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KR20220145374A - 신규 키메라 항원 수용체 및 그 용도 - Google Patents

신규 키메라 항원 수용체 및 그 용도 Download PDF

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Publication number
KR20220145374A
KR20220145374A KR1020227032920A KR20227032920A KR20220145374A KR 20220145374 A KR20220145374 A KR 20220145374A KR 1020227032920 A KR1020227032920 A KR 1020227032920A KR 20227032920 A KR20227032920 A KR 20227032920A KR 20220145374 A KR20220145374 A KR 20220145374A
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KR
South Korea
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cancer
cells
cell
leu
domain
Prior art date
Application number
KR1020227032920A
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English (en)
Inventor
얄리 조우
창슌 우
창šœ 우
샤오얀 지앙
공 첸
Original Assignee
난징 바이오흐엥 바이오테크 씨오., 엘티디
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 난징 바이오흐엥 바이오테크 씨오., 엘티디 filed Critical 난징 바이오흐엥 바이오테크 씨오., 엘티디
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Abstract

본 발명은 항원 결합 영역, 트랜스멤브레인 도메인, 공동자극 도메인, 세포 내 신호 전달 도메인 및 추가 신호 전달 영역을 포함하고, 상기 추가 신호 전달 영역은 γc사슬 또는 이의 세포 내 영역으로 이루어진 신규의 키메라 항원 수용체를 제공한다. 본 발명은 본 발명에 따른 신규한 키메라 항원 수용체의 조작된 면역 세포 및 이의 약물 조성물, 및 암 치료에서의 상기 조작된 면역 세포/약물 조성물의 용도를 더 제공한다.

Description

신규 키메라 항원 수용체 및 그 용도
본 발명은 세포 면역 치료 분야에 관한 것으로, 특히 사이토카인 수용체 공통 γ사슬(γc사슬이라고도 함) 또는 이의 세포 내 영역을 포함하는 신규 키메라 항원 수용체 및 그 용도에 관한 것이다.
근래, 암 면역 치료 기술이 빠르게 발전하고 있으며, 특히 키메라 항원 수용체 T세포(CAR-T)와 관련된 면역 치료법은 혈액 종양의 치료에서 탁월한 임상 효과를 보이고 있다. CAR-T세포 면역 치료법은 체외에서 종양 항원을 인식할 수 있도록 T세포를 유전자 조작하고, 일정 수까지 증폭시킨 후 환자의 체내에 주입하여 종양 치료 목적을 달성하는 것이다.
현재, 기술의 발전에 따라, 4세대의 상이한 CAR 구조가 나타났다. 1세대 CAR의 세포 내 신호 전달 도메인은 CD3ζ과 같은 1차 신호 전달 도메인만을 포함하므로, CAR을 지닌 세포(예를 들어 CAR-T세포)는 활성이 좋지 못하고, 체내 생존 시간이 짧다. 2세대 CAR은 세포가 지속적으로 증식되고 항종양 활성이 증진할 수 있도록 CD28 또는 4-1BB와 같은 공동자극 도메인을 도입하였다. 3세대 CAR은 2개의 공동자극 도메인(예를 들어 CD28 + 4-1BB)을 포함하고, 4세대 CAR은 사이토카인 또는 공동자극 리간드를 추가하여 T세포 응답을 추가로 증진시키거나, 자살 유전자를 추가하여 필요시 CAR-T세포가 자가 파괴되도록 한다. 현재 임상 연구에 대부분 사용되는 것은 여전히 2세대 CAR 구조이다.
그러나, CAR-T세포 요법의 임상 응용에는 혈액종양 치료에서 대량의 종양 재발 현상이 존재하고, 고형종양 치료에서 낮은 응답율 등등과 같은 일부 문제점이 여전히 존재하고, 이러한 문제는 복잡한 종양 미세 환경, CAR-T세포 고갈 등 요인에 의한 것일 수 있다.
따라서, 여전히 기존의 CART세포 요법을 개선하여, 체내에서 CAR-T세포의 증식을 촉진하고, 종양 미세 환경의 면역 억제 작용에 저항함으로써, 종양에 대한 CAR-T세포 요법의 전체적인 치료 효과를 개선할 필요가 있다.
하나의 양태에 있어서, 본 발명은 항원 결합 영역, 트랜스멤브레인 도메인, 공동자극 도메인, 세포 내 신호 전달 도메인 및 추가 신호 전달 영역(additional signaling region)을 포함하고, 상기 추가 신호 전달 영역은 γc사슬 또는 이의 세포 내 영역으로 이루어진 키메라 항원 수용체를 제공한다. 하나의 바람직한 실시형태에서, γc사슬의 아미노산 서열은 서열번호 14로 표시되고; 이의 세포 내 영역의 아미노산 서열은 서열번호 16으로 표시된다.
일 실시형태에 있어서, 상기 공동자극 도메인, 세포 내 신호 전달 도메인 및 추가 신호 전달 영역은 세포막과의 거리에 따라 가까운 곳으로부터 먼 곳으로의 순서로 순차적으로 배열된다.
일 실시형태에 있어서, 상기 항원 결합 영역은 scFv, Fab, 단일 도메인 항체, 나노 항체, 항원 결합 리간드(antigen binding ligand), 재조합 피브로넥틴 도메인(recombinant fibronectin domain), 안티칼린(anticalin) 및 DARPIN로부터 선택된다. 바람직하게, 상기 항원 결합 영역은 scFv, Fab, 단일 도메인 항체 및 나노 항체로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, 상기 항원 결합 영역은 단일클론 항체, 다클론 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 뮤린 항체 및 키메라 항체로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, 상기 항원 결합 영역에 결합된 타겟은, TSHR, CD19, CD123, CD22, BAFF-R, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, GPRC5D, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, 메소텔린, IL-l lRa, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, CD24, PDGFR-β, SSEA-4, CD20, Folate수용체α, ERBB2(Her2/neu), MUC1, EGFR, NCAM, 클라우딘(Claudin)18.2, Prostase, PAP, ELF2M, Ephrin B2, IGF-I수용체, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, 티로시나아제, EphA2, Fucosyl GMl, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, Folate수용체β, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD 179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-la, MAGE-A1, 레구메인, HPV E6, E7, MAGE Al, ETV6-AML, 정자 단백질17(sperm protein 17), XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos관련 항원1, p53, p53변이체, 전립선 특이 단백질(prostate specific protein), 서바이빈(survivin) 및 텔로머라제(telomerase), PCTA-l/Galectin 8, MelanA/MARTl, Ras변이체, hTERT, 육종 전좌 중단점(sarcoma translocation breakpoint), ML-IAP, ERG(TMPRSS2ETS융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, Cyclin Bl, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B 1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES 1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라제 역전사효소(human telomerase reverse transcriptase), RU1, RU2, 장 카르복실에스테라아제(intestinal tract carboxylesterase), mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, IGLL1, PD1, PDL1, PDL2, TGFβ, APRIL, NKG2D 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 바람직하게, 상기 타겟은 CD19, CD20, CD22, BAFF-R, CD33, EGFRvIII, BCMA, GPRC5D, PSMA, ROR1, FAP, ERBB2(Her2/neu), MUC1, EGFR, CAIX, WT1, NY-ESO-1, CD79a, CD79b, GPC3, 클라우딘(Claudin)18.2, NKG2D 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, 상기 트랜스멤브레인 도메인은, TCRα사슬, TCRβ사슬, TCRγ사슬, TCRδ사슬, CD3ζ서브 유닛, CD3ε서브 유닛, CD3γ서브 유닛, CD3δ서브 유닛, CD45, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로부터 선택되는 단백질의 트랜스멤브레인 도메인이다. 바람직하게, 트랜스멤브레인 도메인은 CD8α, CD4, CD28 및 CD278의 트랜스멤브레인 도메인으로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, 상기 세포 내 신호 전달 도메인은, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 선택되는 단백질의 신호 전달 도메인이다. 바람직하게, 상기 세포 내 신호 전달 도메인은 CD3ζ을 포함하는 신호 전달 도메인이다.
일 실시형태에 있어서, 상기 공동자극 도메인은, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD8, CD18(LFA-1), CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD270(HVEM), CD272(BTLA), CD276(B7-H3), CD278(ICOS), CD357(GITR), DAP10, LAT, NKG2C, SLP76, PD-1, LIGHT, TRIM 및 ZAP70으로부터 선택되는 하나 또는 다수의 단백질의 공동자극 신호 전달 도메인이다. 바람직하게, 상기 공동자극 도메인은 CD27, CD28, CD134, CD137 또는 CD278의 공동자극 신호 전달 도메인이다.
제2양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 키메라 항원 수용체를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 핵산 또는 벡터를 포함하는 면역 세포를 더 제공한다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 키메라 항원 수용체를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 바람직하게, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA이고, 보다 바람직하게는 mRNA이다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 구체적으로, 상기 벡터는 선형 핵산 분자, 플라스미드, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 라우스육종바이러스(RSV), 폴리오마 및 아데노 관련 바이러스(AAV), 파지, 파스미드, 코스미드 또는 인공 염색체로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 상기 벡터는 면역 세포에서 자율 복제되는 기점, 선별 마커, 제한 효소 절단 부위, 프로모터, 폴리아데닐산 테일(polyA), 3'UTR, 5'UTR, 인핸서, 터미네이터, 인슐레이터, 오퍼론, 선별 마커, 리포터 유전자, 표적화 서열 및/또는 단백질 정제 태그(protein purification tag) 등과 같은 요소를 더 포함한다. 하나의 구체적인 실시형태에서, 상기 벡터는 생체외 전사된 벡터이다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 핵산 또는 벡터를 포함하는 면역 세포를 제공하고, 이는 본 발명의 키메라 항원 수용체를 발현할 수 있다. 하나의 구체적인 실시형태에서, 상기 면역 세포는 T세포, 대식 세포, 수지상 세포, 단핵구, NK세포 또는 NKT세포로부터 선택된다. 바람직하게, 상기 T세포는 CD4+/CD8+이중 양성T세포, CD4+헬퍼 T세포, CD8+T세포, 종양 침윤 세포, 기억 T세포, 미접촉 T세포, γδ-T세포 또는 αβ-T세포이다.
제3양태에 있어서, 본 발명은 상기에 정의된 본 발명의 키메라 항원 수용체 또는 이에 의해 코딩된 핵산, 벡터 또는 이들이 포함된 면역 세포, 및 하나 또는 다수의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약물 조성물을 제공한다.
