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KR20220093196A - 타우린 또는 하이포타우린을 사용하여 제핵 적혈구 세포를 생성하는 방법 - Google Patents

타우린 또는 하이포타우린을 사용하여 제핵 적혈구 세포를 생성하는 방법 Download PDF

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KR20220093196A
KR20220093196A KR1020227018859A KR20227018859A KR20220093196A KR 20220093196 A KR20220093196 A KR 20220093196A KR 1020227018859 A KR1020227018859 A KR 1020227018859A KR 20227018859 A KR20227018859 A KR 20227018859A KR 20220093196 A KR20220093196 A KR 20220093196A
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KR
South Korea
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culture
culture medium
cells
days
cell
Prior art date
Application number
KR1020227018859A
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English (en)
Inventor
빌리 로우
앨런 벤자민 길버트
Original Assignee
루비우스 테라퓨틱스, 아이엔씨.
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Filing date
Publication date
Application filed by 루비우스 테라퓨틱스, 아이엔씨. filed Critical 루비우스 테라퓨틱스, 아이엔씨.
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Abstract

제핵 적혈구 세포의 집단을 생성하는 방법이 본원에 제공된다.

Description

타우린 또는 하이포타우린을 사용하여 제핵 적혈구 세포를 생성하는 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 11월 4일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/930,528호의 우선권을 주장하며; 그 전체 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 제핵 적혈구 세포를 생성하는 방법에 관한 것이다.
적혈구는 혈액 손실을 경험한 환자에게 수혈된다. 또한, 적혈구를 포함하는 조작된 제핵 적혈구 세포는 외인성 단백질(들)을 이를 필요로 하는 환자에게 전달하거나 제시하는 치료제로서 개발 중이다.
본 발명은 적혈구 전구 세포가 성숙되는 동안 타우린 및/또는 하이포타우린을 포함하는 배양 배지에서 이를 배양하는 것이 (예를 들어, 타우린, 타우린 전구물질, 또는 타우린 분해 산물(예를 들어, 약 1.0 g/L 내지 약 37.5 g/L 또는 약 8 mM 내지 약 300 mM의 타우린, 타우린 전구물질, 또는 타우린 분해 산물) 또는 하이포타우린, 하이포타우린 전구물질, 또는 하이포타우린 분해 산물(예를 들어, 약 1.0 g/L 내지 약 37.5 g/L 또는 약 9 mM 내지 약 345 mM의 하이포타우린, 하이포타우린 전구물질, 또는 하이포타우린 분해 산물)을 포함하는 배양 배지를 사용하지 않는 방법과 비교했을 때) 세포 증식을 증가시키고, 제핵 속도를 증가시켜 제핵 적혈구 세포의 수를 증가시키고/시키거나 적혈구 전구 세포가 계속 성장하고/하거나 제핵될 수 있는 기간을 증가시킨다는 발견에 기초한다.
이러한 발견에 비추어, 제핵 적혈구 세포의 집단을 생성하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은: (a) 적혈구 전구 세포의 제1 세포 배양물의 일정 부피를 용기에 담긴 제2 배양 배지 내에 배치하여 제2 세포 배양물을 수득하는 단계; (b) 제2 세포 배양물을 약 2일 내지 약 15일 동안 배양(예를 들어, 관류 배양, 배치 배양, 또는 유가 배양)하는 단계; (c) 단계 (b)의 제2 세포 배양물의 부피를 용기 내에 포함된 제3 배양 배지에 배치하여 제3 세포 배양물을 수득하는 단계로서, 제3 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 37.5 g/L 또는 약 8 mM 내지 약 300 mM의 타우린(또는 타우린 전구물질 또는 타우린 분해 산물) 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 37.5 g/L 또는 약 9 mM 내지 약 345 mM의 하이포타우린(또는 하이포타우린 전구물질 또는 하이포타우린 분해 산물)을 포함하는, 단계; (d) 단계 (c)의 제3 세포 배양물을 약 5일 내지 약 20일 동안 배양(예를 들어, 관류 배양, 배치 배양, 또는 유가 배양)하는 단계로서, 단계 (d) 후 제3 배양 배지는 제핵 적혈구 세포의 집단을 포함하는, 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 초기 세포 밀도는 약 0.1 x 105개의 세포/mL 내지 약 1 x 107개의 세포/mL이다. 일부 구현예에서, 단계 (c)에서의 초기 세포 밀도는 약 1 x 105개 내지 약 1 x 107개의 세포/mL이다.
본원에 기술된 제핵 적혈구 세포의 집단을 생성하는 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 용기는 관류 바이오리액터이고, 단계 (b)에서의 배양은 관류 배양이고, 단계 (c)에서의 용기는 관류 바이오리액터이고, 단계 (d)에서의 배양은 관류 배양이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 단계 (a) 전에, (i) 용기 내에 포함된 제1 배양 배지에 복수의 적혈구 전구 세포를 배치하여 약 0.1 x 105개의 세포/mL 내지 약 2 x 106개의 세포/mL의 초기 세포 밀도를 갖는 제1 세포 배양물을 수득하는 단계; 및 (ii) 약 1일 내지 약 15일 동안 제1 세포 배양물을 배치 배양하거나 유가 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 용기는 진탕 플라스크(shake flask)이다. 일부 구현예에서, 진탕 플라스크는 약 15 mL 내지 약 5 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 플라스크는 약 50 mL 내지 약 1.5 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 플라스크는 약 100 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 진탕 플라스크를 0.1 x g 내지 약 4.1 x g로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 진탕 플라스크를 0.23 x g 내지 약 1.78 x g로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 용기는 진탕 튜브(shake tube)이다. 일부 구현예에서, 진탕 튜브는 약 2 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 튜브는 약 10 mL 내지 약 250 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 튜브는 약 50 mL 내지 약 200 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 튜브는 원뿔형 용기이다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 진탕 튜브를 0.1 x g 내지 약 4.1 x g로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 진탕 튜브를 0.23 x g 내지 약 1.78 x g로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 용기는 배양 백(culture bag)이다. 일부 구현예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 25 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 5 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 배양 백을 분당 약 10 진동 사이클(rock cycle) 내지 분당 약 50 진동 사이클의 진동 속도로 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 배양 백을 분당 약 10 진동 사이클 내지 분당 약 25 진동 사이클의 진동 속도로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 제1 세포 배양물을 배치 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 제1 세포 배양물을 유가 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 유가 배양은 시간의 경과에 따라 제1 배양 배지의 추가 부피를 제1 세포 배양물에 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지의 추가 부피는 시간의 경과에 따라 제1 세포 배양물에 연속으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 제1 세포 배양 배지의 추가 부피는 시간의 경과에 따라 제1 세포 배양물에 주기적으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 Flt-3 리간드, 줄기 세포 인자(SCF), IL-3, 및 IL-6 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 Flt-3 리간드, SCF, IL-3, 및 IL-6 각각을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 Flt-3 리간드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 50 ng/mL 내지 약 150 ng/mL의 Flt-3 리간드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 1 μg/mL의 SCF를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 50 ng/mL 내지 약 500 ng/mL의 SCF를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 IL-3을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 IL-6을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 IL-6을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 1 μg/mL 내지 약 20 μg/mL의 인슐린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 8 μg/mL 내지 약 12 μg/mL의 인슐린을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 1 mM 내지 약 10 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 5 mM 내지 약 7 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 지질(예: 지질 혼합물)을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 50 μg/mL 내지 약 400 μg/mL의 트랜스페린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 150 μg/mL 내지 약 250 μg/mL의 트랜스페린을 포함한다. 본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 160 μg/mL 내지 약 240 μg/mL의 트랜스페린을 포함한다. 본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 180 μg/mL 내지 약 220 μg/mL의 트랜스페린을 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (ii)에서의 배치 배양 또는 유가 배양은 약 5일 내지 약 12일 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)에서의 배치 배양 또는 유가 배양은 약 5일 내지 약 9일 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 초기 세포 밀도는 약 0.1 x 105개의 세포/mL 내지 약 2 x 105개의 세포/mL이다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 초기 세포 밀도는 약 0.5 x 105개의 세포/mL 내지 약 1.5 x 105개의 세포/mL이다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 관류 바이오리액터는 약 500 mL 내지 약 15,000 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 관류 바이오리액터는 5 L 내지 약 5,000 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 관류 바이오리액터는 약 5 L 내지 약 2,500 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 관류 바이오리액터는 약 5 L 내지 약 100 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 약 10 W/m3 내지 약 200 W/m3의 P/V 값으로 제2 세포 배양물을 교반하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 약 10 W/m3 내지 약 100 W/m 3의 P/V 값으로 제2 세포 배양물을 교반하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (b)에서의 관류 배양은 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (b)에서의 관류 배양은 약 5 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (b)에서의 관류 배양은 약 10 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (b)에서의 관류 배양은 시간의 경과에 따라 제2 배양 배지의 추가 부피를 제2 세포 배양물에 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지의 추가 부피는 시간의 경과에 따라 제2 세포 배양물에 연속으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지의 추가 부피는 시간의 경과에 따라 제2 세포 배양물에 주기적으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 트랜스페린, IL-3, SCF, 덱사메타손, 에리트로포이에틴(EPO), 및 인슐린 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 트랜스페린, IL-3, SCF, 덱사메타손, EPO, 및 인슐린 중 3개 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 트랜스페린, IL-3, SCF, 덱사메타손, EPO, 및 인슐린 각각을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 1 μg/mL 내지 약 500 μg/mL의 트랜스페린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 100 μg/mL 내지 약 300 μg/mL의 트랜스페린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 IL-3을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 IL-3을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 10 ng/mL의 IL-3을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 1 μg/mL의 SCF를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL의 SCF를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 10 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 SCF를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 덱사메타손을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 덱사메타손을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 25 ng/mL의 덱사메타손을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL의 EPO를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 EPO를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 100 mg/mL의 EPO를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 50 μg/mL의 인슐린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 20 μg/mL의 인슐린을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 1 mM 내지 약 10 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 5 mM 내지 약 7 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 지질(예: 지질 혼합물)을 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (b)의 관류 배양은 약 4일 내지 약 10일 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (b)의 관류 배양은 약 5일 내지 약 8일 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 초기 세포 밀도는 약 0.1 x 105개의 세포/mL 내지 약 2 x 105개의 세포/mL이다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 초기 세포 밀도는 약 0.5 x 105개의 세포/mL 내지 약 1.5 x 105개의 세포/mL이다. 일부 구현예에서, 단계 (c)에서의 관류 바이오리액터는 약 500 mL 내지 약 15,000 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (c)에서의 관류 바이오리액터는 5 L 내지 약 5,000 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (c)에서의 관류 바이오리액터는 약 5 L 내지 약 2,500 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (c)에서의 관류 바이오리액터는 약 5 L 내지 약 100 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 약 10 W/m3 내지 약 200 W/m3의 P/V 값으로 제3 세포 배양물을 교반하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 약 10 W/m3 내지 약 100 W/m 3의 P/V 값으로 제3 세포 배양물을 교반하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (d)에서의 관류 배양은 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (d)에서의 관류 배양은 약 5 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (d)에서의 관류 배양은 약 10 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (d)에서의 관류 배양은: (i) 제1 기간 동안 제3 세포 배양물에 제3 세포 배양물의 추가 부피를 첨가하는 단계, 및 (ii) 제2 기간 동안 제3 세포 배양물에 제4 배양 배지의 추가 부피를 첨가하는 단계를 포함하되, 제4 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 37.5 g/L의 타우린 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 37.5 g/L의 하이포타우린을 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 제3 배양 배지의 추가 부피는 제1 기간 동안 제3 세포 배양물에 연속으로 첨가되고/되거나; 단계 (ii)에서의 제4 배양 배지의 추가 부피는 제2 기간 동안 제3 세포 배양물에 연속으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 제3 배양 배지의 추가 부피는 제1 기간 동안 제3 세포 배양물에 주기적으로 첨가되고/되거나; 단계 (ii)에서의 제4 배양 배지의 추가 부피는 제2 기간 동안 제3 세포 배양물에 주기적으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 제1 기간은 약 1일 내지 약 7일이다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 제1 기간은 약 3일 내지 약 5일이다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)에서의 제2 기간은 약 1일 내지 약 10일이다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)에서의 제2 기간은 약 3일 내지 약 7일이다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 20.0 g/L의 타우린 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 20.0 g/L의 하이포타우린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 4.0 g/L의 타우린 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 4.0 g/L의 하이포타우린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 2.5 g/L의 타우린 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 2.5 g/L의 하이포타우린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, SCF, 및 EPO 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, SCF, 및 EPO 중 2개 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, SCF, 및 EPO 각각을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1 μg/mL 내지 약 500 μg/mL의 트랜스페린을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 100 μg/mL 내지 약 300 μg/mL의 트랜스페린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 1 μg/mL의 SCF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL의 SCF를 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 10 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 SCF를 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL의 EPO를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 EPO를 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 100 mg/mL의 EPO를 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 0.1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL의 인슐린을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 0.1 μg/mL 내지 약 20 μg/mL의 인슐린을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1 mM 내지 약 8 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 3 mM 내지 약 5 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 0.5% v/v 내지 약 10% v/v의 혈청을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 4% v/v 내지 약 6% v/v의 혈청을 포함한다.
일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 0.5 g/L 내지 약 54.0 g/L의 미오-이노시톨을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 25.0 g/L의 미오-이노시톨을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 5.0 g/L의 미오-이노시톨을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 2.5 g/L의 미오-이노시톨을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 20.0 g/L의 타우린 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 20.0 g/L의 하이포타우린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 4.0 g/L의 타우린 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 4.0 g/L의 하이포타우린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 2.5 g/L의 타우린 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 2.5 g/L의 하이포타우린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, 및 EPO 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, 및 EPO 중 2개 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, 및 EPO 각각을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 100 μg/mL 내지 약 2 mg/mL의 트랜스페린을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 100 μg/mL 내지 약 1.5 mg/mL의 트랜스페린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL의 EPO를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 EPO를 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 100 mg/mL의 EPO를 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배지는 약 0.1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL의 인슐린을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배지는 약 0.1 μg/mL 내지 약 20 μg/mL의 인슐린을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1 mM 내지 약 8 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 3 mM 내지 약 5 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 0.5% v/v 내지 약 10% v/v의 혈청을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 4% v/v 내지 약 6% v/v의 혈청을 포함한다.
일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 0.5 g/L 내지 약 54.0 g/L의 미오-이노시톨을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 25.0 g/L의 미오-이노시톨을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 5.0 g/L의 미오-이노시톨을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 2.5 g/L의 미오-이노시톨을 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (d)의 관류 배양은 약 8일 내지 약 15일 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (d)의 관류 배양은 약 9일 내지 약 13일 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (c)에서의 초기 세포 밀도는 약 2.0 x 105개의 세포/mL 내지 약 8.0 x 105개의 세포/mL이다. 일부 구현예에서, 단계 (c)에서의 초기 세포 밀도는 약 4.0 x 105개의 세포/mL 내지 약 6.0 x 105개의 세포/mL이다. 일부 구현예에서, 단계 (b) 및 (d)에서의 관류 배양은 접선 여과를 사용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 접선 여과는 교번 접선 여과(ATF)이다. 일부 구현예에서, 접선 여과는 약 10 nm 내지 약 6.0 μM의 평균 기공 크기를 갖는 필터를 사용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 필터는 약 0.1 μm 내지 약 3.0 μm의 평균 기공 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 약 5 x 106개의 제핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 108개의 제핵 적혈구/mL의 세포 밀도를 초래한다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 약 1 x 107개의 제핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 108개의 제핵 적혈구/mL의 세포 밀도를 초래한다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 약 5 x 107개의 제핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 108개의 제핵 적혈구/mL의 세포 밀도를 초래한다.
본원에 기술된 제핵 적혈구 세포의 집단을 생성하는 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 단계 (b)에서의 배양은 배치 배양 또는 유가 배양이고, 단계 (c)에서의 용기는 관류 바이오리액터이며, 단계 (d)에서의 배양은 관류 배양이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 단계 (a) 전에, (i) 용기 내에 포함된 제1 배양 배지에 복수의 적혈구 전구 세포를 배치하여 약 0.1 x 105개의 세포/mL 내지 약 2 x 106개의 세포/mL의 초기 세포 밀도를 갖는 제1 세포 배양물을 수득하는 단계; 및 (ii) 약 1일 내지 약 15일 동안 제1 세포 배양물을 배치 배양하거나 유가 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 용기는 진탕 플라스크(shake flask)이다. 일부 구현예에서, 진탕 플라스크는 약 15 mL 내지 약 5 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 플라스크는 약 50 mL 내지 약 1.5 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 플라스크는 약 100 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 진탕 플라스크를 0.1 x g 내지 약 4.1 x g로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 진탕 플라스크를 0.23 x g 내지 약 1.78 x g로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 용기는 진탕 튜브(shake tube)이다. 일부 구현예에서, 진탕 튜브는 약 2 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 튜브는 약 10 mL 내지 약 250 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 튜브는 약 50 mL 내지 약 200 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 튜브는 원뿔형 용기이다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 진탕 튜브를 0.1 x g 내지 약 4.1 x g로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 진탕 튜브를 0.23 x g 내지 약 1.78 x g로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 용기는 배양 백(culture bag)이다. 일부 구현예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 25 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 5 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 배양 백을 분당 약 10 진동 사이클(rock cycle) 내지 분당 약 50 진동 사이클의 진동 속도로 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 배양 백을 분당 약 10 진동 사이클 내지 분당 약 25 진동 사이클의 진동 속도로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 제1 세포 배양물을 배치 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 제1 세포 배양물을 유가 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 유가 배양은 시간의 경과에 따라 제1 배양 배지의 추가 부피를 제1 세포 배양물에 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지의 추가 부피는 시간의 경과에 따라 제1 세포 배양물에 연속으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 제1 세포 배양 배지의 추가 부피는 시간의 경과에 따라 제1 세포 배양물에 주기적으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 Flt-3 리간드, 줄기 세포 인자(SCF), IL-3, 및 IL-6 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 Flt-3 리간드, SCF, IL-3, 및 IL-6 각각을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 Flt-3 리간드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 50 ng/mL 내지 약 150 ng/mL의 Flt-3 리간드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 1 μg/mL의 SCF를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 50 ng/mL 내지 약 500 ng/mL의 SCF를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 IL-3을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 IL-6을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 IL-6을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 1 μg/mL 내지 약 20 μg/mL의 인슐린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 8 μg/mL 내지 약 12 μg/mL의 인슐린을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 1 mM 내지 약 10 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 5 mM 내지 약 7 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 지질(예: 지질 혼합물)을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 50 μg/mL 내지 약 400 μg/mL의 트랜스페린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 150 μg/mL 내지 약 250 μg/mL의 트랜스페린을 포함한다. 본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 160 μg/mL 내지 약 240 μg/mL의 트랜스페린을 포함한다. 본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 180 μg/mL 내지 약 220 μg/mL의 트랜스페린을 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (ii)에서의 배치 배양 또는 유가 배양은 약 5일 내지 약 12일 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)에서의 배치 배양 또는 유가 배양은 약 5일 내지 약 9일 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 초기 세포 밀도는 약 0.1 x 105개의 세포/mL 내지 약 2 x 105개의 세포/mL이다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 초기 세포 밀도는 약 0.5 x 105개의 세포/mL 내지 약 1.5 x 105개의 세포/mL이다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 용기는 진탕 플라스크이다. 일부 구현예에서, 진탕 플라스크는 약 15 mL 내지 약 3 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 플라스크는 약 50 mL 내지 약 1.5 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 플라스크는 약 100 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 진탕 플라스크를 0.1 x g 내지 약 4.1 x g로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 진탕 플라스크를 0.23 x g 내지 약 1.78 x g로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 용기는 진탕 튜브이다. 일부 구현예에서, 진탕 튜브는 약 2 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 튜브는 약 10 mL 내지 약 250 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 튜브는 약 50 mL 내지 약 200 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 튜브는 원뿔형 용기이다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 진탕 튜브를 0.1 x g 내지 약 4.1 x g로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 진탕 튜브를 0.23 x g 내지 약 1.78 x g로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 용기는 배양 백이다. 일부 구현예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 25 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 5 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 배양 백을 분당 약 10 진동 사이클 내지 분당 약 50 진동 사이클의 진동 속도로 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 배양 백을 분당 약 10 진동 사이클 내지 분당 약 25 진동 사이클의 진동 속도로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 용기는 바이오리액터이다. 일부 구현예에서, 바이오리액터는 약 1 L 내지 약 15,000 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 바이오리액터는 5 L 내지 약 5,000 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 바이오리액터는 약 5 L 내지 약 2,500 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 바이오리액터는 약 5 L 내지 약 100 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 약 10 W/m3 내지 약 200 W/m3의 P/V 값으로 제2 세포 배양물을 교반하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 약 10 W/m3 내지 약 100 W/m 3의 P/V 값으로 제2 세포 배양물을 교반하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 제2 세포 배양물을 배치 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 제2 세포 배양물을 유가 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 유가 배양은 시간의 경과에 따라 제2 배양 배지의 추가 부피를 제2 세포 배양물에 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지의 추가 부피는 시간의 경과에 따라 제2 세포 배양물에 연속으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 제2 세포 배양 배지의 추가 부피는 시간의 경과에 따라 제2 세포 배양물에 주기적으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 트랜스페린, IL-3, SCF, 덱사메타손, 에리트로포이에틴(EPO), 및 인슐린 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 트랜스페린, IL-3, SCF, 덱사메타손, EPO, 및 인슐린 중 3개 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 트랜스페린, IL-3, SCF, 덱사메타손, EPO, 및 인슐린 각각을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 1 μg/mL 내지 약 500 μg/mL의 트랜스페린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 100 μg/mL 내지 약 300 μg/mL의 트랜스페린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 IL-3을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 IL-3을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 10 ng/mL의 IL-3을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 1 μg/mL의 SCF를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL의 SCF를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 10 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 SCF를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 덱사메타손을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 덱사메타손을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 25 ng/mL의 덱사메타손을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL의 EPO를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 EPO를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 100 mg/mL의 EPO를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 50 μg/mL의 인슐린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 20 μg/mL의 인슐린을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 1 mM 내지 약 10 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 5 mM 내지 약 7 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 지질(예: 지질 혼합물)을 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (b)의 배치 배양 또는 유가 배양은 약 4일 내지 약 10일 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (b)의 배치 배양 또는 유가 배양은 약 5일 내지 약 8일 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 초기 세포 밀도는 약 0.1 x 105개의 세포/mL 내지 약 2 x 105개의 세포/mL이다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 초기 세포 밀도는 약 0.5 x 105개의 세포/mL 내지 약 1.5 x 105개의 세포/mL이다. 일부 구현예에서, 단계 (c)에서의 관류 바이오리액터는 약 500 mL 내지 약 15,000 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (c)에서의 관류 바이오리액터는 5 L 내지 약 5,000 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (c)에서의 관류 바이오리액터는 약 5 L 내지 약 2,500 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (c)에서의 관류 바이오리액터는 약 5 L 내지 약 100 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 약 10 W/m3 내지 약 200 W/m3의 P/V 값으로 제3 세포 배양물을 교반하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 약 10 W/m3 내지 약 100 W/m 3의 P/V 값으로 제3 세포 배양물을 교반하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (d)에서의 관류 배양은 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (d)에서의 관류 배양은 약 5 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (d)에서의 관류 배양은 약 10 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (d)에서의 관류 배양은: (i) 제1 기간 동안 제3 세포 배양물에 제3 세포 배양물의 추가 부피를 첨가하는 단계, 및 (ii) 제2 기간 동안 제3 세포 배양물에 제4 배양 배지의 추가 부피를 첨가하는 단계를 포함하되, 제4 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 37.5 g/L의 타우린 및/또는 1.0 g/L 내지 약 37.5 g/L의 하이포타우린을 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 제3 배양 배지의 추가 부피는 제1 기간 동안 제3 세포 배양물에 연속으로 첨가되고/되거나; 단계 (ii)에서의 제4 배양 배지의 추가 부피는 제2 기간 동안 제3 세포 배양물에 연속으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 제3 배양 배지의 추가 부피는 제1 기간 동안 제3 세포 배양물에 주기적으로 첨가되고/되거나; 단계 (ii)에서의 제4 배양 배지의 추가 부피는 제2 기간 동안 제3 세포 배양물에 주기적으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 제1 기간은 약 1일 내지 약 7일이다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 제1 기간은 약 3일 내지 약 5일이다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)에서의 제2 기간은 약 1일 내지 약 10일이다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)에서의 제2 기간은 약 3일 내지 약 7일이다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 20.0 g/L의 타우린 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 20.0 g/L의 하이포타우린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 4.0 g/L의 타우린 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 4.0 g/L의 하이포타우린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 2.5 g/L의 타우린 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 2.5 g/L의 하이포타우린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, SCF, 및 EPO 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, SCF, 및 EPO 중 2개 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, SCF, 및 EPO 각각을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1 μg/mL 내지 약 500 μg/mL의 트랜스페린을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 100 μg/mL 내지 약 300 μg/mL의 트랜스페린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 1 μg/mL의 SCF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL의 SCF를 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 10 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 SCF를 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL의 EPO를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 EPO를 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 100 mg/mL의 EPO를 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배지는 약 0.1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL의 인슐린을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배지는 약 0.1 μg/mL 내지 약 20 μg/mL의 인슐린을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1 mM 내지 약 8 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 3 mM 내지 약 5 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 0.5% v/v 내지 약 10% v/v의 혈청을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 4% v/v 내지 약 6% v/v의 혈청을 포함한다.
일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 0.5 g/L 내지 약 54.0 g/L의 미오-이노시톨을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 25.0 g/L의 미오-이노시톨을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 5.0 g/L의 미오-이노시톨을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 2.5 g/L의 미오-이노시톨을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 20.0 g/L의 타우린 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 20.0 g/L의 하이포타우린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 4.0 g/L의 타우린 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 4.0 g/L의 하이포타우린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 2.5 g/L의 타우린 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 2.5 g/L의 하이포타우린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, 및 EPO 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, 및 EPO 중 2개 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, 및 EPO 각각을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 100 μg/mL 내지 약 2 mg/mL의 트랜스페린을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 100 μg/mL 내지 약 1.5 mg/mL의 트랜스페린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL의 EPO를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 EPO를 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 100 mg/mL의 EPO를 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배지는 약 0.1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL의 인슐린을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배지는 약 0.1 μg/mL 내지 약 20 μg/mL의 인슐린을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1 mM 내지 약 8 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 3 mM 내지 약 5 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 0.5% v/v 내지 약 10% v/v의 혈청을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 4% v/v 내지 약 6% v/v의 혈청을 포함한다.
일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 0.5 g/L 내지 약 54.0 g/L의 미오-이노시톨을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 25.0 g/L의 미오-이노시톨을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 5.0 g/L의 미오-이노시톨을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 2.5 g/L의 미오-이노시톨을 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (d)의 관류 배양은 약 8일 내지 약 15일 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (d)의 관류 배양은 약 9일 내지 약 13일 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (c)에서의 초기 세포 밀도는 약 2.0 x 105개의 세포/mL 내지 약 8.0 x 105개의 세포/mL이다. 일부 구현예에서, 단계 (c)에서의 초기 세포 밀도는 약 4.0 x 105개의 세포/mL 내지 약 6.0 x 105개의 세포/mL이다. 일부 구현예에서, 단계 (d)에서의 관류 배양은 접선 여과를 사용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 접선 여과는 교번 접선 여과(ATF)이다. 일부 구현예에서, 접선 여과는 약 10 nm 내지 약 6.0 μm의 평균 기공 크기를 갖는 필터를 사용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 필터는 약 0.1 μm 내지 약 3.0 μm의 평균 기공 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 약 5 x 106개의 제핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 108개의 제핵 적혈구/mL의 세포 밀도를 초래한다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 약 1 x 107개의 제핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 108개의 제핵 적혈구/mL의 세포 밀도를 초래한다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 약 5 x 107개의 제핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 108개의 제핵 적혈구/mL의 세포 밀도를 초래한다.
본원에 기술된 제핵 적혈구 세포의 집단을 생성하는 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 용기는 관류 바이오리액터이고, 단계 (b)에서의 배양은 관류 배양이며, 단계 (d)에서의 배양은 배치 배양 또는 유가 배양이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 단계 (a) 전에, (i) 용기 내에 포함된 제1 배양 배지에 복수의 적혈구 전구 세포를 배치하여 약 0.1 x 105개의 세포/mL 내지 약 2 x 106개의 세포/mL의 초기 세포 밀도를 갖는 제1 세포 배양물을 수득하는 단계; 및 (ii) 약 1일 내지 약 15일 동안 제1 세포 배양물을 배치 배양하거나 유가 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 용기는 진탕 플라스크(shake flask)이다. 일부 구현예에서, 진탕 플라스크는 약 15 mL 내지 약 3 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 플라스크는 약 50 mL 내지 약 1.5 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 플라스크는 약 100 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 진탕 플라스크를 0.1 x g 내지 약 4.1 x g로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 진탕 플라스크를 0.23 x g 내지 약 1.78 x g로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 용기는 진탕 튜브(shake tube)이다. 일부 구현예에서, 진탕 튜브는 약 2 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 튜브는 약 10 mL 내지 약 250 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 튜브는 약 50 mL 내지 약 200 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 튜브는 원뿔형 용기이다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 진탕 튜브를 0.1 x g 내지 약 4.1 x g로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 진탕 튜브를 0.23 x g 내지 약 1.78 x g로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 용기는 배양 백(culture bag)이다. 일부 구현예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 25 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 5 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 배양 백을 분당 약 10 진동 사이클(rock cycle) 내지 분당 약 50 진동 사이클의 진동 속도로 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 배양 백을 분당 약 10 진동 사이클 내지 분당 약 25 진동 사이클의 진동 속도로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 제1 세포 배양물을 배치 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 제1 세포 배양물을 유가 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 유가 배양은 시간의 경과에 따라 제1 배양 배지의 추가 부피를 제1 세포 배양물에 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지의 추가 부피는 시간의 경과에 따라 제1 세포 배양물에 연속으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 제1 세포 배양 배지의 추가 부피는 시간의 경과에 따라 제1 세포 배양물에 주기적으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 Flt-3 리간드, 줄기 세포 인자(SCF), IL-3, 및 IL-6 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 Flt-3 리간드, SCF, IL-3, 및 I1-6 각각을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 Flt-3 리간드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 50 ng/mL 내지 약 150 ng/mL의 Flt-3 리간드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 1 μg/mL의 SCF를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 50 ng/mL 내지 약 500 ng/mL의 SCF를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 IL-3을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 IL-6을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 IL-6을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 1 μg/mL 내지 약 20 μg/mL의 인슐린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 8 μg/mL 내지 약 12 μg/mL의 인슐린을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 1 mM 내지 약 10 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 5 mM 내지 약 7 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 지질(예: 지질 혼합물)을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 50 μg/mL 내지 약 400 μg/mL의 트랜스페린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 150 μg/mL 내지 약 250 μg/mL의 트랜스페린을 포함한다. 본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 160 μg/mL 내지 약 240 μg/mL의 트랜스페린을 포함한다. 본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 180 μg/mL 내지 약 220 μg/mL의 트랜스페린을 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (ii)에서의 배치 배양 또는 유가 배양은 약 5일 내지 약 12일 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)에서의 배치 배양 또는 유가 배양은 약 5일 내지 약 9일 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 초기 세포 밀도는 약 0.1 x 105개의 세포/mL 내지 약 2 x 105개의 세포/mL이다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 초기 세포 밀도는 약 0.5 x 105개의 세포/mL 내지 약 1.5 x 105개의 세포/mL이다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 관류 바이오리액터는 약 500 mL 내지 약 15,000 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 관류 바이오리액터는 5 L 내지 약 5,000 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 관류 바이오리액터는 약 5 L 내지 약 2,500 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 관류 바이오리액터는 약 5 L 내지 약 100 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 약 10 W/m3 내지 약 200 W/m3의 P/V 값으로 제2 세포 배양물을 교반하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 약 10 W/m3 내지 약 100 W/m 3의 P/V 값으로 제2 세포 배양물을 교반하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (b)에서의 관류 배양은 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (b)에서의 관류 배양은 약 5 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (b)에서의 관류 배양은 약 10 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (b)에서의 관류 배양은 시간의 경과에 따라 제2 배양 배지의 추가 부피를 제2 세포 배양물에 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지의 추가 부피는 시간의 경과에 따라 제2 세포 배양물에 연속으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지의 추가 부피는 시간의 경과에 따라 제2 세포 배양물에 주기적으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 트랜스페린, IL-3, SCF, 덱사메타손, 에리트로포이에틴(EPO), 및 인슐린 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 트랜스페린, IL-3, SCF, 덱사메타손, EPO, 및 인슐린 중 3개 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 트랜스페린, IL-3, SCF, 덱사메타손, EPO, 및 인슐린 각각을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 1 μg/mL 내지 약 500 μg/mL의 트랜스페린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 100 μg/mL 내지 약 300 μg/mL의 트랜스페린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 IL-3을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 IL-3을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 10 ng/mL의 IL-3을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 1 μg/mL의 SCF를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL의 SCF를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 10 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 SCF를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 덱사메타손을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 덱사메타손을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 25 ng/mL의 덱사메타손을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL의 EPO를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 EPO를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 100 mg/mL의 EPO를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 50 μg/mL의 인슐린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 20 μg/mL의 인슐린을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 1 mM 내지 약 10 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 5 mM 내지 약 7 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 지질(예: 지질 혼합물)을 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (b)의 관류 배양은 약 4일 내지 약 10일 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (b)의 관류 배양은 약 5일 내지 약 8일 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 초기 세포 밀도는 약 0.1 x 105개의 세포/mL 내지 약 2 x 105개의 세포/mL이다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 초기 세포 밀도는 약 0.5 x 105개의 세포/mL 내지 약 1.5 x 105개의 세포/mL이다. 일부 구현예에서, 단계 (c)에서의 용기는 진탕 플라스크이다. 일부 구현예에서, 진탕 플라스크는 약 15 mL 내지 약 3 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 플라스크는 약 50 mL 내지 약 1.5 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 플라스크는 약 100 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 진탕 플라스크를 0.1 x g 내지 약 4.1 x g로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 진탕 플라스크를 0.23 x g 내지 약 1.78 x g로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (c)에서의 용기는 진탕 튜브이다. 일부 구현예에서, 진탕 튜브는 약 2 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 튜브는 약 10 mL 내지 약 250 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 튜브는 약 50 mL 내지 약 200 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 튜브는 원뿔형 용기이다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 진탕 튜브를 0.1 x g 내지 약 4.1 x g로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 진탕 튜브를 0.23 x g 내지 약 1.78 x g로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (c)에서의 용기는 배양 백이다. 일부 구현예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 25 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 5 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 배양 백을 분당 약 10 진동 사이클 내지 분당 약 25 진동 사이클의 진동 속도로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (c)에서의 용기는 바이오리액터이다. 일부 구현예에서, 바이오리액터는 1 L 내지 약 15,000 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 바이오리액터는 5 L 내지 약 5,000 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 바이오리액터는 약 5 L 내지 약 2,500 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 바이오리액터는 약 5 L 내지 약 100 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 약 10 W/m3 내지 약 200 W/m3의 P/V 값으로 제2 세포 배양물을 교반하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 약 10 W/m3 내지 약 100 W/m 3의 P/V 값으로 제2 세포 배양물을 교반하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 제3 세포 배양물을 배치 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 제3 세포 배양물을 유가 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 유가 배양은 시간의 경과에 따라 제3 배양 배지의 추가 부피를 제3 세포 배양물에 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지의 추가 부피는 시간의 경과에 따라 제3 세포 배양물에 연속으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 제3 세포 배양 배지의 추가 부피는 시간의 경과에 따라 제3 세포 배양물에 주기적으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 단계 (d)에서의 배치 배양 또는 유가 배양은: (i) 제1 기간 동안 제3 세포 배양물에 제3 세포 배양물의 추가 부피를 첨가하는 단계, 및 (ii) 제2 기간 동안 제3 세포 배양물에 제4 배양 배지의 추가 부피를 첨가하는 단계를 포함하되, 제4 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 37.5 g/L의 타우린 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 37.5 g/L의 하이포타우린을 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 제3 배양 배지의 추가 부피는 제1 기간 동안 제3 세포 배양물에 연속으로 첨가되고/되거나; 단계 (ii)에서의 제4 배양 배지의 추가 부피는 제2 기간 동안 제3 세포 배양물에 연속으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 제3 배양 배지의 추가 부피는 제1 기간 동안 제3 세포 배양물에 주기적으로 첨가되고/되거나; 단계 (ii)에서의 제4 배양 배지의 추가 부피는 제2 기간 동안 제3 세포 배양물에 주기적으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 제1 기간은 약 1일 내지 약 7일이다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 제1 기간은 약 3일 내지 약 5일이다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)에서의 제2 기간은 약 1일 내지 약 10일이다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)에서의 제2 기간은 약 3일 내지 약 7일이다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 20.0 g/L의 타우린 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 20.0 g/L의 하이포타우린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 4.0 g/L의 타우린 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 4.0 g/L의 하이포타우린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 2.5 g/L의 타우린 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 2.5 g/L의 하이포타우린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, SCF, 및 EPO 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, SCF, 및 EPO 중 2개 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, SCF, 및 EPO 각각을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1 μg/mL 내지 약 500 μg/mL의 트랜스페린을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 100 μg/mL 내지 약 300 μg/mL의 트랜스페린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 1 μg/mL의 SCF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL의 SCF를 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 10 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 SCF를 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL의 EPO를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 EPO를 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 100 mg/mL의 EPO를 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배지는 약 0.1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL의 인슐린을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배지는 약 0.1 μg/mL 내지 약 20 μg/mL의 인슐린을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1 mM 내지 약 8 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 3 mM 내지 약 5 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 0.5% v/v 내지 약 10% v/v의 혈청을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 4% v/v 내지 약 6% v/v의 혈청을 포함한다.
일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 0.5 g/L 내지 약 54.0 g/L의 미오-이노시톨을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 25.0 g/L의 미오-이노시톨을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 5.0 g/L의 미오-이노시톨을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 2.5 g/L의 미오-이노시톨을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 20.0 g/L의 타우린 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 20.0 g/L의 하이포타우린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 4.0 g/L의 타우린 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 4.0 g/L의 하이포타우린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 2.5 g/L의 타우린 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 2.5 g/L의 하이포타우린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, 및 EPO 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, 및 EPO 중 2개 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, 및 EPO 각각을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 100 μg/mL 내지 약 2 mg/mL의 트랜스페린을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 100 μg/mL 내지 약 1.5 mg/mL의 트랜스페린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL의 EPO를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 EPO를 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 100 mg/mL의 EPO를 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배지는 약 0.1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL의 인슐린을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배지는 약 0.1 μg/mL 내지 약 20 μg/mL의 인슐린을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1 mM 내지 약 8 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 3 mM 내지 약 5 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 0.5% v/v 내지 약 10% v/v의 혈청을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 4% v/v 내지 약 6% v/v의 혈청을 포함한다.
일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 0.5 g/L 내지 약 54.0 g/L의 미오-이노시톨을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 25.0 g/L의 미오-이노시톨을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 5.0 g/L의 미오-이노시톨을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 2.5 g/L의 미오-이노시톨을 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (d)의 배치 배양 또는 유가 배양은 약 8일 내지 약 15일 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (d)의 배치 배양 또는 유가 배양은 약 9일 내지 약 13일 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (c)에서의 초기 세포 밀도는 약 2.0 x 105개의 세포/mL 내지 약 8.0 x 105개의 세포/mL이다. 일부 구현예에서, 단계 (c)에서의 초기 세포 밀도는 약 4.0 x 105개의 세포/mL 내지 약 6.0 x 105개의 세포/mL이다. 일부 구현예에서, 단계 (b)에서의 관류 배양은 접선 여과를 사용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 접선 여과는 교번 접선 여과(ATF)이다. 일부 구현예에서, 접선 여과는 약 10 nm 내지 약 6.0 μm의 평균 기공 크기를 갖는 필터를 사용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 필터는 약 0.1 μm 내지 약 3.0 μm의 평균 기공 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 약 5 x 106개의 제핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 108개의 제핵 적혈구/mL의 세포 밀도를 초래한다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 약 1 x 107개의 제핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 108개의 제핵 적혈구/mL의 세포 밀도를 초래한다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 약 5 x 107개의 제핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 108개의 제핵 적혈구/mL의 세포 밀도를 초래한다.
본원에 기술된 제핵 적혈구 세포의 집단을 생성하는 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 단계 (b)에서의 배양은 배치 배양 또는 유가 배양이고 단계 (d)에서의 배양은 배치 배양 또는 유가 배양이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 단계 (a) 전에, (i) 용기 내에 포함된 제1 배양 배지에 복수의 적혈구 전구 세포를 배치하여 약 0.1 x 105개의 세포/mL 내지 약 2 x 106개의 세포/mL의 초기 세포 밀도를 갖는 제1 세포 배양물을 수득하는 단계; 및 (ii) 약 1일 내지 약 15일 동안 제1 세포 배양물을 배치 배양하거나 유가 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 용기는 진탕 플라스크(shake flask)이다. 일부 구현예에서, 진탕 플라스크는 약 15 mL 내지 약 5 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 플라스크는 약 50 mL 내지 약 1.5 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 플라스크는 약 100 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 진탕 플라스크를 0.1 x g 내지 약 4.1 x g로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 진탕 플라스크를 0.23 x g 내지 약 1.78 x g로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 용기는 진탕 튜브(shake tube)이다. 일부 구현예에서, 진탕 튜브는 약 2 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 튜브는 약 10 mL 내지 약 250 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 튜브는 약 50 mL 내지 약 200 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 튜브는 원뿔형 용기이다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 진탕 튜브를 0.1 x g 내지 약 4.1 x g로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 진탕 튜브를 0.23 x g 내지 약 1.78 x g로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 용기는 배양 백(culture bag)이다. 일부 구현예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 25 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 5 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 배양 백을 분당 약 10 진동 사이클(rock cycle) 내지 분당 약 50 진동 사이클의 진동 속도로 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 배양 백을 분당 약 10 진동 사이클 내지 분당 약 25 진동 사이클의 진동 속도로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 제1 세포 배양물을 배치 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 제1 세포 배양물을 유가 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 유가 배양은 시간의 경과에 따라 제1 배양 배지의 추가 부피를 제1 세포 배양물에 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지의 추가 부피는 시간의 경과에 따라 제1 세포 배양물에 연속으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 제1 세포 배양 배지의 추가 부피는 시간의 경과에 따라 제1 세포 배양물에 주기적으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 Flt-3 리간드, 줄기 세포 인자(SCF), IL-3, 및 IL-6 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 Flt-3 리간드, SCF, IL-3, 및 I1-6 각각을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 Flt-3 리간드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 50 ng/mL 내지 약 150 ng/mL의 Flt-3 리간드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 1 μg/mL의 SCF를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 50 ng/mL 내지 약 500 ng/mL의 SCF를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 IL-3을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 IL-6을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 IL-6을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 1 μg/mL 내지 약 20 μg/mL의 인슐린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 8 μg/mL 내지 약 12 μg/mL의 인슐린을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 1 mM 내지 약 10 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 5 mM 내지 약 7 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 지질(예: 지질 혼합물)을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 50 μg/mL 내지 약 400 μg/mL의 트랜스페린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 150 μg/mL 내지 약 250 μg/mL의 트랜스페린을 포함한다. 본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 160 μg/mL 내지 약 240 μg/mL의 트랜스페린을 포함한다. 본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 180 μg/mL 내지 약 220 μg/mL의 트랜스페린을 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (ii)에서의 배치 배양 또는 유가 배양은 약 5일 내지 약 12일 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)에서의 배치 배양 또는 유가 배양은 약 5일 내지 약 9일 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 초기 세포 밀도는 약 0.1 x 105개의 세포/mL 내지 약 2 x 105개의 세포/mL이다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 초기 세포 밀도는 약 0.5 x 105개의 세포/mL 내지 약 1.5 x 105개의 세포/mL이다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 용기는 진탕 플라스크이다. 일부 구현예에서, 진탕 플라스크는 약 15 mL 내지 약 3 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 플라스크는 약 50 mL 내지 약 1.5 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 플라스크는 약 100 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 진탕 플라스크를 0.1 x g 내지 약 4.1 x g로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 진탕 플라스크를 0.23 x g 내지 약 1.78 x g로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 용기는 진탕 튜브이다. 일부 구현예에서, 진탕 튜브는 약 2 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 튜브는 약 10 mL 내지 약 250 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 튜브는 약 50 mL 내지 약 200 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 튜브는 원뿔형 용기이다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 진탕 튜브를 0.1 x g 내지 약 4.1 x g로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 진탕 튜브를 0.23 x g 내지 약 1.78 x g로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 용기는 배양 백이다. 일부 구현예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 25 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 5 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 배양 백을 분당 약 10 진동 사이클 내지 분당 약 50 진동 사이클의 진동 속도로 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 배양 백을 분당 약 10 진동 사이클 내지 분당 약 25 진동 사이클의 진동 속도로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 용기는 바이오리액터이다. 일부 구현예에서, 바이오리액터는 1 L 내지 약 15,000 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 바이오리액터는 5 L 내지 약 5,000 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 바이오리액터는 약 5 L 내지 약 2,500 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 바이오리액터는 약 5 L 내지 약 100 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 약 10 W/m3 내지 약 200 W/m3의 P/V 값으로 제2 세포 배양물을 교반하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 약 10 W/m3 내지 약 100 W/m 3의 P/V 값으로 제2 세포 배양물을 교반하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 제2 세포 배양물을 배치 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 제2 세포 배양물을 유가 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 유가 배양은 시간의 경과에 따라 제2 배양 배지의 추가 부피를 제2 세포 배양물에 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지의 추가 부피는 시간의 경과에 따라 제2 세포 배양물에 연속으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 제2 세포 배양 배지의 추가 부피는 시간의 경과에 따라 제2 세포 배양물에 주기적으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 트랜스페린, IL-3, SCF, 덱사메타손, 에리트로포이에틴(EPO), 및 인슐린 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 트랜스페린, IL-3, SCF, 덱사메타손, EPO, 및 인슐린 중 3개 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 트랜스페린, IL-3, SCF, 덱사메타손, EPO, 및 인슐린 각각을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 1 μg/mL 내지 약 500 μg/mL의 트랜스페린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 100 μg/mL 내지 약 300 μg/mL의 트랜스페린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 IL-3을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 IL-3을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 10 ng/mL의 IL-3을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 1 μg/mL의 SCF를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL의 SCF를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 10 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 SCF를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 덱사메타손을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 덱사메타손을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 25 ng/mL의 덱사메타손을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL의 EPO를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 EPO를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 100 mg/mL의 EPO를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 50 μg/mL의 인슐린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 20 μg/mL의 인슐린을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 1 mM 내지 약 10 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 5 mM 내지 약 7 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 지질(예: 지질 혼합물)을 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (b)의 배치 배양 또는 유가 배양은 약 4일 내지 약 10일 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (b)의 배치 배양 또는 유가 배양은 약 5일 내지 약 8일 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 초기 세포 밀도는 약 0.1 x 105개의 세포/mL 내지 약 2 x 105개의 세포/mL이다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 초기 세포 밀도는 약 0.5 x 105개의 세포/mL 내지 약 1.5 x 105개의 세포/mL이다. 일부 구현예에서, 단계 (c)에서의 용기는 진탕 플라스크이다. 일부 구현예에서, 진탕 플라스크는 약 15 mL 내지 약 3 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 플라스크는 약 50 mL 내지 약 1.5 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 플라스크는 약 100 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 진탕 플라스크를 0.1 x g 내지 약 4.1 x g로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 진탕 플라스크를 0.23 x g 내지 약 1.78 x g로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (c)에서의 용기는 진탕 튜브이다. 일부 구현예에서, 진탕 튜브는 약 2 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 튜브는 약 10 mL 내지 약 250 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 튜브는 약 50 mL 내지 약 200 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 진탕 튜브는 원뿔형 용기이다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 진탕 튜브를 0.1 x g 내지 약 4.1 x g로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 진탕 튜브를 0.23 x g 내지 약 1.78 x g로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (c)에서의 용기는 배양 백이다. 일부 구현예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 25 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 5 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 배양 백을 분당 약 10 진동 사이클 내지 분당 약 50 진동 사이클의 진동 속도로 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 배양 백을 분당 약 10 진동 사이클 내지 분당 약 25 진동 사이클의 진동 속도로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (c)에서의 용기는 바이오리액터이다. 일부 구현예에서, 바이오리액터는 1 L 내지 약 15,000 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 바이오리액터는 5 L 내지 약 5,000 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 바이오리액터는 약 5 L 내지 약 2,500 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 바이오리액터는 약 5 L 내지 약 100 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 약 10 W/m3 내지 약 200 W/m3의 P/V 값으로 제2 세포 배양물을 교반하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 약 10 W/m3 내지 약 100 W/m 3의 P/V 값으로 제2 세포 배양물을 교반하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 제3 세포 배양물을 배치 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 제3 세포 배양물을 유가 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 유가 배양은 시간의 경과에 따라 제3 배양 배지의 추가 부피를 제3 세포 배양물에 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지의 추가 부피는 시간의 경과에 따라 제3 세포 배양물에 연속으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 제3 세포 배양 배지의 추가 부피는 시간의 경과에 따라 제3 세포 배양물에 주기적으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 단계 (d)에서의 배치 배양 또는 유가 배양은: (i) 제1 기간 동안 제3 세포 배양물에 제3 세포 배양물의 추가 부피를 첨가하는 단계, 및 (ii) 제2 기간 동안 제3 세포 배양물에 제4 배양 배지의 추가 부피를 첨가하는 단계를 포함하되, 제4 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 37.5 g/L의 타우린 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 37.5 g/L의 하이포타우린을 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 제3 배양 배지의 추가 부피는 제1 기간 동안 제3 세포 배양물에 연속으로 첨가되고/되거나; 단계 (ii)에서의 제4 배양 배지의 추가 부피는 제2 기간 동안 제3 세포 배양물에 연속으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 제3 배양 배지의 추가 부피는 제1 기간 동안 제3 세포 배양물에 주기적으로 첨가되고/되거나; 단계 (ii)에서의 제4 배양 배지의 추가 부피는 제2 기간 동안 제3 세포 배양물에 주기적으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 제1 기간은 약 1일 내지 약 7일이다. 일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 제1 기간은 약 3일 내지 약 5일이다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)에서의 제2 기간은 약 1일 내지 약 10일이다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)에서의 제2 기간은 약 3일 내지 약 7일이다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 20.0 g/L의 타우린 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 20.0 g/L의 하이포타우린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 4.0 g/L의 타우린 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 4.0 g/L의 하이포타우린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 2.5 g/L의 타우린 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 2.5 g/L의 하이포타우린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, SCF, 및 EPO 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, SCF, 및 EPO 중 2개 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, SCF, 및 EPO 각각을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1 μg/mL 내지 약 500 μg/mL의 트랜스페린을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 100 μg/mL 내지 약 300 μg/mL의 트랜스페린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 1 μg/mL의 SCF를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL의 SCF를 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 10 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 SCF를 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL의 EPO를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 EPO를 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 100 mg/mL의 EPO를 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배지는 약 0.1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL의 인슐린을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배지는 약 0.1 μg/mL 내지 약 20 μg/mL의 인슐린을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1 mM 내지 약 8 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 3 mM 내지 약 5 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 0.5% v/v 내지 약 10% v/v의 혈청을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 4% v/v 내지 약 6% v/v의 혈청을 포함한다.
일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 0.5 g/L 내지 약 54.0 g/L의 미오-이노시톨을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 25.0 g/L의 미오-이노시톨을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 5.0 g/L의 미오-이노시톨을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 2.5 g/L의 미오-이노시톨을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 20.0 g/L의 타우린 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 20.0 g/L의 하이포타우린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 4.0 g/L의 타우린 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 4.0 g/L의 하이포타우린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 2.5 g/L의 타우린 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 2.5 g/L의 하이포타우린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, 및 EPO 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, 및 EPO 중 2개 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, 및 EPO 각각을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 100 μg/mL 내지 약 2 mg/mL의 트랜스페린을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 100 μg/mL 내지 약 1.5 mg/mL의 트랜스페린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL의 EPO를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 EPO를 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 100 mg/mL의 EPO를 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배지는 약 0.1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL의 인슐린을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배지는 약 0.1 μg/mL 내지 약 20 μg/mL의 인슐린을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1 mM 내지 약 8 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 3 mM 내지 약 5 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 0.5% v/v 내지 약 10% v/v의 혈청을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 4% v/v 내지 약 6% v/v의 혈청을 포함한다.
일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 0.5 g/L 내지 약 54.0 g/L의 미오-이노시톨을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 25.0 g/L의 미오-이노시톨을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 5.0 g/L의 미오-이노시톨을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 2.5 g/L의 미오-이노시톨을 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (d)의 배치 배양 또는 유가 배양은 약 8일 내지 약 15일 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (d)의 배치 배양 또는 유가 배양은 약 9일 내지 약 13일 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (c)에서의 초기 세포 밀도는 약 2.0 x 105개의 세포/mL 내지 약 8.0 x 105개의 세포/mL이다. 일부 구현예에서, 단계 (c)에서의 초기 세포 밀도는 약 4.0 x 105개의 세포/mL 내지 약 6.0 x 105개의 세포/mL이다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 약 5 x 106개의 제핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 108개의 제핵 적혈구/mL의 세포 밀도를 초래한다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 약 1 x 107개의 제핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 108개의 제핵 적혈구/mL의 세포 밀도를 초래한다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 약 5 x 107개의 제핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 108개의 제핵 적혈구/mL의 세포 밀도를 초래한다.
본원에 기술된 제핵 적혈구 세포의 집단을 생성하는 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 적혈구 전구 세포는 인간 적혈구 전구 세포이다. 일부 구현예에서, 적혈구 전구 세포는 O 음성인 인간 공여자로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 적혈구 전구 세포는 O 음성이고 Kell 음성인 인간 공여자로부터 수득된다.
본원에 기술된 제핵 적혈구 세포의 집단을 생성하는 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포의 집단은 제핵 인간 적혈구 세포의 집단이다. 본원에 기술된 제핵 적혈구 세포의 집단을 생성하는 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 상기 방법은 단계 (d)에서의 제3 세포 배양물로부터 제핵 적혈구 세포의 집단을 단리하는 단계 (e)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은, 단계 (e)에서 단리된 제핵 적혈구 세포의 집단을 제형화하는 단계 (f)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은, 단계 (f)에서의 제핵 적혈구 세포의 제형화된 집단을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계 (g)를 추가로 포함한다.
본원에 기술된 제핵 적혈구 세포의 집단을 생성하는 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 상기 방법은 단계 (a) 동안 및/또는 이전에, 제1 세포 배양물 내의 적혈구 전구 세포 내로 핵산을 도입하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 방법에 의해 조작된 제핵 적혈구 세포의 집단이 생산된다. 일부 구현예에서, 조작된 제핵 적혈구 세포의 집단은 조작된 제핵 인간 적혈구 세포이다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 외인성 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 조작된 인간 제핵 적혈구 세포는 하나 이상의 외인성 단백질(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 외인성 단백질을 세포에 클릭-접합하는(click-conjugating) 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포를 저장성으로(hypotonically) 로딩하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 물리적 조작을 통해 세포를 로딩하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 외인성 단백질(들) 중 하나는 조작된 인간 제핵 적혈구 세포의 세포기질 내에 존재한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 외인성 단백질 중 하나는 조작된 인간 제핵 적혈구 세포의 막 상에 존재한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 외인성 단백질(들) 중 하나는 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL)를 포함하되, 외인성 단백질은 조작된 인간 제핵 적혈구 세포의 세포기질에 존재하고, 조작된 인간 제핵 적혈구 세포는 하이포타우린 또는 타우린을 함유하는 액체 배양 배지와 접촉하지 않은 조작된 인간 제핵 적혈구 세포와 비교하여 증가된 페닐알라닌-분해 활성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 조작된 인간 제핵 적혈구는 하이포타우린 또는 타우린을 함유하는 액체 배양 배지와 접촉하지 않은 조작된 인간 제핵 적혈구와 비교하여 페닐알라닌-분해 활성에 있어서 적어도 10% 증가를 나타낸다. 일부 구현예에서, 조작된 인간 제핵 적혈구는 하이포타우린 또는 타우린을 함유하는 액체 배양 배지와 접촉하지 않은 조작된 인간 제핵 적혈구와 비교하여 페닐알라닌-분해 활성에 있어서 적어도 20% 증가를 나타낸다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 외인성 단백질(들)은 면역조절 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 외인성 단백질(들)은 항원 제시 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은, 단계 (d)에서의 제3 세포 배양물로부터 조작된 제핵 적혈구 세포의 집단을 단리하는 단계 (e)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은, 단계 (e)에서 단리된 조작된 제핵 적혈구 세포의 집단을 제형화하는 단계 (f)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은, 단계 (f)에서의 조작된 제핵 적혈구 세포의 제형화된 집단을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계 (g)를 추가로 포함한다.
또한, 본원에 기술된 제핵 적혈구 세포의 집단을 생성하는 방법 중 어느 하나에 의해 생산된 제핵 적혈구 세포의 집단이 본원에 제공된다. 또한, 본원에 기술된 제핵 적혈구 세포의 집단을 생성하는 방법 중 어느 하나에 의해 생산된 제형이 본원에 제공되며, 상기 방법은, 단계 (e)에서 단리된 제핵 적혈구 세포의 집단을 제형화하는 단계 (f)를 추가로 포함한다. 또한, 본원에 기술된 제핵 적혈구 세포의 집단을 생성하는 방법 중 어느 하나에 의해 생산된 제핵 적혈구 세포의 집단이 본원에 제공되며, 상기 방법은, 단계 (a) 전에, 제1 세포 배양물 중의 적혈구 전구 세포 내로 핵산을 도입하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 상기 방법은 조작된 제핵 적혈구 세포의 집단을 생산한다. 또한, 본원에 기술된 제핵 적혈구 세포를 생성하는 방법 중 어느 하나에 의해 생산된 제형이 본원에 제공되며, 상기 방법은, 단계 (a) 전에, 제1 세포 배양물 중의 적혈구 전구 세포 내로 핵산을 도입하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 방법은 조작된 제핵 적혈구 세포의 집단을 생산하고, 상기 방법은, 단계 (d)에서의 제3 세포 배양물로부터 조작된 제핵 적혈구 세포의 집단을 단리하는 단계 (e)를 추가로 포함하고, 상기 방법은 단계 (e)에서 단리된 조작된 제핵 적혈구 세포의 집단을 제형화하는 단계 (f)를 추가로 포함한다.
용어 “집단(population)”은 주어진 물품(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제핵 적혈구 세포 중 어느 하나)이 하나 이상인 것을 의미한다.
용어 “조작된 제핵 적혈구 세포(engineered enucleated erythroid cell)”는 하나 이상의(예를 들어 2, 3, 4, 5, 또는 6개의) 외인성 단백질(들)(예를 들어 본원에 기술된 또는 당업계에 공지된 예시적인 외인성 단백질의 임의의 조합)을 포함하는 제핵 적혈구 세포(예를 들어 인간 제핵 적혈구 세포)를 의미한다. 예를 들어, 조작된 적혈구 세포는 그의 세포기질에 존재하는 하나 이상의 외인성 단백질(들)을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 적혈구 세포는 그의 원형질 막 상에 존재하는 하나 이상의 외인성 단백질(들)을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 적혈구 세포는 (i) 그의 세포기질에 존재하는 하나 이상의 외인성 단백질(들) 및 (ii) 그의 원형질 막 상에 존재하는 하나 이상의 외인성 단백질을 가질 수 있다. 조작된 제핵 적혈구 세포의 비제한적인 구현예는, 클릭-접합된 제핵 적혈구 세포; 저 긴장성으로 로딩된 제핵 적혈구 세포; 및 물리적 조작(예를 들어 본원에 기술된 또는 당업계에 공지된 예시적인 유형의 물리적 조작 중 어느 하나)에 의해 로딩된 제핵 적혈구 세포를 포함한다. 조작된 제핵 적혈구 세포의 추가적인 비제한적인 양태가 본원에서 기술된다.
용어 “클릭-접합된 제핵 적혈구 세포(click-conjugated enucleated erythroid cell)”는 화학 반응을 통해 조작된 제핵 적혈구 세포의 원형질 막 상에 존재하는 또 다른 단백질(예를 들어 제핵 적혈구 세포의 내인성 단백질 또는 상이한 외인성 단백질)에 접합된 적어도 하나의 외인성 단백질을 갖는 조작된 제핵 적혈구 세포를 의미한다.
용어 “저장성으로 로딩된 제핵 적혈구 세포(hypotonically-loaded enucleated erythroid cell)”는, 하나 이상의 외인성 단백질(들)을 포함하는 저 이온 강도 완충액(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 저 이온 강도 완충액 중 어느 하나)에 제핵 적혈구 세포 또는 적혈구 전구 세포를 노출시킴으로써 적어도 부분적으로 생성된 조작된 제핵 적혈구 세포를 의미한다. 저장성으로 로딩된 제핵 적혈구 세포를 생성하는 데 사용될 수 있는 방법의 비제한적인 예가 본원에 기술된다. 저장성으로 로딩된 제핵 적혈구 세포를 생성하기 위한 추가의 방법이 당업계에 공지되어 있다.
용어 “물리적 조작에 의해 로딩된 제핵 적혈구 세포”는 하나 이상의 외인성 단백질(예를 들어 본원에 기술된 또는 당업계에 알려진 예시적인 외인성 단백질 중 어느 하나) 및/또는 하나 이상의 외인성 단백질(들)(예를 들어 본원에 기술된 또는 당업계에 알려진 예시적인 외인성 단백질 중 어느 하나)을 암호화하는 핵산을 적혈구 전구 세포에 도입하는 방식으로 적혈구 전구 세포를 물리적으로 조작함으로써 적어도 부분적으로 생성된 제핵 적혈구 세포를 의미한다. 하나 이상의 외인성 단백질(들)을 암호화하는 핵산을 적혈구 전구 세포 내에 도입하는 데 사용될 수 있는 물리적 조작의 비제한적인 예는 전기천공 및 입자 매개 형질감염을 포함한다. 하나 이상의 외인성 단백질(들)을 암호화하는 핵산을 적혈구 전구물질 내에 도입하는 데 사용될 수 있는 물리적 조작의 추가 예는 당업계에 공지되어 있다.
용어 “외인성 단백질”은 세포 내에 또는 세포 상에 도입되는 단백질, 또는 단백질을 암호화하는 외인성 핵산을 세포 내에 또는 세포의 전구물질 내에 도입함으로써 해당 세포에 의해 발현되는 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 외인성 단백질은 세포 또는 세포의 전구물질 내에 도입된 외인성 핵산에 의해 암호화된 단백질이며, 여기서 세포는 핵산을 임의로 보유하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 단백질은 화학적 또는 효소적 수단에 의해 세포의 표면에 접합된 단백질이다. 외인성 단백질의 비제한적인 부류는 효소, 인터류킨, 사이토카인 수용체, Fc-결합 분자, T-세포 활성화 리간드, T-세포 수용체, 면역 억제 분자, MHC 분자, APC 결합 분자, 자가항원, 알레르겐, 독소, 표적화제, 수용체 리간드(예를 들어 수용체 작용제 또는 수용체 길항제), 및 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 조작된 제핵 적혈구 세포에 존재할 수 있는 외인성 단백질의 추가 구현예가 본원에 기술된다(예를 들어 표 A~D 참조). 조작된 제핵 적혈구 세포에 존재할 수 있는 외인성 단백질의 추가 구현예는 당업계에 공지되어 있다.
용어 “막 상에 존재하는 단백질”은 (1) 제핵 적혈구 세포에 물리적으로 부착되거나 적어도 부분적으로 포매되는 단백질(예를 들어 막관통 단백질, 말초 막 단백질, 지질 앵커 단백질(예를 들어, GPI -앵커, N-미리스토일화 단백질, 또는 S-팔미토일화 단백질)) 또는 (2) 그의 동족 수용체에 안정적으로 결합되는 단백질로서, 동족 수용체는 제핵 적혈구 세포에 물리적으로 부착되는, 단백질(예를 들어 그의 동족 수용체에 결합되는 리간드로서, 동족 수용체는 제핵 적혈구 세포의 막에 물리적으로 부착되는, 리간드)을 의미한다. 포유류 세포의 막에서 단백질의 존재를 결정하기 위한 비제한적인 방법은 형광 활성화 세포 분류(FACS), 면역조직화학, 세포 분획 검정, 및 웨스턴 블롯팅을 포함한다.
용어 “적혈구 전구 세포”는 궁극적으로 제핵 적혈구로 분화/발달할 수 있는 포유류 세포를 의미한다. 일부 구현예에서, 적혈구 전구 세포는 제대혈 줄기 세포, CD34+ 세포, 조혈 줄기/전구 세포(HSC, HSPC), 비장 콜로니 형성(CFU-S) 세포, 공통 골수 전구(CMP) 세포, 아세포 콜로니 형성 세포, 대집락 형성 단위-적혈구(erythroid/erythrocyte)(BFU-E), 거핵구-적혈구 전구(MEP) 세포, 적혈구 콜로니 형성 단위, 콜로니 형성 단위 적혈구(CFU-E), 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC), 간엽 줄기 세포(MSC), 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 적혈구 전구 세포는 인간 적혈구 전구 세포이다. 일부 구현예에서, 적혈구 전구 세포는 O 음성 인간 공여자로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 적혈구 전구 세포는 O 음성이고 Kell 음성인 인간 공여자로부터 수득될 수 있다.
용어 “대상체(subject)”는 임의의 포유동물을 지칭한다. 일부 구현예에서, 대상체 또는 “치료를 필요로 하는 대상체”는 영장류(예를 들어 인간; 마모셋 원숭이 바분 원숭이와 같은 유인원(simian); 또는 고릴라, 침팬지, 오랑우탄, 또는 긴팔원숭이와 같은 유인원(ape)), 설치류(예를 들어 마우스, 기니피그, 햄스터, 또는 랫트), 토끼, 개, 고양이, 말, 양, 소, 돼지, 또는 염소일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체 또는 “치료에 적합한 대상체”는 비인간 포유동물, 특히 인간에서의 치료 효능을 입증하기 위한 모델로서 편리하게 사용될 수 있는 포유동물(예를 들어, 마우스, 돼지, 랫트, 또는 비인간 영장류)일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 치료가 필요한 것으로 의료 전문가(예를 들어, 의사, 실험실 기술자, 의사 보조사, 간호사, 또는 임상 실험실 기술자)에 의해 이전에 진단되었거나 식별되었을 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “치료(treating)”는 대상체(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 대상체 중 어느 하나)에서 의학적 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상의 수, 중증도, 빈도, 및/또는 지속기간이 감소하는 것을 의미한다.
용어 “진탕 플라스크(shake flask)”는 액체 배양 배지를 담을 수 있는 용기(예: 멸균 용기)로서, 적어도 하나의 기체 투과성 표면(예를 들어, 막과 같이 멸균 장벽으로서 작용할 수도 있는 기체 투과성 요소를 갖는 단부) 및/또는 적어도 하나의 통기성 캡을 가지며, 그 형상의 적어도 일부분은 절단된 원뿔과 유사한 용기를 의미한다. 예를 들어, 진탕 플라스크는 세포 배양 플라스크, 예컨대 T-플라스크, 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask), 또는 당업계에서 인정된 이들의 변형된 버전일 수 있다.
