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KR20220041839A - 종양 침윤 림프구 치료요법 및 이의 용도 - Google Patents

종양 침윤 림프구 치료요법 및 이의 용도 Download PDF

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KR20220041839A
KR20220041839A KR1020227003064A KR20227003064A KR20220041839A KR 20220041839 A KR20220041839 A KR 20220041839A KR 1020227003064 A KR1020227003064 A KR 1020227003064A KR 20227003064 A KR20227003064 A KR 20227003064A KR 20220041839 A KR20220041839 A KR 20220041839A
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KR
South Korea
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cells
cancer
slam
cell
tumor
Prior art date
Application number
KR1020227003064A
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English (en)
Inventor
니콜라 케이 프라이스
존 스티븐 브릿지먼
Original Assignee
인스틸 바이오 유케이 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 인스틸 바이오 유케이 리미티드 filed Critical 인스틸 바이오 유케이 리미티드
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Abstract

본 발명은 양자 세포 치료요법에서 유용한 바이오마커에 관한 것이다. 해당 바이오마커는 CD150 이며, 다르게는 SLAM 또는 SLAMF1 로 불린다. 본원에서 출원인들은 종양 침윤 림프구 주입 생성물 상의 CD150 발현이 이들 환자에서 나타난 반응률과 상관관계가 있다는 것을 입증한다. 높은 CD150 발현은 완전 반응으로 넘어가는 환자에서 발견되며 낮은 발현은 치료요법에 반응하지 않는 환자에서 발견된다. 본 발명은 치료에 대해 반응률을 예측하거나 환자를 계층화하기 위한 바이오마커의 용도에 관한 것이다. 이는 또한 일반적으로, 효능을 증가시키려는 노력으로 T-세포 집단에서의 수용체의 과발현 또는 CD150 을 발현하는 세포의 단리를 포함하지만 이에 제한되지 않는 양자 세포 치료 양생법에서의 이러한 수용체의 이용을 포함한다.

Description

종양 침윤 림프구 치료요법 및 이의 용도
관련 출원 및 참조에 의한 통합
본 출원은 2019 년 7 월 24 일에 출원한 GB 특허 출원 일련 번호 GB1910605.3 및 2019 년 7 월 24 일에 출원한 미국 가출원 일련 번호 62/878,001 에 대한 우선권을 주장하며, 이 각각은 본원에 그 전문이 참조로 포함된다.
2019 년 1 월 23 일에 출원한 국제 특허 출원 일련 번호 PCT/GB2019/050188 및 2018 년 1 월 23 일에 출원한 GB1801067.8 을 참조한다.
전술한 출원, 및 상기 출원에 또는 상기 출원의 절차 중에 인용된 모든 문헌 ("출원 인용 문헌") 및 상기 출원 인용 문헌에 인용되거나 참조된 모든 문헌, 및 본원에서 인용되거나 참조된 모든 문헌 ("본원 인용 문헌") 및 본원 인용 문헌에 인용되거나 참조된 모든 문헌은, 본원에 언급되거나 본원에 참조로 포함된 임의의 문헌에 언급된 임의의 제품에 대한 임의의 제조사의 지침서, 설명서, 제품 명세서 및 제품 시트와 함께, 본원에 참조로 포함되어 있으며, 본 발명의 실행에 사용될 수 있다. 더 구체적으로, 모든 참조된 문헌은, 마치 각각의 개별 문헌을 참조로 포함하는 것으로 특정적으로 그리고 개별적으로 나타내는 것과 동일한 정도로 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL) 를 포함하는 T-세포로의 치료 이후의 암의 예후 분야에 관한 것이다. 예후는 종양 침윤 림프구를 포함하는 T-세포에 의해 발현되는 생물학적 마커의 정량화를 기반으로 한다. 본 발명은 또한 TIL 치료요법을 포함하는 T-세포 치료요법의 치료 효능을 향상시키기 위한 생물학적 마커의 이용 및/또는 조작에 관한 것이다.
암 퇴행을 매개하기 위해 자기유래 T-세포를 사용하는 양자 세포 치료요법 (ACT) 은 초기 임상 시험에서 많은 가능성을 보여주었다. 생체외에서 확장시킨 자연 발생 종양 반응성 또는 종양 침윤 림프구/종양 연관 림프구 (TIL) 의 사용과 같은 몇몇 일반적인 접근법이 선택되었다. 추가로, T-세포는 정해진 종양 항원을 향해 그들을 재표적화시키기 위해 유전적으로 변형될 수 있다. 이는 펩티드 (p)-주요 조직적합성 복합체 (MHC) 특이적 T-세포 수용체 (TCR) 의 유전자 전달; 또는 종양 특이적 단일 사슬 항원 단편 (scFv) 과 T-세포 신호전달 도메인 (예를 들어, CD3ζ) 사이의 합성 융합체를 통해 달성될 수 있고, 후자는 키메라 항원 수용체 (CAR) 로 불린다. TIL 및 TCR 전달은 흑색종을 표적화하는 경우 특히 효과적인 것으로 증명된 한편 (Rosenberg et al., 2011; Morgan et al., 2006), CAR 치료요법은 특정 B-세포 악성 종양의 치료에서 많은 가능성을 보여주었다 (Grupp et al., 2013).
종양 침윤 림프구 치료요법은 위암 (Xu et al., 1995), 신장암 (Figlin et al., 1997; Goedegebuure et al., 1995), 자궁경부암 (Stevanovic et al., 2015) 및 결장직장암 (Gardini et al., 2004) 을 포함하는 다수의 상이한 악성 종양에 적용되었으나, 흑색종 치료요법에서 가장 광범위하게 적용되며 가장 많은 발전 및 가능성을 나타내었다. 진행된 전이성 흑색종에서의 시험은 15-20% 완전 반응 (치유) 과 함께 약 50% 반응률을 일관되게 나타내었다 (Rosenberg et al., 2011; Dudley et al., 2010). 추가로, 종양 연관 림프구는 복수로부터 수득될 수 있으며 TIL 과 동일한 방식으로 성장할 수 있다.
TIL 생성 과정은 유전자-변형된 T-세포에 비해 더 낮은 비용 및 개선된 기술 혁신을 제공하지만; 그 과정이 더 어려우며 성장을 최적화하기 위해 더 높은 정도의 사용자 기술을 필요로 한다. 현재의 방법론에서, 종양 생검이 환자로부터 채취되고 실험실 환경으로 전달된다. TIL 생성을 위한 두 가지 선택사항이 존재한다: i) 종양을 약 1-2 mm3 의 작은 단편으로 절단하고 24-웰 조직 배양 플레이트의 개별 웰에 시딩하거나; ii) 종양을 효소적으로 소화시키고 생성된 단일 세포 현탁액을 24-웰 조직 배양 플레이트에서 배양한다. 두 경우 모두에서, TIL 은 이어서 3000 IU/ml 초과의 IL-2 와 함께 2-3 주 동안 배양되고, 그 후 이들은 조사된 피더 세포로 2 주 확장을 거쳐, 주입을 위한 일반적으로 1x1010 초과의 세포가 수득된다. 확장 단계 동안, 환자는 사전조건형성 (preconditioning) 화학요법 (전형적으로 시클로포스파미드 및 플루다라빈) 을 받고, 세포 주입시 TIL 생착을 향상시키기 위해 지지성 IL-2 치료를 받는다.
임의의 치료적 개입으로, 혼합된 환자 반응이 존재하며, 치료의 개선의 일부로서 그 후 목표는 어떤 환자가 주어진 치료로부터 명백한 이익을 나타낼 것인지를 결정하는 것이다. 면역요법제는 예외는 아니며, 고전적인 예로서 사전-치료 평균 적혈구 헤모글로빈 농도는 TroVax 백신접종의 결과를 예측하는 것으로 나타났고 (Harrop et al., 2012), PDL1 발현은 항-PD1 치료요법으로의 치료로부터 더 많은 이익을 나타내는 환자를 정의하는데 사용되었다 (Topalian et al. 2012). 흑색종에서의 TIL 치료요법이 약 50% 의 반응률을 가지므로, 치료로부터 가장 많은 이익을 얻을 환자를 예측할 수 있는 마커를 발견하는 것이 유리할 것인데, 특히 TIL 과 함께 사용되는 작용제가 잠재적으로 매우 독성이기 때문이다 (IL-2 및 사전조건형성 화학요법). 이를 위해, 효과기 기억 T-세포에 농화된 TIL 생성물은 보다 양호한 환자 반응을 보인다는 것이 제안되었다 (Radvanyi et al., 2015). 또한, TIL 에서의 BTLA 발현은 TIL 주입 후 양호한 예후와 상관관계가 있었다 (Radvanyi et al., 2012; Haymaker et al., 2015).
Mehrle et al, 2008 은 유전자 침묵화 또는 과발현에 의해 활성화된 림프구에서 CD150 및 SAP 둘 모두를 조절하는 효과를 기재하고 있다. Mehrle 은 사이토카인을 사용하는 종양 반응성 T 세포에서의 CD150 발현의 조절을 기재하지 않는다.
Browning at al, 2004 는 진행 중인 동종반응성 (예를 들어, 이식편대숙주 질환) 또는 자가면역성이 있는 환경에서 사용하기 위한 동종활성화된 CD4+25+ 에 대한 마커로서 CD150 을 기재하고 있다.
WO2017/179015 는 태반-유사 콘드로이틴 술페이트 A (pl-CSA) 에 선택적으로 결합할 수 있는 표적 결합 도메인을 갖는 키메릭 항원 수용체를 개시하고 있으며, 종양 반응성 T 세포 집단을 제조하는 방법에 관한 것은 아니다.
본 출원에서 임의의 문헌의 인용 또는 확인은 이러한 문헌이 본 발명에 대한 선행 기술로서 이용가능하다는 것을 인정하는 것은 아니다.
발명의 개요
본원에서 제공되는 본 발명은 주입 후 성공적인 치료와 상관관계가 있으며 따라서 이러한 마커를 발현하는 TIL 집단이 개선된 임상 반응률과 연관됨에 따라 증가된 종양 반응성을 나타내는 것으로 보이므로 예후의 마커로서 사용될 수 있는 세포 표면 마커에 관한 것이다.
본 발명은 또한 유전자-변형된 T-세포를 이용하는 치료요법을 포함하는 TIL 및 다른 T-세포 치료요법을 개선시키기 위해 이 수용체가 이용될 수 있는 방법을 기재한다.
본 발명자들은 T-세포 주입 (TIL 주입) 후 성공적인 치료와 상관관계가 있는 세포 표면 마커: 신호전달 림프구 활성 분자 (SLAM/SLAMF1/SLAM 패밀리 멤버 1/CD150/CDw150/IPO-3 로도 공지됨; 인간 아미노산 서열, 하기 참조: NCBI 참조 서열: NP_003028.1; CD150 에 대한 상이한 용어, 예를 들어 SLAM/SLAMF1 은 본원에서 상호교환가능하게 사용됨) 를 식별하였고, 따라서 마커는 T-세포 (예를 들어 TIL) 가 종양 반응성일 가능성이 있다는 것을 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 종양 반응성 T 세포는 종양 상의 항원에 특이적인 T-세포 수용체 (TCR) 를 보유하는 T 세포를 의미한다. 예를 들어, T 세포는 종양 세포에 대해 세포독성 활성을 갖는다. 현재, 어떠한 메커니즘에 의해 이러한 종양 반응성 증가가 발생하는지는 알려져 있지 않으며, 예를 들어, 이는 SLAM 발현 집단에서 증대된 종양 세포 사멸을 통한 것일 수 있고/있거나, 예를 들어, SLAM 발현은 종양 미세환경에서 세포 생존 및 지속성을 개선할 수 있다. 본 발명은 유전자-변형된 T-세포를 이용하는 치료요법을 포함하는 TIL 치료요법 및 T-세포를 사용하는 다른 치료요법을 개선시키기 위해 이 수용체가 이용될 수 있는 방법에 관한 것이다.
제 1 양태에서, 종양 반응성 T-세포가 농화된 T 세포 집단과 같은 세포 집단을 수득하는 방법이 본원에서 제공되며, 여기서 CD150/SLAM/SLAMF1 을 발현하는 T-세포가 선택되고 임의로 확장된다. 따라서, CD150/SLAM/SLAMF1 을 발현하는 세포는 T-세포 집단 (예를 들어, 유전자 변형된 T-세포) 또는 다른 세포 유형의 적은 비율을 포함하는 T 세포 집단 (예를 들어, TIL 집단) 과 같은 세포의 벌크 집단에서 선택될 수 있다.
CD150/SLAM/SLAMF1 을 발현하는 T-세포는 환자로부터 유래하는 세포 (예를 들어, 종양 생검, 림프절, 복수로부터의 TIL 세포) 에서 선택될 수 있다. 구현예에서, CD150/SLAM/SLAMF1 을 발현하는 T-세포의 선택은 (i) 유세포 분석, (ii) 항체 패닝, (iii) 자기 선택, (iv) 바이오마커 표적화 세포 농화 중 하나 이상을 포함한다. 선택은 세포 집단을 항-CD150/SLAM/SLAMF1 항체와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 그 후, 선택된 세포는 분리되고, 집단에 존재하는 CD150/SLAM/SLAMF1 양성(+ve) 세포의 수가 농화되도록 확장될 수 있다.
본원에서 제공된 구현예에서, 생물학적 마커 CD150/SLAM/SLAMF1 을 발현하는 TIL 은 다음의 옵션 중 하나 또는 둘 모두에 의해 확장된다:
a.항체 또는 공동자극 수용체에 의해 유도된 T-세포 활성화 신호 및 공동자극을 제공하기 위해 조사된 피더 세포로의 확장; 및/또는
b.하나 이상의 생물학적 마커를 통해 유도된 T-세포 활성화 신호 및 공동자극 신호를 제공하는 고정화된 또는 가용성 시약으로의 확장.
본원에 제공된 구현예에서, 세포 집단은 i) 종양 생검, 림프절 또는 복수로부터의 종양 침윤 림프구 (TIL) 의 집단; 및/또는 ii) 유전자 변형된 T-세포, 예를 들어 CAR 및/또는 TCR 및/또는 다른 외인성 핵산을 발현하도록 조작된 T-세포의 집단에서 선택된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본원에서 제공된 임의의 방법에 따라 수득된 종양 반응성 T-세포가 농화된 세포의 집단이 본원에서 제공된다. 이러한 집단은 TIL 집단 또는 집단 유전자 변형된 T-세포로 시작하여 수득될 수 있고, 예를 들어 본원에 제공된 임의의 방법을 사용하여, 상기 집단에서 CD150/SLAM/SLAMF1 양성 (+ve) 세포를 선택하고 임의로 농화시킬 수 있다.
종양 반응성 T-세포가 농화된 세포 (예컨대 TIL 또는 유전자 변형된 T-세포) 의 집단이 또한 본원에서 제공되며, 여기서 T-세포 또는 TIL 의 25% 초과가 생물학적 마커 CD150/SLAM/SLAMF1 을 발현하거나, T-세포 또는 TIL 의 30% 초과, 35% 초과 또는 40% 초과가 생물학적 마커 CD150/SLAM/SLAMF1 을 발현한다.
구현예에서, 생물학적 마커 CD150/SLAM/SLAMF1 이 농화된 TIL 의 집단이 제공된다. 한 구현예에서, 생물학적 마커 CD150/SLAM/SLAMF1 이 농화된 TIL 의 집단은 본원에 기재된 방법에 따라 수득된다. 일부 구현예에서, TIL 은 흑색종으로부터 유래할 수 있다.
T 세포 (TIL 집단으로부터 수득한 T-세포 포함) 는 외인성 핵산으로부터 CD150/SLAM/SLAMF1 을 발현하거나 과발현하도록 조작될 수 있다. 이러한 방식으로 CD150/SLAM/SLAMF1 을 발현 또는 과발현시키는 것은 조작된 T 세포의 종양 반응성을 증가시킬 수 있다. 한 구현예에서, CD150/SLAM/SLAMF1 을 인코딩하는 제 1 외인성 핵산을 포함하는 T-세포가 본원에서 제공된다. T-세포는 키메라 항원 수용체 (CAR) 및/또는 T-세포 수용체 (TCR) 및/또는 다른 단백질을 인코딩하는 제 2 외인성 핵산을 추가로 포함할 수 있다.
적합하게는, T-세포는 CD4+ 또는 CD8+ 세포이다. 일부 구현예에서, T-세포는 기억 세포이다.
특정 구현예에서, T 세포 집단의 확장은 특정 하위집단, 보다 특히 CD150/SLAM/SLAMF1 을 발현하는 세포의 하위집단의 확장을 선호하는 조건을 제공하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 중심 기억의 확장이 선호된다. 한 구현예에서, 중심 기억의 확장은 중심 기억 CD4+ 세포의 확장을 선호하거나 이를 포함한다. 한 구현예에서, 중심 기억의 확장은 중심 기억 CD8+ 세포의 확장을 선호하거나 이를 포함한다. 중심 기억의 비제한적 척도는 CD62L+/CD45RO+ 를 발현하는 확장된 세포의 비율이다. 한 구현예에서, 효과기 기억의 확장이 선호된다. 한 구현예에서, 효과기 기억의 확장은 효과기 기억 CD4+ 세포의 확장을 선호하거나 이를 포함한다. 한 구현예에서, 효과기 기억의 확장은 효과기 기억 CD8+ 세포의 확장을 선호하거나 이를 포함한다. 효과기 기억의 비제한적 척도는 CD62L-/CD45RO+ 를 발현하는 확장된 세포의 비율이다.
특정 구현예에서, T 세포 집단의 확장은 효과기 기능을 조절하는 조건을 제공하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, IL-2 및 IL-12 가 제공되고, 확장된 T 세포 집단은 IL-2 단독에 비해 증가된 비율의 CD4+ 세포 및/또는 CD4+/CD8+ 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, IL-7 및/또는 IL-15 에는 IL-2 및 IL-12 가 제공되고, 확장된 T 세포 집단은 IL-2 단독에 비해 증가된 비율의 CD4+ 세포 및/또는 CD4+/CD8+ 세포를 포함한다.
특정 구현예에서, IL-2 및 IL-12 가 제공되고, 확장된 T 세포 집단은 증가된 비율의 중심 기억 T 세포를 포함한다. 이러한 특정 구현예에서, 효과기 기억 세포의 비율이 감소된다. 특정 구현예에서, IL-7 및/또는 IL-15 에는 IL-2 및 IL-12 가 제공되고, 확장된 T 세포 집단은 증가한 비율의 중심 기억 T 세포를 포함한다. 이러한 특정 구현예에서, 효과기 기억 세포의 비율이 감소된다.
특정 구현예에서, IL-2 및 IL-12 가 제공되고, 확장된 T 세포 집단은 증가된 비율의, IFNγ 을 발현하는 CD8+ 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, IL-7 및/또는 IL-15 에는 IL-2 및 IL-12 가 제공되고, 확장된 T 세포 집단은 증가한 비율의, IFNγ 을 발현하는 CD8+ 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, IL-2 및 IL-12 가 제공되고, 확장된 T 세포 집단은 증가한 비율의, TNFα 를 발현하는 CD8+ 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, IL-7 및/또는 IL-15 에는 IL-2 및 IL-12 가 제공되고, 확장된 T 세포 집단은 증가한 비율의, TNFα 를 발현하는 CD8+ 세포를 포함한다.
특정 구현예에서, T 세포 집단은 IL-7 + IL-15, IL-2 + IL-7 + IL-15, IL-2 + IL-12, IL-2 + IL-18, IL-2 + IL-12 + IL-7 + IL-15, IL-2 + IL-12 + IL-7 + IL-15 + IL-6, IL-2 + IL-12 + IL-7 + IL-15 + IL21, IL-2 + IL-12 + IL-7 + IL-15 + IL-6 + IL-21, IL-7 + IL-15 + IL-6, IL-7 + IL-15 + IL-21, IL-7 + IL-15 + IL-6 + IL-21, IL-2 + IL-12 + IL-6, IL-2 + IL-12 + IL-21, 또는 IL-2 + IL-12 + IL-6 + IL-21 을 제한없이 포함하는 사이토카인의 조합으로 확장된다.
특정 구현예에서, T 세포 집단은 제한없이, αIL-4 와 같은 Th2 차단 시약으로 확장된다. 비제한적 예는 IL-7+ IL-15 + αIL-4, IL-2 + IL-7 + IL-15 + αIL-4, IL-2 + IL-12 + αIL-4, IL-2 + IL-18 + αIL-4, IL-2 + IL-12 + IL-7 + IL-15 + αIL-4, IL-2 + IL-12 + IL-7 + IL-15 + IL-6 + αIL-4, IL-2 + IL-12 + IL-7 + IL-15 + IL21 + αIL-4, IL-2 + IL-12 + IL-7 + IL-15 + IL-6 + IL-21 + αIL-4, IL-7 + IL-15 + IL-6, IL-7 + IL-15 + IL-21 + αIL-4, IL-7 + IL-15 + IL-6 + IL-21 + αIL-4, IL-2 + IL-12 + IL-6 + αIL-4, IL-2 + IL-12 + IL-21 + αIL-4, 또는 IL-2 + IL-12 + IL-6 + IL-21 + αIL-4 를 포함한다.
IL-12 및 다른 사이토카인을 포함하는 사이토카인의 조합이 존재하는 특정 구현예에서, IL-12 는 확장 기간의 초기 부분에 존재하지만, 확장 기간의 후반 부분에는 존재하지 않는다. 예를 들어, IL-2, IL-12, IL-7 및 IL-15 를 포함하는 사이토카인 조합이 존재하는 특정 구현예에서, IL-12 는 초기에 존재한 다음 스위치아웃될 수 있다. 이러한 특정 구현예에서, IL-7 및/또는 IL-15 는 IL-12 가 스위치아웃될 때 첨가된다. 이러한 특정 구현예에서, IL-7 및/또는 IL-15 는 확장 동안 내내 존재한다.
구현예에서, 치료요법에서 사용하기에 적합한 본 발명의 확장된 세포 집단은 109 이상의 세포를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 치료요법에서 사용하기에 적합한 본 발명의 확장된 세포 집단은 5 x 109 이상의 세포를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 치료요법에서 사용하기에 적합한 본 발명의 확장된 세포 집단은 1010 이상의 세포를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, CD150/SLAM/SLAMF1 을 발현하는 T-세포, 예컨대 TIL 또는 유전자 변형된 T-세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서의 질환을 치료하는 방법이 본원에서 제공된다. 또한, 세포 집단으로부터 세포를 이를 필요로 하는 암 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암 치료에 사용하기 위한 종양 반응성 T-세포의 농화되고 확장된 세포 집단이 제공되며, 여기서 세포 집단은 CD150/SLAM/SLAMF1 을 발현하는 세포 집단을 확인 및/또는 수득하고 세포 집단을 확장하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조된다. TIL 은 대상체로부터 유래하는 세포의 선택 및 확장에 의해 CD150/SLAM/SLAMF1 이 농화된 TIL 의 집단일 수 있거나, TIL 은 CD150/SLAM/SLAMF1 을 발현하도록 조작된 TIL 또는 다른 T-세포일 수 있다. 대상체는 전형적으로 인간이다. 치료 방법은 적합하게는 양자 세포 치료요법이고; T-세포는 자기유래 또는 동종이계일 수 있다. 질환은 적합하게는 암, 예를 들어 흑색종, 또는 난소암 또는 자궁경부암이다.
추가 양태는 본원에 교시된 바와 같은 단리된 면역 세포 또는 세포 집단을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또한, CD150/SLAM/SLAMF1 을 발현하도록 조작된 T-세포를 포함하는 CD150/SLAMF/SLAMF1 을 발현하는 종양 반응성 T-세포가 농화된 세포의 집단을 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제, 및 임의로는 하나 이상의 추가의 약학적 활성 폴리펩티드 및/또는 화합물과 함께 포함하는 정맥내 주입에 적합한 약학 조성물이 본원에서 제공된다.
또한, SLAM/SLAMF1/CD150 을 발현하는 세포 집단 내의 T-세포를 정량하는 것을 포함하는, 세포 집단의 종양 반응성을 평가하는 방법이 본원에서 제공된다. 적합하게는, 세포 집단은 i) 환자로부터의 TIL 및 SLAM/SLAMF1/CD150 을 발현하는 T-세포가 사전-REP 및/또는 사후-REP 로 정량되는 것이거나; ii) 외인성 CAR 및/또는 TCR 을 발현하도록 조작된 T-세포의 집단일 수 있다. SLAM/SLAMF1/CD150 의 발현 수준을 평가할 때, T-세포/TIL 집단에서 SLAM/SLAMF1/CD150 을 발현하는 T-세포의 적어도 25% 는 상기 세포 집단이 종양 반응성임을 나타낸다.
본 발명의 양태 및 실시예를 또한 하기에서 기재한다.
본원에 기재된 발명은 암에 대한 종양 침윤 림프구 (TIL) 치료요법을 받을 수 있는 환자의 예후 및 보다 최적의 TIL 생성물을 생성하기 위한 신규한 방법을 개발하기 위한 이들 예후 마커의 이용을 위한 시험관내 방법에 관한 것이며; 방법은 하기 단계를 포함한다:
i) 상기 환자로부터의, 생산 동안 TIL 생성물 또는 종양 소화의 샘플에서, TIL 상의 적어도 하나의 생물학적 마커 (SLAM/CD150) 를 정량하는 단계로서, 정량화는 상기 생물학적 마커 (SLAM/CD150) 를 발현하는 세포의 비율인 단계.
ii) 상기 적어도 하나의 생물학적 마커에 대해 단계 i) 에서 수득한 값을 동일한 생물학적 마커에 대한 선결 참조 값과 비교하는 단계로서; 선결 참조 값은 상기 암의 진행의 특이적 예후와 상관관계가 있는 것인 단계.
iii) 상기 바이오마커(들) 를 발현하는 세포의 농화를 기반으로 하여, 생산 전, 동안 또는 이후에 벌크 TIL 집단으로부터 세포를 단리하는 단계.
iv) 상기 생물학적 마커를 T-세포에서 과발현시켜 생성물의 치료 효능을 개선시키는 단계.
또한, TIL 생성물에 대한 방출 시험으로서 TIL 상의 상기 적어도 하나의 생물학적 마커의 사용이 예상된다.
화학물질, 항체, 다른 세포, 단백질, 지질, 또는 다른 정의되지 않은 메커니즘 또는 방법을 사용하여 상기 생물학적 마커의 발현을 증가, 향상, 또는 유도하기 위해 T-세포 집단을 조작하는 방법이 추가로 제공된다.
방법의 일부 구현예에서, 단계 i) 은 유세포 분석에 의해 하나 이상의 생물학적 마커를 정량하는 것으로 이루어진다.
방법의 일부 다른 구현예에서, 단계 i) 은 전체 종양 조직 샘플에서 유전자 발현 분석에 의해 상기 생물학적 마커를 정량하는 것으로 이루어진다.
방법의 일부 다른 구현예에서, 단계 i) 은 전체 종양 조직 샘플의 면역조직화학에 의한 상기 생물학적 마커의 정량화로 이루어진다.
방법의 일부 구현예에서, 단계 iii) 은 유세포 분석 분류를 사용하여 바이오마커(들) 를 발현하는 세포를 단리하는 것으로 이루어진다.
방법의 일부 다른 구현예에서, 단계 iii) 은 Miltenyi MACS 분리, StemCell Technologies 자성 분리 기술 또는 유세포 분석 분류를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는 일부 다른 형태의 물리적 분리 기법을 사용하여 바이오마커(들) 를 발현하는 세포를 단리하는 것으로 이루어진다.
방법의 일부 다른 구현예에서, 단계 iii) 은 바이오마커를 통한 공동자극이 유도되도록 T-세포 활성화의 자극과 조합으로 이러한 바이오마커와 결합하는 항체 또는 가용성 수용체 단백질을 사용하는 것과 같은 유사분열 자극 과정의 일부 형태를 통해 바이오마커(들) 를 발현하는 세포를 농화하는 것으로 이루어진다.
따라서, 본 발명의 목적은 출원인이 권리를 보유하도록 임의의 이전에 공지된 생성물, 그 생성물의 제조 공정, 또는 그 생성물의 사용 방법을 본 발명 내에 포함시키지 않으며, 이에 의하여 임의의 이전에 공지된 생성물, 공정, 또는 방법의 권리 포기를 개시한다. 출원인(들) 이 권리를 보유하고 이에 의해 이미 기재된 임의의 생성물, 생성물의 제조 공정 또는 생성물의 사용 방법의 포기를 개시하는, USPTO (35 U.S.C. §112, 제 1 단락) 또는 EPO (EPC 제 83 조) 의 명시적 기재 및 실시 가능 요건을 충족시키지 않는, 이미 개시된 임의의 생성물, 생성물 제조 공정 또는 생성물 사용 방법을 본 발명의 범위 내에 포함시키는 의도가 아님이 추가로 주목된다. 본 출원의 계보 또는 임의의 다른 계보 또는 임의의 제 3 자의 임의의 선출원에서 출원인의 임의의 등록 특허(들) 의 주제인 임의의 구현예를 명시적으로 포기하기 위한 모든 권리는 명시적으로 보류된다. 본원에서 어떤 것도 가능성으로 해석되지 않는다.
이러한 개시물 및 특히 청구항 및/또는 단락에서, 용어 예컨대 "포함하다", "포함된", "포함하는" 등은 미국 특허법에서 그에 부여하는 의미를 가질 수 있다는 것을 주의하며, 예를 들어 이들은 "포괄하다", "포괄되는", "포괄하는" 등을 의미할 수 있고; 용어 예컨대 "본질적으로 이루어지는" 및 "본질적으로 이루어지다" 는 미국 특허법에서 이들에 부여하는 의미를 가지며, 예를 들어 이들은 요소를 명백하게 인용하지 않는 것을 허용하지만, 선행 기술에서 발견되거나 본 발명의 기본 또는 신규 특징에 영향을 미치는 요소는 배제한다.
이들 및 다른 구현예는 하기 상세한 설명에 개시되어 있거나 이로부터 명백 해지고 이에 의해 포함된다.
하기의 상세한 설명은 예로서 제공되나, 단독으로 기재된 특정 구현예에 본 발명을 제한하려는 의도가 아니며, 첨부된 도면과 함께 최고로 이해될 수 있다.
도 1 - TIL 생산 과정. 현재 TIL 치료요법은 결정적으로 2 개의 개별 현장에 의존적이다. 임상 현장에서 종양은 절제되며, 종양이 분리되고 T-세포가 플레이트에서 IL-2 를 사용하여 성장되는 제 2 현장 (생산 현장) 에 보내진다. 대략 2 주 후, 세포를 신속 확장 프로토콜 (REP) 에 투입하여 세포를 >1x1010 수로 성장시킨다. REP 동안 환자는 사전조건형성 화학요법을 거친다. 사후-REP TIL 최종 생성물은 재주입된 T-세포를 지지하기 위해 정맥내 IL-2 와 함께 환자에게 복귀된다.
도 2 - SLAM 측정을 위한 예시적 유세포 분석 염색 게이팅 전략. 사전- 또는 사후-REP TIL 을 하기 항체로 염색하고:
고정가능 생존력 염료 eFluor 450, αCD45RO FITC, αCD8 PE Vio770, αCD4 APC Cy7, αCD62L APC; 이어서, mIgG1 PE 및 αSLAM PE 의 어느 한 쌍으로 대조염색하였다. 세포를 MACSQuant 분석기 상에서 획득하였다. 나타낸 게이팅 전략을 사용하여 MACSQuantify 소프트웨어를 사용하여 분석을 수행하였다.
도 3A - TIL 사전- 및 사후-신속 확장 프로토콜 (REP) 에서의 SLAM/CD150 의 발현. 사후-REP TIL 을 하기로 염색하고:
고정가능 생존력 염료 eFluor 450, αCD45RO FITC, αCD8 PE Vio770, αCD4 APC Cy7, αCD62L APC; 이어서 mIgG1 PE 또는 αSLAM PE 의 어느 한 쌍으로 대조염색하였다. 세포를 MACSQuant 분석기 상에서 획득하였다. MACSQuantify 소프트웨어를 사용하여 분석을 수행하였다. SLAM+ 세포의 비율을 각각의 CD4+ 또는 CD8+ 집단에서 결정하고, Graphpad 소프트웨어를 사용하여 플롯팅하였다. 세 그래프 모두에 대해, 환자는 임상 반응 (진행성 질환, 안정한 질환 및 응답자) 에 의해 계층화되고, 표시된 반응률은 고형 종양 (RECISTv 1.1) 측정에서 반응 평가 기준에 의해 결정된 바와 같이 환자에 의해 달성된 최상의 반응이다 (Schwartz et al. Eur J Cancer 2016 참조) * P < 0.05. 나타낸 세 그래프 모두에 대해, 평균 +/- SEM 을 각각의 세포 및 환자 아형에 대해 플롯팅한다. 2원 ANOVA, 이후 사이닥 (Sidak) 다중 비교 시험을 사용하여 유의성을 결정하였다. 상단 그래프 (최종 생성물 (CD4+)) 에 대해, 기억: PD vs R, **p = 0.009. 하단 그래프 (최종 생성물) 에 대해, CD4: PD vs SD, *p = 0.037; PD vs R, **p = 0.004; CD8: PD vs R, **p = 0.008.
도 3B - TIL 사전- 및 사후-신속 확장 프로토콜 (REP) 에서의 SLAM/CD150 의 발현. 사후-REP TIL 을 하기로 염색하고:
고정가능 생존력 염료 eFluor 450, αCD45RO FITC, αCD8 PE Vio770, αCD4 APC Cy7, αCD62L APC; 이어서 mIgG1 PE 및 mIgG1 eFluor 710 동형 대조군 또는 αSLAM PE 및 αGITR eFluor 710 의 어느 쌍으로 대조염색하였다. 세포를 MACSQuant 분석기 상에서 획득하였다. MACSQuantify 소프트웨어를 사용하여 분석을 수행하였다. SLAM+ 세포의 비율을 각각의 CD4+ 또는 CD8+ 집단에서 결정하고, Graphpad 소프트웨어를 사용하여 플롯팅하였다. (A - C) 모든 흑색종 아형으로부터의 사전-REP 및 사후-REP TIL 에서의 SLAM 발현; A) 모든 CD4+ 및 CD8+ T-세포에서의 SLAM 발현; B) 나이브 [N], 기억 [M] 및 효과기 [E] CD4+ TIL 에서의 SLAM 발현; C) 나이브 [N], 기억 [M] 및 효과기 [E] CD8+ TIL 에서의 SLAM 발현; (D - F) 임상 반응에 의해 계층화된 피부 흑색종 환자로부터의 CD4+ 및 CD8+ TIL 에서의 SLAM 발현; D) CD4+ 및 CD8+ TIL 상에서의 SLAM 발현; E) CD4+ T-세포 서브세트에서의 SLAM 발현 및 F) CD8+ 서브세트에서의 SLAM 발현. 흑색 원형 (Closed circle) = 진행성 질환, 백색 삼각형 (open triangle) = 안정한 질환, 백색 사각형 (open square) = 응답자. 나타낸 반응률은 고형 종양 (RECISTv 1.1) 측정에서 반응 평가 기준에 의해 결정된 바와 같이 환자에 의해 달성된 최상의 반응이다 (Schwartz et al. Eur J Cancer 2016 참조) * P < 0.05.
