KR20220088473A - 막 소포의 농축 및 증가된 당단백질 수율을 위한 무세포 추출물 제조 프로토콜 - Google Patents
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Abstract
막 소포가 농축된 무세포 추출물 제조 프로토콜을 제조하기 위한 프로토콜 및 무세포 당단백질 합성 방법 및 당단백질 수율을 증가시키기 위한 플랫폼에서의 개시된 추출물의 용도가 개시된다.
Description
연방 정부 지원된 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 국방위협감소국(DTRA)에 의해 수여된 HDTRA1-15-1-0052 하에서 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
관련 특허 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에서 2019년 10월 25일자로 출원된 미국 가출원 번호 제62/926,166호에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 그 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 분야는 무세포 당단백질 합성을 수행하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 분야는 막 소포가 농축된 무세포 추출물을 제조하기 위한 프로토콜 및 무세포 당단백질 합성을 수행하고 당단백질 수율을 증가시키기 위한 방법 및 플랫폼에서의 이의 용도에 관한 것이다.
당 모이어티에 의한 아미노산 측쇄의 효소적 변형인 단백질 당화는 세포 기능, 인간 건강 및 생명공학에서 중요한 역할을 한다. 그러나, 정의된 당단백질을 연구하고 생산하는 것은 여전히 어렵다. 단백질 합성 및 당화가 미정제 세포 추출물에서 수행되는 무세포 당단백질 합성(CFgPS) 시스템은 이러한 문제를 다루기 위한 새로운 접근법을 제공한다. 그러나, 당단백질 수율을 증가시키고 공지된 CFgPS 시스템 및 방법을 단순화하기 위해 보다 나은 성분 및 프로토콜이 필요하다. 여기서, 본 발명자들은 막 소포가 농축된 무세포 추출물을 제조하기 위한 프로토콜을 개시한다. 본 발명자들의 추출물은 무세포 당단백질 합성을 수행하고 당단백질 수율을 증가시키기 위한 방법 및 플랫폼에서 활용될 수 있다.
개시된 주제는 당화를 위한 성분을 포함하는 막 소포가 농축된, 무세포 추출물을 제조하기 위한 프로토콜에 관한 것이다. 개시된 추출물은 당단백질의 수율을 실질적으로 증가시키기 위해 무세포 당단백질 합성(CFGpS) 반응 및 플랫폼에서 활용될 수 있다. 특히, 개시된 무세포 추출물은 당단백질의 수율을 증가시키기 위해 무세포 반응 혼합물에서 조정된 전사, 번역, 및 당화를 통해 무세포 당단백질 합성(CFGpS) 반응에서 당화된 단백질을 합성하기 위한 방법 및 플랫폼에 활용될 수 있다.
도 1. 미정제 CFE 추출물에서 막 소포의 특성화. (a) 미정제 추출물 및 SEC 정제된 소포의 DLS 분석. 미정제 추출물 흔적은 중첩을 나타내기 위해 반투명하다. 오차 막대는 3 개의 독립적으로 제조된 추출물의 삼중 분석 내 표준 편차를 나타낸다. 정제된 소포의 경우, 오차 막대는 가장 농축된 소포 용리 분획의 삼중 분석의 표준 편차를 나타낸다. (b) 미정제 CFE 추출물에서 검출된 입자의 예시. (c) 미정제 추출물의 저온 전자 현미경 사진. 흑색 화살표는 명백한 단층 형태의 소포를 나타낸다. 백색 화살표는 중첩된 또는 다층 형태를 나타낸다. 자른 이미지는 대표적인 소포를 나타낸다. 스케일 바는 100 ㎚이다. (d) SEC 정제된 소포의 저온 전자 현미경 사진. 자른 이미지는 대표적인 정제된 소포를 나타낸다. 스케일 바는 100 ㎚이다.
도 2. 추출물 가공은 소포 크기 분포 및 농도에 영향을 미친다. (a) 추출물 가공 조건의 예시. 추출물은 제시된 각 조건에 대해 삼중으로 제조되었다. (b) 초음파 처리된(청색) 및 균질화된(녹색) 추출물 내 소포의 나노입자 추적 분석(NTA) 농도 분석. 별표는 추출물 제조를 위한 기본 사례 조건을 나타낸다. NTA 분석의 경우, 오차 막대는 독립적으로 제조된 3 개의 추출물 측정치의 표준 편차를 나타낸다. (c) 초음파 처리된(청색) 및 균질화된(녹색) S30 추출물 내 소포의 NTA 입자 크기 분포(PSD). (d) 초음파 처리된(청색) 및 균질화된(녹색) S12 추출물의 NTA PSD.
도 3. 이종 막-결합 화물은 막 소포를 통해 제어 가능하게 농축될 수 있다. S12 및 S30 추출물에서의 이종 막 단백질의 농축은 (a) 당화 효소 및 (b) 신호 전달 단백질에 대한 이종 단백질에 대한 α-FLAG 웨스턴 블롯을 사용하여 정량화되었다. (c) 막횡단 나선이 없는 세포질 sfGFP 대조군. 각 웨스턴 블롯에서 좌측 레인은 S12 추출물이고 우측 레인은 S30 추출물이다. 흑색 화살표는 관심 있는 막 단백질을 나타낸다. 단백질 사다리 표준으로부터의 분자량(kDa)은 각 블롯의 좌측에 표시된다. 단백질 명칭 및 밴드의 농축 비율(S12/S30)은 각 블롯 바로 아래에 표시된다. 모든 블롯은 3 개의 독립적인 실험을 대표한다. 만화는 각 단백질에 대한 막횡단 위상학을 도시한다. 분류학적 기원, 막횡단 위상학, 기능(들), 이론적 크기 및 유니프롯(UniProt) ID는 보충 표 1 참조. (d) 형광 α-FLAG 항체로 탐침된 추출물의 SEC 분석의 형광 크로마토그램. 추출물을 제조하는데 사용된 균주는 막 단백질 없이(회색 흔적), PglB(진한 자주색 흔적), 또는 PglO(밝은 자주색 흔적)로 농축되었다. 3 개의 독립적인 실험의 특징적인 소포 용리 분획은 회색으로 강조된다.
도 4. 소포 농도의 증가는 N- 및 O-연결 당화 시스템에 대한 무세포 당단백질 합성(CFGpS)을 개선시킨다. (a) PglB 및 씨. 제주니(C. jejuni) LLO가 농축된 S12 또는 S30 추출물로 채워진 CFGpS 반응의 당단백질 수율. 오차 막대는 3 개의 독립적인 CFGpS 반응의 표준 편차를 나타내며, 각각은 독립적인 추출물로 실행된다. (삽입) 2-상 CFGpS 반응의 개략도. (b) 20 분 CFPS 시간으로 N-연결된 CFGpS 반응의 당화된(진한 녹색) 및 총(밝은 녹색) 단백질 수율. 오차 막대는 3 개의 독립적인 반응의 표준 편차를 나타낸다. (삽입) 일반 N-OST 매개된(회색 별) 및 PglB(분홍색 별) 매개된 당화에 대한 시퀀(sequon) 선호도. 당화된 잔기는 굵게 표시된다. (c) (b)의 대표적인 반응으로부터의 수용체 단백질의 웨스턴 블롯, 여기서 go는 비당화된 수용체 단백질을 나타내고 g1은 당단백질을 나타낸다. (d) 20 분 CFPS 시간으로 O-연결된 CFGpS 반응에서 당화된(진한 자주색) 및 총(밝은 자주색) 단백질 수율. (삽입) 일반 O-OST(회색 별) 및 PglO(분홍색 별) 매개된 당화에 대한 시퀀 선호도. 당화된 잔기는 굵게 표시된다. (e) (d)의 대표적인 반응으로부터 수용체 단백질의 웨스턴 블롯. 모든 젤은 3 개의 독립적인 CFGpS 반응을 대표한다.
도 5. 표준 무세포 발현 반응 조건에서 sfGFP 리포터의 생산. 주형 DNA가 존재할 때 단백질 합성이 진행되고, 주형 DNA가 생략될 때 형광이 관찰되지 않는다. 오차 막대는 3 개의 독립적인 CFE 반응의 표준 편차를 나타낸다.
도 6. CFE 추출물로부터 막 소포의 정제 및 특성화. (a) FM 4-64 지질 염료로 탐침된 추출물의 SEC 크로마토그램. 회색 구획은 소포 용리 분획을 나타낸다. (b) (a)에서 용리된 분획 9 및 10에서 수집된 정제된 소포의 NTA 분석. (c) PBS 내의 정제된 소포의 제타 전위 분석. 오차 막대는 정제된 소포의 삼중 측정의 표준 편차를 나타낸다.
도 7. 본 연구에서 특성화된 모든 S30 및 S12 추출물의 CFE 생산성. 반응은 표준 조건 하에 30 ℃에서 20 시간 동안 실행되었다. (a)의 추출물은 과발현된 성분이 없는 '빈' 섀시 균주에 해당한다. 이들 추출물은 도 1, 도 2에 특성화되어 있다. (b)는 도 3에 특성화된 막 단백질이 농축된 추출물을 나타낸다. (c)는 균주 내에 씨. 제주니 LLO 및 표시된 효소가 농축된 CFGpS 추출물을 나타낸다. CFGpS 추출물은 도 4에서 특성화된다. 오차 막대는 삼중 독립 반응의 표준 편차를 나타낸다.
도 8. 도 2에 제시된 추출물의 추가적인 광 산란 특성화. (a)는 NTA에 의해 결정된, 추출물 내의 소포 직경 산술평균을 나타낸다. (b) S30 및 (c) S12 추출물의 DLS 분석. 두 경우 모두에서 스펙트럼은 균질화된 추출물에서 더 크고, 우측-이동된 피크를 확증한다. NTA 입자 계수와 일치되게, 소포 피크에 대한 ~20 ㎚ 피크(리보솜/작은 세포 복합체)의 상대 피크 높이는 각 주어진 제조 방법에 대해 초음파 처리된 추출물보다 균질화된 추출물이 더 높은 농도의 소포를 포함한다는 것을 나타낸다. 오차 막대는 3 개의 독립적인 추출물의 측정치의 표준 편차를 나타낸다.
도 9. S30 및 S12 추출물에서의 막 단백질 농축의 웨스턴 블롯 분석. 표시된 재조합 단백질에 대한 자르지 않은 각각의 α-FLAG 블롯이 제시된다. 각 재조합 단백질의 이론적 질량은 흑색 화살표 옆에 제시된다. 우리는 막 단백질이 SDS-PAGE 상에서 비정상적으로 이동하여, 단백질 사다리 표준과 관련하여 '가볍게' 이동한다는 잘 문서화된 효과를 관찰하였다. 레인 키는 아래에 제시된다. CB1 블롯의 경우, 단백질의 존재를 확인하기 위해 블롯의 우측에 표시된, 여분의 대조군이 필요하였음을 주목한다.
도 10. CFGpS 추출물 내의 소포 및 PglB 농축의 특성화. (a) NTA를 통해 측정된, PglB 및 씨.제주니 LLO가 농축된 추출물 내 소포의 농도. 오차 막대는 3 개의 독립적인 추출물 측정치의 표준 편차를 나타낸다. (b, 좌측) OST 및 LLO 가 모두 농축된 추출물 내의 PglB에 대한 α-FLAG 웨스턴 블롯 및 상응하는 레인 키(b, 우측).
도 11. 당화 성분은 막 소포에 매립되어 있다. α-LLO 및 α-OST 시약으로 탐침된 S30 추출물의 형광 SEC 크로마토그램이 제시된다. 소포 용리 분획은 회색으로 강조된다. N-연결된 PglB OST를 갖는 추출물 및 대조군의 분석은 (a)에, 및 O-연결된 PglO OST의 경우 (b)에 제시되어 있다.
도 12. CFGpS 추출물에서 N-연결된 당화의 특성화. CFGpS 수용체 단백질에 대한 삼중 α-His 웨스턴 블롯은 추출물 복제 1 내지 3에 상응하는 (a) 내지 (c)에 나타난다. (a) 내지 (c)에서의 웨스턴 블롯은 도 4에서 당단백질 수율을 계산하는데 사용되었다. (d) (a)에서 상응하는 반응의 α-글리칸 블롯. (e) 생산된 총 수용체 단백질 및 (f) 각 조건에서 당단백질로 변환된 수용체 단백질의 백분율. 오차 막대는 3 개의 독립적인 반응의 표준 편차를 나타낸다.
도 13. PglB 및 PglO에 대해 허용 가능한 시퀀을 갖는 수용체 단백질의 잔기-특이적 당화. 일반적으로, PglO의 당화 선호도는 PglB에 대한 것보다 덜 이해된다. PglB의 경우 양성 및 음성 시퀀에 대한 시퀀 특이성이 잘 특성화되어 있기 때문에, PglB 샘플은 양성 및 음성 대조군에 대한 블롯 기준으로서 사용된다. (a) CFGpS 반응의 α-His 블롯은 5 분의 CFPS 시간으로 실행된다. 당화된 밴드는 모든 당화 성분 및 허용 가능한 시퀀이 존재할 때만 존재한다. (b) 모든 당화 성분이 존재할 때 오직 g1에 대해서만 신호를 나타내는, 상응하는 α-글리칸 블롯.
도 14. CFGpS 추출물에서 O-연결된 당화의 특성화. (a) PglO CFGpS 반응의 α-His 웨스턴 블롯은 20 분의 CFPS 시간으로 실행되며 (b) 상응하는 α-글리칸 블롯. (c) 당단백질로 변환된 수용체 단백질의 백분율. 오차 막대는 3 개의 독립적인 CFGpS 반응 분석의 표준 편차를 나타낸다.
