 최종 농도)의 첨가에 의해 배양을 유도하고 37℃에서 230 rpm으로 추가의 5h 동안 인큐베이션하였다. 원심분리 (10 min 5000 x g)에 의해 수확을 수행하였다. 음파처리에 의한 세포 파괴 후 62.5℃에서 30 min 동안 열 처리 및 후속되는 원심분리 (15 min, 12000 x g)에 의해 1차 회복을 수행하였다. 20mM 이미다졸 및 1% 트리톤(Triton) X-100을 상청액에 첨가하고, 0.22μm 원심분리 상청액을, 1% 트리톤 X-100으로의 세척 단계 및 250 mM 이미다졸로의 용리 단계를 포함하는 N-말단 His-태그를 사용하는 고정화된 금속 친화도 크로마토그래피 (HisTrap FF 미정제, Cytiva, 스웨덴)에 의해 추가로 정제하였다. 후속 단계에서, IMAC 단계의 용리 분획을 크기 배제 크로마토그래피 (Superdex 200, Cytiva, 스웨덴) 상에 적용하고, 관심 분획을 모으고 농축시켰다. 최종적으로, 농축된 샘플을 내독소 제거 및 멸균 여과를 위해 0.22 μm Mustang E 필터를 통해 여과하고 품질 제어하였다.

모노클로날 참조 항체, RA1 및 RA2의 생성

모노클로날 항체 RA1 및 RA2로부터의 가변 도메인의 공개적으로 이용가능한 서열 (미국 식품의약국은 RA1 및 RA2를 COVID-19의 치료를 위한 칵테일로서 투여하기 위한 긴급 사용 승인을 발표함)을 사용하여 상응하는 cDNA 단편을 합성하고 Evitria AG (스위스)에서 독점 발현 벡터로 클로닝하였다. 불변 면역글로불린 hIgG1 사슬 또는 카파 경쇄를 함유하는 생성 벡터를 Evitria에 의해 차이니즈 햄스터 난소 세포에서 트랜스펙션에 사용하였다. 멸균 여과된 세포 상청액을 HiTrap MabSelect 컬럼으로의 친화도 정제, 그 후 PBS pH7.4 중에서 HiLoad 26/600 Superdex 200 컬럼을 사용한 크기 배제 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 선택된 분획을 모으고 검정에서의 사용 전에 품질 제어하였다 (SDS-PAGE, 크기 배제 크로마토그래피 및 내독소 측정에 의해).

VSV-SARS-CoV-2 유사타입 돌연변이-벡터 생성

SARS-CoV-2의 스파이크 단백질을 코딩하는 플라스미드 pCAGGS (Walser et al., 2020, loc. cit.)를 단일 및 다중 스파이크 단백질 돌연변이체의 생성을 위한 템플레이트로서 사용하였다. 돌연변이를 코딩하는 정방향 및 역방향 상보적 프라이머를 Microsynth (스위스 발가흐)에 의해 합성하였다. 고-충실도 Phusion 폴리머라제 (New England Biolabs, USA)를 모든 DNA 증폭에 사용하였다.

고-충실도 Phusion 폴리머라제 (New England Biolabs, USA)를 사용하여 스파이크 ORF의 2개의 PCR 단편을 통해 스파이크 단백질의 단일 돌연변이를 생성하였다. 제1 단편은 스파이크 ORF의 상류에서 어닐링하는 일반적인 정방향 프라이머 (pCAGGS-5) 및 돌연변이를 코딩하는 특정 역방향 프라이머를 통해 생성하였다. 제2 단편은 돌연변이를 코딩하는 특정 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 (rbglobpA-R)를 사용하여 생성하였다. 2개의 단편을 겔-정제하고 플랭킹 프라이머의 첨가 없이 조립 PCR을 위한 입력으로서 사용하였다.

다중-돌연변이 스파이크 단백질의 경우, 각각의 돌연변이를 코딩하는 상보적 프라이머 쌍 (정방향 및 역방향)을 디자인하였다. 단편 1은 정방향 프라이머 pCAGGS-5 및 돌연변이 1을 코딩하는 역방향 프라이머로 생성하였다. 단편 2는 돌연변이 1을 코딩하는 정방향 프라이머 및 돌연변이 2를 코딩하는 역방향 프라이머를 사용하여 생성하였다. 모든 후속 단편을 유사하게 생성하였다. DNA 단편을 겔-정제하고 등몰량으로 혼합하였다. 이 혼합물을 외부 프라이머 pCAGGS-5 및 rbglobpA-R을 사용하는 전체 스파이크 ORF의 재조립에 사용하였다.

단일 뿐만 아니라 다중-돌연변이 스파이크 단백질 둘 다에서, 전장 스파이크 ORF를 아가로스 겔로부터 단리하였고, 제한 효소 NheI/EcoRI에 의해 소화시키고 pCAGGS 벡터 백본에 삽입하였다. 정확한 서열을 Microsynth (스위스 발가흐)에 의한 스파이크 단백질의 전체 ORF 시퀀싱을 통해 확인하였다.

돌연변이 분석 및 ALE109 도메인 녹아웃에 대한 VSV-SARS-CoV-2 유사타입 중화 검정

유사타입 바이러스 시스템은, 당단백질 유전자 (G)가 결실되고 녹색 형광 단백질 및 루시퍼라제를 코딩하는 유전자로 대체된 재조합 VSV*ΔG-Luc 벡터에 기초하였다 (Berger Rentsch and Zimmer, PLoS One. 2011;6(10):e25858). 유사바이러스를 이전에 보고된 바와 같이 생성하였다 (Torriani et al., Virology. 2019 May;531:57-68; Torriani et al., J Virol. 2019 Mar 5;93(6):e01744-18). 중화 검정을 위해, 화합물의 초기 희석 후 20 μM 인간 혈청 알부민 (CSL Behring)으로 보충된 DMEM-2 % [vol/vol] FCS 중에서의 4중으로의 3배 희석이 이어졌다. 혼합물을 250 IU/웰의 SARS-CoV-2 유사바이러스를 함유하는 등부피의 DMEM-2 % FCS와 혼합하고 37℃에서 90 min 동안 인큐베이션하였다. 혼합물을 37℃에서 90 min 동안 투명 바닥 백색 벽 96-웰 플레이트 내에서 베로 E6 세포 상으로 접종하였다. 접종물을 제거하고 신선한 배지를 첨가하고, 세포를 37℃에서 16 h 동안 추가로 인큐베이션하였다. 세포를 ONE-Glo™ 루시퍼라제 검정 시스템 (Promega, 미국 매디슨)에 따라 용균시키고, Berthold® TriStar LB941 광도계를 사용하여 발광을 기록하였다. 원(raw) 데이터 (상대적 광 단위 값)를 GraphPad Prism v8.01로 내보내고, % 중화 값을 처리되지 않은 PsV 신호에 대하여 정규화하였다. 95% 신뢰 구간을 갖는 IC₅₀을 로그 (억제제) vs 정규화된 반응 곡선에 대한 셋팅으로 비선형 회귀 핏의 모델에 의해 추정하였다.

세포 및 바이러스

베로 E6 세포를 10% 소 태아 혈청 (FBS) 및 보충물 (2 mM L-글루타민, 1% 비-필수 아미노산, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 0.06% 중탄산나트륨, 모두 스위스 샤프하우젠의 Bioswisstec로부터의 것)을 함유하는 최소 필수 배지 (MEM) (Cat N° M3303) 중에서 37℃, >85% 습도 및 5% CO₂에서 패시징하였다. SARS-CoV-2 (2019-nCoV/IDF0372/2020)를 2% FBS 및 보충물을 함유하는 MEM (2%-FBS-MEM) 중에서 37℃, >85% 습도 및 5% CO₂에서 베로 E6 세포에서 전파시켰다. 바이러스 역가를 다른 부분에 기재된 바와 같이 표준 플라크 검정에 의해 결정하였다.

