KR20220081367A - 폐 계면활성제-생체모방 나노입자를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

폐 계면활성제 (PS)-생체모방 나노입자를 포함하는 조성물 및 방법이 개시되어 있다. 구체적으로, 본 개시내용은 복수의 폐 계면활성제 생체모방 분자 (여기서 나노입자는 음으로 하전됨); 및 나노입자에 의해 둘러싸인 하나 이상의 카고 분자 (여기서 카고 분자는 최대 1200 Da의 분자량을 가짐)를 포함하는, 200-400 nm의 평균 크기를 갖는 나노입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

폐 계면활성제-생체모방 나노입자를 위한 조성물 및 방법

연방 지원 연구 또는 개발

본 발명은 미국 국립보건원에서 수여한 승인 번호 AI089779, AI070785 및 AI097696 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.

기술분야

폐 계면활성제-생체모방 나노입자, 예를 들어 PS-GAMP를 포함하는 조성물 및 제조 및 사용 방법이 본원에 기재되어 있다.

현재의 인플루엔자 백신은 주로 바이러스 표면 혈구응집소 (HA) 및 뉴라미니다제 (NA)에 특이적인 중화 항체를 유도함으로써 바이러스 감염으로부터 보호한다. 그러나, 이들 표면 단백질은 지속적인 항원성 드리프트/이동을 겪으며, 이들 백신의 효능을 크게 제한한다 (1). 이종아형 면역에서 폐 CD8+ 상주 기억 T (T_RM) 세포의 필수적인 역할을 입증하는 연구는 이러한 한계에 대한 설명을 제공할 수 있다 (2, 3). 자연적인 바이러스 감염에 의해 충분히 유도되면 이들 세포는 이종아형 인플루엔자 바이러스 중에서 공유되는 고도로 보존된 내부 단백질을 인식할 뿐만 아니라, 그 수가 낮을 때 바이러스 유입 부위에서 바이러스를 제거할 수 있다 (4-6). 유사하게, 생 벡터-조작된 및 약독화된 인플루엔자 백신은 폐 CD8+ T_RM 세포를 유도할 수 있지만 (7, 8), 이들의 안전성 및 면역원성 사이에서 섬세한 균형이 이루어져야 한다. 더욱이, 이들 복제 백신은 종종 기존 면역에 의해 손상되며, 결과적으로 일부 집단에서만 적합하다 (9). 반대로, 비복제 인플루엔자 백신은 기도에서 불량한 T 세포 면역을 유도하고, 호흡기 점막의 면역조절 메커니즘을 극복하기 위해 강력한 점막 아주반트를 필요로 한다.

요약

예를 들어, 인플루엔자 백신을 증대시키기 위해 사용될 수 있는 안전하고 강력한 점막 아주반트가 본원에 기재되어 있다.

본 발명의 다른 특징 및 장점은 하기 상세한 설명 및 도면 및 청구범위로부터 명백할 것이다.

한 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는, 200-400 nm의 평균 크기를 갖는 나노입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다: 복수의 폐 계면활성제-생체모방 분자 (여기서 나노입자는 음으로 하전됨); 및 나노입자에 의해 둘러싸인 하나 이상의 카고 분자 (여기서 카고 분자는 최대 1200 Da의 분자량을 가짐).

일부 실시양태에서, 폐 계면활성제-생체모방 분자는 50-90 중량%의 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC), 5-15 중량%의 음으로 하전된 지질, 및/또는 5-15 중량%의 중성 지질을 포함한다.

일부 실시양태에서, 음으로 하전된 지질은 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) (DPPG)이고, 중성 지질은 콜레스테롤이다.

일부 실시양태에서, 나노입자는 500-5000 Da의 평균 분자량을 갖는 복수의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜은 나노입자의 외부 표면에 연결된다.

일부 실시양태에서, 나노입자는 5-15 중량%의 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (DPPE-PEG2000)을 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 카고 분자는 인터페론 유전자 자극인자 (STING) 효능제이다.

일부 실시양태에서, STING 효능제는 시클릭 구아노신 모노포스페이트 [GMP]-아데노신 모노포스페이트 [AMP] (cGAMP)이거나 이를 포함한다.

일부 실시양태에서, cGAMP는 10-100 μg/ml의 농도로 존재한다.

일부 실시양태에서, 카고 분자는 지속 작용-β2-효능제 (LABA) (예를 들어, 포르모테롤, 살메테롤 또는 빌란테롤); 코르티코스테로이드 (ICS) (예를 들어, 부데소니드, 플루티카손 프로피오네이트 또는 플루티카손 푸로에이트); 류코트리엔-경로 조정제 (예를 들어, 몬테루카스트 또는 질류톤); 키나제 (예를 들어, 비장 티로신 키나제, p38 미토겐-활성화 단백질 키나제 (MAPK), 포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트 3-키나제 (PI3K), 야누스 키나제 (Jak) 또는 포스포디에스테라제-4 (PDE4))를 표적화하는 억제제; 수용체 (예를 들어, Th2 세포 상에 발현되는 화학유인물질 수용체-상동성 분자 (CRTH2), 케모카인 수용체 2 (CCR2))의 효능제 또는 길항제; 이온 채널 (예를 들어, GABA 수용체, 일시적 수용체 전위 양이온 채널, 서브패밀리 A, 구성원 1 (TRPA1), 또는 전압-게이팅 나트륨 채널)의 효능제 또는 길항제; IFN-α의 유도제; 지속-작용 무스카린성 길항제/항콜린제 (LAMA); IL-5, IL-13, IL-33 또는 흉선 기질 림포포이에틴에 대한 억제제; CXCR2 길항제; 전염증성 시토카인 (예를 들어, TNF-α, TNF-β 또는 IL-6)을 차단하는 분자; IL-17/T_H17을 차단하는 분자; 마크로라이드; HDAC2를 활성화시키는 분자; STAT6 억제제 (예를 들어, AS1517499); 항바이러스 소분자 약물 (예를 들어, 오셀타미비르 (타미플루), 리렌자 또는 자나미비르); 파비피라비르 (T705); 효능제 for 세포내 Toll-유사 수용체 (TLR) TLR3 (예를 들어, 이미퀴모드, 레시퀴모드 (R848), 이미다조퀴놀린 (IMQ), 모톨리모드, CU-CPT4a, IPH-3102 또는 린타톨리모드); 노디니팁 (NOD1), NOD2, NLPR3 또는 NPLRC3에 대한 효능제 (예를 들어, 무라밀디펩티드 (MDP), FK565 또는 FK156; TLR7 또는 TLR8 효능제 (예를 들어, 이사토리빈, 록소리빈, 가르디퀴모드, AZD8848, IMO-8400, ANA773, IMO-3100, SM360320 또는 852A); TLR8 효능제 (예를 들어, VTX-1463, VTX-2337, IMO-8400 또는 2,3-디아미노-푸로[2,3-c] 피리딘); 및/또는 TLR9 효능제 (IMO-8400, IMO-3100, SAR-21609, AZD1419, SD-101, IMO-2055, IMO-2125, QAX-935, AVE0675, DIMS0150, MGN-1703, MGN-1706, ISS1018 또는 아가톨리모드)이다.

한 측면에서, 본 개시내용은 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 대상체에게 투여하는 단계; 및 항원을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 항원에 대한 면역 반응을 촉진하는 방법에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물이다.

일부 실시양태에서, 항원은 나노입자 내에 둘러싸여 있거나; 나노입자 및 항원은 단일 조성물로 투여되거나; 또는 나노입자 및 항원은 별도의 조성물로 투여된다.

한 측면에서, 본 개시내용은 치료 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 인플루엔자를 갖는 대상체에게 투여하는 단계; 및 항원을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인플루엔자를 갖는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, 카고 분자는 cGAMP이고, 항원은 인플루엔자 백신이다.

일부 실시양태에서, 대상체는 인간이고, 항원은 인간 인플루엔자 백신이다.

한 측면에서, 본 개시내용은 치료 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 기도 질환을 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 기도 질환을 갖는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, 카고 분자는 지속 작용-β2-효능제 (LABA) (예를 들어, 포르모테롤, 살메테롤 또는 빌란테롤); 코르티코스테로이드 (ICS) (예를 들어, 부데소니드, 플루티카손 프로피오네이트 또는 플루티카손 푸로에이트); 류코트리엔-경로 조정제 (예를 들어, 몬테루카스트 또는 질류톤); 키나제 (예를 들어, 비장 티로신 키나제, p38 미토겐-활성화 단백질 키나제 (MAPK), 포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트 3-키나제 (PI3K), 야누스 키나제 (Jak) 또는 포스포디에스테라제-4 (PDE4))를 표적화하는 억제제; 수용체 (예를 들어, Th2 세포 상에 발현되는 화학유인물질 수용체-상동성 분자 (CRTH2), 케모카인 수용체 2 (CCR2))의 효능제 또는 길항제; 이온 채널 (예를 들어, GABA 수용체, 일시적 수용체 전위 양이온 채널, 서브패밀리 A, 구성원 1 (TRPA1), 또는 전압-게이팅 나트륨 채널)의 효능제 또는 길항제; IFN-α의 유도제; 지속-작용 무스카린성 길항제/항콜린제 (LAMA); IL-5, IL-13, IL-33 또는 흉선 기질 림포포이에틴에 대한 억제제; CXCR2 길항제; 전염증성 시토카인 (예를 들어, TNF-α, TNF-β 또는 IL-6)을 차단하는 분자; IL-17/T_H17을 차단하는 분자; 마크로라이드; HDAC2를 활성화시키는 분자; STAT6 억제제 (예를 들어, AS1517499); 항바이러스 소분자 약물 (예를 들어, 오셀타미비르 (타미플루), 리렌자 또는 자나미비르); 및/또는 파비피라비르 (T705)이다.

일부 실시양태에서, 대상체는 인간이고, 기도 질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD), 알레르기 또는 폐 바이러스 감염 중 하나 또는 이들의 조합이다.

한 측면에서, 치료 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법. 일부 실시양태에서, 카고 분자는 화학요법제이다.

일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물이다.

일부 실시양태에서, 암은 폐암이고, 화학요법제는 제피티닙, 에를로티닙, 크리조티닙, 에베롤리무스, 아파티닙, 크리조티닙 독소루비신, 에토포시드, 옵디보 및/또는 트렉솔이다.

일부 실시양태에서, 암은 비인두암이고, 화학요법제는 시스플라틴, 카르보플라틴, 젬시타빈, 독소루비신 및/또는 D5-플루오로우라실 (5-FU)이다.

일부 실시양태에서, 암은 기관암이고, 화학요법제는 에토포시드, 시스플라틴 및/또는 카르보플라틴이다.

일부 실시양태에서, 암은 기관지암이고, 화학요법제는 에토포시드, 시스플라틴, 카르보플라틴, 5-FU, 도세탁셀, 파클리탁셀 및/또는 에피루비신이다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에서 사용하기 위한 방법 및 재료는 본원에 기재되어 있으며; 관련 기술분야에 공지된 기타 적합한 방법 및 재료가 또한 사용될 수 있다. 재료, 방법 및 예는 예시일 뿐이며 제한하려는 의도가 아니다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 항목, 및 기타 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 충돌하는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다. 본 발명의 다른 특징 및 장점은 하기 상세한 설명 및 도면 및 청구범위로부터 명백할 것이다.

