[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

KR20220103761A - 지카 바이러스를 중화하는 인간 항체 및 이의 사용 방법 - Google Patents

지카 바이러스를 중화하는 인간 항체 및 이의 사용 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20220103761A
KR20220103761A KR1020227020538A KR20227020538A KR20220103761A KR 20220103761 A KR20220103761 A KR 20220103761A KR 1020227020538 A KR1020227020538 A KR 1020227020538A KR 20227020538 A KR20227020538 A KR 20227020538A KR 20220103761 A KR20220103761 A KR 20220103761A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
fragment
clone
paired
antibody fragment
Prior art date
Application number
KR1020227020538A
Other languages
English (en)
Inventor
제임스 이. 주니어 크로우
로버트 에이치. 카나한
파블로 길척
Original Assignee
벤더르빌트 유니버시티
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 벤더르빌트 유니버시티 filed Critical 벤더르빌트 유니버시티
Publication of KR20220103761A publication Critical patent/KR20220103761A/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/42—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum viral
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1081—Togaviridae, e.g. flavivirus, rubella virus, hog cholera virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/18—Togaviridae; Flaviviridae
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/18—Togaviridae; Flaviviridae
    • G01N2333/183—Flaviviridae, e.g. pestivirus, mucosal disease virus, bovine viral diarrhoea virus, classical swine fever virus (hog cholera virus) or border disease virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/18—Togaviridae; Flaviviridae
    • G01N2333/183—Flaviviridae, e.g. pestivirus, mucosal disease virus, bovine viral diarrhoea virus, classical swine fever virus (hog cholera virus) or border disease virus
    • G01N2333/185—Flaviviruses or Group B arboviruses, e.g. yellow fever virus, japanese encephalitis, tick-borne encephalitis, dengue
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 개시는 지카 바이러스에 결합하고 이를 중화시키는 항체 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

지카 바이러스를 중화하는 인간 항체 및 이의 사용 방법
우선권
본 출원은, 2019년 11월 19일에 출원된 미국 가출원 일련번호 제62/937,603호에 대한 우선권의 이익을 주장하고, 그 전체 내용은 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
연방 자금 소명
본 발명은 국방부에서 수여한 보조금 번호 HR0011-18-2-0001에 따라 정부의 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 일정 권리를 갖고 있다.
배경
1. 개시의 분야
본 개시는, 일반적으로, 의학, 감염성 질환 및 면역학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시는 지카 바이러스(Zika virus)에 결합하는 인간 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
2. 배경
ZIKV는, 전 세계적으로 공중보건 위협이 되고 있는 모기에 의해 전파되는 신규한 플라비바이러스이다. 미크로네시아, 브라질, 중남미의 기타 지역, 및 멕시코에서 최근 ZIKV의 유행[참조: Duffy et al., 2009]은 성인의 길랭-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 및 임신 중 감염 상황[참조: Araugo et al., 2016; Gatherer & Kohl, 2016]에서 신생아의 소두증과 관련되어 있다[참조: Oehler et al., 2014; Musso et al., 2014]. ZIKV는 전 세계적으로 분포하는 아에데스(Aedes) 종 모기에 의해 전염되기 때문에, 이들 벡터가 존재하는 국가는 장래의 유행의 장소가 될 수 있다. 수백만 명의 질환을 유발할 가능성이 있음에도 불구하고, ZIKV에 대한 특정 치료법이나 백신은 제공되지 않아, 이 분야에서는 충족되지 않은 요구가 남아 있다.
요약
따라서, 본 개시에 따르면, 대상체(subject)의 지카 바이러스 감염을 검출하는 방법으로서, (a) 상기 대상체로부터의 샘플을 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍을 이룬(clone-paired) 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 항체 또는 항체 단편을 상기 샘플 중의 지카 바이러스 항원에 결합시킴으로써 상기 샘플 중의 지카 바이러스를 검출하는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다. 샘플은 혈액, 가래, 눈물, 타액, 점액 또는 혈청, 정액, 자궁경부 또는 질 분비물, 양수, 태반 조직, 소변, 삼출물, 누출액, 조직 스크래핑(tissue scraping) 또는 대변 등의 체액일 수 있다. 검출은 ELISA, RIA, 측면 유동 검정(lateral flow assay) 또는 웨스턴 블롯(Western blot)을 포함할 수 있다. 이 방법은 단계 (a) 및 (b)를 두 번째로 수행하는 단계 및 제1 검정과 비교하여 지카 바이러스 항원 수준의 변화를 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 의해, 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 대해 70%, 80% 또는 90%의 동일성(identity)을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해, 또는 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩(encoding)될 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하거나, 또는 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있다. 항체 단편은 재조합(recombinant) scFv(단일 쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 지카 바이러스에 감염된 대상체를 치료하거나, 지카 바이러스에 감염될 위험이 있는 대상체의 감염 가능성을 감소시키는 방법으로서, 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편을 상기 대상체에게 전달하는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다. 항체 또는 항체 단편은 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 의해, 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 대해 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해, 또는 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하거나, 또는 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있다. 항체 단편은 재조합 scFv(단일 쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편일 수 있다. 항체는 IgG, 또는 FcR 상호작용을 변경(제거 또는 증강)하고, 반감기를 증가시키고/시키거나 LALA, N297, GASD/ALIE, YTE 또는 LS 돌연변이와 같은, 치료적 효능을 증가시키도록 돌연변이된 Fc 부분, 또는 글리칸의 효소적 또는 화학적 부가 또는 제거, 또는 정의된 글리코실화 패턴으로 조작된 세포주에서의 발현과 같은, FcR 상호작용을 변경(제거 또는 증강)하도록 변형된 글리칸을 포함하는 재조합 IgG 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 항체는 키메라 항체 또는 이중특이적(bispecific) 항체일 수 있다.
항체 또는 항체 단편은 감염 전 또는 감염 후에 투여될 수 있다. 대상체는 임신한 여성, 성적으로 활발한 여성, 또는 불임 치료를 받고 있는 여성일 수 있다. 전달은 항체 또는 항체 단편 투여, 또는 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 RNA 또는 DNA 서열 또는 벡터를 사용한 유전자 전달(genetic delivery)을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 모노클로날 항체(monoclonal antibody)로서, 항체 또는 항체 단편이 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 특징으로 하는 모노클로날 항체가 제공된다. 항체 또는 항체 단편은 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 의해, 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 대해 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해, 또는 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하거나, 또는 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있다. 항체 단편은 재조합 scFv(단일 쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편일 수 있다. 항체는 IgG, 또는 FcR 상호작용을 변경(제거 또는 증강)하고, 반감기를 증가시키고/시키거나 LALA, N297, GASD/ALIE, YTE 또는 LS 돌연변이와 같은, 치료적 효능을 증가시키도록 돌연변이된 Fc 부분, 또는 글리칸의 효소적 또는 화학적 부가 또는 제거, 또는 정의된 글리코실화 패턴으로 조작된 세포주에서의 발현과 같은, FcR 상호작용을 변경(제거 또는 증강)하도록 변형된 글리칸을 포함하는 재조합 IgG 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 세포 투과성 펩티드(cell penetrating peptide)를 추가로 포함할 수 있고/있거나, 인트라바디(intrabody)이다.
또 다른 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 하이브리도마 또는 조작된 세포로서, 항체 또는 항체 단편이 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 특징으로 하는, 하이브리도마 또는 조작된 세포가 제공된다. 하이브리도마 또는 조작된 세포는 항체를 인코딩할 수 있고, 상기 항체 또는 항체 단편은 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 의해, 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 대해 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해, 또는 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 하이브리도마 또는 조작된 세포는 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 인코딩할 수 있거나, 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하거나, 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있다. 항체 단편을 인코딩하는 하이브리도마 또는 조작된 세포는 재조합 scFv(단일 쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편일 수 있다. 하이브리도마 또는 조작된 세포는 IgG, 또는 FcR 상호작용을 변경(제거 또는 증강)하고, 반감기를 증가시키고/시키거나 LALA, N297, GASD/ALIE, YTE 또는 LS 돌연변이와 같은, 치료적 효능을 증가시키도록 돌연변이된 Fc 부분, 또는 글리칸의 효소적 또는 화학적 부가 또는 제거, 또는 정의된 글리코실화 패턴으로 조작된 세포주에서의 발현과 같은, FcR 상호작용을 변경(제거 또는 증강)하도록 변형된 글리칸을 포함하는 재조합 IgG 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 하이브리도마 또는 조작된 세포는 키메라 항체 또는 이중특이적 항체를 인코딩할 수 있다. 하이브리도마 또는 조작된 세포는, 세포 투과성 펩티드를 추가로 포함하고/하거나 인트라바디인 항체 또는 항체 단편을 인코딩할 수 있다.
추가 실시양태에서, 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 특징으로 하는 하나 이상의 항체 또는 항체 단편을 포함하는 백신 제형(vaccine formulation)이 제공된다. 항체 또는 항체 단편은 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 의해, 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 대해 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해, 또는 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하거나, 또는 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있다. 항체 단편은 재조합 scFv(단일 쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편일 수 있다. 항체는 IgG, 또는 FcR 상호작용을 변경(제거 또는 증강)하고, 반감기를 증가시키고/시키거나 LALA, N297, GASD/ALIE, YTE 또는 LS 돌연변이와 같은, 치료적 효능을 증가시키도록 돌연변이된 Fc 부분, 또는 글리칸의 효소적 또는 화학적 부가 또는 제거, 또는 정의된 글리코실화 패턴으로 조작된 세포주에서의 발현과 같은, FcR 상호작용을 변경(제거 또는 증강)하도록 변형된 글리칸을 포함하는 재조합 IgG 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 항체는 키메라 항체 또는 이중특이적 항체일 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 세포 투과성 펩티드를 추가로 포함할 수 있고/있거나 인트라바디이다.
또한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 제1 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 하나 이상의 발현 벡터를 포함하는 백신 제형이 제공된다. 발현 벡터(들)는 신드비스(Sindbis) 바이러스 또는 VEE 벡터(들)일 수 있다. 백신 제형은 바늘 주사, 제트 주사 또는 전기천공에 의한 전달을 위해 제형화될 수 있다. 백신 제형은 본 명세서에 기재된 바와 같은 별개의 항체 또는 항체 단편 등의 제2 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 하나 이상의 발현 벡터를 추가로 포함할 수 있다.
추가 실시양태에서, 지카 바이러스에 감염되었거나 감염 위험이 있는 임신한 대상체의 태반 및/또는 태아의 건강을 보호하는 방법으로서, 각각 표 3 및 4의 클론-쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편을 상기 대상체에게 전달하는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다. 항체 또는 항체 단편은 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 의해, 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 대해 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해, 또는 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하거나, 또는 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있다. 항체 단편은 재조합 scFv(단일 쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편일 수 있다. 항체는 IgG, 또는 FcR 상호작용을 변경(제거 또는 증강)하고, 반감기를 증가시키고/시키거나 LALA, N297, GASD/ALIE, YTE 또는 LS 돌연변이와 같은, 치료적 효능을 증가시키도록 돌연변이된 Fc 부분, 또는 글리칸의 효소적 또는 화학적 부가 또는 제거, 또는 정의된 글리코실화 패턴으로 조작된 세포주에서의 발현과 같은, FcR 상호작용을 변경(제거 또는 증강)하도록 변형된 글리칸을 포함하는 재조합 IgG 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 항체는 키메라 항체 또는 이중특이적 항체일 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 세포 투과성 펩티드를 추가로 포함할 수 있고/있거나, 인트라바디이다.
항체 또는 항체 단편은 감염 전 또는 감염 후에 투여될 수 있다. 대상체는 임신한 여성, 성적으로 활발한 여성, 또는 불임 치료를 받고 있는 여성일 수 있다. 전달은 항체 또는 항체 단편 투여, 또는 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 RNA 또는 DNA 서열 또는 벡터를 사용한 유전자 전달을 포함할 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 미처리 대조군과 비교하여 태반의 크기를 증가시킬 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 미처리 대조군과 비교하여 태아의 바이러스 부하(viral load) 및/또는 병리를 감소시킬 수 있다.
추가 실시양태에서, 지카 바이러스 항원의 항원 완전성, 정확한 형태 및/또는 정확한 서열을 결정하는 방법으로서, (a) 상기 항원을 포함하는 샘플을 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 제1 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 항원에 대한 상기 제1 항체 또는 항체 단편의 검출가능한 결합에 의해 상기 항원의 항원 완전성, 정확한 형태 및/또는 정확한 서열을 결정하는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다. 샘플은 재조합적으로 생산된 항원 또는 백신 제형 또는 백신 생산 뱃치(batch)를 포함할 수 있다. 검출은 ELISA, RIA, 웨스턴 블롯, 표면 플라즈몬 공명 또는 생물층 간섭계를 사용하는 바이오센서, 또는 유세포 분석 염색(flow cytometric staining)을 포함할 수 있다.
제1 항체 또는 항체 단편은 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 의해, 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 대해 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해, 또는 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 제1 항체 또는 항체 단편은 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있다. 제1 항체 단편은 재조합 scFv(단일 쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편일 수 있다. 제1 항체는 IgG, 또는 FcR 상호작용을 변경(제거 또는 증강)하고, 반감기를 증가시키고/시키거나 LALA, N297, GASD/ALIE, YTE 또는 LS 돌연변이와 같은, 치료적 효능을 증가시키도록 돌연변이된 Fc 부분, 또는 글리칸의 효소적 또는 화학적 부가 또는 제거, 또는 정의된 글리코실화 패턴으로 조작된 세포주에서의 발현과 같은, FcR 상호작용을 변경(제거 또는 증강)하도록 변형된 글리칸을 포함하는 재조합 IgG 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 제1 항체는 키메라 항체 또는 이중특이적 항체일 수 있다. 제1 항체 또는 항체 단편은 세포 투과성 펩티드를 추가로 포함할 수 있고/있거나, 인트라바디이다. 이 방법은 시간이 경과함에 따라 항원의 항원 안정성을 결정하기 위해 단계 (a) 및 (b)를 두 번째로 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법은 (c) 상기 항원을 포함하는 샘플을 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 제2 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 단계; 및 (d) 상기 항원에 대한 상기 제2 항체 또는 항체 단편의 검출가능한 결합에 의해 상기 항원의 항원 완전성을 결정하는 단계를 포함한다. 제2 항체 또는 항체 단편은 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 의해, 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 대해 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해, 또는 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 제2 항체 또는 항체 단편은 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 또는 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있다. 제2 항체 단편은 재조합 scFv(단일 쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편일 수 있다. 제2 항체는 IgG, 또는 FcR 상호작용을 변경(제거 또는 증강)하고, 반감기를 증가시키고/시키거나 LALA, N297, GASD/ALIE, YTE 또는 LS 돌연변이와 같은, 치료적 효능을 증가시키도록 돌연변이된 Fc 부분, 또는 글리칸의 효소적 또는 화학적 부가 또는 제거, 또는 정의된 글리코실화 패턴으로 조작된 세포주에서의 발현과 같은, FcR 상호작용을 변경(제거 또는 증강)하도록 변형된 글리칸을 포함하는 재조합 IgG 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 제2 항체는 키메라 항체 또는 이중특이적 항체일 수 있다. 제2 항체 또는 항체 단편은 세포 투과성 펩티드를 추가로 포함할 수 있고/있거나, 인트라바디이다. 상기 방법은 시간이 경과함에 따라 항원의 항원 안정성을 결정하기 위해 단계 (c) 및 (d)를 두 번째로 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
추가 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체 또는 항체 단편, 또는 하이브리도마 또는 이를 생산하는 조작된 세포로서, 상기 항체는 지카 바이러스 E2 항원에 결합하고, 고도로 4차 에피토프(highly quaternary epitope)를 인식하고, D83, P222, F218 및 K123으로부터 선택된 하나 이상의 잔기를 인식하는, 인간 모노클로날 항체 또는 항체 단편, 또는 하이브리도마 또는 조작된 세포가 제공된다. 에피토프는 도메인 II 에피토프일 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 잔기 D83, P222, F218 및 K123 각각을 인식할 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 아프리카 계통(African lineage)의 적어도 하나의 지카 바이러스 및 아시아 계통의 적어도 하나의 지카 바이러스를 중화시킬 수 있다.
청구범위 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우의 단어 "a" 또는 "an"의 사용은 "하나"를 의미할 수 있지만, "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 그 이상"의 의미와 일치한다. 단어 "약"은 기재된 수치의 플러스 또는 마이너스 5%를 의미한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법 또는 조성물은 본 명세서에 기재된 임의의 기타 방법 또는 조성물과 관련하여 실현될 수 있음이 고려된다. 본 개시의 기타 목적, 특징 및 이점은 하기의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 개시의 정신 및 범위 내의 다양한 변경 및 수정이 이들 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이기 때문에, 상세한 설명 및 특정 실시예는 본 발명의 특정 실시예를 나타내면서 단지 예시로서만 제공되는 것으로 이해되어야 한다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 본 개시의 특정 측면을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 개시는 본 명세서에 제시된 특정 실시양태의 상세한 설명과 조합하여 이들 도면 중 하나 이상을 참조함으로써 더 잘 이해될 수 있다.
도 1A-D. ZIKV E2 항원-특이적 인간 B 세포로부터 항체 유전자의 구조(rescue) 및 서열 분석. (도 1A) 이용가능한 대상체의 PBMC로부터 ZIKV E2 항원-특이적 B 세포의 빈도의 평가. 플롯은 생존 가능한 B 세포에 게이트된다. (도 1B) ZIKV E2 항원-특이적 B 세포의 표지 및 선별을 위한 2개의 접근법. 적색 화살표는 선별된 세포를 나타낸다. (도 1C) 인간 CD40L, IL-21 및 BAFF를 발현하도록 조작된 조사된 3T3 세포주를 사용한 선별된 B 세포의 시험관내 증식. (도 1D) 합성을 위한 mAb 서열을 선택하기 위한 생물정보학 필터링 단계.
도 2A-E. 생체내 보호 연구의 주요 후보를 특정하기 위한 고처리량 mAb 생산 및 스크리닝. (도 2A) 마이크로-스케일의 정제된 mAb의 정량화. <1,000mAb를 동시에 정제하는 능력(좌측, 미공개 데이터)와 ZIKV mAb 발견 연구에 대한 추정 mAb 농도(우측)를 나타내는 플레이트의 예가 도시된다. 좌측 패널의 각 도트는 개별 mAb의 농도를 나타낸다. LOD - 검출 한계(5μg/mL). 농도가 LOD(123mAb) 미만인 mAb의 값은 최대 5㎍/mL(LOD)로 설정되었다. mAb 농도의 중앙치(286μg/mL)는 자색 선으로 도시된다. (도 2B) xCelligence(Acea Biosciences) 분석기에서 실시간 세포 분석(RTCA) 세포 임피던스 검정을 사용한 mAb의 중화 활성에 대한 고처리량 스크리닝. 96-웰 E-플레이트의 단일 웰로부터 음영 전극 및 부착 베로(Vero) 세포(세포변성 효과[CPE]를 시각화하기 위한 바이러스의 존재 및 부재)의 확대된 명시야 이미지가 상부 패널에 도시된다. 중간 패널은 중화 mAb의 존재 또는 부재하에 ZIKV를 접종한 베로(Vero) 세포에 대한 대표적 실시간 임피던스 측정 곡선을 나타낸다. 검정 중복의 평균 +/- SEM이 도시된다. 가장 높은 중화 활성을 갖는 mAb의 신속한 동정을 나타내는 96웰 E-플레이트 측정으로부터의 RTCA 동태 곡선의 예가 하부 패널에 도시된다. (도 2C) OD450 nm ELISA 값의 히트맵으로서 도시된 ZIKV 패널의 598 마이크로-스케일 정제 mAb의 재조합 E2 항원 결합(컬럼당 98 내지 100mAb의 6개 컬럼). 0.4의 OD450 nm(음성 대조군의 5배)를 mAb 반응성에 대한 역치로서 설정했다. 각각의 정제된 mAb는 마이크로-스케일의 정제된 샘플(100μl 용적이 고정됨)로부터 단일 희석(40배 또는 100배)으로 시험되었고, mAb의 농도는 정규화되지 않았다. (도 2D) 패널의 개별 mAb의 결합 및 중화 활성 사이의 관계를 나타내는 히트맵(컬럼당 98 내지 100mAb의 6개 컬럼). 결합은 도 2C에서와 같이 결정되었다. 중화 활성은 마이크로-스케일의 정제된 mAb로부터 또는 CHO 세포 배양 상청액으로부터 직접 25배 희석으로 측정되었다. mAb는 브라질(또는 일부 실험에서는 다카르(Dakar)) 바이러스 균주에 대한 베로 세포 배양에서 CPE를 부분적으로 또는 완전히 억제하는 경우, 중화하는 것으로 간주되었다. 시험된 mAb 농도의 추정 범위는 <50ng/ml로부터 >50마이크로그램/ml였다. (도 2E) 정제된 mAb의 IC50 값을 평가함으로써 중화 효능의 랭킹. 상위 20개의 중화 mAb가 도시되고, 브라질 및 다카르 균주 바이러스에 대한 IC50 값은 수자와 히트맵으로 표시된다.
도 3Aa -Cc. ZIKV에 대해 급속하게 발견된 인간 mAb의 주요 치료 후보에 의해 인식된 에피토프. (도 3Aa-c) 중화 mAb를 나타내는 각각의 가장 강력한 클래스에 대한 재조합 E2 항원 ELISA 결합 용량-반응 곡선. 관련 없는 호흡기 합포체 바이러스(RSV) 융합 단백질(F) 항원에 특이적인 MAb rRSV-90은 음성 대조군으로 사용되었다. (도 3Ba-c) 바이러스 중화. RTCA 세포 임피던스 검정에 의해 결정된 브라질 및 다카르 균주 바이러스에 대한 용량-반응 중화 곡선. 제시된 데이터는 3회 검정의 평균 +/1 SD이다. IC50 값은 가변 기울기 분석에 의한 비선형 적합을 사용하여 8개의 3배 mAb 희석에 대한 시간이 경과함에 따른 세포 지수 변화로서 추정되었다. (도 3Ca-c) 주요 에피토프 접촉 잔기는 세포 표면-표시된 prM/E 단백질에 대한 라이브러리에서 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 사용하여 결정되었다.
도 4A-D. 마우스에서 RNA 전달 또는 항체 단백질 처리에 의해 매개되는 ZIKV 에 의한 치명적 챌린지에 대한 보호. 4주령의 C57Bl6/J(B6) 마우스 그룹(그룹당 n=5~14)을 -1일차에 항-IFN-알파 수용체 항체로 복강내 치료했다. 예방을 위해, 마우스를 복강내 경로에 의해 표시된 양의 mAb로 같은 날(-1일차)에 치료했다. 치료적 보호 연구를 위해, 마우스는 바이러스 챌린지의 1일 후에 mAb로 치료했다(1dpi). 0일차에, 마우스는 1,000 FFU의 마우스 적응 ZIKV 다카르 균주 바이러스(ZIKV-MA)를 사용하여 s.q. 챌린지하고, 21일간 생존을 모니터링했다. 혈장 중의 바이러스 부하는 2dpi에서 RT-PCR로 평가했다. 이전에 보고된 ZIKV-117 mAb는 양성 대조군으로 사용되었다. 음성 대조군에는 인플루엔자 A H1N1 혈구응집소 단백질에 특이적인 IgG1 mAb 5J8에 의한 치료가 포함되었다. (도 4A) 70 마이크로그램/마우스 mAb 용량으로 예방(d-1 치료)에 대해 추정된 카플란-마이어 생존 곡선. RT-qPCR에 의해 결정된 ZIKV 혈장 역가(2dpi)(도 4B), 및 9g/마우스 mAb 용량으로 예방(d-1 치료)에 대해 추정된 카플란-마이어 생존 곡선(도 4C). (도 4D) 9마이크로그램/마우스 mAb 용량에 의한 치료적(1dpi) 치료에 대해 추정된 카플란-마이어 생존 곡선. 도트는 개별 마우스로부터의 측정을 나타내고, 검정의 검출 한계(2.9 log10(GEQ/mL)) 미만의 값은 도 4B의 LOD로 설정되었다. 둔네트(Dunnett)의 다중 비교 검정을 수반하는 일원 ANOVA을 사용하여 각 처리 그룹의 바이러스 역가를 대조군 그룹과 비교하고, 중앙치 약 95% CI를 도 4B에 도시한다. 도 4A, 4C 및 4D의 생존 곡선은, 양측 로그-랭크 검정(Mantel-Cox)를 사용하여, 연구 종료까지 생존한 경우에 우측 검열된 대상체와 비교했다. 각 그룹을 대조군 그룹과 비교했다. p<0.05는 유의한 것으로 간주하고, 다중 시험 보정을 위해 조정하지 않았다. *p < 0.05, **p < 0.01, *** p < 0.001, ns - 중요하지 않음.
도 5. ZIKV에 대한 강력한 인간 항체의 신속한 발견을 위한 워크플로.
도 6. RNA 전달에 의한 생체내 보호. 예방적 치료, 40μg RNA 용량.
도 7. RNA 전달에 의한 생체내 보호. 예방적 치료, 40μg RNA 용량.
예시적 실시양태의 기재
상기에서 논의한 바와 같이, 지카 바이러스(ZIKV) 감염은, 임신 중 감염과 관련된 선천적 기형을 수반하는 전신 및 중추신경계의 병리 또는 질환을 유발한다[참조: Coyne et al., 2016]. ZIKV에 대한 후보 치료제(therapeutic agent)를 개발하기 위해, 본 발명자들은 이전에 ZIKV로 감염된 건강한 대상체로부터 인간 모노클로날 항체(mAb)의 패널을 단리했다. 이어서, 본 발명자들은 다양한 모델에서 치료 효능을 평가했다. 본 개시의 이들 및 기타 측면은 이하에서 상세하게 설명된다.
I. 지카 바이러스
지카 바이러스(ZIKV)는 플라비바이러스과(Flaviviridae) 바이러스 패밀리의 구성원이다. 이는, 에이. 아에깁티(A. aegypti) 및 에이. 알보픽투스(A. albopictus) 등의 주간 활동적 아에데스(Aedes) 모기에 의해 확산된다. 이의 명칭은 바이러스가 1947년 최초로 단리된 우간다의 지카 숲에서 유래한다. 지카 바이러스는 뎅기열, 황열병, 일본 뇌염, 웨스트 나일 바이러스와 관련되어 있다. 1950년대 이후, 아프리카로부터 아시아까지의 좁은 적도대에서 발생하는 것으로 공지되어 있다. 2007년부터 2016년 사이에, 이 바이러스는 동방으로, 태평양을 건너 아메리카로 확산되어, 2015-16년의 지카 바이러스의 유행을 유도했다.
지카 열 또는 지카 바이러스 질환으로 공지된 감염증은 종종 매우 경도 형태의 뎅기열과 유사한 증상을 유발하지 않거나 경미한 증상만을 유발한다. 특별한 치료법은 없지만, 파라세타몰(아세트아미노펜)과 휴식이 증상을 개선할 수 있다. 2016년 현재, 이 질환은 약물이나 백신으로 예방할 수 없다. 지카 바이러스는 임신한 여성으로부터 태아에게 확산할 수 있다. 이것은 소두증, 중증의 뇌 기형 및 기타 선천적 결함을 초래할 수 있다. 성인의 지카 감염은 드물게는 길랭-바레 증후군을 유발할 수 있다.
2016년 1월, 미국 질병 예방 관리 센터(CDC)는 강화된 예방 조치의 사용을 포함하여 영향을 받는 국가에 대한 여행 지침, 및 여행의 연기의 고려를 포함한 임신한 여성을 위한 지침을 발표했다. 다른 정부나 보건 기관도 유사한 여행 경고를 발표했으며, 콜롬비아, 도미니카 공화국, 푸에르토리코, 에콰도르, 엘살바도르, 자메이카는 위험에 대해 더 많이 알려질 때까지 임신을 연기할 것을 여성에게 권고했다.
지카 바이러스는 플라비바이러스과(Flaviviridae family) 및 플라비바이러스(Flavivirus) 속에 속하고, 따라서 뎅기열, 황열병, 일본 뇌염, 웨스트 나일 바이러스와 관련되어 있다. 기타 플라비바이러스와 마찬가지로, 지카 바이러스는 20면체에 둘러싸여 있고, 비분절, 단일 쇄의 10kb 포지티브-센스 RNA 게놈을 갖고 있다. 이는 스폰드웨니(Spondweni) 바이러스와 가장 밀접하게 관련되어 있고, 스폰드웨니 바이러스 클래드에서 2개의 공지된 바이러스 중 1개이다.
포지티브-센스 RNA 게놈은 바이러스 단백질로 직접 번역될 수 있다. 유사한 크기의 웨스트 나일(West Nile) 바이러스 등의 기타 플라비바이러스와 마찬가지로, RNA 게놈은 7개의 비구조 단백질과 3개의 구조 단백질을 인코딩한다. 구조 단백질 중 1개는 바이러스를 캡슐화한다. RNA 게놈은 12-kDa 캡시드 단백질의 카피와 함께 뉴클레오캡시드를 형성한다. 이어서, 뉴클레오캡시드는 2개의 바이러스 당단백질로 변형된 숙주-유래 막으로 둘러싸여 있다. 바이러스 게놈의 복제는 단일 쇄 포지티브 센스 RNA(ssRNA(+)) 게놈으로부터 양면 RNA의 합성, 및 이어서 전사 및 복제에 의존하여 바이러스 mRNA 및 신규한 ssRNA(+) 게놈을 제공한다.
지카 혈통에는 아프리카 혈통과 아시아 혈통이 있다. 계통발생학적 연구에 따르면, 아메리카 대륙에 확산하는 바이러스는 아프리카 유전자형과 89% 동일하지만, 2013-2014년의 발병시에 프랑스령 폴리네시아에서 유행한 아시아 균주와 가장 밀접하게 관련되어 있다.
바이러스의 척추동물 숙주는 주로 소위 유행성의 모기-원숭이-모기의 사이클의 원숭이였고, 종종 인간에 대한 전염만 있었다. 현재의 팬데믹이 2007년에 시작되기 전에는, 지카열은 "매우 유행하고 있는 지역에서도, 인간에게 인식된 '유출(spillover)' 감염을 거의 유발하지 않았다." 그러나, 드물게는, 황열병 바이러스와 뎅기열 바이러스(둘 다 플라비바이러스) 및 치쿤구니야 바이러스(토가바이러스) 등의 기타 아르보바이러스가 인간의 질환으로서 확립되어 모기-인간-모기 사이클로 확산되었다. 팬데믹의 원인은 공지되어 있지 않지만, 동종의 모기 벡터를 감염시키는 관련 아르보바이러스인 뎅기열은 특히 도시화와 글로벌화에 의해 더욱 심화되는 것으로 공지되어 있다. 지카열은 아에데스 아에집티(Aedes aegypti) 모기에 의해 주로 확산되고, 성적 접촉이나 수혈을 통해서도 전염될 수 있다. 지카 바이러스의 기본 재생산 수(R0, 전염성 척도)는 1.4 내지 6.6으로 추정된다.
2015년, 뉴스 보도는 라틴 아메리카와 카리브해 지역에서 지카의 급속한 확산에 주목했다. 당시, 범미보건기구(Pan American Health Organization)는 바베이도스, 볼리비아, 브라질, 콜롬비아, 도미니카공화국, 에콰도르, 엘살바도르, 프랑스령 기아나, 과들루프, 과테말라, 가이아나, 아이티, 온두라스, 마르티니크, 멕시코, 파나마, 파라과이, 푸에르토리코, 세인트 마틴, 수리남 및 베네수엘라를 포함하는 "로컬 지카 바이러스 전염"을 경험한 국가 및 지역의 목록을 공개했다. 2016년 8월까지, 50개 이상의 국가에서 지카 바이러스의 활발한(국소적) 전염이 발생했다.
지카는 주로 암컷 아에데스 아에집티(Aedes aegypti) 모기에 의해 확산되고, 이는 주간에 활동하지만, 연구자들은 일반적 쿨렉스(Culex) 집 모기에서도 바이러스를 발견했다. 모기는 산란하기 위해 피를 섭식해야 한다. 이 바이러스는 또한 에이. 아프리카누스(A. africanus), 에이 아피코아르겐테우스(A. apicoargenteus), 에이 푸르시퍼(A. furcifer), 에이. 헨실리(A. hensilli), 에이. 루테오세팔루스(A. luteocephalus) 및 에이. 비타투스(A. vittatus) 등의 아에데스(Aedes) 속의 다수의 수목성 모기 종으로부터 단리되었고, 모기의 외인성 잠복기는 약 10일이다.
벡터의 실제 범위는 아직 공지되지 않았다. 지카는 아노펠레스 코우스타니(Anopheles coustani), 만소니아 유니포르미스(Mansonia uniformis), 쿨렉스 페르푸스쿠스(Culex perfuscus)와 함께 추가로 다수 종의 아에데스(Aedes)에서 검출되었지만, 이것만으로는 벡터로서 식별되지 않는다.
타이거 모기인 에이 알보픽투스(A. albopictus)에 의한 전염은 가봉에서 2007년의 도시 발생으로부터 보고된 바 있는데, 이는 새롭게 그 국가를 침입했고, 치쿤구니야 및 뎅기열 바이러스의 동시 발생의 주요 벡터로 되었다. 이탈리아로 유입된 실험실에서 확인된 지카 감염의 최초의 2건이 프랑스령 폴리네시아에서 돌아온 바이러스혈 여행자로부터 보고되었기 때문에, 에이. 말보픽투스(A. albopictus)에 의해 감염된 유럽 국가의 도시 지역에서 자발 감염이 우려되고 있다.
지카의 잠재적 사회적 위험은 이를 전염시키는 모기 종의 분포에 의해 구분할 수 있다. 지카의 가장 많이 인용되는 담체인 에이. 아에집티(A. aegypti)의 글로벌 분포는 글로벌 무역과 여행 때문에 확대되고 있다. 에이. 아에집티(A. aegypti) 분포는 북미 및 심지어 유럽 주변지역(마데이라, 네덜란드, 흑해 북동부 해안)를 포함한 모든 대륙에 걸쳐 이제까지 기록된 것 중에서 가장 광범위하다. 지카를 운반할 수 있는 모기 모집단이 워싱턴 D.C.의 캐피톨 힐 지구에서 발견되었고, 유전적 증거는 이 지역에서 적어도 4회 연속하여 겨울을 생존한 것을 시사한다. 연구의 저자들은 모기가 북부 기후에서 지속성에 적응하고 있다고 결론지었다. 지카 바이러스는 감염 후 약 1주일 동안 모기를 통해 전염되는 것으로 보인다. 바이러스는, 정액을 통해 전염되면, 감염 후 더 장기간(적어도 2주) 동안 감염되는 것으로 생각된다.
이의 생태학적 적소에 대한 연구는, 지카가 뎅기열보다 강수량과 기온의 변화에 의해 더 큰 영향을 받아, 열대 지역에 한정될 가능성이 더 높다는 것을 시사한다. 그러나, 지구 온도가 상승하면, 질환의 벡터의 범위가 추가로 북쪽으로 확장하여 지카가 따라갈 수 있다.
지카는 남성과 여성으로부터 성적 파트너에게 전염될 수 있다. 2016년 4월 기준으로, 지카의 성적 전염은, 2015년 발생시에, 아르헨티나, 칠레, 프랑스, 이탈리아, 뉴질랜드, 미국 등의 6개국에서 보고되었다.
