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KR20220057517A - 신생아 fc 수용체에 대한 감소된 친화성을 갖는 psma 결합을 위한 항체 - Google Patents

신생아 fc 수용체에 대한 감소된 친화성을 갖는 psma 결합을 위한 항체 Download PDF

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KR20220057517A
KR20220057517A KR1020227002845A KR20227002845A KR20220057517A KR 20220057517 A KR20220057517 A KR 20220057517A KR 1020227002845 A KR1020227002845 A KR 1020227002845A KR 20227002845 A KR20227002845 A KR 20227002845A KR 20220057517 A KR20220057517 A KR 20220057517A
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KR
South Korea
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seq
set forth
sequence set
antibody
sequence
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020227002845A
Other languages
English (en)
Inventor
마이클 폴 휘트크로프트
크리스티안 피터 베런부르크
Original Assignee
테릭스 인터네셔널 피티와이 엘티디
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2019902344A external-priority patent/AU2019902344A0/en
Application filed by 테릭스 인터네셔널 피티와이 엘티디 filed Critical 테릭스 인터네셔널 피티와이 엘티디
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Abstract

본 발명은 야생형 IgG와 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하는 항-PSMA 항체에 관한 것으로, 여기서 하나 이상의 아미노산 치환은 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 항체의 친화도를 감소시키고, 이로써 IgG 클래스의 야생형 항체와 비교하여 변형 항체의 혈청 반감기를 감소시킨다. FcRn 결합을 감소시키는 효과를 갖는 하나 이상의 아미노산 변형은 His310, His433, His435, His436, Ile253 위치로부터 선택된다. 본 발명의 항체는 방사면역요법에 사용하기에 특히 적합하다.

Description

신생아 FC 수용체에 대한 감소된 친화성을 갖는 PSMA 결합을 위한 항체
본 발명은 방사면역요법에 사용하기 위한 혈청 반감기가 감소된 항체, 특히 방사성 동위원소에 접합된 항체를 생산하기 위한 항체, 조성물 및 방법에 관한 것이다.
관련 출원
본 출원은 호주 가출원 제2019902344호로부터 우선권을 주장하며, 그 내용은 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
방사선 요법은 종양 요법의 중요한 형태이다. 종양을 치료하기 위해 다양한 방사선 요법이 개발되어왔다. 그 중, 방사면역요법(radioimmunotherapy: RAIT)은 방사선 요법 제공에 대한 최근 생겨난 접근방식 중 하나이다. 이 방법은 항체 또는 항체 단편을 사용하여 방사성 동위원소를 특정 조직 및 세포로 지시함으로써 종양 치료의 특이성을 높이고 독성을 감소시킨다. RAIT는 저선량률 방사선을 사용하여 부작용을 더욱 감소시킨다.
건강한 조직과 장기에 대한 방사선 손상은 방사선 요법과 관련된 중대한 문제이다. 이러한 손상은 핵산, 탄수화물, 지질 및 지단백질과 같은 기능적으로 중요한 생물학적 분자를 산화시키고 조직과 세포를 손상시키는 방사선-발생 활성 산소 종에 주로 기인한다. 이들 종은 항균 방어, 염증, 발암 및 노화와 같은 다양한 생물학적 과정에 원인이 됨을 시사한다. 체중 감소에 의해 반영되는 바와 같이, 골수 억제 및 혈액 세포 손실, 예를 들면 백혈구(WBC) 및 혈소판 수 감소 및 조혈 독성은 방사선 손상의 가장 현저한 결과이다. 독성은 RAIT의 방사선량을 심각하게 제한하고 종양 치료의 효과를 감소시킨다.
방사선의 조혈 독성을 완화하기 위해 여러 방법이 개발되어왔다. 줄기세포 이식(SCT) 및 골수 이식(BMT)은 가장 흔히 사용되는 방법이다. 그러나 이러한 접근 방식은 침습적이고 비용이 많이 들며, 치료를 받는 개인이 장기간 입원할 수 있다.
다른 방법으로는 사이토카인을 사용하여 면역 체계를 자극하고 HP5b와 같은 혈액 조절 단백질을 사용하여 방사선 노출 기간 동안 조혈을 차단하는 방법을 포함한다. 이들 방법은 소규모 연구에서 조혈독성 퇴치에서 다양한 정도의 성공을 달성했으나, 다시 환자를 추가 약물 및 치료에 노출시켜야 하므로 대부분 사용되지 않는다.
방사면역요법과 관련된 독성을 완화하기 위한 새로운 방법이 여전히 요구된다.
명세서에서 선행 기술에 대한 참조는 본 선행 기술이 모든 관련 업계에서 공통적인 일반 지식의 일부를 형성하거나 또는 본 선행 기술이 관련 기술 분야의 숙련가가 이해하고, 관련 있는 것으로 간주하고/하거나 선행 기술의 다른 부분과 결합하는 것으로 합리적으로 예상할 수 있는 승인 또는 제안이 아니다.
발명의 요약
본 발명은 IgG 클래스의 야생형 항체와 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하는 방사면역요법에 사용하기 위한 IgG 클래스의 변형 항체를 제공하며, 여기서 하나 이상의 아미노산 치환은 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 항체의 친화도를 감소시키고, 이로써 IgG 클래스의 야생형 항체와 비교하여 변형 항체의 혈청 반감기를 감소시킨다.
하나의 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 IgG 분자의 중쇄 불변 영역 2(CH2)에서의 치환으로부터 선택되어, FcRn에 대한 IgG 분자의 친화도를 감소시킨다. 대안적으로, 하나 이상의 아미노산 치환은 IgG 분자의 중쇄 불변 영역 3(CH3)에 존재할 수 있고, 이로써 FcRn에 대한 IgG 분자의 친화도를 감소시킬 수 있다. 보다 추가적으로, 아미노산 치환은 IgG 분자의 CH2 영역에서 적어도 하나의 치환 및 CH3 영역에서 적어도 하나의 치환을 포함할 수 있으며, 이에 의해 치환은 FcRn에 대한 IgG의 친화도를 감소시킨다.
특정 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 IgG의 잔기 His310, His433, His435, His436, 또는 Ile253 중 하나 이상에서 존재할 수 있다. 바람직하게는, 아미노산 치환은 His310 또는 His435 위치에서 중쇄 불변 영역 내 치환을 포함한다. 보다 바람직하게는, FcRn에 대한 항체의 친화도를 감소시키는 아미노산 치환은 His310 및 His435 둘 다에 있다.
특정 실시양태에서, 변형 항체는 하나 이상의 Fc-감마 수용체에 결합하는 능력을 보유하고, 따라서 특정 실시양태에서 변형 항체는 이펙터 반응(ADCC 포함)을 자극하는 능력을 보유한다.
대안적인 실시양태에서, FcRn 수용체에 대한 친화도를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 변형은 또한 Fc 감마 수용체에 대한 친화도를 감소시킨다. 변형 항체는 IgG 클래스의 야생형 항체와 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 아미노산 치환은 하나 이상의 Fc 감마 수용체에 대한 항체의 친화도를 추가로 감소시킨다.
추가 실시양태에서, 변형 항체는 IgG 클래스의 야생형 항체와 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하고, 여기서 아미노산 치환은 IgG 클래스의 야생형 항체에 비해 변형 항체에서 CH1-CH2 힌지(hinge) 영역의 안정성을 증가시킨다.
하나의 실시양태에서, 변형 항체는 진단제 또는 치료제에 접합된다. 진단제 또는 치료제는 항체에 직접적으로 또는 간접적으로, 예를 들면 아미노산 잔기의 할로겐화에 의해 접합될 수 있다. 바람직하게는, 진단제 또는 치료제는 링커 또는 킬레이터 모이어티를 통해 항체에 간접적으로 접합된다. 하나의 예에서, 변형 항체는 TMT (6,6"-비스[N,N",N'"-테트라(카복시메틸)아미노메틸)-4'-(3-아미노-4-메톡시페닐)-2,2':6',2"-테르피리딘), DOTA (1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-NN',N"(N'"-테트라아세트산), TCMC, DO3A, CB-DO2A, NOTA, Diamsar, DTPA, CHX-A"-DTPA, TETE, Te2A, HBED, DFO, DFOsq 및 HOPO 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 기타 킬레이트제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 킬레이트 모이어티에 접합된다.
다른 예에서, 변형 항체는 이관능성 링커, 예를 들어 브로모아세틸, 티올, 숙신이미드 에스테르, TFP 에스테르, 말레이미드, 또는 당업계에 공지된 임의의 아민 또는 티올-개질 화학을 사용하여 접합된다.
바람직하게는, 진단제 또는 치료제는 방사성 동위원소이다. 적합한 동위원소의 예로는 악티늄-225 (225Ac), 아스타틴-211 (211At), 비스무트-212 및 비스무트-213 (212Bi, 213Bi), 구리-64 및 구리-67 (64Cu, 67Cu), 갈륨-67 및 갈륨-68 (67Ga 및 68Ga), 인듐-111 (111In), 요오드-123, -124, -125 또는 -131 (123I, 124I, 125I, 131I) (123I), 납-212 (212Pb), 루테튬-177 (177Lu), 라듐-223 (223Ra), 사마륨-153 (153Sm), 스칸듐-44 및 스칸듐-47 (44Sc, 47Sc), 스트론튬-90 (90Sr), 테크네튬-99 (99mTc), 이트륨-86 및 이트륨-90 (86Y, 90Y), 지르코늄-89 (89Zr)을 포함한다.
IgG 클래스의 비변형 항체와 비교하여 감소된 FcRn 결합 친화도를 갖는 IgG 클래스의 변형 항체는 생물학적 부위에 진단제 또는 치료제를 표적화하는데 유용한 임의의 항체일 수 있다. 항체는 IgG1(인간 또는 뮤린), IgG2, IgG4, 뮤린 IgG2a를 포함하여 임의의 IgG 클래스일 수 있다. 바람직한 예에서, 항체는 암 세포에 진단제 또는 치료제를 표적화하거나 전달하는데 유용한 임의의 항체이다. 적합한 항체의 예로는 IgG1 항체 트라스투주맙(Herceptin®), 리툭시맙(Rituxan®), 베바시주맙(Avastin®), 디누툭시맙(Unituxin®), IgG2 항체 파니투무맙(Vectibix®), IgG4 항체, 펨브롤리주맙(Keytruda®), 니볼루맙(Opdivo®), 뮤린 IgG2a 항체 토시투모맙(Bexxar®) 및 뮤린 IgG1 항체 이브리투모맙(Zevalin®)을 포함한다. 다른 예로는 젬투주맙(Mylotarg®), 브렌툭시맙(Adcetris®), 이노투주맙(Besponsa®), 글렘바투무맙(CDX-011), 아네투맙(BAY 94-9343), 미르베툭시맙(IMGN853), 데파툭시맙(ABT-414), 로발피투주맙(Rova-T) 및 바다스툭시맙 탈리린(SGN-CD33A)을 포함한다.
본 발명은 IgG 클래스의 비변형 항체와 비교 또는 IgG 클래스의 야생형 항체와 비교하여 감소된 FcRn 결합 친화도를 갖는 IgG 클래스의 변형 항체를 제공하며, IgG 클래스의 변형 항체는:
- IgG 클래스의 야생형 항체와 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 여기서 하나 이상의 아미노산 치환은 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 항체의 친화도를 감소시키고, 이로써 IgG 클래스의 야생형 항체와 비교하여 변형 항체의 혈청 반감기를 감소시킨다.
여기서 상기 항체는 전립선 특이적 막 항원(PSMA)에 특이적으로 결합하고, 여기서 항체는
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 - 링커 - FR1a - CDR1a - FR2a - CDR2a - FR3a - CDR3a - FR4a를 포함하고,
여기서:
FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 프레임워크 영역이고;
CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 상보성 결정 영역이고;
FR1a, FR2a, FR3a 및 FR4a는 각각 프레임워크 영역이며;
CDR1a, CDR2a 및 CDR3a는 각각 상보성 결정 영역이고;
여기서 상보성 결정 영역 중 임의의 것의 서열은 표 1에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다. 바람직하게는, 프레임워크 영역은 또한 각각의 항체로부터 유래된 다양한 프레임워크 영역을 정렬함으로써 결정될 수 있는 특정 잔기에서의 아미노산 변이를 포함하는 하기 표 1에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명은 또한 CDR1, CDR2 및 CDR3이 VH로부터의 서열이고, CDR1a, CDR2a 및 CDR3a가 VL로부터의 서열인 경우, 또는 CDR1, CDR2 및 CDR3이 VL로부터의 서열이고, CDR1a, CDR2a 및 CDR3a가 VH로부터의 서열인 경우를 포함한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 IgG 클래스의 비변형 항체와 비교 또는 IgG 클래스의 야생형 항체와 비교하여 감소된 FcRn 결합 친화도를 갖는 IgG 클래스의 변형 항체를 제공하며, IgG 클래스의 변형 항체는
- His310, His433, His435, His436 및 Ile253 위치에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 IgG 클래스의 비변형 항체 또는 야생형 항체에 존재하는 잔기와 상이한 중쇄 불변 영역을 포함하고,
여기서 상기 항체는 전립선 특이적 막 항원(PSMA)에 특이적으로 결합하고, 여기서 항체는
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 - 링커 - FR1a - CDR1a - FR2a - CDR2a - FR3a - CDR3a - FR4a를 포함하고,
여기서:
FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 프레임워크 영역이고;
CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 상보성 결정 영역이고;
FR1a, FR2a, FR3a 및 FR4a는 각각 프레임워크 영역이며;
CDR1a, CDR2a 및 CDR3a는 각각 상보성 결정 영역이고;
여기서 상보성 결정 영역 중 임의의 것의 서열은 표 1에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다. 바람직하게는, 프레임워크 영역은 또한 각각의 항체로부터 유래된 다양한 프레임워크 영역을 정렬함으로써 결정될 수 있는 특정 잔기에서의 아미노산 변이를 포함하는 하기 표 1에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명은 또한 CDR1, CDR2 및 CDR3이 VH로부터의 서열이고, CDR1a, CDR2a 및 CDR3a가 VL로부터의 서열인 경우, 또는 CDR1, CDR2 및 CDR3이 VL로부터의 서열이고, CDR1a, CDR2a 및 CDR3a가 VH로부터의 서열인 경우를 포함한다.
하나의 실시양태에서, PSMA에 특이적으로 결합하는 항체는 서열번호 4 또는 20의 (N에서 C 말단 또는 C에서 N 말단의 순서로) 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 이로 구성되는 항원 결합 부위를 포함한다.
추가 실시양태에서, PSMA에 특이적으로 결합하는 항체는 다음 중 적어도 하나를 포함한다:
(i) 서열번호 1 또는 17에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 2 또는 18에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 3 또는 19에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH;
(ii) 서열번호 4 또는 20에 제시된 서열과 적어도 약 95% 또는 96% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 VH;
(iii) 서열번호 33에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 34에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 35에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL;
(iv) 서열번호 36에 제시된 서열과 적어도 약 95% 동일한 서열을 포함하는 VL;
(v) 서열번호 1 또는 17에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 2 또는 18에 제시된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 3 또는 19에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH;
(vi) 서열번호 4 또는 20에 제시된 서열을 포함하는 VH;
(vii) 서열번호 33에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 34에 제시된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 45에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL;
(viii) 서열번호 36에 제시된 서열을 포함하는 VL;
(ix) 서열번호 1 또는 17에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 2 또는 18에 제시된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 3 또는 19에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH; 및 서열번호 33에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 34에 제시된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 35에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL; 또는
(x) 서열번호 4 또는 20에 제시된 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 36에 제시된 서열을 포함하는 VL.
바람직하게는, 중쇄 불변 영역은 His310 및 His435 모두에서 아미노산 치환을 포함한다. 항체는 또한 불변 중쇄 영역의 Ser228 및 Leu235와 상응하는 잔기에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
임의의 실시양태에서, 항체는 서열번호 49 내지 51 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 바람직하게는 여기서 중쇄 불변 영역은 서열번호 50에 제시된 서열을 포함한다.
또 다른 추가 실시양태에서, 항체의 중쇄는 서열번호 49 내지 56 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하고, 바람직하게는 서열번호 53 중 어느 하나에 제시된 바와 같다.
추가로, 바람직한 실시양태에서, 항체의 경쇄 불변 영역은 서열번호 52에 제시된 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 항체는 서열번호 57에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다
특히 바람직한 실시양태에서, 항체는 서열번호 53에 제시된 아미노산 서열 및 서열번호 57에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 면역글로불린 모이어티 및 이에 접합된 비-단백질 제제를 포함하는 분자를 제공하며,
여기서, 면역글로불린 모이어티는 종양 관련 항원에 특이적으로 결합하고,
여기서 면역글로불린 모이어티는 야생형 면역글로불린과 비교하여 FcRn 수용체에 대한 친화도가 감소되거나 소거되며; 및
여기서 비-단백질 제제는 세포독소 또는 방사성 원소와 같은 치료학적 모이어티를 포함한다.
면역글로불린 모이어티는 트라스투주맙(Herceptin®), 리툭시맙(Rituxan®), 베바시주맙(Avastin®), 디누툭시맙(Unituxin®), 파니투무맙(Vectibix®), 펨브롤리주맙(Keytruda®), 니볼루맙(Opdivo®), 토시투모맙(Bexxar®), 이브리투모맙(Zevalin®), 젬투주맙(Mylotarg®), 브렌툭시맙(Adcetris®), 이노투주맙(Besponsa®), 글렘바투무맙(CDX-011), 아네투맙(BAY 94-9343), 미르베툭시맙(IMGN853) 데파툭시맙(ABT-414), 로발피투주맙(Rova-T) 및 바다툭시맙 탈리린(SGN-CD33A) 또는 본 명세서에 기술된 임의의 다른 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 종양-관련 항원에 결합하는데 유용한 임의의 항체를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 면역글로불린 모이어티 및 이에 접합된 비-단백질 제제를 포함하는 분자를 제공하며,
여기서, 면역글로불린 모이어티는 PSMA에 특이적으로 결합하고, 다음을 포함하는 항원 결합 부위를 포함한다:
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 - 링커 - FR1a - CDR1a - FR2a - CDR2a - FR3a - CDR3a - FR4a,
여기서:
FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 프레임워크 영역이고;
CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 상보성 결정 영역이고;
FR1a, FR2a, FR3a 및 FR4a는 각각 프레임워크 영역이며;
CDR1a, CDR2a 및 CDR3a는 각각 상보성 결정 영역이고;
여기서 상보성 결정 영역 중 임의의 것의 서열은 표 1에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 가지고;
여기서 면역글로불린 모이어티는 야생형 면역글로불린과 비교하여 FcRn 수용체에 대한 친화도가 감소되거나 소거되며;
여기서 비-단백질 제제는 세포독소 또는 방사성 원소와 같은 치료학적 모이어티를 포함한다.
바람직하게는, 프레임워크 영역은 또한 각각의 항체로부터 유래된 다양한 프레임워크 영역을 정렬함으로써 결정될 수 있는 특정 잔기에서의 아미노산 변이를 포함하는 하기 표 1에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명은 또한 CDR1, CDR2 및 CDR3이 VH로부터의 서열이고, CDR1a, CDR2a 및 CDR3a가 VL로부터의 서열인 경우, 또는 CDR1, CDR2 및 CDR3이 VL로부터의 서열이고, CDR1a, CDR2a 및 CDR3a가 VH로부터의 서열인 경우를 포함한다. 바람직하게는, 면역글로불린 모이어티는 불변 중쇄 영역에서 His310 및/또는 His435와 상응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는다. 면역글로불린 모이어티는 또한 불변 중쇄 영역의 Ser228 및 Leu235와 상응하는 잔기에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 비-단백질 제제는 방사성 원소를 포함한다.
본 발명은 또한 면역글로불린 모이어티 및 이에 접합된 비-단백질 제제를 포함하는 분자를 제공하며,
여기서, 면역글로불린 모이어티는 PSMA에 특이적으로 결합하고, 서열번호 4 또는 20의 아미노산 서열(N에서 C 말단 또는 C에서 N 말단의 순서로)로 본질적으로 구성되거나 이로 구성되는 항원 결합 부위를 포함하고;
여기서 면역글로불린 모이어티는 야생형 면역글로불린과 비교하여 FcRn 수용체에 대한 친화도가 감소되거나 소거되며; 및
여기서 비-단백질 제제는 세포독소 또는 방사성 원소와 같은 치료학적 모이어티를 포함한다.
바람직하게는, 면역글로불린 모이어티는 불변 중쇄 영역에서 His310 및/또는 His435와 상응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는다. 면역글로불린 모이어티는 또한 불변 중쇄 영역의 Ser228 및 Leu235와 상응하는 잔기에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 면역글로불린 모이어티 및 이에 접합된 비-단백질 제제를 포함하는 분자를 제공하며,
여기서 면역글로불린 모이어티는 야생형 면역글로불린과 비교하여 FcRn 수용체에 대한 친화도가 감소되거나 소거되고, 면역글로불린 모이어티는 PSMA에 특이적으로 결합하고 다음 중 적어도 하나를 포함한다:
(i) 서열번호 1 또는 17에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 2 또는 18에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 3 또는 19에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH;
(ii) 서열번호 4 또는 20에 제시된 서열과 적어도 약 95% 또는 96% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 VH;
(iii) 서열번호 33에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 34에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 35에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL;
(iv) 서열번호 36에 제시된 서열과 적어도 약 95% 동일한 서열을 포함하는 VL;
(v) 서열번호 1 또는 17에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 2 또는 18에 제시된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 3 또는 19에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH;
(vi) 서열번호 4 또는 20에 제시된 서열을 포함하는 VH;
(vii) 서열번호 33에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 34에 제시된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 45에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL;
(viii) 서열번호 36에 제시된 서열을 포함하는 VL;
(ix) 서열번호 1 또는 17에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 2 또는 18에 제시된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 3 또는 19에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH; 및 서열번호 33에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 34에 제시된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 35에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL; 또는
(x) 서열번호 4 또는 20에 제시된 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 36에 제시된 서열을 포함하는 VL.
바람직하게는, 면역글로불린 모이어티는 불변 중쇄 영역에서 His310 및/또는 His435와 상응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는다. 면역글로불린 모이어티는 또한 불변 중쇄 영역의 Ser228 및 Leu235와 상응하는 잔기에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 비-단백질 제제는 방사성 원소를 포함한다.
임의의 실시양태에서, 면역글로불린은 서열번호 49 내지 51 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 바람직하게는 여기서 중쇄 불변 영역은 서열번호 50에 제시된 서열을 포함한다.
또 다른 추가 실시양태에서, 면역글로불린은 서열번호 53 내지 56 중 어느 하나, 바람직하게는 서열번호 53에 제시된 서열을 포함한다.
임의의 실시양태에서, 면역글로불린은 서열번호 52의 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 면역글로불린은 서열번호 57에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함한다.
특히 바람직한 실시양태에서, 면역글로불린은 서열번호 53 및 57에 제시된 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 방법은 위에 기술된 바와 같이 접합된 면역글로불린 모이어티 및 비-단백질 제제를 포함하는 분자를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하여, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 방사면역요법에 사용하기에 적합한 항체를 생성하는 방법을 제공하고, 방법은:
- 방사면역요법이 필요한 세포 또는 조직에 존재하는 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 갖는 항체를 제공하는 단계;
- 적어도 하나의 아미노산 치환을 항체의 중쇄 불변 영역에 도입하여 변형 항체를 생성하는 단계(여기서 적어도 하나의 아미노산 치환은 잔기 His310, His435, 및 Ile253에서의 아미노산 치환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 이로써 상기 항체의 FcRn에 대한 결합 친화도 및/또는 혈청 반감기가 변경됨);
- 변형 항체를 방사성 원소와 접합시키는 단계를 포함하여,
이로써 방사면역요법에 사용하기에 적합한 항체를 생성한다.
특정 실시양태에서, 항체는 하기 표 1에 기재된 바와 같은 상보성 결정 영역, 프레임워크 영역, 가변 경쇄 또는 가변 중쇄 영역 중 임의의 것을 갖는 항체를 포함하는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체이다. 바람직하게는, 변형 항체는 또한 불변 중쇄 영역의 Ser228 및 Leu235와 상응하는 잔기에서 아미노산 치환을 포함한다. 바람직하게는, 방사성 원소는 킬레이트제, 예를 들어 DOTA를 사용하여 변형 항체에 접합된다.
본 발명은 또한 질병의 치료에 사용하기 위한 항체-방사성 동위원소 면역접합체를 생성하는 방법을 제공하며, 방법은:
- 방사면역요법이 필요한 세포 또는 조직에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 갖는 항체를 제공하는 단계;
- 적어도 하나의 아미노산 치환을 항체의 중쇄 불변 영역에 도입하여 변형 항체를 생성하는 단계(여기서 적어도 하나의 아미노산 치환은 잔기 His310, His435, 및 Ile253에서의 아미노산 치환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 이로써 상기 항체의 FcRn에 대한 결합 친화도 및/또는 혈청 반감기가 변경됨);
- 변형 항체를 방사성 원소와 접합시키는 단계를 포함하여,
이로써 질병의 치료에 사용하기 위한 항체-방사성 동위원소 면역접합체를 생성한다.
바람직하게는, 항체는 하기 표 1에 기재된 바와 같은 상보성 결정 영역, 프레임워크 영역, 가변 경쇄 또는 가변 중쇄 영역 중 임의의 것을 갖는 항체를 포함하는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체이다. 바람직하게는, 변형 항체는 또한 불변 중쇄 영역의 Ser228 및 Leu235와 상응하는 잔기에서 아미노산 치환을 포함한다. 바람직하게는, 방사성 원소는 킬레이트제, 예를 들어 DOTA를 사용하여 변형 항체에 접합된다. 보다 바람직하게는, 변형 항체는 아미노산 치환 His310Ala 및 His435Gln을 포함한다.
바람직하게는 질환은 전립선암 또는 신장세포암종을 포함하는 암이다.
본 발명은 비변형된 형태의 항체와 비교하여 FcRn에 대한 결합 친화도 및/또는 혈청 반감기가 변경된 변형 항체를 생산하는 방법을 추가로 제공하고, 여기서 상기 방법은,
(a) 면역글로불린 중쇄의 적어도 하나의 불변 영역을 인코딩하는 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 적합한 프로모터를 포함하는 발현 벡터(바람직하게는 복제가능한 발현 벡터)를 제공하는 단계(여기서 아미노산 잔기 His310, His435 및 Ile253으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄 불변 영역으로부터의 적어도 하나의 아미노산이 비변형 항체에 존재하는 것과 상이한 아미노산으로 치환되고, 이로써 FcRn 결합 친화도 및/또는 혈청 반감기가 변경됨);
(b) 상기 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계; 및
(c) 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 상기 변형 항체를 생산하는 단계를 포함한다.