도 4 - SLAM 발현과 상관관계가 있는 환자의 카플란-마이어 생존 곡선 - 환자의 전체 생존 시간을 2 개 군으로 플로팅한다: 제 1 그래프 (A)에서 고 SLAM 처리됨 (25% 초과 SLAM 양성 CD4 T-세포를 갖는 환자) 및 저 SLAM 처리됨 (25% 미만 SLAM 양성 T-세포를 갖는 환자); 및 제 2 그래프 (B) 에서 고 SLAM 처리됨 (40% 초과 SLAM 양성 CD4 T-세포를 갖는 환자) 및 저 SLAM 처리됨 (40% 미만 SLAM 양성 T-세포를 갖는 환자).
도 5 - SLAM 분류된 세포에서의 생존력 및 사이토카인 반응 - 2 공여자 최종 생성물, TIL032 및 TIL054 로부터의 TIL 을 고 SLAM 및 저 SLAM 집단에 대해 흐름 분류하였다. 배양 24 시간 후 생존력을 평가하고 (A) 세포를 그의 각각의 매치된 자기유래 종양 세포주와 혼합하고 유세포 분석을 사용하여 사이토카인 반응을 측정하였다 (B).
도 6 - SLAM siRNA - SLAMF1 siRNA (siRNA) 또는 미처리 세포 (대조군) 으로 76 시간 처리 후 SLAMF1 을 Raji, 결장직장 TIL (MRIBB011) 및 흑색종 TIL (TIL032) 에서 qPCR (A) 또는 유세포 분석 (B) 에 의해 측정하였다.
도 7 - SLAM 과발현 - SLAM 발현 카세트를 인간 SLAMF1 서열, 2A 절단 서열 및 인간 세포질 도메인 절두형 CD19 서열을 EF1α 프로모터의 다운스트림에 클로닝하여 생성하였다 (A). Jurkat JRT3-T3.5 세포를 SLAMF1 및 절두형 CD19 유전자를 함유하는 렌티바이러스 입자의 적정 농도로 형질도입하고 유세포 분석에 의해 발현을 분석하였다 (B).
도 8, A)-E): TIL 표현형에 대한 신속 확장 프로토콜 동안 사이토카인 조건형성의 효과 - 4 별개 공여자로부터의 TIL 을 표시된 사이토카인 조건 하에 14 일 동안 혼합 조사 연막 피더로 확장한 후, TIL 계수를 수행하고 CD4+, CD8+, 중심 기억 및 효과기 기억 표현형을 유세포 분석을 사용하여 결정하였다.
도 9, A)-F): SLAM 발현에 대한 신속 확장 프로토콜 동안 사이토카인 조건형성의 효과 - 4 별개 공여자로부터의 TIL 을 표시된 사이토카인 조건 하에 14 일 동안 혼합 조사 연막 피더로 확장한 후, SLAM 발현을 유세포 분석을 사용하여 결정하였다.
도 10, A)-E): TIL 표현형에 대한 신속 확장 프로토콜 동안 정제된 사이토카인 조건형성의 효과 - 4 별개 공여자로부터의 TIL 을 표시된 사이토카인 조건 하에 14 일 동안 혼합 조사 연막 피더로 확장한 후, TIL 계수를 수행하고 CD4+, CD8+, 중심 기억 및 효과기 기억 표현형을 유세포 분석을 사용하여 결정하였다.
도 11, A)-F): SLAM 발현에 대한 신속 확장 프로토콜 동안 정제된 사이토카인 조건형성의 효과 - 4 별개 공여자로부터의 TIL 을 표시된 사이토카인 조건 하에 14 일 동안 혼합 조사 연막 피더로 확장한 후, SLAM 발현을 유세포 분석을 사용하여 결정하였다.
도 12, A)-D): CD8+ TIL 효과기 활성에 대한 신속 확장 프로토콜 동안 정제된 사이토카인 조건형성의 효과 - 4 별개 공여자로부터의 TIL 을 표시된 사이토카인 조건 하에 14 일 동안 혼합 조사 연막 피더로 확장한 후, TIL 을 K562 발현 멤브레인 결합 OKT3 분자로 자극하고 효과기 활성 (CD107a, TNFα, IFNγ 및 IL-2) 을 CD8+ 집단에서 유세포 분석에 의해 정량하였다.
도 13, A)-D): CD8- TIL 효과기 활성에 대한 신속 확장 프로토콜 동안 정제된 사이토카인 조건형성의 효과 - 4 별개 공여자로부터의 TIL 을 표시된 사이토카인 조건 하에 14 일 동안 혼합 조사 연막 피더로 확장한 후, TIL 을 K562 발현 멤브레인 결합 OKT3 분자로 자극하고 효과기 활성 (CD107a, TNFα, IFNγ 및 IL-2) 을 CD8- 집단에서 유세포 분석에 의해 정량하였다.
도 14: CD4+, CD8+, CD4-/CD8- 또는 CD4+/CD8+ 인 세포의 부분에 대한 REP 및 외성장 동안 사이토카인 선택의 효과. 9 공여자로부터의 TIL 을 3000 IU/ml IL-2 (●), IL-2 및 초기 25 ng/ml IL-12 (■), 또는 IL-2 및 초기 IL-12 에서 확장시킨 후 10 ng/ml IL-7 및 10 ng/ml IL-15 (▲) 로 스위치하였다.
도 15: 중심 기억 (CD45RO+/CD62L+), 효과기 기억 (CD45RO+/CD62L-), 또는 효과기 세포로서 표현형화되는 세포의 부분에 대한 REP 및 외성장 동안 사이토카인 선택의 효과. 9 공여자로부터의 TIL 을 3000 IU/ml IL-2 (●), IL-2 및 초기 25 ng/ml IL-12 (■), 또는 IL-2 및 초기 IL-12 에서 확장시킨 후 10 ng/ml IL-7 및 10 ng/ml IL-15 (▲) 로 스위치하였다.
도 16A- B: OKT3 발현 K562 세포와 동시배양된 TIL 에 대한 REP 및 외성장 동안 사이토카인 선택의 효과. 5 공여자로부터의 TIL 을 3000 IU/ml IL-2 (●), IL-2 및 초기 25 ng/ml IL-12 (■), 또는 IL-2 및 초기 IL-12 에서 확장시킨 후 10 ng/ml IL-7 및 10 ng/ml IL-15 (▲) 로 스위치하였다. 확장된 TIL 을 OKT3 발현 K562 세포와 동시배양하고, (A) CD8+ 및 (B) CD8- 세포 집단 내에서 IFNγ, TNFα, IL-2 또는 CD107a 의 생성에 대해 평가하였다.
도 17A- B: 자기유래 종양 세포주와 동시배양된 TIL 에 대한 REP 및 외성장 동안 사이토카인 선택의 효과. 3 공여자로부터의 TIL 을 3000 IU/ml IL-2 (●), IL-2 및 초기 25 ng/ml IL-12 (■), 또는 IL-2 및 초기 IL-12 에서 확장시킨 후 10 ng/ml IL-7 및 10 ng/ml IL-15 (▲) 로 스위치하였다. 확장된 TIL 을 매치된 자기유래 종양 세포주와 동시배양하고, (A) CD8+ 및 (B) CD8- 세포 집단 내에서 IFNγ, TNFα, IL-2 또는 CD107a 의 생성에 대해 평가하였다.
발명의 상세한 설명
본 출원인과 발명자는 Nicola Kaye Price 와 John Stephen Bridgeman 을 발명자로서 Immetacyte Limited 에 의해 2019 년 1 월 23 일에 출원한 국제 출원 일련 번호 PCT/GB2019/050188 를 인지하고, 동의하며 참조한다 ("'188 출원"). '188 출원은 이전에 출원되었으나 본 출원에 대해서는 공개되지 않으며, 미국 이외의 목적을 위해, 본 발명은 '188 출원의 이러한 상태에 대한 특허가능성 요건을 충족한다. 미국과 관련하여, 35 USC § 102(b)(1) 은 청구된 발명의 유효 출원일 1 년 이내에 이루어진 개시가, 상기 개시가 발명자 또는 공동 발명자에 의해 이루어진 경우 청구된 발명에 관한 35 USC § 102(a)(1) 에 따른 선행 기술이 아님을 규정하고 있으며, 35 USC § 102(b)(2) 는 주제가 발명자 또는 공동 발명자로부터 직접 또는 간접적으로 개시되거나 획득된 경우 청구된 발명에 관한 35 USC § 102(a)(2) 에 따른 선행 기술이 아님을 규정하고 있다. 35 USC § 102(b)(2)(C) 는 청구된 발명의 유효 출원일 이전에 개시된 주제 및 청구된 발명이 동일인에게 소유되거나 동일인에게 양도 의무가 있는 경우 미국 특허, 미국 특허 출원 공개 또는 WIPO 공개 출원에서의 개시가 35 USC § 102(a)(2) 에 따른 청구된 발명에 대해 선행 기술이 아님을 규정하고 있다. 본 출원인과 발명자는 특히 37 CFR § 1.130 에 따른 서술 또는 귀속을 규정하고 있고, 이로써 '188 출원 및 본 출원의 내용에 친숙하며 발명자로서 이에 언급된 Nicola Kaye Price 와 John Stephen Bridgeman 가 '188 출원에 대한 발명자이므로, 즉 '188 출원에서의 개시가 본 발명자 또는 공동 발명자에 의해 이루어졌으므로 미국 법 하에 '188 출원이 선행 기술로서 이용가능하지 않다는 것을 미국 법에 따른 위증죄 처벌에 따라 인식하고, 동의하고, 고지하고 선언한다. 또한, Immetacyte Limited 가 '188 출원을 소유하고 있고 본 출원의 소유자이므로 '188 출원 및 본 출원은 공동 소유권을 포함한다.
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 면역 세포, 예를 들어 종양 반응성, 예를 들어 T 세포는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 한 구현예에서, 종양에 침윤된 TIL 또는 T 세포가 단리된다. TIL 또는 T 세포는 수술 중에 제거될 수 있다. TIL 또는 T 세포는 생검에 의해 종양 조직 제거 후 단리될 수 있다. TIL 또는 T 세포는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 단리될 수 있다. 한 구현예에서 방법은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 종양 샘플로부터 TIL 또는 T 세포의 벌크 집단을 수득하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, TIL 또는 T 세포의 벌크 집단은 그로부터 특정 세포 집단이 선택될 수 있는 세포 현탁액에 종양 샘플을 분리함으로써 종양 샘플로부터 수득될 수 있다. TIL 또는 T 세포의 벌크 집단을 수득하는 적합한 방법은 종양을 기계적으로 분리 (예를 들어, 민싱), 종양을 효소적으로 분리 (예를 들어, 소화), 및 흡인 (예를 들어, 바늘과 같이) 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
종양 샘플은 임의의 포유동물로부터 수득될 수 있다. 달리 언급되지 않는 한, 본원에서 사용되는 용어 "포유동물" 은 토끼목, 예컨대 토끼; 고양이과 (고양이) 및 개과 (개) 를 포함하는 식육목; 소과 (소) 및 돼지과 (돼지) 를 포함하는 우제목; 또는 말과 (말) 를 포함하는 말목의 포유동물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 임의의 포유동물을 지칭한다. 포유동물은 영장목, 세보이드 (Ceboid) 또는 시모이드 (Simoid) 목 (원숭이) 의, 또는 유인원목 (인간 및 유인원) 의 비-인간 영장류일 수 있다. 일부 구현예에서, 포유동물은 설치목의 포유동물, 예컨대 마우스 및 햄스터일 수 있다. 바람직하게는, 포유동물은 비-인간 영장류 또는 인간이다. 특히 바람직한 포유동물은 인간이다. 종양 샘플은 본원에서 설명하는 바와 같은 임의 유형의 암으로부터의 것일 수 있다. 한 구현예에서, 종양은 난소암, 폐암 또는 흑색종이다.
종양 반응성 T 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 골수, 림프절 조직, 비장 조직 및 종양을 포함하는 다수의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 세포는 피콜 (Ficoll) 분리와 같은 당업자에게 공지된 임의의 수의 기법을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 수득될 수 있다. 한 바람직한 구현예에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 혈액 성분채집술 (apheresis) 또는 백혈구 성분채집술에 의해 수득된다. 혈액 성분채집술 생성물은 전형적으로 림프구, 예컨대 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 함유한다. 한 구현예에서, 혈액 성분채집술에 의해 수집된 세포를 세척하여 혈장 분획을 제거하고 후속 처리 단계를 위해 적절한 완충제 또는 배지에 세포를 넣을 수 있다. 발명의 한 구현예에서, 세포는 인산완충식염수 (PBS) 로 세척되며, 대안적 구현예에서, 세척 용액은 칼슘이 결핍되고 마그네슘이 결핍될 수 있거나 모두는 아니더라도 많은 이가 양이온이 결핍될 수 있다. 칼슘의 부재 하의 초기 활성화 단계는 확대된 활성화를 초래한다. 당업자라면 세척 단계가 당업자에게 공지된 방법에 의해, 예컨대 제조사 지시사항에 따라 반자동화 "관류 (flow-through)" 원심분리기 (예를 들어, Cobe 2991 세포 처리기) 를 사용하여 달성될 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 세척 후, 세포는 다양한 생체적합성 완충제, 예를 들어 Ca-불포함, Mg-불포함 PBS 에 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 혈액 성분채집술 샘플의 바람직하지 않은 성분은 제거될 수 있으며 세포는 배양 배지에 직접 재현탁된다.
또 다른 구현예에서, 적혈구 세포를 용해시키고 예를 들어 PERCOLLTM 구배를 통한 원심분리에 의해 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 림프구로부터 종양 반응성 T 세포를 단리한다. T 세포의 특정 하위집단, 예컨대 CD28+, CD4+, CDC, CD45RA+ 및 CD45RO+ T 세포는 양성 또는 음성 선택 기법에 의해 더 단리될 수 있다. 예를 들어 한 바람직한 구현예에서, 원하는 T 세포의 양성 선택에 충분한 시간 기간 동안 항-CD3/항-CD28 (즉, 3 x 28)-접합 비드, 예컨대 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T, 또는 XCYTE DYNABEADSTM 와 함께 인큐베이션하여 T 세포를 단리한다. 한 구현예에서, 시간 기간은 약 30 분이다. 추가 구현예에서, 시간 기간은 30 분 내지 36 시간 또는 그 이상의 범위 및 그 사이의 모든 정수 값이다. 추가 구현예에서, 시간 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 시간이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 시간 기간은 10 내지 24 시간이다. 한 바람직한 구현예에서, 인큐베이션 시간 기간은 24 시간이다. 백혈병 환자로부터 T 세포를 단리하기 위해, 24 시간과 같은 더 긴 인큐베이션 시간의 사용은 세포 수율을 증가시킬 수 있다. 더 긴 인큐베이션 시간은 다른 세포 유형에 비해 T 세포가 적은 임의의 상황에서, 예를 들어 종양 조직으로부터 또는 면역손상된 개체로부터 종양 침윤 림프구 (TIL) 를 단리하는 데 사용될 수 있다. 또한, 더 긴 인큐베이션 시간의 사용은 CD8+ T 세포의 포획 효율을 증가시킬 수 있다. T 세포는 나중의 사용을 위해 동결보존되고 냉동될 수 있다. 허용가능한 저장 기간은 결정 및 검증될 수 있으며 최대 6 개월, 최대 1 년 또는 그 이상일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 종양 침윤 세포 (TIL) 는 예를 들어 단편화된, 절개된, 또는 효소 소화된 종양 생검 또는 덩어리에 의해 종양으로부터 단리 및/또는 확장된다. TIL 은 출발 물질로서 종양 생검을 사용하는 2 단계 방법으로 생성될 수 있다: 단계 1 (일반적으로 2-3 시간에 걸쳐 수행됨) 로서, 절개, 효소 소화 및 균질화를 사용하여 종양 물질을 초기 수집 및 처리하여, 후속 생산을 위한 출발 물질이 안정화되도록 직접 동결보존될 수 있는 단일 세포 현탁액을 생성하는 단계, 및 수일 또는 수년 후에 발생할 수 있는 단계 2. 단계 2 를 4 주에 걸쳐 수행할 수 있고, 이는 단계 1 의 생성물의 해동 및 종양 출발 물질로부터의 TIL 의 성장 (약 2 주) 으로 시작하여, 이후 TIL 세포의 신속 확장 과정 (약 2 주) 이 이어져, 세포의 양 및 그에 따른 용량이 증가되는 연속 과정일 수 있다. TIL 은 세포의 액체 현탁액으로서 제형화 전에 농축 및 세척될 수 있다. 예시적인 TIL 제제는 2019 년 12 월 20 일에 출원한 출원인의 미국 특허 출원 일련 번호 62/951,559 에 기재되어 있다.
음성 선택에 의한 T 세포 집단의 농화는 음성 선택된 세포에 고유한 표면 마커에 유도된 항체의 조합으로 달성될 수 있다. 바람직한 방법은 음성 자기 면역부착 또는 유세포 분석을 통한 세포 분류 및/또는 선택이며 이는 음성 선택된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 유도된 단일클론 항체의 칵테일을 사용한다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 농화하기 위해, 단일클론 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8 에 대한 항체를 포함한다.
또한, 단핵구 집단 (즉, CD14+ 세포) 은 항-CD14 코팅된 비드 또는 컬럼을 포함하는 다양한 방법, 또는 제거를 용이하게 하기 위한 이들 세포의 식세포 활성의 활용에 의해 혈액 제제로부터 고갈될 수 있다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명은 식세포성 단핵구에 의해 삼켜지기에 충분한 크기의 상자성 입자를 사용한다. 특정 구현예에서, 상자성 입자는 시판 비드, 예를 들어 상표명 DynabeadsTM 으로 Life Technologies 에 의해 제조된 것들이다. 한 구현예에서, 다른 비-특이적 세포는 상자성 입자를 "무관한" 단백질 (예를 들어 혈청 단백질 또는 항체) 로 코팅하여 제거된다. 무관한 단백질 및 항체는 단리될 T 세포를 특이적으로 표적화하지 않는 이들 단백질 및 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 무관한 비드는 양 항-마우스 항체, 염소 항-마우스 항체, 및 인간 혈청 알부민으로 코팅된 비드를 포함한다.
요약하면, 이러한 단핵구의 고갈은, 전혈, 부착된 말초혈, 또는 종양으로부터 단리된 T 세포를, 단핵구의 제거를 허용하는 임의의 양 (대략 20:1 비드:세포 비) 의 하나 이상의 다양한 무관한 또는 비-항체 커플링된 상자성 입자와 함께 약 30 분 내지 2 시간 동안 22 내지 37℃ 에서 예비인큐베이션한 후, 상자성 입자에 부착되거나 삼켜진 세포를 자기 제거함으로써 수행된다. 이러한 분리는 당업계에서 이용가능한 표준 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 시판되는 다양한 것들, DYNAL® Magnetic Particle Concentrator (DYNAL MPC®) 를 포함하는 임의의 자기 분리 방법이 사용될 수 있다. 필요한 고갈의 보증은 고갈 전 및 후에 CD14 양성 세포의 유세포 분석을 포함하는, 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 모니터링될 수 있다.
양성 또는 음성 선택에 의한 원하는 세포 집단의 단리를 위해, 세포 및 표면 (예를 들어, 비드와 같은 입자) 의 농도가 변경될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포와 비드의 최대 접촉을 보장하기 위해, 비드와 세포가 함께 혼합되는 부피를 상당히 감소시키는 (즉, 세포의 농도를 증가시키는) 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어 한 구현예에서, 20 억 세포/ml 의 농도가 사용된다. 한 구현예에서, 10 억 세포/ml 의 농도가 사용된다. 추가 구현예에서, 1 억 세포/ml 초과의 세포가 사용된다. 추가 구현예에서, 1 천만, 1 천 500 만, 2 천만, 2 천 500 만, 3 천만, 3 천 5 백만, 4 천만, 4 천 500 만 또는 5 천만 세포/ml 의 농도가 사용된다. 또 다른 구현예에서, 7 천 500 만, 8 천만, 8 천 500 만, 9 천만, 9 천 500 만 또는 1 억 세포/ml 의 농도가 사용된다. 추가 구현예에서, 1 억 2500 만 또는 1 억 5000 만 세포/ml 의 농도가 사용될 수 있다. 높은 농도의 사용은 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 확장을 증가시킬 수 있다. 또한, 높은 세포 농도의 사용은 CD28-음성 T 세포와 같은 관심대상 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포, 또는 많은 종양 세포가 존재하는 샘플 (즉, 백혈병 혈액, 종양 조직 등) 로부터 더욱 효율적인 포획을 허용한다. 이러한 세포 집단은 치료적 가치를 가질 수 있고, 수득하기에 바람직할 것이다. 예를 들어, 높은 농도의 세포를 사용하는 것은 통상적으로 더 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포의 보다 효율적인 선택을 가능하게 한다.
관련 구현예에서, 더 낮은 농도의 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. T 세포와 표면 (예를 들어, 비드와 같은 입자) 의 혼합물을 상당히 희석시킴으로써, 입자와 세포 사이의 상호작용이 최소화된다. 이는 입자에 결합될 원하는 항원을 다량으로 발현하는 세포를 선택한다. 예를 들어, CD4+ T 세포는 더 높은 수준의 CD28 을 발현하며, 희석 농도에서 CD8+ T 세포보다 더 효율적으로 포획된다. 한 구현예에서, 사용된 세포의 농도는 5 x 106/ml 이다. 다른 구현예에서, 사용된 농도는 약 1 x 105/ml 내지 1 x 106/ml, 및 그 사이의 임의의 정수 값일 수 있다.
T 세포는 또한 동결될 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 동결 및 후속 해동 단계는 세포 집단에서 과립구 및 어느 정도 단핵구를 제거함으로써 보다 균일한 생성물을 제공한다. 혈장 및 혈소판을 제거하기 위한 세척 단계 후에, 세포는 동결 용액에 현탁될 수 있다. 많은 동결 용액 및 매개변수가 당업계에 공지되어 있고, 이러한 맥락에서 유용할 것이지만, 한 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS, 또는 다른 적합한 세포 동결 배지를 사용하는 것을 포함하며, 이어서 세포를 분당 1° 의 속도로 -80℃ 로 동결시키고 액체 질소 저장 탱크의 증기상으로 저장한다. -20℃ 또는 액체 질소에서 즉시 제어되지 않은 동결 뿐만 아니라 다른 제어되는 동결 방법이 사용될 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 T 세포는 또한 항원-특이적 T 세포일 수 있다. 예를 들어, 종양-특이적 'I' 세포를 사용할 수 있다. 특정 구현예에서, 항원-특이적 T 세포는 관심대상 환자, 예컨대 암 또는 감염성 질환으로 고통받는 환자로부터 단리될 수 있다. 한 구현예에서, 네오에피토프는 대상체에 대해 결정되고, 이들 항원에 특이적인 T 세포가 단리된다. 확장에 사용하기 위한 항원-특이적 세포는 또한 예를 들어 미국 특허 공개 번호 US 20040224402 (발명의 명칭: Generation And Isolation of Antigen-Specific T Cells), 또는 미국 특허 번호 6,040,177 에 기재된 바와 같은 당업계에 공지된 임의 수의 방법을 사용하여 시험관내 생성될 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 항원-특이적 세포는 또한 예를 들어 Current Protocols in Immunology, 또는 Current Protocols in Cell Biology (둘 모두 John Wiley & Sons, Inc., Boston, Mass. 에 의해 출판됨) 에서 기재된 바와 같은 당업계에 공지된 임의 수의 방법을 사용하여 생성될 수 있다.
관련 구현예에서, 하나 또는 두 라운드의 확장 전 또는 후에 항원 특이적 세포를 (예를 들어, 자기 선택을 통해) 분류하거나 그렇지 않으면 양성으로 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 항원-특이적 세포의 분류 또는 양성 선택은 펩티드-WIC 사량체를 사용하여 실행될 수 있다 (Altman, et al., Science. 1996 Oct. 4; 274(5284):94-6). 또 다른 구현예에서 적응가능한 사량체 기술 접근방식이 사용된다 (Andersen et al., 2012 Nat Protoc. 7:891-902). 사량체는 이전 가설을 기반으로 하는 예측된 결합 펩티드를 이용해야 할 필요성 및 특이적 HLA 에 대한 제약에 의해 제한된다. 펩티드-WIC 사량체는 당업계에 공지된 기법을 사용하여 생성될 수 있고, 본원에 기재된 바와 같이 임의의 관심 WIC 분자 및 임의의 관심 항원으로 만들어질 수 있다. 이러한 맥락에서 사용되는 특이적 에피토프는 당업계에 공지된 수많은 어세이를 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드가 WIC 클래스 I 에 결합하는 능력은 125I 표지된 β2-마이크로글로불린 (32m) 의 WIC 클래스 I/β2m/펩티드 이종삼량체성 복합체 내로의 통합을 촉진하는 능력을 모니터링함으로써 간접적으로 평가될 수 있다 (Parker et al., J. Immunol. 152:163, 1994 참조).
한 구현예에서, 세포는 유세포 분석에 의한 단리를 위해 에피토프-특이적 시약으로 직접 표지된 후 표현형 및 TCR 의 특징분석이 이어진다. 한 구현예에서, T 세포는 T 세포 특이적 항체를 접촉시킴으로써 단리된다. 항원-특이적 T 세포, 또는 일반적으로 본 발명의 임의의 세포의 분류는 MoFlo 분류기 (DakoCytomation, Fort Collins, Colo.) FACSAriaTM, FACSArrayTM, FACSVantageTM, BDTM LSR II 및 FACSCaliburTM (BD Biosciences, San Jose, Calif.) 를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 다양한 시판 세포 분류기를 사용하여 실행될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 방법은 또한 CD3 을 발현하는 세포를 선택하는 단계를 포함한다. 방법은 임의의 적합한 방식으로 세포를 특이적으로 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 선택하는 것은 유세포 분석을 사용하여 실행된다. 유세포 분석은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 실행될 수 있다. 유세포 분석은 임의의 적합한 항체 및 균주를 이용할 수 있다. 바람직하게는, 항체는 선택되는 특정 바이오마커를 특이적으로 인식하고 이에 결합하도록 선택된다. 예를 들어, CD3, CD8, TIM-3, LAG-3, 4-1BB 또는 PD-1 의 특이적 선택은 각각 항-CD3, 항-CD8, 항-TIM-3, 항-LAG-3, 항-4-1BB 또는 항-PD-1 항체를 사용하여 실행될 수 있다. 항체 또는 항체들은 비드 (예를 들어, 자기 비드) 또는 플루오로크롬에 접합될 수 있다. 바람직하게는, 유세포 분석은 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 이다. T 세포 상에서 발현되는 TCR 은 자기유래 종양에 대한 반응성을 기반으로 하여 선택될 수 있다. 또한, 종양에 반응성인 T 세포는 본원에 그 전체가 참고로 포함되는 특허 공개 번호 WO2014133567 및 WO2014133568 에 기재된 방법을 사용하여 마커를 기반으로 선택될 수 있다. 또한, 활성화된 T 세포는 CD107a 의 표면 발현을 기반으로 하여 선택될 수 있다.
발명의 한 구현예에서, 방법은 농화된 세포 집단에서 T 세포의 수를 확장하는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 방법은 미국 특허 번호 8,637,307 에 기재되어 있으며 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. T 세포의 수는 적어도 약 3-배 (또는 4-, 5-, 6-, 7-, 8- 또는 9-배), 보다 바람직하게는 적어도 약 10-배 (또는 20-, 30-, 40-, 50-, 60-, 70-, 80- 또는 90-배), 보다 바람직하게는 적어도 약 100-배, 보다 바람직하게는 적어도 약 1,000-배, 또는 가장 바람직하게는 적어도 약 100,000-배 증가될 수 있다. T 세포의 수는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 확장될 수 있다. 세포 수 확장의 예시적 방법은 그 각각이 본원에 참조로 포함되는 특허 공개 번호 WO 2003057171, 미국 특허 번호 8,034,334 및 미국 특허 출원 공개 번호 2012/0244133 에 기재되어 있다.
한 구현예에서, 생체외 T 세포 확장은 TIL 또는 T 세포의 단리 및 후속적인 자극 또는 활성화 및 이후의 추가 확장에 의해 수행될 수 있다. 발명의 한 구현예에서, T 세포는 단일 작용제에 의해 자극되거나 활성화될 수 있다. 또 다른 구현예에서, T 세포는 2 개의 작용제로 자극되거나 활성화되는데, 하나는 1 차 신호를 유도하고, 두 번째는 공동자극 신호이다. 단일 신호를 자극하거나 1 차 신호 및 2 차 신호를 자극하는 부속 분자를 자극하는데 유용한 리간드가 가용성 형태로 사용될 수 있다. 리간드는 세포의 표면, 조작된 다가 신호전달 플랫폼 (Engineered Multivalent Signaling Platform (EMSP)) 에 부착되거나 표면 상에 고정될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 1 차 및 2 차 작용제 둘 모두는 표면, 예를 들어 비드 또는 세포 상에 공동-고정화된다. 한 구현예에서, 1 차 활성화 신호를 제공하는 분자는 CD3 리간드일 수 있고, 공동-자극 분자는 CD28 리간드 또는 4-1BB 리간드일 수 있다.
본 발명은 T-세포, 예를 들어 종양-침윤 림프구 (TIL) 의 샘플에 존재하는 T-세포에 관한 것이다. 특히, 이는 종양-반응성 T-세포가 농화된 TIL 의 집단과 같은 T-세포를 포함하는 세포 집단에 관한 것이다.
종양-침윤 림프구는 혈류를 떠나 종양으로 이동한 백혈구이다. 이들은 단핵 면역 세포이고, 상이한 유형의 세포 (즉, T-세포, B-세포, NK 세포, 대식세포) 의 다양한 비율의 믹스이며, T-세포는 가장 풍부한 세포이다. 이들은 종종 기질 및 종양 자체 내에서 발견될 수 있다.
TIL 은 종양 세포를 특이적으로 인식, 용해 및/또는 사멸시킬 수 있다. 종양에서 림프구의 존재는 종종 보다 양호한 임상 결과와 연관된다. 따라서, TIL 은 환자 내로의 재도입시 고형 종양에 침윤하는 그들의 능력에 의해 기능적으로 정의될 수 있다. TIL 은 일반적으로 세포 표면 마커를 사용하여 생화학적으로 또는 기능적으로 종양에 침윤하여 치료에 영향을 미치는 그들의 능력에 의해 정의될 수 있다. TIL 은 일반적으로 하기 바이오마커 중 하나 이상을 발현함으로써 분류될 수 있다: CD4, CD8, TCR αβ, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45Ra, CD95, PD-1 및 CD25.
T-세포 또는 T-림프구는 세포-매개 면역성에서 중심 역할을 갖는 림프구 유형이다. 이들은 세포 표면 상에 T-세포 수용체 (TCR) 의 존재에 의해서, 다른 림프구, 예컨대 B-세포 및 자연 살해 세포 (NK 세포) 와 구별될 수 있다. 하기에 요약되는 바와 같이, 다양한 유형의 T 세포가 존재한다.
세포독성 T-세포 (TC 세포, 또는 CTL) 는 바이러스 감염된 세포 및 종양 세포를 파괴하고, 또한 이식 거부에 연루된다. CTL 은 그들 표면에서 CD8 분자를 발현한다. 이들 세포는 모든 유핵 세포의 표면 상에 존재하는, MHC 클래스 I 과 연관된 항원과의 결합에 의해 그들 표적을 인식한다. IL-10, 아데노신 및 조절성 T-세포가 분비하는 다른 분자를 통해서, CD8+ 세포는 자가면역 질환 예컨대 실험적 자가면역 뇌척수염을 방지하는, 아네르기 상태로 불활성화될 수 있다.
기억 T-세포는 감염이 해결된 후에 장기간 동안 지속되는 항원-특이적 T-세포의 서브세트이다. 이들은 이들의 동족 항원에 재노출시에 다수의 효과기 T-세포로 신속하게 확장되어서, 과거 감염에 대한 "기억" 을 면역계에 제공한다. 기억 T-세포는 3 개 아형: 중심 기억 T-세포 (TCM 세포) 및 2 개 유형의 효과기 기억 T-세포 (TEM 세포 및 TEMRA 세포) 를 포함한다. 기억 세포는 CD4+ 또는 CD8+ 일 수 있다. 기억 T-세포는 전형적으로 세포 표면 단백질 CD45RO 를 발현한다.
이전에 억제제 T-세포로 공지된, 조절성 T-세포 (Treg 세포) 는 면역학적 내성의 유지를 위해 중요하다. 그들의 주요한 역할은 면역 반응의 종료 쪽으로 T-세포-매개 면역성을 정지시키고 흉선에서 음성 선택의 과정을 탈출하는 자가-반응성 T-세포를 억제하는 것이다.
CD4+ T 세포는 통상적으로 조절성 T (Treg) 세포 및 종래의 T 헬퍼 (Th) 세포로 나뉜다. 2 개 주요 클래스의 CD4+ Treg 세포 - 자연 발생 Treg 세포 및 적응성 Treg 세포가 기재된 바 있다.
자연 발생 Treg 세포 (CD4+CD25+FoxP3+ Treg 세포로도 알려짐) 는 흉선에서 발생되고 TSLP 에 의해 활성화된 골수성 (CD11c+) 및 형질세포양 (CD123+) 둘 모두의 수지상 세포와 발생된 T-세포 간 상호작용과 연관되었다. 자연 발생 Treg 세포는 FoxP3 이라고 불리는 세포내 분자의 존재에 의해 다른 T-세포와 구별될 수 있다.
적응성 Treg 세포 (Tr1 세포 또는 Th3 세포로도 알려짐) 는 정상 면역 반응 동안 기원될 수 있다.
자연 살해 세포 (또는 NK 세포) 는 선천성 면역계의 일부를 형성하는 세포용해성 세포 유형이다. NK 세포는 MHC 독립적 방식으로 바이러스 감염된 세포로부터의 선천적 신호에 신속한 반응을 제공한다.
NK 세포 (선천적 림프구 세포 군에 속함) 는 거대 과립성 림프구 (LGL) 로서 정의되고 B- 및 T-림프구를 생성시키는 공통 림프구 전구체로부터 분화된 제 3 종류의 세포를 구성한다.