제4양태에 있어서, 본 발명은 피험자에게 유효량의 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체, 면역 세포 또는 약물 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암에 걸린 피험자를 치료하는 방법을 제공한다.
일 실시형태에 있어서, 상기 암은 모세포종, 육종, 백혈병, 기저세포암, 담도암, 방광암, 골암, 뇌 및 CNS 암, 유방암, 복막암, 자궁경부암, 융모막암(choriocarcinoma), 결장 및 직장암, 결합조직암(connective tissue cancer), 소화기 계통의 암(cancer of digestive system), 자궁내막암, 식도암, 안암, 두경부암, 위암, 교모세포종(GBM), 간암, 간세포종양, 상피내종양, 신장암, 후두암, 백혈병, 간종양, 폐암, 림프종, 흑색종, 골수종, 신경모세포종, 구강암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 망막모세포종, 횡문근육종, 직장암, 호흡기 계통의 암, 타액샘 암종(salivary gland cancer), 피부암, 편평세포암, 위암, 고환암, 갑상선암, 자궁암 또는 자궁내막암, 비뇨기 계통의 악성 종양, 외음부암 및 기타 암 및 종양, 및 B세포 림프종, 외투세포 림프종, AIDS관련 림프종, 및 발텐스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom macroglobulinemia), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), B세포 급성 림프구성 백혈병(B-ALL), T세포 급성 림프구성 백혈병(T-ALL), B세포 전림프구성 백혈병, 모구 형질세포양 수지상 세포 종양, 버킷 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 만성 골수성 백혈병(CML), 악성 림프 증식 질환(malignant lymphoproliferative disorder), MALT 림프종, 털세포 백혈병, 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성(myelodysplasia), 형질모세포 림프종(plasmablastic lymphoma), 전백혈병, 형질세포양 수지상 세포 종양, 및 이식후 림프세포증식 질환(post-transplant lymphoproliferative disorder, PTLD)으로부터 선택된다. 바람직하게, 본 발명의 키메라 항원 수용체, 핵산, 벡터, 면역 세포 또는 약물 조성물로 치료 가능한 질환은 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 뇌 신경교종, 췌장암, 위암 등으로부터 선택된다.
도 1은 유세포 분석법에 의해 측정된 CAR-T세포의 CAR 발현 수준을 나타낸다.
도 2는 타겟 세포에 대한 CAR-T세포의 살상 효과를 나타낸다. 투-웨이(Two-way) ANOVA로 분석하고, T test로 통계적 분석을 수행하였다. *는 P값이 0.05 미만으로, 유의한 수준에 도달하였음을 나타낸다.
도 3은 CAR-T세포를 타겟 세포 및 비타겟 세포와 각각 공동 배양한 후의 IL-2(A) 및 IFNγ(B) 방출 수준을 나타낸다.
도 4는 처리된 마우스 체내의 종양 부하의 시간에 따른 변화를 나타낸다.
도 5는 D21일째, 마우스 체내의 CD3+(A), CD8+(B) 및 CD4+(C)T세포의 증식 수준을 나타낸다.
도 6은 처리된 마우스의 생존율의 시간에 따른 변화를 나타낸다.
도 7은 타겟 세포에 대한 CAR-T세포의 살상 효과를 나타낸다. Two-way ANOVA로 분석하고, T test로 통계적 분석을 수행하였다. *는 P값이 0.05 미만으로, 유의한 수준에 도달했음을 나타낸다.
달리 명시되지 않는 한, 본 발명에 사용되는 모든 과학 기술 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
키메라 항원 수용체
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"는 인공적으로 구축된 하이브리드 폴리펩타이드를 지칭하고, 상기 하이브리드 폴리펩타이드의 기초 구조는 항원 결합 영역(예를 들어, 항체의 항원 결합 부분), 트랜스멤브레인 도메인, 공동자극 도메인 및 세포 내 신호 전달 도메인을 포함한다. CAR은 단일클론 항체의 항원 결합 특성을 이용하여 T 세포 및 기타 면역 세포의 특이성과 반응성을 비 MHC 제한적 방식(non-MHC-restricted manner)으로 선택한 타겟으로 재지향(redirect)할 수 있다. 비 MHC 제한적 항원 인식은 CAR을 발현하는 세포가 항원 처리와 무관하게 항원을 인식할 수 있는 능력을 제공하여, 종양 회피의 주요 메커니즘을 우회하였다. 이 외에, T세포 내에서 발현될 때, CAR은 유리하게 내인성 T세포 수용체(TCR)의 α사슬과 β사슬과 이량체화되지 않는다. 본 발명의 신규한 키메라 항원 수용체는 항원 결합 영역, 트랜스멤브레인 도메인, 공동자극 도메인 및 세포 내 신호 전달 도메인과 같은 기초적인 구조를 포함하는 외에, γc사슬 또는 이의 세포 내 영역으로 이루어진 추가 신호 전달 영역을 더 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "항원 결합 영역"은 항원에 결합할 수 있는 임의의 구조 또는 기능적 변이체를 지칭한다. 항원 결합 영역은 단일클론 항체, 다클론 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 및 이들의 기능적 단편을 포함하지만 이에 한정되지 않는 항체 구조일 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 영역은 Fab, 단일 사슬 항체(Single Chain Antibody Fragment, scFv), 단일 도메인 항체(Single Domain Antibody, sdAb), 나노 항체(Nanobody, Nb), 항원 결합 리간드, 재조합 피브로넥틴 도메인, 안티칼린(anticalin) 및 DARPIN 등을 포함하지만 이에 한정되지 않고, 바람직하게, Fab, scFv, sdAb 및 나노 항체로부터 선택된다. 본 발명에서, 항원 결합 영역은 1가(monovalent) 또는 2가(bivalent)일 수 있고, 단일특이성, 이중특이성 또는 다중특이성 항체일 수 있다. 다른 일 실시형태에 있어서, 항원 결합 영역은 특정 단백질의 특이적 결합 폴리펩타이드 또는 수용체 구조일 수도 있고, 상기 특정 단백질은 예를 들어 PD1, PDL1, PDL2, TGFβ, APRIL 및 NKG2D이다.
"Fab"는 면역글로불린 분자가 파파인에 의해 용해된 후 생성된 2개의 동일한 단편 중 임의의 하나로서, 이황화 결합에 의해 연결된 완전한 경쇄 및 중쇄 N말단 부분으로 이루어진 것을 의미하며, 여기서 중쇄 N말단 부분은 중쇄 가변 영역과 CH1을 포함한다. 완전한 IgG와 비교할 때, Fab는 Fc단편이 없고, 이동성과 조직 침투성이 높으며, 항체 효과의 매개가 필요없이 항원에 1가(monovalent) 결합된다.
"단일 사슬 항체" 또는 "scFv"는 항체 중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 가변 영역(VL)이 링커에 의해 연결된 항체이다. 링커의 최적 길이 및/또는 아미노산의 조성에 대해 선택할 수 있다. 링커의 길이는 scFv의 가변 영역 폴딩 및 상호작용 상황에 현저한 영향을 미친다. 사실상, 더 짧은 링커를 사용하는 경우(예를 들어, 5-10개의 아미노산 사이), 사슬 내 폴딩(intrachain folding)을 방지할 수 있다. 링커의 크기 및 조성의 선택에 대하여, 예를 들어, Hollinger et al., 1993Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90: 6444-6448: 미국 특허 출원 공개 번호: 2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794; 및 PCT 공개 번호W02006/020258 및 W02007/024715을 참조할 수 있고, 그 전체 내용은 참조로서 본 발명에 포함된다.
"단일 도메인 항체" 또는 "sdAb"는 하나의 중쇄 가변 영역(VHH)과 2개의 통상적인 CH2 및 CH3 영역만을 포함하는 경쇄가 천연적으로 결실된 항체를 지칭하며, "중쇄 항체"라고도 한다.
"나노 항체" 또는 "Nb"는 개별적으로 클로닝되고 발현되는 VHH 구조를 지칭하고, 원래의 중쇄 항체와 동등한 구조 안정성과 항원에 대한 결합 활성을 가지며, 현재 공지된 표적 항원에 결합 가능한 가장 작은 단위이다.
용어 "기능적 변이체" 또는 "기능적 단편"은 실질적으로 모체 아미노산 서열(amino acid sequence of a parent)을 포함하지만 모체 아미노산 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 변형(즉, 치환, 결실 또는 삽입)을 포함하는 변이체를 지칭하며, 상기 변이체는 모체 아미노산 서열의 생물학적 활성을 유지하는 것을 조건으로 한다. 일 실시형태에 있어서, 상기 아미노산 변형은 바람직하게는 보존적 변형(conservative modification)이다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "보존적 변형(conservative modification)"은 상기 아미노산 서열을 함유하는 항체 또는 항체 단편의 결합 특성에 유의한 영향을 미치지 않거나 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭한다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 첨가 및 결실을 포함한다. 변형은 위치-지정 돌연변이 유발 및 PCR-매개 돌연변이 유발과 같은 본 분야에 공지된 표준 기술로 본 발명의 키메라 항원 수용체에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 치환이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리는 본 분야에서 정의되어 있는 것으로, 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띄지 않는 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 사티닌, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 보존적 변형(conservative modification)은 예를 들어, 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성, 및/또는 관련된 잔기의 양친매성의 유사성에 기반하여 선택할 수 있다.
따라서, "기능적 변이체" 또는 "기능적 단편"은 모체 아미노산 서열과 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖고, 결합 활성과 같은 모체 아미노산의 생물학적 활성을 유지한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "서열 동일성"은 2개의(뉴클레오티드 또는 아미노산) 서열이 정렬(alignment)에서 동일한 위치에 동일한 잔기를 갖는 정도를 나타내고, 일반적으로 백분율로 나타낸다. 바람직하게, 동일성은 비교되는 서열의 전체 길이에 의해 결정된다. 따라서, 완전히 동일한 서열을 갖는 2개의 코피(copy)는 100%의 동일성을 갖는다. 당업자는 Blast(Altschul 등 (1997)Nucleic Acids Res.25: 3389-3402), Blast2(Altschul 등(1990)J.Mol.Biol.215: 403-410), Smith-Waterman(Smith 등(1981)J.Mol.Biol.147: 195-197) 및 ClustalW 등과 같은 일부 알고리즘을 표준 매개변수를 사용하여 서열 동일성을 결정하는데 사용될 수 있음을 인식하였다.