선택적으로, 이러한 방법은 상보적 면역글로불린 경쇄를 인코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제2 발현 벡터(바람직하게는 복제가능한 발현 벡터)를 제조하고 상기 세포주를 상기 제2 벡터로 추가로 형질전환시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 방사면역요법에서 사용하기 위한 항체의 혈청 반감기를 변경하는 방법을 제공하고, 방법은:
- 방사면역요법이 필요한 세포 또는 조직에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 갖는 항체를 제공하는 단계;
- 적어도 하나의 아미노산 치환을 항체의 중쇄 불변 영역에 도입하여 변형 항체를 생성하는 단계(여기서 적어도 하나의 아미노산 치환은 잔기 His310, His435, 및 Ile253에서의 아미노산 치환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 이로써 상기 항체의 FcRn에 대한 결합 친화도 및/또는 혈청 반감기가 변경됨)를 포함한다.
바람직하게는, 방법은 변형 항체를 방사성 원소와 접합시키는 단계를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 항체는 하기 표 1에 기재된 바와 같은 상보성 결정 영역, 프레임워크 영역, 가변 경쇄 또는 가변 중쇄 영역 중 임의의 것을 갖는 항체를 포함하는, PSMA에 결합하기 위한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체이다. 바람직하게는, 변형 항체는 또한 Ser228Pro 및/또는 Leu235Glu를 포함하는 불변 중쇄 영역의 Ser228 및 Leu235와 상응하는 잔기에서 아미노산 치환을 포함한다. 보다 바람직하게는, 변형 항체는 아미노산 치환 His310Ala 및 His435Gln을 포함한다.
본 발명은 방사면역요법에서 사용하기 위한 항체의 독성을 감소시키는 방법을 제공하고, 방법은
- 방사면역요법이 필요한 세포 또는 조직에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 갖는 항체를 제공하는 단계;
- 적어도 하나의 아미노산 치환을 항체의 중쇄 불변 영역에 도입하여 변형 항체를 생성하는 단계(여기서 적어도 하나의 아미노산 치환은 잔기 His310, His435, 및 Ile253에서의 아미노산 치환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기서 아미노산 치환은 혈청 반감기를 감소시키고/시키거나 순환으로부터 변형 항체의 제거를 증가시킴)를 포함하고,
이로써 항체가 방사면역요법에 사용하기 위해 방사성 원소에 접합하는 경우 항체의 독성을 감소시킬 수 있다.
임의의 실시양태에서, 항체의 독성을 감소시키는 것은, 그렇지 않은 경우 순환(혈액학적 독성, 골 흡수 및 골수 조사를 포함함)에서 방사성 동위원소의 장기간 체류로 인해 발생할 수 있는 많은 독성 영향을 감소시키는 것을 포함한다.
임의의 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 방사성-표지된 항체 또는 방사면역접합체의 독성은 대상체에 투여한 후 항체 또는 면역접합체의 종양:혈액 비율을 결정함으로써 평가된다.
본 발명의 임의의 실시양태에서, 본 발명의 변형 항체의 종양:혈액 비율은, 비율이 항체 투여 후 적어도 8시간에 결정될 때, 본 명세서에 기재된 바와 같은 중쇄 불변 영역에 대한 변형을 갖지 않는 비변형 항체에 대한 것보다 적어도 2배 이상, 적어도 3배 이상, 적어도 4배 이상, 적어도 6배 이상, 적어도 8배 이상 또는 적어도 10배 이상 또는 그 이상이다. 대안적으로, 비율은 대상체에 대한 항체를 투여한 후 적어도 24, 48, 72 또는 120시간에 결정된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 변형 항체의 종양:혈액 비율은, 비율이 항체를 투여한 후 적어도 120시간에 결정될 때, 본 명세서에 기재된 바와 같은 중쇄 불변 영역에 대한 변형을 갖지 않는 비변형 항체에 대한 것보다 적어도 50배 이상, 적어도 100배 이상, 적어도 200배 이상, 또는 적어도 300배 이상이다.
본 발명의 임의의 실시양태에서, 비변형 항체와 비교하여 감소되거나 변경된 혈청 반감기를 갖는 본 명세서에 기재된 변형 항체는 비변형 항체보다 적어도 2배, 적어도 3배 또는 이상 더 빠른 혈청 제거율을 갖는다.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 항체는 치료학적 쌍에 사용하는데 적합하며, 여기서 치료학적 쌍은 1) 영상화제에 커플링된 항체 및 2) 요법을 위한 제제에 커플링된 항체를 포함한다. 예를 들어, 항체는 먼저 방사선 영상화에 사용하기에 적합한 방사성 동위원소에 커플링될 때 진단제로 사용될 수 있고, 두 번째로 항체는 요법에 사용하기에 적합한 방사성 동위원소 또는 세포독성제에 커플링될 때 치료제로 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 다음을 포함하는 대상체에서 질병, 장애 또는 감염을 진단, 모니터링 또는 예측하는 생체내 방법을 제공한다:
(a) 질병, 장애 또는 감염과 관련된 항원에 특이적으로 결합하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형 항체의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계;
(b) 항체가 상기 항원이 발견되는 상기 대상체의 부위에 농축되도록 하는 단계; 및
(c) 상기 변형 항체를 검출하는 단계;
이로써 백그라운드 또는 표준 수준 이상의 상기 변형 항체의 검출은 대상체가 상기 질병 장애 또는 감염을 가짐을 나타냄.
본 발명은 전립선 특이적 막 항원(PSMA)에 결합하거나 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 항원 결합 부위는 인간 PSMA에 결합하거나 특이적으로 결합한다.
본 발명은 PSMA에 대한 결합을 위한 항원 결합 부위를 제공하고, 항원 결합 부위는 다음을 포함한다:
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 - 링커 - FR1a - CDR1a - FR2a - CDR2a - FR3a - CDR3a - FR4a
여기서:
FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 프레임워크 영역이고;
CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 상보성 결정 영역이고;
FR1a, FR2a, FR3a 및 FR4a는 각각 프레임워크 영역이며;
CDR1a, CDR2a 및 CDR3a는 각각 상보성 결정 영역이고;
여기서 프레임워크 영역 또는 상보성 결정 영역 중 임의의 것의 서열은 본 명세서에 기재된 바와 같다.
본 발명은 PSMA에 대한 결합을 위한 항원 결합 부위를 제공하고, 항원 결합 부위는 다음을 포함한다:
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 - 링커 - FR1a - CDR1a - FR2a - CDR2a - FR3a - CDR3a - FR4a
여기서:
FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 프레임워크 영역이고;
CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 상보성 결정 영역이고;
FR1a, FR2a, FR3a 및 FR4a는 각각 프레임워크 영역이며;
CDR1a, CDR2a 및 CDR3a는 각각 상보성 결정 영역이고;
여기서 상보성 결정 영역 중 임의의 것의 서열은 표 1에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다. 바람직하게는, 프레임워크 영역은 또한 각각의 항체로부터 유래된 다양한 프레임워크 영역을 정렬함으로써 결정될 수 있는 특정 잔기에서의 아미노산 변이를 포함하는 하기 표 1에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명은 또한 CDR1, CDR2 및 CDR3이 VH로부터의 서열이고, CDR1a, CDR2a 및 CDR3a가 VL로부터의 서열인 경우, 또는 CDR1, CDR2 및 CDR3이 VL로부터의 서열이고, CDR1a, CDR2a 및 CDR3a가 VH로부터의 서열인 경우를 포함한다.
본 발명은 서열번호 4 또는 20의 아미노산 서열(N에서 C 말단 또는 C에서 N 말단의 순서로)을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나 이로 구성되는 항원 결합 부위를 제공한다.
본 발명은 또한 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 부위를 제공하며, 여기서 항원 결합 도메인은 PSMA에 결합하거나 특이적으로 결합하며, 항원 결합 도메인은 다음 중 적어도 하나를 포함한다:
(i) 서열번호 1 또는 17에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 2 또는 18에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 3 또는 19에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH;
(ii) 서열번호 4 또는 20에 제시된 서열과 적어도 약 95% 또는 96% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 VH;
(iii) 서열번호 33에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 34에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 35에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL;
(iv) 서열번호 36에 제시된 서열과 적어도 약 95% 동일한 서열을 포함하는 VL;
(v) 서열번호 1 또는 17에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 2 또는 18에 제시된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 3 또는 19에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH;
(vi) 서열번호 4 또는 20에 제시된 서열을 포함하는 VH;
(vii) 서열번호 33에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 34에 제시된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 45에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL;
(viii) 서열번호 36에 제시된 서열을 포함하는 VL;
(ix) 서열번호 1 또는 17에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 2 또는 18에 제시된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 3 또는 19에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH; 및 서열번호 33에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 34에 제시된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 35에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL; 또는
(x) 서열번호 4 또는 20에 제시된 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 36에 제시된 서열을 포함하는 VL.
본 발명의 임의의 국면에서, 항원 결합 도메인은 다음 중 적어도 하나를 추가로 포함한다:
(i) 서열번호 9 또는 25에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 프레임워크 영역(FR) 1, 서열번호 10 또는 26에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 FR2, 서열번호 11 또는 27에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 FR3, 및 서열번호 12 또는 28에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 FR4를 포함하는 VH;
(ii) 서열번호 41에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 FR1, 서열번호 42에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 FR2, 서열번호 43에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 FR3, 및 서열번호 44에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 FR4을 포함하는 VL;
(iii) 서열번호 9 또는 25에 제시된 서열을 포함하는 FR1, 서열번호 10 또는 26에 제시된 서열을 포함하는 FR2, 서열번호 11 또는 27에 제시된 서열을 포함하는 FR3, 및 서열번호 12 또는 28에 제시된 서열을 포함하는 FR4를 포함하는 VH;
(iv) 서열번호 41에 제시된 서열을 포함하는 FR1, 서열번호 42에 제시된 서열을 포함하는 FR2, 서열번호 43에 제시된 서열을 포함하는 FR3, 및 서열번호 44에 제시된 서열을 포함하는 FR4를 포함하는 VL; 또는
(v) 서열번호 9 또는 25에 제시된 서열을 포함하는 FR1, 서열번호 10 또는 26에 제시된 서열을 포함하는 FR2, 서열번호 11 또는 27에 제시된 서열을 포함하는 FR3, 및 서열번호 12 또는 28에 제시된 서열을 포함하는 FR4를 포함하는 VH; 및 서열번호 41에 제시된 서열을 포함하는 FR1, 서열번호 42에 제시된 서열을 포함하는 FR2, 서열번호 43에 제시된 서열을 포함하는 FR3, 및 서열번호 44에 제시된 서열을 포함하는 FR4를 포함하는 VL.
임의의 실시양태에서, 항원 결합 부위는 서열번호 49 내지 51 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 바람직하게는 여기서 중쇄 불변 영역은 서열번호 50에 제시된 서열을 포함한다.
또 다른 추가 실시양태에서, 항원 결합 부위는 서열번호 53 내지 56, 바람직하게는 53 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함한다.
임의의 실시양태에서, 항원 결합 부위는 서열번호 52의 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 부위의 경쇄는 서열번호 57의 서열을 포함한다.
특히 바람직한 실시양태에서, 항원 결합 부위는 서열번호 53 및 57에 제시된 서열을 포함한다.
전술한 항원 결합 부위는 또한 항체의 항원 결합 도메인으로 지칭될 수 있다.
바람직하게는, 본 명세서에 기재된 항원 결합 부위는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 전형적으로, 항원 결합 부위는 항체, 예를 들어 모노클로날 항체이다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 항원 결합 부위는 다음의 형태일 수 있다:
(i) 단일 사슬 Fv 단편(scFv);
(ii) 이량체 scFv(디-scFv);
(iii) 항체의 불변 영역, Fc 또는 중쇄 불변 도메인(CH)2 및/또는 CH3에 연결된 (i) 또는 (ii) 중 하나; 또는
(iv) 면역 이펙터 세포에 결합하는 단백질에 연결된 (i) 또는 (ii) 중 하나.
또한, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 항원 결합 부위는 다음의 형태일 수 있다:
(i) 디아바디(diabody);
(ii) 트리아바디(triabody);
(iii) 테트라바디(tetrabody);
(iv) Fab;
(v) F(ab')2;
(vi) Fv;
(vii) 항체의 불변 영역, Fc 또는 중쇄 불변 도메인(CH)2 및/또는 CH3에 연결된 (i) 내지 (vi) 중 하나; 또는
(viii) 면역 이펙터 세포에 결합하는 단백질에 연결된 (i) 내지 (vi) 중 하나.
임의의 국면 또는 실시양태에서, 항체는 네이키드 항체(naked antibody)이다. 구체적으로, 항체는 비접합 형태이고 접합체를 형성하도록 조정되지 않는다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 항원 결합 부위, 면역글로불린 가변 도메인, 항체, dab (단일 도메인 항체), di-scFv, scFv, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일사슬 항체 분자, 또는 다중특이적 항체를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
본 발명은 또한 표지 또는 세포독성제에 접합된 본 명세서에 기재된 바와 같은 항원 결합 부위, 면역글로불린 가변 도메인, 항체, dab, di-scFv, scFv, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일사슬 항체 분자, 또는 다중특이적 항체 또는 융합 단백질 형태의 접합체를 제공한다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 항원 결합 부위, 면역글로불린 가변 도메인, 항체, dab, di-scFv, scFv, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일사슬 항체 분자, 또는 다중특이적 항체, 융합 단백질 또는 접합체에 결합하기 위한 항체를 제공한다.
바람직한 실시양태에서, 항원 결합 부위는 항체 불변 도메인, CH2-CH3 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 IgG 면역글로불린이며, 이는 야생형 항체 Fc 영역에 비해 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 항체의 결합을 변형시킨다. 하나 이상의 아미노산 변형은 FcRn에 대한 항체 불변 도메인, Fc 영역, 또는 이의 FcRn 결합 단편의 친화도를 변화시킴으로써 항원 결합 부위의 혈청 반감기를 변경시킨다.
바람직하게는, 이러한 치환은 비변형 야생형 항체에 대해 FcRn에 대한 결합 친화도 및/또는 상기 변형 항체의 혈청 반감기를 변경시킨다. 본 발명은 또한 비변형 항체와 비교하여 FcRn에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 혈청 반감기를 갖는 변형 항체를 제공하며, 여기서 CH2 도메인의 Ile253 또는 His310 위치에 존재하는 임의의 하나 이상의 아미노산 잔기 및/또는 CH3 도메인의 잔기 His435는 비변형 항체 또는 비변형 IgG에 존재하는 아미노산과 상이한 또 다른 아미노산으로 치환된다.
하나의 예에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 H310 및 H435에 상응하는 잔기에서의 아미노산 치환으로부터 선택된다. 추가의 예에서, 항체는 His310 및 His435 잔기 둘 다에서 아미노산 치환을 포함한다.
아미노산 치환은 히스티딘 잔기로부터 알라닌, 글루타민, 글루탐산 또는 아스파르트산으로의 치환을 포함할 수 있다. 바람직하게는, His310에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환이다. 바람직하게는, His435에서의 아미노산 치환은 글루타민으로의 치환이다. 바람직하게는, Ile253에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환이다.
추가 실시양태에서, 항원 결합 부위는 활성화 Fc 감마 수용체에 대한 항체의 결합을 변형시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 항체이다. 하나 이상의 아미노산 변형은 임의의 하나 이상의 Fc 감마 수용체에 대한 항체 불변 도메인, Fc 영역, 또는 Fc 감마 수용체 결합 단편의 친화도를 변화시킨다. 바람직하게는, 아미노산 변형은 Leu235에 상응하는 잔기에 존재한다. 보다 바람직하게는, 아미노산 변형은 Leu235에서 글루탐산으로의 변형이다.
하나의 실시양태에서, 아미노산 변형은 Ser228에서의 힌지 안정화 돌연변이이다. 바람직하게는, Ser228에서의 아미노산 변형은 프롤린으로의 변형이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, 항체는 Ser228, Leu235, His310 및 His435에서의 돌연변이를 포함한다. 바람직하게는, 아미노산 변형은 Ser228Pro, Leu235Glu, His310Ala 및 His435Gln이다.
아미노산 변형은 바람직하게는 IgG1 이소형을 갖는 항체에서, 또는 IgG4 이소형 상에서 이루어진다.
바람직한 실시양태에서, 항체는 서열번호 235 내지 238 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 중쇄 불변 영역을 포함한다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 항원 결합 부위, 면역글로불린 가변 도메인, 항체, dab, di-scFv, scFv, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일사슬 항체 분자, 또는 다중특이적 항체, 융합 단백질 또는 접합체를 인코딩하는 핵산을 제공한다.
하나의 예에서, 이러한 핵산은 핵산이 프로모터에 작동가능하게 연결된 발현 작제물에 포함된다. 이러한 발현 작제물은 벡터, 예를 들어 플라스미드에 존재할 수 있다.
단일 폴리펩티드 사슬 항원 결합 부위에 관한 본 발명의 예에서, 발현 작제물은 해당 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 핵산에 연결된 프로모터를 포함할 수 있다.
항원 결합 부위를 형성하는 다중 폴리펩티드 사슬에 대한 예에서, 발현 작제물은 예를 들어 프로모터에 작동가능하게 연결된 VH를 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 및 예를 들어 프로모터에 작동가능하게 연결된 VL을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함한다.
또 다른 예에서, 발현 작제물은 바이시스트론 발현 작제물로, 예를 들어 5'에서 3' 순서로 작동 가능하게 연결된 다음의 구성요소를 포함한다:
(i) 프로모터;
(ii) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산;
(iii) 내부 리보솜 진입 부위; 및
(iv) 제2 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산,
여기서 제1 폴리펩티드는 VH를 포함하고 제2 폴리펩티드는 VL을 포함하거나 또는 그 반대이다.
본 발명은 또한, 하나는 VH를 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하고, 다른 하나는 VL을 포함하는 제2 폴리펩티드를 인코딩하는 별개의 발현 작제물을 고려한다. 예를 들어, 본 발명은 또한 하기를 포함하는 조성물을 제공한다:
(i) 프로모터에 작동가능하게 연결된 VH를 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 발현 작제물; 및
(ii) 프로모터에 작동가능하게 연결된 VL을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 발현 작제물.
본 발명은 본 명세서에 기재된 벡터 또는 핵산을 포함하는 세포를 제공한다. 바람직하게는, 세포는 분리되거나, 실질적으로 정제되거나 재조합된다. 하나의 예에서, 세포는 본 발명의 발현 작제물을 포함하거나 또는:
(i) 프로모터에 작동가능하게 연결된 VH를 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 발현 작제물; 및
(ii) 프로모터에 작동가능하게 연결된 VL을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 발현 작제물을 포함하고,
여기서 제1 및 제2 폴리펩티드는 회합하여 본 발명의 항원 결합 부위를 형성한다.
본 발명의 세포의 예로 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 포유동물 세포를 포함한다.
본 발명은 또한 항원 결합 부위를 포함하거나 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CDR 및/또는 FR 서열, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역글로불린 가변 도메인, 항체, dab(단일 도메인 항체), di-scFv, scFv, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일사슬 항체 분자, 또는 다중특이적 항체, 융합 단백질, 또는 접합체 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 항원 결합 부위를 포함하거나 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CDR 및/또는 FR 서열, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항원 결합 부위, 면역글로불린 가변 도메인, 항체, dab, di-scFv, scFv, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일사슬 항체 분자, 또는 다중특이적 항체, 융합 단백질, 또는 접합체, 희석제 및 선택적으로 표지를 포함하는 진단용 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 항원 결합 부위는 방사성 동위원소에 접합된 단일클론 항체이다.
본 발명은 또한 항원 결합 부위를 포함하거나 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CDR 및/또는 FR 서열, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역글로불린 가변 도메인, 항체, dab, di-scFv, scFv, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일사슬 항체 분자, 또는 다중특이적 항체, 융합 단백질, 또는 접합체를 포함하는 키트 또는 제조 용품을 제공한다.
바람직하게는, 항원 결합 부위는 방사성 동위원소에 접합된 단일클론 항체이다.
본 명세서에 기재된 항원 결합 부위, 단백질 또는 항체는 인간 불변 영역, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 불변 영역 또는 이들의 혼합과 같은 IgG 불변 영역을 포함할 수 있다. VH 및 VL을 포함하는 항체 또는 단백질의 경우, VH는 중쇄 불변 영역에 연결될 수 있고 VL은 경쇄 불변 영역에 연결될 수 있다.
하나의 예에서, 본 명세서에 기술된 단백질 또는 항체 또는 본 명세서에 기술된 단백질 또는 항체의 조성물은 안정화된 중쇄 불변 영역을 포함하는, C-말단 라이신 잔기가 있거나 없는 서열의 혼합을 완전히 또는 부분적으로 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
하나의 예에서, 본 발명의 항체는 IgG4 불변 영역 또는 안정화된 IgG4 불변 영역(예를 들어, 상기 논의된 바와 같음)에 연결되거나 융합된 본 명세서에 개시된 VH를 포함하고, VL은 카파 경쇄 불변 영역에 연결되거나 융합된다.
본 발명의 항원 결합 부위의 기능적 특징을 취하여 본 발명의 항체에 준용하여 적용할 것이다.
본 명세서에 기재된 항원 결합 부위는 정제, 실질적으로 정제, 분리 및/또는 재조합될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항원 결합 부위를 대상체에게 투여하는 것을 포함하여, 대상체에서 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 이와 관련하여, 항원 결합 부위는 상태의 재발을 예방하기 위해 사용될 수 있으며, 이는 상태를 예방하는 것으로 간주된다.
예시적인 암은 전립선암을 포함한다. PSMA에 대한 친화도를 갖는 항체가 이러한 목적에 유용할 것임을 이해할 것이다.
본 발명은 또한 다음을 포함하는 대상체에서 질병, 장애 또는 감염을 진단, 모니터링 또는 예측하는 생체내 방법을 제공한다:
(a) 질병, 장애 또는 감염과 관련된 항원에 특이적으로 결합하는 본 명세서에 기재된 상기 항체의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계;
(b) 항체가 상기 항원이 발견되는 상기 대상체의 부위에 농축되도록 하는 단계; 및
(c) 상기 항체를 검출하는 단계;
이로써 백그라운드 또는 표준 수준 이상의 상기 항체의 검출은 대상체가 상기 질병 장애 또는 감염을 가짐을 나타냄.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 문맥상 달리 요구되는 경우를 제외하고, 용어 "포함한다(comprise)", 및 이러한 용어의 변형, 예를 들면, "포함하는(comprising)", "포함하다(comprises)" 및 "포함된(comprised)"은 추가의 첨가제, 성분, 정수 또는 단계를 배제하도록 의도하지는 않는다.
본 발명의 추가의 국면 및 선행 단락에서 설명된 국면의 추가 실시양태는 첨부 도면을 참조하여 예시로서 제공된 다음 기술된 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1: 본 발명의 항체의 평균 반감기 및 반감기의 Tukey 다중 비교.
오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다. J591 IgG = PSMA 결합을 위한 대조군 HuJ591 항체. ANT4044-K-DOTA = DOTA에 접합된 항체 ANT4044 라이신. ANT4044-A2-K-DOTA - DOTA에 접합된 항체 ANT4044-A2 라이신. ANT4044-FcRn-K-DOTA = FcRn-결합 영역 내 아미노산 치환이 있는, DOTA에 접합된 항체 ANT4044 라이신. ANT4044-FcRg-K-DOTA = FcRn 및 Fc 감마 수용체 결합 영역에 아미노산 치환이 있는, DOTA에 접합된 항체 ANT4044 라이신.
도 2: 본 발명의 선택된 항체에 대한 평균 곡선 아래 면적(AUC) 및 제거율(CL).
J591 IgG = PSMA 결합을 위한 대조군 HuJ591 항체. ANT4044-K-DOTA = DOTA에 접합된 항체 ANT4044 라이신. ANT4044-A2-K-DOTA - DOTA에 접합된 항체 ANT4044-A2 라이신. ANT4044-FcRn-K-DOTA = FcRn-결합 영역 내 아미노산 치환이 있는, DOTA에 접합된 항체 ANT4044 라이신. ANT4044-FcRg-K-DOTA = FcRn 및 Fc 감마 수용체 결합 영역 내 아미노산 치환이 있는, DOTA에 접합된 항체 ANT4044 라이신.
도 3: PET 영상의 ROI 분석으로 결정된 8시간에서의 항체 생체분포.
도 4: PET 영상의 ROI 분석으로 결정된 24시간에서의 항체 생체분포.
도 5: 생체 외 감마 계수로 결정된 48시간에서의 모든 항체의 생체분포.
도 6: PET 영상의 ROI 분석으로 결정된 48시간에서의 항체 생체분포.
도 7: 주입 후 5일까지 항체의 혈액 농도.
도 8: 영상화(8시간, 24시간, 48시간)로 결정된 항체의 종양 축적
도 9: 항체의 종양 대비 혈액의 비율.
각각의 항체에 대한 종양:혈액 비율(생체내 종양:꼬리 혈액)을 8시간, 24시간 및 48시간 시점에 결정하였다. 비율은 항체 JN005 및 hJ591과 비교하여 모든 시점에서 JN006 및 JN007이 상당히 더 높다.
도 10: 항체의 종양 대비 혈액의 비율.
각각의 항체에 대한 종양:혈액 비율(생체외:생체외)을 48시간 및 120시간 시점에서 결정하였다. 비율은 항체 JN005 및 hJ591과 비교하여 모든 시점에서 JN006 및 JN007이 상당히 더 높다.
도 11: 본 발명의 예시적인 항체의 생체내 영상화 및 생체내 분포.
본 발명의 항-PSMA, FcRn-K-DOTA-Lu-변형 항체를 받은 LNCap 이종이식 마우스에서의 SPECT 영상화.
도 12: 본 발명의 예시적인 항체의 혈액 약동학.
본 발명의 항-PSMA, FcRn-K-DOTA-Lu-변형 항체의 투여 후 마우스의 혈액에서 측정된 방사능 수준.
도 13: 본 발명의 예시적인 항체로 처리된 LNCap-보유 이종이식 마우스에서의 효능 연구.
본 발명의 항-PSMA, K-DOTA-Lu FcRn-변형 항체와의 처리는 0일과 비교하여 14일에 종양 부피의 변화가 없음으로 입증된 바와 같이 종양 성장을 유의하게 억제하였다. 대조군(PBS) 그룹에서는 FcRn-K-DOTA-Lu 처리 그룹의 해당 시간과 비교할 때 9일, 12일 및 14일에 종양이 상당히 커지면서 종양 부피가 전반적으로 증가했다.
도 14: 본 발명의 예시적인 항체의 투여 후 LNCap-보유 이종이식 마우스에서의 종양:혈액 비율.
