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KR20230004758A - Gper 단백질분해 표적화 키메라 - Google Patents

Gper 단백질분해 표적화 키메라 Download PDF

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Publication number
KR20230004758A
KR20230004758A KR1020227040856A KR20227040856A KR20230004758A KR 20230004758 A KR20230004758 A KR 20230004758A KR 1020227040856 A KR1020227040856 A KR 1020227040856A KR 20227040856 A KR20227040856 A KR 20227040856A KR 20230004758 A KR20230004758 A KR 20230004758A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gper
ligand
protac
linker
molecule
Prior art date
Application number
KR1020227040856A
Other languages
English (en)
Inventor
밀라드 로우히모가담
알리아스게르 케이. 살렘
에드워드 제이. 필라르도
안 에스. 루
Original Assignee
유니버시티 오브 아이오와 리써치 파운데이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 유니버시티 오브 아이오와 리써치 파운데이션 filed Critical 유니버시티 오브 아이오와 리써치 파운데이션
Publication of KR20230004758A publication Critical patent/KR20230004758A/ko

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Abstract

E3 유비퀴틴 리가제 리간드에 커플링된 링커에 커플링된 G-단백질 커플링된 에스트로겐 수용체 (GPER) 리간드를 포함하는 분자 및 분자를 사용하는 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, GPER 리간드는 에스트라디올이고, E3 유비퀴틴 리가제 리간드는 (S,R,S)- AHPC이다.

Description

GPER 단백질분해 표적화 키메라
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 4월 23일에 출원된 미국 출원 번호 63/014,410 및 2021년 2월 2일에 출원된 미국 출원 번호 63/144,783의 출원일의 이익을 주장하며, 이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
역학, 임상 및 전임상 증거는 유방암이 에스트로겐-구동 악성종양임을 시사한다 (Germain et al., 2011; Parl et al., 2018; Rothenberger et al., 2018; Rugo et al., 2016; Yue et al., 2016). 이는 초기 단계 ER (+) 유방암에 대한 효과적인 아주반트 치료로서 항에스트로겐의 광범위한 성공을 설명한다 (DePlacido et al., 2018; Tremont et al., 2017). 에스트로겐 작용을 길항작용하기 위해 두 부류의 약리학적 작용제가 사용된다: 1) 안드로겐을 에스트로겐으로 내부전환시키는 효소인 아로마타제를 억제하는 화합물 (아로마타제 억제제, AI), 및 2) ER과 에스트로겐의 상호작용을 경쟁적으로 차단하는 에스트로겐 모방체 (ER 길항제). 효과적이기 위해서, AI 또는 ER 길항제는 3-5년 또는 그 이상 지속되는 장기간 약물 스케쥴에 걸쳐 투여되어야 한다. 궁극적으로, 항에스트로겐 요법의 장기간 사용은 폐경기 증상, 골다공증, 골통증 및 관절통을 포함한 바람직하지 않고 때때로 견딜 수 없는 부작용과 연관된다 (Yang et al., 2013). 또한, ER 길항제의 장기간 사용은 자궁내막암 (Hu et al., 2015; Jones et al., 2012) 및 혈전증 (Cosman et al., 2005)의 증가된 위험과 연관된다.
신생 또는 획득된 약물 내성은 항에스트로겐 요법의 사용을 더욱 제한하며, 내성은 치료되는 환자의 20% 이상에서 발생한다 (Augusto et al., 2018; Clarke et al., 2001; Haque et al., 2019; Lei et al., 2019). 신생 내성은 진단 당시 ER 발현의 종양내 이질성에 기인하는 반면 (Reinhardt et al., 2017), 획득된 내성은 치료 동안 항에스트로겐에 의해 적용되는 선택적 압력으로 인해 진화하는 종양 이질성을 반영한다. 예에는 하기가 포함된다: a) 약물-수용체 상호작용의 손실을 초래하거나 (Fan et al., 2015) 또는 에스트로겐-독립적 ER-매개 유전자 트랜스활성화를 구동하는 (Barone et al., 2010; GRCIA-Becerra et al., 2012) 돌연변이의 선택, b) ER 프로모터의 후성유전학적 침묵 (Achinger-Kaecke et al., 2020) 및 c) 세포 주기 활성 (Thngavel et al., 2011) 또는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)의 하류 신호전달 활성 (Guilano et al., 2011)을 조절함으로써 에스트로겐-독립적 성장을 구동하는 보상 유전자의 전사 상향조절. 항에스트로겐 내성의 또 다른 메커니즘은 G-단백질 커플링된 에스트로겐 수용체 (GPER)에 의해 제공된다. 보다 최근에 인정된 이 에스트로겐 수용체는 유방암 생물학 및 치료에 분명히 중요하다 (Rouhimoghadm et al., 2020). 주로 세포내에 상주하고 리간드-유도 전사 인자로서 기능하는 핵 에스트로겐 수용체와 달리, GPER은 원형질막 및 세포내 막에 위치하고 아데닐릴 시클라제의 활성화 (Filardo et al., 20002) 및 EGFR의 트랜스활성화 (Filardo et al., 2000)를 포함하여 신속한 사전-게놈 작용을 촉진하는 Gs-커플링된 7중나선 막횡단 수용체이다. GPER의 자극은 Ras, PI3K, AKT 및 Erk1/2와 같은 EGFR의 하류 신호전달 이펙터의 활성화에 기여하고, 세포 증식, 생존, 침습, 및 내분비 요법에 대한 내성에 관여한다 (Peperman et al., 2019). 원발성 유방 종양에서 GPER 발현의 분석은 이의 존재가 질환 진행 (Filardo et al., 2006), 유방암 줄기 세포의 생존 (Chan et l., 2020), 및 타목시펜 내성 (Ignatov et al., 2011; Rouhimoghadam et al., 2018; Yin et al., 2017)과 연관됨을 입증한다. 더욱이, 이의 발현은 일반적으로 ER, PR 및 her-2/neu가 결여된 삼중-음성 유방암에서 유지된다 (Steiman et al., 2013). 그러므로, GPER은 에스트로겐 반응성에 대한 ER-중심적 관점을 넓히고 (Filardo et al., 2018), 유방암에 대한 아주반트 요법의 합리적인 할당을 가이드하는 이원성 지시문을 파괴한다. 이는 "부분적" (타목시펜) 및 "순수한" (풀베스트란트 및 랄록시펜) ER 길항제가 GPER 효능제로서 기능하기 때문에 내분비 요법을 받는 환자에게 특히 중요하다 (Filardo et al., 2000; Petrie et al., 2013).
현재 임상 가이드라인은 내분비-내성 유방암에 대한 2차 요법으로서 풀베스트란트의 사용을 제안한다 (Nathan et al., 2017; Sammons et al., 2019). 풀베스트란트는 ER에 대한 경쟁적 억제제로서 기능하지만 또한 선택적 ER 분해제 (SERD)로서 작용하는 에스트로겐 모방체이다 (Pike et al., 2001). 풀베스트란트는 이 클래스에서 유일한 FDA-승인된 약물이며, ER에 결합 시, 연관된 열 충격 샤페론 단백질과의 상호작용을 불안정화시켜, 26S 프로테아솜에서 ER의 분해를 초래한다 (Callige et al., 2006). 이러한 방식으로, 풀베스트란트는 이의 약물 표적의 생체이용률을 감소시키는 작용을 하며, 그러므로 2차 약물 내성의 위험을 감소시킨다. 그러나, 풀베스트란트의 주요 한계는 경구 전달 후 불량한 생체이용률이며; 매달 고통스러운 근육내 주사를 필요하게 만든다 (Robertson et al., 2007).
ER의 선택적 분해 방법은 유비퀴틴-프로테아솜 경로를 활용하는 단백질분해 표적화 키메라 (PROTAC)의 사용에 의해 달성되었다 (Cyrus et al., 2011; Huang et al., 2016). 일반적으로, PROTAC은 관심 단백질을 유비퀴틴화 기구에 직접적으로 연결하는 작용을 하는 2개의 기능적 결합 도메인으로 이루어진 이종-이관능성 화합물이다. 이들은 화학적 스페이서를 통해 E3 유비퀴틴 리가제 인식 모티프에 커플링된 표적화 도메인으로 구성된다. 결합 시, PROTAC은 이의 표적을 폴리유비퀴틴화하고, 분해를 위해 26S 프로테아솜을 향하게 한다. PROTAC은 효율적인 PROTAC 분해에도 불구하고 광범위 스펙트럼의 세포질, 핵 및 원형질막 단백질을 표적화하는데 사용되어 왔다는 장점을 제공하고 (Sun et al., 2019), 표적화 및 E3 리가제 동원 도메인의 공간적 배치를 최적화하기 위한 체계적인 접근법을 필요로 한다 (Bondeson et al., 2018). PROTAC은 의도된 표적 단백질에 대해 높은 특이성 및 가공성을 제공한다는 추가 이점을 제공하며; 그러므로, 표적 분자의 농도를 효과적으로 감소시키고 약물-내성 돌연변이체가 진화할 수 있는 가능성을 감소시킨다. 이 전략은 ER을 하향조정하는데 성공적으로 사용되었으며, ER-PROTAC은 17β-에스트라디올 (17b-E2) (Rodriguez-Gonzales et al., 2008), 엔독시펜 (Dragovich et al., 2020), 랄록시펜 (Hu et al., 2019), 및 타목시펜 (Fan, 2020)을 포함한 다양한 에스트로겐 유도체로 이루어진 표적화 도메인으로 개발되었으며; 각각 상이한 화학적 스페이서로 단백질 또는 소분자 E3 리가제 동원 모티프에 연결된다. ERα, ERβ 및 GPER은 천연 및 합성 에스트로겐에 대한 결합 친화성이 상이하지만 (Prissnitz et al., 2015), 각각 낮은 나노몰 범위에서 측정된 해리 상수로 17β-에스트라디올 (E2)에 대해 높은 결합 친화성을 나타낸다.
요약
본 개시내용은 G-단백질 커플링된 에스트로겐 수용체 (GPER)를 불활성화시킬 수 있는 PROTAC을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 GPER을 불활성화시키거나 활성화시킬 수 있는, 예를 들어 암, 예컨대 가장 치료하기 어려운 유방암 중 하나인 삼중 음성 유방암 (TNBC)을 치료하는데 유용한 경구-전달 소분자 PROTAC을 제공한다. TNBC는 효과적인 치료 표적을 갖지 않고 GPER이 흔히 발현되는 유방암의 한 유형이다 (TNBC의 >80%). 본원에 개시된 GPER-PROTAC은 예를 들어 TNBC에서 GPER의 단백질분해적 분해를 향상시켜 암 진행을 지연 또는 억제하며, 그러므로 내분비 요법이 TNBC에 사용될 수 있음을 입증한다. GPER-PROTAC은 또한 다른 암, 예컨대 다른 유형의 유방암 또는 부인과 암, 예를 들어 현재 내분비 요법에 부적격하다고 판단되는 환자에서 유용할 수 있다. GPER-PROTAC은 또한 기존 요법 (예를 들어, 아로마타제 억제제)과 함께 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, GPER-PROTAC은 경구로 전달된다. 한 실시양태에서, GPER-PROTAC은 ERα, ERβ 및 GPER과 상호작용하고 이를 분해하는 E2 기반 PROTAC, 예를 들어 UI-EP001 또는 UI-EP002)이며, 예를 들어 이는 범-에스트로겐 수용체 억제제이다. 한 실시양태에서, 이중-특이성 PROTAC은 원형질막 및 세포내 에스트로겐 수용체와 상호작용하고 유비퀴틴-프로테아솜 의존적 분해를 촉진한다.
GPER을 불활성화시키기 위한 PROTAC은 예를 들어 표적 세포, 예를 들어 유방암 세포로부터의 원형질막에서 GPER 특이적 결합을 결정하기 위해 추적자로서 [3H]-17β-에스트라디올 (17β-E2)을 사용하는 경쟁적 방사성 수용체 결합 검정을 사용하여 평가된다. GPER을 불활성화시키기 위한 PROTAC은 또한 암 세포주, 예를 들어 유방암 세포주에서 GPER의 프로테아솜 분해를 촉진하는 능력, 및 작은 원발성 TNBC 종양을 사용하는 자발적 암 모델과 같은 동물 모델에서 항발암성 효능에 대해 평가된다. 본원에 개시된 바와 같이, GPER을 불활성화시키기 위한 예시적인 PROTAC, UIEP001은 천연 및 재조합 GPER 원형질막 단백질을 감소시키고 HA-GPER의 정상 상태 발현을 감소시키지만 HA-β1AR은 감소시키지 않는 것으로 나타났다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 E3 리가제에 대한 리간드에 커플링된 G-단백질 커플링된 에스트로겐 수용체 (GPER) 리간드를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 링커에 커플링된, 예를 들어 공유 결합을 통해 화학적으로 연결된 G-단백질 커플링된 에스트로겐 수용체 (GPER) 리간드를 제공하며, 링크는 차례로 E3 리가제에 대한 리간드에 커플링, 예를 들어 공유 결합을 통해 화학적으로 연결된다. 한 실시양태에서, GPER 리간드는 17β-에스트라디올, 에스트론, 피토에스트로겐, 제노에스트로겐, 에스트리올, 에스트리올 3-술페이트, 에스트리올 17-술페이트, G-1, G-15, G-36, 제니스테인 또는 퀘르세틴을 포함한다. 한 실시양태에서, 피토에스트로겐은 플라본, 이소플라본, 리그닌 사포닌, 쿠메스틴 또는 스틸벤을 포함한다. 한 실시양태에서, GPER 리간드는 비스페놀, 알킬페놀, 메톡시페놀, 폴리염화 바이페닐, 또는 다이옥신을 포함한다. 한 실시양태에서, GPER 리간드는 GPER 길항제이다. 한 실시양태에서, GPER 리간드는 GPER 효능제이다. 한 실시양태에서, GPER 리간드는 2-시클로헥실-4-이소프로필-N-(4-메톡시벤질)아닐린이 아니다. 한 실시양태에서, GPER PROTAC은 화학식 (II) 또는 (III)을 갖지 않는다. 한 실시양태에서 GPER 리간드는 2-시클로헥실-4-이소프로필-N-(4-메톡시벤질)아닐린을 포함한다. 한 실시양태에서, GPER 리간드는 ER에 결합하지 않는다. 한 실시양태에서, E3 리가제 리간드는 폰 히펠 리가제 (VHL) 리간드이다. 한 실시양태에서, E3 리가제 리간드는 레날리도마이드, 포말리도마이드, 이베르도마이드, (S,R,S)-AHPC, 탈리도마이드, VH-298, CC-885, E3리가제 리간드 8, TD-106, VL285, VH032, VH101,VH298, VHL 리간드 4, VHL 리간드 7 (문헌 [Scheepstra et al., Comput. Struct. Biotech. J., 17:160 (2019)] 참조, 그 개시내용은 본원에 참조로 포함됨), VHL-2 리간드 3, E3 리가제 리간드 3, E3 리가제 리간드 2, 세레블론, CC-122, 또는 BC-1215를 포함한다. 한 실시양태에서, 링커는 2 내지 200개의 원자를 갖는 쇄를 갖는다. 한 실시양태에서, 링커는 5 내지 25개의 원자를 갖는 쇄를 갖는다. 한 실시양태에서, 링커는 25 내지 50개의 원자를 갖는 쇄를 갖는다. 한 실시양태에서, 링커는 30 내지 50개의 원자를 갖는 쇄를 갖는다. 한 실시양태에서, 링커는 50 내지 100개의 원자를 갖는 쇄를 갖는다. 한 실시양태에서, 링커는 알킬 링커이다. 한 실시양태에서, 링커는 헤테로알킬 링커이다. 한 실시양태에서, 링커는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 예를 들어 2, 3, 4 또는 5개의 PEG 단위, 및 임의로 하나 이상의 다른 기, 예컨대 아미도 기를 포함한다. 한 실시양태에서, 링커는 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 PEG 단위, 및 임의로 하나 이상의 다른 기, 예컨대 아미도 기를 포함한다. 한 실시양태에서, 링커는 절단가능한 PEG 링커, 예를 들어 디술피드 연결을 갖는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 링커는 척추동물 세포의 막에 걸칠 수 있는 길이이며, 예를 들어 길이가 적어도 5 내지 10 nm이다. 한 실시양태에서, 링커는 적어도 3개의 PEG 단위, 예를 들어 (OCC)3을 포함한다. 한 실시양태에서, 링커는 적어도 4개의 PEG 단위, 예를 들어 (OCC)4를 포함한다. 한 실시양태에서, 링커는 적어도 5개의 PEG 단위를 갖는다. 한 실시양태에서, 링커는 C1-C10알킬(PEG)n, 적어도 4개의 PEG 단위, 예를 들어 (OCC)4를 포함한다. 한 실시양태에서, 링커는 (PEG)nNH(CO)(PEG)m을 포함하며, 여기서 n 및 m은 독립적으로 1 내지 15이다. 한 실시양태에서, n 및 m은 독립적으로 3 내지 10이다. 한 실시양태에서, n은 5 내지 10이고, m은 3 내지 6이다.
한 실시양태에서, 링커는 GPER 리간드와 E3 유비퀴틴 리가제 리간드 사이의 선형 경로에서 계수된 바와 같은 5 내지 200개의 원자의 쇄 길이를 갖는 백본을 갖는다. 한 실시양태에서, 링커는 GPER 리간드와 E3 유비퀴틴 리가제 리간드 사이의 선형 경로에서 계수된 바와 같은 15 내지 50개의 원자의 쇄 길이를 갖는 백본을 갖는다. 한 실시양태에서, 링커는 GPER 리간드와 E3 유비퀴틴 리가제 리간드 사이의 선형 경로에서 계수된 바와 같은 20 내지 50개의 원자의 쇄 길이를 갖는 백본을 갖는다. 한 실시양태에서, 링커는 GPER 리간드와 E3 유비퀴틴 리가제 리간드 사이의 선형 경로에서 결합 길이의 합으로부터 결정된 바와 같은 8 내지 300 옹스트롬의 계산된 길이를 갖는 백본을 갖는다.
한 실시양태에서, 링커는 GPER 리간드와 E3 유비퀴틴 리가제 리간드 사이의 선형 경로에서 결합 길이의 합으로부터 결정된 바와 같은 25 내지 75 옹스트롬의 계산된 길이를 갖는 백본을 갖는다. 한 실시양태에서, 링커는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00001
여기서 Q는 GPER 리간드에 대한 공유 결합을 형성하는 2가 기 또는 결합이고; Z는 하나 이상의 알킬, 아릴, 헤테로알킬, 헤테로아릴, 알킬옥시, 알킬아미노, 알킬글리콜, 카르보닐, 티오카르보닐, 아실, 카르바메이트, 우레아, 티오카르바메이트, 티오우레아, 디티오카르바메이트, 아미노카르보닐, 아미드, 에스테르, 티오에스테르, 티오아미드, 아민, 산소, 황, 술폰 또는 술폭시드 (2가 형태)를 포함하는 선형 쇄이고; G는 E3 유비퀴틴 리가제 리간드에 대한 공유 결합을 형성하는 2가 기 또는 결합이다. 한 실시양태에서, 링커는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00002
여기서 Q는 GPER 리간드에 대한 결합을 형성하는 2가 기 또는 결합이고;
R은 알킬, 아릴, 헤테로알킬, 헤테로알킬, 헤테로아릴, 알킬옥시, 알킬아미노, 알킬글리콜, 카르보닐, 티오카르보닐, 아실, 카르바메이트, 우레아, 티오카르바메이트, 티오우레아, 디티오카르바메이트, 아미노카르보닐, 아미드, 에스테르, 티오에스테르, 티오아미드, 아민, 산소, 황, 술폰 또는 술폭시드 (2가 형태)이고; G는 E3 유비퀴틴 리가제 리간드에 대한 결합을 형성하는 2가 기 또는 결합이고; m, n, p 및 q는 존재하는 경우 각각 독립적으로 0 내지 50의 정수이고, 단 m, n, p 및 q 중 적어도 하나는 0보다 큰 정수이다. 한 실시양태에서, Q 및 G는 독립적으로 카르보닐, 티오카르보닐, 아실, 카르바메이트, 우레아, 티오카르바메이트, 티오우레아, 디티오카르바메이트, 아미노카르보닐, 아미드, 에스테르, 티오에스테르, 티오아미드, 술폰 또는 술폭시드 (2가 형태)이다. 한 실시양태에서, Q 및 G는 독립적으로, 카르보닐, 또는 아세틸, 2-히드록시아세틸, 2-아미노아세틸, 프로피오닐, 3-히드록시프로파노일, 3-아미노프로파노일, 부타노일, 4-히드록시부타노일 및 4-아미노부타노일로 이루어진 군으로부터 선택된 아실이고, 이들 각각은 2가 형태이다.
한 실시양태에서, m 및 n은 존재하는 경우 각각 독립적으로 0 내지 2의 정수이고, Q 및 G는 각각 독립적으로 카르보닐, 티오카르보닐, 아세틸, 2-히드록시아세틸, 2-아미노아세틸, 프로피오닐, 3-히드록시프로파노일, 3-아미노프로파노일, 부타노일, 4-히드록시부타노일, 4-아미노부타노일, 카르바메이트, 우레아, 티오카르바메이트, 티오우레아, 디티오카르바메이트, 아미노카르보닐, 아미드, 에스테르, 티오에스테르, 티오아미드, 술폰 또는 술폭시드이고, 이들 각각은 2가 형태이다. 한 실시양태에서, Z는 친수성이다. 한 실시양태에서, 링커는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00003
이는 선형 경로에서 계수된 바와 같은 13개 원자의 길이를 갖는 백본을 제공한다. 한 실시양태에서, 링커는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00004
여기서 p 및 q는 각각 독립적으로 0 내지 50의 정수이다. 한 실시양태에서, 링커는 2가 알킬 기, 2가 헤테로알킬 기, 또는 2가 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 중 하나 이상, 또는 각각 중 하나 이상을 포함한다. 한 실시양태에서, 링커는 5개 이상의 2가 에톡시 (-CH2CH2O-) 기를 포함한다. 한 실시양태에서, 링커는 2개의 탄소마다 1개 이상의 헤테로원자를 포함하고 부틸보다 긴 알킬 쇄는 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 링커는 GPER 리간드의 산소, 질소, 황, 카르보닐 또는 에티닐을 통해 GPER 리간드에 부착되고, 링커는 E3 유비퀴틴 리가제 리간드의 산소, 질소, 황, 카르보닐 또는 에티닐을 통해 E3 유비퀴틴 리가제 리간드에 부착된다. 한 실시양태에서, GPER 리간드는 에스트로겐 스테로이드의 산소, 아민, 황, 비닐, 에틴 및 카르보닐로부터 선택된 C6 또는 C17에 위치된 2가 기를 포함하는 에스트로겐 스테로이드이고, C6 또는 C17에 있는 2가 기는 링커에 부착된다. 한 실시양태에서, E3 유비퀴틴 리가제 리간드는 (S,R,S)-AHPC이고, 이는 (S,R,S)-AHPC의 아민을 통해 링커에 부착된다.
또한, 분자를 사용하는 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 포유동물에서 내분비 내성 암 또는 호르몬 요법 내성 암을 예방, 억제 또는 치료하는 방법이 제공된다. 방법은 E3 리가제에 대한 리간드에 커플링된 링커에 커플링된 G-단백질 커플링된 에스트로겐 수용체 (GPER) 리간드를 포함하는 분자의 유효량을 갖는 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 한 실시양태에서, 투여는 전신이다. 한 실시양태에서, 투여는 경구이다. 한 실시양태에서, 조성물은 정제이다. 한 실시양태에서, 조성물은 액체이다. 한 실시양태에서, 조성물은 주사된다. 한 실시양태에서, 포유동물은 아로마타제 억제제 요법에 내성인 인간이다.
또한, E3 리가제에 대한 리간드에 커플링된 링커에 커플링된 G-단백질 커플링된 에스트로겐 수용체 (GPER) 리간드를 포함하는 분자의 유효량을 갖는 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 삼중 음성 유방암을 예방, 억제 또는 치료하는 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 한 실시양태에서, 투여는 전신이다. 한 실시양태에서, 투여는 경구이다. 한 실시양태에서, GPER 리간드는 GPER 길항제이다.
E3 리가제에 대한 리간드에 커플링된 링커에 커플링된 G-단백질 커플링된 에스트로겐 수용체 (GPER) 리간드를 포함하는 분자의 유효량을 갖는 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 암컷 포유동물에서 부인과 암, 예를 들어 자궁경부암, 난소암 또는 자궁내막암을 예방, 억제 또는 치료하는 방법이 추가로 제공된다. 한 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 한 실시양태에서, 투여는 전신이다. 한 실시양태에서, 투여는 경구이다.
또한, E3 리가제에 대한 리간드에 커플링된 링커에 커플링된 G-단백질 커플링된 에스트로겐 수용체 (GPER) 리간드를 포함하는 분자의 유효량을 갖는 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 전립선암 또는 결장암을 포함한 암, 또는 호르몬 의존적이 아닌 임의의 암을 예방, 억제 또는 치료하는 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 한 실시양태에서, 투여는 전신이다. 한 실시양태에서, 투여는 경구이다. 한 실시양태에서, GPER 리간드는 GPER 길항제이다.
도 1. 예시적인 PROTAC을 사용한 GPER의 단백질분해 표적화.
도 2. E2-PROTAC, UI-EP001의 구조적 확인.
도 3. PROTAC 프로토타입 UI-EP001은 표면 GPER을 감소시킨다. UI-EP001 (100 uM, 16hr)은 표면 재조합 GPER의 하향조정을 유발한다. 3개의 현미경 필드로부터 측정된 보정된 총 적색 형광에 의해 오른쪽에서 정량된 결과.
도 4. PROTAC 프로토타입 UI-EP001은 표면 GPER을 감소시킨다. her2+ 및 TNBC 유방암 세포에서 천연 GPER에 대해 유사한 결과가 수득되었다.
도 5. 삼중 음성 유방암 요법을 위한 GRER PROTAC.
도 6. E2β-PROTAC (100uM)는 표면 GPER을 감소시킬 수 있다.
도 7. E2β-PROTAC (100uM)는 표면 GPER을 감소시킬 수 있다.
도 8. E2β-PROTAC (100uM)는 표면 GPER을 감소시킬 수 있다.
도 9. E2β-PROTAC (100uM)는 표면 GPER을 감소시킬 수 있다.
도 10. UI-EP001 하향조정의 특이성의 평가.
도 11. 프레스토블루 검정.
도 12. E2-PROTAC 및 부분 PROTAC에 의해 처리된 HCC 1806 및 SKBR3의 생존가능성의 비교 (12시간의 처리 후).
도 13. E2-PROTAC 및 부분 PROTAC에 의해 처리된 HCC 1806 및 SKBR3의 생존가능성의 비교 (24시간의 처리 후).
도 14. 에스트라디올 포화로 전처리된 HCC 1806 세포주의 생존가능성의 비교 (24시간의 처리).
도 15. 에스트라디올 포화로 전처리된 SKBR3 세포주의 생존가능성의 비교 (24시간의 처리).
도 16. IC50 값.
도 17. PROTAC 작용의 메커니즘. PROTAC은 표적 단백질을 E3 리가제에 연결하여 이의 폴리유비퀴틴화 및 프로테아솜 분해를 유발한다.
도 18. E2-PROTAC (UI-EP001)는 인간 유방암 세포에서 GPER을 하향조정한다. UI-EP001의 구조 (A) 및 NMR 스펙트럼 (B). 인간 SKBR3 (Her2+) 및 HCC-1806 (TNBC) 유방암 세포를 비히클 (미처리) 또는 100μM의 부분-PROTAC 또는 E2β-PROTAC, UI-EP001에 16시간 동안 노출시켰다. 세포를 30분 동안 GPER 항체로 면역염색하고, 염소 항-토끼 알렉사(Alexa) 594 IgG (적색)를 사용하여 표면 GPER을 검출하였다. 핵을 DAPI (파란색)로 대조염색하였다. (C). HA-GPER 또는 HA-β1AR 세포를 표시된 시간 동안 UI-EP001로 처리하고, HA 항체로 면역블롯팅하거나 (D), 표면 수용체에 대해 면역염색하였다 (E). 처리된 및 미처리 HA-GPER 또는 HA-β1AR 세포의 총 보정된 적색 형광 (적색) (TCRF)을 세포 배경을 공제함으로써 측정하였다. E2-PROTAC, UI-EP001 n HA-GPER의 존재 하에 GPER의 유의한 분해가 관찰되었지만 HA-β1AR 세포에서는 그렇지 않았다 (F). 데이터는 나타내지 않았지만, 유리 17β-E2로 유사하게 처리된 세포에서 표면 GPER 발현의 차이가 측정되지 않았다.
도 19. 소분자 GPER-PROTAC의 설계. 17β-에스트라디올은 이의 에스트란 고리의 C6- 또는 C-17을 통해 VHL-유래 유비퀴틴 E3 리가제 리간드, (S,R,S) AHPC에 대한 다양한 서브유닛 길이의 화학적 링커에 부착될 것이다.