본원에서 사용되는 용어 "면역 세포의 적어도 하나의 기능의 조절" 은, 비제한적인 예로서 T 세포 분화를 제어하는 네트워크를 조절하거나 다르게는 영향을 주는 것; T 세포 유지, 예를 들어 T 세포의 수명을 제어하는 네트워크를 조절하거나 다르게는 영향을 주는 것; T 세포 기능을 제어하는 네트워크를 조절하거나 다르게는 영향을 주는 것; 헬퍼 T 세포 (Th 세포) 분화를 제어하는 네트워크를 조절하거나 다르게는 영향을 주는 것; Th 세포 유지, 예를 들어 Th 세포의 수명을 제어하는 네트워크를 조절하거나 다르게는 영향을 주는 것; Th 세포 기능을 제어하는 네트워크를 조절하거나 다르게는 영향을 주는 것; Th17 세포 분화를 제어하는 네트워크를 조절하거나 다르게는 영향을 주는 것; Th17 세포 유지, 예를 들어 Th17 세포의 수명을 제어하는 네트워크를 조절하거나 다르게는 영향을 주는 것; Th17 세포 기능을 제어하는 네트워크를 조절하거나 다르게는 영향을 주는 것; 조절성 T 세포 (Treg) 분화를 제어하는 네트워크를 조절하거나 다르게는 영향을 주는 것; Treg 세포 유지, 예를 들어 Treg 세포의 수명을 제어하는 네트워크를 조절하거나 다르게는 영향을 주는 것; Treg 세포 기능을 제어하는 네트워크를 조절하거나 다르게는 영향을 주는 것; 다른 CD4+ T 세포 분화를 제어하는 네트워크를 조절하거나 다르게는 영향을 주는 것; 다른 CD4+ T 세포 유지를 제어하는 네트워크를 조절하거나 다르게는 영향을 주는 것; 다른 CD4+ T 세포 기능을 제어하는 네트워크를 조절하거나 다르게는 영향을 주는 것; 다른 CD8+ T 세포 분화를 제어하는 네트워크를 조절하거나 다르게는 영향을 주는 것; 다른 CD8T 세포 유지를 제어하는 네트워크를 조절하거나 다르게는 영향을 주는 것; 또는 다른 CD8+ T 세포 기능을 제어하는 네트워크를 조절하거나 다르게는 영향을 주는 것을 포함하는, 임의의 다양한 T 세포-관련 기능 및/또는 활성의 조절을 포함한다.
특정 성분에 관련되는 용어 "단리된" 은 일반적으로 그러한 성분이 그것의 자연 환경의 하나 이상의 다른 성분으로부터 -- 분리되어 존재하는 것 -- 예를 들어, 그로부터 분리되거나 제조되고/되거나 분리되어 유지된다는 것을 나타낸다. 보다 특히, 세포 또는 세포 집단과 관련되어 본원에서 사용되는 용어 "분리된" 는 이러한 세포 또는 세포 집단이 동물 또는 인간 신체의 일부를 형성하지 않는다는 것을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "면역 세포" 는 일반적으로 면역 반응에서 역할을 하는 조혈모세포로부터 유래된 임의의 세포를 포함한다. 면역 세포는 제한없이, 림프구, 예컨대 T 세포 및 B 세포, 항원-제시 세포 (APC), 수지상 세포, 단핵구, 대식세포, 자연 살해 (NK) 세포, 비만 세포, 호염기구, 호산구, 또는 호중구 뿐만 아니라 이러한 세포의 임의의 전구세포를 포함한다. 특정 바람직한 구현예에서, 면역 세포는 T 세포일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "T 세포" (즉, T 림프구) 는 흉선세포, 미성숙 T 세포, 성숙 T 세포 등을 포함하는 T 세포 계통 내의 모든 세포를 포함하는 것으로 의도된다. 용어 "T 세포" 는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포, T 헬퍼 (Th) 세포, 예를 들어, Th1, Th2 및 Th17 세포, 및 T 조절성 (Treg) 세포를 포함할 수 있다.
특정 보다 바람직한 구현예에서, 면역 세포는 세포독성 T 세포 또는 TC 로도 알려져 있는 CD8+ T 세포이다. CD8+ T 세포는 CD8 세포 표면 마커를 발현하는 T 세포이며, MHC 클래스 I 제시의 맥락에서 항원을 인식한다. CD8+ T 세포는 세포독성 활성을 가지며 IFN-감마 및 다른 사이토카인에 반응하여 증식한다. 클래스 I MHC 분자 및 동시-자극 분자에 의해 제시된 CD8+ T-세포 항원의 TCR 수용체에 대한 CD8+ T-세포의 결합은 세포독성 활성, 증식 및/또는 사이토카인 생성을 초래한다. 다른 구현예에서, 면역 세포는 CD4+ T 세포 (즉, CD4+ T 헬퍼 세포) 이다.
본원에서 사용되는 용어 "변형된" 은 광범위하게 면역 세포가 인공적인 분자- 또는 세포 생물학적 방법과 같은 인공적인 방법에 적용되거나 그에 의해 조작되어 면역 세포의 적어도 하나의 특징을 변형시키는 것을 나타낸다. 이러한 인공적인 방법은 예를 들어 시험관내 또는 생체외에서 수행될 수 있다.
용어 "변경된 발현" 은 면역 세포의 변형이 언급된 유전자(들) 또는 폴리펩티드(들) 의 발현을 변경, 즉 변화 또는 조절하는 것을 나타낸다. 용어 "변경된 발현" 은 상기 변경의 임의의 방향 및 임의의 규모를 포함한다. 따라서, "변경된 발현" 은 발현의 정성적 및/또는 정량적 변화(들) 를 반영할 수 있고, 구체적으로 발현의 증가 (예를 들어, 활성화 또는 자극) 또는 감소 (예를 들어, 억제) 둘 모두를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "증가되는" 또는 "증가시키는" 또는 "상향조절되는" 또는 "상향조절시키는" 은 일반적으로 고정적으로 상당한 양의 증가를 의미한다. 의심을 피하기 위해, "증가되는" 은 용어가 본원에서 정의되는 바와 같이, 참조 수준과 비교하여, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100% 또는 그 이상의 증가를 포함하는 적어도 10% 증가, 참조 수준과 비교하여 예를 들어 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 10-배 증가 또는 그를 초과하는 통계적으로 유의한 증가를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "감소되는" 또는 "감소시키는" 또는 "줄이는" 또는 "줄여지는" 또는 "하향조절되는" 또는 "하향조절시키는" 은 일반적으로 참조에 관하여 통계적으로 유의한 양만큼의 감소를 의미한다. 의심을 피하기 위해, "감소되는" 은 용어가 본원에서 정의되는 바와 같이, 참조 수준과 비교하여 적어도 10% 감소, 예를 들어 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 적어도 90% 또는 그 이상, 최대 100% 감소 (즉, 참조 샘플과 비교하여 부재 수준) 의 통계적으로 유의한 감소, 또는 참조 수준과 비교하여 10-100% 의 임의의 감소를 의미한다. 용어 "철폐" 또는 "철폐되는" 은 특히 참조 샘플과 비교하여 100% 감소, 즉 부재 수준을 나타낼 수 있다.
변형은 CD150/SLAM/SLAMF1 또는 본원에 교시된 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 변경된 발현 또는 활성을 포함하는 면역 세포를 생성할 수 있거나; 변형은 CD150/SLAM/SLAMF1 또는 본원에 교시된 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 변경된 발현 또는 활성을 포함하지 않지만 외부 신호에 반응하여 CD150/SLAM/SLAMF1 또는 본원에 교시된 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 변경된 발현 또는 활성을 나타내는 능력을 획득한 면역 세포를 생성할 수 있다. 따라서 후자의 세포는 유도가능하게 (즉, 신호, 보다 특히 외부 신호, 예컨대 외부 화학적, 생물학적 및/또는 물리적 신호에 반응하여) CD150/SLAM/SLAMF1 또는 본원에 교시된 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 또는 활성을 변경시킬 수 있는 작용제를 포함하도록 변형되었다.
따라서 특정 구현예에서, 변형은 면역 세포를 작용제에 노출시키거나 면역 세포를 작용제와 접촉시키거나 면역 세포 내에 CD150/SLAM/SLAMF1 또는 본원에 교시된 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 또는 활성을 변경시킬 수 있는 작용제를 도입함으로써, 면역 세포에서 CD150/SLAM/SLAMF1 또는 본원에 교시된 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 또는 활성이 변경되는 것을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 작용제 또는 이의 하나 이상의 요소는 유도성 제어 하에 있을 수 있다. 예를 들어, 면역 세포에 의한 작용제 또는 이의 하나 이상의 요소의 발현 및/또는 세포에서의 작용제 또는 이의 하나 이상의 요소의 활성은 유도성 제어 하에 있을 수 있다. 따라서, 면역 세포는 작용제 또는 이의 하나 이상의 요소의 발현 및/또는 활성과 같은 작용제 또는 이의 하나 이상의 요소를 조절하도록 구성되는 외부 신호에 반응하여 CD150/SLAM/SLAMF1 또는 본원에 교시된 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 변경된 발현 또는 활성을 나타내는 능력을 획득한다.
주어진 유전자 또는 폴리펩티드의 발현에 관련되는 몇몇 연속적인 분자 메커니즘 중 임의의 하나 이상은 본원에 의도된 바와 같은 면역 세포 변형에 의해 표적화될 수 있다. 제한없이, 이들은 유전자 서열의 표적화 (예를 들어, 유전자 서열의 폴리펩티드-인코딩, 비-코딩 및/또는 조절 부분의 표적화), 유전자의 RNA 로의 전사, 폴리아데닐화 및 적용가능한 경우 RNA 의 mRNA 로의 스플라이싱 및/또는 다른 전사후 변형, mRNA 의 세포 세포질로의 국부화, 적용가능한 경우 mRNA 의 다른 전사후 변경, mRNA 의 폴리펩티드 사슬로의 번역, 적용가능한 경우 폴리펩티드의 번역후 변형, 및/또는 폴리펩티드 사슬의 폴리펩티드의 성숙 형태로의 폴딩을 포함할 수 있다. 구분된 폴리펩티드, 예컨대 분비된 폴리펩티드 및 트랜스멤브레인 폴리펩티드의 경우, 이는 폴리펩티드의 표적화 수송, 즉 폴리펩티드가 적절한 하위 세포 구획 또는 소기관, 멤브레인, 예를 들어 원형질막으로, 또는 세포 외부로 수송되는 세포 메커니즘을 추가로 포함할 수 있다.
따라서, "변경된 발현" 은 특히 변형된 면역 세포에 의한 인용된 유전자 생성물의 변경된 생성을 나타낼 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "유전자 생성물(들)" 은 유전자로부터 전사된 RNA (예를 들어, mRNA), 또는 유전자에 의해 인코딩되거나 RNA 로부터 번역된 폴리펩티드를 포함한다.
또한, 본원에서 의도되는 "변경된 발현" 은 CD150/SLAM/SLAMF1 및/또는 본원에서 교시된 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 활성을 조절하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, "변경된 발현", "발현을 변경시키는", "발현을 조절하는" 또는 "발현을 검출하는" 또는 이와 유사한 것은 각각 "변경된 발현 또는 활성", "발현 또는 활성을 변경시키는", "발현 또는 활성을 조절하는" 또는 "발현 또는 활성을 검출하는" 또는 이와 유사한 것과 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 "조절하는" 또는 "조절하기 위한" 은 일반적으로 표적 또는 항원, 예를 들어 CD150/SLAM/SLAMF1 및/또는 본원에서 교시된 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 활성에 영향을 주고, 유리하게는 적합한 시험관내, 세포 또는 생체내 어세이를 사용하여 측정된 바와 같이 표적 또는 항원, 예를 들어 CD150/SLAM/SLAMF1 및/또는 본원에서 교시된 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 활성을 증가시키는 것을 의미한다. 특히, "조절하는" 또는 "조절하기 위한" 은 일반적으로, 적합한 시험관내, 세포 또는 생체내 어세이를 사용하여 측정된 바와 같이 (통상 관련된 표적 또는 항원에 따라 좌우될 것임), 동일한 조건 하에 그러나 본원에 기재된 억제제/길항제 또는 활성제/작용제의 부재 하에 동일한 어세이에서 표적 또는 항원의 활성과 비교하여 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 90% 또는 그 이상으로 표적 또는 항원, 예를 들어 CD150/SLAM/SLAMF1 및/또는 본원에 교시된 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 (관련 또는 의도된) 생물학적 활성을 증가시키는 것에 관한 것이다.
당업자에게 명백할 바와 같이, "조절하는" 은 또한 동일한 조건이지만 조절제의 부재 하인 것과 비교하여 그의 표적 중 하나 이상에 대해, 표적 또는 항원, 예를 들어, CD150/SLAM/SLAMF1 및/또는 본원에 교시된 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 친화도, 결합력, 특이성 및/또는 선택성의 변화 (증가 또는 감소일 수 있음) 를 달성하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 이는 임의의 적합한 방식으로 및/또는 표적에 따라 그 자체로 공지된 임의의 적합한 어세이를 사용하여 결정될 수 있다. 특히, 억제제/길항제 또는 활성제/작용제로서의 작용은 의도된 생물학적 또는 물리학적 활성이 각각, 동일한 조건이지만 억제제/길항제 또는 활성제/작용제의 부재 하에서 동일한 어세이에서의 생물학적 또는 물리학적 활성과 비교하여, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 90% 또는 그 이상 증가하거나 감소되게 하는 것일 수 있다. 조절은 또한 표적 또는 항원 또는 그것이 관여되는 메커니즘 또는 경로를 활성화시키는 것을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "작용제" 는 일반적으로 시스템, 보다 특히 생물학적 시스템, 예를 들어 세포, 조직, 기관 또는 유기체에서 원하는 효과를 달성할 수 있는 화학적 실체 또는 생물학적 생성물, 또는 화학적 실체 또는 생물학적 생성물의 조합과 같은 임의의 물질 또는 조성물을 지칭한다. 본 맥락에서, 작용제는 면역 세포에 노출되거나, 이와 접촉되거나, 이에 도입되어, 면역 세포의 적어도 하나의 특징을 변형, 예컨대 면역 세포에 의해 CD150/SLAM/SLAMF1 또는 본원에 교시된 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 또는 활성을 (유도가능하게) 변경시킬 수 있다. 또한 본 맥락에서, 작용제를 대상체에게 투여하여, 예를 들어 대상체의 면역 세포에 의해 CD150/SLAM/SLAMF1 또는 본원에 교시된 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 또는 활성을 (유도가능하게) 변경시킴으로써 질환 또는 병상을 치료 또는 예방 또는 조절할 수 있다.
화학적 실체 또는 생물학적 생성물은 바람직하게는 저분자량 화합물이지만, 반드시 저분자량 화합물일 필요는 없으나, 또한 변형된 및 미변형된 핵산 예컨대 안티센스 핵산, RNAi, 예컨대 siRNA 또는 shRNA, CRISPR-Cas 시스템, 펩티드, 펩티드모방체, 수용체, 리간드, 및 항체, 압타머, 폴리펩티드, 핵산 유사체 또는 이의 변이체를 포함하는, 주어진 상황에서 효과적인 더 큰 화합물 또는 임의의 유기 또는 무기 분자일 수 있다. 예는 단백질, 올리고뉴클레오티드, 리보자임, DNA자임, 당단백질, siRNA, 지질단백질, 압타머, 및 이의 변형 및 조합을 제한없이 포함하는 탄수화물, 아미노산 또는 핵산의 올리고머를 포함한다. 작용제는 화학물질; 소분자; 핵산 서열; 핵산 유사체; 단백질; 펩티드; 압타머; 항체; 또는 이의 단편을 포함하는 군에서 선택될 수 있다. 핵산 서열은 RNA 또는 DNA 일 수 있고, 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있으며, 관심 단백질을 인코딩하는 핵산, 올리고뉴클레오티드, 핵산 유사체, 예를 들어 펩티드-핵산 (PNA), 의사상보적 PNA (pc-PNA), 잠금 핵산 (LNA), 변형된 RNA (mod-RNA), 단일 가이드 RNA 등을 포함하는 군에서 선택될 수 있다. 예를 들어 이러한 핵산 서열은, 예를 들어 전사 억제제, 안티센스 분자, 리보자임으로서 작용하는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열, 작은 억제 핵산 서열, 예를 들어 비제한적으로 RNAi, shRNAi, siRNA, 마이크로 RNAi (mRNAi), 안티센스 올리고뉴클레오티드, CRISPR 가이드 RNA, 예를 들어 특이적 DNA 표적 서열에 대해 CRISPR 효소를 표적화하는 CRISPR 가이드 RNA 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 단백질 및/또는 펩티드 이의 단편은 임의의 관심 단백질, 예를 들어 비제한적으로: 돌연변이된 단백질; 치료적 단백질 및 절두형 단백질일 수 있으며, 여기서 단백질은 세포에서 보통 부재하거나 낮은 수준으로 발현된다. 단백질은 또한 돌연변이된 단백질, 유전적으로 조작된 단백질, 펩티드, 합성 펩티드, 재조합 단백질, 키메라 단백질, 항체, 미디바디, 미니바디, 트리아바디, 인간화 단백질, 인간화 항체, 키메라 항체, 변형된 단백질 및 이의 단편을 포함하는 군에서 선택될 수 있다. 대안적으로, 작용제는 세포 내로 핵산 서열의 도입 및 세포 내의 유전자의 핵산 및/또는 단백질 조절제의 생산을 초래하는 그의 전사의 결과로서 세포 내에서 세포내일 수 있다. 일부 구현예에서, 작용제는 합성 및 자연 발생 비-단백질성 실체를 비제한적으로 포함하는 임의의 화학물질, 실체 또는 모이어티이다. 특정 구현예에서 작용제는 화학 모이어티를 갖는 작은 분자이다. 작용제는 원하는 활성 및/또는 특성을 갖는 것으로 공지될 수 있거나, 다양한 화합물의 라이브러리로부터 선택될 수 있다.
RNAi 분자, 예를 들어 siRNA 또는 miRNA 의 활성과 관련하여 본원에서 사용되는 "유전자 침묵화" 또는 "유전자 침묵화된" 은 miRNA 또는 RNA 간섭 분자의 부재 하에 세포에서 발견된 mRNA 수준의 적어도 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 약 100% 의, 표적 유전자에 대한 세포에서의 mRNA 수준에서의 감소를 지칭한다. 한 바람직한 구현예에서, mRNA 수준은 적어도 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 약 100% 감소된다.
본원에서 사용되는 용어 "RNAi" 는 siRNAi, shRNAi, 내인성 microRNA 및 인공 microRNA 를 포함하나 이에 제한되지 않는, 임의 유형의 간섭 RNA 를 지칭한다. 예를 들어, 이는 RNA 의 다운스트림 프로세싱 메커니즘에 관계없이, siRNA 로서 이전에 확인된 서열을 포함한다 (즉, siRNA 가 mRNA 절단을 초래하는 생체내 프로세상의 특정 방법을 갖는 것으로 여겨지지만, 이러한 서열은 본원에 기재된 측면위치 서열의 맥락에서 벡터 내로 통합될 수 있음). 용어 "RNAi" 는 유전자 침묵화 RNAi 분자, 및 또한 유전자 발현을 활성화하는 RNAi 효과기 분자 둘 모두를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 "siRNA" 는 이중 가닥 RNA 를 형성하는 핵산을 지칭하며, 이중 가닥 RNA 는 표적 유전자와 동일한 세포에 존재하거나 발현될 때 유전자 또는 표적 유전자의 발현을 감소시키거나 억제하는 능력을 갖는다. 이중 가닥 RNA siRNA 는 상보적 가닥에 의해 형성될 수 있다. 한 구현예에서, siRNA 는 이중 가닥 siRNA 를 형성할 수 있는 핵산을 지칭한다. siRNA 의 서열은 전장 표적 유전자, 또는 이의 하위서열에 상응할 수 있다. 전형적으로, siRNA 는 적어도 약 15-50 개 뉴클레오티드 길이이다 (예를 들어, 이중 가닥 siRNA 의 각각의 상보적 서열은 약 15-50 개 뉴클레오티드 길이이고, 이중 가닥 siRNA 는 약 15-50 개 염기쌍 길이이고, 바람직하게는 약 19-30 개 염기 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 20-25 개 뉴클레오티드 길이이며, 예를 들어, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 개 뉴클레오티드 길이이다).
본원에서 사용되는 "shRNA" 또는 "작은 헤어핀 RNA" (스템 루프로도 불림) 는 siRNA 의 유형이다. 한 구현예에서, 이들 shRNA 는 짧은, 예를 들어 약 19 내지 약 25 개 뉴클레오티드, 안티센스 가닥, 이어서 약 5 내지 약 9 개 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 루프, 및 유사한 센스 가닥으로 구성된다. 대안적으로, 센스 가닥은 뉴클레오티드 루프 구조에 선행될 수 있으며 안티센스 가닥이 뒤이어질 수 있다.
용어 "microRNA" 또는 "miRNA" 는 본원에서 내인성 RNA 와 상호교환가능하게 사용되며, 이들 중 일부는 전사후 수준에서 단백질-코딩 유전자의 발현을 제어하는 것으로 알려져 있다. 내인성 microRNA 는 mRNA 의 생산적 이용을 조절할 수 있는 게놈에 자연적으로 존재하는 작은 RNA 이다. 용어 인공 microRNA 는 내인성 microRNA 이외의 임의 유형의 RNA 서열을 포함하며, 이는 mRNA 의 생산적 이용을 조절할 수 있다. MicroRNA 서열은 참조로 포함되는 Lim, et al., Genes & Development, 17, p. 991-1008 (2003), Lim et al Science 299, 1540 (2003), Lee and Ambros Science, 294, 862 (2001), Lau et al., Science 294, 858-861 (2001), Lagos-Quintana et al, Current Biology, 12, 735-739 (2002), Lagos Quintana et al, Science 294, 853-857 (2001), 및 Lagos-Quintana et al, RNA, 9, 175-179 (2003) 과 같은 공개물에서 기재되어 있다. 다수의 microRNA 는 또한 전구체 분자 내로 통합될 수 있다. 또한, miRNA-유사 스템-루프는 miRNA 및 또는 RNAi 경로를 통해 내인성 유전자의 발현을 조절하기 위한 목적으로 인공 miRNA 및 짧은 간섭 RNA (siRNA) 를 전달하기 위한 비히클로서 세포 내에서 발현될 수 있다.
본원에서 사용되는 "이중 가닥 RNA" 또는 "dsRNA" 는 두 가닥으로 구성되는 RNA 분자를 지칭한다. 이중-가닥 분자는 그 자체로 다시 이중화되어 2-가닥 구조를 형성하는 단일 RNA 분자로 구성된 것들을 포함한다. 예를 들어, 예비-miRNA 로 지칭되는, 단일-가닥 miRNA 가 그로부터 유래하는 전구 분자의 스템 루프 구조 (Bartel et al. 2004. Cell 1 16:281-297) 는 dsRNA 분자를 포함한다.
용어 "핵산" 은 당업계에 널리 공지되어 있다. 본원에서 사용되는 "핵산" 은 일반적으로 핵염기를 포함하는, DNA, RNA 또는 이의 유도체 또는 유사체의 분자 (즉, 가닥) 를 지칭할 것이다. 핵염기는 예를 들어, DNA (예를 들어, 아데닌, "A", 구아닌, "G", 티민, "T", 또는 시토신, "C") 또는 RNA (예를 들어, A, G, 우라실, "U", 또는 C) 에서 발견되는 자연 발생 퓨린 또는 피리미딘 염기를 포함한다. 용어 "핵산" 은 각각 용어 "핵산" 의 아속으로서 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드" 를 포함한다. 용어 "올리고뉴클레오티드" 는 약 3 내지 약 100 개 핵염기 길이의 분자를 지칭한다. 용어 "폴리뉴클레오티드" 는 약 100 개 초과의 핵염기 길이의 적어도 하나의 분자를 지칭한다. 용어 "핵산" 은 또한 폴리뉴클레오티드 예컨대 데옥시리보핵산 (DNA), 및 적절한 경우, 리보핵산 (RNA) 을 지칭한다. 용어는 또한 등가물로서 뉴클레오티드 유사체로부터 만들어진 RNA 또는 DNA 의 유사체, 및 기재되는 구현예에 적용가능한 바와 같이, 단일 (센스 또는 안티센스) 및 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 용어 "폴리뉴클레오티드 서열" 및 "뉴클레오티드 서열" 은 또한 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질" 은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호교환가능하게 사용되며, 최소 길이에 제한되지 않는다. 펩티드, 올리고펩티드, 이량체, 다량체 등은 또한 펩티드 결합에 의해 연결된 선형적으로 배열된 아미노산으로 구성되며, 생물학적으로, 재조합적으로, 또는 합성적으로 생성되는지, 및 자연 발생 또는 비-자연 발생 아미노산으로 구성되는지 여부가 이러한 정의 내에 포함된다. 전장 단백질 및 이의 단편 둘 모두는 상기 정의에 포함된다. 용어는 또한 폴리펩티드의 동시번역 및 번역후 변형, 예를 들어, 디술피드-결합 형성, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 단백질분해 절단 (예를 들어, 퓨린 또는 메탈로프로테아제 및 프로호르몬 컨버타아제 (PC) 에 의한 절단) 등을 포함한다. 또한, 본 발명의 목적을 위해, "폴리펩티드" 는 단백질이 원하는 활성을 유지하는 한, 천연 서열에 대한 결실, 부가 및 치환 (일반적으로 당업자에게 공지된 바와 같이 자연적으로 보존적임) 과 같은 변형을 포함하는 단백질을 포함한다. 이들 변형은 부위-지정 돌연변이유발을 통해서와 같이 의도적인 것일 수 있거나, 단백질을 생성하는 숙주의 돌연변이를 통해서와 같이 우연한 것일 수 있거나, PCR 증폭 또는 다른 재조합 DNA 방법으로 인한 오류일 수 있다. 폴리펩티드 또는 단백질은 펩티드 결합에 의해 연결된 선형적으로 배열된 아미노산으로 구성되지만, 펩티드와는 대조적으로, 잘 정의된 형태를 갖는다. 펩티드와는 달리, 단백질은 일반적으로 50 개 이상의 아미노산의 사슬로 이루어진다. 본 발명의 목적을 위해, 본원에서 사용되는 용어 "펩티드" 는 전형적으로 D- 또는 L-아미노산의 단일 사슬 또는 펩티드 결합에 의해 연결된 D- 및 L-아미노산의 혼합물로 구성된 아미노산의 서열을 지칭한다. 일반적으로, 펩티드는 적어도 2 개의 아미노산 잔기를 함유하고, 약 50 개 미만의 아미노산 길이이다.
합성 비-천연 아미노산, 치환된 아미노산, 또는 하나 이상의 D-아미노산을 포함하는 비-자연적 아미노산의 펩티드 (또는 프로테아제 인식 서열을 제외한 조성물의 다른 성분) 내로의 통합은 특정 상황에서 바람직하다. D-아미노산-함유 펩티드는 L-아미노산-함유 형태에 비해 시험관내 또는 생체내에서 증가된 안정성을 나타낼 수 있다. 따라서, D-아미노산을 통합하는 펩티드의 구축은 생체내 또는 세포내 안정성이 요구되거나 필요할 때 특히 유용할 수 있다. 보다 특히, D-펩티드는 내인성 펩티다아제 및 프로테아제에 대해 저항성이어서, 이에 의해 연결된 약물 및 접합체의 보다 양호한 경구 경상피 및 경피 전달, 멤브레인-영구 복합체의 개선된 생체이용률 (추가 논의에 대해서는 하기 참조), 및 이러한 특성이 바람직한 경우 연장된 혈관내 및 간질성 수명을 제공한다. D-이성질체 펩티드의 사용은 또한 연결된 약물 및 다른 카고 (cargo) 분자의 경피 및 경구 경상피 전달을 향상시킬 수 있다. 또한, D-펩티드는 T 헬퍼 세포에 대한 주요 조직적합성 복합체 클래스 II-제한된 제시를 위해 효율적으로 처리될 수 없고, 따라서 전체 유기체에서 체액성 면역 반응을 유도할 가능성이 적다. 따라서, 펩티드 접합체는 예를 들어 세포 투과성 펩티드 서열의 D-이성질체 형태, 절단 위치의 L-이성질체 형태, 및 치료적 펩티드의 D-이성질체 형태를 사용하여 구축될 수 있다. 일부 구현예에서, CD150/SLAM/SLAMF1 조절제 또는 본원에 교시된 하나 이상의 유전자 생성물 중 어느 하나의 조절제는 CD150/SLAM/SLAMF1 단백질 또는 이의 단편을 포함하거나, 각각, 자연 발생 L-아미노산 잔기의 사용이 임의의 분해 생성물이 상대적으로 세포 또는 유기체에 대해 비-독성이어야 한다는 이점을 가짐에 따라, D- 또는 L-아미노산 잔기로 구성되는 Fc 단편에 융합된 유전자 생성물 또는 이의 단편을 포함한다.
또 다른 추가 구현예에서, CD150/SLAM/SLAMF1 조절제, 또는 본원에 교시된 하나 이상의 유전자 생성물의 조절제 (이는 펩티드 또는 이의 단편 또는 유도체임) 는 레트로-인버소 (retro-inverso) 펩티드일 수 있다. "레트로-인버소 펩티드" 는 적어도 하나의 위치에서 펩티드 결합 방향이 역전된 펩티드, 즉 아미노산의 측쇄에 대한 아미노-말단과 카르복시-말단이 역전된 펩티드를 지칭한다. 따라서, 레트로-인버소 유사체는 천연 펩티드 서열에서와 같이 측쇄의 토폴로지를 대략적으로 유지하면서 펩티드 결합의 역전된 말단 및 역전된 방향을 갖는다. 레트로-인버소 펩티드는 L-아미노산 또는 D-아미노산, 또는 L-아미노산과 D-아미노산의 혼합물을 함유할 수 있고, 최대 모든 아미노산이 D-이성질체이다. 부분적 레트로-인버소 펩티드 유사체는, 서열의 일부만이 역전되고 거울상이성질체성 아미노산 잔기로 대체되는 폴리펩티드이다. 이러한 유사체의 역-반전된 부분이 역전된 아미노 및 카르복실 말단을 가지므로, 역-반전된 부분에 측면위치하는 아미노산 잔기는 각각 측쇄-유사 a-치환된 같은자리-디아미노메탄 및 말로네이트에 의해 대체된다. 세포 침투성 펩티드의 레트로-인버소 형태는 자연적 형태로서 막을 가로질러 전위함에 있어서 효율적으로 작용하는 것으로 발견되었다. 레트로-인버소 펩티드 유사체의 합성은 본원에 그 전체가 참조로 포함되는 Bonelli, F. et al., Int J Pept Protein Res. 24(6):553-6 (1984); Verdini, A and Viscomi, G. C, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1:697-701 (1985); 및 미국 특허 번호 6,261,569 에 기재되어 있다. 부분 레트로-인버소 펩티드 유사체의 고체상 합성을 위한 방법이 기재된 바 있다 (EP0097994B, 이는 또한 본원에 그 전체가 참조로 포함됨).
일부 구현예에서, 본원에 추가로 설명된 바와 같이, 조절제는 사이토카인, 특히 본원에 추가로 정의된 바와 같은 유형 1 T 헬퍼 (Th1) 편중 (skewing) 사이토카인인 것이다.
용어 "항체" 는 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 단백질을 의미한다. 본원에서 사용되는 항체는 관심 항원 또는 항원 단편에 결합할 수 있는 항체 단편, 예를 들어 F(ab')2, Fab', Fab 를 포함하는 것을 의미한다. 예시적 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fd, 단일 도메인 항체, 예를 들어 VHH, 인간화 VHH, VH, 낙타화 VH 또는 VL, 중쇄 단독 항체 및 scFv 및/또는 Fv 단편을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "항체" 는 가장 넓은 의미로 사용되며, 일반적으로 키메라, 인간화, 인간, 재조합, 유전자이식, 그래프트된 및 단일 사슬 항체 등을 비제한적으로 포함하는 전체 항체, 또는 관심 항원에 선택적으로 결합하는 하나 이상의 도메인을 함유하는 임의의 융합 단백질, 접합체, 단편, 또는 이의 유도체와 같은 임의의 면역학적 결합제를 지칭한다. 따라서, 용어 항체는 전체 면역글로불린 분자, 단일클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 또는 이들 중 임의의 것의 면역학적으로 효과적인 단편을 포함한다. 따라서, 용어는 미손상 단일클론 항체, 다클론 항체, 적어도 2 개의 미손상 항체로부터 형성된 다가 (예를 들어, 2-, 3- 또는 그 이상의 가) 및/또는 다중-특이적 항체 (예를 들어, 2- 또는 그 이상의 특이적 항체), 및 이들이 원하는 생물학적 활성 (특히, 관심 항원에 특이적으로 결합하는 능력) 을 나타내는 한에 있어서는 항체 단편, 뿐만 아니라 이러한 단편의 다가 및/또는 다중-특이적 복합체를 구체적으로 포함한다. 용어 "항체" 는 면역화를 포함하는 방법에 의해 생성된 항체를 포함할 뿐만 아니라, 임의의 폴리펩티드, 예를 들어, 관심 항원 상의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 상보성 결정 부위 (CDR) 를 포함하도록 만들어진 재조합적으로 발현된 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 용어는 이들이 시험관내에서, 세포 배양에서, 또는 생체내에서 생성되는지 여부에 관계없이 이러한 분자에 적용된다.
본원에서 용어 "인간화 항체" 는 완전한 항체 분자, 즉 2 개의 완전한 경쇄 및 2 개의 완전한 중쇄로 구성된 항체 분자, 및 항체 단편, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 로만 구성된 항체를 기재하기 위해 사용되며, 여기서 CDR 은 비인간 공급원으로부터 유래하고, Ig 분자의 나머지 부분 또는 이의 단편은 인간 항체로부터 유래하며, 바람직하게는 인간 항체를 인코딩하는 핵산 서열로부터 생성된다.
본원에서 용어 "인간 항체" 및 "인간화 항체" 는, 항체 분자의 모든 부분이 인간 항체를 인코딩하는 핵산 서열로부터 유래되는 항체를 기재하기 위해 사용된다. 이러한 인간 항체는 인간 대상체에서 면역 반응을 거의 또는 전혀 유도하지 않을 것이기 때문에, 항체 치료요법에서 사용하기에 가장 바람직하다.
모든 유전자 명칭 기호는 당업계에 통상적으로 공지된 바와 같은 유전자를 지칭한다. 유전자 기호는 HUGO 유전자 명명법 위원회 (HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC)) 에 의해 지칭되는 것들일 수 있다. 유전자 기호에 대한 임의의 언급은 전체 유전자 또는 유전자의 변이체에 대해 이루어진 언급이다. HUGO 유전자 명명법 위원회는 인간 유전자 명명 지침을 제공하고 새롭고 고유한 인간 유전자 명칭과 기호를 승인하는 것을 담당한다. 모든 인간 유전자 명칭 및 기호는 www.genenames.org, HGNC 웹 사이트에서 검색할 수 있으며, 그의 형성에 대한 지침은 www.genenarnes.org/guidelines 에서 이용가능하다. 따라서, 본 명세서 전체에서 사용되는 유전자 기호는 특히 바람직하게는 각각의 인간 유전자를 지칭할 수 있다.