도 2. 추출물 가공은 소포 크기 분포 및 농도에 영향을 미친다. (a) 추출물 가공 조건의 예시. 추출물은 제시된 각 조건에 대해 삼중으로 제조되었다. (b) 초음파 처리된(청색) 및 균질화된(녹색) 추출물 내 소포의 나노입자 추적 분석(NTA) 농도 분석. 별표는 추출물 제조를 위한 기본 사례 조건을 나타낸다. NTA 분석의 경우, 오차 막대는 독립적으로 제조된 3 개의 추출물 측정치의 표준 편차를 나타낸다. (c) 초음파 처리된(청색) 및 균질화된(녹색) S30 추출물 내 소포의 NTA 입자 크기 분포(PSD). (d) 초음파 처리된(청색) 및 균질화된(녹색) S12 추출물의 NTA PSD.
도 3. 이종 막-결합 화물은 막 소포를 통해 제어 가능하게 농축될 수 있다. S12 및 S30 추출물에서의 이종 막 단백질의 농축은 (a) 당화 효소 및 (b) 신호 전달 단백질에 대한 이종 단백질에 대한 α-FLAG 웨스턴 블롯을 사용하여 정량화되었다. (c) 막횡단 나선이 없는 세포질 sfGFP 대조군. 각 웨스턴 블롯에서 좌측 레인은 S12 추출물이고 우측 레인은 S30 추출물이다. 흑색 화살표는 관심 있는 막 단백질을 나타낸다. 단백질 사다리 표준으로부터의 분자량(kDa)은 각 블롯의 좌측에 표시된다. 단백질 명칭 및 밴드의 농축 비율(S12/S30)은 각 블롯 바로 아래에 표시된다. 모든 블롯은 3 개의 독립적인 실험을 대표한다. 만화는 각 단백질에 대한 막횡단 위상학을 도시한다. 분류학적 기원, 막횡단 위상학, 기능(들), 이론적 크기 및 유니프롯(UniProt) ID는 보충 표 1 참조. (d) 형광 α-FLAG 항체로 탐침된 추출물의 SEC 분석의 형광 크로마토그램. 추출물을 제조하는데 사용된 균주는 막 단백질 없이(회색 흔적), PglB(진한 자주색 흔적), 또는 PglO(밝은 자주색 흔적)로 농축되었다. 3 개의 독립적인 실험의 특징적인 소포 용리 분획은 회색으로 강조된다.
도 4. 소포 농도의 증가는 N- 및 O-연결 당화 시스템에 대한 무세포 당단백질 합성(CFGpS)을 개선시킨다. (a) PglB 및 씨. 제주니(C. jejuni) LLO가 농축된 S12 또는 S30 추출물로 채워진 CFGpS 반응의 당단백질 수율. 오차 막대는 3 개의 독립적인 CFGpS 반응의 표준 편차를 나타내며, 각각은 독립적인 추출물로 실행된다. (삽입) 2-상 CFGpS 반응의 개략도. (b) 20 분 CFPS 시간으로 N-연결된 CFGpS 반응의 당화된(진한 녹색) 및 총(밝은 녹색) 단백질 수율. 오차 막대는 3 개의 독립적인 반응의 표준 편차를 나타낸다. (삽입) 일반 N-OST 매개된(회색 별) 및 PglB(분홍색 별) 매개된 당화에 대한 시퀀(sequon) 선호도. 당화된 잔기는 굵게 표시된다. (c) (b)의 대표적인 반응으로부터의 수용체 단백질의 웨스턴 블롯, 여기서 go는 비당화된 수용체 단백질을 나타내고 g1은 당단백질을 나타낸다. (d) 20 분 CFPS 시간으로 O-연결된 CFGpS 반응에서 당화된(진한 자주색) 및 총(밝은 자주색) 단백질 수율. (삽입) 일반 O-OST(회색 별) 및 PglO(분홍색 별) 매개된 당화에 대한 시퀀 선호도. 당화된 잔기는 굵게 표시된다. (e) (d)의 대표적인 반응으로부터 수용체 단백질의 웨스턴 블롯. 모든 젤은 3 개의 독립적인 CFGpS 반응을 대표한다.
도 5. 표준 무세포 발현 반응 조건에서 sfGFP 리포터의 생산. 주형 DNA가 존재할 때 단백질 합성이 진행되고, 주형 DNA가 생략될 때 형광이 관찰되지 않는다. 오차 막대는 3 개의 독립적인 CFE 반응의 표준 편차를 나타낸다.
도 6. CFE 추출물로부터 막 소포의 정제 및 특성화. (a) FM 4-64 지질 염료로 탐침된 추출물의 SEC 크로마토그램. 회색 구획은 소포 용리 분획을 나타낸다. (b) (a)에서 용리된 분획 9 및 10에서 수집된 정제된 소포의 NTA 분석. (c) PBS 내의 정제된 소포의 제타 전위 분석. 오차 막대는 정제된 소포의 삼중 측정의 표준 편차를 나타낸다.
도 7. 본 연구에서 특성화된 모든 S30 및 S12 추출물의 CFE 생산성. 반응은 표준 조건 하에 30 ℃에서 20 시간 동안 실행되었다. (a)의 추출물은 과발현된 성분이 없는 '빈' 섀시 균주에 해당한다. 이들 추출물은 도 1, 도 2에 특성화되어 있다. (b)는 도 3에 특성화된 막 단백질이 농축된 추출물을 나타낸다. (c)는 균주 내에 씨. 제주니 LLO 및 표시된 효소가 농축된 CFGpS 추출물을 나타낸다. CFGpS 추출물은 도 4에서 특성화된다. 오차 막대는 삼중 독립 반응의 표준 편차를 나타낸다.
도 8. 도 2에 제시된 추출물의 추가적인 광 산란 특성화. (a)는 NTA에 의해 결정된, 추출물 내의 소포 직경 산술평균을 나타낸다. (b) S30 및 (c) S12 추출물의 DLS 분석. 두 경우 모두에서 스펙트럼은 균질화된 추출물에서 더 크고, 우측-이동된 피크를 확증한다. NTA 입자 계수와 일치되게, 소포 피크에 대한 ~20 ㎚ 피크(리보솜/작은 세포 복합체)의 상대 피크 높이는 각 주어진 제조 방법에 대해 초음파 처리된 추출물보다 균질화된 추출물이 더 높은 농도의 소포를 포함한다는 것을 나타낸다. 오차 막대는 3 개의 독립적인 추출물의 측정치의 표준 편차를 나타낸다.
도 9. S30 및 S12 추출물에서의 막 단백질 농축의 웨스턴 블롯 분석. 표시된 재조합 단백질에 대한 자르지 않은 각각의 α-FLAG 블롯이 제시된다. 각 재조합 단백질의 이론적 질량은 흑색 화살표 옆에 제시된다. 우리는 막 단백질이 SDS-PAGE 상에서 비정상적으로 이동하여, 단백질 사다리 표준과 관련하여 '가볍게' 이동한다는 잘 문서화된 효과를 관찰하였다. 레인 키는 아래에 제시된다. CB1 블롯의 경우, 단백질의 존재를 확인하기 위해 블롯의 우측에 표시된, 여분의 대조군이 필요하였음을 주목한다.
도 10. CFGpS 추출물 내의 소포 및 PglB 농축의 특성화. (a) NTA를 통해 측정된, PglB 및 씨.제주니 LLO가 농축된 추출물 내 소포의 농도. 오차 막대는 3 개의 독립적인 추출물 측정치의 표준 편차를 나타낸다. (b, 좌측) OST 및 LLO 가 모두 농축된 추출물 내의 PglB에 대한 α-FLAG 웨스턴 블롯 및 상응하는 레인 키(b, 우측).
도 11. 당화 성분은 막 소포에 매립되어 있다. α-LLO 및 α-OST 시약으로 탐침된 S30 추출물의 형광 SEC 크로마토그램이 제시된다. 소포 용리 분획은 회색으로 강조된다. N-연결된 PglB OST를 갖는 추출물 및 대조군의 분석은 (a)에, 및 O-연결된 PglO OST의 경우 (b)에 제시되어 있다.
도 12. CFGpS 추출물에서 N-연결된 당화의 특성화. CFGpS 수용체 단백질에 대한 삼중 α-His 웨스턴 블롯은 추출물 복제 1 내지 3에 상응하는 (a) 내지 (c)에 나타난다. (a) 내지 (c)에서의 웨스턴 블롯은 도 4에서 당단백질 수율을 계산하는데 사용되었다. (d) (a)에서 상응하는 반응의 α-글리칸 블롯. (e) 생산된 총 수용체 단백질 및 (f) 각 조건에서 당단백질로 변환된 수용체 단백질의 백분율. 오차 막대는 3 개의 독립적인 반응의 표준 편차를 나타낸다.
도 13. PglB 및 PglO에 대해 허용 가능한 시퀀을 갖는 수용체 단백질의 잔기-특이적 당화. 일반적으로, PglO의 당화 선호도는 PglB에 대한 것보다 덜 이해된다. PglB의 경우 양성 및 음성 시퀀에 대한 시퀀 특이성이 잘 특성화되어 있기 때문에, PglB 샘플은 양성 및 음성 대조군에 대한 블롯 기준으로서 사용된다. (a) CFGpS 반응의 α-His 블롯은 5 분의 CFPS 시간으로 실행된다. 당화된 밴드는 모든 당화 성분 및 허용 가능한 시퀀이 존재할 때만 존재한다. (b) 모든 당화 성분이 존재할 때 오직 g1에 대해서만 신호를 나타내는, 상응하는 α-글리칸 블롯.
도 14. CFGpS 추출물에서 O-연결된 당화의 특성화. (a) PglO CFGpS 반응의 α-His 웨스턴 블롯은 20 분의 CFPS 시간으로 실행되며 (b) 상응하는 α-글리칸 블롯. (c) 당단백질로 변환된 수용체 단백질의 백분율. 오차 막대는 3 개의 독립적인 CFGpS 반응 분석의 표준 편차를 나타낸다.
정의
개시된 주제는 하기와 같은 정의 및 용어를 사용하여 더 설명될 수 있다. 본원에서 사용된 정의 및 용어는 단지 특정 실시양태를 설명하기 위해 사용된 것이고, 한정하려는 의도가 아니다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수형 "한", "하나의" 및 "그"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수형을 포함한다. 예를 들어, 용어 "한 유전자" 또는 "하나의 올리고당"은 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 각각 "하나 이상의 유전자" 및 "하나 이상의 올리고당"을 의미하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "복수"는 "둘 이상"을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "약", "대략", "실질적으로" 및 "상당히"는 관련 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 이해될 것이며 이들이 사용되는 맥락에 따라 어느 정도 변할 것이다. 해당 용어가 사용되는 맥락에서 관련 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하지 않은 용어의 사용이 있는 경우, "약" 및 "대략"은 특정 용어의 + 또는 - 10 % 이하를 의미할 것이고, "실질적으로" 및 "상당히"는 특정 용어의 + 또는 - 10 % 초과를 의미할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하다" 및 "포함하는"은 용어 "구성되다" 및 "구성되는"과 동일한 의미를 갖는다. 용어 "구성되다” 및 "구성되는”은 청구범위에 인용된 이들 구성요소에 추가적인 구성요소를 더 포함할 것을 허용하는 "개방형" 이행 용어로 해석되어야 한다. 용어 "이루어지다" 및 "~로 이루어지는"은 청구범위에 인용된 구성요소 이외의 추가적인 구성요소의 포함을 허용하지 않는 "폐쇄형" 이행 용어로 해석되어야 한다. 용어 "본질적으로 구성된"은 부분적으로 폐쇄되고 청구된 주제의 본질을 근본적으로 변경하지 않는 추가적인 구성요소의 포함만을 허용하는 것으로 해석되어야 한다.
어구 "예컨대"는 "예를 들어, 포함하는"으로 해석되어야 한다. 또한 "예컨대"를 포함하지만 이에 제한되지 않는 모든 예시적인 언어의 사용은, 단지 본 발명을 더 잘 설명하도록 의도된 것이고 달리 청구되지 않는 한 본 발명의 범위에 제한을 두지 않는다.
또한, "A, B 및 C 등 중 적어도 하나"와 유사한 규약이 사용되는 경우, 일반적으로 이러한 구성은 해당 기술 분야의 통상의 기술자가 상기 규약을 이해할 수 있다는 의미로 의도된다(예를 들어, "A, B 및 C 중 적어도 하나를 갖는 시스템"은 A 단독, B 단독, C 단독, A 및 B를 함께, A 및 C를 함께, B 및 C를 함께, 및/또는 A, B 및 C를 함께 갖는 시스템을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.). 설명 또는 도면에서 여부에 관계없이, 둘 이상의 대안적인 용어를 제시하는 사실상 임의의 접속사 및/또는 어구는 용어 중 하나, 어느 하나의 용어, 또는 양쪽 용어 모두를 포함하는 가능성을 고려하는 것으로 이해되어야 한다는 것이 관련 기술 분야의 기술자에 의해 추가로 이해될 것이다. 예를 들어, 어구 "A 또는 B"는 "A" 또는 "B" 또는 "A 및 B"의 가능성을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
"최대", "적어도", "초과", "미만" 등과 같은 모든 언어는 인용된 숫자를 포함하고, 범위 및 하위 범위로 후속적으로 분류될 수 있는 범위를 지칭한다. 범위는 각각의 개별 구성원을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 1 내지 3 개의 구성원을 갖는 그룹은 1, 2 또는 3 개의 구성원을 갖는 그룹을 지칭한다. 유사하게, 6 개의 구성원을 갖는 그룹은 1, 2, 3, 4 또는 6 개의 구성원을 갖는 그룹을 지칭하고, 기타 이와 같다.
