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KR20220034182A - 분자의 세포내 전달용 복합체 - Google Patents

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KR20220034182A
KR20220034182A KR1020227004290A KR20227004290A KR20220034182A KR 20220034182 A KR20220034182 A KR 20220034182A KR 1020227004290 A KR1020227004290 A KR 1020227004290A KR 20227004290 A KR20227004290 A KR 20227004290A KR 20220034182 A KR20220034182 A KR 20220034182A
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KR
South Korea
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sequence
fusion protein
peptide
cargo molecule
lys
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Application number
KR1020227004290A
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English (en)
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셩치앙 거
시위안 위
한 양
하이펑 판
슐링 런
팅동 리
칭슌 구오
칭šœ 구오
준휘 시옹
준 장
닝샤오 시아
Original Assignee
시아먼 유니버시티
시아맨 이노박스 바이오테크 코. 엘티디.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

카고 분자의 세포내 전달을 위해 사용될 수 있는, 융합 단백질 및 이를 포함하는 복합체. 상기 융합 단백질 및 복합체는 내포성 소포(endocytic vesicle)로부터 카고 분자의 효율적인 방출을 구현할 수 있어서, 카고 분자의 세포질 전달 효율성을 크게 개선할 수 있다. 카고 분자를 세포질에 수득할 수 있고, 그들은 그와 관련된 기능을 발휘할 수 있다. 상기 융합 단백질 및 복합체는 세포의 생물학적 메카니즘 및 경로에 영향을 미치는 효과적인 수단을 제공하고, 연구, 치료, 및 진단과 같은 다양한 분야에서 사용될 수 있다.

Description

분자의 세포내 전달용 복합체
본 발명은 분자 생물학 분야, 보다 구체적으로 카고 분자의 세포내 전달을 위한 융합 단백질 및 복합체에 관한 것이다.
선택적 투과성 장벽으로서 세포막은 세포 생존 및 기능에 필수적이다. 소분자들은 세포의 자연적 과정 또는 대부분의 경우에 지질 이중층의 직접적 확산을 통해 세포막을 통과할 수 있으나, 세포내 카고(intracellular cargo), 예를 들면, 외인성 활성 생체거대분자(biomacromolecule)의 원형질막을 통한 효과적인 통과는 여전히 세포 수송 과정에 대한 주요한 장애물이다. 따라서, 살아있는 세포로의 세포내 카고의 수송 효율성을 효과적으로 개선할 수 있는 분자 수송 툴이 생물의학 및 기타 분야에서 그의 적용을 위해 매우 중요하다.
세포 투과 펩티드(cell-penetrating peptide: CPP)가 현재 세포 흡수(cellular uptake)의 과정을 달성하기 위해 이용되는 가장 일반적이고 효과적인 담체 중 하나이다. 일반적으로 5개 내지 30개의 아미노산을 포함하는, 세포 투과 펩티드는 화학적 가교, 융합 발현(fusion expression) 또는 비-공유 결합에 의해 생체거대분자를 세포막을 통해 세포 내로 수송할 수 있다. 현재까지, 천연 단백질 또는 인공적으로 합성된 단백질로부터 유래된 수백종의 CPP가 세포내 카고의 세포내 전달에서 보고되었고 사용되었고, 그들의 화학적 특성에 따라 3개의 카테고리로 분류될 수 있다: (1) 아르기닌 및 라이신 잔기가 풍부하고, 생리적 pH에서 강한 양전하를 갖는, 양이온성 CPP; (2) 극성 영역 및 비-극성 영역을 포함하고, 그들의 서열 전체에 분포된 라이신 및 아르기닌 외에, 친수성 잔기, 예를 들면, 발린, 루이신, 이소루이신, 및 알라닌이 풍부한, 양친매성 CPP; (3) 비극성 아미노산을 주로 포함하는, 소수성 CPP. CPP는 그들의 강한 양전하 또는 소수성 기를 통해 세포막 표면 또는 소수성 지질 이중층에 있는 음전하와 상호작용을 하고; 소분자를 운반하는 경우, 그들은 에너지를 소비하지 않는 방식(non-energy-consuming way)으로 세포막을 통과하여 직접적으로 전위될 수 있고, 생체거대분자를 운반하는 경우, 그들은 기본적으로 에너지-의존적 내포(endocytosis)에 의해 세포로 들어간다. CPP-매개 세포 진입의 저용량, 짧은 수송 시간, 제어가능한 용량, 단순한 작동, 낮은 독성 및 부작용과 같은 장점 때문에, CPP는 현재 인 비트로 및 인 비보에서 폴리펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 플라스미드, 리포좀, 및 금속 이온, 소분자 형광, 나노입자 등을 수송하기 위해 널리 사용되고 있다.
CPP는 생체거대분자의 수송에서 다수의 장점을 가지나, 여전히 일부 한계가 있고, 해결해야 하는 첫번째 문제는 그들의 낮은 막관통 전달 효율성이다. 현재, 세포내 카고가 세포내로 수송되는 경우, CPP는 세포막의 표면과 상호작용하고, 내포작용을 통해 세포로 들어가는 것으로 일반적으로 사료된다. 세포 내포작용은 내포작용 메커니즘에 따라 4개의 주요한 타입으로 분류될 수 있다: 거대음세포작용( macropinocytosis), 클라트린-매개 내포작용(clathrin-mediated endocytosis), 카베올라/지질-래프트-매개(caveolae/lipid raft-mediated) 내포작용 및 클라트린/카베올래-독립적 내포작용. 모든 이러한 상이한 타입의 내포작용은 궁극적으로 엔도좀(endosome)을 생성할 것이고, 초기 엔도좀으로부터 후기 엔도좀으로의 성숙은 엔도좀에서 pH의 점진적 감소를 수반하고, 최종적으로 리소좀과 융합된다. 리소좀으로 들어가기 전에 세포내 카고의 세포질로의 엔도좀 탈출(endosomal escape)이 요구되며, 그렇지 않은 경우, 세포내 카고는 궁극적으로 리소좀으로 들어가서 분해되고, 기능할 수 없다. 연구는 CPP에 의해 운반되는 생체거대분자의 1%만이 성공적으로 엔도좀으로부터 탈출할 수 있고, 그들의 대부분은 궁극적으로 리소좀으로 유도되고 분해된다는 것을 보여주었다. 따라서, 세포내 카고의 탈출이 CPP의 세포내 전달 과정에서 핵심 제한 인자(limiting factor)이고, 그의 효율성이 전체 전달 효율성을 결정한다.
엔도좀으로부터의 탈출 효율성을 개선하기 위해, 주요한 전략은 그의 내용물(전달될 세포내 카고를 포함함)이 세포질 내로 방출되도록 성숙 및 산성화의 과정에서 엔도좀 막의 온전성(integrity)을 파괴하는 것이다. 물리적으로 엔도좀의 투과 및 파열을 촉진하기 위해 클로로퀸, 메틸아민, 및 염화암모늄과 같은 완충제가 시스템에 첨가될 수 있으나, 그의 강한 세포독성이 그의 임상적 적용을 방해하는 것으로 보고되었다. 현재, 가장 효과적인 방법은 바이러스, 박테리아, 동물, 식물, 또는 인간으로부터 유래된 pH-민감성 융합성(fusogenic) 펩티드를 이용하는 것이다. pH-민감성 융합성 펩티드는 특정 비율의 소수성 아미노산을 포함하고, 그들의 구조(conformation)는 낮은 pH에서 크게 변한다. CPP-매개 내포작용 후에 엔도좀의 성숙 및 산성화 과정 동안, CPP에 커플링된 pH-민감성 융합성 펩티드는 pH 값이 임계점(critical point)까지 낮아지면 구조적 변화를 겪고 엔도좀 막의 이중층에 결합하여, 인지질 이중층 막의 온전성을 심하게 교란시키고, 궁극적으로 전달될 생체거대분자를 세포질 내로 방출시킨다. 현재, 가장 흔하게 사용되는 pH-민감성 융합성 펩티드는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌의 스템 영역으로부터의 펩티드(이하에서 HA2로 지칭됨) 및 더 낮은 독성 및 더 우수한 막-파괴 효과를 갖는, HA2에 기반하여 인위적으로 변형된 INF7이고, 이들 모두는 CPP 및 단백질 분자와 융합된 후 수송될 단백질 분자의 엔도좀으로부터의 탈출 효율성을 개선시킬 수 있다. 그러나, pH-민감성 융합성 펩티드와 융합된 CPP에 의해 매개되는 거대분자 세포내 전달은 실제로 개선된 엔도좀으로부터의 탈출 효율성을 가지나, 수송될 거대분자의 상당한 부분은 여전히 엔도좀에 남는다(예를 들면, 형광 단백질이 수송될 거대분자로서 사용되는 경우, 명백한 도트-유사 분포(dot-like distribution)를 볼 수 있다).
따라서, 수송될 생체거대분자의 엔도좀으로부터의 효율적 방출을 달성하기 위해 새로운 전달 시스템을 개발할 필요가 여전히 존재한다.
다수의 실험 및 반복된 탐구 후에, 본 출원의 발명자들은 놀랍게도, 전달 담체(delivery carrier)로서 pH-민감성 펩티드와 특이적 프로테아제 인식 서열의 조합이 엔도좀(endosome)으로부터 카고 분자의 방출을 상당히 개선시켜서, 카고 분자의 세포질 전달 효율성을 크게 개선하고, 카고 분자가 그들의 상응하는 생물학적 기능에 완전한 작용을 부여할 수 있게 한다는 것을 발견했다. 이러한 발견에 근거하여, 본 발명자들은 고-효율 세포질 전달을 달성할 수 있는 담체 시스템을 개발했다.
융합 단백질(fusion protein)
따라서, 본 발명의 제 1 양태는 세포 투과 펩티드, pH-민감성 융합성 펩티드, 및 프로테아제 인식 서열을 포함하는 융합 단백질로서, 상기 프로테아제는 퓨린(furin) 프로테아제 및/또는 리소좀 시스테인 프로테아제(lysosomal cysteine protease)로부터 선택되는 것인 융합 단백질을 제공한다.
일부 구체예에서, 상기 퓨린 인식 서열(furin recognition sequence)은 하기 서열을 포함하거나 그로 구성된다: R-X1-X2-R↓ (서열번호 1), 서열 중 X1는 임의의 아미노산이고, X2는 K 또는 R이며, ↓는 절단 부위(cleavage site)이다.
특정한 구체예에서, 상기 퓨린 인식 서열은 하기 서열을 포함하거나 그로 구성된다: R-R-X1-X2-R↓ (서열번호 2).
특정한 구체예에서, X1은 알라닌 (A), 아르기닌 (R), 아스파르트산 (D), 시스테인 (C), 글루타민 (Q), 글루탐산 (E), 히스티딘 (H), 이소루이신 (I), 글리신 (G), 아스파라긴 (N), 루이신 (L), 라이신 (K), 메티오닌 (M), 페닐알라닌 (F), 프롤린 (P), 세린 (S), 트레오닌 (T), 트립토판 (W), 타이로신 (Y) 및 발린 (V)으로부터 선택된다.
특정한 구체예에서, 상기 퓨린 인식 서열은 하기 서열을 포함하거나 그로 구성된다: RRHKR↓ (서열번호 3).
특정한 구체예에서, 상기 퓨린 인식 서열은 하기 서열을 포함하거나 그로 구성된다: QSVASSRRHKR↓FAGV (서열번호 4).
특정한 구체예에서, 상기 리소좀 시스테인 프로테아제는 카뎁신(cathepsin) B, 카뎁신 C, 카뎁신 X, 카뎁신 S, 카뎁신 L, 카뎁신 D 또는 카뎁신 H로부터 선택된다.
특정한 구체예에서, 상기 리소좀 시스테인 프로테아제는 카뎁신 L이다.
특정한 구체예에서, 카뎁신 L 인식 서열은 하기 서열을 포함하거나 그로 구성된다: NNTHDLVGDVRLAGV (서열번호 6).
특정한 구체예에서, 상기 프로테아제 인식 서열은 퓨린 인식 서열 및 카뎁신 L 인식 서열을 포함한다. 특정한 구체예에서, 상기 프로테아제 인식 서열은 N-말단으로부터 C-말단까지 퓨린 인식 서열 및 카뎁신 L 인식 서열을 포함하거나, 또는 N-말단으로부터 C-말단까지 카뎁신 L 인식 서열 및 퓨린 인식 서열을 포함하는, 단일-사슬 폴리펩티드(single-chain polypeptide)이다.
특정한 구체예에서, 상기 프로테아제 인식 서열은 RRHKR (서열번호 3) 및 NNTHDLVGDVRLAGV (서열번호 6)를 포함한다. 특정한 구체예에서, 상기 프로테아제 인식 서열은 서열번호 4 및 서열번호 6을 포함한다.
본 발명에서, 용어 "pH-민감성 융합성 펩티드(pH-sensitive fusogenic peptide)" 및 "pH-민감성 펩티드(pH-sensitive peptide)"는 호환적으로 사용되고, 엔도좀 막과의 융합을 촉진하기 위해 산성 조건 (예를 들면, pH<6.5)에서 구조적 변화(conformational change)를 겪을 수 있는 종류의 폴리펩티드를 의미한다. pH-민감성 펩티드가 세포에 의해 내포작용에 의해 내포된 후 엔도좀의 성숙 및 산성화의 과정 동안, pH가 임계점(critical point)까지 떨어지면, 인지질 이중막의 온전성을 심하게 교란시키거나, 소공(small pore)을 형성하거나, 엔도좀 막의 용해를 유발하여, 수송된 생체거대분자를 세포질 내로 방출시킬 수 있도록 그러한 펩티드는 구조적 변화를 겪고, 엔도좀의 지질 이중층에 결합할 것이다. 그러한 폴리펩티드가 당해 분야에서 잘 알려져 있고, 예를 들면, Varkouhi, Amir K., et al. Journal of Controlled Release 151.3 (2011): 220-228; Erazo-Oliveras A, Muthukrishnan N, Baker R, et al. Pharmaceuticals, 2012, 5(11): 1177-1209에 기재되고, 이들 문헌은 모두 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 융합 단백질에서 사용될 수 있는 pH-민감성 펩티드는 하기 단백질 또는 폴리펩티드로부터 선택되거나, 또는 하기 단백질 또는 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다:
바이러스 단백질 출처(source)로부터 유래: HA2 (인플루엔자 바이러스) 및 그의 돌연변이체(mutants) KALA, GALA; 펜톤 베이스(penton base) (아데노바이러스 또는 리노바이러스), gp41 (HIV), L2 (파필로마 바이러스), 외피(envelope) 단백질 (웨스트 나일(West Nile) 바이러스);
박테리아 단백질 출처로부터 유래: LLO(listeriolysin O), PLO(pneumococcal pneumolysin), SLO(streptococcal streptolysin O), 디프테리아 독소, 슈도모나스 에어루기노사 외독소(Pseudomonas aeruginosa exotoxin) A, 시가(Shiga) 독소, 콜레라 독소;
식물 단백질 출처로부터 유래: 리신(ricin), 사포린(saporin), 겔로닌(gelonin);
인간/동물 단백질 출처로부터 유래: 인간 칼시토닌, 섬유모세포 성장인자 수용체(fibroblast growth factor receptor), 멜리틴(melittin);
인공적으로 합성된 펩티드: (R-Ahx-R)(4) AhxB, 페네트라틴(penetratin) (pAntp), EB1, 소 프리온 단백질(bovine prion protein) (bPrPp), SAP(sweet arrow peptide), 폴리(L-히스티딘), 프롤린-풍부 펩티드(proline-rich).
특정한 구체예에서, 상기 pH-민감성 융합성 펩티드는 인플루엔자 바이러스 HA2 (서열번호 38) 또는 그의 돌연변이체 (예를 들면, INF7, KALA 또는 GALA), 멜리틴(melittin) (서열번호 41), 및 그의 임의의 조합으로부터 선택된다. 특정한 구체예에서, 상기 인플루엔자 바이러스 HA2의 돌연변이체는 INF7 (서열번호 8), KALA (서열번호 39) 또는 GALA (서열번호 40)로부터 선택된다.
특정한 구체예에서, 상기 pH-민감성 융합성 펩티드는 INF7을 포함한다. 특정한 구체예에서, 상기 pH-민감성 융합성 펩티드는 하기 서열을 포함하거나 또는 그로 구성된다: 서열번호 8.
본 발명에서, 용어 "세포 투과 펩티드(cell penetrating peptide) (CPP)"는 또한, "단백질 전달 도메인(protein translocation domain) (PTD)", "트로이 목마 펩티드(Trojan horse peptide)", 또는 "전달 펩티드(translocation peptide)" 등으로 불리며, 다양한 분자(예를 들면, 단백질 및 핵산을 포함한 다양한 거대분자)의 세포 흡수를 촉진할 수 있는 폴리펩티드를 의미한다. 그러한 폴리펩티드가 당해 분야에서 잘 알려져 있고, 예를 들면, Stewart KM, et al. Org Biomol Chem. 2008 Jul 7;6(13):2242-55 및 중국 특허 출원: CN101490081A (모두가 참조에 의해 본 명세서에 포함됨)에 기재되거나; 또는 당해 분야에서 알려진 방법, 예를 들면, 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 출원: US 2008/0234183에 기재된 방법에 의해 수득될 수 있다.
본 발명의 융합 단백질에서 사용될 수 있는 CPP는: 양이온성 타입: 페네트라틴(penetratin), HIV-TAT-47-57, HIV-1 Rev 34-50, FHV 코트(coat)-35-49, 올리고아르기닌 (R9-R12), CCMV Gag-7-25, S413-PV, VP22, BP16, DPV3, DPV6, FAH 코트, 프로타민 1, 인간 cJun, Engrailed-2, Islet-1, HoxA-13, TP10, 등; 양친매성 타입: 트랜스포르탄(transportan), 트랜스포르탄 10, Pep-1, MPGα, MPGβ, CADY, Pepfect6, Pepfect14, Pepfect15, NickFect, Hel, sC18, pVEC, ARF (1-22), YTA2, PAR1 (Palmitoyl-SFLLRN), F2Pal10 (Palmitoyl-SFLLRN), BprPp (1-30), hLF 펩티드 (19-40), 부포린(Buforin) 2, 크로타민(Crotamine), 아주린(Azurin) p18, hCT 펩티드 (18-32), S413-PVrev, 등; 소수성 타입: 카포시 육종(Kaposi's sarcoma) 섬유모세포 성장 인자, 카이이만 크로코딜루스(Caiiman crocodylus)로부터의 Ig 경쇄의 신호 서열, 인테그린 β3 단편, Grb2-SH2 도메인, HIV-1 gp41 (1-23), HBV 전달 모티프, 정자-난자 융합 단백질(sperm-egg fusion protein) (89-111), 인간 칼시토닌 (9-32), Pep-7, C105Y, K-FGF, 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 융합 단백질에서 사용된 CPP는, 폴리펩티드 서열이 분자의 세포 흡수를 촉진하는 생물학적 능력을 유지하는 한, 전술된 폴리펩티드 서열 중 임의의 서열과 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열로부터 선택될 수 있다.
특정한 구체예에서, 상기 세포 투과 펩티드는 페네트라틴(서열번호 42), Tat-유래 펩티드, Rev(34-50) (서열번호 44), VP22 (서열번호 45), 트랜스포르탄 (서열번호 46), Pep-1 (서열번호 47), Pep-7 (서열번호 48), 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정한 구체예에서, 상기 Tat-유래 펩티드는 Tat (48-60) (서열번호 10) 또는 Tat (47-57) (서열번호 43)으로부터 선택된다.