도면의 설명
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도 1A-1J. AM에 의한 PS-GAMP 흡수는 SP-A 및 SP-D를 필요로 한다. (A) SRB 및 DiD로 표지된 PS-리포솜의 개략적 다이어그램. (B-E) 유리 SRB (20 μg) 또는 SRB-DiD-나노4 또는 SRB-DiD-나노5 (20 μg SRB)를 마우스에 i.n. 투여한 후, 12시간 후에 SRB⁺ 및/또는 DiD⁺ 폐 세포의 유동 세포계측법 분석을 수행하였다. CD11c⁺ AM (적색) 또는 CD11c^- AEC (파란색)이기도 한 SRB⁺ 세포의 백분율을 분석하고 (B) 정량하였다 (C 및 D) (n=4). (E) DiD 및 SRB에 대한 AM 및 AEC 염색의 대표적인 오버레이 유동 세포계측법 플롯. (F) MHC II-GFP 마우스로부터 AM을 단리하고, 30분 동안 PS와 함께 (하부 패널) 또는 없이 (상부 패널) 사전 인큐베이션 후 DiD-나노4 또는 DiD-나노5와 함께 4시간 동안 인큐베이션하였다. 스케일 바: 10 μm. 대안적으로, 야생형 (WT) 마우스로부터 AM을 단리하고, 30분 동안 WT 또는 Sftpa1^-/-Sftpd^-/- PS로 전처리된 DiD-나노4와 함께 4시간 동안 인큐베이션하였다 (I). 세포를 형광 현미경법에 의해 이미지화하고, 이미지 J를 사용하여 개별 세포에서 DiD 형광 강도에 대해 정량화하였다 (G 및 I). n=18-36. (H) DiD-나노4 또는 DiD-나노5를 받은 후 12시간 후에 폐를 형광 현미경법에 의해 시각화하였다. 스케일 바: 50 μm. (J) DiD-나노4를 WT 또는 Sftpa1^-/-Sftpd^-/- 마우스에 i.n. 투여하였다. CD11c⁺CD11b^-CD24^- AM을 DiD⁺에 대해 12시간 후에 분석하였다. n=6. 각 기호는 (C, D 및 J)의 개별 마우스 또는 (G 및 I)의 세포를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로서 제시되었다. 통계적 분석, (C, D, G 및 I)의 경우 일원 ANOVA, 및 (J)의 경우 스튜던트 t-검정. 표시된 그룹 사이에 **p<0.01 및 ***p<0.001. 모든 실험은 3회 반복하였으며 유사한 결과를 갖는다.
도 2A-2L. PS-GAMP의 아주반트성. (A 및 B) 스위스 웹스터 마우스를 VN04 H5N1 백신 + 20 μg의 유리 cGAMP 또는 표시된 양의 cGAMP를 함유하는 PS-GAMP로 i.n. 면역화하였다. Ag-특이적 혈청 HAI (A) 및 BALF IgA (B) 역가를 2주 후에 측정하였다. n=8. (C 내지 E) C57BL/6 마우스를 0일차에 PS-GAMP (20 μg cGAMP)의 존재 또는 부재 하에 VN04 H5N1 백신으로 i.n. 면역화하고, 14일차에 부스트하였다. 혈청을 14일차 (프라임) 또는 21일차 (부스트)에 수집하고, Ag-특이적 IgG (C), IgG2c (D), 및 IgG1 (E) 역가에 대해 측정하였다. n=4. (F 내지 L) C57BL/6 마우스를 20 μg의 PS-GAMP 또는 폴리 IC와 함께 또는 없이 CA09 H1N1 백신으로 i.n. 면역화하였다. 혈청 IgG (F), BALF IgA (G), 및 혈청 HAI (H) 역가를 2주 후에 측정하였다. (I-J) 비장세포를 면역화 7일 후 단리하고, CA09 H1N1 백신으로 자극하였다. 바이러스 Ag 자극 후 IFN-γ를 생성하는 CD8⁺ (I) 및 CD4⁺ (J) T 세포를 유동 세포계측법에 의해 결정하였다. (K 및 L) 비면역화된 마우스 (흑색), 또는 백신 단독 (녹색), 폴리IC (파란색) 또는 PS-GAMP (적색)와 조합된 백신의 단일 면역화를 받고 28일 후에 10×LD₅₀ CA09 H1N1 바이러스로 챌린지된 마우스의 생존 곡선 (K) 및 체중 변화 (L). n=6. 결과는 평균 ± SEM으로서 제시된다. 각 기호는 (A 내지 J)의 개별 마우스를 나타낸다. 통계적 분석, (A 내지 J)의 경우 일원 ANOVA, (L)의 경우 이원 ANOVA, 및 (K)의 경우 로그-순위 검정. PS-GAMP의 존재 또는 부재 하에 *p<0.05, **p<0.01, 및 ***p<0.001. ns, 유의성 없음. 모든 실험은 2회 반복하였으며 유사한 결과를 갖는다.
도 3A-3I. PS-GAMP에 의해 유도된 CD8⁺ T 세포 반응. (A) 마우스에 PS-GAMP를 i.n. 투여한 후 표시된 날짜에 폐 (상부) 및 MLN (하부)에서 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포, NK 세포, 및 CD11b⁺ 및 CD11b^- DC의 수를 유동 세포계측법에 의해 분석하였다. n=4. (B) 마우스를 PS-GAMP로 i.n. 면역화하거나 1×LD₅₀ CA09 H1N1 바이러스로 감염시킨 후 표시된 날짜에 폐 및 MLN의 CD11b⁺ 모노-DC 및 CD11b⁺ tDC를 유동 세포계측법에 의해 정량화하였다. n=4. (C 내지 E) 마우스를 PS-GAMP와 함께 또는 없이 OVA-AF647로 i.n. 백신접종하였다. 면역화 36시간 후 MLN에서 OVA를 캡처하는 DC를 세었다 (C). n=6. 이들 DC 상의 CD40 (E) 또는 CD86 (F)의 평균 형광 강도 (MFI)를 유동 세포계측법에 의해 정량화하였다. n=4. (F 및 G) 마우스를 PS-GAMP와 함께 또는 없이 CA09 H1N1 백신으로 또는 비면역화된 대조군으로서 PBS 단독으로 i.n. 면역화하였다. 폐 및 MLN의 CD8⁺ T 세포를 NP_366-374 사량체로 염색함으로써 이들의 Ag-특이성에 대해 면역화 후 표시된 날짜에 분석하였다. n=4-8. (H) 마우스를 (F 및 G)에 기재된 바와 같이 면역화하고, 2일 후에 10×LD₅₀ CA09 H1N1 바이러스로 챌린지하였다. 면역화 후 표시된 날짜에 GB⁺CD8⁺ T 세포에 대해 BALF 및 폐 세포를 세었다. n=4. (I) 면역화를 위해 PS-GAMP 대신에 20 μg의 폴리 IC 또는 Pam2CSK4를 사용한 점을 제외하고는 마우스를 (H)와 유사하게 면역화하고 챌린지하였다. GB⁺CD8⁺ T 세포를 챌린지 후 4일에 (H)와 같이 계수하였다. n=4. 각 기호는 (A, C-E, 및 I)의 개별 마우스를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로서 제시되었다. 통계적 분석, (A, B 및 I)의 경우 일원 ANOVA, (F 내지 H)의 경우 이원 ANOVA, 및 (C 내지 E)의 경우 스튜던트 t-검정. 0일차 (A 및 B), 인플루엔자 백신 단독 (F 내지 H), 또는 표시된 그룹 사이와 비교하여 *p<0.05; **p<0.01, 및 ***p<0.001. 모든 실험은 2회 반복하였으며 유사한 결과를 갖는다.
도 4A-4J. PS-GAMP-매개 조기 보호. (A-B) 10×LD₅₀ CA09 H1N1 바이러스 챌린지 후 면역화된 C57BL/6 마우스의 생존율. (A) 마우스를 도 28A에 도시된 바와 같이 바이러스 챌린지 전 2, 4, 6, 8 또는 14일차에 CA09 H1N1 백신 (0.5μg HA) 및 PS-GAMP (20 μg cGAMP)로 i.n. 면역화하였다. n=6-11. (B) 마우스를 면역화하고, 동일한 날 (0) 또는 면역화 후 2일 (-2)에 챌린지하였다. n=6. (C) 마우스를 (A)와 같이 면역화하고 2일 후에 챌린지하였다. CD8⁺ T 세포는 백신접종 전 2일에 및 백신접종 후 0, 2 및 4일에 항-CD8 항체의 주사에 의해 일부 마우스에서 고갈되었다. n=4. (D) 도 28A에 도시된 바와 같이 10×LD₅₀ rgVN04 H5N1 바이러스로 0일차 챌린지 이전 표시된 날짜에서 VN04 H5N1 백신 + PS-GAMP로 면역화된 마우스의 생존율. n=4-8. (E) VN04 H5N1 백신, PS-GAMP, 또는 백신 + 유리 cGAMP, CT, 또는 PS-GAMP로 면역화한 다음, 2일 후에 rgVN04 H5N1 바이러스 챌린지한 마우스의 생존율. n=4-8. (F) 마우스를 H7-Re1 H7N9 백신 및 20 μg의 PS-GAMP 또는 폴리 IC로 i.n. 면역화하고, 2일 후에 40×LD₅₀에서 임상적으로 단리된 SH13 H7N9 바이러스에 의해 챌린지하였다. n=8-12. (G 내지 J) 페럿을 200 μg의 PS-GAMP와 함께 또는 없이 CA09 H1N1 백신 (9 μg)으로 i.n. 면역화하고, 2일 후에 10⁶ TCID₅₀ CA09 H1N1 바이러스로 챌린지하였다. 체중 (G), 질환 스코어 (H), 체온 (I), 및 비강 세척액의 바이러스 역가 (J)를 12일 동안 모니터링하였다. n=4. 결과는 평균 ± SEM으로서 제시되었다. 0일차 (A, D), 백신 단독 (B, E 및 F), 또는 항-CD8 항체의 존재 또는 부재 (C)와 비교하여 *p<0.05, **p<0.01, 및 ***p<0.001. 마우스 실험은 2회 반복하였으며 유사한 결과를 갖는다. 페럿의 경우, *는 PBS 및 백신+PS-GAMP 간의 유의성을 표시하고, #은 백신 및 백신+PS-GAMP 간의 유의성을 표시한다. *, #p<0.05; **, ## p<0.01; 및 ***, ###p<0.001. 통계적 분석, (C, G, I 및 J)의 경우 이원 ANOVA, (H)의 경우 크루스칼 왈리스 검정, 및 (A, B 및 D-F)의 경우 로그-순위 검정.
도 5A-5N. AEC는 PS-GAMP 아주반트성에 필수적인 기여를 한다. (A) 마우스에 연속 3일 동안 하루에 한 번 CBX를 i.p. 투여한 후, SRB-나노4를 마우스에 i.n. 제공하였다. SRB⁺ AM (적색) 및 AEC (파란색)를 12시간 후에 분석하고, 이들 세포의 백분율은 (B 및 C)에 표시되었다. n=6. (D) 마우스에 CBX, 토나베르사트 또는 메클로페나메이트를 i.p. 투여하고, 20 μg의 폴리 IC 또는 PS-GAMP와 함께 또는 없이 CA09 H1N1 백신으로 i.n. 면역화하였다. 혈청을 14일 후에 수집하고, IgG2c에 대해 분석하였다. n=6. (E) 마우스를 (D)와 같이 CBX의 존재 또는 부재 하에 CA09 H1N1 백신 및 PS-GAMP로 면역화하였다. 폐 CD11b⁺ DC를 24시간 후에 계수하였다. n=4. (F 및 G) 표시된 간극 연접부 억제제를 받은 마우스를 (D)와 같이 면역화하고, 2일 후에 10×LD₅₀ CA09 H1N1 바이러스로 챌린지하였다. BALF (F) 및 폐 (G)의 GB⁺CD8⁺ T 세포를 유동 세포계측법에 의해 분석하였다. n=4. (H) 키메라 마우스 생성의 개략적 다이어그램. 마우스로의 골수 (BM) 세포 전달 전에 치명적인 방사선조사를 투여하였다. 3개월 후 키메라를 확인하고 (도 32), (F)와 같이 면역화하고 챌린지하였다. 챌린지 후 4일에, GB⁺CD8⁺ T 세포를 BALF (I) 및 폐 (J)에서 유동 세포계측법에 의해 세고, 0일차에 대한 체중 변화 (K) 및 폐 바이러스 역가 (L)를 이들 마우스에서 측정하였다. n=4-7. (M 및 N) GB⁺CD8⁺ T 세포의 수 및 바이러스 역가 간의 상관관계를 회귀 분석에 의해 결정하였다. 결과는 평균 ± SEM으로서 제시되었다. 각 기호는 개별 마우스를 나타낸다. 통계적 분석, (D, F, G 및 I-L)의 경우 일원 ANOVA, (B, C 및 E)의 경우 스튜던트 t-검정. *p<0.05, **p < 0.01, 및 ***p<0.001. 모든 실험은 2회 반복하였으며 유사한 결과를 갖는다.
도 6A-6O. PS-GAMP는 이종아형 인플루엔자 A 바이러스에 대한 교차-보호를 확장한다. (A 내지 H) 마우스를 (G 및 H)의 SH09 H1N1 백신 또는 백신 + PS-GAMP를 제외하고는 CA09 H1N1 백신으로 i.n. 면역화하고, 5×LD₅₀ 원위 PR8 H1N1 바이러스 (A 및 B) 및 이종아형아이치 H3N2 (C 및 D), rgVN04 H5N1 (E 및 F), 또는 SH13 H7N9 바이러스 (G 및 H)로 2일 (제1 패널) 또는 2주 (제2 패널) 후에 챌린지하였다. (A 내지 F)의 경우 n=6-7 및 (G 및 H)의 경우 n=8-13. (I) 마우스를 (A)와 같이 면역화하고, 2일 후에 10×LD₅₀ 오셀타미비르-저항성 NC09 H1N1 바이러스에 의해 챌린지하였다. 비면역화된 마우스를 챌린지 6시간 전에 및 그 후 연구 종료까지 바이러스 챌린지 후 매일 오셀타미비르 (20 mg/kg/일)로 처리하였다. 처리된 마우스를 10×LD₅₀ CA09 H1N1 또는 NC09 H1N1 바이러스에 의해 챌린지하였다. n=6. (J) 마우스를 2018-19 3가 계절성 인플루엔자 백신 (SIV18-19) 단독으로 또는 PS-GAMP와 함께 면역화하고, 1개월 후에 5×LD₅₀ 미스매치된 GZ89 H3N2 바이러스로 챌린지하였다. n=6-12. (K) 마우스를 CA09 H1N1 백신 단독으로 또는 PS-GAMP와 함께 면역화하고, 6개월 후에 5×LD₅₀ 이종아형 rgVN04 H5N1 바이러스로 챌린지하였다. 대안적으로, 마우스를 1×LD₅₀ PR8 H1N1 바이러스로 감염시키고, 감염으로부터 생존한 마우스를 비교 (사전감염)를 위해 5×LD₅₀ rgVN04 H5N1 바이러스로 6개월 후에 다시 챌린지하였다. n=6-7. (L 내지 O) 페럿을 PS-GAMP (200 μg)와 함께 또는 없이 불활성화된 퍼스 H3N2 백신 (15 μg)으로 i.n. 면역화하였다. 면역화 30일 후, 페럿을 10⁶ TCID₅₀ 이종아형 미시간15 H1N1 바이러스로 챌린지하였다. 체중 (L), 질환 스코어 (M), 체온 (N), 및 비강 세척액의 바이러스 역가 (O)를 12일 동안 모니터링하였다. 결과는 평균 ± SEM으로서 제시되었다. 마우스: 비면역화된 마우스와 비교하여 *p<0.05, **p<0.01, 및 ***p<0.001. 마우스를 사용한 실험은 2회 반복하였으며 유사한 결과를 갖는다. 페럿의 경우, *는 PBS 및 백신+PS-GAMP 간의 유의성을 표시하고, #은 백신 및 백신+PS-GAMP 간의 유의성을 표시한다. *, # p<0.05; **, ## p<0.01; 및 ***, ### p<0.001. 통계적 분석, (L, N 및 O)의 경우 이원 ANOVA, (M)의 경우 크루스칼-왈리스 검정, 및 (A 내지 K)의 경우 로그-순위 검정.
도 7A-7K. PS-GAMP 제작 및 특징화. (A) PS-GAMP 제작의 개략적 다이어그램. 리포솜은 전형적으로 90% 지질 및 10% 단백질로 이루어지고 진화적으로 보존되는 포유동물의 PS 성분에 기초하여 합성되었다. 지질은 8-10%의 콜레스테롤, 60-70%의 양쪽성 이온성 포스파티딜콜린 (PC), 주로 디팔미토일화된 포스파티딜콜린 (DPPC), 최대 8-15%의 음이온성 포스파티딜글리세롤 (DPPG), 및 상대적으로 작은 비율의 기타 지질 (17)을 함유한다. PEG2000은 친수성 단백질 대신에 사용되었고, DPPG는 전하의 중요성을 결정하기 위해 나노3 및 나노5의 양이온성 DPTAP로 대체되었다. 이들 PS 지질 및 PEG2000은 재료 및 방법에 자세히 설명된 바와 같이 역상 증발에 의해 cGAMP를 캡슐화하는 단일 지질 이중층을 갖는 리포솜을 형성한다. (B 내지 E) 스위스 웹스터 마우스를 VN04 H5N1 백신 (1 μg HA 함량) + 10 μg 유리 cGAMP 또는 표시된 리포솜에 패키지된 동량의 cGAMP로 i.n. 면역화하였다. 혈청 IgG (B) 및 기관지폐포 세척액 (BALF) IgA (C)를 2주 후에 측정하고, 체중을 면역화 후 7일 동안 모니터링하고 (D), 곡선 아래 면적 (AUC)을 프리즘(PRISM) 소프트웨어에 의해 (D)로부터 계산하였다 (E). n=5. 표시된 리포솜의 크기 (F), 캡슐화 비율 (G) 및 제타 전위 (J)를 측정하였다. (H 및 I) 유리 cGAMP 또는 cGAMP-캡슐화된 리포솜을 BMDC (H) 및 BMM (I)과 함께 10 μg/ml의 최종 cGAMP 농도에서 8시간 동안 배양하였으며, 그 후 IFN-β (Ifnb1)를 실시간 RT-PCR에 의해 측정하였다. n=4. (K) STING-결핍 마우스 (Sting^-/-) (적색) 또는 야생형 (WT) (파란색) 대조군 마우스를 VN04 H5N1 백신 단독으로 또는 PS-GAMP와 함께 i.n. 면역화하고, 혈청 IgG 역가를 상기와 같이 2주 후에 측정하였다. n=4. 결과는 평균 ± SEM으로서 제시되었다. 각 기호는 (B, C, E 및 K)의 개별 마우스 또는 (G, H 및 I)의 독립적인 복제를 나타낸다. 통계적 분석, (B, C, E 및 H-K)의 경우 일원 ANOVA, (D)의 경우 이원 ANOVA. 백신 단독 그룹 또는 표시된 그룹 사이와 비교하여 *p<0.05, **p<0.01, 및 ***p<0.001. 모든 실험은 2회 반복하였으며 유사한 결과를 갖는다.
도 8A-8F. 상이한 조직에서 나노입자 흡수의 동역학. 마우스에 PBS, 유리 SRB, SRB-캡슐화된 및 DiD-표지된 나노4 (나노4-SRB) 또는 SRB-캡슐화된 및 DiD-표지된 나노5 (나노5-SRB)를 i.n. 투여하고, 다양한 시간에 유동 세포계측법에 의해 분석하였다. (A) 뇌 (상부), 비강 조직 (중간) 및 MLN (하부)의 SRB⁺ 세포에 대한 대표적인 흐름 플롯. 데이터는 각각 삼중으로 검정된 2개의 별도의 실험을 나타낸다. (B 및 C) 나노4-SRB (B) 또는 나노5-SRB (C)를 받은 마우스의 폐의 SRB⁺ 세포. 폐포 대식세포 (AM), 사이질 대식세포 (IM), CD11b⁺DC, 및 CD11b^-DC를 도 9A-9D와 같이 게이팅하였다. (D-F) 나노4-SRB 또는 나노5-SRB를 받은 마우스의 MLN (D), 뇌 (E) 또는 비강 조직 (F)의 SRB⁺ 세포. n=4. 결과는 평균 ± SEM으로서 제시되었다. 통계적 분석, (B-F)의 경우 이원 ANOVA. *p<0.05, **p<0.01, 및 ***p<0.001. 실험은 2회 반복하였으며 유사한 결과를 갖는다.
도 9A-9D. 표시된 조직으로부터 단리된 세포의 유동 세포계측법 분석을 위한 게이팅 전략. (A) NK 세포를 폐 세포의 NK1.1⁺ 및 CD3^-에 의해 식별하고, CD3⁺ 세포를 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포로 분리하였다. 폐 CD11c^- 세포는 CD11b⁺Ly6C⁺Ly6G⁺로서 호중구로 분할된 반면, 염증성 단핵구는 CD11b⁺Ly6C^hiLy6G^-로 인식되었다. CD11c⁺ 세포의 게이트에서, 4개의 집단은 CD24 및 CD11b 마커로 판별되었으며, 그 중 AM은 CD24^-CD11b^-시글렉 F⁺이고, IM은 CD24^-CD11b⁺이고, CD24⁺CD11b^-DC는 CD103⁺ MHC II⁺였으며, 조직-상주 CD24⁺CD11b⁺ DC는 또한 MHC II를 발현하였으나 CD103은 그렇지 않았다. (B) 인플루엔자 바이러스 감염 동안 또는 PS-GAMP 투여 후, CD11b⁺ DC는 단핵구-유래 DC (모노-DC) 또는 조직 상주-유사 DC (tDC)로 분리될 수 있었다. 모노-DC는 Ly6C^hi였으며, MHC II 발현은 이들의 활성화 상태에 따라 다양하였다. 반면에, tDC는 Ly6C^loMHC II^hi였다. (C 및 D) MLN (C)의 CD11b⁺DC 및 CD11b^- DC 또는 비강 조직 (D)의 DC에 대한 게이팅 전략. MLN, 비강 조직 및 뇌의 T 세포, NK 세포, 호중구 및 단핵구에 대한 게이팅 전략은 폐 (A)의 것과 유사하였다.
도 10A-10B. 폐에서 PS-리포솜을 캡처하는 세포의 분석. (A) 마우스에 도 1A와 같이 제조된 나노4-SRB를 i.n. 투여하였다. 12시간 후에, CD11c⁺SRB⁺ 세포는 대부분 CD24^-CD11b^- AM으로 특징화되었고, CD11c^-SRB⁺ 세포는 대부분 EpCAM⁺CD11b^- AEC였으며, 이는 또한 MHC II에 대해 양성이었다. (B) 도 9A와 같이 게이팅된 AM, CD103⁺ DC, 및 CD11b⁺ DC는 나노4-SRB를 받은 마우스에서 직접 나노입자 흡수 (SRB⁺DiD⁺)에 대해 분석되었다. AM의 약 절반은 SRB⁺DiD⁺로 표시된 나노4-SRB를 섭취한 반면, DC는 나노입자를 거의 캡처하지 못하였다. 결과는 평균 ± SEM으로서 제시되었다. n=4 마우스. 실험은 2회 반복하였으며 유사한 결과를 갖는다.
도 11A-11C. 나노4는 cGAMP를 AM으로 전달하였다. (A) DiD-표지된 빈 PS-모방체 나노입자 (DiD-PS) 및 cGAMP-캡슐화된 PS-모방체 나노입자 (DiD-PS-GAMP)의 개략적 다이어그램. (B) DiD-PS 또는 DiD-PS-GAMP (20 μg cGAMP)를 i.n. 접종하였다. 폐 세포는 DiD-PS (적색) 또는 DiD-PS-GAMP (파란색)를 받은 마우스에서 12 또는 36시간 후에 유동 세포계측법에 의해 DiD⁺ CD11c⁺ 세포에 대해 분석되었다. 이들 세포는 또한 세포에서 STING 활성화를 입증하기 위해 CD40 발현에 대해 평가되었다. CD40 발현의 대표적인 히스토그램은 중간에 제공되고, 평균 형광 강도 (MFI)는 오른쪽 패널에 요약되어 있다. n=4. (C) CD40을 발현하는 DiD⁺ (파란색) 또는 DiD^- AM (적색)은 (B)와 유사하게 분석되었다. n=4. 결과는 평균 ± SEM으로서 제시되었다. 각 기호는 B 및 C의 오른쪽 패널의 개별 마우스를 나타낸다. 통계적 분석, (B 및 C)의 경우 t-검정. cGAMP의 존재 또는 부재 하에 **p<0.01 및 ***p<0.001. 실험은 2회 반복하였으며 유사한 결과를 갖는다.
도 12. 양으로 하전된 나노5는 생체외 배양에서 PS에 의해 포획되었다. DiD-표지된 나노4 또는 나노5를 30분 동안 PS와 함께 인큐베이션하였다. PS 상의 나노입자 응집체를 공초점 현미경법에 의해 시각화하였다. 제2 패널에 윤곽이 표시된 구역은 오른쪽에서 확대되었다. BF, 명시야. 스케일 바, 패널 1 및 2에서 100 μm 및 패널 3 및 4에서 10 μm. 데이터는 2개의 별도의 실험에서 10개의 유사한 결과를 나타낸다.
도 13A-13C. 비인간 영장류 (NHP)로부터 단리된 AM에 의한 나노4 흡수. AM 및 PS를 레서스 마카크로부터 단리하였다. (A) DiD-나노4 또는 DiD-나노5를 30분 동안 레서스 마카크 PS와 함께 인큐베이션하였다. 나노4가 아닌 나노5가 PS 상에 응집되고 공초점 현미경법에 의해 시각화되었다. 윤곽이 표시된 구역은 오른쪽의 상응하는 패널에서 확대되었다. 스케일 바, 10 μm. 데이터는 5개의 유사한 결과를 나타낸다. (B) 원숭이 AM을 단리하고, 나노입자의 PS 전처리와 함께 또는 없이 3시간 동안 DiD-나노4 (상부) 또는 DiD-나노5 (하부)와 함께 배양하고, 형광 현미경법에 의해 이미지화하였다. 살아있는 세포는 칼세인-AM에 의해 염색되고, 핵은 훽스트에 의해 염색되었다. 스케일 바, 50 μm. 세포의 DiD 형광 강도는 이미지 J에 의해 정량화되었다 (C). n=221-275. 각 기호는 개별 세포를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로서 제시되었다. 통계적 분석, (C)의 경우 일원 ANOVA. 표시된 그룹 사이 ***p<0.001. 본 발명자들은 NHP 연구에 도움을 주신 완리 류(Wanli Liu) 교수, 주니 왕(Junyi Wang) 박사, 및 Ms. 샤오링 시(Shaoling Qi)에게 감사드린다.
도 14. AM은 폐에서 나노4를 캡처한다. 마우스가 DiD-나노4를 비강내로 투여받은 후 12시간 후에 폐를 수집하고, 동결된 얇은 섹션을 AM-특이적 마커 시글렉 F에 대해 염색하고, 형광 현미경법에 의해 시각화하였다. 스케일 바, 30 μm. 제2 패널의 사각형은 오른쪽 패널에서 확대된다. 데이터는 2개의 별도의 실험에서 6개의 유사한 결과를 나타낸다.
도 15. 폐에서 나노입자 분포의 TEM. 나노골드는 도 7A와 같이 나노4 (나노4-골드) 및 나노5 (나노5-골드) 내에 캡슐화되었다. 마우스에 나노입자를 i.n. 투여하였다. 6시간 후에 폐를 수집하고, TEM을 위해 준비하였다. 참고: 나노4-골드는 AM 내부의 세포 소포 내에 포획되었고 (적색 화살표), 일부 나노골드는 세포 소포 내에서 관찰되었다 (열린 적색 화살표, 하부 패널). 대조적으로, 나노5-골드는 대부분 폐포 표면에 제시되었다 (파란색 화살표). 상부 패널의 윤곽이 표시된 구역은 상응하는 하부 패널에서 확대된다. 스케일 바, 상부 패널의 경우 2 μm 및 하부 패널의 경우 500 nm.
도 16. Sftpa1/Sftpd^-/- 마우스로부터의 AM은 나노4 흡수에서 WT AM과 유사한 능력을 가졌다. SP-A/D는 친수성 대형 단백질이며, 선천적 방어의 제1 라인으로서 잘 확립되어 있다. 이들 2개의 콜렉틴은 PS-래핑된 박테리아, 바이러스, 세포 파편, 세포자멸 세포, 및 다양한 나노입자에 통합하여, AM에 의한 이들의 엔도시토시스 또는 식세포작용을 촉진할 수 있다 (20). 이것이 AM에 의한 나노4 흡수에 대한 메커니즘인지 여부를 시험하기 위해, WT 또는 Sftpa1/Sftpd^-/- 마우스로부터 AM을 단리하고, 30분 동안 WT PS로 전처리된 DiD-나노4와 함께 인큐베이션하였다. 세포의 DiD 형광을 공초점 현미경법에 의해 캡처하고, 이미지 J 소프트웨어에 의해 정량화하였다. Sftpa1/Sftpd^-/- 마우스로부터의 AM은 WT PS의 존재 하에 WT AM만큼 효율적으로 나노4를 섭취하는 것으로 밝혀졌지만 (도 16), SP-A/D-결핍 PS의 존재 하에서는 그렇지 않았다 (도 1I). n=25-32. 각 기호는 개별 세포를 나타낸다. 통계적 분석, 일원 ANOVA. 표시된 그룹 사이 *p<0.05 및 **p<0.01 및 ns, 유의하지 않음. 실험은 2회 반복하였으며 유사한 결과를 갖는다.
도 17A-17C. PS-GAMP는 폐, 코 및 중추 신경계 (CNS)에서 명시적인 염증을 유도하지 않았다. 스위스 웹스터 마우스에 PBS, PS-GAMP, VN04 H5N1 백신, 또는 백신 + PS-GAMP 또는 CT를 i.n. 투여하였다. (A) 면역화 2일 후 폐 (제1 및 제2 패널), 코 (제3 및 제4 패널) 및 CNS (제5 및 제6 패널)의 조직학적 검사. 폐의 폐포 및 기관지, 코의 비강 연관 림프계 조직, 및 뇌 조직의 후각 망울 영역은 파선 직사각형에 의해 윤곽이 표시되고, 상응하는 하단 패널에서 확대된다. 뇌 조직의 후각 망울 영역은 비강의 후각 신경과 직접 연결된다. 데이터는 각각 삼중으로 검정된 2개의 별도의 실험을 나타낸다. 폐 및 코에 대한 스케일 바, 상부 패널 400 μm 및 하부 패널 100 μm. CNS에 대한 스케일 바, 상부 패널 800 μm 및 하부 패널 200 μm. (B) 이전에 보고된 바와 같이 각 마우스의 호산구 침윤물, 상피 손상 및 괴사가 분석되었다 (48). 숫자는 호산구 침윤물, 상피 손상 또는 괴사가 있는 (+) 또는 없는 (-) 마우스의 수를 표시한다. n=6 마우스. (C) PS-GAMP 또는 CT의 존재 또는 부재 하에 VN04 H5N1 백신을 받은 마우스의 CNS에서 표시된 시토카인 및 케모카인의 발현은 면역화 2일 후 실시간 RT-PCR에 의해 결정되었다. n=2-8. 각 기호는 개별 마우스를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로서 제시되었다.
도 18A-18V. PS-GAMP 투여 또는 바이러스 감염 후 염증성 및 면역 세포의 변경. C57BL6 마우스에 CA09 H1N1 백신 + 20 μg의 PS-GAMP를 i.n. 투여하거나 (파란색), 또는 1×LD₅₀ CA09 H1N1 인플루엔자 바이러스로 감염시켰다 (적색). 폐 (A 내지 G) 또는 MLN (H 내지 N)의 호중구, NK, CD4⁺, 및 CD8⁺ T 세포, 단핵구, 및 CD11b⁺ 및 CD11b^- DC를 감염 후 또는 면역화 후 표시된 날짜에 (d.p.i) 유동 세포계측법에 의해 분석하였다. 비강 조직의 호중구, NK, CD4⁺, 및 CD8⁺ T 세포, 단핵구 및 DC (O 내지 T) 또는 뇌의 호중구 및 단핵구 (U 및 V)를 유사하게 분석하였다. n=4. 결과는 평균 ± SEM으로서 제시되었다. 통계적 분석, 일원 ANOVA. 0일차와 비교하여 *p<0.05, **p<0.01, 및 ***p<0.001. 실험은 2회 반복하였으며 유사한 결과를 갖는다.
도 19A-19C. PS-GAMP는 바이러스 감염과 대조적으로 폐에서 명시적인 염증을 유도하지 않았다. 마우스를 CA09 H1N1 백신 + 20 μg의 PS-GAMP로 i.n. 면역화하거나 (A), 1×LD₅₀ CA09 H1N1 인플루엔자 바이러스로 감염시켰다 (B). 면역화 또는 감염 후 표시된 날짜에 H&E 염색에 의해 폐를 분석하였다. 데이터는 각각 삼중으로 검정된 2개의 별도의 실험을 나타낸다. 스케일 바, 상부 패널의 경우 400 μm 및 하부 패널의 경우 100 μm. (C) 폐 염증은 오른쪽에 표시된 표준 스코어링 시스템에 따라 정량화되었다 (49). n=6. 데이터는 평균 ±SEM으로서 제시되었다. 비파라미터적 검정에 의해 0일차와 비교하여 *p<0.05 및 ***p<0.001.
도 20. PS-GAMP는 폐에서 면역 매개체의 일시적인 생성을 유도한다. 마우스에 20 μg의 PS-GAMP를 i.n. 제공하거나 (파란색), 1×LD₅₀ CA09 H1N1 인플루엔자 바이러스로 감염시켰다 (적색). 표시된 매개체의 mRNA 수준을 다양한 시점에서 실시간 RT-PCR에 의해 측정하였고, 미처리 마우스에 대해 정규화하였다. n=4. 결과는 평균 ± SEM으로서 제시되었다. 통계적 분석, 일원 ANOVA. 0일차와 비교하여 *p<0.05, ** p<0.01, 및 ***p<0.001. 실험은 2회 반복하였으며 유사한 결과를 갖는다.
도 21A-21C. PS-GAMP는 BALF에서 IFN-β 단백질을 잠시 상승시킨다. 마우스에 20 μg의 PS-GAMP를 i.n. 투여하거나 (파란색), 1×LD₅₀ CA09 H1N1 인플루엔자 바이러스로 감염시켰다 (적색). BALF 중 IFN-β (A), TNF-α (B) 및 IL-10 (C)의 단백질 수준을 다양한 시점에서 ELISA에 의해 측정하였다. n=4. 결과는 평균 ± SEM으로서 제시되었다. 통계적 분석, 일원 ANOVA. 0일차 (처리 전)와 비교하여 *p<0.05 및 ***p<0.001. 실험은 2회 반복하였으며 유사한 결과를 갖는다.
도 22A-22G. PS-GAMP는 전신적으로 어떠한 염증도 유도하지 않았다. 마우스를 CA09 H1N1 백신 + 20 μg의 PS-GAMP로 i.n. 면역화하였다. 체중 (A) 및 체온 (B)을 6일 동안 모니터링하였다. PBS를 받은 마우스가 대조군으로서 사용되었다. n=5. 혈청 IFN-β (C), TNF-α (D), IFN-γ (E), IL-6 (F), 및 IL-10 (G)을 또한 ELISA에 의해 6일 동안 모니터링하였다. n=4. 결과는 평균 ± SEM으로서 제시되었다. 실험은 2회 반복하였으며 유사한 결과를 갖는다.
도 23A-23D. PS-GAMP는 폐 및 MLN에서 세포외 Ag를 섭취하는 CD11b⁺ DC의 수를 증가시킨다. (A) 마우스를 20 μg의 PS-GAMP와 함께 또는 없이 OVA-AF647로 i.n. 백신접종하였다. OVA를 캡처하는 폐 CD11c⁺ 세포를 CD11b 및 CD24 발현에 대해 분석하였다. 플롯의 숫자는 개별 세포 서브세트의 평균 백분율 ± SEM이다. (B) OVA (비-형광) + PS-GAMP를 받은 마우스는 세포 활성화-관련 자가형광을 게이팅하기 위해 대조군으로서 사용되었다. OVA 흡수는 MLN으로부터 준비된 DC의 게이트에서 36시간 후에 분석되었으며, OVA⁺ DC가 대부분 CD11b⁺ DC인 것으로 밝혀졌다. (C) DC는 마우스에 20 μg의 DiD-PS-GAMP를 i.n. 투여하고 유사하게 분석하였을 때 소수의 CD11c⁺DiD⁺ 세포에 의해 나타난 바와 같이 MLN에서 PS-GAMP를 직접 섭취하지 않았다. (D) DiD⁺ 세포는 또한 PS-GAMP 투여 후 0시간에서 60시간까지 MLN에서 추적되었다. n=4. 결과는 평균 ± SEM으로서 제시되었다. 실험은 2회 반복하였으며 유사한 결과를 갖는다.
도 24A-24E. PS-GAMP는 생체내에서 Ag-흡수 또는 프로세싱을 증대시키지 않았다. PS-GAMP가 Ag-흡수 또는 Ag-프로세싱에 영향을 미치는지 여부는 AF647-표지된 OVA 및 DQ-OVA를 사용하여 평가되었다. DQ-OVA는 보디피 형광 염료 (DQ)와 OVA 접합이며, OVA가 단백질분해로 프로세싱되어 Ag-프로세싱을 평가하는데 일반적으로 사용되는 DQ-녹색 형광을 생성할 때까지 자기-켄칭된 상태를 유지한다. 이를 위해, 마우스에 PS-GAMP의 존재 (적색) 또는 부재 (파란색) 하에 DQ-OVA와 함께 AF647-OVA 또는 PBS (회색)를 i.n. 투여하고, 유동 세포계측법 분석을 위해 24시간 후에 안락사시켰다 (A). AF647-OVA는 DC11b⁺ DC의 게이트에서 분석되었으며, 이는 DQ-녹색 형광에 기초하여 OVA 절단에 대해 추가로 정량화되었다. AF647⁺ CD11b⁺ DC의 백분율 및 세포 수는 (B) 및 (C)에 요약되었다. 이들 세포의 AF647 및 DQ-녹색 MFI는 각각 (D) 또는 (E)에 제공되었다. 각 기호는 B 내지 E의 개별 마우스를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로서 제시되었다. 통계적 분석, (B-E)의 경우 일원 ANOVA. PS-GAMP의 존재 또는 부재 하에 *p<0.05, **p<0.01, 및 ***p<0.001. ns, 유의성 없음. 실험은 2회 반복하였으며 유사한 결과를 갖는다. 참고: PS-GAMP가 제시되었는지 여부에 관계없이 AF647⁺CD11b⁺ DC에서 DQ-녹색 형광 또는 OVA의 MFI에는 차이가 없었다 (D 및 E). 그러나, OVA에 양성인 CD11b⁺ DC의 백분율 및 수는 PS-GAMP의 존재 하에 강력하게 증가되었으며 (B 및 C), 이는 일차적으로 증가된 수의 CD11b⁺ DC로부터 이차적으로 PS-GAMP에 의해 유도된 면역 매개체에 기인하였다.
도 25A-25D. PS-GAMP는 Ag 교차-제시를 향상시킨다. (A) 마우스를 20 μg의 PS-GAMP와 함께 또는 없이 60 μg의 OVA로 i.n. 백신접종하였다. 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE)-표지된 OT-I 세포를 1일 후에 백신접종된 마우스에 전달하였다. 폐 및 MLN을 세포 전달 후 3일에 수집하였다. (B) OT-I 세포를 CFSE 형광의 단계적 감소에 의해 Ag-특이적 증식에 대해 분석하였다. 처음 2개의 패널 (PBS 및 OVA)의 삽도: CFSE 감소를 표시하기 위해 y-축의 축소된 축척. 높은 분열 (≥6, hi)의 세포가 게이팅되었다. 폐 (C) 및 MLN (D)에서 고도로 분할된 세포의 수를 요약하였다. n=4-6. 각 기호는 C 및 D의 개별 마우스를 나타낸다. 통계적 분석, (C 및 D)의 경우 일원 ANOVA. 결과는 평균 ± SEM으로서 제시되었다. PS-GAMP의 존재 또는 부재 하에 **p<0.01 및 ***p<0.001. 실험은 2회 반복하였으며 유사한 결과를 갖는다.
도 26A-26C. 비장, 폐 및 MLN에서 CD8⁺ T 세포 반응. C57BL/6 마우스를 CA09 H1N1 백신 + 20 μg의 PS-GAMP로 i.n. 면역화하였다. 마우스는 대조군으로서 PBS를 받았다. (A) 비장세포를 면역화 7일 후 단리하고, CA09 H1N1 백신으로 자극하였다. IFN-γ를 생성하는 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포의 대표적인 세포계측 프로파일이 표시된다. (B) 면역화 4일 후 폐에서 NP_366-374 ⁺ CD8⁺ T 세포의 대표적인 세포계측 프로파일. (C) PA_224-233 (파란색) 또는 PB1_703-711 (적색) 양성 세포의 백분율은 CD3⁺CD8⁺ T 세포의 게이트에서 결정되었다. 각 플롯은 동일한 그룹의 4개의 유사한 결과를 나타낸다. n=4. 데이터는 평균 ± SEM으로서 제시된다. 실험은 2회 반복하였으며 유사한 결과를 갖는다.
도 27A-27C. 조기 바이러스 특이적 GB⁺CD8⁺ T 세포 및 BALF 항체. (A) C57BL/6 마우스를 비면역화된 상태로 두거나, CA09 H1N1 백신 단독 또는 백신 + 20 μg의 PS-GAMP로 면역화한 다음, 2일 후에 10×LD₅₀ CA09 H1N1 바이러스로 챌린지하였다. 감염 후 4일에 폐를 수집하였다. (B) NP_366-374 사량체 (파란색), PB1_703-711 (적색), 또는 PA_224-233 (녹색) 양성 세포의 백분율이 GB⁺CD8⁺ T 세포의 게이트에서 수득되었다. 비면역화된/비챌린지된 마우스로부터의 CD8⁺ T 세포를 음성 대조군으로서 병행하여 분석하였다 (회색). n=3. (C) BALF를 면역화 6일 후 Ag-특이적 IgA 및 IgM 역가에 대해 분석하였다. n=4. 데이터는 평균 ± SEM으로서 제시된다. 실험은 2회 반복하였으며 유사한 결과를 갖는다.
도 28A-28I. 도 4A-4J에 대한 보충 데이터. (A) 백신접종 및 바이러스 챌린지 스케줄의 개략적 다이어그램. (B 내지 F) 각각 도 4A-4E에 기재된 것에 상응하는 마우스의 체중 변화 (B, C, E 및 F) 또는 생존 (D). (G 및 H) 마우스를 H7-Re1 H7N9 백신 단독으로 또는 20 μg의 PS-GAMP 또는 폴리 IC와 함께 i.n. 면역화하고, 14일 후에 임상적으로 단리된 SH13 H7N9 바이러스에 의해 챌린지하였다. n=10-13. (I) 도 4F에 기재된 마우스의 체중 변화. 통계적 분석, (B, C, E, F, H, I)의 경우 이원 ANOVA, (D 및 G)의 경우 로그-순위 검정. *p< 0.05, **p<0.01, ***p<0.001, 및 #p<0.05. 모든 실험은 적어도 2회 반복하였으며 유사한 결과를 갖는다.
도 29A-29B. DiD⁺AM이 백분율로 변경되지 않은 상태로 유지된 동안 생체내 시간 경과에 따른 SRB⁺AM 대 SRB⁺AEC의 역 상관관계. SRB-DiD-나노4를 마우스에 i.n. 접종하였다. (A) 총 폐 세포의 수에 대한 SRB⁺AM 및 SRB⁺AEC의 백분율 변화를 접종 후 시간 경과에 따라 추적하였다. n=4. (B) DiD⁺ AM을 나노입자 투여 후 12 및 18시간 후에 유동 세포계측법에 의해 분석하였다. n=4. 결과는 평균 ± SEM으로서 제시되었다. 통계적 분석, t-검정. 18시간과 12시간 사이에 비교하여 *p<0.05 및 **p<0.01. 모든 실험은 2회 반복하였으며 유사한 결과를 갖는다.
도 30A-30D. AM으로부터 AEC로의 cGAMP의 진입. (A) 마우스에 연속 3일 동안 간극 연접부 억제제 CBX 또는 PBS를 i.p. 주사한 후, 20 μg의 PS-GAMP를 i.n. 투여하였다. 12시간 후에 AM 및 AEC를 분류하고, 실시간 RT-PCR에 의해 Ifnb1 (B) 및 Gmcsf (C) 발현에 대해 분석하였다. mRNA 수준을 먼저 Gapdh로 정규화한 후, 미투여 마우스로부터 단리된 상응하는 세포로 정규화하였다. n=4. (D) 비분류된 폐 세포를 또한 비교를 위해 유사하게 분석하였다. n=8. 결과는 평균 ± SEM으로서 제시되었다. 각 기호는 B 내지 D의 개별 마우스를 나타낸다. 통계적 분석, t-검정. CBX의 존재 또는 부재 하에 *p<0.05 및 ***p<0.001. ns, 유의성 없음. 모든 실험은 2회 반복하였으며 유사한 결과를 갖는다.
도 31A-31E. 폴리 IC의 조직 및 세포 분포. 마우스는 20 μg의 로다민-표지된 폴리 IC를 비강내로 받았다. (A) CD11c⁺ 및 CD11c^- 서브세트에 의한 폴리 IC 흡수의 유동 세포계측법 분석을 위해 12시간 후에 폐를 절개하고 소화시켰다. CD11c⁺폴리 IC⁺ 세포는 CD24^- CD11b^- AM인 것으로 추가로 확인되었다. 폴리 IC 흡수는 다음으로 EpCAM⁺ AEC (B) 또는 CD11c⁺CD24⁺ DC (C)의 게이트에서 분석되었다. MLN (D) 및 비강 상피 및 림프 조직 (E)이 또한 폴리 IC 흡수를 결정하기 위해 단일-세포 현탁액을 위해 준비되었다. 데이터는 각각 삼중으로 검정된 2개의 별도의 실험을 나타낸다.
도 32A-32B. 골수 (BM) 세포 전달 후 세포 재구성 효능. 모든 백혈구에 대한 표면 바이오마커인 상호 CD45 대립유전자, CD45.1 및 CD45.2를 보유하는 마우스로부터 단리된 BM 세포를 주입하기 전에 마우스를 치명적인 방사선조사로 사전-조건화하였다. 공여자 세포는 CD45.1 또는 CD45.2에 대한 특이적 항체에 의해 수용자와 구별되었다. 전달 효능은 주입 3개월 후 수용자의 다양한 조직에서 백혈구 상의 CD45.1 또는 CD45.2 발현을 정량화함으로써 분석되었고 (A), (B)에 요약되어 있다. 각 기호는 (B)의 개별 마우스를 나타낸다. n=5-7. 실험은 2회 반복하였으며 유사한 결과를 갖는다.
도 33A-33K. 교차-보호 연구에 대한 보충 데이터. (A 내지 K) 각각 도 6A-6K에 기재된 마우스에 상응하는 체중 변화. 결과는 평균 ± SEM으로서 제시되었다. 통계적 분석, 이원 ANOVA. *p<0.05, **p< 0.01, ***p<0.001, 및 # p<0.05. 모든 실험은 2회 반복하였으며 유사한 결과를 갖는다.
도 34A-34B. 3가 계절성 인플루엔자 백신 및 PS-GAMP를 사용한 백신접종은 미스매치된 인플루엔자 B 바이러스에 대한 교차-보호성 면역을 유도한다. (A) 백신접종/샘플링 스케줄의 개략도. BALB/c 마우스를 3가 계절성 인플루엔자 백신 (2018-19) (SIV) 단독으로 또는 20 μg의 PS-GAMP와 함께 면역화하고, 1개월 후에 4×10⁵ TCID₅₀ 미스매치된 플로리다06 B 바이러스로 챌린지하였다. (B) 면역화 4일 후 폐를 단리하고 바이러스 역가에 대해 분석하였다. 각 기호는 (B)의 개별 마우스를 나타낸다. n=8-9. 결과는 평균 ± SEM으로서 제시되었다. 통계적 분석, 일원 ANOVA. PS-GAMP의 존재 또는 부재 하에 **p<0.01. ns, 유의성 없음. 실험은 2회 반복하였으며 유사한 결과를 갖는다.
도 35A-35E. PS-GAMP/불활성화된 인플루엔자 백신은 바이러스-특이적 폐 CD8⁺ T_RM 세포를 유도한다. (A) OT-I 마우스 모델의 백신접종/샘플링 타임라인의 개략도. 마우스에 OT-I 세포를 전달하고, 1시간 후에 PS-GAMP의 존재 또는 부재 하에 OVA로 i.n. 면역화하였다. 35일 후에, 유동 세포계측법 분석을 위해 희생되기 전에 순환하는 CD8⁺ T 세포를 배제하기 위해 마우스에 항-CD8β 항체를 i.v. 주사하였다. (B) 폐의 총 CD8⁺ T 세포는 CD3⁺ 및 CD8α⁺에 의해 게이팅되었고 (프로파일은 표시되지 않음), 폐 OT-I 세포는 CD45.2⁺ 및 CD8β^-로서 인식되었다 (항체 i.v. 주사됨) (처음 2개의 패널). T_RM 표현형을 갖는 OT-I 세포는 CD103⁺CD69⁺CD49a⁺로서 식별되었다. 비장의 OT-I 세포가 대조군으로 사용되었다 (회색). 폐 OT-I T_RM 세포의 수를 (C)에 요약하였다. n=6. (D 및 E) 마우스를 PS-GAMP의 존재 또는 부재 하에 CA09 H1N1 백신으로 i.n. 면역화하였다. 유동 세포계측법을 위해 6개월 후에 폐를 단리하였다. NP_366-374 ⁺ CD8⁺ T 세포를 게이팅하고, CD103 및 CD69 발현에 대해 검증하였으며 (D), NP_366-374 ⁺ CD8⁺ T_RM 세포의 수를 (E)에 요약하였다. n=4. 비장의 NP_366-374 ⁺ CD8⁺ T 세포가 대조군으로 사용되었다. 결과는 평균 ± SEM으로서 제시되었다. 통계적 분석, (C)의 경우 t-검정, (E)의 경우 일원 ANOVA. PS-GAMP의 존재 또는 부재 하에 ***p<0.001. 모든 실험은 2회 반복하였으며 유사한 결과를 갖는다.
도 36A-36D. FTY720은 인플루엔자 백신/PS-GAMP에 의해 유발된 교차-보호에 영향을 미치지 않았다. (A 및 B) 마우스를 CA09 H1N1 백신 단독으로 또는 20 μg의 PS-GAMP와 함께 i.n. 면역화하고, 1개월 후에 5×LD₅₀ GZ89 H3N2 바이러스로 챌린지하였다. (C 및 D) 마우스가 챌린지 후 -2일에서 14일 사이에 FTY720 (1 mg/kg/일)의 매일 주사를 추가로 받은 것을 제외하고는 A 및 B와 같이 마우스를 면역화하고 챌린지하였다. n=6-8. 통계적 분석, (B 및 D)의 경우 이원 ANOVA 및 (A 및 C)의 경우 로그-순위 검정. 백신 단독과 비교하여 *p<0.05, **p<0.01, 및 ***p<0.001. 모든 실험은 2회 반복하였으며 유사한 결과를 갖는다.
도 37A-37E. 페럿에서 PS-GAMP의 안전성 및 효능. 페럿을 200 μg의 PS-GAMP와 함께 또는 없이 불활성화된 바이러스 백신 (퍼스 H3N2 15 μg)으로 i.n. 면역화하였다. 동물의 체중 (A) 및 체온 (B)을 6일 동안 모니터링하였다. (C) 면역화 4주 후 혈청을 수집하고, 퍼스H3N2-특이적 IgG 역가에 대해 시험하였다 (C). HAI 역가를 또한 퍼스H3N2 (D) 또는 미시간H1N1 (E) 바이러스 균주에 대해 측정하였다. n=4. 각 기호는 C 내지 E의 개별 동물을 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로서 제시되었다. 통계적 분석, (C 및 D)의 경우 일원 ANOVA. PS-GAMP의 존재 대 부재와 비교하여 **p< 0.01.

