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KR20220005082A - 탈모 및 탈모 관련 문제증상 치료를 위한 감마-c-사이토카인 신호전달 효과 조절 - Google Patents

탈모 및 탈모 관련 문제증상 치료를 위한 감마-c-사이토카인 신호전달 효과 조절 Download PDF

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KR20220005082A
KR20220005082A KR1020217039855A KR20217039855A KR20220005082A KR 20220005082 A KR20220005082 A KR 20220005082A KR 1020217039855 A KR1020217039855 A KR 1020217039855A KR 20217039855 A KR20217039855 A KR 20217039855A KR 20220005082 A KR20220005082 A KR 20220005082A
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KR
South Korea
Prior art keywords
peptide
cytokine
seq
composition
antagonist peptide
Prior art date
Application number
KR1020217039855A
Other languages
English (en)
Inventor
유타카 타가야
나즐리 아지미
Original Assignee
바이오니즈, 엘엘씨
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 바이오니즈, 엘엘씨 filed Critical 바이오니즈, 엘엘씨
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Abstract

γc-패밀리 사이토카인, 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-7(IL-7), 인터루킨-9(IL-9), 인터루킨-15(IL-15), 및 인터루킨-21(IL-21)은 탈모 및 탈모 관련 문제증상과 같은 중요한 인간 질환과 관련이 있다. 하나 이상의 탈모 관련 문제증상을 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방하기 위한 하나 이상의 γc-사이토카인 패밀리 구성원에 의한 신호전달을 조절하는 조성물, 방법 및 키트가 기재되어 있다.

Description

탈모 및 탈모 관련 문제증상 치료를 위한 감마-C-사이토카인 신호전달 효과 조절
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2019년 5월 3일에 출원된 미국 임시 특허 출원 제62/842,846호에 대한 우선권을 주장한다. 상기 출원은 모든 목적을 위해 참고로 본원에 전문이 포함된다.
전자 형식의 서열 목록
본 출원은 EFS-Web을 통해 ASCII 텍스트 파일로서의 서열 목록과 함께 제출되었다. 서열 목록은 2020년 4월 29일에 생성되어 마지막으로 저장된 BION012WOSEQLIST.txt라는 파일로 제공되며, 크기는 47,416 바이트이다. 서열 목록의 전자 형식 정보는 35 U.S.C. § 1.52(e)에 따라 이의 전문이 참고로 본원에 통합된다.
기술분야
본 실시양태는 하나 이상의 c-사이토카인 패밀리 구성원에 의한 신호전달을 조절함으로써 하나 이상의 치료 화합물을 사용하여 탈모 및 탈모 관련 문제증상과 같은 자가면역 질환의 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방에 관한 것이다.
사이토카인은 성장, 기능적 분화, 및 프로그램된 세포 사멸(아폽토시스 세포 사멸)의 촉진 또는 예방과 같은 다양한 세포 기능을 매개하는 다양한 가용성 인자 그룹이다. 사이토카인은, 호르몬과 달리, 특수한 선상 조직에서는 생성되지 않지만, 상피, 기질 또는 면역 세포와 같은 다양한 세포 유형에 의해 생성될 수 있다.
γc-패밀리 사이토카인은 주로 상피, 기질 및 면역 세포에 의해 생성되고, 다양하고 많은 림프구의 정상 및 병리학적 활성화를 제어하는 포유동물 사이토카인 그룹이다. 이러한 사이토카인은 흉선에서 T 세포의 초기 발달뿐만 아니라 주변부에서의 항상성에 매우 중요하다.
일부 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 γc-사이토카인 패밀리 구성원에 의한 신호전달을 조절하여 하나 이상의 탈모 관련 문제증상의 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방하기에 충분한 양의 치료 화합물, 및 이의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
조성물의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 탈모 관련 문제증상은 탈모증, 수포창, 천포창, 건선, 백반증, 이식편대숙주질환, 및 면역-매개 탈모로 이루어진 군으로부터 선택된다.
조성물의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 γc-사이토카인 패밀리 구성원은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택된다.
조성물의 일부 실시양태에서, 치료 화합물은 γc 사이토카인 길항제 펩티드, γc 사이토카인 길항제 펩티드 유도체, 항-CD8 항체, 항-IL-2 항체, 항-IL-15 항체, 항-NKG2A, 또는 이들의 조합 중 적어도 하나이다.
조성물의 일부 실시양태에서, γc 사이토카인 길항제 펩티드는 적어도 2개의 γc-사이토카인 패밀리 구성원 각각의 γc-박스 D-나선 영역의 부분 서열을 포함한다.
조성물의 일부 실시양태에서, 부분 서열은 적어도 2개의 γc-사이토카인 패밀리 구성원 각각의 γc-박스 D-나선 영역의 적어도 5개의 아미노산의 연속 블록을 포함한다.
조성물의 일부 실시양태에서, 부분 서열은 적어도 2개의 γc-사이토카인 패밀리 구성원 각각의 γc-박스 D-나선 영역의 1 내지 10개 아미노산의 연속 블록을 포함한다.
조성물의 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 γc-사이토카인 패밀리 구성원 각각의 γc-박스 D-나선 영역은 IL-15, IL-2, IL-21, IL-4, IL-9 및 IL-7로 이루어진 군으로부터 선택된다.
조성물의 일부 실시양태에서, γc 사이토카인 길항제 펩티드는 11 내지 50개의 아미노산을 포함한다.
조성물의 일부 실시양태에서, γc 사이토카인 길항제 펩티드는 N-말단, C-말단, 측면 잔기, 또는 이들의 조합에서 접합체를 추가로 포함한다.
조성물의 일부 실시양태에서, 접합체는 소 혈청 알부민(BSA), 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), IgG의 Fc 영역, 스캐폴드로서 기능하는 생물학적 단백질, 세포 특이적 항원에 대한 항체, 수용체, 리간드, 금속 이온 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 모이어티를 포함한다.
조성물의 일부 실시양태에서, γc 사이토카인 길항제 펩티드는 신호 펩티드를 추가로 포함한다.
조성물의 일부 실시양태에서, γc 사이토카인 길항제 펩티드는 아미노산 서열 D/E-F-L-E/Q/N-S/R-X-I/K-X-L/I-X-Q(서열 번호: 2)를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산을 나타낸다.
조성물의 일부 실시양태에서, γc 사이토카인 길항제 펩티드 유도체는 서열 번호: 2의 펩티드와 적어도 약 50%의 동일성을 공유한다.
조성물의 일부 실시양태에서, γc 사이토카인 길항제 펩티드 유도체는 서열 번호: 2의 펩티드와 적어도 약 90%의 동일성을 공유한다.
조성물의 일부 실시양태에서, γc 사이토카인 길항제 펩티드 유도체는 서열 번호: 2의 펩티드와 적어도 약 95%의 동일성을 공유한다.
조성물의 일부 실시양태에서, γc 사이토카인 길항제 펩티드는 서열 번호: 1(BNZ-γ)의 서열을 포함한다
조성물의 일부 실시양태에서, γc 사이토카인 길항제 펩티드 및 γc 길항제 펩티드 유도체는 유사한 물리화학적 특성을 갖지만, 별개의 생물학적 활성을 갖는다.
조성물의 일부 실시양태에서, γc 사이토카인 길항제 펩티드 유도체는 서열 번호: 1의 펩티드와 적어도 약 50%의 동일성을 공유한다.
조성물의 일부 실시양태에서, γc 사이토카인 길항제 펩티드 유도체는 서열 번호: 1의 펩티드와 적어도 약 90%의 동일성을 공유한다.
조성물의 일부 실시양태에서, γc 사이토카인 길항제 펩티드 유도체는 서열 번호: 1의 펩티드와 적어도 약 95%의 동일성을 공유한다.
조성물의 일부 실시양태에서, 약학적으로 허용 가능한 담체는 국소, 경구 및/또는 비경구 전달을 위해 제형화된다.
조성물의 일부 실시양태에서, 약학적으로 허용 가능한 담체는 국소 전달을 위해 제형화된다.
조성물의 일부 실시양태에서, 약학적으로 허용 가능한 담체는 경구 전달을 위해 제형화된다.
조성물의 일부 실시양태에서, 약학적으로 허용 가능한 담체는 비경구 전달을 위해 제형화된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 탈모 관련 문제증상의 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방하는 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 본원에서 제공된 하나 이상의 조성물을 투여하여 하나 이상의 탈모 관련 문제증상의 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방하는 단계를 포함한다.
하나 이상의 탈모 관련 문제증상의 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방하는 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 탈모 관련 문제증상은 탈모증, 수포창, 천포창, 건선, 백반증, 이식편대숙주질환, 및 면역-매개 탈모로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 탈모 관련 문제증상을 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방하는 하나 이상의 γc-사이토카인 패밀리 구성원에 의한 신호전달을 조절 및/또는 차단하도록 구성된 γc 사이토카인 길항제 펩티드 및/또는 이의 유도체를 설계하는 방법은 컴퓨터를 사용하여 아미노산 서열 데이터베이스로부터 하나 이상의 γc-사이토카인 패밀리 구성원의 아미노산 서열을 수득하는 단계, 하나 이상의 γc-사이토카인 패밀리 구성원의 서열에 기초하여 γc 사이토카인 길항제 펩티드 및/또는 이의 유도체를 어셈블링하는 단계를 포함하며, 상기 γc 사이토카인 길항제 펩티드 및/또는 이의 유도체는 하나 이상의 γc-사이토카인 패밀리 구성원에 의한 신호전달을 조절 및/또는 차단한다.
γc-사이토카인 길항제 펩티드 및/또는 이의 유도체를 설계하는 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 γc-사이토카인 패밀리 구성원은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택된다.
γc-사이토카인 길항제 펩티드 및/또는 이의 유도체를 설계하는 방법의 일부 실시양태에서, γc 사이토카인 길항제 펩티드는 적어도 2개의 γc-사이토카인 패밀리 구성원 각각의 γc-박스 D-나선 영역의 부분 서열을 포함한다.
γc-사이토카인 길항제 펩티드 및/또는 이의 유도체를 설계하는 방법의 일부 실시양태에서, 서열은 적어도 2개의 γc-사이토카인 패밀리 구성원 각각의 γc-박스 D-나선 영역의 적어도 5개의 아미노산의 연속 블록을 포함한다.
γc-사이토카인 길항제 펩티드 및/또는 이의 유도체를 설계하는 방법의 일부 실시양태에서, 서열은 적어도 2개의 γc-사이토카인 패밀리 구성원 각각의 γc-박스 D-나선 영역의 1 내지 10개의 아미노산의 연속 블록을 포함한다.
γc-사이토카인 길항제 펩티드 및/또는 이의 유도체를 설계하는 방법의 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 γc-사이토카인 패밀리 구성원 각각의 γc-박스 D-나선 영역은 IL-15, IL-2, IL-21, IL-4, IL-9 및 IL-7로 이루어진 군으로부터 선택된다
γc-사이토카인 길항제 펩티드 및/또는 이의 유도체를 설계하는 방법의 일부 실시양태에서, γc 사이토카인 길항제 펩티드는 11 내지 50개의 아미노산을 포함한다.
γc-사이토카인 길항제 펩티드 및/또는 이의 유도체를 설계하는 방법의 일부 실시양태에서, γc 사이토카인 길항제 펩티드는 N-말단, C-말단, 측면 잔기, 또는 이들의 조합에서 접합체를 포함한다.
γc-사이토카인 길항제 펩티드 및/또는 이의 유도체를 설계하는 방법의 일부 실시양태에서, γc 사이토카인 길항제 펩티드는 신호 펩티드를 추가로 포함한다.
γc-사이토카인 길항제 펩티드 및/또는 이의 유도체를 설계하는 방법의 일부 실시양태에서, γc 사이토카인 길항제 펩티드는 아미노산 서열 D/E-F-L-E/Q/N-S/R-X-I/K-X-L/I-X-Q(서열 번호: 2)를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산을 나타낸다.
γc-사이토카인 길항제 펩티드 및/또는 이의 유도체를 설계하는 방법의 일부 실시양태에서, γc 사이토카인 길항제 펩티드 유도체는 서열 번호: 2의 펩티드와 적어도 약 50%의 동일성을 공유한다.
γc-사이토카인 길항제 펩티드 및/또는 이의 유도체를 설계하는 방법의 일부 실시양태에서, γc 사이토카인 길항제 펩티드 유도체는 서열 번호: 2의 펩티드와 적어도 약 90%의 동일성을 공유한다.
γc-사이토카인 길항제 펩티드 및/또는 이의 유도체를 설계하는 방법의 일부 실시양태에서, γc 사이토카인 길항제 펩티드 유도체는 서열 번호: 2의 펩티드와 적어도 약 95%의 동일성을 공유한다.
γc-사이토카인 길항제 펩티드 및/또는 이의 유도체를 설계하는 방법의 일부 실시양태에서, γc 사이토카인 길항제 펩티드는 서열 번호: 1(BNZ-γ)의 서열을 포함한다
γc-사이토카인 길항제 펩티드 및/또는 이의 유도체를 설계하는 방법의 일부 실시양태에서, γc 사이토카인 길항제 펩티드 유도체는 서열 번호: 1의 펩티드와 적어도 약 50%의 동일성을 공유한다.
γc-사이토카인 길항제 펩티드 및/또는 이의 유도체를 설계하는 방법의 일부 실시양태에서, γc 사이토카인 길항제 펩티드 유도체는 서열 번호: 1의 펩티드와 적어도 약 90% 이상의 동일성을 공유한다.
γc-사이토카인 길항제 펩티드 및/또는 이의 유도체를 설계하는 방법의 일부 실시양태에서, γc 사이토카인 길항제 펩티드 유도체는 서열 번호: 1의 펩티드와 적어도 약 95%의 동일성을 공유한다.
γc-사이토카인 길항제 펩티드 및/또는 이의 유도체를 설계하는 방법의 일부 실시양태에서, γc 사이토카인 길항제 펩티드 및 이의 유도체는 유사한 물리화학적 특성을 갖지만, 별개의 생물학적 활성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 탈모 관련 문제증상의 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방을 위한 키트는 본원에 제공된 하나 이상의 조성물을 포함한다.
키트의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 탈모 관련 문제증상은 탈모증, 수포창, 천포창, 건선, 백반증, 이식편대숙주질환, 및 면역 매개 탈모로 이루어진 군으로부터 선택된다.
도 1a는 인간 γc-사이토카인 패밀리 구성원의 D-나선 영역의 정렬을 보여준다.
도 1b는 γc-사이토카인의 D-나선 영역 주위에 공통 서열을 발생시키는 γc-박스(서열번호: 9) 및 IL-2/IL-15 박스(서열번호: 10) 모티프를 도시한다.
도 2는 아미노산의 생화학적 특성을 도표로 나타낸 것이다.
도 3a는 PT-18 증식 분석으로 BNZ-γ에 의한 IL-15의 억제 및 IL-9 활성을 나타낸다.
도 3b는 IL-2 또는 IL-15 및 0, 0.1, 1 또는 10 μM BNZ-γ의 존재 하에 성장한 CTLL-2 세포의 증식 분석을 나타낸다.
도 4는 BNZ-γ에 의한 STAT5의 IL-15-매개 티로신-인산화의 억제를 나타낸다.
도 5는 NSG 마우스에 huPBMC 이식 후 인간 사이토카인 IL-2, IL-15 및 IFNγ의 순환 수준을 나타낸다.
도 6a는 huPBMC 이식 4주 후 대표적인 NSG 마우스로부터의 인간 CD8+ T-세포가 NKG2D(CD314)를 완전히 발현한다는 것을 보여준다.
도 6b는 huPBMC 이식 후 1주부터 4주까지의 대표적인 NSG 마우스에서 NKG2A+ 인간 CD8+ T-세포(박스 안)의 확장을 보여준다.
도 7a는 huPBMC 이식 후 4주인 대표적인 NSG 마우스에서 항-CD8 항체를 주사한 후 인간 CD8+ T-세포의 특이적 고갈을 나타낸다. 항-CD8 AB 후 그래프는 항체 주사 후 8일이다.
도 7b는 huPBMC 이식 후 4주에 항체 처리된 3마리의 NSG 마우스에서 항-CD8 항체-매개 인간 CD8+ T-세포 고갈 후 일 단위로 체중의 평균 회복을 그램으로 나타낸다.
도 7c는 항체 주사 14일 후 및 huPBMC 이식 42일 후 대표적인 NSG 마우스에서 항-CD8 항체-매개 인간 CD8+ T-세포 고갈 후 체모의 재성장을 보여준다.
도 8은 γc-사이토카인 신호전달의 구성적 활성화를 나타내는 huPBMC 이식 후 4주에 대표적인 NSG 마우스로부터 분리된 NKG2A- (-) CD8+ T-세포가 아닌 NKG2A+ (+)에서 Jak3 및 STAT5의 양성 인산화를 나타낸다.
도 9a는 3종의 대표적인 인간화 NSG 마우스로부터의 NKG2A+ 인간 CD8+ T-세포의 확장과 염증성 사이토카인 IFNγ 및 γc-사이토카인 IL-2 및 IL-15의 수준 사이의 양의 상관관계를 huPBMC 이식 후 1주 내지 6주의 과정에 걸쳐 보여준다.
도 9b는 huPBMC 이식 후 3 내지 5주에 3마리의 대표적인 인간화 NSG 마우스에서 주당 2회 항-NKG2A 항체의 투여를 통한 인간 NKG2A+ CD8+ T-세포의 효과적인 고갈이 체중의 손실, 및 γc-사이토카인 IL-2, IL-15 및 염증성 사이토카인 IFNγ의 상당한 감소와 같은 GvHD 증상의 개선을 가져온다는 것을 보여준다.
도 10a는 대표적인 NSG 마우스에서 BNZ-γ에 의한 면역-매개 탈모의 역전을 보여준다. 시점: -30일은 huPBMC 이식 전이다. 0일은 huPBMC 이식 후 4주이다. 7일은 huPBMC 이식 후 5주 및 2주의 치료 기간 동안 매주 2회 BNZ-γ 투여 요법으로의 1주이다. 21일은 huPBMC 이식 후 7주 및 2주의 치료 기간 동안 매주 2회 BNZ-γ 투여 요법 완료 후 1주이다. 30일은 huPBMC 이식 후 8주가 조금 넘고, 2주의 치료 기간 동안 매주 2회 BNZ-γ 투여 요법이 완료된 후 2주가 조금 넘은 것이다.
도 10b는 2주의 치료 기간 동안 매주 2회 BNZ-γ 투여 요법을 완료하거나 완료하지 않고(PBS 대조군), huPBMC 이식 후 6주에 2개의 대표적인 NSG 마우스에서 순환하는 인간 염증성 사이토카인 IL-6 및 IFNγ의 혈청 농도의 비교를 나타낸다. 결과는 통계적으로 유의했다(***), p<0.001.
도 11a는 PBS 대조군(미처리), 항-IL-2 항체, 항-IL-15 항체, 항-IL-2 및 항-IL-15 항체의 조합, 및 BNZ-γ으로 huPBMC 이식 후 35일째에 치료적 처치를 시작한 인간화 NSG 마우스의 생존 곡선을 보여준다.
도 11b는 각각의 처리군 huPBMC 이식 후 35일째의 NSG 마우스에 대한 4주 치료 요법 완료 후 PBS 대조군, 항-IL-2 항체(AB), 항-IL-15 AB, 항-IL-2 및 항-IL-15 AB의 조합, 및 BNZ-γ으로부터의 대표적인 NSG 마우스에서 모발 재성장 수준의 비교를 나타낸다.
도 11c는 각각의 처리군 huPBMC 이식 후 35일째의 NSG 마우스에 대한 4주 치료 요법 완료 후 PBS 대조군, 항-IL-2 항체(Ab), 항-IL-15 Ab, 항-IL-2 및 항-IL-15 Ab의 조합, 및 BNZ-γ으로부터 순환하는 인간 염증성 사이토카인 IL-6 및 IFNγ의 평균 혈청 농도의 비교를 나타낸다.
도 12는 huPBMC 이식 후 3주(BNZ-γ 전) 및 7주(BNZ-γ 처리 유무)에 인간화된 NSG 마우스로부터의 인간 CD8+ T-세포에 대한 면역-염색된 피부 조직을 보여준다. 인간 CD8+ T 세포는 검은색 화살표로 강조 표시되었다.
도 13a는 인간 CD8 알파 사슬의 뉴클레오티드 및 펩티드 서열을 도시한다.
도 13b는 인간 CD8 베타 사슬의 뉴클레오티드 및 펩티드 서열을 도시한다.
도 14는 인간 IL-2의 뉴클레오티드 및 펩티드 서열을 도시한다.
도 15는 인간 IL-15의 뉴클레오티드 및 펩티드 서열을 도시한다.