도 20. C-17 연결된 GPER-PROTAC의 합성. (S,R,S)-AHPC-PEG2-COOH; (S,R,S)-AHPCPEG4-COOH 또는 (S,R,S)-AHPC-PEG6-COOH로 이루어진 부분 PROTAC은 EDC 커플링에 의해 17β-에스트라디올의 17β-OH 기를 통해 커플링될 것이다.
도 21. C-6 연결된 GPER-PROTAC의 합성. (S,R,S)-AHPC-PEG2-COOH; (S,R,S)-AHPC-PEG4-COOH 또는 (S,R,S)-AHPC-PEG6-COOH로 이루어진 부분 PROTAC은 상기 다이어그램에 표시된 여러 단계에서 C-6 탄소 원자에 커플링될 것이다.
도 22. 나노비트(NanoBiT) 발광 검정에 의한 원형질막 및 세포내 GPER의 검출. 무손상 또는 세제-투과화된 HEK293 세포 또는 HiBiT-GPER- HEK293 세포를 4분 동안 주변 온도에서 가용성 LgBiT 단백질 플러스 발광 기질로 라벨링하였다. 4중 샘플로부터 발광성을 측정하였다. 세포를 함유하지 않는 빈 웰의 배경을 공제하고, 상대 발광 단위 (RLU)로서 보고하였다.
도 23. GPER 및 ERα에서 PROTAC의 모델링. A) 링커가 2개의 다양한 길이로 결합 포켓에서 배출되도록 설계된, GPER 상동성 모델 내에 결합된 UI-EP001 (파란색) 및 UI-EP002 (녹색). B) TM1 및 TM7 사이에서 UI-EP001 (파란색) 및 UI-EP002 (녹색)의 출구를 보여주는 GPER 결합 포켓 (회색 표면). C) ERα 동종이량체 (PDB:1A52)의 ERα 리간드 도메인 내에 결합된 UI-EP001 (파란색) 및 UI-EP002 (녹색). D) UI-EP001 (파란색) 및 UI-EP002 (녹색)의 출구를 보여주는 ERα 결합 포켓 (회색 표면).
도 24. UI-EP001 및 UI-EP002의 합성. 반응식 1: 부분 PROTAC (화합물 7)의 합성, 시약 및 조건: (i) NaH, 디옥산, rt, 밤새; (ii) TFA/DCM, rt, 2h; (iii) Pd(OAc)2, KOAc, DMAc, 120℃, 24h; (iv) CoCl2, NaBH4, 무수 메탄올, 0℃ 내지 rt, 2h; (v) HBTU, DIPEA, 무수 DMF, rt, 밤새; (vi) 1. TFA/DCM, rt, 30분; 2. Boc-Tle-OH, HBTU, DIPEA, 무수 DMF, rt, 밤새; (vii) 화합물 2, HBTU, DIPEA, rt, 밤새. 반응식 2: UI-EP001 (화합물 8)의 합성. 시약 및 조건: (viii) DMAP, EDC, 무수 DMF, rt, 48h. 반응식 3: UI-EP002 (화합물 10)의 합성. 시약 및 조건: (ix) Fmoc-NH-PEG8-CH2CH2COOH, DMAP, EDC, 무수 DMF, rt, 72h; (x) 1. Et3N, 무수 DMF; 2. 화합물 7, HATU, DIPEA, 무수 DMF, rt, 48h.
도 25. E2-PROTAC은 GPER 및 ER에 대한 고친화성 결합을 통해 작용한다. A) 무손상 HEK-293 (ER-, GPER-), HA-GPER (ER-, GPER+), SKBR3 (ER-, GPER+) 및 MCF-7 (ER+, GPER+) 세포를 4℃에서 토끼 GPER 항체로 라벨링하였다. 그 후, 표면 GPER을 알렉사 594-접합 염소 항-토끼 IgG (적색)로 시각화하였다. B) 무손상 SKBR3 세포에서 E2-FITC 농도의 함수로서 계산된 특이적 결합. C) 플루오로-추적자로서 E2-FITC를 사용하여 경쟁적 결합 검정에 의해 측정된 무손상 SKBR3 세포에서 17b-E2, UI-EP001, UI-EP002 및 부분 PROTAC의 특이적 결합. D) MCF-7 세포로부터 제조된 시토졸 단백질의 증가하는 농도의 존재 하에 10 nM E2-FITC를 사용한 E2-FITC 총 결합의 결정. E) MCF-7 세포로부터 제조된 시토졸 분획에서 E2, UI-EP001, UI-EP002 및 부분 PROTAC의 특이적 결합을 평가하기 위해 E2-FITC를 사용한 형광 편광 검정. 평균 값 및 SD는 3개의 독립적 실험으로부터 파생되었다.
도 26. E2-PROTAC은 재조합 막 및 세포내 에스트로겐 수용체의 신속한 손실을 촉진한다. HEK-293 세포 (ERα-, GPER-)를 50 ng HiBiT-GPER 또는 HiBiT-ER 플러스 pcDNA3.1(+) 제오 캐리어 플라스미드로 일시적으로 형질감염시켰다. (A) HiBiT-GPER 및 (B) HiBiT-ERα의 농도-반응 곡선은 1시간 동안 UI-EP001 또는 UI-EP002의 증가하는 용량으로 처리한 후 세제-투과화된 세포에서 세포외 LgBiT 및 발광 기질을 사용하여 측정되었다. (C) 100 mM 약물 또는 대조군에서 1시간 처리 후 총 HiBiT-GPER 및 HiBiT-ER을 도시하는 히스토그램. 1 내지 8시간의 다양한 인큐베이션 기간 동안 100 μM의 UI-EP001, UI-EP002 및 부분 PROTAC과 함께 세포의 인큐베이션 후 (D) HiBiT-GPER 및 (E) HiBiT-ERα의 동역학. 표시된 결과는 3개의 독립적 실험의 평균 ± S.E.를 나타낸다. (***, P <0.0004; ****, P <0.0001; 일원 ANOVA).
도 27. E2-PROTAC은 천연 및 재조합 GPER의 발현을 선택적으로 감소시킨다. (A) HA-GPER, HA-β1AR 또는 HA-CXCR4를 안정적으로 발현하는 HEK-293 세포를 100 μM의 UI-EP001, UI-EP002 및 부분 PROTAC로 1시간 동안 처리하였다. 고정된 세포를 투과화한 후, 토끼 HA 항체로 라벨링된 후, 총 수용체를 알렉사 플루오르 594 항-토끼 2차 항체 (적색)를 사용하여 시각화하였다. (B) 비히클, UI-EP001, UI-EP002 및 부분 PROTAC로 처리된 HA-GPER, HA-β1AR 및 HA-CXCR4 세포의 이미지로부터의 보정된 총 적색 형광 (CTRF)은 3개의 상이한 현미경 필드로부터 이미지 제이(Image J) 소프트웨어를 사용하여 측정되었다 (***, P <0.0004; ****, P <0.0001; 일원 ANOVA). (C) MCF-7 (ERa+, ERb+, PR+, GPER+) 세포를 비히클, UI-EP001, UI-EP002 또는 부분 PROTAC과 함께 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 마우스 ERα, 토끼 ERβ, 마우스 PR, 및 토끼 GPER 항체로 면역염색하고, 알렉사 488-접합 항-마우스 IgG 또는 알렉사 488-접합 항-토끼 IgG (녹색)로 검출하였다. (D) CTRF로서 측정된 (C)의 이미지로부터의 결과의 정량화. (E) SKBR3 (ERa+, ERb-, GPER+) 세포를 비히클 (1% DMSO), 100 uM의 UI-EP001, UI-EP002 또는 부분 PROTAC과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 표면 및 세포내 GPER는 각각 토끼 GPER 항체 및 알렉사 594-접합 염소 항-토끼 IgG (적색)를 사용하여 무손상 또는 세제 투과화된 세포에서 시각화되었다.
도 28. E2-PROTAC은 GPER 및 ERα의 프로테아솜-의존적 분해를 유도한다. (A) HiBiT-GPER 및 (B) HiBiT-ERα로 일시적으로 형질감염된 HEK-293 세포를 증가하는 농도의 E2β 또는 알도스테론의 존재 하에 100 μM UI-EP001로 처리하였다. 그 후, 총 수용체를 세제-투과화된 세포에서 이원성 발광 보완에 의해 측정하였다. (C) 일시적으로 형질감염된 세포에서 100 μM UI-EP001 단독 또는 100 μM E2 또는 알도스테론과의 조합의 효과. ****는 통계적 유의성을 나타냄, P < 0.0001 이하. (D) 세포를 100 μM의 UI-EP001 또는 UI-EP002의 존재 또는 부재 하에 (D) 10 μM MG132 또는 (E) 100 μM 클로로퀸으로 1시간 동안 처리하였다. 그 후, 총 수용체를 이원성 발광 보완에 의해 정량화하였다. 3개의 독립적 실험으로부터 파생된 대표적인 발광 데이터 및 평균 값 및 SD가 표시된다. (***, P <0.0004; **, P <0.001; ns, 유의하지 않음; 일원 ANOVA).
도 29. E2-PROTAC은 인간 유방암 세포에서 에스트로겐 수용체-특이적 세포 세포독성을 유도한다. 증가하는 농도의 UI-EP001 또는 UI-EP002 또는 부분 PROTAC로 24시간 처리 후 SKBR3, HCC-1806, MCF-7 및 MDA-MB-231 유방암 세포의 세포 생존율을 측정하였다. 표시된 결과는 3개의 독립적 실험의 평균 ± S.E.를 나타낸다.
도 30. E2-PROTAC은 에스트로겐 수용체-의존적 G2/M 정지를 촉진한다. E2-PROTAC은 막 및/또는 세포내 에스트로겐 수용체를 발현하는 인간 유방암 세포주에서 G2/M 정지를 유도하였다. 10% FBS에서 성장하는 SKBR3, HCC-1806, MCF-7 및 MDA-MB-231 세포를 10 μM의 UI-EP001 또는 UI-EP002 또는 부분 PROTAC로 24시간 동안 처리하였다. 고정된 세포를 투과화하고, 프로피디움 아이오다이드 (PI)로 염색하였다. 세포 주기 데이터를 유동 세포계측기에서 획득하고, 플로우-조(Flow-Jo) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM (n=3)으로서 표현된다. 각 단계의 세포 백분율을 프리즘(Prism) 8.0을 사용하여 플롯팅하였다.
도 31. E2-FITC 합성 반응식.
도 32. 예시적인 구조.
도 33. NMR 데이터.
도 34. 세포 주기 분석을 위한 게이팅 방법. 부스러기를 게이팅 아웃 하기 위해 제1 게이트를 산점도 (A)에 적용하였다. 세포가 식별됨에 따라, 펄스 프로세싱 (펄스 폭 대 펄스 면적) (B)를 사용하여 단일 세포 집단에 제2 게이트를 적용하여 분석으로부터 세포 이중항을 배제하였다. 이 세포 집단으로부터, 각 단계의 각 하위집단의 백분율을 히스토그램 플롯 (C)에 의해 결정하였다.
도 35. MCF7로 챌린지된 누드 마우스 (2일마다 100 μl IT 처리 (7x).
도 36. MCF7로 챌린지된 누드 마우스 (2일마다 100 μl IT 처리 (7x)
도 37. SKB3으로 챌린지된 누드 마우스 (2일마다 100 μl IT 처리 (7x).
도 38. CIMBA-PROTAC은 재조합 GPER을 분해한다. 재조합 HA-태그부착된 GPER을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포를 다양한 농도의 CIMBA-PROTAC-001 또는 부분 PROTAC로 16시간 동안 처리한 후, 세제에서 용해시켰다. 동일한 양의 단백질 용해물을 SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 분해한 후, PVDF 나일론 막으로 전기이동하였다. 막을 토끼 HA 항체로 프로빙하였다 (상단). HA-항체를 낮은 pH에서 막으로부터 스트립핑한 후, 막을 특이성 및 로딩 대조군으로서 트랜스페린 수용체 (TFNR) 항체로 프로빙하고 스트립핑하였다.
도 39. GPER 결합 작용제로서 2-시클로헥실-4-이소프로필-N-(4-메톡시벤질)아닐린을 갖는 GPER-PROTAC의 예시적인 구조 (화학식 (II) 또는 (III)).
도 40. E3 리가제에 대한 예시적인 리간드.
상세한 설명
유방암은 에스트로겐-구동 악성종양이며, 에스트로겐 작용의 차단은 유방암에 고도로 효과적이고 다른 형태의 암 요법보다 독성이 훨씬 적다. 그러나, ER 기능 및 에스트로겐 생합성을 억제하는 전략은 조기 ER-양성 (ER+) 유방암을 갖는 폐경후 여성에서만 사용하기에 적합하다. 더욱이, 약물 내성이 발생하고, 부작용이 심각할 수 있다 (Rugo et al., 2016; Miller et al., 2013). 선택적 에스트로겐 수용체 분해제 (SERD), 예컨대 풀베스트란트는 에스트로겐 수용체 (ER)-양성 유방암, 특히 내분비-내성 질환이 발병하는 환자의 치료에 효과적인 약물이다. SERD는 ER에 결합하고 26S-프로테아솜에서 이의 파괴를 유발하는 알로스테릭 변화를 유도함으로써 작동한다. ER 분해제인 풀베스트란트는 내분비 내성 유방암에 대한 2차 요법으로서 사용되지만, 이의 생체이용률은 불량하며, 그러므로 매달 고통스러운 근육내 주사를 필요로 한다 (Nathan et al., 2017).
에스트로겐은 고아 GPCR 상동체인 GPR30 (일명 GPER)을 통해 작용하여 Gbg-서브유닛 단백질 의존적 HB-EGF 자가분비 루프를 촉발한다. 이 발견은 에스트로겐의 EGF-유사 효과에 대한 최초의 기계론적 설명을 제공하였다. GPR30은 특이적 에스트로겐 결합을 보유하고 아데닐릴 시클라제에 연결된 Gs-커플링된 수용체이다. GPER 트래픽킹에 대한 연구는 그것이 원형질막에서 유비퀴틴화되고, 프로테아솜 분해 전에 트랜스골지 네트워크로의 클라트린-매개, b-아레스틴- 독립적 역행 수송을 사용함을 입증하였다.
인테그린 a5b1은 GPER-매개 EGFR 트랜스활성화에서 막횡단 신호전달 중재자이다. GPER을 통한 에스트로겐 작용은 피브로넥틴 매트릭스 어셈블리 및 EGF-방출, 세포 생존과 연관된 세포 작용을 조화롭게 촉진한다. 예를 들어 문헌 [Filardo et al. (2000)]; [Filardo et al. (2002)]; [Pang et al. (2005)]을 참조한다.
GPER은 유방 종양 표본에서 ER과 독립적으로 발현된다. 더욱이, GPER은 진행성 유방암의 마커와 직접적으로 연관되며, 이들 동일한 예후 변수를 갖는 ER과 정반대의 관계이다. GPER은 또한 여성 생식기 암에서 불량한 예후와 연관된다. GPER은 발정 동안 피질 상피에서 상향조절되며, 시상하부 내의 신경 기능 및 황체형성 호르몬-방출에서 GPER의 역할에 관해 여러 그룹과 협력하였다. 예를 들어 문헌 [Filardo et al. (2006)]; [Noel et al. (2009)]; [Cheng et al. (2014)]; 및 [워터스 et al. (2015)]을 참조한다.
그러므로, GPER의 발현이 ER+ 유방암에 국한되지 않기 때문에 (Prissnitz et al., 2015; Neklesa et al., 2017), GPER은 유방암이 에스트로겐에 반응하는 대안적인 메커니즘을 제공한다 (Ignatov et al., 2011).
TNBC를 갖는 환자 121명의 최근 조사는 이 수용체가 이들 종양의 > 80%에서 발현된다는 것을 시사한다. 대부분의 TNBC에서 GPER의 발현은 다른 소규모 연구에 의해 뒷받침되며, GPER이 TNBC에서 종양 저해제임을 시사하는 종양 및 세포주의 다소 제한된 연구의 데이터와 대조적이다. 진행성 유방암의 임상적 예측인자와 역으로 연관된 ER의 발현과 달리, GPER의 발현은 이들 동일한 변수와 직접적으로 연관되며, 이는 전이에서 역할을 한다는 것을 시사한다. 그러므로, GPER을 선택적으로 분해하는 이러한 유형의 치료제의 개발은 TNBC의 치료에 대한 가능성을 보유하고, 내분비-내성 유방암에도 유용할 수 있다. 최종적으로, GPER은 부인과 암의 진행성 질환 및 불량한 결과와 연관되며, 이는 GPER- PROTAC이 또한 이들 환자에 도움이 될 수 있음을 시사한다.
예시적인 GPER-PROTAC
유방암에 대한 치료 알고리즘은 ER-중심적이고, GPER이 국제 임상 및 기초 약리학자 연합 (IUPHAR)에 의해 인정된다는 사실에도 불구하고 에스트로겐-표적화된 요법의 할당을 위해 아직 GPER을 고려하지 않는다 (Ignatov et al., 2011). PROTAC은 이들의 표적을 제거하고 이에 의해 약물 내성의 선택을 피하기 때문에 치료적 약물의 개발에서 떠오르는 기술이다 (Neklesa et al., 2017; Gu et al. 2018). ER-PROTAC은 양호한 효능 및 개선된 생체이용률을 보여주기 때문에 ER-표적화된 요법에서 가능성을 보여준다 (Flanagan et al., 2018). ER-PROTAC은 ER을 표적화하기 위해 개발되었으며, 합성 ER 알파-특이적 리간드로 이루어진다 (Flanagan et al., 2018; Tria et al., 2018). 그러므로, 이는 GPER을 효과적으로 표적화하지 않는다. GPER에 대한 합성 길항제가 존재하며 (Prissnitz et al., 2015), 동물 모델에서 항종양 활성을 나타내지만 (Petrie et al., 2013), 이들은 복강내 및 만성적으로 전달되며, 내성의 잠재적 발달을 극복하지 못한다. GPER을 표적화하기 위한 PROTAC 접근법은 원형질막으로부터 GPER의 하향조정이 유비퀴틴-프로테아솜 분해 경로를 통해 발생하기 때문에 특히 매력적이다 (Cheng et al., 2011).
ER 및 GPER은 다양한 내인성, 식이 및 환경 에스트로겐 그룹에 결합한다 (Prissnitz et al., 2015). 개별 에스트로겐에 대한 이들 수용체의 상대적 친화성은 뚜렷하며, 각 수용체가 상이한 물리화학적 환경에 존재하기 때문에 이들 친화성을 비교할 수 없다 (Prissnitz et al., 2015; Filardo et al., 2012). ER 및 GPER은 모두 높은 친화성으로 17알파-E2에 결합한다. 그러므로, GPER-표적화 리간드로서 17알파-E2를 갖는 GPER-PROTAC을 제조하였다. GPER-PROTAC은 표적 (GPER 리간드)을 E3 리가제에 연결하여 GPER 폴리유비퀴틴화 및 프로테아솜 분해를 유발한다.
G-단백질 커플링된 에스트로겐 수용체 (GPER)는 GPCR 슈퍼패밀리의 구성원이다. 자극 후, GPER은 이의 탈민감화 및 세포내이입을 유발하는 적응적 변화를 겪는다. 26S 프로테아솜은 세포내이입된 GPER에 대한 자연적 목적지이므로 PROTAC-매개 표적화에 매우 적합하다. GPER은 유방암, 자궁내막암 및 난소암에 대한 공격적 질환 및 불량한 결과와 직접적으로 연관된다. GPER은 삼중 음성 유방암 (TNBC) 121개 중 97개 (> 80%)에서 발현되어, 공지된 치료 표적을 갖지 않는 이 유방암 하위유형을 GPER-PROTAC 요법에 이상적으로 적합한 암으로 만든다. 이용가능한 ER-PROTAC은 ER알파-특이적 리간드에 결합하도록 최적화되었기 때문에 GPER을 표적화하지 않는다. 본원에 기재된 바와 같이, GPER- PROTAC UI-EP001 및 UI-EP00은 인간 유방암 세포에서 GPER의 하향조정을 촉진하였다. 이의 화학적 스페이서의 조성 및 길이의 변형을 갖는 GPER-PROTAC은 GPER 특이적 결합에 대해 [3H]-17β-에스트라디올 (17-β-E2)을 사용한 경쟁적 방사성 수용체 결합 검정을 사용하여 테스트될 수 있다.
17 β-E2에 대해 가장 높은 상대적 결합 친화성 (RBA)을 갖는 PROTAC은 정량적 면역형광 및 면역화학적 검정을 사용하여 유방암 세포에서 GPER 분해를 촉진하는 이들의 능력에 대해 검정되었다. 매우 민감한 이원성 생물발광 보완 검정인 나노비트(Nanobit)™를 사용하여 GPER 제거를 확인할 수 있다. GPER의 폴리유비퀴틴화는 탠덤 유비퀴틴 결합 요소 (TUBE) 검정에 의해 확인되고, 프로테아솜-특이적 분해는 프로테아솜 억제제인 MG132를 사용하여 결정된다. erbB1-to-erk 신호전달 축을 트랜스활성화시키는 GPER의 능력이 또한 평가된다.
GPER-PROTAC의 항발암성 효능, 생체분포 및 독성은 TNBC 발암 모델로서 널리 사용되는 BRCA-1 돌연변이체 마우스를 사용하여 TNBC 재발 및 전이를 지연시키는 능력에 기초하여 테스트된다. 유방암에서 GPER을 불활성화시킬 수 있는 경구-전달 소분자 PROTAC이 식별된다. 이러한 소분자는 GPER의 불활성화가 지시된 다른 암, 예를 들어 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 전립선암 또는 결장암을 치료하는데 유용하다.
예시적인 제형
개시된 GPER-PROTAC은 폴리락트산 (PLA), 폴리글리콜산 (PGA), PLA 및 PGA의 공중합체 (즉, 폴리락트산-코-글리콜산 (PLGA)), 폴리-ε-카프로락톤 (PCL), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리(3-히드록시부티레이트), 폴리(p-디옥사논), 폴리프로필렌 푸마레이트, 폴리(오르토에스테르), 폴리올/디케텐 아세탈 부가 중합체, 폴리-알킬-시아노-아크릴레이트 (PAC), 폴리(세바스산 무수물) (PSA), 폴리(카르복시비스카르복시페녹시페녹시 헥손 (PCPP) 폴리[비스(p-카르복시페녹시)메탄](PCPM), PSA, PCPP 및 PCPM의 공중합체, 폴리(아미노산), 폴리(슈도 아미노산), 폴리포스파젠, 폴리[(디클로로)포스파젠] 및 폴리[(유기)포스파젠]의 유도체, 폴리-히드록시부티르산, 또는 S-카프로산, 엘라스틴, 또는 젤라틴을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는 생분해성 중합체 분자를 포함할 수 있거나 이로부터 형성될 수 있는 생분해성 입자로 전달될 수 있다. (예를 들어, 문헌 [Kumari et al., Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 75 (2010) 1-18]; 및 미국 특허 번호 6,913,767; 6,884,435; 6,565,777; 6,534,092; 6,528,087; 6,379,704; 6,309,569; 6,264,987; 6,210,707; 6,090,925; 6,022,564; 5,981,719; 5,871,747; 5,723,269; 5,603,960; 및 5,578,709; 및 미국 공개 출원 번호 2007/0081972; 및 국제 출원 공개 번호 WO 2012/115806; 및 WO 2012/054425 참조; 이들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).
입자는 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. (예를 들어 문헌 [Nagavarma et al., Asian J. of Pharma. And Clin. Res., Vol 5, Suppl 3, 2012, pages 16-23]; [Cismaru et al., Rev. Roum. Chim., 2010, 55(8), 433-442]; 및 국제 출원 공개 번호 WO 2012/115806; 및 WO 2012/054425 참조; 이들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 입자를 제조하기 위한 적합한 방법은 예비형성된 중합체의 분산을 활용하는 방법을 포함할 수 있으며, 이는 용매 증발, 나노침전, 유화/용매 확산, 염석, 투석 및 초임계 유체 기술을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 입자는 이중 에멀젼 (예를 들어, 수중유중수)을 형성하고 후속적으로 용매-증발을 수행함으로써 제조될 수 있다. 방법에 의해 수득된 입자는 원하는 대로 추가 프로세싱 단계, 예컨대 세척 및 동결건조를 거칠 수 있다. 임의로, 입자는 보존제 (예를 들어, 트레할로스)와 조합될 수 있다.
전형적으로, 입자는 1 마이크로미터 미만의 평균 유효 직경을 가지며, 예를 들어 입자는 약 25 nm 내지 약 500 nm, 예를 들어 약 50 nm 내지 약 250 nm, 약 100 nm 내지 약 150 nm, 또는 약 450 nm 내지 650 nm의 평균 유효 직경, 또는 약 25 μm 내지 약 500 μm, 예를 들어 약 50 μm 내지 약 250 μm, 약 100 μm 내지 약 150 μm, 또는 약 450 μm 내지 650 μm의 평균 유효 직경을 갖는다. 입자의 크기 (예를 들어, 평균 유효 직경)는 투과 전자 현미경법 (TEM), 주사 전자 현미경법 (SEM), 원자력 현미경법 (AFM), 광자 상관 분광법 (PCS), 나노입자 표면적 모니터 (NSAM), 응축 입자 계수기 (CPC), 차등 이동성 분석기 (DMA), 주사 이동성 입자 사이저 (SMPS), 나노입자 추적 분석 (NTA), X선 회절 (XRD), 에어로졸 비행 시간 질량 분광법 (ATFMS), 및 에어로졸 입자 질량 분석기 (APM)를 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 평가될 수 있다.
한 실시양태에서, 전달 비히클은 폴리(락트산-코-글리콜산) (PLGA), 폴리락트산 (PLA), 상이한 분자량 (예를 들어, 2, 22 및 25 kDa)을 갖는 선형 및/또는 분지형 PEI, 덴드리머, 예컨대 폴리아미도아민 (PAMAM) 및 폴리메토아크릴레이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는 중합체; 리포솜, 에멀젼, DOTAP, DOTMA, DMRIE, DOSPA, 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), DOPE 또는 DC-콜레스테롤을 포함하나 이에 제한되지는 않는 지질; 폴리-L-리신 또는 프로타민을 포함하나 이에 제한되지는 않는 펩티드 기반 벡터; 또는 폴리(β-아미노 에스테르), 키토산, PEI-폴리에틸렌 글리콜, PEI-만노스-덱스트로스, 또는 DOTAP-콜레스테롤을 포함한다.
한 실시양태에서, 전달 비히클은 당중합체-기반 전달 비히클, 폴리(글리코아미도아민) (PGAA)이다. 이들 물질은 다양한 탄수화물의 메틸에스테르 또는 락톤 유도체 (D-글루카레이트 (D), 메조-갈락타레이트 (G), D-만나레이트 (M), 및 L-타르타레이트 (T))를 일련의 올리고에틸렌아민 단량체 (1-4개의 에틸렌아민 함유)와 중합함으로써 생성된다 (Liu and Reineke, 2006). 중합체 반복 단위에서 이들 탄수화물 및 4개의 에틸렌아민으로 구성된 서브세트가 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, GPER-PROTAC에 대한 전달 비히클은 폴리에틸렌이민 (PEI), 폴리아미도아민 (PAMAM), PEI-PEG, PEI-PEG-만노스, 덱스트란-PEI, OVA 접합체, PLGA 마이크로입자, 또는 PAMAM으로 코팅된 PLGA 마이크로입자, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 중합체는 폴리아미도아민 (PAMAM) 덴드리머를 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 현재 개시된 나노입자를 제조하는데 적합한 폴리아미도아민 덴드리머는 3세대, 4세대, 5세대 또는 적어도 6세대 덴드리머를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 전달 비히클은 지질, 예를 들어 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로펠]-N,N,N-트리메틸암모늄 (DOTMA), 2,3-디올레일옥시-N-[2-스페르민 카르복사미드] 에틸-N,N-디메틸-1-프로판암모늄 트리플루오르아세테이트 (DOSPA, 리포펙타민); 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DOTAP); N-[1-(2,3-디미리스틸옥시) 프로필]; N,N-디메틸-N-(2-히드록시에틸) 암모늄 브로마이드 (DMRIE), 3-β-[N-(N,N'-디메틸아미노에탄) 카르바모일] 콜레스테롤 (DC-Chol); 디옥타데실 아미도글리세릴 스페르민 (DOGS, 트랜스펙탐); 또는 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB)를 포함한다. 양이온성 지질의 양으로 하전된 친수성 헤드 그룹은 대개 모노아민, 예컨대 3차 및 4차 아민, 폴리아민, 아미디늄 또는 구아니디늄 기로 이루어진다. 일련의 피리디늄 지질이 개발되었다 (Zhu et al., 2008; van der Woude et al., 1997; Ilies et al., 2004). 피리디늄 양이온성 지질 외에, 다른 유형의 헤테로시클릭 헤드 그룹은 이미다졸, 피페리진 및 아미노산을 포함한다. 양이온성 헤드 그룹의 주요 기능은 정전기 상호작용을 통해 음으로 하전된 핵산을 약간 양으로 하전된 나노입자에 응축시켜, 향상된 세포 흡수 및 엔도솜 탈출을 유발하는 것이다.
