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KR20220038594A - 항-hvem 항체 및 이의 사용 - Google Patents

항-hvem 항체 및 이의 사용 Download PDF

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KR20220038594A
KR20220038594A KR1020217038056A KR20217038056A KR20220038594A KR 20220038594 A KR20220038594 A KR 20220038594A KR 1020217038056 A KR1020217038056 A KR 1020217038056A KR 20217038056 A KR20217038056 A KR 20217038056A KR 20220038594 A KR20220038594 A KR 20220038594A
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South Korea
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hvem
cell
antibody
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seq
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KR1020217038056A
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에얄 그린버그
길리 가로레-하스켈
에프라 멜하비-쇼함
갈 마르켈
야코브 샤흐테르
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포씨 바이오메드 리미티드
텔 하쇼머 메디컬 리서치 인프라스트럭쳐 앤드 서비시스 리미티드．
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Publication date
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Abstract

HVEM에 결합하고, HVEM-BTLA 상호작용을 저해하며, 하류 HVEM 신호전달의 활성화하는 제제를 제공한다. 이러한 제제에 의한 질병의 치료 방법 및 상기 제제를 포함하는 키트도 또한 제공된다.

Description

항-HVEM 항체 및 이의 사용
관련 출원에 대한 교차 참조　
본 출원은 2020년 1월 26일 제출된 미국 임시 특허 출원 제62/965,921호, 및 2019년 4월 29일 제출된 미국 임시 특허 출원 제62/839,841호에 대해 우선권의 이익을 주장하며, 상기 문헌들의 내용은 본원에 전문이 참조로서 포함된다.
발명의 기술 분야
본 발명은 면역치료 분야에 속한다.
면역 반응을 향상시키도록 디자인된 면역치료는 면역치료를 활성화시키는 것으로 고려되며, 암 치료의 중심에 있다. 최근, 면역 관문 차단 치료는 진행된 비-소세포 폐암(NSCLC), 전이성 흑색종 및 진행된 신장 세포 암종(RCC)의 치료에 성공적으로 사용되고 있다. 상이한 회사들이 개발하고 제조하는 이러한 몇몇 약물들은, 면역 관문 프로그램화 세포 사멸 단백질 1 수용체(PD1), 프로그램화 세포 사멸 단백질 1 리간드(PDL1) 및 세포독성 T 림프구-관련 단백질 4(CTLA-4)에 대한 항체들을 포함한다. 이들은 상이한 암 타입들에서 매우 유망하였고, FDA에서 승인도 받았다. 그러나, 통상 치료된 환자의 단지 10%~40%만이 잇점을 얻으며, 동시에 환자들은 면역치료제에 의한 치료 이후에 부작용을 겪을 수 있으므로, 환자의 반응률은 여전히 최적이 아니다. 또한, 이러한 제제들에 의한 치료는 추가적인 면역 관문을 상향 조절시켜, 저항성을 유도할 수 있다. 흑색종 환자에서 항-PD1 치료제와 항-CTLA-4 치료제의 조합은, 단일 제제에 비해 더 높은 반응률(60%)을 나타내었다. 그러나, 이러한 조합 치료는 또한 심각한 치료-관련 유해 효과에도 관여한다. 따라서, 새로운 항종양 면역 활성화제에 대한 필요성이 분명히 있다.
헤르페스바이러스 도입 매개자(HVEM)는 조혈 세포와 비-조혈 세포를 포함한 다양한 세포 타입들의 표면에서 발견된 단백질이다.　 HVEM은 표준(canonical) TNF-관련 리간드, 예컨대 LIGHT 및 LTα에 대한 수용체로서 작용하므로, 신호전달 수용체로서 작용한다. 그러나, 이는 또한 면역글로불린(Ig) 슈퍼패밀리 분자, 예컨대 저해성 수용체 BTLA 및 CD160에 대한 리간드로도 작용한다. 따라서, 양방향 신호전달은 HVEM-매개 신호전달 네트워크에서도 가능하여, 상이한 맥락 하에서 양성 또는 음성 면역 반응에 관여할 수 있다. 이 네트워크의 조절장애는 자가면역 질병, 염증성 질병, 뿐만 아니라 암의 발병에 관여하므로, HVEM은 면역치료에 대한 표적이 된다.
본 발명의 요약
본 발명은 HVEM에 결합하고, HVEM-BTLA 상호작용을 저해하며, 하류 BTLA 신호전달을 저해하고, 하류 HVEM 신호전달을 활성화하는 제제를 제공한다. 이러한 제제 및 상기 제제를 포함하는 키트에 의한 질병의 치료 방법도 또한 제공된다.
제1 양태에 의하면, 세포 상의 헤르페스바이러스 도입 매개자(HVEM)에 특이적으로 결합하는 제제가 제공되는데, 이는:
a. HVEM과 B-림프구와 T-림프구 감쇠조절인자(BTLA) 간의 상호작용을 저해하고;
b. 세포 내에서 HVEM을 통한 하류 신호전달을 활성화시킨다.
또 다른 양태에 의하면, 3개의 중쇄 CDR(CDR-H)과 3개의 경쇄 CDR(CDR-L)를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 절편이 제공되는데, 여기에서: CDR-H1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열(SYAMS)을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열(AISGSGGSTYYADSVKG)을 포함하고, CDR-H3는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열(APGDYTAYFDY)을 포함하고, CDR-L1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열(RASQSVSSYLA)을 포함하고, CDR-L2는 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열(GASSRAT)을 포함하고, CDR-L3은 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열(QQYGSSPPYT)을 포함한다.
또 다른 양태에 의하면, 본 발명의 제제, 또는 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 절편, 및 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제(excipient) 또는 어주번트를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
또 다른 양태에 의하면, HVEM 양성 세포를 특징으로 하는 질병 또는 질환의 치료 방법이 제공되는데, 상기 방법은 본 발명의 약학적 조성물을 투여함으로써, 질병 또는 질환을 치료하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에 의하면, HVEM 양성 질병 또는 질환을 치료하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은:
a. HVEM과 BTLA의 상호작용을 저해하는 단계; 및
b. 면역 세포, 질병 세포 또는 상기 둘 다에서 HVEM 신호전달을 활성화하는 단계;를 포함함으로써, HVEM 양성 질병 또는 질환을 치료한다.
또 다른 양태에 의하면, 본 발명의 방법에 의해 치료될 대상체의 적합성을 결정하는 방법이 제공되는데, 대상체로부터 질병 샘플을 얻는 단계, 및 샘플 내 HVEM 수준을 결정하는 단계를 포함하되, 여기에서 HVEM의 양성 발현은 상기 대상체가 본 발명의 치료 방법에 적합하다는 사실을 나타낸다.
또 다른 양태에 의하면, 샘플 내 HVEM을 탐지하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 본 발명의 제제, 또는 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 절편을 샘플과 접촉시킴으로써, HVEM를 탐지하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에 의하면, 본 발명의 약학적 조성물 및 이하의 것들 중 적어도 하나를 포함하는 키트가 제공된다:
a. 항-PD-1/PD-L1 기반 면역치료제;
b. 본 발명의 약학적 조성물이 상기 항-PD-1/PD-L1 기반 면역치료제와 함께 사용하기 위한 것이라는 사실을 명시한 라벨; 및
c. 본 발명의 제제, 또는 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 절편을 탐지하기 위한 2차 탐지 분자.
일부 구현예에 의하면, 상기 제제는 HVEM과 종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 일원 14(TNFSF14) 사이의 상호작용을 실질적으로 저해하지 않는다.
일부 구현예에 의하면, 상기 제제는 HVEM과 CD160, 림포톡신 알파(LTα) 또는 상기 둘 다와의 상호작용을 저해한다.
일부 구현예에 의하면, 상기 제제는 세포에 의해 발현된 HVEM에 결합할 때, HVEM을 발현하는 세포의 어팝토시스를 직접 유도하지 않는다.
일부 구현예에 의하면, 상기 제제는 항체 또는 이의 항원 결합 절편이다.
일부 구현예에 의하면, 본 발명의 제제는 IgG2, IgG4 또는 세포에 대해 세포독성이 아닌 변형된 IgG1 또는 IgG3을 포함한다.
일부 구현예에 의하면, 상기 제제는 단쇄 항체(scFv)이다.
일부 구현예에 의하면, HVEM을 통한 하류 신호전달은 활성화된 B 세포의 핵 인자 카파-경쇄 인핸서(NF-kB) 매개의 전사를 포함한다.
일부 구현예에 의하면, HVEM을 통한 하류 신호전달은 HVEM을 발현하는 면역 세포의 세포독성의 증가를 포함한다.
일부 구현예에 의하면, 세포독성의 증가는 전염증성 사이토카인의 분비의 증가를 포함한다.
일부 구현예에 의하면, 세포는 면역 세포이고, 신호전달은 면역 활성화를 유도한다.
일부 구현예에 의하면, 면역 세포는 종양 침윤 림프구(TIL) 또는 말초혈 단핵 세포(PBMC)이다.
일부 구현예에 의하면, 세포는 암 세포이고, 신호전달은 항-종양 효과를 포함한다.
일부 구현예에 의하면, 본 발명의 제제는 HVEM를 발현하는 질병 세포를 특징으로 하는 질병의 치료에 사용하기 위한 것이다.
일부 구현예에 의하면, 질병은 HVEM 양성 암 또는 전암성 병변이다.
일부 구현예에 의하면, HVEM 양성 암은 흑색종, 신장암, 자궁경부암, 전립선암, 췌장암, 폐암, 난소암, 결장암, 유방암 및 두경부암으로부터 선택된다.
일부 구현예에 의하면, 질병은 감염성 질병이고, 여기에서 감염된 세포는 HVEM 발현을 포함한다.
일부 구현예에 의하면, 항체 또는 이의 항원 결합 절편은 3개의 중쇄 CDR(CDR-H)과 3개의 경쇄 CDR(CDR-L)를 포함하는데, 여기에서: CDR-H1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열(SYAMS)을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열(AISGSGGSTYYADSVKG)을 포함하고, CDR-H3는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열(APGDYTAYFDY)을 포함하고, CDR-L1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열(RASQSVSSYLA)을 포함하고, CDR-L2는 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열(GASSRAT)을 포함하고, CDR-L3는 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열(QQYGSSPPYT)을 포함한다.
일부 구현예에 의하면, 본 발명의 제제는 서열 QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAPGDYTAYFDYWGQGTLVTVSS(서열번호 7)을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 구현예에 의하면, 본 발명의 제제는 서열 ELVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPPYTFGQGTKVEIK(서열번호 8)을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에 의하면, 본 발명의 제제는 서열 MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAPGDYTAYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(서열번호 9)을 포함하는 중쇄와, 서열 MGWSCIILFLVATATGVHSELVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열번호 10)을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에 의하면, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 절편은 서열 QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAPGDYTAYFDYWGQGTLVTVSS(서열번호 7)을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 구현예에 의하면, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 절편은 서열 ELVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPPYTFGQGTKVEIK(서열번호 8)을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에 의하면, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 절편은 서열 MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAPGDYTAYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(서열번호 9)을 포함하는 중쇄와, 서열 MGWSCIILFLVATATGVHSELVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열번호 10)을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에 의하면, 본 발명의 방법은 항-PD-1/PD-L1 기반 면역치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에 의하면, 본 발명의 방법은 적응 세포 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에 의하면, 상기 적응 세포 치료제는 적응 TIL 치료제를 포함한다.
일부 구현예에 의하면, 적응 세포 치료는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 면역 세포를 투여하는 단계를 포함하되, 여기에서 상기 CAR은 HVEM 발현 세포 표면 상의 비-HVEM 단백질을 표적화한다.
일부 구현예에 의하면, 본 발명의 방법은 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 저해하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에 의하면, 본 발명의 방법은 HVEM과 TNFSF14의 상호작용을 실질적으로 저해하지 않는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에 의하면, 질병 또는 질환은 HVEM 양성 암 또는 전암성 병변이다.
일부 구현예에 의하면, HVEM 양성 암은 흑색종 및 신장 세포 암종으로부터 선택된다.
일부 구현예에 의하면, 질병 또는 질환은 감염성 질병이고, 여기에서 감염된 세포는 HVEM 발현을 포함한다.
일부 구현예에 의하면, 면역 세포는 TIL 또는 PBMC이다.
일부 구현예에 의하면, 면역 세포는 CAR-T 세포이다.
일부 구현예에 의하면, 본 발명의 방법은 본 발명의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에 의하면, HVEM의 양성 발현은 건강한 샘플 또는 소정의 임계치에 비해 상승된 HVEM 수준을 포함한다.
본 발명의 추가 구현예 및 응용가능성의 전체 범주는 본원의 이하에 제공된 상세한 설명으로부터 볼 때 명백할 것이다. 그러나, 당업계의 숙련자들이 볼 때 본 명세서로부터 본 발명의 사상과 범주 내에서 다양한 변화와 변형이 가능하다는 사실이 자명하므로, 상세한 설명과 특정 실시예는, 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내기는 하지만, 단지 예시로서 제시된다고 이해해야 한다.
도 1. HVEM을 과다발현하는 CHO-K1 세포에 대한, scFv를 함유하는 용해물의 결합: 인간 HVEM(CHO-K1 hrHVEM), 마우스 HVEM(CHO-K1 mrHVEM), 게먹이 원숭이(cynomolgus) HVEM(CHO-K1 crHVEM)를 과다발현하는 CHO-K1 세포, 또는 대조군으로서의 빈 벡터(빈-CHO-K1)를　1 시간 동안 얼음에서 HIS-태그 scFv1-6을 함유하는 5 ㎍/㎖의 용해물 또는 대조군 용해물과 함께 배양한 후, 항-HIS APC 항체(R&D Systems, USA) 또는 이소타입(isotype)의 대조군 항체(R&D Systems, USA)에 의해 염색하였다. 발현은 CytoFLEX 장비(Beckman Coulter, USA)를 사용한 유세포 분석, 및 FCS Express 6 소프트웨어(DeNovo Software, US)를 사용한 데이터 분석에 의해 평가하였다. 흑색의 단색 선은 빈-CHO-K1 세포의 백그라운드 염색(즉, 이소타입 대조군 항체)을 나타내고, 회색 점선은 빈-CHO-K1 세포의 특이적인 항체 염색을 나타내고, 흑색 점선은 CHO-K1 hrHVEM 세포의 특이적인 항체 염색을 나타내고, 회색의 단색 선은 CHO-K1 mrHVEM 세포의 특이적인 항체 염색을 나타내고, 흑색 파선은 CHO-K1 crHVEM 세포의 특이적인 항체 염색을 나타낸다.
도 2a~2b. 6개의 scFv의 존재 하에서, (2a) hrBTLA 및 (2b) hrLIGHT에 대한 hrHVEM 결합-ELISA의 막대 그래프.
도 3. scFv2-IgG4(S228P)의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석: 정제된 단백질을 SDS-PAGE(좌측 패널) 및 웨스턴 블롯(우측 패널)에 의해 분석하여, 분자량과 순도를 측정하였다. 래인 M1 및 M2는 단백질 마커를 나타낸다. 래인 1 및 2는 각각 환원 상태 및 비-환원 상태를 나타낸다. 래인 P는 양성 대조군으로서의 인간 IgG1-k를 나타낸다.