도 16은 인간 NKG2A의 뉴클레오티드 및 펩티드 서열을 도시한다.
도 17은 인간 NKG2B의 뉴클레오티드 및 펩티드 서열을 도시한다.
도 18은 인간 NKG2C의 뉴클레오티드 및 펩티드 서열을 도시한다.
도 19는 인간 NKG2D의 뉴클레오티드 및 펩티드 서열을 도시한다.
도 20은 인간 NKG2E의 뉴클레오티드 및 펩티드 서열을 도시한다.
도 21은 인간 NKG2F의 뉴클레오티드 및 펩티드 서열을 도시한다.
도 22는 인간 NKG2H의 뉴클레오티드 및 펩티드 서열을 도시한다.
본 실시양태는 탈모 및 탈모 관련 문제증상과 같은 자가면역 질환의 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방을 위한, 하나 이상의 γc-사이토카인 패밀리 구성원에 의한 신호전달을 조절하는 하나 이상의 치료 화합물을 포함하는 조성물, 방법 및 키트에 관한 것이다. γc-패밀리의 사이토카인은 주로 상피, 기질 및 면역 세포에 의해 생성되고, 다양하고 많은 림프구의 정상 및 병리학적 활성화를 제어하는 포유동물 사이토카인 그룹을 포함한다. 치료 화합물의 투여, 생산 및 상업화 방법뿐만 아니라 표적 질환에 대한 설명이 개시되어 있다.
개요
지금까지 100개 초과의 사이토카인이 확인되었으며, 원시 유전자 풀로부터 유전자 복제를 통해 개발된 것으로 간주된다(문헌[Bazan, J.F. 1990, Immunol. Today 11:350-354] 참조). 이러한 견해를 뒷받침하기 위해, 사이토카인 그룹은 다중-소단위 수용체 시스템의 구성 요소를 공유하는 것이 일반이다. 가장 잘 문서화된 T 세포에서의 공유 사이토카인 소단위는 공통 γ 소단위(γc-소단위)이다.
γc-소단위는, 6개의 알려진 사이토카인(인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-7(IL-7), 인터루킨-9(IL-9), 인터루킨-15(IL-15), 및 인터루킨-21(IL-21))이 공유하며, 이들은 통칭하여 "γc-사이토카인" 또는 "γc-패밀리 사이토카인"이라고 하며 이러한 모든 사이토카인에 대한 세포 활성화 신호를 전달하는 데 필수적인 역할을 한다. 또한, 각각의 γc-사이토카인에 대해, γc-소단위와 복합될 때 완전한 기능 수용체를 발생시키는 하나 또는 2개의 전용 사이토카인-특이적 수용체 소단위가 있다. (문헌[Rochman et al., 2009, Nat Rev Immunol. 9: 480-90] 참조).
γc-패밀리 사이토카인은 주로 상피, 기질 및 면역 세포에 의해 생성되고, 다양하고 많은 림프구의 정상 및 병리학적 활성화를 제어하는 포유동물 사이토카인 그룹이다. 이러한 사이토카인은 흉선에서 T 세포의 초기 발달뿐만 아니라 주변부에서의 항상성에 매우 중요하다. 예를 들어, γc-소단위가 없으면, T, B 및 NK 세포가 마우스에서 발생하지 않는다. (문헌[Sugamura et al., 1996, Annu. Rev. Immunol.14:179-205] 참조).
γc-사이토카인은 면역 체계를 구성하는 림프 세포, 특히 T, B 및 NK 세포의 발달에 중요한 역할을 한다. 또한, γc-사이토카인은 다양한 인간 질병과 관련이 있다. 따라서, γc-사이토카인 활성을 억제하는 인자는 림프구 하위 집합의 발달 메커니즘을 설명하고, 면역 질병 및 γc-사이토카인-매개 질환을 치료하는 유용한 도구를 제공할 것이다.
마우스에서 γc-소단위를 코딩하는 유전자의 생식 계열 고갈 또는 인간에서 γc-소단위의 돌연변이는 NK, T 및 B 세포의 정상적인 외관 또는 기능을 방해함으로써 중증 복합 면역결핍(SCID)을 유발하는 것으로 알려져 있다. γc-사이토카인인 IL-2, -4, -7, -9, 15, -21의 신호 전달에서 γc-소단위의 중요성은 γc-사이토카인에 대한 이러한 마우스 및 인간 환자의 림프구 반응 부족을 입증하는 연구에 나타나 있다(문헌[Sugamura et al., 1995 Adv. Immunol. 59:225-277]에서 검토됨). 이는 γc-소단위와 γc-사이토카인 사이의 상호작용의 파괴가 γc-사이토카인 패밀리 구성원에 의한 세포내 신호전달 사건을 효율적으로 차단할 것임을 나타낸다. 따라서, 본 실시형태에 따른 길항제 펩티드는 γc-사이토카인 패밀리 구성원의 잘못된 조절에 의해 매개되는 질환으로 고통받는 인간의 병원성 변화를 효과적으로 차단할 것으로 기대된다.
출원인은 탈모 및 탈모 관련 문제증상과 같은 자가면역 질환의 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방을 위한, 하나 이상의 γc-사이토카인 패밀리 구성원에 의한 신호전달을 조절하는 하나 이상의 치료 화합물을 포함하는 신규한 조성물, 방법 및 키트를 제시한다. 출원인은 또한 다중 γc-사이토카인의 활성을 억제하는 "Simul-Block"으로 지칭되는 본원에서 신규한 저분자량 치료 화합물을 고안하였다. 화학 물질과 펩티드를 모두 포함하는 이러한 저분자량 치료 화합물은 종종 항체보다 면역원성이 낮고, 임상적 개입에서 γc-사이토카인 활성을 조절하기 위한, 독립형 접근 방식으로 또는 항체-매개 접근 방식에 보완적으로 사용될 수 있다.
γc-사이토카인과 관련된 병리학
최근 연구에 따르면 γc-사이토카인의 발현 조절 장애 및 기능 장애는 다양한 인간 면역 및 조혈 질환을 유발할 수 있다.
IL-2
IL-2는 역사적으로 프로토타입 T 세포 성장 인자로 간주되었지만, IL-2 발현이 결여된 녹아웃 마우스의 생성은 IL-2가 생체 내 기존 T 세포의 성장 또는 발달에 중요하지 않다는 것을 보여주었다. 그러나, IL-2의 과발현은 T-세포의 하위 집합, 조절 T 세포(T-reg)의 우선적인 확장을 초래한다. (문헌[Antony et al., 2006, J. Immunol. 176:5255-66] 참조). T-reg는 다른 세포의 면역 반응을 억제하여, 말초 내성을 유지하는 작용을 한다(문헌[Sakaguchi et al., 2008, Cell 133:775-87]에서 검토됨). 말초 내성의 붕괴는 인간의 자가면역 질환을 유발하는 것으로 생각된다.
따라서, T-reg의 면역억제 기능은 자가면역 질환의 발병을 예방하는 것으로 생각된다(문헌[Sakaguchi et al., 2008, Cell 133:775-87] 참조). T-reg는 또한 고형 종양 및 혈액 악성 종양이 증가된 수의 T-reg와 관련된 암과 관련되어 있다(문헌[De Rezende et al., 2010, Arch. Immunol. Ther. Exp. 58:179-190] 참조).
IL-4
IL-4는 T 헬퍼 세포를 Th2(T-헬퍼 유형 2) 하위 집합으로 분화하는 데 관여하는 비중복(non-redundant) 사이토카인이며, 이는 조산 B 세포를 IgE 생성 형질 세포로의 분화를 촉진한다. IgE 수치는 알레르기성 천식에서 상승한다. 따라서, IL-4는 알레르기성 천식의 발병과 관련이 있다. IL-4를 표적으로 하는 항체는 알레르기성 천식의 발병을 치료하거나 심지어 예방하는 데 사용할 수 있다. (문헌[Le Buanec et al., 2007, Vaccine 25:7206-16] 참조).
IL-7
IL-7은 B 세포 발달과 흉선에서 T 세포의 초기 발달에 필수적이다. 마우스에서 IL-7의 비정상적인 발현은 T-세포-관련 백혈병을 유발한다. (문헌[Fisher et al., 1993, Leukemia 2:S66-68] 참조). 그러나, 인간의 경우 IL-7의 잘못된 조절이 T-세포-관련 백혈병을 유발하지 않는 것으로 보인다. 인간에서 단독으로 또는 다른 γc-사이토카인 패밀리 구성원인 IL-15와 함께 IL-7의 상향 조절은 대형 과립 림프구(LGL) 백혈병과 관련이 있다.
IL-9
IL-9의 역할은 다른 γc-사이토카인 패밀리 구성원과 비교하여 여전히 다소 특성이 명확하지 않다. IL-9 유전자가 결핍된 마우스는 정상으로 보이며, 림프구 및 조혈 구획에서 세포의 하위 집합이 부족하지 않다. 그러나, 최근 연구에 따르면 Th17(인터루킨-17에 의해 유도된 T-헬퍼) 세포의 생성에서의 IL-9의 생체 내 역할이 밝혀졌다(문헌[Littman et al., 2010, Cell 140(6):845-58]; 및 문헌[Nowak et al., 2009, J. Exp. Med. 206: 1653-60] 참조).
IL-15
IL-15는 NK 세포, NK-T 세포, 상피내 림프구(IEL)의 일부 하위 집합, γδ-T 세포 및 기억-표현형 CD8 T-세포의 발달에 결정적으로 관여한다(문헌[Waldmann, 2007, J. Clin. Immunol.27:1-18] 및 문헌[Tagaya et al., 1996, EMBO J. 15:4928-39] 참조). 마우스에서 IL-15의 과발현은 NK-T 세포 및 CD8 세포 유형 T 세포 백혈병의 발병으로 이어진다(문헌[Fehniger et al., 2001, J. Exp. Med. 193:219-31]; 문헌[Sato et al. 2011 Blood in press] 참조). 이러한 실험적으로 유도된 백혈병은 두 경우 모두에서 백혈병 세포가 CD8 항원을 발현하기 때문에 인간의 LGL(대과립 림프구) 백혈병과 유사하게 나타난다.
또한 IL-15-매개 자가분비 기전이 CD4 T 림프구의 백혈병 형질전환에 관여할 수 있다고 의심되었다. (문헌[Azimi et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. 95:2452-7]; 문헌[Azimi et al., 1999, J. Immunol. 163:4064-72]; 문헌[Azimi et al., 2000, AIDS Res. Hum. Retroviruses 16:1717-22]; 및 문헌[Azimi et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. 98:14559-64] 참조). 예를 들어, 인간에서 성인 T 세포 백혈병을 유발하는 CD4-트로픽 HTLV-I은 IL-15 및 IL-15Rα의 생성을 통해 바이러스 형질전환된 T 세포의 자가분비 성장을 유도한다(문헌[Azimi et al., 1998, Proc. Natl. Acad.Sci.95:2452-7]).
백혈병 형질전환 외에도, 최근 연구에서는 자가면역 질환인 셀리악 병(CD)의 병리학적 발달에 IL-15가 원인임을 보여준다. IL-15는 인터페론-γ 뿐만 아니라 세포용해 효소(즉, 그랜자임 및 퍼포린)의 발현을 유도하여 NK, CD8 및 장 상피내 림프구(IEL) 세포의 림포카인-활성화 킬러(LAK) 세포로의 분화를 자극시키는 것으로 알려져 있다. 셀리악 병(본원에서 CD로 표시됨)은 특정 HLA-DQ 대립 유전자를 발현하는 개인의 글루텐-함유 식품 섭취에 의해 유발되는 면역-매개 장질환이다.
이 질환의 유병률은 서양 인구의 1%이다. 현재 CD에 대한 유일한 치료법은 환자의 식단에서 글루텐을 완전히 제거하는 것이다. CD의 병리학은 주로 장막 고유판에 침투한 활성화된 CD8 T 세포에 의해 유발되는 장 점막의 광범위한 손상에 의해 유발된다. 이러한 CD8 T 세포는 IL-15와 관련된 메커니즘을 통해 활성화되는 것으로 보인다. 한 최근 간행물에서는 장세포에 의한 IL-15의 이소성 과발현이 CD 환자의 병변과 매우 유사한 장병증의 발병으로 이어진다는 것을 마우스에서 입증했다. IL-15 활성의 중화는 병리학적 변화를 극적으로 감소시켰다. 따라서, IL-15에 의한 CD8 T 세포의 활성화를 차단하는 개입은 기존의 글루텐-프리 식단에 대해 대안적인 CD 관리 전략을 제공하는 것으로 보인다.
IL-21
IL-21은 가장 최근에 발견된 γc-패밀리의 구성원이다. 다른 패밀리 구성원과 달리, IL-21은 강력한 성장-촉진 효과가 없는 것으로 보인다. 대신, IL-21은 세포 증식을 제어하는 인자보다 분화 인자로서 더 많은 기능을 하는 것으로 생각된다(문헌[Tagaya, 2010, J. Leuk. Biol. 87:13-15] 참조).
γc-사이토카인-매개 질병 치료를 위한 현재 전략
γc-사이토카인은 수많은 인간 질병에 관여하는 것으로 생각되기 때문에, γc-사이토카인 패밀리 활성을 억제함으로써 γc-사이토카인-관련 질병을 치료하는 여러 방법이 제안되었다. 이러한 방법에는 생체 내에서 표적 사이토카인의 활성을 중화하기 위한 사이토카인-특이적 단일클론 항체의 사용; 사이토카인 활성을 선택적으로 억제하기 위해 전용 사이토카인-특이적 수용체 소단위(공유된 γc-소단위 이외의 소단위)를 표적으로 하는 단일클론 항체의 사용; 및 다운스트림 세포내 사이토카인 신호 전달 경로를 차단하는 화학적 억제제의 사용을 포함한다.
사이토카인-특이적 항체는 종종 치료제를 설계할 때 첫 번째 선택이지만, 수용체 구성요소를 공유하는 사이토카인은 중복되는 기능을 나타내며(문헌[Paul, W.E., 1989, Cell 57:521-24] 참조), 둘 이상의 사이토카인이 협력하여 질병을 유발할 수 있다(본원에 기재된 실시예 참조). 따라서, 단일 사이토카인의 중화를 포함하는 항체 접근법이 사이토카인-관련 인간 질병의 치료에 항상 최적인 것은 아닐 수 있다. 대안적인 치료 전략은 각각 질병 발병과 관련된 특정 사이토카인을 표적으로 하는 하나 초과의 항체를 사용하는 것, 그리고/또는 활성 및/또는 풍부도가 γc-사이토카인 신호에 의해 직접 조절되는 질병 발병과 관련된 특정 단백질 수용체를 표적으로 하는 것을 포함할 수 있다.
공유된 수용체 구성성분을 인식하는 항체를 통해 다수의 사이토카인의 기능을 억제하는 치료제를 설계하기 위한 전략 또한 제안되었다. 그러나, 사이토카인 수용체 시스템의 다중-소단위 특성과 단일 사이토카인에 대한 기능적 수용체가 다른 구성을 가정할 수 있다는 사실은 이러한 접근법을 어렵게 만든다.
예를 들어, 기능적 IL-15 수용체는 IL-15Rβ/γc 또는 IL-15Rα/β/γc일 수 있다. (문헌[Dubois et al., 2002, Immunity 17:537-47] 참조). IL-15Rβ 수용체(TMβ1)에 대한 항체는 IL-15 기능의 효율적인 억제제이지만, IL-15Rα 분자가 수용체 복합체에 없을 때에만 그렇다. (문헌[Tanaka et al., 1991, J. Immunol. 147:2222-28] 참조). 따라서, 단일클론 항-수용체 항체의 효과는 공유 또는 전용 소단위에 대해 발생하는지 여부에 관계없이 상황에 따라 달라질 수 있으며, 생체 내에서 예측할 수 없다.
치료 화합물의 폴리펩티드, 이의 단편 또는 다른 유도체, 또는 이의 유사체, 또는 이를 발현하는 세포는 이에 대한 항체를 생성하기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "면역원" 또는 "에피토프"는 동물, 바람직하게는 포유동물에서 항원성 또는 면역원성 활성을 갖는 폴리펩티드의 부분을 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 치료 화합물은 에피토프를 포함하는 폴리펩티드뿐만 아니라 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본원에 사용된 "면역원성 에피토프"는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 하기에 기재된 항체를 생성하는 방법에 의해 결정된 바와 같이 동물에서 항체 반응을 유발하는 단백질의 일부로서 정의된다. 본원에 사용된 용어 "항원 에피토프"는 당업계에 널리 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 면역분석법에 의해 결정된 바와 같이 이의 항원에 면역-특이적으로 결합할 수 있다(문헌[Cox et al. 2004 "Immunoassay methods", in Assay Guidance Manual[internet]]). 면역-특이적 결합은 비-특이적 결합을 배제하지만, 다른 항원과의 교차 반응성을 반드시 배제하지는 않는다. 항원 에피토프는 반드시 면역원성일 필요는 없다. 본 개시내용에서 치료 화합물의 전장 폴리펩티드 또는 항원성 펩티드 단편이 사용될 수 있다.
본 개시내용에서 치료 화합물의 에피토프-보유 폴리펩티드 영역은 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, BepiPred-2.0(문헌[Jespersen et al. 2017 Nucleic Acids Res, 45:W24-W29]), SVMTriP(문헌(Yao et al. 2012 PLoS One, 7:e45152]) 및 ABCpred(문헌[Saha et al. 2006 Proteins, 65:40-8])를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 자유롭게 사용가능한 다수의 소프트웨어 프로그램에 의해 결정될 수 있다. 항체는 바람직하게는 이들 영역 또는 이들 영역의 개별 단편으로부터 제조된다. 그러나, 항체는 본원에 기재된 펩티드의 임의의 영역으로부터 제조될 수 있다. 항체는 또한 리간드 결합 부위 또는 글리코실화, 인산화, 미리스토일화 또는 아미드화 부위와 같은 특정 기능 부위에 대해 개발될 수 있다. 에피토프로서 기능하는 펩티드 단편은 재조합 기술을 사용한 생물학적 생성 또는 수동 또는 자동 펩티드 합성 기술을 통한 화학적 생성과 같은 임의의 통상적인 수단에 의해 생성될 수 있다.
당해 분야에 공지된 다양한 절차가 이러한 항체 및 단편의 생성을 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 에피토프-보유 폴리펩티드는 생체 내 면역화, 시험관 내 면역화(문헌[Tomimatsu et al. 2014 Methods Mol Biol, 1060:297- 307]) 및 파지 디스플레이 방법(문헌[Hammers et al. 2014 J Invest Dermatol., 134:e17])을 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 항체를 유도하는 데 사용될 수 있다. 생체 내 면역화를 사용하는 경우, 동물을 유리 펩티드로 면역화할 수 있으나, 항-펩티드 항체 역가는 펩티드를 키홀 림펫 헤마시아닌(KLH) 또는 파상풍 톡소이드와 같은 거대분자 담체에 결합하여 부스트될 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기를 함유하는 펩티드는 말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르(MBS)와 같은 링커를 사용하여 담체에 커플링될 수 있는 반면, 다른 펩티드는 글루타르알데히드와 같은 보다 일반적인 연결제를 사용하여 담체에 커플링될 수 있다. 본 발명의 각각의 치료 화합물에 상응하는 폴리펩티드에 대해 생성된 항체는 폴리펩티드를 동물에 직접 주사하거나, 폴리펩티드를 동물, 바람직하게는 비인간에게 투여함으로써 수득할 수 있다. 토끼, 쥐, 마우스 및 염소와 같은 동물은, 예를 들어 약 100 ug의 펩티드 또는 담체 단백질 및 프로이드 보조제 또는 면역 반응을 자극하는 것으로 알려진 기타 보조제를 포함하는 에멀젼의 복강 및/또는 피하 주사에 의해, 유리 또는 담체-결합 펩티드, 또는 다중 항원성 펩티드(MAP)로 알려진 인위적으로 분지된 형태로 면역화시킬 수 있다. 예를 들어, 고체 표면에 흡착된 유리 펩티드를 사용하는 ELISA 분석에 의해 검출될 수 있는 항-펩티드 항체의 유용한 역가를 제공하기 위해, 예를 들어, 약 2주 간격으로 여러 번의 부스터 주사가 필요할 수 있다. 면역화된 동물로부터의 혈청 내 항-펩티드 항체의 역가는 항-펩티드 항체의 선택, 예를 들어, 고체 지지체 상의 펩티드에 대한 흡착 및 당업계에 널리 공지된 방법에 따른 선택된 항체의 용출에 의해 증가될 수 있다.
