KR20220123237A

KR20220123237A - Il-13 및 tslp를 표적으로 하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩타이드

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Publication number: KR20220123237A
Application number: KR1020227023385A
Authority: KR
Inventors: 헤이디 롬멜라에르; 안 브리제; 시그리드 코르넬리스; 브루노 돔브레흐트; 에릭 로렌트; 멜라니에 리거; 티모시 수스; 존 박; 베른트 웨이글; 클라우스 어브
Original assignee: 아블린쓰 엔.브이.; 사노피
Priority date: 2019-12-09
Filing date: 2020-12-09
Publication date: 2022-09-06
Also published as: CN114980974A; EP4072674A1; AU2020400938A1; CA3163910A1; MX2022007035A; CO2022008813A2; US20220177564A1; US20220177565A1; US11840566B2; TW202136302A; US20220177566A1; TWI861302B; IL293548A; WO2021116182A1; JP2023504914A; BR112022010223A2; US20210188965A1

Abstract

본 기술은 염증성 질환을 앓고 있는 대상체를 치료하기 위한 새로운 유형의 약물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 구체적으로, 본 기술은 적어도 4개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 폴리펩타이드를 제공하며, 적어도 2개의 ISVD가 IL-13에 결합하고, 적어도 2개의 ISVD가 TSLP에 결합하는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 기술은 핵산, 벡터 및 조성물을 제공한다.

Description

IL-13 및 TSLP를 표적으로 하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩타이드

본 기술은 IL-13 및 TSLP를 표적으로 하는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 또한, 본 기술은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자 및 핵산을 포함하는 벡터, 및 폴리펩타이드, 핵산 또는 벡터를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 기술은 염증성 질환을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 이들 생성물에 관한 것이다. 또한, 본 기술은 이들 생성물의 제조 방법에 관한 것이다.

숙주 방어에 필요하지만 억제되지 않은 면역 반응은 천식, 아토피 피부염 및 류마티스 관절염과 같은 다양한 염증성 질환을 유발할 수 있다. 면역계의 선천적 및 적응적 아암에 의해 매개되는 일련의 면역 반응(예를 들어, 항원 인식, 항원 처리, 항원 제시, 사이토카인 생산, 항체 생산, 표적 세포 사멸)은 다양한 면역 질환의 시작 및 전파를 유도한다. 염증성 질환은 종종 만성이며, 심지어 생명을 위협할 수도 있다. 천식 및 아토피 피부염과 같은 알레르기 및 아토피 질환은 주로 제2형 면역 반응에 의해 유발되며, 높은 IgE 생성 및 호산구 증가와 같은 제2형 면역의 두드러진 특성을 특징으로 한다.

흉선 기질 림프포이에틴(TSLP) 및 인터루킨-13(IL-13)은 기질 및/또는 면역 세포에 의해 생성되는 가용성 사이토카인 표적이다(Ziegler & Artis, Nat Rev Immunol (2010) 11:289, Gieseck III et al., Nat Rev Immunol (2018) 18:62). 인간 TSLP 및 IL-13은 2형 면역, 천식 및 아토피 피부염과 같은 2형 염증성 질환 및 광범위한 면역학적 질환의 뚜렷하고 중복되며 상승적인 양태를 유도한다.

TSLP의 신호전달은 흉선 기질 림포포이에틴 수용체(TSLPR)와 IL-7R 알파 사슬(IL-7Rα)로 구성된 이종이량체 수용체 복합체를 통해 시작된다. 유사하게, IL-13 신호전달은 알파 IL-4 수용체(IL-4Rα) 및 알파 인터루킨-13 수용체(IL-13R1α)로 이루어진 이종이량체 수용체 복합체에 결합함으로써 시작된다. IL-13R1에 대한 IL-13의 높은 친화성은 IL-4Rα에 대한 이종이량체 형성 가능성을 더욱 증가시키는 복합체 형성을 유도한다.

TSLP는 수지상 세포의 성숙, 비만 세포의 발달 및 증식을 유도할 뿐만 아니라 호염기구 및 선천 림프구 세포(ILC2)와 같은 다른 면역 세포를 활성화시킨다. 유사하게, IL-13은 상피 장벽 파괴, 점막-상피 표면으로부터의 점액 생성, 기도 리모델링 및 에오탁신과 같은 호산구 동원 케모카인의 유도와 같은 다양한 면역병리를 발휘한다. 이러한 기전은 2형 염증 반응의 시작 및 전파에 중심이 되며, 아토피 피부염 및 천식과 같은 질환에서 다양한 면역병리학의 발달에 중심이 된다.

현재, 중등도/중증 천식 환자는 특히 저-호산구성 표현형을 갖는 천식 환자에서 항-IL4Rα 단일클론항체 Dupixent(두필루맙; 시판됨), 항-IL5(시판됨), 항-IgE 단일클론 항체 Xolair(오말리주맙; 시판됨)와 같은 생물학적 치료제를 포함해 현재 이용 가능한 표준 치료에 부적절하게 반응하고 있다. TSLP(테제펠루맙) 및 IL-13(레브리키주맙)에 대한 길항 단일클론 항체가 현재 임상 시험을 진행 중이지만, TSLP와 IL-13을 모두 표적으로 하는 활발한 임상 개발 프로그램은 없다. 단일 제제를 사용한 TSLP 및 IL-13의 이중 표적화는 저-2형 및 고-2형 천식과 아토피 피부염 모두에 효능을 부여할 가능성이 있으며, 단일 단일특이성 제제 요법이 완전히 효과적이지 않을 수 있는 이러한 적응증 내의 하위 집단에 효능을 부여할 가능성이 있다. 따라서, 천식 및 아토피 피부염과 같은 제2형 염증성 질환의 치료에 더 효과적일 뿐만 아니라 환자에게 편리하게 적용할 수 있는 의학적 요구가 여전히 충족되지 않고 있다.

이러한 요법은 IL-13 및 TSLP와 같은 여러 질환 인자를 표적화하는 것을 포함할 수 있다.

여러 질환 인자를 표적으로 하는 것은 예를 들어 두 가지 개별 생물학적 제제, 예를 들어 다른 치료 표적에 결합하는 항체의 공동 투여 또는 조합 사용에 의해 달성될 수 있다. 그러나, 별도의 생물학적 제제의 공동 투여 또는 조합 사용은 실용적이고 상업적인 관점 모두에서 어려울 수 있다. 예를 들어, 개별 제품을 두 번 주사하면 환자에게 더 불편하고 고통스러운 치료 체제가 생겨 순응도에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 두 가지 개별 제품의 단일 주입과 관련하여, 필요한 농도에서 허용 가능한 점도와 두 제품의 적합한 안정성을 허용하는 제형을 제공하는 것이 어렵거나 불가능할 수 있다. 또한, 공동 투여 및 공동 제형화는 전체 비용을 증가시킬 수 있는 2개의 개별 약물의 생산을 필요로 한다.

2개의 상이한 항원에 결합할 수 있는 이중특이성 항체는 항체와 같은 별개의 생물학적 제제의 공동 투여 또는 조합 사용과 관련된 이러한 제한을 해결하기 위한 하나의 전략으로 제안되었다.

이중특이성 항체 작제물은 여러 형식으로 제안되었다. 예를 들어, 이중특이성 항체 형식은 2개의 항체 또는 이의 단편의 화학적 접합을 포함할 수 있다(문헌[Brennan, M, et al., Science, 1985. 229(4708): p. 81-83]; [Glennie, M. J., et al., J Immunol, 1987. 139(7): p. 2367-2375]).

그러나 이러한 이중특이성 항체 형식의 단점은 고농도에서 점도가 높아 예를 들어 피하 투여가 어렵고, 각 결합 단위는 특이적 및 고친화성 결합을 위해 2개의 가변 도메인의 상호작용을 필요로 하며, 이는 폴리펩타이드 안정성 및 생산 효율에 대한 영향을 포함한다. 이러한 이중특이성 항체 형식은 또한 경쇄의 잘못짝지음(misparing) 또는 중쇄의 잘못짝지음과 관련된 화학, 제조 및 관리(CMC) 문제를 잠재적으로 유발할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 기술은 시험관내 단일특이적 항-IL-13 또는 항-TSLP 폴리펩타이드와 비교하여 2형 염증 반응을 조절하는 효율을 증대시키는 동시에 IL-13 및 TSLP를 특이적으로 표적화하는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 (예를 들어 미생물 숙주에서) 효율적으로 생산된다. 또한, 일부 실시형태에서, 이러한 폴리펩타이드는 치료될 대상체의 기존 항체(즉, 항체 작제물을 사용한 첫 번째 치료 전에 대상체에 존재하는 항체)에 대해 제한된 반응성을 갖는다. 다른 실시형태에서, 이러한 폴리펩타이드는 연속 치료가 편리하게 이격될 수 있도록 충분히 긴 치료 대상체에서의 반감기를 나타낸다.

일 실시형태에서, 본 기술은 IL-13에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드를 제공한다. 추가의 실시형태에서, 본 기술의 폴리펩타이드는 IL-13에 특이적으로 결합하는 적어도 2개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어지며, 여기서 2개의 ISVD는 펩타이드 링커를 통해 임의로 연결된다. 일 실시형태에서, IL-13에 특이적으로 결합하는 2개의 ISVD는 별개의 ISVD이다. 더욱이, 일 실시형태에서, 폴리펩타이드는 임의로 하나 이상의 펩타이드 링커를 통해 연결된 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를 추가로 포함하고, 여기서 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 없는 상응하는 폴리펩타이드와 비교하여 증가된 반감기를 갖는 폴리펩타이드를 제공한다. 예를 들어, 결합 단위는 인간 혈청 알부민과 같은 (인간) 혈청 단백질에 결합하는 ISVD일 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 기술의 폴리펩타이드는 TSLP에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어진다. 추가의 실시형태에서, 본 기술의 폴리펩타이드는 TSLP에 특이적으로 결합하는 적어도 2개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어지며, 여기서 2개의 ISVD는 펩타이드 링커를 통해 임의로 연결된다. 일 실시형태에서, TSLP에 특이적으로 결합하는 2개의 ISVD는 별개의 ISVD이다. 더욱이, 일 실시형태에서, 폴리펩타이드는 임의로 하나 이상의 펩타이드 링커를 통해 연결된 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를 추가로 포함하고, 여기서 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 없는 상응하는 폴리펩타이드와 비교하여 증가된 반감기를 갖는 폴리펩타이드를 제공한다. 예를 들어, 결합 단위는 인간 혈청 알부민과 같은 (인간) 혈청 단백질에 결합하는 ISVD일 수 있다.

또 다른 실시형태에서, 본 기술의 폴리펩타이드는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어지며, 여기서 적어도 2개의 ISVD는 IL-13에 특이적으로 결합하고 적어도 2개의 ISVD는 TSLP에 특이적으로 결합한다. 일 실시형태에서, IL-13에 특이적으로 결합하는 적어도 2개의 ISVD는 인간 IL-13에 특이적으로 결합하고, TSLP에 특이적으로 결합하는 적어도 2개의 ISVD는 인간 TSLP에 특이적으로 결합한다. 일 실시형태에서, IL-13에 특이적으로 결합하는 적어도 2개의 ISVD는 별개의 ISVD이고 TSLP에 결합하는 적어도 2개의 ISVD는 별개의 ISVD이다. 또 다른 실시형태에서, 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드는 임의로 하나 이상의 펩타이드 링커를 통해 연결된 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를 추가로 포함하고, 여기서 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 없는 상응하는 폴리펩타이드와 비교하여 증가된 반감기를 갖는 폴리펩타이드를 제공한다. 예를 들어, 결합 단위는 인간 혈청 알부민과 같은 (인간) 혈청 단백질에 결합하는 ISVD일 수 있다.

또한, 본 기술의 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 핵산 분자, 핵산 또는 핵산을 포함하는 벡터, 및 폴리펩타이드, 핵산 또는 벡터를 포함하는 조성물이 제공된다. 일 실시형태에서, 조성물은 약제학적 조성물이다.

또한, 본 기술에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 또는 숙주 세포가 제공된다.

본 기술에 따른 폴리펩타이드를 생산하는 방법이 추가로 제공되며, 상기 방법은 적어도 다음의 단계를 포함한다:

a. 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서, 또는 다른 적합한 발현 시스템에서, 본 기술의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 발현하는 단계; 선택적으로 다음에:

b. 본 기술에 따라 폴리펩타이드를 단리 및/또는 정제하는 단계.

또한, 본 기술은 의약으로서 사용하기 위한 폴리펩타이드, 폴리펩타이드를 포함하는 조성물, 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 또는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 일 실시형태에서, 폴리펩타이드 또는 조성물은 2형 염증성 질환과 같은 염증성 질환의 치료에 사용하기 위한 것이다. 일 실시형태에서, 2형 염증성 질환은 아토피 피부염 및 천식으로부터 선택된다.

또한, 2형 염증성 질환과 같은 염증성 질환의 치료 방법이 제공되며, 여기서 상기 방법은 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 기술에 따른 폴리펩타이드 또는 조성물의 약제학적 활성량을 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 2형 염증성 질환은 아토피 피부염 및 천식으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 하나 이상의 추가 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

추가로, 2형 염증성 질환과 같은 염증성 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물의 제조에 있어서의 본 기술의 폴리펩타이드 또는 조성물의 용도가 제공된다. 일 실시형태에서, 2형 염증성 질환은 아토피 피부염 및 천식으로부터 선택된다.

특히, 본 기술은 다음 실시형태를 제공한다:

실시형태 1. 의약으로서 사용하기 위한, 폴리펩타이드, 폴리펩타이드를 포함하는 조성물, 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 조성물로서, 상기 폴리펩타이드는 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 구성되고, 여기서 상기 ISVD는 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 ISVD는:

a) 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;

서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및

서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3,

b) 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;

서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및

서열번호 18의 아미노산 서열 또는 서열번호 18과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3,

c) 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;

서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및

서열번호 19의 아미노산 서열 또는 서열번호 19와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3, 또는

d) 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;

서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및

서열번호 21의 아미노산 서열 또는 서열번호 21과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 조성물.

실시형태 2. 실시형태 1에 있어서, 상기 적어도 하나의 ISVD는:

a) 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 17의 아미노산 서열인 CDR3,

b) 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 18의 아미노산 서열인 CDR3,

c) 서열번호 9의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 19의 아미노산 서열인 CDR3, 또는

d) 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 21의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 조성물.

실시형태 3. 실시형태 1 또는 2에 있어서, 적어도 하나의 ISVD의 아미노산 서열은:

a) 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성,

b) 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성,

c) 서열번호 4와 90% 동일성 초과의 서열 동일성, 또는

d) 서열번호 6과 90% 동일성 초과의 서열 동일성을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 조성물.

실시형태 4. 실시형태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 ISVD는:

a) 서열번호 2의 아미노산 서열,

b) 서열번호 3의 아미노산 서열,

c) 서열번호 4의 아미노산 서열, 또는

d) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 조성물.

실시형태 5. 실시형태 1에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 적어도 2개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어지고, 여기서 상기 ISVD 각각은 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하고, 여기서 적어도 2개의 ISVD는 하나 이상의 펩타이드 링커를 통해 임의로 연결되며:

a) 제1 및 제2 ISVD는

i. 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;

ii. 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및

iii. 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,

b) 제1 및 제2 ISVD는

i. 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;

ii. 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및

iii. 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 서열번호 18과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,

c) 제1 ISVD는

iii. 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고,

제2 ISVD는

iv. 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;

v. 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및

vi. 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 서열번호 18과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,

d) 제1 ISVD는

iii. 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 서열번호 18과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고,

제2 ISVD는

iv. 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;

v. 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및

vi. 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,

e) 제1 ISVD는

i. 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;

ii. 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및

iii. 서열번호 21의 아미노산 서열 또는 서열번호 21과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고,

제2 ISVD는

iv. 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;

v. 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및

vi. 서열번호 19의 아미노산 서열 또는 서열번호 19와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나, 또는

f) 제1 ISVD는

i. 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;

ii. 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및

iii. 서열번호 19의 아미노산 서열 또는 서열번호 19와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고/하거나,

제2 ISVD는

iv. 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;

v. 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및

vi. 서열번호 21의 아미노산 서열 또는 서열번호 21과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고,

여기서 ISVD의 순서는 상기 폴리펩타이드의 N-말단에서 C-말단까지 고려되는 서로에 대한 그들의 상대적인 위치를 나타내는, 폴리펩타이드 또는 조성물.

실시형태 6. 실시형태 5에 있어서,

a) 제1 및 제2 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 17의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,

b) 제1 및 제2 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 18의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,

c) 제1 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 17의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 18의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,

d) 제1 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 18의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 17의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,

e) 제1 ISVD는 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 21의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 9의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 19의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나, 또는

f) 제1 ISVD는 서열번호 9의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 19의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 21의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 조성물.

실시형태 7. 실시형태 5 또는 6에 있어서,

a) 제1 및 제2 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하거나,

b) 제1 및 제2 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하거나,

c) 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하거나,

d) 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하거나,

e) 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 6과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하거나, 또는

f) 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 6과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 조성물.

실시형태 8. 실시형태 5 내지 7 중 어느 하나에 있어서,

a) 제1 및 제2 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나,

b) 제1 및 제2 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나,

c) 제1 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나,

d) 제1 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나,

e) 제1 ISVD는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는

f) 제1 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 조성물.

실시형태 9. 실시형태 5 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드는:

a) 서열번호 148의 아미노산 서열,

b) 서열번호 149의 아미노산 서열,

c) 서열번호 150의 아미노산 서열,

d) 서열번호 151의 아미노산 서열,

e) 서열번호 152의 아미노산 서열,

f) 서열번호 153의 아미노산 서열,

g) 서열번호 154의 아미노산 서열,

h) 서열번호 155의 아미노산 서열,

i) 서열번호 156의 아미노산 서열,

j) 서열번호 157의 아미노산 서열,

k) 서열번호 158의 아미노산 서열, 또는

l) 서열번호 159의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진, 폴리펩타이드.

실시형태 10. 실시형태 1 또는 5에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어지고, 여기서 상기 ISVD 각각은 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하고, 여기서 적어도 4개의 ISVD는 하나 이상의 펩타이드 링커를 통해 임의로 연결되며:

a) 제1 ISVD는

iii. 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;

b) 제2 ISVD는

vi. 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 서열번호 18과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;

c) 제3 ISVD는

vii. 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;

viii. 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및

ix. 서열번호 19의 아미노산 서열 또는 서열번호 19와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;

d) 제4 ISVD는

x. 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;

xi. 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및

xii. 서열번호 21의 아미노산 서열 또는 서열번호 21과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고,

실시형태 11. 실시형태 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제 및/또는 아쥬반트를 추가로 포함하고, 하나 이상의 추가의 약제학적으로 활성인 폴리펩타이드 및/또는 화합물을 선택적으로 포함하는 약제학적 조성물인, 조성물.

실시형태 12. 실시형태 10 또는 11에 있어서,

a) 상기 제1 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 17의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;

b) 상기 제2 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 18의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;

c) 상기 제3 ISVD는 서열번호 9의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 19의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;

d) 상기 제4 ISVD는 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 21의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 조성물.

실시형태 13. 실시형태 10 내지 12 중 어느 하나에 있어서,

a) 상기 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하고;

b) 상기 제2 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하고;

c) 상기 제3 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하고; 그리고

d) 상기 제4 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 6과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 조성물.

실시형태 14. 실시형태 10 내지 13 중 어느 하나에 있어서,

a) 상기 제1 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고;

b) 상기 제2 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고;

c) 상기 제3 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고; 그리고

d) 상기 제4 ISVD는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 조성물.

실시형태 15. 실시형태 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 임의로 하나 이상의 펩타이드 링커를 통해 연결된 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를 추가로 포함하고, 여기서 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 없는 상응하는 폴리펩타이드와 비교하여 증가된 반감기를 갖는 폴리펩타이드를 제공하는, 폴리펩타이드 또는 조성물.

실시형태 16. 실시형태 15에 있어서, 증가된 반감기를 갖는 폴리펩타이드를 제공하는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 폴리에틸렌 글리콜 분자, 혈청 단백질 또는 이의 단편들, 혈청 단백질에 결합할 수 있는 결합 단위, Fc 부분, 및 혈청 단백질에 결합할 수 있는 작은 단백질 또는 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된, 폴리펩타이드 또는 조성물.

실시형태 17. 실시형태 15 또는 16에 있어서, 증가된 반감기를 갖는 폴리펩타이드를 제공하는 상기 하나 이상의 다른 결합 단위가 혈청 알부민(예컨대 인간 혈청 알부민)에 결합할 수 있는 결합 단위 또는 혈청 면역글로불린(예컨대 IgG)으로 이루어진 군으로부터 선택된, 폴리펩타이드 또는 조성물.

실시형태 18. 실시형태 17에 있어서, 증가된 반감기를 갖는 폴리펩타이드를 제공하는 상기 결합 단위가 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있는 ISVD인, 폴리펩타이드 또는 조성물.

실시형태 19. 실시형태 18에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD는

i. 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 서열번호 10과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;

ii. 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및

iii. 서열번호 20의 아미노산 서열 또는 서열번호 20과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 조성물.

실시형태 20. 실시형태 18 또는 19에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD가 서열번호 10의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 15의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 20의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 조성물.

실시형태 21. 실시형태 18 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 상기 ISVD의 아미노산 서열이 서열번호 5와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 조성물.

실시형태 22. 실시형태 18 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 상기 ISVD가 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 조성물.

실시형태 23. 실시형태 10 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩타이드의 아미노산 서열이 서열번호 1과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 조성물.

실시형태 24. 실시형태 10 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩타이드가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진, 폴리펩타이드 또는 조성물.

실시형태 25. 실시형태 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 2형 염증성 질환과 같은 염증성 질환의 치료에 사용하기 위한, 폴리펩타이드 또는 조성물.

실시형태 26. 실시형태 25에 있어서, 상기 2형 염증성 질환이 천식 및 아토피 피부염으로부터 선택되는, 폴리펩타이드 또는 조성물.

실시형태 27. 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리펩타이드로서, 상기 ISVD는 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하고; 적어도 하나의 ISVD는:

서열번호 21의 아미노산 서열 또는 서열번호 21과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드.

실시형태 28. 실시형태 27에 있어서, 상기 적어도 하나의 ISVD는:

d) 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 21의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드.

실시형태 29. 실시형태 27 또는 28에 있어서, 적어도 하나의 ISVD의 아미노산 서열은:

a) 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성,

b) 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성,

c) 서열번호 4와 90% 동일성 초과의 서열 동일성, 또는

d) 서열번호 6과 90% 동일성 초과의 서열 동일성을 포함하는, 폴리펩타이드.

실시형태 30. 실시형태 27 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 ISVD는:

a) 서열번호 2의 아미노산 서열,

b) 서열번호 3의 아미노산 서열,

c) 서열번호 4의 아미노산 서열, 또는

d) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.

실시형태 31. 실시형태 1 또는 27에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 적어도 2개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어지고, 여기서 상기 ISVD 각각은 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하고, 여기서 적어도 2개의 ISVD는 하나 이상의 펩타이드 링커를 통해 임의로 연결되며:

a) 제1 및 제2 ISVD는

b) 제1 및 제2 ISVD는

c) 제1 ISVD는

제2 ISVD는

d) 제1 ISVD는

제2 ISVD는

vi. 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고,

e) 제1 ISVD는

제2 ISVD는

f) 제1 ISVD는

iii. 서열번호 19의 아미노산 서열 또는 서열번호 19와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고,

제2 ISVD는

여기서 ISVD의 순서는 상기 폴리펩타이드의 N-말단에서 C-말단까지 고려되는 서로에 대한 그들의 상대적인 위치를 나타내는, 폴리펩타이드.

실시형태 32. 실시형태 31에 있어서,

f) 제1 ISVD는 서열번호 9의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 19의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 21의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드.

실시형태 33. 실시형태 31 또는 32에 있어서,

f) 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 6과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하는, 폴리펩타이드.

실시형태 34. 실시형태 31 내지 33 중 어느 하나에 있어서,

f) 제1 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.

실시형태 35. 실시형태 31 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드는:

a) 서열번호 148의 아미노산 서열,

b) 서열번호 149의 아미노산 서열,

c) 서열번호 150의 아미노산 서열,

d) 서열번호 151의 아미노산 서열,

e) 서열번호 152의 아미노산 서열,

f) 서열번호 153의 아미노산 서열,

g) 서열번호 154의 아미노산 서열,

h) 서열번호 155의 아미노산 서열,

i) 서열번호 156의 아미노산 서열,

j) 서열번호 157의 아미노산 서열,

k) 서열번호 158의 아미노산 서열, 또는

l) 서열번호 159의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지는, 폴리펩타이드.

실시형태 36. 실시형태 27 또는 31에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어지고, 여기서 상기 ISVD 각각은 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하고, 여기서 적어도 4개의 ISVD는 하나 이상의 펩타이드 링커를 통해 임의로 연결되며:

a) 제1 ISVD는

b) 제2 ISVD는

c) 제3 ISVD는

d) 제4 ISVD는

실시형태 37. 실시형태 36에 있어서,

d) 상기 제4 ISVD는 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 21의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드.

실시형태 38. 실시형태 36 또는 37에 있어서,

d) 상기 제4 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 6과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하는, 폴리펩타이드.

실시형태 39. 실시형태 36 내지 38 중 어느 하나에 있어서,

a) 상기 제1 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고;

b) 상기 제2 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고;

d) 상기 제4 ISVD는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.

실시형태 40. 실시형태 27 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 임의로 하나 이상의 펩타이드 링커를 통해 연결된 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를 추가로 포함하고, 여기서 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 없는 상응하는 폴리펩타이드와 비교하여 증가된 반감기를 갖는 폴리펩타이드를 제공하는, 폴리펩타이드.

실시형태 41. 실시형태 40에 있어서, 증가된 반감기를 갖는 폴리펩타이드를 제공하는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 폴리에틸렌 글리콜 분자, 혈청 단백질 또는 이의 단편들, 혈청 단백질에 결합할 수 있는 결합 단위, Fc 부분, 및 혈청 단백질에 결합할 수 있는 작은 단백질 또는 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된, 폴리펩타이드.

실시형태 42. 실시형태 40 또는 41에 있어서, 증가된 반감기를 갖는 폴리펩타이드를 제공하는 상기 하나 이상의 다른 결합 단위가 혈청 알부민(예컨대 인간 혈청 알부민)에 결합할 수 있는 결합 단위 또는 혈청 면역글로불린(예컨대 IgG)으로 이루어진 군으로부터 선택된, 폴리펩타이드.

실시형태 43. 실시형태 42에 있어서, 증가된 반감기를 갖는 폴리펩타이드를 제공하는 상기 결합 단위가 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있는 ISVD인, 폴리펩타이드.

실시형태 44. 실시형태 43에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD는

iii. 서열번호 20의 아미노산 서열 또는 서열번호 20과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드.

실시형태 45. 실시형태 43 또는 44에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD가 서열번호 10의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 15의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 20의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드.

실시형태 46. 실시형태 43 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 상기 ISVD의 아미노산 서열이 서열번호 5와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하는, 폴리펩타이드.

실시형태 47. 실시형태 43 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 상기 ISVD가 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.

실시형태 48. 실시형태 36 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩타이드의 아미노산 서열이 서열번호 1과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하는, 폴리펩타이드.

실시형태 49. 실시형태 36 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩타이드가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진, 폴리펩타이드.

실시형태 50. 실시형태 27 내지 49 중 어느 하나에 따른 폴리펩타이드, 또는 실시형태 36 내지 49 중 어느 하나에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산.

실시형태 51. 실시형태 50에 따른 핵산을 포함하는 숙주 또는 숙주 세포.

실시형태 52. 실시형태 27 내지 49 중 어느 하나에 따른 폴리펩타이드, 또는 실시형태 36 내지 49 중 어느 하나에 따른 폴리펩타이드의 제조 방법으로서, 상기 방법은 적어도:

a) 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서, 또는 또 다른 적합한 발현 시스템에서, 실시형태 50에 따른 핵산을 발현하는 단계; 선택적으로 다음에:

b) 실시형태 27 내지 49 중 어느 하나에 따른 폴리펩타이드, 또는 실시형태 36 내지 49 중 어느 하나에 따른 폴리펩타이드를 단리 및/또는 정제하는 단계를 포함하는, 방법.

실시형태 53. 실시형태 27 내지 49 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 폴리펩타이드, 또는 실시형태 36 내지 49 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 폴리펩타이드, 또는 실시형태 50에 따른 핵산을 포함하는 조성물.

실시형태 54. 실시형태 53에 있어서, 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제 및/또는 아쥬반트를 추가로 포함하고, 하나 이상의 추가의 약제학적으로 활성인 폴리펩타이드 및/또는 화합물을 선택적으로 포함하는 약제학적 조성물인, 조성물.

