KR20220007122A

KR20220007122A - 근위축성 측삭경화증 치료를 위한 방법 및 약물

Info

Publication number: KR20220007122A
Application number: KR1020217040213A
Authority: KR
Inventors: 지난 리
Original assignee: 탈렌젠 인터내셔널 리미티드
Priority date: 2019-05-10
Filing date: 2020-05-11
Publication date: 2022-01-18
Also published as: EP3967322A1; WO2020228681A1; CA3139850A1; CN113795274A; JP2022531937A; JP7455457B2; EP3967322A4; US20220218799A1

Abstract

본 발명은 근위축성 측삭경화증(ALS)의 치료 방법을 개시하고, 피험자에게 치료유효량의 플라스미노겐 경로 활성제를 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명은 근위축성 측삭경화증을 치료하는 플라스미노겐 경로 활성제를 포함하는 약학적 조성물, 제품, 키트를 더 개시한다.

Description

근위축성 측삭경화증 치료를 위한 방법 및 약물

본 발명은 근위축성 측삭경화증 및 그 관련 질병의 치료 방법에 관한 것으로서, 근위축성 측삭경화증 및 그 관련 질병을 앓고 있는 피험자에게 유효량의 플라스미노겐 경로 활성화 성분 또는 그 관련 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 바, 예를 들어 플라스미노겐을 투여하여 신경 손상을 복구하여 임상 증상 및 병증을 개선한다.

근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)은 루게릭병이라고도 칭하는 바, 신경계의 치명적인 퇴행성 질병으로서, 주요하게 추체로, 뇌간 및 척수 전각 세포에 영향을 미치며, 임상 증상은 점진적으로 가중되는 근위축, 무력 및 경련을 수반하며, 60％ 이상의 환자들은 발병 3년 내지 5년 후 호흡근 마비로 인해 사망한다(Kiernan MC, Vucis S,Cheah BC,et al.Amyotrophic lateral sclerosis.Lancet,2011,377:942-955.).

근위축성 측삭경화증의 임상 증상은 상위 운동 뉴런 변성(주요 특징은 건반사 항진, 근긴장도 증가임) 및 하위 운동 뉴런 변성(근위축, 근무력, 근섬유 떨림 및 건반사 상실)을 주요한 증상과 병증으로 한다. 발병 증상은 배대칭이고, 발병 부위는 점차 다른 부위로 진행되지만, 외안근과 괄약근은 대부분 영향을 받지 않는다. 비록 일부 환자는 경미하게 감각 증상이 있을 수 있지만, 통상적으로 감각 기관을 검사하면 음성이다. 기존의 관념에 따르면, 근위축성 측삭경화증 환자의 인지 기능은 양호하게 유지되었다고 하나, 신경 영상학, 신경 심리학 등 진단 기술의 발전과 더불어, 인지 기능의 손상도 근위축성 측삭경화증의 통상적인 특징임을 발견하였다.

상기 병의 발병 확율은 대략 4-6/100,000이고, 현재 유일한 치료 약물로서 흥분성 아미노산 길항제 리루텍(Rilutek)만이 여러 국가의 의약품 감독 부서에서 승인을 받았으나, 이는 단지 병세의 진행을 완화할 수 있을 뿐이다.

본 발명은 연구를 거쳐 예를 들어 플라스미노겐과 같은 플라스미노겐 경로 활성제가 척수 전각 운동 뉴런 손상을 현저하게 개선하고 ALS를 치료하며, ALS의 병세를 개선할 수 있음을 발견하였다.

본 발명은 하기의 각 항에 관련된 것이다.

1. 근위축성 측삭경화증(ALS)의 치료 방법으로서, 플라스미노겐 경로 활성화 성분, 플라스미노겐을 직접 활성화하거나 또는 플라스미노겐 경로 활성화 상위 성분을 활성화하여 플라스미노겐을 간접적으로 활성화하는 화합물, 플라스미노겐 또는 플라스미노겐 활성을 모방하는 화합물, 플라스미노겐 또는 플라스미노겐 활성화제의 발현을 상향 조절할 수 있는 화합물, 플라스미노겐 유사체, 플라스민 유사체, tPA 또는 uPA 유사체 및 섬유소용해 억제제의 길항제로부터 선택된 하나 이상의 플라스미노겐 경로 활성제를 치료유효량으로 근위축성 측삭경화증(ALS)을 앓고 있는 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다.

2. 제1항에 있어서, 상기 플라스미노겐 경로 활성화 성분은, 플라스미노겐, 재조합 인간 플라스민, Lys-플라스미노겐, Glu-플라스미노겐, 플라스민, 플라스미노겐 및 플라스민을 함유하는 하나 이상의 kringle 도메인 및 프로테아제 도메인의 플라스미노겐과 플라스민 변이체 및 유사체, 미니 플라스미노겐(mini-plasminogen), 미니 플라스민(mini-plasmin), 마이크로 플라스미노겐(micro-plasminogen), 마이크로 플라스민(micro-plasmin), delta-플라스미노겐, delta-플라스민(delta-plasmin), 플라스미노겐 활성제, tPA 및 uPA로부터 선택된다.

3. 제1항에 있어서, 상기 섬유소용해 억제제의 길항제는 PAI-1, 보체 C1억제제, α2 항 플라스민 또는 α2 마크로글로불린의 길항제이며, 예를 들어 PAI-1, 보체 C1억제제, α2항 플라스민 또는 α2 마크로글로불린의 항체이다.

4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 근위축성 측삭경화증은 유전형 및 산발형 ALS를 포함한다.

5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라스미노겐 경로 활성제는 상기 근위축성 측삭경화증(ALS)을 앓고 있는 피험자에 대해, 수명 및 중앙 생존 기간의 연장, 근위축 및 근력 감퇴의 지연, 체중 감소 속도의 감소, 척수 전각 세포의 손상, 변성 및 괴사의 경감, 척수 전각 chAT의 합성 촉진, 콜린성 뉴런 기능 회복의 촉진, 척수 전각 시냅토파이신 발현의 촉진, 척수 전각 SMN 단백질 발현의 촉진, 척수 전각 염증 회복의 촉진, 시냅스 손상 회복의 촉진으로부터 선택된 하나 이상의 활성을 구비한다.

6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라스미노겐 경로 활성제는 피험자의 근위축, 근력 감퇴, 경련 및/또는 근섬유 다발 수축 증상을 개선한다.

7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라스미노겐 경로 활성제는 피험자의 체중 감소를 경감하고 및/또는 생존 기간을 연장한다.

8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라스미노겐 경로 활성제는 피험자의 근긴장도를 개선한다.

9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라스미노겐 경로 활성제는 피험자의 근육 기능 회복을 촉진한다.

10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라스미노겐 경로 활성제는 피험자의 척수 전각 뉴런 손상 회복을 촉진한다.

11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라스미노겐 경로 활성제는 하나 이상의 다른 약물 및/또는 치료 방법을 사용하여 병용 투여하고, 바람직하게, 상기 치료 방법은 세포 요법(예를 들어 줄기세포 요법) 및 유전자 치료, 안티센스 RNA, 소분자 접합 변형제 등을 포함한다.

12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라스미노겐 경로 활성제는 플라스미노겐 경로 활성화 성분이고, 예를 들어 플라스미노겐이다.

13. 제12항에 있어서, 상기 플라스미노겐과 서열 2, 6, 8, 10 또는 12는 적어도 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％의 서열 동일성을 구비하고, 플라스미노겐 활성 및/또는 라이신 결합 활성을 여전히 구비한다.

14. 제12항에 있어서, 상기 플라스미노겐은 플라스미노겐 활성 및/또는 라이신 결합 활성 단편을 포함하고, 플라스미노겐 활성 및/또는 라이신 결합 활성을 여전히 구비하는 단백질이다.

15. 제12항에 있어서, 상기 플라스미노겐은 Glu-플라스미노겐, Lys-플라스미노겐, 미니 플라스미노겐, 마이크로 플라스미노겐, delta-플라스미노겐 또는 이들의 플라스미노겐 활성을 보유하는 변이체로부터 선택된다.

16. 제12항에 있어서, 상기 플라스미노겐은 천연 또는 합성된 인간 플라스미노겐, 또는 플라스미노겐 활성 및/또는 라이신 결합 활성을 여전히 보유하는 변이체 또는 단편이다.

17. 제12항에 있어서, 상기 플라스미노겐은 정맥내, 근육내, 척수강내, 비강 흡입, 에어로졸 흡입, 점비액 또는 점안액 방식을 통해 투여된다.

본원 발명의 상기 임의의 실시형태에 있어서, 상기 플라스미노겐은 서열 2, 6, 8, 10 또는 12와 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％의 서열 동일성을 구비할 수 있고, 플라스미노겐 활성 및/또는 라이신 결합 활성을 여전히 구비한다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 서열 2, 6, 8, 10 또는 12의 기초상에서, 1-100, 1-90, 1-80, 1-70, 1-60, 1-50, 1-45, 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 1개 아미노산을 추가, 삭제 및/또는 치환하며, 플라스미노겐 활성 및/또는 라이신 결합 활성을 여전히 구비하는 단백질이다.

일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 플라스미노겐 활성 및/또는 라이신 결합 활성 단편, 플라스미노겐 활성 및/또는 라이신 결합 활성을 여전히 구비하는 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 Glu-플라스미노겐, Lys-플라스미노겐, 미니 플라스미노겐, 마이크로 플라스미노겐, delta-플라스미노겐 또는 이들의 플라스미노겐 활성 및/또는 라이신 결합 활성을 보유하는 변이체로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 천연 또는 합성된 인간 플라스미노겐, 또는 플라스미노겐 활성 및/또는 라이신 결합 활성을 여전히 보유하는 변이체 또는 단편이다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 영장류 동물 또는 설치류 동물에서 유래된 인간 플라스미노겐 이종 상동체 또는 플라스미노겐 활성 및/또는 라이신 결합 활성을 여전히 보유하는 변이체 또는 단편이다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐의 아미노산은 서열 2, 6, 8, 10 또는 12로 표시된다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 천연 인간 플라스미노겐이다.

일부 실시형태에서, 상기 피험자는 사람이다. 일부 실시형태에서, 상기 피험자는 플라스미노겐이 결핍되거나 결실된다. 일부 실시형태에서, 상기 결핍 또는 결실은 선천적, 이차적 및/또는 국소적이다.

전술한 방법의 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 전신 또는 국소적으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 비강 흡입, 에어로졸 흡입, 점비액 또는 점안액을 통해 투여된다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 정맥내, 근내, 피하, 척수강내 주사를 통해 플라스미노겐을 제공하여 치료한다. 전술한 방법의 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 매일 0.0001-2000 mg/kg, 0.001-800 mg/kg, 0.01-600 mg/kg, 0.1-400 mg/kg, 1-200 mg/kg, 1-100 mg/kg, 10-100 mg/kg(체중 1 킬로그램 당 계산) 또는 0.0001-2000 mg/cm², 0.001-800 mg/cm², 0.01-600 mg/cm², 0.1-400 mg/cm², 1-200 mg/cm², 1-100 mg/cm², 10-100 mg/cm²(체표면적의 1 제곱센티미터 당 계산)의 용량으로 투여되며, 한 회 이상 중복되고, 바람직하게 적어도 매일, 이틀에 한 번씩, 3일에 한 번씩 투여된다.

일부 실시형태에서, 본원 발명은 하기의 실시형태에 관한 것이다.

1. 근위축성 측삭경화증(ALS)의 치료 방법으로서, 근위축성 측삭경화증(ALS)을 앓고 있는 피험자에게 치료유효량의 플라스미노겐 경로 활성제를 투여하는 단계를 포함한다.

2. 제1항에 있어서, 상기 플라스미노겐 경로 활성제는 상기 근위축성 측삭경화증(ALS)을 앓고 있는 피험자에 대해, 수명 및 중앙 생존 기간의 연장, 근위축 및 근력 감퇴의 지연, 체중 감소 속도의 감소, 척수 전각 세포의 손상, 변성 및 괴사의 경감, 척수 전각 chAT의 합성 촉진, 콜린성 뉴런 기능 회복의 촉진, 척수 전각 시냅토파이신 발현의 촉진, 척수 전각 SMN 단백질 발현의 촉진, 척수 전각 염증 회복의 촉진, 시냅스 손상 회복의 촉진 중 하나 이상의 활성을 구비한다.

3. 제1항에 있어서, 상기 플라스미노겐 경로 활성제는 피험자의 근위축, 근력 감퇴, 경련 및/또는 근섬유 다발 수축 증상을 개선한다.

4. 제1항에 있어서, 상기 플라스미노겐 경로 활성제는 피험자의 체중 감소를 경감하고 및/또는 생존 기간을 연장한다.

5. 제1항에 있어서, 상기 플라스미노겐 경로 활성제는 피험자의 근긴장도를 개선한다.

6. 제1항에 있어서, 상기 플라스미노겐 경로 활성제는 피험자의 근육 기능 회복을 촉진한다.

7. 제1항에 있어서, 상기 플라스미노겐 경로 활성제는 피험자의 척수 전각 뉴런 손상 회복을 촉진한다.

8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라스미노겐 경로 활성제는 하나 이상의 다른 약물 및/또는 치료 방법을 사용하여 병용 투여한다.

9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라스미노겐 경로 활성제는 정맥내, 피하, 근육내, 척수강내, 비강 흡입, 에어로졸 흡입, 점비액 또는 점안액 방식으로 투여된다.

10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라스미노겐 경로 활성제는 플라스미노겐 경로 활성화 성분이다.

11. 제10항에 있어서, 상기 플라스미노겐 경로 활성화 성분은 플라스미노겐이다.

12. 제11항에 있어서, 상기 플라스미노겐은 서열 2, 6, 8, 10 또는 12와 적어도 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％의 서열 동일성을 구비하고, 플라스미노겐 활성을 여전히 구비한다.

13. 제11항에 있어서, 상기 플라스미노겐은 플라스미노겐 활성 단편, 플라스미노겐 활성 및/또는 라이신 결합 활성을 여전히 구비하는 단백질이다.

14. 제11항에 있어서, 상기 플라스미노겐은 Glu-플라스미노겐, Lys-플라스미노겐, 미니 플라스미노겐, 마이크로 플라스미노겐, delta-플라스미노겐 또는 이들의 플라스미노겐 활성을 보유하는 변이체로부터 선택된다.

15. 제11항에 있어서, 상기 플라스미노겐은 천연 또는 합성된 인간 플라스미노겐, 또는 플라스미노겐 활성 및/또는 라이신 결합 활성을 여전히 보유하는 변이체 또는 단편이다.

본 발명은 또한 근위축성 측삭경화증(ALS)을 치료하는 약학적 조성물, 약물, 제제, 키트, 제품에 관한 것으로서, 치료유효량의 플라스미노겐 경로 활성제를 포함한다.

일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐 경로 활성제는 상기 근위축성 측삭경화증(ALS)을 앓고 있는 피험자에 대해, 수명 및 중앙 생존 기간의 연장, 근위축 및 근력 감퇴의 지연, 체중 감소 속도의 감소, 척수 전각 세포의 손상, 변성 및 괴사의 경감, 척수 전각 chAT의 합성 촉진, 콜린성 뉴런 기능 회복의 촉진, 척수 전각 시냅토파이신 발현의 촉진, 척수 전각 SMN 단백질 발현의 촉진, 척수 전각 염증 회복의 촉진, 시냅스 손상 회복의 촉진으로부터 선택된 하나 이상의 활성을 구비한다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐 경로 활성제는 피험자의 근위축, 근력 감퇴, 경련 및/또는 근섬유 다발 수축 증상을 개선한다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐 경로 활성제는 피험자의 체중 감소를 경감하고 및/또는 생존 기간을 연장한다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐 경로 활성제는 피험자의 근긴장도를 개선한다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐 경로 활성제는 피험자의 근육 기능 회복을 촉진한다. 일부 실시형태에서 상기 플라스미노겐 경로 활성제는 피험자의 척수 전각 뉴런 손상 회복을 촉진한다.