용어 “진탕 튜브(shake tube)”는 액체 배양 배지를 담을 수 있는 용기(예: 멸균 용기)로서, 적어도 하나의 기체 투과성 표면(예를 들어, 막과 같이 멸균 장벽으로서 작용할 수도 있는 기체 투과성 요소를 갖는 단부) 및/또는 적어도 하나의 통기성 캡을 갖고, 교반 시(예: 회전 교반 시) 용기 내의 액체 배양 배지를 유지할 수 있고, 그 형상의 적어도 일부분은 원통과 유사한 용기를 의미한다. 예를 들어, 진탕 튜브는 Eppendorf™ 튜브(예를 들어, 50-mL 또는 15-mL Eppendorf™ 튜브), 또는 당업계에서 인정된 이의 등가물 또는 변형된 버전일 수 있다. 일부 구현예에서, 진탕 튜브는 다중-웰 플레이트 내의 웰(예를 들어 둥근 바닥 웰 또는 평평한 바닥 웰)일 수 있다.
용어 “유가 배양(feed-batch culture)”은 세포 배양물로부터 제1 액체 배양 배지를 실질적으로 또는 상당히 제거하지 않고, 초기 세포 배양물에 제2 액체 배양 배지를 증분적으로 또는 연속으로 첨가하는 것을 포함하는 배양 방법을 의미한다. 일부 경우에, 제2 액체 배양 배지는 제1 액체 배양 배지와 동일한 성분을 실질적으로 동일한 농도로 포함한다. 다른 경우에, 제2 액체 배양 배지는 제1 액체 배양 배지의 농축된 형태이고/이거나 건조 분말로서 첨가된다.
용어 “관류 배양(perfusion culture)”은 액체 배양 배지를 세포 배양물에 (증분적으로 또는 연속으로) 첨가하는 것 및 세포 배양물로부터 액체 배양 배지를 제거하는 것 모두를 포함하는 배양 방법을 의미한다. 제거 및 첨가는 동시에 또는 순차적으로 수행되거나, 둘의 조합일 수 있다. 또한, 제거 및 첨가는 연속으로 수행될 수 있다. 제거된 액체 배양 배지의 부피 및 첨가된 액체 배양 배지의 부피는, 일부 경우에, 배양 기간의 전체 또는 일부 동안, 매 24시간(또는 대안적으로, 약 1시간 내지 약 24시간의 증분 시간 또는 24시간 초과의 증분 시간)에 걸쳐 대략 동일하게 유지될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 액체 배양 배지의 부피가 제거되는 속도(부피/시간 단위) 및 액체 배양 배지의 부피가 첨가되는 속도(부피/시간 단위)가 달라질 수 있다. 액체 배양 배지의 부피가 제거되는 속도(부피/시간 단위) 및 액체 배양 배지의 부피가 첨가되는 속도(부피/시간 단위)는 거의 동일하거나 상이할 수 있다.
대안적으로, 제거되고 첨가되는 부피는 배양 기간 동안 매 24시간(또는 대안적으로, 1시간 내지 약 24시간의 증분 시간 또는 24시간 초과의 증분 시간)에 걸쳐 변화할 수 (예를 들어 점진적으로 증가할 수) 있다. 예를 들어, 배양 기간 동안 매 24시간(또는 대안적으로, 약 1시간 내지 24시간 초과의 증분 시간 또는 24시간 초과의 증분 시간) 이내에 첨가된 액체 배양 배지의 부피 및 제거된 액체 배양 배지의 부피는 배양 기간 동안 (예를 들어, 점진적으로 또는 시차를 둔 증분을 통해) 증가될 수 있다.
액체 배양 배지의 부피는, 예를 들어, 용기(예: 바이오리액터)로부터 액체 배양 배지의 부피를 제거할 수 있는 기계적 시스템에 의해 제거되거나, 세포를 가라 앉히고 피펫팅을 통해 액체 배양 배지의 부피를 제거함으로써 제거되거나, 원심력의 사용을 적어도 부분적으로 포함할 수 있는 방법에 의해 제거될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 액체 배양 배지의 부피는, 적혈구 전구 세포 및 제핵 적혈구 세포를 배제하는 분자량 컷오프를 이용해, 멸균 막을 통해 액체 배양 배지를 여과하거나 중력에 따라 흘림으로써 제거될 수 있다.
액체 배양 배지의 부피는 자동화된 방식으로, 예를 들어 연동 펌프 또는 관류 펌프에 의해 용기(예를 들어, 바이오리액터)에 첨가될 수 있다.
용어 “동물 성분이 없는 액체 배양 배지”는 포유동물로부터 유래된 임의의 성분(예: 단백질 또는 혈청)을 함유하지 않는 액체 배양 배지를 의미한다.
용어 “혈청이 없는 액체 배양 배지”는 포유동물의 혈청을 함유하지 않는 액체 배양 배지를 의미한다.
용어 “화학적으로 정의된 액체 배양 배지”는 모든 화학 성분이 알려져 있는 액체 배양 배지를 의미한다. 예를 들어, 화학적으로 정의된 액체 배양 배지는 태아 혈청, 혈청 알부민, 또는 혈청 알부민을 함유하지 않는데, 이는 이들 제제가 일반적으로 알부민과 지질의 복합 혼합물을 함유하기 때문이다.
용어 “교반(agitation)”은 용기 내에서 세포 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 세포 중 어느 하나를 포함하는 세포 배양물)의 이동을 의미한다. 교반은 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 세포 배양물이 담긴 용기를 원형 또는 타원형으로 움직이는 회전 진탕기(rotary shaker)와 같은 기기를 사용해 수행될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 교반은 세포 배양물이 담긴 용기를 기울이거나 용기를 굴림으로써 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 배양물의 교반은 세포 배양물이 담긴 바이오리액터에서 임펠러(impeller)를 사용함으로써 발생할 수 있다.
용어 “타우린 분해 산물(taurin breakdown product)”, “하이포타우린 분해 산물”, 및 “타우린 또는 하이포타우린 분해 산물”은 포유류 세포에서 타우린 또는 하이포타우린의 이화작용에 의해 생성된 분자(예를 들어 생성물 또는 중간 생성물)를 의미한다. 타우린 또는 하이포타우린 분해 산물의 비제한적인 예는 5-글루타밀-타우린, 타우로콜산염, 및 타우로시아민이다.
용어 “타우린 전구물질(taurine precursor)”, “하이포타우린 전구물질”, 또는 “타우린 및 하이포타우린 전구물질”은 포유류 세포에서 (표시된 것과 같은) 타우린 또는 하이포타우린 생합성 경로 내의 분자(예: 기질 또는 중간체)를 의미한다. 타우린 또는 하이포타우린 전구물질의 비제한적인 예는 L-시스테인, L-시스테인산염, 시스테아민, 및 시스테인설핀산(3-설피노-L-알라닌으로도 알려짐)을 포함한다. 일부 구현예에서, 용어 “타우린 전구물질”, “하이포타우린 전구물질”, 및 “타우린 및 하이포타우린 전구물질”은 L-시스테인을 포함하지 않는다.
용어 “미오-이노시톨 분해 산물(myo-inositol breakdown product)”은 포유류 세포에서 미오-이노시톨의 이화작용에 의해 생성된 분자(예를 들어, 생성물 또는 중간체)를 의미한다. 미오-이노시톨 분해 산물의 비제한적인 예는 글루쿠론산 및 포스파티딜-1D-미오-이노시톨이다.
용어 “미오-이노시톨 전구물질”은 포유류 세포에서 미오-이노시톨 생합성 경로 내의 분자(예를 들어, 기질 또는 중간체)를 의미한다. 미오-이노시톨 전구물질의 비제한적인 예는 1D-미오-이노시톨3-포스페이트 및 1D-미오-이노시톨-1-포스페이트를 포함한다. 미오-이노시톨 전구물질의 추가적인 비제한적인 예는 1-포스파티딜-1D-미오-이노시톨-3,5 비스포스페이트, 1-포스파티딜-1D-미오-이노시톨-5-포스페이트, 1-포스파티딜-1D-미오-이노시톨-3,4,5-트리스포스페이트, 1-포스파티딜-1D-미오-이노시톨-3-포스페이트, 1-포스파티딜-1D-미오-이노시톨-3,4-비스포스페이트, 1-포스파티딜-1D-미오-이노시톨-4,5-비스포스페이트, 1-포스파티딜-1D-미오-이노시톨-4-포스페이트, 포스파티딜-1D-미오-이노시톨, 미오-이노시톨-1,3-비스포스페이트, 1D-미오-이노시톨-4-포스페이트, 1D-미오-이노시톨-1,4-비스포스페이트, 1D-미오-이노시톨-1,4,5-트리스포스페이트, 1D-미오-이노시톨-1,3,4,5-테트라키스포스페이트, 1D-미오-이노시톨-1,3,4-트리스포스페이트, D-글루코스-6-포스페이트, 및 1D-미오-이노시톨-3,4-비스포스페이트를 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 세포 배양은 본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 적어도 일부 동안 세포 배양물을 교반하는 것을 포함하지 않는다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에서 사용하기 위한 방법 및 물질이 본원에 기술되며; 당업계에 공지된 다른 적절한 방법 및 물질이 또한 사용될 수 있다. 물질, 방법, 및 실시예는 단지 예시적인 것이며 제한하도록 의도되지 않는다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 엔트리, 및 기타 참조 문헌은 그 전체가 참조로서 통합된다. 상충하는 경우, 정의를 포함하여 본 명세서가 우선한다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 다음의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용과 도면, 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1은 하이포타우린을 포함하는 배양 배지, 하이포타우린과 미오-이노시톨 둘 다를 포함하는 배양 배지, 및 하이포타우린 또는 미오-이노시톨(대조군)을 포함하지 않는 배양 배지가 사용된 경우, 적혈구 전구 세포의 배양물에서 시간 경과에 따른 총 세포 밀도(“총 밀도”)를 보여준다.
도 2는 하이포타우린을 포함하는 배양 배지, 하이포타우린과 미오-이노시톨 둘 다를 포함하는 배양 배지, 및 하이포타우린 또는 미오-이노시톨(대조군)을 포함하지 않는 배양 배지가 사용된 경우, 적혈구 전구 세포의 배양물에서 시간 경과에 따른 제핵 적혈구 세포 밀도(“제핵 세포 밀도”)를 보여준다.
제핵 적혈구 세포의 집단을 생성하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은: (a) 적혈구 전구 세포의 제1 세포 배양물의 일정 부피를 용기에 담긴 제2 배양 배지 내에 배치하여 제2 세포 배양물을 수득하는 단계; (b) 제2 세포 배양물을 약 2일 내지 약 15일 동안 배양(예를 들어, 관류 배양, 배치 배양, 또는 유가 배양)하는 단계; (c) 단계 (b)의 제2 세포 배양물의 부피를 용기 내에 포함된 제3 배양 배지에 배치하여 제3 세포 배양물을 수득하는 단계로서, 제3 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 37.5 g/L 또는 약 8 mM 내지 약 300 mM의 타우린(또는 타우린 전구물질 또는 타우린 분해 산물) 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 37.5 g/L 또는 약 9 mM 내지 약 345 mM의 하이포타우린(또는 하이포타우린 전구물질 또는 하이포타우린 분해 산물)을 포함하는, 단계; (d) 단계 (c)의 제3 세포 배양물을 약 5일 내지 약 20일 동안 배양(예를 들어, 관류 배양, 배치 배양, 또는 유가 배양)하는 단계로서, 단계 (d) 후 제3 배양 배지는 제핵 적혈구 세포의 집단을 포함하는, 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은, 성숙 동안 타우린 (또는 타우린 전구물질 또는 타우린 분해 산물) 또는 하이포타우린 (또는 하이포타우린 전구물질 또는 하이포타우린 분해 산물)을 포함하거나, 약 1.0 g/L 내지 약 37.5 g/L 또는 약 8 mM 내지 약 300 mM의 타우린 (또는 타우린 전구물질 또는 타우린 분해 산물) 또는 약 1.0 g/L 내지 약 37.5 g/L 또는 약 9 mM 내지 약 345 mM의 하이포타우린 (또는 하이포타우린 전구물질 또는 하이포타우린 분해 산물)을 포함하는 배양 배지의 사용을 포함하지 않는 유사한 방법과 비교했을 때, 본원에 기술된 방법 중 어느 하나가 종료될 때 제핵 속도 또는 제핵된 세포의 백분율에 있어서 증가를 (예를 들어 적어도 1% 내지 약 300% 증가를 (예를 들어 약 1% 내지 약 280% 증가, 약 1% 내지 약 260% 증가, 약 1% 내지 약 240% 증가, 약 1% 내지 약 220% 증가, 약 1% 내지 약 200% 증가, 약 1% 내지 약 180% 증가, 약 1% 내지 약 160% 증가, 약 1% 증가 내지 약 140% 증가, 약 1% 내지 약 120% 증가, 약 1% 증가 내지 약 100% 증가, 약 1% 증가 내지 약 80% 증가, 약 1% 증가 내지 약 60% 증가, 약 1% 증가 내지 약 40% 증가, 약 1% 증가 내지 약 20% 증가, 약 1% 증가 내지 약 10% 증가, 약 1% 증가 내지 약 5% 증가, 약 5% 증가 내지 약 300% 증가, 약 5% 내지 약 280% 증가, 약 5% 내지 약 260% 증가, 약 5% 내지 약 240% 증가, 약 5% 내지 약 220% 증가, 약 5% 내지 약 200% 증가, 약 5% 내지 약 180% 증가, 약 5% 내지 약 160% 증가, 약 5% 증가 내지 약 140% 증가, 약 5% 내지 약 120% 증가, 약 5% 증가 내지 약 100% 증가, 약 5% 증가 내지 약 80% 증가, 약 5% 증가 내지 약 60% 증가, 약 5% 증가 내지 약 40% 증가, 약 5% 증가 내지 약 20% 증가, 약 5% 증가 내지 약 10% 증가, 약 10% 증가 내지 약 300% 증가, 약 10% 내지 약 280% 증가, 약 10% 내지 약 260% 증가, 약 10% 내지 약 240% 증가, 약 10% 내지 약 220% 증가, 약 10% 내지 약 200% 증가, 약 10% 내지 약 180% 증가, 약 10% 내지 약 160% 증가, 약 10% 증가 내지 약 140% 증가, 약 10% 내지 약 120% 증가, 약 10% 증가 내지 약 100% 증가, 약 10% 증가 내지 약 80% 증가, 약 10% 증가 내지 약 60% 증가, 약 10% 증가 내지 약 40% 증가, 약 10% 증가 내지 약 20% 증가, 약 20% 증가 내지 약 300% 증가, 약 20% 내지 약 280% 증가, 약 20% 내지 약 260% 증가, 약 20% 내지 약 240% 증가, 약 20% 내지 약 220% 증가, 약 20% 내지 약 200% 증가, 약 20% 내지 약 180% 증가, 약 20% 내지 약 160% 증가, 약 20% 증가 내지 약 140% 증가, 약 20% 내지 약 120% 증가, 약 20% 증가 내지 약 100% 증가, 약 20% 증가 내지 약 80% 증가, 약 20% 증가 내지 약 60% 증가, 약 20% 증가 내지 약 40% 증가, 약 40% 증가 내지 약 300% 증가, 약 40% 내지 약 280% 증가, 약 40% 내지 약 260% 증가, 약 40% 내지 약 240% 증가, 약 40% 내지 약 220% 증가, 약 40% 내지 약 200% 증가, 약 40% 내지 약 180% 증가, 약 40% 내지 약 160% 증가, 약 40% 증가 내지 약 140% 증가, 약 40% 내지 약 120% 증가, 약 40% 증가 내지 약 100% 증가, 약 40% 증가 내지 약 80% 증가, 약 40% 증가 내지 약 60% 증가, 약 60% 증가 내지 약 300% 증가, 약 60% 내지 약 280% 증가, 약 60% 내지 약 260% 증가, 약 60% 내지 약 240% 증가, 약 60% 내지 약 220% 증가, 약 60% 내지 약 200% 증가, 약 60% 내지 약 180% 증가, 약 60% 내지 약 160% 증가, 약 60% 증가 내지 약 140% 증가, 약 60% 내지 약 120% 증가, 약 60% 증가 내지 약 100% 증가, 약 60% 증가 내지 약 80% 증가, 약 80% 증가 내지 약 300% 증가, 약 80% 내지 약 280% 증가, 약 80% 내지 약 260% 증가, 약 80% 내지 약 240% 증가, 약 80% 내지 약 220% 증가, 약 80% 내지 약 200% 증가, 약 80% 내지 약 180% 증가, 약 80% 내지 약 160% 증가, 약 80% 증가 내지 약 140% 증가, 약 80% 내지 약 120% 증가, 약 80% 증가 내지 약 100% 증가, 약 100% 증가 내지 약 300% 증가, 약 100% 내지 약 280% 증가, 약 100% 내지 약 260% 증가, 약 100% 내지 약 240% 증가, 약 100% 내지 약 220% 증가, 약 100% 내지 약 200% 증가, 약 100% 내지 약 180% 증가, 약 100% 내지 약 160% 증가, 약 100% 증가 내지 약 140% 증가, 약 100% 내지 약 120% 증가, 약 120% 증가 내지 약 300% 증가, 약 120% 내지 약 280% 증가, 약 120% 내지 약 260% 증가, 약 120% 내지 약 240% 증가, 약 120% 내지 약 220% 증가, 약 120% 내지 약 200% 증가, 약 120% 내지 약 180% 증가, 약 120% 내지 약 160% 증가, 약 120% 증가 내지 약 140% 증가, 약 140% 증가 내지 약 300% 증가, 약 140% 내지 약 280% 증가, 약 140% 내지 약 260% 증가, 약 140% 내지 약 240% 증가, 약 140% 내지 약 220% 증가, 약 140% 내지 약 200% 증가, 약 140% 내지 약 180% 증가, 약 140% 내지 약 160% 증가, 약 160% 증가 내지 약 300% 증가, 약 160% 내지 약 280% 증가, 약 160% 내지 약 260% 증가, 약 160% 내지 약 240% 증가, 약 160% 내지 약 220% 증가, 약 160% 내지 약 200% 증가, 약 160% 내지 약 180% 증가, 약 180% 증가 내지 약 300% 증가, 약 180% 내지 약 280% 증가, 약 180% 내지 약 260% 증가, 약 180% 내지 약 240% 증가, 약 180% 내지 약 220% 증가, 약 180% 내지 약 200% 증가, 약 200% 증가 내지 약 300% 증가, 약 200% 내지 약 280% 증가, 약 200% 내지 약 260% 증가, 약 200% 내지 약 240% 증가, 약 200% 내지 약 220% 증가, 약 220% 증가 내지 약 300% 증가, 약 220% 내지 약 280% 증가, 약 220% 내지 약 260% 증가, 약 220% 내지 약 240% 증가, 약 240% 증가 내지 약 300% 증가, 약 240% 내지 약 280% 증가, 약 240% 내지 약 260% 증가, 약 260% 증가 내지 약 300% 증가, 약 260% 내지 약 280% 증가, 또는 약 280% 증가 내지 약 300% 증가를)) 제공한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 예를 들어 성숙 동안 타우린(또는 타우린 전구물질 또는 타우린 분해 산물) 또는 하이포타우린(또는 하이포타우린 전구물질 또는 하이포타우린 분해 산물)을 포함하거나, 약 1.0 g/L 내지 약 37.5 g/L 또는 약 8 mM 내지 약 300 mM의 타우린(또는 타우린 전구물질 또는 타우린 분해 산물) 또는 약 1.0 g/L 내지 약 37.5 g/L 또는 약 9 mM 내지 약 345 mM의 하이포타우린(또는 하이포타우린 전구물질 또는 하이포타우린 분해 산물)을 포함하는 배양 배지의 사용을 포함하지 않는 유사한 방법과 비교했을 때, 본원에 기술된 방법 중 어느 하나가 끝났을 때 제핵 적혈구 세포(예를 들어 본원에 기술된 제핵 적혈구 세포 중 어느 하나)의 농도, 수, 또는 수률에 있어서 약 1% 증가 내지 약 300% 증가(또는 본원에 기술된 이러한 범위 중 어느 하나의 증가)를 제공한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은, 예를 들어 분화하거나 또는 성숙하는 동안 타우린(또는 타우린 전구물질 또는 타우린 분해 산물) 또는 하이포타우린(또는 하이포타우린 전구물질 또는 하이포타우린 분해 산물)을 포함하거나, 약 1.0 g/L 내지 약 37.5 g/L 또는 약 8 mM 내지 약 300 mM의 타우린(또는 타우린 전구물질 또는 타우린 분해 산물) 또는 약 1.0 g/L 내지 약 37.5 g/L 또는 약 9 mM 내지 약 345 mM의 하이포타우린(또는 하이포타우린 전구물질 또는 하이포타우린 분해 산물)을 포함하는 배양 배지의 사용을 포함하지 않는 유사한 방법과 비교했을 때, 본원에 기술된 방법 중 어느 하나 동안 적혈구 전구 세포 당 세포 분열의 평균 수에 있어서 약 1% 증가 내지 약 300% 증가(또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나)를 제공한다.
이들 방법의 비제한적인 양태가 아래에 기술된다. 당업자가 이해할 수 있듯이, 아래에 열거된 예시적인 양태는 임의의 조합으로 사용될 수 있고, 당업계에 공지된 다른 양태와 조합될 수 있다.
진탕 플라스크
본원에 기술된 방법의 일부 양태는 진탕 플라스크의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 진탕 플라스크는 약 2 mL 내지 약 5 L, 약 2 mL 내지 약 4.5 L, 약 2 mL 내지 약 4 L, 약 2 mL 내지 약 3.5 L, 약 2 mL 내지 약 3 L, 약 2 mL 내지 약 2.5 L, 약 2 mL 내지 약 2 L, 약 2 mL 내지 약 1.5 L, 약 2 mL 내지 약 1.0 L, 약 2 mL 내지 약 950 mL, 약 2 mL 내지 약 900 mL, 약 2 mL 내지 약 850 mL, 약 2 mL 내지 약 800 mL, 약 2 mL 내지 약 750 mL, 약 2 mL 내지 약 700 mL, 약 2 mL 내지 약 650 mL, 약 2 mL 내지 약 600 mL, 약 2 mL 내지 약 550 mL, 약 2 mL 내지 약 500 mL, 약 2 mL 내지 약 450 mL, 약 2 mL 내지 약 400 mL, 약 2 mL 내지 약 350 mL, 약 2 mL 내지 약 300 mL, 약 2 mL 내지 약 250 mL, 약 2 mL 내지 약 200 mL, 약 2 mL 내지 약 180 mL, 약 2 mL 내지 약 160 mL, 약 2 mL 내지 약 140 mL, 약 2 mL 내지 약 120 mL, 약 2 mL 내지 약 100 mL, 약 2 mL 내지 약 80 mL, 약 2 mL 내지 약 60 mL, 약 2 mL 내지 약 40 mL, 약 2 mL 내지 약 20 mL, 약 2 mL 내지 약 10 mL, 약 2 mL 내지 약 5 mL, 약 5 mL 내지 약 5 L, 약 5 mL 내지 약 4.5 L, 약 5 mL 내지 약 4 L, 약 5 mL 내지 약 3.5 L, 약 5mL 내지 약 3L, 약 5 mL 내지 약 2.5 L, 약 5 mL 내지 약 2 L, 약 5 mL 내지 약 1.5 L, 약 5 mL 내지 약 1.0 L, 약 5 mL 내지 약 950 mL, 약 5 mL 내지 약 900 mL, 약 5 mL 내지 약 850 mL, 약 5 mL 내지 약 800 mL, 약 5 mL 내지 약 750 mL, 약 5 mL 내지 약 700 mL, 약 5 mL 내지 약 650 mL, 약 5 mL to ab??out 600 mL, 약 5 mL 내지 약 550 mL, 약 5 mL 내지 약 500 mL, 약 5 mL 내지 약 450 mL, 약 5 mL 내지 약 400 mL, 약 5 mL 내지 약 350 mL, 약 5 mL 내지 약 300 mL, 약 5 mL 내지 약 250 mL, 약 5 mL 내지 약 200 mL, 약 5 mL 내지 약 180 mL, 약 5 mL 내지 약 160 mL, 약 5 mL 내지 약 140 mL, 약 5 mL 내지 약 120 mL, 약 5 mL 내지 약 100 mL, 약 5 mL 내지 약 80 mL, 약 5 mL 내지 약 60 mL, 약 5 mL 내지 약 40 mL, 약 5 mL 내지 약 20 mL, 약 5 mL 내지 약 10 mL, 약 10 mL 내지 약 5 L, 약 10 mL 내지 약 4.5 L, 약 10 mL 내지 약 4 L, 약 10 mL 내지 약 3.5 L, 약 10 mL 내지 약 3 L, 약 10 mL 내지 약 2.5 L, 약 10 mL 내지 약 2 L, 약 10 mL 내지 약 1.5 L, 약 10 mL 내지 약 1.0 L, 약 10 mL 내지 약 950 mL, 약 10 mL 내지 약 900 mL, 약 10 mL 내지 약 850 mL, 약 10 mL 내지 약 800 mL, 약 10 mL 내지 약 750 mL, 약 10 mL 내지 약 700 mL, 약 10 mL 내지 약 650 mL, 약 10 mL 내지 약 600 mL, 약 10 mL 내지 약 550 mL, 약 10 mL 내지 약 500 mL, 약 10 mL 내지 약 450 mL, 약 10 mL 내지 약 400 mL, 약 10 mL 내지 약 350 mL, 약 10 mL 내지 약 300 mL, 약 10 mL 내지 약 250 mL, 약 10 mL 내지 약 200 mL, 약 10 mL 내지 약 180 mL, 약 10 mL 내지 약 160 mL, 약 10 mL 내지 약 140 mL, 약 10 mL 내지 약 120 mL, 약 10 mL 내지 약 100 mL, 약 10 mL 내지 약 80 mL, 약 10 mL 내지 약 60 mL, 약 10 mL 내지 약 40 mL, 약 10 mL 내지 약 20 mL, 약 20 mL 내지 약 5 L, 약 20 mL 내지 약 4.5 L, 약 20 mL 내지 약 4 L, 약 20 mL 내지 약 3.5 L, 약 20 mL 내지 약 3 L, 약 20 mL 내지 약 2.5 L, 약 20 mL 내지 약 2 L, 약 20 mL 내지 약 1.5 L, 약 20 mL 내지 약 1.0 L, 약 20 mL 내지 약 950 mL, 약 20 mL 내지 약 900 mL, 약 20 mL 내지 약 850 mL, 약 20 mL 내지 약 800 mL, 약 20 mL 내지 약 750 mL, 약 20 mL 내지 약 700 mL, 약 20 mL 내지 약 650 mL, 약 20 mL 내지 약 600 mL, 약 20 mL 내지 약 550 mL, 약 20 mL 내지 약 500 mL, 약 20 mL 내지 약 450 mL, 약 20 mL 내지 약 400 mL, 약 20 mL 내지 약 350 mL, 약 20 mL 내지 약 300 mL, 약 20 mL 내지 약 250 mL, 약 20 mL 내지 약 200 mL, 약 20 mL 내지 약 180 mL, 약 20 mL 내지 약 160 mL, 약 20 mL 내지 약 140 mL, 약 20 mL 내지 약 120 mL, 약 20 mL 내지 약 100 mL, 약 20 mL 내지 약 80 mL, 약 20 mL 내지 약 60 mL, 약 20 mL 내지 약 40 mL, 약 40 mL 내지 약 5 L, 약 40 mL 내지 약 4.5 L, 약 40 mL 내지 약 4 L, 약 40 mL 내지 약 3.5 L, 약 40 mL 내지 약 3 L, 약 40 mL 내지 약 2.5 L, 약 40 mL 내지 약 2 L, 약 40 mL 내지 약 1.5 L, 약 40 mL 내지 약 1.0 L, 약 40 mL 내지 약 950 mL, 약 40 mL 내지 약 900 mL, 약 40 mL 내지 약 850 mL, 약 40 mL 내지 약 800 mL, 약 40 mL 내지 약 750 mL, 약 40 mL 내지 약 700 mL, 약 40 mL 내지 약 650 mL, 약 40 mL 내지 약 600 mL, 약 40 mL 내지 약 550 mL, 약 40 mL 내지 약 500 mL, 약 40 mL 내지 약 450 mL, 약 40 mL 내지 약 400 mL, 약 40 mL 내지 약 350 mL, 약 40 mL 내지 약 300 mL, 약 40 mL 내지 약 250 mL, 약 40 mL 내지 약 200 mL, 약 40 mL 내지 약 180 mL, 약 40 mL 내지 약 160 mL, 약 40 mL 내지 약 140 mL, 약 40 mL 내지 약 120 mL, 약 40 mL 내지 약 100 mL, 약 40 mL 내지 약 80 mL, 약 40 mL 내지 약 60 mL, 약 60 mL 내지 약 5 L, 약 60 mL 내지 약 4.5 L, 약 60 mL 내지 약 4 L, 약 60 mL 내지 약 3.5 L, 약 60 mL 내지 약 3 L, 약 60 mL 내지 약 2.5 L, 약 60 mL 내지 약 2 L, 약 60 mL 내지 약 1.5 L, 약 60 mL 내지 약 1.0 L, 약 60 mL 내지 약 950 mL, 약 60 mL 내지 약 900 mL, 약 60 mL 내지 약 850 mL, 약 60 mL 내지 약 800 mL, 약 60 mL 내지 약 750 mL, 약 60 mL 내지 약 700 mL, 약 60 mL 내지 약 650 mL, 약 60 mL 내지 약 600 mL, 약 60 mL 내지 약 550 mL, 약 60 mL 내지 약 500 mL, 약 60 mL 내지 약 450 mL, 약 60 mL 내지 약 400 mL, 약 60 mL 내지 약 350 mL, 약 60 mL 내지 약 300 mL, 약 60 mL 내지 약 250 mL, 약 60 mL 내지 약 200 mL, 약 60 mL 내지 약 180 mL, 약 60 mL 내지 약 160 mL, 약 60 mL 내지 약 140 mL, 약 60 mL 내지 약 120 mL, 약 60 mL 내지 약 100 mL, 약 60 mL 내지 약 80 mL, 약 80 mL 내지 약 5 L, 약 80 mL 내지 약 4.5 L, 약 80 mL 내지 약 4 L, 약 80 mL 내지 약 3.5 L, 약 80 mL 내지 약 3 L, 약 80 mL 내지 약 2.5 L, 약 80 mL 내지 약 2 L, 약 80 mL 내지 약 1.5 L, 약 80 mL 내지 약 1.0 L, 약 80 mL 내지 약 950 mL, 약 80 mL 내지 약 900 mL, 약 80 mL 내지 약 850 mL, 약 80 mL 내지 약 800 mL, 약 80 mL 내지 약 750 mL, 약 80 mL 내지 약 700 mL, 약 80 mL 내지 약 650 mL, 약 80 mL 내지 약 600 mL, 약 80 mL 내지 약 550 mL, 약 80 mL 내지 약 500 mL, 약 80 mL 내지 약 450 mL, 약 80 mL 내지 약 400 mL, 약 80 mL 내지 약 350 mL, 약 80 mL 내지 약 300 mL, 약 80 mL 내지 약 250 mL, 약 80 mL 내지 약 200 mL, 약 80 mL 내지 약 180 mL, 약 80 mL 내지 약 160 mL, 약 80 mL 내지 약 140 mL, 약 80 mL 내지 약 120 mL, 약 80 mL 내지 약 100 mL, 약 100 mL 내지 약 5 L, 약 100 mL 내지 약 4.5 L, 약 100 mL 내지 약 4 L, 약 100 mL 내지 약 3.5 L, 약 100 mL 내지 약 3 L, 약 100 mL 내지 약 2.5 L, 약 100 mL 내지 약 2 L, 약 100 mL 내지 약 1.5 L, 약 100 mL 내지 약 1.0 L, 약 100 mL 내지 약 950 mL, 약 100 mL 내지 약 900 mL, 약 100 mL 내지 약 850 mL, 약 100 mL 내지 약 800 mL, 약 100 mL 내지 약 750 mL, 약 100 mL 내지 약 700 mL, 약 100 mL 내지 약 650 mL, 약 100 mL 내지 약 600 mL, 약 100 mL 내지 약 550 mL, 약 100 mL 내지 약 500 mL, 약 100 mL 내지 약 450 mL, 약 100 mL 내지 약 400 mL, 약 100 mL 내지 약 350 mL, 약 100 mL 내지 약 300 mL, 약 100 mL 내지 약 250 mL, 약 100 mL 내지 약 200 mL, 약 100 mL 내지 약 180 mL, 약 100 mL 내지 약 160 mL, 약 100 mL 내지 약 140 mL, 약 100 mL 내지 약 120 mL, 약 120 mL 내지 약 5 L, 약 120 mL 내지 약 4.5 L, 약 120 mL 내지 약 4 L, 약 120 mL 내지 약 3.5 L, 약 120 mL 내지 약 3 L, 약 120 mL 내지 약 2.5 L, 약 120 mL 내지 약 2 L, 약 120 mL 내지 약 1.5 L, 약 120 mL 내지 약 1.0 L, 약 120 mL 내지 약 950 mL, 약 120 mL 내지 약 900 mL, 약 120 mL 내지 약 850 mL, 약 120 mL 내지 약 800 mL, 약 120 mL 내지 약 750 mL, 약 120 mL 내지 약 700 mL, 약 120 mL 내지 약 650 mL, 약 120 mL 내지 약 600 mL, 약 120 mL 내지 약 550 mL, 약 120 mL 내지 약 500 mL, 약 120 mL 내지 약 450 mL, 약 120 mL 내지 약 400 mL, 약 120 mL 내지 약 350 mL, 약 120 mL 내지 약 300 mL, 약 120 mL 내지 약 250 mL, 약 120 mL 내지 약 200 mL, 약 120 mL 내지 약 180 mL, 약 120 mL 내지 약 160 mL, 약 120 mL 내지 약 140 mL, 약 140 mL 내지 약 5 L, 약 140 mL 내지 약 4.5 L, 약 140 mL 내지 약 4 L, 약 140 mL 내지 약 3.5 L, 약 140 mL 내지 약 3 L, 약 140 mL 내지 약 2.5 L, 약 140 mL 내지 약 2 L, 약 140 mL 내지 약 1.5 L, 약 140 mL 내지 약 1.0 L, 약 140 mL 내지 약 950 mL, 약 140 mL 내지 약 900 mL, 약 140 mL 내지 약 850 mL, 약 140 mL 내지 약 800 mL, 약 140 mL 내지 약 750 mL, 약 140 mL 내지 약 700 mL, 약 140 mL 내지 약 650 mL, 약 140 mL 내지 약 600 mL, 약 140 mL 내지 약 550 mL, 약 140 mL 내지 약 500 mL, 약 140 mL 내지 약 450 mL, 약 140 mL 내지 약 400 mL, 약 140 mL 내지 약 350 mL, 약 140 mL 내지 약 300 mL, 약 140 mL 내지 약 250 mL, 약 140 mL 내지 약 200 mL, 약 140 mL 내지 약 180 mL, 약 140 mL 내지 약 160 mL, 약 160 mL 내지 약 5 L, 약 160 mL 내지 약 4.5 L, 약 160 mL 내지 약 4 L, 약 160 mL 내지 약 3.5 L, 약 160 mL 내지 약 3 L, 약 160 mL 내지 약 2.5 L, 약 160 mL 내지 약 2 L, 약 160 mL 내지 약 1.5 L, 약 160 mL 내지 약 1.0 L, 약 160 mL 내지 약 950 mL, 약 160 mL 내지 약 900 mL, 약 160 mL 내지 약 850 mL, 약 160 mL 내지 약 800 mL, 약 160 mL 내지 약 750 mL, 약 160 mL 내지 약 700 mL, 약 160 mL 내지 약 650 mL, 약 160 mL 내지 약 600 mL, 약 160 mL 내지 약 550 mL, 약 160 mL 내지 약 500 mL, 약 160 mL 내지 약 450 mL, 약 160 mL 내지 약 400 mL, 약 160 mL 내지 약 350 mL, 약 160 mL 내지 약 300 mL, 약 160 mL 내지 약 250 mL, 약 160 mL 내지 약 200 mL, 약 160 mL 내지 약 180 mL, 약 180 mL 내지 약 5 L, 약 180 mL 내지 약 4.5 L, 약 180 mL 내지 약 4 L, 약 180 mL 내지 약 3.5 L, 약 180 mL 내지 약 3 L, 약 180 mL 내지 약 2.5 L, 약 180 mL 내지 약 2 L, 약 180 mL 내지 약 1.5 L, 약 180 mL 내지 약 1.0 L, 약 180 mL 내지 약 950 mL, 약 180 mL 내지 약 900 mL, 약 180 mL 내지 약 850 mL, 약 180 mL 내지 약 800 mL, 약 180 mL 내지 약 750 mL, 약 180 mL 내지 약 700 mL, 약 180 mL 내지 약 650 mL, 약 180 mL 내지 약 600 mL, 약 180 mL 내지 약 550 mL, 약 180 mL 내지 약 500 mL, 약 180 mL 내지 약 450 mL, 약 180 mL 내지 약 400 mL, 약 180 mL 내지 약 350 mL, 약 180 mL 내지 약 300 mL, 약 180 mL 내지 약 250 mL, 약 180 mL 내지 약 200 mL, 약 200 mL 내지 약 5 L, 약 200 mL 내지 약 4.5 L, 약 200 mL 내지 약 4 L, 약 200 mL 내지 약 3.5 L, 약 200 mL 내지 약 3 L, 약 200 mL 내지 약 2.5 L, 약 200 mL 내지 약 2 L, 약 200 mL 내지 약 1.5 L, 약 200 mL 내지 약 1.0 L, 약 200 mL 내지 약 950 mL, 약 200 mL 내지 약 900 mL, 약 200 mL 내지 약 850 mL, 약 200 mL 내지 약 800 mL, 약 200 mL 내지 약 750 mL, 약 200 mL 내지 약 700 mL, 약 200 mL 내지 약 650 mL, 약 200 mL 내지 약 600 mL, 약 200 mL 내지 약 550 mL, 약 200 mL 내지 약 500 mL, 약 200 mL 내지 약 450 mL, 약 200 mL 내지 약 400 mL, 약 200 mL 내지 약 350 mL, 약 200 mL 내지 약 300 mL, 약 200 mL 내지 약 250 mL, 약 250 mL 내지 약 5 L, 약 250 mL 내지 약 4.5 L, 약 250 mL 내지 약 4 L, 약 250 mL 내지 약 3.5 L, 약 250 mL 내지 약 3 L, 약 250 mL 내지 약 2.5 L, 약 250 mL 내지 약 2 L, 약 250 mL 내지 약 1.5 L, 약 250 mL 내지 약 1.0 L, 약 250 mL 내지 약 950 mL, 약 250 mL 내지 약 900 mL, 약 250 mL 내지 약 850 mL, 약 250 mL 내지 약 800 mL, 약 250 mL 내지 약 750 mL, 약 250 mL 내지 약 700 mL, 약 250 mL 내지 약 650 mL, 약 250 mL 내지 약 600 mL, 약 250 mL 내지 약 550 mL, 약 250 mL 내지 약 500 mL, 약 250 mL 내지 약 450 mL, 약 250 mL 내지 약 400 mL, 약 250 mL 내지 약 350 mL, 약 250 mL 내지 약 300 mL, 약 300 mL 내지 약 5 L, 약 300 mL 내지 약 4.5 L, 약 300 mL 내지 약 4 L, 약 300 mL 내지 약 3.5 L, 약 300 mL 내지 약 3 L, 약 300 mL 내지 약 2.5 L, 약 300 mL 내지 약 2 L, 약 300 mL 내지 약 1.5 L, 약 300 mL 내지 약 1.0 L, 약 300 mL 내지 약 950 mL, 약 300 mL 내지 약 900 mL, 약 300 mL 내지 약 850 mL, 약 300 mL 내지 약 800 mL, 약 300 mL 내지 약 750 mL, 약 300 mL 내지 약 700 mL, 약 300 mL 내지 약 650 mL, 약 300 mL 내지 약 600 mL, 약 300 mL 내지 약 550 mL, 약 300 mL 내지 약 500 mL, 약 300 mL 내지 약 450 mL, 약 300 mL 내지 약 400 mL, 약 300 mL 내지 약 350 mL, 약 350 mL 내지 약 3 L, 약 350 mL 내지 약 2.5 L, 약 350 mL 내지 약 2 L, 약 350 mL 내지 약 1.5 L, 약 350 mL 내지 약 1.0 L, 약 350 mL 내지 약 950 mL, 약 350 mL 내지 약 900 mL, 약 350 mL 내지 약 850 mL, 약 350 mL 내지 약 800 mL, 약 350 mL 내지 약 750 mL, 약 350 mL 내지 약 700 mL, 약 350 mL 내지 약 650 mL, 약 350 mL 내지 약 600 mL, 약 350 mL 내지 약 550 mL, 약 350 mL 내지 약 500 mL, 약 350 mL 내지 약 450 mL, 약 350 mL 내지 약 400 mL, 약 400 mL 내지 약 5 L, 약 400 mL 내지 약 4.5 L, 약 400 mL 내지 약 4 L, 약 400 mL 내지 약 3.5 L, 약 400 mL 내지 약 3 L, 약 400 mL 내지 약 2.5 L, 약 400 mL 내지 약 2 L, 약 400 mL 내지 약 1.5 L, 약 400 mL 내지 약 1.0 L, 약 400 mL 내지 약 950 mL, 약 400 mL 내지 약 900 mL, 약 400 mL 내지 약 850 mL, 약 400 mL 내지 약 800 mL, 약 400 mL 내지 약 750 mL, 약 400 mL 내지 약 700 mL, 약 400 mL 내지 약 650 mL, 약 400 mL 내지 약 600 mL, 약 400 mL 내지 약 550 mL, 약 400 mL 내지 약 500 mL, 약 400 mL 내지 약 450 mL, 약 450 mL 내지 약 3 L, 약 450 mL 내지 약 2.5 L, 약 450 mL 내지 약 2 L, 약 450 mL 내지 약 1.5 L, 약 450 mL 내지 약 1.0 L, 약 450 mL 내지 약 950 mL, 약 450 mL 내지 약 900 mL, 약 450 mL 내지 약 850 mL, 약 450 mL 내지 약 800 mL, 약 450 mL 내지 약 750 mL, 약 450 mL 내지 약 700 mL, 약 450 mL 내지 약 650 mL, 약 450 mL 내지 약 600 mL, 약 450 mL 내지 약 550 mL, 약 450 mL 내지 약 500 mL, 약 500 mL 내지 약 5 L, 약 500 mL 내지 약 4.5 L, 약 500 mL 내지 약 4 L, 약 500 mL 내지 약 3.5 L, 약 500 mL 내지 약 3 L, 약 500 mL 내지 약 2.5 L, 약 500 mL 내지 약 2 L, 약 500 mL 내지 약 1.5 L, 약 500 mL 내지 약 1.0 L, 약 500 mL 내지 약 950 mL, 약 500 mL 내지 약 900 mL, 약 500 mL 내지 약 850 mL, 약 500 mL 내지 약 800 mL, 약 500 mL 내지 약 750 mL, 약 500 mL 내지 약 700 mL, 약 500 mL 내지 약 650 mL, 약 500 mL 내지 약 600 mL, 약 500 mL 내지 약 550 mL, 약 550 mL 내지 약 5 L, 약 550 mL 내지 약 4.5 L, 약 550 mL 내지 약 4 L, 약 550 mL 내지 약 3.5 L, 약 550 mL 내지 약 3 L, 약 550 mL 내지 약 2.5 L, 약 550 mL 내지 약 2 L, 약 550 mL 내지 약 1.5 L, 약 550 mL 내지 약 1.0 L, 약 550 mL 내지 약 950 mL, 약 550 mL 내지 약 900 mL, 약 550 mL 내지 약 850 mL, 약 550 mL 내지 약 800 mL, 약 550 mL 내지 약 750 mL, 약 550 mL 내지 약 700 mL, 약 550 mL 내지 약 650 mL, 약 550 mL 내지 약 600 mL, 약 600 mL 내지 약 5 L, 약 600 mL 내지 약 4.5 L, 약 600 mL 내지 약 4 L, 약 600 mL 내지 약 3.5 L, 약 600 mL 내지 약 3 L, 약 600 mL 내지 약 2.5 L, 약 600 mL 내지 약 2 L, 약 600 mL 내지 약 1.5 L, 약 600 mL 내지 약 1.0 L, 약 600 mL 내지 약 950 mL, 약 600 mL 내지 약 900 mL, 약 600 mL 내지 약 850 mL, 약 600 mL 내지 약 800 mL, 약 600 mL 내지 약 750 mL, 약 600 mL 내지 약 700 mL, 약 600 mL 내지 약 650 mL, 약 650 mL 내지 약 5 L, 약 650 mL 내지 약 4.5 L, 약 650 mL 내지 약 4 L, 약 650 mL 내지 약 3.5 L, 약 650 mL 내지 약 3 L, 약 650 mL 내지 약 2.5 L, 약 650 mL 내지 약 2 L, 약 650 mL 내지 약 1.5 L, 약 650 mL 내지 약 1.0 L, 약 650 mL 내지 약 950 mL, 약 650 mL 내지 약 900 mL, 약 650 mL 내지 약 850 mL, 약 650 mL 내지 약 800 mL, 약 650 mL 내지 약 750 mL, 약 650 mL 내지 약 700 mL, 약 700 mL 내지 약 5 L, 약 700 mL 내지 약 4.5 L, 약 700 mL 내지 약 4 L, 약 700 mL 내지 약 3.5 L, 약 700 mL 내지 약 3 L, 약 700 mL 내지 약 2.5 L, 약 700 mL 내지 약 2 L, 약 700 mL 내지 약 1.5 L, 약 700 mL 내지 약 1.0 L, 약 700 mL 내지 약 950 mL, 약 700 mL 내지 약 900 mL, 약 700 mL 내지 약 850 mL, 약 700 mL 내지 약 800 mL, 약 700 mL 내지 약 750 mL, 약 750 mL 내지 약 5 L, 약 750 mL 내지 약 4.5 L, 약 750 mL 내지 약 4 L, 약 750 mL 내지 약 3.5 L, 약 750 mL 내지 약 3 L, 약 750 mL 내지 약 2.5 L, 약 750 mL 내지 약 2 L, 약 750 mL 내지 약 1.5 L, 약 750 mL 내지 약 1.0 L, 약 750 mL 내지 약 950 mL, 약 750 mL 내지 약 900 mL, 약 750 mL 내지 약 850 mL, 약 750 mL 내지 약 800 mL, 약 800 mL 내지 약 5 L, 약 800 mL 내지 약 4.5 L, 약 800 mL 내지 약 4 L, 약 800 mL 내지 약 3.5 L, 약 800 mL 내지 약 3 L, 약 800 mL 내지 약 2.5 L, 약 800 mL 내지 약 2 L, 약 800 mL 내지 약 1.5 L, 약 800 mL 내지 약 1.0 L, 약 800 mL 내지 약 950 mL, 약 800 mL 내지 약 900 mL, 약 800 mL 내지 약 850 mL, 약 850 mL 내지 약 5 L, 약 850 mL 내지 약 4.5 L, 약 850 mL 내지 약 4 L, 약 850 mL 내지 약 3.5 L, 약 850 mL 내지 약 3 L, 약 850 mL 내지 약 2.5 L, 약 850 mL 내지 약 2 L, 약 850 mL 내지 약 1.5 L, 약 850 mL 내지 약 1.0 L, 약 850 mL 내지 약 950 mL, 약 850 mL 내지 약 900 mL, 약 900 mL 내지 약 5 L, 약 900 mL 내지 약 4.5 L, 약 900 mL 내지 약 4 L, 약 900 mL 내지 약 3.5 L, 약 900 mL 내지 약 3 L, 약 900 mL 내지 약 2.5 L, 약 900 mL 내지 약 2 L, 약 900 mL 내지 약 1.5 L, 약 900 mL 내지 약 1.0 L, 약 900 mL 내지 약 950 mL, 약 950 mL 내지 약 5 L, 약 950 mL 내지 약 4.5 L, 약 950 mL 내지 약 4 L, 약 950 mL 내지 약 3.5 L, 약 950 mL 내지 약 3 L, 약 950 mL 내지 약 2.5 L, 약 950 mL 내지 약 2 L, 약 950 mL 내지 약 1.5 L, 약 950 mL 내지 약 1.0 L, 약 1.0 L 내지 약 5 L, 약 1.0 L 내지 약 4.5 L, 약 1.0 L 내지 약 4 L, 약 1.0 L 내지 약 3.5 L, 약 1.0 L 내지 약 3 L, 1.0 L 내지 약 2.5 L, 1.0 L 내지 약 2 L, 1.0 L 내지 약 1.5 L, 약 1.5 L 내지 약 5 L, 약 1.5 L 내지 약 4.5 L, 약 1.5 L 내지 약 4 L, 약 1.5 L 내지 약 3.5 L, 약 1.5 L 내지 약 3 L, 약 1.5 L 내지 약 2.5 L, 약 1.5 L 내지 약 2 L, 약 2 L 내지 약 5 L, 약 2 L 내지 약 4.5 L, 약 2 L 내지 약 4 L, 약 2 L 내지 약 3.5 L, 약 2 L 내지 약 3 L, 약 2 L 내지 약 2.5 L, 약 2.5 L 내지 약 5 L, 약 2.5 L 내지 약 4.5 L, 약 2.5 L 내지 약 4 L, 약 2.5 L 내지 약 3.5 L, 약 2.5 L 내지 약 3 L, 약 3 L 내지 약 5 L, 약 3 L 내지 약 4.5 L, 약 3 L 내지 약 4 L, 약 3 L 내지 약 3.5 L, 약 3.5 L 내지 약 5 L, 약 3.5 L 내지 약 4.5 L, 약 3.5 L 내지 약 4 L, 약 4 L 내지 약 5 L, 약 4 L 내지 약 4.5 L, 또는 약 4.5 L 내지 약 5 L의 부피를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 진탕 플라스크를 약 0.1 x g 내지 약 50 x g(예를 들어 약 0.1 x g 내지 약 40 x g, 약 0.1 x g 내지 약 30 x g, 약 0.1 x g 내지 약 20 x g, 약 0.1 x g 내지 약 15 x g, 약 0.1 x g 내지 약 10 x g, 약 0.1 x g 내지 약 9.5 x g, 약 0.1 x g 내지 약 9.0 x g, 약 0.1 x g 내지 약 8.5 x g, 약 0.1 x g 내지 약 8.0 x g, 약 0.1 x g 내지 약 7.5 x g, 약 0.1 x g 내지 약 7.0 x g, 약 0.1 x g 내지 약 6.5 x g, 약 0.1 x g 내지 약 6.0 x g, 약 0.1 x g 내지 약 5.5 x g, 약 0.1 x g 내지 약 5.0 x g, 약 0.1 x g 내지 약 4.5 x g, 약 0.1 x g 내지 약 4.1 x g, 약 0.1 x g 내지 약 4.0 x g, 약 0.1 x g 내지 약 3.5 x g, 약 0.1 x g 내지 약 3.0 x g, 약 0.1 x g 내지 약 2.5 x g, 약 0.1 x g 내지 약 2.0 x g, 약 0.1 x g 내지 약 1.78 x g, 약 0.1 x g 내지 약 1.6 x g, 약 0.1 x g 내지 약 1.4 x g, 약 0.1 x g 내지 약 1.2 x g, 약 0.1 x g 내지 약 1.0 x g, 약 0.1 x g 내지 약 0.8 x g, 약 0.1 x g 내지 약 0.6 x g, 약 0.1 x g 내지 약 0.4 x g, 약 0.1 x g 내지 약 0.23 x g, 약 0.23 x g 내지 약 50 x g, 약 0.23 x g 내지 약 40 x g, 약 0.23 x g 내지 약 30 x g, 약 0.23 x g 내지 약 20 x g, 약 0.23 x g 내지 약 15 x g, 약 0.23 x g 내지 약 10 x g, 약 0.23 x g 내지 약 9.5 x g, 약 0.23 x g 내지 약 9.0 x g, 약 0.23 x g 내지 약 8.5 x g, 약 0.23 x g 내지 약 8.0 x g, 약 0.23 x g 내지 약 7.5 x g, 약 0.23 x g 내지 약 7.0 x g, 약 0.23 x g 내지 약 6.5 x g, 약 0.23 x g 내지 약 6.0 x g, 약 0.23 x g 내지 약 5.5 x g, 약 0.23 x g 내지 약 5.0 x g, 약 0.23 x g 내지 약 4.5 x g, 약 0.23 x g 내지 약 4.1 x g, 약 0.23 x g 내지 약 4.0 x g, 약 0.23 x g 내지 약 3.5 x g, 약 0.23 x g 내지 약 3.0 x g, 약 0.23 x g 내지 약 2.5 x g, 약 0.23 x g 내지 약 2.0 x g, 약 0.23 x g 내지 약 1.78 x g, 약 0.23 x g 내지 약 1.6 x g, 약 0.23 x g 내지 약 1.4 x g, 약 0.23 x g 내지 약 1.2 x g, 약 0.23 x g 내지 약 1.0 x g, 약 0.23 x g 내지 약 0.8 x g, 약 0.23 x g 내지 약 0.6 x g, 약 0.23 x g 내지 약 0.4 x g, 약 0.4 x g 내지 약 50 x g, 약 0.4 x g 내지 약 40 x g, 약 0.4 x g 내지 약 30 x g, 약 0.4 x g 내지 약 20 x g, 약 0.4 x g 내지 약 15 x g, 약 0.4 x g 내지 약 10 x g, 약 0.4 x g 내지 약 9.5 x g, 약 0.4 x g 내지 약 9.0 x g, 약 0.4 x g 내지 약 8.5 x g, 약 0.4 x g 내지 약 8.0 x g, 약 0.4 x g 내지 약 7.5 x g, 약 0.4 x g 내지 약 7.0 x g, 약 0.4 x g 내지 약 6.5 x g, 약 0.4 x g 내지 약 6.0 x g, 약 0.4 x g 내지 약 5.5 x g, 약 0.4 x g 내지 약 5.0 x g, 약 0.4 x g 내지 약 4.5 x g, 약 0.4 x g 내지 약 4.1 x g, 약 0.4 x g 내지 약 4.0 x g, 약 0.4 x g 내지 약 3.5 x g, 약 0.4 x g 내지 약 3.0 x g, 약 0.4 x g 내지 약 2.5 x g, 약 0.4 x g 내지 약 2.0 x g, 약 0.4 x g 내지 약 1.78 x g, 약 0.4 x g 내지 약 1.6 x g, 약 0.4 x g 내지 약 1.4 x g, 약 0.4 x g 내지 약 1.2 x g, 약 0.4 x g 내지 약 1.0 x g, 약 0.4 x g 내지 약 0.8 x g, 약 0.4 x g 내지 약 0.6 x g, 약 0.6 x g 내지 약 50 x g, 약 0.6 x g 내지 약 40 x g, 약 0.6 x g 내지 약 30 x g, 약 0.6 x g 내지 약 20 x g, 약 0.6 x g 내지 약 15 x g, 약 0.6 x g 내지 약 10 x g, 약 0.6 x g 내지 약 9.5 x g, 약 0.6 x g 내지 약 9.0 x g, 약 0.6 x g 내지 약 8.5 x g, 약 0.6 x g 내지 약 8.0 x g, 약 0.6 x g 내지 약 7.5 x g, 약 0.6 x g 내지 약 7.0 x g, 약 0.6 x g 내지 약 6.5 x g, 약 0.6 x g 내지 약 6.0 x g, 약 0.6 x g 내지 약 5.5 x g, 약 0.6 x g 내지 약 5.0 x g, 약 0.6 x g 내지 약 4.5 x g, 약 0.6 x g 내지 약 4.1 x g, 약 0.6 x g 내지 약 4.0 x g, 약 0.6 x g 내지 약 3.5 x g, 약 0.6 x g 내지 약 3.0 x g, 약 0.6 x g 내지 약 2.5 x g, 약 0.6 x g 내지 약 2.0 x g, 약 0.6 x g 내지 약 1.78 x g, 약 0.6 x g 내지 약 1.6 x g, 약 0.6 x g 내지 약 1.4 x g, 약 0.6 x g 내지 약 1.2 x g, 약 0.6 x g 내지 약 1.0 x g, 약 0.6 x g 내지 약 0.8 x g, 약 0.8 x g 내지 약 50 x g, 약 0.8 x g 내지 약 40 x g, 약 0.8 x g 내지 약 30 x g, 약 0.8 x g 내지 약 20 x g, 약 0.8 x g 내지 약 15 x g, 약 0.8 x g 내지 약 10 x g, 약 0.8 x g 내지 약 9.5 x g, 약 0.8 x g 내지 약 9.0 x g, 약 0.8 x g 내지 약 8.5 x g, 약 0.8 x g 내지 약 8.0 x g, 약 0.8 x g 내지 약 7.5 x g, 약 0.8 x g 내지 약 7.0 x g, 약 0.8 x g 내지 약 6.5 x g, 약 0.8 x g 내지 약 6.0 x g, 약 0.8 x g 내지 약 5.5 x g, 약 0.8 x g 내지 약 5.0 x g, 약 0.8 x g 내지 약 4.5 x g, 약 0.8 x g 내지 약 4.1 x g, 약 0.8 x g 내지 약 4.0 x g, 약 0.8 x g 내지 약 3.5 x g, 약 0.8 x g 내지 약 3.0 x g, 약 0.8 x g 내지 약 2.5 x g, 약 0.8 x g 내지 약 2.0 x g, 약 0.8 x g 내지 약 1.78 x g, 약 0.8 x g 내지 약 1.6 x g, 약 0.8 x g 내지 약 1.4 x g, 약 0.8 x g 내지 약 1.2 x g, 약 0.8 x g 내지 약 1.0 x g, 약 1.0 x g 내지 약 50 x g, 약 1.0 x g 내지 약 40 x g, 약 1.0 x g 내지 약 30 x g, 약 1.0 x g 내지 약 20 x g, 약 1.0 x g 내지 약 15 x g, 약 1.0 x g 내지 약 10 x g, 약 1.0 x g 내지 약 9.5 x g, 약 1.0 x g 내지 약 9.0 x g, 약 1.0 x g 내지 약 8.5 x g, 약 1.0 x g 내지 약 8.0 x g, 약 1.0 x g 내지 약 7.5 x g, 약 1.0 x g 내지 약 7.0 x g, 약 1.0 x g 내지 약 6.5 x g, 약 1.0 x g 내지 약 6.0 x g, 약 1.0 x g 내지 약 5.5 x g, 약 1.0 x g 내지 약 5.0 x g, 약 1.0 x g 내지 약 4.5 x g, 약 1.0 x g 내지 약 4.1 x g, 약 1.0 x g 내지 약 4.0 x g, 약 1.0 x g 내지 약 3.5 x g, 약 1.0 x g 내지 약 3.0 x g, 약 1.0 x g 내지 약 2.5 x g, 약 1.0 x g 내지 약 2.0 x g, 약 1.0 x g 내지 약 1.78 x g, 약 1.0 x g 내지 약 1.6 x g, 약 1.0 x g 내지 약 1.4 x g, 약 1.0 x g 내지 약 1.2 x g, 약 1.2 x g 내지 약 50 x g, 약 1.2 x g 내지 약 40 x g, 약 1.2 x g 내지 약 30 x g, 약 1.2 x g 내지 약 20 x g, 약 1.2 x g 내지 약 15 x g, 약 1.2 x g 내지 약 10 x g, 약 1.2 x g 내지 약 9.5 x g, 약 1.2 x g 내지 약 9.0 x g, 약 1.2 x g 내지 약 8.5 x g, 약 1.2 x g 내지 약 8.0 x g, 약 1.2 x g 내지 약 7.5 x g, 약 1.2 x g 내지 약 7.0 x g, 약 1.2 x g 내지 약 6.5 x g, 약 1.2 x g 내지 약 6.0 x g, 약 1.2 x g 내지 약 5.5 x g, 약 1.2 x g 내지 약 5.0 x g, 약 1.2 x g 내지 약 4.5 x g, 약 1.2 x g 내지 약 4.1 x g, 약 1.2 x g 내지 약 4.0 x g, 약 1.2 x g 내지 약 3.5 x g, 약 1.2 x g 내지 약 3.0 x g, 약 1.2 x g 내지 약 2.5 x g, 약 1.2 x g 내지 약 2.0 x g, 약 1.2 x g 내지 약 1.78 x g, 약 1.2 x g 내지 약 1.6 x g, 약 1.2 x g 내지 약 1.4 x g, 약 1.4 x g 내지 약 50 x g, 약 1.4 x g 내지 약 40 x g, 약 1.4 x g 내지 약 30 x g, 약 1.4 x g 내지 약 20 x g, 약 1.4 x g 내지 약 15 x g, 약 1.4 x g 내지 약 10 x g, 약 1.4 x g 내지 약 9.5 x g, 약 1.4 x g 내지 약 9.0 x g, 약 1.4 x g 내지 약 8.5 x g, 약 1.4 x g 내지 약 8.0 x g, 약 1.4 x g 내지 약 7.5 x g, 약 1.4 x g 내지 약 7.0 x g, 약 1.4 x g 내지 약 6.5 x g, 약 1.4 x g 내지 약 6.0 x g, 약 1.4 x g 내지 약 5.5 x g, 약 1.4 x g 내지 약 5.0 x g, 약 1.4 x g 내지 약 4.5 x g, 약 1.4 x g 내지 약 4.1 x g, 약 1.4 x g 내지 약 4.0 x g, 약 1.4 x g 내지 약 3.5 x g, 약 1.4 x g 내지 약 3.0 x g, 약 1.4 x g 내지 약 2.5 x g, 약 1.4 x g 내지 약 2.0 x g, 약 1.4 x g 내지 약 1.78 x g, 약 1.4 x g 내지 약 1.6 x g, 약 1.6 x g 내지 약 50 x g, 약 1.6 x g 내지 약 40 x g, 약 1.6 x g 내지 약 30 x g, 약 1.6 x g 내지 약 20 x g, 약 1.6 x g 내지 약 15 x g, 약 1.6 x g 내지 약 10 x g, 약 1.6 x g 내지 약 9.5 x g, 약 1.6 x g 내지 약 9.0 x g, 약 1.6 x g 내지 약 8.5 x g, 약 1.6 x g 내지 약 8.0 x g, 약 1.6 x g 내지 약 7.5 x g, 약 1.6 x g 내지 약 7.0 x g, 약 1.6 x g 내지 약 6.5 x g, 약 1.6 x g 내지 약 6.0 x g, 약 1.6 x g 내지 약 5.5 x g, 약 1.6 x g 내지 약 5.0 x g, 약 1.6 x g 내지 약 4.5 x g, 약 1.6 x g 내지 약 4.1 x g, 약 1.6 x g 내지 약 4.0 x g, 약 1.6 x g 내지 약 3.5 x g, 약 1.6 x g 내지 약 3.0 x g, 약 1.6 x g 내지 약 2.5 x g, 약 1.6 x g 내지 약 2.0 x g, 약 1.6 x g 내지 약 1.78 x g, 약 1.78 x g 내지 약 50 x g, 약 1.78 x g 내지 약 40 x g, 약 1.78 x g 내지 약 30 x g, 약 1.78 x g 내지 약 20 x g, 약 1.78 x g 내지 약 15 x g, 약 1.78 x g 내지 약 10 x g, 약 1.78 x g 내지 약 9.5 x g, 약 1.78 x g 내지 약 9.0 x g, 약 1.78 x g 내지 약 8.5 x g, 약 1.78 x g 내지 약 8.0 x g, 약 1.78 x g 내지 약 7.5 x g, 약 1.78 x g 내지 약 7.0 x g, 약 1.78 x g 내지 약 6.5 x g, 약 1.78 x g 내지 약 6.0 x g, 약 1.78 x g 내지 약 5.5 x g, 약 1.78 x g 내지 약 5.0 x g, 약 1.78 x g 내지 약 4.5 x g, 약 1.78 x g 내지 약 4.1 x g, 약 1.78 x g 내지 약 4.0 x g, 약 1.78 x g 내지 약 3.5 x g, 약 1.78 x g 내지 약 3.0 x g, 약 1.78 x g 내지 약 2.5 x g, 약 1.78 x g 내지 약 2.0 x g, 약 2.0 x g 내지 약 50 x g, 약 2.0 x g 내지 약 40 x g, 약 2.0 x g 내지 약 30 x g, 약 2.0 x g 내지 약 20 x g, 약 2.0 x g 내지 약 15 x g, 약 2.0 x g 내지 약 10 x g, 약 2.0 x g 내지 약 9.5 x g, 약 2.0 x g 내지 약 9.0 x g, 약 2.0 x g 내지 약 8.5 x g, 약 2.0 x g 내지 약 8.0 x g, 약 2.0 x g 내지 약 7.5 x g, 약 2.0 x g 내지 약 7.0 x g, 약 2.0 x g 내지 약 6.5 x g, 약 2.0 x g 내지 약 6.0 x g, 약 2.0 x g 내지 약 5.5 x g, 약 2.0 x g 내지 약 5.0 x g, 약 2.0 x g 내지 약 4.5 x g, 약 2.0 x g 내지 약 4.1 x g, 약 2.0 x g 내지 약 4.0 x g, 약 2.0 x g 내지 약 3.5 x g, 약 2.0 x g 내지 약 3.0 x g, 약 2.0 x g 내지 약 2.5 x g, 약 2.5 x g 내지 약 50 x g, 약 2.5 x g 내지 약 40 x g, 약 2.5 x g 내지 약 30 x g, 약 2.5 x g 내지 약 20 x g, 약 2.5 x g 내지 약 15 x g, 약 2.5 x g 내지 약 10 x g, 약 2.5 x g 내지 약 9.5 x g, 약 2.5 x g 내지 약 9.0 x g, 약 2.5 x g 내지 약 8.5 x g, 약 2.5 x g 내지 약 8.0 x g, 약 2.5 x g 내지 약 7.5 x g, 약 2.5 x g 내지 약 7.0 x g, 약 2.5 x g 내지 약 6.5 x g, 약 2.5 x g 내지 약 6.0 x g, 약 2.5 x g 내지 약 5.5 x g, 약 2.5 x g 내지 약 5.0 x g, 약 2.5 x g 내지 약 4.5 x g, 약 2.5 x g 내지 약 4.1 x g, 약 2.5 x g 내지 약 4.0 x g, 약 2.5 x g 내지 약 3.5 x g, 약 2.5 x g 내지 약 3.0 x g, 약 3.0 x g 내지 약 50 x g, 약 3.0 x g 내지 약 40 x g, 약 3.0 x g 내지 약 30 x g, 약 3.0 x g 내지 약 20 x g, 약 3.0 x g 내지 약 15 x g, 약 3.0 x g 내지 약 10 x g, 약 3.0 x g 내지 약 9.5 x g, 약 3.0 x g 내지 약 9.0 x g, 약 3.0 x g 내지 약 8.5 x g, 약 3.0 x g 내지 약 8.0 x g, 약 3.0 x g 내지 약 7.5 x g, 약 3.0 x g 내지 약 7.0 x g, 약 3.0 x g 내지 약 6.5 x g, 약 3.0 x g 내지 약 6.0 x g, 약 3.0 x g 내지 약 5.5 x g, 약 3.0 x g 내지 약 5.0 x g, 약 3.0 x g 내지 약 4.5 x g, 약 3.0 x g 내지 약 4.1 x g, 약 3.0 x g 내지 약 4.0 x g, 약 3.0 x g 내지 약 3.5 x g, 약 3.5 x g 내지 약 50 x g, 약 3.5 x g 내지 약 40 x g, 약 3.5 x g 내지 약 30 x g, 약 3.5 x g 내지 약 20 x g, 약 3.5 x g 내지 약 15 x g, 약 3.5 x g 내지 약 10 x g, 약 3.5 x g 내지 약 9.5 x g, 약 3.5 x g 내지 약 9.0 x g, 약 3.5 x g 내지 약 8.5 x g, 약 3.5 x g 내지 약 8.0 x g, 약 3.5 x g 내지 약 7.5 x g, 약 3.5 x g 내지 약 7.0 x g, 약 3.5 x g 내지 약 6.5 x g, 약 3.5 x g 내지 약 6.0 x g, 약 3.5 x g 내지 약 5.5 x g, 약 3.5 x g 내지 약 5.0 x g, 약 3.5 x g 내지 약 4.5 x g, 약 3.5 x g 내지 약 4.1 x g, 약 3.5 x g 내지 약 4.0 x g, 약 4.0 x g 내지 약 50 x g, 약 4.0 x g 내지 약 40 x g, 약 4.0 x g 내지 약 30 x g, 약 4.0 x g 내지 약 20 x g, 약 4.0 x g 내지 약 15 x g, 약 4.0 x g 내지 약 10 x g, 약 4.0 x g 내지 약 9.5 x g, 약 4.0 x g 내지 약 9.0 x g, 약 4.0 x g 내지 약 8.5 x g, 약 4.0 x g 내지 약 8.0 x g, 약 4.0 x g 내지 약 7.5 x g, 약 4.0 x g 내지 약 7.0 x g, 약 4.0 x g 내지 약 6.5 x g, 약 4.0 x g 내지 약 6.0 x g, 약 4.0 x g 내지 약 5.5 x g, 약 4.0 x g 내지 약 5.0 x g, 약 4.0 x g 내지 약 4.5 x g, 약 4.0 x g 내지 약 4.1 x g, 약 4.1 x g 내지 약 50 x g, 약 4.1 x g 내지 약 40 x g, 약 4.1 x g 내지 약 30 x g, 약 4.1 x g 내지 약 20 x g, 약 4.1 x g 내지 약 15 x g, 약 4.1 x g 내지 약 10 x g, 약 4.1 x g 내지 약 9.5 x g, 약 4.1 x g 내지 약 9.0 x g, 약 4.1 x g 내지 약 8.5 x g, 약 4.1 x g 내지 약 8.0 x g, 약 4.1 x g 내지 약 7.5 x g, 약 4.1 x g 내지 약 7.0 x g, 약 4.1 x g 내지 약 6.5 x g, 약 4.1 x g 내지 약 6.0 x g, 약 4.1 x g 내지 약 5.5 x g, 약 4.1 x g 내지 약 5.0 x g, 약 4.1 x g 내지 약 4.5 x g, 약 4.5 x g 내지 약 50 x g, 약 4.5 x g 내지 약 40 x g, 약 4.5 x g 내지 약 30 x g, 약 4.5 x g 내지 약 20 x g, 약 4.5 x g 내지 약 15 x g, 약 4.5 x g 내지 약 10 x g, 약 4.5 x g 내지 약 9.5 x g, 약 4.5 x g 내지 약 9.0 x g, 약 4.5 x g 내지 약 8.5 x g, 약 4.5 x g 내지 약 8.0 x g, 약 4.5 x g 내지 약 7.5 x g, 약 4.5 x g 내지 약 7.0 x g, 약 4.5 x g 내지 약 6.5 x g, 약 4.5 x g 내지 약 6.0 x g, 약 4.5 x g 내지 약 5.5 x g, 약 4.5 x g 내지 약 5.0 x g, 약 5.0 x g 내지 약 50 x g, 약 5.0 x g 내지 약 40 x g, 약 5.0 x g 내지 약 30 x g, 약 5.0 x g 내지 약 20 x g, 약 5.0 x g 내지 약 15 x g, 약 5.0 x g 내지 약 10 x g, 약 5.0 x g 내지 약 9.5 x g, 약 5.0 x g 내지 약 9.0 x g, 약 5.0 x g 내지 약 8.5 x g, 약 5.0 x g 내지 약 8.0 x g, 약 5.0 x g 내지 약 7.5 x g, 약 5.0 x g 내지 약 7.0 x g, 약 5.0 x g 내지 약 6.5 x g, 약 5.0 x g 내지 약 6.0 x g, 약 5.0 x g 내지 약 5.5 x g, 약 5.5 x g 내지 약 50 x g, 약 5.5 x g 내지 약 40 x g, 약 5.5 x g 내지 약 30 x g, 약 5.5 x g 내지 약 20 x g, 약 5.5 x g 내지 약 15 x g, 약 5.5 x g 내지 약 10 x g, 약 5.5 x g 내지 약 9.5 x g, 약 5.5 x g 내지 약 9.0 x g, 약 5.5 x g 내지 약 8.5 x g, 약 5.5 x g 내지 약 8.0 x g, 약 5.5 x g 내지 약 7.5 x g, 약 5.5 x g 내지 약 7.0 x g, 약 5.5 x g 내지 약 6.5 x g, 약 5.5 x g 내지 약 6.0 x g, 약 6.0 x g 내지 약 50 x g, 약 6.0 x g 내지 약 40 x g, 약 6.0 x g 내지 약 30 x g, 약 6.0 x g 내지 약 20 x g, 약 6.0 x g 내지 약 15 x g, 약 6.0 x g 내지 약 10 x g, 약 6.0 x g 내지 약 9.5 x g, 약 6.0 x g 내지 약 9.0 x g, 약 6.0 x g 내지 약 8.5 x g, 약 6.0 x g 내지 약 8.0 x g, 약 6.0 x g 내지 약 7.5 x g, 약 6.0 x g 내지 약 7.0 x g, 약 6.0 x g 내지 약 6.5 x g, 약 6.5 x g 내지 약 50 x g, 약 6.5 x g 내지 약 40 x g, 약 6.5 x g 내지 약 30 x g, 약 6.5 x g 내지 약 20 x g, 약 6.5 x g 내지 약 15 x g, 약 6.5 x g 내지 약 10 x g, 약 6.5 x g 내지 약 9.5 x g, 약 6.5 x g 내지 약 9.0 x g, 약 6.5 x g 내지 약 8.5 x g, 약 6.5 x g 내지 약 8.0 x g, 약 6.5 x g 내지 약 7.5 x g, 약 6.5 x g 내지 약 7.0 x g, 약 7.0 x g 내지 약 50 x g, 약 7.0 x g 내지 약 40 x g, 약 7.0 x g 내지 약 30 x g, 약 7.0 x g 내지 약 20 x g, 약 7.0 x g 내지 약 15 x g, 약 7.0 x g 내지 약 10 x g, 약 7.0 x g 내지 약 9.5 x g, 약 7.0 x g 내지 약 9.0 x g, 약 7.0 x g 내지 약 8.5 x g, 약 7.0 x g 내지 약 8.0 x g, 약 7.0 x g 내지 약 7.5 x g, 약 7.5 x g 내지 약 50 x g, 약 7.5 x g 내지 약 40 x g, 약 7.5 x g 내지 약 30 x g, 약 7.5 x g 내지 약 20 x g, 약 7.5 x g 내지 약 15 x g, 약 7.5 x g 내지 약 10 x g, 약 7.5 x g 내지 약 9.5 x g, 약 7.5 x g 내지 약 9.0 x g, 약 7.5 x g 내지 약 8.5 x g, 약 7.5 x g 내지 약 8.0 x g, 약 8.0 x g 내지 약 50 x g, 약 8.0 x g 내지 약 40 x g, 약 8.0 x g 내지 약 30 x g, 약 8.0 x g 내지 약 20 x g, 약 8.0 x g 내지 약 15 x g, 약 8.0 x g 내지 약 10 x g, 약 8.0 x g 내지 약 9.5 x g, 약 8.0 x g 내지 약 9.0 x g, 약 8.0 x g 내지 약 8.5 x g, 약 8.5 x g 내지 약 50 x g, 약 8.5 x g 내지 약 40 x g, 약 8.5 x g 내지 약 30 x g, 약 8.5 x g 내지 약 20 x g, 약 8.5 x g 내지 약 15 x g, 약 8.5 x g 내지 약 10 x g, 약 8.5 x g 내지 약 9.5 x g, 약 8.5 x g 내지 약 9.0 x g, 약 9.0 x g 내지 약 50 x g, 약 9.0 x g 내지 약 40 x g, 약 9.0 x g 내지 약 30 x g, 약 9.0 x g 내지 약 20 x g, 약 9.0 x g 내지 약 15 x g, 약 9.0 x g 내지 약 10 x g, 약 9.0 x g 내지 약 9.5 x g, 약 9.5 x g 내지 약 50 x g, 약 9.5 x g 내지 약 40 x g, 약 9.5 x g 내지 약 30 x g, 약 9.5 x g 내지 약 20 x g, 약 9.5 x g 내지 약 15 x g, 약 9.5 x g 내지 약 10 x g, 약 10 x g 내지 약 50 x g, 약 10 x g 내지 약 40 x g, 약 10 x g 내지 약 30 x g, 약 10 x g 내지 약 20 x g, 약 10 x g 내지 약 15 x g, 약 15 x g 내지 약 50 x g, 약 15 x g 내지 약 40 x g, 약 15 x g 내지 약 30 x g, 약 15 x g 내지 약 20 x g, 약 20 x g 내지 약 50 x g, 약 20 x g 내지 약 40 x g, 약 20 x g 내지 약 30 x g, 약 30 x g 내지 약 50 x g, 약 30 x g 내지 약 40 x g, 또는 약 40 x g 내지 약 50 x g)로 교반하면서 인큐베이션할 수 있다.