단일클론 항체의 제조를 위해, 연속 세포주 배양에 의해 생성된 항체를 제공하는 모든 기술을 사용할 수 있다. 예로는 하이브리도마 기술(문헌[Kohler et al. 1975 Nature, 256:495-7]), 트리오마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술(문헌[Kozbor et al. 1983 Immunology Today, 4:72-9]), 및 인간 단일클론 항체를 생성하기 위한 EBV-하이브리도마 기술(문헌[Kozbor et al. 1982 Proc Natl Acad Sci, 79:6651-55])이 포함된다. 단일 사슬 항체 단편(scFv)의 생성에 대해 기술된 기술(문헌[Blazek et al. 2003 Folia Microbiol, 48:687-98])은 본 발명의 치료 화합물로부터 유래된 면역원성 폴리펩티드에 대한 단일 사슬 항체를 생성하도록 조정할 수 있다.
인간화 항체는 비-인간 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 인간 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역을 갖는 원하는 항원에 결합하는 비-인간 종 항체로부터 유래된 항체 분자이다. 종종, 인간 프레임워크 영역의 프레임워크 잔기는 항원 결합을 변경, 바람직하게는 개선하기 위해 CDR 공여체 항체의 상응하는 잔기로 치환될 것이다. 이러한 프레임워크 치환은, 예를 들어, 특정 위치에서 특이한 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 서열 비교 및 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 CDR과 프레임워크 잔기의 상호작용을 모델링함으로써 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 확인된다. (문헌[Riechmann et al. 1988 Nature 332:323-7]). 항체는, 예를 들어, CDR-그라프팅(문헌[Williams et al. 2010 "Humanising Antibodies by CDR Grafting", in Antibody Engineering]), 축성 또는 재표면화(문헌[Padlan 1991 Mol Immunol 28:489-98], 문헌[Studnicka et al. 1994 Protein Eng 7:805-14], 문헌[Roguska et al. 1994 Proc Natl Acad Sci 91:969-73]) 및 사슬 셔플링(문헌[Guo-Qiang et al. 2009 Methods Mol Biol 562:133-42])을 포함하는 당업에 공지된 여러 기술을 사용하여 인간화시킬 수 있다.
완전한 인간 항체는 인간 환자의 치료적 처리에 특히 바람직하다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 사용하는 파지 디스플레이를 포함하는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다(Frenzel, et al. 2017 Transfus Med Hemother 44:312-18, Vaughan, et al. 1996 Nature 14:309-14). 선택된 에피토프를 인식하는 인간 항체는 "유도 선택"이라고 하는 기술을 사용하여 생성할 수도 있다. 이러한 접근법에서, 선택된 비-인간 단일클론 항체, 예를 들어, 마우스 항체는 동일한 에피토프를 인식하는 완전한 인간 항체의 선택을 안내하는 데 사용된다. (문헌[Jespers et al. 1994 Biotechnology 12:899-903]).
또한, 형질전환 마우스는 본 발명의 치료 화합물로부터 유래된 면역원성 폴리펩티드에 대한 인간 항체를 발현하는 데 사용될 수 있다(문헌[Laffleur et al. 2012 Methods Mol Biol, 901:149-59]). 기능적 내인성 면역글로불린을 발현할 수 없는 형질전환 마우스는 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체는 무작위로 또는 상동 재조합에 의해 마우스 배아 줄기 세포에 도입될 수 있다. 대안적으로, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자 외에 인간 가변 영역, 불변 영역 및 다양성 영역이 마우스 배아 줄기 세포에 도입될 수 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자는 상동 재조합에 의한 인간 면역글로불린 유전자좌의 도입과 별도로 또는 동시에 불능화될 수 있다. 특히, JH 영역의 동형접합 결실은 내인성 항체 생산을 방지한다. 변형된 배아 줄기 세포를 확장하고 배반포에 미세 주입하여 키메라 마우스를 생성한다. 다음에 키메라 마우스를 사육하여 인간 항체를 발현하는 동형접합 자손을 생성한다. 형질전환 마우스는 선택된 항원, 예를 들어, 본 발명의 치료 화합물에 상응하는 폴리펩티드의 전부 또는 일부로 정상적인 방식으로 면역화된다. 항원에 대한 단일클론 항체는 기존의 하이브리도마 기술을 사용하여 면역화된 형질전환 마우스로부터 얻을 수 있다. 형질전환 마우스에 의해 숨겨져 있는 인간 면역글로불린 형질전환 유전자는 B 세포 분화 동안 재배열되고, 이어서 클래스 전환 및 체세포 돌연변이를 겪는다. 따라서, 이러한 기술을 사용하여 치료적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생성하는 것이 가능하다. 인간 항체를 생성하기 위한 이 기술에 대한 개요는 문헌[Lonberg et al. 1995 Int Rev Immunol. 13:65-93]을 참조한다.
본 발명의 항체는 다클론, 단일클론, 다중-특이적, 인간, 인간화 또는 키메라 항체, 단일 사슬 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 항-유전자형(항-Id) 항체(예를 들어, 본 발명의 항체에 대한 항-Id 항체 포함), 및 임의의 상기의 에피토프-결합 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 사용된 용어 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉 항원에 면역-특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 지칭한다. 본 발명의 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, Ig|D, IgA 및 IgY), 부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 면역글로불린 분자의 하위부류일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 면역글로불린은 IgG1 이소형이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 면역글로불린은 IgG2 이소형이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 면역글로불린은 IgG4 이소형이다. 면역글로불린은 중쇄와 경쇄를 모두 가질 수 있다. 다수의 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY 중쇄는 카파 또는 람다 형태의 경쇄와 쌍을 이룰 수 있다.
다수의 γc-사이토카인의 억제를 위한 기존의 대안적 실시예로서의 JAK3 표적화
γc-하위단위와 γc-사이토카인 사이의 상호작용은 야뉴스 키나제 3(Janus kinase 3, Jak3)이라고 하는 세포내 단백질 티로신 키나제의 활성화를 유도한다. Jak3은 차례로 STAT5 및 PI3 키나제를 포함한 다수의 신호전달 분자를 인산화한다. γc-하위단위와 Jak3의 상호작용은 매우 특이적이다. 사실, 신호 전달을 위해 Jak3를 모집하는 다른 수용체 분자는 없다. (문헌[O'Shea, 2004, Ann. Rheum. Dis. 63:(suppl. II):ii67-7] 참조). 따라서, γc-하위단위를 통한 사이토카인 신호전달의 억제는 Jak3 키나제의 활성을 차단함으로써 달성될 수 있다. 따라서, Jak3의 키나제 활성을 표적으로 하는 다수의 소분자 화학 억제제가 시장에 도입되었다. (문헌[Pesu et al., 2008, Immunol. Rev. 223:132-142] 참조). 이러한 하나의 예는 CP690,550이다.
이러한 단백질 키나제 억제제의 주요 단점은 Jak3 키나제에 대한 특이성이 부족하다는 것이다. 이들 약물은, 많은 단백질 키나제에 대한 일반적인 생화학적 반응인, ATP(아데노신-트리포스페이트) 분자의 Jak3 키나제에 대한 결합을 차단하는데, 따라서 다양한 조직에서 정상 세포의 안녕을 위해 결정적으로 필요한 작용을 하는 Jak3 키나제와 관련이 없는 여러 세포내 단백질 키나제의 작용을 차단하는 경향이 있다. 따라서, γc-하위단위를 통한 신호전달의 보다 구체적인 억제제가 필요하다.
따라서 γc-사이토카인-관련 질병을 치료하기 위한 대안적인 비-소분자 화학적 전략이 매우 필요하다.
γc-박스의 발견
γc-사이토카인의 C-말단(D-나선)은 다중-단위 사이토카인 수용체의 공통 γc-하위단위와 상호작용하기 위한 제안된 부위를 포함한다. (문헌[Bernard et al., 2004 J. Biol. Chem. 279:24313-21]). 마우스와 인간에서 확인된 모든 γc-사이토카인 아미노산의 생화학적 특성을 비교하여 아미노산의 화학적 특성, 예를 들어, 소수성, 친수성, 염기/산성 특성이 γc-사이토카인 패밀리의 구성원에 걸친 D-나선의 여러 위치에서 동일하지는 않더라도 보존된다는 것이 밝혀졌다.
대조적으로, γc-사이토카인인 IL-4와 관련이 있지만 γc-하위단위에 결합하지 않는 IL-13의 서열은 γc-사이토카인에 대한 D-나선 영역에서 유의한 상동성을 나타내지 않고, 이는 D-나선 영역의 서열 상동성이 γc-하위단위에 대한 결합과 상관관계가 있음을 시사한다. 도 1a에 도시된 바와 같이, 인간에서 γc-사이토카인 패밀리 구성원의 D-나선 영역의 아미노산 서열의 정렬은 본원에서 "γc-박스"로 지칭되는 이러한 사이토카인에서 중간 서열 상동성의 모티프를 드러낸다.
γc-박스(서열 번호: 9)는 19개 아미노산을 포함하며, 19개 위치 중 4, 5 및 13번 위치는 각각 페닐알라닌, 류신 및 글루타민으로 완전히 보존되어 있다. 아미노산이 물리-화학적 특성을 공유하는 2개 또는 3개의 관련 아미노산 중 하나인 γc-박스의 위치 6, 7 및 11에서 보존이 덜 된 것이 관찰되었다: 위치 6에는 극성 아미노산인 글루타메이트, 아스파라긴 또는 글루타민이 있을 수 있으며; 비극성 아미노산인 세린 또는 아르기닌은 위치 7을 차지할 수 있고; 11번 위치는 비극성 지방족 아미노산인 류신 또는 이소류신이 차지한다. 9번과 16번 위치는 비극성 아미노산인 이소류신 또는 극성 아미노산인 라이신이 차지할 수 있다. 도 1b를 참조한다. γc-박스의 아미노산 조성에서 약간의 차이가 γc-사이토카인의 하위패밀리 사이 중 위치 9와 16에서 관찰된다. 종에 걸친 γc-사이토카인의 비교는 이소류신이 종종 IL-2/15 하위패밀리의 9번 및 16번 위치에 존재하는 반면, 다른 γc-패밀리 구성원은 종종 이러한 위치에 라이신을 소유한다는 것을 보여준다. 특정 이론에 국한되지 않고, 이소류신과 라이신은 생화학적으로 다르며, 따라서 IL-2/15 하위패밀리와 다른 γc-사이토카인 사이에 특정한 형태적 차이를 부여할 수 있다.
γc-사이토카인 사이의 γc-박스 모티프의 보존은 D-나선 영역에 위치한 글루타민(Gln, Q) 잔기가 γc-하위단위에 대한 γc-사이토카인의 결합에 중요하다는 발견에 의해 뒷받침된다. (문헌[Bernard et al., 2004 J. Biol. Chem. 279: 24313-21])
γc-사이토카인 활성 조절제
γc-패밀리 사이토카인의 활성은, 예를 들어, 다중-하위단위 사이토카인 수용체를 통한 신호전달을 자극하지 않고 γc-하위단위와 상호작용할 수 있는 경쟁적 억제제를 도입함으로써, γc-사이토카인과 γc-하위단위 사이의 상호작용을 방해함으로써 차단될 수 있다. 특정 이론에 국한되지 않고, γc-하위단위에 대한 γc-패밀리 사이토카인의 결합에 참여하는 보존된 γc-박스 모티프는 γc-사이토카인 신호전달의 펩티드 조절제를 설계하는 데 사용될 수 있는 코어 염기 아미노산 서열을 제시한다.
코어 γc-박스 아미노산 서열은 D/E-F-L-E/Q/N-S/R-X-I/K-X-L/I-X-Q(서열 번호: 2)(여기서, X는 임의의 아미노산을 나타냄)를 포함한다. 본원에 기술된 실시양태는 하나 이상의 γc-사이토카인의 활성을 조절할 수 있는 코어 γc-박스 아미노산 서열의 맞춤형 펩티드 유도체에 관한 것이다. 맞춤형 펩티드 유도체는 부분 아미노산 서열이 코어 γc-박스 아미노산 서열에 대한 대략 50%, 50 내지 60%, 60 내지 70%, 70 내지 80%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 99.8% 동일성을 보여주는 임의의 펩티드를 포함한다. 맞춤형 펩티드 유도체는 펩티드 유도체의 부분 아미노산 서열이 코어 γc-박스의 아미노산과 유사한 물리-화학적 특성을 갖는 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드를 추가로 포함한다. 예를 들어, 유사한 물리-화학적 특성을 갖는 아미노산에는 방향족 아미노산인 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 및 히스티딘이 포함된다. 도 2는 코어 γc-박스를 포함하는 아미노산을 대체할 수 있는 유사한 물리-화학적 특성을 갖는 아미노산의 도식화된 표현을 나타낸다. 코어 γc-박스의 펩티드 유도체는 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50 또는 50개 이상의 아미노산 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 맞춤형 펩티드 유도체는 기존 생물학적 단백질/펩티드의 N-말단, C-말단 및/또는 측면 잔기에 접합될 수 있다.
γc-하위단위에 결합하는 사이토카인에서 보존된 γc-박스 모티프의 확인에 기초하여, 출원인은 인간 IL-2 및 IL-15 γc-박스의 아미노산 서열을 결합하는 인공 복합 펩티드인 신규한 19-머(19-mer) 맞춤형 유도체 펩티드를 고안했다. 본원에서 BNZ-γ로 지칭되는 19-머 펩티드는 아미노산 서열 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)로 구성되며, 여기서 굵은 문자로 표시된 아미노산은 IL-2와 IL-15 사이에 보존되며, 밑줄 친 아미노산은 아미노산의 물리-화학적 특성이 보존되는 위치를 나타낸다.
출원인은 19-머 BNZ-γ가 IL-15 및 IL-9 유도된 세포 증식은 억제하지만, IL-3 또는 IL-4 유도된 세포 증식은 억제하지 않는다는 것을 발견했다. 도 3a 및 실시예 2를 참조한다. 출원인은 BNZ-γ가 세포내 사이토카인 신호 전달 분자인 STAT-5의 IL-15 매개 인산화를 억제한다는 것을 추가로 입증했다. 도 4 및 실시예 5를 참조한다. 이러한 결과는 보존된 γc-박스 모티프의 맞춤형 펩티드 유도체가 다수의 γc-사이토카인의 활성을 조절할 수 있음을 입증한다.
여러 실시양태는 탈모 및 탈모 관련 문제증상과 같은 자가면역 질환의 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방을 위해 하나 이상의 γc-사이토카인 패밀리 구성원에 의한 신호전달을 조절하는 하나 이상의 치료 화합물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 치료 화합물은 γc-사이토카인 길항제 펩티드, γc-사이토카인 길항제 펩티드 유도체, 항-CD8 항체, 항-IL-2 항체, 항-IL-15 항체, 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 조합 중 하나 이상이다.
일부 실시양태에서, 본원에서 19-머 BNZ-γ 아미노산 서열, I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)의 맞춤형 유도체 펩티드 또는 복합 펩티드 유도체로도 지칭되는 γc-사이토카인 길항제 펩티드 및 이의 유도체는 하나 이상의 γc-사이토카인의 활성을 억제할 수 있다. 19-머 BNZ-γ 아미노산 서열의 맞춤형 펩티드 유도체는 부분 아미노산 서열이 아미도산 서열: I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)에 대략 50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 99.8% 동일성을 갖는 임의의 펩티드를 포함한다. 맞춤형 펩티드 유도체는 펩티드 유도체의 부분 아미노산 서열이 서열: I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)의 아미노산과 유사한 물리-화학적 특성을 갖는 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드를 추가로 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 맞춤형 유도체 펩티드의 아미노산 잔기는 BNZ-γ의 아미노산 잔기와 유사한 물리-화학적 특성을 유지하지만, 6개의 γc-사이토카인 패밀리 구성원에 대해 원래의 19-머 펩티드의 것과 상이한 생물학적 억제 특이성을 나타낸다. BNZ-γ의 펩티드 유도체는 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50 또는 50개 초과의 아미노산 길이일 수 있다.
일부 실시양태에서, 맞춤형 펩티드 유도체는 기존 생물학적 단백질/펩티드의 N-말단, C-말단 및/또는 측면 잔기에 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, BNZ-γ의 펩티드 유도체는 복합 펩티드의 N-말단, C-말단, 또는 측쇄를 통해 다른 모이어티에 접합될 수 있다. 다른 모이어티는 복합 펩티드를 안정화하는 단백질 또는 펩티드를 포함할 수 있거나, 비제한적으로 소혈청 알부민(BSA), 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), IgG의 Fc 영역, 스캐폴드로 기능하는 생물학적 단백질, 세포-특이적 항원에 대한 항체, 수용체, 리간드, 금속 이온 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하는 기타 모이어티를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 맞춤형 펩티드 유도체는 하나 이상의 펩티드 내 탄화수소 링커 요소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 19-머 BNZ-γ(서열 번호: 1)는 하나 이상의 펩티드 내 탄화수소 링커 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 19-머 BNZ-γ(서열 번호: 1)는 서열 번호: 1에서 4 잔기 떨어져 위치된 2개의 개별 아미노산을 연결하는 하나 이상의 펩티드 내 탄화수소 링커 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 19-머 BNZ-γ(서열 번호: 1)는 서열 번호: 1에서 7 잔기 떨어져 위치된 2개의 개별 아미노산을 연결하는 하나 이상의 펩티드 내 탄화수소 링커 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 19-머 BNZ-γ(서열 번호: 1)는 서열 번호: 1에서 4 잔기 떨어져 위치 및 서열 번호: 1에서 7 잔기 떨어져 위치된 2개의 개별 아미노산을 연결하는 하나 이상의 펩티드 내 탄화수소 링커 요소를 포함한다.
여러 실시양태는 하나 이상의 γc-사이토카인의 활성을 억제할 수 있는 아미노산 서열 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)의 맞춤형 유도체 펩티드에 관한 것이다. 아미노산 서열의 맞춤형 펩티드 유도체는 부분 아미노산 서열이 아미노산 서열: I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)에 대략 50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 99.8% 동일성을 나타내는 임의의 펩티드를 포함한다. 맞춤형 펩티드 유도체는 펩티드 유도체의 부분 아미노산 서열이 서열: I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)의 아미노산과 유사한 물리-화학적 특성을 갖는 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드를 추가로 포함한다.
여러 실시양태에서, 맞춤형 유도체 펩티드의 아미노산 잔기는 서열번호: 1의 아미노산 잔기와 유사한 물리-화학적 특성을 유지하지만, 6개의 γc-사이토카인 패밀리 구성원에 대해 원래의 19-머 펩티드의 것과 상이한 생물학적 억제 특이성을 나타낸다. 서열 번호: 1의 펩티드 유도체는 19 미만, 20, 21, 22, 23, 24, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 또는 50개 초과의 아미노산 길이일 수 있다.
일부 실시양태에서, 맞춤형 펩티드 유도체는 기존 생물학적 단백질/펩티드의 N-말단, C-말단 및/또는 측면 잔기에 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열 번호: 1의 복합 펩티드는 복합 펩티드의 N-말단, C-말단, 또는 측쇄를 통해 다른 모이어티에 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다른 모이어티는 복합 펩티드를 안정화시키는 단백질 또는 펩티드, 또는 제한 없이 소 혈청 알부민(BSA), 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), IgG의 Fc 영역, 스캐폴드로 기능하는 생물학적 단백질, 세포-특이적 항원에 대한 항체, 수용체, 리간드, 금속 이온 및 폴리 에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하는 다른 모이어티를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 맞춤형 펩티드 유도체는 하나 이상의 펩티드 내 탄화수소 링커 요소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열 번호: 1의 복합 펩티드는 하나 이상의 펩티드 내 탄화수소 링커 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열번호: 1의 복합 펩티드는 서열번호: 1에서 4 잔기 떨어져 위치된 2개의 개별 아미노산을 연결하는 하나 이상의 펩티드 내 탄화수소 링커 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열번호: 1의 복합 펩티드는 서열번호: 1에서 7 잔기 떨어져 위치된 2개의 개별 아미노산을 연결하는 하나 이상의 펩티드 내 탄화수소 링커 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열번호: 1의 복합 펩티드는 서열번호: 1에서 4 잔기 떨어져 위치 및 서열번호: 1에서 7 잔기 떨어져 위치된 2개의 개별 아미노산을 연결하는 하나 이상의 펩티드 내 탄화수소 링커 요소를 포함한다.