2014년에, 실험실 배양에서 성장할 수 있는 지카는 지카 열병에 걸린 후, 적어도 2주간(경우에 따라 최대 10주)의 남성의 정액에서 발견되었다. 2011년의 연구에 따르면, 세네갈에서 모기를 연구하는 동안 수회 물린 미국의 생물학자는 2008년 8월에 귀국하고 나서 6일 후에 증상을 발증했지만, 2008년 이후 미국 외에 있지 않았던 그의 아내와 무방비한 성교를 하기 전에는 없었다. 남편과 아내 모두가 지카 항체를 갖는 것으로 확인되어, 성적 전염의 가능성에 대한 경각심을 고조시켰다. 2016년 2월 초, 댈러스 카운티 보건 복지국은, 남성 싱글 성적 파트너가 증상의 발증의 전날과 다음날 항문 삽입 성관계를 가진 후, 해외 여행을 한 적이 없는 텍사스 출신의 남성이 감염되었다고 보고했다. 2016년 2월 현재, 성적 전염의 가능성이 있는 14건의 추가 사례가 조사되고 있지만, 여성이 성적 파트너에게 지카를 전염시킬 수 있는지의 여부는 공지되지 않았다. 당시, "남성 비뇨 생식기에서 탈모의 발생율 및 기간"은 1건의 사례 보고로 한정되었다"는 이해가 있었다. 따라서, CDC 잠정 지침은 성적 전염의 위험을 평가하는 목적으로 남성을 검사하는 것에 대하여 권장했다.
2016년 3월, CDC는 커플의 예방 조치의 기간에 대한 권장 사항을 업데이트했고, 지카 열 또는 지카 증상이 확인된 남성과의 이성애자 커플은 증상이 개시된 후부터 최소 6개월 동안 콘돔을 사용하거나, 또는 삽입 성교(예: 질 성교, 항문 성교, 또는 구강)를 갖지 않는 것을 고려해야 한다고 조언했다. 여기에는 지카가 있는 지역에 거주하는 남성 및 그 지역을 여행한 남성이 포함된다. 지카가 있는 지역을 여행했지만 지카의 증상이 발현되지 않은 남성과의 커플은, 위험을 최소화하기 위해, 귀국 후 적어도 8주 동안 콘돔을 사용하거나, 또는 성관계를 갖지 않는 것을 고려해야 한다. 지카가 있는 지역에 거주하고 있지만 증상이 발현되지 않은 남성과의 커플은 그 지역에서 지카가 활발하게 전염되는 동안 콘돔을 사용하거나, 또는 성관계를 갖지 않는 것을 고려할 수 있다. 지카 바이러스는 임신 중 또는 분만시 감염된 산모로부터 태아로 확산할 수 있다.
2016년 4월 현재, 브라질에서 수혈을 통한 지카 전염의 2개 사례가 세계적으로 보고된 바 있고, 둘 다 브라질 출신이고, 이후 미국 식품의약국(FDA)은 헌혈자의 스크리닝 및 고위험 헌혈자의 4주간 연기를 권고했다. 2013년 11월과 2014년 2월의 공여자의 2.8%(42명)가 지카 RNA에 대해 양성이었고 혈액 검사 당시에 모두 무증상이었던 프랑스령 폴리네시아 지카 발병 당시의 헌혈자 스크리닝 연구를 기반으로 잠재적 위험이 의심되었다. 양성 공여자 중 11명은 이들의 기증 후 지카 열의 증상을 보고했지만, 34개 샘플 중 3개만이 배양에서 성장했다.
지카 바이러스는 모기의 중장 상피 세포에서 복제하고, 이어서 타액선 세포에서 복제한다. 5 내지 10일 후, 바이러스는 모기의 타액에서 발견할 수 있다. 모기의 타액이 인간 피부에 접종되면, 바이러스는 표피 각질세포, 피부의 피부 섬유아세포 및 랑게르한스 세포를 감염시킬 수 있다. 바이러스의 병인은 림프절과 혈류로 계속 확산하는 것으로 가정된다. 플라비바이러스는 일반적으로 세포질에서 복제되지만, 지카 항원은 감염된 세포 핵에서 발견되었다.
지카 열(지카 바이러스 질환이라고도 함)은 지카 바이러스에 의해 유발되는 질환이다. 대부분의 경우, 증상이 없지만, 존재하는 경우, 통상 경도이고 뎅기열과 유사할 수 있다. 증상에는 발열, 적목 현상, 관절 통증, 두통 및 반구진 발진이 포함될 수 있다. 증상은 통상 7일 미만 지속된다. 이는 초기 감염 동안 보고된 사망을 유발하지 않았다. 임신 중의 감염은 일부 아기에게 소두증 및 기타 뇌 기형을 유발한다. 성인의 감염은 길랭-바레 증후군(GBS)과 관련되어 있다. 진단은 사람이 아플 때에 지카 바이러스 RNA의 존재에 대해 혈액, 소변 또는 타액을 검사하는 것에 의해 수행된다.
예방에는 질환이 발생한 지역에서 모기에 물리는 것을 감소시키는 것 및 콘돔을 적절히 사용하는 것이 포함된다. 물림 방지를 위한 노력에는 방충제의 사용, 의복, 모기장으로 신체의 대부분을 덮는 것, 모기가 번식하는 장소에 고인 물을 제거하는 것 등이 있다. 효과적인 백신은 없다. 보건 당국은 2015-16년의 지카 발생의 영향을 받은 지역의 여성은 임신을 연기하는 것을 검토하고, 임신한 여성은 이 지역을 여행하지 말 것을 권고했다. 특별한 치료법은 없지만, 파라세타몰(아세트아미노펜)과 휴식이 증상을 개선시킬 수 있다. 입원은 거의 필요하지 않는다.
효과적 백신은 황열병 백신, 일본 뇌염 백신, 진드기 매개 뇌염 백신 등의 플라비바이러스과의 몇몇 바이러스에 대해 1930년대부터 존재하고, 뎅기열 백신은 2010년대 중반부터 존재했다. 세계보건기구(WHO)의 전문가들은 임신한 여성과 가임기 여성에게 안전하게 사용할 수 있는 불활성화 백신 및 기타 비생백신의 개발을 우선해야 한다고 제안했다.
2016년 3월 시점에서, 18개 기업과 기관이 국제적으로 지카 백신을 개발하고 있지만, 백신이 약 10년간 광범위하게 이용될 가능성은 낮다. 2016년 6월, FDA는 지카 백신에 대한 인간 임상 시험에 대한 최초의 승인을 부여했다.
이 바이러스는, 1947년 4월, 황열병 연구소의 과학자들에 의해 빅토리아 호수 근처의 우간다의 지카 숲에서 케이지에 가두었던 레수스 마카크 원숭이로부터 최초로 단리되었다. 1948년 1월, 동일한 장소에서 모기 에이. 아프리카누스(A. africanus)로부터 제2 단리가 수행되었다. 원숭이가 발열했을 때, 연구자들은 1948년에 지카라는 명명된 "여과 가능한 전염성 제제"를 이의 혈청으로부터 단리했다.
1952년에 발표된 우간다와 나이지리아의 혈청학적 조사 결과로부터, 지카는 인간을 감염시키는 것으로 공지되었고; 모든 연령대의 84명 중, 50명이 지카에 대한 항체를 갖고 있었고, 40세 이상은 모두 면역이 있었다. 인도에서 수행된 1952년의 연구에 따르면, 지카 검사를 받은 "상당한 수"의 인도인이 바이러스에 대한 면역 반응을 나타냈고, 이는 인간 모집단 중에서 장기간 동안 확산되었음을 시사한다.
인간으로부터 지카의 분리가 발표된 것은 1954년이었고, 이는 황열병으로 의심되는 황달에 대한 1952년의 발생 조사의 일환으로 이루어졌다. 이는, 미열, 두통, 말라리아 증세가 있지만, 황달은 없고, 3일 이내에 회복된 10세의 나이지리아 여성의 혈액에서 발견되었다. 실험실 마우스의 뇌에 혈액을 주입한 후, 최대 15마리의 마우스 계대를 수행했다. 이어서, 마우스 뇌로부터의 바이러스를 지카에 특이적으로 면역된 레수스 원숭이 혈청을 사용한 중화 시험으로 시험했다. 대조적으로, 발열, 황달, 기침, 1명의 미만성 관절통, 발열, 두통, 눈 뒤의 통증 및 관절통을 갖는 2명의 성인의 혈액으로부터 바이러스는 단리되지 않았다. 감염은 지카-특이 혈청 항체의 증가에 의해 입증되었다.
1951년부터 1983년까지, 중앙 아프리카공화국, 이집트, 가봉, 시에라리온, 탄자니아, 우간다 등의 기타 아프리카 국가, 및 인도, 인도네시아, 말레이시아, 필리핀, 태국, 베트남 및 파키스탄을 포함한 아시아 일부 국가에서 지카에 의한 인간 감염의 증거가 보고되었다. 이의 발견 이후 2007년까지, 아프리카와 동남아시아에서 인간 지카 감염의 확인된 사례는 14건에 불과했다.
2007년 4월, 아프리카와 아시아 이외의 지역에서 최초의 발생은 미크로네시아 연방의 야프 섬에서 발생했고, 이는 발진, 결막염 및 관절통을 특징으로 하고, 당초에는 뎅기열, 치쿤구니야 또는 로스 리버(Ross River) 질환으로 생각되었다. 질병의 급성기 환자의 혈청 샘플에는 지카의 RNA가 함유되어 있었다. 확진자 사례는 49명, 미확인 사례는 59명, 입원은 없었고, 사망자도 없었다. 2013년과 2014년 사이에, 프렌치 폴리네시아, 이스터 섬, 쿡 제도 및 뉴칼레도니아에서 추가의 유행병이 발생했다. 2016년 3월 22일, 로이터는 후향적 연구의 일환으로서, 방글라데시의 치타공에서 2014년에 채취된 노인의 혈액 샘플로부터 지카 바이러스가 단리되었다고 보도했다.
2016년 초의 시점에서, 주로 아메리카 대륙에서 지카의 확산 발생이 진행되고 있다. 이 발생은 2015년 4월에 브라질에서 개시되어, 남미, 중미, 북미 및 카리브해의 다른 국가로 확산했다. 지카 바이러스는 2016년 8월에 싱가포르와 말레이시아에 도달했다. 2016년 1월에, WHO는 바이러스가 연말까지 대부분의 아메리카 대륙에 확산할 가능성이 있다고 말했고; 2016년 2월에, WHO는 브라질에서 보고된 소두증 및 길랭-바레 증후군 사례의 클러스터(국제적 관심의 공중 위생상의 긴급사태)를 선언했고, 이는 지카 발생과 관련되는 것으로 강력하게 의심되었다. 브라질에서는 150만 명이 지카에 의해 감염된 것으로 추정되고, 2015년 10월부터 2016년 1월 사이에 3,500건 이상의 소두증 사례가 보고되었다.
다수의 국가에서 여행 경보를 발령했고, 이 발생은 관광 산업에 큰 영향을 미칠 것으로 예상된다. 몇몇 국가에서는 바이러스와 이의 태아 발달에 미치는 영향에 대해 더 많이 공지될 때까지 임신을 연기하도록 시민에게 조언하는 이례적 조치를 취했다. 리우데자네이루에서 개최된 2016년 하계 올림픽에서, 세계 보건 당국은 브라질과 무의식적으로 감염되었을 수 있는 국제적 운동선수와 관광객이 귀국하고, 바이러스를 확산시킬 수 있는 경우의 잠재적 위기에 대해 우려를 표명했다. 일부 연구자들은 3주간에 걸쳐 1 또는 2명의 관광객만이 감염될 수 있거나, 관광객 100,000명당 약 3.2명의 감염이 발생할 수 있다고 추측한다.
Ⅱ. 모노클로날 항체 및 이의 생산
"단리된 항체"는 이의 자연 환경의 성분으로부터 분리 및/또는 회수된 항체이다. 자연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리 방법에 의해 측정된 95중량% 초과, 가장 특히 99중량% 초과의 항체; (2) 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 수득하기에 충분한 정도로; 또는 (3) 쿠마시에 블루(Coomassie blue) 또는 은 염색(silver stain)을 사용하여 환원 또는 비환원 조건하에 SDS-PAGE에 의한 균질성까지 정제된다. 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에, 단리된 항체에는 재조합 세포 내의 원위치 항체가 포함된다. 그러나, 통상, 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조된다.
기본적 4-본쇄 항체 단위는 2개의 동일한 경쇄(L)와 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된 헤테로사량체 당단백질이다. IgM 항체는 5개의 기본적 헤테로사량체 단위와 J 쇄라고 하는 추가 폴리펩티드로 구성되어 있고, 따라서 10개의 항원 결합 부위를 포함하는 반면, 분비된 IgA 항체는 중합하여 J 쇄와 함께 2 내지 5개의 기본적 4-본쇄 단위를 포함하는 다가 집합체를 형성할 수 있다. IgG의 경우, 4-본쇄 단위는 일반적으로 약 150,000 달톤이다. 각 L 쇄는 1개의 공유 디설파이드 결합에 의해 H 쇄에 연결되어 있는 반면, 2개의 H 쇄는 H 쇄 아이소타입에 따라 1개 이상의 디설파이드 결합에 의해 서로 연결되어 있다. 각 H 및 L 쇄는 또한 규칙적으로 간격을 둔 쇄 내 디설파이드 브릿지를 갖고 있다. 각 H 쇄는 N-말단에 가변 영역(VH)을 갖고, 이어서 알파 및 감마 쇄 각각에 3개의 불변 도메인(CH)과 뮤 및 아이소타입에 4개의 CH 도메인을 갖는다. 각 L 쇄는 N-말단에 가변 영역(VL)이 있고, 다른 쪽 말단에는 불변 도메인(CL)이 있다. VL은 VH와 정렬되고, CL은 중쇄(CH1)의 최초의 불변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 영역 사이의 계면을 형성하는 것으로 생각된다. VH와 VL의 페어링은 함께 단일 항원 결합 부위를 형성한다. 상이한 클래스의 항체의 구조 및 특성에 대해서는, 예를 들면, 문헌[참조: Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, Conn ., 1994, page 71, and Chapter 6]을 참조한다.
모든 척추동물 종의 L 쇄는 이들의 불변 도메인(CL)의 아미노산 서열에 따라 카파와 람다라고 하는 2개의 명확하게 상이한 유형 중의 하나로 할당될 수 있다. 이들 중쇄(CH)의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린을 상이한 클래스 또는 아이소타입으로 할당할 수 있다. 면역글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개 부류가 있고, 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤라고 하는 중쇄를 갖는다. 이들의 감마 및 알파 클래스는 CH 서열 및 기능의 비교적 작은 차이에 따라 서브클래스로 분류되고, 인간은 하기 서브클래스를 발현한다: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2.
용어 "가변"은 V 도메인의 특정 세그먼트가 항체 사이에서 서열이 광범위하게 상이하다는 사실을 지칭한다. V 도메인은 항원 결합을 매개하고, 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 정의한다. 그러나, 가변성은 가변 영역의 110개 아미노산 범위에 걸쳐 균등하게 분포되지 않는다. 대신, V 영역은, 15 내지 30개 아미노산의 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 비교적 불변의 스트렛치로 구성되고, 각각 9 내지 12개 아미노산 길이의 "초가변 영역"이라고 하는 극단적 가변성의 더 짧은 영역으로 분리되어 있다. 자연 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 4개의 FR을 포함하고, 주로 베타 시트 구성을 채용하고, 3개의 초가변 영역으로 연결되고, 이는 루프 연결을 형성하고, 일부 경우에는 베타 시트 구조의 일부를 형성한다. 각 쇄의 초가변 영역은 FR에 의해 근접하게 함께 유지되고, 다른 쇄의 초가변 영역과 함께, 항체의 항원 결합 부위 형성에 기여한다[참조: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]. 불변 도메인은 항원에 대한 항체의 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 항체 의존성 세포독성(ADCC), 항체-의존성 세포 식세포작용(ADCP), 항체-의존성 호중구 식세포작용(ADNP) 및 항체-의존적 보체 침착(ADCD)에 대한 항체의 관여 등의 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.
본 명세서에 사용된 경우의 용어 "초가변 영역"은 항원 결합에 관여하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기(예를 들면, 카바트(Kabat) 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는 경우, VL에서 약 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3), 및 VH에서 약 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)); 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기(예: 초티아 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는 경우, VL에서 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3), 및 VH에서 26-32(H1), 52-56 (H2) 및 95-101(H3); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)); 및/또는 "초가변 루프"/CDR로부터의 잔기(예: IMGT 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는 경우, VL에서 잔기 27-38(L1), 56-65(L2) 및 105-120(L3), 및 VH에서 27-38(H1), 56-65(H2) 및 105-120(H3); Lefranc, M. P. et al. Nucl. Acids Res. 27:209-212(1999), Ruiz, M. et al.Nucl.Acids Res. 28:219-221(2000))를 포함한다. 임의로, 항체는, 문헌[참조: AHo; Honneger, A. and Plunkthun, A. J. Mol. Biol. 309:657-670 (2001)]에 따라 넘버링되는 경우, 하나 이상의 하기 포인트: VL에서 28, 36(L1), 63, 74-75(L2) 및 123(L3), 및 VsubH에서 28, 36(H1), 63, 74-75(H2) 및 123(H3)에서 비대칭 삽입체를 갖는다.
"생식계열 핵산 잔기"는 불변 또는 가변 영역을 인코딩하는 생식계열 유전자에서 자연적으로 발생하는 핵산 잔기를 의미한다. "생식계열 유전자"는 생식 세포(즉, 난자 또는 정자로 되는 세포)에서 발견되는 DNA이다. "생식계열 돌연변이"는 단일 세포 단계에서 생식 세포 또는 접합자에서 발생한 특정 DNA의 유전적 변화를 지칭하고, 자손에게 전달되면, 이러한 돌연변이는 신체의 모든 세포에 도입된다. 생식계열 돌연변이는 단일 체세포에서 획득되는 체세포 돌연변이와 대조적이다. 일부 경우에, 가변 영역을 인코딩하는 생식계열 DNA 서열의 뉴클레오티드가 돌연변이되고(즉, 체세포 돌연변이), 다른 뉴클레오티드로 치환된다.
본 명세서에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 모집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉 모집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 매우 특이적이고, 단일 항원 부위에 대해 지시되어 있다. 추가로, 상이한 결정기(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 조제물과 대조적으로, 각 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 이들의 특이성에 추가하여, 모노클로날 항체는 다른 항체에 의해 오염되지 않은 상태로 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날"은 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들면, 본 개시에 유용한 모노클로날 항체는 문헌[참조: Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 의해 최초로 기재된 하이브리도마 방법론에 의해 제조될 수 있거나, 또는 항원 특이적 B 세포의 단일 세포 선별, 감염 또는 면역화에 반응하는 항원 특이적 형질모세포, 또는 벌크 선별된 항원 특이적 컬렉션에서 단일 세포로부터 연결된 중쇄 및 경쇄의 포획 후에 세균, 진핵 동물 또는 식물 세포에서 재조합 DNA 방법을 사용하여 제조될 수 있다(예: 미국 특허 제4,816,567호 참조). "모노클로날 항체"는 또한 문헌[참조: Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597(1991)]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.
A. 일반 방법
Zika 바이러스에 결합하는 모노클로날 항체는 몇몇 용도가 있을 것이라는 것을 이해할 것이다. 여기에는 지카 바이러스 감염의 검출 및 진단 및 이의 치료에 사용하는 진단 키트의 생산이 포함된다. 이러한 맥락에서, 이러한 항체를 진단약 또는 치료제에 연결하거나, 이들을 포획제 또는 경쟁 검정에서 경쟁물질로 사용하거나, 추가 약제를 부착하지 않고서 개별적으로 사용할 수 있다. 항체는 하기에 추가로 논의되는 바와 같이 돌연변이되거나 변형될 수 있다. 항체를 제조 및 특성화하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: 예를 들면, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; 미국 특허 제4,196,265호].
모노클로날 항체(MAb)를 생성하는 방법은 일반적으로 폴리클로날 항체를 제조하는 방법과 동일한 방침을 따라 개시한다. 이 2개 방법의 제1 단계는 적절한 숙주의 면역화 또는 이전의 자연 감염 또는 인가된 또는 실험적 백신에 의한 백신화에 기인하여 면역을 갖는 대상체의 특정이다. 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 면역화를 위한 소정 조성물은 이의 면역원성이 상이할 수 있다. 따라서, 펩티드 또는 폴리펩티드 면역원을 담체에 커플링함으로써 달성될 수 있는 바와 같이, 숙주 면역계를 부스트하는 것이 종종 필요하다. 예시적이고 바람직한 담체는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 및 소 혈청 알부민(BSA)이다. 오브알부민, 마우스 혈청 알부민 또는 래빗 혈청 알부민 등의 기타 알부민도 담체로서 사용할 수 있다. 폴리펩티드를 담체 단백질에 접합시키는 수단은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 글루타르알데히드, m-말레이미도벤코일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 카보디이미드 및 비스-비아조화 벤지딘을 포함한다. 또한, 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 특정 면역원 조성물의 면역원성은 애주번트로 공지된 면역 반응의 비특이적 자극제의 사용에 의해 증강될 수 있다. 동물에서 예시적이고 바람직한 애주번트는 완전 프로인트 애주번트(사멸된 결핵균을 함유하는 면역 반응의 비특이적 자극제), 불완전 프로인트 애주번트 및 수산화알루미늄 애주번트를 포함하고, 인간에서는 알룸, CpG, MFP59 및 면역자극 분자의 조합("애주번트 시스템", 예컨대, AS01 또는 AS03)을 포함한다. 나노입자 백신 또는 물리적 전달 시스템(지질 나노입자 또는 금 미립자총 비드 등)에서 DNA 또는 RNA 유전자로서 전달되고 바늘, 유전자 총, 경피 전기 천공 장치로 전달되는 유전자 인코딩 항원을 포함하여 지카-특이적 B 세포를 유도하기 위한 추가 실험적 형태의 접종이 가능하다. 항원 유전자는 또한 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 폭스바이러스, 헤르페스바이러스 또는 알파바이러스 레플리콘 등의 복제 적격 또는 결함 바이러스 벡터, 또는 대안적으로 바이러스 유사 입자에 의해 인코딩된 바와 같이 운반될 수 있다.
자연 병원체에 대한 인간 항체의 경우, 적절한 접근법은 병원체에 노출된 대상체, 예를 들면, 질환에 걸린 것으로 진단된 대상체 또는 백신 접종되어 병원체에 대해 보호 면역을 생성하거나 실험적 백신의 안전성 또는 효능을 시험한 대상체를 특정하는 것이다. 순환하는 항-병원체 항체를 검출할 수 있고, 이어서 항체-양성 대상체로부터 B 세포를 인코딩하거나 생산하는 항체를 획득할 수 있다.
폴리클로날 항체의 생산에 사용되는 면역원 조성물의 양은 면역원의 특성과 면역화에 사용되는 동물에 따라 상이하다. 다양한 경로를 사용하여 면역원을 투여할 수 있다(피하, 근육내, 피내, 정맥내 및 복강내). 폴리클로날 항체의 생산은 면역화 후의 다양한 시점에서 면역화된 동물의 혈액을 샘플링하여 모니터링할 수 있다. 제2 부스터 주사도 제공될 수 있다. 적절한 역가가 달성될 때까지, 부스팅 및 역가측정의 프로세스가 반복된다. 목적하는 수준의 면역원성이 수득되면, 면역화된 동물로부터 채혈하고, 혈청을 단리 및 저장하고/하거나, 동물을 사용하여 MAb를 생성할 수 있다.
면역화 후, 항체 생성의 가능성이 있는 체세포, 특히 B 림프구(B 세포)가 MAb 생성 프로토콜에 사용하기 위해 선택된다. 이 세포는 생검된 비장, 림프절, 편도선 또는 아데노이드, 골수 흡인물 또는 생검, 폐 또는 위장관 등의 점막 기관으로부터의 조직 생검 또는 순환 혈액으로부터 수득될 수 있다. 이어서, 면역화된 동물 또는 면역 인간으로부터의 항체 생성 B 림프구를, 불멸성 골수종 세포의 세포, 일반적으로 면역화된 동물과 동일한 일종, 또는 인간 또는 인간/마우스 키메라 세포와 융합시킨다. 하이브리도마 생성 융합 절차에 사용하기에 적합한 골수종 세포주는 바람직하게는 비항체 생성이고, 높은 융합 효율을 갖고, 따라서 효소 결함에 의해 원하는 융합 세포(하이브리도마)만의 성장을 서포트하는 특정 선택 배지에서 성장할 수 없게 된다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 다수의 골수종 세포 중 임의의 하나를 사용할 수 있다[참조: Goding, pp. 65-66, 1986; Campbell, pp. 75-83, 1984]. HMMA2.5 세포 또는 MFP-2 세포는 이러한 세포의 특히 유용한 예이다.
항체 생성 비장 또는 림프절 세포와 골수종 세포의 하이브리드를 생성하는 방법은 통상 세포막의 융합을 촉진하는 작용제(화학적 또는 전기적)의 존재하에 체세포와 골수종 세포를 2:1 비율로 혼합하는 것을 포함하지만, 비율은 각각 약 20:1 내지 약 1:1로 달라질 수 있다. 일부 경우에, 초기 단계로서 엡스타인 바르 바이러스(EBV)를 사용하여 인간 B 세포를 형질전환하면, B 세포의 크기가 증가하여 비교적 큰 크기의 골수종 세포와의 융합이 증강된다. EBV에 의한 형질전환 효율은 형질전환 배지에서 CpG 및 Chk2 억제제 약물을 사용함으로써 증강된다. 또는, 인간 B 세포는 IL-21 및 TNF 상과의 유형 II 구성원인 인간 B 세포 활성화 인자(BAFF) 등의 추가 가용성 인자를 함유하는 배지에서 CD40 리간드(CD154)를 발현하는 형질감염된 세포주와의 공동 배양에 의해 활성화될 수 있다. 센다이(Sendai) 바이러스를 사용한 융합 방법은 문헌[참조: Kohler and Milstein(1975; 1976)]에 의해 기재되었고, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)(예: 37%(v/v) PEG)을 사용한 융합 방법은 문헌[참조: Gefter et al. (1977)]에 의해 기재되었다. 전기적으로 유도된 융합 방법의 사용도 적절하고[참조: Goding, pp. 71-74, 1986], 더 나은 효율을 위한 프로세스가 있다[참조: Yu et al., 2008]. 융합 절차는 통상 약 1 × 10-6 내지 1 × 10-8의 낮은 주파수에서 실행 가능한 하이브리드를 생산하지만, 최적화된 절차를 사용하면, 200분의 1에 근접하는 융합 효율을 달성할 수 있다[참조: Yu et al., 2008]. 그러나, 생존 가능한 융합된 하이브리드는 선택 배지에서 배양함으로써 모체의 주입된 세포(특히, 통상은 무기한으로 계속 분열하는 주입된 골수종 세포)로부터 분화되기 때문에, 비교적 낮은 융합 효율은 문제가 되지 않는다. 선택 배지는 일반적으로 조직 배양 배지에서 뉴클레오티드의 드 노보 합성을 차단하는 약제를 포함하는 것이다. 예시적이고 바람직한 약제는 아미노프테린, 메토트렉세이트 및 아자세린이다. 아미노프테린과 메토트렉세이트는 퓨린과 피리미딘 모두의 드 노보 합성을 차단하는 반면, 아자세린은 퓨린 합성만을 차단한다. 아미노프테린 또는 메토트렉세이트를 사용하는 경우, 배지에는 뉴클레오티드의 공급원으로서 하이포크산틴 및 티미딘이 보충된다(HAT 배지). 아자세린을 사용하는 경우, 배지에는 하이포크산틴이 보충된다. B 세포 공급원이 EBV 형질전환된 인간 B 세포주인 경우, 골수종에 융합되지 않은 EBV 형질전환 세포주를 제거하기 위해 오우아바인(Ouabain)이 첨가된다.
바람직한 선택 배지는 HAT, 또는 오우아바인을 포함하는 HAT이다. 뉴클레오티드 회수 경로를 조작할 수 있는 세포만이 HAT 배지에서 생존할 수 있다. 골수종 세포는 회수 경로의 중요한 효소(예: 하이포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제(HPRT))에 결함이 있어 생존할 수 없다. B 세포는 이 경로를 조작할 수 있지만, 배양 수명이 제한되어 있고, 통상은 약 2주 이내에 사망한다. 따라서, 선택 배지에서 생존할 수 있는 유일한 세포는 골수종과 B 세포에서 형성된 하이브리드이다. 융합에 사용되는 B 세포의 공급원이 EBV-형질전환된 B 세포 계통인 경우, 여기에서와 같이, EBV-형질전환된 B 세포는 약물 사멸에 감수성이기 때문에, 오우아바인은 하이브리드의 약물 선택에도 사용될 수 있지만, 사용되는 골수종 파트너는 오우아바인 내성으로 되도록 선택되었다.
배양은 특정 하이브리도마가 선택되는 하이브리도마 모집단을 제공한다. 통상, 하이브리도마의 선택은 미세역가 플레이트에서 단일-클론 희석에 의해 세포를 배양하고, 이어서 개별 클론 상청액(약 2-3주 후)을 목적하는 반응성에 대해 시험함으로써 수행된다. 검정은 방사면역검정, 효소 면역검정, 세포독성 검정, 플라크 검정, 도트 면역결합 검정 등의 감수성이고 단순하며 신속해야 한다. 이어서, 선택된 하이브리도마를 연속 희석하거나, 유세포 분석 선별에 의해 단일 세포로 선별하고, 개별 항체 생산 세포주로 클로닝하고, 이어서 이 클론을 무기한 증식시켜 mAb를 제공할 수 있다. 세포주는 2개의 기본 방식으로 MAb 생산에 이용될 수 있다. 하이브리도마 샘플은 동물(예: 마우스)에 (종종 복강 내로) 주사할 수 있다. 임의로, 주사 전에, 동물을 탄화수소, 특히 프리스탄(테트라메틸펜타데칸) 등의 오일로 프라이밍한다. 인간 하이브리도마를 이러한 방식으로 사용하는 경우, 종양의 거부 반응을 예방하기 위해, SCID 마우스 등의 면역무방비 마우스를 주사하는 것이 최적이다. 주사된 동물은 융합된 세포 하이브리드에 의해 생성된 특정 모노클로날 항체를 분비하는 종양을 발증시킨다. 이어서, 혈청 또는 복수액 등의 동물의 체액을 탭핑하여, 고농도의 MAb를 제공할 수 있다. 개별 세포주는 또한 시험관 내에서 배양될 수 있고, 여기서 MAb는 배양 배지로 자연적으로 분비되고, 이로부터 고농도로 용이하게 수득할 수 있다. 또는, 인간 하이브리도마 세포주를 시험관 내에서 사용하여, 세포 상청액에서 면역글로불린을 생성할 수 있다. 세포주는, 고순도의 인간 모노클로날 면역글로불린을 회수하는 능력을 최적화하기 위해, 무혈청 배지에서의 성장에 적합시킬 수 있다.
어느 하나의 수단에 의해 생성된 MAb는, 필요에 따라, 여과, 원심분리 및 FPLC 또는 친화성 크로마토그래피 등의 다양한 크로마토그래피 방법을 사용하여 추가로 정제할 수 있다. 본 개시의 모노클로날 항체의 단편은, 펩신 또는 파파인 등의 효소에 의한 소화를 포함하는 방법에 의해 및/또는 화학적 환원에 의한 디설파이드 결합의 절단에 의해, 정제된 모노클로날 항체로부터 수득할 수 있다. 또는, 본 개시에 포함되는 모노클로날 항체 단편은 자동화된 펩티드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다.
또한, 모노클로날 항체를 생성하기 위해 분자 클로닝 접근법을 사용할 수 있는 것으로 고려된다. 목적 항원으로 표지된 단일 B 세포는 상자성 비드 선택 또는 유세포 분석 선별을 사용하여 물리적으로 선별될 수 있고, 이어서 단일 세포로부터 RNA를 단리하고, RT-PCR에 의해 항체 유전자를 증폭시킬 수 있다. 또는, 항원 특이적 벌크 선별된 세포 모집단은 미세소포로부터 분리되고, 정합된 중쇄 및 경쇄 가변 유전자는 중쇄 및 경쇄 암필리콘의 물리적 결합, 또는 소포로부터의 중쇄 및 경쇄 유전자의 일반적 바코드화를 사용하여 단일 세포로부터 회수된다. 단일 세포를 형성하는 정합된 중쇄 및 경쇄 유전자는 또한 RT-PCR 프라이머 및 세포당 1개의 바코드로 전사물을 마킹하기 위한 바코드를 갖는 세포 투과성 나노입자로 세포를 처리함으로써 항원 특이적 B 세포의 모집단으로부터 수득할 수 있다. 항체 가변 유전자는 또한, 하이브리도마 계통의 RNA 추출에 의해 단리할 수 있고, 항체 유전자는 RT-PCR에 의해 수득되고, 면역글로불린 발현 벡터에 클로닝될 수 있다. 또는, 조합 면역글로불린 파지미드 라이브러리는 세포주로부터 단리된 RNA로부터 제조되고, 적절한 항체를 발현하는 파지미드는 바이러스 항원을 사용하여 패닝함으로써 선택된다. 종래의 하이브리도마 기술에 비해 이 접근법의 장점은 1회의 라운드에서 약 104배 더 많은 항체를 생산 및 스크리닝할 수 있다는 것, 및 H 및 L 쇄의 조합에 의해 신규한 특이성이 생성되어 적절한 항체를 발견할 가능성이 추가로 높아진다는 것이다.
본 개시에서 유용한 항체의 생산을 교시하는, 각각이 참조에 의해 본 명세서에 도입되는 기타 미국 특허에는 조합 접근법을 사용한 키메라 항체의 생산을 기재하는 미국 특허 제5,565,332호; 재조합 면역글로불린 조제물을 기재하는 미국 특허 제4,816,567호; 및 항체-치료제 접합체를 기재하는 미국 특허 제4,867,973호가 포함된다.
B. 본 개시의 항체
본 개시에 따른 항체는, 우선, 이들의 결합 특이성에 의해 정의될 수 있다. 당업자는, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 기술을 사용하여 소정 항체의 결합 특이성/친화성을 평가함으로써 이러한 항체가 본 청구범위의 범위 내에 속하는지의 여부를 결정할 수 있다. 예를 들면, 소정 항체가 결합하는 에피토프는 항원 분자(예: 도메인의 선형 에피토프) 내에 위치한 3개 이상(예를 들면, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20) 아미노산의 단일 연속 서열로 이루어질 수 있다. 또는, 에피토프는 항원 분자(예를 들면, 형태적 에피토프) 내에 위치한 복수의 비인접 아미노산(또는 아미노산 서열)으로 이루어질 수 있다.