특정한 구체예에서, 상기 세포 투과 펩티드는 Tat(48-60)와 같은 Tat-유래 펩티드를 포함한다. 특정한 구체예에서, 상기 세포 투과 펩티드는 하기 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된다: 서열번호 10.
일부 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질은 N-말단으로부터 C-말단까지 상기 pH-민감성 융합성 펩티드, 세포 투과 펩티드, 및 프로테아제 인식 서열을 포함한다. 특정한 구체예에서, 상기 융합 단백질은 N-말단으로부터 C-말단까지 상기 pH-민감성 융합성 펩티드, 세포 투과 펩티드, 퓨린 인식 서열 및 카뎁신 L 인식 서열을 포함한다. 특정한 구체예에서, 상기 융합 단백질은 N-말단으로부터 C-말단까지 상기 pH-민감성 융합성 펩티드, 세포 투과 펩티드, 카뎁신 L 인식 서열 및 퓨린 인식 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질은 N-말단으로부터 C-말단까지 상기 세포 투과 펩티드, pH-민감성 융합성 펩티드 및 프로테아제 인식 서열을 포함한다. 특정한 구체예에서, 상기 융합 단백질은 N-말단으로부터 C-말단까지 상기 세포 투과 펩티드, pH-민감성 융합성 펩티드, 퓨린 인식 서열 및 카뎁신 L 인식 서열을 포함한다. 특정한 구체예에서, 상기 융합 단백질은 N-말단으로부터 C-말단까지 상기 세포 투과 펩티드, pH-민감성 융합성 펩티드, 카뎁신 L 인식 서열 및 퓨린 인식 서열을 포함한다.
특정한 예시적 구체예에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 12 내지 14 중 어느 하나로 표시된 서열로부터 선택된 서열을 포함하거나 또는 서열번호 12 내 14 중 어느 하나로 표시된 서열로 구성된다.
특정한 구체예에서, 상기 융합 단백질은 그의 N-말단에 단백질 태그를 더 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 단백질 태그는 가용화(solubilizing) 효과를 갖는다. 특정한 구체예에서, 상기 단백질 태그는 TrxA, SUMO, NusA, MBP, GST로부터 선택된다.
본 발명의 제2 양태는 또한 제1 양태에 기술된 융합 단백질에 기반하여 특이적 결합 서열을 더 포함하는, 융합 단백질로서, 상기 특이적 결합 서열은 추가적 분자(예를 들면, 폴리펩티드, 단백질, 또는 핵산(예를 들면, DNA))가 그에 특이적으로 결합할 수 있게 하는 것인 융합 단백질을 제공한다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "특이적 결합(specific binding)" 또는 "특이적으로 결합한다(specifically bind)"는 2개의 분자간 비-무작위(non-random) 결합 반응, 예를 들면, 항체 (또는 그의 항원-결합 단편)와 그에 대한 항원(또는 에피토프) 간의 반응, 또는 이종이량체(heterodimer)를 형성하기 위한 2개의 아미노산 서열(예를 들면, 2개의 역-평행(anti-parallel) 루이신-지퍼 도메인들) 간 반응을 의미한다.
특정한 구체예에서, 상기 특이적 결합 서열은 그의 상보적 펩티드와 이종이량체(heterodimer)를 형성할 수 있는 루이신 지퍼(leucine zipper) 펩티드를 포함한다. 특정한 구체예에서, 상기 특이적 결합 서열은 루이신 지퍼 NZ 또는 CZ를 포함한다. 루이신 지퍼 NZ와 CZ는 상호 간에 상보적 펩티드라는 것이 당해 분야에서 알려져 있고, 역평행 루이신 지퍼 NZ와 CZ는 이종이량체를 형성할 수 있도록 이 두개 간의 강한 상호작용이 있다. 특정한 구체예에서, 상기 루이신 지퍼 NZ는 서열번호 49로 표시되는 서열을 포함한다. 특정한 구체예에서, 상기 루이신 지퍼 CZ는 서열번호 50으로 표시되는 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 특이적 결합 서열은 서열번호 49로 표시되는 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 특이적 결합 서열은 서열번호 50으로 표시되는 서열을 포함한다.
특정한 구체예에서, 상기 특이적 결합 서열은 상기 프로테아제 인식 서열의 C-말단에 위치한다. 특정한 구체예에서, 상기 융합 단백질은 그의 C-말단에 특이적 결합 서열을 포함한다.
특정한 구체예에서, 상기 융합 단백질은 그의 N-말단에 단백질 태그를 더 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 단백질 태그는 가용화 효과를 갖는다. 특정한 구체예에서, 상기 단백질 태그는 TrxA, SUMO, NusA, MBP, GST로부터 선택될 수 있다.
융합 단백질의 제조
본 발명의 융합 단백질은 당해 기술 분야에서 알려진 다양한 방법, 예를 들면, 유전공학 방법(재조합 기술)에 의해, 또는 화학적 합성 방법(예를 들면, Fmoc 고상 방법)에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 융합 단백질은 그의 생산 방법에 의해 한정되지 않는다.
따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제1 양태 또는 제2 양태의 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단리된 핵산 분자를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 전술된 단리된 핵산 분자를 포함하는, 벡터(예를 들면, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터)를 제공한다. 특정한 구체예에서, 상기 벡터는 예를 들면, 플라스미드, 코스미드(cosmid), 파아지, 등이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 전술된 바와 같은 단리된 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는, 숙주 세포를 제공한다. 그러한 숙주 세포는 대장균 세포와 같은 원핵 세포, 및 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 및 동물 세포(예를 들면, 마우스 세포, 인간 세포 등과 같은 포유동물 세포)와 같은 진핵 세포를 포함하나, 그에 한정되지 않는다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 제1 양태 또는 제2 양태의 융합 단백질을 제조하는 방법으로서, 융합 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건 하에서 전술된 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 배양된 숙주 세포의 배양물로부터 상기 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 것인 방법이 제공된다.
복합체(complex)
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제1 양태 또는 제2 양태의 융합 단백질 및 카고 분자(카고)를 포함하는 복합체를 제공한다. 상기 카고 분자는 임의의 분자일 수 있다.
특정한 구체예에서, 상기 카고 분자는 핵산, 펩티드 또는 단백질, 탄수화물, 지질, 화합물, 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정한 구체예에서, 상기 핵산은 DNA 분자, RNA 분자, siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 앱타머, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정한 구체예에서, 상기 카고 분자는 10000 Da 미만, 예를 들면, 5000 Da 미만, 3000 Da 미만, 또는 1000 Da 미만의 분자량을 갖는다.
일부 구체예에서, 상기 카고 분자는 검출가능한 표지(label), 예를 들면, 효소, 방사성 핵종(radionuclide), 형광 염료, 화학발광 물질, 또는 비오틴 등을 포함한다.
특정한 구체예에서, 상기 카고 분자는 에피토프 태그(epitope tag), 리포터 유전자 서열, 및/또는 핵 국재화 신호(NLS) 서열을 포함한다. 특정한 구체예에서, 상기 카고 분자는 펩티드 또는 단백질이다.
상기 카고 분자에서 사용될 수 있는 에피토프 태그는 당업자에게 잘 알려져 있고, 그의 예는 His, V5, FLAG, HA, Myc, VSV-G, Trx, 등을 포함하나, 그에 한정되지 않고, 당업자는 원하는 목적(예를 들면, 정제, 검출 또는 추적)에 따라 적절한 에피토프 태그를 어떻게 선택하는지 알고 있다. 특정한 예시적 구체예에서, 상기 카고 분자는 His 태그를 포함한다.
상기 카고 분자에서 사용될 수 있는 리포터 유전자 서열은 당업자에게 잘 알려져 있고, 그의 예는 GST, HRP, CAT, GFP, HcRed, DsRed, CFP, YFP, BFP, 등을 포함하나, 그에 한정되지 않는다.
상기 카고 분자에서 사용될 수 있는 핵 국재화 신호(NLS) 서열은 당업자에게 잘 알려져 있고, 그의 예는 SV40 바이러스 LTA(large T antigen)의 NLS를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정한 예시적 구체예에서, 상기 NLS 서열은 서열번호 15로 표시된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질은 상기 카고 분자에 융합되고, 상기 카고 분자는 펩티드 또는 단백질이다. 특정한 구체예에서, 상기 융합 단백질은 제1 양태에서 정의된 바와 같다.
특정한 구체예에서, 상기 카고 분자는 상기 융합 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 융합된다. 특정한 구체예에서, 상기 카고 분자는 상기 융합 단백질의 C-말단에 융합된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 복합체는 단일-사슬 폴리펩티드를 포함하고, 상기 단일-사슬 폴리펩티드는 N-말단으로부터 C-말단까지 pH-민감성 융합성 펩티드, 세포 투과 펩티드, 프로테아제 인식 서열 및 카고 분자를 포함한다. 특정한 구체예에서, 상기 단일-사슬 폴리펩티드는 N-말단으로부터 C-말단까지 pH-민감성 융합성 펩티드, 세포 투과 펩티드, 퓨린 인식 서열, 카뎁신 L 인식 서열 및 카고 분자를 포함한다. 특정한 구체예에서, 상기 단일-사슬 폴리펩티드는 N-말단으로부터 C-말단까지 pH-민감성 융합성 펩티드, 세포 투과 펩티드, 카뎁신 L 인식 서열, 퓨린 인식 서열, 및 카고 분자를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 복합체는 단일-사슬 폴리펩티드를 포함하고, 상기 단일-사슬 폴리펩티드는 N-말단으로부터 C-말단까지 세포 투과 펩티드, pH-민감성 융합성 펩티드, 프로테아제 인식 서열 및 카고 분자를 포함한다. 특정한 구체예에서, 상기 단일-사슬 폴리펩티드는 N-말단으로부터 C-말단까지 세포 투과 펩티드, pH-민감성 융합성 펩티드, 퓨린 인식 서열, 카뎁신 L 인식 서열 및 카고 분자를 포함한다. 특정한 구체예에서, 상기 단일-사슬 폴리펩티드는 N-말단으로부터 C-말단까지 세포 투과 펩티드, pH-민감성 융합성 펩티드, 카뎁신 L 인식 서열, 퓨린 인식 서열, 및 카고 분자를 포함한다.
특정한 예시적 구체예에서, 카고 분자는 징크 핑거(zinc finger) 단백질(예를 들면, ZFP9), 프로테인 포스파타아제(예를 들면, Ppm1b), 또는 Cas 이펙터 (effector) 단백질 (예를 들면, Cas9)이다. 표현 "Cas 이펙터 단백질(Cas effector protein)"은 CRISPR-Cas 시스템의 이펙터 단백질을 의미한다. 특정한 예시적 구체예에서, 징크 핑거 단백질 또는 Cas 이펙터 단백질은 NLS 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질은 카고 분자에 화학적으로 커플링된다. 용어 "화학적으로 커플링된(chemically coupled)"은 융합 단백질에 포함된 반응성 기와 카고 분자에 포함된 반응성 기의 화학적 반응에서 수득되고, 2개의 모이어티가 공유 결합에 의해 연결되는 것인 결합을 의미한다. 전술된 화학적 반응(커플링 반응) 전에, 융합 단백질, 카고 분자, 또는 둘다 모두 개별적인 반응에서 링커 분자에 의해 변형될 수 있어서, 그들은 각각 화학적 커플링을 위해 요구되는 반응성 기를 포함할 수 있다. 융합 단백질 또는 카고 분자를 변형시키기 위해 사용되는 링커 분자의 선택은 사용되는 커플링 전략에 의존적이다. 특정한 구체예에서, 상기 융합 단백질은 제1 양태에서 정의된 바와 같다.
특정한 구체예에서, 상기 공유 결합은 디술피드 결합, 포스포디에스테르 결합, 포스포로티오에이트 결합, 아미드 결합, 아민 결합, 티오에테르 결합, 에테르 결합, 에스테르 결합, 또는 탄소-탄소 결합이다.
특정한 구체예에서, 상기 카고 분자는 상기 융합 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 커플링된다. 특정한 구체예에서, 상기 카고 분자는 상기 융합 단백질의 C-말단에 커플링된다.
특정한 구체예에서, 상기 카고 분자는 핵산이다.
다른 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질은 상기 카고 분자에 비-공유결합에 의해 연결된다.
특정한 구체예에서, 상기 융합 단백질은 정전기적 상호작용을 통해 상기 카고 분자에 접합된다. 특정한 구체예에서, 상기 카고 분자는 핵산이다.
일부 구체예에서, 상기 융합 단백질은 제2 양태에서 정의된 바와 같고, 상기 융합 단백질은 그가 포함하는 특이적 결합 서열을 통해 상기 카고 분자에 비-공유결합에 의해 연결된다. 그러한 구체예에서, 상기 카고 분자는 상기 융합 단백질 중 특이적 결합 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 융합 단백질 중 특이적 결합 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 도메인은 아미노산 서열이다.
특정한 구체예에서, 상기 카고 분자는 펩티드 또는 단백질이다. 일부 구체예에서, 상기 카고 분자는 그의 N-말단에 상기 융합 단백질 중 특이적 결합 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다.
특정한 구체예에서, 상기 융합 단백질 중 특이적 결합 서열은 루이신 지퍼 펩티드를 포함하고, 상기 카고 분자는 상기 루이신 지퍼의 상보적 펩티드를 포함하여, 상기 루이신 지퍼와 상기 상보적 펩티드는 이종이량체를 형성할 수 있다.
특정한 구체예에서, 상기 융합 단백질 중 특이적 결합 서열은 루이신 지퍼 NZ (예를 들면, 서열번호 49로 표시됨)를 포함하고, 상기 카고 분자는 루이신 지퍼 CZ (예를 들면, 서열번호 50으로 표시됨)를 포함한다.
특정한 구체예에서, 상기 융합 단백질 중 특이적 결합 서열은 루이신 지퍼 CZ (예를 들면, 서열번호 50으로 표시됨)를 포함하고, 상기 카고 분자는 루이신 지퍼 NZ (예를 들면, 서열번호 49로 표시됨)를 포함한다.
복합체의 제조
본 발명의 복합체는 당해 기술 분야에서 알려진 다양한 방법, 예를 들면, 유전공학 방법(재조합 기술)에 의해, 또는 화학적 합성 방법(예를 들면, Fmoc 고상 방법)에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 복합체는 그의 생산 방법에 의해 한정되지 않는다.
일부 구체예에서, 상기 복합체가 함께 융합된 융합 단백질과 카고 분자를 포함하는 경우, 본 발명의 복합체는 유전공학 재조합 기술에 의해 수득될 수 있다. 예를 들면, 상기 복합체를 코딩하는 DNA 분자를 화학적 합성 또는 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 결과적으로 수득된 DNA 분자를 발현 벡터에 삽입하고 숙주 세포에 형질감염시킬 수 있다. 그 후, 형질감염된 숙주 세포를 특정한 조건 하에서 배양할 수 있고, 따라서, 본 발명의 복합체를 발현시킬 수 있다.
따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 전술된 복합체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단리된 핵산 분자를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 전술된 단리된 핵산 분자를 포함하는, 벡터(예를 들면, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터)를 제공한다. 특정한 구체예에서, 상기 벡터는 예를 들면, 플라스미드, 코스미드, 파아지, 등이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 전술된 바와 같은 단리된 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는, 숙주 세포를 제공한다. 그러한 숙주 세포는 대장균 세포와 같은 원핵 세포, 및 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 및 동물 세포(예를 들면, 마우스 세포, 인간 세포 등과 같은 포유동물 세포)와 같은 진핵 세포를 포함하나, 그에 한정되지 않는다.
또 다른 양태에서, 전술된 복합체를 제조하는 방법으로서, 상기 복합체의 발현을 가능하게 하는 조건에서 전술된 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 배양된 숙주 세포의 배양물로부터 상기 복합체를 회수하는 단계를 포함하는 것인 방법이 제공된다.
다른 구체예에서, 상기 복합체가 화학적으로 커플링된 융합 단백질과 카고 분자를 포함하는 경우, 본 발명의 복합체는 상기 융합 단백질 및 카고 분자에 포함된 반응성 기들이 화학적 반응을 수행할 수 있게 하는 조건 하에서 상기 융합 단백질과 상기 카고 분자를 혼합하여, 두 개의 모이어티가 공유 결합에 의해 연결되는 것인 예시적 방법에 의해 수득될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 상기 융합 단백질, 카고 분자, 또는 둘다를 각각 전술된 화학적 반응을 위해 요구되는 반응성 기를 포함하도록 링커 분자로 변형시키는 단계를 더 포함한다. 특정한 구체예에서, 상기 카고 분자는 핵산이다.
다른 구체예에서, 상기 복합체가 정전기적 상호작용에 의해 접합된 융합 단백질과 카고 분자를 포함하는 경우, 본 발명의 복합체는 (1) 본 발명의 융합 단백질과 카고 분자를 혼합하여 혼합물을 형성하는 단계; 및 (2) 상기 융합 단백질과 상기 카고 분자가 상기 복합체를 형성하도록 상기 혼합물을 인큐베이션시키는 단계에 의한 예시적 방법에 의해 수득될 수 있다. 특정한 구체예에서, 상기 카고 분자는 핵산이다.
다른 구체예에서, 상기 복합체가 공유 결합이 아닌 특이적 결합에 의해 연결된 융합 단백질과 카고 분자를 포함하는 경우, 본 발명의 복합체는 (1) 본 발명의 제2 양태의 융합 단백질과 카고 분자를 혼합시키는 단계로서, 상기 카고 분자는 상기 융합 단백질 중 특이적 결합 서열에 특이적으로 결합하는 도메인을 포함하는 것인 단계; 및 (2) 상기 혼합물을 인큐베이션시켜 상기 융합 단백질과 상기 카고 분자가 상기 복합체를 형성하는 단계의 예시적 방법에 의해 수득될 수 있다. 특정한 구체예에서, 상기 카고 분자는 폴리펩티드 또는 단백질이다.
조성물
본 발명의 융합 단백질이 비-공유결합 상호작용을 통해 카고 분자에 연결될 수 있는 경우, 상기 융합 단백질과 상기 카고 분자를 혼합하는 것에 의해 전달 복합체가 수득될 수 있다. 따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 본 발명의 융합 단백질 및 카고 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.
특정한 구체예에서, 상기 카고 분자는 핵산, 펩티드 또는 단백질, 탄수화물, 지질, 화합물, 및 이들의 혼합물로부터 선택된다. 특정한 구체예에서, 상기 핵산은 DNA 분자, RNA 분자, siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 앱타머, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정한 구체예에서, 상기 카고 분자는 핵산으로부터 선택된다.
특정한 구체예에서, 상기 카고 분자는 폴리펩티드 또는 단백질이다.
특정한 구체예에서, 상기 융합 단백질은 제2 양태에 정의된 바와 같다. 상기 카고 분자는 상기 융합 단백질 중 특이적 결합 서열에 특이적으로 결합하는 도메인을 포함한다.
응용 및 방법
본 발명의 융합 단백질은 엔도좀으로부터 카고 분자를 효율적으로 방출시킬 수 있고, 일단 상기 카고 분자는 세포질에서 이용가능하게 되면, 그와 관련된 역할을 수행할 수 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 세포내 전달제로서 이용될 수 있고, 이는 또한 연구 및 치료와 진단 응용에서 이용될 수 있다.