도 4a~4b. (4a) ELISA에 의해 측정된, hrHVEM에 결합한 본 발명의 mAb의 막대 그래프. (4b) CHO-K1 세포에 발현된, hrHVEM, mrHVEM 및 crHVEM에 대한 본 발명의 mAb 또는 hIgG4 이소타입 대조군 항체의 결합에 대한 히스토그램. 흑색 및 회색의 단색 선은 각각 hIgG4 이소타입 대조군 항체와 본 발명의 mAb의 백그라운드 염색(즉, 2차 항-비오틴 FITC 항체)을 나타낸다. 회색 점선과 흑색 파선은 각각 hIgG4 이소타입 대조군 항체와, 본 발명의 mAb의 특이적인 항체 염색(즉, 항-인간 IgG Fc 비오틴 항체 + 항-비오틴 FITC 항체)을 나타낸다.
도 5a~5f. (5a) 건강한 인간의 결장 및 비장 조직 샘플에서, 본 발명의 mAb을 사용한 HVEM 염색의 현미경 사진. (5b) 2개의 상이한 흑색종 환자 1차 세포 샘플에 대한 시판용 항-HVEM 항체(R&D Systems AF356)의 결합의 히스토그램. 흑색 및 회색의 단색 선은 각각 백그라운드 염색(즉, 2차 항-마우스 APC 항체) 및 특이적인 항체 염색을 나타낸다. (5c) 3개의 상이한 흑색종 환자 1차 세포 샘플에 대한 본 발명의 mAb의 히스토그램. 단색 선과 파선은 각각 백그라운드 염색(즉, 2차 항-비오틴 FITC 항체) 및 특이적인 항체 염색(즉 항-인간 IgG Fc 비오틴 항체 ＋ 항-비오틴 FITC 항체)을 나타낸다. (5d) 도 5b에서와 동일하게 염색되었으나, 신장 세포 암종(RCC) 환자로부터의 세포에 대한 히스토그램. (5e) 5c에서와 동일하게 염색되었으나, RCC 환자로부터의 세포에 대한 히스토그램. (5f) 본 발명의 mAb를 사용하여 결정된, 다양한 건강한 샘플과 종양 샘플에서의 HVEM 발현에 대한 표. "NA": 조직 코어(tissue core)가 없고/파괴되었기 때문에, "응용가능하지 않음".
도 6a~6d. 본 발명의 mAb 또는 hIgG4 이소타입(isotype) 대조군 항체의 존재 하에서의 (6a) hrBTLA 및 (6b) hrLIGHT에 대한 hrHVEM 결합-ELISA, 및 MAB356 또는 mIgG1 이소타입 대조군 항체의 존재 하에서의 (6c) 시판용 항-HVEM mAb(R&D Systems, MAB356) 및 (6d) hrBTLA에 대한 hrHVEM 결합-ELISA의 막대 그래프.
도 7. 본 발명의 mAb(좌측) 및 대조군 hIgG4(우측)와 함께 사전-배양한 후, 빈 CHO-K1 세포, hrBTLA를 발현하는 CHO-K1 세포와 함께 공동 배양하고, 세포 없이 배양한 후, hrHVEM 및 NF-kB 루시퍼라제 리포터를 발현하는 Jurkat 세포로부터의 루시퍼라제 생산량의 막대 그래프.
도 8. 본 발명의 mAb 또는 hIgG4 이소타입 대조군과 함께 사전-배양되고, 2명의 개별 환자들로부터의 흑색종 세포와 공동-배양한 후의, TIL에 의한 IFNγ 분비를 나타내는 막대 그래프.
도 9a-9e. (9a-b). 자가유래 TIL와 함께 공동 배양하는 동안 다양한 시점에서 얻은, (9a) 첫번째 1차 환자 샘플, (9b) 두번째 1차 환자 샘플로부터의 흑색종 세포, 및 (9c) 1차 환자 샘플의 RCC 세포에서의 특이적인 사멸의 선 그래프. 흑색 원, 백색 사각형, 흑색 삼각형 및 흑색 마름모꼴 선은 각각 hIgG4 이소타입 대조군 항체, 본 발명의 mAb, 항-PD1 mAb 또는 본 발명의 mAb+항-PD1 mAb와의 배양을 나타낸다. (9d~e) 자가유래 TIL와의 공동 배양 동안 다양한 시점에서 얻은, (9d) 본 발명의 mAb 또는 (9e) MAB356과 함께 사전 배양된 1차 환자 샘플로부터의 흑색종 세포의 특이적인 사멸의 선 그래프. 흑색 원과 백색 사각형은 각각 이소타입 대조군 항체 및 mAb와의 배양을 나타낸다.
도 10a~10b. (10a) 건강한 공여자로부터의 비-자가유래 PBMC와 공동 배양하는 동안 다양한 시점에서 얻은, 1차 환자 샘플로부터의 흑색종 세포의 특이적인 사멸의 선 그래프. 흑색 원은 hIgG4 이소타입 대조군 항체를 나타내고, 백색 사각형은 본 발명의 mAb를 나타낸다. (10b) 단독 배양된 PBMC, 또는 hIgG4 이소타입 대조군 항체, 또는 본 발명의 mAb와 함께 배양된 흑색종 세포와 함께 배양된 PBMC로부터의 IFNγ 분비의 막대 그래프.
도 11. 15 시간 배양 이후 흑색종 세포의 총 수 중 카스파제 3/7 양성 사건의 퍼센트를 나타내는 막대 그래프로써, 이는 본 발명의 mAb 및 hIgG4 이소타입 대조군과 함께 배양된 2개의 1차 샘플로부터의 흑색종 세포의 어팝토시스를 반영한다.
도 12a~12d. (12a) 활성화의 측정치로서의, T 세포 내 41BB FACS 염색의 히스토그램. 흑색의 두꺼운 단색 선은 백그라운드 염색(즉, APC-접합된 이소타입 대조군 항체)을 나타내고, 흑색 점선은 hIgG4 이소타입 대조군을 함유하는 배지와 함께 배양된 TIL의 41BB 염색을 나타내고, 흑색의 가는 단색 선은 본 발명의 mAb를 함유하는 배지와 함께 배양된 TIL의 41BB 염색을 나타내고, 회색 점선은 hIgG4 이소타입 대조군과 함께 사전-배양된 흑색종 세포와 함께 배양된 TIL의 41BB 염색을 나타내고, 회색의 가는 단색 선은 본 발명의 mAb와 함께 사전-배양된 흑색종 세포와 함께 배양된 TIL의 41BB 염색을 나타낸다. (12b~c) 흑색종 환자로부터의 TIL가 20 시간 동안 (12b) 본 발명의 mAb 또는 hIgG4 이소타입 대조군 항체와 함께, 그리고 (12c) MAB356 또는 mIgG1 이소타입 대조군과 함께 배양된 이후 관찰된 T-세포 군집의 평균 수의 막대 그래프. (12d) 다양한 시점에서 현미경에 의해 측정된, hIgG4 이소타입 대조군 또는 본 발명의 mAb와 함께 사전-배양된 흑색종 세포와 함께 배양된 PBMC에서의 41BB의 발현.
도 13. 본 발명의 mAb 및 2개의 시판용 항체에 의한 사이토카인 방출 검정 이후의 사이토카인 분비에 대한 표.
도 14. 인간 흑색종 세포를 이식하고, 인간 자가유래 TIL을 처리한 마우스에서의, 다양한 시점으로부터의 평균 종양 부피의 선 그래프. 흑색 원, 백색 사각형, 흑색 삼각형 및 흑색 마름모꼴 선은 각각 hIgG4 이소타입 대조군 항체, 본 발명의 mAb, 항-PD1 mAb 또는 본 발명의 mAb+항-PD1 mAb과 함께 배양한 것을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
일부 구현예에서, 본 발명은 HVEM에 결합하여, HVEM-BTLA 상호작용을 저해하며, 또한 HVEM의 작용제이기도 한 제제를 제공한다. 본 발명은 추가로 HVEM 양성 질병의 치료 방법 및 이 제제들을 포함하는 키트를 고려한다.
HVEM 양성 암이 면역 세포 표면 상의 BTLA에 결합함으로써 면역 감시(immune surveillance)를 피할 수 있다는 사실은 잘 알려져 있다. BTLA의 관여(Engagement)는 면역 세포 내에서 저해성 신호를 생성하는데, 이는 T 세포 증식을 감소시키고, 암 생존을 증가시킨다. HVEM에 결합하는 항체 또는 BTLA에 결합하는 항체에 의한 이러한 신호전달의 저해는 알려져 있다. 본 발명은 HVEM에 특이적으로 결합하고, HVEM 신호전달을 활성화하는 항체가 암과의 싸움에 대한 다른 이점: 면역 세포 활성화 증가를 제공한다는 놀라운 발현에 기초한다. HVEM은 또한 면역 세포의 표면 상에도 발현된다. 그러나, 이의 역할은 잘 이해되지 않고 있다. 본 발명의 항체는 병원성 세포 상의 HVEM에 결합함으로써, 면역 세포가 저해로부터 풀려나게 함으로써 HVEM-BTLA 상호작용을 차단할 뿐만 아니라, 이는 면역 세포 상의 HVEM에 결합하고, 이의 면역 세포에서 NF-kB 신호전달을 유도하여, 활성화 특징들을 향상시킨다.
제1 양태에 의하면, 헤르페스바이러스 도입 매개자(HVEM)에 결합하여, HVEM와 B-림프구 및 T-림프구 감쇠조절인자(BTLA) 사이의 상호작용을 저해하는 제제가 제공된다.
일부 구현예에서, 상기 제제는 HVEM을 통한 하류 신호전달을 활성화한다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 BTLA를 통한 하류 신호전달을 저해한다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 HVEM을 통한 하류 신호전달을 활성화하고, BTLA를 통한 하류 신호전달을 저해한다. 일부 구현예에서, HVEM와 BTLA 사이의 상호작용의 저해는 BTLA를 통한 하류 신호전달을 저해한다.
일부 구현예에서, HVEM은 포유류 HVEM이다. 일부 구현예에서, HVEM은 설치류 HVEM이다. 일부 구현예에서, HVEM은 원숭이 HVEM이다. 일부 구현예에서, HVEM은 인간 HVEM이다. 일부 구현예에서, HVEM은 마우스, 원숭이 및 인간 HVEM 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, HVEM은 막 결합된 HVEM이다. 일부 구현예에서, HVEM은 세포 상의 HVEM이다. 일부 구현예에서, HVEM은 세포 표면 상의 HVEM이다. 일부 구현예에서, HVEM은 용해성 HVEM이다.
일부 구현예에서, 세포는 병원성 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 암 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 병원체의 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 박테리아 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 진균 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 병원체에 의해 감염된 진핵 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 박테리아에 의해 감염된 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 바이러스에 의해 감염된 세포이다. 일부 구현예에서, 병원체는 박테리아, 바이러스 및 진균으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 세포는 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 조혈 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T-세포이다. 일부 구현예에서, T-세포는 CD8 양성 T-세포이다. 일부 구현예에서, T-세포는 세포독성 CD8 양성 T-세포이다. 일부 구현예에서, T-세포는 CD4 양성 T-세포이다. 일부 구현예에서, T-세포는 CD4 양성 도움 T-세포이다. 일부 구현예에서, T-세포는 CD8 양성 T-세포 및 CD4 양성 T-세포로부터 선택된다. 일부 구현예에서, T-세포는 CD8 양성 T-세포, CD4 양성 T-세포 또는 둘 다이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 종양 침윤 림프구(TIL)이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 말초혈 면역 세포가 아니다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 B-세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 자연 살해(NK) 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 호중구이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 수지상 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 대식세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 골수 유래 저해자 세포(MDSC)이다. 일부 구현예에서, 세포는 T-세포, B-세포, NK 세포, 호중구, 수지상 세포, MDSC 및 대식세포로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 세포는 T-세포, B-세포, NK 세포, 호중구, 수지상 세포, 및 대식세포로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 면역 세포이다. 일부 구현예에서, CAR은 CAR-T 세포이다. 일부 구현예에서, CAR은 CAR-NK 세포이다. 본원에 사용된　"CAR"라는 용어는, 적어도 하나의 관심대상 단백질(예를 들어, HVEM 발현 세포에 의해 발현되는 단백질)에 대해 특이성을 갖고, 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포 또는 NK 세포)에 이식된(grafted) 조작된 수용체를 말한다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포는 T-세포에 이식된 단일클론 항체의 특이성을 갖는다. 일부 구현예에서, CAR-NK 세포는 NK-세포에 이식된 단일클론 항체의 특이성을 갖는다. 일부 구현예에서, T 세포는 세포독성 T 림프구 및 조절 T 세포로부터 선택된다. MART1은 표적 세포 상에서 HVEM과 함께 공동-발현되는 표적 단백질의 예이다. 일부 구현예에서, CAR은 HVEM 발현 세포에 의해 발현되는 단백질을 표적화한다. 일부 구현예에서, 단백질은 HVEM이 아니다. 일부 구현예에서, CAR은 HVEM 발현 세포의 표면에 있는 단백질을 표적화한다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, CAR은 항체를 표적화한다. 일부 구현예에서, CAR은 본 발명의 항체를 표적화한다. 일부 구현예에서, CAR은 세포독성 항체를 표적화한다. 일부 구현예에서, CAR은 항체 불변 도메인을 표적화한다. 일부 구현예에서, CAR은 Fc 도메인을 표적화한다. 일부 구현예에서, CAR 치료는 HVEM 발현 세포를 표적화하는 항체를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 구현예, CAR에 의해 표적화되는 항체는 본 발명의 항체가 아니다.
CAR-T 세포 및 CAR-NK 세포 및 이들의 벡터는 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 세포는 수용체가 결합하는 단백질을 표적화하며, 상기 단백질에 대해 세포독성을 갖는다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포 또는 CAR-NK 세포는 적어도 하나 암 단백질을 표적화한다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포 또는 CAR-NK 세포는 복수의 암 단백질들을 표적화한다.
CAR-T 세포의 제작은 당업계에 잘 알려져 있다. 하나의 비-제한적인 예에서, 암 단백질에 대한 단일클론 항체가 제조될 수 있고, 이후 그 항체에 대해 암호화하는 벡터가 제작될 것이다. 벡터는 또한 공동자극성 신호 영역을 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 공동자극성 신호 영역은 알려진 T 세포 또는 NK 세포 자극성 분자의 세포내 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 도메인은 이하의 CD3Z, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7- H3, 및 CD83가 특이적으로 결합하는 리간드 중 적어도 하나로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 벡터는 또한 CD3Z 신호전달 도메인도 포함한다. 이 벡터는 이후 예를 들어 렌티바이러스 감염에 의해 T-세포에 형질감염된다.
일부 구현예에서, HVEM은 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 일원 14(TNFRSF14)이다. 일부 구현예에서, HVEM은 CD270이다. 일부 구현예에서, HVEM은 BTLA의 수용체이다. 일부 구현예에서, HVEM은 BTLA의 리간드이다. 일부 구현예에서, BTLA는 CD272이다. 일부 구현예에서, HVEM은 종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 일원 14(TNFSF14)의 수용체이다. 일부 구현예에서, HVEM은 TNFSF14의 리간드이다. 일부 구현예에서, TNFSF14는 LIGHT이다. 일부 구현예에서, TNFSF14는 CD258이다. 일부 구현예에서, HVEM은 CD160의 수용체이다. 일부 구현예에서, HVEM은 CD160의 리간드이다. 일부 구현예에서, HVEM은 림포톡신 알파(LTα)의 수용체이다. 일부 구현예에서, HVEM은 LTα의 리간드이다. 일부 구현예에서, LTα는 TNF-α이다.
