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KR20220093334A - Il-33 길항제의 이용 방법 - Google Patents

Il-33 길항제의 이용 방법 Download PDF

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KR20220093334A
KR20220093334A KR1020227018052A KR20227018052A KR20220093334A KR 20220093334 A KR20220093334 A KR 20220093334A KR 1020227018052 A KR1020227018052 A KR 1020227018052A KR 20227018052 A KR20227018052 A KR 20227018052A KR 20220093334 A KR20220093334 A KR 20220093334A
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South Korea
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antagonist
ser
egfr
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gly
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KR1020227018052A
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English (en)
Inventor
라니아 대거
커스티 휴슬레이
마흐부베 가예디
샘 스트릭슨
엠마 수잔 코헨
마리아 벨비시
자비에 로메로 로스
Original Assignee
메디뮨 리미티드
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Abstract

본 개시내용은 비정상적 상피 생리 또는 EGFR-매개 질환의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 IL-33 길항제, 및 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자에게 IL-33 길항제를 투여하는 단계를 포함하는 예방 또는 치료의 대응하는 방법에 관한 것이다.

Description

IL-33 길항제의 이용 방법
본 출원은 2019년 11월 4일자로 출원된 유럽 특허 출원 제19206984.7호에 대한 우선권을 주장한다. 이 출원의 내용은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
기술분야
본 개시내용은 비정상적 상피 생리 또는 EGFR-매개 질환의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 IL-33 길항제, 및 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자에게 IL-33 길항제를 투여하는 단계를 포함하는 예방 또는 치료의 대응하는 방법에 관한 것이다.
IL-1F11로도 알려진 인터류킨-33(IL-33)은 사이토카인의 IL-1 패밀리의 구성원이다. IL-33은 2개 도메인, 즉, 호메오도메인 및 사이토카인(IL-1 유사) 도메인으로 구성된 270개의 아미노산 단백질이다. 호메오도메인은 핵 국재화 신호(nuclear localisation signal: NLS)를 함유한다. IL-33은 상이한 형태; 즉, 환원된 형태(redIL-33) 및 산화된 형태(oxIL-33)로 존재하는 것으로 알려져 있다. 이전의 연구는 환원된 형태가 산화된 형태에서 적어도 하나의 이황화결합을 형성하도록 생리적 조건 하에 빠르게 산화된다는 것과, 두 형태가 상이한 결합 패턴 및 효과를 가질 가능성이 있다는 것을 나타내었다.
IL-33의 환원된 형태는 ST2에 결합하며, 사실 Th2 세포 및 비만 세포에 의해 발현된 ST2 수용체의 유일하게 알려져 있는 리간드라는 것은 이전에 발견되었다. 환원된 IL-33은 ST2에 결합하고 후속적으로 NFκB 및 MAP 키나제 경로를 활성화시킴으로써 표적 세포를 자극하여, 염증을 촉진시키기 위한 사이토카인 및 케모카인, 예컨대, IL-4, IL-5 및 IL-13의 생성을 야기한다. 가용성 ST2(sST2)는 환원-IL-33 신호전달을 방지하는 유인 수용체인 것으로 여겨진다.
더 최근에, IL-33의 산화된 형태는 또한 생리적 효과를 갖는다는 것이 발견되었다. 산화된 IL-33은 ST2에 결합하지 않지만, 대신에 최종당화산물에 대한 수용체(receptor for advanced glycation end product: RAGE)에 결합하고, 이 대안의 경로를 통해 신호를 전달한다는 것이 발견되었다.
IL-33은 주로 ST2를 자극하고 강한 염증 효과를 야기하는 환원 형태로서 현재 알려져 있는 능력으로 인해 치료적 표적으로서 상당한 관심 대상이 되어 왔다. 그러나, 치료적 표적으로서 산화된 IL-33 경로는, 부분적으로는 이것이 나중에 발견되었기 때문에, 그리고 RAGE가 다수의 리간드를 갖고 이의 하류의 상호작용이 잘 이해되고 있지 않다는 사실 때문에, 이에 대한 연구와 관심이 거의 없었다.
산화된 IL-33 자극으로부터 초래되는 이들 하류의 RAGE 상호작용 중 적어도 하나는 본 명세서에 더욱 상세하게 기재된다. 놀랍게도 산화된 IL-33 경로의 부분으로서 상피 성장 인자 수용체(EGFR)와의 RAGE 복합체가 발견되었다. 환원된 IL-33은 산화된 IL-33으로 빠르게 전환되는데, 이는 그 다음에 RAGE에 결합하고, EGFR과 복합체화되어 EGFR 활성을 자극한다. EGFR의 관련성에 대한 놀라운 발견은 비정상적 상피 생리의 양상을 수반하는 다수의 질환에 대한 중요한 치료적 표적이라는 점에서 의미가 있다.
이 발견의 결과로서, IL-33의 형태 중 하나에 결합할 수 있는 길항제는 산화된 IL-33의 신호전달을 효과적으로 방지할 수 있는 것으로 여겨진다. 이는 산화된 IL-33 그 자체에 결합함으로써 직접적이거나, 환원된 IL-33의 산화된 IL-33으로의 전환을 저해함으로써 간접적일 수 있으며, 이들 둘 다 결국 RAGE의 자극 및 EGFR의 자극을 방지할 것이다. EGFR 자극에서 이런 환원은 임의의 EGFR-매개 질환에서, 특히 EGFR이 과자극되는 병태에서 치료적 이점을 가질 것이다.
EGFR은 상피 생리에 대해 다양한 항상성 효과를 갖는 것으로 알려져 있다. EGFR 자극은 상피 세포 분화를 증가시키고, 상피 세포 이동을 증가시키며, 상피 점막 생성을 증가시킨다. EGFR-매개 신호전달의 저해는 비정상적 상피 생리, 예컨대, 비정상적 기도 상피 조직 리모델링 또는 점막의 과생성이 있는 장애를 치료 또는 예방할 것으로 여겨진다.
IL-33은 이전에 기도에서의 조직 리모델링과 관련되었다(문헌[Li et al JACI, 2014 134: 1422-32]; 문헌[Vannella et al Sci Transl Med, 337ra65]; 문헌[Allinne et al JACI, 2019, 144: 1624-37]). 그러나, 이는 자기-영속적(self-perpetuating) 증폭 루프를 통해 간접적으로 일어나는 것으로 여겨지며, 이에 의해 IL-33 신호전달은 IL-33과 이의 동족 수용체 ST2 둘 다의 발현을 상향조절하여, 만성 ST2 축 신호전달을 야기한다. ST2를 통한 활성은 ST2가 발현되는 선천성 세포, 예컨대, 대식세포 및 2형 선천성 림프모양 세포에 의해 매개되기 때문에, IL-33 자체가 기도 상피 생물학에 직접적으로 영향을 미친다는 것은 이전에 확립되거나 제안된 적이 없다.
상기 언급한 바와 같이, 본 개시내용은 IL-33이 또한 상이한 메커니즘; 즉, RAGE-EGFR 경로를 통해 직접적으로 작용하여; 상피 생리에 직접적으로 영향을 미친다는 발견에 기반한다. 이런 새로운 이해는 더 많은 질환, 질환의 더 많은 증상 및 더 많은 환자를 치료하기 위해 IL-33 길항제의 치료적 적용을 확대하는 데 사용될 수 있기 때문에 중요하다. IL-33을 표적화함으로써 IL-33-매개 EGFR-매개 신호전달을 직접적으로 제어 및 저해하는 치료적 기회는 이전에는 실현된 적이 없다.
본 출원의 개시내용은 IL-33 길항제의 사용이 RAGE/EGFR-매개 oxIL-33 활성의 직접 저해를 통해, 손상된 상피 복구 반응에 직접 영향을 미치고, 상피 술잔세포 분화 및 증식을 감소시키며, 점막 생성을 감소시키고, 비정상적 상피 생리를 갖는 환자, 예컨대, COPD 또는 기관지염을 갖는 환자에서 점막 섬모 움직임을 개선시킬 수 있다는 것을 처음으로 나타낸다. 따라서, 본 명세서에 제시된 연구는 전형적으로 EGFR-매개 효과로부터 초래되어, EGFR-매개 질환에 존재하는 비정상적 상피 생리의 직접적인 예방 또는 치료에서의 IL-33 길항제의 치료적 용도를 뒷받침한다.
제1 양상에 따르면, RAGE-EGFR 매개 효과를 조절 또는 저해하는 것에 의한 비정상적 상피 생리의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 IL-33 길항제가 제공된다.
대안의 제1 양상에 따르면, RAGE-EGFR 매개 효과를 조절 또는 저해하기 위해 비정상적 상피 생리의 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 IL-33 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서의 비정상적 상피 생리의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.
대안의 제1 양상에 따르면, 비정상적 상피 생리의 예방 또는 치료를 위한 의약의 제조에서의 IL-33 길항제의 용도가 제공된다.
제2 양상에 따르면, EGFR-매개 질환의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 IL-33 길항제가 제공된다.
대안의 제2 양상에 따르면, EGFR-매개 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 IL-33 길항제를 투여하는 단계를 포함하는 환자에서의 EGFR-매개 질환의 예방 또는 치료의 방법이 제공된다.
대안의 제2 양상에 따르면, EGFR-매개 질환의 예방 또는 치료를 위한 의약의 제조에서의 IL-33 길항제의 용도가 제공된다.
제3 양상에 따르면, 상피 생리를 개선시키는 것에 의한 질환의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 IL-33 길항제가 제공된다.
대안의 제3 양상에 따르면, 호흡기 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 IL-33 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 상피 생리를 개선시키는 것에 의한 호흡기 질환의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.
대안의 제3 양상에 따르면, 상피 생리를 개선시키는 것에 의한 호흡기 질환의 예방 또는 치료를 위한 의약의 제조에서의 IL-33 길항제의 용도가 제공된다.
제4 양상에 따르면, EGFR 매개 효과를 저해하는 것에 의한 질환의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 IL-33 길항제가 제공된다.
대안의 제4 양상에 따르면, 호흡기 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 IL-33 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 EGFR 매개 효과를 저해하는 것에 의한 호흡기 질환의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.
대안의 제4 양상에 따르면, EGFR 매개 효과를 저해하는 것에 의한 호흡기 질환의 예방 또는 치료를 위한 의약의 제조에서의 IL-33 길항제의 용도가 제공된다.
추가 양상에 따르면, IL-33 매개 EGFR 신호전달을 저해하는 것에 의한 질환의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 IL-33 길항제가 제공된다.
대안의 추가 양상에 따르면, 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 IL-33 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 IL-33 매개 EGFR 신호전달을 저해하는 것에 의한 질환의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.
대안의 추가 양상에 따르면, IL-33 매개 EGFR 신호전달을 저해하는 것에 의한 질환의 예방 또는 치료를 위한 의약의 제조에서의 IL-33 길항제의 용도가 제공된다.
상기 정의된 양상의 추가 특징 및 실시형태는 본 명세서에서 이하의 표제 부문에 기재된다. 각 부문은 임의의 양립 가능한 조합에서 상기 언급한 양상 중 임의의 것과 조합 가능하다.
상세한 설명
정의
본 명세서에서 이용되는 IL-33 단백질은 인터류킨 33, 특히, 포유류 인터류킨 33 단백질, 예를 들어, UniProt 번호 095760으로 기탁된 인간 단백질을 나타낸다. 그러나, 상기 대상체는 단일 종이 아니며, 대신에 환원 및 산화된 형태로 존재함이 명확하다. 생체내 그리고 시험관내 환원 형태의 빠른, 예를 들어, 5분 내지 40분 기간 내의 산화에 기반하여, IL-33에 대한 선행 기술에서의 언급은 실제로 산화 형태에 대한 언급일 수 있다. 더 나아가, 상업적 분석은 환원 형태와 산화 형태 간을 효과적으로 구별하지 않을 수도 있다. 용어 "IL-33" 및 "IL-33 폴리펩타이드"는 상호 호환적으로 사용된다. 특정 실시형태에서, IL-33은 전장이다. 다른 실시형태에서, IL-33은 성숙, 절단된 IL-33(아미노산 112 내지 270)이다. 최신의 연구는 전장 IL-33이 활성이라는 것을 시사한다(문헌[Cayrol and Girard, Proc Natl Acad Sci USA 106(22): 9021-6 (2009)]; 문헌[Hayakawa et al., Biochem Biophys Res Commun. 387(1):218-22 (2009)]; 문헌[Talabot-Ayer et al, J Biol Chem. 284(29): 19420-6 (2009)]). 그러나, aa 72 내지 270, 79 내지 270, 95 내지 270, 99 내지 270, 107 내지 270, 109 내지 270, 111 내지 270, 112 내지 270을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, N-말단이 가공되거나 절단된 IL-33은 향상된 활성을 가질 수 있다(Lefrancais 2012, 2014). 다른 실시형태에서, IL-33은 전장 IL-33, 이의 단편, 또는 IL-33 돌연변이체 또는 변이체 폴리펩타이드를 포함할 수 있으며, 여기서 IL-33의 단편 또는 IL-33 변이체 폴리펩타이드는 활성 IL-33의 일부 또는 모든 기능적 특성을 보유한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 '산화된 IL-33' 또는 'oxIL-33'은 RAGE에 결합하며 RAGE-EGFR 매개 신호전달을 촉발하는 IL-33의 형태를 지칭한다. 산화된 IL-33은, 예를 들어, 비환원성 조건 하에 웨스턴 블롯 분석에 의해, 특히 대응하는 환원 형태보다 4 Da 적은 질량을 갖는 구별되는 밴드로서의 가시적인 단백질이다. 특히, 이는 독립적으로 시스테인 208, 227, 232 및 259로부터 선택된 시스테인 사이에 1개 또는 2개의 이황화 결합을 갖는 단백질을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 산화 IL-33은 ST2에 대한 결합을 나타내지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 '환원된 IL-33' 또는 'redIL-33'은 ST2에 결합하고 ST2 매개 신호전달을 촉발시키는 IL-33의 형태를 지칭한다. 특히, 환원 형태의 시스테인 208, 227, 232 및 259는 이황화 결합되지 않는다. 일 실시형태에서, 환원된 IL-33은 RAGE에 대해 결합을 나타내지 않는다.
"WT IL-33" 또는 "IL-33"에 대한 언급은 이것이 사용된 문맥으로부터 형태 중 하나를 의미하는 것이 분명하지 않다면 환원 또는 산화된 형태 중 어느 하나, 또는 둘 다를 지칭할 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 'IL-33의 항원적으로 별개인 형태'는 항원으로서 작용하고 항체 또는 이의 항원 결합 부분에 의해 결합될 수 있는 IL-33의 임의의 형태를 지칭하며, 전형적으로 본 개시내용의 문맥에서 이는 산화된 IL-33, 환원된 IL-33 및 환원된 IL-33/sST2 복합체를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 'ST2 매개 신호전달/효과'는 ST2에 의한 환원된 IL-33 인식이 세포 표면 상 IL-1RAcP와의 이량체화 및 세포 내에서 수용체 복합체 성분 MyD88, TRAF6 및 IRAK1-4의 세포내 TIR 도메인으로의 보충(recruitment)을 촉진시키는 IL-33/ST2 시스템을 나타낸다. 따라서 ST2 의존적 신호전달/효과는 IL-33의 ST2와의 상호작용을 교란시키거나 또는 대안적으로 IL-1RAcP와의 상호작용을 방해함으로써 방해되거나 약화될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 'RAGE-EGFR 매개 신호전달/효과'는 RAGE에 의한 산화된 IL-33 인식이 세포막 내에서 EGFR과의 복합체화를 촉진시키는 산화된 IL-33/RAGE-EGFR 시스템을 지칭한다. 따라서, RAGE-EGFR 매개 신호전달/효과는 산화된 IL-33과 RAGE와의 상호작용을 교란시킴으로써, 또는 환원된 IL-33의 산화된 IL-33으로의 전환을 방해함으로써 방해되고 약화될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "의 활성을 약화시킨다"란 관련 활성의 감소 또는 저해 또는 관련 활성의 정지를 나타낸다. 일반적으로 약화 및 저해는 본 명세서에서 상호 호환적으로 이용된다.
단수 독립체에 대한 용어는 하나 이상의 그 독립체를 나타낸다는 것을 주목하며; 예를 들어, "항-IL-33 항체"는 하나 이상의 항-IL-33 항체를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 단수 형태, "하나 이상의" 및 "적어도 하나"의 용어는 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "치료하다" 또는 "치료"와 같은 용어는 치료적 처치 및 예방적 또는 방지적 조치를 모두 나타내되, 목적은 원치 않는 생리적 변화 또는 장애를 예방하거나 지연하는(경감하는) 것이다. 유리한 또는 원하는 임상 결과는 검출 가능하든 검출 불가능하든 관계없이, 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 둔화, 병태의 개선 또는 경감, 및 (부분적이든지 전체적이든지) 관해를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. "치료"는 또한 치료를 받지 않는 경우 예상되는 생존에 비해 생존이 연장되는 것을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 대상체는 질환 또는 장애를 이미 갖는 대상체뿐만 아니라 상기 질환 또는 장애를 갖기 쉬운 대상체, 또는 상기 질환 또는 장애가 예방되어야 할 대상체를 포함한다.
대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유류"는, 대상체가 '건강한 대상체'로서 정의되는 경우를 제외하고, 그에 대한 진단, 예후 또는 요법이 요망되는 임의의 대상체, 특히 포유류 대상체를 의미한다. 포유류 대상체는 인간; 가축 동물; 농장 동물; 예컨대, 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 랫트, 마우스, 말, 양, 소 등을 포함한다.
IL-33 길항제
본 개시내용은 IL-33 길항제의 의학적 용도, 특히, IL-33 매개 EGFR 신호전달을 저해하는 것에 의한 질환의 예방 또는 치료를 위한 의학적 용도에 관한 것이다. 특정 예에서, 본 개시내용은 EGFR-매개 질환에서 발견될 수 있는 비정상적 상피 생리의 예방 또는 치료를 위한 IL-33 길항제의 용도에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 'IL-33 길항제'는 IL-33 활성, 예를 들어, 환원된 IL-33 활성, 산화된 IL-33 활성 또는 활성 둘 다를 약화시키는 임의의 제제를 지칭한다. 적합하게는, IL-33 길항제는 환원 및/또는 산화된 IL-33에 특이적이다. 적합하게는, 약화는 환원 또는 산화된 형태의 IL-33에 결합하는 것에 의한다. 적합하게는, 길항제는 환원된 IL-33 활성 및 산화된 IL-33 활성을 약화시키며, 약화는 환원된 형태의 IL-33에 결합하는 것에 의한다(즉, 환원된 IL-33에 결합하는 것에 의한다).
적합하게는, IL-33 길항제는 결합 분자 또는 이의 단편이다.
본 개시내용의 "결합 분자" 또는 "항원 결합 분자"는 이의 가장 넓은 의미로 항원성 결정소에 특이적으로 결합하는 분자를 나타낸다. 적합하게는, 결합 분자는 IL-33, 특히 환원된 IL-33 또는 산화된 IL-33에 특이적으로 결합한다.
적합하게는, 결합 분자는 항체, 이의 항원-결합 단편, 앱타머, 기준 항체 분자의 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 CDR 및 하나 이상의 기준 항체 분자로부터의 적어도 6개의 CDR로부터 선택될 수 있다.
적합하게는, IL-33 길항제는 항체 또는 이의 결합 단편이다. 적합하게는, IL-33 길항제는 항-IL-33 항체 또는 이의 결합 단편이다. 적합하게는, 항-IL-33 항체 또는 이의 결합 단편은 IL-33, 특히 환원된 IL-33 또는 산화된 IL-33에 특이적으로 결합한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "항체"는 이하에 보다 상세하게 논의되는 면역글로불린 분자, 특히 전장 항체 또는 전장 항체를 포함하는 분자, 예를 들어, DVD-Ig 분자 등을 나타낸다.
"이의 결합 단편"은 "이의 항원 결합 단편"과 상호 호환되며, 예를 들어, 특히 6개 CDR, 예컨대, 중쇄 가변 영역 내의 3개 CDR 및 경쇄 가변 영역 내의 3개 CDR을 포함하는 결합 영역을 포함하는, 항체 단편의 에피토프/항원 결합 단편을 지칭한다.
적합하게는, 항체 또는 이의 결합 단편은 천연 유래, 다클론성, 단클론성, 다중특이성, 마우스, 인간, 인간화, 영장류화 또는 키메라로부터 선택된다. 적합하게는, 항체 또는 이의 결합 단편은 에피토프-결합 단편, 예를 들어, Fab' 및 F(ab')2, Fd, Fvs, 단일쇄 Fvs(scFv), 이황화 연결된 Fv(sdFv), VL 또는 VH 도메인 중 하나를 포함하는 단편 또는 Fab 발현 라이브러리에 의해 생성되는 단편일 수 있다. 적합하게는, 항체 또는 이의 결합 단편은 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 또는 단일쇄 항체일 수 있다. 적합하게는, 항체 또는 이의 결합 단편은 단클론성 항체이다. ScFv 분자는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제5,892,019호에 기재되어 있다.
본 개시내용의 면역글로불린 또는 항체 분자는 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl 및 IgA2 등) 또는 하위부류의 면역글로불린 분자일 수 있다.
적합하게는, IL-33 길항제는 적합하게는 산화된 IL-33의 형성을 저해함으로서 산화된 IL-33의 활성을 저해한다. 적합하게는, IL-33 길항제는 환원된 IL-33의 산화된 IL-33으로의 전환을 저해한다.
적합하게는, IL-33 길항제는 환원된 IL-33 길항제이다. 다시 말해서, IL-33 길항제는 환원된 IL-33의 활성을 약화시킨다. 적합하게는, 약화는 환원된 IL-33에 결합하는 것에 의한다. 적합하게는, 상기 길항제는 또한 환원된 IL-33에 결합하는 것에 의해, 이의 산화된 IL-33 형태로의 전환을 방지함으로써, 산화된 IL-33의 활성을 저해/약화시킨다.
적합하게는, 산화된 IL-33의 활성 저해는 RAGE 의존적 신호전달 및/또는 RAGE 매개 효과를 하향 조절하거나 끊어버린다. 적합하게는, 저해는 RAGE-EGFR 의존적 신호전달 및/또는 RAGE-EGFR 매개 효과를 하향 조절하거나 끊어버린다. 적합하게는, 저해는 EGFR 의존적 신호전달을 하향 조절하거나 끊어버린다. 적합하게는, 저해는 EGFR 매개 효과를 하향 조절하거나 끊어버린다. 특히, 환원된 IL-33에 결합하는 IL33 길항제는 RAGE에 대한 산화된 IL-33의 결합을 방지하여, RAGE-EGFR 신호전달을 저해할 수 있다는 것이 나타났다.
적합하게는, 산화된 IL-33의 활성 저해는 RAGE-EGFR 복합체화를 하향 조절하거나 방지한다. 적합하게는, 저해는 EGFR 활성화, 적합하게는 RAGE 매개 EGFR 활성화를 하향 조절하거나 방지한다.
적합하게는, IL-33 길항제는 상기 기재한 모든 저해 효과를 갖는다. 적합하게는, 환원된 IL-33 길항제는 상기 기재한 모든 저해 효과를 갖는다.
적합하게는, IL-33 길항제는 환원된 IL-33 결합 분자 또는 이의 단편이다. 적합하게는, IL-33 길항제는 환원된 IL-33 항체 또는 이의 결합 단편, 적합하게는 항-환원된 IL33 항체 또는 이의 결합 단편이다.
적합하게는, 결합 분자 또는 이의 단편은 5×10-2 M, 10-2 M, 5×10-3 M, 10-3 M, 5×10-4 M, 10-4 M, 5×10-5 M, 10-5 M, 5×10-6 M, 10-6 M, 5×10-7 M, 10-7 M, 5×10-8 M, 10-8 M, 5×10-9 M, 10-9 M, 5×10-10 M, 10-10 M, 5×10-11 M, 10-11 M, 5×10-12 M, 10-12 M, 5×10-13 M, 10-13 M, 5×10-14 M, 10-14 M, 5×10-15 M 또는 10-15 M 미만의 결합 친화도(Kd)로 redIL-33에 특이적으로 결합한다. 적합하게는, redIL-33에 대한 결합 친화도는 5×10-14 M(즉, 0.05 pM) 미만이다. 적합하게는, 결합 친화도는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용되는 WO2016/156440(예를 들어, 실시예 11)에 기재된 것과 같은 프로토콜을 이용하는 동력학 배제 분석(Kinetic Exclusion Assay: KinExA) 또는 BIACORE™을 이용하여, 적합하게는 KinExA를 이용하여 측정되는 바와 같다. 이런 결합 친화도로 redIL-33에 결합하는 결합 분자는 생물학적으로 적절한 기간 이내에 결합 분자/redIL-33 복합체의 해리를 방지하기 위해 redIL-33에 충분히 단단하게 결합하는 하는 것으로 나타난다. 이론으로 구속되는 것을 원하지는 않지만, 이런 결합 강도는, redIL-33이 방출되지 않고 redIL-33에서 oxIL-33으로의 전환을 겪을 수 없도록, 생체내 항체/항원 복합체의 분해 전에 항원의 방출을 방지하는 것으로 여겨진다. 따라서, 이런 결합 친화도로 redIL-33에 결합할 때, 결합 분자는 이의 형성을 방지함으로써 oxIL-33의 활성을 저해 또는 약화시켜, RAGE 신호전달을 저해할 수 있다.
적합하게는, 결합 분자 또는 이의 단편은 103 M-1 sec-1, 5×103 M-1 sec-1, 104 M-1 sec-1 또는 5×104 M-1 sec-1 이상의 온 속도(k(on))로 redIL-33에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 결합 분자는 105 M-1 sec-1, 5×105 M-1 sec-1, 106 M-1 sec-1 또는 5×106 M-1sec-1 또는 107 M-1sec-1 이상의 온 속도(k(on))로 redIL-33 또는 이의 단편 또는 변이체에 결합할 수 있다. 적합하게는, k(on) 속도는 107 M-1sec-1 이상이다.
적합하게는, 결합 분자 또는 이의 단편은 5×10-1 sec-1, 10-1 sec-1, 5×10-2 sec-1, 10-2 sec-1, 5×10-3 sec-1 또는 10-3 sec-1 이하의 오프 속도(k(off))로 redIL-33에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 결합 분자는 5×10-4 sec-1, 10-4 sec-1, 5×10-5 sec-1, 10-5 sec-1, 5×10-6 sec-1, 10-6 sec-1, 5×10-7 sec-1 또는 10-7 sec-1 이하의 오프 속도(k(off))로 redIL-33 또는 이의 단편 또는 변이체에 결합하는 것으로 언급될 수 있다. 적합하게는, k(off) 속도는 10-3 sec-1 이하이다. IL-33은 염증 자극에 반응하여 빠르게 고농도로 방출되는 알라민(alarmin) 사이토카인이다. redIL-33은 세포외 환경에 방출 후 대략 5 내지 45분에 산화로 전환된다. 따라서, redIL-33의 oxIL-33으로의 전환을 방지하기 위해, 본 명세서에 기재된 결합 분자는 이러한 k(on) 및/또한 k(off) 속도로 redIL-33에 결합할 수 있다. 이론으로 구속되는 것을 원하지는 않지만, 이들 k(on)/k(off) 속도는 결합 분자가 oxIL-33으로 전환되기 전에 redIL-33에 빠르게 결합하여, oxIL-33의 형성을 감소시킴으로써, RAGE 신호전달, 적합하게는 RAGE/EGFR 신호전달을 약화시키고, 이에 의해 RAGE/EGFR-매개 효과를 약화시키는 것을 보장하는 것으로 여겨진다.