다양한 진탕 플라스크가 상업적으로 이용 가능하다. 진탕 플라스크의 추가적인 비제한적인 양태가 당업계에 공지되어 있다.
진탕 튜브
본원에 기술된 방법의 일부 양태는 진탕 튜브의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 진탕 튜브는 약 1 mL 내지 약 500 mL, 약 1 mL 내지 약 450 mL, 약 1 mL 내지 약 400 mL, 약 1 mL 내지 약 350 mL, 약 1 mL 내지 약 300 mL, 약 1 mL 내지 약 250 mL, 약 1 mL 내지 약 200 mL, 약 1 mL 내지 약 180 mL, 약 1 mL 내지 약 160 mL, 약 1 mL 내지 약 140 mL, 약 1 mL 내지 약 120 mL, 약 1 mL 내지 약 100 mL, 약 1 mL 내지 약 80 mL, 약 1 mL 내지 약 60 mL, 약 1 mL 내지 약 40 mL, 약 1 mL 내지 약 20 mL, 약 1 mL 내지 약 10 mL, 약 1 mL 내지 약 5 mL, 약 1 mL 내지 약 2 mL, 약 2 mL 내지 약 500 mL, 약 2 mL 내지 약 450 mL, 약 2 mL 내지 약 400 mL, 약 2 mL 내지 약 350 mL, 약 2 mL 내지 약 300 mL, 약 2 mL 내지 약 250 mL, 약 2 mL 내지 약 200 mL, 약 2 mL 내지 약 180 mL, 약 2 mL 내지 약 160 mL, 약 2 mL 내지 약 140 mL, 약 2 mL 내지 약 120 mL, 약 2 mL 내지 약 100 mL, 약 2 mL 내지 약 80 mL, 약 2 mL 내지 약 60 mL, 약 2 mL 내지 약 40 mL, 약 2 mL 내지 약 20 mL, 약 2 mL 내지 약 10 mL, 약 2 mL 내지 약 5 mL, 약 5 mL 내지 약 500 mL, 약 5 mL 내지 약 450 mL, 약 5 mL 내지 약 400 mL, 약 5 mL 내지 약 350 mL, 약 5 mL 내지 약 300 mL, 약 5 mL 내지 약 250 mL, 약 5 mL 내지 약 200 mL, 약 5 mL 내지 약 180 mL, 약 5 mL 내지 약 160 mL, 약 5 mL 내지 약 140 mL, 약 5 mL 내지 약 120 mL, 약 5 mL 내지 약 100 mL, 약 5 mL 내지 약 80 mL, 약 5 mL 내지 약 60 mL, 약 5 mL 내지 약 40 mL, 약 5 mL 내지 약 20 mL, 약 5 mL 내지 약 10 mL, 약 10 mL 내지 약 500 mL, 약 10 mL 내지 약 450 mL, 약 10 mL 내지 약 400 mL, 약 10 mL 내지 약 350 mL, 약 10 mL 내지 약 300 mL, 약 10 mL 내지 약 250 mL, 약 10 mL 내지 약 200 mL, 약 10 mL 내지 약 180 mL, 약 10 mL 내지 약 160 mL, 약 10 mL 내지 약 140 mL, 약 10 mL 내지 약 120 mL, 약 10 mL 내지 약 100 mL, 약 10 mL 내지 약 80 mL, 약 10 mL 내지 약 60 mL, 약 10 mL 내지 약 40 mL, 약 10 mL 내지 약 20 mL, 약 20 mL 내지 약 500 mL, 약 20 mL 내지 약 450 mL, 약 20 mL 내지 약 400 mL, 약 20 mL 내지 약 350 mL, 약 20 mL 내지 약 300 mL, 약 20 mL 내지 약 250 mL, 약 20 mL 내지 약 200 mL, 약 20 mL 내지 약 180 mL, 약 20 mL 내지 약 160 mL, 약 20 mL 내지 약 140 mL, 약 20 mL 내지 약 120 mL, 약 20 mL 내지 약 100 mL, 약 20 mL 내지 약 80 mL, 약 20 mL 내지 약 60 mL, 약 20 mL 내지 약 40 mL, 약 40 mL 내지 약 500 mL, 약 40 mL 내지 약 450 mL, 약 40 mL 내지 약 400 mL, 약 40 mL 내지 약 350 mL, 약 40 mL 내지 약 300 mL, 약 40 mL 내지 약 250 mL, 약 40 mL 내지 약 200 mL, 약 40 mL 내지 약 180 mL, 약 40 mL 내지 약 160 mL, 약 40 mL 내지 약 140 mL, 약 40 mL 내지 약 120 mL, 약 40 mL 내지 약 100 mL, 약 40 mL 내지 약 80 mL, 약 40 mL 내지 약 60 mL, 약 60 mL 내지 약 500 mL, 약 60 mL 내지 약 450 mL, 약 60 mL 내지 약 400 mL, 약 60 mL 내지 약 350 mL, 약 60 mL 내지 약 300 mL, 약 60 mL 내지 약 250 mL, 약 60 mL 내지 약 200 mL, 약 60 mL 내지 약 180 mL, 약 60 mL 내지 약 160 mL, 약 60 mL 내지 약 140 mL, 약 60 mL 내지 약 120 mL, 약 60 mL 내지 약 100 mL, 약 60 mL 내지 약 80 mL, 약 80 mL 내지 약 500 mL, 약 80 mL 내지 약 450 mL, 약 80 mL 내지 약 400 mL, 약 80 mL 내지 약 350 mL, 약 80 mL 내지 약 300 mL, 약 80 mL 내지 약 250 mL, 약 80 mL 내지 약 200 mL, 약 80 mL 내지 약 180 mL, 약 80 mL 내지 약 160 mL, 약 80 mL 내지 약 140 mL, 약 80 mL 내지 약 120 mL, 약 80 mL 내지 약 100 mL, 약 100 mL 내지 약 500 mL, 약 100 mL 내지 약 450 mL, 약 100 mL 내지 약 400 mL, 약 100 mL 내지 약 350 mL, 약 100 mL 내지 약 300 mL, 약 100 mL 내지 약 250 mL, 약 100 mL 내지 약 200 mL, 약 100 mL 내지 약 180 mL, 약 100 mL 내지 약 160 mL, 약 100 mL 내지 약 140 mL, 약 100 mL 내지 약 120 mL, 약 120 mL 내지 약 500 mL, 약 120 mL 내지 약 450 mL, 약 120 mL 내지 약 400 mL, 약 120 mL 내지 약 350 mL, 약 120 mL 내지 약 300 mL, 약 120 mL 내지 약 250 mL, 약 120 mL 내지 약 200 mL, 약 120 mL 내지 약 180 mL, 약 120 mL 내지 약 160 mL, 약 120 mL 내지 약 140 mL, 약 140 mL 내지 약 500 mL, 약 140 mL 내지 약 450 mL, 약 140 mL 내지 약 400 mL, 약 140 mL 내지 약 350 mL, 약 140 mL 내지 약 300 mL, 약 140 mL 내지 약 250 mL, 약 140 mL 내지 약 200 mL, 약 140 mL 내지 약 180 mL, 약 140 mL 내지 약 160 mL, 약 160 mL 내지 약 500 mL, 약 160 mL 내지 약 450 mL, 약 160 mL 내지 약 400 mL, 약 160 mL 내지 약 350 mL, 약 160 mL 내지 약 300 mL, 약 160 mL 내지 약 250 mL, 약 160 mL 내지 약 200 mL, 약 160 mL 내지 약 180 mL, 약 180 mL 내지 약 500 mL, 약 180 mL 내지 약 450 mL, 약 180 mL 내지 약 400 mL, 약 180 mL 내지 약 350 mL, 약 180 mL 내지 약 300 mL, 약 180 mL 내지 약 250 mL, 약 180 mL 내지 약 200 mL, 약 200 mL 내지 약 500 mL, 약 200 mL 내지 약 450 mL, 약 200 mL 내지 약 400 mL, 약 200 mL 내지 약 350 mL, 약 200 mL 내지 약 300 mL, 약 200 mL 내지 약 250 mL, 약 250 mL 내지 약 500 mL, 약 250 mL 내지 약 450 mL, 약 250 mL 내지 약 400 mL, 약 250 mL 내지 약 350 mL, 약 250 mL 내지 약 300 mL, 약 300 mL 내지 약 500 mL, 약 300 mL 내지 약 450 mL, 약 300 mL 내지 약 400 mL, 약 300 mL 내지 약 350 mL, 약 350 mL 내지 약 500 mL, 약 350 mL 내지 약 450 mL, 약 350 mL 내지 약 400 mL, 약 400 mL 내지 약 500 mL, 약 400 mL 내지 약 450 mL, 또는 약 450 mL 내지 약 500 mL의 부피를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 진탕 튜브를 약 0.1 x g 내지 약 50 x g(또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나)로 교반하면서 인큐베이션할 수 있다.
다양한 진탕 튜브가 상업적으로 이용 가능하다. 진탕 튜브의 추가적인 비제한적인 양태가 당업계에 공지되어 있다.
배양 백
본원에 기술된 방법의 일부 양태는 배양 백의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 진탕 백은 약 50 mL 내지 약 500 L, 약 50 mL 내지 약 400 L, 약 50 mL 내지 약 300 L, 약 50 mL 내지 약 200 L, 약 50 mL 내지 약 100 L, 약 50 mL 내지 약 50 L, 50 mL 내지 약 25 L, 약 50 mL 내지 약 20 L, 약 50 mL 내지 약 15 L, 약 50 mL 내지 약 10 L, 약 50 mL 내지 약 8 L, 약 50 mL 내지 약 6 L, 약 50 mL 내지 약 5 L, 약 50 mL 내지 약 4 L, 약 50 mL 내지 약 3 L, 약 50 mL 내지 약 2.5 L, 약 50 mL 내지 약 2.0 L, 약 50 mL 내지 약 1.8 L, 약 50 mL 내지 약 1.6 L, 약 50 mL 내지 약 1.4 L, 약 50 mL 내지 약 1.2 L, 약 50 mL 내지 약 1.0 L, 약 50 mL 내지 약 900 mL, 약 50 mL 내지 약 800 mL, 약 50 mL 내지 약 700 mL, 약 50 mL 내지 약 600 mL, 약 50 mL 내지 약 500 mL, 약 50 mL 내지 약 450 mL, 약 50 mL 내지 약 400 mL, 약 50 mL 내지 약 350 mL, 약 50 mL 내지 약 300 mL, 약 50 mL 내지 약 250 mL, 약 50 mL 내지 약 200 mL, 약 50 mL 내지 약 150 mL, 약 50 mL 내지 약 100 mL, 약 50 mL 내지 약 75 mL, 약 75 mL 내지 약 500 L, 약 75 mL 내지 약 400 L, 약 75 mL 내지 약 300 L, 약 75 mL 내지 약 200 L, 약 75 mL 내지 약 100 L, 약 75 mL 내지 약 50 L, 75 mL 내지 약 25 L, 약 75 mL 내지 약 20 L, 약 75 mL 내지 약 15 L, 약 75 mL 내지 약 10 L, 약 75 mL 내지 약 8 L, 약 75 mL 내지 약 6 L, 약 75 mL 내지 약 5 L, 약 75 mL 내지 약 4 L, 약 75 mL 내지 약 3 L, 약 75 mL 내지 약 2.5 L, 약 75 mL 내지 약 2.0 L, 약 75 mL 내지 약 1.8 L, 약 75 mL 내지 약 1.6 L, 약 75 mL 내지 약 1.4 L, 약 75 mL 내지 약 1.2 L, 약 75 mL 내지 약 1.0 L, 약 75 mL 내지 약 900 mL, 약 75 mL 내지 약 800 mL, 약 75 mL 내지 약 700 mL, 약 75 mL 내지 약 600 mL, 약 75 mL 내지 약 500 mL, 약 75 mL 내지 약 450 mL, 약 75 mL 내지 약 400 mL, 약 75 mL 내지 약 350 mL, 약 75 mL 내지 약 300 mL, 약 75 mL 내지 약 250 mL, 약 75 mL 내지 약 200 mL, 약 75 mL 내지 약 150 mL, 약 75 mL 내지 약 100 mL, 약 100 mL 내지 약 500 L, 약 100 mL 내지 약 400 L, 약 100 mL 내지 약 300 L, 약 100 mL 내지 약 200 L, 약 100 mL 내지 약 100 L, 약 100 mL 내지 약 50 L, 100 mL 내지 약 25 L, 약 100 mL 내지 약 20 L, 약 100 mL 내지 약 15 L, 약 100 mL 내지 약 10 L, 약 100 mL 내지 약 8 L, 약 100 mL 내지 약 6 L, 약 100 mL 내지 약 5 L, 약 100 mL 내지 약 4 L, 약 100 mL 내지 약 3 L, 약 100 mL 내지 약 2.5 L, 약 100 mL 내지 약 2.0 L, 약 100 mL 내지 약 1.8 L, 약 100 mL 내지 약 1.6 L, 약 100 mL 내지 약 1.4 L, 약 100 mL 내지 약 1.2 L, 약 100 mL 내지 약 1.0 L, 약 100 mL 내지 약 900 mL, 약 100 mL 내지 약 800 mL, 약 100 mL 내지 약 700 mL, 약 100 mL 내지 약 600 mL, 약 100 mL 내지 약 500 mL, 약 100 mL 내지 약 450 mL, 약 100 mL 내지 약 400 mL, 약 100 mL 내지 약 350 mL, 약 100 mL 내지 약 300 mL, 약 100 mL 내지 약 250 mL, 약 100 mL 내지 약 200 mL, 약 100 mL 내지 약 150 mL, 약 150 mL 내지 약 500 L, 약 150 mL 내지 약 400 L, 약 150 mL 내지 약 300 L, 약 150 mL 내지 약 200 L, 약 150 mL 내지 약 100 L, 약 150 mL 내지 약 50 L, 150 mL 내지 약 25 L, 약 150 mL 내지 약 20 L, 약 150 mL 내지 약 15 L, 약 150 mL 내지 약 10 L, 약 150 mL 내지 약 8 L, 약 150 mL 내지 약 6 L, 약 150 mL 내지 약 5 L, 약 150 mL 내지 약 4 L, 약 150 mL 내지 약 3 L, 약 150 mL 내지 약 2.5 L, 약 150 mL 내지 약 2.0 L, 약 150 mL 내지 약 1.8 L, 약 150 mL 내지 약 1.6 L, 약 150 mL 내지 약 1.4 L, 약 150 mL 내지 약 1.2 L, 약 150 mL 내지 약 1.0 L, 약 150 mL 내지 약 900 mL, 약 150 mL 내지 약 800 mL, 약 150 mL 내지 약 700 mL, 약 150 mL 내지 약 600 mL, 약 150 mL 내지 약 500 mL, 약 150 mL 내지 약 450 mL, 약 150 mL 내지 약 400 mL, 약 150 mL 내지 약 350 mL, 약 150 mL 내지 약 300 mL, 약 150 mL 내지 약 250 mL, 약 150 mL 내지 약 200 mL, 약 200 mL 내지 약 500 L, 약 200 mL 내지 약 400 L, 약 200 mL 내지 약 300 L, 약 200 mL 내지 약 200 L, 약 200 mL 내지 약 100 L, 약 200 mL 내지 약 50 L, 200 mL 내지 약 25 L, 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L, 약 2.0 L 내지 약 5 L, 약 2.0 L 내지 약 4 L, 약 2.0 L 내지 약 3 L, 약 2.0 L 내지 약 2.5 L, 약 2.5 L 내지 약 500 L, 약 2.5 L 내지 약 400 L, 약 2.5 L 내지 약 300 L, 약 2.5 L 내지 약 200 L, 약 2.5 L 내지 약 100 L, 약 2.5 L 내지 약 50 L, 2.5 L 내지 약 25 L, 약 2.5 L 내지 약 20 L, 약 2.5 L 내지 약 15 L, 약 2.5 L 내지 약 10 L, 약 2.5 L 내지 약 8 L, 약 2.5 L 내지 약 6 L, 약 2.5 L 내지 약 5 L, 약 2.5 L 내지 약 4 L, 약 2.5 L 내지 약 3 L, 약 3 L 내지 약 500 L, 약 3 L 내지 약 400 L, 약 3 L 내지 약 300 L, 약 3 L 내지 약 200 L, 약 3 L 내지 약 100 L, 약 3 L 내지 약 50 L, 3 L 내지 약 25 L, 약 3 L 내지 약 20 L, 약 3 L 내지 약 15 L, 약 3 L 내지 약 10 L, 약 3 L 내지 약 8 L, 약 3 L 내지 약 6 L, 약 3 L 내지 약 5 L, 약 3 L 내지 약 4 L, 약 4 L 내지 약 500 L, 약 4 L 내지 약 400 L, 약 4 L 내지 약 300 L, 약 4 L 내지 약 200 L, 약 4 L 내지 약 100 L, 약 4 L 내지 약 50 L, 4 L 내지 약 25 L, 약 4 L 내지 약 20 L, 약 4 L 내지 약 15 L, 약 4 L 내지 약 10 L, 약 4 L 내지 약 8 L, 약 4 L 내지 약 6 L, 약 4 L 내지 약 5 L, 약 5 L 내지 약 500 L, 약 5 L 내지 약 400 L, 약 5 L 내지 약 300 L, 약 5 L 내지 약 200 L, 약 5 L 내지 약 100 L, 약 5 L 내지 약 50 L, 5 L 내지 약 25 L, 약 5 L 내지 약 20 L, 약 5 L 내지 약 15 L, 약 5 L 내지 약 10 L, 약 5 L 내지 약 8 L, 약 5 L 내지 약 6 L, 약 6 L 내지 약 500 L, 약 6 L 내지 약 400 L, 약 6 L 내지 약 300 L, 약 6 L 내지 약 200 L, 약 6 L 내지 약 100 L, 약 6 L 내지 약 50 L, 6 L 내지 약 25 L, 약 6 L 내지 약 20 L, 약 6 L 내지 약 15 L, 약 6 L 내지 약 10 L, 약 6 L 내지 약 8 L, 약 8 L 내지 약 500 L, 약 8 L 내지 약 400 L, 약 8 L 내지 약 300 L, 약 8 L 내지 약 200 L, 약 8 L 내지 약 100 L, 약 8 L 내지 약 50 L, 8 L 내지 약 25 L, 약 8 L 내지 약 20 L, 약 8 L 내지 약 15 L, 약 8 L 내지 약 10 L, 약 10 L 내지 약 500 L, 약 10 L 내지 약 400 L, 약 10 L 내지 약 300 L, 약 10 L 내지 약 200 L, 약 10 L 내지 약 100 L, 약 10 L 내지 약 50 L, 10 L 내지 약 25 L, 약 10 L 내지 약 20 L, 약 10 L 내지 약 15 L, 약 15 L 내지 약 500 L, 약 15 L 내지 약 400 L, 약 15 L 내지 약 300 L, 약 15 L 내지 약 200 L, 약 15 L 내지 약 100 L, 약 15 L 내지 약 50 L, 15 L 내지 약 25 L, 약 15 L 내지 약 20 L, 약 20 L 내지 약 500 L, 약 20 L 내지 약 400 L, 약 20 L 내지 약 300 L, 약 20 L 내지 약 200 L, 약 20 L 내지 약 100 L, 약 20 L 내지 약 50 L, 20 L 내지 약 25 L, 약 25 L 내지 약 500 L, 약 25 L 내지 약 400 L, 약 25 L 내지 약 300 L, 약 25 L 내지 약 200 L, 약 25 L 내지 약 100 L, 약 25 L 내지 약 50 L, 약 50 L 내지 약 500 L, 약 50 L 내지 약 400 L, 약 50 L 내지 약 300 L, 약 50 L 내지 약 200 L, 약 50 L 내지 약 100 L, 약 100 L 내지 약 500 L, 약 100 L 내지 약 400 L, 약 100 L 내지 약 300 L, 약 100 L 내지 약 200 L, 약 200 L 내지 약 500 L, 약 200 L 내지 약 400 L, 약 200 L 내지 약 300 L, 약 300 L 내지 약 500 L, 약 300 L 내지 약 400 L, 또는 약 400 L 내지 약 500 L의 부피를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 배양 백을 분당 약 5 진동 사이클 내지 분당 약 40 진동 사이클, 분당 약 5 진동 사이클 내지 분당 약 35 진동 사이클, 분당 약 5 진동 사이클 내지 분당 약 30 진동 사이클, 분당 약 5 진동 사이클 내지 분당 약 25 진동 사이클, 분당 약 5 진동 사이클 내지 분당 약 20 진동 사이클, 분당 약 5 진동 사이클 내지 분당 약 15 진동 사이클, 분당 약 5 진동 사이클 내지 분당 약 10 진동 사이클, 분당 약 10 진동 사이클 내지 분당 약 40 진동 사이클, 분당 약 10 진동 사이클 내지 분당 약 35 진동 사이클, 분당 약 10 진동 사이클 내지 분당 약 30 진동 사이클, 분당 약 10 진동 사이클 내지 분당 약 25 진동 사이클, 분당 약 10 진동 사이클 내지 분당 약 20 진동 사이클, 분당 약 10 진동 사이클 내지 분당 약 15 진동 사이클, 분당 약 15 진동 사이클 내지 분당 약 40 진동 사이클, 분당 약 15 진동 사이클 내지 분당 약 35 진동 사이클, 분당 약 15 진동 사이클 내지 분당 약 30 진동 사이클, 분당 약 15 진동 사이클 내지 분당 약 25 진동 사이클, 분당 약 15 진동 사이클 내지 분당 약 20 진동 사이클, 분당 약 20 진동 사이클 내지 분당 약 40 진동 사이클, 분당 약 20 진동 사이클 내지 약 35 진동 사이클, 분당 약 20 진동 사이클 내지 약 30 진동 사이클, 분당 약 20 진동 사이클 내지 분당 약 25 진동 사이클, 분당 약 25 진동 사이클 내지 분당 약 40 진동 사이클, 분당 약 25 진동 사이클 내지 분당 약 35 진동 사이클, 분당 약 25 진동 사이클 내지 분당 약 30 진동 사이클, 분당 약 30 진동 사이클 내지 분당 약 40 진동 사이클, 분당 약 30 진동 사이클 내지 분당 약 35 진동 사이클, 또는 분당 약 35 진동 사이클 내지 분당 약 40 진동 사이클로 인큐베이션할 수 있다.
다양한 배양 백이 상업적으로 이용 가능하다. 배양 백의 추가적인 비제한적인 양태가 당업계에 공지되어 있다.
바이오리액터
본원에 기술된 방법의 일부 양태는 바이오리액터(예: 관류 바이오리액터)의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이오리액터(예: 관류 바이오리액터)는 약 500 mL 내지 약 15,000 L, 약 500 mL 내지 약 12,500 L, 약 500 mL 내지 약 10,000 L, 약 500 mL 내지 약 8,000 L, 약 500 mL 내지 약 6,000 L, 약 500 mL 내지 약 4,000 L, 약 500 mL 내지 약 2,000 L, 약 500 mL 내지 약 1,000 L, 약 500 mL 내지 약 800 L, 약 500 mL 내지 약 600 L, 약 500 mL 내지 약 400 L, 약 500 mL 내지 약 200 L, 약 500 mL 내지 약 100 L, 약 500 mL 내지 약 50 L, 약 500 mL 내지 약 20 L, 약 500 mL 내지 약 10 L, 약 500 mL 내지 약 5 L, 약 500 mL 내지 약 1 L, 약 500 mL 내지 약 750 mL, 약 750 mL 내지 약 15,000 L, 약 750 mL 내지 약 12,500 L, 약 750 mL 내지 약 10,000 L, 약 750 mL 내지 약 8,000 L, 약 750 mL 내지 약 6,000 L, 약 750 mL 내지 약 4,000 L, 약 750 mL 내지 약 2,000 L, 약 750 mL 내지 약 1,000 L, 약 750 mL 내지 약 800 L, 약 750 mL 내지 약 600 L, 약 750 mL 내지 약 400 L, 약 750 mL 내지 약 200 L, 약 750 mL 내지 약 100 L, 약 750 mL 내지 약 50 L, 약 750 mL 내지 약 20 L, 약 750 mL 내지 약 10 L, 약 750 mL 내지 약 5 L, 약 750 mL 내지 약 1 L, 약 1 L 내지 약 15,000 L, 약 1 L 내지 약 12,500 L, 약 1 L 내지 약 10,000 L, 약 1 L 내지 약 8,000 L, 약 1 L 내지 약 6,000 L, 약 1 L 내지 약 4,000 L, 약 1 L 내지 약 2,000 L, 약 1 L 내지 약 1,000 L, 약 1 L 내지 약 800 L, 약 1 L 내지 약 600 L, 약 1 L 내지 약 400 L, 약 1 L 내지 약 200 L, 약 1 L 내지 약 100 L, 약 1 L 내지 약 50 L, 약 1 L 내지 약 20 L, 약 1 L 내지 약 10 L, 약 1 L 내지 약 5 L, 약 5 L 내지 약 15,000 L, 약 5 L 내지 약 12,500 L, 약 5 L 내지 약 10,000 L, 약 5 L 내지 약 8,000 L, 약 5 L 내지 약 6,000 L, 약 5 L 내지 약 4,000 L, 약 5 L 내지 약 2,000 L, 약 5 L 내지 약 1,000 L, 약 5 L 내지 약 800 L, 약 5 L 내지 약 600 L, 약 5 L 내지 약 400 L, 약 5 L 내지 약 200 L, 약 5 L 내지 약 100 L, 약 5 L 내지 약 50 L, 약 5 L 내지 약 20 L, 약 5 L 내지 약 10 L, 약 10 L 내지 약 15,000 L, 약 10 L 내지 약 12,500 L, 약 10 L 내지 약 10,000 L, 약 10 L 내지 약 8,000 L, 약 10 L 내지 약 6,000 L, 약 10 L 내지 약 4,000 L, 약 10 L 내지 약 2,000 L, 약 10 L 내지 약 1,000 L, 약 10 L 내지 약 800 L, 약 10 L 내지 약 600 L, 약 10 L 내지 약 400 L, 약 10 L 내지 약 200 L, 약 10 L 내지 약 100 L, 약 10 L 내지 약 50 L, 약 10 L 내지 약 20 L, 약 20 L 내지 약 15,000 L, 약 20 L 내지 약 12,500 L, 약 20 L 내지 약 10,000 L, 약 20 L 내지 약 8,000 L, 약 20 L 내지 약 6,000 L, 약 20 L 내지 약 4,000 L, 약 20 L 내지 약 2,000 L, 약 20 L 내지 약 1,000 L, 약 20 L 내지 약 800 L, 약 20 L 내지 약 600 L, 약 20 L 내지 약 400 L, 약 20 L 내지 약 200 L, 약 20 L 내지 약 100 L, 약 20 L 내지 약 50 L, 약 50 L 내지 약 15,000 L, 약 50 L 내지 약 12,500 L, 약 50 L 내지 약 10,000 L, 약 50 L 내지 약 8,000 L, 약 50 L 내지 약 6,000 L, 약 50 L 내지 약 4,000 L, 약 50 L 내지 약 2,000 L, 약 50 L 내지 약 1,000 L, 약 50 L 내지 약 800 L, 약 50 L 내지 약 600 L, 약 50 L 내지 약 400 L, 약 50 L 내지 약 200 L, 약 50 L 내지 약 100 L, 약 100 L 내지 약 15,000 L, 약 100 L 내지 약 12,500 L, 약 100 L 내지 약 10,000 L, 약 100 L 내지 약 8,000 L, 약 100 L 내지 약 6,000 L, 약 100 L 내지 약 4,000 L, 약 100 L 내지 약 2,000 L, 약 100 L 내지 약 1,000 L, 약 100 L 내지 약 800 L, 약 100 L 내지 약 600 L, 약 100 L 내지 약 400 L, 약 100 L 내지 약 200 L, 약 200 L 내지 약 15,000 L, 약 200 L 내지 약 12,500 L, 약 200 L 내지 약 10,000 L, 약 200 L 내지 약 8,000 L, 약 200 L 내지 약 6,000 L, 약 200 L 내지 약 4,000 L, 약 200 L 내지 약 2,000 L, 약 200 L 내지 약 1,000 L, 약 200 L 내지 약 800 L, 약 200 L 내지 약 600 L, 약 200 L 내지 약 400 L, 약 400 L 내지 약 15,000 L, 약 400 L 내지 약 12,500 L, 약 400 L 내지 약 10,000 L, 약 400 L 내지 약 8,000 L, 약 400 L 내지 약 6,000 L, 약 400 L 내지 약 4,000 L, 약 400 L 내지 약 2,000 L, 약 400 L 내지 약 1,000 L, 약 400 L 내지 약 800 L, 약 400 L 내지 약 600 L, 약 600 L 내지 약 15,000 L, 약 600 L 내지 약 12,500 L, 약 600 L 내지 약 10,000 L, 약 600 L 내지 약 8,000 L, 약 600 L 내지 약 6,000 L, 약 600 L 내지 약 4,000 L, 약 600 L 내지 약 2,000 L, 약 600 L 내지 약 1,000 L, 약 600 L 내지 약 800 L, 약 800 L 내지 약 15,000 L, 약 800 L 내지 약 12,500 L, 약 800 L 내지 약 10,000 L, 약 800 L 내지 약 8,000 L, 약 800 L 내지 약 6,000 L, 약 800 L 내지 약 4,000 L, 약 800 L 내지 약 2,000 L, 약 800 L 내지 약 1,000 L, 약 1,000 L 내지 약 15,000 L, 약 1,000 L 내지 약 12,500 L, 약 1,000 L 내지 약 10,000 L, 약 1,000 L 내지 약 8,000 L, 약 1,000 L 내지 약 6,000 L, 약 1,000 L 내지 약 4,000 L, 약 1,000 L 내지 약 2,000 L, 약 2,000 L 내지 약 15,000 L, 약 2,000 L 내지 약 12,500 L, 약 2,000 L 내지 약 10,000 L, 약 2,000 L 내지 약 8,000 L, 약 2,000 L 내지 약 6,000 L, 약 2,000 L 내지 약 4,000 L, 약 4,000 L 내지 약 15,000 L, 약 4,000 L 내지 약 12,500 L, 약 4,000 L 내지 약 10,000 L, 약 4,000 L 내지 약 8,000 L, 약 2,000 L 내지 약 6,000 L, 약 6,000 L 내지 약 15,000 L, 약 6,000 L 내지 약 12,500 L, 약 6,000 L 내지 약 10,000 L, 약 6,000 L 내지 약 8,000 L, 약 8,000 L 내지 약 15,000 L, 약 8,000 L 내지 약 12,500 L, 약 8,000 L 내지 약 10,000 L, 약 10,000 L 내지 약 15,000 L, 약 10,000 L 내지 약 12,500 L, 또는 약 12,500 L 내지 약 15,000 L의 부피를 가질 수 있다.
다양한 바이오리액터(예: 관류 바이오리액터)가 상업적으로 이용 가능하다. 바이오리액터(예: 관류 바이오리액터)의 추가적인 비제한적인 양태는 당업계에 공지되어 있다.
제2 세포 배양물을 제공하는 단계 (단계 A)
본원에 기술된 방법 중 어느 하나에서, 단계 (a)는 적혈구 전구 세포(예를 들어, 본원에 기술된 또는 당업계에 알려진 예시적인 적혈구 전구 세포 중 어느 하나)의 제1 세포 배양물의 부피를 용기(예를 들어, 바이오리액터(예를 들어, 관류 바이오리액터), 진탕 플라스크, 진탕 튜브, 또는 배양 백)에 담긴 제2 배양 배지(예를 들어, 본원에 기술된 또는 당업계에 알려진 예시적인 제2 배양 배지 중 어느 하나) 내에 배치하여 (예를 들어, 약 0.1 x 104 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL, 약 0.1 x 104 세포/mL 내지 약 0.5 x 107 세포/mL, 약 0.1 x 104 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 0.1 x 104 세포/mL 내지 약 0.5 x 106 세포/mL, 약 0.1 x 104 세포/mL 내지 약 4 x 105 세포/mL, 약 0.1 x 104 세포/mL 내지 약 2 x 105 세포/mL, 약 0.1 x 104 세포/mL 내지 약 1.5 x 105 세포/mL, 약 0.1 x 104 세포/mL 내지 약 1 x 105 세포/mL, 약 0.1 x 104 세포/mL 내지 약 0.5 x 105 세포/mL, 약 0.1 x 104 세포/mL 내지 약 1 x 104 세포/mL, 약 0.1 x 104 세포/mL 내지 약 0.5 x 104 세포/mL, 0.5 x 104 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL, 약 0.5 x 104 세포/mL 내지 약 0.5 x 107 세포/mL, 약 0.5 x 104 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 0.5 x 104 세포/mL 내지 약 0.5 x 106 세포/mL, 약 0.5 x 104 세포/mL 내지 약 4 x 105 세포/mL, 약 0.5 x 104 세포/mL 내지 약 2 x 105 세포/mL, 약 0.5 x 104 세포/mL 내지 약 1.5 x 105 세포/mL, 약 0.5 x 104 세포/mL 내지 약 1 x 105 세포/mL, 약 0.5 x 104 세포/mL 내지 약 0.5 x 105 세포/mL, 약 0.5 x 104 세포/mL 내지 약 1 x 104 세포/mL, 1 x 104 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL, 약 1 x 104 세포/mL 내지 약 0.5 x 107 세포/mL, 약 1 x 104 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 1 x 104 세포/mL 내지 약 0.5 x 106 세포/mL, 약 1 x 104 세포/mL 내지 약 4 x 105 세포/mL, 약 1 x 104 세포/mL 내지 약 2 x 105 세포/mL, 약 1 x 104 세포/mL 내지 약 1.5 x 105 세포/mL, 약 1 x 104 세포/mL 내지 약 1 x 105 세포/mL, 약 1 x 104 세포/mL 내지 약 0.5 x 105 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 107 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 106 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 105 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 105 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 1.5 x 105 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 105 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 107 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 106 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 105 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 105 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 1.5 x 105 세포/mL, 약 1.5 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL, 약 1.5 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 107 세포/mL, 약 1.5 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 1.5 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 106 세포/mL, 약 1.5 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 105 세포/mL, 약 1.5 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 105 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 107 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 106 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 105 세포/mL, 약 4 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL, 약 4 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 107 세포/mL, 약 4 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 4 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 106 세포/mL, 약 0.5 x 106 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL, 약 0.5 x 106 세포/mL 내지 약 0.5 x 107 세포/mL, 약 0.5 x 106 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 1 x 106 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL, 약 1 x 106 세포/mL 내지 약 0.5 x 107 세포/mL, 또는 약 0.5 x 107 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL의 초기 세포 밀도를 갖는) 제2 세포 배양물을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (a)는 약 0.1 mL 내지 약 5,000 L, 약 0.1 mL 내지 약 4,500 L, 약 0.1 mL 내지 약 4,000 L, 약 0.1 mL 내지 약 3,500 L, 약 0.1 mL 내지 약 3,000 L, 약 0.1 mL 내지 약 2,500 L, 약 0.1 mL 내지 약 2,000 L, 약 0.1 mL 내지 약 1,500 L, 약 1 mL 내지 약 1,000 L, 약 0.1 mL 내지 약 800 mL, 약 0.1 mL 내지 약 600 mL, 약 0.1 mL 내지 약 500 mL, 약 0.1 mL 내지 약 450 mL, 약 0.1 mL 내지 약 400 mL, 약 0.1 mL 내지 약 350 mL, 약 0.1 mL 내지 약 300 mL, 약 0.1 mL 내지 약 250 mL, 약 0.1 mL 내지 약 200 mL, 약 0.1 mL 내지 약 150 mL, 약 0.1 mL 내지 약 100 mL, 약 0.1 mL 내지 약 50 mL, 약 0.1 mL 내지 약 20 mL, 약 0.1 mL 내지 약 10 mL, 약 0.1 mL 내지 약 5 mL, 약 5 mL 내지 약 5,000 L, 약 5 mL 내지 약 4,500 L, 약 5 mL 내지 약 4,000 L, 약 5 mL 내지 약 3,500 L, 약 5 mL 내지 약 3,000 L, 약 5 mL 내지 약 2,500 L, 약 5 mL 내지 약 2,000 L, 약 5 mL 내지 약 1,500 L, 약 5 mL 내지 약 1,000 L, 약 5 mL 내지 약 800 mL, 약 5 mL 내지 약 600 mL, 약 5 mL 내지 약 500 mL, 약 5 mL 내지 약 450 mL, 약 5 mL 내지 약 400 mL, 약 5 mL 내지 약 350 mL, 약 5 mL 내지 약 300 mL, 약 5 mL 내지 약 250 mL, 약 5 mL 내지 약 200 mL, 약 5 mL 내지 약 150 mL, 약 5 mL 내지 약 100 mL, 약 5 mL 내지 약 50 mL, 약 5 mL 내지 약 20 mL, 약 5 mL 내지 약 10 mL, 약 10 mL 내지 약 5,000 L, 약 10 mL 내지 약 4,500 L, 약 10 mL 내지 약 4,000 L, 약 10 mL 내지 약 3,500 L, 약 10 mL 내지 약 3,000 L, 약 10 mL 내지 약 2,500 L, 약 10 mL 내지 약 2,000 L, 약 10 mL 내지 약 1,500 L, 약 10 mL 내지 약 1,000 L, 약 10 mL 내지 약 800 mL, 약 10 mL 내지 약 600 mL, 약 10 mL 내지 약 500 mL, 약 10 mL 내지 약 450 mL, 약 10 mL 내지 약 400 mL, 약 10 mL 내지 약 350 mL, 약 10 mL 내지 약 300 mL, 약 10 mL 내지 약 250 mL, 약 10 mL 내지 약 200 mL, 약 10 mL 내지 약 150 mL, 약 10 mL 내지 약 100 mL, 약 10 mL 내지 약 50 mL, 약 10 mL 내지 약 20 mL, 약 20 mL 내지 약 5,000 L, 약 20 mL 내지 약 4,500 L, 약 20 mL 내지 약 4,000 L, 약 20 mL 내지 약 3,500 L, 약 20 mL 내지 약 3,000 L, 약 20 mL 내지 약 2,500 L, 약 20 mL 내지 약 2,000 L, 약 20 mL 내지 약 1,500 L, 약 20 mL 내지 약 1,000 L, 약 20 mL 내지 약 800 mL, 약 20 mL 내지 약 600 mL, 약 20 mL 내지 약 500 mL, 약 20 mL 내지 약 450 mL, 약 20 mL 내지 약 400 mL, 약 20 mL 내지 약 350 mL, 약 20 mL 내지 약 300 mL, 약 20 mL 내지 약 250 mL, 약 20 mL 내지 약 200 mL, 약 20 mL 내지 약 150 mL, 약 20 mL 내지 약 100 mL, 약 20 mL 내지 약 50 mL, 약 50 mL 내지 약 5,000 L, 약 50 mL 내지 약 4,500 L, 약 50 mL 내지 약 4,000 L, 약 50 mL 내지 약 3,500 L, 약 50 mL 내지 약 3,000 L, 약 50 mL 내지 약 2,500 L, 약 50 mL 내지 약 2,000 L, 약 50 mL 내지 약 1,500 L, 약 50 mL 내지 약 1,000 L, 약 50 mL 내지 약 800 mL, 약 50 mL 내지 약 600 mL, 약 50 mL 내지 약 500 mL, 약 50 mL 내지 약 450 mL, 약 50 mL 내지 약 400 mL, 약 50 mL 내지 약 350 mL, 약 50 mL 내지 약 300 mL, 약 50 mL 내지 약 250 mL, 약 50 mL 내지 약 200 mL, 약 50 mL 내지 약 150 mL, 약 50 mL 내지 약 100 mL, 약 100 mL 내지 약 5,000 L, 약 100 mL 내지 약 4,500 L, 약 100 mL 내지 약 4,000 L, 약 100 mL 내지 약 3,500 L, 약 100 mL 내지 약 3,000 L, 약 100 mL 내지 약 2,500 L, 약 100 mL 내지 약 2,000 L, 약 100 mL 내지 약 1,500 L, 약 100 mL 내지 약 1,000 L, 약 100 mL 내지 약 800 mL, 약 100 mL 내지 약 600 mL, 약 100 mL 내지 약 500 mL, 약 100 mL 내지 약 450 mL, 약 100 mL 내지 약 400 mL, 약 100 mL 내지 약 350 mL, 약 100 mL 내지 약 300 mL, 약 100 mL 내지 약 250 mL, 약 100 mL 내지 약 200 mL, 약 100 mL 내지 약 150 mL, 약 150 mL 내지 약 5,000 L, 약 150 mL 내지 약 4,500 L, 약 150 mL 내지 약 4,000 L, 약 150 mL 내지 약 3,500 L, 약 150 mL 내지 약 3,000 L, 약 150 mL 내지 약 2,500 L, 약 150 mL 내지 약 2,000 L, 약 150 mL 내지 약 1,500 L, 약 150 mL 내지 약 1,000 L, 약 150 mL 내지 약 800 mL, 약 150 mL 내지 약 600 mL, 약 150 mL 내지 약 500 mL, 약 150 mL 내지 약 450 mL, 약 150 mL 내지 약 400 mL, 약 150 mL 내지 약 350 mL, 약 150 mL 내지 약 300 mL, 약 150 mL 내지 약 250 mL, 약 150 mL 내지 약 200 mL, 약 200 mL 내지 약 5,000 L, 약 200 mL 내지 약 4,500 L, 약 200 mL 내지 약 4,000 L, 약 200 mL 내지 약 3,500 L, 약 200 mL 내지 약 3,000 L, 약 200 mL 내지 약 2,500 L, 약 200 mL 내지 약 2,000 L, 약 200 mL 내지 약 1,500 L, 약 200 mL 내지 약 1,000 L, 약 200 mL 내지 약 800 mL, 약 200 mL 내지 약 600 mL, 약 200 mL 내지 약 500 mL, 약 200 mL 내지 약 450 mL, 약 200 mL 내지 약 400 mL, 약 200 mL 내지 약 350 mL, 약 200 mL 내지 약 300 mL, 약 200 mL 내지 약 250 mL, 약 250 mL 내지 약 5,000 L, 약 250 mL 내지 약 4,500 L, 약 250 mL 내지 약 4,000 L, 약 250 mL 내지 약 3,500 L, 약 250 mL 내지 약 3,000 L, 약 250 mL 내지 약 2,500 L, 약 250 mL 내지 약 2,000 L, 약 250 mL 내지 약 1,500 L, 약 250 mL 내지 약 1,000 L, 약 250 mL 내지 약 800 mL, 약 250 mL 내지 약 600 mL, 약 250 mL 내지 약 500 mL, 약 250 mL 내지 약 450 mL, 약 250 mL 내지 약 400 mL, 약 250 mL 내지 약 350 mL, 약 250 mL 내지 약 300 mL, 약 300 mL 내지 약 5,000 L, 약 300 mL 내지 약 4,500 L, 약 300 mL 내지 약 4,000 L, 약 300 mL 내지 약 3,500 L, 약 300 mL 내지 약 3,000 L, 약 300 mL 내지 약 2,500 L, 약 300 mL 내지 약 2,000 L, 약 300 mL 내지 약 1,500 L, 약 300 mL 내지 약 1,000 L, 약 300 mL 내지 약 800 mL, 약 300 mL 내지 약 600 mL, 약 300 mL 내지 약 500 mL, 약 300 mL 내지 약 450 mL, 약 300 mL 내지 약 400 mL, 약 300 mL 내지 약 350 mL, 약 350 mL 내지 약 5,000 L, 약 350 mL 내지 약 4,500 L, 약 350 mL 내지 약 4,000 L, 약 350 mL 내지 약 3,500 L, 약 350 mL 내지 약 3,000 L, 약 350 mL 내지 약 2,500 L, 약 350 mL 내지 약 2,000 L, 약 350 mL 내지 약 1,500 L, 약 350 mL 내지 약 1,000 L, 약 350 mL 내지 약 800 mL, 약 350 mL 내지 약 600 mL, 약 350 mL 내지 약 500 mL, 약 350 mL 내지 약 450 mL, 약 350 mL 내지 약 400 mL, 약 400 mL 내지 약 5,000 L, 약 400 mL 내지 약 4,500 L, 약 400 mL 내지 약 4,000 L, 약 400 mL 내지 약 3,500 L, 약 400 mL 내지 약 3,000 L, 약 400 mL 내지 약 2,500 L, 약 400 mL 내지 약 2,000 L, 약 400 mL 내지 약 1,500 L, 약 400 mL 내지 약 1,000 L, 약 400 mL 내지 약 800 mL, 약 400 mL 내지 약 600 mL, 약 400 mL 내지 약 500 mL, 약 400 mL 내지 약 450 mL, 약 450 mL 내지 약 5,000 L, 약 450 mL 내지 약 4,500 L, 약 450 mL 내지 약 4,000 L, 약 450 mL 내지 약 3,500 L, 약 450 mL 내지 약 3,000 L, 약 450 mL 내지 약 2,500 L, 약 450 mL 내지 약 2,000 L, 약 450 mL 내지 약 1,500 L, 약 450 mL 내지 약 1,000 L, 약 450 mL 내지 약 800 mL, 약 450 mL 내지 약 600 mL, 약 450 mL 내지 약 500 mL, 약 500 mL 내지 약 5,000 L, 약 500 mL 내지 약 4,500 L, 약 500 mL 내지 약 4,000 L, 약 500 mL 내지 약 3,500 L, 약 500 mL 내지 약 3,000 L, 약 500 mL 내지 약 2,500 L, 약 500 mL 내지 약 2,000 L, 약 500 mL 내지 약 1,500 L, 약 500 mL 내지 약 1,000 L, 약 500 mL 내지 약 800 mL, 약 500 mL 내지 약 600 mL, 약 600 mL 내지 약 5,000 L, 약 600 mL 내지 약 4,500 L, 약 600 mL 내지 약 4,000 L, 약 600 mL 내지 약 3,500 L, 약 600 mL 내지 약 3,000 L, 약 600 mL 내지 약 2,500 L, 약 600 mL 내지 약 2,000 L, 약 600 mL 내지 약 1,500 L, 약 600 mL 내지 약 1,000 L, 약 600 mL 내지 약 800 mL, 약 800 mL 내지 약 5,000 L, 약 800 mL 내지 약 4,500 L, 약 800 mL 내지 약 4,000 L, 약 800 mL 내지 약 3,500 L, 약 800 mL 내지 약 3,000 L, 약 800 mL 내지 약 2,500 L, 약 800 mL 내지 약 2,000 L, 약 800 mL 내지 약 1,500 L, 약 800 mL 내지 약 1,000 L, 약 1,000 L 내지 약 5,000 L, 약 1,000 L 내지 약 4,500 L, 약 1,000 L 내지 약 4,000 L, 약 1,000 L 내지 약 3,500 L, 약 1,000 L 내지 약 3,000 L, 약 1,000 L 내지 약 2,500 L, 약 1,000 L 내지 약 2,000 L, 약 1,000 L 내지 약 1,500 L, 약 1,500 L 내지 약 5,000 L, 약 1,500 L 내지 약 4,500 L, 약 1,500 L 내지 약 4,000 L, 약 1,500 L 내지 약 3,500 L, 약 1,500 L 내지 약 3,000 L, 약 1,500 L 내지 약 2,500 L, 약 1,500 L 내지 약 2,000 L, 약 2,000 L 내지 약 5,000 L, 약 2,000 L 내지 약 4,500 L, 약 2,000 L 내지 약 4,000 L, 약 2,000 L 내지 약 3,500 L, 약 2,000 L 내지 약 3,000 L, 약 2,000 L 내지 약 2,500 L, 약 2,500 L 내지 약 5,000 L, 약 2,500 L 내지 약 4,500 L, 약 2,500 L 내지 약 4,000 L, 약 2,500 L 내지 약 3,500 L, 약 2,500 L 내지 약 3,000 L, 약 3,000 L 내지 약 5,000 L, 약 3,000 L 내지 약 4,500 L, 약 3,000 L 내지 약 4,000 L, 약 3,000 L 내지 약 3,500 L, 약 3,500 L 내지 약 5,000 L, 약 3,500 L 내지 약 4,500 L, 약 3,500 L 내지 약 4,000 L, 약 4,000 L 내지 약 5,000 L, 약 4,000 L 내지 약 4,500 L, 약 4,500 L 내지 약 5,000 L의 부피를 배치하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (a)는 약 10 μL 내지 약 0.1 mL, 약 10 μL 내지 약 80 μL, 약 10 μL 내지 약 60 μL, 약 10 μL 내지 약 40 μL, 약 10 μL 내지 약 20 μL, 약 20 μL 내지 약 0.1 mL, 약 20 μL 내지 약 80 μL, 약 20 μL 내지 약 60 μL, 약 20 μL 내지 약 40 μL, 약 40 μL 내지 약 0.1 mL, 약 40 μL 내지 약 80 μL, 약 40 μL 내지 약 60 μL, 약 60 μL 내지 약 0.1 mL, 약 60 μL 내지 약 80 μL, 또는 약 60 μL 내지 약 0.1 mL의 부피를 배치하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 용기는 바이오리액터(예: 관류 바이오리액터)(예: 본원에 기술된 예시적인 부피 중 어느 하나를 갖는 본원에 기술된 예시적인 바이오리액터 중 어느 하나)이다. 단계 (a)에서 사용될 수 있는 바이오리액터의 추가적인 예 및 양태가 당업계에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 용기는 진탕 플라스크(예를 들어, 본원에 기술된 예시적인 부피 중 어느 하나를 갖는 본원에 기술된 예시적인 진탕 플라스크 중 어느 하나)이다. 단계 (a)에서 사용될 수 있는 진탕 플라스크의 추가적인 예 및 양태가 당업계에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 용기는 진탕 튜브(예를 들어, 본원에 기술된 또는 당업계에 공지된 예시적인 진탕 튜브 중 어느 하나)이다. 단계 (a)에서 사용될 수 있는 진탕 튜브의 추가적인 예 및 양태가 당업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서의 용기는 배양 백(예를 들어, 본원에 기술된 예시적인 배양 백 중 어느 하나)이다.