여러 실시양태는 도 1a에 도시된 IL-15, IL-2, IL-21, IL-4, IL-9, 또는 IL-7의 γc-박스 모티프의 맞춤형 펩티드 유도체에 관한 것이다. 다른 실시양태는 인간 IL-15, IL-2, IL-21, IL-4, IL-9, 및 IL-7 γc-박스 모티프 중 둘 이상의 아미노산 서열을 결합하는 인공 복합 펩티드인 맞춤형 유도체 펩티드에 관한 것이다. 여러 실시양태는 IL-15, IL-2, IL-21, IL-4, IL-9 또는 IL-7의 γc-박스 모티프의 아미노산 서열에 대략 50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 99.8% 동일성을 나타내는 부분 아미노산 서열을 갖는 IL-15, IL-2, IL-21, IL-4, IL-9, 또는 IL-7의 γc-박스 모티프의 맞춤형 펩티드 유도체에 관한 것이다. IL-15, IL-2, IL-21, IL-4, IL-9, 또는 IL-7의 γc-박스 모티프의 맞춤형 펩티드 유도체는 이의 펩티드 유도체의 부분 아미노산 서열이 IL-15, IL-2, IL-21, IL-4, IL-9 또는 IL-7의 γc-박스 모티프 서열의 아미노산과 물리-화학적 특성이 유사한 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드를 추가로 포함한다.
여러 실시양태는 γc-사이토카인의 하나, 모두, 또는 선택적인 구성원의 기능을 억제하는 맞춤형 펩티드 유도체에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 맞춤형 펩티드 유도체는 개별 γc-사이토카인 패밀리 구성원을 선택적으로 표적화한다. 예를 들어, 맞춤형 펩티드 유도체는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 또는 IL-21의 기능을 선택적으로 억제할 수 있다. 다른 실시양태에서, 맞춤형 펩티드 유도체는 2개 이상의 γc-사이토카인 패밀리 구성원을 억제할 수 있다.
예를 들어, 본 실시양태의 맞춤형 펩티드 유도체는 IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21 중 하나 이상과 조합된 IL-2; IL-2, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21 중 하나 이상과 조합된 IL-4; IL-2, IL-4, IL-9, IL-15 및 IL-21 중 하나 이상과 조합된 IL-7; IL-2, IL-4, IL-7, IL-15 및 IL-21 중 하나 이상과 조합된 IL-9; IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 및 IL-21 중 하나 이상과 조합된 IL-15; 또는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 및 IL-15 중 하나 이상과 조합된 IL-21의 기능을 선택적으로 억제할 수 있다. 다른 실시양태에서, 맞춤형 펩티드 유도체는 모든 γc-사이토카인 패밀리 구성원을 포괄적으로 표적화할 수 있다.
특정 이론에 국한되지 않고, 맞춤형 펩티드 유도체는, 예를 들어, 경쟁적 억제제로서 γc-하위단위에 대한 γc-사이토카인의 결합을 감소시킴으로써 γc-사이토카인의 모든 또는 선택적 구성원의 기능을 억제할 수 있다. 이러한 맞춤형 펩티드 유도체는 임상 약물을 비롯한 다양한 응용 분야에 사용될 수 있다.
여러 실시양태는 γc-사이토카인의 하나, 둘 또는 그 이상의 선택적 구성원의 기능을 조절(증진 또는 감소 포함)하는 맞춤형 펩티드 유도체에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 맞춤형 펩티드 유도체는 개별 γc-사이토카인 패밀리 구성원을 선택적으로 표적화한다. 예를 들어, 맞춤형 펩티드 유도체는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 또는 IL-21의 기능을 선택적으로 향상시키거나 억제할 수 있다. 다른 실시양태에서, 맞춤형 펩티드 유도체는 2개 이상의 γc-사이토카인 패밀리 구성원을 향상시키거나 억제할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 보존된 γc-박스 모티프의 맞춤형 펩티드 유도체 중 하나 이상은 하나 이상의 γc-사이토카인의 활성을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 보존된 γc-박스 모티프의 맞춤형 펩티드 유도체 중 하나 이상은 하나 이상의 γc-사이토카인에 의해 유도된 세포 증식을 억제함으로써 하나 이상의 γc-사이토카인의 활성을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 보존된 γc-박스 모티프의 맞춤형 펩티드 유도체 중 하나 이상은 하나 이상의 γc-사이토카인에 의해 매개되는 세포내 사이토카인 신호 전달 분자의 인산화를 억제함으로써 하나 이상의 γc-사이토카인의 활성을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 보존된 γc-박스 모티프의 맞춤형 펩티드 유도체 중 하나 이상은 하나 이상의 γc-사이토카인에 의해 유도된 세포 증식을 억제하고, 하나 이상의 γc-사이토카인에 의해 매개되는 세포내 사이토카인 신호 전달 분자의 인산화를 억제함으로써 하나 이상의 γc-사이토카인의 활성을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 보존된 γc-박스 모티프의 맞춤형 펩티드 유도체 중 하나 이상은 하나 이상의 다른 메카니즘에 의해 하나 이상의 γc-사이토카인의 활성을 억제할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 펩티드 서열 중 하나 이상은 본원에 개시된 사이토카인(예를 들어, IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21) 중 하나 이상에 의해 유도된 하나 이상의 세포 유형의 증식을 억제한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 펩티드 서열 중 하나 이상은 본원에 개시된 모든 사이토카인에 의해 유도된 하나 이상의 세포 유형의 증식을 억제한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 펩티드 서열 중 하나 이상은 본원에 개시된 사이토카인의 전부가 아닌 일부에 의해 유도된 하나 이상의 세포 유형의 증식을 억제한다. 일부 실시양태에서, 서열 번호: 1은 IL-2 IL-9, 및 IL-15 유도 세포 증식을 억제한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 보존된 γc-박스 모티프의 맞춤형 펩티드 유도체 중 하나 이상은 하나 이상의 본원에 개시된 γc-사이토카인(예를 들어, IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21)에 의해 매개되는 하나 이상의 세포내 사이토카인 신호 전달 분자의 인산화를 억제함으로써 하나 이상의 γc-사이토카인의 활성을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 보존된 γc-박스 모티프의 하나 이상의 맞춤형 펩티드 유도체는 본원에 개시된 모든 γc-사이토카인에 의해 매개되는 하나 이상의 세포내 사이토카인 신호 전달 분자의 인산화를 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 보존된 γc-박스 모티프의 맞춤형 펩티드 유도체 중 하나 이상은 본원에 개시된 γc-사이토카인의 전부는 아니지만 일부에 의해 매개되는 하나 이상의 세포내 사이토카인 신호 전달 분자의 인산화를 억제할 수 있다.
또한, 예를 들어, 본원에 개시된 펩티드는 세포내 사이토카인 신호 전달 분자 STAT-5의 IL-15 매개 인산화를 억제하는 데 사용될 수 있다.
복합 펩티드, 및 γc-사이토카인 신호전달을 조절하기 위한 조성물, 방법 및 키트가 본원에 제공된다. "복합 펩티드", "복합 펩티드 유도체", "맞춤형 펩티드", "길항제 펩티드", "길항제 펩티드 유도체", "올리고펩티드", "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 본 실시형태에 따라 제공된 "맞춤형 펩티드 유도체"를 언급할 때 상호교환적으로 사용될 수 있고, 임의의 길이의 일련의 아미노산 잔기를 지정하는 데 사용될 수 있다. 본 실시형태의 펩티드는 선형 또는 고리형일 수 있다. 본 실시형태의 펩티드는 천연 아미노산, 비-천연 아미노산, (D) 입체화학적 배열의 아미노산, (L) 입체화학적 배열의 아미노산, (R) 입체화학적 배열의 아미노산, (S) 입체화학적 배열의 아미노산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 실시형태의 펩티드는 또한 매우 다양한 측쇄 변형 및/또는 치환이 있거나 없는, 하나 이상의 희귀 아미노산(예컨대, 4-히드록시프롤린 또는 히드록시리신), 유기산 또는 아미드 및/또는 일반적인 아미노산의 유도체, 예컨대 C-말단 카르복실레이트가 에스테르화된 아미노산(예를 들어, 벤질, 메틸 또는 에틸 에스테르) 또는 아미드화된 아미노산 및/또는 N-말단 아미노 기의 변형을 갖는 아미노산(예를 들어, 아세틸화 또는 알콕시카르보닐아미노)을 포함할 수 있다. 본 실시형태의 맞춤형 펩티드 유도체에 존재할 수 있는 측쇄 변형, 치환 또는 이들의 조합은 α-메틸, α-알케닐, 알킬화, 메틸화, 벤질화, t-부틸화, 토실화, 알콕시카르보닐아미노 등을 들 수 있다.
존재할 수 있는 일반적인 아미노산 이외의 잔기에는, 이에 제한되지는 않지만, 페니실라민, 테트라메틸렌 시스테인, 펜타메틸렌 시스테인, 머캅토프로피온산, 노르류신, 펜타메틸렌-머캅토프로피온산, 2-머캅토벤젠, 2-머캅토아닐린, 2-머캅토프롤린, 오르니틴, 아미노이소부티르산, 디아미노부티르산, 아미노아디프산, m-아미노메틸벤조산 및 디아미노프로피온산을 포함한다.
본 실시형태의 펩티드는 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 제조 및 수득될 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 본 실시형태의 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 기초하여 유전 공학 기술로 생성될 수 있거나, 펩티드 고상 합성 등에 의해 화학적으로 합성되거나, 또는 이들의 조합으로 생성 및 수득될 수 있다. 고상 펩티드 합성 분야의 숙련자는 (D) 뿐만 아니라 (L), 또는 (R) 및 (S) 입체화학적 배열의 천연 또는 비-천연 아미노산을 용이하게 혼입할 수 있다. 또한, (D), (L), (R) 또는 (S) 입체화학적 배열, 또는 이들의 조합 중 하나 이상의 α-치환된(예컨대, α-알케닐) 천연 또는 비-천연 아미노산을 이용하여 본 실시형태의 하나 이상의 펩티드 내 탄화수소 링커 요소를 함유하는 펩티드를 생성 및 수득하는 것이 고상 펩티드 합성 분야의 숙련자에게 명백할 것이다. 일부 실시양태에서, α-치환된 아미노산(예를 들어, α-알케닐 아미노산)을 연결하는 펩티드 내 탄화수소 링커 요소는 하나 이상의 고리닫기 복분해(ring-closing metathesis)를 촉매함으로써 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 펩티드 내 탄화수소 링커 요소는 펩티드 합성 동안 수지-결합 펩티드 상의 벤질리덴비스(트리시클로헥실-포스핀)-디클로로루테늄(그랍스 촉매(Grubb's catalyst))을 사용하여 고리닫기 복분해를 촉매함으로써 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 공지된 펩티드 합성 과정 동안 다른 고리닫기 합성 반응 및/또는 메카니즘이 또한 고려된다. 당업자는 보존된 γc-박스 모티프의 본 개시내용 및 도 2에 기재된 바와 같은 아미노산의 생화학적 특성에 대한 지식을 기초로 맞춤형 펩티드 유도체를 합성할 수 있다.
본 실시형태의 펩티드는 또한 2개 이상의 α-알케닐 치환된 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 α-알케닐 치환된 아미노산은 α-알케닐 치환된 아미노산에 혼입된 1개 이상의 펩티드 내 탄화수소 링커 요소를 통해 연결된다. 일부 실시양태에서, α-알케닐 치환된 아미노산은 펩티드 합성 동안 고리닫기 복분해에 의해 펩티드 내 탄화수소 링커 요소의 형성을 촉매하기 위해 사용된다. 펩티드 내 링커 요소는 본 개시내용의 맞춤형 펩티드 유도체의 동일한 서열 상의 별도의 아미노산을 연결한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 펩티드는 선형 또는 고리형이다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 펩티드 내 탄화수소 링커 요소는 복합 펩티드의 2차 구조에서 단일 α-나선 회전과 상관관계가 있는 아미노산 위치에 혼입된다. 일부 실시양태에서, 복합 펩티드가 하나 이상의 비연속적인 단일 α-나선 회전을 포함하는 경우, 복합 펩티드의 단일 α-나선 회전과 상관관계가 있는 아미노산 위치는 복합 펩티드의 아미노산 위치 i 및 i+4에 해당하며, 여기서 i는 단일 α-나선 회전의 첫 번째 아미노산 위치이고, i+4는 단일 α-나선 회전의 마지막 아미노산 위치이며, 아미노산 위치 i 및 i+4는 알파-알케닐 치환된 아미노산을 포함하고, 여기서 i 및 i+4는 4 잔기 떨어져 위치한다(간격 4).
일부 실시양태에서, 고상 펩티드 합성 분야의 숙련자는 복합 펩티드가 하나 이상의 단일 α-나선 회전을 포함하도록 하나 초과의 펩티드 내 탄화수소 링커 요소를 포함하는 복합 펩티드를 용이하게 합성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 초과의 단일 α-나선 회전은 비-연속적이며, 즉 1개 초과의 단일 α-나선 회전은 치환된 아미노산을 공유하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 복합 펩티드는 복합 펩티드의 하나 초과의 비-연속적 단일 α-나선 회전에 걸쳐 있는 화학식 1의 하나 이상의 펩티드 내 탄화수소 링커 요소(표 1 참조)를 포함할 수 있다.
본 실시형태의 하나 이상의 펩티드 내 탄화수소 링커 요소를 함유하는 임의의 특정 펩티드에 국한되지 않고, 4 잔기 떨어져 위치된 2개의 개별 아미노산을 연결하는 하나의 펩티드 내 탄화수소 링커 요소를 함유하는 일반적인 펩티드 예, 또는 하나의 α- 나선 회전(위치 i 및 위치 i+4)은 펩티드가 여전히 고체 지지체에 수지-결합되어 있는 동안 그랍스 촉매를 사용하여 고리닫기 복분해를 촉매하기 전에 펩티드의 고상 합성 동안 위치 i 및 i+4 각각에 혼입된 S-펜테닐알라닌(S5Ala)을 가질 수 있다. 이것은 4 잔기 떨어져 위치된 하기에 도시된 펩티드 내 탄화수소 링커 요소(서열번호: 23)를 함유하는 펩티드 서열을 생성할 것이다:
Figure pct00001
일부 실시양태에서, 하나 이상의 펩티드 내 탄화수소 링커 요소는 복합 펩티드의 2차 구조에서 이중 α-나선 회전과 상관관계가 있는 아미노산 위치에 혼입된다. 일부 실시양태에서, 복합 펩티드가 하나 이상의 비-연속적 이중 α-나선 회전을 포함하는 경우, 복합 펩티드의 이중 α-나선 회전과 상관관계가 있는 아미노산 위치는 복합 펩티드의 아미노산 위치 i 및 i+7에 상응하며, 여기서 i는 이중 α-나선 회전의 첫 번째 아미노산 위치이고, i+7은 이중 α-나선 회전의 마지막 아미노산 위치이며, 아미노산 위치 i 및 i+7은 알파-알케닐 치환된 아미노산을 포함하고, 여기서 i 및 i+7은 7 잔기 떨어져 위치한다(간격 7).
본 실시형태의 하나 이상의 펩티드 내 탄화수소 링커 요소를 함유하는 임의의 특정 펩티드에 국한되지 않고, 7 잔기 떨어져 위치된 2개의 개별 아미노산을 연결하는 하나의 펩티드 내 탄화수소 링커 요소를 함유하는 일반적인 펩티드 예, 또는 2개의 α- 나선 회전(위치 i 및 위치 i+7)은 펩티드가 여전히 고체 지지체에 수지-결합되어 있는 동안 그랍스 촉매를 사용한 고리닫기 복분해를 촉매하기 전에 펩티드의 고상 합성 동안 위치 i에 혼입된 R-옥테닐알라닌(R8Ala) 및 위치 i+7에 혼입된 S-펜테닐알라닌(S5Ala)을 가질 수 있다. 이것은 7 잔기 떨어져 위치하는 하기에 도시된 펩티드 내 탄화수소 링커 요소(서열번호: 24)를 함유하는 펩티드 서열을 생성할 것이다:
Figure pct00002
일부 실시양태에서, 고상 펩티드 합성 분야의 숙련자는 복합 펩티드가 하나 이상의 이중 α-나선 회전을 포함하도록 하나 이상의 펩티드 내 탄화수소 링커 요소를 포함하는 복합 펩티드를 용이하게 합성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 초과의 이중 α-나선 화전은 비-연속적이며, 즉 1개 초과의 이중 α-나선 회전은 치환된 아미노산을 공유하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 복합 펩티드는 복합 펩티드의 하나 초과의 비-연속적 이중 α-나선 회전에 걸쳐 있는 화학식 2의 하나 이상의 펩티드 내 탄화수소 링커 요소(표 1 참조)를 포함할 수 있다.
고상 펩티드 합성 분야의 숙련자는 펩티드가 고체 지지체에 여전히 수지-결합되어 있는 동안 그랍스 촉매를 사용해서 고리닫기 복분해를 촉매하기 전에 고상 펩티드 합성 동안 짝을 이룬 떨어져 있는 이중 α-나선 회전(7 잔기 떨어짐) 또는 단일 α-나선 회전(4 잔기 떨어짐)의 각 α-알케닐 치환된 아미노산을 갖는, 펩티드에서 짝을 이룬 비-중첩 아미노산 위치에 α-알케닐 치환된 아미노산을 혼입함으로써 본 실시형태의 하나 초과의 펩티드 내 탄화수소 링커 요소를 함유하는 펩티드를 쉽게 합성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 펩티드는 단일 α-나선 회전(4 잔기 떨어짐)에 걸쳐 있는 하나 초과의 펩티드 내 탄화수소 링커 요소를 포함할 수 있고, 이중 α-나선 회전(7 잔기 떨어짐)에 걸쳐 있는 탄화수소 링커 요소를 함유할 수 있고, 또는 단일 α-나선 회전(4 잔기 떨어짐) 및 이중 α-나선 회전(7 잔기 떨어짐) 펩티드 내 탄화수소 링커 요소의 조합을 포함할 수 있다.
본 실시형태의 하나 이상의 펩티드 내 탄화수소 링커 요소를 함유하는 펩티드는 (D) 뿐만 아니라 (L), 또는 (R) 뿐만 아니라 (S) 입체화학적 구성으로 상업적으로 입수 가능한 Boc- 또는 Fmoc-보호된 α-알케닐 치환된 천연 또는 비-천연 아미노산을 이용하여 고상 펩티드 합성을 통해 생성될 수 있다. Fmoc-보호된 α-알케닐 치환된 아미노산 및 본 실시형태의 맞춤형 펩티드 유도체의 합성에 사용될 수 있는 고리닫기 복분해 후 생성된 탄화수소 링커 요소는 표 1에 나타나 있으나, 이에 제한되지 않는다:
Figure pct00003
일부 실시양태에서, 펩티드 내 탄화수소 링커는 하나 이상의 화학적 반응을 통해 추가로 기능화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 내 탄화수소 링커(예를 들어, 표 1의 화학식 1 - 화학식 2)에 존재하는 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합(들)은 하나 이상의 추가 화학적 작용기를 추가하기 위한 유기 화학 반응에 사용될 수 있다. 예를 들어, 알켄 반응은 본 실시형태의 하나 이상의 펩티드 내 탄화수소 링커 요소를 함유하는 맞춤형 펩티드 유도체에 이용될 수 있다. 알켄 반응의 비제한적인 예는 수소화 붕소 첨가, 옥시수은화, 수화, 염소화, 브롬화, HF, HBr, HCl 또는 HI의 첨가, 디히드록실화, 에폭시화, 수소화, 및 시클로프로판화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 내 탄화수소 링커 요소의 하나 이상의 추가 화학적 작용기는 알켄 반응 후에 달성될 수 있다. 비제한적인 예는 에폭사이드 및 히드록실 기와의 친핵성 반응 등과 같은 하나 이상의 화학적 기 치환기의 공유 부가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 알켄 반응은 비오틴, 방사성 동위원소, 치료제(비제한적 예는 라파마이신, 빈블라스틴, 탁솔 등을 포함함), 비-단백질 형광성 화학 기(비제한적 예는 FITC, 히드라지드, 로다민, 말레이미드 등을 포함함) 및 단백질 형광성 기(비제한적인 예는 GFP, YFP, mCherry 등을 포함함)를 본 실시양태의 하나 이상의 펩티드 간 및/또는 펩티드 내 탄화수소 링커 요소에 부착시키기 위해 이용될 수 있다.
하나 이상의 펩티드 내 탄화수소 링커 요소를 포함하는 복합 펩티드의 비제한적인 예가 표 2에 제공되어 있다. 표 2의 예는 본 실시형태의 단일 α-나선 회전(간격 4) 및/또는 이중 α-나선 회전(간격 7) 펩티드 내 탄화수소 링커 요소의 합성에 유용한 임의의 특정 α-알케닐 치환된 아미노산 및/또는 본 실시형태의 맞춤형 펩티드 유도체에서 임의의 특정 아미노산 입체화학적 배열(예를 들어, 표 2에서 "d"로 표시된 (D) 입체화학적 배열)과 관련하여 제한되지 않는다.