CellTiter-Glo 및 실시간 RT-PCR에 의해 결정된 정통 SARS-CoV-2의 바이러스 중화

단일-도메인 및 다중-도메인 안키린 반복 결합 단백질의 바이러스 중화 능력을 세포 생존능 검정에서 보호된 세포의 ATP 수준을 측정함으로써 100 TCID50 SARS-CoV-2에 대하여 결정하였다. DARPin® 단백질을 96 웰 플레이트 내에서 10 μM HSA로 풍부화된 100 μl 세포 배양 배지 (2%-FBS-MEM) 중에서 40 nM 내지 2.4 pM으로 1:4로 연속 희석 (3중)하였다. 희석된 DARPin® 단백질을 100 μl 2%-FBS-MEM + HSA 중의 100 TCID50 SARS-CoV-2와 혼합하고 37℃에서 1 h 동안 인큐베이션하였다. DARPin® 단백질/바이러스 혼합물 (200 μl)을 80% 컨플루언트 베로 E6 세포 상으로 옮겼다. 대조군은, 최대 세포변성 효과를 측정하기 위한, 단지 바이러스 현탁액에 노출된 베로 E6 세포 및 세포의 베이스라인 상태를 결정하기 위한, 단지 배지와 인큐베이션된 세포로 이루어졌다. 플레이트를 37℃, >85% 습도 및 5% CO₂에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 모든 웰로부터 100 μl 상청액을 제거하고 제조업체 프로토콜 (CellTiter-Glo® 발광 세포 생존능 검정, Promega, 미국 매디슨)에 기재된 바와 같이 100 μl CellTiter-Glo 시약을 첨가함으로써 세포 생존능을 결정하였다. 궤도 진탕기 상에서 2분 진탕시키고, 혼합물을 불투명 벽 플레이트로 옮기고, 실온에서 10 min 인큐베이션 후 GloMax 기기 (Promega)를 사용하여 발광을 판독하였다. 바이러스 복제의 억제를 결정하기 위해, 이전에 제거된 상청액 (100 μl)을 400 μl AVL-완충제 (Qiagen, 독일 힐덴) 및 400 μl 100% 에탄올 중에서 불활성화시키고, MagNAPure 96 시스템 (Roche, 스위스 바젤)을 사용하여 100 μl 중에서 추출하고 용리하였다. 바이러스 RNA을, 5 μl RNA 및 45 μl TaqMan 고속 바이러스 1-단계 마스터 믹스 (Life Technologies, 스위스 주크)를 사용하여 E 유전자를 표적화하는 실시간 RT-PCR에 의해 정량화하였다 (하기 문헌 참조: Eurosurveillance | Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR). 회귀 분석 및 내부 표준을 사용하여 바이러스 게놈 당량 (ge)을 계산하였다.

다중-특이적 DARPin® 분자 ALE049 및 ALE109 또는 참조 항체 1 또는 2 (각각 RA1 및 RA2)로의 중화 시험의 결과가 표 17에 나타나 있다. 표 18은 스파이크 단백질 변이체에 대한 개별 결합제로서의 ALE049의 3개의 스파이크 단백질-결합 도메인 (서열 번호: 31)의 활성을 나타낸다.

n.d.: 결정되지 않음

*돌연변이 (SA): D80A, D215G, E484K, N501Y, A701V

**돌연변이 (UK): del69-70, del145, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H

¹ 인간 ACE2에 대한 스파이크 단백질 결합에 대한 잔기 돌연변이의 영향 (Yi et al., 2020, loc. cit.)

² DARPin® RBD 결합제에 대한 예측 상호작용 잔기 (Walser et al., 2020, https://doi.org/10.1101/2020.08.25.256339)

표 17: 효능 결과

n.d.: 결정되지 않음

*돌연변이 (SA): D80A, D215G, E484K, N501Y, A701V

¹ 인간 ACE2에 대한 스파이크 단백질 결합에 대한 잔기 돌연변이의 영향 (Yi et al. 2020, loc. cit.)

² DARPin® RBD 결합제에 대한 예측 상호작용 잔기 (Walser et al. 2020)

표 18: ALE049의 RBD 도메인의 효능

이들 결과는, ALE049가 낮은 단일-자릿수 ng/mL 범위의 IC₅₀ 값으로 야생형 형태만큼 효율적으로 변이체 B.1.1.7 및 B.1.351을 중화시킬 수 있음을 보여준다. ALE109는 낮은 단일-자릿수 ng/mL 범위의 IC₅₀ 값으로 야생형 형태와 동등하게 효율적으로 B.1.351 변이체를 중화시켰다. UK 변이체 B.1.1.7에 대하여 ALE109의 경우에는 약간의 효력 손실이 관찰되었다 (70 ng/ml의 IC50 값). 그럼에도 불구하고, UK 변이체 B.1.1.7에 대한 ALE109의 효력은 치료적 범위 내에 있었다. ALE109의 RBD 결합제 (즉, R1b)가 야생형에 대한 것과 B.1.1.7에 대하여 동일한 중화 능력을 유지하였음을 인지하는 것이 흥미롭다. ALE109에 대해 관찰된 약간의 효력 강하는 S2 도메인 (잠재적으로 P681H 및 T716I) 단독에서의 또는 NTD 돌연변이와 조합되어 노출 돌연변이에 의해 유발될 수 있다. 이러한 약간의 효력 강하의 원인이 되는 구조적 결정인자는 현재 조사 중이다. 종합하면, 결과는, 시험된 다중-특이적 결합 단백질, ALE049 및 ALE109 둘 다, 낮은 단일-자릿수 ng/mL 범위의 IC₅₀ 값으로 야생형 형태를 강력하게 중화시키고 치료적 범위 (즉, 낮은 단일-자릿수 내지 두자릿수 ng/mL 범위) 내의 IC₅₀ 값으로 변이체 B.1.1.7 (UK) 및 B.1.351 (SA)을 중화시켰음을 보여주었다.

또한, 다중-특이적 DARPin® 분자 ALE049 및 ALE109 둘 다, 특히 모든 3개의 1가 DARPin® RBD 결합제 및 ALE049에 대한 F486V를 제외하고, 시험된 모든 개별 돌연변이에 대하여 잘 보호하였다. F486은 ACE2 결합에 있어 중요한 잔기임에 따라, 바이러스에 대한 선택적 압력은 그의 보존을 선호하고, 그에 따라 ALE049의 결합을 위한 중요한 앵커링(anchoring) 요소를 유지한다. ALE049에 대한 이러한 돌연변이의 주요 영향은, 이전의 구조적 분석이 F486을 ALE049에서의 3개의 관련된, 그러나 상이한 RBD 결합제에 대한 코어 상호작용 잔기로서 식별하였으므로 (Walser et al. 2020, loc. cit.), 놀라운 것이 아니다. 결과적으로, 돌연변이 F486V는 스파이크 단백질에 대한 ALE049 분자의 결합을 탈안정화시킨다. 종합하면, 본 발명자들의 분석은, DARPin® 분자의 다중-특이적 디자인으로부터 예상되는 바와 같이, 본 발명의 다중-특이적 DARPin® 분자가 가장 빈번히 관찰되는 돌연변이 및 중화 항체의 결합에 영향을 주는 것으로 공지된 돌연변이를 수반하는 스파이크 단백질에 대해 매우 강력하게 남아 있음을 확인시켜준다.

도 29는 SARS-CoV-2의 야생형 형태에 대한 ALE109의 단일 도메인 녹아웃 (k.o.) 작제물의 중화 효력을 나타낸다. 이들 실험은 SARS-CoV-2에 대한 중화 활성에 대한 ALE109의 3개의 스파이크 단백질-결합 DARPin® 도메인 각각의 기여를 결정하였다. NTD 녹아웃 작제물에 대해서는 ALE109에 비해 효력 손실이 관찰되지 않았지만, RBD 및 S2 녹아웃 작제물에 대해서는 일부 효력 손실이 관찰되었다. 이론에 의해 얽매이길 원하지는 않으며, ALE109의 NTD 결합 도메인은, 예를 들어 돌연변이된 스파이크 단백질에 결합의 결합력 증가를 제공함으로써, SARS-CoV-2의 돌연변이 형태 또는 변이체에 대한 ALE109의 중화 활성에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 믿어진다.

실시예 12: SARS-CoV-2의 바이러스 패시징

이전 연구는, 바이러스 탈출 돌연변이체가 치료법의 선택적 압력 하에 빠르게 나타날 수 있음을 보여주었다 (Ku et al., 2021, loc. cit.; Andreano et al., 2020, DOI: 10.1101/2020.12.28.424451). 본 발명자들은 문헌 [Baum et al., Science 369, 1014-1018 (2020)]으로부터 적합화된 바이러스 패시징 모델을 사용하여, 1가 DARPin® 결합제 R1b (서열 번호: 3) 및 단일 분자로서 적용된 모노클로날 항체 S309, RA1 및 RA2에 비해, 다중-특이적 DARPin® 단백질 ALE049 및 ALE109 및 참조 항체 RA1 및 RA2의 칵테일의 치료적 압력으로부터의 바이러스 탈출 위험을 추정하였다. S309는 2003년에 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS)으로부터 회복된 환자로부터 단리되고 세포 및 동물 모델에서 SARS-CoV-2 감염에 대하여 효과적인 것으로 나타난 항체이다 (Pinto et al., Nature, Vol 583, p.290-295, 9 July 2020). S309를 RA1 및 RA2와 동일한 방식으로 제조하였다 (상기 실시예 11 참조).