상세한 설명

cGAS-cGAMP-STING 경로는 예를 들어, 미생물 감염 또는 암 및 자가면역 장애를 포함한 병태생리학적 상태로 인해 세포질 DNA의 존재 하에 활성화되는 중요한 면역 감시 경로이다. 시클릭 GMP-AMP 신타제 (cGAS)는 뉴클레오티딜트랜스퍼라제 패밀리에 속하며, 시토솔 dsDNA에 결합시 활성화되어 신호전달 분자 시클릭 GMP-AMP (또는 2'-3'-cGAMP 또는 시클릭 구아노신 모노포스페이트-아데노신 모노포스페이트)를 생성하는 범용 DNA 센서이다. 미생물 감염 동안 제2 메신저로서 작용하는 2'-3'-cGAMP는 STING에 결합하고 활성화시켜 유형 I 인터페론 (IFN) 및 면역 반응을 촉발하는 다른 공동-자극성 분자의 생성을 초래한다. 감염성 질환에서의 역할 외에도, cGAS/STING 경로는 자가면역 질환 및 암 면역요법에 대한 유망한 새로운 표적으로 부상하였다. 종양 미세환경에 존재하는 DNA 단편은 수지상 세포 (DC)에서 cGAS를 활성화시킨 다음 IFN-유도된 DC 성숙 및 암 세포에 대한 강력하고 유익한 면역 반응의 활성화를 수행하는 것으로 제안된다. 별도의 문맥에서, cGAS/STING 경로의 조절장애는 자기 DNA 촉발된 염증성 및 자가면역 장애, 예컨대 전신성 홍반성 루푸스 (SLE) 및 아이카디-구티에레스 증후군과 관련이 있다.