당업자에게 공지된 다양한 기술을 사용하여, 항체가 폴리펩티드 또는 단백질 내에서 "하나 이상의 아미노산과 상호작용"하는지의 여부를 결정할 수 있다. 예시적 기술에는, 예를 들면, 문헌[참조: Antibodies, Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)]에 기재된 것 등의 통상의 교차-차단 검정이 포함된다. 교차-차단은 ELISA, 생물층 간섭계 또는 표면 플라즈몬 공명 등의 다양한 결합 검정에서 측정할 수 있다. 기타 방법에는 알라닌 스캐닝 돌연변이 분석, 펩티드 블롯 분석[참조: Reineke (2004) Methods Mol. Biol. 248: 443-63], 펩티드 절단 분석, 단일 입자 재구성을 사용한 고해상도 전자 현미경 기술, cryoEM 또는 단층 촬영, 결정학 연구 및 NMR 분석이 포함된다. 또한, 에피토프 절제, 에피토프 추출 및 항원의 화학적 변형 등의 방법을 사용할 수 있다[참조: Tomer (2000) Prot. Sci. 9: 487-496]. 항체가 상호작용하는 폴리펩티드 내의 아미노산을 동정하기 위해 사용할 수 있는 또 다른 방법은 질량 분석에 의해 검출되는 수소/중수소 교환이다. 일반적으로, 수소/중수소 교환 방법에는 목적 단백질을 중수소로 표지한 후, 항체를 중수소로 표지된 단백질에 결합시키는 방식이다. 이어서, 단백질/항체 복합체는 물로 이동하고, 항체 복합체에 의해 보호되는 아미노산 내의 교환 가능한 양성자는 계면의 일부가 아닌 아미노산 내의 교환 가능한 양성자보다 느린 속도로 중수소로부터 수소로의 역교환을 겪는다. 결과적으로, 단백질/항체 계면의 일부를 형성하는 아미노산은 중수소를 보유할 수 있기 때문에, 계면에 포함되지 않은 아미노산과 비교하여 비교적 높은 질량을 나타낼 수 있다. 항체의 해리 후, 표적 단백질은 프로테아제 절단 및 질량 분석에 제공되고, 이에 의해 항체가 상호작용하는 특정 아미노산에 대응하는 중수소 표지된 잔기를 나타낸다[참조: 예를 들면, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267: 252-259; Engen and Smith(2001) Anal. Chem. 73: 256A-265A]. 항체가 지카를 중화하는 경우, 고농도의 항체의 존재하에서, 시험관 내 또는 동물 모델에서 지카를 증식시킴으로써 항체 탈출 돌연변이 변이체 생물을 단리할 수 있다. 항체에 의해 표적화된 항원을 인코딩하는 지카 유전자의 서열 분석에 의해, 항체 탈출을 제공하는 돌연변이(들)이 나타나고, 이는 에피토프 내의 잔기 또는 에피토프의 구조에 알로스테릭으로 영향을 미치는 것을 나타낸다.
용어 "에피토프"는 B 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 상의 부위를 지칭한다. B 세포 에피토프는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치된 인접 아미노산 또는 비인접 아미노산 모두로부터 형성될 수 있다. 인접한 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 통상 변성 용매에 대한 노출로 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 통상 변성 용매로의 처리로 소실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간적 형태로 적어도 3개, 보다 일반적으로 적어도 5개 또는 8 내지 10개의 아미노산을 포함한다.
항원 구조-기반 항체 프로파일링(Antigen Structure-based Antibody Profiling; ASAP)이라고도 하는 변형-지원된 프로파일링(MAP)은 각 항체의 결합 프로필의 유사성에 따라 동일한 항원에 대해 지시된 다수의 모노클로날 항체(mAb)를 분류하는 방법이다(US 제2004/0101920호 참조, 여기서는 참조에 의해 그 전체가 구체적으로 도입됨). 각 카테고리는 다른 카테고리에 의해 대표되는 에피토프와는 명백히 상이하거나, 부분적으로 중첩하는 고유한 에피토프를 반영할 수 있다. 이 기술에 의해, 유전적으로 동일한 항체의 신속한 필터링이 가능해지고, 유전적으로 상이한 항체에 초점을 맞추어 특성화를 수행할 수 있다. 하이브리도마 스크리닝에 적용하면, MAP는 목적하는 특성을 갖는 mAb를 생성하는 희귀 하이브리도마 클론의 동정을 용이하게 할 수 있다. MAP를 사용하여, 본 개시의 항체를, 상이한 에피토프에 결합하는 항체 그룹으로 분류할 수 있다.
본 개시는 동일한 에피토프, 또는 에피토프의 일부에 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 마찬가지로, 본 개시는 또한, 표적 또는 이의 단편에 대한 결합에 대해 본 명세서에 기재된 임의의 특정 예시적 항체와 경쟁하는 항체를 포함한다. 당해 기술분야에 공지된 통상의 방법을 사용함으로써, 항체가 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지, 또는 결합에 대해 경쟁하는지의 여부를 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들면, 시험 항체가 참조와 동일한 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해, 참조 항체는 포화 조건하에서 표적에 결합할 수 있다. 이어서, 표적 분자에 결합하는 시험 항체의 능력이 평가된다. 참조 항체와의 포화 결합 후에 시험 항체가 표적 분자에 결합할 수 있는 경우, 시험 항체는 참조 항체와는 상이한 에피토프에 결합한다고 결론지을 수 있다. 반면에, 참조 항체와의 포화 결합 후 시험 항체가 표적 분자에 결합할 수 없는 경우, 시험 항체는 참조 항체에 의해 결합된 에피토프와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
항체가 참조 항-지카 바이러스 항체와의 결합에 대해 경쟁하는지의 여부를 결정하기 위해, 상기에서 기재된 결합 방법론은 2개의 방향으로 수행된다: 제1 방향에서는, 참조 항체를 포화 조건하에서 지카 바이러스 항원에 결합시키고, 이어서 지카 바이러스 분자에 대한 시험 항체의 결합을 평가한다. 제2 방향에서는, 시험 항체는 포화 조건하에 지카 바이러스 항원 분자에 결합시키고, 이어서 지카 바이러스 분자에 대한 참조 항체의 결합을 평가한다. 2개 방향 모두에서, 제1 (포화) 항체만이 지카 바이러스에 결합할 수 있는 경우, 시험 항체와 참조 항체는 지카 바이러스에 결합하기 위해 경쟁하는 것으로 결론짓는다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 참조 항체와의 결합을 위해 경쟁하는 항체는, 반드시 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합할 필요는 없지만, 중첩 또는 인접 에피토프에 결합함으로써 참조 항체의 결합을 입체적으로 차단할 수 있다.
각각이 항원에 대한 다른 항체의 결합을 경쟁적으로 억제(차단)하는 경우, 2개의 항체는 동일하거나 중첩하는 에피토프에 결합한다. 즉, 1-, 5-, 10-, 20- 또는 100배 과량의 한쪽 항체는, 경쟁 결합 검정으로 측정한 경우, 다른 결합을 적어도 50%, 그러나 바람직하게는 75%, 90% 또는 심지어 99% 억제한다[참조: 예를 들면, Junghans et al., Cancer Res. 1990 50:1495-1502]. 또는, 한쪽 항체의 결합을 감소 또는 제거하는 항원 내의 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 다른 쪽 항체의 결합을 감소 또는 제거하는 경우, 2개의 항체는 동일한 에피토프를 갖는다. 한쪽 항체의 결합을 감소 또는 제거하는 일부 아미노산 돌연변이가 다른 쪽 항체의 결합을 감소 또는 제거하는 경우, 2개 항체는 중첩 에피토프를 갖는다.
이어서, 추가의 통상적 실험(예: 펩티드 돌연변이 및 결합 분석)을 수행하여, 관찰된 시험 항체의 결합의 결여가 실제로 참조 항체와 동일한 에피토프에 대한 결합에 의한 것인지, 또는 입체적 차단(또는 또 다른 현상)이 관찰된 결합의 결여의 원인인지를 확인할 수 있다. 이러한 종류의 실험은 ELISA, RIA, 표면 플라즈몬 공명, 유세포 분석 또는 당해 기술분야에서 이용 가능한 임의의 기타 정량적 또는 정성적 항체 결합 검정을 사용하여 수행할 수 있다. EM 또는 결정학을 사용한 구조 연구는 결합을 위해 경쟁하는 2개의 항체가 동일한 에피토프를 인식하는지의 여부를 입증할 수도 있다.
또 다른 측면에서, 각각 표 3 및 4에 예시된 바와 같은 중쇄 및 경쇄로부터 클론-쌍을 이룬 CDR을 갖는 모노클로날 항체가 제공된다. 이러한 항체는 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여, 하기 실시예 섹션에서 논의된 클론에 의해 생성될 수 있다.
또 다른 측면에서, 항체는 추가의 "프레임워크" 영역을 포함하는 이들의 가변 서열에 의해 정의될 수 있다. 이들은 완전한 가변 영역을 인코딩하거나 나타내는 표 1 및 2에 제공된다. 추가로, 항체 서열은 이들 서열과 상이할 수도 있고, 임의로 이하에 더 상세히 논의되는 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 핵산 서열은, (a) 가변 영역이 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인으로부터 분리될 수 있고, (b) 핵산이, 이에 의해 인코딩된 잔기에 영향을 미치지 않으면서, 상기 제시된 것과 상이할 수 있고, (c) 핵산이 상기 기재된 핵산과는 소정 백분율, 예를 들면, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성으로 상이할 수 있고, (d) 핵산이, 약 0.02M 내지 약 0.15M의 NaCl에 의해 제공되는 것 등의 저염 및/또는 고온 조건하에 예시된 바와 같이, 높은 엄격성 조건하에서 하이브리드화하는 능력에 비추어 상기 기재된 핵산과 상이할 수 있고, (e) 아미노산이 상기 기재된 아미노산과 소정 백분율, 예를 들면, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성으로 상이할 수 있고, 또는 (f) 아미노산이 보존적 치환(하기 설명됨)을 허용함으로써 위에 기재된 아미노산과 상이할 수 있다는 점에서 상기 기재된 핵산 서열과는 상이할 수 있다. 상기 각각은 표 1로서 제시된 핵산 서열 및 표 2의 아미노산 서열에 적용된다.
폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드 서열을 비교하는 경우, 하기 기재된 바와 같이, 최대 대응을 위해 정렬될 때에 2개 서열 중의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열이 동일한 경우, 2개 서열은 "동일한" 것이라고 한다. 2개 서열 사이의 비교는 통상 비교 윈도우에서 서열을 비교하여 서열 유사성의 국소 영역을 확인 및 비교함으로써 수행된다. 본 명세서에 사용된 "비교 윈도우"는, 적어도 약 20개의 인접 위치, 통상은 30 내지 약 75, 40 내지 약 50개의 세그먼트를 지칭하고, 여기서 서열은, 2개 서열이 최적으로 정렬된 후에 동일한 수의 인접 위치의 참조 서열과 비교할 수 있는 한다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬은 디폴트 파라미터를 사용하여 생물정보학 소프트웨어의 레이저진(Lasergene) 제품군(DNASTAR, Inc., Madison, WI)에서 메갈라인(Megalign) 프로그램을 사용하여 수행할 수 있다. 이 프로그램은 하기 참고 문헌에 설명된 몇몇 정렬 도식을 구체화한다: Dayhoff, M. O. (1978) A model of evolutionary change in proteins--Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M. O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington D.C. Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogeny pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Higgins, D. G. and Sharp, P. M. (1989) CABIOS 5:151-153; Myers, E. W. and Muller W. (1988) CABIOS 4:11-17; Robinson, E. D. (1971) Comb. Theor 11:105; Santou, N. Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P. H. A. and Sokal, R. R. (1973) Numerical Taxonomy--the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, Calif.; Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. (1983) Proc. Natl. Acad., Sci. USA 80:726-730.
또는, 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 스미스 및 워터맨의 국소 동정 알고리즘(Smith and Waterman(1981) Add. APL. Math 2:482)에 의해, 니들맨 및 운쉬의 동정 정렬 알고리즘(Needleman and Wunsch(1970) J. Mol. Biol. 48:443)에 의해, 피어슨 및 리프맨의 유사성 방법을 위한 검색(Pearson and Lipman(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444)에 의해, 이러한 알고리즘의 컴퓨터화된 실행(위스콘신주 유전학 소프트웨어 패키지의 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA, Genetics Computer Group(GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis)에 의해, 또는 검사에 의해 수행할 수 있다.
퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하는 데 적합한 알고리즘의 하나의 특정 예는 문헌[참조: Altschul et al. (1977) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402 and Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]에 각각 기재되어 있는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 및 BLAST 2.0은, 예를 들면, 본 명세서에 기재된 파라미터와 함께 사용하여, 본 개시의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드에 대한 퍼센트 서열 동일성을 결정할 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생명공학 정보 센터를 통해 공개적으로 이용 가능하다. 항체 서열의 재배열된 특성과 각 유전자의 가변 길이는 단일 항체 서열에 대한 복수 라운드의 BLAST 검색을 필요로 한다. 또한, 상이한 유전자를 수동으로 조립하는 것은 어렵고 에러가 발생하기 쉽다. 서열 분석 도구 IgBLAST(월드-와이드-웹, ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)는 생식계열 V, D 및 J 유전자에 대한 정합, 재배열 접합부의 상세, Ig V 도메인 프레임워크 영역의 묘사 및 상보성 결정 영역을 동정한다. IgBLAST는 뉴클레오티드 또는 단백질 서열을 분석할 수 있고, 서열을 뱃치로 처리할 수 있으며, 생식계열 유전자 데이터베이스 및 기타 서열 데이터베이스를 동시에 검색하여, 가장 정합하는 생식계열 V 유전자의 누락 가능성을 최소화할 수 있다.
한 가지 예시적 예에서, 누적 스코어는 뉴클레오티드 서열에 대해 파라미터 M(정합하는 잔기의 쌍에 대한 보상 스코어; 항상 >0) 및 N(정합하지 않는 잔기에 대한 패널티 스코어; 항상 <0)을 사용하여 계산할 수 있다. 각 방향의 히트 단어의 확장은 하기의 경우에 중지된다: 누적 정렬 스코어가 달성된 최대치로부터 수량 X만큼 저하되거나, 하나 이상의 음수 스코어의 잔기 정렬의 누적으로 인해 누적 스코어가 0 이하로 되거나, 또는 어느 한 서열의 종점에 도달한 경우. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 감도와 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열용)은 디폴트로서 단어 길이(W) 11, 기대값(E) 10, BLOSUM62 스코어링 매트릭스[참조: Henikoff and Henikoff(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915] 정렬, (B) 50, 기대치(E) 10, M=5, N=-4 및 양쪽 스트랜드의 비교를 사용한다.
아미노산 서열의 경우, 스코어링 매트릭스를 사용하여 누적 스코어를 계산할 수 있다. 각 방향의 히트 단어의 확장은 하기의 경우에 중지된다: 누적 정렬 스코어가 달성된 최대치로부터 수량 X만큼 저하되거나, 하나 이상의 음의 스코어의 잔기 정렬의 누적으로 인해 누적 스코어가 0 이하로 되거나, 또는 어느 한 서열의 종점에 도달한 경우. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 감도와 속도를 결정한다.
한 가지 접근법에서, "서열 동일성 백분율"은 적어도 20의 위치의 비교 윈도우에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되고, 여기서 비교 윈도우에서 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 일부는 2개 서열의 최적 정렬을 위해 참조 서열(이는 부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 20% 이하, 통상 5 내지 15%, 또는 10 내지 12%의 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은, 양쪽 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 존재하는 위치의 수를 결정하여 정합된 위치의 수를 산출하고, 정합된 위치의 수를 참조 서열의 위치의 총 수(즉, 윈도우 크기)로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다.
항체를 정의하는 또 다른 방법은 하기 기재된 항체 및 이의 항원 결합 단편 중 임의의 것의 "유도체"로 하는 것이다. 용어 "유도체"는, 항원에 면역특이적으로 결합하지만, "모체"(또는 야생형) 분자와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 아미노산 치환, 부가, 결실 또는 변형을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 지칭한다. 이러한 아미노산 치환 또는 부가는 자연 발생(즉, DNA-인코딩됨) 또는 비-자연 발생 아미노산 잔기를 도입할 수 있다. 용어 "유도체"는, 예를 들면, 증강되거나 손상된 이펙터 또는 결합 특징을 나타내는 변이체 Fc 영역을 갖는 항체 등을 형성하도록 변경된 CH1, 힌지, CH2, CH3 또는 CH4 영역을 갖는 변이체로서 포함한다. 용어 "유도체"는 비-아미노산 변형, 예를 들면, 글리코실화(예를 들면, 변경된 만노스, 2-N-아세틸글루코사민, 갈락토스, 푸코스, 글루코스, 시알산, 5-N-아세틸뉴라민산, 5-글리콜뉴라민산 등 함유물을 가짐), 아세틸화, 페길화, 포스포릴화, 아미드화, 공지된 보호/차단 그룹에 의해 유도체화, 단백질분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질 등에 연결될 수 있는 아미노산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 변경된 탄수화물 변형은 항체의 가용화, 항체의 세포내 수송 및 분비의 촉진, 항체 조립의 촉진, 형태적 완전성 및 항체 매개 이펙터 기능 중의 하나 이상을 조절한다. 특정 실시양태에서, 변경된 탄수화물 변형은 탄수화물 변형을 결여하는 항체와 비교하여 항체 매개 이펙터 기능을 증강시킨다. 항체 매개 이펙터 기능의 변화를 유도하는 탄수화물 변형은 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: 예를 들면, Shields, R. L. et al. (2002), J. Biol. Chem. 277(30): 26733-26740; Davies J. et al. (2001), Biotechnology & Bioengineering 74(4): 288-294]. 탄수화물 함유량을 변경하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다[참조: 예를 들면, Wallick, S. C. et al. (1988), J. Exp. Med. 168(3): 1099-1109; Tao, M. H. et al. (1989), J. Immunol. 143(8): 2595-2601; Routledge, E. G. et al. (1995), Transplantation 60(8):847-53; Elliott, S. et al. (2003), Nature Biotechnol. 21:414-21; Shields, R. L. et al. (2002), J. Biol. Chem. 277(30): 26733-26740].
유도체 항체 또는 항체 단편은, 비드-기반 또는 세포-기반 검정 또는 동물 모델의 생체내 연구에 의해 측정할 때, 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC), 항체-의존성 세포 식세포작용(ADCP), 항체-의존성 호중구 식세포작용(ADNP) 또는 항체-의존성 보체 침착(ADCD) 기능에서 바람직한 수준의 활성을 부여하기 위해, 조작된 서열 또는 글리코실화 상태로 생성될 수 있다.
유도체 항체 또는 항체 단편은, 특정 화학적 절단, 아세틸화, 제형화, 투니카마이신의 대사 합성 등을 포함하지만 이들로 한정되지 않는, 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 화학적 변형에 의해 변형될 수 있다. 일 실시양태에서, 항체 유도체는 모 항체와 유사한 또는 동일한 기능을 가질 것이다. 또 다른 실시양태에서, 항체 유도체는 모 항체와 비교하여 변경된 활성을 나타낼 것이다. 예를 들면, 유도체 항체(또는 이의 단편)는 모 항체보다 이의 에피토프에 더 강력하게 결합하거나, 또는 단백질 분해에 더 내성이 있을 수 있다.
C. 항체 서열의 조작
다양한 실시양태에서, 개선된 발현, 개선된 교차 반응성 또는 감소된 표적외 결합 등의 다양한 이유로, 동정된 항체의 서열을 조작하도록 선택할 수 있다. 변형된 항체는, 표준 분자 생물학적 기술을 통한 발현, 또는 폴리펩티드의 화학적 합성을 포함하는, 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 제조될 수 있다. 재조합 발현 방법은 이 문서의 다른 장소에서 취급한다. 이하는 항체 조작에 대한 관련 목표 기술에 대한 일반적 논의이다.
하이브리도마를 배양하고, 이어서 세포를 용해하고, 총 RNA를 추출할 수 있다. 랜덤 6량체를 RT와 함께 사용하여 RNA의 cDNA 카피를 생성하고, 이어서 모든 인간 가변 유전자 서열을 증폭하는 것으로 예상되는 PCR 프라이머의 다중 혼합물을 사용하여 PCR을 수행할 수 있다. PCR 산물을 pGEM-T Easy 벡터에 클로닝하고, 이어서 표준 벡터 프라이머를 사용하여 자동화된 DNA 서열분석에 의해 서열분석할 수 있다. 결합 및 중화의 검정은, 하이브리도마 상청액으로부터 수집되고 단백질 G 컬럼을 사용하여 FPLC에 의해 정제된 항체를 사용하여 수행할 수 있다.
재조합 전장 IgG 항체는, 중쇄 및 경쇄 Fv DNA를 클로닝 벡터로부터 IgG 플라스미드 벡터로 서브클로닝하고, 293(예: Freestyle) 세포 또는 CHO 세포로 형질감염시킴으로써 생성할 수 있고, 항체는 293 또는 CHO 세포 상청액으로부터 수집 및 정제할 수 있다. 기타 적절한 숙주 세포 시스템은 이. 콜라이(E. coli) 등의 세균, 곤충 세포(S2, Sf9, Sf29, 하이 파이브(High Five)), 식물 세포(예: 담배, 인간 유사 글리칸에 대한 조작의 존재 또는 부재), 조류, 또는 마우스, 랫트, 염소 또는 소 등의 다양한 비인간 유전자도입 컨텍스트를 포함한다.
후속 항체 정제 및 숙주의 면역화 둘 다를 목적으로, 항체를 인코딩하는 핵산의 발현이 또한 고려된다. 항체 코딩 서열은 자연 RNA 또는 변형된 RNA 등의 RNA일 수 있다. 변형된 RNA는 mRNA에 안정성의 증가와 면역원성의 저하를 부여하고, 이에 의해 치료적으로 중요한 단백질의 발현을 촉진하는 특정 화학적 변형을 고려한다. 예를 들면, N1-메틸-슈도우리딘(N1mΨ)은, 번역 능력 점에서, 기타 몇몇 뉴클레오사이드 변형 및 이들의 조합을 능가한다. 면역/eIF2α 포스포릴화-의존적 번역 억제를 오프(off)로 하는 것에 추가하여, 도입된 N1mΨ 뉴클레오티드는 리보솜의 일시 중지 및 mRNA의 밀도를 증가시킴으로써 번역 프로세스의 다이나믹을 극적으로 변화시킨다. 변형된 mRNA의 리보솜 부하의 증가는 동일한 mRNA에서 리보솜의 리사이클 또는 드 노보 리보솜의 동원을 조장함으로써 이들을 개시에 대해 더 관용적으로 한다. 이러한 변형은 RNA 접종 후 생체 내에서 항체 발현을 증강시키기 위해 사용될 수 있다. RNA는, 자연 또는 변형되든지, 네이키드 RNA로서 또는 지질 나노입자 등의 전달 비히클에서 전달될 수 있다.
또는, 항체를 인코딩하는 DNA를 동일한 목적으로 사용할 수 있다. DNA는 그것이 설계되는 숙주 세포에서 활성인 프로모터를 포함하는 발현 카세트에 포함된다. 발현 카세트는 유리하게는 종래의 플라스미드 또는 미니벡터 등의 복제 가능한 벡터에 포함된다. 벡터에는 폭스바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 아데노-관련 바이러스 등의 바이러스 벡터가 포함되고, 렌티바이러스가 고려된다. VEE 바이러스 또는 신드비스(Sindbis) 바이러스에 기초한 알파바이러스 레플리콘 등의 항체 유전자를 인코딩하는 레플리콘도 고려된다. 이러한 벡터의 전달은 근육내, 피하 또는 피내 경로를 통한 바늘에 의해, 또는 생체내 발현이 요구되는 경우는 경피적 전기천공에 의해 수행될 수 있다.
최종적 cGMP 제조 프로세스와 동일한 숙주 세포 및 세포 배양 프로세스에서 생산된 항체의 신속한 가용성은 프로세스 개발 프로그램의 기간을 단축할 가능성이 있다. 론자(Lonza)는 CHO 세포에서 소량(최대 50g)의 항체를 신속하게 생산하기 위해 CDACF 배지에서 성장한 풀링된 형질감염체를 사용하는 일반적 방법을 개발했다. 진정한 일시적 시스템보다 약간 느리긴 하지만, 이점에는 더 높은 제품 농도와, 생산 세포주와 동일한 숙주 및 프로세스의 사용이 포함된다. 일회용 생물반응기에서 모델 항체를 발현하는 GS-CHO 풀의 성장 및 생산성의 예: 공급-뱃치 방식(fed-batch mode)으로 조작되는 일회용 백 생물반응기 배양물(5L 작업 용적)에서, 2g/L의 수확 항체 농도는 형질전환으로부터 9주 이내에 달성되었다.
항체 분자는, 예를 들면, mAb의 단백질분해 절단에 의해 생산되는 단편(예: F(ab'), F(ab')2), 또는, 예를 들면, 재조합 수단을 통해 생산 가능한 단일 쇄 면역글로불린을 포함할 것이다. F(ab') 항체 유도체는 1가인 반면, F(ab')2 항체 유도체는 2가이다. 일 실시양태에서, 이러한 단편은 서로 또는 다른 항체 단편 또는 수용체 리간드와 조합되어 "키메라" 결합 분자를 형성할 수 있다. 중요하게는, 이러한 키메라 분자는 동일한 분자의 상이한 에피토프에 결합할 수 있는 치환기를 함유할 수 있다.
관련된 실시양태에서, 항체는 개시된 항체의 유도체이고, 예를 들면, 개시된 항체의 것과 동일한 CDR 서열을 포함하는 항체(예를 들면, 키메라 또는 CDR-이식된 항체)이다. 또는, 항체 분자에 보존적 변경을 도입하는 것 등의 변형을 가할 수 있다. 이러한 변경을 수행할 때에, 아미노산의 소수성 지수를 고려할 수 있다. 단백질에 상호작용적 생물학적 기능을 부여할 때의 수치료학적 아미노산 지수의 중요성은 당해 기술분야에서 일반적으로 이해된다[참조: Kyte and Doolittle, 1982]. 아미노산의 상대적 소수성 특성은 수득되는 단백질의 2차 구조에 기여하는 것으로 인정되고, 이는 또한 단백질과 다른 분자(예: 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원, 등)과의 상호작용을 정의한다.
유사한 아미노산의 치환은 친수성에 기초하여 효과적으로 수행될 수 있음이 또한 당해 기술분야에서 이해된다. 참조에 의해 본 명세서에 도입된 미국 특허 제4,554,101호는 인접 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 단백질의 최대 국소 평균 친수성이 단백질의 생물학적 특성과 상관관계가 있다고 서술하고 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 상세히 기재된 바와 같이, 이하의 친수성 값이 아미노산 잔기에 할당되어 있다: 염기성 아미노산: 아르기닌(+3.0), 라이신(+3.0) 및 히스티딘(-0.5); 산성 아미노산: 아스파르테이트(+3.0 ± 1), 글루타메이트(+3.0 ± 1), 아스파라긴(+0.2) 및 글루타민(+0.2); 친수성, 비이온성 아미노산: 세린(+0.3), 아스파라긴(+0.2), 글루타민(+0.2) 및 트레오닌(-0.4), 황 함유 아미노산: 시스테인(-1.0) 및 메티오닌(-1.3); 소수성, 비방향족 아미노산: 발린(-1.5), 류신(-1.8), 이소류신(-1.8), 프롤린(-0.5 ± 1), 알라닌(-0.5) 및 글리신(0); 소수성, 방향족 아미노산: 트립토판(-3.4), 페닐알라닌(-2.5) 및 티로신(-2.3).
아미노산은 유사한 친수성을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있고, 생물학적으로 또는 면역학적으로 변형된 단백질을 생성할 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 변화에 있어서, 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, ±1 이내인 것이 특히 바람직하고, ±0.5 이내인 것이 더욱 특히 바람직하다.
상기에서 개설한 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환기의 상대적 유사성, 예를 들면, 이들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등을 기반으로 한다. 전술한 다양한 특성을 고려하는 예시적 치환은 당업자에게 공지되어 있고, 아르기닌 및 라이신; 글루타메이트 및 아스파르테이트; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 이소류신을 포함한다.
본 개시는 또한 아이소타입 변형을 고려한다. 상이한 아이소타입을 갖도록 Fc 영역을 변형함으로써 상이한 기능을 달성할 수 있다. 예를 들면, IgG1으로 변경하면, 항체 의존성 세포 독성이 증가할 수 있고, 클래스 A로 전환하면 조직 분포가 개선될 수 있으며, 클래스 M으로 전환하면 원자가가 개선될 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 아미노산 변형을, IL-23p19 결합 분자의 Fc 영역의 C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC) 기능을 변화시키는 하나 이상의 추가 아미노산 변형과 조합하는 것이 유용할 수 있다. 특정 목적의 결합 폴리펩티드는 C1q에 결합하고 보체 의존성 세포독성을 나타내는 것일 수 있다. 기존의 C1q 결합 활성을 갖고 임의로 CDC를 매개하는 능력을 추가로 갖는 폴리펩티드는 이들 활성 중 하나 또는 둘 모두가 증강되도록 변형시킬 수 있다. C1q를 변경하고/하거나 이의 보체 의존적 세포독성 기능을 변경하는 아미노산 변형은, 예를 들면, 참조에 의해 본 명세서에 도입되는 WO/0042072에 기재되어 있다.
예를 들면, C1q 결합 및/또는 FcγR 결합을 변형하고 이에 의해 CDC 활성 및/또는 ADCC 활성을 변화시킴으로써 변경된 이펙터 기능을 갖는 항체의 Fc 영역을 설계할 수 있다. "이펙터 기능"은 생물학적 활성을 활성화 또는 감소시키는 역할을 한다(예: 대상체에서). 이펙터 기능의 예에는 이하를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다: C1q 결합; 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체(예: B 세포 수용체, BCR) 등의 하향 조절. 이러한 이펙터 기능은 Fc 영역을 결합 도메인(예: 항체 가변 도메인)과 조합시킬 필요가 있고, 다양한 검정(예: Fc 결합 분석, ADCC 검정, CDC 검정 등)을 사용하여 평가할 수 있다.
예를 들면, 개선된 C1q 결합 및 개선된 FcγRIII 결합(예를 들면, 개선된 ADCC 활성 및 개선된 CDC 활성 둘 모두를 가짐)을 갖는 항체의 변이체 Fc 영역을 생성할 수 있다. 또는, 이펙터 기능을 저하 또는 제거하는 것이 바람직한 경우, 변이체 Fc 영역은 CDC 활성의 저하 및/또는 ADCC 활성의 저하를 수반하여 조작할 수 있다. 다른 실시양태에서, 이들 활성 중 1개만을 증가시킬 수 있고, 임의로 다른 활성도 감소시킬 수 있다(예를 들면, ADCC 활성이 개선되었지만 CDC 활성이 감소된 Fc 영역 변이체를 생성하고, 그 반대의 경우도 마찬가지이다).
FcRn 결합. Fc 돌연변이는 또한 신생아 Fc 수용체(FcRn)와의 상호작용을 변경하고 약물동태 특성을 개선하기 위해 도입 및 조작될 수 있다. FcRn에 대한 결합이 개선된 인간 Fc 변이체의 콜렉션이 문헌[참조: Shields et al., (2001). High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for FcγRI, FcγRII, FcγRIII, and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the FcγR, (J. Biol. Chem. 276:6591-6604]에 기재되어 있다. 증가된 반감기를 초래할 수 있는 다수의 방법은 공지되어 있고[참조: Kuo and Aveson, (2011)], 아미노산 변형을 포함하는 것은, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발, 랜덤 돌연변이유발 및 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합 및/또는 생체내 거동을 평가하기 위한 스크리닝을 포함하는 기술을 통해 생성할 수 있다.
따라서, 본 개시는 FcRn에 대한 최적화된 결합을 갖는 항원 결합 단백질의 변이체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질의 상기 변이체는 상기 항원 결합 단백질의 Fc 영역에 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 상기 변형은 상기 모 폴리펩티드와 비교하여 Fc 영역의 226, 227, 228, 230, 231, 233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 315, 317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 361, 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401 403, 404, 408, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444, 445, 446 및 447로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, Fc 영역의 아미노산 넘버링은 카바트(Kabat)의 EU 인덱스의 넘버링이다. 본 개시의 추가 측면에서, 변형은 M252Y/S254T/T256E이다.
또한, 다양한 간행물은, FcRn 결합 폴리펩티드를 분자에 도입하거나, FcRn-결합 친화성은 보존되어 있지만 다른 Fc 수용체에 대한 친화성이 대폭 저하되어 있는 항체와 분자를 융합시키거나, 항체의 FcRn 결합 도메인과 융합시킴으로써 반감기가 변형된 생리학적 활성 분자를 수득하는 방법을 설명한다[참조: 예를 들면, Kontermann(2009)].
유도체화된 항체는 포유동물, 특히 인간에서 모 항체의 반감기(예를 들면, 혈청 반감기)를 변경하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 변경은 15일 초과, 바람직하게는 20일 초과, 25일 초과, 30일 초과, 35일 초과, 40일 초과, 45일 초과, 2개월 초과, 3개월 초과, 4개월 초과 또는 5개월 초과의 반감기를 초래할 수 있다. 포유동물, 바람직하게는 인간에서 본 개시의 항체 또는 이의 단편의 반감기의 증가는 포유동물에서 상기 항체 또는 항체 단편의 더 높은 혈청 역가를 초래하고, 따라서 상기 항체 또는 항체 단편의 투여 빈도를 감소시키고/시키거나, 투여되는 상기 항체 또는 항체 단편의 농도를 감소시킨다. 생체내 반감기가 증가된 항체 또는 이의 단편은 당업자에게 공지된 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들면, 생체내 반감기가 증가된 항체 또는 이의 단편은 Fc 도메인과 FcRn 수용체 사이의 상호작용에 관여하는 것으로 동정된 아미노산 잔기를 변형(예를 들면, 치환, 결실 또는 부가)함으로써 생성될 수 있다.
문헌[참조: Beltramello et al. (2010)]은, CH2 도메인의 위치 1.3과 1.2에서 류신 잔기(C-도메인에 대한 IMGT 고유 넘버링에 따름)가 알라닌 잔기로 치환된 것을 생성함으로써, 뎅기열 바이러스 감염을 증강시키는 이들의 경향에 기인하여, 중화 mAb의 변형을 보고했다. "LALA" 돌연변이라고도 공지된 이 변형은 문헌[참조: Hessell et al. (2007)]에 기재된 바와 같이 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIIIa에 대한 항체 결합을 무효화한다. 변이체 및 비변형 재조합 mAb를 4개 뎅기열 바이러스 혈청형에 의한 감염을 중화 및 강화하는 능력에 대해 비교했다. LALA 변이체는 비변형 mAb와 동일한 중화 활성을 유지했지만, 증강 활성을 완전히 결여했다. 따라서, 이러한 성질의 LALA 돌연변이는 현재 개시된 항체와 관련하여 고려된다.
변경된 글리코실화. 본 개시의 특정 실시양태는 시알산, 갈락토스 또는 푸코스를 포함하지 않는 실질적으로 균질한 글리칸을 함유하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 모노클로날 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 이들 둘 모두는 각각 중쇄 또는 경쇄 불변 영역에 부착될 수 있다. 전술한 실질적으로 균질한 글리칸은 중쇄 불변 영역에 공유적으로 부착될 수 있다.
본 개시의 또 다른 실시양태는 신규 Fc 글리코실화 패턴을 갖는 mAb를 포함한다. 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 GNGN 또는 G1/G2 글리코형으로 표시되는 실질적으로 균질한 조성물로 존재한다. Fc 글리코실화는 치료용 mAb의 항바이러스 및 항암 특성에서 중요한 역할을 한다. 본 개시는 시험관내에서 푸코스 비함유 항-HIV mAb의 항-렌티바이러스 세포-매개 바이러스 억제의 증가를 나타내는 최근의 연구와 일치한다. 코어 푸코스를 결여하는 균질한 글리칸을 사용한 본 개시의 이 실시양태는 특정 바이러스에 대한 보호가 2배 초과하는 증가를 나타냈다. 코어 푸코스의 제거는 자연 살해(NK) 세포에 의해 매개되는 mAb의 ADCC 활성을 극적으로 개선하지만, 다형핵 세포(PMN)의 ADCC 활성에 역효과를 갖는 것으로 보인다.