일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐 경로 활성제는 플라스미노겐 경로 활성화 성분이다. 일부 실시형태에서, 플라스미노겐 경로 활성화 성분은 플라스미노겐이다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 서열 2, 6, 8, 10 또는 12와 적어도 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％의 서열 동일성을 구비하고, 플라스미노겐 활성 및/또는 라이신 결합 활성을 여전히 구비한다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 플라스미노겐 활성 및/또는 라이신 결합 활성 단편을 포함하고, 플라스미노겐 활성 및/또는 라이신 결합 활성을 여전히 구비하는 단백질이다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 Glu-플라스미노겐, Lys-플라스미노겐, 미니 플라스미노겐, 마이크로 플라스미노겐, delta-플라스미노겐 또는 이들의 플라스미노겐 활성을 보유하는 변이체로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 천연 또는 합성된 인간 플라스미노겐, 또는 플라스미노겐 활성 및/또는 라이신 결합 활성을 여전히 보유하는 변이체 또는 단편이다.

일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐 경로 활성제는, 예를 들어 플라스미노겐 경로 활성화 성분은, 예를 들어 플라스미노겐은 하나 이상의 다른 약물 및/또는 치료 방법을 사용하여 병용 투여한다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐 경로 활성제는, 예를 들어 플라스미노겐 경로 활성화 성분은, 예를 들어 플라스미노겐은 정맥내, 근육내, 피하, 척수강내, 비강 흡입, 에어로졸 흡입, 점비액 또는 점안액 방식을 통해 투여된다.

일부 실시형태에서, 상기 약학적 조성물, 약물, 제제는 약학적으로 허용되는 담체 및 플라스미노겐 경로 활성화제를, 예를 들어 플라스미노겐과 같은 플라스미노겐 경로 활성화 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 키트 및 제품은 하나 이상의 용기를 포함하고, 상기 용기는 상기 약학적 조성물, 약물 또는 제제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 키트 또는 제품은 라벨 또는 사용 설명서를 더 포함하고, 상기 라벨 또는 사용 설명서는 플라스미노겐 경로 활성제, 예를 들어 플라스미노겐 경로 활성화 성분의 사용을 지시하며, 예를 들어 플라스미노겐으로 근위축성 측삭경화증을 치료하는 방법을 지시한다.

일부 실시형태에서, 상기 키트 또는 제품은 별도의 하나 이상의 용기를 더 포함하며, 상기 용기에는 다른 약물이 함유된다.

본 발명은 또한 치료유효량의 플라스미노겐 경로 활성제가 근위축성 측삭경화증(ALS)을 치료하는 약학적 조성물, 약물, 제제, 키트, 제품을 제조하는 데 있어서의 용도에 관한 것이다.

일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐 경로 활성제는 플라스미노겐 경로 활성화 성분이다. 일부 실시형태에서, 플라스미노겐 경로 활성화 성분은 플라스미노겐이다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 서열 2, 6, 8, 10 또는 12와 적어도 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％의 서열 동일성을 구비하고, 플라스미노겐 활성 및/또는 라이신 결합 활성을 여전히 구비한다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 플라스미노겐 활성 및/또는 라이신 결합 활성 단편을 포함하고, 플라스미노겐 활성 및/또는 라이신 결합 활성을 여전히 구비하는 단백질이다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 Glu-플라스미노겐, Lys-플라스미노겐, 미니 플라스미노겐, 마이크로 플라스미노겐, delta-플라스미노겐 또는 이들의 플라스미노겐 활성을 보유하는 변이체로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 천연 또는 합성된 인간 플라스미노겐, 또는 플라스미노겐 활성 및/또는 라이신 결합 활성을 여전히 보유하는 변이체 또는 단편이다.

일부 실시형태에서, 상기 약학적 조성물, 약물, 제제는 약학적으로 허용되는 담체 및 플라스미노겐 경로 활성화제를, 예를 들어 플라스미노겐과 같은 플라스미노겐 경로 활성화 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 키트 및 제품은 하나 이상의 용기를 포함하고, 상기 용기는 상기 약학적 조성물, 약물 또는 제제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 키트 또는 제품은 라벨 또는 사용 설명서를 더 포함하고, 상기 라벨 또는 사용 설명서는 플라스미노겐 경로 활성제， 예를 들어 플라스미노겐 경로 활성화 성분의 사용을 지시하며, 예를 들어 플라스미노겐으로 근위축성 측삭경화증을 치료하는 방법을 지시한다.

본 발명은 본 발명의 실시형태에 속하는 기술특징의 모든 조합을 명확하게 포함하고, 이렇게 조합된 후의 기술적 해결수단은 본원 발명에 이미 명확하게 공개되었으며, 상기 기술적 해결수단이 이미 단독으로 명확하게 공개된 것으로 보아야 한다. 또한, 본 발명은 각 실시형태 및 그 요소 사이의 조합을 명확하게 포함하고, 상기와 같이 조합된 후의 기술적 해결수단은 본문에서 명확하게 공개되었다.

도 1a 및 도 1b는 플라스미노겐 투여 후 ALS 모델 마우스 수명 및 생존 시간의 통계적 결과이다. 도 1a는 수명 통계적 결과이고, 도 1b는 생존 시간의 통계적 결과이다. 그 결과는, 플라스미노겐 투여군 마우스 평균 수명은 164±8.6일이고, 용매 대조군 마우스 평균 수명은 153±0일이며, 플라스미노겐 투여군 수명은 용매 대조군과 비교하면 대략 11일 연장되었고; 플라스미노겐 투여 마우스 중앙 생존 기간은 53±9일이며, 용매 대조군 중앙 생존 기간은 40±0일이고, 플라스미노겐 투여군 중앙 생존 기간은 용매 대조군과 비교하면 대략 13일 연장되었으며, 대략 30％ 연장되었다. 상기 결과는 플라스미노겐은 ALS 마우스 수명 및 중앙 생존 기간을 연장할 수 있다는 것을 나타낸다.
도 2의 결과는, 투여 기간에 비록 두 그룹의 마우스 서스펜션 잠복 시간이 모두 감소하였지만, 플라스미노겐 투여군 마우스 서스펜션 잠복 시간은 용매 대조군 마우스보다 항상 길었고, 투여 6, 21, 23일차에, 플라스미노겐 투여군 서스펜션 잠복 시간과 용매군을 비교하면, 통계적 차이가 유의하거나 극히 유의하였으며, P 값은 각각 0.03, 0.02, 0.008이다. 이는 플라스미노겐이 ALS 마우스 근력 감퇴를 지연시킬 수 있음을 설명한다.
도 3은 플라스미노겐 투여 후 ALS 모델 마우스에서 2점의 신경 행동의 발현 시간을 나타낸다. 그 결과, 플라스미노겐 투여군 마우스에 2점의 신경 발현이 나타난 시간은 용매군보다 유의하게 늦었으며, 통계적 차이가 유의했다(*는 P<0.05를 표시함).
도 4는 플라스미노겐 투여 후 정상적인 마우스 및 ALS 모델 마우스 체중이 첫날 체중에 대한 백분율의 통계적 결과를 나타낸다. 그 결과, 투여 기간에, 블랭크 대조군 마우스는 체중의 파동이 크지 않고 점차 상승하는 추세이며; 용매 대조군 마우스는 체중이 점차 감소하였고; 플라스미노겐 투여군 마우스는 체중이 처음 25일 동안은 파동이 비교적 크지만, 블랭크 대조군 체중에 모두 근접하거나 약간 컸으며, 25일 후에는 체중이 점차 감소하였지만, 용매 대조군 마우스 체중보다 항상 컸고, 용매 대조군과 비교하면, P값은 0.001보다 작거나 근접하는 것을 나타낸다. 이는 플라스미노겐은 ALS 모델 마우스 체중 감소의 속도를 유의하게 지연시키고, ALS 병세의 악화를 지연시킬 수 있음을 설명한다.
도 5는 플라스미노겐 투여 후 정상적인 마우스 및 ALS 모델 마우스 척수 전각의 H&E 염색에서 액포 면적의 통계적 결과를 나타낸다. A는 블랭크 대조군이고, B는 용매군이며, C는 투여군이고, D는 액포 면적 통계적 결과이다. 그 결과, 블랭크 대조군의 마우스 척수 전각은 일정 수준의 액포 면적을 나타내고, 용매군의 마우스 척수 전각 액포 면적은 블랭크 대조군보다 유의하게 컸으며(P<0.001), 투여군의 마우스 척수 전각 액포 면적은 용매군보다 유의하게 작았고, 통계적 차이가 극히 유의했다. 플라스미노겐은 ALS 모델 마우스 척수 전각 액포 면적을 감소할 수 있고, 척수 전각 운동 뉴런의 사멸을 감소할 수 있음을 나타낸다.
도 6은 플라스미노겐 투여 후 정상적인 마우스 및 ALS 모델 마우스 척수 전각 chAT 면역조직화학적 염색 결과를 나타낸다. A는 블랭크 대조군이고, B는 용매군이며, C는 투여군이고, D는 평균 광학 밀도 통계적 결과이다. 그 결과, 블랭크 대조군의 마우스 척수 전각에서 일정량의 chAT가 발현되었고, 용매군의 마우스의 chAT 발현 수준은 블랭크 대조군 마우스보다 유의하게 낮았으며, 투여군의 마우스 척수 전각 chAT의 발현은 용매군 마우스보다 유의하게 높았고, 통계적 차이가 유의했다(P<0.05). 플라스미노겐 6은 SOD1-G93A 마우스 척수 전각 chAT의 합성과 발현을 촉진하고, 콜린성 뉴런 기능 회복을 촉진할 수 있음을 나타낸다.
도 7은 플라스미노겐 투여 후 정상적인 마우스 및 ALS 모델 마우스 척수 전각 시냅토파이신 면역조직화학적 염색 결과를 나타낸다. A는 블랭크 대조군이고, B는 용매군이며, C는 투여군이고, D는 평균 광학 밀도 통계적 결과이다. 그 결과, 블랭크 대조군의 마우스 척수 전각에서 일정 수준의 시냅토파이신이 발현되었고, 용매군의 마우스 시냅토파이신의 발현 수준은 블랭크 대조군 마우스보다 유의하게 낮았고, 투여군의 마우스 척수 전각 시냅토파이신의 발현은 용매군 마우스보다 유의하게 높았으며, 통계적 차이가 유의했다(P<0.05). 플라스미노겐은 모델 마우스 척수 전각 시냅토파이신의 발현을 촉진하고, 시냅스 손상 회복을 촉진할 수 있음을 나타낸다.
도 8은 플라스미노겐 투여 후 정상적인 마우스 및 ALS 모델 마우스 척수 전각 Iba-1 면역조직화학적 염색 결과를 나타낸다. A는 블랭크 대조군이고, B는 용매군이며, C는 투여군이고, D는 평균 광학 밀도 통계적 결과이다. 그 결과, 블랭크 대조군의 마우스 척수 전각은 일정 수준의 Iba-1이 발현되었고, 투여군의 마우스 척수 전각 Iba-1의 발현 수준은 용매군 및 블랭크 대조군의 마우스보다 유의하게 높았으며, 통계적 차이가 유의했다(P<0.05 또는 0.01). 플라스미노겐은 모델 마우스 척수 전각의 염증 회복을 촉진할 수 있음을 나타낸다.
도 9는 플라스미노겐 투여 후 정상적인 마우스 및 ALS 모델 마우스의 비장근 H&E 염색의 대표적인 사진이다. A는 블랭크 대조군이고, B는 용매군이며, C는 투여군이다. 그 결과, 블랭크 대조군의 마우스 비장근 섬유는 구조가 완전하고, 형태와 크기가 비교적 균일한 반면, 용매군 비장근 섬유에 원형 병변(roundness change)에 따른 심각한 위축 현상이 나타났고, 국소 염증 세포가 침윤(적색 화살표)되었으며, 투여군 근섬유 위축 현상은 용매군보다 덜하지만, 염증 세포 침윤의 현상은 여전히 존재하였다. 플라스미노겐은 모델 마우스 근위축을 개선할 수 있음을 나타낸다.
도 10은 플라스미노겐 투여 후 정상적인 마우스 및 ALS 모델 마우스 둔근 H&E 염색의 대표적인 사진이다. A는 블랭크 대조군이고, B는 용매군이며, C는 투여군이다. 그 결과, 블랭크 대조군의 마우스 근섬유 구조는 비교적 완전하고, 형태와 크기가 비교적 균일하였다. 용매군의 마우스 둔근의 근섬유에는 원형 병변이 있고, 크기가 균일하지 않았며, 심각하게 위축되었고, 염증 세포 침윤을 수반하며, 투여군의 마우스 둔근 근섬유 구조 형태는 용매군과 비교하면 어느 정도 회복되었다. 플라스미노겐은 모델 마우스 근위축을 개선할 수 있음을 나타낸다.
도 11은 플라스미노겐 투여 후 ALS 모델 마우스 척수 전각 SMN 단백질 면역조직화학적 염색의 대표적인 사진이다. A는 용매군이고, B는 투여군이다. 그 결과, 투여군의 마우스 척수 전각 SMN 단백질의 발현 수준은 용매군보다 유의하게 높았다. 플라스미노겐은 모델 마우스 척수 전각의 SMN 단백질의 발현을 촉진할 수 있음을 나타낸다.

본 발명의 “근위축성 측삭경화증”은 운동 뉴런 손상으로 초래된 일련의 병리학적 변화의 총칭을 가리킨다. 상기 병리학적 변화는 운동 뉴런 퇴화, 신경교 증식증, 신경섬유 이상, 피질 척수관 및 척수 신경의 전근에서 수초 섬유의 상실을 포함한다. 연수 운동 뉴런 손상의 징후는 예를 들어 안면 근육, 언어 및 연하(삼킴) 장애가 있으며; 척수 운동 뉴런 손상의 징후는 근육 경련, 근육 쇠약, 근위축, 마비 및 호흡 부전을 포함한다.

ALS의 특징은 하위 운동 뉴런 및 상위 운동 뉴런의 기능 장애의 점진적인 표현이다. 하위 운동 뉴런은 뇌간과 척수를 근육 섬유에 연결하고, 그 기능 장애는 근위축, 경련 및 근섬유 다발 수축을 유발한다. 상위 운동 뉴런은 대뇌 피질 또는 뇌간의 운동 영역에서 시작하여, 목표 근육을 자극하기 위해 직접 반응하는 운동 뉴런에 운동 정보를 전달한다. 이들의 기능 장애는 경련(보행, 운동 및 언어를 방해하는 지속적인 근육 수축) 및 병리적 반사를 유발한다. ALS는 가족 유전성을 구비하는 지의 여부에 따라 산발형 ALS(sALS) 및 가족성 ALS(fALS)로 나뉜다. 산발형 ALS는 ALS 가족력이 없고, 가족성 ALS는 가족 중에 1명 이상의 ALS 환자가 있다. 유전 방식이 상이함에 따라, 가족성 ALS는 상염색체 우성 유전, 상염색체 열성 유전, X염색체 연결 유전으로 나뉠 수 있다.

운동 신경은 근육 조직에 영양을 공급하는 작용을 한다. 운동 신경을 차단한 후, 근육내에서 글리코겐 합성이 느려지고 단백질 분해가 가속화되며 근육이 점차 수축한다. 본원 발명은 또한 플라스미노겐을 사용하여 운동 신경 손상 및 관련 장애로 인한 근위축 및 그 관련 질병의 치료에 관한 것이다.