수십년간의 조사에도 불구하고 효과적인 점막 아주반트는 계속 부족하다. 인터페론 유전자 자극인자 (STING)의 천연 효능제인 2'-3'-cGMP-AMP (cGAMP)는 DNA 바이러스 감염 또는 조직 손상에 반응하여 생성되는 2차 메신저이다 (10, 11). 이는 T-헬퍼 1 (Th1) 면역 반응의 크기, 특히 CD8+ T 세포의 면역 반응의 크기를 결정하는데 도움이 되는 유형 I 인터페론 (IFN-I)의 생성을 자극한다 (12, 13). STING 효능제는 종양내 투여 후 강력한 항종양 면역을 유발하고 피내 인플루엔자 백신을 증대시킬 수 있는 강력한 아주반트이다 (13, 14). 그러나, 이들 작은 수용성 효능제를 점막 아주반트로서 사용하는 것은 어려운 일이다. 이들은 유형 II AEC에 의해 분비되는 지질 및 단백질의 혼합물인 폐 계면활성제 (PS) 층의 무결성을 손상시키지 않고 항원 (Ag)-제시 세포 (APC) 및/또는 폐포 상피 세포 (AEC)의 시토솔로 전달되어야 한다. 이 PS 층은 폐포의 내부 폐포 상피로부터 외부 공기를 분리하는 강한 장벽을 형성하고, 나노입자 및 친수성 분자가 AEC에 접근하는 것을 방지한다 (15, 16).

아형내 변이체 뿐만 아니라 다른 아형의 인플루엔자 바이러스에 대한 보호를 부여하는 "범용" 인플루엔자 백신의 개발이 매우 바람직하다. 그러나, 이러한 범용 인플루엔자 백신이 달성가능한지 여부는 여전히 불분명하다. 바이러스 감염이 CD8⁺ T 세포에 의해 일차적으로 매개되는 이종아형 면역을 자극할 수 있다는 것은 인간 및 동물 모델 모두에서 오랫동안 인식되어 왔다 (2, 3, 6). 여기에서, PS-GAMP로 아주반트된 불활성화된 H1N1 백신을 사용한 단일 면역화는 면역화 후 2일 (d)만큼 조기에 H1N1, H3N2, H5N1 또는 H7N9 바이러스를 사용한 치명적인 챌린지에 대한 보호를 부여하였다. 이 교차-보호는 폐의 내구적 바이러스-특이적 CD8⁺ T_RM 세포와 공동으로 적어도 6개월 동안 지속되었다. 이는 주로 PS-GAMP-아주반트 인플루엔자 백신이 AEC 활성화, 신속한 CD11b⁺ DC 동원 및 분화, 및 호흡기계에서 강력한 CD8⁺ T 세포 반응을 특징으로 하는 바이러스 감염-유도된 면역을 시뮬레이션하였다는 사실 때문이었다. PS-GAMP는 불활성화된 인플루엔자 바이러스 백신 뿐만 아니라 다른 백신, 예를 들어 다중 B 및 T 세포 에피토프 또는 인플루엔자 백신 서브유닛의 칵테일을 포함하는 백신과 양립가능한 독립형 아주반트이다. 강한 이종아형 면역을 위한 비복제 인플루엔자 백신을 강화시키는 PS-GAMP의 능력은 인간에서 그의 효능이 나타난 경우 "범용" 인플루엔자 백신을 위한 유망한 아주반트로 만든다. 이와 같이, 백신을 "복제"하는 것보다 유의한 장점을 제공할 것이다.

일차적으로 APC를 표적화하는 통상적인 백신 아주반트와 달리, PS-GAMP는 AM 및 AEC 둘 모두를 활성화시켰으며; 이론에 얽매이지 않고, AEC 활성화는 AEC의 STING 결핍 뿐만 아니라 간극 연접부의 차단이 아주반트성을 상당히 저하시킨 반면, 골수성 세포의 STING 결핍은 그렇지 않았기 때문에, 아주반트성에 중요한 것으로 나타났다. 선천성 및 적응성 면역 반응을 조정하는데 있어 AM보다 AEC가 수행하는 중추적인 역할은 인플루엔자 바이러스 감염의 초기 단계 동안 설명된 것과 일치한다 (24). PS 층을 파괴하지 않고 AEC에 진입하는 cGAMP의 능력은 PS-생체모방 리포솜으로의 SP-A 및 SP-D의 혼입 후 SP-A/D-수용체-매개 엔도시토시스에 기인하며, 이는 어떠한 비-PS-생체모방 리포솜에서도 실현가능하지 않다 (39-41). 또한, 이 아주반트는 면역화 후 단 2일 이내에 강력한 보호를 유도할 수 있었으며, 이는 효과를 나타내기 위해 적어도 10-14일이 요구되는 현재의 인플루엔자 백신과 극명한 대조를 이룬다. 조기 교차-보호는 특별히 항바이러스 약물-저항성 바이러스 또는 고병원성 바이러스, 예컨대 H5N1 및 H7N9 바이러스가 대유행으로 출현할 때 최초 반응자 및 고위험 개체를 보호하는데 극히 중요하다. 바이러스 확산은 유행병에서 대유행병으로 확장된 후 기하급수적으로 가속화될 수 있기 때문에, 유행병 동안 조기 보호는 바이러스 확산을 국한시키고 유행병이 대유행병이 되는 것을 최소화하거나 예방하여 수백만 명의 생명을 구하는 가장 효과적인 수단이 될 것이다 (42).

폐 계면활성제 (PS)-생체모방 나노입자

200-400 nm의 평균 크기를 갖는 PS-생체모방 나노입자를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 나노입자는 복수의 폐 계면활성제-생체모방 분자 (여기서 나노입자는 음으로 하전됨); 및 나노입자에 의해 둘러싸인 하나 이상의 카고 분자 (여기서 카고 분자는 최대 1200 Da의 분자량을 가짐)를 포함한다.

항원에 대한 면역 반응을 촉진하는 방법이 본원에 제공된다. 방법은 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 대상체에게 투여하는 단계; 및 항원을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

인플루엔자를 갖는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 방법은 치료 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 대상체에게 투여하는 단계; 및 항원을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 카고 분자는 cGAMP이고 항원은 인플루엔자 백신이다.

기도 질환을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 방법은 치료 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 카고 분자는 지속 작용-β2-효능제 (LABA) (예를 들어, 포르모테롤, 살메테롤 또는 빌란테롤); 코르티코스테로이드 (ICS) (예를 들어, 부데소니드, 플루티카손 프로피오네이트 또는 플루티카손 푸로에이트); 류코트리엔-경로 조정제 (예를 들어, 몬테루카스트 또는 질류톤); 키나제 (예를 들어, 비장 티로신 키나제, p38 미토겐-활성화 단백질 키나제 (MAPK), 포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트 3-키나제 (PI3K), 야누스 키나제 (Jak) 또는 포스포디에스테라제-4 (PDE4))를 표적화하는 억제제; 수용체 (예를 들어, Th2 세포 상에 발현되는 화학유인물질 수용체-상동성 분자 (CRTH2), 케모카인 수용체 2 (CCR2))의 효능제 또는 길항제; 이온 채널 (예를 들어, GABA 수용체, 일시적 수용체 전위 양이온 채널, 서브패밀리 A, 구성원 1 (TRPA1), 또는 전압-게이팅 나트륨 채널)의 효능제 또는 길항제; IFN-α의 유도제; 지속-작용 무스카린성 길항제/항콜린제 (LAMA); IL-5, IL-13, IL-33 또는 흉선 기질 림포포이에틴에 대한 억제제; CXCR2 길항제; 전염증성 시토카인 (예를 들어, TNF-α, TNF-β 또는 IL-6)을 차단하는 분자; IL-17/T_H17을 차단하는 분자; 마크로라이드; HDAC2를 활성화시키는 분자; STAT6 억제제 (예를 들어, AS1517499); 항바이러스 소분자 약물 (예를 들어, 오셀타미비르 (타미플루), 리렌자 또는 자나미비르); 및/또는 파비피라비르 (T705)이다.

암을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 방법은 치료 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 카고 분자는 화학요법제이다.

본원에 기재된 방법은 PS-생체모방 나노입자의 사용 없이 수행되는 유사한 방법과 비교하여 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 200배, 적어도 500배, 적어도 1000배만큼의 본원에 기재된 바와 같은 카고 분자의 전달 효능의 개선을 제공할 수 있다.

나노입자

일부 실시양태에서, 나노입자는 리포솜, 소포, 에멀젼 또는 미셀이다.

일부 실시양태에서, 나노입자는 세제, 습윤제, 유화제, 발포제 또는 분산제를 포함하는 하나 이상의 유형의 계면활성제를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 계면활성제는 적어도 하나의 소수성 말단 및/또는 적어도 하나의 친수성 말단을 포함한다. 일부 실시양태에서, 계면활성제는 양으로 하전되거나, 중성이거나, 또는 음으로 하전된다.

일부 실시양태에서, 계면활성제는 지질이다. 일부 실시양태에서, 계면활성제는 인지질이다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 계면활성제 층을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 수중유중수 에멀젼이다.

일부 실시양태에서, 나노입자 중 계면활성제의 퍼센트는 0 중량% 내지 100 중량%, 5 중량% 내지 100 중량%, 10 중량% 내지 100 중량%, 15 중량% 내지 100 중량%, 20 중량% 내지 100 중량%, 25 중량% 내지 100 중량%, 30 중량% 내지 100 중량%, 35 중량% 내지 100 중량%, 40 중량% 내지 100 중량%, 45 중량% 내지 100 중량%, 50 중량% 내지 100 중량%, 55 중량% 내지 100 중량%, 60 중량% 내지 100 중량%, 65 중량% 내지 100 중량%, 70 중량% 내지 100 중량%, 75 중량% 내지 100 중량%, 80 중량% 내지 100 중량%, 85 중량% 내지 100 중량%, 90 중량% 내지 100 중량%, 또는 95 중량% 내지 100 중량%의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 나노입자 중 계면활성제의 퍼센트는 0 중량% 내지 95 중량%, 0 중량% 내지 90 중량%, 0 중량% 내지 85 중량%, 0 중량% 내지 80 중량%, 0 중량% 내지 75 중량%, 0 중량% 내지 70 중량%, 0 중량% 내지 65 중량%, 0 중량% 내지 60 중량%, 0 중량% 내지 55 중량%, 0 중량% 내지 50 중량%, 0 중량% 내지 45 중량%, 0 중량% 내지 40 중량%, 0 중량% 내지 35 중량%, 0 중량% 내지 30 중량%, 0 중량% 내지 25 중량%, 0 중량% 내지 20 중량%, 0 중량% 내지 15 중량%, 0 중량% 내지 10 중량%, 또는 0 중량% 내지 5 중량%의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 나노입자 중 계면활성제의 퍼센트는 0 중량%, 대략 1 중량%, 대략 2 중량%, 대략 3 중량%, 대략 4 중량%, 대략 5 중량%, 대략 10 중량%, 대략 15 중량%, 대략 20 중량%, 대략 25 중량%, 대략 30 중량%, 대략 35 중량%, 대략 40 중량%, 대략 45 중량%, 대략 50 중량%, 대략 55 중량%, 대략 60 중량%, 대략 65 중량%, 대략 70 중량%, 대략 75 중량%, 대략 80 중량%, 대략 85 중량%, 대략 90 중량%, 대략 95 중량%, 또는 대략 100 중량%일 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 나노입자는 200 nm 내지 210 nm, 210 nm 내지 220 nm, 220 nm 내지 230 nm, 230 nm 내지 240 nm, 240 nm 내지 250 nm, 250 nm 내지 260 nm, 260 nm 내지 270 nm, 270 내지 280 nm, 280 nm 내지 290 nm, 290 nm 내지 300 nm, 300 nm 내지 310 nm, 310 nm 내지 320 nm, 320 nm 내지 330 nm, 330 nm 내지 340 nm, 340 nm 내지 350 nm, 350 nm 내지 360 nm, 360 nm 내지 370 nm, 370 nm 내지 380 nm, 380 nm 내지 390 nm, 또는 390 nm 내지 400 nm의 평균 크기를 가질 수 있다.

폐 계면활성제 (PS)

폐 계면활성제는 유형 II 폐포 세포에 의해 형성된 표면-활성 지단백질 복합체 (인지단백질)이다. 계면활성제를 구성하는 단백질 및 지질은 친수성 및 소수성 영역을 모두 갖는다. 계면활성제의 주요 지질 구성성분인 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC)은 물에서의 친수성 헤드 기 및 공기를 향한 소수성 꼬리로 폐포의 공기-물 계면에 흡착함으로써 표면 장력을 감소시킨다.

폐 계면활성제는 전형적으로 90% 지질 및 10% 단백질로 이루어지고, 진화적으로 보존된다. 지질은 8-10%의 콜레스테롤, 60-70%의 양쪽성 이온성 포스파티딜콜린 (PC), 주로 디팔미토일화된 포스파티딜콜린 (DPPC), 최대 8-15%의 음이온성 포스파티딜글리세롤 (DPPG), 및 상대적으로 작은 비율의 기타 지질을 함유한다 (17).

폐 계면활성제 (PS)-생체모방 나노입자

일부 실시양태에서, PS-생체모방 나노입자는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) (DPPG), 콜레스테롤, 폴리에틸렌 글리콜 (예를 들어, PEG2000), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (DPPE-PEG2000), 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린, 스핑고미엘린, 및/또는 리소인지질을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 복수의 PS-생체모방 분자를 포함하는 나노입자일 수 있다.

일부 실시양태에서, PS-생체모방 분자는 지질, 단백질, 지단백질, 인지질 또는 인지단백질이다.

일부 실시양태에서, PS-생체모방 분자는 폐 계면활성제의 도메인, 모이어티, 일부 또는 전체 분자이다. 일부 실시양태에서, PS-생체모방 분자는 천연 생성물이다. 일부 실시양태에서, PS-생체모방 분자는 인공적으로 합성된다.

일부 실시양태에서, PS-생체모방 분자는 양으로 하전되거나, 중성이거나, 또는 음으로 하전된다. 일부 실시양태에서, PS-생체모방 분자는 적어도 하나의 소수성 말단 및/또는 적어도 하나의 친수성 말단을 갖는다.

일부 실시양태에서, PS-생체모방 분자는 하나 이상의 지방산 기 또는 그의 염, 및/또는 하나 이상의 헤드 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 지방산 기는 소화가능한 장쇄 (예를 들어, C8-C50), 치환된 또는 비치환된 탄화수소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 지방산 기는 Cl0-C20 지방산 또는 그의 염일 수 있다. 일부 실시양태에서, 지방산 기는 Cl5-C20 지방산 또는 그의 염일 수 있다. 일부 실시양태에서, 지방산 기는 Cl5-C25 지방산 또는 그의 염일 수 있다. 일부 실시양태에서, 지방산 기는 불포화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 지방산 기는 단일불포화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 지방산 기는 다불포화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 불포화 지방산 기의 이중 결합은 시스 형태일 수 있다. 일부 실시양태에서, 불포화 지방산의 이중 결합은 트랜스 형태일 수 있다. 일부 실시양태에서, 지방산 기는 팔미트산이다. 일부 실시양태에서, 헤드 기는 포스파티딜콜린이다.

PS-생체모방 나노입자의 카고 분자

본원에 기재된 나노입자에 운반될 수 있는 카고 분자는 폐의 세포, 예를 들어 폐포 상피 세포 (AEC) 및/또는 폐포 대식세포 (AM)에 대해 치료적 또는 예방적 효과를 갖는 것을 포함할 수 있다. 예는 예를 들어, 면역 반응을 자극하는 아주반트로서 작용하기 위해 공동-투여된 항원에 대한 면역 반응을 향상시키는 작용제 (면역자극제); 예를 들어, 특히 알레르기, 천식 및 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD)을 포함한 염증-연관 폐 질환을 억압하기 위해 염증과 연관된 신호전달 경로를 차단하는 작용제 (항염증제 또는 면역억압제); 및 항암제, 예컨대 화학요법제를 포함한다. 카고 분자는 PS에 의해 완전히 둘러싸일 수 있거나 (예를 들어, 나노입자의 외부 표면을 형성하는 PS 막 내부에 함유됨), PS에 혼합될 수 있거나 (예를 들어, 고체 나노입자), 막의 외부/내부에 있을 수 있다/막에 부착될 수 있다.

일부 실시양태에서, 카고 분자는 AM 및 AEC 사이에 존재하는 간극 연접부를 통해 전달될 수 있고, 간극 연접부를 통과하기에 충분히 작은 소분자로 제한된다. 상세한 설명은 참고문헌 29 및 30에서 찾을 수 있다. 그러므로, 일부 실시양태에서, 카고 분자는 10 Da 내지 1200 Da, 50 Da 내지 1200 Da, 100 Da 내지 1200 Da, 200 Da 내지 1200 Da, 300 Da 내지 1200 Da, 400 Da 내지 1200 Da, 500 Da 내지 1200 Da, 600 Da 내지 1200 Da, 700 Da 내지 1200 Da, 800 Da 내지 1200 Da, 900 Da 내지 1200 Da, 1000 Da 내지 1200 Da, 또는 1100 Da 내지 1200 Da 범위의 분자량을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 카고 분자는 10 Da 내지 50 Da, 10 Da 내지 100 Da, 10 Da 내지 200 Da, 10 Da 내지 300 Da, 10 Da 내지 400 Da, 10 Da 내지 500 Da, 10 Da 내지 600 Da, 10 Da 내지 700 Da, 10 Da 내지 800 Da, 10 Da 내지 900 Da, 10 Da 내지 1000 Da, 10 Da 내지 1100 Da, 또는 10 Da 내지 1200 Da 범위의 분자량을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 카고 분자는 대략 10 Da, 20 Da, 50 Da, 100 Da, 200 Da, 300 Da, 400 Da, 500 Da, 600 Da, 700 Da, 800 Da, 900 Da, 1000 Da, 1100 Da, 또는 1200 Da의 분자량을 가질 수 있다.

일부 실시양태에서, 카고 분자는 면역자극제 (아주반트로서 사용하기 위한), 예를 들어 인터페론 유전자 자극인자 (STING) 효능제 (예를 들어, cGAMP, CDN, MK-1454, ADU-S100, E7766); TLR3, TLR7, TLR8 또는 TLR9를 포함하는 세포내 Toll-유사 수용체에 대한 효능제 (예를 들어, 이미퀴모드, 레시퀴모드 (R848), 이미다조퀴놀린 (IMQ), 모톨리모드, CU-CPT4a, IPH-3102 또는 린타톨리모드); 및/또는 노디니팁 (NOD1), NOD2, NLPR3 또는 NPLRC3에 대한 효능제 (예를 들어, 무라밀디펩티드 (MDP), FK565 또는 FK156)일 수 있다.

일부 실시양태에서, 카고 분자는 기도 질환 (예를 들어, 천식, 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD) 또는 알레르기)을 위한 항염증제, 예를 들어 지속 작용-β2-효능제 (LABA) (예를 들어, 포르모테롤, 살메테롤 또는 빌란테롤); 코르티코스테로이드 (ICS) (예를 들어, 부데소니드, 플루티카손 프로피오네이트 또는 플루티카손 푸로에이트); 류코트리엔-경로 조정제 (예를 들어, 몬테루카스트 또는 질류톤); 키나제 (예를 들어, 비장 티로신 키나제, p38 미토겐-활성화 단백질 키나제 (MAPK), 포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트 3-키나제 (PI3K), 야누스 키나제 (Jak) 또는 포스포디에스테라제-4 (PDE4))를 표적화하는 억제제; 수용체 (예를 들어, Th2 세포 상에 발현되는 화학유인물질 수용체-상동성 분자 (CRTH2), 케모카인 수용체 2 (CCR2))의 효능제 또는 길항제; 이온 채널 (예를 들어, GABA 수용체, 일시적 수용체 전위 양이온 채널, 서브패밀리 A, 구성원 1 (TRPA1), 또는 전압-게이팅 나트륨 채널)의 효능제 또는 길항제; IFN-α의 유도제; 지속-작용 무스카린성 길항제/항콜린제 (LAMA); IL-5, IL-13, IL-33 또는 흉선 기질 림포포이에틴에 대한 억제제; CXCR2 길항제; 전염증성 시토카인 (예를 들어, TNF-α, TNF-β 또는 IL-6)을 차단하는 분자; IL-17/T_H17을 차단하는 분자; 마크로라이드; HDAC2를 활성화시키는 분자; 및/또는 STAT6 억제제 (예를 들어, AS1517499)일 수 있다. 상세한 설명은 문헌 [Barnes, "Therapeutic approaches to asthma-chronic obstructive pulmonary disease overlap syndromes." Journal of Allergy and Clinical Immunology 136.3 (2015): 531-545]; [Glossop et al. "Small-molecule anti-inflammatory drug compositions for the treatment of asthma: a patent review (2013-2014)." Expert opinion on therapeutic patents 25.7 (2015): 743-754]에서 찾을 수 있으며, 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다.

일부 실시양태에서, 카고 분자는 폐 바이러스 감염, 예를 들어 독감 A 및 B 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV), 리노바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 또는 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS) 코로나바이러스의 치료를 위한 항바이러스 소분자 약물일 수 있다. 항바이러스 소분자 약물은 독감 바이러스의 뉴라미니다제를 억제하기 위한 오셀타미비르 (타미플루), 리렌자 및 자나미비르; 및 다양한 폐 바이러스 감염의 치료를 위한 파비피라비르 (T705)를 포함한다.