일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 다음 중 하나 이상(예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개)을 포함한다: 트랜스페린(예를 들어 아포트랜스페린, 홀로 트랜스페린, 또는 이들의 조합)(예를 들어 약 1 μg/mL 내지 약 500 μg/mL 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 트랜스페린(예를 들어 아포트랜스페린, 홀로 트랜스페린, 또는 이들의 조합)), IL-3(예를 들어 약 0.1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 IL-3), 줄기 세포 인자 (SCF)(예를 들어 약 1 ng/mL 내지 약 1 μg/mL 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 SCF), 덱사메타손(예를 들어 약 0.1 nM 내지 약 200 nM 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 덱사메타손), 에리트로포이에틴(EPO) 또는 EPO-모방체 펩티드(예를 들어 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 EPO 또는 EPO-모방체 펩티드), 및 인슐린(예를 들어 약 0.1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 인슐린). 본원에 기술된 제2 배양 배지 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 Iscove의 변형된 Dulbecco 배지(IMDM)를 포함한다. 본원에 기술된 제2 배양 배지 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 지질(예: 지질 혼합물)을 포함한다. 본원에 기술된 제2 배양 배지 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM(또는 본원에 기술된 이 범위의 하위 범위 중 어느 하나)의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 본원에 기술된 제2 배양 배지 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 0.1% w/v 내지 약 4% w/v(예를 들어 약 0.1% w/v 내지 약 3.5% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 3.0% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 0.5% w/v, 약 0.2% w/v 내지 약 4% w/v, 약 0.2% w/v 내지 약 3.5% w/v, 약 0.2% w/v 내지 약 3.0% w/v, 약 0.2% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 0.2% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.2% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.2% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.2% w/v 내지 약 0.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 4% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 3.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 3.0% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 4% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 3.5% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 3.0% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 4% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 3.5% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 3.0% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 2.0% w/v 내지 약 4% w/v, 약 2.0% w/v 내지 약 3.5% w/v, 약 2.0% w/v 내지 약 3.0% w/v, 약 2.0% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 2.5% w/v 내지 약 4% w/v, 약 2.5% w/v 내지 약 3.5% w/v, 약 2.5% w/v 내지 약 3.0% w/v, 약 3.0% w/v 내지 약 4% w/v, 약 3.0% w/v 내지 약 3.5% w/v, 또는 약 3.5% w/v 내지 약 4.0% w/v)의 인간 혈청 알부민을 포함한다. 본원에 기술된 제2 배양 배지 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1% w/v 내지 약 3% w/v(예를 들어 약 0.1% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 0.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 3% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 3% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 3% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 2.0% w/v 내지 약 3% w/v, 약 2.0% w/v 내지 약 2.5% w/v, 또는 약 2.5% w/v 내지 약 3% w/v)의 폴록사머-188(P188)을 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 1 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 480 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 460 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 440 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 420 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 380 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 360 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 340 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 320 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 280 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 260 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 240 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 220 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 200 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 180 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 160 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 140 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 120 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 100 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 80 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 60 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 480 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 460 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 440 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 420 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 380 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 360 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 340 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 320 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 280 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 260 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 240 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 220 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 200 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 180 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 160 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 140 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 120 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 100 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 80 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 60 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 480 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 460 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 440 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 420 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 380 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 360 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 340 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 320 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 280 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 260 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 240 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 220 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 200 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 180 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 160 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 140 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 120 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 100 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 80 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 60 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 480 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 460 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 440 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 420 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 380 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 360 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 340 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 320 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 280 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 260 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 240 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 220 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 200 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 180 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 160 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 140 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 120 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 100 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 80 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 60 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 480 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 460 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 440 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 420 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 380 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 360 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 340 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 320 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 280 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 260 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 240 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 220 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 200 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 180 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 160 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 140 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 120 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 100 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 80 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 480 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 460 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 440 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 420 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 380 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 360 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 340 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 320 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 280 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 260 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 240 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 220 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 200 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 180 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 160 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 140 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 120 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 100 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 480 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 460 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 440 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 420 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 380 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 360 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 340 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 320 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 280 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 260 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 240 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 220 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 200 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 180 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 160 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 140 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 120 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 480 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 460 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 440 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 420 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 380 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 360 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 340 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 320 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 280 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 260 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 240 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 220 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 200 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 180 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 160 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 140 μg/mL, 약 140 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 140 μg/mL 내지 약 480 μg/mL, 약 140 μg/mL 내지 약 460 μg/mL, 약 140 μg/mL 내지 약 440 μg/mL, 약 140 μg/mL 내지 약 420 μg/mL, 약 140 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 140 μg/mL 내지 약 380 μg/mL, 약 140 μg/mL 내지 약 360 μg/mL, 약 140 μg/mL 내지 약 340 μg/mL, 약 140 μg/mL 내지 약 320 μg/mL, 약 140 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 140 μg/mL 내지 약 280 μg/mL, 약 140 μg/mL 내지 약 260 μg/mL, 약 140 μg/mL 내지 약 240 μg/mL, 약 140 μg/mL 내지 약 220 μg/mL, 약 140 μg/mL 내지 약 200 μg/mL, 약 140 μg/mL 내지 약 180 μg/mL, 약 140 μg/mL 내지 약 160 μg/mL, 약 160 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 160 μg/mL 내지 약 480 μg/mL, 약 160 μg/mL 내지 약 460 μg/mL, 약 160 μg/mL 내지 약 440 μg/mL, 약 160 μg/mL 내지 약 420 μg/mL, 약 160 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 160 μg/mL 내지 약 380 μg/mL, 약 160 μg/mL 내지 약 360 μg/mL, 약 160 μg/mL 내지 약 340 μg/mL, 약 160 μg/mL 내지 약 320 μg/mL, 약 160 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 160 μg/mL 내지 약 280 μg/mL, 약 160 μg/mL 내지 약 260 μg/mL, 약 160 μg/mL 내지 약 240 μg/mL, 약 160 μg/mL 내지 약 220 μg/mL, 약 160 μg/mL 내지 약 200 μg/mL, 약 160 μg/mL 내지 약 180 μg/mL, 약 180 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 180 μg/mL 내지 약 480 μg/mL, 약 180 μg/mL 내지 약 460 μg/mL, 약 180 μg/mL 내지 약 440 μg/mL, 약 180 μg/mL 내지 약 420 μg/mL, 약 180 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 180 μg/mL 내지 약 380 μg/mL, 약 180 μg/mL 내지 약 360 μg/mL, 약 180 μg/mL 내지 약 340 μg/mL, 약 180 μg/mL 내지 약 320 μg/mL, 약 180 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 180 μg/mL 내지 약 280 μg/mL, 약 180 μg/mL 내지 약 260 μg/mL, 약 180 μg/mL 내지 약 240 μg/mL, 약 180 μg/mL 내지 약 220 μg/mL, 약 180 μg/mL 내지 약 200 μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 480 μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 460 μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 440 μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 420 μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 380 μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 360 μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 340 μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 320 μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 280 μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 260 μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 240 μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 220 μg/mL, 약 220 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 220 μg/mL 내지 약 480 μg/mL, 약 220 μg/mL 내지 약 460 μg/mL, 약 220 μg/mL 내지 약 440 μg/mL, 약 220 μg/mL 내지 약 420 μg/mL, 약 220 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 220 μg/mL 내지 약 380 μg/mL, 약 220 μg/mL 내지 약 360 μg/mL, 약 220 μg/mL 내지 약 340 μg/mL, 약 220 μg/mL 내지 약 320 μg/mL, 약 220 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 220 μg/mL 내지 약 280 μg/mL, 약 220 μg/mL 내지 약 260 μg/mL, 약 220 μg/mL 내지 약 240 μg/mL, 약 240 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 240 μg/mL 내지 약 480 μg/mL, 약 240 μg/mL 내지 약 460 μg/mL, 약 240 μg/mL 내지 약 440 μg/mL, 약 240 μg/mL 내지 약 420 μg/mL, 약 240 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 240 μg/mL 내지 약 380 μg/mL, 약 240 μg/mL 내지 약 360 μg/mL, 약 240 μg/mL 내지 약 340 μg/mL, 약 240 μg/mL 내지 약 320 μg/mL, 약 240 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 240 μg/mL 내지 약 280 μg/mL, 약 240 μg/mL 내지 약 260 μg/mL, 약 260 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 260 μg/mL 내지 약 480 μg/mL, 약 260 μg/mL 내지 약 460 μg/mL, 약 260 μg/mL 내지 약 440 μg/mL, 약 260 μg/mL 내지 약 420 μg/mL, 약 260 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 260 μg/mL 내지 약 380 μg/mL, 약 260 μg/mL 내지 약 360 μg/mL, 약 260 μg/mL 내지 약 340 μg/mL, 약 260 μg/mL 내지 약 320 μg/mL, 약 260 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 260 μg/mL 내지 약 280 μg/mL, 약 280 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 280 μg/mL 내지 약 480 μg/mL, 약 280 μg/mL 내지 약 460 μg/mL, 약 280 μg/mL 내지 약 440 μg/mL, 약 280 μg/mL 내지 약 420 μg/mL, 약 280 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 280 μg/mL 내지 약 380 μg/mL, 약 280 μg/mL 내지 약 360 μg/mL, 약 280 μg/mL 내지 약 340 μg/mL, 약 280 μg/mL 내지 약 320 μg/mL, 약 280 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 480 μg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 460 μg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 440 μg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 420 μg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 380 μg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 360 μg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 340 μg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 320 μg/mL, 약 320 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 320 μg/mL 내지 약 480 μg/mL, 약 320 μg/mL 내지 약 460 μg/mL, 약 320 μg/mL 내지 약 440 μg/mL, 약 320 μg/mL 내지 약 420 μg/mL, 약 320 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 320 μg/mL 내지 약 380 μg/mL, 약 320 μg/mL 내지 약 360 μg/mL, 약 320 μg/mL 내지 약 340 μg/mL, 약 340 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 340 μg/mL 내지 약 480 μg/mL, 약 340 μg/mL 내지 약 460 μg/mL, 약 340 μg/mL 내지 약 440 μg/mL, 약 340 μg/mL 내지 약 420 μg/mL, 약 340 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 340 μg/mL 내지 약 380 μg/mL, 약 340 μg/mL 내지 약 360 μg/mL, 약 360 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 360 μg/mL 내지 약 480 μg/mL, 약 360 μg/mL 내지 약 460 μg/mL, 약 360 μg/mL 내지 약 440 μg/mL, 약 360 μg/mL 내지 약 420 μg/mL, 약 360 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 360 μg/mL 내지 약 380 μg/mL, 약 380 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 380 μg/mL 내지 약 480 μg/mL, 약 380 μg/mL 내지 약 460 μg/mL, 약 380 μg/mL 내지 약 440 μg/mL, 약 380 μg/mL 내지 약 420 μg/mL, 약 380 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 400 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 400 μg/mL 내지 약 480 μg/mL, 약 400 μg/mL 내지 약 460 μg/mL, 약 400 μg/mL 내지 약 440 μg/mL, 약 400 μg/mL 내지 약 420 μg/mL, 약 420 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 420 μg/mL 내지 약 480 μg/mL, 약 420 μg/mL 내지 약 460 μg/mL, 약 420 μg/mL 내지 약 440 μg/mL, 약 440 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 440 μg/mL 내지 약 480 μg/mL, 약 440 μg/mL 내지 약 460 μg/mL, 약 460 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 460 μg/mL 내지 약 480 μg/mL, 또는 약 480 μg/mL 내지 약 500 μg/mL의 트랜스페린(예: 인간 트랜스페린, 인간 홀로 트랜스페린(human holo transferin), 또는 이들의 조합)을 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 10 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 5 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 10 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 또는 약 180 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 IL-3(예: 인간 IL-3)을 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 550 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 350 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 250 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 10 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 550 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 350 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 250 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 550 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 350 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 250 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 550 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 350 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 250 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 550 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 350 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 250 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 550 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 350 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 250 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 550 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 350 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 250 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 550 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 350 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 250 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 550 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 350 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 250 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 550 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 350 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 550 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 350 ng/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 550 ng/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 550 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 450 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 450 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 450 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 450 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 450 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 450 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 450 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 450 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 450 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 450 ng/mL 내지 약 550 ng/mL, 약 450 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 500 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 500 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 500 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 500 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 500 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 500 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 500 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 500 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 500 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 500 ng/mL 내지 약 550 ng/mL, 약 550 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 550 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 550 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 550 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 550 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 550 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 550 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 550 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 550 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 600 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 600 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 600 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 600 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 600 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 600 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 600 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 600 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 650 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 650 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 650 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 650 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 650 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 650 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 650 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 700 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 700 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 700 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 700 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 700 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 700 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 750 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 750 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 750 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 750 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 750 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 800 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 800 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 800 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 800 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 850 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 850 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 850 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 900 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 900 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 950 ng/mL 내지 약 1 μg/mL의 SCF(예: 인간 줄기 세포 인자)를 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 nM 내지 약 200 nM, 약 0.1 nM 내지 약 180 nM, 약 0.1 nM 내지 약 160 nM, 약 0.1 nM 내지 약 140 nM, 약 0.1 nM 내지 약 120 nM, 약 0.1 nM 내지 약 100 nM, 약 0.1 nM 내지 약 80 nM, 약 0.1 nM 내지 약 60 nM, 약 0.1 nM 내지 약 50 nM, 약 0.1 nM 내지 약 40 nM, 약 0.1 nM 내지 약 30 nM, 약 0.1 nM 내지 약 25 nM, 약 0.1 nM 내지 약 20 nM, 약 0.1 nM 내지 약 15 nM, 약 0.1 nM 내지 약 10 nM, 약 0.1 nM 내지 약 5 nM, 약 0.1 nM 내지 약 2 nM, 약 0.1 nM 내지 약 1 nM, 약 1 nM 내지 약 200 nM, 약 1 nM 내지 약 180 nM, 약 1 nM 내지 약 160 nM, 약 1 nM 내지 약 140 nM, 약 1 nM 내지 약 120 nM, 약 1 nM 내지 약 100 nM, 약 1 nM 내지 약 80 nM, 약 1 nM 내지 약 60 nM, 약 1 nM 내지 약 50 nM, 약 1 nM 내지 약 40 nM, 약 1 nM 내지 약 30 nM, 약 1 nM 내지 약 25 nM, 약 1 nM 내지 약 20 nM, 약 1 nM 내지 약 15 nM, 약 1 nM 내지 약 10 nM, 약 1 nM 내지 약 5 nM, 약 1 nM 내지 약 2 nM, 약 2 nM 내지 약 200 nM, 약 2 nM 내지 약 180 nM, 약 2 nM 내지 약 160 nM, 약 2 nM 내지 약 140 nM, 약 2 nM 내지 약 120 nM, 약 2 nM 내지 약 100 nM, 약 2 nM 내지 약 80 nM, 약 2 nM 내지 약 60 nM, 약 2 nM 내지 약 50 nM, 약 2 nM 내지 약 40 nM, 약 2 nM 내지 약 30 nM, 약 2 nM 내지 약 25 nM, 약 2 nM 내지 약 20 nM, 약 2 nM 내지 약 15 nM, 약 2 nM 내지 약 10 nM, 약 2 nM 내지 약 5 nM, 약 5 nM 내지 약 200 nM, 약 5 nM 내지 약 180 nM, 약 5 nM 내지 약 160 nM, 약 5 nM 내지 약 140 nM, 약 5 nM 내지 약 120 nM, 약 5 nM 내지 약 100 nM, 약 5 nM 내지 약 80 nM, 약 5 nM 내지 약 60 nM, 약 5 nM 내지 약 50 nM, 약 5 nM 내지 약 40 nM, 약 5 nM 내지 약 30 nM, 약 5 nM 내지 약 25 nM, 약 5 nM 내지 약 20 nM, 약 5 nM 내지 약 15 nM, 약 5 nM 내지 약 10 nM, 약 10 nM 내지 약 200 nM, 약 10 nM 내지 약 180 nM, 약 10 nM 내지 약 160 nM, 약 10 nM 내지 약 140 nM, 약 10 nM 내지 약 120 nM, 약 10 nM 내지 약 100 nM, 약 10 nM 내지 약 80 nM, 약 10 nM 내지 약 60 nM, 약 10 nM 내지 약 50 nM, 약 10 nM 내지 약 40 nM, 약 10 nM 내지 약 30 nM, 약 10 nM 내지 약 25 nM, 약 10 nM 내지 약 20 nM, 약 10 nM 내지 약 15 nM, 약 15 nM 내지 약 200 nM, 약 15 nM 내지 약 180 nM, 약 15 nM 내지 약 160 nM, 약 15 nM 내지 약 140 nM, 약 15 nM 내지 약 120 nM, 약 15 nM 내지 약 100 nM, 약 15 nM 내지 약 80 nM, 약 15 nM 내지 약 60 nM, 약 15 nM 내지 약 50 nM, 약 15 nM 내지 약 40 nM, 약 15 nM 내지 약 30 nM, 약 15 nM 내지 약 25 nM, 약 15 nM 내지 약 20 nM, 약 20 nM 내지 약 200 nM, 약 20 nM 내지 약 180 nM, 약 20 nM 내지 약 160 nM, 약 20 nM 내지 약 140 nM, 약 20 nM 내지 약 120 nM, 약 20 nM 내지 약 100 nM, 약 20 nM 내지 약 80 nM, 약 20 nM 내지 약 60 nM, 약 20 nM 내지 약 50 nM, 약 20 nM 내지 약 40 nM, 약 20 nM 내지 약 30 nM, 약 20 nM 내지 약 25 nM, 약 25 nM 내지 약 200 nM, 약 25 nM 내지 약 180 nM, 약 25 nM 내지 약 160 nM, 약 25 nM 내지 약 140 nM, 약 25 nM 내지 약 120 nM, 약 25 nM 내지 약 100 nM, 약 25 nM 내지 약 80 nM, 약 25 nM 내지 약 60 nM, 약 25 nM 내지 약 50 nM, 약 25 nM 내지 약 40 nM, 약 25 nM 내지 약 30 nM, 약 30 nM 내지 약 200 nM, 약 30 nM 내지 약 180 nM, 약 30 nM 내지 약 160 nM, 약 30 nM 내지 약 140 nM, 약 30 nM 내지 약 120 nM, 약 30 nM 내지 약 100 nM, 약 30 nM 내지 약 80 nM, 약 30 nM 내지 약 60 nM, 약 30 nM 내지 약 50 nM, 약 30 nM 내지 약 40 nM, 약 40 nM 내지 약 200 nM, 약 40 nM 내지 약 180 nM, 약 40 nM 내지 약 160 nM, 약 40 nM 내지 약 140 nM, 약 40 nM 내지 약 120 nM, 약 40 nM 내지 약 100 nM, 약 40 nM 내지 약 80 nM, 약 40 nM 내지 약 60 nM, 약 40 nM 내지 약 50 nM, 약 50 nM 내지 약 200 nM, 약 50 nM 내지 약 180 nM, 약 50 nM 내지 약 160 nM, 약 50 nM 내지 약 140 nM, 약 50 nM 내지 약 120 nM, 약 50 nM 내지 약 100 nM, 약 50 nM 내지 약 80 nM, 약 50 nM 내지 약 60 nM, 약 60 nM 내지 약 200 nM, 약 60 nM 내지 약 180 nM, 약 60 nM 내지 약 160 nM, 약 60 nM 내지 약 140 nM, 약 60 nM 내지 약 120 nM, 약 60 nM 내지 약 100 nM, 약 60 nM 내지 약 80 nM, 약 80 nM 내지 약 200 nM, 약 80 nM 내지 약 180 nM, 약 80 nM 내지 약 160 nM, 약 80 nM 내지 약 140 nM, 약 80 nM 내지 약 120 nM, 약 80 nM 내지 약 100 nM, 약 100 nM 내지 약 200 nM, 약 100 nM 내지 약 180 nM, 약 100 nM 내지 약 160 nM, 약 100 nM 내지 약 140 nM, 약 100 nM 내지 약 120 nM, 약 120 nM 내지 약 200 nM, 약 120 nM 내지 약 180 nM, 약 120 nM 내지 약 160 nM, 약 120 nM 내지 약 140 nM, 약 140 nM 내지 약 200 nM, 약 140 nM 내지 약 180 nM, 약 140 nM 내지 약 160 nM, 약 160 nM 내지 약 200 nM, 약 160 nM 내지 약 180 nM, 또는 약 180 nM 내지 약 200 nM의 덱사메타손을 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 25 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 15 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 10 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 5 ng/mL, 5 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 25 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 15 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 10 ng/mL, 10 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 25 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 15 ng/mL, 15 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 25 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 20 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 25 ng/mL, 25 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 30 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 30 ng/mL 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360 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 120 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 140 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 160 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 180 ng/mL,180 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 180 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220 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 220 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 220 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 220 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 240 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 260 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 280 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 280 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 280 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 280 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 280 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 280 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 280 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 280 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 280 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 280 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 280 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 300 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 320 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 320 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 320 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 320 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 320 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 320 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 320 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 320 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 320 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 340 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 340 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 340 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 340 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 340 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 340 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 340 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 340 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 360 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 360 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 360 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 360 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 360 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 360 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 360 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 380 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 380 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 380 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 380 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 380 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 380 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 400 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 420 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 420 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 420 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 420 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 440 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 440 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 440 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 460 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 460 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 또는 약 480 ng/mL 내지 약 500 ng/mL의 EPO (예: 재조합 인간 EPO) 또는 EPO-모방체 펩티드를 포함한다. EPO-모방체 펩티드는 예를 들어, 정의된 화학적 링커 또는 더 큰 중합체 PEG 링커(예컨대 Johnson 및 Jolliffe의 문헌[Nephrology Dialysis Transplantation 15(9):1274-1277, 2000]에 기술된 것들)를 사용하는 EPO 모방체 (EMP1; GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG 서열번호 1) 또는 이의 펩티드 이량체, ERB1-7(예컨대, McConnell 등의 문헌[Biol. Chem. 379(10):1279-86, 1998]에 기술된 것들), EPO-R-유래 펩티드(ERP)(예컨대, Naranda 등의 문헌[PNAS 96(13):7569-7574, 1999]에 기술된 것들), Johnson 등의 문헌[Biochemistry 37(11):3699-3710, 1998]에 기술된 EMP20(YSCHFGPLTWVCK (서열번호 2)), AGEM400(하이드록시에틸 전분), 및 페골레지헤마티드(pegolsihematide)(예컨대, Gupta 및 Wish의 문헌[Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 27(5):345-350, 2018]에 기술된 것들)를 포함한다. EPO-모방체 펩티드의 추가 예는 당업계에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 35 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 약 15 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 5 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 2 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 35 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 1 μg/mL 약 15 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 5 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 2 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 35 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 2 μg/mL 약 15 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 5 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 35 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 5 μg/mL 약 15 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 35 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 10 μg/mL 약 15 μg/mL, 약 15 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 15 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 15 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 15 μg/mL 내지 약 35 μg/mL, 약 15 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 약 15 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 15 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 35 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 25 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 25 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 25 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 25 μg/mL 내지 약 35 μg/mL, 약 25 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 약 30 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 30 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 30 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 30 μg/mL 내지 약 35 μg/mL, 약 35 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 35 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 35 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 또는 약 45 μg/mL 내지 약 50 μg/mL의 인슐린(예: 인간 인슐린)을 포함한다. 본원에 기술된 제2 배양 배지 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 Iscove의 변형된 Dulbecco 배지(IMDM)를 포함한다. 본원에 기술된 제2 배양 배지 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 1 μg/mL 내지 약 10 μg/mL(또는 본원에 기술된 이 범위의 하위 범위 중 어느 하나)의 지질(예: 지질 혼합물)을 포함한다. 본원에 기술된 제2 배양 배지 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM(또는 본원에 기술된 이 범위의 하위 범위 중 어느 하나)의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 본원에 기술된 제2 배양 배지 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 0.1% w/v 내지 약 4% w/v(또는 본원에 기술된 이 범위의 하위 범위 중 어느 하나)의 인간 혈청 알부민을 포함한다. 본원에 기술된 제2 배양 배지 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1% w/v 내지 약 3% w/v(또는 본원에 기술된 이 범위의 하위 범위 중 어느 하나)의 폴록사머-188(P188)을 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 배양 배지는, 예를 들어 화학적으로 정의된 액체 배양 배지, 동물 성분이 없는 액체 배양 배지, 또는 동물 성분이 없는 화학적으로 정의된 액체 배양 배지, 및/또는 혈청이 없는 액체 배양 배지일 수 있다.
단계 A 전의 임의의 배양 단계
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예는, 단계 (a) 이전에, (i) 복수의 적혈구 전구 세포(예를 들어 본원에 기술된 또는 당업계에 알려진 예시적인 적혈구 전구 세포 중 어느 하나)를 용기(예를 들어 바이오리액터, 진탕 튜브, 또는 진탕 플라스크, 예를 들어 본원에 기술된 예시적인 바이오리액터, 진탕 튜브, 또는 진탕 플라스크 중 어느 하나)에 포함된 제1 배양 배지 배치하여 (예를 들어 약 0.1 x 105 세포/mL 내지 약 5 x 106 세포/mL, 약 0.1 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 106 세포/mL, 약 0.1 x 105 세포/mL 내지 약 3 x 106 세포/mL, 약 0.1 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 106 세포/mL, 약 0.1 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 0.1 x 105 세포/mL 내지 약 8 x 105 세포/mL, 약 0.1 x 105 세포/mL 내지 약 6 x 105 세포/mL, 약 0.1 x 105 세포/mL 내지 약 5 x 105 세포/mL, 약 0.1 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 105 세포/mL, 약 0.1 x 105 세포/mL 내지 약 3 x 105 세포/mL, 약 0.1 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 105 세포/mL, 0.1 x 105 세포/mL 내지 약 1.5 x 105 세포/mL, 약 0.1 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 105 세포/mL, 약 0.1 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 105 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 5 x 106 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 106 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 3 x 106 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 106 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 8 x 105 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 6 x 105 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 5 x 105 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 105 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 3 x 105 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 105 세포/mL, 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 1.5 x 105 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 105 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 5 x 106 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 106 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 3 x 106 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 106 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 8 x 105 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 6 x 105 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 5 x 105 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 105 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 3 x 105 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 105 세포/mL, 1 x 105 세포/mL 내지 약 1.5 x 105 세포/mL, 약 1.5 x 105 세포/mL 내지 약 5 x 106 세포/mL, 약 1.5 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 106 세포/mL, 약 1.5 x 105 세포/mL 내지 약 3 x 106 세포/mL, 약 1.5 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 106 세포/mL, 약 1.5 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 1.5 x 105 세포/mL 내지 약 8 x 105 세포/mL, 약 1.5 x 105 세포/mL 내지 약 6 x 105 세포/mL, 약 1.5 x 105 세포/mL 내지 약 5 x 105 세포/mL, 약 1.5 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 105 세포/mL, 약 1.5 x 105 세포/mL 내지 약 3 x 105 세포/mL, 약 1.5 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 105 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 5 x 106 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 106 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 3 x 106 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 106 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 8 x 105 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 6 x 105 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 5 x 105 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 105 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 3 x 105 세포/mL, 약 3 x 105 세포/mL 내지 약 5 x 106 세포/mL, 약 3 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 106 세포/mL, 약 3 x 105 세포/mL 내지 약 3 x 106 세포/mL, 약 3 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 106 세포/mL, 약 3 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 3 x 105 세포/mL 내지 약 8 x 105 세포/mL, 약 3 x 105 세포/mL 내지 약 6 x 105 세포/mL, 약 3 x 105 세포/mL 내지 약 5 x 105 세포/mL, 약 3 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 105 세포/mL, 약 4 x 105 세포/mL 내지 약 5 x 106 세포/mL, 약 4 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 106 세포/mL, 약 4 x 105 세포/mL 내지 약 3 x 106 세포/mL, 약 4 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 106 세포/mL, 약 4 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 4 x 105 세포/mL 내지 약 8 x 105 세포/mL, 약 4 x 105 세포/mL 내지 약 6 x 105 세포/mL, 약 4 x 105 세포/mL 내지 약 5 x 105 세포/mL, 약 5 x 105 세포/mL 내지 약 5 x 106 세포/mL, 약 5 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 106 세포/mL, 약 5 x 105 세포/mL 내지 약 3 x 106 세포/mL, 약 5 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 106 세포/mL, 약 5 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 5 x 105 세포/mL 내지 약 8 x 105 세포/mL, 약 5 x 105 세포/mL 내지 약 6 x 105 세포/mL, 약 6 x 105 세포/mL 내지 약 5 x 106 세포/mL, 약 6 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 106 세포/mL, 약 6 x 105 세포/mL 내지 약 3 x 106 세포/mL, 약 6 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 106 세포/mL, 약 6 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 6 x 105 세포/mL 내지 약 8 x 105 세포/mL, 약 8 x 105 세포/mL 내지 약 5 x 106 세포/mL, 약 8 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 106 세포/mL, 약 8 x 105 세포/mL 내지 약 3 x 106 세포/mL, 약 8 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 106 세포/mL, 약 8 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 1 x 106 세포/mL 내지 약 5 x 106 세포/mL, 약 1 x 106 세포/mL 내지 약 4 x 106 세포/mL, 약 1 x 106 세포/mL 내지 약 3 x 106 세포/mL, 약 1 x 106 세포/mL 내지 약 2 x 106 세포/mL, 약 2 x 106 세포/mL 내지 약 5 x 106 세포/mL, 약 2 x 106 세포/mL 내지 약 4 x 106 세포/mL, 약 2 x 106 세포/mL 내지 약 3 x 106 세포/mL, 약 3 x 106 세포/mL 내지 약 5 x 106 세포/mL, 약 3 x 106 세포/mL 내지 약 4 x 106 세포/mL, 또는 약 4 x 106 세포/mL 내지 약 5 x 106 세포/mL의 초기 세포 밀도를 갖는) 제1 세포 배양물을 수득하는 단계; 및 (ii) 제1 세포 배양물을 약 1일 내지 약 15일(예를 들어 약 1일 내지 약 14일, 약 1일 내지 약 13일, 약 1일 내지 약 12일, 약 1일 내지 약 11일, 약 1일 내지 약 10일, 약 1일 내지 약 9일, 약 1일 내지 약 8일, 약 1일 내지 약 7일, 약 1일 내지 약 6일, 약 1일 내지 약 5일, 약 1일 내지 약 4일, 약 1일 내지 약 3일, 약 1일 내지 약 2일, 약 2일 내지 약 15일, 약 2일 내지 약 14일, 약 2일 내지 약 13일, 약 2일 내지 약 12일, 약 2일 내지 약 11일, 약 2일 내지 약 10일, 약 2일 내지 약 9일, 약 2일 내지 약 8일, 약 2일 내지 약 7일, 약 2일 내지 약 6일, 약 2일 내지 약 5일, 약 2일 내지 약 4일, 약 2일 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 15일, 약 3일 내지 약 14일, 약 3일 내지 약 13일, 약 3일 내지 약 12일, 약 3일 내지 약 11일, 약 3일 내지 약 10일, 약 3일 내지 약 9일, 약 3일 내지 약 8일, 약 3일 내지 약 7일, 약 3일 내지 약 6일, 약 3일 내지 약 5일, 약 3일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 15일, 약 4일 내지 약 14일, 약 4일 내지 약 13일, 약 4일 내지 약 12일, 약 4일 내지 약 11일, 약 4일 내지 약 10일, 약 4일 내지 약 9일, 약 4일 내지 약 8일, 약 4일 내지 약 7일, 약 4일 내지 약 6일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 15일, 약 5일 내지 약 14일, 약 5일 내지 약 13일, 약 5일 내지 약 12일, 약 5일 내지 약 11일, 약 5일 내지 약 10일, 약 5일 내지 약 9일, 약 5일 내지 약 8일, 약 5일 내지 약 7일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 15일, 약 6일 내지 약 14일, 약 6일 내지 약 13일, 약 6일 내지 약 12일, 약 6일 내지 약 11일, 약 6일 내지 약 10일, 약 6일 내지 약 9일, 약 6일 내지 약 8일, 약 6일 내지 약 7일, 약 7일 내지 약 15일, 약 7일 내지 약 14일, 약 7일 내지 약 13일, 약 7일 내지 약 12일, 약 7일 내지 약 11일, 약 7일 내지 약 10일, 약 7일 내지 약 9일, 약 7일 내지 약 8일, 약 8일 내지 약 15일, 약 8일 내지 약 14일, 약 8일 내지 약 13일, 약 8일 내지 약 12일, 약 8일 내지 약 11일, 약 8일 내지 약 10일, 약 8일 내지 약 9일, 약 9일 내지 약 15일, 약 9일 내지 약 14일, 약 9일 내지 약 13일, 약 9일 내지 약 12일, 약 9일 내지 약 11일, 약 9일 내지 약 10일, 약 10일 내지 약 15일, 약 10일 내지 약 14일, 약 10일 내지 약 13일, 약 10일 내지 약 12일, 약 10일 내지 약 11일, 약 11일 내지 약 15일, 약 11일 내지 약 14일, 약 11일 내지 약 13일, 약 11일 내지 약 12일, 약 12일 내지 약 15일, 약 12일 내지 약 14일, 약 12일 내지 약 13일, 약 13일 내지 약 15일, 약 13일 내지 약 14일, 또는 약 14일 내지 약 15일) 동안 배양(예: 배치 배양, 유가 배양, 또는 관류 배양)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 단계 (i)은 진탕 플라스크(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 부피 중 어느 하나를 갖는 본원에 기술된 예시적인 진탕 플라스크 중 어느 하나) 내에 포함된 제1 배양 배지에 복수의 적혈구 전구 세포(예를 들어 본원에 기술된 또는 당업계에 알려진 예시적인 적혈구 전구 세포 중 어느 하나)를 배치하는 단계를 포함한다. 이러한 구현예에서, 단계 (ii)는 진탕 플라스크에서 제1 세포 배양물을 0.1 x g 내지 약 50 x g(또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나)로 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (i)은 진탕 튜브(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 부피 중 어느 하나를 갖는 본원에 기술된 예시적인 진탕 튜브 중 어느 하나) 내에 포함된 제1 배양 배지에 복수의 적혈구 전구 세포(예를 들어 본원에 기술된 또는 당업계에 알려진 예시적인 적혈구 전구 세포 중 어느 하나)를 배치하는 단계를 포함한다. 이러한 구현예에서, 단계 (ii)는 진탕 튜브에서 제1 세포 배양물을 약 0.1 x g 내지 약 50 x g(또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나)로 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (i)은 본원에 기술된 예시적인 부피 중 어느 하나를 갖는 본원에 기술된 배양 백에 복수의 적혈구 전구 세포(예를 들어 본원에 기술된 또는 당업계에 알려진 예시적인 적혈구 전구 세포 중 어느 하나)를 배치하는 단계를 포함한다. 이러한 구현예에서, 단계 (ii)는 배양 백에서 제1 세포 배양물을 분당 약 10 진동 사이클 내지 약 50 진동 사이클(또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나)의 진동 속도로 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (ii)는 제1 세포 배양물을 배치 배양하는 단계를 포함한다.
유가 배양
일부 구현예에서, 단계 (ii)는 제1 세포 배양물을 유가 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)에서의 유가 배양은 시간 경과에 따라 제1 배양 배지(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제1 배양 배지 중 어느 하나)의 추가 부피를 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지의 추가 부피는 시간의 경과에 따라 제1 세포 배양물에 연속으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지의 추가 부피는 시간 경과에 따라 주기적으로 (예를 들어, 3일마다 1회, 2일마다 1회, 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회, 1일 4회, 1일 5회, 1일 6회, 1일 7회, 1일 8회, 1일 9회, 1일 10회, 1일 11회, 또는 1일 12회) 제1 세포 배양물에 첨가된다. 일부 구현예에서, 단계 (i) 직후에 제1 세포 배양물 부피의 약 0.1x 내지 약 10x(예를 들어 약 0.1x 내지 약 9.5x, 약 0.1x 내지 약 9.0x, 약 0.1x 내지 약 8.5x, 약 0.1x 내지 약 8.0x, 약 0.1x 내지 약 7.5x, 약 0.1x 내지 약 7.0x, 약 0.1x 내지 약 6.5x, 약 0.1x 내지 약 6.0x, 약 0.1x 내지 약 5.5x, 약 0.1x 내지 약 5.0x, 약 0.1x 내지 약 4.5x, 약 0.1x 내지 약 4.0x, 약 0.1x 내지 약 3.5x, 약 0.1x 내지 약 3.0x, 약 0.1x 내지 약 2.5x, 약 0.1x 내지 약 2.0x, 약 0.1x 내지 약 1.5x, 약 0.1x 내지 약 1.0x, 약 0.1x 내지 약 0.5x, 약 0.1x 내지 약 0.3x, 약 0.1x 내지 약 0.2x, 약 0.2x 내지 약 10x, 약 0.2x 내지 약 9.5x, 약 0.2x 내지 약 9.0x, 약 0.2x 내지 약 8.5x, 약 0.2x 내지 약 8.0x, 약 0.2x 내지 약 7.5x, 약 0.2x 내지 약 7.0x, 약 0.2x 내지 약 6.5x, 약 0.2x 내지 약 6.0x, 약 0.2x 내지 약 5.5x, 약 0.2x 내지 약 5.0x, 약 0.2x 내지 약 4.5x, 약 0.2x 내지 약 4.0x, 약 0.2x 내지 약 3.5x, 약 0.2x 내지 약 3.0x, 약 0.2x 내지 약 2.5x, 약 0.2x 내지 약 2.0x, 약 0.2x 내지 약 1.5x, 약 0.2x 내지 약 1.0x, 약 0.2x 내지 약 0.5x, 약 0.2x 내지 약 0.3x, 약 0.3x 내지 약 10x, 약 0.3x 내지 약 9.5x, 약 0.3x 내지 약 9.0x, 약 0.3x 내지 약 8.5x, 약 0.3x 내지 약 8.0x, 약 0.3x 내지 약 7.5x, 약 0.3x 내지 약 7.0x, 약 0.3x 내지 약 6.5x, 약 0.3x 내지 약 6.0x, 약 0.3x 내지 약 5.5x, 약 0.3x 내지 약 5.0x, 약 0.3x 내지 약 4.5x, 약 0.3x 내지 약 4.0x, 약 0.3x 내지 약 3.5x, 약 0.3x 내지 약 3.0x, 약 0.3x 내지 약 2.5x, 약 0.3x 내지 약 2.0x, 약 0.3x 내지 약 1.5x, 약 0.3x 내지 약 1.0x, 약 0.3x 내지 약 0.5x, 약 0.5x 내지 약 10x, 약 0.5x 내지 약 9.5x, 약 0.5x 내지 약 9.0x, 약 0.5x 내지 약 8.5x, 약 0.5x 내지 약 8.0x, 약 0.5x 내지 약 7.5x, 약 0.5x 내지 약 7.0x, 약 0.5x 내지 약 6.5x, 약 0.5x 내지 약 6.0x, 약 0.5x 내지 약 5.5x, 약 0.5x 내지 약 5.0x, 약 0.5x 내지 약 4.5x, 약 0.5x 내지 약 4.0x, 약 0.5x 내지 약 3.5x, 약 0.5x 내지 약 3.0x, 약 0.5x 내지 약 2.5x, 약 0.5x 내지 약 2.0x, 약 0.5x 내지 약 1.5x, 약 0.5x 내지 약 1.0x, 약 1.0x 내지 약 10x, 약 1.0x 내지 약 9.5x, 약 1.0x 내지 약 9.0x, 약 1.0x 내지 약 8.5x, 약 1.0x 내지 약 8.0x, 약 1.0x 내지 약 7.5x, 약 1.0x 내지 약 7.0x, 약 1.0x 내지 약 6.5x, 약 1.0x 내지 약 6.0x, 약 1.0x 내지 약 5.5x, 약 1.0x 내지 약 5.0x, 약 1.0x 내지 약 4.5x, 약 1.0x 내지 약 4.0x, 약 1.0x 내지 약 3.5x, 약 1.0x 내지 약 3.0x, 약 1.0x 내지 약 2.5x, 약 1.0x 내지 약 2.0x, 약 1.0x 내지 약 1.5x, 약 1.5x 내지 약 10x, 약 1.5x 내지 약 9.5x, 약 1.5x 내지 약 9.0x, 약 1.5x 내지 약 8.5x, 약 1.5x 내지 약 8.0x, 약 1.5x 내지 약 7.5x, 약 1.5x 내지 약 7.0x, 약 1.5x 내지 약 6.5x, 약 1.5x 내지 약 6.0x, 약 1.5x 내지 약 5.5x, 약 1.5x 내지 약 5.0x, 약 1.5x 내지 약 4.5x, 약 1.5x 내지 약 4.0x, 약 1.5x 내지 약 3.5x, 약 1.5x 내지 약 3.0x, 약 1.5x 내지 약 2.5x, 약 1.5x 내지 약 2.0x, 약 2.0x 내지 약 10x, 약 2.0x 내지 약 9.5x, 약 2.0x 내지 약 9.0x, 약 2.0x 내지 약 8.5x, 약 2.0x 내지 약 8.0x, 약 2.0x 내지 약 7.5x, 약 2.0x 내지 약 7.0x, 약 2.0x 내지 약 6.5x, 약 2.0x 내지 약 6.0x, 약 2.0x 내지 약 5.5x, 약 2.0x 내지 약 5.0x, 약 2.0x 내지 약 4.5x, 약 2.0x 내지 약 4.0x, 약 2.0x 내지 약 3.5x, 약 2.0x 내지 약 3.0x, 약 2.0x 내지 약 2.5x, 약 2.5x 내지 약 10x, 약 2.5x 내지 약 9.5x, 약 2.5x 내지 약 9.0x, 약 2.5x 내지 약 8.5x, 약 2.5x 내지 약 8.0x, 약 2.5x 내지 약 7.5x, 약 2.5x 내지 약 7.0x, 약 2.5x 내지 약 6.5x, 약 2.5x 내지 약 6.0x, 약 2.5x 내지 약 5.5x, 약 2.5x 내지 약 5.0x, 약 2.5x 내지 약 4.5x, 약 2.5x 내지 약 4.0x, 약 2.5x 내지 약 3.5x, 약 2.5x 내지 약 3.0x, 약 3.0x 내지 약 10x, 약 3.0x 내지 약 9.5x, 약 3.0x 내지 약 9.0x, 약 3.0x 내지 약 8.5x, 약 3.0x 내지 약 8.0x, 약 3.0x 내지 약 7.5x, 약 3.0x 내지 약 7.0x, 약 3.0x 내지 약 6.5x, 약 3.0x 내지 약 6.0x, 약 3.0x 내지 약 5.5x, 약 3.0x 내지 약 5.0x, 약 3.0x 내지 약 4.5x, 약 3.0x 내지 약 4.0x, 약 3.0x 내지 약 3.5x, 약 3.5x 내지 약 10x, 약 3.5x 내지 약 9.5x, 약 3.5x 내지 약 9.0x, 약 3.5x 내지 약 8.5x, 약 3.5x 내지 약 8.0x, 약 3.5x 내지 약 7.5x, 약 3.5x 내지 약 7.0x, 약 3.5x 내지 약 6.5x, 약 3.5x 내지 약 6.0x, 약 3.5x 내지 약 5.5x, 약 3.5x 내지 약 5.0x, 약 3.5x 내지 약 4.5x, 약 3.5x 내지 약 4.0x, 약 4.0x 내지 약 10x, 약 4.0x 내지 약 9.5x, 약 4.0x 내지 약 9.0x, 약 4.0x 내지 약 8.5x, 약 4.0x 내지 약 8.0x, 약 4.0x 내지 약 7.5x, 약 4.0x 내지 약 7.0x, 약 4.0x 내지 약 6.5x, 약 4.0x 내지 약 6.0x, 약 4.0x 내지 약 5.5x, 약 4.0x 내지 약 5.0x, 약 4.0x 내지 약 4.5x, 약 4.5x 내지 약 10x, 약 4.5x 내지 약 9.5x, 약 4.5x 내지 약 9.0x, 약 4.5x 내지 약 8.5x, 약 4.5x 내지 약 8.0x, 약 4.5x 내지 약 7.5x, 약 4.5x 내지 약 7.0x, 약 4.5x 내지 약 6.5x, 약 4.5x 내지 약 6.0x, 약 4.5x 내지 약 5.5x, 약 4.5x 내지 약 5.0x, 약 5.0x 내지 약 10x, 약 5.0x 내지 약 9.5x, 약 5.0x 내지 약 9.0x, 약 5.0x 내지 약 8.5x, 약 5.0x 내지 약 8.0x, 약 5.0x 내지 약 7.5x, 약 5.0x 내지 약 7.0x, 약 5.0x 내지 약 6.5x, 약 5.0x 내지 약 6.0x, 약 5.0x 내지 약 5.5x, 약 5.5x 내지 약 10x, 약 5.5x 내지 약 9.5x, 약 5.5x 내지 약 9.0x, 약 5.5x 내지 약 8.5x, 약 5.5x 내지 약 8.0x, 약 5.5x 내지 약 7.5x, 약 5.5x 내지 약 7.0x, 약 5.5x 내지 약 6.5x, 약 5.5x 내지 약 6.0x, 약 6.0x 내지 약 10x, 약 6.0x 내지 약 9.5x, 약 6.0x 내지 약 9.0x, 약 6.0x 내지 약 8.5x, 약 6.0x 내지 약 8.0x, 약 6.0x 내지 약 7.5x, 약 6.0x 내지 약 7.0x, 약 6.0x 내지 약 6.5x, 약 6.5x 내지 약 10x, 약 6.5x 내지 약 9.5x, 약 6.5x 내지 약 9.0x, 약 6.5x 내지 약 8.5x, 약 6.5x 내지 약 8.0x, 약 6.5x 내지 약 7.5x, 약 6.5x 내지 약 7.0x, 약 7.0x 내지 약 10x, 약 7.0x 내지 약 9.5x, 약 7.0x 내지 약 9.0x, 약 7.0x 내지 약 8.5x, 약 7.0x 내지 약 8.0x, 약 7.0x 내지 약 7.5x, 약 7.5x 내지 약 10x, 약 7.5x 내지 약 9.5x, 약 7.5x 내지 약 9.0x, 약 7.5x 내지 약 8.5x, 약 7.5x 내지 약 8.0x, 약 8.0x 내지 약 10x, 약 8.0x 내지 약 9.5x, 약 8.0x 내지 약 9.0x, 약 8.0x 내지 약 8.5x, 약 8.5x 내지 약 10x, 약 8.5x 내지 약 9.5x, 약 8.5x 내지 약 9.0x, 약 9.0x 내지 약 10x, 약 9.0x 내지 약 9.5x, 또는 약 9.5x 내지 약 10x)가 각각 24시간의 증분으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 제1 배양 배지를 제1 세포 배양물에 첨가하는 것은 제1 세포 배양물이 목표 특정 세포 밀도, 예를 들어 약 1.0 x 106 세포/mL, 약 1.5 x 106 세포/mL, 약 2.0 x 106 세포/mL, 약 2.5 x 106 세포/mL, 약 3.0 x 106 세포/mL, 약 3.5 x 106 세포/mL, 약 4.0 x 106 세포/mL, 약 4.5 x 106 세포/mL, 약 5.0 x 106 세포/mL, 약 5.5 x 106 세포/mL, 약 6.0 x 106 세포/mL, 약 6.5 x 106 세포/mL, 약 7.0 x 106 세포/mL, 약 7.5 x 106 세포/mL, 약 8.0 x 106 세포/mL, 약 8.5 x 106 세포/mL, 약 9.0 x 106 세포/mL, 약 9.5 x 106 세포/mL, 또는 약 1.0 x 107 세포/mL에 도달할 때 시작된다.
관류 배양
일부 구현예에서, 단계 (ii)는 제1 세포 배양물을 관류 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 (예를 들어 본원에 기술된 예시적인 부피 중 어느 하나를 갖는 본원에 기술된 바이오리액터 중 어느 하나에서) 제1 세포 배양물을 약 10 W/m3 내지 약 200 W/m3(예를 들어 약 10 W/m3 내지 약 180 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 160 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 140 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 120 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 100 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 80 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 60 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 40 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 35 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 30 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 25 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 20 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 15 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 200 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 180 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 160 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 140 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 120 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 100 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 80 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 60 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 40 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 35 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 30 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 25 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 20 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 200 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 180 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 160 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 140 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 120 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 100 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 80 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 60 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 40 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 35 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 30 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 25 W/m3, 약 25 W/m3 내지 약 200 W/m3, 약 25 W/m3 내지 약 180 W/m3, 약 25 W/m3 내지 약 160 W/m3, 약 25 W/m3 내지 약 140 W/m3, 약 25 W/m3 내지 약 120 W/m3, 약 25 W/m3 내지 약 100 W/m3, 약 25 W/m3 내지 약 80 W/m3, 약 25 W/m3 내지 약 60 W/m3, 약 25 W/m3 내지 약 40 W/m3, 약 25 W/m3 내지 약 35 W/m3, 약 25 W/m3 내지 약 30 W/m3, 약 30 W/m3 내지 약 200 W/m3, 약 30 W/m3 내지 약 180 W/m3, 약 30 W/m3 내지 약 160 W/m3, 약 30 W/m3 내지 약 140 W/m3, 약 30 W/m3 내지 약 120 W/m3, 약 30 W/m3 내지 약 100 W/m3, 약 30 W/m3 내지 약 80 W/m3, 약 30 W/m3 내지 약 60 W/m3, 약 30 W/m3 내지 약 40 W/m3, 약 30 W/m3 내지 약 35 W/m3, 약 35 W/m3 내지 약 200 W/m3, 약 35 W/m3 내지 약 180 W/m3, 약 35 W/m3 내지 약 160 W/m3, 약 35 W/m3 내지 약 140 W/m3, 약 35 W/m3 내지 약 120 W/m3, 약 35 W/m3 내지 약 100 W/m3, 약 35 W/m3 내지 약 80 W/m3, 약 35 W/m3 내지 약 60 W/m3, 약 35 W/m3 내지 약 40 W/m3, 약 40 W/m3 내지 약 200 W/m3, 약 40 W/m3 내지 약 180 W/m3, 약 40 W/m3 내지 약 160 W/m3, 약 40 W/m3 내지 약 140 W/m3, 약 40 W/m3 내지 약 120 W/m3, 약 40 W/m3 내지 약 100 W/m3, 약 40 W/m3 내지 약 80 W/m3, 약 40 W/m3 내지 약 60 W/m3, 약 60 W/m3 내지 약 200 W/m3, 약 60 W/m3 내지 약 180 W/m3, 약 60 W/m3 내지 약 160 W/m3, 약 60 W/m3 내지 약 140 W/m3, 약 60 W/m3 내지 약 120 W/m3, 약 60 W/m3 내지 약 100 W/m3, 약 60 W/m3 내지 약 80 W/m3, 약 80 W/m3 내지 약 200 W/m3, 약 80 W/m3 내지 약 180 W/m3, 약 80 W/m3 내지 약 160 W/m3, 약 80 W/m3 내지 약 140 W/m3, 약 80 W/m3 내지 약 120 W/m3, 약 80 W/m3 내지 약 100 W/m3, 약 100 W/m3 내지 약 200 W/m3, 약 100 W/m3 내지 약 180 W/m3, 약 100 W/m3 내지 약 160 W/m3, 약 100 W/m3 내지 약 140 W/m3, 약 100 W/m3 내지 약 120 W/m3, 약 120 W/m3 내지 약 200 W/m3, 약 120 W/m3 내지 약 180 W/m3, 약 120 W/m3 내지 약 160 W/m3, 약 120 W/m3 내지 약 140 W/m3, 약 140 W/m3 내지 약 200 W/m3, 약 140 W/m3 내지 약 180 W/m3, 약 140 W/m3 내지 약 160 W/m3, 약 160 W/m3 내지 약 200 W/m3, 약 160 W/m3 내지 약 180 W/m3, 및 약 180 W/m3 내지 약 200 W/m3)의 P/V 값으로 교반하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (ii)에서의 관류 배양은 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 8 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 6 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 5 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 4 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 2 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 1 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 0.5 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 0.1 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 8 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 6 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 5 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 4 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 2 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 1 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 0.5 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 8 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 6 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 5 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 4 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 2 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 1 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 8 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 6 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 5 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 4 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 2 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 8 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 6 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 5 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 4 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 8 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 6 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 5 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 8 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 6 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 8 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 30 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 30 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 30 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 30 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 30 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 30 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 35 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 35 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 35 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 35 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 35 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 40 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 40 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 40 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 40 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 45 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 45 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 45 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 50 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 50 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 또는 약 55 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일의 관류 속도로 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 관류 속도는 시간 경과에 따라 증가된다.
일부 구현예에서, 단계 (ii)에서의 관류 배양은 일당 약 0.1 용기 부피(VVD) 내지 약 3 VVD(예를 들어 약 0.1 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 2.4 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 2.2 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 2.0 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 1.8 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 1.6 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 1.4 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 1.2 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 1.0 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 0.8 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 0.6 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 0.4 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 0.2 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 3 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 2.4 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 2.2 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 2.0 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 1.8 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 1.6 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 1.4 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 1.2 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 1.0 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 0.8 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 0.6 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 0.4 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 3 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 2.4 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 2.2 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 2.0 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 1.8 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 1.6 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 1.4 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 1.2 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 1.0 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 0.8 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 0.6 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 3 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 2.4 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 2.2 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 2.0 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 1.8 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 1.6 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 1.4 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 1.2 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 1.0 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 0.8 VVD, 약 0.8 VVD 내지 약 3 VVD, 약 0.8 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 0.8 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 0.8 VVD 내지 약 2.4 VVD, 약 0.8 VVD 내지 약 2.2 VVD, 약 0.8 VVD 내지 약 2.0 VVD, 약 0.8 VVD 내지 약 1.8 VVD, 약 0.8 VVD 내지 약 1.6 VVD, 약 0.8 VVD 내지 약 1.4 VVD, 약 0.8 VVD 내지 약 1.2 VVD, 약 0.8 VVD 내지 약 1.0 VVD, 약 1.0 VVD 내지 약 3 VVD, 약 1.0 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 1.0 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 1.0 VVD 내지 약 2.4 VVD, 약 1.0 VVD 내지 약 2.2 VVD, 약 1.0 VVD 내지 약 2.0 VVD, 약 1.0 VVD 내지 약 1.8 VVD, 약 1.0 VVD 내지 약 1.6 VVD, 약 1.0 VVD 내지 약 1.4 VVD, 약 1.0 VVD 내지 약 1.2 VVD, 약 1.2 VVD 내지 약 3 VVD, 약 1.2 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 1.2 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 1.2 VVD 내지 약 2.4 VVD, 약 1.2 VVD 내지 약 2.2 VVD, 약 1.2 VVD 내지 약 2.0 VVD, 약 1.2 VVD 내지 약 1.8 VVD, 약 1.2 VVD 내지 약 1.6 VVD, 약 1.2 VVD 내지 약 1.4 VVD, 약 1.4 VVD 내지 약 3 VVD, 약 1.4 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 1.4 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 1.4 VVD 내지 약 2.4 VVD, 약 1.4 VVD 내지 약 2.2 VVD, 약 1.4 VVD 내지 약 2.0 VVD, 약 1.4 VVD 내지 약 1.8 VVD, 약 1.4 VVD 내지 약 1.6 VVD, 약 1.6 VVD 내지 약 3 VVD, 약 1.6 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 1.6 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 1.6 VVD 내지 약 2.4 VVD, 약 1.6 VVD 내지 약 2.2 VVD, 약 1.6 VVD 내지 약 2.0 VVD, 약 1.6 VVD 내지 약 1.8 VVD, 약 1.8 VVD 내지 약 3 VVD, 약 1.8 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 1.8 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 1.8 VVD 내지 약 2.4 VVD, 약 1.8 VVD 내지 약 2.2 VVD, 약 1.8 VVD 내지 약 2.0 VVD, 약 2.0 VVD 내지 약 3 VVD, 약 2.0 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 2.0 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 2.0 VVD 내지 약 2.4 VVD, 약 2.0 VVD 내지 약 2.2 VVD, 약 2.2 VVD 내지 약 3 VVD, 약 2.2 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 2.2 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 2.2 VVD 내지 약 2.4 VVD, 약 2.4 VVD 내지 약 3 VVD, 약 2.4 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 2.4 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 2.6 VVD 내지 약 3 VVD, 약 2.6 VVD 내지 약 2.8 VVD, 또는 약 2.8 VVD 내지 약 3 VVD)의 관류 속도를 사용해 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 단계 (ii)에서의 관류 배양은 배양 배지(예를 들어, 제1 배양 배지(예를 들어, 본원에 기술된 예시적인 제1 배양 배지 중 어느 하나))의 추가 부피를 시간 경과에 따라 제1 세포 배양물에 적어도 부분적으로 첨가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 배양 배지(예를 들어, 제1 배양 배지(예를 들어, 본원에 기술된 예시적인 제1 배양 배지 중 어느 하나))의 추가 부피는 시간 경과에 따라 연속으로 제1 세포 배양물에 첨가된다. 일부 구현예에서, 배양 배지(예를 들어, 제1 배양 배지(예를 들어, 본원에 기술된 예시적인 제1 배양 배지 중 어느 하나))의 추가 부피는 시간 경과에 따라 주기적으로 (예를 들어, 3일마다 1회, 2일마다 1회, 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회, 1일 4회, 1일 5회, 1일 6회, 1일 7회, 1일 8회, 1일 9회, 1일 10회, 1일 11회, 또는 1일 12회) 제1 세포 배양물에 첨가된다. 배양 배지(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제1 배양 배지 중 어느 하나)의 첨가는 기계적으로, 예를 들어 연동 펌프 또는 관류 펌프를 사용하여, 또는 수동으로(예를 들어 멸균 피펫팅에 의해) 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 단계 (ii)에서의 관류 배양은 시간 경과에 따라 배양 배지(예를 들어 실질적으로 세포가 없는 배양 배지)의 부피를 적어도 부분적으로 제거하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 배양 배지(예를 들어 실질적으로 세포가 없는 배양 배지)는 시간 경과에 따라 연속으로 제거된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 시간 경과에 따라 주기적으로 (예를 들어, 3일마다 1회, 2일마다 1회, 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회, 1일 4회, 1일 5회, 1일 6회, 1일 7회, 1일 8회, 1일 9회, 1일 10회, 1일 11회, 또는 1일 12회) 제거된다. 배양 배지(예를 들어 실질적으로 세포가 없는 배양 배지)의 제거는 기계적으로, 예를 들어 접선 유동 여과(TFF) 또는 교번 유동 여과(ATF)를 사용하여, 또는 수동으로(예를 들어 멸균 피펫팅에 의해) 수행될 수 있다. 접선 유동 여과의 추가적인 비제한적인 양태가 본원에 기술된다. 일부 구현예에서, 관류 배양은 접선 여과(예를 들어 접선 유동 여과(TFF) 또는 교번 접선 여과(ATF))의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 법선 여과(예를 들어 접선 유동 여과 또는 교번 접선 여과)는 약 10 nm 내지 약 6.0 μm, 약 10 nm 내지 약 5.5 μm, 약 10 nm 내지 약 5.0 μm, 약 10 nm 내지 약 4.5 μm, 약 10 nm 내지 약 4.0 μm, 약 10 nm 내지 약 3.5 μm, 약 10 nm 내지 약 3.0 μm, 약 10 nm 내지 약 2.5 μm, 약 10 nm 내지 약 2.0 μm, 약 10 nm 내지 약 1.5 μm, 약 10 nm 내지 약 1.0 μm, 약 10 nm 내지 약 0.5 μm, 약 10 nm 내지 약 0.2 μm, 10 nm 내지 약 0.1 μm, 약 10 nm 내지 약 50 nm, 약 50 nm 내지 약 6.0 μm, 약 50 nm 내지 약 5.5 μm, 약 50 nm 내지 약 5.0 μm, 약 50 nm 내지 약 4.5 μm, 약 50 nm 내지 약 4.0 μm, 약 50 nm 내지 약 3.5 μm, 약 50 nm 내지 약 3.0 μm, 약 50 nm 내지 약 2.5 μm, 약 50 nm 내지 약 2.0 μm, 약 50 nm 내지 약 1.5 μm, 약 50 nm 내지 약 1.0 μm, 약 50 nm 내지 약 0.5 μm, 약 50 nm 내지 약 0.2 μm, 약 50 nm 내지 약 0.1 μm, 약 0.1 μm 내지 약 6.0 μm, 약 0.1 μm 내지 약 5.5 μm, 약 0.1 μm 내지 약 5.0 μm, 약 0.1 μm 내지 약 4.5 μm, 약 0.1 μm 내지 약 4.0 μm, 약 0.1 μm 내지 약 3.5 μm, 약 0.1 μm 내지 약 3.0 μm, 약 0.1 μm 내지 약 2.5 μm, 약 0.1 μm 내지 약 2.0 μm, 약 0.1 μm 내지 약 1.5 μm, 약 0.1 μm 내지 약 1.0 μm, 약 0.1 μm 내지 약 0.5 μm, 약 0.1 μm 내지 약 0.2 μm, 약 0.2 μm 내지 약 6.0 μm, 약 0.2 μm 내지 약 5.5 μm, 약 0.2 μm 내지 약 5.0 μm, 약 0.2 μm 내지 약 4.5 μm, 약 0.2 μm 내지 약 4.0 μm, 약 0.2 μm 내지 약 3.5 μm, 약 0.2 μm 내지 약 3.0 μm, 약 0.2 μm 내지 약 2.5 μm, 약 0.2 μm 내지 약 2.0 μm, 약 0.2 μm 내지 약 1.5 μm, 약 0.2 μm 내지 약 1.0 μm, 약 0.2 μm 내지 약 0.5 μm, 약 0.5 μm 내지 약 6.0 μm, 약 0.5 μm 내지 약 5.5 μm, 약 0.5 μm 내지 약 5.0 μm, 약 0.5 μm 내지 약 4.5 μm, 약 0.5 μm 내지 약 4.0 μm, 약 0.5 μm 내지 약 3.5 μm, 약 0.5 μm 내지 약 3.0 μm, 약 0.5 μm 내지 약 2.5 μmM, 약 0.5 μm 내지 약 2.0 μm, 약 0.5 μm 내지 약 1.5 μm, 약 0.5 μm 내지 약 1.0 μm, 약 1.0 μm 내지 약 6.0 μm, 약 1.0 μm 내지 약 5.5 μm, 약 1.0 μm 내지 약 5.0 μm, 약 1.0 μm 내지 약 4.5 μm, 약 1.0 μm 내지 약 4.0 μm, 약 1.0 μm 내지 약 3.5 μm, 약 1.0 μm 내지 약 3.0 μm, 약 1.0 μm 내지 약 2.5 μm, 약 1.0 μm 내지 약 2.0 μm, 약 1.0 μm 내지 약 1.5 μm, 약 1.5 μm 내지 약 6.0 μm, 약 1.5 μm 내지 약 5.5 μm, 약 1.5 μm 내지 약 5.0 μm, 약 1.5 μm 내지 약 4.5 μm, 약 1.5 μm 내지 약 4.0 μm, 약 1.5 μm 내지 약 3.5 μm, 약 1.5 μm 내지 약 3.0 μm, 약 1.5 μm 내지 약 2.5 μm, 약 1.5 μm 내지 약 2.0 μm, 약 2.0 μm 내지 약 6.0 μm, 약 2.0 μm 내지 약 5.5 μm, 약 2.0 μm 내지 약 5.0 μm, 약 2.0 μm 내지 약 4.5 μm, 약 2.0 μm 내지 약 4.0 μm, 약 2.0 μm 내지 약 3.5 μm, 약 2.0 μm 내지 약 3.0 μm, 약 2.0 μm 내지 약 2.5 μm, 약 2.5 μm 내지 약 6.0 μm, 약 2.5 μm 내지 약 5.5 μm, 약 2.5 μm 내지 약 5.0 μm, 약 2.5 μm 내지 약 4.5 μm, 약 2.5 μm 내지 약 4.0 μm, 약 2.5 μm 내지 약 3.5 μm, 약 2.5 μm 내지 약 3.0 μm, 약 3.0 μm 내지 약 6.0 μm, 약 3.0 μm 내지 약 5.5 μm, 약 3.0 μm 내지 약 5.0 μm, 약 3.0 μm 내지 약 4.5 μm, 약 3.0 μm 내지 약 4.0 μm, 약 3.0 μm 내지 약 3.5 μm, 약 3.5 μm 내지 약 6.0 μm, 약 3.5 μm 내지 약 5.5 μm, 약 3.5 μm 내지 약 5.0 μm, 약 3.5 μm 내지 약 4.5 μm, 약 3.5 μm 내지 약 4.0 μm, 약 4.0 μm 내지 약 6.0 μm, 약 4.0 μm 내지 약 5.5 μm, 약 4.0 μm 내지 약 5.0 μm, 약 4.0 μm 내지 약 4.5 μm, 약 4.5 μm 내지 약 6.0 μm, 약 4.5 μm 내지 약 5.5 μm, 약 4.5 μm 내지 약 5.0 μm, 약 5.0 μm 내지 약 6.0 μm, 약 5.0 μm 내지 약 5.5 μm, 또는 약 5.5 μm 내지 약 6.0 μm의 평균 기공 크기를 갖는 하나 이상의 필터를 사용하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 세포 배양물의 관류는 제1 세포 배양물이 특정 목표 세포 밀도, 예를 들어 약 1.0 x 106 세포/mL, 약 1.5 x 106 세포/mL, 약 2.0 x 106 세포/mL, 약 2.5 x 106 세포/mL, 약 3.0 x 106 세포/mL, 약 3.5 x 106 세포/mL, 약 4.0 x 106 세포/mL, 약 4.5 x 106 세포/mL, 약 5.0 x 106 세포/mL, 약 5.5 x 106 세포/mL, 약 6.0 x 106 세포/mL, 약 6.5 x 106 세포/mL, 약 7.0 x 106 세포/mL, 약 7.5 x 106 세포/mL, 약 8.0 x 106 세포/mL, 약 8.5 x 106 세포/mL, 약 9.0 x 106 세포/mL, 약 9.5 x 106 세포/mL, 또는 약 1.0 x 107 세포/mL에 도달할 때 시작된다.
