KR20220092363A

KR20220092363A - 지질 나노입자를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20220092363A
Application number: KR1020210153381A
Authority: KR
Inventors: 이혁진; 정예희; 김민정; 김홍중; 정헌순; 김혜정; 김이삭; 강하림
Original assignee: (주)인핸스드바이오
Priority date: 2020-12-24
Filing date: 2021-11-09
Publication date: 2022-07-01

Abstract

본 출원은 지질 나노입자를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 일 예에 따른 약학 조성물은 생체 친화도가 우수하며, 고효율로 유전자 치료제 등을 전달할 수 있어 암 예방 또는 치료 효과가 우수하고, 항암제 및/또는 방사선 치료와 병용시에도 암 예방 또는 치료효과가 우수하다.

Description

지질 나노입자를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating cancer containing lipid nanoparticles}

본 출원은 지질 나노입자를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

의약 제제 산업에 있어 약물의 부작용을 줄이고 효능 및 효과를 극대화시켜 필요한 양의 약물을 효율적으로 전달할 수 있도록 설계한 약물전달시스템(DDS; Drug Delivery System)은 신약개발과 맞먹는 경제적 이익을 창출할 수 있으면서 성공 가능성이 큰 고부가가치 핵심기술로서 약물투여를 효율화함으로서 환자 치료의 질을 높이는데 그 목적이 있다. 약물전달시스템의 핵심기술 중의 하나인 약물흡수 촉진 기술에 속하는 난용성 약물의 가용화 기술은 신약 물질의 개발비용을 줄일 수 있는 동시에 현재 출시되어 있는 의약품의 부가가치를 높일 수 있는 가장 합리적인 방법으로 여겨지고 있다. 특히, 우리나라와 같이 신약개발 여건이 열악한 상황에서 약물의 가용화 기술의 개발을 통한 개량 신약의 개발은 적은 비용으로 막대한 부가가치를 창출할 수 있는 분야이다.

유전자 약물전달시스템을 이용한 유전자 치료법은 유전적 결합을 수정하고 수많은 질병을 치료하는데 있어 커다란 희망으로 자리 잡고 있다. 이러한 유전자 치료법을 성공적이고 안전하게 수행함에 있어서, 효과적인 유전자 전달이 주요한 과제 중 하나이며, 바이러스 전달체가 유전자 전달에 있어 효과적임이 입증되었다. 그러나 면역원성(immunogenicity), 주입된 DNA 크기의 한계 및 대량 생산의 어려움과 같은 몇 가지 결점으로 인해 유전자 전달 시스템으로서 바이러스의 이용이 제한되고 있다. 양이온성 리포좀 및 중합체와 같은 비-바이러스성 유전자 담체가 바이러스성 시스템의 대체 수단으로서 주목을 받기 시작했다.

개선된 안정성 프로파일 및 중합체 전달체의 제조와 조작의 용이성이 효과적이고 안전한 유전자 전달용 비독성 및 생분해성 중합체 담체의 디자인 및 합성에 대한 연구를 촉발시켰다. 폴리(L-라이신), 폴리에틸렌이민(polyethylenimine), 스타버스트(starburst), 폴리아미도아민(polyamidoamine) 덴드리머, 및 양이온성 리포좀 등이 자발적으로 자가 조립가능하고 플라스미드 DNA(pDNA)를 엔도사이토시스를 통해 세포로 진입시키기에 충분히 작은 구조로 압축할 수 있기 때문에 비-바이러스성 유전자 전달체로서 널리 연구되어 왔다.

Antisense RNA, siRNA 등의 핵산은 생체 내에서 특정 단백질의 발현을 억제할 수 있는 물질로, 암, 유전병, 감염질병, 자가면역 질환 등의 치료에 중요한 도구로 각광받고 있다(Novina and Sharp, Nature, 430, 161-164, 2004). 그러나 siRNA와 같은 핵산은 세포 내로 직접 전달이 어렵고, 혈액 내에서 효소에 의해 쉽게 분해되므로 이를 극복하기 위한 연구들이 많이 진행되고 있다. 현재까지 핵산을 세포 내로 운반하는 방법으로 양전하 지질 또는 중합체와 섞어 운반하는 방법(각각 지질-DNA 접합체(lipoplex) 및 폴리머-DNA 접합체(polyplex)라 명명함)이 주로 사용되고 있다(Hirko 등, Curr. Med. Chem., 10, 1185-1193, 2003; Merdan 등, Adv. Drug. Deliv. Rev., 54, 715-758, 2002; Spagnou 등, Biochemistry, 43, 13348-13356, 2004). 지질-DNA 접합체는 핵산과 결합하여 세포 내로 핵산을 잘 전달시켜 세포수준에서 많이 사용되고 있으나, 생체 내에서는 국부적으로 주사 시 많은 경우 체내에서 염증을 유발시키며(Filonand 및 Phillips, Biochim. Biophys. Acta, 1329, 345-356, 1997), 혈관 내 주사 시 주로 1차 통과기관들인 폐, 간, 비장 등과 같은 조직에 축적되는 단점이 있다(Ren 등, Gene Therapy, 7, 764-768, 2000).

또한 이러한 비-바이러스성 전달체는 트랜스펙션 효율이 낮은 문제점이 있다. 트랜스펙션 효율을 높이기 위해 많은 노력이 기울여져 왔으나, 이는 여전히 안정하다고 여겨지는 시스템과는 거리가 멀다. 또한, 비-바이러스성 유전자 전달체 담체는 열악한 생체적합성 및 비-생분해성으로 인해 현저하게 높은 세포독성을 나타낸다.

이러한 기술적 배경 하에서, 항암제를 목적하는 기관 또는 세포에 효율적으로 전달할 수 있어 항암 효과가 우수한 나노입자의 개발이 필요한 실정이다.

대한민국 공개특허 제10-2020-0083804호

일 예는 (1) 6원의 헤테로고리 아민 및 알킬-에폭시드가 결합된 이온화 가능한 지질 (ionizable lipid); 인지질; 콜레스테롤; 및 지질-PEG(polyethyleneglycol) 접합체를 포함하는 지질 나노입자 및

(2) 제1 항암제를 포함하고,

상기 제1 항암제는 음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합인,

암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다

다른 예는 상기 약학 조성물을 포함하는 방사선 치료에 병용하기 위한 암 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 예는 상기 약학 조성물 및 제2 항암제를 추가로 포함하는, 항암제 병용 투여용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양상은

(1) 6원의 헤테로고리 아민 및 알킬-에폭시드가 결합된 이온화 가능한 지질 (ionizable lipid); 인지질; 콜레스테롤; 및 지질-PEG(polyethyleneglycol) 접합체를 포함하는 지질 나노입자 및

(2) 제1 항암제를 포함하고,

상기 제1 항암제는 음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 약학 조성물에 포함되는 상기 지질 나노입자는 생체 친화도가 우수하며, 고효율로 항암제(예를 들면, 유전자 치료제) 등을 전달할 수 있어 지질 나노입자 매개 유전자 치료 및 영상 진단 기술 등 관련 기술분야에 유용하게 사용할 수 있다.

본 명세서에서, '이온화 가능한 지질(ionizable lipid)' 또는 '지질 유사체(lipidoid)'는 용이하게 양성자화될 수 있는 아민-함유 지질을 의미하고, 예를 들면, 주변 pH에 따라 전하상태가 변하는 지질일 수 있다. 상기 이온화 가능한 지질은 6원의 헤테로고리 아민 및 알킬-에폭시드가 결합된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 이온화 가능한 지질은 6원의 헤테로고리 아민 및 알킬-에폭시드가 반응하여 생성되는 지질과 유사한 특성을 갖는 화합물일 수 있으며, 보다 구체적으로, 6원의 헤테로고리 아민을 알킬-에폭시드와 반응시켜 에폭시드의 고리열림반응(ring opening reaction)에 의해 생성되는 화합물일 수 있다.

일 예에서, 상기 이온화 가능한 지질은 6원의 헤테로고리 아민 및 알킬-에폭시드를 1:n (n = 6원의 헤테로고리 아민에 포함된1차 아민의 갯수 x 2 + 2차 아민의 갯수 x 1)의 몰비로 반응시켜 결합된 것일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 1,4-비스(3-아미노프로필)피페라진(1,4-bis(3-aminopropyl)piperazine) 및 1,2-에폭시도데칸을 1: 4의 몰비로 혼합하여 700 내지 800rpm, 85 내지 95℃의 조건에서 2 내지 4일 동안 반응시켜 제조한 것일 수 있다.

상기 이온화 가능한 지질은 양이온성 지질의 pKa 미만의 pH에서 양성자화(양으로 하전)될 수 있고, pKa 초과의 pH에서는 실질적으로 중성일 수 있다. 일 예에서, 상기 지질 나노입자는 양성자화된 이온화 가능한 지질 및/또는 중성을 나타내는 이온화 가능한 지질을 포함할 수 있다.

상기 이온화 가능한 지질은 지질과 유사한 특성을 갖는 이온화 가능한 화합물로서 약물(예를 들면, 음이온성 약물 및/또는 핵산)과의 정전기적 상호작용을 통하여 상기 약물이 지질 나노입자 내에 높은 효율로 봉입되도록 하는 역할을 수행할 수 있다.

상기 6원의 헤테로고리 아민은 피페라진(piperazine) 또는 피페리딘(piperidine) 구조를 포함하는 것일 수 있다.

상기 6원의 헤테로고리 아민은 3차 아민을 포함하는 사슬형 또는 비사슬형의 아민일 수 있고, 일 예에 따르면,

,

,

,

,

, 및

으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

일 예에서, 상기 6원의 헤테로고리 아민은 1,4-비스(3-아미노프로필)피페라진(1,4-bis(3-aminopropyl)piperazine), N-(3-아미노프로필)피페리딘 (N-(3-Aminopropyl)piperidine), (1-메틸-4-피페리디닐)메탄아민((1-Methyl-4-piperidinyl)methanamine), 2-(4-메틸-피페라진-1-일)-에틸아민(2-(4-Methyl-piperazin-1-yl)-ethylamine), 1-(2-아미노에틸)피페라진(1-(2-Aminoethyl)piperazine), 및 1-(3-아미노프로필)피페라진(1-(3-aminopropyl)piperazine)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 이온화 가능한 지질에 포함되는 아민의 종류에 따라, (ⅰ) 상기 지질 나노입자 약물 봉입률, (ii) 상기 지질 나노입자의 PDI(polydispersity index), 및/또는 (ⅲ) 상기 약학적 조성물의 암조직 및/또는 암세포로의 약물 전달 효율 등이 상이할 수 있다.

상기 아민을 포함하는 이온화 가능한 지질을 포함하는 경우 하기 특징 중 1종 이상을 가질 수 있다:

(1) 높은 효율로 상기 지질 나노입자에 약물이 봉입;

(2) 제조된 지질 나노입자의 크기가 균일(또는 낮은 PDI 수치를 가지며);

(3) 암조직 및/또는 암세포로의 약물 전달 효율이 우수;

(4) 생체 내에서 장기 순환 (long circulation)할 수 있음; 및/또는

(5) 암 예방 및/또는 치료 효과 우수.

일 예에 따르면, 1,4-비스(3-아미노프로필)피페라진(1,4-bis(3-aminopropyl)piperazine; Cas Nos. 7209-38-3)을 포함하는 이온화 가능한 지질을 포함하는 지질 나노입자를 포함하는 경우 다른 종류의 아민을 포함하는 이온화 가능한 지질을 포함하는 경우 보다 하기 특징 중 1종 이상을 가질 수 있다:

(1) 높은 효율로 상기 지질 나노입자에 약물이 봉입;

(3) 암조직 및/또는 암세포로의 약물 전달 효율이 우수;

(4) 생체 내에서 장기 순환 (long circulation)할 수 있음; 및/또는

(5) 암 예방 및/또는 치료 효과 우수.

상기 알킬-에폭시드는 하기 화학식 1과 같은 구조를 가질 수 있다.

[화학식 1]

상기 알킬-에폭시드는 C6 내지 C14, C6 내지 C12, C6 내지 C10, C8 내지 C14, C8 내지 C12, C8 내지 C10, C10 내지 C14, C10 내지 C12, 또는 C10의 탄소 길이를 갖는 것일 수 있고, 예를 들면, C10의 1,2-에폭시도데칸(1,2-epoxydodecane)일 수 있다. 이온화 가능한 지질에 포함되는 알킬-에폭시드의 탄소수를 상기 범위로 함으로써 지질 나노입자 내에 봉입되는 약물에 대한 높은 봉입률을 나타낼 수 있다.

일 예에서, 상기 이온화 가능한 지질은 하기 화학식 2의 일반식을 가질 수 있다.

[화학식 2]

상기 화학식 2의 구조는 일 예에 따른 이온화 가능한 지질이 갖는 구조의 일례로서, 이온화 가능한 지질의 구조는 6원의 헤테로고리 아민 및/또는 알킬-에폭시드의 종류에 따라 상이할 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 화학식 2의 구조를 갖는 이온화 가능한 지질을 포함하는 이온화 가능한 지질을 포함하는 경우 다른 종류의 이온화 가능한 지질을 포함하는 지질 나노입자 경우 보다 하기 특징 중 1종 이상을 가질 수 있다:

(1) 높은 효율로 상기 지질 나노입자에 약물이 봉입;

(3) 암조직 및/또는 암세포로의 약물 전달 효율이 우수;

(4) 생체 내에서 장기 순환 (long circulation)할 수 있음; 및/또는

(5) 암 예방 및/또는 치료 효과 우수.

일 예에 따르면, 상기 약학적 조성물에 포함되는 상기 지질 나노 입자는 pKa가 5 내지 8, 5.5 내지 7.5, 6 내지 7, 또는 6.5 내지 7일 수 있다. pKa는 산 해리 상수로, 대상 물질의 산 강도를 나타내는 지표로서 일반적으로 사용되고 있는 것을 가리킨다. 상기 지질 나노입자가 갖는 pKa 값은 지질 나노입자의 생체 내 안정성 및 지질 나노입자의 약물 방출 측면에서 중요하다. 일 예에서 상기 범위의 pKa 값을 나타내는 지질 나노입자는 생체 내에서 안전하게 암 조직 및/또는 암세포로 전달될 수 있고, 암 조직 및/또는 암세포에 도달하여 엔도시토시스(endocytosis) 후에 양전하를 나타내어 엔도좀(endosome) 막의 음이온성 단백질과 정전기적 상호작용을 통해 봉입된 약물(제1 항암제)이 방출되도록 할 수 있다.

상기 인지질은 지질 나노입자 내에서 이온화 가능한 지질 및 약물(제1 항암제)이 상호작용하여 형성된 코어를 감싸서 보호하는 역할을 수행할 수 있고, 타겟 세포의 인지질 이중층과 결합하여 약물의 세포 내 전달시 세포막 통과 및 엔도좀 탈출(endosomal escape)을 용이하게 할 수 있다.

상기 인지질은 일 예에 따른 지질 나노입자의 융합을 촉진할 수 있는 인지질을 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들면, 디올레일포스파티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine, DOPE), 디스테아로일포스파티딜콜린(distearoylphosphatidylcholine, DSPC), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(palmitoyloleoylphosphatidylcholine, POPC), 에그 포스파티딜콜린(egg phosphatidylcholine, EPC), 디올레오일포스파티딜콜린(dioleoylphosphatidylcholine, DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoylphosphatidylcholine, DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(dioleoylphosphatidylglycerol, DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(dipalmitoylphosphatidylglycerol, DPPG), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(distearoylphosphatidylethanolamine, DSPE), 포스파티딜에탄올아민(Phosphatidylethanolamine, PE), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(dipalmitoylphosphatidylethanolamine), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine(POPE), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(POPC), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine](DOPS), 및1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine] 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 예에서, DOPE를 포함하는 지질 나노입자를 포함하는 경우 약물로서 mRNA 전달에 효과적(mRNA에 대한 약물 전달 효율이 우수)일 수 있고, 다른 예에서, DSPE를 포함하는 지질 나노입자를 포함하는 경우 약물로서 siRNA 전달에 효과적(siRNA에 대한 약물 전달 효율이 우수)일 수 있다.

