KR20220092489A

KR20220092489A - 알파-사코글리칸의 아데노 관련 바이러스 벡터 전달 및 근위축증 치료

Info

Publication number: KR20220092489A
Application number: KR1020227007040A
Authority: KR
Inventors: 루이스 로디노-클라팍; 다니엘 그리핀; 제리 알. 멘델
Original assignee: 더 리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈
Priority date: 2019-08-21
Filing date: 2020-08-21
Publication date: 2022-07-01
Also published as: CN114945583A; WO2021035120A1; TW202120532A; MX2022002132A; EP4374880A2; DK4017871T5; BR112022003142A2; RS65421B1; US20220290180A1; JP7532503B2; DK4017871T3; EP4374880A3; CA3150964A1; IL290734A; PL4017871T3; EP4017871A1; CO2022002864A2; HUE066215T2; FI4017871T3; EP4017871B1

Abstract

전신 투여 경로를 사용하여 약 1.0 x 10¹² vg/kg 내지 약 5.0 x 10¹⁵ vg/kg의 용량으로 재조합 AAV 벡터 AAVrh74.tMCK.hSCGA를 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 근위축증을 치료하는 방법이 본원에 기재된다. 이를 필요로 하는 세포 또는 대상체에서 알파-사르코글리칸 유전자를 발현시키고, 혈청 CK 수준을 감소시키고, 대상체의 근육 조직에서 알파-사르코글리칸 양성 섬유를 증가시키는 방법이 추가로 개시되어 있다.

Description

알파-사코글리칸의 아데노 관련 바이러스 벡터 전달 및 근위축증 치료

관련 출원

본 출원은 2019년 8월 21일에 출원된 미국 임시출원 제62/889,749호, 2020년 4월 24일에 출원된 미국 임시출원 제63/014,934호 및 2020년 5월 11일에 출원된 미국 임시출원 제63/022,843호의 우선권을 주장하며, 이들 모두는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.

기술분야

알파-사르코글리칸을 발현하는 AAV 벡터와 같은 치료 벡터 및 LGMD2D와 같은 사지 연결 근위축증을 치료하기 위해 이들 벡터를 사용하는 방법이 본원에 기재된다.

서열 목록의 참조에 의한 인용

본 출원은 개시내용과 별도의 부분으로서 컴퓨터-판독가능한 형태의 서열목록(파일명: 54652_SeqListing.txt; 18,768 바이트 - 2020년 8월 17일에 생성된 ASCII 텍스트 파일)을 포함하며, 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.

근위축증(MD: muscular dystrophy)은 유전 질환의 그룹이다. 이 그룹은 운동을 제어하는 골격근의 진행성 쇠약 및 퇴화를 특징으로 한다. 일부 형태의 MD는 유아기 또는 아동기에 발병하는 반면, 다른 형태는 중년 또는 이후까지 나타나지 않을 수 있다. 장애는 근육 쇠약의 분포 및 정도(일부 형태의 MD는 심장 근육에도 영향을 미침), 발병 연령, 진행 속도 및 유전 패턴의 측면에서 상이하다.

MD의 한 그룹은 사지 연결 근위축증(LGMD)이다. LGMD는 희귀 질환이며 발병 연령, 근력 쇠약 부위, 심장 및 호흡기 관련 개입, 진행 속도 및 중증도와 관련하여 사람마다 다르게 나타난다. LGMD는 아동기, 청소년기, 청년기 또는 그 이후에 시작할 수 있다. 두 성별 모두 똑같이 영향을 받는다. LGMD는 어깨와 골반대에서의 쇠약을 유발하며, 다리와 팔 상부의 인근 근육도 시간이 지나면 쇠약해진다. 다리의 쇠약은 종종 팔보다 먼저 나타난다. 얼굴 근육은 일반적으로 영향을 받지 않는다. 병태가 진행됨에 따라, 보행에 문제가 생길 수 있으며 시간이 지남에 따라 휠체어를 사용해야 할 수도 있다. 어깨와 팔 근육의 개입은 팔을 머리 위로 들어 올리거나 물건을 드는 데 어려움을 유발할 수 있다. 일부 유형의 LGMD에서는 심장 및 호흡 근육이 개입될 수 있다.

LGMD에 대한 전문화된 시험은 현재 국가 진단 계획인 국가 커미셔닝 그룹(National Commissioning Group: NCG)을 통해 이용 가능하다.

종종 α-사르코글리칸병증으로도 지칭되는 LGMD 하위유형 2D(LGMD2D)는 알파-사르코글리칸 유전자(SGCA; α-사르코글리칸)의 돌연변이로 인해 발생하는 상염색체 열성 질환으로, 디스트로핀 관련 단백질 복합체의 다른 구조적 구성요소의 손실과 함께 기능 단백질의 완전한 손실 또는 감소된 손실을 야기한다. 특히, 알파-사르코글리칸 단백질의 손실은 3세에서 8세 사이에 발병하여 근육 기능이 악화되는 진행성 근위축증을 유발한다. 증상은 보행 지연, 지방 대체 및 섬유증으로 인한 근위 근육 쇠약, 크레아틴 키나아제 상승, 척추 측만증 및 관절 구축을 포함한다. 쇠약하게 만드는 질환은 종종 휠체어 의존성 및 호흡 부전으로 인한 사망으로 이어진다. 따라서, LGMD2D에 대한 치료가 여전히 필요하다.

재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) AAVrh74.tMCK.hSCGA를 투여하는 단계를 포함하는 근위축증의 치료가 필요한 대상체에서 근위축증을 치료하는 방법이 본원에 기재되며, rAAV는 전신 투여 경로를 사용하여 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 1.0 x 10¹² vg/kg 내지 약 5.0 x 10¹⁵ vg/kg의 용량으로 투여된다. 일 양태에서, 본 개시내용은 알파-사르코글리칸 유전자를 발현하는 rAAV, 및 섬유증을 감소 및/또는 예방하기 위해 근육에 알파-사르코글리칸을 전달하는 방법; 및/또는 근육의 힘을 증가시키기 위한 방법, 및/또는 근위축증을 앓고 있는 대상체에서 α-사르코글리칸병증을 치료하는 방법에 관한 것이다.

일 양태에서, 알파-사르코글리칸 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 AAV(rAAV)가 본원에 기재된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, or 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 동일한 서열을 포함하고 알파-사르코글리칸 활성을 유지하는 단백질을 코딩한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 2에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 동일한 단백질을 코딩한다. 또 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩한다.

일부 실시형태에서, rAAV는 tMCK 프로모터를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어, tMCK 프로모터는 SEQ ID NO: 3에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또한, rAAV는 SEQ ID NO: 5의 5' 역 말단 반복 서열 및/또는 SEQ ID NO: 6의 3' 역 말단 반복 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV는 SEQ ID NO: 7의 폴리 A 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 개시된 rAAV는 혈청형 AAVrh.74이다.

일 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 4와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 4에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 개시내용은 본원에 개시된 임의의 rAAV를 투여하는 단계를 포함하는 근위축증 치료를 필요로 하는 대상체에서 근위축증을 치료하는 방법을 제공하며, rAAV는 전신 경로에 의해 투여된다. 특히, 임의의 개시된 방법에서, rAAV는 AAVrh74.tMCK.hSCGA이며, rAAV는 전신 투여 경로를 사용하여 투여된다.

임의의 개시된 방법에서, rAAV는 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 1.0 x 10¹² vg/kg 내지 약 5.0 x 10¹⁵ vg/kg의 용량으로 투여된다. 예를 들어, 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 rAAV는 약 1.0 x 10¹² vg/kg 내지 약 2.0 x 10¹⁵ vg/kg, 약 5 x 10¹² vg/kg 내지 약 1.0 x 10¹⁵ vg/kg, 약 1.0 x 10¹³ vg/kg 내지 약 5.0 x 10¹⁴ vg/kg, 약 2.0 x 10¹³ vg/kg 내지 약 3.0 x 10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5x10¹³ vg/kg 내지 약 2x10¹⁴ vg/kg의 용량으로 투여되거나, rAAV는 약 5x10¹³ vg/kg, 약 6x10¹³ vg/kg, 약 7x10¹³ vg/kg, 약 8x10¹³ vg/kg, 약 9x10¹³ vg/kg, 약 1x10¹⁴ vg/kg, 약 2x10¹⁴ vg/kg, 약 3x10¹⁴ vg/kg, 약 4x10¹⁴ vg/kg 또는 약 5x10¹⁴ vg/kg의 용량으로 투여된다.

또 다른 실시형태에서, 임의의 개시된 방법에서, rAAV는 정량 표준으로서 선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 1.85 x 10¹³ vg/kg 또는 7.41 x 10¹³ vg/kg의 용량으로 투여된다. 예를 들어, rAAV는 정량 표준으로서 선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 1.0 x 10¹³ vg/kg 내지 약 8.0 x 10¹³ vg/kg, 약 1.5 x 10¹³ vg/kg 내지 약 8.0 x 10¹³ vg/kg, 약 1.6 x 10¹³ vg/kg 내지 약 8.0 x 10¹³ vg/kg, 약 1.8 x 10¹³ vg/kg 내지 약 8.0 x 10¹³ vg/kg, 약 1.2 x 10¹³ vg/kg 내지 약 7.5 x 10¹³ vg/kg, 약 1.9 x 10¹³ vg/kg 내지 약 7.5 x 10¹³ vg/kg, 약 1.4 x 10¹³ vg/kg 내지 약 7.4 x 10¹³ vg/kg, 약 1.9 x 10¹³ vg/kg 내지 약 7.5 x 10¹³ vg/kg, 또는 약 1.8 x 10¹³ vg/kg 내지 약 8.0 x 10¹³ vg/kg의 용량으로 투여된다.

또한, 임의의 개시된 방법에서, 전신 투여 경로는 정맥내 경로이다. 예를 들어, 임의의 개시된 방법에서, rAAV는 주사, 주입 또는 이식에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, rAAV는 말초 사지 정맥을 통해 정맥내 경로에 의해 투여된다.

임의의 개시된 방법에서, 근위축증은 사지 연결 근위축증이다. 예를 들어, 근위축증은 사지 연결 근위축증 유형 2D(LGMD2D)이다.

예시적인 실시형태에서, 근위축증을 치료하는 방법은 사지 연결 근위축증을 앓고 있는 대상체에게 rAAV를 투여하는 것을 포함하고, rAAV는 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 5x10¹³ vg/kg 내지 약 2x10¹⁴ vg/kg의 용량으로 정맥내 주입에 의해 투여되고, rAAV는 SEQ ID NO: 4의 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

예시적인 실시형태에서, 본 개시내용은 근위축증 치료를 필요로 하는 대상체에서 근위축증을 치료하는 방법을 제공하며, 방법은 사지 연결 근위축증을 앓고 있는 대상체에게 rAAV를 투여하는 단계를 포함하고, rAAV는 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 5x10¹³ vg/kg 내지 약 2x10¹⁴ vg/kg의 용량으로 정맥내 주입에 의해 투여되고, rAAV는 SEQ ID NO: 4의 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어, 이들 방법에서, 대상체의 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자 발현 수준은 rAAV 투여 전 알파-사르코글리칸 유전자 발현 수준과 비교하여 rAAV 투여 후 증가한다.

임의의 개시된 방법에서, 대상체의 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자 발현 수준은 rAAV 투여 전 알파-사르코글리칸 유전자 발현 수준과 비교하여 rAAV 투여 후 증가하고/증가하거나; 대상체에서 혈청 CK 수준은 rAAV 투여 전 혈청 CK 수준과 비교하여 rAAV 투여 후 감소하고/감소하거나; 운동 활성 및 비력 생성은 증가하고; 섬유증은 감소하고; 전방 경골 근육에서 수축 유도 손상에 대한 저항은 증가하고/증가하거나; 대상체의 근육 조직에서 알파-사르코글리칸 양성 섬유의 수는 rAAV 투여 전 알파-사르코글리칸 양성 섬유의 수와 비교하여 rAAV 투여 후 증가하거나; 섬유증은 rAAV 투여 전과 비교하여 rAAV 투여 후 대상체에서 감소하고/감소하거나; 섬유증은 rAAV 투여 전과 비교하여 rAAV 투여 후 대상체에서 감소하고/감소하거나; 대상체의 근육에서 비력, 섬유 직경 크기, 및/또는 편심 수축은 rAAV 투여 전과 비교하여 rAAV 투여 후 증가한다.

일부 실시형태에서, 알파-사르코글리칸 유전자 발현은 웨스턴 블롯 및/또는 면역조직화학에 의해 알파-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다.

또 다른 양태에서, 본 개시내용은 임의의 개시된 rAAV를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자를 발현시키는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용은 SEQ ID NO: 4의 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 뉴클레오티드 서열을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자를 발현시키는 방법을 제공한다. 또한, 임의의 방법에서, 대상체의 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자의 발현은 근육 생검에서 웨스턴 블롯 상의 알파-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다. 대안적으로, 임의의 방법에서, 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자의 발현은 근육 생검에서 면역조직화학에 의해 알파-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다. 다른 실시형태에서, 알파-사르코글리칸 유전자의 발현은 게놈 DNA의 마이크로그램당 벡터 게놈의 수를 검출함으로써 대상체에서 측정된다.

본 개시내용은 혈청 CK 수준 감소를 필요로 하는 대상체에서 혈청 CK 수준을 감소시키는 방법을 제공하며, 방법은 임의의 개시된 rAAV를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용은 혈청 CK 수준 감소를 필요로 하는 대상체에서 혈청 CK 수준을 감소시키는 방법을 제공하며, 방법은 SEQ ID NO: 4의 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 뉴클레오티드 서열을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 개시내용은 임의의 개시된 rAAV를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체의 근육 조직에서 알파-사르코글리칸 양성 섬유를 증가시키기 위한 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용은 알파-사르코글리칸 양성 섬유 증가를 필요로 하는 대상체의 근육 조직에서 알파-사르코글리칸 양성 섬유를 증가시키는 방법을 제공하며, 방법은 SEQ ID NO: 4의 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 뉴클레오티드 서열을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.

본 개시내용은 또한 임의의 개시된 rAAV를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 알파-사르코글리칸 발현 증가를 필요로 하는 대상체에서 알파-사르코글리칸의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용은 알파-사르코글리칸 발현 증가를 필요로 하는 대상체에서 알파-사르코글리칸의 발현을 증가시키는 방법을 제공하며, 방법은 SEQ ID NO: 4의 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 뉴클레오티드 서열을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 또한, 임의의 개시된 방법에서, 대상체의 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자의 발현은 근육 생검에서 웨스턴 블롯 상의 알파-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다. 대안적으로, 임의의 방법에서, 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자의 발현은 근육 생검에서 면역조직화학에 의해 알파-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다. 다른 실시형태에서, 알파-사르코글리칸 유전자의 발현은 게놈 DNA의 마이크로그램당 벡터 게놈의 수를 검출함으로써 대상체에서 측정된다.

본 개시내용은 근위축증 치료를 필요로 하는 대상체에서 근위축증을 치료하기 위한 조성물을 제공하며, 조성물은 임의의 본원에 개시된 rAAV를 포함하며, 조성물은 전신 경로에 의한 투여를 위해 제형화된다. 특히, 임의의 조성물에서, rAAV는 AAVrh74.tMCK.hSCGA이다.

임의의 개시된 조성물은 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 1.0 x 10¹² vg/kg 내지 약 5.0 x 10¹⁵ vg/kg의 용량으로 rAAV를 포함한다. 예를 들어, 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 rAAV는 약 1.0 x 10¹² vg/kg 내지 약 2.0 x 10¹⁵ vg/kg, 약 5 x 10¹² vg/kg 내지 약 1.0 x 10¹⁵ vg/kg, 약 1.0 x 10¹³ vg/kg 내지 약 5.0 x 10¹⁴ vg/kg, 약 2.0 x 10¹³ vg/kg 내지 약 3.0 x 10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5x10¹³ vg/kg 내지 약 2x10¹⁴ vg/kg의 용량이거나, rAAV는 약 5x10¹³ vg/kg, 약 6x10¹³ vg/kg, 약 7x10¹³ vg/kg, 약 8x10¹³ vg/kg, 약 9x10¹³ vg/kg, 약 1x10¹⁴ vg/kg, 약 2x10¹⁴ vg/kg, 약 3x10¹⁴ vg/kg, 약 4x10¹⁴ vg/kg 또는 약 5x10¹⁴ vg/kg의 용량이다.

또 다른 실시형태에서, 임의의 개시된 조성물에서, rAAV는 정량 표준으로서 선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 1.85 x 10¹³ vg/kg 또는 약 7.41 x 10¹³ vg/kg의 용량으로 투여된다. 예를 들어, rAAV는 정량 표준으로서 선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 1.0 x 10¹³ vg/kg 내지 약 8.0 x 10¹³ vg/kg, 약 1.5 x 10¹³ vg/kg 내지 약 8.0 x 10¹³ vg/kg, 약 1.6 x 10¹³ vg/kg 내지 약 8.0 x 10¹³ vg/kg, 약 1.8 x 10¹³ vg/kg 내지 약 8.0 x 10¹³ vg/kg, 약 1.2 x 10¹³ vg/kg 내지 약 7.5 x 10¹³ vg/kg, 약 1.9 x 10¹³ vg/kg 내지 약 7.5 x 10¹³ vg/kg, 약 1.4 x 10¹³ vg/kg 내지 약 7.4 x 10¹³ vg/kg, 약 1.9 x 10¹³ vg/kg 내지 약 7.5 x 10¹³ vg/kg, 또는 약 1.8 x 10¹³ vg/kg 내지 약 8.0 x 10¹³ vg/kg의 용량으로 투여된다.

또한, 임의의 개시된 조성물은 주사, 주입 또는 이식에 의한 투여를 위해 제형화된 조성물과 같이 정맥내 경로에 의한 투여를 위해 제형화된다. 일부 실시형태에서, 개시된 조성물은 말초 사지 정맥을 통한 정맥내 경로에 의한 투여를 위해 제형화된다.

임의의 개시된 조성물은 사지 연결 근위축증, 예컨대 사지 연결 근위축증 유형 2D(LGMD2D)의 치료를 위한 것이다.

예시적인 실시형태에서, 본 개시내용은 사지 연결 근위축증을 앓고 있는 대상체를 치료하기 위한 조성물을 제공하며, 조성물은 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 5x10¹³ vg/kg 내지 약 2x10¹⁴ vg/kg 용량의 rAAV를 포함하고, 조성물은 정맥내 주입에 의한 투여를 위해 제형화되고, rAAV는 SEQ ID NO: 4의 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

또한, 본 개시내용은 사지 연결 근위축증 치료를 필요로 하는 대상체에서 사지 연결 근위축증을 치료하기 위한 조성물을 제공하며, 조성물은 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 5x10¹³ vg/kg 내지 약 2x10¹⁴ vg/kg 용량의 rAAV를 포함하고, 조성물은 정맥내 주입에 의한 투여를 위해 제형화되고, rAAV는 SEQ ID NO: 4의 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어, 조성물의 투여는 조성물 투여 전 알파-사르코글리칸 유전자 발현 수준과 비교하여 대상체의 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자 발현 수준을 증가시킨다.

또한, 임의의 개시된 조성물의 투여는 조성물 투여 전 알파-사르코글리칸 유전자 발현 수준과 비교하여 대상체의 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자 발현 수준을 증가시키고/증가시키거나; 개시된 조성물의 투여는 조성물 투여 전 혈청 CK 수준과 비교하여 대상체에서 혈청 CK 수준을 감소시켰고/감소시켰거나; 운동 활성 및 비력 생성은 증가하고; 섬유증은 감소하고; 전방 경골 전방 근육에서 수축 유도 손상에 대한 저항은 증가하고/증가하거나; 조성물의 투여는 조성물 투여 전 알파-사르코글리칸 양성 섬유의 수와 비교하여 대상체의 근육 조직에서 알파-사르코글리칸 양성 섬유의 수를 증가시키고/증가시키거나; 조성물의 투여는 rAAV 투여 전과 비교하여 대상체에서 섬유증을 감소시켰고/감소시켰거나; 조성물은 조성물 투여 전과 비교하여 섬유증을 감소시켰거나; 조성물의 투여는 조성물 투여 전과 비교하여 대상체의 근육에서 비력, 섬유 직경 크기, 및/또는 편심 수축을 증가시켰다. 일부 실시형태에서, 알파-사르코글리칸 유전자 발현은 웨스턴 블롯 및/또는 면역조직화학에 의해 알파-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다.

또 다른 양태에서, 본 개시내용은 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자를 발현시키기 위한 조성물을 제공하며, 조성물은 임의의 개시된 rAAV를 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용은 SEQ ID NO: 4의 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자를 발현시키기 위한 조성물을 제공한다. 또한, 임의의 조성물에서, 대상체의 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자의 발현은 근육 생검에서 웨스턴 블롯 상의 알파-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다. 대안적으로, 임의의 방법에서, 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자의 발현은 근육 생검에서 면역조직화학에 의해 알파-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다. 다른 실시형태에서, 알파-사르코글리칸 유전자의 발현은 게놈 DNA의 마이크로그램당 벡터 게놈의 수를 검출함으로써 대상체에서 측정된다.

본 개시내용은 혈청 CK 수준 감소를 필요로 하는 대상체에서 혈청 CK 수준을 감소시키기 위한 조성물을 제공하며, 조성물은 임의의 개시된 rAAV를 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용은 혈청 CK 수준 감소를 필요로 하는 대상체에서 혈청 CK 수준을 감소시키기 위한 조성물을 제공하며, 조성물은 SEQ ID NO: 4의 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체의 근육 조직에서 알파-사르코글리칸 양성 섬유를 증가시키기 위한 조성물을 제공하며, 조성물은 임의의 개시된 rAAV를 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용은 대상체의 근육 조직에서 알파-사르코글리칸 양성 섬유를 증가시키기 위한 조성물을 제공하며, 조성물은 SEQ ID NO: 4의 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 개시내용은 또한 알파-사르코글리칸의 발현 증가를 필요로 하는 대상체에서 알파-사르코글리칸의 발현을 증가시키기 위한 조성물을 제공하며, 조성물은 임의의 개시된 rAAV를 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용은 알파-사르코글리칸 발현 증가를 필요로 하는 대상체에서 알파-사르코글리칸의 발현을 증가시키기 위한 조성물을 제공하며, 조성물은 SEQ ID NO: 4의 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또한, 임의의 개시된 조성물의 투여 후, 대상체의 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자의 발현은 근육 생검에서 웨스턴 블롯 상의 알파-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다. 대안적으로, 임의의 개시된 조성물의 투여 후, 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자의 발현은 근육 생검에서 면역조직화학에 의해 알파-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다. 다른 실시형태에서, 임의의 개시된 조성물의 투여 후, 알파-사르코글리칸 유전자의 발현은 게놈 DNA의 마이크로그램당 벡터 게놈의 수를 검출함으로써 대상체에서 측정된다.

본 개시내용은 근위축증 치료를 필요로 하는 대상체에서 근위축증을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 임의의 개시된 rAAV의 용도를 제공하며, 약제는 전신 경로에 의한 투여를 위해 제형화된다. 특히, 본 개시내용은 근위축증을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 AAVrh74.tMCK.hSCGA의 용도를 제공하며, 약제는 전신 투여 경로에 의한 투여를 위해 제형화된다.

임의의 개시된 용도에서, 약제는 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 1.0 x 10¹² vg/kg 내지 약 5.0 x 10¹⁵ vg/kg의 용량으로 rAAV를 포함한다. 예를 들어, 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 rAAV는 약 1.0 x 10¹² vg/kg 내지 약 2.0 x 10¹⁵ vg/kg, 약 5 x 10¹² vg/kg 내지 약 1.0 x 10¹⁵ vg/kg, 약 1.0 x 10¹³ vg/kg 내지 약 5.0 x 10¹⁴ vg/kg, 약 2.0 x 10¹³ vg/kg 내지 약 3.0 x 10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5x10¹³ vg/kg 내지 약 2x10¹⁴ vg/kg의 용량이거나, rAAV는 약 5x10¹³ vg/kg, 약 6x10¹³ vg/kg, 약 7x10¹³ vg/kg, 약 8x10¹³ vg/kg, 약 9x10¹³ vg/kg, 약 1x10¹⁴ vg/kg, 약 2x10¹⁴ vg/kg, 약 3x10¹⁴ vg/kg, 약 4x10¹⁴ vg/kg 또는 약 5x10¹⁴ vg/kg의 용량이다.

또 다른 실시형태에서, 임의의 개시된 용도에서, 약제는 정량 표준으로서 선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 1.85 x 10¹³ vg/kg 또는 7.41 x 10¹³ vg/kg의 용량으로 rAAV를 포함한다. 예를 들어, 약제는 정량 표준으로서 선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 1.0 x 10¹³ vg/kg 내지 약 8.0 x 10¹³ vg/kg, 약 1.5 x 10¹³ vg/kg 내지 약 8.0 x 10¹³ vg/kg, 약 1.6 x 10¹³ vg/kg 내지 약 8.0 x 10¹³ vg/kg, 약 1.8 x 10¹³ vg/kg 내지 약 8.0 x 10¹³ vg/kg, 약 1.2 x 10¹³ vg/kg 내지 약 7.5 x 10¹³ vg/kg, 약 1.9 x 10¹³ vg/kg 내지 약 7.5 x 10¹³ vg/kg, 약 1.4 x 10¹³ vg/kg 내지 약 7.4 x 10¹³ vg/kg, 약 1.9 x 10¹³ vg/kg 내지 약 7.5 x 10¹³ vg/kg, 또는 약 1.8 x 10¹³ vg/kg 내지 약 8.0 x 10¹³ vg/kg의 용량으로 rAAV를 포함한다.

또한, 임의의 개시된 용도에서, 약제는 정맥내 경로에 의한 투여를 위해 제형화된다. 예를 들어, 임의의 개시된 용도에서, 약제는 주사, 주입 또는 이식에 의한 투여를 위해 제형화된다. 일부 실시형태에서, 약제는 말초 사지 정맥을 통한 정맥내 경로에 의한 투여를 위해 제형화된다.

임의의 개시된 용도에서, 약제는 사지 연결 근위축증, 예컨대 사지 연결 근위축증 유형 2D(LGMD2D)의 치료를 위한 것이다.

예시적인 실시형태에서, 본 개시내용은 사지 연결 근위축증을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 rAAV의 용도를 제공하며, 약제는 정맥내 주입에 의한 투여를 위해 제형화되고, rAAV는 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 5x10¹³ vg/kg 내지 약 2x10¹⁴ vg/kg의 용량이고, rAAV는 SEQ ID NO: 4의 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어, 알파-사르코글리칸 유전자 발현 증가를 필요로 하는 대상체에게 약제를 투여하는 것은 rAAV 투여 전 알파-사르코글리칸 유전자 발현 수준과 비교하여 대상체의 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자 발현을 증가시킨다.

임의의 개시 용도에서, 필요한 대상체에게 약제를 투여하는 것은 약제 투여 전 알파-사르코글리칸 유전자 발현 수준과 비교하여 대상체의 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자 발현 수준을 증가시키고/증가시키거나; 대상체에게 약제를 투여하는 것은 약제 투여 전 혈청 CK 수준과 비교하여 대상체에서 혈청 CK 수준을 감소시키고/감소시키거나; 운동 활성 및 비력 생성은 증가하고; 섬유증은 감소하고; 전방 경골 근육에서 수축 유도 손상에 대한 저항은 증가하고/증가하거나; 대상체에게 약제를 투여하는 것은 약제 투여 전 알파-사르코글리칸 양성 섬유의 수와 비교하여 대상체의 근육 조직에서 알파-사르코글리칸 양성 섬유의 수를 증가시키고/증가시키거나, 필요한 대상체에게 약제를 투여하는 것은 약제 투여 전과 비교하여 대상체에서 섬유증을 감소시키고/감소시키거나; 약제의 투여는 약제 투여 전과 비교하여 대상체의 근육에서 비력, 섬유 직경 크기 및/또는 편심 수축을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 알파-사르코글리칸 유전자 발현은 웨스턴 블롯 및/또는 면역조직화학에 의해 알파-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다.