조동사 "~할 수 있다(may)"는 몇몇 설명된 실시양태 또는 그 안에 포함된 특징 중에서 하나 이상의 옵션 또는 선택사항의 바람직한 사용 또는 선별을 지칭한다. 특정 실시양태 또는 그에 포함된 특징과 관련하여 옵션 또는 선택사항이 개시되지 않은 경우, 조동사 "~할 수 있다"는 설명된 실시양태 또는 그에 포함된 특징의 제작 또는 사용 방법 및 양태에 관한 긍정적인 행위, 또는 설명된 실시양태 또는 그에 포함된 특징에 관한 특정 기술을 사용하기 위한 최종 결정을 지칭한다. 이러한 후자의 문맥에서, 조동사 "~할 수 있다"는 보조동사 "할 수 있다(can)"와 동일한 의미 및 함축을 가진다.
무세포 단백질 합성(CFPS)
본원에 개시된 방법 및 조성물은 당업계에 공지된 바와 같은 무세포 단백질 합성 방법에 활용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제4,496,538호; 제4,727,136호; 제5,478,730호; 제5,556,769호; 제5,623,057호; 제5,665,563호; 제5,679,352호; 제6,168,931호; 제6,248,334호; 제6,531,131호; 제6,869,774호; 제6,994,986호; 제7,118,883호; 제7,189,528호; 제7,338,789호; 제7,387,884호; 제7,399,610호; 제8,703,471호; 및 제8,999,668호 참조. 또한 미국 공개 출원 번호 제2015-0259757호, 제2014-0295492호, 제2014-0255987호, 제2014-0045267호, 제2012-0171720호, 제2008-0138857호, 제2007-0154983호, 제2005-0054044호, 및 제2004-0209321호 참조. 또한 미국 공개 출원 번호 제2005-0170452호; 제2006-0211085호; 제2006-0234345호; 제2006-0252672호; 제2006-0257399호; 제2006-0286637호; 제2007-0026485호; 제2007-0178551호; 제2014-0295492호; 제2018-0016612호; 제2018-0016614호; 제2018-0298416호; 및 제2019/0284600호 참조. 또한 공개된 PCT 국제 출원 번호 WO 2003/056914; WO 2004/013151; WO 2004/035605; WO 2006/102652; WO 2006/119987; 및 WO 2007/120932 참조. 또한 문헌[Jewett, M.C., Hong, S.H., Kwon, Y.C., Martin, R.W. and Des Soye, B.J. 2014, “Methods for improved in vitro protein synthesis with proteins containing non standard amino acids,” 미국 특허 출원 일련번호: 62/044,221]; 문헌[Jewett, M.C., Hodgman, C.E. and Gan, R. 2013, “Methods for yeast cell-free protein synthesis,” 미국 특허 출원 일련번호: 61/792,290]; 문헌[Jewett, M.C., J.A. Schoborg and C.E. Hodgman. 2014, “Substrate Replenishment and Byproduct Removal Improve Yeast Cell-Free Protein Synthesis,” 미국 특허 출원 일련번호: 61/953,275]; 및 문헌[Jewett, M.C., Anderson, M.J., Stark, J.C., Hodgman, C.E. 2015, “Methods for activating natural energy metabolism for improved yeast cell-free protein synthesis,” 미국 특허 출원 일련번호: 62/098,578] 참조. 문헌[Guarino, C., & DeLisa, M.P.(2012). A prokaryote-based cell-free translation system that efficiently synthesizes glycoproteins. Glycobiology, 22(5), 596-601] 또한 참조. 이들 모든 참고문헌의 내용은 그 전문이 참고문헌으로서 본 출원에 포함된다.
특정 예시적인 실시양태에서, 본원에 설명된 하나 이상의 방법은 용기, 예를 들어 단일 용기 또는 다중 용기에서 수행된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "용기"는 본원에 설명된 반응물(예를 들어, 하나 이상의 전사, 번역 및/또는 당화 단계에서 사용하기 위한) 중 하나 이상을 보유하기에 적합한 임의의 그릇을 지칭한다. 용기의 예는 미량역가 플레이트, 시험관, 원심분리 튜브, 비커, 플라스크, 다중-웰 플레이트, 큐벳, 유동 시스템, 미세섬유, 현미경 슬라이드 및 기타 등등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
특정 예시적인 실시양태에서, 생리학적으로 적합한(그러나 반드시 천연은 아님) 이온 및 완충제, 예를 들어 포타슘 글루타메이트, 염화암모늄 등이 전사, 번역 및/또는 당화를 위해 활용된다. 생리학적 세포질 염 조건은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
본원에 개시된 방법 및 조성물은 당화된 거대분자(예를 들어, 당화된 펩티드, 당화된 단백질 및 당화된 지질)를 제조하기 위해 무세포 단백질 방법에서 활용될 수 있다. 개시된 균주 및 시스템을 사용하여 제조될 수 있는 당화된 단백질은 N-연결된 당화(즉, 아스파라긴 및/또는 아르기닌 측쇄의 질소에 부착된 글리칸) 및/또는 O-연결된 당화(즉, 세린, 트레오닌, 티로신, 히드록실리신 및/또는 히드록시프롤린의 히드록실 산소에 부착된 글리칸)를 갖는 단백질을 포함할 수 있다. 당화된 지질은 산소 원자를 통해 O-연결된 글리칸, 예컨대 세라미드를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 당화된 거대분자는 당업계에 공지된 바와 같은 단량체로 구성된 비분지형 및/또는 분지형 당 사슬, 예컨대 비제한적으로, 글루코스(예를 들어, β-D-글루코스), 갈락토스(예를 들어, β-D-갈락토스), 만노스(예를 들어, β-D-만노스), 푸코스(예를 들어, α-L-푸코스), N-아세틸-글루코사민(GlcNAc), N-아세틸-갈락토사민(GalNAc), 뉴라민산, N-아세틸뉴라민산(즉, 시알산), 및 자일로스를 포함할 수 있으며, 이는 각각의 글리코실전이효소(예를 들어, 올리고당전이효소, GlcNAc 전이효소, GalNAc 전이효소, 갈락토실전이효소 및 시알릴전이효소)를 통해 당화된 거대분자, 성장 글리칸 사슬, 또는 공여체 분자(예를 들어, 공여체 지질 및/또는 공여체 뉴클레오티드)에 부착될 수 있다. 본원에 개시된 당화된 거대분자는 당업계에 공지된 바와 같은 글리칸을 포함할 수 있다.
개시된 무세포 단백질 합성 방법 및 시스템은 미정제 성분 및/또는 적어도 부분적으로 단리된 및/또는 정제된 성분을 활용할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "미정제"는 세포를 파괴 및 용해하고, 기껏해야 파괴 및 용해된 세포로부터 미정제 성분을 최소한으로 정제함으로써, 예를 들어, 파괴 및 용해된 세포를 원심분리하고 원심분리 후 상층액 및/또는 펠렛으로부터 미정제 성분을 수집함으로써 수득된 성분을 의미할 수 있다. 용어 "단리된 또는 정제된"은 그들의 천연 환경으로부터 제거된 성분을 지칭하고, 이들이 천연적으로 회합된 다른 성분이 60 % 이상, 바람직하게는 75 % 이상, 보다 바람직하게는 90 % 이상, 보다 더 바람직하게는 95 % 이상 없는 것이다.
개시된 방법 및 조성물은 무세포 당단백질 합성(CFGpS)을 수행하기 위해 활용될 수 있다. 특히, 개시된 방법 및 조성물은 당화를 위한 성분이 농축된 원핵 세포 용해물에 관한 것이다. 임의적으로, 본 명세서에 개시된 용해물은 유전적으로 변형된 원핵생물 균주로부터 제조된다. 일부 실시양태에서, 유전적으로 변형된 원핵생물은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 CFGpS에 대한 용해물을 제조하는데 적합한 임의의 기타 원핵생물의 유전적으로 변형된 균주이다. 임의적으로, 에스케리키아 콜라이의 변형된 균주는 rEc.C321로부터 유래된다. 바람직하게는, 변형된 균주는 고수율의 무세포 단백질 합성이 가능한 용해물을 바람직하게는 생성하는 게놈 변형(예를 들어, 유전자를 작동 불가능하게 만드는 유전자의 결실)을 포함한다. 또한, 바람직하게는, 변형된 균주는 상대적으로 높은 농도(예를 들어, 게놈 변형을 갖지 않는 균주와 비교하여)에서 당화를 위한 당 전구체를 포함하는 용해물을 바람직하게는 생성하는 게놈 변형(예를 들어, 유전자를 작동불가능하게 만드는 유전자의 결실)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 균주로부터 제조된 용해물은 변형되지 않은 균주에서 제조된 용해물에 비해 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 % 이상, 또는 그 초과로, 더 높은 농도로 당 전구체를 포함한다. 제한으로서가 아닌 예시로서, 본 방법, 키트 및 시스템에 유용한 박테리아 공급원 균주는 알이콜라이(rEcoli) ΔprfA ΔendA Δgor Δrne(705), 이. 콜라이 BL21(DE3), 이.콜라이 CLM24, 이.콜라이 CLM24 ΔlpxM, 이.콜라이 CLM24 ΔlpxM CH-IpxE, 이.콜라이 CLM24 ΔlpxM CH-IpxE TT-IpxE, 이.콜라이 CLM24 ΔlpxM CH-IpxE TT-IpxE KL-IpxE, 및 이.콜라이 CLM24 ΔlpxM CH-IpxE TT-IpxE KL-IpxE KO-IpxE를 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 균주는 당화에 활용되는 단당류(예를 들어, 글루코스, 만노스, N-아세틸-글루코사민(GlcNAc), N-아세틸-갈락토사민(GalNAc), 갈락토스, 시알산, 뉴라민산, 푸코스)의 농도를 증가시키는 변형을 포함한다. 따라서, 변형은 당화에 활용되는 단당류 또는 다당류를 대사하는 효소를 불활성화시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 탈수효소 또는 탄소-산소 분해효소(EC 4.2)를 불활성화(예를 들어, 효소를 암호화하는 유전자의 적어도 일부의 결실을 통해)시킨다. 특히, 변형은 GDP-만노스 4,6-탈수효소(EC 4.2.1.47)를 불활성화시킬 수 있다. 변형된 균주가 이. 콜라이인 경우, 변형은 gmd 유전자의 불활성화(예를 들어, gmd 유전자의 적어도 일부의 결실을 통해) 변형을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 균주는 글리코실전이효소 경로에서 활용되는 효소를 불활성화시키는 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형은 올리고당 연결효소를 불활성화(예를 들어, 효소를 암호화하는 유전자의 적어도 일부의 결실을 통해)시킨다. 특히, 변형은 O-항원을 지질 A 코어 올리고당에 임의로 접합시키는 O-항원 연결효소를 불활성시킬 수 있다. 변형은 waaL 유전자의 불활성화(예를 들어, waaL 유전자의 적어도 일부의 결실을 통해) 변형을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 균주는 탈수효소 또는 탄소-산소 분해효소를 불활성화(예를 들어, 효소를 암호화하는 유전자의 적어도 일부의 결실을 통해)시키는 변형을 포함하고, 또한 변형된 균주는 올리고당 연결효소를 불활성화(예를 들어, 효소를 암호화하는 유전자의 적어도 일부의 결실을 통해)시키는 변형을 포함한다. 변형된 균주는 gmd 및 waaL 모두의 비활성화 또는 결실을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 균주는 하나 이상의 독립 또는 이종 유전자를 발현하도록 변형될 수 있다. 특히, 변형된 균주는 지질-결합 올리고당(LLO) 경로에 관여하는 글리코실전이효소(GT) 등의 당단백질 합성과 관련된 독립 또는 이종 유전자를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 균주는 독립 또는 이종 올리고당전이효소(EC 2.4.1.119)(OST)를 발현하도록 변형될 수 있다. 올리고당전이효소 또는 OST는 지질로부터 단백질로 올리고당을 전달하는 효소이다.
특히, 변형된 균주는 당화 시스템(예를 들어, N-연결된 당화 시스템 및/또는 O-연결된 당화 시스템)에서 독립 또는 이종 유전자를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)의 N-연결된 당화 시스템이 이. 콜라이로 전달되었다. (문헌[Wacker et al., "N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli," Science 2002, Nov 29; 298(5599):1790-3] 참조, 그 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다). 특히, 변형된 균주는 씨. 제주니의 pgl 유전자좌의 하나 이상의 유전자 또는 상동성 pgl 유전자좌의 하나 이상의 유전자를 발현하도록 변형될 수 있다. pgl 유전자좌의 유전자는 pglG, pglF, pglE, wlaJ, pglD, pglC, pglA, pglB, pglJ, pglI, pglH, pglK 및 gne를 포함하며, 지질-결합 올리고당(LLO)을 합성하고 올리고당 전이효소를 통해 LLO의 올리고당 모이어티를 단백질로 전달하는데 사용된다.