일부 실시양태에서, 카고 분자는 암에 대한 화학요법제, 예를 들어 비소세포 폐암을 위한 제피티닙, 에를로티닙, 에베롤리무스, 아파티닙 및/또는 크리조티닙; 소세포 폐암을 위한 독소루비신, 에토포시드, 옵디보 및/또는 트렉솔; 비인두암을 위한 시스플라틴, 카르보플라틴, 젬시타빈, 독소루비신 및/또는 D5-플루오로우라실 (5-FU); 기관암을 위한 에토포시드, 시스플라틴 및/또는 카르보플라틴; 기관지암을 위한 에토포시드, 시스플라틴, 카르보플라틴, 5-FU, 도세탁셀, 파클리탁셀 및/또는 에피루비신이다.

일부 실시양태에서, 카고 분자는 표지제이고, 예를 들어 나노입자는 예를 들어 카고 분자에 더하여 하나 이상의 검출가능한 모이어티, 예를 들어 형광 염료, 예를 들어 카르보시아닌, 인도카르보시아닌, 옥사카르보시아닌, 투이카르보시아닌, 메로시아닌, 폴리메틴, 쿠마린, 로다민, 술포로다민 B (SRB), 크산텐, 플루오레세인, 붕소-디피로메탄 (보디피) 염료, 또는 그의 유도체 (보디피 FL, 보디피 R6G, 보디피 TR, 보디피 TMR, 보디피 581/591, 보디피 630/650 및 보디피 650/665를 포함하나 이에 제한되지는 않음), Cy5, Cy5.5, Cy7, 비보태그-680, 비보태그-S680, 비보태그-S750, 알렉사플루오르660, 알렉사플루오르680, 알렉사플루오르700, 알렉사플루오르750, 알렉사플루오르790, Dy677, Dy676, Dy682, Dy752, Dy780, 디라이트(DyLight)547, 디라이트647, 하이라이트(HiLyte) 플루오르 647, 하이라이트 플루오르 680, 하이라이트 플루오르 750, IR800 (디메틸{4-[1,5,5-트리스(4-디메틸아미노페닐)-2,4-펜타디에닐리덴]-2,5--시클로헥사디엔-1-일리덴}암모늄 퍼클로레이트), IRDye 800CW, IRDye 800RS, IRDye 700DX, ADS780WS, ADS830WS, ADS832WS, 1,1-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도디카르보시아닌, 4-클로로벤젠술포네이트 염 (DiD), 1,1'-디옥타데실-3,3,3'3'-테트라메틸인도카르보시아닌 (DiI, DiIC18(3)으로도 공지됨), 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 검출가능한 모이어티를 포함할 수 있다. 검출가능한 모이어티는 예를 들어 나노입자 내부 또는 외부에 있을 수 있다 (예를 들어, 외부 표면 막의 내부 또는 이에 연결됨).

일부 실시양태에서, 카고 분자는 소분자 또는 항체 단편, 예를 들어 항체의 항원-결합 단편이다.

STING 효능제

인터페론 유전자 자극인자 (STING) 효능제는 임의의 적절한 효능제일 수 있다. 일부 실시양태에서, STING 효능제는 핵산, 단백질, 펩티드 또는 소분자이다.

일부 실시양태에서, STING 효능제는 뉴클레오티드성 STING 효능제 또는 비-뉴클레오티드성 STING 효능제일 수 있다.

뉴클레오티드성 STING 효능제는 천연 시클릭 디뉴클레오티드 (CDN), 예를 들어 cGAMP; 또는 합성 CDN, 예를 들어 '디티오' 유사체 ADU-S100 (c-디[AMP] 스캐폴드 상의 황-변형 포스포디에스테르 연결), 또는 MK-1454를 포함한다. 비-뉴클레오티드성 STING 효능제는 혈관 파괴제, 예를 들어 5,6-디메틸-9-옥소-9H-크산텐-4-아세트산 (DMXAA, 바디메잔 또는 ASA404로도 공지됨); 또는 아미도벤즈이미다졸 STING 효능제 (WO2019069270A 참조)를 포함한다. 다른 STING 효능제는 WO2015185565A1 (플루오린화된 유도체 포함) 및 WO2019079261A1에 기재되어 있으며, 이들은 본원에 참조로 포함된다. 상세한 설명은 문헌 [Marloye et al. "Current patent and clinical status of stimulator of interferon genes (STING) agonists for cancer immunotherapy." (2019): 87-90]에서 찾을 수 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다.

cGAMP

본원에서 사용된 바와 같이, "cGAMP", 또는 시클릭 GMP-AMP, 또는 2'-3'-cGMP-AMP는 시클릭 구아노신 모노포스페이트-아데노신 모노포스페이트를 지칭한다.

항원

일부 실시양태에서, 나노입자는 항원을 포함하거나 항원과 공동-투여된다. 일부 실시양태에서, 항원은 바이러스 항원이다.

일부 실시양태에서, 항원은 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 RSV F 단백질 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 SARS 코로나바이러스 (CoV) 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 SARS-CoV의 스파이크 (S) 단백질이다. 일부 실시양태에서, 항원은 리노바이러스 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 파라인플루엔자 항원이다.

일부 실시양태에서, 항원은 인플루엔자 바이러스 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 인플루엔자 B 바이러스 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 개별적으로 또는 단백질의 다양한 조합으로 인플루엔자 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 (NP), RNA 폴리머라제 PB1, PB2, PA, 혈구응집소 (HA), 또는 뉴라미니다제 (NA)이다.

화학요법제

본원에서 사용된 바와 같은 "화학요법제"는 악성 세포 및 조직을 파괴하도록 의도된 세포독성 약물 또는 약물의 세포독성 혼합물이다. 화학요법제의 비제한적인 예는 하나 이상의 알킬화제; 안트라사이클린; 세포골격 파괴제 (탁산); 에포틸론; 히스톤 데아세틸라제 억제제; 토포이소머라제 I의 억제제; 토포이소머라제 II의 억제제; 키나제 억제제; 뉴클레오티드 유사체 및 전구체 유사체; 펩티드 항생제; 백금-기반 작용제; 레티노이드; 및/또는 빈카 알칼로이드 및 유도체; 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학요법제는 뉴클레오티드 유사체 또는 전구체 유사체, 예를 들어 아자시티딘; 아자티오프린; 카페시타빈; 시타라빈; 독시플루리딘; 플루오로우라실; 젬시타빈; 히드록시우레아; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 또는 티오구아닌이다. 다른 예는 시클로포스파미드, 메클로레타민, 클로람부실, 멜팔란, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미톡산트론, 발루비신, 파클리탁셀, 도세탁셀, 에토포시드, 테니포시드, 타플루포시드, 블레오마이신, 카르보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 올-트랜스 레티노산, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈, 및 베바시주맙 (또는 그의 항원-결합 단편)을 포함한다. 화학요법제의 추가 예는 관련 기술분야에 공지되어 있다.

일부 실시양태에서, 화학요법제는 암 치료를 위해 사용될 수 있으며, 예를 들어 비소세포 폐암을 위한 제피티닙, 에를로티닙, 에베롤리무스, 아파티닙 및/또는 크리조티닙; 소세포 폐암을 위한 독소루비신, 에토포시드, 옵디보 및/또는 트렉솔; 비인두암을 위한 시스플라틴, 카르보플라틴, 젬시타빈, 독소루비신 및/또는 D5-플루오로우라실 (5-FU); 기관암을 위한 에토포시드, 시스플라틴, 카르보플라틴; 기관지암을 위한 에토포시드, 시스플라틴, 카르보플라틴, 5-FU, 도세탁셀, 파클리탁셀 및/또는 에피루비신이다.

PS-생체모방 나노입자의 제조 방법

본원에 기재된 나노입자는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) (DPPG), 및 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (DPPE-PEG2000) 및 콜레스테롤은 카고 분자에 따라 예를 들어 약 10:1:1:1, 또는 5-12: 0.5-1.5: 0.5-1.5: 0.5-1.5의 질량비로 혼합될 수 있다.

일부 실시양태에서, 하나 이상의 계면활성제는 관련 기술분야에 공지된 임의의 질량비로 혼합될 수 있다.

혼합물은 클로로포름, 디클로로메탄, 트리클로로에틸렌, 메틸클로로포름, 또는 관련 기술분야에 공지된 기타 유기 용매에 용해될 수 있다.

일부 실시양태에서, 지질의 혼합물은 용매에 용해되고 cGAMP 용액과 혼합되었다. 용매 및 cGAMP 용액 사이의 부피비는 약 1:5, 약 1:4, 약 1:3, 약 1:2, 약 1:1, 약 2:1, 약 3:1, 약 4:1, 약 5:1, 약 6:1, 약 7:1, 약 8:1, 약 9:1, 약 10:1 또는 그 이상일 수 있다.

일부 실시양태에서, 나노입자 용액 중 cGAMP의 농도는 약 0.1 μg/ml, 약 0.5 μg/ml, 약 1 μg/ml, 약 5 μg/ml, 약 10 μg/ml, 약 20 μg/ml, 약 30 μg/ml, 약 40 μg/ml, 약 50 μg/ml, 약 60 μg/ml, 약 70 μg/ml, 약 80 μg/ml, 약 90 μg/ml, 약 100 μg/ml, 약 200 μg/ml, 약 300 μg/ml, 약 500 μg/ml, 약 1 mg/ml, 약 5 mg/ml, 약 10 mg/ml, 약 50 mg/ml, 약 100 mg/ml 또는 그 이상일 수 있다.

일부 실시양태에서, 트레할로스는 약 1%, 약 2%, 약 2.5%, 약 3%, 약 5% 또는 약 10%의 최종 농도로 나노입자 현탁액에 첨가될 수 있다.

제약 조성물 및 투여 방법

본원에 기재된 방법은 활성 성분으로서 본원에 기재된 나노입자를 포함하는 제약 조성물의 사용을 포함한다.

제약 조성물은 전형적으로 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은 표현 "제약상 허용되는 담체"는 제약 투여와 양립가능한 염수, 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제, 항바이러스제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 보충 활성 화합물, 예를 들어 추가 아주반트가 또한 조성물에 혼입될 수 있다.

제약 조성물은 전형적으로 그의 의도된 투여 경로와 양립가능하도록 제형화된다. 투여 경로의 예는 비강 (예를 들어, 흡입)을 포함한다.

적합한 제약 조성물을 제형화하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed., 2005; and the books in the series Drugs and the Pharmaceutical Sciences: a Series of Textbooks and Monographs (Dekker, NY)]을 참조한다. 예를 들어, 비강내 흡입 또는 스프레이를 위해 사용되는 용액, 분말 또는 현탁액은 하기 구성성분을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 염수 용액, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매; 항박테리아제, 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 나트륨 비술파이트; 킬레이트제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트, 및 긴장성 조절제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화나트륨으로 조절될 수 있다. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 만든 앰플, 일회용 주사기 또는 다중 용량 바이알에 동봉될 수 있다.

비강내 투여 또는 흡입에 의한 투여의 경우, 나노입자는 예를 들어 대상체에 의해 압착되거나 펌핑되는 펌프 스프레이 용기로부터 용액, 분말, 에어로졸 또는 현탁액의 형태로, 또는 가압 용기 또는 네뷸라이져 (임의로 적합한 추진제 포함)로부터 에어로졸 스프레이 제시로서 전달될 수 있다. 비강내 투여에 적합한 제형은 건조 분말 흡입기로부터 건조 분말의 형태 (단독으로, 혼합물로서, 예를 들어 담체, 예컨대 락토스와의 건조 블렌드, 또는 혼합 구성성분 입자로서, 예를 들어 인지질, 예컨대 포스파티딜콜린과 혼합됨) 또는 가압 용기, 펌프, 스프레이, 아토마이저 (예를 들어, 미세 미스트를 생성하기 위해 전기유체역학을 사용하는 아토마이저), 또는 네뷸라이져 (적합한 추진제, 예컨대 1,1,1,2-테트라플루오로에탄 또는 1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판 사용 또는 사용하지 않음)로부터 에어로졸 스프레이의 형태일 수 있다.

제약 조성물은 또한 좌약 (예를 들어, 통상적인 좌약 기제, 예컨대 코코아 버터 및 기타 글리세리드 사용) 또는 비강 전달을 위한 정체 관장의 형태로 제조될 수 있다.

제약 조성물은 용기, 팩 또는 분배기, 예를 들어 흡입기, 네뷸라이져, 점적기에 포함될 수 있으며, 임의로 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 투여 지침서와 함께 포함될 수 있다.

PS-생체모방 나노입자의 사용 방법

일부 실시양태에서, PS-생체모방 나노입자는 예를 들어 백신의 일부로서, 예를 들어 바이러스 또는 박테리아 감염, 예를 들어 인플루엔자 (또는 독감)의 발병 위험을 치료하거나 감소시키기 위해, 예를 들어, 폐에서 항원에 대한 보호성 면역 반응을 촉진하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, PS-생체모방 나노입자는 천식, 호흡기 알레르기 또는 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD)을 치료하거나, 하나 이상의 증상을 감소시키는데 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, PS-생체모방 나노입자는 점막 (예를 들어, 비강 또는 폐 조직)에 투여된다. 일부 실시양태에서, PS-생체모방 나노입자는 비강내로 (예를 들어, 흡입기, 네뷸라이져에 의해) 투여될 수 있다.

일부 실시양태에서, PS-생체모방 나노입자는 면역 반응 (예를 들어, 폐에서 선천성 면역 활성화; CD8+ T 세포 반응 유발; 바이러스에 대한 보호, 예를 들어 인플루엔자 바이러스에 대한 아형내 보호; 또는 인플루엔자 바이러스에 대한 이종아형 보호)을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, PS-생체모방 나노입자는 암, 예를 들어 폐암을 치료하기 위한 화학요법 아주반트로서 사용될 수 있다. 이들 방법에서, 카고는 화학요법제이고, 방법은 나노입자의 치료 유효량, 예를 들어 종양 크기, 종양 수, 종양 성장 속도 또는 전이의 감소를 초래하기에 충분한 양을 투여하는 것을 포함한다.

실시예

본 발명은 청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않는 하기 실시예에서 추가로 설명된다.

재료 및 방법

PS-GAMP 합성

1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) (DPPG), 1,2-디팔미토일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DPTAP), 및 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (DPPE-PEG2000)을 포함하는 모든 지질을 아반티 폴라 리피즈(Avanti Polar Lipids)로부터 구입하였다. 콜레스테롤을 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)로부터 수득하였다. 나노4 및 나노6의 질량비는 10:1:1:1의 DPPC/DPPG/DPPE-PEG/Chol이었다. 지질을 3 ml의 클로로포름에 용해하고, 1 ml cGAMP 용액 (200 μg cGAMP, 13.7 mM NaCl, 0.27 mM KCl, 0.43 mM Na₂HPO4, 및 0.147 mM KH₂PO4)과 혼합하였다. 대안적으로, cGAMP를 SRB (시그마 알드리치)로 대체하고/거나, 0.5 μmol DiD 염료 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies))를 지질 혼합물에 첨가하여 각각 카고 또는 리포솜 막을 표지하였다. 리포솜을 역상 증발에 의해 합성하였다 (43). 간단히 말해서, 지질 및 cGAMP의 혼합물을 초음파처리하여 50℃에서 30분 동안 N₂ 하에 유중수 에멀젼을 달성한 다음, 220 rpm의 속도로 회전 증발을 통해 용매를 온화하게 제거하였다. 과량의 완충제를 혼합물에 첨가하고, 50℃에서 추가 5분 동안 계속 회전시켰다. 생성된 리포솜을 50℃에서 400- 및 200-nm 막 (아반티 폴라 리피즈)을 통해 압출하였다. 리포솜의 크기 및 제타 전위를 제타사이저(Zetasizer) (말번(Malvern))에 의해 측정하였다. 캡슐화 효율을 나노드롭(Nanodrop) (라이프 테크놀로지스)에서 260 nm에서 cGAMP의 UV 흡수에 의해 결정하고, 액체 크로마토그래피-질량 분광광도법 (LC-MS) (애질런트(Agilent))에 의해 확인하였다. 유리 cGAMP를 크기-배제 컬럼 G-50 (지이 헬스케어(GE Healthcare))에 의해 제거하였다. 리포솜을 안정화시키기 위해, 트레할로스를 리포솜 현탁액에 2.5%의 최종 농도로 첨가하였다. 생성된 현탁액을 드라이아이스/에탄올 배쓰에서 동결시킨 후, 프리존(Freezone) 4.5 (랩콘코(Labconco))에 의해 진공 하에 -45℃에서 동결건조시켰다. 동결건조된 리포솜 (PS-GAMP)을 사용할 때까지 -20℃에서 저장하였으며, 달리 명시하지 않는 한 모든 생체내 연구에서 사용하였다.

동물

C57BL/6J 및 BALB/c 마우스를 잭슨 래보러토리즈(Jackson Laboratories) 또는 상하이 SLAC 래보러토리 애니멀 캄파니, 리미티드(Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.)로부터 구입하였다. Sting-결핍 마우스 (C57BL/6J-Tmem173gt/J), Sftpa1^-/-Sftpd^-/- 마우스 (B6.Cg-Sftpa1tm2Haw Sftpdtm2Haw/J), C57BL/6 CD45.1 마우스 (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ), 및 스위스 웹스터 마우스를 잭슨 래보러토리즈 또는 찰스 리버 래보러토리즈(Charles River Laboratories)로부터 획득하였다. 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP)에 주입된 MHC 클래스 II 분자를 발현하는 MHC II-EGFP 마우스는 매사추세츠 공과대학교의 플로그(H. Ploegh) 박사가 기증한 것이었다. 인플루엔자-비함유 4월령 암컷 페럿을 마샬 바이오리소시스(Marshall BioResources)로부터 구입하였다. 건강한 미투여 6세 수컷 레서스 마카크를 중국 베이징 시신 생물자원연구소로부터 수득하였다. 동물은 기관, 병원 및 NIH 가이드라인에 따라 매사추세츠 종합 병원 (MGH) 또는 푸단 대학교의 무병원체 동물 시설에 수용되었다. MGH 또는 푸단 대학교 동물실험윤리위원회가 연구를 검토하고 승인하였다.

인플루엔자 바이러스 및 백신

A/구이저우/54/1989 H3N2 바이러스 및 A/푸에르토리코/8/1934 (PR8) 바이러스 백본의 H3 및 N2로 이루어진 SH13 H7N9 바이러스 (A/상하이/4664T/2013), SH09 H1N1 바이러스 (A/상하이/37T/2009) 및 rgGZ89 H3N2 바이러스를 푸단 대학교로부터 수득하였다. 대유행 CA09 H1N1 바이러스는 아메리칸 타입 컬처 컬렉션 (ATCC, #FR-201)으로부터 요청되었다. PR8 (NR-348), A/아이치/2/68 H3N2 (아이치, NR-3177), rg퍼스 H3N2 [A/퍼스/16/2009 H3N2×PR8 (NR-3499)], 및 B/플로리다/4/2006 (플로리다06, NR-9696) 바이러스 균주를 BEI 리소시스(BEI Resources), NIAID로부터 수득하였다. 역유전적으로 (rg) 변형된 VN04 (rgVN04) H5N1 바이러스는 A/베트남/1203/2004 H5N1 바이러스로부터의 H5 및 N1 유전자 및 PR8 바이러스 백본으로 구성된 세인트 주드 아동 연구 병원의 웨비(R. Webby) 박사가 기증한 것이었다. A/미시간/45/2015 H1N1 (미시간15, FR-1483) 및 항바이러스 약물-저항성 A/노쓰 캐롤라이나/39/2009 H1N1 바이러스 (NC09, FR-488)를 인터내셔날 리에이전트 리소시스(International Reagent Resources), CDC로부터 획득하였다. 바이러스를 35℃에서 3일 동안 10일령 발육 계란 (찰스 리버 래보러토리즈)에서 확장하고, 수확하고, 수크로스 구배 초원심분리에 의해 정제하고, -80℃에서 동결하였다. 마우스를 챌린지하기 위해, 바이러스를 i.n. 점적주입-폐 균질화액 제조의 3 사이클 동안 마우스에서 적응시키고, 마우스에서 이들의 감염성을 표준 프로토콜에 따라 50% 치사량 (LD₅₀)에 의해 검정하였다.

1가 CA09 H1N1 백신 (NR-20347, 사노피 파스퇴르, 인크.(Sanofi Pasteur, Inc.)) 및 전체 불활성화된 H5N1 백신 (NR-12148, 박스터 아게)을 BEI 리소시스, NIAID로부터 수득하였다. H7-Re1 H7N9 전체 불활성화된 백신은 중국 농업과학연구원의 하얼빈 수의학 연구소에서 기증한 것이었다. 3가 계절성 인플루엔자 백신 2018-2019 (SIV 18-19)를 중국 화란 바이올로지칼 박테린 캄파니, 리미티드(Hualan Biological Bacterin Co., Ltd.)로부터 획득하였다. SH09 H1N1 및 퍼스 H3N2 불활성화된 백신을 37℃에서 24시간 동안 0.02% 포르말린을 사용한 바이러스의 불활성화에 의해 제조하고, 상기와 같이 정제하였다. Ag 농도를 HA 함량에 기초하여 BCA 단백질 검정 및 SDS-PAGE에 의해 정량화하였다.