일부 구현예에서, 상기 제제는 특이적으로 HVEM에 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 HVEM이 아닌 다른 단백질에는 결합하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 HVEM의 세포외 도메인에 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 HVEM의 리간드 결합 도메인에 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 HVEM의 BTLA 결합 도메인에 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 HVEM의 BTLA 결합 도메인을 막는다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 HVEM과 BTLA 간의 상호작용을 저해한다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 HVEM과 BTLA 간의 상호작용을 차단한다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 HVEM 매개, BTLA 유도된 면역 억제를 저해한다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 HVEM에 결합하여, 결합된 HVEM가 추가로 BTLA에 결합하지 못하게 한다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 BTLA를 통한 하류 신호전달을 저해한다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 BTLA를 통한 하류 신호전달을 감소시킨다.
일부 구현예에서, 상기 제제는 HVEM과 TNFSF14 간의 상호작용을 저해하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 HVEM과 TNFSF14 간의 상호작용을 저해한다. 일부 구현예에서, TNFSF14는 막 TNFSF14(mTNFS14)이다. 일부 구현예에서, TNFSF14는 용해성 TNFSF14(sTNFS14)이다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 HVEM과 mTNFS14 및 sTNFS14 중 하나와의 상호작용을 저해하지 않으나, mTNFS14 및 sTNFS14 중 다른 하나와의 상호작용을 저해한다. 일부 구현예에서, 그 제제는 mTNFS14 및 sTNFS14 둘 다와 HVEM 사이의 상호작용을 저해하지 않는다. 일부 구현예에서, 저해는 실질적인 저해이다. 일부 구현예에서, 저해는 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 감소이다. 각각의 가능성은 본 발명의 개별 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 HVEM과 TNFSF14 간의 상호작용을 차단하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 HVEM과 TNFSF14 간의 상호작용을 실질적으로 차단하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 TNFSF14 매개 신호전달을 차단/저해하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 TNFSF14 매개 세포 생존을 차단/저해하지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 제제는 HVEM을 통한 신호전달을 활성화한다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 HVEM 작용제이다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 HVEM을 통한 신호전달을 유도한다. 일부 구현예에서, HVEM을 통한 신호전달은 HVEM 하류 신호전달이다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 세포 상의 HVEM에 결합하여, 세포 내 HVEM 신호전달을 활성화/유도한다. 일부 구현예에서, HVEM 신호전달은 활성화된 B 세포의 핵 인자 카파-경쇄-인핸서(NF-kB) 신호전달의 활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, NF-kB 신호전달은 유전자의 프로모터 내의 NF-kB 반응 요소에 의한 유전자의 조절을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호전달은 세포의 증가된 세포독성을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호전달은 상기 제제가 접촉하는, HVEM을 발현하는 세포의 증가된 세포독성을 포함한다. 일부 구현예에서, 증가된 세포독성은 전염증성 사이토카인의 증가된 분비를 포함한다. 일부 구현예에서, 전염증성 사이토카인은 IL-1, IL-1B, IL-4, IL-6, TNFα, IFNγ, MCP1, IL-12, IL-18, IL-23 및 CM-CSF로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 전염증성 사이토카인은 IFNγ이다. 일부 구현예에서, 증가는 본 발명의 제제와 접촉하지 않은 세포에 비교할 때의 증가이다. 일부 구현예에서, 증가는 적어도 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 또는 500% 증가이다. 각각의 가능성은 본 발명의 개별 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, 세포는 면역 세포이고, 신호전달은 면역 활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 림프구이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 CD8+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 CD4+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 감마/델타 T 세포가 아니다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 감마/델타 T 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 NK 세포이다. 일부 구현예에서, HVEM 신호전달의 활성화는 면역 세포의 활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 활성화는 증가된 증식을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 활성화는 증가된 세포독성을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 활성화는 증가된 이동을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 활성화는 증가된 귀소(homing)를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 활성화는 증가된 세포 군집화를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 활성화는 T 세포 활성화이다. 일부 구현예에서, 면역 활성화는 Th1 T 세포의 갯수 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 증가는 Th2 T 세포에 비해 상대적인 증가이다. 일부 구현예에서, 면역 활성화는 CD8+ T 세포의 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 활성화는 T 조절 세포의 감소를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 활성화는 41BB, CD69, CD25, CD107a, HLA-DR 및 사이토카인의 분비로부터 선택된 마커의 발현 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 전염증성 사이토카인이다. 일부 구현예에서, T 세포 활성화는 증가된 T 세포 군집화를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 암 세포이고, 신호전달은 항-종양 효과를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-종양 효과는 증가된 어팝토시스를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-종양 효과는 감소된 증식을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-종양 효과는 증가된 화학치료 감수성을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-종양 효과는 감소된 이동성을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-종양 효과는 감소된 침입성을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-종양 효과는 감소된 전이성을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-종양 효과는 감소된 자기-재생(self-renewal)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 효과는 본 발명의 제제와 접촉하지 않은 암 세포와 비교한 효과이다. 일부 구현예에서, 상기 감소는 적어도 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 감소이다. 각각의 가능성은 본 발명의 개별 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, 상기 제제는 어팝토시스를 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 어팝토시스의 유도는 어팝토시스의 직접 유도이다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 어팝토시스를 직접 유도하지 않는다. 본원에 사용된 "직접 유도"는 상기 제제의 결합의 즉각적인 결과로 발생하며, 결합된 세포 내에서 하류 신호전달을 특별히 나타내지 않는 결과를 말한다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 세포독성이 없다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 그 자체로 세포독성이 없다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 항체-주도 세포 세포독성(ADCC)을 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 세포독성 모이어티를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 세포에 의해 발현된 HVEM에 결합할 때, HVEM을 발현하는 세포의 어팝토시스를 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 다른 세포와의 상호작용을 통한 어팝토시스를 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 HVEM을 발현하는 세포의 사멸을 직접 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 사멸될 세포를 표적화하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 간접 어팝토시스를 유도한다. 일부 구현예에서, 간접 어팝토시스는 어팝토시스로 이어지는 HVEM을 통한 하류 신호전달에 의해 유도된 어팝토시스이다. 일부 구현예에서, 간접 어팝토시스는 신호 전달을 요구하는 어팝토시스이다. 일부 구현예에서, 간접 어팝토시스는 제2 세포의 관여가 필요하지 않는 어팝토시스이다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 면역 세포에서 어팝토시스를 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 암 세포에서 어팝토시스를 유도한다.
일부 구현예에서, 상기 제제는 HVEM과 CD160의 상호작용을 저해한다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 HVEM과 LTα의 상호작용을 저해한다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 HVEM과 단순 포진 바이러스 타입 1 당단백질 D(HSV1-gD) 간의 상호작용을 저해한다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 HVEM과 CD160, HSV1-gD 및 LTα 중 적어도 2개의 상호작용을 저해한다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 HVEM과 CD160의 상호작용을 차단한다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 HVEM과 LTα의 상호작용을 차단한다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 HVEM과 HSV1-gD와의 상호작용을 차단한다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 HVEM과 CD160, HSV1-gD 및 LTα 중 적어도 2개와의 상호작용을 차단한다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 HVEM과 CD160, HSV1-gD 및 LTα 모두와의 상호작용을 저해/차단한다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 HVEM과 CD160, HSV1-gD 및 LTα 중 적어도 하나와의 상호작용을 저해 또는 차단하지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 제제는 항체 또는 이의 항원 결합 절편이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이들의 절편은 fab 절편이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이들의 절편은 단쇄 항체(scFv)이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이들의 절편은 단일 도메인 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 인간 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 인간화 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 단일클론 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 차단 항체이다.
본원에서 사용된　"항체"라는 용어는, 내부 표면 형태를 갖는 3-차원 결합 공간과, 항원의 항원 결정기의 특징부에 상보적인 전하 분포를 갖는 폴리펩티드 사슬의 폴딩으로부터 형성된 적어도 하나의 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 그룹을 말한다. 항체는 전형적으로 동일한 2 쌍의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 사량체 형태를 갖고, 각각의 한 쌍은 하나의 "경"쇄 및 하나의 "중"쇄를 갖는다.　각각의 한 쌍의 경쇄/중쇄의 가변 영역은, 항체 결합 부분을 형성한다. 항체는 올리고클론, 다중 클론, 단일클론, 키메라, 카멜화(camelised), CDR-이식된, 다중-특이적인, 이중-특이적인, 촉매형, 인간화, 전체 인간, 항-이디오타입(idiotype), 및 용해성 또는 결합된 형태로 표지될 수 있는 항체,　뿐만 아니라　에피토프-결합 절편, 이들의 변형체 또는 유도체를 포함하는, 단독 또는 다른 아미노산 서열과 조합된 절편일 수 있다. 항체는 임의의 종으로부터 유래할 수 있다.　항체라는 용어는, 또한 Fv, Fab, Fab', F(ab')2　단일 가닥 항체(svFC), 이량체 가변 영역(디아바디) 및 디설파이드-연결된 가변 영역(dsFv)을 포함하나 이에 제한되지 않는 결합 절편을 포함한다. 특히, 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역 활성 절편, 즉 항원 결합 부분을 함유하는 분자를 포함한다. 항체 절편은 Fc 영역 또는 이들의 절편을 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 면역글로불린 도메인에 융합되거나, 또는 이에 융합되지 않을 수 있다.　숙련 기술자는 scFv-Fc 융합체, 가변 영역(예를 들어, VL 및 VH)~Fc 융합체, 및 scFv-scFv-Fc 융합체를 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 융합 산물이 생성될 수 있다는 사실을 추가로 인식할 것이다.
면역글로불린 분자는 임의의 타입(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl 및 IgA2) 또는 하위 부류의 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG2 또는 IgG4를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG2를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG4를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG1를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG3를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 독성이 감소된 변형된 IgG1 또는 IgG3를 포함한다.
자연 발생적인 항체 구조의 기본 단위는, 약 150,000 달톤의 이종 4량체 당단백질 복합체로써 2개의 동일한 경(L)쇄 및 2개의 동일한 중(H)쇄로 구성되며, 둘 다 비공유 연결과 디설파이드 결합에 의해 함께 연결된다. 각각의 중쇄와 경쇄는 또한 규칙적으로 배치된 사슬-내 디설파이드 다리를 갖는다. 5개의 인간 항체 부류(IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE)가 존재하고, 이 부류들 내에, 구조적 차이, 예컨대 단일 항체 분자 내 면역글로불린 단위의 수, 개별 단위들의 디설파이드 다리 구조, 및 사슬 길이와 서열의 차이에 기초하여 다양한 하위 부류들이 인식된다. 항체의 부류 및 하위 부류는 이의 이소타입이다.
중쇄 및 경쇄의 아미노 말단 영역은 카르복시 말단 영역보다 서열 다양성이 더 크고, 이런 이유로 가변 도메인이라고 불린다. 항체 구조의 이러한 부분은 항체의 항원-결합 특이성을 부여한다. 중쇄 가변(VH) 도메인과 경쇄 가변(VL) 도메인은 함께 단일 항원-결합 부분을 형성하므로, 기본 면역글로불린 단위는 2개의 항원-결합 부분을 갖는다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인의 사이에 계면을 형성하는 것으로 생각된다(문헌[Chothia 외, J. Mol. Biol. 186, 651-63(1985)]; 문헌[Novotny and Haber,(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 4592-4596]).
중쇄 및 경쇄의 카르복시 말단 부분은 불변 도메인, 즉 CH1, CH2, CH3, CL을 형성한다. 이 도메인들 사이에 다양성은 훨씬 낮으나, 동물 종들 간에 서로 차이가 있으며, 추가로, 동일한 개체 내에서도 각각 상이한 기능을 갖는 몇몇 상이한 이소타입의 항체들이 있다.
"프레임워크 영역" 또는 "FR"라는 용어는, 항체의 가변 도메인 내의 아미노산 잔기를 말하는데, 이들은 본원에서 정의된 과다가변 영역 아미노산 잔기 이외의 것이다. 본원에 사용된 "과다가변 영역"이라는 용어는, 항체의 가변 도메인 내의 아미노산 잔기를 말하는데, 이들은 항원 결합을 담당한다. 과다가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 주로 항원의 에피토프에 대한 결합을 담당한다. FR 및 CDR의 정도는 정확히 정의되었다(문헌[Kabat 외] 참고).
면역글로불린 가변 도메인은 또한 IMGT 정보 시스템(www://imgt. cines.fr/)(IMGT®/V-Quest)을 사용함으로써 분석되어, CDR을 포함하는 가변 영역 세그먼트를 식별할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Brochet, X. 외, Nucl. Acids Res. J6:W503-508(2008)]를 참고한다.
본원에 사용된 "인간화 항체"라는 용어는, 이의 단백질 서열을 인간 항체에 대한 유사성이 증가되도록 변형시킨 비-인간 종으로부터의 항체를 말한다. 인간화 항체는 인간 항체와 비슷한 서열에 의해 둘러싸인 비-인간 항체의 CDR에 대해 암호화하는 재조합 DNA의 생산에 의해 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 인간화 항체는 키메라 항체이다. 일부 구현예에서, 인간화는 본 발명의 CDR을 인간 항체의 뼈대(scaffold) 또는 골격(backbone)에 삽입하는 것을 포함한다. 인간화 항체는 당업계에 잘 알려져 있는데, 본 발명의 CDR을 보유하는 것들을 생산하는 임의의 방법이 이용될 수 있다.
본원에 사용된 "단일클론 항체" 또는 "mAb"라는 용어는, 실질적으로 동질한 항체의 집단으로부터 얻은 항체를 말하며, 즉, 상기 집단을 포함하는 개별적 항체들은 단일클론 항체의 생산 동안 발생할 수 있는 가능한 변형체를 제외하면 동일하고/거나, 동일한 에피토프에 결합하며, 이러한 변형체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 전형적으로 상이한 결정기들(에피토프)에 대한 상이한 항체들을 포함하는 다중 클론 항체의 제조와는 반대로, 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대한 것이다. 이러한 특이성 외에도, 단일클론 항체는 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않았다는 점에서 유리하다. "단일클론"이라는 변형어는, 실질적으로 동질한 집단의 항체로부터 얻은 것으로서의 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특이적인 제조 방법에 의해 생성된 것이라고 해석되지 않을 것이다. 본원에 제공된 방법에 따라 사용될 단일클론 항체는, 먼저 문헌[Kohler 외, Nature 256:495(1975)]에 기재된 하이브리도마(hybridoma) 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참고)에 의해 제조될 수 있다. "단일클론 항체"는 또한 예를 들어 문헌[Clackson 외, Nature 352:624-628(1991)] 및 문헌[Marks 외, J. Mol. Biol. 222:581-597(1991)]에 기재된 기술을 사용하여, 파지 항체 라이브러리(phage antibody library)로부터 분리될 수 있다.
본 발명의 mAb는 IgG, IgM, IgD, IgE 또는 IgA를 포함하는 임의의 면역글로불린 부류일 수 있다. mAb를 생산하는 하이브리도마는 시험관내 또는 생체내에서 배양될 수 있다. 개별적 하이브리도마로부터의 세포를 초회항원자극된(pristine-primed) Balb/c 마우스에 복강내 주입하여, 고농도의 원하는 mAb를 함유하는 복수액(ascites fluid)을 생성할 때, 고 역가의 mAb를 생체내 생산으로 얻을 수 있다. 이소타입 IgM 또는 IgG의 mAb는 당업계의 숙련자에게 잘 알려진 컬럼 크로마토그래피 방법을 사용하여, 이러한 복수액 또는 배양 상청액으로부터 정제할 수 있다.