적합하게는, IL-33 결합 분자는 (WO2016/156440에 기재된 바와 같이) 결합 분자 33_640087-7B에 대한 IL-33의 결합을 경쟁적으로 저해할 수 있다. 적합하게는, WO2016/156440은 33_640087-7B가 특히 고친화도로 redIL-33에 결합하고 ST-2와 RAGE-의존적 IL-33 신호전달을 둘 다 약화시킨다는 것을 기재한다. 따라서, 결합 분자 33_640087-7B에 대한 IL-33의 결합을 경쟁적으로 저해하는 결합 분자는 redIL-33과 oxIL-33 신호전달을 둘 다 저해할 가능성이 크며, 따라서 본 명세서에 기재된 방법에서 사용하기에 특히 적합하다.
결합 분자 또는 이의 단편은 이것이 어느 정도로 에피토프에 대한 참조 항체의 결합을 차단하는 정도까지 해당 에피토프에 특이적으로 결합하는 경우, 주어진 에피토프에 대한 참조 항체의 결합을 경쟁적으로 저해하는 것으로 언급된다. 경쟁적 저해는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 고상 분석, 예컨대, 경쟁 ELISA 검정, 해리-향상 란탄족 원소 형광 면역분석(DELFIA®, Perkin Elmer) 및 방사성리간드 결합 분석에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 당업자는 시험관내 경쟁적 결합 분석, 예컨대, 본 명세서에 참조에 의해 원용된 WO2016/156440의 실시예 1에 기재된 HTRF 분석의 도출을 이용함으로써 결합 분자 또는 이의 단편이 redIL-33에 대한 결합에 대해 경쟁하는지의 여부를 결정할 수 있었다. 예를 들어, 당업자는 표 1의 재조합 항체를 공여자 형광단으로 표지하고, 다양한 농도를 고정된 농도의 수용자(acceptor) 형광단 표지-redIL-33의 샘플과 혼합한다. 후속적으로, 결합 특징을 확인하기 위해 각 샘플 내에서 공여자와 수용자 형광단 사이의 형광 공명 에너지 전달이 측정될 수 있다. 경쟁적 결합 분자를 설명하기 위해, 당업자는 우선 다양한 농도의 시험 결합 분자를 표 1의 고정된 농도의 표지된 항체와 혼합할 수 있다. 표지된 항체-유일한 양성 대조군에 비해, 혼합물이 표지된 IL-33과 함께 인큐베이션될 때 FRET 신호의 감소는 IL-33에 대한 경쟁적 결합을 나타낼 것이다. 결합 분자 또는 이의 단편은 주어진 에피토프에 대한 기준 항체의 결합을 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 또는 적어도 50%만큼 경쟁적으로 저해하는 것으로 언급될 수 있다.
일부 실시형태에서, 결합 분자는 다음의 항-IL-33 항체 중 임의의 것으로부터 선택된다: 33_640087-7B(WO2016/156440에 기재된 바와 같음), 에토키맙(Etokimab)으로 알려진 ANB020(WO2015/106080에 기재된 바와 같음), 9675P(US2014/0271658에 기재된 바와 같음), A25-3H04(US2017/0283494에 기재된 바와 같음), Ab43(WO2018/081075에 기재된 바와 같음), IL33-158(US2018/0037644에 기재된 바와 같음), 10C12.38.H6. 87Y.581 lgG4(WO2016/077381에 기재된 바와 같음) 또는 이들의 결합 단편, 이들 문헌 각각은 본 명세서에 참조에 의해 원용됨. 이들 항체 모두는 표 1에서 언급된다.
적합하게는, IL-33 길항제는 표 1로부터 선택된 가변 중쇄 도메인(VH) 및 가변 경쇄 도메인(VL) 쌍의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 쌍 1은 WO2016/156440에 기재된 33_640087-7B의 VH 및 VL 도메인 서열에 대응한다. 쌍 2 내지 7은 US2014/0271658에 기재된 항체의 VH 및 VL 도메인 서열에 대응한다. 쌍 8 내지 12는 US2017/0283494에 기재된 항체의 VH 및 VL 도메인 서열에 대응한다. 쌍 13은 WO2015/106080에 기재된 ANB020의 VH 및 VL 도메인 서열에 대응한다. 쌍 14 내지 16은 WO2018/081075에 기재된 항체의 VH 및 VL 도메인 서열에 대응한다. 쌍 17은 US2018/0037644에 기재된 IL33-158의 VH 및 VL 도메인 서열에 대응한다. 쌍 18은 WO2016/077381에 기재된 10C12.38.H6. 87Y.581 lgG4의 VH 및 VL 도메인 서열에 대응한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
적합하게는, IL-33 길항제는 서열번호 1의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR)의 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 19의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 이들 CDR은 환원된 IL-33에 결합하고 산화된 IL-33으로의 전환을 저해하는 33_640087-7B(WO2016/156440에 기재된 바와 같음)로부터 유래된 것에 대응한다. 33_640087-7B는 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 WO2016/156440에 전체가 기재된다.
적합하게는, IL-33 길항제는 서열번호 7의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR)의 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 25의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 이들 CDR은 항체 9675P로부터 유래된 것에 대응한다. 9675P는 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 US2014/0271658에 전체가 기재된다.
적합하게는, IL-33 길항제는 서열번호 11의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR)의 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 29의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 이들 CDR은 항체 A25-3H04로부터 유래된 것에 대응한다. A25-3H04는 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 US2017/0283494에 전체가 기재된다.
적합하게는, IL-33 길항제는 서열번호 13의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR)의 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 31의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 이들 CDR은 항체 ANB020로부터 유래된 것에 대응한다. ANB020는 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 WO2015/106080에 전체가 기재된다.
적합하게는, IL-33 길항제는 서열번호 16의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR)의 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 34의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 이들 CDR은 항체 Ab43으로부터 유래된 것에 대응한다. Ab43은 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 WO2018/081075에 전체가 기재된다.
적합하게는, IL-33 길항제는 서열번호 17의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR)의 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 35의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 이들 CDR은 항체 IL33-158로부터 유래된 것에 대응한다. IL33-158은 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 US2018/0037644에 전체가 기재된다.
적합하게는, IL-33 결합 분자는 서열번호 18의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR)의 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 36의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 이들 CDR은 항체 10C12.38.H6. 87Y.581 lgG4으로부터 유래된 것에 대응한다. 10C12.38.H6. 87Y.581 lgG4는 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 WO2016/077381에 전체가 기재된다.
적합하게는, 당업자는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 내에서 CDR을 확인하기 위해 당업계에서 이용 가능한 방법을 안다. 적합하게는, 당업자는, 예를 들어, 서열-기반 주석을 수행할 수 있다.　CDR 사이의 영역은 일반적으로 고도로 보존되며, 따라서, 논리 규칙을 사용하여 CDR 위치를 결정할 수 있다. 당업자는 통상적인 항체에 대한 서열-기반 규칙의 세트(문헌[Pantazes and Maranas,　Protein Engineering, Design and Selection, 2010])를 사용할 수 있고, 대안적으로 또는 추가적으로 다중 서열 정렬에 기반하여 규칙을 개정할 수 있다. 대안적으로, 당업자는 가장 유사한 주석 서열을 확인하기 위해 BLAST+의 BLASTP 명령을 이용하여 Kabat, Chothia 또는 IMGT 방법에 대해 작동하는 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스와 항체 서열을 비교할 수 있다. 이들 방법 각각은 초가변 영역 잔기를 넘버링하고 그에 따라 6개의 CDR 각각의 개시 및 종료가 특정의 중요한 위치에 따라 결정되는 고유한 잔기 넘버링 체계를 고안하였다. 가장 유사한 주석 서열로 정렬 시, 예를 들어, CDR은 주석 서열에서 비주석 서열로 외삽되어, CDR을 확인할 수 있다. 적합한 도구/데이터베이스는, 예를 들어, Kabat 데이터베이스, Kabatman, Scalinger, IMGT, Abnum이다.
적합하게는, IL-33 길항제는 표 1로부터 선택된 가변 중쇄 도메인(VH) 및 가변 경쇄 도메인(VL) 쌍을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다.
적합하게는, IL33 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1의 서열의 VH 도메인 및 서열번호 19의 서열의 VL 도메인을 포함한다.
적합하게는, IL33 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 7의 서열의 VH 도메인 및 서열번호 25의 서열의 VL 도메인을 포함한다.
적합하게는, IL33 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 11의 서열의 VH 도메인 및 서열번호 29의 서열의 VL 도메인을 포함한다.
적합하게는, IL33 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 13의 서열의 VH 도메인 및 서열번호 31의 서열의 VL 도메인을 포함한다.
적합하게는, IL33 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 16의 서열의 VH 도메인 및 서열번호 34의 서열의 VL 도메인을 포함한다.
적합하게는, IL33 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 17의 서열의 VH 도메인 및 서열번호 35의 서열의 VL 도메인을 포함한다.
적합하게는, 따라서, IL-33 길항제는, 예를 들어, 서열번호 1, 7, 11, 13, 16, 17 및 18로부터 독립적으로 선택된 중쇄 가변 영역에 3개의 CDR을 포함할 수 있는 결합 분자이다.
적합하게는, IL-33 길항제는 서열번호 1에 따른 중쇄 가변 영역에 3개의 CDR을 포함하는 결합 분자이다.
적합하게는, IL-33 길항제는 서열번호 19, 25, 29, 31, 34, 35 및 36으로부터 독립적으로 선택된 경쇄 가변 영역에 3개의 CDR을 포함할 수 있는 결합 분자이다.
적합하게는, IL-33 길항제는 서열번호 19에 따른 경쇄 가변 영역에 3개의 CDR을 포함하는 결합 분자이다.
적합하게는, 따라서, IL-33 길항제는, 예를 들어, 서열번호 1, 7, 11, 13, 16, 17 및 18로부터 독립적으로 선택된 중쇄 가변 영역에 3개의 CDR 및, 예를 들어, 서열번호 19, 25, 29, 31, 34, 35 및 36으로부터 독립적으로 선택된 경쇄 가변 영역에 3개의 CDR을 포함할 수 있는 결합 분자이다.
적합하게는, 따라서 IL-33 길항제는 서열번호 1에 따른 중쇄 가변 영역에 3개의 CDR, 및 서열번호 19에 따른 경쇄 가변 영역에 3개의 CDR을 포함하는 결합 분자이다.
적합하게는, 따라서, IL-33 길항제는 서열번호 37, 38 및 39의 서열을 각각 갖는 VH CDR 1 내지 3을 갖는 가변 중쇄 도메인(VH) 및 가변 경쇄 도메인(VL)을 포함할 수 있는 결합 분자이되, 하나 이상의 VHCDR은 3개 이하의 단일 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 갖는다.
적합하게는, 따라서, IL-33 길항제는 서열번호 37, 서열번호 38 및 서열번호 39의 VHCDR 1 내지 3을 각각 포함하는 VH 도메인을 포함하는 결합 분자이다.
적합하게는, 따라서, IL-33 길항제는 서열번호 37, 서열번호 38 및 서열번호 39로 이루어진 VHCDR 1 내지 3을 각각 포함하는 VH 도메인을 포함하는 결합 분자이다.
적합하게는, 따라서, IL-33 길항제는 서열번호 40, 41 및 42의 서열을 각각 갖는 VL CDR 1 내지 3을 갖는 가변 중쇄 도메인(VH) 및 가변 경쇄 도메인(VL)을 포함할 수 있는 결합 분자이되, 하나 이상의 VLCDR은 3개 이하의 단일 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 갖는다.
적합하게는, 따라서, IL-33 길항제는 서열번호 40, 서열번호 41 및 서열번호 42의 VLCDR 1 내지 3을 각각 포함하는 VL 도메인을 포함하는 결합 분자이다.
적합하게는, 따라서, IL-33 길항제는 서열번호 40, 서열번호 41 및 서열번호 42로 이루어진 VLCDR 1 내지 3을 각각 포함하는 VL 도메인을 포함하는 결합 분자이다.
적합하게는, 따라서, IL-33 길항제는 서열번호 37의 서열을 갖는 VHCDR1, 서열번호 38의 서열을 갖는 VHCDR2, 서열번호 39의 서열을 갖는 VHCDR3, 서열번호 40의 서열을 갖는 VLCDR1, 서열번호 41의 서열을 갖는 VLCDR2 및 서열번호 42의 서열을 갖는 VLCDR3을 포함할 수 있는 결합 분자이다.
적합하게는, 따라서 IL-33 길항제는 VH 및 VL을 포함하는 항체 또는 이의 결합 단편이되, VH는 서열번호 1, 7, 11, 13, 16, 17 및 18에 따른 VH에 대해 적어도 90%, 예를 들어, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
적합하게는, 따라서 IL-33 길항제는 VH 및 VL을 포함하는 항체 또는 이의 결합 단편이되, VH는 서열번호 1에 따른 VH에 대해 적어도 90%, 예를 들어, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
적합하게는, 따라서 IL-33 길항제는 VH 및 VL을 포함하는 항체 또는 이의 결합 단편이되, 상기 개시된 VH는 결실되고/되거나, 삽입되고/되거나 상이한 아미노산 아미노산으로 독립적으로 대체되는 프레임워크에 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산을 갖는 서열이다.
적합하게는, 따라서 IL-33 길항제는 VH 및 VL을 포함하는 항체 또는 이의 결합 단편이되, VL은 서열번호 19, 25, 29, 31, 34, 35 및 36에 따른 VL에 대해 적어도 90%, 예를 들어, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
적합하게는, 따라서 IL-33 길항제는 VH 및 VL을 포함하는 항체 또는 이의 결합 단편이되, VL은 서열번호 19에 따른 VL에 대해 적어도 90%, 예를 들어, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
적합하게는, 따라서 IL-33 길항제는 VH 및 VL을 포함하는 항체 또는 이의 결합 단편이되, 상기 개시된 VL은 결실되고/되거나, 삽입되고/되거나 상이한 아미노산 아미노산으로 독립적으로 대체되는 프레임워크에 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산을 갖는 서열이다.
적합하게는, 따라서 IL-33 길항제는 VH 및 VL을 포함하는 항체 또는 이의 결합 단편이되, VH는 서열번호 1, 7, 11, 13, 16, 17 및 18에 따른 VH에 대해 적어도 90%, 예를 들어, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖고, VL은 서열번호 19, 25, 29, 31, 34, 35 및 36에 따른 VL에 대해 적어도 90%, 예를 들어, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
적합하게는, 따라서 IL-33 길항제는 VH 및 VL을 포함하는 항체 또는 이의 결합 단편이되, VH는 서열번호 1, 7, 11, 13, 16, 17 및 18로 이루어진 아미노산 서열을 갖고, VL은 서열번호 19, 25, 29, 31, 34, 35 및 36으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는다.
적합하게는, 따라서 IL-33 길항제는 VH 및 VL을 포함하는 항체 또는 이의 결합 단편이되, VH는 서열번호 1로 이루어진 아미노산 서열을 갖고, VL은 서열번호 19로 이루어진 아미노산 서열을 갖는다.
조성물 및 투여
본 명세서에 기재된 의학적 용도 및 방법에서 IL-33 길항제는 약제학적 조성물의 형태로 환자에게 투여될 수 있다.
적합하게는, 'IL-33 길항제'에 대한 본 명세서의 임의의 언급은 또한 IL-33 길항제를 포함하는 약제학적 조성물을 지칭할 수 있다. 적합하게는, 약제학적 조성물은 1종 이상의 IL-33 길항제를 포함할 수 있다.
적합하게는, IL-33 길항제는 본 명세서의 의학적 용도 및 치료 양상 방법에 정의된 바와 같은 비정상적 상피 생리 또는 EGFR-매개 질환, 또는 호흡기 질환의 생체내 치료를 위한 약제학적 유효량으로 투여될 수 있다.
적합하게는, IL-33 길항제의 '약제학적 유효량' 또는 '치료적 유효량'은 IL-33에 대한 효과적인 결합을 달성하고 유익을 달성하기 위한, 예를 들어, 본 명세서의 의학적 용도/방법에 열거된 바와 같은 질환 또는 병태의 증상을 개선시키기 위한 충분한 양을 의미하는 것으로 간주될 것이다.
적합하게는, IL-33 길항제는 또는 이의 약제학적 조성물은 치료적 효과를 생성하는 데 충분한 양으로 앞서 언급한 치료 방법/의학적 용도에 따라 인간 또는 다른 동물에게 투여될 수 있다.
적합하게는, IL-33 길항제 또는 이의 약제학적 조성물은 알려진 기법에 따라 통상적인 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제와 IL-33 길항제를 조합함으로써 제조된 통상적인 투약 형태로 이러한 인간 또는 다른 동물에게 투여될 수 있다.
당업자는 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제의 형태 및 특징이 이것이 조합되는 활성 성분의 양, 투여 경로 및 다른 널리 공지된 변수에 의해 지정됨을 인식할 것이다. 당업자는 IL-33 길항제의 한 가지 이상의 종을 포함하는 칵테일이 특히 효과적인 것으로 입증될 수 있다는 것을 추가로 인식할 것이다.
단일 투여 형태를 제조하기 위하여 담체 물질과 조합될 수 있는 IL-33 길항제의 양은 치료되는 대상체 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 적합하게는, 약제학적 조성물은 단일 용량, 다중 용량으로서 또는 주입에 확립된 시기에 걸쳐 투여될 수 있다. 적합하게는, 투여량 방식은 또한 최적의 목적하는 반응(예로, 치료 또는 예방 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다).
적합하게는, IL-33 길항제는 투여를 용이하게 하고 IL-33 길항제의 안정성을 촉진시키도록 제형화될 수 있다.
적합하게는, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한, 비독성, 멸균 담체, 예컨대, 생리 식염수, 비독성 완충제, 보존제 등을 포함하도록 제형화된다.
적합하게는, 약제학적 조성물은, 예로, 물, 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 예컨대, 인간 혈청 알부민, 완충 물질, 예컨대, 인산염, 글리신, 소르브산, 소르브산칼륨, 포화 식물성 지방산의 부분 글리세라이드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예컨대, 프로타민 황산염, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연염, 콜로이드성 실리카, 삼규산마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스계 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 카복시메틸셀룰로스나트륨, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지를 포함하는, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.
적합하게는, 약제학적 조성물은 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀션을 포함할 수 있다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예컨대, 올리브유 및 주사용 유기 에스테르, 예컨대, 에틸 올리에이트이다. 수성 담체에는, 예로, 식염수 및 완충 배지를 포함하는, 물, 알코올계/수성 용액, 에멀션 또는 현탁액이 포함된다.
적합하게는, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 비제한적으로 0.01 내지 0.1 M 및 바람직하게는 0.05 M 인산염 완충제 또는 0.8% 식염수를 포함한다. 다른 일반적인 비경구 담체는 나트륨 포스페이트 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 젖산 링거액 또는 고정유가 포함된다. 정맥내 담체는 유체 및 영양소 보충제, 전해질 보충제, 예컨대, 링거 덱스트로스에 기반한 것 등을 포함한다. 보존제 및 다른 첨가제, 예컨대, 항균제, 항산화제, 킬레이트화제 및 비활성 기체 등이 또한 존재할 수 있다.
적합하게는, 주사용 약제학적 조성물은 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 생체외 제조를 위한 멸균 분말을 포함할 수 있다. 이러한 경우, 조성물은 멸균성이어야 하며, 용이한 주사 가능성이 존재하는 정도까지 유체여야 한다. 제조 및 보관 조건 하에 안정해야 하며, 미생물, 예컨대, 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존될 것이다. 적합하게는, 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅, 예컨대, 레시틴의 이용에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 이용에 의해 유지될 수 있다.
본 명세서에 개시된 치료 방법에서의 이용을 위해 적합한 제형물은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16th ed. (1980)]에 기재되어 있다.
적합하게는, 미생물 작용 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 여러 경우에 있어서, 약제학적 조성물 중에 등장성 제제, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예컨대, 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 적합할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 조성물 중에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 초래될 수 있다.
적합하게는, 멸균 주사 용액은 필요한 경우, 적절한 용매 중 필요한 양의 활성 화합물(예로, IL-33 길항제 단독 또는 다른 활성 제제와의 조합물)을 본 명세서에 열거된 성분의 하나 또는 조합물과 함께 혼입한 후에 멸균 여과시킴으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 활성 화합물을 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 진공 건조 및 냉동-건조일 수 있으며, 이것으로 이의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가적인 목적하는 성분을 더한 분말을 수득한다.
IL-33 길항제 또는 이의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계는 잘 공지되어 있거나, 당업자에 의해 용이하게 결정된다.
적합하게는, IL-33 길항제 또는 이의 약제학적 조성물의 투여 경로는, 예를 들어, 경구, 비경구, 흡입 또는 국소일 수 있다. 적합하게는, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 비경구라는 용어는 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 직장, 또는 질 투여를 포함한다.
적합하게는, IL-33 길항제 또는 이의 약제학적 조성물은, 예를 들어, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 용액을 포함하는 허용 가능한 투약 형태로 경구 투여될 수 있다.
적합하게는, IL-33 길항제 또는 이의 약제학적 조성물은 비강 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 생체이용률을 향상시키기 위해 벤질 알코올 또는 다른 적합한 보존제, 흡수 촉진제를 및/또는 다른 통상적 가용화제 또는 분산제를 이용하여, 식염수 중 용액으로 제조될 수 있다.
적합하게는, 비경구 제형은 단일 볼루스 용량, 주입 또는 로딩 볼루스 용량 다음에 유지 용량이 이어질 수 있다. 이들 조성물은 특정한 고정 또는 가변 간격으로, 예를 들어, 1일 1회, 또는 "필요한 경우"에 투여될 수 있다.
적합하게는, IL-33 길항제 또는 이의 약제학적 조성물은 질환 또는 병태, 예를 들어, 비정상적 상피 생리 부위에 직접 전달되어, 치료제에 대한 질환 조직의 노출을 증가시킨다. 적합하게는, IL-33 길항제 또는 이의 약제학적 조성물은 질환 또는 병태 부위에 직접 투여된다. 적합하게는, 따라서, IL-33 길항제 또는 이의 약제학적 조성물은 비정상적 상피 생리, EGFR 매개 질환 또는 호흡기 질환 부위에 투여된다.
일 실시형태에서, IL-33 길항제 또는 이의 약제학적 조성물은 호흡관에 투여된다. 적합하게는 비강내 투여에 의한다. 적합하게는 비강내 흡입에 의한다. 적합하게는, IL-33 길항제 또는 이의 약제학적 조성물은 흡입기 장치에 제공될 수 있다. 적합한 흡입기 장치는 당업계에 널리 공지되어 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 병태 또는 질환의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 IL-33 길항제 또는 이의 약제학적 조성물을 포함하는 흡입기가 제공된다.
적합하게는, 따라서, IL-33 길항제 또는 이의 약제학적 조성물은 액체 조성물로서 제형화된다. 적합하게는 액체 조성물은 에어로졸화될 수 있다.
일 실시형태에서, IL-33 길항제 또는 이의 약제학적 조성물은 에어로졸로서 제공된다.
적합하게는, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물의 제조를 위해 본 명세서에서 상기 열거된 바와 같은 성분이 패키징되고 키트 형태로 판매될 수 있다. 이러한 키트는 관련된 약제학적 조성물이 질환 또는 장애를 앓고 있거나 질병 또는 장애에 취약한 대상체를 치료하는 데에 유용함을 표시하는 표지 또는 포장 삽입물을 적합하게 가질 것이다.
적합하게는, 액체 제형에 대한 성분은 가공되고, 용기, 예컨대, 앰플, 가방, 병, 주사기 또는 바이알 내로 충전되고, 당분야에 공지된 방법에 따라 무균 조건 하에 밀봉된다. 적합하게는, 용기는 가압될 수 있고, 적합하게는 에어로졸 용기일 수 있다. 이들 용기는 상기 기재한 바와 같은 키트에 포함될 수 있다. 적합하게는, 키트는 흡입기 장치를 추가로 포함할 수 있다. 적합하게는, 흡입기 장치는 본 명세서에 기재된 IL-33 길항제 또는 약제학적 조성물을 포함하거나, 본 명세서에 기재된 IL-33 길항제 또는 약제학적 조성물을 포함할 수 있는 상기 기재한 바와 같은 용기를 포함하도록 작동할 수 있다.
비정상적 상피 생리
본 개시내용은 비정상적 상피 생리의 예방 또는 치료를 위한 IL-33 길항제의 의학적 용도에 관한 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "비정상적 상피 생리"는 인간 신체 내 상피의 기능에서의 임의의 비정상성을 의미한다. 인간 신체에서 상피의 기능은 조직 아래를 보호하기 위한 장벽으로서 작용; 조직과 강(cavity) 사이의 화학적 독립체의 조절 및 교환; 강 내로 화학물질의 분비; 및 감각을 포함한다. 이들 기능 중 임의의 것에서 비정상성은 엄청난 생리적 효과를 가질 수 있다. 상피는 피부, 호흡관, 위장관, 생식관, 요관, 외분비 및 내분비선을 포함하는 신체 내 다양한 조직에 존재하며, 이에 따라서, 상피 내의 비정상성은 다양한 질환 또는 병태에 관련될 수 있다. 적합하게는, 상피는 기도 상피이며, 비정상적 상피 생리는 비정상적 기도 상피 생리이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "비정상적"은 건강한 대상체에서의 상기 기능에 비한 기능의 차이, 전형적으로는 건강한 대상체에서의 상기 기능에 비한 기능의 증가 또는 감소를 의미한다.
적합하게는, 상피는 편평상피, 입방상피, 원주상피 및 가성층상(pseudostratified) 상피로부터 선택된다. 적합하게는, 상피는 원주상피이다.
적합하게는, 상피는 섬모상피이다. 적합하게는, 상피는 섬모원주상피이다. 적합하게는, 비정상적 상피 생리는 비정상적 섬모원주 상피 생리이다.
적합하게는, 비정상적 상피 생리는 비정상적 상피 세포 이동을 포함한다. 적합하게는, 비정상적 상피 생리는 감소된 상피 세포 이동을 포함할 수 있다. 적합하게는, 비정상적 상피 생리는 비정상적 상피 세포 증식을 포함할 수 있다. 적합하게는, 비정상적 상피 생리는 감소된 상피 세포 증식을 포함할 수 있다.
적합하게는, 상피 세포 이동의 감소는 상처를 회복시키는 상피의 손상된 능력을 야기한다. 적합하게는, 비정상적 상피 생리는 손상된 상처 회복을 포함한다. 손상된 상처 회복은 손상된 상처 봉합 및 감소된 상처 세포 밀도를 포함할 수 있다.