또 다른 양태에서, 본 개시내용은 필요한 대상체의 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자를 발현시키기 위한 약제의 제조를 위한 임의의 개시된 rAAV의 용도를 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용은 필요한 대상체의 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자를 발현시키기 위한 약제의 제조를 위한 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물의 용도를 제공하며, scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물은 SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또한, 임의의 용도에서, 대상체의 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자의 발현은 근육 생검에서 웨스턴 블롯 상의 알파-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다. 대안적으로, 임의의 용도에서, 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자의 발현은 근육 생검에서 면역조직화학에 의해 알파-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다. 다른 실시형태에서, 알파-사르코글리칸 유전자의 발현은 게놈 DNA의 마이크로그램당 벡터 게놈의 수를 검출함으로써 대상체에서 측정된다.

본 개시내용은 혈청 CK 수준 감소를 필요로 하는 대상체에서 혈청 CK 수준을 감소시키기 위한 약제의 제조를 위한 임의의 개시된 rAAV의 용도를 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용은 혈청 CK 수준 감소를 필요로 하는 대상체에서 혈청 CK 수준을 감소시키기 위한 약제의 제조를 위한 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물의 용도를 제공하며, scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물은 SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체의 근육 조직에서 알파-사르코글리칸 양성 섬유를 증가시키기 위한 약제의 제조를 위한 임의의 개시된 rAAV의 용도를 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용은 대상체의 근육 조직에서 알파-사르코글리칸 양성 섬유를 증가시키기 위한 약제의 제조를 위한 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물의 용도를 제공하며, scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물은 SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 개시내용은 또한 알파-사르코글리칸 발현 증가를 필요로 하는 대상체에서 알파-사르코글리칸의 발현을 증가시키기 위한 약제의 제조를 위한 임의의 개시된 rAAV의 용도를 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용은 알파-사르코글리칸의 발현 증가를 필요로 하는 대상체에서 알파-사르코글리칸의 발현을 증가시키기 위한 약제의 제조를 위한 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물의 용도를 제공하며, scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물은 SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또한, 임의의 개시된 용도에서, 대상체의 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자의 발현은 근육 생검에서 웨스턴 블롯 상의 알파-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다. 대안적으로, 임의의 개시된 용도에서, 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자의 발현은 근육 생검에서 면역조직화학에 의해 알파-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다. 다른 실시형태에서, 알파-사르코글리칸 유전자의 발현은 게놈 DNA의 마이크로그램당 벡터 게놈의 수를 검출함으로써 대상체에서 측정된다.

임의의 개시된 방법, 조성물 또는 용도에서, 대상체는 4세 내지 15세인 인간 대상체, 또는 25세 내지 55세인 인간 대상체 또는 50세 초과인 인간 대상체이다.

임의의 개시된 방법, 조성물 또는 용도에서, 대상체는 소아 대상체, 청소년 대상체 또는 젊은 성인 대상체이다. 대안적으로, 대상체는 중년 성인 또는 노인 대상체이다.

예를 들어, 임의의 개시된 방법, 조성물 또는 용도에서, 대상체는 4 내지 15세인 인간 대상체이며, 두 대립 유전자 모두에서 알파-사르코글리칸(SGCA) 돌연변이가 확인되었으며, AAVrh74 항체에 대해 음성이었고/음성이거나 100 미터 보행 테스트에서 >40% 또는 정상이었다.

또 다른 양태에서, 본 개시내용은 임의의 개시된 방법, 조성물 또는 용도에서 투여되는 rAAV를 생성하는 방법을 제공하며, 방법은 AAV 벡터 플라스미드를 숙주 세포에 전달하는 것을 포함하고, AAV 벡터 플라스미드는 SEQ ID NO: 8과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어, AAV 벡터 플라스미드는 SEQ ID NO: 8의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터 플라스미드는 SEQ ID NO: 1, 4 또는 8과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 벡터 플라스미드는 SEQ ID NO: 1, 4 또는 8의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

임의의 개시된 rAAV 생성 방법에서, 방법은 패키징 플라스미드 및/또는 헬퍼 바이러스를 숙주 세포에 전달하는 것을 추가로 포함한다. 또한, 임의의 개시된 rAAV 생성 방법에서, 패키징 세포는 안정적으로 통합된 AAV cap 유전자를 포함하고/포함하거나 패키징 세포는 안정적으로 통합된 AAV rep 유전자를 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 개시내용은 SEQ ID NO: 1, 4 또는 8과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 AAV 벡터 플라스미드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 예를 들어, 숙주 세포는 SEQ ID NO: 1, 4 또는 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 AAV 벡터 플라스미드를 포함한다.

도 1은 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 유전자 카세트를 도시한다.
도 2는 scAAVrh74.tMCK.hSGCA로의 전신 처리 후 용량 증량 연구에서 이식유전자 발현을 도시한다. (A) 1x10¹² vg, 3x10¹² vg, 및 6x10¹² vg(또는 5x10¹³ vg/kg, 1x10¹⁴ vg/kg, 및 2x10¹⁴ vg/kg, 각각, 20 g 마우스 기준)로 전신(정맥내)처리된 마우스의 다중 근육의 알파-사르코글리칸 면역형광 염색(그룹당 n=6). 처리 12주 후 알파-사르코글리칸을 발현하는 근육 섬유는 미처리 대조군과 비교하여 70% 내지 93% 범위였다. (B) 처리된 sgca^-/- 마우스로부터의 근육의 웨스턴 블롯은 hSGCA 단백질 발현을 확인한다. 약어: TA, 전방 경골; GAS, 비복근; QD, 대퇴사두근; TRI, 삼두근; GLUT, 둔근; PSO, 대요근; DIA, 횡격막; HRT, 심장; WT, 야생형.
도 3은 sgca^-/- 마우스에서 용량과 무관한 scAAVrh74.tMCK.hSGCA에 의한 근육 형태의 개선을 도시한다. (A) 1x10¹² vg, 3x10¹² vg, 및 6x10¹² vg(또는 5x 10¹³ vg/kg, 1x10¹⁴ vg/kg, 및 2x10¹⁴ vg/kg, 각각, 20 g 마우스 기준)의 scAAVrh74.tMCK.hSGCA로 처리된 sgca^-/- 마우스의 다양한 근육의 헤마톡실린 및 에오신 이미지. 대표적인 20x 이미지는 중앙 핵의 극적인 감소와 치료 용량에 독립적인 섬유 크기의 전반적인 정규화를 도시한다. (B) 비히클 처리된 마우스 및 야생형 대조군(그룹당 n=6)과 비교하여 처리된 그룹에서 다양한 근육의 근섬유 직경 정규화를 확인하는 정량화. (C) 미처리 마우스 및 야생형 대조군(그룹당 n=6)과 비교하여 처리된 마우스의 근육의 중앙에 위치한 핵의 정량화. 약어: TA, 전방 경골; GAS, 비복근; QD, 대퇴사두근; GLUT, 둔근; PSO, 대요근; TRI, 삼두근; DIA, 횡격막; WT, 야생형.
도 4는 scAAVrh74.tMCK.hSGCA로 처리된 sgca^-/- 마우스에서 섬유증 감소를 도시한다. (A) 피크로시리우스 레드 염색은 다양한 근육에서 비히클 처리된 sgca^-/- 마우스와 비교하여 콜라겐 침착 감소로 표시된 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 처리된 마우스에서 감소된 섬유증을 보여준다. 대표적인 20x 이미지가 도시된다. (B) 다양한 근육에서 콜라겐 수준의 정량화는 미처리 마우스 및 야생형 대조군(그룹당 n=6)과 비교하여 3개의 처리된 그룹 모두에서 콜라겐 수준의 감소를 확인한다. 약어: PSO, 대요근; DIA, 횡격막; TRI, 삼두근; GLUT, 둔근.
도 5는 scAAVrh74.tMCK.hSGCA로의 처리 후 골격근에 대한 기능적 이점을 도시한다. (A) 3개월 치료 후, 비력 및 수축 유도 손상에 대한 저항(TA 중량으로 정규화됨)을 측정하기 위해 전방 경골(TA) 근육(왼쪽 및 오른쪽 모두)을 수확했다. 비력 및 편심 수축의 정량화는 미처리 대조군과 비교하여 모든 처리된 그룹(용량 간 최소 차이)에서 증가했다(그룹당 n=6). (B) 횡격막 근육 스트립을 수확하여 비력을 측정하였다. 처리 12주 후, 미처리 sgca^-/- 마우스와 비교하여 치료된 마우스에서 힘이 유의하게 증가하였다. (C) 처리 12주 후, 미처리 sgca^-/- 대조군과 비교하여 처리된 마우스에서 개방 필드 분석을 통해 보행 및 수직 활동에서 개선이 나타났다(그룹당 n=6). (D) 미처리 sgca^-/- 대조군과 비교하여 모든 처리 그룹에서 혈청 내 크레아틴 키나제 수준이 감소했다. 데이터는 일방향 ANOVA 이어서 다중 비교를 위해 Tukey의 사후 분석 검정으로 분석되었다. *=p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001, ****=p<0.0001, 언급되지 않는 한, 비히클 처리된 sgca^-/- 마우스와 비교. 약어: TA, 전방 경골; DIA, 횡격막; WT, 야생형.
도 6은 scAAVrh74.tMCK.hSGCA로의 처리 후 혈액 화학 반응을 통한 독성의 증거가 없음을 도시한다. 간 효소(ALT, AST 및 ALP/K) 및 혈당(GLU) 수준을 독성에 대해 분석했다(그룹당 n=6). 처리된 마우스의 모든 화학 값은 점선으로 표시된 마우스의 정상/건강 한계 내에 있었다.
도 7a는 3x10¹² vg 및 6x10¹² vg(또는 1x10¹⁴ vg/kg, 및 2x10¹⁴ vg/kg, 각각, 20 g 마우스 기준)의 scAAVrh74.tMCK.hSGCA의 정맥내 전달 후 sgca^-/- 마우스의 다양한 조직에서 정량적 중합효소 연쇄 반응에 첨가된 마이크로그램 DNA당 전사체의 평균 vg 카피의 전신 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 전달-생체분포 히스토그램의 생체분포 분석을 도시한다. 도 7b는 1.0 x10¹² vg(왼쪽 웨스턴 블롯) 또는 6 x 10¹² vg(오른쪽 웨스턴 블롯)에서 비히클(sgca^-/- LR(젖산 링거)) 또는 scAArh74.tMCK.hSGCA로 처리된 WT 및 sgca^-/- 마우스의 간에서 알파-사르코글리칸 단백질 발현의 웨스턴 블롯을 도시한다. 각 레인은 독립적인 마우스를 나타낸다(M1: 마우스 1, M2: 마우스 2, M3: 마우스 3). 하단 패널은 로딩 대조군으로 사용되었던 빈쿨린을 나타낸다. 약어: DIA, 횡격막; TA, 전방 경골; TRI, 삼두근.
도 8은 면역형광 염색(도 8a) 및 웨스턴 블롯(도 8b)에 의한 12개월령 sgca^-/- 마우스의 골격근에서 scAAVrh74.tMCK.hSGCA의 발현을 도시한다. 도 8c의 그래프는 scAAVrh74.tMCK.hSGCA sgca^-/- 마우스에서 양성 근육 섬유 백분율을 제공한다. 약어: TA, 전방 경골; GAS, 비복근; QD, 대퇴사두근; GLUT, 둔근; TRI, 삼두근; PSOAS, 대요근, 횡격막; WT, 야생형, LRS, 젖산 링거 용액.
도 9는 12개월령 SGCA^-/- 마우스에서 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 투여의 조직학적 결과를 도시한다. 도 9a는 개선된 근육 병리를 도시한다. 도 9b는 비복근(GAS)과 삼두근(TRI) 근육에서 중앙 핵형성의 감소와 평균 섬유 크기의 증가를 도시한다. 도 9c는 미처리 대조군과 비교하여 섬유증 수준의 감소를 도시한다. 약어: TA, 전방 경골; GAS, 비복근; QD, 대퇴사두근; GLUT, 둔근; PSO, 대요근, TRI, 삼두근; 횡격막; WT, 야생형.
도 10은 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 투여 후 고령 마우스에서의 기능적 개선을 도시한다.

본 개시내용은 알파-사르코글리칸을 발현하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 rAAV의 투여가 사지 연결 근위축증 동물 모델에서 근육 섬유증의 감소 또는 완전한 역전을 초래한다는 발견을 기반으로 한다. 본원의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본원에 기재된 rAAV의 투여는 감소된 CK 수준, 증가된 근육력, 개선된 보행 및 수직 활동, 및 기타 운동 기능을 포함하는 근위축증 특징의 역전을 초래하였다.

본 발명의 실시는 달리 지시되지 않는 한 당해 기술 분야 내의 바이러스학, 미생물학, 분자 생물학 및 재조합 DNA 기술의 통상적인 방법을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 완전히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Current Edition)]; 문헌[DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. I & II (D. Glover, ed.)]; 문헌[Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., Current Edition)]; 문헌[Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition)]; 문헌[Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition)]; 문헌[CRC Handbook of Parvoviruses, vol. I & II (P. Tijssen, ed.)]; 문헌[Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & II (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds.)]; 문헌[Freshney Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (Wiley-Liss, Third Edition)]; 및 문헌[Ausubel et al. (1991) Current Protocols in Molecular Biology (Wiley Interscience, N.Y.)]를 참조한다.

상기 또는 하기에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.

정의

본원에서 사용된 단수 형태는 문맥에서 명백하게 달리 지시되지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "세포"에 대한 언급은 복수의 이러한 세포를 포함하고 "배양물"에 대한 언급은 당업자에게 공지된 하나 이상의 배양물 및 그의 등가물 등에 대한 언급을 포함한다. "재조합 AAV"에 대한 언급은 둘 이상의 rAAV 비리온 등의 혼합물을 포함한다. 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 달리 명시되지 않는 한 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

청구범위에서 용어 "또는"의 사용은 대안만 지칭하도록 명시적으로 나타내지 않는 한 "및/또는"을 의미하는 데 사용되거나 대안은 상호 배타적이지만 본 개시는 대안 및 "및/또는"만을 지칭하는 정의를 지지한다.

본 출원 전체에 걸쳐, 용어 "약"은 값을 결정하기 위해 사용되는 장치 또는 방법에 대한 통계적 실험 오차(오차의 표준 편차)를 포함하는 값을 나타내는 데 사용된다.

용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 염색체, 바이러스, 비리온 등과 같은 임의의 유전적 요소를 의미하며, 이는 적절한 제어 요소와 결합될 때 복제가 가능하고 세포들 사이의 유전자 서열을 전사할 수 있다. 일 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 발현 벡터는 다양한 제어 서열, 구조 유전자(예를 들어, 관심 유전자) 및 다른 기능도 수행하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "AAV"는 아데노 관련 바이러스에 대한 표준 약어이다. 아데노 관련 바이러스는 공동 감염 헬퍼 바이러스에 의해 특정 기능이 제공되는 세포에서만 성장하는 단일 가닥 DNA 파보 바이러스이다. 특징화된 13가지 혈청형의 AAV가 현재 존재한다. AAV의 일반 정보 및 리뷰는 예를 들어, 문헌[Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, Vol. 1, pp. 169-228], 및 문헌[Berns, 1990, Virology, pp. 1743-1764, Raven Press, (New York)]에서 확인할 수 있다. 그러나, 다양한 혈청형이 유전적 수준에서도 구조적 및 기능적으로 매우 밀접하게 관련되어 있다는 것이 잘 알려져 있기 때문에 이러한 동일한 원리가 추가 AAV 혈청형에 적용될 수 있을 것으로 기대된다. (예를 들어, 문헌[Blacklowe, 1988, pp. 165-174 of Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ed.]; 및 문헌[Rose, Comprehensive Virology 3:1-61 (1974)] 참조.) 예를 들어, 모든 AAV 혈청형은 상동성 rep 유전자에 의해 매개되는 매우 유사한 복제 특성을 명백히 나타내고; 모두 AAV2에서 발현된 것과 같은 3개의 관련 캡시드 단백질을 보유한다. 관련성의 정도는 게놈의 길이를 따라 혈청형 사이에 광범위한 교차-혼성화를 나타내는 이종이중 분석; 및 "역 말단 반복 서열"(ITR)에 대응하는 말단에 유사한 자가-어닐링 세그먼트의 존재에 의해 추가로 시사된다. 유사한 감염성 패턴은 또한 각 혈청형에서의 복제 기능이 유사한 조절 제어 하에 있음을 시사한다.

용어 "AAV 벡터"는 AAV 말단 반복 서열(ITR)의 측면에 있는 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드(또는 이식유전자)를 포함하는 벡터를 지칭한다. 이러한 AAV 벡터는 rep 및 cap 유전자 생성물을 코딩 및 발현하는 벡터로 형질감염된 숙주 세포에 존재할 때 감염성 바이러스 입자로 복제 및 패키징될 수 있다. 일 실시형태에서, AAV 벡터는 비제한적으로 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV rh10, 및 AAV rh74를 포함하는 아데노 관련 바이러스 혈청형으로부터 유래된 벡터이다. AAV 벡터는 하나 이상의 전체 또는 일부가 결실된 AAV 야생형 유전자, 바람직하게는 rep 및/또는 cap 유전자를 가질 수 있지만, 기능적 측면 ITR 서열은 보유할 수 있다. 기능적 ITR 서열은 AAV 비리온의 구조, 복제 및 패키징에 필요하다. 따라서, AAV 벡터는 바이러스의 복제 및 패키징(예를 들어, 기능적 ITR)을 위해 시스에서 필요한 서열을 적어도 포함하는 것으로 본원에서 정의된다. ITR은 야생형 뉴클레오티드 서열일 필요는 없으며, 서열이 기능적 구조, 복제 및 패키징을 제공하는 한, 예를 들어 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있다.

용어 "AAV 헬퍼 기능"은 생산적인 AAV 복제를 위해 트랜스로 기능하는 AAV 유전자 생성물을 제공하기 위해 발현될 수 있는 AAV-유래 코딩 서열을 지칭한다. 따라서, AAV 헬퍼 기능은 주요 AAV 개방 판독 프레임(ORF), rep 및 cap을 포함한다. Rep 발현 생성물은 특히 하기를 포함하는 많은 기능을 소유하는 것으로 나타났다: DNA 복제의 AAV 기원의 인식, 결합 및 닉킹; DNA 헬리카제 활성; 및 AAV(또는 다른 이종) 프로모터로부터의 전사 조절. Cap 발현 생성물은 필요한 패키징 기능을 제공한다. AAV 헬퍼 기능은 AAV 벡터에서 누락된 트랜스로 AAV 기능을 보완하기 위해 본원에서 사용된다.

"재조합 바이러스"는 예를 들어 바이러스 입자 내로 이종 핵산 서열의 첨가 또는 삽입에 의해 유전적으로 변경된 바이러스를 의미한다.

"AAV 비리온"또는 "AAV 바이러스 입자" 또는 "AAV 벡터 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 캡시드화 폴리뉴클레오티드 AAV 벡터로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다. 일 실시형태에서, AAV 비리온은 이종 폴리뉴클레오티드(즉, 포유동물 세포에 전달될 이식유전자와 같은 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오티드)를 포함한다. 일부 실시형태에서, AAV 바이러스 입자의 생성은 AAV 벡터의 생성을 포함하는데, 이러한 벡터는 AAV 벡터 입자 내에 포함되어 있기 때문이다. 입자가 이종 폴리뉴클레오티드(즉, 포유동물 세포에 전달될 이식유전자와 같은 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 경우, 이는 일반적으로 "rAAV 벡터" 또는 간단히 "rAAV 입자"로 지칭된다. 따라서, AAV 벡터 입자의 생성은 반드시 rAAV의 생성을 포함하는데, rAAV 게놈이 rAAV 벡터 입자 내에 포함되어 있기 때문이다.

예를 들어, 야생형(wt) AAV 바이러스 입자는 AAV 캡시드 단백질 코트와 관련된 선형의 단일 가닥 AAV 핵산 게놈을 포함한다. AAV 비리온은 단일 가닥(ss) AAV 또는 자가 상보적(SC) AAV일 수 있다. 일 실시형태에서, 상보적 센스, 예를 들어 "센스" 또는 "안티센스" 가닥의 단일 가닥 AAV 핵산 분자는 AAV 비리온 내로 패키징될 수 있고 두 가닥 모두 동등하게 감염성이다.

용어 "재조합 AAV" 또는 "rAAV"는 AAV ITR에 의해 양쪽 측면에 있는 관심의 이종 뉴클레오티드 서열을 캡시드화하는 AAV 단백질 쉘로 구성된 감염성 복제-결함 바이러스로 본원에서 정의된다. 일 실시형태에서, rAAV는 AAV 벡터, AAV 헬퍼 기능 및 부속 기능이 도입된 적합한 숙주 세포에서 생성된다. 이러한 방식으로, 숙주 세포는 AAV 벡터(관심의 재조합 뉴클레오티드 서열 함유)를 후속 유전자 전달을 위해 감염성 재조합 비리온 입자로 패키징하는 데 필요한 AAV 폴리펩티드를 코딩할 수 있다.

용어 "형질감염"은 세포에 의한 외래 DNA의 흡수를 의미하며, 세포는 외인성 DNA가 세포막 내부에 도입되었을 때 "형질감염"되었다. 다수의 형질감염 기술이 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Graham et al. (1973) Virology, 52:456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories], 문헌[New York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier], 및 문헌[Chu et al. (1981) Gene 13:197]를 참조한다. 이러한 기술은 뉴클레오티드 통합 벡터 및 기타 핵산 분자와 같은 하나 이상의 외인성 DNA 모이어티를 적합한 숙주 세포에 도입하는 데 사용될 수 있다.

용어 "형질도입"은 DNA 분자가 재조합 AAV 비리온과 같은 복제-결함 바이러스 벡터를 통해 생체내 또는 시험관내에서 수용체 세포로 전달되는 것을 의미한다.

용어 "숙주 세포"는, 예를 들어, AAV 헬퍼 작제물, AAV 벡터 플라스미드, 부속 기능 벡터, 또는 다른 전사 DNA의 수용체로서 사용될 수 있거나 사용된 미생물, 효모 세포, 곤충 세포 및 포유동물 세포를 의미한다. 이 용어는 형질감염된 원래 세포의 자손을 포함한다. 따라서, 본원에 사용된 "숙주 세포"는 일반적으로 외인성 DNA 서열로 형질감염된 세포를 지칭한다. 단일 모 세포의 자손은 자연적, 우연적 또는 고의적 돌연변이로 인해 형태 또는 게놈 또는 전체 DNA 보체가 원래 모체와 반드시 완전히 동일하지 않을 수 있다는 것이 이해된다.

코딩 서열 및 제어 서열과 같은 핵산 서열과 관련된 용어 "이종"은 정상적으로 함께 연결되지 않고/연결되지 않거나 특정 세포와 정상적으로 연관되지 않는 서열을 나타낸다. 따라서, 핵산 작제물 또는 벡터의 "이종" 영역은 자연에서 다른 분자와의 결합에서 발견되지 않는 또 다른 핵산 분자 내에 또는 이에 부착된 핵산의 단편이다. 예를 들어, 핵산 작제물의 이종 영역은 자연에서 코딩 서열과의 결합에서 발견되지 않는 서열에 의해 측면에 있는 코딩 서열을 포함할 수 있다. 이종 코딩 서열의 또 다른 예는 코딩 서열 자체가 자연에서 발견되지 않는 작제물(예를 들어, 천연 유전자와 상이한 코돈을 갖는 합성 서열)이다. 유사하게, 세포에 정상적으로 존재하지 않는 작제물로 형질전환된 세포는 본 발명의 목적상 이종인 것으로 간주될 것이다. 대립형질 변이 또는 자연적으로 발생하는 돌연변이 사건은 본원에 사용된 바와 같이 이종 DNA를 발생시키지 않는다.

"코딩 서열" 또는 특정 단백질을 "코딩하는" 서열은 적절한 조절 서열의 제어 하에 놓일 때 시험관내 또는 생체내에서 폴리펩티드로 전사되고(DNA의 경우) 번역(mRNA의 경우)되는 핵산 서열이다. 코딩 서열의 경계는 5'(아미노) 말단의 시작 코돈과 3'(카르복시) 말단의 번역 정지 코돈에 의해 결정된다. 코딩 서열은 원핵생물 또는 진핵생물 mRNA로부터의 cDNA, 원핵생물 또는 진핵생물 DNA로부터의 게놈 DNA 서열, 및 심지어 합성 DNA 서열을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 전사 종결 서열은 일반적으로 코딩 서열의 3'에 위치할 것이다.

"핵산" 서열은 DNA 또는 RNA 서열을 지칭한다. 핵산은 4-아세틸시토신, 8-하이드록시-N6-메틸아데노신, 아지리디닐시토신, 슈도이소시토신, 5-(카르복시하이드록실메틸)우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸아데닌, 1-메틸슈도우라실, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카르보닐메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 옥시부톡소신, 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, -우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오시토신 및 2,6-디아미노퓨린을 포함하지만 이에 제한되지 않는 DNA 및 RNA의 염기 유사체를 포함한다.

용어 DNA "제어 서열"은 프로모터 서열, 폴리아데닐화 신호, 전사 종결 서열, 업스트림 조절 도메인, 복제 기점, 내부 리보솜 진입 부위("IRES"), 인핸서 등을 총괄적으로 지칭하며, 이는 수용체 세포에서 코딩 서열의 복제, 전사 및 번역을 총괄적으로 제공한다. 선택된 코딩 서열이 적절한 숙주 세포에서 복제, 전사 및 번역될 수 있는 한, 이들 제어 서열 모두가 항상 존재할 필요는 없다.

용어 "프로모터"는 DNA 조절 서열을 포함하는 뉴클레오티드 영역을 지칭하기 위해 본원에서 통상적인 의미로 사용되며, 조절 서열은 RNA 폴리머라제에 결합할 수 있고 다운스트림(3'-방향) 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 유전자로부터 유래된다. 전사 프로모터는 "유도성 프로모터"(프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현이 분석물, 보조인자, 조절 단백질 등에 의해 유도되는 경우), "억제성 프로모터"(프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현이 분석물, 보조인자, 조절 단백질 등에 의해 유도되는 경우) 및 "구성 프로모터"를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 프로모터는 근육 특이적 프로모터이며, 이는 인간 골격 액틴 유전자 요소, 심장 액틴 유전자 요소, 데스민 프로모터, 골격 알파-액틴(ASKA) 프로모터, 트로포닌 I(TNNI2) 프로모터, 근세포 특이적 인핸서 결합 인자 mef 결합 요소, 근육 크레아틴 키나제(MCK) 프로모터, 절단된 MCK(tMCK) 프로모터, 미오신 중쇄(MHC) 프로모터, 하이브리드 a-미오신 중쇄 인핸서-/MCK 인핸서-프로모터(MHCK7) 프로모터, C5-12 프로모터, 뮤린 크레아틴 키나제 인핸서 요소, 골격 속근 트로포닌 c 유전자 요소, 지근 심장 트로포닌 c 유전자 요소, 지근 트로포닌 i 유전자 요소, 저산소증 유도성 핵 인자(HIF)-반응 요소(HRE), 스테로이드 유도성 요소 및 글루코코르티코이드 반응 요소(gre)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 프로모터는 MCK 프로모터, tMCK 프로모터, 또는 MHCK7 프로모터이다.

용어 "작동 가능하게 연결된"은 기재된 구성요소가 일반적인 기능을 수행하도록 구성되는 요소의 배열을 지칭한다. 따라서, 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 제어 서열은 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 제어 서열은 그 발현을 지시하는 기능을 하는 한 코딩 서열과 인접할 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 중간에 번역되지 않았지만 전사된 서열이 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 존재할 수 있고 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동 가능하게 연결된" 것으로 간주될 수 있다.

프로모터는 RNA 폴리머라제가 프로모터 서열에 결합하고 코딩 서열을 mRNA로 전사할 때 세포에서 코딩 서열의 "전사를 지시"하고, 이는 이어서 코딩 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드로 번역된다.