Figure pct00004
일부 실시양태에서, 치료 화합물은 항체일 수 있다. 항체는 IL-2 또는 IL-15와 같은 γc-사이토카인, 또는 둘 다 T-림프구에서 발현되는 막횡단 당단백질 CD8 또는 NKG2 C-형 렉틴 수용체 패밀리의 단백질과 같은 사이토카인 신호전달에 의해 활성 및/또는 존재비가 직접적으로 조절되는 특정 단백질 수용체를 표적으로 하도록 개발될 수 있다.
일부 실시양태는 또한 본 발명의 펩티드 및 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. "뉴클레오티드 서열", "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 DNA 또는 상기 DNA의 전사 생성물(예를 들어, RNA 분자)을 의미하는 것으로 이해된다. 폴리뉴클레오티드는 세포 또는 대상체에 투여되고, 펩티드 자체를 투여하기 보다는 세포 또는 대상체에 의해 발현될 수 있다. 몇몇 실시양태는 또한 본 발명의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 작제물에 관한 것이다. 유전자 작제물은 또한 프로모터 및 인핸서 및 선택적으로 선택 가능한 마커와 같은 추가 조절 요소를 포함할 수 있다.
γc-사이토카인 매개 질환의 치료 방법
여러 실시양태는 γc-길항제 펩티드, 사이토카인 표적화 항체, 및/또는 활성 및/또는 존재비가 γc-사이토카인 매개된 질병의 치료에서 사이토카인 신호전달에 의해 직접 조절되는 특정 단백질 수용체를 표적화하는 항체와 같은 치료 화합물의 사용에 관한 것이다. 본 실시형태에 따른 치료 화합물의 사용은 설계 및 조합의 유연성을 허용하고, 이는 소분자 화학 억제제 또는 항-사이토카인 수용체 항체를 사용하는 통상적인 전략에 의해 달성되지 않을 보다 포괄적인 결과를 가능하게 한다.
γc-패밀리 사이토카인의 작용을 조절하는 신규 방법이 본원에 기재되어 있다. 이러한 조작은 탈모 및 탈모 관련 질환과 같은 자가면역 질병을 치료하는 효과적인 임상 개입 방법을 산출할 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 탈모 관련 질환의 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방을 위한 조성물, 방법 및 키트가 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료 화합물은 원형탈모증, 전두탈모증, 부분탈모증, 보편성 탈모, 확산성 탈모증, 사선형 원형 탈모증, 및 탈모증, 예컨대 편평태선, 경화태선, 위축성 경화태선, 아토피, 아토피성 피부염, 건선, 심상성 건선, 두부 건선, 창자 건선, 반전 건선, 건선성 관절염, 습진, 천포창, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 증식성 천포창, 홍반성 천포창, 점막 천포창, 흉터성 점막 천포창, 수포성 천포창, 중증 근무력증, 갑상성 질환, 갑상선 기능 저하증, 풍토성 갑상선종, 애디슨병, 피부경화증, 두드러기, 가려움증, 주사비 백반증, 백반증, 및 이식편대숙주질환(GvHD)과 관련된 기타 면역-매개 질병 중 하나 이상의 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방을 위해 사용될 수 있다.
여러 실시양태는 γc-사이토카인의 전부 또는 선택적인 구성원의 신호전달을 조절하는 치료 화합물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 치료 화합물은 개별 γc-사이토카인 패밀리 구성원의 신호전달을 선택적으로 조절한다. 다른 실시양태에서, 치료 화합물은 모든 γc-사이토카인 패밀리 구성원의 신호전달을 포괄적으로 조절할 수 있다(Simul-Block). 일부 실시양태에서, 치료 화합물은 γc-사이토카인의 하위세트의 신호전달을 선택적으로 조절할 수 있다. 특정 이론에 국한되지 않고, 치료 화합물은, 예를 들어, 경쟁적 억제제로서 γc-하위단위에 대한 γc-사이토카인의 결합을 감소시킴으로써, 또는 γc-사이토카인 신호전달에 의해 직접 조절되는 특정 단백질 수용체의 활성 및/또는 풍부함을 조절함으로써 γc-사이토카인의 모든 또는 선택적 구성원의 기능을 조절할 수 있다.
γc-사이토카인 패밀리의 몇몇 구성원은 탈모 질환 진행에 관여하는 것으로 나타나 있다. 탈모증은 궁극적으로 탈모를 초래하는 모낭 자가항원의 T 세포 표적화를 지원하는 T 세포 과증식 환경이 존재하는 피부의 면역-매개 질환이다. IL-2 및 IL-15 발현은 환자의 병변 두피 생검에서 상승하며(문헌[Fuentes-Duculan et al. 2016 Exp Dermatol 4:282-6.], 문헌[Suarez-Farinas et al. 2015 J. Allergy Clin. Immunol. 136:1277-87.], 문헌[Waldmann 2013 J Investig Dermatol Symp Proc 16:S28-30.]), γc-사이토카인 IL-2 및 IL-15를 표적으로 하는 항체는 각각 탈모증 마우스 모델에서 억제 활성을 나타냈지만, 차단 항체 단독으로는 확립된 질병을 역전시킬 수 없었다(문헌[Xing et al. 2014 Nat Med 9:1043-9]). IL-21 발현은 건강한 대조군에 비해 탈모증 환자의 혈청에서 증가했으며(문헌[Atwa et al. 2016 Int J Dermatol 55:666-72]), 게놈 전체의 연관성 연구에서도 IL-2 및 IL-21과 탈모증 사이에 양의 상관 관계가 있었다(문헌[Jagielska et al. 2012 J Invest Dermatol 132:2192-7], 문헌[Petukhova et al. 2010 Nature 466:113-7]).
백반증은 표피에 T-세포가 유입되어 멜라닌 세포가 파괴되고, 신체 표면에 흰색 반점이 생기는 것과 관련된 피부의 면역-매개 질환이다. 최근 연구에 따르면 항체 치료를 통해 IL-15 신호 전달을 차단하는 것이 백반증이 확립된 마우스에서 효과적인 치료 전략임을 보여주었다(문헌[Richmond et al. 2018 Sci Transl Med 10:450]). 흥미롭게도 연구에 사용된 항체는 IL-15와 IL-2에 둘 다에 공통적인 전용 사이토카인-특이적 수용체 하위단위인 CD122를 표적으로 삼았다. 실제로 IL-2 발현은 국소 백반증 및 전신 백반증 환자의 혈청에서 상승된 것으로 나타났으며, 질병 중증도와 양의 상관관계가 있었다(문헌[Sushama et al. 2018 J Cosmet Dermatol 00:1-5]).
천포창과 수포창은 신체 표면에 체액으로 가득 찬 큰 수포가 있는 것을 특징으로 하는 피부의 면역-매개 질환이다. 초기 연구에서 인간 환자의 천포창 및 수포창 수포 모두 상승된 IL-2 활성을 나타냈다(문헌[Grando et al., 1989, Arch Dermatol. 125:925-30]). 천포창 환자는 또한 증가된 T-세포 활성화 및 증가된 IL-2 수준을 나타냈다(문헌[Schaller et al., 1990, Arch Dermatol. Res. 282:223-6]). 별도의 연구에서는 천포창 및 수포창 환자 모두에서 IL-15 수준을 평가했으며, 두 질병의 환자 모두 질병 중증도와 양의 상관관계가 있는 증가된 IL-15 혈청 수준을 나타냈다(문헌[D'Auria et al., 1999, Arch Dermatol. Res. 291:354-6]).
특정 γc-사이토카인은 건선과 양의 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 건선은 종종 건조하고 가렵고 때로는 고통스러운 여분의 피부 세포의 비늘 모양의 붉은 반점이 특징인 피부의 면역 -매개 질환이다. IL-15의 발현은 건선 환자의 피부 병변에서 증가된다(문헌[Waldmann 2013 J Investig Dermatol Symp Proc 16:S28-30]). IL-15 사이토카인-수용체 신호전달 복합체의 어셈블리를 강력하게 방해하는 IL-15 특이적 항체는 인간 건선 이종이식 모델에서 질병의 중증도를 감소시켰다(문헌[Villadsen et al., 2003, J. Clin. Invest. 112:1571-80]). 또 다른 γc-사이토카인인 IL-21은 건선 환자에서 상승된 것으로 나타났으며, 질병 중증도와 양의 상관관계가 있는 것으로 나타났다(문헌[Caruso et al. 2009 Cell Cycle 8: 3629-30.], 문헌[Botti et al. 2012 Curr Pharm Biotechnol 13: 1861-7.], 문헌[He et al. 2012, Br. J. Dermatol. 167:191-3]). 항-IL-21 항체 치료를 통한 사이토카인의 차단은 인간 건선 이종이식 마우스 모델에서 각질세포 증식 및 염증의 상당한 감소를 초래하였다(문헌[Caruso et al., 2009 Nat. Med. 15:1013-5]).
이식편대숙주질환(GvHD)은 숙주 세포가 공여자의 T-림프구에 의해 외래 개체로 인식되기 때문에 환자의 조혈 세포 이식 후 종종 발생할 수 있다. GvHD는 공여자 유래 T-세포가 전-염증성 사이토카인의 생성 및 직접적인 CD8 T-세포 세포독성 효과로 CD4 및 CD8 효과기 세포로 분화함에 따라 숙주 기관 조직 손상에 의해 나타난다. γc-사이토카인 패밀리의 구성원이 CD4 및 CD8 T-세포의 활성화에 관여한다는 것이 잘 알려져 있기 때문에, 다수의 γc-사이토카인과 GvHD 발병기전의 양의 연관성이 보고되었다. 2개의 IL-2 수용체 길항 항체의 예방적 사용은 공여자-말초 혈액 줄기 세포 이식 후 혈액 악성 종양 환자에서 GvHD에 유익한 효과를 나타냈다(문헌[Fang et al., 2012 Biol Blood Marrow Transplant. 18:754-62]).IL-15의 혈청 수준은 또한 이식 후 첫 달 내에 GvHD 환자에서 급격히 상승하는 것으로 나타났으며(문헌[Chik et al. 2003, J Pediatr Hematol Oncol. 25:960-4]), 공여자-유래 IL-15은 쥐 GvHD 모델에서 급성 GvHD에 중요한 것으로 나타났다(문헌[Blaser et al., 2005 Blood 105:894-901]). 마지막으로, IL-21 발현은 GvHD 환자의 피부 및 결장 샘플에서 관찰되었지만, GvHD가 없는 대조군 샘플에서는 관찰되지 않았으며, GvHD 쥐 모델에서 혈청 IL-21 수준이 상승하였고, 항인간 IL-21 항체 사용으로 투여 후 GvHD와 관련된 감소된 체중 감소 및 사망률을 보여주었다(문헌[Hippen et al. 2012 Blood 119:619-28], 문헌[Bucher et al. 2009 Blood 114:5375-84]).
여러 실시양태는 단독으로 또는 다른 γc-사이토카인 패밀리 구성원과 조합하여 탈모 및/또는 탈모 관련 질환의 치료제로서 IL-15의 활성을 선택적으로 억제하는 치료적 길항제 펩티드의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, IL-2, IL-15, IL-9, IL-2와 IL-15의 조합, IL-2와 IL-9의 조합, 및/또는 IL-15 및 IL-9 활성의 조합을 선택적으로 억제하는 맞춤형 유도체 길항제 펩티드는 탈모 및/또는 탈모 관련 질환의 치료제로서 사용된다. 일부 실시양태에서, IL-2와 IL-15의 조합, IL-2와 IL-9의 조합, 및/또는 IL-15와 IL-9의 조합을 선택적으로 억제하는 맞춤형 유도체 길항제 펩티드의 효과는 부가적 또는 협력적 효과일 수 있다. 여러 실시양태는 탈모 및/또는 탈모 관련 질환을 치료하기 위한 서열 번호: 2의 용도에 관한 것이다. 여러 실시양태는 탈모 및/또는 탈모 관련 질환을 치료하기 위한 BNZ-γ의 용도에 관한 것이다. 여러 실시양태는 탈모 및/또는 탈모 관련 질환을 치료하기 위한 서열 번호: 1의 용도에 관한 것이다.
여러 실시양태는 탈모 및/또는 탈모 관련 질환에 대한 치료제로서 단독으로 또는 조합하여 사용하는 치료적 화합물의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 치료 화합물은 서열 번호: 2이다. 일부 실시양태에서, 치료 화합물은 BNZ-γ이다. 일부 실시양태에서, 치료 화합물은 서열 번호: 1이다. 일부 실시양태에서, 치료 화합물은 항-CD8 항체이다. 일부 실시양태에서, 치료 화합물은 항-IL-2 항체이다. 일부 실시양태에서, 치료 화합물은 항-IL-15 항체이다. 일부 실시양태에서, 치료 화합물은 항-NKG2A 항체이다.
부가 효과는 조합의 효과가 조합물에 포함된 개개의 효과의 합과 같을 때(예를 들어, 두 가지 이상의 치료 화합물 조합의 효과가 각 치료 화합물의 각각의 효과의 합과 같을 때) 관찰된다. 상승 효과는 조합의 효과가 조합물에 있는 개개의 효과의 합보다 클 때(예를 들어, 두 가지 이상의 치료 화합물 조합의 효과가 각 치료 화합물의 각각의 효과의 합보다 클 때) 관찰된다. 상승 효과는 부가 효과보다 크다. 인간 환자, 비-인간 환자, 비-환자 인간 지원자, 생체 내 모델, 생체 외 모델, 시험관 내 모델 등에서 부가 효과, 상승 효과 또는 둘 모두가 발생할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 2종 이상의 치료 화합물이 조합되어 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조합하여 사용될 때 본원에 개시된 둘 이상의 치료 화합물은 부가 효과를 산출한다. 일부 실시양태에서, 조합하여 사용될 때 본원에 개시된 2개 이상의 치료 화합물은 상승 효과를 산출한다. 상승 효과는 약 >1 내지 약 100배 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상승 효과는 약 2 내지 약 20배이다. 일부 실시양태에서, 상승 효과는 약 20 내지 약 100배이다. 일부 실시양태에서, 상승 효과는 >1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100배, 또는 앞서 언급한 값 중 2개에 의해 정의된 범위 내이다.
또 다른 실시양태는 19-머 아미노산 서열 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)와 유사하고, 결합을 위해 γc-하위단위에 대한 γc-사이토카인의 접근을 구조적으로 방해하는 γc-하위단위의 포켓에 들어갈 수 있는 공간 구조를 갖는 화학적 화합물(비-펩티드, 비-단백질)의 개발에 관한 것이다. 일부 실시양태는 γc-사이토카인 활성의 억제제로서 구조적으로 유사한 화학적 화합물의 용도에 관한 것이다. 기존의 생물학적 펩티드/단백질과 구조가 유사한 합성 화합물의 개발을 더욱 개선하기 위한 이러한 분자 모방 전략은 문헌[Orzaez et al., 2009 Chem. Med. Chem. 4:146-160]에 기재되어 있다. 또 다른 실시양태는 하나 이상의 탈모 및/또는 탈모 관련 질환의 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방을 위한 19-머 아미노산 서열 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)와 유사한 3D 구조를 갖는 화학적 화합물(비-펩티드, 비-단백질)의 투여에 관한 것이다.
여러 실시양태는 하나 이상의 탈모 및/또는 탈모 관련 질환의 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방을 위한 아미노산 서열 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)의 펩티드 투여에 관한 것이다. 또 다른 실시양태는 아미노산 서열 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)의 유도체 펩티드의 투여에 관한 것으로, 여기서 유도체 펩티드의 아미노산 서열은 아미노산 서열 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)의 펩티드와 유사한 물리-화학적 특성을 갖지만, 하나 이상의 탈모 및/또는 탈모 관련 질환의 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방을 위한 별개의 생물학적 활성을 갖는다. 또 다른 실시양태는 하나 이상의 탈모 및/또는 탈모 관련 질환의 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방을 위해, N- 및 C-말단 또는 기존 생물학적 단백질/펩티드의 측면 잔기에 접합된 아미노산 서열 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)의 펩티드를 환자에게 투여하는 것에 관한 것이다.
여러 실시양태는 하나 이상의 탈모 및/또는 탈모 관련 질환의 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방을 위한 아미노산 서열 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)의 펩티드 투여에 관한 것이다. 또 다른 실시양태는 아미노산 서열 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)의 펩티드 유도체의 투여에 관한 것으로, 여기서 유도체 펩티드의 아미노산 서열은 아미노산 서열 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)의 펩티드와 유사한 물리-화학적 특성을 갖지만, 하나 이상의 탈모 및/또는 탈모 관련 질환의 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방을 위한 별개의 생물학적 활성을 갖는다. 또 다른 실시양태는 하나 이상의 탈모 및/또는 탈모 관련 질환의 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방을 위해, N- 및 C-말단 또는 기존 생물학적 단백질/펩티드의 측면 잔기에 접합된 아미노산 서열 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)의 펩티드를 환자에게 투여하는 것에 관한 것이다.
여러 실시양태는 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 대해 발생된 다클론 및 단일클론 항체를 탈모 및/또는 탈모 관련 질환의 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연, 또는 예방을 위한 면역원으로서 환자에게 투여하는 것에 관한 것이다. 또 다른 실시양태는 아미노산 서열 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)의 유도체 펩티드에 대해 생성된 다클론 및 단일클론 항체의 탈모 및/또는 탈모 관련 질환의 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방을 위한 면역원으로서 환자에게 투여하는 것에 관한 것으로, 여기서 유도체 펩티드의 아미노산 서열은 아미노산 서열 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)의 펩티드로서 유사한 물리-화학적 특성을 갖지만, 별개의 생물학적 활성을 갖는다.
여러 실시양태는 하나 이상의 탈모 및/또는 탈모 관련 질환을 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방을 위한 면역원으로서 IL-2에 대해 생성된 다클론 및 단일클론 항체를 환자에게 투여하는 것에 관한 것이다. 또 다른 실시양태는 하나 이상의 탈모 및/또는 탈모 관련 질환을 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방을 위한 면역원으로서 IL-15에 대해 생성된 다클론 및 단일클론 항체를 환자에게 투여하는 것에 관한 것이다. 또 다른 실시양태는 하나 이상의 탈모 및 탈모 관련 질환을 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방을 위한 면역원으로서 막횡단 당단백질 T-세포 공수용체 CD8에 대해 생성된 다클론 및 단일클론 항체를 환자에게 투여하는 것에 관한 것이다. 또 다른 실시양태는 C-형 렉틴 수용체 NKG2 패밀리의 구성원, 예를 들어 NKG2D, NKG2A에 대해 생성된 다클론 및 단일클론 항체를 탈모 및/또는 탈모 관련 질환을 억제, 개선, 이의 증도 감소, 치료, 이의 발병 지연, 또는 예방을 위한 면역원으로서 환자에게 투여하는 것에 관한 것이다.
치료 화합물의 투여
본 실시양태는 또한 하나 이상의 탈모 및/또는 탈모 관련 질환을 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방용 약제의 제조를 위한 γc-사이토카인 길항제 펩티드, γc-사이토카인 길항제 펩티드 유도체, 항-CD8 항체, 항-IL-2 항체, 항-IL-15체, 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치료 화합물의 용도를 포함한다. 본 실시양태는 또한 약학적으로 허용 가능한 담체와 조합된 하나 이상의 치료 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 포함한다. 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 및 비-독성 치료 유효량의 치료 화합물, 또는 본 실시형태의 다른 조성물을 포함할 수 있다.