상기 콜레스테롤은 지질 나노입자 내에서 지질 충전에 형태적 측면에서 견고성을 부여하며, 나노입자의 코어 및 표면에 분산되어 나노입자의 안정성을 향상시키는 역할을 할 수 있다.

본 명세서에서 "지질-PEG(polyethyleneglycol) 접합체", "지질-PEG", “PEG-지질” "PEG-lipid", 또는 "lipid-PEG"는 지질과 PEG가 컨쥬게이트된 형태를 지칭하는 것으로, 일측 단부에 친수성 중합체인 폴리에틸렌글리콜(PEG) 중합체가 결합된 지질을 의미한다. 상기 지질-PEG 접합체는 지질 나노입자 내에서 나노입자의 혈청 내 입자 안정성에 기여하며, 나노입자 간 응집을 막는 역할을 수행한다. 또한, 지질-PEG 접합체는 핵산의 생체 내 전달시 분해효소로부터 핵산을 보호하여 핵산의 체내 안정성을 강화시키며, 나노입자 내 봉입된 약물의 반감기를 증가시킬 수 있다.

상기 지질-PEG 접합체에서 PEG는 지질에 직접 접합될 수 있거나 또는 링커 모이어티를 통해 지질에 연결될 수 있다. PEG를 지질에 결합시키기에 적합한 임의의 링커 모이어티가 사용될 수 있으며, 예를 들면, 에스테르-비함유 링커 모이어티 및 에스테르-함유 링커 모이어티가 포함된다. 상기 에스테르-비함유 링커 모이어티는 아미도(-C(O)NH-), 아미노(-NR-), 카르보닐(-C(O)-), 카르바메이트(-NHC(O)O-), 우레아(-NHC(O)NH-), 다이설파이드(-S-S-), 에테르(-O-), 석시닐(-(O)CCH₂CH₂C(O)-), 석신아미딜(-NHC(O)CH₂CH₂C(O)NH-), 에테르, 다이설파이드뿐만 아니라 이들의 조합(예컨대, 카르바메이트 링커 모이어티 및아미도 링커 모이어티 둘 모두를 함유하는 링커)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 에스테르-함유 링커 모이어티는, 예를 들면 카르보네이트(-OC(O)O-), 석시노일, 포스페이트 에스테르(-O-(O)POH-O-), 설포네이트 에스테르, 및 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

일 예에서, 상기 지질-PEG 접합체의 평균 분자량은 100 내지 10000달톤, 200 내지 10000달톤, 500 내지 10000달톤, 1000 내지 10000달톤, 1500 내지 10000달톤, 2000 내지 10000달톤, 100 내지 7500달톤, 200 내지 7500달톤, 500 내지 7500달톤, 1000 내지 7500달톤, 1500 내지 7500달톤, 2000 내지 7500달톤, 100 내지 5000달톤, 200 내지 5000달톤, 500 내지 5000달톤, 1000 내지 5000달톤, 1500 내지 5000달톤, 2000 내지 5000달톤, 100 내지 3000달톤, 200 내지 3000달톤, 500 내지 3000달톤, 1000 내지 3000달톤, 1500 내지 3000달톤, 2000 내지 3000달톤, 100 내지 2600달톤, 200 내지 2600 달톤, 500 내지 2600달톤, 1000 내지 2600달톤, 1500 내지 2600달톤, 2000 내지 2600달톤, 100 내지 2500달톤, 200 내지 2500달톤, 500 내지 2500달톤, 1000 내지 2500달톤, 1500 내지 2500달톤, 또는 2000 내지 2500달톤일 수 있다.

상기 지질-PEG 접합체 내 지질은 폴리에틸렌글리콜과 결합할 수 있는 지질이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 상기 지질 나노입자의 다른 구성요소인 인지질 및/또는 콜레스테롤 또한 사용할 수 있다. 구체적으로, 지질-PEG 접합체 내 지질은 세라미드(세라마이드)(ceramide), 디미리스톨글리세롤(dimyristoylglycerol, DMG), 석시노일 디아글리세롤(succinoyl-diacylglycerol, s-DAG), 디스테아로일포스파티딜콜린(distearoylphosphatidylcholine, DSPC), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(distearoylphosphatidylethanolamine, DSPE), 또는 콜레스테롤일 수 있다.

일 예에서, 상기 지질-PEG 접합체는 다이알킬옥시프로필에 결합된 PEG(PEG-DAA), 다이아실글리세롤에 결합된 PEG(PEG-DAG), 포스파티딜에탄올아민과 같은 인지질에 결합된 PEG(PEG-PE), 세라마이드에 접합된 PEG(PEG-CER, 또는 세라마이드-PEG 접합체), 콜레스테롤 또는 이의 유도체에 접합된 PEG, PEG-c-DOMG, PEG-DMG, PEG-DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC, PEG-DSPE, 및 이들의 혼합물일 수 있고 예를 들면, C16-PEG2000 세라마이드, DMG-PEG 2000, 14:0 PEG2000 PE 일 수 있다.

일 예에 따르면, 세라마이드-PEG 접합체를 포함하는 지질 나노입자를 포함하는 경우 다른 종류의 지질-PEG 접합체를 포함하는 지질 나노입자를 포함하는 경우 보다 하기 특징 중 1종 이상을 가질 수 있다:

(1) 높은 효율로 상기 지질 나노입자에 약물이 봉입;

(3) 암조직 및/또는 암세포로의 약물 전달 효율이 우수;

(4) 생체 내에서 장기 순환 (long circulation)할 수 있음; 및/또는

(5) 암 예방 및/또는 치료 효과 우수.

상기 지질-PEG 접합체 내 PEG는 친수성 고분자로 혈장 단백질들의 흡착을 억제하는 능력을 가지고 있어서 지질 나노입자의 체내 순환시간을 증가시키며, 나노입자 간의 응집현상을 막는 역할을 한다. 또한, 지질-PEG 접합체는 생체 내에서 스텔스(stealth) 기능을 나타내어 나노입자의 분해를 방지할 수 있다.

상기 PEG는 지질과 결합하지 않은 쪽에 관능기가 결합된 것(functionalized PEG)일 수 있다. 이 때 사용 가능한 관능기는 숙시닐기(succinyl), 카르복시산(carboxylic acid), 말레이미드(maleimide), 아민기, 바이오틴, 시아누르기(cyanur), 및 폴레이트(folate) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 지질-PEG 접합체는 0.1 내지 20몰%, 0.25 내지 20몰%, 0.5 내지 20몰%, 1 내지 20몰%, 1.5 내지 20몰%, 2 내지 20몰%, 2.5 내지 20몰%, 3 내지 20몰%, 0.1 내지 15몰%, 0.25 내지 15몰%, 0.5 내지 15몰%, 1 내지 15몰%, 1.5 내지 15몰%, 2 내지 15몰%, 2.5 내지 15몰%, 3 내지 15몰%, 0.1 내지 12.5몰%, 0.25 내지 12.5몰%, 0.5 내지 12.5몰%, 1 내지 12.5몰%, 1.5 내지 12.5몰%, 2 내지 12.5몰%, 2.5 내지 12.5몰%, 3 내지 12.5몰%, 0.1 내지 10몰%, 0.25 내지 10몰%, 0.5 내지 10몰%, 1 내지 10몰%, 1.5 내지 10몰%, 2 내지 10몰%, 2.5 내지 10몰%, 3 내지 10몰%, 0.1 내지 7.5몰%, 0.25 내지 7.5몰%, 0.5 내지 7.5몰%, 1 내지 7.5몰%, 1.5 내지 7.5몰%, 2 내지 7.5몰%, 2.5 내지 7.5몰%, 3 내지 7.5몰%, 0.1 내지 5몰%, 0.25 내지 5몰%, 0.5 내지 5몰%, 1 내지 5몰%, 1.5 내지 5몰%, 2 내지 5몰%, 2.5 내지 5몰%, 또는 3 내지 5몰%로 상기 지질 나노입자에 포함되는 것일 수 있다.

일 예에 따른 지질 나노입자의 암조직 및/또는 암세포 내로의 약물전달 효과나 암 예방 및/또는 치료 효과는 지질 나노입자에 포함되는 지질-PEG 접합체의 함량에 의존적일 수 있다.

예를 들면, 지질-PEG 접합체를 0.1 내지 20몰%, 0.25 내지 20몰%, 0.5 내지 20몰%, 1 내지 20몰%, 1.5 내지 20몰%, 2 내지 20몰%, 2.5 내지 20몰%, 3 내지 20몰%, 0.1 내지 15몰%, 0.25 내지 15몰%, 0.5 내지 15몰%, 1 내지 15몰%, 1.5 내지 15몰%, 2 내지 15몰%, 2.5 내지 15몰%, 3 내지 15몰%, 0.1 내지 12.5몰%, 0.25 내지 12.5몰%, 0.5 내지 12.5몰%, 1 내지 12.5몰%, 1.5 내지 12.5몰%, 2 내지 12.5몰%, 2.5 내지 12.5몰%, 3 내지 12.5몰%, 0.1 내지 10몰%, 0.25 내지 10몰%, 0.5 내지 10몰%, 1 내지 10몰%, 1.5 내지 10몰%, 2 내지 10몰%, 2.5 내지 10몰%, 3 내지 10몰%, 0.1 내지 7.5몰%, 0.25 내지 7.5몰%, 0.5 내지 7.5몰%, 1 내지 7.5몰%, 1.5 내지 7.5몰%, 2 내지 7.5몰%, 2.5 내지 7.5몰%, 3 내지 7.5몰%, 0.1 내지 5몰%, 0.25 내지 5몰%, 0.5 내지 5몰%, 1 내지 5몰%, 1.5 내지 5몰%, 2 내지 5몰%, 2.5 내지 5몰%, 또는 3 내지 5몰%로 포함하는 지질 나노입자는 상기 범위 외의 함량으로 지질-PEG 접합체를 포함하는 지질 나노입자 보다 하기 특징 중 1종 이상을 가질 수 있다:

(1) 높은 효율로 제1 항암제를 봉입;

(2) 제조된 입자의 크기가 균일(또는 낮은 PDI 수치를 가지며);

(3) 암조직 및/또는 암세포로의 약물 전달 효율이 우수;

(4) 생체 내에서 장기 순환 (long circulation)할 수 있음; 및/또는

(5) 암 예방 및/또는 치료 효과 우수.

일 예에 따르면, 상기 콜레스테롤은 10 내지 60몰%, 20 내지 60몰%, 30 내지 60몰%, 34.5 내지 60몰%, 35 내지 60몰%, 39.5 내지 60몰%, 40 내지 60몰%, 43 내지 60몰%, 44 내지 60몰%, 10 내지 55몰%, 20 내지 55몰%, 30 내지 55몰%, 34.5 내지 55몰%, 35 내지 55몰%, 39.5 내지 55몰%, 40 내지 55몰%, 43 내지 55몰%, 44 내지 55몰%, 10 내지 52.5몰%, 20 내지 52.5몰%, 30 내지 52.5몰%, 34.5 내지 52.5몰%, 35 내지 52.5몰%, 39.5 내지 52.5몰%, 40 내지 52.5몰%, 43 내지 52.5몰%, 44 내지 52.5몰%, 10 내지 51몰%, 20 내지 51몰%, 30 내지 51몰%, 34.5 내지 51몰%, 35 내지 51몰%, 39.5 내지 51몰%, 40 내지 51몰%, 43 내지 51몰%, 44 내지 51몰%, 10 내지 50몰%, 20 내지 50몰%, 30 내지 50몰%, 34.5 내지 50몰%, 35 내지 50몰%, 39.5 내지 50몰%, 40 내지 50몰%, 43 내지 50몰%, 44 내지 50몰%, 10 내지 45몰%, 20 내지 45몰%, 30 내지 45몰%, 34.5 내지 45몰%, 35 내지 45몰%, 39.5 내지 45몰%, 40 내지 45몰% , 43 내지 45몰%, 44 내지 45몰%, 10 내지 44.25몰%, 20 내지 44.25몰%, 30 내지 44.25몰%, 34.5 내지 44.25몰%, 35 내지 44.25몰%, 39.5 내지 44.25몰%, 40 내지 44.25몰%, 43 내지 44.25몰%, 44 내지 44.25몰%, 10 내지 44몰%, 20 내지 44몰%, 30 내지 44몰%, 34.5 내지 44몰%, 35 내지 44몰%, 39.5 내지 44몰%, 40 내지 44몰%, 43 내지 44몰%, 44 내지 44몰%, 10 내지 43몰%, 20 내지 43몰%, 30 내지 43몰%, 34.5 내지 43몰%, 35 내지 43몰%, 39.5 내지 43몰%, 또는40 내지 43몰%로 상기 지질 나노입자에 포함되는 것일 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 지질-PEG접합체와 상기 콜레스테롤의 합은 40 내지 60몰%, 40 내지 55몰%, 40 내지 53.5몰%, 40 내지 50몰%, 40 내지 47.5몰%, 40 내지 45몰%, 40 내지 44,5몰%, 42 내지 60몰%, 42 내지 55몰%, 42 내지 53.5몰%, 42 내지 50몰%, 42 내지 47.5몰%, 42 내지 45몰%, 42 내지 44,5몰%, 44 내지 60몰%, 44 내지 55몰%, 44 내지 53.5몰%, 44 내지 50몰%, 44 내지 47.5몰%, 44 내지 45몰%, 44 내지 44.5몰%, 44.5 내지 60몰%, 44.5 내지 55몰%, 44.5 내지 53.5몰%, 44.5 내지 50몰%, 44.5 내지 47.5몰%, 또는 44.5 내지 45몰%로 상기 지질 나노입자에 포함되는 것일 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 이온화 가능한 지질은 10 내지 60몰%, 10 내지 55몰%, 10 내지 50몰%, 10 내지 45몰%, 10 내지 42.5몰%, 10 내지 40몰%, 10 내지 35몰%, 10 내지 30몰%, 10 내지 26.5몰%, 10 내지 25몰%, 10 내지 20몰%, 15 내지 60몰%, 15 내지 55몰%, 15 내지 50몰%, 15 내지 45몰%, 15 내지 42.5몰%, 15 내지 40몰%, 15 내지 35몰%, 15 내지 30몰%, 15 내지 26.5몰%, 15 내지 25몰%, 15 내지 20몰%, 20 내지 60몰%, 20 내지 55몰%, 20 내지 50몰%, 20 내지 45몰%, 20 내지 42.5몰%, 20 내지 40몰%, 20 내지 35몰%, 20 내지 30몰%, 20 내지 26.5몰%, 20 내지 25몰%, 25 내지 60몰%, 25 내지 55몰%, 25 내지 50몰%, 25 내지 45몰%, 25 내지 42.5몰%, 25 내지 40몰%, 25 내지 35몰%, 25 내지 30몰%, 25 내지 26.5몰%, 26.5 내지 60몰%, 26.5 내지 55몰%, 26.5 내지 50몰%, 26.5 내지 45몰%, 26.5 내지 42.5몰%, 26.5 내지 40몰%, 26.5 내지 35몰%, 26.5 내지 30몰%, 30 내지 60몰%, 30 내지 55몰%, 30 내지 50몰%, 30 내지 45몰%, 30 내지 42.5몰%, 30 내지 40몰%, 30 내지 35몰%, 35 내지 60몰%, 35 내지 55몰%, 35 내지 50몰%, 35 내지 45몰%, 35 내지 42.5몰%, 35 내지 40몰%, 40 내지 60몰%, 40 내지 55몰%, 40 내지 50몰%, 40 내지 45몰%, 40 내지 42.5몰%, 42.5 내지 60몰%, 42.5 내지 55몰%, 42.5 내지 50몰%, 또는 42.5 내지 45몰%로 상기 지질 나노입자에 포함되는 것일 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 인지질은 5 내지 30몰%, 5 내지 25몰%, 5 내지 20몰%, 5 내지 15몰%, 5 내지 13몰%, 5 내지 10몰%, 10 내지 30몰%, 10 내지 25몰%, 10 내지 20몰%, 10 내지 15몰%, 10 내지 13몰%, 15 내지 30몰%, 15 내지 25몰%, 15 내지 20몰%, 20 내지 30몰%, 또는 20 내지 25몰%로 상기 지질 나노입자에 포함되는 것일 수 있다.