FcRn-결합을 감소시키도록 변형된 본 발명의 항-PSMA, K-DOTA-Lu 항체(HuX592R-DOTA-Lu177)로 처리된 마우스에 대한 종양:혈액 비율을 나타낸다. 대조군 마우스에 항-PSMA, K-DOTA-Lu 항체 (HuJ591-DOTA-Lu177)를 투여하였다. 비변형 항체를 받은 마우스에 비해 특히 24시간 및 48시간 시점에서 FcRn 변형 항체를 받은 마우스가 비율이 더 높았다.
도 15: 생체 외 감마 계수로 측정된 건강한 수컷 Balb/c 누드 마우스의 177 Lu-표지된 HuX592R 및 HuJ591 생체분포.
A는 투여 후 24, 48 및 72시간에 평가된 HuX592R 생체분포를 나타내는 반면, B는 투여 후 72시간에서의 HuX592R의 생체분포를 HuJ591과 비교하여 도시한다.
도 16: HuX592R(FcRn-K-DOTA-Lu)의 투여 후 또는 무처리 대조군의 각 치료 코호트에서 LNCaP 이종이식 종양의 퇴행.
도 17: TLX592(FcRn-K-DOTA-Lu), TLX591(K-DOTA-Lu 항체, 본 명세서에서 HuJ591-DOTA-Lu177로도 지칭됨)의 투여 후 또는 무처리 대조군의 연구 기간 동안 코호트 생존의 플롯.
본 명세서에 개시되고 정의된 본 발명은 텍스트 또는 도면으로부터 언급되거나 명백한 개별 특징들 중 둘 이상의 모든 대안적인 조합으로 확장된다는 것을 이해할 것이다. 이들 상이한 조합 모두는 본 발명의 다양한 대안적 국면을 구성한다.
본 발명의 추가의 국면 및 선행 단락에서 설명된 국면의 추가 실시양태는 첨부 도면을 참조하여 예시로서 제공된 다음 기술설명으로부터 명백해질 것이다.
이제 본 발명의 특정 실시양태를 상세히 참조할 것이다. 본 발명은 실시양태와 관련하여 기재될 것이지만, 본 발명을 이러한 실시양태로 제한하려는 의도가 아님을 이해할 것이다. 반대로, 본 발명은 청구범위에 의해 정의된 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있는 모든 대안, 수정 및 등가물을 포함하도록 의도된다.
본 발명은 부분적으로 방사면역요법에 사용하기 위한 방사면역접합체의 독성을 감소시키기 위한 새로운 접근법의 확인에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 방법은 방사면역접합체의 치료 잠재력에 상당한 영향을 미치지 않으면서 독성을 감소시킨다.
앞서 설명한 바와 같이 건강한 조직과 세포에 대한 방사선 손상은 방사면역요법과 관련된 주요 문제이다. 독성은 RAIT의 방사선량을 심각하게 제한하고 종양 치료의 효과를 감소시킨다.
그러나, 본 발명자들은 항체의 불변 중쇄를 변형시켜 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 항체의 친화도를 감소시켜 야생형 항체에 비해 혈청 반감기를 감소시킨 방사면역요법에서 사용하기 위한 항체를 개발하였다. 따라서, 본 발명자들에 의해 개발된 항체는 다양한 면역요법에 사용하는데 상당한 이점을 갖는다.
치료 항체의 FcRn-결합 도메인의 변형이 이전에 보고되었지만, 이러한 변형은 예를 들어 치료 항체의 혈청 반감기를 증가시키고 순환에 있어서 치료 항체의 체류를 연장하기 위해 FcRn 친화도를 증가시킬 목적으로 개발되어왔다. 선행 기술의 접근 방식과 대조적으로, 본 발명은 치료제의 혈청 반감기를 감소시키는 것을 목표로 한다.
놀랍게도, 본 발명자들은 혈청 반감기를 감소시킴(및 투여 후 전신 순환으로부터 제거율이 증가함)에도 불구하고, 본 발명의 항체가 비변형 항체로서 종양 부위로 전달되고 축적될 수 있는 유사한 능력을 갖는다는 것을 발견하였다. 이러한 결과는 변형 항체와 비변형 항체에 대한 종양 로딩이 통계적으로 상이하지 않다는 점에서 놀라운 일이며, 이는 본 발명자들이 채택한 접근법이 혈청 반감기 및 그에 따른 독성을 상당히 감소시키면서, 항체가 표적 에피토프에 결합하는 능력 또는 항체가 표적 부위에 전달되는 능력에 부정적인 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.
보다 중요하게는, 본 발명자들은 증가된 제거율에도 불구하고 본 발명의 변형 항체가 종양 부위에 상주하는 것을 보여주었다. 따라서 본 발명자들의 연구는 방사성 표지된 항체의 FcRn 또는 FcRn 및 Fc 감마 수용체 결합 도메인의 변형이 종양에 축적되는 항체의 능력과 관련하여 항체의 치료 잠재력에 영향을 미치지 않으면서 순환에 있어서 방사성 동위원소의 양을 줄이는 데 상당히 유용함을 나타낸다. 이것은 순환에서 방사성 동위원소의 장기간 체류로 인해 발생할 수 있는 많은 독성 영향(골수 조사 및 골 흡수의 결과로서 혈액학적 독성을 포함함)을 줄이는 것을 포함하여 많은 이점을 가진다. 더욱이, 지금까지 많은 RAIT 요법에 대한 용량 제한 독성이 이러한 확장된 혈액 순환 및 골수 조사의 직접적인 결과로서 혈액학적 독성이었다는 점을 고려하면, 본 발명은 더 높은 수준에서 허용 가능한 투여 가능성을 제공하고, 이에 따라 골 흡수 및 골수 조사에 보다 효과적인 치료를 유도하게 된다.
예기치 않게, 본 발명자들은 또한 불변 중쇄에 대한 아미노산 변형이 FcRn 결합을 소거하면서 단백질 G 및 일부 단백질 A 정제 수지에 결합하는 항체의 능력에 영향을 미치지 않는다는 것을 발견하였다. 따라서, 다른 면역치료제에 비해 혈청 반감기가 감소된 본 발명의 항체는 일반 항체용으로 개발된 동일한 기존/표준화된 생산 플랫폼을 사용하여 생산될 수 있다. 이것은 상이한 다수의 조작된 항체 형식들 중 몇가지, 예를 들어, 생산이 번거롭고 IgG 분자보다 덜 안정적인 미니바디, 디아바디에 비해 중요한 장점이다. 또한, 신체에 '고유한' 분자 형식으로서 전장 항체는 조작된 항체 또는 항체 단편보다 면역원성 반응의 가능성이 감소하는 경향이 있다.
본 발명의 항체의 추가 이점은 치료진단 분야에서의 적용에 대한 이의 특정한 적합성이다. 보다 구체적으로, 전술한 바와 같이, 항체의 감소된 혈청 반감기는 방사성 동위원소에 커플링될 때 항체를 요법에 특히 유용하게 만들며, 항체가 종양에 적절한 양의 방사성 제제를 전달할 수 있기 때문에 순환에서 빠르게 제거된다. 또한, 항체의 감소된 혈청 반감기는 항체에 커플링되고 영상화를 위해 선택된 방사성 동위원소의 신속한 제거가 바람직한 진단 방법에 사용하기에 특히 적합하다. 따라서, 제1 예로서 진단으로서 항체의 용도는 항체의 치료 형태(즉, 항체가 요법에 적합한 방사성 동위원소에 커플링되는 경우)의 사용 및 투여량을 알려주는 것이다. 따라서, 본 발명의 항체는 상이한 방사성 동위원소에 커플링되고 후속적으로 "치료진단 쌍(theranostic pair)"으로 사용되는 경우에 유용하다.
전반적인 기술
본 명세서 전반에 걸쳐, 구체적으로 명시되지 않거나 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단일 단계, 물질의 조성, 단계의 그룹 또는 물질의 조성 그룹에 대한 언급은 이들 단계, 물질의 조성, 단계 그룹 또는 물질의 조성 그룹 중 하나 및 다수(즉, 하나 이상)를 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 따라서, 본 명세서에 사용된 단수 형태 "하나(a)", "하나의(an)" 및 "그(the)"는 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 복수의 국면을 포함하고, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 예를 들어, "하나"에 대한 언급은 단일 및 둘 이상을 포함하고; "하나의"에 대한 언급은 단일 뿐만 아니라 둘 이상을 포함하며; "그"에 대한 언급은 단일뿐만 아니라 둘 이상 등을 포함한다.
당업자는 본 발명이 구체적으로 기술된 것 이외의 변형 및 수정이 가능하다는 것을 이해할 것이다. 본 발명은 이러한 모든 변형 및 수정을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명은 또한 개별적으로 또는 집합적으로 본 명세서에서 참조되거나 표시된 모든 단계, 특징, 조성물 및 화합물, 및 상기 단계 또는 특징 중 임의의 및 모든 조합 또는 이들 중 임의의 둘 이상을 포함한다.
당업자는 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 다수의 방법 및 물질을 인식할 것이다. 본 발명은 기술된 방법 및 물질에 어떠한 방식으로도 제한되지 않는다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 공보는 전문이 참조로 포함된다.
본 발명은 단지 예시의 목적으로 의도된 본 명세서에 기재된 특정 실시예에 의해 범위를 제한하지 않는다. 기능적으로 동등한 제품, 조성물 및 방법은 본 발명의 범위 내에 명백히 존재한다.
본 명세서에서 본 발명의 임의의 실시예 또는 실시양태는 달리 구체적으로 기술되지 않는 한 본 발명의 임의의 다른 실시예 또는 실시양태에 준용하여 적용할 것이다.
달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계(예를 들면, 세포 배양, 분자 유전학, 면역학, 면역 조직 화학, 단백질 화학 및 생화학)의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 간주되어야 할 것이다.
달리 명시되지 않는 한, 본 개시내용에서 사용되는 재조합 단백질, 세포 배양 및 면역학적 기술은 당업자에게 잘 알려진 표준 절차이다. 이러한 기술은 다음과 같은 출처의 문헌 전반에 걸쳐서 서술되고 설명된다: J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook 외 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), and F.M. Ausubel 외 (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates until present), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), and J.E. Coligan 외 (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (현재까지의 모든 업데이트를 포함함).
가변 영역 및 이의 부분, 면역글로불린, 항체 및 이의 단편에 대한 설명 및 정의는 문헌[참조: Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991, Bork 외, J Mol. Biol. 242, 309-320, 1994, Chothia and Lesk J. Mol Biol. 196:901 -917, 1987, Chothia 외 Nature 342, 877-883, 1989 and/or or Al-Lazikani 외, J Mol Biol 273, 927-948, 1997]에 의해 추가로 명확해질 수 있다.
용어 "및/또는", 예를 들어 "X 및/또는 Y"는 "X 및 Y" 또는 "X 또는 Y"를 의미하는 것으로 이해되어야 하며 두 가지 의미 또는 어느 한 의미에 대한 명시적 지원을 제공하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "로부터 유래된"은 특정 출처에서 반드시 직접적으로는 아닐지라도 지정된 정수가 특정 출처에서 얻어질 수 있음을 나타내는 것으로 간주되어야 한다.
선택된 정의
본 명세서에 사용된 바와 같이, 종양:혈액 비율은 대상체의 혈액 내 동일한 항체의 양에 대한 항체(또는 방사성 표지된 항체)의 양의 비율을 지칭한다. 당업자는 종양:혈액 비율을 계산하기 위한 표준 기술과 익숙할 것이다. 예를 들어, 방사성 동위원소(또는 표지된 항체)의 생체외 활성 농도를 측정하고 조직(또는 혈액) 그램당 감쇠-보정된 주입 활성의 백분율로 표시하고, 주입 용량/g 백분율(%ID/g)로 근사치를 낸다. 그런 다음 종양 대 혈액 비율은 혈액에서 검출된 활성에 대한 종양에서 검출된 활성으로 계산한다.
본 명세서에 사용된 용어 '치료진단'은 진단 및 요법에 사용되는 화합물/물질의 능력을 지칭한다. 용어 "치료진단 시약"은 환자의 질병 또는 상태의 검출, 진단 및/또는 치료에 모두 적합한 임의의 시약에 관한 것이다. 치료진단 화합물/물질의 목적은 별개의 진단제와 치료제 사이에 존재할 수 있는 생체 분포 및 선택성의 바람직하지 않은 차이를 극복하는 것이다. 치료진단 쌍을 사용하면 질병을 확인하거나 신체의 영향을 받는 부위를 발견하기 위해 영상화 방사성 핵종을 포함하는 진단학적 화합물이 먼저 환자에게 투여된다. 일단 확인/발견되면, 영상화 및 치료 방사성 핵종의 생체 분포가 동일하기 때문에 표적 특이적 방식으로 치료 방사성 핵종을 포함하는 치료학적 화합물을 투여함으로써 질병을 치료할 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 본 발명의 항체는 예를 들어 항체가 영상화 또는 진단 목적을 위해 방사성 동위원소에 접합되고 동일한 항체가 요법에 적합한 상이한 방사성 동위원소 또는 세포독성제와 접합되는 경우 치료진단 쌍에 포함시키는데 특히 유용하다. 항체의 항원 결합 부위는 진단용 방사성 동위원소를 종양 부위로 지시하거나 표적화하여 진단(종양 분포, 종양 크기, 종양 밀도를 포함함)을 용이하게 하는 한편, 항체의 동일한 항원 결합 부위는 방사성 동위원소를 요법용 종양으로 지시한다.
본 명세서에 사용된 용어 "Fc 영역"은 때때로 "Fc" 또는 "Fc 도메인"으로 지칭되며, IgG 분자의 파파인 소화에 의해 수득된 결정화가능한 단편과 관련있는 IgG 분자의 부분을 지칭한다. Fc 영역은 이황화 결합에 의해 연결된 IgG 분자의 두 중쇄의 C-말단 절반으로 이루어진다. Fc 영역은 항원 결합 활성이 없지만 탄수화물 모이어티 및 보체 및 FcRn 수용체를 포함하는 Fc 수용체에 대한 결합 부위를 포함한다. Fc 영역은 전체 두 번째 불변 도메인 CH2(EU 인덱스 넘버링 시스템에 따른 인간 IgG1의 잔기 231-340으로 카밧(Kabat) 시스템에서 잔기 244-360으로도 정의됨) 및 세 번째 불변 도메인 CH3(잔기 341-447 EU 인덱스/361-478 카밧)을 포함한다(예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함되어 있는 제WO2015175874호의 서열번호 1 또는 CH2의 서열에 대해 도 1C 및 서열번호 2의 서열; CH3의 서열에 대해서는 도 1D를 참조하며; 또한 면역글로불린의 Fc 영역에 있는 다양한 잔기에 사용되는 넘버링 규칙의 비교에 대해서는 http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html#refs를 참조한다).
본 명세서에 사용된 바와 같이, "EU 인덱스" 또는 "EU 넘버링 방식"은 EU 항체의 넘버링을 지칭한다(Edelman 외, 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85, 전문이 참고로 본 명세서에 포함됨). 본 명세서에 사용된 "카밧 시스템"은 카밧 서열(참조: Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991)을 지칭한다. 당업자는 주어진 아미노산 서열이 EU 또는 카밧 시스템에 따라 번호가 매겨졌는지 여부를 쉽게 결정할 수 있을 것이다.
용어 "분리된 단백질" 또는 "분리된 폴리펩티드"는 그 기원 또는 유래의 원천으로 인해 천연 상태에서 이를 수반하는 천연 관련 성분과 연관되지 않고; 동일한 공급원과는 다른 단백질이 실질적으로 없는 단백질 또는 폴리펩티드이다. 단백질은 자연적으로 결합된 성분이 실질적으로 없게 되거나 당업계에 공지된 단백질 정제 기술을 사용하여 분리에 의해 실질적으로 정제될 수 있다. "실질적으로 정제된"은 단백질에 오염 물질이 실질적으로 없는, 예를 들어 약 70% 또는 75% 또는 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 96% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 이상으로 오염 물질이 없음을 의미한다.
용어 "재조합(recombinant)"은 인공 유전자 재조합의 산물을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 항체 항원 결합 도메인을 포함하는 재조합 단백질의 맥락에서, 이 용어는 B 세포 성숙 동안 발생하는 자연 재조합의 산물인 대상체의 신체 내에서 자연적으로 발생하는 항체를 포함하지 않는다. 그러나, 이러한 항체가 분리된 경우, 항체 항원 결합 도메인을 포함하는 분리된 단백질로 간주되어야 한다. 유사하게, 단백질을 인코딩하는 핵산이 분리되고 재조합 수단을 사용하여 발현된다면, 생성된 단백질은 항체 항원 결합 도메인을 포함하는 재조합 단백질이다. 재조합 단백질은 또한 재조합 단백질이 예를 들어 발현되는 세포, 조직 또는 대상체 내에 존재할 때 인공 재조합 수단에 의해 발현되는 단백질을 포함한다.
용어 "단백질"은 단일 폴리펩티드 사슬, 즉 펩티드 결합에 의해 연결된 일련의 연속 아미노산 또는 서로 공유 또는 비공유 연결된 일련의 폴리펩티드 사슬(즉, 폴리펩티드 복합체)을 포함하는 것으로 간주되어야 할 것이다. 예를 들어, 일련의 폴리펩티드 사슬은 적합한 화학물질 또는 이황화 결합을 사용하여 공유적으로 연결될 수 있다. 비공유 결합의 예로는 수소 결합, 이온 결합, 반 데르 발스 힘 및 소수성 상호 작용을 포함한다.
용어 "폴리펩티드" 또는 "폴리펩티드 사슬"은 펩티드 결합에 의해 연결된 일련의 연속적인 아미노산을 의미하는 것으로 앞 단락에서 이해될 것이다.
본 명세서에 사용된 용어 "항원 결합 부위"는 "항원 결합 도메인"과 상호교환적으로 사용되며 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 영역, 즉 VH 또는 VL 또는 VH 및 VL 둘 다를 포함하는 Fv를 의미하는 것으로 간주되어야 한다 항원 결합 도메인은 전체 항체의 맥락에 있을 필요는 없으며, 예를 들어, 분리되어 있거나(예를 들어, 도메인 항체) 또는 예를 들어 scFv와 같이 본 명세서에 기재된 바와 같은 다른 형태일 수 있다.
본 개시내용의 목적을 위해, 용어 "항체"는 Fv 내에 포함된 항원 결합 도메인에 의해 하나 또는 몇 개의 밀접하게 관련된 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질을 포함한다. 이 용어는 4개의 사슬 항체(예를 들어, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄), 재조합 또는 변형 항체(예를 들어, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, CDR-이식 항체, 영장류화 항체, 탈면역화 항체, 동인간화 항체, 반-항체, 이중특이성 항체)를 포함한다. 항체는 일반적으로 불변 영역 또는 불변 단편 또는 결정화가능한 단편(Fc)으로 배열될 수 있는 불변 도메인을 포함한다. 항체의 예시적인 형태는 기본 단위로서 4-사슬 구조를 포함한다. 전장 항체는 공유 연결된 2개의 중쇄(약 50 내지 70kD)와 2개의 경쇄(각각 약 23kDa)를 포함한다. 경쇄는 일반적으로 가변 영역(존재하는 경우) 및 불변 도메인을 포함하고 포유동물에서 κ 경쇄 또는 λ 경쇄이다. 중쇄는 일반적으로 가변 영역 및 힌지 영역에 의해 추가의 불변 도메인(들)에 연결된 1개 또는 2개의 불변 도메인(들)을 포함한다. 포유류의 중쇄는 α, δ, ε, γ 또는 μ 유형 중 하나이다. 각 경쇄는 또한 중쇄 중 하나에 공유적으로 연결되어 있다. 예를 들어, 두 개의 중쇄와 중쇄 및 경쇄는 사슬간 이황화 결합과 비공유 상호작용에 의해 함께 유지된다. 사슬간 이황화 결합의 수는 다양한 유형의 항체에 따라 다양할 수 있다. 각 사슬은 N-말단 가변 영역(각각이 약 110개 아미노산 길이인 VH 또는 VL) 및 C-말단에 하나 이상의 불변 도메인을 갖는다. 경쇄의 불변 도메인(약 110개 아미노산 길이인 CL)은 중쇄의 첫 번째 불변 도메인(330~440개 아미노산 길이인 CH1)과 정렬되고 이황화 결합된다. 경쇄 가변 영역은 중쇄의 가변 영역과 정렬된다. 항체 중쇄는 2개 이상의 추가 CH 도메인(예를 들어, CH2, CH3 등)을 포함할 수 있고 CH1 및 CH2 불변 도메인 사이의 힌지 영역을 포함할 수 있다. 항체는 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위 클래스일 수 있다. 하나의 예에서, 항체는 뮤린(마우스 또는 래트) 항체 또는 영장류(예를 들어, 인간) 항체이다. 하나의 예에서 항체 중쇄에는 C-말단 라이신 잔기가 없다. 하나의 예에서, 항체는 인간화, 동인간화, 키메라, CDR 이식 또는 탈면역화된다.
용어 "전장 항체(full-length antibody)", "온전한 항체(intact antibody)" 또는 "전체 항체(whole antibody)"는 항체의 항원 결합 단편과는 대조적으로, 실질적으로 온전한 형태의 항체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 구체적으로, 전체 항체는 Fc 영역을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 갖는 것을 포함한다. 불변 도메인은 야생형 서열 불변 도메인(예를 들어, 인간 야생형 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다.
본원에 사용된 "가변 영역"은 항원에 특이적으로 결합할 수 있고 상보성 결정 영역(CDR); 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 프레임워크 영역(FR)의 아미노산 서열을 포함하는 본 명세서에 정의된 바와 같은 항체의 경쇄 및/또는 중쇄 부분을 지칭한다. 예를 들어, 가변 영역은 3개의 CDR과 함께 3개 또는 4개의 FR(예를 들어, FR1, FR2, FR3 및 임의로 FR4)을 포함한다. VH는 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. VL은 경쇄의 가변 영역을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "상보성 결정 영역"(동의어 CDR, 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 특이적 항원 결합에 대한 주요 기여자로 존재하는 항체 가변 영역의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각각의 가변 영역 도메인(VH 또는 VL)은 일반적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 확인된 3개의 CDR을 갖는다. VH의 CDR은 또한 본 명세서에서 각각 CDR H1, CDR H2 및 CDR H3으로 지칭되며, 여기서 CDR H1은 VH의 CDR 1에 상응하고, CDR H2는 VH의 CDR 2에 상응하며, CDR H3은 VH의 CDR 3에 상응한다. 마찬가지로, VL의 CDR은 본 명세서에서 각각 CDR L1, CDR L2 및 CDR L3으로 지칭되며, 여기서 CDR L1은 VL의 CDR 1에 상응하고, CDR L2는 VL의 CDR 2에 상응하며, CDR L3은 VL의 CDR 3에 상응한다. 하나의 예에서, CDR 및 FR에 할당된 아미노산 위치는 카밧 서열[Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991(본 명세서에서 "Kabat 넘버링 시스템"으로도 지칭됨)]에 따라 정의된다. 다른 예에서, CDR 및 FR에 할당된 아미노산 위치는 참조(Enhanced Chothia Numbering Scheme, http://www.bioinfo.org.uk/mdex.html)에 따라 정의된다. 본 발명은 카밧 넘버링 시스템에 의해 정의된 FR 및 CDR에 제한되지 않고, 표준 넘버링 시스템 또는 문헌(참조: Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917, 1987; Chothia 외, Nature 342: 877-883, 1989; and/or Al-Lazikani 외, J. Mol. Biol. 273: 927-948, 1997; the numbering system of Honnegher and Plukthun J. Mol. Biol. 309: 657-670, 2001; or the IMGT system discussed in Giudicelli 외, Nucleic Acids Res. 25: 206-211 1997)의 넘버링 시스템을 포함하여 모든 넘버링 시스템을 포함한다. 하나의 예에서, CDR은 카밧 넘버링 시스템에 따라 정의된다. 선택적으로, 카밧 넘버링 시스템에 따른 중쇄 CDR2는 본 명세서에 나열된 5개의 C-말단 아미노산을 포함하지 않거나 이들 아미노산 중 임의의 하나 이상이 또 다른 천연 발생 아미노산으로 치환된다. 이와 관련하여, 문헌(참조: Padlan 외, FASEB J., 9:133-139, 1995)는 중쇄 CDR2의 5개 C-말단 아미노산이 일반적으로 항원 결합에 관여하지 않는다는 것을 확립하였다.
"프레임워크 영역"(FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 영역 잔기이다. VH의 FR은 또한 본 명세서에서 각각 FR H1, FR H2, FR H3 및 FR H4로 지칭되며, 여기서 FR H1은 VH의 FR 1에 상응하고, FR H2는 VH의 FR 2에 상응하고, FR H3은 VH의 FR 3에 상응하며, FR H4는 VH의 FR 4에 상응한다. 마찬가지로, 본 명세서에서 VL의 FR은 각각 FR L1, FR L2, FR L3 및 FR L4로 지칭되며, 여기서 FR L1은 VL의 FR 1에 상응하고, FR L2는 VL의 FR 2에 상응하고, FR L3은 VL의 FR 3에 상응하며, FR L4는 VL의 FR 4에 상응한다.