항원 결합 영역의 선택은 구체적인 질병 상태와 관련된 인식될 타겟 세포 상의 종양 특이적 항원 또는 종양 관련 항원과 같은 세포 표면 마커에 따라 결정된다. 따라서, 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 항원 결합 영역은, TSHR, CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, 메소텔린, IL-l lRa, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, CD24, PDGFR-β, SSEA-4, CD20, Folate수용체α, ERBB2(Her2/neu), MUC1, EGFR, NCAM, Prostase, PAP, ELF2M, Ephrin B2, IGF-I수용체, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, 티로시나아제, EphA2, Fucosyl GMl, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, Folate수용체β, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD 179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-la, MAGE-A1, 레구메인, HPV E6, E7, MAGE Al, ETV6-AML, 정자 단백질17(sperm protein 17), XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos관련 항원1, p53, p53변이체, 전립선 특이 단백질(prostate specific protein), 서바이빈(survivin) 및 텔로머라제(telomerase), PCTA-l/Galectin 8, MelanA/MARTl, Ras변이체, hTERT, 육종 전좌 중단점(sarcoma translocation breakpoint), ML-IAP, ERG(TMPRSS2ETS융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, Cyclin Bl, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B 1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라제 역전사효소(human telomerase reverse transcriptase), RU1, RU2, 장 카르복실에스테라아제(intestinal tract carboxylesterase), mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, IGLL1, PD1, PDL1, PDL2, TGFβ, APRIL, NKG2D 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 또는 다수의 타겟에 결합된다. 바람직하게, 상기 타겟은, CD19, CD20, CD22, BAFF-R, CD33, EGFRvIII, BCMA, GPRC5D, PSMA, ROR1, FAP, ERBB2(Her2/neu), MUC1, EGFR, CAIX, WT1, NY-ESO-1, CD79a, CD79b, GPC3, 클라우딘(Claudin)18.2, NKG2D 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 타겟팅될 항원에 따라, 본 발명의 CAR은 항원에 대한 특이적인 항원 결합 영역을 포함하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, CD19가 타겟팅될 항원인 경우, CD19항체는 본 발명의 본 발명의 항원 결합 영역으로 사용될 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "트랜스멤브레인 도메인" 은 면역 세포(예를 들어, 림프구 또는 NKT세포) 표면에서 키메라 항원 수용체의 발현을 가능하게 하고, 타겟 세포에 대한 면역 세포의 응답을 가이드 하는 폴리펩타이드 구조이다. 트랜스멤브레인 도메인은 천연 또는 합성일 수 있으며, 임의의 막 결합 단백질 또는 막관통 단백질에서 유래된 것일 수도 있다. 키메라 수용체 폴리펩타이드와 타겟 항원이 결합될 때, 트랜스멤브레인 도메인은 신호를 전달할 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 특히 적합한 트랜스멤브레인 도메인은, 예를 들어, TCRα사슬, TCRβ사슬, TCRγ사슬, TCRδ사슬, CD3ζ서브 유닛, CD3ε서브 유닛, CD3γ서브 유닛, CD3δ서브 유닛, CD45, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 및 이의 기능적 단편으로부터 유래된 것일 수 있다. 또는 , 트랜스멤브레인 도메인은 합성된 것일 수 있으며, 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 트랜스멤브레인 도메인은 인간 CD8α사슬로부터 유래되고, 이는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 3으로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70％, 바람직하게는 적어도 80％, 보다 바람직하게는 적어도 90％, 95％, 97％ 또는 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖는다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 항원 결합 영역과 트랜스멤브레인 도메인 사이에 위치하는 힌지 영역을 더 포함할 수 있다. 본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "힌지 영역" 은 일반적으로 트랜스멤브레인 도메인 내지 항원 결합 영역을 연결하는 역할을 하는 임의의 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 구체적으로, 힌지 영역은 항원 결합 영역에 더 큰 유연성과 접근성을 제공하기 위해 사용된다. 힌지 영역은 최대 300개의 아미노산, 바람직하게는 10개 내지 100개의 아미노산, 가장 바람직하게는 25개 내지 50개의 아미노산을 포함할 수 있다. 힌지 영역은 전체 또는 일부분이 천연분자로부터 유래될 수 있고, 예를 들어, 전체 또는 일부분이 CD8, CD4 또는 CD28의 세포 외 영역으로부터 유래되거나, 또는 전체 또는 일부분이 항체 불변 영역으로부터 유래된다. 또는, 힌지 영역은 천연적으로 존재하는 힌지 서열에 대응되는 합성 서열일 수 있거나, 완전 합성된 힌지 서열일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 상기 힌지 영역은 CD8α사슬, FcγRIIIα수용체, IgG4 또는 IgG1의 힌지 영역 부분을 포함하고, 보다 바람직하게는 CD8α 힌지를 포함하며, 이는 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 11로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70％, 바람직하게는 적어도 80％, 보다 바람직하게는 적어도 90％, 95％, 97％ 또는 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖는다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "세포 내 신호 전달 도메인" 은 이펙터 기능 신호(effector function signal)를 전달하여 세포가 지정된 기능을 수행하도록 지시하는 단백질 부분을 지칭한다. 세포 내 신호 전달 도메인은 항원 결합 영역에서 항원에 결합된 후의 세포 내 1차 신호를 전달하여, 면역 세포와 면역 반응을 활성화시키는 것을 책임지고 있다. 다시 말해서, 세포 내 신호 전달 도메인은 CAR을 발현하는 면역 세포의 정상적인 이펙터 기능 중 적어도 하나를 활성화 시키는 것을 책임지고 있다. 예를 들어, T세포의 이펙터 기능은 세포 용해 활성 또는 보조 활성일 수 있고, 예를 들어 사이토카인의 분비를 포함할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 키메라 항원 수용체에 포함된 세포 내 신호 전달 도메인은, 항원 수용체 결합 후 함께 작용하여 1차 신호 전달을 일으키는 T세포 수용체 및 보조 수용체(co-receptor)의 세포 질 서열, 및 이러한 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 동일하거나 유사한 기능을 갖는 임의의 합성 서열일 수 있다. 세포 내 신호 전달 도메인은 많은 면역 수용체 티로신 기반 활성화 모티프(Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motifs, ITAM)를 포함할 수 있다. 본 발명의 세포 내 신호 전달 도메인의 비제한적인 예시로, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d같은 것들로부터 유래되는 것들을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명 CAR의 신호 전달 도메인은 CD3ζ 신호 전달 도메인을 포함할 수 있고, 상기 신호 전달 도메인은 서열번호8로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 7로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70％, 바람직하게는 적어도 80％, 보다 바람직하게는 적어도 90％, 95％, 97％ 또는 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖는다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 하나 또는 다수의 공동자극 도메인을 포함한다. 공동자극 도메인은 공동자극 분자로부터 유래된 세포 내 기능성 신호 전달 도메인일 수 있고, 상기 공동자극 분자의 전체 세포 내 부분 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. "공동자극 분자"는 T세포에서 공동자극 리간드에 특이적으로 결합하여, T세포의 공동 자극 반응(예를 들어, 증식)을 매개하는 동족 결합파트너(homologous binding partner)를 지칭한다. 공동자극 분자는 I클래스(Class) MHC분자, BTLA 및 Toll리간드 수용체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 공동자극 도메인의 비제한적인 예시로, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD8, CD18(LFA-1), CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD270(HVEM), CD272(BTLA), CD276(B7-H3), CD278(ICOS), CD357(GITR), DAP10, LAT, NKG2C, SLP76, PD-1, LIGHT, TRIM 및 ZAP70으로부터 선택되는 단백질로부터 유래된 공동자극 신호 전달 도메인을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게, 본 발명 CAR의 공동자극 도메인은 4-1BB 및/또는 CD28단편이고, 보다 바람직하게, 서열번호6으로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 5로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70％, 바람직하게는 적어도 80％, 보다 바람직하게는 적어도 90％, 95％, 97％ 또는 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖는다.
일 양태에 있어서, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 신호 전달용으로 공동자극 도메인 및 세포 내 신호 전달 도메인 외에, 적어도 하나의 추가 신호 전달 영역을 더 포함하고, 상기 추가 신호 전달 영역은 γc사슬 또는 이의 세포 내 영역으로 이루어졌다. 다시 말해서, 본 발명의 키메라 항원 수용체의 세포 내 영역(즉, 신호 전달용 구조)은 공동자극 도메인, 세포 내 신호 전달 도메인, 및 γc사슬 또는 이의 세포 내 영역의 3가지 신호 전달 구조로 이루어졌다. 이는 본 발명의 키메라 항원 수용체가 사이토카인의 신호 전달 영역(예를 들어, IL-2Ra, IL2Ra, IL2Rb, IL4Ra, IL7Ra, IL9Ra, IL15Ra, IL21Ra등의 세포 내 영역)과 같은 기타 4번째 신호 전달 구조를 포함하지 않음을 의미한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "γc사슬"은 사이토카인 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-21의 수용체가 공유하는 γ사슬을 지칭한다. γc사슬은 최초 IL-2수용체에서 검증되었고, 이 후, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-21 등 수용체의 조성에 참여하는 것으로 밝혀져, 공통 γ사슬이라고도 한다. 예를 들어, IL-2수용체에는 3가지 형태가 있고, α사슬(IL-2Rα라고도 함), β사슬(IL-2Rβ라고도 함) 및 γc사슬(IL-2Rγ 또는 IL-2Rg라고도 함)의 상이한 조성으로 형성되며, 기타 조합에 비해, 3가닥의 사슬 모두를 포함하는 IL-2수용체는 IL-2사이토카인에 대해 가장 높은 친화력을 갖는다. IL-2수용체의 3가닥의 사슬은 세포막에 앵커링(nchoring)되고, IL-2와의 결합에 의해 생화학적 신호를 세포 내로 전달한다. 이러한 γ사슬 의존성 사이토카인에서, IL-2Rβ, IL-4Rα, IL-7Rα, IL-9Rα, IL-21R과 같은 사이토카인 수용체 특유의 성분은 JAK1에 대한 결합을 책임지나, γc사슬은 JAK3에 결합된다. 이러한 사이토카인 수용체가 사이토카인에 결합되는 경우, 3개의 주요한 신호 경로가 활성화되어(MAP키나제, PI3키나제 및 JAK-STAT 경로를 포함), T세포 및 NK세포의 생존 및 증식을 조절한다.
