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KR20220012326A - 18f-방사선 표지된 생체 분자 - Google Patents

18f-방사선 표지된 생체 분자 Download PDF

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Publication number
KR20220012326A
KR20220012326A KR1020217042137A KR20217042137A KR20220012326A KR 20220012326 A KR20220012326 A KR 20220012326A KR 1020217042137 A KR1020217042137 A KR 1020217042137A KR 20217042137 A KR20217042137 A KR 20217042137A KR 20220012326 A KR20220012326 A KR 20220012326A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
biomolecule
labeled
peg
nanobody
tco
Prior art date
Application number
KR1020217042137A
Other languages
English (en)
Inventor
마이클 로드 자루츠키
가네산 베이디아네이던
정위엔 저우
Original Assignee
듀크 유니버시티
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 듀크 유니버시티 filed Critical 듀크 유니버시티
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Abstract

본 출원은 방사성 불소 원자로 생체 분자를 방사성 표지하기 위한 18F-방사성 표지된 잔류화제 및 생체 분자 및 방법에 주목한다. 생체 분자는 특정 유형의 세포에 대해 친화성을 가지며, 암세포와 같은 특정 세포에 특이적으로 결합할 수 있다. 관련 생체 분자는 항체, 모노클로날 항체, 항체 단편, 펩티드, 기타 단백질, 나노입자 및 앱타머를 포함한다. 본 출원은 이러한 표지된 생체 분자를 포함하는 조성물, 뿐만 아니라 이미징 응용 분야에서 표지된 생체 분자 및/또는 조성물을 사용하는 방법을 추가로 제공한다.

Description

18F-방사선 표지된 생체 분자
본 발명은 생체 분자를 방사성 표지하는데 유용한 화합물을 제조하는 방법 및 이러한 방사성 표지된 생체 분자를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 개시 내용은 방사성 표지된 생체 분자 및 상응하는 방사성 표지된 생체 분자의 전구체를 제공한다. 화합물은 세포 내로 내재화되는 생체 분자로부터 방사능을 효과적으로 보유할 수 있어, 이러한 화합물을 질병, 특히 암의 진단에 유용하게 만들 수 있다.
다수의 모노클로날 항체(mAb), 모노클로날 항체 단편 및 펩티드가 다른 방사성핵종으로 표지된 후, 암의 검출 및 치료에 사용되었다. HER2, 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 및 종양 특이적 돌연변이 EGFRvIII와 같은 임상적으로 가장 관련이 있는 분자 표적의 대부분은 종양 세포로 빠르게 내재화된다. 이는 방사성 표지된 생체 분자가 종양 관련 수용체 또는 항원에 결합할 때 세포로 수송되고, 엔도솜/리소좀에서 흡수되어, 빠르게 분해되기 때문에, 표지 관점에서 중요한 문제이다. 어려운 점은, 이러한 방사성 분해 산물이 종양 세포에서 빠르게 빠져나갈 수 있다는 것이다. 결과적으로, 종양의 영상화 또는 치료를 허용하기에 충분한 방사능이 더 이상 종양 세포 내에 존재하지 않는다.
예로서, 사용되는 표준 표지 방법은 직접 친전자성 치환(direct electrophilic substitution)인 방사성 요오드로 EGFRvIII와 반응성인 mAb를 표지하는 것을 고려한다. 이러한 경우에, 광범위한 내재화의 결과로서, 종양 내에 유지되는 방사능은 수용체 결합 및 후속 단백질 분해 후에 낮다. 이는, 주요 이화 산물(catabolite)인 요오드티로신(iodotyrosine)이 빠르게 씻겨 나가기 때문이다. 이 문제를 피하기 위해, 표지된 mAb가 내재화된 후, 종양 세포 내부에 방사능을 가두려고 시도하는 "잔류화제(residualizing agent)"가 개발되었다. 이러한 방사성 요오드에 대한 잔류화제는 N-숙신이미딜 4-구아니디노메틸-3-요오드벤조에이트(SGMIB); Nε-(3-요오드벤조일)-Lys5-Nα-말레이미도-Gly1-Geeek을 포함하고, 여기서 e 및 k는 각각 D-글루탐산 및 D-리신의 잔기를 나타내며, 그렇지 않으면 N2-(2-(2,5-디옥소))-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)아세틸)-D-글루타밀-D-글루타밀-D-글루타밀-N'-(3-요오드벤조일)-D-리신 또는 IB-MalGeeek; 및 2,2',2"-(10-(2-((6-(3-(((N-숙신이미딜)옥시)카르보닐)-5-요오드벤즈아미도)헥실)아미노)-2-옥소에틸)-1, 4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리일)트리아세트산(SIB-DOTA)로 알려진다. 직접 표지된 생체 분자와 비교하여, 동일한 생체 분자가 이러한 잔류 보결분자단(residualizing prosthetic group) 중 하나로 표지되었을 때, 방사능의 종양 보유에서 상당한 향상이 나타났다.
최첨단 영상 기술인 PET(Positron emission tomography)는 매우 민감하고, 우수한 정량 능력을 가지고 있다. 전 세계적으로 가장 널리 사용되는 양전자 방출 방사성 핵종(positron-emitting radionuclide)은 반감기가 110분인 불소-18이다. 이 영상 기술의 장점을 분자 내재화의 표적화 특성과 결합하려면, 이러한 생체 분자를 불소-18로 표지할 수 있는 잔류화제를 개발해야 한다. 또한, 이러한 표지된 생체 분자의 제조를 위한 추가의 효과적인 방법이 바람직하다.
본 발명은 방사성 할로겐 원자, 특히 18F로 생체 분자(거대분자라고도 함)를 방사성 표지하기 위한 방법, 화합물 및 조성물에 관한 것이다. 유리하게는, 이러한 방법, 화합물 및 조성물은 생체 내에서(in vivo) 탈할로겐화로 인한 방사성 할로겐 18F의 손실을 최소화하고, 생체 분자의 생물학적 활성을 보존하고, 암 세포와 같은 병든 세포에서의 보유를 최대화하고, 생체 내 투여 후 정상 조직에서의 방사성 보유를 최소화한다. 생체 분자는 특정 유형의 세포에 대해 친화력이 있다. 즉, 생체 분자는 암세포와 같은 특정 세포에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 조성물은 방사성 표지된 생체 분자를 포함한다. 이러한 생체 분자에는 항체, 모노클로날 항체, 항체 단편, 펩티드, 기타 단백질, 나노입자 및 앱타머를 포함한다. 본 발명의 목적을 위한 생체 분자의 이러한 예는 디아바디, scFv 단편, DARPin, 피브로넥틴 III형 기반 스캐폴드, 어피바디(affibody), VHH 분자(단일 도메인 항체 단편(sdAb) 및 나노바디로도 알려짐), 핵산 또는 단백질 압타머(aptamer), 및 나노입자를 포함한다. 추가로, 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체(humanized antibody), 및 F(ab')2 단편을 포함하는 >50 kDa의 단백질과 같은 더 큰 분자가 본 명세서에 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 또한, 50 nm 미만의 크기를 갖는 나노입자가 본 명세서에 개시된 방법에 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 원리는 일부 양태에서 특히 VHH 분자 및 다른 유형의 소단백질 작제물(construct)과 관련되며, 이는 본 명세서에서 보다 철저하게 기재될 것이다.
본 발명의 방법은 방사성 표지에 효과적인 보결 화합물(prosthetic compound)을 이용한다. 이와 같이, 본 개시 내용은 이러한 방사성 표지 화합물 뿐만 아니라 이러한 보결 화합물을 제공하기 위한 전구체를 제공한다. 본 개시 내용은 이러한 화합물/라디칼 및 하나 이상의 거대분자를 포함하는 방사성 표지된 거대분자(예를 들면, 생체 분자)를 추가로 제공한다. 일부 이러한 양태에서, 이들 방사성 표지된 거대분자는 표적화된 방사선치료제이다. 본 발명의 보결 화합물 및 방사성 표지된 화합물은, 예를 들면 질병 진단에 유용하다.