일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 Flt-3 리간드(예를 들어 0.1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 Flt-3 리간드), SCF(예를 들어 약 1 ng/mL 내지 약 1 μg/mL 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 SCF), IL-3(예를 들어 약 0.1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 IL-3), 및 IL-6(예를 들어 약 0.1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 IL-6) 중 하나 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 또는 4개)을 포함한다. 본원에 기술된 제1 배양 배지 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 CellGenix SCGM 배지를 포함한다. 본원에 기술된 제1 배양 배지 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 IMDM을 포함한다. 제1 배양 배지 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM(예를 들어 약 0.1 mM 내지 약 9.5 mM, 약 0.1 mM 내지 약 9.0 mM, 약 0.1 mM 내지 약 8.5 mM, 약 0.1 mM 내지 약 8.0 mM, 약 0.1 mM 내지 약 7.5 mM, 약 0.1 mM 내지 약 7.0 mM, 약 0.1 mM 내지 약 6.5 mM, 약 0.1 mM 내지 약 6.0 mM, 약 0.1 mM 내지 약 5.5 mM, 약 0.1 mM 내지 약 5 mM, 약 0.1 mM 내지 약 4.5 mM, 약 0.1 mM 내지 약 4.0 mM, 약 0.1 mM 내지 약 3.5 mM, 약 0.1 mM 내지 약 3.0 mM, 약 0.1 mM 내지 약 2.5 mM, 약 0.1 mM 내지 약 2.0 mM, 약 0.1 mM 내지 약 1.5 mM, 약 0.1 mM 내지 약 1.0 mM, 약 0.1 mM 내지 약 0.5 mM, 약 0.5 mM 내지 약 10 mM, 약 0.5 mM 내지 약 9.5 mM, 약 0.5 mM 내지 약 9.0 mM, 약 0.5 mM 내지 약 8.5 mM, 약 0.5 mM 내지 약 8.0 mM, 약 0.5 mM 내지 약 7.5 mM, 약 0.5 mM 내지 약 7.0 mM, 약 0.5 mM 내지 약 6.5 mM, 약 0.5 mM 내지 약 6.0 mM, 약 0.5 mM 내지 약 5.5 mM, 약 0.5 mM 내지 약 5 mM, 약 0.5 mM 내지 약 4.5 mM, 약 0.5 mM 내지 약 4.0 mM, 약 0.5 mM 내지 약 3.5 mM, 약 0.5 mM 내지 약 3.0 mM, 약 0.5 mM 내지 약 2.5 mM, 약 0.5 mM 내지 약 2.0 mM, 약 0.5 mM 내지 약 1.5 mM, 약 0.5 mM 내지 약 1.0 mM, 약 1.0 mM 내지 약 10 mM, 약 1.0 mM 내지 약 9.5 mM, 약 1.0 mM 내지 약 9.0 mM, 약 1.0 mM 내지 약 8.5 mM, 약 1.0 mM 내지 약 8.0 mM, 약 1.0 mM 내지 약 7.5 mM, 약 1.0 mM 내지 약 7.0 mM, 약 1.0 mM 내지 약 6.5 mM, 약 1.0 mM 내지 약 6.0 mM, 약 1.0 mM 내지 약 5.5 mM, 약 1.0 mM 내지 약 5 mM, 약 1.0 mM 내지 약 4.5 mM, 약 1.0 mM 내지 약 4.0 mM, 약 1.0 mM 내지 약 3.5 mM, 약 1.0 mM 내지 약 3.0 mM, 약 1.0 mM 내지 약 2.5 mM, 약 1.0 mM 내지 약 2.0 mM, 약 1.0 mM 내지 약 1.5 mM, 약 1.5 mM 내지 약 10 mM, 약 1.5 mM 내지 약 9.5 mM, 약 1.5 mM 내지 약 9.0 mM, 약 1.5 mM 내지 약 8.5 mM, 약 1.5 mM 내지 약 8.0 mM, 약 1.5 mM 내지 약 7.5 mM, 약 1.5 mM 내지 약 7.0 mM, 약 1.5 mM 내지 약 6.5 mM, 약 1.5 mM 내지 약 6.0 mM, 약 1.5 mM 내지 약 5.5 mM, 약 1.5 mM 내지 약 5 mM, 약 1.5 mM 내지 약 4.5 mM, 약 1.5 mM 내지 약 4.0 mM, 약 1.5 mM 내지 약 3.5 mM, 약 1.5 mM 내지 약 3.0 mM, 약 1.5 mM 내지 약 2.5 mM, 약 1.5 mM 내지 약 2.0 mM, 약 2.0 mM 내지 약 10 mM, 약 2.0 mM 내지 약 9.5 mM, 약 2.0 mM 내지 약 9.0 mM, 약 2.0 mM 내지 약 8.5 mM, 약 2.0 mM 내지 약 8.0 mM, 약 2.0 mM 내지 약 7.5 mM, 약 2.0 mM 내지 약 7.0 mM, 약 2.0 mM 내지 약 6.5 mM, 약 2.0 mM 내지 약 6.0 mM, 약 2.0 mM 내지 약 5.5 mM, 약 2.0 mM 내지 약 5 mM, 약 2.0 mM 내지 약 4.5 mM, 약 2.0 mM 내지 약 4.0 mM, 약 2.0 mM 내지 약 3.5 mM, 약 2.0 mM 내지 약 3.0 mM, 약 2.0 mM 내지 약 2.5 mM, 약 2.5 mM 내지 약 10 mM, 약 2.5 mM 내지 약 9.5 mM, 약 2.5 mM 내지 약 9.0 mM, 약 2.5 mM 내지 약 8.5 mM, 약 2.5 mM 내지 약 8.0 mM, 약 2.5 mM 내지 약 7.5 mM, 약 2.5 mM 내지 약 7.0 mM, 약 2.5 mM 내지 약 6.5 mM, 약 2.5 mM 내지 약 6.0 mM, 약 2.5 mM 내지 약 5.5 mM, 약 2.5 mM 내지 약 5 mM, 약 2.5 mM 내지 약 4.5 mM, 약 2.5 mM 내지 약 4.0 mM, 약 2.5 mM 내지 약 3.5 mM, 약 2.5 mM 내지 약 3.0 mM, 약 3.0 mM 내지 약 10 mM, 약 3.0 mM 내지 약 9.5 mM, 약 3.0 mM 내지 약 9.0 mM, 약 3.0 mM 내지 약 8.5 mM, 약 3.0 mM 내지 약 8.0 mM, 약 3.0 mM 내지 약 7.5 mM, 약 3.0 mM 내지 약 7.0 mM, 약 3.0 mM 내지 약 6.5 mM, 약 3.0 mM 내지 약 6.0 mM, 약 3.0 mM 내지 약 5.5 mM, 약 3.0 mM 내지 약 5 mM, 약 3.0 mM 내지 약 4.5 mM, 약 3.0 mM 내지 약 4.0 mM, 약 3.0 mM 내지 약 3.5 mM, 약 3.5 mM 내지 약 10 mM, 약 3.5 mM 내지 약 9.5 mM, 약 3.5 mM 내지 약 9.0 mM, 약 3.5 mM 내지 약 8.5 mM, 약 3.5 mM 내지 약 8.0 mM, 약 3.5 mM 내지 약 7.5 mM, 약 3.5 mM 내지 약 7.0 mM, 약 3.5 mM 내지 약 6.5 mM, 약 3.5 mM 내지 약 6.0 mM, 약 3.5 mM 내지 약 5.5 mM, 약 3.5 mM 내지 약 5 mM, 약 3.5 mM 내지 약 4.5 mM, 약 3.5 mM 내지 약 4.0 mM, 약 4.0 mM 내지 약 10 mM, 약 4.0 mM 내지 약 9.5 mM, 약 4.0 mM 내지 약 9.0 mM, 약 4.0 mM 내지 약 8.5 mM, 약 4.0 mM 내지 약 8.0 mM, 약 4.0 mM 내지 약 7.5 mM, 약 4.0 mM 내지 약 7.0 mM, 약 4.0 mM 내지 약 6.5 mM, 약 4.0 mM 내지 약 6.0 mM, 약 4.0 mM 내지 약 5.5 mM, 약 4.0 mM 내지 약 5 mM, 약 4.0 mM 내지 약 4.5 mM, 약 4.5 mM 내지 약 10 mM, 약 4.5 mM 내지 약 9.5 mM, 약 4.5 mM 내지 약 9.0 mM, 약 4.5 mM 내지 약 8.5 mM, 약 4.5 mM 내지 약 8.0 mM, 약 4.5 mM 내지 약 7.5 mM, 약 4.5 mM 내지 약 7.0 mM, 약 4.5 mM 내지 약 6.5 mM, 약 4.5 mM 내지 약 6.0 mM, 약 4.5 mM 내지 약 5.5 mM, 약 4.5 mM 내지 약 5.0 mM, 약 5.0 mM 내지 약 10 mM, 약 5.0 mM 내지 약 9.5 mM, 약 5.0 mM 내지 약 9.0 mM, 약 5.0 mM 내지 약 8.5 mM, 약 5.0 mM 내지 약 8.0 mM, 약 5.0 mM 내지 약 7.5 mM, 약 5.0 mM 내지 약 7.0 mM, 약 5.0 mM 내지 약 6.5 mM, 약 5.0 mM 내지 약 6.0 mM, 약 5.0 mM 내지 약 5.5 mM, 약 5.5 mM 내지 약 10 mM, 약 5.5 mM 내지 약 9.5 mM, 약 5.5 mM 내지 약 9.0 mM, 약 5.5 mM 내지 약 8.5 mM, 약 5.5 mM 내지 약 8.0 mM, 약 5.5 mM 내지 약 7.5 mM, 약 5.5 mM 내지 약 7.0 mM, 약 5.5 mM 내지 약 6.5 mM, 약 5.5 mM 내지 약 6.0 mM, 약 6.0 mM 내지 약 10 mM, 약 6.0 mM 내지 약 9.5 mM, 약 6.0 mM 내지 약 9.0 mM, 약 6.0 mM 내지 약 8.5 mM, 약 6.0 mM 내지 약 8.0 mM, 약 6.0 mM 내지 약 7.5 mM, 약 6.0 mM 내지 약 7.0 mM, 약 6.0 mM 내지 약 6.5 mM, 약 6.5 mM 내지 약 10 mM, 약 6.5 mM 내지 약 9.5 mM, 약 6.5 mM 내지 약 9.0 mM, 약 6.5 mM 내지 약 8.5 mM, 약 6.5 mM 내지 약 8.0 mM, 약 6.5 mM 내지 약 7.5 mM, 약 6.5 mM 내지 약 7.0 mM, 약 7.0 mM 내지 약 10 mM, 약 7.0 mM 내지 약 9.5 mM, 약 7.0 mM 내지 약 9.0 mM, 약 7.0 mM 내지 약 8.5 mM, 약 7.0 mM 내지 약 8.0 mM, 약 7.0 mM 내지 약 7.5 mM, 약 7.5 mM 내지 약 10 mM, 약 7.5 mM 내지 약 9.5 mM, 약 7.5 mM 내지 약 9.0 mM, 약 7.5 mM 내지 약 8.5 mM, 약 7.5 mM 내지 약 8.0 mM, 약 8.0 mM 내지 약 10 mM, 약 8.0 mM 내지 약 9.5 mM, 약 8.0 mM 내지 약 9.0 mM, 약 8.0 mM 내지 약 8.5 mM, 약 8.5 mM 내지 약 10 mM, 약 8.5 mM 내지 약 9.5 mM, 약 8.5 mM 내지 약 9.0 mM, 약 9.0 mM 내지 약 10 mM, 약 9.0 mM 내지 약 9.5 mM, 또는 약 9.5 mM 내지 약 10 mM)의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에 기술된 제1 배양 배지 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 1 μg/mL 내지 약 20 μg/mL(예를 들어 약 1 μg/mL 내지 약 19 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 18 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 17 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 16 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 15 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 14 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 13 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 12 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 11 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 9 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 8 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 7 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 6 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 5 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 4 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 3 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 2 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 19 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 18 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 17 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 16 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 15 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 14 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 13 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 12 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 11 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 9 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 8 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 7 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 6 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 5 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 4 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 3 μg/mL, 약 3 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 3 μg/mL 내지 약 19 μg/mL, 약 3 μg/mL 내지 약 18 μg/mL, 약 3 μg/mL 내지 약 17 μg/mL, 약 3 μg/mL 내지 약 16 μg/mL, 약 3 μg/mL 내지 약 15 μg/mL, 약 3 μg/mL 내지 약 14 μg/mL, 약 3 μg/mL 내지 약 13 μg/mL, 약 3 μg/mL 내지 약 12 μg/mL, 약 3 μg/mL 내지 약 11 μg/mL, 약 3 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 3 μg/mL 내지 약 9 μg/mL, 약 3 μg/mL 내지 약 8 μg/mL, 약 3 μg/mL 내지 약 7 μg/mL, 약 3 μg/mL 내지 약 6 μg/mL, 약 3 μg/mL 내지 약 5 μg/mL, 약 3 μg/mL 내지 약 4 μg/mL, 약 4 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 4 μg/mL 내지 약 19 μg/mL, 약 4 μg/mL 내지 약 18 μg/mL, 약 4 μg/mL 내지 약 17 μg/mL, 약 4 μg/mL 내지 약 16 μg/mL, 약 4 μg/mL 내지 약 15 μg/mL, 약 4 μg/mL 내지 약 14 μg/mL, 약 4 μg/mL 내지 약 13 μg/mL, 약 4 μg/mL 내지 약 12 μg/mL, 약 4 μg/mL 내지 약 11 μg/mL, 약 4 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 4 μg/mL 내지 약 9 μg/mL, 약 4 μg/mL 내지 약 8 μg/mL, 약 4 μg/mL 내지 약 7 μg/mL, 약 4 μg/mL 내지 약 6 μg/mL, 약 4 μg/mL 내지 약 5 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 19 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 18 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 17 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 16 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 15 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 14 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 13 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 12 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 11 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 9 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 8 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 7 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 6 μg/mL, 약 6 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 6 μg/mL 내지 약 19 μg/mL, 약 6 μg/mL 내지 약 18 μg/mL, 약 6 μg/mL 내지 약 17 μg/mL, 약 6 μg/mL 내지 약 16 μg/mL, 약 6 μg/mL 내지 약 15 μg/mL, 약 6 μg/mL 내지 약 14 μg/mL, 약 6 μg/mL 내지 약 13 μg/mL, 약 6 μg/mL 내지 약 12 μg/mL, 약 6 μg/mL 내지 약 11 μg/mL, 약 6 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 6 μg/mL 내지 약 9 μg/mL, 약 6 μg/mL 내지 약 8 μg/mL, 약 6 μg/mL 내지 약 7 μg/mL, 약 7 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 7 μg/mL 내지 약 19 μg/mL, 약 7 μg/mL 내지 약 18 μg/mL, 약 7 μg/mL 내지 약 17 μg/mL, 약 7 μg/mL 내지 약 16 μg/mL, 약 7 μg/mL 내지 약 15 μg/mL, 약 7 μg/mL 내지 약 14 μg/mL, 약 7 μg/mL 내지 약 13 μg/mL, 약 7 μg/mL 내지 약 12 μg/mL, 약 7 μg/mL 내지 약 11 μg/mL, 약 7 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 7 μg/mL 내지 약 9 μg/mL, 약 7 μg/mL 내지 약 8 μg/mL, 약 8 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 8 μg/mL 내지 약 19 μg/mL, 약 8 μg/mL 내지 약 18 μg/mL, 약 8 μg/mL 내지 약 17 μg/mL, 약 8 μg/mL 내지 약 16 μg/mL, 약 8 μg/mL 내지 약 15 μg/mL, 약 8 μg/mL 내지 약 14 μg/mL, 약 8 μg/mL 내지 약 13 μg/mL, 약 8 μg/mL 내지 약 12 μg/mL, 약 8 μg/mL 내지 약 11 μg/mL, 약 8 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 8 μg/mL 내지 약 9 μg/mL, 약 9 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 9 μg/mL 내지 약 19 μg/mL, 약 9 μg/mL 내지 약 18 μg/mL, 약 9 μg/mL 내지 약 17 μg/mL, 약 9 μg/mL 내지 약 16 μg/mL, 약 9 μg/mL 내지 약 15 μg/mL, 약 9 μg/mL 내지 약 14 μg/mL, 약 9 μg/mL 내지 약 13 μg/mL, 약 9 μg/mL 내지 약 12 μg/mL, 약 9 μg/mL 내지 약 11 μg/mL, 약 9 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 19 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 18 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 17 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 16 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 15 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 14 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 13 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 12 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 11 μg/mL, 약 11 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 11 μg/mL 내지 약 19 μg/mL, 약 11 μg/mL 내지 약 18 μg/mL, 약 11 μg/mL 내지 약 17 μg/mL, 약 11 μg/mL 내지 약 16 μg/mL, 약 11 μg/mL 내지 약 15 μg/mL, 약 11 μg/mL 내지 약 14 μg/mL, 약 11 μg/mL 내지 약 13 μg/mL, 약 11 μg/mL 내지 약 12 μg/mL, 12 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 12 μg/mL 내지 약 19 μg/mL, 약 12 μg/mL 내지 약 18 μg/mL, 약 12 μg/mL 내지 약 17 μg/mL, 약 12 μg/mL 내지 약 16 μg/mL, 약 12 μg/mL 내지 약 15 μg/mL, 약 12 μg/mL 내지 약 14 μg/mL, 약 12 μg/mL 내지 약 13 μg/mL, 13 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 13 μg/mL 내지 약 19 μg/mL, 약 13 μg/mL 내지 약 18 μg/mL, 약 13 μg/mL 내지 약 17 μg/mL, 약 13 μg/mL 내지 약 16 μg/mL, 약 13 μg/mL 내지 약 15 μg/mL, 약 13 μg/mL 내지 약 14 μg/mL, 14 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 14 μg/mL 내지 약 19 μg/mL, 약 14 μg/mL 내지 약 18 μg/mL, 약 14 μg/mL 내지 약 17 μg/mL, 약 14 μg/mL 내지 약 16 μg/mL, 약 14 μg/mL 내지 약 15 μg/mL, 15 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 15 μg/mL 내지 약 19 μg/mL, 약 15 μg/mL 내지 약 18 μg/mL, 약 15 μg/mL 내지 약 17 μg/mL, 약 15 μg/mL 내지 약 16 μg/mL, 16 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 16 μg/mL 내지 약 19 μg/mL, 약 16 μg/mL 내지 약 18 μg/mL, 약 16 μg/mL 내지 약 17 μg/mL, 17 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 17 μg/mL 내지 약 19 μg/mL, 약 17 μg/mL 내지 약 18 μg/mL, 약 18 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 18 μg/mL 내지 약 19 μg/mL, 또는 약 19 μg/mL 내지 약 20 μg/mL)의 인슐린(예: 인간 인슐린)을 포함한다.
본원에 기술된 제1 배양 배지 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 지질(예: 지질 혼합물)을 포함한다.
본원에 기술된 제1 배양 배지 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 트랜스페린(예를 들어 아포트랜스페린, 홀로 트랜스페린, 또는 이들의 조합)(예를 들어 약 50 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 50 μg/mL 내지 약 350 μg/mL, 약 50 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 50 μg/mL 내지 약 250 μg/mL, 약 50 μg/mL 내지 약 200 μg/mL, 약 50 μg/mL 내지 약 150 μg/mL, 약 50 μg/mL 내지 약 100 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 350 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 250 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 200 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 150 μg/mL, 약 150 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 150 μg/mL 내지 약 350 μg/mL, 약 150 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 150 μg/mL 내지 약 250 μg/mL, 약 150 μg/mL 내지 약 200 μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 350 μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 250 μg/mL, 약 250 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 250 μg/mL 내지 약 350 μg/mL, 약 250 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 350 μg/mL, 또는 약 350 내지 약 400 μg/mL의 트랜스페린(예를 들어 아포트랜스페린, 홀로트랜스페린, 또는 이들의 조합))을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 90 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 70 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 10 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 5 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 90 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 70 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 10 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 90 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 70 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 90 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 70 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 90 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 70 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 90 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 70 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 90 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 70 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 90 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 70 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 90 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 90 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 110 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 110 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 110 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 110 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 110 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 110 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 110 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 110 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 110 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 130 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 130 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 130 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 130 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 130 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 130 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 130 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 170 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 170 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 170 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 또는 약 190 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 Flt-3 리간드(예를 들어 재조합 Flt-3 리간드)를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 550 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 350 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 250 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 25 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 15 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 10 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 5 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 550 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 350 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 250 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 25 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 15 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 10 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 550 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 350 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 250 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 25 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 15 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 550 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 350 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 250 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 25 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 550 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 350 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 250 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 25 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 550 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 350 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 250 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 550 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 350 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 250 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 550 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 350 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 250 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 550 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 350 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 250 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 550 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 350 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 250 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 550 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 350 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 550 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 350 ng/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 550 ng/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 550 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 450 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 450 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 450 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 450 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 450 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 450 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 450 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 450 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 450 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 450 ng/mL 내지 약 550 ng/mL, 약 450 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 500 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 500 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 500 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 500 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 500 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 500 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 500 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 500 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 500 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 500 ng/mL 내지 약 550 ng/mL, 약 550 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 550 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 550 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 550 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 550 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 550 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 550 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 550 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 550 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 600 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 600 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 600 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 600 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 600 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 600 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 600 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 600 ng/mL 내지 약 650 ng/mL, 약 650 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 650 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 650 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 650 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 650 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 650 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 650 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 700 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 700 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 700 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 700 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 700 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 700 ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 750 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 750 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 750 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 750 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 750 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 800 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 800 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 800 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 800 ng/mL 내지 약 850 ng/mL, 약 850 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 850 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 850 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 900 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 900 ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 또는 약 950 ng/mL 내지 약 1 μg/mL의 SCF(예를 들어 재조합 인간 줄기 세포 인자)를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 90 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 70 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 10 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 5 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 2 ng/mL, 2 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 90 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 70 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 10 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 5 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 90 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 70 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 10 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 90 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 70 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 90 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 70 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 90 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 70 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 90 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 70 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 90 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 70 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 90 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 70 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 90 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 90 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 110 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 110 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 110 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 110 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 110 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 110 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 110 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 110 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 110 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 130 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 130 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 130 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 130 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 130 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 130 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 130 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 170 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 170 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 170 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 또는 약 190 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 IL-3(예를 들어 재조합 인간 IL-3)을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 배양 배지는 약 0.1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 90 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 70 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 10 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 5 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 2 ng/mL, 2 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 90 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 70 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 10 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 5 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 90 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 70 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 10 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 90 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 70 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 90 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 70 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 90 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 70 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 90 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 70 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 90 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 70 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 90 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 70 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 90 ng/mL, 약 70 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 90 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 90 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 110 ng/mL, 약 110 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 110 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 110 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 110 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 110 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 110 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 110 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 110 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 110 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 130 ng/mL, 약 130 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 130 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 130 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 130 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 130 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 130 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 130 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 170 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 170 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 170 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 또는 약 190 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 IL-6(예를 들어 재조합 인간 IL-6)을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 배양 배지는, 예를 들어 화학적으로 정의된 액체 배양 배지, 동물 성분이 없는 액체 배양 배지, 또는 동물 성분이 없는 화학적으로 정의된 액체 배양 배지, 및/또는 혈청이 없는 액체 배양 배지일 수 있다.
배양 단계 B
관류 배양
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 단계 (b)는 제2 배양 배지를 (예를 들어 본원에 기술된 예시적인 부피 중 어느 하나를 갖는 예시적인 바이어리액터 중 어느 하나에서 제2 배양물 중 어느 하나를) 약 2일 내지 약 15일 (예를 들어 약 2일 내지 약 14일, 약 2일 내지 약 13일, 약 2일 내지 약 12일, 약 2일 내지 약 11일, 약 2일 내지 약 10일, 약 2일 내지 약 9일, 약 2일 내지 약 8일, 약 2일 내지 약 7일, 약 2일 내지 약 6일, 약 2일 내지 약 5일, 약 2일 내지 약 4일, 약 2일 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 15일, 약 3일 내지 약 14일, 약 3일 내지 약 13일, 약 3일 내지 약 12일, 약 3일 내지 약 11일, 약 3일 내지 약 10일, 약 3일 내지 약 9일, 약 3일 내지 약 8일, 약 3일 내지 약 7일, 약 3일 내지 약 6일, 약 3일 내지 약 5일, 약 3일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 15일, 약 4일 내지 약 14일, 약 4일 내지 약 13일, 약 4일 내지 약 12일, 약 4일 내지 약 11일, 약 4일 내지 약 10일, 약 4일 내지 약 9일, 약 4일 내지 약 8일, 약 4일 내지 약 7일, 약 4일 내지 약 6일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 15일, 약 5일 내지 약 14일, 약 5일 내지 약 13일, 약 5일 내지 약 12일, 약 5일 내지 약 11일, 약 5일 내지 약 10일, 약 5일 내지 약 9일, 약 5일 내지 약 8일, 약 5일 내지 약 7일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 15일, 약 6일 내지 약 14일, 약 6일 내지 약 13일, 약 6일 내지 약 12일, 약 6일 내지 약 11일, 약 6일 내지 약 10일, 약 6일 내지 약 9일, 약 6일 내지 약 8일, 약 6일 내지 약 7일, 약 7일 내지 약 15일, 약 7일 내지 약 14일, 약 7일 내지 약 13일, 약 7일 내지 약 12일, 약 7일 내지 약 11일, 약 7일 내지 약 10일, 약 7일 내지 약 9일, 약 7일 내지 약 8일, 약 8일 내지 약 15일, 약 8일 내지 약 14일, 약 8일 내지 약 13일, 약 8일 내지 약 12일, 약 8일 내지 약 11일, 약 8일 내지 약 10일, 약 8일 내지 약 9일, 약 9일 내지 약 15일, 약 9일 내지 약 14일, 약 9일 내지 약 13일, 약 9일 내지 약 12일, 약 9일 내지 약 11일, 약 9일 내지 약 10일, 약 10일 내지 약 15일, 약 10일 내지 약 14일, 약 10일 내지 약 13일, 약 10일 내지 약 12일, 약 10일 내지 약 11일, 약 11일 내지 약 15일, 약 11일 내지 약 14일, 약 11일 내지 약 13일, 약 11일 내지 약 12일, 약 12일 내지 약 15일, 약 12일 내지 약 14일, 약 12일 내지 약 13일, 약 13일 내지 약 15일, 약 13일 내지 약 14일, 또는 약 14일 내지 약 15일) 동안 관류 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 (예를 들어, 본원에 기술된 예시적인 부피 중 어느 하나를 갖는 본원에 기술된 바이오리액터 중 어느 하나에서) 제2 세포 배양물을 약 10 W/m3 내지 약 200 W/m3의 P/V 값(또는 예를 들어 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 값)으로 교반하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (b)에서의 관류 배양은 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일의 관류 속도(또는 예를 들어 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 관류 속도)를 사용해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 관류 속도는 시간 경과에 따라 증가된다.
일부 구현예에서, 단계 (b)에서의 관류 배양은 일당 약 0.1 용기 부피(VVD) 내지 약 3 VVD(또는 예를 들어 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나)의 관류 속도를 사용해 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 단계 (b)에서의 관류 배양은 시간 경과에 배양 배지(예를 들어 제2 배양 배지(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제2 배양 배지 중 어느 하나))의 추가 부피를 제2 세포 배양물에 적어도 부분적으로 첨가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 배양 배지(예를 들어 제2 배양 배지(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제2 배양 배지 중 어느 하나))의 추가 부피는 시간 경과에 따라 연속으로 제2 세포 배양물에 첨가된다. 일부 구현예에서, 배양 배지(예를 들어, 제2 배양 배지(예를 들어, 본원에 기술된 예시적인 제2 배양 배지 중 어느 하나))의 추가 부피는 시간 경과에 따라 주기적으로 (예를 들어, 3일마다 1회, 2일마다 1회, 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회, 1일 4회, 1일 5회, 1일 6회, 1일 7회, 1일 8회, 1일 9회, 1일 10회, 1일 11회, 또는 1일 12회) 제2 세포 배양물에 첨가된다. 배양 배지(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제2 배양 배지 중 어느 하나)의 첨가는 기계적으로, 예를 들어 연동 펌프 또는 관류 펌프를 사용하여, 또는 수동으로(예를 들어 멸균 피펫팅에 의해) 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 단계 (b)에서의 관류 배양은 시간 경과에 따라 배양 배지(예를 들어 실질적으로 세포가 없는 배양 배지)의 부피를 적어도 부분적으로 제거하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 배양 배지(예를 들어 실질적으로 세포가 없는 배양 배지)는 시간 경과에 따라 연속으로 제거된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 시간 경과에 따라 주기적으로 (예를 들어, 3일마다 1회, 2일마다 1회, 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회, 1일 4회, 1일 5회, 1일 6회, 1일 7회, 1일 8회, 1일 9회, 1일 10회, 1일 11회, 또는 1일 12회) 제거된다. 배양 배지(예를 들어 실질적으로 세포가 없는 배양 배지)의 제거는 기계적으로, 예를 들어 접선 유동 여과(TFF) 또는 교번 유동 여과(ATF)를 사용하여, 또는 수동으로(예를 들어 멸균 피펫팅에 의해) 수행될 수 있다. 접선 유동 여과의 추가적인 비제한적인 양태가 본원에 기술된다.
이들 방법의 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 다음 중 하나 이상(예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개)을 포함한다: 트랜스페린(예를 들어 아포트랜스페린, 홀로 트랜스페린, 또는 이들의 조합)(예를 들어 약 1 μg/mL 내지 약 500 μg/mL 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 트랜스페린(예를 들어 인간 아포트랜스페린, 인간 홀로 트랜스페린, 또는 이들의 조합)), IL-3(예를 들어 약 0.1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 IL-3(예를 들어 재조합 인간 IL-3)), SCF(예를 들어 약 1 ng/mL 내지 약 1 μg/mL 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 SCF(예를 들어 재조합 인간 SCF)), 덱사메타손(예를 들어 약 0.1 nM 내지 약 200 nM 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 덱사메타손), 에리트로포이에틴(EPO) 또는 EPO-모방체 펩티드(예를 들어 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 EPO(예를 들어 재조합 인간 EPO) 또는 EPO-모방체 펩티드), 및 인슐린(예를 들어 약 0.1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 인슐린). 이들 방법의 일부 예에서, 제2 배양 배지는 지질(예를 들어 약 1 μg/mL 내지 약 10 μg/mL 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 지질 혼합물)을 포함한다. 이들 방법의 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM(또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나)의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 관류 배양은 접선 여과(예를 들어 접선 유동 여과(TFF) 또는 교번 접선 여과(ATF))의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 접선 여과(예를 들어 접선 유동 여과 또는 교번 접선 여과)는 약 10 nm 내지 약 6.0 μm(또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나)의 평균 기공 크기를 갖는 하나 이상의 필터의 사용을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제2 세포 배양물의 관류는 상기 제1 세포 배양물이 특정 목표 세포 밀도에 도달하면 시작되고, 예: 약 1.0 x 106 세포/mL, 약 1.5 x 106 세포/mL, 약 2.0 x 106 세포/mL, 약 2.5 x 106 세포/mL, 약 3.0 x 106 세포/mL, 약 3.5 x 106 세포/mL, 약 4.0 x 106 세포/mL, 약 4.5 x 106 세포/mL, 약 5.0 x 106 세포/mL, 약 5.5 x 106 세포/mL, 약 6.0 x 106 세포/mL, 약 6.5 x 106 세포/mL, 약 7.0 x 106 세포/mL, 약 7.5 x 106 세포/mL, 약 8.0 x 106 세포/mL, 약 8.5 x 106 세포/mL, 약 9.0 x 106 세포/mL, 약 9.5 x 106 세포/mL, 또는 약 1.0 x 107 세포/mL.
배치 배양 또는 유가 배양
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 단계 (b)는 제2 세포 배양물을 (예를 들어 본원에 기술된 예시적인 부피 중 어느 하나를 갖는 예시적인 진탕 플라??, 진탕 튜브, 배양 백, 또는 바이오리액터 중 어느 하나에서 제2 세포 배양물 중 어느 하나를) 약 2일 내지 약 15일(예를 들어 약 2일 내지 약 14일, 약 2일 내지 약 13일, 약 2일 내지 약 12일, 약 2일 내지 약 11일, 약 2일 내지 약 10일, 약 2일 내지 약 9일, 약 2일 내지 약 8일, 약 2일 내지 약 7일, 약 2일 내지 약 6일, 약 2일 내지 약 5일, 약 2일 내지 약 4일, 약 2일 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 15일, 약 3일 내지 약 14일, 약 3일 내지 약 13일, 약 3일 내지 약 12일, 약 3일 내지 약 11일, 약 3일 내지 약 10일, 약 3일 내지 약 9일, 약 3일 내지 약 8일, 약 3일 내지 약 7일, 약 3일 내지 약 6일, 약 3일 내지 약 5일, 약 3일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 15일, 약 4일 내지 약 14일, 약 4일 내지 약 13일, 약 4일 내지 약 12일, 약 4일 내지 약 11일, 약 4일 내지 약 10일, 약 4일 내지 약 9일, 약 4일 내지 약 8일, 약 4일 내지 약 7일, 약 4일 내지 약 6일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 15일, 약 5일 내지 약 14일, 약 5일 내지 약 13일, 약 5일 내지 약 12일, 약 5일 내지 약 11일, 약 5일 내지 약 10일, 약 5일 내지 약 9일, 약 5일 내지 약 8일, 약 5일 내지 약 7일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 15일, 약 6일 내지 약 14일, 약 6일 내지 약 13일, 약 6일 내지 약 12일, 약 6일 내지 약 11일, 약 6일 내지 약 10일, 약 6일 내지 약 9일, 약 6일 내지 약 8일, 약 6일 내지 약 7일, 약 7일 내지 약 15일, 약 7일 내지 약 14일, 약 7일 내지 약 13일, 약 7일 내지 약 12일, 약 7일 내지 약 11일, 약 7일 내지 약 10일, 약 7일 내지 약 9일, 약 7일 내지 약 8일, 약 8일 내지 약 15일, 약 8일 내지 약 14일, 약 8일 내지 약 13일, 약 8일 내지 약 12일, 약 8일 내지 약 11일, 약 8일 내지 약 10일, 약 8일 내지 약 9일, 약 9일 내지 약 15일, 약 9일 내지 약 14일, 약 9일 내지 약 13일, 약 9일 내지 약 12일, 약 9일 내지 약 11일, 약 9일 내지 약 10일, 약 10일 내지 약 15일, 약 10일 내지 약 14일, 약 10일 내지 약 13일, 약 10일 내지 약 12일, 약 10일 내지 약 11일, 약 11일 내지 약 15일, 약 11일 내지 약 14일, 약 11일 내지 약 13일, 약 11일 내지 약 12일, 약 12일 내지 약 15일, 약 12일 내지 약 14일, 약 12일 내지 약 13일, 약 13일 내지 약 15일, 약 13일 내지 약 14일, 또는 약 14일 내지 약 15일) 동안 배치 배양 또는 유가 배양하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (b)는 바이오리액터(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 부피 중 어느 하나를 갖는 본원에 기술된 예시적인 바이오리액터 중 어느 하나)에 배치된 제2 세포 배양물을 배치 배양 또는 유가 배양하는 단계를 포함한다. 이러한 구현예에서, 단계 (b)는 바이오리액터에서 제2 세포 배양물을 약 10 W/m3 내지 약 200 W/m3(또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나)의 P/V 값으로 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (b)는 진탕 플라스크(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 부피 중 어느 하나를 갖는 본원에 기술된 예시적인 진탕 플라스크 중 어느 하나)에 배치된 제2 세포 배양물을 배치 배양 또는 유가 배양하는 단계를 포함한다. 이러한 구현예에서, 단계 (b)는 진탕 플라스크에서 제2 세포 배양물을 약 0.1 x g 내지 약 50 x g(또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나)로 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (b)는 진탕 튜브(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 부피 중 어느 하나를 갖는 본원에 기술된 예시적인 진탕 튜브 중 어느 하나(예를 들어 원뿔형 용기))에 배치된 제2 세포 배양물을 배치 배양 또는 유가 배양하는 단계를 포함한다. 이러한 구현예에서, 단계 (b)는 진탕 튜브에서 제2 세포 배양물을 약 0.1 x g 내지 약 50 x g(또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나)로 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (b)는 배양 백(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 부피 중 어느 하나를 갖는 본원에 기술된 예시적인 배양 백 중 어느 하나)에 배치된 제2 세포 배양물을 배치 배양 또는 유가 배양하는 단계를 포함한다. 이러한 구현예에서, 단계 (b)는 배양 백에서 제2 세포 배양물을 분당 10 진동 사이클 내지 약 50 진동 사이클(또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나)의 진동 속도로 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (b)는 제2 세포 배양물을 배치 배양하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (b)는 제2 세포 배양물을 유가 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (b)에서의 유가 배양은 시간 경과에 따라 제2 배양 배지(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제2 배양 배지 중 어느 하나)의 추가 부피를 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 배양 배지(예를 들어 제2 배양 배지(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제2 배양 배지 중 어느 하나))의 추가 부피는 시간 경과에 따라 연속으로 제2 세포 배양물에 첨가된다. 일부 구현예에서, 배양 배지(예를 들어, 제2 배양 배지(예를 들어, 본원에 기술된 예시적인 제2 배양 배지 중 어느 하나))의 추가 부피는 시간 경과에 따라 주기적으로 (예를 들어, 3일마다 1회, 2일마다 1회, 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회, 1일 4회, 1일 5회, 1일 6회, 1일 7회, 1일 8회, 1일 9회, 1일 10회, 1일 11회, 또는 1일 12회) 제2 세포 배양물에 첨가된다. 일부 구현예에서, 단계 (a) 직후에 제2 세포 배양물 부피의 약 0.1x 내지 약 10x(예를 들어 약 0.1x 내지 약 9.5x, 약 0.1x 내지 약 9.0x, 약 0.1x 내지 약 8.5x, 약 0.1x 내지 약 8.0x, 약 0.1x 내지 약 7.5x, 약 0.1x 내지 약 7.0x, 약 0.1x 내지 약 6.5x, 약 0.1x 내지 약 6.0x, 약 0.1x 내지 약 5.5x, 약 0.1x 내지 약 5.0x, 약 0.1x 내지 약 4.5x, 약 0.1x 내지 약 4.0x, 약 0.1x 내지 약 3.5x, 약 0.1x 내지 약 3.0x, 약 0.1x 내지 약 2.5x, 약 0.1x 내지 약 2.0x, 약 0.1x 내지 약 1.5x, 약 0.1x 내지 약 1.0x, 약 0.1x 내지 약 0.5x, 약 0.1x 내지 약 0.3x, 약 0.1x 내지 약 0.2x, 약 0.2x 내지 약 10x, 약 0.2x 내지 약 9.5x, 약 0.2x 내지 약 9.0x, 약 0.2x 내지 약 8.5x, 약 0.2x 내지 약 8.0x, 약 0.2x 내지 약 7.5x, 약 0.2x 내지 약 7.0x, 약 0.2x 내지 약 6.5x, 약 0.2x 내지 약 6.0x, 약 0.2x 내지 약 5.5x, 약 0.2x 내지 약 5.0x, 약 0.2x 내지 약 4.5x, 약 0.2x 내지 약 4.0x, 약 0.2x 내지 약 3.5x, 약 0.2x 내지 약 3.0x, 약 0.2x 내지 약 2.5x, 약 0.2x 내지 약 2.0x, 약 0.2x 내지 약 1.5x, 약 0.2x 내지 약 1.0x, 약 0.2x 내지 약 0.5x, 약 0.2x 내지 약 0.3x, 약 0.3x 내지 약 10x, 약 0.3x 내지 약 9.5x, 약 0.3x 내지 약 9.0x, 약 0.3x 내지 약 8.5x, 약 0.3x 내지 약 8.0x, 약 0.3x 내지 약 7.5x, 약 0.3x 내지 약 7.0x, 약 0.3x 내지 약 6.5x, 약 0.3x 내지 약 6.0x, 약 0.3x 내지 약 5.5x, 약 0.3x 내지 약 5.0x, 약 0.3x 내지 약 4.5x, 약 0.3x 내지 약 4.0x, 약 0.3x 내지 약 3.5x, 약 0.3x 내지 약 3.0x, 약 0.3x 내지 약 2.5x, 약 0.3x 내지 약 2.0x, 약 0.3x 내지 약 1.5x, 약 0.3x 내지 약 1.0x, 약 0.3x 내지 약 0.5x, 약 0.5x 내지 약 10x, 약 0.5x 내지 약 9.5x, 약 0.5x 내지 약 9.0x, 약 0.5x 내지 약 8.5x, 약 0.5x 내지 약 8.0x, 약 0.5x 내지 약 7.5x, 약 0.5x 내지 약 7.0x, 약 0.5x 내지 약 6.5x, 약 0.5x 내지 약 6.0x, 약 0.5x 내지 약 5.5x, 약 0.5x 내지 약 5.0x, 약 0.5x 내지 약 4.5x, 약 0.5x 내지 약 4.0x, 약 0.5x 내지 약 3.5x, 약 0.5x 내지 약 3.0x, 약 0.5x 내지 약 2.5x, 약 0.5x 내지 약 2.0x, 약 0.5x 내지 약 1.5x, 약 0.5x 내지 약 1.0x, 약 1.0x 내지 약 10x, 약 1.0x 내지 약 9.5x, 약 1.0x 내지 약 9.0x, 약 1.0x 내지 약 8.5x, 약 1.0x 내지 약 8.0x, 약 1.0x 내지 약 7.5x, 약 1.0x 내지 약 7.0x, 약 1.0x 내지 약 6.5x, 약 1.0x 내지 약 6.0x, 약 1.0x 내지 약 5.5x, 약 1.0x 내지 약 5.0x, 약 1.0x 내지 약 4.5x, 약 1.0x 내지 약 4.0x, 약 1.0x 내지 약 3.5x, 약 1.0x 내지 약 3.0x, 약 1.0x 내지 약 2.5x, 약 1.0x 내지 약 2.0x, 약 1.0x 내지 약 1.5x, 약 1.5x 내지 약 10x, 약 1.5x 내지 약 9.5x, 약 1.5x 내지 약 9.0x, 약 1.5x 내지 약 8.5x, 약 1.5x 내지 약 8.0x, 약 1.5x 내지 약 7.5x, 약 1.5x 내지 약 7.0x, 약 1.5x 내지 약 6.5x, 약 1.5x 내지 약 6.0x, 약 1.5x 내지 약 5.5x, 약 1.5x 내지 약 5.0x, 약 1.5x 내지 약 4.5x, 약 1.5x 내지 약 4.0x, 약 1.5x 내지 약 3.5x, 약 1.5x 내지 약 3.0x, 약 1.5x 내지 약 2.5x, 약 1.5x 내지 약 2.0x, 약 2.0x 내지 약 10x, 약 2.0x 내지 약 9.5x, 약 2.0x 내지 약 9.0x, 약 2.0x 내지 약 8.5x, 약 2.0x 내지 약 8.0x, 약 2.0x 내지 약 7.5x, 약 2.0x 내지 약 7.0x, 약 2.0x 내지 약 6.5x, 약 2.0x 내지 약 6.0x, 약 2.0x 내지 약 5.5x, 약 2.0x 내지 약 5.0x, 약 2.0x 내지 약 4.5x, 약 2.0x 내지 약 4.0x, 약 2.0x 내지 약 3.5x, 약 2.0x 내지 약 3.0x, 약 2.0x 내지 약 2.5x, 약 2.5x 내지 약 10x, 약 2.5x 내지 약 9.5x, 약 2.5x 내지 약 9.0x, 약 2.5x 내지 약 8.5x, 약 2.5x 내지 약 8.0x, 약 2.5x 내지 약 7.5x, 약 2.5x 내지 약 7.0x, 약 2.5x 내지 약 6.5x, 약 2.5x 내지 약 6.0x, 약 2.5x 내지 약 5.5x, 약 2.5x 내지 약 5.0x, 약 2.5x 내지 약 4.5x, 약 2.5x 내지 약 4.0x, 약 2.5x 내지 약 3.5x, 약 2.5x 내지 약 3.0x, 약 3.0x 내지 약 10x, 약 3.0x 내지 약 9.5x, 약 3.0x 내지 약 9.0x, 약 3.0x 내지 약 8.5x, 약 3.0x 내지 약 8.0x, 약 3.0x 내지 약 7.5x, 약 3.0x 내지 약 7.0x, 약 3.0x 내지 약 6.5x, 약 3.0x 내지 약 6.0x, 약 3.0x 내지 약 5.5x, 약 3.0x 내지 약 5.0x, 약 3.0x 내지 약 4.5x, 약 3.0x 내지 약 4.0x, 약 3.0x 내지 약 3.5x, 약 3.5x 내지 약 10x, 약 3.5x 내지 약 9.5x, 약 3.5x 내지 약 9.0x, 약 3.5x 내지 약 8.5x, 약 3.5x 내지 약 8.0x, 약 3.5x 내지 약 7.5x, 약 3.5x 내지 약 7.0x, 약 3.5x 내지 약 6.5x, 약 3.5x 내지 약 6.0x, 약 3.5x 내지 약 5.5x, 약 3.5x 내지 약 5.0x, 약 3.5x 내지 약 4.5x, 약 3.5x 내지 약 4.0x, 약 4.0x 내지 약 10x, 약 4.0x 내지 약 9.5x, 약 4.0x 내지 약 9.0x, 약 4.0x 내지 약 8.5x, 약 4.0x 내지 약 8.0x, 약 4.0x 내지 약 7.5x, 약 4.0x 내지 약 7.0x, 약 4.0x 내지 약 6.5x, 약 4.0x 내지 약 6.0x, 약 4.0x 내지 약 5.5x, 약 4.0x 내지 약 5.0x, 약 4.0x 내지 약 4.5x, 약 4.5x 내지 약 10x, 약 4.5x 내지 약 9.5x, 약 4.5x 내지 약 9.0x, 약 4.5x 내지 약 8.5x, 약 4.5x 내지 약 8.0x, 약 4.5x 내지 약 7.5x, 약 4.5x 내지 약 7.0x, 약 4.5x 내지 약 6.5x, 약 4.5x 내지 약 6.0x, 약 4.5x 내지 약 5.5x, 약 4.5x 내지 약 5.0x, 약 5.0x 내지 약 10x, 약 5.0x 내지 약 9.5x, 약 5.0x 내지 약 9.0x, 약 5.0x 내지 약 8.5x, 약 5.0x 내지 약 8.0x, 약 5.0x 내지 약 7.5x, 약 5.0x 내지 약 7.0x, 약 5.0x 내지 약 6.5x, 약 5.0x 내지 약 6.0x, 약 5.0x 내지 약 5.5x, 약 5.5x 내지 약 10x, 약 5.5x 내지 약 9.5x, 약 5.5x 내지 약 9.0x, 약 5.5x 내지 약 8.5x, 약 5.5x 내지 약 8.0x, 약 5.5x 내지 약 7.5x, 약 5.5x 내지 약 7.0x, 약 5.5x 내지 약 6.5x, 약 5.5x 내지 약 6.0x, 약 6.0x 내지 약 10x, 약 6.0x 내지 약 9.5x, 약 6.0x 내지 약 9.0x, 약 6.0x 내지 약 8.5x, 약 6.0x 내지 약 8.0x, 약 6.0x 내지 약 7.5x, 약 6.0x 내지 약 7.0x, 약 6.0x 내지 약 6.5x, 약 6.5x 내지 약 10x, 약 6.5x 내지 약 9.5x, 약 6.5x 내지 약 9.0x, 약 6.5x 내지 약 8.5x, 약 6.5x 내지 약 8.0x, 약 6.5x 내지 약 7.5x, 약 6.5x 내지 약 7.0x, 약 7.0x 내지 약 10x, 약 7.0x 내지 약 9.5x, 약 7.0x 내지 약 9.0x, 약 7.0x 내지 약 8.5x, 약 7.0x 내지 약 8.0x, 약 7.0x 내지 약 7.5x, 약 7.5x 내지 약 10x, 약 7.5x 내지 약 9.5x, 약 7.5x 내지 약 9.0x, 약 7.5x 내지 약 8.5x, 약 7.5x 내지 약 8.0x, 약 8.0x 내지 약 10x, 약 8.0x 내지 약 9.5x, 약 8.0x 내지 약 9.0x, 약 8.0x 내지 약 8.5x, 약 8.5x 내지 약 10x, 약 8.5x 내지 약 9.5x, 약 8.5x 내지 약 9.0x, 약 9.0x 내지 약 10x, 약 9.0x 내지 약 9.5x, 또는 약 9.5x 내지 약 10x)가 각각 24시간의 증분으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 배양 배지(예를 들어 제2 배양 배지(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제2 배양 배지 중 어느 하나))의 추가 부피를 제2 세포 배양물에 첨가하는것은 제1 세포 배양물이 목표 특정 세포 밀도, 예를 들어 약 1.0 x 106 세포/mL, 약 1.5 x 106 세포/mL, 약 2.0 x 106 세포/mL, 약 2.5 x 106 세포/mL, 약 3.0 x 106 세포/mL, 약 3.5 x 106 세포/mL, 약 4.0 x 106 세포/mL, 약 4.5 x 106 세포/mL, 약 5.0 x 106 세포/mL, 약 5.5 x 106 세포/mL, 약 6.0 x 106 세포/mL, 약 6.5 x 106 세포/mL, 약 7.0 x 106 세포/mL, 약 7.5 x 106 세포/mL, 약 8.0 x 106 세포/mL, 약 8.5 x 106 세포/mL, 약 9.0 x 106 세포/mL, 약 9.5 x 106 세포/mL, 또는 약 1.0 x 107 cell/mL에 도달할 때 시작된다.
배양 배지(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제2 배양 배지 중 어느 하나)의 첨가는 기계적으로, 예를 들어 연동 펌프를 사용하여, 또는 수동으로(예를 들어 멸균 피펫팅에 의해) 수행될 수 있다.
이들 방법의 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 다음 중 하나 이상(예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개)을 포함한다: 트랜스페린(예를 들어 아포트랜스페린, 홀로 트랜스페린, 또는 이들의 조합)(예를 들어 약 1 μg/mL 내지 약 500 μg/mL 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 트랜스페린(예를 들어 인간 아포트랜스페린, 인간 홀로 트랜스페린, 또는 이들의 조합)), IL-3(예를 들어 약 0.1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 IL-3(예를 들어 재조합 인간 IL-3)), SCF(예를 들어 약 1 ng/mL 내지 약 1 μg/mL 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 SCF(예를 들어 재조합 인간 SCF)), 덱사메타손(예를 들어 약 0.1 nM 내지 약 200 nM 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 덱사메타손), 에리트로포이에틴(EPO) 또는 EPO-모방체 펩티드(예를 들어 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 EPO(예를 들어 재조합 인간 EPO) 또는 EPO-모방체 펩티드(예를 들어 본원에 기술된 EPO-모방체 펩티드 중 어느 하나)), 및 인슐린(예를 들어 약 0.1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 인슐린). 이들 방법의 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 지질(예: 지질 혼합물)을 포함한다. 이들 방법의 일부 구현예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM(또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나)의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다.
제3 세포 배양물을 제공하는 단계 (단계 C)
본원에 기술된 방법들은 단계 (b)의 제2 세포 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제2 세포 배양물 중 어느 하나)의 부피를 용기(예: 바이오리액터(예: 관류 바이오리액터), 진탕 튜브, 진탕 플라스크, 또는 배양 백)에 포함된 제3 배양 배지(예를 들어, 본원에 기술된 예시적인 제3 배양 배지 중 어느 하나) 내에 배치하여 제3 세포 배양물(예를 들어 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 107 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 106 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 0.1 x 106 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 8 x 105 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 6 x 105 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 105 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 105 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 105 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 107 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 106 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 0.1 x 106 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 8 x 105 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 6 x 105 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 105 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 105 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 107 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 106 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 0.1 x 106 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 8 x 105 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 6 x 105 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 105 세포/mL, 약 4 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL, 약 4 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 107 세포/mL, 약 4 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 4 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 106 세포/mL, 약 4 x 105 세포/mL 내지 약 0.1 x 106 세포/mL, 약 4 x 105 세포/mL 내지 약 8 x 105 세포/mL, 약 4 x 105 세포/mL 내지 약 6 x 105 세포/mL, 약 6 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL, 약 6 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 107 세포/mL, 약 6 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 6 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 106 세포/mL, 약 6 x 105 세포/mL 내지 약 0.1 x 106 세포/mL, 약 6 x 105 세포/mL 내지 약 8 x 105 세포/mL, 약 8 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL, 약 8 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 107 세포/mL, 약 8 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 8 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 106 세포/mL, 약 8 x 105 세포/mL 내지 약 0.1 x 106 세포/mL, 약 0.1 x 106 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL, 약 0.1 x 106 세포/mL 내지 약 0.5 x 107 세포/mL, 약 0.1 x 106 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 0.1 x 106 세포/mL 내지 약 0.5 x 106 세포/mL, 약 0.5 x 106 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL, 약 0.5 x 106 세포/mL 내지 약 0.5 x 107 세포/mL, 약 0.5 x 106 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 1 x 106 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL, 약 1 x 106 세포/mL 내지 약 0.5 x 107 세포/mL, 또는 약 0.5 x 107 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL의 초기 세포 밀도를 갖는 제3 세포 배양물)을 수득하는 단계(단계 (c))를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (c)는 단계 (b)의 제2 세포 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제2 세포 배양물 중 어느 하나)을 바이오리액터(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 부피 중 어느 하나를 갖는 바이오리액터(예를 들어 관류 바이오리액터) 중 어느 하나) 내에 포함된 제3 배양 배지 내에 배치하여 약 0.5 x 105개의 세포/mL 내지 약 1 x 107개의 세포/mL(또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나)의 초기 세포 밀도를 갖는 제3 세포 배양물을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (c)는 단계 (b)의 제2 세포 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제2 세포 배양물 중 어느 하나)을 진탕 플라스크(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 부피 중 어느 하나를 갖는 본원에 기술된 예시적인 진탕 플라스크 중 어느 하나) 내에 포함된 제3 배양 배지 내에 배치하여 약 0.5 x 105개의 세포/mL 내지 약 1 x 107개의 세포/mL(또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나)의 초기 세포 밀도를 갖는 제3 세포 배양물을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (c)는 단계 (b)의 제2 세포 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제2 세포 배양물 중 어느 하나)을 진탕 튜브(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 부피 중 어느 하나를 갖는 본원에 기술된 예시적인 진탕 튜브 중 어느 하나(예를 들어 원뿔형 용기)) 내에 포함된 제3 배양 배지 내에 배치하여 약 0.5 x 105개의 세포/mL 내지 약 1 x 107개의 세포/mL(또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나)의 초기 세포 밀도를 갖는 제3 세포 배양물을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (c)는 단계 (b)의 제2 세포 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제2 세포 배양물 중 어느 하나)을 배양 백(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 부피 중 어느 하나를 갖는 본원에 기술된 예시적인 배양 백 중 어느 하나) 내에 포함된 제3 배양 배지 내에 배치하여 약 0.5 x 105개의 세포/mL 내지 약 1 x 107개의 세포/mL(또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나)의 초기 세포 밀도를 갖는 제3 세포 배양물을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 0.01 g/L 내지 약 70 g/L(예를 들어 약 0.01 g/L 내지 약 65 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 60 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 55 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 50 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 45 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 40 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 35 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 30 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 25 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 20 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 18 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 16 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 14 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 12 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 10 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 9.5 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 9.0 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 8.5 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 8.0 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 7.5 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 7.0 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 6.5 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 6.0 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 5.5 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 5.0 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 4.5 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 4.0 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 3.5 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 3.0 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 2.5 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 2.0 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 1.5 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 1.0 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 0.5 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 0.1 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 0.05 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 70 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 65 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 60 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 55 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 50 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 45 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 40 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 35 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 30 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 25 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 20 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 18 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 16 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 14 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 12 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 10 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 9.5 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 9.0 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 8.5 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 8.0 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 7.5 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 7.0 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 6.5 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 6.0 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 5.5 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 5.0 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 4.5 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 4.0 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 3.5 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 3.0 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 2.5 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 2.0 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 1.5 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 1.0 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 0.5 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 0.1 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 70 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 65 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 60 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 55 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 50 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 45 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 40 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 35 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 30 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 25 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 20 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 18 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 16 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 14 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 12 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 10 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 9.5 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 9.0 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 8.5 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 8.0 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 7.5 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 7.0 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 6.5 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 6.0 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 5.5 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 5.0 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 4.5 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 4.0 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 3.5 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 3.0 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 2.5 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 2.0 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 1.5 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 1.0 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 0.5 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 70 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 65 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 60 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 55 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 50 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 45 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 40 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 35 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 30 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 25 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 20 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 18 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 16 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 14 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 12 g/L, 약 0.5 g/L 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520 mM, 약 520 mM 내지 약 560 mM, 약 520 mM 내지 약 540 mM, 또는 약 540 mM 내지 약 560 mM)의 타우린(또는 타우린 전구물질(예를 들어 L-시스테인, L-시스테인산염, 시스테아민, 또는 시스테인설핀산) 또는 타우린 분해 산물(예를 들어 5-글루타밀-타우린, 타우로콜산염, 및 타우로시아민)) 및/또는 0.01 g/L 내지 약 70 g/L(또는 예를 들어 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 하나) 또는 약 90 μM 내지 약 640 mM(예를 들어 약 90 μM 내지 약 600 mM, 약 90 μM 내지 약 550 mM, 약 90 μM 내지 약 500 mM, 약 90 μM 내지 약 480 mM, 약 90 μM 내지 약 460 mM, 약 90 μM 내지 약 440 mM, 약 90 μM 내지 약 420 mM, 약 90 μM 내지 약 400 mM, 약 90 μM 내지 약 380 mM, 약 90 μM 내지 약 360 mM, 약 90 μM 내지 약 340 mM, 약 90 μM 내지 약 320 mM, 약 90 μM 내지 약 300 mM, 약 90 μM 내지 약 280 mM, 약 90 μM 내지 약 260 mM, 약 90 μM 내지 약 240 mM, 약 90 μM 내지 약 220 mM, 약 90 μM 내지 약 200 mM, 약 90 μM 내지 약 180 mM, 약 90 μM 내지 약 160 mM, 약 90 μM 내지 약 140 mM, 약 90 μM 내지 약 120 mM, 약 90 μM 내지 약 100 mM, 약 90 μM 내지 약 95 mM, 약 90 μM 내지 약 90 mM, 약 90 μM 내지 약 85 mM, 약 90 μM 내지 약 80 mM, 약 90 μM 내지 약 75 mM, 약 90 μM 내지 약 70 mM, 약 90 μM 내지 약 65 mM, 약 90 μM 내지 약 60 mM, 약 90 μM 내지 약 55 mM, 약 90 μM 내지 약 50 mM, 약 90 μM 내지 약 45 mM, 약 90 μM 내지 약 40 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μM 내지 약 45 mM, 약 250 μM 내지 약 40 mM, 약 250 μM 내지 약 35 mM, 약 250 μM 내지 약 30 mM, 약 250 μM 내지 약 25 mM, 약 250 μM 내지 약 20 mM, 약 250 μM 내지 약 15 mM, 약 250 μM 내지 약 10 mM, 약 250 μM 내지 약 5 mM, 약 250 μM 내지 약 2 mM, 약 250 μM 내지 약 1 mM, 약 250 μM 내지 약 0.5 mM, 약 0.5 mM 내지 약 640 mM, 약 0.5 mM 내지 약 600 mM, 약 0.5 mM 내지 약 550 mM, 약 0.5 mM 내지 약 500 mM, 약 0.5 mM 내지 약 480 mM, 약 0.5 mM 내지 약 460 mM, 약 0.5 mM 내지 약 440 mM, 약 0.5 mM 내지 약 420 mM, 약 0.5 mM 내지 약 400 mM, 약 0.5 mM 내지 약 380 mM, 약 0.5 mM 내지 약 360 mM, 약 0.5 mM 내지 약 340 mM, 약 0.5 mM 내지 약 320 mM, 약 0.5 mM 내지 약 300 mM, 약 0.5 mM 내지 약 280 mM, 약 0.5 mM 내지 약 260 mM, 약 0.5 mM 내지 약 240 mM, 약 0.5 mM 내지 약 220 mM, 약 0.5 mM 내지 약 200 mM, 약 0.5 mM 내지 약 180 mM, 약 0.5 mM 내지 약 160 mM, 약 0.5 mM 내지 약 140 mM, 약 0.5 mM 내지 약 120 mM, 약 0.5 mM 내지 약 100 mM, 약 0.5 mM 내지 약 95 mM, 약 0.5 mM 내지 약 90 mM, 약 0.5 mM 내지 약 85 mM, 약 0.5 mM 내지 약 80 mM, 약 0.5 mM 내지 약 75 mM, 약 0.5 mM 내지 약 70 mM, 약 0.5 mM 내지 약 65 mM, 약 0.5 mM 내지 약 60 mM, 약 0.5 mM 내지 약 55 mM, 약 0.5 mM 내지 약 50 mM, 약 0.5 mM 내지 약 45 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550 mM, 약 300 mM 내지 약 500 mM, 약 300 mM 내지 약 480 mM, 약 300 mM 내지 약 460 mM, 약 300 mM 내지 약 440 mM, 약 300 mM 내지 약 420 mM, 약 300 mM 내지 약 400 mM, 약 300 mM 내지 약 380 mM, 약 300 mM 내지 약 360 mM, 약 300 mM 내지 약 340 mM, 약 300 mM 내지 약 320 mM, 약 320 mM 내지 약 640 mM, 약 320 mM 내지 약 600 mM, 약 320 mM 내지 약 550 mM, 약 320 mM 내지 약 500 mM, 약 320 mM 내지 약 480 mM, 약 320 mM 내지 약 460 mM, 약 320 mM 내지 약 440 mM, 약 320 mM 내지 약 420 mM, 약 320 mM 내지 약 400 mM, 약 320 mM 내지 약 380 mM, 약 320 mM 내지 약 360 mM, 약 320 mM 내지 약 340 mM, 약 340 mM 내지 약 640 mM, 약 340 mM 내지 약 600 mM, 약 340 mM 내지 약 550 mM, 약 340 mM 내지 약 500 mM, 약 340 mM 내지 약 480 mM, 약 340 mM 내지 약 460 mM, 약 340 mM 내지 약 440 mM, 약 340 mM 내지 약 420 mM, 약 340 mM 내지 약 400 mM, 약 340 mM 내지 약 380 mM, 약 340 mM 내지 약 360 mM, 약 360 mM 내지 약 640 mM, 약 360 mM 내지 약 600 mM, 약 360 mM 내지 약 550 mM, 약 360 mM 내지 약 500 mM, 약 360 mM 내지 약 480 mM, 약 360 mM 내지 약 460 mM, 약 360 mM 내지 약 440 mM, 약 360 mM 내지 약 420 mM, 약 360 mM 내지 약 400 mM, 약 360 mM 내지 약 380 mM, 약 380 mM 내지 약 640 mM, 약 380 mM 내지 약 600 mM, 약 380 mM 내지 약 550 mM, 약 380 mM 내지 약 500 mM, 약 380 mM 내지 약 480 mM, 약 380 mM 내지 약 460 mM, 약 380 mM 내지 약 440 mM, 약 380 mM 내지 약 420 mM, 약 380 mM 내지 약 400 mM, 약 400 mM 내지 약 640 mM, 약 400 mM 내지 약 600 mM, 약 400 mM 내지 약 550 mM, 약 400 mM 내지 약 500 mM, 약 400 mM 내지 약 480 mM, 약 400 mM 내지 약 460 mM, 약 400 mM 내지 약 440 mM, 약 400 mM 내지 약 420 mM, 약 420 mM 내지 약 640 mM, 약 420 mM 내지 약 600 mM, 약 420 mM 내지 약 550 mM, 약 420 mM 내지 약 500 mM, 약 420 mM 내지 약 480 mM, 약 420 mM 내지 약 460 mM, 약 420 mM 내지 약 440 mM, 약 440 mM 내지 약 640 mM, 약 440 mM 내지 약 600 mM, 약 440 mM 내지 약 550 mM, 약 440 mM 내지 약 500 mM, 약 440 mM 내지 약 480 mM, 약 440 mM 내지 약 460 mM, 약 460 mM 내지 약 640 mM, 약 460 mM 내지 약 600 mM, 약 460 mM 내지 약 550 mM, 약 460 mM 내지 약 500 mM, 약 460 mM 내지 약 480 mM, 약 480 mM 내지 약 640 mM, 약 480 mM 내지 약 600 mM, 약 480 mM 내지 약 550 mM, 약 480 mM 내지 약 500 mM, 약 500 mM 내지 약 640 mM, 약 500 mM 내지 약 600 mM, 약 500 mM 내지 약 550 mM, 약 550 mM 내지 약 640 mM, 약 550 mM 내지 약 600 mM, 또는 약 600 mM 내지 약 640 mM)의 하이포타우린(또는 이의 하이포타우린 전구물질(예를 들어 L-시스테인, L-시스테인산염, s-카복시메틸시스테인, 시스테아민, 또는 시스테인설핀산) 또는 하이포타우린 분해 산물(예를 들어 5-글루타밀-타우린, 타우로콜산염, 및 타우로시아민))을 포함하고, 임의로 하나 이상의 (예를 들어 2, 3, 또는 4개의) 트랜스페린(예를 들어 아포트랜스페린, 홀로 트랜스페린, 또는 이들의 조합)(예를 들어 약 1 μg/mL 내지 약 500 μg/mL 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 트랜스페린(예를 들어 인간 아포트랜스페린, 인간 홀로 트랜스페린, 또는 이들의 조합)), 인슐린(예를 들어 약 0.1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 인슐린(예를 들어 재조합 인간 인슐린)), SCF(예를 들어 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 SCF(예를 들어 재조합 인간 SCF)), 및 EPO 또는 EPO 모방체 펩티드(예를 들어 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 EPO(예를 들어 재조합 인간 EPO) 또는 EPO 모방체 펩티드(예를 들어 본원에 기술된 또는 당업계에 알려진 예시적인 EPO 모방체 펩티드 중 어느 하나))를 포함한다. 본원에 기술된 제3 배양 배지 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 Iscove의 변형된 Dulbecco 배지(IMDM)를 포함한다. 본원에 기술된 제3 배양 배지 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 0.1% v/v 내지 약 10% v/v(예를 들어 약 0.1% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 5.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 2.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 1.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 1.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 1.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 5.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 2.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 1.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 1.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 5.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 2.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 1.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 10% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 5.0% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 2.0% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 8.000% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 5.0% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 10% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 5.0% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 5.0% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 10% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 5.0 % v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 5% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 10% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 5.0% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 10% v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 6.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 6.0% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 6.0% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 6.0% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 6.0% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 6.0% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 6.0% v/v 내지 약 7.000% v/v, 약 6.0% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 6.5% v/v 내지 약 10% v/v, 약 6.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 6.5% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 6.5% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 6.5% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 6.5% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 6.5% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 7.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 7.0% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 7.0% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 7.0% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 7.0% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 7.0% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 7.5% v/v 내지 약 10% v/v, 약 7.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 7.5% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 7.5% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 7.5% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 8.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 8.0% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 8.0% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 8.000% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 8.5% v/v 내지 약 10% v/v, 약 8.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 8.5% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 9.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 9.0% v/v 내지 약 9.5% v/v, 또는 약 9.5% v/v 내지 약 10% v/v)의 혈청(예를 들어 인간 AB 혈청)을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 0.1% v/v 내지 약 5% v/v(예를 들어 약 0.1% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 2.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 1.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 1.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 0.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 2.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 1.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 1.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 2.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 1.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 2.0% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 5% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 5% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 4.5% v/v, 또는 약 4.5% v/v 내지 약 5% v/v)의 인간 혈장을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1 U/mL 내지 약 5 U/mL(예를 들어 약 1 U/mL 내지 약 4 U/mL, 약 1 U/mL 내지 약 3 U/mL, 약 1 U/mL 내지 약 2 U/mL, 약 2 U/mL 내지 약 5 U/mL, 약 2 U/mL 내지 약 4 U/mL, 약 2 U/mL 내지 약 3 U/mL, 약 3 U/mL 내지 약 5 U/mL, 약 3 U/mL 내지 약 4 U/mL, 또는 약 4 U/mL 내지 약 5 U/mL)의 헤파린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 0.1% w/v 내지 약 3% w/v(예를 들어 약 0.1% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 0.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 3% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 3% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 3% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 2.0% w/v 내지 약 3% w/v, 약 2.0% w/v 내지 약 2.5% w/v, 또는 약 2.5% w/v 내지 약 3% w/v)의 폴록사머-188(P188)을 포함한다.
본원에 기술된 제3 배양 배지 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 약 1 mM 내지 약 8 mM(예를 들어 약 1 mM 내지 약 7 mM, 약 1 mM 내지 약 6 mM, 약 1 mM 내지 약 5 mM, 약 1 mM 내지 약 4 mM, 약 1 mM 내지 약 3 mM, 약 1 mM 내지 약 2 mM, 약 2 mM 내지 약 8 mM, 약 2 mM 내지 약 7 mM, 약 2 mM 내지 약 6 mM, 약 2 mM 내지 약 5 mM, 약 2 mM 내지 약 4 mM, 약 2 mM 내지 약 3 mM, 약 3 mM 내지 약 8 mM, 약 3 mM 내지 약 7 mM, 약 3 mM 내지 약 6 mM, 약 3 mM 내지 약 5 mM, 약 3 mM 내지 약 4 mM, 약 4 mM 내지 약 8 mM, 약 4 mM 내지 약 7 mM, 약 4 mM 내지 약 6 mM, 약 4 mM 내지 약 5 mM, 약 5 mM 내지 약 8 mM, 약 5 mM 내지 약 7 mM, 약 5 mM 내지 약 6 mM, 약 6 mM 내지 약 8 mM, 약 6 mM 내지 약 7 mM, 또는 약 7 mM 내지 약 8 mM)의 L-글루타민, L-알라닌-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 450 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 350 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 250 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 200 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 180 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 160 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 140 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 120 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 100 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 80 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 60 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 5 μg/mL, 5 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 450 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 350 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 250 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 200 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 180 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 160 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 140 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 120 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 100 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 80 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 60 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 10 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 450 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 350 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 250 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 200 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 180 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 160 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 140 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 120 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 100 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 80 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 60 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 20 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 450 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 350 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 250 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 200 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 180 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 160 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 140 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 120 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 100 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 80 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 60 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 40 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 450 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 350 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 250 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 200 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 180 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 160 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 140 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 120 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 100 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 80 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 60 μg/mL, 60 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 450 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 350 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 250 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 200 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 180 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 160 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 140 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 120 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 100 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 80 μg/mL, 80 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 450 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 350 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 250 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 200 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 180 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 160 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 140 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 120 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 100 μg/mL, 100 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 450 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 350 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 250 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 200 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 180 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 160 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 140 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 120 μg/mL, 120 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 450 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 350 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 250 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 200 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 180 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 160 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 140 μg/mL, 140 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 140 μg/mL 내지 약 450 μg/mL, 약 140 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 140 μg/mL 내지 약 350 μg/mL, 약 140 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 140 μg/mL 내지 약 250 μg/mL, 약 140 μg/mL 내지 약 200 μg/mL, 약 140 μg/mL 내지 약 180 μg/mL, 약 140 μg/mL 내지 약 160 μg/mL, 160 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 160 μg/mL 내지 약 450 μg/mL, 약 160 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 160 μg/mL 내지 약 350 μg/mL, 약 160 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 160 μg/mL 내지 약 250 μg/mL, 약 160 μg/mL 내지 약 200 μg/mL, 약 160 μg/mL 내지 약 180 μg/mL, 180 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 180 μg/mL 내지 약 450 μg/mL, 약 180 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 180 μg/mL 내지 약 350 μg/mL, 약 180 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 180 μg/mL 내지 약 250 μg/mL, 약 180 μg/mL 내지 약 200 μg/mL, 200 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 450 μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 350 μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 250 μg/mL, 250 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 250 μg/mL 내지 약 450 μg/mL, 약 250 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 250 μg/mL 내지 약 350 μg/mL, 약 250 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 300 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 450 μg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 350 μg/mL, 350 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 350 μg/mL 내지 약 450 μg/mL, 약 350 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 400 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 400 μg/mL 내지 약 450 μg/mL, 또는 450 μg/mL 내지 약 500 μg/mL의 트랜스페린(예를 들어 인간 아포트랜스페린, 인간 홀로 트랜스페린, 또는 이들의 조합)을 포함한다.
일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 350 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 250 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 5 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 350 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 250 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 350 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 250 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 350 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 250 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 350 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 250 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 150 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 350 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 250 ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 350 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 250 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 350 ng/mL, 약 250 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 350 ng/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 450 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 450 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 450 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 450 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 450 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 450 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 500 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 500 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 500 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 500 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 500 ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 600 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 600 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 600 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 600 ng/mL 내지 약 700 ng/mL, 약 700 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 700 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 700 ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 800 ng/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 800 ng/mL 내지 약 900 ng/mL, 약 900 ng/mL 내지 약 1 μg/mL의 SCF(예를 들어 재조합 인간 SCF)를 포함한다.