유전적으로 변형된 균주에서 발현될 수 있는 적합한 독립 또는 이종 올리고당전이효소(OST)는 캄필로박터 제주니 올리고당전이효소 PglB를 포함할 수 있다. 씨. 제주니 OST에 대한 유전자는 pglB로 지칭되며, 이 서열은 서열식별번호(SEQ ID NO): 5로서 제공되고, 씨. 제주니 PglB의 아미노산 서열은 서열식별번호: 6으로서 제공된다. PglB는 단백질 상에 존재하는 D/E-Y-N-X-S/T 모티프(Y, X ≠ P)로의 올리고당의 전달을 촉매한다. 본원에 개시된 방법, 키트 및 시스템에 유용한 OST 효소의 추가적인 비제한적 예는 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli) PglB, 캄필로박터 라리(Campylobacter lari) PglB, 데술포비브리오 데술푸리칸스(Desulfovibrio desulfuricans) PglB, 데술포비브리오 기가스(Desulfovibrio gigas) PglB, 및 데술포비브리오 불가리스(Desulfovibrio vulgaris) PglB를 포함한다.
미정제 세포 용해물은 본 명세서에 개시된 변형된 균주로부터 제조될 수 있다. 미정제 세포 용해물은 본 명세서에 개시된 바와 같이 상이한 변형된 균주로부터 제조될 수 있고, 미정제 세포 용해물은 혼합된 미정제 세포 용해물을 제조하기 위해 조합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 미정제 세포 용해물은 바람직하게는 상대적으로 높은 농도(예를 들어, 게놈 변형을 갖지 않는 균주와 비교하여)에서의 당화를 위한 당 전구체를 포함하는 용해물을 생성하는 게놈 변형(예를 들어, 유전자를 작동 불가능하게 만드는 유전자의 결실)을 포함하는 하나 이상의 변형된 균주로부터 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 미정제 세포 용해물은 당단백질 합성과 관련된 하나 이상의 독립 또는 이종 유전자 또는 유전자 클러스터를 발현하도록 변형된 하나 이상의 변형된 균주로부터 제조될 수 있다.
본원에 개시된 방법은 당화 성분, 예컨대 지질-결합 올리고당(LLO), 글리코실전이효소(GT), 올리고당전이효소(OST) 또는 이들의 임의의 조합이 농축된 미정제 세포 용해물 또는 혼합된 미정제 세포 용해물을 제조하는데 활용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 미정제 세포 용해물 또는 혼합된 미정제 세포 용해물은 코어 진핵생물 글리칸을 나타내는 Man3GlcNAc2 LLO 및/또는 완전히 시알릴화된 인간 글리칸을 나타내는 Man3GlcNAc4Gal2Neu5Ac2 LLO가 농축되었다. 제한으로서가 아닌 예시로서, 개시된 방법, 키트 및 시스템에 유용한 글리칸 구조는 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis) SchuS4 O-다당류, 에스케리키아 콜라이 O78 O-다당류, 에스케리키아 콜라이 O-7 O-다당류, 에스케리키아 콜라이 O-9 O-다당류 프라이머, 캄필로박터 제주니 7당류 N-글리칸, 캄필로박터 라리 PglB 육당류 N-글리칸, 조작된 캄필로박터 라리 PglB 육당류 N-글리칸, 월리넬라 숙시노게네스(Wolinella succinogenes) 6당류 N-글리칸, 및 진핵생물 Man3GlcNac2 N-글리칸 구조를 포함한다.
개시된 미정제 세포 용해물은 다양한 당단백질을 합성하기 위해 무세포 당단백질 합성(CFGpS) 시스템에서 사용될 수 있다. CFGpS 시스템에서 합성된 당단백질은 원핵생물 당단백질, 및 인간 단백질을 포함하는 진핵생물 단백질을 포함할 수 있다. CFGpS 시스템은 본원에 개시된 미정제 세포 용해물 또는 미정제 세포 용해물의 혼합물을 사용하는 하기 단계를 수행함으로써 시험관 내에서 당단백질을 합성하는 방법에 활용될 수 있다: (a) 표적 당단백질에 대한 유전자의 무세포 전사를 수행하는 단계; (b) 무세포 번역을 수행하는 단계; 및 (c) 무세포 당화를 수행하는 단계. 상기 방법은 단일 용기 또는 다중 용기에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 합성 방법의 단계는 단일 반응 용기를 사용하여 수행될 수 있다. 개시된 방법은 원핵생물 당단백질 및 진핵생물 당단백질을 포함하는 다양한 당단백질을 합성하는데 사용될 수 있다.
막 소포 및 증가된 당단백질의 농축을 위한 무세포 추출물 제조 프로토콜
개시된 주제는 당화를 위한 성분을 포함하는 막 소포가 농축된, 무세포 추출물을 제조하기 위한 프로토콜에 관한 것이다. 개시된 추출물은 당단백질의 수율을 실질적으로 증가시키기 위해 무세포 당단백질 합성 반응 및 플랫폼에서 활용될 수 있다. 특히, 개시된 무세포 추출물은 당단백질의 수율을 증가시키기 위해 무세포 반응 혼합물에서 조정된 전사, 번역, 및 당화를 통해 무세포 당단백질 합성(CFGpS) 반응에서 당화된 단백질을 합성하기 위한 방법 및 플랫폼에 활용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 개시된 방법 및 플랫폼은 무세포 반응 혼합물 내에서 조정된 전사, 번역 및 당화를 통해 무세포 당단백질 합성(CFGpS) 반응에서 당화된 단백질을 합성하는 것에 관한 것이며, 여기서 반응 혼합물은 원핵 세포를 용해시켜 용해된 세포를 수득하고(예를 들어, 원핵 세포를 초음파 처리함으로써 및/또는 원핵 세포를 균질화함으로써), 용해된 세포를 5,000×g 초과 및 약 30,000×g 미만(또는 약 25,000×g, 20,000×g, 18,000×g, 또는 15,000×g 미만)의 힘으로 원심분리하고, 무세포 분획을 수득하기 위해 상층액을 수집함으로써 수득된, 무세포 분획물을 포함한다. 이러한 방법은 전형적으로 다음을, 및 이러한 플랫폼은 다음을 위한 성분을 포함한다: (i) 무세포 반응 혼합물 내의 단백질을 전사 및 번역하는 단계; 및 (ii) 반응 혼합물 내의 단백질을 하나 이상의 다당류로 당화시켜 당화된 단백질을 수득하는 단계. 일부 실시양태에서, 용해된 세포는 5,000×g 초과 및 약 18,000×g 미만 또는 약 15,000×g 미만의 힘으로 원심분리된다. 추가 실시양태에서, 용해된 세포는 약 12,000×g의 힘으로 원심분리된다.
개시된 무세포 분획은 전형적으로, 예를 들어, 용해된 세포를 약 15,000×g 초과 또는 약 18,000×g 초과의 힘으로 원심분리하여 수득된 무세포 분획에 비해 막 소포가 농축되어 있다. 일부 실시양태에서, 무세포 분획은 막 소포를 약 4×1012, 5×1012, 또는 6×1012, 7×1012, 또는 8×1012 입자/㎖ 이상의 농도로 포함한다.
무세포 분획에 존재하는 막 소포는 전형적으로 1 마이크로미터 미만의 평균 유효 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 막 소포는 평균 유효 직경이 약 10 ㎚, 20 ㎚, 30 ㎚, 40 ㎚, 50 ㎚, 60 ㎚, 70 ㎚, 80 ㎚, 90 ㎚ 또는 100 ㎚ 내지 약 150 ㎚, 200 ㎚, 250 ㎚, 300 ㎚, 350 ㎚, 400 ㎚, 450 ㎚ 또는 500 ㎚이다. 추가 실시양태에서, 막 소포는 평균 유효 직경이 약 50 ㎚ 내지 약 200 ㎚이다.
막 소포는 인지질 소포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 무세포 추출물을 제조하기 위해 활용된 원핵 세포는 무세포 반응 혼합물 내의 단백질을 당화하는 막횡단 올리고당전이효소를 발현하고, 막 소포는 막횡단 올리고당전이효소(예를 들어, 박테리아 막횡단 올리고당전이효소)를 포함한다. 막횡단 올리고당전이효소는 천연 올리고당전이효소일 수 있고/있거나 막횡단 올리고당전이효소는 외인성 올리고당전이효소일 수 있다. 일부 실시양태에서, 막횡단 올리고당전이효소는 PglB, PglO, 및 STT3 중에서 선택된다.
막 소포는 개시된 방법 및 플랫폼에서 당단백질을 당화하기 위한 올리고당을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 막 소포는 지질-결합 올리고당(LLO) 공여자를 포함하고 단백질은 LLO 공여자로 당화된다.
개시된 방법 및 플랫폼에 적합한 세포는 원핵 세포를 포함한다. 적합한 원핵 세포에는 에스케리키아 콜라이가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.
실시예
하기 실시예는 예시적이며, 청구된 주제의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1 - 무세포 당단백질 합성 시스템에서 증가된 당단백질 생산을 위한 이. 콜라이 CFPS 추출물 내 막 소포의 농축
초록
개시된 주제는 새로운 기능성을 조작하기 위한 CFPS 시스템을 이해하기 위한 목적으로 에스케리키아 콜라이 무세포 단백질 합성(CFPS) 추출물에서의 막 결합 성분의 특성화에 관한 것이다. 특히, 단백질 당화에 필요한 많은 효소 및 당 공여자가 막-결합되어 있기 때문에, 이 작업은 CFPS를 단백질 당화(즉, 단백질에 대한 당의 공유 부착)와 상호작용하는데 의미가 있다. 당화는 단백질의 구조 및 기능에 매우 중요하며, 재조합 단백질 생산에서 핵심적인 고려사항이다. 본 발명자들은 세포 용해 시에 형성되고 추출물 가공을 통해 최종 추출물로 운반되는, 수십 내지 수백 나노미터 정도의 유효 직경을 갖는 지질 소포를 포함하는 무세포 추출물이 제조될 수 있음을 발견하였다. 본 발명자들은 보다 높은 농도의 막 소포를 포함하는 활성 추출물을 제조하는 방법을 개발하였다. 당단백질 생산의 경우, 본 발명자들은 막-결합된 당화 기구를 과발현하는 섀시 균주로부터 제조된 추출물이 관심 있는 활성 기구가 농축된 소포를 포함한다는 것을 밝혀내었다. 놀랍게도, 추출물 가공의 최적화는 추출물 가공 시간을 대폭 단축시키면서, 무세포 당단백질 합성(CFGpS) 반응에서 60 % 초과의, 더 높은 당단백질 수율을 초래했다. 이러한 결과는 이. 콜라이 추출물에서 다양한 복잡성의 막-결합 단백질을 농축시키는데 광범위하게 적용할 수 있으며, 특히 주문형 무세포 당단백질 합성의 확장에 큰 영향을 미칠 것이다.
적용
개시된 주제의 적용은 다음을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: (i) 무세포 추출물 내에 막-결합 성분의 농축; (ii) 추출물 내 막 단백질 활성의 선별; (iii) CFPS 생성물과 상호작용하기 위해 추출물 내의 막 단백질의 농축; (iv) 백신 및 당단백질 치료제의 주문형 생체제조를 위한 수율의 개선.
이점
개시된 주제의 이점은 다음을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: (i) CFPS 추출물에 존재하는 막 소포를 증가시키고; (ii) CFPS 추출물에서 막 결합 성분의 농도를 증가시키고; (iii) 추출물 가공 시간을 감소시키고, 이전에 사용된 방법보다 더 간단한 기기에서 수행될 수 있고; 및 (iv) 무세포 당화 시스템에서 당단백질 수율을 증가시킨다.
기술적 설명
본 발명자들은 원심력 중력가속도가 숙주 세포 배양액으로부터 제조된 무세포 추출물에 존재하는 막 소포의 농도에 영향을 미친다는 것을 확인하였다. 개시된 주제의 한 양태는 30,000×g의 원심분리를 사용하여 제조된 통상적으로 사용되는 S30 추출물 대신에, 12,000×g의 원심분리를 사용하여 제조된 S12 추출물이 추출물 내에 막 소포를 더 큰 농도로 포함한다는 예상치 못한 혁신이다. 막 소포가 농축된 S12 추출물은 무세포 당화 시스템 및 방법에서 상당한 유용성을 갖는다. 본 발명자들은 S12 추출물을 사용하여 무세포 당화가 60 % 초과로 향상될 수 있음을 밝혀내었다. 본 발명자들은 또한 놀랍게도 균질화 또는 초음파 용해 방법으로부터 소포가 제조될 수 있다는 것을 보여주었다. 개시된 기술은 추출물 가공 시간을 감소시키고, 이전에 사용된 방법보다 더 간단한 기기에서 수행될 수 있다.
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실시예 2 - 천연 막 소포의 특성화 및 농축에 의한 무세포 당단백질 합성의 개선
초록
미정제 세포 추출물로부터의 무세포 유전자 발현(CFE) 시스템은 세포 기능, 주문형 생체제조, 휴대용 진단 및 교육용 키트의 설계를 가속화하기 위해 많은 관심을 끌었다. 단백질 당화 등의 원하는 기능을 CFE 시스템에 부여할 수 있는 많은 필수적 생물학적 과정은 막-결합 성분의 활성에 의존한다. 그러나, 합성 막 모방체의 사용 없이, 박테리아 CFE 시스템에서 막-의존적 기능성을 활성화하는 것은 대체로 연구되지 않은 채로 남아 있다. 여기에서, 우리는 에스케리키아 콜라이-기반 CFE 추출물 내의 천연, 세포 유래 막 소포를 특성화하고 이종, 막-결합 기구로 소포를 농축시키는 방법을 설명함으로써 이 격차를 다룬다. 우리는 먼저 나노 특성화 기술을 사용하여 CFE 추출물 내의 지질 소포가 수십 내지 수백 나노미터이고, ~3×1012 입자/㎖ 정도임을 보여준다. 그런 다음, 우리는 용해 후-원심분리 등의 추출물 가공 방법이 CFE 시스템에서 막 소포의 농도를 조절하는데 어떻게 사용될 수 있는지를 결정한다. 이러한 방법을 조정함으로써, 우리는 소포 입자의 수를 ~7×1012 입자/㎖로 증가시키는 것은 용해 전에 발현된 이종 막 단백질 화물의 농도를 증가시키는데 사용될 수 있음을 보여준다. 마지막으로, 우리는 N-연결 및 O-연결 당단백질 합성을 개선하기 위해 막-결합 올리고당전이효소 및 지질-결합 올리고당을 농축시키는 방법을 적용한다. 우리는 우리의 발견이 막-의존적 활성을 필요로 하는 시험관내 유전자 발현 시스템을 촉진하고, 당조작에서 새로운 기회를 열 것이라고 기대한다.