본 명세서에서 "몰%(mol%, 몰퍼센트)"는 특정 구성성분의 몰수를 전체 구성성분의 몰수의 합으로 나눈 후 100을 곱하여 퍼센트로 나타낸 것이고, 수식으로 표현하면 하기 수학식 1과 같다.

(수학식 1)

몰% = (특정 구성성분의 몰수) / (전체 구성성분의 몰수의 합) x 100

상기 지질 나노입자는 이온화 가능한 지질 : 인지질 : 콜레스테롤 : 지질-PEG 접합체를 20 내지 50 : 10 내지 30 : 10 내지 60 : 0.25 내지 10의 몰비, 20 내지 50 : 10 내지 30 : 20 내지 60 : 0.25 내지 10의 몰비, 20 내지 50 : 10 내지 30 : 30 내지 60 : 0.5 내지 5 의 몰비, 25 내지 45 : 10 내지 25 : 40 내지 50 : 0.5 내지 3의 몰비, 25 내지 45 : 10 내지 20 : 40 내지 55 : 0.5 내지 3 의 몰비, 25 내지 45 : 10 내지 20 : 40 내지 55 : 1.0 내지 1.5 의 몰비, 40 내지 45 : 10 내지 15 : 40 내지 45 : 0.5 내지 3.0의 몰비, 40 내지 45 : 10 내지 15 : 40 내지 45 : 0.5 내지 3의 몰비, 40 내지 45 : 10 내지 15 : 40 내지 45 : 1 내지 1.5의 몰비, 25 내지 30: 17 내지 22; 50 내지 55 : 0.5 내지 3.0의 몰비, 25 내지 30: 17 내지 22; 50 내지 55 : 1.0 내지 2.5의 몰비, 25 내지 30: 17 내지 22; 50 내지 55 : 1.5 내지 2.5의 몰비로 포함하는 것일 수 있다. 상기 지질 나노입자에 포함되는 구성성분 중 지질-PEG 접합체 및 콜레스테롤의 몰수의 합을 일정하게 유지하면서 지질-PEG 접합체의 몰수를 증가시킨 만큼 콜레스테롤의 몰수를 감소시켜, 상기 구성성분의 몰비를 유지시킬 수 있다.

본 명세서에서, 몰비는 몰수 비를 의미한다.

상기 지질 나노입자는 이온화 가능한 지질 20 내지 50 중량부, 인지질 10 내지 30 중량부, 콜레스테롤 30 내지 60 중량부, 및 지질-PEG 접합체 0.1 내지 5 중량부를 포함하는 것일 수 있다.

본 명세서에서, "중량부"는 각 성분이 포함된 중량 비율을 의미한다.

상기 지질 나노입자는 전체 나노입자 중량을 기준으로 이온화 가능한 지질 20 내지 50 중량%, 인지질 10 내지 30 중량%, 콜레스테롤 40 내지 60 중량％, 및 지질-PEG 접합체 1.5 내지 3 중량%를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 지질 나노입자는 전체 나노입자 중량을 기준으로 이온화 가능한 지질 25 내지 50 중량%, 인지질 10 내지 20 중량%, 콜레스테롤 35 내지 55 중량％, 및 지질-PEG 접합체 0.5 내지 5.0 중량%로 포함할 수 있다.

상기 범위(몰비, 중랑부, 및/또는 중량% 범위)로 이온화 가능한 지질, 콜레스테롤, 인지질, 및/또는 지질-PEG 접합체를 포함하는 지질 나노입자를 포함하는 약학 조성물은 상기 범위 외로 이온화 가능한 지질, 콜레스테롤, 인지질, 및/또는 지질-PEG 접합체를 포함하는 지질 나노입자를 포함하는 경우 보다 (i) 지질 나노입자의 안정도; (ⅱ) 항암제의 봉입률; (ⅲ) 암조직 및/또는 암세포로의 항암제 전달 효율; (iv) 생체 내에서 장기 순환 (long circulation)효과; 및/또는 (iv) 암 예방 및/또는 치료 효과가 우수할 수 있다.

본 명세서에서, 상기 지질 나노입자가 암조직 및/또는 암세포로 "표적화(targeting)", 위치화(localization)"한다는 것은 조직 내 또는 세포 내에 내재화(internalization)하는 것일 수 있고, 핵막도 투과할 수 있어 핵 내부에 내재화하는 것을 의미할 수 있다.

상기 약학 조성물은 상기 지질 나노입자 내부에 제1 항암제 (예를 들면, 음이온성 약물 및/또는 핵산 등의 생리활성물질)이 봉입된 것일 수 있으며, 상기 제1 항암제가 안정적이고 높은 효율로 상기 지질 나노입자에 봉입되어 일 예에 따른 약학 조성물에 의해 우수한 암 예방 및/또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.

일 예에서, 상기 지질 나노입자에 포함된 이온화 가능한 지질 및 제1 항암제 (예를 들면, 음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합)의 중량비는 1 내지 20 : 1, 1 내지 15 : 1, 1 내지 10 : 1, 5 내지 20 : 1, 5 내지 15 : 1, 5 내지 10 : 1, 7.5 내지 20 : 1, 7.5 내지 15 : 1, 또는 7.5 내지 10 : 1 일 수 있다.

일 예에 따른 조성물이 상기 범위 내의 중량비로 (1) 이온화 가능한 지질; 및 (2) 제1 항암제 (예를 들면, 음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합)을 포함하면, (i) 지질 나노입자 내부 제1 항암제 (예를 들면, 음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합)의 봉입률; (ⅱ) 암조직 및/또는 암세포로의 항암제 전달 효율; (ⅲ) 생체 내에서 장기 순환 (long circulation)효과; 및/또는 (iv) 암 예방 및/또는 치료 효과가 상기 범위 밖의 중량비로 (1) 이온화 가능한 지질; 및 (2) 제1 항암제를 포함하는 지질 나노입자를 포함하는 조성물 보다 높을 (우수할 수) 있다.

상기 제1 항암제가 봉입된 지질 나노입자는 암조직 및/또는 암세포 내 도입이 용이하도록 평균 지름이 20nm 내지 200nm, 20 내지 180nm, 20nm 내지 170nm, 20nm 내지 150nm, 20nm 내지 120nm, 20nm 내지 100nm, 20nm 내지 90nm, 30nm 내지 200nm, 30 내지 180nm, 30nm 내지 170nm, 30nm 내지 150nm, 30nm 내지 120nm, 30nm 내지 100nm, 30nm 내지 90nm, 40nm 내지 200nm, 40 내지 180nm, 40nm 내지 170nm, 40nm 내지 150nm, 40nm 내지 120nm, 40nm 내지 100nm, 40nm 내지 90nm, 50nm 내지 200nm, 50 내지 180nm, 50nm 내지 170nm, 50nm 내지 150nm, 50nm 내지 120nm, 50nm 내지 100nm, 50nm 내지 90nm, 60nm 내지 200nm, 60 내지 180nm, 60nm 내지 170nm, 60nm 내지 150nm, 60nm 내지 120nm, 60nm 내지 100nm, 60nm 내지 90nm, 70nm 내지 200nm, 70 내지 180nm, 70nm 내지 170nm, 70nm 내지 150nm, 70nm 내지 120nm, 70nm 내지 100nm, 70nm 내지 90nm, 80nm 내지 200nm, 80 내지 180nm, 80nm 내지 170nm, 80nm 내지 150nm, 80nm 내지 120nm, 80nm 내지 100nm, 80nm 내지 90nm, 90nm 내지 200nm, 90 내지 180nm, 90nm 내지 170nm, 90nm 내지 150nm, 90nm 내지 120nm, 또는 90nm 내지 100nm 일 수 있다. 상기 범위로 지름의 사이즈를 가지는 나노입자는 혈액 내에서 오랫동안 잔존할 수 있게 됨으로, 표적 종양조직에 다다를 수 있는 기회가 증가될 수 있다. 상기 범위의 지름 사이즈를 갖는 지질 나노입자는 EPR(Enhanced Permeability and Retention; 투과상승 및 저류효과) 효과를 나타낼 수 있다. 상기 EPR 효과란 특정한 크기를 갖는 분자가 정상 조직 보다 종양 조직에 축적되는 경향이 있는 것을 의미한다. 상기 범위의 지름 사이즈를 갖는 지질 나노입자는 상기 범위 외의 지름 사이즈를 갖는 지질 나노입자 보다 신장으로 배설이 감소되고, 면역세포의 활성이 유발되지 아니하여 암세포 및/또는 암조직으로의 전달이 효과적으로 이루어질 수 있다.

일 예에서 상기 범위 내의 지름을 갖는 지질 나노입자를 포함하는 조성물은 상기 범위의 상한 값을 초과하는 지름을 갖는 지질 나노입자를 포함하는 조성물 보다 (i) 암조직 및/또는 암세포로의 항암제 전달 효율; (ⅱ) 암조직 및/또는 암세포로의 투과 및 저류 효과(EPR 효과) 증가; 및/또는 (ⅲ) 암 예방 및/또는 치료 효과가 우수하다. 일 예에 따른 지질 나노입자는 5 내지 8, 5.5 내지 7.5, 6 내지 7, 또는 6.5 내지 7의 pKa를 나타냄으로써 산성 pH 조건에서 양전하를 나타내어 음전하를 나타내는 제1 항암제 (예를 들면, 핵산 및 음이온성 약물(예를 들면, 단백질)) 등의 치료제와 정전기적 상호작용을 통해 용이하게 약물과의 복합체를 형성하여 높은 효율로 약물을 봉입할 수 있으며, 제1 항암제(예를 들면, 핵산)를 포함하는 암 예방 및/또는 치료용 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

본 명세서에서, "봉입(encapsulation)"은 전달물질을 둘러싸서 효율적으로 생체 내로 함입시키기 위해 캡슐화하는 것을 말하고, 제1 항암제(약물) 봉입률(캡슐화 효율, Encapsulation efficiency)은 제조에 사용된 전체 약물 함량에 대하여 지질 나노입자 내에 봉입된 제1 항암제(약물)의 함량을 의미한다.

일 예에 따른 조성물에서, 제1 항암제의 봉입률은 70% 이상, 75%이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 80% 초과 내지 99% 이하, 80% 초과 내지 97% 이하, 80% 초과 내지 95% 이하, 85% 이상 내지 95% 이하, 87% 이상 내지 95% 이하, 90% 이상 내지 95% 이하, 91% 이상 내지 95% 이하, 91% 이상 내지 94% 이하, 91% 초과 내지 95% 이하, 92% 이상 내지 99% 이하, 92% 이상 내지 97% 이하, 또는 92% 이상 내지 95% 이하일 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 봉입률은 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 계산될 수 있으며, 예를 들면, 상기 제1 항암제(약물) 봉입률은 일 예에 따른 지질 나노입자에 Triton-X를 처리하고, Triton-X가 처리되고, Triton-X가 처리되지 않은 지질 나노입자의 형광강도를 특정 파장 대역폭(예를 들면, exitation: 480 ~ 490nm, emission: 520 ~ 530nm)를 측정하고, 하기 수학식 2에 의해 계산된 것일 수 있다.

(수학식 2)

약물 봉입률(%)=(Triton-X가 처리된 지질 나노입자의 형광강도(형광도)- Triton-X가 처리되지 않은 지질 나노입자의 형광강도(형광도))/(Triton-X가 처리된 지질 나노입자의 형광강도(형광도)) X 100

상기 제1 항암제는 암 치료 및/또는 예방 효과를 나타내는 음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합일 수 있다.

상기 핵산은 소간섭리보핵산(siRNA), 리보좀 리보핵산(rRNA), 리보핵산(RNA), 디옥시리보핵산(DNA), 상보성 디옥시리보핵산(cDNA), 앱타머(aptamer), 전령 리보핵산(mRNA), 운반 리보핵산(tRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), PNA, DNAzyme, 및 유전자교정을 위한 sgRNA 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 "siRNA"란 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 이중 가닥 RNA(duplex RNA), 혹은 단일 가닥 RNA 내부에서 이중 가닥의 형태를 띄는 단일 가닥 RNA를 지칭한다. 타겟 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉-다운 방법으로서 또는, 유전자치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다. 이중 가닥 사이의 결합은 뉴클레오티드 간의 수소 결합을 통해 이루어지고, 이중 가닥 내부의 모든 뉴클레오티드가 상보적으로 완전 결합해야 하는 것은 아니다.

siRNA의 길이는 약 15 내지 60개, 구체적으로 약 15 내지 50개, 약 15 내지 40개, 약 15 내지 30개, 약 15 내지 25개, 약 16 내지 25개, 약 19 내지 25개, 약 20 내지 25개, 또는 약 20 내지 23개 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 siRNA 길이는 이중 가닥 RNA의 한쪽 뉴클레오티드의 갯수, 즉, 염기쌍의 갯수를 의미하며, 단일 가닥 RNA인 경우에는 단일 가닥 RNA 내부의 이중 가닥의 길이를 의미한다. 또한 siRNA는 혈중 안정성을 증가시키거나 면역 반응을 약화시키는 등의 목적을 위해 다양한 작용기를 도입한 뉴클레오티드로 이루어질 수 있다.

본 명세서에서, "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55, 1995). 올리고뉴클레오티드 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-me 피리미딘(특히, 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6(6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다.

본 명세서에서, "단일가닥 디옥시리보핵산(ssDNA)"은 특정 타겟 DNA에 선택적으로 결합하여 안티진(antigene) 효과를 유도하는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다.

본 명세서에서, "앱타머(aptamer)"는 특정 타겟에 결합하는 올리고뉴클레오티드(일반적으로, 20 ~ 80 nt DNA 혹은 RNA)를 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에서 "앱타머"는 올리고뉴클레오티드 앱타머(예컨대, DNA 혹은 RNA aptamer)를 의미한다.

본 명세서에서, "mRNA"는 유전자를 발현 가능한 합성 mRNA(in vitro transcribed mRNA)를 의미한다.

본 명세서에서, "shRNA"는 단일 가닥으로 50 내지 70개로 구성된 뉴클레오티드를 의미하며, in vivo 상에서 스템-루프(stemloop) 구조를 이루고 있다. 5 내지 10개의 뉴클레오티드의 루프 부위 양쪽으로 상보적으로 19 내지 29개의 뉴클레오티드의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템을 형성한다.

본 명세서에서, "miRNA(microRNA)"는 유전자 발현을 조절하며, 전장 21 내지 23개의 뉴클레오티드로 구성된 단일 가닥 RNA 분자를 의미한다. miRNA는 세포 내에서 발현되지 않는 올리고뉴클레오티드이며, 짧은 스템-루프 구조를 가진다. miRNA는 1 또는 2 이상의 mRNA(messenger RNA)와 전체 또는 부분적으로 상동성을 가지며, 상기 mRNA와 상보적인 결합을 통하여 타겟 유전자 발현을 억제시킨다.

본 명세서에서, "리보자임(ribozyme)"은 RNA의 일종으로 특정한 RNA의 염기 서열을 인식하여 자체적으로 이를 절단하는 효소와 같은 기능을 가진 RNA이다. 리보자임은 타겟 전령 RNA 가닥의 상보적인 염기서열로 특이성을 가지고 결합하는 영역과 타겟 RNA를 절단하는 영역으로 되어 있다.

본 명세서에서, "DNAzyme"은 효소 활성을 가지는 단일 가닥 DNA 분자로, 10 내지 23개의 뉴클레오티드로 구성된 DNAzyme(10-23 DNAzyme)은 생리적으로 유사한 조건 하에서 RNA가닥을 특정위치에서 절단한다. 10-23 DNAzyme은 염기쌍을 이루지 않고 노출된 어떠한 퓨린 및 피리미딘 사이를 절단한다. 10-23 DNA효소(DNAzyme)는 15개의 보존된 염기 서열(예를 들면, 5'-GGCTAGCTACAACGA-3')로 이루어진 효소의 활성부위(catalytic domain) 및 상술한 효소의 활성부위 좌우로 RNA 기질을 인식하는 7 ~ 8개의 DNA 염기서열로 이루어진 기질인식 자리(RNA substrate binding domain)로 구성된다.