"항체 절편"은 무손상 항체의 일부분을 포함하며, 바람직하게는 이의 항원 결합 영역을 포함한다. 항체 절편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 절편; 디아바디; 연쇄적 디아바디(taDb), 선형 항체(예를 들어, 미국 특허 제5,641,870호, 실시예 2; 문헌[Zapata 외, Protein Eng. 8(10): 1057-1062(1995)]); 1-아암 항체, 단일 가변 도메인 항체, 미니바디, 단일-사슬 항체 분자; 항체 절편으로부터 형성된 다중특이적인 항체(예를 들어, Db-Fc, taDb-Fc, taDb-CH3, (scFV)4-Fc, 이중(di)-scFv, 2개의(bi)-scFv, 또는 연쇄적 (이중, 삼중)-scFv를 포함하나, 이에 제한되지 않음); 및 이중-특이적인 T-세포 관여자(engager)(BiTE)를 포함한다.
항원을 파페인(Papain)으로 소화하면, "Fab" 절편이라고 불리는 2개의 동일한 항원-결합 절편을 생성하는데, 이들 각각은 단일 항원-결합 부위와 잔여 "Fc" 절편을 갖고, 그 명칭은 쉽게 결정화하는 이의 능력을 반영한다. 펩신 처리로 2개의 항원-결합 부위를 갖고, 여전히 항원을 교차-연결할 수 있는 F(ab')2　절편을 얻는다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부분을 함유하는 최소 항체 절편이다. 이 영역은 비-공유적으로 단단히 연결된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 이 배치에는, VH-VL　이량체의 3개의 표면이 있다. 종합하면, 6개의 과다가변 영역은 항체에 대해 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 단 3개의 과다가변 영역만을 포함하는 Fv의 절반)은 항원를 인식하여 이에 결합하는 능력을 갖지만, 다만 전체 결합 부분보다 친화성은 더 낮다.
Fab 절편은 또한 경쇄의 불변 도메인과 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab' 절편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇몇 잔기들을 첨가함으로써, Fab 절편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 적어도 하나의 자유 티올기를 보유하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2　항체 절편은 원래 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 한 쌍의 Fab' 절편들로서 생성되었다. 항체 절편의 다른 화학적 커플링도 또한 알려져 있다.
임의의 척추 동물 종 유래의 항체(면역글로불린)의 "경쇄"는, 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로 카파 및 람다로 불리는 2개의 명확히 구별된 타입 중 하나에 할당될 수 있다.
항체는 이들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라서, 상이한 부류에 할당될 수 있다. 5개의 무손상 항체의 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM가 있고, 이들 중 몇몇은 추가로 하위 부류(이소타입), 예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgA2로 나뉘어질 수 있다. 상이한 부류의 항체에 해당하는 중쇄 불변 도메인은 각각 델타, e, 감마, 및 마이크로로 불린다. 상이한 부류의 면역글로불린의 하위단위 구조 및 3-차원 배치는 잘 알려져 있다.
"단일-사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 절편은 항체의 VH　및 VL　도메인을 포함하되, 여기에서 이 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재한다. 일부 구현예에서, Fv 폴리펩티드는 VH　도메인과 VL　도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하는데, 이로 인해 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성하게 된다. scFv의 검토를 위해서는, 문헌[Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113 권, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315(1994)]을 참고한다.
"디아바디(diabodies)"라는 용어는, 2개의 항원-결합 부분을 갖는 작은 항체 절편을 말하는데, 상기 절편들은 동일한 폴리펩티드 사슬 내의 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다(VH　- VL). 동일한 사슬 상의 2개의 도메인들 사이에 짝을 이루기에 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 강제로 다른 사슬의 상보적 도메인과 짝을 이루게 되어, 2개의 항원-결합 부분을 생성한다. 디아바디 생산은 당업계에 알려져 있는데, 문헌[Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448(1993)]에 기재되어 있다.
본 발명의 단일클론 항체는 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예는 다양한 기술, 예컨대 문헌[Kohler, G. and Milstein, C, Nature 256: 495-497(1975)]; 문헌[Kozbor 외, Immunology Today 4: 72(1983)]; 문헌[Cole et al, pg. 77-96 in MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc.(1985)]에 나와있는 것들을 포함한다.
항체를 생체 내에서 육성하는 종래의 방법 외에도, 항체는 파지 디스플레이 기술을 사용하여 시험관 내에서 생성될 수 있다. 이러한 재조합 항체의 생산은 종래의 항체 생산에 비해 훨씬 빠르며, 이들은 매우 많은 항원에 대해 생성될 수 있다. 추가로, 종래의 방법을 사용할 때, 많은 항원들은 비-면역원성 또는 극히 높은 독성을 갖는 것으로 판명되며, 따라서 이들은 동물에서 항체를 생성하는데 사용될 수 없다. 게다가, 재조합 항체의 친화성 성숙(즉, 친화성과 특이성의 증가)은 매우 간단하고, 비교적 신속하다. 최종적으로, 특이적인 항원에 대한 매우 다수의 상이한 항체들이 하나의 선택 과정에서 생성될 수 있다. 재조합 단일클론 항체를 생성하기 위해, 전적으로 디스플레이 라이브러리에 기반을 둔 다양한 방법을 사용하여, 상이한 항원 인식 부위를 갖는 큰 항원의 풀을 생성할 수 있다. 이러한 라이브러리는 몇 가지 방식으로 제조될 수 있고: 중쇄 생식계 유전자의 풀에서 합성 CDR3 영역을 클로닝하여 큰 항체 레퍼토리를 생성함으로써, 합성 레퍼토리를 생성할 수 있고, 이로부터 다양한 특이성을 갖는 재조합 항체 절편들이 선택될 수 있다. 항체 라이브러리의 제작을 위한 개시 물질로서, 인간의 림프구 풀을 사용할 수 있다. 인간 IgM 항체의 미경험 레퍼토리를 제작하고, 따라서 매우 다양한 인간 라이브러리를 생성하는 것이 가능하다. 이 방법은 상이한 항원들에 대한 매우 다수의 항체를 선별하는데 성공적으로 널리 사용되어 왔다. 재조합 항체의 박테리오파지(bacteriophage) 라이브러리 제작 및 선별을 위한 프로토콜은, 잘-알려진 참고 교과서[Current Protocols in Immunology, Colligan 외(Eds.), John Wiley & Sons, Inc.(1992-2000), 챕터 17, 섹션 17.1]에 제공되어 있다.
비-인간 항체는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 인간화될 수 있다. 하나의 방법에서, 비-인간 상보성 결정 영역(CDR)은 인간 항체 또는 공통 항체 프레임워크 서열에 삽입된다. 추가로, 항체 프레임워크에 이후 변화가 도입되어, 친화성 또는 면역원성을 조절한다.
일부 구현예에서, 항체 및 이의 일부는 항체, 항체의 절편, Fab 및 F(ab')2, 단일-도메인 항원-결합 재조합 절편 및 천연 나노바디를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 항원 결합 절편은 Fv, Fab, F(ab')2, scFv, scFv2 또는 scFv4 절편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.　
일부 구현예에서, 본 발명은 항체 또는 본 발명의 항원 결합 부분을 암호화하는 핵산 서열을 제공한다.
예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 전체 면역글로불린 분자 사슬, 예컨대 경쇄 또는 중쇄를 암호화할 수 있다. 완전한 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH), 뿐만 아니라 중쇄 불변 영역(CH)도 포함하며, 이는 전형적으로 3개의 불변 도메인: CH1, CH2 및 CH3; 및 "힌지" 영역을 포함한다. 일부 상황에서, 불변 영역이 존재하는 것이 바람직하다.
폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있는 다른 폴리펩티드는, 항원-결합 항체 절편, 예컨대 단일 도메인 항체("dAb"), Fv, scFv, Fab' 및 CHI를 포함하고, CK　또는 CL　도메인은 제거되었다. 미니바디는 종래의 항체보다 더 작기 때문에, 이들은 임상/진단적 사용시 더 나은 조직 침투력을 달성해야 하나, 이들은 1가 항체 절편, 예컨대 dAb보다 더 높은 결합 친화성을 보유해야 한다. 따라서, 문맥상 달리 지시된 바 없는 경우, 본원에 사용된 "항체"라는 용어는, 전체 항체 분자, 뿐만 아니라 상기 논의된 타입의 항원-결합 항체 절편도 포괄한다. 암호화된 폴리펩티드 내에 존재하는 각각의 프레임워크 영역은, 상응하는 인간 수용기 프레임워크에 비해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 프레임워크 영역은 수용기 프레임워크 영역에 비해 총 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 또는 15개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 개시된 단백질 산물을 포함하는 개별적인 아미노산의 특성들을 고려하여, 숙련 기술자들은 일부 합리적인 치환을 인식할 것이다. 아미노산 치환, 즉 "보존적 치환"은 예를 들어 관여된 잔기의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 특성에서의 유사성을 기초로 하여 제조될 수 있다.
적합하기는, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 분리 및/또는 정제될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 분리된 폴리뉴클레오티드이다.
본원에 사용된 "비-자연 발생적인" 물질, 조성물, 엔티티(entity), 및/또는 "비-자연 발생적인" 물질, 조성물 또는 엔티티의 임의의 조합이라는 용어, 또는 이들의 임의의 문법적 변형체는, 당업계의 통상의 숙련자들이 "자연-발생적인" 것으로 잘-이해하는 물질, 조성물, 엔티티, 및/또는 "자연-발생적인" 것으로 잘-이해하는 물질, 조성물 또는 엔티티의 임의의 조합의 형태를 명백히 배제하나 단지 이들만을 배제하는 조건부 용어이거나, 또는 언제든 판사 또는 행정 기구 또는 사법 기구에 의해 "자연-발생적인" 것으로 결정되거나 해석되거나, 상기와 같이 결정되거나 해석될 수 있는 조건부 용어이다.
일부 구현예에서, 항체는 IgG4를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG2를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG2 또는 IgG4를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG1을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG3을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG1 또는 IgG3을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 항체는 돌연변이 IgG1 및/또는 IgG3을 포함하되, 상기 돌연변이는 ADCC, CDC 또는 둘 다의 유도를 저해한다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 FcR 감마 결합 모티프이다.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 절편은 3개의 중쇄 CDR(CDR-H)과 3개의 경쇄 CDR(CDR-L)를 포함하는데, 여기에서: CDR-H1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열(SYAMS)을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열(AISGSGGSTYYADSVKG)을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열(APGDYTAYFDY)을 포함하고, CDR-L1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열(RASQSVSSYLA)을 포함하고, CDR-L2는 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열(GASSRAT)을 포함하고, CDR-L3은 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열(QQYGSSPPYT)을 포함한다. 일부 구현예에서, CDR은 KABAT 넘버링 시스템에 따른다.
다른 양태에 의하면, 3개의 중쇄 CDR(CDR-H)과 3개의 경쇄 CDR(CDR-L)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 절편이 제공되는데, 여기에서: CDR-H1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열(SYAMS)을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열(AISGSGGSTYYADSVKG)을 포함하고, CDR-H3는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열(APGDYTAYFDY)을 포함하고, CDR-L1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열(RASQSVSSYLA)을 포함하고, CDR-L2는 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열(GASSRAT)을 포함하고, CDR-L3은 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열(QQYGSSPPYT)을 포함한다. 일부 구현예에서, CDR은 KABAT 넘버링 시스템에 따른다.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 절편은 3개의 중쇄 CDR(CDR-H)과 3개의 경쇄 CDR(CDR-L)을 포함하는데, 여기에서: CDR-H1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열 11(GFTFSSYA)을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 12에 나열된 아미노산 서열(ISGSGGST)을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 13에 나열된 아미노산 서열(AKAPGDYTAYFDY)을 포함하고, CDR-L1은 서열번호 14에 나열된 아미노산 서열(QSVSSY)을 포함하고, CDR-L2는 서열번호 15에 나열된 아미노산 서열(GAS)을 포함하고, CDR-L3은 서열번호 16에 나열된 아미노산 서열(QQYGSSPPYT)을 포함한다. 일부 구현예에서, CDR은 IMGT 넘버링 시스템에 따른다.
다른 양태에 의하면, 3개의 중쇄 CDR(CDR-H)과 3개의 경쇄 CDR(CDR-L)를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 절편이 제공되는데, 여기에서: CDR-H1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열 1(GFTFSSYA)을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 12에 나열된 아미노산 서열(ISGSGGST)을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 13에 나열된 아미노산 서열(AKAPGDYTAYFDY)을 포함하고, CDR-L1은 서열번호 14에 나열된 아미노산 서열(QSVSSY)을 포함하고, CDR-L2는 서열번호 15에 나열된 아미노산 서열(GAS)을 포함하고, CDR-L3은 서열번호 16에 나열된 아미노산 서열(QQYGSSPPYT)을 포함한다. 일부 구현예에서, CDR은 IMGT 넘버링 시스템을 따른다.
일부 구현예에서, 항체는 서열 QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAPGDYTAYFDYWGQGTLVTVSS(서열번호 7)을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄는 서열번호 7의 서열로 이루어진다. 일부 구현예에서, 항체는 서열 MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAPGDYTAYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(서열번호 9)을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄는 서열번호 9의 서열로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항체는 서열 ELVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPPYTFGQGTKVEIK(서열번호 8)을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄는 서열번호 8의 서열로 이루어진다. 일부 구현예에서, 항체는 서열 MGWSCIILFLVATATGVHSELVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열번호 10)를 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄는 서열번호 10의 서열로 이루어진다.
일부 구현예에서, 중쇄와 경쇄는 링커에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 아미노산 링커이다. 일부 구현예에서, 링커는 대부분 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 12개, 14개, 15개, 16개, 18개, 20개, 22개, 24개 또는 25개의 아미노산 길이이다. 각각의 가능성은 본 발명의 개별 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 링커는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 12개, 14개, 15개, 16개, 18개, 20개, 22개, 24개 또는 25개의 아미노산 길이이다. 각각의 가능성은 본 발명의 개별 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 링커는 1-25, 5-25개, 10-25개, 15-25개, 20-25개, 1-20개, 5-20개, 10-20개, 15-20개, 1-15개, 5-15개, 10-15개, 1-10개, 5-10개 또는 1-5개의 아미노산 길이이다. 각각의 가능성은 본 발명의 개별 구현예를 나타낸다.
다른 양태에 의하면, 본 발명의 제제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 어주번트를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 치료 유효량의 본 발명의 제제이다.