섬유소 용해 시스템(Fibrinolytic system)은 섬유 용해 시스템이라고도 하는 바, 섬유소 용해(섬유 용해) 과정에 참여하는 일련의 화학 물질로 구성된 시스템이며, 주요하게 피브리놀리신(플라스미노겐), 플라스민, 플라스미노겐 활성인자, 섬유 용해 억제제를 포함한다. 플라스미노겐 활성인자는 조직형 플라스미노겐 활성인자(t-PA) 및 우로키나제형 플라스미노겐 활성인자(u-PA)를 포함한다. t-PA는 세린 프로테아제로서, 혈관 내피 세포에 의해 합성된다. t-PA는 플라스미노겐을 활성화하며, 이 과정은 주로 섬유소에서 수행되고; 우로키나제형 플라스미노겐 활성인자(u-PA)는 신세뇨관 상피세포와 혈관 내비 세포에서 생성되며 보조 인자 피브린이 필요없이 직접적으로 플라스미노겐을 활성화할 수 있다. 플라스미노겐(PLG)은 간에서 합성되며, 혈액이 응고될 시, PLG는 피브린망(fibrin net)에 대량으로 흡수되고, t-PA 또는 u-PA의 작용하에, 플라스민으로 활성화되어, 섬유소 용해를 촉진한다. 플라스민(PL)은 세린 프로테아제로서, 피브린 및 피브리노겐을 분해하고; 다양한 응혈 인자 Ⅴ, Ⅷ, Ⅹ, Ⅶ, , Ⅱ 등을 가수 분해하여; 플라스미노겐이 플라스민으로 전환되도록 하며; 보체 등을 가수 분해하는 작용을 한다. 섬유 분해 억제제는, 플라스미노겐 활성인자 억제제(PAI) 및 α2 항 플라스민(α2-AP)을 포함한다. PAI는 주요하게 PAI-1 및 PAI-2 두 가지 방식이 존재하는 바, t-PA과 1 : 1의 비율로 특이적으로 결합하여, 이를 불활성화시키고, 동시에 PLG를 활성화시킨다. α2-AP는 간에서 합성되며, PL과 1 : 1의 비율로 결합하여 복합물을 형성하여, PL 활성을 억제한다. FⅩⅢ은 α2-AP가 공유 결합으로 피브린과 결합하도록 하여, 피브린이 PL에 대한 작용의 민감성을 약화시킨다. 체내에서 섬유 분해 시스템의 활성을 억제하는 물질은, PAI-1, 보체 C1억제제; α2 항 플라스민; α2 마크로글로불린이 있다.

본 발명의 “플라스미노겐 경로 활성제” 또는 “피브리놀리신 경로 활성제”라는 용어는 플라스미노겐 경로 활성화 성분, 플라스미노겐을 직접 활성화하거나 또는 플라스미노겐 경로 활성화 상위 성분을 활성화하여 플라스미노겐을 간접적으로 활성화하는 화합물, 플라스미노겐 또는 플라스미노겐 활성을 모방하는 화합물, 플라스미노겐 또는 플라스미노겐 활성화제의 발현을 상향 조절할 수 있는 화합물, 플라스미노겐 유사체, 플라스민 유사체, tPA 또는 uPA유사체 및 섬유소용해 억제제의 길항제를 포함한다.

본 발명의 용어 “플라스미노겐 경로 활성화 성분” 또는 “피브리놀리신 경로 활성화 성분”은,

1. 플라스미노겐, Lys-플라스미노겐, Glu-플라스미노겐, 마이크로 플라스미노겐(micro-plasminogen), delta-플라스미노겐; 이들의 변이체 또는 유사체;

2. 플라스민 및 이들의 변이체 또는 유사체; 및

3. 플라스미노겐 활성제, 예를 들어 tPA과 uPA 및 하나 이상의 tPA 또는 uPA를 포함하는 도메인(예컨대 하나 이상의 kringle 도메인 및 단백질 가수 분해 도메인)의 tPA 또는 uPA 변이체 및 유사체를 포함한다.

상기 “섬유소용해 억제제의 길항제”라는 용어는 PAI-1, 보체 C1억제제, α2 항 플라스민 또는 α2 마크로글로불린의 길항제를 포함하는 바, 예를 들어 PAI-1, 보체 C1억제제, α2 항 플라스민 또는 α2 마크로글로불린의 항체이다.

상기 플라스미노겐, 플라스민, tPA 및 uPA의 “변이체”는 천연적으로 존재하는 인류 유전 변이체 및 이런 단백질의 기타 포유 동물 방식, 및 예를 들어 1-100, 1-90, 1-80, 1-70, 1-60, 1-50, 1-45, 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 1개 아미노산을 추가, 삭제 및/또는 치환, 플라스미노겐, 플라스민, tPA 또는 uPA 활성을 여전히 보유하는 단백질을 포함한다. 예를 들어, 플라스미노겐, 플라스민, tPA 및 uPA의 “변이체”는 예를 들어 1-100, 1-90, 1-80, 1-70, 1-60, 1-50, 1-45, 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 1개 보존적 아미노산을 치환하여 획득한 이들의 단백질의 돌연변이체를 포함한다.

본 발명의 “플라스미노겐 변이체”는 서열 2, 6, 8, 10 또는 12와 적어도 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％의 서열 동일성을 구비하고, 플라스미노겐 활성 및/또는 라이신 결합 활성을 여전히 구비하는 단백질을 포함한다. 예를 들어 본 발명의 “플라스미노겐 변이체”는 서열 2, 6, 8, 10 또는 12의 기초상에서, 1-100, 1-90, 1-80, 1-70, 1-60, 1-50, 1-45, 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 1개 아미노산을 추가, 삭제 및/또는 치환, 플라스미노겐 활성 및/또는 라이신 결합 활성을 여전히 구비하는 단백질일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 플라스미노겐 변이체는 천연적으로 존재하는 인류 유전 변이체 및 이러한 단백질의 다른 포유 동물 방식 및 보존적 아미노산 치환을 통해 예를 들어 1-100, 1-90, 1-80, 1-70, 1-60, 1-50, 1-45, 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 1개 아미노산이 획득한 이들의 단백질의 돌연변이체를 포함한다.

본 발명의 플라스미노겐은 영장류 동물 또는 설치류 동물의 인간 플라스미노겐 이종 상동체 또는 플라스미노겐 활성 및/또는 라이신 결합 활성을 여전히 보유하는 변이체에서 유래된 것일 수 있으며, 예를 들어 서열 2, 6, 8, 10 또는 12의 플라스미노겐, 예를 들어 서열 2로 표시되는 천연 플라스미노겐이다.

상기 플라스미노겐, 플라스민, tPA 및 uPA의 “유사체”는 플라스미노겐, 플라스민, tPA 또는 uPA와 기본적으로 유사한 작용을 각각 제공하는 화합물을 포함한다.

상기 플라스미노겐, 플라스민, tPA 및 uPA의 “변이체” 및 “유사체”는 하나 이상의 도메인(예를 들어 하나 이상의 kringle 도메인 및 단백질 가수 분해 도메인)의 플라스미노겐, 플라스민, tPA 및 uPA의 “변이체” 및 “유사체”를 포함한다. 예를 들어, 플라스미노겐의 “변이체” 및 “유사체”는 하나 이상의 플라스미노겐 도메인(예를 들어 하나 이상의 kringle 도메인 및 단백질 가수 분해 도메인)의 플라스미노겐 변이체 및 유사체를 포함하고, 예를 들어 미니 플라스미노겐(mini-plasminogen)이다. 플라스민의 “변이체” 및 “유사체”는 하나 이상의 플라스민 도메인(예를 들어 하나 이상의 kringle 도메인 및 단백질 가수 분해 도메인)의 플라스민 “변이체” 및 “유사체”를 포함하며, 예를 들어 미니 플라스민(mini-plasmin) 및 δ-플라스민(delta-plasmin)이다.

상기 플라스미노겐, 플라스민, tPA 또는 uPA의 “변이체” 또는 “유사체”가 각각 플라스미노겐, 플라스민, tPA 또는 uPA의 활성을 구비하는 지의 여부, 또는 플라스미노겐, 플라스민, tPA 또는 uPA과 기본적으로 유사한 작용을 각각 제공하는 지의 여부는 본 기술분야의 기존의 방법을 통해 검출하는 바, 예를 들어, 효소법(enzymography), ELISA(효소결합면역흡착측정법) 및 FACS(형광활성화세포분류방법)에 기반하여 활성화된 플라스민 활성 수준을 통해 가늠하며, 예를 들어 하기의 문헌에 기재된 방법을 참조하여 측정할 수 있다. Ny, A., Leonardsson, G., Hagglund, A.C, Hagglof, P., Ploplis, V.A., Carmeliet, P.and Ny, T.(1999).Ovulation inplasminogen-deficient mice.Endocrinology 140, 5030-5035; Silverstein RL,Leung LL,Harpel PC,Nachman RL(November 1984)."Complex formation of platelet thrombospondin with plasminogen.Modulation of activation by tissue activator".J.Clin.Invest.74(5):1625-33; Gravanis I,Tsirka SE(February2008)."Tissue-type plasminogen activator as a therapeutic target in stroke".Expert Opinion on Therapeutic Targets.12(2):159-70; Geiger M,Huber K,Wojta J,Stingl L,Espana F,Griffin JH,Binder BR(Aug 1989)."Complex formation between urokinase and plasma protein C inhibitor in vitro and in vivo".Blood.74(2):722-8.

본 발명의 일부 실시형태에서, 본 발명의 “플라스미노겐 경로 활성화 성분”은 플라스미노겐이며, Glu-플라스미노겐, Lys-플라스미노겐, 미니 플라스미노겐, 마이크로 플라스미노겐, delta-플라스미노겐 또는 이들의 플라스미노겐 활성을 보유하는 변이체로부터 선택된 것이다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 천연 또는 합성된 인간 플라스미노겐, 또는 플라스미노겐 활성 및/또는 라이신 결합 활성을 여전히 보유하는 보수 돌연변이체 또는 그 단편이다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 영장류 동물 또는 설치류 동물에서 유래된 인간 플라스미노겐 이종 상동체 또는 플라스미노겐 활성 및/또는 라이신 결합 활성을 여전히 보유하는 보수 돌연변이체 또는 그 단편이다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐의 아미노산은 서열 2, 6, 8, 10 또는 12로 표시된다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 천연 인간 플라스미노겐이다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 서열 2로 표시되는 천연 인간 플라스미노겐이다.

“플라스미노겐을 직접 활성화하거나 또는 플라스미노겐 경로 활성화 상위 성분을 활성화하여 플라스미노겐을 간접적으로 활성화하는 화합물”은 플라스미노겐을 직접 활성화하거나 또는 플라스미노겐 경로 활성화 상위 성분을 활성화하여 플라스미노겐을 간접적으로 활성화하는 임의의 화합물을 가리키는 바, 예를 들어 tPA, uPA, 스트렙토키나제, 사루플라제, 알테플라제, 레테플라제, 테넥테플라제, 아니스트레플라제, 몬테플라제, 라노테플라제, 파미테플라제, 스타필로키나제이다.

본 발명의 “섬유소용해 억제제의 길항제”는 섬유 분해 억제제의 작용을 길항, 약화, 차단 및 방지하는 화합물이다. 상기 섬유 분해 억제제는 예를 들어 PAI-1, 보체 C1억제제, α2 항 플라스민 및 α2 마크로글로불린이다. 상기 길항제는 예를 들어 PAI-1, 보체 C1억제제, α2 항 플라스민 또는 α2 마크로글로불린의 항체이거나, 또는 예를 들어 PAI-1, 보체 C1억제제, α2 항 플라스민 또는 α2 마크로글로불린의 발현을 차단 또는 하향 조절하는 안티센스 RNA 또는 미니 RNA이거나, 또는 PAI-1, 보체 C1억제제, α2 항 플라스민 또는 α2 마크로글로불린의 결합 부위를 점유하지만 PAI-1, 보체 C1억제제, α2 항 플라스민 또는 α2 마크로글로불린기능이 없는 화합물”이거나, 또는 PAI-1, 보체 C1억제제, α2 항 플라스민 또는 α2 마크로글로불린의 결합 도메인 및/또는 활성 도메인을 차단하는 화합물이다.

플라스민은 플라스미노겐 활성화 시스템(PA 시스템)의 핵심 성분이다. 이는 광범위 스펙트럼의 프로테아제로서, 세포외 기질(ECM)의 몇 가지 성분을 가수 분해할 수 있고, 피브린, 젤라틴, 피브로넥틴, 라미닌 및 프로테오글리칸을 포함한다. 또한, 플라스민은 일부 메탈로프로테아제 전구체(pro-MMPs)를 활성화하여 활성 메탈로프로테아제(MMPs)를 형성할 수 있다. 따라서 플라스민은 세포외 단백질 가수 분해의 중요한 상위 조절자로 간주된다. 플라스민은 플라스미노겐이 조직형 플라스미노겐 활성제(tPA) 또는 우로키나제형 플라스미노겐 활성제(uPA)의 두 가지 생리학적 PAs를 통한 단백질 가수 분해에 의해 형성된다. 혈장 및 다른 액체에서 플라스미노겐의 수준이 상대적으로 높기에, 종래에는 PA 시스템의 조절은 주요하게 PAs의 합성과 활성 수준에 의해 구현된다고 간주하였다. PA 시스템 성분의 합성은 예컨대 호르몬, 성장 인자 및 세포 인자와 같은 상이한 요소에 의해 엄격하게 조절된다. 또한, 플라스민 및 PAs의 특정 생리학적 억제제도 존재한다. 플라스민의 주요한 억제제는 α2-항 플라스민(α2-antiplasmin)이다. PAs의 활성은 uPA 및 tPA의 플라스미노겐 활성제 억제제-1(PAI-1)에 의해 동시에 억제되며 주요하게 uPA의 플라스미노겐 활성제 억제제 -2(PAI-2)에 의해 조절된다. 일부 세포 표면에는 직접적인 가수 분해 활성을 갖는 uPA 특이적 세포 표면 수용체(uPAR)가 있다.

플라스미노겐 단쇄 당단백이고, 791개 아미노산으로 구성되며, 분자량은 대략 92 kDa이다. 플라스미노겐은 주요하게 간에서 합성되며, 세포외액에 대량으로 존재한다. 혈장에서 플라스미노겐의 함량은 대략 2μM이다. 따라서 플라스미노겐은 조직 및 체액에서 단백질 가수 분해 활성의 잠재적인 래원이다. 플라스미노겐은 글루타민산-플라스미노겐(Glu-plasminogen) 또는 라이신-플라스미노겐(Lys-plasminogen) 두 가지 분자 방식이 존재한다. 천연적으로 분비되고 절단되지 않은 방식의 플라스미노겐은 하나의 아미노 말단(N-말단) 글루타민산을 구비하기에, 따라서 글루타민산-플라스미노겐으로 불리운다. 그러나, 플라스민이 존재할 시, 글루타민산-플라스미노겐은 Lys76-Lys77에서 라이신-플라스미노겐으로 가수 분해된다. 글루타민산-플라스미노겐과 비교하면, 라이신-플라스미노겐은 피브린보다 더 높은 친화력을 가지며, 더 빠른 속도로 PAs에 의해 활성화될 수 있다. 이 두 가지 방식의 플라스미노겐의 Arg560-Val561 펩티드 결합은 uPA 또는 tPA에 의해 절단되어, 이황화 결합 연결된 이중쇄 프로테아제 플라스민을 형성한다. 플라스미노겐의 아미노 말단 부분은 5개의 상동 삼환식 고리, 즉 소위의 kringles을 포함하고, 카르복시 말단 부분은 프로테아제 도메인을 포함한다. 일부 kringles는 플라스미노겐과 피브린 및 그 억제제 α2-AP와 특이적으로 상호 작용을 매개하는 라이신 결합 부위를 포함한다. 가장 최근에 발견된 플라스미노겐은 38 kDa인 단편으로서, kringles1-4를 포함하고, 혈관에서 생성되는 효과적인 억제제이다. 이 단편은 안지오스타딘으로 명명되고, 몇 가지 프로테아제에 의한 플라스미노겐의 가수 분해에 의해 생성될 수 있다.

플라스민의 주요한 기질은 피브린이고, 피브린의 용해는 병리학적 혈전의 형성을 예방하는 관건이다. 플라스민은 또한 라미닌, 피브로넥틴, 프로테오글리칸 및 젤라틴을 포함하는 여러 ECM의 몇 가지 성분에 대한 기질 특이성을 구비하고, 플라스민이 ECM 재구성에서도 중요한 작용을 일으킨다는 것을 나타낸다. 간접적으로, 플라스민은 또한 일부 프로테아제 전구체를 활성 프로테아제로 전?하여 ECM의 다른 성분을 분해할 수 있고, MMP-1, MMP-2, MMP-3 및 MMP-9를 포함한다. 따라서, 일각에서는 플라스민은 세포외 단백질의 가수 분해의 중요한 상위 조절자일 수 있다고 제기되었다. 또한, 플라스민은 일부 잠재 방식의 성장 인자를 활성화하는 능력을 구비한다. 체외(in vitro)에서, 플라스민은 또한 보체 시스템의 성분을 가수 분해하고 주화성 보체 단편을 방출할 수도 있다.