실시형태 55. 2형 염증성 질환과 같은 염증성 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 실시형태 27 내지 49 중 어느 하나에 따른, 또는 실시형태 36 내지 49 중 어느 하나에 따른 폴리펩타이드, 또는 실시형태 53 또는 54 중 어느 하나에 따른 조성물의 약제학적으로 활성인 양을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.

실시형태 56. 실시형태 55에 있어서, 상기 2형 염증성 질환이 천식 및 아토피 피부염으로부터 선택되는, 방법.

실시형태 57. 2형 염증성 질환과 같은 염증성 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물의 제조에 있어서, 실시형태 27 내지 49 중 어느 하나에 따른, 또는 실시형태 36 내지 49 중 어느 하나에 따른 폴리펩타이드, 또는 실시형태 53 또는 54에 따른 조성물의 용도.

실시형태 58. 실시형태 57에 있어서, 상기 2형 염증성 질환이 천식 및 아토피 피부염으로부터 선택되는, 용도.

도 1: TSLP를 통해 캡처된 F027400161에 대한 IL13 및 HSA의 동시 결합을 보여주는 센서그램.
도 2: V_HH F027400161 및 참조 화합물 항-hIL-13 mAb1 및 항-hIL-13 mAb2에 의한 에오탁신 방출 분석에서 인간, 사이노 및 레서스 IL13의 억제.
도 3: F027400161 및 참조 화합물 항-hIL-13 mAb1 및 항-hIL-13 mAb2에 의한 SEAP 리포터 분석에서 인간 및 사이노 IL13의 억제.
도 4: F027400161 및 참조 화합물 항-hTSLP mAb1에 의한 인간 및 사이노 TSLP 유도 BaF3 증식의 억제. IRR00096은 음성 대조군 Nb이다.
도 5: 대조군 F027301186과 비교하여 F027400161, 163 및 164에 대한 96개의 인간 혈청 샘플에 존재하는 기존 항체들의 결합을 보여주는 박스 플롯.
도 6: 인간 DC에서 TSLP-유도 CCL17 반응에 대한 F-27400161(F027400161이라고도 함) 및 비교 항체 항-hTSLP 참조 mAb1의 용량-반응 억제 프로필. 강화된 인간 DC가 4 ng/mL의 TSLP로 처리되고, 8가지 농도의 ISVD 작제물 및 항-hTSLP 참조 mAb1과 함께 36시간 동안 인큐베이션되었다. 새로 수집된 상청액의 CCL17 농도는 ELISA로 측정되었다. IC₅₀ 값은 제약 조건 없이 Graphpad Prism 8.0에서 비선형 회귀(로그 억제제 대 반응 - 가변 기울기 4개 매개변수 최소 제곱 적합)에 의해 계산되었다. 데이터는 8개의 개별 실험에서 결합된 모든 8명의 공여자의 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 나타낸다.
도 7: 인간 PBMC에서 CCL17의 0.5 ng/mL IL-13 및 TSLP-유도 상승적 생산에 대한 F-27400161(F027400161이라고도 함) 및 비교 물질 항-hIL-13 참조 mAb1 및 항-hTSLP 참조 mAb1의 용량 억제 반응. 건강한 공여자 PBMC가 0.5 ng/mL의 재조합 IL-13+TSLP로 자극되고 10회 용량의 ISVD 작제물(Nb) 및 비교 물질과 함께 20시간 동안 인큐베이션되었다. 세포 배양 상청액의 CCL17 농도는 MSD V-Plex 키트로 측정되었다. IC₅₀ 값은 제약 조건 없이 Graphpad Prism 8.0에서 비선형 회귀(로그 억제제 대 반응 - 가변 기울기 4개 매개변수 최소 제곱 적합)에 의해 계산되었다. 데이터는 8개의 개별 실험에서 결합된 모든 공여자의 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 나타낸다.
도 8: 인간 PBMC에서 CCL17의 5 ng/mL IL-13 및 TSLP-유도 상승적 생산에 대한 F-27400161(F027400161이라고도 함) 및 비교 항체 항-hIL-13 참조 mAb1 및 항-hTSLP 참조 mAb1의 용량 억제 반응. 건강한 공여자 PBMC가 5 ng/mL의 재조합 IL-13+TSLP로 자극되고 10회 용량의 ISVD 작제물(Nb) 및 비교 항체와 함께 20시간 동안 인큐베이션되었다. 새로 수집된 상청액의 CCL17 농도는 MSD V-Plex 키트로 측정되었다. IC₅₀ 값은 제약 조건 없이 Graphpad Prism 8.0에서 비선형 회귀(로그 억제제 대 반응 - 가변 기울기 4개 매개변수 최소 제곱 적합)에 의해 계산되었다. 데이터는 8개의 개별 실험에서 결합된 모든 공여자의 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 나타낸다.
도 9: 삼중 배양 분석에서 인간 PBMC에 의한 알레르겐 Der P-유도 IL-5, CCL17 및 CCL26 생산에 대한 F-27400161(F027400161이라고도 함) 및 비교 항체 항-hIL-13 참조 mAb1 및 항-hTSLP 참조 mAb1의 억제 프로필. MRC5 섬유아세포 및 A549 상피 세포와 공동 배양된 정상 공여자 PBMC가 3 mg/mL의 Der P로 자극되고, 37℃ 세포-배양 인큐베이터에서 6일 동안 24-웰 플레이트에서 11.1 nM의 ISVD, 항-hIL-13 참조 mAb1, 또는 항-hTSLP 참조 mAb1과 함께 인큐베이션되었다. 새로 수집된 상청액의 IL-5, CCL17, 및 CCL26 농도는 Human Magnetic Luminex 분석에 의해 측정되었다. ISVD 폴리펩타이드 또는 항체를 받지 않은 비자극(최소) 및 자극(최대) 대조군 샘플에 대한 억제 백분율이 계산되었다. 모든 계산은 GraphPad Prism 8.0을 사용하여 수행되었다. 데이터는 3개의 독립적 실험에서 결합된 모든 공여자의 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 나타낸다.
도 10: F027400161은 NSG-SGM3 마우스의 혈장내 인간 TSLP의 검출가능한 수준을 유의하게 감소시켰다. 비히클 처리된 마우스(376.166 pg/ml)와 비교할 때, 인간 혈장 TSLP 수준은 0.1 mg/kg F027400161 용량(45.772 pg/ml) 및 10 mg/kg F027400161 용량(0.072 pg/ml)으로 감소되었으며, 이는 F027400161의 TSLP 아암이 인간화 NSG-SGM3 마우스의 혈장에서 인간 TSLP에 결합할 수 있음을 입증한다.
도 11: F027400161은 NSG-SGM3 마우스의 혈장내 인간 IL-13의 검출가능한 수준을 유의하게 감소시켰다. 비히클 처리된 마우스(274.052 pg/ml)와 비교할 때, 인간 IL-13 수준은 0.01 mg/kg F027400161 용량(201.286 pg/ml), 0.05 mg/kg F027400161 용량(22.028 pg/ml), 0.1 mg/kg F027400161 용량(40.740 pg/ml), 및 10 mg/kg F027400161 용량(1.777 pg/ml)으로 감소되었으며, 이는 F27400161의 IL-13 아암이 인간화 NSG-SGM3 마우스의 혈장에서 인간 IL-13에 결합할 수 있음을 입증한다.
도 12 및 도 13: F027400161은 hTSLP 및 hIL-4의 유체역학적 전달을 받은 NSG-SGM3 마우스의 폐에서 마우스 Retnla 및 Clca1 전사체 발현을 현저히 감소시켰다. NSG-SGM3 마우스에서 인간 TSLP 및 IL-4의 과발현은 전구체 CD34⁺에서 유래된 인간 면역 세포로부터 hIL-13의 생산을 유도한다. F027400161에 의한 인간 IL-13의 중화는 10 mg/Kg 용량에서 마우스 Retnla 및 Clca1 마커 유전자의 억제를 초래하였다.
도 14: N-말단에서 C-말단까지 1가 빌딩 블록/ISVDs 4B02, 4B06, 501A02, 529F10, 및 알부민 결합제 ALB23002를 보여주는 ISVD 작제물 F027400161의 개략도. 4B02 및 4B06은 35GS 링커를 통해 연결되지만, 나머지 빌딩 블록은 9GS 링커를 통해 연결된다.

본 기술은 아토피 피부염 및 천식과 같은 염증성 질환을 치료하기 위한 새로운 유형의 약물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

일부 실시형태에서, 본 기술은 시험관내 및/또는 생체내 단일특이적 항-IL-13 또는 항-TSLP 폴리펩타이드와 비교하여 2형 염증 반응을 조절하는 효율을 증가시키는 동시에 IL-13 및 TSLP를 표적화하는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 (예를 들어 미생물 숙주에서) 효율적으로 생산된다. 또한, 일부 실시형태에서, 이러한 폴리펩타이드는 치료될 대상체의 기존 항체(즉, 항체 작제물을 사용한 첫 번째 치료 전에 대상체에 존재하는 항체)에 대해 반응성이 제한된 것으로 보일 수 있다. 다른 실시형태에서, 이러한 폴리펩타이드는 연속 치료가 편리하게 이격될 수 있도록 충분히 긴 치료 대상체에서의 반감기를 나타낸다.

1. 본 기술의 폴리펩타이드

단일특이적-1가 폴리펩타이드

일 실시형태에서, 본 기술의 폴리펩타이드는 단일특이적이고, 1가이다.

용어 "단일특이적"은 표적 분자(들)의 하나의 (특이적) 유형에 대한 결합을 지칭한다. 따라서, 본 기술의 단일특이적 폴리펩타이드는 IL-13에 특이적으로 결합한다. 본 기술의 또 다른 단일특이적 폴리펩타이드는 TSLP에 특이적으로 결합한다.

용어 "1가"는 ISVD와 같은 분자를 (특이적으로) 표적으로 하는 단 하나의 결합 단위/빌딩 블록의 존재를 나타낸다.

따라서, 한 양태에서, 본 기술은 IL-13에 특이적으로 결합하는 하나의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어진 단일특이적-1가 폴리펩타이드를 제공하며, 이는 3개의 상보성 결정 영역(각각, CDR1 내지 CDR3)을 포함한다. ISVD는:

a) 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3; 또는

b) 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 서열번호 18과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는 ISVD로부터 선택될 수 있다.

본 기술의 본 양태의 일 실시형태에서, ISVD는 인간 IL-13에 특이적으로 결합한다.

추가 실시형태에서, IL-13에 특이적으로 결합하는 ISVD는:

a) 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 17의 아미노산 서열인 CDR3; 또는

b) 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 18의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는 ISVD로부터 선택될 수 있다.

본 기술의 본 양태의 추가 실시형태에서, IL-13에 특이적으로 결합하는 ISVD는:

a) 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성; 또는

b) 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하는 ISVD로부터 선택된다.

일 실시형태에서, IL-13에 특이적으로 결합하는 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열; 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 ISVD로부터 선택된다.

또 다른 양태에서, 본 기술은 TSLP에 특이적으로 결합하는 하나의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어진 단일특이적-1가 폴리펩타이드를 제공하며, 이는 3개의 상보성 결정 영역(각각, CDR1 내지 CDR3)을 포함한다. ISVD는:

a) 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 19의 아미노산 서열 또는 서열번호 19와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3; 또는

b) 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 21의 아미노산 서열 또는 서열번호 21과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는 ISVD로부터 선택될 수 있다.

본 기술의 본 양태의 일 실시형태에서, ISVD는 인간 TSLP에 특이적으로 결합한다.

추가 실시형태에서, TSLP에 특이적으로 결합하는 ISVD는:

a) 서열번호 9의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 19의 아미노산 서열인 CDR3; 또는

b) 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 21의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는 ISVD로부터 선택된다.

본 기술의 본 양태의 추가 실시형태에서, TSLP에 특이적으로 결합하는 ISVD는:

a) 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성; 또는

b) 서열번호 6과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하는 ISVD로부터 선택된다.

일 실시형태에서, TSLP에 특이적으로 결합하는 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열; 또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 ISVD로부터 선택된다.

단일특이적-다가 폴리펩타이드

또 다른 양태에서, 본 기술의 폴리펩타이드는 단일특이적이고, 적어도 2가이지만, 또한 예를 들어, 3가, 4가, 5가, 6가 등일 수 있다.

용어들 "2가", "3가", "4가", "5가", 또는 "6가"는 모두 용어 "다가"에 해당하며, ISVD와 같이 각각 2, 3, 4, 5 또는 6개의 결합 단위/빌딩 블록의 존재를 나타낸다.

따라서, 한 양태에서, 본 기술은 IL-13에 특이적으로 결합하는 2개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어진 단일특이적-2가 폴리펩타이드를 제공하며, 2개의 ISVD 각각은 3개의 상보성 결정 영역(각각, CDR1 내지 CDR3)을 포함하고, 여기서 2개의 ISVD는 하나 이상의 펩타이드 링커를 통해 선택적으로 연결되며, 여기서:

a) 제1 및 제2 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나;

b) 제1 및 제2 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 서열번호 18과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나;

c) 제1 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;

제2 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 서열번호 18과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나;

d) 제1 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 서열번호 18과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;

제2 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함한다.

본 기술의 본 양태의 일 실시형태에서, ISVD는 하나 이상의 펩타이드 링커를 통해 연결된다. 일 실시형태에서, 2개의 ISVD는 인간 IL13에 특이적으로 결합한다.

추가 실시형태에서, 단일특이적-2가 폴리펩타이드는 IL-13에 특이적으로 결합하는 2개의 ISVD를 포함하거나, 이로 이루어지며:

a) 제1 및 제2 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 17의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나;

b) 제1 및 제2 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 18의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나;

c) 제1 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 17의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 18의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나; 또는

d) 제1 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 18의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 17의 아미노산 서열인 CDR3을 포함한다.

본 기술의 본 양태의 추가 실시형태에서, 단일특이적-2가 폴리펩타이드는 IL-13에 특이적으로 결합하는 2개의 ISVD를 포함하거나, 이로 이루어지며:

a) 제1 및 제2 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하거나;

b) 제1 및 제2 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하거나;

c) 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하거나;

d) 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성을 포함한다.

일 실시형태에서, 단일특이적-2가 폴리펩타이드는 IL-13에 특이적으로 결합하는 2개의 ISVD를 포함하거나, 이로 이루어지며:

a) 제1 및 제2 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나;

b) 제1 및 제2 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나;

c) 제1 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나;

d) 제1 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 기술은 TSLP에 특이적으로 결합하는 2개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어진 단일특이적-2가 폴리펩타이드를 제공하며, 2개의 ISVD 각각은 3개의 상보성 결정 영역(각각, CDR1 내지 CDR3)을 포함하고, 여기서 2개의 ISVD는 하나 이상의 펩타이드 링커를 통해 선택적으로 연결되며, 여기서:

a) 제1 ISVD는 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 21의 아미노산 서열 또는 서열번호 21과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;

제2 ISVD는 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 19의 아미노산 서열 또는 서열번호 19와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,

b) 제1 ISVD는 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 19의 아미노산 서열 또는 서열번호 19와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고,

제2 ISVD는 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 21의 아미노산 서열 또는 서열번호 21과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함한다.

본 기술의 본 양태의 일 실시형태에서, ISVD는 하나 이상의 펩타이드 링커를 통해 연결된다. 일 실시형태에서, 2개의 ISVD는 인간 TSLP에 특이적으로 결합한다.

추가 실시형태에서, 단일특이적-2가 폴리펩타이드는 TSLP에 특이적으로 결합하는 2개의 ISVD를 포함하거나, 이로 이루어지며:

a) 제1 ISVD는 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 21의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 9의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 19의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,

b) 제1 ISVD는 서열번호 9의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 19의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 21의 아미노산 서열인 CDR3을 포함한다.

본 기술의 본 양태의 추가 실시형태에서, 단일특이적-2가 폴리펩타이드는 TSLP에 특이적으로 결합하는 2개의 ISVD를 포함하거나, 이로 이루어지며:

a) 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 6과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하거나,

b) 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 6과 90% 초과의 서열 동일성을 포함한다.

일 실시형태에서, 단일특이적-2가 폴리펩타이드는 TSLP에 특이적으로 결합하는 2개의 ISVD를 포함하거나, 이로 이루어지며:

a) 제1 ISVD는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나;

b) 제1 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 ISVD는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함한다.

이와 관련하여, 용어들 "제1 ISVD" 및 "제2 ISVD"는 서로에 대해 IL-13/TSLP에 결합하는 특이적으로 인용된 ISVD의 상대적 위치만을 나타내며, 여기서 넘버링은 본 기술의 폴리펩타이드의 N-말단으로부터 시작된다. 따라서, "제1 ISVD"는 "제2 ISVD"보다 N-말단에 더 가깝다. 따라서, "제2 ISVD"는 "제1 ISVD"보다 C-말단에 더 가깝다. 따라서, 넘버링은 절대적이지 않으며, 두 ISVD의 상대적인 위치만을 나타내기 때문에 IL-13 및 TSLP에 각각 결합하는 ISVD와 같은 추가 결합 단위/빌딩 블록이 폴리펩타이드에 존재할 수 있는 가능성을 배제하지 않는다. 또한, ISVD와 같은 다른 결합 단위/빌딩 블록이 그 사이에 배치될 가능성을 배제하지 않는다. 예를 들어, 하기에 추가로 기재된 바와 같이(특히, "다중특이성-다가 폴리펩타이드" 및 5.4 "(생체내) 반감기 연장" 섹션 참조), 폴리펩타이드는 심지어 "제1 ISVD"와 "제2 ISVD" 사이에 위치할 수 있는 인간 혈청 알부민에 결합하는 또 다른 ISVD를 추가로 포함할 수 있다(이러한 작제물은 다음 섹션에 설명된 대로 다중특이성으로 지칭됨).

일 실시형태에서, 단일특이적-다가 폴리펩타이드, 특히 상기 기재된 단일특이적-2가 폴리펩타이드의 (적어도 2개의) ISVD는 펩타이드 링커를 통해 연결된다. 둘 이상의 (폴리)펩타이드를 연결하기 위한 펩타이드 링커의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 단일특이적-다가 폴리펩타이드, 특히 상기 기재된 단일특이적-2가 폴리펩타이드와 함께 사용될 수 있는 예시적인 펩타이드 링커는 표 A-5에 제시되어 있다. 펩타이드 링커의 자주 사용되는 부류 중 하나는 "Gly-Ser" 또는 "GS" 링커로 알려져 있다. 이들은 본질적으로 글리신(G) 및 세린(S) 잔기로 구성되고, 일반적으로 GGGGS(서열번호 73) 모티프와 같은 펩타이드 모티프의 하나 이상의 반복부를 포함하는 링커이다(예를 들어, 식 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n(식 중, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 그 이상일 수 있음)을 포함함). 이러한 GS 링커의 일부 자주 사용되는 예는 9GS 링커(GGGGSGGGS, 서열번호 76) 15GS 링커(n=3) 및 35GS 링커(n=7)이다. 예를 들어 문헌[Chen et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 2013 Oct 15; 65(10): 1357-1369]; 및 [Klein et al., Protein Eng. Des. Sel. (2014) 27 (10): 325-330]을 참고한다. 본 기술의 일 실시형태에서, 단일특이적-다가 폴리펩타이드, 특히 본 기술의 단일특이적-2가 폴리펩타이드의 ISVD는 표 A-5에 제시된 링커를 통해 연결된다. 일 실시형태에서, (적어도) 2개의 ISVD는 35GS 링커(들)을 통해 연결된다.

따라서, 일 실시형태에서, 단일특이적-2가 폴리펩타이드는:

a) 서열번호 148의 아미노산 서열,

b) 서열번호 149의 아미노산 서열,

c) 서열번호 150의 아미노산 서열,

d) 서열번호 151의 아미노산 서열,

e) 서열번호 152의 아미노산 서열,

f) 서열번호 153의 아미노산 서열,

g) 서열번호 154의 아미노산 서열,

h) 서열번호 155의 아미노산 서열,

i) 서열번호 156의 아미노산 서열,

j) 서열번호 157의 아미노산 서열,

k) 서열번호 158의 아미노산 서열, 또는

l) 서열번호 159의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다.

다중특이적-다가 폴리펩타이드

추가 양태에서, 본 기술의 폴리펩타이드는 적어도 이중특이적이지만, 예를 들어 삼중특이적, 사중특이적, 오중특이적 등일 수 있다. 더욱이, 폴리펩타이드는 적어도 2가이지만, 예를 들어 3가, 4가, 5가, 6가 등일 수도 있다.

용어들 "이중특이적", "삼중특이적", "사중특이적", "오중특이적", 등은 모두 용어 "다중특이적"에 해당하며, 각각 2, 3, 4, 5개 등의 다른 표적 분자들에 대한 결합을 나타낸다.

용어들 "2가", "3가", "4가", "5가", "6가" 등은 모두 용어 "다가"에 해당하며, ISVD와 같이 각각 2, 3, 4, 5, 6개 등의 결합 단위/빌딩 블록의 존재를 나타낸다.

예를 들어, 폴리펩타이드는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드와 같은 이중특이적-4가일 수 있으며, 여기서 적어도 2개의 ISVD는 IL-13에 특이적으로 결합하고 적어도 2개의 ISVD는 TSLP에 특이적으로 결합한다. 일 실시형태에서, IL-13 및 TSLP는 인간 IL-13 및 인간 TSLP이다. 또 다른 예에서, 폴리펩타이드는 5개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드와 같은 삼중특이적-5가일 수 있으며, 여기서 2개의 ISVD는 인간 IL-13에 특이적으로 결합하고, 2개의 ISVD는 인간 TSLP에 특이적으로 결합하고, 1개의 ISVD는 인간 혈청 알부민에 결합한다. 그러한 폴리펩타이드는 예를 들어 2개의 ISVD가 인간 IL-13 또는 인간 TSLP 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 경우 동시에 2중 파라토프일 수 있다. 용어 "2중 파라토프"는 동일한 표적 분자의 2개의 상이한 부분(예를 들어, 에피토프)에 대한 결합을 지칭한다. 일 실시형태에서, 본 기술의 삼중특이적-5가 폴리펩타이드는 예를 들어 인간 IL-13에 특이적으로 결합하는 2개의 ISVD, 인간 TSLP에 특이적으로 결합하는 2개의 ISVD, 인간 혈청 알부민에 결합하는 1개의 ISVD를 포함하는 ISVD 작제물 F027400161이며, 이는 IL-13 및 TSLP에 대한 결합 모두에 대해 2중 파라토프이다.

일 실시형태에서, 다중특이적-다가 폴리펩타이드는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어지고, 여기서 상기 ISVD 각각은 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하고, 여기서 적어도 4개의 ISVD는 하나 이상의 펩타이드 링커를 통해 임의로 연결되며:

a) IL-13에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;

b) IL-13에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 서열번호 18과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;

c) TSLP에 특이적으로 결합하는 제3 ISVD는 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 19의 아미노산 서열 또는 서열번호 19와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;

d) TSLP에 특이적으로 결합하는 제4 ISVD는 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2, 및 서열번호 21의 아미노산 서열 또는 서열번호 21과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함한다.

일 실시형태에서, 상기 폴리펩타이드에 의해 결합된 IL-13 및 TSLP는 각각 인간 IL-13 및 인간 TSLP이다.

다중특이적-다가 폴리펩타이드의 추가 실시형태에서:

d) 상기 제4 ISVD는 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 21의 아미노산 서열인 CDR3을 포함한다.

다중특이적-다가 폴리펩타이드의 추가 양태에서:

c) 상기 제3 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하고;

d) 상기 제4 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 6과 90% 초과의 서열 동일성을 포함한다.

다중특이적-다가 폴리펩타이드의 일 실시형태에서:

a) 제1 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고;

b) 제2 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고;

c) 제3 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고;

d) 제4 ISVD는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함한다.

이와 관련하여, 용어들 "제1 ISVD", "제2 ISVD", "제3 ISVD” 등은 서로에 대해 ISVD의 상대적 위치만을 나타내며, 여기서 넘버링은 본 기술의 폴리펩타이드의 N-말단으로부터 시작된다. 따라서, "제1 ISVD"는 "제2 ISVD"보다 N-말단에 더 가까운 반면, "제2 ISVD"는 "제3 ISVD"보다 N-말단에 더 가깝다. 따라서, ISVD 배열은 C-말단에서 고려할 때 반대이다. 넘버링은 절대적이지 않고 적어도 4개의 ISVD의 상대적인 위치만을 나타내기 때문에, IL-13 또는 TSLP에 결합하는 추가 ISVD 또는 또 다른 표적에 결합하는 ISVD와 같은 다른 결합 단위/빌딩 블록이 폴리펩타이드에 존재할 수 있음을 배제하지 않는다. 또한, ISVD와 같은 다른 결합 단위/빌딩 블록이 그 사이에 배치될 가능성을 배제하지 않는다. 예를 들어, 하기에 추가로 기술된 바와 같이(특히, 하기 섹션 5.4 "(생체내) 반감기 연장" 참조), 폴리펩타이드는 예를 들어 "제3 ISVD" 및 "제4 ISVD” 사이에 심지어 위치될 수 있는 인간 혈청 알부민에 결합하는 또 다른 ISVD를 추가로 포함할 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 기술은 상기 단일특이적-1가 폴리펩타이드(섹션 5.1; "단일특이적-1가 폴리펩타이드")에 대해 상세히 기재된 바와 같이 IL-13 또는 TSLP에 특이적으로 결합하는 ISVD 및 아래에 상세히 기재된 바와 같이(섹션 5.4; "(생체내) 반감기 연장") 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD를 포함하는 이중특이적-2가 폴리펩타이드를 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 기술은 상기 단일특이적-2가 폴리펩타이드(섹션 5.1; "단일특이적-2가 폴리펩타이드") 및 아래에 상세히 기재된 바와 같이(섹션 5.4; "(생체내) 반감기 연장") 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD를 포함하는 이중특이적-3가 폴리펩타이드를 제공한다.

상기 다중특이적-다가 폴리펩타이드의 성분, 예컨대 ISVD는 펩타이드 링커와 같은 하나 이상의 적합한 링커에 의해 서로 연결될 수 있다.

둘 이상의 (폴리)펩타이드를 연결하기 위한 링커의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 예시적인 펩타이드 링커는 표 A-5에 제시되어 있다. 펩타이드 링커의 자주 사용되는 부류 중 하나는 "Gly-Ser" 또는 "GS" 링커로 알려져 있다. 이들은 본질적으로 글리신(G) 및 세린(S) 잔기로 구성되고, 일반적으로 GGGGS(서열번호 73) 모티프와 같은 펩타이드 모티프의 하나 이상의 반복부를 포함하는 링커이다(예를 들어, 식 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n(식 중, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 그 이상일 수 있음)을 포함함). 이러한 GS 링커의 일부 자주 사용되는 예는 9GS 링커(GGGGSGGGS, 서열번호 76) 15GS 링커(n=3)(서열번호 78) 및 35GS 링커(n=7)(서열번호 83)이다. 예를 들어 문헌[Chen et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 2013 Oct 15; 65(10): 1357-1369]; 및 [Klein et al., Protein Eng. Des. Sel. (2014) 27 (10): 325-330]을 참고한다. 본 기술의 폴리펩타이드(들)에서, 9GS(서열번호 76) 및 35GS(서열번호 83) 링커는 폴리펩타이드의 구성요소를 서로 연결하기 위해 사용된다.

본 기술의 다중특이적-다가 폴리펩타이드의 한 양태에서, 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드는 IL-13에 특이적으로 결합하는 적어도 2개의 ISVD 및 TSLP에 특이적으로 결합하는 적어도 2개의 ISVD를 포함한다. 본 기술의 이러한 양태에서, IL-13에 결합하는 적어도 2개의 ISVD는 35GS 링커를 통해 연결되는 반면, TSLP에 특이적으로 결합하는 적어도 2개의 ISVD는 9GS 링커를 통해 연결된다. 일 실시형태에서, TSLP에 특이적으로 결합하는 적어도 2개의 ISVD는 알부민(9GS-Alb-9GS)에 대한 ISVD 결합에 의해 분리된다(섹션 5.4 "(생체내) 반감기 연장"에 기재된 바와 같음). 본 발명자들은 놀랍게도 이러한 구성이 폴리펩타이드의 생산 수율을 증가시킬 수 있음을 발견하였다.

따라서, 일 실시형태에서, 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 N-말단에서 시작하는 순서로 하기를 포함하거나 이로 이루어진다: IL-13에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD, IL-13에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD, TSLP에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD, 본원에 정의된 증가된 반감기를 갖는 폴리펩타이드를 제공하는 선택적 결합 단위, 및 TSLP에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD. 일 실시형태에서, 증가된 반감기를 갖는 폴리펩타이드를 제공하는 결합 단위는 ISVD이다.