본 명세서에 사용된 용어 "Fv"는 다중 폴리펩티드 또는 단일 폴리펩티드로 구성되든 간에 VL 및 VH가 회합하고 항원 결합 도메인을 갖는, 즉 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 복합체를 형성하는 임의의 단백질을 의미하는 것으로 간주되어야 한다. 항원 결합 도메인을 형성하는 VH 및 VL은 단일 폴리펩티드 사슬 또는 상이한 폴리펩티드 사슬에 존재할 수 있다. 또한, 본 발명의 Fv (및 본 발명의 임의의 단백질)는 동일한 항원에 결합하거나 결합하지 않을 수 있는 다중 항원 결합 도메인을 가질 수 있다. 이 용어는 항체로부터 직접적으로 유래된 단편뿐만 아니라 재조합 수단을 사용하여 생산된 이러한 단편에 상응하는 단백질을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 예에서, VH는 중쇄 불변 도메인(CH) 1에 연결되지 않고/않거나 VL은 경쇄 불변 도메인(CL)에 연결되지 않는다. 폴리펩티드 또는 단백질을 포함포함하는 예시적인 Fv는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab') 단편, scFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 또는 고차 복합체, 또는 불변 영역 또는 이의 도메인, 예를 들어, CH2 또는 CH3 도메인에 연결된 전술한 것 중 임의의 것, 예를 들어, 미니바디를 포함한다. "Fab 단편"은 면역글로불린의 1가 항원 결합 단편으로 이루어지며, 전체 항체를 효소 파파인으로 분해하여 온전한 경쇄 및 일부 중쇄로 이루어진 단편을 생성함으로써 생산할 수 있거나 또는 재조합 수단을 사용하여 생산할 수 있다. 항체의 "Fab' 단편"은 전체 항체를 펩신으로 처리한 후 환원하여 VH 및 단일 불변 도메인을 포함하는 중쇄의 일부 및 온전한 경쇄로 이루어진 분자를 생성함으로써 수득할 수 있다. 이러한 방식으로 처리된 항체당 2개의 Fab' 단편이 수득된다. Fab' 단편은 또한 재조합 수단에 의해 생산될 수 있다. 항체의 "F(ab')2 단편"은 2개의 이황화 결합에 의해 함께 유지된 2개의 Fab' 단편의 이량체로 이루어지며, 후속 환원 없이 전체 항체 분자를 효소 펩신으로 처리하여 수득된다. "Fab2" 단편은 예를 들어 류신 지퍼 또는 CH3 도메인을 사용하여 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 재조합 단편이다. "단일 사슬 Fv" 또는 "scFv"는 경쇄의 가변 영역과 중쇄의 가변 영역이 적절하고 유연한 폴리펩티드 링커에 의해 공유 연결되어 있는 항체의 가변 영역 단편(Fv)을 포함하는 재조합 분자이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 항원 결합 부위 또는 이의 항원 결합 도메인과 항원의 상호작용과 관련하여, 용어 "결합하다"는 상호작용이 항원 상에서 특정 구조(예를 들어, 항원 결정기 또는 에피토프)의 존재에 의존한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 항체는 일반적으로 단백질이 아닌 특정 단백질 구조를 인식하고 결합한다. 항체가 에피토프 "A"에 결합하는 경우, 표지된 "A"와 단백질을 포함하는 반응에서 에피토프 "A"(또는 유리, 표지되지 않은 "A")를 포함하는 분자의 존재는 항체에 결합된 표지된 "A"의 양을 감소시킬 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합하다" 또는 "특이하게 결합하다"는 본 발명의 항원 결합 부위가 대안적인 항원 또는 세포에서 하는 것보다 특정 항원 또는 이를 발현하는 세포와 보다 빈번히, 보다 신속하게, 더 긴 지속기간 및/또는 더 큰 친화도로 반응하거나 회합함을 의미하는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 항원 결합 부위는 다른 항원에 비해 물질적으로 더 큰 친화도(예를 들어, 1.5배 또는 2배 또는 5배 또는 10배 또는 20배 또는 40배 또는 60배 또는 80배 내지 100배 또는 150배 또는 200배)로 PSMA에 결합한다.
본 명세서에 사용된 용어 "에피토프(epitope)"(동의어 "항원 결정기")는 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 부위가 결합하는 세포 표면 단백질(예를 들어, PSMA)의 영역을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "상태"는 정상 기능의 파괴 또는 간섭을 지칭하고, 임의의 특정 상태에 제한되지 않으며, 질병 또는 장애를 포함할 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "예방하는", "예방하다" 또는 "예방"은 본 발명의 항원 결합 부위를 투여하여 한 상태의 적어도 하나의 증상의 발병을 중지 또는 방해하는 것을 포함한다. 이 용어는 또한 재발을 예방하거나 방해하기 위해 호전중인 대상체의 치료를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는", "치료하다" 또는 "치료"는 본 명세서에 기재된 항원 결합 부위를 투여하여 특정 질병 또는 상태의 적어도 하나의 증상을 감소 또는 제거하는 것을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 인간을 포함하는 모든 동물, 예를 들어 포유동물을 의미하는 것으로 간주되어야 한다. 예시적인 대상체는 인간 및 인간이 아닌 영장류를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 대상체는 인간이다.
변형 항체
본 발명은 부분적으로 IgG 항체에 대한 변형에 관한 것으로, FcRn에 대한 항체의 친화도를 감소시키거나 소거시킴으로써 항체의 혈청 반감기를 감소시키는 항체 영역에 대한 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
본 발명에 따르면, 감소된 혈청 반감기가 요구되는 임의의 항체는 본 명세서에 기재된 방법에 따라 변형될 수 있음이 이해될 것이다. 또한, 바람직한 실시양태에서, 혈청 반감기를 감소시키도록 변형되는 항체는 진단 또는 치료 적용, 보다 구체적으로 진단치료학적 적용에 유용한 항체인 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 방법에 따라 사용하기에 적합한 항체의 예로는 트라스투주맙 (Herceptin®), 리툭시맙 (Rituxan®), 베바시주맙 (Avastin®), 디누툭시맙 (Unituxin®), 파니투무맙 (Vectibix®), 펨브롤리주맙 (Keytruda®), 니볼루맙 (Opdivo®), 토시투모맙 (Bexxar®) 이브리투모맙 (Zevalin®)이 포함된다. 그러나, 본 발명이 특정 항체에 제한되는 것은 아님을 또한 이해해야 할 것이며, 단 항체는 FcRn에 의한 결합을 허용할 것이다.
본 발명은 또한 종양 항원을 표적화하기 위한 항체 약물 접합체의 용도를 고려하며, 여기서 접합체는 세포독성 페이로드(cytotoxic payload)를 포함한다. 이러한 항체의 예로는 젬투주맙 (Mylotarg®), 브렌툭시맙 (Adcetris®), 이노투주맙 (Besponsa®), 글렘바투무맙 (CDX-011), 아네투맙 (BAY 94-9343), 미르베툭시맙 (IMGN853), 데파툭시맙 (ABT-414), 로발피투주맙 (Rova-T) 및 바다스툭시맙 탈리린 (SGN-CD33A)을 포함한다. 추가 예들이 문헌(참조: Lambert 외, 2017, Adv Ther (2017) 34:1015-1035)에 기재되어 있으며, 본 명세서에 참조로 포함된다.
특정 실시양태에서, FcRn에 대한 친화도를 감소시키기 위해 본 발명에 따른 변형에 적합한 항체는 표 1에 나타난 바와 같은 서열 중 하나 이상을 갖는 항체이다.
본 발명은 또한 본원에 제시된 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 항원 결합 부위 또는 이를 인코딩하는 핵산을 제공한다. 하나의 예에서, 본 발명의 항원 결합 부위 또는 핵산은 본 명세서에 제시된 서열과 적어도 약 85% 또는 90% 또는 95% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함한다.
대안적으로 또는 추가로, 항원 결합 부위는 임의의 예에 따라 본 명세서에 기재된 바와 같은 VH 또는 VL의 CDR(들)과 적어도 약 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일한 CDR(예를 들어, 3개의 CDR)을 포함한다.
또 다른 예에서, 본 발명의 핵산은 임의의 예에 따라 본 명세서에 기재된 바와 같은 기능을 갖는 항원 결합 부위를 인코딩하는 서열과 적어도 약 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 항원 결합 부위를 인코딩하는 핵산을 포함하며, 이는 유전암호의 축퇴의 결과로서 본 명세서에 예시된 서열과 상이하다.
핵산 또는 폴리펩티드의 동일성(%)은 갭 생성 패널티=5 및 갭 확장 패널티=0.3으로 하는 GAP(Needleman and Wunsch. Mol. Biol. 48, 443-453, 1970) 분석 (GCG 프로그램)으로 결정된다. 쿼리 서열(query sequence)은 길이가 50개 이상의 잔기이고 GAP 분석은 50개 이상의 잔기 영역에 걸쳐 두 개의 서열을 정렬한다. 예를 들면, 쿼리 서열은 길이가 100개 이상의 잔기이고 GAP 분석은 100개 이상의 잔기 영역에 걸쳐 두 개의 서열을 정렬한다. 예를 들어, 두개의 서열은 전체 길이에 걸쳐 정렬된다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 항원 결합 부위를 인코딩하는 핵산으로 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화하는 핵산을 고려한다. "적당한 엄격성"은 45℃ 내지 65℃ 범위의 온도에서 2 x SSC 완충액, 0.1% (w/v) SDS로 또는 동등한 조건으로 수행되는 혼성화 및/또는 세척으로 본 명세서에 정의된다. "높은 엄격성"은 0.1 x SSC 완충액, 0.1% (w/v) SDS, 또는 더 낮은 염 농도 및 65℃ 이상의 온도에서 또는 동등한 조건에서 수행되는 혼성화 및/또는 세척인 것으로 본 명세서에 정의된다. 본 명세서에서 특정 수준의 엄격성에 대한 참조는 당업자에게 공지된 SSC 이외의 세척/혼성화 용액을 사용하는 동등한 조건을 포함한다. 예를 들어, 이중 가닥 핵산의 가닥이 해리되는 온도 (융점 온도 또는 Tm으로도 공지되어 있음)를 계산하는 방법이 당업계에 공지되어 있다. 핵산의 Tm과 유사(예: 50℃ 이내 또는 10℃ 이내)하거나 동일한 온도는 높은 엄격성으로 고려된다. 중간 엄격성은 핵산의 계산된 Tm의 10℃ 내지 20℃ 또는 10℃ 내지 15℃ 이내인 것으로 고려된다.
본 발명은 또한 본 명세서에 제시된 서열과 비교하여 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 본 발명의 항원 결합 부위의 돌연변이 형태를 고려한다. 일부 예에서, 항원 결합 부위는 10개 이하, 예를 들어, 9 또는 8 또는 7 또는 6 또는 5 또는 4 또는 3 또는 2 또는 1개의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄 및/또는 소수성 및/또는 친수성을 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다.
유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열은, 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), β-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함하여 당업계에 정의되어 있다. 소수성 지수는 예를 들어 문헌[참조: Kyte and Doolittle J. Mol. Biol., 157: 105-132, 1982]에 기재되어 있고, 친수성 지수는 예를 들어 제US4554101호에 기재되어 있다.
본 발명은 또한 비보존적 아미노산 변화를 고려한다. 예를 들어, 하전된 아미노산을 다른 하전된 아미노산 및 중성 또는 양전하를 띤 아미노산으로 치환하는 것에 특히 관심이 있다. 일부 예에서, 항원 결합 부위는 10개 이하, 예를 들어, 9 또는 8 또는 7 또는 6 또는 5 또는 4 또는 3 또는 2 또는 1개의 보존적 아미노산 치환을 포함한다.
하나의 예에서, 돌연변이(들)는 본 발명의 항원 결합 부위의 항원 결합 도메인의 FR 내에서 발생한다. 다른 예에서, 돌연변이(들)는 본 발명의 항원 결합 부위의 CDR 내에서 발생한다.
항원 결합 부위의 돌연변이 형태를 생성하기 위한 예시적인 방법은 다음을 포함한다:
* DNA(Thie 외, Methods Mol. Biol. 525: 309-322, 2009) 또는 RNA(Kopsidas 외, Immunol. Lett. 107:163-168, 2006; Kopsidas 외 BMC Biotechnology, 7: 18, 2007; 및 제WO1999/058661호)의 돌연변이 생성단계;
* 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 돌연변이 세포, 예를 들어 XL-1Red, XL-mutS 및 XL-mutS-Kanr 박테리아 세포(Stratagene)에 도입하는 단계;
* 예를 들어 문헌[Stemmer, Nature 370: 389-91, 1994]에 기재된 바와 같은 DNA 셔플링 단계; 및
* 예를 들어 문헌[Dieffenbach (ed) and Dveksler (ed) (In: PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, NY, 1995)]에 기재된 바와 같은 부위 지정 돌연변이 생성단계.
본 발명의 돌연변이 항원 결합 부위의 생물학적 활성을 결정하기 위한 예시적인 방법은 숙련된 기술자에게 명백하고/거나 본 명세서에 기재된, 예를 들어 항원 결합이다. 예를 들어, 항원 결합, 결합의 경쟁적 억제, 친화도, 회합, 해리 및 치료 효능을 결정하는 방법이 본 명세서에 기술되어 있다.
불변 영역
본 발명은 항체의 불변 영역을 포함하는 본 명세서에 기재된 항원 결합 부위 및/또는 항체를 포함한다. 이것은 Fc에 융합된 항체의 항원 결합 단편을 포함한다.
본 발명의 단백질을 생산하는데 유용한 불변 영역의 서열은 다수의 상이한 공급원으로부터 수득할 수 있다. 일부 예에서, 단백질의 불변 영역 또는 이의 부분은 인간 항체로부터 유래된다. 불변 영역 또는 이의 부분은 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함하는 임의의 항체 클래스 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 항체 이소형으로부터 유래될 수 있다. 하나의 예에서, 불변 영역은 인간 이소형 IgG4 또는 안정화된 IgG4 불변 영역이다.
선호하는 변형
본 발명은 구체적으로 Fc 영역 또는 불변 영역을 포함하는 항체 또는 항원 결합 부위에 대한 변형을 고려한다.
신생아 Fc-수용체(FcRn)는 생체 내에서 IgG 클래스의 항체의 대사 운명에 중요하다. FcRn은 리소좀 분해 경로에서 IgG를 구조하는 기능을 하여 제거율이 감소하고 반감기가 증가한다. 이는 50kDa 클래스 I 주요 조직적합성 복합체-유사 단백질(α-FcRn) 및 15kDa p2-마이크로글로불린(β2η)의 두 가지 폴리펩티드로 구성된 이종이량체 단백질이다. FcRn은 IgG 클래스 항체의 Fc-영역의 CH2-CH3 부분에 높은 친화도로 결합한다. IgG 클래스의 항체와 FcRn 사이의 상호작용은 pH 의존적이며 1:2 화학량론에서 발생하고, 즉, 하나의 IgG 항체 분자는 두 개의 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드를 통해 두 개의 FcRn 분자와 상호작용할 수 있다[예를 들어, Huber, A.H.외, J. Mol. Biol. 230 (1993) 1077-1083)].
따라서, IgG의 시험관 내 FcRn 결합 특성/특징은 혈액 순환에서의 생체 내 약동학적 특성을 나타낸다. FcRn과 IgG 클래스의 항체의 Fc-영역 사이의 상호작용에는 중쇄 CH2- 및 CH3-도메인의 상이한 아미노산 잔기가 참여한다.
FcRn 결합 및 이와 함께 혈액 순환의 반감기에 영향을 미치는 다양한 돌연변이가 공지되어 있다. 마우스 Fc-영역-마우스 FcRn 상호작용에 중요한 Fc-영역 잔기는 부위 지향적 돌연변이유발에 의해 확인되었다[예를 들어, Dall'Acqua, W.F., 외 J. Immunol 169 (2002) 5171-5180를 참조한다]. 잔기 Ile253, His310, His433, Asn434 및 His435(EU 인덱스 넘버링 시스템에 따른 넘버링)가 상호작용에 관여한다(Medesan, C, 외, Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533-2536; Firan, M., 외, Int. Immunol. 13 (2001) 993-1002; Kim, J.K., 외, Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542-548). (Kabat 시스템을 사용하여, 관련 잔기는 Ile266, His329, His464, Asn465 및 His466이다). 잔기 Ile253, His310 및 His435는 인간 Fc-영역과 뮤린 FcRn의 상호작용에 중요한 것으로 밝혀졌다(Kim, J.K., 외, Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819-2885).
보다 구체적으로, 항체는 단백질의 반감기를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체는 신생아 Fc 영역(FcRn)에 대한 Fc 영역의 친화도를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 Fc 영역을 포함한다.
본 발명은 또한 천연 발생 IgG 클래스 항체 불변 영역과 실질적으로 동일한 불변 영역을 갖는 항체를 제공하고, 여기서 잔기 His310, His435, 및 Ile253으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 잔기는 천연 발생 IgG 클래스 항체에 존재하는 것과 상이하여, 이에 따라 천연 발생 항체에 비해 상기 항체의 FcRn 결합 친화도 및/또는 혈청 반감기를 변경시킨다. 바람직한 실시양태에서, 천연 발생 IgG 클래스 항체는 인간 IgG1, IgG2, IgG2M3, IgG3 또는 IgG4 분자의 중쇄 불변 영역을 포함한다.
또한 바람직한 실시양태에서, 천연 발생 IgG 클래스 항체와 실질적으로 동일한 불변 영역을 갖는 항체의 중쇄 불변 영역으로부터의 아미노산 잔기 310 또는 잔기 435는 히스티딘이 아니고 FcRn에 대한 불변 영역의 친화도를 감소시키는 임의의 아미노산이다. 예를 들어, 잔기 310 또는 435의 아미노산은 알라닌, 글루탐산, 아스파르트산, 류신, 이소류신, 아르기닌, 프롤린, 글루타민, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 라이신, 아스파라긴, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 시스테인, 발린 또는 글리신일 수 있다.
바람직하게는, 중쇄 불변 영역으로부터의 310 위치의 잔기는 알라닌, 글루탐산 또는 글루타민으로부터 선택되고; 또는 아미노산 잔기 435는 아르기닌, 글루타민 또는 알라닌으로부터 선택된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 천연 발생 클래스 IgG 항체와 실질적으로 동일한 불변 영역을 갖는 항체는 310 위치에서 알라닌 잔기 및 435 위치에서 글루타민 잔기를 갖는다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 변형 항체의 FcRn에 대한 결합 친화도 및/또는 혈청 반감기는 적어도 약 30%, 50%, 80%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배 감소한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 변형 항체의 FcRn에 대한 결합 친화도 및/또는 혈청 반감기는 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 감소한다.
또한, 본 발명의 항체는 임의의 하나 이상의 Fc 감마 수용체에 대한 항체의 친화도를 변형시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 불변 영역의 Fc 영역은 이펙터 기능을 유도하는 능력을 보유한다. 하나의 예에서, 불변 영역의 Fc 영역은 야생형 IgG와 비교하여 증가하는 이펙터 기능을 포함하여 이펙터 기능을 조절하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
하나의 예에서, 불변 영역의 Fc 영역은 예를 들어 천연 또는 야생형 인간 IgG1 또는 IgG3 Fc 영역과 비교하여 이펙터 기능을 유도하는 능력이 감소되어 있다. 하나의 예에서, 이펙터 기능은 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 및/또는 항체-의존성 세포-매개 식균작용(ADCP) 및/또는 보체-의존성 세포독성(CDC)이다. 단백질을 포함하는 Fc 영역의 이펙터 기능 수준을 평가하는 방법은 당업계에 공지되어 있고/있거나 본 명세서에 기술되어 있다.
하나의 예에서, 이펙터 기능을 유도하는 항체의 능력을 수정하는 아미노산 치환은 중쇄 불변 영역으로부터 잔기 Ile253에서의 아미노산 치환이다. 하나의 예에서, 치환은 알라닌, 글루탐산, 아스파르트산, 류신, 이소류신, 아르기닌, 프롤린, 글루타민, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 라이신, 아스파라긴, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 시스테인, 발린 또는 글리신으로부터 선택된 임의의 아미노산으로의 치환으로, 여기서 치환은 이펙터 기능을 유도하는 항체의 능력을 감소시킨다. 바람직한 실시양태에서, 잔기 253에서 Ile로부터의 치환은 아르기닌, 프롤린 또는 아스파르테이트, 보다 바람직하게는 알라닌으로의 치환이다.
하나의 예에서, Fc 영역은 IgG4 Fc 영역(즉, IgG4 불변 영역으로부터), 예를 들어 인간 IgG4 Fc 영역이다. 적합한 IgG4 Fc 영역의 서열은 숙련가에게 명백할 것이고/또는 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스(예를 들어, National Center for Biotechnology Information에서 이용 가능함)에서 이용가능할 것이다.
하나의 예에서, 불변 영역은 안정화된 IgG4 불변 영역이다. 용어 "안정화된 IgG4 불변 영역"은 Fab 암(arm) 교환을 감소하도록 변형된 또는 Fab 암 교환 또는 반-항체 형성을 겪는 경향 또는 절반 항체를 형성하는 경향을 가진 IgG4 불변 영역을 의미하는 것으로 이해될 것이다. "Fab 암 교환"은 인간 IgG4에 대한 일종의 단백질 변형을 지칭하며, 여기서 IgG4 중쇄 및 부착된 경쇄(반-분자)는 다른 IgG4 분자의 중쇄 쌍으로 교체된다. 따라서, IgG4 분자는 2개의 별개의 항원을 인식하는 2개의 별개의 Fab 암을 획득할 수 있다 (이중특이적 분자를 생성함). Fab 암 교환은 생체 내에서 자연적으로 발생하며 정제된 혈액 세포 또는 환원된 글루타티온과 같은 환원제에 의해 시험관 내에서 유도될 수 있다. "절반 항체"는 IgG4 항체가 해리되어 각각 단일 중쇄 및 단일 경쇄를 포함하는 2개의 분자를 형성하는 경우 형성된다.
하나의 예에서, 안정화된 IgG4 불변 영역은 카밧 시스템(문헌 참조: Kabat 외, Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 1987 and/or 1991)에 따라 힌지 영역의 241 위치에 프롤린을 포함한다. 이 위치는 EU 넘버링 시스템에 따른 힌지 영역의 228 위치에 해당한다. 인간 IgG4에서 이 잔기는 일반적으로 세린이다. 프롤린에 대한 세린의 치환 후, IgG4 힌지 영역은 서열 CPPC를 포함한다. 이와 관련하여, 숙련가는 "힌지 영역"이 항체의 2개의 Fab 암에 이동성을 부여하는 Fab 영역 및 Fc를 연결하는 항체 중쇄 불변 영역의 프롤린이 풍부한 부분이라는 것을 인지할 것이다. 힌지 영역은 중쇄간 이황화 결합에 관여하는 시스테인 잔기를 포함한다. 일반적으로 카밧의 넘버링 시스템에 따라 인간 IgG1의 Glu226에서 Pro243으로(또는 EU 인덱스를 사용하여 Glu216에서 Pro230으로) 신장시키는 것으로 정의된다. 다른 IgG 이소형의 힌지 영역은 중쇄간 이황화(S-S) 결합을 형성하는 첫 번째 및 마지막 시스테인 잔기를 동일한 위치에 위치시킴으로써 IgG1 서열과 정렬될 수 있다(예를 들어, 제WO2010/080538호 참조).
안정화된 IgG4 항체의 추가 예는 (EU 넘버링 시스템에 따라) 인간 IgG4의 중쇄 불변 영역에서 409 위치에 있는 아르기닌이 라이신, 트레오닌, 메티오닌 또는 류신으로 치환된 항체이다(예를 들면, 제WO2006/033386호에 기재된 바와 같음). 불변 영역의 Fc 영역은 (EU 넘버링 시스템에 따라) 405에 상응하는 위치에서 알라닌, 발린, 글리신, 이소류신 및 류신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 잔기를 추가로 또는 대안적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 힌지 영역은 241 위치에서 프롤린(즉, CPPC 서열)을 포함한다(상기 설명된 바와 같음).
또 다른 예에서, Fc 영역은 감소된 이펙터 기능을 갖도록 변형된 영역, 즉 "비-면역자극 Fc 영역"이다. 예를 들어, Fc 영역은 268, 309, 330 및 331로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 치환을 포함하는 IgG1 Fc 영역이다. 또 다른 예에서, Fc 영역은 하기 변경 E233P, L234V, L235A 및 G236의 결실 중 하나 이상 및/또는 하기 변경 A327G, A330S 및 P331S 중 하나 이상을 포함하는 IgG1 Fc 영역이다 (Armour 외, Eur J Immunol. 29:2613-2624, 1999; Shields 외, J Biol Chem. 276(9):6591-604, 2001). 비-면역자극성 Fc 영역의 추가 예는 예를 들어 문헌(참조: Dall'Acqua 외, J Immunol. 177 : 1129-1138 2006; 및/또는 Hezareh J Virol ;75: 12161-12168, 2001)에 기재되어 있다.
또 다른 예에서, Fc 영역은 키메라 Fc 영역으로, 예를 들어, IgG4 항체로부터의 적어도 하나의 CH2 도메인 및 IgG1 항체로부터의 적어도 하나의 CH3 도메인을 포함하고, 여기서 Fc 영역은 240, 262, 264, 266, 297, 299, 307, 309, 323, 399, 409 및 427(EU 넘버링)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서 치환을 포함한다(예를 들어, 제WO2010/085682호에 기술된 바와 같음). 예시적인 치환은 240F, 262L, 264T, 266F, 297Q, 299A, 299K, 307P, 309K, 309M, 309P, 323F, 399S, 및 427F를 포함한다.
항체 생산
바람직하게는, 임의의 예에 따른 본 명세서에 기재된 항원 결합 부위는 재조합체이다.
재조합 단백질의 경우, 이를 인코딩하는 핵산은 발현 작제물 또는 벡터로 클로닝될 수 있으며, 이어서 숙주 세포, 예를 들어, 달리 단백질을 생성하지 않는 대장균 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 포유동물 세포, 예를 들어, 유인원 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 배아 신장(HEK) 세포, 또는 골수종 세포로 형질감염된다. 단백질 발현에 사용되는 예시적인 세포는 CHO 세포, 골수종 세포 또는 HEK 세포이다. 이러한 목적을 달성하기 위한 분자 복제 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[참조: Ausubel 외, (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates until present) or Sambrook 외, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]에 기재되어 있다. 다양한 클로닝 및 시험관 내 증폭 방법이 재조합 핵산의 구성에 적합하다. 재조합 항체를 생산하는 방법은 또한 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 제US4816567호 또는 제US5530101호를 참조한다.
분리 후, 핵산은 추가 클로닝 (DNA 증폭)을 위해 또는 무세포 시스템 또는 세포에서 발현을 위해 발현 작제물 또는 발현 벡터의 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 삽입된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터"는 가장 넓은 맥락에서 사용되어야 하며, 예를 들어, 발달 및/또는 외부 자극에 대한 반응으로, 또는 조직 특이적 방식으로 핵산의 발현을 변경하는 추가적인 조절 요소[예를 들어, 업스트림 활성화 서열, 전사 인자 결합 부위, 인핸서(enhancer) 및 사일런서(silencer)]의 유무에 관계없이 정확한 전사 개시에 필요한 TATA 박스 또는 개시제 요소를 포함하는 게놈 유전자의 전사 조절 서열을 포함한다. 현재 맥락에서, 용어 "프로모터"는 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 부여, 활성화 또는 강화시키는 재조합, 합성 또는 융합 핵산, 또는 유도체를 설명하는 데에도 사용된다. 예시적인 프로모터는 발현을 추가로 강화시키고/시키거나 상기 핵산의 공간적 발현 및/또는 시간적 발현을 변경하기 위해 하나 이상의 특이적 조절 요소의 추가 카피를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산의 발현이 프로모터에 의해 제어되도록 핵산에 대해 프로모터를 위치시키는 것을 의미한다.