적합하게는, 비정상적 상피 생리의 치료는 상피 세포 이동의 증가 또는 개선을 포함할 수 있다. 적합하게는, 비정상적 상피 생리의 치료는 상피 상처 회복의 증가 또는 개선을 포함할 수 있다. 적합하게는, 비정상적 상피 생리의 치료는 상처 봉합의 증가 또는 개선을 포함할 수 있다. 적합하게는, 비정상적 상피 생리의 치료는 상처 세포 밀도의 증가 또는 개선을 포함할 수 있다.
적합하게는, 비정상적 상피 생리는 비정상적 점막 섬모 생리이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "비정상적 점막 섬모 생리"는 상피의 점막 섬모 역할에 특이적으로 기능함에 있어서의 임의의 비정상성을 의미한다. 상피의 점막 섬모 역할 기능에서의 비정상성은 점막 섬모 기능에 중요한 섬모원주세포 및/또는 술잔세포의 기능에서의 비정상성으로 인한 것일 수 있다. 적합하게는, 비정상적 점막 섬모 생리는 술잔세포의 비정상적 기능으로 인한 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "점막 섬모"는 점액을 분비 및 이동시키기 위한 상피 내의 섬모원주세포 및 술잔 원주 세포의 기능을 지칭한다. 상피의 점막 섬모 역할은 술잔세포의 증식; 술잔세포의 분화; 점액 분비; 점액 조성의 조절; 및/또는 점액의 움직임 또는 제거를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 비정상적 점막 섬모 생리, 예컨대, 상피의 비정상적 점막 섬모 생리의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 IL-33 길항제가 제공된다.
일 실시형태에서, 비정상적 점막 섬모 생리의 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 IL-33 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서의 비정상적 점막 섬모 생리, 예컨대, 상피의 비정상적 점막 섬모 생리의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.
비정상적 점막 섬모 생리는 상피의 섬모원주세포 또는 술잔세포의 임의의 비정상적 기능을 포함할 수 있다. 적합하게는 비정상적 점막 섬모 생리는 비정상적 점액 생성; 비정상적 술잔세포 분화; 비정상적 술잔세포 증식; 상피의 비정상적 두께; 비정상적 점액 제거; 및/또는 비정상적 점액 조성을 포함한다.
적합하게는 비정상적 점액 생성은 비정상적 MUC5AC 생성을 포함한다. 적합하게는 비정상적 술잔세포 분화는 비정상적 MUC5AC+ 술잔세포 분화를 포함한다. 적합하게는 비정상적 술잔세포 증식은 비정상적 MUC5AC+ 술잔세포 증식을 포함한다. 적합하게는 상피의 비정상적 두께는 상피의 총 조직 면적에서의 비정상적 양의 MUC5AC+ 술잔세포를 포함한다.
적합하게는 비정상적 점막 섬모 생리는 증가된 술잔세포 수; 증가된 점액 생성; 증가된 술잔세포 분화; 상피의 증가된 두께; 및/또는 감소된 점액 제거를 포함한다.
적합하게는 증가된 점액 생성은 증가된 MUC5AC 생성을 포함한다. 적합하게는 증가된 술잔세포 분화는 증가된 MUC5AC+ 술잔세포 분화를 포함한다. 적합하게는 증가된 술잔세포 증식은 증가된 MUC5AC+ 술잔세포 증식을 포함한다. 적합하게는 상피의 증가된 두께는 상피의 총 조직 면적에서의 증가된 양의 MUC5AC+ 술잔세포를 포함한다.
적합하게는 증가된 MUC5AC 생산은 MUC5AC 유전자 발현의 증가에 의해 야기된다. 적합하게는 비정상적 점막 섬모 생리는 상피 세포에서 증가된 MUC5AC 유전자 발현을 포함한다. 적합하게는, 비정상적 점막 섬모 생리는 상피의 술잔세포에서 MUC5AC의 증가된 발현을 포함한다.
적합하게는 비정상적 점막 섬모 생리는 점액 조성의 변화를 포함한다. 이러한 변화는 점액에 함유된 상이한 점액 화합물 비의 증가 또는 감소, 하나 이상의 특정 점액 화합물의 증가 또는 감소, 또는 점액의 농도 또는 두께의 증가 또는 감소를 포함할 수 있다.
점액 조성의 변화는 상이한 뮤신 비의 증가 또는 감소, 예컨대, 뮤신 MUC5AC 및 MUC5B 비의 증가 또는 감소를 포함할 수 있다.
점액 조성의 변화는 뮤신 농도의 증가 또는 감소를 포함할 수 있다. 적합하게는, 점액 조성의 변화는 Mucin 5AC 농도의 감소를 포함한다. 적합하게는, 점액 조성의 변화는 상향조절된 MUC5AC 발현을 갖는 술잔세포 수의 감소를 포함한다.
점액에 함유된 뮤신의 이러한 변화는 본 명세서에 참고로 원용되는 WO2018/204598에 기재된 바와 같이 측정 및 계산될 수 있다.
적합하게는 비정상적 점액 조성은 MUC5AC:MUC5B 비의 증가를 포함한다. 적합하게는 비정상적 점액 조성은 점액에 함유된 MUC5AC의 증가를 포함한다. 적합하게는 비정상적 점액 조성은 점액 두께의 증가를 포함한다.
비정상적 점막 섬모 생리는 상기 증상 중 하나 이상을 조합하여 포함할 수 있다.
적합하게는 비정상적 상피 생리는 비정상적 조직 리모델링, 예컨대, 비정상적 상피 리모델링을 포함한다. 적합하게는 비정상적 상피 생리는 증가된 조직 리모델링을 포함한다. 적합하게는 비정상적 상피 생리는 증가된 상피 리모델링을 포함한다.
비정상적 상피 생리는 상기 증상 중 하나 이상을 조합하여 포함할 수 있다.
비정상적 상피 생리의 치료 또는 예방, 또는 비정상적 점막 섬모 생리의 치료 또는 예방은 하기를 포함할 수 있다:
점막 섬모 제거의 개선 또는 증가;
점액 생성의 감소 또는 저해;
비정상적 점액 조성의 저해;
상피 리모델링의 감소 또는 저해; 및/또는
술잔세포 분화 및/또는 증식의 감소 또는 저해.
적합하게는, 점액 생성의 감소 또는 저해는 MUC5AC 생성의 감소 또는 저해를 포함한다. 적합하게는 따라서, 치료 또는 예방은 MUC5AC 생성을 감소시키거나 저해한다.
적합하게는 비정상적 점액 조성의 저해는 정상 점액 조성을 회복시키는 단계를 포함할 수 있다. 적합하게는 이는 MUC5AC:MUC5B 비를 감소시키는 단계를 포함할 수 있다. 적합하게는 따라서, 치료 또는 예방은 MUC5AC:MUC5B 비를 감소시킨다. 적합하게는, 예방 또는 치료는 점액 중 MUC5AC를 저해 또는 감소시킨다. 적합하게는, 예방 또는 치료는 점액의 두께를 감소시킨다.
적합하게는, 술잔세포 분화 및/또는 증식을 감소 또는 저해시키는 것은 MUC5AC+ 술잔세포 분화 또는 증식을 감소 또는 저해시키는 것을 포함한다. 적합하게는 따라서, 치료 또는 예방은 MUC5AC+ 술잔세포 분화 또는 증식을 감소 또는 저해시킨다.
적합하게는 상피 리모델링을 감소 또는 저해시키는 것은 호흡기 상피의 두께를 감소시키는 것을 포함한다. 적합하게는 따라서, 치료 또는 예방은 호흡기 상피의 두께를 감소시킨다.
적합하게는 상피 리모델링을 감소 또는 저해시키는 것은 상피의 총 조직 면적에서의 MUC5AC+ 술잔세포의 양을 감소시키는 것을 포함한다. 적합하게는 따라서, 치료 또는 예방은 상피의 총 조직 면적에서의 MUC5AC+ 술잔세포의 양을 감소 또는 저해한다.
점막 섬모 제거를 개선 또는 증가시키는 것은 점막 섬모 움직임을 개선 또는 증가시키는 것을 포함한다. 적합하게는 따라서, 치료 또는 예방은 점막 섬모 움직임을 개선 또는 증가시킨다.
적합하게는, 상피는 호흡기 상피이다. 적합하게는, 비정상적 상피 생리는 호흡기 상피에서의 비정상적 상피 생리이다.
일 실시형태에서, 호흡기 질환에서 비정상적 상피 생리의 치료에서 사용하기 위한 IL-33 길항제가 제공된다.
일 실시형태에서, 비정상적 상피 생리의 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 IL-33 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 호흡기 질환을 갖는 환자에서 비정상적 상피 생리의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.
적합한 호흡기 질환은 본 명세서의 다른 곳에 정의되어 있다.
적합하게는, 비정상적 상피 생리는 호흡기 상피에서 비정상적 점막 섬모 생리이다.
일 실시형태에서, 호흡기 상피에서 비정상적 점막 섬모 생리의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 IL-33 길항제가 제공된다.
일 실시형태에서, 호흡기 상피의 비정상적 점막 섬모 생리의 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 IL-33 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 호흡기 상피의 비정상적 점막 섬모 생리의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.
적합하게는, 비정상적 상피 생리는 호흡기 질환에서의 비정상적 점막 섬모 생리이다.
일 실시형태에서, 호흡기 질환에서 비정상적 점막 섬모 생리의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 IL-33 길항제가 제공된다.
일 실시형태에서, 비정상적 점막 생리의 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 IL-33 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 호흡기 질환을 갖는 환자에서 비정상적 점막 생리의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.
적합하게는, 비정상적 상피 생리는 호흡관에 존재한다. 적합하게는, 비정상적 상피 생리는 호흡관의 비정상적 상피 생리이다. 적합하게는, 비정상적 상피 생리는 호흡관의 비정상적 점막 섬모 생리이다.
호흡관은 상부 및 하부 호흡관을 포함한다. 전형적으로, 상부 호흡관은 기강, 부비강, 인두 및 후두를 포함한다. 전형적으로 하부 호흡관은 기관, 기관지, 세기관지, 폐포관 및 폐포를 포함한다.
적합하게는, 비정상적 상피 생리는 하부 호흡관, 예컨대, 기관지의 비정상적 상피 생리이다.
적합하게는, 비정상적 상피 생리는 하부 호흡관의 비정상적 상피 생리이다. 적합하게는, 비정상적 상피 생리는 기관지의 비정상적 상피 생리이다. 적합하게는, 비정상적 하부 호흡관 상피 생리는 하부 호흡관의 비정상적 점막 섬모 생리이다. 적합하게는, 하부 호흡관의 비정상적 점막 섬모 생리는 기관지의 비정상적 점막 섬모 생리이다.
일 실시형태에서, 하부 호흡관의 비정상적 점막 섬모 생리의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 IL-33 길항제가 제공된다.
일 실시형태에서, 하부 호흡관의 비정상적 점막 섬모 생리의 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 IL-33 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 하부 호흡관의 비정상적 점막 섬모 생리의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.
일 실시형태에서, 기관지의 비정상적 점막 섬모 생리의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 IL-33 길항제가 제공된다.
일 실시형태에서, 기관지의 비정상적 점막 섬모 생리의 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 IL-33 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 기관지의 비정상적 점막 섬모 생리의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.
EGFR 신호전달
본 개시내용은 산화된 IL-33이 RAGE에 결합하고, 결국 EGFR과 복합체화하고, 상피 항상성을 방해하는 작용을 한다는 발견에 기반한다. IL-33 길항제의 사용은 산화된 IL-33의 신호전달을 저해할 수 있고, 이에 의해 RAGE의 활성화를 저해하고 RAGE-EGFR 복합체화를 저해한다. 본 명세서에 개시된 데이터는 RAGE-EGFR 복합체의 형성을 방지하는 것이 IL-33-매개 EGFR 신호전달을 방지하고, 정상 상피 생리를 회복시킨다는 것을 입증한다.
적합하게는, IL-33 길항제는 산화된 IL-33 신호전달을 저해한다.
적합하게는, IL-33 길항제는 RAGE에 대한 산화된 IL-33의 결합을 저해한다.
적합하게는, IL-33 길항제는 RAGE-EGFR 복합체의 형성을 저해한다. 적합하게는, IL-33 길항제는 산화된-IL33-RAGE-EGFR 복합체의 형성을 저해한다.
적합하게는, IL-33 길항제는 EGFR의 클러스터링을 저해한다. 적합하게는, IL-33 길항제는 세포막에서 EGFR의 클러스터링을 저해한다. 적합하게는, IL-33 길항제는 EGFR의 내재화를 저해한다. 적합하게는, IL-33 길항제는 세포막 내에서 RAGE 및 EGFR의 공동 국재화를 저해한다. 적합하게는, IL-33 길항제는 RAGE-EGFR 복합체의 내재화를 저해한다.
적합하게는, IL-33 길항제는 EGFR의 활성화를 저해한다. 적합하게는, IL-33 길항제는 EGFR의 인산화를 저해한다.
적합하게는, IL-33 길항제는 RAGE-EGFR 매개 효과를 저해한다. 적합하게는, IL-33 길항제는 RAGE-EGFR 복합체에 의해 매개된 효과를 저해한다. 적합하게는, IL-33 길항제는 산화된 IL33-RAGE-EGFR 복합체에 의해 매개된 효과를 저해한다.
적합하게는, IL-33 길항제는 EGFR 신호전달을 저해한다. 적합하게는, IL-33 길항제는 RAGE-EGFR 신호전달을 저해한다. 적합하게는, IL-33 길항제는 산화된-IL33-RAGE-EGFR 신호전달을 저해한다.
적합하게는, IL-33 길항제는 RAGE에 대한 산화된 IL-33의 결합을 저해하고, 이에 의해 RAGE-EGFR 복합체화를 저해함으로써, RAGE-EGFR 매개 효과, 예컨대, 하류의 신호전달을 저해한다.
적합하게는, IL-33 길항제는 IL-33-매개 EGFR 효과를 저해한다. 적합하게는, IL-33 길항제는 IL-33-매개 EGFR 신호전달을 저해한다. 적합하게는, IL-33 길항제는 산화된 IL-33-매개 EGFR 효과를 저해한다. 적합하게는, IL-33 길항제는 산화된 IL-33-매개 EGFR 신호전달을 저해한다. 적합하게는, IL-33 길항제는 산화된 IL-33-매개 RAGE-EGFR 효과를 저해한다. 적합하게는, IL-33 길항제는 산화된 IL-33-매개 RAGE-EGFR 신호전달을 저해한다.
적합하게는 RAGE-EGFR 매개 효과는 RAGE-EGFR 복합체에 의해, 적합하게는 산화된 IL-33-RAGE-EGFR 복합체에 의해 야기된다.
적합하게는 이러한 효과는 전형적으로는 본 명세서에서 EGFR 신호전달 또는 RAGE-EGFR 신호전달로서 지칭될 수 있는 하류의 신호전달을 포함할 수 있다. 적합하게는 이러한 EGFR 신호전달은 인산화 및/또는 케모카인 방출을 포함할 수 있다.
적합하게는 이러한 EGFR 신호전달은 EGFR의 인산화 및 EGFR 경로에서의 성분, 예컨대, EGFR, PLC, JNK, MAPK/ERK 1/2, p38 및 STAT5의 후속적 인산화를 포함한다. 적합하게는 EGFR 신호전달은 타이로신 키나제, 예컨대, JNK, MAPK/ERK, p38의 인산화를 포함한다.
적합하게는 EGFR 신호전달은 케모카인, 예컨대, IL-8의 증가된 방출을 포함한다.
따라서, 적합하게는, IL-33 길항제는 EGFR 매개 인산화 및/또는 케모카인 방출을 저해한다.
따라서, 적합하게는, IL-33 길항제는 EGFR 경로에서 성분의 인산화를 저해한다. 적합하게는, IL-33 길항제는 EGFR, PLC, JNK, MAPK/ERK 1/2, p38 및 STAT5 중 어느 하나의 인산화를 저해한다. 적합하게는, IL-33 길항제는 EGFR, PLC, JNK, MAPK/ERK 1/2, p38 및 STAT5 중 어느 하나의 EGFR-매개 인산화를 저해한다. 적합하게는, IL-33 길항제는 타이로신 키나제의 인산화를 저해한다. 적합하게는, IL-33 길항제는 JNK, MAPK/ERK, p38로부터 선택된 타이로신 키나제의 인산화를 저해한다. 적합하게는, IL-33 길항제는 JNK, MAPK/ERK 및 p38로부터 선택된 타이로신 키나제의 EGFR-매개 인산화를 저해한다.
따라서, 적합하게는, IL-33 길항제는 케모카인의 방출을 저해한다. 적합하게는, IL-33 길항제는 IL-8의 방출을 저해한다. 적합하게는, IL-33 길항제는 케모카인의 EGFR-매개 방출을 저해한다. 적합하게는, IL-33 길항제는 IL-8의 EGFR-매개 방출을 저해한다.
일 실시형태에서, EGFR-매개 질환의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 IL-33 길항제가 제공된다.
다른 실시형태에서, IL-33 길항제는 EGFR-매개 효과를 저해하는 것에 의한 호흡기 질환의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 것일 수 있다.
더 나아가, IL-33 길항제는 EGFR-매개 질환에서의 비정상적 상피 생리의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 것일 수 있다.
일 실시형태에서, 비정상적 상피 생리를 개선시키는 것에 의해 EGFR-매개 질환의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 IL-33 길항제가 제공된다.
적합하게는, EGFR-매개 질환은 RAGE-EGFR 매개 질환이다.
적합하게는, EGFR-매개 효과는 RAGE-EGFR 매개 효과이다.
적합하게는, EGFR-매개 효과는 RAGE-EGFR 매개 신호전달이다.
적합하게는, IL-33 길항제는 EGFR 매개 효과를 저해한다. 적합하게는, IL-33 길항제는 EGFR-매개 효과를 저해함으로써 질환 또는 병태를 치료하거나 예방한다.
적합하게는, IL-33 길항제는 RAGE-EGFR 매개 효과를 저해한다. 적합하게는, IL-33 길항제는 RAGE-EGFR-매개 효과를 저해함으로써 질환 또는 병태를 치료하거나 예방한다.
본 명세서에 열거되는 바와 같은 "RAGE-EGFR 매개 효과"는 세포막에서 EGFR과 RAGE의 복합체화 및 얻어진 비정상적 EGFR 활성에 의해 야기되는 임의의 생리학적 효과를 지칭한다. RAGE-EGFR 매개 효과는 또한 본 명세서에서 'RAGE-EGFR 신호전달' 선택적으로 'RAGE-EGFR 매개 신호전달'을 포함하고/하거나 이들로 지칭될 수 있다. 이러한 RAGE-EGFR 매개 효과는 전형적으로 상피에서 보이며, 비정상적 상피 생리로서 존재한다. 비정상적 상피 생리는 본 명세서에서 상기 정의되지만, 장벽 무결성(barrier integrity); 조직과 강 사이의 화학물질 독립체의 조절 및 교환; 강 내로의 화학물질의 분비; 및 감각에 대해 부정적인 효과를 포함할 수 있다.
적합하게는, RAGE-EGFR 매개 질환 및/또는 효과는 비정상적 EGFR 활성을 특징으로 한다. 적합하게는, RAGE-EGFR 매개 질환 및/또는 효과는 비정상적 RAGE-EGFR 신호전달을 특징으로 한다. 적합하게는 RAGE-EGFR 매개 효과 및/또는 RAGE-EGFR 신호전달은 RAGE-EGFR 매개 질환의 특징이다.
적합하게는 RAGE-EGFR 매개 질환은 비정상적 상피 생리를 특징으로 하는 질환일 수 있다.
적합하게는 RAGE-EGFR 매개 질환은 호흡기 상피에서의 비정상적 상피 생리를 특징으로 하는 질환일 수 있다.
적합하게는 RAGE-EGFR 매개 질환은 비정상적 점막 섬모 생리를 특징으로 하는 질환일 수 있다.
적합하게는 RAGE-EGFR 매개 질환은 호흡기 상피에서의 비정상적 점막 섬모 생리를 특징으로 하는 질환일 수 있다.
적합한 RAGE-EGFR 매개 질환은 본 명세서에서 이하에 정의되는 호흡기 질환 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다.
호흡기 질환
본 개시내용은 상피 생리를 개선시킴으로써 또는 EGFR-매개 효과를 조절함으로써, 적합하게는, EGFR-매개 효과를 저해함으로써, 적합하게는, RAGE/EGFR-매개 효과를 저해함으로써 호흡기 질환의 예방 또는 치료를 위한 IL-33 길항제의 의학적 용도에 관한 것이다.
적합하게는, 비정상적 상피 생리는 호흡기 질환의 증상일 수 있다. 적합하게는 따라서, IL-33 길항제는 비정상적 상피 생리를 특징으로 하는 호흡기 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 것일 수 있다.
추가 실시형태에서 정의되는 바와 같이, 상피 생리를 개선시키는 것에 의한 호흡기 질환의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 IL-33 길항제가 제공된다.
비정상적 상피 생리는 본 명세서의 다른 곳에 정의된다.
적합하게는 상피 생리를 개선시키는 것은 비정상적 상피 생리를 개선시키는 것을 포함할 수 있다.
비정상적 상피 생리를 개선시키는 적합한 수단은 본 명세서에서 상기에 기재되어 있다.
적합하게는 비정상적 상피 생리를 개선시키는 것에 의한 호흡기 질환의 치료는 하기를 포함할 수 있다:
점막 섬모 제거의 개선 또는 증가;
점액 생성의 감소 또는 저해;
비정상적 점액 조성의 저해;
비정상적 상피 리모델링의 감소 또는 저해; 및/또는
술잔세포 분화 또는 증식의 감소 또는 저해.
이들 효과 각각에 대한 추가적인 상세한 설명은 비정상적 상피 생리의 치료 또는 예방에 관해 본 명세서에서 상기 제공되며, 본 명세서에서 호흡기 질환의 치료와 조합될 수 있다.
적합하게는, 비정상적 EGFR 활성은 호흡기 질환의 증상일 수 있다. 적합하게는 따라서, IL-33 길항제는 비정상적 EGFR 활성을 특징으로 하는 호흡기 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 것일 수 있다.
추가 실시형태에서 정의되는 바와 같이, EGFR-매개 효과를 저해하는 것에 의한 호흡기 질환의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 IL-33 길항제가 제공된다.
EGFR-매개 효과는 본 명세서의 다른 곳에 정의되어 있다.
적합하게는, 호흡기 질환은 하부 호흡기 질환이고, 적합하게는 호흡기 질환은 기관, 기관지, 세기관지, 폐포관 및/또는 폐포에 영향을 미치는 질환이다. 적합하게는, 호흡기 질환은 기관지 질환이다.
적합하게는, 호흡기 질환은 COPD, 기관지염, 폐기종, 기관지 확장증, 예컨대, CF-기관지확장증 또는 비-CF-기관지확장증, 천식, 천식과 COPD의 중복(ACO)으로부터 선택될 수 있다.
적합하게는, 호흡기 질환은 COPD이다. 적합하게는, 호흡기 질환은 기관지염성 COPD이다. 기관지염성 COPD는 만성 기관지염이 COPD를 갖는 환자에 존재하는 COPD의 특정 형태이다. 기관지염성 COPD는 더 빠른 폐 기능 저하, 증가된 증상 및 2차 감염의 증가된 위험으로 인해 COPD를 갖는 환자보다 환자에서의 더 큰 사망률을 야기한다. 특히, 기관지염성 COPD 환자는 보다 높은 총 뮤신 농도 및 점액질 과다분비를 갖는다. 따라서, 기관지염성 COPD 환자는 IL-33 길항제가 EGFR 활성을 저해하고 점막 섬모 생리를 개선시킨다는 발견에 의해 IL-33 길항제에 의한 치료로부터 특히 유익을 얻을 수 있다.
적합하게는, 동일한 이유로, 호흡기 질환은 기관지염성 천식일 수 있다.
일 실시형태에서, 기관지염성 COPD의 예방 또는 치료를 위한 IL-33 길항제가 제공된다.
일 실시형태에서, 기관지염성 COPD의 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 IL-33 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서의 기관지염성 COPD의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.
ST2 신호전달
본 개시내용은 RAGE-EGFR 매개 신호전달 및 효과를 저해하는 IL-33 길항제의 의학적 용도에 관한 것이지만, IL-33 길항제가 ST2-매개 신호전달 및 효과를 저해할 수 있다는 것은 이미 알려져 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 의학적 용도는 EGFR-매개 효과와 ST2-매개 효과 둘 다의 조절을 예상한다.
적합하게는, IL-33 길항제는 EGFR-매개 효과 및 ST2-매개 효과를 조절하는 것에 의한 비정상적 상피 생리의 예방 및 치료에서 사용하기 위한 것이다. 적합하게는, IL-33 길항제는 EGFR-매개 효과 및 ST2-매개 효과를 저해하는 것에 의한 비정상적 상피 생리의 예방 및 치료에서 사용하기 위한 것이다. 적합하게는, IL-33 길항제는 RAGE/EGFR-매개 효과 및 ST2-매개 효과를 저해하는 것에 의한 비정상적 상피 생리의 예방 및 치료에서 사용하기 위한 것이다. 비정상적 상피 생리는 본 명세서의 다른 곳에 정의된 바와 같다.
적합하게는, IL-33 길항제는 EGFR-매개 효과 및 ST2-매개 효과를 조절하는 것에 의해 EGFR-매개 질환의 예방 및 치료에서 사용하기 위한 것이다. 적합하게는, IL-33 길항제는 EGFR-매개 효과 및 ST2-매개 효과를 저해함으로써 EGFR-매개 질환의 예방 및 치료에서 사용하기 위한 것이다. 적합하게는, IL-33 길항제는 RAGE/EGFR-매개 효과 및 ST2-매개 효과를 저해함으로써 EGFR-매개 질환의 예방 및 치료에서 사용하기 위한 것이다. EGFR-매개 질환은 본 명세서의 다른 곳에 정의되어 있다.
적합하게는, ST2-매개 효과는 염증을 포함한다. 적합하게는, 따라서 IL-33 길항제는 EGFR-매개 효과 및 ST2-매개 효과를 조절함으로써 ST2-매개 질환의 예방 및 치료에서 사용하기 위한 것이다. 적합하게는, IL-33 길항제는 EGFR-매개 효과 및 ST2-매개 효과를 저해함으로써 ST2-매개 질환의 예방 및 치료에서 사용하기 위한 것이다. 적합하게는, IL-33 길항제는 RAGE/EGFR-매개 효과 및 ST2-매개 효과를 저해함으로써 ST2-매개 질환의 예방 및 치료에서 사용하기 위한 것이다. 적합한 ST2 매개 질환은 염증을 특징으로 하는 질환을 포함할 수 있다. 적합한 ST2 매개 질환은 염증 질환을 포함할 수 있다.
ST2-매개 질환 또는 염증 질환은 하기를 포함할 수 있다: COPD; 알레르기 장애, 예컨대, 천식, 만성 비부비동염, 식품 알레르기, 습진 및 피부염; 섬유증식성 질환, 예컨대, 폐 섬유증; 폐 호산구증가증; 흉막 악성종양; 류마티스성 관절염, 콜라겐 혈관 질환; 죽상경화성 혈관 질환; 두드러기; 염증성 장 질환; 크론병; 셀리악병; 전신 홍반성 루푸스; 진행성 전신 경화증; 베게너 육아종; 패혈성 쇼크; 및 베체트병.