실험 프로토콜:

100 μg/ml 내지 0.032 μg/ml의 DARPin® 단백질 및 모노클로날 항체의 1:5 연속 희석액을 2% FBS, 보충물 및 10 μM 인간 혈청 알부민을 함유하는 최소 필수 배지 (MEM) (HSA; CSL Behring, 스위스; 2%-FBS-MEM + HSA) 중에서 제조하였다. 2%-FBS-MEM + HSA 중의 1.5 x 10⁶ 플라크 형성 단위 (pfu) SARS-CoV-2 (야생형에 비해 하기 차이를 갖는 프랑스 단리물: V367F; E990A)를 함유하는 500 ul의 바이러스 현탁액을 500 μl의 연속 희석 DARPin® 단백질 또는 모노클로날 항체와 혼합하고, 이어서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 혼합물을 12 웰 플레이트 내의 80% 컨플루언트 베로 E6 세포로 옮기고, 37℃, >85% 습도 및 5% CO₂에서 4일 동안 인큐베이션하였다. 각각의 배양 웰을 현미경검사에 의해 세포변성 효과 (CPE)에 대해 평가하였다. 현저한 CPE (>20%)를 나타내는 최고 DARPin® 단백질 또는 항체 농도를 갖는 웰로부터 상청액을 제거하고 총 RNA 추출 및 추가의 패시징에 사용하였다. 패시징의 후속 라운드를 위해, 선택된 웰의 남아 있는 900 μl 상청액을 2%-FCS-MEM + HSA 중에서 4 ml로 희석하고, 그 중 500 μl를 DARPin® 단백질 또는 항체의 연속 희석액과 혼합하고, 인큐베이션하고, 혼합물을 상기에 기재된 바와 같이 신선한 베로 E6 세포를 갖는 12 웰 플레이트로 옮겼다. 세포 배양 웰을 4일 후 다시 CPE에 대하여 평가하고, 명확한 바이러스 복제 (CPE)를 갖는 최고 DARPin® 단백질 또는 항체 농도를 갖는 웰의 상청액을 수확하고, 추가의 패시지에 사용하였다 (도 30 참조). 이러한 방식으로 총 4회 패시지를 수행하였다.

결과:

증가하는 농도의 항바이러스 단백질의 선택 압력을 유지하면서 최대 선택 압 력 하에 현저한 바이러스-유도된 세포변성 효과를 나타내는 배양물의 상청액을 신선한 세포 상으로 패시징함으로써 내성 탈출 변이체를 선택하였다. 도 31은 제1 내지 제4 인큐베이션 사이클 (패시지 #1 내지 #4) 후 얻어진 결과를 나타낸다. 4일의 제1 인큐베이션 사이클 (패시지 # 1) 후 1가 DARPin® 결합제 Rb1 및 다중-특이적 DARPin® 단백질 ALE049 및 ALE109, 뿐만 아니라 모노클로날 항체 RA1 및 2개의 모노클로날 항체 RA1 및 RA2의 칵테일은 0.4 μg/mL의 동일한 농도에서 보호를 제공하였다. 모노클로날 항체 S309는 덜 효율적이었고, 보호를 위해 보다 높은 농도 (10 μg/mL)를 필요로 하였고, 단일 분자로서의 모노클로날 항체 RA2는 50 μg/mL의 최고 시험 농도까지 보호성이 아니었다. 패시지 2 내지 4의 연속적 선택 압력 하에, 1가 DARPin® 결합제 Rb1, 및 개별 모노클로날 항체 RA2 및 RA1은 바이러스-유도된 세포변성 효과로부터 세포를 보호하는 능력을 잃었고, 이는 시험된 최고 선택 압력까지 완전한 CPE에서 나타났다. 반면, 단일 분자로서 또는 혼합물로서의, 2개의 다중-특이적 DARPin® 단백질 ALE049 및 ALE109, 및 2개의 모노클로날 항체 (RA1 및 RA2)의 칵테일은 4 패시지 전반에 걸쳐 효과적으로 남아 있었고 CPE로부터 세포를 보호하였다.

단일 작용제로서 다중-특이적 DARPin® 단백질 ALE049 및 ALE109는, 4 패시지 후, 각각 2 μg/mL 및 10 μg/mL의 농도에서 탈출 돌연변이체의 선택을 방지하였으며, 2개의 다중-특이적 DARPin® 단백질 ALE049 및 ALE109의 조합은 0.08 μg/mL의 낮은 농도에서도 유효성을 유지하였다. 항체 칵테일 RA1 & RA2는 패시지 4 후 0.4 μg/mL의 농도에서 탈출 돌연변이체의 선택을 방지하였다.

실시예 13: SARS-CoV-2 VSV 유사바이러스 (PsV nCoV)를 사용한 중화 검정에서 여러 다중-특이적 결합 단백질의 비교

본 발명의 여러 다중-특이적 결합 단백질을 SARS-CoV-2 VSV 유사바이러스 (PsV nCoV)를 사용하여 중화 검정에서 비교하였다. 중화 검정을 상기 실시예 4에 기재된 것과 유사하게 수행하였다. 시험된 다중-특이적 결합 단백질은 ALE049, ALE058, ALE109, ALE126, ALE129 및 ALE133을 포함하였다. ALE049, ALE058 및 ALE109는 상기에 기재되었다. ALE126, ALE129 및 ALE133은 vS07_08F10v27 (서열 번호: 76)을 포함하는 ALE109에 비해 추가로 조작된 S1-NTD 결합 도메인 (vS07_08F10v47; 서열 번호: 85)을 포함한다. ALE126, ALE129 및 ALE133은 S1-NTD 결합 도메인 및 S2 결합 도메인 (서열 번호: 77)을 연결하는 링커의 길이에 있어서만 서로 상이하다.

PsV nCoV 검정의 결과가 도 32에 나타나 있고, EC50 값은 nM 단위로 제공되어 있다. 실험은, 모든 시험된 다중-특이적 결합 단백질이 이 SARS-CoV-2 VSV 유사바이러스 중화 검정에서 전체적으로 유사한 중화 효력을 가짐을 입증하였다. 모든 시험된 작제물의 EC50 값은 20 내지 50 pM의 범위 내에 있었다.

실시예 14: 마우스에서의 본 발명의 다중-특이적 결합 단백질의 약동학 분석

또 다른 약동학 (PK) 연구를 수행하여 마우스에서 본 발명의 여러 다중-특이적 재조합 결합 단백질의 PK 특징을 평가하였다. 이러한 PK 특징은 동물 약동학 연구에서, 독성학 연구에서 또는 인간 임상 시험에서 본 발명의 다중-특이적 결합 단백질의 용량 예측을 위해 유용하다.

PK 연구를 본질적으로 실시예 9에 기재된 바와 같이 수행하였다.

본 연구에서는 하기 다중-특이적 결합 단백질을 시험하였다:

표 19

약동학 데이터를, Certara로부터의 Phoenix WinNonlin^TM 8.0 프로그램을 사용하여, 또한 실시예 9에 기재된 바와 같이 수행하였다. 정맥내 볼루스 주사를 통해 투여된 동물의 평균 농도-시간 데이터에 기초한 연구의 약동학 파라미터의 계산을 비-구획 분석 (NCA 모델 200-202, IV 볼루스, 선형 사다리꼴 선형 내삽)으로 수행하였다.

계산된 약동학 파라미터는 적어도 하기를 포함하였다: AUCinf_pred, AUClast, AUC_%extrapol, AUC_%Back_Ext_pred, Cmax, Tmax, Cl_pred, Vss_pred, t1/2 (HL_람다_z). 결과가 표 20 및 도 33 및 34에 나타나 있다:

표 20

결과 및 결론

결과는, ALE109가 전구체 분자 ALE058에 비해 전신 투여를 위한 개선된 약동학 특성을 가짐을 입증하였다. 혈청 농도 시간 프로파일의 단일-지수 제거 단계에서, ALE109 혈청 농도는 31.5시간의 반감기로 감소한 반면, ALE058은 20시간의 반김기를 나타내었다. 또한, 추가로 조작된 결합 단백질 ALE126, ALE129 및 ALE133은 ALE109와 비교할 때 훨씬 더 연장된 반감기, 즉 각각 36.7시간, 41.4시간 및 41.1시간의 반감기를 나타내었다.