한 양태에서, 본원에서 제공되는 본 발명은 세포의 벌크 집단으로부터 CD150/SLAM/SLAMF1 을 발현하는 T-세포를 선택하여 종양 반응성 T-세포가 농화되는, 종양-침윤 림프구 (TIL) 집단에 존재하는 T-세포를 포함하는 T-세포의 집단을 수득하고 사용하는 것에 관한 것이다. 선택되는 경우, CD150/SLAM/SLAMF1 양성 세포는 CD150/SLAM/SLAMF1 을 발현하는 T-세포가 농화된 집단을 제공하기 위해 벌크 집단으로부터 분리되고, 그 후 임의로는 선택된 세포가 CD150/SLAM/SLAMF1 +ve (양성) 세포의 수를 증가시키기 위해 확장된다. CD150/SLAM/SLAMF1 +ve 세포가 선택되고 나면, 당업계에 공지된 임의의 적합한 T-세포 확장 방법이 사용될 수 있으며, 단, CD150/SLAM/SLAMF1 발현이 확장 후 유지된다.
예를 들어, 하기 선택 기법 중 하나 이상을 사용하여 상기 생물학적 마커 (CD150/SLAM/SLAMF1) 의 예후적으로 유리한 수준을 발현하는 세포를 선택하는 시험관내 방법이 본원에 기재된다: (i) 유세포 분석, (ii) 항체 패닝, (iii) 자기 선택, (iv) 바이오마커 표적화된 세포 농화.
많은 다른 인간 유전자와 마찬가지로, SLAMF1 의 다수의 동등형 (isoform) 이 존재하며, 이들 중 일부는 비-코딩이거나 기능성 표면 단백질을 생성하지 않는다. 그러나, 이들 스플라이스 변이체는 그의 세포질 도메인이 상이하며, SLAMF1 에 대한 항체, 예컨대 본원에 기재된 것들은 세포외 도메인에 결합하여 그에 따라 SLAMF1 의 상이한 동등형에 결합한다.
상기 생물학적 마커 (CD150/SLAM/SLAMF1) 를 발현하는 선택된 세포는 예를 들어, 하기 옵션 중 하나 또는 둘 모두에 의해 확장될 수 있다:
a) 항체 또는 공동자극 수용체에 의해 유도된 T-세포 활성화 신호 및 공동자극이 제공되도록 하는 방식으로의 조사된 피더 세포; 및/또는
b) 상기 하나 이상의 생물학적 마커를 통해 유도된 T-세포 활성화 신호 및 공동자극 신호를 제공하는 고정화된 또는 가용성 시약.
예를 들어 일부 구현예에서, 항체를 사용하는 SLAM/CD150 을 통한 공동자극은 문헌에서 이들이 공동자극을 유도하는 것으로 나타났기 때문에 실현가능할 수 있다 (참조: Aversa G. Chang CC, Carballido JM, Cocks BG, de Vries JE. J Immunol. 1997 May 1;158(9):4036-44).
한 양태에서, 본 발명은 /SLAMF1/CD150/ 1/CD150/CDw150/IPO-3; 인간 아미노산 서열로도 지칭되는 SLAM (신호전달 림프구 활성화 분자 (Signaling lymphocyte activation molecule)) 을 인코딩하는 외인성 핵산 분자를 포함하는 세포를 제공한다 (참조: NCBI 참조 서열: NP_003028.1).
단어 "외인성" 은 핵산 분자가 재조합 수단에 의해 만들어지며 렌티바이러스 벡터와 같은 벡터에 의해 세포 내로 도입되는 것을 의미한다. 세포는 핵산 분자를 함유하고 SLAM/SLAMF1/CD150 을 발현 (또는 과발현) 하도록 조작된다. 임의로는, 세포는 예를 들어 키메라 항원 수용체 (Chimeric Antigen Receptor (CAR)) 또는 T-세포 수용체 (T-cell receptor (TCR)) 를 인코딩하며 따라서 또한 CAR 또는 TCR 을 발현하는 제 2 외인성 핵산을 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드", 및 "핵산" 은 서로 동의어인 것으로 의도된다.
용어 "벡터" 는 그것이 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하며; 플라스미드는 "벡터" 에 의해 포함되는 속의 종류이다. 용어 "벡터" 는 전형적으로 복제 원점 및 숙주 세포에서 복제 및/또는 유지에 필요한 다른 실체를 함유하는 핵산 서열을 지칭한다. 이들이 작동가능하게 연결되는 유전자 및/또는 핵산 서열의 발현을 지시할 수 있는 벡터를 본원에서 "발현 벡터" 로 지칭한다. 일반적으로, 유용한 발현 벡터는 종종 그들의 벡터 형태에서 염색체에 결합되지 않는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드" 의 형태이고, 전형적으로 안정한 또는 일시적인 발현을 위한 실체 또는 인코딩된 DNA 를 포함한다. 예를 들어 플라스미드, 에피솜, 박테리아 인공 염색체, 효모 인공 염색체, 박테리오파지 또는 바이러스 벡터로 제한되지는 않는 다른 발현 벡터가 본원에 개시된 바와 같은 방법에서 사용될 수 있고, 이러한 벡터는 숙주의 게놈 내로 통합되거나 특정 세포에서 자율적으로 복제될 수 있다. 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 동등한 기능을 수행하는 당업자에게 공지된 다른 형태의 발현 벡터, 예를 들어 자가 복제 염색체외 벡터 또는 숙주 게놈 내로 통합되는 벡터가 또한 사용될 수 있다. 바람직한 벡터는 이들이 연결되는 핵산의 자가 복제 및/또는 발현을 가능하게 할 수 있는 것들이다. 이들이 작동가능하게 연결되는 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터를 본원에서 "발현 벡터" 로 지칭한다.
"바이러스 벡터" 는 세포 내로의 핵산 구축물의 운반체로서 바이러스 또는 바이러스-연관 벡터로서 사용되는 것을 지칭한다. 구축물은 세포 내로의 감염 또는 형질도입을 위해 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV), 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV) 또는 다른 것들 (레테로바이러스 및 렌티바이러스 벡터를 포함함) 과 같은 비복제 결함 바이러스 게놈 내로 통합되고 패키징될 수 있다. 벡터는 세포 게놈 내로 통합되거나 통합되지 않을 수 있다. 구축물은 원하는 경우 형질감염을 위한 바이러스 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 구축물은 에피솜 복제가 가능한 벡터, 예를 들어, EPV 및 EBV 벡터 내로 통합될 수 있다.
본원에서 사용되는 "프로모터" 또는 "프로모터 부위" 또는 "프로모터 요소" 는, 작동가능하게 연결되는 핵산 서열의 전사를 조절하는 핵산 서열의 세그먼트, 전형적으로, 비제한적으로 DNA 또는 RNA 또는 이의 유사체를 지칭한다. 프로모터 부위는 RNA 폴리머라아제 인식, 결합 및 전사 개시에 충분한 특정 서열을 포함한다. 프로모터 부위의 이러한 부분을 프로모터로 지칭한다. 또한, 프로모터 부위는 RNA 폴리머라아제의 이러한 인식, 결합 및 전사 개시 활성을 조절하는 서열을 포함한다. 이들 서열은 시스-작용할 수 있거나 트랜스-작용 인자에 반응할 수 있다. 제어의 특성에 따라, 프로모터는 구성적이거나 제어될 수 있다.
용어 "조절성 서열" 은 본원에서 "조절성 요소" 와 상호교환가능하게 사용되며, 작동가능하게 연결되는 핵산 서열의 전사를 조절하고 그에 따라 전사 조절제로서 작용하는 핵산 세그먼트, 전형적으로 비제한적으로 DNA 또는 RNA 또는 이의 유사체에 대한 요소를 지칭한다. 조절성 서열은 이들이 작동가능하게 연결되는 유전자 및/또는 핵산 서열의 발현을 조절한다. 조절성 서열은 종종 전사 결합 도메인이며 전사 단백질 및/또는 전사 인자, 억제자 또는 인핸서 등의 핵산 결합 도메인에 의해 인식되는 핵산 서열인 "조절성 요소" 를 포함한다. 전형적인 조절성 서열은 전사 프로모터, 유도성 프로모터 및 전사 요소, 전사를 조절하기 위한 임의의 작동 서열, 적합한 mRNA 리보솜 결합 위치를 인코딩하는 서열, 및 전사 및/또는 번역의 종결을 조절하기 위한 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 조절성 서열은 단일 조절성 서열 또는 다중 조절성 서열, 또는 변형된 조절성 서열 또는 이의 단편일 수 있다. 변형된 조절성 서열은 핵산 서열이 예를 들어 비제한적으로, 돌연변이, 메틸화 등의 여러 수단에 의해 변화 또는 변형된 조절성 서열이다.
본원에서 사용되는 용어 "작동가능하게 연결되는" 은 핵산 서열과 뉴클레오티드의 조절성 서열, 예컨대 프로모터, 인핸서, 전사 및 번역 정지 위치 및 기타 신호 서열의 기능적 관계를 지칭한다. 예를 들어, 핵산 서열, 전형적으로 DNA 를 조절성 서열 또는 프로모터 부위에 작동가능하게 연결시키는 것은 DNA 와 조절성 서열 또는 프로모터 사이의 물리적 및 기능적 관계를 지칭하여, 이러한 DNA 의 전사가 조절성 서열 또는 프로모터로부터, DNA 를 특이적으로 인식하고, 결합하고, 전사하는 RNA 폴리머라아제에 의해 개시되도록 한다. 발현 및/또는 시험관내 전사를 최적화하기 위해, 발현되는 세포 유형에서 핵산 또는 DNA 의 발현을 위한 조절성 서열을 변형시키는 것이 필요할 수 있다. 이러한 변형의 바람직함 또는 필요성은 경험적으로 결정될 수 있다. 인핸서는 그의 전사를 향상시키는 코딩 서열에 매우 근접하게 위치될 필요는 없다. 또한, 제 2 프로모터에 의해 전사되는 인자에 의해 트랜스로 제어되는 프로모터로부터 전사되는 유전자는 제 2 프로모터에 작동가능하게 연결된다고 할 수 있다. 이러한 경우, 제 1 유전자의 전사는 제 1 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것으로 언급되고, 또한 제 2 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것으로 언급된다.
수많은 상이한 폴리뉴클레오티드 및 핵산이 유전자 코드의 축퇴성의 결과로서 동일한 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다는 것을 당업자는 이해하게 될 것이다. 또한, 당업자는 통상의 기술을 사용하여, 폴리펩티드를 발현시키고자 하는 임의의 특정 숙주 유기체의 코돈 용법, 예를 들어 코돈 최적화를 반영하기 위해 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 서열에 영향을 미치지 않는 뉴클레오티드 치환을 만들 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명에 따른 핵산은 DNA 또는 RNA 를 포함할 수 있다. 이들은 단일-가닥일 수 있거나 이중-가닥일 수 있다. 이들은 또한 합성 또는 변형된 뉴클레오티드 내에 포함되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 올리고뉴클레오티드에 대한 다수의 상이한 유형의 변형이 당업계에 공지되어 있다. 이들은 메틸포스포네이트 및 포스포로티오에이트 백본, 분자의 3' 및/또는 5' 말단에 아크리딘 또는 폴리리신 사슬의 첨가를 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 폴리뉴클레오티드는 당업계에서 이용가능한 임의의 방법에 의해 변형될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 이러한 변형은 관심 폴리뉴클레오티드의 생체내 활성 또는 수명을 증진시키기 위해 실행될 수 있다.
T 세포의 유전적 변형 전 또는 후에, T 세포는 일반적으로, 예를 들어 미국 특허 번호 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; 및 7,572,631 에서 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 활성화 및 확장될 수 있다. T 세포는 시험관내 또는 생체내에서 확장될 수 있다.
한 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 표적은 이를 필요로 하는 환자에게, 바람직하게는, CD150/SLAM/SLAMF1 을 투여하기 전에 CAR T 세포에서 조절된다. 이론에 얽매이지 않고, 기능장애와 관련된 유전자의 발현 또는 활성을 조절하는 것은 T 세포의 활성을 증가시킨다. 이론에 얽매이지 않고, 활성화와 관련된 유전자의 발현 또는 활성을 조절하는 것은 T 세포의 활성을 증가시킨다.
본원에서 사용되는 용어 "유전자" 는 엑손 및 (임의로는) 인트론 서열 둘 모두를 포함하는, 폴리펩티드를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 핵산을 지칭한다. "유전자" 는 유전자 생성물의 코딩 서열 뿐만 아니라 유전자 생성물의 5'UTR 및 3'UTR 부위, 인트론 및 프로모터를 포함하는 유전자 생성물의 비-코딩 부위를 지칭한다. 유전자의 코딩 부위는 아미노산 서열 또는 기능적 RNA, 예컨대 tRNA, rRNA, 촉매 RNA, siRNA, miRNA 및 안티센스 RNA 를 코딩하는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 유전자는 또한, 임의로 그에 연결된 5'- 또는 3' 미번역 서열을 포함하는 코딩 부위 (예를 들어, 엑손 및 miRNA) 에 상응하는 mRNA 또는 cDNA 일 수 있다. 이들 정의는 일반적으로 단일-가닥 분자를 지칭하지만, 특정 구현예에서 또한 단일-가닥 분자에 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보적인 추가의 가닥을 포함할 것이다. 따라서, 핵산은 분자를 포함하는 특정 서열의 하나 이상의 상보성 가닥(들) 또는 "보체(들)" 를 포함하는 단일 가닥 분자 또는 이중 가닥 분자를 포함할 수 있다. 본원에서, 단일 가닥 핵산은 접두사 "ss" 로, 이중 가닥 핵산은 접두사 "ds" 로, 삼중 가닥 핵산은 접두사 "is" 로 표기될 수 있다. 용어 "유전자" 는 폴리펩티드 사슬을 생성하는데 관여하는 DNA 의 세그먼트를 지칭할 수 있으며, 이는 코딩 부위의 앞 및 뒤에 위치하는 부위 뿐만 아니라 개별 코딩 세그먼트 (엑손) 사이의 개재 서열 (인트론 및 비번역 서열, 예를 들어 5'- 및 3'-미번역 서열 및 조절성 서열) 을 포함한다. 유전자는 또한 코딩 부위의 전부 또는 일부 및/또는 그에 연결된 5'- 또는 3'-미번역 서열을 포함하는 시험관내 생성되는 증폭된 핵산 분자일 수 있다.
"프로모터" 는 전사의 개시 및 속도가 조절되는 핵산 서열의 부위이다. 조절성 단백질 및 분자가 예컨대 RNA 폴리머라아제 및 다른 전사 인자에 결합할 수 있는 요소를 함유하여 핵산 서열의 특정 전사를 개시할 수 있다. 용어 "인핸서" 는 핵산 서열의 전사 활성화에 관여하는 시스-작용 조절성 서열을 지칭한다. 인핸서는 어느 한 방향으로 기능할 수 있고, 프로모터의 업스트림 또는 다운스트림에 있을 수 있다.
따라서, 내인성 표적 유전자, 예를 들어, CD150/SLAM/SLAMF1 유전자는 변형되거나 "돌연변이" 될 수 있다. 의도된 효과를 달성하는 임의 유형의 돌연변이가 본원에서 고려된다. 예를 들어, 적합한 돌연변이는 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함할 수 있다. 용어 "결실" 은 핵산의 하나 이상의 뉴클레오티드, 전형적으로 연속적인 뉴클레오티드가 핵산으로부터 제거되는, 즉 결실되는 돌연변이를 지칭한다. 용어 "삽입" 은 하나 이상의 뉴클레오티드, 전형적으로 연속적인 뉴클레오티드가 핵산에 첨가되는, 즉 삽입되는 돌연변이를 지칭한다. 용어 "치환" 은 핵산의 하나 이상의 뉴클레오티드가 각각 독립적으로 또 다른 뉴클레오티드에 의해 대체되는, 즉 치환되는 돌연변이를 지칭한다.
특정 다른 구현예에서, 돌연변이는 표적 단백질, 예를 들어 CD150/SLAM/SLAMF1 의 하나 이상의 아미노산의 치환을 초래하는 표적 단백질, 예를 들어 CD150/SLAM/SLAMF1 을 인코딩하는 ORF 에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환일 수 있다. 이러한 돌연변이는 전형적으로 폴리펩티드의 생성을 보존할 수 있고, 바람직하게는 폴리펩티드의 일부 또는 모든 생물학적 기능(들) 을 감소 또는 철폐하는 것과 같이 영향을 줄 수 있다. 당업자는 이러한 치환을 용이하게 도입할 수 있다.
특정 바람직한 구현예에서, 돌연변이는 예를 들어, CD150/SLAM/SLAMF1 을 인코딩하는 프리-mRNA 의 천연 스플라이싱을 철폐할 수 있다. 천연 스플라이싱의 부재 하에, 프리-mRNA 는 분해될 수 있거나, 프리-mRNA 는 대안적으로 스플라이싱될 수 있거나, 프리-mRNA 는 이용가능한 경우 잠재적 스플라이스 위치(들) 을 이용하여 부적절하게 스플라이싱될 수 있다. 따라서, 이러한 돌연변이는 전형적으로 폴리펩티드의 mRNA 의 생성 및 그에 따라 폴리펩티드의 생성을 효과적으로 철폐할 수 있다. 적절한 스플라이싱을 간섭하는 다양한 방식, 예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 스플라이싱에 필요한 하나 이상의 서열 요소의 서열을 변경하여 이들을 작동불가능하게 하는 돌연변이, 또는 스플라이싱에 필요한 하나 이상의 서열 요소의 결실을 포함하거나 이로 이루어지는 돌연변이가 당업자에게 이용가능하다. 본원에서 사용되는 용어 "스플라이싱", "유전자의 스플라이싱", "프리-mRNA 의 스플라이싱" 및 그와 유사한 것은 동의어이며 당업계에서 확립된 의미를 갖는다. 추가적인 설명에 의해, 스플라이싱은 성숙 mRNA 를 생성하는 과정에서 프리-mRNA 로부터 개재 서열 (인트론) 을 제거하는 과정 및 수단을 나타낸다. 스플라이싱에 대한 언급은 특히 정상적인 생리적 조건 하에서 발생하는 것과 같은 천연 스플라이싱을 목적으로 한다. 용어 "프리-mRNA" 및 "전사체" 는 본원에서 성숙한 mRNA 에 선행하는 RNA 종류, 예컨대 특히 1 차 RNA 전사체 및 이의 임의의 부분적으로 가공된 형태를 나타내기 위해 사용된다. 스플라이싱에 필요한 서열 요소는 특히, 세포 스플라이싱 기구 (스플라이세오좀) 가 프리-mRNA 로부터 인트론을 정확하고 정밀하게 제거하도록 지시하는 프리-mRNA 의 서열 내의 시스 요소를 지칭한다. 스플라이싱에 관여하는 서열 요소는 일반적으로 그 자체로 공지되어 있고, 그 중에서도 돌연변이 또는 결실 분석을 포함하는 공지된 기법에 의해 추가로 결정될 수 있다. 추가 설명에 의해, "스플라이스 공여체 위치" 또는 "5' 스플라이스 위치" 는 일반적으로 인트론의 5' 말단에서 엑손-인트론 경계에 바로 인접한 보존된 서열을 지칭한다. 통상적으로, 스플라이스 공여체 위치는 디뉴클레오티드 GU 를 함유할 수 있고, 약 위치 +2 내지 -6 에서 약 8 개 염기의 컨센서스 서열을 포함할 수 있다. "스플라이스 수용체 위치" 또는 "3' 스플라이스 위치" 는 일반적으로 인트론의 3' 말단에서 인트론-엑손 경계에 바로 인접한 보존된 서열을 지칭한다. 통상적으로, 스플라이스 수용체 위치는 디뉴클레오티드 AG 를 함유할 수 있고, 약 위치 -14 내지 +2 에서 약 16 개 염기의 컨센서스 서열을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 내인성 표적 유전자, 예를 들어, 내인성 CD150/SLAM/SLAMF1 유전자는 뉴클레아제를 사용하여 변형될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "뉴클레아제" 는 광범위하게는 핵산 분자 내 뉴클레오티드 잔기를 연결하는 포스포디에스테르 결합을 절단할 수 있는 작용제, 예를 들어 단백질 또는 작은 분자를 지칭한다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 단백질, 예를 들어, 핵산 분자에 결합할 수 있고 핵산 분자 내의 뉴클레오티드 잔기를 연결하는 포스포디에스테르 결합을 절단할 수 있는 효소일 수 있다. 뉴클레아제는 폴리뉴클레오티드 사슬 내에서 포스포디에스테르 결합을 절단하는 엔도뉴클레아제, 또는 폴리뉴클레오티드 사슬의 말단에서 포스포디에스테르 결합을 절단하는 엑소뉴클레아제일 수 있다. 바람직하게는, 뉴클레아제는 엔도뉴클레아제이다. 바람직하게는, 뉴클레아제는 특정 뉴클레오티드 서열 내에서 특정 포스포디에스테르 결합을 절단 및/또는 결합하는 부위-특이적 뉴클레아제이며, 이는 "인식 서열", "뉴클레아제 표적 위치" 또는 "표적 위치" 로 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 단일 가닥 표적 위치를 인식할 수 있고, 다른 구현예에서 뉴클레아제는 이중 가닥 표적 위치, 예를 들어 이중 가닥 DNA 표적 위치를 인식할 수 있다. 일부 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 핵산 표적 위치를 대칭적으로 절단하는데, 즉, 양 가닥을 동일한 위치에서 절단하여 말단이 평활 말단으로도 알려진 염기쌍 뉴클레오티드를 포함하도록 한다. 다른 엔도뉴클레아제는 비대칭적으로 이중 가닥 핵산 표적 위치를 절단하는데, 즉, 상이한 위치에서 각각의 가닥을 절단하여 말단이 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드를 포함하도록 한다. 이중 가닥 DNA 분자의 말단에서 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드는 또한 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드(들) 가 각각의 DNA 가닥의 5' 또는 5' 말단을 형성하는지 여부에 따라, "오버행", 예를 들어 "5"-오버행" 또는 "3"-오버행" 으로 지칭된다.
뉴클레아제는 내인성 표적 유전자, 예를 들어, 내인성 CD150/SLAM/SLAMF1 유전자에서 하나 이상의 단일 가닥 닉 (nick) 및/또는 이중 가닥 파단을 도입할 수 있어, 그 결과 내인성 표적 유전자, 예를 들어, 내인성 CD150/SLAM/SLAMF1 유전자의 서열이 비-상동 말단 연결 (non-homologous end joining (NHEJ)) 또는 상동성-유도 복구 (homology-directed repair (HDR)) 를 통해 변형되거나 돌연변이될 수 있다.
특정 구현예에서, 뉴클레아제는 (i) 내인성 표적 유전자, 예를 들어, 내인성 CD150/SLAM/SLAMF1 유전자에 특이적으로 결합하도록 구성된 DNA-결합 부분 및 (ii) DNA 절단 부분을 포함할 수 있다. 일반적으로, DNA 절단 부분은 DNA-결합 부분이 결합하도록 구성되는 서열 내에서 또는 그 부근에서 핵산을 절단할 것이다.
특정 구현예에서, DNA-결합 부분은 징크 핑거 단백질 또는 이의 DNA-결합 도메인, 전사 활성화제-유사 효과기 (TALE) 단백질 또는 이의 DNA-결합 도메인, 또는 이의 RNA-유도 단백질 또는 DNA-결합 도메인을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, DNA-결합 부분은 (i) Cas9 또는 Cpf1 또는 임의의 Cas 단백질 (그의 뉴클레아제 활성을 제거하도록 변형된 본원에 기재된) 또는 (ii) Cas9 또는 Cpf1 또는 임의의 Cas 단백질의 DNA-결합 도메인을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, DNA 절단 부분은 FokI 또는 이의 변이체 또는 Fold 또는 그의 변이체의 DNA 절단 도메인을 포함한다.
특정 구현예에서, 뉴클레아제는 RNA-유도 뉴클레아제, 예컨대 Cas9 또는 Cpf1 또는 임의의 Cas 일 수 있다.
CRISPR-Cas 시스템, 이의 성분, 및 방법, 재료, 전달 비히클, 벡터, 입자, AAV 를 포함하는 이러한 성분의 전달, 및 양 및 제형에 관한 것을 포함하는 이의 제조 방법 및 사용 방법에 대한 일반적 정보에 관해,본 발명의 실행에서 유용한 모든 것은 하기를 참조한다: 미국 특허 번호 8,999,641, 8,993,233, 8,945,839, 8,932,814, 8,906,616, 8,895,308, 8,889,418, 8,889,356, 8,871,445, 8,865,406, 8,795,965, 8,771,945 및 8,697,359; 미국 특허 공개 US 2014-0310830 (미국 출원 일련 번호 14/105,031), US 2014-0287938 A1 (미국 출원 일련 번호 14/213,991), US 2014-0273234 A1 (미국 출원 일련 번호 14/293,674), US2014-0273232 A1 (미국 출원 일련 번호 14/290,575), US 2014-0273231 (미국 출원 일련 번호 14/259,420), US 2014-0256046 A1 (미국 출원 일련 번호 14/226,274), US 2014-0248702 A1 (미국 출원 일련 번호 14/258,458), US 2014-0242700 A1 (미국 출원 일련 번호 14/222,930), US 2014-0242699 A1 (미국 출원 일련 번호 14/183,512), US 2014-0242664 A1 (미국 출원 일련 번호 14/104,990), US 2014-0234972 A1 (미국 출원 일련 번호 14/183,471), US 2014-0227787 A1 (미국 출원 일련 번호 14/256,912), US 2014-0189896 A1 (미국 출원 일련 번호 14/105,035), US 2014-0186958 (미국 출원 일련 번호 14/105,017), US 2014-0186919 A1 (미국 출원 일련 번호 14/104,977), US 2014-0186843 A1 (미국 출원 일련 번호 14/104,900), US 2014-0179770 A1 (미국 출원 일련 번호 14/104,837) 및 US 2014-0179006 A1 (미국 출원 일련 번호 14/183,486), US 2014-0170753 (미국 출원 일련 번호 14/183,429); 유럽 특허 EP 2 784 162 B1 및 EP 2 771 468 B1; 유럽 특허 출원 EP 2 771 468 (EP13818570.7), EP 2 764 103 (EP13824232.6) 및 EP 2 784 162 (EP14170383.5); 및 PCT 특허 공개 PCT 특허 공개 WO 2014/093661 (PCT/US2013/074743), WO 2014/093694 (PCT/US2013/074790), WO 2014/093595 (PCT/US2013/074611), WO 2014/093718 (PCT/US2013/074825), WO 2014/093709 (PCT/US2013/074812), WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667), WO 2014/093635 (PCT/US2013/074691), WO 2014/093655 (PCT/US2013/074736), WO 2014/093712 (PCT/US2013/074819), WO2014/093701 (PCT/US2013/074800), WO2014/018423 (PCT/US2013/051418), WO 2014/204723 (PCT/US2014/041790), WO 2014/204724 (PCT/US2014/041800), WO 2014/204725 (PCT/US2014/041803), WO 2014/204726 (PCT/US2014/041804), WO 2014/204727 (PCT/US2014/041806), WO 2014/204728 (PCT/US2014/041808), WO 2014/204729 (PCT/US2014/041809). 또한 각각 2013 년 1 월 30 일; 2013 년 3 월 15 일; 2013 년 3 월 28 일; 2013 년 4 월 20 일; 2013 년 5 월 6 일 및 2013 년 5 월 28 일에 출원한 미국 특허 가출원 번호 61/758,468; 61/802,174; 61/806,375; 61/814,263; 61/819,803 및 61/828,130 을 참조한다. 또한 2013 년 6 월 17 일에 출원한 미국 특허 가출원 번호 61/836,123 을 참조한다. 추가로, 각각 2013 년 6 월 17 일에 출원한 미국 특허 가출원 번호 61/835,931, 61/835,936, 61/836,127, 61/836,101, 61/836,080 및 61/835,973 을 참조한다. 또한, Further reference is made t 2013 년 8 월 5 일에 출원한 미국 특허 가출원 번호 61/862,468 및 61/862,355; 2013 년 8 월 28 일에 출원한 61/871,301; 2013 년 9 월 25 일에 출원한 61/960,777, 및 2013 년 10 월 28 일에 출원한 61/961,980 을 참조한다. 또한 각각 2014 년 6 월 10 일에 출원한 PCT 특허 출원 번호: PCT/US2014/041803, PCT/US2014/041800, PCT/US2014/041809, PCT/US2014/041804 및 PCT/US2014/041806; 2014 년 6 월 11 일에 출원한 PCT/US2014/041808; 및 2014 년 10 월 28 일에 출원한 PCT/US2014/62558, 및 각각 2013 년 12 월 12 일에 출원한 미국 특허 가출원 일련 번호 61/915,150, 61/915,301, 61/915,267 및 61/915,260; 2013 년 1 월 29 일 및 2013 년 2 월 25 일에 출원한 61/757,972 및 61/768,959; 2013 년 6 월 17 일에 출원한 61/835,936, 61/836,127, 61/836,101, 61/836,080, 61/835,973 및 61/835,931; 모두 2014 년 6 월 11 일에 출원한 62/010,888 및 62/010,879; 각각 2014 년 6 월 10 일에 출원한 62/010,329 및 62/010,441; 각각 2014 년 2 월 12 일에 출원한 61/939,228 및 61/939,242; 2014 년 4 월 15 일에 출원한 61/980,012; 2014 년 8 월 17 일에 출원한 62/038,358; 각각 2014 년 9 월 25 일에 출원한 62/054,490, 62/055,484, 62/055,460 및 62/055,487; 및 2014 년 10 월 27 일에 출원한 62/069,243 을 참조한다. 또한, 2014 년 9 월 25 일에 출원한 미국 특허 가출원 번호 62/055,484, 62/055,460 및 62/055,487; 2014 년 4 월 15 일에 출원한 미국 특허 가출원 61/980,012; 및 2014 년 2 월 12 일에 출원한 미국 특허 가출원 61/939,242 를 참조한다. 그 중에서도, 2014 년 6 월 10 일에 출원한 미국 출원 번호 PCT/US14/41806 을 지정하는 PCT 출원을 참조한다. 2014 년 1 월 22 일에 출원한 미국 특허 가출원 61/930,214 를 참조한다. 각각 2013 년 12 월 12 일에 출원한 미국 특허 가출원 61/915,251; 61/915,260 및 61/915,267 을 참조한다. 2014 년 4 월 15 일에 출원한 미국 특허 가출원 일련 번호 61/980,012 를 참조한다. 그 중에서도, 2014 년 6 월 10 일에 출원한 미국 출원 번호 PCT/US14/41806 을 지정하는 PCT 출원을 참조한다. 2014 년 1 월 22 일에 출원한 미국 특허 가출원 61/930,214 를 참조한다. 각각 2013 년 12 월 12 일에 출원한 미국 특허 가출원 61/915,251; 61/915,260 및 61/915,267 을 참조한다.
한 양태에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열 또는 핵산 구축물을 포함하는 벡터를 제공한다.
이러한 벡터는 핵산 서열(들) 또는 핵산 구축물(들) 을 숙주 세포 내로 도입하여 이것이 SLAM/SLAMF1/CD150 을 발현하도록 사용될 수 있다.
벡터는 예를 들어 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터, 또는 트랜스포존 기반 벡터 또는 합성 mRNA 일 수 있다. 레트로바이러스, 예컨대 렌티바이러스로부터 유래된 벡터는, 이들이 이식유전자 또는 이식유전자들의 장기간, 안정한 통합 및 30 개 딸 세포에서 이의 전파를 허용하므로 장기간 유전자 전달을 달성하기에 적합한 도구이다.
벡터는 T-림프구를 형질감염 또는 형질도입시킬 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산이 삽입되는 벡터를 제공한다.
SLAM/SLAMF1/CD150, 및 임의로는 TCR 또는 CAR 을 인코딩하는 자연적 또는 합성 핵산의 발현은 전형적으로 SLAM/SLAMF1/CD150 및 TCR/CAR 폴리펩티드 또는 이의 일부분을 인코딩하는 핵산을 하나 이상의 프로모터에 작동가능하게 연결하고, 구축물을 발현 벡터에 통합시킴으로써 달성된다. 벡터는 진핵생물 세포에서 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 바람직한 핵산 서열의 발현의 조절에 유용한 전사 및 번역 종결인자, 개시 서열, 및 프로모터를 함유한다.
바이러스 벡터 기술은 당업계에 널리 공지되어 있고 예를 들어 Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), 및 다른 바이러스학 및 분자생물학 매뉴얼에서 기재되어 있으며, 또한 WO 01/96584; WO 01/29058; 및 미국 특허 번호 6,326,193 을 참조한다).
SLAM/SLAMF1/CD150 폴리펩티드 또는 이의 일부분의 발현을 평가하기 위해서, 세포로 도입시키려는 발현 벡터는 또한 바이러스 벡터를 통해 형질감염 또는 형질도입시키고자 하는 세포의 집단으로부터 발현 세포의 확인 및 선택이 용이하도록 선택가능 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 둘 모두를 함유할 수 있다. 예를 들어, 마커 유전자는 도 7A 에서 나타낸 바와 같은 CD19 일 수 있다.
일부 구현예에서, 핵산 구축물은 도 7A 에서 나타낸 바와 같다. 도 7A 는 SLAMF1 및 CD19 마커 유전자가 EF1α 프로모터에 의해 구동되는, 제작된 렌티바이러스 발현 구축물을 나타낸다.
본 발명은 또한 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제, 및 임의로는 하나 이상의 추가 약학적 활성 폴리펩티드 및/또는 화합물과 함께, 본 발명의 세포, T-세포 또는 TIL(들) 의 집단을 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다. 이러한 제형은 예를 들어 정맥내 주입에 적합한 형태일 수 있다. T-세포의 적어도 25%, 30%, 40% 또는 50% 가 SLAM/SLAMF1/CD150 을 발현하는 T-세포의 집단을 포함하는 정맥내 주입용 약학 조성물이 본원에 제공된다. 특정 구현예에서, 본원에서 의도된 바와 같은 면역 세포, 예컨대 T 세포, 바람직하게는 CD8+ T 세포는 종양 특이성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 면역 세포, 예컨대 T 세포, 바람직하게는 CD8+ T 세포는 대상체의 종양으로부터 단리되었을 수 있다. 보다 바람직하게는, 면역 세포는 종양 침윤 림프구 (TIL) 일 수 있다. 일반적으로, "종양 침윤 림프구" 또는 "TIL" 은 혈류를 떠나 종양으로 이동한 백혈구 세포를 지칭한다. 이러한 T 세포는 전형적으로 종양 세포에 의해 발현되는 항원에 대한 특이성 (종양 항원 특이성) 을 갖는 T 세포 수용체를 내인성으로 발현한다.