적합하게는, ST2-매개 질환 또는 염증 질환은 호흡기 질환이다. 적합하게는, ST2-매개 질환 또는 염증 질환은 상기 정의한 바와 같은 호흡관에 존재한다.
적합하게는, IL-33 길항제는 추가적으로 염증 또는 염증 질환의 예방 및 치료에서 사용하기 위한 것이다. 적합하게는, IL-33 길항제는 추가적으로 ST2-매개 염증 또는 ST2-매개 염증 질환의 예방 및 치료에서 사용하기 위한 것일 수 있다.
적합하게는, ST2-매개 질환과 EGFR-매개 질환은 중복된다. 다시 말해서, ST2-매개 효과 및 EGFR-매개 효과, 적합하게는 RAGE-EGFR-매개 효과는 질환 병리의 원인이 된다. 유리하게는, 단일 IL-33 길항제의 의학적 용도는 IL-33에 의한 RAGE와 ST2 활성화를 둘 다 저해할 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서, 단일 IL-33 길항제는 동시에 RAGE-EGFR 매개 질환과 ST2 매개 질환을 둘 다 치료할 수 있다.
일 실시형태에서, 비정상적 상피 생리 및 염증의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 IL-33 길항제가 제공된다. 일 실시형태에서, 유효량의 IL-33 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서의 비정상적 상피 생리 및 염증의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.
적합하게는, 비정상적 상피 생리 및 염증은 호흡기 질환의 증상일 수 있다. 따라서, 이들 증상의 치료 및 예방에 관한 언급은 호흡기 질환과 관련될 수 있으며, 적합하게는 호흡기 질환에서 비정상적 상피 생리 및 염증의 치료 또는 예방을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, EGFR-매개 질환 및 ST2-매개 질환의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 IL-33 길항제가 제공된다.
일 실시형태에서, 유효량의 IL-33 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서의 EGFR-매개 질환 및 ST2매개 질환의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.
적합하게는, IL-33 길항제는 환원된 IL-33 길항제이다. 적합하게는, 환원된 IL-33 길항제는 본 명세서에서 상기 정의된 바와 같다.
적합하게는, IL-33 길항제는 본 명세서에서 상기 정의된 바와 같다. 적합하게는, IL-33 길항제는 33_640087-7B이다.
대안적으로, 상이한 IL-33 길항제는 IL-33에 의한 RAGE와 ST2 활성화를 둘 다 저해하는 병용요법으로서 사용될 수 있었다. 따라서, IL-33 길항제의 조합은 RAGE-EGFR 매개 질환과 ST2 매개 질환을 둘 다 동시에 치료하는 것으로 예상된다.
적합하게는, 호흡기 질환은 본 명세서에서 상기 정의된 바와 같다. 적합하게는, 호흡기 질환은 비정상적 EGFR 활성 및 비정상적 ST2 활성을 특징으로 한다.
적합하게는, 따라서, 일 실시형태에서, 염증의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 제2 IL-33 길항제와 병용하는 비정상적 상피 생리의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 제1 IL-33 길항제가 제공된다.
적합하게는, 따라서, 일 실시형태에서, 유효량의 제2 IL-33 길항제와 병용하여 유효량의 제1 IL-33 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 비정상적 상피 생리 및 염증의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.
적합하게는, 따라서, 일 실시형태에서, ST2-매개 질환의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 제2 IL-33 길항제와 병용하는 EGFR 매개 질환의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 제1 IL-33 길항제가 제공된다.
적합하게는, 따라서, 일 실시형태에서, 유효량의 제2 IL-33 길항제와 병용하여 유효량의 제1 IL-33 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 EGFR-매개 질환 및 ST2-매개 질환의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.
적합하게는, 제1 IL-33 길항제는 비정상적 상피 생리 및/또는 EGFR-매개 질환의 예방 또는 치료를 위한 것이다.
적합하게는, 제2 IL-33 길항제는 염증 및/또는 ST2-매개 질환의 예방 또는 치료를 위한 것이다.
적합하게는, 제1 IL-33 길항제와 제2 IL-33 길항제는 상이하다.
적합하게는, 제1 IL-33 길항제는 본 명세서에서 상기 정의된 바와 같다. 적합하게는, 제2 IL-33 길항제는 ST2 매개 효과를 저해하는 것으로 알려진 임의의 다른 IL-33 길항제일 수 있다. 적합하게는, 제2 IL-33 길항제는 또한 본 명세서에서 상기에 정의되어 있다.
적합하게는, 제1 길항제는 환원 또는 산화된 IL-33 길항제일 수 있다. 적합하게는, 제2 IL-33 길항제는 환원된 IL-33 길항제이다.
적합하게는 IL-33 길항제 중 적어도 하나는 33_640087-7B이다. 적합하게는, 제1 길항제는 33_640087-7B이다.
적합하게는, 제1 IL-33 길항제와 제2 IL-33 길항제는 병용하여 투여될 수 있다. 적합하게는, 제1 IL-33 길항제와 제2 IL-33 길항제는 동시에 또는 상이한 시간에 병용하여 투여될 수 있다. 적합한 투약 요법은 의료 전문가에 의해 결정될 수 있다.
이들 언급은 ST-2 매개 질환이 또한 예방 또는 치료될 수 있는 상기 언급한 의학적 용도/치료 방법에 동일하게 적용한다.
대안적으로, 추가 실시형태에서, IL-33 길항제는 ST2 저해제와 병용하여 투여될 수 있다. 적합하게는, ST2 저해제는 IL-33 길항제가 아닐 수도 있지만, ST2 수용체를 다른 수단에 의해 저해할 수 있다. 적합하게는, ST2 저해제는 상기 확인한 바와 같은 ST2-매개 질환을 치료 또는 예방하는 작용을 할 수 있다.
따라서, 일 실시형태에서, 염증의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 ST2 저해제와 병용하여 비정상적 상피 생리의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 IL-33 길항제가 제공된다.
일 실시형태에서, 유효량의 ST2 저해제와 병용하여 유효량의 IL-33 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 비정상적 상피 생리 및 염증의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.
적합하게는, 비정상적 상피 생리 및 염증은 호흡기 질환의 증상일 수 있다. 따라서, 이들 증상의 치료 및 예방에 관한 언급은 호흡기 질환과 관련될 수 있으며, 호흡기 질환에서 비정상적 상피 생리 및 염증의 치료 또는 예방을 적합하게 포함할 수 있다.
따라서, 일 실시형태에서, ST2-매개 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 ST2 저해제와 병용하여 EGFR-매개 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 IL-33 길항제가 제공된다.
일 실시형태에서, 유효량의 ST2 저해제와 병용하여 유효량의 IL-33 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 ST2-매개 질환과 병용하는 EGFR-매개 질환의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.
적합하게는, IL-33 길항제는 본 명세서의 다른 곳에 정의된 바와 같다. 적합한 EGFR-매개 질환 및 ST2-매개 질환은 본 명세서의 다른 곳에 정의되어 있다.
적합하게는, ST2 저해제는 당업계에 공지된 임의의 이러한 저해제, 예를 들어, GSK3772847 (WO2013/165894에 기재됨) 및 RG6149(WO2013/173761)일 수 있으며, 이들 둘 다 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
적합하게는, IL-33 길항제 및 ST2 저해제는 병용하여 투여될 수 있다. 적합하게는, IL-33 길항제 및 ST2 저해제는 동시에 또는 상이한 시점에 병용하여 투여될 수 있다. 적합한 투약 요법은 의료 전문가에 의해 결정될 수 있다.
환자
방법 및 의학적 용도는 환자 또는 대상체에 관해 실행된다. 환자는 생리적 병태 또는 질환, 예컨대, 비정상적 상피 생리, EGFR 매개 질환 또는 호흡기 질환에 대한 확인, 진단 또는 치료를 필요로 하는 대상일 수 있다.
적합하게는, 환자는 인간일 수 있다. 환자는 의료 진료를 받고 있거나, 또는 의료 진료를 요청하는 개체일 수 있다. 적합하게는, 환자는 남성 또는 여성이다. 적합하게는, 환자는 성인 또는 아동이다.
적합하게는 본 명세서에 기재된 방법에서, 적합한 환자는 비정상적 상피 생리, 또는 EGFR 매개 질환, 또는 호흡기 질환을 갖는 것으로 여겨지는 대상일 수 있다. 예를 들어, 적합한 환자는 이러한 병태와 일치되는 증상을 가질 수 있다.
대안적으로, 본 명세서에 기재된 방법과 관련하여 적합한 환자는 비정상적 상피 생리 또는 EGFR 매개 질환 또는 호흡기 질환이 발생될 위험에 있는 것으로 여겨지는 대상일 수 있다. 예를 들어, 이러한 환자는 이러한 병태를 앓고 있는 개체와 접촉했을 수 있거나, 관련된 병태를 앓을 수 있거나, 또는 흡연, 노환, 알레르기와 같은 상기 병태와 연관된 위험 인자를 충족할 수 있다.
실시형태
본 개시내용의 부분은 다음의 실시형태를 특징으로 할 수 있다:
실시형태 1은 EGFR-매개 효과를 저해하는 것에 의한 질환의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 IL-33 길항제를 기재한다.
실시형태 2는 실시형태 1에 있어서, 상기 EGFR-매개 효과는 RAGE-EGFR-매개 효과인, 용도를 위한 IL-33 길항제를 기재한다.
실시형태 3은 실시형태 1 또는 2에 있어서, EGFR-매개 효과는 RAGE-EGFR-매개 신호전달인, 용도를 위한 IL-33 길항제를 기재한다.
실시형태 4는 실시형태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 질환은 호흡기 질환인, 용도를 위한 IL-33 길항제를 기재한다.
실시형태 5는 실시형태 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 질환은 비정상적 상피 생리 및/또는 비정상적 EGFR 활성을 특징으로 하는, 용도를 위한 IL-33 길항제를 기재한다.
실시형태 6은 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 질환은 COPD, 기관지염, 폐기종, 기관지확장증, 예컨대, CF-기관지확장증 또는 -CF-기관지확장증, 천식 또는 천식과 COPD의 중복(ACO)으로부터 선택된, 용도를 위한 IL-33 길항제를 기재한다.
실시형태 7은 실시형태 4 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 호흡기 질환은 기관지염성 COPD인, 용도를 위한 IL-33 길항제를 기재한다.
실시형태 8은 실시형태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 점액 제거를 개선시키고/시키거나; 비정상적 점액 생성을 저해하고/하거나; 비정상적 상피 리모델링을 저해하고/하거나 비정상적 술잔세포 분화를 저해하는, 용도를 위한 IL-33 길항제를 기재한다.
실시형태 9는 선행하는 실시형태 중 임의의 것에 있어서, 상기 IL-33 길항제는 산화된 IL-33의 활성을 저해하는, 용도를 위한 IL-33 길항제를 기재한다.
실시형태 10은 선행하는 실시형태 중 임의의 것에 있어서, 상기 IL-33 길항제는 RAGE에 대한 산화된 IL-33의 결합을 방지하여, RAGE-EGFR 신호전달을 저해하는, 용도를 위한 IL-33 길항제를 기재한다.
실시형태 11은 선행하는 실시형태 중 임의의 것에 있어서, 상기 IL-33 길항제는 항-IL-33 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 바람직하게는 항-환원된-IL-33 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 용도를 위한 IL-33 길항제를 기재한다.
실시형태 12는 실시형태 11에 있어서, 항-IL-33 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 1로부터 선택된 가변 중쇄 도메인(VH) 및 가변 경쇄 도메인(VL) 쌍의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는, 용도를 위한 IL-33 길항제를 기재한다.
실시형태 13은 실시형태 12에 있어서, 항-IL-33 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 1로부터 선택된 가변 중쇄 도메인(VH) 및 가변 경쇄 도메인(VL) 쌍을 포함하는, 용도를 위한 IL-33 길항제를 기재한다.
실시형태 14는 실시형태 11 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 항-IL-33 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 37의 서열을 갖는 VHCDR1, 서열번호 38의 서열을 갖는 VHCDR2, 서열번호 39의 서열을 갖는 VHCDR3, 서열번호 40의 서열을 갖는 VLCDR1, 서열번호 41의 서열을 갖는 VLCDR2 및 서열번호 42의 서열을 갖는 VLCDR3을 포함하는, 용도를 위한 IL-33 길항제를 기재한다.
실시형태 15는 실시형태 11 내지 14 중 어느 하나에 있어서, IL-33 길항제는 서열번호 1의 서열의 VH 도메인 및 서열번호 19의 서열의 VL 도메인을 포함하는 항-IL33 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, 용도를 위한 IL-33 길항제를 기재한다.
실시형태는, 예로서, 다음의 도면을 참조로 하여 기재될 것이다:
도 1: MAP 키나제 인산화 항체 어레이 상에서 검출 어레이 각각에 대해 비처리 대조군에 비교되는 키나제 인산화의 배수 증가의 그레이스케일 히트맵을 나타낸다. 환원된 IL-33(각각 IL-33-01 및 IL-33-16)은 기준선 초과의 임의의 신호를 야기하지 않았다. oxIL-33(산화된 IL-33-01)은 여러 키나제에서 증가된 인산화를 야기하였다;
도 2: 수용체 타이로신 키나제(RTK) 활성 어레이 상에서의 각 자극 상태에 대한 신호 패턴을 나타낸다. oxIL-33은 상피 성장 인자 수용체(EGFR)에 대응하는 RTK 어레이 상의 양성 신호를 촉발하였지만, 환원된 IL33-01 및 IL33-16 각각은 그렇지 않다. 도트 강도는 수용체 타이로신 키나제 인산화와 상관 관계가 있다;
도 3a: 정상 인간 기관지 상피(NHBE) 세포에서 pEGFR(Tyr1068) 활성이 IL-33 또는 EGFR 리간드의 농도가 증가됨에 따라 자극되었다는 것을 나타낸다. oxIL-33은 EGF, HB-EGF 및 TGFα와 유사하게 EGFR의 인산화를 촉진시켰지만, 환원된 IL-33(IL33-01)은 그렇지 않았다;
도 3b: A549 세포에서의 pEGFR(Tyr1068) 활성이 IL-33 또는 EGFR 리간드의 농도가 증가됨에 따라 자극되었다는 것을 나타낸다. oxIL-33(산화된 IL-33-01)은 NHBE 세포에서 보이는 것과 유사한 패턴으로 EGF, HB-EGF 및 TGFα와 유사하게 EGFR의 인산화를 촉진시켰지만, 환원된 IL-33(IL-33-01)은 그렇지 않았다.
도 3c: A549 세포에서의 pEGFR(Tyr1068) 활성이 IL-33, EGFR 리간드 또는 RAGE 리간드의 농도가 증가됨에 따라 자극되었다는 것을 나타낸다. oxIL-33은 EGF와 유사하게 EGFR의 인산화를 촉진시켰지만, 야생형(WT) IL-33(IL-33-01), C->S 돌연변이된(mut) IL-33(IL-33-16) 또는 RAGE 리간드는 그렇지 않았다;
도 4: 산화된 IL-33이 웨스턴 블롯에 의해 분석된 바와 같은 EGFR 경로(EGFR, PLC, AKT, JNK, ERK 1/2, p38)에 관련된 여러 분자의 인산화를 유도한다는 것을 나타낸다;
도 5: oxIL-33-01에 의해 유도된 STAT5 인산화가 아이소타입 대조군에 비해 증가하는 용량의 항-EGFR 항체에 의해 감소된다는 것을 나타낸다;
도 6: 항-EGFR에 의한 면역침전 후에 웨스턴 블롯에 의한 EGFR, RAGE 또는 IL-33의 검출을 나타낸다. IL-33 및 RAGE는 oxIL-33에 의한 NHBE 자극 후 EGFR과 함께 공동침전하였고, 이는 이들이 복합체를 형성한다는 것을 시사한다. RAGE는 EGF에 비해 oxIL-33 신호전달 복합체에 대해 고유한 것으로 나타난다;
도 7a: oxIL-33이 RAGE에 직접 결합한다는 것을 나타낸다. HMGB1은 알려진 RAGE 리간드이며, 본 연구에서 양성 대조군으로서 작용한다;
도 7b: oxIL-33이 EGFR에 직접 결합하지 않는다(그러나 알려진 EGFR 리간드 EGF는 직접 결합한다)는 것을 나타낸다. 그러나, RAGE가 oxIL-33과 조합하여 이 분석에 첨가될 때, EGFR 결합이 보인다;
도 8: 항-EGFR 또는 항-RAGE에 의한 면역침전 다음에, 표시된 시점에 oxIL-33에 의한 활성화 후 야생형 및 RAGE-결핍 A549 세포에서의 EGFR, RAGE 및 IL-33에 대한 웨스턴 블롯을 나타낸다;
도 9: oxIL-33-01에 의해 유도되는 STAT5 인산화는 항-RAGE 항체에 의해 감소되지만 항-ST2 항체에 의해서는 그렇지 않다는 것을 나타낸다;
도 10: EGF 및 산화된 IL33(oxIL33)은 EGFR-GFP A549 세포에서의 EGFR 클러스터링 및 내재화를 유도한다는 것을 나타낸다. 자극 5분 후의 대표적인 이미지를 나타낸다. 히스토그램은 EGF 및 oxIL-33으로 처리한 세포에서 비클러스터링된 영역에서 EGFR의 고갈(히스토그램 종 형상 피크의 좌측 이동), 및 클러스터링에 의해 야기되는, 이들 세포에서의 포화된 픽셀의 증가된 수(강도 255)를 나타낸다.
도 11: 배지 단독(비자극 대조군), 30 ng/㎖ IL-33-01, 30 ng/㎖ IL-33-16, 30 ng/㎖의 산화된 IL-33 또는 30 ng/㎖ EGF에 의한 24시간 자극 후에 NHBES 및 DHBE에 의한 IL-8 분비의 배수 증가를 나타낸다. 막대 다이어그램은 4명의 NHBE 및 3명의 DHBE 공여자로부터의 평균 및 SEM을 나타낸다;
도 12a: 환원된 IL-33, oxIL-33 또는 EGF에 의한 처리 후 A549 세포에 대한 상대 상처 치유 밀도를 나타낸다. 막대 다이어그램은 조건 당 6개의 기술적 복제물로부터의 평균 및 SEM을 나타낸다;
도 12b: 환원된 IL-33, oxIL-33 또는 EGF에 의한 처리 후 NHBE 세포에 대한 상대 상처 치유 밀도를 나타낸다. 막대 다이어그램은 조건 당 6개의 기술적 복제물로부터의 평균 및 SEM을 나타낸다;
도 13: 배지 단독(비자극 대조군), 환원된 IL-33, 산화된 IL-33, 또는 항-ST2, 항-RAGE 또는 항-EGFR의 존재 하에 산화된 IL-33으로 처리된 NHBE 세포의 긁힌 상처 치유 봉합 백분율을 나타낸다. 막대 다이어그램은 조건 당 6개의 기술적 복제물로부터의 평균 및 SEM을 나타낸다;
도 14: 산화된 IL-33에 의한 자극에 의해 그리고 이러한 자극 없이, 건강한 대상체, 흡연자 및 COPD로부터의 인간 기관지 상피 세포에서의 상대 상처 치유 밀도를 나타낸다;
도 15: IgG1 대조군, 항-IL-33(33_640087-7B), 항-RAGE(M4F4) 및 항-ST2로 처리한 DHBE COPD 세포(n=5 공여자) 및 DHBE에 비해 NHBE 세포(n=5 공여자)의 24시간(%)에서의 상처 봉합을 나타낸다. 막대 다이어그램은 n=5 개개 공여자로부터의 평균 및 SEM을 나타낸다;
도 16a: 건강한 공여자로부터 유래된 ALI 배양물로부터의 기저세포(p63+; 청색), 섬모세포(알파 튜불린; 보라색) 및 술잔세포(Mucin5ac+MucinB; 황색)의 대표적인 면역조직화학 염색을 나타낸다.
도 16b: 항-IL-33(33_640087-7B) 또는 아이소타입 대조군 항체에 의한 처리 7일 후에 HALO 소프트웨어를 이용한 다양한 상피 세포 유형의 면역조직화학의 정량화를 나타낸다; 나타낸 데이터는 n=2 내지 3명의 개개 공여자로부터의 평균 및 SEM을 나타낸다.
도 16c: 항-IL-33(33_640087-7B) 또는 아이소타입 대조군 항체에 의한 처리 7일 후에 HALO 소프트웨어를 이용한 술잔세포의 정량화를 나타낸다; 나타낸 데이터는 n=2 내지 3명의 개개 공여자로부터의 평균 및 SEM을 나타낸다.
도 17: 건강체(1명의 공여자) 또는 COPD(1명의 공여자)로부터 유래된 ALI 배양물에서의 개개 뮤신(뮤신5AC 및 뮤신5B)에 대한 염색 및 항-IL-33(33_640087-7B)에 의한 처리 7일 후 COPD 배양물에서의 뮤신 염색 감소를 나타낸다.
도 18: 처리 없음에 비해 항-IL-33으로 처리한 개개 공여자로부터의 COPD ALI 배양물에서 발견되는 상이한 비율의 세포 아형을 도시하는 tSNE 플롯을 나타낸다.
도 19a: 정상 공여자로부터의 ALI 배양물에서 술잔세포를 검출하는 대표적인 유세포분석 등고선 플롯을 나타낸다. Muc5B는 x-축 상에 있으며, Muc5AC는 y-축 상에 있다. ALI 배양물을 7일 동안 단백질로 처리하였다. 환원된 IL-33(IL-33[C->S])에 의한 처리는 술잔세포를 기준선 초과로 증가시키지 않았다. oxIL-33(산화된 IL-33-01)은 IL-13과 같이 증가된 술잔세포 백분율을 야기하였다. IL-13은 ALI 배양물에서 술잔세포를 증가시키는 것으로 알려져 있고, 본 연구에서 양성 대조군으로서 사용된다. 사분면의 수는 총 집단의 백분율을 나타낸다: 상단 좌측 사분면에 Muc5AC 단일-양성 술잔세포, 하단 우측 사분면에 Muc5B 단일-양성 술잔세포 및 Muc5AC 및 상단-우측 사분면에 Muc5B 이중-양성 술잔세포.
도 19b: 총 상피 집단에 대해 술잔세포(Muc5AC 단일-양성, Muc5B 단일-양성 및 Muc5AC 및 Muc5B 이중-양성 술잔세포를 조합) 백분율을 나타내는 정상 공여자(n=6)로부터의 ALI 배양물로부터의 조합된 유세포분석 데이터를 나타낸다. 환원된 IL-33(IL-33[C->S])은 술잔세포를 기준선 초과로 증가시키지 않았다. oxIL-33(산화된 IL-33-01)은 IL-13과 같이 술잔세포 백분율의 증가를 야기하였다. 바이올린 플롯은 모든 데이터 지점 및 중위값을 나타낸다.
도 19c: Muc5AC 단일-양성 술잔세포를 나타내는 정상 공여자(n=6)로부터의 ALI 배양물로부터의 조합된 유세포분석 데이터를 나타낸다. 환원된 IL-33(IL-33[C->S])은 술잔세포를 기준선 초과로 증가시키지 않았다. oxIL-33(산화된 IL-33-01)은 IL-13과 같이 술잔세포 백분율의 증가를 야기하였다. 바이올린 플롯은 모든 데이터 지점 및 중위값을 나타낸다.
도 19d: MUC5AC mRNA의 배수-변화를 나타내는 정상 공여자(n=4)로부터의 ALI 배양물로부터의 조합된 RT-qPCR 데이터를 나타낸다. 환원된 IL-33(IL-33[C->S])은 MUC5AC mRNA를 증가시키지 않았다. oxIL-33(산화된 IL-33-01)은 IL-13과 같이 MUC5AC mRNA의 증가를 야기하였다. 바이올린 플롯은 모든 데이터 지점 및 중위값을 나타낸다.
도 20a: 건강한 공여자로부터 유래된 ALI 배양물로부터의 기저세포(p63+; 보라색), 섬모세포(알파 튜불린; 청록색) 및 술잔세포(Muc5ac+Muc5B; 황색)의 대표적인 면역조직화학 염색을 나타낸다. 환원된 IL-33(IL-33[C->S])은 술잔세포를 시각적으로 증가시키지 않았다. oxIL-33(산화된 IL-33-01)은 술잔세포의 시각적 증가를 야기하였다.
도 20b: HALO 소프트웨어를 이용하는 면역조직화학 이미지(조건 당 최소 n=3명의 공여자)로부터의 뮤신5ac+뮤신5b 면적(총 상피 조직 면적%)의 정량화를 나타낸다. 비처리 및 환원된 IL-33 처리 대조군에 비해, oxIL-33 및 IL-13은 뮤신 염색 면적을 증가시킨다.
도 21a: COPD 공여자로부터의 ALI 배양물에서 술잔세포를 검출하는 대표적인 유세포분석 등고선 플롯을 나타낸다. Muc5B는 x-축 상에 있으며, Muc5AC는 y-축 상에 있다는 것이 도시된다. ALI 배양물을 7일 동안 항체로 처리하였다. 항-IL-33(33_640087-7B) 처리는 총 술잔세포 수를 감소시켰다. 사분면의 수는 총 집단의 백분율을 나타낸다: 상단 좌측 사분면에 Muc5AC 단일-양성 술잔세포, 하단 우측 사분면에 Muc5B 단일-양성 술잔세포 및 상단-우측 사분면에 Muc5AC 및 Muc5B 이중-양성 술잔세포.
도 21b: 총 술잔세포(조합된 Muc5AC 단일-양성, Muc5B 단일-양성 및 Muc5AC 및 Muc5B 이중-양성 술잔세포)를 나타내는 COPD 공여자(n=6)로부터의 ALI 배양물로부터의 조합된 유세포분석 데이터를 나타낸다. ALI 배양물을 7일 동안 항체로 처리하였다. 항-IL-33(33_640087-7B) 처리는 총 술잔세포 수를 감소시켰다. 바이올린 플롯은 모든 데이터 지점 및 중위값을 나타낸다.
도 21c: Muc5AC 단일-양성 술잔세포를 나타내는 COPD 공여자(n=6)로부터의 ALI 배양물로부터의 조합된 유세포분석 데이터를 나타낸다. ALI 배양물을 7일 동안 항체로 처리하였다. 항-IL-33(33_640087-7B) 처리는 Muc5AC 단일-양성 술잔세포 수를 감소시켰다. 바이올린 플롯은 모든 데이터 지점 및 중위값을 나타낸다.
도 21d: MUC5AC mRNA의 배수-변화를 나타내는 COPD 공여자(n=5)로부터의 ALI 배양물로부터의 조합된 RT-qPCR 데이터를 나타낸다. 항-IL-33(33_640087-7B) 처리는 MUC5AC 발현을 감소시켰다. 바이올린 플롯은 모든 데이터 지점 및 중위값을 나타낸다.
도 21e: LD 음성 세포 염색에 의해 판단되는 바와 같은 처리 상태에 따른 총 생존도를 나타내는 COPD 공여자(n=6)로부터의 ALI 배양물로부터의 조합된 유세포분석 데이터를 나타낸다.
도 22a: COPD 공여자로부터 유래된 ALI 배양물로부터의 기저세포(p63+; 보라색), 섬모세포(알파 튜불린; 청록색) 및 술잔세포(Muc5ac+MucB; 황색)의 대표적인 면역조직화학 염색을 나타낸다. 7일 동안 항-IL-33(33_640087-7B) 처리는 술잔세포에서 시각적 감소를 야기하였다.