2개의 선형 지방산 쇄를 갖는 지질, 예컨대 DOTMA, DOTAP 및 SAINT-2 또는 DODAC, 뿐만 아니라 테트라알킬 지질 쇄 계면활성제, N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드 (DODAC)의 이량체가 전달 비히클로서 사용될 수 있다. 이들의 소수성 쇄 길이 (C16:1, C18:1 및 C20:1)에 관계없이 모든 트랜스-배향된 지질은 이들의 시스-배향된 대응물과 비교하여 형질감염 효율을 향상시키는 것으로 보인다.
전달 비히클로서 유용한 중합체의 구조는 선형 중합체, 예컨대 키토산 및 선형 폴리(에틸렌이민), 분지형 중합체, 예컨대 분지형 폴리(에틸렌이민) (PEI), 원형-유사 중합체, 예컨대 시클로덱스트린, 네트워크 (가교된) 유형 중합체, 예컨대 가교된 폴리(아미노산) (PAA), 및 덴드리머를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 덴드리머는 중심 코어 분자로 이루어지며, 여기로부터 여러 고도로 분지된 아암이 '성장'하여 대칭 또는 비대칭 방식으로 트리-유사 구조를 형성한다. 덴드리머의 예에는 폴리아미도아민 (PAMAM) 및 폴리프로필렌이민 (PPI) 덴드리머가 포함된다.
DOPE 및 콜레스테롤은 일반적으로 리포솜을 제조하기 위해 중성 공동-지질로 사용된다. 분지형 PEI-콜레스테롤 수용성 지질중합체 접합체는 양이온성 미셀로 자기-어셈블리한다. 비이온성 중합체인 플루로닉 (폴록사머), 및 플루로닉 L61 및 F127의 조합인 SP1017이 또한 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, PLL과의 복합체 형성이 캡슐화 효율을 또한 증가시킬 수 있지만, PLGA 입자는 캡슐화 빈도를 증가시키기 위해 사용된다. 다른 물질, 예를 들어 PEI, DOTMA, DC-Chol 또는 CTAB가 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, GPER-PROTAC은 폴록사머의 히드로겔, 폴리아크릴아미드, 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트), 카르복시비닐-중합체 (예를 들어, 카르보폴 934, 굿리치 케미칼 캄파니(Goodrich Chemical Co.)), 셀룰로스 유도체, 예를 들어 메틸셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트 및 히드록시프로필 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈 또는 폴리비닐 알콜, 또는 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는 물질에 매립되거나 적용된다.
일부 실시양태에서, 생체적합성 중합체성 물질은 생분해성 중합체성 예컨대 콜라겐, 예를 들어 히드록실화된 콜라겐, 피브린, 폴리락트산-폴리글리콜산, 또는 폴리무수물로부터 유래된다. 다른 예에는 제한 없이, 임의의 생체적합성 중합체 (친수성, 소수성 또는 양친매성), 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트 공중합체 (EVA), 폴리메틸 메타크릴레이트, 폴리아미드, 폴리카르보네이트, 폴리에스테르, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리테트라플루오로에틸렌, N-이소프로필아크릴아미드 공중합체, 폴리(에틸렌 옥시드)/폴리(프로필렌 옥시드) 블록 공중합체, 폴리(에틸렌 글리콜)/폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드) 블록 공중합체, 폴리글리콜리드, 폴리락티드 (PLLA 또는 PDLA), 폴리(카프로락톤) (PCL), 또는 폴리(디옥사논) (PPS)이 포함된다.
또 다른 실시양태에서, 생체적합성 물질은 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리에틸렌 옥시드 및 폴리프로필렌 옥시드의 공중합체, 폴리글리콜산 및 폴리히드록시알카노에이트의 조합, 젤라틴, 알기네이트, 폴리-3-히드록시부티레이트, 폴리-4-히드록시부티레이트, 및 폴리히드록시옥타노에이트, 및 폴리아크릴로니트릴폴리비닐클로라이드를 포함한다.
한 실시양태에서, 하기 중합체, 예를 들어 천연 중합체, 예컨대 전분, 키틴, 글리코사미노글리칸, 예를 들어 히알루론산, 더마탄 술페이트 및 콘드로이틴 술페이트, 및 미생물 폴리에스테르, 예를 들어 히드록시알카노에이트, 예컨대 히드록시발레레이트 및 히드록시부티레이트 공중합체, 및 합성 중합체, 예를 들어 폴리(오르토에스테르) 및 폴리무수물, 및 글리콜리드 및 락티드의 동종중합체 및 공중합체 (예를 들어, 폴리(L-락티드, 폴리(L-락티드-코-D,L-락티드), 폴리(L-락티드-코-글리콜리드, 폴리글리콜리드 및 폴리(D,L-락티드), 폴리(D,L-락티드-코글리콜리드), 폴리(락트산 코리신) 및 폴리카프로락톤이 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 생체적합성 물질은 단리된 세포외 매트릭스 (ECM)로부터 유래된다. ECM은 다양한 세포 집단, 조직 및/또는 장기, 예를 들어 온혈 척추동물의 피부, 간, 소화기, 호흡기, 장, 비뇨기 또는 생식기 관의 진피를 포함하는 임의의 장기 또는 조직 공급원의 내피 층으로부터 단리될 수 있다. 본 발명에서 사용된 ECM은 공급원의 조합으로부터 유래될 수 있다. 단리된 ECM은 시트, 미립자 형태, 겔 형태 등으로 제조될 수 있다.
생체적합성 중합체는 실크, 엘라스틴, 키틴, 키토산, 폴리(d-히드록시산), 폴리(무수물), 또는 폴리(오르토에스테르)를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 생체적합성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 락트산 및 글리콜산의 공중합체, 폴리에틸렌 글리콜과 락트산 및 글리콜산의 공중합체, 폴리(E-카프로락톤), 폴리(3-히드록시부티레이트), 폴리(p-디옥사논), 폴리프로필렌 푸마레이트, 폴리(오르토에스테르), 폴리올/디케텐 아세탈 부가 중합체, 폴리(세바스산 무수물) (PSA), 폴리(카르복시비스카르복시페녹시페녹시 헥손 (PCPP) 폴리[비스(p-카르복시페녹시) 메탄] (PCPM), SA, CPP 및 CPM의 공중합체, 폴리(아미노산), 폴리(슈도 아미노산), 폴리포스파젠, 폴리[(디클로로)포스파젠] 또는 폴리[(유기) 포스파젠]의 유도체, 폴리-히드록시부티르산, 또는 S-카프로산, 폴리락티드-코-글리콜리드, 폴리락트산, 폴리에틸렌 글리콜, 셀룰로스, 산화된 셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴 또는 이의 유도체로 형성될 수 있다.
그러므로, 중합체는 자연 발생 중합체, 합성 중합체 또는 이들의 조합을 포함하는 중합체를 포함하는 임의의 광범위한 물질로 형성될 수 있다. 한 실시양태에서, 스캐폴드는 생분해성 중합체를 포함한다. 한 실시양태에서, 자연 발생 생분해성 중합체는 자연 발생 중합체로부터 유래된 합성 생분해성 중합체를 제공하도록 변형될 수 있다. 한 실시양태에서, 중합체는 폴리(락트산) ("PLA") 또는 폴리(락트산-코-글리콜산) ("PLGA")이다. 한 실시양태에서, 스캐폴드 중합체는 알기네이트, 키토산, 폴리(2-히드록시에틸메타크릴레이트), 자일로글루칸, 2-메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린, 폴리(비닐 알콜), 실리콘, 소수성 폴리에스테르 및 친수성 폴리에스테르의 공중합체, 폴리(락티드-코-글리콜리드), N-이소프로필아크릴아미드 공중합체, 폴리(에틸렌 옥시드)/폴리(프로필렌 옥시드), 폴리락트산, 폴리(오르토에스테르), 폴리무수물, 폴리우레탄, 2-히드록시에틸메타크릴레이트 및 나트륨 메타크릴레이트의 공중합체, 포스포릴콜린, 시클로덱스트린, 폴리술폰 및 폴리비닐피롤리딘, 전분, 폴리-D,L-락트산-파라-디옥사논-폴리에틸렌 글리콜 블록 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리(테트라플루오로에틸렌), 폴리-엡실론-카프로락톤, 또는 가교된 키토산 히드로겔을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
수많은 리포솜 전달 시스템이 GPER-PROTAC을 갖는 제형에 사용될 수 있다. 사실상 임의의 지질을 사용하여 리포솜을 형성할 수 있다. 사용을 위한 예시적인 지질은 예를 들어 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포르-L-세린] (DOPS), 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 (18:1 DOTAP), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) (DOPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (18:1 PEG-2000 PE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (16:0 PEG-2000 PE), 1-올레오일-2-[12-[(7-니트로-2-1,3-벤즈옥사디아졸-4-일)아미노]라우로일]-sn-글리세로-3-포스포콜린 (18:1-12:0 NBD PC), 1-팔미토일-2-{12-[(7-니트로-2-1,3-벤즈옥사디아졸-4-일)아미노]라우로일}-sn-글리세로-3-포스포콜린 (16:0-12:0 NBD PC), 콜레스테롤 및 이들의 혼합물/조합을 포함한다. 콜레스테롤이 한 실시양태에 따른 프로토셀의 지질 이중층의 중요한 구성성분일 수 있다는 사실이 주어진 실시양태의 목적을 위해 콜레스테롤 (기술적으로 지질은 아님)은 지질로서 제시된다. 종종 콜레스테롤은 이중층의 구조적 무결성을 향상시키기 위해 혼입된다. 이들 지질은 모두 아반티 폴라 리피즈, 인크.(Avanti Polar Lipids, Inc.) (미국 앨라바마주 앨라배스터)로부터 상업적으로 쉽게 입수가능하다.
제약 조성물
본 개시내용은 적어도 하나의 GPER-PROTAC 및 제약상 허용되는 (예를 들어, 생리학적으로 허용되는) 담체를 포함하거나 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어진 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 조성물이 적어도 하나의 GPER-PROTAC 및 임의로 제약상 허용되는 담체로 본질적으로 이루어진 경우, 조성물에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가 구성성분 (예를 들어, 아주반트, 완충제, 안정화제, 항염증제, 가용화제, 보존제 등)이 포함될 수 있다. 한 실시양태에서, 조성물이 입자로 캡슐화된 적어도 하나의 GPER-PROTAC 및 제약상 허용되는 담체로 이루어진 경우, 조성물은 임의의 추가 구성성분을 포함하지 않는다. 임의의 적합한 담체가 본 발명의 맥락 내에서 사용될 수 있고, 이러한 담체는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 담체의 선택은 부분적으로 조성물이 투여될 수 있는 특정 부위 및 조성물을 투여하는데 사용되는 특정 방법에 의해 결정될 것이다. 조성물은 저장을 위해 동결 또는 동결건조될 수 있고, 사용 전에 적합한 멸균 담체에서 재구성될 수 있다. 조성물은 예를 들어 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2001)]에 기재된 통상적인 기술에 따라 생성될 수 있다.
조성물에 적합한 제형은 항산화제, 완충제 및 정균제를 함유할 수 있는 수성 및 비수성 용액, 등장성 멸균 용액, 및 현탁화제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 제형은 단위-용량 또는 다중-용량 밀봉 컨테이너, 예컨대 앰플 및 바이알에 제공될 수 있으며, 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들어 물을 첨가하기만 하면 되는 동결-건조된 (동결건조된) 조건에서 저장될 수 있다. 즉석 용액 및 현탁액은 이전에 기재된 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, 담체는 완충된 염수 용액이다. 한 실시양태에서, GPER-PROTAC은 투여 전에 손상으로부터 GPER-PROTAC을 보호하도록 제형화된 조성물로 투여된다. 예를 들어, 조성물은 GPER-PROTAC을 제조, 저장 또는 투여하는데 사용되는 장치, 예컨대 유리 제품, 주사기 또는 바늘에서 GPER-PROTAC의 손실을 감소시키도록 제형화될 수 있다. 조성물은 GPER-PROTAC의 광 감수성 및/또는 온도 감수성을 감소시키도록 제형화될 수 있다. 이를 위해, 조성물은 제약상 허용되는 액체 담체, 예컨대, 예를 들어 상기 기재된 것들, 및 폴리소르베이트 80, L-아르기닌, 폴리비닐피롤리돈, 트레할로스 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 안정화제를 포함할 수 있다.
조성물은 또한 형질도입 효율을 향상시키도록 제형화될 수 있다. 또한, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 적어도 하나의 GPER-PROTAC이 다른 치료제 또는 생물학적 활성제와 함께 조성물에 존재할 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 염증을 제어하는 인자, 예컨대 이부프로펜 또는 스테로이드는 부종 및 염증을 감소시키기 위한 조성물의 일부일 수 있다. 면역계 자극제 또는 아주반트, 예를 들어 인터루킨, 지질다당류, 및 이중-가닥 RNA가 또한 투여될 수 있다. 항생제, 즉, 살미생물제 및 살진균제는 기존 감염을 치료하고/거나 미래 감염의 위험을 감소시키기 위해 존재할 수 있다.
주사가능한 데포 형태는 생분해성 중합체, 예컨대 폴리락티드-폴리글리콜리드에서 적어도 하나의 GPER-PROTAC을 형성함으로써 제조된다. GPER-PROTAC 대 중합체의 비율, 및 사용된 특정 중합체의 성질에 따라, GPER-PROTAC 방출 속도를 제어할 수 있다. 다른 생분해성 중합체의 예에는 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(무수물)이 포함된다. 데포 주사가능한 제형은 또한 임의로 신체 조직과 양립가능한 리포솜 또는 마이크로에멀젼의 중합체와 복합체에 GPER-PROTAC을 포획함으로써 제조된다.
특정 실시양태에서, 제형은 폴리아미드, 폴리카르보네이트, 폴리알킬렌, 아크릴산 및 메타크릴산 에스테르의 중합체, 폴리비닐 중합체, 폴리글리콜리드, 폴리실록산, 폴리우레탄 및 이들의 공중합체, 셀룰로스, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 락트산 및 글리콜산의 중합체, 폴리무수물, 폴리(오르토)에스테르, 폴리(부틱산), 폴리(발레르산), 폴리(락티드-코-카프로락톤), 다당류, 단백질, 폴리히알루론산, 폴리시아노아크릴레이트, 및 이들의 블렌드, 혼합물 또는 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 생체적합성 중합체를 포함한다.
조성물은 제어 또는 지속 방출을 허용하는 장치, 예컨대 스펀지, 생체적합성 메쉬워크, 기계적 저장소 또는 기계적 임플란트 내에 또는 상에 투여될 수 있다. 중합체성 조성물로 구성된 임플란트 (예를 들어 미국 특허 번호 5,443,505 참조), 장치 (예를 들어 미국 특허 번호 4,863,457 참조), 예컨대 이식가능한 장치, 예를 들어 기계적 저장소 또는 임플란트 또는 장치가 GPER-PROTAC의 투여에 특히 유용하다. 조성물은 또한 예를 들어 겔 폼, 히알루론산, 젤라틴, 콘드로이틴 술페이트, 폴리포스포에스테르, 예컨대 비스-2-히드록시에틸-테레프탈레이트 (BHET), 및/또는 폴리락트산-글리콜산을 포함하는 지속-방출 제형의 형태로 투여될 수 있다 (예를 들어 미국 특허 번호 5,378,475 참조).
포유동물에 투여되는 조성물 중 GPER-PROTAC의 용량은 포유동물의 크기 (질량), 임의의 부작용의 정도, 특정 투여 경로 등을 포함하는 다수의 인자에 의존할 것이다. 한 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 GPER-PROTAC을 포함하는 조성물의 "치료 유효량"을 투여하는 것을 포함한다. "치료 유효량"은 원하는 치료 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 치료 유효량은 인자, 예컨대 질환 또는 장애의 정도, 개체의 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 도출하는 GPER-PROTAC의 능력에 따라 달라질 수 있다.
한 실시양태에서, 조성물은 포유동물에게 1회 투여된다. 조성물의 단일 투여는 최소 부작용으로 포유동물에서 지속적인 발현을 초래할 수 있다고 믿어진다. 그러나, 특정 경우에, 조성물에 대한 세포의 충분한 노출을 보장하기 위해 치료 기간 동안 조성물을 여러 번 투여하는 것이 적절할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 치료 기간 동안 포유동물에게 2회 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 6, 8, 9 또는 10회 또는 그 이상) 투여될 수 있다.
본 개시내용은 적어도 하나의 GPER-PROTAC의 치료 유효량을 포함하는 제약상 허용되는 조성물을 제공한다.
투여 경로, 투여량 및 투여 형태
GPER-PROTAC의 투여는 예를 들어 수용자의 생리학적 상태, 및 숙련된 전문인에게 공지된 다른 인자에 따라 연속적 또는 간헐적일 수 있다. GPER-PROTAC의 투여는 본질적으로 미리 선택된 기간에 걸쳐 연속적일 수 있거나, 일련의 간격을 둔 용량일 수 있다. 국소 투여, 예를 들어 비강내 또는 경막내, 및 전신 투여가 모두 고려된다. 임의의 투여 경로, 예를 들어 정맥내, 비강내 또는 경구, 또는 국소 투여가 사용될 수 있다.
임의로 지속 방출을 위해 제형화될 수 있는 GPER-PROTAC을 포함하는 하나 이상의 적합한 단위 투여 형태는 직장, 협측, 질 및 설하, 경피, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 흉곽내, 또는 폐내 경로를 포함한 국소, 예를 들어 경막내, 경구 또는 비경구를 포함한 다양한 경로에 의해 투여될 수 있다. 제형은 적절한 경우 별개의 단위 투여 형태로 편리하게 제공될 수 있고, 약학에 널리 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은 벡터를 액체 담체, 고체 매트릭스, 반고체 담체, 미분된 고체 담체 또는 이들의 조합과 회합시킨 후, 필요한 경우 생성물을 원하는 전달 시스템으로 도입 또는 형상화하는 단계를 포함할 수 있다.
특정 결과를 달성하기 위해 투여되는 GPER-PROTAC의 양은 상태, 환자 특이적 파라미터, 예를 들어 키, 체중 및 연령, 및 예방 또는 치료가 달성되어야 하는지 여부를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 인자에 따라 달라질 것이다.
GPER-PROTAC은 투여에 적합한 제형의 형태로 편리하게 제공될 수 있다. 적합한 투여 형식은 표준 절차에 따라 각 환자에 대해 개별적으로 의료 전문인이 결정하는 것이 최상이다. 적합한 제약상 허용되는 담체 및 이들의 제형은 표준 제형 논문, 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceuticals Sciences]에 기재되어 있다. "제약상 허용되는"은 제형의 다른 성분과 양립가능하고 이의 수용자에게 해롭지 않은 담체, 희석제, 부형제 및/또는 염을 의미한다.
GPER-PROTAC은 허용되는 보존제, 예컨대 메타크레졸 0.1% 내지 0.75%, 또는 0.15% 내지 0.4% 메타크레졸과 함께 일반적으로 안전한 것으로 간주되는 관련 기술분야에 공지된 완충제 용액, 예컨대 인산나트륨으로 pH 완충된, 용액을 약 등장성으로 만들기 위한 부형제, 예를 들어 4.5% 만니톨 또는 0.9% 염화나트륨으로, 중성 pH, 예를 들어 약 pH 6.5 내지 약 pH 8.5, 또는 약 pH 7 내지 8의 용액으로 제형화될 수 있다. 원하는 등장성을 수득하는 것은 염화나트륨 또는 다른 제약상 허용되는 작용제, 예컨대 덱스트로스, 붕산, 타르타르산나트륨, 프로필렌 글리콜, 폴리올 (예컨대 만니톨 및 소르비톨), 또는 다른 무기 또는 유기 용질을 사용하여 성취될 수 있다. 염화나트륨은 나트륨 이온을 함유하는 완충제에 유용하다. 원하는 경우, 저장 수명 및 안정성을 향상시키기 위해 상기 조성물의 용액을 또한 제조할 수 있다. 치료적으로 유용한 조성물은 일반적으로 허용되는 절차에 따라 성분을 혼합함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 선택된 구성성분을 혼합하여 농축된 혼합물을 생성할 수 있으며, 이는 이어서 물 및/또는 pH를 제어하기 위한 완충제 또는 긴장성을 제어하기 위한 추가 용질의 첨가에 의해 최종 농도 및 점도로 조정될 수 있다.
GPER-PROTAC은 1회 또는 다중 용량에 효과적인 양을 함유하는 투여 형태로 제공될 수 있다. GPER-PROTAC은 적어도 약 0.0001 mg/kg 내지 약 1 mg/kg, 적어도 약 0.001 mg/kg 내지 약 0.5 mg/kg, 적어도 약 0.01 mg/kg 내지 약 0.25mg/kg 또는 적어도 약 0.01 mg/kg 내지 약 0.25 mg/kg 체중의 투여량으로 투여될 수 있지만, 다른 투여량이 유익한 결과를 제공할 수 있다. 투여되는 양은 포유동물의 질환, 체중, 신체 상태, 건강 및/또는 연령을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자는 동물 모델 또는 관련 기술분야에서 이용가능한 다른 테스트 시스템을 사용하여 임상의에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 언급된 바와 같이, 투여될 정확한 용량은 담당 임상의에 의해 결정되지만, 1 mL 포스페이트 완충된 염수일 수 있다. 한 실시양태에서, 0.0001 내지 1 mg 이상, 예를 들어 최대 1 g (개별 또는 분할된 용량으로), 예를 들어 0.001 내지 0.5 mg, 또는 0.01 내지 0.1 mg의 GPER-PROTAC이 투여될 수 있다.
예시로서, 리포솜 및 다른 지질-함유 복합체를 사용하여 하나 이상의 GPER-PROTAC을 전달할 수 있다.
GPER-PROTAC을 함유하는 제약 제형은 널리 공지되어 있고 쉽게 입수가능한 성분을 사용하여 관련 기술분야에 공지된 절차에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 작용제는 일반적인 부형제, 희석제 또는 담체로 제형화될 수 있으며, 정제, 캡슐, 현탁액, 분말 등으로 형성될 수 있다. GPER-PROTAC은 또한 예를 들어 근육내, 피하 또는 정맥내 경로에 의한 비경구 투여에 적절한 엘릭시르 또는 용액으로서 제형화될 수 있다.
제약 제형은 또한 수성 또는 무수 용액, 예를 들어 동결건조된 제형 또는 분산액의 형태, 또는 대안적으로 에멀젼 또는 현탁액의 형태를 취할 수 있다.
한 실시양태에서, 벡터는 예를 들어 주사, 예를 들어 볼루스 주사 또는 카테터를 통한 연속적 주입에 의한 투여를 위해 제형화될 수 있고, 앰플, 미리 충전된 주사기, 작은 부피 주입 컨테이너 또는 첨가된 보존제가 포함된 다중-용량 컨테이너의 단위 용량 형태로 제공될 수 있다. 활성 성분은 유성 또는 수성 비히클 중 현탁액, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있으며, 제형화제, 예컨대 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어 멸균, 무발열원 물을 사용한 구성을 위해 멸균 고체의 무균 단리에 의해 또는 용액으로부터의 동결건조에 의해 수득된 분말 형태일 수 있다.
이들 제형은 선행 기술에 널리 공지된 제약상 허용되는 비히클 및 아주반트를 함유할 수 있다. 예를 들어, 생리학적 관점으로부터 허용되는 하나 이상의 유기 용매(들)를 사용하여 용액을 제조하는 것이 가능하다.
흡입에 의한 상기도 (비강) 또는 하기도로의 투여를 위해, 벡터는 취입기, 네뷸라이저 또는 가압된 팩 또는 에어로졸 스프레이를 전달하는 다른 편리한 수단으로부터 편리하게 전달된다. 가압된 팩은 적합한 추진제, 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 포함할 수 있다. 가압된 에어로졸의 경우, 투여량 단위는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다.
대안적으로, 흡입 또는 취입에 의한 투여를 위해, 조성물은 건조 분말, 예를 들어 치료제 및 적합한 분말 베이스, 예컨대 락토스 또는 전분의 분말 믹스의 형태를 취할 수 있다. 분말 조성물은 예를 들어 캡슐 또는 카트리지, 또는 예를 들어 젤라틴 또는 블리스터 팩의 단위 투여 형태로 제공될 수 있으며, 이로부터 분말이 흡입기, 취입기 또는 계량-용량 흡입기의 도움으로 투여될 수 있다
비강내 투여의 경우, GPER-PROTAC은 점비제, 액체 스프레이를 통해, 예컨대 플라스틱 병 아토마이저 또는 계량-용량 흡입기를 통해 투여될 수 있다. 전형적인 아토마이저는 미스토미터(Mistometer) (윈트롭(Wintrop)) 및 메디할러(Medihaler) (리커(Riker))이다.
국소 전달은 또한 예를 들어 카테터 또는 바늘을 사용하여 질환 부위에 또는 그 근처에서 GPER-PROTAC을 투여하는 다양한 기술에 의한 것일 수 있다. 부위-특이적 또는 표적화된 국소 전달 기술의 예는 제한하려는 것이 아니라 이용가능한 기술을 설명하려는 것이다. 예에는 국소 전달 카테터, 예컨대 주입 또는 유치 카테터, 예를 들어 바늘 주입 카테터, 션트 및 스텐트 또는 다른 이식가능한 장치, 부위 특이적 담체, 직접 주사, 또는 직접 적용이 포함된다.
본원에 기재된 제형 및 조성물은 또한 다른 성분, 예컨대 항미생물제 또는 보존제를 함유할 수 있다.
대상체
대상체는 인간 및 비인간 동물을 포함한 임의의 동물일 수 있다. 비인간 동물은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류 및 파충류 (비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소 및 말 포함)를 포함한다. 대상체는 또한 가축, 예컨대, 소, 돼지, 양, 가금류 및 말, 또는 애완동물, 예컨대 개 및 고양이일 수 있다.
대상체는 산화적 손상을 앓고 있거나 이에 대한 위험에 처한 인간 대상체를 포함한다. 대상체는 일반적으로 관련 기술분야의 통상의 기술자, 예컨대 의료 전문인에 의해 본 발명의 상태로 진단된다.
본원에 기재된 방법은 임의의 종, 성별, 연령, 민족 집단 또는 유전자형의 대상체에 대해 사용될 수 있다. 따라서, 용어 대상체는 남성 및 여성을 포함하며, 노인, 노인에서 성인으로의 전환 연령 대상체 성인, 성인에서 미성년으로의 전환 연령 대상체, 및 청소년, 어린이 및 유아를 포함한 미성년을 포함한다.
인간 민족 집단의 예에는 코카시안, 아시아인, 히스패닉, 아프리카인, 아프리카계 미국인, 아메리카 원주민, 셈족 및 태평양 섬 주민들이 포함된다. 본 발명의 방법은 일부 민족 집단, 예컨대 코카시안, 특히 북유럽 집단, 뿐만 아니라 아시아인 집단에 더 적합할 수 있다.
용어 대상체는 또한 상기 기재된 바와 같이 본 발명이 필요한 한 임의의 유전자형 또는 표현형의 대상체를 포함한다. 또한, 대상체는 임의의 모발색, 눈색, 피부색 또는 이들의 임의의 조합에 대한 유전자형 또는 표현형을 가질 수 있다.
용어 대상체는 임의의 신장, 체중, 또는 임의의 장기 또는 신체 부분 크기 또는 형상의 대상체를 포함한다.
예시적인 링커
여기에서 용어 "연결기", "링커 분자", "링커" 등은 적어도 2개의 별개의 화학적 실체를 연결하는데 유용한 임의의 분자 기를 지칭한다. 화학적 실체 간의 연결을 수행하기 위해, 각 반응물이 화학적으로 상보적인 반응성 기를 함유할 필요가 있다. 상보적인 반응성 기의 예는 아미드 연결을 형성하기 위한 아미노 및 카르복실 기, 에스테르 연결을 형성하기 위한 카르복시 및 히드록시 기, 알킬아미노 연결을 형성하기 위한 아미노 및 알킬 할라이드, 디술피드를 형성하기 위한 티올 및 티올, 또는 티오에테르를 형성하기 위한 티올 및 말레이미드 또는 알킬할라이드이다. 히드록실, 카르복실, 아미노 및 다른 관능성은 이미 존재하지 않는 경우 공지된 방법에 의해 도입될 수 있다. 원하는 경우, 반응성 상보적 기 중 하나 이상이 "보호"될 수 있으며, 이 경우 보호된 반응성 기는 특정 연결 화학에 영향을 미치는데 필요한 화학을 수행하기 전에 "탈보호"되어야 한다. 특정 상황에서 임의의 적합한 보호/탈보호 반응식을 사용할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 임의의 적합한 분자 기가 링커로서 사용될 수 있으며, 특정 상황에 적합한 분자 기는 다양할 수 있지만, 원하는 연결을 수행하기 위해 적합한 화학적으로 상보적인 반응성 기를 갖는 적절한 분자 기를 선택 또는 제조하는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 기술 범위 내에서 용이하다. 특정 상황에서 선택된 분자 기에 관계없이, 이는 본 발명에 따른 접합체를 형성하기 위해 상이한 화학적 실체 사이에 안정적인 공유 결합을 제공할 수 있다. 구체적으로, 공유 결합은 링커 및 연결기가 적용되는 용액 조건에 비해 안정적이어야 한다. 일반적으로, 임의의 적합한 길이 또는 배열의 링커가 사용될 수 있지만, 약 4 내지 80개의 탄소, 바람직하게는 약 10 내지 70개의 탄소, 약 10 내지 50개의 탄소, 또는 약 10 내지 30개의 탄소 또는 약 10 내지 20개의 탄소를 함유하는 링커가 고려된다. 링커는 또한 분자 연결기에 하나 이상의 헤테로원자 (예를 들어, N, O, S 및 P), 특히 0 내지 10개의 헤테로원자를 함유할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 링커는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 헤테로원자를 함유할 수 있다. 또 다른 추가 실시양태에서, 링커는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 2가 산소 (-O-), 2가 질소 (-NH-), 또는 둘 모두를 함유한다. 분자 연결기는 분지쇄 또는 직쇄일 수 있다. 또한 일부 경우에, 접합체가 퓨린 유사체 및 표적화 모이어티 또는 특이적 결합 분자 사이에 직접 형성될 수 있으며, 이 경우 링커가 사용되지 않음이 이해될 것이다. 이러한 경우에, 퓨린 유사체의 치환체 및 특이적 결합 분자의 치환체는 전형적으로 상이한 화학적 실체를 연결하기 위해 적합한 화학을 수행하는데 필요한 상보적인 반응성 기 (적절한 경우 보호될 수 있는 하나 이상)를 제공하도록 유도체화된다.