따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질, 복합체, 조성물, 단리된 핵산 분자, 벡터 또는 숙주 세포, 및 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는, 약학적 조성물을 제공한다.
특정한 구체예에서, 상기 복합체 또는 조성물에 포함된 카고 분자는 약학적활성제(pharmaceutically active agent)이다.
특정한 구체예에서, 상기 복합체 또는 조성물에 포함된 카고 분자는 검출가능한 표지이다. 상기 표지는 진단을 위해, 약물 처리(예를 들면, 흡착, 분포, 대사, 배설)의 연구를 위해, 치료 또는 약물 효능 또는 부작용의 연구 등을 위해 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 또한, 본 발명의 융합 단백질, 또는 상기 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자, 벡터, 또는 숙주 세포의 약제의 제조에서 전달제(예를 들면, 세포내 전달제 및/또는 형질감염제)로서의 용도에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 질병 치료를 위한 약제의 제조에서 본 발명의 복합체, 또는 조성물, 또는 상기 복합체 또는 조성물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자, 벡터 또는 숙주 세포의 용도로서, 상기 복합체 또는 조성물에 포함된 카고 분자는 상기 질병을 치료할 수 있는 것인 용도에 관한 것이다.
특정한 구체예에서, 상기 질병은 예정된 세포사(programmed cell death)와 관련된 질병이고, 상기 카고 분자는 프로테인 포스파타아제 1B를 포함한다. 특정한 구체예에서, 상기 예정된 세포사와 관련된 질병은 간 손상(예를 들면, 약물-유도 간 손상), 염증성 질환, 허혈-재관류 손상 및/또는 신경퇴행성 질환을 포함한다.
본 발명의 융합 단백질, 복합체, 또는 조성물, 또는 약학적 조성물은 의학 분야에서 공지된 임의의 제형일 수 있고, 예를 들면, 정제, 환제(pill), 현탁액, 에멀젼, 용액, 겔, 캡슐, 분말, 과립, 엘릭시르, 로젠지(lozenge), 좌제(suppository), 주사(주사 용액, 동결건조 분말 포함), 흡입제, 스프레이 및 기타 제형일 수 있다. 바람직한 투여 제형은 투여의 의도된 모드 및 치료 용도에 의존적이다.
본 발명의 융합 단백질, 복합체 또는 조성물, 또는 약학적 조성물은 경구 투여, 직장 투여, 비경구 투여 또는 국소 투여를 포함하나, 그에 한정되지 않는, 당해 기술 분야에서 공지된 적절한 방법에 의해 투여될 수 있다.
투여의 예시적 경로는 경구 투여이다. 경구 투여용 액체 투여 제형은 약학적으로 허용가능한 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽, 엘릭시르, 등을 포함한다. 활성 성분 외에, 상기 액체 투여 제형은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 비활성 희석제, 예를 들면, 물 또는 기타 용매, 가용화제 및 유화제(emulsifier), 예를 들면, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부탄디올, 디메틸포름아미드, 오일(예를 들면, 면실유, 피넛유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유 및 참깨유), 글리세롤, 테트라히드로퓨르퓨릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 비활성 희석제 외에, 경구 투여용 액체 제형은 또한 아쥬반트, 예를 들면, 습윤제(wetting agent), 유화제, 및 현탁제, 감미제, 향미제(flavoring agent), 및 방향제(perfuming agent)를 포함할 수 있다. 경구 투여용 고체 투여 제형은 캡슐, 정제, 환제, 로젠지, 분말, 과립 등을 포함한다. 활성 성분 외에, 고체 투여 제형은 약학적으로 허용가능한 비활성 부형제 또는 담체, 예를 들면, 충진제 (예를 들면, 락토오스, 수크로오스, 글루코오스, 만니톨, 전분, 미정질 셀룰로오스, 갈락토오스, 크로스포비돈, 및 황산칼슘); 결합체 (예를 들면, 카르복시메틸 셀룰로오스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 수크로오스 및 아카시아); 습윤제 (예를 들면, 세틸 알코올 및 글리세릴 모노스테아레이트); 붕해제 (예를 들면, 아가, 탄산칼슘, 전분, 알긴산, 소디움 카르복시메틸 셀룰로오스, 소디움 카르복시메틸 전분); 윤활제 (예를 들면, 활석, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고형 폴리에틸렌 글리콜, 소디움 라우렐술페이트); 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질, 복합체 또는 조성물, 또는 약학적 조성물은 또한 비-경구 경로에 의해 투여될 수 있다.
따라서, 또 다른 투여의 예시적 경로는 비경구 투여, 예를 들면, 피하 주사, 정맥내 주사, 복막내 주사, 근육내 주사, 흉골내(intrastemal) 주사, 및 주입이다. 비경구 투여용 투여 제형은 주사 용액, 주사용 멸균 산제(powder), 또는 주사용 농축액을 포함한 주사 제제일 수 있다. 활성 성분 외에, 주사 투여 제형은 약학적으로 허용가능한 담체, 예를 들면, 멸균수, 링거액, 및 등장성 염화나트륨 용액을 포함할 수 있고, 적합한 첨가제, 예를 들면, 항산화제, 완충제, 및 정균제(bacteriostatic agent)가 또한 약물의 특성에 따라 첨가될 수 있다.
또 다른 예시적 투여 경로는 국소 투여, 예를 들면, 경피 투여(예를 들면, 경피 패치 또는 이온영동(iontophoresis) 장치를 통한 투여), 안내 투여, 또는 비강내 투여, 또는 흡입 투여이다. 경피 투여용 투여 제형은 국소 겔, 스프레이, 연고 및 크림일 수 있다. 활성 성분 외에, 국소 투여 제형은 피부 또는 기타 작용 영역을 통한 활성 화합물의 흡수 또는 투과를 강화하는 성분을 포함할 수 있다.
또다른 예시적 투여 경로는 직장 투여이다. 직장 투여용 투여 제형은 좌제일 수 있다.
또한, 제약 분야에서 공지된 기타 담체 물질 및 투여 방법이 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 융합 단백질, 복합체 또는 조성물, 또는 약학적 조성물은 임의의 공지된 약학적 방법, 예를 들면, 제형 및 투여를 위한 효과적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질, 복합체, 조성물, 단리된 핵산 분자, 벡터, 또는 숙주 세포를 포함하는 키트를 제공한다. 특정한 구체예에서, 상기 키트는 형질감염 및/또는 세포내 전달을 위한 설명서를 더 포함한다. 특정한 구체예에서, 상기 키트는 카고 분자(예를 들면, 핵산, 펩티드 또는 단백질, 탄수화물, 지질, 화합물, 및 이들의 혼합물)의 형질감염 및/또는 세포내 전달을 위해 사용된다. 특정한 구체예에서, 상기 세포는 포유동물 세포, 예를 들면, 인간 세포이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 또한, 본 발명의 융합 단백질, 복합체, 조성물, 단리된 핵산 분자, 벡터, 또는 숙주 세포의 전달제(예를 들면, 형질감염제 또는 세포내 전달제)로서의 용도에 관한 것이다. 특정한 구체예에서, 상기 전달제는 카고 분자(예를 들면, 핵산, 펩티드 또는 단백질, 탄수화물, 지질, 화합물, 및 이들의 혼합물)의 세포내 전달을 위해 사용된다. 특정한 구체예에서, 상기 세포는 포유동물 세포, 예를 들면, 인간 세포이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 분자를 세포 내로 전달하는 방법으로서, 상기 세포를 본 발명의 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 복합체가 상기 분자를 포함하는 것인 방법을 제공한다.
특정한 구체예에서, 상기 세포를 상기 복합체와 접촉시키는 단계는 인 비보에서 수행된다.
특정한 구체예에서, 상기 세포를 상기 복합체와 접촉시키는 단계는 엑스 비보(ex vivo)로 수행된다.
특정한 구체예에서, 상기 세포를 상기 복합체와 접촉시키는 단계는 인 비트로에서 수행된다.
특정한 구체예에서, 상기 세포는 진핵 세포, 예를 들면, 포유동물 세포, 예를 들면, 인간 세포이다.
용어의 정의
본 발명에서, 달리 특정되지 않으면, 본 명세서에서 사용된 과학 및 기술 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 또한, 본 명세서에서 사용된 세포 배양, 생화학, 핵산 화학, 면역학의 실험 절차는 모두 해당하는 분야에서 널리 사용되는 통상적인 단계들이다. 동시에, 본 발명을 더 잘 이해하기 위해, 관련 용어의 정의 및 설명이 하기에 제공된다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "단리된(isolated)"은 인위적 수단에 의해 자연발생적 상태로부터 수득되는 것을 의미한다. 특정한 "단리된" 물질 또는 성분이 현실적으로 나타나는 경우, 그 물질 또는 성분이 위치한 자연발생적 환경이 변하거나, 또는 그 물질 또는 성분이 자연발생적 환경으로부터 분리되었거나, 또는 양자 모두가 일어난 것일 수 있다. 예를 들면, 살아있는 동물에 자연발생적으로 존재하는 특정한 미-단리된(un-isolated) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 경우, 이 자연발생적 상태로부터 단리된 높은 순도의 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 "단리된" 것으로 지칭된다. 용어 "단리된"은 인공적 물질 또는 합성 물질의 존재를 배제하지 않고, 상기 물질의 활성에 영향을 미치지 않는 기타 불순물의 존재를 배제하지 않는다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "벡터(vector)"는 그 내부로 폴리뉴클레오티드가 삽입될 수 있는 핵산 전달 비히클(nucleic acid delivery vehicle)을 의미한다. 벡터가 삽입된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 단백질을 발현할 수 있는 경우, 상기 벡터는 발현 벡터로 지칭된다. 벡터는 형질전환(transformation), 형질도입(transduction) 또는 형질감염(transfection)을 통해 숙주 세포 내로 도입될 수 있어서, 벡터가 운반하는 유전적 물질 성분이 상기 숙주 세포 내에서 발현될 수 있다. 플라스미드; 파아지미드(phagemid); 코스미드(cosmid); 인공 염색체(artificial chromosome), 예를 들면, YAC(yeast artificial chromosome), BAC(bacterial artificial chromosome) 또는 PAC(P1-derived artificial chromosome); 파아지, 예를 들면, 람다 파아지 또는 M13 파아지, 및 동물 바이러스를 포함하나, 이에 한정되지 않는 벡터가 당업자에게 잘 알려져 있다. 벡터로 사용될 수 있는 동물 바이러스는 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 헤르페스 바이러스(예를 들면, 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus)), 폭스바이러스(poxvirus), 바큘로바이러스(baculovirus), 파필로마바이러스(papillomavirus), 및 파포바바이러스(papovavirus) (예를 들면, SV40)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 벡터는 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서(enhancer) 서열, 선택 요소(selection element), 및 리포터 유전자를 포함하나, 그에 한정되지 않는, 발현을 조절하는 다양한 요소들을 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 복제 원점을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "숙주 세포(host cell)"는 그 내부로 벡터가 도입될 수 있는 세포를 의미하고, 에스케리시아 콜라이(Escherichia coli) 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 박테리아 세포, 효모 세포 또는 아스퍼길러스(Aspergillus)와 같은 균류 세포, S2 초파리(Drosophila) 세포 또는 Sf9와 같은 곤충 세포, 또는 섬유모세포, CHO 세포, COS 세포, NSO 세포, HeLa 세포, BHK 세포, HEK 293 세포 또는 인간 세포와 같은 동물 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "동일성(identity)"은 2개의 폴리펩티드 또는 2개의 핵산 간 일치(match) 정도를 의미한다. 비교를 위한 2개의 서열이 특정한 부위에 염기 또는 아미노산의 동일한 단량체 서브유닛을 갖는 경우(예를 들면, 2개의 DNA 분자 각각이 특정한 부위에서 아데닌을 갖거나, 또는 2개의 폴리펩티드 각각이 특정한 부위에서 라이신을 갖는 경우), 상기 2개의 분자들은 그 부위에서 동일하다. 2개의 서열간 퍼센트 동일성(percent identity)은 비교를 위한 부위의 총 개수에 대해 2개의 서열간 공유된 동일한 부위의 개수 x 100의 함수이다. 예를 들면, 2개의 서열의 10개의 부위 중 6개가 일치하는 경우, 이 2개의 서열은 60%의 동일성을 갖는다. 예를 들면, DNA 서열: CTGACT와 CAGGTT는 50%의 동일성을 갖는다(6개의 부위 중 3개가 일치된다). 일반적으로, 2개의 서열의 비교는 최대 동일성을 생성하는 방식으로 수행된다. 그러한 정렬은 Align 프로그램(DNAstar, Inc.)과 같은 컴퓨터 프로그램을 이용하여 수행될 수 있고, 이는 Needleman, et al. (J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970)의 방법에 근거한다. 2개의 아미노산 서열간 퍼센트 동일성은 또한 PAM120 가중치 잔기 표(weight residue table), 12의 갭 길이 페널티(gap length penalty) 및 4의 갭 페널티를 이용하여, ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 포함된 E. Meyers 및 W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))의 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열간 동일성의 비율은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 가중치(gap weight) 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 이용하여, GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com에서 이용가능함) 중 GAP 프로그램에 포함된 Needleman 및 Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) 알고리즘에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에 포함된 20개의 통상적 아미노산은 일반적인 방식으로 표현된다. 예를 들면, 참조에 의해 본 명세서에 포함된, Immunology-A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))를 참조한다. 본 발명에서, 용어 "폴리펩티드(polypeptide)" 및 "단백질"은 동일한 의미를 갖고 호환적으로 사용될 수 있다. 본 발명에서, 아미노산은 일반적으로 당해 분야에서 잘 알려진 1-문자 및 3-문자 약어로 나타낸다. 예를 들면, 알라닌은 A 또는 Ala로 나타낼 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제(pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient)"는 개체 및 활성 성분과 약리학적으로 및/또는 생리학적으로 조화가능한 담체 및/또는 부형제를 의미하고, 당해 분야에서 잘 알려져 있고 (예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995 참조), pH 조절제(pH adjusting agent), 계면활성제, 이온 강도 강화제(ionic strength enhancer), 삼투압 유지제, 흡수 지연제, 희석제, 아쥬반트, 보존제, 안정화제, 등을 포함하나, 그에 한정되지 않는다. 예를 들면, pH 조절제는 포스페이트 완충제를 포함하나, 그에 한정되지 않는다. 계면활성제는 양이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들면, Tween-80을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이온 강도 강화제는 염화나트륨을 포함하나, 그에 한정되지 않는다. 삼투압 유지제는 당, NaCl 등을 포함하나, 그에 한정되지 않는다. 흡수 지연제(agent for delaying absorption)는 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함하나, 그에 한정되지 않는다. 희석제는 물, 수성 완충액(예를 들면, 완충 염수(buffered saline)), 알코올 및 폴리올(예를 들면, 글리세롤), 등을 포함하나, 그에 한정되지 않는다. 아쥬반트는 알루미늄 아쥬반트(예를 들면, 수산화 알루미늄), 프로인트 아쥬반트(Freund's adjuvant) (예를 들면, 완전 프로인트 아쥬반트(complete Freund's adjuvant)) 등을 포함하나, 그에 한정되지 않는다. 보존제는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들면, 티메로살, 2-페녹시에탄올, 파라벤, 트리클로로-터트-부탄올, 페놀, 소르브산 등을 포함하나, 그에 한정되지 않는다. 안정화제는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖고, 약물 중 활성 성분의 원하는 활성(예를 들면, PSD-95 유비퀴틴화(ubiquitination)의 억제 활성)을 안정화시킬 수 있고, 소디움 글루타메이트, 젤라틴, SPGA, 사카라이드 (예를 들면, 소르비톨, 만니톨, 전분, 수크로오스, 락토오스, 덱스트란, 또는 글루코오스), 아미노산 (예를 들면, 글루탐산, 글리신), 단백질 (예를 들면, 건조 유청, 알부민, 또는 카세인), 또는 그의 분해 산물(예를 들면, 락트알부민 가수분해물) 등을 포함하나, 그에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "치료(treatment)"는 유용하거나 또는 원하는 임상적 결과를 얻기 위해 수행되는 방법을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해, 유용한 또는 원하는 임상적 결과는 검출 가능할 수 있거나, 또는 검출 가능하지 않은지 여부에 관계 없이, 증상의 완화, 질병의 질병의 범위 축소, 질병 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음), 질병의 진행의 지연 또는 둔화, 및 (부분적 또는 완전한) 증상의 경감을 포함하나, 그에 한정되지 않는다. 또한, "치료"는 기대 생존 시간(치료를 받지 않는 경우)에 비해 생존 시간을 연장시키는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "개체(subject)"는 포유동물, 예를 들면, 영장류 포유동물, 예를 들면, 인간을 의미한다.
본 발명의 유용한 효과
본 발명의 전달 시스템은 엔도좀으로부터 카고 분자의 방출을 유의성 있게 개선시킬 수 있어서, 카고 분자의 세포질 전달 효율을 유의성 있게 개선시켜, 상기 카고 분자가 그의 해당된 생물학적 기능을 완전히 발휘할 수 있다. 따라서, 본 발명의 전달 시스템은 세포의 생물학적 메커니즘 및 경로에 영향을 미치는 효과적인 수단을 제공하고, 연구, 치료, 진단과 같은 다수의 분야에서 사용될 수 있으며, 광범위한 응용 전망 및 임상적 가치를 갖는다.
본 발명의 구체예는 첨부된 도면 및 실시예와 함께 하기에서 상세하게 기재될 것이다. 그러나, 당업자는 하기 도면 및 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위해 사용되나, 본 발명의 범위를 한정하지 않는 것으로 이해할 것이다. 첨부된 도면 및 하기의 바람직한 구체예의 상세한 설명에 따라, 본 발명의 다양한 목적 및 양태가 당업자에게 자명할 것이다.
도 1은 실시예 1에서 엔도좀으로부터의 탈출 효율을 검출하기 위한 Split-GFP 시스템의 원리의 개략도를 보여준다.
도 2는 실시예 1에서 전달 시스템-GFPβ1-10 단백질 복합체의 구조의 개략도를 보여준다.
도 3 및 4는 실시예 1에서 전달 시스템-GFPβ1-10 단백질 복합체의 SDS-PAGE 결과를 보여준다.
도 5는 실시예 1에서 GFPβ1-10의 형질도입을 위한 전달 시스템의 유동 세포측정법 분석의 결과를 보여준다.
도 6은 실시예 1에서 GFPβ1-10의 형질도입을 위한 전달 시스템의 형광 현미경 관찰의 결과를 보여준다.
도 7은 실시예 1에서 GFPβ1-10의 형질도입을 위한 효소 절단 부위(enzymatic cleavage site)에 돌연변이를 포함하는 전달 시스템의 유동 세포측정법 분석의 결과를 보여준다.
도 8은 실시예 1에서 전달 시스템에 의한 형질도입 후 세포에서 절단 및 비-절단(un-cleaved)/완전 GFPβ1-10의 상대적 비율의 웨스턴 블롯 검출 결과 및 그의 유지(retention) 시간을 보여준다.
도 9는 실시예 1에서 효소 절단 부위에 돌연변이를 포함하는 전달 시스템에 의한 형질도입 후 절단 및 미-절단/완전 GFPβ1-10의 상대적 비율의 웨스턴 블롯 검출 결과를 보여준다.
도 10은 실시예 1에서 효소 절단 부위에 돌연변이를 포함하나 pH-민감성 펩티드는 포함하지 않는 전달 시스템에 의한 형질도입의 유동 세포측정법 분석의 결과를 보여준다.