"발현 카세트" 또는 "발현 작제물"은 관심 서열(들) 또는 유전자(들)의 발현을 지시할 수 있는 어셈블리를 지칭한다. 발현 카세트는 관심 서열(들) 또는 유전자(들)에 작동 가능하게 연결된(전사를 지시하기 위해) 프로모터와 같은 상기 기재된 바와 같은 제어 요소를 포함하고 종종 폴리아데닐화 서열도 포함한다. 본 발명의 특정 실시형태 내에서, 본원에 기재된 발현 카세트는 플라스미드 작제물 내에 함유될 수 있다. 발현 카세트의 구성요소 이외에, 플라스미드 작제물은 또한 하나 이상의 선택 가능한 마커, 플라스미드 작제물이 단일 가닥 DNA로서 존재하도록 하는 신호, 적어도 하나의 다중 클로닝 부위, 및 "포유동물" 복제 기점(예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스 복제 기점)을 포함할 수 있다.

뉴클레오티드 서열을 언급할 때 "단리된"은 지시된 분자가 다른 뉴클레오티드 서열, 염색질 물질 등과 같은 다른 생물학적 거대분자의 실질적인 부재 하에 존재함을 의미한다. 따라서, "특정 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자"는 대상체 폴리펩티드를 코딩하지 않는 다른 핵산 분자가 실질적으로 없는 핵산 분자를 지칭하며; 그러나, 분자는 조성물의 기본 특성에 해로운 영향을 미치지 않는 일부 추가 염기 또는 모이어티를 포함할 수 있다.

본 출원 전반에 걸쳐 특정 핵산 분자에서 뉴클레오티드 서열의 상대적 위치를 설명하기 위해, 예를 들어 특정 뉴클레오티드 서열이 다른 서열에 대해 "업스트림", "다운스트림", "3" 또는 "5"에 위치하는 것으로 기술되는 경우, 당업계에서 통상적인 것으로 언급되는 DNA 분자의 "센스" 또는 "코딩" 가닥에서 서열의 위치인 것으로 이해되어야 한다.

핵산 또는 아미노산 서열의 맥락에서 용어 "서열 동일성", "퍼센트 서열 동일성", 또는 "퍼센트 동일한"은 최대 일치성을 위해 정렬될 때 동일한 2개의 서열 내의 잔기를 지칭한다. 서열 동일성 비교의 길이는 게놈의 전장에 걸쳐 있을 수 있고, 유전자 코딩 서열의 전장, 또는 적어도 약 500 내지 5000개 뉴클레오티드의 단편이 바람직하다. 그러나, 더 작은 단편 간의 동일성, 예를 들어 적어도 약 9개의 뉴클레오티드, 일반적으로 적어도 약 20개 내지 24개의 뉴클레오티드, 적어도 약 28개 내지 32개의 뉴클레오티드, 적어도 약 36개 또는 그 이상의 뉴클레오티드가 또한 바람직할 수 있다. 서열의 동일성 백분율은 당업계에 공지된 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 상동성은 서열 정보를 정렬하고 ALIGN, ClustalW2 및 BLAST와 같은 쉽게 이용 가능한 컴퓨터 프로그램을 사용하여 2개의 폴리펩티드 분자 사이의 서열 정보를 직접 비교함으로써 결정될 수 있다. 일 실시형태에서, BLAST가 정렬 도구로서 사용될 때, 기본 매개변수는 다음과 같다: 유전자 코드=표준; 필터=없음; 가닥=둘 다; 컷오프=60; 기대=10; 매트릭스=BLOSUM62; 설명=50개 서열; 정렬 기준=높은 점수; 데이터베이스=비중복, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS 번역+Swiss 단백질+Spupdate+PIR.

용어 "대상체"는 동물계의 모든 구성원을 지칭하며, 여기에는 비제한적으로 인간 및 비인간 영장류, 예컨대 침팬지 및 기타 유인원 및 원숭이 종; 농장 동물, 예컨대 소, 양, 돼지, 염소 및 말; 가축 포유동물, 예컨대 개 및 고양이; 마우스, 래트 및 기니피그와 같은 설치류를 포함하는 실험 동물 등이 포함된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 출생 내지 2세, 1 내지 10세, 또는 4 내지 15세, 또는 10 내지 19세, 또는 20 내지 40세, 또는 15 내지 29세 또는 25 내지 55세, 또는 40 내지 60세, 또는 50세 초과 또는 60세 초과 또는 65세 초과 또는 70세 초과의 인간이다. 예를 들어, 대상체는 인간 어린이(2 내지 12세), 인간 청소년(10 내지 19세)이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 성인 인간(18세 또는 그 이상)이다. 특히, 대상체는 젊은 성인 인간(15 내지 29세), 중년 성인 인간(25 내지 55세) 또는 나이든 성인 인간(50세 초과) 또는 노인 인간 대상체(65세 초과) 또는 노령 인간 대상체(70세 초과)이다.

"치료 효과"는 본원에 기재된 치료에 의해 부여되는 임의의 치료적 이점을 의미한다. 예를 들어, 이러한 효과는 적절한 표적 조직에서 관심 근위축증에서 결핍되거나 누락된 단백질 또는 효소의 지속적인 발현일 수 있다. 또한, 치료 효과는 관심 질환 또는 장애의 하나 이상의 임상 또는 무증상 징후의 감소 또는 제거일 수 있다. 예를 들어, CK 수준의 감소, 섬유증의 감소가 감소하며; 전방 경골 근육에서 수축 유발 손상에 대한 저항 증가; 및/근육에서 증가된 비력 및 개선된 운동 기능은 치료된 LGMD-2D 대상체에게 치료적 이점을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본원에 기재된 재조합 AAV 벡터는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 알파-사르코글리칸을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 단백질은 α-사르코글리칸 활성을 유지한다. 또 다른 실시형태에서, 알파-사르코글리칸은 SEQ ID NO: 2에 제시된 폴리펩티드 서열을 포함한다.

또 다른 양태에서, 엄격한 조건 하에 SEQ ID NO: 1과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 기능성 알파-사르코글리칸을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 AAV 벡터, 또는 이의 상보체가 본원에 기재된다. 또 다른 실시형태에서, rAAV는 SEQ ID NO: 4와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, rAAV는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

용어 "엄격한"은 당업계에서 일반적으로 엄격한 것으로 이해되는 조건을 지칭하기 위해 사용된다. 혼성화 엄격성은 주로 온도, 이온 강도 및 포름아미드와 같은 변성제의 농도에 의해 결정된다. 혼성화 및 세척을 위한 엄격한 조건의 예는 65 내지 68℃에서 0.015 M 염화나트륨, 0.0015 M 시트르산나트륨 또는 42℃에서 0.015 M 염화나트륨, 0.0015 M 시트르산나트륨 및 50% 포름아미드이다. 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, N.Y. 1989)]을 참조한다. 보다 엄격한 조건(예컨대 더 높은 온도, 더 낮은 이온 강도, 더 높은 포름아미드 또는 다른 변성제)이 사용될 수도 있지만, 혼성화 속도에 영향을 줄 것이다. 데옥시올리고뉴클레오티드의 혼성화가 관련된 경우에, 추가의 예시적인 엄격한 혼성화 조건은 37℃(14-염기 올리고), 48℃(17-염기 올리고), 55℃(20-염기 올리고) 및 60℃(23-염기 올리고)에서 6x SSC 0.05% 피로인산나트륨으로 세척하는 것을 포함한다.

분자량, 농도 또는 투여량과 같은 물리적 특성에 대한 범위가 본원에서 사용되는 경우, 범위 및 그 안의 특정 실시형태의 모든 조합 및 하위 조합이 포함되는 것으로 의도된다. 숫자 또는 숫자 범위를 언급할 때 "약"이라는 용어는 언급된 숫자 또는 숫자 범위가 실험적 변동성(또는 통계적 실험 오차 내)의 근사치임을 의미하므로 숫자 또는 숫자 범위는 예를 들어 명시된 숫자 또는 숫자 범위의 1% 내지 15% 사이로 다를 수 있다.

비특이적 및/또는 백그라운드 혼성화를 감소시키기 위해 다른 작용제가 혼성화 및 세척 완충제에 포함될 수 있다. 예는 0.1% 소 혈청 알부민, 0.1% 폴리비닐-피롤리돈, 0.1% 피로인산나트륨, 0.1% 나트륨 도데실설페이트, NaDodSO₄, (SDS), 피콜, 덴하르트 용액, 초음파 처리된 연어 정자 DNA(또는 다른 비-상보적 DNA) 및 덱스트란 설페이트이지만, 다른 적합한 작용제가 또한 사용될 수 있다. 이들 첨가제의 농도 및 유형은 혼성화 조건의 엄격성에 실질적으로 영향을 미치지 않으면서 변경될 수 있다. 혼성화 실험은 일반적으로 pH 6.8 내지 7.4에서 수행되지만, 전형적인 이온 강도 조건에서 혼성화 속도는 pH에 거의 독립적이다. 문헌[Anderson et al., Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach, Ch. 4, IRL Press Limited (Oxford, England)]를 참조한다. 혼성화 조건은 이들 변수를 수용하고 상이한 서열 관련성의 DNA가 하이브리드를 형성하게 하기 위해 당업자에 의해 조정될 수 있다.

사지 연결 근위축증 유형 2D(LGMD2D)는 근육 쇠약, 호흡 이상 및 드문 경우 심근병증으로 나타나는 진행성 근위축증이다. LGMD2D는 알파-사르코글리칸 유전자의 돌연변이로 인해 단백질이 손실되고 사르코글리칸 및 디스트로핀 관련 당단백질 복합체가 동시에 손실된다. Sgca-null(sgca^-/-) 마우스는 근육 괴사 및 섬유증, 혈청 크레아틴 키나아제(CK) 상승, 및 절대 근육력 생성 및 운동 활동 감소와 같은 이영양 특징을 포함하는 LGMD2D 환자의 임상 표현형을 요약한다. 따라서, sgca^-/- 마우스는 유전자 대체의 안전성과 효능을 시험하기 위한 관련 모델을 제공한다. 이로써, 본 개시내용은 근육 특이적 프로모터, 절단된 근육 크레아틴 키나제(tMCK)에 의해 구동되는 코돈 최적화된 전장 인간 SGCA(hSGCA) 이식유전자를 함유하는 자가-상보적 AAVrh74 벡터를 제공한다. sgca^-/- 마우스에서 scAAVrh74.tMCK.hSGCA의 효능 및 안전성은 비히클 처리 및 야생형 마우스와 비교하여 1 x 10¹², 3 x 10¹², 및 6 x 10¹² vg의 단일 전신 주사를 평가하기 위해 용량 증량 설계를 사용하여 시험되었다. sgca^-/- 마우스에서 scAAVrh74.tMCK.hSGCA로의 처리는 시험된 모든 용량에서 골격근의 근막에서 α-SG의 강력한 단백질 발현을 초래하였다. 또한, scAAVrh74.tMCK.hSGCA는 섬유증 및 중앙 핵형성의 감소 및 근섬유 크기의 정규화에 의해 나타난 바와 같이 sgca^-/- 마우스의 사지 및 횡격막 근육의 조직병리를 개선하는 데 효과적이었다. 이러한 분자 변화는 횡격막과 전경골근의 비력 생성의 유의한 증가, 편심력 손실에 대한 보호 및 혈청 CK의 감소와 동시에 발생했다. 비히클 처리된 sgca^-/- 마우스와 비교하여 벡터 처리된 모든 용량에서 운동 활동이 개선되었다. 마지막으로, 혈청 화학 패널과 육안 부검에서 벡터 관련 독성의 결핍이 검출되었다. 종합적으로, 이 연구는 LGMD2D 치료를 위한 임상 설정에서 scAAVrh74.tMCK.hSGCA의 전신 전달을 지원한다.

또 다른 양태에서, 본원에 기재된 재조합 AAV 벡터는 근육-특이적 제어 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 근육 특이적 프로모터는 인간 골격 액틴 유전자 요소, 심장 액틴 유전자 요소, 데스민 프로모터, 골격 알파-액틴(ASKA) 프로모터, 트로포닌 I(TNNI2) 프로모터, 근세포 특이적 인핸서 결합 인자 mef 결합 요소, 근육 크레아틴 키나제(MCK) 프로모터, 절단된 MCK(tMCK) 프로모터, 미오신 중쇄(MHC) 프로모터, 하이브리드 a-미오신 중쇄 인핸서-/MCK 인핸서-프로모터(MHCK7) 프로모터, C5-12 프로모터, 뮤린 크레아틴 키나제 인핸서 요소, 골격 속근 트로포닌 c 유전자 요소, 지근 심장 트로포닌 c 유전자 요소, 지근 트로포닌 i 유전자 요소, 저산소증 유도성 핵 인자(HIF)-반응 요소(HRE), 스테로이드 유도성 요소 및 글루코코르티코이드 반응 요소(gre) 중 하나 이상을 포함한다.

일 실시형태에서, 근육 특이적 프로모터는 SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 tMCK 프로모터이다. 본원에 기재된 예시적인 rAAV는 SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 AAVrh74.tMCK.hSCGA이다. 일부 실시형태에서, AAVrh74.tMCK.hSCGA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 4에 제시된 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID NO: 1과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다.

또 다른 실시형태에서, AAVrh74.tMCK.hSCGA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 알파-사르코글리칸 활성을 유지하는 단백질을 코딩한다.

일 실시형태에서, rAAV는 SEQ ID NO: 5의 5' 역 말단 반복 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, rAAV는 SEQ ID NO: 6의 3' 역 말단 반복 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV는 SEQ ID NO: 7의 폴리 A 서열을 포함한다.

AAV는 임의의 혈청형, 예를 들어 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV rh.10, AAV rh.74, 또는 이의 변이체 및 유도체일 수 있다. 일 실시형태에서, rAAV는 혈청형 AAVrh.74이다. 슈도형(pseudotyped) rAAV의 제조는 예를 들어 국제공개 WO 2001/083692호에 개시되어 있으며, 그 전체 내용이 인용되어 포함된다. 다른 유형의 rAAV 변이체, 예를 들어 캡시드 돌연변이를 갖는 rAAV가 또한 고려된다. 예를 들어 문헌[Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014)]을 참조한다.

본원에 기재된 임의의 rAAV 벡터를 포함하는 조성물이 또한 고려된다.

재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) scAAVrh74.tMCK.hSGCA를 투여하는 단계를 포함하는 근위축증 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근위축증을 치료하는 방법이 제공되며, rAAV는 약 1.0 x 10¹² vg/ kg 내지 약 5.0 x 10¹⁵ vg/kg의 용량으로 투여된다. 예를 들어, 임의의 제공된 방법에서, 투여되는 rAAV의 용량은 약 1.0 x 10¹² vg/kg 내지 약 2.0 x 10¹⁵ vg/kg, 약 5 x 10¹² vg/kg 내지 약 1.0 x 10¹⁵ vg/kg, 약 1.0 x 10¹³ vg/kg 내지 약 5.0 x 10¹⁴ vg/kg, 약 5x10¹³ vg/kg 내지 약 2x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 2.0 x 10¹³ vg/kg 내지 약 3.0 x 10¹⁴ vg/kg이다. 또 다른 실시형태에서, 용량은 약 5.0 x 10¹³ vg/kg, 1.0 x 10¹⁴ vg/kg, 또는 2.0 x 10¹⁴ vg/kg이다. 일 실시형태에서, rAAV는 정맥내 경로를 포함하는 전신 경로에 의해 투여된다. 또 다른 실시형태에서, rAAV는 약 5.0 x 10¹³ vg/kg, 1.0 x 10¹⁴ vg/kg, 또는 2.0 x 10¹⁴ vg/kg의 용량으로 정맥내 투여된다. 일 실시형태에서, 근위축증은 사지 연결 근위축증이다.

또한, 투여되는 rAAV의 용량은 약 1.5 x 10¹³ vg 내지 약 3.5 x 10¹⁶ vg, 또는 3 x 10¹³ vg 내지 1 x 10¹⁶ vg, 또는 약 1.5 x 10¹³ vg 내지 약 2 x 10¹⁵ vg, 또는 약 1.5 x 10¹³ vg 내지 약 1 x 10¹⁵ vg이다. 또한, 임의의 방법에서, rAAV의 용량은 약 10 mL/kg의 농도로 투여된다. 일 실시형태에서, 근위축증은 사지 연결 근위축증이다. 일 실시형태에서, 근위축증은 사지 연결 근위축증, 유형 2D이다. vg 또는 vg/kg으로 표시되는 본 개시내용의 용량은 정량적 PCR(qPCR)에 의한 적정 자격 방법을 기반으로 한다. qPCR 기반 적정 방법은 당업계에 알려져 있다.

또한, 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) scAAVrh74.tMCK.hSGCA를 투여하는 단계를 포함하는 근위축증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 근위축증을 치료하는 방법이 제공되며, rAAV는 전신 투여 경로를 사용하여 약 1.0 x 10¹² vg/kg 내지 약 2.0 x 10¹⁵ vg/kg의 용량으로 투여되고; 대상체의 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자 발현 수준은 rAAV 투여 전 알파-사르코글리칸 유전자 발현 수준과 비교하여 rAAV 투여 후 증가하고; 대상체에서 혈청 CK 수준은 rAAV 투여 전 혈청 CK 수준과 비교하여 rAAV 투여 후 감소하고/감소하거나; 운동 활성 및 비력 생성은 증가하고; 섬유증은 감소하고; 전방 경골 근육에서 수축 유도 손상에 대한 저항이 증가하고; 대상체의 근육 조직에서 알파-사르코글리칸 양성 섬유의 수는 rAAV 투여 전 알파-사르코글리칸 양성 섬유의 수와 비교하여 rAAV 투여 후 증가하고; 대상체의 근육 조직에서 섬유 직경 크기는 rAAV 투여 전 섬유 직경의 수와 비교하여 rAAV 투여 후 증가하거나; 대상체의 근육 조직에서 중앙 핵형성은 rAAV 투여 전 중앙 핵형성과 비교하여 rAAV 투여 후 감소한다. 근육 조직은 삼두근, 전방 경골, 가자미근, 비복근, 이두근, 승모근, 둔근, 대요근, 삼각근, 대퇴사두근 및 횡격막을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 근육 조직은 전방 경골, 비복근, 둔근, 대요근 및 삼두근을 포함한다. 알파-사르코글리칸의 발현은 당업자에게 공지된 방법에 의해 결정된다. 일 실시형태에서, 발현은 근육 생검에서 웨스턴 블롯, 면역화학에 의해, 및/또는 게놈 DNA의 마이크로그램당 벡터 게놈의 수를 검출함으로써 결정된다.

일부 실시형태에서, 본 개시내용은 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) scAAVrh74.tMCK.hSGCA를 투여하는 단계를 포함하는 근위축증 치료를 필요로 하는 대상체에서 근위축증을 치료하는 방법을 포함하며, 운동 기능은 rAAV 투여 전 상기 인간 대상체의 운동 기능과 비교하여 상기 인간 대상체에서 명백하게 개선된다.

SEQ ID NO: 4의 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 뉴클레오티드 서열을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 알파-사르코글리칸 증가를 필요로 하는 환자에서 알파-사르코글리칸을 증가시키는 방법이 제공된다.

임의의 제공된 근위축증 치료의 방법, 용도 및 조성물에서, 대상체는 4 내지 15세이며, 두 대립 유전자 모두에서 알파-사르코글리칸(SGCA) 돌연변이가 확인되었으며, AAVrh74 항체에 대해 음성이었고/음성이었거나 100 미터 보행 테스트에서 >40% 또는 정상이었다. 임의의 제공된 근위축증 치료 방법, 용도 및 조성물에서, 대상체는 소아 대상체이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 1세 내지 21세 범위의 대상체와 같은 소아 대상체이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 1세 내지 10세, 또는 2세 내지 12세, 4세 내지 15세, 또는 10세 내지 19세이다. 일 실시형태에서, 대상체는 12세 내지 21세 범위의 대상체와 같은 청소년 대상체이다. 또한, 일 실시형태에서, 대상체는 15세 내지 29세 또는 18세 내지 39세 범위의 대상체와 같은 젊은 성인 대상체이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 중년 성인 또는 노인 대상체이며, 이에 따라 중년 성인 대상체는 25 내지 55세 연령 범위일 수 있고, 나이든 성인 대상체는 50세 초과 연령 범위일 수 있고, 노인 대상체는 65세 초과 연령 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, rAAV는 주사, 주입 또는 이식에 의해 투여된다. 예를 들어, rAAV는 대략 1 내지 2시간에 걸친 주입에 의해 투여된다. 또한, rAAV는 말초 사지 정맥을 통한 정맥내 경로에 의해 투여된다.

재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) scAAVrh74.tMCK.hSGCA를 투여하는 단계를 포함하는 근위축증 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근위축증을 치료하는 방법에서, rAAV는 전신 투여 경로를 사용하여 약 1.0 x 10¹² vg/kg 내지 약 5.0 x 10¹⁴ vg/kg의 용량으로 투여되고, rAAV는 SEQ ID NO: 1과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, rAAV는 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, rAAV는 SEQ ID NO: 2와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하는 단백질을 코딩한다. 또 다른 실시형태에서, rAAV는 SEQ ID NO: 2에 제시된 폴리펩티드 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또한, 임의의 개시된 rAAV는 SEQ ID NO: 3의 tMCK 프로모터 서열과 같은 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV는 혈청형 AAVrh.74이다. 또한, rAAV는 SEQ ID NO: 3의 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, rAAV는 SEQ ID NO: 5의 5' 역 말단 반복 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, rAAV는 SEQ ID NO: 6의 3' 역 말단 반복 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, rAAV는 SEQ ID NO: 7의 폴리 A 서열을 포함한다.

AAV 투여량은 LISA, 역전사효소 활성 평가, FACS, 형질도입 분석 노던 블롯팅(예를 들어, 반정량적 노던), 도트 블롯 분석 또는 PCR(예를 들어, qPCR)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 여러 방법에 의해 결정될 수 있다. AAV 용량은 정량적 실시간 PCR(qPCR)로 AAV 벡터 게놈을 측정함으로써 결정될 수 있다는 것은 잘 알려져 있다. 이러한 qPCR 방법은 기존의 형질도입 분석의 불일치 또는 임의의 결과를 극복한다. PCR 투여량 결정의 일 실시형태에서, 플라스미드 DNA는 보정 표준으로 사용된다. 플라스미드의 형태는 qPCR 방법의 투여량 결과에 영향을 미칠 수 있다. 일 실시형태에서, 원형 또는 초나선형 DNA 또는 플라스미드가 정량화 표준으로서 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 선형 DNA 또는 플라스미드가 정량화 표준으로서 사용된다.

용어 "초나선형 DNA" 또는 "초나선형 플라스미드"는 자유 말단을 포함하지 않는 DNA 또는 플라스미드를 지칭한다. 용어 "선형 DNA" 또는 "선형 플라스미드"는 서로 연결되지 않은 자유 5' 말단 및 자유 3' 말단을 포함하는 DNA 또는 플라스미드를 지칭한다. 일 실시형태에서, 선형 DNA 또는 플라스미드는 원형 DNA(예를 들어, 플라스미드 DNA)의 제한 절단 또는 dbDNA의 제한 절단에 의해 수득된다. 또 다른 실시형태에서, 제한 절단은 적어도 하나의 블런트 말단을 생성하는 효소를 사용하여 수행된다.

예시적인 실시형태에서, 근위축증 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근위축증을 치료하는 방법은 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) scAAVrh74. tMCK7.hSGCA를 투여하는 단계를 포함하며, rAAV는 전신 투여 경로를 사용하여 약 1.0 x 10¹² vg/kg 내지 약 5.0 x 10¹⁴ vg/kg의 용량으로 투여되고, 인간 대상체는 사지 연결 근위축증을 앓고 있다. 일 실시형태에서, rAAV는 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 5.0 x 10¹³ vg/kg, 1.0 x 10¹⁴ vg/kg, 또는 2.0 x 10¹⁴ vg/kg의 용량으로 대략 1 내지 2시간에 걸쳐 정맥내 주입에 의해 투여되고, rAAV는 SEQ ID NO: 3의 scAAVrh74. tMCK7.hSGCA 작제물 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 용량은 정량 표준으로서 선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 1.85 x 10¹³ vg/kg 또는 7.41 x 10¹³ vg/kg이다.

본 개시내용은 또한 SEQ ID NO: 1, 및/또는 4와 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체의 근육 조직에서 사르코글리칸 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 개시내용은 SEQ ID NO: 1 및/또는 4와 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 작제물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체의 근육 기능을 개선하는 방법을 추가로 제공한다.

일부 양태에서, 대상체는 사르코글리칸 단백질을 코딩하는 유전자의 유전적 돌연변이 또는 근위축증을 앓고 있다. 일부 양태에서, 대상체는 알파-사르코글리칸 단백질을 코딩하는 유전자의 유전적 돌연변이를 앓고 있다.

임의의 제공된 방법에서, 대상체의 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자 발현 수준은 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 투여 전 알파-사르코글리칸 유전자 발현 수준과 비교하여 scAAVrh74.tMCK 7.hSGCA 작제물의 투여 후 증가한다.

또한, 임의의 제공된 방법에서, 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자의 발현은 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물의 투여 전후에 생검된 근육에서 웨스턴 블롯 또는 면역조직화학에서 알파-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다.

임의의 제공된 방법에서, 알파-사르코글리칸 단백질의 수준은 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물의 투여 후 증가한다. 예를 들어, 알파-사르코글리칸 단백질의 수준은 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물의 투여 전후에 생검된 근육에서 웨스턴 블롯 상의 알파-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출된 바와 같이 적어도 33% 증가하거나, 알파-사르코글리칸 단백질의 수준은 근육 생검에서 면역조직화학에 의해 및/또는 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물의 투여 전후에 게놈 DNA의 마이크로그램당 벡터 게놈의 수를 검출함으로써 측정된다.

본원에 제공된 임의의 방법에서, 대상체에서 혈청 CK 수준은 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 투여 전 혈청 CK 수준과 비교하여 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물의 투여 후 감소된다.

본원에 제공된 임의의 방법에서, 대상체의 근육 조직에서 알파-사르코글리칸 양성 섬유의 수는 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 투여 전 알파-사르코글리칸 양성 섬유의 수와 비교하여 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물의 투여 후 증가한다. 예를 들어, 알파-사르코글리칸 양성 섬유의 수는 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물의 투여 전후에 근육 생검에 대한 웨스턴 블롯 또는 면역조직화학에 의해 알파-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다. 예를 들어, 대상체의 근육 조직에서 알파-사르코글리칸 양성 섬유의 수는 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물의 투여 후 증가한다.

본원에 제공된 임의의 방법에서, 대상체에서 알파-사르코글리칸의 수준은 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 투여 전 알파-사르코글리칸의 수준과 비교하여 rAAV의 투여 후 증가한다. 알파-사르코글리칸의 수준은 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물의 투여 전후 근육 생검에 대한 면역조직화학 또는 웨스턴 블롯에 의해 알파-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다.

또 다른 실시형태는 SEQ ID NO: 4의 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 뉴클레오티드 서열을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자를 발현시키는 방법을 제공한다. 환자 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자를 발현하는 임의의 제공된 방법에서, 환자 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자의 발현은 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물의 투여 전후 근육 생검에서 웨스턴 블롯 또는 면역조직화학에서 알파-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다. 일 실시형태에서, 알파-사르코글리칸 유전자는 핵당 하나 초과의 rAAV 벡터 게놈 카피를 검출함으로써 환자에서 측정된다. 또 다른 실시형태에서, 알파-사르코글리칸 유전자의 발현은 게놈 DNA의 마이크로그램당 벡터 게놈의 수를 검출함으로써 대상체에서 측정된다.

SEQ ID NO: 4의 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 뉴클레오티드 서열을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 혈청 CK 수준 감소를 필요로 하는 환자에서 혈청 CK 수준을 감소시키는 방법이 또한 제공된다.

SEQ ID NO: 4의 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 뉴클레오티드 서열을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 환자 근육 조직에서 알파-사르코글리칸 양성 섬유를 증가시키는 방법이 제공된다. 임의의 이들 방법에서, 알파-사르코글리칸 양성 섬유의 수는 rAAV 투여 전후에 근육 생검에 대한 웨스턴 블롯 또는 면역조직화학에 의해 알파-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다.