γc사슬은 분자량이 64kD인 당단백질로서, 347개의 아미노산으로 이루어지고, 232개의 아미노산의 세포 외 영역, 29개의 아미노산의 막관통 영역 및 86개의 아미노산의 세포 내 영역을 포함한다. 세포 내 영역은 Src상동 영역을 포함하고, 세포 성장 촉진 및 IL-2에 의해 매개된 c-myc, c-fos, c-jun 등의 유전자의 발현에 매우 중요하다. 일 실시형태에 있어서, 본 발명에 사용 가능한 γc사슬은 서열번호14로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 13으로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70％, 바람직하게는 적어도 80％, 보다 바람직하게는 적어도 90％, 95％, 97％ 또는 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖는다. 일 실시형태에 있어서, 본 발명에 사용 가능한 γc사슬 세포 내 영역은 서열번호16으로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 15로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70％, 바람직하게는 적어도 80％, 보다 바람직하게는 적어도 90％, 95％, 97％ 또는 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖는다. 바람직하게, 본 발명의 γc사슬은 서열번호 14로 이루어지고, 이의 세포 내 영역은 서열번호 16으로 이루어진다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 CAR은 T세포와 같은 세포에서 발현될 때, 초기 단백질이 소포체로 가이드된 후 세포 표면으로 가이드되도록 하는 시그널 펩타이드를 더 포함할 수 있다. 시그널 펩타이드의 코어는 단일α-나선을 형성하는 경향이 있는 긴 소수성 아미노산 세그먼트를 포함할 수 있다. 시그널 펩타이드의 말단에는 통상적으로 시그널 펩티다아제에 의해 인식되고 절단되는 아미노산 세그먼트가 있다. 시그널 펩티다아제는 전위(transposition)되는 동안 또는 완료 후 절단되어, 유리된 시그널 펩타이드 및 성숙 단백질을 생성할 수 있다. 이 후, 유리된 시그널 펩타이드는 특정 프로테아제에 의해 소화된다. 본 발명에 사용 가능한 시그널 펩타이드는 CD8α, IgG1, GM-CSFRα로부터 유래된 것과 같은 당업자에게 잘 공지된 시그널 펩타이드이다.
하나의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 CD8α트랜스멤브레인 도메인, 4-1BB공동자극 도메인, CD3ζ신호 전달 도메인 및 γc사슬 또는 이의 세포 내 영역을 포함한다. 보다 바람직하게, 상기 키메라 항원 수용체는 CD8α신호 펩타이드, CD8α힌지 영역 및/또는 CD28공동자극 도메인을 더 포함한다.
또 하나의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 키메라 항원 수용체에서, 공동자극 도메인, 세포 내 신호 전달 도메인 및 추가 신호 전달 영역은 세포막과의 거리에 따라 가까운 곳으로부터 먼 곳으로의 순서로 순차적으로 배열되며, 즉, 공동자극 도메인은 세포막과 가장 가깝고, 추가 신호 전달 영역은 세포막과 가장 멀다.
벡터
본 발명은 본 발명에 따른 하나 또는 다수의 핵산을 포함하는 벡터를 더 제공한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 (외인성)유전 물질을 숙주 세포로 전달하기 위한 매개체로 사용되는 핵산 분자이며, 상기 숙주 세포에서 상기 핵산 분자는 예를 들어 복제 및/또는 발현될 수 있다.
벡터는 일반적으로 타겟 벡터 및 발현 벡터를 포함한다. "타겟 벡터"는 예를 들어 상동 재조합을 통해, 또는 특이적 타겟 부위의 서열의 하이브리드 리콤비나아제(hybrid recombinases)를 사용하여, 분리된 핵산을 세포 내부로 전달하는 매질이다. "발현 벡터" 는 적합한 숙주 세포에서 이종 핵산 서열(예를 들어, 본 발명의 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드를 코딩하는 서열)의 전사 및 이들의 mRNA 번역에 사용되는 벡터이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 벡터는 본 분야에 공지되어 있으며, 대부분 상업적으로 구입할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 벡터는 선형 핵산 분자(예를 들어, DNA 또는 RNA), 플라스미드, 바이러스(예를 들어, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 라우스육종바이러스(RSV), 폴리오마 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 등), 파지, 파스미드, 코스미드 및 인공 염색체(BAC 및 YAC) 를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 벡터 자체는 일반적으로 뉴클레오티드 서열이고, 일반적으로 삽입체(전이 유전자(transgene))의 DNA 서열 및 벡터의 “백본”인 더 큰 서열을 포함한다. 조작된 벡터는 또한 일반적으로 숙주 세포에서 자율 복제되는 기점(폴리뉴클레오티드의 안정적인 발현이 필요한 경우), 선별 마커(selectable marker) 및 제한 효소 절단 부위(예를 들어, 다중 클로닝 부위, MCS)를 포함한다. 벡터는 프로모터, 폴리아데닐산 테일(polyA), 3'UTR, 인핸서, 터미네이터, 인슐레이터, 오퍼론, 선별 마커, 리포터 유전자, 표적화 서열(targeting sequence) 및/또는 단백질 정제 태그(protein purification tag)와 같은 요소를 포함할 수 있다. 하나의 구체적인 실시형태에서, 상기 벡터는 생체외 전사된 벡터이다.
조작된 면역 세포 및 그 제조방법
본 발명은 키메라 항원 수용체 또는 이의 코딩 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포를 제공한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "면역 세포"는 하나 또는 다수의 이펙터 기능(예를 들어, 세포 독성 세포 살상 활성(cytotoxic cell killing activity), 사이토카인의 분비, ADCC 및/또는 CDC의 유도)을 갖는 면역계의 임의의 세포를 지칭한다. 예를 들어, 면역 세포는 T세포, 대식 세포, 수지상 세포, 단핵구, NK세포 및/또는 NKT세포일 수 있다. 바람직하게, 면역 세포는 T세포이다. T세포는 체외 배양된 T세포와 같은 임의의 T세포일 수 있고, 예를 들어, 1차 T세포, 또는 Jurkat, SupTl 등과 같은 체외 배양된 T세포주에서 유래된 T세포, 또는 피험자로부터 수득된 T세포일 수 있다. 피험자의 예시로 인간, 개, 고양이, 마우스, 래트 및 형질전환 종(transgenic species)을 포함한다. T세포는 말초 혈액 단핵구, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위의 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직 및 종양을 비롯한 다양한 공급원으로부터 얻을 수 있다. T세포는 농축되거나 정제될 수도 있다. T세포는 임의의 유형의 T세포일 수 있고, 임의의 발달 단계에 있을 수 있으며, CD4+/CD8+이중 양성T세포, CD4+헬퍼 T세포(예를 들어, Th1 및 Th2세포), CD8+T세포(예를 들어, 세포 독성 T세포), 종양 침윤 세포, 기억 T세포, 미접촉 T세포, γδ-T세포, αβ-T세포 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 면역 세포는 인간 T세포이다. T 세포는 피콜(Ficoll) 분리와 같은 당업자에게 공지된 다양한 기술을 사용하여 피험자의 혈액으로부터 수득될 수 있다. 본 발명에서, 면역 세포는 조작되어 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드를 발현한다.
당업계에 공지된 통상적인 방법(예를 들어, 형질도입, 형질감염, 형질전환 등을 통해)을 사용하여 본 발명의 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드를 발현하도록 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 면역 세포에 도입할 수 있다. "형질감염"은 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드(벡터 포함)를 타겟 세포에 도입하는 과정이다. 일 예로, RNA형질감염은 RNA(예를 들어, 생체외 전사된 RNA, ivtRNA)를 숙주 세포에 도입하는 과정이다. 상기 용어는 주로 진핵 세포에서의 비바이러스성 방법에 사용된다. 용어 "형질도입"은 일반적으로 바이러스에 의해 매개되는 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드의 전이의 설명에 사용된다. 동물 세포의 형질감염은 일반적으로 세포막에 일시적인 기공(pores) 또는 "구멍(holes)"을 열어 물질의 흡수를 허용하는 것에 관한 것이다. 인산칼슘을 사용거나, 전기천공법을 통하거나, 세포 스퀴징을 통하거나, 또는 양이온성 지질을 재료물질과 혼합하여 세포막과 융합되고 내부에 캐리어 물질을 침착시키는 리포솜을 생성함으로써, 형질감염시킬 수 있다. 진핵 숙주 세포를 형질감염시키기 위한 예시적인 기술은 지질 소포 매개 흡수(lipid vesicle-mediated uptake), 열 충격 매개 흡수, 인산칼슘 매개 형질감염(인산칼슘/DNA공침전), 미세주입 및 전기천공법을 포함한다. 용어 "형질전환"은 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드(벡터 포함)의 박테리아으로의, 또는 비동물성 진핵 세포(식물 세포 포함)로의 비바이러스성 전달의 설명에 사용된다. 따라서, 형질전환은 박테리아(bacteria) 또는 비동물 진핵 세포의 유전학적 변형으로서, 세포막을 통해 주위로 부터 직접 흡수 한 후 외인성 유전 물질(핵산 분자)을 도입시킴으로써 발생된다. 형질전환은 인공적 수단으로 구현될 수 있다. 형질전환이 일어나려면 세포나 박테리아가 컴피턴스의 상태(competent state)여야 한다. 원핵 형질전환의 경우, 기술로서 열 충격 매개 흡수, 완전한 세포와의 박테리아 원형질체의 융합, 미세주입 및 전기천공법을 포함할 수 있다.
또 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 면역 세포는, CD52, GR, TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD247ζ, HLA-I, HLA-II 유전자, 및 PD1 및 CTLA-4과 같은 면역 체크포인트 유전자로부터 선택되는 적어도 하나의 비활성 유전자를 더 포함한다. 더욱 특히, 면역 세포에서 적어도 TCRα 또는 TCRβ 유전자는 비활성화된다. 이러한 비활성화는 TCR이 세포에서 기능이 없도록 한다. 이러한 전략은 이식편대숙주병(GvHD)을 방지하는데 특히 유용하다. 유전자를 비활성화시키는 방법은 본 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, TALE뉴클레아제 또는 CRISPR계에서의 Cas효소에 의해 DNA 절단을 매개하여, 유전자를 비활성화시킨다.