도 11은 실시예 1에서 효소 절단 부위에 돌연변이를 포함하나 pH-민감성 펩티드는 포함하지 않는 전달 시스템에 의한 형질도입 후 세포에서 절단 및 미-절단/완전 GFPβ1-10의 상대적 비율의 웨스턴 블롯 검출 결과를 보여준다.
도 12는 실시예 2에서 전달 시스템-ZFP9 복합체의 개략도를 보여준다.
도 13은 실시예 2에서 전달 시스템-ZFP9 복합체의 SDS-PAGE의 결과를 보여준다.
도 14는 실시예 2에서 ZFP9 결합 부위를 포함하는 진핵세포 발현 플라스미드의 맵을 보여준다.
도 15 및 16은 실시예 2에서 전달 시스템에 의한 ZFP9의 형질도입의 유동 세포측정법 분석의 결과를 보여준다.
도 17은 실시예 3에서 전달 시스템-Ppm1b 복합체의 구조의 개략도를 보여준다.
도 18은 실시예 3에서 전달 시스템-Ppm1b 복합체의 SDS-PAGE의 결과를 보여준다.
도 19는 실시예 3에서 TNF-α-유도 세포 괴사의 비율에 대한 전달 시스템-Ppm1b 복합체의 효과의 유동 세포측정법 분석의 결과를 보여준다.
도 20은 실시예 4에서 전달 시스템-Cas9 복합체의 구조의 개략도를 보여준다.
도 21은 실시예 4에서 전달 시스템-Cas9 복합체의 SDS-PAGE의 결과를 보여준다.
도 22는 실시예 4에서 HEK293T-RFP 리포터 세포를 이용한 CRISPR/Cas9의 편집 효율(editing efficiency)의 검출 원리의 개략도를 보여준다.
도 23은 실시예 4에서 RFP 리포터 렌티바이러스 플라스미드의 맵을 보여준다.
도 24는 실시예 4에서 전달 시스템-Cas9 복합체의 유전자 편집 효율의 유동 세포측정법 분석의 결과를 보여준다.
도 25는 실시예 5에서 어댑터(adapter) 방법에 근거한 전달 시스템의 원리를 보여준다.
도 26은 실시예 5에서 어댑터 방법에 근거한 전달 시스템을 위한 재조합 단백질의 클로닝 설계를 보여준다.
도 27은 실시예 5에서 어댑터 방법에 근거한 전달 시스템을 위한 재조합 단백질의 정제 결과를 보여준다.
도 28은 실시예 5에서 Split-GFP 엔도좀 탈출 시스템에 의한 어댑터-기반 전달 시스템의 전달 효과의 평가 결과를 보여준다.
서열 정보
본 발명에 관련된 일부 서열의 정보가 하기 표 1에 제공된다.
표 1: 서열의 설명
서열번호 설명
1 퓨린 인식 서열(Furin recognition sequence)-1
2 퓨린 인식 서열-2
3 퓨린 인식 서열-3
4 퓨린 인식 서열-4 (Ne)
5 Ne를 코딩하는 핵산 서열
6 CTSL 인식 서열 N
7 N을 코딩하는 핵산 서열
8 INF7
9 INF7을 코딩하는 핵산 서열
10 Tat(48-60)
11 Tat(48-60)를 코딩하는 핵산 서열
12 융합 단백질 TIN
13 융합 단백질 TINe
14 융합 단백질 TINNe
15 NLS
16 CTSL 인식 서열 Na
17 CTSL 인식 서열 Nb
18 퓨린 인식 서열 Nc
19 퓨린 인식 서열 Nd
20 CTSD 식별 서열(identification sequence) Nf
21 돌연변이체(Mutant) N
22 돌연변이체 Ne
23 GFPβ1-10-NLS
24 GFPβ1-10-NLS를 코딩하는 핵산 서열
25 히스톤-H3을 코딩하는 핵산 서열
26 GFPβ11을 코딩하는 핵산 서열
27 ZFP9-NLS
28 ZFP9-NLS를 코딩하는 핵산 서열
29 BFP를 코딩하는 서열
30 ZFP9 결합 부위 서열
31 Ppm1b
32 Ppm1b를 코딩하는 핵산 서열
33 Cas9-NLS
34 Cas9-NLS를 코딩하는 핵산 서열
35 dsRed를 코딩하는 핵산 서열
36 mCherry를 코딩하는 핵산 서열
37 sgRNA에 대한 인식 부위의 DNA 서열
38 인플루엔자 바이러스 HA2
39 KALA
40 GALA
41 멜리틴(Melittin)
42 페네트라틴(Penetratin)
43 HIV-TAT(47-57)
44 HIV-1 Rev(34-50)
45 VP22
46 트랜스포르탄(Transportan)
47 Pep-1
48 Pep-7
49 루이신 지퍼 NZ
50 루이신 지퍼 CZ
51 루이신 지퍼 NZ를 코딩하는 핵산 서열
52 루이신 지퍼 CZ를 코딩하는 핵산 서열
53 TrxA 아미노산 서열
54 TrxA 핵산 서열
실시예
본 발명을 한정하지 않고, 본 발명을 예시하기 위해 의도된 하기 실시예를 참조하여 본 발명이 하기에서 설명될 것이다.
달리 특정되지 않으면, 본 발명에서 사용된 분자 생물학 실험 방법 및 면역분석 방법은 기본적으로, J. Sambrook et al., Molecular Cloning: Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 및 FM Ausubel et al., Compiled Molecular Biology Experiment Guide, 3rd edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995에 기재된 방법을 참조하여 수행하였고; 제한효소는 제조사에 의해 권장된 조건에 따라 사용했다. 당업자는 실시예가 예시로서 본 발명을 기술하고, 본 발명에 의해 보호받고자 하는 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않는다는 것을 인지한다.
하기 실시예에 관련된 주요 시약의 출처는 다음과 같다:
클로닝 및 작제(construction)를 위해 필요한 재료는 하기와 같았다: DNA 폴리머라아제 (TaKaRa, R040A), DNA 회수 키트(recovery kit) (TianGen, DP214-03), 플라스미드 미니-키트 (TianGen, DP103-03), 플라스미드 대규모(large scale) 키트 (QIAGEN, 12663), Gibson 조립 프리믹스(assembly premix) 튜브 5개 (NEB, E2611L), DNA 마커 (ThmeroFisher, SM0331), 아가로오스 (Biowest, BW-R0100);
대규모 단백질 발현을 위해 필요한 재료는 하기와 같았다: 펩톤 (BiSIGMA-ALDRICH, T7293-1KG), 효모 분말(yeast powder) (OXOID, LP0021B), 염화나트륨 (Xilong Chemical, 10011012AR), IPTG (Inalco, 1758-1400);
단백질 정제를 위해 필요한 배지는 하기와 같았다: SP SEPHAROSE FAST FLOW (GE Healthcare, 17-0729-01), NI SEPHAROSE (GE Healthcare, 17-5268-02);
단백질 정제 및 보관을 위해 필요한 시약은 하기와 같았다: 글리세롤/글리세롤/C3H8O3 (SIGMA-ALDRICH, G5516), KCl (Xilong Chemical Industry, 1002007), Na2HPO4·12H2O (Xilong Chemical Industry, 1001067AR), KH2PO4 (Xilong Chemical Industry, 1002048AR500), 이미다졸 (SIGMA-ALDRICH, V900153), Tris 염기 (Seebio, 183995), 글루코오스 (Xilong Chemical Industry, 1064008AR500), BCA 단백질 분석 키트 (Thermo Scientific, 23227);
세포 배양을 위해 필요한 시약: FBS (GIBCO, 10099-133), DMEM (GIBCO, 11965092), 트립신 (AMRESCO, 0458);
렌티바이러스 패키징(packaging) 및 감염을 위해 필요한 시약: 렌티바이러스 패키징 플라스미드: pCMV-VSV-G (Addgene, 8454), pRSV-Rev (Addgene, 12253), pMDLg/pRRE (Addgene, 12251); X-tremeGENE 형질감염 시약 (Roche, 06366244001), 퓨로마이신(Puromycin) (InvivoGen, ant-pr-5), 블라스티시딘(Blasticidin) (InvivoGen, ant-bl-5b), 폴리브렌 (Santa Cruz, sc-134220);
실험에서 사용된 GFPβ1-10, ZFP9, Ppm1b, dsRed, mCherry, 및 Histone-H3 관련 플라스미드는 모두 Biotech에 의해 합성됨. Cas9 서열의 증폭을 위한 플라스키드 pCasKP-hph(Addgene, 117232);
기타 시약: TNF-α (Novoprotein, CF09), PI (ThmeroFisher, P3566),
세포주: HEK-293T (인간 신장 상피 세포), L929 (마우스 섬유모세포), ATCC로부터 구입함
실시예 1: 전달 시스템의 엔도좀 탈출 효율의 Split-GFP 시스템-기반 평가
Split-GFP 시스템에서, GFP의 11개의 β-주름 시트(β-pleated sheet)가 대 단편(large fragment) (β1-10)과 소(small) 단편 (β11)으로 분할되고, 이들 모두는 형광 활성을 상실하나; 그들이 만나면, 그들은 자발적으로 회합하고 GFP의 형광 성능을 회복한다. 이에 근거하여, 본 발명자들은 히스톤-β11을 안정적으로 발현하는 HEK293T 세포를 작제하고, 평가할 카고 및 세포내 전달 시스템으로서 핵 국재화 신호(NLS)를 갖는 GFPβ1-10을 융합 단백질로 발현시키고, 안정한 세포주의 형질도입에 적용했다. GFPβ1-10을 전달 시스템에 의해 형질도입한 경우, GFPβ1-10은 엔도좀으로부터 성공적으로 탈출하고 세포질 또는 핵에 들어간 후 GFPβ11에 결합하고 완전한 GFP를 생성할 수 있어서, 엔도좀 탈출 효율을 GFP의 비율 및 GFP 비의 상대적 형광 강도에 의해 평가할 수 있다 (도 1).
1.1 전달 시스템-GFPβ1-10 단백질 복합체 발현 벡터의 작제
TAT (서열번호 10), INF7 (서열번호 8), 프로테아제 절단 부위 (표 2) 및 핵 국재화 신호 (NLS)를 포함하는 카고 분자 GFPβ1-10 (서열번호 23)의 재조합 단백질 발현 벡터의 작제를 수행했고, 각각의 재조합 단백질의 구조의 개략도가 도 2에 표시되며, 그들의 C-말단으로부터 N-말단까지의 성분들 및 아미노산 서열이 하기 표 3에 표시된다. 작제 방법은 하기와 같았다: 먼저, 전달 시스템의 TAT, INF7, N, Na, Nb, Nc, Nd, Ne, Nf, 돌연변이체 N, 돌연변이체 Ne, 및 카고 분자 GFPβ1-10의 핵산 서열을 PCR 증폭에 의해 수득하고; 이 부분들을 복수 회의 PCR을 통해 연결시키고, PCR의 마지막 회(last round)에서, pET21b(+)의 상응하는 NdeI 제한효소 부위의 상류에 NdeI 제한효소 부위 및 오버랩(overlap)을 정방향 프라이머를 통해 단편의 5' 말단에 도입하고, pET21b(+)의 상응하는 BamHI 제한효소 부위의 하류에 BamHI 제한효소 부위 및 오버랩을 역방향 프라이머를 통해 단편의 3' 말단에 도입했다. 상기 pET-21b(+) 플라스미드를 NdeI 및 BamHI에 의한 이중 처리(double digestion)에 적용했다. 오버랩을 갖는 삽입 단편을 GIBSON 조립에 의해 제한효소로 처리된 벡터 pET-21b(+)에 라이게이션시켰다.
표 2: 프로테아제 인식 서열
프로테아제 인식 서열 서열번호
CTSL N 6
돌연변이체 N 21
Na 16
Nb 17
퓨린 Nc 18
Nd 19
Ne 4
돌연변이체 Ne 22
CTSD Nf 20
표 3: 전달 시스템-카고 분자 복합체에 포함된 성분
Figure pct00001
1.2 전달 시스템-GFPβ1-10 복합체의 발현 및 정제:
1.1에 기재된 발현 플라스미드를 발현 균주 대장균 BL21 (DE3)에 형질전환시켰다. 형질전환 후 플레이트로부터 단일 콜로니를 채취하고(pick) 암피실린 저항성을 함유한 LB 액체 배지 5 ml에 접종하고 밤새 배양하고, 밤새-배양된 박테리아 배양액 1 ml를 암피실린 저항성을 포함하는 LB 액체 배지 500 ml로 옮기고, 박테리아 배양액이 약 0.6의 OD600에 도달할 때까지 37℃ 및 180 rpm에서 배양하고, 유도제 IPTG를 0.2 mM의 최종 농도까지 첨가하고 25℃에서 8 시간 동안 유도시켰다. 유도 후에, 4℃에서 10분 동안 7000 g로 원심분리하여 박테리아 세포를 회수했다. 그 후, 박테리아 세포를 단백질 정제를 위해 평형화 완충액 10 ml(1 L의 2차 증류수에 용해된 50 ml 글리세롤, 8 g NaCl, 0.201 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4)에 재현탁시키고, 초음파 처리하여 파쇄시켰다. 그 후, 원심분리에 의해 상층액을 회수하고 단백질 정제 시스템의 폴리히스티딘-태깅된 단백질을 위한 단백질 정제 컬럼에 로딩했다. 원하는 단백질을 단백질 정제 시스템에 대한 용리 완충액(1 L의 2차 증류수에 용해된 50 ml 글리세롤, 8 g NaCl, 0.201 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, 17 g 이미다졸)으로 용리시켰다. 분광광도계 또는 BCA 단백질 분석 키트에 의해 단백질 농도를 결정할 수 있었다. 각각의 정제된 융합 단백질을 분주하고 -20℃에 보관했다. 각 단백질의 SDS-PAGE 결과가 도 3 및 4에 표시된다.
1.3 HEK293T-GFPβ11 세포주의 작제
1.3.1 GFPβ11 세포주를 위한 렌티바이러스 플라스미드의 작제:
히스톤-H3 (서열번호 25)의 코딩 서열을 PCR 증폭에 의해 수득하였고, GFPβ11 (서열번호 26)의 코딩 서열은 더 짧았고 정방향 프라이머에 직접 설계되었다. 성분들을 복수 회의 PCR을 통해 연결시키고, PCR의 마지막 회에서, 렌티(Lenti) 벡터의 상응하는 Hind III 제한효소 부위의 상류에 Hind III 제한효소 부위 및 오버랩을 정방향 프라이머를 통해 단편의 5' 말단에 도입하고, 렌티 벡터의 상응하는 BamHI 제한효소 부위의 하류에 BamHI 제한효소 부위 및 오버랩을 역방향 프라이머를 통해 단편의 3' 말단에 도입했다. 상기 Lenti 플라스미드를 Hind III 및 BamHI에 의한 이중 처리에 적용했다. 오버랩을 갖는 삽입 단편을 GIBSON 조립에 의해 제한효소로 처리된 벡터 Lenti 벡터에 라이게이션시켰다.
1.3.2 렌티바이러스 패키징(packaging), 감염 및 세포주의 내성 스크리닝:
HEK-293T 세포를 6-웰 플레이트에 접종하고 밤새 배양하고, 플라스미드 형질감염 전에 웰당 세포의 개수가 약 2*107/ml이도록 확인했다. 형질감염 전에, 세포를 무혈청 DMEM 배지로 옮겼다. 1.5 ㎍의 Lenti 재조합 플라스미드, 0.75 ㎍의 pMDL 플라스미드, 0.45 ㎍의 pVSV-G 플라스미드, 및 0.3 ㎍의 pREV (질량비 5:3:2:1)를 300 ㎕의 무혈청 DMEM에 첨가하고, 천천히 블로잉(blowing)시켰다. 9 ㎕ (1:3)의 X-tremeGENE 형질감염 시약을 첨가하고, 천천히 블로잉시키고, 실온에서 15분 동안 방치했다. 세포 상층액을 점적하고, 8시간 후에, 배지를 10% FBS를 포함하는 DMEM으로 교체하여 배양을 지속했다. 60시간 후에, 후속 감염을 위해 배양물 상층액을 회수했다.
HEK-293T 세포를 12-웰 플레이트에 접종하고 밤새 배양하여 렌티바이러스 감염 전에 웰당 세포 개수가 약 2*106/ml (50% 밀도)이도록 확인했다. 최초(original) 세포 배양물 상층액을 버리고, 300 ㎕의 렌티바이러스 (moi=3) 및 700 ㎕의 10% FBS DMEM을 첨가하고, 10 ㎍/ml의 농도로 폴리브렌을 첨가했다. 무균 조건에서 세포 플레이트를 2500 rpm에서 30분 동안 원심분리하고, 배양을 지속했다.
48시간의 렌티바이러스 감염 후에, 세포를 1/3의 비율로 계대시키고, 내성 스크리닝을 위해 퓨로마이신을 2.5 ㎍/ml의 농도로 첨가했다. 스크리닝으로부터 수득된 양성 세포를 클로닝하여 HEK-293T-Hitone-GFPβ11 단일클론 세포주를 수득했다.
1.4 Split-GFP 시스템에 의한 전달 시스템-GFPβ1-10 복합체의 엔도좀 탈출 효율의 검출
1.3에서 수득된 HEK-293T-Hitone-GFPβ11 세포주를 12-웰 플레이트에 접종하고, 밤새 배양하고, 단백질 처리 전에 웰당 세포 개수가 약 5*106/ml이 되도록 확인했다. 세포를 무혈청 DMEM 배지로 3회 세정한 후, 5μM의 1.2에서 수득된 전달 시스템-GFPβ1-10 복합체 100 ㎕를 무혈청 배지에 첨가하고, 3시간 동안 인큐베이션을 수행했다. 헤파린 용액을 이용하여 3회 세척하여 세포 표면에 흡착되었으나, 세포 내로 내포작용에 의해 들어가지 않은 단백질을 제거하고, 배지를 10% FBS DMEM 배지로 교체한 후 배양을 지속했다. 12시간 차에 녹색 형광 단백질(GFP) 발현의 형광 현미경 관찰 및 유동 세포측정법 분석을 수행했다.
유동 세포측정법 분석의 결과가 도 5에 표시된다. 그 결과는 pH-민감성 펩티드 INF7이 TAT의 기반에 도입된 경우, 세포의 평균 형광 강도가 증가했다는 것을 보여주고, 이는 pH-민감성 펩티드가 엔도좀 막을 깨는 효과를 갖는다는 것을 입증한다. 특히, CTSL 또는 퓨린 절단 부위가 TAT-INF7 기반에 도입된 경우, 세포 형광 강도가 더 증가했고, CTSL 절단 부위 N 및 퓨린 절단 부위 Ne가 가장 유의한 효과를 보였다. 형광 현미경 관찰 결과가 도 6에 표시되고, 그 결과는 전술된 2개의 절단 부위의 조합 (TINNe-GFPβ1-10)이 엔도좀 탈출 효율을 더 유의하게 개선할 수 있다는 것을 보여주었다.