실시예 15: 로보로브스키(Roborovski) 왜성 햄스터 모델에서의, 2개의 다중-특이적 결합 단백질, ALE049 및 ALE109의 치료적 효능의 생체내 평가

본 연구에서는, 로보로브스키 왜성 햄스터 모델을 사용하여 SARS-CoV-2에 대한 잠재적 항바이러스제로서의 본 발명의 2개의 다중-특이적 결합 단백질의 효능을 평가하였다. 로보로브스키 왜성 햄스터 모델은, 중증 임상 징후 (예: 체중 감소 또는 체온 강하), 그의 상부 및 하부 호흡기 둘 다에서의 바이러스 복제 및 조직병리학 변화에 의해 나타나는 바와 같이 (Trimpert et al., Cell Reports 33, 108488, December 8, 2020), 그의 SARS-CoV-2 감염에 대한 높은 민감도로 인해 SARS-CoV-2 연구를 위한 가치 있는 비-형질전환 설치류 모델이다.

따라서, 본 연구의 목적은, 체중 감소, 상부 및 하부 호흡기에서의 SARS-CoV-2의 복제 및 조직병리학 변화를 억제하거나 방지하는 ALE049 및 ALE109의 치료적 가능성을 조사하는 것이었다.

시험된 결합 단백질 ALE049 및 ALE109는 장기간-작용 활성을 지지하도록 인간 혈청 알부민 (HSA) (뿐만 아니라 햄스터 혈청 알부민)에 결합하는 도메인으로 혈청 반감기 연장된 것이다. 시험관내 데이터는, 두 결합 단백질 모두에 의해 세포 배양 적정 실험에서 SARS-CoV-2 바이러스 감염의 강력한 억제를 입증하였다.

연구 디자인은, 각각 6마리의 동물의 5개 그룹을 사용하고 SARS-CoV-2로의 접종 후 0, 6 또는 24시간에 시험 결합 단백질로의 치료가 주어지는 것을 제공하였다. 연구 디자인은 도 35에 나타나 있다 (ALE049는 본 실시예에서 또한 MP0420이라 불림). 동물을, 정맥내 투여에 대한 안전하고 재현가능한 대안으로서 제공되는 복강내 (i.p.) 투여에 의해 치료하였다. 그룹 1에서의 동물은 0h에 20 mg/kg으로 ALE049로 치료하였고, 그룹 2 내지 4에서의 동물은 각각 감염-후 0, 6 또는 24h 시점에 20 mg/kg으로 ALE109로 치료하였다. 대조군 (그룹 5)에서의 동물은 시간 0h에 위약 (즉, 단지 시험 단백질의 비히클)으로 치료하였다. 비내 (i.n.) 경로를 통해 SARS-CoV-2로의 감염을 수행하였고, 여기서 감염의 용량 및 경로는 이전 (모델 개발) 연구로부터의 결과에 기초하였다. 매일 동물을 칭량하고 온도를 측정하였다. 각각의 그룹의 3마리의 동물을 감염-후 각각 제3 및 5일에 안락사시켜 부검을 수행하였다. 폐 및 인후 조직에서의 바이러스 로드를 qPCR 또는 바이러스 적정 및 플라크 형성 단위 (PFU)의 카운팅에 의해 결정하였다. 안락사 후 선택 조직에서의 조직병리학 변화를 평가하였다.

물질

제제 완충제 및 모든 시험 및 대조군 항목 제제를 투여 당일에 제조하고, 각각의 그룹에 대해 적절한 부피로 분취하고, 투여까지 4℃에 저장하였다. 투여된 시험/대조군 항목의 부피는 동물 당 100 μL였고, 투여일에 측정된 동물의 체중에 대해 조정하였다. 감염 물질은 SARS-CoV-2, 균주 BetaCoV/독일/BavPat1/2020이었다.

동물

제-2일에 연구 시작시 20-25 그램의 체중 범위를 갖는 6-9주령의 로보로브스키 왜성 햄스터 (포도푸스(Phodopus) 로보로브스키)를 사용하였다.

절차

마취 및 진통제

감염을 위해 안락사 전에, 동물을 각각 0.15, 2.0 및 2.5 mg/kg 용량의 메데토미딘, 미다졸람, 및 부토르파놀의 주사에 의해 마취시켰다. 감염 후, 마취를 0.15 mg/kg 아티파메졸로 길항시켰다.

복강내 투여

복강내 투여를 위해 목 피부 및 등 피부를 엄지와 손가락 사이에 잡아서 동물을 고정시켰다. 이어서, 동물이 손바닥에 그의 등을 대고 눕도록 손을 뒤집었다. 동물의 머리는 장기에 대한 주사/손상을 방지하도록 하향 유지하였고, 바늘을 사타구니 영역의 정중선 좌측, 제4 및 제5 유선/유두 사이에 삽입하였다. 최종적으로, 바늘을 부드러운 동작으로 제거하였다.

비내 투여

비내 투여를 위해, 동물을 그의 등에서 유지하고 피펫을 사용하여 접종물 (20 μl)을 양쪽 비공에 동등하게 나누었다. 완전한 접종물이 흡입될 때까지 동물을 그의 등에서 유지하고, 그 후 이들을 회복을 위해 케이지에 다시 넣었다.

조직학을 위한 샘플링

실험적 또는 인도적 종점 (즉, 제2, 5 및 7일)에 안락사된 모든 동물에 대하여 선택된 조직으로부터의 조직병리학 분석을 수행하였다. 최소 48시간 동안 4% 포르말린으로의 고정 후, 폐 및 인후로부터의 섹션을 파라핀 내에 포매하고, 조직 섹션을 조직 검사를 위해 염색하였다.

종점 혈청 샘플

감염-후 제2, 5 및 7일에 혈청 샘플을 안락사 동안 수집하고, 응고 활성화제를 함유하는 적절한 튜브로 즉시 옮겼다.

바이러스학 분석

바이러스 RNA의 검출

제조업체의 지시에 따라 RTP DNA/RNA 바이러스 미니 키트 (Stratec, 독일 비르켄펠트)를 사용하여 비강 세척 및 기관 면봉으로부터 RNA를 추출하였다. innuPREP 바이러스 DNA/RNA 키트 (Analytic Jena, 독일 예나)를 조직 샘플로부터의 RNA 추출에 사용하였다. 바이러스 RNA를, 제조업체의 지시에 따라 NEB Luna 유니버셜 프로브 1-단계 RT-qPCR (New England Biolabs, 미국 매사추세츠주 입스위치) 및 StepOnePlus 실시간 PCR 시스템 (Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬) 상의 2019-nCoV RT-qPCR 프라이머 및 프로브 (E_Sarbeco)로 1-단계 RT qPCR 반응을 사용하여 정량화하였다. 이어서 바이러스 RNA 카피를 이전에 기재된 바와 같이 세포 RPL18에 대해 정량화하였다. 박테리아 인공 염색체로서 클로닝되고 대장균에서 전파된 전장 바이러스 게놈으로부터 얻어진 SARS-CoV-2의 연속 희석액으로부터 절대 정량화에 대한 표준 곡선을 생성하였다.

복제 적격 바이러스의 검출

2중의 10배 연속 희석을 사용하여 베로 E6 세포의 컨플루언트 층에서 바이러스 역가를 결정하였다 (베로 E6 세포 상의 SARS-CoV-2 적정). 이를 위해, 샘플 (폐 조직 균질물)의 연속 희석액을 제조하고 37도에서 2시간 동안 베로 E6 단층 상에서 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고 1.5% Avicel을 함유하는 반-고체 세포 배양 배지로 덮어씌우고 37도에서 48 h 동안 인큐베이션하고, 그 후 플레이트를 4% 포르말린으로 고정시키고 플라크 카운팅을 위해 0.75% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다.

조직병리학

선택된 조직으로부터의 조직병리학 분석을 실험적 또는 인도적 종점 도달로 인해 안락사된 모든 동물에 대하여 수행하였다. 48시간 동안 4% 포르말린으로의 고정 후, 폐로부터의 섹션을 파라핀 내에 포매하고, 조직 섹션을 조직 검사을 위해 염색하였다.

결과

이 연구의 목표는 COVID-19 로보로브스키 왜성 햄스터 모델에서 결합 단백질 ALE049 및 ALE109의 치료적 가능성을 평가하는 것이었다. 이 평가를 위해, 햄스터를, 105 PFU/동물로의 SARS-CoV-2 비내 챌린지 후 0, 6 또는 24시간에 20 mg/kg의 결합 단백질로 치료적으로 치료하였다.