대안적 구현예에서, 면역 세포, 예컨대 T 세포, 바람직하게는 CD8+ T 세포는 원하는 항원, 예컨대 종양 세포 항원에 대한 특이성을 갖는 T 세포 수용체를 발현하도록 조잘될 수 있다. 예를 들어, 면역 세포, 예컨대 T 세포, 바람직하게는 CD8+ T 세포는 원하는 항원, 예컨대 종양-특이적 키메라 항원 수용체 (CAR) 에 대한 특이성을 갖는 키메라 항원 수용체 (CAR) 을 포함할 수 있다.
"약학 조성물" 은 당업계에서 통상적인 약학적으로 허용가능한 담체와 같은 부형제를 보통 함유하며 세포 또는 대상체에 투여하기에 적합한 조성물을 지칭한다. 또한, 국소 (예를 들어, 경구 점막, 호흡기 점막) 및/또는 경구 투여를 위한 조성물은 당업계에 공지되고 본원에 기재된 바와 같이 용액, 현탁액, 정제, 알약, 캡슐, 서방성 제형, 경구 린스 또는 분말의 형태일 수 있다. 조성물은 또한 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있다. 담체, 안정화제 및 보조제의 예로, University of the Sciences in Philadelphia (2005) Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons, 21 st Ed. 를 참조한다.
어구 "약학적으로 허용가능한" 은 본원에서 건전한 의학적 판단의 범주 내에서, 타당한 이익/위험 비율에 알맞게, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉에 사용하기에 적합한, 화합물, 재료, 조성물, 및/또는 투약 형태를 지칭하는 것으로 사용된다.
본원에서 사용되는 어구 "약학적으로 허용가능한 담체" 는 약학적으로 허용가능한 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질을 의미하며, 이것과 본원에서 기재되는 조절제는 대상체에 투여할 제형으로 조합된다. 각각의 담체는 제형의 다른 성분과 양립할 수 있다는 점에서, 뿐만 아니라 독성이 없거나 개인의 과도한 부작용을 유발하지 않는다는 점에서 "허용가능" 해야 한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 당업자에게 널리 공지되어 있다.
추가 양태는 치료요법에서 사용하기 위해 본원에 교시된 바와 같은 단리된 면역 세포 또는 세포 집단을 제공한다.
추가 양태는 면역요법 또는 양자 면역요법, 바람직하게는 종양 또는 암과 같은 증식성 질환, 또는 만성 바이러스 감염과 같은 만성 감염의 면역요법 또는 양자 면역요법에 사용하기 위해 본원에 교시된 바와 같은 단리된 면역 세포 또는 세포 집단을 제공한다. 특정 구현예는 대상체에서 면역요법 또는 양자 면역요법에 사용하기 위해 본원에 교시된 바와 같은 단리된 면역 세포 또는 세포 집단을 제공하며, 여기서 대상체는 CD150/SLAM/SLAMF1 을 발현하고; 기능장애이거나 기능장애가 아니거나; 본 명세서에 기재된 바와 같은 기능장애의 특징을 발현하는 면역 세포를 포함하는 것으로 결정되었다. 따라서, 한 양태는 세포 집단으로부터 세포를 이를 필요로 하는 암 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암 치료에 사용하기 위한 종양 반응성 T-세포의 농화되고 확장된 세포 집단을 제공하며, 여기서 세포 집단은 CD150/SLAM/SLAMF1 을 발현하는 세포 집단을 확인 및/또는 수득하고 세포 집단을 확장하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조된다. 또한, 종양 반응성 T-세포의 농화되고 확장된 세포 집단이 제공되며, 여기서 세포 집단은 암 치료용 약제의 제조에서 사용하기 위해 CD150/SLAM/SLAMF1 을 발현하는 세포 집단을 확인 및/또는 수득하고 세포 집단을 확장하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조된다.
용어 "면역요법" 은 대상체에서의 면역 반응을 상향조절 또는 하향조절하는 것과 같이 조절하는 것을 목적으로 하는 치료적 또는 예방적 치료를 광범위하게 포함한다.
본원에서 사용되는 "면역 반응" 은 면역계의 세포, 예컨대 B 세포, T 세포 (CD4+ 또는 CD8), 조절성 T 세포, 항원-제시 세포, 수지상 세포, 단핵구, 대식세포, NKT 세포, NK 세포, 호염기구, 호산구 또는 호중구에 의한, 자극에 대한 반응을 의미한다. 본원에 기재된 양태의 일부 구현예에서, 반응은 특정 항원에 대해 특이적이고 ("항원-특이적 반응"), 그의 항원-특이적 수용체를 통한 CD4 T 세포, CD8 T 세포 또는 B 세포에 의한 반응을 지칭한다. 본원에 기재된 양태의 일부 구현예에서, 면역 반응은 T 세포 반응, 예컨대 CD4+ 반응 또는 CD8+ 반응이다. 이들 세포에 의한 이러한 반응은, 예를 들어, 세포독성, 증식, 사이토카인 또는 케모카인 생성, 트래피킹, 또는 식세포작용을 포함할 수 있고, 반응을 거치는 면역 세포의 성질에 의존적일 수 있다.
본원에서 용어 "질환" 또는 "장애" 는 신체 또는 일부 기관의 상태에서 임의의 교체, 기능의 수행을 중단 또는 방해하는 것 및/또는 고통받는 사람 또는 사람과 접촉하는 사람들에게 불편함, 기능장애, 괴로움 또는 심지어 죽음과 같은 증상을 야기하는 것을 지칭한다. 질환 또는 장애는 또한 디스템퍼 (distemper), 병듬 (ailing), 질병 (ailment), 고질병 (malady), 장애, 아픔 (sickness), 병환 (illness), 불편 (complaint), 가벼운 병 (indisposition), 또는 고통 (affliction) 에 관한 것일 수 있다.
용어 "증식성 질환 또는 장애" 는 일반적으로 양성, 전악성 또는 악성 중 어느 것이건 간에 신생물 세포 성장 및 증식을 특징으로 하는 임의의 질환 또는 장애를 지칭한다. 용어 증식성 질환은 일반적으로 모든 형질전환된 세포 및 조직 및 모든 암성 세포 및 조직을 포함한다. 증식성 질환 또는 장애는 비정상적 세포 성장, 양성 종양, 전악성 또는 전암성 병변, 악성 종양, 및 암을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "종양" 또는 "종양 조직" 은 과도한 세포 분열로 인한 조직의 비정상적인 덩어리를 지칭한다. 종양 또는 종양 조직은 유용한 신체 기능이 없고 비정상적 성장 특성을 갖는 신생물 세포인 "종양 세포" 를 포함한다. 종양, 종양 조직 및 종양 세포는 양성, 전악성 또는 악성일 수 있거나, 임의의 암성 가능성이 없는 병변을 나타낼 수 있다. 종양 또는 종양 조직은 또한 "종양-연관 비-종양 세포", 예를 들어, 종양 또는 종양 조직에 공급하기 위해 혈관을 형성하는 혈관 세포를 포함할 수 있다. 비-종양 세포는 종양 세포, 예를 들어, 종양 또는 종양 조직에서 혈관신생의 유도에 의해 복제 및 발생하도록 유도될 수 있다.
용어 "암" 은 조절해제되거나 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 악성 종양을 지칭한다. 용어 "암" 은 1 차 악성 세포 또는 종양 (예를 들어, 본래의 악성세포 또는 종양의 위치 외의 대상체의 신체 위치로 그의 세포가 이동하지 않은 것들) 및 2 차 악성세포 또는 종양 (예를 들어, 본래의 종양의 위치와 상이한 2 차 위치로 전이, 악성 세포 또는 종양 세포의 이동으로 인해 발생하는 것들) 을 포함한다. 용어 "전이성" 또는 "전이" 는 일반적으로 하나의 기관 또는 조직으로부터 또 다른 비-인접 기관 또는 조직으로의 암의 퍼짐을 지칭한다. 다른 비-인접 기관 또는 조직에서 증식성 질환의 발생은 전이로 지칭된다.
특정 구현예에서, 증식성 질환은 흑색종, 폐암, 편평 세포암, 복막암, 간세포암, 위장관암을 포함하는 위암 또는 위장암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막암 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암 또는 신암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 두부암 및 경부암으로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다. 한 구현예에서, 암은 난소암, 폐암 및 흑색종으로 이루어지는 군에서 선택된다.
개시된 방법은 또한 다른 공지된 암 치료요법과 병용하여 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 항암제를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항암제는 시스플라틴, 옥살리플라틴, 키나아제 억제제, 트라스투주맙, 세툭시맙, 파니투무맙, 람브롤리주맙 및 니볼루맙 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료" 는 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상 또는 측정가능한 마커의 완화 또는 측정가능한 감소를 지칭하며; 이러한 것으로 제한되고자 의도되지는 않지만, 특정 관심의 질환 또는 장애는 자가면역 질환, 만성 감염 및 암을 포함한다. 측정가능한 감소는 측정가능한 마커 또는 증상의 임의의 통계적으로 유의한 감소를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료는 예방적 치료이다.
용어 "치료적 유효량" 은 원하는 치료적 결과, 예를 들어 다양한 질환 상태 또는 병상과 연관된 효과의 감소 또는 예방을 달성하기 위해 필요한 투약량에서 및 시간 기간 동안 유효한 양을 지칭한다. 용어 "치료적 유효량" 은 포유동물에서 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는데 유효한, 세포 집단, 표적 유전자 또는 유전자 생성물 조절제, 예를 들어 본원에 개시된 바와 같은 CD150/SLAM/SLAMF1 조절제, 유리하게는 CD150/SLAM/SLAMF1 발현을 증가시키는 작용제의 양을 지칭한다. 표적 유전자 또는 유전자 생성물 조절제, 예를 들어 CD150/SLAM/SLAMF1 조절제, 유리하게는 CD150/SLAM/SLAMF1 발현을 증가시키는 작용제의 치료적 유효량은 대상체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 대상체에서 원하는 반응을 이끌어내는 치료적 화합물의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 치료적 유효량은 또한 치료제의 임의의 독성 또는 유해 효과보다 치료적으로 유익한 효과가 큰 것이다. 일부 구현예에서, 치료적 유효량은 "유효량" 이며, 이는 본원에서 사용되는 바와 같이 질환 또는 장애의 증상의 적어도 하나 또는 일부를 완화시키기 위한 약학 조성물의 치료제의 양을 지칭한다. 따라서, 본원에서의 목적을 위한 "유효량" 은 당업계에 공지된 바와 같은 그러한 고려사항에 의해 결정되고, 당업자에 의한 적절한 조치인 면역 또는 자가면역 질환의 적어도 하나의 증상 및 다른 지표의 개선 또는 제거, 또는 개선된 생존율 또는 보다 신속한 회복을 포함하지만 이에 제한되지 않는 개선을 달성하기 위한 양이다. 표적 유전자 또는 유전자 생성물 조절제, 예를 들어 본원에 개시된 바와 같은 CD150/SLAM/SLAMF1 조절제는 약학적으로 허용가능한 염으로서 투여될 수 있고, 단독으로 투여될 수 있거나 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 보조제 및 비히클과 조합으로 활성 성분으로서 투여될 수 있다는 것에 주의해야 한다.
용어 "예방적 유효량" 은 원하는 예방 결과를 달성하기 위해 필요한 투약량에서 및 시간 기간 동안 유효한 세포 집단, 표적 유전자 또는 유전자 생성물 조절제, 예를 들어 CD150/SLAM/SLAMF1 조절제의 양, 예를 들어 대상체에서의 만성 면역 질환, 예를 들어 만성 감염의 증상을 감소시키거나 암을 치료하기 위한 표적 유전자 또는 유전자 생성물 조절제, 예를 들어 CD150/SLAM/SLAMF1 활성화제의 양을 지칭한다. 전형적으로, 표적 유전자 또는 유전자 생성물 조절제, 예를 들어 CD150/SLAM/SLAMF1 조절제의 예방적 용량이 질환 이전에 또는 질환의 초기 단계에서 대상체에게 투여되므로, 일부 구현예에서, 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 적다. 표적 유전자 또는 유전자 생성물 조절제, 예를 들어 CD150/SLAM/SLAMF1 조절제의 예방적 유효량은 또한 화합물의 임의의 독성 또는 유해한 효과보다 유익한 효과가 더 큰 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "예방하다", "예방하는" 및 "예방" 은 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상 또는 측정가능한 마커의 발현의 방지 또는 지연을 지칭한다. 증상 또는 마커의 발현의 지연은, 이러한 증상 또는 마커가 질환 또는 장애 발생의 가능성 또는 감수성이 유사한 대조군 또는 치료되지 않은 대상체에서 나타나는 시간에 관한 지연이다. 용어 "예방하다", "예방하는" 및 "예방" 은 질환의 증상 또는 마커의 방지 또는 예방 뿐만 아니라, 질환 또는 장애 발생의 가능성 또는 감수성이 유사한 대조군 또는 치료되지 않은 개인에서 이들 증상 또는 마커에 관한, 또는 질환 또는 장애에 의해 영향받은 집단의 역사적 또는 통계적 척도를 기반으로 하여 발생할 가능성이 있는 증상 또는 마커에 관한 질환의 증상 또는 마커 중 임의의 하나의 감소된 중증도 또는 정도를 포함한다. "감소된 중증도" 는 대조군 또는 참조에 관한 증상 또는 측정가능한 질환 마커의 중증도 또는 정도에서의 적어도 10% 감소, 예를 들어, 적어도 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 심지어 100% (즉, 증상 또는 측정가능한 마커가 없음) 감소를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "투여하는" 및 "도입하는" 은 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 원하는 위치에서의 유전자 생성물 조절제, 예를 들어, CD150/SLAM/SLAMF1 조절제의 적어도 부분적인 국부화를 초래하는 방법 또는 경로에 의해 CD150/SLAM/SLAMF1 발현의 조절제를 대상체에 배치하는 것을 지칭한다. 대상체에 투여하기 위한 이러한 조절제는 본원에 추가로 기재된 바와 같이 Th2 차단제, 예를 들어 항체에서 선택될 수 있다. 본 발명의 조절제, 세포 집단 또는 약학적 제형은 대상체에서 효과적인 치료를 초래하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 투여는 전신 투여가 아니다. 일부 구현예에서, 투여는 생체외에서 T 세포의 특정 집단과 표적 유전자 또는 유전자 생성물 조절제, 본원에 개시된 예를 들어 CD150/SLAM/SLAMF1 조절제를 접촉시키는 단계, 및 처리된 특정 T 세포 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어 일부 구현예에서, CD8 T-세포 집단은 표적 유전자 또는 유전자 생성물 조절제, 예를 들어 CD150/SLAM/SLAMF1 활성화제와 접촉되고, 활성화제 처리된 CD8+ T-세포는 대상체, 예를 들어 치료를 필요로 하는 대상체, 예를 들어 만성 면역 질환, 예를 들어 만성 감염 및/또는 암을 갖는 대상체에게 투여된다.
본원에서 사용되는 어구 "비경구 투여" 및 "비경구 투여된" 은 통상적으로 주사에 의한 장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 심실내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관경, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 뇌척추내, 및 흉골내 주사 및 주입을 제한없이 포함한다. 본원에서 사용되는 어구 "전신 투여", "전신 투여된", "말초 투여" 및 "말초 투여된" 은, 동물의 시스템에 들어가, 그에 따라 예를 들어 피하 투여와 같은 대사 및 다른 유사한 과정을 거치게 되는 CD150/SLAM/SLAMF1 조절제의 투여를 의미한다.
본 발명의 면역 세포는 양자 세포 전달에 사용될 수 있다. 양자 세포 치료요법 (ACT) 은 면역학적 기능 및 특징을 새로운 숙주로 전달하는 것을 목표로, 세포, 가장 일반적으로 면역-유래된 세포를 동일한 환자 또는 새로운 수령체 숙주에 다시 전달하는 것을 지칭할 수 있다. 가능한 경우, 자기유래 세포의 사용은 GVHD 문제를 최소화함으로써 수령체에게 도움을 준다. 자기유래 종양 침윤 림프구 (TIL) (Besser et al., (2010) Clin. Cancer Res 16 (9) 2646-55; Dudley et al., (2002) Science 298 (5594): 850-4; 및 Dudley et al., (2005) Journal of Clinical Oncology 23 (10): 2346-57) 또는 유전적으로 재-유도된 말초 혈액 단핵 세포 (Johnson et al., (2009) Blood 114 (3): 535-46; 및 Morgan et al., (2006) Science 314(5796) 126-9) 의 양자 전달을 사용하여, 흑색종 및 결장직장 암종을 포함하는 진행성 고형 종양을 갖는 환자 뿐만 아니라 CD19-발현 혈액암을 갖는 환자를 성공적으로 치료하였다 (Kalos et al., (2011) Science Translational Medicine 3 (95): 95ra73).
본 발명의 양태는 종양 연관 항원과 같은 선택된 항원에 특이적인, T 세포와 같은 면역계 세포의 양자 전달을 수반한다 (Maus et al., 2014, Adoptive Immunotherapy for Cancer or Viruses, Annual Review of Immunology, Vol. 32: 189-225; Rosenberg and Restifo, 2015, Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer, Science Vol. 348 no. 6230 pp. 62-68; Restifo et al., 2015, Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat. Rev. Immunol. 12(4): 269-281; 및 Jenson and Riddell, 2014, Design and implementation of adoptive therapy with chimeric antigen receptor-modified T cells. Immunol Rev. 257(1): 127-144 참조). 예를 들어, T 세포 수용체 (TCR) 의 특이성을 변경시킴으로써, 예를 들어 선택된 펩티드 특이성을 갖는 새로운 TCRα 및 β 사슬을 도입함으로써 T 세포를 유전적으로 변형시키기 위해 다양한 전략이 사용될 수 있다 (미국 특허 번호 8,697,854; PCT 특허 공개: WO2003020763, WO2004033685, WO2004044004, WO2005114215, WO2006000830, WO2008038002, WO2008039818, WO2004074322, WO2005113595, WO2006125962, WO2013166321, WO2013039889, WO2014018863, WO2014083173; 미국 특허 번호 8,088,379 참조).
TCR 변형에 대한 대안으로서 또는 추가로, 기재되었던 매우 다양한 수용체 키메라 구성체를 사용하여, 악성 세포와 같은, 선택된 표적에 특이적인 면역반응성 세포, 예컨대 T 세포를 생성하기 위해 키메라 항원 수용체 (CAR) 가 사용될 수 있다 (미국 특허 번호 5,843,728; 5,851,828; 5,912,170; 6,004,811; 6,284,240; 6,392,013; 6,410,014; 6,753,162; 8,211,422; 및 PCT 공개 WO9215322 참조). 대안적 CAR 구성체는 연속 세대에 속하는 것으로 특징분석될 수 있다. 제 1 세대 CAR 은 전형적으로 항원에 특이적인 항체의 단일 사슬 가변 단편으로 이루어지는데, 예를 들어 가요성 링커에 의해, 예를 들어, CD8a 힌지 도메인 및 CD8a 트랜스멤브레인 도메인에 의해, CD3 또는 FcRγ 중 하나의 트랜스멤브레인 및 세포내 신호전달 도메인에 연결되는 특정 항체의 VH 에 연결된 VL 을 포함한다 (scFv-CD3 또는 scFv-FcRγ; 미국 특허 번호 7,741,465; 5,912,172; 5,906,936 참조).
제 2 세대 CAR 은 엔도도메인 내에 하나 이상의 공동자극 분자, 예컨대 CD28, OX40 (CD134), 또는 4-1BB (CD137) 의 세포내 도메인을 통합시킨다 (예를 들어 scFv-CD28/OX40/4-1BB-CD3ζ; 미국 특허 번호 8,911,993; 8,916,381; 8,975,071; 9,101,584; 9,102,760; 9,102,761 참조). 제 3 세대 CAR 은 공동자극 엔도도메인, 예컨대, CD3-사슬, CD97, GDI la-CD18, CD2, ICOS, CD27, CD154, CD5, OX40, 4-1BB 또는 CD28 신호전달 도메인의 조합을 포함한다 (예를 들어 scFv-CD28-4-1BB-CD3t 또는 scFv-CD28-OX40-CD3; 미국 특허 번호 8,906,682; 8,399,645; 5,686,281; PCT 공개 번호 WO2014134165; PCT 공개 번호 WO2012079000 참조). 대안적으로, 공동자극은 그들의 천연 αβTCR 의 결합 후, 예를 들어 전문적 항원-제시 세포 상에서 항원에 의해, 수반하는 공동자극으로 활성화되고 확장될 수 있도록 선택되는 항원-특이적 T 세포에서 CAR 을 발현시킴으로써 조직될 수 있다. 추가로, 추가의 조작된 수용체가 예를 들어 T-세포 공격의 표적화를 개선시키기 위해 및/또는 부작용을 최소화하기 위해 면역반응성 세포 상에 제공될 수 있다.
표적 면역반응성 세포를 형질전환시키기 위해 대안적 기법, 예컨대 원형질체 융합, 리포펙션, 형질감염 또는 전기천공법이 사용될 수 있다. 광범위한 벡터가 사용될 수 있으며, 예컨대 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 플라스미드 또는 트랜스포존, 예컨대 슬리핑 뷰티 트랜스포존 (Sleeping Beauty transposon) (미국 특허 번호 6,489,458; 7,148,203; 7,160,682; 7,985,739; 8,227,432 참조) 을 사용하여, 예를 들어 CD28 또는 CD137 및 CD3.제타. 를 통한 제 2 세대 항원-특이적 CAR 신호전달을 사용하여 CAR 을 도입할 수 있다. 바이러스 벡터는, 예를 들어 HIV, SV40, EBV, HSV 또는 BPV 를 기반으로 하는 벡터를 포함할 수 있다.
형질전환을 위해 표적화된 세포는, 예를 들어 T 세포, 자연살해 (NK) 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 조절성 T 세포, 인간 배아 줄기 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL) 또는 림프구 세포가 그로부터 분화될 수 있는 다능성 줄기 세포를 포함할 수 있다. 목적하는 CAR 을 발현하는 T 세포는 예를 들어, 암 항원 및 공동자극 분자를 동시발현하는 감마-조사된 활성화 및 증식 세포 (AaPC) 와 함께 공동배양을 통해 선택될 수 있다. 조작된 CAR T-세포는 예를 들어 가용성 인자, 예컨대 IL-2 및 IL-21 의 존재 하에 AaPC 에 대한 공동배양에 의해, 확장될 수 있다. 이러한 확장은, 예를 들어 기억 CAR+ T 세포가 제공되도록 실행될 수 있다 (예를 들어, 비효소적 디지털 어레이 및/또는 다중-패널 유세포 분석에 의해 평가될 수 있음). 이러한 방식으로, 항원-함유 종양에 대해 특이적 세포독성 활성을 갖는 CAR T 세포가 제공될 수 있고 (임의로는 인터페론-γ 와 같은 원하는 케모카인의 생성과 함께) 이러한 종류의 CAR T 세포는 예를 들어 종양 이종이식편을 치료하기 위해 동물 모델에서 사용될 수 있다.
앞서 언급한 것과 같은 접근방식은 예를 들어 선택된 항원에 결합하는 수용체를 인식하는 항원을 포함하는 유효량의 면역반응성 세포를 투여함으로써, 질환, 예컨대 신생물을 갖는 대상체를 치료하고/하거나 생존을 증가시키는 방법이 제공되도록 조정될 수 있으며, 여기서 결합은 면역반응성 세포를 활성화시켜, 그로써 질환 (예컨대 신생물, 병원균 감염, 자가면역 장애 또는 동종이계 이식 반응) 을 치료하거나 예방한다.
한 구현예에서, 치료는 면역억제 치료를 거치는 환자에게 투여될 수 있다. 세포 또는 세포 집단은 이러한 면역억제제에 대한 수용체를 인코딩하는 유전자의 불활성화로 인해 적어도 하나의 면역억제제에 대해 저항성이 될 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 면역억제 치료는 환자 내에서 본 발명에 따른 면역반응성 또는 T 세포의 선택 및 확장에 도움을 주어야 한다.
본 발명에 따른 세포 또는 세포 집단의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 이식 주입 또는 이식을 포함하는 임의의 편리한 방법으로 실행될 수 있다. 세포 또는 세포 집단은 환자에게 피하로, 피내로, 종양내로, 낭내로, 척수내로, 근육내로, 정맥내 또는 림프내 주사로 또는 복강내로 투여될 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명의 세포 조성물은 바람직하게는 정맥내 주사에 의해 투여된다.
세포 또는 세포 집단의 투여는 체중 kg 당 104-109 세포, 바람직하게는 105 내지 106 세포/kg (체중) (이 범위 내에서 모든 정수 값의 세포 수를 포함함) 의 투여로 이루어질 수 있다. CAR T 세포 치료요법에서의 용량은 예를 들어 림프구고갈 과정의 존재 또는 부재 하에, 예를 들어 시클로포스파미드의 존재 하에, 106 내지 109 세포/kg 의 투여를 수반할 수 있다. 세포 또는 세포 집단은 1 회 이상의 용량으로 투여될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 유효량의 세포는 단일 용량으로서 투여된다. 또 다른 구현예에서, 유효량의 세포는 일정 기간에 걸쳐 1 회 초과의 용량으로서 투여된다. 투여 시기는 담당 의사의 판단 내에 있으며 환자의 임상적 병상에 따라 좌우된다. 세포 또는 세포 집단은 임의의 공급원, 예컨대 혈액 은행 또는 공여자로부터 수득할 수 있다. 각각의 요구가 다르지만, 특정 질환 또는 병상에 대해 유효량의 주어진 세포 유형의 최적 범위의 결정은 당업자의 기술 내에 있다. 유효량은 치료적 또는 예방적 이득을 제공하는 양을 의미한다. 투여되는 투약량은 수령자의 연령, 건강 및 체중, 존재시 병용 치료의 종류, 치료 빈도 및 목적하는 효과의 성질에 따라 좌우될 것이다.
또 다른 구현예에서, 이들 세포를 포함하는 유효량의 세포 또는 조성물은 비경구로 투여된다. 투여는 정맥내 투여일 수 있다. 투여는 종양 내에서 주사에 의해 직접적으로 행해질 수 있다.
가능한 유해 반응에 대해 보호하기 위해, 조작된 면역반응성 세포는 특정 신호에 대한 노출에 취약한 세포를 제공하는 이식유전자의 형태로 유전자이식 안전성 스위치를 구비할 수 있다. 예를 들어, 단순 포진 바이러스성 티미딘 키나아제 (TK) 유전자가 이 방법에서, 줄기 세포 이식 후 공여자 림프구 주입으로서 사용되는 동종이계 T 림프구 내로 도입에 의해 사용될 수 있다 (Greco, et al., Improving the safety of cell therapy with the TK-suicide gene. Front. Pharmacol. 2015; 6: 95). 이러한 세포에서, 뉴클레오시드 전구약물 예컨대 간시클로비르 또는 아시클로비르의 투여는 세포 사멸을 야기한다. 대안적인 안전성 스위치 구성체는, 예를 들어 활성 효소를 형성하는 2 개의 비기능성 icasp9 분자와 함께 작은 분자 이량체의 투여에 의해 촉발되는 유도성 카스파아제 9 를 포함한다. 세포 증식 조절을 구현하기 위한 광범위한 대안적 접근방식이 기재되어 있다 (미국 특허 공개 번호 20130071414; PCT 특허 공개 WO2011146862; PCT 특허 공개 WO2014011987; PCT 특허 공개 WO2013040371; Zhou et al. BLOOD, 2014, 123/25:3895-3905; Di Stasi et al., The New England Journal of Medicine 2011; 365:1673-1683; Sadelain M, The New England Journal of Medicine 2011; 365:1735-173; Ramos et al., Stem Cells 28(6):1107-15 (2010) 참조).
양자 치료요법의 추가적인 개선에서, 게놈 편집은 예를 들어 편집 CAR T 세포를 제공하는 대안적인 실행을 위해 면역반응성 세포를 조정하는데 사용될 수 있다 (Poirot et al., 2015, Multiplex genome edited T-cell manufacturing platform for "off-the-shelf" adoptive T-cell immunotherapies, Cancer Res 75 (18): 3853 참조). 세포는 본원에 기재된 바와 같은 임의의 CRISPR 시스템 및 이의 사용 방법을 사용하여 편집될 수 있다. CRISPR 시스템은 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 면역 세포에 전달될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 세포는 생체외에서 편집되고, 이를 필요로 하는 대상체에게 전달된다. 면역반응성 세포, CAR T 세포 또는 양자 세포 전달을 위해 사용되는 임의의 세포는 편집될 수 있다. 편집은 잠재적인 동종반응성 T-세포 수용체 (TCR) 를 제거하기 위해, 화학치료제의 표적을 붕괴시키기 위해, 면역 체크포인트를 차단하기 위해, T 세포를 활성화시키기 위해 및/또는 기능적으로 감손되거나 또는 기능장애 CD+ T-세포의 분화 및/또는 증식을 증가시키기 위해 수행될 수 있다 (PCT 특허 공개: WO2013176915, WO2014059173, WO2014172606, WO2014184744 및 WO2014191128 참조). 편집은 유전자의 불활성화를 초래할 수 있다.
T 세포 수용체 (TCR) 는 항원 제시에 반응하는 T 세포의 활성화에 참여하는 세포 표면 수용체이다. TCR 은 일반적으로, 이종이량체를 형성하도록 조립되고 세포 표면 상에 제시되는 T 세포 수용체 복합체를 형성하기 위해 CD3-형질도입 서브유닛과 회합하는 2 개의 사슬, 즉, α 및 β 로 이루어진다. TCR 의 각각의 α 및 β 사슬은 면역글로불린-유사 N-말단 가변 (V) 및 불변 (C) 부위, 소수성 트랜스멤브레인 도메인 및 짧은 세포질 부위로 이루어진다. 면역글로불린 분자에 대해서와 같이, α 및 β 사슬의 가변 부위는 V(D)J 재조합에 의해 생성되어, T 세포 집단 내에서 매우 다양한 항원 특이성을 생성시킨다. 그러나, 미손상 항원을 인식하는 면역글로불린과 대조적으로, T 세포는 MHC 분자와 회합되는 처리된 펩티드 단편에 의해 활성화되어, MHC 제한으로서 알려진 T 세포에 의한 항원 인식에 대해 여분의 차원을 도입한다. T 세포 수용체를 통한 공여자와 수령자 사이의 MHC 의 인식 차이는 T 세포 증식 및 이식편대숙주질환 (GVHD) 의 잠재적 발생을 야기한다. TCRα 또는 TCRβ 의 불활성화는 T 세포 표면으로부터 TCR 의 제거를 초래하여 동종항원의 인식을 방지하고 그에 따라 GVHD 를 방지할 수 있다. 그러나, TCR 붕괴는 일반적으로 CD3 신호전달 성분의 제거를 초래하고 추가적인 T 세포 확장 수단을 변경시킨다.
동종이계 세포는 숙주 면역계에 의해 빠르게 거부된다. 비-방사선조사 혈액 생성물에 존재하는 동종이계 백혈구는 5 내지 6 일 이하 동안 지속된다는 것이 입증되었다 (Boni, Muranski et al. 2008 Blood 1; 112(12):4746-54). 따라서, 동종이계 세포의 거부를 방지하기 위해, 숙주의 면역계는 일반적으로 어느 정도까지는 억제되어야 한다. 그러나, 양자 세포 전달의 경우에, 면역억제 약물의 사용이 또한 도입된 치료적 T 세포에 대해 해로운 효과를 갖는다. 그러므로, 이들 조건에서 양자 면역요법 접근방식을 효과적으로 사용하기 위해, 도입된 세포는 면역억제 치료에 저항성일 필요가 있을 것이다. 따라서 특정 구현예에서, 본 발명은, 바람직하게는 면억억제제에 대한 표적을 인코딩하는 적어도 하나의 유전자의 불활성화에 의해, T 세포를 면역억제제에 저항성이 되도록 변형시키는 단계를 추가로 포함한다. 면역억제제는 몇몇 작용 메커니즘 중 하나에 의해 면역 기능을 억제하는 작용제이다. 면역억제제는 칼시뉴린 억제제, 라파마이신의 표적, 인터류킨-2 수용체 α-사슬 차단제, 이노신 모노포스페이트 데히드로게나아제의 억제제, 디히드로엽산 리덕타아제의 억제제, 코티코스테로이드 또는 면역억제성 항대사물질일 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 발명은 T 세포 내 면역억제제의 표적을 불활성화시킴으로써 면역요법을 위해 T 세포에 면역억제 저항성을 부여하는 것을 허용한다. 비제한적인 예로서, 면역억제제에 대한 표적은 면역억제제, 예컨대: CD52, 글루코코티코이드 수용체 (GR), FKBP 패밀리 유전자 구성원 및 시클로필린 패밀리 유전자 구성원에 대한 수용체일 수 있다.
SLAM/SLAMF1/CD150 을 발현하는 TIL 을 포함하는, 치료에서 사용하기 위한 TIL 생성물은 대상체로부터 유래하는 세포로부터 SLAM/SLAMF1/CD150 을 발현하는 세포를 농화하거나 SLAM/SLAMF1/CD150 을 발현하도록 세포를 조작함으로써 수득될 수 있다.
본 발명의 SLAM/SLAMF1/CD150 을 발현하는 종양 침윤 림프구 (TIL) 를 포함하는 T-세포는 환자 자신의 말초 혈액 (자기유래) 으로부터, 또는 공여자 말초 혈액 (동종이계) 또는 미관련 공여자로부터의 말초 혈액 (동종이계) 으로부터의 조혈 줄기 세포 이식의 상황에서, 생체외의 것일 수 있다. 이들 예에서, SLAM/SLAMF1/CD150 및 임의로는 CAR 및/또는 TCR 을 발현하는 T-세포는, 바이러스 벡터에 의한 형질도입, DNA 또는 RNA 에 의한 형질감염을 포함하는 많은 수단 중 하나에 의해 SLAM/SLAMF1/CD150 및 임의로는 CAR 및/또는 TCR 을 코딩하는 DNA 또는 RNA 를 도입시켜 생성된다.
본 발명의 방법의 목적을 위해서, 세포가 환자에게 투여되고, 세포는 환자에 대해 동종이계이거나 자기유래인 T 세포일 수 있다.
질환의 치료를 위한 방법은 본 발명의 벡터 또는 세포의 치료적 용도에 관한 것이다. 이와 관련하여, 벡터, 또는 T 세포는 질환과 연관된 적어도 하나의 증상을 축소, 감소, 또는 개선시키고/시키거나, 질환의 진행을 둔화, 감소 또는 차단하기 위해서 현존하는 질환 또는 병상을 갖는 대상체에게 투여될 수 있다. 본 발명의 방법은 TIL 세포 집단 내에 존재하고 대다수의 TIL 세포 집단을 구성하는 T 세포와 같은 T 세포의 종양 반응성을 증가시키는 것에 관한 것이다. 증가된 항종양 활성은 SLAM/SLAMF1/CD150 이 증가된 T-세포가 이들 세포로 치료된 암 환자에서 개선된 임상 반응과 상관관계가 있다는 것을 보여주는 본원의 데이터에 의해 입증되었다. 이들 세포는 종양 반응성 T-세포로 간주될 수 있다. 증가된 SLAM 발현이 개선된 임상 반응 (본원에서 증가된 종양 반응성으로 지칭됨) 과 상관관계가 있는 이유는 공지되지 않으며, 예를 들어, SLAM 이 종양 사멸을 증가시키는데 관여하거나 SLAM 이 T-세포 지속성을 촉진시키는데 관여할 수 있다.