본 실시양태는 적합한 희석제 또는 담체에 유효량의 치료 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 본 실시형태의 치료 화합물은 약학적으로 유용한 조성물을 제조하는 데 사용되는 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 치료 화합물은 단독 활성 물질로서 또는 다른 공지된 활성 물질과 함께 약학적으로 적합한 희석제(예를 들어, 포스페이트, 아세테이트, Tris-HCl), 보존제(예를 들어, 티메로살, 벤질 알코올, 파라벤), 유화 화합물, 가용화제, 보조제, 및/또는 담체, 예컨대 소혈청 알부민과 함께 혼합물로 조합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 치료 화합물 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 조성물 및 키트가 고려된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 조성물 및 키트는 하나 이상의 질병을 예방 및/또는 치료하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 조성물 및 키트는 하나 이상의 탈모 및/또는 탈모 관련 질환의 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방에 사용된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 치료 화합물을 포함하는 하나 이상의 조성물 및 키트는 본원에 제공된 임의의 투여 경로를 통해 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 조성물 및 키트는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 γc-사이토카인의 신호전달을 조절하기 위한 치료학적 유효량으로 하나 이상의 치료 화합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 조성물 및 키트는 하나 이상의 질병을 예방 및/또는 치료하기 위한 치료 유효량으로 하나 이상의 치료 화합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 치료 화합물을 포함하는 하나 이상의 조성물 및 키트는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 이의 조합을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 조성물 및 키트 중 하나 이상의 치료 화합물은 하나 이상의 질병을 예방 및/또는 치료하기 위해 대상체에 투여하기에 적합한 것으로 제형화된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 조성물 및 키트 중 하나 이상의 치료 화합물은 탈모 및/또는 탈모 관련 질환을 예방 및/또는 치료하기 위해 대상체에 투여하기에 적합한 것으로 제형화된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 조성물 및 키트 내의 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 항-CD8 항체, 항-IL-2 항체, 항-IL-15 항체, 및 항-NKG2A 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치료 화합물은 하나 이상의 질병을 예방 및/또는 치료하기 위해 대상체에 투여하기에 적합한 것으로 제형화된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 탈모 및/또는 탈모 관련 질환을 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방을 위해 하나 이상의 조성물 및 키트 중의 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 항-CD8 항체, 항-IL-2 항체, 항-IL-15 항체, 및 항-NKG2A 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 복합 펩티드는 대상체에게 투여하기에 적합한 것으로 제형화된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 조성물 및 키트 내의 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 항-CD8 항체, 항-IL-2 항체, 항-IL-15 항체, 및 항-NKG2A 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 복합 펩티드의 하나 이상의 유도체는 하나 이상의 질병을 예방 및/또는 치료하기 위해 대상체에 투여하기에 적합한 것으로 제형화된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 탈모 및/또는 탈모 관련 질환을 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방을 위해 하나 이상의 조성물 및 키트 중의 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 항-CD8 항체, 항-IL-2 항체, 항-IL-15 항체, 및 항-NKG2A 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 복합 펩티드의 하나 이상의 유도체는 대상체에게 투여하기에 적합한 것으로 제형화된다.
"질병", "질환" 및 "생물학적 병태"라는 용어는 본 실시양태에 따라 제공된 "하나 이상의 질병을 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방"을 언급할 때 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 복합 펩티드의 하나 이상의 유도체는 하나 이상의 복합 펩티드와 약 50% 내지 약 99% 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 복합 펩티드의 하나 이상의 유도체는 하나 이상의 복합 펩티드와 50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 99.8% 동일성, 또는 전술한 값 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위 내를 공유하는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 탈모 관련 질환은 원형탈모증, 전두탈모증, 부분탈모증, 보편성 탈모, 확산성 탈모증, 사선형 원형 탈모증, 편평태선, 경화태선, 위축성 경화태선, 아토피, 아토피성 피부염, 건선, 심상성 건선, 두부 건선, 창자 건선, 반전 건선, 건선성 관절염, 습진, 천포창, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 증식성 천포창, 홍반성 천포창, 점막 천포창, 흉터성 점막 천포창, 수포성 천포창, 중증 근무력증, 갑상성 질환, 갑상선 기능 저하증, 풍토성 갑상선종, 애디슨병, 피부경화증, 두드러기, 가려움증, 주사비 백반증, 백반증, 및 이식편대숙주질환(GvHD)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
적합한 담체 및 이의 제형은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed. 1980 Mack Publishing CO, and Overview of Antibody Drug Delivery (Awwad et al. 2018 Pharmaceutics 10:83)]에 기재되어 있다. 추가로, 이러한 조성물은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 금속 이온과 복합체를 형성하거나, 폴리아세트산, 폴리글리콜산, 히드로겔 등과 같은 중합체 화합물에 혼입되거나, 리포솜, 마이크로에멀젼, 미셀, 단층 또는 다층 소포, 적혈구 유령, 또는 구상아세포에 혼입된 치료 화합물을 함유할 수 있다. 이러한 조성물은 치료 화합물의 물리적 상태, 용해도, 안정성, 생체 내 방출 속도 및 생체 내 제거 속도에 영향을 미칠 것이다. 치료 화합물은 세포-특이적 항원, 수용체, 리간드에 대한 항체에 접합되거나, 조직-특이적 수용체에 대한 리간드에 커플링될 수 있다.
본 실시형태의 치료 화합물을 투여하는 방법은 질환의 유형, 대상체의 상태 및/또는 표적으로 하는 부위와 같은 인자에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 치료 화합물은 국소적으로, 경구로, 비경구적으로, 직장으로, 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 치료 화합물의 국소 투여는 로션, 도포제(밤(balms)), 용액, 연고, 크림, 페이스트, 겔 또는 필요에 따라 기타 적절한 국소 전달 시스템으로의 제형화를 통해 달성될 수 있다(문헌[Gupta et al. 2016 Indo Amer J Pharm Res 6:6353 -69]). 국소 제형 성분은 세틸 알코올, 세틸 에스테르 왁스, 카르나우바 왁스, 라놀린, 라놀린 알코올, 파라핀, 바셀린, 폴리에틸렌 글리콜, 스테아르산, 스테아릴 알코올, 백색 또는 황색 왁스와 같은 연화제 및/또는 경화제; 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 60, 폴록사머, 소르비탄 모노스테아레이트, 소르비탄 모노올레에이트, 나트륨 라우릴 설페이트, 프로필렌 글리콜 모노스테아레이트와 같은 유화제 및/또는 가용화제; 글리세린, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등의 보습제; 카보머, 메틸 셀룰로오스, 나트륨 카르복실 메틸 셀룰로오스, 카라기난, 콜로이드성 이산화규소, 구아 검, 히드록시프로필 셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스, 젤라틴, 폴리에틸렌 옥시드, 알긴산, 알긴산나트륨, 흄드 실리카와 같은 증점제/겔화제; 벤조산, 프로필파라벤, 메틸파라벤, 이미두레아, 소르브산, 소르빈산칼륨, 염화벤잘코늄, 아세트산페닐수은, 클로로부탄올, 페녹시에탄올 등의 방부제; 프로필렌 글리콜, 에탄올, 이소프로필 알코올, 올레산, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 투과 증진제; 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔과 같은 항산화제; 시트르산, 인산, 수산화나트륨, 일염기성 인산나트륨과 같은 완충제; 및 정제수, 프로필렌 글리콜, 헥실렌 글리콜, 올레일 알코올, 프로필렌 카보네이트 및 광유와 같은 비히클 제제를 포함할 수 있다(문헌[Chang et al. 2013 AAPS J 15:41-52]). 경구 제형 성분은 라우르산, 카프릴산, 올레산과 같은 지방산 및 유도체; 나트륨 콜레이트, 나트륨 데옥시콜레이트, 나트륨 타우로데옥시콜레이트, 나트륨 글리코콜레이트와 같은 담즙염; 시트르산, 살리실산나트륨과 같은 킬레이트제; 알킬글리코사이드 함유 중합체, 양이온성 중합체, 음이온성 중합체 및 나노입자; 및 나트륨 도데실 설페이트, 나트륨 라우레이트 도데실말토사이드, 폴락사머, 나트륨 미리스테이트, 나트륨 라우릴설페이트, 퀼라야사포닌 및 수크로스 팔미테이트와 같은 계면활성제를 포함할 수 있다(문헌[Liu et al. 2018 Expert Opin Drug Del 15:223-33.], 문헌[Aguirre et al. 2016 Adv Drug Deliv Rev 106:223-41]). 용어 "비경구"는 피하 주사, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 수조 내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 이러한 조성물은 통상적으로 유효량의 치료 화합물을 단독으로 또는 유효량의 임의의 다른 활성 물질과 조합하여 포함할 것이다. 비경구, 피하, 관절 내, 기관지 내, 복강 내, 피막 내, 연골 내, 강 내, 세포 내, 소뇌 내, 뇌실 내, 복강 내, 자궁경부, 위 내, 간 내, 복강 내, 심근 내, 골강 내, 복강 내, 흉막 내, 전립선 내, 폐 내, 직장 내, 신장 내, 망막 내, 척수 내, 활액 내, 흉부 내, 자궁 내, 방광 내, 병변 내, 볼루스, 질, 직장, 협측, 설하, 비강 내, 또는 경피를 비롯한 여러 비제한적인 투여 경로가 가능하다.
본원에 개시된 하나 이상의 치료 화합물은 다양한 매개변수에 기초하여 당업자에 의해 결정된 바와 같이 임의의 투여량, 임의의 투여 경로를 통해, 및 임의의 투여 빈도로 투여될 수 있다. 비제한적인 예로는 치료 중인 상태, 상태의 중증도, 환자 순응도, 치료 효능, 부작용 등이 있다.
본 실시형태의 약학적 조성물에 포함되는 치료 화합물의 양, 약학적 조성물의 제형, 투여 빈도 등은 질병의 유형, 대상체의 상태, 및/또는 표적화되는 부위와 같은 인자에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 조성물에 함유된 이러한 투여량 및 원하는 약물 농도는 의도된 용도, 환자의 체중 및 연령, 투여 경로를 비롯한 많은 매개변수에 의해 영향을 받을 수 있다. 파일럿 연구는 먼저 동물 연구를 사용하여 수행되고, 인간 투여에 대한 규모 조정은 기술 분야에서 허용되는 관행에 따라 수행된다.
하나의 실시양태에서, 하나 이상의 치료 화합물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 유전적으로 변형된 숙주 세포는 하나 이상의 탈모 및/또는 탈로 관련 질환의 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방을 위해 대상체에게 투여된다. 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에 의해 발현되어 대상체 내에서 치료 화합물을 생성한다. 바람직하게, 숙주 세포는 대상체에 대해 동종이계 또는 자가계이다.
추가적인 양태에서, γc-사이토카인 길항제 펩티드, γc-사이토카인 길항제 펩티드 유도체, 항-CD8 항체, 항-IL-2 항체, 항-IL-15 항체, 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치료 화합물은 다른 요법, 예를 들어, 암 세포 증식 및 성장을 억제하는 요법과 조합하여 사용될 수 있다. "병용 요법"이라는 어구는 γc-사이토카인 길항제 펩티드, γc-사이토카인 길항제 펩티드 유도체, 항-CD8 항체, 항-IL-2 항체, -IL-15 항체, 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치료 화합물 및 하나 이상의 추가 치료제의, 이들 치료제의 공동 작용으로부터 유익한 효과를 제공하도록 의도된 특정 치료 요법의 일부로서의 투여를 포함한다. 조합된 이들 치료제의 투여는 통상적으로 정의된 기간(선택된 조합에 따라 일반적으로 분, 시간, 수일 또는 수주)에 걸쳐 수행된다.
병용 요법은 순차적 방식으로 이들 치료제를 투여하는 것을 포함하는 것으로 의도되며, 여기서 각각의 치료제는 상이한 시간에 투여될 뿐만 아니라 이들 치료제 또는 치료제 중 2종 이상을 실질적으로 동시에 투여한다. 실질적으로 동시 투여는, 예를 들어, 고정된 비율의 각 치료제를 갖는 단일 캡슐 또는 각각의 치료제에 대한 다수의 단일 캡슐을 대상체에게 투여함으로써 달성될 수 있다. 각각의 치료제의 순차적 또는 실질적 동시 투여는 경구 경로, 정맥 내 경로, 근육 내 경로, 및 점막 조직을 통한 직접 흡수를 포함하나 이에 제한되지 않는 적절한 경로에 의해 수행될 수 있다. 치료제는 동일한 경로 또는 다른 경로로 투여될 수 있다. 치료제가 투여되는 순서는 그렇게 중요하지 않다.
병용 요법은 또한 다른 생물학적 활성 성분(예를 들어, 이에 제한되지는 않지만, 제2 및 상이한 치료제) 및 비-약물 요법(예를 들어, 이제 제한되지는 않지만, 수술 및 방사선 치료)과의 추가 조합으로 상기 기재된 바와 같은 치료제의 투여를 포함할 수 있다. 병용 요법이 방사선 치료를 추가로 포함하는 경우, 방사선 치료는 치료제와 방사선 치료의 병용에 의한 유익한 효과가 달성되는 한 임의의 적절한 시간에 수행될 수 있다. 예를 들어, 적절한 경우에, 방사선 치료가 치료제의 투여로부터 아마도 수일 또는 심지어 수주까지 일시적으로 제거될 때 유익한 효과는 여전히 달성된다.
특정 실시양태에서, γc-사이토카인 길항제 펩티드, γc-사이토카인 길항제 펩티드 유도체, 항-CD8 항체, 항-IL-2 항체, 항-IL-15 항체, 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치료 화합물은 화학요법제, 대사길항물질 및 항종양제, 및 항유사분열제, 및 항바이러스제, 및 항신생물제, 면역치료제, 및 방사선치료제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항증식제와 조합하여 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, γc-사이토카인 길항제 펩티드, γc-사이토카인 길항제 펩티드 유도체, 항-CD8 항체, 항-IL-2 항체, 항-IL-15 항체, 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치료 화합물은 스테로이드, 코르티코스테로이드 및 비스테로이드성 항염증제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항염증제와 조합하여 투여될 수 있다.
또한 상기 방법 중 하나를 수행하기 위한 키트가 제공된다. 키트는 본 실시양태에 따른 γc-사이토카인 길항제 펩티드, γc-사이토카인 길항제 펩티드 유도체, 항-CD8 항체, 항-IL-2 항체, 항-IL-15 항체, 항- NKG2A 항체, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치료 화합물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트에는 설명서가 포함될 수 있다. 설명서는 서면 또는 그림 형태로 되어 있거나 오디오 테이프, 오디오 CD, 비디오 테이프, DVD, CD-ROM 등을 포함한 기록 매체에 있을 수 있다. 키트는 포장지를 포함할 수 있다.
추가 실시양태
방법의 일부 실시양태에서, 복합 펩티드는 아미노산 서열 D/E-F-L-E/Q/N-S/R-X-I/K-X-L/I-X-Q(서열 번호: 2)를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산을 나타낸다. 방법의 일부 실시양태에서, 복합 펩티드 유도체는 서열 번호: 2의 펩티드와 약 50% 이상의 동일성을 공유한다. 방법의 일부 실시양태에서, 복합 펩티드 유도체는 서열 번호: 2의 펩티드와 약 90% 이상의 동일성을 공유한다. 방법의 일부 실시양태에서, 복합 펩티드 유도체는 서열 번호: 2의 펩티드와 약 95% 이상의 동일성을 공유한다. 방법의 일부 실시양태에서, 복합 펩티드 및 복합 펩티드 유도체는 유사한 물리-화학적 특성을 갖지만, 별개의 생물학적 활성을 갖는다.
방법의 일부 실시양태에서, 복합 펩티드는 아미노산 서열 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)(BNZ-γ)를 포함한다. 방법의 일부 실시양태에서, 복합 펩티드 유도체는 서열 번호: 1의 펩티드와 약 50% 이상의 동일성을 공유한다. 방법의 일부 실시양태에서, 복합 펩티드 유도체는 서열 번호: 1의 펩티드와 약 90% 이상의 동일성을 공유한다. 방법의 일부 실시양태에서, 복합 펩티드 유도체는 서열 번호: 1의 펩티드와 약 95% 이상의 동일성을 공유한다. 방법의 일부 실시양태에서, 복합 펩티드 및 복합 펩티드 유도체는 유사한 물리-화학적 특성을 갖지만, 별개의 생물학적 활성을 갖는다.
방법의 일부 실시양태에서, 복합 펩티드는 아미노산 서열 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)를 포함한다. 방법의 일부 실시양태에서, 복합 펩티드 유도체는 서열 번호: 1의 펩티드와 약 50% 이상의 동일성을 공유한다. 방법의 일부 실시양태에서, 복합 펩티드 유도체는 서열 번호: 1의 펩티드와 약 90% 이상의 동일성을 공유한다. 방법의 일부 실시양태에서, 복합 펩티드 유도체는 서열 번호: 1의 펩티드와 약 95% 이상의 동일성을 공유한다. 방법의 일부 실시양태에서, 복합 펩티드 및 복합 펩티드 유도체는 유사한 물리-화학적 특성을 갖지만, 별개의 생물학적 활성을 갖는다.
방법의 일부 실시양태에서, 복합 펩티드 또는 복합 펩티드 유도체는 하나 이상의 γc-사이토카인의 활성을 억제한다. 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 γc-사이토카인은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택된다. 방법의 일부 실시양태에서, 복합 펩티드 또는 복합 펩티드 유도체는 IL-2, IL-15 및 IL-9의 활성을 억제한다. 방법의 일부 실시양태에서, 복합 펩티드 또는 복합 펩티드 유도체는 IL-2 및 IL-15의 활성을 억제한다. 방법의 일부 실시양태에서, 복합 펩티드 또는 복합 펩티드 유도체는 IL-15 및 IL-9의 활성을 억제한다. 방법의 일부 실시양태에서, 복합 펩티드 또는 복합 펩티드 유도체는 IL-15 및 IL-21의 활성을 억제한다.
일부 실시양태에서, 복합 펩티드 또는 복합 펩티드 유도체는 신호 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복합 펩티드 또는 복합 펩티드 유도체는 복합 펩티드 또는 복합 펩티드 유도체의 N 말단, C 말단 또는 측면 잔기에서 하나 이상의 추가 모이어티에 추가로 접합된다. 복합 펩티드 또는 복합 펩티드 유도체의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 추가 모이어티는 소 혈청 알부민(BSA), 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), IgG의 Fc 영역, 스캐폴드로서 기능하는 생물학적 단백질, 세포-특이 항원에 대한 항체, 수용체, 리간드, 금속 이온 및 폴리 에틸렌 글리콜(PEG)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 복합 펩티드 또는 복합 펩티드 유도체는 2개 이상의 알파-알케닐 치환된 아미노산을 포함하며, 상기 2개 이상의 알파-알케닐 치환된 아미노산은 하나 이상의 펩티드 내 탄화수소 링커 요소를 통해 연결된다. 복합 펩티드의 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 알파-알케닐 치환된 아미노산이 연결되어 고리닫기 복분해에 의해 하나 이상의 펩티드 내 탄화수소 링커 요소를 형성하고, 여기서 고리닫기 복분해는 그랍스 촉매에 의해 촉매된다.
일부 실시양태에서, 복합 펩티드의 아미노산은 천연 아미노산, 비-천연 아미노산, (D) 입체화학적 배열 아미노산, (L) 입체화학적 배열 아미노산, (R) 입체화학적 배열 아미노산 및 (S) 입체화학적 배열 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 2개 이상의 알파-알케닐 치환된 아미노산은 S-펜테닐알라닌(CAS: 288617-73-2; S5Ala) 및 R-옥테닐알라닌(CAS: 945212-26- 0; R8Ala)으로부터 선택된다.
복합 펩티드의 일부 실시양태에서, 1개 이상의 펩티드 내 탄화수소에 의해 연결된 2개 이상의 알파-알케닐 치환된 아미노산은 n-2개의 아미노산에 의해 분리되며, 여기서 n은 펩티드 내 연결에 의해 포함되는 아미노산의 수를 나타낸다.
복합 펩티드의 일부 실시양태에서, 1개 이상의 펩티드 내 탄화수소에 의해 연결된 2개 이상의 알파-알케닐 치환된 아미노산이 3개의 아미노산에 의해 분리되는 경우, 1개 이상의 펩티드 내 탄화수소 링커 요소는 복합 펩티드의 단일 α-나선 회전에 걸쳐 있다.
복합 펩티드의 일부 실시양태에서, 복합 펩티드가 하나 이상의 비-연속적인 단일 α-나선 회전을 포함할 때, 복합 펩티드의 단일 α-나선 회전과 상관관계가 있는 아미노산 위치는 복합 펩티드의 아미노산 위치 i 및 i+4에 상응하며, 여기서 i는 단일 α-나선 회전의 첫 번째 아미노산 위치이고, i+4는 단일 α-나선 회전의 마지막 아미노산 위치이고, 여기서 아미노산 위치 i 및 i+4는 알파-알케닐 치환된 아미노산을 포함한다. 복합 펩티드의 일부 실시양태에서, 위치 i의 알파-알케닐 치환된 아미노산이 S5Ala인 경우, 위치 i+4의 알파-알케닐 치환된 아미노산 또한 S5Ala이고, 고리닫기 복분해에 의해 형성된 탄화수소 링커 요소는 화학식 1로 나타낸다.
복합 펩티드의 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 펩티드 내 탄화수소에 의해 연결된 적어도 2개의 알파-알케닐 치환된 아미노산이 6개의 잔기에 의해 분리되는 경우, 적어도 1개의 펩티드 내 탄화수소 링커 요소는 복합 펩티드의 이중 α-나선 회전에 걸쳐 있다.