하나의 측면에서, 본 개시 내용은, 18F-표지된 생체 분자의 제조방법으로서, 상기 방법은, 친디엔체(dienophile)를 포함하는 기능화된 생체 분자를 제공하는 단계; 디엔을 포함하는 18F-함유 시약을 제공하는 단계; 및 역전자-요구 딜스-알더 고리화첨가 반응(inverse electron-demand Diels-Alder cycloaddition reaction)을 통해 기능화된 생체 분자 및 18F-함유 시약을 반응시켜 18F-표지된 생체 분자를 제공하는 단계;를 포함한다. 시약 및 생성된 18F-표지된 생체 분자는 다양할 수 있다. 상기 언급된 방법의 하나의 특정한 비제한적인 양태에서, 18F-함유 시약은 6-[18F]플루오로니코티닐-PEG4-메틸테트라진을 포함한다. 하나의 특정한 비제한적 양태에서, 기능화된 생체 분자는 TCO-GK-PEG4-NHS로 유도체화된 생체 분자를 포함한다. 상기 방법은 하나의 특정 양태에서, 예를 들면 [18F]FN-PEG4-Tz-TCO-GK-PEG4-5F7을 포함하지만 이에 제한되지 않는 하기 화학식: [18F]FN-PEG4-Tz-TCO-GK-PEG4-생체 분자의 18F-표지된 생체 분자를 제공하는데 사용될 수 있다.
본 개시 내용의 다른 측면에서, 18F-표지된 생체 분자의 제조방법이 제공되고, 상기 제조방법은, 디엔을 포함하는 기능화된 생체 분자를 제공하는 단계; 친디엔체를 포함하는 18F-함유 시약을 제공하는 단계; 기능화된 생체 분자와 18F-함유 시약을 역전자요구 딜스-알더 고리화첨가 반응을 통해 반응시켜 18F-표지된 생체 분자를 제공하는 단계;를 포함한다. 다시, 이러한 방법과 관련된 시약 및 생성된 18F-표지된 생체 분자는 다양할 수 있다. 바로 위에 언급된 방법의 하나의 특정한 비제한적인 양태에서, 18F-함유 시약은 6-[18F]플루오로니코티닐-PEG4-GK-TCO를 포함한다. 하나의 특정한 비제한적 양태에서, 기능화된 생체 분자는 -Mal-PEG4-Tz로 유도체화된 생체 분자를 포함한다. 상술한 방법은 하나의 특정 양태에서, 예를 들면 [18F]FN-PEG4-GK-TCO-Tz-PEG4-Mal 5F7GGC를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 하기 화학식: [18F]FN-PEG4-GK-TCO-Tz-PEG4-Mal-생체 분자의 18F-표지된 생체 분자를 제공하는데 사용될 수 있다.
상술한 방법의 일부 양태에서, 18F-함유 시약은 [18F]플루오로니코티닐(FN) 기를 포함한다. 친디엔체 기능은 다를 수 있다. 일부 양태에서, 친디엔체는 옥텐 모이어티를 포함한다. 예를 들면, 하나의 적합한 친디엔체는 트랜스-사이클로옥텐(TCO) 모이어티를 포함한다. 마찬가지로, 디엔 기능은 다양할 수 있다. 일부 양태에서, 디엔은 테트라진(Tz) 모이어티를 포함한다. IEDDAR에 적합한 디엔 및 친디엔체의 다양한 다른 예는 당업자에 의해 인식될 것이다. 18F-함유 시약 및/또는 기능화된 생체 분자는 일부 양태에서 링커를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 링커는, 예를 들면 PEG 및/또는 신장 브러시 경계 효소-절단 가능한 링커(renal brush border enzyme-cleavable linker)를 포함할 수 있다.
본 개시 내용은 [18F]FN-PEG4-Tz-TCO-GK-PEG4- 및 [18F]FN-PEG4-GK-TCO-Tz-PEG4-Mal-로부터 선택된 18F-표지된 잔류화제에 접합된 생체 분자를 포함하는 특정 18F-표지된 생체 분자를 추가로 제공하고, 이러한 표지된 생체 분자의 특정 비제한적인 예는 하기 화학식: [18F]FN-PEG4-Tz-TCO-GK-PEG4-5F7 및 [18F]FN-PEG4-GK-TCO-Tz-PEG4-Mal-5F7GGC이다.
본 개시 내용의 다른 측면에서, 18F-표지된 잔류화제의 제조방법이 제공되고, 상기 제조방법은, 구아니딘 모이어티 및 알킨 모이어티를 포함하는 제1 화합물을 제공하는 단계; 플루오로알킬 아지드 및 PEG 링커를 포함하는 제2 화합물을 제공하는 단계; 클릭 화학물질을 통해 제1 및 제2 화합물을 반응시켜 18F-표지된 잔류화제를 제공하는 단계;를 포함한다. 일부 양태에서 클릭 화학물질은, 예를 들면 구리 촉매에 의해 촉매화된다. 이 방법의 시약은 다를 수 있다. 하나의 특정한, 비제한적인 양태에서, 제1 화합물은 N-숙신이미딜 3-((2,3-비스(tert-부톡시카르보닐)3우아니딘)메틸)-5-에티닐벤조에이트이고, 제2 화합물은 1-아지도-2-( 2-(2-(2-[18F]플루오로에톡시)에톡시)에톡시)에탄이다. 본 개시 내용은 18F-표지된 생체 분자의 제조방법을 추가로 제공하며, 이 방법은 바로 위에 언급된 방법을 수행하는 단계; 및 표지 모이어티를 생체 분자와 반응시키는 단계를 포함한다. 본 개시 내용은 N-숙신이미딜 3-(1-(2-(2-(2-(2-[18F]플루오로에톡시)에톡시)에톡시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)-5-(구아니디노메틸)벤조에이트 및 18F-표지된 잔류화제에 접합된 생체 분자를 포함하는 상응하는 18F-표지된 생체 분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 특정 18F-표지 잔류화제를 추가로 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 18F-표지된 잔류화제의 제조방법을 제공하고, 상기 방법은 구아니딘 모이어티를 포함하는 보로네이트 전구체를 제공하는 단계; 및 보로네이트 전구체를 18F-플루오로탈붕소화와 18F-함유 시약과 반응시키는 단계를 포함한다. 시약은 다를 수 있다. 일부 양태에서, 보로네이트 전구체는 TFP 에스테르를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 18F-함유 시약은 [18F]테트라에틸암모늄 플루오라이드이다. 반응 단계는 일부 양태에서 촉매, 예를 들면 구리 촉매를 포함하지만 이에 제한되지 않는 촉매의 존재 하에 수행될 수 있다. 또한, 18F-표지된 생체 분자의 제조방법이 제공되며, 상기 방법은 18F-표지된 잔류화제를 제공하기 위해 바로 앞의 방법을 수행하는 단계; 및 18F-표지된 잔류화제를 생체 분자와 반응시키는 단계;를 포함한다. 본 개시 내용은 테트라플루오로페닐 3-[18F]플루오로-5-구아니디노메틸벤조에이트를 포함하는 18F-표지된 잔류화제, 뿐만 아니라 이러한 제제에 접합된 생체 분자를 포함하는 18F-표지된 생체 분자를 추가로 제공한다.