약물 조성물
본 발명은 활성제인 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체, 핵산, 벡터 또는 조작된 면역 세포, 및 하나 또는 다수의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약물 조성물을 더 제공한다. 따라서, 본 발명은 또한 약물 조성물 또는 약물의 제조에서의 상기 키메라 항원 수용체, 핵산, 벡터 또는 조작된 면역 세포의 용도를 더 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용 가능한 부형제"는 약리학적 및/또는 생리학적으로 피험자 및 활성 성분과 상용(즉, 원하지 않는 국소 또는 전신 작용을 일으키지 않으면서 원하는 치료 효과를 일으킴)되는 벡터 및/또는 부형제를 지칭하고, 당업계에 공지된 것이다(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR, 19th ed.Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995 참조). 약학적으로 허용 가능한 부형제의 예시로, 충진제, 결합제, 붕해제, 피복제, 흡착제, 부착방지제, 활택제, 항산화제, 향미제, 착색제, 감미제, 용매, 공용매, 완충제, 킬레이트제, 계면활성제, 희석제, 습윤제, 방부제, 유화제, 코팅제, 등장제, 흡수 지연제, 안정제 및 장력 조절제를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서 원하는 약물 조성물을 제조하기 위해 적합한 부형제를 선택하는 것은 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명의 약물 조성물에 사용하기 위한 예시적인 부형제는 식염수, 완충 식염수, 글루코스 및 물을 포함한다. 통상적으로, 적합한 부형제의 선택은 특히 사용된 활성제, 치료할 질병 및 약물 조성물의 원하는 투여 형태에 따라 결정된다.
본 발명의 약물 조성물은 다양한 경로에 의한 투여에 적합할 수 있다. 통상적으로, 비경구적으로 투여된다. 비경구 투여는 국소, 동맥내, 근육내, 피하, 골수내(intramedullary), 척수강내(intrathecal), 심실내, 정맥내, 복강내, 자궁내, 질내, 설하 또는 비강내 투여를 포함한다.
본 발명의 약물 조성물은, 고체, 액체, 기체 또는 동결건조 형태와 같은 다양한 형태로 제조될 수도 있고, 특히 연고, 크림, 경피 패치, 겔, 분말, 정제, 용액, 에어로졸, 과립, 환제, 현탁액, 에멀젼, 캡슐, 시럽, 엘릭시르, 엑스제(extract), 팅크제 또는 유동 엑스제(liquid extract) 추출물의 형태일 수 있고, 또는 특히 원하는 투여 방법에 적합한 형태일 수 있다. 발명에 공지된 약물을 생산하기 위한 과정은 예를 들어, 통상적인 혼합, 용해, 제립, 당의정 제조, 밀링, 유화, 봉입(encapsulating), 포매 또는 동결건조 과정을 포함할 수 있다. 본 발명에 기재된 것과 같은 면역 세포를 포함하는 약물 조성물은 통상적으로 용액 형태로 제공되고, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 완충제를 포함한다.
본 발명에 따른 약물 조성물은 치료될 질환의 치료 및/또는 예방에 적합한 하나 또는 다수의 기타 약제와 조합하여 투여될 수 있다. 조합에 적합한 약제의 바람직한 예시로, 시스플라틴(cisplatin), 메이탄신(maytansine) 유도체, 라켈마이신(rachelmycin), 칼리키아미신(calicheamicin), 도세탁셀(docetaxel), 에토포시드(etoposide), 젬시타빈(gemcitabine), 이포스파미드(ifosfamide), 이리노테칸(irinotecan), 멜파란(melphalan), 미토산트론(mitoxantrone), 소르피머 소듐포토프린II(sorfimer sodiumphotofrin II) , 테모졸로미드(temozolomide), 토포테칸(topotecan), 트리메트레이트 글루쿠로네이트(trimetreate glucuronate), 아우리스타틴E(auristatinE), 빈크리스틴(vincristine) 및 아드리아마이신(adriamycin)과 같은 항암 약물; 리신(ricin), 디프테리아 독소(diphtheria toxin), 슈도모나스 균체외 독소A(pseudomonas exotoxin A), DNA효소 및 RNA효소와 같은 펩타이드 세포독소(peptide cytotoxins); 요드131, 레늄186, 인듐111, 이리듐90, 비스무트210 및 213, 악티늄225 및 아스타틴213과 같은 방사성핵종(radionuclide); 항체 지향적 효소 프로드러그와 같은 프로드러그; IL-2, 케모카인(예를 들어, IL8), 혈소판 인자4, 흑색종 성장 자극 단백질(melanoma growth stimulating protein) 등과 같은 면역 자극제; 항CD3항체 또는 이의 단편과 같은 항체 또는 이의 단편, 보체 활성화제, 이종 단백질 도메인, 동종 단백질 도메인, 바이러스/박테리아 단백질 도메인 및 바이러스/박테리아 펩타이드를 포함한다. 이 외에, 본 발명의 약물 조성물은 화학요법, 방사선 요법과 같은 하나 또는 다수의 치료 방법과 함께 조합하여 사용될 수도 있다.
조작된 면역 세포의 제조방법
면역 세포가 본 발명의 키메라 항원 수용체를 발현하도록 본 발명의 키메라 항원 수용체 또는 이의 코딩 핵산 서열을 면역 세포에 도입하는 단계를 포함하는 조작된 면역 세포의 제조 방법을 더 제공한다.
일 실시형태에 있어서, 상기 면역 세포는 인간 면역 세포이고, 보다 바람직하게는 인간 T세포, 대식 세포, 수지상 세포, 단핵구, NK세포 및/또는 NKT세포이다.
핵산 또는 벡터를 면역 세포에 도입하여 발현시키는 방법은 본 분야에 공지된 것이다. 예를 들어, 인산칼슘 침전법(calcium phosphate precipitation), 리포펙션법, 입자 충격법, 미세주입법, 전기천공법 등과 같은 물리적 방법에 의해 핵산 또는 벡터를 면역 세포에 도입할 수 있다. 또는, 화학 방법을 사용할 수도 있고, 예를 들어, 대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로스피어, 비드 및 지질 기반 시스템과 같은 콜로이드 분산 시스템(수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀 및 리포솜을 포함)에 의해 핵산 또는 벡터를 도입한다. 이 외에, 생물학적 방법을 사용하여 핵산 또는 벡터를 도입할 수도 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터, 특히 레트로바이러스 벡터 등은 유전자를 포유동물(예를 들어 인간 세포)에 삽입하기 위한 가장 일반적인 방법이 되었다. 기타 바이러스 벡터로 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순포진바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스 등으로부터 유래되는 바이러스 벡터일 수 있다.
핵산 또는 벡터를 면역 세포에 도입한 후, 본 분야 기술자들은 얻은 면역 세포를 통상적인 기술에 의해 증식 및 활성화시킬 수 있다.
치료 응용
본 발명은 또한 유효량의 본 발명에 따른 면역 세포 또는 약물 조성물을 피험자에 투여하는 단계를 포함하는 암에 걸린 피험자를 치료하는 방법을 제공한다.
일 실시형태에 있어서, 유효량의 본 발명의 면역 세포 및/또는 약물 조성물을 피험자에게 직접 투여한다.
다른 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 치료 방법은 생체 외 치료(ex-vivo treatment)이다. 구체적으로, 상기 방법은, (a) 면역 세포를 포함하는 시험자의 시료를 제공하는 단계; (b) 체외에서 본 발명의 키메라 항원 수용체를 상기 면역 세포에 도입하여, 변형된 면역 세포를 얻는 단계; (c) 상기 변형된 면역 세포를 이를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 단계; 를 포함한다. 바람직하게, 단계 (a)에서 제공된 면역 세포는 T세포, NK세포 및/또는 NKT세포로부터 선택되고; 상기 면역 세포는 본 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 피험자의 시료(특히, 혈액 시료) 로부터 수득될 수 있다. 그러나, 본 발명의 키메라 항원 수용체를 발현할 수 있고 본 발명에 기재된 바와 같은 원하는 생물학적 이펙터 기능을 발휘할 수 있는 기타 면역 세포를 사용할 수도 있다. 이 외에, 통상적으로 선택된 면역 세포는 피험자의 면역계와 상용될 수 있고, 즉, 바람직하게 상기 면역 세포는 면역원성 반응을 유도하지 않는다. 예를 들어, "만능 수용 세포(universal recipient cell)"를 사용할 수 있고, 즉, 원하는 생물학적 이펙터 기능을 발휘하고 보편적으로 상용되며 체외에서 성장 및 증폭될 수 있는 림프구를 사용할 수 있다. 이러한 세포를 사용하는 경우, 피험자 자체의 림프구를 획득 및/또는 제공할 필요가 없다. 단계 (b) 의 생체외 도입은 전기천공을 통해 본 발명에 기술된 핵산 또는 벡터를 면역 세포에 도입하거나 바이러스 벡터로 면역 세포를 감염시킴으로써 수행될 수 있으며, 상기 바이러스 벡터는 전술된 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터이다. 기타 이용 가능한 방법으로는 형질감염 시약(예를 들어, 리포솜)을 사용하는 형질감염 또는 일시적 RNA 형질감염이 포함된다.
일 실시형태에 있어서, 상기 면역 세포는 자가 또는 동원이계(allogeneic)의 세포이고, 바람직하게는 T세포, 대식 세포, 수지상 세포, 단핵구, NK세포 및/또는 NKT세포이며, 보다 바람직하게는 T세포, NK세포 또는 NKT세포이다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "자가"는 개체로부터 유래된 임의의 물질이 잠시 뒤 동일한 개체에 다시 도입되는 것을 의미한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "동원이계(allogeneic)"는 임의의 물질()의 유래되는 개체와 당해 물질이 도입되는 개체가 동일한 종의 다른 동물 또는 다른 환자인 것을 의미한다. 하나 또는 다수의 유전자좌에서의 유전자가 상이한 경우, 당해 둘 또는 그 이상의 개체가 서로 동원이계(allogeneic)인 것으로 간주된다. 일부 경우, 같은 종의 개체에서 유래한 동종이계 물질은 유전적으로 다르므로 충분히 항원 상호작용이 일어날 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "피험자"는 포유동물이다. 포유동물은 인간, 비 인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말 또는 소일 수 있지만, 이들 예시에 한정되지 않는다. 인간 이외의 포유동물은 암의 동물 모델을 나타내는 대상으로 유리하게 사용될 수 있다. 바람직하게, 상기 피험자는 인간이다.