본원에 사용된 "담체", "부형제" 또는 "어주번트"라는 용어는, 활성제가 아닌 약학적 조성물의 임의의 성분을 말한다. 본원에 사용된 "약학적으로 허용가능한 담체"라는 용어는, 무-독성, 불활성 고체, 반-고체 액체 필터, 희석제, 캡슐화 물질, 임의의 타입의 보조 조제, 또는 단순 멸균 수성 매질, 예컨대 식염수를 말한다. 약학적으로 허용가능한 담체로 작용할 수 있는 물질의 일부 예는, 락토스, 글루코스 및 수크로스와 같은 당, 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분, 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 셀룰로스 및 이의 유도체; 분말 트라가칸트; 맥아, 젤라틴, 탈크; 코코아 버터 및 좌제 왁스와 같은 부형제; 땅콩유, 면실유, 사플라워유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유와 같은 오일; 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜, 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르, 아가; 수산화 마그네슘 및 수산화 알루미늄과 같은 완충제; 알긴산; 발열원-불포함수; 등장성 식염수, 링거 용액; 에틸 알콜 및 인산 완충 용액, 뿐만 아니라 약학적 제제에 사용되는 다른 무-독성의 양립가능한 물질이다. 본원에서 담체로 작용할 수 있는 물질의 일부 비-제한적인 예는, 당, 전분, 셀룰로스 및 이의 유도체, 분말 트라가칸트, 맥아, 젤라틴, 탈크, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 황산칼슘, 식물유, 폴리올, 알긴산, 발열원-불포함수, 등장성 식염수, 인산 완충 용액, 코코아 버터(좌제 기제), 유화제, 뿐만 아니라 다른 약학적 제제에 사용된 다른 무-독성의 약학적으로 양립가능한 물질을 포함한다. 습윤제 및 윤활제, 예컨대 소듐 라우릴 설페이트, 뿐만 아니라 착색제, 착향제, 부형제, 안정화제, 항산화제, 및 방부제도 또한 존재할 수 있다. 임의의 무-독성이고 불활성의 효과적인 담체는 본원에서 고려된 조성물을 제제화하는데 사용될 수 있다. 이에 대해 적합한 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 및 희석제는, 당업계의 숙련자에게 잘 알려진 것들, 예컨대 문헌[The Merck Index, 13판, Budavari 외, Eds., Merck & Co., Inc., Rahway, N.J.(2001)]; 문헌[CTFA(Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association) International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook, 10판(2004)]; 및 문헌["Inactive Ingredient Guide," U.S. Food and Drug Administration(FDA) Center for Drug Evaluation and Research(CDER) Office of Management]에 기재된 것들이 있으며, 상기 문헌 모두의 내용은 본원에 전문이 참조로서 포함된다. 본 발명의 조성물에 유용한 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체 및 희석제의 예는, 증류수, 생리 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 행크 용액(Hank's 용액), 및 DMSO를 포함한다. 이러한 추가적인 불활성 성분, 뿐만 아니라 효과적인 제제 및 투여 과정은 당업계에 잘 알려져 있고, 표준 교과서, 예컨대 문헌[Goodman and Gillman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8판, Gilman 외 Eds. Pergamon Press(1990)]; 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18판, Mack Publishing Co., Easton, Pa.(1990)]; 및 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21판, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.,(2005)]에 기재되어 있으며, 상기 문헌 각각은 본원에 전문이 참조로서 포함된다. 본원에 기재된 조성물은 또한 인공적으로 생성된 구조, 예컨대 리포좀, ISCOMS, 서-방성 입자, 및 혈청 내 펩티드 또는 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 다른 비히클 내에 함유될 수도 있다. 리포좀은 에멀전, 발포체, 마이셀, 불용성 단일층, 액정, 인지질 분산액, 라멜라 층 등을 포함한다. 본원에 기재된 펩티드와 함께 사용하기 위한 리포좀은, 일반적으로 중성 및 음전하성 인지질 및 스테롤, 예컨대 콜레스테롤을 포함하는 표준 소포-형성 지질로부터 형성된다. 지질의 선택은 일반적으로 혈중 리포좀 크기 및 안정성과 같은 고려 사항에 의해 결정된다. 예를 들어, 문헌[Coligan, J. E. 외, Current Protocols Protein Science, 1999, John Wiley & Sons, Inc., New York]에 의해 검토된 바와 같이, 다양한 방법들이 리포좀을 제조하는데 이용가능하며, 또한 미국 특허 제4,235,871호, 제4,501,728호, 제4,837,028호, 및 제5,019,369호도 참고한다.
담체는 전체적으로 본원에 제시된 약학적 조성물의 약 0.1 중량% 내지 약 99.99999 중량%을 포함할 수 있다.
"치료 유효량"이라는 용어는, 포유류에서 질병 또는 장애를 치료하는데 효과적인 약물의 양을 말한다. 일부 구현예에서, 치료 유효량은 원하는 치료 또는 예방 결과를 얻는데 필요한 투여량과 시기 동안 효과적인 양이다. 정확한 제형 및 요법은 환자의 상태에 따라 의사가 결정할 것이다.
일부 구현예에서, 상기 제제는 질병 또는 질환을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 질병 또는 질환을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 질병 또는 질환은 HVEM을 발현하는 세포를 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 세포는 HVEM을 발현하는 것을 특징으로 하는 질병 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 HVEM을 과다 발현하는 것을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 과다발현은 건강한 세포에 비해 과다발현된 것이다. 일부 구현예에서, 건강한 세포는 비-발병 세포이다. 일부 구현예에서, 과다발현은 증가된 발현이다. 일부 구현예에서, 질병 또는 질환은 HVEM 양성 질병 또는 질환이다. 일부 구현예에서, 질병 또는 질환은 BTLA 양성 질병 또는 질환이다.
일부 구현예에서, 질병 또는 질환은 HVEM 양성 암이다. 일부 구현예에서, 질병 또는 질환은 BTLA 양성 암이다. 일부 구현예에서, 질병 또는 질환은 HVEM 양성 전암성 병변이다. 일부 구현예에서, 암은 흑색종이다. 일부 구현예에서, 암은 신장 세포 암종이다. 일부 구현예에서, 암은 흑색종, 신장암, 자궁경부암, 전립선암, 췌장암, 폐암, 난소암, 결장암, 유방암 및 두경부암으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 신장암은 신장 세포 암종이다. 숙련 기술자는 HVEM을 발현하는 임의의 암이 치료 표적이 될 수 있음을 인식할 것이다. 일부 구현예에서, 질병은 감염성 질병이다. 일부 구현예에서, 감염의 세포는 HVEM 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 감염된 세포는 HVEM 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 감염성 질병은 박테리아이며, 박테리아 세포는 HVEM 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 감염성 질병은 진균 감염이며, 진균 세포는 HVEM 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 감염성 질병은 바이러스이고, 바이러스 감염된 대상 세포는 HVEM 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스는 헤르페스 바이러스이다. 일부 구현예에서, HVEM 발현은 HVEM 과다발현이다. 일부 구현예에서, HVEM 발현은 증가된 HVEM 발현이다.
다른 양태에 의하면, HVEM 양성 질병 또는 질환을 치료하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 HVEM과 BTLA의 상호작용을 저해하는 단계, 및 면역 세포, 질병 세포 또는 둘 다에서 HVEM 신호전달을 활성화하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 본 발명의 제제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 본 발명의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양태에 의하면, HVEM 양성 질병 또는 질환을 치료하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 본 발명의 제제를 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양태에 의하면, HVEM 양성 질병 또는 질환을 치료하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 본 발명의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 HVEM-TNFSF14 상호작용을 저해하지 않는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 HVEM-TNFSF14 상호작용을 실질적으로 저해하지 않는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 PD-1과 이의 리간드들 중 하나 사이의 상호작용을 저해하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, PD-1 리간드는 PD-L1 및 PD-L2로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 PD-1, PD-L1 또는 PD-L2를 저해하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 PD-1 대 PD-L1의 상호작용을 저해하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 PD-1 대 PD-L2의 상호작용을 저해하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 PD-1 대 PD-L1 또는 PD-L2의 상호작용을 저해하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상호작용을 저해하는 단계는 PD-1 대 PD-L1의 상호작용, 또는 PD-1 대 PD-L2의 상호작용을 저해하는 제제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상호작용을 저해하는 단계는 PD-1과 이의 리간드들 중 적어도 하나 사이의 상호작용을 저해하는 제제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 리간드는 2개의 리간드이다. 일부 구현예에서, 상호작용을 저해하는 단계는 PD-1/PD-L1 차단을 포함한다. 일부 구현예에서, 상호작용을 저해하는 단계는 PD-1/PD-L1 또는 PD-L2 차단을 포함한다. 일부 구현예에서, 상호작용을 저해하는 단계는 항-PD-1/PD-L1 치료제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상호작용을 저해하는 단계는 항-PD-1/PD-L1 또는 PD-L2 치료제를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료제는 면역치료제이다. 일부 구현예에서, 상호작용을 저재하는 제제는 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체이다. 일부 구현예에서, 상호작용을 저재하는 제제는 항-PD-1, 항-PD-L1 또는 항-PD-L2 항체이다. 일부 구현예에서, 상호작용을 저재하는 제제는 PD-1/PD-L1 저해제이다. 일부 구현예에서, 상호작용을 저재하는 제제는 PD-1/PD-L1/PD-L2 저해제이다. 일부 구현예에서, 항체는 차단 항체이다. PD-L1/L2 및 PD-1 치료제는 당업계에 잘 알려져 있는데, 니볼루맙(nivolumab)(옵디보(Opdivo)), 펨브롤리주맙(pembrolizumab)(키트루다(Keytruda)), 아테졸리주맙(atezolizumab), 아벨루맙(avelumab), 두발루맙(durvalumab), 세미플리맙(cemiplimab)(리브타요(Libtayo)), 피딜리주맙(pidilizumab), AMP-224, AMP-514 및 PDR001을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 치료 방법은 HVEM-발현 세포에 대한 다른 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 또 다른 치료제는 항-암 치료제이다. 일부 구현예에서, 치료제는 비-자가유래 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 또 다른 치료제는 자가유래 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 CAR 발현 면역 세포이다. 일부 구현예에서, CAR은 CAR-T이다. 일부 구현예에서, CAR은 CAR-NK이다. 일부 구현예에서, 자가유래 면역 세포는 TIL 치료제이다. 일부 구현예에서, 비-자가유래 면역 세포는 적응 세포 치료제이다. 일부 구현예에서, 자가유래 면역 세포는 적응 세포 치료제이다. 일부 구현예에서, 적응 세포는 CAR 세포이다. 일부 구현예에서, 적응 세포는 TIL이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물과 다른 치료제는 동시에 투여된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 다른 치료제 전에, 후에, 또는 동시에 투여된다.
다른 양태에 의하면, 본 발명의 방법에 의해 치료될 대상체의 적합성을 결정하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 대상체로부터 샘플을 얻는 단계, 및 상기 샘플 내의 HVEM 수준을 결정하는 단계를 포함하되, 여기에서 HVEM의 양성 발현은 그 대상체가 본 발명의 치료 방법에 적합하다는 것을 나타낸다.
다른 양태에 의하면, 샘플 내 HVEM을 탐지하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 샘플을 본 발명의 제제, 또는 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 절편과 접촉시킴으로써, HVEM을 탐지하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 접촉 단계는 상기 제제, 또는 항체 또는 이의 항원 결합 절편의 결합에 적합한 상태 하에서 HVEM에 결합하는 것이다. 일부 구현예에서, 상기 상태는 HVEM에 대한 특이적인 결합에 적합한다. 일부 구현예에서, 상기 결합은 혼성화이다. 항체/제제 결합을 위한 상태는 샘플에 따라 달라질 것이다. 숙련 기술자는(고정화의 방법/타입에 따라서) 조직 샘플에 결합하는데 필요한 상태가 액체 용액, 예컨대 전체 세포 용해물에서의 이들의 결합과 다르다는 사실을 인식할 것이다. 이러한 결합 조건은 당업계에 잘 알려져 있으며, 숙련 기술자는 소정의 샘플에 대한 적합한 조건을 선별할 수 있다.
일부 구현예에서, 샘플은 조직 샘플이다. 일부 구현예에서, 샘플은 파리핀 포매된 샘플이다. 일부 구현예에서, 샘플은 관류된 샘플이다. 일부 구현예에서, 샘플은 대상체로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 샘플은 건강한 샘플이다. 일부 구현예에서, 샘플은 발병 샘플이다. 일부 구현예에서, 샘플은 진단 샘플이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 본 발명의 제제, 또는 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 절편을 탐지하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 탐지는 면역조직화학적 탐지이다. 일부 구현예에서, 상기 탐지는 면역형광 탐지이다. 일부 구현예에서, 상기 탐지는 FACS 탐지이다. 일부 구현예에서, 상기 탐지는 상기 제제 또는 본 발명의 항체를 인식한 2차 항체와 샘플을 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 탐지는 2차 항체를 탐지하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 탐지는 현미경을 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체는 질병 또는 질환을 앓고 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 질병 또는 질환을 앓고 있을 것으로 의심된다. 일부 구현예에서, 대상체는 질병 또는 질환이 발생할 위험이 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 증가된 HVEM 발현을 포함할 수 있는 질병 또는 질환을 앓고 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 증가된 HVEM 발현을 특징으로 할 수 있는 질병 또는 질환을 앓고 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 암을 앓고 있다. 일부 구현예에서, 암은 최우선 치료에 반응하지 않았던 암이다. 일부 구현예에서, 암은 재발 암이다. 일부 구현예에서, 상기 암은 PD-1/PD-L1 치료제에 반응하지 않았던 암이다.
일부 구현예에서, 샘플은 질병 샘플이다. 일부 구현예에서, 샘플은 생물학적 유체이다. 일부 구현예에서, 생물학적 유체는 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 대변, 담즙, 정액, 종양액, 및 뇌 척수액으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 샘플은 혈액 샘플이다. 일부 구현예에서, 샘플은 세포 샘플이다. 일부 구현예에서, 샘플은 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플은 질병 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플은 종양 샘플이다. 일부 구현예에서, 샘플은 생검이다.
일부 구현예에서, HVEM의 양성 발현은 HVEM 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, HVEM의 양성 발현은 상승된(elevated) HVEM 수준을 포함한다. 일부 구현예에서, HVEM의 양성 발현은 증가된(increased) HVEM 수준을 포함한다. 일부 구현예에서, HVEM의 양성 발현은 HVEM의 과다발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 건강한 샘플과 비교할 때 HVEM이 양성 발현된다. 일부 구현예에서, 건강한 샘플은 건강한 조직 및/또는 질병 조직 및/또는 세포에 인접한 세포로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 건강한 샘플은 비-감염된 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 건강한 샘플은 건강한 공여자에 대한 것이다. 일부 구현예에서, 소정의 임계치과 비교할 때, HVEM이 양성 발현된다.
다른 양태에 의하면, 본 발명의 약학적 조성물, 또는 본 발명의 제제를 포함하는 키트가 제공된다.
일부 구현예에서, 키트는 PD-1 기반 치료제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 PD-L1 기반 치료제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 치료제는 면역치료제이다. 일부 구현예에서, 치료는 항-PD-1 치료제이다. 일부 구현예에서, 치료제는 항-PD-L1 치료제이다. 일부 구현예에서, 치료제는 PD-1/PD-L1 차단 치료제이다. 일부 구현예에서, 치료제는 차단 항체이다. 일부 구현예에서, 치료제는 항-PD-1 항체이다. 일부 구현예에서, 치료제는 항-PD-L1 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 차단 항체이다.
일부 구현예에서, 키트는 본 발명의 약학적 조성물이 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 치료제와 함께 사용하기 위한 것이라는 사실을 명시한 라벨을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 본 발명의 제제가 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 치료제와 함께 사용하기 위한 것이라는 사실을 명시한 라벨을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 2차 탐지 분자를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 탐지 분자는 본 발명의 제제를 탐지하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 2차 탐지 분자는 본 발명의 제제에 결합하는 항체이다. 일부 구현예에서, 탐지 분자는 탐지가능한 모이어티를 포함한다. 탐지가능한 모이어티의 예는 형광 모이어티, 태그, 방사능 표지, 염료 및 화학발광 모이어티를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 탐지가능한 모이어티는 형광 모이어티이다. 형광 모이어티의 예는 GFP, RFP, YFP, APC, CY5, CY7, 및 Pacific Blue를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 2차 탐지 분자는 당업계에 잘 알려져 있고, 본 발명의 제제를 탐지할 임의의 이러한 분자가 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "약"이라는 용어는, 수치값과 조합될 때, 인용된 값의 플러스 및 마이너스 10%를 말한다. 예를 들어, 약 1000 나노미터(nm)의 길이는 1000 nm±100 nm의 길이를 말한다.