감염-후 0, 6 또는 24시간에 본 발명의 결합 단백질로 치료된 모든 24마리의 동물은 희생일 (즉, 제3 또는 5일)까지 생존하였지만, 위약 그룹으로부터의 6마리 중 5마리는 심한 임상 증상 및 체중 감소로 인해 제3일까지 연구 종점 전에 연구로부터 제외되어야 했다. 체중의 평균을 5개 연구 그룹 각각에서 결정하였다. 위약 그룹은 제3일의 시점까지 체중의 꾸준한 감소를 나타내었다. 이 시점 후 위약 그룹으로부터 단지 1마리의 동물만이 추가 평가를 위해 제5일까지 전진될 수 있었다. 모든 시험 단백질-치료된 그룹은 체중 감소가 없거나 단지 경미한 것으로 나타났다. 치료에 대한 다양한 시점을 비교할 때 또는 ALE049와 ALE109를 비교할 때, 임상 증상 또는 체중 감소와 관련하여 유의한 차이가 관찰되지 않았다 (도 36 참조). 일반적으로, 체중 감소의 상대적으로 폭넓은 확산으로 이어진 바이러스 감염 또는 치료에 대한 개별 동물의 반응에 일부 변동이 있는 것으로 보였다.

폐 균질물의 생바이러스 적정 및 플라크 카운팅에 의한 폐에서의 바이러스 역가의 측정은, 이미 제3일에, 생바이러스의 감소가 관찰될 수 있음을 입증하였다 (도 37a). 이는 치료가 바이러스 챌린지 직후 (0 h 시점)에 개시된 시점에 대하여 특히 두드러졌다. 또한, 바이러스 챌린지 후 6 h 또는 24 h에 투여된 ALE109로의 치료 주사는 또한 이미 제3일에 감염성 바이러스의 로드의 상당한 감소를 나타내었다. 이 효과는, 12마리의 결합 단백질-치료된 동물 중 단지 5마리가 폐 균질물 중에 남아 있는 검출가능한 감염성 바이러스를 가졌던 제5일에 남아 있는 3마리 동물에 대해 훨씬 더 두드러진 것으로 보였다 (도 37b). qPCR에 의해 검출된 바이러스 RNA 게놈 카피의 감소는 감염성 바이러스의 제거보다 상당히 더 느린 것으로 보였다. 제3일에, 0 h 시점 각각에 대하여 3마리 동물 중 단지 1마리가 폐에서의 바이러스 RNA의 감소를 나타내었다 (도 37c). 바이러스 게놈 수준에 대하여, 결합 단백질-치료된 그룹과 위약 그룹 사이의 보다 두드러진 차이가 단지 감염 후 제5일에 나타났으며, 여기서도 보다 이른 치료 시점에 대하여 바이러스 게놈 RNA의 보다 우수한 감소 추세가 관찰될 수 있었다 (도 37d). 0 h 시점에 ALE049와 ALE109를 비교할 때, 보다 우수한 바이러스 제거 추세가 ALE049에서 관찰될 수 있었다.

상이한 조직에서의 다양한 파라미터에 대한 조직병리학 평가를 0 (명백한 조직병리학 징후가 없음)부터 4 (가장 심한 조직병리학 징후)까지의 순위로 점수화하였다. 모든 점수를 상이한 치료 그룹에 대하여 평균내고, 4개 세트로 카테고리화하였다: i) 염증, ii) 혈관, iii) 폐포, 및 iv) 기관지. 모든 평균낸 파라미터에 대한 합계 그래프가 도 38a 내지 38d에 제공되어 있다. 일반적으로. 모든 4개 카테고리에서, 결합 단백질-치료된 햄스터와 위약-치료된 햄스터 사이에 명백한 차이가 관찰되었다. 조직병리학 평가에 따르면, 모든 결합 단백질 치료는, 위약 그룹과 비교할 때, 기관지 (도 38d), 폐포 (도 38c) 및 혈관 (도 38b)에서 조직 손상의 감소에 대하여 가장 강한 효과를, 또한 염증성 세포의 감소에 대하여 가장 낮은 영향 (도 38a)을 가졌다. 바이러스 감염 후 6 h 시점에 ALE109로 치료된 그룹은 모든 결합 단백질-치료된 그룹 중 염증 및 조직 손상의 최저 감소를 나타내었다.

결론

105 PFU의 바이러스 접종에서, 로보로브스키 왜성 햄스터 모델은 COVID-19 질환 모델에 잘 적합화되며, 여기서 치료되지 않은 동물은 일반적으로 안락사 기준에 도달하는 강한 임상 증상을 나타낸다. 바이러스 챌린지 후 0시간에 ALE049 또는 바이러스 챌린지 후 0, 6 또는 24시간에 ALE109로의 동물의 치료적 치료는, 모든 결합 단백질 치료 그룹에 있어 유사한, 심한 임상 증상의 현저한 감소를 제공하였고, 그에 따라 24마리의 결합 단백질-치료된 동물 중 어느 것도 제3 또는 5일의 공식적인 희생 시점 전에 안락사 기준에 도달하지 않았지만, 6마리의 위약-치료된 동물에서는, 제2일에 2마리 및 제3일에 또 다른 3마리가 강한 임상 증상을 나타내었고, 연구로부터 제외되어야 했으며, 단지 1마리의 위약-치료된 동물만이 제5일까지 연구에 남아 있었다.

감염성 바이러스 또는 바이러스 게놈 카피에 대한 바이러스 로드 측면에서, 모든 결합 단백질 치료 그룹에서 명확한 감소가 관찰되었다. 이 감소는 제3일부터 제5일까지 증가하였고, 치료법이 보다 조기에 주어진 치료 그룹은 보다 두드러진 감소로 반응하는 것으로 보였다. 0h에 투여된, ALE049와 ALE109를 비교할 때, ALE049 치료 그룹은, 치료 그룹 당 다소 적은 수의 동물에 대하여, 약간 더 우수하게 반응하였다.

폐에서의 조직병리학 결과는, 위약 그룹과 비교할 때 모든 결합 단백질 치료 그룹에 대하여 병리학적 점수의 명백한 감소를 나타내었다. 이들 결과는 본 연구에서 시험된 치료 요법에 대하여 독립적인 것으로 보인다.

결론적으로, ALE049 및 ALE109 둘 다, 로보로브스키 왜성 햄스터 모델 사용시, SARS-CoV-2 감염에 대한 치료적 가능성을 나타내었다.

명세서는 명세서 내에서 인용된 참조문헌의 교시에 비추어 가장 완전히 이해된다. 명세서 내의 구현예는 본 발명의 구현예의 예시를 제공하며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어선 안된다. 당업자는, 많은 다른 구현예가 본 발명에 포함됨을 쉽게 인식한다. 본 개시내용에서 인용된 모든 공개, 특허, 및 진뱅크(GenBank) 서열은 그 전체가 참조로 포함된다. 참조로 포함된 자료가 본 명세서와 상충되거나 모순된다면, 명세서가 임의의 이러한 자료를 대체할 것이다. 본원에서의 임의의 참조문헌의 인용은 이러한 참조문헌이 본 발명의 선행 기술임을 인정하는 것은 아니다.