서론
지질 막은 생명의 모든 영역에 걸쳐 생물학적 기능에서 중추적인 역할을 하며, 유전자의 ~20-30 %가 막 단백질을 암호화하고, 많은 필수적인 과정이 막 상에서 및 가로질러 일어난다1,2. 예를 들어, 막은 분자 수송, 면역학적 방어, 에너지 재생, 및 번역 후 단백질 변형에 필요하다. 무손상 세포 막의 부재에도 불구하고, 유기체의 미정제 추출물은 이러한 생물학적 현상의 일부를 재구성함으로써 다양한 시험관내 연구에서 유용한 것으로 입증되었다. 이것은 세포 용해 및 추출물 제조 동안 세포막의 단편화 및 재배열 시에 형성되는 막 구조의 존재로 인해 가능하다. 진핵생물-유래 무세포 유전자 발현(CFE) 시스템에서, 소포체(ER)-유래 마이크로솜은 기능성을 향상시켜 막 단백질, 이황화 결합을 갖는 단백질의 합성 및 단백질 당화를 가능하게 한다3-7. 진핵생물 ER 마이크로솜은 마이크로미터-규모 크기로 인해, 형광 현미경으로 품질 관리를 위해 일상적으로 특성화되어, 마이크로솜을 활용하는 다양한 시스템의 개발을 가능하게 하였다8-10. 유사하게, 이. 콜라이-유래 CFE 시스템에서, 전자 수송 사슬 기구를 보유하는 역막 소포는 산화적 인산화 및 ATP 재생을 활성화한다11,12. 전형적인 이. 콜라이 추출물 내의 소포는 생화학적 방법, 수크로스 분획화 및 인지질 정량을 사용하여 분석되었지만, 무손상, 세포-유래 소포를 셈하고 특성화하는 방법의 사용은 아직 추구되지 않았다13-15. 이는 부분적으로, 이. 콜라이 추출물 내의 소포가 나노 규모이고, 따라서 특성화를 위해 형광 현미경보다 더 고해상도의 기술이 필요하기 때문이다. 나노디스크, 합성 인지질 구조, 정제된 마이크로솜 및 정제된 소포 등의 외인성 막은 CFE 시스템16-21에서 막 생물학을 가능하게 하면서, 숙주로부터의 천연 막을 사용하는 것은 가공을 단순화하고 및 매력적인 대안이다. 따라서, 천연 소포를 분석하기 위한 특성화 작업흐름은 이. 콜라이 기반 CFE에서 막 결합 생물학의 적용을 가능하게 하는 기초적인 단계이다.
기술 르네상스는 최근 CFE 시스템을 분자 생물학 기술에서 널리 적용 가능한 생체생산 및 프로토타입 플랫폼으로 변형시켰고, 이. 콜라이 시스템이 선두에 있다4,22-27. 추출물 제조 및 반응 조건 최적화에 전념한 일련의 작업은 이. 콜라이 CFE 시스템22,28-30의 비용 및 성능을 단순화하고 진척시키고 개선했다. 최적화된 이. 콜라이 기반 CFE 반응은: (i) 배치 반응31-33에서 리터당 단백질 수 그램을 빠르게 합성하고, (ii) nL에서 100 L 규모로 규모확대가능하고34,35, 및 (iii) 수 개월 동안의 저장 안정성 및 관리 시점까지 유통을 위해 동결 건조가 가능하다6,22,29,36-41. 동결 건조된 CFE 시스템은 사용시점(point-of-use) 바이오센싱42-47, 치료 및 백신 생산38,39,48, 및 교육용 키트22,49-51에 이미 활용되어, 생명 공학에 파괴적인 영향을 미칠 태세이다.
증가하는 수의 맥락에서, CFE 추출물은 정제의 필요성을 피하면서, 세포 용해에 앞서 생체내에서 가용성, 이종 성분을 사전 농축함으로써 새로운 적용에 맞춰져 왔다. 예에는 부위 특이적 비정규 아미노산의 단백질로의 통합32,52,53, 분석물의 바이오센싱46,54,55, 및 귀중한 소분자의 생산을 위한 대사 경로의 조립26,56-58 을 포함한다. 그러나, CFE 시스템을 향상시키기 위한 막 통합 성분의 설계는 거의 연구되지 않은 상태로 남아 있다. CFE 시스템에서 막-결합 성분을 농축시키는 것은 강력한 응용을 가능하게 한다. 예를 들어, 막-결합 성분에 의해 매개되는 단백질 당화는 단백질 치료제 및 접합 백신의 무세포 생체제조에서 핵심적인 고려 사항이다. 우리는 최근 이종, 막-결합 당화 기구48가 농축된 추출물에서 규정된 당단백질의 원-포트 생체제조를 위한 플랫폼인 무세포 당단백질 합성(CFGpS)을 설명하였다. 현재까지, CFGpS는 모델 당단백질, 인간 당단백질, 및 접합 백신을 생산하는데 사용되었다39,48,59-61. 중요하게는, CFGpS 반응은 효과적인 백신을 만들기 위해, 저장 안정성을 위해 동결 건조될 수 있고 관리 시점에서 재수화될 수 있다39. CFGpS 활성은 막 결합 당화 성분에 의존하기 때문에, 추출물 내의 막 결합 성분을 특성화 및 품질-관리하는 방법은 앞으로 기술을 발전시키는데 있어 최우선이다.
이 연구에서, 우리는 추출물 내의 천연 막 소포의 크기 분포 및 농도를 특성화하여, CFE 시스템의 분석 및 조작을 위한 벤치마크를 제공한다. 우리는 상류 추출물 가공 단계가 소포 프로필에 미치는 영향을 조사하여, 추출물 내의 소포 농도를 조절하는 간단한 취급을 밝혀냈다. 우리는 합성-유래 막을 사용하지 않으면서, 천연 막 소포를 사용하여 추출물 내에서 다양한 이종, 막 결합 단백질 및 기질을 농축시킨다. 마지막으로, 우리는 우리의 발견을 적용하여 기존의 아스파라긴-결합(N-결합) CFGpS 시스템 및 세린/트레오닌-결합(O-결합) 당화를 기반으로 하는 새로운 막-의존성 CFGpS 시스템에서 당단백질 수율을 향상시킨다. 우리 연구의 의미는 당화를 넘어 확장되고, 막 관련 활성을 갖는 새로운 CFE 시스템을 조작하는데 적용할 수 있다.
결과
본 연구에서, 우리는 세포 용해 동안 세포막의 단편화 시에 형성되는 이. 콜라이-기반 CFE 시스템에서 막 소포를 특성화하는 것을 목표로 했다. 이어서, 우리는 이 지식을 사용하여 규정된 기능을 향상시키기 위해 막 결합 성분의 농축을 제어하고자 했다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 우리는 (i) 이. 콜라이 추출물에서 막 소포의 크기 및 양을 결정하기 위해 나노 특성화 기술을 사용하고; (ii) 추출물 가공이 추출물 내 소포의 농축을 어떻게 제어할 수 있는지를 결정하고; (iii) 소포를 통해 추출물의 수 개의 이종, 막 결합 성분을 농축시키고; 및 (iv) 막 결합 성분의 농축이 N- 및 O-결합 당화를 위한 무세포 당단백질 합성 시스템을 개선함을 입증한다.
CFE 추출물 내의 막 소포의 특성화. 초기에, 우리는 소포의 크기를 분석하고 CFE 추출물에서 이러한 입자를 시각화하기 위해 여러 나노 특성화 기술을 사용했다. 미정제 추출물의 동적 광 산란(DLS) 분석은 두 개의 주요 피크를 나타냈다. 하나는 ~20 ㎚에서 최대 강도를 갖는 더 좁은 피크이고, 다른 하나는 ~100-200 ㎚에서의 더 넓은 피크이다(도 1a). 20 ㎚ 피크는 조립된 20 ㎚ 이. 콜라이 리보솜62을 포함하여 작은 세포 유래 입자를 나타내며, 이는 우리의 추출물에서 활성인 것으로 확인되었다(도 5). 우리는 ~100-200 ㎚ 피크에서 측정된 입자가 소포인 것으로 가정했다. 추출물에서 검출된 입자의 예시는 도 1b에 도시되어 있다. 리보솜 및 기타 세포 입자 없이 막 소포를 직접 분석하기 위해, 우리는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)63-65를 통해 막 입자를 식별 및 정제했다(도 6a). 정제된 막 소포의 DLS 분석은 우리의 미정제 추출물의 DLS 흔적으로부터의 제안된 소포 피크와 직접적으로 중첩되는 강도 입자 크기 분포(PSD)를 밝혀내었다(도 1a). 용액에서 나노입자의 크기를 정하고 정량하는 독립 방법인 나노입자 추적 분석(NTA)은 118.5±0.7 ㎚의 평균 정제 소포 직경을 밝혀내어, DLS로 측정된 크기 범위를 확증한다(도 6b). 정제된 소포의 제타 전위는 -14.5±-1.0 ㎷였으며, 이는 인지질 소포와 일치하는 음의 입자 표면 전하를 나타낸다(도 6c). 추출물의 저온-전자 현미경(cryo-EM)은 작은(≤20 ㎚) 입자 및 소포 형태와 일치하는 기타 더 큰 원형 입자를 나타내었다(도 1c). 추출물의 저온-전자 현미경 사진은 크기가 ~40 ㎚ 및 ~150 ㎚ 사이인 소포를 밝혀내었고, 형태는 SEC 정제 전 및 후에 일관되었다(도 1c-1d). 측정치 간의 비교는 용액 내 대량 측정인 DLS가 소포 직경을 과대평가한다는 것을 밝혀낸다. 그러나 DLS는, 소포보다 작고 NTA 검출 크기 한계 미만인 50 ㎚ 미만의 입자(리보솜 포함)를 검출할 수 있기 때문에, 미정제 추출물 입자 프로필을 신속하게 특성화하는데 유용한 도구이다. 종합하면, 이러한 결과는 미정제 추출물의 입자 프로필을 보여주고, 소포가 다분산이고 전반적으로 수십 내지 수백 ㎚ 정도이며 리보솜 및 기타 작은 복합체에 비해 농도가 상대적으로 낮다는 것을 밝혀낸다.
추출물 가공은 소포 크기 분포 및 농도에 영향을 미친다. 추출물에서 어떻게 막 소포를 제어하는지를 이해하기 위해, 우리는 다음으로 추출물을 처리하는 프로토콜이 어떻게 소포 특성에 영향을 미치는지를 연구했다. 구체적으로, 용해 동안 세포 막이 파열되고 원심분리가 입자 분리를 지시하기 때문에, 우리는 세포 용해 및 추출 원심분리를 연구했다. 우리는 표준 초음파 처리(세포 현탁액 부피당 일정한 입력 에너지) 또는 균질화 프로토콜(~20,000 psig)28,48을 사용하여 세포를 용해한 다음, 용해물을 전통적인 30,000×g 원심분리 프로토콜('S30 제조'라고 명명됨) 또는 최대 원심분리 속도가 12,000×g인 더 낮은 중력가속도의 프로토콜('S12 제조'라고 명명됨)(도 2a)28,29에 적용하였다. 용해 및 원심분리 프로토콜의 이러한 조합은 4 개의 별개의 추출물 조건을 생성했으며, 이들 모두는 표준 CFE 반응 조건에서 단백질 합성에 대해 활성이었다(도 7a). 전술한 우리의 원-포트 무세포 당단백질 합성 플랫폼에 사용된 추출물뿐 아니라 도 1에 사용된 추출물이 이러한 조건으로 제조되었기 때문에, 표준 균질화 및 S30 제조의 조합은 기본 사례를 나타낸다.
시험된 조건 중에서, 원심분리 프로토콜이 소포 농도에 가장 큰 영향을 미쳤다. 우리는 양쪽 용해 방법 모두에 대해 S12 추출물에서 유의하게 더 많은 수의 소포를 관찰했다. 특히, 우리는 초음파 처리된 및 균질화된 S12 추출물에서, 각각 소포의 1.2배 및 2.0배 농축을 관찰했다(도 2b). 균질화된 S12 추출물은 6.5±0.8×1012 입자/㎖로 가장 높은 농도의 소포(기본 사례의 3.4±05×1012 입자와 비교하여)를 포함하여, 이는 소포 농축을 위한 가장 유망한 조건이 되었다.