“플라스민”은 혈액에 존재하는 매우 중요한 효소로서, 피브린 응괴를 피브린 분해 생성물 및 D-이량체로 가수 분해할 수 있다.

“플라스미노겐”은 플라스민의 자이모겐 방식으로서, swiss prot 중의 서열에 따라, 시그널 펩티드를 함유하는 천연 인간 플라스미노겐 아미노산 서열(서열 4)에 따라 계산되어 810개 아미노산으로 구성되었으며, 분자량은 대략 90 kD이고, 주요하게 간에서 합성되며 혈액에서 순환할 수 있는 당단백이고, 상기 아미노산 서열을 코딩하는 cDNA서열은 서열 3로 표시된다. 전장 플라스미노겐은 7개의 도메인을 포함하는 바, C 말단에 위치한 세린 프로테아제 도메인, N 말단의 PanApple(PAp) 도메인 및 5개 kringle 도메인(Kringle1-5)이다. swiss prot 중의 서열을 참조하면, 그 시그널 펩티드는 잔기 Met1-Gly19를 포함하고, PAp는 잔기 Glu20-Val98을 포함하며, Kringle1은 잔기 Cys103-Cys181을 포함하고, Kringle2는 잔기 Glu184-Cys262를 포함하며, Kringle3은 잔기 Cys275-Cys352를 포함하고, Kringle4는 잔기 Cys377-Cys454를 포함하며, Kringle5는 잔기 Cys481-Cys560을 포함한다. NCBI 데이터에 따르면, 세린 프로테아제 도메인은 잔기 Val581-Arg804를 포함한다.

Glu-플라스미노겐은 천연 전장 플라스미노겐으로서, 791개 아미노산으로 구성되며(19개 아미노산의 시그널 펩티드를 포함하지 않음), 상기 서열을 코딩하는 cDNA서열은 서열 1로 표시되고, 그 아미노산 서열은 서열 2로 표시된다. 체내에서, Glu-플라스미노겐의 제76-77 번째 아미노산에서 가수 분해되어 형성된 Lys-플라스미노겐이 존재할 수 있으며, 서열 6로 표시되고, 상기 아미노산 서열을 코딩하는 cDNA서열은 서열 5로 표시된다. Delta-플라스미노겐(δ-plasminogen)은 전장 플라스미노겐이 Kringle2-Kringle5 구조가 결실된 단편이고, 단지 Kringle1 및 세린 프로테아제 도메인을 포함하며, 문헌에서는 delta-플라스미노겐의 아미노산 서열(서열 8)을 공개하였고, 상기 아미노산 서열을 코딩하는 cDNA서열은 서열 7이다. 미니 플라스미노겐(Mini-plasminogen)은 Kringle5 및 세린 프로테아제 도메인에 의해 구성되고, 문헌에서는 이가 잔기 Val443-Asn791(시그널 펩티드를 함유하지 않는 Glu-플라스미노겐 서열의 Glu잔기를 시작 아미노산으로 함)을 포함하는 것을 공개하였고, 그 아미노산 서열은 서열 10으로 표시되며, 상기 아미노산 서열을 코딩하는 cDNA서열은 서열 9로 표시된다. 마이크로 플라스미노겐(Micro-plasminogen)은 단지 세린 프로테아제 도메인을 함유하고, 문헌에서 그 아미노산 서열이 잔기 Ala543-Asn791(시그널 펩티드를 함유하지 않은 Glu-플라스미노겐 서열의 Glu잔기를 시작 아미노산으로 함)을 포함한다고 공개하였고, 특허 문헌CN102154253A에서 그 서열이 잔기 Lys531-Asn791(시그널 펩티드를 함유하지 않은 Glu-플라스미노겐 서열의 Glu잔기를 시작 아미노산으로 함)을 포함한다고도 공개하였으며, 본 특허 서열은 특허 문헌 CN102154253A를 참조하였는 바, 그 아미노산 서열은 서열 12로 표시되고, 상기 아미노산 서열을 코딩하는 cDNA서열은 서열 11로 표시된다.

본 발명의 “플라스민”과 “피브리놀리신”, “섬유소 용해 효소”는 상호 혼용될 수 있고 의미가 동일하며; “플라스미노겐”과 “플라스민”, “섬유소 용해 자이모겐”은 상호 혼용될 수 있고 의미가 동일하다.

본원 발명에서, 상기 플라스미노겐 “결핍”의 의미 또는 활성은 피험자의 체내 플라스미노겐의 함량이 정상인보다 낮고, 상기 피험자의 정상적인 생리적 기능에 영향을 미칠 만큼 낮다는 것을 의미하고; 상기 플라스미노겐 “결실”의 의미 또는 활성은 피험자 체내 플라스미노겐의 함량이 정상인보다 낮고, 심지어 활성 또는 발현이 극히 미미하며, 외부 공급원을 통해서만 정상적인 생리적 기능을 유지할 수 있음을 의미한다.

본 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 플라스미노겐의 모든 기술적 해결수단은 플라스민에 적용될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명에 기재된 기술적 해결수단은 플라스미노겐 및 플라스민을 포함한다. 순환 과정에서, 플라스미노겐은 폐쇄된 비활성 형상을 사용하지만, 혈전 또는 세포의 표면에 결합할 시, 플라스미노겐 활성제(plasminogen activator, PA)의 매개하에, 이를 개방형 활성 플라스민으로 전환되도록 한다. 활성을 갖는 플라스민은 피브린 응괴를 피브린 분해 생성물 및 D-이량체로 가수 분해하여, 혈전을 용해할 수 있다. 여기서 플라스미노겐의 PAp 도메인은 비활성 폐쇄 형상으로 플라스미노겐을 유지하는 중요한 결정인자를 포함하지만, KR 도메인은 수용체 및 기질에 존재하는 라이신 잔기에 결합할 수 있다. 플라스미노겐 활성제로 이미 알려진 다양한 효소는, 조직형 플라스미노겐 활성제(tPA), 우로키나제형 플라스미노겐 활성제(uPA), 칼리크레인 및 응혈 인자 XII(하그만 인자) 등을 포함한다.

“플라스미노겐 활성 단편”은 본원 발명에서는 하기와 같은 것을 포함한다. 1) 플라스미노겐 단백질에서, 기질 중의 표적 서열과 결합할 수 있는 활성 단편은 라이신 결합 단편이라고도 하며, 예를 들어 Kringle1, Kringle2, Kringle3, Kringle4 및/또는 Kringle5를 포함하는 단편을 포함함(상기 플라스미노겐 구조는 Aisina R B, Mukhametova L I. Structure and function of plasminogen/plasminsystem[J]. Russian Journal of Bioorganic Chemistry,2014,40(6):590-605 참조바람); 2) 플라스미노겐 단백질에서 단백질 가수 분해 기능을 나타내는 활성 단편은, 예를 들어 서열 14로 표시되는 플라스미노겐 활성(단백질 가수 분해 기능)을 갖는 단편이다. 3) 플라스미노겐 단백질에서, 기질 중의 표적 서열과 결합하는 활성(라이신 결합 활성)을 구비할 뿐만 아니라 플라스미노겐 활성(단백질 가수 분해 기능)의 단편을 구비한다. 본원 발명의 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 서열 14로 표시되는 플라스미노겐 활성 단편을 포함하는 단백질이다. 본원 발명의 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 Kringle1, Kringle2, Kringle3, Kringle4및/또는 Kringle5의 라이신 결합 단편을 포함하는 단백질이다. 일부 실시형태에서, 본원 발명의 플라스미노겐 활성 단편은 서열 14, 서열 14와 적어도 80％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％의 상동성을 갖는 아미노산 서열의 단백질을 포함한다. 따라서, 본 발명의 상기 플라스미노겐은 상기 플라스미노겐 활성 단편, 또한 여전히 상기 플라스미노겐 활성을 유지하는 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원 발명의 플라스미노겐은 Kringle1, Kringle2, Kringle3, Kringle4 및/또는 Kringle5, 또는 Kringle1, Kringle2, Kringle3, Kringle4 또는 Kringle5와 적어도 80％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 상동성을 가지고 여전히 라이신 결합 활성을 구비하는 단백질을 포함한다.

현재, 혈액에서 플라스미노겐 및 그 활성을 측정하는 방법은, 조직 플라스미노겐 활성제 활성에 대한 검출(t-PAA), 혈장 조직 플라스미노겐 활성제 항원의 검출(t-PAAg), 혈장 조직 플라스미노겐 활성에 대한 검출(plgA), 혈장 조직 플라스미노겐 항원에 대한 검출(plgAg), 혈장 조직 플라스미노겐 활성제 억제제 활성의 검출, 혈장 조직 플라스미노겐 활성제 억제제 항원의 검출, 혈장 플라스민-항 플라스민 복합물 검출(PAP)을 포함한다. 여기서 가장 흔히 사용하는 검출 방법은 발색 기질 방법으로서, 스트렙토키나제(SK) 및 발색 기질을 검사할 혈장에 첨가하고, 검사할 혈장 중의 PLG는 SK의 작용하에 PLM으로 변환되며, 후자는 발색 기질에 작용하고, 이어서 분광 광도계로 측정하며, 흡광도의 증가는 플라스미노겐 활성과 정비례한다. 또한, 면역 화학법, 겔 전기영동, 면역 탁도법, 방사선 면역 확산법 등을 사용하여 혈액 중의 플라스미노겐 활성을 측정할 수도 있다.

“오르토로구 또는 오솔로그(ortholog)”는 단백질 상동체 및 DNA 상동체를 모두 포함하는 상이한 종 간의 상동체를 말하며, 이들은 또한 이종 상동체 및 수직 상동체로도 알려져 있다. 이는 특히 다른 종의 동일한 선조 유전자에서 진화된 단백질 또는 유전자를 가리킨다. 본 발명의 플라스미노겐은 인간 천연 플라스미노겐을 포함하며, 또한 플라스미노겐 활성을 갖는 상이한 종 유래 플라스미노겐의 오르토로구 또는 오솔로그를 포함한다.

“보존적 치환 변이체”는 그 중의 이미 결정된 아미노산 잔기가 변화되지만 단백질 또는 효소의 전반적인 배좌 및 기능은 변화되지 않은 것을 가리키는 바, 이는 유사한 특성(예컨대 산성, 알칼리성 또는 소수성 등)의 아미노산으로 모 단백질(parent protein)에서 아미노산 서열 중의 아미노산을 치환하는 것을 포함하지만 이에 한하지 않는다. 유사한 성질을 갖는 아미노산은 자명한 것이다. 예를 들어, 아르기닌, 히스티딘 및 라이신은 친수성 알칼리성 아미노산이며 호환 가능하다. 마찬가지로, 이소류신은 소수성 아미노산이고, 류신, 메티오닌 또는 발린으로 대체될 수 있다. 따라서, 유사한 기능의 두 개의 단백질 또는 아미노산 서열의 유사성은 상이할 수 있다. 예를 들어, MEGALIGN 알고리즘에 기반한 70％ 내지 99％의 유사도(동일성)를 가진다. “보존 치환 변이체”는 또한 BLAST 또는 FASTA 알고리즘에 의해 60% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 90% 이상의 아미노산 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 효소를 포함하는 것으로 결정되고, 천연 또는 모 단백질 또는 효소와 동일하거나 실질적으로 유사한 특성 또는 기능을 갖는다.

“분리된” 플라스미노겐은 자연 환경에서 분리 및/또는 회수된 플라스미노겐 단백질을 가리킨다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 90％보다 크고, 95％보다 크며, 98％보다 큰 순도로 정제될 수 있으며(중량계)(1), 예컨대 Lowry법을 통해 결정되고, 예를 들어 99％(중량계에 따름)를 초과하며, 스피닝 컵 서열 분석기를 사용하여 N단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 수득하기에 충분한 정도(2), 또는 동질성(3)을 수득하기에 충분하고, 상기 동질성은 쿠마시 블루 또는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건하에 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 결정된 것이다. 분리된 플라스미노겐은 생물 공학 기술에 의해 재조합 세포로부터 제조되고, 적어도 하나의 정제 단계에 의해 분리된 플라스미노겐을 포함한다.

용어 “폴리펩티드”, “펩티드” 및 “단백질”은 본문에서 상호 혼용되며, 유전적으로 코딩된 아미노산 및 비유전적으로 코딩된 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된 또는 유도된 아미노를 포함할 수 있는 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태 및 변형된 펩티드 골격을 갖는 폴리펩티드를 가리킨다. 상기 용어는 융합 단백질을 포함하고, 이종 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을 포함하지만 이에 한하지 않고, 이종 및 상동 리더 서열을 갖는(N-말단 메티오닌 잔기가 있거나 없는) 융합물 등을 구비한다.

참조 폴리펩티드 서열에 대한 “아미노산 서열 동일성 백분율(％)”은 필요 시 갭을 도입하여 최대 백분율 서열 동일성을 실현한 후, 임의의 보존 대체를 서열 동일성의 일 부분으로 간주하지 않을 시, 후보 서열에서 참조 폴리펩티드 서열 중의 아미노산 잔기와 동일한 아미노산 잔기의 백분율로 정의한다. 백분율 아미노산 서열 동일성을 측정하는 목적의 대조는 본 기술분야 내의 다양한 방식으로 실현될 수 있는 바, 예를 들어 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같이 대중적으로 얻을 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용한다. 본 기술분야의 통상의 기술자는 서열을 비교하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있으며, 비교된 서열 전장에 대해 최대 대조에 필요한 임의의 알고리즘을 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 아미노산 서열 동일성 백분율의 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다.

ALIGN-2를 사용하여 아미노산 서열을 비교할 경우, 주어진 아미노산 서열 A는 주어진 아미노산 서열 B에 대한 ％아미노산 서열 동일성(또는 주어진 아미노산 서열 B에 대해 특정 ％아미노산 서열 동일성을 구비하거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 표현 가능함)은 하기와 같이 산출한다.

분수 X/Y×100

여기서 X는 서열 대조 프로그램 ALIGN-2가 상기 프로그램의 A와 B의 대조에서 평점이 서로 매칭되는 아미노산 잔기의 개수이고, 여기서 Y는 B 중의 아미노산 잔기의 총수이다. 아미노산 서열 A의 길이는 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않을 경우, A가 B에 대한 ％아미노산 서열 동일성은 B가 A에 대한 ％아미노산 서열 동일성과 상이할 수 있다. 별도로 명확하게 설명하지 않는 한, 본문에서 사용되는 모든 ％아미노산 서열 동일성의 값은 여전히 상기 내용을 참조하여, ALIGN-2컴퓨터 프로그램을 사용하여 획득한 것이다.

본문에서 사용되는 용어 “치료”는 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미한다. 상기 효과는 질병 또는 그 증상의 완전한 또는 부분적 예방, 및/또는 질병 및/또는 그의 증상의 부분적 또는 완전한 치유일 수 있으며, (a) 피험자의 체내에서 질병의 발생을 예방하는 것(상기 피험자는 질병에 대한 소인이 있지만 질병이 있는 것으로 진단되지 않았을 수 있음); (b) 질병의 억제, 즉 질병의 발달을 차단하는 것; 및 (c) 질병 및/또는 그의 증상의 완화, 즉 질병 및/또는 그의 증상의 해소를 포함한다.

용어 “대상”, “피험자” 및 “환자”는 본문에서 상호 혼용되며, 쥐(래트 및 마우스), 비인간 영장류, 인간, 개, 고양이, 발굽이 있는 동물(예를 들어, 말, 소, 양, 돼지, 염소) 등을 포함하지만 이에 한하지 않는다.