추가 실시형태에서, 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 N-말단에서 시작하는 순서로 하기를 포함하거나 이로 이루어진다: IL-13에 특이적으로 결합하는 ISVD, 링커, IL-13에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD, 링커, TSLP에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD, 링커, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD, 링커, 및 TSLP에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD. 한 특정 실시형태에서, IL-13에 결합하는 2개의 ISVD들 사이의 링커는 35GS 링커인 반면, 다른 링커들은 9GS 링커이다.

폴리펩타이드의 이러한 구성은 증가된 생산 수율, 충분한 용해도 및 생물물리학적 안정성과 같은 우수한 CMC 특성, 2형 면역 반응의 조절에 관한 강력한 효능 및 기존 항체에 대한 낮은 결합을 제공할 수 있다.

일 실시형태에서, 본 기술의 다중특이적-다가 폴리펩타이드는 인간 혈청내 기존 항체에 의한 감소된 결합을 나타낸다. 이를 위해, 일 실시형태에서, 폴리펩타이드는 적어도 하나의 ISVD에서 아미노산 위치 11에 발린(V) 및 아미노산 위치 89(Kabat 넘버링에 따름)에 류신(L)을 포함한다. 일 실시형태에서, 폴리펩타이드는 각각의 ISVD에서 아미노산 위치 11에 발린(V) 및 아미노산 위치 89(Kabat 넘버링에 따름)에 류신(L)을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 폴리펩타이드는 C-말단 ISVD의 C-말단에서 단일 알라닌(A) 연장과 같은, 1 내지 5개(자연 발생) 아미노산의 연장을 포함한다. ISVD의 C-말단은 일반적으로 VTVSS(서열번호 138)이다. 또 다른 실시형태에서, 폴리펩타이드는 적어도 하나의 ISVD에서의 위치 100(Kabat 넘버링에 따름)에 리신(K) 또는 글루타민(Q)을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, ISVD는 적어도 하나의 ISVD에서의 위치 112(Kabat 넘버링에 따름)에 리신(K) 또는 글루타민(Q)을 포함한다. 이들 실시형태에서, ISVD의 C-말단은 VKVSS(서열번호 139), VQVSS(서열번호 140), VTVKS(서열번호 166), VTVQS(서열번호 167), VKVKS(서열번호 168), VKVQS(서열번호 169), VQVKS(서열번호 170), 또는 VQVQS(서열번호 171)이고, 이에 따라, 단일 알라닌 첨가후, 폴리펩타이드의 C-말단은 예를 들어 서열 VTVSSA(서열번호 141), VKVSSA(서열번호 142), VQVSSA(서열번호 143), VTVKSA(서열번호 172), VTVQSA(서열번호 173), VKVKSA(서열번호 174), VKVQSA(서열번호 175), VQVKSA(서열번호 176), 또는 VQVQSA(서열번호 177)를 포함한다. 일 실시형태에서, C-말단은 VTVSSA(서열번호 141)를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 폴리펩타이드는 각각의 ISVD에서 아미노산 위치 11에 발린(V) 및 아미노산 위치 89(Kabat 넘버링에 따름)에 류신(L), 선택적으로 적어도 하나의 ISVD에서 위치 110(Kabat 넘버링에 따름)에 리신(K) 또는 글루타민(Q)을 포함하며, (폴리펩타이드의 C-말단이 예를 들어, 서열 VTVSSA(서열번호 141), VKVSSA(서열번호 142) 또는 VQVSSA(서열번호 143), 예컨대 VTVSSA(서열번호 141)를 갖도록) C-말단 ISVD의 C-말단에 1 내지 5개의 (자연 발생) 아미노산의 연장, 예컨대 단일 알라닌(A) 연장을 포함한다. 이와 관련한 추가 정보는 예를 들어 WO2012/175741 및 WO2015/173325를 참조한다.

일 실시형태에서, 본 기술의 다중특이적-다가 폴리펩타이드는 서열번호 1과 90% 초과, 예컨대 95% 초과 또는 99% 초과의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며, 여기서 5개의 ISVD의 CDR은 각각 아래에 섹션 "5.2 면역글로불린 단일 가변 도메인" 및 "5.4 (생체내) 반감기 연장"에 제시된 항목 A 내지 E (또는 Kabat 정의를 사용하는 경우, A' 내지 E’)에 정의된 바와 같으며, 여기서, 특히:

· IL-13에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 17의 아미노산 서열인 CDR3을 가지고;

· IL-13에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 18의 아미노산 서열인 CDR3을 가지고;

· TSLP에 특이적으로 결합하는 제3 ISVD는 서열번호 9의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 19의 아미노산 서열인 CDR3을 가지고;

· TSLP에 특이적으로 결합하는 제4 ISVD는 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 21의 아미노산 서열인 CDR3을 가지고;

· 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD는 서열번호 10의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 15의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 20의 아미노산 서열인 CDR3을 가지고,

또는 대안적으로 Kabat 정의를 사용하는 경우:

· IL-13에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD는 서열번호 37의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 42의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 17의 아미노산 서열인 CDR3을 가지고;

· IL-13에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 38의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 43의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 18의 아미노산 서열인 CDR3을 가지고;

· TSLP에 특이적으로 결합하는 제3 ISVD는 서열번호 39의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 44의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 19의 아미노산 서열인 CDR3을 가지고;

· TSLP에 특이적으로 결합하는 제4 ISVD는 서열번호 41의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 46의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 21의 아미노산 서열인 CDR3을 가지고;

· 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD는 서열번호 40의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 45의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 20의 아미노산 서열인 CDR3을 갖는다.

또 다른 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진다.

일 실시형태에서, 본 기술의 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드와 비교하여 인간 IL-13 및 인간 TSLP에 대해 적어도 절반의 결합 친화도, 또는 적어도 동일한 결합 친화도를 가지며, 여기서 결합 친화도는 표면 플라스몬 공명(SPR)과 같은 동일한 방법을 사용하여 측정된다.

2. 면역글로불린 단일 가변 도메인

"단일 가변 도메인"과 상호 교환적으로 사용되는 용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인"(ISVD)은 항원 결합 부위가 단일 면역글로불린 도메인에 존재하거나 이에 의해 형성되는 면역글로불린 분자를 정의한다. 이것은 ISVD를 2개의 면역글로불린 도메인, 특히 2개의 가변 도메인이 상호 작용하여 항원 결합 부위를 형성하는 "통상적인" 면역글로불린(예를 들어, 단일클론 항체) 또는 이의 단편(예컨대 Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, di-scFv)과 구별한다. 전형적으로, 통상적인 면역글로불린에서, 중쇄 가변 도메인(V_H)과 경쇄 가변 도메인(V_L)은 상호 작용하여 항원 결합 부위를 형성한다. 이 경우, V_H와 V_L 모두의 상보성 결정 영역(CDR)은 항원 결합 부위에 기여할 것이며, 즉, 총 6개의 CDR이 항원 결합 부위 형성에 관여할 것이다.

상기 정의에 비추어 볼 때, 통상적인 4-쇄 항체(예컨대 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 분자; 당업계에 공지됨) 또는 Fab 단편, F(ab')₂ 단편, 이황화 결합 Fv 또는 scFv 단편과 같은 Fv 단편, 또는 이러한 통상적인 4-쇄 항체로부터 유래된 디아바디(모두 당업계에 공지됨)의 항원-결합 도메인은 일반적으로 다음과 같이 ISVD로 간주되지 않는데, 이러한 경우에, 항원의 각 에피토프에 대한 결합은 일반적으로 하나의 (단일) 면역글로불린 도메인에 의해 발생하지 않고 경쇄 및 중쇄 가변 도메인과 같은 한 쌍의 (연관) 면역글로불린 도메인, 즉, 면역글로불린의 V_H-V_L 쌍에 의해 발생하여, 각 항원의 에피토프에 공동으로 결합하기 때문이다.

대조적으로, ISVD는 추가적인 면역글로불린 가변 도메인과 쌍을 이루지 않으면서 항원의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. ISVD의 결합 부위는 단일 V_H, 단일 V_HH 또는 단일 V_L 도메인에 의해 형성된다.

이와 같이, 단일 항원 결합 단위를 형성할 수 있는 한, 단일 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인 서열(예를 들어, V_L-서열) 또는 이의 적합한 단편; 또는 중쇄 가변 도메인 서열(예를 들어, V_H-서열 또는 V_HH 서열) 또는 이의 적합한 단편일 수 있다(즉, 기능적 항원 결합 단위를 형성하기 위해 단일 항원 결합 도메인이 다른 가변 도메인과 상호작용할 필요가 없도록, 본질적으로 단일 가변 도메인으로 이루어진 기능적 항원 결합 단위).

ISVD는 예를 들어 낙타화 V_H 또는 인간화 V_HH를 포함하는 V_H, V_HH와 같은 중쇄 ISVD일 수 있다. 일 실시형태에서, 이는 낙타화 V_H 또는 인간화 V_HH를 포함하는 V_HH이다. 중쇄 ISVD는 종래의 4쇄 항체로부터, 또는 중쇄 항체로부터 유래될 수 있다.

예를 들어, ISVD는 단일 도메인 항체(또는 단일 도메인 항체로 사용하기에 적합한 아미노산 서열), "dAb" 또는 dAb(또는 dAb로 사용하기에 적합한 아미노산 서열) 또는 Nanobody®(본원에서 정의된 바와 같으며 V_HH를 포함하지만, 이에 제한되지 않음); 기타 단일 가변 도메인, 또는 이의 임의의 것의 임의의 적합한 단편일 수 있다.

특히, ISVD는 Nanobody®(예컨대, 인간화 V_HH 또는 낙타화 V_H를 포함하는 V_HH) 또는 이의 적합한 단편일 수 있다. 나노바디(Nanobody^®, Nanobodies^®) 및 나노클론(Nanoclone^®)은 Ablynx N.V.의 등록상표이다.

V_HH, V_HH 항체 단편, 및 V_HH 항체로도 알려져 있는 "V_HH 도메인"은 원래 "중쇄 항체"의 항원 결합 면역글로불린 가변 도메인으로 기재되어 있다(즉, "경쇄 없는 항체"; 문헌[Hamers-Casterman et al. Nature 363: 446-448, 1993]). 용어 "V_HH 도메인"은 이들 가변 도메인을 통상적인 4-쇄 항체에 존재하는 중쇄 가변 도메인(본원에서 "V_H 도메인"으로 지칭됨) 및 통상적인 4-쇄 항체에 존재하는 경쇄 가변 도메인(본원에서 "V_L 도메인"으로 지칭됨)과 구별하기 위해 선택되었다. V_HH에 대한 추가 설명은, Muyldermans의 리뷰 기사를 참조한다(Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001).

전형적으로, 면역글로불린의 생성은 실험 동물의 면역화, 하이브리도마를 생성하기 위한 면역글로불린 생성 세포의 융합 및 원하는 특이성을 위한 스크리닝을 포함한다. 대안적으로, 면역글로불린은 나이브 또는 합성 라이브러리의 스크리닝에 의해, 예를 들어 파지 디스플레이에 의해 생성될 수 있다.

Nanobodies®와 같은 면역글로불린 서열의 생성은 다양한 공보들에 기재되어 있으며, 그중에서도 WO 94/04678, 문헌[Hamers-Casterman et al. 1993] 및 문헌[Muyldermans et al. 2001]이 예시될 수 있다. 이들 방법에서, 낙타과는 표적 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 표적 항원으로 면역화된다. 상기 면역화로부터 수득된 나노바디의 레퍼토리는 표적 항원에 결합하는 나노바디에 대해 추가로 스크리닝된다.

이러한 경우에, 항체의 생성은 면역화 및/또는 스크리닝을 위해 정제된 항원을 필요로 한다. 항원은 천연 공급원에서, 또는 재조합 생산 과정에서 정제될 수 있다.

면역글로불린 서열에 대한 면역화 및/또는 스크리닝은 이러한 항원의 펩타이드 단편을 사용하여 수행될 수 있다.

본 기술은 마우스, 래트, 토끼, 당나귀, 인간 및 낙타과 면역글로불린 서열을 비롯한 상이한 기원의 면역글로불린 서열을 사용할 수 있다. 본 기술은 또한 완전한 인간, 인간화 또는 키메라 서열을 포함한다. 예를 들어, 본 기술은 낙타과 면역글로불린 서열 및 인간화 낙타과 면역글로불린 서열, 또는 낙타화 도메인 항체, 예를 들어, Ward 등에 기재된 낙타화 dAb를 포함한다(예를 들어 WO 94/04678 및 문헌[Davies and Riechmann (1994 and 1996)] 참조). 더욱이, 본 기술은 또한 예를 들어, 다가 및/또는 다중특이적 작제물을 형성하는 융합된 면역글로불린 서열(하나 이상의 V_HH 도메인을 함유하는 다가 및 다중특이적 폴리펩타이드 및 그의 제조의 경우, 문헌[Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, 10. 7346-7350, 2001] 뿐만 아니라 예를 들어 WO 96/34103 및 WO 99/23221을 참조), 및 본 기술의 면역글로불린 서열로부터 유래될 수 있는 태그 또는 다른 기능적 모이어티, 예를 들어, 독소, 표지, 방사성화학물질 등을 포함하는 면역글로불린 서열을 사용한다.

"인간화 V_HH"는 자연 발생 V_HH 도메인의 아미노산 서열에 상응하지만, 예를 들어 상기 자연 발생 V_HH 서열의 아미노산 서열내에서 (및 특히 프레임워크 서열내에서) 하나 이상의 아미노산 잔기를 인간으로부터의 종래의 4쇄 항체로부터의 V_H 도메인의 상응하는 위치(들)에서 발생하는 아미노산 잔기 중 하나 이상으로 대체함으로써 "인간화"된, 아미노산 서열을 포함한다(예를 들어, 상기 지시됨). 이는 예를 들어 본원의 추가 설명 및 선행 기술(예를 들어, WO 2008/020079)에 기초하여 당업자에게 명백할 그 자체로 공지된 방식으로 수행될 수 있다. 다시 말하지만, 이러한 인간화 V_HH는 그 자체로 공지된 임의의 적합한 방식으로 수득될 수 있고, 따라서 자연 발생 VHH 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 출발 물질로서 사용하여 수득된 폴리펩타이드에 엄격하게 제한되지 않는다는 점에 유의해야 한다.

"낙타화 V_H"는 자연 발생 V_H 도메인의 아미노산 서열에 상응하지만, 예를 들어 종래의 4쇄 항체로부터의 자연 발생 V_H 도메인의 아미노산 서열내에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 중쇄 항체의 V_HH 도메인의 상응하는 위치(들)에서 발생하는 아미노산 잔기 중 하나 이상으로 대체함으로써 “낙타화"된, 아미노산 서열을 포함한다. 이는 예를 들어 본원의 추가 설명 및 선행 기술(예를 들어, WO 2008/020079)에 기초하여 당업자에게 명백할 그 자체로 공지된 방식으로 수행될 수 있다. 이러한 "낙타화" 치환은 일반적으로 V_H-V_L 계면에서 형성하고/하거나 존재하는 아미노산 위치에, 및/또는 본원에 정의된 바와 같은 소위 Camelidae 홀마크(hallmark) 잔기에 삽입된다(예를 들어 WO 94/04678 및 Davies and Riechmann(1994 및 1996) 참조, 상기). 일 실시형태에서, 낙타화된 V_H를 생성 또는 설계하기 위한 출발 물질 또는 출발점으로 사용되는 V_H 서열은 포유동물로부터의 V_H 서열, 또는 V_H3 서열과 같은 인간의 V_H 서열이다. 그러나, 이러한 낙타화 V_H는 그 자체로 공지된 임의의 적합한 방식으로 수득될 수 있고, 따라서 자연 발생 V_H 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 출발 물질로서 사용하여 수득된 폴리펩타이드에 엄격하게 제한되지 않는다는 점에 유의해야 한다.

ISVD 서열의 구조는 당업계 및 본원에서, 각각 "프레임워크 영역 1"("FR1"); "프레임워크 영역 2"("FR2"); "프레임워크 영역 3"("FR3"); 및 "프레임워크 영역 4"("FR4")로 지칭되는 4개의 프레임워크 영역("FR")을 포함하는 것으로 고려될 수 있으며; 프레임워크 영역은 3개의 상보성 결정 영역("CDR")에 의해 중단되며, 이들은 당업계 및 본원에서 각각 "상보성 결정 영역 1"("CDR1"); "상보성 결정 영역 2"("CDR2"); 및 "상보성 결정 영역 3"("CDR3")으로 지칭된다.

WO 08/020079의 58페이지 및 59페이지의 단락 q)에 추가로 기재된 바와 같이, ISVD의 아미노산 잔기는 Riechmann and Muyldermans, 2000의 논문에서 낙타과의 V_HH 도메인에 적용되는 바와 같이, Kabat et al.이 제공한 V_H 도메인에 대한 일반 넘버링에 따라 넘버링될 수 있다 ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91)(문헌[J. Immunol. Methods 240 (1-2): 185-195]; 예를 들어 본 공보의 도 2 참조). V_H 도메인 및 V_HH 도메인에 대해 당업계에 잘 알려진 바와 같이 각각의 CDR에 있는 아미노산 잔기의 총 수는 다양할 수 있으며, Kabat 넘버링에 의해 표시된 아미노산 잔기의 총 수와 일치하지 않을 수 있다(즉, Kabat 넘버링에 따른 하나 이상의 위치가 실제 서열에서 점유되지 않을 수 있거나, 실제 서열이 Kabat 넘버링에 의해 허용되는 수보다 더 많은 아미노산 잔기를 포함할 수 있음). 이것은 일반적으로 Kabat에 따른 넘버링이 실제 서열에서 아미노산 잔기의 실제 넘버링과 일치하거나 일치하지 않을 수 있음을 의미한다. V_H 도메인 및 V_HH 도메인에서 아미노산 잔기의 총 수는 일반적으로 110 내지 120, 종종 112 내지 115의 범위일 것이다. 그러나 더 작고 더 긴 서열이 또한 본 명세서에 기재된 목적에 적합할 수 있음을 주목해야 한다.

본 출원에서, 달리 명시되지 않는 한, CDR 서열은 Kontermann 및 D

bel에 기재된 AbM 정의에 따라 결정되었다(문헌[Eds. 2010, Antibody Engineering, vol 2, Springer Verlag Heidelberg Berlin, Martin, Chapter 3, pp. 33-51]). 본 방법에 따르면, FR1은 위치 1-25의 아미노산 잔기를 포함하고, CDR1은 위치 26-35의 아미노산 잔기를 포함하고, FR2는 위치 36-49의 아미노산 잔기를 포함하고, CDR2는 위치 50-58의 아미노산 잔기를 포함하고, FR3은 위치 59-94의 아미노산 잔기를 포함하고, CDR3은 위치 95-102의 아미노산 잔기를 포함하고, FR4는 위치 103-113의 아미노산 잔기를 포함한다.

CDR 영역의 결정은 또한 상이한 방법에 따라 수행될 수 있다. Kabat에 따른 CDR 결정에서, ISVD의 FR1은 위치 1-30의 아미노산 잔기를 포함하고, ISVD의 CDR1은 위치 31-35의 아미노산 잔기를 포함하고, ISVD의 FR2는 위치 36-49의 아미노산 잔기를 포함하고, ISVD의 CDR2는 위치 50-65의 아미노산 잔기를 포함하고, ISVD의 FR3은 위치 66-94의 아미노산 잔기를 포함하고, ISVD의 CDR3은 위치 95-102의 아미노산 잔기를 포함하고, ISVD의 FR4는 위치 103-113의 아미노산 잔기를 포함한다.

이러한 면역글로불린 서열에서, 프레임워크 서열은 임의의 적합한 프레임워크 서열일 수 있고, 적합한 프레임워크 서열의 예는 예를 들어 표준 핸드북 및 추가 개시내용 및 본원에 언급된 선행 기술에 기초하여 당업자에게 명백할 것이다.

프레임워크 서열은 (예를 들어, 인간화 또는 낙타화에 의해) 면역글로불린 프레임워크 서열로부터 유래된 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 프레임워크 서열의 적합한 조합이다. 예를 들어, 프레임워크 서열은 경쇄 가변 도메인(예를 들어, V_L-서열) 및/또는 중쇄 가변 도메인(예를 들어, V_H-서열 또는 V_HH 서열)으로부터 유래된 프레임워크 서열일 수 있다. 한 양태에서, 프레임워크 서열은 V_HH-서열로부터 유래된 프레임워크 서열이거나(여기서, 상기 프레임워크 서열은 선택적으로 부분적으로 또는 완전히 인간화되었을 수 있음), (본원에 정의된 바와 같이) 낙타화된 통상적인 V_H 서열이다.

특히, 본 기술에 사용된 ISVD 서열에 존재하는 프레임워크 서열은 홀마크 잔기(본원에 정의된 바와 같음) 중 하나 이상을 함유할 수 있어서, ISVD 서열은 인간화 V_HH 또는 낙타화 V_H를 포함하는 V_HH와 같은 Nanobody®이다. 이러한 프레임워크 서열의 (적절한 조합의) 일부 비제한적 예는 본원의 추가 개시내용으로부터 명백해질 것이다.

다시, 면역글로불린 서열에 대해 본원에 일반적으로 기재된 바와 같이, 하나 이상의 프레임워크 서열에 의해 적절하게 플랭킹되고/되거나 이를 통해 연결된 하나 이상의 CDR 서열을 함유하는 단편과 같은 전술한 것 중 임의의 것의 적합한 단편(또는 단편들의 조합)을 사용하는 것도 가능하다(예를 들어, 이들 CDR과 동일한 순서로, 그리고 프레임워크 서열은 단편이 유래된 전체 크기 면역글로불린 서열에서 발생할 수 있음).

그러나, 본 기술은 ISVD 서열(또는 이를 발현하는 데 사용된 뉴클레오타이드 서열)의 기원이나 ISVD 서열 또는 뉴클레오타이드 서열이 생성 또는 획득되는 (또는 생성되거나 획득된) 방식에 대해 제한되지 않는다는 점에 유의해야 한다. 따라서, ISVD 서열은 (임의의 적합한 종으로부터의) 자연 발생 서열 또는 합성 또는 반합성 서열일 수 있다. 구체적이지만 비제한적인 양태에서, ISVD 서열은 (임의의 적합한 종으로부터의) 자연 발생 서열 또는 합성 또는 반합성 서열이며, 여기에는 (본원에 정의된 바와 같은) "인간화” 면역글로불린 서열(예컨대 부분적으로 또는 완전히 인간화된 마우스 또는 토끼 면역글로불린 서열, 특히 부분적으로 또는 완전히 인간화된 V_HH 서열), (본원에 정의된 바와 같은) "낙타화된" 면역글로불린 서열뿐만 아니라 친화도 성숙(예를 들어, 합성, 무작위 또는 자연 발생 면역글로불린 서열로부터 개시), CDR 이식, 베니어링(veneering), 상이한 면역글로불린 서열로부터 유래된 단편 결합, 중첩 프라이머를 사용한 PCR 조립, 및 당업자에게 잘 알려진 면역글로불린 서열을 조작하기 위한 유사한 기술; 또는 전술한 것 중 임의의 적절한 조합과 같은 기술에 의해 수득된 면역글로불린 서열이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.

유사하게, 뉴클레오타이드 서열은 자연 발생 뉴클레오타이드 서열 또는 합성 또는 반합성 서열일 수 있고, 예를 들어 적합한 자연 발생 주형(예를 들어, 세포로부터 단리된 DNA 또는 RNA)으로부터 PCR에 의해 단리된 서열, 라이브러리(및 특히, 발현 라이브러리)로부터 단리된 뉴클레오타이드 서열, (미스매치 PCR과 같이 그 자체로 공지된 임의의 적합한 기술을 사용하여) 자연 발생 뉴클레오타이드 서열에 돌연변이를 도입함으로써 제조된 뉴클레오타이드 서열, 중복 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 제조된 뉴클레오타이드 서열, 또는 그 자체로 알려진 DNA 합성 기술을 사용하여 제조된 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.

전술한 바와 같이, ISVD는 Nanobody® 또는 이의 적합한 단편일 수 있다. 나노바디에 대한 일반적인 설명은 아래의 추가 설명 및 본원에서 인용된 선행 기술을 참고한다. 그러나 이와 관련하여, 이 설명 및 선행 기술은 소위 "V_H3 클래스"의 나노바디(즉, DP-47, DP-51 또는 DP-29와 같은 V_H3 클래스의 인간 생식계열 서열에 대해 높은 서열 상동성을 갖는 나노바디)를 주로 기술했음을 주목해야 한다. 그러나 가장 넓은 의미에서 본 기술은 일반적으로 모든 유형의 나노바디를 사용할 수 있으며, 예를 들어 WO 2007/118670에 기재된 바와 같이, 예를 들어 소위 "V_H4 클래스"에 속하는 나노바디(즉, V_H4 클래스의 인간 생식계열 서열에 대해 높은 서열 상동성을 갖는 나노바디, 예컨대 DP-78)도 사용할 수 있음을 주목해야 한다.

일반적으로 나노바디(특히 (부분적으로) 인간화 V_HH 서열 및 낙타화된 VH 서열을 포함하는 V_HH 서열)는 하나 이상의 프레임워크 서열(다시 여기에 추가로 설명됨)에 (본원에 기재된 바와 같은) 하나 이상의 "홀마크 잔기”가 존재하는 것을 특징으로 할 수 있다. 따라서, 일반적으로, 나노바디는 (일반) 구조를 갖는 면역글로불린 서열로 정의될 수 있다:

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

여기서 FR1 내지 FR4는 각각 프레임워크 영역 1 내지 4를 나타내고, CDR1 내지 CDR3은 각각 상보성 결정 영역 1 내지 3을 나타내고, 여기서 홀마크 잔기 중 하나 이상은 본원에 추가로 정의된 바와 같다.

특히, 나노바디는 (일반) 구조를 갖는 면역글로불린 서열일 수 있다:

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

여기서 FR1 내지 FR4는 각각 프레임워크 영역 1 내지 4를 나타내고, CDR1 내지 CDR3은 각각 상보성 결정 영역 1 내지 3을 나타내고, 여기서 프레임워크 서열은 본원에 추가로 정의된 바와 같다.

더욱 특히, 나노바디는 (일반) 구조를 갖는 면역글로불린 서열일 수 있다:

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

여기서 FR1 내지 FR4는 각각 프레임워크 영역 1 내지 4를 나타내고, CDR1 내지 CDR3은 각각 상보성 결정 영역 1 내지 3을 나타내며, 여기서:

Kabat 넘버링에 따른 위치 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108에서의 아미노산 잔기 중 하나 이상은 하기 표 A-0에 언급된 홀마크 잔기로부터 선택된다.

[표 A-0]

본 기술은 특히 IL-13 또는 TSLP에 결합할 수 있는 ISVD를 사용한다. 본 기술의 맥락에서, 특정한 표적 분자"에 결합하는"은 항체 및 그들의 각각의 항원의 맥락에서 이해되는 당해 분야에서의 통상적인 의미를 갖는다.

본 기술의 다중특이적-다가 폴리펩타이드는 IL-13에 특이적으로 결합하는 2개 이상의 ISVD 및 TSLP에 특이적으로 결합하는 2개 이상의 ISVD를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 IL-13에 특이적으로 결합하는 2개의 ISVD 및 TSLP에 특이적으로 결합하는 2개의 ISVD를 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 적어도 하나의 ISVD는 그의 표적 분자를 기능적으로 차단할 수 있다. 예를 들어, 표적화 모이어티는 IL-13과 IL-13Rα1(인터류킨 13 수용체, 알파 1) 간의 상호작용 및/또는 IL-13/IL-13Rα1 복합체와 IL-4Rα(알파 인터류킨-4 수용체) 간의 상호작용을 차단할 수 있거나, TSLP와 TSLPR(TSLP 수용체) 간의 상호작용 및/또는 TSLP/TSLPR 복합체와 IL-7Rα(인터류킨-7 수용체 서브유닛 알파) 간의 상호작용을 차단할 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 기술의 폴리펩타이드는 IL-13에 특이적으로 결합하고 IL-13Rα1과의 그의 상호작용 및/또는 IL-13/IL-13Rα1 복합체와 IL-4Rα 간의 상호작용을 기능적으로 차단하는 적어도 2개의 ISVD, 및 TSLP에 특이적으로 결합하고 TSLPR과의 그의 상호작용 및/또는 TSLP/TSLPR 복합체와 IL-7Rα 간의 상호작용을 기능적으로 차단하는 2개의 ISVD를 포함한다.

본 기술에 사용된 ISVD는 본 기술의 폴리펩타이드의 일부를 형성하며, 이는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어져서 폴리펩타이드가 IL-13 및 TSLP에 특이적으로 결합할 수 있다.