일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 25 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 15 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 10 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 5 ng/mL, 5 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 25 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 15 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 10 ng/mL, 10 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 25 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 15 ng/mL, 15 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 25 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 20 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 25 ng/mL, 25 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 30 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 40 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 60 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 80 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 100 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 120 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 140 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 160 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 180 ng/mL,180 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 200 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 220 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 220 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 220 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 220 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 220 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 220 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 220 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 220 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 220 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 220 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 220 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 220 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 220 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 220 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 240 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 260 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 280 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 280 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 280 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 280 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 280 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 280 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 280 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 280 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 280 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 280 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 280 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 300 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 320 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 320 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 320 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 320 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 320 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 320 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 320 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 320 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 320 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 340 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 340 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 340 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 340 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 340 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 340 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 340 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 340 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 360 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 360 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 360 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 360 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 360 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 360 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 360 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 380 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 380 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 380 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 380 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 380 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 380 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 400 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 420 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 420 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 420 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 420 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 440 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 440 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 440 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 460 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 460 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 또는 약 480 ng/mL 내지 약 500 ng/mL의 EPO(예를 들어 재조합 인간 EPO) 또는 EPO-모방체 펩티드를 포함한다. EPO-모방체 펩티드의 비제한적인 예가 본원에 기술된다. EPO-모방체 펩티드의 추가 예는 당업계에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 0.1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 35 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 약 15 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 5 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 2 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 35 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 1 μg/mL 약 15 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 5 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 2 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 35 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 2 μg/mL 약 15 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 5 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 35 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 5 μg/mL 약 15 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 35 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 10 μg/mL 약 15 μg/mL, 약 15 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 15 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 15 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 15 μg/mL 내지 약 35 μg/mL, 약 15 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 약 15 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 15 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 35 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 25 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 25 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 25 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 25 μg/mL 내지 약 35 μg/mL, 약 25 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 약 30 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 30 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 30 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 30 μg/mL 내지 약 35 μg/mL, 약 35 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 35 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 35 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 또는 약 45 μg/mL 내지 약 50 μg/mL의 인슐린(예: 인간 인슐린)을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 0.01 g/L 내지 약 80 g/L(예를 들어, 약 0.01 g/L 내지 약 75 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 70 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 65 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 60 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 55 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 50 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 45 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 40 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 35 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 30 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 25 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 20 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 18 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 16 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 14 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 12 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 10 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 9.5 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 9.0 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 8.5 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 8.0 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 7.5 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 7.0 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 6.5 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 6.0 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 5.5 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 5.0 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 4.5 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 4.0 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 3.5 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 3.0 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 2.5 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 2.0 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 1.5 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 1.0 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 0.5 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 0.1 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 0.05 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 80 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 75 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 70 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 65 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 60 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 55 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 50 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 45 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 40 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 35 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 30 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 25 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 20 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 18 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 16 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 14 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 12 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 10 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 9.5 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 9.0 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 8.5 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 8.0 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 7.5 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 7.0 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 6.5 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 6.0 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 5.5 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 5.0 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 4.5 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 4.0 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 3.5 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 3.0 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 2.5 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 2.0 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 1.5 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 1.0 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 0.5 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 0.1 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 80 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 75 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 70 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 65 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 60 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 55 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 50 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 45 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 40 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 35 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 30 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 25 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 20 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 18 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 16 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 14 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 12 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 10 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 9.5 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 9.0 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 8.5 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 8.0 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 7.5 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 7.0 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 6.5 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 6.0 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 5.5 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 5.0 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 4.5 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 4.0 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 3.5 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 3.0 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 2.5 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 2.0 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 1.5 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 1.0 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 0.5 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 80 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 75 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 70 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 65 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 60 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 55 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 50 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 45 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 40 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 35 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 30 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 25 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 20 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 18 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 16 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 14 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 12 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 10 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 9.5 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 9.0 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 8.5 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 8.0 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 7.5 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 7.0 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 6.5 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 6.0 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 5.5 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 5.0 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 4.5 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 4.0 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 3.5 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 3.0 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 2.5 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 2.0 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 1.5 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 1.0 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 80 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 75 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 70 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 65 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 60 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 55 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 50 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 45 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 40 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 35 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 30 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 25 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 20 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 18 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 16 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 14 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 12 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 10 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 9.5 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 9.0 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 8.5 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 8.0 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 7.5 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 7.0 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 6.5 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 6.0 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 5.5 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 5.0 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 4.5 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 4.0 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 3.5 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 3.0 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 2.5 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 2.0 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 1.5 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 80 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 75 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 70 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 65 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 60 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 55 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 50 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 45 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 40 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 35 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 30 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 25 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 20 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 18 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 16 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 14 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 12 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 10 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 9.5 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 9.0 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 8.5 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 8.0 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 7.5 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 7.0 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 6.5 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 6.0 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 5.5 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 5.0 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 4.5 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 4.0 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 3.5 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 3.0 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 2.5 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 2.0 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 80 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 75 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 70 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 65 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 60 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 55 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 50 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 45 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 40 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 35 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 30 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 25 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 20 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 18 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 16 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 14 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 12 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 10 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 9.5 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 9.0 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 8.5 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 8.0 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 7.5 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 7.0 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 6.5 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 6.0 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 5.5 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 5.0 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 4.5 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 4.0 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 3.5 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 3.0 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 2.5 g/L, 약 2.5 g/L 내지 약 80 g/L, 약 2.5 g/L 내지 약 75 g/L, 약 2.5 g/L 내지 약 70 g/L, 약 2.5 g/L 내지 약 65 g/L, 약 2.5 g/L 내지 약 60 g/L, 약 2.5 g/L 내지 약 55 g/L, 약 2.5 g/L 내지 약 50 g/L, 약 2.5 g/L 내지 약 45 g/L, 약 2.5 g/L 내지 약 40 g/L, 약 2.5 g/L 내지 약 35 g/L, 약 2.5 g/L 내지 약 30 g/L, 약 2.5 g/L 내지 약 25 g/L, 약 2.5 g/L 내지 약 20 g/L, 약 2.5 g/L 내지 약 18 g/L, 약 2.5 g/L 내지 약 16 g/L, 약 2.5 g/L 내지 약 14 g/L, 약 2.5 g/L 내지 약 12 g/L, 약 2.5 g/L 내지 약 10 g/L, 약 2.5 g/L 내지 약 9.5 g/L, 약 2.5 g/L 내지 약 9.0 g/L, 약 2.5 g/L 내지 약 8.5 g/L, 약 2.5 g/L 내지 약 8.0 g/L, 약 2.5 g/L 내지 약 7.5 g/L, 약 2.5 g/L 내지 약 7.0 g/L, 약 2.5 g/L 내지 약 6.5 g/L, 약 2.5 g/L 내지 약 6.0 g/L, 약 2.5 g/L 내지 약 5.5 g/L, 약 2.5 g/L 내지 약 5.0 g/L, 약 2.5 g/L 내지 약 4.5 g/L, 약 2.5 g/L 내지 약 4.0 g/L, 약 2.5 g/L 내지 약 3.5 g/L, 약 2.5 g/L 내지 약 3.0 g/L, 약 3.0 g/L 내지 약 80 g/L, 약 3.0 g/L 내지 약 75 g/L, 약 3.0 g/L 내지 약 70 g/L, 약 3.0 g/L 내지 약 65 g/L, 약 3.0 g/L 내지 약 60 g/L, 약 3.0 g/L 내지 약 55 g/L, 약 3.0 g/L 내지 약 50 g/L, 약 3.0 g/L 내지 약 45 g/L, 약 3.0 g/L 내지 약 40 g/L, 약 3.0 g/L 내지 약 35 g/L, 약 3.0 g/L 내지 약 30 g/L, 약 3.0 g/L 내지 약 25 g/L, 약 3.0 g/L 내지 약 20 g/L, 약 3.0 g/L 내지 약 18 g/L, 약 3.0 g/L 내지 약 16 g/L, 약 3.0 g/L 내지 약 14 g/L, 약 3.0 g/L 내지 약 12 g/L, 약 3.0 g/L 내지 약 10 g/L, 약 3.0 g/L 내지 약 9.5 g/L, 약 3.0 g/L 내지 약 9.0 g/L, 약 3.0 g/L 내지 약 8.5 g/L, 약 3.0 g/L 내지 약 8.0 g/L, 약 3.0 g/L 내지 약 7.5 g/L, 약 3.0 g/L 내지 약 7.0 g/L, 약 3.0 g/L 내지 약 6.5 g/L, 약 3.0 g/L 내지 약 6.0 g/L, 약 3.0 g/L 내지 약 5.5 g/L, 약 3.0 g/L 내지 약 5.0 g/L, 약 3.0 g/L 내지 약 4.5 g/L, 약 3.0 g/L 내지 약 4.0 g/L, 약 3.0 g/L 내지 약 3.5 g/L, 약 3.5 g/L 내지 약 80 g/L, 약 3.5 g/L 내지 약 75 g/L, 약 3.5 g/L 내지 약 70 g/L, 약 3.5 g/L 내지 약 65 g/L, 약 3.5 g/L 내지 약 60 g/L, 약 3.5 g/L 내지 약 55 g/L, 약 3.5 g/L 내지 약 50 g/L, 약 3.5 g/L 내지 약 45 g/L, 약 3.5 g/L 내지 약 40 g/L, 약 3.5 g/L 내지 약 35 g/L, 약 3.5 g/L 내지 약 30 g/L, 약 3.5 g/L 내지 약 25 g/L, 약 3.5 g/L 내지 약 20 g/L, 약 3.5 g/L 내지 약 18 g/L, 약 3.5 g/L 내지 약 16 g/L, 약 3.5 g/L 내지 약 14 g/L, 약 3.5 g/L 내지 약 12 g/L, 약 3.5 g/L 내지 약 10 g/L, 약 3.5 g/L 내지 약 9.5 g/L, 약 3.5 g/L 내지 약 9.0 g/L, 약 3.5 g/L 내지 약 8.5 g/L, 약 3.5 g/L 내지 약 8.0 g/L, 약 3.5 g/L 내지 약 7.5 g/L, 약 3.5 g/L 내지 약 7.0 g/L, 약 3.5 g/L 내지 약 6.5 g/L, 약 3.5 g/L 내지 약 6.0 g/L, 약 3.5 g/L 내지 약 5.5 g/L, 약 3.5 g/L 내지 약 5.0 g/L, 약 3.5 g/L 내지 약 4.5 g/L, 약 3.5 g/L 내지 약 4.0 g/L, 약 4.0 g/L 내지 약 80 g/L, 약 4.0 g/L 내지 약 75 g/L, 약 4.0 g/L 내지 약 70 g/L, 약 4.0 g/L 내지 약 65 g/L, 약 4.0 g/L 내지 약 60 g/L, 약 4.0 g/L 내지 약 55 g/L, 약 4.0 g/L 내지 약 50 g/L, 약 4.0 g/L 내지 약 45 g/L, 약 4.0 g/L 내지 약 40 g/L, 약 4.0 g/L 내지 약 35 g/L, 약 4.0 g/L 내지 약 30 g/L, 약 4.0 g/L 내지 약 25 g/L, 약 4.0 g/L 내지 약 20 g/L, 약 4.0 g/L 내지 약 18 g/L, 약 4.0 g/L 내지 약 16 g/L, 약 4.0 g/L 내지 약 14 g/L, 약 4.0 g/L 내지 약 12 g/L, 약 4.0 g/L 내지 약 10 g/L, 약 4.0 g/L 내지 약 9.5 g/L, 약 4.0 g/L 내지 약 9.0 g/L, 약 4.0 g/L 내지 약 8.5 g/L, 약 4.0 g/L 내지 약 8.0 g/L, 약 4.0 g/L 내지 약 7.5 g/L, 약 4.0 g/L 내지 약 7.0 g/L, 약 4.0 g/L 내지 약 6.5 g/L, 약 4.0 g/L 내지 약 6.0 g/L, 약 4.0 g/L 내지 약 5.5 g/L, 약 4.0 g/L 내지 약 5.0 g/L, 약 4.0 g/L 내지 약 4.5 g/L, 약 4.5 g/L 내지 약 80 g/L, 약 4.5 g/L 내지 약 75 g/L, 약 4.5 g/L 내지 약 70 g/L, 약 4.5 g/L 내지 약 65 g/L, 약 4.5 g/L 내지 약 60 g/L, 약 4.5 g/L 내지 약 55 g/L, 약 4.5 g/L 내지 약 50 g/L, 약 4.5 g/L 내지 약 45 g/L, 약 4.5 g/L 내지 약 40 g/L, 약 4.5 g/L 내지 약 35 g/L, 약 4.5 g/L 내지 약 30 g/L, 약 4.5 g/L 내지 약 25 g/L, 약 4.5 g/L 내지 약 20 g/L, 약 4.5 g/L 내지 약 18 g/L, 약 4.5 g/L 내지 약 16 g/L, 약 4.5 g/L 내지 약 14 g/L, 약 4.5 g/L 내지 약 12 g/L, 약 4.5 g/L 내지 약 10 g/L, 약 4.5 g/L 내지 약 9.5 g/L, 약 4.5 g/L 내지 약 9.0 g/L, 약 4.5 g/L 내지 약 8.5 g/L, 약 4.5 g/L 내지 약 8.0 g/L, 약 4.5 g/L 내지 약 7.5 g/L, 약 4.5 g/L 내지 약 7.0 g/L, 약 4.5 g/L 내지 약 6.5 g/L, 약 4.5 g/L 내지 약 6.0 g/L, 약 4.5 g/L 내지 약 5.5 g/L, 약 4.5 g/L 내지 약 5.0 g/L, 약 5.0 g/L 내지 약 80 g/L, 약 5.0 g/L 내지 약 75 g/L, 약 5.0 g/L 내지 약 70 g/L, 약 5.0 g/L 내지 약 65 g/L, 약 5.0 g/L 내지 약 60 g/L, 약 5.0 g/L 내지 약 55 g/L, 약 5.0 g/L 내지 약 50 g/L, 약 5.0 g/L 내지 약 45 g/L, 약 5.0 g/L 내지 약 40 g/L, 약 5.0 g/L 내지 약 35 g/L, 약 5.0 g/L 내지 약 30 g/L, 약 5.0 g/L 내지 약 25 g/L, 약 5.0 g/L 내지 약 20 g/L, 약 5.0 g/L 내지 약 18 g/L, 약 5.0 g/L 내지 약 16 g/L, 약 5.0 g/L 내지 약 14 g/L, 약 5.0 g/L 내지 약 12 g/L, 약 5.0 g/L 내지 약 10 g/L, 약 5.0 g/L 내지 약 9.5 g/L, 약 5.0 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약 400 mM, 약 200 mM 내지 약 380 mM, 약 200 mM 내지 약 360 mM, 약 200 mM 내지 약 340 mM, 약 200 mM 내지 약 320 mM, 약 200 mM 내지 약 300 mM, 약 200 mM 내지 약 280 mM, 약 200 mM 내지 약 260 mM, 약 200 mM 내지 약 240 mM, 약 200 mM 내지 약 220 mM, 약 220 mM 내지 약 445 mM, 약 220 mM 내지 약 425 mM, 약 220 mM 내지 약 400 mM, 약 220 mM 내지 약 380 mM, 약 220 mM 내지 약 360 mM, 약 220 mM 내지 약 340 mM, 약 220 mM 내지 약 320 mM, 약 220 mM 내지 약 300 mM, 약 220 mM 내지 약 280 mM, 약 220 mM 내지 약 260 mM, 약 220 mM 내지 약 240 mM, 약 240 mM 내지 약 445 mM, 약 240 mM 내지 약 425 mM, 약 240 mM 내지 약 400 mM, 약 240 mM 내지 약 380 mM, 약 240 mM 내지 약 360 mM, 약 240 mM 내지 약 340 mM, 약 240 mM 내지 약 320 mM, 약 240 mM 내지 약 300 mM, 약 240 mM 내지 약 280 mM, 약 240 mM 내지 약 260 mM, 약 260 mM 내지 약 445 mM, 약 260 mM 내지 약 425 mM, 약 260 mM 내지 약 400 mM, 약 260 mM 내지 약 380 mM, 약 260 mM 내지 약 360 mM, 약 260 mM 내지 약 340 mM, 약 260 mM 내지 약 320 mM, 약 260 mM 내지 약 300 mM, 약 260 mM 내지 약 280 mM, 약 280 mM 내지 약 445 mM, 약 280 mM 내지 약 425 mM, 약 280 mM 내지 약 400 mM, 약 280 mM 내지 약 380 mM, 약 280 mM 내지 약 360 mM, 약 280 mM 내지 약 340 mM, 약 280 mM 내지 약 320 mM, 약 280 mM 내지 약 300 mM, 약 300 mM 내지 약 445 mM, 약 300 mM 내지 약 425 mM, 약 300 mM 내지 약 400 mM, 약 300 mM 내지 약 380 mM, 약 300 mM 내지 약 360 mM, 약 300 mM 내지 약 340 mM, 약 300 mM 내지 약 320 mM, 약 320 mM 내지 약 445 mM, 약 320 mM 내지 약 425 mM, 약 320 mM 내지 약 400 mM, 약 320 mM 내지 약 380 mM, 약 320 mM 내지 약 360 mM, 약 320 mM 내지 약 340 mM, 약 340 mM 내지 약 445 mM, 약 340 mM 내지 약 425 mM, 약 340 mM 내지 약 400 mM, 약 340 mM 내지 약 380 mM, 약 340 mM 내지 약 360 mM, 약 360 mM 내지 약 445 mM, 약 360 mM 내지 약 425 mM, 약 360 mM 내지 약 400 mM, 약 360 mM 내지 약 380 mM, 380 mM 내지 약 445 mM, 약 380 mM 내지 약 425 mM, 약 380 mM 내지 약 400 mM, 400 mM 내지 약 445 mM, 약 400 mM 내지 약 425 mM, 또는 약 425 mM 내지 약 445 mM)의 미오-이니시톨(또는 미오-이니시톨 전구물질(예를 들어, D-글루코스-6-포스페이트 또는 이노시톨-D-포스페이트) 또는 미오-이노시톨 분해 산물(예를 들어, 글루쿠론산))을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제3 배양 배지는, 예를 들어 화학적으로 정의된 액체 배양 배지, 동물 성분이 없는 액체 배양 배지, 또는 동물 성분이 없는 화학적으로 정의된 액체 배양 배지, 및/또는 혈청이 없는 액체 배양 배지일 수 있다.
배양 단계 D
관류 배양
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 단계 (d)는 제3 세포 배양물을 (예를 들어, 본원에 기술된 예시적인 부피 중 어느 하나를 갖는 본원에 기술된 예시적인 바이오리액터(예: 관류 바이오리액터) 중 어느 하나에서 본원에 기술된 제3 세포 배양물 중 어느 하나를) 약 5일 내지 약 20일(예를 들어 약 5일 내지 약 19일, 약 5일 내지 약 18일, 약 5일 내지 약 17일, 약 5일 내지 약 16일, 약 5일 내지 약 15일, 약 5일 내지 약 14일, 약 5일 내지 약 13일, 약 5일 내지 약 12일, 약 5일 내지 약 11일, 약 5일 내지 약 10일, 약 5일 내지 약 9일, 약 5일 내지 약 8일, 약 5일 내지 약 7일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 20일, 약 6일 내지 약 19일, 약 6일 내지 약 18일, 약 6일 내지 약 17일, 약 6일 내지 약 16일, 약 6일 내지 약 15일, 약 6일 내지 약 14일, 약 6일 내지 약 13일, 약 6일 내지 약 12일, 약 6일 내지 약 11일, 약 6일 내지 약 10일, 약 6일 내지 약 9일, 약 6일 내지 약 8일, 약 6일 내지 약 7일, 약 7일 내지 약 20일, 약 7일 내지 약 19일, 약 7일 내지 약 18일, 약 7일 내지 약 17일, 약 7일 내지 약 16일, 약 7일 내지 약 15일, 약 7일 내지 약 14일, 약 7일 내지 약 13일, 약 7일 내지 약 12일, 약 7일 내지 약 11일, 약 7일 내지 약 10일, 약 7일 내지 약 9일, 약 7일 내지 약 8일, 약 8일 내지 약 20일, 약 8일 내지 약 19일, 약 8일 내지 약 18일, 약 8일 내지 약 17일, 약 8일 내지 약 16일, 약 8일 내지 약 15일, 약 8일 내지 약 14일, 약 8일 내지 약 13일, 약 8일 내지 약 12일, 약 8일 내지 약 11일, 약 8일 내지 약 10일, 약 8일 내지 약 9일, 약 9일 내지 약 20일, 약 9일 내지 약 19일, 약 9일 내지 약 18일, 약 9일 내지 약 17일, 약 9일 내지 약 16일, 약 9일 내지 약 15일, 약 9일 내지 약 14일, 약 9일 내지 약 13일, 약 9일 내지 약 12일, 약 9일 내지 약 11일, 약 9일 내지 약 10일, 약 10일 내지 약 20일, 약 10일 내지 약 19일, 약 10일 내지 약 18일, 약 10일 내지 약 17일, 약 10일 내지 약 16일, 약 10일 내지 약 15일, 약 10일 내지 약 14일, 약 10일 내지 약 13일, 약 10일 내지 약 12일, 약 10일 내지 약 11일, 약 11일 내지 약 20일, 약 11일 내지 약 19일, 약 11일 내지 약 18일, 약 11일 내지 약 17일, 약 11일 내지 약 16일, 약 11일 내지 약 15일, 약 11일 내지 약 14일, 약 11일 내지 약 13일, 약 11일 내지 약 12일, 약 12일 내지 약 20일, 약 12일 내지 약 19일, 약 12일 내지 약 18일, 약 12일 내지 약 17일, 약 12일 내지 약 16일, 약 12일 내지 약 15일, 약 12일 내지 약 14일, 약 12일 내지 약 13일, 약 13일 내지 약 20일, 약 13일 내지 약 19일, 약 13일 내지 약 18일, 약 13일 내지 약 17일, 약 13일 내지 약 16일, 약 13일 내지 약 15일, 약 13일 내지 약 14일, 약 14일 내지 약 20일, 약 14일 내지 약 19일, 약 14일 내지 약 18일, 약 14일 내지 약 17일, 약 14일 내지 약 16일, 약 14일 내지 약 15일, 약 15일 내지 약 20일, 약 15일 내지 약 19일, 약 15일 내지 약 18일, 약 15일 내지 약 17일, 약 15일 내지 약 16일, 약 16일 내지 약 20일, 약 16일 내지 약 19일, 약 16일 내지 약 18일, 약 16일 내지 약 17일, 약 17일 내지 약 20일, 약 17일 내지 약 19일, 약 17일 내지 약 18일, 약 18일 내지 약 20일, 약 18일 내지 약 19일, 또는 약 19일 내지 약 20일) 동안 관류 배양하는 단계를 포함하되, 단계 (d) 후에, 제3 배양 배지는 제핵 적혈구 세포(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제핵 적혈구 세포 중 어느 하나)의 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 (예를 들어, 본원에 기술된 예시적인 부피 중 어느 하나를 갖는 본원에 기술된 바이오리액터 중 어느 하나에서) 약 10 W/m3 내지 약 200 W/m3의 (예를 들어, 본원에 기술된 범위 중 어느 하나의 하위 범위 중 어느 하나의) P/V 값으로 제3 세포 배양물을 교반하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (d)에서의 관류 배양은 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 8 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 6 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 5 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 4 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 2 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 1 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 0.5 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 0.1 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 8 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 6 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 5 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 4 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 2 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 1 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 0.5 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 8 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 6 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 5 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 4 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 2 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 1 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 8 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 6 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 5 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 4 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 2 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 8 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 6 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 5 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 4 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 8 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 6 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 5 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 8 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 6 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 8 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 30 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 30 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 30 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 30 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 30 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 30 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 35 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 35 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 35 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 35 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 35 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 40 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 40 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 40 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 40 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 45 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 45 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 45 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 50 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 50 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 또는 약 55 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일의 관류 속도를 사용해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 관류 속도는 시간 경과에 따라 증가된다.
일부 구현예에서, 단계 (d)에서의 관류 배양은 약 0.1 VVD 내지 약 3 VVD(또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나)의 관류 속도를 사용해 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 단계 (d)에서의 관류 배양은: (i) 제1 기간 동안 제3 배양 배지(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 배양 배지 중 어느 하나)의 추가 부피를 제3 세포 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 어느 하나)에 첨가하는 단계; 및 (ii) 제2 기간 동안 제4 배양 배지(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제4 배양 배지 중 어느 하나)의 추가 부피를 제3 세포 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 어느 하나)에 첨가하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (i)에서 제3 배양 배지(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 배양 배지 중 어느 하나)의 추가 부피는 제1 기간 동안 제3 세포 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 어느 하나)에 연속으로 첨가되고/되거나; 단계 (ii)에서 제4 배양 배지(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제4 배양 배지 중 어느 하나)의 추가 부피는 제2 기간 동안 제3 세포 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 어느 하나)에 연속으로 첨가된다.
일부 구현예에서, 단계 (i)에서 제3 배양 배지(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 배양 배지 중 어느 하나)의 추가 부피는 제1 기간 동안 주기적으로 (예를 들어, 3일마다 1회, 2일마다 1회, 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회, 1일 4회, 1일 5회, 1일 6회, 1일 7회, 1일 8회, 1일 9회, 1일 10회, 1일 11회, 또는 1일 12회) 제3 세포 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 어느 하나)에 첨가되고/되거나; (ii) 단계 (ii)에서 제4 배양 배지(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제4 배양 배지 중 어느 하나)의 추가 부피는 제2 기간 동안 주기적으로 (예를 들어, 3일마다 1회, 2일마다 1회, 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회, 1일 4회, 1일 5회, 1일 6회, 1일 7회, 1일 8회, 1일 9회, 1일 10회, 1일 11회, 또는 1일 12회) 제3 세포 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 어느 하나)에 첨가된다.
배양 배지(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 또는 제4 배양 배지 중 어느 하나)의 첨가는 기계적으로, 예를 들어 연동 펌프를 사용하여, 또는 수동으로(예를 들어 멸균 피펫팅에 의해) 수행될 수 있다.
배양 배지(예를 들어 실질적으로 세포가 없는 배양 배지)의 제거는 기계적으로, 예를 들어 접선 유동 여과(TFF) 또는 교번 유동 여과(ATF)를 사용하여, 또는 수동으로(예를 들어 멸균 피펫팅에 의해) 수행될 수 있다. 접선 유동 여과의 추가적인 비제한적인 양태가 본원에 기술된다.
일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 제1 기간은 약 1일 내지 약 12일, 약 1일 내지 약 11일, 약 1일 내지 약 10일, 약 1일 내지 약 9일, 약 1일 내지 약 8일, 약 1일 내지 약 7일, 약 1일 내지 약 6일, 약 1일 내지 약 5일, 약 1일 내지 약 4일, 약 1일 내지 약 3일, 약 1일 내지 약 2일, 약 2일 내지 약 12일, 약 2일 내지 약 11일, 약 2일 내지 약 10일, 약 2일 내지 약 9일, 약 2일 내지 약 8일, 약 2일 내지 약 7일, 약 2일 내지 약 6일, 약 2일 내지 약 5일, 약 2일 내지 약 4일, 약 2일 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 12일, 약 3일 내지 약 11일, 약 3일 내지 약 10일, 약 3일 내지 약 9일, 약 3일 내지 약 8일, 약 3일 내지 약 7일, 약 3일 내지 약 6일, 약 3일 내지 약 5일, 약 3일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 12일, 약 4일 내지 약 11일, 약 4일 내지 약 10일, 약 4일 내지 약 9일, 약 4일 내지 약 8일, 약 4일 내지 약 7일, 약 4일 내지 약 6일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 12일, 약 5일 내지 약 11일, 약 5일 내지 약 10일, 약 5일 내지 약 9일, 약 5일 내지 약 8일, 약 5일 내지 약 7일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 12일, 약 6일 내지 약 11일, 약 6일 내지 약 10일, 약 6일 내지 약 9일, 약 6일 내지 약 8일, 약 6일 내지 약 7일, 약 7일 내지 약 12일, 약 7일 내지 약 11일, 약 7일 내지 약 10일, 약 7일 내지 약 9일, 약 7일 내지 약 8일, 약 8일 내지 약 12일, 약 8일 내지 약 11일, 약 8일 내지 약 10일, 약 8일 내지 약 9일, 약 9일 내지 약 12일, 약 9일 내지 약 11일, 약 9일 내지 약 10일, 약 10일 내지 약 12일, 약 10일 내지 약 11일, 또는 약 11일 내지 약 12일이다.
일부 구현예에서, 단계 (ii)에서의 제2 기간은 약 1일 내지 약 12일, 약 1일 내지 약 11일, 약 1일 내지 약 10일, 약 1일 내지 약 9일, 약 1일 내지 약 8일, 약 1일 내지 약 7일, 약 1일 내지 약 6일, 약 1일 내지 약 5일, 약 1일 내지 약 4일, 약 1일 내지 약 3일, 약 1일 내지 약 2일, 약 2일 내지 약 12일, 약 2일 내지 약 11일, 약 2일 내지 약 10일, 약 2일 내지 약 9일, 약 2일 내지 약 8일, 약 2일 내지 약 7일, 약 2일 내지 약 6일, 약 2일 내지 약 5일, 약 2일 내지 약 4일, 약 2일 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 12일, 약 3일 내지 약 11일, 약 3일 내지 약 10일, 약 3일 내지 약 9일, 약 3일 내지 약 8일, 약 3일 내지 약 7일, 약 3일 내지 약 6일, 약 3일 내지 약 5일, 약 3일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 12일, 약 4일 내지 약 11일, 약 4일 내지 약 10일, 약 4일 내지 약 9일, 약 4일 내지 약 8일, 약 4일 내지 약 7일, 약 4일 내지 약 6일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 12일, 약 5일 내지 약 11일, 약 5일 내지 약 10일, 약 5일 내지 약 9일, 약 5일 내지 약 8일, 약 5일 내지 약 7일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 12일, 약 6일 내지 약 11일, 약 6일 내지 약 10일, 약 6일 내지 약 9일, 약 6일 내지 약 8일, 약 6일 내지 약 7일, 약 7일 내지 약 12일, 약 7일 내지 약 11일, 약 7일 내지 약 10일, 약 7일 내지 약 9일, 약 7일 내지 약 8일, 약 8일 내지 약 12일, 약 8일 내지 약 11일, 약 8일 내지 약 10일, 약 8일 내지 약 9일, 약 9일 내지 약 12일, 약 9일 내지 약 11일, 약 9일 내지 약 10일, 약 10일 내지 약 12일, 약 10일 내지 약 11일, 또는 약 11일 내지 약 12일이다.
이들 방법의 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 0.01 g/L 내지 약 70 g/L(또는 예를 들어 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나) 또는 약 80 μM 내지 약 560 mM(또는 예를 들어 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나)의 타우린(또는 타우린 전구물질(예를 들어 L-시스테인, L-시스테인산염, 시스테아민, 또는 시스테인설핀산) 또는 타우린 분해 산물(예를 들어 5-글루타밀-타우린, 타우로콜산염, 및 타우로시아민) 및/또는 0.01 g/L 내지 약 70 g/L(또는 예를 들어 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나) 또는 약 90 μM 내지 약 640 mM(또는 예를 들어 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나)의 하이포타우린(또는 이의 하이포타우린 전구물질(예를 들어 L-시스테인, L-시스테인산염, s-카복시메틸시스테인, 시스테아민, 또는 시스테인설핀산) 또는 하이포타우린 분해 산물(예를 들어 5-글루타밀-타우린, 타우로콜산염, 및 타우로시아민)을 포함하고, 임의로 다음 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 또는 3개)을 포함한다: 트랜스페린(예를 들어 아포트랜스페린, 홀로 트랜스페린, 또는 이들의 조합)(예를 들어 약 100 μg/mL 내지 약 2 mg/mL 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 트랜스페린(예를 들어 인간 아포트랜스페린, 인간 홀로 트랜스페린, 또는 이들의 조합)); 에리트로포이에틴(EPO) 또는 EPO-모방체 펩티드(예를 들어 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 EPO(예를 들어 재조합 인간 EPO) 또는 EPO-모방체 펩티드); 및 인슐린(예를 들어 약 0.1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 인슐린).
본원에 기술된 제4 배양 배지 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 Iscove의 변형된 Dulbecco 배지(IMDM)를 포함한다. 본원에 기술된 제3 배양 배지 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 0.1% v/v 내지 약 10% v/v(예를 들어 약 0.1% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 5.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 2.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 1.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 1.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 1.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 10% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 2.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 1.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 1.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 2.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 1.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 10% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 2.0% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 8.000% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 10% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 5% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 10% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 5% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 10% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 5.0% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 10% v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 6.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 6.0% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 6.0% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 6.0% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 6.0% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 6.0% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 6.0% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 6.0% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 6.5% v/v 내지 약 10% v/v, 약 6.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 6.5% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 6.5% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 6.5% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 6.5% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 6.5% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 7.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 7.0% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 7.0% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 7.0% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 7.0% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 7.0% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 7.5% v/v 내지 약 10% v/v, 약 7.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 7.5% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 7.5% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 7.5% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 8.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 8.0% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 8.0% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 8.0% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 8.5% v/v 내지 약 10% v/v, 약 8.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 8.5% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 9.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 9.0% v/v 내지 약 9.5% v/v, 또는 약 9.5% v/v 내지 약 10% v/v)의 혈청(예를 들어 인간 AB 혈청)을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 0.1% v/v 내지 약 5% v/v(예를 들어 약 0.1% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 2.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 1.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 1.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 0.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 2.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 1.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 1.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 2.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 1.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 2.0% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 5% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 5% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 4.5% v/v, 또는 약 4.5% v/v 내지 약 5% v/v)의 인간 혈장을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1 U/mL 내지 약 5 U/mL(예를 들어 약 1 U/mL 내지 약 4 U/mL, 약 1 U/mL 내지 약 3 U/mL, 약 1 U/mL 내지 약 2 U/mL, 약 2 U/mL 내지 약 5 U/mL, 약 2 U/mL 내지 약 4 U/mL, 약 2 U/mL 내지 약 3 U/mL, 약 3 U/mL 내지 약 5 U/mL, 약 3 U/mL 내지 약 4 U/mL, 또는 약 4 U/mL 내지 약 5 U/mL)의 헤파린을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 0.1% w/v 내지 약 3% w/v(예를 들어 약 0.1% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 0.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 3% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 3% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 3% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 2.0% w/v 내지 약 3% w/v, 약 2.0% w/v 내지 약 2.5% w/v, 또는 약 2.5% w/v 내지 약 3% w/v)의 폴록사머-188(P188)을 포함한다.
일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1 mM 내지 약 8 mM(예를 들어 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나)의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 100 μg/mL 내지 약 2 mg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 1.8 mg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 1.6 mg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 1.5 mg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 1.4 mg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 1.3 mg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 1.2 mg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 1.1 mg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 1.0 mg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 900 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 800 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 700 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 600 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 200 μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 2 mg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 1.8 mg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 1.6 mg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 1.5 mg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 1.4 mg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 1.3 mg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 1.2 mg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 1.1 mg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 1.0 mg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 900 μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 800 μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 700 μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 600 μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 2 mg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 1.8 mg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 1.6 mg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 1.5 mg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 1.4 mg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 1.3 mg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 1.2 mg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 1.1 mg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 1.0 mg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 900 μg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 800 μg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 700 μg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 600 μg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 400 μg/mL 내지 약 2 mg/mL, 약 400 μg/mL 내지 약 1.8 mg/mL, 약 400 μg/mL 내지 약 1.6 mg/mL, 약 400 μg/mL 내지 약 1.5 mg/mL, 약 400 μg/mL 내지 약 1.4 mg/mL, 약 400 μg/mL 내지 약 1.3 mg/mL, 약 400 μg/mL 내지 약 1.2 mg/mL, 약 400 μg/mL 내지 약 1.1 mg/mL, 약 400 μg/mL 내지 약 1.0 mg/mL, 약 400 μg/mL 내지 약 900 μg/mL, 약 400 μg/mL 내지 약 800 μg/mL, 약 400 μg/mL 내지 약 700 μg/mL, 약 400 μg/mL 내지 약 600 μg/mL, 약 400 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 500 μg/mL 내지 약 2 mg/mL, 약 500 μg/mL 내지 약 1.8 mg/mL, 약 500 μg/mL 내지 약 1.6 mg/mL, 500 μg/mL 내지 약 1.5 mg/mL, 약 500 μg/mL 내지 약 1.4 mg/mL, 약 500 μg/mL 내지 약 1.3 mg/mL, 약 500 μg/mL 내지 약 1.2 mg/mL, 약 500 μg/mL 내지 약 1.1 mg/mL, 약 500 μg/mL 내지 약 1.0 mg/mL, 약 500 μg/mL 내지 약 900 μg/mL, 약 500 μg/mL 내지 약 800 μg/mL, 약 500 μg/mL 내지 약 700 μg/mL, 약 500 μg/mL 내지 약 600 μg/mL, 약 600 μg/mL 내지 약 2 mg/mL, 약 600 μg/mL 내지 약 1.8 mg/mL, 약 600 μg/mL 내지 약 1.6 mg/mL, 약 600 μg/mL 내지 약 1.5 mg/mL, 약 600 μg/mL 내지 약 1.4 mg/mL, 약 600 μg/mL 내지 약 1.3 mg/mL, 약 600 μg/mL 내지 약 1.2 mg/mL, 약 600 μg/mL 내지 약 1.1 mg/mL, 약 600 μg/mL 내지 약 1.0 mg/mL, 약 600 μg/mL 내지 약 900 μg/mL, 약 600 μg/mL 내지 약 800 μg/mL, 약 600 μg/mL 내지 약 700 μg/mL, 약 700 μg/mL 내지 약 2 mg/mL, 약 700 μg/mL 내지 약 1.8 mg/mL, 약 700 μg/mL 내지 약 1.6 mg/mL, 약 700 μg/mL 내지 약 1.5 mg/mL, 약 700 μg/mL 내지 약 1.4 mg/mL, 약 700 μg/mL 내지 약 1.3 mg/mL, 약 700 μg/mL 내지 약 1.2 mg/mL, 약 700 μg/mL 내지 약 1.1 mg/mL, 약 700 μg/mL 내지 약 1.0 mg/mL, 약 700 μg/mL 내지 약 900 μg/mL, 약 700 μg/mL 내지 약 800 μg/mL, 약 800 μg/mL 내지 약 2 mg/mL, 약 800 μg/mL 내지 약 1.8 mg/mL, 약 800 μg/mL 내지 약 1.6 mg/mL, 약 800 μg/mL 내지 약 1.5 mg/mL, 약 800 μg/mL 내지 약 1.4 mg/mL, 약 800 μg/mL 내지 약 1.3 mg/mL, 약 800 μg/mL 내지 약 1.2 mg/mL, 약 800 μg/mL 내지 약 1.1 mg/mL, 약 800 μg/mL 내지 약 1.0 mg/mL, 약 800 μg/mL 내지 약 900 μg/mL, 약 900 μg/mL 내지 약 2 mg/mL, 약 900 μg/mL 내지 약 1.8 mg/mL, 약 900 μg/mL 내지 약 1.6 mg/mL, 약 900 μg/mL 내지 약 1.5 mg/mL, 약 900 μg/mL 내지 약 1.4 mg/mL, 약 900 μg/mL 내지 약 1.3 mg/mL, 약 900 μg/mL 내지 약 1.2 mg/mL, 약 900 μg/mL 내지 약 1.1 mg/mL, 약 900 μg/mL 내지 약 1.0 mg/mL, 약 1.0 mg/mL 내지 약 2 mg/mL, 약 1.0 mg/mL 내지 약 1.8 mg/mL, 약 1.0 mg/mL 내지 약 1.6 mg/mL, 약 1.0 mg/mL 내지 약 1.5 mg/mL, 약 1.0 mg/mL 내지 약 1.4 mg/mL, 약 1.0 mg/mL 내지 약 1.3 mg/mL, 약 1.0 mg/mL 내지 약 1.2 mg/mL, 약 1.0 mg/mL 내지 약 1.1 mg/mL, 약 1.1 mg/mL 내지 약 2 mg/mL, 약 1.1 mg/mL 내지 약 1.8 mg/mL, 약 1.1 mg/mL 내지 약 1.6 mg/mL, 약 1.1 mg/mL 내지 약 1.5 mg/mL, 약 1.1 mg/mL 내지 약 1.4 mg/mL, 약 1.1 mg/mL 내지 약 1.3 mg/mL, 약 1.1 mg/mL 내지 약 1.2 mg/mL, 약 1.2 mg/mL 내지 약 2 mg/mL, 약 1.2 mg/mL 내지 약 1.8 mg/mL, 약 1.2 mg/mL 내지 약 1.6 mg/mL, 약 1.2 mg/mL 내지 약 1.5 mg/mL, 약 1.2 mg/mL 내지 약 1.4 mg/mL, 약 1.2 mg/mL 내지 약 1.3 mg/mL, 약 1.3 mg/mL 내지 약 2 mg/mL, 약 1.3 mg/mL 내지 약 1.8 mg/mL, 약 1.3 mg/mL 내지 약 1.6 mg/mL, 약 1.3 mg/mL 내지 약 1.5 mg/mL, 약 1.3 mg/mL 내지 약 1.4 mg/mL, 약 1.4 mg/mL 내지 약 2 mg/mL, 약 1.4 mg/mL 내지 약 1.8 mg/mL, 약 1.4 mg/mL 내지 약 1.6 mg/mL, 약 1.4 mg/mL 내지 약 1.5 mg/mL, 약 1.5 mg/mL 내지 약 2 mg/mL, 약 1.5 mg/mL 내지 약 1.8 mg/mL, 약 1.5 mg/mL 내지 약 1.6 mg/mL, 약 1.6 mg/mL 내지 약 2 mg/mL, 약 1.6 mg/mL 내지 약 1.8 mg/mL, 또는 약 1.8 mg/mL 내지 약 2 mg/mL의 트랜스페린(예를 들어 인간 아포트랜스페린, 인간 홀로 트랜스페린, 또는 이들의 조합)을 포함한다.
일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 25 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 15 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 10 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 5 ng/mL, 5 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 25 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 15 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 10 ng/mL, 10 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 25 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 15 ng/mL, 15 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 25 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 20 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 25 ng/mL, 25 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 30 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 40 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 60 ng/mL, 60 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 80 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 100 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 120 ng/mL, 120 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 140 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 140 ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 160 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 180 ng/mL,180 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 200 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 220 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 220 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 220 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 220 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 220 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 220 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 220 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 220 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 220 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 220 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 220 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 220 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 220 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 220 ng/mL 내지 약 240 ng/mL, 240 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 약 240 ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 260 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 280 ng/mL, 280 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 280 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 280 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 280 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 280 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 280 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 280 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 280 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 280 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 280 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 280 ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 300 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 300 ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 320 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 320 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 320 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 320 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 320 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 320 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 320 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 320 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 약 320 ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 340 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 340 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 340 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 340 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 340 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 340 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 340 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 340 ng/mL 내지 약 360 ng/mL, 360 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 360 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 360 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 360 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 360 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 360 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 360 ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 380 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 380 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 380 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 380 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 380 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 380 ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 400 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 420 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 420 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 420 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 420 ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 440 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 440 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 440 ng/mL 내지 약 460 ng/mL, 약 460 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 460 ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 또는 약 480 ng/mL 내지 약 500 ng/mL의 EPO(예를 들어 재조합 인간 EPO) 또는 EPO-모방체 펩티드를 포함한다. EPO-모방체 펩티드의 비제한적인 예가 본원에 기술된다. EPO-모방체 펩티드의 추가 예는 당업계에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 0.1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 35 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 약 15 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 5 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 2 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 35 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 1 μg/mL 약 15 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 5 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 2 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 35 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 2 μg/mL 약 15 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 5 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 35 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 5 μg/mL 약 15 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 35 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 10 μg/mL 약 15 μg/mL, 약 15 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 15 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 15 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 15 μg/mL 내지 약 35 μg/mL, 약 15 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 약 15 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 15 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 35 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 25 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 25 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 25 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 25 μg/mL 내지 약 35 μg/mL, 약 25 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 약 30 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 30 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 30 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 30 μg/mL 내지 약 35 μg/mL, 약 35 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 35 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 35 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 또는 약 45 μg/mL 내지 약 50 μg/mL의 인슐린(예: 인간 인슐린)을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 0.01 g/L 내지 약 80 g/L(예를 들어 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나) 또는 약 50 μM 내지 약 445 mM(예를 들어 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나)의 미오-이노시톨(또는 미오-이노시톨 전구물질(예를 들어 D-글루코스-6-포스페이트 또는 이노시톨-D-포스페이트) 또는 미오-이노시톨 분해 산물(예: 글루쿠론산))을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 관류 배양은 접선 여과(예를 들어 접선 유동 여과(TFF) 또는 교번 접선 여과(ATF))의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 접선 여과(예를 들어 TFF 또는 ATF)는 약 10 nm 내지 약 6.0 μm(또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나)의 평균 기공 크기를 갖는 하나 이상의 필터의 사용을 포함한다.
일부 구현예에서, 제4 배양 배지는, 예를 들어 화학적으로 정의된 액체 배양 배지, 동물 성분이 없는 액체 배양 배지, 또는 동물 성분이 없는 화학적으로 정의된 액체 배양 배지, 및/또는 혈청이 없는 액체 배양 배지일 수 있다.
일부 구현예에서, 제3 세포 배양물의 관류는 제1 세포 배양물이 특정 목표 세포 농도, 예를 들어 약 1.0 x 106 세포/mL, 약 1.5 x 106 세포/mL, 약 2.0 x 106 세포/mL, 약 2.5 x 106 세포/mL, 약 3.0 x 106 세포/mL, 약 3.5 x 106 세포/mL, 약 4.0 x 106 세포/mL, 약 4.5 x 106 세포/mL, 약 5.0 x 106 세포/mL, 약 5.5 x 106 세포/mL, 약 6.0 x 106 세포/mL, 약 6.5 x 106 세포/mL, 약 7.0 x 106 세포/mL, 약 7.5 x 106 세포/mL, 약 8.0 x 106 세포/mL, 약 8.5 x 106 세포/mL, 약 9.0 x 106 세포/mL, 약 9.5 x 106 세포/mL, 또는 약 1.0 x 107 세포/mL에 도달할 때 시작된다.
일부 구현예에서, 단계 (d)의 관류 배양은 약 8일 내지 약 15일, 약 8일 내지 약 14일, 약 8일 내지 약 13일, 약 8일 내지 약 12일, 약 8일 내지 약 11일, 약 8일 내지 약 10일, 약 8일 내지 약 9일, 약 9일 내지 약 15일, 약 9일 내지 약 14일, 약 9일 내지 약 13일, 약 9일 내지 약 12일, 약 9일 내지 약 11일, 약 9일 내지 약 10일, 약 10일 내지 약 15일, 약 10일 내지 약 14일, 약 10일 내지 약 13일, 약 10일 내지 약 12일, 약 10일 내지 약 11일, 약 11일 내지 약 15일, 약 11일 내지 약 14일, 약 11일 내지 약 13일, 약 11일 내지 약 12일, 약 12일 내지 약 15일, 약 12일 내지 약 14일, 약 12일 내지 약 13일, 약 13일 내지 약 15일, 약 13일 내지 약 14일, 또는 약 14일 내지 약 15일 동안 수행된다.
일부 구현예에서, 단계 (d)는 약 5 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 2 x 108개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 5 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 1 x 108개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 5 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 8 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 5 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 6 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 5 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 4 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 5 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 2 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 5 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 1 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 5 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 8 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 5 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 6 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 6 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 1 x 108개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 6 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 8 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 6 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 6 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 6 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 4 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 6 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 2 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 6 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 1 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 6 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 8 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 8 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 1 x 108개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 8 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 8 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 8 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 6 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 8 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 4 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 8 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 2 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 8 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 1 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 1 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 1 x 108개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 1 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 8 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 1 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 6 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 1 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 4 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 1 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 2 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 2 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 1 x 108개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 2 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 8 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 2 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 6 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 2 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 4 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 4 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 1 x 108개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 4 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 8 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 4 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 6 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 6 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 1 x 108개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 6 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 8 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 8 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 1 x 108개의 제핵 적혈구 세포/mL의 세포 밀도를 초래한다.
배치 배양 또는 유가 배양
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 단계 (d)는 제3 세포 배양물을 (예를 들어 본원에 기술된 예시적인 부피 중 어느 하나를 갖는 본원에 기술된 예시적인 진탕 플라스크, 진탕 튜브, 배양 백, 또는 바이오리액터 중 어느 하나에서 본원에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 어느 하나를) 약 5일 내지 약 20일(예를 들어 약 5일 내지 약 19일, 약 5일 내지 약 18일, 약 5일 내지 약 17일, 약 5일 내지 약 16일, 약 5일 내지 약 15일, 약 5일 내지 약 14일, 약 5일 내지 약 13일, 약 5일 내지 약 12일, 약 5일 내지 약 11일, 약 5일 내지 약 10일, 약 5일 내지 약 9일, 약 5일 내지 약 8일, 약 5일 내지 약 7일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 20일, 약 6일 내지 약 19일, 약 6일 내지 약 18일, 약 6일 내지 약 17일, 약 6일 내지 약 16일, 약 6일 내지 약 15일, 약 6일 내지 약 14일, 약 6일 내지 약 13일, 약 6일 내지 약 12일, 약 6일 내지 약 11일, 약 6일 내지 약 10일, 약 6일 내지 약 9일, 약 6일 내지 약 8일, 약 6일 내지 약 7일, 약 7일 내지 약 20일, 약 7일 내지 약 19일, 약 7일 내지 약 18일, 약 7일 내지 약 17일, 약 7일 내지 약 16일, 약 7일 내지 약 15일, 약 7일 내지 약 14일, 약 7일 내지 약 13일, 약 7일 내지 약 12일, 약 7일 내지 약 11일, 약 7일 내지 약 10일, 약 7일 내지 약 9일, 약 7일 내지 약 8일, 약 8일 내지 약 20일, 약 8일 내지 약 19일, 약 8일 내지 약 18일, 약 8일 내지 약 17일, 약 8일 내지 약 16일, 약 8일 내지 약 15일, 약 8일 내지 약 14일, 약 8일 내지 약 13일, 약 8일 내지 약 12일, 약 8일 내지 약 11일, 약 8일 내지 약 10일, 약 8일 내지 약 9일, 약 9일 내지 약 20일, 약 9일 내지 약 19일, 약 9일 내지 약 18일, 약 9일 내지 약 17일, 약 9일 내지 약 16일, 약 9일 내지 약 15일, 약 9일 내지 약 14일, 약 9일 내지 약 13일, 약 9일 내지 약 12일, 약 9일 내지 약 11일, 약 9일 내지 약 10일, 약 10일 내지 약 20일, 약 10일 내지 약 19일, 약 10일 내지 약 18일, 약 10일 내지 약 17일, 약 10일 내지 약 16일, 약 10일 내지 약 15일, 약 10일 내지 약 14일, 약 10일 내지 약 13일, 약 10일 내지 약 12일, 약 10일 내지 약 11일, 약 11일 내지 약 20일, 약 11일 내지 약 19일, 약 11일 내지 약 18일, 약 11일 내지 약 17일, 약 11일 내지 약 16일, 약 11일 내지 약 15일, 약 11일 내지 약 14일, 약 11일 내지 약 13일, 약 11일 내지 약 12일, 약 12일 내지 약 20일, 약 12일 내지 약 19일, 약 12일 내지 약 18일, 약 12일 내지 약 17일, 약 12일 내지 약 16일, 약 12일 내지 약 15일, 약 12일 내지 약 14일, 약 12일 내지 약 13일, 약 13일 내지 약 20일, 약 13일 내지 약 19일, 약 13일 내지 약 18일, 약 13일 내지 약 17일, 약 13일 내지 약 16일, 약 13일 내지 약 15일, 약 13일 내지 약 14일, 약 14일 내지 약 20일, 약 14일 내지 약 19일, 약 14일 내지 약 18일, 약 14일 내지 약 17일, 약 14일 내지 약 16일, 약 14일 내지 약 15일, 약 15일 내지 약 20일, 약 15일 내지 약 19일, 약 15일 내지 약 18일, 약 15일 내지 약 17일, 약 15일 내지 약 16일, 약 16일 내지 약 20일, 약 16일 내지 약 19일, 약 16일 내지 약 18일, 약 16일 내지 약 17일, 약 17일 내지 약 20일, 약 17일 내지 약 19일, 약 17일 내지 약 18일, 약 18일 내지 약 20일, 약 18일 내지 약 19일, 또는 약 19일 내지 약 20일) 동안 배치 배양 또는 유가 배양하는 단계를 포함하되, 단계 (d) 후에, 제3 배양 배지는 제핵 적혈구 세포(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제핵 적혈구 세포 중 어느 하나)의 집단을 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (d)는 바이오리액터(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 부피 중 어느 하나를 갖는 본원에 기술된 예시적인 바이오리액터 중 어느 하나)에 배치된 제3 세포 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 어느 하나)을 배치 배양 또는 유가 배양하는 단계를 포함한다. 이러한 구현예에서, 단계 (d)는 바이오리액터에서 제3 세포 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 어느 하나)을 약 10 W/m3 내지 약 200 W/m3(또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나)의 P/V 값으로 교반하면서 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (d)는 진탕 플라스크(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 부피 중 어느 하나를 갖는 본원에 기술된 예시적인 진탕 플라스크 중 어느 하나)에 배치된 제3 세포 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 어느 하나)을 배치 배양 또는 유가 배양하는 단계를 포함한다. 이러한 구현예에서, 단계 (d)는 진탕 플라스크에서 제3 세포 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 어느 하나)을 약 0.1 x g 내지 약 50 x g(예를 들어 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나)로 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (d)는 진탕 튜브(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 부피 중 어느 하나를 갖는 본원에 기술된 예시적인 진탕 튜브 중 어느 하나(예: 원뿔형 용기))에 배치된 제3 세포 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 어느 하나)을 배치 배양 또는 유가 배양하는 단계를 포함한다. 이러한 구현예에서, 단계 (d)는 진탕 튜브에서 제3 세포 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 어느 하나)을 약 0.1 x g 내지 약 50 x g(또는 예를 들어 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나)로 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (d)는 배양 백(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 부피 중 어느 하나를 갖는 본원에 기술된 예시적인 배양 백 중 어느 하나)에 배치된 제3 세포 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 어느 하나)을 배치 배양 또는 유가 배양하는 단계를 포함한다. 이러한 구현예에서, 단계 (d)는 배양 백에서 제3 세포 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 어느 하나)을 분당 10 진동 사이클 내지 약 50 진동 사이클(또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나)의 진동 속도로 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (d)는 제3 세포 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 어느 하나)을 배치 배양하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (d)는 제3 세포 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 어느 하나)을 유가 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (d)에서의 유가 배양은 제3 세포 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 배양물 중 어느 하나) 및/또는 제4 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제4 배양물 중 어느 하나)의 추가 부피를 시간 경과에 따라 제3 세포 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 어느 하나)에 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 세포 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 배양물 중 어느 하나) 및/또는 제4 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제4 배양물 중 어느 하나)의 추가 부피는 시간 경과에 따라 제3 세포 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 어느 하나)에 연속으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 배양 배지 중 어느 하나) 및/또는 제4 배양 배지(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제4 배양 배지 중 어느 하나)의 추가 부피는 시간 경과에 따라 주기적으로 (예를 들어, 3일마다 1회, 2일마다 1회, 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회, 1일 4회, 1일 5회, 1일 6회, 1일 7회, 1일 8회, 1일 9회, 1일 10회, 1일 11회, 또는 1일 12회) 제3 세포 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 어느 하나)에 첨가된다. 일부 구현예에서, 단계 (c) 직후에 제3 세포 배양물 부피의 약 0.1x 내지 약 10x(예를 들어 약 0.1x 내지 약 9.5x, 약 0.1x 내지 약 9.0x, 약 0.1x 내지 약 8.5x, 약 0.1x 내지 약 8.0x, 약 0.1x 내지 약 7.5x, 약 0.1x 내지 약 7.0x, 약 0.1x 내지 약 6.5x, 약 0.1x 내지 약 6.0x, 약 0.1x 내지 약 5.5x, 약 0.1x 내지 약 5.0x, 약 0.1x 내지 약 4.5x, 약 0.1x 내지 약 4.0x, 약 0.1x 내지 약 3.5x, 약 0.1x 내지 약 3.0x, 약 0.1x 내지 약 2.5x, 약 0.1x 내지 약 2.0x, 약 0.1x 내지 약 1.5x, 약 0.1x 내지 약 1.0x, 약 0.1x 내지 약 0.5x, 약 0.1x 내지 약 0.3x, 약 0.1x 내지 약 0.2x, 약 0.2x 내지 약 10x, 약 0.2x 내지 약 9.5x, 약 0.2x 내지 약 9.0x, 약 0.2x 내지 약 8.5x, 약 0.2x 내지 약 8.0x, 약 0.2x 내지 약 7.5x, 약 0.2x 내지 약 7.0x, 약 0.2x 내지 약 6.5x, 약 0.2x 내지 약 6.0x, 약 0.2x 내지 약 5.5x, 약 0.2x 내지 약 5.0x, 약 0.2x 내지 약 4.5x, 약 0.2x 내지 약 4.0x, 약 0.2x 내지 약 3.5x, 약 0.2x 내지 약 3.0x, 약 0.2x 내지 약 2.5x, 약 0.2x 내지 약 2.0x, 약 0.2x 내지 약 1.5x, 약 0.2x 내지 약 1.0x, 약 0.2x 내지 약 0.5x, 약 0.2x 내지 약 0.3x, 약 0.3x 내지 약 10x, 약 0.3x 내지 약 9.5x, 약 0.3x 내지 약 9.0x, 약 0.3x 내지 약 8.5x, 약 0.3x 내지 약 8.0x, 약 0.3x 내지 약 7.5x, 약 0.3x 내지 약 7.0x, 약 0.3x 내지 약 6.5x, 약 0.3x 내지 약 6.0x, 약 0.3x 내지 약 5.5x, 약 0.3x 내지 약 5.0x, 약 0.3x 내지 약 4.5x, 약 0.3x 내지 약 4.0x, 약 0.3x 내지 약 3.5x, 약 0.3x 내지 약 3.0x, 약 0.3x 내지 약 2.5x, 약 0.3x 내지 약 2.0x, 약 0.3x 내지 약 1.5x, 약 0.3x 내지 약 1.0x, 약 0.3x 내지 약 0.5x, 약 0.5x 내지 약 10x, 약 0.5x 내지 약 9.5x, 약 0.5x 내지 약 9.0x, 약 0.5x 내지 약 8.5x, 약 0.5x 내지 약 8.0x, 약 0.5x 내지 약 7.5x, 약 0.5x 내지 약 7.0x, 약 0.5x 내지 약 6.5x, 약 0.5x 내지 약 6.0x, 약 0.5x 내지 약 5.5x, 약 0.5x 내지 약 5.0x, 약 0.5x 내지 약 4.5x, 약 0.5x 내지 약 4.0x, 약 0.5x 내지 약 3.5x, 약 0.5x 내지 약 3.0x, 약 0.5x 내지 약 2.5x, 약 0.5x 내지 약 2.0x, 약 0.5x 내지 약 1.5x, 약 0.5x 내지 약 1.0x, 약 1.0x 내지 약 10x, 약 1.0x 내지 약 9.5x, 약 1.0x 내지 약 9.0x, 약 1.0x 내지 약 8.5x, 약 1.0x 내지 약 8.0x, 약 1.0x 내지 약 7.5x, 약 1.0x 내지 약 7.0x, 약 1.0x 내지 약 6.5x, 약 1.0x 내지 약 6.0x, 약 1.0x 내지 약 5.5x, 약 1.0x 내지 약 5.0x, 약 1.0x 내지 약 4.5x, 약 1.0x 내지 약 4.0x, 약 1.0x 내지 약 3.5x, 약 1.0x 내지 약 3.0x, 약 1.0x 내지 약 2.5x, 약 1.0x 내지 약 2.0x, 약 1.0x 내지 약 1.5x, 약 1.5x 내지 약 10x, 약 1.5x 내지 약 9.5x, 약 1.5x 내지 약 9.0x, 약 1.5x 내지 약 8.5x, 약 1.5x 내지 약 8.0x, 약 1.5x 내지 약 7.5x, 약 1.5x 내지 약 7.0x, 약 1.5x 내지 약 6.5x, 약 1.5x 내지 약 6.0x, 약 1.5x 내지 약 5.5x, 약 1.5x 내지 약 5.0x, 약 1.5x 내지 약 4.5x, 약 1.5x 내지 약 4.0x, 약 1.5x 내지 약 3.5x, 약 1.5x 내지 약 3.0x, 약 1.5x 내지 약 2.5x, 약 1.5x 내지 약 2.0x, 약 2.0x 내지 약 10x, 약 2.0x 내지 약 9.5x, 약 2.0x 내지 약 9.0x, 약 2.0x 내지 약 8.5x, 약 2.0x 내지 약 8.0x, 약 2.0x 내지 약 7.5x, 약 2.0x 내지 약 7.0x, 약 2.0x 내지 약 6.5x, 약 2.0x 내지 약 6.0x, 약 2.0x 내지 약 5.5x, 약 2.0x 내지 약 5.0x, 약 2.0x 내지 약 4.5x, 약 2.0x 내지 약 4.0x, 약 2.0x 내지 약 3.5x, 약 2.0x 내지 약 3.0x, 약 2.0x 내지 약 2.5x, 약 2.5x 내지 약 10x, 약 2.5x 내지 약 9.5x, 약 2.5x 내지 약 9.0x, 약 2.5x 내지 약 8.5x, 약 2.5x 내지 약 8.0x, 약 2.5x 내지 약 7.5x, 약 2.5x 내지 약 7.0x, 약 2.5x 내지 약 6.5x, 약 2.5x 내지 약 6.0x, 약 2.5x 내지 약 5.5x, 약 2.5x 내지 약 5.0x, 약 2.5x 내지 약 4.5x, 약 2.5x 내지 약 4.0x, 약 2.5x 내지 약 3.5x, 약 2.5x 내지 약 3.0x, 약 3.0x 내지 약 10x, 약 3.0x 내지 약 9.5x, 약 3.0x 내지 약 9.0x, 약 3.0x 내지 약 8.5x, 약 3.0x 내지 약 8.0x, 약 3.0x 내지 약 7.5x, 약 3.0x 내지 약 7.0x, 약 3.0x 내지 약 6.5x, 약 3.0x 내지 약 6.0x, 약 3.0x 내지 약 5.5x, 약 3.0x 내지 약 5.0x, 약 3.0x 내지 약 4.5x, 약 3.0x 내지 약 4.0x, 약 3.0x 내지 약 3.5x, 약 3.5x 내지 약 10x, 약 3.5x 내지 약 9.5x, 약 3.5x 내지 약 9.0x, 약 3.5x 내지 약 8.5x, 약 3.5x 내지 약 8.0x, 약 3.5x 내지 약 7.5x, 약 3.5x 내지 약 7.0x, 약 3.5x 내지 약 6.5x, 약 3.5x 내지 약 6.0x, 약 3.5x 내지 약 5.5x, 약 3.5x 내지 약 5.0x, 약 3.5x 내지 약 4.5x, 약 3.5x 내지 약 4.0x, 약 4.0x 내지 약 10x, 약 4.0x 내지 약 9.5x, 약 4.0x 내지 약 9.0x, 약 4.0x 내지 약 8.5x, 약 4.0x 내지 약 8.0x, 약 4.0x 내지 약 7.5x, 약 4.0x 내지 약 7.0x, 약 4.0x 내지 약 6.5x, 약 4.0x 내지 약 6.0x, 약 4.0x 내지 약 5.5x, 약 4.0x 내지 약 5.0x, 약 4.0x 내지 약 4.5x, 약 4.5x 내지 약 10x, 약 4.5x 내지 약 9.5x, 약 4.5x 내지 약 9.0x, 약 4.5x 내지 약 8.5x, 약 4.5x 내지 약 8.0x, 약 4.5x 내지 약 7.5x, 약 4.5x 내지 약 7.0x, 약 4.5x 내지 약 6.5x, 약 4.5x 내지 약 6.0x, 약 4.5x 내지 약 5.5x, 약 4.5x 내지 약 5.0x, 약 5.0x 내지 약 10x, 약 5.0x 내지 약 9.5x, 약 5.0x 내지 약 9.0x, 약 5.0x 내지 약 8.5x, 약 5.0x 내지 약 8.0x, 약 5.0x 내지 약 7.5x, 약 5.0x 내지 약 7.0x, 약 5.0x 내지 약 6.5x, 약 5.0x 내지 약 6.0x, 약 5.0x 내지 약 5.5x, 약 5.5x 내지 약 10x, 약 5.5x 내지 약 9.5x, 약 5.5x 내지 약 9.0x, 약 5.5x 내지 약 8.5x, 약 5.5x 내지 약 8.0x, 약 5.5x 내지 약 7.5x, 약 5.5x 내지 약 7.0x, 약 5.5x 내지 약 6.5x, 약 5.5x 내지 약 6.0x, 약 6.0x 내지 약 10x, 약 6.0x 내지 약 9.5x, 약 6.0x 내지 약 9.0x, 약 6.0x 내지 약 8.5x, 약 6.0x 내지 약 8.0x, 약 6.0x 내지 약 7.5x, 약 6.0x 내지 약 7.0x, 약 6.0x 내지 약 6.5x, 약 6.5x 내지 약 10x, 약 6.5x 내지 약 9.5x, 약 6.5x 내지 약 9.0x, 약 6.5x 내지 약 8.5x, 약 6.5x 내지 약 8.0x, 약 6.5x 내지 약 7.5x, 약 6.5x 내지 약 7.0x, 약 7.0x 내지 약 10x, 약 7.0x 내지 약 9.5x, 약 7.0x 내지 약 9.0x, 약 7.0x 내지 약 8.5x, 약 7.0x 내지 약 8.0x, 약 7.0x 내지 약 7.5x, 약 7.5x 내지 약 10x, 약 7.5x 내지 약 9.5x, 약 7.5x 내지 약 9.0x, 약 7.5x 내지 약 8.5x, 약 7.5x 내지 약 8.0x, 약 8.0x 내지 약 10x, 약 8.0x 내지 약 9.5x, 약 8.0x 내지 약 9.0x, 약 8.0x 내지 약 8.5x, 약 8.5x 내지 약 10x, 약 8.5x 내지 약 9.5x, 약 8.5x 내지 약 9.0x, 약 9.0x 내지 약 10x, 약 9.0x 내지 약 9.5x, 또는 약 9.5x 내지 약 10x)가 각각 24시간의 증분으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 제3 배양 배지(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 배양 배지 중 어느 하나) 및/또는 제4 배양 배지(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제4 배양 배지 중 어느 하나)의 추가 부피를 제3 세포 배양물에 첨가하는 것은 제3 세포 배양물이 특정 목표 세포 밀도, 예를 들어 약 1.0 x 106 세포/mL, 약 1.5 x 106 세포/mL, 약 2.0 x 106 세포/mL, 약 2.5 x 106 세포/mL, 약 3.0 x 106 세포/mL, 약 3.5 x 106 세포/mL, 약 4.0 x 106 세포/mL, 약 4.5 x 106 세포/mL, 약 5.0 x 106 세포/mL, 약 5.5 x 106 세포/mL, 약 6.0 x 106 세포/mL, 약 6.5 x 106 세포/mL, 약 7.0 x 106 세포/mL, 약 7.5 x 106 세포/mL, 약 8.0 x 106 세포/mL, 약 8.5 x 106 세포/mL, 약 9.0 x 106 세포/mL, 약 9.5 x 106 세포/mL, 또는 약 1.0 x 107 cell/mL에 도달할 때 시작된다.
일부 구현예에서, 제3 배양 배지(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 배양 배지 중 어느 하나)는 하나 이상의(예를 들어 2개, 3개, 또는 4개의) 트랜스페린(예를 들어 아포트랜스페린, 홀로 트랜스페린, 또는 이들의 조합)(예를 들어 약 1 μg/mL 내지 약 500 μg/mL 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 트랜스페린(예를 들어 인간 아포트랜스페린, 인간 홀로 트랜스페린, 또는 이들의 조합)), 인슐린(예를 들어 약 0.1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 인슐린(예를 들어 재조합 인간 인슐린)), SCF(예를 들어 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 SCF(예를 들어 재조합 인간 SCF)), 및 EPO 또는 EPO-모방체 펩티드(예를 들어 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 EPO(예를 들어 재조합 인간 EPO) 또는 EPO-모방체 펩티드(예를 들어 본원에 기술된 또는 당업계에 알려진 예시적인 EPO 모방체 펩티드 중 어느 하나))를 포함한다. 본원에 기술된 제3 배양 배지 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 0.1% v/v 내지 약 10% v/v(예를 들어 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나)의 혈청(예를 들어 인간 AB 혈청)을 포함한다. 본원에 기술된 제3 배양 배지 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제3 배양 배지는 약 1 mM 내지 약 8 mM(예를 들어 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나)의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (d)에서의 유가 배양은: (i) 제1 기간 동안 제3 배양 배지(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 배양 배지 중 어느 하나)의 추가 부피를 제3 세포 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 어느 하나)에 첨가하는 단계; 및 (ii) 제2 기간 동안 제4 배양 배지(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제4 배양 배지 중 어느 하나)의 추가 부피를 제3 세포 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 어느 하나)에 첨가하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (i)에서 제3 배양 배지(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 배양 배지 중 어느 하나)의 추가 부피는 제1 기간 동안 제3 세포 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 어느 하나)에 연속으로 첨가되고/되거나; 단계 (ii)에서 제4 배양 배지(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제4 배양 배지 중 어느 하나)의 추가 부피는 제2 기간 동안 제3 세포 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 어느 하나)에 연속으로 첨가된다.