마우스 면역화 및 챌린지

마우스를 케타민/크실라진으로 진정시키고, 30 μl (콧구멍 당 15 μl)의 표시된 인플루엔자 백신 또는 백신 및 아주반트의 혼합물을 i.n. 접종하였다. VN04 H5N1, SIV 18-19, 및 CA09 H1N1 SV 백신을 각각 마우스 당 1 μg (HA 함량), 1 μg, 또는 0.5 μg의 상응하는 용량으로 사용한 반면, H7-Re1 및 SH09 H1N1 백신을 각각 용량 당 0.25 μg 또는 3 μg으로 투여하였다. 폴리 IC (인비보젠(Invivogen)), Pam2CSK4 (인비보젠), 및 콜레라 독소 (시그마)를 각각 마우스 당 20, 20 또는 10 μg으로 투여하였다. 간극 연접부를 차단하기 위해, CBX, 토나베르사트 및 메클로페나메이트를 시그마 알드리치로부터 수득하고, 각각 25, 10 또는 20 mg/kg/일의 상응하는 투여량으로 연속 4일 동안 (면역화 후 하루 전 2일부터) 개별 마우스에 i.p. 주사하였다 (31, 32). 백신접종 및 챌린지 동안 CD8⁺ T 세포를 고갈시키기 위해, 마우스에 200 μg/일의 용량으로 면역화 2일 전 및 면역화 0, 2 및 4일 후 항-CD8α (53-6.7, 바이오레전드(BioLegend)) 항체를 투여하였다. 달리 표시되지 않는 한 스위스 웹스터 마우스 또는 BALB/c 마우스에 대신 챌린지된 아이치 H3N2, 플로리다06 인플루엔자 B, 및 GZ89 바이러스를 제외하고, C57BL/6 마우스를 챌린지 연구에 사용하였으며, 이는 C57BL/6 마우스가 이들 바이러스에 상대적으로 덜 민감하기 때문이다. NC09 바이러스의 항바이러스 약물 저항성을 입증하기 위해, 비면역화된 마우스를 챌린지 6시간 전에 오셀타미비르 (20 mg/kg/일)로 처리한 후, 연구 종료까지 매일 처리하였다. 40×LD₅₀의 H7N9 바이러스를 제외하고 면역화 후 표시된 날짜에 10×LD₅₀ 마우스-적응된 상동성 바이러스의 i.n. 점적주입에 의해 면역화된 마우스 및 대조군 마우스를 챌린지하였다. 그러나, 각각 5×LD₅₀의 이종 바이러스는 4×10⁵ TCID₅₀ 용량의 플로리다06 인플루엔자 B 바이러스를 제외하고 챌린지에 사용되었으며, 이는 이 바이러스가 마우스에 치명적이지 않기 때문이다. 챌린지 후 12일 동안 체중 및 생존을 매일 모니터링하였다.

페럿 면역화 및 챌린지

항-인플루엔자 바이러스 항체에 음성인 4월령 암컷 페럿을 케타민/크실라진/아트로핀에 의해 마취하고, 비히클, 인플루엔자 백신, 또는 백신 및 PS-GAMP의 혼합물로 i.n. 면역화하였다. 조기 보호를 검정하기 위해, 9 μg의 CA09 H1N1 백신 단독으로 또는 200 μg의 PS-GAMP와 함께 받은 각 페럿을 면역화 2일 후 10⁶ TCID₅₀ CA09 H1N1 바이러스로 챌린지하였다. 교차-보호를 평가하기 위해, 각 페럿을 200 μg의 PS-GAMP의 존재 또는 부재 하에 15 μg의 퍼스H3N2 백신으로 i.n. 면역화하고, 면역화 30일 후 10⁶ TCID₅₀ 이종아형 미시간15 H1N1 바이러스로 챌린지하였다. 체온을 각 동물에 이식된 2개의 마이크로칩 (바이오메딕 데이터 시스템스(BioMedic Data Systems))에 의해 모니터링하고, 임상 증상을 공개된 프로토콜 (표 1)에 따라 스코어링하였다 (44). 바이러스 챌린지 2주 후 진정 및 심장에 0.5 ml의 유서네이지아(Euthanasia)-III의 주사에 의해 동물을 인도적으로 안락사시켰다.

<표 1>

페럿 임상 증상 스코어 (44)

조직 프로세싱 및 유동 세포계측법

표시된 마우스로부터 폐, 비강 조직, MLN 및 비장을 절개하고, 유동 세포계측법 분석을 위해 단일-세포 현탁액으로 프로세싱하였다. 구체적으로, 폐 및 비강 조직을 1-㎟ 조각으로 저미고, 37℃에서 60분 동안 둘 다 로슈(Roche)로부터의 1 ml의 콜라게나제 D (2 mg/ml)/DNase I (5 mg/ml)로 소화시킨 후, 40-μm 셀 스트레이너를 통해 통과시켰다 (18). BALF를 수집하기 위해, 마우스를 먼저 빙냉 PBS로 철저히 관류한 후, PBS 중 0.5% BSA로 기관내 세척을 수행하였다. 조직을 40-μm 셀 스트레이너를 통해 직접 통과시킴으로써 비장 및 MLN의 단일-세포 현탁액을 제조하였다. ACK 완충제에서 적혈구를 제거한 후, 남아있는 세포를 세척하고, 항-CD16/CD32 항체 (클론 93,10 μg/ml, 바이오레전드)에 의해 20분 동안 차단하고, 얼음 위에서 30분 동안 형광으로 접합된 항체로 염색하거나, 얼음 위에서 1시간 동안 NP_366-374, PA_224-233, PB1_703-711 MHC I 사량체로 염색하였다. 표면 염색 후 활성화된 T 세포를 고정시키고 투과화한 다음, 4℃에서 밤새 항-그랜자임 B (GB) 항체로 세포내 염색을 수행하였다. 염색된 세포를 FACSAria II (BD)에서 획득하고, 플로우조(FlowJo) 소프트웨어 (트리 스타(Tree Star))를 사용하여 분석하였다. 마우스 호흡기계의 세포 집단 및 서브세트를 기재된 바와 같이 게이팅하고 분석하였다 (18). 다양한 항체의 정보는 표 2에 제공된다.

<표 2>

유동 세포계측법을 위한 항체 및 사량체

시토카인 및 케모카인 측정

C57BL/6 마우스에 20 μg의 PS-GAMP를 i.n. 투여하거나 1×LD₅₀ CA09 H1N1 바이러스로 감염시켰다. 표시된 시간에 폐를 수확하고, RNA 정제 키트 (로슈)를 사용하여 총 RNA 추출을 위해 준비하였다. 뇌에서 시토카인을 측정하기 위해, 마우스에 VN04 H5N1 백신 (1 μg HA)을 단독으로 또는 PS-GAMP (20 μg) 또는 CT (10 μg)와 함께 i.n. 투여하고, 48시간 후에 희생시켜 상기와 같이 RNA 추출을 위한 뇌 조직을 수집하였다. RNA를 역전사하고 (라이프 테크놀로지스), SYBR 녹색 PCR 키트 (로슈)를 사용하여 실시간 PCR에 의해 증폭하였다. 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제 (GAPDH)가 내부 대조군으로 사용되었다. 사용된 모든 프라이머는 표 3에 나열되어 있다. BALF 및 혈청 중 뮤린 GM-CSF (이바이오사이언스), IFN-β (인비보젠), TNF-α (바이오레전드), IFN-γ (이바이오사이언스), IL-6 (이바이오사이언스) 및 IL-10 (바이오레전드) 수준을 특정 ELISA 키트에 의해 측정하였다.

<표 3>

실시간 PCR을 위한 프라이머

조직학

스위스 웹스터 마우스에 PBS, PS-GAMP (20 μg), H5N1 백신 (1 μg HA), 또는 백신 + PS-GAMP 또는 CT (5 μg)를 i.n. 투여하였다. 일부 마우스를 양성 대조군으로서 CA09 H1N1 바이러스 (250 PFU)에 의해 감염시켰다. 면역화 또는 감염 후 표시된 날짜에 폐, 비강 조직 및 뇌를 절개하고, 고정시키고, 표준 H&E 절차를 사용하여 염색하였다. 슬라이드를 스캔하고 나노주머(NanoZoomer) (하마마쓰(Hamamatsu))를 사용하여 분석하였다.

공초점 현미경법

폐에서 DiD-표지된 리포솜을 추적하기 위해, C57BL/6 마우스에 동량의 DiD-나노4 또는 DiD-나노5를 i.n. 투여하였다. 12시간 후 폐를 절제하고, 최적의 절단 온도 (OCT) 화합물 (사쿠라 파인텍(Sakura Finetek))에 포매시키고, 5-μm 동결 섹션으로 절단하였다. DAPI (라이프 테크놀로지스)를 함유하는 프로롱 안티페이드 마운턴트(ProLong Antifade Mountant)로 슬라이드를 탑재하고, 공초점 현미경법 (올림푸스 FV1000, UPLSAPO 60XW)에 의해 이미지화하였다. 생체외 나노입자의 AM 흡수를 시각화하기 위해, 마우스 폐를 0.5% BSA 및 5 mM EDTA를 함유하는 1 ml의 PBS로 6회 세척하였다. 폐 세척액을 풀링하고, 220×g에서 원심분리하였다. 세포를 수집하고, PBS에 의해 철저히 세척하고, RPMI 1640 배지에서 45분 동안 배양한 후, 비접착성 세포를 제거하였다. 접착성 세포를 AM으로서 수집하고, 배지에 2×10⁵ 세포/ml로 현탁하고, 200 μl/웰로 96-웰-플레이트에 첨가하였다. PS를 정제하기 위해, 폐를 1 ml의 PBS로 6회 세척함으로써 폐 세척액을 준비하고, 220×g에서 10분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거한 후, 100,000×g에서 1시간 동안 원심분리하여 PS를 펠렛화하였다. 상청액 (6 ml)을 3-kDa 아미콘 울트라 센트리푸갈 필터 유닛(Amicon Ultra Centrifugal Filter Units) (머크 밀리포어(Merk Millipore))에 의해 200 μl로 농축하고, 위에서 제조된 PS 펠렛과 혼합하였다. 그 후, 생성된 PS (100 μg 총 단백질)를 30분 동안 DiD-나노4 또는 DiD-나노5 (나노입자 중 12 μg 지질 함량)와 혼합한 다음, 200 μl의 배지에서 4×10⁴ 세포가 있는 AM 세포 배양물에 첨가하였다. 37℃에서 5% CO₂ 하에 4시간 인큐베이션 후, 세포를 필수 염료 칼세인-AM (라이프 테크놀로지스)으로 염색하였다. 리포솜의 흡수를 공초점 현미경법 (올림푸스 FV1000, UPLSAPO 60XW)에 의해 정량화한 후, 이미지J 소프트웨어 분석에 의해 정량화하였다.

통계적 분석

두 그룹 간의 차이를 분석하기 위해 양측 스튜던트 t-검정을 사용하였다. 프리즘 소프트웨어 (그래프패드(GraphPad))에 의해 다중 그룹 간의 차이를 분석하기 위해 ANOVA 또는 크루스칼-왈리스 검정을 사용하였다. <0.05의 p는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 0.8의 통계적 검정력을 제공하기 위해 예비 실험에 기초하여 샘플 크기를 결정하였다. 대부분의 실험은 적어도 2회 반복하였으며 유사한 결과를 갖는다. 조사자-맹검 방식으로 평가된 현미경법 이미지 및 H&E 슬라이드 검사를 제외하고, 고도로 표준화되고 미리 정의된 조건 하에 수행된 실험에 대해 조사자에 맹검법을 수행하지 않았다.

혈구응집반응 억제 (HAI) 검정

혈청 샘플을 면역화된 동물 및 대조군 동물로부터 표시된 시간에 수집하고, 37℃에서 20시간 동안 수용체-파괴 효소 (RDE) (덴카 세이켄(Denka Seiken), 일본 도쿄)로 처리한 후, 56℃에서 30분 동안 열 불활성화를 수행하였다. 생성된 혈청 샘플을 연속 희석하고, 37℃에서 1시간 동안 표시된 인플루엔자 바이러스의 4 혈구응집반응 단위 (HAU)와 함께 인큐베이션하였다. 혈청-처리된 바이러스를 실온에서 30분 동안 0.5% 닭 적혈구 (H1N1 및 H7N9의 경우) 또는 말 적혈구 (H5N1의 경우)와 함께 인큐베이션하였다. HAI 역가는 주어진 바이러스의 4 HAU를 억제한 가장 높은 혈청 희석의 역수로서 정의되었다.

효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)

인플루엔자-특이적 IgG, IgG1, IgG2a, IgA 및 IgG2c 항체 역가를 ELISA에 의해 측정하였다. 간단히 말해서, 1 μg/ml의 재조합 HA를 NaHCO3 완충제, pH 9.6의 ELISA 플레이트에 밤새 코팅하고, 여기에 연속 희석된 혈청 샘플을 첨가하였다. 항체 아형을 HRP-접합 염소 항-마우스 IgG (NA931V, 지이 헬스케어, 희석 1:6000), IgG1 (1073-05, 써던 바이오테크(Southern Biotech), 1:4000), IgG2c (1079-05, 써던 바이오테크, 1:4000), IgA (A90-103P, 베틸(Bethyl), 1:10000), IgM (ab97230, 1:20000) 또는 IgG2a (1083-05, 써던 바이오테크, 1:4000) 항체에 의해 정량화하였다. 시그마FASTM OPD를 기질로서 사용하고, 플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices))에서 A490에서의 반응을 판독함으로써 특이적 항체 아형의 역가를 정량화하였다.

세포성 면역 반응

비장을 40-μm 스트레이너를 통해 통과시킨 다음, 얼음 위에서 4분 동안 ACK (암모늄-클로라이드-칼륨) 완충제로 적혈구를 용해시킴으로써 면역화 7일 후 마우스로부터 비장세포를 단리하였다. 1× 106/ml의 세포를 인플루엔자 백신 (1 μg/ml) 및 4 μg/ml의 항-CD28 (클론 37.51, 비디 파밍겐(BD Pharmingen)) 항체와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 골지-플러그 (비디 파밍겐)를 배양물에 첨가하고, 추가 5시간 동안 인큐베이션하였다. 자극된 세포를 먼저 CD3, CD4 및 CD8에 대한 형광-접합 항체로 염색한 다음, 항-IFN-γ 항체로 세포내 염색을 수행하였다. 모든 항체는 표 S2에 나열되었다. 염색된 세포를 FACSAria II (BD)에서 획득하고, 플로우조 소프트웨어 (트리 스타)를 사용하여 분석하였다.

골수 이식에 의해 생성된 키메라 마우스

기재된 바와 같이 골수 (BM) 이식에 의해 키메라 마우스를 생성하였다 (33). 간단히 말해서, CD45 대립유전자가 상이한 성별- 및 연령-매치된 공여자 마우스의 대퇴골 및 경골로부터 BM 세포를 수확하였다. 수용자 마우스는 3시간 간격으로 두 분획으로 투여된 1100 rad의 용량으로 137Cs 감마 방사선조사기 (마크 I, 30 J.L. 셰퍼드)로부터 치명적인 방사선조사를 받았다. 제2 방사선조사 직후, 5×106 공여자 BM 세포를 수용자 마우스에 정맥내 주사하였다. STING-결핍 마우스 (Sting^-/- 또는 ST)의 BM 세포를 연령 및 성별-매치된 WT 마우스에 전달하거나 그 반대의 경우도 마찬가지였다. WT BM 세포를 받은 WT 마우스 또는 ST BM 세포를 받은 ST 마우스를 또한 병행하여 준비하였다. 마우스에 방사선조사 5일전부터 방사선조사 14일후까지 항생제-함유 물을 공급하고 3개월 동안 수용하여 공여자 집단의 완전한 재구성을 확립하였으며, 이는 항-CD45.1 (클론 A20, 바이오레전드, 2 μg/ml) 또는 항-CD45.2 (클론 104, 바이오레전드, 2.5 μg/ml) 항체로 염색한 후, 폐, MLN, 비장, 및 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 유동 세포계측법 분석에 의해 확증되었다.

BM-유래 수지상 세포 (BMDC) 및 BM-유래 대식세포 (BMM)

BMDC 및 BMM을 이전에 기재된 바와 같이 준비하였다 (45). 간단히 말해서, 4-6주령 C57BL/6 마우스의 경골 및 대퇴골로부터 BM 세포를 수확하였다. 1×106 / ml 농도의 세포를 10 ng/ml 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 또는 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF)와 함께 7일 동안 배양하여 각각 BMDC 또는 BMM을 생성하였다. CD11c+ BMDC를 FACSAria II (BD)에서 고속 세포 분류법에 의해 추가로 정제하였다.

비인간 영장류 (NHP)에서 나노4의 AM 흡수를 위한 PS 요구사항

레서스 마카크를 안락사시킨 후, 폐를 외과적으로 제거하고, 항생제로 보충된 차가운 RPMI 1640 배지 150 ml로 충전하고, 차가운 배지에 침지하고, 얼음 위에서 실험실로 옮겼다. AM 및 PS를 기재된 바와 같이 단리하였다 (46). 간단히 말해서, 충전된 RPMI 1640 배지를 폐로부터 수집하고, 200×g에서 원심분리하여 세포 파편을 제거한 후, 8000×g에서 20분 동안 원심분리하여 PS를 펠렛화하였다. 상청액 (30 ml)을 10 kDa 아미콘 울트라 센트리푸갈 필터 유닛 (머크 밀리포어)에 의해 1 ml로 농축하고, 위에서 제조된 PS 펠렛과 혼합하여 지질 및 계면활성제 단백질 모두를 갖는 농축된 PS를 수득하였다. 0.5 mM EDTA를 함유하는 100 ml의 PBS로 폐를 6회 세척함으로써 AM을 단리하였다. 폐 세척액을 풀링하고, 200×g에서 원심분리하여 세포를 수집하였다. 세포를 PBS로 철저히 세척하고, RPMI 1640에서 20분 동안 배양한 후, 비접착성 세포를 제거하였다. 2 mg의 총 단백질의 농축된 PS를 DiD-나노4 또는 DiD-나노5 (48 μg 지질 함량)와 30분 동안 혼합한 후, 5% CO2와 37℃에서 3시간 동안 1 ml의 배지에서 1.6 ×105 AM과 함께 인큐베이션하였다. AM을 필수 염료 칼세인-AM (라이프 테크놀로지스) 및 훽스트 (시그마)로 염색하였다. 나노입자의 AM 흡수를 공초점 현미경법 (올림푸스 FV3000, UPLSAPO 40×)에 의해 평가하고, 이미지J 소프트웨어에 의해 분석하였다.

투과 전자 현미경법 (TEM)

폐포에서 나노4 및 나노5의 미세구조적 편재화를 결정하기 위해, 나노골드 (5 nm, 알파 에이사)를 기재된 바와 같이 역상 증발에 의해 나노4 또는 나노5로 캡슐화하였다 (47). 마우스에 나노골드-나노4 또는 나노5를 동량으로 i.n. 투여하고, 12시간 후, 폐를 단리하고, 카르노브스키(Karnovsky) 고정액에 4℃에서 밤새 고정시키고, 0.1 M 나트륨 카코딜레이트 완충제 중 1% OsO4에 1.5시간 동안 후고정시키고, 구배 알콜 시리즈에서 탈수시키고, s-프로필렌 옥시드/Epon t812 구배 혼합물로 침윤시키고, Epon t812 (투시미스(Tousimis))에 포매시켰다. 초박 섹션을 마이크로톰 (라이헤르트-정 울트라컷 E(Reichert-Jung Ultracut E))에서 80 nm로 절단하고, 100-메쉬 구리 그리드에서 수집하고, 2% 우라닐 아세테이트 및 시트르산납 (2.66% 질산납, 3.52% 시트르산나트륨)으로 염색하고, CM-10 투과 전자 현미경 (필립스(Philips))에서 검사하였다. 디지털 TEM 이미지를 AMT-XR41M 4.0 메가픽셀 쿨드 sCMOS 카메라 (어드밴스드 마이크로스코피 테크니크스(Advanced Microscopy Techniques))에 의해 촬영하였다.

실시예 1: PS-GAMP는 PS 구성요소로 제작된다

본 발명자들은 PS 구성요소에 기초하여 일련의 리포솜을 합성하여 (17), cGAMP를 캡슐화하였다 (도 7A). 음으로 하전된 나노4는 지질 조성 및 전하에 관하여 PS에 가장 가까웠다. 전체 불활성화된 A/베트남/1203/2004(VN04) H5N1 백신과 함께 비강내로 (i.n.) 도입되었을 때 혈청 IgG 및 기관지폐포 세척액 (BALF) IgA의 생성을 격렬하게 자극한 유일한 리포솜이었으며, 동시에 백신 단독 대조군에 비해 체중 감소가 없었다 (도 7B-7E). 대조적으로, 중성 (예를 들어, 나노1)이거나, 음이온성 포스파티딜글리세롤 (DPPG)을 양이온성 1,2-디팔미토일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DPTAP) (예를 들어, 나노3 또는 나노5)으로 대체하거나, PEG2000이 없는 리포솜 (예를 들어, 나노2 및 나노3)은 유의한 체중 감소를 야기하면서 실질적으로 더 적은 아주반트성을 나타내었다 (도 7A-7E). 이는 나노4와 이들의 유사한 크기 및 캡슐화 비율에도 불구하고 발생하였다 (도 7F-7G). 그러므로, 음전하 및 PEG2000은 리포솜의 기능 및 안전성에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 예상외로, 양으로 하전된 리포솜 (나노3 또는 나노5)에 캡슐화된 cGAMP로 시험관내에서 자극된 골수-유래 수지상 세포 (BMDC)는 음으로 하전된 리포솜 (나노2 및 나노4)으로 자극되었을 때보다 더 높은 수준의 Ifnb1을 발현하였다 (도 7H). 골수-유래 대식세포 (BMM)가 cGAMP로 캡슐화된 양으로 또는 음으로 하전된 리포솜으로 자극되었을 때 유사한 패턴이 나타났다 (도 7I). 이는 나노입자의 안전성 및 효능에 대한 생체내 평가의 필요성을 강조한다. 그 후, 동결건조 전에 리포솜 현탁액에 트레할로스를 첨가하여 나노4 안정성을 증가시켰다 (도 7A). 본 발명자들이 PS-GAMP라고 명명한 생성된 나노6 리포솜은 -20℃에서 적어도 6개월 동안 안정적이었고, 신선하게 제조된 나노4와 유사한 제타 전위, 크기, 기능 및 안전성을 나타내었다 (도 7A, 7F, 7J, 및 7B-7E). 더욱이, 야생형 (WT)에서 PS-GAMP-아주반트된 인플루엔자 백신에 의해 유도된 높은 Ag-특이적 IgG 역가 (그러나 STING-결핍 마우스에서는 그렇지 않음)는 임의의 다른 구성요소보다는 cGAMP가 PS-GAMP의 아주반트성을 담당한다는 것을 확증하였다 (도 7K).