세포에서 발현을 위한 많은 벡터를 사용할 수 있다. 벡터 성분은 일반적으로 신호 서열, 단백질을 인코딩하는 서열(예를 들어, 본 명세서에 제공된 정보로부터 유래됨), 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 순서 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 숙련된 기술자는 단백질 발현에 적합한 서열을 인지할 것이다. 예시적인 신호 서열은 원핵생물 분비 신호(예를 들어, pelB, 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, Ipp, 또는 열안정성 장독소 II), 효모 분비 신호(예를 들어, 인버타제 리더, α 인자 리더 또는 산 포스파타제 리더) 또는 포유동물 분비 신호(예를 들어, 단순 포진 gD 신호)를 포함한다.
포유동물 세포에서 활성인 예시적인 프로모터는 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 프로모터(CMV-IE), 인간 신장 인자 1-a 프로모터(EF1), 소형 핵 RNA 프로모터(U1a 및 U1b), a-미오신 중쇄 프로모터, 유인원 바이러스 40 프로모터(SV40), 라우스 육종 바이러스 프로모터(RSV), 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, β-액틴 프로모터; CMV 인핸서/β-액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터를 포함하는 하이브리드 조절 요소 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예로는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주(현탁 배양에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포); 아기 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10), 또는 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO))이다.
예를 들어 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 및 에스.폼베(S. pombe)를 포함하는 그룹으로부터 선택된 효모 세포와 같은 효모 세포에서의 발현에 적합한 전형적인 프로모터는 ADH1 프로모터, GAL1 프로모터, GAL4 프로모터, CUP1 프로모터, PHO5 프로모터, nmt 프로모터, RPR1 프로모터 또는 TEF1 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
분리된 핵산 또는 이를 포함하는 발현 작제물을 발현을 위해 세포에 도입하는 수단은 당업자에게 공지되어 있다. 주어진 세포에 사용되는 기술은 공지된 성공적인 기술에 좌우된다. 재조합 DNA를 세포에 도입하기 위한 수단은 미세주입, DEAE-덱스트란에 의해 매개되는 형질감염, 리포펙타민(Gibco, MD, USA) 및/또는 셀펙틴(Gibco, MD, USA)을 사용하는 것과 같은 리포솜에 의해 매개되는 형질감염, PEG-매개 DNA 흡수, 전기천공 및 다른 것들 중에서 DNA-피복된 텅스텐 또는 금 입자(Agracetus Inc., WI, USA)를 사용하는 마이크로입자 충돌을 포함한다.
단백질을 생산하는 데 사용되는 숙주 세포는 사용되는 세포 유형에 따라 다양한 배지에서 배양될 수 있다. Ham's Fl0 (Sigma), Minimal Essential Medium (MEM) (Sigma), RPM1-1640 (Sigma) 및 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Sigma)과 같은 상업적으로 이용 가능한 배지가 포유류 세포의 배양에 적합하다. 본 명세서에 논의된 다른 세포 유형을 배양하기 위한 배지가 당업계에 공지되어 있다.
단백질의 분리
단백질을 분리하는 방법은 당업계에 공지되어 있고/있거나 본 명세서에 기술되어 있다.
항원 결합 부위가 배양 배지로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템의 상청액은 상업적으로 이용가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 장치를 사용하여 먼저 농축될 수 있다. PMSF와 같은 프로테아제 억제제는 단백질 분해를 억제하기 위해 임의의 상기 단계에 포함될 수 있고, 항생제는 외래성 오염물의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 상청액은 예를 들어 연속 원심분리를 사용하여 단백질을 발현하는 세포로부터 여과 및/또는 분리될 수 있다.
세포로부터 제조된 항원 결합 부위는 예를 들어 이온 교환, 수산화인회석 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 친화성 크로마토그래피(예를 들어, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 또는 단백질 G 크로마토그래피), 또는 이들의 임의의 조합을 사용하여 정제될 수 있다. 이들 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 제WO99/57134호 또는 문헌[참조: Ed Harlow 및 David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)]에 기재되어 있다.
숙련된 기술자는 또한 단백질이 정제 또는 검출을 용이하게 하는 태그, 예를 들어 폴리-히스티딘 태그, 예를 들어 헥사-히스티딘 태그, 또는 인플루엔자 바이러스 혈구응집소(HA) 태그 또는 유인원 바이러스 5(V5) 태그, FLAG 태그 또는 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST) 태그를 포함하도록 변형될 수 있음을 인지할 것이다. 이후, 생성된 단백질을 친화성 정제와 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 정제한다. 예를 들어, 헥사-히스 태그를 포함하는 단백질은, 단백질을 포함하는 시료를 고체 또는 반고체 지지체에 고정된 헥사-히스 태그에 특이적으로 결합하는 니켈-니트릴로트리아세트산(Ni-NTA)과 접촉시키고, 시료를 세척하여 미결합된 단백질을 제거하며, 이어서 결합된 단백질을 용출함으로써 정제된다. 대안적으로, 또는 추가로 태그에 결합하는 리간드 또는 항체는 친화성 정제 방법에 사용된다.
방사성 동위원소를 항체에 연결함
본 발명의 임의의 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 항체는 진단제 또는 치료제에 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있고, 바람직하게는, 진단제 또는 치료제는 방사성 동위원소이다.
적합한 동위원소의 예는 악티늄-225 (225Ac), 아스타틴-211 (211At), 비스무트-212 및 비스무트-213 (212Bi, 213Bi), 구리-64 및 구리-67 (64Cu, 67Cu), 갈륨-67 및 갈륨-68 (67Ga 및 68Ga), 인듐-111 (111In), 요오드-123, -124, -125 또는 -131 (123I, 124I, 125I, 131I) (123I), 납-212 (212Pb), 루테튬-177 (177Lu), 라듐-223 (223Ra), 사마륨-153 (153Sm), 스칸듐-44 및 스칸듐-47 (44Sc, 47Sc), 스트론튬-90 (90Sr), 테크네튬-99 (99mTc), 이트륨-86 및 이트륨-90 (86Y, 90Y), 지르코늄-89 (89Zr)을 포함한다. 당업자는 어떤 방사성 동위원소가 진단제로서 사용하기에 바람직하고 어떤 것이 치료제로 사용하기 바람직한지 잘 알 것이다.
방사성 동위원소는 직접적(킬레이트제 또는 보결기 또는 링커를 통해)으로 또는 항체의 단일 또는 다중 아미노산 잔기에 대한 결합(예를 들어, 티로신 잔기의 할로겐화)을 통해 간접적으로 본 발명의 항체에 접합될 수 있음이 이해될 것이다.
대안적인 실시양태에서, 방사성 동위원소를 항체에 접합시키기 위해 킬레이트제 또는 링커가 사용될 수 있다. 하나의 예에서, 항체는 TMT(6,6"-비스[N,N",N'"-테트라(카복시메틸)아미노메틸)-4'-(3-아미노-4-메톡시페닐)-2,2':6',2"-테르피리딘), DOTA(1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-NN',N"(N'"-테트라아세트산, 테트라세탄으로도 알려짐), TCMC(DOTA의 테트라-1차 아미드), DO3A(1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리스(아세트산)-10-(2-티오에틸)아세트아미드), CB-DO2A(4,10-비스(카복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자비시클로[5.5.2]테트라데칸), NOTA(1,4,7-트리아자시클로노난-트리아세트산), 디암사르(3,6,10,13,16,19-헥사아자비시클로[6.6.6]에이코산-1,8-디아민), DTPA(펜텐산 또는 디에틸렌트리아민펜타아세트산), CHX-A"-DTPA ([(R)-2-아미노-3-(4-이소티오시아네이토페닐)프로필]-트랜스-(S,S)-시클로헥산-1,2-디아민-펜타아세트산), TETA(1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1,4,8), 11-테트라아세트산, Te2A(4,11-비스(카르복시메틸)-1,4,8,11-테트라아자비사이클로[6.6.2]헥사데칸), HBED, DFO(데스페리옥사민), DFOsq (DFO-스콰라미드) 및 HOPO (3,4,3-(LI-1,2-HOPO) 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 기타 킬레이트제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 킬레이트 모이어티에 접합될 수 있다.
방사성 금속 및 기타 할로겐화된 방사성 동위원소를 갖는 킬레이터는 하나 이상의 라이신 잔기, 티로신 잔기 또는 티올 잔기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 항체 내의 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 반응성 모이어티를 통해 본 발명의 항체에 결합될 수 있다.
다른 예에서, 변형 항체는 이관능성 링커, 예를 들어 브로모아세틸, 티올, 숙신이미드 에스테르, TFP 에스테르, 말레이미드, 또는 당업계에 공지된 임의의 아민 또는 티올-개질 화학을 사용하여 접합된다.
당업자는 킬레이트제를 항체 및 이의 유도체 또는 단편에 접합시키는 표준 방법에 익숙할 것이다. 또한, 당업자는 예를 들어 본 명세서에 참조로 포함되어 있는 문헌 [참조: Chem. Soc. Rev., 2014,43, 260]에 기재된 바와 같이, 방사성 금속과 짝을 이루는 관련 킬레이트제를 선택하기 위한 접근 방식에 익숙할 것이다.
항원 결합 부위의 활성 검정
PSMA에 대한 결합
본 발명의 바람직한 항원 결합 부위가 PSMA에 결합한다는 것은 본 명세서의 개시내용으로부터 숙련된 기술자에게 명백할 것이다. 단백질에 대한 결합을 평가하는 방법은, 예를 들어 문헌[참조: Scopes (In: Protein purification: principles and practice, Third Edition, Springer Verlag, 1994)에 기재된 바와 같이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은 일반적으로 항원 결합 부위를 고정화하고 표지된 항원과 접촉시키는 것을 포함한다. 비특이적 결합 단백질을 제거하기 위해 세척한 후 표지의 양과 결과적으로 결합된 항원이 검출된다. 물론, 항원 결합 부위는 표지되어 항원이 고정될 수 있다. 패닝-유형 검정도 사용할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 표면 플라즈몬 공명 검정이 사용될 수 있다.
치료, 진단 및 치료진단 방법
본 발명의 항체는 방사면역요법에 의한 치료를 필요로 하는 다수의 상태를 치료하는데 유용하다. 일반적으로 이러한 상태는 암을 포함한다.
예시적인 암은 항문 조직, 담관, 방광, 혈액 세포, 장, 뇌, 유방, 유암종, 자궁경부, 눈, 식도, 두경부, 신장, 후두, 백혈병, 간, 폐, 림프절, 림프종, 흑색종, 중피종, 골수종, 난소, 췌장, 음경, 전립선, 피부(예를 들어, 편평 세포 암종), 육종, 위, 고환, 갑상선, 질, 외음부의 종양을 포함하여 낭성 및 고형 종양, 뼈 및 연조직 종양을 포함한다. 연조직 종양에는 양성 신경초종 단일염색체(Benign schwannoma Monosomy), 데스모이드 종양(Desmoid tumor), 지방모세포종(lipo-blastoma), 지방종(lipoma), 자궁 평활근종(uterine leiomyoma), 투명 세포 육종(clear cell sarcoma), 피부 섬유 육종(dermatofibrosarcoma), 유잉 육종(Ewing sarcoma), 골격외 점액성 연골육종(extraskeletal myxoid chondrosarcoma), 지방육종 점액종(liposarcooma myxoid), 폐포 횡문근육종(Alveolar rhabdomyosarcoma) 및 활액 육종(synovial sarcoma)이 포함된다. 특정 골종양에는 비골화 섬유종(nonossifying fibroma), 단일 골낭종(unicameral bone cyst), 내연골종(enchon-droma), 동맥류 골낭종(aneurismal bone cyst), 골모세포종(osteoblastoma), 연골모세포종(chondroblastoma), 연골점액섬유종(chondromyxofibroma), 골화 섬유종 및 선종(ossifying fibroma and adamantinoma), 거대 세포 종양(Giant cell tumor), 섬유성 이형성증(fibrous dysplasia), 유잉 육종 호산구성 육아종(Ewing's sarcoma eosinophilic granuloma), 골육종(osteosarcoma), 연골종(chondroma), 연골육종(chondrosarcoma), 악성 섬유성 조직구종(malignant fibrous histiocytoma) 및 전이성 암종(metastatic carcinoma)이 포함된다. 백혈병에는 급성 림프모구성(acute lymphoblastic), 급성 골수모구성(acute myeloblastic), 만성 림프구성(chronic lymphocytic) 및 만성 골수(chronic myeloid)가 포함된다.
다른 예로는 유방 종양(breast tumor), 결장직장종양(colorectal tumor), 선암종(adenocarcinoma), 중피종(mesothelioma), 방광종양(bladder tumor), 전립선종양(prostate tumor), 생식 세포 종양(germ cell tumor), 간/담관암(hepatoma/cholongio), 암종(carcinoma), 신경내분비 종양(neuroendocrine tumor), 뇌하수체 종양(pituitary neoplasm), 작은 원형 세포 종양(small round cell tumor ), 편평세포암(squamous cell cancer), 흑색종(melanoma), 비정형 섬유황색종(atypical fibroxanthoma), 정상피종(seminoma), 비정상피종(nonseminoma), 간질 라이디히 세포 종양(stromal leydig cell tumor), 세르톨리 세포 종양(Sertoli cell tumor), 피부 종양(skin tumor), 신장 종양(kidney tumor), 고환 종양(testicular tumor), 뇌종양(brain tumor), 난소 종양(ovarian tumor), 위 종양(stomach tumor), 구강 종양(oral tumor), 방광 종양(bladder tumor), 뼈 종양(bone tumor), 자궁경부 종양(cervical tumor), 식도 종양(esophageal tumor), 후두 종양(laryngeal tumor), 간 종양(liver tumor), 폐 종양(lung tumor), 질 종양(vaginal tumor) 및 빌름스 종양(Wilm's tumor)이 포함된다.
바람직하게는, 본 발명의 항원 결합 부위는 PSMA의 존재를 특징으로 하는 암 치료에 유용하다. 예를 들어, PSMA에 결합하는 항체는 전립선암을 포함하여 PSMA의 증가된 발현을 특징으로 하는 암을 치료하는데 유용하다.
당업자는 본 명세서에 기재된 상태를 진단하기 위한 방사선 영상화에 사용하기 위한 방사성 동위원소를 포함하여, 본 발명의 항체와 함께 사용하기에 적합한 진단제를 선택하는 방법에 익숙할 것이다. 또한, 당업자는 본 명세서에 기재된 진단 시약과 함께 사용하기 위한 영상화 기술에 익숙할 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 치료진단 방법은 종양 세포 및/또는 전이의 시험관내 및/또는 생체내 시각화, 확인 및/또는 검출 방법 뿐만 아니라 암 치료 방법이다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 진단학적 방법을 포함한다.
(1) 진단학적 유효량의 본 발명의 항체를 환자 또는 대상체에게 투여하는 단계,
(여기서 항체는 하나 이상의 진단학적으로 유용한 표지를 포함함), 및
(2) 진단학적 유효량의 본 발명의 항체를 환자 또는 대상체에게 투여하는 단계,
여기서 항체는 종양 치료제(들)(예를 들어, 방사성 동위원소, 독소(들), 약물(들)))를 포함한다.
바람직하게는, 단계 1 및 단계 2는 순차적으로 수행되고 단계 1 및 단계 2의 항체는 동일하다.
단백질을 포함하는 항체 결합 도메인
단일-도메인 항체
일부 예에서, 본 발명의 항원 결합 부위 또는 단백질은 단일-도메인 항체이거나 이를 포함한다(이는 용어 "도메인 항체" 또는 "dAb"와 상호교환적으로 사용됨). 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬이다. 특정 예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다(Domantis, Inc., Waltham, MA; 예를 들어, 제US6248516호를 참조함).
디아바디, 트리바디, 테트라바디
일부 예에서, 본 발명의 단백질은 제WO98/044001호 및/또는 제WO94/007921호에 기재된 것과 같은 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 또는 고차 단백질 복합체이거나 이를 포함한다.
예를 들어, 디아바디는 각각의 폴리펩티드 사슬이 구조 VL-X-VH 또는 VH-X-VL을 포함하는 2개의 연관된 폴리펩티드 사슬을 포함하는 단백질이고, 여기서 VL은 항체 경쇄 가변 영역이고, VH는 항체 중쇄 가변 영역이고, X는 단일 폴리펩티드 사슬에서 VH 및 VL이 회합(또는 Fv를 형성)하도록 하는데 불충분한 잔기를 포함하는 링커이거나 또는 부재이고, 여기서 하나의 폴리펩티드 사슬의 VH는 다른 폴리펩티드 사슬의 VL에 결합하여 항원 결합 도메인을 형성하고, 즉, 하나 이상의 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fv 분자를 형성한다. VL 및 VH는 각각의 폴리펩티드 사슬에서 동일할 수 있고 또는 VL 및 VH는 이중특이성 디아바디(즉, 상이한 특이성을 갖는 2개의 Fv를 포함함)를 형성하도록 각각의 폴리펩티드 사슬에서 상이할 수 있다.
단일 사슬 Fv(scFv)
숙련된 기술자는 scFv가 단일 폴리펩티드 사슬에 VH 및 VL 영역 및 scFv가 항원 결합(즉, 단일 폴리펩티드 사슬의 VH 및 VL이 서로 회합하여 Fv를 형성함)을 위해 바람직한 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH 및 VL 사이의 폴리펩티드 링커를 포함한다는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, 링커는 scFv에 대해 보다 선호되는 링커 중 하나인 (Gly4Ser)3과 함께 12개를 초과하는 아미노산 잔기를 포함한다.
본 발명은 또한 단일 시스테인 잔기가 VH의 FR 및 VL의 FR에 도입되고 시스테인 잔기는 안정한 Fv를 생성하기 위해 이황화 결합에 의해 연결되는, 이황화 안정화된 Fv(또는 diFv 또는 dsFv)를 고려한다.
대안적으로 또는 추가로, 본 발명은 이량체 scFv, 즉, 비공유 또는 공유 연결, 예를 들어 류신 지퍼 도메인(예를 들어, Fos 또는 Jun으로부터 유래됨)에 의해 연결된 2개의 scFv 분자를 포함하는 단백질을 포괄한다. 대안적으로, 2개의 scFv는, 예를 들어 제US20060263367호에 기재된 바와 같이, scFv 둘 모두가 항원을 형성하고 항원에 결합하도록 하는데 충분한 길이의 펩티드 링커에 의해 연결된다.
중쇄 항체
중쇄 항체는 중쇄를 포함하지만 경쇄는 포함하지 않는다는 점에서 많은 다른 형태의 항체와 구조적으로 상이하다. 따라서 이러한 항체는 "중쇄 전용 항체"라고도 한다. 중쇄 항체는 예를 들어 낙타과 연골어류(IgNAR라고도 함)에서 발견된다.
자연 발생 중쇄 항체에 존재하는 가변 영역은 일반적으로 낙타류 항체에서는 "VHH 도메인", IgNAR에서는 V-NAR로 지칭되는데, 이는 통상적인 4-사슬 항체(이들은 "VH 도메인"으로 지칭됨)에 존재하는 중쇄 가변 영역과 구별하고 통상적인 4-사슬 항체("VL 도메인"으로 지칭됨)에 존재하는 경쇄 가변 영역과 구별하기 위해서이다.
낙타과로부터의 중쇄 항체 및 이의 가변 영역 및 이의 생산 및/또는 분리 및/또는 사용 방법에 대한 일반적인 설명은 특히 다음의 참조문헌 제WO94/04678호, 제WO97/49805호 및 제WO 97/49805호에서 찾을 수 있다.
연골 어류로부터의 중쇄 항체 및 이의 가변 영역 및 이의 생산 및/또는 분리 및/또는 사용 방법에 대한 일반적인 설명은 특히 제WO2005/118629호에서 찾을 수 있다.
기타 항체 및 이의 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질
본 발명은 또한 기타 항체 및 이의 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질, 예를 들어:
(i) 제US5731168호에 기재된 바와 같은 "키 앤 홀(key and hole)" 이중특이성 단백질;
(ii) 예를 들어, 제US4676980호에 기재된 바와 같은 이종접합체 단백질;
(iii) 예를 들어, 제US4676980호에 기재된 바와 같은 화학적 가교제를 사용하여 생산된 이종접합체 단백질; 및
(iv) Fab3 (예를 들어, 제EP19930302894호에 기술된 바와 같음)을 고려한다.
조성물
일부 예에서, 본 명세서에 기술된 항원 결합 부위는 경구, 비경구, 흡입 스프레이, 흡착, 흡수, 국소, 직장, 비강, 협측, 질, 뇌실내, 통상적인 무독성 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 투여 제형의 이식된 저장소를 통해, 또는 임의의 다른 편리한 투여 형태에 의해 투여될 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 척추강내, 뇌실내, 흉골내 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.
항원 결합 부위를 대상체(예를 들어, 약제학적 조성물)에 투여하기에 적합한 형태로 제조하는 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (18th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990) 및 U.S. Pharmacopeia: National Formulary (Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1984)]에 기재된 방법을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 정맥내 투여 또는 장기 또는 관절의 체강 또는 내강으로의 투여와 같은 비경구 투여에 특히 유용하다. 투여용 조성물은 일반적으로 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들어 수성 담체에 용해된 항원 결합 부위의 용액을 포함할 것이다. 다양한 수성 담체, 예를 들어 완충 식염수 등을 사용할 수 있다. 조성물은 pH 조절제 및 완충액, 독성 조절제 등과 같은 생리학적 조건을 근사화하기 위해 필요한 약제학적으로 허용되는 보조 물질, 예를 들어, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 젖산나트륨 등을 포함할 수 있다. 이들 제형에서 본 발명의 항원 결합 부위의 농도는 광범위하게 변할 수 있고, 주로 선택된 특정 투여 방식 및 환자의 요구에 따라 체적, 점도, 체중 등을 기반으로 선택될 것이다. 예시적인 담체는 물, 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 및 5% 인간 혈청 알부민을 포함한다. 혼합유 및 에틸올레이트와 같은 비수성 비히클도 사용될 수 있다. 리포솜은 또한 담체로 사용될 수 있다. 비히클에는 등장성 및 화학적 안정성을 강화시키는 소량의 첨가제(예를 들어, 완충액 및 방부제)를 포함할 수 있다.
투여량 및 투여 시기
본 발명의 항원 결합 부위의 적합한 투여량은 특정 항원 결합 부위, 치료될 상태 및/또는 치료되는 대상체에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 차선의 투여량으로 시작하여 최적 또는 유용한 투여량을 결정하기 위해 투여량을 점진적으로 수정함으로써 적절한 투여량을 결정하는 것은 숙련된 의사의 능력 범위 내에 있다. 대안적으로, 치료/예방을 위한 적절한 투여량을 결정하기 위해 세포 배양 분석 또는 동물 연구의 데이터가 사용되며, 여기서 적절한 투여량은 독성이 거의 또는 전혀 없는 활성 화합물의 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있다. 투여량은 사용된 투여 형태 및 사용된 투여 경로에 따라 이러한 범위 내에서 다양할 수 있다. 치료학적/예방학적 유효 용량은 세포 배양 검정으로부터 초기에 추정할 수 있다. 세포 배양에서 결정된 IC50(즉, 증상의 최대 억제의 절반을 달성하는 화합물의 농도 또는 양)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위한 용량이 동물 모델에서 제형화될 수 있다. 이러한 정보를 사용하여 인간에게 유용한 용량을 보다 정확하게 결정할 수 있다. 혈장 내 수준은 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
일부 예에서, 본 발명의 방법은 본 명세서에 기재된 단백질을 예방학적 또는 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.
용어 "치료학적 유효량"은 치료를 필요로 하는 대상체에 투여될 때 대상체의 예후 및/또는 상태를 개선하고/하거나 본 명세서에 기재된 임상 상태의 하나 이상의 증상을 해당 상태를 임상 진단하거나 또는 임상학적 특징으로 관찰되고 허용되는 수준보다 낮은 수준으로 감소 또는 억제하는 양이다. 대상체에게 투여되는 양은 치료할 상태의 특정 특성, 치료되는 상태의 유형 및 단계, 투여 방식 및 대상체의 특성(예를 들어, 일반적인 건강, 기타 질병, 나이, 성별, 유전자형 및 체중)에 좌우될 것이다. 숙련가는 이들 및 기타 인자에 따라 적절한 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 따라서, 이 용어는 본 발명을 특정 양, 예를 들어 단백질(들)의 중량 또는 양으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안되며, 오히려 본 발명은 대상체에서 언급된 결과를 달성하기에 충분한 항원 결합 부위(들)의 임의의 양을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "예방학적 유효량"은 임상 상태의 하나 이상의 검출 가능한 증상의 발병을 예방 또는 억제 또는 지연시키기에 충분한 양의 단백질을 의미하는 것으로 간주되어야 한다. 숙련된 기술자는 이러한 양이 예를 들어 투여된 특정 항원 결합 부위(들) 및/또는 특정 대상체 및/또는 상태의 유형 또는 중증도 또는 수준 및/또는 상태에 대한 경향(유전적 또는 기타)에 따라 달라질 것임을 인식할 것이다. 따라서, 이 용어는 본 발명을 특정 양, 예를 들어 항원 결합 부위(들)의 중량 또는 양으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안되며, 오히려 본 발명은 대상체에서 언급된 결과를 달성하기에 충분한 항원 결합 부위(들)의 임의의 양을 포함한다.
키트
본 발명은 하기 중 하나 이상을 포함하는 키트를 추가로 포함한다:
(i) 본 발명의 항체 또는 이를 인코딩하는 발현 작제물(들);
(ii) 본 발명의 분자;
(iii) 본 발명의 복합체; 또는
(iii) 본 발명의 약제학적 조성물.
암을 검출하기 위한 키트의 경우, 키트는 예를 들어 본 발명의 항원 결합 부위에 연결된 검출 수단을 추가로 포함할 수 있다.
치료용/예방용 키트의 경우, 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
선택적으로, 본 발명의 키트는 임의의 예에 따라 본 명세서에 기재된 방법에 사용하기 위한 설명서와 함께 제공된다.