본 명세서에서, "PNA(Peptide nucleic acid)"는 핵산과 단백질의 성질을 모두 가지고 있는 분자로서, DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합이 가능한 분자를 의미한다. PNA는 핵산염기(nucleobase)가 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로 1999년에 처음 보고되었다(문헌 [Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O, "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide", Science 1991, Vol. 254: pp1497-1500]). PNA는 자연계에서는 발견되지 않고 인공적으로 화학적인 방법으로 합성된다. PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 일으켜서 이중가닥을 형성한다. 길이가 같은 경우 PNA/DNA 이중가닥은 DNA/DNA 이중가닥보다, PNA/RNA 이중가닥은 DNA/RNA 이중가닥보다 안정하다. 펩티드 기본 골격으로는 N-(2-아미노에틸)글리신이 아미드 결합에 의해 반복적으로 연결된 것이 가장 흔히 쓰이며, 이 경우 펩티드 핵산의 기본골격(backbone)은 음전하를 띠는 천연 핵산의 기본골격과 달리 전기적으로 중성이다. PNA에 존재하는 4개의 핵산염기는 공간적 크기와 핵산염기 사이의 거리가 천연 핵산의 경우와 거의 같다. PNA는 화학적으로 천연 핵산보다 안정할 뿐 아니라 핵산분해효소(nuclease)나 단백질분해효소(protease)에 의해 분해되지 않아 생물학적으로도 안정하다.

본 명세서에서, "sgRNA"는 특정 DNA 타겟에 결합하는 올리고뉴클레오티드(일반적으로, RNA 분자)로 crispr RNA(crRNA)와 tracer(tracrRNA)의 복합 단일 RNA 분자를 의미한다. CRISPR system에서 Cas9 nuclease와 함께 특정 DNA 서열을 인식하는데 이용이 되며 선택적인 유전자 절단을 가능케 하는 RNA분자로서, 대략 DNA와 상보적으로 결합이 가능한 20-nt 서열을 포함하며, 총 길이는 100 nt이다.

본 명세서에서, "유전자 교정 단백질"은 Cas9, spCas9, cjCas9, casX, CasY 및 Cpf1 등을 일컬으며, sgRNA와 함께 타겟 DNA 염기 배열을 인식하여 DNA 절단을 일으키는 단백질을 말한다.

일 예에 따른 약물 전달용 조성물은 Cas9 mRNA를 높은 봉입률로 포함할 수 있다. 기존에 알려진 Cas9 mRNA 전달용 조성물은 낮은 비율로 Cas9 mRNA를 포함하여 Cas9 mRNA 전달용 조성물로 활용하는데 한계가 있었다. 이와 달리, 일 예에 따른 지질 나노입자는 높은 봉입률로, 구체적으로 70% 이상의 봉입률로 Cas9 mRNA를 포함할 수 있으며, 이에 따라 유전자 교정치료에 유용하게 활용될 수 있다.

상기 음이온성 약물은 음이온을 띠는 각종 펩타이드, 단백질 약물, 단백질-핵산 구조체 또는 히알루로닉산-펩타이드 접합체, 히알루로닉산-단백질 접합체 등의 음이온성 생체고분자-약물 접합체 등일 수 있다. 상기 단백질 약물의 비제한적인 예로는, 유전자 교정가위인 Cas 9, cpf1 등의 유전자 교정 단백질을 비롯하여 세포사멸 유도인자(예컨대, cytocrome C, caspase 3/7/8/9 등) 및 다양한 세포내 단백질(예컨대, 전사인자) 등일 수 있다.

일 예에 따른 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 내부에 음이온성 약물 및/또는 핵산이 봉입된 지질 나노입자를 포함할 수 있다.

상기 암은 HPV(human papilloma virus) 감염에 의해 유발된 암일 수 있다. 예를 들면, 상기 HPV 감염에 의해 유발된 암은, 이에 제한되는 것은 아니나 자궁경부암, 질암, 외음부암, 항문암, 음경암, 편도암, 인두암, 후두암, 머리와 목암 및 폐의 선암으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

상기 암은 자궁경부암, 자궁내막암, 질암(vagina cancer), 외음부암(vulvacancer), 항문암(anal cancer), 음경암(penis cancer), 편도암(tonsil cancer), 인두암(pharynx cancer), 후두암(larynx cancer), 두경부암, 편평 세포 두경부암, 폐의 선암(lung adenocarcinoma), 비소세포 폐암, 폐의 편평 세포 암종, 폐암, 위암, 육종, 림프종, 호지킨 림프종, 만성 또는 급성 백혈병, 흉선암, 상피암, 타액선암, 간암, 위암, 갑상선암, 부갑상선암, 난소암, 유방암, 전립선암, 식도암, 췌장암, 신경교종, 다발성 골수종, 신세포 암종, 방광암, 융모막암종, 결장암, 구강암, 피부암, 흑색종, 골암, 직장암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 척수 종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 사람을 포함하는 포유동물에 비경구 투여를 포함한 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 비경구 투여는 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

일 예에 따른 상기 약학적 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다.

비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

일 예에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 일 예에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 화합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

일 구체예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 약학적 조성물에 포함된 약물(음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합)의 농도를 기준으로 0.1 내지 100mg/kg, 0.1 내지 50mg/kg, 1 내지 10mg/kg, 또는 1 내지 5mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다.

다른 양상은 상기 약학 조성물을 포함하는, 방사선 치료에 병용하기 위한 암 치료용 약학 조성물; 방사선 민감성 증진용 약학 조성물; 또는 방사선 치료 병용 암 치료용 약학 조성물을 제공할 수 있다. 상기 약학 조성물은 암의 치료시에 암세포의 방사선에 대한 손상 민감도를 향상시켜 암 치료의 효과를 보다 상승시킬 수 있고/있거나 방사선에 대한 암세포의 내성을 억제하여 방사선에 의한 암세포의 사멸 유도가 쉽게 발생하도록 처리할 수 있는 조성물 또는 제제로 활용될 수 있어, 상기 약학 조성물을 포함하는 조성물은 방사선 치료와 병용되어 사용될 수 있다.

본 명세서에서, 방사선 민감성 증진이란 방사선을 이용한 질병 치료에 있어서, 방사선에 대한 세포의 민감성을 증진시키는 것을 의미한다. 이를 통해 방사선 치료효율을 상승시킬 수 있고 특히, 암 치료시 병행처리되면 암 세포의 방사선 민감성이 증진되어 암 세포의 살상 효과 및 증식 억제효과를 낼 수 있게 된다.

일 예에 따른 방사선 치료에 병용하기 위한 암 치료용 약학 조성물 (또는 방사선 민감성 증진용 조성물, 방사선 치료 병용 암 치료용 약학 조성물)은 제1 항암제로서, HPV 16형(HPV16) 또는 HPV 18형(HPV18) 바이러스의 E6 및/또는 E7 단백질; 포스포메발로네이트 키나아제(phosphomevalonate kinase; PMVK) 단백질; 또는 이의 조합의 발현 또는 활성 억제제를 포함할 수 있다. 상기 PMVK 발현 억제제, E6, 및/또는 E7발현 억제제는 PMVK, E6, 및/또는 E7 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA), 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 구성된 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 PMVK 활성 억제제 및/또는 상기 HPV16 (또는 HPV 18형) 바이러스의 E6 및/또는 E7 활성 억제제는 PMVK, HPV16(또는 HPV 18형) 바이러스의 E6, 및/또는 E7 단백질에 특이적으로 결합하는 펩티드, 펩티드 미메틱스, 및 앱타머로 구성된 군으로부터 선택된 것일 수 있다.

일 예에서 상기 약학 조성물은 암의 치료시 방사선 조사와 병용하여 투여될 수 있다. 상기 "방사선 조사"는 악성 세포의 DNA를 손상시키는 국소 치료 방법을 의미한다. 정상 세포는 종양 세포에 비해 이런 손상을 수선하는 능력이 더 크다. 방사선 조사는 이런 차이를 이용하는 치료를 의미하여, 통상적으로 의미하는 방사선을 이용하여 치료하는 방법을 포함한다. 방사선 조사는 치료 목적에 따라 근치(적)방사선치료, 보조적 방사선치료, 고식적 방사선치료로 나눌 수 있다. 근치(적)방사선치료는 종양이 비교적 국소부위에 제한되어 있으며 원격전이가 없을 때, 완치를 목적으로 하는 방사선치료를 말한다. 보조적 방사선치료는 외과적 수술 후 국소 재발 방지를 목적으로 시행하는 방사선치료를 말한다. 방사선치료를 병용함으로써 단순히 재발을 줄일 뿐만 아니라 수술의 범위를 줄여 기능을 유지할 수도 있다. 고식적 방사선치료는 암으로 인한 증상 완화를 목적으로 시행하는 방사선치료이다.

방사선은 고에너지 방사선을 이용하여 암세포를 죽이는 치료법이나, 암세포뿐만 아니라 주위에 있는 정상 조직에도 영향을 미치므로, 치료에 따른 부작용이 발생하기도 한다. 그 예로 피부변화, 탈모, 오심 및 구토, 설사, 점막염/식도염, 구강건조증, 생식기능의 변화 등이 있다.

일 예에 따른 방사선 치료에 병용하기 위한 암 치료용 약학 조성물; 방사선 민감성 증진용 약학 조성물; 또는 방사선 치료 병용 암 치료용 약학 조성물은 방사선의 필요량을 감소시킴으로써 이러한 부작용을 줄일 수 있다. 또한, 방사선에 민감한 암세포뿐만 아니라, 방사선에 저항성이 있는 암세포에서도 방사선 민감도를 증가시킬 수 있다.

전술한 바와 같은 범위(몰비, 중랑부, 및/또는 중량% 범위)로 이온화 가능한 지질, 콜레스테롤, 인지질, 및/또는 지질-PEG 접합체를 포함하는 지질 나노입자를 포함하는 방사선 치료에 병용하기 위한 암 치료용 약학 조성물 (또는 방사선 민감성 증진용 조성물, 방사선 치료 병용 암 치료용 약학 조성물)은 상기 범위 외로 이온화 가능한 지질, 콜레스테롤, 인지질, 및/또는 지질-PEG 접합체를 포함하는 지질 나노입자를 포함하는 경우 보다 방사선에 대한 암세포, 종양세포, 암조직의 민감도를 증가시켜 암세포 사멸, 암 치료 효과가 우수한 것일 수 있다.

일 예에서, 일 예에 따르면, 1,4-비스(3-아미노프로필)피페라진(1,4-bis(3-aminopropyl), 및/또는 세라마이드-PEG 접합체를 포함하는 지질 나노입자를 포함하는 경우 다른 종류의 지질-PEG 접합체를 포함하는 지질 나노입자를 포함하는 경우 보다 방사선에 대한 암세포, 종양세포, 암조직의 민감도를 증가시켜 암세포 사멸, 암 치료 효과가 우수한 것일 수 있다.

또 다른 양상은 상기 약학 조성물 및 제2 항암제를 추가로 포함하는, 항암제 병용 투여용 약학 조성물; 또는 항암 치료 증진용 약학적 조성물을 제공할 수 있다. 상기 약학 조성물에 대해서는 전술한 바와 같다.

상기 제2 항암제는 고시폴, 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴, 및 카르무스틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

일 예에서 상기 제2 항암제는 상기 약학 조성물에 포함되는 지질 나노입자의 내부에 봉입되지 않은 것일 수 있다.

또 다른 양상은 암 (예를 들면, HPV 감염에 의해 유발된 암)의 치료를 위한 화학요법 또는 방사선 요법의 수행 시, 상기 약학 조성물을 병용투여하는 단계를 포함하는, 암의 화합요법 또는 방사선요법에 대한 민감도 증진 방법을 제공할 수 있다.

상기 "병용투여"는 화합요법의 경우, 화학요법을 수행하기 수 시간 전에, (예를 들면, 4시간) 전에 상기 약학 조성물을 투여하는 단계를 먼저 수행할 수 있다. 또한, 방사선요법의 경우, 방사선 조사 1일 후에, 2일에 걸쳐 수 차례 (예를 들면 2~4차례) 상기 약학 조성물을 투여할 수 있다.

다른 양상은, 상기 약학 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다. 암에 대해서는 전술한 바와 같다.

일 예에 따른 암 예방 또는 치료방법은 상기 투여하는 단계 이전에, 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인(선별)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 예에서 상기 환자는 방사선 치료 및/또는 화학 치료를 받은 적이 있는 환; 방사선 치료 및/또는 화학 치료를 받는 중인 환자; 및/또는 방사선 치료 및/또는 화학 치료를 받을 예정인 환자일 수 있다.

상기 치료방법이 적용되는 대상 개체는 암이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 가축 등을 포함하는 포유 동물을 의미하나 이에 한정되지 않는다. 전술한 바와 같은 범위(몰비, 중랑부, 및/또는 중량% 범위)로 이온화 가능한 지질, 콜레스테롤, 인지질, 및/또는 지질-PEG 접합체를 포함하는 지질 나노입자를 포함하는 약학 조성물 (또는 방사선 치료 및/또는 항암제 병용 투여용 약학 조성물)을 대상 개체에 투여함으로써, 개체를 효율적으로 치료할 수 있다.

본 명세서에서, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 대상 개체에게 상기 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구(예를 들면 정맥 내, 피하, 복강내 또는 국소 적용)의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

상기 예방 또는 치료 방법은 상기 약학 조성물(또는 방사선 치료 및/또는 항암제 병용 투여용 약학 조성물)을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치에 의해 결정될 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용할 수 있다.

또 다른 양상은 상기 약학적 조성물을 동물(예를 들면, 인간을 제외한 동물)에게 투여하는 단계; 및 방사선을 조사하는 단계를 포함하는 암에 대한 치료 방법에 관한 것이다.

상기 약학적 조성물을 투여한 뒤 방사선을 조사하는 경우 시너지 효과에 따라 방사선 치료 효과, 나아가 암 치료효과를 현저히 증진될 수 있다.

상기 치료의 대상이 되는 동물은 인간, 가축, 및 애완동물을 포함한 임의의 포유류일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 방사선 조사는 종래 암의 방사선 치료를 위해 사용되었던 임의의 방사선 조사 방법 혹은 추후 개발되는 암에 대한 방사선 조사 방법이 적용될 수 있다.

또 다른 양상은 상기 지질 나노입자 및 상기 제1 항암제를 포함하는 암세포 사멸용 조성물을 제공할 수 있다. 또 다른 양상은 상기 제1 항암제를 상기 지질 나노입자에 봉입시키는 단계를 포함하는 암세포 사멸 방법을 제공할 수 있다. 일 예에 따른 조성물로 사멸시킬 수 있는 암세포는 전술한 암의 세포를 의미할 수 있다.

일 예에 따른 약학 조성물은 생체 친화도가 우수하며, 고효율로 유전자 치료제 등을 전달할 수 있어 암 예방 또는 치료 효과가 우수하고, 다른 항암제 및/또는 방사선 치료와 병용시에도 암 예방 또는 치료효과가 우수하다.