본원에 그리고 첨부된 청구 범위에 사용된 단수형["a", "an" 및 "the"]은, 문맥상 명백히 달리 기재된 바 없는 경우, 복수형 언급 단어도 포함한다는 사실을 주목한다. 따라서, 예를 들어, "폴리뉴클레오티드"에 대한 언급은 이러한 복수의 폴리뉴클레오티드들을 포함하며, "폴리펩티드"에 대한 언급은 하나 이상의 폴리펩티드 및 당업계의 숙련자들에게 알려진 이들의 균등물 등을 포함한다. 추가로, 청구항은 어떠한 선택적인 요소도 배제하도록 작성될 수 있다는 사실에 주목한다. 따라서, 이러한 진술은 청구항 구성 요소들을 나열할 때 단지["solely", "only" 등]와 같은 이러한 배타적 용어를 함께 사용하는 경우, 또는 "부정적인" 제한을 사용할 경우에 대한 선행 기초의 역할을 하도록 의도된다.
"A, B, 및 C 등 중 적어도 하나"와 비슷한 관례가 사용되는 경우에, 일반적으로 이러한 구조는 당업계의 숙련자가 그 관례를 이해할 것이라는 의미를 갖는 것으로 의도된다(예를 들어, "A, B, 및 C 중 적어도 하나를 갖는 시스템"은, A 단독, B 단독, C 단독, A와 B 함께, A와 C 함께, B와 C 함께, 및/또는 A, B 및 C 함께 등을 갖는 시스템을 포함하나, 이에 제한되지 않을 것이다). 추가로 당업자들은 둘 이상의 대안적인 용어를 나타내는 임의의 분리된(disjunctive) 단어 또는 어구가, 명세서, 청구항 또는 도면에 있든 간에, 실질적으로 하나의 용어, 용어들 중 어느 하나, 또는 상기 용어 둘 다를 포함할 가능성이 있다는 사실을 고려해야 한다고 이해할 것이다. 예를 들어, "A 또는 B"라는 어구는 "A" 또는 "B", 또는 "A와 B"의 가능성을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
명확함을 위해 개별 구현예의 맥락에서 기재된 본 발명의 특정한 특징들은, 또한 단일 구현예에서 조합하여 제공될 수 있다고 인정된다. 반대로, 간략성을 위해 단일 구현예의 맥락에서 기재된 본 발명의 다양한 특징들은, 또한 개별적으로 또는 임의의 적합한 하위-조합으로 제공될 수도 있다. 본 발명에 관한 구현예의 모든 조합들은 구체적으로 본 발명에 포괄되며, 마치 각각의 모든 조합들이 개별적으로 명확히 개시된 것처럼 본원에 개시된다. 또한, 다양한 구현예 및 이의 요소들의 모든 하위-조합들도 또한 본 발명에서 구체적으로 포괄되며, 마치 각각의 모든 이러한 하위-조합들이 개별적으로 명확히 개시된 것처럼 본원에 개시된다.
본 발명의 추가적인 목표, 장점 및 신규한 특징은 이하 실시예의 평가시 당업계의 통상의 숙련자에서 명백할 것이며, 제한의 의도가 아니다. 추가적으로, 본원에서 상기 기술되고 이하의 청구항 섹션에서 주장된 본 발명의 다양한 구현예 및 양태 각각은, 이하 실시예에서 실험적으로 뒷받침된다.
본원에서 상기 기술되고 이하의 청구항 섹션에서 주장된 본 발명의 다양한 구현예 및 양태는, 이하 실시예에서 실험적으로 뒷받침된다.
실시예
일반적으로, 본원에 사용된 명명법과 본 발명에 이용된 실험 공정은 분자, 생화학, 미생물 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 이러한 기술은 문헌에서 철저히 설명된다. 예를 들어, 문헌["Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook 외,(1989)]; 문헌["Current Protocols in Molecular Biology" I-III 권, Ausubel, R. M., ed.(1994)]; 문헌[Ausubel 외, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland(1989)]; 문헌[Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York(1988)]; 문헌[Watson 외, "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York]; 문헌[Birren 외(eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", 1-4 권, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1998)]; 미국 특허 제4,666,828호; 제4,683,202호; 제4,801,531호; 제5,192,659호 및 제5,272,057호에 나열된 방법들; 문헌[Cell Biology: A Laboratory Handbook", I-III 권, Cellis, J. E., ed.(1994)]; 문헌["Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y.(1994), 3판]; 문헌["Current Protocols in Immunology" I-III 권, Coligan J. E., ed.(1994)]; 문헌[Stites 외(eds), "Basic and Clinical Immunology"(8판), Appleton & Lange, Norwalk, CT(1994)]; 문헌[Mishell and Shiigi(eds), "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press(1996)]를 참고하고; 상기 문헌들 모두는 참조로서 포함된다. 다른 전반적인 참고 문헌은 본 문서 전반에서 제공된다.
재료 및 방법
파지 디스플레이에 의한, HVEM에 대한 scFv의 생성: 미경험 인간 scFv 라이브러리를, 태그 특이적인 클론을 제거하기 위해 합성/재조합 태그와 함께 배양하고, CHO-K1 세포 결합 클론을 제거하기 위해 대조군 빈-CHO-K1 세포와 함께 배양하였다. 이후, hrHVEM을 과다발현하는 CHO-K1 세포와 함께 배양하는 동안, 파지에 3회의 바이오패닝(biopanning) 라운드를 실시하였다. 클론들을 따서, 헬퍼-파지의 도움으로 탈출시키고(rescued), 이를 hrHVEM, mrHVEM 및 crHVEM에 대한 파지 ELISA에 의해 스크리닝하였다. 클론들을 시퀀싱하고, 양성의 독특한 클론들은 pET25b 단백질 발현 벡터에 서브-클로닝하였다. 용해물은 200㎖의 유도된 배양액으로부터 생산하였다. 박테리아 세포를 펠렛화하고, PBS로 씻어내고, 프렌치 프레스(French press)에 의해 용해시켰다. 불용성 찌꺼기는 고-속 원심분리에 의해 제거하고, scFv를 포함하는 용해성 단백질을 함유하는 용해물을 모았다. scFv를 HIS 태그와 함께 클로닝하였다.
형질감염된 CHO-K1 세포의 생성: 6-웰 플레이트에서 10% FBS(Biological Industries, 이스라엘)이 보충된 L-글루타민 배지(Biological Industries, 이스라엘)와 함께 Nutrient Mixture F-12(Ham's) 중의 CHO-K1 세포를 200K 세포/웰의 밀도로 분주하고, 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양 후, 2 ㎍의 플라스미드 DNA를 제조사의 지시에 따라 4 ㎕의 jetPRIME 형질감염 시약(Polyplus-transfection, 프랑스)을 사용하여 형질감염시켰다. 형질감염 2일 후에, 1 mg/㎖의 G418 설페이트 항생제(Millipore, 독일)에 의한 선별을 실시하고, 항생제를 첨가하여 세포를 관례대로 배양하였다.
유세포 분석: FACS 완충액(PBS, 0.02% 소듐 아자이드, 0.5% BSA)에 희석된 적절한 순수 특이적 항체에 의해, 30 분 동안 얼음에서 ≤1×105 세포에 대해 표면 세포 염색을 실시하였다. 배양 후, 세포를 5분 동안 4℃에서 500g로 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 세포를 얼음을 덮어서 형광단-접합된 적절한 2차 항체와 함께 30분 동안 배양하였다. 형광단-접합된-1차 항체의 경우, 2차 항체 없이 직접 염색을 실시하였다. 배양 후, 세포를 씻어내고, 유세포 분석 분석을 위해 이를 200 ㎕의 FACS 완충액에 재-현탁시켰다.
mAb 생산:
a. 루시퍼라제 리포터 검정: 루시퍼라제 활성은, Bright-Glo 루시퍼라제 검정 시스템(Promega, USA)을 사용하여 제조자의 지시에 따라서 측정하였다. 간략히, 루시퍼라제 검정 시약은 한 병의 완충액과 한 병의 기질을 조합하고 혼합함으로써 제조하였다.　동일한 부피의 시약과 샘플을 혼합하고, 시약을 첨가한 지 3분 또는 10분 후에 적절한 장비 세팅을 사용하여 발광을 측정하였다.
b. 플라스미드 제조: scFv2를 S228P 돌연변이를 함유하는 완전한 IgG4 항체로 전환시켰다. 표적 DNA 서열을 디자인하여, 최적화하고, 합성하였다. 완전한 서열을 pcDNA3.4 벡터에 서브-클로닝하였다. 형질감염 등급 플라스미드를 Expi293F 세포 발현을 위해 최대로-제조하였다.
c. 세포 배양 및 일시적인 형질감염: Expi293F 세포를 무-혈청 Expi293FTM 발현 배지(Thermo Fisher Scientific, USA)에서 키웠다. 세포를 37℃, 8% CO2에서 오비탈 진탕기(VWR Scientific, USA) 위의 Erlenmeyer 플라스크(Corning Inc., USA) 내에 유지하였다. 형질감염시키기 하루 전에, 세포를 Corning Erlenmeyer 플라스크에 적절한 밀도로 분주하였다. 형질감염시킨 날, DNA와 형질감염 시약을 최적 비율로 혼합한 후, 이를 형질감염될 준비가 된 세포가 들어 있는 플라스크에 첨가하였다. 표적 단백질을 암호화하는 재조합 플라스미드를, Expi293F 세포 배양 현탁액에 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염 6일 후에 모은 세포 배양 상청액을 정제를 위해 사용하였다.
정제 및 분석: 세포 배양 배지를 원심분리한 후, 여과하였다. 여과된 세포 배양 상청액을 친화성 정제 컬럼에 적절한 유속으로 로딩하였다. 적절한 완충액으로 세척하고 용출한 후, 용출된 분획을 모아서, 최종 제제화 완충액에 완충 교환하였다. 정제된 단백질을 분자량 및 순도 측정을 위해, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅 분석으로 분석하였다. 농도는 A280 방법(항체)에 의해 결정하였다.
세포독성 검정: 핵 RFP로 염색된 흑색종 세포를 분주하고 밤새 배양하여, 이들이 부착되게 하였다. 이후, 흑색종 세포를 20 ㎍/㎖의　본 발명의 mAb 또는 hIgG4 이소타입 대조군 항체(Invivogen, 프랑스)와 함께 사전-배양하였고, TIL을 20 ㎍/㎖의 항-PD1 mAb(니볼루맙, BMS) 또는 hIgG4 이소타입 대조군 항체(Invivogen, 프랑스)와 함께 사전-배양하였다. 항-PD1 또는 hIgG4 이소타입 대조군 mAb과 함께 사전-배양된 TIL 또는 단지 배지만을, 흑색종 세포에 CellEvent 카스파제-3/7 Green 탐지 시약(Invitrogen, USA)과 함께 첨가하였다. 플레이트를 Incucyte ZOOM 시스템(ESSEN Bioscience, USA)에 두고, 매 시간 스캐닝하였다. 흑색종의 특이적인 사멸을 반영하는 카스파제 3/7 양성 사건을 계수하였다. 유사한 프로토콜을 RCC 세포에 의한 세포독성 검정 실험과 MAB356에 의한 세포독성 검정 실험에 사용하였다.
유세포 분석에 의한 T 세포 활성화 검정: 흑색종 세포 또는 단지 배지만을, 20 ㎍/㎖의 본 발명의 mAb 또는 hIgG4 이소타입 대조군 항체(Invivogen, 프랑스)와 함께 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 1 시간 후, TIL을 흑색종 세포 또는 배지에 첨가하고, 4 시간 동안 37℃에서 공동 배양하였다.　4 시간 후, 세포를 항-CD3(Biolegend, USA) 및 항-41BB(Biolegend, USA)에 의해 표면 염색하고, CytoFLEX 장비(Beckman Coulter, USA)를 사용하는 유세포 분석에 의해 발현을 평가하고, FCS Express 6 소프트웨어(DeNovo Software, US)을 사용하여 데이터 분석을 실시하였다.
Incucyte ZOOM 시스템에 의한 T 세포 활성화 검정: 핵 RFP에 의해 염색된 흑색종 세포를 분주하고, 밤새 배양하여 서로 부착되게 하였다. 밤새 배양한 후, 흑색종 세포를 1 시간 동안 37℃에서 20 ㎍/㎖의 본 발명의 mAb 또는 hIgG4 이소타입 대조군과 함께 배양하였다. MART-1 전기영동된 PBMC 또는 배지를, FabFlour-488 표지 시약(ESSEN Bioscience, USA)으로 표지된 항-41BB(Biolegend, USA)과 함께 흑색종 세포에 첨가하엿다. 플레이트를 Incucyte ZOOM 시스템에 두고, 매 시간 스캐닝하였다.
T 세포 군집의 검정: 이미지는 Incucyte ZOOM 시스템에 의해 얻었다. 군집의 수는 image J 버전 1.52a에 의한 이미지 분석을 통해 계산하였다. 이미지를 평탄화하고, 대비를 강화시킨 후, 이후 8-비트 이미지로 변화시켰다. 이미지 이진화(image binarization) 이후, "close", "fill holes" 및 "erode" 명령을 적용하여 이미지를 가공하였다. 이후, "analyze particles" 명령을 이하의 변수들과 함께 적용하였다: 500mm2-무한대의 크기, 및 0.1 내지 1 사이의 환상도(Circularity).
실시예 1: 면역차단 표적으로서의 HVEM의 식별
8,300개 이하의 유전자로 이루어진 고속-대량의 게놈 전체에 대한(high-throughput genome-wide) 1차 siRNA 스크리닝을, 2개의 환자-유래의 흑색종 세포 시스템에서 가동하였다. 사멸에 대한 효과는, TIL과 공동-배양에 의해 siRNA 형질감염시킨 지 96 시간 이후, LDH-기반 세포독성 검정을 사용하여 평가하였다. 양성 대조군의 성공적인 녹다운은, FACS에 의해 평가하였다. 360개의 유전자로 이루어진 확인 스크리닝은, 1차 스크리닝과 동일한 디자인을 사용하여 8개의 흑색종 세포 시스템에서 검증되었고, 여기에서 양성 히트(positive hit)는 이들의 Z-점수와 사멸 향상의 퍼센트에 기초하여 정의되고, 증식에 대한 siRNA의 효과를 위해 보정되었다. 최종적으로, 5개의 흑색종 세포 시스템에서 54개의 유전자로 이루어지는 검증 스크리닝(validation screen)을 실시하였다. HVEM은 잠재적인 면역치료 표적만큼 강한 양성 히트로서 발견되었다.
실시예 2: HVEM에 대한 scFv의 선별
암의 치료에서 치료적 면역차단에 대한 잠재적인 표적으로서 HVEM을 확립하고, HVEM에 결합할 수 있는 단쇄 항체 절편(scFv)를 분리하여, 검정하였다. scFv는 본원에서 상기 기재된 바와 같이 분리하였다(재료 및 방법). 6개의 선택된 scFv을 재조합 인간, 마우스 및 게먹이 원숭이(cynomolgus) HVEM에 대한 결합에 대해 스크리닝하였다(표 1 참고). 세포 ELISA에 의해 측정할 때, 6개 중 5개는 CHO-K1 세포에서 발현된 인간 재조합 HVEM(hrHVEM)에 강하게 결합하는 것으로 나타났다. 빈-CHO-K1 세포는 음성 대조군으로 사용하였다. 이들 5개 중 2개는 마우스 재조합 HVEM(mrHVEM)에 대해 강한 결합을 보이는 반면, 다른 3개는 훨씬 약한 결합을 나타내었다. 상기 5개 중 하나는 또한 원숭이(게먹이 원숭이) HVEM에 대해 강한 결합을 보이는 반면, 나머지 것들 중 3개는 훨씬 약한 결합을 나타내었다. FACS 분석을 사용하여 이 결과들을 확인하였다. HIS 태그를 함유하는 scFv와 항-HIS 2차 APC-접합된 항체를, 표면 결합의 탐지에 사용하였다. ELISA에 의해 예측된 바와 같이, scFv 중 5개는 CHO-K1 HVEM 과다발현 세포에서 표면 hrHVEM에 결합하는 것으로 밝혀졌으나, 상기 scFv 중 2개는 매우 약하게 결합하였다(도 1).