따라서, 본 기술의 폴리펩타이드에 사용되는 적어도 4개의 ISVD의 표적 분자는 IL-13 및 TSLP이다. 예는 포유류 IL-13 및 TSLP이다. 인간 IL-13(Uniprot 수탁 P35225) 및 인간 TSLP(Uniprot 수탁 Q969D9)외에도 다른 종의 버전들, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 고양이, 개, 염소, 양, 말, 돼지, 사이노몰구스 원숭이와 같은 비인간 영장류(본원에서 "사이노"로도 지칭됨), 또는 라마 또는 알파카와 같은 낙타과가 본 기술에 적용될 수 있다.

본 기술에서 사용할 수 있는 IL-13에 특이적으로 결합하는 ISVD의 구체적인 예는 다음 항목 A 및 B에 설명되어 있다:

A. 인간 IL-13에 특이적으로 결합하고 다음을 포함하는 ISVD:

iii. 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3.

일 실시형태에서, ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 17의 아미노산 서열인 CDR3을 포함한다.

B. 인간 IL-13에 특이적으로 결합하고 다음을 포함하는 ISVD:

iii. 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 서열번호 18과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3.

일 실시형태에서, ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 18의 아미노산 서열인 CDR3을 포함한다.

인간 IL-13에 특이적으로 결합하는 이러한 ISVD의 예는 (각각 앞의 항목 A와 B에서 정의된 CDR에 추가하여) 표 A-2에서 각각 작제물 4B02 또는 4B06에 대해 표시된 바와 같은 하나 이상의, 또는 모든 프레임워크 영역을 갖는다. 일 실시형태에서, 이는 작제물 4B02 또는 작제물 4B06 (각각, 서열번호 2 및 3; 표 A-1 및 A-2 참조)의 전체 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 ISVD이다.

또 다른 실시형태에서, 인간 IL-13에 특이적으로 결합하는 ISVD(들)의 아미노산 서열은 각각 서열번호 2 또는 3과 90% 초과, 예컨대 95% 초과, 또는 99% 초과의 서열 동일성을 가질 수 있으며, 여기서 CDR은 각각 앞의 항목 A 또는 B에 정의된 바와 같다. 일 실시형태에서, IL-13에 특이적으로 결합하는 ISVD는 서열번호 2 또는 3의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다.

IL-13에 대한 그러한 ISVD 결합이 상응하는 참조 CDR 서열(상기 항목 A 또는 B)에 비해 적어도 하나의 CDR에서 2 또는 1개의 아미노산 차이를 가질 때, ISVD는 각각 서열번호 2 또는 3에 제시된 작제물 4B02 또는 4B06로서 인간 IL-13에 대한 적어도 절반의 결합 친화도, 또는 동일한 결합 친화도를 가지며, 여기서 결합 친화도는 SPR과 같은 동일한 방법을 사용하여 측정된다.

본 기술에서 사용할 수 있는 TSLP에 특이적으로 결합하는 ISVD의 구체적인 예는 다음 항목 C 및 D에 설명되어 있다:

C. 인간 TSLP에 특이적으로 결합하고 다음을 포함하는 ISVD:

iii. 서열번호 19의 아미노산 서열 또는 서열번호 19와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3.

일 실시형태에서, ISVD는 서열번호 9의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 19의 아미노산 서열인 CDR3을 포함한다.

D. 인간 TSLP에 특이적으로 결합하고 다음을 포함하는 ISVD:

iii. 서열번호 21의 아미노산 서열 또는 서열번호 21과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3.

일 실시형태에서, ISVD는 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 21의 아미노산 서열인 CDR3을 포함한다.

인간 TSLP에 특이적으로 결합하는 이러한 ISVD의 예는 (앞의 항목 C와 D에서 정의된 CDR에 추가하여) 표 A-2에서 각각 작제물 501A02 및 529F10에 대해 표시된 바와 같은 하나 이상의, 또는 모든 프레임워크 영역을 갖는다. 일 실시형태에서, 이는 작제물 501A02 또는 529F10 (서열번호 4 또는 6, A-1 및 A-2 참조)의 전체 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 ISVD이다.

또 다른 실시형태에서, 인간 TSLP에 특이적으로 결합하는 ISVD(들)의 아미노산 서열은 각각 서열번호 4 또는 6과 90% 초과, 예컨대 95% 초과, 또는 99% 초과의 서열 동일성을 가질 수 있으며, 여기서 CDR은 각각 앞의 항목 C 또는 D에 정의된 바와 같다. 일 실시형태에서, 인간 TSLP에 결합하는 ISVD는 서열번호 4 또는 6의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다.

인간 TSLP에 대한 그러한 ISVD 결합이 상응하는 참조 CDR 서열(상기 항목 C 또는 D)에 비해 적어도 하나의 CDR에서 2 또는 1개의 아미노산 차이를 가질 때, ISVD는 각각 서열번호 4 및 6에 제시된 작제물 501A02 또는 529F10로서 인간 TSLP에 대한 적어도 절반의 결합 친화도, 또는 동일한 결합 친화도를 가지며, 여기서 결합 친화도는 SPR과 같은 동일한 방법을 사용하여 측정된다.

일 실시형태에서, 상기 항목 A 내지 D에 정의된 바와 같은 ISVD 각각은 본 기술의 폴리펩타이드에 포함된다.

상기 항목 A 내지 D에 정의된 바와 같은 ISVD 각각을 포함하는 본 기술의 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드로서 인간 IL-13 및 인간 TSLP에 대해 적어도 절반의 결합 친화도, 또는 적어도 동일한 결합 친화도를 가지며, 여기서 결합 친화도는 SPR과 같은 동일한 방법을 사용하여 측정된다.

상기 항목 A 내지 D 및 아래 항목 E(섹션 5.4 "(생체내) 반감기 연장" 참조)에서 언급된 서열번호는 AbM 정의(표 A-2 참조)에 따른 CDR 정의를 기반으로 한다. Kabat 정의(표 A-2.1 참조)에 따라 동일한 CDR을 정의하는 서열번호는 마찬가지로 상기 항목 A 내지 D 및 아래 항목 E(섹션 5.4 "(생체내) 반감기 연장" 참조)에서 사용될 수 있음을 주목한다.

따라서, 본 기술에서 사용될 수 있는 IL-13 또는 TSLP에 특이적으로 결합하는 ISVD의 구체적인 예는 AbM 정의를 사용하여 위에서 설명한 바와 같으며, 또한 하기 항목 A' 내지 D'에 기재된 바와 같은 Kabat 정의를 사용하여 설명될 수 있다:

A'. 인간 IL-13에 특이적으로 결합하고 다음을 포함하는 ISVD:

i. 서열번호 37의 아미노산 서열 또는 서열번호 37과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;

ii. 서열번호 42의 아미노산 서열 또는 서열번호 42와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및

일 실시형태에서, ISVD는 서열번호 37의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 42의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 17의 아미노산 서열인 CDR3을 포함한다.

B'. 인간 IL-13에 특이적으로 결합하고 다음을 포함하는 ISVD:

i. 서열번호 38의 아미노산 서열 또는 서열번호 38과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;

ii. 서열번호 43의 아미노산 서열 또는 서열번호 43과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및

일 실시형태에서, ISVD는 서열번호 38의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 43의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 18의 아미노산 서열인 CDR3을 포함한다.

인간 IL-13에 특이적으로 결합하는 이러한 ISVD(들)의 예는 (각각 앞의 항목 A’와 B’에서 정의된 CDR에 추가하여) 표 A-2-1에서 각각 작제물 4B02 또는 4B06에 대해 표시된 바와 같은 하나 이상의, 또는 모든 프레임워크 영역을 갖는다. 일 실시형태에서, 이는 작제물 4B02 또는 작제물 4B06 (각각, 서열번호 2 및 3; 표 A-1 및 A-2-1 참조)의 전체 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 ISVD이다.

C'. 인간 TSLP에 특이적으로 결합하고 다음을 포함하는 ISVD:

i. 서열번호 39의 아미노산 서열 또는 서열번호 39와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;

ii. 서열번호 44의 아미노산 서열 또는 서열번호 44와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및

일 실시형태에서, ISVD는 서열번호 39의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 44의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 19의 아미노산 서열인 CDR3을 포함한다.

D'. 인간 TSLP에 특이적으로 결합하고 다음을 포함하는 ISVD:

i. 서열번호 41의 아미노산 서열 또는 서열번호 41과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;

ii. 서열번호 46의 아미노산 서열 또는 서열번호 46과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및

일 실시형태에서, ISVD는 서열번호 41의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 46의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 21의 아미노산 서열인 CDR3을 포함한다.

인간 TSLP에 특이적으로 결합하는 이러한 ISVD(들)의 예는 (앞의 항목 C’와 D’에서 정의된 CDR에 추가하여 ') 표 A-2-1에서 각각 작제물 501A02 및 529F10에 대해 표시된 바와 같은 하나 이상의, 또는 모든 프레임워크 영역을 갖는다. 일 실시형태에서, 이는 작제물 501A02 또는 529F10 (서열번호 4 또는 6, A-1 및 A-2-1 참조)의 전체 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 ISVD이다.

제1 아미노산 서열과 제2 아미노산 서열 사이의 "서열 동일성"의 백분율은 [제2 아미노산 서열의 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기와　동일한 제1 아미노산 서열의 아미노산 잔기의 수]를 [제1 아미노산 서열의 아미노산 잔기의 총 수]로 나누고 [100%]를 곱하여 계산할 수 있으며, - 제1 아미노산 서열과 비교하여 - 제2 아미노산 서열의 아미노산 잔기의 각 결실, 삽입, 치환 또는 부가는 단일 아미노산 잔기(즉, 단일 위치)에서의 차이로 간주된다.

통상적으로, 본원의 위에서 개략적으로 설명된 계산 방법에 따라 2개의 아미노산 서열 사이의 "서열 동일성"의 백분율을 결정하기 위하여, 가장 많은 수의 아미노산 잔기를 가진 아미노산 서열을 "제1" 아미노산 서열로 취할 것이고, 다른 아미노산 서열을 "제2" 아미노산 서열로 취할 것이다.

본원에 사용된 "아미노산 차이"는 참조 서열에 대한 단일 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 지칭한다. 일 실시형태에서, "아미노산 차이"는 치환이다.

일 실시형태에서, 아미노산 치환은 보존적 치환이다. 이러한 보존적 치환은 다음의 군 (a) 내지 (e) 내의 하나의 아미노산이 동일한 군의 또 다른 아미노산 잔기로 치환되는 치환이다: (a) 작은 지방족의, 비극성 또는 약한 극성의 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro 및 Gly; (b) 극성의, 음으로 하전된 잔기 및 그들의 (하전되지 않은) 아미드: Asp, Asn, Glu 및 Gln; (c) 극성의, 양으로 하전된 잔기: His, Arg 및 Lys; (d) 큰 지방족의, 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val 및 Cys; 및 (e) 방향족 잔기: Phe, Tyr 및 Trp.

일 실시형태에서, 보존적 치환은 다음과 같다: Ala에서 Gly 또는 Ser으로; Arg에서 Lys으로; Asn에서 Gln 또는 His으로; Asp에서 Glu으로; Cys에서 Ser으로; Gln에서 Asn으로; Glu에서 Asp으로; Gly에서 Ala 또는 Pro으로; His에서 Asn 또는 Gln로; Ile에서 Leu 또는 Val으로; Leu에서 Ile 또는 Val로; Lys에서 Arg, Gln 또는 Glu으로; Met에서 Leu, Tyr 또는 Ile으로; Phe에서 Met, Leu 또는 Tyr으로; Ser에서 Thr으로; Thr에서 Ser으로; Trp에서 Tyr으로; Tyr에서 Trp으로; 및/또는 Phe에서 Val, Ile 또는 Leu으로.

3. 특이성

용어들 "특이성", "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적 결합"은 ISVD와 같은 특정 결합 단위가 충분히 높은 친화도로 결합할 수 있는 동일한 유기체로부터의 항원과 같은 상이한 표적 분자의 수를 나타낸다(아래 참조). "특이성", "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적 결합"은 본원에서 "선택성", "선택적으로 결합하는" 또는 "선택적 결합”과 상호교환적으로 사용된다. ISVD와 같은 결합 단위는 그들의 지정된 표적에 특이적으로 결합한다.

결합 단위의 특이성/선택성은 친화도를 기반으로 결정될 수 있다. 친화도는 분자의 상호 작용의 강도 또는 안정성을 나타낸다. 친화도는 통상적으로 몰/L(또는 M) 단위를 갖는 KD 또는 해리 상수로 제공된다. 또한, 친화도는, 1/KD와 같으며 (몰/L)^-1(또는 M^-1) 단위를 갖는 결합 상수, KA로 나타낼 수 있다.

친화도는 모이어티와 표적 분자의 결합 부위 사이의 결합 강도에 대한 척도이다: KD 값이 낮을수록 표적 분자와 표적 모이어티 사이의 결합 강도가 더 강해진다.

전형적으로, 본 기술에서 사용되는 결합 단위(예컨대 ISVD)는 10^-5 내지 10^-12 몰/리터 이하, 또는 10^-7 내지 10^-12 몰/리터 이하, 또는 10^-8 내지 10^-12 몰/리터의 해리 상수(KD)로 (즉, 10⁵ 내지 10¹² 리터/몰 이상, 또는 10⁷ 내지 10¹² 리터/몰 이상, 또는 10⁸ 내지 10¹² 리터/몰의 결합 상수(KA)로) 그들의 표적에 결합할 것이다.

10^-4 몰/리터보다 큰 임의의 KD 값(또는 10⁴ 리터/몰보다 낮은 임의의 KA 값)은 일반적으로 비 특이적 결합을 나타내는 것으로 간주된다.

항원에 대한 면역글로불린 서열의 결합과 같은 생물학적 상호작용에 대한 KD는, 전형적으로 10^-5 몰/리터(10000 nM 또는 10 μM) 내지 10^-12몰/리터(0.001 nM 또는 1 pM) 이하의 범위에서 특이적인 것으로 간주된다.

따라서, 특이적/선택적 결합은 - 동일한 측정 방법, 예를 들어 SPR을 사용하여 - 결합 단위 (또는 이를 포함하는 폴리펩타이드)가 10^-5 내지 10^-12 몰/리터 이하의 KD 값으로 IL13 및/또는 TSLP에 결합하고 10^-4 몰/리터 초과의 KD 값으로 관련 사이토카인에 결합함을 의미할 수 있다. IL13 관련 표적의 예는 인간 IL4이다. TSLP에 대한 관련 사이토카인의 예는 인간 IL7이다. 따라서, 본 기술의 실시형태에서, 폴리펩타이드에 포함된 적어도 2개의 ISVD는 10^-5 내지 10^-12 몰/리터 이하의 KD 값으로 IL13에 결합하고, 10^-4 몰/리터 초과의 KD 값으로 동일한 종의 IL4에 결합하며, 폴리펩타이드에 포함된 적어도 2개의 ISVD는 10^-5 내지 10^-12 몰/리터 이하의 KD 값으로 TSLP에 결합하고, 10^-4 몰/리터 초과의 KD 값으로 동일한 종의 인간 IL7에 결합한다.

따라서, 본 기술의 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드와 비교하여 인간 IL13 및 인간 TSLP에 대해 적어도 절반의 결합 친화도, 또는 적어도 동일한 결합 친화도를 가지며, 여기서 결합 친화도는 SPR과 같은 동일한 방법을 사용하여 측정된다.

특정 종으로부터의 특정 표적에 대한 특이적 결합은 결합 단위가 또한 상이한 종으로부터의 유사한 표적에 특이적으로 결합할 수 있다는 것을 배제하지 않는다. 예를 들어, 인간 IL13에 대한 특이적 결합은 결합 단위(또는 이를 포함하는 폴리펩타이드)가 또한 사이노몰구스 원숭이로부터의 IL13에 특이적으로 결합할 수 있다는 것을 배제하지 않는다. 마찬가지로, 예를 들어, 인간 TSLP에 대한 특이적 결합은 결합 단위(또는 이를 포함하는 폴리펩타이드)가 또한 사이노몰구스 원숭이(“사이노”)로부터의 TSLP에 특이적으로 결합할 수 있다는 것을 배제하지 않는다.

그의 지정된 표적에 대한 결합 단위의 특이적 결합은 예를 들어, 스캐차드 분석 및/또는 경쟁 결합 분석, 예컨대 방사선 면역측정법(RIA), 효소 면역분석법(EIA) 및 샌드위치 경쟁 분석법, 및 당해 분야에서 그 자체로 공지된 이들의 다양한 변이형; 및 본원에서 언급된 기타 기술을 비롯한, 그 자체로 공지된 임의의 적합한 방법에서 결정될 수 있다.

해리 상수는 당업자에게 명백하듯이 실제 또는 겉보기 해리 상수일 수 있다. 해리 상수를 결정하는 방법은 당업자에게 명확할 것이며, 예를 들어 하기에서 언급된 기술을 포함한다. 이와 관련하여, 10^-4 몰/리터 또는 10^-3 몰/리터 초과(예를 들어, 10^-2 몰/리터)의 해리 상수를 측정하는 것은 가능하지 않을 수 있음은 명백할 것이다. 선택적으로, 또한 당업자에게 명확하듯이, (실제 또는 겉보기) 해리 상수는 관계식 [KD = 1/KA]에 의해 (실제 또는 겉보기) 결합 상수(KA)를 기초로 하여 계산될 수 있다.

두 분자 사이의 분자 상호 작용의 친화도는 그 자체로 공지된 상이한 기술, 예를 들어 잘 알려진 표면 플라스몬 공명(SPR) 바이오센서 기술을 통해 측정될 수 있다(예를 들어 문헌[Ober et al. 2001, Intern. Immunology 13: 1551-1559] 참조). 본원에서 사용된 용어 "표면 플라스몬 공명"은 바이오센서 매트릭스 내에서 단백질 농도의 변화를 검출함으로써 실시간 생물특이적 상호작용의 분석을 가능하게 하는 광학 현상을 지칭하며, 여기서 하나의 분자가 바이오센서 칩에 고정되어 있고 다른 분자는 k_on, k_off 측정값 및 따라서 K_D (또는 K_A) 값을 산출하는 흐름 조건에서 고정된 분자 위로 통과된다. 이것은 예를 들어 잘 알려진 BIAcore® 시스템(BIAcore International AB, a GE Healthcare company, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ)을 사용하여 수행될 수 있다. 추가의 설명에 대해서는, 문헌[Jonsson et al. (1993, Ann. Biol. Clin. 51: 19-26)], 문헌[Jonsson et al. (1991 Biotechniques 11: 620-627)], 문헌[Johnsson et al. (1995, J. Mol. Recognit. 8: 125-131)], 및 문헌[Johnnson et al. (1991, Anal. Biochem. 198: 268-277)]을 참조한다.

생체분자 상호작용의 친화도를 결정하기 위한 또 다른 잘 알려진 바이오센서 기술은 생물층 간섭계(BLI)이다(예를 들어 문헌[Abdiche et al. 2008, Anal. Biochem. 377: 209-217)] 참조). 본원에 사용된 용어 "생물층 간섭계" 또는 "BLI"는 두 표면에서 반사된 빛의 간섭 패턴을 분석하는 무표지 광학 기술을 지칭한다: 내부 참조 레이어(참조 빔) 및 바이오센서 팁 상에 고정된 단백질 레이어(신호 빔). 바이오센서 팁에 결합된 분자 수의 변화는 간섭 패턴의 이동을 유발하며, 파장 이동(nm)으로 보고되며, 그 크기는 바이오센서 팁 표면에 결합된 분자 수의 직접적인 측정값이다. 상호 작용이 실시간으로 측정될 수 있으므로, 결합 및 해리 속도와 친화도가 결정될 수 있다. BLI는 예를 들어 잘 알려진 Octet® 시스템(ForteBio, a division of Pall Life Sciences, Menlo Park, USA)을 사용하여 수행될 수 있다.

대안적으로, 친화도는 동역학 배제 분석(KinExA)(예를 들어 문헌[Drake et al. 2004, Anal. Biochem., 328: 35-43])에서, KinExA® 플랫폼(Sapidyne Instruments Inc, Boise, USA)을 사용하여 측정될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "KinExA"는 변형되지 않은 분자의 진정한 평형 결합 친화도 및 동역학을 측정하기 위한 용액-기반 방법을 지칭한다. 항체/항원 복합체의 평형 용액이 항원(또는 항체)으로 미리 코팅된 비드가 있는 컬럼 위로 통과되어, 유리 항체(또는 항원)가 코팅된 분자에 결합하도록 한다. 이렇게 포획된 항체(또는 항원)의 검출은 항체(또는 항원)에 결합하는 형광 표지된 단백질로 달성된다.

GYROLAB® 면역분석 시스템은 자동화된 생물분석 및 신속한 샘플 턴어라운드를 위한 플랫폼을 제공한다(문헌[Fraley et al. 2013, Bioanalysis 5: 1765-74]).

4. (생체내) 반감기 연장

폴리펩타이드는 임의로 하나 이상의 펩타이드 링커를 통해 연결된 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 없는 상응하는 폴리펩타이드와 비교하여 증가된 (생체내) 반감기를 갖는 폴리펩타이드를 제공한다. 생체내 반감기 연장은 예를 들어, 폴리펩타이드가 투여 후 인간 대상체와 같은 포유동물에서 증가된 반감기를 갖는 것을 의미한다. 반감기는 예를 들어 as t1/2베타로 표현될 수 있다.

기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위의 유형은 일반적으로 제한되지 않으며, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 분자, 혈청 단백질 또는 이의 단편들, 혈청 단백질에 결합할 수 있는 결합 단위, Fc 부분, 및 혈청 단백질에 결합할 수 있는 작은 단백질 또는 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

보다 구체적으로, 증가된 반감기를 갖는 폴리펩타이드를 제공하는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 혈청 알부민(예컨대 인간 혈청 알부민)에 결합할 수 있는 결합 단위 또는 혈청 면역글로불린, 예컨대 IgG로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 실시형태에서, 증가된 반감기를 갖는 폴리펩타이드를 제공하는 상기 하나 이상의 다른 결합 단위는 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있는 결합 단위이다. 일 실시형태에서, 결합 단위는 ISVD이다.

예를 들어, WO 04/041865는 상기 단백질의 반감기를 증가시키기 위해 다른 단백질(예컨대 원하는 표적에 결합하는 하나 이상의 다른 나노바디)에 연결될 수 있는 혈청 알부민에 대한(특히 인간 혈청 알부민에 대한) Nanobodies® 결합을 기술한다.

국제출원 WO06/122787은 (인간) 혈청 알부민에 대한 다수의 Nanobodies®를 기술하고 있다. 이러한 Nanobodies®에는 Alb-1(WO 06/122787의 서열번호 52)로 불리는 Nanobody® 및 Alb-8(WO 06/122787의 서열번호 62)과 같은 이의 인간화 변이체가 포함된다. 다시 말하지만, 이들은 치료 단백질 및 폴리펩타이드 및 기타 치료 엔티티 또는 모이어티의 반감기를 연장하는 데 사용될 수 있다.

더욱이, WO2012/175400은 Alb-23이라 불리는 Alb-1의 추가 개선된 버전을 기술하고 있다.

일 실시형태에서, 폴리펩타이드는 Alb-1, Alb-3, Alb-4, Alb-5, Alb-6, Alb-7, Alb-8, Alb-9, Alb-10 및 Alb-23으로부터 선택된 혈청 알부민 결합 모이어티를 포함한다. 일 실시형태에서, 혈청 알부민 결합 모이어티는 WO2012/175400의 페이지 7~9에 제시된 바와 같은 Alb-8 또는 Alb-23 또는 그의 변이체 및 WO 2012/175741, WO2015/173325, WO2017/080850, WO2017/085172, WO2018/104444, WO2018/134235, WO2018/134234에 기술된 알부민 결합제이다. 일부 혈청 알부민 결합제는 또한 표 A-4에 제시되어 있다. 일 실시형태에서, 본 기술의 폴리펩타이드의 추가 성분은 항목 E에 기술된 바와 같다:

E. 인간 혈청 알부민에 결합하고, 하기를 포함하는 ISVD:

iii. 서열번호 20의 아미노산 서열 또는 서열번호 20과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3.

일 실시형태에서, ISVD는 서열번호 10의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 15의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 20의 아미노산 서열인 CDR3을 포함한다.

인간 혈청 알부민에 결합하는 이러한 ISVD의 예는 (앞의 항목 E에서 정의된 CDR에 추가하여) 표 A-2에서 작제물 ALB23002에 대해 표시된 바와 같은 하나 이상의, 또는 모든 프레임워크 영역을 갖는다. 일 실시형태에서, 이는 작제물 ALB23002(서열번호 5, 표 A-1 및 A-2 참조)의 전체 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 ISVD이다.

항목 E는 또한, 하기와 같은 Kabat 정의를 사용하여 기술될 수 있다:

E'. 인간 혈청 알부민에 결합하고, 하기를 포함하는 ISVD:

i. 서열번호 40의 아미노산 서열 또는 서열번호 40과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;

ii. 서열번호 45의 아미노산 서열 또는 서열번호 45와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및

일 실시형태에서, ISVD는 서열번호 40의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 45의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 20의 아미노산 서열인 CDR3을 포함한다.

인간 혈청 알부민에 결합하는 이러한 ISVD의 예는 (앞의 항목 E’에서 정의된 CDR에 추가하여) 표 A-2-1에서 작제물 ALB23002에 대해 표시된 바와 같은 하나 이상의, 또는 모든 프레임워크 영역을 갖는다. 일 실시형태에서, 이는 작제물 ALB23002(서열번호 5, 표 A-1 및 A-2-1 참조)의 전체 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 ISVD이다.

또 다른 실시형태에서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 5와 90% 초과, 예컨대 95% 초과, 또는 99% 초과의 서열 동일성을 가질 수 있으며, 여기서 CDR은 앞의 항목 E 또는 E’에 정의된 바와 같다. 일 실시형태에서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는다.

인간 혈청 알부민에 대한 그러한 ISVD 결합이 상응하는 참조 CDR 서열(상기 항목 E)에 비해 적어도 하나의 CDR에서 2 또는 1개의 아미노산 차이를 가질 때, ISVD는 서열번호 5에 제시된 작제물 ALB23002로서 인간 혈청 알부민에 대한 적어도 절반의 결합 친화도, 또는 동일한 결합 친화도를 가지며, 여기서 결합 친화도는 SPR과 같은 동일한 방법을 사용하여 측정된다.

일 실시형태에서, 인간 혈청 알부민에 대한 이러한 ISVD 결합이 C-말단 위치를 가질 때, 이는 C-말단 알라닌(A) 또는 글리신(G) 연장을 나타낸다. 일 실시형태에서, 이러한 ISVD는 서열번호 59, 60, 62, 64, 65, 66, 67, 68, 69 및 71로부터 선택된다(하기 표 A-4 참조). 일 실시형태에서, 인간 혈청 알부민에 대한 ISVD 결합은 C-말단 위치 이외의 다른 위치를 갖는다(즉, 본 기술의 폴리펩타이드의 C-말단 ISVD가 아님). 일 실시형태에서, 이러한 ISVD는 서열번호 5, 57, 58, 61, 및 63으로부터 선택된다(하기 표 A-4 참조).

5. 핵산 분자

또한, 본 기술의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자가 제공된다.

"핵산 분자"(“핵산"과 상호교환적으로 사용됨)는 뉴클레오타이드 서열을 형성하기 위해 포스페이트 백본을 통해 서로 연결된 뉴클레오타이드 단량체의 사슬이다. 핵산은 예를 들어, 폴리펩타이드의 발현 및/또는 생산을 위해 숙주 세포 또는 숙주 유기체를 형질전환/형질감염시키는데 사용될 수 있다. 생산 목적에 적합한 숙주 또는 숙주 세포는 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들어 임의의 적합한 진균, 원핵 또는 진핵 세포 또는 세포주 또는 임의의 적합한 진균, 원핵 또는 진핵 유기체일 수 있다. 본 기술의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 또는 숙주 세포도 본 기술에 포함된다.

핵산은 예를 들어 DNA, RNA, 또는 이들의 하이브리드일 수 있고, 또한 PNA와 같은 (예를 들어, 화학적으로) 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이는 단일- 또는 이중 가닥일 수 있다. 일 실시형태에서, 이는 이중-가닥 DNA의 형태이다. 예를 들어, 본 기술의 뉴클레오타이드 서열은 게놈 DNA, cDNA일 수 있다.

본 기술의 핵산은 그 자체로 알려진 방식으로 제조 또는 수득될 수 있고/있거나 적합한 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 자연 발생 (폴리)펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 변이를 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 제공하기 위해, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발에 적용될 수 있다. 또한, 당업자에게 명백한 바와 같이, 핵산을 제조하기 위해, 표적화 모이어티를 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열 및 예를 들어 하나 이상의 링커를 암호화하는 핵산과 같은 여러 뉴클레오타이드 서열도 적절한 방식으로 함께 연결될 수 있다.