당업자는 단지 일상적 실험을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 구체적 구현예에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 포함되도록 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> MOLECULAR PARTNERS AG <120> Novel Ankyrin Repeat Binding Proteins And Their Uses <130> P028 <160> 95 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Spike protein binding domain <400> 1 Gly Ser Asp Leu Gly Asn Lys Leu Leu Asp Ala Ala Trp Val Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Trp Gln Gly Glu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Thr Lys Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Val Val Gly Tyr Thr Pro Leu His Val Ala Ala Ser Gln 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Val His Gly Tyr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Gln 100 105 110 Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 2 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Spike protein binding domain <400> 2 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Arg Glu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His Gln Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Val Phe Gly Arg Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Val 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp Val Ser Gly Ala Thr Pro Leu His Pro Ala Ala Ile 100 105 110 Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 3 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Spike protein binding domain <400> 3 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Arg Glu Gly Lys Thr Pro Leu His Val Ala Ala Gln Glu Gly 35 40 45 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His-tag <400> 46 Met Arg Gly Ser His His His His His His 1 5 10 <210> 47 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human serum albumin binding domain <400> 47 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly 35 40 45 His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp 100 105 110 Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 48 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human serum albumin binding domain <400> 48 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly 35 40 45 His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp 100 105 110 Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 49 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human serum albumin binding domain <400> 49 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly 35 40 45 His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp 100 105 110 Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 50 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <220> <221> VARIANT <222> 2,3,5,12,13,14,16,17,18,21,25,26,33 <223> x" denotes any amino acid <400> 50 Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Leu Ala Xaa Xaa Xaa Gly Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Leu Val Xaa Val Leu Leu Xaa Xaa Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Xaa <210> 51 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <220> <221> VARIANT <222> 2,3,5,13,14,26,33 <223> x" denotes any amino acid x" in position 26 is selected from the group consisting of asparagine, histidine, or tyrosine <400> 51 Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly His 1 5 10 15 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Xaa Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Xaa <210> 52 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PT-rich linker <400> 52 Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr 1 5 10 15 Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser 20 <210> 53 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PT-rich linker <400> 53 Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr 1 5 10 15 Pro Thr Pro Thr Pro Thr 20 <210> 54 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus GS linker <220> <221> VARIANT <222> 1..5 <223> [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n, wherein n is 1, 2, 3, 4, 5, or 6 <400> 54 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 55 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-cap <400> 55 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 <210> 56 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-cap <400> 56 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 <210> 57 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-cap <400> 57 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 <210> 58 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-cap <400> 58 Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala Gly 1 5 10 15 His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 20 25 <210> 59 <211> 977 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Target domain of spike protein <400> 59 Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe Asn 1 5 10 15 His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp Asn 20 25 30 Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn Ala 35 40 45 Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala Gln 50 55 60 Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln Leu 65 70 75 80 Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys Ser 85 90 95 Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser Thr 100 105 110 Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu Glu 115 120 125 Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu Arg 130 135 140 Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu Arg 145 150 155 160 Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg Ala 165 170 175 Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu Val 180 185 190 Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu Asp 195 200 205 Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu His 210 215 220 Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile Ser 225 230 235 240 Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly Arg 245 250 255 Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys Pro 260 265 270 Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala Gln 275 280 285 Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu Pro 290 295 300 Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro Gly 305 310 315 320 Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly Lys 325 330 335 Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp Phe 340 345 350 Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala Tyr 355 360 365 Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe His 370 375 380 Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys His 385 390 395 400 Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn Glu 405 410 415 Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly Thr 420 425 430 Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe Lys 435 440 445 Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met Lys 450 455 460 Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr Tyr 465 470 475 480 Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe Ile 485 490 495 Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala Leu 500 505 510 Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile Ser 515 520 525 Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu Gly 530 535 540 Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala Lys 545 550 555 560 Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe Thr 565 570 575 Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr Asp 580 585 590 Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu Lys 595 600 605 Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met Tyr 610 615 620 Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu Lys 625 630 635 640 Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val Ala 645 650 655 Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro Lys 660 665 670 Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile Arg 675 680 685 Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn Ser 690 695 700 Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln Pro 705 710 715 720 Pro Val Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 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protein <400> 61 Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser 1 5 10 15 Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val 20 25 30 Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr 35 40 45 Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe 50 55 60 Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr 65 70 75 80 Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp 85 90 95 Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val 100 105 110 Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val 115 120 125 Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe 145 150 155 160 Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu 165 170 175 Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His 180 185 190 Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu 195 200 205 Glu 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cgcagaagtg ctgcaaaagg ctgcgggtag cccaacccca 1380 acgccgacca ctcctacccc taccccaacc accccaactc caactccgac tggtagcgac 1440 ctgggcaaga aactgctgca agccgcacgt gccggtcagc tggacgaagt gcgtgagttg 1500 ttgaaggctg gcgctgacgt gaacgcaaaa gaccgtgagg gtaagacgcc gttacacgtg 1560 gcagcgcaag aaggccacct ggagattgtt gaagtgctgc tcaaagctgg cgcagacgtc 1620 aacgctaaag atgtgtgggg tcgcactccg ctgcatctgg