“치료 유효량” 또는 “유효량”은 포유 동물 또는 다른 피험자에 대해 투여하여 질병을 치료할 시 질병에 대한 예방 및/또는 치료하는 플라스미노겐의 양을 말한다. “치료 유효량”은 사용되는 플라스미노겐, 치료하고자 하는 피험자의 질병 및/또는 그 증상의 심각성 및 연령, 체중 등에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 플라스미노겐의 제조

플라스미노겐은 자연계에서 분리 및 정제되어 추가로 치료의 용도를 위한 것일 수 있고, 표준 화학 펩티드 합성 기술에 의해 합성될 수도 있다. 화학적으로 폴리펩티드를 합성할 시, 액상 또는 고상으로 합성될 수 있다. 고상 폴리펩티드 합성(SPPS)(서열 C의 말단 아미노산이 불용성 지지체에 부착된 후, 서열의 나머지 아미노산이 순차적으로 첨가됨)은 플라스미노겐 화학적 합성에 적합한 방법이다. Fmoc 및 Boc와 같은 다양한 방식의 SPPS를 플라스미노겐의 합성에 사용할 수 있다. 고상 합성을 위한 기술적 서술은 Barany 및 Solid-Phase Peptide Synthesis; 제3-284페이지 The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology.제2권: Special Methods in Peptide Synthesis,Part A.,Merrifield,등 J.Am.Chem.Soc., 85:2149-2156(1963); Stewart등,Solid Phase Peptide Synthesis,2nded.Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.(1984); 및 Ganesan A.2006MiniRev.Med Chem.6:3-10 및 Camarero JA 등 2005 Protein Pept Lett.12:723-8에 있다. 간단하게 말하자면, 작은 불용성 다공성 비드는 펩티드 사슬이 구성된 기능 단위로 처리된다. 커플링/탈보호가 반복 순환된 후, 부착된 고상 유리 N 말단 아민과 단일 N 보호된 아미노산 단위에 커플링된다. 그 다음, 이 단위를 탈호보하고, 다른 아미노산에 부착될 수 있는 새로운 N 말단 아민을 노출시킨다. 펩티드는 고상에 고정된 것을 유지하고, 나중에 절단한다.

표준 재조합 방법을 사용하여 본 발명의 플라스미노겐을 생산할 수 있다. 예를 들어, 플라스미노겐을 코딩하는 핵산이 발현 담체에 삽입되어, 발현 담체 중의 조절 서열에 작동 가능하게 연결되도록 한다. 발현 조절 서열은 프로모터(예를 들어 자연적으로 연관되거나 이종 프로모터), 신호 서열, 인핸서 요소, 및 전사 종결 서열을 포함하지만 이에 한하지 않는다. 발현 조절은 담체 중의 진핵 프로모터 시스템일 수 있으며, 상기 담체는 진핵 숙주 세포(예를 들어 COS 또는 CHO 세포)를 형질 전환 또는 형질 감열시킬 수 있다. 일단 담체가 적합한 숙주에 결합되면, 숙주는 뉴클레오티드 서열의 고수준 발현 및 플라스미노겐의 수집 및 정제에 적합한 조건하에 유지된다.

적합한 발현 담체는 통상적으로 숙주 생물체에서 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 정합 부분으로서 복제된다. 통상적으로, 발현 담체는 선택적 마커(예를 들어 암피실린 내성, 하이그로마이신 내성, 테트라사이클린 내성, 카나마이신 내성 또는 네오마이신 내성)를 포함하여 원하는 DNA 서열로 형질 전환된 외인성 세포의 검출을 용이하게 한다.

대장균(Escherichiacoli)은 플라스미노겐의 코딩 폴리뉴클레오티드를 복제하는 데 사용할 수 있는 원핵 숙주 세포의 예이다. 사용하기에 적합한 다른 미생물 숙주는 Bacillus subtilis와 같은 Bacillus, 및 Salmonella, Serratia 및 다양한 Pseudomonas 종과 같은 장내세균과의 다른 종을 포함한다. 이들의 원핵 숙주에서, 발현 담체가 생성될 수도 있고, 이들은 전형적으로 숙주 세포와 양립할 수 있는 발현 조절 서열(예를 들어, 복제 기점)을 포함할 것이다. 또한, 락토스 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, beta-락타마제 프로모터 시스템 또는 파지 λ의 프로모터 시스템과 같이 잘 알려진 프로모터가 많이 있을 수 있다. 프로모터는 통상적으로 발현을 제어할 수 있고, 임의로 유전자 서열을 조작할 경우, 리보솜 결합 부위 서열 등을 구비하며, 전사 및 번역을 시작 및 완성한다.

효모와 같은 다른 미생물도 발현에 사용될 수 있다. 사카로마이세스(예를 들어 S. cerevisiae) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)는 적합한 효모 숙주 세포의 예이며, 적절한 담체가 필요에 따라 발현 조절 서열(예를 들어 프로모터), 복제 기점, 종결 서열 등을 갖는다. 전형적인 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제 및 기타 해당 효소를 포함한다. 유도성 효모 촉진제는 구체적으로 에탄올 탈수소효소, 이소시토크롬 C, 말토오스 및 갈락토오스 이용을 담당하는 효소에서 유래한 촉진제를 포함한다.

미생물 외에도, 포유 동물 세포(예를 들어 체외 세포 배양물에서 배양된 포유 동물 세포)도 본 발명의 플라스미노겐(예를 들어 플라스미노겐을 코딩하는 폴리뉴클레오티드)을 발현 및 생성할 수도 있다. Winnacker, From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.(1987)를 참조 바란다. 적합한 포유 동물 숙주 세포는 CHO 세포계, 다양한 Cos 세포계, HeLa 세포, 골수종 세포계, 및 형질 전환된 B 세포 또는 하이브리도마를 포함한다. 이러한 세포에 대한 발현 담체는 발현 제어 서열을 포함할 수 있는 바, 예컨대 복제 기점, 프로모터 및 인핸서(Queen 등, Immunol.Rev.89:49(1986)), 및 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결자 서열과 같이 가공이 필요한 정보 부위이다. 적합한 발현 조절 서열의 예는 면역글로불린 유전자, SV40, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스, 거대세포바이러스 등으로부터 유래된 프로모터이다. Co 등,J. Immunol.148:1149(1992)를 참조 바란다.

일단 합성(화학적 또는 재조합적으로)되면, 본 발명의 플라스미노겐은 황산암모늄 침전, 친화성 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 겔 전기영동 등을 포함하는 본 기술분야의 표준 절차에 따라 규정될 수 있다. 상기 플라스미노겐은 예를 들어, 적어도 약 80% 내지 85%, 적어도 약 85% 내지 90%, 적어도 약 90% 내지 95%, 또는 98% 내지 99% 이상의 순도로 기본상 순수하며, 세포 파괴물, 플라스미노겐 이외의 거대 분자 등과 같은 오염 물질이 없다.

약학 제제

원하는 순도를 갖는 플라스미노겐을 선택 가능한 약용 담체, 부형제, 또는 안정제(Remington's Pharmaceutical Sciences,16판, Osol,A.ed.(1980))와 혼합하여 동결 건조 제제 또는 수용액을 형성하여 치료 제제를 제조할 수 있다. 허용 가능한 담체, 부형제, 안정제는 사용된 용량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 예를 들어 인산염, 구연산염 및 다른 유기산과 같은 완충제; 항산화제는 아스코르빈산 및 메티오닌을 포함하며; 방부제(예를 들어 옥타데실 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드; 헥산디아민 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드(benzalkonium chloride), 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부탄올 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 p-하이드록시벤조에이트와 같은 알킬 p-하이드록시벤조에이트; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; m-크레졸); 저분자량 폴리펩티드(약 10개 미만의 잔기); 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 고분자; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 포도당, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 푸코스 또는 소르비톨과 같은 탄수화물; 나트륨과 같은 염 형성 반대 이온; 금속 착물(예를 들어 아연-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEEN™, PLURONICS™, 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.

본 발명의 제형은 또한 치료될 특정 질병에 필요한 하나 이상의 활성 화합물을 포함할 수 있고, 바람직하게는 활성이 상보적이고 서로 부작용이 없는 것들을 포함한다. 예를 들어, 고혈압, 부정맥 및 당뇨병 치료용 약제를 포함할 수 있다.

본 발명의 플라스미노겐은 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합과 같은 기술에 의해 제조된 마이크로캡슐에 캡슐화될 수 있으며, 예를 들어 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에 혼입될 수 있거나 또는 매크로에멀젼의 히드록시메틸 셀룰로스 또는 겔-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸 메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 혼입된다. 이러한 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 16^th edition,Osol,A.Ed.(1980)에 공개되었다.

체내 투여를 위한 본 발명의 플라스미노겐은 멸균되어야 한다. 이는 동결건조 및 재조제 전 또는 후에 멸균용 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 실현될 수 있다.

본 발명의 플라스미노겐은 서방형 제제로 제조될 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예는 일정 형태를 구비하고 당단백, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐을 포함하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함한다. 서방형 기질의 예는 폴리에스테르, 히드로겔(예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트))(Langer et al. J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981) 및 Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)), 또는 폴리(비닐 알코올), 폴리락티드(미국 특허 3,773,919 및 EP 58,481), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루탐산의 공중합체(Sidman et al. , Biopolymers 22:547(1983)), 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트(Langer et al. supra), 또는 Lupron DepotTM(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드로 구성된 주사 가능한 미소구체)와 같은 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 아세테이트), 및 폴리 D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 젖산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상 동안 분자를 지속적으로 방출할 수 있는 반면 일부 하이드로겔은 더 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 단백질 안정화를 위한 합리적인 전략은 관련 메커니즘에 따라 설계될 수 있다. 예를 들어, 응집 메커니즘이 이활화 교환을 통해 분자간 S-S 결합을 형성하는 것으로 밝혀지면, 술프하이드릴 잔류물을 수정하고, 산성 용액에서 동결 건조하고, 수분 함량을 조절하며, 적절한 첨가제를 사용하고, 특정 고분자 매트릭스 조성을 개발하여 안정성을 실현할 수 있다.

투여 및 용량

본 발명의 약학적 조성물은 예를 들어 정맥내, 복강내, 피하, 두개내, 척추강내, 동맥내(예를 들어, 경동맥을 통해), 근육내 투여와 같은 다양한 방식으로 투여될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제조물은 멸균된 수성 또는 비수성 용액, 서스펜션액 및 유제를 포함한다. 비수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름 및 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 유기 에스테르가 있다. 수성 담체에는 물, 알코올/수성 용액, 에멀젼 또는 서스펜션액이 포함되고 염수 및 완충 매질을 포함한다. 비경구 매개체에는 염화나트륨 용액, 링거 포도당, 포도당 및 염화나트륨, 또는 고정유가 포함된다. 정맥내 매개체에는 액체 및 영양 보충제, 전해질 보충제 등이 포함된다. 방부제 및 기타 첨가제, 예를 들어 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 가스 등이 존재할 수도 있다.

의료진은 다양한 임상적 요소에 따라 용량 방안을 결정할 수 있다. 의학 분야에서 주지된 바와 같이, 임의의 환자의 용량은 다양한 요소에 의해 결정되며, 환자의 체형, 체표 면적, 연령, 투여하고자 하는 구체적인 화합물, 성별, 투여 횟수 및 경로, 전반적인 건강, 함께 투여되는 다른 약물을 포함한다. 본 발명에서 플라스미노겐을 포함하는 약학적 조성물의 용량 범위는 매일 약 0.0001 내지 2000 mg/kg, 또는 약 0.001 내지 500 mg/kg(예를 들어 0.02 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.75 mg/kg, 10 mg/kg, 50 mg/kg 등) 피험자 체중이다. 예를 들어, 용량은 1 mg/kg체중 또는 50 mg/kg체중 또는 1-50 mg/kg의 범위일 수 있거나, 적어도 1 mg/kg일 수 있다. 특히 상기 요소를 고려하면 이 예시적인 범위의 용량보다 높거나 낮은 것도 포함된다. 상기 범위 중의 중간 용량도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 피험자는 매일, 격일로, 매주 또는 경험적 분석에 의해 결정된 임의의 다른 일정에 따라 이러한 투여량으로 투여될 수 있다. 예시적인 용량의 스케쥴은 연속 며칠 동안 1-10 mg/kg을 포함한다. 본 발명의 약물 투여 과정에서 치료 효과 및 안전성에 대해 실시간으로 평가해야 한다.

제품 또는 키트

본 발명의 일 실시형태는 제품 또는 키트에 관한 것으로서, 이는 당뇨병으로 인한 심혈관 질환 및 그 관련 질병을 치료하기 위한 본 발명의 플라스미노겐 또는 플라스민을 포함한다. 상기 제품은 바람직하게 하나의 용기, 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적당한 용기는 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 만들 수 있다. 상기 용기는 본 발명의 질병 또는 장애를 치료하는 데 효과적인 조성물을 함유하고 멸균 입구를 구비한다(예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 플러그를 포함하는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 상기 조성물 중 적어도 하나의 활성제는 플라스미노겐/플라스민이다. 상기 용기 상의 또는 부착된 라벨은 조성물이 본 발명의 당뇨병으로 인한 심혈관 질환 및 관련 장애의 치료에 사용됨을 나타낸다. 상기 제품은 포스페이트 완충 식염수, 링거 용액 및 포도당 용액과 같은 약제학적으로 허용되는 완충제를 함유하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 요구되는 기타 물질을 더 포함할 수 있다. 또한, 제품은 예를 들어 환자에게 플라스미노겐 조성물 및 수반되는 질병을 치료하기 위한 기타 약제를 투여하기 위한 조성물의 사용자에 대한 지침을 포함하는 사용 지침이 있는 패키지 삽입물을 포함한다.

실시예

실시예 1: 플라스미노겐이 근위축성 측삭 경화증 모델 마우스의 수명 및 중앙 생존 기간을 연장

본 실시예에서 사용되는 인간 플라스미노겐은 공여자 혈장에서 유래된 것이며, 문헌^[1-3]에 기재된 방법에 따라 공정을 최적화하여 정제하여 얻은 것이다. 인간 플라스미노겐 단량체의 순도는 >95％이다. 하기의 모든 실시예는 동일하다.

형질 전환 돌연변이 SOD1은 산발형 및 가족성 근위축성 측삭 경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS)은 임상에서 관찰되는 조직 병리학적 특징을 구비한다. 본원 발명의 ALS 모델 마우스는 B6.Cg-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J 형질 전환 마우스(약칭 SOD1-G93A)이고, Jackson 실험실에서 구입하였으며, SPF 환경에서 동물 관련 실험을 수행하였다. SOD1-G93A 모델 마우스는 약 100일차에 뒷다리 떨림이 발생하였고, 이후 상태가 빠르게 악화되었으며, 50％의 생존율은 157.1±9.3일^[4]이었다. 현재 ALS의 메커니즘에 광범위하게 응용되는 연구 및 신약 개발의 임상전 실험을 여전히 진행중이다.

16주령 SOD1-G93A 수컷 마우스 9 마리를 취하여 체중에 따라 무작위로 두 그룹으로 나누고, 용매 대조군 5마리와 플라스미노겐 투여군 4마리이며, 용매 대조군의 마우스의 꼬리 정맥에 용매(PBS, pH 7.4)를 0.1 ml/day의 용량으로 주사하고, 플라스미노겐 투여군의 마우스의 꼬리 정맥에 플라스미노겐을 1 mg/0.1 ml/마리/일의 용량으로 주사하였으며, 생쥐의 생존 상황을 매일 관찰하고 기록하였다.

그 결과, 플라스미노겐 투여군 마우스 평균 수명은 164±8.6일이고, 용매 대조군 마우스 평균 수명은 153±0일이며, 플라스미노겐 투여군 수명은 용매 대조군에 비해 약 11일 연장되었고(도 1a); 플라스미노겐 투여 마우스 중앙 생존 기간은 53±9일이며, 용매 대조군 중앙 생존 기간은 40±0일이고, 플라스미노겐 투여군 중앙 생존 기간은 용매 대조군에 비해 약 13일 연장되었고, 약 30％(도 1b) 증가되었다. 상기 결과는 플라스미노겐이 ALS 마우스 수명 및 중앙 생존 기간을 연장할 수 있음을 나타낸다.