일부 구현예에서, 단계 (i)에서 제3 배양 배지(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 배양 배지 중 어느 하나)의 추가 부피는 제1 기간 동안 주기적으로 (예를 들어, 3일마다 1회, 2일마다 1회, 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회, 1일 4회, 1일 5회, 1일 6회, 1일 7회, 1일 8회, 1일 9회, 1일 10회, 1일 11회, 또는 1일 12회) 제3 세포 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 어느 하나)에 첨가되고/되거나; (ii) 단계 (ii)에서 제4 배양 배지(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제4 배양 배지 중 어느 하나)의 추가 부피는 제2 기간 동안 주기적으로 (예를 들어, 3일마다 1회, 2일마다 1회, 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회, 1일 4회, 1일 5회, 1일 6회, 1일 7회, 1일 8회, 1일 9회, 1일 10회, 1일 11회, 또는 1일 12회) 제3 세포 배양물(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 어느 하나)에 첨가된다.
배양 배지(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제3 배양 배지 또는 본원에 기술된 예시적인 제4 배양 배지 중 어느 하나)의 첨가는 기계적으로, 예를 들어 연동 펌프를 사용하여, 또는 수동으로(예를 들어 멸균 피펫팅에 의해) 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 단계 (i)에서의 제1 기간은 약 1일 내지 약 12일, 약 1일 내지 약 11일, 약 1일 내지 약 10일, 약 1일 내지 약 9일, 약 1일 내지 약 8일, 약 1일 내지 약 7일, 약 1일 내지 약 6일, 약 1일 내지 약 5일, 약 1일 내지 약 4일, 약 1일 내지 약 3일, 약 1일 내지 약 2일, 약 2일 내지 약 12일, 약 2일 내지 약 11일, 약 2일 내지 약 10일, 약 2일 내지 약 9일, 약 2일 내지 약 8일, 약 2일 내지 약 7일, 약 2일 내지 약 6일, 약 2일 내지 약 5일, 약 2일 내지 약 4일, 약 2일 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 12일, 약 3일 내지 약 11일, 약 3일 내지 약 10일, 약 3일 내지 약 9일, 약 3일 내지 약 8일, 약 3일 내지 약 7일, 약 3일 내지 약 6일, 약 3일 내지 약 5일, 약 3일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 12일, 약 4일 내지 약 11일, 약 4일 내지 약 10일, 약 4일 내지 약 9일, 약 4일 내지 약 8일, 약 4일 내지 약 7일, 약 4일 내지 약 6일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 12일, 약 5일 내지 약 11일, 약 5일 내지 약 10일, 약 5일 내지 약 9일, 약 5일 내지 약 8일, 약 5일 내지 약 7일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 12일, 약 6일 내지 약 11일, 약 6일 내지 약 10일, 약 6일 내지 약 9일, 약 6일 내지 약 8일, 약 6일 내지 약 7일, 약 7일 내지 약 12일, 약 7일 내지 약 11일, 약 7일 내지 약 10일, 약 7일 내지 약 9일, 약 7일 내지 약 8일, 약 8일 내지 약 12일, 약 8일 내지 약 11일, 약 8일 내지 약 10일, 약 8일 내지 약 9일, 약 9일 내지 약 12일, 약 9일 내지 약 11일, 약 9일 내지 약 10일, 약 10일 내지 약 12일, 약 10일 내지 약 11일, 또는 약 11일 내지 약 12일이다.
일부 구현예에서, 단계 (ii)에서의 제2 기간은 약 1일 내지 약 12일, 약 1일 내지 약 11일, 약 1일 내지 약 10일, 약 1일 내지 약 9일, 약 1일 내지 약 8일, 약 1일 내지 약 7일, 약 1일 내지 약 6일, 약 1일 내지 약 5일, 약 1일 내지 약 4일, 약 1일 내지 약 3일, 약 1일 내지 약 2일, 약 2일 내지 약 12일, 약 2일 내지 약 11일, 약 2일 내지 약 10일, 약 2일 내지 약 9일, 약 2일 내지 약 8일, 약 2일 내지 약 7일, 약 2일 내지 약 6일, 약 2일 내지 약 5일, 약 2일 내지 약 4일, 약 2일 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 12일, 약 3일 내지 약 11일, 약 3일 내지 약 10일, 약 3일 내지 약 9일, 약 3일 내지 약 8일, 약 3일 내지 약 7일, 약 3일 내지 약 6일, 약 3일 내지 약 5일, 약 3일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 12일, 약 4일 내지 약 11일, 약 4일 내지 약 10일, 약 4일 내지 약 9일, 약 4일 내지 약 8일, 약 4일 내지 약 7일, 약 4일 내지 약 6일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 12일, 약 5일 내지 약 11일, 약 5일 내지 약 10일, 약 5일 내지 약 9일, 약 5일 내지 약 8일, 약 5일 내지 약 7일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 12일, 약 6일 내지 약 11일, 약 6일 내지 약 10일, 약 6일 내지 약 9일, 약 6일 내지 약 8일, 약 6일 내지 약 7일, 약 7일 내지 약 12일, 약 7일 내지 약 11일, 약 7일 내지 약 10일, 약 7일 내지 약 9일, 약 7일 내지 약 8일, 약 8일 내지 약 12일, 약 8일 내지 약 11일, 약 8일 내지 약 10일, 약 8일 내지 약 9일, 약 9일 내지 약 12일, 약 9일 내지 약 11일, 약 9일 내지 약 10일, 약 10일 내지 약 12일, 약 10일 내지 약 11일, 또는 약 11일 내지 약 12일이다.
이들 방법의 일부 구현예에서, 제4 배양 배지(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 제4 배양 배지 중 어느 하나)는 다음 중 하나 이상(예를 들어 1개, 2개, 또는 3개)을 포함한다: 트랜스페린(예를 들어 아포트랜스페린, 홀로 트랜스페린, 또는 이들의 조합)(예를 들어 약 100 μg/mL 내지 약 2 mg/mL 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 트랜스페린(예를 들어 인간 아포트랜스페린, 인간 홀로 트랜스페린, 또는 이들의 조합)), 에리트로포이에틴(EPO) 또는 EPO-모방체 펩티드(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 EPO-모방체 펩티드 중 어느 하나)(예를 들어 약 1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 EPO(예를 들어 재조합 인간 EPO) 또는 EPO-모방체 펩티드), 및 인슐린(예를 들어 약 0.1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL 또는 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나의 인슐린(예를 들어 재조합 인간 인슐린)). 본원에 기술된 제4 배양 배지 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 0.1% v/v 내지 약 10% v/v(예를 들어 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나)의 혈청(예를 들어 인간 AB 혈청)을 포함한다. 본원에 기술된 제4 배양 배지 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 제4 배양 배지는 약 1 mM 내지 약 8 mM(예를 들어 본원에 기술된 이러한 범위의 하위 범위 중 어느 하나)의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (d)의 배치 배양 또는 유가 배양은 약 8일 내지 약 15일, 약 8일 내지 약 14일, 약 8일 내지 약 13일, 약 8일 내지 약 12일, 약 8일 내지 약 11일, 약 8일 내지 약 10일, 약 8일 내지 약 9일, 약 9일 내지 약 15일, 약 9일 내지 약 14일, 약 9일 내지 약 13일, 약 9일 내지 약 12일, 약 9일 내지 약 11일, 약 9일 내지 약 10일, 약 10일 내지 약 15일, 약 10일 내지 약 14일, 약 10일 내지 약 13일, 약 10일 내지 약 12일, 약 10일 내지 약 11일, 약 11일 내지 약 15일, 약 11일 내지 약 14일, 약 11일 내지 약 13일, 약 11일 내지 약 12일, 약 12일 내지 약 15일, 약 12일 내지 약 14일, 약 12일 내지 약 13일, 약 13일 내지 약 15일, 약 13일 내지 약 14일, 또는 약 14일 내지 약 15일 동안 수행된다.
일부 구현예에서, 단계 (d)는 약 5 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 2 x 108개의 제핵 적혈구 세포/mL(또는 약 5 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 1 x 108개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 5 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 8 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 5 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 6 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 5 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 4 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 5 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 2 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 5 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 1 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 5 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 8 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 5 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 6 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 6 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 1 x 108개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 6 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 8 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 6 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 6 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 6 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 4 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 6 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 2 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 6 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 1 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 6 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 8 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 8 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 1 x 108개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 8 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 8 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 8 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 6 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 8 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 4 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 8 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 2 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 8 x 106개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 1 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 1 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 1 x 108개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 1 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 8 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 1 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 6 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 1 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 4 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 1 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 2 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 2 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 1 x 108개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 2 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 8 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 2 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 6 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 2 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 4 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 4 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 1 x 108개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 4 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 8 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 4 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 6 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 6 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 1 x 108개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 6 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 8 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL, 약 8 x 107개의 제핵 적혈구 세포/mL 내지 약 1 x 108개의 제핵 적혈구 세포/mL의 하위 범위 중 어느 하나)의 세포 밀도를 초래한다.
제핵 적혈구 세포
일부 구현예에서, 본원에 기술된 제핵 적혈구 세포(예를 들어 인간 제핵 적혈구 세포)는 하나 이상의 마이너 혈액형 항원, 예를 들어, Le(a-b-)(Lewis 항원 시스템의 경우), Fy(a-b-)(Duffy 시스템의 경우), Jk(a-b-)(Kidd 시스템의 경우), M-N-(MNS 시스템의 경우), K-k-(Kell 시스템의 경우), Lu(a-b-)(Lutheran 시스템의 경우), 및 H-항원 음성(Bombay 표현형), 또는 이들의 임의의 조합에 대해 음성이다. 일부 구현예에서, 탈핵 적혈구 세포는 또한 O형 및/또는 Rh-이다. 마이너 혈액형은, 예를 들어 Agarwal 등의 문헌[“Blood group phenotype frequencies in blood donors from a tertiary care hospital in north India,” Blood Res. 48(1):51-54, 2013], 및 Mitra 등의 문헌[“Blood groups systems,” Indian J. Anaesth. 58(5):524-528, 2014]에 기술되어 있으며, 이들의 내용은 참조로서 본원에 통합된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 제핵 적혈구 세포(예를 들어 인간 제핵 적혈구 세포)는 외인성 단백질(예를 들어 본원에 기술된 또는 당업계에 공지된 외인성 단백질)을 포함하지 않는 단리된 미배양 제핵 적혈구 세포와 실질적으로 동일한 삼투막 취약성(osmotic membrane fragility)을 나타낸다. 일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포의 집단은 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 또는 0.5% NaCl에서 50%의 세포 용해 미만의 삼투압 취약성을 갖는다. 일부 구현예에서, 삼투압 취약성은 WO 2015/073587의 실시예 59에 기술된 방법(이의 내용은 참조로서 본원에 통합됨)을 사용하여 결정된다.
일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포(예를 들어 인간 제핵 적혈구 세포)는 야생형 미치료 제핵 적혈구 세포와 대략 동일한 직경 또는 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포(예를 들어, 인간 제핵 적혈구 세포)의 집단의 평균 직경은 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 마이크론, 또는 약 4.0 내지 약 12.0 마이크론, 약 4.0 내지 약 11.5 마이크론, 약 4.0 내지 약 11.0 마이크론, 약 4.0 내지 약 10.5 마이크론, 약 4.0 내지 약 10 마이크론, 약 4.0 내지 약 9.5 마이크론, 약 4.0 내지 약 9.0 마이크론, 약 4.0 내지 약 8.5 마이크론, 약 4.0 내지 약 8.0 마이크론, 약 4.0 내지 약 7.5 마이크론, 약 4.0 내지 약 7.0 마이크론, 약 4.0 내지 약 6.5 마이크론, 약 4.0 내지 약 6.0 마이크론, 약 4.0 내지 약 5.5 마이크론, 약 4.0 내지 약 5.0 마이크론, 약 4.0 내지 약 4.5 마이크론, 약 4.5 내지 약 12.0 마이크론, 약 4.5 내지 약 11.5 마이크론, 약 4.5 내지 약 11.0 마이크론, 약 4.5 내지 약 10.5 마이크론, 약 4.5 내지 약 10.0 마이크론, 약 4.5 내지 약 9.5 마이크론, 약 4.5 내지 약 9.0 마이크론, 약 4.5 내지 약 8.5 마이크론, 약 4.5 내지 약 8.0 마이크론, 약 4.5 내지 약 7.5 마이크론, 약 4.5 내지 약 7.0 마이크론, 약 4.5 내지 약 6.5 마이크론, 약 4.5 내지 약 6.0 마이크론, 약 4.5 내지 약 5.5 마이크론, 약 4.5 내지 약 5.0 마이크론, 약 5.0 내지 약 12.0 마이크론, 약 5.0 내지 약 11.5 마이크론, 약 5.0 내지 약 11.0 마이크론, 약 5.0 내지 약 10.5 마이크론, 약 5.0 내지 약 10.0 마이크론, 약 5.0 내지 약 9.5 마이크론, 약 5.0 내지 약 9.0 마이크론, 약 5.0 내지 약 8.5 마이크론, 약 5.0 내지 약 8.0 마이크론, 약 5.0 내지 약 7.5 마이크론, 약 5.0 내지 약 7.0 마이크론, 약 5.0 내지 약 6.5 마이크론, 약 5.0 내지 약 6.0 마이크론, 약 5.0 내지 약 5.5 마이크론, 약 5.5 내지 약 12.0 마이크론, 약 5.5 내지 약 11.5 마이크론, 약 5.5 내지 약 11.0 마이크론, 약 5.5 내지 약 10.5 마이크론, 약 5.5 내지 약 10.0 마이크론, 약 5.5 내지 약 9.5 마이크론, 약 5.5 내지 약 9.0 마이크론, 약 5.5 내지 약 8.5 마이크론, 약 5.5 내지 약 8.0 마이크론, 약 5.5 내지 약 7.5 마이크론, 약 5.5 내지 약 7.0 마이크론, 약 5.5 내지 약 6.5 마이크론, 약 5.5 내지 약 6.0 마이크론, 약 6.0 내지 약 12.0 마이크론, 약 6.0 내지 약 11.5 마이크론, 약 6.0 내지 약 11.0 마이크론, 약 6.0 내지 약 10.5 마이크론, 약 6.0 내지 약 10.0 마이크론, 약 6.0 내지 약 9.5 마이크론, 약 6.0 내지 약 9.0 마이크론, 약 6.0 내지 약 8.5 마이크론, 약 6.0 내지 약 8.0 마이크론, 약 6.0 내지 약 7.5 마이크론, 약 6.0 내지 약 7.0 마이크론, 약 6.0 내지 약 6.5 마이크론, 약 6.5 내지 약 12.0 마이크론, 약 6.5 내지 약 11.5 마이크론, 약 6.5 내지 약 11.0 마이크론, 약 6.5 내지 약 10.5 마이크론, 약 6.5 내지 약 10.0 마이크론, 약 6.5 내지 약 9.5 마이크론, 약 6.5 내지 약 9.0 마이크론, 약 6.5 내지 약 8.5 마이크론, 약 6.5 내지 약 8.0 마이크론, 약 6.5 내지 약 7.5 마이크론, 약 6.5 내지 약 7.0 마이크론, 약 7.0 내지 약 12.0 마이크론, 약 7.0 내지 약 11.5 마이크론, 약 7.0 내지 약 11.0 마이크론, 약 7.0 내지 약 10.5 마이크론, 약 7.0 내지 약 10.0 마이크론, 약 7.0 내지 약 9.5 마이크론, 약 7.0 내지 약 9.0 마이크론, 약 7.0 내지 약 8.5 마이크론, 약 7.0 내지 약 8.0 마이크론, 약 7.0 내지 약 7.5 마이크론, 약 7.5 내지 약 12.0 마이크론, 약 7.5 내지 약 11.5 마이크론, 약 7.5 내지 약 11.0 마이크론, 약 7.5 내지 약 10.5 마이크론, 약 7.5 내지 약 10.0 마이크론, 약 7.5 내지 약 9.5 마이크론, 약 7.5 내지 약 9.0 마이크론, 약 7.5 내지 약 8.5 마이크론, 약 7.5 내지 약 8.0 마이크론, 약 8.0 내지 약 12.0 마이크론, 약 8.0 내지 약 11.5 마이크론, 약 8.0 내지 약 11.0 마이크론, 약 8.0 내지 약 10.5 마이크론, 약 8.0 내지 약 10.0 마이크론, 약 8.0 내지 약 9.5 마이크론, 약 8.0 내지 약 9.0 마이크론, 약 8.0 내지 약 8.5 마이크론, 약 8.5 내지 약 12.0 마이크론, 약 8.5 내지 약 11.5 마이크론, 약 8.5 내지 약 11.0 마이크론, 약 8.5 내지 약 10.5 마이크론, 약 8.5 내지 약 10.0 마이크론, 약 8.5 내지 약 9.5 마이크론, 약 8.5 내지 약 9.0 마이크론, 약 9.0 내지 약 12.0 마이크론, 약 9.0 내지 약 11.5 마이크론, 약 9.0 내지 약 11.0 마이크론, 약 9.0 내지 약 10.5 마이크론, 약 9.0 내지 약 10.0 마이크론, 약 9.0 내지 약 9.5 마이크론, 약 9.5 내지 약 12.0 마이크론, 약 9.5 내지 약 11.5 마이크론, 약 9.5 내지 약 11.0 마이크론, 약 9.5 내지 약 10.5 마이크론, 약 9.5 내지 약 10.0 마이크론, 약 10.0 내지 약 12.0 마이크론, 약 10.0 내지 약 11.5 마이크론, 약 10.0 내지 약 11.0 마이크론, 약 10.0 내지 약 10.5 마이크론, 약 10.5 내지 약 12.0 마이크론, 약 10.5 내지 약 11.5 마이크론, 약 10.5 내지 약 11.0 마이크론, 약 11.0 내지 약 12.0 마이크론, 약 11.0 내지 약 11.5 마이크론, 또는 약 11.5 내지 약 12.0 마이크론이며, 임의로 집단의 표준 편차는 1, 2, 또는 3 마이크론 미만이다. 제핵 적혈구 세포의 직경은, 예를 들어 Advia 120 혈액 시스템(hematology system), Vi-cell™ 세포 생존 분석기(Cell Viability Analyzer, Beckman Coulter), 또는 Moxi Z 세포 계수기(cell counter, Orflo)를 사용해 측정할 수 있다.
일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포의 평균 적혈구 부피는 약 10 fL 내지 약 175 fL, 약 10 fL 내지 약 160 fL, 약 10 fL 내지 약 140 fL, 약 10 fL 내지 약 120 fL, 약 10 fL 내지 약 100 fL, 약 10 fL 내지 약 95 fL, 약 10 fL 내지 약 90 fL, 약 10 fL 내지 약 85 fL, 약 10 fL 내지 약 80 fL, 약 10 fL 내지 약 75 fL, 약 10 fL 내지 약 70 fL, 약 10 fL 내지 약 65 fL, 약 10 fL 내지 약 60 fL, 약 10 fL 내지 약 55 fL, 약 10 fL 내지 약 50 fL, 약 10 fL 내지 약 45 fL, 약 10 fL 내지 약 40 fL, 약 10 fL 내지 약 35 fL, 약 10 fL 내지 약 30 fL, 약 10 fL 내지 약 25 fL, 약 10 fL 내지 약 20 fL, 약 10 fL 내지 약 15 fL, 약 15 fL 내지 약 175 fL, 약 15 fL 내지 약 160 fL, 약 15 fL 내지 약 140 fL, 약 15 fL 내지 약 120 fL, 약 15 fL 내지 약 100 fL, 약 15 fL 내지 약 95 fL, 약 15 fL 내지 약 90 fL, 약 15 fL 내지 약 85 fL, 약 15 fL 내지 약 80 fL, 약 15 fL 내지 약 75 fL, 약 15 fL 내지 약 70 fL, 약 15 fL 내지 약 65 fL, 약 15 fL 내지 약 60 fL, 약 15 fL 내지 약 55 fL, 약 15 fL 내지 약 50 fL, 약 15 fL 내지 약 45 fL, 약 15 fL 내지 약 40 fL, 약 15 fL 내지 약 35 fL, 약 15 fL 내지 약 30 fL, 약 15 fL 내지 약 25 fL, 약 15 fL 내지 약 20 fL, 약 20 fL 내지 약 175 fL, 약 20 fL 내지 약 160 fL, 약 20 fL 내지 약 140 fL, 약 20 fL 내지 약 120 fL, 약 20 fL 내지 약 100 fL, 약 20 fL 내지 약 95 fL, 약 20 fL 내지 약 90 fL, 약 20 fL 내지 약 85 fL, 약 20 fL 내지 약 80 fL, 약 20 fL 내지 약 75 fL, 약 20 fL 내지 약 70 fL, 약 20 fL 내지 약 65 fL, 약 20 fL 내지 약 60 fL, 약 20 fL 내지 약 55 fL, 약 20 fL 내지 약 50 fL, 약 20 fL 내지 약 45 fL, 약 20 fL 내지 약 40 fL, 약 20 fL 내지 약 35 fL, 약 20 fL 내지 약 30 fL, 약 20 fL 내지 약 25 fL, 약 25 fL 내지 약 175 fL, 약 25 fL 내지 약 160 fL, 약 25 fL 내지 약 140 fL, 약 25 fL 내지 약 120 fL, 약 25 fL 내지 약 100 fL, 약 25 fL 내지 약 95 fL, 약 25 fL 내지 약 90 fL, 약 25 fL 내지 약 85 fL, 약 25 fL 내지 약 80 fL, 약 25 fL 내지 약 75 fL, 약 25 fL 내지 약 70 fL, 약 25 fL 내지 약 65 fL, 약 25 fL 내지 약 60 fL, 약 25 fL 내지 약 55 fL, 약 25 fL 내지 약 50 fL, 약 25 fL 내지 약 45 fL, 약 25 fL 내지 약 40 fL, 약 25 fL 내지 약 35 fL, 약 25 fL 내지 약 30 fL, 약 30 fL 내지 약 175 fL, 약 30 fL 내지 약 160 fL, 약 30 fL 내지 약 140 fL, 약 30 fL 내지 약 120 fL, 약 30 fL 내지 약 100 fL, 약 30 fL 내지 약 95 fL, 약 30 fL 내지 약 90 fL, 약 30 fL 내지 약 85 fL, 약 30 fL 내지 약 80 fL, 약 30 fL 내지 약 75 fL, 약 30 fL 내지 약 70 fL, 약 30 fL 내지 약 65 fL, 약 30 fL 내지 약 60 fL, 약 30 fL 내지 약 55 fL, 약 30 fL 내지 약 50 fL, 약 30 fL 내지 약 45 fL, 약 30 fL 내지 약 40 fL, 약 30 fL 내지 약 35 fL, 약 35 fL 내지 약 175 fL, 약 35 fL 내지 약 160 fL, 약 35 fL 내지 약 140 fL, 약 35 fL 내지 약 120 fL, 약 35 fL 내지 약 100 fL, 약 35 fL 내지 약 95 fL, 약 35 fL 내지 약 90 fL, 약 35 fL 내지 약 85 fL, 약 35 fL 내지 약 80 fL, 약 35 fL 내지 약 75 fL, 약 35 fL 내지 약 70 fL, 약 35 fL 내지 약 65 fL, 약 35 fL 내지 약 60 fL, 약 35 fL 내지 약 55 fL, 약 35 fL 내지 약 50 fL, 약 35 fL 내지 약 45 fL, 약 35 fL 내지 약 40 fL, 약 40 fL 내지 약 175 fL, 약 40 fL 내지 약 160 fL, 약 40 fL 내지 약 140 fL, 약 40 fL 내지 약 120 fL, 약 40 fL 내지 약 100 fL, 약 40 fL 내지 약 95 fL, 약 40 fL 내지 약 90 fL, 약 40 fL 내지 약 85 fL, 약 40 fL 내지 약 80 fL, 약 40 fL 내지 약 75 fL, 약 40 fL 내지 약 70 fL, 약 40 fL 내지 약 65 fL, 약 40 fL 내지 약 60 fL, 약 40 fL 내지 약 55 fL, 약 40 fL 내지 약 50 fL, 약 40 fL 내지 약 45 fL, 약 45 fL 내지 약 175 fL, 약 45 fL 내지 약 160 fL, 약 45 fL 내지 약 140 fL, 약 45 fL 내지 약 120 fL, 약 45 fL 내지 약 100 fL, 약 45 fL 내지 약 95 fL, 약 45 fL 내지 약 90 fL, 약 45 fL 내지 약 85 fL, 약 45 fL 내지 약 80 fL, 약 45 fL 내지 약 75 fL, 약 45 fL 내지 약 70 fL, 약 45 fL 내지 약 65 fL, 약 45 fL 내지 약 60 fL, 약 45 fL 내지 약 55 fL, 약 45 fL 내지 약 50 fL, 약 50 fL 내지 약 175 fL, 약 50 fL 내지 약 160 fL, 약 50 fL 내지 약 140 fL, 약 50 fL 내지 약 120 fL, 약 50 fL 내지 약 100 fL, 약 50 fL 내지 약 95 fL, 약 50 fL 내지 약 90 fL, 약 50 fL 내지 약 85 fL, 약 50 fL 내지 약 80 fL, 약 50 fL 내지 약 75 fL, 약 50 fL 내지 약 70 fL, 약 50 fL 내지 약 65 fL, 약 50 fL 내지 약 60 fL, 약 50 fL 내지 약 55 fL, 약 60 fL 내지 약 175 fL, 약 60 fL 내지 약 160 fL, 약 60 fL 내지 약 140 fL, 약 60 fL 내지 약 120 fL, 약 60 fL 내지 약 100 fL, 약 60 fL 내지 약 95 fL, 약 60 fL 내지 약 90 fL, 약 60 fL 내지 약 85 fL, 약 60 fL 내지 약 80 fL, 약 60 fL 내지 약 75 fL, 약 60 fL 내지 약 70 fL, 약 60 fL 내지 약 65 fL, 약 70 fL 내지 약 175 fL, 약 70 fL 내지 약 160 fL, 약 70 fL 내지 약 140 fL, 약 70 fL 내지 약 120 fL, 약 70 fL 내지 약 100 fL, 약 70 fL 내지 약 95 fL, 약 70 fL 내지 약 90 fL, 약 70 fL 내지 약 85 fL, 약 70 fL 내지 약 80 fL, 약 70 fL 내지 약 75 fL, 약 80 fL 내지 약 175 fL, 약 80 fL 내지 약 160 fL, 약 80 fL 내지 약 140 fL, 약 80 fL 내지 약 120 fL, 약 80 fL 내지 약 100 fL, 약 80 fL 내지 약 95 fL, 약 80 fL 내지 약 90 fL, 약 80 fL 내지 약 85 fL, 약 100 fL 내지 약 175 fL, 약 100 fL 내지 약 160 fL, 약 100 fL 내지 약 140 fL, 약 100 fL 내지 약 120 fL, 약 120 fL 내지 약 175 fL, 약 120 fL 내지 약 160 fL, 약 120 fL 내지 약 140 fL, 약 140 fL 내지 약 175 fL, 약 140 fL 내지 약 160 fL, 또는 약 160 fL 내지 약 175 fL이며, 임의로 집단의 표준 편차는 50, 40, 30, 20, 10, 5, 또는 2 fL 미만이다. 평균 혈구 부피(mean corpuscular volume)는, 예를 들어 Coulter 계수기, Moxi Z 세포 계수기(Orflo), 또는 Sysmex 혈액 분석기와 같은 혈액 분석 기기를 사용해 측정할 수 있다.
일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포는 인간(예를 들어 인간 공여자 적혈구 전구 세포로부터 유래된) 제핵 적혈구 세포이다.
일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포는 조작된 인간 제핵 적혈구 세포이다. 일부 구현예에서, 조작된 제핵 적혈구 세포는 단일 외인성 단백질(예를 들어 조작된 제핵 적혈구 세포의 세포기질에 존재하거나 막에 존재하는 외인성 단백질)(예를 들어 본원에 기술된 또는 당업계에 공지된 예시적인 외인성 단백질 중 어느 하나)을 포함한다.
다른 구현예에서, 조작된 제핵 적혈구 세포는 2개 이상의 외인성 단백질(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 외인성 단백질 중 어느 하나)을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 외인성 단백질 중 적어도 하나는 조작된 제핵 적혈구 세포에 세포기질(예를 들어 페닐알라닌 암모니아 리아제와 같은 효소)에 존재할 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 조작된 제핵 적혈구 세포 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 외인성 단백질은 조작된 제핵 적혈구 세포의 세포기질에 존재하며, 세포는 하이포타우린(또는 하이포타우린 전구물질 또는 하이포타우린 분해 산물) 또는 타우린(또는 타우린 전구물질 또는 타우린 분해 산물)을 함유하는 액체 배양 배지와 접촉하지 않았거나, 약 1.0 g/L 내지 약 37.5 g/L의 하이포타우린(또는 하이포타우린 전구물질 또는 하이포타우린 분해 산물) 또는 약 1.0 g/L 내지 약 37.5 g/L의 타우린(또는 타우린 전구물질 또는 타우린 분해 산물)을 포함하지 않는 제핵 적혈구 세포와 비교했을 때 증가된 (예를 들어 적어도 5% 증가, 적어도 10% 증가, 적어도 15% 증가, 적어도 20% 증가, 적어도 25% 증가, 적어도 30% 증가, 적어도 35% 증가, 적어도 40% 증가, 적어도 45% 증가, 적어도 50% 증가, 적어도 55% 증가, 적어도 60% 증가, 적어도 65% 증가, 적어도 70% 증가, 적어도 75% 증가, 적어도 80% 증가, 적어도 85% 증가, 적어도 90% 증가, 적어도 95% 증가, 적어도 100% 증가, 적어도 110% 증가, 적어도 120% 증가, 적어도 130% 증가, 적어도 140% 증가, 적어도 150% 증가, 적어도 160% 증가, 적어도 170% 증가, 적어도 180% 증가, 적어도 190% 증가, 적어도 200% 증가, 적어도 210% 증가, 적어도 220% 증가, 적어도 230% 증가, 적어도 240% 증가, 적어도 250% 증가, 적어도 260% 증가, 적어도 270% 증가, 적어도 280% 증가, 적어도 290% 증가, 또는 적어도 300% 증가, 또는 약 1% 증가 내지 약 300% 증가, 약 1% 증가 내지 약 280% 증가, 약 1% 증가 내지 약 260% 증가, 약 1% 증가 내지 약 240% 증가, 약 1% 증가 내지 약 220% 증가, 약 1% 증가 내지 약 200% 증가, 약 1% 증가 내지 약 180% 증가, 약 1% 증가 또는 약 160% 증가, 약 1% 증가 내지 약 140% 증가, 약 1% 증가 내지 약 120% 증가, 약 1% 증가 내지 약 100% 증가, 약 1% 증가 내지 약 95% 증가, 약 1% 증가 내지 약 90% 증가, 약 1% 증가 내지 약 85% 증가, 약 1% 증가 내지 약 80% 증가, 약 1% 증가 내지 약 75% 증가, 약 1% 증가 내지 약 70% 증가, 약 1% 증가 내지 약 65% 증가, 약 1% 증가 내지 약 60% 증가, 약 1% 증가 내지 약 55% 증가, 약 1% 증가 내지 약 50% 증가, 약 1% 증가 내지 약 45% 증가, 약 1% 증가 내지 약 40% 증가, 약 1% 증가 내지 약 35% 증가, 약 1% 증가 내지 약 30% 증가, 약 1% 증가 내지 약 25% 증가, 약 1% 증가 내지 약 20% 증가, 약 1% 증가 내지 약 15% 증가, 약 1% 증가 내지 약 10% 증가, 약 1% 증가 내지 약 5% 증가, 약 5% 내지 약 300% 증가, 약 5% 증가 내지 약 280% 증가, 약 5% 증가 내지 약 260% 증가, 약 5% 증가 내지 약 240% 증가, 약 5% 증가 내지 약 220% 증가, 약 5% 증가 내지 약 200% 증가, 약 5% 증가 내지 약 180% 증가, 약 5% 증가 또는 약 160% 증가, 약 5% 증가 내지 약 140% 증가, 약 5% 증가 내지 약 120% 증가, 약 5% 증가 내지 약 100% 증가, 약 5% 증가 내지 약 95% 증가, 약 5% 증가 내지 약 90% 증가, 약 5% 증가 내지 약 85% 증가, 약 5% 증가 내지 약 80% 증가, 약 5% 증가 내지 약 75% 증가, 약 5% 증가 내지 약 70% 증가, 약 5% 증가 내지 약 65% 증가, 약 5% 증가 내지 약 60% 증가, 약 5% 증가 내지 약 55% 증가, 약 5% 증가 내지 약 50% 증가, 약 5% 증가 내지 약 45% 증가, 약 5% 증가 내지 약 40% 증가, 약 5% 증가 내지 약 35% 증가, 약 5% 증가 내지 약 30% 증가, 약 5% 증가 내지 약 25% 증가, 약 5% 증가 내지 약 20% 증가, 약 5% 증가 내지 약 15% 증가, 약 5% 증가 내지 약 10% 증가, 약 10% 증가 내지 약 300% 증가, 약 10% 증가 내지 약 280% 증가, 약 10% 증가 내지 약 260% 증가, 약 10% 증가 내지 약 240% 증가, 약 10% 증가 내지 약 220% 증가, 약 10% 증가 내지 약 200% 증가, 약 10% 증가 내지 약 180% 증가, 약 10% 증가 또는 약 160% 증가, 약 10% 증가 내지 약 140% 증가, 약 10% 증가 내지 약 120% 증가, 약 10% 증가 내지 약 100% 증가, 약 10% 증가 내지 약 95% 증가, 약 10% 증가 내지 약 90% 증가, 약 10% 증가 내지 약 85% 증가, 약 10% 증가 내지 약 80% 증가, 약 10% 증가 내지 약 75% 증가, 약 10% 증가 내지 약 70% 증가, 약 10% 증가 내지 약 65% 증가, 약 10% 증가 내지 약 60% 증가, 약 10% 증가 내지 약 55% 증가, 약 10% 증가 내지 약 50% 증가, 약 10% 증가 내지 약 45% 증가, 약 10% 증가 내지 약 40% 증가, 약 10% 증가 내지 약 35% 증가, 약 10% 증가 내지 약 30% 증가, 약 10% 증가 내지 약 25% 증가, 약 10% 증가 내지 약 20% 증가, 약 10% 증가 내지 약 15% 증가, 약 15% 증가 내지 약 300% 증가, 약 15% 증가 내지 약 280% 증가, 약 15% 증가 내지 약 260% 증가, 약 15% 증가 내지 약 240% 증가, 약 15% 증가 내지 약 220% 증가, 약 15% 증가 내지 약 200% 증가, 약 15% 증가 내지 약 180% 증가, 약 15% 증가 또는 약 160% 증가, 약 15% 증가 내지 약 140% 증가, 약 15% 증가 내지 약 120% 증가, 약 15% 증가 내지 약 100% 증가, 약 15% 증가 내지 약 95% 증가, 약 15% 증가 내지 약 90% 증가, 약 15% 증가 내지 약 85% 증가, 약 15% 증가 내지 약 80% 증가, 약 15% 증가 내지 약 75% 증가, 약 15% 증가 내지 약 70% 증가, 약 15% 증가 내지 약 65% 증가, 약 15% 증가 내지 약 60% 증가, 약 15% 증가 내지 약 55% 증가, 약 15% 증가 내지 약 50% 증가, 약 15% 증가 내지 약 45% 증가, 약 15% 증가 내지 약 40% 증가, 약 15% 증가 내지 약 35% 증가, 약 15% 증가 내지 약 30% 증가, 약 15% 증가 내지 약 25% 증가, 약 15% 증가 내지 약 20% 증가, 약 20% 증가 내지 약 300% 증가, 약 20% 증가 내지 약 280% 증가, 약 20% 증가 내지 약 260% 증가, 약 20% 증가 내지 약 240% 증가, 약 20% 증가 내지 약 220% 증가, 약 20% 증가 내지 약 200% 증가, 약 20% 증가 내지 약 180% 증가, 약 20% 증가 또는 약 160% 증가, 약 20% 증가 내지 약 140% 증가, 약 20% 증가 내지 약 120% 증가, 약 20% 증가 내지 약 100% 증가, 약 20% 증가 내지 약 95% 증가, 약 20% 증가 내지 약 90% 증가, 약 20% 증가 내지 약 85% 증가, 약 20% 증가 내지 약 80% 증가, 약 20% 증가 내지 약 75% 증가, 약 20% 증가 내지 약 70% 증가, 약 20% 증가 내지 약 65% 증가, 약 20% 증가 내지 약 60% 증가, 약 20% 증가 내지 약 55% 증가, 약 20% 증가 내지 약 50% 증가, 약 20% 증가 내지 약 45% 증가, 약 20% 증가 내지 약 40% 증가, 약 20% 증가 내지 약 35% 증가, 약 20% 증가 내지 약 30% 증가, 약 20% 증가 내지 약 25% 증가, 약 25% 증가 내지 약 300% 증가, 약 25% 증가 내지 약 280% 증가, 약 25% 증가 내지 약 260% 증가, 약 25% 증가 내지 약 240% 증가, 약 25% 증가 내지 약 220% 증가, 약 25% 증가 내지 약 200% 증가, 약 25% 증가 내지 약 180% 증가, 약 25% 증가 또는 약 160% 증가, 약 25% 증가 내지 약 140% 증가, 약 25% 증가 내지 약 120% 증가, 약 25% 증가 내지 약 100% 증가, 약 25% 증가 내지 약 95% 증가, 약 25% 증가 내지 약 90% 증가, 약 25% 증가 내지 약 85% 증가, 약 25% 증가 내지 약 80% 증가, 약 25% 증가 내지 약 75% 증가, 약 25% 증가 내지 약 70% 증가, 약 25% 증가 내지 약 65% 증가, 약 25% 증가 내지 약 60% 증가, 약 25% 증가 내지 약 55% 증가, 약 25% 증가 내지 약 50% 증가, 약 25% 증가 내지 약 45% 증가, 약 25% 증가 내지 약 40% 증가, 약 25% 증가 내지 약 35% 증가, 약 25% 증가 내지 약 30% 증가, 약 30% 증가 내지 약 300% 증가, 약 30% 증가 내지 약 280% 증가, 약 30% 증가 내지 약 260% 증가, 약 30% 증가 내지 약 240% 증가, 약 30% 증가 내지 약 220% 증가, 약 30% 증가 내지 약 200% 증가, 약 30% 증가 내지 약 180% 증가, 약 30% 증가 또는 약 160% 증가, 약 30% 증가 내지 약 140% 증가, 약 30% 증가 내지 약 120% 증가, 약 30% 증가 내지 약 100% 증가, 약 30% 증가 내지 약 95% 증가, 약 30% 증가 내지 약 90% 증가, 약 30% 증가 내지 약 85% 증가, 약 30% 증가 내지 약 80% 증가, 약 30% 증가 내지 약 75% 증가, 약 30% 증가 내지 약 70% 증가, 약 30% 증가 내지 약 65% 증가, 약 30% 증가 내지 약 60% 증가, 약 30% 증가 내지 약 55% 증가, 약 30% 증가 내지 약 50% 증가, 약 30% 증가 내지 약 45% 증가, 약 30% 증가 내지 약 40% 증가, 약 30% 증가 내지 약 35% 증가, 약 35% 증가 내지 약 300% 증가, 약 35% 증가 내지 약 280% 증가, 약 35% 증가 내지 약 260% 증가, 약 35% 증가 내지 약 240% 증가, 약 35% 증가 내지 약 220% 증가, 약 35% 증가 내지 약 200% 증가, 약 35% 증가 내지 약 180% 증가, 약 35% 증가 또는 약 160% 증가, 약 35% 증가 내지 약 140% 증가, 약 35% 증가 내지 약 120% 증가, 약 35% 증가 내지 약 100% 증가, 약 35% 증가 내지 약 95% 증가, 약 35% 증가 내지 약 90% 증가, 약 35% 증가 내지 약 85% 증가, 약 35% 증가 내지 약 80% 증가, 약 35% 증가 내지 약 75% 증가, 약 35% 증가 내지 약 70% 증가, 약 35% 증가 내지 약 65% 증가, 약 35% 증가 내지 약 60% 증가, 약 35% 증가 내지 약 55% 증가, 약 35% 증가 내지 약 50% 증가, 약 35% 증가 내지 약 45% 증가, 약 35% 증가 내지 약 40% 증가, 약 40% 증가 내지 약 300% 증가, 약 40% 증가 내지 약 280% 증가, 약 40% 증가 내지 약 260% 증가, 약 40% 증가 내지 약 240% 증가, 약 40% 증가 내지 약 220% 증가, 약 40% 증가 내지 약 200% 증가, 약 40% 증가 내지 약 180% 증가, 약 40% 증가 또는 약 160% 증가, 약 40% 증가 내지 약 140% 증가, 약 40% 증가 내지 약 120% 증가, 약 40% 증가 내지 약 100% 증가, 약 40% 증가 내지 약 95% 증가, 약 40% 증가 내지 약 90% 증가, 약 40% 증가 내지 약 85% 증가, 약 40% 증가 내지 약 80% 증가, 약 40% 증가 내지 약 75% 증가, 약 40% 증가 내지 약 70% 증가, 약 40% 증가 내지 약 65% 증가, 약 40% 증가 내지 약 60% 증가, 약 40% 증가 내지 약 55% 증가, 약 40% 증가 내지 약 50% 증가, 약 40% 증가 내지 약 45% 증가, 약 45% 증가 내지 약 300% 증가, 약 45% 증가 내지 약 280% 증가, 약 45% 증가 내지 약 260% 증가, 약 45% 증가 내지 약 240% 증가, 약 45% 증가 내지 약 220% 증가, 약 45% 증가 내지 약 200% 증가, 약 45% 증가 내지 약 180% 증가, 약 45% 증가 또는 약 160% 증가, 약 45% 증가 내지 약 140% 증가, 약 45% 증가 내지 약 120% 증가, 약 45% 증가 내지 약 100% 증가, 약 45% 증가 내지 약 95% 증가, 약 45% 증가 내지 약 90% 증가, 약 45% 증가 내지 약 85% 증가, 약 45% 증가 내지 약 80% 증가, 약 45% 증가 내지 약 75% 증가, 약 45% 증가 내지 약 70% 증가, 약 45% 증가 내지 약 65% 증가, 약 45% 증가 내지 약 60% 증가, 약 45% 증가 내지 약 55% 증가, 약 45% 증가 내지 약 50% 증가, 약 50% 증가 내지 약 300% 증가, 약 50% 증가 내지 약 280% 증가, 약 50% 증가 내지 약 260% 증가, 약 50% 증가 내지 약 240% 증가, 약 50% 증가 내지 약 220% 증가, 약 50% 증가 내지 약 200% 증가, 약 50% 증가 내지 약 180% 증가, 약 50% 증가 또는 약 160% 증가, 약 50% 증가 내지 약 140% 증가, 약 50% 증가 내지 약 120% 증가, 약 50% 증가 내지 약 100% 증가, 약 50% 증가 내지 약 95% 증가, 약 50% 증가 내지 약 90% 증가, 약 50% 증가 내지 약 85% 증가, 약 50% 증가 내지 약 80% 증가, 약 50% 증가 내지 약 75% 증가, 약 50% 증가 내지 약 70% 증가, 약 50% 증가 내지 약 65% 증가, 약 50% 증가 내지 약 60% 증가, 약 50% 증가 내지 약 55% 증가, 약 55% 증가 내지 약 300% 증가, 약 55% 증가 내지 약 280% 증가, 약 55% 증가 내지 약 260% 증가, 약 55% 증가 내지 약 240% 증가, 약 55% 증가 내지 약 220% 증가, 약 55% 증가 내지 약 200% 증가, 약 55% 증가 내지 약 180% 증가, 약 55% 증가 또는 약 160% 증가, 약 55% 증가 내지 약 140% 증가, 약 55% 증가 내지 약 120% 증가, 약 55% 증가 내지 약 100% 증가, 약 55% 증가 내지 약 95% 증가, 약 55% 증가 내지 약 90% 증가, 약 55% 증가 내지 약 85% 증가, 약 55% 증가 내지 약 80% 증가, 약 55% 증가 내지 약 75% 증가, 약 55% 증가 내지 약 70% 증가, 약 55% 증가 내지 약 65% 증가, 약 55% 증가 내지 약 60% 증가, 약 60% 증가 내지 약 300% 증가, 약 60% 증가 내지 약 280% 증가, 약 60% 증가 내지 약 260% 증가, 약 60% 증가 내지 약 240% 증가, 약 60% 증가 내지 약 220% 증가, 약 60% 증가 내지 약 200% 증가, 약 60% 증가 내지 약 180% 증가, 약 60% 증가 또는 약 160% 증가, 약 60% 증가 내지 약 140% 증가, 약 60% 증가 내지 약 120% 증가, 약 60% 증가 내지 약 100% 증가, 약 60% 증가 내지 약 95% 증가, 약 60% 증가 내지 약 90% 증가, 약 60% 증가 내지 약 85% 증가, 약 60% 증가 내지 약 80% 증가, 약 60% 증가 내지 약 75% 증가, 약 60% 증가 내지 약 70% 증가, 약 60% 증가 내지 약 65% 증가, 약 65% 증가 내지 약 300% 증가, 약 65% 증가 내지 약 280% 증가, 약 65% 증가 내지 약 260% 증가, 약 65% 증가 내지 약 240% 증가, 약 65% 증가 내지 약 220% 증가, 약 65% 증가 내지 약 200% 증가, 약 65% 증가 내지 약 180% 증가, 약 65% 증가 또는 약 160% 증가, 약 65% 증가 내지 약 140% 증가, 약 65% 증가 내지 약 120% 증가, 약 65% 증가 내지 약 100% 증가, 약 65% 증가 내지 약 95% 증가, 약 65% 증가 내지 약 90% 증가, 약 65% 증가 내지 약 85% 증가, 약 65% 증가 내지 약 80% 증가, 약 65% 증가 내지 약 75% 증가, 약 65% 증가 내지 약 70% 증가, 약 70% 증가 내지 약 300% 증가, 약 70% 증가 내지 약 280% 증가, 약 70% 증가 내지 약 260% 증가, 약 70% 증가 내지 약 240% 증가, 약 70% 증가 내지 약 220% 증가, 약 70% 증가 내지 약 200% 증가, 약 70% 증가 내지 약 180% 증가, 약 70% 증가 또는 약 160% 증가, 약 70% 증가 내지 약 140% 증가, 약 70% 증가 내지 약 120% 증가, 약 70% 증가 내지 약 100% 증가, 약 70% 증가 내지 약 95% 증가, 약 70% 증가 내지 약 90% 증가, 약 70% 증가 내지 약 85% 증가, 약 70% 증가 내지 약 80% 증가, 약 70% 증가 내지 약 75% 증가, 약 75% 증가 내지 약 300% 증가, 약 75% 증가 내지 약 280% 증가, 약 75% 증가 내지 약 260% 증가, 약 75% 증가 내지 약 240% 증가, 약 75% 증가 내지 약 220% 증가, 약 75% 증가 내지 약 200% 증가, 약 75% 증가 내지 약 180% 증가, 약 75% 증가 또는 약 160% 증가, 약 75% 증가 내지 약 140% 증가, 약 75% 증가 내지 약 120% 증가, 약 75% 증가 내지 약 100% 증가, 약 75% 증가 내지 약 95% 증가, 약 75% 증가 내지 약 90% 증가, 약 75% 증가 내지 약 85% 증가, 약 75% 증가 내지 약 80% 증가, 약 80% 증가 내지 약 300% 증가, 약 80% 증가 내지 약 280% 증가, 약 80% 증가 내지 약 260% 증가, 약 80% 증가 내지 약 240% 증가, 약 80% 증가 내지 약 220% 증가, 약 80% 증가 내지 약 200% 증가, 약 80% 증가 내지 약 180% 증가, 약 80% 증가 또는 약 160% 증가, 약 80% 증가 내지 약 140% 증가, 약 80% 증가 내지 약 120% 증가, 약 80% 증가 내지 약 100% 증가, 약 80% 증가 내지 약 95% 증가, 약 80% 증가 내지 약 90% 증가, 약 80% 증가 내지 약 85% 증가, 약 85% 증가 내지 약 300% 증가, 약 85% 증가 내지 약 280% 증가, 약 85% 증가 내지 약 260% 증가, 약 85% 증가 내지 약 240% 증가, 약 85% 증가 내지 약 220% 증가, 약 85% 증가 내지 약 200% 증가, 약 85% 증가 내지 약 180% 증가, 약 85% 증가 또는 약 160% 증가, 약 85% 증가 내지 약 140% 증가, 약 85% 증가 내지 약 120% 증가, 약 85% 증가 내지 약 100% 증가, 약 85% 증가 내지 약 95% 증가, 약 85% 증가 내지 약 90% 증가, 약 90% 증가 내지 약 300% 증가, 약 90% 증가 내지 약 280% 증가, 약 90% 증가 내지 약 260% 증가, 약 90% 증가 내지 약 240% 증가, 약 90% 증가 내지 약 220% 증가, 약 90% 증가 내지 약 200% 증가, 약 90% 증가 내지 약 180% 증가, 약 90% 증가 또는 약 160% 증가, 약 90% 증가 내지 약 140% 증가, 약 90% 증가 내지 약 120% 증가, 약 90% 증가 내지 약 100% 증가, 약 90% 증가 내지 약 95% 증가, 약 95% 증가 내지 약 300% 증가, 약 95% 증가 내지 약 280% 증가, 약 95% 증가 내지 약 260% 증가, 약 95% 증가 내지 약 240% 증가, 약 95% 증가 내지 약 220% 증가, 약 95% 증가 내지 약 200% 증가, 약 95% 증가 내지 약 180% 증가, 약 95% 증가 또는 약 160% 증가, 약 95% 증가 내지 약 140% 증가, 약 95% 증가 내지 약 120% 증가, 약 95% 증가 내지 약 100% 증가, 약 100% 증가 내지 약 300% 증가, 약 100% 증가 내지 약 280% 증가, 약 100% 증가 내지 약 260% 증가, 약 100% 증가 내지 약 240% 증가, 약 100% 증가 내지 약 220% 증가, 약 100% 증가 내지 약 200% 증가, 약 100% 증가 내지 약 180% 증가, 약 100% 증가 또는 약 160% 증가, 약 100% 증가 내지 약 140% 증가, 약 100% 증가 내지 약 120% 증가, 약 120% 증가 내지 약 300% 증가, 약 120% 증가 내지 약 280% 증가, 약 120% 증가 내지 약 260% 증가, 약 120% 증가 내지 약 240% 증가, 약 120% 증가 내지 약 220% 증가, 약 120% 증가 내지 약 200% 증가, 약 120% 증가 내지 약 180% 증가, 약 120% 증가 또는 약 160% 증가, 약 120% 증가 내지 약 140% 증가, 약 140% 증가 내지 약 300% 증가, 약 140% 증가 내지 약 280% 증가, 약 140% 증가 내지 약 260% 증가, 약 140% 증가 내지 약 240% 증가, 약 140% 증가 내지 약 220% 증가, 약 140% 증가 내지 약 200% 증가, 약 140% 증가 내지 약 180% 증가, 약 140% 증가 또는 약 160% 증가, 약 160% 증가 내지 약 300% 증가, 약 160% 증가 내지 약 280% 증가, 약 160% 증가 내지 약 260% 증가, 약 160% 증가 내지 약 240% 증가, 약 160% 증가 내지 약 220% 증가, 약 160% 증가 내지 약 200% 증가, 약 160% 증가 내지 약 180% 증가, 약 180% 증가 내지 약 300% 증가, 약 180% 증가 내지 약 280% 증가, 약 180% 증가 내지 약 260% 증가, 약 180% 증가 내지 약 240% 증가, 약 180% 증가 내지 약 220% 증가, 약 180% 증가 내지 약 200% 증가, 약 200% 증가 내지 약 300% 증가, 약 200% 증가 내지 약 280% 증가, 약 200% 증가 내지 약 260% 증가, 약 200% 증가 내지 약 240% 증가, 약 200% 증가 내지 약 220% 증가, 약 220% 증가 내지 약 300% 증가, 약 220% 증가 내지 약 280% 증가, 약 220% 증가 내지 약 260% 증가, 약 220% 증가 내지 약 240% 증가, 약 240% 증가 내지 약 300% 증가, 약 240% 증가 내지 약 280% 증가, 약 240% 증가 내지 약 260% 증가, 약 260% 증가 내지 약 300% 증가, 약 260% 증가 내지 약 280% 증가, 또는 약 280% 증가 내지 약 300% 증가된) 페닐알라닌-분해 활성을 갖는다. 페닐알라닌-분해 활성을 결정하기 위한 검정의 비제한적인 예는, 예를 들어, Wang 등의 문헌[(2008) J. Mol. Biol. 380(4): 623-35]; Moffitt 등의 문헌[(2007) Biochem. 46(4): 1004-12]; 및 Jaliani 등의 문헌[(2013) Appl. Biochem. Biotechnol. 171(7): 1805-18]에 기술되어 있고, 이들 각각은 참조로서 본원에 통합된다.
일부 구현예에서, 2개 이상의 외인성 단백질 중 적어도 하나는 조작된 제핵 적혈구 세포의 막에 (예를 들어 Fc-결합 분자, 사이토카인 수용체, T-세포 활성화 리간드, T-세포 수용체, 면역 억제 분자, MHC 분자, APC 결합 분자, 자가항원, 알레르겐, 독소, 표적화제, 수용체 리간드(예를 들어 작용제 또는 수용체 길항제), 또는 항체 또는 항체 단편 상에) 존재할 수 있다.
외인성 단백질을 포함하는 조작된 적혈구 세포를 사용해 치료할 수 있는 상응하는 질환 또는 병태에 추가하여, 본원에 기술된 조작된 적혈구 세포 중 어느 하나가 포함할 수 있는 하나 이상의 외인성 단백질의 비제한적인 구현예가 아래 표 A~D에 열거되어 있다. 본원에 기술된 적혈구 세포 중 어느 하나가 포함할 수 있는 외인성 단백질의 추가 구현예는 당업계에 공지되어 있다.
[표 A] 예시적인 외인성 단백질
Figure pct00001
[표 B] 예시적인 외인성 단백질
Figure pct00002
[표 C] 예시적인 외인성 단백질
Figure pct00003
[표 D] 예시적인 외인성 단백질
Figure pct00004
일부 구현예에서, 조작된 제핵 적혈구 세포의 막 상에 존재하는 외인성 단백질은 클릭 화학 반응의 산물일 수 있다(예를 들어 외인성 단백질은 본원에 기술된 방법 중 어느 하나를 사용하여 세포 막 상에 존재하는 단백질(예를 들어 제2 외인성 단백질 또는 내인성 단백질)에 접합될 수 있다). 일부 구현예에서, 조작된 제핵 적혈구 세포의 막 상에 존재하는 외인성 단백질은 소르타제(sortase) 효소를 사용하는 접합 반응의 산물일 수 있다(예를 들어 외인성 단백질은 본원에 기술된 방법 중 어느 하나를 사용해 세포 막 상에 존재하는 단백질(예를 들어 제2 외인성 단백질 또는 내인성 단백질)에 접합될 수 있다). 소르타제 효소를 사용하는 접합 반응의 비제한적인 구현예는 미국 특허 제10,260,038호 및 미국 특허 공개 제2016/0082046 A1호에 기술되어 있으며, 이들 모두는 참조로서 통합된다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예는 (예를 들어 본원에 기술된 방법 중 어느 하나를 사용하여) 하나 이상의 외인성 단백질을 세포(예를 들어 본원에 기술된 세포 중 어느 하나, 예를 들어 제핵 적혈구 세포, 조작된 제핵 적혈구 세포, 또는 본원에 기술된 적혈구 전구 세포 중 어느 하나)에 클릭-접합하는 단계를 추가로 포함한다. 본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예는 (예를 들어 본원에 기술된 방법 중 어느 하나를 사용하여) 세포를 (예를 들어 본원에 기술된 세포 중 어느 하나, 예를 들어 제핵 적혈구 세포, 조작된 제핵 적혈구 세포, 또는 본원에 기술된 적혈구 전구 세포 중 어느 하나를) 저장성으로 로딩하는 단계를 추가로 포함한다. 본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예는 (예를 들어 본원에 기술된 방법 중 어느 하나를 사용하여) 물리적 조작을 통해 세포를 (예를 들어 본원에 기술된 세포 중 어느 하나, 예를 들어 제핵 적혈구 세포, 조작된 제핵 적혈구 세포, 또는 본원에 기술된 적혈구 전구 세포 중 어느 하나를) 로딩하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 조작된 제핵 적혈구 세포의 막 상에 존재하는 외인성 단백질은 지질-앵커링된 단백질, 예를 들어 GPI-앵커, N-미리스토일화 단백질, 또는 S-팔미토일화 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 제핵 적혈구 세포의 막 상에 존재하는 외인성 단백질은 막관통 단백질(예를 들어 단일-통과 또는 다중-통과 막관통 단백질) 또는 말초 막 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 제핵 적혈구 세포의 막 상에 존재하는 외인성 단백질은 막관통 도메인을 포함하는 융합 단백질(예를 들어 SMIM1 또는 글리코포린 A(GPA)의 막관통 도메인을 포함하는 융합 단백질)일 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 제핵 적혈구 세포의 막 상에 존재하는 외인성 단백질은 세포외 공간 내로 돌출하는 임의의 아미노산을 갖지 않는다. 일부 구현예에서, 조작된 제핵 적혈구 세포의 막 상에 존재하는 외인성 단백질은 조작된 제핵 적혈구 세포의 세포기질 내로 돌출하는 임의의 아미노산을 갖지 않는다. 일부 구현예에서, 조작된 제핵 적혈구 세포의 막 상에 존재하는 외인성 단백질은 조작된 제핵 적혈구 세포의 세포외 공간 내로 돌출하는 아미노산 및 조작된 제핵 적혈구 세포의 세포기질 내로 돌출하는 아미노산을 갖는다.
본원에 기술된 방법은, 단계 (a) 전에 하나 이상의 재조합 단백질을 암호화하는 핵산을 적혈구 전구 세포(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 적혈구 전구 세포 중 어느 하나) 내로 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 조작된 제핵 적혈구는 하나 이상의 외인성 단백질(예를 들어 본원에 기술된 또는 당업계에 공지된 외인성 단백질 중 어느 하나)을 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어 DNA 발현 벡터 또는 mRNA)을 적혈구 전구 세포(예를 들어 본원에 기술된 또는 당업계에 공지된 적혈구 전구 세포 중 어느 하나)에 도입함으로써 생산될 수 있다. DNA 발현 벡터를 적혈구 전구 세포 내로 도입하기 위한 예시적인 방법은 리포좀 매개 전달, 형질전환, 유전자 총, 형질감염, 및 형질도입, 예를 들어 (예를 들어 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 단순포진 바이러스 벡터, 및 레트로바이러스 기반 벡터를 포함하여, 바이러스 벡터를 사용하여 수행되는) 바이러스 매개 유전자 전달을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 적혈구 전구 세포 내로 DNA 발현 벡터를 도입하기 위한 추가의 예시적인 방법은, 예를 들어 네이키드 DNA, CaPO4 침전, DEAE 덱스트란, 전기천공, 원형질 융합, 리포펙션, 및 세포 미세주입의 사용을 포함한다.
적혈구 전구 세포는 임의로, 조작된 제핵 적혈구 세포로의 분화를 허용하는 적절한 조건 하에서, 하나 이상의 외인성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산의 도입 이전에 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, 생성된 조작된 제핵 적혈구 세포는 성숙 적혈구와 관련된 단백질, 예를 들어 표준 방법(예를 들어 웨스턴 블롯팅 또는 FACS 분석)에 의해 검증되고 정량화될 수 있는 헤모글로빈(예를 들어 성인 헤모글로빈 및/또는 태아 헤모글로빈), 글리코포린 A, 및 외인성 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포 또는 적혈구 전구 세포는 외인성 단백질을 암호화하는 mRNA로 형질감염되어 조작된 제핵 적혈구를 생성할 수 있다. 전령 RNA는 외인성 단백질을 암호화하는 서열을 함유하는 cDNA 플라스미드 작제물의 시험관 내 전사로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 외인성 단백질을 암호화하는 cDNA 서열은 특정 RNA 중합효소와 양립할 수 있는 프로모터 서열을 함유하는 클로닝 벡터 내에 삽입될 수 있다. 예를 들어, 클로닝 벡터 ZAP Express® pBK-CMV(Stratagene, La Jolla, Calif., USA)는 T3 및 T7 RNA 중합효소와 각각 양립 가능한 T3 및 T7 프로모터 서열을 함유한다. 센스 mRNA의 시험관 내 전사를 위해, 플라스미드는 외인성 단백질을 암호화하는 서열의 단부에 상응하는 종결 코돈(들)의 하류에 있는 제한 부위에서 선형화된다. mRNA는, 예를 들어 RNAMaxx® 고수율 전사 키트(Stratagene, La Jolla, Calif., USA)와 같은 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하여 선형 DNA 템플릿으로부터 전사된다. 일부 경우에, 5'-m7GpppG-캡핑된 mRNA를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 이와 같이, 선형화된 cDNA 템플릿의 전사는, 예를 들어 Ambion(Austin, Tex., USA)의 mMESSAGE mMACHINE 고수율 캡핑된 RNA 전사 키트를 사용하여 수행될 수 있다. 전사는 30분 내지 4시간 동안 37℃에서 20 내지 100 μL의 반응 부피로 수행될 수 있다. 전사된 mRNA를 DNase I로 간단히 처리하여 이를 반응 혼합물로부터 정제하여 선형화된 DNA 템플릿을 제거한 다음, 염화리튬, 아세트산나트륨, 또는 아세트산암모늄의 존재 하에 70% 에탄올에서 침전시킨다. 전사된 mRNA의 무결성은 아가로스-포름알데히드 겔 또는 상업적으로 이용 가능한 Novex pre-cast 캐스트 TBE 겔(Novex, Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA)을 이용한 전기영동을 사용하여 평가될 수 있다.
외인성 단백질을 암호화하는 전령 RNA는, 예를 들어 리포펙션 및 전기천공을 포함하는 다양한 접근법을 사용하여 제핵 적혈구 세포 또는 적혈구 전구 세포 내로 도입될 수 있다(van Tandeloo 등의 문헌[Blood 98:49-56, 2001]). 리포펙션을 위해, 예를 들어, Opti-MEM(Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA) 중에서 시험관 내 전사된 5 μg의 mRNA를 양이온성 지질 DMRIE-C(Invitrogen)와 함께 1:4의 비율로 5~15분 동안 인큐베이션한다.
대안적으로, 예를 들어 DOTAP, 다양한 형태의 폴리에틸렌이민 및 폴리L-리신(Sigma-Aldrich, Saint Louis, Mo. USA), 및 Superfect(Qiagen, Inc., Valencia, Calif., USA; 예를 들어 Bettinger 등의 문헌[Nucleic Acids Res. 29:3882-3891, 2001] 참조)를 포함하여, 다양한 다른 양이온성 지질 또는 양이온성 중합체가 mRNA로 적혈구 전구 세포 또는 제핵성 적혈구를 형질감염시키는 데 사용될 수 있다. 생성된 mRNA/지질 복합체는 세포(1~2 x 106개의 세포/mL)와 함께 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 세척하고, 배양물에 다시 넣는다. 전기천공을 위해, 예를 들어 500 μL의 Opti-MEM(Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA) 중 약 5~20 x 106개의 세포를 약 20 μg의 시험관 내 전사된 mRNA와 혼합하고, 예를 들어 Easyject Plus 장치(EquiBio, Kent, United Kingdom)를 사용하여 0.4 cm 큐벳에서 전기천공한다. 일부 경우에, 특정 mRNA를 적혈구 전구 세포 내로 형질감염시키는 데 유용한 조건을 결정하기 위해 다양한 전압, 정전 용량, 및 전기천공 부피를 시험하는 것이 필요할 수 있다. 일반적으로, mRNA로 세포를 효율적으로 형질감염시키는 데 필요한 전기천공 파라미터는 DNA의 전기천공에 필요한 것보다 세포에 덜 유해한 것으로 보인다(van Tandeloo 등의 문헌[Blood 98:49-56, 2001]).
대안적으로, mRNA는 펩티드-매개 RNA 전달 전략을 사용하여 적혈구 전구 세포 또는 제핵 적혈구 세포 내로 형질감염될 수 있다(예를 들어, Bettinger 등의 문헌[Nucleic Acids Res. 29:3882-3891, 2001]). 예를 들어, 양이온성 지질 폴리에틸렌이민 2 kDa(Sigma-Aldrich, Saint Louis, Mo., USA)를 멜리틴 펩티드(Alta Biosciences, Birmingham, UK)와 조합하여, 특히 유사분열 후 일차 세포에서 mRNA 형질감염의 효율을 증가시킬 수 있다. 멜리틴 펩티드는, 예를 들어 이종-이기능성 가교제 숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트와 같은 이황화 가교제를 사용하여 PEI에 접합될 수 있다. 시험관 내 전사된 mRNA를 멜리틴-PEI와 5 내지 15분 동안 사전 인큐베이션하여 RNA/펩티드/지질 복합체를 형성한다. 그런 다음, 이 복합체를 37℃의 5% CO2 가습 환경에서, 무혈청 배양 배지 중의 세포에 2 내지 4시간 동안 첨가한 다음, 제거하고, 형질감염된 세포를 추가로 배양한다.
일부 구현예에서, 조작된 제핵 적혈구 세포는 하나 이상의 외인성 단백질(들)(예를 들어 본원에 기술된 임의의 외인성 단백질 또는 외인성 단백질의 임의의 조합)을 암호화하는 핵산(예를 들어 본원에 기술된 예시적인 핵산 중 어느 하나)을 적혈구 전구 세포 내에 도입함으로써 생성된다. 일부 구현예에서, 외인성 단백질은 DNA에 의해 암호화되고, 이는 적혈구 전구 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 외인성 단백질은 RNA에 의해 암호화되고, 이는 적혈구 전구 세포 내로 도입된다.
적혈구 전구 세포가 제핵 적혈구 세포로 최종 분화되기 전에, 하나 이상의 외인성 단백질(들)을 암호화하는 핵산을, 예를 들어 일시적 또는 안정한 형질감염 및 유전자 요법 접근법을 포함하는 다양한 DNA 기술을 사용하여 적혈구 전구 세포 내로 도입할 수 있다.
하나 이상의 외인성 단백질(들)을 암호화하는 핵산으로 세포를 형질감염시키는 데 바이러스 유전자 전달이 사용될 수 있다. 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스(MMLV), 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 단순포진 바이러스(HSV), 인간 면역 결핍 바이러스 1(HIV1)과 같은 렌티바이러스, 및 발포 바이러스와 같은 스푸마바이러스를 포함하는 다수의 바이러스가 유전자 전달 비히클로서 사용될 수 있다(예를 들어, Osten 등의 문헌[HEP 178:177-202, 2007]). 레트로바이러스는, 예를 들어 인간 세포를 포함하는 포유류 세포를 효율적으로 형질도입하고 염색체에 혼입하여, 안정한 유전자 전달을 가능하게 한다.