본 발명의 PSMA-결합 항체에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열의 요약
항체 ID 영역 서열번호 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열
ANT4044 가변 중쇄 HCDR1 (단백질) 1 EYTIH
HCDR2 (단백질) 2 NINPNNGGTTYNQKFED
HCDR3 (단백질) 3 GWNFDY
VH (단백질) 4 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYTIHWVRQAPGKGLEWIGNINPNNGGTTYNQKFEDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAAGWNFDYWGQGTTVTVSS
HCDR1 (DNA) 5 GAATACACCATCCAC
HCDR2 (DNA) 6 AACATTAATCCTAACAATGGTGGTACTACCTACAACCAGAAGTTCGAGGAC
HCDR3 (DNA) 7 GGTTGGAACTTTGACTAC
VH (DNA) 8 GAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGAATACACCATCCACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGAAAGGGCCTTGAGTGGATTGGAAACATTAATCCTAACAATGGTGGTACTACCTACAACCAGAAGTTCGAGGACAGAGTCACAATCACTGTAGACAAGTCCACCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGAGATCTGAGGATACTGCAGTCTATTACTGTGCAGCTGGTTGGAACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACGGTCACCGTCTCCTCA
HFR1 (단백질) 9 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT
HFR2 (단백질) 10 WVRQAPGKGLEWIG
HFR3 (단백질) 11 RVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAA
HFR4 (단백질) 12 WGQGTTVTVSS
HFR1 (DNA) 12 GAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACT
HFR2 (DNA) 14 TGGGTGAGGCAGGCCCCTGGAAAGGGCCTTGAGTGGATTGGA
HFR3 (DNA) 15 AGAGTCACAATCACTGTAGACAAGTCCACCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGAGATCTGAGGATACTGCAGTCTATTACTGTGCAGCT
HFR4 (DNA) 16 TGGGGCCAAGGCACCACGGTCACCGTCTCCTCA
ANT4044-A2 가변 중쇄 HCDR1 (단백질) 17 EYTIH
HCDR2 (단백질) 18 NINPNNGGTTYNQKFED
HCDR3 (단백질) 19 YWLFDY
VH (단백질) 20 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYTIHWVRQAPGKGLEWIGNINPNNGGTTYNQKFEDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAAYWLFDYWGQGTTVTVSS
HCDR1 (DNA) 21 GAATACACCATCCAC
HCDR2 (DNA) 22 AACATTAATCCTAACAATGGTGGTACTACCTACAACCAGAAGTTCGAGGAC
HCDR3 (DNA) 23 TACTGGCTGTTCGACTAC
VH (DNA) 24 GAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGAATACACCATCCACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGAAAGGGCCTTGAGTGGATTGGAAACATTAATCCTAACAATGGTGGTACTACCTACAACCAGAAGTTCGAGGACAGAGTCACAATCACTGTAGACAAGTCCACCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGAGATCTGAGGATACTGCAGTCTATTACTGTGCAGCTTACTGGCTGTTCGACTACTGGGGCCAAGGCACCACGGTCACCGTCTCCTCA
HFR1 (단백질) 25 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT
HFR2 (단백질) 26 WVRQAPGKGLEWIG
HFR3 (단백질) 27 RVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAA
HFR4 (단백질) 28 WGQGTTVTVSS
HFR1 (DNA) 29 GAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACT
HFR2 (DNA) 30 TGGGTGAGGCAGGCCCCTGGAAAGGGCCTTGAGTGGATTGGA
HFR3 (DNA) 31 AGAGTCACAATCACTGTAGACAAGTCCACCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGAGATCTGAGGATACTGCAGTCTATTACTGTGCAGCT
HFR4 (DNA) 32 TGGGGCCAAGGCACCACGGTCACCGTCTCCTCA
ANT4044/ ANT4044-A2 가변 경쇄 LCDR1 (단백질) 33 KASQDVGTAVD
LCDR2(단백질) 34 WASTRHT
LCDR3 (단백질) 35 QQYNSYPLT
VL (단백질) 36 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVDWYQQKPGQAPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISRLQPEDFAVYYCQQYNSYPLTFGQGTKVDIK
LCDR1 (DNA) 37 AAGGCCAGTCAGGATGTGGGTACTGCTGTAGAC
LCDR2 (DNA) 38 TGGGCATCCACCCGGCACACT
LCDR3 (DNA) 39 CAGCAATATAACAGCTATCCTCTCACG
VL (DNA) 40 GACATTCAGATGACCCAGTCTCCCAGCACCCTGTCCGCATCAGTAGGAGACAGGGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGGGTACTGCTGTAGACTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAAGCTCCTAAACTACTGATTTACTGGGCATCCACCCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGCAGCCTGAAGACTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATAACAGCTATCCTCTCACGTTCGGCCAGGGGACCAAGGTGGATATCAAA
LFR1 (단백질) 41 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC
LFR2 (단백질) 42 WYQQKPGQAPKLLIY
LFR3 (단백질) 43 GVPDRFSGSGSGTDFTLTISRLQPEDFAVYYC
LFR4 (단백질) 44 FGQGTKVDIK
LFR1 (DNA) 45 GACATTCAGATGACCCAGTCTCCCAGCACCCTGTCCGCATCAGTAGGAGACAGGGTCACCATCACTTGC
LFR2 (DNA) 46 TGGTATCAACAGAAACCAGGGCAAGCTCCTAAACTACTGATTTAC
LFR3 (DNA) 47 GGAGTCCCTGATCGCTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGCAGCCTGAAGACTTTGCAGTTTATTACTGT
LFR4 (DNA) 48 TTCGGCCAGGGGACCAAGGTGGATATCAAA
ANT4044/ANT4044-A2 비변형 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 IgG1 HC (단백질) 49 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
ANT4044/ANT4044-A2 변형 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 IgG1 H310A H435Q HC (단백질) 50 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLAQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNQYTQKSLSLSPGK
ANT4044/ANT4044-A2 변형 인간 IgG4 불변 사슬 영역 IgG4 S228P L235E H310A H435Q HC (단백질) 51 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLAQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNQYTQKSLSLSLGK
ANT4044/ANT4044-A2 카파 경쇄 불변 영역 인간 κ LC 불변 영역 53 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
ANT4044 RADmAb IgG1 중쇄 (HuX592r) FcRn-무효, IgG1 동종이형 G1m(3) H310A H435Q 53 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYTIHWVRQAPGKGLEWIGNINPNNGGTTYNQKFEDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAAGWNFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLAQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNQYTQKSLSLSPGK
ANT4044 RADmAb IgG4 중쇄 FcRn+FcRγ-무효, IgG4 S228P L235E H310A H435Q 54 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYTIHWVRQAPGKGLEWIGNINPNNGGTTYNQKFEDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAAGWNFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLAQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNQYTQKSLSLSLGK
ANT4044-A2 RADmAb IgG1 중쇄 FcRn-무효, IgG1 H310A H435Q 55 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYTIHWVRQAPGKGLEWIGNINPNNGGTTYNQKFEDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAAYWLFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLAQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNQYTQKSLSLSPGK
ANT4044-A2 RADmAb IgG4 중쇄 FcRn+FcRγ-무효 IgG4 S228P L235E H310A H435Q 56 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYTIHWVRQAPGKGLEWIGNINPNNGGTTYNQKFEDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAAYWLFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLAQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNQYTQKSLSLSLGK
ANT4044-ANT4044-A2 Vκ 경쇄 Vκ 경쇄 57 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVDWYQQKPGQAPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISRLQPEDFAVYYCQQYNSYPLTFGQGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
실시예
실시예 1: PSMA에 결합하기 위한 항체
요약
2개의 항체인 ANT4044 및 ANT4044-A2에 대한 항체 VH 유전자 서열은, 비변형 IgG1, 돌연변이 H310A 및 H435Q(FcRn 결합 및 단백질 A 결합을 소거함(Andersen 외, 2012))을 보유하는 IgG1 (IgG1 (H310A, H435Q)라고 지칭함) 및 힌지 안정화 S228P 돌연변이(Angal 외, 1993) 및 Fc 사일런싱 L235E 돌연변이(Reddy 외, 2000)와 함께 위에 기재된 동일한 FcRn 소거 돌연변이를 가진 변형 IgG4(IgG4 (S228P, L235E, H310A, H435Q)라고 지칭함)를 인코딩하는 3개의 상이한 인간 IgG 이중 발현 벡터로 클로닝된다. 각각의 이중 발현 벡터는 또한 ANT4044 및 ANT4044-A2 둘 다에 공통적인 항체 Vκ 유전자 서열을 포함하였다.
총 5개의 항체를 일시적으로 형질감염시키고 CHO 세포에서 발현시키고 단백질 A(ANT4044-A2 IgG1) 또는 단백질 G(IgG1(H310A, H435Q) 및 IgG4(S228P, L235E, H310A, H435Q) 둘 다로서 ANT4044 및 ANT4044-A2 둘 다)를 사용하여 정제하였다. 친화성 크로마토그래피에 이어 예비 크기배제 크로마토그래피(SEC)를 수행하였다.
항체 무결성은 바이어코어에 의한 SDS-PAGE, 분석학적 SEC, 열 안정성 및 PSMA에 대한 항원 결합으로 평가하였다. 바이어코어 단일 주기 분석을 사용하여 인간 Fc 감마 수용체의 패널(FcγRlllA176F, FcγRlllA176V, FcγRlllB, FcγRlIA167R, FcγRllA167H, FcγRllB, FcgRl) 뿐만 아니라 신생아 수용체 FcRn에 대해 추가 테스트를 수행하였다.
방법 및 결과
항체-발현 플라스미드의 작제
인간화 항체 ANT4044 및 친화성 성숙 인간화 항체 ANT4044-A2의 VH 및 Vκ 서열을 사용하여 IgG1 (pANT18), IgG1 (H310A, H435Q) (pANT71) 및 IgG4 (S228P, L235E, H310A, H435Q) (pANT73)에 대한 pANT 이중 발현 벡터로 클로닝하기 위한 측면 제한 효소 부위가 있는 DNA 단편을 생성하였다. 각 이소형(isotype) 벡터 내의 VH 영역을 Mlu I 및 Hind III 제한 부위 사이에 클로닝하였고 Vκ 영역을 Pte I 및 BamHI 제한 부위 사이에 클로닝하였다. 5개의 모든 작제물은 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
항체의 일시적인 발현
5가지 항체 작제물에 상응하는 내독소가 없는(Endotoxin-free) DNA를 제조하고 MaxCyte STX® 전기천공 시스템(MaxCyte Inc., Gaithersburg, USA)을 사용하여 CHO-S 세포(ThermoFisher, Loughborough, UK)에 일시적으로 형질감염시켰다. 세포를 회수한 후, 8 mM L-글루타민(ThermoFisher, Loughborough, UK) 및 1x 하이포잔틴-티미딘(ThermoFisher, Loughborough, UK)를 포함하는 CD Opti-CHO 배지(ThermoFisher, Loughborough, UK)에서 3 x106 세포/ml로 세포를 희석하였다. 형질감염 24시간 후, 배양 온도를 32℃로 낮추고 1 mM 부티르산나트륨(Sigma, Dorset, UK)을 첨가하였다.
배양물에게 3.6%(시작 부피 중) 사료(2.5% CHO CD Efficient Feed A(ThermoFisher, Loughborough, UK), 0.5% Yeastolate(BD Biosciences, Oxford, UK), 0.25mM Glutamax(ThermoFisher, Loughborough, UK) 및 2 g/L 포도당(Sigma, Dorset, UK))를 첨가하여 매일 급식하였다. IgG 상청액 역가를 IgG ELISA에 의해 모니터링하고 형질감염된 세포를 상청액을 수확하기 전에 최대 14일 동안 배양하였다.
항체 정제
세포 배양 상청액을 단백질 A(ANT4044-A2 IgG1) 또는 단백질 G(IgG1(H310A, H435Q) 및 IgG4(S228P, L235E, H310A, H435Q) 둘 다로서 ANT4044 및 ANT4044-A2 둘 다) 세파로스 컬럼(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)에 통과시켰다. 모든 항체를 pH 7.2의 1x PBS 완충액으로 교환하였다. 단백질 A 또는 단백질 G 정제 물질을 이동상으로 1x PBS를 사용하여 HiLoadTM 26/600 SuperdexTM 200 pg 분취 SEC 컬럼(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)에서 실행했으며, 그 동안 단량체 분획을 수집하고, 모아서 여과멸균하였다. SEC 프로필은 항체, 특히 ANT4044-A2가 IgG4(S228P, L235E, H310A, H435Q)로 발현되었을 때 다른 IgG 이소형으로 발현된 항체와 비교하여 더 큰 수준의 응집(최대 22%)을 나타냈다는 것을 보여주었다.
항체는 OD280nm를 측정하고 예측된 아미노산 서열을 기반으로 하는 흡광 계수(Ec(0.1%))를 사용하여 정량화하였다.
분석학적 SEC 및 SDS-PAGE
스톡 ANT4044 IgG1 및 단백질 A 또는 단백질 G에 이어 예비 SEC 정제 물질을 SuperdexTM 200 Increase 10/300 GL 분석 컬럼(GE Healthcare, Little Chalfont, UK) 및 1x PBS를 이동상으로 사용하여 분석학적 SEC에 의해 분석하였다. 용출 프로파일은 올바르게 폴딩된 단량체 종의 IgG에 대해 일반적이었다. 항체를 또한 비환원 및 환원 SDS-PAGE으로 분석하였다. VH 및 Vκ 사슬의 예측된 크기에 해당하는 밴드가 관찰되었다.
열안정성 분석
스톡으로부터 ANT4044 IgG1과 함께 5개의 정제된 항체의 열안정성을 평가하기 위해, 형광-기반 열 이동 검정을 사용하여 용융 온도(단백질 도메인의 50%가 언폴딩되는 온도)를 결정하였다. 모든 항체를 SYPRO® Orange(ThermoFisher, Loughborough, UK)를 포함하는 1x PBS 중 100 μg/ml의 작업 농도로 희석하고 25℃에서 99℃까지의 온도 구배로 StepOnePlus 실시간 PCR 시스템(ThermoFisher, Loughborough, UK)을 56분 동안 수행하였다. 단백질 열안정성 소프트웨어(버전 1.2)를 사용하여 용융 곡선을 분석하고 1차 미분 데이터를 기반으로 Tm을 계산하였다.
ANT4044와 ANT4044-A2 둘 다에서 IgG1 백본이 둘 다 69.3℃의 최저 융점을 보이며 가장 열적으로 안정한 것으로 나타났다. 다른 IgG 백본을 비교할 때 ANT4044는 ANT4044-A2와 비교하여 더 큰 열 안정성을 나타내었다.
PSMA에 대한 결합의 평가
전립선-특이적 막 항원(PSMA)에 대한 결합을 평가하기 위해 정제된 각각의 항체에 대해 다중-주기 동역학 분석을 수행하였다. 바이어코어 T200 평가 소프트웨어 V3.0.1을 실행하는 바이어코어 T200(일련 번호 1909913) 기기(Uppsala, Sweden)를 사용하여 분석을 수행하였다. 직접적인 비교를 위해 모든 항체는 단백질 G 칩(GE healthcare, Uppsala, Sweden)에 포획되었다.
정제된 항체를 HBS-EP+ 중 1 μg/ml의 농도로 희석하였다. 각 주기가 시작될 때 각 항체는 단백질 G 표면에 포획되어 약 50 RU의 RL을 제공했다. 포획 후, 표면이 안정화되도록 하였다. 임의의 잠재적인 물질 전달 효과를 최소화하기 위해 35 μl/분의 유속을 사용하여 동역학 데이터를 수득하였다. 동역학 분석을 위해, PSMA(R&D Systems, Minneapolis, U.S.A)를 사용하였다. 동역학 주기에 걸쳐 표면 및 분석물 둘 다의 안정성을 확인하기 위해 블랭크(PSMA)의 다중 반복 및 단일 농도의 분석물의 반복이 동역학 실행에서 프로그래밍되었다. 동역학 분석을 위해 25 nM에서 1.5625 nM PSMA까지 2배 희석 범위를 선택했다. PSMA의 회합 단계는 600초 동안 모니터링하였고 해리 단계는 2400초 동안 모니터링하였다. 각 주기의 마지막에 0.5% P20를 포함하는 10 mM 글리신-HCL pH 1.5를 2회 주입하여 단백질 G 표면의 재생을 수행하였다.
기준 채널 Fc1의 신호를 Fc2, Fc3 및 Fc4의 신호에서 차감하여 기준 표면에 대한 비특이적 결합의 차이를 보정하고 전역 Rmax 매개변수를 1:1 결합 모델에 사용하였다. 상대적 KD는 각 항체의 KD를 동일한 칩에 있는 ANT4044 IgG1의 KD로 나누어 계산하였다.
인간 FcRn에 대한 결합의 평가
FcRn에 대한 정제된 항체의 결합은 바이어코어 T200 평가 소프트웨어 V3.0.1을 실행하는 바이어코어 T200(일련 번호 1909913) 기기(Uppsala, Sweden)를 사용하여 정상 상태 친화도 분석으로 평가하였다. FcRn (Sino Biological, Beijing, China)을 300 RU인 표준 아민 커플링을 사용하여 pH 5.5의 아세트산나트륨 중 10 μg/mL로 CM5 칩에 코팅하였다.
정제된 항체를 pH 6.0 또는 pH 7.4에서 0.05% P20을 포함하는 PBS 중 37 nM에서 3000 nM으로 5점 희석으로 적정하였다. 항체를 30 μl/분의 유속 및 25℃에서 증가하는 농도로 칩에 통과시켰다. 주입 시간은 30초, 해리 시간은 100초였다. 단일 해리 후, 칩은 0.1 M Tris pH 8.0으로 재생하였다.
예상한 바와 같이, H310A H435Q 돌연변이는 pH 6.0에서 FcRn에 대한 항체 결합을 유의하게 감소시켰다. 비변형 IgG1으로 시험된 ANT4044 및 ANT4044-A2 항체 둘 다는 pH 6.0에서 FcRn에 대해 유사한 친화도를 나타내었다. pH 7.4에서 임의의 항체에 대한 결합은 거의 관찰되지 않았다.
인간 Fc 감마 수용체에 대한 결합 평가
고친화성 및 저친화성 Fc 감마 수용체에 대한 정제된 항체의 결합은 30 μl/분의 유속으로 실행되는 바이어코어 T200 평가 소프트웨어 V3.0.1을 실행하는 바이어코어 T200(일련 번호 1909913) 기기(Uppsala, Sweden)를 사용하여 단일 주기 분석으로 평가하였다. 인간 Fc 수용체인 FcγRI, FcγRIIa(167R 및 167H 다형성 모두), FcγRIIb, FcγRIIIa(176F 및 176V 다형성 모두) 및 FcγRIIIb는 시노 바이오로지컬(Sino Biological, Beijing, China)에서 입수하였다. 표준 아민 화학을 사용하여 히스캡처 키트(Hiscapture kit)(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)를 사용하여 미리 커플링된 CM5 센서 칩에서 FcγR을 포획하였다.
각 주기가 시작될 때, HBS-P+에 희석된 His 태그가 붙은 Fc 감마 수용체를 특정 RU 수준으로 로딩하였다. 각 농도 사이에 재생이 없는 5점, 3배 희석 범위의 항체를 각 수용체에 사용하였다. 모든 경우에서, 해리 후 pH 1.5의 글리신을 2회 주입하여 칩을 재생시켰다. 기준 채널 Fc1(블랭크)의 신호는 기준 표면에 대한 비특이적 결합의 차이를 보정하기 위해 수용체가 로딩된 Fc의 신호에서 차감되었다.
고친화성 Fc 감마 수용체 FcγRI 및 저친화성 Fc 감마 수용체에 대한 정상 상태 결합에 의해 1:1 동역학에 대한 센서그램을 분석하였다. 대표적인 센서그램
비변형 IgG1으로 발현된 ANT4044 및 ANT4044-A2는 모든 고친화성 및 저친화성 인간 활성화 Fcγ 수용체에 결합하였다. 저친화성 인간 Fcγ 수용체에 대한 결합이 약간 더 낮아지는 사소한 경향이 관찰되었으나, IgG1 내 H310A 및 H435Q 돌연변이의 도입은 상기 결합에 영향을 주지는 않았다. 예상한 바와 같이, IgG4(S228P, L235E, H310A, H435Q) 항체는 모든 활성화 Fcγ 수용체에 대해 현저히 감소된 결합을 나타내었다. 시험된 모든 항체는 억제 수용체 FcγRIIB에 대한 낮은 친화도 결합을 나타내었다. 따라서, IgG1 및 IgG1(H310A, H435Q) 둘 다는 잠재적으로 이펙터 기능을 자극할 수 있는 반면, IgG4(S228P, L235E, H310A, H435Q)는 이펙터 기능을 자극할 가능성이 없다.
결론
인간화 항-PSMA 항체 ANT4044 및 이의 친화성 성숙 변이체 ANT4044-A2에 상응하는 가변 중쇄 및 경쇄 서열을 비변형 인간 IgG1, 돌연변이 H310A 및 H435Q(FcRn 결합을 소거함)를 갖는 인간 IgG1, 또는 인간 IgG4(S228P, L235E, H310A, H435Q)을 인코딩하는 이중 발현 벡터로 클로닝하였다. CHO 세포를 일시적으로 형질감염시키고 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피 및 예비 SEC에 의해 5개의 항체를 정제하였다. 분석학적 SEC를 수행하여 응집의 증거가 거의 없는 단량체 IgG와 일치하는 프로파일을 밝혀냈다. ANT4044 IgG1(스톡으로부터)을 포함한 모든 항체는 열안정성 및 PSMA, 인간 FcRn 및 인간 Fcγ 수용체에 대한 결합 측면에서 특성화되었다.
ANT4044 및 ANT4044-A2 둘 다의 경우, IgG1 백본이 가장 열적으로 안정한 것으로 나타난 반면, ANT4044 항체는 ANT4044-A2 항체와 비교하여 더 큰 열 안정성을 나타냈다. IgG1(H310A, H435Q) 및 IgG4(S228P, L235E, H310A, H435Q) 형식 둘 다의 모든 항체는 비변형 IgG1로 발현되는 대응물로서 PSMA에 유사한 결합을 나타냈다. 친화성 성숙 ANT4044-A2 항체는 ANT4044와 비교하여 PSMA에 대해 2-3배 더 큰 친화도를 보여주었다.
pH 6.0에서 FcRn에 대한 결합은 H310A, H435Q 돌연변이의 도입에 의해 상당히 감소된 반면, pH 7.4에서 FcRn에 대한 결합은 임의의 항체에서 거의 관찰되지 않았다.
인간 Fcγ 수용체에 대한 항체 결합을 분석하여 IgG4 (S228P, L235E, H310A, H435Q)로 발현되는 항체에서 L235E 돌연변이에 의한 결합의 소거를 확인하였다. 돌연변이 H310A 및 H435Q는 인간 Fcγ 수용체에 대한 항체의 결합에 유의한 영향을 미치지 않았으므로, IgG1 및 IgG1(H310A, H435Q) 둘 다는 유사한 이펙터 기능 특성을 나타낼 것으로 예상된다.
실시예 2: 항체의 접합
항체 ANT4044-IgG1, ANT4044-A2-IgG1, ANT4044-IgG1 H310A H435Q(일명 ANT4044-IgG1-2M) 및 ANT4044-IgG4 S228P L235E H310A H435Q (일명 ANT4044-IgG4-4M)를 ThioBridgeTM-PEG(6u)-DOTA 시약 또는 NHS-DOTA 시약에 접합하였다.
ThioBridgeTM는 PolyTherics의 독점적인 이황화 접합 링커이며 DOTA는 킬레이터 페이로드, 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 모노 아미드이다.
ThioBridge TM DOTA 접합 평가: ANT4044-IgG1은 반응 완충액(20 mM 인산나트륨, pH 7.5, 150 mM NaCl, 20 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)) 중 6-10 mg/mL 용액으로 제조되었다. 반응 완충액(6-10 mg/mL, 40℃) 중 ANT4044-IgG1에 항체 또는 DTT 10 mM 당 6-10 당량의 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP)을 첨가하였다. 항체 농도를 반응 완충액으로 희석하여 5 mg/mL로 조정하였다. 환원 혼합물을 37-40℃에서 1시간 동안 배양하였다. 시약을 첨가하기 전에 환원 혼합물을 22℃로 냉각시켰다. 아세토니트릴 중 ThioBridgeTM-PEG(6u)-DOTA 5.6-8 당량을 혼합물에 첨가하고, 이를 반응 완충액으로 4 mg/mL로 추가 희석하였다. 혼합물 중 아세토니트릴의 백분율은 5%이었다. 반응 혼합물을 22℃에서 최대 22시간 동안 배양하였다. 완충액 교환 및 여분의 시약 제거를 비바스핀(Vivaspin) 20 필터(30 kDa MWCO, PES 멤브레인, Generon)를 사용하여 14,000 rcf에서 초원심분리에 의해 수행하였다. 시료를 비바스핀 20 필터(30 kDa MWCO, PES 멤브레인, Generon)를 사용하여 pH 7.2-7.5의 둘베코 PBS 완충액으로 7 내지 9회 교환하였다. 항체-ThioBridgeTM DOTA 접합체 농도를 UV-vis로 측정하고 pH 7.2-7.5의 둘베코-PBS를 사용하여 4.0 mg/mL로 보정하고, 멸균 여과(0.22 μm 셀룰로오스 아세테이트 필터)한 다음, -80℃에서 보관하였다.
라이신-DOTA 접합 평가: ANT4044-IgG1은 0.1M NaHCO3 및 20 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), pH 8-9 (반응 완충액) 중 6 mg/mL 용액으로 제조되었다. 다음으로, pH 7.2-7.5의 둘베코(Dulbecco)의 PBS 완충액 5.0 mg/mL 중 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 모노-N-하이드록시숙신이미드 에스테르 헥사플루오로포스페이트 트리플루오로아세테이트 염(NHS-DOTA 시약)을 제조하였다. 10-25 당량의 NHS-DOTA 시약 용액을 가하고 반응 완충액을 추가하여 항체 농도를 4.0 mg/mL로 보정하였다. 2-3시간 동안 22℃에서 배양하였다. 다음으로, pH 5.5(4:1 v/v)의 0.2M 아세트산나트륨을 첨가하여 퀀칭(quenching)하고 비바스핀 20 필터(30kDa MWCO, PES 멤브레인, Generon)를 사용하여 14,000 rcf에서 초원심분리하였다. 희석 및 초원심분리를 2배 더 반복하였다. 이후, 완충액을 비바스핀 20 필터(30 kDa MWCO, PES 멤브레인, Generon)를 사용하여 pH 7.2-7.5인 둘베코의 PBS 로 4회 교환하였다. 항체-DOTA 접합체 농도를 UV-vis로 측정하고 둘베코-PBS pH 7.2-7.5를 사용하여 4.0 mg/mL로 보정하고, 멸균 여과(0.22 μm 셀룰로오스 아세테이트 필터)한 다음, -80℃에서 보관하였다. 적절한 접합 조건을 확인하기 위해 소규모 반응 및 정제가 먼저 수행되었다. 분석학적 SEC 및 분석 LC-MS 방법은 존재하는 접합의 정도, 순도 및 잔류 시약을 확인하기 위해 전개되었다. 접합은 두 시약 모두에 효과적인 것으로 밝혀졌다. 두 시약 모두 접합 중 또는 접합 후에 응집을 일으키지 않았다. 라이신 접합체는 다양한 범위로 상이하게 로딩된 DOTA 종을 나타내고 ThioBridgeTM 접합체보다 LC-MS 분석에 더 많은 양을 필요로 하였다. 시험한 모든 시료는 LC-MS에 의해 평균 DAR이 4.0~4.2 (ThioBridgeTM 접합체)이고 평균 DAR이 3.8 내지 4.9 (라이신 접합체)인 것으로 나타났다.