일 실시형태에 있어서, 상기 암은 리간드 결합 도메인에 결합되는 타겟 발현과 관련된 암이다. 예를 들어, 상기 암은, 뇌 신경교종, 모세포종, 육종, 백혈병, 기저세포암, 담도암, 방광암, 골암, 뇌 및 CNS 암, 유방암, 복막암, 자궁경부암, 융모막암(choriocarcinoma), 결장 및 직장암, 결합조직암(connective tissue cancer), 소화기 계통의 암(cancer of digestive system), 자궁내막암, 식도암, 안암, 두경부암, 위암(위장암 포함), 교모세포종(GBM), 간암, 간세포종양, 상피내종양, 신장암, 후두암, 간종양, 폐암(예를 들어, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐 선암 및 편평상피 폐암), 림프종(호지킨 림프종 및 비호지킨 림프종 포함), 흑색종, 골수종, 신경모세포종, 구강암(예를 들어, 입술, 혀, 입 및 인두), 난소암, 췌장암, 전립선암, 망막모세포종, 횡문근육종, 직장암, 호흡기 계통의 암, 타액샘 암종(salivary gland cancer), 피부암, 편평세포암, 위암, 고환암, 갑상선암, 자궁암 또는 자궁내막암, 비뇨기 계통의 악성 종양, 외음부암 및 기타 암 및 종양, 및 B세포 림프종(저등급/여포성 비호지킨 림프종(NHL), 소림프구성(SL)NHL, 중등급/여포성NHL, 중등급 미만성NHL, 고등급 면역아세포성NHL(high-grade immunoblastic NHL), 고등급 림프아세포성NHL(high-grade lymphoblastic NHL), 고등급 소형 비-절단된 세포NHL(high-grade small non-cracked cell NHL), 벌키병 NHL(bulky disease NHL)), 외투세포 림프종, AIDS관련 림프종, 및 발텐스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom macroglobulinemia), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), B세포 급성 림프구성 백혈병(B-ALL), T세포 급성 림프구성 백혈병(T-ALL), B세포 전림프구성 백혈병, 모구 형질세포양 수지상 세포 종양, 버킷 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 만성 골수성 백혈병(CML), 악성 림프 증식 질환(malignant lymphoproliferative disorder), MALT 림프종, 털세포 백혈병, 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성(myelodysplasia), 형질모세포 림프종(plasmablastic lymphoma), 전백혈병, 형질세포양 수지상 세포 종양, 및 이식후 림프세포증식 질환(post-transplant lymphoproliferative disorder, PTLD); 및 기타 타겟 발현과 관련된 질환을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 바람직하게, 본 발명의 조작된 면역 세포 또는 약물 조성물을 사용하여 치료할 수 있는 질환은 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 뇌 신경교종, 췌장암, 위암 등으로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, 상기 방법은 또한 하나 또는 다수의 별도의 화학요법제, 생물학적 제제, 약물 또는 치료제를 피험자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 실시형태에서, 화학요법제, 생물학적 제제, 약물 또는 치료제는 방사선 요법, 수술, 항체 시약 및/또는 소분자 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.
본 발명은 첨부된 도면 및 실시예를 참조하여 이하에서 상세히 설명될 것이다. 당업자는 첨부된 도면 및 본 발명의 실시예가 단지 예를 들기 위한 목적이며 본 발명에 대해 어떠한 제한도 구성하지 않는다는 것을 이해해야 한다는 점에 유의해야 한다. 본 출원의 실시예와 실시예의 특징은 모순되지 않는 범위에서 서로 조합될 수 있다.
하기 실시예에 사용된 서열은 표1에 요약된 바와 같다.
표1. 본 발명에 사용된 서열
Figure pct00001
본 발명의 모든 실시예에 사용된 T세포는 Ficoll-PaqueTM PREMIUM(GE Healthcare, Lot No. 17-5442-02)에 의해 건강한 공여체로부터 분리된 1차 인간 CD4+CD8+T세포이다. Nalm6종양 세포는 Nanjing Jicui Yaokang Biotechnology Co., Ltd.로부터 구입하였다.
실시예 1: CAR T세포의 구축
CD8α신호 펩타이드(서열번호 9), 항CD19scFv(서열번호 1), CD8α힌지 영역(서열번호 11), CD8α막관통 영역(서열번호 3), 4-1BB공동자극 도메인(서열번호 5), CD3ζ세포 내 신호 전달 도메인(서열번호 7)의 코딩 서열을 합성하고, 이를 pGEM-T Easy벡터(Promega, Lot No. A1360)에 순차적으로 클로닝하여, 기존의 bbz-CAR플라스미드를 얻으며, 시퀀싱을 통해 표적 서열의 정확한 삽입을 확인하였다. 동일한 방법으로 bbzg-CAR플라스미드를 얻고, bbz-CAR플라스미드와의 유일한 구별점은 CD3ζ세포 내 신호 전달 도메인에 연결된 γ사슬 세포 내 영역(서열번호 15)을 더 포함하는 것이다. bbzg-CAR플라스미드에서, 4-1BB공동자극 도메인, CD3ζ세포 내 신호 전달 도메인 및 γ사슬 세포 내 영역은 세포막과의 거리에 따라 가까운 곳으로부터 먼 곳으로의 순서로 순차적으로 배열된다.
무균 튜브에 3ml의 Opti-MEM(Gibco, Lot No. 31985-070)을 넣어 상기 플라스미드를 희석한 후, 다시 플라스미드: 바이러스 패키징 벡터: 바이러스 외피 벡터＝4:2:1의 비율에 따라 패키징 벡터psPAX2(Addgene, Lot No. 12260) 및 외피 벡터pMD2.G(Addgene, Lot No. 12259)를 넣었다. 다음, 120ul의 X-treme GENE HP DNA 형질감염 시약(Roche, Lot No. 06366236001)을 넣어, 즉시 균일하게 혼합하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션한 후, 플라스미드/벡터/형질감염 시약 혼합물을 293T세포의 배양 플라스크에 적가하였다. 24시간 및 48시간에 바이러스를 수집하고, 합병 후 초원심분리(25000g, 4℃, 2.5시간) 하여, 농축된 렌티바이러스를 얻었다.
DynaBeads CD3/CD28CTSTM(Gibco,Lot No. 40203D)로 T세포를 활성화 하고, 37℃ 및 5%의 CO2의 조건 하에서 1일 배양하였다. 다음, 농축된 렌티바이러스를 첨가하고, 계속하여 3일 배양한 후, CD19를 타겟팅하는 기존 con-CAR T세포(대조로 사용) 및 본 발명의 bbzg-CAR T세포를 얻었다.
37℃ 및 5％의 CO2의 조건 하에서 11일 동안 배양한 후, 비오틴-SP(롱스페이서) 아피니퓨어 염소 항 마우스 IgG(Biotin-SP(long spacer)AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG), F(ab')2 단편 특이적 항체(F(ab')2 Fragment Specific)(min X Hu,Bov,Hrs Sr Prot)(jackson immunoresearch, Lot No. 115-065-072)를 1차 항체로 사용하고, PC 스트렙타비딘(APC Streptavidin)(BD Pharmingen, Lot No. 554067) 또는 PE 스트렙타비딘(PE Streptavidin)(BD Pharmingen, Lot No. 554061)을 2차 항체로 사용하며, 유세포 분석기로 Fite-CAR T세포에서의 scF의 발현 수준을 검출하였으며, 결과는 도 1에 도시된 바와 같다(NT는 변형되지 않은 야생형 T세포)이다.
본 발명의 bbzg-CAR T세포가 scFv를 효과적으로 발현할 수 있고, 발현 수준이 기존의 bbz-CAR T세포보다 높은 것을 알 수 있다. γ사슬 세포 내 영역의 첨가는 CAR구조의 표면 발현에 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
실시예 2: 타겟 세포에 대한 CAR T세포의 살상 효과 및 사이토카인 방출
2.1 타겟 세포에 대한 CAR-T세포의 살상 효과
T세포가 타겟 세포를 살상할 때, 타겟 세포의 수는 감소된다. T세포와 루시퍼라제를 발현 가능한 타겟 세포와 공동 배양하면, 타겟 세포의 수가 감소되는 동시에, 분비되는 루시퍼라제도 감소된다. 루시퍼라제는 루시페린의 산화적 루시페린으로의 전환을 촉매할 수 있으나, 이러한 산화 과정에서, 생물발광이 이루어지게 되고, 이러한 발광의 강도는 타겟 세포에 의해 발현되는 루시퍼라제의 수준에 의해 결정된다. 따라서, 검출된 형광 강도는 타겟 세포에 대한 T세포의 살상 능력을 반영할 수 있다.
타겟 세포에 대한 CAR-T세포의 살상 능력을 검출하기 위하여, 먼저, 1x104/웰로 루시페린 유전자를 지닌 Nalm6 타겟 세포를 96웰플레이트에 분주한 다음, 32:1의 이펙터-타겟 비율(즉 효과 T세포와 타겟 세포의 비율)로 bbzg-CAR T세포, Con-CAR T세포(양성 대조) 및 형질감염되지 않은 T세포(음성 대조)를 96웰플레이트에 분주하여 공동 배양하고, 16-18시간 후 마이크로플레이트 리더로 형광 값을 측정하였다. 계산 공식: (타겟 세포 형광 평균 값-시료 형광 평균 값)/타겟 세포 형광 평균 값Х100％에 따라 계산하여 살상 효율을 얻고, 결과는 도 2에 도시된 바와 같다.
NT에 비해, 타겟 세포에 대한 본 발명의 bbzg-CAR T세포의 살상 효율은 기존 bbz-CAR T세포보다 현저하게 높은 것을 알 수 있다.
2.2 CAR-T세포의 사이토카인 방출
T세포가 타겟 세포를 살상할 때, 타겟 세포의 수는 감소되는 동시에, 또한 사이토카인 IL2 및 IFN-γ등을 방출한다. 하기 단계에 따라, 효소결합면역흡착법 (ELISA)으로 Fite-CARX T세포에 의한 타겟 세포 살상시 사이토카인 IL2 및 IFNγ의 방출 수준을 측정하였다.
(1) 세포 공동 배양 상등액 수집
1x105/웰로 타겟 세포(Nalm6 및 Raji) 및 비타겟세포(193F)를 각각 96웰플레이트에 분주한 후, 1:1의 비율로 bbzg-CAR T, con-CAR T(양성 대조) 및 NT세포(음성 대조)를 각각 타겟 세포 또는 비타겟 세포와 공동으로 배양하고, 18-24시간 후 세포 공동 배양 상등액을 수집하였다.