실시예 2: 플라스미노겐이 ALS 모델 마우스 신경 근육 기능을 개선

16주령 SOD1-G93A 수컷 마우스 9마리를 취하여, 체중에 따라 마우스를 무작위로 두 그룹으로 나누며, 용매 대조군 5마리 및 플라스미노겐 투여군 4마리이고, 용매 대조군 마우스는 꼬리 정맥에 0.1ml/일의 용량으로 용매(PBS, pH 7.4)를 주입하고, 플라스미노겐 투여군 마우스는 꼬리 정맥에 1mg/0.1ml/마리/일의 용량으로 플라스미노겐을 주사하였으며, 연속 34일 투여하고, 투여하기 시작한 날을 0일로 하고, 투여 6, 8, 12, 16, 21, 23, 27, 30, 34일차에 하기의 서스펜션 그립 강도 테스트를 수행하여, 플라스미노겐이 ALS 모델 마우스 신경 근육 기능에 대한 약효 작용을 고찰하였으며, 또한 하기와 같이 ALS 마우스 신경 행동학 표현을 통계 분석하였다.

서스펜션 그립 강도 테스트

서스펜션 실험은 일반적으로 마우스의 운동 능력(근육)을 평가하는 데 사용된다. 단일 마우스를 마우스 케이지의 금속 덮개에 놓고 덮개를 부드럽게 흔들어 마우스가 덮개를 잡도록 한 다음 덮개를 뒤집는다. 마우스가 두 뒷다리를 느슨해지는 잠복 시간을 기록하였다^[5]. 각 마우스에 대해 3개의 실험을 수행하며, 단일 실험의 최장 지속 시간은 90초이며 각 마우스의 가장 긴 잠복 시간을 통계 분석에 사용하였다.

그 결과, 투여 기간에 두 그룹의 마우스 서스펜션 잠복 시간이 모두 감소하였으나, 플라스미노겐 투여군 마우스 서스펜션 잠복 시간은 용매 대조군 마우스보다 항상 길었으며, 투여 6, 21, 23일차에, 플라스미노겐 투여군 서스펜션 잠복 시간을 용매군과 비교하였는데, 통계적 차이는 유의하거나 극히 유의하며, P값은 각각 0.03, 0.02, 0.008(도 2)이다. 플라스미노겐은 ALS 마우스 근력 감퇴를 지연시킬 수 있음을 설명한다.

ALS 운동 이상 특성화 점수는 아래와 같다. 0점: 운동 기능 장애의 징후 없음; 1점: 꼬리 서스펜션 동안 뒷다리의 현저한 떨림이 있음; 2점: 비정상적인 보행, 75cm 보행 과정에서 발가락이 2회 이상 말리거나 케이지 바닥을 따라 다리가 끌림; 3점: 최소 1일 후 뒷다리가 끌리고, 뻣뻣하고 무력하며(강직 마비), 다리를 앞으로 움직일 수 없음; 4점: 마우스를 앙와위 자세로 놓고 30초 이내에 엎드린 자세로 뒤집을 수 없음(사망에 가까운 것으로 판단)^[5].

그 결과, 플라스미노겐 투여군 마우스의 2점 신경 표현의 시간은 용매 대조군보다 유의하게 늦고, 통계적 차이가 유의했다(*은 P<0.05를 표시함)(도 3).

상기 결과는, 플라스미노겐이 ALS 질환의 근력 감퇴를 유의하게 지연시키고, ALS 질환의 진행을 지연시킬 수 있음을 나타낸다.

실시예 3: 플라스미노겐이 ALS 모델 마우스 체중의 감소를 완화

유사한 주령의 야생형 마우스 20마리, 수컷 SOD1-G93A 마우스 29마리 및 암컷 SOD1-G93A 마우스 31마리를 취하였다. 야생형 마우스는 블랭크 대조군으로 사용되며(투여 처리가 수행되지 않음). SOD1-G93A 마우스는 14주차에 발병 후 다리 떨림이 발생했을 때 관찰 및 기록하고, 각 마우스의 발병 시간을 기록하고, 발병 후 14일차에 투여를 시작하였다. 모든 마우스를 질병의 발병에 따라 용매 대조군과 플라스미노겐 투여군으로 무작위로 나누고, 여기서 용매 대조군 마우스 32마리에 대해, 매일 0.1ml/마리의 용량으로 용매(10mM구연산 나트륨 완충액, pH 7.4)를 꼬리 정맥에 주사하며; 플라스미노겐 투여군 28마리에 대해, 매일 1mg/0.1 ml/마리의 용량으로 플라스미노겐을 꼬리 정맥에 주사하고, SPF 환경하에서 연속 35일 동안 투여하였다. 투여하기 시작한 날을 0일차로 하고, 투여 기간 동안 3일에 한 번씩 체중을 측정하고, 플라스미노겐이 ALS 모델 마우스 체중 감소에 대한 영향을 고찰하였다.

ALS는 통상적으로 현저한 체중 감소를 수반하는데 이는 ALS의 주요한 특징 중의 하나이다^[5]. 매 번 체중 측정 결과를 0일차 체중으로 표준화 처리하는 바, 즉, 매 번 체중 측정 값/0일차 체중 *100이다.

그 결과, 투여 기간에, 블랭크 대조군의 마우스는 체중 파동이 크지 않고, 점차 상승하는 추세이며; 용매 대조군 마우스는 체중이 점차 감소하였고; 플라스미노겐 투여 그룹 마우스는 체중이 처음 25일 동안은 파동이 비교적 크지만, 모두 블랭크 대조군 체중보다 크거나 근접하였고, 25일 후에는 체중이 점차 감소하였지만, 용매 대조군 마우스 체중보다 항상 컷으며, 용매 대조군과 비교하면, P값은 0.001보다 작거나 근접하였다(도 4). 플라스미노겐은 ALS 모델 마우스 체중 감소의 속도를 유의하게 완화시킬 수 있고, ALS 병세의 악화를 지연할 수 있음을 설명한다.

실시예 4: 플라스미노겐이 ALS 모델 마우스 척수 전각 액포 면적을 감소

비슷한 주령을 가지는 야생형 수컷 마우스 5 마리 및 수컷 SOD1-G93A 마우스 9 마리를 취하였다. 야생형 마우스는 블랭크 대조군으로 하고, SOD1-G93A 마우스는 14주차에 뒷다리 떨림이 발생하였을 때부터 관찰 기록하기 시작하며, 각 마우스의 발병 시간을 기록하고, 발병 14일 후부터 투여하기 시작하며, 모든 마우스는 발병 상황에 따라 무작위로 용매군 및 투여군으로 나누고, 여기서 용매군 마우스 5 마리는, 꼬리 정맥에 매일 0.1ml/마리의 용량으로 용매(10mM구연산 나트륨 완충액, pH 7.4)를 주사하고; 투여군 4마리는, 꼬리 정맥에 매일 1mg/0.1ml/마리의 용량으로 플라스미노겐을 주사하며, SPF 환경에서 연속 투여하고, 사망시 채취하며, 최대 61일 동안 투여하였다. 척수를 채취하여 포르말린 고정액으로 고정하였다. 고정된 후의 조직은 알코올 구배에 의해 탈수하고 자일렌으로 투명하게 한 후 파라핀에 포매하였다. 절편의 두께는 3μm이고, 절편을 탈파라핀화 및 재수화한 후 1회 물세척하며, 헤마톡실린 염료로 10 min 동안 염색한 후, 물로 5 min 동안 세척하며, 1％ 염산 에탄올로 10초 동안 분화하고, 흐르는 물에 10분 동안 세척하며, 0.2％의 에오신 염료로 10초 동안 염색하고, 알코올 구배에 의해 탈수하고 투명하게 하여 밀봉하였다. 절편은 400배 광학 현미경으로 관찰하였다.

척수 전각 운동 뉴런의 변성과 사망은 ALS의 주요한 병리적 특징 중의 하나이다^[6]. 그 결과, 블랭크 대조군(도 5의 A) 마우스의 척수 전각은 일정 수준의 액포 면적을 나타내고, 용매군(도 5의 B) 마우스의 척수 전각 액포 면적은 블랭크 대조군(P<0.001)보다 유의하게 컸으며, 투여군(도 5의 C) 마우스의 척수 전각 액포 면적은 용매군보다 유의하게 작았고, 통계적 차이도 극히 유의했다(도 5의 D). 플라스미노겐은 ALS 모델 마우스 척수 전각 액포 면적을 감소할 수 있고, 척수 전각 운동 뉴런의 사멸을 감소시킬 수 있음을 설명한다.

실시예 5: 플라스미노겐이 ALS 모델 마우스 척수 전각에서 콜린 아세틸전이효소의 발현을 촉진

주령이 비슷한 야생형 수컷 마우스 5 마리 및 수컷 SOD1-G93A마우스 9 마리를 취하였다. 야생형 마우스를 블랭크 대조군으로 하고, SOD1-G93A마우스는 14주차에 뒷다리 떨림이 발생하였을 때부터 관찰 기록하기 시작하며, 각 마우스의 발병 시간을 기록하고, 발병 14일 후부터 투여하기 시작하며, 모든 마우스는 발병 상황에 따라 무작위로 용매군 및 투여군으로 나누고, 여기서 용매군 마우스 5 마리는, 꼬리 정맥에 매일 0.1ml/마리의 용량으로 용매(10mM구연산 나트륨 완충액, pH 7.4)를 주사하고; 투여군 4마리는, 꼬리 정맥에 매일 1mg/0.1ml/마리의 용량으로 플라스미노겐을 주사하며, SPF 환경에서 연속 투여하고, 사망시 채취하며, 최대 61일 동안 투여하였다. 척수를 채취하여 포르말린 고정액으로 고정하였다. 고정된 후의 조직은 알코올 구배에 의해 탈수하고 자일렌으로 투명하게 한 후 파라핀에 포매하였다. 조직 절편의 두께는 3μm이고, 절편을 탈파라핀화 및 재수화한 후 1회 물세척하였다. 조직을 PAP 편으로 원을 그리며, 3%의 과산화수소로 15분 동안 배양하고, 0.01M PBS로 2회 세척하되 회당 5분 동안 세척하였다. 5％의 정상 염소 혈청(Vector laboratories,Inc.,USA)으로 30분 동안 차단하고; 시간이 되면, 염소 혈청액을 폐기하고, 토끼 유래 항콜린 아세틸전이효소 항체(ab178850,Abcam)를 적가하여 4℃로 하룻밤 배양하며, 0.01M PBS로 2회 세척하되 회당 5분 동안 세척하였다. 염소 항 토끼 IgG(HRP) 항체(Abcam) 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 배양하고, 0.01M PBS로 2회 세척하되 회당 5분 동안 세척하였다. DAB 키트(Vector laboratories,Inc.,USA)에 따라 발색하고, 3회 물세척한 후 헤마톡실린으로 30초 동안 대조 염색하며, 흐르는 물로 5분 동안 세척하였다. 알코올 구배에 의해 탈수하고, 크실렌으로 투명하게 하며 중성 검으로 밀봉하며, 절편은 400배 광학 현미경으로 관찰하였다.

콜린 아세틸전이효소(chAT)는 콜린성 뉴런의 표지 효소이고, 신경 세포 내에서 합성된다. 연구에 따르면 ALS동물 모델의 동물 척수 운동 뉴런과 환자 체내 chAT 수준이 감소했다^[7,8].

그 결과, 블랭크 대조군(도 6의 A) 마우스 척수 전각은 일정한 양의 chAT가 발현되었고, 용매군(도 6의 B) 마우스 chAT 발현 수준은 블랭크 대조군의 마우스보다 유의하게 낮으며, 투여군(도 6의 C) 마우스 척수 전각 chAT의 발현 수준은 용매군 마우스보다 유의하게 높고, 통계학적 차이가 유의하였다(P<0.05)(도 6의 D). TP01HN106가 SOD1-G93A마우스 척수 전각 chAT의 합성과 발현을 촉진할 수 있고, 콜린성 뉴런 기능 회복을 촉진할 수 있음을 설명한다.

실시예 6: 플라스미노겐이 ALS 모델 마우스 척수 전각 시냅토파이신의 발현을 촉진

주령이 비슷한 야생형 수컷 마우스 5 마리 및 수컷 SOD1-G93A마우스 9 마리를 취하였다. 야생형 마우스를 블랭크 대조군으로 하고, SOD1-G93A마우스는 14주차에 뒷다리 떨림이 발생하였을 때부터 관찰 기록하기 시작하며, 각 마우스의 발병 시간을 기록하고, 발병 14일 후부터 투여하기 시작하며, 모든 마우스는 발병 상황에 따라 무작위로 용매군 및 투여군으로 나누고, 여기서 용매군 마우스 5 마리는, 꼬리 정맥에 매일 0.1ml/마리의 용량으로 용매(10mM구연산 나트륨 완충액, pH 7.4)를 주사하고; 투여군 4마리는, 꼬리 정맥에 매일 1mg/0.1ml/마리의 용량으로 플라스미노겐을 주사하며, SPF 환경에서 연속 투여하고, 사망시 채취하며, 최대 61일 동안 투여하였다. 척수를 채취하여 포르말린 고정액으로 고정하였다. 고정된 후의 조직은 알코올 구배에 의해 탈수하고 자일렌으로 투명하게 한 후 파라핀에 포매하였다. 조직 절편의 두께는 3μm이고, 절편을 탈파라핀화 및 재수화한 후 1회 물세척하며. 조직을 PAP 편으로 원을 그리며, 3%의 과산화수소로 15분 동안 배양하고, 0.01M PBS로 2회 세척하되 회당 5분 동안 세척하였다. 5％의 정상 염소 혈청(Vector laboratories,Inc.,USA)으로 30분 동안 차단하고; 시간이 되면, 염소 혈청액을 폐기하고, 토끼 유래 항콜린 시냅토파이신 항체(17785-1-AP,Proteintech)를 적가하여 4℃로 하룻밤 배양하며, 0.01M PBS로 2회 세척하되 회당 5분 동안 세척하였다. 염소 항토끼 IgG(HRP) 항체(Abcam) 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 배양하고, 0.01M PBS로 2회 세척하되 회당 5분 동안 세척하였다. DAB 키트(Vector laboratories,Inc.,USA)에 따라 발색하고, 3회 물세척한 후 헤마톡실린으로 30초 동안 대조 염색하며, 흐르는 물로 5분 동안 세척하였다. 알코올 구배에 의해 탈수하고, 크실렌으로 투명하게 하며 중성 검으로 밀봉하며, 절편은 400배 광학 현미경으로 관찰하였다.

시냅토파이신(synaptophysin)은 측삭의 성장과 시냅스 형성의 신호로 시냅스 전막의 인산화된 단백질로 시냅스의 유연성과 밀접하게 관련된다. ALS 모델 마우스는 임상 증상이 나타나기 전에 현저한 시냅스 변성과 운동 뉴런 세포체의 손실을 보였다^[9].

그 결과, 블랭크 대조군(도 7의 A) 마우스 척수 전각은 일정 수준의 시냅토파이신이 발현되었고, 용매군(도 7의 B) 마우스 시냅토파이신의 발현 수준은 블랭크 대조군 마우스보다 유의하게 낮으며, 투여군(도 7의 C) 마우스 척수 전각 시냅토파이신의 발현 수준은 용매군 마우스보다 유의하게 높고, 통계적 차이가 유의했다(P<0.05)(도 7의 D). 플라스미노겐은 모델 마우스 척수 전각 시냅토파이신의 발현을 촉진할 수 있고, 시냅스 손상 회복을 촉진할 수 있음을 설명한다.