도 1a는 일 예에 따른 지질 나노입자의 예시적인 구조를 나타낸 것이고, 도 1b는 일 예에 따른 나노입자를 Cryo-TEM으로 관찰한 이미지를 나타낸다.
도 2는 CDCl₃에서 246-C10의 ¹H NMR (실온, 400MHz) 결과를 나타낸다.
도 3a(241-C10 LNP 내지 243-C10 LNP) 및 도 3b(244-C10 LNP 내지 246-C10 LNP)는 각 지질 나노입자가 pH 4.1 내지 pH 9.6 범위를 갖는 용액에서 나타나는 형광 강도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 4a 및 도 4b는 각 나노입자의 세포 내 유전자 전달 효율을 나타내는 결과이다. 구체적으로, 도 4a는 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA(luc mRNA)를 봉입한 LNP를 HeLa cell에 형질전환 시킨 후 세포를 용해시켜 측정한 발광 강도를 나타내고, 도 4b는 일 예에 따라 siRNA를 봉입한 LNP를 Hela-Luc 암세포에 형질전환 시킨 후의 루시퍼라제(luciferase) 발현을 측정한 결과를 나타낸다.
도 5a 내지 도 5c는 나노입자의 마우스 내 유전자 전달 효율을 나타내는 결과이다. 구체적으로, 도 5a는 형광이 부착된 siGFP를 LNP로 봉입 후 mouse 모델에 주입하여 48시간 후 IVIS에 의해 생체 분포를 암조직, 간, 신장에서 확인한 결과를 나타내고, 도 5b는 siLuc을 포함하는 지질 나노입자를 Hela-Luc xenograft mouse 모델에 투여하여 루시퍼라제 발현 증감을 생체발광 장비로 측정한 결과를 나타낸다,
도 5c는 siLuc을 포함하는 지질 나노 입자를 Hela-Luc xenograft mouse 모델에 투여하고 주사방법에 따른 루시퍼라제 발현 증감을 생체발광 도표로 나타낸다.
도 6a는 두경부 편평 세포암 세포주, 자궁경부암 세포주에서 siRNA를 포함하는 나노입자에 의한 세포사멸 효과를 나타낸다.
도 6b는 두경부 편평 세포암 세포주와, 자궁경부암 세포주에서 siRNA를 포함하는 나노입자에 의한 mRNA 유전자들의 발현 증감을 나타낸다.
도 6c는 두경부 편평 세포암 세포주와, 자궁경부암 세포주에서 siRNA를 포함하는 나노입자에 의한 단백질들의 발현 증감을 나타낸다.
도 7a는 췌장암 세포주, 폐암 세포주, 유방암 세포주, 자궁경부암 세포주에서 siRNA를 포함하는 나노입자에 의한 세포사멸 효과를 나타낸다.
도 7b는 췌장암 세포주, 폐암 세포주, 유방암 세포주, 자궁경부암 세포주에서 siRNA를 포함하는 나노입자에 의한 mRNA 유전자 발현 증감을 나타낸다.
도 7c는 췌장암 세포주, 폐암 세포주, 유방암 세포주, 자궁경부암 세포주에서 siRNA를 포함하는 나노입자에 의한 단백질 발현 증감을 나타낸다.
도 7d는 췌장암 세포주, 폐암 세포주, 자궁경부암 세포주에서 siRNA를 포함하는 나노입자 및 방사선에 의한 세포사멸을 나타낸다.
도 7e는 췌장암 세포주, 폐암 세포주, 자궁경부암 세포주에서 siRNA를 포함하는 나노입자 및 방사선에 의한 단백질 발현 증감을 나타낸다.
도 7f는 췌장암 세포주 이식 마우스 모델에서 방사선에 대한 siRNA를 포함하는 나노입자에 의한 siRNA 전달 및 mRNA 유전자 발현 증감을 나타낸다.
도 7g는 폐암 세포주 이식 마우스 모델에서 방사선에 대한 siRNA를 포함하는 나노입자에 의한 siRNA 전달 및 mRNA 유전자 발현 증감을 나타낸다.

본 발명은 하기 실시예를 들어 더욱 자세히 설명할 것이나, 하기 실시예로 권리범위가 한정되는 의도는 아니다.

실시예 1. 이온화 가능한 지질(ionizable lipid)의 제조

실시예 1-1. 이온화 가능한 지질의 제조

6원의 헤테로고리 3차 아민을 포함하는 하기 표 1의 아민계 화합물 및 1,2-epoxidodecane(이하, C10)(Sigma-Aldrich, USA)을 1:n (n = 1차 아민 x 2 +2차 아민 x 1)의 몰비로 반응시켜 이온화 가능한 지질을 합성하였다.

구체적으로, 5㎖ 바이알에 상기 표 1의 241 내지 246 아민 각각과 에폭시드(C10)를 1:n (n = 1차 아민 x 2 + 2차 아민 x 1)의 몰비로 마그네틱바와 함께 첨가하여 교반기에서 750rpm, 90℃로 3일 동안 반응시켰다. 이후 WELUX fine silica column(Intertec, 한국)으로 정제 후 상기 반응에 의해 생성된 각 이온화 가능한 지질의 분자량을 계산하고 에탄올을 사용하여 100mg/㎖의 농도로 맞춰 보관하였다. 241 아민과 C10을 이용하여 제조한 이온화 가능한 지질을‘241-C10’으로 명명하고, 다른 종류의 아민을 사용하여 제조한 이온화 가능한 지질도 마찬가지로 ‘사용된 아민 이름(241 내지 246)-C10’으로 명명하였다.

실시예 1-2. 생성된 이온화 가능한 지질의 확인

상기 실시예 1-1에서 제조한 이온화 가능한 지질을 확인하기 위하여, ¹H NMR을 수행하였다. 구체적으로, 실시예 1-1에서 합성된 이온화 가능한 지질(246-C10) 5㎍을 CDCl₃(sigma, USA) 0.5㎖에 희석하여 100mmole 농도가 되도록 준비하였다. 이후 400MHz NMR 전용 튜브에 0.5㎖씩 넣고 상부를 막은 후 파라필름으로 실링하여 Agilent 400MHZ FT-NMR(Agilent, USA)을 이용하여 NMR spectra을 얻었고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이, 246-C10의 각 작용기를 나타내는 신호가 포화된 것을 알 수 있었다.

또한, 실시예 1-1에서 제조한 이온화 가능한 지질(241-C10 내지 246-C10)을 확인하기 위하여, MS분석을 수행하였다. 구체적으로, 이온화 가능한 지질은 0.5ppm 이하 농도로 에탄올에 희석하여 MS 분석을 수행하였다. 분석에 사용된 기기는 Agilent Technologies사 (Palo Alto, USA)의 6230 LC/MS로 분리관은 Agilent Technologies사 Zorbax SB-C18(100 mm×2.1 mm i.d., 3.5 μm)를 사용하였고, 이동상으로 0.1% 개미산이 포함된 증류수(A)와 아세토니트릴(B)의 두 가지 용매를 기울기 용리하였다. 이동상의 용매 기울기는 처음 유기용매 아세토니트릴(B)의 비율을 30%에서 시작하여 2분까지 80%까지 올린 후 다시 유기용매의 비율이 30%까지 낮추고 안정화될 때까지 4분간 유지하였다. 이동상의 유속은 300㎕/min이며, 이때 분석기기 주입량은 2㎕였다. MS분석을 수행한 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 표 2에 나타난 바와 같이 이온화 가능한 지질의 측정된 m/z ratio와 계산된 m/z ratio가 거의 일치하는 것을 확인할 수 있었다.

	Chemical formula	Calculated m/z ratio	Observed m/z ratio
241-C10	C₃₂H₆₆N₂O₂	510.87864	511.5201
242-C10	C₃₁H₆₄N₂O₂	496.85206	497.5043
243-C10	C₃₁H₆₅N₃O₂	511.8667	513.5186
244-C10	C₄₂H₈₇N₃O₃	682.15848	682.6821
245-C10	C₄₃H₈₉N₃O₃	696.18506	696.7045
246-C10	C₅₈H₁₂₀N₄O₄	937.5978	937.9383

상기 결과로부터 실시예 1-1에서 이온화 가능한 지질이 잘 만들어진 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2. 지질 나노입자의 제조

실시예 2-1. 지질 나노입자 제조

상기 실시예 1-1에서 제조한 이온화 가능한 지질(241-C10 내지 246-C10), 콜레스테롤(Cholesterol powder, BioReagent, suitable for cell culture, ≥99%, sigma, 한국), 인지질(DSPC)(Avanti, 미국), 및 지질-PEG 접합체(C16-PEG2000 세라마이드)(C16 PEG2000 Ceramide, Avanti, 미국)를 에탄올에 42.5:13:43:1.5의 몰비로 용해시켰다.

이온화 가능한 지질, 콜레스테롤, 인지질, 및 지질-PEG가 용해된 에탄올 및 아세테이트 버퍼를 1:3의 부피비로 12㎖/min의 유속으로 미세 유체 혼합 장치(Benchtop Nanoassemblr; PNI, Canada)를 통해 혼합하여, 지질 나노입자(LNP)를 제조하였다.

실시예 2-2. 핵산이 봉입된 지질 나노입자의 제조

상기 실시예 1-1에서 제조한 이온화 가능한 지질(241-C10 내지 246-C10), 콜레스테롤(Cholesterol powder, BioReagent, suitable for cell culture, ≥99%, sigma, 한국), 인지질(DSPC 또는 DOPE) (18:0 PC (DSPC), 18:1 (△9-Cis) PE (DOPE), Avanti, 미국), 및 지질-PEG 접합체(C16-PEG2000 세라마이드)(C16 PEG2000 Ceramid, Avanti, 미국)를 에탄올에 용해시켰다. RNA 치료제인 mRNA(luciferase mRNA; 서열번호 1) 30㎍을 시트르산 나트륨 0.75㎖에 희석시키거나, siRNA(siLUC, siGFP, Anti-HPV16 E6/E7 siRNA, Anti-PMVK siRNA 등) 30㎍을 50mM의 아세트산 나트륨 0.75㎖에 희석시켜 수성상을 제조하였다. mRNA 및 siRNA는 Bioneer (한국)에 의뢰하여 합성하여 사용하였다.

이온화 가능한 지질, 콜레스테롤, 인지질, 및 지질-PEG 접합체(이하, 지질-PEG)가 용해된 유기상(에탄올) 및 RNA 치료제(핵산)이 용해된 수성상(아세트산 나트륨 또는 시트르산 나트륨)을 12㎖/min의 유속으로 미세 유체 혼합 장치(Benchtop Nanoassemblr; PNI, Canada)를 통해 혼합하여, 핵산이 봉입된 지질 나노입자(LNP)를 제조하였다. (ⅰ) mRNA 가 봉입된 지질 나노입자를 제조하기 위하여, 이온화 가능한 지질 : 인지질(DOPE) : 콜레스테롤 : 지질-PEG(C16-PEG2000 세라마이드)를 26.5 : 20 : 52.5 내지 51 : 1.0 내지 2.5 (몰비의 총 합이 100이 되도록 콜레스테롤과 지질-PEG 함량을 조절)의 몰비로 에탄올에 용해시켰고, mRNA(luciferase mRNA; 서열번호 1) : 이온화 가능한 지질이 1:10의 중량비가 되도록 유기상 및 수성상을 혼합하여 지질 나노입자를 제조하였다. (ⅱ) siRNA 가 봉입된 지질 나노입자를 제조하기 위하여 이온화 가능한 지질 : 인지질(DSPC) : 콜레스테롤 : 지질-PEG(C16-PEG2000 세라마이드)를 42.5 : 13 : 34.5 내지 44.25 : 0.25 내지 10.0 (몰비의 총 합이 100이 되도록 콜레스테롤과 지질-PEG 함량을 조절) 의 몰비로 에탄올에 용해시켰고, siRNA (siLUC, siGFP, Anti-HPV16 E6/E7 siRNA, Anti-PMVK siRNA등): 이온화 가능한 지질이 1 : 7.5의 중량비가 되도록 유기상 및 수성상을 혼합하여 지질 나노입자(lipid nanoparticle; LNP)를 제조하였다. 사용된 siRNA의 서열은 하기 표 3에 기재하였다. 표 3에서 소문자로 표시된 염기는 2’-O-Methyl로 변형되었다.

		염기서열(5’->3’)	서열번호
siLuc	sense	AAcGcuGGGcGuuAAucAAdTdT	서열번호 2
siLuc	antisense	UUGAUuAACGCCcAGCGUUdTdT	서열번호 3
Cy5.5 labeled siGFP	sense	ACAUGAAGCAGCACGACUUdTdT	서열번호 4
Cy5.5 labeled siGFP	antisense	AAGUCGUGCUGCUUCAUGUdTdT	서열번호 5
Anti-HPV16 E6/E7 siRNA	sense	GACCGGUCGAUGUAUGUCUUG	서열번호 6
Anti-HPV16 E6/E7 siRNA	antisense	AGACAuACAuCGACCGGuCCA	서열번호 7
Anti-PMVK siRNA	sense	UGGACGAUGCUGAGUCAGAdTdT	서열번호 14
Anti-PMVK siRNA	antisense	UCUGACUCAGCAUCGUCCAdTdT	서열번호 15

제조된 LNP를 에탄올 제거 및 체내의 pH와 지질 나노입자의 pH를 맞추기 위해서, 10,000 MWCO 투석 카세트를 사용하여 16 시간 동안 PBS에 대해 투석하였다.

이온화 가능한 지질 '241-C10'를 포함하는 지질 나노입자를 '241-C10 LNP'로 명명하고, 다른 종류의 아민을 포함하는 이온화 가능한 지질을 사용하여 제조한 지질 나노입자(핵산이 봉입된 지질 나노입자 포함)를'포함된 아민 이름(241 내지 246)-C10 LNP'로 명명하였다.

실시예 2-3. 핵산이 봉입된 지질 나노입자의 관찰

siLuc (서열번호 5)가 봉입된 지질 나노입자를 세라마이드-PEG 접합체(C16-PEG2000 세라마이드)를 사용하여 실시예 2-2 와 같이 제조하였다. 제조된 지질 나노입자(세라마이드-PEG 접합체를 1.5몰% 포함)를 200 mesh carbon lacey film Cu-grid에 siRNA 농도 기준으로 60ug 로딩하여 vitrobot으로 액화된 (약 -170도 이하) Ethane에 담구어 plunge freeze 시켜 준비한 후 Cryo-TEM (Tecnai F20, FEI)으로 관찰하고, 그 결과를 도 1b에 나타내었다. 도 1b에 나타난 바와 같이, 속이 꽉찬 형태의 구모양의 100nm 이하 크기의 입자가 관찰되었다.

실시예 3. 지질 나노입자의 pKa

본 실시예에서 인비트로 TNS 분석(In vitro TNS assay)을 통하여 상기 실시예 2-1에서 제형화된 각 지질 나노입자(LNP)의 pKa를 계산하였다. 음이온성 TNS는 양으로 하전된 이온화 가능한 지질과 상호 작용하여 친유성이 되고, pH값이 각각의 LNP의 pKa값에 근접함에 따라 TNS의 친유성이 낮아지고 더 많은 물분자가 TNS 형광을 퀀칭(quenching)시키므로, 6.0 내지 7.0의 pKa를 갖는 지질 나노입자는 생체 내 약물전달 효율이 우수하고, pH에 따른 형광(fluorescence)를 나타내는 그래프에서“s형 곡선”을 나타내는 지질 나노입자는 엔도좀 막과 상호작용이 용이하고, 산성화시에 용이하게 엔도좀을 탈출할 수 있는 것을 의미한다.

구체적으로, 20mM sodium phosphate, 25mM citrate, 20mM ammonium acetate, 및 150mM NaCl를 포함하는 용액의 pH를 0.1N NaOH 및/또는 0.1N HCl를 이용하여 pH 4.1에서 pH 9.6까지 0.5의 간격으로 조정하여 다양한 pH단위의 용액을 제조하였다. 각각의 pH(pH 4.1에서 pH 9.6까지 0.5의 간격의 pH)를 갖는 용액을 100㎕씩 black 96well plate에 첨가하고, 300uM의 TNS 스톡(stock) 용액을 이용하여 6uM의 최종 농도가 되도록 상기 범위의 pH를 갖는 용액에 각각 첨가하였다. 241-C10 LNP 내지 246-C10 LNP를 최종 농도가 20uM가 되도록 혼합용액에 첨가하였다. 형광강도는 Tecan 기기를 통해 325nm의 excitation, 435nm의 emission으로 측정하여, 각 지질 나노입자에 대한 형광강도를 도 3a 및 도 3b에 나타내었고, 각 지질 나노입자에 대한 pKa는 최대형광의 절반에 도달하는 pH값으로 계산하여 하기 표 4에 기재하였다. 도 3b에 나타난 바와 같이, 244-C10 LNP 내지 246-C10 LNP는 비선형 회귀분석(nonlinear regression)을 통해 형광적정 s형 곡선을 나타내는 것을 알 수 있었다.

지질 나노입자	pKa
241-C10 LNP	7.7
242-C10 LNP	8.7
243-C10 LNP	8.2
244-C10 LNP	6.8
245-C10 LNP	6.9
246-C10 LNP	7

상기 표 3에서 확인되는 바와 같이, 일 예에 따른 지질 나노 입자는 생체 내 안전성 및 약물 방출이 우수한 pKa 6.0 내지 7.0범위를 나타내는 것을 확인하였다.

실시예 2-2의 방법과 같이 제조한, 핵산이 봉입된 LNP의 경우에도 포함된 이온화 가능한 지질의 종류(이온화 가능한 지질에 포함된 아민의 종류)에 따라 동일한 양상을 보였다.