핵산을 생성하는 기술은 당업자에게 명확할 것이며, 예를 들어 자동화된 DNA 합성; 부위-지정 돌연변이유발; 2개 이상의 자연 발생 및/또는 합성 서열(또는 이의 2개 이상의 부분)을 결합하고, 절단된 발현 생성물의 발현을 유도하는 돌연변이의 도입; (예를 들어, 적절한 제한 효소를 사용하여 쉽게 소화 및/또는 결찰될 수 있는 카세트 및/또는 영역을 생성하기 위해) 하나 이상의 제한 부위의 도입, 및/또는 하나 이상의 "미스매치된” 프라이머를 사용한 PCR 반응에 의한 돌연변이의 도입을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

6. 벡터

또한, 본 기술의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터가 제공된다. 본원에서 사용되는 벡터는 유전 물질을 세포 내로 운반하기에 적합한 비히클이다. 벡터는 플라스미드 또는 mRNA와 같은 네이키드 핵산, 또는 리포솜 또는 바이러스 벡터와 같은 더 큰 구조에 내장된 핵산을 포함한다.

벡터는 일반적으로 예를 들어 하나 이상의 적합한 프로모터(들), 인핸서(들), 터미네이터(들) 등과 같은 하나 이상의 조절 요소에 선택적으로 연결된 적어도 하나의 핵산을 포함한다. 일 실시형태에서, 벡터는 발현 벡터, 즉 적합한 조건 하에, 예를 들어, 벡터가 (예를 들어, 인간) 세포에 도입될 때, 암호화된 폴리펩타이드 또는 작제물을 발현하기에 적합한 벡터이다. DNA-기반 벡터의 경우, 이는 일반적으로 전사(예를 들어, 프로모터 및 polyA 신호) 및 번역(예를 들어, Kozak 서열)을 위한 요소의 존재를 포함한다.

일 실시형태에서, 벡터에서, 상기 적어도 하나의 핵산 및 상기 조절 요소는 서로 "작동가능하게 연결"되며, 이는 일반적으로 이들이 서로 기능적 관계에 있음을 의미한다. 예를 들어, 프로모터가 암호화 서열의 전사 및/또는 발현을 개시하거나 달리 제어/조절할 수 있는 경우 프로모터는 암호화 서열에 "작동가능하게 연결된" 것으로 간주된다(여기서 상기 암호화 서열은 상기 프로모터"의 제어 하에 있다"고 이해되어야 함). 일반적으로, 2개의 뉴클레오타이드 서열이 작동 가능하게 연결되어 있을 때, 그것들은 동일한 방향에 있을 것이고 일반적으로 동일한 리딩 프레임에 있을 것이다. 이들은 일반적으로 또 한 본질적으로 연속적일 것이지만, 이는 또한 필수가 아닐 수도 있다.

일 실시형태에서, 벡터의 임의의 조절 요소는 의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 그들의 의도된 생물학적 기능을 제공할 수 있도록 한다.

예를 들어, 프로모터, 인핸서 또는 터미네이터는 의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 "작동 가능"해야 하며, 이는 예를 들어 상기 프로모터가 그들이 작동가능하게 연결된 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 암호화 서열의 전사 및/또는 발현을 개시하거나 달리 제어/조절할 수 있어야 함을 의미한다.

7. 조성물

본 기술은 또한, 본 기술의 적어도 하나의 폴리펩타이드, 본 기술의 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 분자 또는 이러한 핵산 분자를 포함하는 적어도 하나의 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 약제학적 조성물일 수 있다. 조성물은 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제 및/또는 아쥬반트를 추가로 포함하고, 하나 이상의 추가의 약제학적으로 활성인 폴리펩타이드 및/또는 화합물을 선택적으로 포함할 수 있다.

8. 숙주 유기체

본 기술은 또한, 본 기술의 폴리펩타이드, 본 기술의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 및/또는 본 기술의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포 또는 숙주 유기체에 관한 것이다.

적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체는 당업자에게 명백하며, 예를 들어 임의의 적합한 진균, 원핵 또는 진핵 세포 또는 세포주 또는 임의의 적합한 진균, 원핵 또는 진핵 유기체이다. 특정 예에는 HEK293 세포, CHO 세포, 에스케리치아 콜리(Escherichia coli) 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)가 포함된다. 일 실시형태에서, 숙주는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)이다.

9. 폴리펩타이드의 방법 및 용도

본 기술은 또한, 본 기술의 폴리펩타이드를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산으로 숙주 세포 또는 숙주 유기체를 형질전환/형질감염시키는 단계, 숙주에서 폴리펩타이드를 발현시키는 단계, 선택적으로 하나 이상의 단리 및/또는 정제 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, 방법은 다음을 포함할 수 있다:

a) 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서, 또는 또 다른 적합한 발현 시스템에서, 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 발현하는 단계; 선택적으로 다음에:

b) 폴리펩타이드를 단리 및/또는 정제하는 단계.

생산 목적에 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체는 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들어 임의의 적합한 진균, 원핵 또는 진핵 세포 또는 세포주 또는 임의의 적합한 진균, 원핵 또는 진핵 유기체일 수 있다. 특정 예에는 HEK293 세포, CHO 세포, 에스케리치아 콜리(Escherichia coli) 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)가 포함된다. 일 실시형태에서, 숙주는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)이다.

본 기술의 폴리펩타이드, 기재된 바와 같은 핵산 분자 또는 벡터, 또는 본 기술의 폴리펩타이드, 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 조성물은 의약으로서 유용하다.

따라서, 본 기술은 의약으로서 사용하기 위한, 본 기술의 폴리펩타이드, 기재된 바와 같은 핵산 분자 또는 벡터, 또는 본 기술의 폴리펩타이드, 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.

또한, 염증성 질환의 (예방적 또는 치료적) 치료에 사용하기 위한, 본 기술의 폴리펩타이드, 기재된 바와 같은 핵산 분자 또는 벡터, 또는 본 기술의 폴리펩타이드, 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 조성물이 제공된다.

염증성 질환을 치료하는 (예방적 및/또는 치료적) 방법이 추가로 제공되며, 여기서 상기 방법은 약제학적으로 활성인 양의 본 기술의 폴리펩타이드, 기재된 바와 같은 핵산 분자 또는 벡터, 또는 본 기술의 폴리펩타이드, 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

또한, 약제학적 조성물의 제조에 있어서의, 본 기술의 폴리펩타이드, 기재된 바와 같은 핵산 분자 또는 벡터, 또는 본 기술의 폴리펩타이드, 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 조성물의 용도가 추가로 제공된다. 일 실시형태에서, 제조된 약제학적 조성물은 염증성 질환을 치료하기 위한 것이다.

염증성 질환은 아토피 피부염 및 천식과 같은 2형 염증성 질환이다.

본 기술의 맥락에서 언급되는 "대상체"는 임의의 동물, 보다 구체적으로 포유동물일 수 있다. 포유동물 중에서 인간과 비-인간 포유동물을 구별할 수 있다. 비인간 동물은 예를 들어 반려 동물(예를 들어, 개, 고양이), 가축(예를 들어, 소, 말, 양, 염소 또는 돼지), 또는 연구 목적 및/또는 항체 생산을 위해 일반적으로 사용되는 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 고양이, 개, 염소, 양, 말, 돼지, 사이노몰구스 원숭이와 같은 비인간 영장류, 또는 라마 또는 알파카와 같은 낙타과)일 수 있다.

예방 및/또는 치료 목적의 맥락에서, 대상체는 임의의 동물, 보다 구체적으로 임의의 포유동물일 수 있다. 일 실시형태에서, 대상체는 인간 대상체이다.

물질(폴리펩타이드, 핵산 분자 및 벡터 포함) 또는 조성물은 임의의 적합한 투여 경로, 예를 들어 장(예컨대 경구 또는 직장) 또는 비경구(예컨대 피부, 설하, 협측, 비강, 관절내, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 경피 또는 경점막) 투여로 대상체에 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 물질은 근육내, 피하 또는 피내 투여와 같은 비경구 투여에 의해 투여된다. 일 실시형태에서, 피하 투여가 사용된다.

기재된 바와 같은 폴리펩타이드, 핵산 분자 또는 벡터, 또는 폴리펩타이드, 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량은 의도된 치료 결과를 제공하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다.

하나 이상의 용량이 투여될 수 있다. 하나 초과의 용량이 투여되는 경우, 용량은 폴리펩타이드, 조성물, 핵산 분자 또는 벡터의 효과를 최대화하기 위해 적절한 간격으로 투여될 수 있다.

[표 A-1]

[표 A-2]

[표 A-2.1]

[표 A-3]

[표 A-4]

[표 A-5]

[표 A-6]

실시예

1. IL-13 및 TSLP에 각각 특이적으로 결합하는 1가 ISVD의 생성

1.1 실시예 1: 면역화

중쇄 항체 의존 체액성 면역 반응을 유도하기 위해 3마리의 라마를 표준 프로토콜에 따라 재조합 인간 IL-13 (Peprotech, cat nr 200-13, 에스케리치아 콜리(E. coli)-유래됨)으로 면역화하였다. 또한, 이들 라마를 다른 공급원(Sino Biological, cat nrs 10369-HNAC 및 11057-CNAH, 포유류 세포 유래)의 인간/사이노 IL-13으로 부스팅하였다.

또 다른 3마리의 라마를 재조합 hTSLP-Fc로 면역화시켰다. 또한, 이들 라마를 사이노 TSLP-Fc로 부스팅하였다. 2마리의 추가 라마를 사이노 TSLP-Fc와 교대로 hTSLP로 면역화하였다.

면역 혈액(PBL) 샘플을 일정한 간격으로 채취하고, 단리된 B-세포로부터 총 RNA를 제조하였다. 체액성 면역 반응은 면역화 개시 전에 수집된 샘플의 항원 특이적 혈청 역가와 다중 항원 투여 후에 전형적으로 수집된 혈청 샘플을 비교함으로써 면역화 과정 동안 모니터링하였다. 간단히 말해서, 96-웰 Maxisorp 플레이트를 인간 IL-13(Sino Biological, cat nr 10369-HNAC) 또는 인간 TSLP로 코팅하였다. 재조합 인간 TSLP는 R&D Systems (cat nr 1398-TS) 등으로부터 상업적으로 이용 가능하다. 차단 및 희석된 혈청 샘플의 첨가 후, 항-IL-13 및 항-TSLP ISVD의 존재는 HRP(홀스래디쉬 퍼옥시다제) 접합된 염소 항-라마 면역글로불린(Bethyl Laboratories Inc.)을 사용하고 기질 TMB(3,3',5,5'-테트라멘틸벤지딘)의 존재하에 후속 효소 반응을 사용하여 입증되었다.

1.2 실시예 2: 라이브러리 구성 및 파지 표시 선택

제조사의 지침에 따라 Ficoll-Hypaque를 사용하여 혈액 샘플로부터 말초 혈액 단핵 세포를 제조하였다. 이들 세포와 림프절에서 추출한 총 RNA는 ISVD 암호화 유전자 단편을 증폭하기 위한 RT-PCR의 출발 물질로 사용되었다. 이들 단편을 파지미드 벡터 pAX212에 클로닝하였다. 파지는 표준 프로토콜(Antibody Phage Display: Methods and Protocols(First Edition, 2002, O'Brian and Aitken eds., Humana Press, Totowa, NJ)에 따라 제조하고, 추가 사용 시까지 필터 멸균 후 4℃에서 보관하였다. 5개의 파지 라이브러리를 IL13 용으로 작제하였으며, 라이브러리 크기는 6.1x10⁸ 내지 1.3x10⁹이고, 삽입 비율은 87 내지 96%이었다. 5개의 파지 라이브러리를 TSLP 용으로 작제하였으며, 라이브러리 크기는 4.2x10⁸ 내지 9.8x10⁸이고, 삽입 비율은 91 내지 100%이었다.

인간 및 사이노 IL-13을 인식하는 ISVD를 확인하기 위해, 파지 라이브러리를 인간 혈청(Sigma, I4506)으로부터의 IgG의 존재 하에 50 nM 가용성 비오틴화된 hIL13-Fc와 함께 인큐베이션하였다. hIL-13-Fc 및 파지의 복합체는 스트렙타비딘 코팅된 자성 비드 상의 용액으로부터 포획되었다. PBS/ 0.05% Tween20으로 광범위하게 세척한 후, 트립신(1 mg/ml)을 첨가하여, 결합된 파지를 용리시켰다. 이러한 라운드 1 선택의 산출물을 0.05, 0.5 또는 5 nM 가용성 비오티닐화된 hIL-13-Fc 또는 사이노 IL-13-Fc와 함께 인큐베이션하였다. 라운드 2 선택으로부터의 농축되지 않은 산출물은 라운드 3에서 0.005, 0.05, 0.5 또는 5 nM 가용성 비오티닐화된 인간 또는 사이노 IL-13-Fc와 함께 추가로 인큐베이션하였다. 농축된 라운드 2 및 라운드 3 선택으로부터 개별 클론을 뽑았다.

인간 및 사이노 TSLP를 인식하는 ISVD를 확인하기 위해, 파지 라이브러리를 인간 혈청(Sigma, I4506)으로부터의 IgG의 존재 하에 50 nM 가용성 비오티닐화된 hTSLP-Fc 또는 500 nM 비오티닐화된 hTSLP 또는 500 nM 비오티닐화된 사이노 TSLP와 함께 인큐베이션하였다. 인간 및 사이노 TSLP 서열이 알려져 있다(각각 Uniprot 수탁 Uniprot 수탁 Q969D9 및 NCBI RefSeq XP_005557555.1). 재조합 단백질을 사용하여 분석을 수행하였다. TSLP 및 파지의 복합체는 스트렙타비딘 코팅된 자성 비드 상의 용액으로부터 포획하였다. PBS/ 0.05% Tween20으로 광범위하게 세척한 후, 트립신(1 mg/ml)을 첨가하여, 결합된 파지를 용리시켰다. 이러한 라운드 1 선택의 산출물을 5 nM 가용성 비오티닐화된 hILTSLP-Fc 또는 사이노 TLSP-Fc 또는 0.5 nM 비오티닐화된 hTSLP와 함께 인큐베이션하였다. 이러한 라운드 2 선택의 산출물을 0.05, 0.5 또는 5 nM 가용성 비오티닐화된 인간 TSLP, TSLP-Fc 또는 사이노 TSLP-Fc와 함께 인큐베이션하였다. 각 라운드로부터 농축된 산출물로부터의 개별 클론을 뽑았다.

모든 개별 클론을 96개 딥 웰 플레이트(1 ml 부피)에서 성장시켰다. IPTG를 1 mM의 최종 농도로 첨가하여 ISVD 발현을 유도하였다. 세포 펠렛을 동결하고 100 μl PBS에 용해시켜 주변세포질 추출물을 준비하였다. 원심분리에 의해 세포 파편을 제거하였다.

대조군으로서, 선택된 주변세포질 추출물을 인간 및 사이노 IL13-Fc, 각각 TSLP-Fc에 대한 결합에 대해 ELISA에서 스크리닝하였다. 평가는 25 μl 형식의 Spectraplate 384-HB(PerkinElmer)에서 수행하였다. 항원을 4℃에서 PBS에서 1 μg/ml로 밤새 코팅하였다. 웰을 카제인 용액(1%)으로 차단하였다. 주변세포질 추출물의 5-배 희석액을 첨가한 후, 마우스 항-Flag-HRP(Sigma) 및 기질 esTMB(3,3',5,5'-테트라멘틸벤지딘)의 존재하의 후속 효소 반응을 사용하여 ISVD 결합을 검출하였다.

1.3 실시예 3: 인간 IL13 및 인간 TSLP를 사용한 AlphaScreen 분석에 의한 주변세포질 추출물에서 ISVD 차단에 대한 스크리닝

ISVD의 차단 능력을 결정하기 위해, AlphaScreen 기술(PerkinElmer, Waltham, MA USA)을 사용하여 다양한 단백질-기반 경쟁 분석에서 미정제 주변세포질 추출물을 스크리닝하였다. 680 nm의 여기 파장 및 520 nm의 방출 파장을 사용하여 EnVision 멀티라벨 플레이트 리더(PerkinElmer)를 사용하여 형광을 측정하였다.

hIL-13:hIL-13Rα1 이원 복합체 AlphaScreen에서, ISVD가 hIL-13과 hIL-13Rα1 세포외 도메인 간의 상호작용을 차단할 수 있는지 조사하였다. 이를 위해 주변세포질 추출물의 희석액을 비오티닐화된 hIL-13(Peprotech cat nr 200-13)과 함께 사전-인큐베이션하였다. 이 혼합물에 hIL-13Rα1-hFc(R&D systems; cat nr 146-IR) 및 항 hFc-결합 수여자 비드를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 추가로 인큐베이션한 다음, 스트렙타비딘-결합 공여자 비드를 첨가하고, 추가 1시간 인큐베이션하였다. 이원 복합체가 형성되면, 수여자와 공여자 비드가 근접하게 되고, 레이저 여기 시 감지가능한 신호가 생성된다. AlphaScreen 신호의 감소는 hIL-13Rα1에 대한 비오티닐화된 hIL-13의 결합이 주변세포질 추출물에 존재하는 ISVD에 의해 차단되었음을 나타낸다. 유사한 설정에서, ISVD가 hTSLP(eBioscience, cat nr 10-8499)와 hTSLPR 세포외 도메인(R&D Systems cat nr 981-TR) 간의 상호작용을 차단할 수 있는지 조사하였다.

hIL-13:hIL-13Rα1:hIL4Rα 삼원 복합체 AlphaScreen에서 ISVD가 hIL13:hIL13Rα1 이원 복합체로의 hIL4Rα 동원을 차단할 수 있는지 여부를 스크리닝하였다. hIL-13은 hIL-13Rα1에 결합하고, 이 이원 복합체는 hIL4Rα를 동원하여 삼원 복합체 hIL-13:hIL-13Rα1:hIL4Rα를 형성한다. 주변세포질 추출물의 희석액을 hIL-13(peprotech cat nr 200-13) 및 비오티닐화된 huIL4Rα(R&D Systems; cat nr 230-4R/CF)와 함께 사전-인큐베이션하였다. 이 혼합물에 hIL-13Rα1-hFc(R&D systems; cat nr 146-IR) 및 항 hFc-결합 수여자 비드를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 추가로 인큐베이션한 다음, 스트렙타비딘-결합 공여자 비드를 첨가하고, 추가 1시간 인큐베이션하였다. 삼원 복합체가 형성되면, 수여자와 공여자 비드가 근접하게 되고, 레이저 여기 시 감지가능한 신호가 생성된다. AlphaScreen 신호의 감소는 삼원 복합체의 형성이 주변세포질 추출물에 존재하는 ISVD에 의해 차단되었음을 나타낸다. 유사하게, ISVD가 hTSLP:hTSLPR:hIL7Rα 복합체(hIL7Rα source = Sino Biological cat nr 1095-H08H)의 형성을 차단할 수 있는지 조사하였다.

Alphascreen 분석(표 3 및 표 4)을 기반으로, 여러 차단 ISVD를 선택하고 시퀀싱하였다(표 1 및 표 2).

[표 1]

[표 2]

1.4 실시예 4: IL13 및 TSLP에 대한 주변세포질 추출물의 표면 플라스몬 공명 분석

항-IL13 또는 항-TSLP ISVD를 함유하는 주변세포질 추출물의 오프율은 Proteon XPR36 기기(Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 사용하여 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정하였다. 0.005% Tween20이 보충된 pH 7.4의 인산염 완충 식염수(PBS)를 실행 완충액으로 사용하고, 25℃에서 실험을 수행하였다.

활성화를 위한 유속 30 μl/분에서 EDC 및 NHS를 사용하여 아민 커플링에 의해 ProteOn GLC 센서 칩에 hIL13-Fc, 사이노 IL13-Fc, hTSLP-Fc 및 사이노 TSLP-Fc를 고정하였다. pH 5.0의 ProteOn 아세테이트 완충액에 IL13 단백질을 10 μg/ml로 주입하였다. pH 5.5의 ProteOn 아세테이트 완충액에 TSLP 단백질을 5 μg/ml로 주입하였다. 고정 후, 표면이 에탄올아민으로 비활성화되었다.

ISVD 후보물질의 주변세포질 추출물을 PBS-Tween20(0.1%)에서 10배 희석하고, 45 μl/분으로 2분 동안 주입하고, 900초 동안 해리되도록 두었다. 서로 다른 샘플 사이에서, 표면은 IL13의 경우 45 μl/분에서 2분간 인산(0.425%) 주입으로, 또는 TSLP의 경우 45 μL/분에서 1분간 글리신 pH3.0(5 mM)/SDS(0.25%) 주입으로 재생되었다. 상이한 주변세포질 추출물에 대해 얻은 센서그램으로부터 오프율을 계산하였다.

hIL-13-Fc 및 사이노 IL-13-Fc에 대한 오프율 분석은 표 3에 제시되어 있다.

[표 3]

hTSLP-Fc 및 사이노 TSLP-Fc에 대한 오프율 분석은 표 4에 제시되어 있다.

[표 4]

1.5 실시예 5: 항-IL-13 및 항-TSLP ISVD의 발현 및 정제

항-IL-13 ISVD 및 항-TSLP ISVD는 AlphaScreen 분석 및 오프율 값에서 그들의 차단 능력을 기반으로 하여 발현 및 정제를 위해 선택되었다. 서열은 표 1 및 2에 나타낸다.

ISVD는 이.콜라이(E. coli) TG1 세포에서 c-myc, His6-태그된 단백질로 발현되었다. 1 mM IPTG를 첨가하여 발현을 유도하고, 37℃에서 3시간 동안 계속 두었다. 세포 배양물을 스피닝한 후, 펠렛을 동결-해동하고 dPBS에서 재현탁하여 주변세포질 추출물을 제조하였다. 이러한 추출물은 니켈 세파로스(Nickel Sepharose) TM 6 FF 컬럼(Atoll)을 사용하는 고정 금속 친화도 크로마토그래피(IMAC)의 출발 물질로 사용하였다. ISVD는 250 mM 이미다졸을 사용하여 컬럼에서 용리되었으며, 후속적으로 dPBS로 탈염되었다. 아래에 설명된 세포-기반 분석의 경우, 50 mM 옥틸β-D-글루코피라노사이드(OGP, Sigma)의 존재 하에 겔 여과에 의해 내독소를 제거하였다. 내독소 수준은 표준 LAL-분석을 사용하여 결정하였다.

1.6 실시예 6: AlphaScreen 분석에서 정제된 항-IL13 및 항-TSLP ISVD의 차단 능력

실시예 3에 기재된 바와 같은 이원 및 삼원 복합체 AlphaScreen 분석을 사용하여, 실시예 5에 기재된 바와 같이 정제된 항-IL-13 및 항-TSLP ISVD의 IC50 값을 결정하였다. 주변세포질 추출물의 희석 대신, 500 nM에서 시작하여 1.8 pM까지 각각의 정제된 ISVD의 희석 시리즈를 IL-13 또는 TSLP와 함께 사전 인큐베이션하였다.

시험된 항-IL-13 ISVD는 표 5에 나타낸 바와 같은 IC50 값으로, 이 삼원 복합체의 형성을 억제하고 이원 복합체를 부분적으로 차단하였다.

[표 5]

시험된 항-TSLP ISVD는 표 6에 나타낸 바와 같은 IC50 값으로, 삼원 복합체의 형성을 완전히 억제하고 또한 이원 복합체의 형성을 억제하였다.

[표 6]

1.7 실시예 7: 세포-기반 분석에서 정제된 항-IL-13 및 항-TSLP ISVD의 차단 능력

항-IL-13 ISVD의 억제 효능은 TF-1 세포의 IL-13 매개 증식을 모니터링하는 세포-기반 분석에서 결정되었다. 이를 위해, TF-1 세포를 1/5 HEPES, 1/500 Na-피루베이트, 1/500 Glutamax 및 2 ng/mL 재조합 인간 GM-CSF가 첨가된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. TF-1 세포를 GM-CSF가 없는 성장 배지에서 웰당 40,000개 세포로 시딩하였다. 정제된 항-IL-13 ISVD 또는 참조 화합물의 희석 시리즈를 첨가하였다. 37℃에서 15분 인큐베이션한 후, 200 pM의 IL-13(Peprotech cat nr 200-13)을 첨가하였다. 96시간 후, EnVision 멀티라벨 리더(Perkin Elmer)에서 세포 적정기 96 Aqueous One Solution(Promega #G3580)을 사용하여 TF-1 세포의 증식을 결정하였다.

표 7에 나타낸 ISVD는 IL-13-유도된 TF1 증식을 억제한다.

[표 7]

항-TSLP ISVD의 차단 효능은 hTSLPR 및 hIL7Ra를 암호화하는 플라스미드로 형질감염된 BaF3 세포의 TSLP 매개 증식을 모니터링하는 세포-기반 분석에서 결정되었다. 세포를 세포 배양 처리된 백색 96웰 플레이트에서 RPMI 1640 성장 배지에서 20,000개 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 항-TSLP ISVD의 희석 시리즈를 첨가한 다음, 세포 자극을 위해 50 pM hTLSP-Fc 또는 50 pM 사이노 TSLP-Fc를 첨가하였다. 인간 및 사이노 TSLP 서열이 알려져 있다(각각 Uniprot 수탁 Uniprot 수탁 Q969D9 및 NCBI RefSeq XP_005557555.1). 재조합 단백질을 사용하여 분석을 수행하였다.

72시간 동안 인큐베이션한 후, CellTiter-Glo® 발광 세포 생존능 분석(Promega, G7571/G7572/G7573)을 사용하여 세포 밀도 및 생존력을 모니터링하고, EnVision 멀티라벨 리더(Perkin Elmer)에서 판독하였다. 결과는 표 8에 나타나 있다.

[표 8]

1.8 실시예 8: 인간 및 사이노 IL-13 및 TSLP에 대한 정제된 항-IL-13 및 항-TSLP ISVD의 결합 친화도

SPR에 의한 전체 결합 동역학 연구는 BIAcore T100 instrument(GE Healthcare)에서 수행하였다.

IL-13의 경우, 약 2000 RU의 hIL13-Fc 또는 4000 RU 사이노 IL13-Fc가 CM5 센서 칩에 직접 고정되었다. 그런 다음 ISVD를 120초 동안 다른 농도(3 μM 내지 12 nM)로 주입하고 900초 동안 해리시켰다. hIL-13-Fc 및 사이노 IL-13-Fc 표면의 재생은 0.85% H₃PO₄:MilliQ(1:1)의 47초 주입을 사용하여 수행하였다.

TSLP의 경우, 약 8000 RU의 항-huIgG 항체(GE Healthcare)를 CM5 센서 칩 상에 직접 고정하였다. hTSLP-Fc(1 μg/mL에서) 또는 사이노 TSLP-Fc(0.75 μg/mL에서)를 플로팅하고, 칩 위에 120초 동안 포획하였다. 그런 다음 ISVD를 120초 동안 다른 농도(0.4 nM 내지 3000 nM)로 주입하고 900초 동안 해리시켰다.

결합 곡선의 평가는 BIAcore T100 평가 소프트웨어 V2.0.3을 사용하여 수행하였다. 동역학 분석은 1:1 상호작용 모델(Langmuir 결합)을 피팅하여 수행하였다(Rmax = 전역; RI = 상수 = 0, 오프셋 = 0). 1:1 상호작용 모델에 대한 허용 기준을 충족할 수 없는 상호작용은 이종 리간드 핏 모델(RI = 상수 = 0, 오프셋 = 0)을 사용하여 피팅했다.

동역학 데이터는 IL-13 ISVD에 대한 표 9 및 TSLP ISVD에 대한 표 10에 제시되어 있다.

[표 9]

[표 10]

2. IL-13 및 TSLP에 각각 결합하는 단일특이적 다가 폴리펩타이드의 생성

2.1 실시예 10: 야생형 항-IL-13 2가 또는 바이파라토픽 ISVD 작제물의 생성 및 시험관내 특성화

선택된 항-IL-13 ISVD(F0107004B02 및 F0107004B06)를 바이파라토프 및 2가 ISVD 작제물로 포맷하였다. 작제물의 빌딩 블록은 가요성 35GS(GlySer) 링커에 의해 유전적으로 연결시킨다. ISVD는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 FLAG3-HIS6-태그된 단백질로 발현되었다(아미노산 서열은 표 14에 제시됨). 메탄올의 단계적 첨가에 의해 ISVD 작제물 발현의 유도가 발생하였다. 분비된 ISVD 작제물을 갖는 정화 배지를 고정화 금속 친화도 크로마토그래피(IMAC)의 출발 물질로 사용한 다음, 탈염하여 SDS-PAGE로 평가한 바와 같이 90% 순도를 얻었다.