본 개시물 및 당업계의 지식을 통하여, 본원에 기재된 바와 같은 DNA 표적제 또는 이의 성분을 인코딩하거나 제공하는 핵산 분자는 본원에서 일반적으로 그리고 상세하게 기재된 전달 시스템에 의해 전달될 수 있다.
벡터 전달, 예를 들어, 플라스미드, 바이러스 전달: 일부 구현예에서, 벡터, 예를 들어 플라스미드 또는 바이러스 벡터는 관심 조직에, 예를 들어 근육내 주사에 의해 전달되는 한편, 다른 시기에 정맥내, 경피, 비강내, 경구, 점막 또는 다른 전달 방법을 통해 전달된다. 이러한 전달은 단일 용량 또는 다수 용량을 통한 것일 수 있다. 당업자는 본원에서 전달하려는 실제 투약량이 다양한 인자, 예컨대 벡터 선택, 표적 세포, 유기체, 또는 조직, 치료하려는 대상체의 일반적 병상, 추구되는 형질전환/변형 정도, 투여 경로, 투여 방식, 추구되는 형질전환/변형 유형 등에 따라 크게 다를 수 있다는 것을 이해한다.
이러한 투약량은, 예를 들어 담체 (물, 식염수, 에탄올, 글리세롤, 락토오스, 수크로오스, 칼슘 포스페이트, 젤라틴, 덱스트란, 한천, 펙틴, 땅콩 오일, 참깨 오일 등), 희석제, 약학적으로 허용가능한 담체 (예를 들어, 인산 완충 식염수), 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 당업계에 공지된 다른 화합물을 추가로 함유할 수 있다. 투약량은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 염, 예를 들어 무기산 염 예컨대 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 포스페이트, 술페이트 등; 유기 산의 염 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등을 추가로 함유할 수 있다. 추가로, 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질, 겔 또는 겔화 물질, 향료, 착색제, 미소구체, 중합체, 현탁제 등이 또한 존재할 수 있다. 추가로, 특히 투약 형태가 재구성가능한 형태라면, 하나 이상의 다른 통상적인 약학적 성분, 예컨대 보존제, 습윤제, 현탁제, 계면활성제, 산화방지제, 고결방지제, 충전제, 킬레이트제, 코팅제, 화학적 안정제 등이 또한 존재할 수 있다. 적합한 예시적 성분은 미정질 셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 소듐, 폴리소르베이트 80, 페닐에틸 알코올, 클로로부탄올, 포타슘 소르베이트, 소르브산, 설퍼 디옥시드, 프로필 갈레이트, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀, 파라클로로페놀, 젤라틴, 알부민 및 이의 조합을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 부형제의 철저한 논의는 본원에 참조로 포함되는 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991) 에서 이용가능하다.
본원의 한 구현예에서 전달은 아데노바이러스 벡터를 통한 것이며, 이는 적어도 1 x 105 개 입자 (입자 단위, pu 로도 지칭함) 의 아데노바이러스 벡터를 함유하는 단일 부스터 용량으로 일 수 있다. 본원의 한 구현예에서, 용량은 바람직하게는 적어도 약 1 x 106 개 입자 (예를 들어, 약 1 x 106-1 x 1012 개 입자), 보다 바람직하게는 적어도 약 1 x 1010 개 입자, 보다 바람직하게는 적어도 약 1 x 108 개 입자 (예를 들어, 약 1 x 108-1 x 1011 개 입자 또는 약 1 x 108-1 x 1012 개 입자), 가장 바람직하게는 적어도 약 1 x 109 개 입자 (예를 들어, 약 1 x 109-1 x 1010 개 입자 또는 약 1 x 109-1 x 1012 개 입자), 또는 심지어 적어도 약 1 x 1010 개 입자 (예를 들어, 약 1 x 1010-1 x 1012 개 입자) 의 아데노바이러스 벡터이다. 대안적으로, 용량은 약 1 x 1014 개 이하의 입자, 바람직하게는 약 1 x 1013 개 이하의 입자, 보다 더 바람직하게는 약 1 x 1012 개 이하의 입자, 보다 더 바람직하게는 약 1 x 1011 개 이하의 입자, 가장 바람직하게는 약 1 x 1010 개 이하의 입자 (예를 들어, 약 1 x 109 개 이하의 입자) 를 포함한다. 따라서, 용량은 예를 들어, 약 1 x 106 개 입자 단위 (pu), 약 2 x 106 pu, 약 4 x 106 pu, 약 1 107 pu, 약 2 x 107 pu, 약 4 x 107 pu, 약 1 x 108 pu, 약 2 x 108 pu, 약 4 x 108 pu, 약 1 x 109 pu, 약 2 x 109 pu, 약 4 x 109 pu, 약 1 x 1010 pu, 약 2 x 1010 pu, 약 4 x 1010 pu, 약 1 x 1011 pu, 약 2 x 1011 pu, 약 4 x 1011 pu, 약 1 x 1012 pu, 약 2 x 1012 pu, 또는 약 4 x 1012 pu 의 아데노바이러스 벡터에 의한 단일 용량의 아데노바이러스 벡터를 함유할 수 있다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 2013 년 6 월 4 일에 등록된 Nabel, et. al. 의 미국 특허 번호 8,454,972 B2 에서의 아데노바이러스 벡터; 및 이의 29 컬럼, 36-58 라인에서의 투약량을 참조한다. 본원에서의 한 구현예에서, 아데노바이러스는 다수 용량을 통해 전달된다.
본원의 한 구현예에서, 전달은 AAV 를 통한 것이다. 인간에 대한 AAV 의 생체내 전달을 위한 치료적 유효 투약량은 약 1 x 1010 내지 약 1 x 1010 기능성 AAV/ml 용액을 함유하는 약 20 내지 약 50 ml 의 식염수 용액의 범위 내에 있는 것으로 여겨진다. 투약량은 임의의 부작용에 대해 치료적 이점의 균형을 맞추도록 조절될 수 있다. 본원의 한 구현예에서, AAV 용량은 일반적으로 약 1 x 105 내지 1 x 1050 개 게놈 AAV, 약 1 x 108 내지 1 x 1020 개 게놈 AAV, 약 1 x 1010 내지 약 1 x 1016 개 게놈, 또는 약 1 x 1011 내지 약 1 x 1016 개 게놈 AAV 의 농도 범위 내에 있다. 인간 투약량은 약 1 x 1013 개 게놈 AAV 일 수 있다. 이러한 농도는 약 0.001 ml 내지 약 100 ml, 약 0.05 내지 약 50 ml, 또는 약 10 내지 약 25 ml 의 담체 용액 중 전달될 수 있다. 다른 유효 투약량은 용량 반응 곡선을 확립하는 일상적 시행을 통해 당업자에 의해 용이하게 확립될 수 있다. 예를 들어, 2013 년 3 월 26 일에 등록된 Hajjar, et al. 의 미국 특허 번호 8,404,658 B2, 27 컬럼, 45-60 라인을 참조한다.
본원의 용량은 평균 70 kg 의 개체를 기준으로 한다. 투여 빈도는 의학 또는 수의학 종사자 (예를 들어 의사, 수의사) 또는 당업계의 숙련된 과학자의 영역 내에 있다. 또한 실험에서 사용되는 마우스는 전형적으로 약 20 g 이고, 마우스 실험으로부터 70 kg 까지의 개체로 확대될 수 있다는 것에 주의한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 종양 반응성 T 세포 집단, 예를 들어 TIL 집단을 농화, 확장 또는 치료하는 방법에 관한 것이며, 이는 CD150/SLAM/SLAMF1 의 조절제, 예를 들어 CD150/SLAM/SLAMF1 유전자 발현을 증가시키거나 CD150/SLAM/SLAMF1 단백질 활성을 향상시키는 것에 T 세포를 노출시키는 단계를 포함한다. 본원에 설명된 바와 같이, 본원에 기재된 바와 같은 종양 반응성 T 세포 집단을 농축, 확장 또는 치료하기 위한 방법은 세포를 확장하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 추가 양태에서, 세포를 확장하는 단계는 조절제; 예를 들어, CD150/SLAM/SLAMF1 발현을 증가시키는 것을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명자들은 사이토카인이 CD150/SLAM/SLAMF1 유전자 발현을 향상시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 따라서, 조절제는 바람직하게는 하나 이상의 사이토카인, 예를 들어 조합으로 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개 사이토카인에서 선택된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 조절제는 유형 2 T 헬퍼 (Th2) 차단제일 수 있다. 조절제; 즉, 본원에 기재된 바와 같은 사이토카인은 또한 T 세포 집단의 다른 특성, 예컨대 CD8+ T 세포의 확장 및 수에 유리한 효과를 가질 수 있다.
예를 들어, 본 발명은 CD150/SLAM/SLAMF1 발현을 증가시키는 조절제를 포함하는 배양 배지에서 확장된 T 세포를 생성하기 위해 T 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 양자 세포 치료요법에 사용하기 위한 TIL 과 같은 종양-반응성 T 세포의 생체외 또는 시험관내 확장을 위한 방법에 관한 것이다.
또 다른 예에서, 방법은 종양-반응성 T-세포가 농화된 세포 집단을 수득하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) T 세포의 벌크 집단, 예를 들어 TIL 집단을 종양 샘플로부터 수득하는 단계;
(b) CD150/SLAM/SLAMF1 유전자 발현을 증가시키는 조절제의 존재 하에 세포를 배양하는 단계; 및
(c) 선택되지 않은 세포로부터 (b) 에서 선택된 세포를 분리하여, 종양-반응성 T 세포가 농화된 세포 집단을 수득하는 단계.
본 발명은 또한 CD150/SLAM/SLAMF1 을 발현하는 세포 집단을 확인 및/또는 수득하고, CD150/SLAM/SLAMF1 발현을 증가시키는 조절제에 노출되는 세포의 집단을 확장시키는 것을 포함하는 단계를 포함하는, 암 치료요법에서 사용하기 위한 종양 반응성 T-세포의 농화되고 확장된 세포 집단을 제조하는 방법에 관한 것이다. 세포는 확장 단계의 일부로서 또는 별도의 단계에서 SLAM 발현을 증가시키는 조절제에 노출될 수 있다. 조절제는 사이토카인일 수 있다. 예를 들어, 조절제는 단일 사이토카인 또는 둘 이상의 사이토카인, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개 사이토카인의 조합일 수 있다.
특히, 세포 집단은 CD8+ 및 CD4+ 세포 중 하나 이상을 포함한다. 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 세포는 양자 세포 치료요법에 사용될 수 있다. CD150/SLAM/SLAMF1 조절제, 즉 본원에 개시된 사이토카인 또는 조합에 노출시, CD150/SLAM/SLAMF1 의 발현은 기준점과 비교하여, 예를 들어 미처리된 세포, 즉 조절제에 노출되지 않은 세포에서의 CD150/SLAM/SLAMF1 발현과 비교하여, 증가된다. 발현은 적어도 5%, 10 %, 15%, 20% 또는 25%, 예를 들어 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24% 또는 25% 증가된다.
상기 언급된 바와 같이, 이들 방법에서, CD150/SLAM/SLAMF1 발현의 조절제는 유리하게는 사이토카인; 예를 들어 단일 사이토카인 또는 2 개 이상의 사이토카인의 조합에서 선택된다. 사이토카인은 하기 설명하는 바와 같이 또 다른 작용제와 조합으로 사용될 수 있다. 사이토카인은 면역반응 (즉, 세포 및 다른 사이토카인의 활성, 분화, 증식 및 생성) 을 촉진하고 조절하는 역할을 하는, 상이한 면역 세포, 주로 T 세포, 호중구 및 대식세포에 의해 합성된 저분자량 세포외 폴리펩티드/당단백질의 세포 신호전달 군이다. 이들 폴리펩티드는 신호전달 분자 및 세포에 작용하여, 이들을 염증, 감염, 외상의 위치를 향해 자극하고, 1 차 림프구 성장 인자 및 다른 생물학적 기능에 작용한다. 사이토카인은 인터루킨 (IL) 및 인터페론 (IFN) 을 포함한다.
한 구현예에서, 사이토카인 또는 사이토카인의 조합은 유형 1 T 헬퍼로의 시험관내 분화 (Th1) ("Th1 편중") 를 유도하는 것에서 선택되는 사이토카인을 포함한다. Th1 및 유형 2 T 헬퍼 (Th1)Th2 는 Th 세포 분화를 위한 분극화 신호에 반응하는 CD4+ T 세포의 분화로 인해 발생한다. Th1 및 Th2 는 사이토카인의 상호 배타적 발현 패턴을 특징으로 한다. Th1 세포는 IFN-γ 및 IL-2 를 생성하는 반면, Th2 세포는 IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 및 IL-13 을 생성한다. 기능적으로, Th1 반응은 세포내 감염의 제거를 위해 요구되고, Th2 반응은 기생충 감염의 제거에 요구된다. 적절한 Th 세포 반응을 생성하지 못하는 것은 종종 만성 감염성 질환의 원인이다. 자가면역 조건 하에서, 분극화된 Th1 및 Th2 반응은 각각 기관-특이적 자가면역 질환 및 알레르기와 연관된다.
예를 들어, IL-12 는 Th1 로의 시험관내 분화 ("Th1 편중") 를 유도하는 반면, IL-4 는 Th2 로의 시험관내 분화 ("Th2 편중") 를 유도한다. 따라서 Th1 편중 사이토카인은 바람직하게는 Th2 차단 시약, 예컨대 αIL4 과 조합으로, 예를 들어 IL-12, IL-18, IL-7 또는 이의 조합에서 선택된다.
예시적인 조절제는 Th1 편중이며 본 발명에 따라 사용될 수 있는 것은 사이토카인 IL-2, IL-15, IL-18, IL-12, IL-23, IL-27, IL-35, IL-39, IL-18, IL-36, IL-37, IL-38, IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마이다.
인터류킨 (IL)-12 는 디술피드-연결된 글리코실화된 단백질 서브유닛 2 개로 구성된 분비된 이종이량체 사이토카인이며, 이들의 대략적인 분자량에 대해 p35 및 p40 으로 지정된다. IL-12 는 주로 항원 제시 세포에 의해 생성되며, T 세포 또는 자연 살해 (NK) 세포의 표면에 발현되는 2-사슬 수용체 복합체에 결합함으로써 세포 매개 면역을 유도한다. IL-12 수용체 베타-1 (IL-12Rpi) 사슬은 IL-12 의 p40 서브유닛에 결합하여, IL-12 와 그의 수용체 사이의 1 차 상호작용을 제공한다. 그러나, 이는 세포내 신호전달을 부여하는 제 2 수용체 사슬, IL-12RP2 의 IL-12p35 라이게이션이다. 항원 제시와 동시에 IL-12 신호전달은 인터페론 감마 (IFNγ) 생성을 특징으로 하는 T 헬퍼 1 (Thl) 표현형으로의 T 세포 분화를 유발하는 것으로 여겨진다. Thl 세포는 일부 세포내 병원균에 대한 면역력을 촉진하여, 보체-고정 항체 동형을 생성하고, 종양 면역감시에 기여하는 것으로 여겨진다. 따라서, IL-12 는 숙주 방어 면역 메커니즘에 대한 중요한 성분인 것으로 여겨진다. IL-12 는 IL-23, IL-27, IL-35, IL-39 를 또한 포함하는 사이토카인의 IL-12 패밀리의 일부이다.
인터류킨 6 (IL-6) 은 신호전달을 위해 공통 gp130 수용체와 쌍을 이루는 사이토카인 특이적 수용체 사슬을 사용하는 사이토카인의 별개의 패밀리에 속한다. IL-21 과 유사하게, STAT3 의 인산화를 유도하는 IL-6 은 IL-7 또는 IL-15 와 상승작용으로 CD8+ T 세포의 증식을 자극할 수 있다. IL-6 은 CD8+ 림프구 효과기 기능을 촉진하고 세포자멸사 사멸로부터 T 세포를 보호하는 것으로 보고되었다.
인터류킨-18 (IL-18) 은 그의 구조, 수용체 패밀리 및 신호 전달 경로로 인해, IL-1 사이토카인 패밀리에 속하는 전염증성 사이토카인이다. 관련 사이토카인은 IL-36, IL-37, IL-38 을 포함한다.
인터루킨 21 (IL-21) 은 공통 γ-사슬 (γc) 수용체 사이토카인 패밀리의 일원이며, 다양한 T 세포 서브세트의 발생 및 기능을 조절하는 것으로 보고되었다. 공통-γ 사슬 수용체는 사이토카인-특이적 서브유닛 및 공유 γ-사슬 CD132 서브유닛으로 이루어진다. 감마-사슬 서브유닛은 각각, 상이한 사이토카인-특이적 수용체 서브유닛과 결합하여 IL-4, IL-7, IL-9 및 IL-21 에 대한 고유한 이종이량체 수용체를 형성하거나, IL-2/IL-15R 베타 및 IL-2R 알파 또는 IL-15R 알파 모두와 결합하여 IL-2 또는 IL-15 에 대한 이종삼량체 수용체를 형성한다. IL-21 은 STAT3 을 통해 신호전달하여 기억 CD8+ T 세포의 기능적 성숙을 촉진한다. IL-21 은 IL-7 과 상승작용하여 항원-활성화된 CD8+ 세포의 확장을 유도하고 Th1 및 염증성 사이토카인의 생성에 의한 항종양 활성을 증가시킬 수 있다.
본원에서 언급되는 사이토카인, 즉 인터류킨 및 인터페론은 인간 및 포유동물 형태, 보존적 아미노산 치환, 글리코폼, 바이오시밀러 및 이의 변이체를 포함한다. 용어는 또한 페길화된 형태를 포함한다.
따라서 한 구현예에서, 사이토카인은 IL-2, IL-15, IL-18, IL-12, IL-23, IL-27, IL-35, IL-39, IL-18, IL-36, IL-37, IL-38, IFN-알파, FN-베타, IFN-감마 또는 이의 조합에서 선택된다. 한 구현예에서, 단일 사이토카인이 사용되는 경우, 사이토카인은 T 세포, 예를 들어 IL-2 의 확장에 흔히 사용되는 것이 아니다.
한 구현예에서, 조절제는 사이토카인의 조합, 특히 Th1 편중 사이토카인의 조합, 또는 적어도 하나의 사이토카인이 Th1 편중 사이토카인인 조합을 포함한다. 한 구현예에서, 조절제는 IL-12 패밀리 사이토카인, 예를 들어 IL-12 와, 또 다른 사이토카인의 조합; IL-2 와 또 다른 사이토카인의 조합; IL-7 와 또 다른 사이토카인의 조합; IL-18 과 또 다른 사이토카인의 조합 또는 IL-15 와 또 다른 사이토카인의 조합을 포함한다. 한 구현예에서, 조합은 IL-7 + IL-15, IL-2 + IL-7 + IL-15, IL-2 + IL-12, IL-2+ IL-4, IL-2 + IL-18, IL-2 + IL-12 + IL-7 + IL-15, IL-2 + IL-12 + IL-7 + IL-15 + IL-6, IL-2 + IL-12 + IL-7 + IL-15 + IL-21, IL-2 + IL-12 + IL-7 + IL-15 + IL-6 + IL-21, IL-7 + IL-15 + IL-6, IL-7 + IL-15 + IL-21, IL-7 + IL-15 + IL-6 + IL-21, IL-2 + IL-12 + IL-6, IL-2 + IL-12 + IL-21, 또는 IL-2 + IL-12 + IL-6 + IL-21 에서 선택된다.
조절제는 항체와 같은 Th2 차단 시약을 추가로 포함할 수 있다. 항체는 항-IL-4 (αIL4), 항 IL-4R (αIL4R), 항 IL-5R (αIL5R), 항 IL-5 (αIL5), 항-IL13R (αIL13R) 또는 항-IL13 (αIL13) 에서 선택될 수 있다. 한 구현예에서, 항체는 αIL4 이다. 한 구현예에서, 항체는 메폴리주맙, 레실리주맙, 벤랄리주맙, 트랄로키누맙, 레브리키주맙 또는 두필루맙에서 선택된다.
한 구현예에서, 조절제는 IL-2, IL-15, IL-18, IL-12, IL-23, IL-27, IL-35, IL-39, IL-18, IL-36, IL-37, IL-38, IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 또는 Th2 차단 시약, 예를 들어 항-IL-4 (αIL4), 항 IL-4R (αIL4R), 항 IL-5R (αIL5R), 항 IL-5 (αIL5), 항-IL13R (αIL13R) 또는 항-IL13 (αIL13) 에서 선택되는 항체와의 조합으로의 둘 이상의 사이토카인의 조합에서 선택되는 사이토카인을 포함한다. 한 구현예에서, 항체는 항-IL-4 (αIL4) 이다.
한 구현예에서, 조절제는 IL-2 + αIL4; IL-12+ αIL4; IL-2 + IL-12 + αIL4; IL-2+ IL-12 + IL-7 + IL-15 + αIL4; IL-7 + αIL4; IL-15 + αIL4 중 하나에서 선택되는 조합을 포함한다. 한 구현예에서, 조절제는 IL-2 + IL-7 + IL-15, IL-2 + IL-12, IL-2 + IL-18, IL-2 + IL-12 + IL-7 + IL-15 + IL-21, IL-7 + IL-15 + IL-21, 또는 IL-2 + IL-12 + IL-21 을 포함하는 조절제에서 선택된다. 특히, 본원에서 나타낸 바와 같이, IL-2 + IL-7 + IL-15 및 IL-2 + IL-12 로 처리된 CD4+ 세포는 SLAM 발현이 향상되었고, IL-2 + IL-18 로 처리된 CD8+ 세포는 SLAM 발현이 향상되었다.
일부 구현예에서, 세포는 약 1 시간 내지 1, 2, 3 또는 4 주, 예를 들어 약 1 시간, 약 6 시간, 약 12 시간, 약 24 시간, 약 36 시간, 약 48 시간, 약 3 일, 약 5 일, 약 1 주, 약 10 일, 약 2 주, 약 3 주, 또는 약 4 주 동안 조절제에 노출될 수 있다.
또 다른 구현예에서, IL-12 는 단독으로 또는 또 다른 사이토카인, 예컨대 IL-2 와 조합으로, 확장 단계 시작시에 첨가되지만, 또 다른 사이토카인 또는 확장 나머지 동안 사이토카인의 조합, 예컨대 IL-2 + IL-7 + IL-15, IL-7 + IL-15 의 조합 또는 사이토카인, 예컨대 IL-15, IL-7 및 Th2 차단 항체, 예컨대 αIL4 의 조합; 예를 들어 IL-15 + αIL4 으로 대체된다. 이론에 얽매이지 않고, IL-12 에 대한 짧은 노출이 SLAM 발현을 자극하지만, IL-12 노출의 유해 독성 효과를 방지한다고 가정된다.
예를 들어, L-12 에 대한 노출은 1-96 시간; 예를 들어 1 내지 12, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 시간; 1 내지 24, 1 내지 36, 1 내지 48, 1 내지 60, 1 내지 72, 1 내지 84 시간의 지속기간 동안 세포 집단에 제공된 후, 또 다른 사이토카인, 예를 들어 IL-2 + IL-7 + IL-15 로 대체될 수 있다.
사이토카인은 다음의 농도: 5-150 ng/ml, 예를 들어 5, 10, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 ng 으로 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 농도는 시간에 따라; 예를 들어 1-96 시간에 걸쳐; 예를 들어 1 내지 12, 1 내지 24, 1 내지 36, 1 내지 48, 1 내지 60, 1 내지 72, 1 내지 84 시간에 걸쳐 증가하거나 감소될 수 있다.
상기에 설명한 바와 같이 사이토카인의 조합/사이토카인과 항체의 조합을 사용하는 경우, 조합의 성분은 동시에 또는 별도로 제공되지만, 바람직하게는 동시에 제공된다.
세포는 세포 확장 단계 전에 또는 세포 확장 동안에 조절제에 노출될 수 있다.
한 구현예에서, 조절제는 인공 항원 제시 세포 (aAPC) 에 의해 생성되고, 종양 반응성 T 세포는 항원 제시 세포와 공동배양된다. 따라서, 본 발명은 또한 CD150/SLAM/SLAMF1 을 발현하는 세포 집단을 확인 및/또는 수득하고, T 세포가 사이토카인을 생성하는 인공 항원 제시 세포의 집단과 공동배양되는 세포 집단을 확장하는 단계를 포함하는, 암 치료요법에서 사용하기 위한 종양 반응성 T-세포의 농화되고 확장된 세포 집단을 제조하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 사이토카인은 세포주 상에 분비된 또는 멤브레인 고정된 형태로 발현되며, 이어서 세포의 확장에 사용된다.
한 구현예에서, 본 발명은 종양 반응성 T 세포, 예를 들어 종양 침윤 림프구 (TIL) 를 확장하는 방법을 제공하며, 방법은 (b) 세포 배양 배지에서 종양 반응성 T 세포의 집단과 사이토카인, 예를 들어 사이토카인의 조합을 발현하는 aAPC 의 집단을 접촉시키는 단계를 포함한다. 사이토카인은 상기 설명된 바와 같은 Th1 편중 사이토카인에서 선택될 수 있다. 추가 단계에서, 방법은 상기 기재된 바와 같은 Th1 차단제, 예를 들어 항체에 세포를 노출시키는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체외 방법일 수 있다.
다른 곳에서 설명된 바와 같이, T 세포는 종양 생검, 림프절 또는 복수로부터의 종양 침윤 림프구 (TIL) 의 집단; 및/또는 혈액으로부터 단리된 T-세포의 집단이 CAR 및/또는 TCR 을 발현하도록 조작된 T-세포의 집단일 수 있다. T 세포는 종양 반응성이며, 양자 T 세포 치료요법에 유용하다. T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포일 수 있다.
aAPC 는 TIL 의 확장에서 사용하기 위해 개발되었으며 지금까지 잘 확립된 K562 세포주에 초점이 맞춰졌다. 따라서 APC 는 예를 들어 적합한 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터 (LV) 를 사용하여 형질도입되는 K562 세포를 포함할 수 있다. aAPC 는 하나 이상의 공동자극 분자를 발현하도록 변형될 수 있다.
본 방법의 또 다른 구현예에서, T 세포는 또 다른 약물 또는 사이토카인의 결합시 사이토카인 신호전달을 제공하는 사이토카인 수용체를 발현하도록 조작된다. 사이토카인 신호전달은 상기 설명한 바와 같이 사이토카인 Th1 편중 신호전달을 지칭한다. 수용체는 Th2 사이토카인에 반응하여 Th1 신호를 제공한다. 수용체는 예를 들어, IL-4-IL-2 수용체 또는 IL-4-IL-12 수용체일 수 있다.
본 발명은 또한 특히 단리된 T 세포 집단에서, SLAM 의 발현을 증가시키는데 있어서 상기 나타낸 바와 같은 사이토카인, 사이토카인 조합, 또는 사이토카인 및 Th2 차단제의 조합의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 CD150/SLAM/SLAMF1 을 발현하는 세포 집단을 확인 및/또는 수득하고, CD150/SLAM/SLAMF1 의 발현을 증가시키는 사이토카인의 존재 하에 세포 집단을 확장하는 단계를 포함하는, 세포 치료요법에서 사용하기 위한 종양 반응성 T-세포에서의 CD150/SLAM/SLAMF1 의 발현을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 양자 세포 치료요법에서 사용하기 위한, T 세포, 예를 들어 종양-침윤 림프구의 단리된 생체외 확장에서 SLAM 발현을 증가시키는 작용제를 확인하는 방법에 관한 것이다:
종양-침윤 림프구를 T 세포, 예를 들어 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 SLAM 의 발현을 상향조절하는 능력에 대한 후보 조절제와 접촉시키는 단계;
세포에서 SLAM 의 발현에 대한 조절제의 효과를 스크리닝하는 단계,
세포에서 SLAM 의 발현을 증가시키는 조절제를 확인하는 단계.
T 세포에서 SLAM 의 발현을 증가시키는 후보 조절제의 확인으로, ACT 에서 사용하기 위한, TIL 집단 내의 T 세포와 같은 종양 반응성 T 세포의 생체외 확장에 사용될 수 있는 작용제가 확인된다.
본 발명의 양태 및 실시예의 추가적인 세부사항이 하기와 같다.
현재 면역계가 많은 암 유형에 효과적인 반응을 제공할 수 있다는 반박할 수 없는 증거가 존재한다. 이는 다수의 암 면역요법의 개발을 초래하였다. 이들은 광범위하게는 세포 기반 면역요법과 비세포 기반 면역요법으로 분류될 수 있다. 비세포 기반 면역요법은 여러 흥미로운 결과를 보여주었다. 특히 체크포인트 차단 항체 예컨대 항-PD1 (니볼루맙; 펨브롤리주맙), 및 PDL1 (아테졸리주맙), 또는 항-CTLA4 (이필루무맙) 의 30 가지 사용은 은 진행성 전이 흑색종에 대한 임상 환경에서 놀라운 결과를 가졌다. 암에 대한 세포-기반 면역요법은 B-세포 악성종양을 표적으로 하는 CD19-CAR T-세포로 초기 시험에서 동등하게 흥미로운 결과를 가졌으며, 특히 고무적인 결과를 나타내었다.
TIL 치료요법은 일반적으로 유전적 변형이 필요하지 않아 매력적이라는 점에서 더 간단한 접근방식이다. 흑색종에서, 약 50% 의 반응률이 일반적으로 관찰된다. 자궁경부암에서의 시험에서도 33% 의 반응률을 보였다. 난소암을 포함한 다른 암 징후들에 대한 많은 지속적인 시험이 존재한다.
암 반응은 RECIST 가이드라인 (2000 년에 공개된 버전 1) 을 사용하여 측정하며, 보다 최근에는 RECIST 가이드라인 1.1 (Eisenhauer et al 2009) 에 업데이트되었다. 암 치료제의 임상 평가의 중요한 특징인 종양 부담 변화의 균일한 평가를 가능하게 하는 것: 종양 수축 또는 검출가능한 질환이 없음 둘 모두, 즉, 객관적 반응 (CR + PR), 변화 없음 (안정한 질환 (SD)) 및 질환 진행 (PD), 이는 치료 효능 및 환자 예후를 결정하기 위한 임상 시험에서 유용한 종점임. RECIST 1.1 에서의 중요한 변화는 이것이 수축 전에 염증으로 인해 종양의 크기가 증가될 수 있게 한다는 것이었으며, 이는 TIL 과 같은 치료제가 이들 치료요법이 실패로 지칭될 수 있는 다른 경우에서 기능하도록 하는데 중요하다.
본 발명은 환자에서 종양 침윤 림프구 치료요법을 이용한 치료 결과의 예후를 위한 방법을 제공하며, 이 신규한 방법은 예를 들어 종양 내 CD4+ 및/또는 CD8+ 종양 침윤 림프구 상에서, TIL 생산 과정 동안 생성물에서 또는 주입 전 TIL 생성물에서 하나 이상의 생물학적 마커의 검출 및/또는 정량화를 기반으로 한다.
TIL 생성물의 유세포 분석에 의해, 본 출원인들은 TIL 생성물 내의 CD4+ 및/또는 CD8+ T-세포 상에서 발현된 세포 분자 마커를 발견하였으며, 이는 주입 시 환자에서 관찰되는 반응과 상관관계가 있다.
환자의 반응과 상관관계가 있다는 것이 본 발명자들에 의해 나타난 본원에 기재된 마커는 SLAM (CD150) 이다.
본 발명에 따르면, 세포 표면 마커의 발현과 TIL 에 의한 처리 결과 사이에 상관관계가 있다는 것이 발견되었다.
확인된 수용체는 SLAM (신호전달 림프구 활성화 분자/SLAMF1/CD150) 이다. SLAM 은 SLAM 수용체 1 (SLAMF1) 에 대해 구체적으로 30 을 언급하는, 수용체의 SLAM 패밀리의 특정 일원에게 주어지는 명칭이다. SLAM 패밀리는 SLAMF3 (CD229), SLAMF4 (CD244) 및 SLAMF7 (CRACC/CD319) 을 포함하는 다수의 다른 일원을 포함한다. 이들 수용체의 대부분은 자가-리간드이며, 즉 이들은 조혈 세포를 통해 서로 결합한다. SLAM 패밀리 수용체의 세포질 도메인은 SAP (T-세포에서) 또는 EAT-2 (NK-세포에서) 단백질 어댑터와 회합하는 면역수용체 티로신-기반 스위치 모티프를 함유한다. SLAM 패밀리 수용체의 역할은 다소 해결되지 않은 채로 남아 있다. 이들은 의문의 SLAM 패밀리 수용체 및 그것이 발현되는 세포에 따라 활성화 역할 또는 억제 역할에서 면역 반응을 보조할 수 있다. CD150 자체는 공동자극 기능을 갖는 것으로 입증되었다. SLAM 결합은 IFNγ 에 의해 지배되는 사이토카인의 TH1 표현형을 유도하며, 따라서 SLAM 의 조작이 TH2 분극화 질환에 유리할 수 있다는 것이 제안되었다 (Quiroga et al 2004). 또한, SLAM 은 TH2 세포에 비해 TH1 세포에서 더 높은 정도로 발현된다는 것이 주목되었는데 (Hamalainen et al 2000), 이는 TH1 유사 사이토카인을 유도하는 이유에 대한 관찰을 부분적으로 설명할 수 있다. CD150 에 관하여 마지막으로 흥미로운 점은 그것이 홍역 바이러스에 대한 1 차 바이러스 수용체라는 것이다 (Erlenhoefer et al 2001). 이는 T-세포에 보다 특이적으로 렌티바이러스를 표적화하기 위해 홍역 바이러스 외피로 위형화되는 렌티바이러스를 사용함으로써 세포 치료요법 목적으로 이용되었다 (Frecha et al. 2011).
따라서, 본 발명의 제 1 목적은 암에 대해 종양 침윤 림프구 (TIL) 치료요법을 받을 수 있는 환자의 예후를 위한 시험관내 방법으로 이루어지며; 방법은 하기를 포함한다:
i) 상기 환자로부터의 종양 소화 샘플, 생산 과정 동안의 TIL 물질 또는 TIL 생성물에서, TIL 상의 적어도 하나의 생물학적 마커를 정량하는 단계; 및
ii) 상기 적어도 하나의 생물학적 마커에 대해 단계 i) 에서 수득한 값을 동일한 생물학적 마커에 대한 선결 참조 값과 비교하는 단계로서; 선결 참조 값은 상기 암의 진행의 특이적 예후와 상관관계가 있는 것인 단계.