도 22b: HALO 소프트웨어를 이용하여 면역조직화학 이미지(n=4 공여자)로부터의 Muc5ac+Muc5b 면적(총 상피 조직 면적%)의 정량화를 나타낸다. 비처리 및 인간 IgG1 처리 대조군에 비해, 항-IL-33(33-640087_7B)은 뮤신 염색의 면적을 감소시킨다.
도 23a: COPD 및 건강체 ALI 배양물로부터 얻은 정단부 세척 내의 Muc5AC의 정량화를 나타낸다. Muc5AC 수준은 Muc5AC ELISA에 의해 판단할 때 COPD 배양물에서 더 높다.
도 23b: 건강체 ALI 배양물로부터 얻은 정단부 세척 내의 Muc5AC의 정량화를 나타낸다. ALI 배양물을 Muc5AC ELISA에 의해 결정된 바와 같이 환원된 IL-33mut16(IL-33[C->S]), oxIL-33 및 야생형 IL-33으로 처리하였다.
도 23c: COPD ALI 배양물로부터 얻은 정단부 세척 내의 Muc5AC의 정량화를 나타낸다. 세포를 인간 및 마우스 IgG1 대조군(hIgG1 및 mIgG1), 33-640087_7B 또는 항-ST2 항체로 처리하였다. 항-IL-33(33-640087_7B)에 의한 처리는 Muc5AC ELISA에 의해 결정된 바와 같이 Muc5AC 수준을 감소시켰다.
실시예
실시예 1 - 산화된 IL-33은 RAGE와 EGFR 사이의 신호전달 복합체의 형성을 유도한다
문헌[Cohen, E. S. et al. Nat. Commun. 6:8327 (2015)]에서, 출원인은 IL-33의 산화된, 이황화결합 형태(DSB IL-33)의 발견을 기재하였고, 이 형태가 ST2에 결합하지 않으며, ST2-의존적 신호전달을 활성화시킬 수 없다는 것을 나타내었다. 후속적으로(WO2016156440A1 참조), 출원인은 oxIL-33이 최종당화산물에 대한 수용체(RAGE)에 결합하고, STAT5를 활성화시키며 상피 이동에 영향을 미치는 RAGE-의존적 방식으로 신호를 전달한다는 것을 나타내었다.
oxIL-33의 기능을 추가로 탐구하기 위해, 상피 세포를 환원 또는 산화된 형태의 IL-33으로 자극하고, 신호전달 경로를 연구하였다. 본 명세서에서 본 발명자들은 oxIL-33이 상피 기능에 엄청난 효과를 야기하는 최종당화산물에 대한 수용체(RAGE)와 상피 성장 인자 수용체(EGFR)의 복합체에 대한 신규한 리간드라는 것을 나타낸다.
1. IL33의 인간 성숙 및 시스테인-돌연변이 변이체의 클로닝 및 발현
인간 IL-33(112 내지 270)의 성숙 성분을 암호화하는 cDNA 분자; 수탁번호(UniProt) 095760(IL33-01 또는 IL-33으로도 지칭됨), 및 세린으로 돌연변이되는 4개의 시스테인 잔기를 갖는 변이체(IL33-16 또는 IL-33[C->S]으로도 지칭됨)를 프라이머 연장 PCR에 의해 합성하고, pJexpress 411(DNA 2.0)에 클로닝시켰다. 단백질의 N-말단에 10xHis, Avitag, 및 인자-Xa 프로테아제 절단 부위(MHHHHHHHHHHAAGLNDIFEAQKIEWHEAAIEGR 서열번호 43)를 포함하도록 야생형(WT) 및 돌연변이체 IL-33 암호화 서열을 변형시켰다. 이콜라이 BL21(DE3) 세포를 형질전환시킴으로써 N-말단 태그된 His10/Avitag IL33-01(WT, 서열번호 44) 및 N-말단 태그된 His10/Avitag IL33-16(WT, 서열번호 45)을 생성하였다. 형질전환 세포를 18시간 동안 37℃에서 자동유도 배지(Overnight Express™ Autoinduction System 1, Merck Millipore, 71300-4)에 배양시킨 후 원심분리에 의해 세포를 채취하고 -20℃에서 보관하였다. 세포를 완전 무 EDTA(EDTA-free) 프로테아제 저해제 칵테일 정제(Roche, 11697498001) 및 50 U/㎖ 벤조나제 뉴클레아제(Merck Millipore, 70746-3)를 함유하는 2× DPBS에 재현탁시키고, 음파처리에 의해 용해시켰다. 세포 용해물을 50,000×g에서 30분 동안 4℃에서 원심분리에 의해 정제하였다. IL-33 단백질을 5 ㎖/분으로 2× DPBS, 1 mM DTT에서 평형상태로 만든 HisTrap excel 칼럼(GE Healthcare, 17371205) 상에 장입하여 고정된 금속 친화도 크로마토그래피에 의해 상청액으로부터 정제하였다. 고정된 내독소 단백질을 고갈시키기 위해 칼럼을 2× DPBS, 1 mM DTT, 20 mM 이미다졸, pH 7.4, 다음에, 2× DPBS, 0.1% Triton X-114로 세척하여 불순물을 제거하였다. 2× DPBS, 1 mM DTT, 20 mM 이미다졸, pH 7.4로 추가적인 세척 후에, 샘플을 2× DPBS, 1 mM DTT, 400 mM 이미다졸, pH 7.4로 용리시켰다. 2.5 ㎖/분으로 2× DPBS에서 HiLoad Superdex 75 26/600 pg 칼럼(GE Healthcare, 28989334)을 이용하여 IL-33을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. SDS PAGE에 의해 피크 분획을 분석하였다. 순수한 IL-33을 함유하는 분획을 풀링하고, 280 ㎚에서의 흡광도에 의해 농도를 결정하였다. SDS-PAGE에 의해 최종 샘플을 분석하였다.
비태그 IL-33을 생성하기 위해, N-말단 태그된 His10/Avitag IL33을 RT에서 1시간 동안 2× DPBS 완충제에서 단백질의 ㎎당 10개 단위의 인자 Xa(GE healthcare, 27084901)와 함께 인큐베이션시켰다. 1 ㎖/분의 유속으로 HiLoad 16/600 Superdex 75 pg 칼럼(GE healthcare, 28989333) 상에서 2× DPBS 중의 SEC 크로마토그래피를 이용하여 비태그 IL-33을 정제하였다.
2. 산화된 IL-33의 생성 및 정제(oxIL-33)
환원된 IL33-01을 60% IMDM 배지(페놀 레드 없음), 40% DPBS에서 0.5 ㎎/㎖의 최종 농도로 희석, 및 37℃에서 18시간 동안의 인큐베이션에 의해 산화시켰다. 산화 과정 동안 생성된 응집물을 HiTrap Capto Q ImpRes 음이온 교환 칼럼(GE Healthcare, 17547055) 상에 장입함으로써 샘플로부터 제거하였다. 장입 전에, 샘플을 pH가 8.3에 도달될 때까지 pH 9.0인 1 M Tris의 첨가, 및 125 mM의 최종 농도가 되도록 5 M NaCl의 첨가에 의해 변형시켰고, 이들 장입 조건 하에 응집물은 칼럼에 결합되었고, 단량체 oxIL-33은 결합 없이 통과하고, 수집되었다. 태그를 120분 동안 22℃에서 50 ㎍의 oxIL-33당 1 ㎍ 인자 Xa의 최종 농도로 인자 Xa(NEB, P8010L)와 함께 인큐베이션에 의해 oxIL-33로부터 절단시켰다. 임의의 남아있는 환원된 IL-33의 샘플을 고갈시키기 위해, 인간 IgG1 Fc-His6에 융합된 가용성 인간 ST2S 세포외 도메인을 30분 동안 22℃에서 샘플과 함께 인큐베이션시키고, 환원된 IL-33에 결합시켰다. 샘플을 3,000 Da 컷오프로 원심분리 농축기에서 농축시키고, 2 ㎖/분의 유속으로 HiLoad Superdex 75 26/600 pg 칼럼(GE Healthcare, 28989334) 상에 장입시켜, 다른 샘플 성분으로부터 단량체 oxIL-33을 분리시켰다. 순수한 oxIL-33을 함유하는 분획을 풀링하고, 농축시키고, 280 ㎚에서 UV 흡광도 분광학을 통해 샘플의 최종 농도를 결정하였다. SDS-PAGE, HP-SEC 및 RP-HPLC에 의해 최종 생성물 품질을 평가하였다.
3. 인간 ST2 ECD의 클로닝, 발현 및 정제
ST2S 암호화 서열의 N-말단에 융합된 Gibson 어셈블리 및 CD33 신호 펩타이드와 양립 가능한 연장을 암호화하는 프라이머를 이용하는 PCR에 의해 내인성 신호 펩타이드(아미노산 잔기 19 내지 328) 없이 ST2의 천연 유래 ST2S 가용성 아이소폼을 암호화하는 cDNA(UniProt 수탁번호 Q01638-2)를 증폭시켰다. C-말단의 His6-태그를 갖는 인간 IgG1 Fc에 대한 암호화 서열을 유사하게 증폭시켰다. pDEST12.2 OriP, 포유류, EBV로부터의 OriP 복제기점을 보유하는 CMV-프로모터 유도 발현 벡터를 갖는 Gibson 조립체를 이용하여 ST2S cDNA 및 IgG1 Fc-His6 cDNA를 조립하여, EBNA-1 단백질을 발현시키는 세포주의 에피솜 유지를 가능하게 하였다. 단백질 발현을 위해, 형질감염 시약으로서 폴리에틸렌이민을 이용하여 EBNA-1을 과발현시키는 CHO 세포의 현탁액 배양물에 플라스미드를 일시적으로 형질전환시켰다. 분비된 ST2S-Fc-His6 융합 단백질을 함유하는 조건화 배지를 형질감염 후 7일에 수집하였고, 2 ㎖/분으로 HiTrap MabSelect SuRe(Protein A, GE Healthcare, 11-0034-95) 친화도 크로마토그래피 칼럼에 장입하였다. 칼럼을 2× DPBS로 세척하고, 단백질을 25 mM 아세트산나트륨, pH 3.6으로 용리시켰다. ST2S-Fc-His6을 함유하는 분획을 풀링하고, 2 ㎖/분으로 2× DPBS에서 평형상태로 만든 HiLoad Superdex 200 26/600 pg 칼럼(GE Healthcare, 28989336) 상에 장입하였다. 순수한 ST2S-Fc-His6 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고, 280 ㎚에서의 흡광도에 의해 농도를 결정하였다. SDS-PAGE에 의해 최종 샘플을 분석하였다.
4. 인간 아시알로글리코단백질 수용체(ASGPR) ECD의 클로닝, 발현 및 정제
세포질 및 막관통 도메인(아미노산 잔기 62 내지 291)이 없는 아시알로글리코단백질 수용체(UniProt 수탁번호 P07306)의 세포외 도메인(ECD)을 암호화하는 cDNA를 CD33 신호 펩타이드 다음에 ECD 도메인의 N-말단에 융합된 His10_Avi 태그 서열로 Geneart에서 화학적으로 합성하였다. 작제물을 pDEST12.2 OriP, 포유류, EBV로부터의 OriP 복제기점을 보유하는 CMV-프로모터 유도 발현 벡터에 직접 클로닝시켜, EBNA-1 단백질을 발현시키는 세포주의 에피솜 유지를 가능하게 하였다. 단백질 발현을 위해, 형질감염 시약으로서 293 Fectin을 이용하여 HEK Freestyle 293F 세포의 현탁액 배양물로 플라스미드를 일시적으로 형질전환시켰다. 분비된 HisAVi_hASGPR ECD 융합 단백질을 함유하는 조건화 배지를, 4 ㎖/분으로 2× DPBS에서 평형상태로 만든 HisTrap excel 칼럼(GE Healthcare, 17371205) 상에 장입하여 고정된 금속 친화도 크로마토그래피에 의한 형질감염 7일 후에 수집하였다. 칼럼을 2× DPBS, 40 mM 이미다졸, pH 7.4로 세척하여 불순물을 제거하고, 샘플을 2× DPBS, 400 mM 이미다졸, pH 7.4로 용리시켰다. 1 ㎖/분으로 2× DPBS에서 HiLoad Superdex 75 16/600 pg 칼럼(GE Healthcare, 28-9893-33)을 이용하여 인간 ASGPR ECD를 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. SDS PAGE에 의해 피크 분획을 분석하였다. 순수한 단량체 ASGPR을 함유하는 분획을 풀링하고, 280 ㎚에서의 흡광도에 의해 농도를 결정하였다. SDS-PAGE에 의해 최종 샘플을 분석하였다.
5. IL-33의 산화된 형태는 MAP 키나제 경로를 활성화시킨다
정상 인간 기관지 상피(NHBE) 세포(CC-2540)를 Lonza로부터 얻었고, 제조업자의 프로토콜에 따라 완전 BEGM 배지(Lonza)에서 유지하였다. NHBE를 어큐타제(accutase)(PAA, #L1 1-007)로 채취하고, 배양 배지[BEGM(Lonza CC-3171) 및 보충 키트(Lonza CC-4175)]에서 6-웰 접시(Corning Costar, 3516)에 1×106개/2 ㎖로 파종하였다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이 후에, 배지를 흡입하고, 세포를 1 ㎖ PBS로 2회 세척한 후에 기아상태(starve) 배지(1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충한 BEGM(Lonza CC-3171))를 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 자극 전에 37℃, 5% CO2에서 추가 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다.
MAP 키나제 인산화 항체 어레이 키트(ab211061)를 Abcam으로부터 구입하였고, 제조업자의 프로토콜에 따라 실험을 수행하였다. 18 내지 24시간 동안 기아상태로 만든 6웰 접시의 NHBE를 비처리로 남겨두거나 또는 30 ng/㎖의 환원된 IL-33, IL-33-16 또는 산화된 IL-33 중 하나로 처리한 후에, 10분 동안 인큐베이터 37℃, 5% CO2에 복귀시켰다(본 분석에서 사용한 활성체에 대해 표 2 참조). 플레이트를 인큐베이터에서 제거하고, 세포를 빙랭 PBS로 세척한 후에 키트가 공급된 1× 용해 완충제의 웰마다 100 ㎕를 첨가하였다. 단백질 추출물을 1.5 ㎖ 관에 옮긴 후에 14,000 rpm으로 4℃에서 정제하였다. BCA 기법(Thermo, 23225)을 이용하여 단백질 농도를 결정하였고, 250 ㎍의 총 단백질을 어레이 막마다 사용하였다. 제조업자의 설명서에 따라 모든 후속 단계를 수행하였다. 막을 LiCor C-digit 상에서 시각화하고, Image Lite studio를 이용하여 정량화하였다.
Figure pct00006
IL-33의 야생형(IL-33) 및 C->S(IL-33[C->S]) 환원된 형태(각각 IL33-01 및 IL33-16)와 대조적으로, 산화된 IL33-01(oxIL-33)은 수용체 타이로신 키나제(RTK)에 의해 관여되는 경로와 일치되는 다수의 중요한 신호전달 분자를 활성화시켰다(도 1).
6. IL-33의 산화된 형태는 상피 성장 인자 수용체(EGFR)를 활성화시킨다
oxIL-33에 의해 활성화된 수용체 타이로신 키나제(RTK)를 시험하고 확인하기 위해, 71개의 RTK 어레이를 이용하여 선별을 수행하였다. RTK 인산화 항체 어레이 키트(ab193662)를 Abcam으로부터 구입하였고, 제조업자의 프로토콜에 따라 실험을 수행하였다. NHBE를 배양시키고, 배양 배지[BEGM(Lonza CC-3171) 및 보충 키트(Lonza CC-4175)]에서 6-웰 플레이트(Corning Costar, 3516)로 1×106개/2 ㎖로 파종하였다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이 후에, 배지를 흡입하고, 세포를 1 ㎖의 PBS로 2회 세척한 후에 기아상태 배지(보충 키트 없이 BEGM(Lonza CC-3171))를 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 자극 전에 37℃, 5% CO2에서 추가 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. MAP 키나제 어레이에 대해 앞서 기재한 동일한 단계 후에, 세포를 활성화시키고(표 2 활성체), 용해시키고, 250 ㎍의 총 단백질을 어레이 막마다 사용하였다. 제조업자의 설명서에 따라 모든 후속 단계를 수행하였다. 막을 LiCor C-digit 상에서 시각화하고, Image Lite studio를 이용하여 정량화하였다. 환원된 야생형(IL-33) 또는 C->S(IL-33[C->S]) IL-33(각각 IL33-01 및 IL33-16) 중 하나에 대해 검출된 반응은 없었다. 그러나, oxIL-33(산화된 IL-33-01)은 상피 성장 인자 수용체(EGFR)에 대응하는 RTK 어레이 상의 양성 신호를 촉발하였다(도 2).
추가적인 방법에 의해 EGFR 신호전달을 자극하는 oxIL-33(산화된 IL-33-01)의 능력을 확인하였다. 활성화 시, EGFR을 Tyr1068에서 인산화시키고, 이 포스포-EGFR을 균질 FRET(형광 공명 에너지 전달) HTRF®(균질 시간 분해 형광법, Cisbio International) 분석(Cisbio 키트 #64EG1PEH)을 이용하여 검출하였다. 간략히 말해서, NHBE를 배양 배지[BEGM(Lonza CC-3171) 및 보충 키트(Lonza CC-4175)] 내 96-웰 플레이트(Corning Costar, 3598)에서 5×105개/100 ㎕로 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이 후에, 배지를 흡입하고, 세포를 0.2 ㎖ PBS로 2회 세척한 후에 기아상태 배지(보충 키트 없이 BEGM(Lonza CC-3171))를 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 추가 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시킨 후에, IL-33-01, IL-33-16 및 oxIL-33(산화된 IL-33-01) 및 EGFR 리간드(표 2 및 표 3)의 농도를 증가시키면서 자극한 후에 인큐베이터 37℃, 5% CO2에 10분 동안 복귀시켰다. 배지를 흡입하고, 웰당 50 ㎕의 용해 완충제(Cisbio, 64EG1PEH)로 대체하였다. 이어서, 분석을 제조업자의 프로토콜(Cisbio, 64EG1PEH)에 따라 수행하였다. 시간 분해 형광을 EnVision 플레이트 판독기(Perkin Elmer)를 이용하여 620 ㎚ 및 665 ㎚ 방출 파장에서 판독하였다. 665/620 ㎚ 비를 계산함으로써 데이터를 분석하고, 4-모수 로지스틱 방정식을 이용하여 곡선 적합화함으로써 GraphPad Prism 소프트웨어를 이용하여 EC50 값을 결정하였다.
Figure pct00007
유사하게, EGFR 인산화를 본 부문에서 앞서 언급한 바와 같은 HTRF 분석을 이용하여 상피 세포주 A549에서 평가하였다. 간략히 말해서, A549를 ATCC로부터 얻었고, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 10% FBS로 보충한 RPMI GlutaMax 배지에서 배양하였다. 세포를 어큐타제(PAA, #L1 1-007)로 채취하고, 5×105개/100 ㎕로 96웰 플레이트에 파종하고 나서, 37℃, 5% CO2에서 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 웰을 100 ㎕의 PBS로 2회 세척한 후에 100 ㎕의 기아상태 배지(1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충한 RPMI GlutaMax 배지)를 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 증가하는 농도의 IL-33-01, IL-33-16 및 oxIL-33-01(산화된 IL-33-01의 동의어), EGFR 리간드 및 RAGE 리간드(표 2 및 표 3)로 자극시킨 후에, 인큐베이터 37℃, 5% CO2에 10분 동안 복귀시켰다. 배지를 흡입하고, 웰당 50 ㎕의 용해 완충제(Cisbio, 64EG1PEH)로 대체하였다. 이어서, 분석을 제조업자의 프로토콜(Cisbio, 64EG1PEH)에 따라 수행하였다. 시간 분해 형광을 EnVision 플레이트 판독기(Perkin Elmer)를 이용하여 620 ㎚ 및 665 ㎚ 방출 파장에서 판독하였다. 665/620 ㎚ 비를 계산함으로써 데이터를 분석하고, 4-모수 로지스틱 방정식을 이용하여 곡선 적합화함으로써 GraphPad Prism 소프트웨어를 이용하여 EC50 값을 결정하였다.
NHBE와 A549 세포 둘 다에서, oxIL-33은 진짜 작용제인 EGF와 유사하게 EGFR의 인산화를 촉진시켰다(도 3). 이는 시험한 다른 RAGE 리간드에 의해서는 재현되지 않았다.
7. 신호전달 성분의 웨스턴 블롯팅
EGFR 신호전달 복합체의 요소가 oxIL-33(산화된 IL33-01)에 반응하여 활성화되는지를 추가로 연구하기 위해 웨스턴 블롯 실험을 수행하였다. NHBE를 배양시키고, 부문 5에서 상기 기재한 바와 같이 6웰 접시에 플레이팅하였다. 혈청 기아상태 후에, 5 내지 240분 동안 세포를 oxIL-33(30 ng/㎖)으로 자극하였다. 이어서, 배지를 흡입하고, 세포를 빙랭 PBS로 세척한 후 150 ㎕의 용해 완충제 [1× LDS 샘플 완충제(Thermo, NP0008), 10 mM MgCl2(VWR, 7786-30-3), 2.5% β-머캅토에탄올(Sigma, M6250) 및 0.4 ㎍/㎖ 벤조나제(Millipore, 70746)]를 첨가하였다. 세포를 얼음 상에 10분 동안 둔 후에, 용해물을 1.5 ㎖ 관에 옮기고, 90℃로 5분 동안 가열하였다. 용액을 새로운 1.5 ㎖ 관에 옮기고, 5 ㎕의 단백질 사다리(protein ladder)(BioRad, 1610374)에 따라 10 ㎕의 샘플을 MES 실행 완충제(B0002)에서 4 내지 12%의 SDS-PAGE 겔(Thermo, NW04127BOX) 상에서 실행하였다. Transblot Turbo(BioRad)를 이용하여 겔을 PVDF 막(BioRad, 1704156) 상에 옮겼다. PVDF 막을 5% 탈지유 분말(Marvel)을 함유하는 PBS-tween 용액에서 10분 동안 차단시켰다. 이어서, 막을 4℃에서 밤새 5% BSA를 함유하는 PBS-tween에서 1차 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 막을 PBS-tween으로 5회 세척하고, 이어서, 1시간 동안 실온에서 5% 탈지유 분말을 함유하는 PBS-tween에서 2차 HRP 태그 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 막을 PBS-tween으로 5회 세척한 후에, ECL(BioRad, 1705062)을 첨가하고 Licor C-digit로 시각화하였다.
결과는 oxIL-33-01이 몇몇 EGFR 신호전달 성분을 활성화시켰다는 것을 나타낸다(도 4)
8. Ox-IL-33은 EGFR-중화 Ab에 의해 차단되는 STAT-5 인산화를 유도한다
다음에, EGFR에 대한 결합을 방지함으로써 oxIL33-매개 STAT5 활성화가 저해될 수 있는지의 여부를 확인하고자 하였다. 간략히 말해서, A549 세포를 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 10% FBS로 보충한 RPMI GlutaMax 배지에서 배양하였다. 세포를 어큐타제로 채취하고, 5×105개/100 ㎕로 96웰 플레이트에 파종하고 나서, 37℃, 5% CO2에서 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 웰을 100 ㎕의 PBS로 2회 세척한 후에 100 ㎕의 기아상태 배지(1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충한 RPMI GlutaMax 배지)를 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 항-EGFR 항체(Clone LA1(05-101, Millipore) 또는 아이소타입 대조군(MAB002, R&D Systems)을 용량 의존적 방식으로 웰에 첨가하고, 플레이트를 30분 동안 인큐베이터에 복귀시켰다. 이어서, 플레이트를 산화된 IL-33(30 ng/㎖)으로 30분 동안 자극한 후에 포스포-STAT5 ELISA 키트 용해 완충제(85-86112-11, ThermoFischer Scientific)를 이용하여 용해시키고, 제조업자의 지침에 따라 전개시킨 후 450 nM에서 흡광도를 판독하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, oxIL-33-01로 활성화시킨 세포는 STAT5의 인산화를 나타내고, 이는 항-EGFR 항체의 존재를 감소시킨다(도 5).
실시예 2 - 산화된 IL-33은 EGFR과 RAGE 간의 복합체 형성을 유도한다
9. OxIL-33은 EGFR과 RAGE 간의 복합체 형성을 유도한다
RAGE 및 EGFR이 oxIL-33의 신호전달을 촉진시키는 데 어떻게 관련되는지를 이해하기 위해, 신호전달 복합체를 탐구하도록 면역침전 실험을 수행하였다. 우선, 항-EGFR 항체를 Dynabeads에 공유 결합시켰다. 항-EGFR 항체(R&D systems, AF231)의 2개의 100 ㎍ 바이알을 40 ㎎의 Dynabeads(Thermo, 14311D)와 함께 인큐베이션시키고 제조업자의 지침에 따라 공유결합시켰다. 성공적인 결합 후에, 비드를 30 ㎎/㎖로 PBS 중에 재현탁시키고, 4℃에서 유지시켰다.