링커 쇄의 길이는 원자의 면에서, 연결되지 않은 GPER 리간드 또는 E3 유비퀴틴 리가제 리간드의 원자에 상응하는 원자를 포함하지 않고, 링커의 선형 백본을 따라 G-단백질 커플링된 에스트로겐 수용체 (GPER) 리간드로부터 E3 유비퀴틴 리가제 리간드까지의 원자 수의 계수에 기초하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 베타-에스트라디올이 GPER 리간드인 경우, 링커 쇄의 원자 수를 계수할 때 베타-에스트라디올의 산소는 모두 계수되지 않는다. 또 다른 추가 실시양태에서, 링커는 GPER 리간드 및 E3 유비퀴틴 리가제 리간드 사이 (그러나 포함하지 않음)의 선형 경로에서 계수된 바와 같은, 약 5, 6, 7, 8, 9, 19, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 또는 그 이상, 최대 200개의 원자의 백본의 원자 수를 갖는 쇄 길이를 갖는다. 추가 실시양태에서, 원자의 면에서 6, 7, 8, 9, 19, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개 이하의 원자의 쇄 길이. 링커의 길이는 또한 링커를 각각의 이러한 리간드에 연결하는 결합을 포함하여 GPER 리간드와 E3 유비퀴틴 리가제 리간드 사이의 선형 경로에서 결합 길이의 계산에 기초하여 옹스트롬의 면에서 기재될 수 있다. 다양한 추가 실시양태에서, 링커는 GPER 리간드와 E3 유비퀴틴 리가제 리간드 사이의 선형 경로에서 결합 길이의 첨가에 기초하여 계산된 바와 같이 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40 옹스트롬 또는 그 이상, 최대 300 옹스트롬의 이러한 계산된 길이를 가질 수 있다. 추가 실시양태에서, 링커는 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 옹스트롬 이하의 계산된 길이를 갖는다.
GPER-PROTAC에 유용한 링커의 비제한적인 예에는 산소 원자, 황 원자, 질소 원자 및/또는 탄소 원자 (및 원자가를 채우는데 필요한 경우 적절하게 첨부된 수소 원자)가 포함되지만, 또한 용해도를 증가시키는 측쇄를 갖는 링커, 예컨대, 예를 들어 모르폴리노, 피페리디노, 피롤리디노, 또는 피페라지노 고리 등을 함유하는 기; 아미노산, 아미노산의 중합체 (단백질 또는 펩티드), 예를 들어 디펩티드 또는 트리펩티드 등; 탄수화물 (다당류), 뉴클레오티드, 예컨대, 예를 들어 PNA, RNA 및 DNA 등; 유기 물질의 중합체, 예컨대, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리락티드 등이 포함된다. 한 실시양태에서, 링커는 2가 아릴 또는 헤테로아릴, 비스-아미드 아릴, 비스-아미드 헤테로아릴, 비스-히드라지드 아릴, 비스-히드라지드 헤테로아릴 등일 수 있다. 한 실시양태에서, 링커는 최대 약 24 내지 50개의 원자를 갖는 쇄를 갖고; 여기서 원자는 탄소, 질소, 황, 비-퍼옥시드 산소 및 인으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 링커는 약 4 내지 약 12 내지 20개의 원자 또는 약 16 내지 약 48개의 원자를 갖는 쇄를 갖는다.
한 실시양태에서, 링커는 알킬렌 링커, 페닐렌 링커 또는 알킬 링커이다. 링커는 C4-C48 알킬 또는 이의 헤테로 형태일 수 있다. 이들 링커는 카르보닐 기를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 링커는 때때로 -C(Y')(Z')-C(Y")(Z")- 링커이며, 여기서 Y', Y", Z' 및 Z"는 각각 독립적으로 수소 C1-C10 알킬, 치환된 C1-C10 알킬, C1-C10 알콕시, 치환된 C1-C10 알콕시, C3-C9 시클로알킬, 치환된 C3-C9 시클로알킬, C5-C10 아릴, 치환된 C5-C10 아릴, C5-C9 헤테로시클릭, 치환된 C5-C9 헤테로시클릭, C1-C6 알카노일, Het, Het C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 알콕시카르보닐이며, 여기서 알킬, 시클로알킬, 알카노일, 알콕시카르보닐, Het, 아릴 또는 헤테로시클릭 기 상의 치환체는 히드록실, C1-C10 알킬, 히드록실 C1-C10 알킬렌, C1-C6 알콕시, C3-C9 시클로알킬, C5-C9 헤테로시클릭, C1-6 알콕시 C1-6 알케닐, 아미노, 시아노, 할로겐 또는 아릴이다. 한 실시양태에서, 링커는 쇄이며, 여기서 쇄의 원자는 탄소, 질소, 황 및 산소로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 임의의 탄소 원자는 예를 들어 옥소로 치환될 수 있고, 여기서 임의의 황 원자는 1 또는 2개의 옥소 기로 치환될 수 있다. 쇄는 하나 이상의 시클로알킬, 아릴, 헤테로시클릴, 또는 헤테로아릴 고리로 산재될 수 있다. 한 실시양태에서, 링커는 쇄에 약 4 내지 약 50개의 원자를 갖는 쇄를 포함하고, 여기서 쇄의 원자는 탄소, 질소, 황 및 산소로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 임의의 탄소 원자는 옥소로 치환될 수 있고, 여기서 임의의 황 원자는 1 또는 2개의 옥소 기로 치환될 수 있다.
한 실시양태에서, 링커는 -(Y)y-, -(Y)y-C(O)N-(Z)z-, -(CH2)y-C(O)N-(CH2)z-, -(Y)y-NC(O)-(Z)z-, -(CH2)y-NC(O)-(CH2)z-를 포함하고, 여기서 각각의 y (아래첨자) 및 z (아래첨자)는 독립적으로 0 내지 20이고, 각각의 Y 및 Z는 독립적으로 C1-C10 알킬, 치환된 C1-C10 알킬, C1-C10 알콕시, 치환된 C1-C10 알콕시, C3-C9 시클로알킬, 치환된 C3-C9 시클로알킬, C5-C10 아릴, 치환된 C5-C10 아릴, C5-C9 헤테로시클릭, 치환된 C5-C9 헤테로시클릭, C1-C6 알카노일, Het, Het C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 알콕시카르보닐이고, 여기서 알킬, 시클로알킬, 알카노일, 알콕시카르보닐, Het, 아릴 또는 헤테로시클릭 기 상의 치환체는 히드록실, C1-C10 알킬, 히드록실 C1-C10 알킬렌, C1-C6 알콕시, C3-C9 시클로알킬, C5-C9 헤테로시클릭, C1-6 알콕시 C1-6 알케닐, 아미노, 시아노, 할로겐 또는 아릴이다. 특정 실시양태에서, 링커는 때때로 -C(Y')(Z')-C(Y")(Z")- 링커이고, 여기서 각각의 Y', Y", Z' 및 Z"는 독립적으로 수소 C1-C10 알킬, 치환된 C1-C10 알킬, C1-C10 알콕시, 치환된 C1-C10 알콕시, C3-C9 시클로알킬, 치환된 C3-C9 시클로알킬, C5-C10 아릴, 치환된 C5-C10 아릴, C5-C9 헤테로시클릭, 치환된 C5-C9 헤테로시클릭, C1-C6 알카노일, Het, Het C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 알콕시카르보닐이고, 여기서 알킬, 시클로알킬, 알카노일, 알콕시카르보닐, Het, 아릴 또는 헤테로시클릭 기 상의 치환체는 히드록실, C1-C10 알킬, 히드록실 C1-C10 알킬렌, C1-C6 알콕시, C3-C9 시클로알킬, C5-C9 헤테로시클릭, C1-6 알콕시 C1-6 알케닐, 아미노, 시아노, 할로겐 또는 아릴이다.
한 실시양태에서, 링커는 아미도 연결기 (예를 들어, -C(O)NH- 또는 -NH(O)C-); 알킬 아미도 연결기 (예를 들어, -C1-C6 알킬-C(O)NH-, -C1-C6 알킬-NH(O)C-, -C(O)NH-C1-C6 알킬-, -NH(O)C-C1-C6 알킬-, -C1-C6 알킬--NH(O)C-C1-C6 알킬-, -C1-C6 알킬-C(O)NH-C1-C6 알킬-, 또는 -C(O)NH-(CH2)t-, 여기서 t는 1, 2, 3 또는 4임); 치환된 5-6원 고리 (예를 들어, 아릴 고리, 헤테로아릴 고리 (예를 들어, 테트라졸, 피리딜, 2,5-피롤리딘디온 (예를 들어, 치환된 페닐 모이어티로 치환된 2,5-피롤리딘디온)), 카르보시클릭 고리, 또는 헤테로시클릭 고리) 또는 산소-함유 모이어티 (예를 들어, -O-, -C1-C6 알콕시)를 포함한다.
한 실시양태에서, 링커는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티 (R3)r을 포함하고, 여기서 R3은 PEG 단위이고, r은 약 1 내지 약 10이다 (예를 들어, r은 약 2 내지 약 6이다). 특정 실시양태에서 R3은 -O-CH2-CH2- 또는 -CH2-CH2-O-이다. 일부 실시양태에서 R3은 -O-CH2-CH2- 또는 -CH2-CH2-O-이고, r은 약 1 내지 약 100 (예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100이다. 특정 관련 실시양태에서, r은 약 5 내지 약 25, 약 10 내지 약 50, 약 5 내지 약 15, 약 12 내지 약 35, 약 25 내지 약 55 또는 약 65 내지 약 95이다. 일부 실시양태에서 (R3)r 치환체는 선형이고, 특정 실시양태에서, (R3)r 치환체는 분지형이다. 선형 모이어티의 경우, s는 때때로 r보다 작고 (예를 들어, R3이 -O-CH2-CH2- 또는 -CH2-CH2-O-인 경우), 때로는 s는 1이다. 일부 실시양태에서 R3은 선형 PEG 모이어티 (예를 들어, 약 1 내지 약 30개의 PEG 단위를 가짐)이다.
다른 링커는 WO19/123367 및 문헌 [Sun et al. (Signal Transd. Targeted Ther., 4:64 (2019))]에 기재된 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "알킬", "알케닐" 및 "알키닐"은 직쇄, 분지쇄 및 시클릭 1가 히드로카르빌 라디칼, 및 이들의 조합을 포함할 수 있으며, 이는 비치환된 경우 C 및 H만을 함유한다. 예에는 메틸, 에틸, 이소부틸, 시클로헥실, 시클로펜틸에틸, 2 프로페닐, 3 부티닐 등이 포함된다. 각각의 이러한 기의 탄소 원자의 총 수는 때때로 본원에 기재되어 있으며, 예를 들어 기가 최대 10개의 탄소 원자를 함유할 수 있는 경우, 이는 1-10C 또는 C1-C10 또는 C1-10으로 표시될 수 있다. 헤테로원자 (전형적으로 N, O 및 S)가 헤테로알킬 기에서와 같이 탄소 원자를 대체하도록 허용되는 경우, 예를 들어 기를 설명하는 숫자 (여전히 예를 들어 C1-C6으로서 표기되긴 하지만)는 기에 있는 탄소 원자의 수 플러스 기재될 고리 또는 쇄의 백본에 있는 탄소 원자에 대한 대체물로서 포함된 이러한 헤테로원자의 수의 합계를 나타낸다.
전형적으로, 본 발명의 알킬, 알케닐 및 알키닐 치환체는 1개의 10C (알킬) 또는 2개의 10C (알케닐 또는 알키닐)를 함유한다. 예를 들어, 이들은 1개의 8C (알킬) 또는 2개의 8C (알케닐 또는 알키닐)를 함유한다. 때때로 이들은 1개의 4C (알킬) 또는 2개의 4C (알케닐 또는 알키닐)를 함유한다. 단일 기는 하나 초과의 유형의 다중 결합, 또는 하나 초과의 다중 결합을 포함할 수 있고; 이러한 기는 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 함유하는 경우 용어 "알케닐"의 정의 내에 포함되고, 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 경우 용어 "알키닐" 내에 포함된다.
알킬, 알케닐 및 알키닐 기는 종종 이러한 치환이 화학적으로 의미가 있는 정도로 임의로 치환된다. 전형적인 치환체는 할로, =O, =N-CN, =N-OR, =NR, OR, NR2, SR, SO2R, SO2NR2, NRSO2R, NRCONR2, NRCOOR, NRCOR, CN, COOR, CONR2, OOCR, COR 및 NO2를 포함하나 이에 제한되지는 않고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, C1-C8 알킬, C2-C8 헤테로알킬, C1-C8 아실, C2-C8 헤테로아실, C2-C8 알케닐, C2-C8 헤테로알케닐, C2-C8 알키닐, C2-C8 헤테로알키닐, C6-C10 아릴, 또는 C5-C10 헤테로아릴이고, 각각의 R은 할로, =O, =N-CN, =N-OR', =NR', OR', NR'2, SR', SO2R', SO2NR'2, NR'SO2R', NR'CONR'2, NR'COOR', NR'COR', CN, COOR', CONR'2, OOCR', COR' 및 NO2로 임의로 치환되고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, C1-C8 알킬, C2-C8 헤테로알킬, C1-C8 아실, C2-C8 헤테로아실, C6-C10 아릴 또는 C5-C10 헤테로아릴이다. 알킬, 알케닐 및 알키닐 기는 또한 C1-C8 아실, C2-C8 헤테로아실, C6-C10 아릴 또는 C5-C10 헤테로아릴에 의해 치환될 수 있고, 이들 각각은 특정 기에 적절한 치환체에 의해 치환될 수 있다.
"아세틸렌" 치환체는 임의로 치환된 2-10C 알키닐 기를 포함할 수 있고, 화학식 -C≡C-Ri의 것이며, 여기서 Ri는 H 또는 C1-C8 알킬, C2-C8 헤테로알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 헤테로알케닐, C2-C8 알키닐, C2-C8 헤테로알키닐, C1-C8 아실, C2-C8 헤테로아실, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C7-C12 아릴알킬, 또는 C6-C12 헤테로아릴알킬이고, 각각의 Ri 기는 할로, =O, =N-CN, =N-OR', =NR', OR', NR'2, SR', SO2R', SO2NR'2, NR'SO2R', NR'CONR'2, NR'COOR', NR'COR', CN, COOR', CONR'2, OOCR', COR' 및 NO2로부터 선택된 하나 이상의 치환체 임의로 치환되고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C2-C6 헤테로알킬, C1-C6 아실, C2-C6 헤테로아실, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C7-12 아릴알킬, 또는 C6-12 헤테로아릴알킬이고, 이들 각각은 할로, C1-C4 알킬, C1-C4 헤테로알킬, C1-C6 아실, C1-C6 헤테로아실, 히드록시, 아미노 및 =O로부터 선택된 하나 이상의 기로 임의로 치환되고; 여기서 2개의 R'는 연결되어 N, O 및 S로부터 선택된 최대 3개의 헤테로원자를 임의로 함유하는 3-7원 고리를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, -C≡C-Ri의 Ri는 H 또는 Me이다.
"헤테로알킬", "헤테로알케닐" 및 "헤테로알키닐" 등은 상응하는 히드로카르빌 (알킬, 알케닐 및 알키닐) 기와 유사하게 정의되지만, '헤테로' 용어는 백본 잔기 내에 1 내지 3개의 O, S 또는 N 헤테로원자 또는 이들의 조합을 함유하는 기를 지칭하고; 그러므로 상응하는 알킬, 알케닐 또는 알키닐 기의 적어도 하나의 탄소 원자는 특정된 헤테로원자 중 하나에 의해 대체되어 헤테로알킬, 헤테로알케닐 또는 헤테로알키닐 기를 형성한다. 알킬, 알케닐 및 알키닐 기의 헤테로 형태에 대한 전형적인 크기는 일반적으로 상응하는 히드로카르빌 기에 대한 것과 동일하고, 헤테로 형태에 존재할 수 있는 치환체는 히드로카르빌 기에 대해 상기 기재된 것과 동일하다. 화학적 안정성의 이유로, 달리 명시하지 않는 한, 이러한 기는 니트로 또는 술포닐 기에서와 같이 N 또는 S에 옥소 기가 존재하는 경우를 제외하고는 2개 초과의 연속 헤테로원자를 포함하지 않는 것으로 또한 이해된다.
본원에서 사용된 바와 같은 "알킬"은 시클로알킬 및 시클로알킬알킬 기를 포함하지만, 용어 "시클로알킬"은 고리 탄소 원자를 통해 연결된 카르보시클릭 비방향족 기를 설명하기 위해 본원에서 사용될 수 있고, "시클로알킬알킬"은 알킬 링커를 통해 분자에 연결된 카르보시클릭 비방향족 기를 설명하는데 사용될 수 있다. 유사하게, "헤테로시클릴"은 고리 구성원으로서 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하고 C 또는 N일 수 있는 고리 원자를 통해 분자에 연결된 비방향족 시클릭 기를 설명하는데 사용될 수 있고; "헤테로시클릴알킬"은 링커를 통해 또 다른 분자에 연결된 이러한 기를 설명하는데 사용될 수 있다. 시클로알킬, 시클로알킬알킬, 헤테로시클릴 및 헤테로시클릴알킬 기에 적합한 크기 및 치환체는 알킬 기에 대해 상기 기재된 것과 동일하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 이들 용어는 또한 고리가 방향족이 아닌 한 이중 결합 또는 2개를 함유하는 고리를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "아실"은 카르보닐 탄소 원자의 2개의 이용가능한 원자가 위치 중 하나에 부착된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴 또는 아릴알킬 라디칼을 포함하는 기를 포함하고, 헤테로아실은 상응하는 기를 지칭하고, 여기서 카르보닐 탄소 이외의 적어도 하나의 탄소는 N, O 및 S로부터 선택된 헤테로원자에 의해 대체되었다. 그러므로, 헤테로아실은 예를 들어 -C(=O)OR 및 -C(=O)NR2 뿐만 아니라 -C(=O)-헤테로아릴을 포함한다.
아실 및 헤테로아실 기는 카르보닐 탄소 원자의 개방 원자가를 통해 부착된 임의의 기 또는 분자에 결합된다. 전형적으로, 이들은 포르밀, 아세틸, 피발로일 및 벤조일을 포함하는 C1-C8 아실 기, 및 메톡시아세틸, 에톡시카르보닐 및 4-피리디노일을 포함하는 C2-C8 헤테로아실 기이다. 히드로카르빌 기, 아릴 기, 및 아실 또는 헤테로아실 기를 포함하는 이러한 기의 헤테로 형태는 아실 또는 헤테로아실 기의 상응하는 구성성분 각각에 대해 일반적으로 적합한 치환체로서 본원에 기재된 치환체로 치환될 수 있다.
"방향족" 모이어티 또는 "아릴" 모이어티는 방향족성의 널리 공지된 특징을 갖는 모노시클릭 또는 융합된 바이시클릭 모이어티를 지칭하고; 예에는 페닐 및 나프틸이 포함된다. 유사하게, "헤테로방향족" 및 "헤테로아릴"은 고리 구성원으로서 O, S 및 N으로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 이러한 모노시클릭 또는 융합된 바이시클릭 고리 시스템을 지칭한다. 헤테로원자의 포함은 5원 고리 뿐만 아니라 6원 고리에서 방향족성을 허용한다. 전형적인 헤테로방향족 시스템은 모노시클릭 C5-C6 방향족 기, 예컨대 피리딜, 피리미딜, 피라지닐, 티에닐, 푸라닐, 피롤릴, 피라졸릴, 티아졸릴, 옥사졸릴 및 이미다졸릴, 및 이들 모노시클릭 기 중 하나를 페닐 고리 또는 임의의 헤테로방향족 모노시클릭 기와 융합하여 C8-C10 바이시클릭 기, 예컨대 인돌릴, 벤즈이미다졸릴, 인다졸릴, 벤조트리아졸릴, 이소퀴놀릴, 퀴놀릴, 벤조티아졸릴, 벤조푸라닐, 피라졸로피리딜, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 신놀리닐 등을 형성함으로써 형성된 융합된 바이시클릭 모이어티를 포함한다. 고리 시스템 전체에 걸쳐 전자 분포의 면에서 방향족성의 특징을 갖는 임의의 모노시클릭 또는 융합된 고리 바이시클릭 시스템이 이 정의에 포함된다. 또한, 이는 적어도 분자의 나머지에 직접적으로 부착된 고리가 방향족성의 특징을 갖는 바이시클릭 기를 포함한다. 전형적으로, 고리 시스템은 5-12개의 고리 구성원 원자를 함유한다. 예를 들어, 모노시클릭 헤테로아릴은 5-6개의 고리 구성원을 함유할 수 있고, 바이시클릭 헤테로아릴은 8-10개의 고리 구성원을 함유할 수 있다.
아릴 및 헤테로아릴 모이어티는 C1-C8 알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 알키닐, C5-C12 아릴, C1-C8 아실, 및 이들의 헤테로 형태를 포함하는 다양한 치환체로 치환될 수 있고, 이들 각각은 그 자체가 추가로 치환될 수 있고; 아릴 및 헤테로아릴 모이어티에 대한 다른 치환체는 할로, OR, NR2, SR, SO2R, SO2NR2, NRSO2R, NRCONR2, NRCOOR, NRCOR, CN, COOR, CONR2, OOCR, COR 및 NO2를 포함하고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, C1-C8 알킬, C2-C8 헤테로알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 헤테로알케닐, C2-C8 알키닐, C2-C8 헤테로알키닐, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C7-C12 아릴알킬, 또는 C6-C12 헤테로아릴알킬이고, 각각의 R은 알킬 기에 대해 상기 기재된 바와 같이 임의로 치환된다. 아릴 또는 헤테로아릴 기 상의 치환기는 물론 이러한 치환체의 각 유형 또는 치환체의 각 구성성분에 적합한 것으로서 본원에 기재된 기로 추가로 치환될 수 있다. 그러므로, 예를 들어 아릴알킬 치환체는 아릴 부분에서 아릴 기에 대해 전형적인 것으로서 본원에 기재된 치환체로 치환될 수 있고, 이는 알킬 부분에서 알킬 기에 대해 전형적이거나 적합한 것으로서 본원에 기재된 치환체로 추가로 치환될 수 있다.
유사하게, "아릴알킬" 및 "헤테로아릴알킬"은 치환된 또는 비치환된, 포화 또는 불포화, 시클릭 또는 비시클릭 링커를 포함하는 연결기, 예컨대 알킬렌을 통해 이들의 부착점에 결합된 방향족 및 헤테로방향족 고리 시스템을 지칭한다. 전형적으로 링커는 C1-C8 알킬 또는 이의 헤테로 형태이다. 이들 링커는 또한 카르보닐 기를 포함할 수 있으며, 그러므로 이들이 아실 또는 헤테로아실 모이어티로서 치환체를 제공할 수 있게 만든다. 아릴알킬 또는 헤테로아릴알킬 기에서 아릴 또는 헤테로아릴 고리는 아릴 기에 대해 상기 기재된 동일한 치환체로 치환될 수 있다. 예를 들어, 아릴알킬 기는 아릴 기에 대해 상기 정의된 기로 임의로 치환된 페닐 고리, 및 1 또는 2개의 C1-C4 알킬 기 또는 헤테로알킬 기로 치환되거나 비치환된 C1-C4 알킬렌을 포함하고, 여기서 알킬 또는 헤테로알킬 기는 임의로 고리화되어 고리, 예컨대 시클로프로판, 디옥솔란 또는 옥사시클로펜탄을 형성할 수 있다. 유사하게, 헤테로아릴알킬 기는 아릴 기에 전형적인 치환체로서 상기 기재된 기로 임의로 치환된 C5-C6 모노시클릭 헤테로아릴 기, 및 1 또는 2개의 C1-C4 알킬 기 또는 헤테로알킬 기로 치환되거나 비치환된 C1-C4 알킬렌을 포함할 수 있거나, 또는 임의로 치환된 페닐 고리 또는 C5-C6 모노시클릭 헤테로아릴, 및 1 또는 2개의 C1-C4 알킬 또는 헤테로알킬 기로 치환되거나 비치환된 C1-C4 헤테로알킬렌을 포함하고, 여기서 알킬 또는 헤테로알킬 기는 임의로 고리화되어 고리, 예컨대 시클로프로판, 디옥솔란 또는 옥사시클로펜탄을 형성할 수 있다.
아릴알킬 또는 헤테로아릴알킬 기가 임의로 치환된 것으로 기재되는 경우, 치환체는 기의 알킬 또는 헤테로알킬 부분 또는 아릴 또는 헤테로아릴 부분 상에 있을 수 있다. 알킬 또는 헤테로알킬 부분 상에 임의로 존재하는 치환체는 일반적으로 알킬 기에 대해 상기 기재된 것과 동일하고; 아릴 또는 헤테로아릴 부분 상에 임의로 존재하는 치환체는 일반적으로 아릴 기에 대해 상기 기재된 것과 동일하다.
본원에서 사용된 바와 같은 "아릴알킬" 기는 이들이 비치환된 경우 히드로카르빌 기이고, 고리 및 알킬렌 또는 유사한 링커 내의 탄소 원자의 총 수에 의해 기재되어 있다. 그러므로, 벤질 기는 C7-아릴알킬 기이고, 페닐에틸은 C8-아릴알킬이다.
상기 기재된 바와 같은 "헤테로아릴알킬"은 연결기를 통해 부착된 아릴 기를 포함하는 모이어티를 지칭하며, 아릴 모이어티의 적어도 하나의 고리 원자 또는 연결기의 하나의 원자가 N, O 및 S로부터 선택된 헤테로원자라는 점에서 "아릴알킬"과 상이하다. 헤테로아릴알킬 기는 조합된 고리 및 링커의 총 원자 수에 따라 본원에 기재되어 있으며, 이들은 헤테로알킬 링커를 통해 연결된 아릴 기; 히드로카르빌 링커, 예컨대 알킬렌을 통해 연결된 헤테로아릴 기; 및 헤테로알킬 링커를 통해 연결된 헤테로아릴 기를 포함한다. 그러므로, 예를 들어 C7-헤테로아릴알킬은 피리딜메틸, 페녹시 및 N-피롤릴메톡시를 포함할 것이다.
본원에서 사용된 바와 같은 "알킬렌"은 2가 히드로카르빌 기를 지칭하고; 이는 2가이기 때문에, 2개의 다른 기를 함께 연결할 수 있다. 전형적으로 이는 -(CH2)n-을 지칭하고, 여기서 n은 1-8이고, 예를 들어 n은 1-4이지만, 특정된 경우, 알킬렌은 또한 다른 기에 의해 치환될 수 있고, 다른 길이를 가질 수 있으며, 개방 원자가는 쇄의 반대쪽 말단에 있을 필요는 없다. 그러므로 -CH(Me)- 및 -C(Me)2-는 시클릭 기, 예컨대 시클로프로판-1,1-디일과 마찬가지로 알킬렌이라고도 지칭될 수 있다. 알킬렌 기가 치환되는 경우, 치환체는 본원에 기재된 바와 같은 알킬 기 상에 전형적으로 존재하는 것을 포함한다.
일반적으로, 치환체에 함유된 임의의 알킬, 알케닐, 알키닐, 아실 또는 아릴 또는 아릴알킬 기 또는 이들 기 중 하나의 임의의 헤테로 형태는 그 자체가 추가 치환체에 의해 임의로 치환될 수 있다. 이들 치환체의 성질은 치환체가 달리 기재되지 않는 경우 1차 치환체 자체와 관련하여 인용된 것과 유사하다. 그러므로, 링커 R2의 실시양태가 알킬인 경우, 이 알킬은 이것이 화학적으로 의미가 있고 이것이 알킬 자체에 대해 제공된 크기 제한을 훼손하지 않는 경우 R2에 대한 실시양태로서 나열된 나머지 치환체에 의해 임의로 치환될 수 있고; 예를 들어, 알킬에 의해 또는 알케닐에 의해 치환된 알킬은 이들 실시양태에 대한 탄소 원자의 상한을 단순히 연장할 것이고 포함되지 않는다. 그러나, 아릴, 아미노, 알콕시, =O 등에 의해 치환된 알킬은 본 발명의 범위 내에 포함될 것이며, 이들 치환기의 원자는 기재될 알킬, 알케닐 등의 기를 기재하는데 사용되는 수에 계수되지 않는다. 치환체의 수가 특정되지 않은 경우, 각각의 이러한 알킬, 알케닐, 알키닐, 아실 또는 아릴 기는 이의 이용가능한 원자가에 따라 다수의 치환체로 치환될 수 있으며; 특히, 이들 기 중 임의의 것은 예를 들어 이의 임의의 또는 모든 이용가능한 원자가에서 플루오린 원자로 치환될 수 있다.