TIL 상의 분자 마커의 이전 예는 임상적 효능과 상관관계가 있는 것으로 보이나 (예를 들어, BTLA), SLAM 에 대해서는 기재되지 않았다. Radvanyi et al. 2015 는 TIL 내의 CD8+ T-세포의 비율을 양호한 임상 결과와 연관되는 것으로 기재하였다. 이는 BTLA 가 T-세포 활성의 음성 조절제로서 작용할 수 있다는 관찰에 의해 혼동된다 (Watanabe et al. 2003).
CD8+ 세포가 농화된 TIL 생성물은 혼합된 CD4+ 및 CD8+ 세포에 비해 생존 이점을 제공하지 않는다 (Dudley et al., 2010). 이는 CD4+ 헬퍼 T-세포의 존재가 CD8+ T-세포 생존 및 생착을 보조하기 때문인 것으로 주로 추정된다. 또한, CD4+ 세포가 종양 세포의 직접적인 인식 및 사멸을 보조할 수 있다는 증거가 있다 (Tran et al., 2014).
Radvanyi et al. (2015) 는 또한 BTLA 의 발현이 임상적 이익과 유리한 연관성을 갖는 것으로 기재하였다. BTLA 의 발현은 향상된 생존 특성을 갖는 덜 분화된 T-세포와 연관되어 있다 (Haymaker et al., 2015). 그러나 역설적으로, TIL 주입 생성물 내의 더 분화된 효과기 기억 T-세포의 존재가 유리한 결과와 연관된다는 것이 또한 나타났다. 효과기 기억 T-세포는 통상 CD45RO 또는 CD45RA 와 조합된 CD62L 또는 CCR7 의 동시발현에 의해 표기되어, 효과기 기억 세포는 하기의 표현형을 가질 수 있다: CD62L-/CD45RO+, CD62L- /CD45RA-, CCR7-/CD45RO+ 또는 CCR7-/CD45RA-.
또한, 임상 결과와 생체내 TIL 상의 다양한 세포 표면 마커와의 연관성을 기재하는 다수의 간행물 및 선행 기술 연구가 존재하지만, 이는 종양 생검의 분석보다는 TIL 제조와 연관되지 않는다. 예는 특허 US20090215053A1 - Vitro Method for the Prognosis of Progression of a Cancer and of the Outcome in a Patient and Means for Performing Said Method 를 포함한다.
본원에서 의도되는 바와 같이, 종양 침윤 림프구는 a) 물리적 또는 효소적 분해를 통해 암을 앓는 환자의 종양 샘플로부터 직접 단리된 CD45+ 세포, b) 상기 환자의 림프절로부터 단리된 CD45+ 세포, c) 복수부터 단리된 CD45+ 세포 (다르게는 종양 연관 림프구로 지칭됨) 이다. TIL 은 TIL 생산 과정 전체에 걸쳐 이들이 CD45+ 로 남아 있는 약간 상이한 표현형이 수득되는 경향을 갖도록 유지되지만, CD3+ 세포의 비율은 세포가 IL-2 에서 배양되고 조사된 피더 세포 또는 대안적 TIL 확장 시스템으로 활성화됨에 따라 증가한다. 이러한 CD45+/CD3+ 세포는 T-세포 또는 T-림프구로 명명된다. 이와 같이, 용어 'TIL' 은 수술 지점으로부터 동일한 환자에게 다시 주입되는 지점까지의 임의의 CD45+ 세포를 포함한다.
상기 마커 (SLAM/SLAMF1/CD150) 의 분석은 여러 메커니즘 중 하나에 의해 수행될 수 있다. 제 1 예에서 유세포 분석을 수행할 수 있다. 이 경우에, 세포는 SLAM 에 대한 항체로 염색되어 이의 존재 또는 부재를 결정할 수 있다. 더욱이, 다른 항체가 염색 패널에 통합되어 TIL 내의 세포의 정의된 집단을 관찰할 수 있다. 예를 들어 세포는 CD62L, CD45RO, CD4 및/또는 CD8 에 대한 항체로 대조염색될 수 있다.
상기 마커 (SLAM/SLAMF1/CD150) 는 다르게는 최종 생성물의 효능을 개선하기 위한 노력으로 상기 마커를 발현하는 세포를 농화시키는 방식으로 이용될 수 있다. 예를 들어, 유세포 분석은 형광단 또는 다른 직접 또는 간접 선택가능 마커에 접합된 특정 항체 (항-SLAM) 또는 재조합 (r) 단백질 (예를 들어, r-SLAM) 을 사용하여 상기 마커를 발현하는 세포를 단리하는 이점을 취할 수 있다.
대안적으로는, 세포를 단리하기 위한 다른 기술이 수행될 수 있다. 예를 들어, Miltenyi MACS magnetic technology, Invitrogen Dynal technology 또는 Stem Cell Technologies EasySep 기술을 사용하여 상기 마커를 발현하는 세포를 단리할 수 있다.
또한 대안적으로, 플레이트, 비드 또는 다른 고체 매트릭스에 고정되거나 인공 항원 제시 세포 플랫폼 상에서 발현되는 항체 (또는 이의 항체 단편) 또는 재조합 단백질은 상기 마커를 발현하는 세포를 농화시키는데 사용될 수 있다. 이러한 예에서, 항체 또는 재조합 단백질은 단독으로 또는 T-세포에 대한 1 차 활성화 신호를 유도하는 항체 또는 다른 활성화 플랫폼과 조합으로 발견될 수 있다 (예는 피토헤마글루티닌, 항-CD3 항체, 펩티드-주요 조직 적합성 항원 복합체, 포르볼 미리스테이트 아세테이트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다).
상기 모두의 목적은 상기 마커의 발현을 기반으로 하여 환자를 계층화하는 것이고, 가능한 경우 상기 기재된 하나 이상의 방법을 통해 치료적 세포를 단리 및/또는 농화하는 것이다.
본원에서 의도되는 바와 같이, 다음을 사용하여 바이오마커의 존재를 평가하기 위한 다수의 방법이 당업계에서 이용가능하다: (a) 유세포 분석에서 흔히 사용되는 것들과 같이 검출될 수 있는 리포터 시스템에 접합된 바이오마커 결합 항체와 같은, 바이오마커 결합 모이어티가 단일 또는 다수 단계 방법에서 2 차 리포트 모이어티에 결합하는 직접 방법. 현미경 또는 프로테오믹 겔 크로마토그래피; 또는 (b) 정량 PCR 과 같은 바이오마커 인코딩 핵산을 정량하는 간접 방법. 선택 방법이 단일 세포 및 집단 기반 방법 상의 세포를 분석하는 것인 경우, 세포는 형광단에 직접 또는 간접적으로 결합될 수 있는 정의된 표면 마커에 대한 항체로 로딩되고, 이는 규정된 파장에서 광을 방출하여 유세포 분석기의 성분에 의해 검출할 수 있다. 본원에서 용어 유세포 분석은 Becton Dickinson 유세포 분석기의 상표인 더 일반적으로 사용되지만 부정확한 용어 FACS 보다 바람직하다. 이와 같이, 임의의 유세포 분석기는 이 방법의 목적을 위해 분석 (Becton Dickinson [BD], Miltenyi, Acea 등) 에 사용될 수 있지만, 다른 방법이 사용될 수 있다.
바람직하게는, 단계 a) 가 하나 이상의 유전자, 즉 하나 이상의 적절한 생물학적 마커의 발현 분석으로 이루어지는 경우, 상기 하나 이상의 유전자의 발현의 정량화는 전체 종양 조직 샘플로부터 수행된다.
본 발명의 다양한 추가 양태 및 구현예는 본 개시물의 관점에서 당업자에게 자명할 것이다.
본 명세서에서 언급되는 모든 문헌은 그들 전문이 참조로 본원에 포함된다.
본원에서 사용될 때 "및/또는" 은 다른 하나가 있거나 또는 없는 2 개의 명시된 특성 또는 성분의 각각의 특별한 개시로서 간주되어야 한다. 예를 들어, "A 및/또는 B" 는 각각이 개별적으로 본원에 제시된 것처럼, (i) A, (ii) B 및 (iii) A 및 B 의 각각의 특별한 개시로서 간주되어야 한다.
문맥에서 달리 명시하지 않는 한, 상기 제시된 특성의 설명 및 정의는 본 발명의 임의의 특정한 양태 또는 구현예로 제한되지 않고 기재된 모든 양태 및 구현예에 동등하게 적용된다.
본 발명의 특정 양태 및 구현예는 이제 실시예를 통해서, 그리고 상기 기재된 도면 및 하기 기재된 표를 참조하여 예시될 것이다.
본 발명 및 그 이점이 상세히 설명되었지만, 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 바와 같은 본 발명의 취지 및 범주로부터 벗어남이 없이 다양한 변화, 대체 및 변경이 본원에서 행해질 수 있음을 이해해야 한다.
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 예시될 것이며, 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공된 것이고 어떠한 방식으로 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1 - 종양 침윤 림프구에서 SLAM/ CD150 의 발현 분석
전이성 흑색종 종양 생검을 환자로부터 채취하고, 실험실로 가져가 메스를 사용하여 미세 조각으로 먼저 절단한 다음, 콜라게나아제 및 DNase 의 혼합물을 사용하여 단일 세포 현탁액으로 소화시켰다.
세포 현탁액을, 3000 IU/ml IL-2 를 첨가하여 완전 배지 중에서 24-웰 플레이트의 웰 당 대략 1x106 생존가능 CD3+ 세포로 시딩하였다. 배양물을 세포 성장에 대해 모니터링하고, 그에 따라 건강한 배양물이 유지되도록 필요에 따라 분할하였다.
TIL 은 최대 21 일 동안 또는 CD3+ 세포 수가 30x106 초과일 때까지 성장시킨 후, 세포를 세척하고 동결시켰다. 동결 전에, 유세포 분석을 위해 샘플을 채취하였다. 이 시점에서, 샘플은 사전-REP (Pre-REP) 로 지칭된다. 세포가 주입을 위해 준비되기 전에, 이들은 바람직하게는 109 이상의 수로, 보다 바람직하게는 1x1010 을 초과하여 확장될 필요가 있다. 이를 달성하기 위해 TIL 은 신속 확장 프로토콜을 거친다 (Dudley et al., 2003). 간략하게, TIL 세포를 확장 1 내지 3 일 전에 해동하였다. 그런 다음, TIL 을 1:50 내지 1:1000 비로, 10 - 50 ng/ml OKT3 을 첨가하여 조사된 자가/동종이형 PBMC 피더 세포와 혼합하였다. 이어서, TIL 을 2 주 기간 동안 확장시킨 후, 이를 사후-REP TIL (Post-REP TIL) 로 지칭한다. 치료적 TIL 생성물 (즉, 사후-REP TIL) 의 주입 전에 환자는 플루다라빈 및 시클로포스파미드로 이루어지는 사전-조건형성 화학요법을 거쳤다. 사후-19 REP TIL 은 환자에게 발급되며 다수의 IL-2 투여 전에 단일 주입으로서 제공된다.
사전-REP 및 사후-REP DML 의 시점에서 TIL 세포를 유세포 분석에 의해 분석하였다. 간략하게, 1-2x105 세포의 3 개 샘플을 PBS 에서 세척한 다음, 5 분 동안 실온에서 암환경 하에 고정가능 생존력 Dye eFluor 450 의 1:400 희석물 50 μl 와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 150 μl 의 PBS 로 2 회 세척한 후, 2 mM EDTA 및 0.5% 송아지 태아 혈청 (PEF) 이 보충된 50 μl 냉각 PBS 에 재현탁하였다. 각각의 샘플에 항체를 하기 표에서 나타낸 바와 같이 30 분 동안 4℃ 에서 첨가하였다.
표 1
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인큐베이션 후 세포를 150 μl 냉각 PEF 로 2 회 세척하고, 최종적으로 200 μl PBS 에 재현탁하였다. 세포를 MACSQuant 분석기 상에서 획득하고, MACSQuantify 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다 (도 1). 사전-REP 및 사후-REP 에서 TIL 을 비교할 때, 출원인들은 사후-REP 단계와 비교하여 사전-REP 단계에서 CD4+ 및 CD8+ TIL 에서 향상된 SLAM 발현을 발견하였다. 특히 출원인들은 CD4+ 사후-REP TIL 에서의 SLAM 발현의 분명한 2 개 집단이 고-SLAM 및 저-SLAM 인 환자 군을 제시함을 관찰하였다. 특히 SLAM 발현은 나이브 및 효과기 집단에서의 더 낮은 발현과 함께, CD4+ 및 CD8+ 집단에서 기억 세포 집단에 크게 제한되는 경향이 있었다. 나이브 및 효과기 집단은 전체 TIL 생성물의 작은 부분을 형성한다.
출원인들이 피부 흑색종에서의환자 반응에 대한 SLAM+ 세포의 비율을 분석했을 때, 진행성 질환을 갖는 환자 ('감염자 (progressor)') 와 비교하여, 안정한 질환을 갖는 환자 (p = 0.0252) 또는 응답자 (p = 0.0113) 에서 SLAM+ 인 CD4+ T-세포의 비율이 유의하게 증가하였음이 발견되었다. CD8+ 집단에서, 치료에 대한 반응을 갖는 환자와 진행성 질환을 갖는 환자 사이에 유의한 차이가 관찰되었다 (p = 0.0248). 유의한 차이는 기억 셀 집단에서 관찰된 차이에 주로 제한되었다. CD4+ T-세포에서 기억 세포 집단은 안정한 질환을 갖는 환자와 감염자 사이 (p = 0.0384), 그리고 진행성 질환을 갖는 환자와 응답자 사이 (p = 0.0221) 에서 유의한 차이를 가졌다. CD8+ 기억 T-세포에서 출원인들은 진행성 질환을 갖는 환자와 안정한 질환을 갖는 환자 사이 (p = 0.0348), 그리고 진행성 질환을 갖는 환자와 응답자 사이 (p = 0.0169) 에 유의한 차이를 관찰하였다.
TIL 주입 생성물로의 처리 후, 고형 종양에서의 반응 평가 기준 (RECISTv1.1) 측정에 따라 종양 크기를 측정하기 위해 환자를 평가하였다. 최근 RECIST 1.1 가이드라인 (Schwartz et al. 2016) 에 따라 각각의 환자에 대해 최상의 반응을 결정하였다. 출원인들은 반응의 지속기간에 대한 환자의 전체 생존을 플로팅하였다 (도 4). 출원인들은 고-SLAM 및 저-SLAM 에 대한 두 개의 컷오프를 사용하였다: 각각 최종 생성물에서 모든 CD4+ TIL 의 25% 및 40%. 출원인들은, >25% SLAM+ 세포를 갖는 환자가 <25% SLAM+ 세포를 갖는 환자와 비교하여 향상된 생존을 갖는다는 것을 발견하였다 (각각, 중간값 21.3 개월 v 2.4 개월, 윌콕슨 시험에 의해 p = 0.009 의 유의한 차이, 및 44% 의 안정기) (도 4A). 동일하게, 출원인들은 >40% SLAM+ 세포를 갖는 환자가 <40% SLAM+ 세포를 갖는 환자와 비교하여 향상된 생존을 갖는다는 것을 발견하였다 (각각, 중간값에 도달하지 못함 v 4 개월, 윌콕슨 시험에 의해 p = 0.027 의 유의한 차이, 및 55% 의 안정기) (도 4A).
실시예 2 - T-세포 및 TIL 에서의 SLAM 발현 조절
출원인들은 먼저, 매치된 종양에 대한 TIL (TIL032 및 TIL054) 의 생존력 및 기능적 반응에 대한 TIL 에서의 SLAM 발현의 영향을 평가하였다. 이를 위해, 출원인들은 2 개의 TIL 주입 생성물을 선택하고 항-SLAM 항체 및 유동 분류기를 사용하여 고-SLAM 및 저-SLAM 집단을 분류하였다. 밤새 휴지기 후, 세포를 그의 자기유래 종양주와 공동배양하거나, 16 시간 동안 웰 내에 미자극되게 두고, 그런 다음 DRAQ7 을 사용하여 생존력을 결정하고 (도 5A), IL-2, IFNγ 및 TNFα 를 생성하는 세포의 비율을 유세포 분석을 사용하여 결정하였다 (도 5B). 출원인들은 TIL032 및 TIL054 고-SLAM 세포가 저-SLAM 또는 미분류된 세포와 비교하여 30 증가된 생존력을 가졌다는 것을 발견하였다 (도 5A). 그의 종양과 혼합시 효과가 덜 분명하였으나, TIL054 에서 명백하였다. 출원인들이 사이토카인 생성을 평가하였을 때, TIL 을 그의 매치된 종양과 배양하였을 경우 상승된 사이토카인 반응이 발견되었다. 이는 TNFα 의 생성을 살펴볼 때 가장 명백하였다. 그러나, 출원인들은 고-SLAM 분류된 집단으로부터의 TNFα 반응이, TIL054 에서 종양에 대한 CD8+ 반응을 제외하고는, 대체로 저-SLAM 분류된 세포의 경우보다 더 크다는 것을 발견하였다.
다음으로, 출원인들은 SLAM 발현을 조절하기 위한 접근방식으로서 세포주 및 T-세포에서 SLAM 발현에 대한 SLAMF1 siRNA 의 영향을 평가하였다. 출원인들은 SLAM+ 세포주 Raji 및 2 개의 TIL 샘플 (MRIBB011 결장직장 종양 TIL 샘플 및 TIL032 로부터의 TIL032 주입 생성물) 을 채취하였다. 최소 배지 (RPMI + 1% FCS + ITS, TIL 에 대해 1000 IU/ml 의 IL-2 가 보충됨) 에서 96 웰에서 세포를 10 μM 의 자가-전달 siRNA (Accell Human SLAMF1 siRNA SMARTpool, 5 nmol - [Dharmacon, Colorado, USA]) 와 함께 플레이팅하였다 (웰 당 1x105). siRNA 의 부재 하에, 동일한 조건에서 대조군을 성장시켰다. 76 시간 후 각 조건으로부터의 2x105 세포 (2x 웰) 를 풀링하고 Cells-to-CTTM 1-Step TaqMan® Kit (Invitrogen) 를 사용하였다.
간략하게, 세포를 스핀다운시키고, PBS (R/T) 로 세척하고, 다시 펠렛화하였다. 상청액을 제거하고, 49 μl 용해 용액 + 1 μl DNAse 를 첨가하였다. 이들을 5 분 동안 R/T 에서 인큐베이션하고, 5 μl 의 STOP 용액을 첨가하였다. 샘플을 2 분 동안 RT 에서 둔 후, 사용할 때까지 얼음 상에 두었다. 모든 상기 시약은 키트로 제공된다. 용해물은 -80℃ 에서 5 개월까지 안정하다.
SLAMF1 (어세이 ID: Hs00234149_m1, Invitrogen) 및 GAPDH (어세이 ID: Hs03929097_g1, Invitrogen) 에 대한 TaqMan 반응을 삼반복으로 설정하고, 반응 부피를 키트에 의해 제시된 20 μl 로부터 10 μl 로 축소시켰다. 1 μl 의 용해액을 각 반응에서 첨가하였다. 미처리된 Raji 세포로부터 이미 추출된 RNA 를 사용한 양성 대조군 반응을 또한 구성하여, 세포 용해물에 존재하는 가능한 PCR 억제제를 설명하였다.
출원인들은 Raji 세포에서 SLAM 전사체의 거의 완전한 녹다운 (knock down) (>99%) 을 관찰하였다 (도 6A). MRIBB011 에서 출원인들은 SLAM 전사체의 31% 감소를 관찰하였고; TIL032 에서 출원인들은 SLAM 전사체의 57% 증가를 관찰하였다. 단백질 발현은 상이한 정도로 변경되었다 (도 6B). Raji 세포에서 동일한 시간 과정에 따른 단백질의 세포 표면 발현은 5.3%, MRIBB011 TIL 에서 30.8%, TIL032 에서 9.6% 감소하였다. 따라서, 발현에서 최적의 녹다운을 관찰하기 위해 시험한 각각의 세포주에 대해 최적화가 요구되지만, SLAM siRNA 는 SLAM 발현을 조절하는 적합한 수단이다.
다음으로, 출원인들은 T-세포에서 SLAM 발현의 향상이 siRNA 를 통해 달성된 바와 같이 녹다운 30 보다는 SLAM 발현의 영향을 정량하기 위한 대안적 접근방식을 제공할 수 있는지 여부를 결정하였다. 이를 위해, SLAMF1 및 CD19 마커 유전자가 EF1α 프로모터에 의해 유도되는 렌티바이러스 발현 구축물을 생성하였다 (도 7A). 일시적 형질감염에 의해 렌티바이러스 입자를 HEK293T 세포에서 생성시킨 다음, 생성 입자를 SLAM-음성 Jurkat JRT3-T3.5 세포에서 적정하였다 (도 7B). SLAM 및 CD19 의 동시발현은 Jurkat 세포에서 입증되었다.
실시예 3 - 사이토카인으로의 자극
재료 및 방법
종양 침윤 림프구 (TIL) 신속 확장
진행성 피부 (공여자 12, 32 및 43) 및 포도막 (공여자 42) 흑색종을 갖는 4 명의 상이한 공여자로부터의 TIL 을 효소적 종양 해리에 의해 단리하고 3000 단위/ml 의 IL-2 이 보충된 RPMI 배지에서 14 일 동안 성장시켰다. TIL 을 이후 2 일 동안 동결 및 해동시킨 후, 신속 확장 단계를 시작하였다. 해동 후, 이를 200 단위/ml 의 IL-2 가 보충된 RPMI 에서 2 일 동안 두고, 그런 다음 MacsQuant (Milteny Biotech) 에서 Draq7 생존 사멸 염식에 의해 계수하였다.
4 명의 건강한 공여자로부터 피콜 구배를 사용하여 PBMC 를 신선하게 단리하였다. PBMC 를 계수하고 조사한 다음, 혼합하여 TIL 확장을 위한 조사된 피더 세포의 풀을 생성하였다.
1:200 (TIL:피더) 의 비로 TIL 을 조사된 PBMC 피더와 혼합하고 7 ml 의 배지와 함께 24 Grex 플레이트에 넣었다 (24 웰 당 100.000 TIL). 각각의 공여자에 대해, 7 가지 상이한 확장 조건을 설정하였다 (표 2). 배지에 사이토카인/항체 (표 2 에 상세히 나타냄) 를 보충하고 제 6 일 및 제 12 일에 배지를 바꾸었다 (Grex 플레이트에 대한 제조사 지시사항에 따름). 배지를 바꾸지 않고, 제 3 일 및 제 9 일에 배지에 표 2 에서 상세히 나타낸 사이토카인을 보충하였다.
표 2
Figure pct00002
신속 확장의 제 14 일에 총 TIL 을 계수하고, 조건 당 100.000 세포를 96 웰 둥근 바닥 플레이트에 플레이팅하고 PBS x2 로 세척하였다. 이들을 5 분 동안 R/T 에서 고정가능 생존력 염료 eF450 (1 μL/mL) 과 함께 인큐베이션하고, PEF 로 세척하고, 하기 항체 믹스 또는 IgG 동형 믹스로 20 분 동안 4℃ 에서 염색하였다:
항체 믹스:
CD62L-APC
CD4-APC-Cy7
CD8-PE Vio777
SLAMf1-PE
CD137-ef710
CD45RO-FITC
항체 동형 믹스:
CD62L-APC
CD4-APC-Cy7
CD8-PE Vio777
IgG1-PE
CD137-ef710
CD45RO-FITC
세포를 PEF 로 세척한 다음, 4% PFA 로 15 분 동안 4℃ 에서 고정하였다. 세척 후, 이들을 웰 당 100 μl 의 PEF 에 재현탁하고 MacsQuant (Milteny Biotech) 을 사용하여 분석하였다.
남아 있는 세포를 48 시간 동안 3000 단위/ml 로 넣었다. 조건 1, 2 및 3 에 48 시간의 말미에 밤새 IL-2 의 공급을 차단하고, 그런 다음 이들을 K562s 야생형 및 OKT3 항 CD3 항체를 발현하는 K562s 와 공동배양하였다. 공동배양을 96 웰 둥근 바닥 플레이트 (웰 당 100.000 TIL) 에서 5 시간 동안 1:2 (TIL: K562/K562 OKT3) 의 비로 설정하였다. 공동배양 동안 브레펠딘 (Brefeldin) 및 모넨신 (Monensin) 을 CD107a-Viobright FITC 와 함께 배지에 첨가하였다.
이후, 세포를 PBS 로 세척하고, 고정가능 생존력 염료 eF450 (1 μL/mL) 와 함께 5 분 동안 R/T 에서 인큐베이션하였다. 세포를 PEF 로 세척한 다음, 4% PFA 로 15 분 동안 4℃ 에서 고정하였다. 세척 후, 이들을 100 μl 의 PEF 로 재현탁하고 항체 및 IgG 대조군 염색을 위해 2 개 플레이트에 나누었다.
그런 다음, 세포를 perm/세척 완충제로 세척하고, 하기 항체 또는 IgG 동형의 믹스에 대해 45 분 동안 4℃ 에서 염색하였다.
perm 세척에서의 사이토카인 믹스:
IL-2 PE-Cy7
IFN-γ PE
TNF APC-Cy7
CD2 eF710
perm 세척에서의 IgG 동형 믹스:
ISO PE-Cy7
ISO APC-Cy7
ISO PE
CD2 eF710
염색 후 세포를 perm/세척 완충제 (x 2) 로 세척한 다음, CD8 APC 항체를 함유하는 PEF (2/50) 에 재현탁하였다. 이들을 20 분 동안 4℃ 에서 인큐베이션하고, 그런 다음 PEF 로 2 회 세척하였다. 이들을 웰 당 100 μl 로 재현탁하고, MacsQuant (Milteny Biotech) 을 사용하여 분석하였다.
실시예 4 - SLAM 발 현 및 TIL 표현형에 대한 사이토카인 조건의 효과 분석
SLAM 이 T-세포 배양물에서 Th1 편향과 상관관계가 있을 수 있다는 증거가 문헌으로부터 존재한다. 따라서 출원인들은 Th1 또는 Th2 편중 사이토카인의 조합이 TIL 에서 SLAM 의 발현에 영향을 줄 수 있는지 여부를 결정하는 것을 모색하였다. 이를 위해, 출원인들은 G-rex 플레이트에서 사후-외성장 TIL 을 혼합 조사 PBMC 및 피토헤마글루티딘과 혼합하여, 모델 신속 확장 프로토콜 (REP) 을 설정하였다. 관련 사이토카인을 제 0 일에 및 확장 동안의 시점에 첨가하였다. 14 일 후 세포를 제거하고 염색하여 유세포 분석에 의해 세포수를 확인하고, SLAM+, CD4+ 및 CD8+ 세포 뿐만 아니라 CD45RO 및 CD62L+ 세포의 중심 기억 (CM), 효과기 기억 (EM), 나이브-유사 (NL) 및 효과기 (E) 세포의 마커로서의 빈도를 결정하였다 (CM = CD45RO+/CD62L+; EM = CD45RO+/CD62L-; NL = CD45RO-/CD62L+; E = CD45RO-/CD62L-). 출원인들은 이전의 연구 및 관찰을 기반으로 하여 사이토카인을 선택하였다. 예를 들어 IL-4 는 Th2 편향의 강력한 동인으로서 알려져 있는 반면, IL-12 는 Th1 편향을 유도한다 (Heufler et al. 1996). 출원인들은 또한 IFNγ 및 IL-18 이 또한 Th1 편중을 향상시킬 수 있다는 증거가 있으므로 이들을 포함시켰다 (Li et al. 2005; Smeltz et al. 2002). 마지막으로, IL-7 이 또한 TH1 편향을 강화시킬 수 있으므로 IL-7 및 IL-15 가 함께 조건에 포함되었고 (Lee et al. Sci Trans Med 2011), 조합으로 일반적으로 사용되므로 IL-15 를 IL-7 과 함께 추가하였다 (Gong et al. 2019; Zoon et al. 2014). 출원인들은 TIL REP 에 보통 첨가되는 IL-2 의 존재 및 부재 하의 사이토카인을 포함시켰고, 출원인들은 또한 사이토카인이 없는 대조군 웰을 포함시켰다. 2 명의 공여자에 대해서만 처음에 IL-4 를 첨가하고, 다른 2 명에 대해서는 배양 내내 첨가하였다. 이는 이러한 사이토카인의 투여 반응속도가 표현형에 영향을 주는지 여부를 확인하기 위한 것이었다.
TIL 의 확장 배수를 결정하기 위해 사후-REP 로 계수하였다. 출원인들은 사이토카인 처리가 최소 전체 확장을 유도하지 않았고, IL-4, IL12, IFNγ 및 IL-18 단독이 또한 확장 유도에 덜 효율적이지만 IL-7 및 IL-15 단독은 IL-2 단독과 유사하였으며 IL-2 와 IL-4, IL-7 + IL-15 및 IL-18 및 IFNγ 의 조합에서도 마찬가지임을 발견하였다 (도 8A). 확장은 IL-2 및 IL-12 의 조합에 의해 제한되는 것으로 보였는데, 이 관찰은 IL-12 의 독성으로 인한 것일 수 있다 (Wang et al. 2017). 가장 두드러지는 차이는 수학적으로 유의한 것들, 즉 미처리 v IL-2, 미처리 v IL-7 + IL-15, IFNγ v IL-7 + IL-15 및 미처리 v IL-2 + IFNγ 였다 (모두 p > 0.05, 프리드만 시험에 의함).
각 조건 하에서 CD4+ 세포의 총 빈도는 크게 상이한 것으로 나타나지 않았으나 (도 8C), CD8+ 빈도는 IL-4 처리된 세포에서는 감소하지만 IL-2 + IL-7 + IL-15 및 IL-2 + IL-12 처리된 세포에서는 증가하는 것으로 나타났다 (도 8B). 출원인들은 동일하게, CM 및 EM 세포의 비율에서 몇몇 흥미로운 차이를 관찰하였다. CM 세포는 IL-12 또는 IL-2 + IL-12 로 처리된 세포에서 농화되었고, IL-2 + IL-4 에서 가장 낮았다 (도 8E). 반대로, IL-2 + IL-4 로 처리된 세포에서 가장 높은 비율로, 그리고 IL-12 또는 IL-2 + IL-12 로 처리된 세포에서 가장 낮은 비율로 EM 에 대한 효과가 관찰되었다 (도 8D).
출원인들이 SLAM 발현을 관찰하였을 때, CD4+ 세포에서 SLAM 이 IL-2 + IL-7 + IL-15, IL-2 + IL-12 및 IL-2 + IL-18 로 처리된 세포에서 가장 높은 것이 발견되었다 (도 9A). 출원인들은 IFNγ v IL-2 + IL-7 + IL-15 처리된 세포 사이에 유의한 차이를 관찰하였다. CD4+ 세포에서 SLAM 의 효과는, IL-4, IL-18 단독 또는 IFNγ 단독을 함유하는 조건이 가장 낮은 발현을 가진 반면 IL-2 + IL-7 + IL-15 및 IL-2 + IL-12 로 처리된 세포에서 가장 높은 발현이 발견된 CM 세포에서 훨씬 더 명백하였다 (도 9B). IL-2 + IL-12 로 처리된 세포 v 미처리 세포 사이의 유의한 차이가 관찰되었다 (p > 0.05). EM 세포에서 차이는 더 작았으나 IL-12 v IL-2 + IL-7 + IL-15 사이에 유의한 차이가 관찰되었다 (p > 0.05) (도 9C). CD8+ 세포에서 SLAM 발현은 일반적으로 IL-4 로 처리된 세포에서 가장 낮은 발현이 관찰된 CD4+ 세포를 반영하지만, CD8+ 세포에서 출원인들은 IL-2 + IL-18 이 특히 IL-4 처리된 세포와 비교하여 SLAM 발현을 향상시켰다는 것을 발견하였다 (p > 0.05) (도 9D). CD4+ 세포와 유사하게, CM 세포에서 가장 큰 차이가 명백하였으나, IL-18 로 이루어진 관찰은 또한 EM 세포에서 명백하였다.
요약하면, 이 실험으로부터 IL-2, IL-12, IL-18 및 IL-7 + IL-15 가 SLAM 발현을 지지하는 반면, IL-4 는 반대 효과를 갖는 것으로 나타났다. 그러나 IL-12 는 몇몇 독성 쟁점을 갖는 것으로 나타난 반면, IL-7 + IL-15 는 낮은 T-세포 확장의 효과를 완화시킬 수 있을 뿐 아니라 SLAM 발현을 증가시킬 수 있기 때문에 흥미롭게 보였다.
따라서 출원인들은 일부 정제된 조건으로 두 번째 실험을 시도하였다. 출원인들은 이전과 같이 IL-2 단독, IL-2 + IL-12, IL-2 + IL-4 를 포함시켰으나, 이제는 추가적인 조건을 포함시켰다. IL-2 + 항 (α) IL-4 항체, Th1 편중 능력을 가질 수 있는 임의의 유리 IL-4 를 중화시키려는 시도에서, IL-2 + IL-12 + αIL-4, 그런 다음 IL-2 및 IL-12 를 배양 시작시 첨가한 조건, 이어서 항-IL-4 를 첨가하거나 첨가하지 않고, 확장 나머지에 대해 IL-12 를 IL-2 + IL-7 + IL-15 로 대체하였다 (도 10A). 전체 확장은 IL-2 또는 IL-2 + IL-4 를 제외한 모든 조건에서 비교적 동등하였다. CD4+ 빈도는 IL-2 + IL-4 v IL-2 + IL-12 + IL-7 + IL-15 ± αIL-4 에서 유리한 것으로 나타난 반면 (모두 p > 0.05) (도 10B), CD8+ 빈도는 IL-2 + IL-4 처리된 세포에서 더 낮았다 (도 10C). 중심 기억 세포는 IL-2 + IL-4 의 조건에서 덜 유리하였으며, IL-2 + IL-12 ± αIL-4 는 그의 빈도에 있어서 유리하다 (p > 0.05) (도 10D). EM 은 특히 IL-2 + IL-12 에 대해 IL-2 + IL-4 의 조건에서 유리하였다 (p > 0.01) (도 10E). SLAM 분석시, 출원인들은 CD4+ 세포가 IL-2 + IL-12 + IL-7 + IL-15 + αIL-4 와 비교하여 IL-2 + IL-4 조건에서 더 낮은 SLAM 을 가졌다는 것을 발견하였으며 (p > 0.05) (도 11A), IL-2 + IL-12 가 IL-2 + IL-4 보다 SLAM 에 대해 유의하게 더 높았음에도 불구하고 CD8+ 세포에서 동일하게 마찬가지였다 (p > 0.05) (도 11B). CD4+ (도 11D) 또는 CD8+ (도 11F) 의 EM 집단에서 SLAM 발현에 대해 명백한 차이가 존재하지 않았으나, CD4+ (도 11C) 및 CD8+ (도 11E) CM 집단에서 SLAM 발현은 IL-2 + IL-12 + Il-7 + IL-15 + αIL-4 보다 IL-2 + IL-4 에서 유의하게 더 낮았다.