실시예 4. 지질 나노입자의 특성 확인

실시예 4-1. 입자크기 측정

본 실시예에서 상기 실시예 2-2에서 제조된 mRNA가 봉입된 지질 나노입자(LNP; 지질-PEG를 1.5몰% 포함)의 크기를 측정하고자 하였다. 상기 실시예 2-2에서 제조한 각 지질 나노입자에 포함된 RNA(luciferase mRNA; 서열번호 1)의 농도가 1㎍/㎖가 되도록 PBS를 사용하여 희석하고, Malvern Zetasizer Nano(Malvern Instruments, UK)에서 동적 광산란(DLS)을 사용하여 LNP의 지름 및 다분산도(PDI; polydispersity index)를 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 5에 기재하였다.

지질 나노입자	지름(nm)	PDI
241-C10 LNP	128	0.259
242-C10 LNP	77	0.210
243-C10 LNP	56	0.225
244-C10 LNP	66	0.149
245-C10 LNP	70	0.210
246-C10 LNP	68	0.143

상기 표 5에서 확인되는 바와 같이, 일 예에 따른 지질 나노 입자는 간세포 내 도입이 용이하고 약물 방출이 우수한 입자크기를 나타내었고, 241-C10 LNP > 243-C10 LNP > 242-C10 LNP = 245-C10 LNP > 244-C10 LNP > 246-C10 LNP 순서대로 PDI 수치가 작고, 입자가 균일한 것을 알 수 있었다.

실시예 4-2. 약물 봉입률 측정

핵산 약물로서 siRNA(siFⅦ siRNA)를 봉입한 각 LNP(지질-PEG를 1.5몰% 포함)의 캡슐화 효율(약물 봉입률, %)을 Ribogreen 분석 (Quant-iT™ RiboGreen® RNA, Invitrogen)을 통해 측정하였다. 상기 실시예 2-2에서 제조한 핵산 약물을 봉입한 LNP를 96 웰 플레이트에서 siRNA의 최종 농도가 4 ~ 7 ㎍/㎖이 되도록 1xTE 완충액 50㎕로 희석하였다. Triton-X를 처리하지 않은 그룹(Triton-x LNP(-))은 1xTE 버퍼 50㎕를 첨가하고, Triton-X를 처리한 그룹(Triton-X LNP(+))은 2% Triton-X 버퍼 50 ㎕를 첨가하였다. 37℃에서 10분간 인큐베이션하여, Triton-X로 LNP를 분해하여 캡슐화된 핵산을 방출시켰다. 그 후 Ribogreen 시약 100㎕를 각 웰에 첨가하였다. Triton LNP(-)와 Triton LNP(+)의 형광 강도(FL)는 Infinite® 200 PRO NanoQuant(Tecan)에서 파장 대역폭(exitation: 485nm, emission: 528nm)으로 측정하였으며, 약물 봉입률(캡슐화 효율, %)은 하기 수학식 3과 같이 계산하였다. 각 LNP에 대한 약물 봉입률(%)은 2회 반복하여 측정된 결과값의 평균값으로 하기 표 6에 나타내었다.

(수학식 3)

약물 봉입률(%)=(Triton LNP(+)의 형광도 - Triton LNP(-)의 형광도)/(Triton LNP(+)의 형광도) X 100

지질 나노입자	봉입률 (Encapsulation efficiency, %)
241-C10 LNP	84
242-C10 LNP	83
243-C10 LNP	91
244-C10 LNP	87
245-C10 LNP	91
246-C10 LNP	94

상기 표 6에서 확인되는 바와 같이, 일 예에 따른 지질 나노입자는 높은 효율로 약물을 봉입할 수 있음을 확인하였다.

실시예 5. 지질 나노입자를 이용한 세포 내 핵산 전달 확인

실시예 5-1. LNP에 포함되는 이온화 가능한 지질의 종류에 따른 핵산 전달 효과

일 예에 따른 LNP를 세포에 형질 전환(transfection)시키기 하루 전에 HeLa 세포를(한국 세포주 은행)을 white plate(96well)에 0.01x10⁶ cells/well 로 분주하여 DMEM media(SH30022, Hyclone, USA)에서 37℃, 0.5~3% CO₂조건으로 배양하였다. 실시예 2-2에서 제조된, 루시퍼라제(luciferase) 유전자를 코딩하는 mRNA(luc mRNA; 서열번호 1)가 봉입된 LNP(지질-PEG를 1.5몰% 포함하는 241-C10 LNP 내지 246-C10 LNP)를 ApoE3 0.1㎍/㎖와 파이펫팅으로 교반 후 상온에서 10분 동안 인큐베이션 후 HeLa cell에 처리(지질 나노입자에 포함된 mRNA 기준으로 100ng/well) 하였다. ApoE3는 LNP 표면에 결합하여 세포 표면에 발현된 LDL 수용체를 통해 LNP가 세포 안으로 엔도시토시스(endocytosis)를 통해 들어갈 수 있도록 하는 역할을 한다.

24시간 후 Bright-Glo™ Luciferase Assay 용액(promega, USA)을 100㎕/well씩 처리하여 10분간 상온에 둔 후 용해된 세포를 Infinite M200 발광 측정기기(Tecan, USA)를 이용하여 발광 강도(luminescence intensity)를 측정하고, 그 결과를 도 4a에 나타내었다. 도 4a에 나타난 바와 같이, pKa 범위가 6.0 내지 7.0인 244-C10 LNP, 245-C10 LNP, 및 246-C10 LNP의 경우, 강한 발광 강도를 나타내었고, 그 중에서도 246-C10 LNP의 경우 발광 강도가 가장 높아, 246-C10 LNP가 세포 내 약물 전달 효율이 가장 높은 것을 알 수 있었다.

실시예 5-2. 암세포 내 핵산 전달 확인

지질 나노입자에 C16 PEG-ceramide 또는 PEG-DSPE를 포함하여 지질-PEG의 함량을 1.5내지 10.0 몰%로 변경하여 상기 실시예 2-2의 방법과 유사하게 지질 나노입자를 제조하였다.

지질 나노입자에 포함된 이온화 가능한 지질: siRNA의 중량비는 7.5 : 1 이였고, LNP에 포함되는 이온화 가능한 지질(246-C10): 인지질(DSPC): 콜레스테롤: 지질-PEG(C16-PEG2000 세라마이드 또는 PEG-DSPE의 몰비는 42.5 : 13 : 39.5 내지 43 : 1.5 내지 5.0 (몰비의 총 합이 100이 되도록 콜레스테롤과 지질-PEG 함량을 조절)이었다.

일 예에 따른 LNP를 세포에 형질 전환(transfection)시키기 하루 전에 HeLa 세포를(한국 세포주 은행)을 white plate(96well)에 0.01x10⁶ cells/well 로 분주하여 DMEM media(SH30022, Hyclone, USA)에서 37℃, 0.5~3% CO₂ 조건으로 배양하였다. siLuc (서열번호 2 및 3)가 봉입된 지질 나노입자를 siRNA 농도 10 nM 로 HeLa-Luc 세포주에 처리 24시간 후 Bright-Glo™ Luciferase Assay 용액(promega, USA)을 100㎕/well씩 처리하여 10분간 상온에 둔 후 용해된 세포를 Infinite M200 발광 측정기기(Tecan, USA)를 이용하여 발광 강도(luminescence intensity)를 측정하여 그 결과를 도 4b에 나타내었다. 사용된 siLuc (루시퍼라제 (luciferase) 유전자를 타겟하는 siRNA)의 서열은 상기 표 3에 기재하였다

도 4b에 나타난 바와 같이, 일 예에 따른 지질 나노입자는 암세포인 Hela-Luc 세포로의 핵산 전달 효과가 우수하였다.

실시예 5-3. 약물동태학적 분석 (Pharmacokinetic Analysis)

상기 실시예 2-2의 방법과 같이 지질 나노입자에 포함되는 지질-PEG의 함량을 1.5 내지 5.0몰%로 하여 Anti-HPV16 E6/E7 siRNA (서열번호 6 및 7; 표 3) 가 봉입된 지질 나노입자를 제조하였다. 지질 나노입자에 포함된 이온화 가능한 지질: siRNA의 중량비는 7.5 : 1 이였고, LNP에 포함되는 이온화 가능한 지질(246-C10): 인지질(DSPC): 콜레스테롤 : 지질-PEG(C16-PEG2000 세라마이드)의 몰비는 42.5 : 13 : 39.5 내지 43 : 1.5 내지 5.0 이었다. 상기에서 제조한 지질 나노입자의 지름 및 PDI를 상기 실시예 4-1의 방법과 동일하게 측정하여 하기 표 7에 나타내었다.

지질-PEG (몰%)	평균 지름 (nm)	PDI
5.0	67.4	0.312
1.5	122.9	0.214

anti-HPV16 E6/E7 siRNA가 봉입된 지질나노입자 2 mg/kg 약물을 Spragu-Dawley 렛트(7-8 주령, male)의 대퇴정맥에 주사(femoral vein)한 후, 0.5분 ~ 24시간 동안 혈액을 채취하고 즉시 13,000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리를 한 후, plasma를 확보하여 -70℃ deep freezer에 보관하였다. 확보된 plasma로부터 stem-loop RT-qPCR 검출법을 사용하여 plasma 내에 Anti-HPV16 E6/E7 siRNA 를 확인하였다. siRNA에 특이적인 Stem-loop RT primer와 probe를 선별하여 siRNA 표준시료를 이용하여 Real time PCR 기법을 적용하였을 때 siRNA 표준시료에 대한 Cp 값(y)간의 선형분석 결과, 기울기 평균과 결정계수 R²을 가지고 siRNA 표준시료와 Cp 값 간의 회귀성을 분석하여 stem-loop RT-qPCR 검출법을 수행하였다. WinNonlin 프로그램을 이용하여 약물동태 파라미터를 분석한 결과를 표 8에 나타내었다.

	Naked	246C10 Lipid (지질-PEG 5%)	246C10 Lipid (지질-PEG 1.5%)
T max (min)	1.000	1.000	30.000
C max (ng/mL)	146025.200	473280.700	289864.600
T 1/2 (min)	3.384	87.321	588.182
CL (mL/min/kg)	2.020	0.034	0.006

표 8에 나타난 바와 같이, siHPV16_E6/E7가 봉입된 LNP는 naked siRNA에 비하여 약물투여 후 최고 혈중농도(Cmax)가 높고, 약물 소실 반감기(T1/2)가 더 오래 유지되고, 약물의 청소율 (CL)이 낮아, 채내에서 오랜시간 유지되고 약물이 소실되는 정도가 낮아 생체 내 안정성(in vivo stability)이 증가되었다.

실시예 5-4. 암조직으로의 siRNA-LNPs 이행 확인

지질 나노입자에 포함되는 지질-PEG의 함량을 5.0몰%로 하여 Cy5.5 labeled siGFP(서열 번호 4 및 5; 표 3) 가 봉입된 지질 나노입자(246-C10 LNP)를 제조하였다. 지질 나노입자에 포함된 이온화 가능한 지질: siRNA의 중량비는 7.5 : 1 이였고, LNP에 포함되는 이온화 가능한 지질(246-C10): 인지질(DSPC): 콜레스테롤 : 지질-PEG(C16-PEG2000 세라마이드)의 몰비는 42.5 : 13 : 39.5 : 5.0이었다. 상기에서 제조한 지질 나노입자의 지름 및 PDI를 상기 실시예 4-1의 방법과 동일하게 측정하여 하기 표 9에 나타내었다.

지질-PEG (%)	평균 지름 (nm)	PDI
5.0	30	0.142

C57BL/6 female 7주령 20g 마우스에 5x10⁶개의 HeLa 세포를 피하로 접종하였다. 마우스의 종양 부피 및 체중을 주 2 회 모니터링 하였다. 종양 크기는 디지털 캘리퍼스를 사용하여 측정되었다. 종양의 부피는 V = 0.5 x W² x L (V = 종양 부피, W = 종양 폭, L = 종양 길이)을 사용하여 계산했다. 종양 크기가 100mm³에 도달했을 때 지질 나노입자를 마우스에 주입하고 주입 48 시간 후 IVIS에 의해 생체 분포를 확인하였다. 암조직, 간, 신장에서의 형광을 측정하고 그 결과를 도 5a에 나타내었다. 도 5a에 나타난 바와 같이, 일 예에 따른 지질 나노입자를 투여시 암조직으로의 이행이 우수한 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5-5. Xenograft tumor mouse 모델에서의 in vivo siRNA 전달 및 유전자 조절 확인

상기 실시예 5-2에서 확인한 바와 같이, 인비트로에서 우수한 유전자 발현 효과(유전자 전달 효과)를 나타내는 246-C10 LNP의 생체 내 약물전달 효율 및 생체 분포(biodistribution)를 본 실시예에서 확인하고자 하였다.

상기 실시예 5-4의 방법대로 siLuc (서열 번호 2 및 3; 표3)을 246-C10 LNP(지질-PEG를 1.5몰% 포함)로 제조하고, 각 나노입자를 PBS에서 16시간 동안 투석하여 에탄올을 제거하였다. C57BL/6 Female 7주령 마우스(오리엔트 바이오) 20g 마우스에 5x10⁶개의 HeLa-Luc 암세포를 피하로 접종하였다. 마우스의 종양 부피 및 체중을 주 2 회 모니터링 하였다. 종양 크기는 디지털 캘리퍼스를 사용하여 측정되었다. 종양의 부피는 V = 0.5 x W² x L (V = 종양 부피, W = 종양 폭, L = 종양 길이)을 사용하여 계산했다. 종양 크기가 100mm³에 도달했을 때 siLuc 지질 나노입자와 Negative control siRNA를 마우스에 주입하고 주입 48 시간 후 IVIS(PerkinElmer, USA) 장비를 이용하여 생체발광(bioluminescence) 강도를 도5b에 나타내었다. 도 5b에 나타난 바와 같이, HeLa-Luc xenograft 마우스의 생체 내에서 상보적인 siLuc 지질 나노입자를 투여한 그룹이 Negative control siRNA 지질 나노입자를 투여한 그룹보다 발광 강도가 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 일 예에 따른 지질 나노입자의 전달 및 보존력이 우수한 것을 확인할 수 있었다

상기 실시예 5-4의 방법대로 siLuc (서열 번호 2 및 3; 표 3)을 246-C10 LNP(지질-PEG를 1.5몰% 포함)로 제조하고, 각 나노입자를 PBS에서 16시간 동안 투석하여 에탄올을 제거하였다. 도 5b와 동일한 방법으로 Xenograft 마우스 모델을 제작하여 주사방법에 따른 생체발광 강도를 측정하였다.

siLuc 이 봉입된 지질 나노입자를 정맥주사 (IV(intravenous) injection) 또는 종양내 주사 (IT (intratumoral)) 방법으로 주사 후 3시간 뒤에 IVIS(PerkinElmer, USA) 장비를 통해 생체발광(bioluminescence)을 확인하여, 그 결과를 도 5c에 나타내었다. 5c에 나타낸 바와 같이, siLuc를 포함하는 지질 나노입자가 투여된 주사방법에 따른 생체 발광을 도표로 표기하였으며, 정맥주사, 종양내 주사 방법 모두, 발광 강도를 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6. Anti-HPV16 E6/E7 siRNA 를 이용한 암 치료 효과 확인

실시예 6-1. HPV16 E6/E7 유전자를 타겟하는 siRNA를 봉입한 지질 나노입자의 제조

상기 실시예 2-2의 방법과 유사하게 HPV16의 E6/E7 유전자를 타겟하는 siRNA(서열번호 6 및 7; 표 3)가 봉입된 246-C10 지질 나노입자 (지질-PEG를 1.5몰% 포함)를 제조하였다.

실시예 6-2. 암세포 사멸 효과 측정

암세포의 사멸 효과를 측정하기 위하여 두경부 편평 세포암 (head and neck squamous carcinoma carcinoma(HNSCC) 세포주인 UM-SCC-47 (Meark Cat No. SCC071) 세포와, 자궁경부암 세포주인 Ca Ski (ATCC Cat No. CRL-1550) 세포주에 상기 실시예 6-1에서 제조한 Anti-HPV16 E6/E7 siRNA이 봉입된 LNP를 형질주입 (Transfection) 시켰다.