또한, 본 개시 내용은 본 명세서에 기재된 18F-표지된 생체 분자 중 어느 하나를 사용하는 것을 포함하는, 암 세포를 영상화하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 제공된 방법에 따라 표지되고 본 명세서에 제공된 18F-표지된 생체 분자 내에 포함되는 적합한 생체 분자는 광범위하게 변할 수 있다. 다양한 양태에서, 상술한 방법을 통해 표지된 생체 분자는 나노바디이다. 예시적인 나노바디는 HER2-특이적 나노바디를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특이적 HER-2-특이적 나노바디는 5F7, 5F7GCC, 2Rs15d, 및 이들의 변이체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 양태에 대한 이해를 제공하기 위해, 반드시 일정한 비율로 도시되지 않은 첨부 도면을 참조하며, 도면에서 참조 번호는 본 발명의 예시적인 양태의 구성요소를 나타낸다. 도면은 예시일 뿐이며, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
도 1a는 [18F]AlF-NOTA-PEG4-Tz-TCO-GK-2Rs15d의 구조이고;
도 1B는 [18F]FN-PEG4-Tz-TCO-GK-PEG4-5F7의 합성을 위한 예시적인 반응 도식이고;
도 2a는 [18F]FN-PEG4-GK-TCO-Tz-PEG4-Mal-5F7GGC의 구조이고;
도 2b는 BT474M1 이종이식편을 보유하고 있는 흉선이 없는 마우스에서 짝지어진 표지 생체분포로부터 얻은 종양, 신장, 혈액 및 근육에서의 iso-[125I]SGMIB-5F7(검정) 및 [18F]FN-PEG4-GK-TCO-Tz-PEG4-Mal-5F7GGC(흑색/백색 줄무늬)의 흡수 플롯이고;
도 2c는 BT474M1 이종이식편(xenograft) 보유 마우스에서 [18F]FN-PEG4-GK-TCO-Tz-PEG4-Mal-5F7GGC를 투여한 후 얻은 일련의 최대 강도 투영(MIP) 이미지이고;
도 3은 [18F]RL-III-2Rs15d의 합성을 위한 예시적인 반응식이고;
도 4a는 BT474M1BrM3-Fluc 두개내 이종이식편을 포함하는 마우스에서 [18F]RL-III-5F7을 투여한 지 2시간 후에 얻은 MicroPET/CT 이미지이고;
도 4b는 H&E로 염색된 도 2a에서 마우스의 뇌 단면이고;
도 4c는 마우스의 인접 부위에 대한 방사선 사진이고(여기서, 4b 및 4c에서의 사진의 크기는 동일한 축적이 아님);
도 5a는 SGMIB의 구조이고;
도 5B는 [18F]TFPFGMB의 합성을 위한 예시적인 반응식이다.
본 개시 내용은 일반적으로 생체 분자의 18F 표지화를 위한 특정 방법, 뿐만 아니라 이에 의해 제공되는 특정 전구체 및 생성물을 제공한다. 개시된 방법은 특정 18F-표지된 잔류화제 및 특정 예시적인 표지된 생체 분자의 제조에 주로 초점을 맞추고 있으며; 그러나, 이러한 방법은 특정 상황, 예를 들면 이들 전체가 본 명세서에 참조로 포함되는 Zalutsky 등의 미국 특허 제9,839,704호 또는 Zalutsky 등의 WO2018/178936에 개시된 다른 표지 생체 분자의 제조에서 더 넓은 적용 가능성을 발견할 수 있다. 본 개시 내용은 특정 18F-표지된 잔류화제 및 특정 18F-표지된 생체 분자, 뿐만 아니라 이를 포함하는 조성물, 및 영상화 목적을 위해 이러한 표지된 생체 분자 및/또는 조성물을 사용하는 방법을 추가로 제공한다.
특정 약어가 본 출원 전반에 걸쳐 사용되며, 당업계에서 일반적으로 인식되는 바와 같이 사용되며, 편의상 이들의 정의는 다음과 같다.
2Rs15d: 예를 들면 Vaneycken I, et al(2011) 유방암의 분자 영상화를 위한 항-HER2 나노바디의 전임상 스크리닝에 기재된 바와 같은 나노바디; FASEB J 25:2433-2446, 이의 전체 내용이 본 명세서에 참고로 포함됨;
5F7: 예를 들면, M. Pruszynski et al., Nuclear Medicine and Biology 40 (2013) 52-59에 기재된 바와 같은 나노바디;
5F7-GCC: 예를 들면, M. Pruszynski et al. / Nuclear Medicine and Biology 40 (2013) 52-59에 기재된 바와 같은, 이의 C-말단에서 시스테인을 함유하는 5F7 나노바디 변이체.
Boc: tert-부틸옥시카르보닐 보호기(tert-butyloxycarbonyl protecting group)
DMA: 디메틸아세트아미드(dimethylacetamide)
FN: 플루오로니코티닐(fluoronicotinyl)
GK: 글리신라이신(GlycineLysine)
HER-2: 인간 표피 성장 인자 수용체 2 단백질(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 protein)
HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피
IEDDAR: 역전자 요구 디엘스-알더 고리화 첨가 반응(Inverse Electron Demand Diels Alder Cycloaddition Reaction)
iso-[131I]SGMIB: N-숙신이미딜 3-구아니디노메틸-5-[131I]요오드벤조에이트(N-succinimidyl 3-guanidinomethyl-5-[131I]iodobenzoate)
Mal: 말레이미도(maleimido)
PEG: 폴리(에틸렌 글리콜)(poly(ethylene glycol))
RBBE: 신장 브러시 경계 효소(renal brush border enzyme)
RCY: 방사화학적 수율(radiochemical yield)
sdAbs: 단일 도메인 항체 단편(Single domain antibody fragments)
[*I]SGMIB: N-숙신이미딜 4-구아니디노메틸-3-[*I]요오드벤조에이트(N-succinimidyl 4-guanidinomethyl-3-[*I]iodobenzoate)
TCO: 트랜스-사이클로옥텐 함유 모이어티(Trans-cyclooctene-containing moiety)
TFA: 트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic acid)
TFP: 테트라플루오로페닐(tetrafluorophenyl)
Tz: 테트라진-함유 모이어티(Tetrazine-containing moiety)(테트라진, 3-메틸-6-페닐-1,2,4,5-테트라진 및 추가 유도체를 포함하나 이에 제한되지 않음).
VHH: 중쇄 전용 항체의 가변 도메인(일명 sdAb, 나노바디).
본 개시 내용의 한 양태에 따르면, sdAbs 및 다른 유형의 작은 단백질 작제물을 표지하는 맥락에서 특정 적용을 찾을 수 있는 18F 표지 방법이 제공된다. 이 방법은 역전자 요구 디엘스-알더 고리화 첨가 반응(IEDDAR)을 포함한다. 이러한 방법은, 하기 단계: a) 18F 함유 시약을 제공하는 단계; 및 b) IEDDAR를 사용하여 18F-함유 시약을 기능화된 생체 분자(예를 들면, sdAbs 또는 기타 작은 단백질 구축물)에 커플링하여, 18F-표지된 생체 분자를 제공하는 단계;를 포함한다.
개시된 방법은 비-부위 특이적 표지 또는 부위 특이적 표지를 제공할 수 있다. 유리하게는, 이러한 방법은 높은 생산 수율 및 친화성 및/또는 면역반응성의 보유를 허용할 수 있다. 일반적으로, 18F-함유 시약은 18F 모이어티 이외에도 IEDDAR에 적합한 모이어티(즉, 디엔 또는 친디엔체 작용기)를 포함한다. 마찬가지로, 기능화된 생체 분자는, 생체 분자 이외에도 IEDDAR에 적합한 상보적 모이어티(complementary moiety)를 포함하여, 18F 모이어티가 디엔을 포함하는 경우, 기능화된 생체 분자는 친디엔체를 포함하고, 18F 모이어티가 친디엔체를 포함하는 경우 기능화된 생체 분자는 디엔을 포함한다. 일부 양태에서, 이러한 시약의 선택 및/또는 제조는 생체 분자의 부위-특이적 또는 비-부위-특이적 표지를 제공할 수 있다.