복합 펩티드의 일부 실시양태에서, 복합 펩티드가 하나 이상의 비-연속적 이중 α-나선 회전을 포함하는 경우, 복합 펩티드의 이중 α-나선 회전과 상관관계가 있는 아미노산 위치는 복합 펩티드의 아미노산 위치 i 및 i+7에 상응하며, 여기서 i는 이중 α-나선 회전의 첫 번째 아미노산 위치이고, i+7은 이중 α-나선 회전의 마지막 아미노산 위치이며, 여기서 아미노산 위치 i 및 i+7는 알파-알케닐 치환된 아미노산을 포함한다. 복합 펩티드의 일부 실시양태에서, 위치 i의 알파-알케닐 치환된 아미노산이 R8Ala이고, 위치 i+7의 알파-알케닐 치환된 아미노산이 S5Ala인 경우, 고리닫기 복분해에 의해 형성된 탄화수소 링커 요소는 화학식 2로 나타낸다.
일부 실시양태에서, 복합 펩티드는 적어도 2개의 인터루킨(IL) 단백질 감마-c-박스 D-나선 영역의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 복합 펩티드는 아미노산 서열 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)를 포함하고, 여기서 복합 펩티드는 적어도 2개의 알파-알케닐 치환된 아미노산을 포함하고, 여기서 적어도 2개의 알파-알케닐 치환된 아미노산은 적어도 1개의 펩티드 내 탄화수소 링커 요소를 통해 연결된다.
일부 실시양태에서, 복합 펩티드는 적어도 2개의 인터루킨(IL) 단백질 감마-c-박스 D-나선 영역의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 복합 펩티드는 아미노산 서열 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)를 포함하고, 여기서 복합 펩티드는 적어도 2개의 알파-알케닐 치환된 아미노산을 포함하고, 여기서 적어도 2개의 알파-알케닐 치환된 아미노산은 적어도 1개의 펩티드 내 탄화수소 링커 요소를 통해 연결된다.
복합 펩티드의 일부 실시양태에서, 펩티드 내 탄화수소 링커에 존재하는 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합은 하나 이상의 추가 화학 작용기를 부가하기 위한 하나 이상의 유기 화학 반응에 사용된다. 복합 펩티드의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유기 화학 반응은 알켄 반응을 포함한다. 복합 펩티드의 일부 실시양태에서, 알켄 반응은 수소화붕소화, 옥시수은화, 수화, 염소화, 브롬화, HF, HBr, HCl 또는 HI의 첨가, 디히드록실화, 에폭시화, 수소화, 및 시클로프로판화로 이루어진 군으로부터 선택된다. 복합 펩티드의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 추가 화학적 관능기가 알켄 반응 후에 첨가될 수 있고, 여기서 하나 이상의 추가 화학적 작용기는 하나 이상의 화학적 기 치환기의 공유 부가를 포함하고, 여기서 하나 이상의 화학적 기 치환기는 에폭사이드 및 히드록실 기와의 친핵성 반응을 포함한다. 복합 펩티드의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 추가 화학적 작용기는 비오틴, 방사성 동위원소, 치료제, 라파마이신, 빈블라스틴, 탁솔, 비-단백질 형광성 화학기, FITC, 히드라지드, 로다민, 말레이미드, 단백질 형광 그룹, GFP, YFP 및 mCherry로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 약학적 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 치료 유효량의 펩티드 접합체 또는 이의 유도체, 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 이의 조합을 포함하고, 여기서 펩티드 접합체 또는 이의 유도체는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 γc-사이토카인의 활성을 조절하고, 여기서 펩티드 접합체는 아미노산 서열 D/E-F-L-E/Q/N-S/R-X-I/K-X-L/I-X-Q(서열번호: 2)를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산을 나타내고, 이의 유도체는 서열번호: 2의 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 공유하는 펩티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 약학적 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 치료 유효량의 펩티드 접합체 또는 이의 유도체, 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 이의 조합을 포함하고, 여기서 펩티드 접합체 또는 이의 유도체는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 γc-사이토카인의 활성을 조절하고, 여기서 펩티드 접합체는 아미노산 서열 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열번호: 1)를 포함하며, 여기서 이의 유도체는 서열번호: 1의 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 공유하는 펩티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 약학적 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 치료 유효량의 펩티드 접합체 또는 이의 유도체, 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 이의 조합을 포함하고, 여기서 펩티드 접합체 또는 이의 유도체는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 γc-사이토카인의 활성을 조절하고, 여기서 펩티드 접합체는 아미노산 서열 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열번호: 1)를 포함하며, 여기서 이의 유도체는 서열번호: 1의 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 공유하는 펩티드 서열을 포함한다.
약학적 조성물의 일부 실시양태에서, 펩티드 접합체 또는 이의 유도체는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 γc-사이토카인의 활성을 억제한다. 약학적 조성물의 일부 실시양태에서, 펩티드 접합체 또는 이의 유도체는 이의 N 말단, C 말단 또는 측면 잔기에 추가의 접합체를 추가로 포함한다.
약학적 조성물의 일부 실시양태에서, 펩티드 접합체 또는 이의 유도체는 단일 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 펩티드 접합체 또는 이의 유도체의 구조를 안정화시키고 이의 생물학적 활성을 개선시키는 단백질을 추가로 포함하고, 여기서 단백질은 소 혈청 알부민 (BSA), 알부민, 면역글로불린 G(IgG)의 Fc 영역, 스캐폴드로 기능하는 생물학적 단백질, 폴리 에틸렌 글리콜(PEG) 및 이의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 약학적 조성물의 일부 실시양태에서, 이의 유도체는 서열 번호: 2의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 공유하는 펩티드 서열을 포함한다. 약학적 조성물의 일부 실시양태에서, 이의 유도체는 서열 번호: 1의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 공유하는 펩티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 탈모 관련 문제증상을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 본원에서 제공되는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 탈모 관련 문제증상은 원형탈모증, 전두탈모증, 부분탈모증, 보편성 탈모, 확산성 탈모증, 사선형 원형 탈모증, 편평태선, 경화태선, 위축성 경화태선, 아토피, 아토피성 피부염, 건선, 심상성 건선, 두부 건선, 창자 건선, 반전 건선, 건선성 관절염, 습진, 천포창, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 증식성 천포창, 홍반성 천포창, 점막 천포창, 흉터성 점막 천포창, 수포성 천포창, 중증 근무력증, 갑상성 질환, 갑상선 기능 저하증, 풍토성 갑상선종, 애디슨병, 피부경화증, 두드러기, 가려움증, 주사비 백반증, 백반증, 및 이식편대숙주질환(GvHD)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 환자의 탈모 관련 문제증상을 치료하는 키트가 제공된다.
일부 실시양태에서, 키트는 약학적 조성물을 포함하며, 여기서 약학적 조성물은 치료 유효량의 펩티드 접합체 또는 이의 유도체, 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 이의 조합을 포함하고, 여기서 펩티드 접합체 또는 이의 유도체는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 γc-사이토카인의 활성을 조절하고, 여기서 펩티드 접합체는 아미노산 서열 D/E-F-L-E/Q/N-S/R-X-I/K-X-L/I-X-Q(서열번호: 2)를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산을 나타내고, 이의 유도체는 서열번호: 2의 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 공유하는 펩티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키트는 약학적 조성물을 포함하며, 여기서 약학적 조성물은 치료 유효량의 펩티드 접합체 또는 이의 유도체, 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 이의 조합을 포함하고, 여기서 펩티드 접합체 또는 이의 유도체는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 γc-사이토카인의 활성을 조절하고, 여기서 펩티드 접합체는 아미노산 서열 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열번호: 1)를 포함하며, 여기서 이의 유도체는 서열번호: 1의 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 공유하는 펩티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키트는 약학적 조성물을 포함하며, 여기서 약학적 조성물은 치료 유효량의 펩티드 접합체 또는 이의 유도체, 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 이의 조합을 포함하고, 여기서 펩티드 접합체 또는 이의 유도체는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 γc-사이토카인의 활성을 조절하고, 여기서 펩티드 접합체는 아미노산 서열 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열번호: 1)를 포함하며, 여기서 이의 유도체는 서열번호: 1의 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 공유하는 펩티드 서열을 포함한다.
키트의 일부 실시양태에서, 병태는 원형탈모증, 전두탈모증, 부분탈모증, 보편성 탈모, 확산성 탈모증, 사선형 원형 탈모증, 편평태선, 경화태선, 위축성 경화태선, 아토피, 아토피성 피부염, 건선, 심상성 건선, 두부 건선, 창자 건선, 반전 건선, 건선성 관절염, 습진, 천포창, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 증식성 천포창, 홍반성 천포창, 점막 천포창, 흉터성 점막 천포창, 수포성 천포창, 중증 근무력증, 갑상성 질환, 갑상선 기능 저하증, 풍토성 갑상선종, 애디슨병, 피부경화증, 두드러기, 가려움증, 주사비 백반증, 백반증, 및 이식편대숙주질환(GvHD) 중 하나 이상이다.
정의
본원에 사용된 용어 "환자" 또는 "대상체"는 본원에 개시된 복합 펩티드의 임의의 실시양태의 수용자를 지칭하고, 동물 왕국 내의 모든 유기체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 및 기타 영장류(예를 들어, 침팬지 및 기타 유인원 및 원숭이 종), 농장 동물(예를 들어, 소, 양, 돼지, 염소 및 말), 가축(예를 들어, 개 및 고양이), 실험 동물(예를 들어, 마우스, 쥐, 기니피그와 같은 설치류) 및 조류(예를 들어, 닭, 칠면조 및 기타 담즙 조류, 오리, 거위 등의 가축, 야생 및 게임 조류)를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 포유동물이 포함된다. 바람직한 실시양태에서, 동물은 인간, 소, 양, 돼지, 고양이, 버팔로, 개, 염소, 말, 당나귀, 사슴 및 영장류와 같은 포유동물 과에 속한다. 가장 선호하는 동물은 인간이다. 일부 실시양태에서, 환자는 남성 또는 여성이다.
본 원에서 사용되는 용어 "치료하다" 또는 이의 임의의 변형(예를 들어, 치료, 치료하는 등)은 생물학적 병태, 예컨대, 원형탈모증, 전두탈모증, 부분탈모증, 보편성 탈모, 확산성 탈모증, 사선형 원형 탈모증, 편평태선, 경화태선, 위축성 경화태선, 아토피, 아토피성 피부염, 건선, 심상성 건선, 두부 건선, 창자 건선, 반전 건선, 건선성 관절염, 습진, 천포창, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 증식성 천포창, 홍반성 천포창, 점막 천포창, 흉터성 점막 천포창, 수포성 천포창, 중증 근무력증, 갑상성 질환, 갑상선 기능 저하증, 풍토성 갑상선종, 애디슨병, 피부경화증, 두드러기, 가려움증, 주사비 백반증, 백반증, 및 이식편대숙주질환(GvHD)으로 진단받은 환자의 임의의 치료를 나타낸다.
본원에 사용된 용어 치료하다는 하기를 포함한다: (i) 생물학적 병태와 관련된 증상이 아직 나타내지 않은 위험에 처한 환자에서 관심있는 생물학적 병태와 관련된 증상 제시의 예방 또는 지연; (ii) 생물학적 병태로 진단된 환자의 관심있는 생물학적 병태와 관련된 증상의 개선; (iii) 위험에 처한 환자 또는 생물학적 병태로 진단된 환자에서 관심있는 생물학적 병태와 관련된 합병증, 병태 또는 질병과 관련된 증상 표시의 예방, 지연 또는 개선; (iv) 생물학적 병태의 진행을 늦추거나, 지연, 정지; 및/또는 (v) 염증의 세포적 이벤트를 예방, 지연, 감속, 정지 또는 개선; 및/또는 (vi) 생물학적 병태의 조직학적 이상 및/또는 기타 임상적 측정의 예방, 지연, 감속, 정지 또는 개선.
본원에 사용된 용어 "증상(들)"은 환자가 특정 병태 또는 질병을 앓고 있다는 일반적인 신호 또는 징후를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 원하는 생물학적 반응을 유도하는 데 필요한 양을 지칭한다. 본 실시양태에 따르면, γc-길항제의 유효량은 생물학적 병태를 치료하는 데 사용하기 위한 하나 이상의 생물학적 인자에서 관찰가능한 효과를 제공하는 데 필요한 양이다.
"재조합 DNA 기술" 또는 "재조합"은, 이종 펩티드의 생합성을 가능하게 하기 위해 클로닝된 또는 합성 DNA 서열로 형질전환되거나 형질감염되는, 미생물(예를 들어, 박테리아, 효모), 무척추동물(곤충), 포유동물 세포 또는 유기체(예를 들어, 형질전환 동물 또는 식물)로부터 특정 폴리펩티드를 생산하기 위한 기술 및 공정의 사용을 의미한다. 천연 글리코실화 패턴은 포유동물 세포 발현 시스템에서만 달성될 것이다. 원핵생물 발현 시스템은 합성된 단백질에 글리코실화를 추가하는 능력이 부족하다. 효모와 곤충 세포는 고유의 패턴과 다를 수 있는 독특한 글리코실화 패턴을 제공한다.
"뉴클레오티드 서열"은 표준 분자 생물학 방법에 의해 이의 구성 요소 뉴클레오티드 서열의 식별, 조작 및 회수를 가능하게 하는 양 또는 농도(분자 생물학의 현재 프로토콜에 설명된 대로)로 내인성 물질을 오염시키지 않고 실질적으로 순수한 형태로 적어도 한 번 분리된 DNA 또는 RNA로부터 유래된 별도의 단편 형태 또는 더 큰 DNA 작제물의 성분인 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
"재조합 발현 벡터"는 (1) 프로모터 및 인핸서를 포함하여 유전자 발현에 조절 역할을 하는 유전적 요소 또는 요소들, (2) 본 실시양태에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 구조 또는 코딩 서열, 및 (3) 적절한 전사 및 번역 개시 서열, 및 목적하는 경우, 종결 서열의 어셈블리를 포함하는 전사 단위를 포함하는 플라스미드를 지칭한다. 효모 및 포유동물 시스템에 사용하려고 의도된 구조적 요소는 바람직하게 효모 또는 포유동물 숙주 세포에 의해 번역된 폴리펩티드의 세포외 분비를 가능하게 하는 신호 서열을 포함한다.
"재조합 미생물 발현 시스템"은 재조합 전사 단위를 염색체 DNA에 안정적으로 통합하거나 잔류 플라스미드의 구성요소로서 재조합 전사 단위를 운반하는 적합한 고온 미생물, 예를 들어, 대장균과 같은 박테리아 또는 에스. 세레비제(S. cerevisiae)와 같은 효모의 실질적으로 균질한 단일 배양을 의미한다. 일반적으로 재조합 미생물 발현 시스템을 구성하는 숙주 세포는 단일 조상 형질전환 세포의 자손이다. 재조합 미생물 발현 시스템은 발현될 구조적 뉴클레오티드 서열에 연결된 조절 요소의 유도 시 이종 폴리펩티드를 발현할 것이다.
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본 발명이 특정 실시예 및 실시예의 맥락에서 개시되었지만, 당업자는 본 발명이 구체적으로 개시된 실시예를 넘어 본 발명의 다른 대안적인 실시예 및/또는 용도 및 이의 명백한 수정 및 등가물로 확장된다는 것을 이해할 것이다. 또한, 본 발명의 여러 변형이 상세하게 도시되고 설명되었지만, 본 발명의 범위 내에 있는 다른 변형은 본 개시에 기초하여 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.
또한, 실시예의 특정 특징 및 측면의 다양한 조합 또는 하위 조합이 만들어질 수 있고 여전히 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 고려된다. 개시된 실시예의 다양한 특징 및 양태는 개시된 발명의 다양한 모드 또는 실시예를 형성하기 위해 서로 결합되거나 대체될 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 여기에 개시된 본 발명의 범위는 위에서 설명된 특정한 개시된 실시예에 의해 제한되어서는 안 되는 것으로 의도된다.
그러나, 본 상세한 설명은 본 발명의 바람직한 실시예를 나타내지만, 본 발명의 사상 및 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 당업자에게 명백할 것이기 때문에 단지 예시의 방법으로 제공된다는 것을 이해해야 한다.
실시예
하기 실시예는 설명의 목적으로 제공되며, 제한으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1 - γc-길항제 펩티드의 억제 활성 평가 방법
하나의 γc-사이토카인 패밀리 구성원의 작용을 억제하기 위한 본 실시양태에 따라 제조된 임의의 맞춤형 유도체 펩티드의 능력은 γc-사이토카인 패밀리 구성원에 대한 증식 반응을 측정하기 위해 포유동물 세포 분석을 사용하여 결정된다.
6가지 γc-사이토카인 각각에 대한 지표 세포주: NK92, American Type Culture Collection(ATCC)에 의해 입수 가능한 인간 NK 세포주 NK92(카탈로그 # CRL-2407), ATCC로부터 입수 가능한 쥐 CD8 T 세포주인 CTLL-2, 및 쥐 비만 세포주인 PT-18 및 이의 서브클론 PT-18β는 인간 IL-2Rβ 유전자로 형질감염되어 세포가 IL-2 및 IL-15에 반응하도록 하고(문헌[Tagaya et al., 1996, EMBO J. 15:4928-39]), γc-사이토카인의 성장 촉진 활성을 정량적으로 결정하기 위해 사용된다(문헌[Current protocols in Immunology from Wiley and Sons for a methodological reference] 참조). 지표 세포는 농도 범위에 걸쳐 비색 WST-1 분석으로 측정할 때 반-선형 용량-의존적 반응을 나타낸다(시약 및 방법에 대한 자세한 설명은 Clontech PT3946-1 및 관련 사용자 설명서를 참조).
지표 세포주로부터 50% 및 95% 최대 반응을 생성하는 사이토카인의 적절한 용량이 결정되면, 정제 또는 합성된 맞춤형 유도체 펩티드의 다양한 농도(1 pM에서 10 μM 범위)를 사이토카인과 지표 세포가 함유된 각 웰에 첨가한다. 450 nm에서의 흡광도 감소는 사이토카인-자극 세포 증식 억제의 지표로 사용된다. 통상적으로, 세포는 지표 세포주와 사이토카인이 함유된 웰의 흡광도가 2.0 내지 3.0이 되도록 사이토카인에 의해 자극되며, 상기 흡광도는 억제 펩티드의 첨가에 의해 0.1 내지 0.5 범위로 감소된다.
실시예 2 - BNZ-γ에 의한 특정 γc-사이토카인의 성장-촉진 활성의 선택적 억제
상기 기재된 바와 같이 PT-18β 세포를 사용하여, 선별된 γc-사이토카인의 성장-촉진 활성을 특이적으로 억제하는 BNZ-γ 펩티드의 능력을 결정하였다(도 3a). PT-18β 세포의 성장을 지원하는 비-γc-사이토카인인 IL-3을 음성 대조군으로 사용하였다. 간단히 말해서, PT-18β 세포는 HEK293T 세포에 의해 생성된 BNZ-γ 펩티드의 두 가지 다른 희석액(BNZ-γ 발현 작제물로 형질감염된 HEK293T 세포의 원래 상청액의 1:20 또는 1:60 희석)과 함께 또는 BNZ-γ 펩티드 없이 IL-3, IL-9, IL-15 또는 IL-4(배양에서 각 사이토카인의 1 nM)의 존재 하에서 배양하였다.
세포의 성장-반응은 WST-1 분석을 사용하여 BNZ-γ 펩티드 및 사이토카인의 도입 2일 후에 결정하였다. IL-3(비 γc-사이토카인)의 성장-촉진 활성은 BNZ-γ에 의해 억제되지 않았다. 대조적으로, IL-15 및 IL-9의 활성은 BNZ-γ 펩티드에 의해 유의하게(p<0.01 스튜던트 T 테스트) 감소하였다. 또 다른 γc-사이토카인인 IL-4에 의해 자극된 세포 증식은 BNZ-γ 펩티드의 첨가에 의해 영향을 받지 않았다. IL-3, IL-9, IL-15 및 IL-4에 대한 결과는 도 3a에 도시되어 있다.
유사한 분석에서 쥐 세포주 CTTL2를 사용하였다. 이 분석에서 세포는 RPMI 10% 태아 송아지 혈청에서 0.5 nM의 재조합 IL-2와 함께 배양하였다. 증식 분석을 설정하기 위해 세포를 사이토카인으로부터 3회 세척했다. 세포는 IL-2 또는 IL-15의 최종 농도가 50 pM인 96-웰 플레이트의 웰 당 1 x 10(5) 세포로 시딩하였다. 다양한 농도의 BNZ-γ 펩티드(0.1, 1, 및 10 μM)를 각 웰에 첨가했다. 세포를 20시간 동안 배양하고, 마지막 4시간 동안 3H-티미딘을 플레이트에 첨가하였다. 세포를 수확하고, 방사능을 측정하여 세포 증식 수준을 결정했다. 데이터는 도 3b에 나타냈다.