GNGN 또는 G1/G2 글리코형으로 표시되는 실질적으로 균질한 조성물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 실질적으로 균질한 GNGN 글리코형을 포함하지 않고 G0, G1F, G2F, GNF, GNGNF 또는 GNGNFX 함유 글리코형을 포함하는 동일한 항체와 비교하여 Fc 감마 RI 및 Fc 감마 RIII에 대해 증가된 결합 친화성을 나타낸다. 본 개시의 일 실시양태에서, 항체는 1 × 10-8 M 이하의 Kd를 갖는 Fc 감마 RI로부터 해리되고, 1 × 10-7 M 이하의 Kd를 갖는 Fc 감마 RIII로부터 해리된다.
Fc 영역의 글리코실화는 통상 N-연결형 또는 O-연결형 중의 어느 하나이다. N-연결형은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 부착을 지칭한다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토오스 또는 자일로오스 중 하나가 하이드록시아미노산, 가장 일반적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착되는 것을 지칭하지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신도 사용할 수 있다. 아스파라긴 측쇄 펩티드 서열에 대한 탄수화물 모이어티의 효소적 부착에 대한 인식 서열은 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌이고, 여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다. 따라서, 폴리펩티드에서 이들 펩티드 서열 중 하나의 존재는 잠재적 글리코실화 부위를 생성한다.
글리코실화 패턴은, 예를 들면, 폴리펩티드에서 발견되는 하나 이상의 글리코실화 부위(들)를 결실시키고/시키거나 폴리펩티드에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위(들)를 부가함으로써 변경할 수 있다. 항체의 Fc 영역에 대한 글리코실화 부위의 부가는 상기 기재된 트리펩티드 서열(N-연결된 글리코실화 부위의 경우) 중 하나 이상을 함유하도록 아미노산 서열을 변경하여 편리하게 달성된다. 예시적 글리코실화 변이체는 중쇄의 잔기 Asn 297의 아미노산 치환을 갖는다. 변경은 또한 원래의 폴리펩티드의 서열(O-연결된 글리코실화 부위의 경우)에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 부가하거나 치환함으로써 수행될 수 있다. 추가로, Asn 297을 Ala로 변경하면, 글리코실화 부위 중 하나를 제거할 수 있다.
특정 실시양태에서, 항체는 베타 (1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III(GnT III)를 발현하는 세포에서 발현되고, 그 결과, GnT III는 GlcNAc를 IL-23p19 항체에 부가한다. 이러한 방식으로 항체를 생산하는 방법은 WO/9954342, WO/03011878, 특허 공개 20030003097A1 및 문헌[참조: Umana et al., Nature Biotechnology, 17:176-180, February 1999]에서 제공된다. 일정 간격으로 분포하는 짧은 회문성 반복서열(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; CRISPR) 등의 게놈 편집 기술을 사용하여, 글리코실화 등의 특정 번역 후 변형을 증강, 감소 또는 제거하도록 세포주를 변경할 수 있다. 예를 들면, CRISPR 기술을 사용하여, 재조합 모노클로날 항체의 발현에 사용되는 293 또는 CHO 세포에서 글리코실화 효소를 인코딩하는 유전자를 제거할 수 있다.
모노클로날 항체 단백질 서열에 대한 라이어빌리티(liability)의 제거. 인간 B 세포에서 수득된 항체 가변 유전자 서열을 조작하여, 이들의 제조 가능성과 안전성을 향상시키는 것이 가능하다. 잠재적 단백질 서열의 라이어빌리티는 이하를 포함하는 부위와 관련된 서열 모티프를 검색함으로써 특정할 수 있다:
1) 쌍을 이루지 않은 Cys 잔기,
2) N-연결된 글리코실화,
3) Asn 탈아미드화,
4) Asp 이성질체화,
5) SYE 절단,
6) Met 산화,
7) Trp 산화,
8) N-말단 글루타메이트,
9) 인테그린 결합,
10) CD11c/CD18 결합, 또는
11) 단편화.
이러한 모티프는 재조합 항체를 인코딩하는 cDNA의 합성 유전자를 변경함으로써 제거할 수 있다.
치료용 항체 개발 분야에서 단백질 조작 노력은 특정 서열 또는 잔기가 용해도 차이와 관련되어 있음을 명확히 보여준다[참조: Fernandez-Escamilla et al., Nature Biotech., 22 (10), 1302-1306, 2004; Chennamsetty et al., PNAS, 106 (29), 11937-11942, 2009; Voynov et al., Biocon. Chem., 21 (2), 385-392, 2010]. 문헌에서 용해도를 변경시키는 돌연변이로부터의 증거는, 아스파르트산, 글루탐산 및 세린 등의 몇몇 친수성 잔기가 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 라이신 및 아르기닌 등의 기타 친수성 잔기보다 단백질 용해도에 현저히 유리하게 기여하는 것을 나타낸다.
안정성. 항체는 생물물리학적 특성을 증강시키기 위해 조작될 수 있다. 평균 겉보기 용융 온도를 사용하여, 고온을 사용하여 항체를 비폴딩하고 상대적 안정성을 결정할 수 있다. 시차 주사 열량계(DSC)는 분자의 열용량(Cp)(1도당 분자의 가온에 필요한 열)을 온도의 함수로서 측정한다. DSC를 사용하여 항체의 열 안정성을 조사할 수 있다. mAb에 대한 DSC 데이터는, mAb 구조 내에서 개별 도메인의 비폴딩을 해결하여 서모그램에서 최대 3개의 피크(Fab, CH2 및 CH3 도메인의 비폴딩으로부터)를 생성할 수 있기 때문에 특히 흥미롭다. 통상, Fab 도메인의 비폴딩은 가장 강력한 피크를 생성한다. DSC 프로필 및 Fc 부분의 상대적 안정성은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 서브클래스에 대한 특징적 차이를 나타낸다[참조: Garber and Demarest, Biochem. Biophys. Res. Commun. 355, 751-757, 2007]. CD 분광계로 수행되는 원형 이색성(CD)을 사용하여 평균 겉보기 용융 온도를 결정할 수도 있다. 원자외선(Far-UV) CD 스펙트럼은 0.5nm의 증분으로 200 내지 260nm 범위의 항체에 대해 측정된다. 최종 스펙트럼은 20회 누적의 평균으로서 결정할 수 있다. 잔류 타원율 값은 배경을 차감한 후에 계산할 수 있다. 항체의 열 비폴딩(0.1mg/mL)은 235nm에서 25 내지 95℃ 및 1℃/min의 가열 속도에서 모니터링할 수 있다. 동적 광산란(DLS)을 사용하여 응집 경향을 평가할 수 있다. DLS는 단백질을 포함한 다양한 입자의 크기를 특성화하기 위해 사용된다. 시스템의 크기가 분산되지 않은 경우, 입자의 평균 유효 직경을 결정할 수 있다. 이 측정은 입자 코어의 크기, 표면 구조의 크기 및 입자 농도에 의존한다. DLS는 본질적으로 입자로 인한 산란광 강도의 변동을 측정하기 때문에, 입자의 확산 계수를 결정할 수 있다. 상업용 DLA 기기의 DLS 소프트웨어는 다양한 직경의 입자 모집단을 표시한다. 안정성 연구는 DLS를 사용하여 편리하게 수행할 수 있다. 샘플의 DLS 측정은, 입자의 유체역학적 반경이 증가하는지의 여부를 결정함으로써, 입자가 시간이 경과함에 따라 응집되는지 또는 온도 변화에 따라 응집되는지의 여부를 나타낼 수 있다. 입자가 응집되는 경우, 반경이 더 큰 입자의 더 많은 모집단을 볼 수 있다. 온도에 따른 안정성은 그 장소에서 온도를 제어함으로써 분석할 수 있다. 모세관 전기영동(CE) 기술에는 항체 안정성의 특징을 결정하기 위한 입증된 방법론이 포함된다. iCE 접근법을 사용하여, 탈아미드화, C-말단 라이신, 시알릴화, 산화, 글리코실화 및 단백질의 pI 변화를 초래할 수 있는 단백질에 대한 기타 변화로 인한 항체 단백질 전하 변이체를 해결할 수 있다. 발현된 각각의 항체 단백질은 단백질 심플 마우리스(Protein Simple Maurice) 기기를 사용하여 모세관 컬럼(cIEF)에서 높은 처리량, 유리 용액 등전점 전기영동(IEF)에 의해 평가할 수 있다. 등전점(pIs)에 초점을 맞춘 분자를 실시간 모니터링하기 위해, 전체 컬럼 UV 흡수 검출을 30초마다 수행할 수 있다. 이 접근법은 종래의 겔 IEF의 고분해능과 컬럼-기반 분리에서 발견되는 정량 및 자동화의 이점을 조합하고, 동원 단계의 필요성을 제거한다. 이 기술은, 발현된 항체에 대한 동일성, 순도 및 불균일성 프로파일의 재현성 정량 분석을 산출한다. 이 결과는 항체의 전하 불균일성 및 분자 크기를 특정하고, 흡광도 및 기본 형광 검출 모드와 0.7μg/mL까지의 검출 감도를 구비한다.
용해도. 항체 서열의 고유 용해도 스코어를 결정할 수 있다. 고유 용해도 스코어는 CamSol Intrinsic을 사용하여 계산할 수 있다[참조: Sormanni et al., J Mol Biol 427, 478-490, 2015]. scFv 등의 각 항체 단편의 HCDR3에서 잔기 95-102(Kabat 넘버링)에 대한 아미노산 서열은 용해도 스코어를 계산하기 위해 온라인 프로그램을 통해 평가될 수 있다. 또한, 실험실 기술을 사용하여 용해도를 결정할 수 있다. 용액이 포화되고 용해도 한계에 도달할 때까지 동결건조된 단백질을 용액에 첨가하거나, 적절한 분자량 컷오프를 갖는 미세농축기에서 한외여과(ultrafiltration)에 의한 농축을 포함하는 다양한 기술이 존재한다. 가장 간단한 방법은 무정형 침전을 유도하는 것이고, 이는 황산암모늄을 사용하여 단백질 침전을 포함하는 방법을 사용하여 단백질 용해도를 측정한다[참조: Trevino et al., J Mol Biol, 366: 449-460, 2007]. 황산암모늄 침전은 상대 용해도 값에 대한 신속하고 정확한 정보를 제공한다. 황산암모늄 침전은 명확한 수성 및 고체상을 구비한 침전 용액을 생성하고, 비교적 소량의 단백질을 필요로 한다. 황산암모늄에 의한 무정형 침전의 유도를 사용하여 수행된 용해도 측정도 상이한 pH 값에서 용이하게 수행할 수 있다. 단백질 용해도는 pH에 크게 의존하고, pH는 용해도에 영향을 미치는 가장 중요한 외인성 요인으로 간주된다.
자가반응성. 일반적으로 자가반응 클론은 개체 발생 동안 음성 선택에 의해 제거되어야 한다고 생각되지만, 자가반응 특성을 갖는 다수의 인간 자연 발생 항체가 성인의 성숙한 레퍼토리에 지속되고 자가반응이 병원체에 대한 다수 항체의 항바이러스 기능을 증강시킬 수 있다는 것이 명백해졌다. 초기 B 세포 발달 동안 항체의 HCDR3 루프는, 다수의 경우, 양전하가 풍부하고 자가반응 패턴을 나타내는 것으로 주목되었다[참조: Wardemann et al., Science 301, 1374-1377, 2003]. 현미경검사(부착성 HeLa 또는 HEp-2 상피 세포를 사용) 및 유세포 분석 세포 표면 염색(현탁액 주르카트(Jurkat) T 세포 및 293S 인간 배아 신장 세포를 사용)에서 인간 유래 세포에 대한 결합 수준을 평가함으로써 소정 항체의 자가반응성을 시험할 수 있다. 자가 반응성은 또한 조직 어레이 내의 조직에 대한 결합 평가를 사용하여 조사할 수 있다.
바람직한 잔기 ("인간 유사성"). 혈액 공여자로부터의 인간 B 세포의 B 세포 레퍼토리 심층 서열분석은 다수의 최근 연구에서 대규모로 수행되고 있다. 인간 항체 레퍼토리의 상당 부분에 대한 서열 정보는 건강한 인간에게 공통하는 항체 서열 특징의 통계적 평가를 용이하게 한다. 인간 재조합 항체 가변 유전자 참조 데이터베이스의 항체 서열의 특징에 대한 지식을 사용하여, 항체 서열의 "인간 유사성"(HL)의 위치 특이적 정도를 추정할 수 있다. HL은 치료용 항체 또는 백신으로서의 항체 등의 임상 용도에서 항체 개발에 유용한 것으로 나타났다. 목표는 항체의 인간 유사성을 증가시켜, 항체 약물의 효능을 현저히 감소시키거나, 심각한 건강에의 영향을 유발할 수 있는 잠재적 부작용 및 항-항체 면역 반응을 감소시키는 것이다. 합계 약 4억개 서열의 3명의 건강한 인간 혈액 공여자의 조합된 항체 레퍼토리의 항체 특성을 평가할 수 있고, 항체의 초가변 영역에 초점을 맞춘 새로운 "상대적 인간 유사성"(rHL) 스코어를 작성할 수 있다. rHL 스코어를 사용하면, 인간(양성 스코어)과 비인간 서열(음성 스코어)을 간단하게 구별할 수 있다. 항체는 인간 레퍼토리에서 일반적이지 않은 잔기를 제거하도록 조작될 수 있다.
D. 단일 쇄 항체
단일 쇄 가변 단편(scFv)은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 융합이고, 짧은(통상은 세린, 글리신) 링커로 함께 연결된다. 이 키메라 분자는, 불변 영역의 제거와 링커 펩티드의 도입에도 불구하고, 원래 면역글로불린의 특이성을 유지한다. 이 변형은 통상 특이성을 변경하지 않는다. 이들 분자는 항원 결합 도메인을 단일 펩티드로서 발현시키는 것이 매우 편리한 파지 디스플레이를 용이하게 하기 위해 역사적으로 생성되었다. 또는, scFv는 하이브리도마 또는 B 세포로부터 유래하는 서브클로닝된 중쇄 및 경쇄로부터 직접 생성될 수 있다. 단일 쇄 가변 단편에는, 완전한 항체 분자에서 발견되는 불변 Fc 영역을 결여하고 있기 때문에, 항체의 정제에 사용되는 공통 결합 부위(예: 단백질 A/G)가 없다. 단백질 L이 카파 경쇄의 가변 영역과 상호작용하기 때문에, 이러한 단편은 종종 단백질 L을 사용하여 정제/고정화할 수 있다.
유연한 링커는 일반적으로 알라닌, 세린 및 글리신 등의 헬릭스 및 턴-촉진 아미노산 잔기로 구성된다. 그러나, 다른 잔기도 기능할 수 있다. 문헌[참조: Tanget al. (1996)]은 단백질 링커 라이브러리로부터 단일 쇄 항체(scFv)를 위해 조정된 링커를 신속하게 선택하는 수단으로서 파지 디스플레이를 사용했다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인에 대한 유전자가 가변 조성의 18-아미노산 폴리펩티드를 인코딩하는 세그먼트에 의해 연결된 랜덤 링커 라이브러리가 작제되었다. scFv 레퍼토리(약 5 × 106개의 상이한 멤버)를 필라멘트 파지에 표시하고, 합텐과의 친화성 선택을 수행했다. 선택된 변이체의 모집단은 결합 활성에서 유의한 증가를 나타냈지만, 상당한 서열 다양성을 유지했다. 이어서, 1054 개별 변이체를 스크리닝하면, 가용성 형태로 효율적으로 생성된 촉매 활성 scFv가 수득되었다. 서열 분석은 VH C 말단의 2개 잔기 후의 링커에 보존된 프롤린과, 선택된 테더의 유일한 공통 특징으로서 다른 위치에서 풍부한 아르기닌 및 프롤린을 나타냈다.
본 개시의 재조합 항체는 또한, 수용체의 이량체화 또는 다량체화를 가능하게 하는 서열 또는 모이어티를 포함할 수 있다. 이러한 서열에는 J-쇄와 조합하여 다량체의 형성을 가능하게 하는 IgA로부터 유래하는 서열이 포함된다. 또 다른 다량체화 도메인은 Gal4 이량체화 도메인이다. 다른 실시양태에서, 쇄는 2개의 항체의 조합을 가능하게 하는 비오틴/아비딘 등의 약제로 변형시킬 수 있다.
별도의 실시양태에서, 단일 쇄 항체는 비-펩티드 링커 또는 화학 단위를 사용하여 수용체 경쇄 및 중쇄를 연결함으로써 생성될 수 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 별개의 세포에서 생성되고, 정제되고, 후속적으로 적절한 방식으로 함께 연결된다(즉, 중쇄의 N-말단은 적절한 화학 브릿지를 통해 경쇄의 C-말단에 부착됨).
가교-결합 시약은 2개의 상이한 분자의 관능기, 예를 들면, 안정화제 및 응고제를 연결하는 분자 브릿지를 형성하기 위해 사용된다. 그러나, 동일한 유사체의 이량체 또는 다량체 또는 상이한 유사체로 구성된 헤테로머 복합체가 생성될 수 있는 것으로 고려된다. 2개의 상이한 화합물을 단계적으로 연결하기 위해, 불필요한 단독중합체 형성을 제거하는 헤테로-이관능성 가교결합제를 사용할 수 있다.
예시적 헤테로-이관능성 가교제는 2개의 반응성 기를 함유한다: 1개는 1급 아민 그룹(예: N-하이드록시 숙신이미드)와 반응하고, 다른 1개는 티올 그룹(예: 피리딜 디설파이드, 말레이미드, 할로겐 등)와 반응한다. 1급 아민 반응 그룹을 통해 가교제는 1개의 단백질(예를 들면, 선택된 항체 또는 단편)의 라이신 잔기(들)와 반응할 수 있고, 티올 반응 그룹을 통해, 이미 제1 단백질에 연결된 가교제는 다른 단백질(예: 선택제)의 시스테인 잔기(유리 설프하이드릴 그룹)와 반응한다.
혈액 중에서 적당한 안정성을 갖는 가교제를 사용하는 것이 바람직하다. 표적화제 및 치료제/예방제를 접합하는데 성공적으로 사용될 수 있는 다수 유형의 디설파이드-결합 함유 링커가 공지되어 있다. 입체 장애가 있는 디설파이드 결합을 포함하는 링커는 생체내에서 더 큰 안정성을 제공하여, 작용 부위에 도달하기 전에 표적화 펩티드의 방출을 방지할 수 있는 것으로 입증되었다. 따라서, 이러한 링커는 연결제의 하나의 그룹이다.
또 다른 가교 시약은 SMPT이고, 이는 인접한 벤젠 환 및 메틸 그룹에 의해 "입체 장애"가 있는 디설파이드 결합을 포함하는 이관능성 가교제이다. 디설파이드 결합의 입체 장애는 조직 및 혈액 중에 존재할 수 있는 글루타티온 등의 티올레이트 음이온에 의한 공격으로부터 결합을 보호하는 기능을 하고, 이에 의해 부착된 약제를 표적 부위로 전달하기 전에 접합체의 디커플링을 방지하는 역할을 하는 것으로 여겨진다.
SMPT 가교 시약은, 기타 다수의 공지된 가교 시약과 마찬가지로, 시스테인의 SH 또는 1급 아민(예: 라이신의 엡실론 아미노 그룹) 등의 관능기를 가교하는 능력을 제공한다. 또 다른 가능한 유형의 가교제에는 설포숙신이미딜-2-(p-아지도 살리실아미도)에틸-1,3'-디티오프로피오네이트 등의 절단 가능한 디설파이드 결합을 함유하는 헤테로-이관능성 광반응성 페닐아지드가 포함된다. N-하이드록시-숙신이미딜 그룹은 1급 아미노 그룹과 반응하고, 페닐아지드(광분해시)는 임의의 아미노산 잔기와 비선택적으로 반응한다.
장애된 가교제에 추가하여, 장애되지 않은 링커도 또한 본 명세서에 따라 사용될 수 있다. 보호된 디설파이드를 함유하거나 생성하는 것으로 간주되지 않는 다른 유용한 가교-링커에는 SATA, SPDP 및 2-이미노티올란이 포함된다[참조: Wawrzynczak & Thorpe, 1987]. 이러한 가교-링커의 사용은 당해 기술분야에 잘 이해되어 있다. 또 다른 실시양태는 유연한 링커의 사용을 포함한다.
미국 특허 제4,680,338호는 아민-함유 중합체 및/또는 단백질과 리간드의 접합체를 생성하기 위해, 특히 킬레이트제, 약물, 효소, 검출 가능한 표지 등과의 항체 접합체를 형성하기 위해 유용한 이관능성 링커를 기재한다. 미국 특허 제5,141,648호 및 제5,563,250호는 다양한 온화한 조건하에서 절단 가능한 불안정한 결합을 함유하는 절단 가능한 접합체를 개시하고 있다. 이 링커는 목적 약제가 링커에 직접 결합될 수 있고, 절단에 의해 활성제가 방출될 수 있다는 점에서 특히 유용하다. 특정 용도에는 항체 또는 약물 등의 단백질에 유리 아미노 또는 유리 설프하이드릴 그룹을 부가하는 것이 포함된다.
미국 특허 제5,856,456호은 폴리펩티드 구성요소를 연결하여 융합 단백질, 예를 들면, 단일 쇄 항체를 제조하는 데 사용하기 위한 펩티드 링커를 제공한다. 링커는 길이가 최대 약 50개 아미노산이고, 하전된 아미노산(바람직하게는 아르기닌 또는 라이신)의 적어도 하나의 발생, 이어서 프롤린의 발생을 함유하고, 더 큰 안정성과 감소된 응집을 특징으로 한다. 미국 특허 제5,880,270호는 다양한 면역진단 및 분리 기술에 유용한 아미노옥시-함유 링커를 개시하고 있다.
E. 다중특이적 항체
특정 실시양태에서, 본 개시의 항체는 이중특이적 또는 다중특이적이다. 이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항체이다. 예시적 이중특이적 항체는 단일 항원의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 기타 이러한 항체는 제1 항원 결합 부위를 제2 항원에 대한 결합 부위와 조합할 수 있다. 또는, 항-병원체 아암(arm)은 T-세포 수용체 분자(예: CD3) 등의 백혈구 상의 유발 분자, 또는 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 Fc 감마 RIII(CD16) 등의 IgG의 Fc 수용체(FcγR)에 결합하는 아암과 조합하여, 세포 방어 메커니즘을 감염된 세포에 집중 및 국재화시킬 수 있다. 이중특이적 항체를 또한 사용하여 감염된 세포에 세포독성제를 국재화시킬 수 있다. 이들 항체는 병원체 결합 아암과 세포독성제(예: 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 A 쇄, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)에 결합하는 아암을 갖고 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예: F(ab')2 이중특이적 항체)으로서 제조할 수 있다. WO 96/16673은 이중특이적 항-ErbB2/항-Fc 감마 RIII 항체를 기재하고, 미국 특허 제5,837,234호는 이중특이적 항-ErbB2/항-Fc 감마 RI 항체를 개시하고 있다. 이중특이적 항-ErbB2/Fc 알파 항체는 WO98/02463에 제시되어 있다. 미국 특허 제5,821,337호는 이중특이적 항-ErbB2/항-CD3 항체를 교시하고 있다.
이중특이적 항체의 제조 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 종래의 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공-발현을 기반으로 하고, 여기서 2개의 쇄는 상이한 특이성을 갖는다[참조: Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)]. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 랜덤 분류로 인해, 이러한 하이브리도마(쿼드로마)는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생성하고, 이 중 1개만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 통상, 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 정확한 분자의 정제는 다소 번거롭고, 생성물 수율이 낮다. 유사한 절차는 WO 93/08829 및 문헌[참조: Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659(1991)]에 개시되어 있다.
상이한 접근법에 따르면, 목적하는 결합 특이성(항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 영역을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 바람직하게는, 융합은 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 Ig 중쇄 불변 도메인과의 융합이다. 융합물 중 적어도 하나에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 포함하는 제1 중쇄 불변 영역(CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합물 및 필요에 따라 면역글로불린 경쇄를 인코딩하는 DNA는 별도의 발현 벡터에 삽입되고, 적합한 숙주 세포에 동시-형질감염된다. 이것은 구성에 사용된 3개의 폴리펩티드 쇄의 비균등한 비율이 목적하는 이중특이적 항체의 최적 수율을 제공하는 경우, 실시양태에서 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정할 때에 더 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비율의 적어도 2개의 폴리펩티드 쇄의 발현이 높은 수율을 초래하는 경우 또는 비율이 목적하는 쇄 조합의 수율에 유의한 영향을 미치지 않는 경우, 2개 또는 3개의 모든 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 단일 발현 벡터에 삽입하는 것이 가능하다.
이 접근법의 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄 및 다른 쪽 아암에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍(제2 결합 특이성을 제공함)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 절반에만 면역글로불린 경쇄가 존재하는 것에 의해 용이한 분리 방법이 제공되기 때문에, 이러한 비대칭 구조는 목적하지 않는 면역글로불린 쇄의 조합으로부터 목적하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이 접근법은 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체의 생성에 대한 추가 상세는, 예를 들면, 문헌[참조: Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.
미국 특허 제5,731,168호에 기재된 또 다른 접근법에 따르면, 항체 분자의 쌍 사이의 계면은 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 헤테로이량체의 백분율을 최대화하도록 조작할 수 있다. 바람직한 인터페이스는 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서, 1차 항체 분자의 계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄는 더 큰 측쇄(예: 티로신 또는 트립토판)로 치환된다. 큰 아미노산 측쇄(들)를 작은 측쇄(예: 알라닌 또는 트레오닌)로 치환함으로써, 큰 측쇄(들)와 동일하거나 유사한 크기의 보상성 "공동"이 2차 항체 분자의 계면에 생성된다. 이것은 호모이량체 등의 기타 원치 않는 최종 생성물보다 헤테로이량체의 수율을 증가시키는 메커니즘을 제공한다.
이중특이적 항체에는 가교 항체 또는 "헤테로접합체" 항체가 포함된다. 예를 들면, 헤테로접합체의 항체 중 1개는 아비딘에 결합되고, 다른 1개는 비오틴에 결합될 수 있다. 이러한 항체는, 예를 들면, 면역계 세포를 원치 않는 세포로 표적화하기 위해(미국 특허 제4,676,980호) 및 HIV 감염 치료를 위해(WO 91/00360, WO 92/200373, 및 EP 03089) 제안되었다. 헤테로접합체 항체는 임의의 편리한 가교 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 적합한 가교제는 당해 기술분야에 공지되어 있고, 다수의 가교 기술과 함께 미국 특허 제4,676,980호에 개시되어 있다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하는 기술도 문헌에 기재되어 있다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 화학적 연결을 사용하여 제조할 수 있다. 문헌[참조: Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]은 무손상 항체를 단백질 분해적으로 절단하여 F(ab')2 단편을 생성하는 절차를 기재하고 있다. 이 단편은 디티올 착화제인 나트륨 아르세나이트의 존재하에서 환원되어 인접 디티올을 안정화하고, 분자간 디설파이드 형성을 방지한다. 이어서, 생성된 Fab' 단편은 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환된다. 이어서, Fab'-TNB 유도체 중 1개는 머캅토에틸아민에 의한 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환되고, 등몰량의 기타 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이적 항체를 형성한다. 생성된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 약제로서 사용될 수 있다.
이. 콜라이(E. coli)로부터 Fab'-SH 단편의 직접 회수를 촉진하는 기술이 존재하고, 이는 화학적으로 결합하여 이중특이적 항체를 형성할 수 있다. 문헌[참조: Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225(1992)]은 인간화 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산을 기재한다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 별도로 분비되고, 시험관내에서 지시된 화학적 커플링에 적용하여 이중특이적 항체를 형성했다. 이렇게 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과발현하는 세포 및 정상 인간 T 세포에 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 유발할 수 있다.
재조합 세포 배양물로부터 직접 이중특이적 항체 단편을 작제하고 단리하는 다양한 기술도 기재되어 있다[참조: Merchant et al., Nat. Biotechnol. 16, 677-681, 1998]. 예를 들면, 이중특이적 항체는 류신 지퍼를 사용하여 생산되었다[참조: Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553, 1992]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드는 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결되었다. 항체 호모이량체는 힌지 영역에서 환원되어 단량체를 형성하고, 이어서 재산화되어 항체 헤테로이량체를 형성했다. 이 방법은 또한 항체 호모이량체의 생산에 이용될 수 있다. 문헌[참조: Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 의해 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편을 작성하기 위한 대체 메카니즘을 제공했다. 단편은, 동일한 쇄 상의 2개 도메인 사이의 페어링을 가능하게 하기에는 너무 짧은 링커에 의해 VL에 연결된 VH를 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인은 다른 단편의 상보적 VL 및 VH 도메인과 강제적으로 페어링되고, 이에 의해 2개의 항원 결합 부위가 형성된다. 단일 쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 작성하는 또 다른 전략도 보고되었다[참조: Gruber et al., J. Immunol., 152:5368(1994)].
특정 실시양태에서, 이중특이적 또는 다중특이적 항체는 DOCK-AND-LOCK™(DNL™) 복합체로서 형성될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제7,521,056호; 제7,527,787호; 제7,534,866호; 제7,550,143호 및 제7,666,400호 참조, 참조에 의해 본 명세서에 도입되는 각각의 실시예 섹션). 일반적으로, 이 기술은, cAMP 의존성 단백질 키나제(PKA)의 조절(R) 서브유닛의 이량체화 및 도킹 도메인(DDD) 서열과, 임의의 다양한 AKAP 단백질로부터 유래하는 앵커 도메인(AD) 서열 사이에서 발생하는 특이적 및 고친화성 결합 상호작용을 이용한다[참조: Baillie et al., FEBS Letters. 2005; 579: 3264; Wong and Scott, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004; 5:959]. DDD 및 AD 펩티드는 임의의 단백질, 펩티드 또는 기타 분자에 부착될 수 있다. DDD 서열은 자발적으로 이량체화되어 AD 서열에 결합하기 때문에, 이 기술은 DDD 또는 AD 서열에 부착될 수 있는 선택된 분자 사이에 복합체의 형성을 가능하게 한다.
2가 이상을 갖는 항체가 고려된다. 예를 들면, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다[참조: Tutt et al., J. Immunol. 147: 60, 1991; Xu et al., Science, 358(6359):85-90, 2017]. 다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 신속하게 내재화(및/또는 이화)될 수 있다. 본 개시의 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 다가 항체(예를 들면, 4가 항체)일 수 있고, 이는 항체의 폴리펩티드 쇄를 인코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 용이하게 생성될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함(또는 이들로 구성)한다. 이 시나리오에서, 항체는 Fc 영역 및 Fc 영역에 대한 아미노 말단의 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 본 명세서에서 바람직한 다가 항체는 3개 내지 약 8개, 그러나 바람직하게는 4개의 항원 결합 부위를 포함(또는 이들로 구성)한다. 다가 항체는 적어도 하나의 폴리펩티드 쇄(및 바람직하게는 2개의 폴리펩티드 쇄)를 포함하고, 여기서 폴리펩티드 쇄(들)는 2개 이상의 가변 영역을 포함한다. 예를 들면, 폴리펩티드 쇄(들)는 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc를 포함할 수 있고, 여기서 VD1은 제1 가변 영역이고, VD2는 제2 가변 영역이고, Fc는 Fc 영역의 하나의 폴리펩티드 쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내고, n은 0 또는 1이다. 예를 들면, 폴리펩티드 쇄(들)는 VH-CH1-유연한 링커-VH-CH1-Fc 영역 쇄; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 쇄를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 다가 항체는 바람직하게는 적어도 2개(및 바람직하게는 4개)의 경쇄 가변 영역 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 본 명세서의 다가 항체는, 예를 들면, 약 2 내지 약 8개의 경쇄 가변 영역 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 고려되는 경쇄 가변 영역 폴리펩티드는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 임의로 CL 도메인을 추가로 포함한다.
전하 변형은, Fab 분자의 아미노산 치환에 의해 경쇄와 부정합의 중쇄(Bence-Jones 유형 부산물)의 미스페어링이 감소하는 다중특이적 항체의 문맥에서 특히 유용하고, 이는 결합 아암의 1개(2개 이상의 항원-결합 Fab 분자의 경우에 1개 이상)에서 VH/VL 교환으로 Fab-기반 이중/다중특이적 항원 결합 분자에서 발생할 수 있다(PCT 공개공보 WO 제2015/150447호, 특히 그 중의 실시예, 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 도입됨).
따라서, 특정 실시양태에서, 치료제에 포함된 항체는
(a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 Fab 분자
(b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 Fab 분자를 포함하고,
여기서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 치환되고,
여기서, 제1 항원은 활성화 T 세포 항원이고 제2 항원은 표적 세포 항원이거나, 또는 제1 항원은 표적 세포 항원이고 제2 항원은 활성화 T 세포 항원이고;
여기서,
i) a)하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서는, 위치 124의 아미노산이 양으로 하전된 아미노산(카바트에 따른 넘버링)으로 치환되고, a)하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서는, 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산이 음으로 하전된 아미노산(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)으로 치환되거나; 또는
ii) b)하의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서는, 위치 124의 아미노산이 양으로 하전된 아미노산(카바트에 따른 넘버링)으로 치환되고, b)하의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서는, 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산이 음으로 하전된 아미노산(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)으로 치환된다.
항체는 i) 및 ii)에 언급된 변형을 모두 포함하지 않을 수 있다. 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 치환되지 않는다(즉, 교환되지 않은 상태로 유지됨).
항체의 또 다른 실시양태에서, a)하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서는, 위치 124의 아미노산이 독립적으로 라이신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고(바람직한 일 실시양태에서, 독립적으로 라이신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해), a)하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서는, 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산이 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환된다.
추가 실시양태에서, a)하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서는, 위치 124의 아미노산이 독립적으로 라이신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, a)하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서는, 위치 147의 아미노산이 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환된다.
특정 실시양태에서, a)하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서는, 위치 124의 아미노산이 독립적으로 라이신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고(바람직한 일 실시양태에서는 독립적으로 라이신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해), 위치 123의 아미노산이 독립적으로 라이신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고(바람직한 일 실시양태에서는 독립적으로 라이신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해), a)하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서는, 위치 147의 아미노산이 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213의 아미노산이 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환된다.
보다 특정한 실시양태에서, a)하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서는 위치 124의 아미노산이 라이신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123의 아미노산이 리신(K) 또는 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, a)하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서는 위치 147의 아미노산이 글루탐산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213의 아미노산이 글루탐산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)으로 치환된다.
보다 더 특정한 실시양태에서, a)하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서는, 위치 124의 아미노산이 라이신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123의 아미노산이 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, a)하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서는 위치 147의 아미노산이 글루탐산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213의 아미노산이 글루탐산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환된다.
F. 키메라 항원 수용체
인공 T 세포 수용체(키메라 T 세포 수용체, 키메라 면역수용체, 키메라 항원 수용체(CAR)라고도 함)는, 면역 이펙터 세포에 임의의 특이성을 이식하는 조작된 수용체이다. 통상, 이러한 수용체는 모노클로날 항체의 특이성을 T 세포에 이식하기 위해 사용되고, 레트로바이러스 벡터에 의해 이들의 코딩 서열의 전달이 촉진된다. 이러한 방식으로, 입양 세포 전달을 위해, 다수의 표적 특이적 T 세포를 생성할 수 있다. 이 접근법의 1상 임상 연구는 효능을 나타낸다.