ccgcgtggat tggtcatttg 1680 gaaattgtgg aagttctgct caaggccggc gctgatgtca acgccaaaga tgtgagcggt 1740 gcgaccccgc tgcacgcagc ggcgctgcac ggtcacttgg aaatcgtgga ggttctgttg 1800 aacgccggtg ctgatgttaa cgcgcaagat aaatcgggta agactccggc ggatctggcg 1860 gctcgtgcgg gtcaccagga tattgccgaa gttttgcaga aagccgctgg ttctcctacg 1920 ccgaccccga cgacgccgac tccaaccccg accacgccga cgcctacccc gaccggtagc 1980 gacttgggta agaaactgtt gcaggcagcg cgcgcgggtc aactggacga ggttcgtgag 2040 cttttgaaag ccggtgcgga cgttaacgcg aaggatcaag aaggcattac cccactgcac 2100 gtggcggcac atcagggtca tctggagatc gttgaggttc tgctgaaggc cggagcggat 2160 gtcaacgcga aagacgtttg 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gtcaaaagtt gttacacgcg 1020 gctcaagcgg gacaattaga cgaggtccgt attctgctta aagccggggc tgatgtaaat 1080 gcaaaagaca aacagggcaa cacaccctta catatcgcgg cattccatgg acatctggag 1140 attgtggaag tactgctgaa agccggggca gatgtcaacg ctaaagacca atggggattg 1200 accccccttc atttggccgc tgcctggggc catttggaga ttgtagaggt acttctgaag 1260 gcgggggctg atgttaatgc ccaggataac tatgggcaaa ctcctgcgga tctggcggct 1320 gaatctgggc accaagatat tgctgaagtt ctgcagaagg cggca 1365 <210> 84 <211> 766 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Multi-specific binding protein <400> 84 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly 35 40 45 His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln 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Ala Glu Ser Gly His Gln Asp Ile Ala Glu 450 455 460 Val Leu Gln Lys Ala Ala 465 470 <210> 92 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid encoding spike protein binding domain <400> 92 ggatcagacc tgggtaaaaa gttgttactt gcagctcgcg ccggccaatt ggacgaagtc 60 cgcattttac tgaaggccgg tgcggatgtg aacgcgaaag acgtgtttgg gcagacccct 120 cttcacaccg cagcagttgc aggtcatctg gagatcgtgg aagtgctttt aaaagcgggt 180 gcggacgtca acgctaagga caaagttggg tacacgccac tgcacttagc tgcacagtca 240 ggacatcttg agattgtgga ggtcttgctg aaggcaggcg cagatgtgaa cgctaaggat 300 gtcgttgggg ttacgccggc ggatttggca gctttcgagg gacaccagga cattgctgaa 360 gttctgcaga aggcagca 378 <210> 93 <211> 2253 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid encoding multi-specific binding protein <400> 93 ggatccgacc tgggtaaaaa gctgctggag gcagcgcgtg ccggtcaaga cgacgaggtt 60 cgcgaattgc ttaaagcggg tgcagacgtc aacgccaaag attatttctc tcataccccg 120 ttgcatttag ccgcgcgtaa tggccatctg aagatcgtcg aggtcctctt gaaggcaggc 180 gcggatgtca atgcgaagga ttttgcgggc aaaacgccgc tgcacttagc ggcgaacgag 240 ggtcatttag aaatcgttga agtcctgtta aaagcgggcg ccgatgtgaa tgcgcaggat 300 attttcggta aaacgccggc ggacattgcg gcagatgcgg gtcatgaaga tatcgcagaa 360 gtcctgcaga aggcagcagg cagccctaca cctacgccga ctacgcctac gccgactccg 420 actaccccga ctccgacccc gaccggatca gacctgggta aaaagctgct ggaggcagcg 480 cgtgccggtc aagacgacga ggttcgcgaa ttgcttaaag cgggtgcaga cgtcaacgcc 540 aaagattatt tctctcatac cccgttgcat ttagccgcgc gtaatggcca tctgaagatc 600 gtcgaggtcc tcttgaaggc aggcgcggat gtcaatgcga aggattttgc gggcaaaacg 660 ccgctgcact tagcggcgaa cgagggtcat ttagaaatcg ttgaagtcct gttaaaagcg 720 ggcgccgatg tgaatgcgca ggatattttc ggtaaaacgc cggcggacat tgcggcagat 780 gcgggtcatg aagatatcgc agaagtcctg cagaaggcag caggttcccc gacccctacg 840 ccaacgactc cgaccccaac tccaacgacc cctaccccga ccccgaccgg atcagacctg 900 ggtaaaaaac tgctgcaagc agcacgtgca ggtcagctgg atgaagttcg tgaactgctg 960 aaagcaggcg ccgatgttaa tgcaaaagat agagagggca agaccccgct gcatgtggct 1020 gctcaagagg gtcacctgga aattgttgaa gttctgctga aagccggtgc agatgttaat 1080 gcaaaagatg tgtggggcag aaccccgctg catctggctg cttggatcgg tcacctggaa 1140 attgttgaag ttctgctgaa agccggtgca gatgttaatg caaaagatgt gtctggcgct 1200 accccgctgc atgcggctgc tctgcacggt cacctggaaa ttgttgaagt tctgctgaac 1260 gccggtgcag atgttaacgc acaggataaa agcggtaaaa cccctgccga tctggcagct 1320 cgcgccggtc atcaggatat tgctgaagtg ctgcagaagg cagcaggcag ccccacgcca 1380 actcctacaa cccccacacc tacaccgacg acgccgacac cgactccaac cggatcagac 1440 ctgggtaaaa agttgttact tgcagctcgc gccggccaat tggacgaagt ccgcatttta 1500 ctgaaggccg gtgcggatgt gaacgcgaaa gacgtgtttg ggcagacccc tcttcacacc 1560 gcagcagttg caggtcatct ggagatcgtg gaagtgcttt taaaagcggg tgcggacgtc 1620 aacgctaagg acaaagttgg gtacacgcca ctgcacttag ctgcacagtc aggacatctt 1680 gagattgtgg aggtcttgct gaaggcaggc gcagatgtga acgctaagga tgtcgttggg 1740 gttacgccgg cggatttggc agctttcgag ggacaccagg acattgctga agttctgcag 1800 aaggcagcag gttcgccgac cccaacccct accactccaa cgccgacgcc taccactcca 1860 acaccaacac caacgggatc agacctgggt caaaagttgt tacacgcggc tcaagcggga 1920 caattagacg aggtccgtat tctgcttaaa gccggggctg atgtaaatgc aaaagacaaa 1980 cagggcaaca cacccttaca tatcgcggca ttccatggac atctggagat tgtggaagta 2040 ctgctgaaag ccggggcaga tgtcaacgct aaagaccaat ggggattgac cccccttcat 2100 ttggccgctg cctggggcca tttggagatt gtagaggtac ttctgaaggc gggggctgat 2160 gttaatgccc aggataacta tgggcaaact cctgcggatc tggcggctga atctgggcac 2220 caagatattg ctgaagttct gcagaaggcg gca 2253 <210> 94 <211> 2277 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid encoding multi-specific binding protein <400> 94 ggatccgacc tgggtaaaaa gctgctggag gcagcgcgtg ccggtcaaga cgacgaggtt 60 cgcgaattgc ttaaagcggg tgcagacgtc aacgccaaag attatttctc tcataccccg 120 ttgcatttag ccgcgcgtaa tggccatctg aagatcgtcg aggtcctctt gaaggcaggc 180 gcggatgtca atgcgaagga ttttgcgggc aaaacgccgc tgcacttagc ggcgaacgag 240 ggtcatttag aaatcgttga agtcctgtta aaagcgggcg ccgatgtgaa tgcgcaggat 300 attttcggta aaacgccggc ggacattgcg gcagatgcgg gtcatgaaga tatcgcagaa 360 gtcctgcaga aggcagcagg cagccctaca cctacgccga ctacgcctac gccgactccg 420 actaccccga ctccgacccc gaccggatca gacctgggta aaaagctgct ggaggcagcg 480 cgtgccggtc aagacgacga ggttcgcgaa ttgcttaaag cgggtgcaga cgtcaacgcc 540 aaagattatt tctctcatac cccgttgcat ttagccgcgc gtaatggcca tctgaagatc 600 gtcgaggtcc tcttgaaggc aggcgcggat gtcaatgcga aggattttgc gggcaaaacg 660 ccgctgcact tagcggcgaa cgagggtcat ttagaaatcg ttgaagtcct gttaaaagcg 720 ggcgccgatg tgaatgcgca ggatattttc ggtaaaacgc cggcggacat tgcggcagat 780 gcgggtcatg aagatatcgc agaagtcctg cagaaggcag caggttcccc gacccctacg 840 ccaacgactc cgaccccaac tccaacgacc cctaccccga ccccgaccgg atcagacctg 900 ggtaaaaaac tgctgcaagc agcacgtgca ggtcagctgg atgaagttcg tgaactgctg 960 aaagcaggcg ccgatgttaa tgcaaaagat agagagggca agaccccgct gcatgtggct 1020 gctcaagagg gtcacctgga aattgttgaa gttctgctga aagccggtgc agatgttaat 1080 gcaaaagatg tgtggggcag aaccccgctg catctggctg cttggatcgg tcacctggaa 1140 attgttgaag ttctgctgaa agccggtgca gatgttaatg caaaagatgt gtctggcgct 1200 accccgctgc atgcggctgc tctgcacggt cacctggaaa ttgttgaagt tctgctgaac 1260 gccggtgcag atgttaacgc acaggataaa agcggtaaaa cccctgccga tctggcagct 1320 cgcgccggtc atcaggatat tgctgaagtg ctgcagaagg cagcaggcag ccccacgcca 1380 actcctacaa cccccacacc tacaccgacg acgccgacac cgactccaac cggatcagac 1440 ctgggtaaaa agttgttact tgcagctcgc gccggccaat tggacgaagt ccgcatttta 1500 ctgaaggccg gtgcggatgt gaacgcgaaa gacgtgtttg ggcagacccc tcttcacacc 1560 gcagcagttg caggtcatct ggagatcgtg gaagtgcttt taaaagcggg tgcggacgtc 1620 aacgctaagg acaaagttgg gtacacgcca ctgcacttag ctgcacagtc aggacatctt 1680 gagattgtgg aggtcttgct gaaggcaggc gcagatgtga acgctaagga tgtcgttggg 1740 gttacgccgg cggatttggc agctttcgag ggacaccagg acattgctga agttctgcag 1800 aaggcagcag gttcgccgac cccaacccct accactccaa cgccgacgcc taccactcca 1860 acaccaacac caacgggatc accgacccct accccaacag gatcagacct gggtcaaaag 1920 ttgttacacg cggctcaagc gggacaatta gacgaggtcc gtattctgct taaagccggg 1980 gctgatgtaa atgcaaaaga caaacagggc aacacaccct tacatatcgc ggcattccat 2040 ggacatctgg agattgtgga agtactgctg aaagccgggg cagatgtcaa cgctaaagac 2100 caatggggat tgacccccct tcatttggcc gctgcctggg gccatttgga gattgtagag 2160 gtacttctga aggcgggggc tgatgttaat gcccaggata actatgggca aactcctgcg 2220 gatctggcgg ctgaatctgg gcaccaagat attgctgaag ttctgcagaa ggcggca 2277 <210> 95 <211> 1365 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid encoding multi-specific binding protein <400> 95 ggatcagacc tgggtaaaaa actgctgcaa gcagcacgtg caggtcagct ggatgaagtt 60 cgtgaactgc tgaaagcagg cgccgatgtt aatgcaaaag atagagaggg caagaccccg 120 ctgcatgtgg ctgctcaaga gggtcacctg gaaattgttg aagttctgct gaaagccggt 180 gcagatgtta atgcaaaaga tgtgtggggc agaaccccgc tgcatctggc tgcttggatc 240 ggtcacctgg aaattgttga agttctgctg aaagccggtg cagatgttaa tgcaaaagat 300 gtgtctggcg ctaccccgct gcatgcggct gctctgcacg gtcacctgga aattgttgaa 360 gttctgctga acgccggtgc agatgttaac gcacaggata aaagcggtaa aacccctgcc 420 gatctggcag ctcgcgccgg tcatcaggat attgctgaag tgctgcagaa ggcagcaggc 480 agccccacgc caactcctac aacccccaca cctacaccga cgacgccgac accgactcca 540 accggatcag acctgggtaa aaagttgtta cttgcagctc gcgccggcca attggacgaa 600 gtccgcattt tactgaaggc cggtgcggat gtgaacgcga aagacgtgtt tgggcagacc 660 cctcttcaca ccgcagcagt tgcaggtcat ctggagatcg tggaagtgct tttaaaagcg 720 ggtgcggacg tcaacgctaa ggacaaagtt gggtacacgc cactgcactt agctgcacag 780 tcaggacatc ttgagattgt ggaggtcttg ctgaaggcag gcgcagatgt gaacgctaag 840 gatgtcgttg gggttacgcc ggcggatttg gcagctttcg agggacacca ggacattgct 900 gaagttctgc agaaggcagc aggttcgccg accccaaccc ctaccactcc aacgccgacg 960 cctaccactc caacaccaac accaacggga tcagacctgg gtcaaaagtt gttacacgcg 1020 gctcaagcgg gacaattaga cgaggtccgt attctgctta aagccggggc tgatgtaaat 1080 gcaaaagaca aacagggcaa cacaccctta catatcgcgg cattccatgg acatctggag 1140 attgtggaag tactgctgaa agccggggca gatgtcaacg ctaaagacca atggggattg 1200 accccccttc atttggccgc tgcctggggc catttggaga ttgtagaggt acttctgaag 1260 gcgggggctg atgttaatgc ccaggataac tatgggcaaa ctcctgcgga tctggcggct 1320 gaatctgggc accaagatat tgctgaagtt ctgcagaagg cggca 1365