돌연변이를 포함하는 전달 시스템-카고 분자 복합체를 수득하기 위해 N 또는 Ne 절단 부위 중 핵심 부위에 돌연변이를 도입했고, 돌연변이체 N은 서열번호 21로 표시된 서열을 갖고, 돌연변이체 Ne는 서열번호 22로 표시된 서열을 가졌다. 돌연변이체 전달 시스템-카고 분자 복합체 (Mut)와 돌연변이 없는 전달 시스템-카고 분자 복합체(WT) 간 형질감염 효율의 비교를 수행했다. 결과가 도 7에 표시된다. 절단 부위의 핵심 아미노산이 돌연변이된 경우, 단일 절단 부위인지 또는 2개의 절단 부위의 조합인지 여부에 관계없이, 엔도좀 탈출 효율을 강화하는 효과가 상실되었다. 전술된 결과는 CTSL 및 퓨린 절단 부위가 실제로 엔도좀으로부터 카고의 탈출 효율을 유의성 있게 개선시킬 수 있다는 것을 나타냈다.
세포 표면에 흡착되었으나 세포 내로 내포작용에 의해 들어가지 않은 단백질을 제거하기 위해 헤파린 용액으로 3회 세척 후에, 형질도입의 개시 후 상이한 시점에 세포를 회수하였다. 세포를 용해시켜 단백질을 추출하고, SDS-PAGE 전기영동을 수행하고, 세포내 단백질의 절단 및 유지(retension)를 분석하기 위해 GFPβ1-10을 인식하는 단일클론 항체(Abcam, ab32146)를 이용하여 웨스턴 블롯 검출을 수행하였다. 결과가 도 8에 표시된다. 6시간 전 각 시점에, 검출된 세포내 단백질의 총량은 다른 그룹의 세포들 간에 유사하여, pH-민감성 펩티드 및 절단 부위가 카고의 내포작용에 의한 흡수 효율을 증가시키지 않았고; 절단 부위를 포함하는 단백질(TIN-, TINe-, TINNe-)의 절단이 30분 이내에 개시되며, 3시간 후에는 절단된 단백질의 양이 더 이상 증가되지 않고; 단일 절단 부위를 갖는 단백질의 약 40%가 절단되고, 2개의 절단 부위를 갖는 단백질의 약 70%가 절단되었으며; 그 후, 절단 부위를 갖지 않는 단백질(T-, TI-) 및 절단 부위가 절단되지 않은 온전한(intact) 단백질이 리소좀으로 도입되어 빠르게 분해되기 시작하고, 상응하는 밴드가 12시간 차에 거의 사라졌고, 절단 후 TAT-INF7로부터 분리된 단백질은 여전히 잔류하며, TINNe 그룹이 가장 많이 잔류했다는 것을 나타냈다. 전술된 결과는 유동 세포측정법의 결과와 일치했고, 즉, 효소 절단의 효율성이 높을수록, 세포에서 비분해(undegraded) GFPβ1-10-NLS가 더 많이 유지되었고, GFPβ1-10-NLS가 핵 내로 들어가서 GFPβ11와 회합된 후 더 많은 온전한 GFP가 형성되었고, 녹색 형광 강도가 더 높았다.
또한, 3시간 동안 세포의 형질도입 후 N 또는 Ne 절단 부위에 돌연변이를 포함하는 전술된 전달 시스템-카고 분자 복합체의 절단을 분석하기 위해 웨스턴 블롯을 수행했다. 결과가 도 9에 표시되었다. 돌연변이체 전달 시스템-카고 분자 복합체 (TINm-, TINNem- 및 TINNem-)의 세포내 절단은 충족될 수 없었다. 따라서, 도 7에 표시된 유동 세포측정법 결과와 조합하면, 돌연변이체 전달 시스템-카고 분자 복합체의 낮은 전달 효율의 이유가 절단 및 후속 탈출이 달성될 수 없었기 때문이라는 것을 알 수 있었다. 또한, CTSL 및 퓨린 절단 부위가 전달 시스템에서 핵심 역할을 수행했다는 것을 확인하였다.
또한, pH-민감성 펩티드 성분이 결핍된 전달 시스템-복합체 (TNNe-GFPβ1-10-NLS)의 전달 효율이 유동 세포측정법에 의해 검출되었고, 결과가 도 10에 표시되었다. 본 발명자들은 12시간의 형질도입 후 평균 형광 강도가 기본적으로 T-GFPβ1-10-NLS의 형광 강도와 동일하다는 것을 확인했고, 이는 절단 부위가 있더라도, pH-민감성 펩티드의 결핍은 효율적 전달을 달성할 수 없었다는 것을 나타낸다. 또한, 웨스턴 블롯에 의해, pH-민감성 펩티드의 존재 또는 부재가 전달 시스템-복합체의 세포내 절단 효율에 영향을 미치지 않는다는 것을 확인했다(도 11). 전술된 결과들을 종합하여, 본 발명자들은 전달 시스템에서 pH-민감성 펩티드와 특정한 절단 부위의 공존만이 최종 고-효율 전달을 달성할 수 있다는 것을 확인했다.
실시예 2: 징크 핑거 단백질 ZFP의 형질도입에서 전달 시스템의 응용
2.1 전달 시스템-징크 핑거 단백질 ZFP9 복합체의 발현 벡터의 작제
TAT, INF7, 프로테아제 절단 부위 및 핵 국재화 신호 (NLS)를 운반하는 카고 분자 ZFP9(서열번호 27)를 포함하는 재조합 단백질의 발현 벡터를 작제하였고, 각각의 재조합 단백질의 구조의 개략도가 도 12에 표시되며, 성분들의 아미노산 서열이 하기 표 4에 표시된다. 작제 방법은 하기와 같았다: 먼저, 전달 시스템의 TAT, INF7, 프로테아제 절단 부위, 및 카고 분자 ZFP9를 코딩하는 핵산 서열을 PCR 증폭에 의해 수득하고; 이 부분들을 복수 회의 PCR을 통해 연결시키고, PCR의 마지막 회에서, pET21b(+)의 상응하는 NdeI 제한효소 부위의 상류에 NdeI 제한효소 부위 및 오버랩을 정방향 프라이머를 통해 단편의 5' 말단에 도입하고, pET21b(+)의 상응하는 BamHI 제한효소 부위의 하류에 BamHI 제한효소 부위 및 오버랩을 역방향 프라이머를 통해 단편의 3' 말단에 도입했다. 상기 pET-21b(+) 플라스미드를 NdeI 및 BamHI에 의한 이중 처리에 적용했다. 오버랩을 갖는 삽입 단편을 GIBSON 조립에 의해 제한효소로 처리된 벡터 pET-21b(+)에 라이게이션시켰다.
표 4: 전달 시스템-카고 분자 복합체에 포함된 성분
복합체 명칭 N-말단으로부터 C-말단까지의 성분 및 그들의 서열
CPP pH-민감성 펩티드 프로테아제 절단 서열 카고
ZFP9 불포함 불포함 불포함 ZFP9-NLS
서열번호 27
T- ZFP9 Tat
서열번호 10		 불포함 불포함
TI- ZFP9 INF7
서열번호 8
TINNe-ZFP9 N+Ne
2.2 전달 시스템-ZFP9 복합체의 발현 및 정제
2.1에 기재된 발현 플라스미드를 발현 균주 대장균 BL21 (DE3)에 형질전환시켰다. 형질전환 후 플레이트로부터 단일 콜로니를 채취하고 암피실린 저항성을 함유한 LB 액체 배지 5 ml에 접종하고 밤새 배양하고, 밤새-배양된 박테리아 배양액 1 ml를 암피실린 저항성을 포함하는 LB 액체 배지 500 ml로 옮기고, 박테리아 배양액이 약 0.6의 OD600에 도달할 때까지 37℃ 및 180 rpm에서 배양하고, 유도제 IPTG를 0.2 mM의 최종 농도까지 첨가하고 25℃에서 8 시간 동안 유도시켰다. 유도 후에, 4℃에서 10분 동안 7000 g로 원심분리하여 박테리아 세포를 회수하고, 박테리아 세포의 일부를 채취하여 단백질의 유도 발현을 검출했다. 그 후, 박테리아 세포를 단백질 정제를 위해 평형화 완충액 10 ml(1 L의 2차 증류수에 50 ml 글리세롤, 3.6342 g 트리스(히드록시메틸)아미노메탄을 용해시키고, pH 8.0으로 조정됨)에 재현탁시키고, 초음파 처리하여 파쇄시켰다. 그 후, 원심분리에 의해 상층액을 회수하고 AKTA 단백질 정제 시스템의 SP(Sulphopropyl) 양이온 교환 컬럼에 로딩했다; 그 후, 원하는 단백질을 상이한 비율의 평형화 완충액과 고-염 용리액(high-salt eluent) (1L의 이차 증류수에 50 ml 글리세롤, 116.88 g NaCl, 3.6342 g 트리스(히드록시메틸)아미노메탄을 용해시키고, pH를 8.0으로 조정함)을 이용한 구배 용리(gradient elution)에 의해 수득했다. 분광광도계 또는 BCA 단백질 분석 키트에 의해 단백질 농도를 결정할 수 있었다. 각각의 정제된 융합 단백질을 분주하고 -20℃에 보관했다. 각 단백질의 SDS-PAGE 결과가 도 13에 표시되었다.
2.3 ZFP9 결합 부위를 포함하는 진핵세포 발현 플라스미드의 작제
청색 형광 단백질 (BFP) 및 ZFP9 결합 부위를 포함하는 발현 벡터를 작제하였고, 그의 구조 개략도가 도 14에 표시되었다. 청색 형광 단백질의 코딩 서열 (서열번호 29) 및 ZFP9 결합 부위 (6* 결합 부위) (서열번호 30)의 코딩 서열을 PCR 증폭에 의해 수득하고, 2개의 부분을 2회의 PCR에 의해 라이게이션시키고, 제2회 PCR에서, pTT5 벡터의 상응하는 Hind III 제한효소 부위의 상류에 Hind III 제한효소 부위 및 오버랩을 정방향 프라이머를 통해 단편의 5' 말단에 도입하고, pTT5 벡터의 상응하는 BamHI 제한효소 부위의 하류에 BamHI 제한효소 부위 및 오버랩을 역방향 프라이머를 통해 단편의 3' 말단에 도입했다. 상기 pTT5 플라스미드를 Hind III 및 BamHI에 의한 이중 처리에 적용했다. 오버랩을 갖는 삽입 단편을 GIBSON 조립에 의해 제한효소로 처리된 벡터 pTT5 벡터에 라이게이션시켜서 pTT5-BFP-6BS 플라스미드를 수득했다.
2.4 전달 시스템에 의해 징크 핑거 단백질 ZFP9을 형질도입시키는 전달 효율의 검출
HEK-293T 세포를 12-웰 플레이트에 접종하고 밤새 배양하고, 단백질 처리 전에 전에 웰당 세포의 개수가 약 5*106/ml이도록 확인했다. 5 μM의 2.2에서 수득된 전달 시스템-ZFP9 복합체 (ZFP9, T-ZFP9, TI-ZFP9, TINNe-ZFP9) 100 ㎕와 2.3에서 수득된 pTT5-BFP-6BS 플라스미드 5 ㎍을 37℃에서 30분 동안 동시-인큐베이션시켜서 완전히 복합체를 형성시키고, X-tremeGENE 형질감염 시약 (Roche)을 양성 대조군으로 사용했다 (5 ㎍의 플라스미드와 15 ㎕의 형질감염 시약을 혼합하고 무혈청 조건에서 세포를 형질감염시키기 위해 사용하고, 8시간 후에, 배지를 10% FBS DMEM으로 교체하여 배양을 지속했다). 세포를 무혈청 DMEM으로 3회 세척하고, 복합체를 첨가하고 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 헤파린 용액을 이용하여 3회 세척하여 세포 표면에 흡착되었으나, 세포 내로 내포작용에 의해 들어가지 않은 단백질을 제거하고, 배지를 10% FBS DMEM 배지로 교체한 후 배양을 지속하고, 배지의 교체 후 12시간, 24시간, 36시간, 및 48시간 차에 청색 형광 단백질(BFP) 발현의 유동 세포측정법 분석을 수행했다.
유동 세포측정법 분석의 결과가 도 15 및 16에 표시된다. ZFP9에 결합된 플라스미드는 핵으로 들어간 경우에만 전사 과정을 완료할 수 있었다. 따라서, ZFP9가 엔도좀으로부터 탈출한 경우에만, 결합된 플라스미드를 핵 내로 들어가도록 운반할 수 있고, 따라서, 청색 형광 단백질을 발현하기 위한 전사 과정이 개시될 수 있었다. T-ZFP9에 비해, pH-민감성 펩티드 INF7 (TI-ZFP9)의 도입은 청색 형광 비율을 약 10% 증가시킬 수 있었으나(p=0.035), 여전히 낮은 수준이었고, 즉, 복합체의 대부분이 탈출해서 핵 내로 들어가지 못했다. 시스템 내로 프로테아제 절단 부위를 추가적으로 도입하면 (TINNE-ZFP9), 청색 형광 세포의 비율을 유의성 있게 증가시킬 수 있어서, 48시간 차에 약 65%에 도달했고 (p=0.018), 이는 Roche 형질감염 시약 X-tremeGENE의 경우와 동일했다. ZFP9/pTT5-BFP-6BS 복합체를 운반하는 전달 시스템의 세포 내로의 내포작용에 의한 흡수 과정 동안, CTSL 및 퓨린-특이적 절단 부위 N 및 Ne의 도입은 운반된 ZFP9의 탈출 과정을 유의성 있게 촉진했고, 더 많은 복합체가 핵 내로 들어가서 전사 및 BFP 형광 발현을 완료시킬 수 있었다는 것을 알 수 있었다.
실시예 3: 프로테인 포스파타아제 Ppm1b의 형질도입에서 전달 시스템의 응용
TNF-α는 세포 표면 수용체에 결합하여 RIP3 인산화를 유도하고 다중-단백질 복합체(multi-protein complex)의 네크로좀(necrosome)을 형성하고, 네크로좀 중 인산화된 RIP3은 M1k1을 동원하고 인산화시키고, 그 후, 세포가 괴사(necrosis) 프로그램에 들어간다. 이 과정에서, 세포내 프로테인 포스파타아제 1B (Ppm1b)가 RIP3을 탈인산화시키는 것에 의해 예정된 세포 괴사(네크로톱시스(Necroptosis))를 억제할 수 있다. 예정된 세포 괴사가 염증성 질환, 허혈-재관류 손상, 신경퇴행성 질환 및 기타 질환의 발생과 밀접하게 관련된 것으로 발견되었다는 사실을 고려할 때, Ppm1b 단백질은 예정된 세포 괴사와 관련된 전술된 질환의 치료에서 큰 가능성을 보였다.
3.1 전달 시스템-Ppm1b 단백질 복합체를 위한 발현 벡터의 작제
TAT, INF7, 프로테아제 절단 부위, 및 카고 분자 Ppm1b (서열번호 31)를 포함하는 발현 벡터를 작제하였다. 각각의 재조합 단백질의 구조의 개략도가 도 17에 표시되며, 각 성분의 아미노산 서열이 하기 표 6에 표시되었다. 작제 방법은 하기와 같았다: TAT, INF7, 프로테아제 절단 부위, 및 Ppm1b의 핵산 서열을 PCR 증폭에 의해 수득하고; 이 부분들을 복수 회의 PCR을 통해 연결시키고, PCR의 마지막 회에서, pET-21b(+)의 상응하는 NdeI 제한효소 부위의 상류에 NdeI 제한효소 부위 및 오버랩을 정방향 프라이머를 통해 단편의 5' 말단에 도입하고, pET-21b(+)의 상응하는 BamHI 제한효소 부위의 하류에 BamHI 제한효소 부위 및 오버랩을 역방향 프라이머를 통해 단편의 3' 말단에 도입했다. 상기 pET-21b(+) 플라스미드를 NdeI 및 BamHI에 의한 이중 처리에 적용했다. 오버랩을 갖는 삽입 단편을 GIBSON 조립에 의해 제한효소로 처리된 벡터 pET-21b(+)에 라이게이션시켰다.
표 5: 전달 시스템-카고 분자 복합체에 포함된 성분
복합체 명칭 N-말단으로부터 C-말단까지의 성분 및 그들의 서열
CPP pH-민감성 펩티드 프로테아제 인식 서열 카고
Ppm1b 불포함 불포함 불포함 Ppm1b
서열번호 31
T- Ppm1b Tat
서열번호 10		 불포함 불포함
TI- Ppm1b INF7
서열번호 8
TINNe- Ppm1b N+Ne
3.2 전달 시스템-Ppm1b 복합체의 발현 및 정제
3.1에 기재된 발현 플라스미드를 발현 균주 대장균 BL21 (DE3)에 형질전환시켰다. 형질전환 후 플레이트로부터 단일 콜로니를 채취하고 암피실린 저항성을 함유한 LB 액체 배지 5 ml에 접종하고 밤새 배양하고, 밤새-배양된 박테리아 배양액 1 ml를 암피실린 저항성을 포함하는 LB 액체 배지 500 ml로 옮기고, 박테리아 배양액이 약 0.6의 OD600에 도달할 때까지 37℃ 및 180 rpm에서 배양하고, 유도제 IPTG를 0.2 mM의 최종 농도까지 첨가하고 25℃에서 8 시간 동안 유도시켰다. 유도 후에, 4℃에서 10분 동안 7000 g로 원심분리하여 박테리아 세포를 회수하고, 박테리아 세포의 일부를 채취하여 단백질의 유도 발현을 검출했다. 그 후, 박테리아 세포를 단백질 정제를 위해 평형화 완충액 10 ml(1 L의 2차 증류수에 50 ml C3H8O3, 3.6342 g 트리스(히드록시메틸)아미노메탄을 용해시키고, pH 8.0으로 조정됨)에 재현탁시키고, 초음파 처리하여 파쇄시켰다. 그 후, 원심분리에 의해 상층액을 회수하고 AKTA 단백질 정제 시스템의 SP(Sulphopropyl) 양이온 교환 컬럼에 로딩했다; 그 후, 원하는 단백질을 상이한 비율의 평형화 완충액과 고-염 용리액 (1L의 이차 증류수에 50 ml C3H8O3, 116.88 g NaCl, 3.6342 g 트리스(히드록시메틸)아미노메탄을 용해시키고, pH를 8.0으로 조정함)을 이용한 구배 용리에 의해 수득했다. 분광광도계 또는 BCA 단백질 분석 키트에 의해 단백질 농도를 결정할 수 있었다. 각각의 정제된 융합 단백질을 분주하고 -20℃에 보관했다. 각 단백질의 SDS-PAGE 결과가 도 18에 표시되었다.
3.3 TNF-α에 의해 유도되는 괴사율에 대한 전달 시스템-Ppm1b 복합체의 효과
L929 세포를 12-웰 플레이트에 접종하고 밤새 배양하고, 단백질 처리 전에 전에 웰당 세포의 개수가 약 2*106/ml이도록 확인했다. 5 μM의 3.2에서 수득된 전달 시스템단백질 (Ppm1b, T-Ppm1b, TI-Ppm1b, TINNe-Ppm1b) 100 ㎕를 무혈청 배지에 각각 첨가하고, 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 20 ng/ml TNF-α 및 20mM z-VAD을 포함하는 10% FBS DMEM 1 ml를 첨가하고 10시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 회수하고 PI 염색에 적용하고, 세포 괴사율(ratio of cell necrosis)을 관찰하기 위해 유동 세포측정법 분석을 수행했다. 렌티바이러스-형질도입 Ppm1b (Lenti-Ppm1b) 및 대조군으로 렌티바이러스 (Lenti-vec)를 사용하여, Ppm1b 발현 서열을 갖는 렌티바이러스 및 대조군 렌티바이러스를 패키징시키고, HEK-293T 세포에서 회수하고, 세포에서 Ppm1b가 완전히 발현되도록 하기 위해, L929 세포를 24시간 동안 감염시킨 후, 감염된 L929 세포를 후속 TNF-α 자극을 위해 재-플레이팅하였다.