NHBE를 Lonza(CC-2540)로부터 얻었고, 동결 바이알을 접시마다 1×106개의 세포로 15 ㎝ 접시(Thermo, 157150)에 직접 파종하였다. 세포가 합류(confluency)에 도달될 때까지 3일마다 배지를 교체하면서 제조업자의 프로토콜에 따라 완전 BEGM 배지(Lonza)에 NHBE를 1개월간 유지시켰다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 이 지속 시간 동안 인큐베이션시켰다. 자극 전날에, 플레이트를 20 ㎖ PBS로 2회 세척한 후에 15 ㎖의 기아상태 배지(보충 키트 없이 BEGM(Lonza CC-3171))를 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 추가 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시킨 후에 배지 단독(비자극 대조군), 30 ng/㎖의 환원된 IL-33-01, 30 ng/㎖의 산화된 IL-33-01 또는 30 ng/㎖ EGF로 자극하고, 37℃, 5% CO2로 10분 동안 복귀시켰다. 배지를 흡입하고, 플레이트를 빙랭 PBS로 2회 세척한 후 15 ㎝ 접시마다 포스파타제 및 프로테아제 저해제(Thermo, 78440)를 함유하는 1 ㎖의 용해 완충제(Abcam, ab152163)를 첨가하였다. 세포를 용해 완충제에 스크레이핑한 후에 2 ㎖ Protein LoBind 관(Eppendorf, Z666513)에 옮기고, 14,000 rpm, 4℃에서 교반시킴으로서 정제하였다. BCA 키트(Thermo, 23225)를 이용하여 단백질 농도를 결정하였고, 용해 완충제를 이용하여 모든 단백질 추출물을 3 ㎎/㎖로 정규화시켰다. 6 ㎎의 총 단백질 추출물을 100 ㎕의 항-EGFR Dynabead(상기 기재)가 있는 깨끗한 2 ㎖ LoBind 관에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 관을 4℃에서 5시간 동안 회전 믹서에 두었다. 자석(BioRad, 1614916)을 이용하여, Dynabead를 고정시키고, 단백질 추출물을 흡입하고 나서, 2 ㎖의 세척 완충제 1(50 mM Tris-HCl pH 7.5(Thermo, 15567027), 0.5% TritonX 100(Sigma, X100), 0.3 M NaCl로 대체하였다. 이를 4회 더 반복하였다. 이어서, 비드를 세척 완충제 2(50 mM Tris-HCl pH 7.5)를 사용하여 동일한 방식으로 추가 10회 세척하였다. 최종 세척 단계 후에, 50 mM Tris-HCl pH 8.0 중의 50 ㎕의 1% Rapigest(w/v)(Waters, 186001861)를 비드에 첨가하고, 60℃에서 10분 동안 가열하였다. 이어서, 상청액을 새로운 LoBind 2 ㎖ 관에 옮겼다. 추가 100 ㎕의 50 mM Tris-HCl pH 8.0을 수지에 첨가하고, 혼합한 후에 이를 제1 용출물과 합하였다. 이어서, TCEP(Sigma, 646547)를 5 mM의 최종 농도로 첨가하고, 샘플을 60℃에서 10분 동안 가열하였다. 이어서, 용출액을 아이오도아세트아마이드(Sigma, 16125)의 첨가에 의해 실온에서 20분 동안 실온의 암실 내에서 10 mM까지 알킬화시켰다. DTT(Sigma, D5545)를 10 mM까지 첨가하여 알킬화를 퀀칭시켰다. 이어서, Tris-HCl 완충제 50 mM pH 8.0을 첨가하여 500 ㎕의 최종 샘플 용적을 제공하였다. 관마다 0.5 ㎍의 트립신(Promega, V5111)을 첨가하고, 샘플을 400 rpm에서 진탕 플랫폼 상에서 30℃에서 밤새 분해시켰다. 이어서, 샘플을 트리플루오로아세트산(Sigma, 302031)을 이용하여 2.0%(v/v)의 농도로 산성화시키고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 샘플을 14,000 rpm에서 30분 동안 원심분리시키고, 상청액을 새로운 2 ㎖ LoBind 관에 옮겼다. 이어서, 샘플을 제조업자의 지침에 따라 C18 칼럼(Thermo, 87784)을 통해 처리하였다. 이어서, 샘플을 speed-vac을 이용하여 건조시킨 후에 -20℃에서 저장하였다. 이어서, 샘플을 펩타이드 질량 지문법 질량 분석법(PMF-LC-MS)에 의해 분석하였다. 결과를 분석하기 위해 Scaffold 소프트웨어를 사용하였다.
EGFR를 모두 4개 조건에 걸쳐 유사하게 검출하였고, 이는 면역침전이 모든 샘플에 걸쳐 제대로 작용하였다는 것을 시사한다. IL33-01(IL-33) 또는 EGF로 처리한 것과 대조적으로 oxIL-33으로 처리한 샘플에서 RAGE 및 IL-33이 검출되었고, 이는 oxIL-33 및 RAG가 신호전달 동안 EGFR과 연관된다는 것을 시사한다. oxIL-33 및 EGF를 갖는 이들 세포에서의 EGFR 활성화의 사전 관찰과 일치되게, EGFR 신호전달 및 내포작용에 관련된 것으로 이전에 보고된 단백질은 이들 리간드에 의한 자극 후에 검출되었지만, 환원된 IL33-01은 그렇지 않았다(표 4).
표 4는 환원된 IL-33-01(IL-33), oxIL-33(산화된 IL-33-01) 또는 EGF로 자극한 NHBE의 LCMS 분석을 나타낸다. IL-33 및 RAGE는 oxIL-33에 의한 자극 후 EGFR과의 복합체에서 검출되지만, 환원된 IL33-01(IL-33) 또는 EGF에 의한 자극 후에는 그렇지 않다. 괄호는 각 단백질에 대해 확인된 고유 펩타이드의 수를 나타낸다.
Figure pct00008
이들 관찰을 확인하기 위해, 상기 프로토콜에 따라 제조한 세포 용해물에 대해 면역침전 및 웨스턴 블롯을 또한 수행하였다. NHBE 단백질 추출물 농도 결정 후에, 3 ㎎의 총 단백질을 1.5 ㎖ 관에서 6 ㎍의 항-EGFR 항체(R&D systems, AF231)와 함께 인큐베이션시키고, 4℃에서 2.5시간 동안 회전 믹서에 넣었다. 이어서, 1.5 ㎎의 단백질 A/G 자기 비드(Thermo, 88802)를 각 관에 첨가한 다음, 관을 혼합하면서 4℃까지 다시 1시간 동안 복귀시켰다. 이어서, 비드를 자석(BioRad, 1614916)으로 수집하고, 500 ㎕의 (50 mM Tris(pH 7.5), 1% TritonX 및 0.25 M NaCl)로 3회 세척하고, 500 ㎕의 10 mM Tris(pH 7.5)로 1회 세척하였다. 이어서, 단백질을 환원제(Thermo, NP0004)와 함께 35 ㎕의 LDS 샘플 완충제(Thermo, NP0008)을 이용하여 자기 비드로부터 방출시키고, 95℃에서 5분 동안 가열하였다. 용액을 새로운 1.5 ㎖ 관에 옮기고, 5 ㎕의 단백질 사다리(BioRad, 1610374)에 따라 10 ㎕의 샘플을 MES 실행 완충제(B0002)에서 4 내지 12%의 SDS-PAGE 겔(Thermo, NW04127BOX) 상에서 실행하였다. Transblot Turbo(BioRad)을 이용하여 겔을 PVDF 막(BioRad, 1704156) 상에 옮겼다. PVDF 막을 5% 탈지유 분말(Marvel)을 함유하는 PBS-tween 용액에서 10분 동안 차단시켰다. 이어서 막을 5% BSA를 함유하는 PBS-tween에서 밤새 4℃에서 1차 항체(항-EGFR(Cell Signaling Technology, 2232), 항-RAGE(Cell Signaling Technology, 6996) 또는 항-IL-33(R&D systems, AF3625)과 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 막을 PBS-tween으로 5회 세척하고, 이어서, 1시간 동안 실온에서 5% 탈지유 분말을 함유하는 PBS-tween에서 항-토끼 2차 HRP 태그 항체(Cell Signalling Technology, 7074) 또는 항-염소 2차 HRP 태그 항체(R&D systems, HAF109)와 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 막을 PBS-tween으로 5회 세척한 후에, ECL(BioRad, 1705062)을 첨가하고 Licor C-digit로 시각화하였다. 웨스턴 블롯은 RAGE가 oxIL-33의 존재 하에 EGFR과 함께 공동침전된 반면 EGF 자극에 의해 RAGE가 검출되지 않았다는 것을 확인하였다(도 6). 이들 결과는 RAGE 및 EGFR이 산화된 IL-33 신호전달 복합체의 기능적 부분이라는 것을 나타낸다.
10. RAGE는 EGFR과의 복합체를 형성하기 위해 oxIL-33을 필요로 한다
상기 기재한 실험은 oxIL-33이 하류의 신호전달을 생성하는 EGF 수용체(EGFR)의 복합체에 대한 리간드라는 것을 나타내었다. oxIL-33이 RAGE 또는 EGFR 중 하나에 대한 직접 결합 리간드인지의 여부를 결정하기 위해 본 부문의 실험을 설계한다. 신호전달 복합체의 형성에 관해 더욱 이해하고 oxIL-33이 EGFR과 직접 상호작용하는지의 여부를 평가하기 위해, RAGE, ST2-Fc 및 EGFR에 대한 oxIL-33의 결합을 탐구하는 데 ELISA 형식을 사용하였다.
단백질 및 변형: Avitag 서열 모티프(GLNDIFEAQKIEWHE 서열번호 46)를 함유하는 단백질을 제조업체의 프로토콜에 따라 바이오틴 리가제(BirA) 효소(Avidty, Bulk BirA)를 이용해서 바이오티닐화하였다. 본 명세서에서 이용되는 Avitag가 없는 모든 변형 단백질을 제조업자의 프로토콜에 따라 EZ 링크 설포-NHS-LC-바이오틴(Thermo/Pierce, 21335)을 이용해서 유리 아민을 통해 바이오티닐화하였다. 표 5는 사용한 바이오티닐화된 단백질의 목록이다.
Figure pct00009
스트렙타비딘 플레이트(Thermo Scientific, AB-1226)를 100㎕/의 바이오티닐화된 항원(PBS 중 10 ㎍/㎖)으로 1시간 동안 실온에서 코팅하였다. 플레이트를 200 ㎕의 PBS-T(PBS + 1%(v/v) Tween-20)로 3회 세척하고 1시간 동안 300 ㎕/웰 차단 완충액(1% BSA 함유 PBS(Sigma, A9576))으로 차단하였다. 플레이트를 PBS-T로 3x 세척하였다. RAGE-Fc(R&D Systems #1145-RG) 또는 ST2-Fc(R&D Systems #523-ST)를 차단 완충제에서 PBS 중 10 ㎍/㎖로 희석시키고, 적절한 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 대안적으로, PBS 중 10 ㎍/㎖에서 1시간 동안 비태그 RAGE(Sino Biological, 11629-HCCH)의 존재 또는 부재 하에 PBS 중 10 ㎍/㎖에서 100㎕의 EGFR-Fc(R&D Systems #344-ER-050)를 첨가하였다. 플레이트를 200㎕ PBS-T로 3회 세척하였다. 이어서, RAGE-Fc, ST2-Fc 및 EGFR-Fc를 1시간 동안 실온에서 100 ㎕/웰로 차단 완충제에서 1:10000로 희석시킨 항-인간 IgG HRP(Sigma AO170, 5.1㎎/㎖)로 검출하였다. 플레이트를 PBS-T로 3회 세척하고, TMB, 100 ㎕/웰(Sigma, T0440)로 전개시켰다. 50 ㎕/웰 0.1M H2SO4로 반응을 ??칭시켰다. Cytation Gen5 또한 유사한 장비 상에서 450 ㎚에서 흡광도를 판독하였다. 결과는 oxIL-33이 RAGE와의 분명한 상호작용을 나타낸 반면(도 7a) EGFR에 대한 oxIL-33의 직접적인 결합은 무시 가능하였다는 것을 나타낸다(도 7b). oxIL-33에 대한 EGFR 결합은 본 분석에 대한 sRAGE의 첨가에 의해서만 관찰되었다(도 7b). 이는 oxIL-33이 진짜 RAGE 작용제인 HMGB1을 대체하는 경우에는 재현될 수 없었다(도 7b).
oxIL-33에 의해 촉발되는 EGFR 신호전달에서 RAGE의 필요성은 RAGE-결핍 세포주를 사용하여 추가로 확인되었다. RAGE 넉아웃 A549 세포주를 다음과 같이 생성하였다:
적색 형광 단백질(RFP), AGER의 엑손 3에 표적화된 가이드 RNA(TGAGGGGATTTTCCGGTGC 서열번호 47) 및 Cas9 엔도뉴클레아제에 대한 발현 벡터를 포함하는 포유류 플라스미드를 생성하였다. 2일 동안 T-175 플라스크에서 F12K 너트 믹스(Gibco, 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충)에서 A549 세포를 성장시킴으로써 A549 조건화 배지를 생성하였다. 소모한 배지를 A549에서 제거하고, 여과시키고 나서, 신선한 Gibco F12K 너트 믹스(20% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충)에서 5배 희석시켰다. A549를 총 15 ㎖ 중 2×105개의 세포/㎖에서 3개의 T-75 플라스크에 파종하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 밤새 두었다. 8 ㎍의 AGER 가이드 RNA 플라스미드 및 22.5 ㎍의 PEI(Polysciences, 23966-2)가 있는 1.6 ㎖의 F12K 너트 믹스(1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충)를 이용하여 형질감염 혼합물을 제조하였다. 이어서, 혼합물을 10초 동안 교반하고, 실온에서 15분 동안 두었다. 이어서, 0.75 ㎖의 형질감염 혼합물을 각 T-75 플라스크에 첨가하였다. 플라스크를 2일 동안 인큐베이터로 복귀시켰다. 이어서, 아큐타제를 이용하여 A549 세포를 분리시키고, 1% FBS를 함유하는 PBS에 옮기고, 단일 세포를 Aria 세포 분류기(BD) 상에서 RFP의 발현에 기반하여 96-웰 접시에 분류하였다. 세포를 조건화 배지를 이용하여 3 내지 5일마다 공급하였다. 일단 세포가 50% 초과의 합류가 되면, 이들을 24-웰 플레이트에 옮기고 성장시켰다. 각각의 성공적인 클론이 T15 플라스크에 분할될 때까지 이 업스케일링 과정을 계속하였다. 이어서, 세포를 12개의 웰 플레이트로 분할시키고, 성공적인 넉아웃에 대한 게놈 PCR 분석 전에 50% 초과의 합류까지 성장시켰다. 세포를 웰당 100㎕ DNA 용해 완충제(Viagen Bitoech, 301-C, 0.3 ㎍/㎖ 프로테이나제 K로 보충)에 용해시켰다. 이들 샘플을 55℃에서 4시간 동안 인큐베이션시킨 후에 15분 동안 85℃에서 인큐베이션시켰다. 다음의 서열을 갖는 정방향 및 역방향 프라이머를 이용하여 RAGE의 PCR을 수행하였다: 정방향 - gttgcagcctcccaacttc(서열번호 48), 역방향 - aatgaggccagtggaagtca(서열번호 49). 50 ㎕ 반응 용적에서 다음과 같이 반응 및 사이클링을 설정하였다[25 ㎕ Q5 중합효소 혼합, 2.5 ㎕ 정방향 프라이머(10 μM 저장액), 2.5 ㎕ 역방향 프라이머(10 μM 저장액), 2 ㎕의 주형 DNA 용해물, 18 ㎕의 무 뉴클레아제 워터]. 98℃에서 30초 동안 초기 변성, 다음에 35주기의 5초 동안 98℃, 10초 동안 57℃ 및 20초 동안 72℃ 후에 2분 동안 72℃에서 최종 단계로 PCR 반응을 실행하였다. 4 ㎕의 PCR 산물을 6 ㎕의 무 뉴클레아제 워터 및 2 ㎕의 6x DNA 로딩 완충제(Thermo Scientific, R0611)와 혼합하였다. Versadoc Imager 상에서 시각화 전 1시간 동안 90 V에서 1% 아가로스겔(1:10000 SYBR safe) 상에서 샘플을 실행하였다. 이어서, PCR 산물의 나머지를 제조업자의 프로토콜에 따라 QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen, 28104)로 세정하였다. nanodrop을 이용하여 DNA-50 농도를 측정하였다. 사내 서열분석을 위해 몇몇 클론(결과로부터 선택)을 보냈다. 결과는 클론 RAGE09 및 RAGE10에서 정지 코돈의 성공적인 삽입을 나타내었다.
oxIL-33-매개 EGFR 신호전달에 대한 RAGE의 본질을 확인하기 위해, 이어서, A549 및 RAGE-결핍 A549 세포 상에서 면역침전 및 웨스턴 블롯을 수행하였다. 간략히 말해서, oxIL-33-01을 이용하여 세포주를 다양한 시점(0 내지 15분)에 활성화시켰다. EGFR 또는 RAGE의 후속적 면역침전 다음에 부문 9에서 상술한 적절한 실험 프로토콜에 따라 항-RAGE, 항-EGFR 및 항-IL-33에 의한 웨스턴 블롯팅이 이어졌다. 결과는 oxIL-33 및 EGFR과의 복합체 형성에서 RAGE의 필수적 역할을 나타낸다(도 8).
11. 산화된 IL-33은 STAT5 인산화를 유도하며, 이는 RAGE에 의해 차단되지만, ST2 중화 항체에 의해서는 차단되지 않는다
oxIL-33 신호전달에서 ST2에 대한 RAGE의 중요성을 확인하기 위해, 차단 항체를 시험하였다. 간략히 말해서, A549를 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 10% FBS로 보충한 RPMI GlutaMax 배지에서 배양하였다. 세포를 어큐타제로 채취하고, 5×105개/100 ㎕로 96웰 플레이트에 파종하고 나서, 37℃, 5% CO2에서 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 웰을 100 ㎕의 PBS로 2회 세척한 후에 100 ㎕의 기아상태 배지(1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충한 RPMI GlutaMax 배지)를 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 항-RAGE(M4F4; WO 2008137552); 항-ST2(AF532; RnD Systems) 또는 아이소타입 대조군(MAB002, R&D Systems)을 용량 의존적 방식으로 웰에 첨가하고, 플레이트를 30분 동안 인큐베이터에 복귀시켰다. 이어서, 플레이트를 산화된 IL-33(30 ng/㎖)으로 30분 동안 자극한 후에 포스포-STAT5 ELISA 키트 용해 완충제(85-86112-11, ThermoFisher Scientific)를 이용하여 용해시키고, 제조업자의 지침에 따라 전개시킨 후 450 nM에서 흡광도를 판독하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, oxIL-33-01로 활성화시킨 세포는 항-RAGE의 존재 하에 감소된 STAT5의 인산화를 나타내지만 항-ST2 항체는 그렇지 않다(도 9).
실시예 3 - OxIL-33은 상피 세포에서 EGFR의 내재화를 촉발시킨다
다음에 oxIL-33이 EGF에 비해 EGFR의 역학 변화를 유도하는지의 여부를 연구하였다.
12. EGF 내재화의 공초점 실험
본 실험은 공초점 영상화를 이용하여 EGF, IL-33의 환원 또는 산화된 형태에 의한 자극 후 상피 세포에서의 EGFR의 역학을 연구하는 것을 목적으로 한다. EGFR-GFP A549 상피 세포주(Sigma, CLL1141-1VL)를 20000개의 세포/㎖(RPMI 배지+ 10%FCS + Pen/Strep)의 농도로, 24웰 유리 바닥 플레이트(Greiner, 662892)당 1 ㎖ 플레이팅하였다. 녹색 형광 단백질(GFP)에 연결된 EGF 수용체는 EGFR 막 역학 및 내재화가 추적되는 것을 가능하게 한다. 세포를 PBS로 1회 세척하고, RPMI 배지(FCS 없음)에서 인큐베이션시켰다. 24시간의 기아상태 후에, 세포를 RPMI로 세척하고, 1:5000 희석으로 CellMask(Invitrogen C10046) 딥 레드가 있는 0.5 ㎖의 RPMI 배지와 함께 인큐베이션시켰다. 세포를 막 마킹을 위한 처리 전에 CellMask로 간단히 염색하고, EGFR-GFP의 역학을 기록하기 위해 공초점 상에서 1개 프레임/분에서 처리 즉시 라이브 영상화하였다. 세포를 37℃에서 5분 동안 염색하고, PBS로 1회 세척하고, 0.5 ㎖ 무 혈청 RPMI/웰에서 200 ng/㎖의 농도로 oxIL-33(산화된 IL-33-01) 또는 IL-33-16로 자극하였다. 공초점 영상은 즉시 40× 오일 대물렌즈, 1분/프레임, 25분 동안 2 ㎛ 간격으로 5개의 적층(단백질을 첨가한 후 약 30분)을 촬영하였다. GFP 신호의 붕괴된(점선) 패턴은 막 상의 수용체의 클러스트링 및 내재화를 나타낸다. 막 면적(CellMask에 의해 마스킹) 및 세포내 면적(반전 CellMask에 의해 마스킹, 나타내지 않음)의 픽셀 강도 히스토그램을 라이브 이미징과 상이한 시점에 생성하였고, 비-클러스터링된 영역에서 EGFR의 고갈(히스토그램 종 형상 피크의 좌측 이동), 및 클러스터링에 의해 야기되는 포화된 픽셀의 증가된 수(강도 255)를 나타낸다. EGF 자극이 가장 분명한 EGFR 클러스터링을 초래하였지만, oxIL-33은 EGF 수용체의 클러스터링 및 내재화를 유도하였다. 대조적으로, IL-33의 환원된 형태(IL -33-16)는 EGFR 세포 분포의 주된 변화를 나타내지 않았다(도 10).
실시예 4 - OxIL-33은 EGF과 유사하게 상피 세포에 의한 IL-8의 분비를 유도한다
13. oxIL-33에 의한 IL-8의 선택적 분비
건강한 대상체(NHBE; Lonza CC-2540) 및 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD)(DHBE; Lonza 00195275)으로부터의 인간 기관지 상피 세포를, 세포가 합류에 도달될 때까지 3일마다 배지를 교체하면서 1개월 동안 제조업자의 프로토콜에 따라 완전 BEGM 배지(Lonza)에서 유지시켰다. 세포를 어큐타제로 채취하고, 배양 배지 중 96-웰 플레이트(Corning 3596)에서 5×105개/100 ㎕로 파종하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이 후에, 배지를 흡입하고, 세포를 100 ㎖의 PBS로 2회 세척한 후에 기아상태 배지(1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충한 보충 키트 없이 BEGM(Lonza CC-3171))를 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 추가 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시킨 후에 배지 단독(비자극 대조군), 30 ng/㎖의 환원된 IL-33-01, 30 ng/㎖ IL-33-16, 30 ng/㎖의 산화된 IL-33-01 또는 30 ng/㎖ EGF로 자극하고, 37℃, 5% CO2로 복귀시켰다. 자극 후 24시간에, 상청액을 수집하고, 다중복합 분석(Mesoscale Discovery K15047D-2)을 이용하여 케모카인 생성에 대해 평가하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, NHBE 및 DHBE는 비자극 세포(배지 단독)에 비해 oxIL-33에 의한 활성화 시 IL-8의 분비에서 4배 증가를 나타내었다. 다른 케모카인(TARC, MIP-1a, MIP1b, MCP4, MCP1, IP10, Eotaxin, Eotaxin-3, MDC - 데이터 미제시)에 대해 주요 차이는 관찰되지 않았다.
실시예 5 - OxIL-33은 침지 단일층 상피 배양물에서의 긁힌 상처 회복 반응을 손상시킨다
14. oxIL-33은 EGF와 대조적으로 A549 및 NHBE 세포에서의 긁힌 상처 봉합을 손상시킨다
A549를 ATCC로부터 얻었고, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 10% FBS로 보충한 RPMI GlutaMax 배지에서 배양하였다. 세포를 어큐타제(PAA, #L1 1-007)로 채취하고, 5×105개/100 ㎕로 96웰 플레이트에 파종하고 나서, 37℃, 5% CO2에서 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 웰을 100 ㎕의 PBS로 2회 세척한 후에 100 ㎕의 기아상태 배지(1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충한 RPMI GlutaMax 배지)를 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. WoundMaker™(Essen Bioscience)를 이용하여, 세포를 긁어내고, 이어서, 웰을 200 ㎕의 PBS로 2× 세척한 후에 표시된 자극; 배지 단독(비자극 대조군), 30 ng/㎖의 환원된 IL-33-01, 30 ng/㎖의 산화된 IL-33-01 또는 30 ng/㎖ EGF를 포함하는 0.1% FBS(v/v) 및 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신으로 보충한 RPMI GlutaMax 배지를 첨가하고 37℃, 5% CO2로 복귀시켰다. 상처 치유 영상화를 위해 플레이트를 IncucyteZoom에 두었고, 48시간에 걸쳐 분석하였다. Incucyte Zoom 소프트웨어 내의 상처 치유 알고리즘을 통해 상대 상처 밀도를 계산하였다.
NHBE(CC-2540)를 Lonza로부터 얻고, 제조업자의 프로토콜에 따라 완전 BEGM 배지[BEGM(Lonza CC-3171) 및 보충 키트(Lonza CC-4175)]에서 유지하였다. 세포를 어큐타제로 채취하고, 배양 배지 중 96-웰 플레이트 ImageLock 플레이트(Sartorius, 4379)에서 5×105개/100 ㎕에서 파종하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이 후에, 배지를 흡입하고, 세포를 100 ㎖의 PBS로 2회 세척한 후에 기아상태 배지(1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충한 보충 키트 없이 BEGM(Lonza CC-3171))를 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 긁힘 상처 전에 37℃, 5% CO2에서 추가 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. WoundMaker™(Essen Bioscience)를 이용하여, 세포를 긁어내고, 이어서, 웰을 200 ㎕의 PBS로 2× 세척한 후에 표시된 자극; 배지 단독(비자극 대조군), 30 ng/㎖의 환원된 IL-33-01, 30 ng/㎖의 산화된 IL-33-01 또는 30 ng/㎖ EGF를 포함하는 0.1% FBS(v/v) 및 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신으로 보충한 BEBM 배지(Lonza)를 첨가하고 37℃, 5% CO2로 복귀시켰다. 상처 치유 영상화를 위해 플레이트를 IncucyteZoom에 두었고, 48시간에 걸쳐 분석하였다. Incucyte Zoom 소프트웨어 내의 상처 치유 알고리즘을 통해 상대 상처 밀도를 계산하였다. 도 12에 나타낸 바와 같이, oxIL-33은 A549 세포(도 12a) 및 NHBE 세포(도 12b)의 침지된 배양물에서 상처 치유를 저해하였고, 이는 증가된 상처 세포 밀도가 관찰된 EGF와 반대 효과를 갖는다.
15. 산화된 IL-33에 의한 긁힘 상처 봉합의 손상은 항체 중화 RAGE 또는 EGFR에 의해 방지될 수 있지만 ST2에 의해서는 방지될 수 없다
oxIL-33의 이들 기능적 효과가 RAGE/EGFR을 통해 매개되었는지 여부를 이해하기 위해, 부문 14에 기재된 바와 같은 NHBE 세포에서 긁힘 분석을 수행하였지만, 상이한 수용체 성분을 중화시킨 항체의 존재에서는 그렇지 않았다. NHBE 세포를 10 ㎍/㎖ 항-ST2(AF532, R&D Systems), 항-RAGE(M4F4, WO 2008137552) 또는 항-EGFR(Clone LA1, 05-101 Millipore)의 존재 하에 배지 단독(비자극 대조군), 환원된 IL-33, 또는 산화된 IL-33으로 처리하였다. OxIL-33은 긁힘 봉합을 저해하지만, 환원된 IL-33은 그렇지 않았다. oxIL-33의 이런 효과는 항-RAGE 및 항-EGFR에 의해 반전되지만 항-ST2에서는 그렇지 않으며, 또한 RAGE 및 EGFR이 산화된 IL-33 신호전달 경로에 관련된 필수 수용체라는 것을 입증한다(도 13).
실시예 6 - 항-IL-33은 침지된 배양물에서 COPD 세포의 표현형을 개선시킨다
16. OxIL-33은 긁힘 상처 봉합 분석에서 건강체 NHBE에서 COPD-유사 반응을 유도할 수 있다
다음에, 건강체, 흡연자 및 COPD 기관지 상피 세포에서 산화된 IL-33의 효과를 연구하였다. NHBE(CC-2540), 흡연자로부터의 NHBE(CC-2540) 및 DHBE(COPD, 00195275)를 Lonza로부터 얻었고, 제조업자의 프로토콜에 따라 완전 BEGM 배지(Lonza)에서 유지하였다. 부문 14에 기재한 바와 같이 긁힘 분석을 수행하였다. 세포를 배지 단독(비자극 대조군), 또는 30 ng/㎖의 산화된 IL-33으로 처리하였다. 흡연자 또는 COPD로부터의 기관지 상피 세포는 oxIL-33에 의한 건강체 세포의 처리 후에 관찰된 손상과 유사한 건강한 대상체로부터의 세포와 비교할 때 긁힘 봉합의 손상된 능력을 나타내었다(도 14). 건강체 세포와 대조적으로, 긁힘 봉합 반응은 흡연자 및 COPD HBE 세포에서 oxIL-33에 의해 추가로 손상되지 않았다(도 14).