하나의 양태에서, 18F-함유 시약(이는 제공된 후 기능화된 생체 분자에 커플링됨)은 표지(18F) 이외에도 상기 단계 b)의 IEDDAR에 적합한 디엔을 포함한다. 하나의 예시적인 디엔은 테트라진-함유 모이어티이며, 이는 18F-함유 시약 내에 유리하게 포함될 수 있다. 유리하게는, 이러한 일부 양태에서 18F-함유 시약은 플루오로니코티닐 모이어티를 포함하고, 여기서 플루오로니코티닐 모이어티는 18F를 포함한다. 이러한 다른 작용기가 목적하는 IEDDAR를 부정적으로 방해하지 않는 한, 다양한 다른 작용기가 18F 함유 시약 내에 존재할 수 있다. 예를 들면, 18F-함유 시약은 다양한 길이의 링커(예를 들면, PEG)를 추가로 포함할 수 있다. 개시된 방법에서 효과적으로 사용될 수 있는 하나의 특정 예시적인 18F-함유 (디엔) 시약은 6-[18F]플루오로니코티닐-PEG4-메틸에트라진이다.
18F-함유 시약이 단계 b)의 IEDDAR에 적합한 디엔을 포함하는 경우, 이 방법에 사용되는 기능화된 생체 분자는 친디엔체를 포함한다. 본 명세서에 개시된 IEDDAR에 적합한 하나의 예시적인 친디엔체는 옥텐 모이어티(예를 들면, TCO 작용기 내)이다. 이 "기능화된 생체 분자(functionalized biomolecule)"의 생체 분자는 일반적으로 다양한 sdAb 또는 기타 작은 단백질 작제물을 포함할 수 있다. 하나의 특정 양태에서, 생체 분자는 항-HER2 sdAb를 포함한다. 이 방법이 효과적으로 입증된 한 가지 예시적인 생체 분자는 5F7이고; 그러나, 이 방법은 이에 한정되는 것은 아니다. 기능화된 생체 분자는 일부 이러한 양태에서 하나 이상의 화학적 모이어티, 예를 들면 하나 이상의 링커로 추가로 변형될 수 있다. 특정 양태에서, 링커는 신장 브러시 경계 효소(RBBE)-절단 가능한 링커를 포함한다. 다시, 일부 양태에서, 이러한 다른 작용기가 목적하는 IEDDAR를 부정적으로 방해하지 않는 한, 다양한 다른 작용기가 기능화된 생체 분자 내에 포함될 수 있다. 개시된 방법에 유용한 하나의 특정 양태에서, 기능화된 생체 분자는 TCO-GK-PEG4-NHS 링커를 포함한다. 기능화된 생체 분자(디엔체를 통해)와 18F-함유 시약(디엔을 통해) 사이의 반응은 IEDDAR를 통해 목적하는 표지된 생체 분자를 제공할 수 있다.
다른 양태에서, 기능화된 생체 분자 및 18F-함유 시약과 관련된 모이어티는 전환된다(예를 들면, 디엔이 (상기 기재된 바와 같은 18F-함유 시약보다) 기능화된 생체 분자와 회합되고, 친디엔체가 (상기 기재된 바와 같은 기능화된 생체 분자보다) 18F-함유 시약과 회합된다). 유리하게는, 일부 양태에서 18F-함유 시약은 플루오로니코티닐 모이어티를 포함하고, 여기서 플루오로니코티닐 모이어티는 18F를 포함한다. 이러한 양태에서, 18F-함유 시약(이는 제공된 후, 기능화된 생체 분자에 커플링됨)은 표지(18F) 이외에도 상기 단계 b)의 IEDDAR에 적합한 친디엔체를 포함한다. 본 명세서에 개시된 IEDDAR에 적합한 하나의 예시적인 친디엔체는 옥텐 모이어티(예를 들면, TCO 작용기 내)이다. 이러한 다른 작용기가 목적하는 IEDDAR를 부정적으로 방해하지 않는 한 다양한 다른 작용기가 18F 함유 시약 내에 존재할 수 있다. 예를 들면, 18F-함유 시약은 다양한 길이의 링커를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 링커는, 예를 들면 PEG 및/또는 신장 브러시 경계 효소(RBBE)-절단 가능한 링커를 포함한다. 개시된 방법에서 효과적으로 사용될 수 있는 하나의 특정 예시적인 18F-함유(친디엔체) 시약은 6-[18F]플루오로니코티닐-PEG4-GK-TCO이다.
18F-함유 시약이 단계 b)의 IEDDAR에 적합한 친디엔체를 포함하는 경우, 이 방법에 사용된 기능화된 생체 분자는 디엔을 포함한다. 하나의 예시적인 디엔은 테트라진-함유 모이어티이며, 이는 기능화된 생체 분자 내에 유리하게 포함될 수 있다. 이 "기능화된 생체 분자"의 생체 분자는 다시 일반적으로 다양한 sdAb 또는 기타 작은 단백질 작제물을 포함할 수 있다. 하나의 특정 양태에서, 생체 분자는 항-HER2 sdAb를 포함한다. 이 방법이 효과적으로 입증된 한 가지 예시적인 생체 분자는 5F7-GGC이고; 그러나, 이 방법이 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 다른 작용기가 목적하는 IEDDAR를 부정적으로 방해하지 않는 한, 기능화된 생체 분자 내에 존재할 수 있다. 예를 들면, 기능화된 생체 분자는 다양한 길이의 링커(예를 들면, PEG)를 추가로 포함할 수 있다. 추가 양태에서, 18F-함유 시약은 RBBE 절단 가능한 링커를 포함한다. 개시된 방법에서 효과적으로 사용될 수 있는 하나의 특정 예시적인 기능화된 생체 분자(디엔) 시약은 5F7-GGC-Mal-PEG4-Tz이다. 기능화된 생체 분자(디엔을 통해)와 18F-함유 시약(디엔체를 통해) 사이의 반응은 IEDDAR를 통해 목적하는 표지된 생체 분자를 제공할 수 있다.
하나의 양태에서, 참조된 방법은 18F-표지된 생체 분자(예를 들면, 상기 본 명세서에 참조된 방법 중 하나에 따라 제조됨)를 제공한다. 2개의 예시적인 이러한 18F-표지된 생체 분자는 화학식 I 및 II로 하기에 나타냈다.
Figure pct00001
화학식 I: [18F]FN-PEG4-Tz-TCOGK-PEG4-생체 분자
Figure pct00002
화학식 II: [18F]FN-PEG4-GK-TCO-Tz-PEG4-Mal-5F7GGC
다른 양태에서, 클릭 반응(예를 들면, 구리-촉매화 클릭 반응(copper-catalyzed click reaction))을 포함하는 18F-표지된 잔류화제, 및 18F-표지된 생체 분자의 제조방법이 제공된다. 개시된 반응은, 하기 단계들: a) 알킨 모이어티를 포함하는 구아니딘 함유 화합물을 제공하는 단계; b) 플루오로알킬 아지드를 포함하고 PEG 링커를 포함하는 화합물을 제공하는 단계; c) 클릭 화학물질을 통해 단계 a) 및 b)의 화합물을 반응시키는 단계; 및 임의로, 방사성 표지된 생체 분자를 형성하기 위해, d) 생성된 화합물을 생체 분자와 반응시키는 단계;를 포함한다. 클릭 반응이 구리-촉매되는 경우에 사용되는 구리 촉매는 다양할 수 있고, 반응을 촉매화하는데 적합한 임의의 구리-함유 화합물 또는 염일 수 있다. 하나의 특정 양태에서, 구리 촉매는 황산구리이다. 유리하게는, 클릭 반응 기반 방법은, 일부 양태에서, 알킨(6-[18F]플루오로헥신)과 반응한 구아니딘 함유 화합물에 아지드 모이어티가 존재하는 유사한 반응에 대해 이전에 보고된 것보다 더 높은 방사화학적 수율을 제공한다. 이의 전체가 본 명세서에 참조로 포함되는 Glaser, Bioconjugate Chem. 2007, 18, 989-993를 참조한다.