이러한 분자의 가장 일반적 형태는 모노클로날 항체로부터 유래하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)의 융합이고, CD3-제타 막관통 및 엔도도메인에 융합된다. 이러한 분자는 이의 표적의 scFv에 의한 인식에 응답하여 제타 신호의 전달을 초래한다. 이러한 작제물의 예는 하이브리도마 14g2a(디시알로강글리오사이드 GD2를 인식함)으로부터 유래하는 scFv의 융합체인 14g2a-제타이다. T 세포가 이 분자를 발현하면(통상은 온코레트로바이러스 벡터 형질도입에 의해 달성됨), GD2를 발현하는 표적 세포(예: 신경모세포종 세포)를 인식하여 사멸한다. 악성 B 세포를 표적으로 하기 위해, 연구자들은 B 계통 분자 CD19에 특이적인 키메라 면역수용체를 사용하여 T 세포의 특이성을 재지시했다.
면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 가변 부분은 유연한 링커에 의해 융합되어 scFv를 형성한다. 이 scFv에는 신호 펩티드가 선행하여 신생 단백질을 소포체로 지시하고, 후속 표면 발현을 수행한다(이는 절단됨). 유연한 스페이서에 의해, scFv를 다른 방향으로 배향시켜 항원 결합을 가능하게 한다. 막관통 도메인은 통상 세포 내로 돌출하여 목적하는 신호를 전달하는 신호전달 엔도도메인의 원래 분자로부터 유래하는 전형적 소수성 알파 헬릭스이다.
유형 I 단백질은 실제로는 그 사이에 막관통 알파 나선에 의해 연결된 2개의 단백질 도메인이다. 막관통 도메인이 통과하는 세포막 지질 이중층은 내측 부분(엔도도메인)을 외측 부분(엑토도메인)으로부터 단리하는 역할을 한다. 어느 단백질의 엑토도메인을 다른 단백질의 엔도도메인에 부착하면, 전자의 인식을 후자의 신호와 조합하는 분자가 생성된다는 것은 놀라운 것이 아니다.
엑토도메인. 신호 펩티드는 신생 단백질을 소포체로 유도한다. 이것은 수용체가 글리코실화되어 세포막에 고정되는 경우에 필수적이다. 모든 진핵생물 신호 펩티드 서열은 통상 정상으로 작동한다. 일반적으로, 대부분의 아미노 말단 성분에 자연적으로 부착된 신호 펩티드가 사용된다(예: 경쇄-링커-중쇄 배향을 갖는 scFv에서는 경쇄의 자연 신호가 사용된다).
항원 인식 도메인은 통상 scFv이다. 그러나, 다수의 대안이 있다. 자연 T-세포 수용체(TCR) 알파 및 베타 단일 쇄로부터의 항원 인식 도메인은, 단순 엑토도메인(예: HIV 감염 세포를 인식하는 CD4 엑토도메인) 및 연결된 사이토카인 등의 보다 외래 인식 성분(이는 사이토카인 수용체를 갖는 세포의 인식을 유도함)을 갖기 때문에 기재되었다. 사실, 소정 표적에 높은 친화성으로 결합하는 거의 모든 것을 항원 인식 영역으로서 사용할 수 있다.
스페이서 영역은 항원 결합 도메인을 막관통 도메인에 연결한다. 항원 인식을 용이하게 하기 위해, 항원 결합 도메인이 상이한 방향으로 배향되도록 하기에 충분히 유연해야 한다. 가장 단순한 형태는 IgG1의 힌지 영역이다. 대안으로는 면역글로불린의 CH2CH3 영역과 CD3의 일부가 포함된다. 대부분의 scFv 기반 작제물의 경우에는, IgG1 힌지로 충분하다. 그러나, 다수의 경우, 최상의 스페이서는 경험적으로 결정되어야 한다.
막관통 도메인. 막관통 도메인은 막을 가로지르는 소수성 알파 헬릭스이다. 일반적으로, 엔도도메인의 가장 막 근위의 구성요소로부터의 막관통 도메인이 사용된다. 흥미롭게도, CD3-제타 막관통 도메인을 사용하면, 인공 TCR이 자연 TCR에 도입될 수 있고, 이는 자연 CD3-제타 막관통 하전된 아스파라긴산 잔기의 존재에 의존하는 인자이다. 상이한 막관통 도메인은 상이한 수용체 안정성을 초래한다. CD28 막관통 도메인은 밝게 발현되고 안정한 수용체를 생성한다.
엔도도메인. 이것은 수용체의 "비즈니스-종점"이다. 항원 인식 후, 수용체가 클러스터링되고, 신호가 세포로 전달된다. 가장 일반적으로 사용되는 엔도도메인 구성요소는 3개의 ITAM을 포함하는 CD3-제타이다. 이것은, 항원이 결합된 후, 활성화 신호를 T 세포에 전달한다. CD3-제타는 완전히 유능한 활성화 신호를 제공하지 않을 수 있고, 추가의 공-자극 신호가 필요하다.
"제1 세대"의 CAR은 통상 내인성 TCR로부터의 신호의 주요 전달물질인 CD3 ξ-쇄로부터의 세포내 도메인을 갖고 있다. "제2 세대"의 CAR은 다양한 공-자극 단백질 수용체(예: CD28, 41BB, ICOS)로부터의 세포내 신호전달 도메인을 CAR의 세포질 테일에 부가하여, T 세포에 추가의 신호를 제공한다. 전임상 연구에 따르면, 제2 세대의 CAR 설계가 T 세포의 항종양 활성을 개선시키는 것을 보여준다. 보다 최근에, "제3 세대"의 CAR은 CD3z-CD28-41BB 또는 CD3z-CD28-OX40 등의 복수의 신호전달 도메인을 조합하여 효능을 더욱 증대한다.
G. ADC
항체 약물 접합체 또는 ADC는 감염성 질환을 갖는 사람들의 치료를 위한 표적 요법으로 설계된 새로운 클래스의 매우 강력한 생물약제학 약물이다. ADC는 항체(mAb 전체, 또는 단일 쇄 가변 단편 또는 scFv 등의 항체 단편)으로 구성되는 복잡한 분자이고, 불안정한 결합을 갖는 안정한 화학적 링커를 통해 생물학적 활성 세포독성/항-바이러스 페이로드 또는 약물에 연결된다. 항체 약물 접합체는 생체접합체 및 면역접합체의 예이다.
모노클로날 항체의 독특한 표적화 능력과 세포독성 약물의 암 사멸 능력을 조합함으로써, 항체-약물 접합체는 건강한 조직과 발병 조직을 민감하게 구별할 수 있다. 이는, 종래의 전신적 접근법과는 대조적으로, 항체-약물 접합체가 감염된 세포를 표적으로 하여 공격하기 때문에, 건강한 세포가 덜 심각하게 영향을 받는다는 것을 의미한다.
ADC-기반 항-종양 요법의 개발에서, 항암제(예: 세포 독소 또는 세포독소)는 특정 세포 마커를 특이적으로 표적화하는 항체(예를 들면, 이상적으로는, 감염된 세포 중 또는 상에서만 발견되는 단백질)에 결합된다. 항체는 이러한 단백질을 체내에서 추적하여 암 세포의 표면에 부착한다. 항체와 표적 단백질(항원) 사이의 생화학적 반응은 종양 세포에서 신호를 촉발하고, 이어서 이는 세포독소와 함께 항체를 흡수 또는 내재화한다. ADC가 내재화된 후, 세포독성 약물이 방출되어 세포를 사멸하거나, 바이러스 복제를 손상시킨다. 이러한 표적화로 인해, 이상적으로는, 약물은 다른 약물보다 부작용이 적고 치료 윈도우가 넓어진다.
항체와 세포독성/항-바이러스제 사이의 안정한 연결은 ADC의 중요한 측면이다. 링커는, 디설파이드, 하이드라존 또는 펩티드(절단 가능) 또는 티오에테르(절단 불가능)를 포함한 화학적 모티프를 기반으로 하고, 세포독성제의 표적 세포로의 분포 및 전달을 제어한다. 절단 가능한 및 절단 불가능한 유형의 링커는 전임상 및 임상 시험에서 안전한 것으로 입증되었다. 브렌툭시맙 베도틴에는, 강력하고 독성이 강한 항미세소관제인 모노메틸 아우리스타틴 E 또는 MMAE(합성 항종양제)를 인간 특이적 CD30-양성 악성 세포에 전달하는 효소 감수성의 절단 가능한 링커가 포함된다. 튜불린의 중합을 차단함으로써 세포분열을 억제하는 MMAE는 독성이 높기 때문에, 단일-약제 화학치료제로는 사용할 수 없다. 그러나, 항-CD30 모노클로날 항체(cAC10, 종양 괴사 인자 또는 TNF 수용체의 세포막 단백질)에 연결된 MMAE의 조합은 세포외 유체에서 안정하고 카텝신에 의해 절단될 수 있으며 치료에 안전한 것으로 입증되었다. 또 다른 승인된 ADC인 트라투주맙 엠탄신(Trastuzumab emtansine)은 마이탄신의 유도체인 미소관-형성 억제제 메르탄신(DM-1)과, 안정한 절단 불가능한 링커에 의해 부착된 항체 트라투주맙(Herceptin®/Genentech/Roche)의 조합이다.
더 우수하고 더 안정한 링커의 가용성은 화학 결합의 기능을 변화시켰다. 절단 가능한 또는 절단 불가능한 링커의 유형은 세포독성(항암) 약물에 특정 특성을 부여한다. 예를 들면, 절단 불가능한 링커는 약물을 세포 내에 유지한다. 결과적으로, 전체 항체, 링커 및 세포독성제는 항체가 표적 암 세포로 진입하고, 여기서 항체가 아미노산 수준으로 분해된다. 수득된 복합체(아미노산, 링커 및 세포독성제)는 활성 약물로 된다. 대조적으로, 절단 가능한 링커는 세포독성제를 방출하는 숙주 세포 내의 효소에 의해 촉매된다.
현재 개발 중의 또 다른 유형의 절단 가능한 링커는 세포독성/항-바이러스 약물과 절단 부위 사이에 여분의 분자를 추가한다. 이 링커 기술에 의해, 연구자는 절단 속도의 변화에 대해 걱정하지 않고 보다 유연하게 ADC를 생성할 수 있다. 연구자들은 또한, 펩티드 중의 아미노산을 서열분석하는 방법인 에드만(Edman) 분해를 기반으로 하는 새로운 펩티드 절단 방법을 개발하고 있다. ADC 개발의 장래의 방향성에는 안정성과 치료 지수를 추가로 개선하기 위한 부위 특이적 접합(TDC)의 개발, 및 α 방출 면역접합체 및 항체-접합 나노입자의 개발도 포함된다.
H. BiTE
BiTE(이중특이적 T-세포 인게이저)는 항암제로서 사용하기 위해 검토되는 인공 이중특이적 모노클로날 항체의 일종이다. 이들은 감염된 세포에 대한 숙주의 면역계, 보다 구체적으로는 T 세포의 세포독성 활성을 지시한다. BiTE는 마이크로메트 아게(Micromet AG)의 등록 상표이다.
BiTE는, 약 55킬로달톤의 단일 펩티드 쇄에 상이한 항체의 2개 단일 쇄 가변 단편(scFv) 또는 4개의 상이한 유전자로부터의 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질이다. scFv 중 하나는 CD3 수용체를 통해 T 세포에 결합하고, 다른 하나는 특정 분자를 통해 감염된 세포에 결합한다.
다른 이중특이적 항체와 마찬가지로 및 통상의 모노클로날 항체와는 달리, BiTE는 T 세포와 표적 세포 사이에 연결을 형성한다. 이것에 의해, T 세포는 MHC I 또는 공-자극 분자의 존재와 무관하게 퍼포린 및 그랜자임 등의 단백질을 생성함으로써 감염된 세포에 대해 세포독성/항바이러스 활성을 발휘한다. 이 단백질은 감염된 세포에 진입하고, 세포의 아폽토시스를 개시한다. 이 작용은 감염된 세포에 대한 T 세포의 공격 동안 관찰되는 생리학적 프로세스를 모방한다.
I. 인트라바디
특정 실시양태에서, 이 항체는 세포 내에서의 작용에 적합한 재조합 항체이고, 이러한 항체는 "인트라바디(intrabody)"로 공지되어 있다. 이러한 항체는 세포 내 단백질 수송의 변화, 효소 기능의 방해, 단백질-단백질 또는 단백질-DNA 상호작용의 차단 등의 다양한 메커니즘에 의해 표적 기능을 방해할 수 있다. 다수의 점에서, 이들의 구조는 상기에서 논의한 단일 쇄 및 단일 도메인 항체의 구조를 모방 또는 유사하다. 실제로, 단일 전사물/단일 쇄는 표적 세포에서의 세포내 발현을 가능하게 하고, 또한 세포막을 통한 단백질 수송을 보다 실현 가능하게 하는 중요한 기능이다. 그러나, 추가 기능이 필요하다.
체내 치료의 실시에 영향을 미치는 2개의 주요 문제는 세포/조직 표적화를 포함한 전달 및 안정성이다. 전달과 관련하여, 조직-지시된 전달, 세포-유형 특이적 프로모터의 사용, 바이러스-기반 전달 및 세포-투과성/막 전위 펩티드의 사용 등의 다양한 접근법이 사용되었다. 안정성과 관련하여, 접근법은 일반적으로 파지 디스플레이를 수반하고 컨센서스 서열의 서열 성숙 또는 발달을 포함하는 방법을 포함하는 무차별 대입에 의한 스크리닝, 또는 삽입 안정화 서열(예: Fc 영역, 샤페론 단백질 서열, 류신 지퍼) 및 디설파이드 치환/변형 등의 보다 지시된 변형이다.
인트라바디에 필요할 수 있는 추가 기능은 세포내 표적화를 위한 신호이다. 세포질, 핵, 미토콘드리아 및 ER 등의 세포내 영역에 대한 인트라바디(또는 기타 단백질)를 표적화할 수 있는 벡터가 설계되었고 상업적으로 입수 가능하다[참조: Invitrogen Corp.; Persic et al., 1997].
세포에 진입하는 능력에 비추어, 인트라바디는 기타 유형의 항체가 달성할 수 없는 추가 용도를 갖는다. 본 발명의 항체의 경우, 살아있는 세포 내의 MUC1 세포질 도메인과 상호작용하는 능력은 신호전달 기능(다른 분자에 결합) 또는 올리고머 형성 등의 MUC1 CD와 관련된 기능을 방해할 수 있다. 특히, 이러한 항체는 MUC1 이량체 형성을 억제하기 위해 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
J. 정제
특정 실시양태에서, 본 개시의 항체는 정제될 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "정제된"은, 단백질이 자연적으로 수득되는 상태에 비해 임의의 정도로 정제되는, 다른 성분으로부터 단리 가능한 조성물을 지칭하는 것으로 의도된다. 따라서, 정제된 단백질은 자연적으로 발생할 수 있는 환경으로부터 유리된 단백질을 지칭한다. 용어 "실질적으로 정제된"이 사용되는 경우, 이 명칭은 단백질 또는 펩티드가 조성물의 주요 성분을 형성하는 조성물을 지칭하고, 예를 들면, 조성물 중의 단백질의 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 또는 그 이상을 구성한다.
단백질 정제 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 기술은, 하나의 수준에서, 세포 환경을 폴리펩티드 및 비-폴리펩티드 분획으로 조 분별하는 것을 포함한다. 폴리펩티드를 다른 단백질로부터 분리한 후, 목적 폴리펩티드는 부분적 또는 완전한 정제(또는 균질성을 위한 정제)를 달성하기 위해 크로마토그래피 및 전기영동 기술을 사용하여 추가로 정제할 수 있다. 순수한 펩티드의 제조에 특히 적합한 분석 방법은 이온 교환 크로마토그래피, 배제 크로마토그래피; 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; 등전점 전기영동이다. 단백질 정제를 위한 기타 방법에는 황산암모늄, PEG, 항체 등을 사용한 침전 또는 열 변성 및 이어서 원심분리; 겔 여과, 역상, 하이드록실아파타이트 및 친화성 크로마토그래피; 및 이러한 기술 및 기타 기술의 조합이 포함된다.
본 개시의 항체를 정제할 때에, 원핵생물 또는 진핵생물 발현 시스템에서 폴리펩티드를 발현시키고, 변성 조건을 사용하여 단백질을 추출하는 것이 바람직할 수 있다. 폴리펩티드는 폴리펩티드의 태그된 부분에 결합하는 친화성 컬럼을 사용하여 다른 세포 성분으로부터 정제될 수 있다. 당해 기술분야에 일반적으로 공지된 바와 같이, 다양한 정제 단계를 수행하는 순서를 변경할 수 있거나, 특정 단계를 생략할 수 있으며, 실질적으로 정제된 단백질 또는 펩티드를 제조하기 위한 적합한 방법을 초래하는 것으로 믿어진다.
일반적으로, 완전한 항체는 항체의 Fc 부분에 결합하는 약제(즉, 단백질 A)를 사용하여 분획시킨다. 또는, 항원을 사용하여, 적절한 항체를 동시에 정제 및 선택할 수 있다. 이러한 방법은 종종 컬럼, 필터 또는 비드 등의 지지체에 결합된 선택 약제를 활용한다. 항체는 지지체에 결합되고, 오염물질을 제거하고(예: 세척), 조건(염, 열 등)을 적용하여 항체를 방출한다.
단백질 또는 펩티드의 정제 정도를 정량화하는 다양한 방법은 본 개시에 비추어 당업자에게 공지될 것이다. 여기에는, 예를 들면, 활성 분획의 비활성을 결정하는 것, 또는 SDS/PAGE 분석에 의해 분획 내의 폴리펩티드의 양을 평가하는 것이 포함된다. 분획의 순도를 평가하는 또 다른 방법은 분획의 비활성을 계산하고, 이를 초기 추출물의 비활성과 비교하여 순도를 계산하는 것이다. 활성의 양을 나타내기 위해 사용되는 실제 단위는, 물론, 정제를 추적하기 위해 선택된 특정 검정 기술, 및 발현된 단백질 또는 펩티드가 검출 가능한 활성을 나타내는지의 여부에 의존한다.
폴리펩티드의 이동은 SDS/PAGE의 조건이 상이하면, 경우에 따라 상당히 변화할 수 있는 것으로 공지되어 있다[참조: Capaldi et al., 1977]. 따라서, 상이한 전기영동 조건하에서, 정제 또는 부분적으로 정제된 발현 생성물의 겉보기 분자량이 변화할 수 있음이 이해될 것이다.
III. 지카 바이러스 감염의 능동/수동 면역화 및 치료/예방
A. 제형 및 투여
본 개시는 항-지카 바이러스 항체 및 이를 생성하기 위한 항원을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 예방적 또는 치료적 유효량의 항체 또는 이의 단편, 또는 펩티드 면역원, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 용어 "약제학적으로 허용되는"은 연방 정부 또는 주 정부의 규제 당국에 의해 승인되거나, 또는 미국 약국방 또는 동물, 보다 특히 인간에서의 사용에 대해 일반적으로 인정되는 기타 약국방에 수록된 것을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 약제학적 담체는 물 등의 멸균 액체 및 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 것을 포함하는 오일, 예를 들면, 땅콩유, 대두유, 광유, 참기름 등일 수 있다. 약제학적 조성물이 정맥내 투여되는 경우, 물은 특정한 담체이다. 생리식염수, 덱스트로스 및 글리세롤 수용액도 특히 주사용 용액의 액체 담체로 사용할 수 있다. 다른 적합한 약제학적 부형제에는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등이 포함된다.
조성물은, 필요에 따라, 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 지속 방출 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 경구 제형은 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 사카린나트륨, 셀룰로오스, 탄산마그네슘 등의 표준 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약제의 예는 문헌[참조: "Remington's Pharmaceutical Sciences"]에 기재되어 있다. 이러한 조성물은, 예방적 또는 치료적 유효량의 항체 또는 이의 단편을, 바람직하게는 정제된 형태로, 적절한 양의 담체와 함께 함유하여, 환자에게 적절한 투여를 위한 형태를 제공한다. 제형은 경구, 정맥내, 동맥내, 협측, 비강내, 분무, 기관지 흡입, 직장내, 질, 국소 또는 기계적 인공호흡에 의해 전달될 수 있는 투여 방식에 적합해야 한다.
개시된 바와 같은 항체가 지카 바이러스 감염의 위험이 있는 대상체에서 생체내에서 생성되는 활성 백신도 또한 상정된다. 이러한 백신은 비경구 투여용으로 제형화될 수 있고, 예를 들면, 피내, 정맥내, 근육내, 피하 또는 심지어 복강내 경로를 통한 주사용으로 제형화될 수 있다. 피내 및 근육내 경로에 의한 투여가 고려된다. 또는, 백신은 국소 경로에 의해 점막에 직접 투여할 수 있고, 예를 들면, 점비제, 흡입, 분무기에 의해, 또는 직장내 또는 질내 전달을 통해 투여할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 산성 염 및, 예를 들면, 염산 또는 인산 등의 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등의 유기산으로 형성된 염을 포함한다. 유리 카복실 그룹으로 형성된 염은 또한, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화제2철 등의 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등의 유기 염기로부터 유해할 수 있다.
인공적으로 획득한 수동 면역으로서 공지된 항체의 수동적 전달은 일반적으로 정맥내 주사 또는 근육내 주사의 사용을 포함한다. 항체의 형태는 정맥내(IVIG) 또는 근육내(IG) 사용을 위한 풀링된 인간 면역글로불린으로서, 면역화 또는 질환으로부터 회복된 공여자로부터의 고역가 인간 IVIG 또는 IG로서, 및 모노클로날 항체(MAb)로서 인간 또는 동물의 혈장 또는 혈청일 수 있다. 이러한 면역은 일반적으로 짧은 기간 동안만 지속되고, 특히 비인간 기원의 감마 글로불린에 의해 과민 반응 및 혈청병의 잠재적 위험도 있다. 그러나, 수동 면역은 즉시 보호를 제공한다. 항체는 주사에 적합한, 즉 멸균되고 주사 가능한 담체에서 제형화될 것이다.
일반적으로, 본 개시의 조성물의 성분은 개별적으로 공급되거나, 또는 단위 투여 형태로 함께 혼합되어, 예를 들면, 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 사셰 등의 밀폐 용기에 건조 동결건조 분말 또는 물-비함유 농축물로서 공급된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 이는 멸균 약제학적 등급의 물 또는 생리식염수를 포함하는 주입 병과 함께 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 주사용 멸균수의 앰플 또는 생리식염수를 제공하여, 투여 전에 성분을 혼합할 수 있다.
본 개시의 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유래된 것 등의 음이온으로 형성된 염, 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화제이철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래된 것 등의 양이온으로 형성된 염을 포함한다.
2. ADCC
항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)는 면역 이펙터 세포에 의해 항체-코팅된 표적 세포의 용해를 유도하는 면역 메커니즘이다. 표적 세포는 일반적으로 Fc 영역의 N-말단인 단백질 부분을 통해 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 이의 단편이 특이적으로 결합하는 세포이다. "항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)의 증가/감소를 갖는 항체"는 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 측정된 바와 같이 ADCC의 증가/감소를 갖는 항체를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "증가/감소된 ADCC"는, 상기 정의된 ADCC의 메커니즘에 의해 표적 세포를 둘러싸고 있는 배지에서 소정 항체 농도에서 소정 시간에 용해되는 표적 세포 수의 증가/감소, 및/또는 ADCC의 메커니즘에 의해 소정 시간에 소정 수의 표적 세포의 용해를 달성하는 데 필요한, 표적 세포를 둘러싼 배지에서 항체 농도의 감소/증가로서 정의된다. ADCC의 증가/감소는 동일한 표준 생산, 정제, 제형 및 저장 방법(이는 당업자에게 공지됨)을 사용하여 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 생성된 동일한 항체에 의해 매개되는 ADCC와 비교하여 상대적이지만, 이는 조작되지 않는다. 예를 들면, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 (예를 들면, 글리코실트랜스퍼라제, GnTIII 또는 다른 글리코실트랜스퍼라제를 발현하기 위해) 변경된 패턴의 글리코실화를 갖도록 조작된 숙주 세포에 의해 생성된 항체에 의해 매개되는 ADCC의 증가는 동일한 유형의 비조작된 숙주 세포에 의해 생성된 동일한 항체에 의해 매개된 ADCC에 상대적이다.
3. CDC
보체-의존성 세포독성(CDC)은 보체 시스템의 기능이다. 면역계의 항체나 세포의 개입 없이, 병원체의 막을 손상시켜 병원체를 사멸시키는 것은 면역계의 프로세스이다. 3개의 주요 프로세스가 있다. 3개 모두가 치명적 콜로이드 삼투압 팽창, 즉 CDC를 일으키는 병원체에 하나 이상의 막 공격 복합체(MAC)를 삽입한다. 이는 항체 또는 항체 단편이 항-바이러스 효과를 갖는 메커니즘 중 하나이다.
IV. 항체 접합체
본 개시의 항체는 항체 접합체를 형성하기 위해 적어도 하나의 약제에 연결될 수 있다. 진단제 또는 치료제로서의 항체 분자의 효능을 증가시키기 위해, 적어도 하나의 목적하는 분자 또는 모이어티를 연결하거나, 공유 결합하거나, 또는 복합체를 형성하는 것이 통상적이다. 이러한 분자 또는 모이어티는 적어도 하나의 이펙터 또는 리포터 분자일 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 이펙터 분자는 목적하는 활성, 예를 들면, 세포독성 활성을 갖는 분자를 포함한다. 항체에 부착된 이펙터 분자의 비제한적 예에는 독소, 항종양제, 치료용 효소, 방사성핵종, 항바이러스제, 킬레이트제, 사이토카인, 성장 인자, 및 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 대조적으로, 리포터 분자는 검정을 사용하여 검출될 수 있는 임의의 모이어티로 정의된다. 항체에 접합된 리포터 분자의 비제한적 예에는 효소, 방사성 표지, 합텐, 형광 표지, 인광 분자, 화학발광 분자, 발색단, 광친화성 분자, 착색 입자 또는 리간드, 예를 들면, 비오틴이 포함된다.
항체 접합체는 일반적으로 진단제로서 사용하기에 바람직하다. 항체 진단은 일반적으로 2개의 클래스, 즉 다양한 면역검정 등의 시험관내 진단에 사용되는 것들 및 일반적으로 "항체-지시된 이미징"으로 공지된 생체내 진단 프로토콜에 사용되는 것들로 분류된다. 항체에 부착하는 방법과 동일하게, 다수의 적절한 조영제가 당해 기술분야에 공지되어 있다(예를 들면, 미국 특허 제5,021,236호, 제4,938,948호 및 제4,472,509호 참조). 사용된 조영 모이어티는 상자성 이온, 방사성 동위원소, 형광색소, NMR 검출 가능한 물질 및 X선 조영제일 수 있다.
상자성 이온의 경우, 예로서, 크롬(III), 망간(II), 철(III), 철(II), 코발트(II), 니켈(II), 구리(II), 네오디뮴(III), 사마륨(III), 이테르븀(III), 가돌리늄(III), 바나듐(II), 테르븀(III), 디스프로슘(III), 홀뮴(III) 및/또는 에르븀(III) 등의 이온이 언급될 수 있고, 가돌리늄이 특히 바람직하다. X선 이미징 등의 기타 상황에서 유용한 이온에는 란탄(III), 금(III), 납(II), 특히 비스무트(III)가 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다.
치료 및/또는 진단용의 방사성 동위원소의 경우, 아스타틴211, 14카본, 51크롬, 36염소, 57코발트, 58코발트, 구리67, 152Eu, 갈륨67, 3수소, 요오드123, 요오드125, 요오드131, 인듐111, 59철, 32인, 레늄186, 레늄188, 75셀레늄, 35황, 테크니슘99m 및/또는 이트륨90을 언급할 수 있다. 125I는 특정 실시양태에서 사용하기에 종종 바람직하고, 테크니슘99m 및/또는 인듐111은 또한 이들의 낮은 에너지와 장거리 검출에 대한 적합성으로 인해 종종 바람직하다. 본 개시의 방사성 표지된 모노클로날 항체는 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 생성될 수 있다. 예를 들면, 모노클로날 항체는 요오드화나트륨 및/또는 요오드화칼륨 및 차아염소산나트륨 등의 화학적 산화제 또는 락토페록시다제 등의 효소적 산화제와의 접촉에 의해 요오드화될 수 있다. 본 개시에 따른 모노클로날 항체는, 예를 들면, 퍼테크네이트를 제1주석 용액으로 환원시키고, 환원된 테크네튬을 세파덱스 컬럼 상에서 킬레이트화하고, 항체를 이 컬럼에 적용함으로써 리간드 교환 프로세스에 의해 테크네튬99m으로 표지될 수 있다. 또는, 예를 들면, 퍼테크네이트, SNCl2 등의 환원제, 나트륨-칼륨 프탈레이트 용액 등의 완충 용액 및 항체를 배양함으로써 직접 표지 기술을 사용할 수 있다. 금속 이온으로 존재하는 방사성 동위원소를 항체에 결합시키기 위해 종종 사용되는 중간 관능기는 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 또는 에틸렌 디아민테트라아세트산(EDTA)이다.
접합체로서 사용하기 위해 고려되는 형광성 표지에는 Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, 캐스케이드 블루(Cascade Blue), Cy3, Cy5,6-FAM, 플루오레세인 이소티오시아네이트, HEX, 6-JOE, 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린 500, 오레곤 그린 514, 퍼시픽 블루(Pacific Blue), REG, 로다민 그린(Rhodamine Green), 로다민 레드(Rhodamine Red), 레노그래핀(Renographin), ROX, TAMRA, TET, 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine) 및/또는 텍사스 레드(Texas Red)가 포함된다.
본 개시에서 고려되는 추가 유형의 항체는 주로 시험관내에서의 사용을 위한 것이고, 여기서 항체는 2차 결합 리간드 및/또는 발색 기질과 접촉시에 착색된 생성물을 생성하는 효소(효소 태그)에 연결된다. 적합한 효소의 예에는 우레아제, 알칼린 포스파타제, (서양고추냉이) 과산화수소 또는 글루코스 옥시다제가 포함된다. 바람직한 2차 결합 리간드는 비오틴 및 아비딘 및 스트렙트아비딘 화합물이다. 이러한 표지의 사용은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면, 미국 특허 제3,817,837호, 제3,850,752호, 제3,939,350호, 제3,996,345호, 제4,277,437호, 제4,275,166호 및 제4,366,241호에 기재되어 있다.
항체에 대한 분자의 부위-특이적 부착의 또 다른 공지된 방법은 항체를 합텐-기반 친화성 표지와 반응시키는 것을 포함한다. 기본적으로, 합텐-기반 친화성 표지는 항원 결합 부위의 아미노산과 반응하고, 이에 의해 이 부위를 파괴하고, 특정 항원 반응을 차단한다. 그러나, 이는 항체 접합체에 의한 항원 결합의 상실을 초래하기 때문에 유리하지 않을 수 있다.
아지도 그룹을 포함하는 분자는 또한 낮은 강도의 자외선에 의해 생성되는 반응성 니트렌 중간체를 통해 단백질에 대한 공유 결합을 형성하기 위해 사용될 수 있다[참조: Potter and Haley, 1983]. 특히, 퓨린 뉴클레오티드의 2- 및 8-아지도 유사체는 조 세포 추출물 중의 뉴클레오티드 결합 단백질을 동정하기 위한 부위-지시된 광프로브로서 사용되어 왔다[참조: Owens & Haley, 1987; Atherton et al., 1985]. 2- 및 8-아지도 뉴클레오티드는 또한 정제된 단백질의 뉴클레오티드 결합 도메인의 맵핑에도 사용되고 있고[참조: Khatoon et al., 1989; King et al., 1989; Dholakia et al., 1989], 항체 결합제로 사용될 수 있다.
이의 접합체 모이어티에 대한 항체의 부착 또는 접합을 위한 몇몇 방법이 당해 기술분야에 공지되어 있다. 일부 부착 방법은, 예를 들면, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 무수물(DTPA) 등의 유기 킬레이트제; 에틸렌트리아민테트라아세트산; N-클로로-p-톨루엔술폰아미드; 및/또는 항체에 부착된 테트라클로로-3α-6α-디페닐글리코우릴-3을 사용하는 금속 킬레이트 복합체의 사용을 수반한다(미국 특허 제4,472,509호 및 제4,938,948호). 모노클로날 항체는 또한 글루타르알데히드 또는 퍼요오데이트 등의 커플링제의 존재하에 효소와 반응시킬 수 있다. 플루오레세인 마커와의 접합체는 이러한 커플링제의 존재하에 또는 이소티오시아네이트와의 반응에 의해 제조된다. 미국 특허 제4,938,948호에서, 유방 종양의 영상화는 모노클로날 항체를 사용하여 달성되고, 검출 가능한 영상화 모이어티는 메틸-p-하이드록시벤즈이미데이트 또는 N-숙신이미딜-3-(4-하이드록시페닐)프로피오네이트 등의 링커를 사용하여 항체에 결합된다.
다른 실시양태에서, 항체 결합 부위를 변경하지 않는 반응 조건을 사용하여, 면역글로불린의 Fc 영역에 설프하이드릴 그룹을 선택적으로 도입함으로써 면역글로불린의 유도체화가 고려된다. 이 방법론에 따라 생성된 항체 접합체는 개선된 수명, 특이성 및 감도를 나타내는 것으로 개시되어 있다(미국 특허 제5,196,066호, 참조에 의해 본 명세서에 도입됨). 리포터 또는 이펙터 분자가 Fc 영역의 탄수화물 잔기에 접합되어 있는 이펙터 또는 리포터 분자의 부위-특이적 부착도 문헌에 개시되어 있다[참조: O'Shannessy et al., 1987]. 이 접근법은 현재 임상 평가 중의 진단적 및 치료적으로 유망한 항체를 생산하는 것으로 보고되었다.
V. 면역검출 방법
또 다른 실시양태에서, 본 개시는 지카 바이러스 및 이의 관련 항원을 결합, 정제, 제거, 정량화 및 달리 일반적으로 검출하기 위한 면역검출 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 종래의 의미로 적용될 수 있지만, 또 다른 용도는 백신 및 기타 바이러스 스톡의 품질 관리 및 모니터링에 있고, 여기서 본 개시에 따른 항체는 바이러스 중의 항원의 양 또는 완전성(즉, 장기간 안정성)을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 또는, 이 방법을 사용하여, 적절한/목적하는 반응성 프로파일에 대해 다양한 항체를 스크리닝할 수 있다.
다른 면역검출 방법에는 대상체에서 지카 바이러스의 존재를 결정하기 위한 특정 검정이 포함된다. 다양한 검정 포맷이 고려되지만, 구체적으로는 타액, 혈액, 혈장, 가래, 정액 또는 소변 등의 대상체로부터 수득된 유체 중의 지카 바이러스를 검출하기 위해 사용되는 것들이 고려된다. 특히, 정액은 지카 바이러스 검출을 위한 실행 가능한 샘플로서 입증되었다[참조: Purpura et al., 2016; Mansuy et al., 2016; Barzon et al., 2016; Gornet et al., 2016; Duffy et al., 2009, CDC, 2016; Halfon et al., 2010; Elder et al. 2005]. 검정은 가정에서의 임신 시험과 유사한 측면 유동 검정(하기 참조)을 포함하여 비의료(가정)에서의 사용을 위해 유리하게 포맷시킬 수 있다. 이러한 검정은 가족 구성원의 대상체에 의한 사용을 가능하게 하기에 적절한 시약 및 지시를 포함하는 키트 형태로 패키징될 수 있다.