또 다른 실시형태는 SEQ ID NO: 4의 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 뉴클레오티드 서열을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 알파-사르코글리칸 발현을 증가를 필요로 하는 대상체에서 알파-사르코글리칸의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다. 임의의 이들 방법에서, 알파-사르코글리칸의 수준은 rAAV의 투여 전후에 근육 생검에 대한 웨스턴 블롯 또는 면역조직화학에 의해 알파-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다.

본원에 기재된 임의의 재조합 AAV 벡터로 전달된 숙주 세포를 배양하고 형질감염된 세포의 상청액으로부터 재조합 AAV 입자를 회수하는 것을 포함하는 재조합 AAV 벡터 입자를 생성하는 방법이 또한 제공된다. 본원에 기재된 임의의 재조합 AAV 벡터를 포함하는 바이러스 입자가 또한 고려된다. 일 실시형태에서, rAAV를 생성하는 방법은 AAV 벡터 플라스미드를 숙주 세포에 전달하는 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 재조합 AAV 벡터 입자 및/또는 AAV 벡터 플라스미드는 SEQ ID NO: 8과 적어도 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 또는 약 89%, 보다 전형적으로 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 또는 그 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 SEQ ID NO: 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 AAV 벡터 플라스미드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 숙주 세포에서 안정적으로 발현된다. AAV 벡터 플라스미드를 안정적으로 보유하는 숙주 세포를 사용하여 rAAV를 생성할 수 있다. 일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 pAAV.tMCK.hSGCA. KAN 플라스미드(SEQ ID NO: 8)이다.

섬유증 감소를 필요로 하는 포유동물 대상체에서 섬유증을 감소시키는 방법이 또한 제공된다. 이와 관련하여, 상기 방법은 치료적 유효량의 본원에 기재된 AAV 벡터(또는 본원에 기재된 AAV 벡터를 포함하는 조성물)를 포유동물 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 포유동물 대상체는 근위축증을 앓고 있다. 일 실시형태에서, 근위축증은 LGMD2D이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 AAV 벡터(또는 본원에 기재된 AAV 벡터를 포함하는 조성물)의 투여는 대상체의 근육 조직에서 섬유증을 감소시킨다. 일 실시형태에서, 근육 조직은 대요근, 횡격막, 삼두근, 및/또는 둔근을 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "근위축증"은 근력 및 근육량이 점차적으로 감소하는 장애를 지칭한다. 근위축증 질환의 비제한적인 예는 베커 근위축증, 경골 근위축증, 뒤셴 근위축증, 에머리-드라이푸스 근위축증, 안면견갑상완 근위축증, 사코글리칸병증, 부분 LAMA2 결핍으로 인한 선천성 근위축증과 같은 선천성 근위축증, 메로신 결핍 선천성 근위축증, 유형 1D 선천성 근위축증, 후쿠야마 선천성 근위축증, 사지 연결 유형 1A 근위축증, 사지 연결 유형 2A 근위축증, 사지 연결 유형 2B 근위축증, 사지 연결 유형 2C 근위축증, 사지 연결 유형 2D 근위축증, 사지 연결 유형 2E 근위축증, 사지 연결 유형 2F 근위축증, 사지 연결 유형 2G 근위축증, 사지 연결 유형 2H 근위축증, 사지 연결 유형 2I 근위축증, 사지 연결 유형 2I 근위축증, 사지 연결 유형 2J 근위축증, 사지 연결 유형 2K 근위축증, 사지 연결 유형 IC 근위축증, 단순 수포성 표피박리증을 동반한 경직성 척추 근위축증, 안인두 근위축증, 울리히 선천성 근위축증 및 울리히 경화성 근위축증을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 사지 연결 근위축증을 앓고 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 사지 연결 근위축증 유형 2D(LGMD2D)를 앓고 있다.

본원에서 사용된 용어 "섬유증"은 세포외 기질(ECM) 성분의 과도하거나 조절되지 않는 침착 및 부상시 골격근, 심장 근육, 간, 폐, 신장 및 췌장을 포함하는 비정상적인 조직 복구 프로세스를 지칭한다. 침착되는 ECM 성분은 콜라겐, 예를 들어 콜라겐 1, 콜라겐 2 또는 콜라겐 3, 및 피브로넥틴을 포함한다.

또 다른 양태에서, 치료적 유효량의 본원에 기재된 AAV 벡터(또는 본원에 기재된 AAV 벡터를 포함하는 조성물)를 포유동물 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 포유동물 대상체에서 근육 조직의 알파-사르코글리칸 양성 섬유, 섬유 직경 크기, 근육의 편심 수축, 근육의 힘 및/또는 알파-사르코글리칸의 발현을 증가시키는 방법이 본원에 기재된다. 치료적 유효량의 본원에 기재된 AAV 벡터(또는 본원에 기재된 AAV 벡터를 포함하는 조성물)를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 섬유증, 중앙 핵형성, CK 수준, 및/또는 콜라겐 침착을 감소시키는 방법이 또한 본원에 기재된다.

본 발명의 임의의 방법에서, 대상체는 근위축증, 예컨대 사지 연결 근위축증 또는 임의의 다른 디스트로핀 관련 근위축증을 앓고 있을 수 있다. 일 실시형태에서, 근위축증은 LGMD-2D이다.

치료적 유효량의 본원에 기재된 AAV 벡터(또는 본원에 기재된 AAV 벡터를 포함하는 조성물)를 포유동물 대상체에 투여하는 것을 포함하는 포유동물 대상체에서 근위축증을 치료하는 방법이 또한 제공된다. 일부 실시형태에서, 근위축증은 사지 연결 근위축증이다.

본 발명의 임의의 방법에서, rAAV는 근육내 주사 또는 정맥내 주사에 의해 투여된다. 또한, 본 발명의 임의의 방법에서, rAAV는 주사, 주입 또는 이식에 의한 비경구 투여와 같이 전신 투여된다.

본 발명의 조성물은 근육내 주사 또는 정맥내 주사를 위해 제형화된다. 또한, 본 발명의 조성물은 주사, 주입 또는 이식에 의한 비경구 투여와 같은 전신 투여를 위해 제형화된다.

또한, 임의의 조성물은 근위축증(예컨대 사지 연결 근위축증 또는 임의의 다른 디스트로핀 관련 근위축증)을 앓고 있는 대상체에게 투여하기 위해 제형화된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 알파-사르코글리칸을 발현한 제2 재조합 AAV 벡터 또는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 4에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 재조합 AAV 벡터를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 임의의 용도에서, 약제는 근육내 주사 또는 정맥내 주사를 위해 제형화된다. 또한, 본 발명의 임의의 용도에서, 약제는 주사, 주입 또는 이식에 의한 비경구 투여와 같은 전신 투여를 위해 제형화된다. 또한, 임의의 약제는 근위축증(예컨대 사지 연결 근위축증 또는 임의의 다른 디스트로핀 관련 근위축증)을 앓고 있는 대상체에게 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제는 알파-사르코글리칸을 발현한 제2 재조합 AAV 벡터 또는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 4의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 재조합 AAV 벡터를 추가로 포함할 수 있다.

전술한 단락들은 본 발명의 모든 양태를 정의하고자 하는 것이 아니며, 부가적인 양태가 다른 섹션, 예컨대 상세한 설명에 기재된다. 전체 문헌은 통합된 개시내용으로 연관시키고자 의도되며, 본원에 기재된 특징의 모든 조합은 이러한 특징의 조합이 본 문헌의 동일한 문장 또는 단락 또는 섹션에서 발견되지 않는 경우에도 고려된다. 부가적인 양태로서, 본 발명은 상기 구체적인 단락들에 의해 정의된 변형 이외의 임의의 방식으로 범주 내에서 더 좁은 본 발명의 모든 실시형태를 포함한다. 예를 들어, 속(genus)으로서 기재된 본 발명의 특정 양태에서, 속의 모든 구성원은 개별적으로 본 발명의 한 양태인 것으로 이해되어야 한다.

AAV

본 발명의 재조합 AAV 게놈은 본 발명의 핵산 분자 및 핵산 분자 측면에 있는 하나 이상의 AAV ITR을 포함한다. rAAV 게놈의 AAV DNA는 재조합 바이러스가 유래될 수 있는 AAV 혈청형 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13 및 AAV rh.74를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 AAV 혈청형으로부터 나올 수 있다. 슈도형 rAAV의 제조는 예를 들어 국제공개 WO 01/83692호에 개시되어 있다. 다른 유형의 rAAV 변이체, 예를 들어 캡시드 돌연변이를 갖는 rAAV가 또한 고려된다.

본 발명의 DNA 플라스미드는 rAAV 게놈을 포함한다. DNA 플라스미드는 rAAV 게놈을 감염성 바이러스 입자로 조립하기 위해 AAV의 헬퍼 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, E1-결실 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스)로의 감염 가능한 세포로 전달된다. 패키징될 AAV 게놈, rep 및 cap 유전자, 및 헬퍼 바이러스 기능이 세포에 제공되는 rAAV 입자 제조 기술은 당업계에서 표준이다. rAAV의 생성은 하기 구성요소: rAAV 게놈, rAAV 게놈으로부터 분리된(즉, rAAV 게놈 내에 존재하지 않음) AAV rep 및 cap 유전자, 및 헬퍼 바이러스 기능이 단일 세포(본원에서 패키징 세포로 지칭됨) 내에 존재할 것을 요구한다. AAV rep 및 cap 유전자는 재조합 바이러스가 유래될 수 있는 임의의 AAV 혈청형으로부터 나올 수 있고, AAV 혈청형 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV rh10 및 AAV rh.74를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 rAAV 게놈 ITR과 상이한 AAV 혈청형으로부터 나올 수 있다. 슈도형 rAAV의 제조는 예를 들어 국제공개 WO 2001/083692호에 개시되어 있으며, 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.

패키징 세포를 생성하는 방법은 AAV 입자 제조에 필요한 모든 구성요소를 안정적으로 발현하는 세포주를 만드는 것이다. 예를 들어, AAV rep 및 cap 유전자가 결여된 rAAV 게놈, rAAV 게놈으로부터 분리된 AAV rep 및 cap 유전자, 및 선택 가능한 마커, 예컨대 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 플라스미드(또는 다수의 플라스미드)는 세포의 게놈 내에 통합된다. AAV 게놈을 GC 테일링(문헌[Samulski et al., 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79: 2077-2081]), 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 함유하는 합성 링커의 첨가(문헌[Laughlin et al., 1983, Gene, 23: 65-73])와 같은 절차에 의해 또는 직접 블런트 말단 라이게이션(문헌[Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259: 4661-4666])에 의해 박테리아 플라스미드 내에 도입하였다. 패키징 세포주는 이후 아데노바이러스와 같은 헬퍼 바이러스로 감염된다. 이 방법의 장점은 세포가 선택 가능하고 rAAV의 대규모 제조에 적합하다는 것이다. 적합한 방법의 다른 예는 rAAV 게놈 및/또는 rep 및 cap 유전자를 패키징 세포로 도입하기 위해 플라스미드보다는 아데노바이러스 또는 바큘로바이러스를 이용한다.

rAAV 제조의 일반 원리는 예를 들어 문헌[Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539]; 및 문헌[Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial. and Immunol., 158:97-129)]에서 검토된다. 다양한 접근법이 문헌[Ratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4: 2072 (1984)]; 문헌[Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6466 (1984)]; 문헌[Tratschin et al., Mo1. Cell. Biol. 5: 3251 (1985)]; 문헌[McLaughlin et al., J. Virol., 62: 1963 (1988)]; 및 문헌[Lebkowski et al., 1988 Mol. Cell. Biol., 7: 349 (1988)]; 문헌[Samulski et al. (1989, J. Virol., 63: 3822-3828)]; 미국 특허 제5,173,414호; 국제공개 WO 95/13365호 및 상응하는 미국 특허 제5,658.776호; 국제공개 WO 95/13392호; 국제공개 WO 96/17947호; 국제출원 PCT/US98/18600호; 국제공개 WO 97/09441호(국제출원 PCT/US96/14423호); 국제공개 WO 97/08298호(국제출원 PCT/US96/13872호); 국제공개 WO 97/21825호(국제출원 PCT/US96/20777호); 국제공개 WO 97/06243호(국제출원 PCT/FR96/01064호); 국제공개 WO 99/11764호; 문헌[Perrin et al. (1995) Vaccine 13: 1244-1250]; 문헌[Paul et al. (1993) Human Gene Therapy 4: 609-615]; 문헌[Clark et al. (1996) Gene Therapy 3: 1124-1132]; 미국 특허 제5,786,211호; 미국 특허 제5,871,982호; 및 미국 특허 제6,258,595호에 기재되어 있다. 상기 문헌들은 rAAV 제조와 관련된 문헌의 해당 섹션을 특히 강조하여 그 전체내용이 본원에서 인용되어 포함된다.

따라서, 본 발명은 감염성 rAAV를 생성하는 패키징 세포를 제공한다. 일 실시형태에서, 패키징 세포는 안정적으로 형질전환된 암세포, 예컨대 HeLa 세포, 293 세포 및 PerC.6 세포(동족 293 라인)일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 패키징 세포는, 형질전환된 암 세포, 예컨대 낮은 계대 293 세포(아데노바이러스의 E1으로 형질전환된 인간 태아 신장 세포), MRC-5 세포(인간 태아 섬유모세포), WI-38 세포(인간 태아 섬유모세포), 베로 세포(원숭이 신장 세포) 및 FRhL-2 세포(레서스원숭이 태아 폐 세포)가 아닌 세포이다.

본 발명의 재조합 AAV(즉, 감염성 캡시드화 rAAV 입자)는 rAAV 게놈을 포함한다. 실시형태는 SEQ ID NO: 3에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 pAAV.tMCK.hSCGA로 명명된 rAAV를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

rAAV는 칼럼 크로마토그래피 또는 염화세슘 구배와 같은 당업계의 표준 방법에 의해 정제될 수 있다. 헬퍼 바이러스로부터 rAAV 벡터를 정제하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Clark et al., Hum. Gene Ther., 10(6): 1031-1039 (1999)]; 문헌[Schenpp and Clark, Methods Mol. Med., 69 427-443 (2002)]; 미국 특허 제6,566,118호 및 국제공개 WO 98/09657호에 개시된 방법을 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 rAAV를 포함하는 조성물을 고려한다. 본원에 기재된 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체에 rAAV를 포함한다. 조성물은 또한 희석제 및 아쥬반트와 같은 다른 성분을 포함할 수 있다. 허용가능한 담체, 희석제 및 아쥬반트는 수용체에게 비독성이며, 바람직하게는 사용된 투여량 및 농도에서 불활성이고, 인산염, 시트레이트 또는 다른 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산과 같은 항산화제; 저분자량 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류 및 포도당, 만노오스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알코올; 나트륨과 같은 염-형성 반대 이온; 및/또는 트윈, 플루로닉스 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면 활성제를 포함한다.

본 발명의 방법에서 투여될 rAAV의 역가는 예를 들어 특정 rAAV, 투여 방식, 치료 목표, 개체, 및 표적화되는 세포 유형에 따라 달라질 것이며, 당업계의 표준 방법에 의해 결정될 수 있다. rAAV의 역가는 ml당 약 1x10⁶, 약 1x10⁷, 약 1x10⁸, 약 1x10⁹, 약 1x10¹⁰, 약 1x10¹¹, 약 1x10¹², 약 1x10¹³ 내지 약 1x10¹⁴ 또는 그 이상의 DNase 저항성 입자(DRP)의 범위일 수 있다. 투여량은 또한 qPCR에 의해 측정된 바와 같은 바이러스 게놈(vg)의 단위로 표현될 수 있다.

생체내 또는 시험관내에서 rAAV로 표적 세포를 형질도입시키는 방법이 본 발명에 의해 고려된다. 생체내 방법은 본 발명의 rAAV를 포함하는 조성물의 유효 용량 또는 유효 다중 용량을 이를 필요로 하는 동물(인간 포함)에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 용량이 장애/질환의 발병 이전에 투여되는 경우, 상기 투여는 예방적이다. 상기 용량이 장애/질환의 발병 후에 투여되는 경우, 상기 투여는 치료적이다. 본 발명의 실시형태에서, 유효 용량은 치료되는 장애/질환 상태와 관련된 적어도 하나의 증상을 경감(제거 또는 감소)시키고, 장애/질환 상태로의 진행을 늦추거나 예방하고, 장애/질환 상태의 진행을 늦추거나 예방하고, 질환의 범위를 감소시키고, 질환의 차도(부분 또는 전체)를 초래하고/초래하거나 생존을 연장시키는 용량이다. 본 발명의 방법으로 예방 또는 치료하기 위해 고려되는 질환의 예는 근위축증, 예컨대 사지 연결 근위축증이다. 따라서, SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 rAAV scAAVrh74.tMCK.hSGCA로 표적 세포를 형질도입하는 방법이 제공된다.

또 다른 실시형태에서, 본 개시내용은 AAV 벡터 플라스미드를 숙주 세포에 전달하는 것을 포함하는 rAAV scAAVrh74.tMCK.hSGCA를 생성하는 방법을 제공한다. DNA를 숙주 세포에 전달하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 이는 형질감염, 감염, 형질전환, 전기천공 및 형질도입을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 벡터 플라스미드는 SEQ ID NO: 8과 적어도 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 또는 약 89%, 보다 전형적으로 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 또는 그 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 벡터 플라스미드는 SEQ ID NO: 8과 적어도 90%, 95% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 벡터 플라스미드는 SEQ ID NO: 8의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 SEQ ID NO: 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 AAV 벡터 플라스미드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 숙주 세포에서 안정적으로 발현된다. AAV 벡터 플라스미드를 안정적으로 보유하는 숙주 세포를 사용하여 rAAV를 생성할 수 있다. 일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 pAAV.tMCK.hSGCA. KAN 플라스미드이다.

일 실시형태에서, 벡터 플라스미드는 SEQ ID NO: 1, 4 또는 8과 적어도 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 또는 약 89%, 보다 전형적으로 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 또는 그 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

일 실시형태에서, 벡터 플라스미드는 SEQ ID NO: 1, 4 또는 8과 적어도 약 90%, 95% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 벡터 플라스미드는 SEQ ID NO: 1, 4 또는 8의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, rAAV를 생성하는 방법은 패키징 플라스미드 및/또는 헬퍼 바이러스를 숙주 세포에 전달하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 패키징 플라스미드는 프로모터에 작동가능하게 연결된 AAV rep 및/또는 cap 유전자를 포함한다. 일 실시형태에서, 프로모터는 AAV 전사 프로모터이다. 일 실시형태에서, 숙주 세포는 패키징 세포이다. 일 실시형태에서, 패키징 세포는 안정적으로 통합된 AAV cap 유전자를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 패키징 세포는 안정적으로 통합된 AAV rep 유전자를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "숙주 세포"는 외인성 DNA 서열을 발현하는 데 사용될 수 있는 세포를 지칭한다. 숙주 세포의 비제한적인 예는 미생물, 효모 세포, 곤충 세포, 및/또는 포유동물 세포를 포함한다. 숙주 세포는 AAV 헬퍼 작제물, 패키징 플라스미드, AAV 벡터 플라스미드, 보조 기능 벡터, 또는 기타 DNA에 대한 수용체로서 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 용어는 원래 숙주 세포에서 외인성 DNA 서열을 발현시킨 후 원래 세포의 자손을 포함한다. AAV 제조를 위한 숙주 세포의 비제한적 예는 Sf9 곤충 세포 및 HEK 293T 세포를 포함한다. AAV 벡터 플라스미드는 감염(바이러스 또는 바큘로바이러스), 시약(예를 들어, 리포솜, 인산칼슘) 또는 물리적 수단(예를 들어, 전기천공)을 사용한 일시적 형질감염, 또는 당업계에 공지된 다른 수단에 의해 숙주 세포, 예를 들어 Sf9 또는 293T에 도입될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 숙주 세포주는 rAAV 플라스미드와 함께 그의 게놈 내로 안정적으로 통합된다. 이러한 안정한 세포주는 벡터 플라스미드에 선택 마커를 혼입시킴으로써 확립될 수 있다.

[0098] 일 실시형태에서, 숙주 세포는 AAV 바이러스 입자의 제조를 위한 패키징 세포이다. 따라서, 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 SEQ ID NO: 8과 적어도 90%, 95% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 AAV 벡터 플라스미드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 SEQ ID NO: 8의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 숙주 세포는 SEQ ID NO: 1, 4 또는 8의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

조합 요법도 본 발명에 의해 고려된다. 본원에 사용된 조합은 동시 치료 및 순차적 치료 둘 다를 포함한다. 본 발명의 방법과 표준 의학적 치료제(예를 들어, 스테로이드, 코르티코스테로이드, 및/또는 프레드니손, 프레드니솔론 및 데플라자코르트 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는 글루코코르티코이드)와의 조합이 구체적으로 고려되며, 이는 신규 요법과의 조합도 마찬가지이다. 이와 관련하여, 상기 조합은 대상체에게 본 발명의 방법의 rAAV를 투여하기 전, 대상체에게 rAAV를 투여하는 것과 동시에, 또는 대상체에게 rAAV를 투여한 후에 하나 이상의 스테로이드, 코르티코스테로이드, 및/또는 프레드니손, 프레드니솔론 및 데플라자코르트 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는 글루코코르티코이드를 투여하는 것을 포함한다.

본 발명에 의해 고려되는 조합 요법의 관련 실시형태에서, 글루코코르티코이드는 베클로메타손, 베타메타손, 부데소니드, 코르티손, 덱사메타손, 하이드로코르티손, 메틸프레드니솔론 또는 트리암시놀론을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

항원 특이적 T-세포 반응은 rAAV 벡터가 투여된 대상체에서 발생할 수 있는 것으로 인식된다. 이것은 유전자 전달 후 2 내지 4주 사이에 예상되는 반응이다. 이러한 항원 특이적 T-세포 반응에 대한 한 가지 가능한 결과는 형질도입된 세포의 제거 및 이식유전자 발현의 손실이다. rAAV 기반 요법에 대한 숙주 면역 반응을 약화시키기 위해, 요법 전, 예를 들어 요법 절차 24시간 전에, 대상체는 대략 1 mg/kg/일의 예방적 프레드니손 또는 이에 상응하는 글루코코르티코이드를 60 mg/일의 최대 용량으로 경구 투여 받기 시작할 수 있다. 필요한 경우 1 mg/kg/일의 대략적인 용량으로 유사한 글루코코르티코이드를 IV 투여하는 것도 허용된다. 치료는 대략 한 달 동안 계속될 것이다. 프레드니손 또는 유사한 글루코코르티코이드에 대한 테이퍼링 프로토콜은 유전자 전달에 대한 개별 대상체의 면역 반응을 기반으로 구현될 수 있으며, ELISpot 분석 및 또한 GGT를 통한 간 기능 모니터링에 의해 평가된다.

rAAV 벡터의 치료학적 유효량은 약 1.0 x 10¹² vg/kg 내지 약 2.0 x 10¹⁵ vg/kg, 약 5 x 10¹² vg/kg 내지 약 1.0 x 10¹⁵ vg/kg, 약 1.0 x 10¹³ vg/kg 내지 약 5.0 x 10¹⁴ vg/kg, 약 5x10¹³ vg/kg 내지 약 2x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 2.0 x 10¹³ vg/kg 내지 약 3.0 x 10¹⁴ vg/kg 범위의 rAAV의 용량이다. 또 다른 실시형태에서, 용량은 약 5.0 x 10¹³ vg/kg, 약 1.0 x 10¹⁴ vg/kg, 또는 약 2.0 x 10¹⁴ vg/kg이다. 또 다른 실시형태에서, 용량은 5.0 x 10¹³ vg/kg, 1.0 x 10¹⁴ vg/kg, 또는 2.0 x 10¹⁴ vg/kg이다. 본 발명은 또한 이러한 범위의 rAAV 벡터를 포함하는 조성물을 포함하는 것으로 고려된다.

투여량은 또한 바이러스 게놈(vg)의 단위로 표현될 수 있다. rAAV의 역가는 초나선형 DNA 또는 플라스미드 정량 표준 또는 선형 DNA 또는 플라스미드 정량 표준에 의해 결정될 수 있다. AAV 벡터의 역가 또는 투여량은 정량 표준으로서 플라스미드 또는 DNA의 물리적 형태에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 역가 또는 투여량의 값은 초나선형 표준 qPCR 역가 방법 또는 선형 표준 qPCR 역가 방법에 따라 달라질 수 있다. 일 실시형태에서, 본 개시내용에서 투여량은 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 한다. 또 다른 실시형태에서, 본 개시내용에서 투여량은 정량 표준으로서 선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 한다. 따라서, 일 실시형태에서, rAAV 벡터의 치료학적 유효량은 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 1.0 x 10¹² vg/kg 내지 약 2.0 x 10¹⁵ vg/kg, 약 5 x 10¹² vg/kg 내지 약 1.0 x 10¹⁵ vg/kg, 약 1.0 x 10¹³ vg/kg 내지 약 5.0 x 10¹⁴ vg/kg, 약 5x10¹³ vg/kg 내지 약 2x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 2.0 x 10¹³ vg/kg 내지 약 3.0 x 10¹⁴ vg/kg 범위의 rAAV의 용량이다. 또 다른 실시형태에서, 용량은 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 5.0 x 10¹³ vg/kg, 약 1.0 x 10¹⁴ vg/kg, 또는 약 2.0 x 10¹⁴ vg/kg이다. 또 다른 실시형태에서, 용량은 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 5.0 x 10¹³ vg/kg, 1.0 x 10¹⁴ vg/kg, 또는 2.0 x 10¹⁴ vg/kg이다.

또 다른 실시형태에서, rAAV 벡터의 치료학적 유효량은 정량 표준으로서 선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 1.0 x 10¹³ vg/kg 내지 약 8.0 x 10¹³ vg/kg, 약 1.5 x 10¹³ vg/kg 내지 약 8.0 x 10¹³ vg/kg, 약 1.6 x 10¹³ vg/kg 내지 약 8.0 x 10¹³ vg/kg, 약 1.8 x 10¹³ vg/kg 내지 약 8.0 x 10¹³ vg/kg, 약 1.2 x 10¹³ vg/kg 내지 약 7.5 x 10¹³ vg/kg, 약 1.9 x 10¹³ vg/kg 내지 약 7.5 x 10¹³ vg/kg, 약 1.4 x 10¹³ vg/kg 내지 약 7.4 x 10¹³ vg/kg, 약 1.9 x 10¹³ vg/kg 내지 약 7.5 x 10¹³ vg/kg, 또는 약 1.8 x 10¹³ vg/kg 내지 약 8.0 x 10¹³ vg/kg 범위의 rAAV의 용량이다. 예를 들어, rAAV 벡터의 치료학적 유효량은 정량 표준으로서 선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 1.85 x 10¹³ vg/kg 또는 7.41 x 10¹³ vg/kg의 용량이다.

일 실시형태에서, 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 5.0 x 10¹³ vg/kg의 용량은 정량 표준으로서 선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 1.85 x 10¹³ vg/kg의 용량과 동등하다. 또 다른 실시형태에서, 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 2.0 x 10¹⁴ vg/kg의 용량은 정량 표준으로서 선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 7.41 x 10¹³ vg/kg과 동등하다. 따라서, 또 다른 실시형태에서, 정량 표준으로서 선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 1.85 x 10¹³ vg/kg 또는 7.41 x 10¹³ vg/kg이다.

유효량의 조성물의 투여는 근육내, 비경구, 정맥내, 경구, 협측, 비강, 폐, 두개내, 골내, 안구내, 직장 또는 질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계의 표준 경로에 의해 이루어질 수 있다. 본 발명의 rAAV의 AAV 성분(특히, AAV ITR 및 캡시드 단백질)의 투여 경로(들) 및 혈청형(들)은 치료되는 감염 및/또는 질환 상태 및 α-사르코글리칸을 발현하기 위한 표적 세포/조직(들)을 고려하여 당업자에 의해 선택되고/선택되거나 매칭될 수 있다.

본 발명은 유효량의 rAAV 및 본 발명의 조성물의 국소 투여 및 전신 투여를 제공한다. 예를 들어, 전신 투여는 전신에 영향을 미치기 위한 순환계로의 투여이다. 전신 투여는 위장관을 통한 흡수 및 주사, 주입 또는 이식을 통한 비경구 투여와 같은 장 투여를 포함한다.