실시예 2: 폐포 대식세포에 의한 PS-GAMP 흡수는 계면활성제 단백질 A 및 D를 필요로 한다

다음으로, 리포솜 내에서 cGAMP에 필적하는 분자 질량 및 순 음전하를 갖는 또 다른 형광 염료 (술포로다민 B, SRB)를 패키지함으로써, 나노4 및 나노5 막을 형광 친유성 카르보시아닌인 DiD로 표지하고, 나노4 및 그의 카고의 세포 표적을 연구하였다 (도 1A). 리포솜을 마우스에 i.n. 투여하고, 이들의 비강 조직, 뇌, 종격동 림프절 (MLN) 및 폐를 다양한 시점에서 유동 세포계측법에 의해 분석하였다. 폐는 본 발명자들이 대조군에 비해 SRB⁺ 신호를 발견한 유일한 조직이었다 (도 1B 및 도 8A). 거기에서, 나노4는 CD11b^- CD11c⁺CD24^- 폐포 대식세포 (AM)에 의해 직접 흡수되고, CD11b^-CD11c^- EpCAM⁺MHC II⁺ AEC에 의해 간접적으로 흡수되었다 (도 1B-1D 및 10A) (18). 그러므로, AEC는 SRB⁺이지만 DiD^-인 반면, SRB⁺AM의 대부분은 또한 DiD⁺였으며, 이는 세포가 나노4에 직접 관여함을 시사한다 (도 1E). CD11c⁺SRB⁺ 세포의 95% 초과가 AM으로 식별되었거나 (도 10A, 제2 패널), 폐에서 총 AM의 44%가 SRB⁺DiD⁺로 표시된 리포솜을 차지하였다 (도 10B, 제1 패널). SRB⁺AM 및 SRB⁺AEC의 비율은 각각 12시간 및 18시간에 피크에 도달하였으며, 36시간 이내에 기본 수준으로 돌아갔다 (도 8B). 현저히 대조적으로, 극히 소수의 폐 CD103⁺ 수지상 세포 (DC) (<2%) 및 CD11b⁺ DC (<2%)가 DiD⁺ 및 SRB⁺였으며, 이는 이들 세포에 의한 리포솜의 직접 흡수를 배제하였다 (도 10B). cGAMP를 AM으로 전달하는 PS-GAMP의 능력은 DiD-표지된 및 cGAMP-캡슐화된 나노4 (DiD-PS-GAMP)로 i.n. 접종 후 DiD⁺ AM에서 CD40 상향조절에 의해 기능적으로 입증되었다. cGAMP가 결여된 동일한 나노입자 (DiD-PS)는 CD40 발현에 영향을 미치지 않았다 (도 11A-11B) (19). 그러므로, AM 활성화는 방관자 효과를 통하기 보다는 PS-GAMP 흡수로부터 직접적으로 발생하는 것으로 보인다 (도 11C). 나노4와 대조적으로, 나노5는 유리 SRB와 비교할 때 AM 또는 AEC와 유의하게 연관되지 않았다 (도 1B-1D 및 도 8C).

놀랍게도, 폐 세척액으로부터 단리된 AM은 생체외에서 나노4를 효율적으로 섭취하지 않았다. AM은 실제로 더 높은 DiD 형광에 의해 입증된 바와 같이 나노4보다 더 많은 나노5를 차지하였으며 (도 1F-1G), 이는 나노5가 BMDC 및 BMM에서 더 높은 Ifnb1 발현을 유도하였다는 더 이른 관찰을 보완하였다 (도 7H-7I). 이들 리포솜의 생체내 및 생체외 흡수 간의 차이는 생체외 배양에서 PS의 결여 때문일 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 BALF로부터 PS를 정제하고, AM에 첨가하기 전에 30분 동안 PS를 나노입자와 함께 인큐베이션하였다. 나노4 흡수는 실질적으로 증가한 반면, 나노5 흡수는 저하되었다 (도 1F-1G). 특히, 양으로 하전된 나노5는 음으로 하전된 PS에 응집되었으며, 이는 AM의 불량한 진입을 설명한다 (도 12). PS가 유사한 조건 하에 나노4와 함께 인큐베이션되었을 때 이러한 응집체는 형성되지 않았다 (도 12). AM 및 PS가 비인간 영장류 (NHP)로부터 단리되었을 때 유사한 결과가 수득되었다 (도 13A-13C). 그러므로, PS는 PS-GAMP 엔도시토시스에서 진화적으로 보존된 역할을 할 수 있다. 이들 생체외 관찰과 일관되게, DiD-나노4는 i.n. 투여 후 AM에 대한 바이오마커인 시글렉 F에 대해 양성인 개별 세포 내에 편재화하였다 (도 1H 및 도 14). 대조적으로, 양으로 하전된 나노5는 음으로 하전된 PS와 정전기적으로 상호작용하고 융합하였으며, 이는 폐포 표면을 따라 확산 염색을 나타내었다 (도 1H). 나노4 및 나노5의 별개의 편재화는 나노골드-표지된 나노5 및 나노4를 사용하여 투과 전자 현미경법 (TEM)에 의해 확증되었다 (도 15). PS의 존재 하에서만 나노4의 효과적인 흡수의 시험관내 검증은 계면활성제 단백질 (SP)-A 및 -D ("콜렉틴"이라고 함)가 이러한 흡수에 역할을 한다는 것을 암시하였다. 실제로, Sftpa1^-/-Sftpd^-/- 마우스로부터 단리된 PS는 WT 마우스로부터 단리된 PS와 현저히 대조적으로 대조군에 비해 시험관내에서 WT AM에 의한 나노4 흡수를 향상시키지 못하였다 (도 1I). 더욱이, 나노4 흡수는 Sftpa1^-/-Sftpd^-/- 마우스에서 심각하게 방해를 받았으며 (도 1J), 이는 Sftpa1^-/-Sftpd^-/- AM의 어떠한 결함으로 인한 것도 아니었으며, 이는 Sftpa1^-/-Sftpd^-/- AM은 WT PS와 시험관내에서 사전 인큐베이션 후에 WT AM이 하는 것과 필적하는 양의 나노4를 차지하기 때문이었다 (도 16).

실시예 3: PS-GAMP는 일시적으로 폐에서 선천성 면역을 활성화시킨다

나노4 흡수에서 SP-A 및 SP-D에 대한 의존은 폐에서 입자 청소의 자연적이고 분자-특이적 메커니즘이 관련되어 있음을 시사하였으며, 이는 PS 및 폐포 상피 장벽의 무결성을 유지하기 위한 최선의 접근법이 될 것이다 (20). 실제로, PS-GAMP, 전체 불활성화된 VN04H5N1 백신, 또는 이 둘의 조합을 i.n. 투여한 후 2일에, 마우스 폐, 비강 조직, 및 뇌는 PBS 대조군과 조직학적으로 구별불가능하였다 (도 17A-17B). 이들 조직에서 세포 사멸, 상피 장벽에 대한 손상, 또는 염증성 세포의 명시적인 침윤이 없었다 (도 17A-17C). 단핵구의 온건하고 일시적인 침윤만이 3일차에 폐에서 발견되었으며, 이는 바이러스 감염에 대한 단핵구 반응보다 실질적으로 덜 중증이었다 (도 18E). 또한, 본 발명자들은 대조군에 비해 뇌에서 어떠한 유의한 시토카인 생성도 관찰하지 못하였다 (도 17C). 뚜렷하게 대조적으로, 콜레라 독소 (CT)로 제형화된 VN04 H5N1 백신은 폐의 대규모 염증성 세포 침윤물 및 일부 마우스의 뇌에서 측정가능한 시토카인 mRNA 발현을 모두 유발하였다 (도 17A-17C).

조직학적으로 시간 경과에 따른 명시적인 폐 염증의 결여에도 불구하고 (도 19A), PS-GAMP는 빠르고 강력하게, 그러나 일시적으로만 선천성 면역을 활성화시키는 것으로 밝혀졌다. Ifnb1, Gmcsf 및 Tnf 뿐만 아니라 Ccl2, Ccl3, Ccl5 및 Cxcl10 mRNA 발현은 자극 12시간 후 피크에 도달하였고 48시간 이내에 해결되었다 (도 20). 대조적으로, CA09 H1N1 인플루엔자 바이러스를 사용한 저용량 감염은 이들 매개체의 실질적으로 더 높은 수준을 유도하였으며 (도 20), 강력한 Il10 발현에도 불구하고 바이러스 감염 과정에 걸쳐 악화되는 명시적인 폐 염증을 야기하였다 (도 19B-19C 및 20). 일시적인 IFN-β 생성은 또한 BALF의 단백질 수준에서 확증되었지만, TNF-α 및 IL-10은 검출 한계를 벗어났다 (도 21A-21C). 현저히 대조적으로, 이들 시토카인은 감염이 진행됨에 따라 2일차부터 6일차까지 실질적으로 더 많이 생성되었다 (도 21A-21C). 혈청 IFN-β, IFN-γ, IL-6, IL-10 및 TNF-α 수준이 대조군과 비교하여 변경되지 않았기 때문에 선천성 면역의 일시적인 활성화는 폐에 국한되었다 (도 22C-22G). 이는 마우스 체중 및 체온에 관하여 아주반트 부작용의 결여와 일치하였다 (도 22A-22B).

실시예 4: PS-GAMP는 체액성 및 세포성 면역 반응 모두에 대한 강력한 아주반트이다

PS-GAMP가 선천성 면역만을 일시적으로 활성화시켰지만, 이 효과는 체액성 및 세포성 면역 반응을 모두 증대시키기에 충분한 것으로 나타났으며, 이는 선천성 면역의 연장된 활성화가 강한 적응성 면역에 필요하지 않다는 이전 발견과 일치하였다 (13, 21, 22). PS-GAMP는 용량-의존적 방식으로 혈청 혈구응집반응 억제성 (HAI) 항체 및 BALF IgA 역가를 상승시켰다 (도 2A-2B). 아주반트는 1차 및 부스터 면역 반응 모두에서 강력하였으며, 이는 VN04 H5N1 백신 단독에 비해 혈청에서 Ag-특이적 IgG1을 10배, IgG를 100배 초과, 및 IgG2c를 ~1,000배 증가시켰다 (도 2C-2E). 전체 불활성화된 VN04 H5N1 백신 외에도, PS-GAMP는 또한 A/캘리포니아/7/2009 (CA09) H1N1 백신과 같은 스플릿 비리온 (SV) 백신과 조합하였을 때 강한 아주반트성을 나타내었다. 아주반트는 SV 백신 단독에 비해 HAI 역가를 10배, BALF IgA를 60배, 및 IgG를 10,000배 증대시켰다 (도 2F-2H). 유사한 조건 하에, 폴리 IC는 HAI 역가, BALF IgA 및 혈청 IgG를 증대시키는데 있어서 각각 5배, 30배 및 100배 더 낮은 효능을 나타내었다 (도 2F-2H). PS-GAMP는 체액성 면역 반응을 증대시켰을 뿐만 아니라 세포성 면역 반응을 크게 향상시켰다. PS-GAMP-아주반트된 CA09 H1N1 백신은 IFN-γ⁺CD8⁺ T 세포를 백신 단독과 비교하여 24배 또는 폴리 IC로 제형화된 백신에 비해 8배 증가시켰다 (도 2I 및 도 26A). 듀오는 또한 모든 백신접종 그룹 중에서 가장 높은 양의 IFN-γ⁺CD4⁺ T 세포를 유도하였다 (도 2J 및 도 26A). 강력한 면역 반응은 10×LD₅₀ CA09 H1N1 바이러스 챌린지에 대한 완전한 보호로 해석되었으며, 동시에 체중 감소가 거의 없거나 전혀 없었다 (도 2K-2L). 대조적으로, 폴리 IC-아주반트된 CA09H1N1 백신은 중증 체중 감소와 함께 바이러스 챌린지에 대한 부분적 (33%) 보호만을 부여하였다.

실시예 5: PS-GAMP는 강력한 CD8⁺ T 세포 반응을 유발한다

본 발명자들은 DC 서브세트가 PS-GAMP-매개 아주반트성에 관여하였는지 조사하였고, PS-GAMP의 i.n. 투여 후, CD11b^- DC가 아닌 CD11b⁺ DC가 폐 (상부) 및 MLN (하부)에서 각각 0일차에 비해 3일차에 14배 및 36배 상승되었음이 발견되었다 (도 3A). CD11b⁺ DC 중에서, 단핵구-유래 CD11b⁺ DC (모노-DC) 및 조직-상주 CD11b⁺ DC (tDC)는 MHC II 및 Ly6C 발현에 의해 구별되었다 (도 3B) (23, 24). MHC II^hiCD11b⁺ tDC는 인플루엔자 바이러스 감염 동안 교차-제시에 대해 가장 유능한 폐 DC인 것으로 나타났다 (23). 놀랍게도, PS-GAMP 투여 후, 이들 세포는 바이러스 감염의 초기 단계 (처음 3일)에서와 유사하게 격렬하게 축적된 반면, 전염증성 모노-DC는 동일한 실험 기간 동안 0일차에 비해 유의하게 상대적이기는 하지만 약간만 증가되었다 (도 3B). 그 후, CD11b⁺ tDC는 PS-GAMP를 받은 폐 및 MLN에서 감소하였으며, 이는 감염 3일 이후에 폐 및 MLN 둘 모두에서 이들 CD11b⁺ DC의 지속적인 축적과 현저한 대조를 이룬다 (도 3B). 다른 면역 세포 유형의 변화는 도 18A-18V에서 면역화 또는 감염 후 폐, MLN, 비강 조직 및 뇌에서 상세히 설명되었다. DC에 더하여, 자연 살해 (NK) 세포 및 CD4⁺ T 세포는 폐에서 1 또는 2일 동안 잠시 상승된 반면, 다른 면역 세포는 실험 기간 동안 변경되지 않았다 (도 3A).

이들 CD11b⁺ DC는 Ag 교차-제시에서 효율적인 것으로 나타났으며, 강력한 CD8⁺ T 세포 증식을 유도할 수 있었다. 형광으로 표지된 오브알부민 (OVA)이 i.n. 투여되었을 때, 극히 소수의 폐 CD11b⁺ DC (0.3%)가 OVA 흡수를 나타내었다. 그러나, OVA를 섭취하는 이들 DC의 비율은 PS-GAMP의 존재 하에 면역화 후 12시간에 3%에서 36시간에 26%로 실질적으로 증가하였다 (도 23A). 이는 OVA 단독을 받은 마우스와 비교하여 우세한 CD11b⁺ DC를 갖는 MLN에서 OVA⁺ DC의 10배 증가로 해석되었다 (도 3C 및 도 23B). 이들 DC는 CD40 및 CD86의 상향조절에 의해 제안된 바와 같이 성숙되고 활성화되었다 (도 3D-3E). 이 효과는 아마도 대부분의 MLN DC가 PS-GAMP에 대해 음성임을 고려하면 AEC 및 AM 활성화에 이차적이었다 (도 23C-23D). Ag-특이적 CD11b⁺ DC의 증가는 변경된 Ag-프로세싱 또는 Ag-흡수에 기인하지 않았으며, 이는 OVA 흡수 또는 그의 단백질분해적 절단이 PS-GAMP에 의해 영향을 받지 않았기 때문이다 (도 24D-24E). 그러므로, PS-GAMP의 존재 하에 OT-I 세포의 격렬한 증식은 CD11b⁺ DC의 증대된 분화 및 성숙으로 인한 것일 가능성이 높았다. 차례로, 이들 세포는 OVA가 OVA 단독과 비교하여 PS-GAMP와 함께 도입되었을 때 폐 및 MLN 모두에서 고도로 증식하는 OT-I 세포에서 6배 이상 증가를 야기하였다 (도 25A-25D).

많은 수의 핵단백질 (NP)_366-374-특이적 CD8⁺ T 세포가 폐에서 관찰되었고, PS-GAMP-아주반트된 인플루엔자 백신으로 면역화한 후 4일만큼 조기에 MLN에서 더 적은 정도로 관찰되었다 (도 3F-3G 및 도 26B). NP_366-374는 우세한 CD8⁺ T 세포 에피토프였으며, 다른 에피토프, 예컨대 PA_224-233 또는 PB1_703-711에 특이적인 CD8⁺ T 세포는 이들 동물에서 검출불가능하였으며, 이는 아마도 불활성화된 인플루엔자 백신에서 이들 단백질의 낮은 카피 수 때문일 것이다 (도 26C) (25). 이들 바이러스-특이적 CD8⁺ T 세포는 바이러스 챌린지 시 초기 활성화 바이오마커인 그랜자임 B (GB)를 발현하였다 (도 27A) (26). GB⁺CD8⁺ T 세포는 PS-GAMP-아주반트된 CA09 H1N1 백신을 받은 후 BALF에서 4일에 및 폐에서 6일에 유의하게 증가하였다 (도 3H). 이들 GB⁺CD8⁺ T 세포의 65% 초과가 NP_366-374에 대해 양성인 반면, PA_224-233 또는 PB1_703-711에 대해서는 소수의 세포만이 양성이었다 (도 27B). 유사한 조건 하에, 백신 단독은 GB⁺CD8⁺ T 세포를 유의하게 확장시키는데 실패하였다 (도 3H). PS-GAMP에 의해 유발된 CD8⁺ T 세포 반응은 폴리 IC 또는 TLR2 효능제 Pam2CSK4보다 우수한 것으로 밝혀졌다 (27, 28) (도 3I). 면역화 직후에 T 세포 면역 반응이 유도되었지만, Ag-특이적 BALF IgA 및 IgM은 이들 조기 시점에서 검출불가능하였다 (도 27C). 그러므로, PS-GAMP는 과도한 폐 염증 또는 면역병리를 유발하지 않으면서 CD8⁺ T 세포 유도에 관하여 바이러스 감염의 중요한 사건을 모방한다 (도 17A-17C, 18A-18V, 19A-19C, 20, 21A-21C, 및 22A-22G).

실시예 6: PS-GAMP는 면역화 후 2일만큼 조기에 강력한 보호를 제공한다

CD8⁺ T 세포의 신속한 유도는 PS-GAMP가 얼마나 빨리 보호를 달성할 수 있는지를 결정하게 하였다. 이를 위해, 도 28A에 도시된 바와 같이 면역화 후 0, 2, 4, 6, 8 또는 14일차에 마우스를 챌린지하였다. 백신접종에 PS-GAMP의 포함은 면역화 후 2일만큼 조기에 상동성 바이러스 챌린지로부터 마우스를 완전히 보호하였다 (도 4A). 모든 조기 챌린지 시점 (-2, -4 및 -6일)에서, 마우스는 단지 약간의 체중 감소를 경험하였고 (<10%), 모든 마우스는 생존하였다 (도 4A 및 도 28B). 면역화 8일 후 챌린지되었을 때, 마우스는 100% 생존으로 어떠한 체중 감소도 겪지 않았다 (도 4A 및 도 28B). 이러한 조기 보호는 0 또는 2일차에 단독으로 제공된 PS-GAMP가 어떠한 보호도 부여하지 않았기 때문에 선천성 면역으로부터 직접적으로 초래되지 않았다 (도 4B 및 도 28C). CD8⁺ T 세포가 조기 보호에 책임이 있는지 여부를 결정하기 위해, 면역화 2일전부터 시작하여 면역화 4일 후까지 격일로 항-CD8 항체의 복강내 (i.p.) 주사에 의해 CD8⁺ T 세포를 고갈시켰다. CD8⁺ T 세포의 고갈은 백신 단독을 받은 마우스와 유사한 급격한 체중 감소 및 100% 치사율에 의해 입증된 바와 같이 조기 보호를 폐지하였다 (도 4C 및 도 28D). 이 조기 보호가 CA09 H1N1 백신에 고유한 것임을 배제하기 위해, 본 발명자들은 CA09 H1N1 백신과 비교하여 면역원적으로 약한 백신인 H5N1 백신으로 조사를 확장하였다. 다시 한번, PS-GAMP의 존재는 적응성 면역 반응에 의존적인 방식으로 2-8일 전에 면역화된 마우스에 대해 rgVN04 H5N1 바이러스 챌린지에 대해 75%-100% 보호를 부여하였으며 (도 4D 및 도 28E), PS-GAMP 단독으로는 보호가 획득되지 않았기 때문이다 (도 4E 및 도 28F). 유사한 조건 하에, CT와 조합된 백신은 어떠한 조기 보호도 제공하지 않았고 (도 4E 및 도 28F), 상승된 염증이 반드시 강한 적응성 면역 반응과 연관되지는 않는다고 설득력 있게 주장한다 (도 17A-17C). rgH5N1 바이러스 외에도, 마우스는 PS-GAMP-아주반트된 불활성화된 H7N9 백신 (H7-Re1)으로 면역화된 후 2 또는 14일에 대유행 이전 A/상하이/4664T/2013 (SH13) H7N9 바이러스의 임상적 분리주의 치명적인 챌린지로부터 유의하게 또는 완전히 보호되었다 (도 4F 및 도 28G-28I). 폴리 IC에 의해 아주반트된 백신은 유사한 조건 하에 백신 단독에 비해 어떠한 이점도 제공하지 않았다 (도 4F 및 도 28I).