표 1. HVEM을 과다발현하는 CHO-K1 세포에 대한 scFv를 함유하는 용해물에 의한 세포 ELISA. 숫자는 OD 값을 나타낸다.
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다음으로, scFv를, HVEM와 이의 리간드 중 2개: BTLA 및 LIGHT(TNFSF14) 사이의 상호작용을 저해하는 이들의 능력에 대해 체크하였다. ELISA 플레이트를 2.5㎍/㎖의　hrHVEM로 코팅하고,　4℃에서 밤새 항온 처리하였다. 이후, 플레이트를 씻어내고, 1 시간 동안 실온에서 2% BSA로 차단시켰다. scFv1-6 용해물과 대조군 용해물을 ELISA 플레이트에 첨가하고, 1 시간 동안 실온에서 배양하였다. 플레이트를 씻어내고, 10분 동안 차단시킨 후, 좀 더 세척하였다. hrBTLA-Fc 또는 hrLIGHT-HIS를 ELISA 플레이트에 첨가하고, 2 시간 동안 실온에서 항온 처리하였다. 플레이트를 씻어내고, 차단시키고, 1 시간 동안 마우스 항-BTLA 비오틴 mAb 또는 염소 항-LIGHT pAb와 함께 실온에서 항온 처리하였다. 플레이트를 씻어내고, 30분 동안 실온에서 스트렙타비딘 퍼록시다제(streptavidin peroxidase) 또는 소의 항-염소 HRP 항체와 함께 항온 처리하였다. 최종적으로, 플레이트를 씻어내고, 황산 정지 용액을 첨가함으로써 TMB를 씻어내었다. Spark 10M 플레이트-판독기를 사용하여, 450nM 및 570nM에서 흡광도를 판독하였다. 예상 외로, 비록 scFv 1, 3, 4 및 6이 hrHVEM에 결합하기는 했지만, 이 항체들은 HVEM-BTLA 결합을 저해하지 않았다. 반대로, scFv2는 BTLA 결합을 거의 완전히 저해하였다(도 2a). 확실히, 어떠한 항체도 HVEM에 대한 LIGHT의 결합을 유의하게 저해하지 않았다(도 2b). 인간, 마우스 및 원숭이 rHVEM에 대한 scFv2의 결합과, HVEM-BTLA 상호작용을 차단하는 scFv2의 능력 때문에, 모든 미래의 작업을 위해 scFv2를 선택하였다.
실시예 3: 항-HVEM IgG 항체
비록 단일-사슬 항체 scFv2가 HVEM-BTLA 상호작용을 차단하는데 효과적이기는 하지만, 전체 IgG 단일클론 항체(mAb)는 scFv2의 경쇄 및 중쇄, 및 특히 CDR로부터 디자인하였다. scFv2를 시퀀싱하고, 경쇄 및 중쇄를 S228P 돌연변이를 제외한 IgG4 골격에 클로닝하였다. 이 mAb의 중쇄의 전체 서열은 서열번호 9로 제시되고, 경쇄는 서열번호 10로 제시되어 있다. 전체 IgG 항체의 존재는 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다(도 3).
다음으로, 인간, 마우스 및 원숭이 유래의 재조합 HVEM에 대한 새로운 mAb의 결합은, 이전과 같이 평가하였다. hrHVEM에 대한 결합은 이전과 마찬가지로 ELISA에 의해 평가하였다. 새로운 mAb는 hrHVEM에 강하게 결합하였다(도 4a). 결합은 또한 이전과 마찬가지로 FACS에 의하여 평가하였다. 빈-CHO-K1, CHO-K1 hrHVEM, CHO-K1 mrHVEM 및 CHO-K1 crHVEM　세포를 20 ㎍/㎖의 항체 또는 hIgG4 이소타입 대조군 항체와 함께 1 시간 동안 얼음에서 배양한 후, 항-인간 IgG FC 비오틴 및 항-비오틴 FITC에 의해 염색하였다. 발현은 CytoFLEX 장비를 사용한 유세포 분석과 FCS Express 6 소프트웨어를 사용한 데이터 분석에 의해 평가하였다. 새로운 mAb는 모든 3개 종 유래의 rHVEM에 강하게 결합하였다(도 4b).
새로운 mAb는 재조합 인간 HVEM에 결합할 수 있었으므로, 건강한 세포 및 암 세포의 표면 상의 내재성 HVEM에 결합하는 이의 능력을 시험하였다. 첫번째 면역조직화학적 방법은 본 발명의 mAb에 의하여 건강한 인간 결장 및 비장 조직에 대해 실시하였고, 염색이 확실히 관찰되었다(도 5a). 다음, HVEM를 발현한다고 알려진 1차 환자 샘플로부터 얻은 3개의 흑색종 세포(도 5b)를, 20 ㎍/㎖의 본 발명의 mAb와 함께 얼음에서 1 시간 동안 배양한 후, 항-인간 IgG FC 비오틴 및 항-비오틴 FITC에 의해 염색하였다. 발현은 이전과 마찬가지로 FACS에 의해 평가하였다. 새로운 mAb는 3개의 모든 시험된 흑색종 샘플에 결합하였다(도 5c). 신장 세포 암종(RCC) 환자 샘플에 대한 결합도 또한 시험하였다. 다시, 시판용 항-HVEM 항체(R&D Systems AF356)를 사용하여, 암 세포가 HVEM을 발현한다는 사실을 확인하였다(도 5d). 아들의 표면에 대한 새로운 mAb의 결합은, 상업적인 항체에 필적할만하였다(도 5e). 최종적으로, 종양 마이크로어레이를 본 발명의 mAb에 의해 탐색하였다(도 5f). 12개의 상이한 지표를 시험하였는데, 지표마다 1개의 건강한 조직 샘플과 5개의 상이한 종양 샘플을 포함한다. 건강한 췌장, 폐, 유방, 방광 및 난소는 HVEM에 대해 음성이었으나; 림프절, 후두/구강/혀, 뇌, 신장, 간 및 위는 다양한 정도로 모두 양성이었다. 비록 모든 종양이 HVEM을 발현하지 않기는 하지만, 각각의 장기 타입으로부터 얻은 적어도 하나의 종양 샘플은 양성이었다.
전체 mAb가 HVEM에 결합하는 BTLA를 저해하는 능력도 또한 이전과 마찬가지로 평가하였다. ELISA에 의해 측정할 때, 본 발명의 mAb의 존재 하에서 BTLA는 HVEM에 결합하지 않았다(도 6a). 이소타입 대조군 IgG의 첨가는 양성 대조군으로 작용하며, 이 경우 BTLA가 HVEM에 강하게 결합하였다. 또한, scFv에서 나타난 바와 같이, mAb는 HVEM에 대한 LIGHT의 결합을 저해하지 않았다(도 6b). 반대로, 시판용 항-HVEM mAB인 MAB356는, 예상대로 hrHVEM에 강하게 결합할 수 있었으나(도 6c), MAB356의 존재는 mIgG1 이소타입 대조군 항체의 첨가에 비해 HVEM과 BTLA의 상호작용을 단지 약간만 방해하였다(도 6d). 따라서, 본 발명의 mAb는 BTLA-HVEM 상호작용의 저해에 대해 MAB356보다 크게 우수하였다.
다음으로, HVEM을 통한 하류 신호전달을 평가하였다. 리간드 결합에 의한 HVEM 활성화는 NF-kB 신호전달을 유도한다. HVEM 신호전달에 대한 본 발명의 mAb의 영향을 평가하기 위해, hrHVEM를 발현하는 Jurkat T 세포와 NF-kB 루시퍼라제 리포터를 20 ㎍/㎖의 mAb 또는 hIgG4 이소타입 대조군과 함께 1 시간 동안 얼음에서 사전-배양하였다. 세포를 씻어낸 후, 6 시간 동안 37℃에서 빈-CHO-K1, CHO-K1-hrBTLA와 함께 공동-배양하거나, 또는 세포 없이 배양하였다. 루시퍼라제 활성은 Bright-Glo 루시퍼라제 검정 시스템을 사용하여 시험하였고,　발광은 시약 첨가 10분 후에, Spark 10M 플레이트-판독기를 사용하여 측정하였다. 루시퍼라제는 단지 CHO 세포가 BTLA를 발현할 때에만, 대조군 항체와 함께 사전-배양된 Jurkat 세포에서 유도되었다(도 7, 우측). 이것은 NF-kB 신호전달이 단지 HVEM의 리간드에 의해서만 유도되어야 하기 때문인 것으로 예상된다. 흥미롭게도, 본 발명의 mAb와 사전-배양했을 때, 루시퍼라제의 매우 강한 유도는 CHO-K1-hrBTLA 세포와 공동 배양되었을 경우에는 나타나지 않았다(도 7, 좌측 중간 막대). 이것은 mAb가 HVEM-BTLA 상호작용을 차단하기 때문이다. 그러나, mAb와의 사전-배양 이후 루시퍼라제의 수준은 전혀 기저 수준은 아니다. 오히려, mAb 자체는 HVEM의 약한 활성화와 NF-kB 신호전달을 유도하였다(도 7, 좌측). 동일한 수준의 활성화는 CHO 세포가 공동-배양되는지와는 전혀 무관하게 나타났으며, 이는 이 활성화가 mAb 자체에 의해 유발되고, 세포에 의해서는 유발되지 않는다는 사실을 확고히 한다.
실시예 4: 본 발명의 mAb는 암 세포에 대한 T 세포 세포독성을 증가시킨다.
mAb는 HVEM에 결합하여, BTLA에 대한 이의 결합을 차단하므로, 이론적으로 이는 BTLA 신호전달이 T 세포에 대해 갖는 저해 효과를 완화시킬 것이다. 이것을 시험하기 위해, 접착된 흑색종 세포를 1 시간 동안 37℃에서, 20 ㎍/㎖의 본 발명의 mAb 또는 hIgG4 이소타입 대조군 항체와 함께 배양하였다. 1 시간 후, 종양 침윤 림프구(TIL)를 흑색종 세포에 첨가하고, 24 시간 동안 37℃에서 공동-배양하였다. 배양 이후, 공동-배양 샘플, 또는 백그라운드 IFNγ 분비에 대한 대조군으로서의 TIL 단독 샘플로부터 상청액을 모았다. IFNγ 분비는 인간 IFNγ ELISA Max Deluxe 키트를 사용하여 ELISA에 의해 측정하였다. 본 발명의 mAb과의 사전-배양은 하나의 흑색종 세포 시스템에서 거의 2배의 양의 IFNγ 분비를 생성하고, 제2 시스템에서는 더 낮기는 하지만 여전히 유의한 증가를 생성하였고(도 8), 이는 T 세포 저해가 항체에 의해 정말 완화된다는 것을 나타낸다.
다음, 자가유래 TIL의 존재 하에 1차 환자 흑색종 세포의 특이적인 사멸을 측정하였다. 2명의 환자들로부터의 접착된 흑색종 세포를, 본 발명의 mAb 또는 이소타입 대조군과 함께 사전-배양하였다. 동시에, TIL를 항-PD-1 항체 또는 이소타입 대조군과 함께 사전-배양하였다. 이후, 흑색종 세포와 TIL를 모든 가능한 조합으로 공동-배양하고, 흑색종 세포의 특이적인 사멸을 11 시간 동안 매 시간마다 측정하였다(도 9a-b). 제1 세포 시스템에서, 본 발명의 mAb의 첨가는 11 시간 이후 이소타입 대조군이 처리된 세포에 비해, 총 세포 사멸을 거의 30% 증가시켰다. 유사한 수준의 사멸은 항-PD1 처리시 관찰되었다(33% 증가). 양쪽 항체와 조합된 처리는, 전체 사멸을 추가로 60% 증가시켰다. 조합된 효과는 두번째 환자로부터의 세포에서 얻은 결과에 의해 보강되었다. 다시 한번, 본 발명의 mAb 및 항-PD1는 유사한 효과를 갖는데, 사멸을 각각 67% 및 64% 증가시켰다. 예상 외로, 양쪽 항체와의 조합된 처리는 시너지 효과를 가졌는데, 총 사멸은 대조군 공동-배양에 비해 180% 증가하였다. 이것은 2개의 항체가 함께 면역 관문 저해에 대해 시너지 효과를 생성할 수 있다는 것을 입증한다.
다음, MAB356을 동일한 시스템에서 시험하였다. TIL에 의한 흑색종 세포의 사멸을, 첫번째 환자로부터의 흑색종 세포에 대해 상기와 같이 시험하였다. 흑색종 세포를 MAB356 또는 본 발명의 mAb 또는 적절한 이소타입 대조군과 함께 사전 배양한 후, 자가유래 TIL과 혼합하였다. 흑색종 세포의 특이적인 사멸은, 15 시간 동안 매 시간마다 측정하였다. 본 발명의 mAb의 첨가는 15 시간 이후, hIgG4 이소타입 대조군을 처리한 세포에 비해 전체 세포 사멸을 22% 증가시켰으나(도 9d), 상업적인 MAB356의 첨가는 mIgG1 이소타입 대조군을 처리한 세포에 비해, 총 세포 사멸을 9% 감소시켰다(도 9e). 이것은 MAB356 대비, 본 발명의 mAb의 우수함을 명확히 나타낸다.
유사한 실험을 RCC 환자로부터의 세포에 대해 실시하였다. 암 세포를 밤새 부착시키고, 동일한 환자 유래의 TIL과 공동-배양하기 전에, 1 시간 동안 본 발명의 mAb 또는 이소타입 대조군과 함께 사전-배양하였다. 암 세포에서의 세포 사멸을 카스파제 3/7 양성 사건에 의해 측정하였고, 26 시간 후, 본 발명의 mAb는 이소타입 대조군에 비해 총 세포 사멸을 47% 증가시킨 것으로 밝혀졌다(도 9c).
실시예 5: 본 발명의 mAb는 암 세포에 대한 비-자가유래 면역 세포의 세포독성을 증가시킨다.
본 발명의 mAb을 사용하여 암 환자로부터의 TIL의 세포독성이 향상될 수 있다는 사실이 나타나서, 비-자가유래 면역 세포를 강화시키는 능력을 시험하였다. 건강한 공여자로부터의 PBMC를 모아서, 인간 MART1 TCR의 알파 및 베타 사슬을 발현시켰다. MART1을 발현하는 핵 RFP로 염색된 흑색종 세포를 밤새 부착시키고, PBMC와 공동-배양하기 전에, 한 시간 동안 본 발명의 mAb 또는 이소타입 대조군와 함께 사전-배양하였다. 암 세포에서의 세포 사멸은 카스파제 3/7 양성 사건에 의해 측정하였고, 26 시간 이후 본 발명의 mAb는 이소타입 대조군에 비해 총 세포 사멸을 28% 증가시키는 것으로 밝혀졌다(도 10a).
PBMC로부터의 전염증성 사이토카인 분비도 또한 측정하였다. 구체적으로, 인터페론 감마(IFNγ) 분비는 본 발명의 mAb 또는 이소타입 대조군을 함유하는 배지와 함께 배양되거나, 본 발명의 mAb 또는 이소타입 대조군과 함께 사전-배양된 흑색종 세포와 배양된 PBMC로부터의 배지에서 측정하였다. 배양이 시작된 지 24 시간 후에, IFNγ 수준을 측정하였다. 예상대로, 흑색종 세포와의 배양은 IFNγ 분비를 크게 증가시켰으나, 본 발명의 mAb과 함께 사전-배양된 흑색종 세포와의 배양은, 이소타입 대조군과 함께 사전-배양된 흑색종 세포에 비해 분비를 추가로 32% 증가시켰다(도 10b).