결과를 도 19에 표시하였다. T-Ppm1b와 비교하여, pH-민감성 펩티드 INF7의 도입 (TI-Ppm1b)은 세포 괴사를 단지 약간 억제할 수 있었으나, 여전히 낮은 수준이었다. 그러나, 시스템에 프로테아제 절단 부위의 추가 도입 (TINNe-Ppm1b)에 의해, TINNe 그룹은 렌티바이러스 그룹의 수준과 유사한 세포 괴사 억제 능력을 가졌고, 세포 괴사율은 약 25%까지 크게 감소될 수 있었다. 따라서, Ppm1b 복합체를 운반하는 전달 시스템의 세포 내로의 내포작용 과정 동안, CTSL 및 퓨린 특이적 부위 N 및 Ne의 도입은 운반된 Ppm1b의 탈출 과정을 유의성 있게 촉진했고, 보다 많은 Ppm1b가 세포질 내로 들어가서 RIP3의 인산화를 억제하여, 세포 괴사율을 감소시킬 수 있었다.
실시예 4: 유전자-편집 효소 Cas9에서 전달 시스템의 응용
CRISPR/Cas9 유전자 편집 시스템에서, sgRNA가 Cas9 단백질에 결합하고, sgRNA는 특이적으로 표적 부위를 인식할 수 있고, Cas9는 DNA 이중-가닥 분자에 결합하고 절단할 수 있으며, 표적화된 유전자의 편집은 비-상동성 말단 재조합(non-homologous end recombination) 또는 상동성-기반 복구(homology-directed repair)를 통해 실현된다. 이 시스템에서, Cas9은 그의 기능을 완료하기 위해 핵 내로 들어가야 한다. 이에 근거하여, 본 발명자들은 진핵 세포에서 유전자 편집을 달성하기 위해 전달 시스템을 Cas9 단백질과 융합시켰다.
4.1 전달 시스템-Cas9 단백질 복합체를 위한 발현 벡터의 작제
TAT, INF7, 프로테아제 절단 부위, 및 핵 국재화 서열(NLS)를 운반하는 카고 분자 Cas9 (서열번호 33)를 포함하는 발현 벡터를 작제하였다. 각각의 재조합 단백질의 구조의 개략도가 도 20에 표시되며, 각 성분의 아미노산 서열이 하기 표 6에 표시되었다. 작제 방법은 하기와 같았다: TAT, INF7, 프로테아제 절단 부위 N 및 Ne, 및 Cas9을 코딩하는 핵산 서열을 PCR 증폭에 의해 수득하고; 이 부분들을 복수 회의 PCR을 통해 연결시키고, PCR의 마지막 회에서, pET-21b(+)의 상응하는 NdeI 제한효소 부위의 상류에 NdeI 제한효소 부위 및 오버랩을 정방향 프라이머를 통해 단편의 5' 말단에 도입하고, pET-21b(+)의 상응하는 BamHI 제한효소 부위의 하류에 BamHI 제한효소 부위 및 오버랩을 역방향 프라이머를 통해 단편의 3' 말단에 도입했다. 상기 pET-21b(+) 플라스미드를 NdeI 및 BamHI에 의한 이중 처리에 적용했다. 오버랩을 갖는 삽입 단편을 GIBSON 조립에 의해 제한효소로 처리된 벡터 pET-21b(+)에 라이게이션시켰다.
표 6: 전달 시스템-카고 분자 복합체에 포함된 성분
복합체 명칭 N-말단으로부터 C-말단까지의 성분 및 그들의 서열
CPP pH-민감성 펩티드 프로테아제 인식 서열 카고
T- Cas9 Tat
서열번호 10		 불포함 불포함 Cas9-NLS
서열번호 33
TI- Cas9 INF7
서열번호 8
TINNe- Cas9 N+Ne
4.2 전달 시스템-Cas9 복합체의 발현 및 정제
니켈 컬럼 상에서의 예비 정제: 4.1에 기재된 발현 플라스미드를 발현 균주 대장균 BL21 (DE3)에 형질전환시켰다; 형질전환 후 플레이트로부터 단일 콜로니를 채취하고 암피실린 저항성을 함유한 LB 액체 배지 5 ml에 접종하고 밤새 배양하고, 밤새-배양된 박테리아 배양액 1 ml를 암피실린 저항성을 포함하는 LB 액제 배지 500 ml로 옮기고, 박테리아 배양액이 약 0.6의 OD600에 도달할 때까지 37℃ 및 180 rpm에서 배양하고, 유도제 IPTG를 0.2 mM의 최종 농도까지 첨가하고 25℃에서 8 시간 동안 유도시켰다. 유도 후에, 4℃에서 10분 동안 7000 g로 원심분리하여 박테리아 세포를 회수하고, 박테리아 세포를 단백질 정제를 위해 평형화 완충액 10 ml(5% 글리세롤, 30mM TB8.0, 50mM 글리세롤, 500mM 염화나트륨, 25mM 글루코오스)에 재현탁시키고, 초음파 처리하여 파쇄시켰다. 그 후, 원심분리에 의해 상층액을 회수하고 단백질 정제 시스템의 폴리히스티딘-태깅된 단백질을 위한 단백질 정제 컬럼에 로딩하고, 원하는 단백질을 단백질 정제 시스템에 대한 용리 완충액(5% 글리세롤, 30mM TB8.0, 50mM 글리세롤, 500mM 염화나트륨, 25mM 글루코오스, 250 mM 이미다졸)으로 단백질 정세 시스템에 의해 용리시켰다.
양이온 교환 컬럼에서의 최종 정제: 니켈 컬럼에서의 예비 정제로부터 회수된 원하는 단백질을 평형화 완충액 (30 mM TB8.0, 50 mM 글리세롤, 250 mM 염화 나트륨, 25 mM 글루코오스, pH를 7.2로 조정함)으로 투석시키고, AKTA 단백질 정제 시스템의 SP(Sulphopropyl) 양이온 교환 컬럼에 로딩했다; 그 후, 원하는 단백질을 상이한 비율의 평형화 완충액과 고-염 용리액 (30 mM TB8.0, 50 mM 글리세롤, 2 M 염화 나트륨, 25 mM 글루코오스, pH를 7.2로 조정함)을 이용한 구배 용리에 의해 수득했다. 분광광도계 또는 BCA 단백질 분석 키트에 의해 단백질 농도를 결정할 수 있었다. 각각의 정제된 융합 단백질을 분주하고 -20℃에 보관했다. 각 단백질의 SDS-PAGE 결과가 도 21에 표시되었다.
4.3 HEK293T-RFP 리포터 세포주의 작제
Cas9은 sgRNA로의 결합에 의해 표적 부위를 특이적으로 인식할 수 있고, 도너(donor)가 제공되지 않는 경우, 비-상동성 말단 재조합이 일어날 것이다. 따라서, sgRNA 인식 부위 및 해독 프레임(reading frame)에 있지 않은 2개의 적색 형광 단백질 (dsRed 및 mCherry가 G에 의해 연결됨)을 렌티바이러스 감염에 의해 HEK-293T 세포의 게놈 내로 통합시킨다. 그러한 경우에, Cas9이 sgRNA 인식 부위에서 DNA 서열의 상동성 말단 재조합의 발생을 유발하는 경우, 해독 프레임에 있지 않는 적색 형광 단백질 유전자가 해독 프레임으로 들어가서 발현되게 할 것이고, 이는 세포를 비-형광 상태에서 적색 형광 상태로 변화시킬 것이므로, 유전적으로 조작된 효소 Cas9의 형질도입에 대한 전달 시스템의 효율이 적색 형광이 생성되는지 여부 및 적색 형광 세포의 개수에 의해 평가될 수 있다 (도 22).
4.3.1 RFP 리포터 세포주를 위한 렌티바이러스 플라스미드의 작제
dsRed의 코딩 서열 (서열번호 35) 및 mCherry의 코딩 서열 (서열번호 36)을 PCR 증폭에 의해 수득하였고, sgRNA 인식 부위의 DNA 서열 (서열번호 37)은 더 짧았고 따라서, 프라이머에 설계하고, 성분들을 복수 회의 PCR에 의해 라이게이션시켰다. PCR의 마지막 회에서, Lenti 벡터의 상응하는 Hind III 제한효소 부위의 상류에 Hind III 제한효소 부위 및 오버랩을 정방향 프라이머를 통해 단편의 5' 말단에 도입하고, Lenti 벡터의 상응하는 BamHI 제한효소 부위의 하류에 BamHI 제한효소 부위 및 오버랩을 역방향 프라이머를 통해 단편의 3' 말단에 도입했다. 상기 Lenti 플라스미드를 Hind III 및 BamHI에 의한 이중 처리에 적용했다. 오버랩을 갖는 삽입 단편을 GIBSON 조립에 의해 제한효소로 처리된 벡터 Lenti 벡터에 라이게이션시켰다. 성공적으로 작제된 플라스미드의 맵이 도 23에 표시된다.
4.3.2 렌티바이러스 패키징, 감염 및 세포주 내성 스크리닝
HEK293T 세포를 6-웰 플레이트에 접종하고 밤새 배양하고, 플라스미드 형질감염 전에 웰당 세포의 개수가 약 2*107/ml이도록 확인했다. 형질감염 전에, 배지를 무혈청 DMEM 배지로 교체했다. 1.5 ㎍의 Lenti 재조합 플라스미드(RFP 리포터), 0.75 ㎍의 pMDL 플라스미드, 0.45 ㎍의 pVSV-G 플라스미드, 및 0.3 ㎍의 pREV (질량비 5:3:2:1)를 300 ㎕의 무혈청 DMEM에 첨가하고, 천천히 블로잉시키고, 5분 동안 정치시켰다. 9 ㎕의 X-tremeGENE 형질감염 시약을 첨가하고, 천천히 블로잉시키고, 실온에서 15분 동안 방치했다. 세포 상층액을 첨가하고, 8시간 후에, 배지를 10% FBS를 포함하는 DMEM으로 교체하여 배양을 지속했다. 60시간 후에, 배양물 상층액을 회수하고, 4℃에서 보관했다.
HEK293T 세포를 12-웰 플레이트에 접종하고 밤새 배양하여 렌티바이러스 감염 전에 웰당 세포 개수가 약 2*106/ml (50% 밀도)이도록 확인했다. 세포 배양물 상층액을 버리고, 300 ㎕의 렌티바이러스 (Moi=3), 700 ㎕의 10% FBS DMEM, 및 10 ㎍/ml의 농도의 폴리브렌을 첨가하고, 무균 조건에서 2500 rpm에서 30분 동안 원심분리하고, 배양을 지속했다.
48시간의 렌티바이러스 감염 후에, 세포를 1/3의 비율로 계대시키고, 내성 스크리닝을 위해 퓨로마이신을 2.5 ㎍/ml의 농도로 첨가했다; 스크리닝으로부터 수득된 양성 세포를 클로닝하여 HEK293T-RFP 리포터의 단일클론 세포주를 수득했다.
4.3.3 GM3-gRNA 전사 플라스미드의 작제
gRNA의 도입을 세포에서 gRNA로 전사될 전사 플라스미드의 형질감염에 의해 수행한다. gRNA에 상응하는 DNA 서열을 프라이머 어닐링 및 오버랩핑에 의해 생성한다. 프라이머 설계의 과정에서, AflII 제한효소 부위의 점착성 말단(sticky end)을 직접 도입했다; gRNA-클로닝 벡터를 AflII 단일 효소 처리(digestion)에 의해 처리했다; 상기 벡터 및 삽입 단편을 그들의 점착성 말단을 이용하여 T4 리가아제에 의해 라이게이션시켰다.
4.4 전달 시스템-Cas9 복합체의 편집 효율의 평가
gRNA 전사 플라스미드의 형질감염: HEK-293T-RFP 리포터 세포주를 12-웰 플레이트에 접종하고 밤새 배양하고, 형질감염 전에 웰당 세포의 개수가 약 2.5*106/ml이 되도록 확인했다. 형질감염 전에, 배지를 무혈청 DMEM으로 대체했다. 1 ㎍의 gRNA-GM3 전사 플라스미드를 100 ㎕의 무혈청 DMEM에 첨가하고, 천천히 블로잉하고, 5분 동안 정치시켰다. 3 ㎕의 X-tremeGENE 형질감염 시약을 더 첨가하고, 잘 블로잉하고, 15분 동안 정치시켰다. 그 후, 세포 상층액에 첨가했다. 8시간 후에, 배지를 10% FBS DMEM으로 교체했다.
전달 시스템에 의한 Cas9의 형질도입: gRNA 전사 플라스미드의 형질 감염 후 12시간차(혈청-함유 DMEM으로 교체 후 4시간차)에, 세포를 무혈청 DMEM으로 3회 세정하고, 4.2에서 수득된 전달 시스템-Cas9 복합체 5 μM을 무혈청 DMEM 조건 하에 첨가하고, 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 배지를 10% FBS DMEM으로 교체하고 배양을 지속하고, 적색 형광 단백질(RFP) 발현의 관찰 및 유동 세포측정법 분석을 48시간차에 수행했다.
유동 세포측정법 결과가 도 24에 표시되었다. T-Cas9의 형질도입 후에, 적색 형광 세포의 비율은 낮았고 (3.7%), 즉, Cas9 단백질의 대부분은 탈출하여 핵 내로 들어가지 못했다; pH-민감성 펩티드 INF7 (TI-Cas9)의 도입은 적색 형광 세포의 비율을 9%까지 증가시킬 수 있었고; 시스템 (TINNE-Cas9) 내로 프로테아제 절단 부위의 추가적 도입은 적색 형광 단백질을 발현하는 세포의 개수를 유의성 있게 증가시켰고, 이는 48시간차에 약 14%에 도달할 수 있었다. 따라서, Cas9을 운반하는 전달 시스템의 세포 내로의 내포작용에 의한 흡수 과정 동안, CTSL 및 퓨린 특이적 부위 N 및 Ne의 도입은 운반된 Cas9의 탈출 과정을 크게 촉진했고, 더 많은 Cas9이 핵 국재화 신호의 작용에 의해 세포 내로 들어갔다. 세포내 전사에 의해 형성된 GM3 sgRNA로의 결합 후에, Cas9은 표적 서열을 특이적으로 인식했고, 상동성 말단 복구(homologous end repair)가 이 부위 부근에서 일어나서, 적색 형광 유전자가 해독 프레임에 들어가서 발현되었다.
실시예 5: 비-공유결합 연결에 근거한 전달 시스템의 확립
융합 발현 외에, 본 발명의 융합 단백질과 카고 간의 연결 모드가 또한 어댑터 쌍(adapter pairs)이라 불리는 단백질 도메인, 예를 들면, 강한 상호작용을 갖는 이형이량체 루이신 지퍼를 통한 비-공유결합성 상호작용일 수 있다 (도 25). 2개의 역-평행 루이신 지퍼 도메인은 그들의 공간적 구조 및 전하 분포의 상보성(complementarity) 때문에 자발적으로 조합되어 올리고머를 형성할 수 있다. NZ와 CZ는 상호 간에 조합될 수 있는 루이신 지퍼의 쌍인 것으로 보고되었다. 본 발명자들은 NZ 도메인을 본 발명의 세포내 전달 시스템에 융합시키고 (TINNe-NZ), CZ 도메인을 카고로서 핵 국재화 신호 (NLS)를 갖는 GFPβ1-10에 융합시켰다 (CZ-GFPβ1-10-NLS). 수득된 2종의 융합된 단백질을 혼합하고 상호 간에 조합되도록 인큐베이션하고, Histone-β11을 안정적으로 발현하는 HEK293T 세포로의 형질도입에 적용하고, GFP의 비율 및 상대적 형광 강도에 의해 엔도좀 탈출 효율을 평가할 수 있었다. 따라서, 융합 단백질을 카고 분자에 연결시키기 위해 NZ-CZ의 어댑터 쌍을 사용하는 것의 가능성을 평가했다.
5.1 전달 시스템-NZ 융합 단백질 및 CZ-GFPβ1-10 융합 단백질을 위한 발현 벡터의 작제
pET32a 벡터에 기반하여, TAT, INF7, 프로테아제 절단 부위 및 NZ 도메인을 포함하는 재조합 단백질을 위한 발현 벡터, 및 CZ 도메인, 핵 국재화 신호 (NLS)를 갖는 카고 분자 GFPβ1-10을 포함하는 재조합 단백질을 위한 발현 벡터를 작제하였고, TrxA를 가용화 표지(solubilizing label)로 도입하였다. 각 재조합 단백질의 구조적 개략도가 도 26에 표시되고, 전달 시스템의 아미노산 서열이 하기 표에 표시되었다. 작제 방법은 하기와 같았다: 먼저, 전술된 벡터를 주형으로 사용했고, 전달 시스템 중 TAT, INF7, N, Ne, 및 NZ 서열을 코딩하는 핵산 서열 및 CZ 서열 및 카고 분자 GFPβ1-10을 코딩하는 핵산 서열을 PCR 증폭에 의해 수득하였다. TrxA-TINNe-NZ의 경우, PCR 과정의 마지막 회에서, pET-32a(+)의 상응하는 BamHI 제한효소 부위의 상류에 BamHI 제한효소 부위 및 오버랩을 정방향 프라이머를 통해 단편의 5' 말단에 도입하고, pET-32a(+)의 상응하는 HIindIII 제한효소 부위의 하류에 HIindIII 제한효소 부위 및 오버랩을 역방향 프라이머를 통해 단편의 3' 말단에 도입했다. 상기 pET-32a(+) 플라스미드를 BamHI 및 HIindIII에 의한 이중 처리에 적용했다. 오버랩을 갖는 삽입 단편을 GIBSON 조립에 의해 제한효소로 처리된 벡터 pET-32a(+)에 라이게이션시켰다. CZ-GFPβ1-10의 경우, PCR 과정의 마지막 회에서, pET21b(+)의 상응하는 NdeI 제한효소 부위의 상류에 NdeI 제한효소 부위 및 오버랩을 정방향 프라이머를 통해 단편의 5' 말단에 도입하고, pET21b(+)의 상응하는 BamHI 제한효소 부위의 하류에 BamHI 제한효소 부위 및 오버랩을 역방향 프라이머를 통해 단편의 3' 말단에 도입했다. 상기 pET-21b(+) 플라스미드를 NdeI 및 BamHI에 의한 이중 처리에 적용했다. 오버랩을 갖는 삽입 단편을 GIBSON 조립에 의해 제한효소로 처리된 벡터 pET-21b(+)에 라이게이션시켰다.