실시예 7: 플라스미노겐이 ALS 모델 마우스 척수 전각 염증의 회복을 촉진

주령이 비슷한 야생형 수컷 마우스 5 마리 및 수컷 SOD1-G93A마우스 9 마리를 취하였다. 야생형 마우스를 블랭크 대조군으로 하고, SOD1-G93A마우스는 14주차에 뒷다리 떨림이 발생하였을 때부터 관찰 기록하기 시작하며, 각 마우스의 발병 시간을 기록하고, 발병 14일 후부터 투여하기 시작하며, 모든 마우스는 발병 상황에 따라 무작위로 용매군 및 투여군으로 나누고, 여기서 용매군 마우스 5 마리는, 꼬리 정맥에 매일 0.1ml/마리의 용량으로 용매(10mM구연산 나트륨 완충액, pH 7.4)를 주사하고; 투여군 4마리는, 꼬리 정맥에 매일 1mg/0.1ml/마리의 용량으로 플라스미노겐을 주사하며, SPF 환경에서 연속 투여하고, 사망시 채취하며, 최대 61일 동안 투여하였다. 척수를 채취하여 포르말린 고정액으로 고정하였다. 고정된 후의 조직은 알코올 구배에 의해 탈수하고 자일렌으로 투명하게 한 후 파라핀에 포매하였다. 조직 절편의 두께는 3μm이고, 절편을 탈파라핀화 및 재수화한 후 1회 물세척하며. 조직을 PAP 편으로 원을 그리며, 3%의 과산화수소로 15분 동안 배양하고, 0.01M PBS로 2회 세척하되 회당 5분 동안 세척하였다. 5％의 정상 염소 혈청(Vector laboratories,Inc.,USA)으로 30분 동안 차단하고; 시간이 되면, 염소 혈청액을 폐기하고, 항 토끼 Iba-1(ab178847,Abcam) 4℃로 하룻밤 배양하며, 0.01M PBS로 2회 세척하되 회당 5분 동안 세척하였다. 염소 항토끼 IgG(HRP) 항체(Abcam) 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 배양하고, 0.01M PBS로 2회 세척하되 회당 5분 동안 세척하였다. DAB 키트(Vector laboratories,Inc.,USA)에 따라 발색하고, 3회 물세척한 후 헤마톡실린으로 30초 동안 대조 염색하며, 흐르는 물로 5분 동안 세척하였다. 알코올 구배에 의해 탈수하고, 크실렌으로 투명하게 하며 중성 검으로 밀봉하며, 절편은 400배 광학 현미경으로 관찰하였다.

이온화 칼슘 결합 어댑터 분자-1(Ionized calcium binding adaptor molecule-1, Iba-1)은 중추 신경 계통 중의 소교세포의 표면 마커이다. 소교세포는 중추 신경 계통 중의 면역 세포로서, 병변 또는 손상 시 신경 장애를 빠르게 감지하고 활성화한다. 활성화된 소교세포는 개수와 형태에서 유의하게 변화되고 손상 부위로 이동하며 예를 들어 사멸된 세포의 식균 작용, 염증 유발 사이토카인 생성 증가 등^[10] 다양한 기능을 수행한다.

그 결과, 블랭크 대조군(도 8의 A) 마우스 척수 전각은 일정 수준의 Iba-1이 발현되었고, 투여군(도 8의 C) 마우스 척수 전각 Iba-1의 발현 수준도 용매군(도 8의 B) 및 블랭크 대조군의 마우스보다 유의하게 높으며, 통계적 차이가 유의했다(P<0.05 또는 0.01)(도 8의 D). 플라스미노겐은 모델 마우스 척수 전각 염증 회복을 촉진할 수 있음을 설명한다.

실시예 8: 플라스미노겐이 ALS 모델 마우스 근위축을 개선

주령이 비슷한 야생형 수컷 마우스 5 마리 및 수컷 SOD1-G93A마우스 9 마리를 취하였다. 야생형 마우스를 블랭크 대조군으로 하고, SOD1-G93A마우스는 14주차에 뒷다리 떨림이 발생하였을 때부터 관찰 기록하기 시작하며, 각 마우스의 발병 시간을 기록하고, 발병 14일 후부터 투여하기 시작하며, 모든 마우스는 발병 상황에 따라 무작위로 용매군 및 투여군으로 나누고, 여기서 용매군 마우스 5 마리는, 꼬리 정맥에 매일 0.1ml/마리의 용량으로 용매(10mM구연산 나트륨 완충액, pH 7.4)를 주사하고; 투여군 4마리는, 꼬리 정맥에 매일 1mg/0.1ml/마리의 용량으로 플라스미노겐을 주사하며, SPF 환경에서 연속 투여하고, 사망시 채취하며, 최대 61일 동안 투여하였다. 비장근을 취하여 포르말린 고정액으로 고정하였다. 고정된 후의 조직은 알코올 구배에 의해 탈수하고 자일렌으로 투명하게 한 후 파라핀에 포매하였다. 절편의 두께는 3μm이고, 절편을 탈파라핀화 및 재수화한 후 1회 물세척하며, 헤마톡실린 염료로 10 min 동안 염색한 후, 물로 5 min 동안 세척하며, 1％ 염산 에탄올로 10초 동안 분화하고, 흐르는 물에 10분 동안 세척하며, 0.2％의 에오신 염료로 10초 동안 염색하고, 알코올 구배에 의해 탈수하고 투명하게 하여 밀봉하였다. 절편은 200배 광학 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 블랭크 대조군(도 9의 A) 마우스 비장근 근섬유 구조는 완전하고, 형태와 크기가 비교적 균일하나, 용매군(도 9의 B) 비장근 근섬유에는 심각한 위축 현상이 나타나고, 국소 염증 세포가 침윤(적색 화살표)되었으며, 근섬유에 원형 병변이 발생하였고, 투여군(도 9의 C) 근섬유 위축 현상은 용매군보다 덜하지만, 염증 세포 침윤의 현상은 여전히 존재하였다. 플라스미노겐은 모델 마우스 근위축을 개선할 수 있음을 나타낸다.

실시예 9: 플라스미노겐이 ALS 모델 마우스 근위축을 개선

주령이 비슷한 야생형 수컷 마우스 5 마리 및 수컷 SOD1-G93A마우스 9 마리를 취하였다. 야생형 마우스를 블랭크 대조군으로 하고, SOD1-G93A마우스는 14주차에 뒷다리 떨림이 발생하였을 때부터 관찰 기록하기 시작하며, 각 마우스의 발병 시간을 기록하고, 발병 14일 후부터 투여하기 시작하며, 모든 마우스는 발병 상황에 따라 무작위로 용매군 및 투여군으로 나누고, 여기서 용매군 마우스 5 마리는, 꼬리 정맥에 매일 0.1ml/마리의 용량으로 용매(10mM 구연산 나트륨 완충액, pH 7.4)를 주사하고); 투여군 4마리는, 꼬리 정맥에 매일 1mg/0.1ml/마리의 용량으로 플라스미노겐을 주사하며, SPF 환경에서 연속 투여하고, 사망시 채취하며, 최대 61일 동안 투여하였다. 둔근을 취하여 포르말린 고정액으로 고정하였다. 고정된 후의 조직은 알코올 구배에 의해 탈수하고 자일렌으로 투명하게 한 후 파라핀에 포매하였다. 절편의 두께는 3μm이고, 절편을 탈파라핀화 및 재수화한 후 1회 물세척하며, 헤마톡실린 염료로 10 min 동안 염색한 후, 물로 5 min 동안 세척하며, 1％ 염산 에탄올로 10초 동안 분화하고, 흐르는 물에 10분 동안 세척하며, 0.2％의 에오신 염료로 10초 동안 염색하고, 알코올 구배에 의해 탈수하고 투명하게 하여 밀봉하였다. 절편은 200배 광학 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 블랭크 대조군(도 10의 A) 마우스는 근섬유 구조가 비교적 완전하고, 형태와 크기가 비교적 균일하였다. 용매군(도 10의 B) 마우스 둔근의 근섬유에는 원형 병변이 있고, 크기가 균일하지 않으며, 심각하게 위축되었고, 염증 세포 침윤을 수반하며, 투여군(도 10의 C) 마우스 둔근 근섬유 구조 형태는 용매군과 비교하면 일정 정도 회복되었다. 플라스미노겐은 ALS 모델 마우스 근위축을 개선할 수 있음을 나타낸다.

실시예 10: 플라스미노겐이 ALS 모델 마우스 척수 전각 SMN 단백질의 발현을 촉진

주령이 비슷한 야생형 수컷 마우스 5 마리 및 수컷 SOD1-G93A마우스 9 마리를 취하였다. SOD1-G93A마우스는 14주차에 뒷다리 떨림이 발생하였을 때부터 관찰 기록하기 시작하며, 각 마우스의 발병 시간을 기록하고, 발병 14일 후부터 투여하기 시작하며, 모든 마우스는 발병 상황에 따라 무작위로 용매군 및 투여군으로 나누고, 여기서 용매군 마우스 5 마리는, 꼬리 정맥에 매일 0.1ml/마리의 용량으로 용매(10mM 구연산 나트륨 완충액, pH 7.4)를 주사하고; 투여군 4마리는, 꼬리 정맥에 매일 1mg/0.1ml/마리의 용량으로 플라스미노겐을 주사하며, SPF 환경에서 연속 투여하고, 사망시 채취하며, 최대 61일 동안 투여하였다. 척수를 채취하여 포르말린 고정액으로 고정하였다. 고정된 후의 조직은 알코올 구배에 의해 탈수하고 자일렌으로 투명하게 한 후 파라핀에 포매하였다. 조직 절편의 두께는 3μm이고, 절편을 탈파라핀화 및 재수화한 후 1회 물세척하며. 조직을 PAP 편으로 원을 그리며, 3%의 과산화수소로 15분 동안 배양하고, 0.01M PBS로 2회 세척하되 회당 5분 동안 세척하였다. 5％의 정상 염소 혈청(Vector laboratories,Inc.,USA)으로 30분 동안 차단하고; 시간이 되면, 염소 혈청액을 폐기하고, 항 토끼 SMN 항체(Abcam)를 적가하여 4℃로 하룻밤 배양하며, 0.01M PBS로 2회 세척하되 회당 5분 동안 세척하였다. 염소 항토끼 IgG(HRP) 항체(Abcam) 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 배양하고, 0.01M PBS로 2회 세척하되 회당 5분 동안 세척하였다. DAB 키트(Vector laboratories,Inc.,USA)에 따라 발색하고, 3회 물세척한 후 헤마톡실린으로 30초 동안 대조 염색하며, 흐르는 물로 5분 동안 세척하였다. 알코올 구배에 의해 탈수하고, 크실렌으로 투명하게 하며 중성 검으로 밀봉하며, 절편은 400배 광학 현미경으로 관찰하였다.

운동 뉴런 생존(Survival Motor Neuron, SMN) 단백질에 대한 연구에 따르면, SOD1-ALS 모델 운동 뉴런 생존(Survival Motor Neuron, SMN) 단백질의 수준이 감소하고, SMN 단백질의 증가는 질병 표현형을 개선할 수 있다^[11].

그 결과, 투여군(도 11의 B) 마우스 척수 전각 SMN 단백질의 발현 수준은 용매군(도 11의 A)보다 유의하게 높다. 플라스미노겐은 모델 마우스 척수 전각 SMN 단백질의 발현을 촉진할 수 있음을 설명한다.

참조 문헌

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[11] L.M.Murray,K.Talbot,T.H.Gillingwater.Review: Neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease:amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy[J].neuropathology&applied neurobiology,2010,36(2): 133-156.