Claims

제1 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질로서, 상기 제1 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 11, 76, 77 및 85로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 결합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 제1 안키린 반복 도메인이 서열 번호 1 내지 11, 76, 77 및 85로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 결합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 제1 안키린 반복 도메인이 서열 번호 1 내지 11, 76, 77 및 85로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 재조합 결합 단백질.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 안키린 반복 도메인을 추가로 포함하며, 여기서 상기 제2 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 11, 76, 77 및 85로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 결합 단백질.
제4항에 있어서, 상기 제2 안키린 반복 도메인이 서열 번호 1 내지 11, 76, 77 및 85로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 결합 단백질.
제4항에 있어서, 상기 제2 안키린 반복 도메인이 서열 번호 1 내지 11, 76, 77 및 85로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 재조합 결합 단백질.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 안키린 반복 도메인을 추가로 포함하며, 여기서 상기 제3 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 11, 76, 77 및 85로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 결합 단백질.
제7항에 있어서, 상기 제3 안키린 반복 도메인이 서열 번호 1 내지 11, 76, 77 및 85로 이루어진 군으로부터 선택된 안키린 반복 도메인과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 결합 단백질.
제7항에 있어서, 상기 제3 안키린 반복 도메인이 서열 번호 1 내지 11, 76, 77 및 85로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 재조합 결합 단백질.
제7항에 있어서, 상기 제1, 제2 및 제3 안키린 반복 도메인이, 하기와 같이, 아미노산 서열을 포함하고 N-말단으로부터 C-말단까지 배열되는 것인, 재조합 결합 단백질:
(i) 서열 번호 6, 1 및 3과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(ii) 서열 번호 4, 2 및 1과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(iii) 서열 번호 4, 6 및 3과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(iv) 서열 번호 6, 3 및 6과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(v) 서열 번호 7, 3 및 6과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(vi) 서열 번호 8, 4 및 1과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(vii) 서열 번호 3, 6 및 7과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(viii) 서열 번호 4, 1 및 8과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(ix) 서열 번호 3, 6 및 9와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(x) 서열 번호 9, 3 및 6과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(xi) 서열 번호 1, 6 및 9와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(xii) 서열 번호 9, 6 및 1과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(xiii) 서열 번호 6, 9 및 10과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(xiv) 서열 번호 3, 9 및 11과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(xv) 서열 번호 10, 9 및 6과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(xvi) 서열 번호 11, 9 및 3과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(xvii) 서열 번호 5, 1 및 3과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(xviii) 서열 번호 1, 2 및 5와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(xix) 서열 번호 3, 5 및 6과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(xx) 서열 번호 6, 3 및 5와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(xxi) 서열 번호 7, 3 및 5와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(xxii) 서열 번호 8, 5 및 6과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(xxiii) 서열 번호 6, 10 및 11과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(xxiv) 서열 번호 3, 10 및 10과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(xxv) 서열 번호 5, 6 및 9와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(xxvi) 서열 번호 9, 3 및 5와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(xxvii) 서열 번호 9, 6 및 5와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(xxviii) 서열 번호 5, 9 및 10과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(xxix) 서열 번호 6, 9 및 11과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(xxx) 서열 번호 10, 9 및 5와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(xxxi) 서열 번호 11, 9 및 6과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(xxxii) 서열 번호 3, 76 및 77과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는
(xxxiii) 서열 번호 3, 85 및 77과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.
제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 68, 69, 79, 및 89 내지 91로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합하는 것인, 재조합 결합 단백질.
제12항에 있어서, 상기 스파이크 단백질이 SARS-CoV-2 스파이크 단백질인, 재조합 결합 단백질.
제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 제1, 제2 및/또는 제3 안키린 반복 도메인이 약 100 nM 이하의 해리 상수 (K_D)로 상기 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합하는 것인, 재조합 결합 단백질.
적어도 하나의 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질로서, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 약 100 nM 이하의 해리 상수 (K_D)로 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합하는 것인, 재조합 결합 단백질.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 혈청 알부민 결합 도메인을 추가로 포함하는 재조합 결합 단백질.
제16항에 있어서, 상기 혈청 알부민 결합 도메인이 서열 번호: 47-49로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 결합 단백질.
폴리펩티드를 포함하는 재조합 결합 단백질로서, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 12-42, 75, 84, 87 및 88로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질.
제18항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열 번호: 31과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질.
제18항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열 번호: 39와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질.
제18항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열 번호: 75와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질.
제18항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열 번호: 84와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질.
제18항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열 번호: 87과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질.
제18항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열 번호: 88과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질.
제18항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열 번호: 12-42, 75, 84, 87 및 88로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질.
제18항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열 번호: 12-42, 75, 84, 87 및 88로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질.
폴리펩티드를 포함하는 재조합 결합 단백질로서, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 31, 서열 번호: 39, 서열 번호: 75, 서열 번호: 84, 서열 번호: 87, 또는 서열 번호: 88의 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 결합 단백질.
제18항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합하는 것인, 재조합 결합 단백질.
제28항에 있어서, 상기 스파이크 단백질이 SARS-CoV-2 스파이크 단백질인, 재조합 결합 단백질.
제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 결합 단백질이 약 100 nM 이하의 해리 상수 (K_D)로 상기 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합하는 것인, 재조합 결합 단백질.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 코로나바이러스에 의한 세포의 감염을 억제할 수 있는 재조합 결합 단백질.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 SARS-CoV-2에 의한 세포의 감염을 억제할 수 있는 재조합 결합 단백질.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 재조합 결합 단백질을 코딩하는 핵산.
제33항에 있어서, 서열 번호 70 또는 서열 번호 70과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진 핵산.
제33항에 있어서, 서열 번호 71 또는 서열 번호 71과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진 핵산.
제33항에 있어서, 서열 번호 72 또는 서열 번호 72와 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진 핵산.
제33항에 있어서, 서열 번호 73 또는 서열 번호 73과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진 핵산.
제33항에 있어서, 서열 번호 74 또는 서열 번호 74와 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진 핵산.
제33항에 있어서, 서열 번호 80 또는 서열 번호 80과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진 핵산.
제33항에 있어서, 서열 번호 81 또는 서열 번호 81과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진 핵산.
제33항에 있어서, 서열 번호 82 또는 서열 번호 82와 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진 핵산.
제33항에 있어서, 서열 번호 83 또는 서열 번호 83과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진 핵산.
제33항에 있어서, 서열 번호 78 또는 서열 번호 78과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진 핵산.
제33항에 있어서, 서열 번호 86 또는 서열 번호 86과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진 핵산.
제33항에 있어서, 서열 번호 92 또는 서열 번호 92와 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진 핵산.
제33항에 있어서, 서열 번호 93 또는 서열 번호 93과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진 핵산.
제33항에 있어서, 서열 번호 94 또는 서열 번호 94와 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진 핵산.
제33항에 있어서, 서열 번호 95 또는 서열 번호 95와 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 변이체를 포함하거나 이것으로 이루어진 핵산.
제33항 내지 제48항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
제49항의 숙주 세포를 상기 재조합 결합 단백질이 발현되는 조건 하에 배양하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 재조합 결합 단백질의 제조 방법.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 결합 단백질 또는 제33항 내지 제48항 중 어느 한 항의 핵산, 및 제약상 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
대상체의 코로나바이러스 감염의 치료 방법으로서, 방법은 유효량의 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 결합 단백질, 또는 제33항 내지 제48항 중 어느 한 항의 핵산, 또는 제51항에 따른 제약 조성물을 코로나바이러스 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
대상체의 코로나바이러스 감염의 방지 방법으로서, 방법은 유효량의 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 결합 단백질, 또는 제33항 내지 제48항 중 어느 한 항의 핵산, 또는 제51항에 따른 제약 조성물을 코로나바이러스 감염의 방지를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
대상체의 코로나바이러스 감염의 검출 방법으로서, 방법은:
a) 대상체로부터 샘플을 얻는 단계;
b) 상기 샘플을 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 결합 단백질과 접촉시키는 단계; 및
c) 코로나바이러스 감염의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 방법.
제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 코로나바이러스 감염이 SARS-CoV-2에 의해 유발되는 것인 방법.
제52항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 인간인 방법.