(2) ELISA로 상등액에서 IFNγ분비량을 검출
포획 항체인 정제된 항-인간 IFN-γ 항체(Purified anti-human IFN-γ Antibody)(Biolegend, Lot No. 506502)를 사용하여 96웰플레이트에 코팅하여 4℃에서 하룻밤 인큐베이션한 후, 항체 용액을 제거하고, 250μL의 2％의 BSA(sigma, Lot No. V900933-1kg)가 함유된 PBST(0.1％의 트윈이 함유된 1XPBS) 용액을 넣어, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 다음, 250μL의 PBST(0.1％의 트윈이 함유된 1XPBS)로 플레이트를 3회 세척하였다. 각 웰당 50μL의 세포 공동 배양 상등액 또는 표준품을 넣고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 250μL의 PBST(0.1%의 트윈이 함유된 1XPBS)로 3회 세척하였다. 다음, 각 웰에 50μL의 검출 항체인 항-인터페론 감마 (Anti-Interferon gamma)항체[MD-1](Biotin)(abcam, Lot No. ab25017)를 넣고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 250μL의 PBST(0.1%의 트윈이 함유된 1XPBS)로 3회 세척하였다. HRP스트렙트아비딘(HRP Streptavidin)(Biolegend, Lot No. 405210)을 더 넣고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 상등액을 버리며, 250μL의 PBST(0.1%의 트윈이 함유된 1XPBS)로 5회 세척하였다. 각 웰에 50μL의 TMB기질 용액을 넣었다. 실온에서 30분 동안 암실에서 반응이 일어나도록 한 후, 각 웰에 lmol/L의 H2SO4를 50μL 넣어 반응을 정지시켰다. 반응을 정지시킨 후 30분 이내에 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450nm에서의 흡광도를 검출하고, 표준 그래프(표준품의 리딩값 및 농도에 따라 제작)에 따라 사이토카인 함량을 계산하며, 결과는 도 3에 도시된 바와 같다.
비타겟 세포293F에서는 IFNγ의 방출을 모두 검출하지 못했음을 알 수 있으며, bbz-CAR T세포와 bbzg-CAR T세포의 살상이 모두 특이적인 것을 나타낸다. 또한, 타겟 세포 살상시, bbzg-CAR T세포의 IL2 방출 수준은 기존 CAR T세포보다 현저히 낮으나, 이의 IFN-γ의 방출 수준은 기존 CAR T세포보다 현저하게 높다. 전반적으로, 본 발명의 bbzg-CAR T세포의 사이토카인 방출은 기존 CAR-T세포와 유사하였다.
실시예 3 CAR-T세포의 종양 억제 효과 검증
마우스 모델 체내에서 종양 세포에 대한 CAR-T세포의 억제 효과를 검증하였다.
20마리의 8주령의 건강한 암컷 NCG 마우스를 PBS군, NT군(음성 대조), bbz-CART 군(양성 대조) 및 bbzg-CAR T군의 4개 그룹으로 나누었다. 0일째(D0), 각 마우에 1x106 개의 Nalm6세포를 미정맥 주사하였다. 7일 후(D7), 나뉘운 그룹 상황에 따라, 각 마우스에 PBS용액 또는 2x106개의 NT세포, con-CAR T세포 또는 bbzg-CAR T세포를 미정맥 주사하였다. 매주 마우스의 생존율 및 종양 부하의 변화에 대해 평가하였다.
생체 동물 체내 광학 이미징 기술을 사용하여 각 그룹 마우스의 종양 부하 변화를 평가하였다. D7, D14, D21, D28, D35, D42, D49에 마우스 종양 부하를 검출하고 Photons/s로 나타냈으며, 결과는 도 4에 도시된 바와 같다.
PBS 및 NT군에서, 마우스 체내의 종양 부하가 빠르게 진행되었고, D21에 최고치 (즉시 사망)에 도달한 것을 알 수 있다. bbz-CAR군의 마우스에서 CAR-T세포 처리된 후, 종양 부하가 급격히 감소하였으나, D28 또는 D35에서 다시 점차적으로 반등하였다. 반면, bbzg-CAR T군의 마우스는 처리된 후 종양 부하가 급격히 감소되었을 뿐만 아니라, 감소 수준이 D49까지 재발 없이 낮은 수준을 유지하였다. 이는 본 발명의 bbzg-CAR T세포가 종양 성장을 효과적으로 억제할 수 있고, 효과가 기존의 bbz-CAR T세포보다 현저함을 나타낸다.
발명자는 bbz-CART세포 및 bbzg-CAR T세포 처리된 두 그룹의 마우스에서 21일째에 체내의 T세포 증폭 상황을 모니터링하였다. 구체적으로, D21에 마우스의 턱밑 정맥(submandibular vein)에서 채혈하여, Trucount FACS분석(hCD3, hCD8, hCD4의 발현 수준)을 수행하였고, 결과는 도 5에 도시된 바와 같다.
bbz-CAR T군 및 bbzg-CAR T군의 마우스 체내에서 모두 T세포 증폭이 검출되었음을 알 수 있다. 이 둘의 CD4+T세포의 증폭 정도는 유사였으나, bbzg-CAR T군의 CD3+ 및 CD8+T세포의 증폭은 bbz-CAR T군보다 현저하게 높았다. 따라서, 이 두 그룹에서 21일째의 종양 부하 상황이 유사하였으나(도 4), bbzg-CAR T군 마우스 체내의 T세포 증폭이 현저하게 많아, 종양 부하를 낮은 수준으로 계속 억제할 수 있는 반면; bbz-CAR T군 마우스에서는 T세포의 증폭이 적고 지속적으로 고갈되어, 종양 부하가 나중에 반등하였다.
이 외에, 발명자는 실험 종료(즉, 종양 세포 Nalm6 접후 후 105일째)까지 각 그룹에서 마우스의 생존 백분율을 계산하였다(도 6). 여기서, PBS 및 NT군 마우스는 전부 사망하였고, bbz-CAR T세포로 처리된 마우스에서 1마리만 생존(20％)한 반면, bbzg-CAR T세포로 처리된 마우스에서는 여전히 60％가 생존하였다. 이는 본 발명의 bbzg-CAR T세포가 종양을 효과적으로 억제하여 생존율을 향상시킬 수 있음을 나타냈다.
상기 내용을 종합하면, 기존의 CAR T세포에 비해, 본 발명의 bbzg-CAR T세포는 사이토카인 수용체 공통 γ사슬의 도입으로 인해, T세포의 증폭을 크게 촉진할 수 있어, 종양 세포에 대한 지속적인 살상 효과를 향상시키고, 체내의 종양 억제 효과를 개선하고, 마우스의 생존을 증가시킬 수 있다.
실시예 4. 상이한 구조 CAR-T세포의 제조 및 기능 검증
γc사슬 세포 내 영역(서열번호 15)을 bbz-CAR플라스미드의 4-1BB공동자극 도메인 및 CD3ζ 1차 신호 전달 도메인 사이에 삽입하여, bbgz-CAR플라스미드를 얻되, 이와 bbzg-CAR플라스미드와의 구별점은 단지 γc사슬 세포 내 영역의 위치가 상이한 것이다. 실시예 1의 방법에 따라 bbgz-CAR T세포를 제조하였다.
실시예 2에 따른 방법에 따라 타겟 세포에 대한 CAR-T세포의 살상 효과를 검출하였고, 결과는 도 7에 도시된 바와 같다. 타겟 세포에 대한 bbgz-CAR T세포의 살상 효과는 기존의 bbz-CAR T세포와 유사하였나, bbzg-CAR T세포의 살상 효과보다 현저히 낮았다. 이는 CAR 구조에서 추가 신호 전달 영역(즉, γc사슬 또는 이의 세포 내 영역)의 위치가 CAR T세포의 살상 활성에 중요한 영향을 미침을 나타낸다.
상기 내용은 본 발명의 바람직한 실시예일 뿐, 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니며, 본 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 본 발명은 다양한 보정 및 변경을 가할 수 있다. 본 발명의 사상 및 원리 내에서 이루어진 모든 수정, 균등한 대체, 개선 등은 본 발명의 보호 범위 내에 포함되어야 한다는 것은 본 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 이해된다.