17. RAGE/EGFR 경로를 통한 내인성 IL-33의 차단은 COPD 기저 세포의 손상된 긁힘 상처 회복 표현형을 개선시킬 수 있다.
상피 세포는 IL-33을 생성하는 것으로 알려져 있기 때문에, 오토크린 IL-33 분비는 COPD 세포에서 관찰된 손상된 긁힘 회복 표현형의 원인일 수 있다. 연구를 위해, IL-33 중화의 존재 하에 COPD로부터의 기관지 상피세포에서 긁힘 봉합 분석을 수행하였다. NHBE(Lonza CC-2540) 및 DHBE(Lonza, COPD 00195275)를 제조업자의 프로토콜에 따라 완전 BEGM 배지(Lonza)에서 유지하였다. 세포를 어큐타제로 채취하고, 배양 배지 중 96-웰 플레이트 ImageLock 플레이트(Sartorius, 4379)에서 5×105개/100 ㎕로 파종하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이 후에, 배지를 흡입하고, 세포를 100 ㎖의 PBS로 2회 세척한 후에 기아상태 배지(1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충한 보충 키트 없이 BEGM(Lonza CC-3171))를 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 긁힘 상처 전에 37℃, 5% CO2에서 추가 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. WoundMaker™(Essen Bioscience)를 이용하여, 세포를 긁고, 이어서, 웰을 10 ㎍/㎖의 항-IL-33(33_640087-7B, WO2016/156440에 기재), 항-ST2(AF532, R&D Systems), 항-RAGE(M4F4, WO 2008137552) 또는 NIP228(IgG1 아이소타입 대조군)을 함유하는 0.1% FBS(v/v) 및 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신으로 보충한 BEBM 배지(Lonza)의 첨가 전에 200 ㎕의 PBS로 2× 세척하고, 37℃, 5% CO2로 복귀시켰다. 상처 치유 영상화를 위해 플레이트를 IncucyteZoom에 두었고, 48시간에 걸쳐 분석하였다. Incucyte Zoom 소프트웨어 내의 상처 치유 알고리즘을 통해 상대 상처 밀도를 계산하였다. 이전에 관찰된 바와 같이, COPD 세포는 건강한 대상체로부터 유래된 세포에 비해 이들의 긁힘 봉합 반응이 손상되었다. 항-IL-33 및 항-RAGE는 건강체 세포와 유사한 수준으로 COPD 세포의 긁힘 봉합 반응을 개선시킬 수 있었으나, 항-ST2는 그렇지 않았는데(도 15), 이는 상피 세포가 RAGE/EGFR 경로를 통해 신호를 전달하는 오토크린 IL-33을 생성한다는 것을 입증한다(도 15).
실시예 7 - 항-IL-33은 3D 상피 배양물에서 술잔세포를 감소시킨다
18. 기도 기저 세포의 공기-액체 계면(ALI) 배양물
다음에 발명자들은 공기-액체 계면 세포 배양물("ALI 배양물")에서 IL-33 신호전달의 연관성을 확인하고자 하였다. ALI 배양은 기저 세포가 공기에 노출된 배지 및 상부(정단부) 세포층과 접촉되는 이들의 기저 표면에 의해 성장되는 방법이다. ALI 배양은 기관 상피와 유사한 다열상피의 점막 섬모 표현형을 갖는 시험관내 3차원 세포 구조의 발생을 가능하게 한다. 따라서, ALI 배양물은, 호흡기 상피, 예컨대, 세포-대-세포 신호전달, 질환 모델링 및 호흡기 재생의 근본적인 양상을 연구하기 위해 사용될 수 있다.
건강한 공여자 또는 COPD 환자로부터의 냉동 폐 기저 세포의 동결 바이알을 University of North Carolina 및 University of Pittsburgh로부터 받았다. 세포를 해동시키고, 1X PBS(Gibco, 매사추세츠주 월섬 소재)에서 1:70으로 희석시킨 Purecol I형 소 콜라겐(Advanced BioMatrix, 캘리포니아주 샌디에이고 소재)으로 코팅한 T-75 플라스크 상에서 플레이팅하고, Epix 배지(276-201, Propagenix, 메릴랜드주 록빌 소재)에서 성장시켰다. 합류에 도달된 후, 이들 세포를 적절한 수의 T-75 플라스크로 한 번 분할시킨 후에 ALI 배양물에 대해 채취하였다. 12 ㎜, 0.4 μM 폴리에스터 막 삽입물(Costar, Corning, 뉴욕주 소재)을 함유하는 ALI 배양을 위한 트랜스웰을, 1:70 Purecol 용액으로 삽입물을 코팅하고 37℃에서 1 내지 16시간 동안 인큐베이션시킴으로써 제조하였다. Purecol 용액을 제거하고, 트랜스웰을 UV 광 하에 30분 동안 두고, 이어서, PBS로 세척하였다. T-75 플라스크 내 기저 세포를 4 ㎖의 트립신 용액(ThermoFisher, 15400054)을 이용하여 분리시켰다. 세포 현탁액을 5 ㎖의 FBS를 함유하는 50 ml 관에 첨가하고, 이어서, ViCell 계수기(Beckman Coulter, 캘리포니아주 브레아 소재) 상에서 계수하고, 1,000 RPM에서 5분 동안 교반하였다. 이어서, 세포를 3.57×105개/㎖의 밀도로 Pneumacult ALI 배지(Stemcell Tech, 브리티시컬럼비아주 밴쿠버 소재)에서 재현탁시키고, 700 ㎕를 각 트랜스웰 상에 제공하였다. 1 ㎖의 ALI 배지를 삽입물 아래 공간에 첨가하였다. 배지가 정단부 측으로부터 제거되고 세포가 2주 동안 분화되는 시점인 합류 및 밀착연접이 형성될 때까지(전형적으로 7일) 세포를 ALI 배지에 침지된 채로 두었고, 배지를 격일로 기저측에서 교체하였다. 완전히 분화된 배양물을 항체로 처리하지 않거나, 배양물의 기저측에 공급한 배지에서 처리의 포함에 의해 7일 동안 1 ㎍/㎖ 항-IL-33(33_640087-7B) 또는 1 ㎍/㎖ NIP228(IgG1 아이소타입 대조군)로 처리하였다. 배지 교체를 격일로 수행하였다(적절한 처리를 포함).
19. IHC triplex 염색(기저, 술잔 및 섬모) 및 정량화
COPD 공여자로부터의 ALI 배양물을 생성하고, 부문 18에 기재한 바와 같이 처리하였다. ALI 상피 배양물을 24시간 동안 10% 중성 완충 포르말린에 고정시키고, 파라핀 포매하였다. 파라핀 절편(4 ㎛)을 양으로 하전된 슬라이드 상에 장착하고, 순차적 3 플렉스 색원체 분석(plex chromogenic assay)으로 Ventana Discovery Ultra 상에서 염색하였다. 세포 조건조 1(cell conditioner 1: CC1)(카탈로그 번호 5424569001, Roche)을 이용하여 항원 회수를 행하고, 내인성 퍼옥시다제를 Discovery 저해제(카탈로그 번호 7017944001, Roche)로 12분 동안 차단시켰다. 항-p63(클론 4A4)(카탈로그 번호 790-4509, Roche, 스위스 바젤 소재)을 24시간 동안 36℃에서 적용하고, 마우스 항-HQ(12분)(카탈로그 번호 7017782001, Roche) 및 항-HQ HRP(12분)(카탈로그 번호 7017936001, Roche)으로 시각화하고, Teal 기재(카탈로그 번호 8254338001, Roche)에서 12분 동안 인큐베이션시켰다. 슬라이드를 세포 조건조 2(CC2)(카탈로그 번호 5424542001, Roche)를 이용하는 항체 변성 단계(24분 동안 100℃)로 처리하고, 이어서, 항-튜불린(카탈로그 번호 ab24610, Abcam, 영국 캠브리지 소재)을 Dako 항체 희석제(카탈로그 번호 S3022)로 16분 동안 0.01 ㎍/㎖로 희석시키고, 마우스 OmniMap-HRP(8분)(카탈로그 번호 5269652001, Roche)로 검출하고, Discovery Purple 기재(카탈로그 번호 7053983001, Roche)로 16분 동안 시각화하였다. 슬라이드를 CC2에 의한 추가적인 항체 변성으로 처리하고, 이어서, 토끼 항-뮤신 5AC 1.1 ㎍/㎖ 및 토끼 항-뮤신 5B 7 ㎍/㎖(각각 카탈로그 번호 ab198294 및 카탈로그 번호 ab87376, Abcam)의 칵테일을 20분 동안 적용하고, 항-토끼 NP(4분)(카탈로그 번호 7425317001, Roche), 항-NP-AP(8분)(카탈로그 번호 7425325001, Roche), 이어서, Discovery Yellow(카탈로그 번호 7698445001, Roche)로 20분 동안 시각화하였다. 염색 슬라이드를 Dawn 세정제로 린스하고, 헤마톡실린(카탈로그 번호 5277965001, Roche)으로 대비염색하고 나서, 린스하고, 등급화된 일련의 에탄올과 자일렌으로 탈수시키고, 영구적인 장착 배지로 장착하였다. HALO 소프트웨어를 이용한 정량화는 항-IL-33으로 처리된 건강한 공여자로부터 유래된 ALI 배양물에서의 술잔세포 감소를 나타내었다(도 16).
실시예 8 - 항-IL-33은 COPD으로부터의 3D 상피 배양물에서 뮤신을 조절하고 점액 움직임을 개선시킨다
20. IHC 이중가닥 IF 염색(뮤신5B+뮤신5AC)
COPD 공여자로부터의 ALI 배양물을 생성하고, 부문 18에 기재한 바와 같이 처리하였다. ALI 상피 배양물을 24시간 동안 10% 중성 완충 포르말린에 고정시키고, 파라핀 포매하였다. 파라핀 절편(4 um)을 양으로 하전된 슬라이드 상에 장착하고, 순차적 2 플렉스 면역형광 분석으로 Ventana Discovery Ultra 상에서 염색하였다. 세포 조건조 1(CC1)을 이용하여 항원 회수를 행하고, 내인성 퍼옥시다제를 Discovery 저해제로 12분 동안 차단시키고, S Block(RUO) Roche Diagnostics(카탈로그 번호 760-4212)로 8분 동안 차단시키고, Dako Ab 희석제인 S3022에 희석시킨 7 ㎍/㎖에서 사용된 항-Mucin5B에서 24분 동안 36C에서 인큐베이션하고, 항-토끼-HQ(Roche Diagnostics 카탈로그 번호 760-4815)로 4분 동안 그리고 항-HQ-HRP(Roche Diagnostics 카탈로그 번호 760-4820)로 8분 동안 검출하였다. 이어서, 샘플을 티라마이드 접합체인 Discovery FITC(Roche Diagnostics 카탈로그 번호 760-232)와 함께 8분 동안 인큐베이션시켰다. Discovery Ultra 프로그램에서 Dual Sequence를 선택하고, 샘플을 세포 조건조 2(CC2)를 이용하여 항체 변성 단계(24분 동안 100℃)로 처리하고, 이어서, 항-Mucin5AC, 1.1 ㎍/㎖의 적용 전에 20분 동안 36℃에서 Discovery 저해제(40℃, 24분)로 중화시켰다. Mucin5AC를 항-토끼-HQ(Roche Diagnostics 카탈로그 번호 760-4815)로 4분 동안 그리고 항-HQ-HRP(Roche Diagnostics 카탈로그 번호 760-4820)로 8분 동안 검출하고, 티라마이드 접합체인 Discovery Red610으로 8분 동안 시각화시켰다. 이 단계를 완료한 후에, 염색된 슬라이드를 Discovery Ultra Autostainer로부터 제거하고, Dawn 세정제로 린스하고, 이어서, 탈이온수로 린스하였다. 1 ㎍/㎖에서 2분 동안 탈이온수 중에 희석시킨 4',6-디아미디노-2-페닐인돌, 디하이드로클로라이드(DAPI Nucleic Acid Stain), ThermoFisher 카탈로그 번호 D1306에서 샘플을 인큐베이션시켰다. 샘플을 탈이온수로 린스하고, ProLong Gold Antifade 장착 배지(ThermoFisher, 카탈로그 번호 P36930)로 커버슬립하고, 가벼운 꽉 끼는 슬라이드 박스에 보관하였다. 염색 슬라이드를 Zeiss LSM 880 공초점 현미경(Carl Zeiss Microscopy, LLC, 뉴욕주 화이트 플레인즈 소재)으로 영상화하였다. 도 17은 ALI 배양물의 항-IL-33 처리가 COPD 배양물에서 상이한 뮤신의 하향 조절을 야기할 수 있다는 것을 나타낸다.
21. 항-IL-33은 COPD ALI 배양물에서 관찰된 손상된 점막 섬모 제거를 반전시킨다
COPD 공여자로부터의 ALI 배양물을 생성하고, 부문 18에 기재한 바와 같이 처리하였다. 이어서, PBS 중 1:33으로 희석시킨 30 ㎕의 0.2 μM FluoSpheres(ThermoFisher, F8811)를 정단부 면에 첨가하고, Zeiss LSM800 현미경을 이용하여, FluoSphere 움직임의 짧은 영상을 포착하고, 점막 섬모 움직임이 항-IL-33(33_640087-7B)에 의한 처리 후에 증가되지만, 대조군 항체는 그렇지 않다는 것을 나타낸다.
실시예 9 - ALI 배양물의 단세포 RNA 분석은 항-IL-33에 의한 처리 후 술잔세포 변화를 나타낸다
COPD 공여자로부터의 ALI 배양물을 생성하고, 부문 18에 기재한 바와 같이 처리하였다. 단세포 현탁액을 얻기 위해, 필터 삽입물을 0.25% 트립신과 함께 5분 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 아래 위로 PBS 피펫팅에 의해 세척함으로써 상피 세포를 필터로부터 부드럽게 제거하고, 이어서, 15 ㎖ Falcon 관에 옮겼다. 세포를 1000 RPM에서 5분 동안 4℃에서 원심분리시켰다. 상청액을 제거한 후에, 세포를 PBS 중 0.4% BSA에서 재현탁시키고, 서열분석을 위해 세포 농도를 1000개의 세포/㎕로 조절하였다. 5000 내지 10,000개의 세포/통로를 포획하기 위해 크로뮴 단세포 3' 키트에서 표준 프로토콜에 따라 세포 현탁액을 장입하였다. Version 2 chemistry를 사용하였다. 제조업자의 프로토콜(Chromium™ 단세포 3' 시약 키트, v2 Chemistry)에 따라 Illumina 서열분석을 위한 단세포 3' 라이브러리를 얻었다. 라이브러리를 품질에 대해 평가하였고(TapeStation 4200, Agilent), 이어서, NextSeq 500 또는 NovaSeq 6000 기기(Illumina) 상에서 서열분석하였다. Cell Ranger 버전 2.0 파이프라인(10x Genomics)를 이용하여 초기 데이터 처리를 수행하였다. 낮은 세포 품질의 제외 및 정규화를 위해 Seurat 패키지를 이용하여 후 처리를 수행하였다. 샘플 내 이질성을 포착하기 위해 각 샘플을 독립적 데이터로서 분석하였다(세포 서브타이핑). t-분포 확률적 임베딩(t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding: tSNE)을 이용하여 클러스트링 및 시각화를 실현하였다. 마커 유전자에 의해 COPD에서 세포 클러스터의 식별을 가이드하였다. 다른 샘플에 대해, 초기 클러스터를 수동으로 검사하고, 이어서, Seurat's Label Transfer 알고리즘을 아형 식별을 위해 적용하였다. 부문 18에 언급된 바와 같은 항-IL-33 처리와 함께 그리고 이러한 처리 없이 COPD ALI 배양물로부터의 세포 사이의 각 클러스터에 대해 MUC5AC 및 MUC5B 유전자 발현 분석을 수행하였다. Seurat를 이용하여 히트맵 및 tSNE 플롯을 생성하였다. 도 18은 처리 없음에 비해 항-IL-33(33_640087-7B)으로 처리한 COPD ALI 배양물에서 발견되는 상이한 비율의 세포 아형을 도시하는 tSNE 플롯을 나타낸다. 도 18에 나타낸 바와 같이, 항-IL-33 처리 후에 MUC5B 고세포의 감소가 확인되었다.
실시예 10 - 항-IL-33은 COPD 3D 상피 배양물에서 술잔세포를 감소시킨다
22. 기도 기저 세포의 공기 액체 계면(ALI) 배양물
생리적으로 적절한 공기 액체 계면(ALI) 배양 시스템에서 oxIL-33의 효과를 정량화하고 정보를 얻기 위해, 술잔세포 유형(MUC5ac 대 MUC5b)과 상피 집단 나머지(뮤신 음성) 간을 구별하기 위한 목적의 유세포분석을 개발하였다.
건강체(CC-2540) 대조군 또는 COPD(195275) 환자로부터의 냉동 폐 기저 세포의 동결 바이알을 Lonza로부터 받았다. 공여자당 1개의 바이알을 해동시키고, Epix 배지(276-201, Propagenix, 메릴랜드주 록빌 소재)에서 4× T-175 플라스크 상에 플레이팅하였다. 합류에 도달된 후에, 이들 세포를 P2에서 바이알당 1e6개의 세포로 냉동시켰다. P2에서 세포를 Epix 배지에서 2× T-75 플라스크 내로 개시하였고 80% 합류까지 성장시켰다. 12 ㎜ 또는 6.5 ㎜의 0.4 μM 폴리에스터 막 삽입물(Costar, Corning, 뉴욕주 소재)을 함유하는 ALI 배양을 위한 트랜스웰을 1× 콜라겐 I 용액(Celladhere™ 콜라겐 I - Stemcell #07001, dH2O에서 제조)으로 삽입물을 코팅하고 37℃에서 1 내지 16시간 동안 인큐베이션시킴으로써 제조하였다. 콜라겐 I 용액을 제거하고, 트랜스웰을 PBS로 세척하였다. T-75 플라스크에서 기저 세포를 PBS로 세척하고, 6 ㎖의 트립신 용액(Lonza 트립신 계대배양 팩 - #CC-5034)을 이용하여 분리시켰다. 트립신을 6 ㎖의 트립신 중화 용액(Lonza 트립신 하위배양 팩 - #CC-5034)으로 중화시키고, 세포 현탁액을 15 ㎖ 관에 첨가하고, 계수하고 나서, 1,200 RPM에서 5분 동안 교반하였다. 이어서, 세포를 Pneumacult ALI 배지(Stemcell Tech, 브리티시컬럼비아주 밴쿠버 소재)에서 8×105개/㎖의 밀도로 재현탁시키고, 0.5 ㎖를 각 12 ㎜ 트랜스웰에 제공하고, 0.25 ㎖를 각 6.5 ㎜ 트랜스웰에 제공하였다. 1 ㎖의 ALI 배지를 12 ㎖ 삽입물 아래 공간에 첨가하고, 0.5 ㎖를 6.5 ㎜ 삽입물 아래에 첨가하였다. 배지가 정단부 측으로부터 제거되고 세포가 3주 동안 분화되는 시점인 합류 및 밀착연접이 형성될 때까지(전형적으로 7일) 세포를 ALI 배지에 침지된 채로 두었고, 배지를 월요일, 수요일 및 금요일마다 기저측에서 교체하였다. 완전 분화된 정상 배양물을 비처리인 채로 두거나 또는 배양물의 기저측에 공급된 배지에서의 처리의 포함에 의해 환원 또는 산화된 비태그 IL33-01(30 ng/㎖), 비태그 IL33-16(30 ng/㎖), IL-13(10 ng/㎖), EGF(30 ng/㎖) 또는 HMGB1(30 ng/㎖)로 7일 동안 처리하였다(7일 처리). 완전 분화된 COPD 배양물을 비처리인 채로 두거나 또는 배양물의 기저측에 공급된 배지에서의 처리의 포함에 의해 1 ㎍/㎖ 항-IL-33(33_640087-7B), 1 ㎍/㎖ NIP228(IgG1 아이소타입 대조군), 10 ㎍/㎖ mNIP228, 10 ㎍/㎖ 항-ST2, 1 ㎍/㎖ 항-RAGE 또는 1 ㎍/㎖ 항-EGFR로 7일 동안 처리하였다. 배지 교체를 월요일, 수요일 및 금요일마다 수행하였다(적절한 처리를 포함).
Figure pct00010
23. ALI 배양물에서의 술잔세포의 FACS 분석
7-일 처리 후에(표 6), 6.5 ㎜ 삽입물에 대한 4-주령 정상 대조군 또는 COPD ALI 배양물을 유세포분석에 의해 분석하였다. 200 ㎕, 37℃ PBS를 각 트랜스웰의 정단부 영역(트랜스웰 표면)에 첨가하고, 인큐베이터에 30분 동안 넣었다. 뮤신 분석을 위해 정단부 세척물을 -80에서 보관하였다. 150 ㎕ 트립신(Lonza 트립신 계대배양 팩 - #CC-5034)을 정단부와 기저측부(트랜스웰 아래) 구획 둘 다에 첨가하였다. 트랜스웰을 인큐베이터에 30분 동안 복귀시켰다. 트립신을 위 아래로 부드럽게 피펫팅함으로써 ALI를 해리시켰다. 150 ㎕ 트립신 중화 용액(Lonza 트립신 계대배양 팩 - #CC-5034)을 각 정단부 챔버에 첨가하고, 혼합하였다. 세포 현탁액을 U-형 90-웰 플레이트로 이동시키고, 세포를 계수하고, 1200 RPM에서 5분 동안 4℃에서 원심분리시켰다. 트립신/TNS를 제거하고, 200 ㎕의 live dead 염색(eBioscience™ Fixable Viability Dye eFluor™ 780 Thermo 65-0865-14, PBS 중 1:2000로 희석)을 각 웰에 첨가하였다. 세포를 재현탁시키고, 암실 내 얼음 상에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 1200 RPM에서 5분 동안 4℃에서 원심분리시키고, live dead 염색을 제거하고, 200 ㎕ PBS를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 1200 RPM에서 5분 동안 4℃에서 원심분리시키고, PBS를 제거하고, 200 ㎕ 고정/침투화 용액(Thermo 00-5123 및 00-5223)으로 대체하였다. 플레이트를 암실 내 얼음 상에서 40분 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 1200 RPM에서 5분 동안 4℃에서 원심분리시키고, 용액을 제거하였다. 300 ㎕의 1× 침투화 용액(Thermo 00-8333)에서 세포를 재현탁시켰다. 각 웰로부터의 5e4 세포를 새로운 96-웰 U 바닥 플레이트에 첨가하고, 4℃에서 5분 동안 1200 RPM에서 원심분리시키고 나서, 세포를 50 ㎕의 1× 침투화 용액에서 재현탁시켰다. 동일 용리에서 50 ㎕의 항체 염색 칵테일(1:400로 항-Muc5AC 및 1:800으로 항-Muc5B) 또는 아이소타입 염색 칵테일. 플레이트를 암실 내 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 1200 RPM에서 5분 동안 4℃에서 원심분리시키고, 용액을 제거하였다. 세포를 PBS로 세척하고, 원심분리시키고, 이어서, 150 ㎕의 PBS에서 재현탁시켰다. 이어서, 데이터를 BD FACSymphony™에서 획득하고, FlowJo 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
Figure pct00011
24. ALI 배양물의 qPCR/벌크 RNA 서열분석.
7-일 처리 후에(표 6), 6.5 ㎜ 삽입물에 대한 4-주령 정상 대조군 또는 COPD ALI 배양물을 RNA분석을 위해 용해시켰다. 처음에 200 ㎕의 37℃ PBS를 각 ALI 정단부 면에 첨가하고, 플레이트를 인큐베이터에 30분 동안 복귀시켰다. 뮤신 분석을 위해 정단부 세척물을 -80에서 보관하였다. ALI 배양물을 용해시키고 RNA를 추출하기 위해 MagMAX™-96 총 RNA 단리 키트(Thermo, AM1830)를 사용하였다. 이어서, High-Capacity RNA-대-cDNA™ 키트(Thermo, 4388950)를 이용하여 cDNA를 합성하기 위해 RNA를 사용하였다. 이에 의해, 9 ㎕의 각 RNA 샘플을 PCR 관(Thermo, AM12230)에서 10 ㎕의 2X RT 완충제 혼합물 및 1 ㎕의 20X RT 효소 혼합물과 함께 인큐베이션시키고, 서모사이클러에 넣고, 37℃에서 60분 동안 인큐베이션시켰다. 5분 동안 95℃까지 가열함으로써 반응을 중단시키고, 4℃에서 유지하였다. 60 ㎕의 무 뉴클레아제 워터(Thermo, 750024)를 20 ㎕의 cDNA를 함유하는 각 관에 첨가하였다. RT-qPCR을 위해, 4 ㎕의 cDNA를 5 ㎕의 TaqMan Fast Advanced Master Mix(Thermo, 4444557) 및 0.5 ㎕의 Muc5AC FAM 프로브(Thermo, Hs01365616_m1) 및 0.5 ㎕의 GAPDH VIC 프로브(Thermo, Hs02786624_g1)와 함께 바코드를 갖는 MicroAmp™ EnduraPlate™ 광학 384-웰 투명 반응 플레이트(Thermo, 4483273)에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 잠시 원심분리시킨 후에 QuantStudio™ 7 Flex 실시간 PCR 시스템(Thermo)을 이용하여 분석하였다. 이어서, 데이터를 비처리 정상 대조군에 정규화함으로써 델타-델타-ct를 계산하였다.
oxIL-33은 증가된 술잔세포 수, 특히, MUC5AC+ 술잔세포 서브세트를 야기하였지만, 환원된 IL-33은 그렇지 않았다(도 19a 내지 도 19c). 따라서, MUC5AC mRNA 복제물은 qPCR에 의해 판단할 때 oxIL-33에 의한 처리 시 증가되었다(도 19d).