바이파라토픽 및 2가 IL-13 작제물은 2원 및 3원 복합체 차단 AlphaScreen 분석(실시예 6에 설명됨) 및 TF-1 증식 분석(실시예 7에 설명됨)에서 특성화하였다. 이원 및 삼원 AlphaScreen 분석 및 TF-1 증식 분석에서 생성된 작제물 및 이들의 차단 효능에 대한 개요가 표 11에 제시되어 있다. 바이파라토픽 작제물은 항-hIL-13 참조 mAb1의 효능과 유사하게 hIL-13 및 cyIL-13에 대해 우수한 효능을 나타낸다. 또한 2가 작제물은 효능이 개선되지만 TF1 증식 분석에서 바이파라토픽 작제물 F010700029와 동일한 정도는 아니다. 또한, 2가 작제물은 IL13-IL13Rα1 Alphascreen에서 완전한 억제에 도달하지 않는다.

[표 11]

가장 강력한 항-IL-13 바이파라토픽 ISVD 작제물을 IL-13 유도 A549 에오탁신 방출 분석에서 테스트하였다. 이를 위해 A549 현탁 세포를 10% FCS가 보충된 Ham의 F12K 배지에서 배양하였다. 세포를 200,000개 세포/웰로 96웰 플레이트에 시딩하였다. 다음날 200 pM hIL-13(Sino Biological cat nr 10369-HNAC) 또는 사이노 IL-13(Sino Biological cat nr 11057-CNAH)을 첨가한 다음 ISVD 작제물의 희석 시리즈를 첨가하였다. 24시간 후, MSD ELISA(인간 에오탁신-3 조직 배양 키트(Meso Scale, K151ABB-1))를 사용하여 상청액에서 에오탁신-3을 측정하였다. 결과는 표 12에 나타나 있다.

[표 12]

항-IL-13 1가 및 바이파라토픽 ISVD 작제물이 IL13Rα2에 대한 hIL-13의 결합을 억제하는지 시험하기 위해 경쟁 ELISA를 사용하였다. IL13Rα2(SinoBiological cat nr 10350-H08H)를 384웰 스펙트라플레이트(Perkin Elmer)에 코팅하였다. hIL13-Fc(SinoBiological, cat nr 10369-H01H)를 ISVD 작제물 또는 양성 대조군 화합물 IL-13Rα2의 연속 희석액과 혼합하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 및 차단 후, 코팅된 수용체를 IL13-Fc ISVD/대조군 혼합물과 함께 인큐베이션하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 결합된 IL-13-Fc의 존재는 항-인간 IgG-퍼옥시다제 항체를 사용하여 검출되었고, 기질 esTMB의 존재 하에 후속 효소 반응이 검출되었다. ISVD가 IL-13-IL-13Rα2 상호작용을 억제하는 경우, IL-13-Fc의 검출은 용량 의존적으로 사라진다. 결과는 표 13에 나타나 있다.

[표 13]

[표 14]

2.2 실시예 11: 야생형 바이파라토픽 항- TSLP ISVD 작제물의 생성 및 특성화

선택된 TSLPR 차단제(F0107501A02 및 F0107529F10)를 바이파라토픽 ISVD 작제물과 조합하였다. 작제물은 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 FLAG3-HIS6-태그된 단백질로 발현되었다(아미노산 서열은 표 16에 제시됨). ISVD 작제물 발현의 유도는 메탄올의 단계적 첨가에 의해 발생하였다. 분비된 ISVD 작제물을 갖는 정화 배지를 고정화 금속 친화도 크로마토그래피(IMAC)의 출발 물질로 사용한 다음, 탈염하여 SDS-PAGE로 평가한 바와 같이 90% 순도를 얻었다.

바이파라토픽 작제물은 BaF3 증식 분석(실시예 7에 기술된 바와 같음)에서 50 또는 5 pM hTSLP 및 50 또는 5 pM 사이노 TSLP에 대해 정제된 단백질로서 적정하고, 상이한 항-TSLP 참조 화합물(항-hTSLP 참조 mAb2 및 항-hTSLP 참조 mAb1)과 비교하였다. 데이터는 표 15(hTSLP 및 사이노 TSLP)에 제시되어 있다. 바이파라토픽 작제물은 참조 mAb를 분명히 능가한다. N-말단에 F0107501A02가 있는 바이파라토픽 작제물은 C-말단에 F0107501A02가 있는 작제물과 비교하여 사이노 TSLP에 대해 개선된 반응성을 보여준다.

[표 15]

[표 16]

3. 항-IL-13 및 항-TSLP 1가 ISVD의 서열 최적화

3.1 실시예 12: 항-IL-13 및 항-TSLP 1가 ISVD의 서열 최적화

항-IL-13 ISVD F0107004B02 및 F0107004B06 및 항-TSLP ISVD F0107501A02 및 F0107529F10을 추가로 서열최적화하였다.

서열 최적화는 ISVD의 하나 이상의 (원하는) 특성을 개선하기 위해 서열에서 하나 이상의 특정 아미노산 잔기를 대체하는 것을 포함한다.

이러한 서열 최적화의 일부 예는 본원의 추가 설명에 언급되어 있으며, 예를 들어 제한 없이 다음을 포함한다:

1) 인간 VH3-JH 생식계열 컨센서스 서열과 더 동일한 ISVD 서열을 생성하기 위한 부모 야생형 ISVD 서열의 치환, 인간화라고 하는 과정. 이를 위해, ISVD와 인간 VH3-JH 생식계열 컨센서스 간에 상이한 FR에서 소위 홀마크 잔기를 제외하고는 특정 아미노산이 단백질 구조, 활성 및 안정성이 그대로 유지되는 방식으로 인간 대응물로 변경된다.

2) 낙타화로 정의되는 ISVD의 안정성을 높이기 위한 라마 생식계열로의 치환. 이를 위해, 부모 야생형 ISVD 아미노산 서열은 ISVD의 라마 IGHV 생식계열 아미노산 서열에 정렬된다(라마 IGHV 생식계열에 대한 ISVD의 BlastP 분석에서 최고 히트로 확인됨).

3) 장기 안정성 또는 저장 시 특성을 개선하는 치환, 원하는 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 발현 수준을 증가시키는 치환, 및/또는 다시 원하는 숙주 세포 또는 숙주 유기체에 따라 다른, (원하지 않는) 번역 후 변형(들)(예컨대 글리코실화 또는 인산화)을 제거하거나 감소시키는 치환. N-말단 피로글루타메이트 형성을 피하기 위해, 표준적으로 E1D 돌연변이가 효능 또는 안정성에 영향을 미치지 않으면서 다가 Nb의 N-말단 빌딩 블록에 도입된다. 따라서, 빌딩 블록의 서열 최적화 동안 E1D 돌연변이가 일관되게 도입되지 않는다.

4) 위치 11에서 Val에 대한 돌연변이 및 위치 89에서 Leu에 대한 돌연변이를 통해 임의의 자연 발생 기존 항체 활성의 결합을 최소화한다.

F0107004B02 및 F0107004B06

항-IL-13 ISVD F0107004B02의 서열 최적화는 부모 ISVD F107004B02와 비교하여, 8개의 아미노산 치환(즉, E1D, L11V, A14P, N64K, S65G, A74S, K83R, I89L)을 포함하는 최종 서열 최적화된 변이체 F027100019를 생성하였다. 항-IL-13 ISVD F0107004B06의 서열 최적화는 부모 ISVD F107004B06과 비교하여, 4개의 아미노산 치환(즉, L11V, R74S, K83R, V89L)을 포함하는 최종 서열 최적화된 변이체 F027100183를 생성하였다.

서열 최적화된 변이체는 PCR 중첩 확장 방법을 사용하여 올리고뉴클레오타이드로부터 조립되었다. 변이체는 이.콜라이(E.coli)에서 발현되었고, IMAC 및 탈염에 의해 정제하였다. F027100019 및 F027100183은 Peprotech의 hIL-13(cat nr 200-13)을 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 hIL-13 결합 능력에 대해 평가되었다. 또한, F027100019는 에오탁신 방출 분석에서 그의 중화 활성에 대해 테스트하였다. 두 변이체의 단량체 거동을 크기 배제-HPLC(SE-HPLC)로 모니터링하였다. 변이체의 열 안정성은 Lightcycler(Roche)를 사용하는 열 이동 분석(TSA)에서 테스트하였다. 이 분석에서, 부모 ISVD와 그의 변이체는 사이프로 오렌지가 있는 상태에서 다양한 pH에서 인큐베이션되고 온도 구배가 적용된다. ISVD가 변성되기 시작하면 사이프로 오렌지가 결합하고 측정된 형광이 갑자기 증가하며, 이로써 특정 pH에 대한 용융 온도를 결정할 수 있다. 결과는 표 17 및 표 18에 요약되어 있다.

[표 17]

F027100019는 에오탁신 방출 분석에서 좋은 효능을 보였고 hIL-13에 대한 그의 친화도는 SPR에서 34 nM인 것으로 결정되었다. F027100019의 Tm은 부모 ISVD F0107004B2보다 3℃ 더 높다. F027100019에 대한 프레임워크 영역의 % 프레임워크 동일성은 AbM 정의를 기반으로 하여 85%이고(문헌[Antibody Engineering, Vol2 by Kontermann & D

bel (Eds), Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010] 참조), Kabat 정의를 기반으로 하여 86%이다.

[표 18]

F027100183의 친화도는 WT 서열과 유사하고 변이체의 Tm은 61℃이다. 변이체는 SE-HPLC에서 100% 단량체 피크로 용리된다. F027100183에 대한 프레임워크 영역의 % 프레임워크 동일성은 AbM 정의를 기반으로 94.4%이고, Kabat 정의를 기반으로 93.1%이다.

F0107529F10

항-TSLP ISVD F0107529F10의 서열 최적화는 부모 ISVD F0107529F10과 비교하여, 8개의 아미노산 치환(즉, L11V, A14P, T60A, S71R, A74S, S79Y, K83R, V89L)을 포함하는 최종 서열 최적화된 변이체 F027400021을 생성하였다. 항-TSLP ISVD F0107501A02의 서열 최적화는 부모 ISVD F0107501A02와 비교하여, 6개의 아미노산 치환(즉, L11V, A14P, E16G, A74S, K83R, V89L)을 포함하는 최종 서열 최적화된 변이체 F027400160을 생성하였다.

서열 최적화된 변이체는 PCR 중첩 확장 방법을 사용하여 올리고뉴클레오타이드로부터 조립되었다. 작제물은 이.콜라이(E.coli)에서 발현되었고, IMAC 및 탈염에 의해 정제하였다. 변이체를 표면 플라즈몬 공명에 의해 인간 및 사이노 TSLP에 대한 결합 능력에 대해 평가하였다. 모든 변이체의 단량체 거동을 크기 배제-HPLC(SE-HPLC) 및 열 이동 분석(TSA)의 열 안정성에 의해 모니터링하였다. 또한, 삼원 복합체 Alphascreen에서 hTSLP에 대한 차단 활성에 대해 F0107501A02의 변이체를 테스트하였다. 결과는 표 19 및 표 20에 요약되어 있다.

[표 19]

돌연변이 A14P, T60A, S71R, A74S, S79Y, K83R을 갖는 중간 변이체 F010704099는 부모 ISVD F0107529F10과 비교하여 hTSLP에 대해 유사한 친화도 및 사이노 TSLP에 대해 2배 더 낮은 친화도를 나타냈다. Tm은 부모 ISVD와 비교하여 전체적으로 11.4℃ 증가했다. 2개의 추가 돌연변이, 즉 L11V 및 V89L이 기존 항체 결합을 최소화하기 위해 변이체 F010704099에 도입되어, 최종 변이체 F027400021이 생성되었다. F027400021에 대한 프레임워크 영역의 % 프레임워크 동일성은 AbM 정의를 기반으로 89.9%이고 Kabat 정의를 기반으로 88.5%이다.

[표 20]

돌연변이 A14P, E16G, A74S, K83R을 갖는 중간 변이체 F010704076은 부모 ISVD F0107501A02와 비교하여 hTSLP 및 사이노 TSLP에서 유사한 오프율을 보였고, 삼원 복합체 Alphascreen에서 유사한 효능을 보였다. Tm은 부모 ISVD와 비교하여 전체적으로 12.3℃ 증가했다. 2개의 추가 돌연변이, 즉 L11V 및 V89L이 기존 항체 결합을 최소화하기 위해 변이체 F010704076에 도입되어, 최종 변이체 F027400160이 생성되었다.

F027400160에 대한 프레임워크 영역의 % 프레임워크 동일성은 AbM 정의를 기반으로 83.1%이고 Kabat 정의를 기반으로 80.5%이다.

[표 21]

4. 다중특이적 ISVD 작제물 F027400161

상기 확인된 최적화된 ISVD F027100019(F0107004B02의 최적화된 변이체), F027100183(F0107004B06의 최적화된 변이체), F027400021(F0107529F10의 최적화된 변이체), 및 F027400160(F0107501A02의 최적화된 버전)을 다중특이적 ISVD 작제물 F027400161의 생성을 위해 사용하였다. F027400161에 사용된 최적화된 1가 빌딩 블록은 ISVD 기원에 따라 각각 04B02, 04B06, 529F10 및 501A02로 축약된 형식으로 지정된다.

4.1 실시예 15: 다중특이적 ISVD 작제물 생성

IL-13 및 TSLP에 결합하는 ISVD-함유 폴리펩타이드 F027400161(서열번호 1)의 확인은 데이터-기반 이중특이적 조작 및 형식화 캠페인에서 비롯되었으며, 여기서 여러 항-TLSP 빌딩 블록, 여러 항-IL13 빌딩 블록 및 항-HSA 빌딩 블록 ALB23002가 포함되었다. 빌딩 블록의 다른 위치/배향과 다른 링커 길이(9GS 대 35GS)가 적용되었고, 다른 매개변수(역가, 교차 반응성, 발현 수율 등)에 대해 중요한 것으로 입증되었다.

다양한 ISVD 작제물의 대형 패널이 소규모 생산을 위해 피치아 파스토리스(Pichia Pastoris)에서 변형되었다. 메탄올의 단계적 첨가에 의해 ISVD 발현의 유도가 발생하였다. 분비된 ISVD를 갖는 정화 배지를 단백질 A 친화도 크로마토그래피를 통한 정제를 위한 출발 물질로 사용한 후 탈염하였다. 정제된 샘플은 기능적 특성화 및 발현 평가에 사용되었다.

일부 작제물은 ISVD 빌딩 블록의 링커 길이 및 상대적 위치에 따라 손상된 효능을 보여주었다. 예를 들어: 항-TSLP 바이파라토픽 조합 501A02-529F10의 사이노 TSLP에 대한 효능은 짧은 9GS 링커와 연결될 때 강하게 손상된다. 일부 작제물은 빌딩 블록의 조합 및 순서에 따라 낮은 발현 수준을 보였다. 4B02-4B06을 포함하는 이중특이체의 경우 발현은 501A02-529F10과의 조합에서 가장 양호하였다.

[표 22]

표 23은 동일한 빌딩 블록을 포함하지만 상이한 방식으로 정렬되고 상이한 링커 길이로 연결된 6개의 작제물의 경우 저역가에서 고역가 범위의 상이한 수율이 수득되었음을 예시한다. 35GS 링커(F027400161 및 F027400163)를 통해 연결된 IL-13 ISVD 4B02 및 4B06을 포함하는 작제물에 대해 가장 높은 발현 역가가 수득된다. 또한, F027400161 및 F027400163의 용해도는 각각의 대응물 F027400296 및 298보다 훨씬 높았으며, 이 중 빌딩 블록은 4개의 9GS 링커와 연결되고 ALB는 C-말단에 위치한다.

후속적으로, 큰 이중특이적 패널은, 예비 수율 추정치를 기반으로 두 표적(인간 및 사이노) 모두에 대해 강력한 것으로 입증되고 높은 발현 수준의 가능성을 갖는 ISVD 작제물 F027400161 및 F027400163으로 구성된, 2개의 이중특이적 작제물의 패널로 축소되었다.

피치아 파스토리스(Pichia Pastoris)의 대규모 2L 및 5L 생산은 발현 수율 결정 및 생물물리학적 특성과 기존 항체 반응성 평가를 위해 수행하였다.

표 24 및 실시예 22는 기존 항체 반응성이 빌딩 블록의 배향 및 링커 길이에 의해 유도된다는 것을 입증한다.

[표 23]

[표 24]

마지막으로, ISVD 작제물 F027400161은 효능, 기존 항체에 대한 감소된 결합 및 우수한 발현 수준 및 CMC 특성을 기반으로 선택되었다.

4.2 실시예 16: TSLP, IL13 및 혈청 알부민에 대한 다중특이적 ISVD 작제물 결합 친화도

평형 해리 상수(K_D)로 표현된, 인간 및 사이노 TSLP(인간 및 사이노 TSLP 서열)에 대한 F027400161의 친화도가 알려져 있다(각각, Uniprot 수탁 Uniprot 수탁 Q969D9 및 NCBI RefSeq XP_005557555.1). 분석을 수행하는데 재조합 단백질을 사용하고, 인간 IL-13(Sino Biological cat nr 10369-HNAC), 사이노 IL-13(Sino Biological cat nr 11057-CNAH) 및 레서스 IL-13(R&D systems cat nr 2674-RM) 및 인간(Sigma Aldrich, cat nr A8763), 사이노 및 마우스(Albumin Bioscience cat nr N1204H1CM) 혈청 알부민을 Gyrolab xP Workstation(Gyros)에서 용액내 친화도 측정에 의해 정량화하였다.

K_D-제어 측정에서 TSLP 또는 IL-13(1 μM - 0.25 fM 범위) 또는 혈청 알부민(100 μM - 320 pM 범위) 및 고정량의 F027400161(TSLP 및 IL13의 경우 5 pM 또는 10 pM 및 혈청 알부민의 경우 20 nM)의 연속 희석액을 혼합하여, 상호작용을 허용시키고, (TSLP 및 IL13의 경우) 48 또는 72시간 동안, 그리고 (혈청 알부민의 경우) 2시간 동안 인큐베이션하여 평형에 도달시켰다.

수용체-제어 측정에서, TSLP 또는 IL-13(1 μM - 0.25 fM 범위) 또는 혈청 알부민(100 μM - 320 pM 범위) 및 고정량의 F027400161(TSLP의 경우 250 pM, IL-13의 경우 10 nM 및 혈청 알부민의 경우 1 μM)의 연속 희석액을 혼합하여, 상호작용을 허용시키고, (TSLP 및 IL13의 경우) 48 또는 72시간 동안, 그리고 (혈청 알부민의 경우) 2시간 동안 인큐베이션하여 평형에 도달시켰다.

비오티닐화된 인간 TSLP/IL-13/혈청 알부민을, 비드 컬럼을 포함하고 평형 용액에서 유리 F027400161을 포획하기 위한 분자 프로브로 사용되는 Gyrolab Bioaffy 1000 CD의 미세구조에서 포획되었다. TLSP/IL-13/혈청 알부민 및 F027400161의 혼합물(유리 TLSP/IL-13/혈청 알부민, 유리 F027400161 및 TLSP/IL-13/혈청 알부민 - F027400161 복합체 함유)을 비드를 통해 흐르게 하고, 적은 비율의 유리 F027400161이 포획되었으며, 이는 유리 ISVD 농도에 비례한다. 그런 다음 형광 표지된 항-V_HH 항체인, ABH0086-Alexa647을 주입하여 포획된 F027400161을 표지하고 과량의 형광 프로브를 씻어낸 후 형광 변화를 측정하였다. 희석 시리즈의 피팅은 Gyrolab 분석 소프트웨어를 사용하여 수행하였으며, 여기서 K_D- 및 수용체-제어 곡선을 분석하여 K_D 값을 결정하였다.

결과(표 25)는 다중특이적 ISVD 작제물이 인간/사이노 TSLP 및 인간/사이노/레서스 IL13에 높은 친화도로 결합함을 입증한다.

[표 25]

4.3 실시예 17: TSLP 및 IL13에 선택적으로 결합하는 다중특이적 ISVD 작제물

IL13 및 TSLP 관련 사이토카인으로서 IL-4 및 IL-7에 결합하는 F027400161의 부재는 각각 SPR(Proteon XPR36)을 통해 평가하였다.

사이토카인은 활성화를 위해 EDC/NHS를 80초 주입하고 비활성화를 위해 1M 에탄올아민 HCl을 150초 주입하여 아민 커플링을 사용하여 600초 동안 25 μg/mL의 프로테온 GLC 센서 칩에 고정하였다(ProteOn Amine Coupling Kit. cat. 176-2410). 활성화 및 비활성화 동안의 유속은 30 μl/분으로, 리간드 주입 동안에는 25 μl/분으로 설정하였다. 10 mM 아세테이트 고정 완충액의 pH는 IL13 및 IL4(Peprotech cat nr 200-07)의 경우 6.0이고, TSLP 및 IL7(R&D systems cat nr 204-IL/CF)의 경우 5.5였다.

다음으로, 1 μM의 F027400161을 2분간 주입하고, 45 μL/분의 유속으로 600초 동안 해리시켰다. 실행 완충액으로 PBS (pH7.4) + 0.005% Tween 20을 사용하였다. 양성 대조군으로, 100 nM α-hIL4 Ab 및 100 nM α-IL7 Ab를 주입하였다. F027400161과 고정된 표적을 가진 양성 대조군 사이의 상호작용은 결합 시 칩의 질량 변화의 결과로 발생하는 내화 지수의 증가를 검출하여 측정하였다.

모든 양성 대조군은 각각의 표적에 결합하였다. 인간 IL4 및 IL7에 대한 F027400161의 결합은 검출되지 않았다.

또한, F027400161이 TSLP의 짧은 형태에 결합할 수 있는지 조사하였다. 이를 위해, TSLP와 TSLP의 짧은 형태(Fornasa, 2015에 설명됨)는 위에서 설명한 대로 아민 커플링을 사용하여 150초 동안 10 μg/mL, 각각 5 μg/ml에서 proteon GLC 센서 칩에 고정하였다. 10 mM 아세테이트 고정 완충액의 pH는 TSLP의 경우 5.5이고, 짧은 형태의 TSLP의 경우 4.0이었다.

다음으로, 500 nM의 F027400161을 2분간 주입하고, 45 μL/분의 유속으로 600초 동안 해리시켰다. 실행 완충액으로 PBS (pH7.4) + 0.005% Tween 20을 사용하였다. 참조 화합물로 500 nM 항-hTSLP 참조 mAb1을 주입하고, 양성 대조군으로 500 nM α-hTSLP pAb(Abcam ab47943)를 주입하였다.

양성 대조군은 TSLP의 긴 형태(정상) 및 짧은 형태 모두에 결합했지만, TSLP의 짧은 형태에 대한 F027400161 및 항-hTSLP 참조 mAb1의 결합은 검출되지 않았다.

4.4 실시예 18: IL13, TSLP 및 HSA에 대한 다중특이적 ISVD 작제물의 동시 결합

F027400161이 hTSLP 및 hIL13에 동시에 결합할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 Biacore T200 기기를 사용하였다. 이를 위해, hTSLP(재조합 인간 TSLP는 R&D Systems(cat nr 1398-TS)와 같이 상업적으로 이용 가능함)를 아민 커플링을 통해 CM5 센서 칩에 고정하였다. TSLP 빌딩 블록 501A02-529F10을 통해 ISVD 작제물을 포획하기 위해 100 nM의 F027400161을 TSLP 표면에 10 μΙ/분으로 2분 동안 주입하였다. 후속해서, 100 nM의 hIL13(PeproTech, cat nr 200-13), HSA 또는 hOX40L 또는 1000 nM의 HSA를 주입하거나, 100 nM IL13 + 100 nM HSA, 100 nM IL13 + 1000 nM HSA, 100 nM OX40L + 100 nM HSA, 100 nM OX40L + 1000 nM HSA 또는 100 nM IL13 + 100 nM OX40L의 혼합물을 10 μl/분의 유속으로 2분간 주입한 후 300초 해리 단계가 뒤따랐다. 45 μΙ/분에서 0.5% SDS + 10 mM 글리신 pH3의 1분 주입으로 TSLP 표면을 재생하였다. 센서그램(도 1)은 F027400161이 TSLP에 포획된 후 반응 단위의 증가에 의해 나타난 바와 같이 인간 IL13, 인간 TSLP 및 HSA에 동시에 결합할 수 있음을 입증한다: IL13 단독에서 약 130 RU 증가, 100 nM HSA에서 약 60 RU 증가 및 1000 nM HSA 단독에서 약 350 RU 증가, IL13 및 100 nM HSA 혼합물의 경우 약 180 RU 증가, 및 IL13 및 1000 nM HSA 혼합물의 경우 약 500 RU 증가. HSA에 대한 F027400161의 더 낮은 친화도로 인해, 적절한 RU 증가 수준을 보려면 더 높은 농도의 HSA가 필요했다(실시예 16 참조).

실시예 19: 시험관내에서 IL13 유도된 에오탁신 방출의 다중특이적 ISVD 작제물 억제

다양한 관심 종(인간, 레서스 및 사이노몰구스 원숭이)으로부터의 가용성 IL13의 기능적 활성 및 F027400161에 의한 그의 억제는 A549 인간 폐암 세포에 의한 에오탁신 방출을 조사하는 세포 기반 분석을 사용하여 연구하였다.

이를 위해, A549 현탁 세포를 10% FCS가 보충된 Ham의 F12K 배지에서 배양하고, 400.000 세포/웰로 96 웰 플레이트에 시딩하였다. 24시간 인큐베이션 후, F027100161 또는 참조 화합물(항-hIL-13 참조 mAb1 및 항-hIL-13 참조 mAb2)의 희석 시리즈를 추가하였다. 20분 인큐베이션 후, 인간 IL13(Sino Biological cat nr 10369-HNAC), 사이노 IL13(Sino Biological cat nr 11057-CNAH) 또는 레서스 IL13(R&D Systems, cat nr 2674-RM-025)을 160 pM의 최종 농도로 첨가한다. 30 μM HSA 존재하에 24시간 동안 추가 인큐베이션한 후, 헤파린을 50 μg/ml의 최종 농도로 첨가하여 에오탁신 발현을 향상시킨다. 추가 4시간의 인큐베이션 후, 인간 CCL26/에오탁신-3 DuoSet ELISA(R&D systems, DY346)를 사용하여 세포 상청액에서 분비된 에오탁신-3을 정량화하였다.

F027400161은 194 pM(인간 IL13의 경우), 1040 pM(사이노 IL13의 경우) 및 713 pM(레서스 IL13의 경우)의 IC50으로 농도 의존적 방식으로 인간, 사이노 및 레서스 IL13 유도 에오탁신-3 방출을 억제하였으며, 이는 참조 화합물 항-hIL-13 참조 mAb1에 필적하며, 참조 화합물 항-hIL-13 참조 mAb2보다는 우수했다(표 26, 도 2).

[표 26]

4.5 실시예 20: HEK-Blue IL4/IL13 세포에서 IL13 유도된 STAT-6 활성화의 다중특이적 ISVD 작제물 억제

HEK293 세포를 인간 STAT6 유전자 및 STAT6-유도성 SEAP 리포터 유전자로 안정적으로 형질감염시켜 HEK-Blue™ IL-4/IL-13 세포를 생성시켰다. IL-4 및 IL-13 자극 시, 세포는 QUANTI-Blue™에 의해 정량화된 상청액에서 분비되는 STAT6-유도 SEAP를 생성한다.

HEK-Blue™ 세포를 10% FBS가 보충된 DMEM으로 배양하고 50,000개 세포/웰로 96웰 플레이트에 시딩하였다. F027100161 또는 참조 화합물(항-hIL-13 참조 mAb1 및 항-hIL-13 참조 mAb2)의 희석 시리즈를 10 pM hIL13(Sino Biological cat nr 10369-HNAC) 또는 사이노 IL-13(Sino Biological cat nr 11057-CNAH)과 함께 실온에서 1시간 동안 사전 인큐베이션하고, 세포에 첨가하였다. 30 μM HSA의 존재하에 22 내지 24시간 동안 인큐베이션한 후, 40 μl의 세포 세포 상청액을 160 μl QUANTI-Blue™와 혼합하였다. 분비된 SEAP는 Clariostar 기기에서 620 nm에서 흡광도를 측정하여 정량화하였다.

F027400161은 32.8 pM(인간 IL-13의 경우) 및 53.4 pM(사이노 IL-13의 경우)의 IC50으로 농도-의존적 방식으로 인간 및 사이노 IL-13 유도 SEAP 분비를 억제했으며, 이는 참조 화합물 항-hIL-13 참조 mAb2보다 양호했다(표 27, 도 3).