표 7: 전달 시스템에 포함된 성분
전달 시스템 N-말단으로부터 C-말단까지의 성분 및 그들의 서열
가용화 태그 CPP pH-민감성 펩티드 프로테아제 인식 서열 특이적 결합 서열
TINNe-NZ TrxA
서열번호 53		 Tat
서열번호 10		 INF7
서열번호 8		 N+Ne NZ
서열번호 49
5.2 전달 시스템-NZ 융합 단백질 및 CZ-GFPβ1-10 융합 단백질의 발현 및 정제
5.1에 기재된 발현 플라스미드를 발현 균주 대장균 BL21 (DE3)에 형질전환시켰다; 형질전환 후 플레이트로부터 단일 콜로니를 채취하고 암피실린 저항성을 함유한 LB 액체 배지 5 ml에 접종하고 밤새 배양하였다. 밤새-배양된 박테리아 배양액 1 ml를 암피실린 저항성을 포함하는 LB 액체 배지 500 ml로 옮기고, 박테리아 배양액이 약 0.6의 OD600에 도달할 때까지 37℃ 및 180 rpm에서 배양하였다. 유도제 IPTG를 0.2 mM의 최종 농도까지 첨가하고 25℃에서 8 시간 동안 유도시켰다. 유도 후에, 4℃에서 10분 동안 7000 g로 원심분리하여 박테리아 세포를 회수하고, 박테리아 세포를 단백질 정제를 위해 평형화 완충액 10 ml(1 L의 2차 증류수에 50 ml 글리세롤, 8 g NaCl, 0.201 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4를 용해시킴)에 재현탁시키고, 초음파 처리하여 파쇄시켰다. 원심분리에 의해 상층액을 회수하고 단백질 정제 시스템의 폴리히스티딘-태깅된 단백질을 위한 단백질 정제 컬럼에 로딩하고; 원하는 단백질을 단백질 정제를 위한 용리 완충액, 용리 완충액(Elution buffer) 2# (1L의 이차 증류수에 용해된, 50 ml 글리세롤, 8 g NaCl, 0.201 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, 17 g의 이미다졸)을 이용하여 단백질 정제 시스템에 의해 용리시켰다. 분광광도계 또는 BCA 단백질 분석 키트에 의해 단백질 농도를 결정할 수 있었다. 각각의 정제된 융합 단백질을 분주하고 -20℃에 보관했다. 각 단백질의 SDS-PAGE 결과가 도 27에 표시된다.
5.3 Split-GFP 시스템에 의한 어댑터-기반 전달 시스템의 전달 효율의 검출
앞서 수득된 HEK-293T-Hitone-GFPβ11 세포주를 12-웰 플레이트에 접종하고 밤새 배양하고, 단백질 처리 전에 웰당 세포의 개수가 약 5*106/ml이 되도록 확인했다; 그 후, 세포를 무혈청 DMEM으로 3회 세정했다. 대조군과 실험군 및 그들이 사용한 단백질(5.2에서 수득됨)의 양이 하기 표에 표시되었으며, 세포와의 인큐베이션 전에, 대조군 2 및 실험군의 2종의 단백질을 무혈청 배지 중에 실온에서 10분 동안 혼합했다. 무혈청 배지 조건에서 3시간 동안 인큐베이션 후에, 세포를 헤파린 용액으로 3회 세척하여 세포 표면에 흡착되었으나, 내포 작용에 의해 흡수되지 않은 단백질을 제거하고, 배지를 10% FBS DMEM 배지로 변경한 후에 배양을 지속하고, 녹색 형광 양성 세포의 비율 및 MFI의 형광 현미경 관찰 및 유동 세포측정법 분석을 12시간차에 수행했다.
유동 세포측정법 분석 결과가 도 28에 표시되었다. 결과는 2개의 대조군 (CZ-GFPβ1~10/TrxA-TINNe+CZ-GFPβ1~10)의 MFI 값이 모두 5보다 낮았으며, 대조 군 2 (TrxA-TINNe+CZ-GFPβ1~10)가 대조군 1의 MFI보다 약간 더 높은 MFI를 가졌다. 본 발명자들은 이것이 TrxA-TINNe와 CZ-GFPβ1~10간의 비-특이적 흡착에 의해 유발되며, 카고 CZ-GFPβ1~10이 세포로 들어가서 TINNe에 의해 엔도좀으로부터 탈출할 수 있게 한 것으로 추측했다. TrxA-TINNe-NZ+CZ-GFPβ1~10 군의 MFI 값은 20에 근접했고, 대조군의 MFI보다 훨씬 더 높았고, GFPβ1~10와 조합된 NZ 및 CZ, TrxA-TINNe의 작용 하에 및 TINNe의 작용을 통해, GFPβ1~10이 세포 내로 들어가고 엔도좀으로부터 탈출했다는 것을 나타냈다. 어댑터-기반 연결(adapter-based linking) 방법의 형광 강도가 여전히 융합 발현에 의해 수득된 TINNe-GFPβ1~10의 형광 강도보다 낮았으나, 실험은 NZ-CZ 또는 유사한 어댑터에 기반한 연결 방법이 전달 시스템을 카고와 연결시키기 위해 이용될 수 있고, 카고를 세포 내로 들어가서 엔도좀으로부터 탈출하도록 효과적으로 전달할 수 있다는 것을 확인했다.
표 8: 대조군 및 실험군
군 첨가되는 단백질 및 그의 최종 농도
TrxA-TINNe TrxA-TINNe-NZ CZ-GFP β1-10 TINNe-GFP β1-10
대조군 1 5μM
대조군 2 5μM 5μM
대조군 3 5μM
실험군 5μM 5μM
본 발명의 특정한 구체예들이 상세하게 설명되었으나, 당업자는 다양한 변형 및 변경이 개시된 모든 교시에 따라 세부사항에 이루어질 수 있고, 이러한 변화는 본 발명의 범위 내에 속한다는 것을 이해할 것이다. 본 발명 전체는 첨부된 청구항 및 그의 균등물에 의해 주어진다.
SEQUENCE LISTING <110> XIAMEN UNIVERSITY XIAMEN INNOVAX BIOTECH CO., LTD. <120> COMPLEX FOR INTRACELLULAR DELIVERY OF MOLECULES <130> IEC190104PCT <150> CN201910624609.9 <151> 2019-07-11 <160> 54 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Furin recognition sequence-1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X=any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X=K or R <400> 1 Arg Xaa Xaa Arg 1 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Furin recognition sequence-2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X=any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X=K or R <400> 2 Arg Arg Xaa Xaa Arg 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Furin recognition sequence-3 <400> 3 Arg Arg His Lys Arg 1 5 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Furin recognition sequence-4 (Ne) <400> 4 Gln Ser Val Ala Ser Ser Arg Arg His Lys Arg Phe Ala Gly Val 1 5 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Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Leu Phe 1 5 10 15 Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp 20 25 30 Gly Trp Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Ser Asn Asn Thr His Asp Leu Val 35 40 45 Gly Asp Val Arg Leu Ala Gly Val Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val 50 55 60 Ala Ser Ser Arg Arg His Lys Arg Phe Ala Gly Val 65 70 75 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NLS <400> 15 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 16 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CTSL recognition sequence Na <400> 16 Ala Arg Ala Tyr Gly Phe Arg Gly Pro Gly Pro Gln Leu Arg Arg Gly 1 5 10 15 Trp Arg Pro Ser Ser 20 <210> 17 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CTSL recognition sequence Nb <400> 17 Glu Glu Asp Asn Arg Asp Ser Ser Met Lys Leu Ser Phe Arg Ala Arg 1 5 10 15 Ala Tyr Gly Phe Arg Gly Pro Gly 20 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Furin recognition sequence Nc <400> 18 Gly Thr Ser Gly Gly Arg Gln Arg Arg Glu Leu Asp Pro Met Asp Ile 1 5 10 15 Arg <210> 19 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Furin recognition sequence Nd <400> 19 Glu Asp Thr Asp Phe Ala Arg Lys Asn Lys Ile Leu Tyr Thr Gln Gln 1 5 10 15 Val His Gln Thr 20 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CTSD identification sequence Nf <400> 20 Lys Pro Ile Leu Phe Phe Arg Leu Lys 1 5 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Mutant N <400> 21 Asn Asn Thr His Asp Leu Val Gly Asp Val Gly Leu Ala Gly Val 1 5 10 15 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Mutant Ne <400> 22 Gln Ser Val Ala Ser Ser Arg Arg His Lys Gly Phe Ala Gly Val 1 5 10 15 <210> 23 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> GFP(beta)1-10-NLS <400> 23 Met Gly Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Ile Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 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aaggagaaga acttttcact ggagttgtcc caattcttgt tgaattagat 60 ggtgatgtta atgggcacaa attttctgtc agaggagagg gtgaaggtga tgctacaatc 120 ggaaaactca cccttaaatt tatttgcact actggaaaac tacctgttcc atggccaaca 180 cttgtcacta ctctgaccta tggtgttcaa tgcttttccc gttatccgga tcacatgaaa 240 aggcatgact ttttcaagag tgccatgccc gaaggttatg tacaggaacg cactatatct 300 ttcaaagatg acgggaaata caagacgcgt gctgtagtca agtttgaagg tgataccctt 360 gttaatcgta tcgagttaaa gggtactgat tttaaagaag atggaaacat tctcggacac 420 aaactcgagt acaactttaa ctcacacaat gtatacatca cggcagacaa acaaaagaat 480 ggaatcaaag ctaacttcac agttcgccac aacgttgaag atggttccgt tcaactagca 540 gaccattatc aacaaaatac tccaattggc gatggccctg tccttttacc agacaaccat 600 tacctgtcga cacaaactgt cctttcgaaa gatcccaacg aaaagcacca ccaccaccac 660 caccccaaga agaagaggaa ggtgtaa 687 <210> 25 <211> 411 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding Histone-H3 <400> 25 atggctcgca ctaagcaaac tgctcggaag tctactggtg gcaaggcgcc acgcaaacag 60 ttggccacta aggcagcccg caaaagcgct ccggccaccg gcggcgtgaa aaagccccac 120 cgctaccggc cgggcaccgt ggctctgcgc gagatccgcc gttatcagaa gtccactgaa 180 ctgcttattc gtaaactacc tttccagcgc ctggtgcgcg agattgcgca ggactttaaa 240 acagacctgc gtttccagag ctccgctgtg atggctctgc aggaggcgtg cgaggcctac 300 ttggtagggc tatttgagga cactaacctg tgcgccatcc acgccaagcg cgtcactatc 360 atgcccaagg acatccagct cgcccgccgc atccgcggag agagggcgtg a 411 <210> 26 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding GFP(beta)11 <400> 26 cgggaccaca tggtgctgca cgagtacgtg aacgccgccg gcatcac 47 <210> 27 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> ZFP9-NLS <400> 27 Val Ser Arg Pro Gly Glu Arg Pro Phe Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg 1 5 10 15 Asn Phe Ser Asp Lys Thr Lys Leu Arg Val His Thr Arg Thr His Thr 20 25 30 Gly Glu Lys Pro Phe Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe Ser Val 35 40 45 Arg His Asn Leu Thr Arg His Leu Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro 50 55 60 Phe Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe Ser Gln Ser Thr Ser 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300 gaagacgggg gcgtgctgac cgctacccag gacaccagcc tccaggacgg ctgcctcatc 360 tacaacgtca agatcagagg ggtgaacttc acatccaacg gccctgtgat gcagaagaaa 420 acactcggct gggaggcctt caccgagacg ctgtaccccg ctgacggcgg cctggaaggc 480 agaaacgaca tggccctgaa gctcgtgggc gggagccatc tgatcgcaaa cgccaagacc 540 acatatagat ccaagaaacc cgctaagaac ctcaagatgc ctggcgtcta ctatgtggac 600 tacagactgg aaagaatcaa ggaggccaac aacgagacct acgtcgagca gcacgaggtg 660 gcagtggcca gatactgcga cctccctagc aaactggggc acaagcttaa ttga 714 <210> 30 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ZFP9 binding site sequence <400> 30 tgtagatgga g 11 <210> 31 <211> 378 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Ppm1b <400> 31 Met Gly Ala Phe Leu Asp Lys Pro Lys Thr Glu Lys His Asn Ala His 1 5 10 15 Gly Ala Gly Asn Gly Leu Arg Tyr Gly Leu Ser Ser Met Gln Gly Trp 20 25 30 Arg Val Glu Met Glu Asp Ala His Thr Ala Val Val Gly Ile Pro His 35 40 45 Gly Leu Asp Asn Trp Ser Phe Phe Ala Val Tyr Asp Gly His Ala Gly 50 55 60 Ser Arg Val Ala Asn 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gcgtaacttc 360 tcagacctga ggaacgggat ggacaggagc ggctcgactg cagtgggcgt gatggtctcc 420 cctacacaca tgtacttcat caactgtggt gactctcgag ctgttctgtg taggaacgga 480 caggtctgct tttctaccca ggatcacaaa ccttgtaatc cagtggagaa ggagcgcatc 540 caaaacgcag gaggcagtgt gatgatccag cgtgtgaacg gctcactagc agtgtctcgg 600 gctctggggg actatgacta caagtgtgtg gatggcaagg gccctacaga gcagcttgtt 660 tctccagagc ctgaggttta tgagattgtg agagcagaag aggatgagtt tgtcgtcttg 720 gcctgtgatg ggatctggga tgtgatgagc aatgaggagc tctgtgagtt tgttaagtct 780 aggcttgagg tgtcggacga cctggagaat gtgtgcaatt gggtagtgga cacttgttta 840 cataagggaa gtcgagataa catgagtgtt gtattagttt gcttttcaaa tgcccccaag 900 gtctcagagg aagccgtgaa gagagattca gagttggata agcacttgga atcacgggtt 960 gaagaaatca tgcagaagtc tggggaggaa ggaatgcctg atcttgccca tgtgatgcgc 1020 attttgtctg cagaaaatat cccgaattta cctcccgggg gaggtctcgc tggcaagcgc 1080 catgttattg aagctgttta tagtagactt aatccacaca aagacaatga tggg 1134 <210> 33 <211> 1368 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cas9-NLS <400> 33 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 100 105 110 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 115 120 125 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp 130 135 140 Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 145 150 155 160 Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 165 170 175 Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala 195 200 205 Lys Ala Ile 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Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala 1040 1045 1050 Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu 1055 1060 1065 Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val 1070 1075 1080 Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr 1085 1090 1095 Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys 1100 1105 1110 Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro 1115 1120 1125 Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val 1130 1135 1140 Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys 1145 1150 1155 Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser 1160 1165 1170 Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys 1175 1180 1185 Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu 1190 1195 1200 Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly 1205 1210 1215 Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val 1220 1225 1230 Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser 1235 1240 1245 Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys 1250 1255 1260 His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys 1265 1270 1275 Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala 1280 1285 1290 Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn 1295 1300 1305 Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala 1310 1315 1320 Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser 1325 1330 1335 Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr 1340 1345 1350 Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp 1355 1360 1365 <210> 34 <211> 4125 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding Cas9-NLS <400> 34 atggataaga aatactcaat aggcttagat atcggcacaa atagcgtcgg atgggcggtg 60 atcactgatg aatataaggt tccgtctaaa aagttcaagg ttctgggaaa tacagaccgc 120 cacagtatca aaaaaaatct tataggggct cttttatttg acagtggaga gacagcggaa 180 gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga aggtatacac gtcggaagaa tcgtatttgt 240 tatctacagg agattttttc aaatgagatg gcgaaagtag atgatagttt ctttcatcga 300 cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac aagaagcatg aacgtcatcc tatttttgga 360 aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag aaatatccaa ctatctatca tctgcgaaaa 420 aaattggtag attctactga taaagcggat ttgcgcttaa tctatttggc cttagcgcat 480 atgattaagt ttcgtggtca ttttttgatt gagggagatt taaatcctga taatagtgat 540 gtggacaaac tatttatcca gttggtacaa acctacaatc aattatttga agaaaaccct 600 attaacgcaa gtggagtaga tgctaaagcg attctttctg cacgattgag taaatcaaga 660 cgattagaaa atctcattgc tcagctcccc ggtgagaaga aaaatggctt atttgggaat 720 ctcattgctt tgtcattggg tttgacccct aattttaaat caaattttga tttggcagaa 780 gatgctaaat tacagctttc aaaagatact tacgatgatg atttagataa tttattggcg 840 caaattggag atcaatatgc tgatttgttt ttggcagcta agaatttatc agatgctatt 900 ttactttcag atatcctaag agtaaatact gaaataacta aggctcccct atcagcttca 960 atgattaaac gctacgatga acatcatcaa gacttgactc ttttaaaagc tttagttcga 1020 caacaacttc cagaaaagta taaagaaatc ttttttgatc aatcaaaaaa cggatatgca 1080 ggttatattg atgggggagc tagccaagaa gaattttata aatttatcaa accaatttta 1140 gaaaaaatgg atggtactga ggaattattg gtgaaactaa atcgtgaaga tttgctgcgc 1200 aagcaacgga cctttgacaa cggctctatt ccccatcaaa ttcacttggg tgagctgcat 1260 gctattttga gaagacaaga agacttttat ccatttttaa aagacaatcg tgagaagatt 1320 gaaaaaatct tgacttttcg aattccttat tatgttggtc cattggcgcg tggcaatagt 1380 cgttttgcat ggatgactcg gaagtctgaa gaaacaatta ccccatggaa ttttgaagaa 1440 gttgtcgata aaggtgcttc agctcaatca tttattgaac gcatgacaaa ctttgataaa 1500 aatcttccaa atgaaaaagt actaccaaaa catagtttgc tttatgagta ttttacggtt 1560 tataacgaat tgacaaaggt caaatatgtt actgaaggaa tgcgaaaacc agcatttctt 1620 tcaggtgaac agaagaaagc cattgttgat ttactcttca aaacaaatcg aaaagtaacc 1680 gttaagcaat taaaagaaga ttatttcaaa aaaatagaat gttttgatag tgttgaaatt 1740 tcaggagttg aagatagatt taatgcttca ttaggtacct accatgattt gctaaaaatt 1800 attaaagata aagatttttt ggataatgaa gaaaatgaag atatcttaga ggatattgtt 1860 ttaacattga ccttatttga agatagggag atgattgagg aaagacttaa aacatatgct 1920 cacctctttg atgataaggt gatgaaacag cttaaacgtc gccgttatac tggttgggga 1980 cgtttgtctc gaaaattgat taatggtatt agggataagc aatctggcaa aacaatatta 2040 gattttttga aatcagatgg ttttgccaat cgcaatttta tgcagctgat ccatgatgat 2100 agtttgacat ttaaagaaga cattcaaaaa gcacaagtgt ctggacaagg cgatagttta 2160 catgaacata ttgcaaattt agctggtagc cctgctatta aaaaaggtat tttacagact 2220 gtaaaagttg ttgatgaatt ggtcaaagta atggggcggc ataagccaga aaatatcgtt 2280 attgaaatgg cacgtgaaaa tcagacaact caaaagggcc agaaaaattc gcgagagcgt 2340 atgaaacgaa tcgaagaagg tatcaaagaa ttaggaagtc agattcttaa agagcatcct 2400 gttgaaaata ctcaattgca aaatgaaaag ctctatctct attatctcca aaatggaaga 2460 gacatgtatg tggaccaaga attagatatt aatcgtttaa gtgattatga tgtcgatcac 2520 attgttccac aaagtttcct taaagacgat tcaatagaca ataaggtctt aacgcgttct 2580 gataaaaatc gtggtaaatc ggataacgtt ccaagtgaag aagtagtcaa aaagatgaaa 2640 aactattgga gacaacttct aaacgccaag ttaatcactc aacgtaagtt tgataattta 2700 acgaaagctg aacgtggagg tttgagtgaa cttgataaag ctggttttat caaacgccaa 2760 ttggttgaaa ctcgccaaat cactaagcat gtggcacaaa ttttggatag tcgcatgaat 2820 actaaatacg atgaaaatga taaacttatt cgagaggtta aagtgattac cttaaaatct 2880 aaattagttt ctgacttccg