25. IHC 삼중복합 염색(기저, 술잔 및 섬모) 및 정량화
다음에, ALI 면역조직화학으로부터의 정량적 영상 분석을 평가하였다. COPD 공여자로부터의 ALI 배양물을 생성하고, 부문 22; 공기 기저 세포의 공기 액체 계면(ALI) 배양물에 기재한 바와 같이 처리하였다. ALI 상피 배양물을 24시간 동안 10% 중성 완충 포르말린에 고정시키고, 파라핀 포매하였다. 파라핀 절편(4 ㎛)을 양으로 하전된 측면 상에 장착하고, 순차적 3 플렉스 색원체 분석(plex chromogenic assay)으로 Ventana Discovery Ultra 상에서 염색하였다. 세포 조건조 1(Ultra CC1)(카탈로그 번호 5424569001, Roche)을 이용하여 항원 회수를 행하고, 내인성 퍼옥시다제를 Discovery 저해제(카탈로그 번호 7017944001, Roche)로 12분 동안 차단시켰다. 항-p63(클론 4A4)(카탈로그 번호 790-4509, Roche, 스위스 바젤 소재)을 24분 동안 적용하고, 항-마우스 HQ(12분)(카탈로그 번호 7017782001, Roche) 및 항-HQ HRP(12분)(카탈로그 번호 7017936001, Roche)로 시각화하고, Discovery Purple 키트(카탈로그 번호 07053983001, Roche)로 12분 동안 인큐베이션시켰다. 슬라이드를 세포 조건조 2(CC2)(카탈로그 번호 5424542001, Roche)를 이용하여 항체 변성 단계(24분 동안 92℃)로 처리하고, 이어서, 항-튜불린(카탈로그 번호 ab24610, Abcam, 영국 캠브리지 소재)을 Dako 항체 희석제(카탈로그 번호 S3022)로 16분 동안 희석시키고(슬라이드 상의 농도 0.003 ㎍/㎖), 마우스 OmniMap-HRP(8분)(카탈로그 번호 5269652001, Roche)로 검출하고, Teal HRP 키트(카탈로그 번호 82544338001, Roche)로 시각화하였다. 슬라이드를 CC2에 의한 추가적인 항체 변성으로 처리하고, 이어서, 토끼 항-뮤신 5AC 1.1 ㎍/㎖(디스펜서 농도) 및 토끼 항-뮤신 5B 7 ㎍/㎖(디스펜서 농도)(각각 카탈로그 번호 ab198294 및 카탈로그 번호 ab87376, Abcam)의 칵테일을 20분 동안 적용하고, 항-토끼 NP(4분)(카탈로그 번호 7425317001, Roche), 항-NP-AP(8분)(카탈로그 번호 7425325001, Roche)으로 시각화하고, 이어서, Discovery Yellow 키트(카탈로그 번호 7698445001, Roche)로 20분 동안 시각화하였다. 염색 슬라이드를 헤마톡실린 II(8분)(카탈로그 번호 5277965001, Roche) 및 Bluing 시약(4분)(카탈로그 번호 5266769001, Roche)로 대비 염색하고, 식기 세척 세제로 린스하고, 등급화된 일련의 에탄올 및 자일렌으로 탈수시키고, 영구적 장착 배지를 장착하였다.
IHC 영상을 HALO v3.1(Indica Labs)에서 분석하고, 이들을 초점이 맞지 않은 영역과 조직 손상 영역을 제외하도록, 먼저 수동으로 주석을 붙였다. 랜덤 포레스터 분류기(random forest classifier)를 상피를 인식하고 이를 막 및 유리 슬라이드 배경으로부터 분리시키도록 트레이닝하였다. 섬모 영역 정량화를 위해, 다른 랜덤 포레스트 분류기를 튜불린 염색의 개략적인 검출 다음에 알고리즘 Area Quantification v2.1.7을 이용하는 미세한 검출을 위해 트레이닝시켰다. 염색을 검출하기 위해 뮤신 면적 정량화 Area Quantification v2.1.7을 직접 사용하였다. 기저(p63+) 세포 계수를 위해, 알고리즘 CytoNuclear 2.0.9를 사용하여 핵 염색에 기반하여 세포를 절편화하고, p63 양성 핵을 계수함으로써 기저 세포를 추가로 검출하였다. 모든 정량화 방법은 인간 인식에 대해 입증되었고, 90% 초과의 정확도를 가졌다.
이전의 결과와 일치되게, oxIL-33은 술잔세포(MUC5ac+b)의 수에 깊이 영향을 미쳤다(도 20a 및 도 20b).
종합하면, 이들 연구는 폐 상피 내의 술잔세포 분화를 촉진시킴에 있어서 oxIL-33의 역할을 나타내었다. 이는 ox-IL33에 만성으로 노출된 상피가 폐 기능에 부정적으로 영향을 미치는 술잔 과형성 표현형으로 진화한다는 것을 시사한다.
26. 차단제를 사용한 COPD 술잔 표현형의 반전
COPD의 중요한 특질은 술잔세포 및 점액 분비의 증가로 인한 과도한 점액이다(Gohy et al 2019 Sci Rep 9:17963). 산화된 IL-33이 술잔 COPD 표현형에서 직접적인 역할을 할 수 있는지의 여부를 연구하기 위해, COPD 공여자로부터의 ALI 배양물을 부문 22 내지 25에 기재된 바와 같은 판독으로 확인하였다.
항-IL-33(33-640087_7B), 항-RAGE 또는 항-EGFR 중화 항체의 존재 하에 COPD ALI를 배양시켰다. 3가지의 처리는 모두 감소된 MUC5AC+ 술잔세포 수를 초래하였다(도 21a 내지 도 21d). 어떠한 처리도 ALI 배양물의 생존도에 영향을 미치지 않았고(도 21e), 이는 처리 현상이 인공물 또는 항체 독성 결과가 아니라는 것을 확인한다. 앞의 결과와 일치되게, 항-ST2 처리는 술잔세포 수의 감소를 야기하지 않았고, 이것이 oxIL-33-RAGE-EGFR 경로를 통해 IL-33, 원칙적으로는 ox-IL-33에 의해 직접 매개된 질환 표현형이라는 추가적인 증거를 제공한다. COPD ALI 배양물에 대한 항-IL-33 항체(33-640087_7B)의 효과는, IL-33의 차단이 쌍별 분석에서 감소된 술잔세포 수를 초래한 면역조직화학 분석에서 추가로 확인되었다(도 22a 및 도 22b). 항-IL-33 항체(33-640087_7B)에 의한 처리 후, COPD ALI 배양물의 상피는 도 20a에 나타낸 바와 같은 건강체 상피와 비슷하였다.
마지막으로, ELISA를 이용하여 건강체와 COPD ALI 배양물 둘 다로부터의 정단부 점액에서 방출된 MUC5AC 및 MUC5B를 측정하였다. ALI 배양물로부터 방출된 뮤신의 정량화를 위해, 정단부 상청액을 제조업자의 프로토콜에 따라 면역분석(Novus NBP2-76703)에 의해 MUC5AC 수준에 대해 분석하였다. 샘플을 샘플 희석물 중 1:2000로 희석시키고, 재조합 MUC5AC 단백질 표준 곡선으로부터 농도를 추론하였다. 도 23에 나타낸 바와 같이, COPD 환자로부터의 ALI 배양물은 건강한 공여자로부터의 ALI에 비해 증가된 수준의 MUC5AC를 방출시켰다(도 23a). 외인성 oxIL-33에 의한 처리는 건강체 ALI 배양물로부터의 증가된 뮤신 분비를 초래하였다(도 23b). COPD ALI 공여자에서, 증가된 수준의 뮤신은 ALI 배양물로부터 방출된 MUC5AC 단백질 수준을 저해하는 항-IL-33(33_640087_7B)에 의한 차단을 통해 감소되었지만, 항-ST2 또는 아이소타입 mAb 대조군은 그렇지 않았다(도 23c).
전반적으로 본 실시예는 폐에서의 상피 세포 분화의 하향조절에서 산화된 IL-33의 역할을 강조한다. 결과는, 제어되지 않을 때, 산화된 IL-33이 COPD의 일부 표현형에서 보이는 술잔세포 과형성 및 과도한 점액 생성의 원인일 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, oxIL-33 신호전달 축 길항제, 예컨대, 항-IL-33, 항-RAGE 또는 항-EGFR 결합 분자에 의한 처리는 정상 상피 생리를 회복함으로써, 예를 들어, 술잔세포 수를 감소시키고 과도한 점액 생성을 감소시킴으로써 COPD 환자에 대한 큰 치료적 이점을 가질 수 있다.
추가적인 서열
표 1에 열거되는 서열에 추가로, 본 명세서는 다음의 추가적인 CDR 서열을 제공한다:
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
SEQUENCE LISTING <110> MEDIMMUNE LIMITED <120> METHODS OF USING IL-33 ANTAGONISTS <130> IL33-107-WO-PCT <160> 52 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAIR 1 VH <400> 1 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Ala Ile Asp Gln Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Lys Phe Met Gln Leu Trp Gly Gly Gly Leu Arg Tyr Pro 100 105 110 Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 2 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAIR 2 VH <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ser Asp Leu Arg Thr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser His Tyr Ser Thr Ser Trp Phe Gly Gly Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAIR 3 VH <400> 3 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn His Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ser Gln 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Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu 1 5 10 15 Ala Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val 20 25 30 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr 35 40 45 Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 50 55 60 Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 85 90 95 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Lys Thr Tyr Pro 100 105 110 Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 <210> 32 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAIR 14 VL <400> 32 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ile Asn 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser His Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 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Artificial Sequence <220> <223> PAIR 1 LCDR1 <400> 40 Ser Gly Glu Gly Met Gly Asp Lys Tyr Ala Ala 1 5 10 <210> 41 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAIR 1 LCDR2 <400> 41 Arg Asp Thr Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAIR 1 LCDR3 <400> 42 Gly Val Ile Gln Asp Asn Thr Gly Val 1 5 <210> 43 <211> 34 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> N terminal His10/Avitag/Factor Xa protease cleavage site <400> 43 Met His His His His His His His His His His Ala Ala Gly Leu Asn 1 5 10 15 Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Ala Ala Ile Glu 20 25 30 Gly Arg <210> 44 <211> 159 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 44 Ser Ile Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Ser 1 5 10 15 Thr Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser Tyr 20 25 30 Glu Ile Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys Val 35 40 45 Leu Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly Asp 50 55 60 Gly Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys Asp 65 70 75 80 Phe Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His Lys 85 90 95 Cys Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn Met 100 105 110 His Ser Asn Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys Thr Asp Pro Gly Val Phe 115 120 125 Ile Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp Ser Ser 130 135 140 Glu Asn Leu Cys Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr 145 150 155 <210> 45 <211> 159 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> IL33-16 <400> 45 Ser Ile Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Ser 1 5 10 15 Thr Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser Tyr 20 25 30 Glu Ile Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys Val 35 40 45 Leu Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly Asp 50 55 60 Gly Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys Asp 65 70 75 80 Phe Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His Lys 85 90 95 Ser Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn Met 100 105 110 His Ser Asn Ser Val Ser Phe Glu Ser Lys Thr Asp Pro Gly Val Phe 115 120 125 Ile Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp Ser Ser 130 135 140 Glu Asn Leu Ser Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr 145 150 155 <210> 46 <211> 15 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Avitag sequence motif <400> 46 Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 1 5 10 15 <210> 47 <211> 19 <212> DNA <213> artificial <220> <223> gRNA vector targeting RAGE exon 3 <400> 47 tgaggggatt ttccggtgc 19 <210> 48 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> RAGE forward primer <400> 48 gttgcagcct cccaacttc 19 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> RAGE reverse primer <400> 49 aatgaggcca gtggaagtca 20 <210> 50 <211> 328 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 50 Met Gly Phe Trp Ile Leu Ala Ile Leu Thr Ile Leu Met Tyr Ser Thr 1 5 10 15 Ala Ala Lys Phe Ser Lys Gln Ser Trp Gly Leu Glu Asn Glu Ala Leu 20 25 30 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Tyr Trp Phe Ser Arg Ser Gly Lys Ala 145 150 155 160 Trp Ala Asp Ala Asp Asn Tyr Cys Arg Leu Glu Asp Ala His Leu Val 165 170 175 Val Val Thr Ser Trp Glu Glu Gln Lys Phe Val Gln His His Ile Gly 180 185 190 Pro Val Asn Thr Trp Met Gly Leu His Asp Gln Asn Gly Pro Trp Lys 195 200 205 Trp Val Asp Gly Thr Asp Tyr Glu Thr Gly Phe Lys Asn Trp Arg Pro 210 215 220 Glu Gln Pro Asp Asp Trp Tyr Gly His Gly Leu Gly Gly Gly Glu Asp 225 230 235 240 Cys Ala His Phe Thr Asp Asp Gly Arg Trp Asn Asp Asp Val Cys Gln 245 250 255 Arg Pro Tyr Arg Trp Val Cys Glu Thr Glu Leu Asp Lys Ala Ser Gln 260 265 270 Glu Pro Pro Leu Leu 275

Claims (89)

  1. RAGE-EGFR 매개 효과를 조절 또는 저해하는 것에 의한 비정상적 상피 생리의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한, IL-33 길항제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 비정상적 상피 생리는 비정상적 점막 섬모 생리, 바람직하게는 호흡기 상피의 비정상적 점막 섬모 생리인, IL-33 길항제.
  3. 제2항에 있어서, 비정상적 점막 섬모 생리는 비정상적 점액 생성; 비정상적 술잔세포 분화, 비정상적 술잔세포 증식; 상기 상피의 비정상적 두께; 비정상적 점액 제거; 및/또는 비정상적 점액 조성으로부터 선택된, IL-33 길항제.
  4. 제3항에 있어서, 비정상적 점액 생성은 비정상적 MUC5AC 생성을 포함하고/하거나; 비정상적 술잔세포 분화는 비정상적 MUC5AC+ 술잔세포 분화를 포함하고/하거나; 비정상적 술잔세포 증식은 비정상적 MUC5AC+ 술잔세포 증식을 포함하고/하거나; 상기 상피의 비정상적 두께는 상기 상피의 총 조직 면적에서의 MUC5AC+ 술잔세포의 비정상적 양을 포함하는, IL-33 길항제.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 비정상적 점막 섬모 생리는 증가된 점액 생성; 증가된 술잔세포 분화; 증가된 술잔세포 증식; 상기 상피의 증가된 두께; 및/또는 감소된 점액 제거를 포함하는, IL-33 길항제.
  6. 제5항에 있어서, 증가된 점액 생성은 증가된 MUC5AC 생성을 포함하고/하거나; 증가된 술잔세포 분화는 증가된 MUC5AC+ 술잔세포 분화를 포함하고/하거나; 증가된 술잔세포 증식은 증가된 MUC5AC+ 술잔세포 증식을 포함하고/하거나; 상기 상피의 증가된 두께는 상기 상피의 총 조직 면적에서의 MUC5AC+ 술잔세포의 증가된 양을 포함하는, IL-33 길항제.
  7. 제3항에 있어서, 비정상적 점액 조성은 점액에 함유된 상이한 점액 화합물 비의 증가 또는 감소; 하나 이상의 점액 화합물의 증가 또는 감소; 및/또는 점액의 농도 또는 두께의 증가 또는 감소를 포함하는, IL-33 길항제.
  8. 제7항에 있어서, 비정상적 점액 조성은 MUC5AC:MUC5B 비의 증가를 포함하고/하거나; 비정상적 점액 조성은 점액에 함유된 MUC5AC 증가를 포함하고/하거나; 비정상적 점액 조성은 점액 두께의 증가를 포함하는, IL-33 길항제.
  9. 제1항에 있어서, 상기 비정상적 상피 생리는 비정상적 상피 리모델링인, IL-33 길항제.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비정상적 상피 생리는 호흡관, 바람직하게는 상기 호흡관의 비정상적 점막 섬모 생리인, IL-33 길항제.
  11. 제10항에 있어서, 상기 호흡관은 하부 호흡관, 바람직하게는 기관지인, IL-33 길항제.
  12. EGFR-매개 질환의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 IL-33 길항제.
  13. 제12항에 있어서, 상기 EGFR-매개 질환은 RAGE-EGFR 매개 질환인, IL-33 길항제.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 EGFR 매개 질환은 비정상적 EGFR 활성을 특징으로 하는, IL-33 길항제.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EGFR 매개 질환은 비정상적 상피 생리를 특징으로 하는, IL-33 길항제.
  16. 상피 생리를 개선시키는 것에 의한 질환의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 IL-33 길항제.
  17. EGFR-매개 효과를 저해하는 것에 의한 질환의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 IL-33 길항제.
  18. 제17항에 있어서, 상기 EGFR-매개 효과는 EGFR 신호전달인, IL-33 길항제.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 EGFR-매개 효과는 RAGE-EGFR-매개 효과인, IL-33 길항제.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EGFR-매개 효과는 RAGE-EGFR-매개 신호전달인, IL-33 길항제.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환은 호흡기 질환인, IL-33 길항제.
  22. 제21항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 비정상적 상피 생리 및/또는 비정상적 EGFR 활성을 특징으로 하는, IL-33 길항제.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 하부 호흡기 질환, 바람직하게는 기관지의 호흡기 질환인, IL-33 길항제.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 COPD, 기관지염, 폐기종, 기관지확장증, 예컨대, CF-기관지확장증 또는 -CF-기관지확장증, 천식 또는 천식과 COPD의 중복(ACO)으로부터 선택된, IL-33 길항제.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 COPD, 바람직하게는 기관지염성 COPD인, IL-33 길항제.
  26. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 천식, 바람직하게는 기관지염성 천식인, IL-33 길항제.
  27. 제16항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 예방 또는 치료는 점액 제거를 개선시키는, IL-33 길항제.
  28. 제16항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 예방 또는 치료는 비정상적 점액 생성을 저해하거나 또는 감소시키는, IL-33 길항제.
  29. 제28항에 있어서, 상기 예방 또는 치료는 MUC5AC 생성을 저해하거나 또는 감소시키는, IL-33 길항제.
  30. 제16항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 예방 또는 치료는 비정상적 점액 조성을 저해하는, IL-33 길항제.
  31. 제30항에 있어서, 상기 예방 또는 치료는 MUC5AC:MUC5B 비를 저해 또는 감소시키고/시키거나; 상기 예방 또는 치료는 점액 중 MUC5AC를 저해 또는 감소시키고/시키거나; 상기 예방 또는 치료는 점액의 상기 두께를 감소시키는, IL-33 길항제.
  32. 제16항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 예방 또는 치료는 비정상적 상피 리모델링을 저해하는, IL-33 길항제.
  33. 제16항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 예방 또는 치료는 비정상적 술잔세포 분화 또는 증식을 저해하는, IL-33 길항제.
  34. 제33항에 있어서, 상기 비정상적 술잔세포 분화 또는 증식은 비정상적 MUC5AC+ 술잔세포 분화 또는 증식인, IL-33 길항제.
  35. 제16항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 예방 또는 치료는 상기 호흡기 상피의 두께를 감소시키는, IL-33 길항제.
  36. 제35항에 있어서, 상기 예방 또는 치료는 상기 상피의 총 조직 면적에서의 MUC5AC+ 술잔세포의 양을 감소시키는, IL-33 길항제.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-33 길항제는 산화된 IL-33의 상기 활성을 저해하는, IL-33 길항제.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-33 길항제는 RAGE에 대한 산화된 IL-33의 결합을 방지하여, RAGE-EGFR 신호전달을 저해하는, IL-33 길항제.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-33 길항제는 RAGE-EGFR 의존적 신호전달 및/또는 RAGE-EGFR 매개 효과를 하향조절하거나 저해하는, IL-33 길항제.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-33 길항제는 IL-33에 결합하고, 바람직하게는 환원된 IL-33 또는 산화된 IL-33에 결합하고, 바람직하게는 환원된 IL-33에 결합하는 결합 분자 또는 이의 단편인, IL-33 길항제.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-33 길항제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 바람직하게는 항-IL-33 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 바람직하게는 항-환원된-IL-33 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, IL-33 길항제.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-33 길항제는 표 1로부터 선택된 가변 중쇄 도메인(VH) 및 가변 경쇄 도메인(VL) 쌍의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 결합 분자인, IL-33 길항제.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-33 길항제는 표 1로부터 선택된 가변 중쇄 도메인(VH) 및 가변 경쇄 도메인(VL) 쌍을 포함하는 결합 분자인, IL-33 길항제.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-33 길항제는 서열번호 37의 서열을 갖는 VHCDR1, 서열번호 38의 서열을 갖는 VHCDR2, 서열번호 39의 서열을 갖는 VHCDR3, 서열번호 40의 서열을 갖는 VLCDR1, 서열번호 41의 서열을 갖는 VLCDR2 및 서열번호 42의 서열을 갖는 VLCDR3을 포함하는 결합 분자인, IL-33 길항제.
  45. RAGE-EGFR 매개 효과를 조절 또는 저해하기 위한 치료적 유효량의 IL-33 길항제를 투여하는 것에 의한 대상체에서의 비정상적 상피 생리의 예방 또는 치료 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 비정상적 상피 생리는 비정상적 점막 섬모 생리, 바람직하게는 호흡기 상피의 비정상적 점막 섬모 생리인, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 비정상적 점막 섬모 생리는 비정상적 점액 생성; 비정상적 술잔세포 분화, 비정상적 술잔세포 증식; 상기 상피의 비정상적 두께; 비정상적 점액 제거; 및/또는 비정상적 점액 조성으로부터 선택된, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 비정상적 점액 생성은 비정상적 MUC5AC 생성을 포함하고/하거나; 비정상적 술잔세포 분화는 비정상적 MUC5AC+ 술잔세포 분화를 포함하고/하거나; 비정상적 술잔세포 증식은 비정상적 MUC5AC+ 술잔세포 증식을 포함하고/하거나; 상기 상피의 비정상적 두께는 상기 상피의 총 조직 면적에서의 MUC5AC+ 술잔세포의 비정상적 양을 포함하는, 방법.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 비정상적 점막 섬모 생리는 증가된 점액 생성; 증가된 술잔세포 분화; 증가된 술잔세포 증식; 상기 상피의 증가된 두께; 및/또는 감소된 점액 제거를 포함하는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 증가된 점액 생성은 증가된 MUC5AC 생성을 포함하고/하거나; 증가된 술잔세포 분화는 증가된 MUC5AC+ 술잔세포 분화를 포함하고/하거나; 증가된 술잔세포 증식은 증가된 MUC5AC+ 술잔세포 증식을 포함하고/하거나; 상기 상피의 증가된 두께는 상기 상피의 총 조직 면적에서의 MUC5AC+ 술잔세포의 증가된 양을 포함하는, 방법.
  51. 제47항에 있어서, 비정상적 점액 조성은 점액에 함유된 상이한 점액 화합물 비의 증가 또는 감소; 하나 이상의 점액 화합물의 증가 또는 감소; 및/또는 점액의 농도 또는 두께의 증가 또는 감소를 포함하는, 방법.
  52. 제51항에 있어서, 비정상적 점액 조성은 MUC5AC:MUC5B 비의 증가를 포함하고/하거나; 비정상적 점액 조성은 점액에 함유된 MUC5AC 증가를 포함하고/하거나; 비정상적 점액 조성은 점액 두께의 증가를 포함하는, 방법.
  53. 제45항에 있어서, 상기 비정상적 상피 생리는 비정상적 상피 리모델링인, 방법.
  54. 제45항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비정상적 상피 생리는 호흡관, 바람직하게는 상기 호흡관의 비정상적 점막 섬모 생리인, 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 호흡관은 하부 호흡관, 바람직하게는 기관지인, 방법.
  56. 치료적 유효량의 IL-33 길항제를 투여하는 것에 의한 EGFR-매개 질환의 예방 또는 치료 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 EGFR-매개 질환은 RAGE-EGFR 매개 질환인, 방법.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 EGFR 매개 질환은 비정상적 EGFR 활성을 특징으로 하는, 방법.
  59. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EGFR 매개 질환은 비정상적 상피 생리를 특징으로 하는, 방법.
  60. 상피 생리를 개선시키기 위해 치료적 유효량의 IL-33 길항제를 투여하는 것에 의한 질환의 예방 또는 치료 방법.
  61. EGFR-매개 효과를 저해하기 위해 치료적 유효량의 IL-33 길항제를 투여하는 것에 의한 질환의 예방 또는 치료 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 EGFR-매개 효과는 EGFR 신호전달인, 방법.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서, 상기 EGFR-매개 효과는 RAGE-EGFR-매개 효과인, 방법.
  64. 제61항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EGFR-매개 효과는 RAGE-EGFR-매개 신호전달인, 방법.
  65. 제60항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환은 호흡기 질환인, 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 비정상적 상피 생리 및/또는 비정상적 EGFR 활성을 특징으로 하는, 방법.
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 하부 호흡기 질환, 바람직하게는 기관지의 호흡기 질환인, 방법.
  68. 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 COPD, 기관지염, 폐기종, 기관지확장증, 예컨대, CF-기관지확장증 또는 -CF-기관지확장증, 천식 또는 천식과 COPD의 중복(ACO)으로부터 선택된, 방법.
  69. 제65항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 COPD, 바람직하게는 기관지염성 COPD인, 방법.
  70. 제65항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 천식, 바람직하게는 기관지염성 천식인, 방법.
  71. 제45항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 점액 제거를 개선시키는, 방법.
  72. 제45항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 비정상적 점액 생성을 저해 또는 감소시키는, 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 비정상적 점액 생성은 MUC5AC 생성의 증가인, 방법.
  74. 제45항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 비정상적 점액 조성을 저해하는, 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 방법은 MUC5AC:MUC5B 비를 저해 또는 감소시키고/시키거나; 상기 방법은 점액 중 MUC5AC를 저해 또는 감소시키고/시키거나; 상기 방법은 점액의 상기 두께를 감소시키는, 방법.
  76. 제45항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 비정상적 상피 리모델링을 저해하는, 방법.
  77. 제45항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 비정상적 술잔세포 분화 또는 증식을 저해 또는 감소시키는, 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 방법은 비정상적 MUC5AC+ 술잔세포 분화 또는 증식을 저해 또는 감소시키는, 방법.
  79. 제45항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 호흡기 상피의 두께를 감소시키는, 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 방법은 상기 호흡기 상피의 총 조직 면적에서의 MUC5AC+ 술잔세포의 양을 감소시키는, 방법.
  81. 제45항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-33 길항제는 산화된 IL-33의 상기 활성을 저해하는, 방법.
  82. 제45항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-33 길항제는 RAGE에 대한 산화된 IL-33의 결합을 방지하여, RAGE-EGFR 신호전달을 저해하는, 방법.
  83. 제45항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-33 길항제는 RAGE-EGFR 의존적 신호전달 및/또는 RAGE-EGFR 매개 효과를 하향조절하거나 저해하는, 방법.
  84. 제45항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-33 길항제는 IL-33, 바람직하게는 환원된 IL-33 또는 산화된 IL-33, 바람직하게는 환원된 IL-33에 결합하는 결합 분자 또는 이의 단편인, 방법.
  85. 제45항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-33 길항제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 바람직하게는 항-IL-33 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 바람직하게는 항-환원된-IL-33 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 방법.
  86. 제45항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-33 길항제는 표 1로부터 선택된 가변 중쇄 도메인(VH) 및 가변 경쇄 도메인(VL) 쌍의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 결합 분자인, 방법.
  87. 제45항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-33 길항제는 표 1로부터 선택된 가변 중쇄 도메인(VH) 및 가변 경쇄 도메인(VL) 쌍을 포함하는 결합 분자인, 방법.
  88. 제45항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-33 길항제는 서열번호 37의 서열을 갖는 VHCDR1, 서열번호 38의 서열을 갖는 VHCDR2, 서열번호 39의 서열을 갖는 VHCDR3, 서열번호 40의 서열을 갖는 VLCDR1, 서열번호 41의 서열을 갖는 VLCDR2 및 서열번호 42의 서열을 갖는 VLCDR3을 포함하는 결합 분자인, 방법.
  89. 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-33 길항제는 서열번호 1의 서열의 VH 도메인 및 서열번호 19의 서열의 VL 도메인을 포함하는 항-IL33 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, IL-33 길항제 또는 방법.
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