특히, 본 발명의 rAAV의 실제 투여는 rAAV 재조합 벡터를 동물의 표적 조직으로 수송할 임의의 물리적 방법을 사용함으로써 달성될 수 있다. 본 발명에 따른 투여는 근육, 및 혈류 및/또는 직접적으로 간으로의 주사를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 인산염 완충 식염수에 rAAV를 단순히 재현탁하는 것은 근육 조직 발현에 유용한 비히클을 제공하기에 충분한 것으로 입증되었으며, rAAV와 함께 공동 투여될 수 있는 담체 또는 다른 구성요소에 관하여(DNA를 분해하는 조성물이라면 rAAV를 사용한 정상적인 방식에서 피해야 하지만) 공지된 제한은 없다. rAAV의 캡시드 단백질은 rAAV가 근육과 같은 관심 특정 표적 조직을 표적화하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 국제공개 WO 02/053703호를 참조하며, 그 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.

약학 조성물은 경피 수송에 의해 근육에 전달되는 주사 가능한 제형으로서 또는 국소 제형으로 제조될 수 있다. 근육내 주사 및 경피 수송 둘 다를 위한 수많은 제형이 이전에 개발되었고 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. rAAV는 용이한 투여 및 취급을 위해 임의의 약학적으로 허용되는 담체와 함께 사용될 수 있다. 따라서, 또 다른 양태에서, 본 출원은 AAVrh74 유래 캡시드, 완충제, 이온 강화제, 및 계면활성제를 포함하는 rAAV를 포함하는 제형에 관한 것이다. 일 실시형태에서, rAAV는 약 1.0 x 10¹² vg/kg 내지 약 5.0 x 10¹⁴ vg/kg의 농도이다. 또 다른 실시형태에서, rAAV는 약 5.0 x 10¹² vg/kg 내지 약 1.0 x 10¹⁴ vg/kg의 농도이다. 또 다른 실시형태에서, rAAV는 약 5x10¹³ vg/kg, 약 1x10¹⁴ vg/kg, 및/또는 약 2x10¹⁴ vg/kg의 농도이다. 일 실시형태에서, 투여량은 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 한다. 일 실시형태에서, rAAV는 scAAVrh74. tMCK.hSGCA 벡터이다. 일 실시형태에서, 완충제는 트리스, 트리신, 비스-트리신, HEPES, MOPS, TES, TAPS, PIPES, 및 CAPS 중 하나 이상을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 완충제는 약 5 mM 내지 약 40 mM의 농도로 pH 8.0의 트리스를 포함한다. 일 실시형태에서, 완충제는 약 20 mM로 pH 8.0의 트리스를 포함한다. 일 실시형태에서, 이온 강화제는 염화칼륨(KCl), 아세트산칼륨, 황산칼륨, 황산암모늄, 염화암모늄(NH₄Cl), 아세트산암모늄, 염화마그네슘(MgCl₂), 아세트산마그네슘, 황산마그네슘, 염화망간(MnCl₂)_, 아세트산망간, 황산망간, 염화나트륨(NaCl), 아세트산나트륨, 염화리튬(LiCl), 및 아세트산리튬 중 하나 이상을 포함한다. 일 실시형태에서, 이온 강화제는 약 0.2 mM 내지 약 4 mM 농도로 MgCl₂를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 이온 강화제는 약 50 mM 내지 약 500 mM의 농도로 NaCl을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 이온 강화제는 약 0.2 mM 내지 약 4 mM 농도로 MgCl₂ 및 약 50 mM 내지 약 500 mM의 농도로 NaCl을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 이온 강화제는 약 1 mM 농도로 MgCl₂ 및 약 200 mM의 농도로 NaCl을 포함한다. 일 실시형태에서, 계면활성제는 술포네이트, 설페이트, 포스포네이트, 포스페이트, 폴록사머, 및 양이온성 계면활성제 중 하나 이상을 포함한다. 일 실시형태에서, 폴록사머는 폴록사머 124, 폴록사머 181, 폴록사머 184, 폴록사머 188, 폴록사머 237, 폴록사머 331, 폴록사머 338, 및 폴록사머 407 중 하나 이상을 포함한다. 일 실시형태에서, 계면활성제는 약 0.00001% 내지 약 1%의 농도로 폴록사머를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 계면활성제는 약 0.001%의 농도로 폴록사머 188을 포함한다. 근육내 주사를 위해, 멸균 수용액뿐만 아니라 참기름 또는 땅콩 오일과 같은 아쥬반트 또는 수용성 프로필렌 글리콜 중 용액이 사용될 수 있다. 이러한 수용액은 원하는 경우 완충될 수 있고, 액체 희석제는 먼저 식염수 또는 포도당으로 등장성이 되게 한다. 유리산으로서 rAAV의 용액(DNA는 산성 포스페이트기를 함유함) 또는 약학적으로 허용가능한 염은 하이드록시프로필셀룰로스와 같은 계면활성제와 물에서 적절히 혼합되어 제조될 수 있다. rAAV의 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 및 오일에서 제조될 수 있다. 일반적인 보관 및 사용 조건에서 이러한 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위해 방부제를 포함한다. 이와 관련하여, 사용된 멸균 수용성 매질은 모두 당업자에게 잘 알려진 표준 기법에 의해 쉽게 수득가능하다.

주사용으로 적합한 약제학적 형태는 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용성 용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에 상기 형태는 멸균되어야 하며 용이하게 주사할 수 있는 정도까지 유체여야 한다. 이것은 제조 및 저장 조건 하에서 안정해야 하며, 박테리아 및 진균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅제의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면 활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등과 같은 다양한 항박테리아제 및 항진균제에 의해 야기될 수 있다. 많은 경우에, 당 또는 염화나트륨과 같은 등장화제를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 장시간 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 야기될 수 있다.

멸균 주사용 용액은 필요에 따라 rAAV를 필요한 양으로 상기 열거된 다양한 다른 성분과 함께 적절한 용매에 혼입시킨 이후 여과 멸균함으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은 멸균된 활성 성분을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내에 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조 기술이며, 활성 성분의 분말 및 이전의 멸균 여과된 용액으로부터 임의의 추가적으로 원하는 성분을 수득한다.

rAAV를 사용한 형질도입은 시험관내에서 수행될 수도 있다. 일 실시형태에서, 원하는 표적 근육 세포는 대상체로부터 제거되고, rAAV로 형질도입되고 대상체 내로 재도입된다. 대안적으로, 동종 또는 이종 근육 세포는 이들 세포가 대상체에서 부적절한 면역 반응을 생성하지 않는 곳에서 사용될 수 있다.

형질도입된 세포의 대상체로의 형질도입 및 재도입에 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일 실시형태에서, 세포는 rAAV를 근육 세포와, 예를 들어 적절한 배지에서 조합하고, 서던 블롯 및/또는 PCR과 같은 통상적인 기술을 사용하여 관심 DNA를 보유하는 세포를 스크리닝함으로써, 또는 선별 마커를 사용함으로써 시험관내에서 형질도입될 수 있다. 이어서, 형질도입된 세포는 약학적 조성물로 제형화될 수 있고, 조성물은 다양한 기술, 예컨대 근육내, 정맥내, 피하 및 복강내 주사에 의해, 또는 예를 들어 카테터를 사용하여 평활 심장 근육에 주사함으로써 대상체에 도입될 수 있다.

본 발명의 rAAV를 사용한 세포의 형질도입은 α-사르코글리칸 단백질을 지속적으로 발현시킨다. 따라서, 본 발명은 알파-사르코글리칸을 발현하는 rAAV를 포유동물 대상체, 바람직하게는 인간에게 투여/전달하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 본 발명의 하나 이상의 rAAV로 조직(근육과 같은 조직, 간 및 뇌와 같은 기관, 및 침샘과 같은 땀샘을 포함하지만 이들로 제한되지 않음)을 형질도입하는 것을 포함한다. 조직 특이적 제어 요소를 포함하는 유전자 카세트를 사용하여 형질도입을 수행할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시형태는 액틴 및 미오신 유전자 패밀리, 예컨대 myoD 유전자 패밀리로부터 유래된 것(문헌[Weintraub et al., Science, 251: 761-766 (1991)] 참조), 근세포 특이적 인핸서 결합 인자 MEF-2(문헌[Cserjesi and Olson, Mol Cell Biol 11: 4854-4862 (1991)]), 인간 골격 액틴 유전자로부터 유래된 제어 요소(문헌[Muscat et al., Mol Cell Biol, 7: 4089-4099 (1987)]), 심장 액틴 유전자, 근육 크레아틴 키나제 서열 요소(문헌[Johnson et al., Mol Cell Biol, 9:3393-3399 (1989)] 참조), 및 뮤린 크레아틴 키나제 인핸서(mCK) 요소, 골격 속근 트로포닌 C 유전자, 지근 심장 트로포닌 C 유전자 및 지근 트로포닌 I 유전자로부터 유래된 제어 요소: 저산소증 유도성 핵 인자(문헌[Semenza et al., Proc Natl Acad Sci USA, 88: 5680-5684 (1991)]), 스테로이드-유도성 요소 및 글루코코르티코이드 반응 요소(GRE)를 포함하는 프로모터(문헌[Mader and White, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5603-5607 (1993)] 참조) 및 기타 제어 요소를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 근육 특이적 제어 요소에 의해 지시되는 근육 세포 및 근육 조직을 형질도입하는 방법을 제공한다.

근육 조직은 생체내 DNA 전달을 위한 매력적인 표적인데, 근육 조직이 생명 유지에 필수적인 기관이 아니고 접근하기 쉽기 때문이다. 본 발명은 형질도입된 근섬유로부터 miRNA의 지속된 발현을 고려한다.

"근육 세포" 또는 "근육 조직"은 임의의 종류의 근육(예를 들어, 소화관, 방광, 혈관 또는 심장 조직의 평활근 및 골격근)으로부터 유래된 세포 또는 세포 군을 의미한다. 이러한 근육 세포는 근 아세포, 근세포, 근관, 심근 세포 및 심근 아세포와 같이 분화되거나 미분화될 수 있다.

용어 "형질도입"은 수용체 세포에 의해 알파-사르코글리칸을 발현하는 기재된 복제-결핍 rAAV를 통해 생체내 또는 시험관내에서 수용체 세포로의 관심 폴리뉴클레오티드(예를 들어, α-사르코글리칸을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열)의 투여/전달을 지칭하기 위하여 사용된다.

따라서, 이를 필요로 하는 포유류 대상체에게 알파-사르코글리칸을 코딩하는 유효량(또는 실질적으로 동시에 투여되는 용량 또는 간격을 두고 주어진 용량)의 rAAV를 투여하는 방법이 또한 본원에 개시된다.

본원에 언급된 모든 간행물 및 특허는 마치 각각의 개별 간행물 또는 특허가 구체적이고 개별적으로 인용되어 포함되는 것으로 표시된 것처럼 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. 상충하는 경우, 본원의 정의를 포함하여 본 출원이 우선한다. 기재된 수치 범위는 각 범위 내의 각 정수 값을 포함하고 명시된 가장 낮은 정수와 가장 높은 정수를 포함한다.

본 발명은 하기 실시예에서 추가로 설명되며, 이는 청구범위에 기술된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.

실시예

AAVrh74.tMCK.hSCGA를 사용한 전임상 연구는 국제공개 제WO 2013/078316호 및 미국 특허 제9,434,928호 및 제10,105,453호에 기재되어 있으며, 이들은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.

실시예 1

재료 및 방법

동물 모델

모든 절차는 전국 아동 병원 동물 보호 및 이용 위원회(Nationwide Children's Hospital Institutional Animal Care and Use Committee)의 연구소에서 승인하였다. 녹아웃(sgca^-/-) 마우스는 Nationwide Children's Hospital에 있는 연구소의 동물 자원 코어에서 표준화된 조건 하에 동형 접합 동물로 사육되고 유지되었다. 마우스는 12:12시간의 명:암 주기로 테클래드 글로벌 설치류 식단(Teklad Global Rodent Diet)(3.8% 섬유, 18.8% 단백질, 5% 지방 섭취)에서 유지되었다. 모든 동물은 자유롭게 음식과 물이 있는 표준 마우스 케이지에 수용되었다.

유전자형

DNA 유전자형을 사용하여 sgca^-/- 마우스를 확인했다. 꼬리 자르기에서 DNA를 단리하고 OneTaq DNA 중합효소(New England Biolabs, Ipswich, MA)를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 분석했다. 일련의 프라이머를 PCR 분석에 사용하여 α-SG 녹아웃 상태를 결정했다. 하기 프라이머 및 조건이 사용되었다: 인트론1(CAGGGCTGGGAGCTGGGTTCTG; SEQ ID NO: 9); 돌연변이 프라이머-인트론 3(CCCAGGGCCTTGATGCCT; SEQ ID NO: 10); 및 NEOTR(GCTATCAGGACATAGCGTTGGCTA; SEQ ID NO: 11). 반응은 하기 조건에서 30 사이클 동안 게놈 DNA에 대해 수행되었다: 94℃, 5 분; 94℃, 1 분; 64℃, 1 분; 72℃, 2.5 분; 및 72℃, 7 분.

α-SG 유전자 작제

scAAVrh74.tMCK.hSGCA 이식유전자 카세트는 코돈 최적화된 인간 α-SG cDNA 서열(인간 cDNA, Genbank Accession # U08895)을 구동하는 tMCK 발현 카세트를 자가-상보적 벡터 백본 pHpa7에 삽입함으로써 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터 DNA 플라스미드 pAAV.tMCK.aSG-네오를 사용하여 제조되었다. 이 벡터에 포함된 유일한 바이러스 서열은 rAAV 벡터 게놈의 바이러스 DNA 복제 및 패키징 모두에 필요한 AAV2의 역 말단 반복부이다. 역 말단 반복부(ITR) 중 하나는 자가-상보성 벡터 패키징을 위한 이량체 복제 형태의 생성을 촉진하는 이 ITR로부터의 복제를 제한하기 위해 말단 분해 부위(TRS)의 표적화된 결실을 갖는다. AAVrh74 바이러스는 마우스, 비인간 영장류(NHP) 및 인간에서 혈관 장벽을 가로질러 근육을 형질도입하는 데 있어 안전하고 매우 효율적인 것으로 입증되었다.

벡터 생성

재조합 AAV, (sc)rAAVrh74.tMCK.hSGCA는 삼중 형질감염에 의해 제조되었다. qPCR 기반 적정 방법을 사용하여 Prism 7500 Fast Taqman 검출기 시스템(PE Applied Biosystems)을 사용하여 캡슐화된 vg 역가를 결정했다. 작제물은 높은 수준의 발현을 촉진하기 위해 키메라 인트론을 포함한다. 키메라 인트론은 인간 β-글로빈 유전자의 제1 인트론의 5' 도너 부위와 면역글로불린 유전자 중쇄 가변 영역의 리더와 바디 사이에 있는 인트론의 분기점과 3' 스플라이스 수용체 부위로 구성된다. rAAV는 또한 효율적인 전사 종결을 위해 사용되는 합성 SV40 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 발현 카세트의 개략도는 아래 도 1에 도시되어 있다. 벡터는 AAV2 ITR 서열 옆에 있고 AAVrh74 비리온으로 캡슐화된 인간 알파-사크로글리칸(α-SG) 유전자를 사용하여 생성되었다. 작제물은 tMCK 즉시 초기 프로모터/인핸서(GenBank Accession No. M21390)를 포함하고 높은 수준의 발현을 위해 β-글로빈 인트론을 사용한다.

유전자 전달

마우스에서 전신 전달은 sgca^-/- 마우스의 꼬리 정맥에 벡터를 주사하여 달성되었다. 30 게이지 초미세 인슐린 주사기를 사용하여 200 내지 250 μL 부피의 젖산 링거 용액에 희석된 scAAVrh74.tMCK.hSGCA의 1x10¹² vg, 3x10¹² vg 또는 6x10¹² vg 총 용량(13 내지 20 g 범위의 마우스; 5x10¹³ vg/kg, 1x10¹⁴ vg/kg, 및 2x10¹⁴ vg/kg - 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 한 투여량 - 각각, 20 g 마우스 기준)을 마우스에 주사했다. 모든 처리된 마우스는 4 내지 5주령에 주사되었고 주사 후 12주에 안락사되었다. 또 다른 실시형태에서, 용량은 정량 표준으로서 선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 1.85 x 10¹³ vg/kg 또는 7.41 x 10¹³ vg/kg이다.

혈청 크레아틴 키나제 측정

크레아틴 키나아제의 수준은 크레아틴 키나제 SL 분석 및 해당 제조사의 프로토콜(Sekisui Diagnostics; Charlottetown, PE, Canada)(카탈로그 no. 326-10)을 사용하여 야생형 C57BL/6 마우스(n = 6), 비히클(젖산 링거 용액) 처리된 sgca^-/- 마우스(n = 6), 및 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 처리된 sgca^-/- 마우스(용량당 n = 6)의 혈청에서 측정되었다. 간단히 말해서, 25 μL의 혈청을 1 mL의 작업 시약과 혼합하고 큐벳에 첨가했다. 180초 동안 30초마다 340 nm에서 흡광도를 측정하기 위해 분광광도계에 동역학 분석을 설정했다. 크레아틴 키나아제 수준은 흡광도 판독값과 하기 나열된 방정식을 사용하여 계산되었다:

U/L= [ΔAbs./분) * 1.025 * 1000] / [1 * 6.22 * 0.025] = (ΔAbs./분) * 6592.

기능 평가를 위한 횡격막 강직성 수축

마우스를 안락사시키고 횡격막(DIA)을 늑골 부착물 및 중심 힘줄이 손상되지 않은 상태로 절개하고 K-H 완충액에 두었다. DIA의 2 내지 4mm 너비 섹션이 단리되었다. DIA 스트립은 땋은 수술용 실크(6/0; Surgical Specialties, Reading, PA)로 중앙 힘줄에 단단히 묶었고 스트립의 말단부에 부착된 갈비뼈의 일부를 통해 봉합되었다. 각 근육을 37℃로 유지되는 산소화된 K-H 용액으로 채워진 수조로 옮겼다. 근육은 수평으로 정렬되었고 고정 핀과 이중 모드 힘 변환기-서보모터(305C; Aurora Scientific, Aurora, Ontario, Canada) 사이에 직접 연결되었다. 2개의 백금 플레이트 전극을 근육의 길이 측면에 위치하도록 장기 배스에 배치했다. 근육은 연축 수축의 측정을 위한 최적의 길이로 신장되었고 강직성 프로토콜을 시작하기 전에 10분 동안 휴식하게 했다. 근육이 안정화되면 최적의 길이 1 g으로 설정하고 30초마다 3번의 1Hz 연축과 1분마다 3번의 150Hz 연축으로 구성된 워밍업을 실시했다. 3분의 휴식 기간 후, DIA는 20, 50, 80, 120, 150, 180 Hz에서 자극되며 각 자극 사이에 2분의 휴식 시간을 허용했으며 각 자극은 최대 강직성력을 결정하기 위해 250 ms의 지속 시간을 가졌다. 근육 길이와 중량을 측정했다. 힘은 근육 중량 및 길이에 대해 정규화되었다.

기능 평가를 위한 전방 경골(TA) 강직성 수축

TA 평가 절차는 문헌[Hakim et al., Methods Mol Biol; 709:75-89 (2011)]에 나열된 프로토콜을 따랐다. 마우스는 케타민/자일라진 혼합물(각각 100 mg/kg 및 10 mg/kg)을 사용하여 복강 내 공동을 통해 마취되었다. 해부 범위 하에 뒷다리 피부를 제거하여 TA 근육과 슬개골을 노출시켰다. 이중 사각형을 슬개건 주위에 4-0 봉합사로 묶었다. 그런 다음 TA 말단 힘줄을 절개하고 근육에 가능한 한 가깝게 4-0 봉합사로 힘줄 주위에 이중 사각 매듭을 묶은 다음 힘줄을 절단했다. 노출된 근육은 지속적으로 식염수로 적셔졌다. 그런 다음 마우스를 열 제어 플랫폼으로 옮기고 37℃에서 유지했다. 무릎은 슬개건 봉합사로 금속 핀에 고정되었고 말단 TA 힘줄 봉합사는 힘 변환기(Aurora Scientific, Aurora, Canada)의 수평 팔에 고정되었다. 이를 자극하기 위해 좌골신경 근처에 전극을 위치시켰다. 일단 근육이 안정화되면, 휴식 장력은 연축 수축이 최대가 되는 길이(최적 길이)로 설정되었다. 3분 휴식 후, TA를 50, 100, 150, 200 Hz에서 자극했으며 각 자극 사이에 1분 휴식을 허용하였다. 5분 휴식 후, 근육은 10% 신장-재연장 절차와 함께 1분 간격으로 발생하는 일련의 10가지 등척성 수축을 받았다. 편심 수축 후, 마우스를 안락사시키고 TA 근육을 절개하고 조직학을 위해 동결시켰다.

면역형광

TA, 비복근(GAS), 대퇴사두근(QD), 대요근(PSOAS), 둔근(GLUT), 삼두근(TRI), DIA, 및 심장(HRT) 근육의 동결절편(12 μm 두께)에 hSGCA 이식유전자에 대한 면역형광 염색을 실시하였다. 섹션을 1:100의 희석에서 토끼 단일클론 α-SG 1차 항체(Abcam; Cambridge, UK; 카탈로그 no. ab189254)와 함께 배양하였다. 근육 섹션의 4개의 다른 사분면을 커버하는 4개의 무작위 20x 이미지는 Zeiss(독일) AxioCam MRC5 카메라를 사용하여 촬영되었다. 대조군과 비교하여 α-SG 염색에 대해 양성인 섬유의 백분율을 각 이미지에 대해 결정하고 각 근육에 대해 평균을 냈다. 양성 α-SG 섬유 발현은 비히클 처리된 sgca^-/- 대조군보다 섬유 염색이 적어도 30% 더 밝은 것으로 정의되었다.

웨스턴 블롯 분석

야생형 C57BL/6 마우스, 비히클 처리된 sgca^-/- 마우스 및 벡터 투여된 sgca^-/- 마우스의 샘플을 각각의 웨스턴 블롯에 사용했다. hSGCA 블롯에는 토끼 단일클론 α-SG 항체(Abcam, 카탈로그 no. ab189254)의 1:10,000 희석물과 마우스 단일클론 α-액티닌 항체(Sigma-Aldrich, 카탈로그 no. A7811)의 1:5,000 희석물을 사용하였다. 토끼 단일클론 마우스 빈쿨린 항체(Invitrogen, 카탈로그 no. 70062)의 1:1,000 희석물도 사용되었다. 항-마우스(Millipore, 카탈로그 no. AP308P) 및 항-토끼(Life Technologies, 카탈로그 no. 656120) 2차 홀스래디쉬 퍼옥시다제 항체를 향상된 화학발광 면역검출에 사용했다. ImageQuantTL 1D 8.1.0(GE Healthcare Life Sciences)을 사용하여 농도계에 의해 웨스턴 블롯 정량화를 수행했다.

형태 분석

헤마톡실린 & 에오신(H&E) 염색은 분석을 위해 16 내지 17주령 야생형 C57BL/6 마우스(n=6), 비히클 처리된 sgca^-/- 마우스(n=6), 및 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 16 내지 17주령 처리된 sgca^-/- 마우스(용량당 n=6)의 근육의 12 μm 두께 동결절편에서 수행되었다. 중앙 핵을 갖는 근섬유의 백분율은 TA, GAS, QD, GLUT, PSOAS 및 TRI 근육에서 결정되었다. 또한, TA, GAS, QD, TRI 및 PSOAS 근육에서 근섬유 직경을 측정하였다. 동물당 근육당 4개의 무작위 20x 이미지가 Zeiss AxioCam MRC5 카메라로 촬영되었다. 중앙 핵이 있는 섬유는 국립 보건원의 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량화되었고, 섬유 직경은 Zeiss Axiovision LE4 소프트웨어를 사용하여 측정되었다.

생체분포 정량적 중합효소 연쇄 반응(PCR) 분석

전술한 바와 같이 표적 및 비표적 반대측 근육 및 비표적 기관에 존재하는 벡터 게놈 카피의 수를 정량화하기 위해 Taqman 정량적 PCR을 수행하였다. 벡터-특이적 프라이머 프로브 세트를 사용하여 고유하고 scAAVrh.74.tMCK.hSGCA 이식유전자 카세트 내에 위치한 tMCK 프로모터로부터 직접 다운스트림인 인트론 영역의 서열을 증폭시켰다. 하기 프라이머 및 프로브가 이 연구에서 사용되었다: tMCK 인트론 포워드 프라이머 5′-ACC CGA GAT GCC TGG TTA TAA TT-3′; tMCK 인트론 리버스 프라이머 5′-TCC ATG GTG TAC AGA GCC TAA GAC-3′; 및 tMCK 인트론 프로브 5′-FAM-CTG CTG CCT GAG CCT GAG CGG TTA C- IABkFQ-3'(Integrated DNA Technologies). 카피 수는 게놈 DNA의 마이크로그램당 벡터 게놈으로 보고되었다.

피크로시리우스 레드 염색 및 콜라겐 정량화

근육 조직에서 콜라겐 침착 수준을 결정하기 위해 피크로시리우스 레드 염색을 수행하였다. 염색은 16 내지 17주령 야생형 C57BL/6(n=6), 비히클 처리된 sgca^-/-(n=6), 및 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 16 내지 17주령 처리된 sgca^-/-(용량당 n=6) GLUT, PSOAS, TRI, 및 DIA 근육의 12 μm 동결절편에서 수행되었다. 마우스당 근육당 4개의 20x 이미지를 촬영하고 ImageJ 소프트웨어 프로그램을 사용하여 콜라겐 침착의 양을 결정했다. 각 근육에 대한 평균 콜라겐 백분율은 모든 그룹에 대해 계산되었다.

개방 필드 케이지 활동의 레이저 모니터링

개방 필드 활동 챔버를 사용하여 실험 마우스의 전반적인 활동을 결정하였다. scAAVrh74.tMCK.hSGCA 16 내지 17주령 처리된 sgca^-/- 마우스(용량당 n=6)와 함께, 야생형 C57BL/6(n=6) 및 미처리 sgca^-/-(n=6) 대조군의 16 내지 17주령 마우스를 분석하였다. 모든 마우스는 마우스가 가장 활동적인 밤 주기가 끝날 무렵 이른 아침에 하루 중 동일한 시간에 시험되었다. 모든 마우스는 어두운 조명 아래 격리된 방에서 매번 동일한 핸들러로 시험되었다. 또한, 불안을 줄이고 잠재적으로 마우스의 정상적인 활동과 결과적으로 분석 결과에 영향을 미칠 수 있는 행동 변수를 최소한으로 유지하기 위해, 개별적으로 수용되지 않은 마우스를 시험하였다. Photobeam 활동 시스템(San Diego Instruments, San Diego, CA)을 사용하여 마우스 활동을 모니터링하였다. 이 시스템은 x-y-z 평면 내에서 마우스의 위치와 움직임을 모니터링하기 위해 동물 챔버를 앞뒤로 그리고 왼쪽에서 오른쪽으로 가로지르는 보이지 않는 적외선 광 빔의 그리드를 사용한다. 활성은 5분 간격으로 1시간 주기로 기록되었다. 마우스는 데이터 수집을 시작하기 며칠 전에 초기 1시간 세션 동안 활동 시험 룸에 적응하였다. 마우스는 4마리의 세트로 개별 챔버에서 시험되었다. 시험 장비는 결과를 변경할 수 있는 마우스 반응 행동 변수를 줄이기 위해 각 사용 사이에 청소되었다. 데이터는 Microsoft Excel 워크시트로 변환되었으며 모든 계산은 Excel 프로그램 내에서 수행되었다. x 및 y 평면에서의 이동에 대한 개별 빔 브레이크는 총 보행을 나타내기 위해 각 마우스에 대해 합산되었고, z 평면에서의 빔 브레이크는 1시간 시간 간격 내에서 수직 활동을 수득하기 위해 합산되었다.

안전성 연구

혈액학

혈액 화학을 위해 심장 천자에서 전혈을 채취하였다. 혈액을 혈청 분리 튜브에 수집하고 15,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 혈청을 수집하고 동결하고 화학 시험을 위해 Charles River Laboratories로 보냈다. 간 효소와 포도당 화학은 혈액학 분석에서 우선시되었다.