보호를 신속하게 확립하는 PS-GAMP의 능력은 또한 FDA-승인된 페럿 모델에서 검증되었다. 2일 전에 PS-GAMP-아주반트된 CA09 H1N1 백신을 받은 페럿은 상동성 CA09H1N1 바이러스로 감염되었을 때 <5% 체중 감소를 경험하였으며, 부수적으로 경증 내지 임상 증상이 없었으며, 바이러스 챌린지 후 2일차에 단지 짧은 발열을 경험하였다 (도 4G-4I). 바이러스 발산은 4일차 이후부터 유의하게 둔해졌다 (도 4J). 그러나, CA09H1N1 백신 단독은 유사한 바이러스 챌린지 후 체중 감소로부터 동물을 예방하는데 실패하였고, 체온을 적당히 낮추었음에도 불구하고 대조군에 비해 임상 증상을 개선하거나 바이러스 발산을 감소시키지 않았다 (도 4G-4J).

실시예 7: AEC는 PS-GAMP-매개 아주반트성에 필수적이다

cGAMP는 AM 및 AEC 사이에 제시된 간극 연접부를 통해 쉽게 전달되는 것으로 잘 문서화되어 있다 (29, 30). AM으로부터 AEC로의 동적 플럭스는 AM에서 SRB의 점진적인 손실에 의해 입증되었으며, SRB-나노4의 i.n. 투여 후 12시간에서 18시간까지 AEC에서 SRB의 지속적인 증가와 동시에 나타났다 (도 29A). AM에서 SRB의 손실은 DiD⁺ 세포의 수가 18시간 후까지 변경되지 않았기 때문에 리포솜의 손실에 기인할 수 없었다 (도 29B). AEC로의 SRB의 진입은 AM에 의한 SRB 흡수에 영향을 미치지 않는 간극-연접부 차단제 (29)인 카르베녹솔론 (CBX) (도 5A 및 5C)에 의해 차단되었다 (도 5A-5B). PS-GAMP를 받은 폐로부터 분류된 AM 및 AEC에서, CBX는 AEC에서 Ifnb1 및 Gmcsf의 전사를 크게 저하시킨 반면, AM에서 Ifnb1 전사를 증가시켰다 (도 30B-30C). 이것은 세포에서 상승된 cGAMP 수준의 결과일 가능성이 가장 컸다. 그러므로, AM으로부터 AEC로의 cGAMP의 간극-연접부-매개 플럭스가 있다. 반면에, 폴리 IC는 일차적으로 i.n. 면역화 후 AM (>97%) 내에 남아있었다 (도 31A). 총 AEC의 0.4% 및 총 DC의 4%만이 폐에서 폴리 IC를 차지하였다 (도 31B-31C). MLN 및 비강 조직 DC 뿐만 아니라 비강 상피 세포는 폴리 IC를 거의 내재화하지 않았다 (도 31D-31E).

PS-GAMP는 폴리 IC보다 100배 더 높은 IgG2c 역가를 유도하였다 (도 5D). 그러나, 면역화 이전 및 동안 마우스를 CBX 또는 2개의 다른 간극 연접부 억제제 토나베르사트 및 메클로페나메이트로 처리하였을 때 아주반트성은 실질적으로 둔해졌다 (도 5D) (31, 32). 대조적으로, 이들 억제제는 폴리 IC-매개 아주반트성에 거의 영향을 미치지 않았으며 (도 5D), 큰 분자인 폴리 IC가 간극 연접부를 통해 이웃 세포에 진입할 수 없는 것과 일치한다 (도 31A). AEC로의 cGAMP의 진입에 대한 차단은 CD11b⁺ DC의 동원을 50%만큼 감소시켰고 (도 5E), BALF 및 폐 모두에서 조기 CD8⁺ T 세포 반응에 더 중요한 효과를 나타내었다 (도 5F-5G). 더욱이, Sting-결핍 (Sting^-/- 또는 ST) 골수 (BM) 세포 및 WT AEC를 포함하는 키메라 마우스 (ST→WT)는 BALF 및 폐 모두에서 WT→WT 마우스와 유사한 수준의 CD8⁺ T 세포를 가졌다 (도 5H-5J 및 도 32A-32B) (33). 대조적으로, WT BM 세포를 Sting-결핍 마우스 (WT→ST 마우스)로 전달함으로써 제조된 AEC에서 STING-결핍을 갖는 마우스는 유의하게 더 낮은 수준의 Ag-특이적 CD8+ T 세포를 생성하였다 (도 5I-5J). 이들 WT→ST 마우스는 ST→WT 및 WT→WT 마우스 사이에서 유사하게 관찰된 보호와 대조적으로 체중 감소 및 높은 폐 바이러스 역가에 의해 시사되는 바와 같이 PS-GAMP-아주반트된 CA09 H1N1 백신에 의한 불량한 보호를 나타내었다 (도 5K-5L). 또한, 본 발명자들은 바이러스 역가를 갖는 폐와 BALF의 GB⁺CD8⁺ T 세포의 수 사이의 역 상관관계를 발견하였으며, 이는 감염 제어에서 GB⁺CD8⁺ T 세포의 중추적인 역할을 추가로 뒷받침한다 (도 5M-5N). 그러므로, AM보다는 AEC가 PS-GAMP의 효력을 결정하는데 필수적인 것으로 보이며, 이는 바이러스 감염 동안 호흡기계에서 선천성 및 적응성 면역 반응을 조정하는 중추적인 역할과 일치한다 (24, 34-36).

실시예 8: PS-GAMP는 이종아형 인플루엔자 바이러스에 대한 보호를 확장한다

PS-GAMP에 의해 유발된 강력한 CD8⁺ T 세포 면역은 범용 인플루엔자 백신 분야에서 격렬한 논쟁의 쟁점인 이종아형 보호에서의 역할을 연구할 수 있게 해주었다. 동물이 면역화 후 2일 (도 6A, 6C, 6E, 및 6G) 또는 14일 (도 6B, 6D, 6F, 및 6H)에 감염되었는지 여부에 관계없이, CA09H1N1 백신 (도 6A-6F) 또는 A/상하이/37T/2009 (SH09) H1N1 백신 (도 6G-6H)을 PS-GAMP와 함께 받은 마우스는 별개의 PR8 H1N1 바이러스 및 이종아형 A/아이치/2/1968 (아이치) H3N2, rgVN04 H5N1 또는 고병원성 SH13 H7N9 바이러스에 의한 치명적인 챌린지로부터 고도로 보호되었다 (도 33A-33H). 백신접종은 또한 2009 H1N1 대유행 및 H7N9 유행 동안 출현한 H275Y 돌연변이 (NC09)를 갖는 오셀타미비르-저항성 A/노쓰 캐롤라이나/39/2009 H1N1 바이러스로부터 보호하였다 (도 6I 및 도 33I) (37, 38). 오셀타미비르에 대한 이 바이러스의 저항성은 NC09가 아닌 CA09H1N1 바이러스 감염을 효과적으로 제어하는 오셀타미비르의 능력에 의해 입증되었다 (도 6I). 유사한 조건 하에, H1N1 백신 단독은 이들 이종아형 변이체의 챌린지에 대한 보호가 없거나 낮은 보호를 제공하였다 (도 6A-6I 및 도 33A-33I). PS-GAMP와 대조적으로, 폴리 IC-아주반트된 SH09 H1N1 백신은 H7N9 바이러스에 대한 유의한 이종아형 보호를 유발하는데 실패하였다 (도 6G-6H 및 도 33G-33H). 1가 백신에 더하여, PS-GAMP는 야마가타(Yamagata)-계통으로부터의 미스매치된 재배열체 A/구이저우/54/1989 H3N2 (rgGZ89) 바이러스 (도 6J 및 도 33J) 또는 플로리다/4/2006 인플루엔자 B 바이러스에 대한 3가 2018-2019 계절성 인플루엔자 백신 (SIV18-19)에 의해 유도된 면역 반응의 폭을 향상시켰다 (도 34A-34B). 이들 발견은 PS-GAMP가 다중 인플루엔자 백신을 동시에 증대시킬 수 있고 인플루엔자 A 및 B 바이러스 백신 모두에 유사하게 효과적임을 시사한다.

바이러스 감염 시 신속하게 소환될 수 있는 수명이 긴 Ag-특이적 기억 CD8⁺ T 세포는 폐에서 바이러스 복제의 충분한 제어에 중추적이다 (2, 3). OT-I 세포를 받은 마우스에서, CD103⁺CD49a⁺CD69⁺에 의해 표시된 바와 같은 폐 CD8⁺ T_RM 세포의 수는 OVA 단독에 비해 PS-GAMP와 조합된 OVA로 면역화한 후 20배 증가하였다 (도 35A-35C). 더욱이, PS-GAMP-아주반트된 CA09 H1N1 백신은 단일 면역화 6개월 후 이종아형 rgVN04 H5N1 바이러스 챌린지로부터 마우스를 완전히 보호하였다 (도 6K 및 도 33K). 이러한 장기간 교차-보호는 면역화 후 6개월 내에 쉽게 검출될 수 있는 폐의 내구적 인플루엔자-특이적 CD8⁺ T_RM 세포와 일치하였다 (도 35D-35E). 순환 기억 CD8⁺ T 세포가 아닌 이들 CD8⁺ T_RM 세포는 이들의 기능이 T 세포 egress 억제제 FTY720에 의해 손상되지 않았기 때문에 관찰된 장기간 보호에 기여하였다 (도 36A-36D) (3).

이종아형 면역은 불활성화된 rg퍼스H3N2 백신과 함께 PS-GAMP를 사용한 면역화에 의해 페럿에서 추가로 확증되었다. 동물의 체중 및 체온은 PBS 또는 백신 단독을 받은 동물과 비교할 때 면역화에 의해 영향을 받지 않았으며, 이는 페럿에서 PS-GAMP에 대한 양호한 안전성 프로파일을 입증한다 (도 37A-37B). 면역화는 면역화 후 28일에 상동성 퍼스 H3N2 바이러스에 대해 백신 단독보다 40배 더 높은 혈청 IgG 역가 및 5배 더 높은 HAI 역가를 유도하였지만 (도 37C-37D), 예상대로 이종아형 A/미시간/45/2015 H1N1 (미시간 H1N1) 바이러스에 대해 HAI 항체가 검출되지 않았다 (도 37E). 미시간 H1N1 바이러스로 챌린지 시, 백신 및 PS-GAMP를 받은 페럿은 특별히 감염 후기 (>7일)에 유의하게 더 적은 체중 감소 및 더 경미한 임상 증상을 나타내었으며, PBS 또는 백신 단독을 받은 동물보다 훨씬 빠르게 이들의 체온을 정상화시켰다 (도 6L-6N). 동물은 또한 감염 2일 후 유의하게 더 낮은 양의 바이러스를 배출하였다 (도 6O). 임상 결과의 유의한 개선 및 체중 회복의 가속화를 초래하는 바이러스 복제를 억압하는 백신접종의 능력은 동물에서 우세한 T 세포 면역의 결과일 가능성이 높았다.

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기타 실시양태

본 발명이 상세한 설명과 관련하여 설명되었지만, 전술한 설명은 첨부된 청구항의 범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 제한하지 않고 예시하기 위한 것임을 이해해야 한다. 다른 측면, 장점 및 변형은 하기 청구항의 범위 내에 있다.

SEQUENCE LISTING <110> The General Hospital Corporation <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR PULMONARY SURFACTANT-BIOMIMETIC NANOPARTICLES <130> 29539-0472WO1 <140> PCT/US2020/054377 <141> 2020-10-06 <150> US 62/911,559 <151> 2019-10-07 <150> US 62/932,552 <151> 2019-11-08 <150> US 62/961,073 <151> 2020-01-14 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer Gapdh forward <400> 1 atcaagaagg tggtgaagca 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer Gapdh reverse <400> 2 agacaacctg gtcctcagtg t 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer Ifnb1 forward <400> 3 agctccaaga aaggacgaac a 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer Ifnb1 reverse <400> 4 gccctgtagg tgaggttgat 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer Tnf forward <400> 5 cctgtagccc acgtcgtag 19 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer Tnf reverse <400> 6 gggagtagac aaggtacaac cc 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer Il10 forward <400> 7 gctggacaac atactgctaa cc 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer Il10 reverse <400> 8 atttccgata aggcttggca a 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer Cxcl10 forward <400> 9 ccaagtgctg ccgtcatttt c 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer Cxcl10 reverse <400> 10 tccctatggc cctcattctc a 21 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer Ccl2 forward <400> 11 tctgggcctg ctgttcaca 19 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer Ccl2 reverse <400> 12 cctactcatt gggatcatct tgct 24 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer Ccl3 forward <400> 13 tgtaccatga cactctgcaa c 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer Ccl3 reverse <400> 14 caacgatgaa ttggcgtgga a 21 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer Ccl5 forward <400> 15 gcccacgtca aggagtattt cta 23 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer Ccl5 reverse <400> 16 acacacttgg cggttccttc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer Gmcsf forward <400> 17 gaagcatgta gaggccatca 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer Gmcsf reverse <400> 18 gaatatcttc aggcgggtct 20

Claims (22)

1. 하기를 포함하는, 200-400 nm의 평균 크기를 갖는 나노입자를 포함하는 조성물이며:
   복수의 폐 계면활성제-생체모방 분자; 및
   나노입자에 의해 둘러싸인 하나 이상의 카고 분자,
   여기서 나노입자는 음으로 하전되고, 카고 분자는 최대 1200 Da의 분자량을 갖는 것인 조성물.
2. 제1항에 있어서, 폐 계면활성제-생체모방 분자가 50-90 중량%의 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC), 5-15 중량%의 음으로 하전된 지질, 및/또는 5-15 중량%의 중성 지질을 포함하는 것인 조성물.
3. 제2항에 있어서, 음으로 하전된 지질이 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) (DPPG)이고, 중성 지질이 콜레스테롤인 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자가 500-5000 Da의 평균 분자량을 갖는 복수의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 추가로 포함하고, 여기서 폴리에틸렌 글리콜이 나노입자의 외부 표면에 연결된 것인 조성물.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자가 5-15 중량%의 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (DPPE-PEG2000)을 추가로 포함하는 것인 조성물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 카고 분자가 인터페론 유전자 자극인자 (STING) 효능제인 조성물.
7. 제6항에 있어서, STING 효능제가 시클릭 구아노신 모노포스페이트 [GMP]-아데노신 모노포스페이트 [AMP] (cGAMP)이거나 이를 포함하는 것인 조성물.
8. 제7항에 있어서, cGAMP가 10-100 μg/ml의 농도로 존재하는 것인 조성물.
9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 카고 분자가 지속 작용-β2-효능제 (LABA) (예를 들어, 포르모테롤, 살메테롤 또는 빌란테롤); 코르티코스테로이드 (ICS) (예를 들어, 부데소니드, 플루티카손 프로피오네이트 또는 플루티카손 푸로에이트); 류코트리엔-경로 조정제 (예를 들어, 몬테루카스트 또는 질류톤); 키나제 (예를 들어, 비장 티로신 키나제, p38 미토겐-활성화 단백질 키나제 (MAPK), 포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트 3-키나제 (PI3K), 야누스 키나제 (Jak) 또는 포스포디에스테라제-4 (PDE4))를 표적화하는 억제제; 수용체 (예를 들어, Th2 세포 상에 발현되는 화학유인물질 수용체-상동성 분자 (CRTH2), 케모카인 수용체 2 (CCR2))의 효능제 또는 길항제; 이온 채널 (예를 들어, GABA 수용체, 일시적 수용체 전위 양이온 채널, 서브패밀리 A, 구성원 1 (TRPA1), 또는 전압-게이팅 나트륨 채널)의 효능제 또는 길항제; IFN-α의 유도제; 지속-작용 무스카린성 길항제/항콜린제 (LAMA); IL-5, IL-13, IL-33 또는 흉선 기질 림포포이에틴에 대한 억제제; CXCR2 길항제; 전염증성 시토카인 (예를 들어, TNF-α, TNF-β 또는 IL-6)을 차단하는 분자; IL-17/T_H17을 차단하는 분자; 마크로라이드; HDAC2를 활성화시키는 분자; STAT6 억제제 (예를 들어, AS1517499); 항바이러스 소분자 약물 (예를 들어, 오셀타미비르 (타미플루), 리렌자 또는 자나미비르); 파비피라비르 (T705); 세포내 Toll-유사 수용체 TLR3에 대한 효능제 (예를 들어, 이미퀴모드, 레시퀴모드 (R848), 이미다조퀴놀린 (IMQ), 모톨리모드, CU-CPT4a, IPH-3102 또는 린타톨리모드); 노디니팁 (NOD1), NOD2, NLPR3 또는 NPLRC3에 대한 효능제 (예를 들어, 무라밀디펩티드 (MDP), FK565 또는 FK156; TLR7 또는 TLR8 효능제 (예를 들어, 이사토리빈, 록소리빈, 가르디퀴모드, AZD8848, IMO-8400, ANA773, IMO-3100, SM360320 또는 852A); TLR8 효능제 (예를 들어, VTX-1463, VTX-2337, IMO-8400 또는 2,3-디아미노-푸로[2,3-c] 피리딘); 및/또는 TLR9 효능제 (IMO-8400, IMO-3100, SAR-21609, AZD1419, SD-101, IMO-2055, IMO-2125, QAX-935, AVE0675, DIMS0150, MGN-1703, MGN-1706, ISS1018 또는 아가톨리모드)인 조성물.
10. 유효량의 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계; 및 항원을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 항원에 대한 면역 반응을 촉진하는 방법.
11. 제10항에 있어서, 대상체가 포유동물인 방법.
12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 항원이 나노입자 내에 둘러싸여 있거나; 나노입자 및 항원이 단일 조성물로 투여되거나; 또는 나노입자 및 항원이 별도의 조성물로 투여되는 것인 방법.
13. 치료 유효량의 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 인플루엔자를 갖는 대상체에게 투여하는 단계; 및 항원을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인플루엔자를 갖는 대상체를 치료하는 방법이며, 여기서 카고 분자는 cGAMP이고 항원은 인플루엔자 백신인 방법.
14. 제13항에 있어서, 대상체가 인간이고 항원이 인간 인플루엔자 백신인 방법.
15. 치료 유효량의 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 기도 질환을 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 기도 질환을 갖는 대상체를 치료하는 방법이며, 여기서 카고 분자는 지속 작용-β2-효능제 (LABA) (예를 들어, 포르모테롤, 살메테롤 또는 빌란테롤); 코르티코스테로이드 (ICS) (예를 들어, 부데소니드, 플루티카손 프로피오네이트 또는 플루티카손 푸로에이트); 류코트리엔-경로 조정제 (예를 들어, 몬테루카스트 또는 질류톤); 키나제 (예를 들어, 비장 티로신 키나제, p38 미토겐-활성화 단백질 키나제 (MAPK), 포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트 3-키나제 (PI3K), 야누스 키나제 (Jak) 또는 포스포디에스테라제-4 (PDE4))를 표적화하는 억제제; 수용체 (예를 들어, Th2 세포 상에 발현되는 화학유인물질 수용체-상동성 분자 (CRTH2), 케모카인 수용체 2 (CCR2))의 효능제 또는 길항제; 이온 채널 (예를 들어, GABA 수용체, 일시적 수용체 전위 양이온 채널, 서브패밀리 A, 구성원 1 (TRPA1), 또는 전압-게이팅 나트륨 채널)의 효능제 또는 길항제; IFN-α의 유도제; 지속-작용 무스카린성 길항제/항콜린제 (LAMA); IL-5, IL-13, IL-33 또는 흉선 기질 림포포이에틴에 대한 억제제; CXCR2 길항제; 전염증성 시토카인 (예를 들어, TNF-α, TNF-β 또는 IL-6)을 차단하는 분자; IL-17/T_H17을 차단하는 분자; 마크로라이드; HDAC2를 활성화시키는 분자; STAT6 억제제 (예를 들어, AS1517499); 항바이러스 소분자 약물 (예를 들어, 오셀타미비르 (타미플루), 리렌자 또는 자나미비르); 및/또는 파비피라비르 (T705)인 방법.
16. 제15항에 있어서, 대상체가 인간이고, 기도 질환이 천식, 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD), 알레르기 또는 폐 바이러스 감염 중 하나 또는 이들의 조합인 방법.
17. 치료 유효량의 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법이며, 여기서 카고 분자는 화학요법제인 방법.
18. 제17항에 있어서, 대상체가 포유동물인 방법.
19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 암이 폐암이고, 화학요법제가 제피티닙, 에를로티닙, 크리조티닙, 에베롤리무스, 아파티닙, 크리조티닙 독소루비신, 에토포시드, 옵디보 및/또는 트렉솔인 방법.
20. 제17항 또는 제18항에 있어서, 암이 비인두암이고, 화학요법제가 시스플라틴, 카르보플라틴, 젬시타빈, 독소루비신 및/또는 D5-플루오로우라실 (5-FU)인 방법.
21. 제17항 또는 제18항에 있어서, 암이 기관암이고, 화학요법제가 에토포시드, 시스플라틴 및/또는 카르보플라틴인 방법.
22. 제17항 또는 제18항에 있어서, 암이 기관지암이고, 화학요법제가 에토포시드, 시스플라틴, 카르보플라틴, 5-FU, 도세탁셀, 파클리탁셀 및/또는 에피루비신인 방법.

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