플루오로알킬 아지드를 포함하고 PEG 링커를 포함하는 화합물은 다양할 수 있다. 하나의 양태에서, 이 화합물은 1-아지도-2-(2-(2-(2-[18F]플루오로에톡시)에톡시)에톡시)에탄이다. 마찬가지로, 반응하는 화합물(즉, 구아니딘 함유 화합물)은 다양할 수 있다. 하나의 예시적인 이러한 화합물은 N-숙신이미딜 3-((2,3-비스(tert-부톡시카르보닐)구아니딘)메틸)-5-에티닐벤조에이트)이다.
단계 a)-c)를 통해 제공된 18F-표지된 잔류화제는 18F-표지된 생체 분자를 제공하기 위해 다양한 생체 분자와 반응할 수 있다. 이 방법에 사용된 생체 분자는 일반적으로 다양한 sdAb 또는 기타 작은 단백질 작제물(예를 들면, 상기 본 명세서에 개괄된 생체 분자의 유형)을 포함할 수 있다. 하나의 특정 양태에서, 생체 분자는 항-HER2 sdAb를 포함한다. 이 방법이 효과적으로 입증된 두 가지 예시적인 생체 분자는 2Rs15d 및 5F7이고; 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이 방법은 이러한 화합물의 제조를 위한 이전의 클릭 화학물질 방법보다 더 간단한 합성 조작을 제공할 수 있고, 일부 양태에서, 더 높은 전체 방사화학적 수율을 제공할 수 있다. 본 개시 내용은 이러한 반응에 의해 제공되는 18F-표지된 생체 분자 및 중간체(18F-표지된 잔류화제 포함)를 추가로 제공한다. 하나의 예시적인 18F-표지된 생체 분자를 하기 화학식 III으로 나타냈다.
Figure pct00003
화학식 III: [18F]RL-III-2Rs15d
18F-표지된 잔류화제 및 18F-표지된 생체 분자의 생산을 위한 추가 방법이 본 명세서에 제공되며, 이는 플루오로탈붕소화를 적용한다. 특정 양태에서, 이 방법은 TFP 에스테르 및 구아니딘 모이어티를 함유하는 보로네이트 전구체를 제공하는 단계를 포함하며, 여기서 구아니딘 모이어티 상의 질소 원자는 보호된다(예를 들면, 목적하는 반응에 부정적인 영향을 미치지 않는 조건 하에서 도입/제거될 수 있는 Boc 기 또는 기타 적절한 보호기). 보로네이트 전구체는 적절한 18F-함유 시약(예를 들면, [18F]테트라에틸암모늄 플루오라이드, [18F]TEAF)으로 처리하여 18F-플루오로탈붕소화된다. 이러한 플루오로탈붕소화는 유리하게는, 예를 들면 Cu(Py)4(OTf)2를 포함하나 이에 제한되지 않는 구리 시약에 의해 촉매화된다. 이어서, 생성된 화합물을 처리하여 기아니딘 모이어티 상의 질소 원자를 탈보호할 수 있다(예를 들면, 보호기가 Boc인 경우, 이들 기는 TFA 처리를 통해 제거될 수 있음).
이어서, 이 탈보호된 18F-표지된 잔류화제는 상기 본 명세서에 기재된 임의의 생체 분자를 포함할 수 있는 생체 분자에 접합될 수 있다. 하나의 특정한, 비제한적 양태에서, 생체 분자는 나노바디, 예를 들면 5F7 또는 5F7의 변이체이다. 본 개시 내용은 이러한 반응에 의해 제공되는 18F-표지된 생체 분자 및 중간체를 추가로 제공한다. 이러한 18F-표지된 생체 분자의 한 예시를 하기 화학식 IV에 나타냈다.
화학식 IV: [18F]TFPFGMB-5F7
Figure pct00004
본 개시 내용은 약제학적으로 허용되는 아쥬번트, 희석제 또는 담체와 함께 본 명세서에 개시된 바와 같은 방사성 표지된 생체 분자 (예를 들면, 상기 기재된/표시된 18F-표지된 생체 분자, 예를 들면 화학식 I, II, III 및/또는 IV의 것들을 포함함)를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다. 본 개시 내용의 추가 측면에서 암 진단 방법이 제공되며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 개체에게 유효량의 본 명세서에 개시된 바와 같은 방사성 표지된 생체 분자 및/또는 유효량의 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
하기 실시예는 제한이 아니라 예시를 위해 제공된다.
실시예 1: 신장 브러시 경계 효소-절단 가능한 링커를 포함하는 역전자 요구 디엘스-알더 고리화 첨가 반응(IEDDAR)을 통한 6-플루오로니코티닐 모이어티를 갖는 항-HER2 sdAb의 불소-18 표지
목적:
단일 도메인 항체 단편(sdAbs)은 현재 이들의 저분자량으로 인해 18F와 같은 단명한 양전자 방출체로 표지하기에 유용한 플랫폼으로 간주되어, 빠른 종양 흡수 및 빠른 전신 제거를 초래한다. 그러나, 표지된 sdAbs로부터의 높은 수준의 신장 활성은 중요한 문제이다. 이전에, 우리는 보결 분자단(prosthetic group)([18F]AlF-NOTA-PEG4-Tz-TCO-GK-PEG4-2Rs15d)에 포함된 신장 브러시 경계 효소(BBE)-절단 가능한 링커로 테트라진(Tz)/트랜스-사이클로옥텐(TCO) [4+2] 역전자 요구 디엘스-알더 고리화 첨가 반응(IEDDAR)을 통해 [18F]AlF-NOTA 모이어티를 사용하여 HER2 특이적 sdAb, 2Rs15d를 18F로 표지했고; 이의 전체가 본 명세서에 참조로 포함되는 도 1A 및 Zhou et al., Bioconjugate Chem.2018, 29, 12, 4090-4103을 참조한다. 비 BBE-절단성 링커 함유 대조군에 비해 [18F]AlF-NOTA-PEG4-Tz-TCO-GK-PEG4-2Rs15d에 대해 유의하게(>15배) 더 낮은 신장 활성 수준이 달성되었지만, 종양 흡수는 보통이었고, 이는 [18F]AlF-NOTA가 매우 잔류하지 않았음을 시사한다. 플루오로니코티닐 모이어티가 더 높은 종양 흡수를 초래할 것인지 여부를 조사하기 위해, [18F]AlF-NOTA를 6-[18F]플루오로니코티닐 (FN) 기로 대체하여 위의 접근 방식을 수정했다.
방법:
다른 HER2-특이적 sdAb인 5F7을 TCO-GK-PEG4-NHS로 유도체화한 후, 도 1b에 도시된 바와 같이 IEDAR에 의해 6-[18F]플루오로니코티닐-PEG4-메틸테트라진([18F]2)과 커플링시켰다([18F]2는 N,N,N-트리메틸-5-((2-(2-(2-(2-(4-(6-메틸-1,2,4,5-테트라진-1,2,4,5-테트라진-3-일)페녹시)에톡시)에톡시)에톡시)에틸)카바모일)10우아니딘-2-아미늄 트리플레이트(1)를 합성했다)(도 1B 참조). 비교를 위해, 5F7은 또한 검증된 잔류화제인 N-숙신이미딜 3-구아니디노메틸-5-[125I]요오드벤조에이트 (iso-[125I]SGMIB; 이의 전체가 본 명세서에 참조로 포함되는 Choi et al., Nucl.Med.Biol.2014, 41, 10, 802-812를 참조)를 사용하여 표지했다. 방사화학적 순도(RCP)는 SDS-PAGE로, 면역반응 분획(IRF)은 Lindmo 방법으로 측정했다. HER2-발현 SKOV-3 인간 난소 암종 세포에 대해 HER2-결합 친화도 및 짝지어진 표지(18F/125I) 세포 흡수 분석을 수행했다. SKOV-3 이종이식편이 있는 흉선이 없는 마우스에서 짝을 이루는 표지 생체 분포를 수행했다.