두경부 편평 세포암 세포주인 UM-SCC-47는 10% 우태아 혈청과 항생제가 포함된 DMEM 배지(Hyclone 사 Cat: SH30243.01)에서 37℃, 5% CO₂ 및 100% 습도 조건으로 배양하였다. 자궁경부암 세포주인 Ca Ski는 10% 우태아 혈청과 항생제가 포함된 RPMI (Hyclone 사 Cat: SH30027.01) 배지에서 37℃, 5% CO₂ 및 100% 습도 조건으로 배양하였다.

형질주입 24시간 전 6well plate에 1x10⁵ 세포를 넣어 배양시킨 뒤, Anti HPV16 E6/E7 siRNA가 봉입된 246-C10 LNP (지질-PEG를 1.5몰% 포함)을 단독 투여군 및 병용 투여군에서 UM-SCC-47에 10 ~ 30nM 농도로 처리하고, Ca Ski 세포에 10~40nM 농도로 처리하였으며, 시스플라틴(CDDP)의 경우 단독 투여군 및 병용 투여군에서 UM-SCC-47에서 1~5uM 농도로, Ca Ski에서 5~10uM 농도로 처리하고, Apoe4 1.5ug/ml과 상온에서 15 분간 결합시킨 뒤, 6 well plate에 처리하였다. 형질 주입 후 48시간 이후에 혈구 계산기(hemocytometer)를 이용하여 위상차 현미경으로, 세포내의 trypan blue의 염색정도를 확인하여 세포 생존율을 확인하고 그 결과를 도 6a에 나타내었다.

도 6a에 나타난 바와 같이, 일 예에 따라 siRNA 가 봉입된 지질 나노입자에 의한 암세포 사멸 효과가 우수하고, 항암제(CDDP)와 병용시 사멸 효과가 더욱 증가하였다.

실시예 6-3. mRNA 발현 측정

본 실시예에서 일 예에 따른 지질 나노입자에 의한 약물(siRNA) 전달 효율을 측정하기 위해 HPV 16 E6/E7의 mRNA 발현을 측정하고, 일 예에 따른 지질 나노입자에 의한 암 예방 또는 치료 효과를 확인하기 위하여 p21 mRNA 발현을 측정하였다.

mRNA발현 정도를 측정하기 위하여 두경부 편평 세포암 (head and neck squamous carcinoma carcinoma(HNSCC) 세포주인 UM-SCC-47 (Meark Cat No. SCC071) 세포, 자궁경부암 세포주인 Ca Ski (ATCC Cat No. CRL-1550) 세포주에 상기 실시예 6-1에서 제조한 Anti-HPV16 E6/E7 siRNA이 봉입된 LNP를 형질주입 (Transfection) 시켰다. 두경부 편평 세포암 세포주인 UM-SCC-47 와 자궁경부암 세포주인 Ca Ski는 실시예 6-2와 같이 배양하였다.

형질주입 24시간 전 6well plate에 1x10⁵ 세포를 넣어 배양시킨 뒤, Anti HPV16 E6/E7 siRNA가 봉입된 246-C10 LNP (지질-PEG를 1.5몰% 포함)을 단독 투여군 및 병용 투여군에서 UM-SCC-47에서 10 ~ 30nM 농도로 처리하고, Ca Ski 세포에서 10~40nM 농도로 처리하였다. 시스플라틴(CDDP)의 경우 단독 투여군 및 병용 투여군에서 UM-SCC-47에서 1~5uM 농도로, Ca Ski에서 5~10uM 농도로 처리하고, Apoe4 1.5ug/ml과 상온에서 15 분간 결합시킨 뒤, 6 well plate에 처리하였다.

형질 주입 후 48시간 이 후에 세포를 용해하여 RiboEX ^TM(GeneAll, Cat no 301-001)를 이용하여 제조사 지침에 따라 RNA를 추출하여, HPV16 E6/E7 (Forward primer: 서열번호 8 / Reverse primer: 서열번호 9/ Probe : UPL#63 (Roche)), P21 (Forward primer: 서열번호 10/ Reverse primer: 서열번호 11/ Probe : UPL#82 (Roche)), HPRT1 (Forward primer: 서열번호 12 / Reverse primer: 서열번호 13/ Probe : UPL#73(Roche)) 의 mRNA의 발현 정도를 확인할 수 있는 Quantitative Real time - Polymerase chain Reaction (qRT-PCR) 을 수행하고 그 결과를 도 6b에 나타내었다. HPRT1은 House keeping gene으로서 사용되었고, 사용한 프라이머 서열은 하기 표 10에 기재하였다.

프라이머		염기서열(5’->3’)	서열번호
HPV16_E6/E7	Forward	CCACTGATCTCTACTGTTATGAGCAA	서열번호 8
HPV16_E6/E7	Reverse	CCAGCTGGACCATCTATTTCA	서열번호 9
P21	Forward	CGAAGTCAGTTCCTTGTGGAG	서열번호 10
P21	Reverse	CATGGGTTCTGACGGACAT	서열번호 11
HPRT1	Forward	TGACCTTGATTTATTTTGCATACC	서열번호 12
HPRT1	Reverse	CGAGCAAGACGTTCAGTCCT	서열번호 13

도 6b에 나타낸 바와 같이, Anti-HPV16 E6/E7 siRNA가 봉입된 지질 나노입자 처리시, HPV16 E6/E7의 mRNA 발현이 현저히 감소하고, 종양억제 유전자 p53 하위 유전자인 p21 mRNA 발현은 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었고, 화학항암제(Cisplatin, CDDP)와 병용시 HPV16 E6/E7의 mRNA 발현 감소 및 p21 mRNA 발현 증가가 더욱 증가하였다.

실시예 6-4. 단백질 발현 측정

본 실시예에서, 일 예에 따른 지질 나노입자에 의한 암 예방 또는 치료 효과를 확인하기 위하여 p21 및 p53 단백질 발현을 측정하였다.

단백질의 발현 정도를 측정하기 위하여 두경부 편평 세포암 (head and neck squamous carcinoma carcinoma(HNSCC)) 세포주인 UM-SCC-47 (Meark Cat No. SCC071) 세포, 자궁경부암 세포주인 Ca Ski (ATCC Cat No. CRL-1550) 세포주에 상기 실시예 6-1에서 제조한 Anti-HPV16 E6/E7 siRNA이 봉입된 LNP를 형질주입 (Transfection) 시켰다. 두경부 편평 세포암 세포주인 UM-SCC-47 와 자궁경부암 세포주인 Ca Ski는 실시예 6-2와 같이 배양하였다.

형질주입 24시간 전 6well plate에 1x10⁵ 세포를 넣어 배양시킨 뒤 Anti HPV16 E6/E7 siRNA가 봉입된 246-C10 LNP (지질-PEG를 1.5몰% 포함)을 단독 투여군 및 병용 투여군에서 UM-SCC-47에서 10 ~ 30nM 농도로 처리하고, Ca Ski 세포에서 10~40nM 농도로 처리하였다. 시스플라틴(CDDP)의 경우 단독 투여군 및 병용 투여군에서 UM-SCC-47에서 1~5uM 농도로, Ca Ski에서 5~10uM 농도로 처리하고, Apoe4 1.5ug/ml과 상온에서 15 분간 결합시킨 뒤, 6 well plate에 처리하였다.

형질 주입 48시간 이후에 웨스턴 블럿 분석 방법을 이용하여 p21, p53, House keeping 단백질인 b-actin의 발현 수준을 측정하였다. RIPA 세포용해 완충액 (RIPA Cell lysis buffer: 150mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (Ph7.4), 5 mM EDTA, 0.1% SDS, 0.5% deoxycholate 및 1% NP-40)을 첨가하여 용해하였고, 단백질의 양을 정량할수 있는 BCA assay를 통하여 동일한 단백질량으로 웨스턴 블럿을 진행하였다. 1차 항체 Anti-P21 (Santacruz Cat no. SC-817) 은 1:2000으로 희석하여 사용하였고, Anti-p53 (Santacruz Cat no. SC-47698)은 1:2000으로 희석하여 사용하였고, Anti-B-actin (Santacruz Cat no. SC-47778)는 1:3000으로 희석하여 사용하였다. 2차 항체로는 IgG-Mouse-HRP 가 결합된 항체를 1:5000으로 희석하여 수행하고 그 결과를 도 6c에 나타내었다.

도 6c에 나타낸 바와 같이, Anti-HPV16 E6/E7 siRNA가 봉입된 지질 나노입자 단독 또는 항암제(CDDP)와 병용 처리시, p21 및 p53 단백질 발현이 현저히 증가하였다.

실시예 7. PMVK siRNA를 이용한 암 치료 효과 확인

실시예 7-1. PMVK를 타겟하는 siRNA를 봉입한 지질 나노입자의 제조

상기 실시예 2-2의 방법과 유사하게 PMVK를 타겟하는 siRNA (서열번호 14 및 15; 표 3)가 봉임된 246-C10 지질 나노입자 (지질-PEG를 1.5몰% 포함)를 제조하였다.

실시예 7-2. 암세포 사멸 효과 측정

암세포의 사멸 효과를 측정하기 위하여 췌장암 세포주인 Miapaca-2 (ATCC Cat.no CL-1420), 폐암 세포주 A549 (ATCC Cat.no CCL-185), 유방암 세포주인 MCF-7 (ATCC Cat.no HTB-22), 및 자궁경부암 세포주인 Hela (ATCC Cat.no CCL-2) 세포주에 상기 실시예 7-1에서 제조한 Anti-PMVK siRNA가 봉입된 LNP를 형질주입 (Transfection) 시켰다.

췌장암 세포주인 Miapaca-2, 자궁경부암 세포주인 Hela는 10% 우태아 혈청과 항생제가 포함된 DMEM 배지(Hyclone 사 Cat: SH30243.01)에서 37℃, 5% CO₂ 및 100% 습도 조건으로 배양하였다.

폐암 세포주 A549, 유방암 세포주인 MCF-7는 10% 우태아 혈청과 항생제가 포함된 RPMI (Hyclone 사 Cat: SH30027.01) 배지에서 37℃, 5% CO₂ 및 100% 습도 조건으로 배양하였다.

형질주입 24시간 전 6well plate에 0.5~1x10⁵ 세포를 넣어 배양시킨 뒤 Anti PMVK siRNA가 봉입된 246-C10 LNP (지질-PEG를 1.5몰% 포함)을 단독 투여군 및 병용 투여군에서 20~40nM 농도로 처리하였고, 시스플라틴((CDDP) Sigma, Cat no. P4394)의 경우 단독 투여군 및 병용 투여군에서 1~5uM 농도로 처리하였으며, Apoe4 1.5ug/ml을 상온에서 15 분간 결합시킨 뒤, 6 well plate에 처리하였다. 형질 주입 후 48시간 이후에 혈구 계산기(hemocytometer)를 이용하여 위상차 현미경으로, 세포내의 trypan blue의 염색정도를 확인하여 세포 생존율을 확인하고 그 결과를 도 7a에 나타내었다.

도 7a에 나타난 바와 같이, 일 예에 따른 약물이 봉입된 지질 나노입자에 의해 siRNA에 의한 암세포 사멸 효과가 증가하였다.

실시예 7-3. mRNA 발현 측정

본 실시예에서 일 예에 따른 지질 나노입자에 의한 약물(siRNA) 전달 효율을 측정하기 위해 폐암, 췌장암, 유방암, 자궁경부암 세포에서 PMVK mRNA 발현을 측정하였다.

mRNA의 발현 정도를 측정하기 위하여 췌장암 세포주인 Miapaca-2 (ATCC Cat.no CL-1420), 폐암 세포주 A549 (ATCC Cat.no CCL-185), 유방암 세포주인 MCF-7 (ATCC Cat.no HTB-22), 및 자궁경부암 세포주인 Hela (ATCC Cat.no CCL-2) 세포주에 상기 실시예 7-1에서 제조한 Anti-PMVK siRNA가 봉입된 LNP를 형질주입 (Transfection) 시켰다. 췌장암 세포주인 Miapaca-2, 자궁경부암 세포주인 Hela, 폐암 세포주 A549, 유방암 세포주인 MCF-7는 실시예 7-2와 같이 배양하였다.

형질주입 24시간 전 6well plate에 0.5~1 x 10⁵ 세포를 넣어 배양시킨 뒤 Anti PMVK siRNA가 봉입된 246-C10 LNP (지질-PEG를 1.5몰% 포함)을 단독 투여군 및 병용 투여군에서 20~40nM 농도로 처리하였고, 시스플라틴((CDDP) Sigma, Cat no. P4394)의 경우 단독 투여군 및 병용 투여군에서 1~5uM 농도로 처리하였으며, Apoe4 1.5ug/ml을 상온에서 15 분간 결합시킨 뒤, 6 well plate에 처리하였다. 형질 주입 후 48시간 이 후에 세포를 용해하여 RiboEX ^TM(GeneAll, Cat no 301-001)를 이용하여 제조사 지침에 따라 RNA를 추출하고, PMVK (Forward: 서열번호 16 /Reverse: 서열번호 17 /Probe: UPL#49 (Roche)), B-ACTIN (Forward: 서열번호 18 /Reverse: 서열번호 19 /Probe: UPL#64(Roche))의 mRNA의 발현 정도를 확인할 수 있는 Quantitative Real time-Polymerase chain Reaction (qRT-PCR)을 수행하고 그 결과를 도 7b에 나타내었다. B-ACTIN은 House keeping gene으로서 사용되었고, 사용한 프라이머 서열은 하기 표 11에 기재하였다.

프라이머		염기서열(5’->3’)	서열번호
PMVK	Forward	ATATCCCCAGTGCCAGTCC	서열번호 16
PMVK	Reverse	AACAAGGGGCTGAGAACATC	서열번호 17
B-ACTIN	Forward	CCAACCGCGAGAAGATGA	서열번호 18
B-ACTIN	Reverse	CCAGAGGCGTACAGGGATAG	서열번호 19

도 7b에 나타낸 바와 같이, PMVK siRNA가 봉입된 지질 나노입자를 암세포에 처리시, PMVK의 mRNA 발현이 현저히 감소하였다.

실시예 7-4. 단백질 발현 측정

본 실시예에서 일 예에 따른 지질 나노입자에 의한 약물(siRNA) 전달 효율을 측정하기 위해 폐암, 췌장암, 유방암, 자궁경부암 세포에서 PMVK의 단백질 발현을 측정하였다.

단백질의 발현 정도를 측정하기 위하여 췌장암 세포주인 Miapaca-2 (ATCC Cat.no CL-1420), 폐암 세포주 A549 (ATCC Cat.no CCL-185), 유방암 세포주인 MCF-7 (ATCC Cat.no HTB-22), 및 자궁경부암 세포주인 Hela (ATCC Cat.no CCL-2) 세포주에 상기 실시예 7-1에서 제조한 Anti-PMVK siRNA가 봉입된 LNP를 형질주입 (Transfection) 시켰다. 췌장암 세포주인 Miapaca-2, 자궁경부암 세포주인 Hela, 폐암 세포주 A549, 유방암 세포주인 MCF-7는 실시예 7-2와 같이 배양하였다.

형질주입 24시간 전 6well plate에 0.5~1 x 10⁵ 세포를 넣어 배양시킨 뒤 Anti PMVK siRNA가 봉입된 246-C10 LNP (지질-PEG를 1.5몰% 포함)을 단독 투여군 및 병용 투여군에서 20~40nM 농도로 처리하였고, 시스플라틴((CDDP) Sigma, Cat no. P4394)의 경우 단독 투여군 및 병용 투여군에서 1~5uM 농도로 처리하였으며, Apoe4 1.5ug/ml을 상온에서 15 분간 결합시킨 뒤, 6 well plate에 처리하였다. 형질 주입 48시간 이후에 웨스턴 블럿 분석 방법을 이용하여 PMVK 발현 수준을 측정하였다. RIPA 세포용해 완충액 (RIPA Cell lysis buffer: 150mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH7.4), 5 mM EDTA, 0.1% SDS, 0.5% deoxycholate 및 1% NP-40)을 첨가하여 용해하였고, 단백질의 양을 정량할수 있는 BCA assay를 통하여 동일한 단백질량으로 웨스턴 블럿을 진행하였다. 1차 항체 Anti-PMVK(Atlas antibody Cat no. HPA029900) 은 1:2000으로 희석하여 사용하였다. 2차 항체로는 IgG-Mouse-HRP 가 결합된 항체를 1:5000으로 희석하여 수행하고 그 결과를 도 7c에 나타내었다.