실시예 3: PSMA 결합에 대한 항체의 약동학 분석
실시예 1에 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여 하기 항체의 혈청 반감기를 평가하였다: J591 IgG 라이신 DOTA 접합체(PSMA 결합을 위한 대조군 항체), ANT4044 라이신 DOTA 접합체(ANT4044-K-DOTA), ANT4044-A2 라이신 DOTA 접합체(ANT4044-A2-K-DOTA), FcRn 결합 영역에 아미노산 치환이 있는 ANT4044 라이신 DOTA 접합체(ANT4044-FcRn-K-DOTA) 및 FcRn 및 Fc 감마 수용체 결합 영역에 아미노산 치환이 있는 ANT4044 라이신 DOTA 접합체(ANT4044-FcRg-K-DOTA). 이에 대한 결과는 도 1에 도시되어 있다.
도 2는 각 시험 항체에 대한 평균 곡선 아래 면적(AUC, 상단) 및 제거율(CL, 하단)를 보여준다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
실시예 4: 생체 분포 및 종양 축적 연구
마우스 모델에서 LNCaP 세포에 대한 본 발명의 상이한 항체의 비교 표적화를 정량적으로 분석하여 평가하였다.
항체의 방사성 표지 및 TLC 분석.
시험 항체는 다음과 같다:
1. ANT4044-IgG1+DOTA ("JN005")
2. ANT4044-A2-IgG1+DOTA ("JN008")
3. ANT4044-IgG1(FcRn)+DOTA ("JN007")
4. ANT4044-IgG4(FcRn/FcR감마)+DOTA ("JN006")
5. HuJ591 IgG1+DOTA("J591" - PSMA에 대한 결합 대조군)
모든 항체는 실온에서 45분 동안 0.1M pH 5.5 암모늄 아세테이트 완충액 중 200배 과량의 생체분자로 64Cu와 함께 배양하였다. 각 용액의 시료를 취하여 50 mM EDTA와 1:1로 혼합하였다. 5 μL의 각 용액을 TLC 종이(실리카 겔이 함침된 Agilent iTLC-SG 글래스 극세사 크로마토그래피 종이)에 스폿팅하고 50:50 H2O:에탄올로 실행하였다. 이후, 플레이트를 방사성 동위원소 형광체 스크린을 사용하여 Carestream MSFX 영상화 시스템으로 영상화하였다. 필요한 경우 제조업체 프로토콜에 따라 7K MWCO Zeba 스핀 컬럼(Thermo Scientific)을 사용하여 정제하여 결합되지 않은 구리를 제거하였다. 모든 시료는 >95% 표지화를 나타내었다.
품질 관리를 위해 EDTA에 결합된 Cu-64 및 유리 Cu-64의 용출 거동을 모니터링하기 위해 대조군 실험을 수행하였다.
종양 개시 및 성장
8주령 수컷 Balb/c 누드 마우스에 100 μL 인산 완충 식염수 중 5 x 106 LNCaP 세포를 각 마우스 우측면에 피하 주입(27G 바늘)하였다.
꼬리 정맥(29G)을 통해 항체 용액을 주입한 다음, Siemens Inveon PET-CT 기기를 사용하여 마우스를 영상화하거나, 꼬리 자르기를 통해 혈액을 수집하고 표시된 시점의 혈액 농도 분석을 위해 감마 계수기를 통해 활성을 측정하였다.
영상화 프로토콜
폐쇄형 마취 유도실에서 2% 용량의 이소플루란(IsoFlo, Abbott Laboratories)으로 마우스를 마취시켰다. 깊은 마취를 보장하기 위해 안구 및 페달 반사를 사용하여 마우스를 모니터링했다. 마우스가 깊이 마취되면 마취 공기 혼합물(1%)이 노즈콘을 통해 코와 입으로 전달되는 적절한 동물 베드에 놓았다. 동물 모니터링 시스템(BioVetTM 시스템, m2m Imaging, Australia)을 사용하여 모든 실험에 걸쳐 생리학적 모니터링(센서 프로브를 사용한 호흡)을 달성하였다. 항체의 꼬리 정맥 주입 후 Siemens Inveon PET-CT 스캐너를 사용하여 영상을 획득하였다.
주입용 주사기에 방사성 동위원소 용액(약 150 μL)을 채우고 교정 계수가 35인 용량 교정기(Capintec CRC-25)를 사용하여 주사기 내의 활성을 측정하였다. 꼬리 정맥 주입 후 주사기에 남은 활성을 동일한 용량 교정기를 사용하여 측정하고 각 마우스에 주입된 총 부피를 계산하였다.
방사선 공급원으로서 일정량의 Cu-64 용액을 포함하는 자체 제작 팬텀으로 PET/CT 스캐너의 보정을 수행하였다.
마우스를 스캐너 베드에 위치시키고(자체 개발한 베드를 사용하여 스캔당 n=4) 해부학적 공동 등록을 위해 마이크로-CT 스캔을 획득하였다. 마우스의 CT 영상은 전압을 80 kV로 설정하고 전류를 500 μA로 설정한 X선 공급원을 통해 획득하였다. 스캔은 낮은 배율과 4의 비닝 계수로 120 개의 회전 단계로 360° 회전을 사용하여 수행하였다. 노출 시간은 106 μm의 유효 픽셀 크기로 230 ms이었다. CT 영상은 Feldkamp 재구성 소프트웨어(Siemens)를 사용하여 재구성되었다. CT 영상화 후, 30 내지 60분 정적 획득을 사용하여 방사성추적자 주입 후 8 시간, 24 시간 및 48 시간에 PET 스캔을 획득하였다. PET 영상은 OSEM2D(ordered-subset Expectation maximization) 알고리즘을 사용하여 재구성하였으며 CT 및 PET 영상의 융합 및 관심 영역(ROI) 정의를 허용하는 인베온 리서치 워크플레이스(Inveon Research Workplace) 소프트웨어(IRW 4.1)(Siemens)를 사용하여 분석하였다. 각 개별 동물의 CT 및 PET 데이터 세트는 IRW 소프트웨어(Siemens)를 사용하여 정렬되어 관심있는 장기가 양호하게 중첩되는 것을 보장하였다. 3차원 ROI는 심장, 신장, 폐, 방광, 간, 비장, 장 및 종양과 같은 관심있는 모든 장기 뿐만 아니라 전신 내에 배치되었으며 형태학적 CT 정보를 사용하여 장기를 묘사했다. 3D 화소 당 활성은, PET 스캐너 효율성을 설명하기 위해 알려진 Cu-64 활성으로 채워진 원통형 팬텀을 스캔하여 얻은 변환 계수를 사용하여 nci/cc로 변환되었다. 이후, 활성 농도는 주입 용량/g 백분율(%ID/g)로 근사할 수 있는 조직 cm3 당 감쇠-보정된 주입 활성의 백분율로 표현하였다.
그 다음, 혈액에서 검출된 활성에 대한 종양에서 검출된 활성으로 종양 대 혈액 비율을 계산하였다.
결과
주입 후 8, 24 및 48시간에 마우스를 영상화하였다. 48시간 시점 이후, 감마 계수 및 장기 분포의 정량화를 위해 장기를 수거하였다.
종양 가장자리(CT 스캔에서 기술된 대로) 주위로 관심 영역이 도시화되었고, 영상화 연구에서 각 마우스에 대한 항체 농도(주입 용량%를 기준으로 함)를 계산하였다. 도 3 내지 6 및 8은 생체내 및 생체외(감마 계수기에 의해) 측정된 장기 축적을 나타낸다. 생체 내 및 생체 외 사이의 정량화 변동성은 생체 내 플롯에 대한 ROI 및 백그라운드 신호로 인해 발생한다. ns P > 0.05, * P ≤ 0.05, ** P ≤ 0.01, *** P ≤ 0.001, **** P ≤ 0.0001
도 7은 주입 후 5일까지의 항체의 혈액 농도를 도시한다.
생체내 영상화는 모든 항체에 대한 종양 축적 및 장기간 국소화(2일 이상)를 나타내었다. 상이한 항체 사이에는 통계적 차이가 없었고 종양의 양은 48시간까지 대략 5% ID/g이었다.
생체외 분석으은 모든 항체에 대해 48시간의 생체분포를 나타내었다. 이 시점에서, 종양 축적은 항체 농도가 가장 높았고 간, 비장, 및 폐의 순서였다.
JN005는 다른 변이체(J591 제외)보다 더 낮은 간 및 비장 축적을 보여준다. 이것은 훨씬 더 긴 순환 시간에서도 극명하며, 120 시간에서 순환하는 JN005는 여전히 약 10% ID/g이었다.
혈액 시료를 120시간 동안 채취하여 약동학 평가를 수행하였다. 다른 항체에 비해 JN007이 빠르게 제거되는 것이 가장 주목할만한 관찰이었다.
또한, 혈액 시료를 사용하여 항체의 종양:혈액 비율을 계산하였다. 각각의 항체에 대한 종양:혈액 비율(생체내:꼬리 출혈)을 8시간, 24시간 및 48시간 시점에 결정하고 그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 10은 48시간 및 120시간에서의 종양:혈액 비율(생체외:생체외)을 도시한다.
종양:혈액 비율은 항체 JN005(ANT4044-IgG1+DOTA) 및 J591와 비교하여 모든 시점에서 항체 JN006(ANT4044-IgG4(FcRn/FcRgamma)+DOTA) 및 JN007(ANT4044-IgG1(FcRn)+DOTA)가 상당히 더 높다. 120시간에서의 비율은 특히 현저하며, FcRn 결합 변형 및 FcRn/Rf 감마 수용체-결합 변형 항체의 종양:혈액 비율은 비변형 항체의 종양:혈액 비율보다 약 200배 초과한다.
논의
시험된 항체 중 일부가 혈청 반감기를 유의하게 감소(및 제거율을 증가)시켰음에도 불구하고, 종양에 축적되는 모든 항체의 양은 통계적으로 다르지 않았다. 이러한 결과는 각 항체에 대한 종양 로딩이 동일하고, 이는 모든 항체가 표적 에피토프에 대해 유사한 결합 친화도를 가졌음을 나타내며, FcRn 및 Fc 감마 수용체 변형이 JN007 및 JN006 항체의 제거율을 상당히 증가시키고 혈청 반감기를 감소시켰음에도 불구하고 모든 항체는 표적 부위에 전달되는 유사한 능력을 가졌음을 보여준다는 점에서 놀라운 결과이다.
이들 결과는 방사성 표지된 항체의 FcRn 또는 FcRn 및 Fc 감마 수용체 결합 도메인의 변형이 종양 내 축적 능력과 관련하여 항체의 치료 잠재력에 영향을 미치지 않으면서 순환 중 방사성 동위원소의 양을 줄이는 데 상당한 유용성을 갖는다는 것을 나타낸다. 이것은 그렇지 않은 경우 순환(혈액학적 독성, 골 흡수 및 골수 조사를 포함함)에서 방사성 동위원소의 장기간 체류로 인해 발생할 수 있는 많은 독성 영향을 감소시키는 것을 포함하여 수많은 이점을 갖는다.
실시예 5: 본 발명의 예시적인 항체의 177 Lu 영상화 및 방사선요법 효능 연구
시험 물품
1. TXP02-JN007 (ANT4044-FcRn-K-DOTA)
2. TXP02-JN005 (ANT4044-K-DOTA)
3. PSMA-617 (PSMA-결합 펩티드)
1단계 화학: 영상화 연구
표지화 개요: JN007, JN005.
ANT4044는 본 명세서에 기재된 항-PSMA 항체이다. ANT4044-FcRN은 항체의 변형 형태로, 불변 중쇄의 FcRn 결합 부위를 변형시켜 혈청 반감기를 감소시킨 것이다. ANT4044-FcRn-K-DOTA는 라이신 잔기를 통해 킬레이터 DOTA에 접합되는 ANT4044-FcRN이다.
150 μg의 ANT4044-FcRn은 37℃에서 2시간 배양하면서 500 MBq의 Lu-177로 표지화하였다. 표지화 효율은 81%였다. 반응 혼합물을 NAP-5 컬럼에서 PBS로 정제하였으며, 후속 표지화 효율이 98%였다. 표지된 항체를 포함하는 분획을 대조하였다. 각각 20 MBq의 Lu-177로 표지된 10 μg, 100 μg 및 370 μg을 포함하는 용량을 비표지된 ANT4044-FcRn 항체 및 PBS을 적절한 양으로 첨가하여 제조하였다.
500 μg의 ANT4044 항체를 37℃에서 2시간 배양하면서 100 MBq의 Lu-177로 표지하였다. 표지화 효율은 98.2%이었다. 제제를 PBS에 희석하고 추가 정제 없이 사용하였다.
2단계 화학: 효능 연구
표지화 개요: PSMA-617, ANT4044-FcRn.
6 μg(4 nmol)의 PSMA-617(6 μl의 1 mg/ml 수용액)을 0.1 M 암모늄 아세테이트 완충액(pH 5.5) 중 200 MBq Lu-177로 표지하고 10분 동안 95℃로 가열하였다. 표지화 효율은 97.6%이었다. 제제를 PBS에 희석하고 추가 정제 없이 사용하였다.
300 μg ANT4044-FcRn을 120 MBq Lu-177로 표지화하였다. 37℃에서 2시간 항온처리 후 표지화 효율은 96.5%이었다. 제제를 5 μl 0.1 M EDTA를 첨가하여 퀀칭하고 PBS에 희석하고 추가 정제 없이 사용하였다.
1단계 - 영상화 연구 설계
1. 1단계 연구를 위해, 적절한 종양 크기(150-300 mm3)를 가진 동물을 n=3의 4개 그룹으로 연구에 배치하여 다음과 같이 투여하였다.
a. 그룹 1: 200 μL 중 10 μg [177Lu]TXP02-ANT4044-FcRn, 측면 꼬리 정맥에 정맥(IV) 주입
b. 그룹 2: 200 μL 중 100 μg [177Lu]TXP02-ANT4044-FcRn, 측면 꼬리 정맥에 정맥(IV) 주입.
c. 그룹 3: 200 μL 중 370 μg [177Lu]TXP02-ANT4044-FcRn, 측면 꼬리 정맥에 정맥(IV) 주입.
d. 그룹 4: 200 μL 중 100 μg [177Lu]TXP02- ANT4044, 측면 꼬리 정맥에 정맥(IV) 주입.
2. 항체 생체분포는 SPECT/CT 영상화를 통해 항체 주입 후 4, 24 및 48시간에 평가되었다.
a. 해부학적 참조를 위해 전신 정적 SPECT 영상을 획득한 후 전신 CT를 촬영하였다.
b. SPECT 스캔 시간은 40분이었고 CT 스캔 시간은 스캔당 12분이었다.
c. 여러 마리의 마우스가 있는 호텔에서 한 번에 세 마리의 동물을 촬영하였다.
3. 일주일에 3번 캘리퍼스 측정을 통해 종양 부피를 평가하였다. 동물에게 부작용이 있는지 검사하고 정기적으로 무게를 측정하였다.
4. 선택된 동물의 경우 추가적인 생체외 분석을 위해 조직을 수집하였다.
5. 나머지 동물은 도태되었고 사체는 폐기하였다.
2단계 - 효능 연구 설계
1. 주요 효능 연구를 위해, 적절한 종양 크기(150-300 mm3)를 가진 동물을 다음과 같은 투여량으로 n=6의 3개 그룹으로 연구에 배치하였다.
a. 그룹 1: 200 μL 중 50 μg [177Lu]TXP02- ANT4044-FcRn, 정맥주입
b. 그룹 2: 200 μL 중 600 ng [177Lu]PSMA-617, 정맥주입
c. 그룹 3: 200 μL PBS, IV
2. 시험제제 주입 후 3주 동안 주 3회 캘리퍼스 측정을 통해 종양 크기를 평가하였다.
3. 동물에게 부작용이 있는지 검사하고 정기적으로 무게를 측정하였다.
4. 0.5, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120시간에 그룹 1 및 2의 꼬리 찌르기 방법을 통해 동물에서 혈액 시료를 채취하고 감마 계수를 통해 평가하였다.
5. 전혈 시료의 무게를 측정한 다음 참조 표준과 함께 감마 계수기에서 계수하였다.
6. 초기 연구 목표는 치료 후 5주 동안 종양 성장을 모니터링하는 것이었다. 이 시간 프레임은 일부 [177Lu]TXP02-ANT4044-FcRn 마우스에서 관찰된 방사선 질병으로 인해 단축되었다.
7. 선택된 동물의 경우 추가적인 생체외 분석을 위해 조직을 수집하였다.
8. 나머지 동물은 도태되었고 사체는 폐기하였다.
결과 및 논의
도 11은 이종이식 마우스에서 [177Lu]TXP02-ANT4044-FcRn 분포의 예시적인 영상이다.
도 12는 마우스의 혈액에서 측정된 [177Lu]TXP02-ANT4044-FcRn 방사능 수준의 플롯이다.
도 13은 본 연구에서 결정된 바와 같은 종양 성장의 플롯이다. ANT4044-FcRn-DOTA-Lu 처리는 0일과 비교하여 14일에 종양 부피의 변화가 없다는 증거로서 종양 성장을 유의하게 억제하였다. 대조군(PBS) 그룹에서는 종양 부피가 전반적으로 증가하였는데, ANT4044-FcRn-DOTA-Lu 처리군의 상응하는 시간과 비교할 때 9일, 12일 및 14일에 종양의 크기가 상당히 커졌다.
시험(JN007) 항체와 비교 항체(JN005) 모두의 방사성 표지는 2 MBq/μg의 최대 비활성을 달성하여 성공적(>96% 표지 효율)이었다.
영상 연구를 통해 LNCaP 종양 이종이식편에서 시험 항체와 비교 항체 모두의 흡수를 보여주었다(표 2 참조).
심장의 좌심실에 그려진 작은 ROI에 의해 추론된 혈액 제거율은 JN005 항체의 동일한 시점과 비교하여 주입 후 48시간에 모든 그룹의 JN007 항체에서 더 빨랐다(표 3 참조).
4, 24 및 48시간에서의 [ 177 Lu] TXP02-JN007 및 [ 177 Lu]TXP02-JN005 종양 흡수
그룹 질량 용량(μg/동물) 영상화 추적자 방사선량(Mbq/동물, 평균 ± SD) 4시간:종양
%ID/g
(평균 ± SD) 		24시간:
종양
%ID/g
(평균 ± SD) 		48시간:
종양
%ID/g(평균 ± SD)
1 100 [177Lu] TXP02-JN007 19.4 ±0.6 3.2 ± 0.4 6.9 ± 1.2 8.3 ± 1.7
2 100 [177Lu] TXP02-JN005 19.7 ± 0.7 4.5 ± 0.2 16.8 ± 1.2 23.7 ± 0.8
4, 24 및 48시간에서의 [ 177 Lu] TXP02-JN007 및 [ 177 Lu]TXP02-JN005 심장(혈액) 흡수
그룹 질량 용량
(μg/동물) 		영상화 추적자 방사선량(Mbq/동물, 평균 ± SD) 4시간:혈액
%ID/g
(평균 ± SD) 		24시간:
혈액
%ID/g
(평균 ± SD) 		48시간: 혈액 %ID/g(평균 ± SD)
1 100 [177Lu] TXP02-JN007 19.4 ± 0.6 11.7 ± 1.7 3.0 ± 0.2 1.7 ± 0.1
2 100 [177Lu] TXP02-JN005 19.7 ± 0.7 16.5 ± 1.1 10.0 ± 0.6 7.8 ± 0.9
도 14는 JN007 항체(FcRn-결합을 감소시키도록 변형된 본 발명의 항-PSMA, K-DOTA-Lu 항체- HuX592R-DOTA-Lu177로도 지칭됨)를 투여한 후 마우스에서 종양:혈액 비율의 플롯이다. 대조군 마우스(JN005, 즉 FcRn-결합 영역에 변형을 갖지 않는 항-PSMA, K-DOTA-Lu 항체 HuJ591-DOTA-Lu177)와 비교하여 FcRn 변형 항체를 받은 마우스는 항체의 종양 대비 혈액의 비율이 더 높았다.
실시예 6
시험 항체
1. HuX592R (ANT4044-FcRN).
2. HuJ591 (ANT4044)
항체의 방사성 표지 및 TLC 분석.
모든 항체는 0.1M pH 5.5 암모늄 아세테이트 완충액 중 HuX592R 및 HuJ591에 대해 각각 50배 또는 100배 과량의 생체분자로 실온에서 45분 동안 177Lu와 함께 배양하였다. 각 용액의 시료를 취하여 50 mM EDTA와 1:1로 혼합하였다. 5 uL의 각 DTPA 배양된 시료 또는 순수한 용액을 TLC 종이(실리카 겔이 함침된 Agilent iTLC-SG 글래스 극세사 크로마토그래피 종이)에 스폿팅하고 50:50 H2O:에탄올로 실행하였다. 이후, Eckert 및 Ziegler 미니-스캔 및 플로우-카운트 시스템을 사용하여 방사성 표지된 종 이동의 검출을 달성하였다. 모든 시료는 ≥90% 표지화를 나타내었다. 대조군 실험은 품질 관리를 위해 DTPA에 결합된 유리 177Lu 및 177Lu의 용출 거동을 모니터링하기 위해 수행하였다.
세포 결합
Lu-표지된 작제물 HuX592R 및 HuJ591을 세포 결합에 대해 평가하였다.
요약하면, 0.100 mL PBS에 1.25 x 105 PC-3 종양 세포(음성 대조군) 또는 1.25 x 105 LNCaP 종양 세포를 포함하는 에펜도르프(Eppendorf) 튜브를 5 μL(0.030 MBq)의 표지된 항체와 함께 37℃에서 배양하였다. 배양은 분석을 위해 1시간, 2시간, 4시간, 및 24시간의 시점에서 중단되었다.
비결합된 분획 결정.
각 배양 기간이 끝나면 에펜도르프(Eppendorf) 튜브를 500 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 유리 Lu-177 항체를 포함하는 상청액을 별도의 튜브에서 회수하고 감마 분석을 사용하여 계수하였다. Lu-177 표지된 항체와 관련된 세포를 포함하는 펠렛을 0.200 mL의 PBS 용액으로 세척하고 500 g에서 5분 동안 3회 반복하여 원심분리하였다. 각각의 세척액의 상청액을 수집하고 계수하며, 회수된 항온처리 상청액과 결합한 값을 총 유리 비결합된 항체의 결과로 하였다.
표면 결합된 분획 결정.
펠렛을 빙냉 온도에서 20분 동안 pH 4.0에서 0.1mL PBS에 재현탁시켰다. 이후, 에펜도르프 튜브를 4℃에서 500 g에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 수집하여 계수하였다. 빙냉 PBS pH 4.0으로 추가로 3회 세척한 후, 감마 계수를 위해 상청액을 수집하였다.
내재화된 분획 결정.
세척 및 원심분리 후, 세포 펠렛을 내재화된 분획으로 계수하였다.
단백질 농도
세포를 1 M NaOH에 의해 용해시키고 단백질 농도를 측정하였다.
계산
종양 세포(표면 결합 및 내재화 분획)에 대한 Lu-177 항체의 결합 및 비결합된 항체를 계산하고 단백질 mg당 배양된 총 방사능의 백분율로 보고하였다.
동물
6주령의 건강한 수컷 Balb/C 누드 마우스(약 20g)를 ARC(Western Australia)에서 입수하여 본 연구에 사용하였다. 세포 주입 전에 환경에 순응하기 위해 연구 전 1주일 동안 마우스를 모니터링하였다. 모든 동물은 실험 전과 실험 도중 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있었다.
투여
주입용 주사기에 방사성 표지된 항체 용액(약 100 μL)을 채우고 교정 계수가 35인 용량 교정기(Capintec CRC-25)를 사용하여 주사기의 활성을 측정하였다. 꼬리 정맥 주입 후 주사기에 남은 활성은 동일한 용량 교정기를 사용하여 측정하고 각 마우스에 주입된 총 부피를 계산하였다.
내약성
건강한 수컷 Balb/C 누드 마우스(용량 코호트당 n=3)에 177Lu로 표지된 HuX592R을 7일 간격으로 총 3회 주입(29G, 약 100 μL 식염수에 꼬리 정맥 주입함)하여 마우스당 약 100 μg의 질량 용량으로 6, 9 또는 12 MBq 주입 용량을 제공하였다. 다음으로, 주입 후의 마우스 건강을 모니터링하고 초기 주입 후 28일에 모든 마우스는 도태되었고 장기를 PFA로 고정하고 30% 자당으로 옮기고 필요한 경우 잠재적인 미래 분석을 위해 냉동 보관하기 전에 감퇴하도록 두었다.
생체 분포
건강한 수컷 Balb/C 누드 마우스(코호트당 n=3)에 177Lu로 표지된 작제물을 주입(29G, 식염수에 꼬리 정맥 주입함)하여 마우스당 질량 용량 100(HuX592R) 또는 140(HuJ591) μg으로 6 MBq 주입 용량을 제공하였다. 다음으로, 주입 후 24, 48 및 72시간(HuX592R의 경우) 및 72시간(HuJ591의 경우)에 동물을 희생시켰다. 혈액을 샘플링하고 조직을 수집하고 과량의 혈액을 제거하고 생체 외 분석을 위해 칭량하였다. Perkin PerkinElmer 2480 자동 감마 계수기를 사용하여 조직의 방사능을 측정하였다. 177Lu의 알려진 시료를 사용하여 감마 계수를 보정하였고, 주입된 활동을 기반으로 하는 조직 중량의 %ID/g으로 표시된 활동을 측정하였다.
종양 개시 및 성장
자가방사촬영 및 치료 연구를 위해 8-12주령 수컷 Balb/c 누드 마우스에 50 μL 50:50 인산염 완충 식염수:마트리겔 중 4 x 106 LNCaP 세포를 각 마우스의 우측면에 피하 주입(27G 바늘)하였다. 세포 주입 당시 궤양의 증거는 없었으며; 동물을 면밀히 모니터링하고 캘리퍼스로 종양을 측정했으며 고형 종양의 성장을 제외하고는 양호한 상태를 유지하였다. 종양 성장은 LNCaP 종양에서 종종 관찰되는 것처럼 산발적이었고 종양이 100-200 mm3에 도달함에 따라 마우스를 적절한 연구 절차에 참여시켰다.