하나 이상의 외인성 단백질(들)을 암호화하는 핵산을 적혈구 전구 세포 내로 형질감염시킬 수 있다. 예를 들어, 형질감염은 단계 (b) 후에 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 형질감염은 제2 배양 배지에서 수행될 수 있다. 적절한 벡터는 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스(MMLV) 벡터이다(Malik 등의 문헌[Blood 91:2664-2671, 1998]). 종양원성 레트로바이러스인 MMLV에 기초한 벡터는 현재 유전자 요법 임상시험에 사용되고 있다(Hassle 등의 문헌[News Physiol. Sci. 17:87-92, 2002]). 예를 들어, 외인성 단백질을 암호화하는 cDNA를 함유하는 DNA 작제물을 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 MMLV 벡터 백본에서 생성할 수 있다. 작제물은, 예를 들어 PA317 세포와 같은 포장 세포주 내로 형질감염되고, 바이러스 상청액은, 예를 들어 PG13 세포와 같은 생산자 세포를 형질감염시키는 데 사용된다. PG13 바이러스 상청액을 적혈구 전구 세포와 함께 인큐베이션한다. 외인성 단백질이 조작된 인간 제핵 적혈구 세포의 막 상에 존재하는 경우, 외인성 단백질의 발현은 예를 들어 외인성 단백질에 대해 유도되는 형광 표지된 항체를 이용해 FACS 분석(형광 활성화 세포 분류)을 사용해 모니터링될 수 있다. 외인성 단백질이 조작된 인간 제핵 적혈구 세포의 세포기질에 존재하도록 유사한 방법이 사용될 수 있다.
임의로, 예를 들어 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 형광 추적 분자를 암호화하는 핵산을 바이러스 기반 접근법을 사용하여 적혈구 전구 세포 내로 형질감염시킬 수 있다(Tao 등의 문헌[Stem Cells 25:670-678, 2007]). 향상된 녹색 형광 단백질(EGFP) 또는 적색 형광 단백질(예: DsRed-Express)을 암호화하는 DNA를 함유하는 이소성 레트로바이러스 벡터는, 예를 들어 Phoenix-Eco 세포주(Orbigen, San Diego, Calif.에 의해 배포됨)와 같은 포장 세포를 사용해 포장된다. 포장 세포주는 적절한 바이러스 포장에 필요한, 예를 들어 gag, pol, 및 env를 포함하는 바이러스 단백질을 안정적으로 발현한다. 바이러스 입자가 섞인, Phoenix-Eco 세포의 상청액을 사용하여 적혈구 전구 세포를 형질도입한다. 일부 경우에, 형질도입은, 예를 들어 재조합 피브로넥틴의 단편과 같은 특수 코팅된 표면 상에서 수행되어 레트로바이러스 매개 유전자 전달(예를 들어, RetroNectin, Takara Bio USA, Madison, Wis.)의 효율을 개선할 수 있다. 세포는 RetroNectin-코팅된 플레이트에서 레트로바이러스 Phoenix-Eco 상청액 + 적절한 공동 인자와 함께 인큐베이션된다. 형질도입은 다음 날에 반복될 수 있다. 이 경우, EGFP 또는 DsRed-Express를 발현하는 적혈구 전구 세포의 백분율은 FACS에 의해 평가될 수 있다. 형질도입 효율을 평가하는 데 사용될 수 있는 다른 리포터 유전자는, 예를 들어 베타-갈락토시다아제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제, 및 루시페라아제를 비곳하여 저-친화도 신경 성장 인자 수용체(LNGFR) 및 인간 세포 표면 CD24 항원도 포함한다(Bierhuizen 등의 문헌[Leukemia 13:605-613, 1999]).
비-바이러스 벡터를 사용해 하나 이상의 외인성 단백질(들)을 암호화하는 핵산을 적혈구 전구 세포 내로 도입하여 조작된 제핵 적혈구 세포를 생성할 수 있다. 화학적 및 물리적 방법을 포함하여 다수의 전달 방법이 비-바이러스 벡터를 적혈구 전구 세포 내로 도입하는 데 사용될 수 있다.
외인성 단백질을 암호화하는 비-바이러스 벡터는 양이온성 지질 및 중합체와 같은 합성 거대분자를 사용하여 적혈구 전구 세포 내로 도입될 수 있다(Papapetrou 등의 문헌[Gene Therapy 12:S118-S130, 2005]). 양이온성 리포좀은 전하 상호작용을 통해, 예를 들어 DNA와 복합체를 형성한다. 양으로 하전된 DNA/지질 복합체는 음성 세포 표면에 결합하여 엔도시토시스(endocytosis)에 의해 세포에 흡수된다. 이러한 접근법은, 예를 들어 조혈 세포를 형질감염시키는 데 사용될 수 있다(예를 들어, Keller 등의 문헌[Gene Therapy 6:931-938, 1999]). 적혈구 전구 세포의 경우, (예를 들어 OptiMEM(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)과 같은 무혈청 배지 중의) 플라스미드 DNA를 (무혈청 배지 중의) 양이온성 리포좀(예를 들어 상업적으로 이용 가능한 형질감염 시약인 Lipofectamine™(Invitrogen, Carlsbad, Calif.))과 혼합하고, 적어도 20분 동안 인큐베이션하여 복합체를 형성한다. DNA/리포좀 복합체를 적혈구 전구 세포에 첨가하고, 5~24시간 동안 인큐베이션하는데, 이 시점 이후로 외인성 단백질(들)의 이식 유전자 발현을 검정할 수 있다. 대안적으로, 상업적으로 이용 가능한 다른 리포좀 형질감염제(예를 들어, In vivo GeneSHUTTLE™, Qbiogene, Carlsbad, Calif.)가 사용될 수 있다.
임의로, 예를 들어 폴리에틸렌이민(PEI)과 같은 양이온성 중합체가 적혈구 전구 세포, 예를 들어 조혈 및 제대혈 유래 CD34+ 세포를 효율적으로 형질감염시키는 데 사용될 수 있다(예를 들어, Shin 등의 문헌[Biochim. Biophys. Acta 1725:377-384, 2005] 참조). 인간 CD34+ 세포를 인간 제대혈로부터 단리하고, 200 ng/ml 줄기 세포 인자 및 20% 열 불활성화 혈청이 보충된 Iscove의 변형된 Dulbecco 배지에서 배양한다. 외인성 단백질(들)을 암호화하는 플라스미드 DNA를 0.8 K 내지 750 K의 다양한 크기를 갖는 분지형 또는 선형 PEI(Sigma Aldrich, Saint Louis, Mo., USA; Fermetas, Hanover, Md., USA)와 함께 인큐베이션한다. PEI는 4.2 mg/mL 증류수에서 모액으로서 제조되고, HCl을 사용하여 pH 5.0까지 약간 산성화된다. 1 μg의 DNA가 3 nmol 인산염을 함유하고 1 μl의 PEI 모액이 10 nmol 아민 질소를 함유한다는 계산에 기초하여, DNA는 다양한 질소/인산염 비율로 실온에서 30분 동안 PEI와 조합될 수 있다. 단리된 CD34+ 세포를 DNA/양이온 복합체와 함께 시딩하고, 280 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 외인성 단백질(들)의 발현이 평가될 때까지 배양 배지에서 4시간 이상 동안 인큐베이션한다.
플라스미드 벡터는 입자 매개 형질감염, 유전자 총(“gene gun” 또는 biolistics), 또는 입자 충돌 기술과 같은 물리적 방법을 사용해 적절한 적혈구 전구 세포 내로 도입될 수 있다(Papapetrou 등의 문헌[Gene Therapy 12:S118-S130, 2005]). 이 경우, 외인성 단백질을 암호화하는 DNA는 금 입자 상에 흡수되어 입자 총에 의해 세포에 투여된다. 이러한 접근법은, 예를 들어 제대혈로부터 유래된 조혈 줄기 세포와 같은 적혈구 전구 세포를 형질감염시키는 데 사용될 수 있다(예를 들어, Verma 등의 문헌[Gene Therapy 5:692-699, 1998] 참조). 이와 같이, 제대혈을 단리하고 인산염 완충 식염수에서 3배로 희석한다. CD34+ 세포는 2차 항체로 코팅된 자기 마이크로비드와 조합된 항-CD34 단클론 항체 및 자기 단리 시스템(예: Miltenyi MiniMac System, Auburn, Calif., USA)을 사용해 정제한다. CD34+ 풍부 세포는 본원에 기술된 바와 같이 배양될 수 있다. 형질감염을 위해, 외인성 단백질(들)을 암호화하는 플라스미드 DNA를 염화칼슘 및 스페리딘으로 처리하여 입자(예를 들어, 금 비드) 상에 침전시킨다. DNA-코팅된 비드를 에탄올로 세척한 후, 예를 들어 Biolistic PDS-1000/He 시스템(Bio-Rad, Hercules, Calif., USA)을 사용해 비드를 배양된 세포 내로 전달할 수 있다. 예를 들어 베타-갈락토시다아제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제, 루시페라아제, 또는 녹색 형광 단백질과 같은 리포터 유전자가 형질감염의 효율을 평가하는 데 사용될 수 있다.
임의로, 전기천공 방법이 플라스미드 벡터를 적혈구 전구 세포 내로 도입하는 데 사용될 수 있다. 전기천공은 세포막에 일시적인 기공을 생성하여, 예를 들어 DNA 및 RNA를 포함하는 다양한 분자를 세포 내로 도입할 수 있게 한다. 이와 같이, CD34+ 세포를 본원에 기술된 것과 같이 단리하고 배양한다. 전기천공 직전에, 세포를 실온에서 250xg로 10분 동안 원심분리하여 단리하고, 예를 들어 1.0% 인간 혈청 알부민(HSA)이 보충된 X-VIVO 10과 같은 전기천공 완충액에 0.2~10x106개의 생존 세포/ml로 재현탁한다. 플라스미드 DNA(1~50 μg)를 500 μL의 세포 현탁액과 함께 적절한 전기천공 큐벳에 첨가한다.
전기천공은, 예를 들어 전압이 200 V 내지 280 V 범위이고 펄스 길이가 25 내지 70 ms 범위인 ECM 600 전기천공기(Genetronics, San Diego, Calif., USA)를 사용하여 수행될 수 있다. 다수의 대안적인 전기천공 기기가 상업적으로 이용 가능하며, 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다(예를 들어, Gene Pulser Xcell™, BioRad, Hercules, Calif.; Cellject Duo, Thermo Science, Milford, Mass.). 대안적으로, 단리된 CD34+ 세포의 효율적인 전기천공은 다음의 파라미터를 사용하여 수행될 수 있다: 4 mm 큐벳, 1600 μΕ, 550 V/cm, 및 1x105개의 세포/mL의 세포 500 μL당 10 μg의 DNA(Oldak 등의 문헌[Acta Biochim. Polonica 49:625-632, 2002]).
전기천공의 한 형태인 핵감염(nucleofection)이 적혈구 전구 세포를 형질감염시키는 데 사용될 수도 있다. 이러한 경우에, DNA(또는 다른 시약)를 핵으로 직접 수송할 수 있는 세포 유형 특이적 용액에서 전기적 파라미터를 사용해 형질감염을 수행하여, 세포기질에서 DNA가 분해될 위험을 감소시킨다. 예를 들어, 인간 CD34 세포 Nucleotfector™ 키트(Amaxa Inc.)를 사용하여 적혈구 전구 세포를 형질감염시킬 수 있다. 이 경우, 인간 CD34 세포 Nucleofector™ 용액 중의 1~5x106개의 세포를 1~5 μg의 DNA와 혼합하고, 제조사에 의해 결정된 것과 같은 미리 프로그래밍된 설정을 사용하여 Nucleofector™ 기기에서 형질감염시킨다.
적혈구 전구 세포는, 게놈에 통합되지 않는 한 포유류 세포에서 자가 복제할 수 없는 종래의 발현 벡터로 비-바이러스적으로 형질감염될 수 있다. 대안적으로, 적혈구 전구 세포는 염색체에 통합되지 않고 자가 복제하는 유전자 단위로서 숙주 핵에서 지속될 수 있는 에피솜 벡터로 형질감염될 수 있다(Papapetrou 등의 문헌[Gene Therapy 12:S118-S130, 2005]). 이들 벡터는, 예를 들어 EBV, 인간 폴리오마바이러스 BK, 소 유두종 바이러스-1(BPV-1), 단순 포진 바이러스-1(HSV), 및 시미안 바이러스 40(SV40)과 같이, 잠복 감염 시 세포에서 정상적으로 염색체 외 복제되는 바이러스로부터 유래된 유전적 요소를 이용한다. 포유류 인공 염색체가 비-바이러스 유전자 전달에 사용될 수도 있다(Vanderbyl 등의 문헌[Exp. Hematol. 33:1470-1476, 2005]).
하나 이상의 외인성 단백질(들)을 암호화하는 외인성 핵산은 당업계에 알려진 표준 분자 생물학 방법, 예를 들어 제한 분해, 중첩-연장 PCR, 및 Gibson 조립에 의해 발현 벡터 내로 조립될 수 있다.
외인성 핵산은 외인성 단백질이 세포 표면 상에서 발현되도록, 내인성 막 단백질 또는 고유 막 단백질을 암호화하는 유전자에 융합된 세포(예를 들어 제핵 적혈구 세포)의 표면에서는 일반적으로 존재하지 않는 외인성 단백질을 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 외인성 단백질을 암호화하는 외인성 유전자는 1형 막 단백질의 리더 서열 다음의 N 말단에서, 2형 막 단백질의 C 말단에서, 또는 GPI-연결 막 단백질의 GPI 부착 부위의 상류에서 클로닝될 수 있다.
표준 클로닝 방법을 사용해 2개의 융합 유전자 사이에 가요성 아미노산 링커를 도입할 수 있다. 예를 들어, 가요성 링커는 폴리-글리신 폴리-세린 링커, 예컨대 전장 항체로부터 단쇄 항체 단편을 생성하는 데 흔히 사용되는 [Gly4Ser]3(서열번호 3)(Antibody Engineering: Methods & Protocols, Lo 2004), 또는 단쇄 Arc 억제인자를 생성하는데 사용되는 것들과 같은 Ala-Gly-Ser-Thr(서열번호 4) 폴리펩티드(Robinson & Sauer, PNAS 1998)이다. 일부 구현예에서, 가요성 링커는 가요성 링커가 없는 등등한 작제물보다 더 많은 가요성 및 입체적 자유도를 갖는 외인성 단백질을 제공한다. 이렇게 추가된 가요성은, 표적(예를 들어, 항체 또는 단백질)에 대한 결합을 필요로 하거나, 활성 부위가 기질(예를 들어, 표적)에 접근 가능해야 하는 단백질의 효소 반응을 필요로 하는 응용예에서 유용하다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은, 적혈구 전구 세포를 핵산과 접촉시키고, 본원에 기술된 것들과 같이 핵산을 세포에 전달하는 데 효과적인 조건 하에서, 전기천공에 의해 핵산을 도입함으로써, 큰 핵산(구체적으로는 mRNA와 같은 RNA)을 적혈구 전구 세포 내로 전달하는 단계를 포함한다. 적합한 전기천공기는 Bio-Rad GENE PULSER 및 GENE PULSER II; Life Technologies NEON; BTX GEMINI 시스템; 및 MAXCYTE 전기천공기를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 이들 방법은 바이러스 전달 또는 바이러스 벡터의 사용을 필요로 하지 않는다. 적합한 핵산은 mRNA와 같은 RNA를 포함한다. 적합한 핵산은 전이 가능한 요소, 안정한 에피솜, 플라스미드 DNA, 또는 선형 DNA를 포함하는 DNA를 또한 포함한다.
K562 적백혈병 세포와 같은 세포주의 전기천공 조건은 예를 들어 Van Tendeloo 등의 문헌[Blood 98(l):49-56, 2001]에 기술되어 있다. 본원에 기술된 방법에 적합한 전기천공 조건은, Life Technologies Neon Transfection System의 경우, 다음을 포함한다: 약 500 내지 약 2000 V, 약 800 내지 약 1800 V, 또는 약 850 내지 약 1700 V 범위의 펄스 전압; 약 5 내지 약 50 msec, 또는 약 10 내지 약 40 msec 범위의 펄스 폭; 및 1 내지 2 펄스, 1 내지 3 펄스, 1 내지 4 펄스, 또는 1 내지 5 펄스 범위의 펄스 수.
적혈구 전구 세포의 전기천공에 특히 적합한 조건은, 예를 들어, 4일 동안 다음을 포함한다: a) 펄스 전압 1300~1400, 펄스 폭: 10~20 msec, 펄스 수: 1~3; b) 펄스 전압 1400, 펄스 폭: 10 msec, 펄스 수: 3; c) 펄스 전압 1400, 펄스 폭: 20 msec, 펄스 수: 1; 및 d) 펄스 전압 1300, 펄스 폭: 10 msec, 펄스 수: 3.
적혈구 전구 세포의 전기천공에 특히 적합한 조건은, 예를 들어, 8~9일 동안 다음을 포함한다: a) 펄스 전압 1400~1600, 펄스 폭: 20, 펄스 수: 1; b) 펄스 전압 1100~1300, 펄스 폭: 30, 펄스 수: 1; c) 펄스 전압 1100~1200, 펄스 폭: 40, 펄스 수: 1; d) 펄스 전압 1100~1400, 펄스 폭: 20, 펄스 수: 2; e) 펄스 전압 950~1150, 펄스 폭: 30, 펄스 수: 2; f) 펄스 전압 1300~1600, 펄스 폭: 10, 펄스 수: 3. 이들 조건은 일반적으로 적어도 약 60% 이상(예를 들어, 적어도 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 약 97% 또는 그 이상)의 형질감염 효율, 및 적어도 약 70% 이상(예를 들어, 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 약 97% 또는 그 이상)의 세포 생존율을 초래한다.
분화 조건 하에서, 배양물 중 적혈구 전구 세포의 전기천공에 특히 적합한 조건은, 예를 들어, 12~13일 동안 다음을 포함한다: a) 펄스 전압: 1500~1700, 펄스 폭: 20, 펄스 수: 1; 및 b) 펄스 전압 1500~1600, 펄스 폭: 10, 펄스 수: 3. 이들 조건은 일반적으로 적어도 약 50% 이상(예를 들어, 적어도 약 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 약 97% 또는 그 이상)의 형질감염 효율, 및 적어도 약 70% 이상(예를 들어, 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 약 97% 또는 그 이상)의 세포 생존율을 초래한다.
Life Technologies Neon 시스템을 참조하여 본원에 개시된 조건은 통상적인 실험만으로 상이한 전기천공기 및/또는 상이한 전기천공 환경에 맞도록 당업자에 의해 쉽게 조정될 수 있고, 본원에 기술된 특정 전기천공기는 개시된 방법에 대해 제한하지 않는다.
일부 구현예에서, 배양된 적혈구 전구 세포를 본원에 기술된 전기천공 조건을 사용하여 처음으로 전기천공한 다음, 원하는 기간 동안 (임의로 분화 조건 하에서) 배양한 다음, 두 번째로 전기천공한다. 일부 구현예에서, 배양된 적혈구 전구 세포를 처음으로 전기천공한 다음, 원하는 기간 동안 (임의로 분화 조건 하에서) 배양한 다음, 2, 3, 4, 5, 또는 6 번째로 전기천공한다. 임의로, 제1 및 제2 전기천공 사이의 배양 기간, 제2 및 제3 전기천공 사이의 배양 기간 등은 달라질 수 있다. 예를 들어, 전기천공 사이의 기간은 원하는 대로 조정될 수 있는데, 예를 들어 이 기간은 30분, 1시간, 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 30시간, 36시간, 48시간, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 또는 21일일 수 있다. 예를 들어, 적혈구 전구 세포는 1 및 2일차, 1 및 3일차, 1 및 4일차, 1 및 5일차, 1 및 6일차, 1 및 7일차, 1 및 8일차, 1 및 9일차, 1 및 10일차, 1 및 11일차, 1 및 12일차, 1 및 13일차, 1 및 14일차, 1 및 15일차, 또는 1 및 16일차에 전기천공될 수 있다. 또 다른 예에서, 세포는 2 및 3일차, 2 및 4일차, 2 및 5일차, 2 및 6일차, 2 및 7일차, 2 및 8일차, 2 및 9일차, 2 및 10일차, 2 및 11일차, 2 및 12일차, 2 및 13일차, 2 및 14일차, 2 및 15일차, 또는 2 및 16일차에 전기천공될 수 있다. 또 다른 예에서, 적혈구 전구 세포는 3 및 4일차, 3 및 5일차, 3 및 6일차, 3 및 7일차, 3 및 8일차, 3 및 9일차, 3 및 10일차, 3 및 11일차, 3 및 12일차, 3 및 13일차, 3 및 14일차, 3 및 15일차, 또는 3 및 16일차에 전기천공될 수 있다. 또 다른 예에서, 세포는 4 및 5일차, 4 및 6일차, 4 및 7일차, 4 및 8일차, 4 및 9일차, 4 및 10일차, 4 및 11일차, 4 및 12일차, 4 및 13일차, 4 및 14일차, 4 및 15일차, 또는 4 및 16일차에 전기천공될 수 있다. 또 다른 예에서, 세포는 5 및 6일차, 5 및 7일차, 5 및 8일차, 5 및 9일차, 5 및 10일차, 5 및 11일차, 5 및 12일차, 5 및 13일차, 5 및 14일차, 5 및 15일차, 또는 5 및 16일차에 전기천공될 수 있다. 또 다른 예에서, 적혈구 전구 세포는 6 및 7일차, 6 및 8일차, 6 및 9일차, 6 및 10일차, 6 및 11일차, 6 및 12일차, 6 및 13일차, 6 및 14일차, 6 및 15일차, 또는 6 및 16일차에 전기천공될 수 있다. 또 다른 예에서, 적혈구 전구 세포는 7 및 8일차, 7 및 9일차, 7 및 10일차, 7 및 11일차, 7 및 12일차, 7 및 13일차, 7 및 14일차, 7 및 15일차, 또는 7 및 16일차에 전기천공될 수 있다. 또 다른 예에서, 적혈구 전구 세포는 8 및 9일차, 8 및 10일차, 8 및 11일차, 8 및 12일차, 8 및 13일차, 8 및 14일차, 8 및 15일차, 또는 8 및 16일차에 전기천공될 수 있다. 또 다른 예에서, 적혈구 전구 세포는 9 및 10일차, 9 및 11일차, 9 및 12일차, 9 및 13일차, 9 및 14일차, 9 및 15일차, 또는 9 및 16일차에 전기천공될 수 있다. 또 다른 예에서, 적혈구 전구 세포는 10 및 11일차, 10 및 12일차, 10 및 13일차, 10 및 14일차, 10 및 15일차, 또는 10 및 16일차에 전기천공될 수 있다. 또 다른 예에서, 적혈구 전구 세포는 11 및 12일차, 11 및 13일차, 11 및 14일차, 11 및 15일차, 또는 11 및 16일차에 전기천공될 수 있다. 또 다른 예에서, 적혈구 전구 세포는 12 및 13일차, 12 및 14일차, 12 및 15일차, 또는 12 및 16일차에 전기천공될 수 있다. 또 다른 예에서, 적혈구 전구 세포는 13 및 14일차, 13 및 15일차, 또는 13 및 16일차에 전기천공될 수 있다. 또 다른 예에서, 적혈구 전구 세포는 14 및 15일차, 또는 14 및 16일차에 전기천공될 수 있다. 임의로, 적혈구 전구 세포는 2회보다 많이, 예를 들어, 3회, 4회, 5회, 또는 6회 전기천공될 수 있고, 간격은 세포 분화 과정의 임의의 시점에 원하는 대로 선택할 수 있다.
일부 구현예에서, 배양된 적혈구 전구 세포는 분화의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16일차에 본원에 기술된 전기천공 조건을 사용하여 전기천공된다.
일부 구현예에서, 조작된 제핵 적혈구 세포는 클릭-접합된 조작된 제핵 적혈구 세포일 수 있다. 촉매 결합-형성 폴리펩티드 도메인은, 예를 들어 세포기질 내에 존재하거나 막 상에 존재하는 적혈구 전구 세포 상에서 또는 내에서 발현될 수 있다. 화농연쇄구균(Streptococcus pyogenes)으로부터 단리된 단백질인 Spy0128로부터 유래된 것들을 포함하여, 트랜스펩티다아제, 소르타아제, 및 이소펩티다아제를 포함하는 많은 촉매 결합 형성 폴리펩티드가 존재한다. Spy0128의 자가촉매 이소펩티드 결합-형성 서브유닛(CnaB2 도메인)을 분할하면 촉매 활성을 보유하면서 서로에 대한 특이성을 갖는 2개의 구별되는 폴리펩티드가 생성된다는 것이 입증되었다. 이러한 시스템에서의 폴리펩티드는 SpyTag 및 SpyCatcher로 지칭된다. 혼합 시, SpyTag와 SpyCatcher는 SpyTag 상의 Aspl17과 SpyCatcher 상의 Lys31 간의 이소펩티드 결합 형성을 거친다(Zakeri 및 Howardth의 문헌[JACS 132:4526, 2010]). 반응은 세포 환경과 양립할 수 있고 단백질/펩티드 접합에 매우 특이적이다(Zakeri 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109:E690-E697, 2012]). SpyTag 및 SpyCatcher는 엘라스틴-유사 단백질에서 번역 후 토폴로지 변형을 유도하는 것으로 나타났다. 예를 들어, N-말단에 SpyTag를 배치하고 C-말단에 SpyCatcher를 배치하면 원형 엘라스틴-유사 단백질의 형성이 유도된다(Zhang 등의 문헌[J. Am. Chem. Soc. 2013]).
SpyTag 및 SpyCatcher 성분들은, 분자 A가 SpyTag에 융합되고 분자 B가 SpyCatcher에 융합되는 시스템이 분자 A가 SpyCatcher에 융합되고 분자 B가 SpyTag에 융합되는 시스템과 기능적으로 동등하도록 상호 교환될 수 있다. 본 개시의 목적을 위해, SpyTag 및 SpyCatcher가 사용될 때, 상보적 분자가 대신에 치환될 수 있는 것으로 이해해야 한다.
SpyTag/SpyCatcher 시스템과 같은 촉매 결합-형성 폴리펩티드는 외인성 단백질을 예를 들어 적혈구 전구 세포 또는 제핵 적혈구 세포의 표면에 부착하는 데 사용될 수 있다. SpyTag 폴리펩티드 서열은 적혈구 전구 세포 또는 제핵 적혈구 세포의 세포외 표면에서 발현될 수 있다. SpyTag 폴리펩티드는 예를 들어, 1형 또는 3형 막관통 단백질(예를 들어 글리코포린 A)의 N 말단에 융합되거나; 2형 막관통 단백질(예: Kell)의 C 말단에 융합되거나; 다중 통과 막관통 단백질(예: Band 3)의 세포외 말단에서 또는 세포외 루프에서 프레임 내 삽입되거나; GPI 수용자 폴리펩티드(예: CD55 또는 CD59)에 융합되거나; 지질-사슬-앵커된 폴리펩티드에 융합되거나; 말초 막 단백질에 융합될 수 있다. 외인성 단백질은 SpyCatcher에 융합될 수 있다. SpyCatcher 융합을 암호화하는 핵산은 SpyTag 융합을 발현하는 동일한 적혈구 전구 세포 또는 제핵 적혈구 세포로부터 발현되고 분비될 수 있다. 대안적으로, SpyCatcher 융합을 암호화하는 핵산 서열은, 예를 들어 박테리아, 진균, 곤충, 포유류, 또는 세포가 없는 생산 시스템에서 외인적으로 생산될 수 있다. SpyTag 및 SpyCatcher 폴리펩티드의 반응 시, 외인성 단백질을 적혈구 전구 세포 또는 제핵 적혈구 세포의 표면에 부착시키는 공유 결합이 형성되게 된다.
일 구현예에서, SpyTag 폴리펩티드는 적혈구에서 Gatal 프로모터의 조절 하에 글리코포린 A의 N 말단에 대한 융합으로서 발현될 수 있다. SpyCatcher 폴리펩티드 서열에 융합된 외인성 단백질은 동일한 적혈구 세포에서 Gatal 프로모터의 조절 하에 발현될 수 있다. 두 융합 폴리펩티드의 발현 시, SpyTag와 SpyCatcher 폴리펩티드 사이에 이소펩티드 결합이 형성되어, 적혈구 세포 표면과 외인성 단백질 사이에 공유 결합이 형성된다.
또 다른 구현예에서, SpyTag 폴리펩티드는 적혈구 전구 세포 또는 제핵 적혈구 세포에서 Gatal 프로모터의 조절 하에 글리코포린 A의 N 말단에 대한 융합으로서 발현될 수 있다. SpyCatcher 폴리펩티드 서열에 융합된 외인성 단백질은 적절한 포유류 세포 발현 시스템, 예를 들어 HEK293 세포에서 발현될 수 있다. 적혈구 전구 세포 또는 제핵 적혈구 세포 상에서 SpyTag 융합 폴리펩티드의 발현 시, SpyCatcher 융합 폴리펩티드는 세포와 접촉할 수 있다. 적절한 반응 조건 하에서, SpyTag와 SpyCatcher 폴리펩티드 사이에 이소펩티드 결합이 형성되어, 적혈구 전구 세포 표면 또는 제핵 적혈구 세포 표면과 외인성 단백질 사이에 공유 결합이 형성되게 된다.
SpyTag/SpyCatcher 시스템과 같은 촉매 결합-형성 폴리펩티드는 외인성 단백질을 적혈구 전구 세포 또는 제핵 적혈구 세포의 세포 내 공간에 앵커링하는 데 사용될 수 있다. SpyTag 폴리펩티드 서열은, 이식유전자의 직접 발현; 헤모글로빈과 같은 내인성 세포내 단백질에 대한 융합; Band 3, 글리코포린 A, Kell과 같은 내인성 세포 표면 단백질의 세포내 도메인에 대한 융합; 또는 세포골격의 구조 성분에 대한 융합을 포함하는 다수의 방법에 의해 적혈구 전구 세포 또는 제핵 적혈구 세포의 세포내 공간에서 발현될 수 있다. SpyTag 서열은 폴리펩티드 말단에 한정되지 않으며, 폴리펩티드 번역 및 국소화가 교란되지 않도록 내인성 폴리펩티드의 내부 서열 내에 통합될 수 있다. 외인성 단백질은 SpyCatcher에 융합될 수 있다. SpyCatcher 융합을 암호화하는 핵산 서열은 SpyTag 융합을 발현하는 동일한 적혈구 전구 세포 또는 제핵 적혈구 세포 내에서 발현될 수 있다. SpyTag 및 SpyCatcher 폴리펩티드의 반응 시, 외인성 단백질을 적혈구 전구 세포 또는 제핵 적혈구 세포의 세포내 공간에 앵커링하도록 작용하는 공유 결합이 형성되게 된다.
일 구현예에서, 적혈구 전구 세포 또는 제핵 적혈구 세포는 헤모글로빈 베타에 세포 내에서 융합된 SpyTag를 포함한다. 적혈구 전구 세포는, 번역 시 세포내 베타 글로빈이 C 말단에 있는 SpyTag에 융합되도록, 헤모글로빈 프로모터, 베타 글로빈 유전자, 및 SpyTag 서열을 포함하는 유전자 서열로 유전적으로 변형될 수 있다. 또한, 적혈구 전구 세포 또는 제핵 적혈구 세포는 외인성 폴리펩티드의 발현을 유도하는 SpyCatcher를 코딩하는 Gatal 프로모터-리딩 유전자를 발현하여, 번역 시 외인성 폴리펩티드가 그의 N 말단에서 SpyCatcher에 융합되게 한다. 두 융합 단백질 모두의 발현 시, SpyTag가 결합된 베타 글로빈은 세포내 공간에서 SpyCatcher가 결합된 외인성 폴리펩티드에 이소펩티드 결합을 통해 연결되어, 외인성 폴리펩티드를 베타 글로빈에 앵커링하고 성숙 동안 유지시킨다.
또 다른 구현예에서, SpyTag 폴리펩티드는 적혈구 전구 세포 또는 제핵 적혈구 세포 내의 외인성 단백질에 대한 융합체로서 발현될 수 있다. SpyCatcher 폴리펩티드는 동일한 적혈구 전구 세포 또는 제핵 적혈구 세포 내에서 글리코포린 A의 C 말단(세포내)에 대한 융합체로서 발현될 수 있다. 두 융합 폴리펩티드의 발현 시, SpyTag와 SpyCatcher 폴리펩티드 사이에 이소펩티드 결합이 형성되어, 막-앵커링된 내인성 적혈구 폴리펩티드와 외인성 단백질 사이에 공유 결합이 형성된다.
다른 분자 융합체가 폴리펩티드들 사이에 형성되어 직접 또는 간접 접합을 포함할 수 있다. 폴리펩티드들은 서로 직접 접합되거나 링커를 통해 간접적으로 접합될 수 있다. 링커는 펩티드, 중합체, 앱타머, 또는 핵산일 수 있다. 중합체는, 예를 들어 천연, 합성, 선형, 또는 분지형일 수 있다. 외인성 단백질은, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 이종 융합 단백질을 포함할 수 있고, 상기 융합 단백질은 서로 직접 연결되거나 개재 링커 서열 및/또는 일 단부 또는 양 단부에 있는 추가 서열에 의해 연결되는 폴리펩티드를 포함한다. 링커에 대한 접합은 공유 결합 또는 이온 결합을 통한 것일 수 있다.
일부 구현예에서, 조작된 제핵 적혈구 세포는 저장성으로 로딩된 인간 제핵 적혈구 세포이다. 저장성 로딩/용해를 위해, 적혈구 전구 세포 또는 제핵 적혈구를 낮은 이온 강도의 완충액에 노출시켜, 이들을 파열을 유발한다. 외인성 단백질은 세포 내에 분포한다. 적출된 적혈구 세포 또는 적혈구 전구 세포는, 단리된 제핵 적혈구 세포의 펠릿에 5 mM 인산염 완충액(pH 8)의 30~50배 과량의 부피를 첨가함으로써 저장성으로 용해될 수 있다. 생성된 용해된 세포막을 원심분리에 의해 단리한다. 용해된 세포막의 펠릿을 재현탁하고, 외인성 단백질의 존재 하에 낮은 이온 강도의 완충액 중에서, 예를 들어 30분 동안인큐베이션한다. 대안적으로, 용해된 세포막을, 제핵 적혈구 세포 또는 적혈구 전구 세포를 효율적으로 로딩하는 것으로 확인된 최상의 조건에 따라, 짧게는 1분 동안 또는 길게는 수일 동안 외인성 단백질과 함께 인큐베이션할 수 있다. 하나 이상의 외인성 단백질(들)(예를 들어 본원에 기술된 또는 당업계에 공지된 예시적인 외인성 단백질 중 어느 하나)을 암호화하는 핵산의 저장성 로딩을 위해, 핵산을 저장성 트리스-HCl 용액(PH 7.0)에 현탁하고 적혈구 전구 세포 내로 주입할 수 있다. 트리스-HCl의 농도는, 제핵 적혈구를 효율적으로 로딩하는 것으로 확인된 최상의 조건에 따라, 약 20 mmol/l 내지 약 150 mmol/l일 수 있다.
대안적으로, 저장성 용액에 대한 조절된 투석을 사용해 적혈구 전구 세포 또는 제핵 적혈구 세포에 외인성 단백질을 로딩하여 세포를 팽윤시키고 세포막에 기공을 생성할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,327,710호; 제5,753,221호; 제6,495,351호; 및 제10,046,009호 참조). 예를 들어, 세포 펠릿을 10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 5 mM 포도당(pH 7.4)에 재현탁하고, 10 mM NaH2P04, 10 mM NaHCO3, 20 mM 포도당, 및 4 mM MgCl2(pH 7.4)를 함유하는 저이온 강도의 완충액에 대해 투석한다. 30~60분 후, 외인성 단백질을 함유하는 16 mM NaH2P04(pH 7.4) 용액에 대해 추가로 30~60분 동안 세포를 투석한다. 이들 절차 모두는 4℃의 온도에서 유리하게 수행될 수 있다. 일부 경우에, 투석 접근법에 의해 다량의 적혈구 전구 세포 또는 제핵 적혈구 세포를 로딩하는 것이 유익할 수 있고, 이러한 목적으로 설계된 특정 장치가 사용될 수 있다(예를 들어 미국 특허 제4,327,710호, 제6,139,836호, 및 제6,495,351호 참조).
제핵 적혈구 세포의 단리 및 제형화
일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 단계 (d)에서의 제3 세포 배양물로부터 조작된 제핵 적혈구의 집단을 단리하는 단계 (e)를 추가로 포함할 수 있다. 조작된 제핵 적혈구 세포는 원심분리(예를 들어, 밀도-구배 원심분리), FACS, 및 MACS와 같은 그러나 이들로 한정되지 않는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 단리될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 단계 (e)에서 단리된 조작된 제핵 적혈구 세포의 집단을 제형화하는 단계 (f)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 제핵 적혈구 세포의 집단을 제형화하는 단계는 조작된 제핵 적혈구 세포의 단리된 집단을 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 완충액 또는 부형제(예: 인산염 완충 식염수)와 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 조작된 제핵 적혈구 세포의 집단은 세포의 보관, 수송, 및/또는 대상체에 대한 투여에 적합한 조성물(예: 약학적 조성물)로 제형화된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 단계 (f)에서의 조작된 제핵 적혈구 세포의 제형화된 집단을 이를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 조작된 제핵 적혈구 세포에 존재하는 하나 이상의 외인성 단백질을 필요로 하는 것으로 이전에 식별되었거나 진단된 대상체, 또는 수혈 및/또는 적혈구의 증가를 필요로 하는 것으로 식별된 대상체)에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 이들 방법의 일부 구현예에서, 대상체는 투여된 제핵 적혈구 세포 내에 존재하는 외인성 단백질 중 하나 이상을 필요로 하는 것으로 이전에 식별되었거나 진단된 적이 있다. 이들 방법의 일부 구현예에서, 조작된 제핵 적혈구 세포의 제형화된 집단은 정맥 내 투여를 통해 대상체에게 투여된다.
조성물
또한, 본원에 기술된 방법 중 어느 하나에 의해 생산된 제핵 적혈구 세포의 집단이 본원에 제공된다. 또한, 본원에 기술된 방법 중 어느 하나에 의해 생산된 제핵 적혈구 세포의 집단 중 어느 하나를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 또한, 본원에 기술된 방법 중 어느 하나에 의해 생산된 제형(예: 약학적 조성물)이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 제형은 대상체(예를 들어, 본원에 기술된 대상체 중 어느 하나)에게 정맥 내 투여하기에 적합하다. 본원에 기술된 조성물 또는 제형 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 조성물 또는 제형은 본원에 기술된 제핵 적혈구 세포 중 어느 하나의 투여 형태이다.
키트
또한, 본원에 기술된 제핵 적혈구 세포의 조성물, 제형, 또는 집단 중 어느 하나를 포함하는 키트가 본원에 제공된다. 또한, 본원에 기술된 제혁 적혈구 세포의 조성물, 제형, 또는 집단 중 어느 하나가 담기는 하나 이상의 멸균 용기(예를 들어, 멸균 원뿔형 튜브, 멸균 페트리 접시, 멸균 바이알(예를 들어 붕규산염 유리 바이알), 및 멸균 비닐 백(디-2-에틸헥실 프탈레이트(DEHP)-연질 폴리염화비닐(PVC) 백, 또는 n-부티릴-트리(n-헥실)-시트레이트(BTHC)-연질 PVC 백)를 포함하는 키트가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 키트 중 어느 하나는 본원에 기술된 제핵 적혈구 세포의 조성물, 제형, 또는 집단 중 어느 하나를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위한 지침을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기술된 키트의 일부 구현예는 본원에 기술된 제혁 적혈구 세포의 조성물, 제형, 및 집단 중 어느 하나의 적절한 단일 투여 형태를 포함한다. 예를 들어, 본원에 기술된 조성물 또는 제형 중 어느 하나의 단일 투여 형태는 다음의 부피를 가질 수 있다: 약 0.5 mL 내지 약 2 L, 약 0.5 mL 내지 약 1800 mL, 약 0.5 mL 내지 약 1500 mL, 약 0.5 mL 내지 약 1200 mL, 약 0.5 mL 내지 약 1000 mL, 약 0.5 mL 내지 약 800 mL, 약 0.5 mL 내지 약 600 mL, 약 0.5 mL 내지 약 500 mL, 약 0.5 mL 내지 약 450 mL, 약 0.5 mL 내지 약 400 mL, 약 0.5 mL 내지 약 350 mL, 약 0.5 mL 내지 약 300 mL, 약 0.5 mL 내지 약 250 mL, 약 0.5 mL 내지 약 200 mL, 약 0.5 mL 내지 약 180 mL, 약 0.5 mL 내지 약 160 mL, 약 0.5 mL 내지 약 140 mL, 약 0.5 mL 내지 약 120 mL, 약 0.5 mL 내지 약 100 mL, 약 0.5 mL 내지 약 80 mL, 약 0.5 mL 내지 약 60 mL, 약 0.5 mL 내지 약 40 mL, 약 0.5 mL 내지 약 20 mL, 약 0.5 mL 내지 약 10 mL, 약 0.5 mL 내지 약 5 mL, 약 0.5 mL 내지 약 1.0 mL, 약 1.0 mL 내지 약 2 L, 약 1.0 mL 내지 약 1800 mL, 약 1.0 mL 내지 약 1500 mL, 약 1.0 mL 내지 약 1200 mL, 약 1.0 mL 내지 약 1000 mL, 약 1.0 mL 내지 약 800 mL, 약 1.0 mL 내지 약 600 mL, 약 1.0 mL 내지 약 500 mL, 약 1.0 mL 내지 약 450 mL, 약 1.0 mL 내지 약 400 mL, 약 1.0 mL 내지 약 350 mL, 약 1.0 mL 내지 약 300 mL, 약 1.0 mL 내지 약 250 mL, 약 1.0 mL 내지 약 200 mL, 약 1.0 mL 내지 약 180 mL, 약 1.0 mL 내지 약 160 mL, 약 1.0 mL 내지 약 140 mL, 약 1.0 mL 내지 약 120 mL, 약 1.0 mL 내지 약 100 mL, 약 1.0 mL 내지 약 80 mL, 약 1.0 mL 내지 약 60 mL, 약 1.0 mL 내지 약 40 mL, 약 1.0 mL 내지 약 20 mL, 약 1.0 mL 내지 약 10 mL, 약 1.0 mL 내지 약 5 mL, 약 5 mL 내지 약 2 L, 약 5 mL 내지 약 1800 mL, 약 5 mL 내지 약 1500 mL, 약 5 mL 내지 약 1200 mL, 약 5 mL 내지 약 1000 mL, 약 5 mL 내지 약 800 mL, 약 5 mL 내지 약 600 mL, 약 5 mL 내지 약 1800 mL, 약 5 mL 내지 약 500 mL, 약 5 mL 내지 약 450 mL, 약 5 mL 내지 약 400 mL, 약 5 mL 내지 약 350 mL, 약 5 mL 내지 약 300 mL, 약 5 mL 내지 약 250 mL, 약 5 mL 내지 약 200 mL, 약 5 mL 내지 약 180 mL, 약 5 mL 내지 약 160 mL, 약 5 mL 내지 약 140 mL, 약 5 mL 내지 약 120 mL, 약 5 mL 내지 약 100 mL, 약 5 mL 내지 약 80 mL, 약 5 mL 내지 약 60 mL, 약 5 mL 내지 약 40 mL, 약 5 mL 내지 약 20 mL, 약 5 mL 내지 약 10 mL, 약 10 mL 내지 약 2 L, 약 10 mL 내지 약 1800 mL, 약 10 mL 내지 약 1500 mL, 약 10 mL 내지 약 1200 mL, 약 10 mL 내지 약 1000 mL, 약 10 mL 내지 약 800 mL, 약 10 mL 내지 약 600 mL, 약 10 mL 내지 약 500 mL, 약 10 mL 내지 약 450 mL, 약 10 mL 내지 약 400 mL, 약 10 mL 내지 약 350 mL, 약 10 mL 내지 약 300 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대상체를 치료하는 방법
또한, 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 본원에 기술된 제핵 적혈구 세포의 조성물, 제형, 또는 집단 중 어느 하나의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 투여는 정맥내 투여에 의해 수행된다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나의 일부 구현예는 하나 이상의 추가 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 치료제는 본원에 제공된 조성물 중 어느 하나와 실질적으로 동일한 시간에 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 치료제는 본원에 제공된 조성물 중 어느 하나를 대상체에게 투여하기 전 또는 후에 대상체에게 투여될 수 있다.
실시예
본 발명은 청구범위에 기술된 본 발명의 범주를 제한하지 않는 하기 실시예에서 추가로 기술된다.
실시예 1: 하이포타우린 단독 또는 미오-이노시톨과의 조합이 적혈구 성장 및 제핵에 미치는 효과
하이포타우린 단독 또는 미오-이노시톨과의 조합이 적혈구 전구 세포 배양물에 미치는 효과를 조사하였다. 인간 CD34+ 조혈 줄기 세포(HSC)를 3단계 방법으로 배양하여 제핵 적혈구 세포를 생성하였다. 1 단계에서, IMDM을 함유하고 재조합 인간 인슐린, 재조합 인간 트랜스페린, 재조합 인간 SCF, 재조합 IL-3, 재조합 Flt-3 리간드, 및 재조합 인간 IL-3으로 보충된 제1 세포 배양 배지가 담긴 T 플라스크에서 CD34+ HSC를 증식시켰다. 이어서, 페닐알라닌 암모니아 리아제를 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 세포를 형질도입하였다. 형질도입 후, IMDM을 함유하고 재조합 인간 에리트로포이에틴, 재조합 인간 SCF, 재조합 인간 IL3, 재조합 인간 인슐린, 덱사메타손, 및 재조합 인간 트랜스페린이 보충된 제2 배양 배지가 담긴 50 L 바이오리액터 배양 용기에서 세포를 배양하였다. 방법의 3 단계(성숙 단계)의 경우, IMDM을 함유하고 재조합 인간 EPO, 재조합 인간 SCF, 재조합 인간 인슐린, 재조합 트랜스페린, 인간 AB 혈청, 및 인간 혈장이 보충된 제3 배양 배지가 담긴 24 웰 플레이트 내에 세포의 분취물을 시딩하였다.
제3 배양 배지를 (a) 1.0 g/L의 하이포타우린 또는 (b) 1.0 g/L의 하이포타우린 및 1.0 g/L의 미오-이노시톨로 보충하거나, (c) 대조군으로서, 하이포타우린 또는 미오-이노시톨로 보충하지 않았다. 참고로, 제1, 제2 및 제3 배양 배지는 0.0072 g/L의 미오-이노시톨을 포함하는 염기 배지(즉, IMDM)를 포함하였다. 3 단계 동안 형광 활성화 세포 분류 기반 세포 계수기를 사용하여 주기적으로 샘플링 및 세포 계수를 수행하였다.
도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이, 하이포타우린 단독이 제3 세포 배양 배지에 첨가되었을 때, 대조군 배양 조건과 비교해, 적혈구 세포의 총 세포 밀도(도 1)뿐만 아니라 제핵 적혈구 세포 밀도(도 2) 모두를 상당히 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 유사하게, 하이포타우린의 산화 산물인 타우린으로 제3 배양 배지를 보충했을 때에도, 대조군 배양 조건과 비교해, 적혈구 세포의 총 세포 밀도 및 제핵 적혈구 세포 밀도 모두가 상당히 증가하였다(데이터 미도시). 또한, 하이포타우린과 미오-이노시톨 둘 다를 제3 세포 배양 배지에 보충했을 때, 대조군 배양 조건과 비교해, 적혈구 세포의 총 세포 밀도(도 1)뿐만 아니라 제핵 적혈구 세포 밀도(도 2) 모두가 더 상당히 증가하였다. 이들 데이터는, 하이포타우린 단독, 및 미오-이노시톨과 조합된 하이포타우린이 성숙기 적혈구 세포가 성장하고 분열하는 능력을 개선시켰고, 제핵 적혈구 세포의 수율을 개선시켰음을 보여준다.
다른 구현예
본 발명은 본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용과 함께 설명되었지만, 전술한 설명은 예시하기 위한 것이고, 첨부된 청구범위의 범주에 의해 정의되는 본 발명의 범주를 제한하도록 의도되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 다른 양태, 장점, 및 변형은 다음의 청구범위의 범주에 포함된다.
<110> MABWELL (SHANGHAI) BIOSCIENCE CO., LTD. <120> ANTI-HUMAN CLAUDIN 18.2 ANTIBODY AND APPLICATION THEREOF <130> LC20210007P-KR <150> CN201910929614.0 <151> 2019-09-29 <160> 133 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region <400> 1 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Val Val Ile Trp Ser Asp Gly Arg Ile Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Arg Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ile Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg His Pro Ala Phe Gly Pro His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Ile Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region <400> 2 Asp Ile Val Met Thr Gln Asp Ala Pro Ser 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aaaatgaaca gtctccaaat tgatgacaca gccatttatt attgtgtcag acatcccgcc 300 ttcggtcccc atgctatgga ctactggggt caaggaatct cagtcaccgt ctcctca 357 <210> 95 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region <400> 95 gatattgtga tgactcagga tgcaccctct atacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 60 atctcctgca ggtctagtaa gagtctcctg aatagtaatg gcaacactta cttatattgg 120 ttcttgcaga ggccaggcca gtctcctcac ctcctgcttt atcggatgtc caaccctgcc 180 tcaggagccc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggga ctgaattcac actgagaatc 240 agtagagtgg aggctgaaga tgtgggtgtt tattactgta tgcaatatct ggaatatccg 300 cccacgttcg gtgctgggac caggctggag ctgaaa 336 <210> 96 <211> 352 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region <400> 96 gaagtgatgc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaggc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag gctctggaat cactctcagt acctatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccagagagga ggctggagtg ggtcgcatcc attattagtg gtggtatcac ctattattta 180 gacagtgtga agggccgctt caccatctcc agagataatg ccaggaacat cctgtacctg 240 caaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccatttatt actgtgcaag aaaataccac 300 gggaatgctt tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcttt ag 352 <210> 97 <211> 340 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region <400> 97 gacattgtga tgacacagtc tccatcgtcc ctgcctgtga cagcaggaga gacggtcact 60 atgcgctgca agtccagtca gagtctttta aacagtggaa atcaaaggaa ctacttgacc 120 tggtaccagc ggaaaccagg acagcctcct aagaaactga tctactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240 atcagtggtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaataa ttatttttat 300 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaac 340 <210> 98 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region <400> 98 cagatccaga tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaggatc 60 tcctgcaagg cttctgggta ttccttcaca actgctggaa tgcagtgggt gcgaaagatg 120 cctggagagg gtttgaagtg gattggctgg ataatcgccc actctggaga gccaaaatat 180 acagaagact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactacatat 240 ttacagataa gtaacctcaa aaatgaggac acggctacgt atttctgtgc gagatgggga 300 aagggaaata ctatggacta ttggggtcaa ggaacctcag tcatcgtctc ctca 354 <210> 99 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region <400> 99 gacattgtga tgacacagtc gccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacggtggaa atcagaggaa ctacttgacc 120 tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aaacttttga tctactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacacattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatgc ttattttttt 300 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagcta gagctgaaa 339 <210> 100 <211> 358 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region <400> 100 gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc ccggaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctttggaa tgcactgggt tcgtcaggct 120 ccagagaagg ggctggagtg ggtcgcatac attagtagtg gcagtagtac catctactat 180 ccagacacag tgaagggccg attcaccgtc tccagagaca atcccaagaa caccctgttc 240 ctgcaaatga ccagtctaag gtctgaggac acggccatgt attactgtgt aagattgggt 300 ccacggggga atgttatgga ccattggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctcag 358 <210> 101 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region <400> 101 gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaggaa ctacttgacc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatgt ttatttttat 300 ccactcacgt tcggtactgg gaccaagctg gagctgaga 339 <210> 102 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region <400> 102 gatgtgcagc ttcaggagtc aggacctgac ctggtaaaac cctctcagtc actttcactc 60 acctgcactg tcagtggcta ctccatcagc ggtgcttata actggcactg gatccggcag 120 tttccaggaa acaaactgga gtggctggcc tacatgcagt acagtggtag ctctaactac 180 aacccatctt tcaaaagtcg aatctctatc agtcgagaca cgtccaagaa ccaattcttc 240 ctgcagttga aatctgtgac tactgaagac acagccacat attactgtgc aagaatgtat 300 aacggaaact cgtttcttta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354 <210> 103 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region <400> 103 gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggcga gaaggtcact 60 atgaactgca agtccagtca gagtctgttt aacagtggaa atcaaaagaa ctatttgacc 120 tggtatcagc aaaaaccagg gcagcctcct agattgttga tctattgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctgtca ctttattact gtcagaattc ttatagttat 300 cctctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagttgaaa 339 <210> 104 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region <400> 104 caggtgcagc tgaaggagtc aggacctgac ctggtggcgc cctcacagag cctgtccctc 60 acatgctccg tctcagggtt ctccttaacc agctatggta ttcactgggt tcgccagcct 120 ccaggaaagg gtctggagtg gctggtggtg atatggagtg atggaagaac aacctataat 180 tcaggtctca aatccagact gagcatcagc aaggacaact ccaagagcca agttctctta 240 aaaatgaaca gtctccgaac tgatgacaca gccatttact actgtgtcag acatcccgcc 300 ttcggtcccc atgctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357 <210> 105 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region <400> 105 gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 60 atctcctgca ggtctagtaa gagtctcctg aatagtaatg gcaacactta cttgtattgg 120 ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag ctcctgatat atcggatgtc caaccttgcc 180 tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa ctgatttcac actgagaatc 240 agtagagtgg aggctgggga tgtgggtgtt tattactgta tgcaatatct agaatatccg 300 gtcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaa 336 <210> 106 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region <400> 106 gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc ccggaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt cgctttggaa tgcactgggt tcgtcaggct 120 ccaaaaaagg gactggagtg ggtcgcatac attagtagtg gcagtaatac catctactat 180 gcagacacag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atcccaagaa caccctgttc 240 ctgcaaacga ccagtctaag gtctgaggac acggccatat attactgtgg aagattgggc 300 ttctatggta actcgtttga tcactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357 <210> 107 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region <400> 107 aacattttga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcgggaga gaaggtcact 60 atgaactgca agtccagtca gagtctgtta aacggtggaa atcaaaggaa ctacttgacc 120 tggtaccagc agaaagcagg gcagcctccc aaactgttga tctactgggc atccactagg 180 gagtctgggg tccctgatcg cttcacaggc ggtggatctg gaacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca ctttattact gtcagaattc ttattattat 300 ccgctcacgt tcggtgctgg taccaagctg gagctgaaa 339 <210> 108 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region <400> 108 gaggtccagc tgcggcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggata cacattcact acctatatta taaactgggt gaagcagaag 120 cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acaatgatga tacaaggtac 180 aatgagaggg tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cactgcctac 240 atggagctca gcagcctgac ctctgaagac tctgcggtct attactgtgc aagattttac 300 tttggtaact cgtttactta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354 <210> 109 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region <400> 109 gacattgtga tgacacagtc tccgtcctcc ctgcctgtga cagtaggaga gagggtcact 60 atgacctgca agtccagtca gggtctgttt aacagtggaa atcaaaggaa ctacttgacc 120 tggtaccaac agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca atttattact gtcagaataa ttatatttat 300 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagttg gagctgaaa 339 <210> 110 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region <400> 110 gaggtccagc tgcggcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggata cacattcact acctatatta taaactgggt gaagcagaag 120 cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acaatgatgg tactaggtac 180 aatgagaggg tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag tacagcctac 240 atggagctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct actactgtgc aagatttcac 300 tttggtaatt cgtttactta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354 <210> 111 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region <400> 111 gacattgtga tgacacagtc tccgtcctcc ctgcctgtga caacaggaga gaaggtcact 60 atgacttgca agtccagtca gggtctgttt aacaatggaa atcaaaggaa ctacttgacc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcataggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca atttattact gtcagaataa ttatattttt 300 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagttg gagctgaaa 339 <210> 112 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region <400> 112 cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60 tcctgcaagg cttctggata taccctcaca aactatggaa tgaattgggt gaggcaggct 120 ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaggccca acactggaga gccaacatat 180 gctgaagact tcaagggacg atttgtcttc tctttggaaa cctctgccgc cactgcctat 240 ttacagatca ccaacctcaa aagtgaggac acgtctacat atttctgtgc aagactgtac 300 aggggaaata ctttggacaa ctggggtcaa ggaacctcag tcatcgtctc ctca 354 <210> 113 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region <400> 113 gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga caacagggga gaaggtcact 60 atgagctgca agtccagtca gaatctgtta aacagtggaa atcaaaggaa ctacttgacc 120 tggtaccagc agaagccagg acagtctcct aaactattga tctactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tcccttatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tacagactga tgacctggct atttattact gtcagaatgg ttatagtttt 300 ccattcacgt tcggctcggg gacaaagttg gaaataaaa 339 <210> 114 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region <400> 114 caggttcacc tgcagcagtc tggggctgaa ctggtgaggc 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25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Lys Tyr Ser Gly Lys Phe 50 55 60 Asn Ser Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Tyr Tyr Gly Asn Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115

Claims (50)

  1. 제핵 적혈구 세포의 집단을 생성하는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 적혈구 전구 세포의 제1 세포 배양물의 일정 부피를 용기에 담긴 제2 배양 배지 내에 배치하여 제2 세포 배양물을 수득하는 단계;
    (b) 제2 세포 배양물을 약 2일 내지 약 15일 동안 배양하는 단계;
    (c) 단계 (b)의 제2 세포 배양물의 부피를 용기 내에 포함된 제3 배양 배지에 배치하여 제3 세포 배양물을 수득하는 단계로서, 제3 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 37.5 g/L의 타우린 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 37.5 g/L의 하이포타우린을 포함하는, 단계;
    (d) 단계 (c)의 제3 세포 배양물을 약 5일 내지 약 20일 동안 배양하는 단계를 포함하되,
    단계 (d) 이후, 제3 배양 배지는 제핵 적혈구 세포의 집단을 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (a)에서의 용기는 관류 바이오리액터이고, 단계 (b)에서의 배양은 관류 배양이고, 단계 (c)에서의 용기는 관류 바이오리액터이고, 단계 (d)에서의 배양은 관류 배양인, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 방법은 단계 (a) 전에,
    (i) 용기 내에 포함된 제1 배양 배지에 복수의 적혈구 전구 세포를 배치하여 약 0.1 x 105개의 세포/mL 내지 약 2 x 106개의 세포/mL의 초기 세포 밀도를 갖는 제1 세포 배양물을 수득하는 단계; 및
    (ii) 약 1일 내지 약 15일 동안 제1 세포 배양물을 배치 배양하거나 유가 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 단계 (ii)에서의 배치 배양 또는 유가 배양은 약 5일 내지 약 12일 동안 수행되는, 방법.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)의 관류 배양은 약 4일 내지 약 10일 동안 수행되는, 방법.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)에서의 관류 배양은,
    (i) 제3 배양 배지의 추가 부피를 제1 기간 동안 제3 세포 배양물에 첨가하는 단계, 및
    (ii) 제4 배양 배지의 추가 부피를 제2 기간 동안 제3 세포 배양물에 첨가하는 단계를 포함하되, 제4 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 37.5 g/L의 타우린 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 37.5 g/L의 하이포타우린을 포함하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 단계 (i)에서의 제1 기간은 약 1일 내지 약 7일이고, 단계 (ii)에서의 제2 기간은 약 1일 내지 약 10일인, 방법.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)의 관류 배양은 약 8일 내지 약 15일 동안 수행되는, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 단계 (b)에서의 배양은 배치 배양 또는 유가 배양이고, 단계 (c)에서의 용기는 관류 바이오리액터이고, 단계 (d)에서의 배양은 관류 배양인, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 방법은 단계 (a) 전에,
    (i) 용기 내에 포함된 제1 배양 배지에 복수의 적혈구 전구 세포를 배치하여 약 0.1 x 105개의 세포/mL 내지 약 2 x 106개의 세포/mL의 초기 세포 밀도를 갖는 제1 세포 배양물을 수득하는 단계; 및
    (ii) 약 1일 내지 약 15일 동안 제1 세포 배양물을 배치 배양하거나 유가 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 단계 (ii)에서의 배치 배양 또는 유가 배양은 약 5일 내지 약 12일 동안 수행되는, 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)의 배치 배양 또는 유가 배양은 약 4일 내지 약 10일 동안 수행되는, 방법.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)에서의 관류 배양은,
    (i) 제3 배양 배지의 추가 부피를 제1 기간 동안 제3 세포 배양물에 첨가하는 단계, 및
    (ii) 제4 배양 배지의 추가 부피를 제2 기간 동안 제3 세포 배양물에 첨가하는 단계를 포함하되, 제4 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 37.5 g/L의 타우린 및/또는 1.0 g/L 내지 약 37.5 g/L의 하이포타우린을 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 단계 (i)에서의 제1 기간은 약 1일 내지 약 7일이고, 단계 (ii)에서의 제2 기간은 약 1일 내지 약 10일인, 방법.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)의 관류 배양은 약 8일 내지 약 15일 동안 수행되는, 방법.
  16. 제1항에 있어서, 단계 (a)에서의 용기는 관류 바이오리액터이고, 단계 (b)에서의 배양은 관류 배양이고, 단계 (d)에서의 배양은 배치 배양 또는 유가 배양인, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 방법은 단계 (a) 전에,
    (i) 용기 내에 포함된 제1 배양 배지에 복수의 적혈구 전구 세포를 배치하여 약 0.1 x 105개의 세포/mL 내지 약 2 x 106개의 세포/mL의 초기 세포 밀도를 갖는 제1 세포 배양물을 수득하는 단계; 및
    (ii) 약 1일 내지 약 15일 동안 제1 세포 배양물을 배치 배양하거나 유가 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 단계 (ii)에서의 배치 배양 또는 유가 배양은 약 5일 내지 약 12일 동안 수행되는, 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)의 관류 배양은 약 4일 내지 약 10일 동안 수행되는, 방법.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)에서의 배치 배양 및유가 배양은,
    (i) 제3 배양 배지의 추가 부피를 제1 기간 동안 제3 세포 배양물에 첨가하는 단계, 및
    (ii) 제4 배양 배지의 추가 부피를 제2 기간 동안 제3 세포 배양물에 첨가하는 단계를 포함하되, 제4 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 37.5 g/L의 타우린 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 37.5 g/L의 하이포타우린을 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 단계 (i)에서의 제1 기간은 약 1일 내지 약 7일이고, 단계 (ii)에서의 제2 기간은 약 1일 내지 약 10일인, 방법.
  22. 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)의 배치 배양 또는 유가 배양은 약 8일 내지 약 15일 동안 수행되는, 방법.
  23. 제1항에 있어서, 단계 (b)에서의 배양은 배치 배양 또는 유가 배양이고, 단계 (d)에서의 배양은 배치 배양 또는 유가 배양인, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 방법은 단계 (a) 전에,
    (i) 용기 내에 포함된 제1 배양 배지에 복수의 적혈구 전구 세포를 배치하여 약 0.1 x 105개의 세포/mL 내지 약 2 x 106개의 세포/mL의 초기 세포 밀도를 갖는 제1 세포 배양물을 수득하는 단계; 및
    (ii) 약 1일 내지 약 15일 동안 제1 세포 배양물을 배치 배양하거나 유가 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  25. 제3항 내지 제8항, 제10항 내지 제15항, 제17항 내지 제22항, 및 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 배양 배지는 Flt-3 리간드, 줄기 세포 인자(SCF), IL-3, 및 IL-6 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  26. 제24항에 있어서, 단계 (ii)에서의 배치 배양 또는 유가 배양은 약 5일 내지 약 12일 동안 수행되는, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 배양 배지는 트랜스페린, IL-3, SCF, 덱사메타손, 에리트로포이에틴(EPO), 및 인슐린 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  28. 제23항, 제24항, 또는 제26항에 있어서, 단계 (b)의 배치 배양 또는 유가 배양은 약 4일 내지 약 10일 동안 수행되는, 방법.
  29. 제23항, 제24항, 제26항, 또는 제28항에 있어서, 단계 (d)에서의 배치 배양 및 유가 배양은,
    (i) 제3 배양 배지의 추가 부피를 제1 기간 동안 제3 세포 배양물에 첨가하는 단계, 및
    (ii) 제4 배양 배지의 추가 부피를 제2 기간 동안 제3 세포 배양물에 첨가하는 단계를 포함하되, 제4 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 37.5 g/L의 타우린 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 37.5 g/L의 하이포타우린을 포함하는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 단계 (i)에서의 제1 기간은 약 3일 내지 약 5일이고, 단계 (ii)에서의 제2 기간은 약 1일 내지 약 10일인, 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 20.0 g/L의 타우린 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 20.0 g/L의 하이포타우린을 포함하고, 임의로 약 0.5 g/L 내지 약 54.0 g/L의 미오-이노시톨을 추가로 포함하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 제3 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, SCF, 및 EPO 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 방법.
  33. 제6항 내지 제8항, 제13항 내지 제15항, 및 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 20.0 g/L의 타우린 및/또는 약 1.0 g/L 내지 약 20.0 g/L의 하이포타우린을 포함하고, 임의로 약 0.5 g/L 내지 약 54.0 g/L의 미오-이노시톨을 추가로 포함하는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 제4 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, 및 EPO 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 방법.
  35. 제23항, 제24항, 제26항, 및 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)의 배치 배양 또는 유가 배양은 약 8일 내지 약 15일 동안 수행되는, 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 적혈구 전구 세포는 인간 적혈구 전구 세포인, 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 제핵 적혈구 세포의 집단은 제핵 인간 적혈구 세포의 집단인, 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은,
    (e): 단계 (d)에서의 제3 세포 배양물로부터 제핵 적혈구 세포의 집단을 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 방법은,
    (f): 단계 (e)에서 단리된 제핵 적혈구 세포의 집단을 제형화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 방법은,
    (g): 단계 (f)에서의 제핵 적혈구 세포의 제형화된 집단을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  41. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은, 단계 (a) 전에, 핵산을 제1 세포 배양물 중의 적혈구 전구 세포 내로 도입하는 단계를 추가로 포함하고,
    상기 방법은 조작된 제핵 적혈구 세포의 집단을 생성을 초래하는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 조작된 제핵 적혈구 세포의 집단은 조작된 인간 제핵 적혈구 세포인, 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 핵산은 하나 이상의 외인성 폴리펩티드를 암호화하는, 방법.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 인간 제핵 적혈구 세포는 하나 이상의 외인성 단백질(들)을 포함하는, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 방법은 하나 이상의 외인성 단백질을 세포에 클릭-접합하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  46. 제44항에 있어서, 상기 방법은 세포를 저장성으로 로딩하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  47. 제44항에 있어서, 상기 방법은 세포를 물리적 조작을 통해 로딩하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  48. 제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 외인성 단백질(들) 중 하나는 조작된 인간 제핵 적혈구 세포의 세포기질에 존재하는, 방법.
  49. 제44항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 외인성 단백질 중 하나는 조작된 인간 제핵 적혈구 세포의 막 상에 존재하는 단백질인, 방법.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 제핵 적혈구 세포의 집단.
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