한 실시양태에서, 링커는 (R3)r - (R4)를 포함하거나, R3이거나 ((R3)r-(R4)-(R3)t이다. 한 실시양태에서, R3은 PEG 모이어티 또는 PEG 모이어티의 유도체이다. 특정 실시양태에서 R3은 -O-CH2-CH2- 또는 -CH2-CH2-O-이다. 한 실시양태에서, PEG 모이어티는 하나 이상의 PEG 단위를 포함할 수 있다. PEG 모이어티는 약 1 내지 약 1,000개의 PEG 단위 (일부 실시양태에서 제한 없이, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 또는 900개의 단위 포함)를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, PEG 모이어티는 약 1 내지 5 및 최대 약 25개의 PEG 단위, 약 1 내지 5 최대 약 10개의 PEG 단위, 약 10 최대 약 50개의 PEG 단위, 약 18 최대 약 50개의 PEG 단위, 약 47 최대 약 150개의 PEG 단위, 약 114 최대 약 350개의 PEG 단위, 약 271 최대 약 550개의 PEG 단위, 약 472 최대 약 950개의 PEG 단위, 약 50 최대 약 150개의 PEG 단위, 약 120 최대 약 350개의 PEG 단위, 약 250 최대 약 550개의 PEG 단위 또는 약 650 최대 약 950개의 PEG 단위를 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서 PEG 단위는 -O-CH2-CH2- 또는 -CH2-CH2-O-이다. 한 실시양태에서, R4는 NH(CO), -C1-C6 알킬, -C1-C6 알콕시, -NRaRb, -N3, -OH, -CN, -COOH, -COOR1, -C1-C6 알킬-NRaRb, C1-C6 알킬-OH, C1-C6 알킬-CN, C1-C6 알킬-COOH, C1-C6 알킬-COOR1, 5-6원 고리, 치환된 5-6원 고리, -C1-C6 알킬- 5-6원 고리, -C1-C6 알킬- 치환된 5-6원 고리 C2-C9 헤테로시클릭, 또는 치환된 C2-C9 헤테로시클릭이다.
일부 실시양태에서 R3은 -O-CH2-CH2- 또는 -CH2-CH2-O-이고, r 또는 t는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이다. 특정 실시양태에서, r 또는 t는 약 4 내지 약 15이고, 때때로 r은 약 4 또는 11이다. 일부 실시양태에서, R3은 PEG 단위 (PEG)r이고, r은 약 2 내지 약 4이고, t는 약 8 내지 14이다.
특정 실시양태에서, R4는 아미도 연결기 (예를 들어, -C(O)NH- 또는 -NH(O)C-); 알킬 아미도 연결기 (예를 들어, -C1-C6 알킬-C(O)NH-, -C1-C6 알킬-NH(O)C-, -C(O)NH-C1-C6 알킬-, -NH(O)C-C1-C6 알킬-, -C1-C6 알킬--NH(O)C-C1-C6 알킬-, -C1-C6 알킬-C(O)NH-C1-C6 알킬-, 또는 -C(O)NH-(CH2)t- (여기서 t는 1, 2, 3 또는 4임)); 치환된 5-6원 고리 (예를 들어, 아릴 고리, 헤테로아릴 고리 (예를 들어, 테트라졸, 피리딜, 2,5-피롤리딘디온 (예를 들어, 치환된 페닐 모이어티로 치환된 2,5-피롤리딘디온)), 카르보시클릭 고리, 또는 헤테로시클릭 고리) 또는 산소-함유 모이어티 (예를 들어, -O-, -C1-C6 알콕시)이다.
예시적인 실시양태
한 실시양태에서, E3 리가제에 대한 리간드에 커플링된 링커에 커플링된 G-단백질 커플링된 에스트로겐 수용체 (GPER) 리간드를 포함하는 분자가 제공된다. 한 실시양태에서, GPER 리간드는 17β-에스트라디올, 에스트론, 피토에스트로겐, 제노에스트로겐, 에스트리올, 에스트리올 3-술페이트, 에스트리올 17-술페이트, G-1, G-15, G-36, 제니스테인 또는 퀘르세틴을 포함한다. 한 실시양태에서, GPER 리간드는 17β-에스트라디올을 포함한다. 한 실시양태에서, GPER 리간드는 GPER 길항제이다. 한 실시양태에서, E3 리가제 리간드는 폰 히펠 리가제 (VHL) 리간드이다. 한 실시양태에서, E3 리가제 리간드는 레날리도마이드, 포말리도마이드, 이베르도마이드, (S,R,S)-AHPC, 탈리도마이드, VH-298, CC-885, E3리가제 리간드 8, TD-106, VL285, VH032, VH101,VH298, VHL 리간드 4, VHL-2 리간드 3, E3 리가제 리간드 3, E3 리가제 리간드 2 또는 BC-1215를 포함한다. 한 실시양태에서, 링커는 5 내지 50개의 원자, 예를 들어 약 8 내지 약 35개의 원자를 갖는 쇄를 갖는다. 한 실시양태에서, 링커는 알킬 링커이다. 한 실시양태에서, 링커는 하나 이상의 O, N 또는 S를 갖는 헤테로알킬 링커이다. 한 실시양태에서, 링커는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 한 실시양태에서, 링커는 4 내지 15개의 PEG 단위를 포함한다. 한 실시양태에서, 링커는 (PEG)mNH(CO)(PEG)n을 포함하고, 여기서 n 및 m은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이다. 한 실시양태에서, n은 3, 4, 5 또는 6이다. 한 실시양태에서, m은 7, 8, 9 또는 10이다.
한 실시양태에서, GPER 리간드, 링커 또는 E3 리간드는 또 다른 분자와 공유 결합을 형성하는데 유용한 아민 기, 카르복실 기, 카르보닐 기, 술프히드릴 기, 예를 들어 말레이미드, 알데히드 기, 예를 들어 히드라지드, 또는 히드록실 기를 포함한다. 한 실시양태에서, 링커는 카르보디이미드, 예를 들어 EDC, NHS, ABH, ANB-NOS, APDP, EMCH, EMCS, GMBS, MBS 또는 SIAB를 포함한다.
한 실시양태에서, 인간에서 내분비 내성 암 또는 호르몬 요법 내성 암을 예방, 억제 또는 치료하는 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 방법은 E3 리가제에 대한 리간드에 커플링된 링커에 커플링된 G-단백질 커플링된 에스트로겐 수용체 (GPER) 리간드를 포함하는 분자의 유효량을 갖는 조성물을 인간에게 투여하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, E3 리가제에 대한 리간드에 커플링된 링커에 커플링된 G-단백질 커플링된 에스트로겐 수용체 (GPER) 리간드를 포함하는 분자의 유효량을 갖는 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 삼중 음성 유방암을 예방, 억제 또는 치료하는 방법이 제공된다.
한 실시양태에서, E3 리가제에 대한 리간드에 커플링된 링커에 커플링된 G-단백질 커플링된 에스트로겐 수용체 (GPER) 리간드를 포함하는 분자의 유효량을 갖는 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 자궁경부암, 난소암 또는 자궁내막암을 예방, 억제 또는 치료하는 방법이 제공된다.
한 실시양태에서, E3 리가제에 대한 리간드에 커플링된 링커에 커플링된 G-단백질 커플링된 에스트로겐 수용체 (GPER) 리간드를 포함하는 분자의 유효량을 갖는 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 전립선암 또는 난소암을 예방, 억제 또는 치료하는 방법이 제공된다.
예시적인 키메라
하기 화학식 I의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 염이 제공된다:
<화학식 I>
X-L-Y
상기 식에서
X는 G-단백질 커플링된 에스트로겐 수용체 (GPER) 리간드이고;
Y는 E3 유비퀴틴 리가제 리간드이고;
L은 링커이다.
한 예에서, X는 17β-에스트라디올, 에스트론, 피토에스트로겐, 제노에스트로겐, 에스트리올, 에스트리올 3-술페이트, 에스트리올 17-술페이트, G-1, G-15, G-36, 제니스테인, 다진, 퀘르세틴, 또는 이의 유도체이다. 한 예에서, X는 GPER 길항제이다. 한 예에서, Y는 폰 히펠 리가제 (VHL) 리간드이다. 한 예에서, Y는 세레블론, 레날리도마이드, 포말리도마이드, 이베르도마이드, (S,R,S)-AHPC, 탈리도마이드, VH-298, CC-122, CC-885, E3리가제 리간드 8, TD-106, VL285, VH032, VH101, VH298, VHL 리간드 4, VHL 리간드 7, VHL-2 리간드 3, E3 리가제 리간드 3, E3 리가제 리간드 2, BC-1215, 또는 이의 유도체이다. 한 예에서, L은 X와 Y 사이의 선형 경로에서 계수된 바와 같은 5 내지 200개의 원자의 쇄 길이를 갖는 백본을 갖는다. 한 예에서, L은 X와 Y 사이의 선형 경로에서 계수된 바와 같은 15 내지 50개의 원자의 쇄 길이를 갖는 백본을 갖는다. 한 예에서, L은 X와 Y 사이의 선형 경로에서 계수된 바와 같은 20 내지 50개의 원자의 쇄 길이를 갖는 백본을 갖는다. 한 예에서, L은 X와 Y 사이의 선형 경로에서 결합 길이의 합으로부터 결정된 바와 같은 8 내지 300 옹스트롬의 계산된 길이를 갖는 백본을 갖는다. 한 예에서, L은 X와 Y 사이의 선형 경로에서 결합 길이의 합으로부터 결정된 바와 같은 25 내지 75 옹스트롬의 계산된 길이를 갖는 백본을 갖는다. 한 예에서, L은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00005
여기서
Q는 X에 대한 공유 결합을 형성하는 2가 기 또는 결합이고;
Z는 하나 이상의 알킬, 아릴, 헤테로알킬, 헤테로아릴, 알킬옥시, 알킬아미노, 알킬글리콜, 카르보닐, 티오카르보닐, 아실, 카르바메이트, 우레아, 티오카르바메이트, 티오우레아, 디티오카르바메이트, 아미노카르보닐, 아미드, 에스테르, 티오에스테르, 티오아미드, 아민, 산소, 황, 술폰 또는 술폭시드 (2가 형태)를 포함하는 선형 쇄이고;
G는 Y에 대한 공유 결합을 형성하는 2가 기 또는 결합이다.
한 예에서, L은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00006
여기서
Q는 X에 대한 결합을 형성하는 2가 기 또는 결합이고;
R은 알킬, 아릴, 헤테로알킬, 헤테로알킬, 헤테로아릴, 알킬옥시, 알킬아미노, 알킬글리콜, 카르보닐, 티오카르보닐, 아실, 카르바메이트, 우레아, 티오카르바메이트, 티오우레아, 디티오카르바메이트, 아미노카르보닐, 아미드, 에스테르, 티오에스테르, 티오아미드, 아민, 산소, 황, 술폰 또는 술폭시드 (2가 형태)이고;
G는 Y에 대한 결합을 형성하는 2가 기 또는 결합이고;
m, n, p 및 q는 존재하는 경우 각각 독립적으로 0 내지 50의 정수이고, 단 m, n, p 및 q 중 적어도 하나는 0보다 큰 정수이다.
한 예에서, Q 및 G는 독립적으로 카르보닐, 티오카르보닐, 아실, 카르바메이트, 우레아, 티오카르바메이트, 티오우레아, 디티오카르바메이트, 아미노카르보닐, 아미드, 에스테르, 티오에스테르, 티오아미드, 술폰 또는 술폭시드 (2가 형태)이다.
한 예에서, Q 및 G는 독립적으로 아세틸, 2-히드록시아세틸, 2-아미노아세틸, 프로피오닐, 3-히드록시프로파노일, 3-아미노프로파노일, 부타노일, 4-히드록시부타노일 및 4-아미노부타노일 (이들 각각은 2가 형태임)로 이루어진 군으로부터 선택된 아실 또는 카르보닐이다.
한 예에서, m 및 n은 존재하는 경우 각각 독립적으로 0 내지 2의 정수이고, Q 및 G는 각각 독립적으로 카르보닐, 티오카르보닐, 아세틸, 2-히드록시아세틸, 2-아미노아세틸, 프로피오닐, 3-히드록시프로파노일, 3-아미노프로파노일, 부타노일, 4-히드록시부타노일, 4-아미노부타노일, 카르바메이트, 우레아, 티오카르바메이트, 티오우레아, 디티오카르바메이트, 아미노카르보닐, 아미드, 에스테르, 티오에스테르, 티오아미드, 술폰 또는 술폭시드이며, 이들 각각은 2가 형태이다.
한 예에서, Z는 친수성이다.
한 예에서, L은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00007
이는 선형 경로에서 계수된 바와 같은 13개 원자의 길이를 갖는 백본을 제공한다.
한 예에서, L은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00008
여기서 p 및 q는 각각 독립적으로 0 내지 50의 정수이다.
한 예에서, L은 2가 알킬 기, 2가 헤테로알킬 기, 또는 2가 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 중 하나 이상, 또는 각각 중 하나 이상을 포함한다.
한 예에서, L은 5개 이상의 2가 에톡시 (-CH2CH2O-) 기를 포함한다. 한 예에서, L은 2개의 탄소마다 1개 이상의 헤테로원자를 포함하고 부틸보다 긴 알킬 쇄는 포함하지 않는다.
한 예에서, L은 X의 산소, 질소, 황, 카르보닐 또는 에티닐을 통해 X에 부착되고, L은 Y의 산소, 질소, 황, 카르보닐 또는 에티닐을 통해 Y에 부착된다.
한 예에서, X는 에스트로겐 스테로이드의 산소, 아민, 황, 비닐, 에틴 및 카르보닐로부터 선택된 C6 또는 C17에 위치된 2가 기를 포함하는 에스트로겐 스테로이드이고, C6 또는 C17에 있는 2가 기는 L에 부착된다.
한 예에서, Y는 (S,R,S)-AHPC이고, 이는 (S,R,S)-AHPC의 아민을 통해 L에 부착된다.
한 예에서, 화합물은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00009
여기서 L은 링커이다.
한 예에서, 화합물은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00010
여기서 L은 링커이다.
한 예에서, 화합물은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00011
한 예에서, 화합물은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00012
한 예에서, 화합물은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00013
한 예에서, 화합물은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00014
본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해 설명될 것이다.
실시예 1
GPER은 유방암 (Filardo etal., 2000; Filardo et al., 2006; Sjostrom et al., 2014), 난소암 (smith et al., 2009) 및 자궁내막암 (Smith et al., 2007)에서 불량한 생존 및 질환 진행과 연관된다. 유의하게, GPER은 이용가능한 약물이 표적화하는 단백질의 발현 결여로 인해 불량한 전체 생존을 갖는 유방암 하위유형인 TNBC의 >80%에서 발현된다. 이 에스트로겐 수용체는 에스트로겐 작용의 독립적 척도를 나타내고, 약물 투여가 가능한 표적이다. 이 프로젝트의 목표는 GPER을 표적화 및 분해하기 위한 PROTAC 개발에서 핵심 단계를 거치는 것이다.
TNBC를 갖는 환자 121명의 조사는 이 수용체가 이들 종양의 > 80%에서 발현된다는 것을 시사한다. 대부분의 TNBC에서 GPER의 발현은 다른 소규모 연구에 의해 뒷받침되며, GPER이 TNBC에서 종양 저해제임을 시사하는 6개의 종양 및 2개의 세포주의 다소 제한된 연구의 데이터와 대조적이다. 진행성 유방암의 임상적 예측인자와 역으로 연관된 ER의 발현과 달리, GPER의 발현은 이들 동일한 변수와 직접적으로 연관되며 (Filardo et al., 2006; Ignatov et al., 2011), 이는 전이에서 역할을 한다는 것을 시사한다. 이러한 관찰 및 GPCR이 제약 산업의 표적이라는 사실은 GPER을 유방암에 대한 유망한 약물 투여가 가능한 표적으로 만든다. 그러므로, GPER을 선택적으로 분해하는 이러한 유형의 치료제는 TNBC의 치료에 유용할 수 있고, 다른 내분비-내성 유방암에도 유용할 수 있다. 최종적으로, GPER은 부인과 암의 진행성 질환 및 불량한 결과와 연관되며, 이는 GPER- PROTAC이 이들 환자에 도움이 될 수 있음을 시사한다.
에스트로겐-표적화된 요법은 폐경후 여성에서 효과적이다. 종양 형성이 폐경후 발생하는 TNBC 발암의 자발적인 모델이 사용된다. GPER-PROTAC은 초기 단계 TNBC (종양 ≤ 0.5 cm)를 갖는 마우스에 전달된다. GPER-PROTAC은 내인성 에스트로겐의 부재 하에 가장 효과적으로 기능할 수 있지만, 남성의 유방암이 전체 사례의 < 1% 를 차지하지만 남성에 대한 테스트도 수행된다 (Anderson et al., 2010).
GPER-PROTAC 프로토타입인 UI-EP001은 재조합 GPER을 선택적으로 분해하고, 인간 유방암 세포에서 천연 GPER의 발현을 하향조정한다 (도 2 및 3). GPER-PROTAC을 스크리닝하기 위해, GPER을 발현하지만 핵 ER이 결여된 인간 SKBR3 유방암 세포의 원형질막에서 에스트로겐에 특이적인 고친화성 (Kd= 2.7 nm), 제한된 능력, 대체가능한, 단일 결합 부위를 측정하는 GPER 결합 검정을 사용할 수 있다 (Thomas et al., 2005). GPER은 수용체 인산화, β--아레스틴과의 상호작용 또는 리소좀 활성을 필요로 하지 않는 세포내이입의 드문 메커니즘을 겪는다. 대신, GPER은 원형질막에서 폴리유비퀴틴화되고, 프로테아솜 분해 전에 rab11-양성 리사이클링 엔도솜을 통해 트랜스 골지 네트워크 (TGN)로 역행 방식으로 트래픽킹된다 (Cheng et al., 2011). 최종적으로, GPER 분해 정도를 정량하기 위해, GPER을 단백질분해하는 GPER-PROTAC의 상대적 효능을 측정하기 위한 민감한 나노비트 이원성 발광 검정을 사용한다 (도 11).
GPER에 대한 높은 결합 친화성 및 특이성을 갖는 GPER-PROTAC을 식별한다.
근거. ER의 단백질분해 표적화는 내분비-내성 유방암을 치료하는 효과적인 수단이다. ER-PROTAC은 경구로 전달될 때 ER+ 유방암의 전임상 모델에서 종양 퇴행을 촉진한다 (Flanagan et al., 2019). 대부분의 ER-음성 (Filardo et al., 2006; Ignatov et al., 2011) 및 삼중-음성 종양 (97/121= 80.2%)에서 발현되는 별개의 에스트로겐 수용체인 GPER을 표적화하는 PROTAC은 개발된 선택적 GPER 길항제를 보완하지만 (Prissnitz et al., 2015), 아직 임상 용도로 승인되지 않았으며 잠재적으로 더 효과적일 수 있다.
GPER-PROTAC의 설계. 한 실시양태에서, PROTAC 설계는 표적화 리간드로서 17 β--E2 및 폰 히펠-린다우 (VHL)-유래 유비퀴틴 E3 리가제 리간드, (2S,4R)-1-((S)-2-아미노-3,3-디메틸-부타노일)-4 히드록시 -N-(4-(4-메틸티아졸-5-일) 벤질) 피롤리딘-2-카르복사미드 ((S,R,S) AHPC로서 공지됨)의 사용에 기초한다 [24]. GPER-PROTAC은 2, 4 또는 6개의 단위 페길화된 화학적 링커 어레이에 접합된 AHPC로 이루어진 부분 PROTAC을 사용하여 어셈블리된다 (도 19). 구조-활성 관계 (SAR) 데이터는 에스트란 고리의 C6 및 C17 원자에 화학적 링커의 커플링이 GPER의 에스트로겐 결합 기능을 보존할 가능성이 가장 높다는 것을 시사한다. C6 측쇄를 함유하는 풀베스트란트 (ICI 182,780)는 5%의 상대적 결합 활성을 가지며, 500 nM에서 GPER 효능제로서 기능하고 (Filardo et al., 2007), 17 β-E2-헤미숙시네이트-17-BSA의 효력은 세포내 cAMP 생산을 자극하는 것과 관련하여 17 β-E2와 유사하다 (Filardo et al., 2007).
GPER-PROTAC의 합성, 정제 및 구조의 확인. C-17 연결된 GPER-PROTAC은 실온에서 DMF의 존재 하에 EDC.HCl 및 HOBt를 사용하여 (S,R,S)-AHPC-PEG2-COOH; (S,R,S)-AHPC-PEG4-COOH 또는 (S,R,S)-AHPC-PEG6-COOH와 17 β-E2의 17 β-히드록실 기의 EDC 커플링을 통해 합성한다. 원하는 화합물의 합성을 NMR 분석 및 고분해능 질량 분광법에 의해 확인한다. C-6 연결된 GPER-PROTAC을 다단계 반응을 통해 합성할 수 있다. 첫째, 환류 메탄올 중 암모늄 아세테이트의 존재 하에 나트륨 시아노보로히드리드를 사용하여 13-메틸-6-옥소-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카히드로 -6H-시클로펜타[a]페난트렌-3,17-디일 디아세테이트 (1)의 6 카르보닐 기의 환원적 아민화. 둘째, DMF의 존재 하에 EDC.HCl 및 HOBt를 사용하여 (S,R,S)-AHPC-PEG2-COOH; (S,R,S)-AHPC-PEG4-COOH 또는 (S,R,S)-AHPC-PEG6-COOH와 6-아미노-13-메틸-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카히드로-6H-시클로펜타[a]페난트렌-3,17-디일 디아세테이트 (2)의 커플링. 화합물의 정제를 C18 역상 분취용 HPLC 컬럼에 의해 달성한다. 원하는 화합물의 합성 및 순도를 NMR 분석 및 LC-MS를 사용하여 확인한다. 이 합성에 사용되는 모든 화학물질은 상업적으로 입수가능하다.
GPER-PROTAC 결합의 평가. GPER-PROTAC을 경쟁적 방사성 수용체 검정을 사용하여 결합 활성에 대해 테스트한다 [22]. 간단히 말해서, GPER-PROTAC을 에탄올에 용해하고, 1 nM 내지 10 uM의 최종 농도를 위해 유리 반응 튜브에 첨가하고; 에탄올을 질소 하에 증발시킨다. 막 단백질 (100 ug) 및 4 nM (89 Ci/mmol) 3H-17 β-에스트라디올 (E2)을 튜브에 첨가하고 4℃에서 30분 동안 인큐베이션한다. 유리 3H-E2로부터 결합물을 분리하기 위해 미리 적신 유리 섬유 필터를 통한 신속한 여과에 의해 결합을 종결시킨다. 필터를 세척하고, 액체 섬광 계수기를 사용하여 방사선을 측정한다. 최대 특이적 결합은 17 β-E2 또는 GPER-PROTAC의 1,000배 몰 과량의 존재 하에 총 결합 (경쟁자의 부재) 및 비특이적 결합 간의 차이로서 계산한다. 50% 최대 특이적 결합을 대체하는데 필요한 경쟁자의 농도 (EC50)는 한 부위 경쟁적 결합 곡선으로부터 계산하며, 여기서 곡선의 상단 및 하단은 각각 100% 및 0%로서 정의된다. 상대적 결합 친화성 (RBA)은 백분율로서 표현되는 GPER-PROTAC의 EC50에 대한 17 β-E2의 EC50의 비율로서 계산된다. 한 실시양태에서, 17β-E2에 대한 하나 이상의 GPER-PROTAC의 RBA는 >10%이다.
GPER을 분해하고 이의 신호전달 활성을 감소시키는 능력에 대한 GPER-PROTAC 후보의 테스트.
근거. 이는 E3 유비퀴틴 리가제를 동원하고 GPER을 유비퀴틴화하여 프로테아솜에 의한 이의 파괴를 초래하는 GPER-PROTAC의 능력을 다룬다. GPER-PROTAC의 분해 능력을 먼저 정량적 면역형광 및 면역화학적 분석에 의해 평가한다. 그 후, 강력한 분해 능력을 나타내는 약물 후보를 고처리량 민감한 발광 검정을 사용하여 추가로 평가한다. 최종적으로, 활성 GPER을 감소시키는 각 테스트된 GPER-PROTAC의 효능은 GPER-의존적 erbB1 티로실 인산화 및 erk-1/2의 인산화를 측정함으로써 평가한다 (Prissnitz et al., 2015). 종합적으로, GPER 하향조정의 이들 측정은 GPER 활성을 효과적으로 감소시키는 GPER-PROTAC을 식별한다.
유방암 세포에서, GPER의 대부분은 이의 이종삼량체 G 단백질로부터 커플링되지 않은 낮은 친화성 상태에 있으며, 소포체에서 유지된다. 작은 분획만이 높은 친화성 G-단백질 커플링된 상태로 원형질막에서 발현된다 (Prissnitz et al., 2015; Smith et al., 2007). 무손상 세포에서 높은 농도로 사용되는 경우, GPER-PROTAC은 낮은 및 높은 친화성 수용체 둘 모두를 분해할 수 있다. 세포 표면-연관 및 총 GPER에 대한 GPER-PROTAC의 영향을 측정한다. 상기 언급되고 하기 자세히 설명된 바와 같이, GPER-PROTAC 후보로 처리된 유방암 세포에서, 예를 들어 GPER-PROTAC 후보로 처리된 루미날 A, 루미날 B, her2 과발현 및 기저 면역표현형의 유방암 세포에서 GPER 분해 및 이의 신호전달 활성을 측정하기 위해 여러 정량적 양식이 사용된다. 최종적으로, GPER 신호전달 활성의 감소에 대한 기존 GPER 길항제인 G15 또는 G36의 상대적 효능을 비교한다.
GPER 분해의 평가. 가장 높은 RBA를 갖는 GPER-PROTAC을 GPER을 유비퀴틴화하고 분해하는 능력에 대해 테스트한다. GPER을 발현하는 유방암 세포를 5분 내지 8시간 동안 다양한 용량의 GPER-PROTAC 또는 비히클로 처리하고, GPER 하향조정을 면역형광 및 면역화학적 분석 둘 모두에 의해 평가한다. N-말단 또는 C-말단 항체를 사용하여 고정된 무손상 또는 세제-투과화된 유방암 세포에서 천연 GPER의 존재를 검출한다. 면역형광에 의해 검출된 GPER을 총 보정된 세포 형광 (제이-이미지(J-Image)) 및 ELISA에 의해 정량화한다. 미성숙 또는 성숙 형태의 GPER 단백질의 정상 상태 수준을 GPER 특이적 항체를 사용하여 면역블롯팅에 의해 결정한다. 이들 실험에서, 밴드 픽셀 강도 (이미지 제이)를 측정하고 GAPDH에 대해 정규화함으로써 GPER 분해 정도를 결정한다. 과량의 유리 17 β-E2 또는 대조군 스테로이드 (17 β-에스트라디올, 이는 GPER에 대한 측정가능한 결합을 나타내지 않음)의 존재 하에 GPER 작용의 특이성을 확인한다 (Thomas et al., 2005). 17 β-E2가 결여된 또는 17 β-E2에 커플링된 부분 PROTAC은 약물 대조군으로서 역할을 한다. HA-GPER, HA-CXCR4 또는 HA-β-1AR을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포에서 표적화 특이성을 평가한다 (Filardo et al., 2018).
GPER 폴리유비퀴틴화의 평가. 탠덤 유비퀴틴 결합 요소 (TUBE) 풀다운 검정, GPER-특이적 항체를 사용한 블롯팅에서 유비퀴틴화 상태를 확인한다. 다시, 미처리, PROTAC-처리된 및 부분 PROTAC-처리된 세포로부터의 용해물에서 픽셀 밴드 강도를 측정함으로써 이의 미성숙 및 표면 형태 둘 모두의 GPER 유비퀴틴화의 정도를 정량화한다. 세포를 프로테아솜 억제제인 MG132로 처리함으로써 프로테아솜 분해를 평가하는 반면, 대조군 세포는 리소좀 히드롤라제를 억제하는 클로로퀸을 받는다. GPER-PROTAC 분해에 대한 이들의 감수성에 대해 유비퀴틴화될 수 없는 GPER의 리신 없는 버전을 또한 테스트한다 (Lys333Arg, Lys341Arg, Lys351Arg).