원심분리가 소포 농도에 영향을 미치는 반면, 용해 방법은 소포 크기에 영향을 미쳤다. 초음파 처리된 추출물은 원심분리 프로토콜에 관계없이, 균질화된 추출물보다 더 좁은 크기 분포를 가진 더 작은 소포를 포함했다. 용해 방법이 소포 크기에 영향을 미친다는 우리의 관찰은 인지질(또는 일반적으로 양친매성 물질)을 분산시키기 위한 다양한 실험 매개변수가 소포 크기에 영향을 미친다는 것을 보여주는 연구와 일치한다66. 초음파 처리된 추출물의 PSD는 ~110 ㎚에서 단일 최대값에 도달했고, ~130 ㎚의 평균 입자 직경을 가지며; 균질화된 추출물은 ~160 ㎚의 더 높은 평균 입자 직경을 갖고, ~120 ㎚에서 뚜렷한 피크, ~150 ㎚에서 상당한 숄더 피크를 나타내었다(도 2c-2d, 도 8a). 균질화된 PSD는 복수의, 별개의 소포 집단의 존재를 나타낼 수 있다(도 2c-2d). DLS 측정은 초음파 처리된 추출물이 균질화된 추출물보다 상대적으로 더 작고 덜 다분산된 소포를 포함한다는 관찰을 확인시켜주었다(도 8b-8c). 특히, 추출물에서의 직접적인 소포 분석은 이전에는 접근할 수 없었던 방식으로 추출물 가공의 영향을 측정할 수 있게 하고, 추출물의 무손상 소포 농도에 대한 벤치마크를 제공한다.
이종 막 결합 화물은 막 소포를 통해 제어 가능하게 농축될 수 있다. 천연 소포의 특성 및 농도에 대한 더 나은 이해와 함께, 우리는 이. 콜라이의 주변 세포막에서 유래된 이종 화물을 포함하는 소포로 추출물을 농축시키려고 노력했다. S12 추출물은 S30 추출물보다 더 높은 농도로 소포를 포함하고 있기 때문에, 우리는 S12 추출물이 관련 이종 화물을 더 높은 농도로 포함할 것이라고 가정했다. S12 및 S30 제조 사이의 소포 농도의 가장 높은 동적 범위는 균질화로 관찰되었고, 따라서 우리는 농축 실험을 위해 균질화를 진행했다(도 2b). 우리는 농축을 시험하기 위해 다양한 크기, 막횡단 위상학, 생물학적 기능 및 분류학적 기원의 6 개의 막 결합 단백질을 과발현했다: PglB, 캄필로박터 제주니, 유니프롯 ID Q5HTX9; PglO, 네이세리아 고노레아에(Neisseria gonorrhoeae), 유니프롯 ID Q5FA54; NarX 에스케리키아 콜라이, 유니프롯 ID P0AFA2; 프로테오로돕신, 미배양 해양 감마 프로테오박테리움 EBAC3108, 유니프롯 ID Q9F7P4; 칸나비노이드 수용체 1(CB1), 호모 사피엔스(Homo sapiens), 유니프롯 ID P21554; 및 STT3D, 리슈마니아 메이저(Leishmania major), 유니프롯 ID E9AET9. 농축을 위해 선택된 단백질에는 당화 효소(PglB, PglO, STT3) 및 신호 전달/감지 단백질(NarX, PR, CB1)을 포함하여, CFE에서 새로운 기능성을 가능하게 할 수 있는 단백질의 부류가 포함된다. 우리는 C-말단 FLAG 태그로 생체 내에서 각 막 단백질을 발현하고, S30 및 S12 추출물을 제조한 다음, 정량적 웨스턴 블롯팅을 사용하여 과발현된 막 단백질의 농도를 분석했다. 우리는 4배 농축을 관찰한 PR 이외의 모든 단백질에 대해, S30 추출물에 비해 S12(S12/S30)에서 2배의 막 단백질 농축을 관찰했다(도 3a-3b). 대조군으로서, 막횡단 나선이 없는 sfGFP가 생체내에서 발현되었을 때, 우리는 유의한 S12/S30 농축을 관찰하지 못했다(도 3c). 도 3a-3c에 대한 전체 블롯은 도 9에 나와 있다. 특히, 블로팅을 통해 수득된 농축 값은 과발현이 없는 균질화된 S12 및 S30 추출물에서 NTA를 통해 관찰된 2배 소포 농축과 밀접하게 상응한다(도 2b). 사전 농축된 막 단백질을 갖는 모든 추출물은 단백질 합성 활성을 나타냈다(도 7b).
다음으로, 우리는 당화를 위한 핵심적인 효소인 PglB 및 PglO가 용액 내 자유로운 것과는 대조적으로, 막 소포와 연관되어 있음을 확인하였다(도 3d). 사전 농축된 PglB 또는 PglO를 갖는 추출물은 녹색 형광 α-FLAG 항체로 탐침된 다음, SEC를 통해 분석되었다. 형광 크로마토그램은 도 3d에 나와 있으며, 특징적인 소포 용리 분획은 회색으로 강조되어 있다(도 6a). 특징적인 소포 용리 피크는 PglB 또는 PglO를 포함하는 추출물의 경우의 녹색 형광에 해당하고, 과발현된 막 단백질이 없는 추출물에서는 상응하는 피크가 관찰되지 않았다(도 3d). 우리의 결과는 이종, 주변 막 화물이 추출물이 미리 농축되고 소포를 통해 조정될 수 있음을 보여준다.
소포 농도의 증가는 N- 및 O-연결 당화 시스템에 대한 무세포 당단백질 합성(CFGpS)을 향상시킨다. 우리는 다음으로 하나의 적용에서 이종 화물을 담고 있는 소포를 농축시키는 능력을 활용하기 시작했다. 당화가 세포 기능, 인간 건강 및 생명공학에서 중요한 역할을 하기 때문에, 우리는 단백질 당화에 초점을 맞췄다. 모델로서, 우리는 더 높은 농도의 막 결합 당화 기구를 포함하는 S12 추출물로 반응을 채움으로써 이전에 보고된 CFGpS 플랫폼48에서 당단백질 수율을 증가시키려고 노력했다. 우리는 캄필로박터 제주니로부터의 모델 N-연결된 당화 경로를 과발현하는 균주로부터 S30 및 S12 추출물을 제조했고, 이는 당화를 촉매하는 막 결합 올리고당 전이효소(OST) PglB 및 운데카프레닐피로포스페이트-연결 공여자67로부터의 하기 형태의 지질-결합 올리고당(LLO) 공여자를 포함한다: GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,4-(Glcβ1,3)-GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,3-Bac(여기서 Bac는 2,4-디아세트아미도-2,4,6-트리데옥시글루코피라노스임). CFGpS 추출물의 NTA 및 웨스턴 블롯 분석은 소포의 2.5배 S12/S30 농축 및 PglB의 상응하는 2배 S12/S30 농축을 밝혀냈다(도 10). 형광 염색 및 SEC 분석은 소포 내 LLO 및 PglB의 존재를 확인하였다(도 11a).
무세포 당단백질 합성에 대한 농축된 소포의 영향을 평가하기 위해, 우리는 두 단계로 반응을 수행했다(도 4a, 삽입)39. 먼저, 수용체 단백질의 무세포 단백질 합성(CFPS)을 'CFPS 시간'으로 명명된, 규정된 시간 동안 실행했다. CFPS 시간에, 반응은 MnCl2로 스파이크되어, CFPS를 식히고, OST에 그의 Mn2+ 보조인자를 제공함으로써 당화를 개시했다. S30 또는 S12 추출물로 채워진 CFGpS 반응은 His-태그된 sfGFPDQNAT 수용체 단백질을 사용하여, 2, 10, 20, 30 및 60 분의 CFPS 시간 동안 실행되었으며, 여기서 DQNAT는 허용 가능한 PglB 시퀀이다. 종점 당단백질 수율은 웨스턴 블롯에 의해 결정된 총 수용체 단백질 형광 및 % 당화를 사용하여 정량화되었다(도 4a, 도 12a-12d). 더 긴 CFPS 시간에서 우리는 S12 추출물이 S30 추출물보다 상당히 더 많은 당단백질을 생산한다는 것을 관찰했다. S30 및 S12 반응에 대한 총 수용체 단백질 농도는 각 CFPS 시간에 대해 유사했기 때문에(도 12e), S12 추출물에서 증가된 당단백질 수율은 더 높은 CFE 수율이 아닌, 더 높은 당화 활성으로부터 기인한다. 구체적으로, 20 분, 30 분 및 60 분 CFPS 시간에서, 우리는 S12 반응에서 당단백질 수율의 각각 66 %, 85 % 및 90 % 증가를 관찰했다. 60 분 CFPS 시간에서, S12 반응은 배치에서 117.2±9.9 ㎍/㎖를 산출했으며, 우리가 아는 한 처음으로 수백 ㎍/㎖ 정도의 당단백질 역가를 합성했다. (도 4a). S12 반응은 또한 상당히 더 높은 말단 % 당화, 또는 16-시간 당화 반응의 종료 시에 당화된 CFPS 유래 수용체 단백질의 백분율을 가졌다. 이것은 시험된 모든 CFPS 시간에 대해 사실이었다(도 12f). 예를 들어, 20-분 CFPS 시간의 반응에서, 우리는 S30 반응의 경우 51 % 당화로부터 S12 반응의 경우 82 % 당화로의 증가를 관찰했다(도 4b). 대표적인 반응의 α-His(당화된 및 비당화된 수용체 단백질을 나타냄) 및 α-글리칸(씨. 제주니 글리칸에 대항함) 웨스턴 블롯이 도 4c에 도시되어 있다. 종합하면, 이러한 결과는 S12 추출물에서 더 높은 소포 농도의 존재가 CFGpS에 측정 가능한 영향을 갖고, 당단백질 수율 및 종점 % 당화를 개선시킨다는 것을 나타낸다.
무세포 시스템에서 다양한 당단백질 합성에 대한 장기적인 관심으로, 우리는 다음으로 광범위한 글리칸 특이성을 갖는 것으로 공지된 O-연결된 당화 시스템을 CFGpS 플랫폼61,68,69에 이식했다. 우리는 씨. 제주니 헵타사카라이드 LLO를 공여자로서 받아들이지만 수용체 서열 선호도가 PglB와 상이한70, 네이세리아 고노레아에로부터의 O-OST PglO를 선택했다. 도 4b 및 도 4d 삽입은 각각 PglB 및 PglO에 대한 시퀀을 도시한다. PglO의 경우, 우리는 최근에 결정된 8 개의 아미노산 최소 최적 O 연결 인식 부위('MOOR'라고 명명된다)70를 포함하는 sfGFP-융합 수용체 단백질을 사용했다. 우리는 잔기 특이적 O-연결된 당화 및 소포에서 PglO 및 LLO의 농축을 확인했다(도 13, 도 11b). PglB-매개 CFGpS에서와 같이, 우리는 S12 추출물로 채워진 반응에서 종점 당단백질 수율 및 % 당화의 증가를 관찰했다. 구체적으로, 20 분의 CFPS 시간을 사용한 반응은 S30 추출물을 포함한 것과 비교하여, S12 추출물과의 반응에서 당단백질 수율이 68 % 증가하고 당화가 27 %에서 40 %로 증가하는 결과를 초래했다(도 4d, 도 14). 상응하는 블롯은 도 4e 및 도 14a-14b에 도시되어 있다. 종합하면, 이러한 결과는 S12 추출물의 당화 개선이 N-연결된 당화 시스템에서 O-연결된 당화 시스템으로 이동함을 나타낸다.
토의
본 연구에서, 우리는 기능성을 확장하고 향상시키기 위해 CFE 추출물 내에서 단백질이 농축된 소포를 벤치마킹하고, 이해하고, 및 품질 관리하는 것을 제시한다. 우리는 상류 추출물 가공이 주변 세포질로부터의 소포 및 관련 화물의 농도를 조정하는데 사용될 수 있음을 보여주었다. 이어서, 이 지식을 적용하여 무세포 당단백질 합성을 개선하였다. 우리의 결과는 몇 가지 주요 특징을 갖는다.
첫째, 여기에 사용된 나노 특성화 도구를 사용하여 CFE 추출물 내의 무손상 소포 수 및 크기를 정량화할 수 있었다. 이것은 이러한 지식이 무세포 시스템에서 그들의 관련 단백질 화물로부터의 소포 농도 및 기능을 향상시키기 위한 설계 규칙을 알려주기 때문에 중요하다. 특히, NTA 측정(~0.3 ㎡ 막/㎖ 추출물)으로부터 계산된 유효 소포 표면적은 유사한 추출물의 인지질 농도로부터 계산된 값과 일치한다15.
둘째, 우리의 결과는 이. 콜라이 기반 CFE 시스템의 분야 전체 관찰 및 한계에 대한 통찰을 제공한다. 예를 들어, 용해 프로토콜이 CFE 생산성71에 지대하게 영향을 미칠 수 있다는 것은 널리 문서화되어 있다. 우리의 발견은 용해 방법이 산화적 인산화 및 ATP 재생에 필요한 기구의 막 환경에 영향을 미치는 이 단계 동안 생성된 소포의 크기 분포에 영향을 미친다는 것을 보여준다. 소포는 CFE의 산화적 인산화로부터 비용 효율적인 에너지 대사를 활성화하는데 핵심이기 때문에, 일상적인 소포 특성화는 중요한 품질 관리 검사가 될 수 있으며, 이는 실험실 내에서 및 사이에서 재현성의 향상으로 이어질 수 있다72. 우리의 결과는 또한, 이. 콜라이 CFE 시스템 내에 소포의 존재에도 불구하고, CFE 유래 막 단백질이 추가적인 소포 보충 없이 천연 소포 내의 삽입을 통해 합성될 수 없는 이유에 대한 통찰을 제공한다12,19,21. CFE 반응에서 ~6 ㎚의 무손상 소포(NTA 측정으로부터 추정됨)의 경우, 소포의 농도는 CFE 추출물에서 생성된 전형적인 단백질 역가(~30 μM의 리포터 단백질 이상)보다 수십 배 더 낮다.