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aactctgtgc tgggcatttg gccggaggca ctgacagttg ccagggtgac 2220 agtggaggtc ctctggtttg cttcgagaag gacaaataca ttttacaagg agtcacttct 2280 tggggtcttg gctgtgcacg ccccaataag cctggtgtct atgttcgtgt ttcaaggttt 2340 gttacttgga ttgagggagt gatgagaaat aattaa 2376 <210> 2 <211> 791 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence：synthesized polypeptide <220> <223> Nucleic acid sequence of natural plasminogen (Glu-PLG, Glu-plasminogen) without signal peptide <400> 2 Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser Leu Phe Ser 1 5 10 15 Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu Cys Ala Ala 20 25 30 Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe Gln Tyr His 35 40 45 Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg Lys Ser Ser 50 55 60 Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys Lys Val Tyr 65 70 75 80 Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met 85 90 95 Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser 100 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acacacccct cagagggact ggaggagaac tactgcagga atccagacaa cgatccgcag 480 gggccctggt gctatactac tgatccagaa aagagatatg actactgcga cattcttgag 540 tgtgaagagg aatgtatgca ttgcagtgga gaaaactatg acggcaaaat ttccaagacc 600 atgtctggac tggaatgcca ggcctgggac tctcagagcc cacacgctca tggatacatt 660 ccttccaaat ttccaaacaa gaacctgaag aagaattact gtcgtaaccc cgatagggag 720 ctgcggcctt ggtgtttcac caccgacccc aacaagcgct gggaactttg tgacatcccc 780 cgctgcacaa cacctccacc atcttctggt cccacctacc agtgtctgaa gggaacaggt 840 gaaaactatc gcgggaatgt ggctgttacc gtgtccgggc acacctgtca gcactggagt 900 gcacagaccc ctcacacaca taacaggaca ccagaaaact tcccctgcaa aaatttggat 960 gaaaactact gccgcaatcc tgacggaaaa agggccccat ggtgccatac aaccaacagc 1020 caagtgcggt gggagtactg taagataccg tcctgtgact cctccccagt atccacggaa 1080 caattggctc ccacagcacc acctgagcta acccctgtgg tccaggactg ctaccatggt 1140 gatggacaga gctaccgagg cacatcctcc accaccacca caggaaagaa gtgtcagtct 1200 tggtcatcta tgacaccaca ccggcaccag aagaccccag aaaactaccc aaatgctggc 1260 ctgacaatga actactgcag gaatccagat gccgataaag gcccctggtg ttttaccaca 1320 gaccccagcg tcaggtggga gtactgcaac ctgaaaaaat gctcaggaac agaagcgagt 1380 gttgtagcac ctccgcctgt tgtcctgctt ccagatgtag agactccttc cgaagaagac 1440 tgtatgtttg ggaatgggaa aggataccga ggcaagaggg cgaccactgt tactgggacg 1500 ccatgccagg actgggctgc ccaggagccc catagacaca gcattttcac tccagagaca 1560 aatccacggg cgggtctgga aaaaaattac tgccgtaacc ctgatggtga tgtaggtggt 1620 ccctggtgct acacgacaaa tccaagaaaa ctttacgact actgtgatgt ccctcagtgt 1680 gcggcccctt catttgattg tgggaagcct caagtggagc cgaagaaatg tcctggaagg 1740 gttgtagggg ggtgtgtggc ccacccacat tcctggccct ggcaagtcag tcttagaaca 1800 aggtttggaa tgcacttctg tggaggcacc ttgatatccc cagagtgggt gttgactgct 1860 gcccactgct tggagaagtc cccaaggcct tcatcctaca aggtcatcct gggtgcacac 1920 caagaagtga atctcgaacc gcatgttcag gaaatagaag tgtctaggct gttcttggag 1980 cccacacgaa aagatattgc cttgctaaag ctaagcagtc ctgccgtcat cactgacaaa 2040 gtaatcccag cttgtctgcc atccccaaat tatgtggtcg ctgaccggac cgaatgtttc 2100 atcactggct ggggagaaac ccaaggtact tttggagctg gccttctcaa ggaagcccag 2160 ctccctgtga ttgagaataa agtgtgcaat cgctatgagt ttctgaatgg aagagtccaa 2220 tccaccgaac tctgtgctgg gcatttggcc ggaggcactg acagttgcca gggtgacagt 2280 ggaggtcctc tggtttgctt cgagaaggac aaatacattt tacaaggagt cacttcttgg 2340 ggtcttggct gtgcacgccc caataagcct ggtgtctatg ttcgtgtttc aaggtttgtt 2400 acttggattg agggagtgat gagaaataat taa 2433 <210> 4 <211> 810 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence：synthesized polypeptide <220> <223> Amino acid sequence of natural plasminogen (from swiss prot) comprising signal peptide <400> 4 Met Glu His Lys Glu Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Lys Ser 1 5 10 15 Gly Gln Gly Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser 20 25 30 Leu Phe Ser Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu 35 40 45 Cys Ala Ala Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe 50 55 60 Gln Tyr His Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg 65 70 75 80 Lys Ser 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ggaatgtatg cattgcagtg gagaaaacta tgacggcaaa 300 atttccaaga ccatgtctgg actggaatgc caggcctggg actctcagag cccacacgct 360 catggataca ttccttccaa atttccaaac aagaacctga agaagaatta ctgtcgtaac 420 cccgataggg agctgcggcc ttggtgtttc accaccgacc ccaacaagcg ctgggaactt 480 tgtgacatcc cccgctgcac aacacctcca ccatcttctg gtcccaccta ccagtgtctg 540 aagggaacag gtgaaaacta tcgcgggaat gtggctgtta ccgtgtccgg gcacacctgt 600 cagcactgga gtgcacagac ccctcacaca cataacagga caccagaaaa cttcccctgc 660 aaaaatttgg atgaaaacta ctgccgcaat cctgacggaa aaagggcccc atggtgccat 720 acaaccaaca gccaagtgcg gtgggagtac tgtaagatac cgtcctgtga ctcctcccca 780 gtatccacgg aacaattggc tcccacagca ccacctgagc taacccctgt ggtccaggac 840 tgctaccatg gtgatggaca gagctaccga ggcacatcct ccaccaccac cacaggaaag 900 aagtgtcagt cttggtcatc tatgacacca caccggcacc agaagacccc agaaaactac 960 ccaaatgctg gcctgacaat gaactactgc aggaatccag atgccgataa aggcccctgg 1020 tgttttacca cagaccccag cgtcaggtgg gagtactgca acctgaaaaa atgctcagga 1080 acagaagcga gtgttgtagc acctccgcct gttgtcctgc ttccagatgt agagactcct 1140 tccgaagaag actgtatgtt tgggaatggg aaaggatacc gaggcaagag ggcgaccact 1200 gttactggga cgccatgcca ggactgggct gcccaggagc cccatagaca cagcattttc 1260 actccagaga caaatccacg ggcgggtctg gaaaaaaatt actgccgtaa ccctgatggt 1320 gatgtaggtg gtccctggtg ctacacgaca aatccaagaa aactttacga ctactgtgat 1380 gtccctcagt gtgcggcccc ttcatttgat tgtgggaagc ctcaagtgga gccgaagaaa 1440 tgtcctggaa gggttgtagg ggggtgtgtg gcccacccac attcctggcc ctggcaagtc 1500 agtcttagaa caaggtttgg aatgcacttc tgtggaggca ccttgatatc cccagagtgg 1560 gtgttgactg ctgcccactg cttggagaag tccccaaggc cttcatccta caaggtcatc 1620 ctgggtgcac accaagaagt gaatctcgaa ccgcatgttc aggaaataga agtgtctagg 1680 ctgttcttgg agcccacacg aaaagatatt gccttgctaa agctaagcag tcctgccgtc 1740 atcactgaca aagtaatccc agcttgtctg ccatccccaa attatgtggt cgctgaccgg 1800 accgaatgtt tcatcactgg ctggggagaa acccaaggta cttttggagc tggccttctc 1860 aaggaagccc agctccctgt gattgagaat aaagtgtgca atcgctatga gtttctgaat 1920 ggaagagtcc aatccaccga actctgtgct gggcatttgg ccggaggcac tgacagttgc 1980 cagggtgaca gtggaggtcc tctggtttgc ttcgagaagg acaaatacat tttacaagga 2040 gtcacttctt ggggtcttgg ctgtgcacgc cccaataagc ctggtgtcta tgttcgtgtt 2100 tcaaggtttg ttacttggat tgagggagtg atgagaaata attaa 2145 <210> 6 <211> 714 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: synthesized polypeptide <220> <223> Amino acid sequence of LYS77-PLG (Lys-plasminogen) <400> 6 Lys Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg 1 5 10 15 Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser 20 25 30 Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser 35 40 45 Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln 50 55 60 Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys 65 70 75 80 Asp Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn 85 90 95 Tyr Asp Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala 100 105 110 Trp Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr 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acid sequence of delta-plg (delta-plasminogen) <400> 7 gagcctctgg atgactatgt gaatacccag ggggcttcac tgttcagtgt cactaagaag 60 cagctgggag caggaagtat agaagaatgt gcagcaaaat gtgaggagga cgaagaattc 120 acctgcaggg cattccaata tcacagtaaa gagcaacaat gtgtgataat ggctgaaaac 180 aggaagtcct ccataatcat taggatgaga gatgtagttt tatttgaaaa gaaagtgtat 240 ctctcagagt gcaagactgg gaatggaaag aactacagag ggacgatgtc caaaacaaaa 300 aatggcatca cctgtcaaaa atggagttcc acttctcccc acagacctag attctcacct 360 gctacacacc cctcagaggg actggaggag aactactgca ggaatccaga caacgatccg 420 caggggccct ggtgctatac tactgatcca gaaaagagat atgactactg cgacattctt 480 gagtgtgaag aggcggcccc ttcatttgat tgtgggaagc ctcaagtgga gccgaagaaa 540 tgtcctggaa gggttgtagg ggggtgtgtg gcccacccac attcctggcc ctggcaagtc 600 agtcttagaa caaggtttgg aatgcacttc tgtggaggca ccttgatatc cccagagtgg 660 gtgttgactg ctgcccactg cttggagaag tccccaaggc cttcatccta caaggtcatc 720 ctgggtgcac accaagaagt gaatctcgaa ccgcatgttc aggaaataga agtgtctagg 780 ctgttcttgg agcccacacg aaaagatatt gccttgctaa agctaagcag tcctgccgtc 840 atcactgaca aagtaatccc agcttgtctg ccatccccaa attatgtggt cgctgaccgg 900 accgaatgtt tcatcactgg ctggggagaa acccaaggta cttttggagc tggccttctc 960 aaggaagccc agctccctgt gattgagaat aaagtgtgca atcgctatga gtttctgaat 1020 ggaagagtcc aatccaccga actctgtgct gggcatttgg ccggaggcac tgacagttgc 1080 cagggtgaca gtggaggtcc tctggtttgc ttcgagaagg acaaatacat tttacaagga 1140 gtcacttctt ggggtcttgg ctgtgcacgc cccaataagc ctggtgtcta tgttcgtgtt 1200 tcaaggtttg ttacttggat tgagggagtg atgagaaata attaa 1245 <210> 8 <211> 414 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: synthesized polypeptide <220> <223> Amino acid sequence of delta-plg (delta-plasminogen) <400> 8 Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser Leu Phe Ser 1 5 10 15 Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu Cys Ala Ala 20 25 30 Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe Gln Tyr His 35 40 45 Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg Lys Ser 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gagactcctt ccgaagaaga ctgtatgttt 120 gggaatggga aaggataccg aggcaagagg gcgaccactg ttactgggac gccatgccag 180 gactgggctg cccaggagcc ccatagacac agcattttca ctccagagac aaatccacgg 240 gcgggtctgg aaaaaaatta ctgccgtaac cctgatggtg atgtaggtgg tccctggtgc 300 tacacgacaa atccaagaaa actttacgac tactgtgatg tccctcagtg tgcggcccct 360 tcatttgatt gtgggaagcc tcaagtggag ccgaagaaat gtcctggaag ggttgtaggg 420 gggtgtgtgg cccacccaca ttcctggccc tggcaagtca gtcttagaac aaggtttgga 480 atgcacttct gtggaggcac cttgatatcc ccagagtggg tgttgactgc tgcccactgc 540 ttggagaagt ccccaaggcc ttcatcctac aaggtcatcc tgggtgcaca ccaagaagtg 600 aatctcgaac cgcatgttca ggaaatagaa gtgtctaggc tgttcttgga gcccacacga 660 aaagatattg ccttgctaaa gctaagcagt cctgccgtca tcactgacaa agtaatccca 720 gcttgtctgc catccccaaa ttatgtggtc gctgaccgga ccgaatgttt catcactggc 780 tggggagaaa cccaaggtac ttttggagct ggccttctca aggaagccca gctccctgtg 840 attgagaata aagtgtgcaa tcgctatgag tttctgaatg gaagagtcca atccaccgaa 900 ctctgtgctg ggcatttggc cggaggcact gacagttgcc agggtgacag tggaggtcct 960 ctggtttgct tcgagaagga caaatacatt ttacaaggag tcacttcttg gggtcttggc 1020 tgtgcacgcc ccaataagcc tggtgtctat gttcgtgttt caaggtttgt tacttggatt 1080 gagggagtga tgagaaataa ttaa 1104 <210> 10 <211> 367 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: synthesized polypeptide <220> <223> Amino acid sequence of mini-plg (mini-plasminogen) <400> 10 Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala 1 5 10 15 Ser Val Val Ala Pro Pro Pro Val Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr 20 25 30 Pro Ser Glu Glu Asp Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly 35 40 45 Lys Arg Ala Thr Thr Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala 50 55 60 Gln Glu Pro His Arg His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg 65 70 75 80 Ala Gly Leu Glu Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly 85 90 95 Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys 100 105 110 Asp Val Pro Gln Cys Ala Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln 115 120 125 Val Glu Pro Lys Lys Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala 130 135 140 His Pro His Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly 145 150 155 160 Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr 165 170 175 Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val 180 185 190 Ile Leu Gly Ala His Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu 195 200 205 Ile Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala 210 215 220 Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro 225 230 235 240 Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys 245 250 255 Phe Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu 260 265 270 Leu Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg 275 280 285 Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly 290 295 300 His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro 305 310 315 320 Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser 325 330 335 Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg 340 345 350 Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn 355 360 365 <210> 11 <211> 750 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: synthesized polynucleotide <220> <223> Nucleic acid sequence of micro-plg (micro-plasminogen) <400> 11 gccccttcat ttgattgtgg gaagcctcaa gtggagccga agaaatgtcc tggaagggtt 60 gtaggggggt gtgtggccca cccacattcc tggccctggc aagtcagtct tagaacaagg 120 tttggaatgc acttctgtgg aggcaccttg atatccccag agtgggtgtt gactgctgcc 180 cactgcttgg agaagtcccc aaggccttca tcctacaagg tcatcctggg tgcacaccaa 240 gaagtgaatc tcgaaccgca tgttcaggaa atagaagtgt ctaggctgtt cttggagccc 300 acacgaaaag atattgcctt gctaaagcta agcagtcctg ccgtcatcac tgacaaagta 360 atcccagctt gtctgccatc cccaaattat gtggtcgctg accggaccga atgtttcatc 420 actggctggg gagaaaccca aggtactttt ggagctggcc ttctcaagga agcccagctc 480 cctgtgattg agaataaagt gtgcaatcgc tatgagtttc tgaatggaag agtccaatcc 540 accgaactct gtgctgggca tttggccgga ggcactgaca gttgccaggg tgacagtgga 600 ggtcctctgg tttgcttcga gaaggacaaa tacattttac aaggagtcac ttcttggggt 660 cttggctgtg cacgccccaa taagcctggt gtctatgttc gtgtttcaag gtttgttact 720 tggattgagg gagtgatgag aaataattaa 750 <210> 12 <211> 249 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: synthesized polypeptide <220> <223> Amino acid sequence of micro-plg (micro-plasminogen) <400> 12 Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys Cys 1 5 10 15 Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro 20 25 30 Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly 35 40 45 Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu 50 55 60 Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln 65 70 75 80 Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu 85 90 95 Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser 100 105 110 Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro 115 120 125 Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp Gly 130 135 140 Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu 145 150 155 160 Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly 165 170 175 Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr 180 185 190 Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys 195 200 205 Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala 210 215 220 Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr 225 230 235 240 Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn 245 <210> 13 <211> 684 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: synthesized polynucleotide <220> <223> Nucleic acid sequence of serine protease (structure) domain <400> 13 gttgtagggg ggtgtgtggc ccacccacat tcctggccct ggcaagtcag tcttagaaca 60 aggtttggaa tgcacttctg tggaggcacc ttgatatccc cagagtgggt gttgactgct 120 gcccactgct tggagaagtc cccaaggcct tcatcctaca aggtcatcct gggtgcacac 180 caagaagtga atctcgaacc gcatgttcag gaaatagaag tgtctaggct gttcttggag 240 cccacacgaa aagatattgc cttgctaaag ctaagcagtc ctgccgtcat cactgacaaa 300 gtaatcccag cttgtctgcc atccccaaat tatgtggtcg ctgaccggac cgaatgtttc 360 atcactggct ggggagaaac ccaaggtact tttggagctg gccttctcaa ggaagcccag 420 ctccctgtga ttgagaataa agtgtgcaat cgctatgagt ttctgaatgg aagagtccaa 480 tccaccgaac tctgtgctgg gcatttggcc ggaggcactg acagttgcca gggtgacagt 540 ggaggtcctc tggtttgctt cgagaaggac aaatacattt tacaaggagt cacttcttgg 600 ggtcttggct gtgcacgccc caataagcct ggtgtctatg ttcgtgtttc aaggtttgtt 660 acttggattg agggagtgat gaga 684 <210> 14 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: synthesized polypeptide <220> <223> Amino acid sequence of serine protease (structure) domain <400> 14 Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro Trp Gln Val 1 5 10 15 Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile 20 25 30 Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro 35 40 45 Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln Glu Val Asn 50 55 60 Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu Glu 65 70 75 80 Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Val 85 90 95 Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val 100 105 110 Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln 115 120 125 Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val Ile 130 135 140 Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val Gln 145 150 155 160 Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys 165 170 175 Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr 180 185 190 Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn 195 200 205 Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile Glu 210 215 220 Gly Val Met Arg 225

Claims

근위축성 측삭경화증(ALS)을 앓고 있는 피험자에게 치료유효량의 플라스미노겐 경로 활성제를 투여하는 단계를 포함하는, 근위축성 측삭경화증의 치료 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 플라스미노겐 경로 활성제는 상기 근위축성 측삭경화증(ALS)을 앓고 있는 피험자에 대해, 수명 및 중앙 생존 기간(Median Survival Time)의 연장, 근위축 및 근력 감퇴의 지연, 체중 감소 속도의 감소, 척수 전각 세포의 손상, 변성 및 괴사의 경감, 척수 전각 chAT의 합성 촉진, 콜린성 뉴런 기능 회복의 촉진, 척수 전각 시냅토파이신 발현의 촉진, 척수 전각 SMN 단백질 발현의 촉진, 척수 전각 염증 회복의 촉진, 시냅스 손상 회복의 촉진 중 하나 이상의 활성을 구비하는, 근위축성 측삭경화증의 치료 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 플라스미노겐 경로 활성제는 피험자의 근위축, 근력 감퇴, 경련 및/또는 근섬유 다발 수축 증상을 개선하는, 근위축성 측삭경화증의 치료 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 플라스미노겐 경로 활성제는 피험자의 체중 감소를 경감하고 및/또는 생존 기간을 연장하는, 근위축성 측삭경화증의 치료 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 플라스미노겐 경로 활성제는 피험자의 근긴장도를 개선하는, 근위축성 측삭경화증의 치료 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 플라스미노겐 경로 활성제는 피험자의 근육 기능 회복을 촉진하는, 근위축성 측삭경화증의 치료 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 플라스미노겐 경로 활성제는 피험자의 척수 전각 뉴런 손상 회복을 촉진하는, 근위축성 측삭경화증의 치료 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 플라스미노겐 경로 활성제는 하나 이상의 다른 약물 및/또는 치료 방법을 사용하여 병용 투여하는, 근위축성 측삭경화증의 치료 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 플라스미노겐 경로 활성제는 정맥내, 피하, 근육내, 척수강내, 비강 흡입, 에어로졸 흡입, 점비액 또는 점안액 방식으로 투여되는, 근위축성 측삭경화증의 치료 방법.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 플라스미노겐 경로 활성제는 플라스미노겐 경로 활성화 성분인, 근위축성 측삭경화증의 치료 방법.
제 10 항에 있어서,
상기 플라스미노겐 경로 활성화 성분은 플라스미노겐인, 근위축성 측삭경화증의 치료 방법.
제 11 항에 있어서,
상기 플라스미노겐은 서열 2, 6, 8, 10 또는 12와 적어도 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％의 서열 동일성을 구비하고, 플라스미노겐 활성을 여전히 구비하는, 근위축성 측삭경화증의 치료 방법.
제 11 항에 있어서,
상기 플라스미노겐은 플라스미노겐 활성 단편, 플라스미노겐 활성 및/또는 라이신 결합 활성을 여전히 구비하는 단백질인, 근위축성 측삭경화증의 치료 방법.
제 11 항에 있어서,
상기 플라스미노겐은 Glu-플라스미노겐, Lys-플라스미노겐, 미니 플라스미노겐, 마이크로 플라스미노겐, delta-플라스미노겐 또는 이들의 플라스미노겐 활성을 보유하는 변이체로부터 선택되는, 근위축성 측삭경화증의 치료 방법.
제 11 항에 있어서,
상기 플라스미노겐은 천연 또는 합성된 인간 플라스미노겐, 또는 플라스미노겐 활성 및/또는 라이신 결합 활성을 여전히 보유하는 변이체 또는 단편인, 근위축성 측삭경화증의 치료 방법.