표면 및 총 GPER의 분해를 평가하기 위한 나노비트 보완 검정. 나노비트™ (프로메가(Promega)) 이원성 발광 보완 검정을 수행하여 세포 표면으로부터의 GPER의 제거 뿐만 아니라 이의 총 분해를 정량한다. 이 검정은 6 로그 이상의 동적 범위를 갖는 발광 신호를 기록한다. HiBit 및 LgBit라고 하는 바다 새우 루시페라제의 2개의 스플릿 구성성분의 상호작용에 따라 루시페린 기질의 존재 하에 발광 신호가 생성된다. 이들 실험을 위해, 가용성 LgBit는 루시페린과 함께 N-말단 HiBit 태그를 갖는 GPER을 발현하는 무손상 또는 세제-투과화된 세포에 전달된다.
GPER 신호전달의 평가. 다양한 기간 동안 GPER-PROTAC로 처리 후, 세포를 17 β-E2로 자극하고, erbB1 티로실 인산화 또는 erk-1/2 인산화를 모니터링함으로써 GPER 활성을 측정한다. EGF-자극된 erbB1 또는 erk-1/2의 측정은 GPER-PROTAC의 특이성에 대한 대조군으로서 역할을 한다. erbB1 또는 erk-1/2 자극을 측정하는 추가 대조군 실험을 17 β-E2에 커플링된 부분 PROTAC로 수행한다. 데이터를 픽셀 밴드 강도에 의해 정량하고 미처리 세포에 대해 정규화한다.
리드 GPER-PROTAC의 생체내 효능을 결정한다.
근거. 합리적으로-설계된 약물의 초기 평가 및 이의 구조의 후속 변형에서 효능, 생체분포 및 독성의 조기 고려가 중요하다. GPER-PROTAC의 경구 투여 후 이들 생물학적 반응을 측정한다.
GPER은 암 세포에서 작용하여 이들의 생존을 촉진하고, 종양 미세환경을 정의하고 암 진행을 촉진하는 세포에도 영향을 미친다 (Filardo et al., 2018). 그러므로, 예를 들어 종양 성장 또는 동물 생존의 억제를 측정함으로써 인간 TNBC 발암을 시뮬레이션하는 마우스 모델을 사용하여 GPER-PROTAC의 항발암성 또는 항종양 활성을 결정한다. 야생형 및 GPER-null 마우스 둘 모두에서 독성 및 생체분포 연구를 수행한다. 난소-무손상 및 난소 절제된 (OVX) 마우스에서 실험을 수행한다.
통계적 분석. 그룹당 12마리의 마우스는 그룹-특이적 표준 편차의 1.2배의 평균 차이를 검출하기 위해 80% 검정력을 달성한다. 검정력은 5%의 유의성 수준으로 한 시점에서 양측, 2-샘플 t-테스트를 사용하는 것에 기초하여 보존적으로 추정된다. 혼합된 효과 회귀는 시간 및 치료 그룹의 함수로서 종양 성장 속도를 추정 및 비교하는데 사용될 것이다. 무작위 효과 모델은 반복된 종양 측정의 종방향으로 상관관계가 있는 성질을 설명하기 위해 활용될 것이다. 이러한 형식적 분석은 시간에 따른 모든 종양 측정이 활용될 것이기 때문에 더 높은 검정력을 가질 것으로 예상된다. 전체 생존을 위해, 각 치료 그룹에 대한 곡선은 카플란-마이어 방법을 사용하여 구축될 것이고, 로그-순위 테스트를 사용하여 비교될 것이다.
암 약물로서의 GPER-PROTAC. 가장 높은 시험관내 효능을 갖는 것으로 밝혀진 GPER-PROTAC을 이들의 항발암성 효능에 대해 검사한다. 수컷 p53fl/flBrca1fl/fl 마우스를 암컷 K14-cre와 사육하고; p53fl/flBrca1fl/fl 마우스는 정상적인 한배새끼 크기를 초래하고 생성된 트랜스제닉 새끼가 배아 치사율을 겪지 않음을 입증한다. 암컷 마우스의 대략 85%는 중앙값 생존 시간이 248일인 유선 종양을 발생시킨다. 디지털 캘리퍼스를 사용하여 종양 형성을 주의깊게 모니터링하고, 종양이 1차원에서 5 mm에 도달하면, 마우스를 대조군 및 치료 그룹으로 무작위화한다. 초기 실험은 독성 테스트에 의해 가이드된 GPER-PROTAC 투여 (100-4,000 mg/kg)로 종양 성장 (퇴행)에 대한 영향이 관찰되는 용량 및 치료 스케쥴을 식별하는데 중점을 둔다. 마우스는 위관영양에 의해 비히클 또는 GPER-PROTAC의 단일 용량을 받는다. 캘리퍼스를 사용하여 종양 성장에 대해 마우스를 모니터링한다. 종양 성장 및 전체 생존 (OS)은 요법에 대한 반응성의 척도로서 사용된다.
생체분포 연구. GPER-PROTAC을 위관영양에 의해 야생형 및 GPER-null 마우스에 투여한다. 용량 스케쥴 및 용량 농도는 달라질 수 있다. 유방, 회장, 십이지장, 비장, 심장, 폐 및 간으로부터 종양 및 조직을 추출하고, 약물 농도를 LC-MS에 의해 측정한다. 접종 후 1시간, 4시간, 24시간, 7일, 14일, 21일 및 28일에 종양 및 조직을 수확한다.
독성 연구. GPER-PROTAC을 사용한 요법과 연관된 임의의 독성을 식별하기 위해, 상기 요약된 실험과 함께 처리된 마우스 및 미처리 마우스 (그룹당 5마리) 둘 모두에서 간 기능 (ALT, AST, LDH, 빌리루빈), 신장 기능 (크레아티닌, BUN), 및 염증성 장 질환 (IBD) (설사, 혈변)을 매주 간격으로 모니터링한다. 독성을 나타내는 객관적인 기준은 간 및 신장 기능 값의 3배 이상의 상승, 및 완화되지 않은 설사 및/또는 혈변을 포함한다.
도 11에 도시된 바와 같이, 24시간의 처리 후, HCC 1806 및 SKBR3 세포는 부분 PROTAC과 비교하여 E2-PROTAC로 처리된 경우 더 낮은 생존가능성을 나타내었다. HCC 1806은 SKBR3보다 E2-PROTAC에 대해 더 높은 반응을 나타내었다. IC50은 약 10 내지 약 50 uM의 범위였다. 에스트라디올을 사용한 세포의 전처리는 HCC 1806 및 SKBR3 둘 모두에서 세포 사멸의 유의한 강하를 나타내었다. GPER의 분해는 세포 사멸 또는 세포 증식의 감소를 초래할 수 있다. 대안적으로, 막으로부터 핵으로의 GPER의 비편재화는 세포질/핵 내부의 단백질을 분해하기 위해 리가제의 동원을 초래할 수 있다.
실시예 2
유방암에 대한 호르몬 요법의 할당에 대한 결정은 생검된 종양 조직에서 핵 에스트로겐 수용체 (ER)의 존재에 전적으로 기초한다. 이는 G-단백질-커플링된 에스트로겐 수용체 (GPER)가 진행성 유방암과 연관되어 있고 유방암 줄기 세포 생존에 필요하다는 사실에도 불구하고; 효과적인 내분비 요법이 또한 이 수용체를 표적화해야 함을 시사하는 관찰이다. 여기에서, ERa, ERb 및 GPER을 효과적으로 분해하는 2개의 ER/GPER-표적화 단백질분해 키메라 (UI-EP001 및 UI-EP002)가 기재되어 있다. 이들 키메라는 각각 약 30 nM 및 10-20 nM의 결합 해리 상수로 GPER 및 ER과의 높은 친화성 상호작용을 형성한다. 원형질막 및 세포내 GPER 및 핵 ER은 UI-EP001 및 UI-EP002에 의해 분해되었지만, 이의 에스트로겐-표적화 도메인이 결여된 부분 PROTAC에 의해 분해되지 않았다. 프로테아솜 억제제인 MG132를 사용한 세포의 전처리는 UI-EP001 및 UI-EP002 단백질분해를 차단한 반면, 리소소모트로픽 억제제인 클로로퀸은 효과를 갖지 않았다. 재조합 b1-아드레날린성 수용체 또는 CXCR4에 대해서는 오프타겟 활성이 관찰되지 않았다. 표적 특이성은 약물 둘 모두가 ERa, ERβ 및 GPER을 효과적으로 분해하면서도 프로게스테론 수용체 (PR)를 보존한 인간 MCF-7 세포에서 추가로 입증되었다. UI-EP001 및 UI-EP002는 MCF-7 유방암 및 인간 SKBR3 (ERa-ERb-GPER+) 유방암 세포에서 세포독성 및 G2/M 세포 주기 정지를 유도하였지만, 기능적 GPER/ER을 발현하지 않는 인간 MDA-MB-231 유방암 세포에서는 그렇지 않았다. 이들 결과는 원형질막 및 세포내 에스트로겐 수용체 둘 모두를 표적화하는 유방암에 대한 항에스트로겐 치료의 수용체-기반 전략을 제공한다.
재료 및 방법
ERa 또는 GPER에 대한 E2-PROTAC의 분자 도킹. 이전에 확립된 GPER 상동성 모델을 GLIDE (슈로딩거(Schroedinger), 미국 매사추세츠주 케임브리지) 도킹 연구에서 사용하였다 (Amatt et al., 2012; Amatt et al., 2013). 이들 연구에서, 그리드는 GLIDE 내에서 수용체 그리드 생성을 사용하여 E2의 이전에 확립된 결합 부위 주위에 먼저 구축되었다. UI-EP001 및 UI-EP002를 마에스트로(Maestro) 11.3 (슈로딩거, 미국 매사추세츠주 케임브리지)에 끌어 들이고, 슈로딩거 내에서 LigPrep 기능을 사용하여 도킹을 위해 준비하였다. OPLS3 포스 필드를 사용하였고, pH 7 ± 2에서 가능한 이온화 상태가 Epik을 사용하여 생성되었고; 모든 다른 설정을 이들의 디폴트 설정에서 유지하였다. 그 후, UI-EP001 및 UI-EP002의 GLIDE 도킹을 수행하였다. 반 데르 발스 반경은 0.15의 부분적 전하 컷오프로 0.8의 스케일링 인자로 설정되었다. 샘플 질소 역전 및 샘플 고리 입체형태가 모두 켜진 상태에서 유연성 리간드 샘플링으로 XP (초정밀) 도킹을 수행하였다. 비평면 입체형태에 패널티를 주기 위해 아미드에 대한 편향 샘플링을 설정하였다. Epik 상태 패널티를 도킹 스코어에 추가하였다. 도킹을 위해, 도킹의 초기 단계 동안 리간드당 10,000개의 포즈가 유지되었고, 리간드당 최상의 1,000개의 포즈가 OPLS3 포스 필드를 사용하여 에너지 최소화를 위해 유지되었다. 도킹 후 최소화가 수행되었고, 리간드당 100개의 포즈가 유지되었다. 모든 다른 설정은 이들의 디폴트 설정에서 유지되었다. UI-EP001 및 UI-EP002 둘 모두는 또한 유사한 방법으로 ERα 내에 도킹되었다. ERα 동종이량체 결정 구조가 사용되었고 (PDB: 1A52, Tanenbaum et al., 1998), 결합된 E2 분자를 제거한 후, UI-EP001 및 UI-EP002를 사용한 도킹 연구 전에 GLIDE 내에서 수용체 그리드 생성을 사용함으로써 도킹을 위해 준비하였다.
E2-PROTAC 및 E2-FITC의 합성. UI-EP001, UI-EP002 및 E2-FITC의 화학적 합성을 각각 도 24 및 도 31의 개략도에 따라 수행하였다. 1H 및 13C NMR 스펙트럼은 300 K에서 브루커(Bruker) AVANCE AV-300 및 브루커 AVANCE AV-500 기구에서 기록되었다. 1H NMR 스펙트럼은 테트라메틸실란 (TMS)의 다운필드에서 백만분율 (ppm)로 보고된다. 모든 13CNMR 스펙트럼은 ppm으로 보고되며 1H 디커플링으로 수득된다. 보고된 스펙트럼 데이터에서, 형식 (δ) 화학적 이동 (다중도, J 값 (Hz), 통합)이 하기 약어와 함께 사용되었다: s = 단일항, d = 이중항, t = 삼중항, q = 사중항, m = 다중항. MS 분석을 워터스(Waters) Q-Tof 프리미어 질량 분광기로 수행하였다. 용리액으로서 용매 A (H2O 중 0.1% TFA) 및 용매 B (MeCN 중 0.1% TFA)를 사용하여 시마즈(Shimadzu) 넥세라(Nexera) X2 UHPLC 시스템을 사용하여 C18 역상 분취용 HPLC 컬럼에 의해 UI-EP001 및 UI-EP002를 정제하였다.
세포 및 배양 조건. 인간 MCF-7, MDA-MB-231, HCC-1806, 및 SKBR3 유방 암종 세포 및 인간 배아 신장 293 세포 (HEK-293)를 아메리칸 티슈 컬쳐 컬렉션(American Tissue Culture Collection) (미국 버지니아 머내서스)에서 구입하였다. 혈구응집소-태그부착된 GPER (HA-GPER), β1-아드레날린성 수용체 (HA-β1AR) 및 CXCR4 (HA-CXCR4)를 안정적으로 발현하는 HEK-293 세포는 이전에 기재되었다 (Filardo et al., 2007). 10% 소 태아 혈청 및 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 페놀 레드-비함유 (1:1) DMEM/햄(Ham) F-12 배지 (PRF-DF12) (인비트로젠, 미국 캘리포니아 칼즈배드) 및 5% CO2를 함유한 가습 챔버에서 37℃에서 모든 세포주를 배양하였다.
스테로이드 및 억제제. 17β-에스트라디올 (17b-E2) 및 알도스테론을 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) (미국 미주리주 세인트루이스)에서 구입하였다. 26S-프로테아솜 억제제인 MG132를 셀렉켐(Selleckchem) (미국 펜실베이니아주 피츠버그)에서 구입하고, 리소소모트로픽 작용제인 클로로퀸 디포스페이트를 바이오-테크네(Bio-Techne) (미국 미네소타 미니애폴리스)에서 구입하였다.
항체. 인간 GPER 폴리펩티드의 N-말단으로부터 아미노산 1-62로부터 유래된 합성 펩티드에 대한 GPER-특이적 항체를 뉴질랜드 화이트 래빗에서 생성하였다 (퍼시픽 이뮤놀로지(Pacific Immunology), 미국 캘리포니아주 라모나). 상업적 항체는 하기를 포함하였다: 토끼 항-HA 에피토프 항체 (셀 시그널링 테크놀로지스, 미국 매사추세츠주 비버리), 마우스 모노클로날 ER-α (2Q418), PR (F-4)을 산타크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology) (미국 캘리포니아주 산타크루즈)에서 구입하고, 토끼 모노클로날 ER-β 항체, 클론 68-4를 EMD 밀리포어(EMD Millipore) (미국 매사추세츠주 빌레리카)에서 구입하였다. 염소 항-토끼 알렉사-플루오르 594, 염소 항-토끼 알렉사-플루오르 488 및 염소 항-마우스 알렉사-플루오르 488 2차 항체를 압캠(Abcam) (미국 매사추세츠주 케임브리지)에서 구입하고, 염소 항-토끼 IgG 및 염소-항-마우스 호스래디시 퍼옥시다제 (HRP)-접합 항체를 서던 바이오테크놀로지(Southern Biotechnology) (미국 앨라배마주 버밍엄)에서 구입하였다.
플라스미드. CMV 프로모터의 전사 제어 하에 전장 인간 GPER (Filardo et al., 2007) 및 Era (deConink et al., 1995)를 코딩하는 분자 클론이 설명되었다. HiBiT 태그 (VSGWRLFKKIS)는 정방향 5'-GTTCAAGAAGATTAGCGATGTGACTTCCCAAGCC-3' (서열식별번호(SEQ ID NO):1) 및 역방향 5'-AGCCGCCAGCCGCTCACCA-TGTCTCTGCACCGTGC-3' (서열식별번호:2) 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 Q5 돌연변이유발 키트 (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 미국 매사추세츠주 세일럼)를 사용하여 역 PCR에 의해 GPER의 아미노 말단에 인-프레임 삽입되었다. 정방향 5'-TGGCGGCTGTTCAAGAAGATTAGCTGAGAGCTCCCTGGCGGA-3' (서열식별번호:3) 및 역방향 5'-GCCGCTCACAG-AGCCTCCTCCACCGACTGTGGCAGGGAAACCC-3' (서열식별번호:4) 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 ER-α의 카르복실 말단에 HiBiT 태그를 삽입하기 위해 유사한 역 PCR 전략을 사용하였다.
일시적 형질감염 및 이원성 나노비트™ 발광 검정. 나노-글로(Nano-Glo) HiBiT 세포외 검출 시스템 키트 (프로메가 코포레이션, 미국 위스콘신주 매디슨)를 사용하여 재조합 LgBit 및 기질을 사용한 이원성 발광 보완에 의해 세제-투과화된 세포에서 총 HiBiT-태그부착된 GPER 또는 ER 에스트로겐 수용체를 검출하였다. 간단히 말해서, HEK293 세포 (0.75 x 106)를 35 mm 조직 배양 접시에 시딩하고, 24시간 후, 리포펙타민 2000 (인비트로젠, 미국 캘리포니아 칼즈배드)을 사용하여 50 ng의 HiBiT-GPER 또는 HiBiT-ERa 및 950 ng의 pcDNA3.1(+) 제오 캐리어 플라스미드로 일시적으로 형질감염시켰다. 다음 날, 형질감염된 세포를 트립신처리에 의해 수확하고, 96-웰 폴리-L-리신-코팅된 그라이너(Greiner) 백색-바닥 마이크로플레이트에서 104개 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 그 다음 날, 세포 배양 배지를 흡인하고, 37℃에서 표시된 시간 간격 동안 및 다양한 농도의 E2-PROTAC, 부분-PROTAC 또는 비히클을 함유하는 100 μL의 무혈청 PRF-DF12로 대체하였다. 일부 실험에서, 클로로퀸 (100 mM) 또는 프로테아솜 억제제인 MG132 (10 mM)가 포함되었다. 처리 후, LgBiT 단백질 및 나노-글로® HiBiT 기질로 이루어진 HiBiT 상보성 시약을 사용하여 0.05% 트리톤(Triton) X-100에서 투과화된 세포에서 총 HiBiT-태그부착된 수용체를 측정하였다. 테칸(Tecan) (미국 노스캐롤라이나주 롤리)으로부터의 인피니트(Infinite) 200 PRO 멀티모드 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 발광을 측정하고, 상대 발광 단위 (RLU)로서 보고하였다. 모든 샘플을 삼중으로 측정하고, 평균 값 플러스 또는 마이너스 표준 편차로서 표현하였다.
면역세포형광. 12-웰 클러스터 플레이트 (코스타(CoStar), 미국 뉴욕주 코닝)에 5% FBS를 함유하는 PRF-DF12에서 12,500 내지 25,000개 세포/㎠의 밀도로 폴리-L-리신-코팅된 18 mm 유리 커버슬립에 세포를 시딩하였다. 다음 날, 세포를 미처리 상태로 두거나, 클로로퀸 (100 mM) 또는 프로테아솜 억제제인 MG132 (10 mM)의 존재 또는 부재 하에 100 mM의 UI-EP001, UI-EP002 또는 부분 PROTAC로 37℃에서 1시간 동안 처리하였다. 처리 후, 플레이트를 얼음 위에서 10분 동안 냉각시킨 후, 30분 동안 4℃에서 GPER N-말단 펩티드 항체로 라벨링하였다. 과량의 항체를 냉 PBS로 세척함으로써 제거한 후, 세포를 PBS 중 4% 파라포름알데히드에서 5분 동안 고정시켰다. 그 후, 세포를 PBS에서 2회 세척하고, 비특이적 항체 결합 부위를 5% 소 혈청 알부민 (BSA) 및 5% 정상 염소 혈청을 함유하는 PBS에서 1시간 동안 차단하였다. 면역염색 전에 10분 동안 0.1% 트리톤 X-100에서 투과화된 세포에서 총 수용체를 측정하였다. 고정된, 투과화된 세포를 PBS에서 2회 세척하고, 1차 항체에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 과량의 1차 항체를 PBS에서 세척함으로써 제거한 후, 세포를 추가 1시간 동안 염소 항-토끼 또는 항-마우스 2차 항체에 노출시켰다. 이러한 제2 인큐베이션 후, 세포를 PBS로 1회 세척하고, 트리스-완충된 염수로 1회 세척한 후, DAPI (벡터 래보러토리즈(Vector Laboratories), 미국 캘리포니아주 벌링게임)를 함유하는 벡타-쉴드(Vecta-Shield) 항-켄치 배지에 커버슬립을 탑재하였다. 큐이미징 레티가(Qimaging Retiga) 2000R 디지털 카메라 및 니콘(Nikon) 이미징 소프트웨어 (NIS-Elements-BR 3.0)를 사용하여 차등적 간섭 대비 및 에피형광 능력을 갖는 니콘 플랜 플루오르 100 × 0.5-1.3 오일 홍채가 장착된 이클립스(Eclipse) 80i 현미경 (니콘, 인크.(Nikon, Inc.), 미국 뉴욕주 멜빌)으로 면역형광 이미지를 시각화하였다. 캡처 후, 이미지를 포토샵(Photoshop) CS2 (어도비(Adobe))를 사용하여 명도/대비 조정으로 프로세싱하였다.
경쟁적 결합 검정. 사소한 변형으로 기재된 바와 같이 추적자로서 플루오레세인-라벨링된 에스트라디올 (E2-FITC)을 사용하여 무손상 세포-기반 경쟁적 결합 검정에서 GPER 결합을 측정하였다 (Cao et al., 2017). SKBR3 세포를 175 ㎠ 플라스크 (미국 뉴욕주 코닝)에서 거의 전면성장까지 성장시킨 후, 밤새 무혈청 배지에 두었다. 세포를 5 mM EDTA를 함유하는 HBSS에서 탈착하고, 150 g에서 5분 동안 원심분리에 의해 회수하였다. 세포 펠렛을 2 mM CaCl2 및 2 mM MgCl2를 함유하는 빙냉 HBSS에서 2회 세척하고, 세포를 동일한 완충제에서 106/ml의 최종 농도로 조정하였다. 세포 (100 μL)를 100 nM E2-FITC와 혼합하고, 동일한 부피의 HBSS 또는 다양한 농도의 17b-E2, 부분 PROTAC 또는 E2-PROTAC을 함유하는 얼음 위의 96 웰 코니칼 V-형상 바닥 미세역가 플레이트에 시딩하였다. 그 후, 샘플을 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 4℃에서 원심분리에 의해 펠렛화하고, 양이온을 갖는 HBSS에서 1회 세척하고, 오로라(Aurora) FCM 기구 (사이텍 바이오사이언시스(Cytek Biosciences), USA)에서 분석하였다. 1차 세포 집단을 분해하기 위해 전방 산란 대 측면 산란 도트-플롯 게이팅을 사용하여 샘플당 적어도 10,000개의 사건을 분석하였다. 각 샘플에 대한 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 채널에서 세포의 형광 강도를 로그 모드로 기록하였다. 각 조건을 삼중으로 수행하고, 중앙값 강도 형광 플러스 또는 마이너스 표준 편차로서 보고하였다.
형광 편광에 의해 MCF-7 세포로부터 제조된 시토졸 분획을 사용하여 ER 결합을 측정하였다. MCF-7 (106개 세포)을 EDTA에서 탈착하고, 다운스(Dounce) 균질화기를 사용하여 세포 균질화액을 제조하고, 이전에 기재된 바와 같이 차등 원심분리에 의해 세포이하의 분획을 단리하였다 (Filardo et al, 2002). 각 분획의 단백질 농도를 비친코닉산 (BCA) 검정 (피어스(Pierce)™ BCA 단백질 검정 키트, 써모 피셔(Thermo Fisher))에 의해 결정하였다. 프로브의 포화 결합 검정을 위해, 10 nM E2-FITC를 함유하는 200 uL의 최종 부피로 검정 완충제 (10 mM 트리스-HCl, pH 7.4; 50 mM KCl, 10% 글리세롤, 0.1 mM 디티오트레이톨 (DTT), 1 ug/mL BGG, 10 nM 프로테아제 억제제 칵테일 (로슈(Roche))에서 상이한 농도의 시토졸 분획을 희석하였다. 혼합물을 주변 온도에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 시토졸 단백질과 프로브의 상호작용을 형광 편광 (FP)에 의해 결정하였다. 경쟁적 결합 검정을 위해, 시토졸 분획 및 E2-FITC (10 nM 최종 농도)의 분취액을 혼합하고, 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 상이한 농도의 약물 및 대조군을 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 추가 1시간 동안 인큐베이션한 후, FP에 적용하였다. 모든 샘플을 삼중으로 측정하였다. 음성 대조군 (시토졸 분획 단독 또는 E2-FITC 단독) 및 양성 대조군 (E2-FITC 및 시토졸 분획 (처리 없이 100% 결합))을 포함시켰다. 상대적 결합 친화성은 양성 대조군과 비교하여 처리된 웰로부터 기록된 FP의 백분율로서 표현하였다. 96-웰, 검정색, 편평-바닥 마이크로플레이트 (그라이너 바이오-원 노스 아메리카, 인크.(Greiner Bio-One North America, Inc.), 미국 노스캐롤라이나주 먼로)에서 스펙트럼 맥스 플러스 384 마이크로플레이트 분광광도계 (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices), 미국 캘리포니아주 서니베일)를 사용하여 각각 485 nm/530 nm의 ex/em 파장에서 밀리편광 단위 (mP)의 FP 값을 측정하였다. 프로브의 Kd 값을 포화 곡선의 비선형 회귀 피팅에 의해 결정한 반면, 처리의 IC50 값을 경쟁 곡선의 비선형 회귀 피팅에 의해 결정하였다.
세포 세포독성 검정. 제조사 제안 프로토콜 (써모 피셔 사이언티픽)에 따라 프레스토-블루 생존율 키트를 사용하여 E2-PROTAC 처리 후 세포 생존율을 측정하였다. 간단히 말해서, 유방암 세포를 성장 배지에서 104개 세포/웰의 밀도로 96 웰-플레이트에 시딩하였다. 그 다음 날, 96 웰 플레이트의 내용물을 흡인하고, 상이한 농도 (10-9 내지 10-3 M 범위)의 처리에 의해 대체한 후, 배지를 첨가하여 총 부피가 200 μL/웰이 되도록 하였다. 미처리 대조군을 200 μL/웰의 신선한 배지와 함께 인큐베이션하였다. 하루 후, 배지를 흡인하고, 90 μL 배지 + 10 μL 프레스토블루 시약에 의해 대체한 후, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 형광을 560 nm에서 여기시키고, 방출을 스펙트럼 맥스 플러스 384 마이크로플레이트 분광광도계 (몰레큘라 디바이시스, 미국 캘리포니아주 서니베일)를 사용하여 590 nm에서 기록하였다. 상대적 세포 생존율 값은 미처리 세포를 함유하는 대조군 웰과 비교하여 처리된 세포를 함유하는 웰로부터 기록된 형광 백분율로서 표현하였다.
세포 주기 분석. 세포를 2.5x105개 세포/웰의 밀도로 6개의 웰-플레이트에 시딩한 후, 미처리 상태로 두거나, 또는 부분 PROTAC, UI-EP001 또는 UI-EP002에 24시간 동안 노출시켰다. 처리 후, 세포를 트립신처리에 의해 수확하고, 빙냉 PBS에서 2회 세척하였다. 그 후, 세포를 4℃에서 30분 동안 70% 에탄올에서 고정시켰다. 고정된 세포를 230 g에서 5분 동안 원심분리에 의해 펠렛화하고, 세포 펠렛을 크리샨(Krishan) 용액 (3.8 mM 시트르산나트륨 (피셔 사이언티픽), 0.014 mM 프로피디움 아이오다이드 (아나스펙(AnaSpec), 미국 캘리포니아주 프리몬트), 1% NP-40 (시그마) 및 2.0 mg/mL RNase A (피셔 사이언티픽))에서 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 원심분리하고, 팩스칼리버(FacScallibur) 유동 세포계측기를 사용하여 분석하기 전에 PBS에서 세척하였다. 유동 세포계측법으로부터의 데이터를 셀퀘스트(CellQuest) 소프트웨어 버전 3.3에 의한 추가 분석에 적용하였다. 생성된 DNA 히스토그램은 세포 주기의 하위-G1, G0-G1, S 또는 G2/M 단계의 세포 집단의 분획을 나타낸다.
통계적 분석. 모든 데이터를 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) (그래프패드 소프트웨어, 미국 캘리포니아주 샌디에고)을 사용하여 분석하였다. 모든 데이터의 분산의 정규성 및 동질성을 일원 분산 분석 (ANOVA)에 의해 분석하였다. 각 실험을 삼중으로 수행하였고, P<0.05인 경우 차이는 유의한 것으로 간주되었다.