일부 면역검출 방법에는 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 방사선면역검정(RIA), 면역방사성 검정, 형광면역검정, 화학발광 검정, 생물발광 검정 및 웨스턴 블롯이 포함된다. 특히, 샘플 중의 특정 기생충 에피토프에 대해 지시된 지카 바이러스 항체의 검출 및 정량화를 위한 경쟁 검정도 제공된다. 다양한 유용한 면역검출 방법의 단계는, 예를 들면, 문헌[참조: Doolittle and Ben-Zeev (1999), Gulbis and Galand (1993), De Jager et al. (1993), and Nakamura et al. (1987)] 등의 과학 문헌에 기재되어 있다. 일반적으로, 면역결합 방법은, 경우에 따라, 면역복합체의 형성을 가능하게 하기에 효과적인 조건하에, 지카 바이러스를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 수득하고, 샘플을 본 개시에 따라 제1 항체와 접촉시키는 것을 포함한다.
이러한 방법에는 샘플로부터 지카 바이러스 또는 관련 항원을 정제하는 방법이 포함된다. 항체는 바람직하게는 컬럼 매트릭스 형태 등의 고체 지지체에 연결될 것이고, 지카 바이러스 또는 항원 성분을 함유하는 것으로 의심되는 샘플은 고정화된 항체에 적용될 것이다. 목적하지 않는 성분은 컬럼으로부터 세척되어, 고정된 항체에 면역 복합체를 형성한 지카 바이러스 항원을 잔류시키고, 이어서 컬럼으로부터 생물 또는 항원을 제거함으로써 수집한다.
면역결합 방법에는 또한, 샘플 중의 지카 바이러스 또는 관련 성분의 양을 검출 및 정량화하는 방법 및 결합 프로세스 중에 형성된 면역 복합체의 검출 및 정량화 방법이 포함된다. 여기에서는, 지카 바이러스 또는 그 항원을 포함하는 것으로 의심되는 샘플을 수득하고, 이 샘플을 지카 바이러스 또는 이의 성분에 결합하는 항체와 접촉시킨 후, 특정 조건하에서 형성된 면역 복합체의 양을 검출 및 정량화한다. 항원 검출과 관련하여, 분석된 생물학적 샘플은, 조직 절편 또는 표본, 균질화된 조직 추출물, 혈액 및 혈청을 포함한 생물학적 유체 또는 대변이나 소변 등의 분비물 등의 지카 바이러스 또는 지카 바이러스 항원을 함유하는 것으로 의심되는 임의의 샘플일 수 있다.
선택된 생물학적 샘플을 면역 복합체(1차 면역 복합체)의 형성을 가능하게 하기에 충분한 기간 동안 효과적인 조건하에서 항체와 접촉시키는 것은 일반적으로 항체 조성물을 샘플에 단순히 첨가하고, 혼합물을 면역 복합체를 형성하기에 충분한 기간, 즉 존재하는 지카 바이러스 또는 항원과 결합하기에 충분한 기간 동안 인큐베이팅하는 것의 문제이다. 이 후, 조직 절편, ELISA 플레이트, 도트 블롯 또는 웨스턴 블롯 등의 샘플 항체 조성물을 일반적으로 세척하여, 비특이적으로 결합된 항체 종을 제거하여, 1차 면역 복합체 내에서 특이적으로 결합된 항체만이 검출되도록 한다.
일반적으로, 면역복합체 형성의 검출은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 다수의 접근법을 적용함으로써 달성할 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로 방사성, 형광성, 생물학적 및 효소적 태그 중의 임의의 것들 등의 표지 또는 마커의 검출을 기반으로 한다. 이러한 표지의 사용에 관한 특허에는 미국 특허 제3,817,837호, 제3,850,752호, 제3,939,350호, 제3,996,345호, 제4,277,437호, 제4,275,149호 및 제4,366,241호가 포함된다. 물론, 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 2차 항체 등의 2차 결합 리간드 및/또는 비오틴/아비딘 리간드 결합 배열을 사용함으로써 추가의 이점을 발견할 수 있다.
검출에 사용된 항체는 그 자체가 검출가능한 표지에 연결될 수 있고, 이어서 이 표지를 단순히 검출하고, 이에 의해 조성물 중의 1차 면역 복합체의 양을 결정할 수 있다. 또는, 1차 면역 복합체 내에서 결합되는 1차 항체는 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 2차 결합 리간드에 의해 검출될 수 있다. 이러한 경우, 제2 결합 리간드는 검출 가능한 표지에 연결될 수 있다. 2차 결합 리간드는 그 자체가 종종 항체이고, 따라서 "이차" 항체로 지칭될 수 있다. 1차 면역 복합체는 2차 면역 복합체의 형성을 가능하게 하기에 충분한 시간 동안 효과적인 조건하에 표지된 2차 결합 리간드 또는 항체와 접촉된다. 이어서, 2차 면역 복합체를 일반적으로 세정하여, 비특이적으로 결합된 표지된 2차 항체 또는 리간드를 제거하고, 이어서 2차 면역 복합체의 잔류 표지를 검출한다.
추가 방법에는 2단계의 접근법에 의한 1차 면역 복합체의 검출이 포함된다. 상기한 바와 같이, 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 항체 등의 제2 결합 리간드를 사용하여 2차 면역 복합체를 형성한다. 세척 후, 2차 면역 복합체는 면역 복합체(3차 면역 복합체)의 형성을 가능하게 하기에 충분한 기간 효과적인 조건하에 다시 2차 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 제3 결합 리간드 또는 항체와 접촉된다. 제3 리간드 또는 항체는 검출 가능한 표지에 연결되어, 이렇게 형성된 3차 면역 복합체를 검출하게 한다. 이 시스템은, 이것이 필요한 경우, 신호 증폭을 제공할 수 있다.
면역 검출의 한 가지 방법은 2개의 상이한 항체를 사용한다. 제1 비오틴화된 항체를 사용하여 표적 항원을 검출하고, 이어서 제2 항체를 사용하여 복합체화된 비오틴에 부착된 비오틴을 검출한다. 이 방법에서, 시험되는 샘플은 먼저 제1 단계의 항체를 포함하는 용액에서 인큐베이팅된다. 표적 항원이 존재하는 경우, 항체의 일부는 항원에 결합하여 비오틴화된 항체/항원 복합체를 형성한다. 이어서, 항체/항원 복합체는 스트렙트아비딘(또는 아비딘), 비오틴화된 DNA 및/또는 상보적 비오틴화된 DNA의 연속 용액에서 인큐베이션에 의해 증폭되고, 각 단계에서 항체/항원 복합체에 추가의 비오틴 부위가 부가된다. 적절한 증폭 수준에 도달할 때까지 증폭 단계가 반복되고, 이 시점에서 샘플은 비오틴에 대한 제2 단계의 항체를 포함하는 용액에서 인큐베이팅된다. 이 제2 단계의 항체는, 예를 들면, 발색체 기질을 사용하는 조직효소학에 의해 항체/항원 복합체의 존재를 검출하기 위해 사용할 수 있는 효소로 표지된다. 적절한 증폭에 의해, 거시적으로 볼 수 있는 접합체를 생성할 수 있다.
면역검출의 또 다른 공지된 방법은 면역-PCR(폴리머라제 연쇄 반응) 방법론을 이용한다. PCR 방법은 비오티닐화된 DNA와 함께 인큐베이션할 때까지 캔터(Cantor) 방법과 유사하지만, 스트렙트아비딘 및 비오티닐화된 DNA의 인큐베이션을 복수회 사용하는 대신에, DNA/비오틴/스트렙트아비딘/항체 복합체를, 항체를 방출하는 낮은 pH 또는 높은 염 완충액으로 세척한다. 이어서, 수득된 세척 용액을 사용하여, 적절한 대조군을 구비한 적절한 프라이머로 PCR 반응을 수행한다. 적어도 이론상으로는, PCR의 거대한 증폭 능력과 특이성을 이용하여 단일 항원 분자를 검출할 수 있다.
A. ELISA
면역검정은, 가장 간단하고 직접적 의미에서, 결합 검정이다. 특정 바람직한 면역검정은 당해 기술분야에 공지된 다양한 유형의 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA) 및 방사선면역검정(RIA)이다. 조직 절편을 사용한 면역조직화학 검출도 특히 유용하다. 그러나, 검출은 이러한 기술에 한정되지 않고, 웨스턴 블롯팅, 도트 블롯팅, FACS 분석 등도 또한 사용될 수 있음을 용이하게 이해할 것이다.
하나의 예시적 ELISA에서, 본 개시의 항체는 폴리스티렌 미세적정 플레이트 내의 웰 등의, 단백질 친화성을 나타내는 선택된 표면 상에 고정화된다. 이어서, 지카 바이러스 또는 지카 바이러스 항원을 함유하는 것으로 의심되는 시험 조성물을 웰에 첨가한다. 비특이적으로 결합된 면역 복합체를 제거하기 위한 결합 및 세척 후, 결합된 항원을 검출할 수 있다. 검출 가능한 표지에 연결된 또 다른 항-지카 바이러스 항체를 첨가함으로써 검출을 달성할 수 있다. 이러한 유형의 ELISA는 단순히 "샌드위치 ELISA"이다. 검출은 또한 제2 항-지카 바이러스 항체의 첨가, 이어서 제2 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 제3 항체의 첨가에 의해 달성할 수 있고, 제3 항체는 검출 가능한 표지에 연결된다.
또 다른 예시적 ELISA에서, 지카 바이러스 또는 지카 바이러스 항원을 함유하는 것으로 의심되는 샘플은 웰 표면에 고정시키고, 이어서 본 개시의 항-지카 바이러스 항체와 접촉시킨다. 비특이적으로 결합된 면역 복합체를 제거하기 위한 결합 및 세척 후, 결합된 항-지카 바이러스 항체가 검출된다. 초기 항-지카 바이러스 항체가 검출 가능한 표지에 연결되어 있는 경우, 면역 복합체를 직접 검출할 수 있다. 이 경우에도, 면역 복합체는 제1 항-지카 바이러스 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 제2 항체를 사용하여 검출할 수 있고, 제2 항체는 검출 가능한 표지에 연결되어 있다.
사용된 포맷에 관계없이, ELISA는 코팅, 인큐베이팅 및 결합, 비특이적으로 결합된 종을 제거하기 위한 세척, 결합된 면역 복합체 검출 등의 공통의 특정 기능을 갖고 있다. 이들은 이하에 설명되어 있다.
플레이트를 항원 또는 항체로 코팅하는 경우, 일반적으로, 플레이트의 웰을 항원 또는 항체 용액과 함께 밤새 또는 지정된 시간 동안 인큐베이팅한다. 이어서, 플레이트의 웰을 세척하여, 불완전하게 흡착된 물질을 제거한다. 웰의 임의의 잔류하는 이용 가능한 표면은 시험 항혈청과 관련하여 항원적으로 중성인 비특이적 단백질로 "코팅"된다. 이들에는 소 혈청 알부민(BSA), 카제인 또는 분유 용액이 포함된다. 코팅은 고정화 표면 상의 비특이적 흡착 부위의 차단을 가능하게 하고, 따라서 표면에 대한 항혈청의 비특이적 결합에 의해 유발되는 배경을 감소시킨다.
ELISA에서는, 직접 절차보다 2차 또는 3차 검출 수단을 사용하는 것이 더 일반적이다. 따라서, 단백질 또는 항체를 웰에 결합하고, 비반응성 물질로 코팅하여 배경을 감소시키고, 세척하여 비결합 물질을 제거한 후, 고정화 표면은 면역 복합체(항원/항체) 형성을 가능하게 하기에 효과적인 조건하에서 시험되는 생물학적 샘플과 접촉시킨다. 이어서, 면역 복합체의 검출에는 표지된 2차 결합 리간드 또는 항체, 및 표지된 3차 항체 또는 3차 결합 리간드와 조합하여 2차 결합 리간드 또는 항체가 필요하다.
"면역 복합체(항원/항체) 형성을 가능하게 하기에 효과적인 조건하에서"는 조건이 바람직하게는 BSA, 소 감마 글로불린(BGG) 또는 인산염 완충 생리식염수(PBS)/트윈 등의 용액으로 항원 및/또는 항체를 희석하는 것을 포함하는 것을 의미한다. 이러한 첨가된 약제는 또한 비특이적 배경의 감소를 지원하는 경향이 있다.
"적합한" 조건은 또한, 인큐베이션이 효과적 결합을 가능하게 하기에 충분한 온도 또는 기간 동안 진행되는 것을 의미한다. 인큐베이션 단계는 통상 약 1~2~4시간 정도, 바람직하게는 25℃~27℃ 정도의 온도에서 또는 약 4℃ 정도에서 밤새 수행할 수 있다.
ELISA의 모든 인큐베이션 단계 후에, 접촉된 표면을 세척하여, 복합체를 형성하지 않는 물질을 제거한다. 바람직한 세척 절차에는 PBS/트윈(Tween) 또는 보레이트 완충액 등의 용액으로 세척하는 것이 포함된다. 시험 샘플과 최초 결합된 물질 사이에 특정 면역 복합체의 형성 및 후속 세척 후, 미량의 면역 복합체의 발생이 결정될 수 있다.
검출 수단을 제공하기 위해, 제2 또는 제3 항체는 검출을 가능하게 하는 연관 표지를 가질 것이다. 바람직하게는, 이것은 적절한 발색성 기질과 함께 인큐베이션할 때에 발색을 생성하는 효소일 것이다. 따라서, 예를 들면, 추가 면역 복합체 형성의 발달에 유리한 조건하에서 소정 기간 동안 제1 및 제2 면역 복합체를 우레아제, 글루코스 옥시다제, 알칼린 포스파타제 또는 과산화수소-접합된 항체와 접촉시키거나 배양하기를 원할 것이다(예: PBS-트윈 등의 PBS 함유 용액에서 실온에서 2시간 동안 인큐베이션).
표지된 항체와 함께 인큐베이션한 후 및 비결합된 물질을 제거하기 위한 세척 후, 예를 들면, 우레아, 브로모크레졸 퍼플 또는 2,2'-아지노-디-(3-에틸-벤즈티아졸린-6-설폰산(ABTS), 또는 효소 표지로서의 퍼옥시다제의 경우에 H2O2 등의 발색 기질과의 인큐베이션에 의해 표지의 양을 정량화한다. 이어서, 예를 들면, 가시 스펙트럼 분광광도계를 사용하여, 생성된 색상 정도를 측정함으로써 정량화를 달성한다.
다른 실시양태에서, 본 개시는 경쟁 포맷의 사용을 고려한다. 이것은 샘플 중의 지카 바이러스 항체의 검출에 특히 유용하다. 경쟁-기반 검정에서, 미지의 양의 분석물 또는 항체는 공지된 양의 표지된 항체 또는 분석물을 치환하는 능력에 의해 결정된다. 따라서, 신호의 정량화 가능한 손실은 샘플 중의 미지의 항체 또는 분석물의 양을 나타낸다.
여기에서, 본 발명자는, 샘플 중의 지카 바이러스 항체의 양을 결정하기 위해, 표지된 지카 바이러스 모노클로날 항체의 사용을 제안한다. 기본 포맷에는 공지된 양의 지카 바이러스 모노클로날 항체(검출 가능한 표지에 연결됨)를 지카 바이러스 항원 또는 입자와 접촉시키는 것이 포함된다. 지카 바이러스 항원 또는 생물은 바람직하게는 지지체에 부착된다. 표지된 모노클로날 항체를 지지체에 결합시킨 후, 샘플을 첨가하고, 샘플 중의 임의의 비표지된 항체가 표지된 모노클로날 항체와 경쟁하고, 따라서 치환할 수 있는 조건하에서 인큐베이팅한다. 소실된 표지 또는 잔류하는 표지를 측정함으로써(및 결합된 표지의 원래 양으로부터 이를 차감함으로써), 비표지된 항체의 양이 지지체에 결합되고, 따라서 샘플에 존재하는 항체의 양을 결정할 수 있다.
B. 웨스턴 블롯
웨스턴 블롯(또는 단백질 면역블롯)은 조직 균질물 또는 추출물의 특정 샘플에서 특정 단백질을 검출하기 위해 사용되는 분석 기술이다. 이는 겔 전기영동을 사용하여, 폴리펩티드의 길이(변성 조건) 또는 단백질의 3D 구조(자연/비변성 조건)에 따라 자연 또는 변성된 단백질을 분리한다. 이어서, 단백질은 막(통상은 니트로셀룰로오스 또는 PVDF)으로 전사하고, 표적 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 프로빙(검출)된다.
샘플은 전체 조직 또는 세포 배양으로부터 채취할 수 있다. 대부분의 경우, 고형 조직은 먼저 블렌더(샘플 용적이 큰 경우), 균질화기(용적이 작은 경우)를 사용하거나, 또는 초음파처리를 사용하여 기계적으로 분해된다. 세포는 또한 상기 기계적 방법 중 하나에 의해 파괴되어 개방될 수 있다. 그러나, 박테리아, 바이러스 또는 환경 샘플이 단백질의 공급원이 될 수 있기 때문에, 웨스턴 블롯팅은 세포 연구에만 한정되지 않는 것에 주의해야 한다. 세포의 용해를 촉진하고, 단백질을 가용화하기 위해, 다양한 세정제, 염 및 완충액을 사용할 수 있다. 프로테아제 및 포스파타제 억제제는 자체 효소에 의한 샘플의 소화를 방지하기 위해 종종 첨가된다. 조직 준비는 단백질 변성을 회피하기 위해 저온에서 종종 수행된다.
샘플의 단백질은 겔 전기영동을 사용하여 분리된다. 단백질의 분리는 등전점(pI), 분자량, 전하 또는 이러한 요인의 조합에 의해 수행될 수 있다. 분리의 성질은 샘플의 처리와 겔의 성질에 따라 상이하다. 이것은 단백질을 결정하기 위한 매우 유용한 방법이다. 단일 샘플로부터 단백질을 2차원으로 확산시키는 2차원(2-D) 젤을 사용하는 것도 가능하다. 단백질은 1차원에서는 등전점(중성의 순전하를 갖는 pH)에 따라, 2차원에서는 분자량에 따라 분리된다.
단백질을 항체 검출에 이용할 수 있도록 하기 위해, 이들은 젤 내에서 니트로셀룰로오스 또는 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF)로 제조된 막 상으로 이동한다. 막을 젤 위에 놓고, 그 위에 여과지 스택을 놓는다. 전체 스택은 완충 용액에 위치하고, 이는 모세관 작용에 의해 종이 위로 이동하고, 단백질이 이와 함께 운반된다. 단백질을 전사하는 또 다른 방법은 전기블로팅(electroblotting)이라고 하고, 전류를 사용하여 단백질을 겔로부터 PVDF 또는 니트로셀룰로오스 막으로 끌어당긴다. 단백질은 겔 내에서 조직을 유지하면서 겔 내로부터 막으로 이동한다. 이 블로팅 프로세스의 결과, 단백질은 검출을 위해 얇은 표면층에 노출된다(이하 참조). 양쪽 종류의 막은 비특이적 단백질 결합 특성을 위해 선택된다(즉, 모든 단백질에 동등하게 충분히 결합함). 단백질 결합은 소수성 상호작용, 게다가 막과 단백질 사이의 하전 상호작용을 기반으로 한다. 니트로셀룰로오스 막은 PVDF보다 저렴하지만, 훨씬 더 취약하고, 반복되는 프로빙에 충분히 견디지 못한다. 겔로부터 막으로의 단백질 이동의 균일성과 전반적 효과는 쿠마시에 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 또는 폰세아우 에스(Ponceau S) 염료로 막을 염색하여 확인할 수 있다. 일단 전달되면, 단백질은 표지된 1차 항체 또는 비표지된 1차 항체를 사용하여 검출되고, 이어서 1차 항체의 Fc 영역에 결합하는 표지된 단백질 A 또는 2차 표지된 항체를 사용하여 간접적으로 검출된다.
C. 측면 유동 검정
측면 유동 면역크로마토그래피 검정이라고도 하는 측면 유동 검정은, 판독 장치에 의해 서포트되는 다수의 실험실 기반 적용이 존재하지만, 특수하고 고가의 장비 없이도 샘플(매트릭스) 중의 표적 분석물의 존재(또는 부재)를 검출하는 것을 목적으로 하는 간단한 장치이다. 통상, 이러한 시험은 가정 시험, 현장 진료 시험 또는 실험실 사용 중 어느 하나를 위해 낮은 자원의 의료 진단으로서 사용된다. 광범위하게 보급되고 공지된 적용은 가정 임신 시험이다.
이 기술은 다공성 페이퍼 또는 소결 폴리머 등의 일련의 모세관 베드를 기반으로 한다. 이 요소들 각각은 자발적으로 체액(예: 소변)을 수송하는 능력을 갖고 있다. 제1 요소(샘플 패드)는 스폰지 역할을 하고, 과량의 샘플 유체를 보유한다. 일단 침지하면, 유체는 제2 요소(접합체 패드)로 이동하고, 이 요소에는 제조업자가 소위 접합체라고 하는 건조된 포맷의 생리-활성 입자(이하 참조)를 염-당 매트릭스에 저장하고, 이 매트릭스는 표적 분자(예: 항원)와, 입자 표면에 고정된 이의 화학적 파트너(예: 항체) 사이의 최적화된 화학 반응을 보장하는 모든 것을 함유한다. 샘플 유체는 염-당 매트릭스를 용해하는 동안, 입자도 용해하고, 1개의 조합된 수송 작용으로 샘플과 접합체가 다공성 구조를 유동하면서 혼합된다. 이러한 방식으로, 분석물은 입자에 결합하고, 제3 모세관 베드를 통해 추가로 이동한다. 이 물질에는 제조업자에 의해 제3 분자가 고정된 하나 이상의 영역(종종 스트립이라 함)이 있다. 샘플-접합체 혼합물이 이러한 스트립에 도달할 때까지, 분석물은 입자에 결합하고, 제3 '포착' 분자가 복합체에 결합한다. 잠시 후, 점점 더 많은 액체가 스트립을 통과하면, 입자가 축적되고, 스트립-영역의 색상이 변화한다. 통상, 적어도 2개의 스트립이 있다: 하나는 임의의 입자를 포착하고, 이에 의해 반응 조건과 기술이 정상으로 작동한 것을 나타내고, 다른 하나는 특정 포착 분자를 포함하고, 분석물 분자가 고정된 입자만을 포착한다. 이러한 반응 존을 통과한 후, 유체는 최종적으로 다공성 재료인 심지(wick)로 진입하고, 이는 단순히 폐기물 용기로서 기능한다. 측면 유동 시험은 경쟁 검정 또는 샌드위치 검정으로 기능할 수 있다. 측면 유동 검정은 미국 특허 제6,485,982호에 개시되어 있다.
D. 면역조직화학
본 개시의 항체는 또한 면역조직화학(IHC)에 의한 연구를 위해 제조된 신선한-동결 및/또는 포르말린-고정된, 파라핀-포매된 조직 블록의 둘 모두와 함께 사용될 수 있다. 이러한 입자상 시료로부터 조직 블록을 제조하는 방법은 다양한 예후 인자에 대한 이전의 IHC 연구에서 성공적으로 사용되었고, 당해 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있다[참조: Brown et al., 1990; Abbondanzo et al., 1990; Allred et al., 1990].
간단히 말하면, 동결 절편은, 작은 플라스틱 캡슐 중의 인산염 완충 생리식염수(PBS)에서 실온에서 50ng의 동결된 "분쇄된" 조직을 재수화하고; 원심분리에 의해 입자를 펠릿화하고; 이들을 점성 포매 매질(OCT)에 재현탁시키고; 캡슐을 반전시키고/시키거나 원심분리에 의해 다시 펠릿화하고; -70℃ 이소펜탄에서 급속 동결시키고; 플라스틱 캡슐을 절단하고/하거나 조직의 동결된 실린더를 제거하고; 크리오스탯 마이크로톰 척에 조직 실린더를 고정하고/하거나; 캡슐로부터 25-50개의 연속 절편을 절단함으로써 제조할 수 있다. 또는, 냉동 조직 샘플 전체를 연속 절편 절단에 사용할 수 있다.
영구 절편은 플라스틱 마이크로퓨지 튜브에서 50mg 샘플의 재수화; 펠릿화; 10% 포르말린에 재현탁하여 4시간 고정; 세척/펠릿화; 따뜻한 2.5% 한천에 재현탁; 펠릿화; 한천을 고화하기 위해 빙수에서 냉각; 튜브로부터 조직/한천 블록의 제거; 파라핀에 블록의 침투 및/또는 매립; 및/또는 최대 50개의 연속 영구 절편의 절단을 포함하는 유사한 방법으로 제조할 수 있다. 이 경우에도, 전체 조직 샘플을 대용할 수 있다.
E. 면역검출 키트
또 다른 실시양태에서, 본 개시는 상기 기재된 면역검출 방법과 함께 사용하기 위한 면역검출 키트에 관한 것이다. 항체는 지카 바이러스 또는 지카 바이러스 항원을 검출하기 위해 사용될 수 있기 때문에, 항체는 키트에 포함될 수 있다. 따라서, 면역검출 키트는 적절한 용기 수단에서 지카 바이러스 또는 지카 바이러스 항원에 결합하는 제1 항체, 및 임의로 면역검출 시약을 포함할 것이다.
특정 실시양태에서, 지카 바이러스 항체는 컬럼 매트릭스 및/또는 미세역가 플레이트의 웰 등의 고체 지지체에 사전에 결합될 수 있다. 키트의 면역검출 시약은, 소정 항체와 연관되거나 또는 연결된 검출가능한 표지를 포함하여 다양한 형태 중 어느 하나를 취할 수 있다. 2차 결합 리간드와 연관되거나 또는 부착된 검출가능한 표지가 또한 고려된다. 예시적 2차 리간드는 1차 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 2차 항체이다.
본 키트에 사용하기 위한 추가의 적합한 면역검출 시약에는 1차 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 2차 항체, 및 2차 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 3차 항체를 포함하는 2-성분 시약이 포함되고, 제3 항체는 검출 가능한 표지에 연결된다. 상기 언급된 바와 같이, 다수의 예시적 표지가 당해 기술분야에 공지되어 있고, 이러한 모든 표지를 본 개시와 관련하여 사용할 수 있다.
키트는, 검출 검정을 위한 표준 곡선을 작성하기 위해 사용될 수 있는 바와 같이, 표지되었든 비표지되었든, 지카 바이러스 또는 지카 바이러스 항원의 적절하게 분취된 조성물을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 완전히 접합된 형태로, 중간체 형태로, 또는 키트의 사용자에 의해 접합되는 별개의 모이어티로서 항체-표지 접합체를 포함할 수 있다. 키트의 구성요소는 수성 매질 또는 동결건조된 형태로 패키징될 수 있다.
키트의 용기 수단은, 일반적으로, 항체가 위치시킬 수 있거나, 또는 바람직하게는 적절하게 분취할 수 있는, 적어도 하나의 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 시린지 또는 기타 용기 수단을 포함한다. 본 개시의 키트는 또한, 전형적으로는, 상업적 판매를 위해 긴밀하게 밀폐하여 항체, 항원, 및 임의의 다른 시약 용기를 함유하는 수단을 포함할 것이다. 이러한 용기는 목적하는 바이알이 유지되는 주사 또는 취입 성형 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.
F. 백신 및 항원 품질 관리 검정
본 개시는 또한, 샘플 중의 바이러스 항원의 항원 완전성을 평가할 때에 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 및 항체 단편의 사용을 고려한다. 백신과 같은 생물학적 의약품은 통상 분자적으로 특성화될 수 없다는 점에서 화학 약품과는 상이하고; 항체는 상당히 복잡한 큰 분자이고, 각 준비에 광범위하게 상이한 능력을 갖고 있다. 이들은 또한 인생 초기의 어린이를 포함하여 건강한 개인에게 투여되고, 따라서 생명을 위협하는 질환의 예방 또는 치료에 있어서, 그 자체가 상해를 유발하지 않고서 효과적이라는 것을 가능한 한 보장하기 위해 이들의 품질에 강력한 중점을 두어야 한다.
백신 생산 및 유통에서 글로벌화의 증가는, 공중 위생상의 개념을 더 적절하게 관리할 수 있는 새로운 가능성을 열었지만, 다양한 공급원에서 조달된 백신의 동등성과 호환성에 대한 의문도 제기되었다. 따라서, 출발 물질, 생산 및 품질 관리 시험의 국제 표준화, 및 이러한 제품의 제조 및 사용 방식에 대한 규제 감독에 대한 높은 기대의 설정은 지속적 성공을 위한 초석이었다. 그러나, 이는 끊임없이 변화하는 분야로 남아 있고, 이 분야의 지속적 기술 발전은 가장 오래된 공중 위생의 위협, 및 새로운 위협(말라리아, 팬데믹 인플루엔자, HIV 등)에 대한 강력한 신규 무기의 개발 약속을 제공하지만, 또한 제조업체, 규제 당국 및 광범위한 의료 커뮤니티에 큰 압력을 가하여, 제품이 달성 가능한 최고 수준의 품질을 지속적으로 충족하도록 한다.
따라서, 임의의 공급원으로부터 또는 제조 프로세스 중의 임의의 시점에서 항원 또는 백신을 수득할 수 있다. 따라서, 품질 관리 프로세스는 바이러스 항원에 대한 본 명세서에 개시된 항체 또는 단편의 결합을 동정하는 면역검정용의 샘플을 제조하는 것으로 개시할 수 있다. 이러한 면역검정은 이 문서의 다른 장소에 개시되어 있고, 이들 중 어느 것을 사용하여, 항원의 구조적/항원 완전성을 평가할 수 있다. 허용 가능한 양의 항원적으로 정확하고 무손상 항원을 포함하는 샘플을 발견하기 위한 표준은 규제 당국에 의해 확립할 수 있다.
항원 완전성이 평가되는 또 다른 중요한 실시양태는 저장 수명 및 저장 안정성을 결정하는 것이다. 백신을 포함한 대부분의 의약품은 시간이 경과함에 따라 열화할 수 있다. 따라서, 시간이 경과함에 따라, 대상체에게 투여될 때 더 이상 항원성이 아니고/아니거나 면역 반응을 생성할 수 있도록, 백신 등의 항원이 분해 또는 불안정화하는 정도를 결정하는 것이 중요하다. 이 경우에도, 허용 가능한 양의 항원적으로 무손상 항원을 포함하는 샘플을 발견하기 위한 기준은 규제 당국에 의해 확립될 수 있다.
특정 실시양태에서, 바이러스 항원은 하나 이상의 보호 에피토프를 함유할 수 있다. 이러한 경우, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 항체 등의 하나 이상의 항체의 결합을 조사하는 검정을 사용하는 것이 유용할 수 있다. 이러한 항체는 밀접하게 관련된 에피토프에 결합하여, 서로 인접하거나 심지어 중첩된다. 한편, 이들은 항원의 상이한 부분으로부터 별개의 에피토프를 나타낼 수 있다. 복수의 에피토프의 완전성을 조사함으로써, 항원의 전체적 완전성에 대한 보다 완전한 전체상, 및 따라서 보호 면역 반응을 생성하는 능력을 결정할 수 있다.
본 개시에 기재된 바와 같은 항체 및 이의 단편은 또한 보호적 지카 바이러스 항체의 존재를 검출함으로써 백신화 절차의 효능을 모니터링하기 위한 키트에서 사용될 수 있다. 본 개시에 기재된 바와 같은 항체, 항체 단편, 또는 이의 변이체 및 유도체는 또한 목적하는 면역원성을 갖는 백신 제조를 모니터링하기 위한 키트에서 사용될 수 있다.
VI. 실시예
하기 실시예는 바람직한 실시양태를 설명하기 위해 포함된다. 하기 실시예에 개시된 기술은 실시양태의 실시에서 충분히 기능하기 위해 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내고, 따라서 그 실시를 위한 바람직한 모드를 구성하는 것으로 간주될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해되어야 한다. 그러나, 당업자는, 본 개시에 비추어, 개시되는 특정 실시양태에서 다수의 변경을 수행할 수 있고, 그럼에도 개시의 정신 및 범위로부터 벗어나지 않고서 비슷한 또는 유사한 결과를 수득할 수 있음을 인식해야 한다.
실시예 1 - 메모리 B 세포의 선별 및 항체 유전자의 서열분석
인간 면역 공여자에서 지카 E2 특이적 메모리 B 세포의 빈도는 낮은 것으로 추정된다. 따라서, 본 발명자들은 먼저, 가장 높은 반응을 갖는 공여자를 특정하기 위해, 이전에 ZIKV 아시아 계통에 노출된 11명의 공여자 코호트로부터 PBMC에서 ZIKV에 대한 B 세포 반응을 평가했다. 강력한 ZIKV mAb를 동정하기 위해 이전에 사용되었던 항원인 아프리카 ZIKV 계통 가용성 재조합 E2 단백질을 사용하여, 본 발명자들은 11명의 공여자의 PBMC로부터 ZIKV-특이적 B 세포의 빈도를 열거했다. 간단히 설명하면, B 세포를 자기적으로 정제하고, 표현형 항체, 생존성 염료 및 비오틴화된 E2로 염색했다. 항원-표지된 클래스-스위칭 메모리 B 세포-E2 복합체(CD19+IgM-IgD-IgA-E2+DAPI-)는 형광 표지된 스트렙트아비딘으로 검출하고, 4색 유세포 분석 접근법을 사용하여 정량화했다(도 1A). 이 연구에 의해, E2-특이적 B 세포는 IgG 클래스 스위칭 메모리 B 세포의 0.4 내지 2.5% 범위의 빈도로 11명의 ZIKV-면역 공여자 중 7명의 PBMC에서 용이하게 검출되었음이 밝혀졌고(데이터는 제시되지 않음); ZIKV 비면역 PBMC의 배경 염색은 0.2%였다. ZIKV에 대해 가장 높은 B 세포 반응을 갖는 7명의 공여자를 특정한 후, 본 발명자들은 FACS를 사용하여, 이들 공여자의 풀링된 PBMC로부터 E2-특이적 메모리 B 세포를 단리했다. 비오틴화된 E2 항원에 의한 선별은 인간 중화 ZIKV mAb의 단리에 성공적으로 사용되었고; 그러나, 본 발명자들은, 이들 항원성 부위가 단백질에 결합하는 비오틴의 화학적 성질에 의해 변화하는 경우, 이 접근법은 일부 특이성을 갖는 mAb의 동정을 간과할 수 있다고 생각했다. 에피토프 특이성에 대한 본 발명자들의 mAb 패널의 다양성을 증가시키기 위해, 이들은 2개의 표지 접근법(도 1B)을 사용하고, 또한 상이한 E2-특이적 B 세포 게이팅 전략을 적용하고, 그 결과, mAb의 3개의 독립적 서브-패널이 생성되었다. 제1 표지화 접근법에는 비오틴화된 E2에 의한 선별이 포함되었다(서브-패널 1). 제2 표지화 접근법에는, 융합 루프(FL)-특이적 mAb인 B 세포의 서브세트가 특정되었고, 이는 ZIKV에 대한 반응에서 우세하지만, 통상은 바이러스의 중화가 불충분하다. 본 발명자들은 이전에 동정된 FL-특이적 mAb ZIKV-88의 경쟁 결합을 사용하여, 이러한 클론을 동정한다. 본 발명자들은 무손상 E2로 표지하고, 이어서 새로운 ZIKV, 이어서 ZIKV-88을 적용했다. 새로운 mAb가 ZIKV-88 결합을 차단한 경우, 이러한 FL-특이적 B 세포는 패널로부터 제거되었다. 패널을 추가로 다양화하기 위해, 본 발명자들은 모든 표지된 B 세포(서브-패널 2에서와 같이) 및 고친화성 B 세포의 특정 서브세트(높은 E2 표지 클론, 서브-패널 3)을 별도로 선별했다. 전반적으로, > 5 × 108 PBMC로부터 > 5,000 E2-특이적 B 세포가 선별되고, 추가 분석을 수행했다.