[표 27]

4.6 실시예 21: 시험관내에서 TSLP-유도된 Ba/F3 세포 증식의 다중특이적 ISVD 작제물 억제

다양한 관심 종(인간, 레서스 및 사이노몰구스 원숭이)으로부터의 가용성 TSLP의 기능적 활성 및 F027400161에 의한 그의 억제는 hTSLPR 및 hIL7Ra를 암호화하는 플라스미드로 형질감염된 BaF3 세포의 증식을 조사하는 세포-기반 분석을 사용하여 연구하였다.

세포를 세포 배양 처리된 백색 96웰 플레이트에서 RPMI 1640 성장 배지에서 15000개 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. F027100161 또는 참조 화합물(항-hTSLP 참조 mAb1)의 희석 시리즈를 첨가한 후 세포 자극을 위해 5 pM 인간 또는 사이노 TLSP를 첨가하였다. 인간 및 사이노 TSLP 서열이 알려져 있다(각각 Uniprot 수탁 Uniprot 수탁 Q969D9 및 NCBI RefSeq XP_005557555.1). 재조합 단백질을 사용하여 분석을 수행하였다. 30 μM HSA의 존재하에 48시간 동안 인큐베이션한 후, CellTiter-Glo® 발광 세포 생존능 분석(Promega, G7571/G7572/G7573)을 사용하여 세포 밀도 및 생존력을 모니터링하고, EnVision 멀티라벨 리더(Perkin Elmer)에서 판독하였다.

F027400161은 7.8 pM(인간 TSP의 경우) 및 24 pM(사이노 TSLP의 경우)의 IC50으로 농도-의존적 방식으로 Ba/F3 세포의 인간 및 사이노 TSLP 의존적 증식을 억제했으며, 이는 참조 화합물 항-hTSLP 참조 mAb1보다 훨씬 양호했다(표 28, 도 4).

[표 28]

4.7 실시예 22: 기존 항체에 결합하는 다중특이적 ISVD 작제물

ISVD 작제물 F027400161의 기존 항체 반응성은 ProteOn XPR36(Bio-Rad Laboratories, Inc.)을 사용하여 정상 인간 혈청(n=96)에서 평가하였다. PBS/Tween(인산염 완충 식염수, pH7.4, 0.005% Tween20)을 실행 완충액으로 사용하고, 실험을 25℃에서 수행하였다.

ISVD는 칩에 고정된 HSA에 ALB23002 빌딩 블록을 결합하여 칩에 캡처시킨다. HSA를 고정화하기 위해, ProteOn GLC 센서 칩의 리간드 레인을 EDC/NHS(유속 30 μl/분)로 활성화하고 HSA를 ProteOn 아세테이트 완충액 pH4.5에 100 μl/ml로 주입하여 대략 2900 RU의 고정화 수준을 제공한다. 고정화 후, 표면은 에탄올아민 HCl(유속 30 μl/분)로 비활성화시킨다.

후속해서, ISVD 작제물을 HSA 표면에 45 μl/분으로 2분 동안 주입하여 ISVD 포획 수준이 대략 800 RU가 되도록 한다. 기존 항체를 함유하는 샘플을 14,000 rpm에서 2분 동안 원심분리하고, 상청액을 PBS-Tween20(0.005%)에서 1:10으로 희석한 후 45 μΙ/분으로 2분 동안 주입한 후 후속 400초 해리 단계를 수행한다. 각 주기 후(즉, 새로운 ISVD 캡처 및 혈액 샘플 주입 단계 전), HSA 표면은 45 μl/분에서 HCl(100 mM)의 2분 주입으로 재생된다. 기존 항체 결합을 나타내는 센서그램은 1) ISVD-HSA 해리 및 2) 참조 리간드 레인에 대한 비특이적 결합을 빼서 이중 참조 후 얻는다. 기존 항체의 결합 수준은 보고 지점을 125초(결합 종료 후 5초)로 설정하여 결정된다. 기존 항체 결합의 감소율은 참조 ISVD의 125초에서의 결합 수준에 대해 계산된다.

각 빌딩 블록 및 C-말단 알라닌에 돌연변이 L11V 및 V89L의 도입에 의해 감소된 기존 항체 결합에 대해 최적화된 5가 ISVD 작제물 F027400161은 대조군 비최적화 5가 ISVD 작제물 F027301186과 비교하여 기존 항체에 대한 결합이 실질적으로 더 적게 나타난다(표 24 및 도 5).

기존 항체 결합은 빌딩 블록의 배향과 다중특이적 작제물에 존재하는 링커 길이에 따라 달라진다. 표 24 및 도 5는 작제물 F027400161이 이의 특이적 배향으로 인해 작제물 F027400163보다 더 낮은 기존 항체 반응성을 나타내지만, F027400164는 전체에 걸쳐 짧은 링커로 인해 F027400161보다 더 낮은 반응성을 나타낸다는 것을 입증한다.

4.8 실시예 23: F027400161은 시험관내에서 인간 수지상 세포에서 TSLP-유도된 CCL17을 차단한다

2형 염증 캐스케이드는 상황에 따라 상피 세포, 수지상 세포, 2형 헬퍼 T 세포(Th2 세포), 비만 세포 및 선천 림프 세포의 협력 작용에 의해 시작되고 전파된다. 사이토카인 흉선 기질 림프포이에틴(TSLP)은 수지상 세포(DC)를 활성화하는 그의 능력을 통해 알레르기 염증의 시작 및 진행에 연루되어 있다. TSLP에 의해 활성화되면, 인간 DC는 Th2-관련 케모카인인 CCL17을 생성하고, 나이브 CD4⁺ T 세포로부터 Th2 세포 분화를 유도한다. F027400161은 TSLP와 IL-13을 모두 표적으로 하고, TSLP와 DC 사이의 상호작용을 차단할 수 있어, CCL-17 생산을 감소시키고 2형 염증성 질환 및 그 이상에서 효능을 부여할 것으로 예상된다.

TSLP-유도된 CCL17 생산을 억제하는 F027400161의 능력은 참조 단일특이적 항체인 항-hTSLP 참조 mAb1과 비교하여 8명의 개별 건강한 공여자로부터 단리된 인간 DC에서 평가하였다. 인간 DC(CD3^-CD14^-CD11c⁺HLA-DR^high)를 단리하고, 버피 코트(인간 백혈구 팩) 샘플의 건강한 인간 PBMC에서 농축하였다. 총 0.5~0.8x10⁶ DC/웰을 8개의 3배 연속 희석 농도의 F027400161(400 ng/mL 또는 5.714 nM 최고 농도) 또는 8개의 4배 연속 희석 농도의 항-hTSLP 참조 mAb1(4000 ng/mL 또는 27 nM 최고 농도)과 함께 37℃ 세포 배양 인큐베이터에서 36시간 동안 4 ng/mL의 재조합 인간 TSLP로 자극하기 전에 인큐베이션하였다. 재조합 인간 TSLP는 R&D Systems (카탈로그 번호 1398-TS)와 같이 상업적으로 이용 가능하다. 새로 수집된 세포 배양 상청액에서의 CCL17 생산을 ELISA에 의해 측정하고, ISVD 작제물 및 벤치마크 항체의 IC₅₀ 값을 Graphpad Prism에서 계산하였다

인간 DC에서 F027400161 및 항-hTSLP 참조 mAb1의 용량 억제 반응의 집합적 결과는 도 6에 도시되어 있다. 참조 단일특이적 항체 항-hTSLP 참조 mAb1은 793.4 pM의 평균 IC₅₀ 농도에서 TSLP 유도 CCL17 생산을 억제한 반면, F027400161은 53.26 pM의 평균 IC₅₀으로 TSLP 유도 CCL17 생산을 억제하였다.

결론적으로, 이러한 결과는 ISVD 작제물 F027400161이 항-hTSLP 참조 mAb1과 비교하여 인간 DC에서 TSLP-유도된 CCL17 반응을 억제하는 데 더 강력하다는 것을 입증한다.

4.9 실시예 24: F027400161은 시험관 내에서 인간 PBMC에서 0.5 ng/mL [IL-13+TSLP] 유도 상승적 CCL17을 차단한다

흉선 기질 림프포이에틴(TSLP) 및 인터루킨-13(IL-13)과 같은 2형 사이토카인은 천식 및 아토피 피부염(AD) 병태생리를 유발하기 위해 독특하고 부가적이며 상승적인 반응을 발휘한다. 2형 면역 캐스케이드의 상피 세포-유래 개시제로서의 TSLP 및 다운스트림 이펙터 사이토카인으로서의 IL-13의 역할은 광범위하게 검증되었다. F027400161은 TSLP와 IL-13을 모두 표적으로 하여 2형 매개 염증성 질환 및 그 이상에서 효능을 부여할 것으로 예상된다.

F027400161이 0.5 ng/mL의 IL-13 및 TSLP-유도된 CCL17(TARC)의 상승적 생산을 억제하는 능력을 8명의 건강한 공여자의 인간 PBMC에서 평가하였다. 이 연구는 단일특이적 생물학적 제제, 항-hTSLP 참조 mAb1 및 항-hIL-13 참조 mAb1에 대한 ISVD 작제물의 비열등성을 평가하도록 설계되었다. 인간 PBMC의 웰당 백만 세포를 0.5 ng/mL의 재조합 인간 TSLP(재조합 인간 TSLP는 R&D Systems(cat nr 1398-TS)와 IL-13(R&D Systems, cat nr 213-ILB-005/CF)에서와 같이 상업적으로 이용 가능함)으로 자극시키고, 10개의 3배 연속 희석 농도의 ISVD 작제물(10 nM 최고 농도), 항-hIL-13 참조 mAb1(10 nM 최고 농도) 및 항-hTSLP 참조 mAb1(100 nM 최고 농도)과 함께 96웰 플레이트에서 37℃ 세포-배양 인큐베이터에서 20시간 동안 인큐베이션하였다. 분석은 F027400161에 대해 각 공여자 내에서 기술적 삼중으로 수행되었다. 사용된 사이토카인의 농도는 정상 인간, 천식 및 아토피 피부염 환자의 혈청, BAL액, 객담 및 피부에서 보고된 문헌 값의 표준 오차의 2배 이내였다(문헌[Berra

es A et al, Immunol Letter 178: 85-91, 2016]; [Bellini A et al, Mucosal Immunology 5(2):140-9, 2012]; [Davoodi P et al, Cytokine 60(2):431-7, 2012]; [Szegedi K et al, J Eur Acad Dermatol Venereol 29(11):2136-44, 2015]). 새로 수집한 세포 배양 상청액에서의 CCL17 생산을 Meso Scale Diagnostics(MSD) V-PLEX 인간 TARC 키트로 측정하였다.

F027400161 및 벤치마크 항체, 항-hIL-13 참조 mAb1 및 항-hTSLP 참조 mAb1의 용량 억제 반응의 집합적 결과는 도 7에 도시되어 있다. F027400161은 0.0061 nM의 평균 IC₅₀으로 0.5 ng/mL IL-13+TSLP-유도 상승적 CCL17 생산의 100% 억제를 입증하였다. 참조 항체 항-hIL-13 mAb1은 0.0028 nM의 더 낮은 평균 IC₅₀을 가짐에도 불구하고 등몰 용량의 F027400161에서 상승작용적 CCL17 반응을 완전히 차단할 수 없었고, 대략 80% 억제에서 정체되었다. 반면에, 항-hTSLP 참조 mAb1은 평균 IC₅₀이 2.932 nM으로 CCL17 생산의 약 50%만 차단할 수 있었다.

결론적으로, 이러한 결과는 F027400161이 항-hTSLP 참조 mAb1보다 더 강력하고 항-hIL-13 참조 mAb1에 비해 인간 PBMC에서 병태생리학적 관련 농도의 IL-13 및 TSLP-유도된 상승적 반응을 차단하는 데 우수함을 입증하며, 천식 및 아토피 피부염과 같은 2형 염증성 질환의 치료를 위한 치료 가능성을 강조한다.

4.10 실시예 25: F027400161은 시험관 내에서 인간 PBMC에서 5 ng/mL [IL-13+TSLP] 유도 상승적 CCL17을 차단한다

F027400161이 5 ng/mL의 IL-13+TSLP-유도된 CCL17 생산을 억제하는 능력을 8명의 건강한 공여자의 인간 PBMC에서 평가하였다. 이 연구는 단일특이적 생물학적 제제, 항-hTSLP 참조 mAb1 및 항-IL-13 참조 mAb1에 대한 ISVD 작제물의 비열등성을 평가하도록 설계되었다. 사용된 사이토카인의 농도는 정상 인간, 천식 및 아토피 피부염 환자의 문헌에서 일과성 염증 상태 동안의 가상 농도로써 보고된 TSLP 및 IL-13의 병태생리학적 범위의 상한에 비해 약 10배였다(문헌[Berra

es A et al, Immunol Letter 178: 85-91, 2016]; [Bellini A et al, Mucosal Immunology 5(2):140-9, 2012]; [Davoodi P et al, Cytokine 60(2):431-7, 2012]; [Szegedi K et al, J Eur Acad Dermatol Venereol 29(11):2136-44, 2015]). 인간 PBMC의 웰당 백만 세포를 5 ng/mL의 재조합 인간 TSLP와 IL-13(R&D Systems, cat nr 213-ILB-005/CF)으로 자극시키고, 10개의 3배 연속 희석 농도의 F-27400161(10 nM 최고 농도), 항-hIL-13 참조 mAb1(10 nM 최고 농도) 및 항-hTSLP 참조 mAb1(100 nM 최고 용량)과 함께 96웰 플레이트에서 37℃ 세포-배양 인큐베이터에서 20시간 동안 인큐베이션하였다. 분석은 F027400161에 대해 각 공여자 내에서 기술적 삼중으로 수행되었다. 새로 수집한 세포 배양 상청액에서의 CCL17 생산을 Meso Scale Diagnostics(MSD) V-PLEX 인간 TARC 키트로 측정하였다.

F027400161 및 벤치마크 항체, 항-hIL-13 참조 mAb1 및 항-hTSLP 참조 mAb1의 용량 억제 반응의 집합적 결과는 도 8에 도시되어 있다. F027400161은 0.0387 nM의 평균 IC₅₀으로 5 ng/mL IL-13+TSLP-유도 상승적 CCL17 생산의 100% 억제를 입증하였다. 등몰 용량의 비교 항체 항-hIL-13 참조 mAb1로 처리된 PBMC는 0.01339 nM의 더 낮은 평균 IC₅₀을 나타내었지만, 억제 반응은 결코 100%에 도달하지 않았고 대략 90% 억제에서 정체되었다. 반면에, 항-hTSLP 참조 mAb1은 평균 IC₅₀이 19 nM으로 CCL17 생산의 약 40%만 부분적으로 차단하였다.

결론적으로, 이러한 결과는 F027400161이 사이토카인의 병태생리학적 범위를 뛰어넘어 10배의 [TSLP+IL-13] 농도에서 인간 PBMC에서 IL-13 및 TSLP-유도 상승적 CCL17 반응을 차단하는 데 있어 항-hTSLP 참조 mAb1 및 항-hIL-13 참조 mAb1보다 우수하다는 것을 입증하며, 이는 급성 또는 염증 단계에서 천식 및 아토피 피부염 치료에 대한 치료 가능성을 강조한다.

4.11 실험예 27: T027400161은 삼중배양 분석 시스템에서 IL-5, CCL17, 및 CCL26의 알레르겐 Der P-유도 생성을 차단한다

TSLP는 CCL17, IL-5, 및 IL-13 생성을 유도하여 2형 면역 반응을 유도한다. 이후, IL-13은 국소 상피 세포에 의한 CCL26 생성을 유발하여, 2형 면역 반응 매개 염증성 질환 및 그 이상의 결과를 초래한다.

F027400161의 TSLP-유도 IL-5 및 CCL17, IL-13-유도 CCL26 생산을 억제하는 능력은 6명의 개별 정상 공여자의 Der P-자극 인간 PBMC와 6일 동안 공동 배양하는 MRC5 섬유아세포 및 A549 상피 세포를 사용하는 삼중배양 분석 시스템에서 평가하였다. 이 연구는 단일특이적 생물학적 제제, 항-hTSLP 참조 mAb1 및 항-hIL-13 참조 mAb1에 대한 ISVD의 비열등성을 평가하도록 설계되었다. MRC5 섬유아세포는 약 100 pg/mL의 내인성 TSLP를 구성적으로 생성했으며, A549 상피 세포는 Der P 및 내인성 TSLP 자극으로 PBMC에 의해 생성된 IL-13에 반응하여 CCL26을 생성했다. 인간 PBMC와의 공동배양 하루 전에, 웰당 75,000 MRC5 섬유아세포 및 A549 상피 세포를 플레이팅하였다. 플레이팅된 MRC5 섬유아세포 및 A549 상피 세포에 인간 PBMC의 웰당 100만 세포를 첨가하고, 3 μg/mL의 Der P로 자극하고, 37℃ 세포-배양 인큐베이터에서 6일 동안 24-웰 플레이트에서 11.1 nM의 ISVD, 항-hIL-13 참조 mAb1, 또는 항-hTSLP 참조 mAb1과 함께 인큐베이션하였다. 분석은 F027400161에 대해 각 공여자 내에서 기술적 삼중으로 수행되었다. 새로 수집된 세포 배양 상청액에서 IL-5, CCL17 및 CCL26의 생산은 RnD System의 Human Magnetic Luminex Assays에 의해 측정하였다.

F027400161 및 벤치마크 항체, 항-hIL-13 참조 mAb1 및 항-hTSLP 참조 mAb1의 억제 반응의 집합적 결과는 도 9에 도시되어 있다. F027400161은 CCL17의 60% 억제, IL-5의 50% 억제 및 CCL26 생산의 95% 억제를 입증하였다. 참조 항체 항-hTSLP 참조 mAb1은 CCL17의 50% 억제, IL-5의 50% 억제 및 CCL26 생산의 대략 55% 억제를 나타냈다. 항-hIL-13 참조 mAb1은 CCL26 생산에 대한 필적할만한 95% 억제를 보여주지만, 이 참조 항체는 CCL17 생산의 약 35%와 IL-5 생산의 10% 미만만 차단할 수 있었다(도 9). 이러한 시험된 분자에 의한 IL-5 및 CCL17의 완전한 억제의 부족은 Der P 자극이 PBMC를 유발하여 TSLP 및 IL-13 이외의 경로를 유도하여 IL-5 및 CCL17의 생산을 유도함을 시사할 수 있다.

결론적으로, 이러한 결과는 조직 구조 세포와 함께 배양된 인간 PBMC로 구성된 복잡한 분석 시스템에서 항-TSLP/IL-13 ISVD F027400161이 3가지 사이토카인 및 케모카인(CCL17, IL-5 및 CCL26)을 차단하는 그의 능력에 의해 항-hTSLP 참조 mAb1 및 항-hIL-13 참조 mAb1보다 우수함을 입증하며, 천식 및 아토피 피부염과 같은 2형 염증성 질환의 치료 및 광범위한 면역학적 질환 징후에 대한 치료 가능성을 강조한다.

4.12 실시예 26: F027400161 매개된 표적 점유율 및 생체내 약력학을 평가하기 위한 NSG-SGM3 마우스 모델

F027400161은 인간 TSLP와 IL-13을 모두 표적으로 하며, 뮤린의 오르토로그와 교차 반응하지 않는다. 따라서, F027400161의 생물학적 활성을 평가하기 위해, 이종이식된 인간화 모델 시스템을 사용하였다. 암컷 NSG-SGM3(NOD/SCID-IL2Rγ/, NOD.Cg-PrkdcscidIl2rγtm1Wjl/SzJ)은 Jackson labs, Bar Harbor, ME, USA로부터 입수하였다. 이 마우스는 인간 조혈 사이토카인: 줄기 세포 인자(SCF), 과립구/대식세포 자극 인자(GM-CSF) 및 인터루킨-3(IL-3)을 발현하며, 이들은 모두 인간 사이토메갈로바이러스 프로모터/인핸서 서열에 의해 유도된다. 삼중 형질전환 마우스는 세포 증식 및 생존 신호를 제공하고 CD33+ 골수 계통 및 여러 유형의 림프 세포의 안정적인 생착을 지원하는 상기의 사이토카인을 구성적으로 생성한다. 간단히 말해서, 생착을 위한 프로토콜은 다음과 같다:

연구 0일째에 마우스에 1분 15초 동안 120 rads/분의 속도로 150 센티그레이를 조사하였다. 생착 후 대략 6시간에 200 μl의 둘베코 인산염 완충 식염수(DPBS)에서 정맥내(IV) 경로에 의해 마우스를 1x10⁵ 제대혈 CD34+ 줄기/전구 세포로 생착시켰다. 마우스의 한 그룹은 동일한 방식으로 조사되었지만 생착되지는 않았다. 이들 마우스는 조사된 나이브 마우스로 고려된다. 생착 후 88일째에, 마우스는 식염수(생착된 대조군 마우스) 또는 50 μg의 TSLP 미니서클 DNA와 함께 50 μg의 IL-4 미니서클 DNA를 유체역학(HDD) 정맥내 주입받았다. 91일째에, 턱밑 채혈을 수행하고 각 마우스에서 100 내지 150 μl의 혈액을 채취하여 리튬 헤파린 튜브에 넣었다. 유세포 분석으로 생착 검사를 수행하고, IL-4 및 TSLP의 혈장 수준을 평가하였다. 생착 확인 및/또는 사이토카인 측정으로부터의 정보를 사용하여 연구에서 마우스를 선택(할당 또는 제거)하였다. 인간 CD45+ 세포가 25% 미만인 생착된 대조군으로부터의 마우스를 연구에서 제거했다. 유사하게, 미니서클 DNA를 받고 평균 미만의 혈장 TSLP 수준 1 표준 편차를 나타내는 생착된 마우스도 연구에서 제거되었다. 미니서클 DNA를 HDD 정맥내 주입받은 마우스는 95, 97, 99, 및 101일째에 비히클(20 mM 포스페이트, 125 mM L-아르기닌 HCL 및 0.01% 트윈 20 pH 7.0) 또는 F027400161(0.01, 0.05, 0.1, 또는 10 mg/kg)의 피하 용량을 받았다. 103일째에, 마우스를 이소플루란 마취로 마취시켰다. 이소플루란 마취 하에 안와후 출혈로 혈액을 채취했다. 채혈 후, 여전히 이소플루란 마취 상태에서 마우스를 경추 탈구로 종결시켰다. 폐의 일부를 수확하고, 나중에 유전자 발현 평가를 위해 RNA에 넣었다. 103일째 혈장 샘플로부터의 인간 TSLP의 혈장 수준은 MSD 키트 평가(Cat# K15067-L-2, Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD, USA)에 의해 결정하였다. 103일째 혈장 샘플로부터 인간 IL-13의 혈장 수준을 ELISA(Cat# 88-7439--88Human IL-13 ELISA 키트, Invitrogen/Thermo-Fischer, Waltham, MA, USA)에 의해 결정하였다. 내부 분석 검증 실험은 인간 TSLP 및 IL-13 검출 키트 모두 F027400161 결합 hTSLP 및 hIL-13을 검출할 수 없음을 입증했다.

도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같은 이러한 실험의 집합적 결과는 F027400161이 인간화 NSG-SGM3 마우스의 혈장에서 인간 TSLP 및 IL-13의 검출 가능한 수준을 유의하게 억제할 수 있음을 입증하여, 인간 TSLP 및 인간 IL-13 모두에 대한 표적 점유를 입증한다.

NSG-SGM3 마우스 모델에서, TSLP 및 IL-4 cDNA의 유체역학적 전달은 인간 IL-13의 발현을 활성화한다(도 11). F027400161의 약력학적 효과는 마우스 IL-13 수용체를 통해 신호를 보내는 인간 IL-13의 능력을 이용하여 NSG-SGM3 연구에서 유도된 샘플을 사용하여 연구되었다(문헌[Hershey GK. 2003, J Allergy Clin Immunol.;111(4):677-90]). 이 연구에서, F027400161 처리가 인간 IL-13 조절 마우스 유전자 전사체에 미치는 영향을 연구하였다. 위 연구로부터의 마우스 폐 조직을 이 분석에 사용하였다.

처리 및 대조군 NSG-SGM3 마우스로부터의 폐를 수확하고 처리하여 첨부된 프로토콜에 자세히 설명된 대로 RNA를 제조하였다. RNA는 TaqMan에 의한 정량화를 위해 처리되었고, 데이터는 프로토콜에 설명된 대로 분석되었다. 간단히 말해서, 마우스에서 채취한 폐를 RNALater에 저장하고, 표준 프로토콜에 따라 처리 및 정제하여 고품질 RNA를 생성했다. 그런 다음 제조업체의 프로토콜에 따라 Quanta Q-Script 5X 마스터 믹스를 사용하여, 상기 정제된 폐 RNA를 cDNA로 역전사했다. 수득된 폐 cDNA를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 TaqMan 분석을 사용하여 인간 IL-13 반응성 마우스 표적 유전자(마우스 Retnla 및 마우스 Clca1) 및 내인성 대조군(Rp137a)의 전사체 발현 수준을 정량화하였다. 데이터 분석은 Quantstudio 6&7 flex 소프트웨어에서 수행하였다. 각 프로브에 대해, C_T 값 및 델타 C_T 값(Rp137a에 대해)을 엑셀(Excel)로 내보내고, 다음 식을 사용하여 각 유전자에 대한 상대 발현 값을 계산하였다:

정규화된 상대 발현 = (Power(2, -(delta CT)))*1000.

평가된 2개의 인간 IL-13 조절 마우스 유전자는 폐혈관 리모델링에 역할을 하는 Retnla(Resistin 유사 알파) 및 Clca1(염화물 채널 액세서리 1)이었다(문헌[Lewis CC, 2009, J Allergy Clin Immunol.;123(4):795-804]).

도 12 및 13에 도시된 바와 같은 이러한 실험의 집합적 결과는 F027400161이 마우스 Retnla 및 마우스 Clca1 전사체 발현을 유의하게 억제할 수 있음을 입증하여, 인간 IL-13 유도된 마우스 전사체 반응에 대한 F027400161의 생체내 약력학 효과를 입증한다.

방법:

샘플 균질액 준비:

마우스에서 폐를 채취하여 나중에 RNA에 저장했다. 그 다음, 폐엽을 건조시키고 1 mL RLT+2-ME를 함유하는 fastprep 용해 매트릭스 A 튜브(폐 균질화용)로 옮겼다. 샘플은 프로그램 1을 사용하여 MP-Bio 균질화기에서 균질화되었다(샘플 가열을 피하기 위해 5분 간격으로 2회의 40초 주기). 그런 다음 샘플을 10,000 g에서 3분 동안 스피닝하였다. 용해물 350 ul를 수집했다[RLT + 2ME (1% v/v)에서]. 다중 채널을 여러 번 사용하여 피펫(~20x)하여 세포를 용해시킨다.

RNA-준비:

RNA 정제를 위해 350 ul 균질액을 사용하였다. 1X 부피(350 ul)의 70% 에탄올을 첨가하고, 균질액을 완전히 혼합하고, 용출 플레이트에 배치된 96웰 RNeasy 스핀 플레이트로 옮기고, 다음과 같은 변형을 통해 Qiagen RNA 미니 조직 RNA 추출 프로토콜을 사용하여 RNA를 준비했다. 96 웰 플레이트를 밀봉 가능한 알루미늄 호일로 덮고, 4000 x g에서 2분 동안 원심분리하였다. 컬럼을 세척하기 위해, 400 μl 완충액 RWT를 RNeasy 스핀 컬럼에 첨가하고, 스핀-컬럼 플레이트를 4000 x g에서 실온에서 2분 동안 원심분리하였다. 80 ul의 1X DNAse I 혼합물을 첨가하고 실온에서 15분 동안 인큐베이션하여 DNAse I 분해를 수행했다. 400 ul 완충액 RWT를 첨가하고 플레이트를 4000 x g에서 2분 동안 스피닝하여 DNAse I을 씻어내었다. 그 다음 500 ul의 완충액 RPE와 80% 에탄올로 스핀 플레이트를 세척했다. 이어서 4분 동안 4000 x g에서 스피닝하여 컬럼 막을 건조시켰다. 그런 다음, RNA를 40 μl Tris HCl(10mM; pH-8.0)에서 용출시켰다. Nanodrop을 사용하여 RNA를 정량화하고, cDNA 제조에 500 ng RNA를 사용하였다.

제1 가닥 합성:

Quanta Q-Script 5X 마스터 믹스를 사용하고, 제조업체의 프로토콜을 사용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA의 최종 농도는 25 ng/ul였다. cDNA는 TaqMan 분석이 수행될 때까지 -20℃에서 저장하였다.

TaqMan 분석:

다음 순서로 성분들을 추가하여 1.5 ml 미세원심분리기 튜브에서 TaqMan 멀티플렉스 마스터 믹스를 준비했다. 내부 Rpl37a 대조군과 함께 각 프로브 세트에 대해 3개의 개별 마스터 믹스를 제조하였다. 각각의 다중 qPCR 반응은 10 μl 반응 부피에서 수행되었다.