결과
E2-PROTAC과의 ERa 또는 GPER1 상호작용의 분자 도킹 분석
GPER 결합 포켓 및 E2와의 이의 상호작용의 이전 연구는 E2가 PROTAC 전략을 사용하여 변형될 수 있고 여전히 이의 결합 효능을 유지할 수 있음을 나타낸다 (Amatt et al., 2012; Amatt et al., 2013). 이러한 상동성 모델링 연구에 기초하여, 17C-히드록실 기는 TM1 및 TM7 사이의 GPER 결합 포켓의 바깥쪽을 가리키고 N1182.62 및 H3077.37과 상호작용하는 것으로 가정된다. 이전 연구는 17C의 형광단의 부착이 GPER 활성에 부정적인 영향을 미치지 않음을 나타내었다 (Filardo et al., 2007). 따라서, 2개의 상이한 PROTAC 분자는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 링커를 통해 17-히드록실 기에 부착된 폰 히펠 린다우, VHL, E3 리간드 (VHL1/VHL032)를 갖도록 인실리코(in silico) 설계되었다. 합성 용이성을 위해 17-히드록실 기에 대한 에스테르 연결을 선택하였고, GPER-PROTAC에 대한 가능한 공간적 제약을 탐구하기 위해 2개의 상이한 링커의 길이를 선택하였다. 제1 분자인 UI-EP001은 E2 및 VHL1 사이에 14-원자 링커로 설계되었고, 제2 분자인 UI-EP002는 E2 및 VHL1 사이에 32-원자 링커로 설계되었다. UI-EP001에 대한 링커 길이는 보고된 문헌에 기초하였으며, 여기서 13-14-원자 링커는 표적 수용체의 높은 분해율 및 선택성을 초래한 반면, UI-EP002의 더 신장된 링커는 화합물의 전체 친수성 및 유연성을 증가시키는데 도움이 되었다. GPER1과의 UI-EP001 및 UI-EP002에 대한 도킹 연구는 원래 E2 결합 포켓이 유지되고 링커가 TM1 및 TM7 사이의 결합 포켓을 배출함을 나타낸다 (도 23). 이들의 단백질 표적을 갖는 공지된 PROTAC의 결정 구조에 기초하여, 두 링커 길이는 모두 UI-EP001 및 UI-EP002가 GPER1에 결합된 동안 VHL E3 리가제와 상호작용하도록 허용할 것이다 (Farnaby et al., 2019; Gadd et al., 2017).
E2의 17C-위치의 변형이 GPER 결합에 대해 관용되는 것으로 공지되어 있지만 (Thomas et al., 2005), 설계된 PROTAC 분자가 ERα와 유리하게 결합하는지 여부는 불분명하다. 따라서, ERα 리간드-결합 도메인 (PDB:1A52)에 결합된 E2의 결정 구조를 사용하여 ERα와의 UI-EP001 및 UI-EP002에 대한 추가 도킹 연구를 수행하였다. E2 및 ERα 사이의 모든 공지된 상호작용은 UI-EP001 및 UI-EP002 둘 모두에 대해 유지된다. 또한, 분자 둘 모두의 링커 길이는 VHL1 부분이 VHL E3 리가제와 상호작용하기에 충분히 길다.
부분 PROTAC (화합물 7)의 합성 세부사항은 도 24 (반응식 1)에 도식화되어 있다. 링커 2를 2-단계 반응식 1A에 따라 트리에틸렌 글리콜로부터 제조하였다. VHL E3 리가제 리간드 (VH032)를 이전에 공개된 문헌 (반응식 1B) (Steinebach et al., 2019; Madak et al., 2017)에 따라 합성하였다. 4-브로모벤조니트릴 및 4-메틸티아졸 사이의 팔라듐-촉매된 교차-커플링을 수행하여 시아나이드 3을 달성하였고, 이를 후속적으로 염화코발트 (II) 및 수소화붕소나트륨으로 처리하여 1차 아민 4를 얻었다. 후속적으로, Boc-Hyp-OH, Boc-Tle-OH 및 링커 2와의 아미드 커플링 후 4로부터 화합물 7을 달성하였다. E2 및 화합물 7 사이의 접합을 스테글리치(Steglich) 조건 하에 수행하여 UI-EP001 또는 화합물 8을 얻었다 (반응식 2). E2 및 화합물 7 사이에 PEG8 링커를 도입함으로써 UI-EP002 (화합물 10)를 제조하였다. 먼저, E2 및 Fmoc-NH-PEG8-CH2CH2COOH를 스테글리치 에스테르화에 적용한 후, 트리메틸아민으로 처리하여 Fmoc 기를 제거하고 화합물 9를 얻었다. 최종적으로, 72시간 동안 HPLC에 의해 주의깊게 모니터링하면서 화합물 9 및 화합물 7 사이의 접합으로부터 화합물 10을 달성하였다 (반응식 3).
E2-PROTAC은 원형질막 및 세포내 에스트로겐 수용체에 대한 고친화성 특이적 결합을 나타내었다
GPER 및 ER은 각각 높은 친화성으로 E2에 결합한다 (Prissnitz et al., 2015). 그러나, 각각의 에스트로겐 수용체는 별개의 세포이하의 구획에 상주하며, 이는 E2-PROTAC과 상호작용하는 이들의 상대적 능력과 관련하여 중요한 암시를 갖는다. GPER은 수용체의 대부분이 세포내 막에서 발현된다는 사실에도 불구하고 원형질막 수용체의 모든 특징을 나타낸다 (Filardo et al., 2007). 원형질막 수용체로서의 역할을 뒷받침하기 위해, 이전 연구는 원형질막 결합 부위를 암시하는 수크로스 밀도 구배 강화된 막 균질화액에서 3H-E2의 특이적 결합을 측정하였다 (Thomas et al., 2005). 원형질막 상의 GPER에 대한 UI-EP0001 및 UI-EP002의 결합을 직접적으로 평가하기 위해, 세포 불투과성 E2-FITC를 플루오로-추적자로서 사용하여 GPER을 발현하지만 ERa 또는 ERb를 발현하지 않는 무손상 SKBR3 세포를 사용하여 경쟁적 결합 검정을 수행하였다 (도 25). 세포 표면 상에 GPER을 발현하거나 발현하지 않는 세포의 결합 활성을 공제하는 차등 포화 분석에 의해 E2-FITC의 GPER 특이적 결합 활성을 측정하였다 (도 25A). 최대 GPER 특이적 결합은 100 nM E2-FITC 근처에 도달하였고 (도 25B), 이 농도를 경쟁적 결합 실험을 위해 선택하였다 (도 25C). E2-FITC의 50%를 대체하는데 필요한 E2의 농도 (IC50)는 17b-E2의 100 ± 1.5 nM에서 E2에 대한 해리 상수 (Kd)로서 계산되었다. 이는 이전에 보고된 E2에 대한 300 nM의 IC50 값과 유사하다 (Cao et al., 2017). 비교에 의해, UI-EP001 및 UI-EP002의 IC50 값은 E2에 대해 측정된 값보다 거의 3배 더 컸다 (RBA= 330%) (각각 30.2 ± 0.9 nM 및 30.2 ± 2.3 nM) (표 1). 이는 부분적으로 E2-FITC 및 E2-PROTAC 사이에 공유된 구조적 상동성에 의해 설명될 수 있으며, 각각은 17C-치환된 히드록실을 함유한다. 대조적으로, VHL E3 유비퀴틴 리가제 인식 모티프에 연결되었지만 이의 E2-표적화 도메인이 결여된 UI-EP001에 대한 화학적 스페이서로 이루어진 부분 PROTAC은 10 mM만큼 높은 농도에서도 E2-FITC 결합에 대해 경쟁할 수 없었다 (도 25C).
표 1. GPER 및 ER에 대한 UI-EP001 및 UI-EP002의 결합 효능
Figure pct00015
약어: IC50, 50% 억제의 농도; RBA, 17β-E2의 IC50 값을 테스트 화합물의 IC50으로 나눈 비율로서 계산된 상대적 결합 친화성. 모든 IC50 값은 삼중 샘플로부터 측정되었고, 평균 ± SD로서 보고된다; NA, 달성되지 않음.
표 2. 세포 생존율 검정에서 UI-EP001 및 UI-EP002에 대한 IC50 값
Figure pct00016
약어: IC50, 50% 억제의 농도; 모든 IC50 값은 삼중 샘플로부터 측정되었고, 평균 ± SD로서 보고된다.
GPER과 대조적으로, ERa 및 ERb는 세포질 및 핵에 농축되어 있는 세포내 수용체이다. 그러므로, 형광 편광 (FP)을 사용하여 MCF-7 유방암 세포로부터 단리된 시토졸 분획에서 UI-EP001 및 UI-EP002 ER의 결합 활성은 평가하였다. 10 nM E2-FITC 및 증가하는 농도의 시토졸 단백질을 사용하여 포화 분석을 수행하였다 (도 25D). 거의 포화 (80%) FP 값에 기초하여, 600 mg/mL의 시토졸 단백질을 사용하여 경쟁적 결합 검정을 수행하였으며, E2는 절반-최대 대체 (IC50= 5.6 ± 1.4 nM)를 나타내었다 (도 25E). 비교에 의해, UI-EP001 및 UI-EP002에 대한 IC50 값은 각각 17.2 ± 8.2 nM 및 11.4 ± 3.3 nM에서 계산되었다. 이들 결과는 UI-EP001 및 UI-EP002가 각각 32% 및 49%의 RBA로 E2와 비교하여 약간 더 약한 결합 친화성을 나타냄을 입증한다 (표 1). 종합적으로, 무손상 세포 및 시토졸 분획에 대해 수행된 이들 경쟁적 결합 검정은 UI-EP001 및 UI-EP002가 낮은 나노몰 범위에서 높은 친화성으로 원형질막 및 세포내 에스트로겐 수용체 GPER에 결합한다는 것을 보여준다.
E2-PROTAC은 천연 및/또는 재조합 에스트로겐 수용체의 발현 수준을 감소시킨다
원형질막 및 세포내 에스트로겐 수용체를 분해하는 UI-EP001 및 UI-EP002의 효능을 평가하기 위해, HiBiT-태그부착된 단백질 및 가용성 Lg-BiT 단백질 간의 상호작용을 측정하는 고도로 민감한 나노비트 이원성 발광 보완 검정을 사용하였다. UI-EP001 또는 UI-EP002로 처리된 세포는 HiBiT-GPER 또는 HiBiT-ERα의 용량-의존적 감소를 입증한 반면 (도 26A 및 B), 100 μM의 부분 PROTAC은 테스트된 농도 내에서 재조합 수용체에 대해 어떠한 유의한 감소도 나타내지 않았다 (도 26C). 이들 검정으로부터, GPER (100 μM) 및 ERα (10-100 μM)에 대해 DC50 값 (50% 단백질 분해에 필요한 농도)을 각각 계산하였다. 이들 DC50 농도를 사용하여, HiBiT-GPER 및 HiBiT-ER의 UI-EP001 및 UI-EP002 분해의 동역학을 측정하였다. UI-EP001 및 UI-EP002 둘 모두는 재조합 GPER 또는 ER의 발현 수준의 시간-의존적 감소를 유도하였으며, 50% 감소는 1시간 이내에 측정되었다 (도 26D 및 E). 대조적으로, 8시간 동안 부분 PROTAC로 세포를 처리한 후 수용체의 83%가 존재하였다.
b1-아드레날린성 수용체, b1AR 및 케모카인 C-X-C 케모카인 유형 4 수용체, CXCR4를 포함한 다른 GPCR을 분해하는 능력을 검사함으로써 GPER에 대한 UI-EP001 및 UI-EP002의 특이성을 결정하였다 (도 27A). 이 목적을 위해, 안정적으로 형질감염된 HEK293 세포주에서 HA-GPER, -b1AR, 또는 -CXCR4를 분해하는 효능에 대해 UI-EP001 또는 UI-EP002 또는 부분 PROTAC의 상대적 효능을 평가하였다. HA-특이적 항체를 사용한 면역형광 분석에 의해, HA-b1AR 또는 HA-CXCR4의 검출가능한 오프타겟 분해 없이 HA-GPER의 특이적 분해를 측정하였다 (도 27A 및 B). 다음으로, ERa, ERb 및 GPER을 발현하는 인간 MCF-7 유방암 세포를 사용하여 내인성 원형질막 및 세포내 에스트로겐 수용체를 분해하는 UI-EP001 및 UI-EP002의 특이성을 평가하였다 (도 27C 및 D). MCF-7 세포를 UI-EP001, UI-EP002, 부분 PROTAC에 1시간 동안 노출시키거나 미처리 상태로 둔 후, 고정시키고, 투과화하고, GPER, ERa, ERb 또는 프로게스테론 수용체, PR에 대한 특이적 항체로 면역염색하였다. 핵 ERα 및 ERβ 및 세포내 GPER에 대해 명확한 부위-특이적 감소가 관찰되었다 (도 27C 및 D). 대조적으로, 부분 PROTAC을 사용한 MCF-7 세포의 처리는 ERa, ERb 또는 GPER 발현에 영향을 미치지 않았다. UI-EP001 또는 UI-EP002는 MCF-7 세포에서 PR의 임의의 검출가능한 분해를 나타내지 않았고, 이는 에스트로겐 수용체에 대한 E2-PROTAC의 특이성을 추가로 나타낸다 (도 5D). 더욱이, 부분 PROTAC이 아닌 UI-EP001 및 UI-EP002는 ERa 및 ERb에 대해 음성인 인간 SKBR3 유방암 세포에서 원형질막 및 총 GPER을 감소시켰다 (도 27E). 유사하게, E2-특이적 PROTAC-매개 분해가 MCF-7 세포의 표면에서 관찰되었다. E2-PROTAC-매개 ER/GPER 분해를 억제하는 외인성 E2의 능력을 검사함으로써 의도된 표적에 대한 UI-EP001 및 UI-EP002의 특이성을 추가로 평가하였다 (도 28A 및 B). ER-HiBiT 또는 GPER-HiBiT로 형질감염된 세포를 100 μM의 UI-EP001 및 UI-EP002 단독으로 또는 증가하는 용량의 E2β 또는 알도스테론 (100 nM-100 μM)과 조합하여 1시간 동안 처리하였다 (도 28A 및 B). E2가 UI-EP001 및 UI-EP002 분해를 효과적으로 억제한 반면, 에스트로겐 수용체 표적의 분해는 대조군 스테로이드인 알도스테론의 존재 하에 측정되지 않았다 (도 28C).
종합하면, 이들 발견은 UI-EP001 및 UI-EP002가 원형질막 및 세포내 에스트로겐 수용체를 선택적으로 분해할 수 있는 에스트로겐 수용체 분해제 (SERD)로서 기능함을 시사한다.
ER 및 GPER의 UI-EP001 및 UI-EP002 분해는 26S-프로테아솜을 통해 발생한다. 최종적으로, UI-EP001 및 UI-EP002가 유비퀴틴-프로테아솜 경로를 통해 이들의 표적 수용체의 분해를 촉진할 수 있는지 여부를 평가하였다. 이들 실험을 수행하기 위해, HiBiT-태그부착된 에스트로겐 수용체를 일시적으로 발현하는 HEK293 세포를 UI-EP001 또는 UI-EP002에 노출시키기 전에 프로테아솜 억제제인 MG132, 리소소모트로픽 작용제인 클로로퀸, 또는 비히클로 전처리한 후, 총 수용체 발현을 상기와 같이 평가하였다. MG132는 GPER 또는 ERα의 UI-EP001 또는 UI-EP002 분해를 역전시켰지만, 클로로퀸은 이러한 효과를 갖지 않았다 (도 28D 및 E). 이 결과는 26S-프로테아솜에서 수용체 폴리유비퀴틴화 및 단백질분해의 결과로서 PROTAC-유도 단백질 분해가 발생한다는 사실과 일치한다. 유의하게, 이들 결과는 본 발명자들의 1세대 E2-PROTAC; UI-EP001 및 UI-EP002가 원형질막 및 세포내 구획에 상주하는 에스트로겐 수용체와 상호작용하여 26S-프로테아솜에서 막 (GPER) 및 핵 (ER) 에스트로겐 수용체의 분해를 신속하게 촉진한다는 것을 시사한다.
종합적으로, 이들 연구는 UI-EP001 및 UI-EP002에 의한 에스트로겐 수용체 (ERα 및 GPER) 및 VHL E3 유비퀴틴 리가제의 동시 결착이 효과적인 분해에 중요함을 암시한다.
E2-PROTAC은 세포 주기 정지를 유도함으로써 유방암 세포 성장을 억제한다
E2-PROTAC의 세포독성 잠재성을 평가하기 위해, UI-EP001, UI-EP002 또는 부분 PROTAC로 처리한 후 상이한 에스트로겐 수용체 프로파일을 갖는 4개의 상이한 인간 유방암 세포주의 생존율을 측정하였다 (도 29). 이 연구에 하기가 포함되었다: i) 3개의 에스트로겐 수용체 모두를 발현하는 MCF-7 세포 (ERa+ ERb+, GPER+), ii) her2/neu를 과발현하는 SKBR3 세포 (ERa-, ERb-, GPER+), iii) 삼중 음성 및 GPER-양성인 HCC1806 세포 (ERa-, ERb-, GPER+), 및 iv) ERa-음성이고 낮은 수준의 ERb 및 GPER을 발현하고 ER (Al-Badar et al., 2011) 또는 GPER (Filardo et al., 2000)-의존적 신호전달 활성을 도출하지 않는 MDA-MB-231 세포 (ERa-, ERblow, GPERlow). 각 유방암 세포주를 다양한 농도의 E2-PROTAC 또는 부분 PROTAC로 24시간 동안 처리한 후, 테트라졸륨 염을 포르마잔 염료로 전환시킬 수 있는 미토콘드리아 옥시도-리덕타제 효소를 측정하는 MTS 검정을 사용하여 세포 생존율을 평가하였다 (표 2에 요약됨). UI-EP001 또는 UI-EP002로 처리된 모든 유방암 세포주에서 세포 생존율의 용량-의존적 감소가 측정되었다. UI-EP001의 경우, GPER을 발현하는 MCF-7, SKBR3 및 HCC1806 유방암 세포주에서 각각 9.0, 10.9 및 34.9 mM의 IC50 값이 측정되었다. 이들 세 가지 세포주 (17.0, 11.1 및 7.4 mM)에서 UI-EP002에 대해 유사한 IC50 값이 각각 측정되었다. 대조적으로, UI-EP001 및 UI-EP002에 대한 IC50 값은 >80% 세포 생존가능성으로 낮은 농도의 기능적 ERb 또는 GPER을 발현하는 MDA-MB-231 세포에서 대략 100배 더 높았다 (> 100 mM). 이들 IC50 값은 부분 PROATAC로 처리된 세포에 대해 측정된 값과 유사하였다. 이들 데이터는 막 및 세포내 에스트로겐 수용체의 제거가 유방암 세포 생존율을 결정하는 중요한 인자임을 시사한다.
감소된 세포 생존율과 연관된 생물학적 효과를 조사하기 위해, 프로피디움 아이오다이드 염색을 사용하여 동일한 4개의 세포주에 대해 세포 주기 분석을 수행하고, 10 μM E2-PROTAC 또는 부분 PROTAC로 세포를 처리한 후 24시간에 유동 세포계측법에 의해 측정하였다 (도 30). 4개의 모든 세포주로부터의 미처리 세포는 대부분의 세포가 G1에 있고 작은 백분율의 세포가 S 또는 G2/M에 있는 전형적인 세포 주기 분포 패턴을 나타내었다. UI-EP001 또는 UI-EP002로 처리한 후, G1의 유의한 감소와 함께 G2/M 피크의 극적인 증가가 MCF-7, SKBR3 및 HCC1806 유방암 세포에서 관찰되었다. 이러한 이동은 ERa를 발현하지 않고 낮은 양의 기능적 ERb 또는 GPER을 발현하는 MDA-MB-231 세포에서는 관찰되지 않았으며, 이는 E2-PROTAC이 에스트로겐 수용체 중 하나 또는 둘 모두를 감소시킴으로써 G2/M 단계에서 세포 주기 정지를 유도함을 시사한다. 예상된 바와 같이, 부분 PROTAC로 처리된 세포는 G1 및 G2/M 사이의 총 세포 집단의 백분율의 훨씬 덜 유의한 이동을 나타내었다. 이들 시험관내 결과는 ERα 및/또는 GPER의 분해가 생체내에서 ER+ 뿐만 아니라 ER- 유방암의 치료에 효과적일 잠재성을 갖는다는 것을 강력하게 시사한다.
논의
에스트로겐의 발암 효과는 핵 스테로이드 호르몬 및 G-단백질 커플링된 수용체 슈퍼패밀리에 속하는 세포 수용체를 통해 나타난다 (Filardo et al., 2018). 다수의 ER-표적화된 PROTAC이 개발되었지만, GPER을 분해하는 이들의 능력에 대해 아직 테스트되지 않았다. 여기에서, 단일 에스트라디올-기반 PROTAC이 수용체 클래스 둘 모두를 표적화할 수 있다는 원리 증명 증거가 제공된다. 인실리코 모델링 및 구조-활성 관계 데이터에 따라, 17C에서 소분자 VHL E3 유비퀴틴 리가제 동원 모티프에 연결된 에스테르-연결된 14- 또는 32- 원자 길이 PEG 스페이서로 치환된 에스트라디올-기반 표적화 도메인; (S, R, S) AHPC를 함유하는 2개의 1세대 PROTAC (UI-EP001 및 UI-EP002)을 설계하였다. 각 PROTAC은 핵 ER 및 GPER에 대한 높은 결합 친화성 및 측정가능한 검출가능한 오프타겟 활성 없이 GPER 및 ER에 대한 선택적 프로테아솜-의존적 분해적 활성을 나타내었다. 가장 중요하게는, UI-EP001 및 UI-EP002는 표적-특이적 세포독성 및 G2/M 정지를 나타내었고, 이는 1세대 범-에스트로겐 수용체 PROTAC에 대한 바람직한 시험관내 특징이다.
PROTAC 플랫폼은 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는 인간 질환에 대한 치료적 잠재성을 갖는 광범위한 단백질을 선택적으로 분해하는데 사용되었다: 스테로이드 호르몬 수용체 (AR, ERa, ERRa, RAR) (Itoh et al., 2011; Peng et al., 2019; Schneekloth et al., 2008), 브로모- 및 말단외 (BET) 패밀리 단백질 (Lu et al., 2015; Winter et al., 2015), 키나제 (Bondesonet al., 2018; Lai et al., 2016), 및 미세소관-연관 단백질 (Tau, TACC3) (Silva et al., 2019). 이 그룹은 최근에 GPCR을 포함하도록 연장되었다 (Li et al., 2020). PROTAC이 별개의 세포이하의 구획에 편재화된 고유한 구조적 특징을 갖는 단백질을 효율적으로 표적화할 수 있다는 사실만으로도 이들의 흥미로운 가능성을 입증한다. 그러나, 단일 단백질 표적에 대한 PROTAC의 개발은 사소한 문제가 아니다. 궁극적으로, 표적 최적화는 상이한 표적화 도메인 및/또는 워헤드 도메인을 평가하고, 화학적 스페이서의 길이 및 조성 뿐만 아니라 전체 이종-이관능성 분자의 전체 입체화학을 변경하는 수많은 미세 조정을 수행함으로써 달성된다. 이론적으로, 별개의 물리화학적 환경에 상주하는 고유한 구조를 갖는 2개의 구조적으로 및 기능적으로 별개의 에스트로겐 수용체를 표적화할 수 있는 단일 PROTAC을 설계하는 것은 더 어려운 작업을 제기할 것이지만, 이들 종양의 대부분이 GPER을 또한 발현하기 때문에 ER+ 유방암을 치료하는데 필요한 작업이다. ERa-PROTAC의 광범위한 분류가 지난 10년에 걸쳐 개발되었지만, 이들 화합물이 또한 고도로 관련된 에스트로겐 수용체인 ERb 또는 보다 최근에 기재된 원형질막 에스트로겐 수용체인 GPER을 표적화할 수 있는지 여부를 입증한 단일 공개된 연구는 없다.
선구적인 ER-PROTAC은 펩티드성 워헤드 도메인을 함유하였고, 결과적으로 E3 유비퀴틴 리가제 SCFb-TCRP를 효과적으로 동원하기 위해 낮은 세포 투과성 및 세포 효소적 활성에 대한 의존성을 나타내었다 (Sakamoto et al., 2003). 보다 최근의 2세대 ER-PROTAC은 이들의 표적화 도메인에서 ER 길항제를 사용하고, 낮은 나노몰 농도에서 높은 세포 투과성 및 분해 능력을 나타낸다 (Hu et al., 2019: Denizu 2012; Okuhira et al., 2013). 이들 후자 PROTAC은 또한 GPER 뿐만 아니라 ER을 표적화할 수 있지만, 수용체에 대한 ER 길항제와 비교하여 E2의 예상되는 감소된 RBA로 인해 아마도 그 정도가 더 적을 수 있다. 실험 방법론에 의한 약물-표적 상호작용의 평가는 표적 특이성 및 선택성을 평가하기 위한 중요한 단계이다. 그러나, 일반적으로, ER-PROTAC의 결합 특성은 측정되지 않았으며, 많은 경우에 표적 선택성이 평가되지 않았다. UI-EP001 및 UI-EP002 둘 모두는 낮은 나노몰 범위에서 계산된 Kd 값으로 표적 에스트로겐 수용체 둘 모두에 대해 높은 친화성을 나타내며, 이는 17C 치환된 E2 표적화 도메인이 GPER 및 ER 둘 모두 상의 리간드 접촉 부위와 잘 상호작용함을 시사한다. RT-PCR에 의해 검출가능한 ERa 또는 ERb 없이 GPER을 발현하는 17C 치환된 E2-FITC 및 무손상 SKBR3 유방암 세포를 사용하여 (Vladusic et al., 1998), UI-EP001 및 UI-EP002에 대해 30.2 nM의 Kd 값이 측정되었다. 이는 1, 3, 5(10)-에스트라트리엔-3, 17β-디올 17-헤미숙시네이트: BSA (E2-BSA)가 세포내 cAMP의 GPER-의존적 활성화를 자극할 수 있다는 과거의 증거와 일치한다 (Filardo et al. 2007). 그러나, 이들 발견은 E2-BSA가 아닌 유리 E2가 재조합 ERa 또는 ERb에 결합된 125I-16a-아이오도-E2를 대체하거나 전기영동 이동성 검정에서 겔 이동을 유도할 수 있음을 보여주는 출판된 연구와 상충한다 (Stevis et al., 1999). 유리 17b-E2, UI-EP001 또는 UI-EP002는 각각 5.6 nM, 17.2 nM 및 11.4 nM에서 측정된 Kd 값을 갖는 내인성 ERa 및 ERb를 함유하는 MCF-7 세포 균질화액으로부터 제조된 시토졸 분획에 결합된 E2-FITC를 대체하였다. 본 발견 및 스테비스(Stevis) 및 동료의 것과 일치하지 않는 이유는 명확하지 않지만, E2 및 FITC의 1:1 화학량론에 비해 BSA에 대한 E2의 다중가 뿐만 아니라 결합 프로브의 차이 둘 모두와 관련될 수 있다. 한 가지 가능성은 GPER에 대한 E2-FITC의 결합 동역학이 프로브의 대체에 영향을 미치는 125I-16a-아이오도-E2와 비교하여 상이하다는 것이다. 그럼에도 불구하고, 이들 데이터는 본 발명자들의 1세대 E2-PROTAC이 임의의 새로운 약물의 가장 중요한 특징, 이의 의도된 표적에 대해 특이적으로 및 높은 친화성으로 상호작용하는 능력을 보유하고 있음을 시사한다.