결과:
중간체 [18F](2)를 전구체(1)로부터 44.8 ± 3.5% 수율로 합성했다. [18F]FN-PEG4-Tz-TCO-GK-PEG4-5F7은 IEDDAR에 대해 76.0% RCY에서 수득되었고, 그의 RCP는 SDS-PAGE에 의해 >99%였고; KD 및 IRF는 각각 5.4 ± 0.7 nM 및 77.5%였다. 시험관 내(in vitro) SKOV-3 세포에서 [18F]FN-PEG4-Tz-TCO-GK-PEG4-5F7의 흡수는 각각 1, 2 및 4시간에 2.4 ± 0.2%, 2.3 ± 0.3% 및 2.6 ± 0.1%의 입력 활성(input activity)이었다. 공동 배양된 iso-[125I]SGMIB-5F7(25.9 ± 1.5%, 32.6 ± 2.3% 및 40.8 ± 0.8%)에 대해 상당히 더 높은 값이 얻어졌다. 시험관 내 결과와 달리, [18F]FN-PEG4-Tz-TCO-GK-PEG4-5F7의 SKOV3 이종이식편 흡수(1시간 및 3시간에서 2.6 ± 2.0 %ID/g 및 3.7 ± 1.4 %ID/g)는 동시 주입된 iso-[125I]SGMIB-5F7 {2.0 ± 2.2 %ID/g 및 6.5 ±2.6 %ID/g(P > 0.05)}과 크게 다르지 않다. 신장에서 18F의 수준이 7배 더 낮기 때문에, [18F]FN-PEG4-Tz-TCO-GK-PEG4-5F7에 대한 종양 대 신장 비율(T:K)은 각각 1시간 및 3시간에, 동시 주입된 iso-[125I]SGMIB-5F7(0.1 ± 0.1 및 1.3 ± 1.2)에 보이는 것보다 상당히 더 높은 (P < 0.05) 0.6 ± 0.2 및 4.6 ± 2.0이었다. sdAbs는 다르지만, [18F]FN-PEG4-Tz-TCO-GK-PEG4-5F7에 대해 이 연구에서 얻은 T:K 값은 [18F]AlF-NOTA-PEG4-Tz-TCO-GK-PEG4-2Rs15d (1시간 및 3시간에 각각 0.4 ± 0.1 및 2.1 ± 0.8, 3시간에서 P < 0.05)에 대해 이전에 보고된 값보다 상당히 높았다.
결론:
테트라진 모이어티는 일반적으로 SNAr에 의한 표준 18F 표지 조건에 대해 불안정한 것으로 간주되지만, 염기의 양을 줄임으로써 최대 47% RCY를 얻었다. TCO 모이어티 및 브러시 경계 효소-절단 가능한 링커로 변형된 sdAb 5F7은 HER2에 대한 친화도 및 면역반응성을 유지하면서 우수한 수율로 [18F]2를 사용하여 IEDDAR를 통해 18F로 표지했다. 이 18F 표지 방법은 sdAbs 및 기타 유형의 작은 단백질 작제물에 적용하기 위한 추가 조사를 보증한다.
실시예 2: 신장 브러시 경계 효소-절단 가능한 링커를 포함하는 역전자 요구 디엘스-알더 고리화 첨가 반응(IEDDAR)을 통한 6-플루오로니코티닐 모이어티를 갖는 항-HER2 sdAb의 불소-18 표지
목적:
HER2-특이적 sdAb, 5F7을 다음과 같이 유도체화했다. 먼저, 5F7-GGC에 말레이미도-PEG4-Tz를 마이클 첨가(Michael addition)하고, SE-HPLC로 5F7-GGC-Mal-PEG4-Tz의 1:1 접합체를 분리하였다. IEDDAR를 사용하여 18F-표지화를 수행하기 위해, 신장 브러시 경계 효소(RBBE)-절단 가능한 링커, PEG4 링커 및 6-[18F]플루로니코티닐 모이어티가 함유되는 18F-표지된 TCO 함유 제제를 합성했다([18F]FN-PEG4-GK-TCO). F 대신에 트리메틸암모늄 트리플레이트를 갖는 유사한 시약(전구체)도 합성했다. 18F-표지된 제제 [18F]FN-PEG4-GK-TCO를 47.8±9.4%(n=10) 방사화학적 수율(RCY)로 전구체로부터 수득했다. 27.3±8.2%(n=5) 수율로 5F7-GGC-Mal-PEG4-Tz에 접합시켰다. [18F]FN-PEG4-GK-TCO-Tz-PEG4-Mal-5F7GGC(도 2A)의 합성에 대한 전체 붕괴 보정된 수율은 7-8%였고, 표지된 나노바디는 HER2에 대한 친화도를 유지했다. [18F]FN-PEG4-GK-TCO-Tz-PEG4-Mal-5F7GGC 및 iso-[125I]SGMIB-5F7의 짝지어진-표지 생체 분포로부터 종양, 신장, 혈액 및 근육의 흡수 값을 도 2B에 도시했다. 18F 대 125I에서 사실상 더 높은 종양/신장 및 종양/혈액 비율이 얻어졌다. BT474M1 이종이식편-보유 마우스의 MIP 이미지는 도 2C에 도시했다. 가설된 바와 같이, 간담도 기관에서의 흡수는 거의 관찰되지 않았고, 본질적으로 종양 및 방광에서만 흡수가 있는 매우 높은 대비 이미지가 3시간 p.i.에서 관측했다.
실시예 3: N-숙신이미딜 3-(1-(2-(2-(2-(2-[18F]플루오로에톡시)에톡시)에톡시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)-5-(구아니디노메틸)벤조에이트, 대체 잔류 보결 제제(alternative residualizing prosthetic agent)를 사용한 단일 도메인 항체 단편의 불소-18 표지
목적:
단일 도메인 항체 단편(sdAbs)은 면역 PET의 매력적인 벡터이다. 이전에, 우리는 잔류 보결 제제인 N-숙신이미딜 3-((4-(4-[18F]플루오로부틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-5-(구아니디노메틸) 벤조에이트([18F]SFBTMGMB 또는 [18F]RL-I; 그 내용 전체가 본 명세서에 참조로 포함되는 Vaidyanathan et al., J. Nucl. Med., 2018, 115, 171306; 및 그 내용 전체가 본 명세서에 참조로 포함되는 Zhou et al., Mol. Imag. Biol., 2018, 19, 867-877)를 사용하여 항-HER2 sdAb를 18F로 표지했다. 보결 제제는 6-[18F]플루오로헥신(FH)과 아지드- 및 구아니딘- 함유 분자 사이의 구리 촉매 클릭 반응에 의해 합성했다. 그러나, FH의 하나의 단점은 극단적인 변동성으로 인해, 합성 조작이 어렵다는 것이다. 이 문제를 극복하기 위해, 우리는 클릭 파트너를 역전시켜 유사 제제를 개발했다 - 구아니딘 함유 분자는 PEG 링커를 포함하는 플루오로알킬 아지드로 클릭된 알킨 모이어티를 함유했다.