셋째, 우리의 연구는 농축된 막 결합 성분에 의존하는 공학 시스템에 대한 문을 열어 준다. 우리는 주변 세포질에서 생체내에서 발현되는 막 결합 단백질 및 지질-결합 올리고당이 소포에 농축될 수 있음을 보여주며, 이는 소포 집단이 주변 세포질 막으로부터 유래됨을 나타낸다73,74. 전형적인 S30 추출물에서의 외막 및 내막 단백질 모두의 단백질체 식별 및 이. 콜라이 추출물에서의 내독소의 존재에 기초하여75, 우리는 소포의 다수의 방향 및 구성(예를 들어, 내부/외부 및 내막/외막)이 존재할 수 있음을 가정하였다. 이러한 세부 사항을 분석하는 것은 향후 특성화를 필요로 한다. 또한, 우리의 작업 흐름은 막 특성(예를 들어, 조성, 크기, 유동성, 곡률)을 변경하거나 변화시키는 첨가제와 쉽게 상호작용하여, 용해 완충액에 첨가되어 재조합 효소 활성을 추가로 개선하기 위해 소포의 생물물리학적 특징을 조정할 수 있다19. 그리고, 우리는 여기에서 이. 콜라이 기반 시스템에 전적으로 초점을 맞추고 있지만, 보고된 특성화 방법은 원칙적으로, 당화를 수행하고 신생 막 단백질을 매립시키고, 기타 막 의존적 기능을 수행하기 위해, ER-유래 마이크로솜에 의존하는 곤충 및 CHO 기반 CFE 시스템을 추가로 최적화하도록 확장될 수 있다.
앞으로 살펴보면, 우리는 우리의 연구가 당단백질 등의, 막 의존적 변형을 필요로 하는 단백질을 제조하기 위한 노력을 가속화할 것으로 기대한다. 예를 들어, 설명된 접근 방식은 >100 ㎍/㎖ 초과의 N-연결된 당단백질 합성 수율을 가능하게 하며, 이는 자원이 제한된 환경에서 주문형 백신 생산에 대한 접근성을 높인다. 또한, S12 제조는 고속 원심분리기를 필요로 하지 않으며 기본 사례보다 덜 시간 집약적이므로, CFGpS 플랫폼을 단순화한다. 종합하면, 우리의 결과는 시스템 기능성을 확장하고 다양한 합성 생물학 응용을 가능하게 하기 위해 막 결합 활성을 필요로 하는, 효율적이고 접근 가능한 CFE 시스템을 위한 길을 열어준다.
방법
추출물 제조. 모든 추출물에 사용된 섀시 균주는 CLM2448이었다. 공급원 균주는 37 ℃에서 1 L의 2xYTPG 배지에서 교반하면서 성장시켰다. 세포를 OD 3까지 성장시킨 다음 원심분리(5000×g, 4 ℃, 15 분)에 의해 수확했다. 생체내 단백질의 과발현을 위해, CLM24 공급원 균주를 적절한 항생제(들)와 함께 2xYTPG에서 37 ℃에서 성장시켰다. 세포를 OD 0.6-0.8에서 0.02 %(w/v%) L-아라비노스로 유도하고, 30 ℃로 이동시키고, OD 3에서 수확했다. 달리 명시되지 않는 한, 모든 후속 단계는 4 ℃ 및 얼음에서 수행되었다. 펠렛화된 세포를 S30 완충제(10 mM 트리스 아세테이트 pH 8.2, 14 mM 아세트산 마그네슘, 60 mM 아세트산 칼륨)에서 3회 세척하였다. 마지막 세척 후, 세포를 7000×g에서 10 분 동안 펠릿화하고 급속 동결하고 -80 ℃에서 저장했다. 성장 및 수확 후, 세포를 해동하고 습윤 세포 질량 그램당 1 ㎖의 S30 완충제에서 균질하게 재현탁시켰다. 균질화를 위해, 아베스틴 애멀시플렉스(Avestin EmulsiFlex)-B15 고압 균질화기를 20,000-25,000 psig에서 단일 통과(아베스틴, 인크.(Avestin, Inc.), 캐나다 온타나주 오타와)를 사용하여 세포를 파괴했다. 초음파 처리의 경우, 입력 에너지는 상기에서 설명한 바와 같이28 경험적 상관 관계를 사용하여 계산되었다. 20 ㎑의 주파수 및 50 % 진폭에서 3.175 ㎜ 직경 탐침이 있는 Q125 초음파 처리기(큐소니카(Qsonica), 코네티컷주 뉴타운)를 사용하여 세포를 얼음 상에서 초음파 처리했다. 에너지는 목표 에너지가 전달될 때까지 45 초의 펄스 후 59 초 꺼짐으로 세포에 전달되었다. 세포를 삼중으로 용해하고 정화하였다. S30 제조를 위해 용해된 세포를 30 분 동안 30,000×g에서 두 번 원심분리했고; 각 회전에 대해 상층액을 새로운 튜브로 옮겼다. 유출 반응을 위해 상층액을 37 ℃에서 60 분 동안 250 rpm으로 진탕하면서 인큐베이션했다. 유출 후, 용해물을 15 분 동안 15,000×g에서 원심분리했다. 상층액을 수집하고, 분취하고, 급속 동결하고, 추가 사용을 위해 -80 ℃에 저장했다. S12 제조를 위해 용해된 세포를 10 분 동안 12,000×g에서 한 번 원심분리했고; 상층액을 수집하고 상기에서 설명한 바와 같이 유출 반응을 거쳤다. 유출 후, 용해물을 4 ℃에서 10 분 동안 10,000×g로 원심분리했다. 상층액을 수집하고, 분취하고, 액체 질소에서 급속 동결하고, -80 ℃에서 저장했다.
동적 광 산란(DLS) 및 나노입자 추적 분석(NTA) 측정. DLS 측정은 일회용 큐벳(말번 인스트러먼츠 엘티디.(Malvern Instruments Ltd.), 영국 ZEN0040)에서 173 °의 측정 각도로 제타사이저 나노(Zetasizer Nano) ZS(말번 인스트러먼츠 엘티디., 영국) 상에서 수행되었다. 모든 측정은 측정당 13회 스캔에 대해 삼중으로 수집되었다. 굴절률 및 점도는 기기의 매개변수 라이브러리로부터 수득되었다. 기기의 '범용' 설정이 강도 및 수 입자 크기 분포를 계산하기 위해 사용되었다. 미정제 추출물의 DLS의 경우, 추출물을 분석 전에 0.1 ㎛ 여과된 PBS로 1:10 희석했다. 정제된 소포 샘플의 경우, 희석 없이 용리를 직접 분석했다.
NTA 측정은 642 ㎚ 적색 레이저를 사용하여 나노사이트(Nanosight) NS300(말번 인스트러먼츠 엘티디., 영국) 상에서 수행되었다. 희석 인자 및 측정된 농도 사이의 선형 추세가 발견될 때까지 샘플을 멸균 PBS에서 제조업체-권장 입자 농도로 희석했다. 샘플을 셀 내로 유동시키고, 제조업체 권장사항에 따라 기기의 초점을 맞췄다. 1 ㎖ 주사기 및 30(임의 단위)의 주사기 펌프 주입 속도를 사용하여 실온에서 측정치를 수집했다. 각 샘플에 대한 데이터는 연속 유동 조건 하에서 5개의 별개의 1 분 비디오로 수집되었다. 입자 직경 산술평균 및 입자 농도는 각 실행의 집계 나노사이트 실험 보고서로부터 수득된 다음, 삼중으로 평균을 내고 희석 계수에 대해 보정했다.
투과 전자 현미경. 저온-TEM 측정을 위해, 레이스형 탄소 막(EMS Cat. # LC200-CU)을 갖는 200 메쉬 Cu 그리드를 펠코 이지글로우(Pelco easiGlow) 글로우 방전기(테드 펠라 인크.(Ted Pella Inc.), 미국 캘리포니아주 레딩)에 넣고 0.24 mbar의 압력에서 15 ㎃의 전류로 30 초 동안 그리드 표면 상에 대기 플라즈마를 도입했다. 이러한 처리는 탄소 막 상에 음전하를 생성하여, 수성 액체 샘플이 그리드 상에 고르게 퍼질 수 있도록 한다. 4 ㎕의 샘플을 그리드 상에 피펫팅하고, +0.5 ㎜의 블롯 오프셋으로 5 초 동안 블롯한 후, FEI 비트로봇 마크(Vitrobot Mark) III 플런지 동결 기기(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), 미국 매사추세츠주 월섬) 내에서 액체 에탄 내로 즉시 빠트렸다(plunge). 이어서, 저장을 위해 그리드를 액체 질소로 옮겼다. 제올(JEOL) JEM1230 LaB6 방출 TEM(제올 유에스에이, 인크.(JEOL USA, Inc.), 매사추세츠주 피바디) 120 keV에서 관찰하면서, 빠트려져-동결된 그리드는 가탄 크리오 트랜스퍼 홀더 모델(Gatan Cryo Transfer Holder model) 626.6(가탄 인크.(Gatan Inc.), 미국 캘리포니아주 플레전턴) 내에서 -172 ℃에서 유리질로 유지되었다. 이미지 데이터는 가탄 오리우스(Gatan Orius) SC1000 CCD 카메라 모델 831(가탄 인크., 미국 캘리포니아주 플레전턴)에 의해 수집되었다. 이미지 분석은 이미지(Image) J를 사용하여 수행되었다.
웨스턴 블롯팅 및 농도계 분석. SDS-PAGE는 MOPS-SDS 완충제(써모 피셔 사이언티픽, 미국)와 함께 NuPAGE 4-12 % 비스-트리스 단백질 젤을 사용하여 실행되었다. 전기 영동 후, 단백질은 제조업체의 프로토콜에 따라, 젤로부터 이모빌론(Immobilon)-P 폴리비닐리덴 디플루오라이드 0.45 μm 막(밀리포어(Millipore), 미국)으로 옮겨졌다. 막은 오디세이(Odyssey) 또는 인터셉트(Intercept) 차단 완충제(LI-COR, 미국)에서 차단되었다. 막 단백질의 α-FLAG 블롯은 1차로서 α-FLAG 항체(압캠(Abcam) 2493)를 사용하여 탐침되었다. α-His 블롯은 1차로서 6xHis 항체(압캠, ab1187)를 사용하여 탐침되었다. α-글리칸 블롯의 경우, 천연 씨. 제주니 글리칸에 결합하는 토끼의 hR6 혈청을 1차 탐침20으로서 사용했다. 형광 염소 α-토끼 IgG IRDye 680RD(LI-COR, 미국)를 모든 블롯에 대해 2차로서 사용했다. 블롯은 LI-COR 오디세이 Fc(LI-COR 바이오사이언시즈(Biosciences), USA)를 사용하여 이미지화되었다. 밀도 측정은 밴드 강도를 측정하기 위해 이미지 스튜디오 라이트(Image Studio Lite) 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 밴드 강도를 결정하기 전에 블롯으로부터 형광 배경을 뺐다. 막 단백질 농축(S12/S30)을 결정하기 위해, 3 개의 독립적인 S12 추출물 복제 및 3 개의 독립적인 S30 복제에 대한 막 단백질의 밴드 강도를 각 단백질에 대해 측정했다. 삼중 비율(S12/S30)의 반올림 평균 및 관련 오류는 도 3에 농축으로서 보고된다. CFGpS 반응으로부터의 당단백질 수율을 결정하기 위해, 당화된 및 비당화된 밴드에 대한 밴드 강도는 독립적인 삼중 반응으로부터 수득되었다. 당화된 단백질의 분율 및 관련 표준 편차는 밴드 강도를 통해 계산되었다. 당단백질 수율을 수득하기 위해, 당화된 평균 분획에 하기 설명된 sfGFP 형광으로부터 계산된 평균 총 단백질 수율을 곱했다.
소포의 지질 염료 염색 및 형광 면역염색. 면역염색 및 SEC에 사용된 모든 시약은 0.1 ㎛ 필터(밀렉스-VV 시린지 필터(Millex-VV Syringe Filter), 머크 밀리포어 엘티디.(Merck Millipore Ltd.) 또는 래피드-플로우 필터(Rapid-Flow Filter), 날진(Nalgene))로 멸균 여과되었다. 소포 용리 분획을 결정하기 위해, 수용액 내에서 낮은 형광을 갖고 막에 결합하면 밝게 형광을 띠는 친유성 스티렌 염료인, FM 4-64 지질 염료(라이프 테크놀로지스(Life Technologies))로 추출물을 탐침했다. FM-464 염료는 이. 콜라이의 내막을 우선적으로 염색하지만, 외막을 염색하기 위해서도 사용되었다76,77. FM 4-64 지질 염료는 100 % DMSO 중에서 10 ㎎/㎖의 원액으로 제조된 다음, 사용 전에 뉴클레아제 무함유 물에서 1,000배 희석되었다. 80 ㎕의 추출물, 10 ㎕ 10x PBS 및 10 ㎕의 FM 4-64를 1 ng 염료/㎕의 최종 농도로 혼합했다. 샘플을 SEC 전에 37 ℃에서 10 분 동안 암실에서 염료와 함께 인큐베이션했다. 소포 내 당화 성분의 존재를 확인하기 위해, 우리는 씨. 제주니 LLO67에 특이적으로 결합하는 단백질 복합체인 적색 형광 대두 응집소(SBA) 렉틴을 사용하여 LLO를, 및 상기 설명한 바와 같은 독립 녹색 형광 α-FLAG 항체를 사용하여 PglB를 탐침했다. α-FLAG 면역염색 및 SBA 염색을 위해, 90 ㎕ 추출물 및 10 ㎕의 10xPBS를 2 ㎕의 α-FLAG-DyLight 488(인비트로젠(Invitrogen), MA191878D488) 및 4 ㎕의 SBA-알렉사플루오르™(AlexaFluor™) 594(인비트로젠, 32462)와 혼합했다. 항체 및 SBA를 SEC 전에 4 ℃에서 밤새 교반하면서 암실에서 추출물과 함께 인큐베이션하였다.