조직병리학

부검 시, 근육은 액체 질소로 냉각된 메틸-부탄에서 신선하게 동결되었고; 다른 모든 장기는 수확하여 포르말린에 고정하고 파라핀에 포매했다. 처리 후, 조직을 H&E로 염색하고 슬라이드와 모든 조직을 수의병리학자의 공식 검토를 위해 GEMPath, Inc로 보냈다.

통계적 분석

달리 명시되지 않는 한, 데이터는 평균 ± SEM(오차 막대)으로 표현되었고 GraphPad Prism 5(GraphPad Software, La Jolla, CA)를 사용하여 Tukey의 사후 분석 검정에 의해 평가된 그룹 간의 다중 비교와 함께 일방향 ANOVA를 사용하여 분석되었다.

실시예 2

scAAVrh74.tMCK.hSGCA의 전신 전달 효율

1x10¹² vg 총 용량(20 g 마우스 기준으로 5x10¹³ vg/kg, n=4)의 용량으로 sgca^-/- 마우스의 측면 꼬리 정맥으로 정맥 주사하여 유전자 전달의 효능을 관찰하기 위한 소규모 예비 연구가 시작되었다. 면역형광 분석은 유전자 전달 후 4주에 수확된 근육에서 수행되었다. 7개의 다른 사지 골격근: TA, GAS, GLUT, QD, PSOAS, 및 TRI 및 DIA에서 hSGCA 이식유전자 발현의 양. α-SG가 결핍된 마우스는 면역형광으로 분석했을 때 단백질이 완전히 결여된 것으로 나타났다(도 2a; TA, GAS, TRI 및 DIA의 대표 이미지). 1x10¹² vg 총 용량의 치료 용량은 유전자 전달 4주 후 DIA를 포함한 모든 골격근에 걸쳐 평균 54±23.81% 벡터 형질도입을 초래했다.

sgca ^-/- 마우스에 전신적으로 전달된 scAAVrh74.tMCK.hSGCA의 용량 증량 연구

가장 안전하고 가장 효과적인 용량을 결정하기 위해, 3가지 개별 용량의 벡터의 전달이 용량 증량 연구에서 연구되었으며, 여기서 4주령 sgca^-/- 마우스의 측면 꼬리 정맥은 1x10¹² vg 총 용량(5x10¹³ vg/kg), 3x10¹² vg 총 용량(1x10¹⁴ vg/kg), 또는 6x10¹² vg 총 용량(2x10¹⁴ vg/kg)의 scAAVrh74.tMCK.hSGCA로 처리되었다. 면역형광을 사용하여 TA, GAS, QD, GLUT, PSOAS, TRI, DIA, 및 HRT 근육에서 hSGCA 이식유전자 발현을 평가하기 위해 유전자 전달 후 12주에 마우스를 안락사시켰다. 1x10¹² vg 총 용량(5x10¹³ vg/kg)의 최저 용량으로 처리된 마우스에서 평균 hSGCA 발현은 DIA를 포함한 골격근에서 70.07±3.71% 전체 발현이었다. 3x10¹² vg 총 용량(1x10¹⁴ vg/kg)의 중간 용량으로 처리된 마우스에서 평균 hSGCA 발현은 모든 골격근에서 85.35±2.36%였다. 6x10¹² vg 총 용량(2x10¹⁴ vg/kg)의 최고 용량으로 처리된 마우스에서 평균 hSGCA 발현은 모든 골격근에서 93.86±2.02%였다. 명확성을 위해, 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 용량을 계산했다. HRT 근육에서 hSGCA 발현은 용량과 무관하게 75%로 유지되었다. 조직의 대표적인 이미지는 도 2a에 도시되어 있다. 강력한 hSGCA 발현은 3가지 용량 모두에서 유전자 전달의 효능을 보여준다. 유전자 전달은 앞다리와 뒷다리 모두에서 여러 근육을 표적으로 했으며, 세 가지 용량 모두에서 마우스에서 예외적인 α-SG 발현을 보여주었다. 가장 중요하게, 생명 유지에 필수적인 횡격막 근육도 전달 후 α-SG 유전자 발현을 나타냈다. 도 2b에 도시된 웨스턴 블롯은 처리된 마우스의 3개 투여 코호트 모두의 모든 근육에서 단백질 발현을 확인한다. 마우스의 심장 근육도 처리 후 α-SG 발현을 나타냈다.

α-SG 단백질이 결여된 인간과 마우스 둘 모두의 조직병리학적 특징은 중앙 핵형성, 섬유 크기 분포의 불규칙성, 괴사 및 섬유증을 포함한다. H&E 염색을 사용하여 섬유 크기와 중앙 핵생성을 포함한 근육 형태를 시각화하였다(도 3). 도 3a 및 도 3b에 도시된 바와 같이, 야생형 대조군에서 관찰된 것과 유사한 섬유 크기 분포의 정규화가 비히클 처리된 sgca^-/- 대조군과 비교하여 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 처리된 sgca^-/- 마우스의 TA, QD 및 TRI에서 관찰되었다. 섬유의 평균 직경 크기는 비히클 처리된 sgca^-/- 대조군 마우스와 비교하여 TA, QD 및 TRI 근육의 모든 용량에서 유의하게 증가했다(표 1).

scAAVrh74.tMCK.hSGCA로 처리된 sgca^-/- 마우스에서 중앙 핵형성의 감소도 관찰되었다. 비히클 처리된 sgca^-/- 마우스의 골격근은 중앙에 위치한 핵을 갖는 68.72±3.01% 섬유를 가졌다. scAAVrh74.tMCK.hSGCA로의 처리 후, 모든 근육 조직에 걸친 중앙 핵형성의 전체 값은 scAAVrh74.tMCK.hSGCA의 최저 용량으로 감소하였으며, 중앙에 위치한 핵을 나타내는 골격근 섬유의 55.60±3.25%를 초래했다(표 2).

중간 용량으로 처리된 마우스는 중앙 핵을 갖는 근섬유의 61.85±4.00%를 갖는 반면, 최고 용량으로 처리된 근섬유의 핵형성은 37.93±12.46%로 감소하였다(도 3c).

조직이 콜라겐에 의해 극복되는 섬유증은 종종 LGMD 환자의 근육에서 발생하여 흉터 조직을 형성한다. 섬유증의 마커로서 콜라겐 I 및 III 함량을 검출하기 위해 피크로시리우스 레드 염색을 사용하여 섬유증을 평가하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, scAAVrh74.tMCK.hSGCA로의 처리 후 sgca^-/- 마우스에서 레드 염색의 강력한 감소가 관찰되었다. 정량화 결과 비히클 처리된 sgca^-/- 대조군 마우스와 비교하여 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 처리된 sgca^-/- 마우스에서 모든 근육에 걸쳐 콜라겐 함량의 유의한 감소가 나타났다(도 4b). 함께, 이들 데이터는 근육 조직에서의 강력한 발현 및 sgca^-/- 마우스에서 α-SG 단백질의 결핍과 관련된 조직병리학적 특징의 개선에 의해 나타난 바와 같이 hSGCA 이식유전자의 성공적인 전신 전달을 입증한다.

실시예 3

scAAVrh74.tMCK.hSGCA rAAV는 횡격막 및 경골 전방 근육 기능을 개선하고 운동 능력을 증가시킨다

근위 근육의 쇠약 및 기능 상실이 LGMD2D의 주요 증상이고 호흡 부전이 LGMD2D의 주요 사망 원인이므로 TA 및 DIA의 기능 및 강도 개선은 LGMD2D가 있는 대상체의 수명과 삶의 질을 증가시키는 데 필수적이다. DIA 및 전체 TA 근육의 스트립을 사용하여 hSGCA 발현과 근육 강도 사이의 상관관계를 확인했다. 도 5a 및 5b에 도시된 바와 같이, 비력 및 수축 유발 손상에 대한 저항의 결손은 야생형 마우스에 비해 sgca^-/- 미처리 마우스의 TA 및 DIA 근육의 비력에서 확인되었다.

sgca^-/- 마우스의 TA 근육은 야생형 마우스와 비교하여 비력 출력의 감소에서 44%의 상당한 기능적 결손을 나타냈을 뿐만 아니라(161.6±8.20 mN/mm² vs. 291.7±6.17 mN/mm², 각각; p<0.0001) 엄격한 편심 수축 프로토콜에 따라 생성된 것에서 더 큰 힘 손실을 나타냈다(sgca^-/- 마우스에서 44.0±6.0% 손실; 야생형 마우스에서 18.0±1.0% 손실; p<0.0001)(도 5a). 꼬리 정맥 전달 12주 후, 출원인은 각각 218±11.94 mN/mm², 227±11.7 mN/mm², 및 255±11.7 mN/mm²로 증가된 비력 출력에서 scAAVrh74.tMCK.hSGCA의 저용량, 중간 용량 및 고용량으로 처리 후 극적인 개선을 언급했다. 편심 수축 프로토콜에 따른 손상에 대한 저항도 비히클 처리된 sgca^-/- 마우스와 비교하여 개선되었으며, 저용량, 중간 용량 및 고용량 처리된 마우스는 각각 22.0±4.0%, 22.0±3.0%, 및 12.0±1.0%만 손실되었다(비히클 처리된 sgca^-/- 마우스와 비교하여 p<0.0001)(도 5a).

비히클 처리된 sgca^-/- 마우스의 DIA에서, 생성된 비력은 야생형 마우스에 비해 강도가 41% 감소한 것으로 나타났다(131.5±12.07 mN/mm² vs. 223.8±15.85 mN/mm²). 세 가지 용량 모두에서 scAAVrh74.tMCK.hSGCA로의 처리 후 힘의 개선이 관찰되었으며, 저용량 마우스에서 DIA의 비력은 179.2±21.03 mN/mm²로, 중간 용량 마우스에서는 201.2±22.94 mN/mm²로, 고용량 마우스에서는 261.46±9.73 mN/mm²로 증가했다(도 5b). 이들 데이터는 sgca^-/- 마우스의 TA 및 DIA 근육이 힘이 부족하고 야생형 마우스보다 빨리 지친다는 것을 보여준다. 그러나, scAAVrh74.tMCK.hSGCA의 전달 후, 기능 회복이 달성되었다.

LGMD2D의 추가 증상은 운동 불내성, 활동 및 보행 감소를 포함하며, 이는 아마도 근육 손상으로 인한 것이며, 통증과 근육 피로를 유발할 수 있다. 신체 활동 수준을 평가하기 위해, sgca^-/- 및 야생형 C57BL/6 마우스에 이전 보고서에서 사용된 것과 유사한 개방 필드 활동 프로토콜을 적용했다. 마우스의 보행 관련 활동을 모니터링하여 sgca^-/- 마우스에서 α-SG의 결핍이 야생형 마우스와 비교하여 보행을 감소시키는지 결정했다. 도 5c의 그래프는 야생형 대조군과 비교하여 sgca^-/- 마우스 모델에서 보행 및 수직 후진의 감소를 도시한다. sgca^-/- 마우스에서 기록된 평균 수평 보행 빔 브레이크는 2000±159 빔 브레이크/시간이었으며, 야생형 대조군의 8911±1193 빔 브레이크/시간에 비해 보행에서 77.5% 감소했다. sgca^-/- 마우스에서 기록된 평균 수직 후진 빔 브레이크는 24.75±11.47 빔 브레이크/시간이었으며, 야생형 마우스의 803.3±55.03 빔 브레이크/시간에 비해 수직 후진에서 97% 감소했다. scAAVrh74.tMCK.hSGCA로의 처리 후, 마우스의 보행 및 수직 후진 활동은 유전자 전달 후 12주에 증가했다. 평균 수평 보행은 1x10¹² vg 총 용량으로 처리된 마우스에서 3595±55.03 빔 브레이크/시간으로 증가했고, 3x10¹² vg 총 용량으로 처리된 마우스에서 5238±861.9 빔 브레이크/시간으로 증가했고, 6x10¹² vg 총 용량으로 처리된 마우스에서 6487±467.9 빔 브레이크/시간으로 증가했다. 평균 수직 후진 활동은 1x10¹² vg 총 용량으로 처리된 마우스에서 377±146.1 빔 브레이크/시간으로 증가했고, 3x10¹² vg 총 용량으로 처리된 마우스에서 321±126.1 빔 브레이크/시간으로 증가했고, 6x10¹² vg 총 용량으로 처리된 마우스에서 448.8±53.43 빔 브레이크/시간으로 증가했다(도 5c). 처리된 마우스의 신체 활동은 비히클 처리된 sgca^-/- 마우스와 비교하여 보행에서 44% 내지 69%, 수직 후진에서 92% 내지 94%의 개선을 나타냈다. 또한, 혈청 크레아틴 키나제 수준은 처리되지 않은 마우스와 비교하여 모든 처리된 그룹에서 유의하게 감소했다(도 5d). 함께, 이들 데이터는 α-SG의 전달이 sgca^-/- 마우스에서 신체 활동을 회복하고 근육의 브레이크다운(breakdown)으로부터 보호한다는 것을 보여준다.

scAAVrh74.tMCK.hSGCA의 안전성 및 생체분포 분석

안전성 제공으로서, 벡터 투여된 sgca^-/- 및 야생형 마우스에 대해 혈액 화학 및 혈액학 연구를 수행하였다. 모든 값은 마우스의 정상 기준 범위 내에 있었다(도 6). 뿐만 아니라, scAAVrh74.tMCK.hSGCA가 투여된 sgca^-/- 및 야생형 마우스의 H&E로 염색된 모든 근육 및 기관의 조직 섹션을 정식 검토를 위해 수의사 병리학자에게 보냈다. 임의의 scAAVrh74.tMCK.hSGCA가 투여된 sgca^-/- 및 야생형 마우스의 임의의 샘플에서 부작용이 관찰되지 않았다. 효능에 추가하여, 이들 데이터는 scAAVrh74.tMCK.hSGCA의 3가지 용량 모두의 전신 전달이 sgca^-/- 및 야생형 마우스에 대해 잘 견디고, 안전하고, 비독성임을 입증하였다.

scAAVrh74.tMCK.hSGCA의 전달로부터 잠재적인 독성 또는 안전성 문제를 시험하기 위해, 벡터 생체분포 정량적 PCR을 수행하여 벡터 게놈 존재를 정량화하였다(도 7a). 벡터 특이적 tMCK.hSGCA 프라이머 프로브 세트를 사용하여 scAAVrh74.tMCK/hSGCA 투여된 sgca^-/- 마우스에서 시험한 모든 근육 및 기관에서 벡터 게놈을 검출했다. 예상대로, 벡터 게놈은 시험된 조직에 존재했으며 간에서 가장 높은 복제 수를 보였고, 근육이 그 뒤를 이었다. 비히클(sgca^-/- LR) 또는 scAArh74.tMCK.hSGCA로 처리된 WT 및 sgca^-/- 마우스의 간에서 알파-사르코글리칸 단백질의 웨스턴 블롯이 도 7b에 도시되어 있다.

α-SG 발현의 효율을 개선하기 위해, 일 실시형태에서, hSGCA cDNA 서열은 자가-상보성 벡터에 패키징된다. 자가-상보성 AAV 벡터는 dsDNA의 형성을 촉진하는 역 반복 게놈을 포함하므로 이러한 과정을 촉진하기 위해 여러 벡터 게놈이 필요 없이 복제 및 전사가 일어날 수 있게 한다. 이와 같이, 자가-상보성 벡터를 사용하면 속도 제한 단계를 제거하여 이식유전자를 보다 신속하게 발현하게 한다. 출원인은 LGMD2D 환자에서 scAAVrh74.tMCK.hSGCA의 혈관내 전달이 1 x 10¹² 및 3 x 10¹²의 용량에서 유전자 전달 후 180일에 증가된 α-SG 발현과 관련이 있음을 보여주었다.

scAAVrh74.tMCK.hSGCA의 정맥내 전달은 비히클 처리된 대조군과 비교하여 모든 3개의 벡터 처리된 코호트에서 전방 경골 및 횡격막 근육의 수축 유도 손상에 대해 증가된 강도 및 저항을 근육에 제공한다. 또한, scAAVrh74.tMCK.hSGCA로의 처리는 CK를 유의하게 감소시켰다. 더욱이, scAAVrh74.tMCK.hSGCA로의 처리 후, 마우스는 비히클 처리된 마우스보다 더 자주 걸을 수 있었고 뒷다리로 후진할 수 있었다.

중앙에 위치한 핵, 섬유 크기의 넓은 다양성, 염증, 괴사 및 섬유증을 포함하는 명백한 조직 병리학은 일반적으로 LGMD2D 환자의 근육 생검을 통해 관찰된다. hSGCA 전달 후, 마우스는 CN 감소, 근섬유 크기의 보다 균일한 분포, 콜라겐 함량 감소를 보였고 근육은 비히클 처리된 마우스와 비교하여 전반적으로 더 건강한 외관을 가졌다. 조직병리학 및 흉터 조직의 총 감소는 벡터 처리된 마우스에서 근육의 전반적인 정상 기능 및 생리학의 개선과 동시에 연관되었다.

마지막으로, 정량적 PCR, 혈청 화학 분석 및 조직병리학을 통해 수행된 안전성 연구는 독성 징후를 검토하지 않았다. tMCK 프로모터는 표적 조직(모든 근육)에서만 검출되었으며 간을 제외한 다른(근육이 아닌) 기관에서는 없었다. 간에서의 tMCK 검출은 청소 기관이기 때문에 드물지 않거나 우려된다. 인증된 수의사 병리학자가 모든 조직(간 포함)에 대한 조직병리학 검토에서 scAAVrh74.tMCK.hSGCA의 전신 전달은 모든 조직에서 안전할 뿐만 아니라 유전자 전달이 비히클 처리된 sgca^-/- 마우스의 골격근에서 발견되는 영양 장애 병리의 양을 극적으로 감소시켰다고 결론지었다. 벡터 처리된 마우스의 혈액 샘플에 대해 수행된 화학 반응도 독성이 없음을 뒷받침한다.

본 개시에서와 같이, 용량 증량 연구는 여기에서 전신적으로 시험된 최저 용량, 즉 1 x 10¹² vg 총(5 x 10¹³ vg/kg)이 α-SG 단백질 손실과 관련된 징후 및 증상을 감소시키기에 충분하다는 것을 뒷받침하는 전임상 데이터를 제공한다. 가장 낮은 용량에서 시험한 모든 근육의 기능적 개선은 강도 및 운동 행동(보행 및 후진)의 증가에 의해 입증된 바와 같이 벡터 처리 마우스에서 관찰되었다. 안전성 연구에서는 총 6 x 10¹² vg(2 x 10¹⁴ vg/kg)의 최고 전달 용량에서도 독성 징후가 나타나지 않았다.

실시예 4

고령의 환자 및 내구성

rAAVrh74.tMCK.hSGCA 매개 유전자 대체는 LGMD-2D 및 기타 관련 질환 치료에 긍정적인 결과를 보여주었다. 이 연구는 rAAVrh74.tMCK.hSGCA가 고령이고 더 심하게 영향을 받은 근육을 치료하는 능력을 시험하고 AAV 바이러스 벡터의 장기 내구성을 결정하기 위해 설계되었다.

모든 절차는 전국 아동 병원 동물 보호 및 이용 위원회의 연구소의 승인에 따라 수행되었다. 마우스는 12:12시간 명:암 주기의 표준화된 조건 하에 유지되었으며, 음식과 물은 자유롭게 제공되었다. 먼저, rAAVrh74.tMCK.hSGCA를 세 가지 용량(1.0x10¹², 3.0x10¹², 및 6.0x10¹² vg)으로 12개월령 sgca^-/- 마우스(n=5)에 꼬리 정맥 주사로 전신 투여하여 심각한 근육 조직 병리학을 나타냈다. 대조군에는 젖산 링거 용액(LRS)을 주사한 sgca^-/- 마우스(n=5) 및 LRS를 주사한 BL6 야생형 마우스(n=4)가 포함되었다. 치료 후 6개월 종료점에서, 치료된 마우스의 근육을 SCGA 단백질 발현, 조직학적 구조 및 기능 개선에 대해 평가했다. 세 가지 용량 모두 근초에서 대조군과 비교하여 α-SG의 강력한 단백질 발현, 개선된 조직 병리학, 증가된 운동 활성 및 비력 생성, 편심력 손실에 대한 보호, 및 감소된 혈청 CK를 나타냈다. 벡터 독성이 검출되지 않았다. 고령 마우스에서 치료는 분석된 근육에서 광범위하고 높은 수준의 단백질 발현을 초래했고, 섬유증을 감소시켰으며, 전방 경골 근육에서 수축 유도 손상에 대한 저항을 증가시켰다.

특히, 12개월령 sgca^-/- 마우스에 대한 rAAVrh74.tMCK.hSGCA의 IV 투여는 횡격막 및 심장을 포함하는 하지, 상지 및 근위 몸통 근육 전반에 걸쳐 근육에서 광범위한 고수준 단백질 발현을 초래하였다(도 8).

scAAVrh74.tMCK.hSGCA 투여 후 근육 병리학의 전반적인 개선(도 9a) 및 중앙 핵형성의 감소가 관찰되었다. 또한, 평균 섬유 크기는 투여 후 비복근(GAS) 및 삼두근(TRI) 근육의 WT 섬유 수준과 유사한 수준으로 증가하였다(도 9b).

콜라겐 침착 수준을 섬유증의 척도로서 정량화하였다. scAAVrh74.tMCK.hSGCA의 투여는 미처리 대조군과 비교하여 섬유증 수준의 감소를 초래하였다(도 9c). scAAVrh74.tMCK.hSGCA 투여 후 기능 개선은 전방 경골(TA) 및 횡격막(DIA) 근육의 개선된 힘 출력(비력)과 TA 근육의 수축 유발 손상에 대한 저항 증가로 입증되었다(도 10).

유전자 요법의 장기간 내구성을 추가로 조사하기 위해, 4주령의 sgca^-/-마우스에 rAAVrh74.tMCK.hSGCA를 전신 투여하였다. 치료 후 24개월 초과에, 벡터 게놈 카피 수는 시험된 모든 형질도입 근육(TA, TRI, DIA, GLUT, PSOAS, GAS 및 QUAD)에서 qPCR로 검출된다. 단백질 발현 및 국소화는 처리된 근육의 면역형광 염색에 의해 연구된다.

본 개시내용이 특정 실시형태의 관점에서 설명되었지만, 당업자에게 변형 및 수정이 일어날 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 청구범위에 나타난 것과 같은 제한만 본 개시내용에 적용되어야 한다.

본 출원에서 언급된 모든 문헌은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.

SEQ ID NO: 1

SGCA cDNA 코돈 최적화된 서열:

ATGGCCGAGACACTGTTCTGGACTCCTCTGCTGGTGGTGCTGCTGGCTGGACTGGGAGATACCGAGGCTCAGCAGACCACACTGCACCCACTGGTGGGCCGGGTGTTCGTGCACACCCTGGACCATGAGACATTTCTGAGTCTGCCAGAACACGTGGCTGTGCCACCTGCTGTGCATATCACTTACCACGCCCATCTGCAGGGCCATCCTGATCTGCCACGGTGGCTGAGATACACCCAGAGATCACCCCACCATCCTGGATTCCTGTATGGAAGCGCTACCCCAGAGGACAGGGGACTGCAGGTGATCGAAGTGACAGCTTACAACCGCGACAGTTTTGATACTACCAGGCAGCGCCTGGTGCTGGAGATTGGGGATCCAGAAGGACCCCTGCTGCCTTATCAGGCCGAGTTCCTGGTGCGGTCACACGACGCTGAGGAAGTGCTGCCATCAACACCCGCCAGCAGATTTCTGTCCGCTCTGGGAGGACTGTGGGAGCCAGGAGAACTGCAGCTGCTGAATGTGACTAGCGCTCTGGATAGGGGAGGAAGGGTGCCACTGCCAATCGAGGGAAGGAAGGAAGGGGTGTACATTAAAGTGGGAAGCGCTTCCCCATTCTCCACCTGCCTGAAGATGGTGGCTTCTCCTGATAGTCACGCTAGGTGCGCTCAGGGACAGCCACCACTGCTGTCCTGTTATGACACACTGGCCCCCCATTTTCGCGTGGACTGGTGCAACGTGACTCTGGTGGATAAATCTGTGCCTGAGCCAGCTGACGAAGTGCCAACCCCTGGAGACGGAATCCTGGAGCACGATCCTTTCTTTTGTCCTCCAACAGAAGCCCCAGACAGGGATTTCCTGGTGGACGCTCTGGTGACTCTGCTGGTGCCTCTGCTGGTGGCTCTGCTGCTGACCCTGCTGCTGGCTTATGTGATGTGCTGTCGGAGAGAGGGACGGCTGAAGAGAGACCTGGCCACATCTGATATCCAGATGGTGCACCATTGTACTATTCACGGCAACACCGAGGAACTGCGCCAGATGGCTGCTTCTAGGGAGGTGCCAAGGCCACTGAGTACACTGCCTATGTTTAATGTGCACACTGGCGAACGGCTGCCCCCTAGAGTGGATAGCGCCCAGGTGCCACTGATTCTGGACCAGCATTGA

SEQ ID NO: 2

인간 SGCA 단백질 서열:

MAETLFWTPLLVVLLAGLGDTEAQQTTLHPLVGRVFVHTLDHETFLSLPEHVAVPPAVHITYHAHLQGHPDLPRWLRYTQRSPHHPGFLYGSATPEDRGLQVIEVTAYNRDSFDTTRQRLVLEIGDPEGPLLPYQAEFLVRSHDAEEVLPSTPASRFLSALGGLWEPGELQLLNVTSALDRGGRVPLPIEGRKEGVYIKVGSASPFSTCLKMVASPDSHARCAQGQPPLLSCYDTLAPHFRVDWCNVTLVDKSVPEPADEVPTPGDGILEHDPFFCPPTEAPDRDFLVDALVTLLVPLLVALLLTLLLAYVMCCRREGRLKRDLATSDIQMVHHCTIHGNTEELRQMAASREVPRPLSTLPMFNVHTGERLPPRVDSAQVPLILDQH*

SEQ ID NO: 3

tMCK 프로모터 서열:

CCACTACGGGTCTAGGCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAACCCCAACACCTGCTGCCCCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCCTGAGCCTGAGCGGTTACCCCACCCCGGTGCCTGGGTCTTAGGCTCTGTACACCATGGAGGAGAAGCTCGCTCTAAAAATAACCCTGTCCCTGGTGGATCCACTACGGGTCTATGCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAACCCCAACACCTGCTGCCCCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCCTGAGCCTGAGCGGTTACCCCACCCCGGTGCCTGGGTCTTAGGCTCTGTACACCATGGAGGAGAAGCTCGCTCTAAAAATAACCCTGTCCCTGGTGGACCACTACGGGTCTAGGCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAACCCCAACACCTGCTGCCCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCCTGAGCCTGAGCGGTTACCCCACCCCGGTGCCTGGGTCTTAGGCTCTGTACACCATGGAGGAGAAGCTCGCTCTAAAAATAACCCTGTCCCTGGTCCTCCCTGGGGACAGCCCCTCCTGGCTAGTCACACCCTGTAGGCTCCTCTATATAACCCAGGGGCACAGGGGCTGCCCCCGGGTCAC

SEQ ID NO: 4

AAVrh74-tMCK-SGCA:

CTGCGCGCTC GCTCGCTCAC TGAGGCCGCC CGGGCAAAGC CCGGGCGTCG

GGCGACCTTT GGTCGCCCGG CCTCAGTGAG CGAGCGAGCG CGCAGAGAGG

GAGTGGGGTT AACCAATTGG CGGCCGCAAA CTTGCATGCC CCACTACGGG

TCTAGGCTGC CCATGTAAGG AGGCAAGGCC TGGGGACACC CGAGATGCCT

GGTTATAATT AACCCCAACA CCTGCTGCCC CCCCCCCCCC AACACCTGCT

GCCTGAGCCT GAGCGGTTAC CCCACCCCGG TGCCTGGGTC TTAGGCTCTG

TACACCATGG AGGAGAAGCT CGCTCTAAAA ATAACCCTGT CCCTGGTGGA

TCCACTACGG GTCTATGCTG CCCATGTAAG GAGGCAAGGC CTGGGGACAC

CCGAGATGCC TGGTTATAAT TAACCCCAAC ACCTGCTGCC CCCCCCCCCC

CAACACCTGC TGCCTGAGCC TGAGCGGTTA CCCCACCCCG GTGCCTGGGT

CTTAGGCTCT GTACACCATG GAGGAGAAGC TCGCTCTAAA AATAACCCTG

TCCCTGGTGG ACCACTACGG GTCTAGGCTG CCCATGTAAG GAGGCAAGGC

CTGGGGACAC CCGAGATGCC TGGTTATAAT TAACCCCAAC ACCTGCTGCC

CCCCCCCCCC AACACCTGCT GCCTGAGCCT GAGCGGTTAC CCCACCCCGG

TGCCTGGGTC TTAGGCTCTG TACACCATGG AGGAGAAGCT CGCTCTAAAA

ATAACCCTGT CCCTGGTCCT CCCTGGGGAC AGCCCCTCCT GGCTAGTCAC

ACCCTGTAGG CTCCTCTATA TAACCCAGGG GCACAGGGGC TGCCCCCGGG

TCACCTGCAG AAGTTGGTCG TGAGGCACTG GGCAGGTAAG TATCAAGGTT

ACAAGACAGG TTTAAGGAGA CCAATAGAAA CTGGGCTTGT CGAGACAGAG

AAGACTCTTG CGTTTCTGAT AGGCACCTAT TGGTCTTACT GACATCCACT

TTGCCTTTCT CTCCACAGGT GTCCACTCCC AGTTCAATTA CAGCGCGTGG

TACCACCATG GCCGAGACAC TGTTCTGGAC TCCTCTGCTG GTGGTGCTGC

TGGCTGGACT GGGAGATACC GAGGCTCAGC AGACCACACT GCACCCACTG

GTGGGCCGGG TGTTCGTGCA CACCCTGGAC CATGAGACAT TTCTGAGTCT

GCCAGAACAC GTGGCTGTGC CACCTGCTGT GCATATCACT TACCACGCCC

ATCTGCAGGG CCATCCTGAT CTGCCACGGT GGCTGAGATA CACCCAGAGA

TCACCCCACC ATCCTGGATT CCTGTATGGA AGCGCTACCC CAGAGGACAG

GGGACTGCAG GTGATCGAAG TGACAGCTTA CAACCGCGAC AGTTTTGATA

CTACCAGGCA GCGCCTGGTG CTGGAGATTG GGGATCCAGA AGGACCCCTG

CTGCCTTATC AGGCCGAGTT CCTGGTGCGG TCACACGACG CTGAGGAAGT

GCTGCCATCA ACACCCGCCA GCAGATTTCT GTCCGCTCTG GGAGGACTGT

GGGAGCCAGG AGAACTGCAG CTGCTGAATG TGACTAGCGC TCTGGATAGG

GGAGGAAGGG TGCCACTGCC AATCGAGGGA AGGAAGGAAG GGGTGTACAT

TAAAGTGGGA AGCGCTTCCC CATTCTCCAC CTGCCTGAAG ATGGTGGCTT

CTCCTGATAG TCACGCTAGG TGCGCTCAGG GACAGCCACC ACTGCTGTCC

TGTTATGACA CACTGGCCCC CCATTTTCGC GTGGACTGGT GCAACGTGAC

TCTGGTGGAT AAATCTGTGC CTGAGCCAGC TGACGAAGTG CCAACCCCTG

GAGACGGAAT CCTGGAGCAC GATCCTTTCT TTTGTCCTCC AACAGAAGCC

CCAGACAGGG ATTTCCTGGT GGACGCTCTG GTGACTCTGC TGGTGCCTCT

GCTGGTGGCT CTGCTGCTGA CCCTGCTGCT GGCTTATGTG ATGTGCTGTC

GGAGAGAGGG ACGGCTGAAG AGAGACCTGG CCACATCTGA TATCCAGATG

GTGCACCATT GTACTATTCA CGGCAACACC GAGGAACTGC GCCAGATGGC

TGCTTCTAGG GAGGTGCCAA GGCCACTGAG TACACTGCCT ATGTTTAATG

TGCACACTGG CGAACGGCTG CCCCCTAGAG TGGATAGCGC CCAGGTGCCA

CTGATTCTGG ACCAGCATTG AGGCCGCAAT AAAAGATCTT TATTTTCATT

AGATCTGTGT GTTGGTTTTT TGTGTGTCCT GCAGGGGCGC GCCTCTAGAG

CATGGCTACG TAGATAAGTA GCATGGCGGG TTAATCATTA ACTACAAGGA

ACCCCTAGTG ATGGAGTTGG CCACTCCCTC TCTGCGCGCT CGCTCGCTCA

CTGAGGCCGG GCGACCAAAG GTCGCCCGAC GCCCGGGCTT TGCCCGGGCG

GCCTCAGTGA GCGAGCGAGC GCGCAG

SEQ ID NO: 5

5'ITR

CTGCGCGCTC GCTCGCTCAC TGAGGCCGCC CGGGCAAAGC CCGGGCGTCG GGCGACCTTT GGTCGCCCGG CCTCAGTGAG CGAGCGAGCG CGCAGAGAGG GAGTGGGGTT

SEQ ID NO: 6

3'ITR

CCACTCCCTC TCTGCGCGCT CGCTCGCTCA CTGAGGCCGG GCGACCAAAG GTCGCCCGAC GCCCGGGCTT TGCCCGGGCG GCCTCAGTGA GCGAGCGAGC GCGC

SEQ ID NO: 7

폴리A

GGCCGCAAT AAAAGATCTT TATTTTCATT AGATCTGTGT GTTGGTTTTT TGTG

SEQ ID NO: 8

ATGCAGCTGC GCGCTCGCTC GCTCACTGAG GCCGCCCGGG CAAAGCCCGG GCGTCGGGCG 60

ACCTTTGGTC GCCCGGCCTC AGTGAGCGAG CGAGCGCGCA GAGAGGGAGT GGGGTTAACC 120

AATTGGCGGC CGCAAACTTG CATGCCCCAC TACGGGTCTA GGCTGCCCAT GTAAGGAGGC 180

AAGGCCTGGG GACACCCGAG ATGCCTGGTT ATAATTAACC CCAACACCTG CTGCCCCCCC 240

CCCCCCAACA CCTGCTGCCT GAGCCTGAGC GGTTACCCCA CCCCGGTGCC TGGGTCTTAG 300

GCTCTGTACA CCATGGAGGA GAAGCTCGCT CTAAAAATAA CCCTGTCCCT GGTGGATCCA 360

CTACGGGTCT ATGCTGCCCA TGTAAGGAGG CAAGGCCTGG GGACACCCGA GATGCCTGGT 420

TATAATTAAC CCCAACACCT GCTGCCCCCC CCCCCCCAAC ACCTGCTGCC TGAGCCTGAG 480

CGGTTACCCC ACCCCGGTGC CTGGGTCTTA GGCTCTGTAC ACCATGGAGG AGAAGCTCGC 540

TCTAAAAATA ACCCTGTCCC TGGTGGACCA CTACGGGTCT AGGCTGCCCA TGTAAGGAGG 600

CAAGGCCTGG GGACACCCGA GATGCCTGGT TATAATTAAC CCCAACACCT GCTGCCCCCC 660

CCCCCCAACA CCTGCTGCCT GAGCCTGAGC GGTTACCCCA CCCCGGTGCC TGGGTCTTAG 720

GCTCTGTACA CCATGGAGGA GAAGCTCGCT CTAAAAATAA CCCTGTCCCT GGTCCTCCCT 780

GGGGACAGCC CCTCCTGGCT AGTCACACCC TGTAGGCTCC TCTATATAAC CCAGGGGCAC 840

AGGGGCTGCC CCCGGGTCAC CTGCAGAAGT TGGTCGTGAG GCACTGGGCA GGTAAGTATC 900

AAGGTTACAA GACAGGTTTA AGGAGACCAA TAGAAACTGG GCTTGTCGAG ACAGAGAAGA 960

CTCTTGCGTT TCTGATAGGC ACCTATTGGT CTTACTGACA TCCACTTTGC CTTTCTCTCC 1020

ACAGGTGTCC ACTCCCAGTT CAATTACAGC GCGTGGTACC ACCATGGCCG AGACACTGTT 1080

CTGGACTCCT CTGCTGGTGG TGCTGCTGGC TGGACTGGGA GATACCGAGG CTCAGCAGAC 1140

CACACTGCAC CCACTGGTGG GCCGGGTGTT CGTGCACACC CTGGACCATG AGACATTTCT 1200

GAGTCTGCCA GAACACGTGG CTGTGCCACC TGCTGTGCAT ATCACTTACC ACGCCCATCT 1260

GCAGGGCCAT CCTGATCTGC CACGGTGGCT GAGATACACC CAGAGATCAC CCCACCATCC 1320

TGGATTCCTG TATGGAAGCG CTACCCCAGA GGACAGGGGA CTGCAGGTGA TCGAAGTGAC 1380

AGCTTACAAC CGCGACAGTT TTGATACTAC CAGGCAGCGC CTGGTGCTGG AGATTGGGGA 1440

TCCAGAAGGA CCCCTGCTGC CTTATCAGGC CGAGTTCCTG GTGCGGTCAC ACGACGCTGA 1500

GGAAGTGCTG CCATCAACAC CCGCCAGCAG ATTTCTGTCC GCTCTGGGAG GACTGTGGGA 1560

GCCAGGAGAA CTGCAGCTGC TGAATGTGAC TAGCGCTCTG GATAGGGGAG GAAGGGTGCC 1620

ACTGCCAATC GAGGGAAGGA AGGAAGGGGT GTACATTAAA GTGGGAAGCG CTTCCCCATT 1680

CTCCACCTGC CTGAAGATGG TGGCTTCTCC TGATAGTCAC GCTAGGTGCG CTCAGGGACA 1740

GCCACCACTG CTGTCCTGTT ATGACACACT GGCCCCCCAT TTTCGCGTGG ACTGGTGCAA 1800

CGTGACTCTG GTGGATAAAT CTGTGCCTGA GCCAGCTGAC GAAGTGCCAA CCCCTGGAGA 1860

CGGAATCCTG GAGCACGATC CTTTCTTTTG TCCTCCAACA GAAGCCCCAG ACAGGGATTT 1920

CCTGGTGGAC GCTCTGGTGA CTCTGCTGGT GCCTCTGCTG GTGGCTCTGC TGCTGACCCT 1980

GCTGCTGGCT TATGTGATGT GCTGTCGGAG AGAGGGACGG CTGAAGAGAG ACCTGGCCAC 2040

ATCTGATATC CAGATGGTGC ACCATTGTAC TATTCACGGC AACACCGAGG AACTGCGCCA 2100

GATGGCTGCT TCTAGGGAGG TGCCAAGGCC ACTGAGTACA CTGCCTATGT TTAATGTGCA 2160

CACTGGCGAA CGGCTGCCCC CTAGAGTGGA TAGCGCCCAG GTGCCACTGA TTCTGGACCA 2220

GCATTGAGGC CGCAATAAAA GATCTTTATT TTCATTAGAT CTGTGTGTTG GTTTTTTGTG 2280

TGTCCTGCAG GGGCGCGCCT CTAGAGCATG GCTACGTAGA TAAGTAGCAT GGCGGGTTAA 2340

TCATTAACTA CAAGGAACCC CTAGTGATGG AGTTGGCCAC TCCCTCTCTG CGCGCTCGCT 2400

CGCTCACTGA GGCCGGGCGA CCAAAGGTCG CCCGACGCCC GGGCTTTGCC CGGGCGGCCT 2460

CAGTGAGCGA GCGAGCGCGC AGCTGGCGTA ATAGCGAAGA GGCCCGCACC GATCGCCCTT 2520

CCCAACAGTT GCGCAGCCTG AATGGCGAAT GGCGATTCCG TTGCAATGGC TGGCGGTAAT 2580

ATTGTTCTGG ATATTACCAG CAAGGCCGAT AGTTTGAGTT CTTCTACTCA GGCAAGTGAT 2640

GTTATTACTA ATCAAAGAAG TATTGCGACA ACGGTTAATT TGCGTGATGG ACAGACTCTT 2700

TTACTCGGTG GCCTCACTGA TTATAAAAAC ACTTCTCAGG ATTCTGGCGT ACCGTTCCTG 2760

TCTAAAATCC CTTTAATCGG CCTCCTGTTT AGCTCCCGCT CTGATTCTAA CGAGGAAAGC 2820

ACGTTATACG TGCTCGTCAA AGCAACCATA GTACGCGCCC TGTAGCGGCG CATTAAGCGC 2880

GGCGGGTGTG GTGGTTACGC GCAGCGTGAC CGCTACACTT GCCAGCGCCC TAGCGCCCGC 2940

TCCTTTCGCT TTCTTCCCTT CCTTTCTCGC CACGTTCGCC ATCTTCAAAT ATGTATCCGC 3000

TCATGAGACA ATAACCCTGA TAAATGCTTC AATAATATTG AAAAAGGAAG AGTCCTGAGG 3060

CGGAAAGAAC CAGCTGTGGA ATGTGTGTCA GTTAGGGTGT GGAAAGTCCC CAGGCTCCCC 3120

AGCAGGCAGA AGTATGCAAA GCATGCATCT CAATTAGTCA GCAACCAGGT GTGGAAAGTC 3180

CCCAGGCTCC CCAGCAGGCA GAAGTATGCA AAGCATGCAT CTCAATTAGT CAGCAACCAT 3240

AGTCCCGCCC CTAACTCCGC CCCATGGCTG ACTAATTTTT TTTATTTATG CAGAGGCCGA 3300

GGCCGCCTCG GCCTCTGAGC TATTCCAGAA GTAGTGAGGA GGCTTTTTTG GAGGCCTAGG 3360

CTTTTGCAAA GATCGATCAA GAGACAGGAT GAGGATCGTT TCGCATGATT GAACAAGATG 3420

GATTGCACGC AGGTTCTCCG GCCGCTTGGG TGGAGAGGCT ATTCGGCTAT GACTGGGCAC 3480

AACAGACAAT CGGCTGCTCT GATGCCGCCG TGTTCCGGCT GTCAGCGCAG GGGCGCCCGG 3540

TTCTTTTTGT CAAGACCGAC CTGTCCGGTG CCCTGAATGA ACTGCAAGAC GAGGCAGCGC 3600

GGCTATCGTG GCTGGCCACG ACGGGCGTTC CTTGCGCAGC TGTGCTCGAC GTTGTCACTG 3660

AAGCGGGAAG GGACTGGCTG CTATTGGGCG AAGTGCCGGG GCAGGATCTC CTGTCATCTC 3720

ACCTTGCTCC TGCCGAGAAA GTATCCATCA TGGCTGATGC AATGCGGCGG CTGCATACGC 3780

TTGATCCGGC TACCTGCCCA TTCGACCACC AAGCGAAACA TCGCATCGAG CGAGCACGTA 3840

CTCGGATGGA AGCCGGTCTT GTCGATCAGG ATGATCTGGA CGAAGAGCAT CAGGGGCTCG 3900

CGCCAGCCGA ACTGTTCGCC AGGCTCAAGG CGAGCATGCC CGACGGCGAG GATCTCGTCG 3960

TGACCCATGG CGATGCCTGC TTGCCGAATA TCATGGTGGA AAATGGCCGC TTTTCTGGAT 4020

TCATCGACTG TGGCCGGCTG GGTGTGGCGG ACCGCTATCA GGACATAGCG TTGGCTACCC 4080

GTGATATTGC TGAAGAGCTT GGCGGCGAAT GGGCTGACCG CTTCCTCGTG CTTTACGGTA 4140

TCGCCGCTCC CGATTCGCAG CGCATCGCCT TCTATCGCCT TCTTGACGAG TTCTTCTGAG 4200

CGGGACTCTG GGGTTCGAAA TGACCGACCA AGCGACGCCC AACCTGCCAT CACGAGATTT 4260

CGATTCCACC GCCGCCTTCT ATGAAAGGTT GGGCTTCGGA ATCGTTTTCC GGGACGCCGG 4320

CTGGATGATC CTCCAGCGCG GGGATCTCAT GCTGGAGTTC TTCGCCCACC CTAGGGGGAG 4380

GCTAACTGAA ACACGGAAGG AGACAATACC GGAAGGAACC CGCGCTATGA CGGCAATAAA 4440

AAGACAGAAT AAAAACGTTG CGCAAACTAT TAACTGGCGA ACTACTTACT CTAGCTTCCC 4500

GGCAACAATT AATAGACTGG ATGGAGGCGG ATAAAGTTGC AGGACCACTT CTGCGCTCGG 4560

CCCTTCCGGC TGGCTGGTTT ATTGCTGATA AATCTGGAGC CGGTGAGCGT GGGTCTCGCG 4620

GTATCATTGC AGCACTGGGG CCAGATGGTA AGCCCTCCCG TATCGTAGTT ATCTACACGA 4680

CGGGGAGTCA GGCAACTATG GATGAACGAA ATAGACAGAT CGCTGAGATA GGTGCCTCAC 4740

TGATTAAGCA TTGGTAACTG TCAGACCAAG TTTACTCATA TATACTTTAG ATTGATTTAA 4800

AACTTCATTT TTAATTTAAA AGGATCTAGG TGAAGATCCT TTTTGATAAT CTCATGACCA 4860

AAATCCCTTA ACGTGAGTTT TCGTTCCACT GAGCGTCAGA CCCCGTAGAA AAGATCAAAG 4920

GATCTTCTTG AGATCCTTTT TTTCTGCGCG TAATCTGCTG CTTGCAAACA AAAAAACCAC 4980

CGCTACCAGC GGTGGTTTGT TTGCCGGATC AAGAGCTACC AACTCTTTTT CCGAAGGTAA 5040

CTGGCTTCAG CAGAGCGCAG ATACCAAATA CTGTTCTTCT AGTGTAGCCG TAGTTAGGCC 5100

ACCACTTCAA GAACTCTGTA GCACCGCCTA CATACCTCGC TCTGCTAATC CTGTTACCAG 5160

TGGCTGCTGC CAGTGGCGAT AAGTCGTGTC TTACCGGGTT GGACTCAAGA CGATAGTTAC 5220

CGGATAAGGC GCAGCGGTCG GGCTGAACGG GGGGTTCGTG CACACAGCCC AGCTTGGAGC 5280

GAACGACCTA CACCGAACTG AGATACCTAC AGCGTGAGCT ATGAGAAAGC GCCACGCTTC 5340

CCGAAGGGAG AAAGGCGGAC AGGTATCCGG TAAGCGGCAG GGTCGGAACA GGAGAGCGCA 5400

CGAGGGAGCT TCCAGGGGGA AACGCCTGGT ATCTTTATAG TCCTGTCGGG TTTCGCCACC 5460

TCTGACTTGA GCGTCGATTT TTGTGATGCT CGTCAGGGGG GCGGAGCCTA TGGAAAAACG 5520

CCAGCAACGC GGCCTTTTTA CGGTTCCTGG CCTTTTGCTG GCCTTTTGCT CACATGTTCT 5580

TTCCTGCGTT ATCCCCTGAT TCTGTGGATA ACCGTATTAC CGCCTTTGAG TGAGCTGATA 5640

CCGCTCGCCG CAGCCGAACG ACCGAGCGCA GCGAGTCAGT GAGCGAGGAA GCGGAAGAGC 5700

GCCCAATACG CAAACCGCCT CTCCCCGCGC GTTGGCCGAT TCATTAATG 5749

SEQUENCE LISTING <110> Research Institute at Nationwide Children's Hospital <120> ADENO-ASSOCIATED VIRUS VECTOR DELIVERY OF ALPHA-SARCOGLYCAN AND THE TREATMENT OF MUSCULAR DYSTROPHY <130> 28335/54625 <140> PCT/US20/47339 <141> 2020-08-21 <150> US 62/889,749 <151> 2019-08-21 <150> US 63/014,934 <151> 2020-04-24 <150> US 63/022,843 <151> 2020-05-11 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1164 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 1 atggccgaga cactgttctg gactcctctg ctggtggtgc tgctggctgg actgggagat 60 accgaggctc agcagaccac actgcaccca ctggtgggcc gggtgttcgt gcacaccctg 120 gaccatgaga catttctgag tctgccagaa cacgtggctg tgccacctgc tgtgcatatc 180 acttaccacg cccatctgca gggccatcct gatctgccac ggtggctgag atacacccag 240 agatcacccc accatcctgg attcctgtat ggaagcgcta ccccagagga caggggactg 300 caggtgatcg aagtgacagc ttacaaccgc gacagttttg atactaccag gcagcgcctg 360 gtgctggaga ttggggatcc agaaggaccc ctgctgcctt atcaggccga gttcctggtg 420 cggtcacacg acgctgagga agtgctgcca tcaacacccg ccagcagatt tctgtccgct 480 ctgggaggac tgtgggagcc aggagaactg cagctgctga atgtgactag cgctctggat 540 aggggaggaa gggtgccact gccaatcgag ggaaggaagg aaggggtgta cattaaagtg 600 ggaagcgctt ccccattctc cacctgcctg aagatggtgg cttctcctga tagtcacgct 660 aggtgcgctc agggacagcc accactgctg tcctgttatg acacactggc cccccatttt 720 cgcgtggact ggtgcaacgt gactctggtg gataaatctg tgcctgagcc agctgacgaa 780 gtgccaaccc ctggagacgg aatcctggag cacgatcctt tcttttgtcc tccaacagaa 840 gccccagaca gggatttcct ggtggacgct ctggtgactc tgctggtgcc tctgctggtg 900 gctctgctgc tgaccctgct gctggcttat gtgatgtgct gtcggagaga gggacggctg 960 aagagagacc tggccacatc tgatatccag atggtgcacc attgtactat tcacggcaac 1020 accgaggaac tgcgccagat ggctgcttct agggaggtgc caaggccact gagtacactg 1080 cctatgttta atgtgcacac tggcgaacgg ctgcccccta gagtggatag cgcccaggtg 1140 ccactgattc tggaccagca ttga 1164 <210> 2 <211> 387 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 2 Met Ala Glu Thr Leu Phe Trp Thr Pro Leu Leu Val Val Leu Leu Ala 1 5 10 15 Gly Leu Gly Asp Thr Glu Ala Gln Gln Thr Thr Leu His Pro Leu Val 20 25 30 Gly Arg Val Phe Val His Thr Leu Asp His Glu Thr Phe Leu Ser Leu 35 40 45 Pro Glu His Val Ala Val Pro Pro Ala Val His Ile Thr Tyr His Ala 50 55 60 His Leu Gln Gly His Pro Asp Leu Pro Arg Trp Leu Arg Tyr Thr Gln 65 70 75 80 Arg Ser Pro His His Pro Gly Phe Leu Tyr Gly Ser Ala Thr Pro Glu 85 90 95 Asp Arg Gly Leu Gln Val Ile Glu Val Thr Ala Tyr Asn Arg Asp Ser 100 105 110 Phe Asp Thr Thr Arg Gln Arg Leu Val Leu Glu Ile Gly Asp Pro Glu 115 120 125 Gly Pro Leu Leu Pro Tyr Gln Ala Glu Phe Leu Val Arg Ser His Asp 130 135 140 Ala Glu Glu Val Leu Pro Ser Thr Pro Ala Ser Arg Phe Leu Ser Ala 145 150 155 160 Leu Gly Gly Leu Trp Glu Pro Gly Glu Leu Gln Leu Leu Asn Val Thr 165 170 175 Ser Ala Leu Asp Arg Gly Gly Arg Val Pro Leu Pro Ile Glu Gly Arg 180 185 190 Lys Glu Gly Val Tyr Ile Lys Val Gly Ser Ala Ser Pro Phe Ser Thr 195 200 205 Cys Leu Lys Met Val Ala Ser Pro Asp Ser His Ala Arg Cys Ala Gln 210 215 220 Gly Gln Pro Pro Leu Leu Ser Cys Tyr Asp Thr Leu Ala Pro His Phe 225 230 235 240 Arg Val Asp Trp Cys Asn Val Thr Leu Val Asp Lys Ser Val Pro Glu 245 250 255 Pro Ala Asp Glu Val Pro Thr Pro Gly Asp Gly Ile Leu Glu His Asp 260 265 270 Pro Phe Phe Cys Pro Pro Thr Glu Ala Pro Asp Arg Asp Phe Leu Val 275 280 285 Asp Ala Leu Val Thr Leu Leu Val Pro Leu Leu Val Ala Leu Leu Leu 290 295 300 Thr Leu Leu Leu Ala Tyr Val Met Cys Cys Arg Arg Glu Gly Arg Leu 305 310 315 320 Lys Arg Asp Leu Ala Thr Ser Asp Ile Gln Met Val His His Cys Thr 325 330 335 Ile His Gly Asn Thr Glu Glu Leu Arg Gln Met Ala Ala Ser Arg Glu 340 345 350 Val Pro Arg Pro Leu Ser Thr Leu Pro Met Phe Asn Val His Thr Gly 355 360 365 Glu Arg Leu Pro Pro Arg Val Asp Ser Ala Gln Val Pro Leu Ile Leu 370 375 380 Asp Gln His 385 <210> 3 <211> 714 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 3 ccactacggg tctaggctgc ccatgtaagg aggcaaggcc tggggacacc cgagatgcct 60 ggttataatt aaccccaaca cctgctgccc cccccccccc aacacctgct gcctgagcct 120 gagcggttac cccaccccgg tgcctgggtc ttaggctctg tacaccatgg aggagaagct 180 cgctctaaaa ataaccctgt ccctggtgga tccactacgg gtctatgctg cccatgtaag 240 gaggcaaggc ctggggacac ccgagatgcc tggttataat taaccccaac acctgctgcc 300 cccccccccc caacacctgc tgcctgagcc tgagcggtta ccccaccccg gtgcctgggt 360 cttaggctct gtacaccatg gaggagaagc tcgctctaaa aataaccctg tccctggtgg 420 accactacgg gtctaggctg cccatgtaag gaggcaaggc ctggggacac ccgagatgcc 480 tggttataat taaccccaac acctgctgcc cccccccccc aacacctgct gcctgagcct 540 gagcggttac cccaccccgg tgcctgggtc ttaggctctg tacaccatgg aggagaagct 600 cgctctaaaa ataaccctgt ccctggtcct ccctggggac agcccctcct ggctagtcac 660 accctgtagg ctcctctata taacccaggg gcacaggggc tgcccccggg tcac 714 <210> 4 <211> 2476 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 4 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggggtt aaccaattgg 120 cggccgcaaa cttgcatgcc ccactacggg tctaggctgc ccatgtaagg aggcaaggcc 180 tggggacacc cgagatgcct ggttataatt aaccccaaca cctgctgccc cccccccccc 240 aacacctgct gcctgagcct gagcggttac cccaccccgg tgcctgggtc ttaggctctg 300 tacaccatgg aggagaagct cgctctaaaa ataaccctgt ccctggtgga tccactacgg 360 gtctatgctg cccatgtaag gaggcaaggc ctggggacac ccgagatgcc tggttataat 420 taaccccaac acctgctgcc cccccccccc caacacctgc tgcctgagcc tgagcggtta 480 ccccaccccg gtgcctgggt cttaggctct gtacaccatg gaggagaagc tcgctctaaa 540 aataaccctg tccctggtgg accactacgg gtctaggctg cccatgtaag gaggcaaggc 600 ctggggacac ccgagatgcc tggttataat taaccccaac acctgctgcc cccccccccc 660 aacacctgct gcctgagcct gagcggttac cccaccccgg tgcctgggtc ttaggctctg 720 tacaccatgg aggagaagct cgctctaaaa ataaccctgt ccctggtcct ccctggggac 780 agcccctcct ggctagtcac accctgtagg ctcctctata taacccaggg gcacaggggc 840 tgcccccggg tcacctgcag aagttggtcg tgaggcactg ggcaggtaag tatcaaggtt 900 acaagacagg tttaaggaga ccaatagaaa ctgggcttgt cgagacagag aagactcttg 960 cgtttctgat aggcacctat tggtcttact gacatccact ttgcctttct ctccacaggt 1020 gtccactccc agttcaatta cagcgcgtgg taccaccatg gccgagacac tgttctggac 1080 tcctctgctg gtggtgctgc tggctggact gggagatacc gaggctcagc agaccacact 1140 gcacccactg gtgggccggg tgttcgtgca caccctggac catgagacat ttctgagtct 1200 gccagaacac gtggctgtgc cacctgctgt gcatatcact taccacgccc atctgcaggg 1260 ccatcctgat ctgccacggt ggctgagata cacccagaga tcaccccacc atcctggatt 1320 cctgtatgga agcgctaccc cagaggacag gggactgcag gtgatcgaag tgacagctta 1380 caaccgcgac agttttgata ctaccaggca gcgcctggtg ctggagattg gggatccaga 1440 aggacccctg ctgccttatc aggccgagtt cctggtgcgg tcacacgacg ctgaggaagt 1500 gctgccatca acacccgcca gcagatttct gtccgctctg ggaggactgt gggagccagg 1560 agaactgcag ctgctgaatg tgactagcgc tctggatagg ggaggaaggg tgccactgcc 1620 aatcgaggga aggaaggaag gggtgtacat taaagtggga agcgcttccc cattctccac 1680 ctgcctgaag atggtggctt ctcctgatag tcacgctagg tgcgctcagg gacagccacc 1740 actgctgtcc tgttatgaca cactggcccc ccattttcgc gtggactggt gcaacgtgac 1800 tctggtggat aaatctgtgc ctgagccagc tgacgaagtg ccaacccctg gagacggaat 1860 cctggagcac gatcctttct tttgtcctcc aacagaagcc ccagacaggg atttcctggt 1920 ggacgctctg gtgactctgc tggtgcctct gctggtggct ctgctgctga ccctgctgct 1980 ggcttatgtg atgtgctgtc ggagagaggg acggctgaag agagacctgg ccacatctga 2040 tatccagatg gtgcaccatt gtactattca cggcaacacc gaggaactgc gccagatggc 2100 tgcttctagg gaggtgccaa ggccactgag tacactgcct atgtttaatg tgcacactgg 2160 cgaacggctg ccccctagag tggatagcgc ccaggtgcca ctgattctgg accagcattg 2220 aggccgcaat aaaagatctt tattttcatt agatctgtgt gttggttttt tgtgtgtcct 2280 gcaggggcgc gcctctagag catggctacg tagataagta gcatggcggg ttaatcatta 2340 actacaagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca 2400 ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga 2460 gcgagcgagc gcgcag 2476 <210> 5 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 5 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggggtt 110 <210> 6 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 6 ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac 60 gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgc 104 <210> 7 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 7 ggccgcaata aaagatcttt attttcatta gatctgtgtg ttggtttttt gtg 53 <210> 8 <211> 5749 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 8 atgcagctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgcccggg caaagcccgg gcgtcgggcg 60 acctttggtc gcccggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gagagggagt ggggttaacc 120 aattggcggc cgcaaacttg catgccccac tacgggtcta ggctgcccat gtaaggaggc 180 aaggcctggg gacacccgag atgcctggtt ataattaacc ccaacacctg ctgccccccc 240 ccccccaaca cctgctgcct gagcctgagc ggttacccca ccccggtgcc tgggtcttag 300 gctctgtaca ccatggagga gaagctcgct ctaaaaataa ccctgtccct ggtggatcca 360 ctacgggtct atgctgccca tgtaaggagg caaggcctgg ggacacccga gatgcctggt 420 tataattaac cccaacacct gctgcccccc cccccccaac acctgctgcc tgagcctgag 480 cggttacccc accccggtgc ctgggtctta ggctctgtac accatggagg agaagctcgc 540 tctaaaaata accctgtccc tggtggacca ctacgggtct aggctgccca tgtaaggagg 600 caaggcctgg ggacacccga gatgcctggt tataattaac cccaacacct gctgcccccc 660 ccccccaaca cctgctgcct gagcctgagc ggttacccca ccccggtgcc tgggtcttag 720 gctctgtaca ccatggagga gaagctcgct ctaaaaataa ccctgtccct ggtcctccct 780 ggggacagcc cctcctggct agtcacaccc tgtaggctcc tctatataac ccaggggcac 840 aggggctgcc cccgggtcac ctgcagaagt tggtcgtgag gcactgggca ggtaagtatc 900 aaggttacaa gacaggttta aggagaccaa tagaaactgg gcttgtcgag acagagaaga 960 ctcttgcgtt tctgataggc acctattggt cttactgaca tccactttgc ctttctctcc 1020 acaggtgtcc actcccagtt caattacagc gcgtggtacc accatggccg agacactgtt 1080 ctggactcct ctgctggtgg tgctgctggc tggactggga gataccgagg ctcagcagac 1140 cacactgcac ccactggtgg gccgggtgtt cgtgcacacc ctggaccatg agacatttct 1200 gagtctgcca gaacacgtgg ctgtgccacc tgctgtgcat atcacttacc acgcccatct 1260 gcagggccat cctgatctgc cacggtggct gagatacacc cagagatcac cccaccatcc 1320 tggattcctg tatggaagcg ctaccccaga ggacagggga ctgcaggtga tcgaagtgac 1380 agcttacaac cgcgacagtt ttgatactac caggcagcgc ctggtgctgg agattgggga 1440 tccagaagga cccctgctgc cttatcaggc cgagttcctg gtgcggtcac acgacgctga 1500 ggaagtgctg ccatcaacac ccgccagcag atttctgtcc gctctgggag gactgtggga 1560 gccaggagaa ctgcagctgc tgaatgtgac tagcgctctg gataggggag gaagggtgcc 1620 actgccaatc gagggaagga aggaaggggt gtacattaaa gtgggaagcg cttccccatt 1680 ctccacctgc ctgaagatgg tggcttctcc tgatagtcac gctaggtgcg ctcagggaca 1740 gccaccactg ctgtcctgtt atgacacact ggccccccat tttcgcgtgg actggtgcaa 1800 cgtgactctg gtggataaat ctgtgcctga gccagctgac gaagtgccaa cccctggaga 1860 cggaatcctg gagcacgatc ctttcttttg tcctccaaca gaagccccag acagggattt 1920 cctggtggac gctctggtga ctctgctggt gcctctgctg gtggctctgc tgctgaccct 1980 gctgctggct tatgtgatgt gctgtcggag agagggacgg ctgaagagag acctggccac 2040 atctgatatc cagatggtgc accattgtac tattcacggc aacaccgagg aactgcgcca 2100 gatggctgct tctagggagg tgccaaggcc actgagtaca ctgcctatgt ttaatgtgca 2160 cactggcgaa cggctgcccc ctagagtgga tagcgcccag gtgccactga ttctggacca 2220 gcattgaggc cgcaataaaa gatctttatt ttcattagat ctgtgtgttg gttttttgtg 2280 tgtcctgcag gggcgcgcct ctagagcatg gctacgtaga taagtagcat