다음으로, 출원인들은 고-SLAM 및 저-SLAM 표현형을 유도하는데 사용된 조건이 유사분열 자극에 반응하는 TIL 의 능력에 영향을 주는지 여부를 조사하였다. 이를 위해 출원인들은 표면 결합된 OKT3 단일 사슬 항체 단편이 발현되도록 조작된 K562 와 함께 TIL 을 인큐베이션하였다. 6 시간 자극 후, 세포를 투과화하고, CD107a (탈과립화의 마커), TNFα, IFNγ 및 IL-2 에 대한 세포내 염색을 CD8+ 및 CD8- 를 게이트 온하기 위해 수행된 CD8 에 대해 대조염색을 수행하였고, 후자의 경우 CD4+ 에서 주로 게이트팅되어야 한다. CD8- 및 IL-2 단독 및 IL-2 + IL-4 둘 모두가 탈과립화를 감소시키는 경향이 있으나, 탈과립화하는 CD8+ 및 CD8- 세포의 능력은 확장 단계 동안 사용되는 사이토카인 칵테일에 의해 크게 영향을 받지 않는다. CD8+ 세포에 의한 IL-2 의 생성은 IL-2 + 항-IL-4 와 비교하여 IL-12 + 항-IL-4 의 존재 하에 상당히 더 나빴으며 (P > 0.05), IL-12 는 일반적으로 IL-2 생성을 감소시켰으나 IL-7 및 IL-15 의 존재에 의해 구제된다 (도 12B). IL-2 가 후속 IL-2 생성에 대한 부정적 영향임과 관련하여 CD8- 세포에서 동일한 관찰이 이루어졌다 (도 13B). TNFα 생성은 특히 IL2 + IL-4 와 비교시 (p > 0.05) IL-2 + IL-12 + IL-7 + IL-15 + 항-IL-4 와 인큐베이션된 세포에서 최적이었고 (도 12C), TNFα 생성은 CD8- 세포에서 외견상 영향을 받지 않았다 (도 13C). 마지막으로, CD8+ 세포에 의한 IFNγ 생성은 특히 IL-2 + IL-12 + 항-IL-4 처리된 세포 (p > 0.05), 및 IL-2 + IL12 + IL-7 + IL-15 (p > 0.05) 처리된 세포와 비교하여 IL-2 + IL-4 와의 선행 배양에 의해 가장 부정적인 영향을 받았다 (도 12D).
요약하여, TH2 편중 조건은 양자 세포 치료요법의 관점에서 T-세포 표현형 및 활성의 많은 양태에 부정적 영향을 가져, 일반적으로 더 많은 CD4+ 세포, 더 많은 EM 세포 및 다클론 자극에 대한 더 낮은 반응을 초래한다. 반대로, TH2 차단 시약을 첨가한 TH1 편중 사이토카인의 조합은 다클론 자극에 반응하여 증가된 CD8+ 빈도, 더 큰 CM 비율 및 향상된 활성을 포함하는 양자 T-세포 치료요법과 연관된 특징을 향상시킨다.
실시예 4
표현형 및 기능에 대한 TIL 성장 과정 전반에 걸친 조절성 사이토카인의 연속 투여의 영향을 결정하였다. 9 명의 공여자로부터의 TIL 은 IL-2 (3000 IU/ml) 에서 초기 외성장 및 신속 확장 프로토콜 전반에 걸쳐 성장시켰다 (IL-12 초기 투여 (25 ng/ml) 로의 IL-2, 또는 IL-12 초기 투여 (25 ng/ml) 로의 IL-2, 이후 IL-7 및 IL-15 로의 전환 (둘 모두 10 ng/ml)). TIL 성장 후, 세포를 CD4/CD8 세포 뿐만 아니라 중심/효과기 기억의 존재에 대해 표현형화하였다. IL-2, IL-12, IL-7 및 IL-15 의 칵테일과의 인큐베이션은 IL-2 단독과 비교하여 CD4+ 세포 뿐만 아니라 CD4+/CD8+ 세포의 비율을 유의하게 증가시켰고, 동시에 CD4-/CD8- 세포의 비율을 감소시켰다 (도 14). IL-7/15 의 존재 또는 부재 하의 사이토카인 IL-12 을 함유하는 동시배양물은 또한 IL-2 단독으로 배양된 세포와 비교하여 중심 기억 (CD45RO+/CD62L+) 의 비율을 유의하게 증가시킨 반면, IL-2 및 IL-12 의 조합은 효과기 기억 (CD45RO+/CD62L-) 세포의 비율을 유의하게 감소시켰다 (도 15).
그런 다음, 공여자 TIL 중 5 개를 OKT3 발현 K562 세포와 동시배양하고, 유세포 분석을 사용하여 다양한 효과기 기능 (IFNγ, IL-2, TNFα 및 CD107a) 을 이끌어낼 수 있는 세포의 비율을 평가하였다. CD8+ 집단 내에서 IFNγ, TNFα, IL-2 또는 CD107a 를 생성하는 세포의 비율에서 차이가 관찰되지 않았다 (도 16A). CD8- (주로 CD4+ 세포) 에서, IL-2 및 IL-12 단독과 비교하여 IL-2, IL-12, IL-7 및 IL-15 에서 배양된 세포에서 IL-2 및 CD107a 동원의 감소된 빈도가 관찰되었다 (도 16B).
공여자 TIL 중 3 개를 또한 매치된 자기유래 종양 세포주와 동시배양하여, 동일한 환자로부터의 매치된 종양에 대한 반응에 대한 배양 조건의 영향을 평가하였다. 예상한 바와 같이, 매칭된 세포주에 대한 반응은 다클론 자극을 제공하는 K563-OKT3 에 대한 반응과 비교하여 훨씬 더 낮은데, CD107a 는 가장 쉽게 관찰된 기능적 판독이다. IL-2 + IL-12 에서 성장시킨 세포가 IL-2, IL-12, IL-7 및 IL-15 와 인큐베이션한 것들과 비교하여 유의하게 더 많은 TNFα 를 생성한 CD8+ 세포의 경우를 제외하고, 상이한 배양 조건에서 성장시킨 세포 사이에 유의한 차이가 관찰되지 않았다 (도 17A).
참고문헌
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
본 발명의 양태 및 구현예를 또한 하기 조항에서 나타낸다:
1. 종양 침윤 림프구 (TIL) 치료요법을 거치는 환자의 예후를 위한 시험관내 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
a. 상기 환자로부터의 TIL 의 샘플에서, 후천성 면역 반응의 상태를 나타내는 것인 생물학적 마커 (CD150/SLAM/SLAMF1) 를 정량하는 단계; 및
b. 상기 생물학적 마커 (CD150/SLAM/SLAMF1) 는 암 반응을 나타내는 것인 단계; 및
c. 상기 적어도 하나의 생물학적 마커 (CD150/SLAM/SLAMF1) 에 대해 단계 a) 에서 수득한 값을 동일한 생물학적 마커에 대한 선결 참조 값과 비교하는 단계로서; 이에 대해 상기 암의 특이적 예후 또는 진행과 상관관계가 있는 선결 참조 값이 존재하는 단계.
2. 조항 1 에 있어서, 상기 종양 조직 샘플이 (i) 원발성 종양, (ii) 전이성 종양 병변, (iii) 상기 환자로부터의 종양 병변 중 하나에 가장 근접하게 위치한 림프절로 이루어지는 군에서 기원하는 것인 시험관내 방법.
3. 조항 1 에 있어서, 단계 a) 가 유세포 분석을 사용하여 수행되는 것인 시험관내 방법.
4. 조항 1 에 있어서, 단계 a) 가 상기 생물학적 마커 (CD150/SLAM/SLAMF1) 의 값을 평가하는 대안적인 직접 또는 간접 방법을 사용하여 수행되고, 상기 방법이 상기 적어도 하나의 생물학적 마커 (CD150/SLAM/SLAMF1) 에 대해 단계 a) 에서 수득한 값을 비교하여 동일한 생물학적 마커에 대한 선결 참조 값의 결정을 가능하게 하며; 이에 대해 상기 암의 특이적 예후 또는 진행과 상관관계가 있는 선결 참조 값이 존재하는 시험관내 방법.
5. 조항 1 에 있어서, 상기 생물학적 마커 (CD150/SLAM/SLAMF1) 가 림프구에 의해 발현되는 것인 시험관내 방법.
6. 조항 1 에 있어서, 상기 환자 암에 대한 상기 환자의 후천성 면역 반응의 상황을 나타내는 것인 상기 생물학적 마커 (CD150/SLAM/SLAMF1) 가 T 림프구, NK 세포, NKT 세포, γδ T-세포, CD4+ 세포 및/또는 CD8+ 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 면역계로부터의 세포에 의해 발현되는 적어도 하나의 생물학적 마커로 이루어지는 것인 시험관내 방법.
7. 조항 1 에 있어서, 상기 생물학적 마커가 SLAM (CD150) 인 시험관내 방법.
8. 조항 1 에 있어서, 상기 생물학적 마커 (CD150/SLAM/SLAMF1) 가 하기 샘플 중 하나에서 정량되는 것인 시험관내 방법: (i) 종양의 단일 세포 현탁액, (ii) 종양 침윤 림프구의 배양 동안 임의의 시점에서 종양의 단일 세포 현탁액으로부터 수득한 물질의 샘플, (iii) 상기 환자에게 주입하기 위해 발급될 최종 생성물.
9. 하기 선택 기법 중 하나 이상을 사용하여 진단적으로 유리한 수준의 상기 생물학적 마커 (CD150/SLAM/SLAMF1) 를 발현하는 세포를 선택하는 시험관내 방법: (i) 유세포 분석, (ii) 항체 패닝, (iii) 자기 선택, (iv) 바이오마커 표적화 세포 농화.
10. 조항 9 에 있어서, 상기 생물학적 마커 (CD150/SLAM/SLAMF1) 를 발현하는 세포가 하기 옵션 중 하나 또는 둘 모두에 의해 확장되는 것인 시험관내 방법:
c) 항체 또는 공동자극 수용체에 의해 유도된 T-세포 활성화 신호 및 공동자극을 제공하도록 하는 방식으로의 조사된 피더 세포; 및
d) 상기 하나 이상의 생물학적 마커를 통해 유도된 T-세포 활성화 신호 및 공동자극 신호를 제공하는 고정화된 또는 가용성 시약.
11. 하나 이상의 림프구에서 상기 생물학적 마커 (CD150/SLAM/SLAMF1) 를 발현시키는 시험관내 방법.
12. 조항 11 에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터.
13. 조항 11 에 따른 폴리펩티드를 발현하는 세포.
14. 조항 12 에 따른 벡터로 세포를 형질도입 또는 형질감염시키는 단계를 포함하는, 조항 11 에 따른 세포의 제작 방법.
15. 조항 12 에 있어서, 관심 이식유전자가 또한 키메라 항원 수용체, T-세포 수용체 또는 양자 세포 치료요법에 면역치료학적으로 사용하기 위한 또 다른 수용체를 인코딩하여, 벡터가 표적 세포를 형질도입하는데 사용되는 경우 표적 세포가 조항 13 에 따른 폴리펩티드 및 키메라 항원 수용체, T-세포 수용체 또는 면역치료학적 관심 대상인 또 다른 수용체를 동시발현하는 것인 벡터. 명백하게, 이러한 추가적인 폴리펩티드 인코딩된 단백질은 관심 단백질 (POI) 로 지칭된다.
16. POI 를 발현하는 세포를 선택하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
I. 조항 15 에 따른 벡터로 형질감염 또는 형질도입된 세포 표면 상의 POI 에피토프의 발현을 검출하는 단계; 및
II. POI 에피토프를 발현하는 것으로서 확인되는 세포를 농화하는 단계.
17. POI 를 발현하는 세포가 농화된 세포의 정제된 집단을 제조하는 방법으로서, 조항 16 에 따른 방법을 사용하여 세포 집단으로부터 POI 를 발현하는 세포를 선택하는 단계를 포함하는 방법.
18. 조항 1 에 따른 폴리펩티드를 발현하는 세포가 농화되며, 따라서 POI 를 발현하는 세포가 농화되는 세포 집단.
19. 생체내에서 형질도입된 세포를 추적하는 방법으로서, 세포 표면에서 조항 1 에 따른 폴리펩티드의 발현을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
20. 대상체에서 질환을 치료하는 방법으로서, 조항 12-14 중 어느 하나에 따른 세포, 또는 조항 18 에 따른 세포 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
* * *
본 발명의 상세한 바람직한 구현예를 이렇게 설명하였지만, 상기 단락에 의해 정의되는 본 발명은 많은 이의 분명한 변형이 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않고 가능하므로 상기 설명에 기재된 특별한 상세한 설명에 제한되지 않는다는 것이 이해될 것이다.

Claims (91)

  1. 암 치료요법에서 사용하기 위한 종양 반응성 T-세포의 농화되고 확장된 세포 집단을 제조하는 방법으로서, CD150/SLAM/SLAMF1 을 발현하는 세포 집단을 확인 및/또는 수득하고 세포 집단을 확장시키는 것을 포함하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, CD150/SLAM/SLAMF1 을 발현하는 T-세포가 대상체로부터 기원하는 세포에서 선택되는 T-세포인 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, CD150/SLAM/SLAMF1 을 발현하는 T-세포를 선택하는 것이 (i) 유세포 분석, (ii) 항체 패닝 (panning), (iii) 자기 선택, (iv) 바이오마커 표적화 세포 농화 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, T-세포를 선택하는 것이 세포 집단을 항-CD150/SLAM/SLAMF1 항체와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 확장시키는 것이 하기를 포함하는 것인 방법:
    a. 피더 세포를 조사하고 항-CD150/SLAM/SLAMF1 항체 및 임의로는 하나 이상의 사이토카인으로 공동자극시킴; 또는
    b. CD150/SLAM/SLAMF1 을 자극하거나 활성화시킴; 또는
    c. 적어도 1x109 또는 적어도 5x109 또는 적어도 1x1010 세포가 수득될 때까지 세포를 조사된 피더 세포 및 하나 이상의 사이토카인과 혼합하는 것인 신속 확장 프로토콜 (REP).
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단이 하기의 것인 방법:
    a. 종양 생검, 림프절 또는 복수로부터의 종양 침윤 림프구 (TIL) 의 집단; 및/또는
    b. CAR 및/또는 TCR 을 발현하도록 조작된 T-세포의 집단;
    c. 혈액으로부터 단리된 T-세포의 집단.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 흑색종, 폐암, 편평 세포암, 복막암, 간세포암, 위장관암을 포함하는 위암 또는 위장암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막암 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암 또는 신암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 두부암 또는 경부암인 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 암 치료요법이 양자 세포 치료요법인 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, SLAM 생성을 증가시키는 조절제에 T-세포를 노출시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 조절제가 사이토카인을 포함하는 것인 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 사이토카인이 IL-2, IL-15, IL-18, IL-12, IL-23, IL-27, IL-35, IL-39, IL-18, IL-36, IL-37, IL-38, IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마 또는 이의 조합인 방법.
  12. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 조절제가 IL-7 + IL-15, IL-2 + IL-7 + IL-15, IL-2 + IL-12, IL-2 + IL-18, IL-2 + IL-12 + IL-7 + IL-15, IL-2 + IL-12 + IL-7 + IL-15 + IL-6, IL-2 + IL-12 + IL-7 + IL-15 + IL-21, IL-2 + IL-12 + IL-7 + IL-15 + IL-6 + IL-21, IL-7 + IL-15 + IL-6, IL-7 + IL-15 + IL-21, IL-7 + IL-15 + IL-6 + IL-21, IL-2 + IL-12 + IL-6, IL-2 + IL-12 + IL-21, 또는 IL-2 + IL-12 + IL-6 + IL-21 의 사이토카인 조합인 방법.
  13. 제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 조절제가 Th2 차단제를 추가로 포함하는 것인 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, Th2 차단제가 항체인 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 항체가 항-IL-4 (αIL4), 항-IL-4R (αIL4R), 항-IL-5R (αIL5R), 항-IL-5 (αIL5), 항-IL13R (αIL13R) 또는 항-IL13 (αIL13) 에서 선택되는 것인 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 항체가 메폴리주맙, 레실리주맙, 벤랄리주맙, 트랄로키누맙, 레브리키주맙 또는 두필루맙에서 선택되는 것인 방법.
  17. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, 조절제가 IL-2 + αIL4 를 포함하는 것인 방법.
  18. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, 조절제가 IL-2 + IL-12 + αIL4 를 포함하는 것인 방법.
  19. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, 조절제가 IL-2 + IL-12 + IL-7 + IL-15 + αIL4 를 포함하는 것인 방법.
  20. 제 11 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, IL-12 가 확장 단계에서 1-150 ng/ml 으로 1-96 시간 동안 간단히 첨가되고, 이후 또 다른 사이토카인으로 대체되는 것인 방법.
  21. 제 10 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인이 인공적 항원 제시 세포에 의해 생성되고 종양 반응성 T 세포가 항원 제시 세포와 함께 공동배양되는 것인 방법.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단이 단리되고, CD150/SLAM/SLAMF1 생성을 증가시키는 조절제와 함께 배양되고, 배양된 세포가 미선택된 세포로부터 분리되는 것인 방법.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 또 다른 약물 또는 사이토카인의 결합시 사이토카인 신호전달을 제공하는 사이토카인 수용체를 발현하도록 조작되는 것인 방법.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 CD4+ 또는 CD8+ T 세포인 방법.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득한 세포 집단.
  26. 제 25 항에 있어서, 암 치료에서 사용하기 위한 세포 집단.
  27. 암 치료에서 사용하기 위한 CD150/SLAM/SLAMF1 을 발현하는 종양 반응성 T-세포의 농화되고 확장된 세포 집단.
  28. 제 25 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 집단이 T-세포를 포함하고, >25%, >30% 또는 >40% 의 T-세포가 CD150/SLAM/SLAMF1 을 발현하는 것인 세포 집단.
  29. 제 25 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 TIL 인 세포 집단.
  30. 제 25 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 따른 세포 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 양자 세포 치료요법의 방법으로서, T-세포가 자기유래 또는 동종이계인 방법.
  31. 대상체에서의 암을 치료하는 방법으로서, 제 25 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 따른 세포 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  32. 제 25 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 따른 세포 집단을 포함하는 약학 조성물.
  33. 제 32 항에 있어서, 암 치료에서 사용하기 위한 약학 조성물.
  34. 세포 집단의 종양 반응성을 평가하는 방법으로서, 세포 집단에서 SLAM/SLAMF1/CD150 을 발현하는 T-세포의 비율을 정량하는 것을 포함하는 방법.
  35. 제 34 항에 있어서, 세포 집단이 i) 환자로부터의 TIL 및 SLAM/SLAMF1/CD150 을 발현하는 T-세포가 사전-REP 및/또는 사후-REP 로 정량되는 것이거나; ii) 외인성 CAR 및/또는 TCR 을 발현하도록 조작된 T-세포의 집단인 방법.
  36. 제 34 항 또는 제 35 항에 있어서, SLAM/SLAMF1/CD150 을 발현하는 T-세포의 비율이 세포 집단의 적어도 25% 인 것은 세포 집단이 종양 반응성임을 나타내는 것인 방법.
  37. 하기 단계를 포함하는, 양자 세포 치료요법에서 사용하기 위한 T 세포의 단리된 생체외 확장에서 SLAM/SLAMF1/CD150 발현을 증가시키는 작용제를 확인하는 방법:
    a. 종양-침윤 림프구를 T 세포에서 SLAM 의 발현을 상향조절하는 후보 조절제와 접촉시키는 단계;
    b. 세포에서 SLAM 의 발현에 대한 조절제의 효과를 스크리닝하는 단계; 및
    c. 세포에서 SLAM 의 발현을 증가시키는 조절제를 확인하는 단계.
  38. 제 37 항에 있어서, T 세포가 CD4+ 또는 CD8+ T 세포인 방법.
  39. 하기 단계를 포함하는, 암에 대해 종양 침윤 림프구 (TIL) 치료요법을 받을 수 있는 환자의 예후를 위한 시험관내 방법:
    a. 상기 환자로부터의 종양 소화 샘플, 생산 과정 동안의 TIL 물질 또는 TIL 생성물에서, TIL 상의 적어도 하나의 생물학적 마커를 정량하는 단계; 및
    b. 상기 적어도 하나의 생물학적 마커에 대해 단계 a) 에서 수득한 값을 동일한 생물학적 마커에 대한 선결 참조 값과 비교하는 단계로서; 선결 참조 값은 상기 암의 진행의 특이적 예후와 상관관계가 있는 것인 단계.
  40. 제 39 항에 있어서, 적어도 하나의 생물학적 마커가 SLAM/SLAMF1/CD150 인 방법.
  41. CD150/SLAM/SLAMF1 을 발현하는 세포 집단을 확인 및/또는 수득하고, 세포 집단을 확장시키고, 세포 집단으로부터의 세포를 이를 필요로 하는 암 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 종양 반응성 T-세포의 농화되고 확장된 세포 집단을 제조하는 것을 포함하는 암 치료 방법.
  42. 제 41 항에 있어서, CD150/SLAM/SLAMF1 을 발현하는 T-세포가 대상체로부터 기원하는 세포에서 선택되는 T-세포인 방법.
  43. 제 41 항 또는 제 42 항에 있어서, CD150/SLAM/SLAMF1 을 발현하는 T-세포를 선택하는 것이 (i) 유세포 분석, (ii) 항체 패닝, (iii) 자기 선택, (iv) 바이오마커 표적화 세포 농화 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  44. 제 41 항 또는 제 42 항에 있어서, T-세포를 선택하는 것이 세포 집단을 항-CD150/SLAM/SLAMF1 항체와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  45. 제 41 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서, 확장시키는 것이 하기를 포함하는 것인 방법:
    a. 피더 세포를 조사하고 항-CD150/SLAM/SLAMF1 항체 및 임의로는 하나 이상의 사이토카인으로 공동자극시킴; 또는
    b. CD150/SLAM/SLAMF1 을 자극하거나 활성화시킴; 또는
    c. 적어도 1x109 또는 적어도 5x109 또는 적어도 1x1010 세포가 수득될 때까지 세포를 조사된 피더 세포 및 하나 이상의 사이토카인과 혼합하는 것인 신속 확장 프로토콜 (REP).
  46. 제 41 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단이 하기의 것인 방법:
    a. 종양 생검, 림프절 또는 복수로부터의 종양 침윤 림프구 (TIL) 의 집단; 및/또는
    b. CAR 및/또는 TCR 을 발현하도록 조작된 T-세포의 집단;
    c. 혈액으로부터 단리된 T-세포의 집단.
  47. 제 41 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 흑색종, 폐암 또는 난소암인 방법.
  48. 제 41 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서, 암 치료요법이 양자 세포 치료요법인 방법.
  49. 제 41 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서, SLAM 생성을 증가시키는 조절제에 T-세포를 노출시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  50. 제 49 항에 있어서, 조절제가 사이토카인을 포함하는 것인 방법.
  51. 제 50 항에 있어서, 사이토카인이 IL-2, IL-15, IL-18, IL-12, IL-23, IL-27, IL-35, IL-39, IL-18, IL-36, IL-37, IL-38, IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마 또는 이의 조합인 방법.
  52. 제 50 항 또는 제 51 항에 있어서, 조절제가 IL-7 + IL-15, IL-2 + IL-7 + IL-15, IL-2 + IL-12, IL-2 + IL-18, IL-2 + IL-12 + IL-7 + IL-15, IL-2 + IL-12 + IL-7 + IL-15 + IL-6, IL-2 + IL-12 + IL-7 + IL-15 + IL-21, IL-2 + IL-12 + IL-7 + IL-15 + IL-6 + IL-21, IL-7 + IL-15 + IL-6, IL-7 + IL-15 + IL-21, IL-7 + IL-15 + IL-6 + IL-21, IL-2 + IL-12 + IL-6, IL-2 + IL-12 + IL-21, 또는 IL-2 + IL-12 + IL-6 + IL-21 의 사이토카인 조합인 방법.
  53. 제 49 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서, 조절제가 Th2 차단제를 추가로 포함하는 것인 방법.
  54. 제 53 항에 있어서, Th2 차단제가 항체인 방법.
  55. 제 54 항에 있어서, 항체가 항-IL-4 (αIL4), 항-IL-4R (αIL4R), 항-IL-5R (αIL5R), 항-IL-5 (αIL5), 항-IL13R (αIL13R) 또는 항-IL13 (αIL13) 에서 선택되는 것인 방법.
  56. 제 55 항에 있어서, 항체가 메폴리주맙, 레실리주맙, 벤랄리주맙, 트랄로키누맙, 레브리키주맙 또는 두필루맙에서 선택되는 것인 방법.
  57. 제 54 항 또는 제 55 항에 있어서, 조절제가 IL-2 + αIL4 를 포함하는 것인 방법.
  58. 제 54 항 또는 제 55 항에 있어서, 조절제가 IL-2 + IL-12 + αIL4 를 포함하는 것인 방법.
  59. 제 54 항 또는 제 55 항에 있어서, 조절제가 IL-2 + IL-12 + IL-7 + IL-15 + αIL4 를 포함하는 것인 방법.
  60. 제 51 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, IL-12 가 확장 단계에서 1-150 ng/ml 으로 1-96 시간 동안 간단히 첨가되고, 이후 또 다른 사이토카인으로 대체되는 것인 방법.
  61. 제 49 항 내지 제 60 항 중 어느 한 항에 있어서, 조절제가 인공적 항원 제시 세포에 의해 생성되고 종양 반응성 T 세포가 항원 제시 세포와 함께 공동배양되는 것인 방법.
  62. 제 41 항 내지 제 61 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단이 단리되고, CD150/SLAM/SLAMF1 생성을 증가시키는 조절제와 함께 배양되고, 배양된 세포가 미선택된 세포로부터 분리되는 것인 방법.
  63. 제 41 항 내지 제 62 항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 또 다른 약물 또는 사이토카인의 결합시 사이토카인 신호전달을 제공하는 사이토카인 수용체를 발현하도록 조작되는 것인 방법.
  64. 세포 집단으로부터의 세포를 이를 필요로 하는 암 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암 치료에서 사용하기 위한 종양 반응성 T-세포의 농화되고 확장된 세포 집단으로서, 세포 집단이 CD150/SLAM/SLAMF1 을 발현하는 세포 집단을 확인 및/또는 수득하고, 세포 집단을 확장시키는 것을 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 세포 집단.
  65. 제 64 항에 있어서, CD150/SLAM/SLAMF1 을 발현하는 T-세포가 대상체로부터 기원하는 세포에서 선택되는 T-세포인, 암 치료에서 사용하기 위한 종양 반응성 T-세포의 농화되고 확장된 세포 집단.
  66. 제 64 항 또는 제 65 항에 있어서, CD150/SLAM/SLAMF1 을 발현하는 T-세포를 선택하는 것이 (i) 유세포 분석, (ii) 항체 패닝, (iii) 자기 선택, (iv) 바이오마커 표적화 세포 농화 중 하나 이상을 포함하는 것인, 암 치료에서 사용하기 위한 종양 반응성 T-세포의 농화되고 확장된 세포 집단.
  67. 제 64 항 또는 제 65 항에 있어서, T-세포를 선택하는 것이 세포 집단을 항-CD150/SLAM/SLAMF1 항체와 접촉시키는 것을 포함하는 것인, 암 치료에서 사용하기 위한 종양 반응성 T-세포의 농화되고 확장된 세포 집단.
  68. 제 64 항 내지 제 67 항 중 어느 한 항에 있어서, 확장시키는 것이 하기를 포함하는 것인, 암 치료에서 사용하기 위한 종양 반응성 T-세포의 농화되고 확장된 세포 집단:
    a. 피더 세포를 조사하고 항-CD150/SLAM/SLAMF1 항체 및 임의로는 하나 이상의 사이토카인으로 공동자극시킴; 또는
    b. CD150/SLAM/SLAMF1 을 자극하거나 활성화시킴; 또는
    c. 적어도 1x109 또는 적어도 5x109 또는 적어도 1x1010 세포가 수득될 때까지 세포를 조사된 피더 세포 및 하나 이상의 사이토카인과 혼합하는 것인 신속 확장 프로토콜 (REP).
  69. 제 64 항 내지 제 68 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단이 하기의 것인, 암 치료에서 사용하기 위한 종양 반응성 T-세포의 농화되고 확장된 세포 집단:
    a. 종양 생검, 림프절 또는 복수로부터의 종양 침윤 림프구 (TIL) 의 집단; 및/또는
    b. CAR 및/또는 TCR 을 발현하도록 조작된 T-세포의 집단;
    c. 혈액으로부터 단리된 T-세포의 집단.
  70. 제 64 항 내지 제 69 항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 흑색종, 폐암, 편평 세포암, 복막암, 간세포암, 위장관암을 포함하는 위암 또는 위장암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막암 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암 또는 신암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 두부암 또는 경부암인, 암 치료에서 사용하기 위한 종양 반응성 T-세포의 농화되고 확장된 세포 집단.
  71. 제 64 항 내지 제 70 항 중 어느 한 항에 있어서, 암 치료가 양자 세포 치료요법인, 암 치료에서 사용하기 위한 종양 반응성 T-세포의 농화되고 확장된 세포 집단.
  72. 제 64 항 내지 제 71 항 중 어느 한 항에 있어서, SLAM 생성을 증가시키는 조절제에 T-세포를 노출시키는 것을 추가로 포함하는, 암 치료에서 사용하기 위한 종양 반응성 T-세포의 농화되고 확장된 세포 집단.
  73. 제 72 항에 있어서, 조절제가 사이토카인을 포함하는 것인, 암 치료에서 사용하기 위한 종양 반응성 T-세포의 농화되고 확장된 세포 집단.
  74. 제 73 항에 있어서, 사이토카인이 IL-2, IL-15, IL-18, IL-12, IL-23, IL-27, IL-35, IL-39, IL-18, IL-36, IL-37, IL-38, IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마 또는 이의 조합인, 암 치료에서 사용하기 위한 종양 반응성 T-세포의 농화되고 확장된 세포 집단.
  75. 제 73 항 또는 제 74 항에 있어서, 조절제가 IL-7 + IL-15, IL-2 + IL-7 + IL-15, IL-2 + IL-12, IL-2 + IL-18, IL-2 + IL-12 + IL-7 + IL-15, IL-2 + IL-12 + IL-7 + IL-15 + IL-6, IL-2 + IL-12 + IL-7 + IL-15 + IL-21, IL-2 + IL-12 + IL-7 + IL-15 + IL-6 + IL-21, IL-7 + IL-15 + IL-6, IL-7 + IL-15 + IL-21, IL-7 + IL-15 + IL-6 + IL-21, IL-2 + IL-12 + IL-6, IL-2 + IL-12 + IL-21, 또는 IL-2 + IL-12 + IL-6 + IL-21 의 사이토카인 조합인, 암 치료에서 사용하기 위한 종양 반응성 T-세포의 농화되고 확장된 세포 집단.
  76. 제 72 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 있어서, 조절제가 Th2 차단제를 추가로 포함하는 것인, 암 치료에서 사용하기 위한 종양 반응성 T-세포의 농화되고 확장된 세포 집단.
  77. 제 76 항에 있어서, Th2 차단제가 항체인, 암 치료에서 사용하기 위한 종양 반응성 T-세포의 농화되고 확장된 세포 집단.
  78. 제 77 항에 있어서, 항체가 항-IL-4 (αIL4), 항-IL-4R (αIL4R), 항-IL-5R (αIL5R), 항-IL-5 (αIL5), 항-IL13R (αIL13R) 또는 항-IL13 (αIL13) 에서 선택되는 것인 방법.
  79. 제 78 항에 있어서, 항체가 메폴리주맙, 레실리주맙, 벤랄리주맙, 트랄로키누맙, 레브리키주맙 또는 두필루맙에서 선택되는 것인 방법.
  80. 제 77 항 또는 제 78 항에 있어서, 조절제가 IL-2 + αIL4 를 포함하는 것인, 암 치료에서 사용하기 위한 종양 반응성 T-세포의 농화되고 확장된 세포 집단.
  81. 제 77 항 또는 제 78 항에 있어서, 조절제가 IL-2 + IL-12 + αIL4 를 포함하는 것인, 암 치료에서 사용하기 위한 종양 반응성 T-세포의 농화되고 확장된 세포 집단.
  82. 제 77 항 또는 제 78 항에 있어서, 조절제가 IL-2 + IL-12 + IL-7 + IL-15 + αIL4 를 포함하는 것인, 암 치료에서 사용하기 위한 종양 반응성 T-세포의 농화되고 확장된 세포 집단.
  83. 제 74 항 내지 제 82 항 중 어느 한 항에 있어서, IL-12 가 확장 단계에서 1-150 ng/ml 으로 1-96 시간 동안 간단히 첨가되고, 이후 또 다른 사이토카인으로 대체되는 것인, 암 치료에서 사용하기 위한 종양 반응성 T-세포의 농화되고 확장된 세포 집단.
  84. 제 64 항 내지 제 83 항 중 어느 한 항에 있어서, 조절제가 인공적 항원 제시 세포에 의해 생성되고 종양 반응성 T 세포가 항원 제시 세포와 함께 공동배양되는 것인, 암 치료에서 사용하기 위한 종양 반응성 T-세포의 농화되고 확장된 세포 집단.
  85. 제 64 항 내지 제 83 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단이 단리되고, CD150/SLAM/SLAMF1 생성을 증가시키는 조절제와 함께 배양되고, 배양된 세포가 미선택된 세포로부터 분리되는 것인, 암 치료에서 사용하기 위한 종양 반응성 T-세포의 농화되고 확장된 세포 집단.
  86. 제 64 항 내지 제 85 항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 또 다른 약물 또는 사이토카인의 결합시 사이토카인 신호전달을 제공하는 사이토카인 수용체를 발현하도록 조작되는 것인, 암 치료에서 사용하기 위한 종양 반응성 T-세포의 농화되고 확장된 세포 집단.
  87. 제 64 항 내지 제 87 항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 CD4+ 또는 CD8+ T 세포인, 암 치료에서 사용하기 위한 종양 반응성 T-세포의 농화되고 확장된 세포 집단.
  88. T 세포를 사이토카인에 노출시키는 것을 포함하는 암 치료요법에서 사용하기 위한 종양 반응성 T-세포의 농화되고 확장된 세포 집단을 제조하는 방법에서 CD150/SLAM/SLAMF1 의 발현을 증가시키는데 있어서의 사이토카인의 용도.
  89. 제 88 항에 있어서, 사이토카인이 Th2 차단제와 조합으로 사용되는 것인 사이토카인의 용도.
  90. CD150/SLAM/SLAMF1 을 발현하는 세포 집단을 확인 및/또는 수득하고, CD150/SLAM/SLAMF1 의 발현을 증가시키는 사이토카인의 존재 하에 세포 집단을 확장시키는 것을 포함하는 암 치료요법에서 사용하기 위한 종양 반응성 T-세포에서 CD150/SLAM/SLAMF1 의 발현을 증가시키는 방법.
  91. 제 90 항에 있어서, 사이토카인이 Th2 차단제와 조합으로 사용되는 것인 방법.
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