소포의 크기 배제 크로마토그래피(SEC). 100 ㎕의 추출물 혼합물(지질 염료 또는 항체로 염색됨)을 PBS가 있는 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 유동시켰다. 길슨(Gilson) FC 204 분획 수집기(길슨, 인크.(Gilson, Inc.), 미국)를 사용하여 0.4 분/웰의 속도로 투명한 폴리스티렌 96-웰 플레이트(코스타(Costar) 3370, 코닝 인크.(Corning Inc.), 미국)에 용리 분획을 수집하였다. 폴리-프렙(Poly-Prep) 크로마토그래피 컬럼(바이오-래드(Bio-Rad), 미국)에 8 ㎖의 세파로스(Sepharose) 4B 수지 45-165 ㎛ 비드 직경(시그마 알드리치(Sigma Aldrich), 미국)을 팩킹하고, 사용하기 전에 멸균 PBS로 3회 세척했다. 용리 형광은 시너지(Synergy) H1 마이크로플레이트 판독기(바이오텍(Biotek), 미국)를 사용하여 측정하였다. SBA-알렉사플루오르™ 594의 여기 및 방출 파장은 각각 590 및 617 ㎚였다. a-FLAG-디라이트(DyLight) 488의 여기 및 방출 파장은 각각 493 및 528 ㎚였다. FM 4-64 지질 염료로 염색된 소포를 사용하여 특징적인 소포 용리 분획을 결정했다. FM 4-64로 탐침된 참조 샘플을 사용하여 각 실험에서 특징적인 소포 용리 분획을 결정했다. 플롯의 경우, 각 곡선은 배경을 빼고 각각의 형광 용리 프로필에 대해 측정된 최대 RFU로 정규화되었다.
CFE 반응. 단백질 합성은 삼중 반응으로, 변형된 PANOx-SP 시스템에 의해 수행되었으며, 각 반응은 고유하게 제조된 추출물을 포함한다71. 구체적으로, 1.5 ㎖ 미세원심분리 튜브(액시젠(Axygen), MCT-150-C)에 200 ng pJL1-sfGFP 플라스미드, 30 %(v/v%) 추출물 및 하기를 포함하는 15 ㎕ 반응물을 채웠다: 6 mM 글루탐산 마그네슘(시그마, 49605), 10 mM 글루탐산 암모늄(MP, 02180595), 130 mM 글루탐산 칼륨(시그마, G1501), 1.2 mM 아데노신 트리포스페이트(시그마 A2383), 0.85 mM 구아노신 트리포스페이트(시그마, G8877), 0.85 mM 우리딘 트리포스페이트(시그마 U6625), 0.85 mM 시티딘 트리포스페이트(시그마, C1506), 0.034 ㎎/㎖ 폴린산, 0.171 ㎎/㎖ 이. 콜라이 tRNA(로슈(Roche) 10108294001), 각각 2 mM의 20개 아미노산, 30 mM 포스포에놀피루베이트(PEP, 로슈 10108294001), 0.4 mM 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(시그마 N8535-15VL), 0.27 mM 조효소-A(시그마 C3144), 4 mM 옥살산(시그마, PO963), 1 mM 푸트레신(시그마, P5780), 1.5 mM 스페르미딘(시그마, S2626), 및 57 mM HEPES(시그마, H3375). 추출물 CFE 생산성을 측정하기 위해 30 ℃에서 20 시간 동안 반응을 수행하였다.
GFP 형광 검정. 무세포-유래 sfGFP의 활성은 상기에 설명한 바와 같이 추출물-내 형광 분석을 사용하여 결정되었다48. 간단히 말해, 2 ㎕의 무세포 반응 생성물을 48 ㎕의 앰비온(Ambion) 나노순수 물(인비트로젠, 미국)에 희석하였다. 이어서, 용액을 코스타 96-웰 흑색 검정 플레이트(코닝, 미국)에 넣었다. 형광은 시너지 H1 마이크로플레이트 판독기(바이오텍, 미국)를 사용하여 측정하였다. sfGFP 형광에 대한 자극 및 방출 파장은 각각 485 및 528 ㎚였다.
무세포 당단백질 합성(CFGpS) 반응. 당단백질의 미정제 추출물 기반 발현의 경우, 전술한 바와 같은 2-단계 방식이 구현되었다48. 이 연구에서, 단백질 합성은 50 ng의 주형 DNA를 갖는 PCR 스트립 튜브(써모 사이언티픽(Thermo Scientific) AB-2000)에서 15 ㎕로 상기 기재된 바와 같이 수행되었다. 반응은 sfGFP 수용체 단백질 상에 허용가능한 또는 허용가능하지 않는 시퀀을 암호화하는 플라스미드로 보충되었다. pJL1-sfGFP-DQNAT-His(허용) 및 pJL1-sfGFP-AQNAT-His(비허용)는 PglB 매개 당화에 사용되었고; pJL1-sfGFP-MOOR-His(허용) 및 pJL1-sfGFP-MOORmut-His(비허용)는 PglO 매개 당화에 사용되었다. 반응은 얼음 위에서 삼중으로 설정되었으며, 각 반응은 고유하게 제조된 추출물을 포함한다. CFPS 시간은 반응이 30 ℃로 이동된 시간으로부터 반응이 MnCl2로 스파이크된 시간까지 측정되었다. 제2 단계에서, 단백질 당화는 25 mM의 최종 농도에서 MnCl2를 첨가함으로써 개시되었다. MnCl2(시그마 63535) 외에도 0.1 %(w/v%) DDM(아나트라스(Anatrace), D310S) 또는 100 mM 수크로스가 각각 PglB 또는 PglO 반응에 보충되었다. 당화는 30 ℃에서 16 시간 동안 진행되었다. 당화 후, GFP 형광을 사용하여 합성된 수용체 단백질의 총량을 정량하고, 웨스턴 블롯을 사용하여 당화 및 비당화된 단백질의 분율을 계산하였다.
소포 막 면적의 추정. 소포 표면적(㎡/㎖)을 계산하기 위해 하기의 수식을 사용했고, 여기서 Rave는 평균 소포 반경(m), C는 NTA에 의해 측정된 입자 농도(입자/㎖)이다.
본 발명의 범위 및 정신을 벗어나지 않고 본 명세서에 개시된 본 발명에 대해 다양한 치환 및 변형이 이루어질 수 있음이 관련 기술분야의 기술자에게 용이하게 명백할 것이다. 본원에 예시적으로 설명된 본 발명은 적합하게는 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재 하에 실시될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 제한이 아닌, 설명의 측면에서 사용되었고, 이러한 용어 및 표현을 사용함에 있어 도시되고 설명된 특징 또는 그 일부의 임의의 등가물을 배제하려는 것으로 의도되지 않으며, 다만 본 발명의 범위 내에서 다양한 변형이 가능하다는 것이 인식된다. 따라서, 본 발명이 특정 실시양태 및 선택적인 특징에 의해 예시되었지만, 본 명세서에 개시된 개념의 변형 및/또는 변화가 관련 기술분야의 기술자에 의해 의지될 수 있으며, 이러한 변형 및 변화가 본 발명의 범위 내에서 고려된다는 것을 이해해야 한다.
다수의 특허 및 비특허 참고문헌에 대한 인용이 본원에서 이루어진다. 인용된 참고문헌은 그 전문이 본원에 참고로서 포함된다. 인용된 참고문헌에 있는 용어의 정의와 본 명세서에 있는 용어의 정의에 불일치가 있는 경우, 용어는 본 명세서의 정의에 기초하여 해석되어야 한다.
Claims (32)
- (i) 무세포 반응 혼합물 내의 단백질을 전사 및 번역하는 단계;
(ii) 당화된 단백질을 수득하기 위해 반응 혼합물 내의 단백질을 하나 이상의 다당류로 당화시키는 단계
를 포함하는, 원핵 세포를 용해시켜 용해된 세포를 수득하고, 용해된 세포를 5,000×g 초과 및 20,000×g 미만의 힘으로 원심분리하고, 무세포 분획을 수득하기 위해 상층액을 수집함으로써 수득된 무세포 분획을 포함하는, 무세포 반응 혼합물 내에서 조정된 전사, 번역 및 당화를 통해 무세포 당단백질 합성(CFGpS) 반응에서 당화된 단백질을 합성하는 방법. - 제1항에 있어서, 상기 용해된 세포는 5,000×g 초과 및 18,000×g 미만의 힘으로 원심분리되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 용해된 세포는 5,000×g 초과 및 15,000×g 미만의 힘, 예를 들어 약 12,000×g의 힘으로 원심분리되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 무세포 분획은 용해된 세포를 15,000×g 초과의 힘으로 원심분리하여 수득된 무세포 분획에 비해 막 소포가 농축된 것인, 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 막 소포는 평균 유효 직경이 약 10 ㎚ 내지 약 500 ㎚인, 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 막 소포는 평균 유효 직경이 약 50 ㎚ 내지 약 200 ㎚인, 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 막 소포는 인지질 소포를 포함하는, 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 무세포 분획이 막 소포를 약 4×1012, 5×1012, 또는 6×1012, 또는 7×1012 입자/㎖ 이상의 농도로 포함하는, 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 원핵 세포는 무세포 반응 혼합물 내의 단백질을 당화하는 막횡단 올리고당전이효소를 발현하고, 막 소포는 막횡단 올리고당전이효소를 포함하는, 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 원핵 세포는 무세포 반응 혼합물 내의 단백질을 당화하는 외인성 막횡단 올리고당전이효소를 발현하고, 막 소포는 외인성 막횡단 올리고당전이효소를 포함하는, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 막횡단 올리고당전이효소는 PglB, PglO 및 STT3 중에서 선택되는, 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 막횡단 외인성 올리고당전이효소는 PglB, PglO 및 STT3 중에서 선택되는, 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 막 소포는 지질-결합 올리고당(LLO) 공여자를 포함하고 단백질은 LLO 공여자로 당화되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 용해된 세포는 초음파 처리를 수행함으로써 수득되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 용해된 세포는 균질화를 수행함으로써 수득되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 원핵 세포는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)인, 방법.
- 원핵 세포를 용해시켜 용해된 세포를 수득하고, 용해된 세포를 5,000×g 초과 및 20,000×g 미만의 힘으로 원심분리하고, 무세포 분획을 수득하기 위해 상층액을 수집함으로써 수득된 무세포 분획을 포함하는, 당단백질의 조정된 전사, 번역 및 당화를 수행하기 위한 무세포 단백질 합성 플랫폼.
- 제17항에 있어서, 상기 용해된 세포는 5,000×g 초과 및 18,000×g 미만의 힘으로 원심분리되는, 플랫폼.
- 제17항에 있어서, 상기 용해된 세포는 5,000×g 초과 및 15,000×g 미만의 힘, 예를 들어 약 12,000×g의 힘으로 원심분리되는, 플랫폼.
- 제17항에 있어서, 상기 무세포 분획은 용해된 세포를 15,000×g 초과의 힘으로 원심분리하여 수득된 무세포 분획에 비해 막 소포가 농축된 것인, 플랫폼.
- 제20항에 있어서, 상기 막 소포는 평균 유효 직경이 약 10 ㎚ 내지 약 500 ㎚인, 플랫폼.
- 제20항에 있어서, 상기 막 소포는 평균 유효 직경이 약 50 ㎚ 내지 약 200 ㎚인, 플랫폼.
- 제20항에 있어서, 상기 막 소포는 인지질 소포를 포함하는, 플랫폼.
- 제20항에 있어서, 상기 무세포 분획이 막 소포를 약 4×1012, 5×1012, 또는 6×1012, 또는 7×1012 입자/㎖ 이상의 농도로 포함하는, 플랫폼.
- 제20항에 있어서, 상기 원핵 세포는 무세포 반응 혼합물 내의 단백질을 당화하는 막횡단 올리고당전이효소를 발현하고, 막 소포는 막횡단 올리고당전이효소를 포함하는, 플랫폼.
- 제20항에 있어서, 상기 원핵 세포는 무세포 반응 혼합물 내의 단백질을 당화하는 외인성 막횡단 올리고당전이효소를 발현하고, 막 소포는 외인성 막횡단 올리고당전이효소를 포함하는, 플랫폼.
- 제25항에 있어서, 상기 막횡단 올리고당전이효소는 PglB, PglO, 및 STT3 중에서 선택되는, 플랫폼.
- 제26항에 있어서, 상기 막횡단 외인성 올리고당전이효소는 PglB, PglO, 및 STT3 중에서 선택되는, 플랫폼.
- 제20항에 있어서, 상기 막 소포는 지질-결합 올리고당(LLO) 공여자를 포함하고 단백질은 LLO 공여자로 당화되는, 플랫폼.
- 제17항에 있어서, 상기 용해된 세포는 초음파 처리를 수행함으로써 수득되는, 플랫폼.
- 제17항에 있어서, 상기 용해된 세포는 균질화를 수행함으로써 수득되는, 플랫폼.
- 제17항에 있어서, 상기 원핵 세포는 에스케리키아 콜라이인, 플랫폼.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0105 | International application |
Patent event date: 20220524 Patent event code: PA01051R01D Comment text: International Patent Application |
|
| PG1501 | Laying open of application |