ggcgggttaa 2340 tcattaacta caaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct 2400 cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct 2460 cagtgagcga gcgagcgcgc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt 2520 cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat ggcgattccg ttgcaatggc tggcggtaat 2580 attgttctgg atattaccag caaggccgat agtttgagtt cttctactca ggcaagtgat 2640 gttattacta atcaaagaag tattgcgaca acggttaatt tgcgtgatgg acagactctt 2700 ttactcggtg gcctcactga ttataaaaac acttctcagg attctggcgt accgttcctg 2760 tctaaaatcc ctttaatcgg cctcctgttt agctcccgct ctgattctaa cgaggaaagc 2820 acgttatacg tgctcgtcaa agcaaccata gtacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc 2880 ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc 2940 tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc atcttcaaat atgtatccgc 3000 tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtcctgagg 3060 cggaaagaac cagctgtgga atgtgtgtca gttagggtgt ggaaagtccc caggctcccc 3120 agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccaggt gtggaaagtc 3180 cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccat 3240 agtcccgccc ctaactccgc cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga 3300 ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg 3360 cttttgcaaa gatcgatcaa gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg 3420 gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac 3480 aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg 3540 ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaagac gaggcagcgc 3600 ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg 3660 aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc 3720 accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc 3780 ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta 3840 ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg 3900 cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgagcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg 3960 tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat 4020 tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc 4080 gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta 4140 tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgag 4200 cgggactctg gggttcgaaa tgaccgacca agcgacgccc aacctgccat cacgagattt 4260 cgattccacc gccgccttct atgaaaggtt gggcttcgga atcgttttcc gggacgccgg 4320 ctggatgatc ctccagcgcg gggatctcat gctggagttc ttcgcccacc ctagggggag 4380 gctaactgaa acacggaagg agacaatacc ggaaggaacc cgcgctatga cggcaataaa 4440 aagacagaat aaaaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc 4500 ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg 4560 cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg 4620 gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga 4680 cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac 4740 tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa 4800 aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca 4860 aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag 4920 gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac 4980 cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa 5040 ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc 5100 accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag 5160 tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac 5220 cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc 5280 gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc 5340 ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca 5400 cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 5460 tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 5520 ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct 5580 ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata 5640 ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc 5700 gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatg 5749 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 9 cagggctggg agctgggttc tg 22 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 10 cccagggcct tgatgcct 18 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 11 gctatcagga catagcgttg gcta 24 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 12 acccgagatg cctggttata att 23 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 13 tccatggtgt acagagccta agac 24 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Seuqence <220> <223> Synthetic Primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> FAM <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> IABkFQ <400> 14 ctgctgcctg agcctgagcg gttac 25

Claims

재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) AAVrh74.tMCK.hSCGA를 투여하는 단계를 포함하는 근위축증의 치료가 필요한 대상체에서 근위축증을 치료하는 방법으로서, rAAV는 전신 투여 경로를 사용하여 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 1.0 x 10¹² vg/kg 내지 약 5.0 x 10¹⁵ vg/kg의 용량으로 투여되는 방법.
제1항에 있어서, rAAV는 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 1.0 x 10¹² vg/kg 내지 약 2.0 x 10¹⁵ vg/kg, 약 5 x 10¹² vg/kg 내지 약 1.0 x 10¹⁵ vg/kg, 약 1.0 x 10¹³ vg/kg 내지 약 5.0 x 10¹⁴ vg/kg, 약 2.0 x 10¹³ vg/kg 내지 약 3.0 x 10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5x10¹³ vg/kg 내지 약 2x10¹⁴ vg/kg의 용량으로 투여되는, 방법.
제1항에 있어서, rAAV는 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 5x10¹³ vg/kg 내지 약 2x10¹⁴ vg/kg의 용량으로 투여되는, 방법.
제1항에 있어서, rAAV는 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 5x10¹³ vg/kg, 약 1x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 2x10¹⁴ vg/kg의 용량으로 투여되는, 방법.
재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) AAVrh74.tMCK.hSCGA를 투여하는 단계를 포함하는 근위축증의 치료가 필요한 대상체에서 근위축증을 치료하는 방법으로서, rAAV는 전신 투여 경로를 사용하여 투여되고 정량 표준으로서 선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 1.85 x 10¹³ vg/kg 또는 7.41 x 10¹³ vg/kg의 용량으로 투여되는, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자 발현 수준은 rAAV 투여 전 알파-사르코글리칸 유전자 발현 수준과 비교하여 rAAV 투여 후 증가하고; 대상체에서 혈청 CK 수준은 rAAV 투여 전 혈청 CK 수준과 비교하여 rAAV 투여 후 감소하고; 운동 활성 및 비력 생성은 증가하고; 섬유증은 감소하고; 전방 경골 근육에서 수축 유도 손상에 대한 저항은 증가하고/증가하거나; 대상체의 근육 조직에서 알파-사르코글리칸 양성 섬유의 수는 rAAV 투여 전 알파-사르코글리칸 양성 섬유의 수와 비교하여 rAAV 투여 후 증가하는, 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 전신 투여 경로가 정맥내 경로인, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV는 주사, 주입 또는 이식에 의해 투여되는, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV는 주입에 의해 투여되는, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV는 말초 사지 정맥을 통한 정맥내 경로에 의해 투여되는, 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV는 SEQ ID NO: 1과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
제11항에 있어서, rAAV는 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV는 SEQ ID NO: 2와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV는 SEQ ID NO: 2에 제시된 폴리펩티드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV는 SEQ ID NO: 4와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
제15항에 있어서, rAAV는 SEQ ID NO: 4의 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV는 tMCK 프로모터를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, tMCK 프로모터가 SEQ ID NO: 3에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV는 SEQ ID NO: 5의 5' 역 말단 반복 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV는 SEQ ID NO: 6의 3' 역 말단 반복 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV는 SEQ ID NO: 7의 폴리 A 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV는 혈청형 AAVrh.74인, 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 근위축증이 사지 연결 근위축증인, 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 근위축증이 사지 연결 근위축증 유형 2D(LGMD2D)인, 방법.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 사지 연결 근위축증을 앓고 있고, rAAV는 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 5x10¹³ vg/kg 내지 약 2x10¹⁴ vg/kg의 용량으로 정맥내 주입에 의해 투여되고, rAAV는 SEQ ID NO: 4의 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자 발현 수준이 rAAV 투여 전 알파-사르코글리칸 유전자 발현 수준과 비교하여 rAAV 투여 후 증가하는, 방법.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 섬유증이 rAAV 투여 전과 비교하여 rAAV 투여 후 대상체에서 감소하는, 방법.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 섬유증, 중앙 핵형성, CK 수준, 및/또는 콜라겐 침착이 rAAV 투여 전과 비교하여 rAAV 투여 후 감소하는, 방법.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 근육에서 비력, 섬유 직경 크기 및/또는 편심 수축이 rAAV 투여 전과 비교하여 rAAV 투여 후 증가하는, 방법.
제26항에 있어서, 알파-사르코글리칸 유전자 발현이 웨스턴 블롯 및/또는 면역조직화학에 의해 알파-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출되는, 방법.
SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자를 발현시키는 방법.
제31항에 있어서, 대상체의 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자의 발현이 근육 생검에서 웨스턴 블롯 상의 알파-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출되는, 방법.
제31항에 있어서, 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자의 발현이 근육 생검에서 면역조직화학에 의해 알파-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출되는, 방법.
제31항에 있어서, 알파-사르코글리칸 유전자의 발현이 게놈 DNA의 마이크로그램당 벡터 게놈의 수를 검출함으로써 대상체에서 측정되는, 방법.
SEQ ID NO: 4의 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 뉴클레오티드 서열을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 혈청 CK 수준 감소를 필요로 하는 대상체에서 혈청 CK 수준을 감소시키는 방법.
SEQ ID NO: 4의 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 뉴클레오티드 서열을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 근육 조직에서 알파-사르코글리칸 양성 섬유를 증가시키는 방법.
SEQ ID NO: 4의 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 뉴클레오티드 서열의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 알파-사르코글리칸의 발현 증가를 필요로 하는 대상체에서 알파-사르코글리칸의 발현을 증가시키는 방법.
근위축증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 근위축증을 치료하기 위한 조성물로서, 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 1.0 x 10¹² vg/kg 내지 약 5.0 x 10¹⁵ vg/kg의 용량으로 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) AAVrh74.tMCK.hSCGA를 포함하고, 전신 투여 경로를 위해 제형화되는 조성물.
근위축증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 근위축증을 치료하기 위한 조성물로서, 정량 표준으로서 선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 1.85 x 10¹³ vg/kg 또는 7.41 x 10¹³ vg/kg의 용량으로 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) AAVrh74.tMCK.hSCGA를 포함하고, 전신 투여 경로를 위해 제형화되는 조성물.
재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)를 포함하는 조성물로서, rAAV는 SEQ ID NO: 4와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물.
제38항 또는 제40항에 있어서, rAAV는 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 5x10¹³ vg/kg 내지 약 2x10¹⁴ vg/kg의 용량인, 조성물.
제38항 또는 제40항에 있어서, rAAV는 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 5x10¹³ vg/kg, 약 1x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 2x10¹⁴ vg/kg의 용량인, 조성물.
제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자 발현 수준은 조성물 투여 전 알파-사르코글리칸 유전자 발현 수준과 비교하여 조성물 투여 후 증가하거나; 대상체에서 혈청 CK 수준은 조성물 투여 전 혈청 CK 수준과 비교하여 조성물 투여 후 감소하거나; 대상체의 근육 조직에서 알파-사르코글리칸 양성 섬유의 수는 조성물 투여 전 알파-사르코글리칸 양성 섬유의 수와 비교하여 조성물 투여 후 증가하는, 조성물.
제38항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 전신 투여 경로가 정맥내 경로인, 조성물.
제38항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 주사, 주입 또는 이식에 의한 투여를 위해 제형화되는, 조성물.
제38항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 주입에 의한 투여를 위해 제형화되는, 조성물.
제38항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 말초 사지 정맥을 통한 정맥내 경로에 의한 투여를 위해 제형화되는, 조성물.
제38항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV는 SEQ ID NO: 1과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조성물.
제48항에 있어서, rAAV는 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조성물.
제38항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV는 SEQ ID NO: 2와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조성물.
제38항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV는 SEQ ID NO: 2에 제시된 폴리펩티드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조성물.
제38항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV는 SEQ ID NO: 4와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조성물.
제52항에 있어서, rAAV는 SEQ ID NO: 4의 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조성물.
제38항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV는 tMCK 프로모터를 포함하는, 조성물.
제54항에 있어서, tMCK 프로모터가 SEQ ID NO: 3에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조성물.
제38항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV는 SEQ ID NO: 5의 5' 역 말단 반복 서열을 포함하는, 조성물.
제38항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV는 SEQ ID NO: 6의 3' 역 말단 반복 서열을 포함하는, 조성물.
제38항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV는 SEQ ID NO: 7의 폴리 A 서열을 포함하는, 조성물.
제38항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV는 혈청형 AAVrh.74인, 조성물.
제38항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 근위축증이 사지 연결 근위축증인, 조성물.
제38항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 근위축증이 사지 연결 근위축증 유형 2D(LGMD2D)인, 조성물.
제38항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 사지 연결 근위축증을 앓고 있고, 조성물은 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 5x10¹³ vg/kg 내지 약 2x10¹⁴ vg/kg의 용량으로 정맥내 주입에 의한 투여를 위해 제형화되고, rAAV는 SEQ ID NO: 4의 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조성물.
제38항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자 발현 수준이 조성물 투여 전 알파-사르코글리칸 유전자 발현 수준과 비교하여 조성물 투여 후 증가하는, 조성물.
제38항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 섬유증이 조성물 투여 전과 비교하여 조성물 투여 후 대상체에서 감소하는, 조성물.
제38항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 섬유증, 중앙 핵형성, CK 수준, 및/또는 콜라겐 침착이 조성물 투여 전과 비교하여 조성물 투여 후 감소하는, 조성물.
제38항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 근육에서 비력, 섬유 직경 크기 및/또는 편심 수축이 조성물 투여 전과 비교하여 조성물 투여 후 증가하는, 조성물.
제63항에 있어서, 알파-사르코글리칸 유전자 발현이 웨스턴 블롯 및/또는 면역조직화학에 의해 알파-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출되는, 조성물.
세포에서 알파-사르코글리칸 유전자를 발현시키기 위한 조성물로서, SEQ ID NO: 4의 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물.
제68항에 있어서, 대상체의 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자의 발현이 근육 생검에서 웨스턴 블롯 상의 알파-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출되는, 조성물.
제68항에 있어서, 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자의 발현이 근육 생검에서 면역조직화학에 의해 알파-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출되는, 조성물.
제68항에 있어서, 알파-사르코글리칸 유전자의 발현이 게놈 DNA의 마이크로그램당 벡터 게놈의 수를 검출함으로써 대상체에서 측정되는, 조성물.
혈청 CK 수준 감소를 필요로 하는 대상체에서 혈청 CK 수준을 감소시키기 위한 조성물로서, SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물을 포함하는 조성물.
SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물을 포함하는 대상체의 근육 조직에서 알파-사르코글리칸 양성 섬유를 증가시키기 위한 조성물.
알파-사르코글리칸의 발현 증가를 필요로 하는 대상체에서 알파-사르코글리칸의 발현을 증가시키기 위한 조성물로서, SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물을 포함하는 조성물.
근위축증 치료를 필요로 하는 대상체에서 근위축증을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) AAVrh74.tMCK.hSCGA A의 용도로서, rAAV는 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 1.0 x 10¹² vg/kg 내지 약 5.0 x 10¹⁵ vg/kg의 용량이고, 약제는 전신 투여 경로를 위해 제형화되는 용도.
제75항에 있어서, rAAV는 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 1.0 x 10¹² vg/kg 내지 약 2.0 x 10¹⁵ vg/kg, 약 5 x 10¹² vg/kg 내지 약 1.0 x 10¹⁵ vg/kg, 약 1.0 x 10¹³ vg/kg 내지 약 5.0 x 10¹⁴ vg/kg, 약 2.0 x 10¹³ vg/kg 내지 약 3.0 x 10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5x10¹³ vg/kg 내지 약 2x10¹⁴ vg/kg의 용량인, 용도.
제75항에 있어서, rAAV는 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 5x10¹³ vg/kg 내지 약 2x10¹⁴ vg/kg의 용량인, 용도.
제75항에 있어서, rAAV는 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 5x10¹³ vg/kg, 약 1x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 2x10¹⁴ vg/kg의 용량인, 용도.
근위축증 치료를 필요로 하는 대상체에서 근위축증을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) AAVrh74.tMCK.hSCGA A의 용도로서, rAAV는 정량 표준으로서 선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 1.85 x 10¹³ vg/kg 또는 7.41 x 10¹³ vg/kg의 용량이고, 약제는 전신 투여 경로를 위해 제형화되는 용도.
제75항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자 발현 수준은 약제 투여 전 알파-사르코글리칸 유전자 발현 수준과 비교하여 약제 투여 후 증가하거나; 대상체에서 혈청 CK 수준은 약제 투여 전 혈청 CK 수준과 비교하여 약제 투여 후 감소하거나; 대상체의 근육 조직에서 알파-사르코글리칸 양성 섬유의 수는 약제 투여 전 알파-사르코글리칸 양성 섬유의 수와 비교하여 약제 투여 후 증가하는, 용도.
제75항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 전신 투여 경로가 정맥내 경로인, 용도.
제75항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 약제가 주사, 주입 또는 이식에 의한 투여를 위해 제형화되는, 약제.
제75항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 약제가 주입에 의한 투여를 위해 제형화되는, 약제.
제75항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 약제가 말초 사지 정맥을 통한 정맥내 경로에 의한 투여를 위해 제형화되는, 약제.
제75항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV는 SEQ ID NO: 1과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 용도.
제85항에 있어서, rAAV는 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 용도.
제75항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV는 SEQ ID NO: 2와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 용도.
제75항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV는 SEQ ID NO: 2에 제시된 폴리펩티드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 용도.
제75항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV는 SEQ ID NO: 4와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 용도.
제89항에 있어서, rAAV는 SEQ ID NO: 4의 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 용도.
제75항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV는 tMCK 프로모터를 포함하는, 용도.
제91항에 있어서, tMCK 프로모터가 SEQ ID NO: 3에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 용도.
제75항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV는 SEQ ID NO: 5의 5' 역 말단 반복 서열을 포함하는, 용도.
제75항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV는 SEQ ID NO: 6의 3' 역 말단 반복 서열을 포함하는, 용도.
제73항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV는 SEQ ID NO: 7의 폴리 A 서열을 포함하는, 용도.
제73항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV는 혈청형 AAVrh.74인, 용도.
제73항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 근위축증이 사지 연결 근위축증인, 용도.
제73항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 근위축증이 사지 연결 근위축증 유형 2D(LGMD2D)인, 용도.
제73항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 사지 연결 근위축증을 앓고 있고, 약제는 정맥내 주입을 위해 제형화되고 rAAV는 정량 표준으로서 초나선형 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 약 5x10¹³ vg/kg 내지 약 2x10¹⁴ vg/kg의 용량이고, rAAV는 SEQ ID NO: 4의 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 용도.
제73항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자 발현 수준이 약제 투여 전 알파-사르코글리칸 유전자 발현 수준과 비교하여 약제 투여 후 증가하는, 용도.
제73항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 섬유증이 약제 투여 전과 비교하여 약제 투여 후 대상체에서 감소하는, 용도.
제73항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 섬유증, 중앙 핵형성, CK 수준, 및/또는 콜라겐 침착이 약제 투여 전과 비교하여 약제 투여 후 감소하는, 용도.
제72항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 근육에서 비력, 섬유 직경 크기 및/또는 편심 수축이 약제 투여 전과 비교하여 약제 투여 후 증가하는, 용도.
제100항에 있어서, 알파-사르코글리칸 유전자 발현이 웨스턴 블롯 및/또는 면역조직화학에 의해 알파-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출되는, 용도.
세포에서 알파-사르코글리칸 유전자를 발현시키기 위한 약제의 제조를 위한 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물의 용도로서, scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물은 SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 용도.
제105항에 있어서, 대상체의 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자의 발현이 근육 생검에서 웨스턴 블롯 상의 알파-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출되는, 용도.
제105항에 있어서, 세포에서 알파-사르코글리칸 유전자의 발현이 근육 생검에서 면역조직화학에 의해 알파-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출되는, 용도.
제105항에 있어서, 알파-사르코글리칸 유전자의 발현이 게놈 DNA의 마이크로그램당 벡터 게놈의 수를 검출함으로써 대상체에서 측정되는, 용도.
혈청 CK 수준 감소를 필요로 하는 대상체에서 혈청 CK 수준을 감소시키기 위한 약제의 제조를 위한 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물의 용도로서, scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물은 SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 용도.
대상체의 근육 조직에서 알파-사르코글리칸 양성 섬유를 증가시키기 위한 약제의 제조를 위한 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물의 용도로서, scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물은 SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 용도.
알파-사르코글리칸의 발현 증가를 필요로 하는 대상체에서 알파-사르코글리칸의 발현을 증가시키기 위한 약제의 제조를 위한 scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물의 용도로서, scAAVrh74.tMCK.hSGCA 작제물은 SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 용도.
제1항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 4 내지 15세의 인간 대상체인, 방법, 조성물 또는 용도.
제1항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 소아 대상체, 청소년 대상체 또는 젊은 성인 대상체인, 방법, 조성물 또는 용도.
제1항 내지 111항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 4 내지 15세의 인간 대상체이고, 두 대립 유전자 모두에서 알파-사르코글리칸(SGCA) 돌연변이가 확인되었고, AAVrh74 항체에 대해 음성이었고/음성이거나 100 미터 보행 테스트에서 >40% 또는 정상인, 방법, 조성물 또는 용도.
제1항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 중년 성인 또는 노인 대상체인, 방법, 조성물 또는 용도.
제1항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 25세 내지 55세인 인간 대상체인, 방법, 조성물 또는 용도.
제1항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 50세 초과인 인간 대상체인, 방법, 조성물 또는 용도.
제1항 내지 제117항 중 어느 한 항의 방법, 조성물 또는 용도로 투여되는 rAAV를 생성하는 방법으로서, AAV 벡터 플라스미드를 숙주 세포에 전달하는 것을 포함하고, AAV 벡터 플라스미드는 SEQ ID NO: 8과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
제118항에 있어서, AAV 벡터 플라스미드가 SEQ ID NO: 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
제118항 또는 제119항에 있어서, 벡터 플라스미드가 SEQ ID NO: 1, 4 또는 8과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
제118항 또는 제119항에 있어서, 벡터 플라스미드가 SEQ ID NO: 1, 4 또는 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
제118항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 패키징 플라스미드 및/또는 헬퍼 바이러스를 숙주 세포에 전달하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
제118항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 패키징 세포가 안정적으로 통합된 AAV cap 유전자를 포함하는, 방법.
제118항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 패키징 세포가 안정적으로 통합된 AAV rep 유전자를 포함하는, 방법.
SEQ ID NO: 1, 4 또는 8과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 AAV 벡터 플라스미드를 포함하는 숙주 세포.
제125항에 있어서, AAV 벡터 플라스미드가 SEQ ID NO: 1, 4 또는 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 숙주 세포.