페어링된 중쇄 및 경쇄 항체 서열을 구제하기 위해, 본 발명자들은 상업용 단일 세포 유전자 발현 자동화 시스템(10× Genomics Chromium 서열분석 기술)을 사용했다. 이 서열분석 접근법은, 쇄 페어링 외에도, 중쇄 서브클래스/아이소타입의 동정 및 프레임워크 1 및 4 영역의 정확한 서열분석을 가능하게 하기 때문에, 다른 기존의 mAb 유전자 구제 방법보다 이점이 있다. 이 플랫폼의 또 다른 바람직한 기능은 전례 없는 규모의 페어링된 항체 분석이고, 단일 실험당 최대 100,000개의 개별 세포/mAb 서열을 사용한다. 또한, 각각의 mAb 서열은 고유한 분자 식별자를 갖기 때문에, 라이브러리를 생성할 필요 없이 개별적으로 발현 및 시험할 수 있다. 또한, 이 기능에 의해, 목적하는 mAb를 동정하기 위해 반복적 선택 서열분석을 수행할 필요가 없다. 다른 바이러스 표적(미공개 데이터)을 사용한 본 발명자들의 이전 연구는 항체 가변 유전자 서열의 비교적 낮은 회수율(약 10%)을 나타냈고, 이는 메모리 B 세포 중의 낮은 수준의 IgG mRNA 및 단일 세포 증폭의 도전적 성질에 기인한다. 이 연구에서, 본 발명자들은 서열분석을 위해 선별된 B 세포를 제조하기 위한 2개 방법을 평가했다. 유세포 분석 선별 직후에, 대략 800개의 선별된 세포가 직접 서열분석되었다(서브-패널 3). 나머지 세포는 인간 CD40L, IL-21 및 BAFF를 발현하도록 조작된 조사된 3T3 피더 세포(도 1C)의 존재하에 8일 동안 배양물에서 벌크-확장되었다. 확장된 림프모구성 세포주(LCL)는, 배양 상청액으로부터의 ELISA에 의해 확인된 바와 같이, 높은 수준의 E2-특이적 mAb를 분비하고, 입력 세포와 비교하여 적어도 10배 더 많은 세포 수를 나타냈다(데이터는 제시되지 않음). 이어서, 확장된 LCL은 10× Genomics의 기술을 사용하여 서열분석되었다.
생물정보학 시빙을 사용하여, 본 발명자들은 가능한 서열의 전체 풀을 다운-선택하여, 추가 연구를 위해 단지 598 쌍의 서열을 선택했다(도 1D). 다운-선택은 2단계로 수행했다. 제1 단계에서, 단일 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 수득된 모든 쌍의 중쇄 및 경쇄 뉴클레오티드 서열은 본 발명자의 PyIR 도구(github.com/crowelab/PyIR)를 사용하여 처리되었다. 정지 코돈을 포함하지 않고 무손상 CDR3을 갖고 생산적 접합 영역을 포함하는 모든 중쇄 및 경쇄 쌍은 생산적인 것으로 간주되었고, 추가 하류 처리를 위해 보유되었다.
처리의 제2 단계는 모든 중쇄 뉴클레오티드 서열이 V3J 클론형[PMID: 30760926](CDR3에서 공통의 추정 VH 및 JH 유전자와 동일한 아미노산을 공유하는 클론)으로 감소했다. 이 단계는 먼저 샘플 A, B 및 C 사이에 공유되는 모든 중쇄 V3J 클론형을 결정함으로써 달성되었다. 이어서, 각 중쇄 V3J 클론형과 관련된 체세포 변이체는 순위 부여되었고, 가장 돌연변이된 중쇄 서열만이 하류의 발현 및 특성화를 위해 유지되었다. IgG 아이소타입이 아닌 모든 체세포 변이체(Chromium Cell Ranger 분석 파이프라인에 의한 서열 및 할당을 기반으로 함)는 고려로부터 제외되었다. 모든 중쇄 뉴클레오티드 서열이 번역되었고, 동일한 mAb의 발현을 회피하기 위해 중복 엔트리가 제거되었다.
이전의 ZIKV-특이적 mAb 발견의 노력에 의해, 도메인 III 특이적 항체에 대한 공개 클론형, 예를 들면, VH3-23*04/D3-10*01/JH4*02(중쇄) + VK1-5*03/J1*01(경쇄) 클론형의 mAb ZIKV-116[참조: Nature, 2016 Dec 15; 540(7633): 443-447) 및 이후 독립 공여자로부터 보고된 항체[참조: Cell, 2017 May 4; 169(4): 597-609. e11.]가 동정되었다. 수득된 새로운 항체 가변 유전자 서열을 인간 ZIKV mAb에 대해 이전에 보고된 것과 비교하여도, 공개 클론형의 임의의 구성원이 동정되지 않았다. 이러한 결과는 ZIKV mAb의 새로운 패널이 클론형의 독특한 컬렉션을 동정했음을 시사했다. 598개의 선택된 ZIKV mAb 후보 모두의 서열을 고처리량 cDNA 합성 플랫폼(Twist Bioscience)을 사용하여 합성하고, 포유동물 세포 배양 mAb 분비용의 IgG1 발현 벡터에 클로닝시켰다.
요약하면, 본 발명자들은, 전례 없는 속도, 규모 및 효율성으로 재조합 발현 및 기능적 검증을 위해 준비된 ZIKV 면역 공여자의 B 세포로부터 수백 개의 인간 mAb 서열을 수득했다. 데이터는, 바이러스 항원을 사용할 수 있는 경우에, 커스텀화된 표적-특이적 B 세포 선택 및 대규모 인간 항체 발견을 위한 발명자의 능력을 입증했다.
실시예 2 - 고처리량 mAb 발현과 결합 및 중화 활성에 대한 스크리닝
mAb 패널을 특성화하고 생체내 보호 연구의 주요 후보를 동정하기 위해, 본 발명자들은 598개의 모든 ZIKV mAb 후보를 재조합으로 발현시켰다. 이들은 96웰 플레이트 포맷("마이크로 스케일"로 정의)에서 소량의 샘플(0.1 내지 1mL)로부터 mAb를 신속하게 생산 및 분석할 수 있는 몇몇 고처리량 기술을 채용 및 최적화했다. 예를 들면, 1,000개 이상의 개별 재조합 mAb는 플라스미드 DNA로부터 출발하여 5일 이내에 생성, 정제 및 정량화할 수 있다(도 2A, 좌측 패널) - 개별 mAb의 활성을 완전히 특성화하고 생체내에서 주요 후보를 동정하기에 충분한 정제된 단백질. 고처리량 방식으로 개별 mAb를 생산하기 위해, 본 발명자들은 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 배양물의 마이크로스케일 일시적 형질감염을 수행했다. iQue 스크리너 플러스(Screener Plus)(Intellicyt Corp) 유세포 분석기에 의한 고처리량 및 반자동 IgG 정량 분석은, 배양 상청액을 형질감염의 3일 후에 조기 평가한 경우, 패널에서 대부분의 mAb에 대해 검출 가능한 생산 수준(> 5 마이크로그램 mAb/mL CHO 배양)을 나타냈다(데이터는 제시되지 않음). 598개의 mAb 중 475개가 정상으로 발현되었고, 마이크로스케일 형식으로 친화도 정제되었다. 마이크로스케일의 형질감염된 CHO 배양물(형질감염당 1mL)로부터의 mAb 수율은 0.5마이크로그램(IgG 정량 검정에 대한 검출 한계)로부터 300g의 범위였고, 정제된 항체당 중앙값은 29g이었다(도 2A, 우측 패널). 이 결과는 정제된 mAb의 신속하게 분리하기 위한 마이크로스케일 방법의 높은 유용성을 나타낸다.
대형 패널 내에서 중화 mAb를 신속하게 동정하기 위해, 본 발명자들은 실시간 세포 분석(RTCA) 세포 임피던스 분석 및 xCelligence(Acea Biosciences) 분석기를 사용했다. RTCA는 바이러스 유발성 세포변성 효과(CPE)를 포함하여 세포 생리학의 동역학적 변화를 모니터링하는 마이크로전자 바이오센서 기술을 기반으로 한다(도 2B, 상부 및 중앙 패널). 하나의 xCelligence 유닛은 중간-처리량 CPE 동역학적 분석을 위한 능력을 갖고 있고; 최대 576개의 개별 mAb를 동시에 평가하고, 중화 활성에 대해 실시간 웰당 기반으로 모니터링할 수 있으며, 복수의 유닛을 사용할 수 있다(6 × 96 웰 E-플레이트 유닛)(도 3Ba-c). 비교의 병렬 연구로부터, 본 발명자들은 임피던스 기반 CPE 동역학 분석이 ZIKV에 대한 종래의 초점 감소 중화 시험(FRNT)와 유사하게 수행되는 것을 발견했다. 요약하면, 양쪽 검정에서 패널로부터 동일한 중화 mAb가 동정되었고, 중화 mAb는 각 검정에서 최대 억제 농도의 절반(IC50) 측정치로부터의 효능에 따라 유사하게 순위 부여되었다(데이터는 제시되지 않음). 그러나, xCelligence 플랫폼은 이의 속도에 기인하여 대규모 mAb 패널 분석에 명백한 이점을 제공했다 - 중화 활성의 초기 정성적 동정에는 24 내지 36시간(종래의 FRNT 검정에서는 5 내지 6일) 및 ZIKV mAb의 완전한 CPE 동태 및 IC50 값의 결정에서는 약 60시간. 예를 들면, 7일 사이에, 본 발명자들은 ZIKV에 대해 3회의 후속 mAb 시험을 수행했다. 이들에는 (1) 미정제된 CHO 배양 상청액으로부터 중화 mAb 활성을 동정하기 위한 초기 분석, (2) 2개 바이러스((1)에서 동정된 것들의 활성을 확인하고 중화 폭을 조사하기 위한 ZIKV Brazil 및 Dakar)에 대한 단일 농도의 각각의 정제된 mAb의 반복 분석, 및 (3) 용량-반응 곡선 분석을 사용하여 2개 바이러스에 대한 효능(추정 IC50 값)에 의해 동정된 중화 mAb의 순위 부여가 포함된다. H3N2 인플루엔자 바이러스 및 유사한 10× Genomics의 서열분석 접근법에 의해 형질모세포로부터 단리된 1,100 mAb의 더 큰 패널에 대한 본 발명자의 이전 연구는, 더 신속하게 복제하는 바이러스를 사용하여, 강력하게 중화하는 항체를 동정하고, 완전히 특성화하고, RTCA 분석을 사용하여 3일 이내에 이들의 효능에 따라 순위 부여할 수 있음을 나타냈다(미공표 및 데이터는 제시되지 않음).
598개의 마이크로-스케일 정제된 인간 mAb의 패널을 특성화하기 위해, 본 발명자들은 RTCA를 통한 이들의 중화 활성과 함께 ELISA를 통해 재조합 E2 항원에 대한 이들의 결합을 평가했다. 정제된 샘플로부터 단일 희석으로 시험한 경우, 약 15%(92/598)의 mAb가 E2에 강력하게 결합하고, 8%(48/598)의 mAb가 적어도 하나의 ZIKV 균주에 대해 중화 활성을 나타냈다(도 2C-D). 흥미롭게도, 14개의 강력하게 중화하는 mAb는 ELISA에 의해 재조합 E2 항원에 대한 검출 가능한 결합을 나타내지 않았고(2μg/mL의 mAb에서 OD450 nm <0.4), 패널로부터 총 106개의 ZIKV 특이적 mAb가 수득되었다(92개의 E2 반응성 플러스 14개의 E2-비반응성 중화). 이 발견은 플레이트에 결합된 E2 항원의 형태가 용액 중의 E2 항원의 형태와는 상이하다는 것을 시사하고, 이는 선별을 위한 B 세포 표지화 절차 중에 제시된 방식이다. 이 발견은 또한, 에볼라바이러스 당단백질 항원을 사용한 유사한 선별 전략을 사용한 본 발명자의 이전 데이터와 비교하는 경우, ZIKV 패널(약 15%)에서 E2-반응성 mAb의 관찰된 빈도가 비교적 낮다는 것을 설명할 수 있다(미발표 및 데이터는 제시되지 않음).
우리의 대상체들은 남아메리카에서 최근 발생하는 동안 아시아 균주 ZIKV에 감염되었다. 패널의 29개 mAb는 항원적으로 상동성(브라질 균주, 아시아 계통) 및 이종(다카르 균주, 아프리카 계통) 바이러스를 모두 중화했다(데이터는 제시되지 않음). 2개의 시험된 바이러스 중 적어도 하나를 완전히 중화시킨 20개의 mAb(단일 샘플 희석 패널 스크린으로부터 결정됨)는 생체내 보호 연구의 주요 후보로 간주되었고, 추가로 특성화되었다. 용량-반응 중화 곡선은 다카르 또는 브라질 바이러스 또는 양쪽 바이러스의 강력한 중화를 나타내고, RTCA 추정 IC50 값은 약 7 내지 1,100ng/mL 범위였다(도 2E). 3개의 가장 강력한 mAb(ZIKV-491, -350 및 -538)는 브라질 및 다카르를 100ng/mL 미만의 IC50 값으로 교차 중화했지만, 재조합 E2에 대해 상이한 결합을 나타냈다. ZIKV-350은 강력하게 결합하고, ZIKV-538은 약하게 결합하고, ZIKV-491의 결합은 시험된 최고 mAb 농도(10㎍/mL)에서 검출되지 않았다(도 3Aa-Bc). 본 발명자들의 이전 연구로부터 참조 ZIKV E2-특이적 인간 mAb ZIKV-117(이량체-이량체 인터페이스 인식), ZIKV-116(도메인 III) 및 ZIKV-88(FL)을 사용한 경쟁 결합 분석은 3개의 새롭게 동정된 중화 ZIKV-491, -350 및 -538이 비중첩하는 별개의 에피토프를 인식했음을 나타냈다. 이 결론은, 세포 표면-표시된 E2 항원의 알라닌 돌연변이 라이브러리에 대한 결합 분석으로부터의 에피토프 맵핑 데이터에 의해 뒷받침되고, 이는 ZIKV-491, -350 및 -538에 대한 3개의 상이한 에피토프를 보여주었다(도 3Ca-c). 주목하게는, 이들 mAb는 상이한 E2-항원 선별 전략으로부터 동정되었고, 여기서 ZIKV-491은 서브-패널 2로부터의 것이고, ZIKV-350 및 -538은 각각 서브-패널 1 또는 3으로부터의 것이었다. 이 발견은 항체 발견 워크플로에서 연구 설계의 중요성을 강조했고, 이는, 다양한 에피토프 특이성의 강력한 mAb를 동정하기 위해, B 세포 분리용의 몇몇 독립적 전략에 의존할 수 있고 상보적 특이성 및 활성을 갖는 치료 칵테일용의 mAb의 발견과도 높은 관련성을 갖는다.
본 발명자들은 항체의 4개의 상이한 그룹을 동정했다. 그룹 1 항체는 아마도 도메인 III에 결합하고, ZIKV-116과 경쟁하며, ELISA에 의해 재조합 E2에 강력하게 결합한다. ZIKV-350은 그룹 1 항체이다. 그룹 2 항체는 아마도 도메인 II이고, ZIKV-117과 경쟁하며, ELISA에 의해 재조합 E2에 강력하게 결합한다. ZIKV-207 및 ZIKV-604는 그룹 2 항체이다. 그룹 3 항체는 ZIKV-88(FL), ZIKV-116(DIII) 및 ZIKV-117(DII)을 포함하는 참조 mAb와 경쟁하지 않고, ELISA에 의해 재조합 E2에 강력하게 결합한다. ZIKV-538 및 ZIKV-578은 그룹 3 항체이다. 그룹 4 항체는 ELISA에 의해 재조합 E2에 약하게 결합하고, prM/E - 푸린을 공-발현하는 비고정된 세포에 결합하며, 4차 에피토프이다. ZIKV-491 및 ZIKV-233 항체는 그룹 4 항체이다.
요약하면, 이러한 데이터는 통합된 워크플로우에서 새롭게 개발된 검정의 높은 유용성을 입증하고, 생체내 연구를 위한 주요 후보를 동정하기 위해 재조합 인간 항체의 거대 패널의 신속한 생산 및 분석을 위한 본 발명자의 능력을 입증했다.
실시예 3 - 치사적 ZIKV 챌린지 마우스 모델에서 동정된 mAb의 보호 효능
이어서, 본 발명자들은 ZIKV에 대한 치사적 마우스 챌린지 모델을 사용하여 주요 후보로서 선택된 중화 mAb의 보호 능력을 결정했다. 예방적 치료를 위해, 4주령 C57Bl6/J(B6) 마우스 그룹(그룹당 n=5 내지 14마리 마우스)을 항-IFN-알파 수용체 항체 및 개별 ZIKV mAb로 -1일차에 복강내(i.p.) 치료했다. 관계없는 IgG1 아이소타입 mAb(인플루엔자 A 바이러스 혈구응집소에 특이적인 FLU-5J8)가 대조군으로서 사용되었다. 0일차에, 마우스에 1,000개의 초점 형성 단위(FFU)의 마우스 적응 ZIKV 다카르 바이러스(ZIKV-MA)를 피하(s.q.)로 챌린지하고, 21일간 생존을 모니터링했다. 고용량 예방(마우스당 약 70마이크로그램의 mAb, 이는 14g의 4주령 마우스의 경우 약 5mg/kg의 mAb 용량에 상당)은, 대조군과 비교한 경우, 5개의 시험된 mAb 중 3개의 mAb에 의해 사망으로부터 완전한 보호를 제공했고(ZIKV-233, -350 및 -491의 경우 p=0.049), p ≤0.05는 로그-순위 검정에 의해 유의한 것으로 간주되었다. MAb ZIKV-266은 부분적 보호를 제공했지만 유의한 보호를 제공하지 않았고, mAb ZIKV-32는 보호하지 못했다(도 4A). 고용량의 mAb 예방에 의한 완전한 보호를 전제로 하여, 본 발명자들은 이어서 저용량의 예방 접근법(마우스당 약 9마이크로그램의 mAb를 사용하고, 이는 약 14g의 4주령 마우스의 경우에 0.65mg/kg mAb의 용량에 상당)으로 10개 중화 mAb의 거대 패널을 시험했다(도 4A-D). mAb-매개 보호의 초기 시점 상관으로서, 본 발명자들은 실시간 정량적 PCR(RT-qPCR) 분석에 의해 각 치료 그룹의 개별 마우스로부터 혈장 바이러스 역가를 결정했다. 주목하게는, ZIKV mAb로 치료된 모든 그룹은, 혈장 1mL당 6.4 log10 게놈 당량(GEq)의 중앙 바이러스 부하를 갖는 모든 동물에서 높은 바이러스혈증을 발증한 대조군 mAb FLU-5J8 치료 그룹과 비교하는 경우, 혈장 역가가 2 dpi 유의하게 감소된 것을 나타냈다(바이러스 부하의 중앙값은 1mL당 3 내지 3.7 log10 게놈 당량(GEQ) 범위였다)(도 4B). 주목하게는, ZIKV mAb 치료 그룹의 다수 동물의 혈장에서는 바이러스가 검출되지 않았고(검출 한계 = 2.9 log10(GEQ/mL)), 이는 예방 설정에서 낮은 용량의 항체에 의한 바이러스혈증의 효율적인 억제를 시사한다. 혈장 중의 바이러스 부하 감소와 일치하여, 모든 마우스가 10 dpi(p ≤0.05는 로그-순위 검정에 의해 유의한 것으로 간주됨)까지 질환에 굴복한 mAb FLU-5J8 치료된 그룹과 비교하는 경우의 사망률의 저하 및/또는 지연에 의해 판단된 바와 같이, 시험된 모든 mAb는 질환에 대한 유의한 보호를 제공했다(도 4C). 10개의 시험된 교차 중화 mAb 중 3개(ZIKV-233, 266 및 491)는 완전한 보호를 제공했고(100%의 마우스가 생존함), 다른 2개의 교차 중화 mAb, ZIKV-350 및 ZIKV-538에 의한 보호는 부분적이지만, 각 그룹당 5 내지 13마리의 동물에 대한 연구로 추정된 바와 같이, 매우 유의적이었다(로그 순위 검정에 의해 p<0.001)(도 4C). 상기 결과는 ZIKV에 대한 새롭게 동정된 일부 mAb의 높은 수준의 예방 효능을 입증한다.
이들 클론에 대한 저용량 예방적 치료에 의한 높은 수준의 보호를 고려하여, 본 발명자들은 이어서, 1dpi로 마우스에게 제공된 저용량의 mAb(마우스당 약 9마이크로그램의 mAb, 14g 4주령 마우스의 경우 약 0.65mg/kg의 mAb 용량에 상당)를 사용함으로써 치료 효능을 시험했다. 이들은, ZIKV의 광범위하고 강력한 중화(브라질 및 다카르, 도 2E, 도 3Ba-c), E2의 명확한 비-중첩 에피토프의 인식(도 3Ca-c), 및 예방적 치료에 의한 높은 수준의 보호(도 4C)를 포함하는 이들의 특징 때문에 3개의 mAb ZIKV-350, -491 및 -538을 시험하기 위해 선택했다. 주목하게는, ZIKV-491 및 -538은 치료적 치료 설정에서 비교적 낮은 mAb 용량으로 완전한 보호를 제공했다(도 4D). 종합하면, 이러한 결과는 ZIKV에 대해 새롭게 동정된 중화 mAb의 높은 수준의 치료 효능을 입증하고, 레수스 마카크(비인간 영장류 - NHP) ZIKV 챌린지 모델에서 시험하기 위한 새로운 유망한 후보를 시사한다.
요약하면, 본 발명자들은 전례 없는 속도, 규모 및 효율로 ZIKV에 대한 다수의 강력한 중화 및 보호 인간 mAb를 동정했다(표 A; 도 5). 본 발명자들의 데이터는 공지된 바이러스 항원에 대한 강력한 항바이러스 인간 모노클로날 항체 치료제의 대규모 발견을 위한 로드맵을 제공했다.
[표 A]
ZIKV에 대해 급속하게 발견된 인간 mAb의 패널에 대한 결합, 중화, 및 보호 특성의 요약
Figure pct00001
· 도 4A 내지 4D에 도시된 바와 같이, 마우스에서 예방에 의해 사망으로부터 완전한 보호를 제공했다.
[표 B]
항체의 명명/지정에 대한 대응 차트
Figure pct00002
[표 1]
항체 가변 영역에 대한 뉴클레오티드 서열
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
[표 2]
항체 가변 영역의 단백질 서열
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
[표 3]
CDR 중쇄 서열
Figure pct00012
[표 4]
CDR 경쇄 서열
Figure pct00013
* * * * * * * * * * * * * * * * *
본 명세서에 개시 및 청구된 모든 조성물 및 방법은 본 개시에 비추어 과도한 실험 없이 제조 및 실행될 수 있다. 본 개시의 조성물 및 방법은 바람직한 실시양태의 관점에서 설명되었지만, 당해 기술분야의 당업자에게는 본 개시의 개념, 정신 및 범위로부터 벗어나지 않고서 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법, 및 방법의 단계 또는 단계의 순서에 변경을 적용할 수 있음이 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적으로 및 생리학적으로 관련된 특정 약제를 본 명세서에 기재된 약제 대신에 사용할 수 있지만, 동일하거나 유사한 결과를 달성한다는 것은 명백할 것이다. 당업자에게 자명한 이러한 모든 유사한 대체물 및 변형은 첨부된 청구범위에 의해 정의된 개시의 정신, 범위 및 개념의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
VII. 참조문헌
이하의 참조문헌은 이들이 본 명세서에 제시된 것들을 보완하는 예시적 절차 및 기타 상세를 제공하는 범위에서, 참조에 의해 본 명세서에 구체적으로 도입된다.
미국 특허 제3,817,837호
미국 특허 제3,850,752호
미국 특허 제3,939,350호
미국 특허 제3,996,345호
미국 특허 제4,196,265호
미국 특허 제4,275,149호
미국 특허 제4,277,437호
미국 특허 제4,366,241호
미국 특허 제4,472,509호
미국 특허 제4,554,101호
미국 특허 제4,680,338호
미국 특허 제4,816,567호
미국 특허 제4,867,973호
미국 특허 제4,938,948호
미국 특허 제5,021,236호
미국 특허 제5,141,648호
미국 특허 제5,196,066호
미국 특허 제5,563,250호
미국 특허 제5,565,332호
미국 특허 제5,856,456호
미국 특허 제5,880,270호
미국 특허 제6,485,982호
Figure pct00014
Figure pct00015
SEQUENCE LISTING <110> VANDERBILT UNIVERSITY <120> HUMAN ANTIBODIES THAT NEUTRALIZE ZIKA VIRUS AND METHODS OF USE THEREFOR <130> VBLT.P0299WO <140> Not Yet Assigned <141> 2020-11-09 <150> 62/937,603 <151> 2019-11-19 <160> 200 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 1 gaagtgcagt tgttggagtc ggggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcatgtgcag cctctggatt cacctttagc aactatggcg tgggctgggt ccgccaggct 120 ccaggttcgg gacttgaatg ggtctcatct attaacacgg ctggtgacag cacatactac 180 gccggctccg tgaagggccg cttcaccatc tccagagaca actccaagaa cacactattt 240 ctgcaaatga acagcctgag agacgaagac acggccgtat atttctgtgc gaaagatcgg 300 acgtcagggg gtttcgggga gttattcaaa cactggggac agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 2 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 2 gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggccagtca gagtattaat agctggttgg cctggtttca gcagaagcca 120 ggaaaagccc ctaaactcct gatccacaag gcgtcaagtt tagaaagtgg ggtcccattt 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcaacag cctgcagcct 240 gatgactttg caacttacta ctgccaacac tatcatagtt atccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 3 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 3 gaggtccaac tgttggagtc tgggggaggc ttggttctcc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agttatgaaa tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaggg ggctggagtg ggtttcacac attagtccta gtggtgttag caaagactat 180 tcagactctg tgaagggccg attcaccatc ttcagagaca acgccaagga ctcattgtat 240 ctacaaatga acggcctgag agccgacgac acggctgttt attactgtgc gagagatcgg 300 tacgattttt ggagtggtga ccccatgggg tactttgact actggggcca gggaaccctg 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 4 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 4 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc aggcgagtca ggacattacc aactatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaaactcct gatctataag gcgtctagtt tagaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataatagag gttcgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 5 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 5 gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaggatc 60 tcctgtcaga gttttggata cacctttagc aactactgga tcacctgggt gcgccaggtg 120 cccggaaaag gcctggaatg gatggggaag attgatccta atgaccctta tatcaactac 180 agtccgccct tccgtgggca cgttatcatc tcagttgaca agtccatcaa gactgcctac 240 ttgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagagcgaca 300 tatagtagtt cgtatgacta ctggtacttc gatgtctggg gccgtggcac cctggtcact 360 gtctcctca 369 <210> 6 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 6 tcctatgtgc tgactcagcc accctcggtg tcagtggccc cacgacagac ggccaggatc 60 acctgtgggg gaaacaacat tggaagtaaa agtgtgcagt ggcaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg tgctggtcgt ctatgatgat agcgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaagccggg 240 gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gatgatagta gtgatcaatg ggtgttcggc 300 ggagggacca aggtgaccgt ccta 324 <210> 7 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 7 gaggtgcttt tggtggagtc tgggggaggc ctggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgaag cctctggatt ctcctttagt agatatgcca tgaactgggt ccgccaggcg 120 ccagggaagg gactggagtg ggtctcaacc attaccgttg atgggggcag cacatactac 180 gcaggctccg tgaggggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa caaactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccctat attactgtgc gaaagatcgg 300 ccctctctgg gggtcgggga gttatatgac tactggggtc agggaacgct ggtcaccgtc 360 tcttca 366 <210> 8 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 8 gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcgtctagtt tagaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt atccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 9 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 9 gaggtgcatc tcttggagtc tgggggaggc ttggtgaagt ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttacc acctatccca tgagctgggt ccgccgggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaact attagtaata gtggtggtga cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa catcctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccattt attactgtgc caaagatcac 300 ccacagtggc tgggatcgca tgagtggggc cagggagccc cggtcaccgt ctcctca 357 <210> 10 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 10 tcctatgtgc tgactcagcc accctcggtg tcagtggccc caggacagac ggccaggatt 60 acctgtgggg gaaacaacat tggaagaaca attgtgcact ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg tgctggtcgt ctacgatgat agcgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaagccggg 240 gatgaggccg acttttactg tcaggtgtgg gatagtactc gtgatcaata tgtcttcgga 300 actgggacca cggtcaccgt ccta 324 <210> 11 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 11 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcttgtgcag cctctggatt caccttcagt gactactaca tgagttggat ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagtggta ttagtagttt cacaaactac 180 gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagataga 300 aggctctata ccccctacta ccactactac atggacgtct ggggcaaagg gaccacggtc 360 accgtctcct ca 372 <210> 12 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 12 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 ttttgttctg gaagcagctc cagcatccga agtaatcctg taaactggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcattcat agtaatgatc agcggccctc aggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240 tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgaa tggtcgagtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 13 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 13 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactatggca ttcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagtaa taaatactat 180 gccgactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attcccagaa cactctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag acctgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaagattcg 300 gcggggaggc ggtggcagca gctctcggca ggtatctggg gccaagggac aatggtcacc 360 gtctcttca 369 <210> 14 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 14 gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg catagtaatg gatacaactt tttggattgg 120 tacctgcaga agccggggca gtctccacag ctcctcatct atttgggttc ttatcgggcc 180 tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaactccg 300 tggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaa 336 <210> 15 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 15 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaaac ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgtag cctctggatt cacctttagt ggctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctagagtg ggtctcagct attagtggta gtggtgatag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgttt 240 ttgcaaatga acagcctgag aggcgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagtaatt 300 gaccagtggc ttggatttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357 <210> 16 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 16 tcctatgtgc tgactcagcc accctcggtg tcagtggccc caggacagac ggccaggatt 60 acctgtgggg gaaacaacat tggaaggata actgtgcact ggtaccagca gaaggcaggc 120 caggcccctg tgctggtcgt ctatgatgat agcgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaagccggg 240 gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gatagtagta gtgatcagtg ggtgttcggc 300 ggagggacca agctgaccgt ccta 324 <210> 17 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 17 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc cagggcggtc cctgagactc 60 tcctgttcag cttctggatt cagctttggt gattatgcta tgagctggtt ccgccaggct 120 ccagggaagg gactggagtg ggtaggtatc attagaagca aagcttttgg tgggacaaca 180 gaatacgccg cgtctgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc caaaagcatc 240 gcctatctgc aaatgaacag cctgaaaatc gaggacacag ccgtgtatta ctgtactaga 300 gacttcaacg atttttggac tggtcaccac cccaactggt tcgacccctg gggccaggga 360 accctggtca ccgtctcctc a 381 <210> 18 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 18 gacatccaga tgacccaggc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc aactatttaa attggtatca gcagaaaaca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta tccctcgaac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 19 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 19 gaggtgcggc tggtgcaatc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc actgagactc 60 tcctgtgtaa cctctggatt ctcctttacc agccatgcga tgagttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatct cttgcttttg atggtgatag cacatactac 180 gcagactctg tgaagggccg cttcaccatc tccagagaca gttccacgaa cactctctac 240 cttcaaatga ggagcctgag aggcgaggac acggccattt attactgtgc gaaagatcgt 300 gttgtccgcg gggtcgggga gaaccttgac cactggggcc cgggaacgct ggtcaccgtc 360 tcttca 366 <210> 20 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 20 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcgt ctgtcggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcgagtca gggtattagc gattatttag cctggtatca gcagaagcca 120 ggcagagttc ctatactcct gatctataga gcatccactt tgcaatcggg ggtcccgtcc 180 cggttccgtg gcagtggttc tggcacagat ttcactctca ccatcaccgg cctgcagcct 240 gaagatgttg gaacttatta ctgtcagaag tataacagtg tcccgtggac gttcggccca 300 gggaccaagg tgaccgtcct a 321 <210> 21 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 21 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aactatggca tacactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg gctggcaatt atttcatatg atggaagtac taaatattat 180 gcagactccg tgaagggccg aatcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag acctgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaagagaga 300 gagtgggagg tacgggacgg aggttttgac tactggggcc agggagccct ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 22 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 22 tcctatgtgc tgactcagcc accctcggtg tcagtggccc caggacagac ggccaggatt 60 acctgtgggg gaaacaacat tggaagtaaa agtgtgcact ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg cgctggtcgt ctatgatgat agcgcccggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcaccagggt cgaagccggg 240 gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg catagtaata ctgatcatgt ggtattcggc 300 ggagggacca agctgaccgt ccta 324 <210> 23 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 23 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctgggtt cagtttcagt gactctgcta tgcactgggt ccgccaggct 120 tccgggaaag ggctggagtg ggttggccgt attagaggca aggctaacga ttacgcgaca 180 gcatatgatg cgtcggtgaa aggcaggttc accatctcca gagatgattc aaagaacacg 240 gcgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacgg ccgtctatta ttgtattaga 300 caggggggtt actatgagag tagcgagttt gactactggg gccggggaac cctggtcacc 360 gtctcctca 369 <210> 24 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 24 cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg atgtccactg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatggtaaca acaatcggcc ctcaggggtc 180 cctggccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgagg atgaggctga ttatttctgc cagtcctatg acagcagcct gactgtccat 300 gtggtattcg gcggagggac caagctgacc gtccta 336 <210> 25 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 25 gacgtgcagc tggtggagtc tgggggtggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctgggtt caccgccaga accaactaca tgacctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt atttatagcg gtggtagcac aatctacgca 180 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaactc actgtatctg 240 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agatcgaggg 300 tatcttgacc actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca 345 <210> 26 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 26 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttacc aactacttcg cctggtacca acagagacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gtatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcaacag cgtagcaact ggccgtacac ttttggccag 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 27 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 27 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgcgcag cctctggatt caccttcagt agctacgaca tgcactgggt ccgccaagct 120 acaggaaaag gtctggagtg ggtctcaggt attggtactg ctgatgacac atactatcca 180 ggctccgtga agggccgatt cagcatctcc agagagaatg ccaagcatct cttgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc cggagacacg gctgtctatt actgtgcaag agtggcgcac 300 cattccgagt accacctgtt atatatgcct cacggtatgg acgtctgggg ccaagggacc 360 acggtcaccg tctcctca 378 <210> 28 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 28 cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60 tcctgcactg gaaccagcag tgatgttggg agttataatt ttgtctcctg gtaccgacag 120 cacccaggca aagcccccaa actgatgatt tatgagggca gtaagcggcc ctcaggggtt 180 tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgacaat ctctgggctc 240 caggctgagg acgaggctga ttattactgc tgctcatata cagataatag tccttatgtg 300 ctgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333 <210> 29 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 29 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttatc agatatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagat attagtggta gtggtggtag tacattctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtct attactgtgc gagagatgac 300 gagggttata ccaccaactg gtacgatgct tatgatatct ggggccaagg gacaatggtc 360 accgtctctt ca 372 <210> 30 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 30 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattggc agctatttaa attggtatca gcagagacca 120 gggaaggccc ctaaactcct gatctatact gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcattctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag aattacaata tccctcaggt cactttcggc 300 cctgggacca aagtggatat caaa 324 <210> 31 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 31 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ttggtacagc cgggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggttt cacctttagc atctatgcca tgagctgggt ccgtcaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctctgca attactcatg actctggaag cacatattac 180 gcaaactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacggtgtat 240 ttgcagatga accgcctgag agccgaggac acggccacat attattgtgc gaaagatcgg 300 ccctctcggg gggtcgggga attatatgac tattggggcc agggtgcgct ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 32 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 32 gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggccagtca gagtattagt tcctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct catcaatacg gcgtctaaat tagaaactgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtgcatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gatgattttg caacttatta ctgccaacaa tatcttagtt atccgtggac attcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 33 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 33 caggtgcaac tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acatgcactg tctctggtgg ctccctcagt aataaatact ggagttggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca ctgggaccac caactacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccatatca gttgacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgaact ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtctatt actgtgcgag agattgcgcc 300 agtggctggg acggatgtga cttctggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357 <210> 34 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 34 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccgtc 60 tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga agtaatactg taaactggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatccac agtactaatc agcggccctc aggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240 tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgaa tggttatgtc 300 ttcggaactg ggaccaaggt caccgtccta 330 <210> 35 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 35 caggtgcagc tggtggaggc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagagtc 60 tcctgtgcag cctctggatt taccttcagt agttatgcta tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg gatgggaatt atatcatatg aaggaagtaa caaatattac 180 tcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtat attactgtgt gagagatcgg 300 aaagtggctg gacaaatgat ccgccacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360 accgtctcct ca 372 <210> 36 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 36 cagactgtgg tgacccagga gccatcgttc tcagtgtccc ctggagggac agtcacactc 60 acttgtggct tgagctctgg ctcagtctct actaattact acccctgctg gtaccagcag 120 accccaggcc aggctccacg cacgctcatc tacaacacaa acactcgctc ttctggggtc 180 cctgatcgct tctctggctc catccttggg aacaaagctg ccctcaccat cacgggggcc 240 caggcagatg atgaatctga ttattactgt acgctatata tgggtagtgg catttcggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 37 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 37 caggtgcggc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcact aactatgcca tgaactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg gcctggagtg ggtgacaatt atatggtatg atgggattac tatatactat 180 gctgactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacggtgtat 240 ctgcaaatga gcagtctgag agccgaggac acggctatgt attactgtgc gagagtaggg 300 gttcggggag ccgatgatgc ttttgatatt tggggccaag ggacaatggt caccgtctct 360 tca 363 <210> 38 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 38 tcctatgtgc tgactcagcc accctcggtg tcagtggccc caggacagac ggccaggatt 60 acctgtgggg gacacaacat tggaaataaa aatctccact ggtaccaaca gaagccaggc 120 caggcccctg tgctggtcgt ctatgatgat agcgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaagccggg 240 gatgaggccg actattattg tcaggtgtgg gatagtaata gtgatcatgg ggtgttcggc 300 ggagggacca agctgaccgt ccta 324 <210> 39 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 39 gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120 ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagtggga atggtcgtac tataggctat 180 gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag agttgaggac acggccttgt attactgtgc aaaaaccaag 300 gcgtacggtg acttccactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360 <210> 40 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 40 tcctatgtgc tgactcagcc accctcggtg tcagtggccc caggacagac ggccaggatt 60 acctgtgggg gaaacaacat tggaaataag gctgtgcact ggtaccagcg gaagccaggc 120 caggcccctg tgctggtcgt ctatgatgat agcgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaagccggg 240 gatgaggccg actattactg tcagttatgg gatactagta gtaatcccca tgtggtattc 300 ggcggaggga ccaaggtgac cgtccta 327 <210> 41 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 41 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Ser Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Asn Thr Ala Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Arg Thr Ser Gly Gly Phe Gly Glu Leu Phe Lys His Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 42 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 42 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 His Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Phe Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr His Ser Tyr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 43 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 43 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Leu Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser His Ile Ser Pro Ser Gly Val Ser Lys Asp Tyr Ser Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Phe Arg Asp Asn Ala Lys Asp Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Asp Pro Met Gly Tyr Phe 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 44 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 44 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Thr Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Gly Ser Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 45 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 45 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Gln Ser Phe Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Lys Ile Asp Pro Asn Asp Pro Tyr Ile Asn Tyr Ser Pro Pro Phe 50 55 60 Arg Gly His Val Ile Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile Lys Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Thr Tyr Ser Ser Ser Tyr Asp Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 46 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 46 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Arg Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val 20 25 30 Gln Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asp Ser Ser Asp Gln 85 90 95 Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 <210> 47 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 47 Glu Val Leu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Thr Val Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Lys Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Arg Pro Ser Leu Gly Val Gly Glu Leu Tyr Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 48 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 49 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 49 Glu Val His Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Pro Met Ser Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Asn Ser Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ile Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp His Pro Gln Trp Leu Gly Ser His Glu Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Ala Pro Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 50 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 50 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Arg Thr Ile Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Phe Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Thr Arg Asp Gln 85 90 95 Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Leu 100 105 <210> 51 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 51 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Gly Ile Ser Ser Phe Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Arg Leu Tyr Thr Pro Tyr Tyr His Tyr Tyr Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 52 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 52 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Phe Cys Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ile Arg Ser Asn 20 25 30 Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile His Ser Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 53 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 53 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Ser Ala Gly Arg Arg Trp Gln Gln Leu Ser Ala Gly Ile 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 54 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 54 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Phe Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Leu Gln Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 55 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 55 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Asn Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Gly Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Ile Asp Gln Trp Leu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 56 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 56 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Arg Ile Thr Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Gln 85 90 95 Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 57 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 57 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Ser Phe Gly Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Ile Ile Arg Ser Lys Ala Phe Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ile Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg Asp Phe Asn Asp Phe Trp Thr Gly His His Pro Asn 100 105 110 Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 58 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 58 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ala Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 59 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 59 Glu Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Ser Phe Thr Ser His 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Leu Ala Phe Asp Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ser Thr Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Arg Ser Leu Arg Gly Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Arg Val Val Arg Gly Val Gly Glu Asn Leu Asp His Trp 100 105 110 Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 60 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 60 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asp Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Val Pro Ile Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asn Ser Val Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val 100 <210> 61 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 