자기방사촬영
종양이 있는 수컷 Balb/C 누드 마우스(코호트당 n=2)에 177Lu로 표지된 작제물을 주입(29G, 약 100 μL 식염수에 꼬리 정맥 주입)하여 마우스당 100(HuX592R) 또는 140(HuJ591) μg의 질량 용량으로 6 MBq 주입 용량을 제공하였다. 주입 후 7일째에 동물을 희생시키고, 종양 시료를 이소펜탄-드라이 아이스 슬러리에서 급속 냉동시킨 다음, 절단을 위해 OCT 화합물에 삽입하였다. 20 μm 섹션을 슬라이드에 수집하고 공기 건조시킨 다음 약 3.5시간 동안 폐쇄형 카세트의 형광 스크린에 노출시켰다. 그런 다음 1000의 감도 설정으로 177Lu에 최적화된 50 μm(스캔 시간 20-30분)의 픽셀 크기를 이용하는 아머샴 타이푼 인광영상기(Amersham Typhoon Phosphorimager)를 사용하여 영상을 수득하였다. 이미지퀀트(ImageQuant) TL 소프트웨어를 사용하여 영상을 분석하였다.
치료학적 연구
종양이 있는 수컷 Balb/C 누드 마우스(코호트당 n=6)에 177Lu로 표지된 작제물을 주입(29G, 약 100 μL 식염수에 꼬리 정맥 주입)하여 HuX592R의 경우 100 μg 또는 HuJ591의 경우 140 μg의 질량 용량으로 HuX592R의 경우 6 또는 8 MBq 또는 HuJ591의 경우 6 MBq 주입 용량을 마우스당 3주 동안 매주 제공하였다. 비히클 단독 대조군과 비교하여 요법에 대한 반응으로 종양 성장을 90일에 걸쳐 모니터링하였다.
결과
HuX592R과 HuJ591는 둘 다 성공적인 177Lu 표지화를 보여주었다. 이러한 177Lu 표지된 작제물은 세포 결합, 내약성, 생체 분포 및 치료학적 효능 연구에 직접 사용되었다.
세포 결합
177Lu-표지된 HuX592R 및 HuJ591의 결합을 LNCaP(PSMA+) 및 PC3(PSMA-) 세포주에 대해 평가하였다. 작제물을 세포에 첨가한 후 1, 2 및 4시간에 미결합, 표면 결합 및 세포 펠렛 관련 분획을 평가하였다. 세포 검정을 통해 HuJ591 및 HuX592R 둘 다는 PSMA 발현 세포주에서 향상된 축적을 보여주었고, 세포 펠렛에서 관찰된 최고 농도는 검정 기간 동안(모든 시점에서) 성공적인 내재화를 나타냈다. PSMA-음성 세포주(PC3)에서 일반적으로 최소 회합/내재화를 관찰하였으며, 이는 결합이 수용체-의존적이었고 표지화가 수용체에 대한 항체 결합을 유의하게 방해하지 않았음을 나타냈다.
내약성
건강한 수컷 Balb/c 누드 마우스(코호트당 n=3)에서 177Lu로 표지된 HuX592R의 내약성은 1주일 간격으로 3회 투여되는 12, 9 및 6 MBq의 3가지 용량 수준으로 평가하였다. 동물 건강은 치료 투여 3주를 포함하여 4주 동안 동물 체중 및 동물성적표로 평가하였다. 이 연구에서 12 MBq 용량이 너무 높은 것으로 밝혀져서 6 MBq 및 8 MBq 용량을 사용하여 전체 연구를 수행하였다.
생체 분포
건강한 수컷 Balb/c 누드 마우스(코호트당 n=3)에서 177Lu-표지된 작제물의 생체 분포를 HuX592R의 경우 투여 후 24, 48 및 72 시간에 평가하고(도 15A) HuJ591의 경우에만 투여 후 72 시간에 평가하였다(도 15B). 그 결과, HuX592R에 비해 HuJ591의 순환 시간이 유의하게 더 높았고 간 및 비장과 같은 정리 장기에서 축적 수준이 그에 비례하여 더 낮음을 보여주었으며, 시스템에 의해 보다 빨리 제거됨을 시사한다.
자기방사촬영
177Lu-표지된 작제물을 종양이 있는 수컷 Balb/c 누드 마우스에 투여하였다. 동물은 주입 1주일 후 희생되었고, 종양은 OCT에서 동결되었고, 절단되고 자기방사촬영 영상을 획득하였다. 결과를 종합하자면, 이 시점에서 HuX592R에 비해 HuJ591에 대한 축적이 강화되어, 두 작제물에 의한 종양 축적 및 침투와 일치한다. 더욱이, 방사선 치료제의 분포는 두 항체 모두에 대해 종양 전체에 잘 분산된 것으로 나타났다.
치료학적 연구
측면에 LNCaP 이종이식 종양이 있는 수컷 Balb/c 누드 마우스를 치료 코호트에 배정하고 다음 중 하나를 1주 간격으로 3회 용량을 투여하였다:
1. 비히클 대조군
2. 6 MBq [177Lu]-HuX592R
3. 8 MBq [177Lu]-HuX592R
4. 6 MBq [177Lu]-HuJ591
동물 체중으로 평가된 종양 퇴행(도 17) 및 동물 건강을 100일 동안 모니터링하였다. 그 결과, HuX592R 8 MBq에서 2 마리의 마우스 및 HuJ591(도시되지 않음) 코호트에서 4 마리의 마우스가 HuX592R(도 16) 둘 모두에 대한 상당한 종양 성장 억제를 보여주며, 여기서 종양 부담이 캘리퍼스에 의해 측정될 수 없는 완전한 종양 퇴행을 나타냈다. 치료를 시작한 지 37일(모든 코호트가 통계적 비교를 허용하는 n=6인 최종 데이터 지점), 3가지 처리군 모두 2원 변량분석(ANOVA)에 의해 결정된 바와 같이 대조군 코호트와 비교하여 6 MBq에서 HuX592R (p 0.0105), 8MBq에서 HuX592R(p 0.0086) 및 6MBq에서 HuJ591(p 0.0056)으로 종양 성장이 유의하게 감소하였다.
체중 변화에 의해 평가된 바와 같이 심각한 건강 악화를 나타내는 투여 그룹은 없었다.
마우스 생존(도 17)은 대조군 코호트(중앙 생존값 83.5일)와 비교하여 모든 3개의 치료 코호트(중앙 생존값 > 연구 기간)에 대해 통계적으로 더 길다(Mantel-Cox 테스트에 의해 p < 0.05). 위쪽 눈금은 비종양/건강 관련 문제로 인해 안락사된 동물을 나타낸다.
두 제형 HuJ591(6MBq) 및 HuX592R(6MBq 및 8MBq 모두)은 종양을 발현하는 PSMA에 대해 효능을 보여주었다. HuJ591(6MBq)과 HuX592R(8MBq) 모두 연구 100일 동안 치료/종양 관련 사망이 없었고 HuX592R 8MBq에서 2마리의 마우스와 HuJ591 그룹에서 4마리의 마우스가 종양의 절대 퇴행(캘리퍼스로 측정할 수 없음)을 나타냈다. 생존 플롯의 관점에서, 항체가 있는 모든 처리군은 대조군보다 통계적으로 더 우수하였다.
본 명세서에 개시되고 정의된 본 발명은 텍스트 또는 도면으로부터 언급되거나 명백한 개별 특징들 중 둘 이상의 모든 대안적인 조합으로 확장된다는 것을 이해할 것이다. 이들 상이한 조합 모두는 본 발명의 다양한 대안적 국면을 구성한다.
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IgG1 H310A H435Q HC (protein) <400> 50 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 Ala Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Gln Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 51 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ANT4044/ANT4044-A2 modified human IgG4 constant chain region - IgG4 S228P L235E H310A H435Q HC (protein) <400> 51 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu Ala Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Gln Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 52 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ANT4044/ANT4044-A2 kappa light chain constant region - Human kappa LC constant region (protein) <400> 52 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 53 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ANT4044 RADmAb IgG1 heavy chain (HuX592r) - FcRn-null, IgG1 allotype G1m(3) H310A H435Q (protein) <400> 53 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Glu Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Trp Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 Gln Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 54 <211> 442 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ANT4044 RADmAb IgG4 heavy chain - FcRn+FcRgamma-null, IgG4 S228P L235E H310A H435Q (protein) <400> 54 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Glu Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Trp Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 245 250 255 Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 260 265 270 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 290 295 300 Ala Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320 Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 325 330 335 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 340 345 350 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 370 375 380 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn 405 410 415 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Gln Tyr Thr 420 425 430 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 55 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ANT4044-A2 RADmAb IgG1 heavy chain - FcRn-null, IgG1 H310A H435Q (protein) <400> 55 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Glu Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Tyr Trp Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 Gln Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 56 <211> 442 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ANT4044-A2 RADmAb IgG4 heavy chain - FcRn+FcRgamma-null IgG4 S228P L235E H310A H435Q (protein) <400> 56 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Glu Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Tyr Trp Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 245 250 255 Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 260 265 270 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 290 295 300 Ala Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320 Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 325 330 335 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 340 345 350 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 370 375 380 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn 405 410 415 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Gln Tyr Thr 420 425 430 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 57 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ANT4044-ANT4044-A2 Vk Light chain - Vk Light chain (protein) <400> 57 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims (44)

  1. 비변형 항체와 비교하여 또는 IgG 클래스의 야생형 항체와 비교하여 감소된 FcRn 결합도를 갖는 변형된 항체로,
    - His310, His433, His435, His436 및 Ile253 위치에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 IgG 클래스의 비변형 항체 또는 야생형 항체에 존재하는 잔기와 상이한 중쇄 불변 영역을 포함하고,
    여기서 상기 항체는 전립선 특이적 막 항원(PSMA)에 특이적으로 결합하고, 상기 항체는
    FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 - 링커 - FR1a - CDR1a - FR2a - CDR2a - FR3a - CDR3a - FR4a를 포함하고,
    여기서:
    FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 프레임워크 영역이고;
    CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 상보성 결정 영역이고;
    FR1a, FR2a, FR3a 및 FR4a는 각각 프레임워크 영역이며;
    CDR1a CDR2a 및 CDR3a는 각각 상보성 결정 영역이고;
    여기서 상보성 결정 영역 중 임의의 것의 서열은 표 1에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는, 변형 항체.
  2. 제1항에 있어서, PSMA에 특이적으로 결합하는 항체는 서열번호 4 또는 20의 (N에서 C 말단 또는 C에서 N 말단의 순서로) 아미노산 서열을 포함하거나 본질적으로 구성되거나 이로 구성되는, 변형 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    항체가 다음 중 적어도 하나를 포함하는, 변형 항체:
    (i) 서열번호 1 또는 17에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 2 또는 18에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 3 또는 19에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH;
    (ii) 서열번호 4 또는 20에 제시된 서열과 적어도 약 95% 또는 96% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 VH;
    (iii) 서열번호 33에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 34에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 35에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL;
    (iv) 서열번호 36에 제시된 서열과 적어도 약 95% 동일한 서열을 포함하는 VL;
    (v) 서열번호 1 또는 17에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 2 또는 18에 제시된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 3 또는 19에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH;
    (vi) 서열번호 4 또는 20에 제시된 서열을 포함하는 VH;
    (vii) 서열번호 33에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 34에 제시된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 45에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL;
    (viii) 서열번호 36에 제시된 서열을 포함하는 VL;
    (ix) 서열번호 1 또는 17에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 2 또는 18에 제시된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 3 또는 19에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH; 및 서열번호 33에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 34에 제시된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 35에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL; 또는
    (x) 서열번호 4 또는 20에 제시된 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 36에 제시된 서열을 포함하는 VL.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체의 중쇄 불변 영역은 His310 및 His435 모두에서 아미노산 치환을 포함하는, 변형 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체의 중쇄 불변 영역이 중쇄 불변 영역의 Ser228 및 Leu235와 상응하는 잔기에서 아미노산 치환을 포함하는, 변형 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체의 중쇄 불변 영역이 서열번호 50 또는 서열번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 변형 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 서열번호 53 및 57의 서열을 포함하는, 변형 항체.
  8. 면역글로불린 모이어티 및 이에 접합된 비단백질 제제를 포함하는 분자로,
    여기서, 면역글로불린 모이어티는 PSMA에 특이적으로 결합하고,
    FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 - 링커 - FR1a - CDR1a - FR2a - CDR2a - FR3a - CDR3a - FR4a을 포함하는 항원 결합 부위를 포함하고,
    여기서:
    FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 프레임워크 영역이고;
    CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 상보성 결정 영역이고;
    FR1a, FR2a, FR3a 및 FR4a는 각각 프레임워크 영역이며;
    CDR1a, CDR2a 및 CDR3a는 각각 상보성 결정 영역이고;
    여기서 상보성 결정 영역 중 임의의 것의 서열은 표 1에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 가지고;
    여기서 면역글로불린 모이어티는 야생형 면역글로불린과 비교하여 FcRn 수용체에 대한 친화도가 감소되거나 소거되며;
    여기서 비-단백질 제제는 치료학적 모이어티, 바람직하게는 세포독소 또는 방사성 원소를 포함하는, 분자.
  9. 제8항에 있어서,
    면역글로불린 모이어티는 서열번호 4 또는 20의 아미노산 서열(N에서 C 말단 또는 C에서 N 말단의 순서로)로 본질적으로 구성되거나 이로 구성되는 항원 결합 부위를 포함하는, 분자.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    면역글로불린 모이어티는 다음 중 적어도 하나를 포함하는, 분자:
    (i) 서열번호 1 또는 17에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 2 또는 18에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 3 또는 19에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH;
    (ii) 서열번호 4 또는 20에 제시된 서열과 적어도 약 95% 또는 96% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 VH;
    (iii) 서열번호 33에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 34에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 35에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL;
    (iv) 서열번호 36에 제시된 서열과 적어도 약 95% 동일한 서열을 포함하는 VL;
    (v) 서열번호 1 또는 17에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 2 또는 18에 제시된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 3 또는 19에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH;
    (vi) 서열번호 4 또는 20에 제시된 서열을 포함하는 VH;
    (vii) 서열번호 33에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 34에 제시된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 45에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL;
    (viii) 서열번호 36에 제시된 서열을 포함하는 VL;
    (ix) 서열번호 1 또는 17에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 2 또는 18에 제시된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 3 또는 19에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH; 및 서열번호 33에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 34에 제시된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 35에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL; 또는
    (x) 서열번호 4 또는 20에 제시된 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 36에 제시된 서열을 포함하는 VL.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역글로불린 모이어티가 불변 중쇄 영역의 His310 및/또는 His435와 상응하는 잔기에서 아미노산 치환을 포함하여, FcRn 수용체에 대한 면역글로불린 모이어티의 친화도를 감소 또는 소거시키는, 분자.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역글로불린 모이어티가 불변 중쇄 영역의 Ser228 및 Leu235에 상응하는 잔기에서 아미노산 치환을 추가로 포함하여, 활성화 Fc 감마 수용체에 대한 모이어티의 친화도를 감소시키거나 또는 모이어티를 안정화시키는, 분자.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    비-단백질 제제가 방사성 동위원소 형태의 치료제를 포함하는, 분자.
  14. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    비-단백질 제제는 악티늄-225 (225Ac), 아스타틴-211 (211At), 비스무트-212 및 비스무트-213 (212Bi, 213Bi), 구리-64 및 구리-67 (64Cu, 67Cu), 갈륨-67 및 갈륨-68 (67Ga 및 68Ga), 인듐-111 (111In), 요오드-123, -124, -125 또는 -131 (123I, 124I, 125I, 131I) (123I), 납-212 (212Pb), 루테튬-177 (177Lu), 라듐-223 (223Ra), 사마륨-153 (153Sm), 스칸듐-44 및 스칸듐-47 (44Sc, 47Sc), 스트론튬-90 (90Sr), 테크네튬-99 (99mTc), 이트륨-86 및 이트륨-90 (86Y, 90Y), 및 지르코늄-89 (89Zr)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방사성 동위원소를 포함하는, 분자.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    방사성 동위원소가 악티늄-225(225Ac), 아스타틴-211(211At) 및 요오드-123(123I)으로부터 선택되는, 분자.
  16. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체, 또는 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항의 분자를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 전립선 암을 치료하는 방법.
  17. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체 또는 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항의 분자의 전립선 암의 치료용 약제의 제조에서의 용도.
  18. 전립선 암의 치료에 사용하기 위한, 제7항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체 또는 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항의 분자.
  19. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체, 또는 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항의 분자를 포함하는 약제학적 조성물.
  20. - 각각의 사슬이 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는 중쇄 및 경쇄;
    - 여기서 중쇄 불변 영역은 IgG 클래스의 야생형 항체와 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 하나 이상의 아미노산 치환은 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 항체의 친화도를 감소시키고, 이로써 IgG 클래스의 야생형 항체와 비교하여 변형 모노클로날 항체의 혈청 반감기를 감소시키며;
    - 중쇄 또는 경쇄의 하나 이상의 아미노산 잔기에 접합된 방사성 동위원소:
    여기서 IgG 분자는:
    (i) 서열번호 1 또는 17에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 2 또는 18에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 3 또는 19에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH;
    (ii) 서열번호 4 또는 20에 제시된 서열과 적어도 약 95% 또는 96% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 VH;
    (iii) 서열번호 33에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 34에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 35에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL;
    (iv) 서열번호 36에 제시된 서열과 적어도 약 95% 동일한 서열을 포함하는 VL;
    (v) 서열번호 1 또는 17에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 2 또는 18에 제시된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 3 또는 19에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH;
    (vi) 서열번호 4 또는 20에 제시된 서열을 포함하는 VH;
    (vii) 서열번호 33에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 34에 제시된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 45에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL;
    (viii) 서열번호 36에 제시된 서열을 포함하는 VL;
    (ix) 서열번호 1 또는 17에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 2 또는 18에 제시된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 3 또는 19에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH; 및 서열번호 33에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 34에 제시된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 35에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL; 또는
    (x) 서열번호 4 또는 20에 제시된 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 36에 제시된 서열을 포함하는 VL를 포함하는, 치료학적 IgG 분자.
  21. 제20항에 있어서,
    중쇄(VH)의 가변 영역이 서열번호 4 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 치료학적 IgG 분자.
  22. 제20항 및 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    경쇄 가변 영역이 서열번호 36 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 치료학적 IgG 분자.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 아미노산 치환이 His310 또는 His435 위치에서 중쇄 불변 영역에서의 치환을 포함하고, 바람직하게는 아미노산 치환이 His310 및 His435 둘 다에 존재하는, 치료학적 IgG 분자.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    변형 항체가 (a) IgG 클래스의 야생형 항체와 비교하여 하나 이상의 Fc 감마 수용체에 대한 항체의 친화도를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환; 및/또는 (b) IgG 클래스의 야생형 항체와 비교하여 변형 항체에서 CH1-CH2 힌지 영역의 안정성을 증가시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 치료학적 IgG 분자.
  25. 제24항에 있어서,
    Fc 감마 수용체에 대한 항체의 친화도를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환이 Leu235 위치에서의 치환을 포함하는, 치료학적 IgG 분자.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서,
    항체에서 CH1-CH2 힌지 영역의 안정성을 증가시키는 하나 이상의 아미노산 치환이 IgG 분자에서의 치환을 포함하는, 치료학적 IgG 분자.
  27. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    중쇄가 서열번호 53에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 치료학적 항체.
  28. 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    경쇄가 서열번호 57에 제시된 아미노산을 포함하는, 치료학적 IgG 분자.
  29. 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 서열번호 53에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 항체가 서열번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 치료학적 IgG 분자.
  30. 전립선 특이적 막 항원(PSMA)에 결합하거나 또는 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위로서, 항원 결합 부위는
    FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 - 링커 - FR1a - CDR1a - FR2a - CDR2a - FR3a - CDR3a - FR4a를 포함하고,
    여기서:
    FR1, FR2, FR3 및 FR4는 각각 프레임워크 영역이고;
    CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 상보성 결정 영역이고;
    FR1a, FR2a, FR3a 및 FR4a는 각각 프레임워크 영역이며;
    CDR1a CDR2a 및 CDR3a는 각각 상보성 결정 영역이고;
    여기서 상보성 결정 영역 중 임의의 것의 서열은 표 1에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 가지는, 항원 결합 부위.
  31. 제30항에 있어서,
    서열번호 20의 아미노산 서열(N에서 C 말단 또는 C에서 N 말단의 순서로)을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나 이로 구성되는, 항원 결합 부위.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서,
    항체의 항원 결합 도메인을 포함하고, 여기서 항원 결합 도메인은 PSMA에 결합하거나 또는 특이적으로 결합하며, 항원 결합 도메인은 다음 중 적어도 하나를 포함하는, 항원 결합 부위:
    (i) 서열번호 17에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 18에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 19에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH;
    (ii) 서열번호 4 또는 20에 제시된 서열과 적어도 약 95% 또는 96% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 VH;
    (iii) 서열번호 33에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 34에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 35에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL;
    (iv) 서열번호 36에 제시된 서열과 적어도 약 95% 동일한 서열을 포함하는 VL;
    (v) 서열번호 17에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 18에 제시된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 19에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH;
    (vi) 서열번호 4 또는 20에 제시된 서열을 포함하는 VH;
    (vii) 서열번호 33의 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 34에 제시된 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 45에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL;
    (viii) 서열번호 36에 제시된 서열을 포함하는 VL;
    (ix) 서열번호 17에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 18에 제시된 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 19에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH; 및 서열번호 33에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 34에 제시된 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 35에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL; 또는
    (x) 서열번호 20에 제시된 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 36에 제시된 서열을 포함하는 VL.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 도메인이 다음 중 적어도 하나를 추가로 포함하는, 항원 결합 부위:
    (i)서열번호 25에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 프레임워크 영역(FR) 1, 서열번호 26에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 FR2, 서열번호 27에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 FR3, 및 서열번호 28에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 FR4를 포함하는 VH;
    (ii) 서열번호 41에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 FR1, 서열번호 42에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 FR2, 서열번호 43에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 FR3, 및 서열번호 44에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 FR4을 포함하는 VL;
    (iii) 서열번호 25에 제시된 서열을 포함하는 FR1, 서열번호 26에 제시된 서열을 포함하는 FR2, 서열번호 27에 제시된 서열을 포함하는 FR3, 및 서열번호 28에 제시된 서열을 포함하는 FR4를 포함하는 VH;
    (iv) 서열번호 41에 기재된 서열을 포함하는 FR1, 서열번호 42에 기재된 서열을 포함하는 FR2;를 포함하는 VL, 서열번호 43에 기재된 서열을 포함하는 FR3, 및 서열번호 44에 기재된 서열을 포함하는 FR4를 포함하는 VL; 또는
    (v) 서열번호 25에 제시된 서열을 포함하는 FR1, 서열번호 26에 제시된 서열을 포함하는 FR2, 서열번호 27에 기재된 서열을 포함하는 FR3, 및 서열번호 28에 기재된 서열을 포함하는 FR4를 포함하는 VH; 및 서열번호 41에 제시된 서열을 포함하는 FR1, 서열번호 42에 제시된 서열을 포함하는 FR2, 서열번호 43에 기재된 서열을 포함하는 FR3, 및 서열번호 44에 기재된 서열을 포함하는 FR4를 포함하는 VL.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 부위가 항체, 바람직하게는 네이키드 항체(naked antibody)인, 항원 결합 부위.
  35. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 부위가 방사성표지 또는 세포독성제를 포함하는 표지에 접합되는, 항원 결합 부위.
  36. 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 부위는 항체 불변 도메인, CH2-CH3 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 IgG 면역글로불린으로, 야생형 항체 Fc 영역에 비해 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 항체의 결합 친화도를 감소시키는, 항원 결합 부위.
  37. 제36항에 있어서,
    IgG 면역글로불린이 야생형 IgG 면역글로불린과 비교하여 중쇄 불변 영역의 His310, His435, Ile253 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 항원 결합 부위.
  38. 제37항에 있어서,
    하나 이상의 아미노산 변형이 H310 및 H435에 상응하는 잔기에서의 아미노산 치환으로부터 선택되고, 바람직하게는 아미노산 치환이 H310 및 H435 잔기 둘 다에 존재하는, 항원 결합 부위.
  39. 제38항에 있어서,
    아미노산 치환이 His310Ala 및/또는 His435Gln인, 항원 결합 부위.
  40. 제30항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 부위가 활성화 Fc 감마 수용체에 대한 항체의 결합을 변형시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 IgG 면역글로불린이고, 바람직하게는 아미노산 변형이 Leu235에서 글루탐산으로의 변형인, 항원 결합 부위.
  41. 제30항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 부위가 Ser228에서의 힌지 안정화 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 바람직하게는 Ser228에서의 아미노산 변형은 프롤린으로의 변형인, 항원 결합 부위.
  42. (a) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체, 또는 제30항 내지 제41항 중 어느 한 항의 항원 결합 부위(상기 항체 또는 항원 결합 부위는 질병, 장애 또는 감염과 관련된 항원에 특이적으로 결합함)의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계;
    (b) 항체 또는 항원 결합 부위가 상기 항원이 발견되는 상기 대상체의 부위에 농축되도록 하는 단계; 및
    (c) 상기 항체 또는 항원 결합 부위를 검출하는 단계;
    이로써, 백그라운드 또는 표준 수준 이상의 상기 항체 또는 항원 결합 부위의 검출은 대상체가 상기 질병 장애 또는 감염을 가짐을 나타내는 것을 포함하는, 대상체에서 질병, 장애 또는 감염을 진단, 모니터링 또는 예측하는, 생체내 방법.
  43. 제42항에 있어서,
    항체 또는 항원 결합 부위가 방사성표지에 접합되고, 바람직하게는 여기서 방사성표지가
    악티늄-225 (225Ac), 아스타틴-211 (211At), 비스무트-212 및 비스무트-213 (212Bi, 213Bi), 구리-64 및 구리-67 (64Cu, 67Cu), 갈륨-67 및 갈륨-68 (67Ga 및 68Ga), 인듐-111 (111In), 요오드-123, -124, -125 또는 -131 (123I, 124I, 125I, 131I), 바람직하게는 (124I), 납-212 (212Pb), 루테튬-177 (177Lu), 라듐-223 (223Ra), 사마륨-153 (153Sm), 스칸듐-44 및 스칸듐-47 (44Sc, 47Sc), 스트론튬-90 (90Sr), 테크네튬-99 (99mTc), 이트륨-86 및 이트륨-90 (86Y, 90Y), 지르코늄-89 (89Zr)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  44. 제43항에 있어서,
    방사성표지가 갈륨-67 및 갈륨-68 (67Ga 및 68Ga), 요오드-124 (124I) 및 지르코늄-89 (89ZR)으로부터 선택되는, 방법.
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