aaaagatttc caattctata aagtacgtga gattaacaat 2940 taccatcatg cccatgatgc gtatctaaat gccgtcgttg gaactgcttt gattaagaaa 3000 tatccaaaac ttgaatcgga gtttgtctat ggtgattata aagtttatga tgttcgtaaa 3060 atgattgcta agtctgagca agaaataggc aaagcaaccg caaaatattt cttttactct 3120 aatatcatga acttcttcaa aacagaaatt acacttgcaa atggagagat tcgcaaacgc 3180 cctctaatcg aaactaatgg ggaaactgga gaaattgtct gggataaagg gcgagatttt 3240 gccacagtgc gcaaagtatt gtccatgccc caagtcaata ttgtcaagaa aacagaagta 3300 cagacaggcg gattctccaa ggagtcaatt ttaccaaaaa gaaattcgga caagcttatt 3360 gctcgtaaaa aagactggga tccaaaaaaa tatggtggtt ttgatagtcc aacggtagct 3420 tattcagtcc tagtggttgc taaggtggaa aaagggaaat cgaagaagtt aaaatccgtt 3480 aaagagttac tagggatcac aattatggaa agaagttcct ttgaaaaaaa tccgattgac 3540 tttttagaag ctaaaggata taaggaagtt aaaaaagact taatcattaa actacctaaa 3600 tatagtcttt ttgagttaga aaacggtcgt aaacggatgc tggctagtgc cggagaatta 3660 caaaaaggaa atgagctggc tctgccaagc aaatatgtga attttttata tttagctagt 3720 cattatgaaa agttgaaggg tagtccagaa gataacgaac aaaaacaatt gtttgtggag 3780 cagcataagc attatttaga tgagattatt gagcaaatca gtgaattttc taagcgtgtt 3840 attttagcag atgccaattt agataaagtt cttagtgcat ataacaaaca tagagacaaa 3900 ccaatacgtg aacaagcaga aaatattatt catttattta cgttgacgaa tcttggagct 3960 cccgctgctt ttaaatattt tgatacaaca attgatcgta aacgatatac gtctacaaaa 4020 gaagttttag atgccactct tatccatcaa tccatcactg gtctttatga aacacgcatt 4080 gatttgagtc agctaggagg tgaccccaag aagaagagga aggtg 4125 <210> 35 <211> 672 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding dsRed <400> 35 gcctcctccg agaacgtcat caccgagttc atgcgcttca aggtgcgcat ggagggcacc 60 gtgaacggcc acgagttcga gatcgagggc gagggcgagg gccgccccta cgagggccac 120 aacaccgtga agctgaaggt gaccaagggc ggccccctgc ccttcgcctg ggacatcctg 180 tccccccagt tccagtacgg ctccaaggtg tacgtgaagc accccgccga catccccgac 240 tacaagaagc tgtccttccc cgagggcttc aagtgggagc gcgtgatgaa cttcgaggac 300 ggcggcgtgg cgaccgtgac ccaggactcc tccctgcagg acggctgctt catctacaag 360 gtgaagttca tcggcgtgaa cttcccctcc gacggccccg tgatgcagaa gaagaccatg 420 ggctgggagg cctccaccga gcgcctgtac ccccgcgacg gcgtgctgaa gggcgagacc 480 cacaaggccc tgaagctgaa ggacggcggc cactacctgg tggagttcaa gtccatctac 540 atggccaaga agcccgtgca gctgcccggc tactactacg tggacgccaa gctggacatc 600 acctcccaca acgaggacta caccatcgtg gagcagtacg agcgcaccga gggccgccac 660 cacctgttcc tg 672 <210> 36 <211> 708 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding mCherry <400> 36 atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60 gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120 cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180 ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240 cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300 gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360 ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420 atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480 gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540 gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600 aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660 cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaag 708 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> DNA sequence of the recognition site for sgRNA <400> 37 cccaaaagga ggatcgtact tgg 23 <210> 38 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Influenza virus HA2 <400> 38 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly 1 5 10 15 Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly 20 <210> 39 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> KALA <400> 39 Trp Glu Ala Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys His 1 5 10 15 Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Ala Cys Glu Ala 20 25 30 <210> 40 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> GALA <400> 40 Trp Glu Ala Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His 1 5 10 15 Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala 20 25 30 <210> 41 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Melittin <400> 41 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu 1 5 10 15 Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln 20 25 <210> 42 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Penetratin <400> 42 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 43 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> HIV-TAT(47-57) <400> 43 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 44 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> HIV-1 Rev(34-50) <400> 44 Lys Gln Ala Ile Pro Val Ala Lys 1 5 <210> 45 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> VP22 <400> 45 Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr 1 5 10 15 Glu Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro 20 25 30 Val Glu <210> 46 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Transportan <400> 46 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu 1 5 10 15 Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25 <210> 47 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pep-1 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> AMIDATION (-NH-CH2-CH2-SH) <400> 47 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 48 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pep-7 <400> 48 Ser Asp Leu Trp Glu Met Met Met Val Ser Leu Ala Cys Gln Tyr 1 5 10 15 <210> 49 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Leucine zipper NZ <400> 49 Ala Leu Lys Lys Glu Leu Gln Ala Asn Lys Lys Glu Leu Ala Gln Leu 1 5 10 15 Lys Trp Glu Leu Gln Ala Leu Lys Lys Glu Leu Ala Gln 20 25 <210> 50 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Leucine zipper CZ <400> 50 Glu Gln Leu Glu Lys Lys Leu Gln Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ala Gln 1 5 10 15 Leu Glu Trp Lys Asn Gln Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ala Gln 20 25 30 <210> 51 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding leucine zipper NZ <400> 51 gcactgaaaa aagaactgca ggcaaataaa aaagaactgg cacagctgaa atgggaactg 60 caggcactga aaaaagaact ggcacag 87 <210> 52 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding leucine zipper CZ <400> 52 gaacagctgg aaaaaaaact gcaggcactg gaaaaaaaac tggcacagct ggaatggaaa 60 aatcaggcac tggaaaaaaa actggcacag 90 <210> 53 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> TrxA amino acid sequence <400> 53 Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp 1 5 10 15 Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp 20 25 30 Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp 35 40 45 Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn 50 55 60 Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu 65 70 75 80 Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser 85 90 95 Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala 100 105 <210> 54 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> TrxA nucleic acid sequence <400> 54 atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60 gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120 ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180 atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240 ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300 aaagagttcc tcgacgctaa cctggcc 327

Claims (27)

  1. 세포 투과 펩티드, pH-민감성 융합성(fusogenic) 펩티드, 및 프로테아제 인식 서열을 포함하는 융합 단백질로서, 상기 프로테아제는 퓨린(furin) 및/또는 리소좀 시스테인 프로테아제(lysosomal cysteine protease)로부터 선택되는 것인 융합 단백질.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 퓨린 인식 서열은 X1는 임의의 아미노산이고, X2는 K 또는 R인 것인 R-X1-X2-R (서열번호 1)을 포함하고;
    바람직하게는, 상기 퓨린 인식 서열은 R-R-X1-X2-R (서열번호 2)을 포함하며;
    바람직하게는, 상기 퓨린 인식 서열은 서열번호 3으로 표시된 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 상기 퓨린 인식 서열은 서열번호 4로 표시된 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 리소좀 시스테인 프로테아제는 카뎁신 B, 카뎁신 C, 카뎁신 X, 카뎁신 S, 카뎁신 L, 카뎁신 D 또는 카뎁신 H로 구성된 군으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 상기 리소좀 시스테인 프로테아제는 카뎁신 L이며;
    바람직하게는, 상기 카뎁신 L 인식 서열은 서열번호 6으로 표시된 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제 인식 서열은 퓨린 인식 서열 및 카뎁신 L 인식 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 상기 프로테아제 인식 서열은 서열번호 3 및 서열번호 6을 포함하며;
    바람직하게는, 상기 프로테아제 인식 서열은 서열번호 4 및 서열번호 6을 포함하는 것인 융합 단백질.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH-민감성 융합성 펩티드는 인플루엔자 바이러스 HA2 또는 그의 돌연변이체 (예를 들면, INF7, KALA 또는 GALA), 멜리틴(melittin), 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 상기 pH-민감성 융합성 펩티드는 INF7을 포함하며;
    바람직하게는, 상기 pH-민감성 융합성 펩티드는 서열번호 8로 표시된 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 투과 펩티드는 페네트라틴(penetratin), Tat-유래 펩티드 (예를 들면, Tat(48-60) 또는 Tat(47- 57)), Rev(34-50), VP22, 트랜스포르탄(transportan), Pep-1, Pep-7, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 상기 세포 투과 펩티드는 Tat(48-60)와 같은 Tat-유래 펩티드를 포함하고;
    바람직하게는, 상기 세포 투과 펩티드는 서열번호 10으로 표시된 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 N-말단으로부터 C-말단까지 상기 pH-민감성 융합성 펩티드, 세포 투과 펩티드, 및 프로테아제 인식 서열을 포함하거나; 또는 상기 융합 단백질은 N-말단으로부터 C-말단까지 상기 세포 투과 펩티드, pH-민감성 융합성 펩티드 및 프로테아제 인식 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 상기 프로테아제 인식 서열은 N-말단으로부터 C-말단까지 퓨린 인식 서열 및 카뎁신 L 인식 서열을 포함하거나, 또는 N-말단으로부터 C-말단까지 카뎁신 L 인식 서열 및 퓨린 인식 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 퓨린 단백질은 서열번호 12 내지 14 중 어느 하나로 표시된 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 특이적 결합 서열을 더 포함하고, 상기 특이적 결합 서열은 또 다른 분자(예를 들면, 폴리펩티드, 단백질, 또는 핵산)가 그에 특이적으로 결합할 수 있게 하고;
    바람직하게는, 상기 특이적 결합 서열은 그의 상보적 펩티드와 이종이량체(heterodimer)를 형성할 수 있는 루이신 지퍼(leucine zipper) 펩티드를 포함하며;
    바람직하게는, 상기 특이적 결합 서열은 루이신 지퍼 NZ 또는 CZ를 포함하고;
    바람직하게는, 상기 특이적 결합 서열은 서열번호 49 또는 50으로 표시되는 서열을 포함하며;
    바람직하게는, 상기 특이적 결합 서열은 상기 프로테아제 인식 서열의 C-말단에 위치하는 것인 융합 단백질.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질 및 카고 분자를 포함하는, 복합체로서,
    바람직하게는, 상기 카고 분자는 핵산, 펩티드 또는 단백질, 탄수화물, 지질, 화합물 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 상기 핵산은 DNA 분자, RNA 분자, siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 앱타머, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되며;
    바람직하게는, 상기 카고 분자는 검출가능한 표지를 포함하고;
    바람직하게는, 상기 카고 분자는 에피토프 태그(epitope tag), 리포터 유전자 서열 및/또는 핵 국재화 신호(NLS) 서열을 포함하는 것인 복합체.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 융합 단백질은 상기 카고 분자와 융합되고, 상기 카고 분자는 펩티드 또는 단백질이며;
    바람직하게는, 상기 카고 분자는 상기 융합 단백질의 C-말단에 융합되고;
    바람직하게는, 상기 복합체는 단일-사슬 폴리펩티드를 포함하고, 상기 단일-사슬 폴리펩티드는 N-말단으로부터 C-말단까지 pH-민감성 융합성 펩티드, 세포 투과 펩티드, 프로테아제 인식 서열 및 카고 분자를 포함하고; 바람직하게는, 상기 프로테아제 인식 서열은 N-말단으로부터 C-말단까지 퓨린 인식 서열 및 카뎁신 L 인식 서열을 포함하거나, 또는 N-말단으로부터 C-말단까지 카뎁신 L 인식 서열 및 퓨린 인식 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 상기 복합체는 단일-사슬 폴리펩티드를 포함하고, 상기 단일-사슬 폴리펩티드는 N-말단으로부터 C-말단까지 세포 투과 펩티드, pH-민감성 융합성 펩티드, 프로테아제 인식 서열 및 카고 분자를 포함하고; 바람직하게는, 상기 프로테아제 인식 서열은 N-말단으로부터 C-말단까지 퓨린 인식 서열 및 카뎁신 L 인식 서열을 포함하거나 또는 N-말단으로부터 C-말단까지 카뎁신 L 인식 서열 및 퓨린 인식 서열을 포함하는 것인 복합체.
  12. 청구항 10에 있어서, 상기 융합 단백질은 상기 카고 분자에 화학적으로 커플링되고;
    바람직하게는, 상기 화학적 커플링은 디술피드 결합, 포스포디에스테르 결합, 포스포로티오에이트 결합, 아미드 결합, 아민 결합, 티오에테르 결합, 에테르 결합, 에스테르 결합 또는 탄소-탄소 결합을 통해 달성되고;
    바람직하게는, 상기 카고 분자는 상기 융합 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 커플링되는 것인 복합체.
  13. 청구항 10에 있어서, 상기 융합 단백질은 상기 카고 분자에 비-공유결합에 의해 연결되는 것인 복합체.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 융합 단백질은 청구항 9에 따른 융합 단백질이고, 상기 카고 분자는 상기 융합 단백질 중 특이적 결합 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 도메인을 포함하고;
    바람직하게는, 상기 융합 단백질 중 특이적 결합 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 도메인은 아미노산 서열이며;
    바람직하게는, 상기 카고 분자는 펩티드 또는 단백질이고;
    바람직하게는, 상기 융합 단백질 중 특이적 결합 서열은 루이신 지퍼 펩티드를 포함하고, 상기 카고 분자는 상기 루이신 지퍼의 상보적 펩티드를 포함하여, 상기 루이신 지퍼 펩티드와 상기 상보적 펩티드는 이종이량체를 형성할 수 있으며;
    바람직하게는, 상기 융합 단백질 중 특이적 결합 서열은 루이신 지퍼 NZ (예를 들면, 서열번호 49로 표시된 서열)를 포함하며, 상기 카고 분자는 루이신 지퍼 CZ (예를 들면, 서열번호 50으로 표시된 서열)를 포함하고;
    바람직하게는, 상기 융합 단백질 중 특이적 결합 서열은 루이신 지퍼 CZ (예를 들면, 서열번호 50으로 표시된 서열)를 포함하고, 상기 카고 분자는 루이신 지퍼 NZ (예를 들면, 서열번호 49로 표시된 서열)를 포함하는 것인 복합체.
  15. 청구항 13에 있어서, 상기 융합 단백질 및 상기 카고 분자는 정전기적 상호작용에 의해 접합되는 것인 복합체.
  16. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질 및 카고 분자를 포함하는, 조성물로서,
    바람직하게는, 상기 카고 분자는 핵산, 펩티드 또는 단백질, 탄수화물, 지질, 화합물 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 상기 카고 분자는 핵산, 펩티드 또는 단백질로 구성된 군으로부터 선택되며;
    바람직하게는, 상기 핵산은 DNA 분자, RNA 분자, siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 앱타머, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  17. 청구항 16에 있어서, 청구항 9에 따른 융합 단백질을 포함하고, 상기 카고 분자는 상기 융합 단백질 중 특이적 결합 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 도메인을 포함하며;
    바람직하게는, 상기 융합 단백질 중 특이적 결합 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 도메인은 아미노산 서열이고;
    바람직하게는, 상기 카고 분자는 펩티드 또는 단백질이며;
    바람직하게는, 상기 융합 단백질 중 특이적 결합 서열은 루이신 지퍼 펩티드를 포함하고, 상기 카고 분자는 상기 루이신 지퍼의 상보적 펩티드를 포함하여, 상기 루이신 지퍼 펩티드와 상기 상보적 펩티드는 이종이량체를 형성할 수 있으며;
    바람직하게는, 상기 융합 단백질 중 특이적 결합 서열은 루이신 지퍼 NZ (예를 들면, 서열번호 49로 표시된 서열)를 포함하고, 상기 카고 분자는 루이신 지퍼 CZ (예를 들면, 서열번호 50으로 표시된 서열)를 포함하며;
    바람직하게는, 상기 융합 단백질 중 특이적 결합 서열은 루이신 지퍼 CZ (예를 들면, 서열번호 50으로 표시된 서열)를 포함하고, 상기 카고 분자는 루이신 지퍼 NZ (예를 들면, 서열번호 49로 표시된 서열)를 포함하는 것인 조성물.
  18. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 또는 청구항 11에 따른 복합체, 또는 청구항 16 또는 17에 따른 조성물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단리된 핵산 분자.
  19. 청구항 18에 따른 단리된 핵산 분자를 포함하는, 벡터.
  20. 청구항 18에 따른 단리된 핵산 분자, 또는 청구항 19에 따른 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  21. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 청구항 11에 따른 복합체를 제조하는 방법으로서, 청구항 20에 따른 숙주 세포를 적합한 조건에서 배양하는 단계, 및 상기 세포의 배양물로부터 상기 융합 단백질 또는 복합체를 회수하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  22. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 또는 청구항 10 내지 15 중 어느 한 항에 따른 복합체, 청구항 16 또는 17에 따른 조성물, 청구항 18에 따른 단리된 핵산, 청구항 19에 따른 벡터, 또는 청구항 20에 따른 숙주 세포, 및 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물로서,
    바람직하게는, 상기 약학적 조성물은 청구항 10 내지 15 중 어느 한 항에 따른 복합체를 포함하고, 카고 분자는 약학적 활성제 또는 검출가능한 표지인 것인 약학적 조성물.
  23. 약제의 제조에서, 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 또는 상기 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자, 벡터, 또는 숙주 세포의 용도.
  24. 질병의 치료용 약제의 제조에서, 청구항 10 내지 15 중 어느 한 항에 따른 복합체 또는 청구항 16 또는 17에 따른 조성물, 또는 상기 복합체 또는 조성물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자, 벡터, 또는 숙주 세포의 용도로서, 상기 복합체 또는 조성물에 포함된 카고 분자는 상기 질병을 치료할 수 있고;
    바람직하게는, 상기 질병은 예정된 세포 괴사(programmed cell necrosis)와 관련된 질병이고, 상기 카고 분자는 프로테인 포스파타아제 1B를 포함하며;
    바람직하게는, 상기 예정된 세포 괴사와 관련된 질병은 간 손상(예를 들면, 약물-유도 간 손상), 염증성 질환, 허혈-재관류 손상 및/또는 신경퇴행성 질환을 포함하는 것인 용도.
  25. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 청구항 10 내지 15 중 어느 한 항에 따른 복합체, 청구항 16 또는 17에 따른 조성물, 청구항 18에 따른 단리된 핵산 분자, 청구항 19에 따른 벡터, 또는 청구항 20에 따른 숙주 세포를 포함하는, 키트로서,
    바람직하게는, 상기 키트는 형질감염 및/또는 세포내 전달을 위한 설명서를 포함하는 것인 키트.
  26. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 청구항 10 내지 15 중 어느 한 항에 따른 복합체, 청구항 16 또는 17에 따른 조성물, 청구항 18에 따른 단리된 핵산 분자, 청구항 19에 따른 벡터, 또는 청구항 20에 따른 숙주 세포의 전달제(delivery agent)로서의 용도.
  27. 세포를 청구항 10 내지 15 중 어느 한 항에 따른 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 카고 분자를 세포에 전달하는 방법으로서, 상기 복합체는 상기 카고 분자를 포함하고;
    바람직하게는, 상기 세포를 상기 복합체와 접촉시키는 단계는 인 비트로에서 수행되며;
    바람직하게는, 상기 카고 분자는 핵산, 펩티드 또는 단백질, 탄수화물, 지질, 화합물, 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되고; 바람직하게는, 상기 핵산은 DNA 분자, RNA 분자, siRNA, 및 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 앱타머, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
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