방법:
N-숙신이미딜 3-((1,2-비스(tert-부톡시카르보닐)구아니디노)메틸)-5-에티닐벤조에이트 ((6); 도 3)는 2-(트리메틸실릴)에틸 3-(히드록시메틸)-5-요오드벤조에이트((3); 이의 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 Choi et al., Nucl. Med. Biol. 2014, 41, 10, 802-812)로부터 3단계로 합성했다. 이를 1-아지도-2-(2-(2-(2-[18F]플루오로에톡시)에톡시)에톡시)에탄 및 제거된 생성된 중간체(7)로부터의 Boc기로 클릭하여(이의 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 Michel et al., J. Med. Chem. 2011, 54, 4, 939-948), N-숙신이미딜 3-(1-(2-(2-(2-(2-[18F]플루오로에톡시)에톡시)에톡시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)-5-(구아니디노메틸)벤조에이트 ((8); [18F]SFETGMB; [18F]RL-III; 도 3 참조)를 수득했다. 항-HER2 sdAb 2Rs15d는 이들을 각각 [18F]RL-III 및 N-숙신이미딜 4-구아니디노메틸-3-[125I]요오드벤조에이트로 접합함으로써 18F 및 125I를 표지했다([125I]SGMIB; 이의 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 Vaidyanathan and Zalutsky, Nat. Protocols, 2007, 2, 282-286 참조). [18F]RL-III-2Rs15d의 순도는 TCA 침전, SDS PAGE 및 크기 배제 HPLC로 평가하였다. 그것의 HER2-결합 친화도는 HER2-발현 BT474M1 인간 유방암 세포 및 Lindmo 방법에 의해 평가된 면역반응 분획(IRF)을 사용한 포화 결합 분석에서 결정했다. [18F]RL-III-2Rs15d 및 [125I]SGMIB-2Rs15d의 짝지어진 표지 내재화를 시험관 내 BT474M1 세포에 수행했다. [18F]RL-III-2Rs15d 및 [125I]SGMIB-2Rs15d의 생체분포를 피하 HER2-발현 SKOV3 인간 난소 암종 이종이식편이 있는 흉선이 없는 마우스에서 비교했다.
결과:
Boc2-[18F]SFETGMB를 125분 동안 22.1 ± 2.4%(n = 5)의 전체 방사화학적 수율로 합성했다. [18F]RL-III은 37.5 ± 13.5% 수율로 2Rs15d(2 mg/mL)에 접합되었다. [18F]RL-III-2Rs15d의 방사화학적 순도는 >96%였다. Kd 및 IRF는 각각 5.7 ± 0.3 nM 및 81.5 ± 1.0%였다. BT474M1 세포에 내재화된 [18F]RL-III-2Rs15d의 초기 결합 방사능 비율은 1, 2 및 4시간에 각각 10.8 ± 1.0%, 10.6 ± 0.4% 및 9.8 ± 0.7%였고; [125I]SGMIB-2Rs15d에 대한 해당 값은 10.2 ± 0.6%, 10.0 ± 0.4% 및 9.1 ± 0.4%였다. [18F]RL-III-2Rs15d에 대한 SKOV3 이종이식편의 흡수는 각각 1, 2 및 3시간에 4.0 ± 0.5 %ID/g, 4.2 ± 1.4 %ID/g 및 2.5 ± 0.3 %ID/g였다. [125I]SGMIB-2Rs15d에 대한 이러한 값은 5.5 ± 0.8 %ID/g, 6.4 ± 3.1 %ID/g 및 3.8 ± 0.7 %ID/g이었다(2시간을 제외하고 P<0.05). 일부 정상 조직에서의 흡수는 [125I]SGMIB-2Rs15d에 비해 [18F]RL-III-2Rs15d에 대해 상당히 더 높았다(신장 2-4배, 간 25-43배, 비장 14-19배).
또한, 이 새로운 잔류 보결 제제 RL-III는 [18F]RL-III를 사용하여 2개의 나노바디(5F7 및 2Rs15d)를 표지함으로써 평가했다. 우리는 두개 내 종양이 있는 마우스에서 이미징을 위한 [18F]RL-III-5F7의 가능성을 추가로 평가했다. 도 4에 도시된 바와 같이, 두개내 BT474M1 종양은 [18F]RL-III-5F7에 의해 명확하게 가시화되었다(도 4A). 뇌 단면의 조직학 및 자가방사선촬영은 종양의 존재 및 위치를 확인하였다(도 4B & C).
결론:
보결 제제 [18F]RL-III은 [18F]RL-I에 대해 이전에 얻은 것보다 약 3배 더 높은 방사화학적 수율로 합성했다. sdAb 2Rs15d는 [18F]RL-I에 대해 얻은 것과 유사한 수율로 [18F]RL-III로 표지되어, [18F]RL-III-2Rs15d에 대한 RCY와 관련하여 상당한 이점을 제공한다. [18F]RL-III-2Rs15d의 시험관 내 및 생체 내 종양 흡수는 [125I]SGMIB-2Rs15d의 동시 인큐베이션/주사된 경우와 유사하여, [18F]RL-III의 잔류화 능력을 입증했다. [18F]RL-III-2Rs15d의 정상 조직 흡수는 다른 모델이기는 하지만 [18F]RL-I-2Rs15d에 대해 이전에 관찰된 것과 유사했다. 이러한 결과는 [18F]RL-III이 [18F]RL-I보다 더 나은 보결 제제임을 시사하고, 일부 정상 조직에서 표지된 sdAb의 활성 흡수를 감소시키기 위한 추가 구조적 변형으로 추가 조사를 보증한다. 두개 내 종양의 맥락에서 이 보결 제제를 사용하여 표지된 sdAb의 사용은 [18F]RL-III-sdAb가 우수한 영상화제임을 나타낸다.
실시예 4: 테트라플루오로페닐 3-[18F]플루오로-5-구아니디노메틸벤조에이트([18F]TFPFGMB)의 제조.
목적:
우리는 SGMIB와 유사한 18F-표지된 잔류화제를 만들기 시작했다(도 5A). 특히, 우리는 iso-SGMIB와 유사하지만, 허용 가능한 RCY에서 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 에스테르(([18F]TFPFGMB; 도 5B) 대신 테트라플루오로페닐(TFP) 에스테르를 함유하는 제제를 표적으로 삼았다.
방법:
이를 위해, 구아니딘 기의 모든 질소가 Boc 기로 보호된 TFP 에스테르((9), 도 5B에 도시됨)를 함유하는 보로네이트 전구체를 합성하고, 이를 [18F] 테트라에틸암모늄 플루오라이드([18F]TEAF), DMA의 Cu(Py)4(OTf)2로 ~100 ℃에서 5-10분 동안 처리함으로써 18F-플루오로탈붕소화를 수행했다. 생성물(도 5B의 중간체(2))은 18.0±7.0%(n=4) RCY에서 순상 HPLC에 의해 분리했다. 생성된 표지된 중간체(10)를 TFA 처리에 의해 탈보호하였다. 5F7의 나노바디 변이체("5F7-변이체")는, 보레이트 용액 중 5F7-변이체의 용액을 pH 8.5에서 37 ℃에서 20분 동안 (3)과 함께 배양함으로써, 4.7 ± 0.2% (n=2)의 수율로 화합물(11)(도 5B에 도시된)과 접합시켰다.
결과:
단일 실험에서, HER2-발현 BT474M1 세포를 [18F]TFPFGMB-5F7-변이체와 37 ℃에서 배양한 후, 각각 1, 2 및 4시간에 입력 용량의 30.2 ± 1.7%, 40.1 ± 1.5% 45.5 ± 1.6%가 흡수되고, 2시간에 측정된 비특이적 결합은 6.9 ± 0.3%인 것으로 나타났다. 이들 3개의 시점에서 세포내 포획된 활성은 각각 13.8 ± 0.3%, 17.1 ± 1.0% 및 24.0 ± 1.4%였다.
명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 본 발명이 존재하는 본 분야의 통상의 기술자의 수준에서 나타낸 것이다. 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 포함된다.　 상술한 발명은 이해를 분명히 하기 위한 목적에서 예시 및 실시예의 방식으로 일부 자세히 설명되었지만, 특정 변화 및 변형이 첨부된 청구항의 범위 내에서 실시될 수 있음은 자명할 것이다.