도 7c에 나타낸 바와 같이, Anti-PMVK siRNA가 봉입된 지질 나노입자를 암세포에 처리시 PMVK 단백질 발현이 현저히 감소하였다.

실시예 7-5. 암세포 주에서 PMVK 넉-다운시 방사선 민감도에 의한 생존율 측정

본 실시예에서 일 예에 따른 지질 나노입자에 의한 약물(siRNA) 전달 효율을 측정하기 위해 폐암, 췌장암, 자궁경부암 세포에서 방사선 치료 저항성 관련인자로 알려진 PMVK가 넉 다운시의 세포 생존율 측정하였다.

세포 생존율을 측정하기 위하여 췌장암 세포주인 Miapaca-2 (ATCC Cat.no CL-1420), 폐암 세포주 A549 (ATCC Cat.no CCL-185), 자궁경부암 세포주인 Hela (ATCC Cat.no CCL-2) 및 Ca Ski (ATCC Cat.no CRL-1550)세포주에 상기 실시예 2-2의 방법과 유사하게 PMVK 유전자를 타겟하는 siRNA (서열번호 14 및 15; 표 3)가 봉입된 246-C10 지질 나노입자 (지질-PEG를 1몰% 포함)를 제조하여 형질주입 (Transfection) 시켰다. 췌장암 세포주인 Miapaca-2, 자궁경부암 세포주인 Hela, Ca Ski, 폐암 세포주 A549는 실시예 7-2와 같이 배양하였다.

형질주입 24시간 전, Miapaca-2, A549, HeLa, Ca Ski 세포를 0.3 × 10⁴개로 96웰 플레이트에 시딩한 후 24시간 배양하였다. 배양된 세포에 상기 실시예 7-5에서 제조한 Anti-PMVK siRNA가 봉입된 246-C10 지질 나노입자 (지질-PEG를 1몰% 포함)를 형질주입 (Transfection) 시켰다. 또한 6-MV 광자선 선형 가속기(6-MV photon beam linear accelerator)를 이용하여 10 Gy의 방사선을 처리하였다. 방사선 처리 후 2일 째에 CCK-8 어세이를 통해 세포의 생존율을 확인하였다. 그 결과를 도 7d에 나타내었다.

도 7d에 나타낸 바와 같이, Anti-PMVK siRNA가 봉입된 246-C10 지질 나노입자와 방사선을 암세포에 처리시 세포사멸이 현저히 증가하였다.

실시예 7-6. 암세포 주에서 PMVK 나노입자에 의한 넉-다운시 방사선 민감도에 의한 단백질 발현 측정

본 실시예에서 일 예에 따른 지질 나노입자에 의한 약물(siRNA) 전달 효율을 측정하기 위해 폐암, 췌장암, 자궁경부암 세포에서 방사선 치료 저항성 관련인자로 알려진 PMVK를 넉 다운시의 단백질 발현을 측정하였다.

단백질 발현을 측정하기 위하여 췌장암 세포주인 Miapaca-2 (ATCC Cat.no CL-1420), 폐암 세포주 A549 (ATCC Cat.no CCL-185), 자궁경부암 세포주인 Hela (ATCC Cat.no CCL-2) 및 Ca Ski (ATCC Cat.no CRL-1550)세포주에 상기 실시예 7-5에서 제조한 Anti-PMVK siRNA가 봉입된 LNP를 형질주입 (Transfection) 시켰다. 췌장암 세포주인 Miapaca-2, 자궁경부암 세포주인 Hela, Ca Ski, 폐암 세포주 A549는 실시예 7-2와 같이 배양하였다.

형질주입 24시간 전, Miapaca-2, A549, HeLa, Ca Ski 세포를 1.0 × 10⁵개로 6웰 플레이트에 시딩한 후 24시간 배양하였다. 배양된 세포에 상기 실시예 7-5에서 제조한 Anti-PMVK siRNA가 봉입된 246-C10 LNP(지질-PEG를 1.0몰% 포함)를 형질주입 (Transfection) 시켰다. 또한 6-MV 광자선 선형 가속기(6-MV photon beam linear accelerator)를 이용하여 10 Gy의 방사선을 처리하였다. 방사선 처리 후 2일 째에 단백질을 추출한 뒤 PMVK 항체를 이용한 웨스턴 블로팅을 수행함으로써 단백질의 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 7e에 나타내었다.

도 7e에 나타낸 바와 같이, Anti-PMVK siRNA가 봉입된 246-C10 지질 나노입자와 방사선을 암세포에 처리시 PMVK siRNA에 의한 단백질 발현이 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 7-7. Xenograft tumor mouse 모델에서의 siRNA를 포함하는 나노입자에 의한 in vivo siRNA 전달 및 유전자 조절 확인

본 실시예에서 일 예에 따른 지질 나노입자에 의한 약물(siRNA) 전달 효율을 측정하기 위해 폐암, 췌장암 Xenograft mouse 모델에서 방사선 치료 저항성 관련인자로 알려진 PMVK가 넉 다운시의 종양 크기 변화를 측정하였다.

BALB/c male 5주령 누드 마우스(오리엔트 바이오) 20g 마우스 오른쪽 허벅지에 3x10⁶개의 Miapaca-2 암세포(ATCC, Cat. No. CRL-1420)와 1x10⁶개의 A549 암세포(ATCC, Cat. No. CCL-185)를 피하로 접종하였다. 마우스 종양 부피 및 체중을 주 3회 모니터링 하였다. 종양 크기는 디지털 캘리퍼스를 사용하여 측정되었다. 종양의 부피는 V = 0.5 x W² x L (V = 종양 부피, W = 종양 폭, L = 종양 길이)을 사용하여 계산했다. 상기 실시예 7-5의 방법과 유사하게 PMVK 유전자를 타겟하는 siRNA (서열번호 14 및 15; 표 3)가 봉입된 246-C10 지질 나노입자 (지질-PEG를 1몰% 포함)를 제조하였다. 종양의 크기가 100mm³ ± 20에 도달하였을 때 PMVK 가 봉입된 246-C10 지질 나노입자와 Vehicle LNP를 Miapaca-2 Xenograft 누드 마우스에서 IV(Intravenouse)로 첫째 주, 셋째 주에 QD x 3 로 3mg/kg으로 주입하였고, 나노입자 주입 후 주 1회 6-MV 광자선 선형 가속기(6-MV photon beam linear accelerator)를 이용하여 4 Gy의 방사선을 처리하였다. 그 결과를 7f에 나타내었다.

상기 실시예 7-5의 방법과 유사하게 PMVK 유전자를 타겟하는 siRNA (서열번호 14 및 15; 표 3)가 봉입된 246-C10 지질 나노입자 (지질-PEG를 1몰% 포함)를 제조하였다. 종양의 크기가 100mm³ ± 20에 도달하였을 때 PMVK 가 봉입된 LNP와, Vehicle LNP를 A549 Xenograft 누드 마우스에서 IV(Intravenouse)로 첫째 주, 셋째 주에 QD x 3 로 3mg/kg으로 주입하였고, 또한 나노입자 주입 후 주 1회 6-MV 광자선 선형 가속기(6-MV photon beam linear accelerator)를 이용하여 2 Gy의 방사선을 처리하였다. 그 결과를 도 7g에 나타내었다. 도 7f와 도 7g에 나타낸 바와 같이, Anti-PMKV siRNA를 포함하는 246-C10 지질 나노입자가 투여된 마우스 모델에서 PMVK 유전자의 발현 감소가 방사선을 처리하자 더욱더 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

<110> EnhancedBio Inc. <120> Composition for preventing or treating cancer containing lipid nanoparticles <130> DPP20215265KR <150> KR 10-2020-0183898 <151> 2020-12-24 <160> 19 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1653 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> luciferase mRNA <400> 1 auggaagacg ccaaaaacau aaagaaaggc ccggcgccau ucuauccgcu ggaagaugga 60 accgcuggag agcaacugca uaaggcuaug aagagauacg cccugguucc uggaacaauu 120 gcuuuuacag augcacauau cgagguggac aucacuuacg cugaguacuu cgaaaugucc 180 guucgguugg cagaagcuau gaaacgauau gggcugaaua caaaucacag aaucgucgua 240 ugcagugaaa acucucuuca auucuuuaug ccgguguugg gcgcguuauu uaucggaguu 300 gcaguugcgc ccgcgaacga cauuuauaau gaacgugaau ugcucaacag uaugggcauu 360 ucgcagccua ccgugguguu cguuuccaaa aagggguugc aaaaaauuuu gaacgugcaa 420 aaaaagcucc caaucaucca aaaaauuauu aucauggauu cuaaaacgga uuaccaggga 480 uuucagucga uguacacguu cgucacaucu caucuaccuc ccgguuuuaa ugaauacgau 540 uuugugccag aguccuucga uagggacaag acaauugcac ugaucaugaa cuccucugga 600 ucuacugguc ugccuaaagg ugucgcucug ccucauagaa cugccugcgu gagauucucg 660 caugccagag auccuauuuu uggcaaucaa aucauuccgg auacugcgau uuuaaguguu 720 guuccauucc aucacgguuu uggaauguuu acuacacucg gauauuugau auguggauuu 780 cgagucgucu uaauguauag auuugaagaa gagcuguuuc ugaggagccu ucaggauuac 840 aagauucaaa gugcgcugcu ggugccaacc cuauucuccu ucuucgccaa aagcacucug 900 auugacaaau acgauuuauc uaauuuacac gaaauugcuu cugguggcgc uccccucucu 960 aaggaagucg gggaagcggu ugccaagagg uuccaucugc cagguaucag gcaaggauau 1020 gggcucacug agacuacauc agcuauucug auuacacccg agggggauga uaaaccgggc 1080 gcggucggua aaguuguucc auuuuuugaa gcgaagguug uggaucugga uaccgggaaa 1140 acgcugggcg uuaaucaaag aggcgaacug ugugugagag guccuaugau uauguccggu 1200 uauguaaaca auccggaagc gaccaacgcc uugauugaca aggauggaug gcuacauucu 1260 ggagacauag cuuacuggga cgaagacgaa cacuucuuca ucguugaccg ccugaagucu 1320 cugauuaagu acaaaggcua ucagguggcu cccgcugaau uggaauccau cuugcuccaa 1380 caccccaaca ucuucgacgc aggugucgca ggucuucccg acgaugacgc cggugaacuu 1440 cccgccgccg uuguuguuuu ggagcacgga aagacgauga cggaaaaaga gaucguggau 1500 uacgucgcca gucaaguaac aaccgcgaaa aaguugcgcg gaggaguugu guuuguggac 1560 gaaguaccga aaggucuuac cggaaaacuc gacgcaagaa aaaucagaga gauccucaua 1620 aaggccaaga agggcggaaa gaucgccgug uaa 1653 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siLuc_sense <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxyribonucleotides <400> 2 aacgcugggc guuaaucaat t 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siLuc_antisense <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxyribonucleotides <400> 3 uugauuaacg cccagcguut t 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cy5.5 labeled siGFP_sense <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxyribonucleotides <400> 4 acaugaagca gcacgacuut t 21 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cy5.5 labeled siGFP_antisense <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxyribonucleotides <400> 5 aagucgugcu gcuucaugut t 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-HPV16 E6/E7_sense <400> 6 gaccggucga uguaugucuu g 21 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-HPV16 E6/E7_antisense <400> 7 agacauacau cgaccggucc a 21 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV16 E6/E7_Forward_primer <400> 8 ccactgatct ctactgttat gagcaa 26 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV16 E6/E7_Reverse_primer <400> 9 ccagctggac catctatttc a 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P21_Forward_primer <400> 10 cgaagtcagt tccttgtgga g 21 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P21_Reverse_primer <400> 11 catgggttct gacggacat 19 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_Forward_primer <400> 12 tgaccttgat ttattttgca tacc 24 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-PMVK_sense <400> 13 cgagcaagac gttcagtcct 20 <210> 14 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-PMVK_sense <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxyribonucleotides <400> 14 uggacgaugc ugagucagat t 21 <210> 15 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-PMVK_antisense <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxyribonucleotides <400> 15 ucugacucag caucguccat t 21 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PMVK_Forward_primer <400> 16 atatccccag tgccagtcc 19 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PMVK_Reverse_primer <400> 17 aacaaggggc tgagaacatc 20 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B-ACTIN_Forward_primer <400> 18 ccaaccgcga gaagatga 18 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B-ACTIN _Reverse_primer <400> 19 ccagaggcgt acagggatag 20

Claims

(1) 1,4-비스(3-아미노프로필)피페라진(1,4-bis(3-aminopropyl)piperazine) 및 알킬-에폭시드가 결합된 이온화 가능한 지질 (ionizable lipid); 인지질; 콜레스테롤; 및 지질-PEG(polyethyleneglycol) 접합체를 포함하는 지질 나노입자 및
(2) 제1 항암제를 포함하고,
상기 제1 항암제는 음이온성 약물, 핵산, 또는 이의 조합인,
암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 알킬-에폭시드는 1,2-에폭시도데칸(1,2-epoxydodecane)인, 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 인지질은 DOPE, DSPC, POPC, EPC, DOPC, DPPC, DOPG, DPPG, DSPE, Phosphatidylethanolamine, dipalmitoylphosphatidylethanolamine, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, POPE, POPC, DOPS, 및 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine]으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 지질-PEG 접합체 내 지질은 세라마이드(ceramide), 디미리스톨글리세롤(dimyristoylglycerol, DMG), 석시노일 디아글리세롤(succinoyl-diacylglycerol, s-DAG), 디스테아로일포스파티딜콜린(distearoylphosphatidylcholine, DSPC), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(distearoylphosphatidylethanolamine, DSPE), 및 콜레스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 지질-PEG 접합체를 0.25 내지 10 몰%로 포함하는, 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 지질 나노입자는 이온화 가능한 지질 : 인지질 : 콜레스테롤 : 지질-PEG 접합체를 20 내지 50 : 10 내지 30 : 10 내지 60 : 0.25 내지 10 의 몰비로 포함하는, 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 지질 나노입자는 pKa가 6.0 내지 7.0인, 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 제1 항암제는 상기 지질 나노입자 내부에 봉입되어 있는, 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 지질 나노입자는 평균 지름이 30nm 내지 150nm인, 약학 조성물
제1항에 있어서, 상기 음이온성 약물은 펩타이드, 단백질 약물, 단백질-핵산 구조체, 및 음이온성 생체고분자-약물 접합체로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인, 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 핵산은 소간섭리보핵산(siRNA), 리보좀 리보핵산(rRNA), 리보핵산(RNA), 디옥시리보핵산(DNA), 상보성 디옥시리보핵산(cDNA), 앱타머(aptamer), 전령 리보핵산(mRNA), 운반 리보핵산(tRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), PNA, 및 DNAzyme로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인, 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 암은 HPV(human papilloma virus) 감염에 의해 유발된 암인, 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 암은 자궁경부암, 자궁내막암, 질암(vagina cancer), 외음부암(vulvacancer), 항문암(anal cancer), 음경암(penis cancer), 편도암(tonsil cancer), 인두암(pharynx cancer), 후두암(larynx cancer), 두경부암, 편평 세포 두경부암, 폐의 선암(lung adenocarcinoma), 비소세포 폐암, 폐의 편평 세포 암종, 폐암, 위암, 육종, 림프종, 호지킨 림프종, 만성 또는 급성 백혈병, 흉선암, 상피암, 타액선암, 간암, 위암, 갑상선암, 부갑상선암, 난소암, 유방암, 전립선암, 식도암, 췌장암, 신경교종, 다발성 골수종, 신세포 암종, 방광암, 융모막암종, 결장암, 구강암, 피부암, 흑색종, 골암, 직장암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 척수 종양, 뇌간신경교종, 및 뇌하수체 선종으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 약학 조성물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물을 포함하는, 방사선 치료에 병용하기 위한 암 치료용 약학 조성물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물 및 제2 항암제를 추가로 포함하는, 항암제 병용 투여용 약학 조성물.
제15항에 있어서, 상기 제2 항암제는 시스플라틴, 파크리탁셀, 도세탁셀, 젬시타빈, 독소루비신, 플루오로우라실, 및 카보플라틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인, 항암제 병용 투여용 약학 조성물.