증가된 세포독성은 항체에 의해 직접 유도되며, 증가된 T 세포 사멸 때문이 아니라는 가능성을 배제하기 위해, mAb의 직접 세포독성 효과를 측정하였다. 핵 RFP로 염색된 접착된 흑색종 세포를 1 시간 동안 37℃에서, 20 ㎍/㎖의　본 발명의 mAb 또는 hIgG4 이소타입 대조군 항체와 함께 배양하였다. 1 시간 후, 세포 Event 카스파제-3/7 Green 탐지 시약을 흑색종 세포에 첨가하였다. 플레이트를 Incucyte ZOOM 시스템(ESSEN Bioscience, USA)에 두고, 15 시간 동안 매 시간마다 스캐닝하였다. mAb와 배양된 2개의 다른 흑색종 세포에서는, 세포 사멸이 전혀 관찰되지 않았는데(도 11), 이는 항체 자체는 세포독성이 없으며, 마지막 실험에서 관찰된 암 사멸의 증가가 오히려 증가된 T 세포의 세포독성 때문이라는 사실을 나타낸다.
실시예 6: 본 발명의 mAb는 TIL의 약한 기저 활성화를 유도한다.
본 발명의 mAb는, T 세포에서 BTLA 유도된 억제를 감소시키는 반면, T 세포 자체 상의 HVEM에도 또한 결합한다. mAb가 HVEM 신호전달을 통해 NF-kB 유도된 전사를 증가시키기 때문에, mAb의 직접 결합은 T 세포 활성화를 직접 증가시킬 수 있다. 이것을 시험하기 위해, TIL을 mAb 또는 이소타입 대조군, 둘 다 단독에 의해, 그리고 자가유래 흑색종 세포의 존재 하에서 자극하여, T 세포의 활성화를 모니터링하였다(도 12a). 활성화된 T 세포의 백분율은, 흑색종 세포가 있는 경우와 흑색종 세포가 없는 경우 모두에서 mAb의 존재 하에 증가하였다. 이것은 T 세포 상의 HVEM에 대한 항체의 결합이 스스로 활성화를 유도한다는 사실을 나타낸다. 이런 이유로, 항체는 적어도 이중 효과를 갖는데, 둘 다 암 세포의 면역 감시 회피 메커니즘을 차단하는 동시에, T 세포를 직접 활성화한다.
HVEM을 통한 신호전달은 또한 T 세포 군집화를 측정함으로써 시험하였다. 세포 군집화는 활성화된 T 세포의 특징이다. 흑색종 환자로부터의 2개의 다른 TIL을, 본 발명의 mAb 또는 hIgG4 이소타입 대조군과 함께 20 시간 동안 배양한 후, 군집 수를 측정하였다. 시험된 양쪽 샘플에 대해, 본 발명의 mAb는 T 세포 군집화를 상당히 증가시켰다(도 12b). MAB356을 시험했을 때, mIgG1 대조군 대비 T 세포 군집화에 대한 변화는 관찰되지 않았다(도 12c). 이것은 T 세포 상의 HVEM에 대한 본 발명의 mAb의 결합이 신호전달 및 낮은-수준 활성화를 유도하는 반면, 시판용 MAB356의 결합은 그렇지 않다는 것을 나타낸다.
흑색종 세포의 존재 하에서의 PBMC의 활성화도 또한 측정하였다. 이전과 마찬가지로, PBMC는 MART-1 특이적인 TCR을 발현하여, 흑색종 세포을 표적화한다. 또한 비-자가유래 세포에 대해서도 역시, mAb는 세포 상의 41BB 발현을 측정할 때 활성화를 크게 증가시켰다(도 12d).
면역 관문 저해제가 투여될 때, 사이토카인 방출 증후군은 항상 염려된다. 본원에서 상기 나타난 바와 같이, 본 발명의 mAb는 심지어 암 세포가 없을 때에도 TIL의 약한 활성화를 유도할 수 있다. 이러한 활성화의 정도를 추가로 설명하기 위해, 사이토카인 방출 검정을 실시하였다. 10명의 건강한 공여자로부터 전혈을 채취하여, 본 발명의 mAb를 0.1 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖의 농도로 시험하였다. 24 시간 후, 샘플들을 5개의 사이토카인: IL-6, IL-8, IL-10, IFNγ 및 TNFα의 발현에 대해 측정하였다. 2개의 시판용 항-암 항체 얼비툭스(Erbitux)(EGFR 저해제) 및 렘트라다(Lemtrada)(항-CD52)를 대조군으로 사용하였다. 분석 결과는 도 13에 요약되어 있다. 굳건한 사이토카인 반응을 유도하는 렘트라다와 달리, 본 발명의 mAb는 얼비툭스에 필적할만한 약한 반응만을 일으켰다.
실시예 7: 본 발명의 mAb에 의한 생체내 암 치료
인간 흑색종 세포를 SCID-NOD 마우스의 옆구리에 피하 이식하였다(0일 차). 종양이 45 ㎣ 이하에 이를 때(17일차), 마우스를 4개의 치료 그룹(3마리의 마우스/그룹)으로 할당하고, 인간 자가유래 TIL를 정맥내 투여하였다. TIL를 다시 34일 차에 투여하였다. 17일 차에, TIL 투여에 부수적으로, hIL-2를 연속 5일 동안, 그리고 그 후에는 주 2회 피하 투여하였다. 18일 차에, 그리고 그 이후에는 한 주에 2회, hIgG4 이소타입 대조군(흑색 원), 본 발명의 mAb(백색 사각형), 항-PD1(흑색 삼각형) 또는 양쪽 항체들의 조합(흑색 마름모꼴)을 마우스에 정맥내 투여하였다. 이소타입 대조군에 비해, 본 발명의 mAb에 의한 치료는 31%의 종양 성장 저해율(TGI)을 나타낸 반면, 항-PD1에 의한 치료는 단지 11%의 TGI만을 나타내었다. 조합 치료는 48%의 TGI를 나타내는 시너지 효과를 가졌다(도 14). 어느 마우스에서도 유해한 부작용이 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 본 발명의 항체가 암의 생체내 치료에 효과적이며, 항-PD1 항체와의 조합 치료가 치료를 향상시키는 시너지 효과를 갖는다는 사실을 입증한다.
비록 본 발명이 이의 특정 구현예과 함께 기재되었지만, 당업계의 숙련자들에게는 많은 대안예, 변형예 및 수정예들이 자명할 것이라는 사실은 명백하다. 따라서, 첨부된 청구항의 사상 및 넓은 범주 내에 속하는 이러한 모든 대안예, 변형예 및 수정예가 포괄되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> 4C Biomed INC. Tel Hashomer Medical Research Infrastructure and Serviced LTD. <120> ANTI-HVEM ANTIBODIES AND USE THEREOF <130> 4CB-P-001-PCT <150> 62/965,921 <151> 2020-01-26 <150> 62/839,841 <151> 2019-04-29 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 1 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 2 Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 3 Ala Pro Gly Asp Tyr Thr Ala Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 4 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 5 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 6 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro Tyr Thr 1 5 10 <210> 7 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial 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Ser Arg Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 9 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Lys Ala Pro Gly Asp Tyr Thr Ala Tyr Phe Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser 145 150 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val 210 215 220 Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys 225 230 235 240 Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly 245 250 255 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 260 265 270 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu 275 280 285 Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 290 295 300 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg 305 310 315 320 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 325 330 335 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu 340 345 350 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 355 360 365 Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 370 375 380 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 385 390 395 400 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 405 410 415 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp 420 425 430 Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 435 440 445 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu 450 455 460 Gly Lys 465 <210> 10 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 10 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu 20 25 30 Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val 35 40 45 Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 50 55 60 Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg 85 90 95 Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser 100 105 110 Ser Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 11 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 12 Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 13 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 13 Ala Lys Ala Pro Gly Asp Tyr Thr Ala Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 14 Gln Ser Val Ser Ser Tyr 1 5 <210> 15 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 15 Gly Ala Ser 1 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 16 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro Tyr Thr 1 5 10

Claims (44)

  1. 세포 상의 헤르페스바이러스 도입 매개자(HVEM)에 특이적으로 결합하는 제제로써,
    a. 상기 HVEM과 B-림프구 및 T-림프구 감쇠조절인자(BTLA) 간의 상호작용을 저해하고;
    b. 상기 세포 내에서 상기 HVEM을 통해 하류 신호전달을 활성화하는, 제제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제제는 상기 HVEM과 종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 일원 14(TNFSF14) 간의 상호작용을 실질적으로 저해하지 않는, 제제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제제는 상기 HVEM과 CD160, 림포톡신 알파(LTα) 또는 상기 둘 다와의 상호작용을 저해하는, 제제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 상기 세포에 의해 발현되는 상기 HVEM와 결합할 때, HVEM을 발현하는 세포의 어팝토시스를 직접 유도하지 않는, 제제.
  5. 제1항 또는 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 항체 또는 이의 항원 결합 절편인, 제제.
  6. 제5항에 있어서, IgG2, IgG4 또는 상기 세포에 대해 세포독성이 없는 변형된 IgG1 또는 IgG3를 포함하는, 제제.
  7. 제5항에 있어서, 상기 제제는 단쇄 항체(scFv)인, 제제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HVEM을 통한 하류 신호전달은 활성화된 B 세포의 핵 인자 카파-경쇄 인핸서(NF-kB) 매개 전사를 포함하는, 제제.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HVEM을 통한 하류 신호전달은 상기 HVEM을 발현하는 면역 세포의 증가된 세포독성을 포함하는, 제제.
  10. 제9항에 있어서, 상기 증가된 세포독성은 전염증성 사이토카인의 증가된 분비를 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 면역 세포이고, 상기 신호전달은 면역 활성화를 유도하는, 제제.
  12. 제11항에 있어서, 상기 면역 세포는 종양 침윤 림프구(TIL) 또는 말초혈 단핵 세포(PBMC)인, 제제.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 암 세포이고, 상기 신호전달은 항-종양 효과를 포함하는, 제제.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, HVEM를 발현하는 질병 세포를 특징으로 하는 질병의 치료에 사용하기 위한, 제제.
  15. 제14항에 있어서, 상기 질병은 HVEM 양성 암 또는 전암성 병변인, 제제.
  16. 제15항에 있어서, 상기 HVEM 양성 암은 흑색종, 신장암, 자궁경부암, 전립선암, 췌장암, 폐암, 난소암, 결장암, 유방암 및 두경부암으로부터 선택되는, 제제.
  17. 제14항에 있어서, 상기 질병은 감염성 질병이고, 상기 감염된 세포는 HVEM 발현을 포함하는, 제제.
  18. 제5항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 절편은 3개의 중쇄 CDR(CDR-H)과 3개의 경쇄 CDR(CDR-L)를 포함하되, 여기에서 CDR-H1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열(SYAMS)을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열(AISGSGGSTYYADSVKG)을 포함하고, CDR-H3는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열(APGDYTAYFDY)를 포함하고, CDR-L1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열(RASQSVSSYLA)을 포함하고, CDR-L2는 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열(GASSRAT)을 포함하고, CDR-L3은 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열(QQYGSSPPYT)을 포함하는, 제제.
  19. 제18항에 있어서, 서열 QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAPGDYTAYFDYWGQGTLVTVSS(서열번호 7)을 포함하는 중쇄를 포함하는, 제제.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 서열 ELVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPPYTFGQGTKVEIK(서열번호 8)을 포함하는 경쇄를 포함하는, 제제.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAPGDYTAYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(서열번호 9)을 포함하는 중쇄와, 서열 MGWSCIILFLVATATGVHSELVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열번호 10)을 포함하는 경쇄를 포함하는, 제제.
  22. 3개의 중쇄 CDR(CDR-H)과 3개의 경쇄 CDR(CDR-L)를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 절편으로써, 여기에서 CDR-H1는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열(SYAMS)을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열(AISGSGGSTYYADSVKG)을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열(APGDYTAYFDY)을 포함하고, CDR-L1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열(RASQSVSSYLA)을 포함하고, CDR-L2는 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열(GASSRAT)을 포함하고, CDR-L3는 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열(QQYGSSPPYT)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 절편.
  23. 제22항에 있어서, 서열 QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAPGDYTAYFDYWGQGTLVTVSS(서열번호 7)을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 절편.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 서열 ELVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPPYTFGQGTKVEIK(서열번호 8)을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 절편.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAPGDYTAYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(서열번호 9)을 포함하는 중쇄와, 서열 MGWSCIILFLVATATGVHSELVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열번호 10)을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 절편.
  26. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 제제, 또는 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 절편, 및 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제(excipient) 또는 어주번트를 포함하는, 약학적 조성물.
  27. HVEM 양성 세포를 특징으로 하는 질병 또는 질환의 치료 방법으로써, 상기 방법은 제26항의 약학적 조성물을 투여함으로써, 상기 질병 또는 질환을 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 항-PD-1/PD-L1 기반 면역치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 적응 세포 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 적응 세포 치료제는 적응 TIL 치료제를 포함하는, 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 적응 세포 치료는 면역 세포를 발현하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 투여하는 단계를 포함하되, 여기에서 상기 CAR은 상기 HVEM 발현 세포의 표면 상의 비-HVEM 단백질을 표적화하는, 방법.
  32. HVEM 양성 질병 또는 질환을 치료하는 방법으로써, 상기 방법은:
    a. HVEM와 BTLA의 상호작용을 저해하는 단계; 및
    b. 면역 세포, 질병 세포 또는 이들 둘 다에서 HVEM 신호전달을 활성화하여, HVEM 양성 질병 또는 질환을 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, PD-1와 PD-L1의 상호작용을 저해하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, HVEM과 TNFSF14의 상호작용을 실질적으로 저해하지 않는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  35. 제27항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질병 또는 질환은 HVEM 양성 암 또는 전암성 병변인, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 HVEM 양성 암은 흑색종 및 신장 세포 암종으로부터 선택되는, 방법.
  37. 제27항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질병 또는 질환은 감염성 질병이고, 상기 감염된 세포는 HVEM 발현을 포함하는, 방법.
  38. 제29항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포는 TIL 또는 PBMC인, 방법.
  39. 제29항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포는 CAR-T 세포인, 방법.
  40. 제29항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 제26항의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  41. 제27항 내지 제40항 중 어느 한 항의 방법에 의해 치료될 대상체의 적합성을 결정하는 방법으로써, 상기 대상체로부터 질병 샘플을 얻는 단계, 및 상기 샘플 내의 HVEM 수준을 결정하는 단계를 포함하되, 여기에서 상기 HVEM의 양성 발현은 상기 대상체가 제27항 내지 제40항 중 어느 한 항의 치료 방법에 적합하다는 것을 나타내는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 HVEM의 양성 발현은 건강한 샘플 또는 소정의 임계치에 비해 증가된 HVEM 수준을 포함하는, 방법.
  43. 샘플 내의 HVEM을 탐지하는 방법으로써, 상기 방법은 상기 샘플과 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 제제, 또는 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 절편을 접촉시킴으로써, HVEM을 탐지하는 단계를 포함하는, 방법.
  44. 제26항의 약학적 조성물과 이하의 것들 중 적어도 하나를 포함하는 키트:
    a. 항-PD-1/PD-L1 기반 면역치료제;
    b. 본 발명의 약학적 조성물이 항-PD-1/PD-L1 기반 면역치료제와 함께 사용하기 위한 것이라는 사실을 명시한 라벨; 및
    c. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 상기 적어도 하나의 제제, 또는 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항의 상기 적어도 하나의 항체 또는 이의 항원 결합 절편을 탐지하기 위한 2차 탐지 분자.
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