Claims (50)

18F-표지된 생체 분자의 제조방법으로서, 상기 방법은,
친디엔체(dienophile)를 포함하는 기능화된 생체 분자를 제공하는 단계;
디엔을 포함하는 18F-함유 시약을 제공하는 단계;
기능화된 생체 분자와 18F-함유 시약을 역전자 요구 디엘스-알더 고리화 첨가 반응(inverse electron-demand Diels-Alder cycloaddition reaction)을 통해 반응시켜 18F-표지된 생체 분자를 제공하는 단계;를 포함하는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 친디엔체는 옥텐 모이어티를 포함하는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 친디엔체는 트랜스-사이클로옥텐(TCO) 모이어티를 포함하는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 디엔은 테트라진(Tz) 모이어티를 포함하는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 18F-함유 시약은 [18F]플루오로니코티닐(FN) 기를 포함하는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 18F-함유 시약은 6-[18F]플루오로니코티닐-PEG4-메틸테트라진을 포함하는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 기능화된 생체 분자는 링커를 추가로 포함하는 것인, 제조방법.
제7항에 있어서,
상기 링커는 신장 브러시 경계 효소-절단 가능한 링커(renal brush border enzyme-cleavable linker)를 포함하는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 기능화된 생체 분자는 TCO-GK-PEG4-NHS로 유도체화된 생체 분자를 포함하는 것인, 제조방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 생체 분자는 나노바디(nanobody)인 것인, 제조방법.
제10항에 있어서,
상기 나노바디는 HER2-특이적 나노바디인 것인, 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 18F-표지된 생체 분자는 [18F]FN-PEG4-Tz-TCO-PEG4-GK-생체 분자인 것인, 제조방법.
18F-표지된 생체 분자의 제조방법으로서, 상기 방법은,
디엔을 포함하는 기능화된 생체 분자를 제공하는 단계;
친디엔체를 포함하는 18F-함유 시약을 제공하는 단계;
기능화된 생체 분자와 18F-함유 시약을 역전자 요구 디엘스-알더 고리화 첨가 반응(inverse electron-demand Diels-Alder cycloaddition reaction)을 통해 반응시켜 18F-표지된 생체 분자를 제공하는 단계;를 포함하는 것인, 제조방법.
제13항에 있어서,
상기 친디엔체는 옥텐 모이어티를 포함하는 것인, 제조방법.
제13항에 있어서,
상기 친디엔체는 트랜스-사이클로옥텐(TCO) 모이어티를 포함하는 것인, 제조방법.
제13항에 있어서,
상기 디엔은 테트라진(Tz) 모이어티를 포함하는 것인, 제조방법.
제13항에 있어서,
상기 18F 함유 시약은 [18F]플루오로니코티닐(FN) 기를 포함하는 것인, 제조방법.
제13항에 있어서,
상기 18F-함유 시약은 신장 브러시 경계 효소-절단 가능한 링커(renal brush border enzyme-cleavable linker)를 포함하는 것인, 제조방법.
제13항에 있어서,
상기 18F-함유 시약은 6-[18F]플루오로니코티닐-PEG4-GK-TCO를 포함하는 것인, 제조방법.
제13항에 있어서,
상기 기능화된 생체 분자는 링커를 추가로 포함하는 것인, 제조방법.
제20항에 있어서,
상기 링커는 PEG를 포함하는 것인, 제조방법.
제13항에 있어서,
상기 기능화된 생체 분자는 -Mal-PEG4-Tz로 유도체화된 생체 분자를 포함하는 것인, 제조방법.
제13항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 생체 분자는 나노바디인 것인, 제조방법.
제23항에 있어서,
상기 나노바디는 HER2-특이적 나노바디인 것인, 제조방법.
제13항에 있어서,
상기 18F-표지된 생체 분자는 [18F]FN-PEG4-GK-TCO-Tz-PEG4-Mal-생체 분자인 것인, 제조방법.
[18F]FN-PEG4-Tz-TCO-GK-PEG4- 및 [18F]FN-PEG4-GK-TCO-Tz-PEG4-Mal- 로부터 선택된 18F-표지된 잔류화제에 접합된 생체 분자를 포함하는, 18F-표지된 생체 분자.
제26항에 있어서,
상기 생체 분자는 나노바디인 것인, 18F-표지된 생체 분자.
제27항에 있어서,
상기 나노바디는 HER2-특이적 나노바디인 것인, 18F-표지된 생체 분자.
18F-표지된 잔류화제의 제조방법으로서, 상기 방법은,
구아니딘 모이어티 및 알킨 모이어티를 포함하는 제1 화합물을 제공하는 단계;
플루오로알킬 아지드(fluoroalkyl azide) 및 PEG 링커를 포함하는 제2 화합물을 제공하는 단계;
클릭 화학물질을 통해 제1 및 제2 화합물을 반응시켜 18F-표지된 잔류화제를 제공하는 단계;를 포함하는 것인, 제조방법.
제27항에 있어서,
상기 클릭 화학물질은 구리 촉매에 의해 촉매화되는 것인, 제조방법.
제27항에 있어서,
상기 제1 화합물은 N-숙신이미딜 3-((2,3-비스(tert-부톡시카르보닐)17우아니딘)메틸)-5-에티닐벤조에이트이고, 제2 화합물은 1-아지도-2-(2-(2-(2-[18F]플루오로에톡시)에톡시)에톡시)에탄인 것인, 제조방법.
18F-표지된 생체 분자의 제조방법으로서, 상기 방법은,
제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 기재된 방법을 수행하는 단계; 및
18F-표지된 잔류화제를 생체 분자와 반응시키는 단계;를 포함하는 것인, 제조방법.
제32항에 있어서,
상기 생체 분자는 나노바디인 것인, 제조방법.
제32항에 있어서,
상기 나노바디는 HER2-특이적 나노바디인 것인, 제조방법.
N-숙신이미딜 3-(1-(2-(2-(2-(2-[18F]플루오로에톡시)에톡시)에톡시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)-5-(구아니디노메틸)벤조에이트를 포함하는, 18F-표지된 잔류화제.
제35항에 기재된 18F-표지된 잔류화제에 접합된 생체 분자를 포함하는, 18F-표지된 생체 분자.
제36항에 있어서,
상기 생체 분자는 나노바디인 것인, 18F-표지된 생체 분자.
제37항에 있어서,
상기 나노바디는 HER2-특이적 나노바디인 것인, 18F-표지된 생체 분자.
18F-표지된 잔류화제의 제조방법으로서, 상기 방법은,
구아니딘 모이어티를 포함하는 보로네이트 전구체를 제공하는 단계; 및
상기 보로네이트 전구체를 18F-함유 시약과 함께 18F-플루오로탈붕소화 반응시키는 단계;를 포함하는 것인, 제조방법.
제39항에 있어서,
상기 보로네이트 전구체는 TFP 에스테르를 추가로 포함하는 것인, 제조방법.
제39항에 있어서,
상기 18F 함유 시약은 [18F]테트라에틸암모늄 플루오라이드인 것인, 제조방법.
제39항에 있어서,
상기 반응은 구리 촉매의 존재 하에 수행되는 것인, 제조방법.
18F-표지된 생체 분자의 제조방법으로서, 상기 방법은,
제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 기재된 방법을 수행하는 단계; 및
18F로 표지된 생체 분자를 생체 분자와 반응시키는 단계;를 포함하는 것인, 제조방법.
제43항에 있어서,
상기 생체 분자는 나노바디인 것인, 제조방법.
제44항에 있어서,
상기 나노바디는 HER2-특이적 나노바디인 것인, 제조방법.
테트라플루오로페닐 3-[18F]플루오로-5-구아니디노메틸벤조에이트를 포함하는, 18F-표지된 잔류화제.
제46항의 18F-표지된 잔류화제에 접합된 생체 분자를 포함하는, 18F-표지된 생체 분자.
제47항에 있어서,
상기 생체 분자는 나노바디인 것인, 18F-표지된 생체 분자.
제47항에 있어서,
상기 나노바디는 HER2-특이적 나노바디인 것인, 18F-표지된 생체 분자.
제26항 내지 제28항, 제36항 내지 제38항 또는 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 기재된 18F-표지된 생체 분자를 사용하는 것을 포함하는, 암 세포를 영상화하는 방법.
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