61 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ala Ile Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Arg Glu Trp Glu Val Arg Asp Gly Gly Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 62 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 62 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ala Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Ala Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp His Ser Asn Thr Asp His 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 63 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 63 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Arg Gly Lys Ala Asn Asp Tyr Ala Thr Ala Tyr Asp Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ile Arg Gln Gly Gly Tyr Tyr Glu Ser Ser Glu Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 64 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 64 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95 Leu Thr Val His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 65 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 65 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ala Arg Thr Asn 20 25 30 Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Arg Gly Tyr Leu Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 66 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 66 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Asn Tyr 20 25 30 Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Val Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 67 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 67 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Gly Thr Ala Asp Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys His Leu Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Val Ala His His Ser Glu Tyr His Leu Leu Tyr Met Pro His Gly 100 105 110 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 68 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 68 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Tyr 20 25 30 Asn Phe Val Ser Trp Tyr Arg Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Glu Gly Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Thr Asp Asn 85 90 95 Ser Pro Tyr Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 69 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 69 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ile Arg Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Asp Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Asp Glu Gly Tyr Thr Thr Asn Trp Tyr Asp Ala Tyr Asp 100 105 110 Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 70 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 70 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Thr Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr Asn Ile Pro Gln 85 90 95 Val Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 71 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 71 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Thr His Asp Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Arg Pro Ser Arg Gly Val Gly Glu Leu Tyr Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 72 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 72 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Asn Thr Ala Ser Lys Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Ala Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 73 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 73 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Leu Ser Asn Lys 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Thr Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Cys Ala Ser Gly Trp Asp Gly Cys Asp Phe Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 74 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 74 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Val Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile His Ser Thr Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 75 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 75 Gln Val Gln Leu Val Glu Ala Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Ser Tyr Glu Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ser Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Asp Arg Lys Val Ala Gly Gln Met Ile Arg His Gly Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 76 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 76 Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Leu Ser Ser Gly Ser Val Ser Thr Asn 20 25 30 Tyr Tyr Pro Cys Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr 35 40 45 Leu Ile Tyr Asn Thr Asn Thr Arg Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Ala Asp Asp Glu Ser Asp Tyr Tyr Cys Thr Leu Tyr Met Gly Ser 85 90 95 Gly Ile Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 77 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 77 Gln Val Arg Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Thr Ile Ile Trp Tyr Asp Gly Ile Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gly Val Arg Gly Ala Asp Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 78 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 78 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Asn Lys Asn Leu 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Asn Ser Asp His 85 90 95 Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 79 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 79 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Gly Asn Gly Arg Thr Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Thr Lys Ala Tyr Gly Asp Phe His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 80 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 80 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Asn Lys Ala Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Leu Trp Asp Thr Ser Ser Asn Pro 85 90 95 His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 <210> 81 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 81 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly 1 5 <210> 82 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 82 Ile Asn Thr Ala Gly Asp Ser Thr 1 5 <210> 83 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 83 Ala Lys Asp Arg Thr Ser Gly Gly Phe Gly Glu Leu Phe Lys His 1 5 10 15 <210> 84 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 84 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Glu 1 5 <210> 85 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 85 Ile Ser Pro Ser Gly Val Ser Lys 1 5 <210> 86 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 86 Ala Arg Asp Arg Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Asp Pro Met Gly Tyr Phe 1 5 10 15 Asp Tyr <210> 87 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 87 Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr Trp 1 5 <210> 88 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 88 Ile Asp Pro Asn Asp Pro Tyr Ile 1 5 <210> 89 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 89 Ala Arg Ala Thr Tyr Ser Ser Ser Tyr Asp Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 15 <210> 90 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 90 Gly Phe Ser Phe Ser Arg Tyr Ala 1 5 <210> 91 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 91 Ile Thr Val Asp Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 92 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 92 Ala Lys Asp Arg Pro Ser Leu Gly Val Gly Glu Leu Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 93 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 93 Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr Pro 1 5 <210> 94 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 94 Ile Ser Asn Ser Gly Gly Asp Thr 1 5 <210> 95 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 95 Ala Lys Asp His Pro Gln Trp Leu Gly Ser His Glu 1 5 10 <210> 96 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 96 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr 1 5 <210> 97 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 97 Ile Ser Gly Ile Ser Ser Phe Thr 1 5 <210> 98 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 98 Ala Arg Asp Arg Arg Leu Tyr Thr Pro Tyr Tyr His Tyr Tyr Met Asp 1 5 10 15 Val <210> 99 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 99 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gly 1 5 <210> 100 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 100 Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys 1 5 <210> 101 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 101 Ala Lys Asp Ser Ala Gly Arg Arg Trp Gln Gln Leu Ser Ala Gly Ile 1 5 10 15 <210> 102 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 102 Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Ala 1 5 <210> 103 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 103 Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr 1 5 <210> 104 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 104 Ala Lys Val Ile Asp Gln Trp Leu Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 105 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 105 Gly Phe Ser Phe Gly Asp Tyr Ala 1 5 <210> 106 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 106 Ile Arg Ser Lys Ala Phe Gly Gly Thr Thr 1 5 10 <210> 107 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 107 Thr Arg Asp Phe Asn Asp Phe Trp Thr Gly His His Pro Asn Trp Phe 1 5 10 15 Asp Pro <210> 108 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 108 Gly Phe Ser Phe Thr Ser His Ala 1 5 <210> 109 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 109 Leu Ala Phe Asp Gly Asp Ser Thr 1 5 <210> 110 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 110 Ala Lys Asp Arg Val Val Arg Gly Val Gly Glu Asn Leu Asp His 1 5 10 15 <210> 111 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 111 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly 1 5 <210> 112 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 112 Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Thr Lys 1 5 <210> 113 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 113 Ala Lys Glu Arg Glu Trp Glu Val Arg Asp Gly Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 114 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 114 Gly Phe Ser Phe Ser Asp Ser Ala 1 5 <210> 115 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 115 Ile Arg Gly Lys Ala Asn Asp Tyr Ala Thr 1 5 10 <210> 116 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 116 Ile Arg Gln Gly Gly Tyr Tyr Glu Ser Ser Glu Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 117 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 117 Gly Phe Thr Ala Arg Thr Asn Tyr 1 5 <210> 118 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 118 Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 119 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 119 Ala Arg Asp Arg Gly Tyr Leu Asp His 1 5 <210> 120 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 120 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp 1 5 <210> 121 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 121 Ile Gly Thr Ala Asp Asp Thr 1 5 <210> 122 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 122 Ala Arg Val Ala His His Ser Glu Tyr His Leu Leu Tyr Met Pro His 1 5 10 15 Gly Met Asp Val 20 <210> 123 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 123 Gly Phe Thr Phe Ile Arg Tyr Ala 1 5 <210> 124 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 124 Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 125 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 125 Ala Arg Asp Asp Glu Gly Tyr Thr Thr Asn Trp Tyr Asp Ala Tyr Asp 1 5 10 15 Ile <210> 126 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 126 Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr Ala 1 5 <210> 127 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 127 Ile Thr His Asp Ser Gly Ser Thr 1 5 <210> 128 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 128 Ala Lys Asp Arg Pro Ser Arg Gly Val Gly Glu Leu Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 129 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 129 Gly Gly Ser Leu Ser Asn Lys Tyr 1 5 <210> 130 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 130 Ile Tyr Tyr Thr Gly Thr Thr 1 5 <210> 131 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 131 Ala Arg Asp Cys Ala Ser Gly Trp Asp Gly Cys Asp Phe 1 5 10 <210> 132 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 132 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 133 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 133 Ile Ser Tyr Glu Gly Ser Asn Lys 1 5 <210> 134 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 134 Val Arg Asp Arg Lys Val Ala Gly Gln Met Ile Arg His Gly Met Asp 1 5 10 15 Val <210> 135 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 135 Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr Ala 1 5 <210> 136 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 136 Ile Trp Tyr Asp Gly Ile Thr Ile 1 5 <210> 137 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 137 Ala Arg Val Gly Val Arg Gly Ala Asp Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 138 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 138 Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala 1 5 <210> 139 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 139 Ile Ser Gly Asn Gly Arg Thr Ile 1 5 <210> 140 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 140 Ala Lys Thr Lys Ala Tyr Gly Asp Phe His Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 141 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 141 Gln Ser Ile Asn Ser Trp 1 5 <210> 142 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 142 Lys Ala Ser 1 <210> 143 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 143 Gln His Tyr His Ser Tyr Pro Trp Thr 1 5 <210> 144 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 144 Gln Asp Ile Thr Asn Tyr 1 5 <210> 145 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 145 Lys Ala Ser 1 <210> 146 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 146 Gln Gln Tyr Asn Arg Gly Ser Trp Thr 1 5 <210> 147 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 147 Asn Ile Gly Ser Lys Ser 1 5 <210> 148 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 148 Asp Asp Ser 1 <210> 149 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 149 Gln Val Trp Asp Asp Ser Ser Asp Gln Trp Val 1 5 10 <210> 150 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 150 Gln Ser Ile Ser Ser Trp 1 5 <210> 151 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 151 Lys Ala Ser 1 <210> 152 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 152 Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp Thr 1 5 <210> 153 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 153 Asn Ile Gly Arg Thr Ile 1 5 <210> 154 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 154 Asp Asp Ser 1 <210> 155 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 155 Gln Val Trp Asp Ser Thr Arg Asp Gln Tyr Val 1 5 10 <210> 156 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 156 Ser Ser Ser Ile Arg Ser Asn Pro 1 5 <210> 157 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 157 Ser Asn Asp 1 <210> 158 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 158 Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Arg Val 1 5 10 <210> 159 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 159 Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Phe 1 5 10 <210> 160 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 160 Leu Gly Ser 1 <210> 161 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 161 Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 162 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 162 Asn Ile Gly Arg Ile Thr 1 5 <210> 163 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 163 Asp Asp Ser 1 <210> 164 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 164 Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Gln Trp Val 1 5 10 <210> 165 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 165 Gln Ser Ile Ser Asn Tyr 1 5 <210> 166 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 166 Ala Ala Ser 1 <210> 167 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 167 Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Arg Thr 1 5 <210> 168 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 168 Gln Gly Ile Ser Asp Tyr 1 5 <210> 169 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 169 Arg Ala Ser 1 <210> 170 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 170 Gln Lys Tyr Asn Ser Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 171 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 171 Asn Ile Gly Ser Lys Ser 1 5 <210> 172 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 172 Asp Asp Ser 1 <210> 173 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 173 Gln Val Trp His Ser Asn Thr Asp His Val Val 1 5 10 <210> 174 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 174 Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp 1 5 <210> 175 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 175 Gly Asn Asn 1 <210> 176 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 176 Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Thr Val His Val Val 1 5 10 <210> 177 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 177 Gln Ser Val Thr Asn Tyr 1 5 <210> 178 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 178 Asp Val Ser 1 <210> 179 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 179 Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Tyr Thr 1 5 <210> 180 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 180 Ser Ser Asp Val Gly Ser Tyr Asn Phe 1 5 <210> 181 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 181 Glu Gly Ser 1 <210> 182 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 182 Cys Ser Tyr Thr Asp Asn Ser Pro Tyr Val Leu 1 5 10 <210> 183 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 183 Gln Ser Ile Gly Ser Tyr 1 5 <210> 184 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 184 Thr Ala Ser 1 <210> 185 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 185 Gln Gln Asn Tyr Asn Ile Pro Gln Val Thr 1 5 10 <210> 186 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 186 Gln Ser Ile Ser Ser Trp 1 5 <210> 187 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 187 Thr Ala Ser 1 <210> 188 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 188 Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Pro Trp Thr 1 5 <210> 189 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 189 Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr 1 5 <210> 190 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 190 Ser Thr Asn 1 <210> 191 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 191 Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Tyr Val 1 5 10 <210> 192 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 192 Ser Gly Ser Val Ser Thr Asn Tyr Tyr 1 5 <210> 193 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 193 Asn Thr Asn 1 <210> 194 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 194 Thr Leu Tyr Met Gly Ser Gly Ile Ser Val 1 5 10 <210> 195 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 195 Asn Ile Gly Asn Lys Asn 1 5 <210> 196 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 196 Asp Asp Ser 1 <210> 197 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 197 Gln Val Trp Asp Ser Asn Ser Asp His Gly Val 1 5 10 <210> 198 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 198 Asn Ile Gly Asn Lys Ala 1 5 <210> 199 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 199 Asp Asp Ser 1 <210> 200 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 200 Gln Leu Trp Asp Thr Ser Ser Asn Pro His Val Val 1 5 10

Claims (100)

  1. 대상체(subject)에서 지카 바이러스(Zika virus) 감염을 검출하는 방법으로서,
    (a) 상기 대상체로부터의 샘플을, 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍을 이룬(clone-paired) 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 항체 또는 항체 단편을 상기 샘플 중의 지카 바이러스 항원에 결합시킴으로써 상기 샘플 중의 지카 바이러스를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 샘플이 체액인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 샘플이 혈액, 가래, 눈물, 타액, 점액 또는 혈청, 정액, 자궁경부 또는 질 분비물, 양수, 태반 조직, 소변, 삼출물, 누출액, 조직 스크래핑(tissue scraping) 또는 대변인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출이 ELISA, RIA, 측면 유동 검정(lateral flow assay) 또는 웨스턴 블롯(Western blot)을 포함하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 및 (b)를 두 번째로 수행하는 단계 및 제1 검정과 비교하여 지카 바이러스 항원 수준의 변화를 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 의해 인코딩(encoding)되는, 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 대해 70%, 80% 또는 90%의 동일성(identity)을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 단편이 재조합(recombinant) scFv(단일 쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편인, 방법.
  13. 지카 바이러스에 감염된 대상체를 치료하거나, 지카 바이러스에 감염될 위험이 있는 대상체의 감염 가능성을 감소시키는 방법으로서,
    각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편을 상기 대상체에게 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1에 제시된 것에 대해 95%의 동일성을 갖는 클론-쌍을 이룬 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
  16. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  18. 제13항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  19. 제13항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  20. 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 단편이 재조합 scFv(단일 쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편인, 방법.
  21. 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 IgG, 또는 FcR 상호작용을 변경(제거 또는 증강)하고, 반감기를 증가시키고/시키거나 LALA, N297, GASD/ALIE, YTE 또는 LS 돌연변이와 같은, 치료적 효능을 증가시키도록 돌연변이된 Fc 부분, 또는 글리칸의 효소적 또는 화학적 부가 또는 제거, 또는 정의된 글리코실화 패턴으로 조작된 세포주에서의 발현과 같은, FcR 상호작용을 변경(제거 또는 증강)하도록 변형된 글리칸을 포함하는 재조합 IgG 항체 또는 항체 단편인, 방법.
  22. 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 키메라 항체 또는 이중특이적(bispecific) 항체인, 방법.
  23. 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 감염 전 또는 감염 후에 투여되는, 방법.
  24. 제13항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 임신한 여성, 성적으로 활발한 여성, 또는 불임 치료를 받고 있는 여성인, 방법.
  25. 제13항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 전달이 항체 또는 항체 단편의 투여, 또는 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 RNA 또는 DNA 서열 또는 벡터를 사용한 유전자 전달(genetic delivery)을 포함하는, 방법.
  26. 모노클로날 항체(monoclonal antibody)로서,
    상기 항체 또는 항체 단편이 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 특징으로 하는, 모노클로날 항체.
  27. 제26항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 모노클로날 항체.
  28. 제26항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 적어도 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 모노클로날 항체.
  29. 제26항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 적어도 95%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 모노클로날 항체.
  30. 제26항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 모노클로날 항체.
  31. 제26항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 모노클로날 항체.
  32. 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 단편이 재조합 scFv(단일 쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편인, 모노클로날 항체.
  33. 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 키메라 항체이거나, 이중특이적 항체인, 모노클로날 항체.
  34. 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 IgG, 또는 FcR 상호작용을 변경(제거 또는 증강)하고, 반감기를 증가시키고/시키거나 LALA, N297, GASD/ALIE, YTE 또는 LS 돌연변이와 같은, 치료적 효능을 증가시키도록 돌연변이된 Fc 부분, 또는 글리칸의 효소적 또는 화학적 부가 또는 제거, 또는 정의된 글리코실화 패턴으로 조작된 세포주에서의 발현과 같은, FcR 상호작용을 변경(제거 또는 증강)하도록 변형된 글리칸을 포함하는 재조합 IgG 항체 또는 항체 단편인, 모노클로날 항체.
  35. 제26항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 세포 투과성 펩티드(cell penetrating peptide)를 추가로 포함하고/하거나 인트라바디(intrabody)인, 모노클로날 항체.
  36. 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 하이브리도마 또는 조작된 세포로서,
    상기 항체 또는 항체 단편이 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 특징으로 하는, 하이브리도마 또는 조작된 세포.
  37. 제36항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 하이브리도마 또는 조작된 세포.
  38. 제36항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1로부터의 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 대해 적어도 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 하이브리도마 또는 조작된 세포.
  39. 제36항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1로부터의 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 대해 95%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 하이브리도마 또는 조작된 세포.
  40. 제36항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 하이브리도마 또는 조작된 세포.
  41. 제36항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 대해 적어도 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 하이브리도마 또는 조작된 세포.
  42. 제36항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 하이브리도마 또는 조작된 세포.
  43. 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 단편이 재조합 scFv(단일 쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편인, 하이브리도마 또는 조작된 세포.
  44. 제36항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 키메라 항체 또는 이중특이적 항체인, 하이브리도마 또는 조작된 세포.
  45. 제36항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 IgG, 또는 FcR 상호작용을 변경(제거 또는 증강)하고, 반감기를 증가시키고/시키거나 LALA, N297, GASD/ALIE, YTE 또는 LS 돌연변이와 같은, 치료적 효능을 증가시키도록 돌연변이된 Fc 부분, 또는 글리칸의 효소적 또는 화학적 부가 또는 제거, 또는 정의된 글리코실화 패턴으로 조작된 세포주에서의 발현과 같은, FcR 상호작용을 변경(제거 또는 증강)하도록 변형된 글리칸을 포함하는 재조합 IgG 항체 또는 항체 단편인, 하이브리도마 또는 조작된 세포.
  46. 제36항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 세포 투과성 펩티드를 추가로 포함하고/하거나 인트라바디인, 하이브리도마 또는 조작된 세포.
  47. 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 특징으로 하는 하나 이상의 항체 또는 항체 단편을 포함하는 백신 제형(vaccine formulation).
  48. 제47항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편 중 적어도 하나가 표 1로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 백신 제형.
  49. 제47항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편 중 적어도 하나가 표 1로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 적어도 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 백신 제형.
  50. 제47항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편 중 적어도 하나가 표 1로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 적어도 95%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 백신 제형.
  51. 제47항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편 중 적어도 하나가 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 백신 제형.
  52. 제47항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편 중 적어도 하나가 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 백신 제형.
  53. 제47항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 단편 중 적어도 하나가 재조합 scFv(단일 쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편인, 백신 제형.
  54. 제47항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 중 적어도 하나가 키메라 항체이거나, 이중특이적 항체인, 백신 제형.
  55. 제47항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 IgG, 또는 FcR 상호작용을 변경(제거 또는 증강)하고, 반감기를 증가시키고/시키거나 LALA, N297, GASD/ALIE, YTE 또는 LS 돌연변이와 같은, 치료적 효능을 증가시키도록 돌연변이된 Fc 부분, 또는 글리칸의 효소적 또는 화학적 부가 또는 제거, 또는 정의된 글리코실화 패턴으로 조작된 세포주에서의 발현과 같은, FcR 상호작용을 변경(제거 또는 증강)하도록 변형된 글리칸을 포함하는 재조합 IgG 항체 또는 항체 단편인, 백신 제형.
  56. 제47항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편 중 적어도 하나가 세포 투과성 펩티드를 추가로 포함하고/하거나, 인트라바디인, 백신 제형.
  57. 제26항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 제1 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 하나 이상의 발현 벡터를 포함하는 백신 제형.
  58. 제57항에 있어서, 상기 발현 벡터(들)가 신드비스(Sindbis) 바이러스 또는 VEE 벡터(들)인, 백신 제형.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 바늘 주사, 제트 주사 또는 전기천공에 의한 전달을 위해 제형화된, 백신 제형.
  60. 제57항에 있어서, 제26항 내지 제34항의 별개의 항체 또는 항체 단편 등의 제2 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 하나 이상의 발현 벡터를 추가로 포함하는, 백신 제형.
  61. 지카 바이러스에 감염되었거나, 감염 위험이 있는 임신 대상체의 태반 및/또는 태아의 건강을 보호하는 방법으로서,
    각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편을 상기 대상체에게 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1에 제시된 바와 같이 95%의 동일성을 갖는 클론-쌍을 이룬 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
  64. 제61항 또는 제62항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
  65. 제61항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  66. 제61항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  67. 제61항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  68. 제61항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 단편이 재조합 scFv(단일 쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편인, 방법.
  69. 제61항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 IgG, 또는 FcR 상호작용을 변경(제거 또는 증강)하고, 반감기를 증가시키고/시키거나 LALA, N297, GASD/ALIE, YTE 또는 LS 돌연변이와 같은, 치료적 효능을 증가시키도록 돌연변이된 Fc 부분, 또는 글리칸의 효소적 또는 화학적 부가 또는 제거, 또는 정의된 글리코실화 패턴으로 조작된 세포주에서의 발현과 같은, FcR 상호작용을 변경(제거 또는 증강)하도록 변형된 글리칸을 포함하는 재조합 IgG 항체 또는 항체 단편인, 방법.
  70. 제61항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 키메라 항체 또는 이중특이적 항체인, 방법.
  71. 제61항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 감염 전 또는 감염 후에 투여되는, 방법.
  72. 제61항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 임신한 여성, 성적으로 활발한 여성, 또는 불임 치료를 받고 있는 여성인, 방법.
  73. 제61항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 전달이 항체 또는 항체 단편의 투여, 또는 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 RNA 또는 DNA 서열 또는 벡터를 사용한 유전자 전달을 포함하는, 방법.
  74. 제61항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 미처리 대조군과 비교하여 태반의 크기를 증가시키는, 방법.
  75. 제61항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 미처리 대조군과 비교하여 태아의 바이러스 부하(viral load) 및/또는 병리를 감소시키는, 방법.
  76. 지카 바이러스 항원의 항원 완전성, 정확한 형태 및/또는 정확한 서열을 결정하는 방법으로서,
    (a) 상기 항원을 포함하는 샘플을 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 제1 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 항원에 대한 상기 제1 항체 또는 항체 단편의 검출가능한 결합에 의해 상기 항원의 항원 완전성, 정확한 형태 및/또는 정확한 서열을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  77. 제76항에 있어서, 상기 샘플이 재조합적으로 생산된 항원을 포함하는, 방법.
  78. 제76항에 있어서, 상기 샘플이 백신 제형 또는 백신 생산 뱃치(batch)를 포함하는, 방법.
  79. 제76항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 검출이 ELISA, RIA, 웨스턴 블롯, 표면 플라즈몬 공명 또는 생물층 간섭계를 사용하는 바이오센서, 또는 유세포 분석 염색(flow cytometric staining)을 포함하는, 방법.
  80. 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항체 또는 항체 단편이 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
  81. 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항체 또는 항체 단편이 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 대해 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
  82. 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항체 또는 항체 단편이 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
  83. 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  84. 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  85. 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  86. 제76항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항체 단편이 재조합 scFv(단일 쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편인, 방법.
  87. 제76항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 시간이 경과함에 따라 항원의 항원 안정성을 결정하기 위해 단계 (a) 및 (b)를 두 번째로 수행하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  88. 제76항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서,
    (c) 상기 항원을 포함하는 샘플을 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 제2 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 단계; 및
    (d) 상기 항원에 대한 상기 제2 항체 또는 항체 단편의 검출가능한 결합에 의해 상기 항원의 항원 완전성을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  89. 제88항에 있어서, 상기 제2 항체 또는 항체 단편이 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
  90. 제89항에 있어서, 상기 제2 항체 또는 항체 단편이 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 대해 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
  91. 제89항에 있어서, 상기 제2 항체 또는 항체 단편이 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
  92. 제89항에 있어서, 상기 제2 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  93. 제89항에 있어서, 상기 제2 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  94. 제89항에 있어서, 상기 제2 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95%의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  95. 제89항에 있어서, 상기 제2 항체 단편이 재조합 scFv(단일 쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편인, 방법.
  96. 제89항에 있어서, 시간이 경과함에 따라 항원의 항원 안정성을 결정하기 위해 단계 (c) 및 (d)를 두 번째로 수행하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  97. 인간 모노클로날 항체 또는 항체 단편, 또는 하이브리도마 또는 이를 생산하는 조작된 세포로서, 상기 항체는 지카 바이러스 E2 항원에 결합하고, 고도로 4차 에피토프(highly quaternary epitope)를 인식하고, D83, P222, F218 및 K123으로부터 선택된 하나 이상의 잔기를 인식하는, 인간 모노클로날 항체 또는 항체 단편, 또는 하이브리도마 또는 이를 생산하는 조작된 세포.
  98. 제97항에 있어서, 상기 에피토프가 도메인 II 에피토프인, 인간 모노클로날 항체 또는 항체 단편.
  99. 제97항 또는 제98항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 잔기 D83, P222, F218 및 K123을 각각 인식하는, 인간 모노클로날 항체 또는 항체 단편.
  100. 제97항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 아프리카 계통(African lineage)의 적어도 하나의 지카 바이러스 및 아시아 계통의 적어도 하나의 지카 바이러스를 중화시키는, 인간 모노클로날 항체 또는 항체 단편.
KR1020227020538A 2019-11-19 2020-11-09 지카 바이러스를 중화하는 인간 항체 및 이의 사용 방법 KR20220103761A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962937603P 2019-11-19 2019-11-19
US62/937,603 2019-11-19
PCT/US2020/059604 WO2021101739A1 (en) 2019-11-19 2020-11-09 Human antibodies that neutralize zika virus and methods of use therefor

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220103761A true KR20220103761A (ko) 2022-07-22

Family

ID=75980179

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227020538A KR20220103761A (ko) 2019-11-19 2020-11-09 지카 바이러스를 중화하는 인간 항체 및 이의 사용 방법

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20230085393A1 (ko)
EP (1) EP4061422A4 (ko)
JP (1) JP2023502387A (ko)
KR (1) KR20220103761A (ko)
CN (1) CN115135345A (ko)
BR (1) BR112022009574A2 (ko)
CA (1) CA3158401A1 (ko)
WO (1) WO2021101739A1 (ko)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018010789A1 (en) * 2016-07-13 2018-01-18 Humabs Biomed Sa Novel antibodies specifically binding to zika virus epitopes and uses thereof
WO2018085400A1 (en) * 2016-11-02 2018-05-11 Vanderbilt University Human zika virus antibodies and methods of use therefor
EP3606552A4 (en) * 2017-04-07 2020-08-05 The Rockefeller University COMPOSITIONS AND PROCEDURES RELATED TO HUMAN NEUTRALIZING ANTIBODIES AGAINST ZIKA AND DENGUE-1 VIRUS

Also Published As

Publication number Publication date
EP4061422A1 (en) 2022-09-28
BR112022009574A2 (pt) 2022-08-02
EP4061422A4 (en) 2024-05-08
CN115135345A (zh) 2022-09-30
WO2021101739A1 (en) 2021-05-27
CA3158401A1 (en) 2021-05-27
JP2023502387A (ja) 2023-01-24
US20230085393A1 (en) 2023-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210277092A1 (en) HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS 2 (SARS-CoV-2)
KR20220158053A (ko) 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)에 대한 인간 단클론 항체
KR102541905B1 (ko) 치쿤군야 바이러스의 항체-매개 중화
WO2021195326A1 (en) Human monoclonal antibodies to severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-cov-2)
US20210324050A1 (en) Human monoclonal antibodies that neutralize pandemic gii.4 noroviruses
KR20220038415A (ko) 엔테로바이러스 d68에 대한 인간 모노클로날 항체
US20230122364A1 (en) HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS 2 (SARS-CoV-2)
WO2021195385A1 (en) HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS 2 (SARS-GoV-2)
WO2020061159A1 (en) Human antibodies to zika virus
KR20220098003A (ko) 한타바이러스에 대한 인간 모노클로날 항체 및 이의 사용 방법
WO2019210144A1 (en) Broadly neutralizing antibodies against hepatitis c virus
US20230181714A1 (en) Human monoclonal antibodies to venezuelan equine encephalitis virus and uses therefor
US20230063625A1 (en) Human antibodies to rift valley fever virus
KR20220103761A (ko) 지카 바이러스를 중화하는 인간 항체 및 이의 사용 방법
US12037384B2 (en) Human monoclonal antibodies against yellow fever virus and uses therefor
US20240288426A1 (en) Human antibodies to crimean congo hemorrhagic fever virus
WO2023187407A1 (en) Human monoclonal antibodies binding to sars-cov-2 and methods of use thereof
US20220280618A1 (en) Antibodies to candida and uses thereof
WO2024015760A2 (en) Human monoclonal antibodies to omicron variant of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-cov- 2)
AU2020273365A1 (en) Human antibodies to Ross River virus and methods of use therefor
TWI854285B (zh) 抗體介導屈公(chikungunya)病毒中和