<110> NANJING BIOHENG BIOTECH CO., LTD <120> Novel Chimeric Antigen Receptor and Use thereof <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD19 scFv <400> 1 gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240 gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc 360 ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg 420 tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc 480 cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac 540 tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt 600 ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat 660 tattactacg gtggtagcta tgctatggac tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc 720 tcctca 726 <210> 2 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD19 scFv <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 5 9 14 19 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 24 29 34 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 39 44 49 Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 54 59 64 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 69 74 79 84 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr 89 94 99 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser 104 109 114 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu 119 124 129 Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys 134 139 144 Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg 149 154 159 164 Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser 169 174 179 Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile 184 189 194 Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln 199 204 209 Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly 214 219 224 Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val 229 234 239 244 Ser Ser <210> 3 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8 transmembrane domain <400> 3 atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60 accctttact gcaaa 75 <210> 4 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8┒transmembrane domain <400> 4 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 5 9 14 19 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys 24 29 <210> 5 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-1BB co-stimulatory domain <400> 5 cggggcagaa agaaactcct gtatatattc aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact 60 actcaagagg aagatggctg tagctgccga tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa 120 120 <210> 6 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-1BB co-stimulatory domain <400> 6 Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg 5 9 14 19 Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro 24 29 34 Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu 39 44 <210> 7 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3┕signaling domain <400> 7 ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 60 ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 120 ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180 aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240 cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300 acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 339 <210> 8 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3┕signaling domain <400> 8 Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln 5 9 14 19 Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu 24 29 34 Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly 39 44 49 Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 54 59 64 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 69 74 79 84 Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 89 94 99 Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro 104 109 114 Arg <210> 9 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8┒signal peptide <400> 9 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccg 63 <210> 10 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8┒signal peptide <400> 10 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 5 9 14 19 His Ala Ala Arg Pro 24 <210> 11 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8┒hinge region <400> 11 accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60 tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120 gacttcgcct gtgat 135 <210> 12 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8┒hinge region <400> 12 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 5 9 14 19 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 24 29 34 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 39 44 49 <210> 13 <211> 1107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ┚c chain <400> 13 atgttgaagc catcattacc attcacatcc ctcttattcc tgcagctgcc cctgctggga 60 gtggggctga acacgacaat tctgacgccc aatgggaatg aagacaccac agctgatttc 120 ttcctgacca ctatgcccac tgactccctc agtgtttcca ctctgcccct cccagaggtt 180 cagtgttttg tgttcaatgt cgagtacatg aattgcactt ggaacagcag ctctgagccc 240 cagcctacca acctcactct gcattattgg tacaagaact cggataatga taaagtccag 300 aagtgcagcc actatctatt ctctgaagaa atcacttctg gctgtcagtt gcaaaaaaag 360 gagatccacc tctaccaaac atttgttgtt cagctccagg acccacggga acccaggaga 420 caggccacac agatgctaaa actgcagaat ctggtgatcc cctgggctcc agagaaccta 480 acacttcaca aactgagtga atcccagcta gaactgaact ggaacaacag attcttgaac 540 cactgtttgg agcacttggt gcagtaccgg 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Val 54 59 64 Phe Asn Val Glu Tyr Met Asn Cys Thr Trp Asn Ser Ser Ser Glu Pro 69 74 79 84 Gln Pro Thr Asn Leu Thr Leu His Tyr Trp Tyr Lys Asn Ser Asp Asn 89 94 99 Asp Lys Val Gln Lys Cys Ser His Tyr Leu Phe Ser Glu Glu Ile Thr 104 109 114 Ser Gly Cys Gln Leu Gln Lys Lys Glu Ile His Leu Tyr Gln Thr Phe 119 124 129 Val Val Gln Leu Gln Asp Pro Arg Glu Pro Arg Arg Gln Ala Thr Gln 134 139 144 Met Leu Lys Leu Gln Asn Leu Val Ile Pro Trp Ala Pro Glu Asn Leu 149 154 159 164 Thr Leu His Lys Leu Ser Glu Ser Gln Leu Glu Leu Asn Trp Asn Asn 169 174 179 Arg Phe Leu Asn His Cys Leu Glu His Leu Val Gln Tyr Arg Thr Asp 184 189 194 Trp Asp His Ser Trp Thr Glu Gln Ser Val Asp Tyr Arg His Lys Phe 199 204 209 Ser Leu Pro Ser Val Asp Gly Gln Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Val Arg 214 219 224 Ser Arg Phe Asn Pro Leu Cys Gly Ser Ala Gln His Trp Ser Glu Trp 229 234 239 244 Ser His Pro Ile His Trp Gly Ser Asn Thr Ser Lys Glu Asn Pro Phe 249 254 259 Leu Phe Ala Leu Glu Ala Val Val Ile Ser Val Gly Ser Met Gly Leu 264 269 274 Ile Ile Ser Leu Leu Cys Val Tyr Phe Trp Leu Glu Arg Thr Met Pro 279 284 289 Arg Ile Pro Thr Leu Lys Asn Leu Glu Asp Leu Val Thr Glu Tyr His 294 299 304 Gly Asn Phe Ser Ala Trp Ser Gly Val Ser Lys Gly Leu Ala Glu Ser 309 314 319 324 Leu Gln Pro Asp Tyr Ser Glu Arg Leu Cys Leu Val Ser Glu Ile Pro 329 334 339 Pro Lys Gly Gly Ala Leu Gly Glu Gly Pro Gly Ala Ser Pro Cys Asn 344 349 354 Gln His Ser Pro Tyr Trp Ala Pro Pro Cys Tyr Thr Leu Lys Pro Glu 359 364 369 Thr <210> 15 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ┚c chain intracellular region <400> 15 gaacggacga tgccccgaat tcccaccctg aagaacctag aggatcttgt tactgaatac 60 cacgggaact tttcggcctg gagtggtgtg tctaagggac tggctgagag tctgcagcca 120 gactacagtg aacgactctg cctcgtcagt gagattcccc caaaaggagg ggcccttggg 180 gaggggcctg gggcctcccc atgcaaccag catagcccct actgggcccc cccatgttac 240 accctaaagc ctgaaacc 258 <210> 16 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ┚c chain intracellular region <400> 16 Glu Arg Thr Met Pro Arg Ile Pro Thr Leu Lys Asn Leu Glu Asp Leu 5 9 14 19 Val Thr Glu Tyr His Gly Asn Phe Ser Ala Trp Ser Gly Val Ser Lys 24 29 34 Gly Leu Ala Glu Ser Leu Gln Pro Asp Tyr Ser Glu Arg Leu Cys Leu 39 44 49 Val Ser Glu Ile Pro Pro Lys Gly Gly Ala Leu Gly Glu Gly Pro Gly 54 59 64 Ala Ser Pro Cys Asn Gln His Ser Pro Tyr Trp Ala Pro Pro Cys Tyr 69 74 79 84 Thr Leu Lys Pro Glu Thr 89

Claims (18)

  1. 항원 결합 영역, 트랜스멤브레인 도메인, 공동자극 도메인, 세포 내 신호 전달 도메인 및 추가 신호 전달 영역을 포함하고, 상기 추가 신호 전달 영역은 γc사슬 또는 이의 세포 내 영역으로 이루어진 것인 키메라 항원 수용체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 공동자극 도메인, 세포 내 신호 전달 도메인 및 추가 신호 전달 영역은 세포막과의 거리에 따라 가까운 곳으로부터 먼 곳으로의 순서로 순차적으로 배열되는 키메라 항원 수용체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 γc사슬의 아미노산 서열은 서열번호 14로 표시되고; 이의 세포 내 영역의 아미노산 서열은 서열번호 16으로 표시되는 것인 키메라 항원 수용체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 항원 결합 영역은 sdAb, 나노 항체, 항원 결합 리간드, 재조합 피브로넥틴 도메인, 안티칼린(anticalin) 및 DARPIN으로부터 선택되는 것인 키메라 항원 수용체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 항원 결합 영역은 단일클론 항체, 다클론 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 뮤린 항체 및 키메라 항체로부터 선택되는 것인 키메라 항원 수용체.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원 결합 영역에 결합된 타겟은, TSHR, CD19, CD123, CD22, BAFF-R, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, GPRC5D, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, 메소텔린, IL-l lRa, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, CD24, PDGFR-β, SSEA-4, CD20, Folate수용체α, ERBB2(Her2/neu), MUC1, EGFR, NCAM, Claudin 18.2, Prostase, PAP, ELF2M, Ephrin B2, IGF-I수용체, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, 티로시나아제, EphA2, Fucosyl GMl, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, Folate수용체β, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD 179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-la, MAGE-A1, 레구메인, HPV E6, E7, MAGE Al, ETV6-AML, 정자 단백질17(sperm protein 17), XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos관련 항원1, p53, p53변이체, 전립선 특이 단백질(prostate specific protein), 서바이빈(survivin) 및 텔로머라제(telomerase), PCTA-l/Galectin 8, MelanA/MARTl, Ras변이체, hTERT, 육종 전좌 중단점(sarcoma translocation breakpoint), ML-IAP, ERG(TMPRSS2 ETS융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, Cyclin Bl, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B 1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES 1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라제 역전사효소(human telomerase reverse transcriptase), RU1, RU2, 장 카르복실에스테라아제(intestinal tract carboxylesterase), mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, IGLL1, PD1, PDL1, PDL2, TGFβ, APRIL, NKG2D 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 것인 키메라 항원 수용체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 트랜스멤브레인 도메인은, TCRα사슬, TCRβ사슬, TCRγ사슬, TCRδ사슬, CD3ζ서브 유닛, CD3ε서브 유닛, CD3γ서브 유닛, CD3δ서브 유닛, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로부터 선택되는 단백질의 트랜스멤브레인 도메인인 키메라 항원 수용체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 내 신호 전달 도메인은, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 선택되는 단백질의 신호 전달 도메인인 키메라 항원 수용체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키메라 수용체 폴리펩타이드는 하나 또는 다수의 공동자극 도메인을 포함하고, 상기 공동자극 도메인은, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD8, CD18(LFA-1), CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD150(SLAMF1), CD152(CTLA4), CD223(LAG3), CD270(HVEM), CD272(BTLA), CD273(PD-L2), CD274(PD-L1), CD276(B7-H3), CD278(ICOS), CD357(GITR), DAP10, LAT, NKG2C, SLP76, LIGHT, TRIM 및 ZAP70으로부터 선택되는 단백질의 공동자극 신호 전달 도메인인 키메라 항원 수용체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 키메라 항원 수용체를 포함하는 핵산.
  11. 제10항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 키메라 항원 수용체, 제10항에 따른 핵산, 또는 제11항에 따른 벡터를 포함하는 면역 세포.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 벡터는 선형 핵산 분자, 플라스미드, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 라우스육종바이러스(RSV), 폴리오마 및 아데노 관련 바이러스(AAV), 파지, 코스미드 또는 인공 염색체인 면역 세포.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    상기 면역 세포는 T세포, 대식 세포, 수지상 세포, 단핵구, NK세포 또는 NKT세포로부터 선택되는 것인 면역 세포.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 면역 세포는 CD4+/CD8+이중 양성T세포, CD4+헬퍼 T세포, CD8+T세포, 종양 침윤 세포, 기억 T세포, 미접촉 T세포, γδ-T세포 및 αβ-T세포로부터 선택되는 세포인 면역 세포.
  16. 제12항에 있어서,
    상기 면역 세포는 CD52, GR, TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD247ζ, HLA-I, HLA-II 유전자, 및 PD1 및 CTLA-4와 같은 면역 체크포인트 유전자로부터 선택되는 적어도 하나의 비활성 유전자를 더 포함하는 것인 면역 세포.
  17. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 키메라 항원 수용체, 제10항에 따른 핵산, 또는 제11항에 따른 벡터 또는 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 면역 세포, 및 하나 또는 다수의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약물 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 약물 조성물은, 모세포종, 육종, 백혈병, 기저세포암, 담도암, 방광암, 골암, 뇌 및 CNS 암, 유방암, 복막암, 자궁경부암, 융모막암(choriocarcinoma), 결장 및 직장암, 결합조직암(connective tissue cancer), 소화기 계통의 암(cancer of digestive system), 자궁내막암, 식도암, 안암, 두경부암, 위암, 교모세포종(GBM), 간암, 간세포종양, 상피내종양, 신장암, 후두암, 백혈병, 간종양, 폐암, 림프종, 흑색종, 골수종, 신경모세포종, 구강암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 망막모세포종, 횡문근육종, 직장암, 호흡기 계통의 암, 타액샘 암종(salivary gland cancer), 피부암, 편평세포암, 위암, 고환암, 갑상선암, 자궁암 또는 자궁내막암, 비뇨기 계통의 악성 종양, 외음부암 및 기타 암 및 종양, 및 B세포 림프종, 외투세포 림프종, AIDS관련 림프종, 및 발텐스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom macroglobulinemia), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), B세포 급성 림프구성 백혈병(B-ALL), T세포 급성 림프구성 백혈병(T-ALL), B세포 전림프구성 백혈병, 모구 형질세포양 수지상 세포 종양, 버킷 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 만성 골수성 백혈병(CML), 악성 림프 증식 질환(malignant lymphoproliferative disorder), MALT 림프종, 털세포 백혈병, 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성(myelodysplasia), 형질모세포 림프종(plasmablastic lymphoma), 전백혈병, 형질세포양 수지상 세포 종양, 및 이식후 림프세포증식 질환(post-transplant lymphoproliferative disorder, PTLD)으로부터 선택되는 암을 치료하기 위한 것인 약물 조성물.
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