각 샘플에 대해 총 8.8 ul의 마스터 믹스를 384-웰 광학 플레이트의 적절한 웰에 첨가하였다. 30 ng (1.2 ul) cDNA 샘플을 각 웰에 첨가했다. TaqMan 분석은 QuantStudio 7K에서 설정하였다. 써모 사이클러의 조건은 다음과 같았다: 95℃에서 3분 동안 사전 변성, 95℃에서 2초 동안 변성 주기 40회, 및 60℃에서 5초 동안 어닐링 및 확장. 확장 단계 동안 형광 측정을 수행하였다.

데이터 분석:

데이터 분석은 Quantstudio 6&7 flex 소프트웨어에서 수행하였다.

각 프로브에 대해, CT 값 및 델타 CT 값(Rp137a에 대해)을 엑셀(Excel)로 내보내고, 다음 식을 사용하여 각 유전자에 대한 상대 발현 값을 계산하였다:

정규화된 상대 발현 = (power(2, -(delta CT)))*1000

참고문헌:

Liu, Y.J. 2006, J Exp Med.;203(2):269-73. Thymic stromal lymphopoietin: master switch for allergic inflammation.

Hershey GK. 2003, J Allergy Clin Immunol.;111(4):677-90. IL-13 receptors and signaling pathways: an evolving web.

Lewis CC, Aronow B, Hutton J, Santeliz J, Dienger K, Herman N, Finkelman FD, Wills-Karp M. 2009, J Allergy Clin Immunol.;123(4):795-804. Unique and overlapping gene expression patterns driven by IL-4 and IL-13 in the mouse lung.

본원에 기재된 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 핵산 분자, 핵산을 포함하는 벡터 및 조성물은 예를 들어 염증성 질환을 앓고 있는 대상체의 치료에 사용될 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Ablynx NV <110> Sanofi <120> POLYPEPTIDES COMPRISING IMMUNOGLOBULIN SINGLE VARIABLE DOMAINS TARGETING IL-13 AND TSLP <130> 228533 <150> US 62/945,391 <151> 2019-12-09 <150> EP 20 305 064.6 <151> 2020-01-27 <160> 177 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 671 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F027400161 <400> 1 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Arg Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Leu Ser Gly Asp Gly Tyr Ser Thr Tyr Thr Ala Asn Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Lys Leu Gln Tyr Val Ser Gly Trp Ser Tyr Asp Tyr Pro Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val 145 150 155 160 Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu 165 170 175 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr Ala Met 180 185 190 Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser 195 200 205 Ile Thr Thr Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 210 215 220 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 225 230 235 240 Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Asn 245 250 255 Val Pro Phe Gly Tyr Tyr Ser Glu His Phe Ser Gly Leu Ser Phe Asp 260 265 270 Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 275 280 285 Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val 290 295 300 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser 305 310 315 320 Gly Phe Gly Val Asn Ile Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Ile 325 330 335 Glu Arg Glu Leu Ile Ala Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ile Thr Asn Tyr 340 345 350 Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu 355 360 365 Asn Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly 370 375 380 Leu Tyr Tyr Cys Ala Ser Arg Asn Ile Phe Asp Gly Thr Thr Glu Trp 385 390 395 400 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 405 410 415 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 420 425 430 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 435 440 445 Arg Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro 450 455 460 Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala 465 470 475 480 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 485 490 495 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu 500 505 510 Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr 515 520 525 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu 530 535 540 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser 545 550 555 560 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr Asp 565 570 575 Tyr Asp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly 580 585 590 Val Ser Cys Ile Ser Asn Arg Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 595 600 605 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val 610 615 620 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr 625 630 635 640 Cys Ala Val Glu Ile His Cys Asp Asp Tyr Gly Val Glu Asn Phe Asp 645 650 655 Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 660 665 670 <210> 2 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4B02 <400> 2 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Arg Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Leu Ser Gly Asp Gly Tyr Ser Thr Tyr Thr Ala Asn Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Lys Leu Gln Tyr Val Ser Gly Trp Ser Tyr Asp Tyr Pro Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4B06 <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Thr Thr Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Val Pro Phe Gly Tyr Tyr Ser Glu His Phe Ser Gly Leu Ser 100 105 110 Phe Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 4 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 501A02 <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Gly Phe Gly Val Asn 20 25 30 Ile Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Ile Glu Arg Glu Leu Ile 35 40 45 Ala Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Thr Met Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Arg Asn Ile Phe Asp Gly Thr Thr Glu Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ALB23002 <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 6 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 529F10 <400> 6 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr 20 25 30 Asp Tyr Asp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu 35 40 45 Gly Val Ser Cys Ile Ser Asn Arg Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Val Glu Ile His Cys Asp Asp Tyr Gly Val Glu Asn Phe 100 105 110 Asp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 7 Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Arg Met Gly 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 8 Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 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Asn Arg Asp Gly Ser Thr Tyr 1 5 10 <210> 17 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 17 Lys Leu Gln Tyr Val Ser Gly Trp Ser Tyr Asp Tyr Pro Tyr 1 5 10 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 18 Val Pro Phe Gly Tyr Tyr Ser Glu His Phe Ser Gly Leu Ser Phe Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 19 Arg Asn Ile Phe Asp Gly Thr Thr Glu 1 5 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 20 Gly Gly Ser Leu Ser Arg 1 5 <210> 21 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 21 Glu Ile His Cys Asp Asp Tyr Gly Val Glu Asn Phe Asp Phe Asp Pro 1 5 10 15 <210> 22 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 22 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 23 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 23 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 24 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 24 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 1 5 10 <210> 25 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 25 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210> 26 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 26 Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Ile Glu Arg Glu Leu Ile Ala 1 5 10 <210> 27 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 27 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210> 28 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 28 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser 1 5 10 <210> 29 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 29 Thr Ala Asn Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 1 5 10 15 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 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Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Gly Phe Gly Val Asn 20 25 30 Ile Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Ile 35 40 45 Ala Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Arg Asn Ile Phe Asp Gly Thr Thr Glu Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 145 150 155 160 Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 165 170 175 Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr Asp Tyr Asp Ile Gly Trp Phe Arg 180 185 190 Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser Cys Ile Ser Asn Arg 195 200 205 Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile 210 215 220 Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 225 230 235 240 Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Val Glu Ile His Cys 245 250 255 Asp Asp Tyr Gly Val Glu Asn Phe Asp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly 260 265 270 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 275 <210> 154 <211> 284 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F010700003-SO <400> 154 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Thr Thr Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Val Pro Phe Gly Tyr Tyr Ser Glu His Phe Ser Gly Leu Ser 100 105 110 Phe Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 115 120 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Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Leu Ser Gly Asp Gly Tyr Ser Thr Tyr Thr Ala Asn Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Lys Leu Gln Tyr Val Ser Gly Trp Ser Tyr Asp Tyr Pro Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val 145 150 155 160 Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu 165 170 175 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Arg Met 180 185 190 Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala 195 200 205 Leu Ser Gly Asp Gly Tyr Ser Thr Tyr Thr Ala Asn Ser Val Lys Gly 210 215 220 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 225 230 235 240 Met Asn Ser Leu Arg 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Val 145 150 155 160 Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu 165 170 175 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr Ala Met 180 185 190 Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser 195 200 205 Ile Thr Thr Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 210 215 220 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 225 230 235 240 Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Asn 245 250 255 Val Pro Phe Gly Tyr Tyr Ser Glu His Phe Ser Gly Leu Ser Phe Asp 260 265 270 Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 275 280 <210> 157 <211> 287 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F010700031-SO <400> 157 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Thr Thr Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Val Pro Phe Gly Tyr Tyr Ser Glu His Phe Ser Gly Leu Ser 100 105 110 Phe Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly 165 170 175 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn 180 185 190 Tyr Ala Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 195 200 205 Val Ser Ser Ile Thr Thr Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser 210 215 220 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 225 230 235 240 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr 245 250 255 Cys Ala Asn Val Pro Phe Gly Tyr Tyr Ser Glu His Phe Ser Gly Leu 260 265 270 Ser Phe Asp 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Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Gly Phe Gly 180 185 190 Val Asn Ile Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Ile Glu Arg Glu 195 200 205 Leu Ile Ala Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Val Asp Ser 210 215 220 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Thr Met 225 230 235 240 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr 245 250 255 Cys Ala Ser Arg Asn Ile Phe Asp Gly Thr Thr Glu Trp Gly Gln Gly 260 265 270 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 275 <210> 159 <211> 279 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F027400016-SO <400> 159 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Gly Phe Gly Val Asn 20 25 30 Ile Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Ile Glu Arg Glu Leu Ile 35 40 45 Ala Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Thr Met Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys Ala 85 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Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Gly Phe Gly Val Asn 20 25 30 Ile Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Ile Glu Arg Glu Leu Ile 35 40 45 Ala Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Thr Met Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Arg Asn Ile Phe Asp Gly Thr Thr Glu Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 161 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F010704099 <400> 161 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr 20 25 30 Asp Tyr Asp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu 35 40 45 Gly Val Ser Cys Ile Ser Asn Arg Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Val Glu Ile His Cys Asp Asp Tyr Gly Val Glu Asn Phe 100 105 110 Asp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 162 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F027100019 <400> 162 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Arg Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Leu Ser Gly Asp Gly Tyr Ser Thr Tyr Thr Ala Asn Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Lys Leu Gln Tyr Val Ser Gly Trp Ser Tyr Asp Tyr Pro Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala 115 120 125 <210> 163 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F027100183 <400> 163 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Thr Thr Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Val Pro Phe Gly Tyr Tyr Ser Glu His Phe Ser Gly Leu Ser 100 105 110 Phe Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 164 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F027400021 <400> 164 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr 20 25 30 Asp Tyr Asp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu 35 40 45 Gly Val Ser Cys Ile Ser Asn Arg Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 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<212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 176 Val Gln Val Lys Ser Ala 1 5 <210> 177 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminus <400> 177 Val Gln Val Gln Ser Ala 1 5

Claims

의약으로서 사용하기 위한, 폴리펩타이드, 폴리펩타이드를 포함하는 조성물, 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 조성물로서, 상기 폴리펩타이드는 IL-13 또는 TSLP에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 구성되고, 여기서 상기 ISVD는 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 ISVD는:
a) 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3,
b) 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
서열번호 18의 아미노산 서열 또는 서열번호 18과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3,
c) 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
서열번호 19의 아미노산 서열 또는 서열번호 19와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3, 또는
d) 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
서열번호 21의 아미노산 서열 또는 서열번호 21과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 조성물.
제1항에 있어서,
IL-13 또는 TSLP에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 ISVD는:
a) 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 17의 아미노산 서열인 CDR3,
b) 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 18의 아미노산 서열인 CDR3,
c) 서열번호 9의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 19의 아미노산 서열인 CDR3, 또는
d) 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 21의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
IL-13 또는 TSLP에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 ISVD의 아미노산 서열은:
a) 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성,
b) 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성,
c) 서열번호 4와 90% 동일성 초과의 서열 동일성, 또는
d) 서열번호 6과 90% 동일성 초과의 서열 동일성을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
IL-13 또는 TSLP에 특이적으로 결합하는 상기 적어도 하나의 ISVD는:
a) 서열번호 2의 아미노산 서열,
b) 서열번호 3의 아미노산 서열,
c) 서열번호 4의 아미노산 서열, 또는
d) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 폴리펩타이드는 적어도 2개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어지고, 여기서 상기 ISVD 각각은 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하고, 여기서 적어도 2개의 ISVD는 하나 이상의 펩타이드 링커를 통해 임의로 연결되며:
a) 제1 및 제2 ISVD가 IL-13에 특이적으로 결합하고,
i. 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,
b) 제1 및 제2 ISVD가 IL-13에 특이적으로 결합하고,
i. 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 서열번호 18과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,
c) 제1 ISVD가 IL-13에 특이적으로 결합하고,
i. 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고,
제2 ISVD가 IL-13에 특이적으로 결합하고,
iv. 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
v. 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
vi. 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 서열번호 18과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,
d) 제1 ISVD가 IL-13에 특이적으로 결합하고,
i. 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 서열번호 18과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고,
제2 ISVD가 IL-13에 특이적으로 결합하고,
iv. 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
v. 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
vi. 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,
e) 제1 ISVD가 TSLP에 특이적으로 결합하고,
i. 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 21의 아미노산 서열 또는 서열번호 21과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고,
제2 ISVD가 TSLP에 특이적으로 결합하고,
iv. 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
v. 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
vi. 서열번호 19의 아미노산 서열 또는 서열번호 19와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나, 또는
f) 제1 ISVD가 TSLP에 특이적으로 결합하고,
i. 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 19의 아미노산 서열 또는 서열번호 19와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고,
제2 ISVD가 TSLP에 특이적으로 결합하고,
iv. 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
v. 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
vi. 서열번호 21의 아미노산 서열 또는 서열번호 21과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고,
여기서 ISVD의 순서는 상기 폴리펩타이드의 N-말단에서 C-말단까지 고려되는 서로에 대한 그들의 상대적인 위치를 나타내는, 폴리펩타이드 또는 조성물.
제5항에 있어서,
a) IL-13에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 17의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,
b) IL-13에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 18의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,
c) IL-13에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 17의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, IL-13에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 18의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,
d) IL-13에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 18의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, IL-13에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 17의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,
e) TSLP에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD는 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 21의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, TSLP에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 9의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 19의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나, 또는
f) TSLP에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD는 서열번호 9의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 19의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, TSLP에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 21의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 조성물.
제5항 또는 제6항에 있어서,
a) IL-13에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하거나,
b) IL-13에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하거나,
c) IL-13에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하고, IL-13에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하거나,
d) IL-13에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하고, IL-13에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하거나,
e) TSLP에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 6과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하고, TSLP에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하거나, 또는
f) TSLP에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하고, TSLP에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 6과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 조성물.
제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
a) IL-13에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나,
b) IL-13에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나,
c) IL-13에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, IL-13에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나,
d) IL-13에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고, IL-13에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나,
e) TSLP에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하고, TSLP에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는
f) TSLP에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, TSLP에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 조성물.
제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
폴리펩타이드는:
a) 서열번호 148의 아미노산 서열,
b) 서열번호 149의 아미노산 서열,
c) 서열번호 150의 아미노산 서열,
d) 서열번호 151의 아미노산 서열,
e) 서열번호 152의 아미노산 서열,
f) 서열번호 153의 아미노산 서열,
g) 서열번호 154의 아미노산 서열,
h) 서열번호 155의 아미노산 서열,
i) 서열번호 156의 아미노산 서열,
j) 서열번호 157의 아미노산 서열,
k) 서열번호 158의 아미노산 서열, 또는
l) 서열번호 159의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지는, 폴리펩타이드.
제1항 또는 제5항에 있어서,
상기 폴리펩타이드는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어지고, 여기서 상기 ISVD 각각은 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하고, 여기서 적어도 4개의 ISVD는 하나 이상의 펩타이드 링커를 통해 임의로 연결되며:
a) 제1 ISVD가 IL-13에 특이적으로 결합하고,
i. 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;
b) 제2 ISVD가 IL-13에 특이적으로 결합하고,
iv. 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
v. 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
vi. 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 서열번호 18과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;
c) 제3 ISVD가 TSLP에 특이적으로 결합하고,
vii. 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
viii. 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
ix. 서열번호 19의 아미노산 서열 또는 서열번호 19와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고; 그리고
d) 제4 ISVD가 TSLP에 특이적으로 결합하고,
x. 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
xi. 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
xii. 서열번호 21의 아미노산 서열 또는 서열번호 21과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고,
여기서 ISVD의 순서는 상기 폴리펩타이드의 N-말단에서 C-말단까지 고려되는 서로에 대한 그들의 상대적인 위치를 나타내는, 폴리펩타이드 또는 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제 및/또는 아쥬반트를 추가로 포함하고, 하나 이상의 추가의 약제학적으로 활성인 폴리펩타이드 및/또는 화합물을 선택적으로 포함하는 약제학적 조성물인, 조성물.
제10항 또는 제11항에 있어서,
a) 상기 제1 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 17의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;
b) 상기 제2 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 18의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;
c) 상기 제3 ISVD는 서열번호 9의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 19의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고; 그리고
d) 상기 제4 ISVD는 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 21의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 조성물.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
a) 상기 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하고;
b) 상기 제2 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하고;
c) 상기 제3 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하고; 그리고
d) 상기 제4 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 6과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 조성물.
제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
a) 상기 제1 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고;
b) 상기 제2 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고;
c) 상기 제3 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
d) 상기 제4 ISVD는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 조성물.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩타이드는 임의로 하나 이상의 펩타이드 링커를 통해 연결된 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를 추가로 포함하고, 여기서 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 없는 상응하는 폴리펩타이드와 비교하여 증가된 반감기를 갖는 폴리펩타이드를 제공하는, 폴리펩타이드 또는 조성물.
제15항에 있어서,
증가된 반감기를 갖는 폴리펩타이드를 제공하는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 폴리에틸렌 글리콜 분자, 혈청 단백질 또는 이의 단편들, 혈청 단백질에 결합할 수 있는 결합 단위, Fc 부분, 및 혈청 단백질에 결합할 수 있는 작은 단백질 또는 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된, 폴리펩타이드 또는 조성물.
제15항 또는 제16항에 있어서,
증가된 반감기를 갖는 폴리펩타이드를 제공하는 상기 하나 이상의 다른 결합 단위가 혈청 알부민(예컨대 인간 혈청 알부민)에 결합할 수 있는 결합 단위 또는 혈청 면역글로불린(예컨대 IgG)으로 이루어진 군으로부터 선택된, 폴리펩타이드 또는 조성물.
제17항에 있어서,
증가된 반감기를 갖는 폴리펩타이드를 제공하는 상기 결합 단위가 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있는 ISVD인, 폴리펩타이드 또는 조성물.
제18항에 있어서,
인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD는
i. 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 서열번호 10과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 20의 아미노산 서열 또는 서열번호 20과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 조성물.
제18항 또는 제19항에 있어서,
인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD가 서열번호 10의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 15의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 20의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 조성물.
제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 혈청 알부민에 결합하는 상기 ISVD의 아미노산 서열이 서열번호 5와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 조성물.
제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 혈청 알부민에 결합하는 상기 ISVD가 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 조성물.
제10항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
폴리펩타이드의 아미노산 서열이 서열번호 1과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 조성물.
제10항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
폴리펩타이드가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진, 폴리펩타이드 또는 조성물.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
2형 염증성 질환과 같은 염증성 질환의 치료에 사용하기 위한, 폴리펩타이드 또는 조성물.
제25항에 있어서,
상기 2형 염증성 질환이 천식 및 아토피 피부염으로부터 선택되는, 폴리펩타이드 또는 조성물.
IL-13 또는 TSLP에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리펩타이드로서, 상기 ISVD는 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하고; 적어도 하나의 ISVD는:
a) 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3,
b) 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
서열번호 18의 아미노산 서열 또는 서열번호 18과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3,
c) 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
서열번호 19의 아미노산 서열 또는 서열번호 19와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3, 또는
d) 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
서열번호 21의 아미노산 서열 또는 서열번호 21과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드.
제27항에 있어서,
IL-13 또는 TSLP에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 ISVD는:
a) 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 17의 아미노산 서열인 CDR3,
b) 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 18의 아미노산 서열인 CDR3,
c) 서열번호 9의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 19의 아미노산 서열인 CDR3, 또는
d) 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 21의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드.
제27항 또는 제28항에 있어서,
IL-13 또는 TSLP에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 ISVD의 아미노산 서열은:
a) 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성,
b) 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성,
c) 서열번호 4와 90% 동일성 초과의 서열 동일성, 또는
d) 서열번호 6과 90% 동일성 초과의 서열 동일성을 포함하는, 폴리펩타이드.
제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
IL-13 또는 TSLP에 특이적으로 결합하는 상기 적어도 하나의 ISVD는:
a) 서열번호 2의 아미노산 서열,
b) 서열번호 3의 아미노산 서열,
c) 서열번호 4의 아미노산 서열, 또는
d) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
제27항에 있어서,
상기 폴리펩타이드는 적어도 2개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어지고, 여기서 상기 ISVD 각각은 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하고, 여기서 적어도 2개의 ISVD는 하나 이상의 펩타이드 링커를 통해 임의로 연결되며:
a) 제1 및 제2 ISVD가 IL-13에 특이적으로 결합하고,
i. 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,
b) 제1 및 제2 ISVD가 IL-13에 특이적으로 결합하고,
i. 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 서열번호 18과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,
c) 제1 ISVD가 IL-13에 특이적으로 결합하고,
i. 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고,
제2 ISVD가 IL-13에 특이적으로 결합하고,
iv. 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
v. 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
vi. 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 서열번호 18과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,
d) 제1 ISVD가 IL-13에 특이적으로 결합하고,
i. 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 서열번호 18과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고,
제2 ISVD가 IL-13에 특이적으로 결합하고,
iv. 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
v. 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
vi. 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,
e) 제1 ISVD가 TSLP에 특이적으로 결합하고,
i. 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 21의 아미노산 서열 또는 서열번호 21과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고,
제2 ISVD가 TSLP에 특이적으로 결합하고,
iv. 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
v. 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
vi. 서열번호 19의 아미노산 서열 또는 서열번호 19와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나, 또는
f) 제1 ISVD가 TSLP에 특이적으로 결합하고,
i. 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 19의 아미노산 서열 또는 서열번호 19와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고,
제2 ISVD가 TSLP에 특이적으로 결합하고,
iv. 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
v. 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
vi. 서열번호 21의 아미노산 서열 또는 서열번호 21과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고,
여기서 ISVD의 순서는 상기 폴리펩타이드의 N-말단에서 C-말단까지 고려되는 서로에 대한 그들의 상대적인 위치를 나타내는, 폴리펩타이드.
제31항에 있어서,
a) IL-13에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 17의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,
b) IL-13에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 18의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,
c) IL-13에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 17의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, IL-13에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 18의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,
d) IL-13에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 18의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, IL-13에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 17의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나,
e) TSLP에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD는 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 21의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, TSLP에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 9의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 19의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하거나, 또는
f) TSLP에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD는 서열번호 9의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 19의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고, TSLP에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 21의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드.
제31항 또는 제32항에 있어서,
a) IL-13에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하거나,
b) IL-13에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하거나,
c) IL-13에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하고, IL-13에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하거나,
d) IL-13에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하고, IL-13에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하거나,
e) TSLP에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 6과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하고, TSLP에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하거나, 또는
f) TSLP에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하고, TSLP에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 6과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하는, 폴리펩타이드.
제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
a) IL-13에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나,
b) IL-13에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나,
c) IL-13에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, IL-13에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나,
d) IL-13에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고, IL-13에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나,
e) TSLP에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하고, TSLP에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는
f) TSLP에 특이적으로 결합하는 제1 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, TSLP에 특이적으로 결합하는 제2 ISVD는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
폴리펩타이드는
a) 서열번호 148의 아미노산 서열,
b) 서열번호 149의 아미노산 서열,
c) 서열번호 150의 아미노산 서열,
d) 서열번호 151의 아미노산 서열,
e) 서열번호 152의 아미노산 서열,
f) 서열번호 153의 아미노산 서열,
g) 서열번호 154의 아미노산 서열,
h) 서열번호 155의 아미노산 서열,
i) 서열번호 156의 아미노산 서열,
j) 서열번호 157의 아미노산 서열,
k) 서열번호 158의 아미노산 서열, 또는
l) 서열번호 159의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지는, 폴리펩타이드.
제27항 또는 제31항에 있어서,
상기 폴리펩타이드는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어지고, 여기서 상기 ISVD 각각은 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하고, 여기서 적어도 4개의 ISVD는 하나 이상의 펩타이드 링커를 통해 임의로 연결되며:
a) 제1 ISVD가 IL-13에 특이적으로 결합하고,
i. 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;
b) 제2 ISVD가 IL-13에 특이적으로 결합하고,
iv. 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
v. 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
vi. 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 서열번호 18과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;
c) 제3 ISVD가 TSLP에 특이적으로 결합하고,
vii. 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
viii. 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
ix. 서열번호 19의 아미노산 서열 또는 서열번호 19와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고; 그리고
d) 제4 ISVD가 TSLP에 특이적으로 결합하고,
x. 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
xi. 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
xii. 서열번호 21의 아미노산 서열 또는 서열번호 21과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고,
여기서 ISVD의 순서는 상기 폴리펩타이드의 N-말단에서 C-말단까지 고려되는 서로에 대한 그들의 상대적인 위치를 나타내는, 폴리펩타이드.
제36항에 있어서,
a) 상기 제1 ISVD는 서열번호 7의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 17의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;
b) 상기 제2 ISVD는 서열번호 8의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 18의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고;
c) 상기 제3 ISVD는 서열번호 9의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 19의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하고; 그리고
d) 상기 제4 ISVD는 서열번호 11의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 16의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 21의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드.
제36항 또는 제37항에 있어서,
a) 상기 제1 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 2와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하고;
b) 상기 제2 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 3과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하고;
c) 상기 제3 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 4와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하고;
d) 상기 제4 ISVD의 아미노산 서열은 서열번호 6과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하는, 폴리펩타이드.
제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
a) 상기 제1 ISVD는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고;
b) 상기 제2 ISVD는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고;
c) 상기 제3 ISVD는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
d) 상기 제4 ISVD는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
제27항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩타이드는 임의로 하나 이상의 펩타이드 링커를 통해 연결된 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를 추가로 포함하고, 여기서 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 없는 상응하는 폴리펩타이드와 비교하여 증가된 반감기를 갖는 폴리펩타이드를 제공하는, 폴리펩타이드.
제40항에 있어서,
증가된 반감기를 갖는 폴리펩타이드를 제공하는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 폴리에틸렌 글리콜 분자, 혈청 단백질 또는 이의 단편들, 혈청 단백질에 결합할 수 있는 결합 단위, Fc 부분, 및 혈청 단백질에 결합할 수 있는 작은 단백질 또는 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된, 폴리펩타이드.
제40항 또는 제41항에 있어서,
증가된 반감기를 갖는 폴리펩타이드를 제공하는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 혈청 알부민(예컨대 인간 혈청 알부민)에 결합할 수 있는 결합 단위 또는 혈청 면역글로불린(예컨대 IgG)으로 이루어진 군으로부터 선택된, 폴리펩타이드.
제42항에 있어서,
증가된 반감기를 갖는 폴리펩타이드를 제공하는 상기 결합 단위가 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있는 ISVD인, 폴리펩타이드.
제43항에 있어서,
인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD는
i. 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 서열번호 10과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR1;
ii. 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR2; 및
iii. 서열번호 20의 아미노산 서열 또는 서열번호 20과 2개 또는 1개의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드.
제43항 또는 제44항에 있어서,
인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD가 서열번호 10의 아미노산 서열인 CDR1, 서열번호 15의 아미노산 서열인 CDR2 및 서열번호 20의 아미노산 서열인 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드.
제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 혈청 알부민에 결합하는 상기 ISVD의 아미노산 서열이 서열번호 5와 90% 초과의 서열 동일성을 포함하는, 폴리펩타이드.
제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 혈청 알부민에 결합하는 상기 ISVD가 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
제36항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
폴리펩타이드의 아미노산 서열이 서열번호 1과 90% 초과의 서열 동일성을 포함하는, 폴리펩타이드.
제36항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
폴리펩타이드가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진, 폴리펩타이드.
제27항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, 또는 제36항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산.
제50항에 따른 핵산을 포함하는 숙주 또는 숙주 세포.
제27항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, 또는 제36항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드의 제조 방법으로서,
상기 방법은 적어도:
a) 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서, 또는 또 다른 적합한 발현 시스템에서, 제50항에 따른 핵산을 발현하는 단계; 선택적으로 다음에:
b) 제27항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, 또는 제36항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 단리 및/또는 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
제27항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 폴리펩타이드, 또는 제36항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 폴리펩타이드, 또는 제50항에 따른 핵산을 포함하는 조성물.
제53항에 있어서,
적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제 및/또는 아쥬반트를 추가로 포함하고, 하나 이상의 추가의 약제학적으로 활성인 폴리펩타이드 및/또는 화합물을 선택적으로 포함하는 약제학적 조성물인, 조성물.
염증성 질환, 바람직하게는 2형 염증성 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 제27항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른, 또는 제36항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, 또는 제53항 또는 제54항에 따른 조성물의 약제학적으로 활성인 양을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제55항에 있어서,
상기 2형 염증성 질환이 천식 및 아토피 피부염으로부터 선택되는, 방법.
2형 염증성 질환과 같은 염증성 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물의 제조에 있어서, 제27항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른, 바람직하게는 제36항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, 또는 제53항 또는 제54항에 따른 조성물의 용도.
제57항에 있어서,
상기 2형 염증성 질환이 천식 및 아토피 피부염으로부터 선택되는, 용도.