이들의 설계에 의해, PROTAC은 선택적 단백질 표적화된-분해의 암 치료제로서의 가능성을 제공한다. 주어진 PROTAC에 대한 표적 특이성을 입증하기 위한 목적으로, 골드 표준 검정은 처리된 세포 및 미처리 세포의 프로테옴의 비교 전체 판독값을 제공하기 위해 질량 분광법 분석을 사용하는 것이다 (Beveridge et al., 2020). 실제적인 관점에서, 표적 특이성은 암 치료 표적을 발현하거나 결여된 암 세포의 생존의 차이를 평가함으로써 가장 잘 평가될 수 있다. 이는 ER 및 GPER을 선택적으로 분해하도록 설계된 이중 특이성 PROTAC을 평가하는데 특히 중요하다. 본 연구에서, 면역형광, 생화학적 및 생물학적 방법을 사용하여 표적 선택성을 평가하였다. 면역형광 분석에 의해, 세포 표면 및 세포내 모두에서 핵 내 및 GPER에 대한 ERa 및 ERb의 선택적 부위-특이적 감소를 보여줄 수 있었다. UI-EP001 또는 UI-EP002에 의한 세포내 GPER의 분해는 수크로스 밀도 원심분리에 의해 강화된 조질 막 분획 뿐만 아니라 원형질막 분획으로부터의 3H-17b-E2의 GPER-의존적 특이적 대체를 나타낸 본 발명자들의 이전 발견과 일치한다 (Thomas et al., 2005). E2-PROTAC-처리된 세포에서 PR, CXCR4 또는 b1AR에 대한 감소가 측정되지 않았다는 사실에 의해 선택성을 입증하였다. 마찬가지로, 이원성 발광 보완에 의해, 알도스테론이 아닌 외인성 E2가 HiBiT-GPER 또는 HiBiT-ER의 E2-PROTAC-매개 분해를 차단할 수 있음을 보여줌으로써 표적 선택성을 또한 입증하였다. 최종적으로, UI-EP001 및 UI-EP002에 대한 표적 선택성은 에스트로겐 수용체의 상이한 보체를 발현하는 다양한 유방암 세포주에서 생존율 및 세포 주기 분포에 대한 이들의 상대적 효과를 비교한 생물학적 검정에서 나타났다. 3개의 에스트로겐 수용체를 모두 발현하는 MCF-7 세포에서 감소된 생존율 및 G2/M 정지가 관찰되었지만, ERa가 결여되어 있고 낮은 수준의 기능적 ERb 및 GPER을 발현하는 MDA-MB-231 세포에서는 그렇지 않았다. 이것이 감소된 ER 또는 GPER, 또는 둘 모두로 인한 것인지 여부는 이들 세포에서 명확하지 않다. 다른 조사자들이 ER-양성 MCF-7, BT-474 및 CAMA-1 유방암 세포주에서 ER-PROTAC의 세포독성을 평가하였으며, 이들 세포가 또한 GPER을 발현한다는 점은 주목할 만한다 (Kargno et al., 2019; Zhang et al., 2004). 이 연구에서 E2-PROTAC은 her-2/neu 과발현 및 TNBC 종양 면역표현형을 나타내는 ER-음성, GPER-양성 SKBR3 및 HCC-1806 유방암 세포주의 처리 후 세포독성 및 G2/M 정지를 유도하였다. 상이한 화학요법제가 세포 주기의 상이한 단계에서 세포 주기 정지를 나타내지만, E2-PROTAC이 G2/M 정지를 유도한다는 관찰은 안드로겐 수용체 (AR)-PROTAC, ARD-61이 또한 G2/M 정지를 유도한다는 이전 보고서와 일치한다 (Zhao et al., 2020). 일부 면에서는, UI-EP001 또는 UI-EP002가 ER 또는 GPER의 완전한 손실이 관찰되지 않았다는 사실로 인해 세포독성 효과 및 세포 주기 정지를 유도한다는 것이 다소 놀라운 것처럼 보일 수 있다. 이들 결과에 대한 한 가지 가능한 설명은 GPCR이 일반적으로 리간드 점유 및 수용체 반응 사이의 쌍곡선 관계를 나타낸다는 사실과 관련될 수 있다. 이러한 관계는 "분획 점유"라고 불리며, 수용체 활성의 유의한 감소를 관찰하기 위해 원형질막에서 GPER의 총량을 제거할 필요가 없을 수 있는 이유를 제안한다. 더 중요하게는, 본 시험관내 발견은 E2-PROTAC이 GPER을 발현하는 유방암 뿐만 아니라 에스트로겐 표적화된 요법에 의해 치료불가능한 것으로 간주되는 일부 ER-음성 유방암에 대해서도 치료적 이점을 가질 수 있음을 나타낸다.
아르비나스, 엘엘씨(Arvinas, LLC)는 암의 전임상 마우스 모델에서 유망한 성공을 보여준 ER (ARV-471) 또는 AR (ARV-110)을 표적화하는 PROTAC을 개발하였다. 두 PROTAC 모두는 각각 전립선암 및 유방암에 대한 I상 임상 시험 (clinicaltrials.gov의 NCT03888612 및 NCT04072952) 중이다 (Flanagan et al., 2018; Neklessa et al., 2019). PROTAC은 유방암 치료를 위해 현재 SERD보다 더 매력적으로 만드는 여러 장점을 갖는다 (Neklessa et al., 2019). PROTAC은 본질적으로 촉매적이기 때문에, 내분비 요법의 주요 한계 중 하나인 과발현 또는 돌연변이 (유비퀴틴화 수용자 부위가 변경되지 않은 경우)에 의해 획득된 약물 내성을 극복하는데 이상적으로 적합하다. 실제로, ARV-471은 세포주 및 PDX 모델에서 임상적으로 관련된 ERα 돌연변이체 (Y537S 및 D538G)를 효율적으로 분해하는 것으로 입증되었다 (Flanagan et al., 2018). ARV-471의 표적화 도메인은 개시되어 있지 않고 독점적이므로, GPER을 또한 표적화할 수 있는지 여부는 명확하지 않다. 마찬가지로, 수많은 다른 ER-PROTAC이 개발되었으며, 이들 PROTAC이 GPER을 표적화하는지 여부도 명확하지 않다. GPER은 ER-양성 유방암의 60%에서 발현되고 (Filardo et al., 2008), 진행성 암을 예측하는 임상 변수와 연관되어 있고, ER-음성 유방암 및 TNBC에서 일반적으로 발현되고, 항에스트로겐 요법에 대한 내성과 연관되어 있기 때문에, GPER을 표적화하는 암 치료제를 개발하는 것이 중요하다. 범-에스트로겐 수용체 PROTAC, 예컨대 E2-PROTAC, UI-EP001 및 UI-EP002는 이러한 목적에 이상적으로 적합할 수 있으며 기존 항에스트로겐 요법을 보완할 것이다.
실시예 3
반응식
Figure pct00017
반응식 1. E2-FITC 12의 합성. 시약 및 조건: (xi) tert-부틸-4-아이오도벤질카르바메이트, Pd(Ph3)4, CuI, Et3N, r.t, 밤새; (xii) 1. TFA/DCM, rt, 2h; 2. FITC, 피리딘, DMF, rt, 밤새.
합성 절차
UI-EP001 (8)의 합성
Figure pct00018
디-tert-부틸 3, 6, 9, 12 - 테트라옥사테트라데칸디오에이트 (1). 트리에틸렌 글리콜 (1.50 g, 1.36 ml, 10 mmol, 1 eq.), 미네랄 오일 중 NaH 60% (800 mg, 20 mmol, 2 eq.) 및 tert-부틸 브로모아세테이트 (4.50 g, 3.4 ml, 20 mmol, 2 eq.)의 혼합물을 10 mL의 디옥산에 용해하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반한 후, 포화 NH4Cl로 켄칭하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하고, Na2SO4에 의해 건조한 후, 진공에서 농축하였다. 생성물을 플래쉬 크로마토그래피 (헥산:EtOAc = 8:2)에 적용하여 화합물 1을 무색 오일로서 얻었다. 수율: 3.25 g, 8.60 mmol (92%). 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 3.99 (s, 4H), 3.72-3.66 (m, 16H), 1.46 (s, 9H). HRMS (ESI+) 계산치 C18H34O8 [M + 1] +: 379.23, 실측치 379.46.
Figure pct00019
디-tert-부틸 3, 6, 9, 12 - 테트라옥사테트라데칸디오산 (2). DCM (mmol 당 6 mL) 중 50% v/v 트리플루오로아세트산 (TFA) 중 화합물 1 (1.74 g, 4.62 mmol)의 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. TLC 분석 (DCM 중 10% 메탄올)은 출발 물질의 완전한 전환을 나타내었다. 그 후, 반응 혼합물을 진공 하에 농축하고, 조질 생성물을 동결-건조하여 원하는 생성물 2 (정량적 수율)를 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 4.03 (s, 4H), 3.85-3.42 (m, 16H). HRMS (ESI+) 계산치 C10H18O8 [M + 1] +: 267.10, 실측치 267.56.
Figure pct00020
4-(4-메틸티아졸-5-일) 벤조니트릴 (3). 4-브로모벤조니트릴 (5.00 g, 27.5 mmol), 4-메틸티아졸 (4.98 mL, 54.7 mmol), KOAc (5.40 g, 55.0 mmol), 및 팔라듐 아세테이트 (62.0 mg, 0.27 mmol)의 혼합물을 20 mL의 DMAc에 용해하였다. 혼합물을 밤새 120℃로 가열하고, 냉각하고, EtOAc로 희석하였다. 용액을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 농축하였다. 생성된 오일을 플래쉬 크로마토그래피 (헥산:EtOAc = 9:1 -> 1:1 -> 1:9)에 적용하였다. 화합물 3을 황색 고체로서 수득하였다 (4.49 g, 22.5 mmol, 82%). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.76 (s, 1H), 7.75 - 7.71 (m, 2H), 7.60 - 7.55 (m, 2H), 2.58 - 2.56 (m, 3H). HRMS (ESI+) 계산치 C11H8N2S [M + 1] +: 201.04, 실측치 201.36.
Figure pct00021
(4-(4-메틸티아졸-5-일) 페닐) 메탄아민 (4). 화합물 3 (4.49 g, 22.5 mmol)을 300 mL 무수 MeOH에 용해하였다. 코발트 클로라이드 (CoCl2) (4.39g, 33.75 mmol)를 첨가하고, 용액을 얼음 수조에서 30분 동안 냉각하였다. NaBH4 (5.22 g, 138 mmol)를 20분에 걸쳐 분획으로 첨가하였다. 혼합물을 추가 90분 동안 교반하고, 냉 H2O로 켄칭하였다. 혼합물을 여과하고, H2O에 희석하고, EtOAc로 추출하였다. 유기 층을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 농축하고, 플래쉬 크로마토그래피 (DCM:MeOH = 99:1 -> 90:10, 0.5M Et3N 사용)를 통해 정제하였다. 화합물 4를 백색 분말로서 수득하였다 (3.44 g, 16.88 mmol, 75%). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.94 (s, 1H), 7.42 (m, 4H), 3.77 (s, 2H), 2.45 (s, 3H). 13C NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 152.23, 147.98, 145.01, 131.89, 129.95, 129.01, 127.35, 45.23, 15.98. HRMS (ESI+) 계산치 C11H12N2S [M + 1] +: 205.07, 실측치 205.77.
Figure pct00022
(4R)-4-히드록시-N-(4-(4-메틸티아졸-5-일) 벤질)-Boc-피롤리딘-2-카르복사미드 (5). 화합물 4 (2.04 g, 10.00 mmol), Boc-Hyp-OH (2.31 g, 10.00 mmol), DIPEA (6.95 mL, 40.00 mmol), 및 HBTU (4.16 g, 11.00 mmol)의 혼합물을 50 mL의 무수 DMF에 용해하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, H2O로 희석하고, EtOAc로 추출하였다. 유기 층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 농축하였다. 조질 생성물을 플래쉬 크로마토그래피 (DCM:MeOH = 99:1 -> 90:10)를 통해 정제하였다. 화합물 5를 무색 오일로서 수득하였다 (2.79 g, 6.7 mmol, 67%). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.69 (s, 1H), 8.28 - 8.04 (m, 1H), 7.45 - 7.32 (m, 4H), 4.52 - 4.44 (m, 3H), 4.10 (t, 1H), 3.10 - 3.00 (m, 1H), 2.88 - 2.77 (m, 1H), 2.54 (s, 3H), 2.41 - 2.32 (m, 1H), 2.07 - 1.93 (m, 1H), 1.43 (s, 9H). 13C NMR (300 MHz, CDCl3) δ 172.15, 153.88, 152.12, 148.02, 139.75, 131.52, 130.66, 129.05, 128.05, 77.25, 65.48, 55.98, 53.95, 42.16, 28.96, 14.86. HRMS (ESI+) 계산치 C21H27N3O4S [M + 1] +: 418.17, 실측치 418.03.
Figure pct00023
(4R)-1-((S)-2-Boc-아미노-3,3-디메틸부타노일)-4-히드록시-N-(4-(4-메틸티아졸-5-일) 벤질) 피롤리딘-2-카르복사미드 (6). 화합물 5 (2.79, 6.7 mmol)를 50% v/v TFA/DCM (mmol 당 6 mL)에 용해하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축하고, 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. 마지막 단계 생성물, Boc-L-tert-류신 (1.54 g, 6.7 mmol), HBTU (2.79 g, 7.37 mmol), 및 DIPEA (4.66 mL, 26.8 mmol)의 혼합물을 50 mL의 DMF에 용해하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, H2O로 희석하고, EtOAc로 추출하였다. 유기 층을 포화 NaHCO3 용액, 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 농축하였다. 조질 생성물을 플래쉬 크로마토그래피 (DCM:MeOH = 99:1 -> 90:10)로 정제하여, 화합물 6을 백색 분말로서 얻었다 (2.09 g, 3.95 mmol, 2 단계 후 59% 수율). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.98 (s, 1H), 7.56 - 7.50 (m, 4H), 4.91 - 4.86 (m, 4H), 4.08 (s, 1H), 3.36 - 3.31 (m, 1H), 2.58 (s, 3H), 2.34 - 2.30 (m, 1H), 2.13 - 2.07 (m, 1H), 1.20-1.02 (m, 18H). 13C NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 173.12, 170.15, 157.23, 153.48, 148.16, 139.68, 132.36, 130.12, 128.79, 125.56, 75.69, 65.26, 58.56, 55.23, 53.29, 42.56, 38.26, 36.18, 27.48, 25.42, 15.99. HRMS (ESI+) 계산치 C27H38N4O5S [M + 1] +: 531.26, 실측치 531.49.
Figure pct00024
부분 PROTAC (7). 화합물 5 (2.09, 3.95 mmol)를 50% v/v TFA/DCM (mmol 당 6 mL)에 용해하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축하고, 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. 마지막 단계 생성물 (1 eq), 화합물 2 (2.1 g, 7.9 mmol, 2 eq), HBTU (1.65 g, 4.30 mmol), 및 DIPEA (2.75 mL, 15.8 mmol)의 혼합물을 50 mL의 DMF에 용해하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. TLC가 출발 물질의 완전한 반응을 나타내면, 혼합물을 DCM에 희석하고, 염수로 세척하고, 건조하고, 농축하였다. 생성물을 HPLC 역상 컬럼 (Zorbax300SB-C18, 21.2x150mm, 5uCrt)에 의해 정제하여 원하는 생성물 7을 수득하였다. 수율: (1.21 g, 2 단계 후 46%). 1H NMR (500 MHz, MeOD-d 4 ) δ 9.68 (s, 1H), 7.56 - 7.50 (m, 4H), 4.67. - 4.69 (t, 1H), 4.58 - 4.55 (m, 2H), 4.43 - 4.40 (d, 1H), 4.15 - 4.11 (m, 4H), 4.08 - 4.05 (m, 17H), 3.78 - 3.80 (m, 1H), 3.85 - 3.71 (m, 1H), 3.36 - 3.31 (m, 1H), 2.58 (s, 3H), 2.34 - 2.30 (m, 1H), 2.13 - 2.07 (m, 1H), 1.20-1.02 (m, 9H). 13C NMR (500 MHz, MeOD-d 4 ) δ 172.97, 170.73, 170.31, 151.43, 147.69, 138.87, 132.01, 130.15, 129.00, 127.58, 70.93, 70.37, 70.24, 70.20, 69.77, 69.73, 69.66, 59.41, 56.75, 56.69, 50.39, 42.33, 37.53, 37.70, 29.26, 25.56, 14.40. HRMS (ESI+) 계산치 C31H44N4O10S [M + 1] +: 679.29, 실측치 679.89.
Figure pct00025
UI-EP001 (8). 화합물 7 (300 mg, 0.46 mmol)을 3시간 동안 5 mL의 DMF에서 N-히드록시숙신이미드 (NHS) (53 mg, 0.46 mmol)에 의해 활성화시킨 후, 17β-에스트라디올 (125 mg, 0.46 mmol) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC) (71.3 mg, 0.46 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반하고, 역상 HPLC에 의해 모니터링하였다. 조질 생성물을 DCM:MeOH (90:10)에 희석하고, 염수로 세척하고, 건조하고, 농축하였다. 생성물 8을 HPLC 역상 컬럼 (Zorbax300SB-C18, 21.2x150mm, 5uCrt)에 의해 수득하였다. 수율 (119 mg, 28%). 1H NMR (500 MHz, MeOD-d 4 ) δ 9.64 (s, 1H), 7.56 - 7.49 (m, 4H), 7.09 - 7.07 (d, 1H), 6.55 - 6.53 (m, 1H), 6.48-6.49 (d, 1H), 4.71 - 4.67 (t, 1H), 4.58 - 4.55 (m, 2H), 4.12 - 3.95 (m, 17H), 3.86 - 3.84 (d, 1H), 3.74 - 3.71 (m, 1H), 3.68 - 3.65 (t, 1H), 2.78 - 2.77 (m, 2H), 2.57 (s, 3H), 2.32 - 2.30 (m, 2H), 2.14 - 1.95 (m, 4H), 1.74 - 1.67 (m, 1H), 1.54 - 1.18 (m, 7H), 1.15 (s, 9H), 0.78 (m, 3H). 13C NMR (500 MHz, MeOD-d 4 ) δ 173.12, 170.15, 157.23, 153.48, 148.16, 139.68, 132.36, 130.12, 128.79, 125.56, 75.69, 65.26, 58.56, 55.23, 53.29, 42.56, 38.26, 36.18, 27.48, 25.42, 15.99. HRMS (ESI+) 계산치 C50H68N4O11S [M + 1] +: 933.46, 실측치 933.23.
UI-EP002 (10)의 합성
Figure pct00026
화합물 (9). Fmoc-NH-PEG8-CH2CH2COOH (300 mg, 0.3 mmol)를 3시간 동안 1 mL의 DMF에서 N-히드록시숙신이미드 (NHS) (34.5 mg, 0.3 mmol)에 의해 활성화시킨 후, 17β-에스트라디올 (81.6 mg, 0.3 mmol,) 및 EDC (46.6 mg, 0.3 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 72시간 동안 교반하고, 역상 HPLC에 의해 모니터링하였다. 조질 생성물을 HPLC 역상 컬럼 (Zorbax300SB-C18, 21.2x150mm, 5uCrt)에 의해 정제하여 화합물 9를 얻었다. 수율 (41 mg, 16%). 1H NMR (500 MHz, MeOD-d 4 ) δ 7.12 - 7.11 (d, 1H), 6.59 - 6.57 (m, 1H), 6.52-6.51 (d, 1H), 4.26 - 4.24 (m, 1H), 3.77 - 3.74 (t, 2H), 3.71 - 3.56 (m, 31H), 3.34 - 3.32 (m, 2H), 2.83 - 2.80 (m, 2H), 2.59 - 2.56 (t, 2H), 2.36 - 2.31 (m, 1H), 2.17 - 2.14 (m, 1H), 2.09 - 2.05 (m, 1H), 2.01 - 1.97 (m, 1H), 1.92 - 1.88 (m, 1H), 1.59 - 1.19 (m, 8H), 0.81 (s, 3H). 13C NMR (500 MHz, MeOD-d 4 ) δ 171.62, 152.12, 141.58, 138.85, 135.04, 128.85, 125.00, 123.42, 122.38, 117.17, 112.27, 109.95, 78.73, 67.76, 67.74, 67.67, 67.59, 67.53, 67.14, 64.07, 63.81, 47.54, 40.59, 38.02, 36.76, 34.26, 32.13, 26.94, 26.93, 26.88, 24.75, 23.83, 20.25, 7.90HRMS (ESI+) 계산치 C51H69NO13 [M + 1]+: 905.11, 실측치 905.19.
Figure pct00027
UI-EP002 (10). 화합물 9 (35.0 mg, 0.39 mmol)의 Fmoc 기를 DMF (5 mL) 중 Et3N (1 mL)에 의해 제거하였다. Et3N을 회전증발기에 의해 반응 혼합물로부터 제거한 후, 부분 PROTAC 7 (264.4 mg, 0.39 mmol), HATU (178.6 mg, 0.47 mmol) 및 DIPEA (0.271 mL, 1.56 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반하고, 역상 HPLC에 의해 모니터링하였다. 생성물 10을 HPLC 역상 컬럼 (Zorbax300SB-C18, 21.2x150mm, 5uCrt)에 의해 수득하였다. 수율 (26 mg, 52%). 1H NMR (500 MHz, MeOD-d 4 ) δ 9.69 (s, 1H), 7.57 - 7.51 (m, 4H), 7.12 - 7.11 (d, 1H), 6.59 - 6.57 (m, 1H), 6.52 - 6.51 (d, 1H), 4.71 - 4.68 (m, 1H), 4.59 - 4.56 (d, 1H), 4.44 - 4.40 (d, 1H), 4.26 - 4.24 (m, 1H), 4.09 (s, 1H), 3.88 - 3.86 (m, 1H), 3.77 - 3.74 (t, 2H), 3.71 - 3.56 (m, 47H), 3.36 - 3.32 (m, 6H), 2.83 - 2.23 (m, 2H), 2.59 - 2.56 (m, 5H), 2.36 - 2.31 (m, 1H), 2.21 - 2.14 (m, 1H), 2.10 - 2.03 (m, 1H), 2.01 - 1.97 (m, 1H), 1.92 - 1.88 (m, 1H), 1.76 - 1.70 (m, 1H), 1.43 - 1.30 (m, 8H), 1.15 (s, 9H), 0.81 (s, 3H). 13C NMR (500 MHz, MeOD-d 4 ) δ 174.01, 167.15, 154.52, 143.97, 141.25, 137.43, 131.25, 127.39, 126.77, 125.81, 124.81, 124.78, 119.56, 114.67, 112.34, 81.12, 70.16, 70.13, 69.98, 69.93, 69.54, 66.47, 66.21, 49.94, 42.98, 40.41, 39.16, 34.52, 29.33, 29.32, 29.17, 27.14, 26.22, 22.64, 10.30. HRMS (ESI+) 계산치 C68H103N5O20S [M + 1] +: 1342.69, 실측치 1342.15.
E2-FITC (12)의 합성
Figure pct00028
화합물 (11). 17α-에티닐에스트라디올 (592 mg, 2 mmol)을 아르곤 분위기 하에 Et3N (20 ml) 중 4-(t-부틸옥시카르보닐아미노메틸)아이오도벤젠 (778 mg, 2.33 mmol), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 Pd(Ph3)4 (5 몰%), 및 CuI (5 몰%)의 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 용매를 진공 하에 감소시켰다. 조질 생성물을 플래쉬 크로마토그래피 (헥산:EtOAc = 20:80 -> DCM:MeOH = 90:10)에 의해 정제하여 황색 분말 생성물을 얻었다. 수율 (756 mg, 78%). 1H NMR (300 MHz, MeOD-d4) δ 7.43 - 7.41 (m, 2H), 7.28 - 7.16 (m, 2H), 6.67 - 6.64 (m, 1H), 6.59 - 6.58 (d, 1H), 4.71 - 4.67 (t, 1H), 4.33 - 4.31 (d, 1H), 2.83 (m, 2H), 2.43 - 1.72 (m, 15H), 1.57 - 1.38 (s, 9H), 0.94 (s, 3H). 13C NMR (500 MHz, MeOD-d 4 ) δ 155.12, 143.25, 131.59, 130.98, 125.16, 124.33, 113.25, 113.21, 95.23, 84.03, 77.69, 62.22, 49.96, 45.11, 42.68, 35.66, 33.22, 27.22, 26.45, 25.56, 24.21, 13.56. HRMS (ESI+) 계산치 C32H39NO3 [M + 1] +: 486.29, 실측치 486.85.
Figure pct00029
E2-FITC (12). 50% v/v TFA/DCM 중 화합물 11 (485 mg, 1 mmol)의 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. TLC가 완전한 전환을 나타낸 후, 혼합물을 DCM으로 5-6회 공동-증발시켜 TFA를 제거하였다. 잔류물을 DMF (5 mL)에 재용해한 후, FITC (429 mg, 1.1 mmol) 및 피리딘 (0.25 mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 암실에서 실온에서 밤새 교반하였다. 건조 후, 조질 생성물을 플래쉬 크로마토그래피 (CHCl3:MeOH = 95:5 -> 90:10)에 의해 정제하여 화합물 12를 황색 오일로서 수득하였다 (355 mg, 45%). 1H NMR (300 MHz, MeOD-d4) δ 10.23 (s, 1H), 8.05 (m, 1H), 7.83 - 7.79 (m, 1H), 7.43 - 7.41 (m, 2H), 7.27 (m, 2H), 6.68 - 6.53 (m, 8H), 4.70 (t, 1H), 4.32 (m, 1H), 2.85 (m, 2H), 2.40 - 1.53 (m, 15H), 0.93 (s, 3H). HRMS (ESI+) 계산치 C48H42N2O7S [M + 1] +: 791.27, 실측치 791.28.
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모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 본원에 참조로 포함된다. 전술한 명세서에서, 본 발명은 이의 특정 바람직한 실시양태와 관련하여 설명되었고, 많은 세부사항이 예시의 목적으로 제시되었지만, 본 발명이 추가 실시양태에 민감하고 본원의 특정 세부사항은 본 발명의 기본 원리를 벗어나지 않고 상당히 변경될 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Salem, Aliasger K. Filardo, Edward J. Lu, Anh S. Rouhimoghadam, Milad University of Iowa Research Foundation <120> GPER PROTEOLYTIC TARGETING CHIMERAS <130> 875.207WO1 <140> PCT/US2021/028900 <141> 2021-04-23 <150> US 63/014,410 <151> 2020-04-23 <160> 5 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic sequence <400> 1 gttcaagaag attagcgatg tgacttccca agcc 34 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic sequence <400> 2 agccgccagc cgctcaccat gtctctgcac cgtgc 35 <210> 3 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic sequence <400> 3 tggcggctgt tcaagaagat tagctgagag ctccctggcg ga 42 <210> 4 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic sequence <400> 4 gccgctcaca gagcctcctc caccgactgt ggcagggaaa ccc 43 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic sequence <400> 5 Val Ser Gly Trp Arg Leu Phe Lys Lys Ile Ser 1 5 10

Claims (32)

  1. E3 유비퀴틴 리가제 리간드에 커플링된 링커에 커플링된 G-단백질 커플링된 에스트로겐 수용체 (GPER) 리간드를 포함하는 분자.
  2. 제1항에 있어서, GPER 리간드가 17β-에스트라디올, 에스트론, 피토에스트로겐, 제노에스트로겐, 에스트리올, 에스트리올 3-술페이트, 에스트리올 17-술페이트, G-1, G-15, G-36, 제니스테인, 다진, 또는 퀘르세틴을 포함하는 것인 분자.
  3. 제2항에 있어서, 피토에스트로겐이 플라본, 이소플라본, 리그닌 사포닌, 쿠메스틴 또는 스틸벤을 포함하는 것인 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, GPER 리간드가 GPER 길항제인 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, E3 유비퀴틴 리가제 리간드가 폰 히펠 리가제 (VHL) 리간드인 분자.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, E3 유비퀴틴 리가제 리간드가 세레블론, 레날리도마이드, 포말리도마이드, 이베르도마이드, (S,R,S)-AHPC, 탈리도마이드, VH-298, CC-122, CC-885, E3리가제 리간드 8, TD-106, VL285, VH032, VH101, VH298, VHL 리간드 4, VHL 리간드 7, VHL-2 리간드 3, E3 리가제 리간드 3, E3 리가제 리간드 2 또는 BC-1215를 포함하는 것인 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 10 내지 50개의 원자를 갖는 쇄를 갖는 것인 분자.
  8. 제7항에 있어서, 링커가 알킬 링커인 분자.
  9. 제7항에 있어서, 링커가 헤테로알킬 링커인 분자.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하는 것인 분자.
  11. 제10항에 있어서, 링커가 3 내지 15개의 PEG 단위를 포함하는 것인 분자.
  12. 제10항에 있어서, 링커가 (PEG)mNH(CO)(PEG)n을 포함하고, 여기서 n 및 m이 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15인 분자.
  13. 제12항에 있어서, n이 3, 4, 5 또는 6인 분자.
  14. 제12항에 있어서, m이 7, 8, 9 또는 10인 분자.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 분자의 일정량을 포함하는 제약 조성물.
  16. 제15항에 있어서, GPER 리간드가 17β-에스트라디올을 포함하는 것인 제약 조성물.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, E3 유비퀴틴 리가제 리간드가 폰 히펠 리가제 (VHL) 리간드인 제약 조성물.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 PEG를 포함하는 것인 제약 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 링커가 3 내지 12개의 PEG 단위를 포함하는 것인 제약 조성물.
  20. E3 유비퀴틴 리가제 리간드에 커플링된 링커에 커플링된 G-단백질 커플링된 에스트로겐 수용체 (GPER) 리간드를 포함하는 분자의 유효량을 갖는 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 암을 예방, 억제 또는 치료하는 방법.
  21. E3 유비퀴틴 리가제 리간드에 커플링된 링커에 커플링된 G-단백질 커플링된 에스트로겐 수용체 (GPER) 리간드를 포함하는 분자의 유효량을 갖는 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 GPER 양성 암을 예방, 억제 또는 치료하는 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 암이 내분비 내성 암인 방법.
  23. 제20항 또는 제21항에 있어서, 암이 호르몬 요법 내성 암인 방법.
  24. 제20항 또는 제21항에 있어서, 암이 삼중 음성 유방암인 방법.
  25. 제20항 또는 제21항에 있어서, 암이 부인과 암인 방법.
  26. 제20항 또는 제21항에 있어서, 암이 난소암인 방법.
  27. 제20항 또는 제21항에 있어서, 암이 자궁내막암인 방법.
  28. 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
  29. 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 전신인 방법.
  30. 제20항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 경구인 방법.
  31. 제20항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 지속 방출 투여 형태인 방법.
  32. 제20항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 분자가 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 분자인 방법.
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