실시예 3 - 세포 증식의 마커로서 3H-티미딘 혼입을 분석하여 억제 γc-사이토카인 활성을 측정하는 방법
길항제 맞춤형 유도체 펩티드에 의한 지표 세포 집단의 γc-사이토카인-유도 증식 억제는 3H-티미딘 혼입 분석에 의해 측정했다. 간단히 말해서, 방사성 표지된 티미딘(1 microCi)은 사이토카인의 존재 하에 증식되는 20-50,000개의 세포에 제공된다. 세포-혼입 방사능은 기존의 수확기(Example, Perkin-Elmer의 Filtermate Universal Harvester)를 사용하여 유리-섬유 필터에 세포-결합 방사능을 트래핑하여 측정한 후 b-counter(Example 1450, Trilux microplate scintillation counter)를 사용하여 방사능을 측정한다.
실시예 4 - 세포 증식의 마커로서 세포-추적자 염료의 혼입을 분석하여 억제 γc-사이토카인 활성을 측정하는 방법
지표 세포는 선택된 γc-사이토카인의 존재 또는 선택된 γc-사이토카인 및 선택된 맞춤형 유도체 펩티드의 존재 하에 인큐베이션된다. 그런 다음 세포 집단은 세포-추적기 염료, 예를 들어, CMFDA, Invitrogen의 C2925를 사용하여 시험관 내에서 표지하고, 각 세포 분열에서 세포 녹색 형광의 붕괴는 유세포 분석기(예를 들어, Beckton-Dickinson FACScalibur)를 사용하여 모니터링한다. 통상적으로, γc-사이토카인 자극에 대한 반응으로 세포가 겪은 분열 수에 해당하는 7~10개의 다른 피크가 녹색 형광 채널에 나타날 것이다. 선택된 γc-사이토카인 및 길항제 맞춤형 유도체 펩티드와 세포의 인큐베이션은 억제 정도에 따라 피크의 수를 1에서 3으로만 감소시킨다.
실시예 5 - 맞춤형 펩티드 유도체 길항제에 의한 세포내 신호전달의 억제
세포 증식을 자극하는 것 외에도 γc-사이토카인이 수용체에 결합하면 다양한 세포 내 이벤트가 발생한다. (문헌[Rochman et al. 2009 Nat. Rev. Immunol. 9:480-90], 및 문헌[Pesu et al. 2005 Immunol. Rev. 203:127-142]). 사이토카인이 이의 수용체에 결합한 직후 Jak3(야누스-키나제 3)이라고 하는 티로신 키나제가 원형질막의 수용체로 동원된다. 이 키나제는 γc-하위단위, STAT5(신호 변환자 및 전사 활성자 5(Signal Transducer and Activator of Transcription 5)) 및 PI3(포스파티딜이노시톨 3) 키나제의 하위단위를 포함한 여러 단백질의 티로신 잔기를 인산화한다. 이들 중 STAT5의 인산화는 γc-사이토카인에 의해 시작된 세포의 증식과 관련이 있는 것으로서 많은 연구에서 시사되어 있다. (문헌[Hennighausen and Robinson, 2008 Genes Dev. 22:711-21]에서 리뷰됨) 이러한 공개된 데이터에 따라 BNZ-γ 펩티드가 IL-15에 의해 자극된 PT-18β 세포에서 STAT5 분자의 티로신 인산화를 억제하는지 여부를 조사하였다(결과는 도 4에 나타냄).
PT-18β 세포는 BNZ-γ 펩티드의 존재 또는 부재하에 IL-15에 의해 자극되었다. 세포질 단백질은 문헌[Tagaya et al. 1996 EMBO J. 15:4928-39]에 기재된 종래 방법에 따라 세포에서 추출하였다. 추출된 세포질 단백질은 표준 SDS-PAGE(나트륨 도데실-설페이트 폴리아크릴아미드겔 전기영동(Sodium Dodecyl-Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis))를 사용하여 분리하고, 인산화 상태는 면역블롯팅을 사용하여 항-포스포-STAT5 항체(Cell Signaling Technology, Catalog # 9354, Danvers MA)에 의해 확인하였다(도 4의 상단 패널 참조). 각 레인이 유사한 총 단백질 부하를 나타내는지 확인하기 위해, 막을 제거하고 항-STAT5 항체(Cell Signaling Technology, 카탈로그 # 9358)로 다시 프로빙했다(도 4의 하단 패널 참조).
이러한 결과는 신호전달의 마커인 STAT5의 티로신 인산화가 PT-18β 세포에서 IL-15에 의해 유도되고, BNZ-γ 펩티드에 의해 STAT5의 티로신 인산화가 현저히 감소됨을 입증하였다.
실시예 6 - γc-길항제 펩티드 유도체에 대한 합리적인 설계
유도체 펩티드는 도 2에 나타낸 동일한 물리-화학적 특성을 갖는 아미노산으로 코어 서열의 규정된 아미노산을 치환하여 코어 서열 D/E-F-L-E/Q/N-S/R-X-I/K-X-L/I-X-Q(서열 번호: 2)(여기서, X는 임의의 아미노산을 나타냄)로부터 기초하여 제조하였다.
대안적으로, 맞춤형 펩티드 또는 이들의 유도체 펩티드는 상이한 γc-사이토카인 패밀리 구성원의 D-나선 영역의 서열 정렬에 기초하여 제조될 수 있다.
실시예 7 - 길항성 맞춤형 유도체 펩티드의 억제 특이성을 확인하는 방법
길항성 맞춤형 유도체 펩티드의 γc-사이토카인 억제 특이성은 각각의 γc-사이토카인에 대한 사이토카인-반응성 세포주의 증식 반응을 억제하는 맞춤형 유도체 펩티드의 능력을 분석함으로써 결정된다. 예를 들어, 마우스 세포주 CTLL-2는 후보 펩티드가 IL-2 및 IL-15의 기능을 억제하는지 여부를 결정하는 데 사용된다. PT-18(β) 세포는 후보 펩티드가 IL-4 및 IL-9의 기능을 억제하는지 여부를 결정하는 데 사용된다. PT-18(7α) 세포는 후보 펩티드가 IL-7의 기능을 억제하는지 여부를 결정하는 데 사용되며, PT-18(21α) 세포는 후보 펩티드가 IL-21의 기능을 억제하는지 여부를 결정하는 데 사용된다. PT-18(β)은 유전자 형질감염에 의해 인간 IL-2Rβ를 외인성으로 발현하는 PT-18 세포의 서브클론을 나타내고(문헌[Tagaya et al. 1996] 참조), PT-18(7α)은 유전자 형질감염에 의해 인간 IL-7Rα를 발현하는 서브클론을 나타내며, PT-18(21Rα) 세포는 인간 IL-21Rα를 발현한다.
또 다른 대안은 사이토카인 배열에 반응하는 다른 세포주를 사용하는 것이다. 이러한 세포주의 예는 ATCC(카탈로그 # CRL-2407)에서 상업적으로 입수할 수 있는 인간 NK 세포주 NK92이다. 이러한 세포주는 IL-9, IL-7, IL-15, IL-12, IL-18, IL-21을 포함한 다른 사이토카인에 반응하는 IL-2 의존성 세포주이다(문헌[Gong et al. 1994 Leukemia 8: 652 -658], 문헌[Kingemann et al., 1996, Biol Blood Marrow Transplant 2:68;75], 문헌[Hodge DL et al., 2002 J. Immunol. 168:9090-8]).
실시예 8 - γc-길항제 펩티드의 제조
맞춤형 유도체 γc-길항제 펩티드는 수동 및 자동화 공정을 통해 화학적으로 합성된다.
수동 합성: 하나의 아미노산의 카르복실기 또는 C-말단을 다른 아미노산의 아미노기 또는 N-말단에 연결하는 것을 포함하는 고전적인 액상 합성이 사용된다. 대안적으로 고상 펩티드 합성(SPPS)이 이용된다.
자동 합성: 많은 상업적 회사는 비용을 지불하고 자동화된 펩티드 합성을 제공한다. 이들 회사는 Applied Biosystems(ABI)에서 제공하는 합성기를 포함하여 다양한 상용 펩티드 합성기를 사용한다. 맞춤형 유도체 γc-길항제 펩티드는 자동화된 펩티드 합성기에 의해 합성된다.
실시예 9 - 맞춤형 유도체 γc-길항제 펩티드의 생물학적 생성 재조합 기술 사용
맞춤형 유도체 γc-길항제 펩티드는 적절한 태깅 펩티드(tagging peptide), 신호 펩티드, 또는 BNZ-γ 펩티드의 구조를 향상 또는 안정화시키고 이들의 생물학적 구조를 개선하는 알려진 인간 단백질 유래의 펩티드로 구성된 프로-펩티드(pro-peptide)로서 생물학적으로 합성된다. 원하는 경우, 펩티드의 N-말단으로 진행하는 적절한 효소-절단 서열은 최종 단백질에서 태그 또는 펩티드의 일부를 제거하도록 설계되어야 한다.
3' 말단에 정지 코돈이 있는 맞춤형 유도체 펩디드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 대장균의 티오레독신(thioredoxin)에서 유래한 태그 부분과 태그 부분과 맞춤형 유도체 펩티드 및 정지 코돈을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 사이에 개재된 적절한 단백질 분해효소(예를 들면, 엔테로키나제)에 의해 인식되고 소화되는 특수한 펩티드 서열을 가진 상용 벡터에 삽입된다. 적합한 벡터의 한 예는 캘리포니아주 Invitrogen에서 입수 가능한 pThioHis 플라스미드이다. 다른 발현 벡터를 사용할 수 있다.
실시예 10 - 면역화 목적을 위한 맞춤형 펩티드 및 담체 단백질에 대한 유도체의 접합 및 맞춤형 펩티드에 대한 항체 생성
BNZ-γ 또는 이의 유도체는 동물을 면역화하여 다클론 및 단일클론 항체를 얻는 데 사용된다. 펩티드는 글루타르알데히드 또는 m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르를 사용하는 통상적인 방법에 의해 적절한 담체 단백질(예를 들어, 소 혈청 알부민, 키홀 림펫 호모시아닌(KLH) 등)의 N- 또는 C-말단에 접합된다. 다음에 적절한 보조제와 함께 접합된 펩티드를 사용하여 토끼, 설치류 또는 당나귀와 같은 동물을 면역화한다. 생성된 항체는 통상적인 방법을 사용하여 특이성에 대해 검사된다. 생성된 항체가 면역원성 펩티드와 반응하는 경우, 이후 실시예 1-3에 기재된 세포 증식 분석에 따라 개별 γc-사이토카인 활성을 억제하는 능력에 대해 시험한다. 유도체 펩티드의 복합 특성으로 인해, 이들 펩티드의 복합 특성으로 인해 두 개의 서로 다른 사이토카인을 동시에 인식하는 단일 항체를 생성하는 것이 가능한다.
실시예 11 - 맞춤형 유도체 γc-길항제 펩티드의 대규모 생성 방법
재조합 단백질은 다른 곳에서 설명한 바와 같이 무세포 시스템을 사용하여 대규모로 생성된다. (문헌[Takai et al., 2010 Curr. Pharm. Biotechnol. 11(3):272-8] 참조). 간략하게, γc-길항제 펩티드 및 태그를 코딩하는 cDNA를 적절한 벡터로 서브클로닝하고(문헌[Takai et al., 2010 Curr. Pharm. Biotechnol. 11(3):272-8]), 이는 시험관 내 전사를 거친 후 즉시 시험관 내 번역을 수행하여 태그된 펩티드를 생성한다. 그런 다음 프로-폴리펩티드(pro-polypeptide)는 태그된 에피토프를 인식하는 고정된 항체를 사용하여 정제되고, 단백질 분해 효소로 처리되고, 용출액(대부분 관심 있는 맞춤형 유도체 펩타이드가 포함됨)은 기존의 18% Tricine-SDS-PAGE(Invitrogen) 및 기존의 코마시 염색을 사용하여 순도를 시험한다. 펩티드의 원하는 순도가 충족되지 않으면(>98%), 혼합물을 추가 정제를 위해 기존의 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피)에 적용한다.
실시예 12 - 면역-매개 탈모 및 탈모증관련 질환의 치료적 조사를 위한 인간화 NSG 마우스 모델의 사용
인간 면역 시스템의 생체 내 연구를 위한 주요 발전은 면역이 약화된 NOD/Scid/Il2rg-/-(NSG) 마우스와 같은 심각한 면역 결핍 마우스에서 기능적 인간 면역 시스템을 확립할 수 있다는 개발이었다. (문헌[Shultz et al., 2012 Nat. Rev. Immunol. 12:786-98]) NSG 마우스는 γc-사이토카인 신호 전달에 필요한 작용화 γc-하위단위가 부족하고, 림프 세포가 매우 결핍되어 있으며, 피콜-구배 정제 인간 말초 혈액 단핵 세포(huPBMC)의 복강 내 투여 후 매우 효율적인 인간 면역계 생착을 허용한다. 인간 면역 세포의 후속 확장은 인간 T 세포가 피부를 포함한 쥐 조직을 표적으로 하기 때문에 전신 이식편대숙주질환(GvHD)의 인간화 마우스 모델을 생성한다(문헌[Sonntag et al., 2015 J. Autoimmun. 62:55-66]). 인간화된 NSG 마우스는 전신 GvHD의 한 증상으로 진행성 탈모(탈모증)가 발생하며, 대머리 패치는 약 3-4주 후에 나타나며 약 45-50일까지 완전한 모발 손실로 진행된다. 동물은 GvHD로 인해 곧 죽는다.
인간화 마우스 모델에서 탈모증의 기본 메커니즘을 추가로 이해하기 위해 3개의 주요 순환 인간 사이토카인(IL-2, IL-15 및 IFNγ)의 발현 프로파일을 200만 huPBMC를 5마리의 3주령 NSG 마우스의 복강 내에 투여한 후 탈모증에 대해 특성화시켰다. IL-15의 증가는 14일에 가장 빠르고 명백했던 반면, IL-2 및 IFNγ는 35일까지 상승하지 않았으며, 3가지 사이토카인 모두가 49일까지 증가했고(결과는 도 5에 나타냄), 이는 실험군에서 마우스의 죽음으로 인해 이용 가능한 마지막 시점이었다. 이것은 IL-15가 질병의 주요 동인임을 나타낸다. 35일까지, 마우스는 체중 감소 및 중등도 내지 중증 탈모증을 포함하는 GvH 반응의 증상을 나타냈다.
실시예 13 - 면역-매개 탈모가 있는 인간화 NSG 마우스에 대한 항-인간 CD8 항체의 효과
NKG2 패밀리의 구성원은 NK 및 CD8+ T 세포의 세포독성 과정에 연루되어 있으며, γc-사이토카인 IL-15를 포함한 다중 사이토카인에 의해 조절된다(문헌[Borrego et al. 1998 J Exp Med 187:813-18], 문헌[Brumbaugh et al. 1996 J Immunol 157:2804-12], 문헌[Cantoni et al. 1998 Eur J Immunol 28:327-38], 문헌[Mingari et al. 1998 Proc Natl Acad Sci 95:1172-7]). 각 NKG2 수용체는 동종이량체로 존재하는 NKG2D를 제외하고(문헌[Garrity et al. 2005 Proc Natl Acad Sci 102:7641-6]), 렉틴 단백질 CD94와 이량체화되어 이종이량체 수용체 복합체를 형성한다(문헌[Lazetic et al. 1996 J Immunol 157:4741-5]). 이전 보고서에서는 탈모증 환자의 탈모가 NKG2D 수용체를 발현하는 세포독성 CD8+ T-세포에 의해 매개된다고 제시한다(문헌[Xing et al. 2014 Nat Med 9:1043-9.], 문헌[Gilhar et al. 2016 Autoimmun. Rev. 15:726-35]). 이 질병 모델에서 CD8+ T-세포의 중요성을 특성화하기 위해, 인간 CD8+ T-세포를 고갈시키는 항-인간 CD8 항체(OKT8)(BD Biosciences)로 동물을 처리했다. 200만 개의 huPBMC를 이식한 후 4주 이내에 5마리의 마우스 코호트에서 체중 감소가 발생하고, 탈모가 완료되었다. 그런 다음 3마리의 인간화된 마우스를 50 μg/마우스의 항-CD8 항체를 2회 주사(주 2회)로 처리하기 위해 선택하였다.
항-인간 CD8 항체로 처리하기 전에, 인간 CD8+ T 세포를 대표적인 인간화 NSG 마우스로부터 수집된 혈액 샘플로부터 분리하고, NKG2D(CD314) 수용체 및 NKG2 패밀리(NKG2A 및 NKG2C)의 수용체의 발현에 대해 염색하여 유세포 분석에 의한 측정을 용이하게 하였다. 탈모증 질환 진행에서 세포독성 CD8+ T 세포는 또한 활성화 NKG2D 수용체의 발현에 대해 양성인 것으로 나타났다(문헌[Xing et al. 2014 Nat Med 9:1043-9]). 유세포 분석은 인간화 NSG 마우스로부터 분리된 거의 전체 인간 CD8+ T-세포 집단이 NKG2D+임을 보여주었다(도 6a 참조). 흥미롭게도, 인간 NKG2C+ CD8+ T-세포는 huPBMC 이식 후 감소하는 것으로 관찰된 반면, 인간 NKG2A+ CD8+ T-세포는 huPBMC 이식 후 GvHD 증상이 악화되고 질병이 진행됨에 따라 확장되는 현저한 증가를 나타냈다(도 6b 참조).
항-인간 CD8 항체로 처리한 후, 모든 인간 CD8+ T-세포는 유의하고 특이적으로 고갈되었고(도 7a 참조), 이는 처리 후에 다시 나타나지 않았다. CD8+ T-세포의 고갈 후 4일 이내에, 3마리의 인간화된 마우스 모두는 체중 증가를 나타내었고(도 7b 참조), 체모의 재성장은 처리 후 2주에 명백했다(도 7c 참조).
실시예 14 - 면역-매개 탈모가 있는 인간화 NSG 마우스에서 인간 NKG2A+ CD8+ T-세포의 구성적 γc-신호전달
γc-하위단위와 γc-사이토카인 사이의 상호작용은 Jak3의 활성화와 인산화로 이어진다. 신호 전달을 위해 Jak3을 모집하는 다른 수용체 분자가 없다는 점에서 γc-하위단위와 Jak3의 상호작용이 매우 특이적임을 고려하여, 이후에 200만 huPBMC의 이식 후 4주에 인간화된 NSG 마우스로부터 분리된 인간 NKG2A+ CD8+ T-세포가 Jak3의 인산화 및 STAT5의 다운스트림 인산화에 대해 양성인지의 여부를 시험하였다. 인간 NKG2A+ 및 NKG2A- CD8+ T-세포는 3개의 대표적인 인간화 NSG 마우스의 혈액 및 비장에서 피콜l-정제하였다. 그런 다음 세포를 FITC-항-CD4, PE-항-CD8 및 PE/Cy7-항-NKG2A의 혼합물로 염색하고, 형광-활성화된 세포를 CD4-CD8+ NKG2A+ 및 CD4- CD8+ NKG2A- 하위집단으로 분류하였다(FACSAria II, BD Biosciences). 대조군으로서, 이식되지 않은 NKG2A+ 및 NKG2A-CD8+ T-세포는 자극되지 않은 채로 놔두거나, 생체 외에서 IL-15의 첨가에 의해 자극하였다. 세포질 단백질은 문헌[Tagaya et al. 1996 EMBO J. 15:4928-39]에 기재된 종래 방법에 따라 세포에서 추출하였다. 추출된 세포질 단백질은 표준 SDS-PAGE를 사용하여 분리하였고, 인산화 상태는 면역블롯팅을 사용하여 스포-Jak3 항체(Cell Signaling Technology, Catalog # 5031, Danvers MA) 또는 항 -포스포-STAT5 항체(Cell Signaling Technology, Catalog # 9354, Danvers MA)로 확인하였다(도 8 참조). 빈큘린(Vinculin)을 대조군으로서 조사하였다. 결과는 200만 huPBMC의 이식 4주 후에 인간화된 NSG 마우스에서 인간 NKG2A+의 구성적 γc-신호전달을 나타내지만, NKG2A-CD8+ T-세포는 나타내지 않는다.
실시예 15 - 면역-매개 탈모가 있는 인간화 NSG 마우스의 CD8+ T-세포에서 인간 C-형 렉틴 수용체 NKG2 패밀리 구성원의 항체-매개 고갈
인간화 NSG 마우스에서 전신 GvHD의 발병기전에서 CD8+ T-세포의 인간 C-형 렉틴 수용체 NKG2 패밀리(NKG2A, B, C, D, E, F, 및 H) 구성원의 인과적 관여를 테스트하기 위해, CD8+ T 세포에서 각 개별 인간 NKG2 단백질 구성원의 항체-매개 고갈이 연구 중인 NKG2 단백질 구성원에 특이적인 항-NKG2 항체 50 μg/마우스를 200만 huPBMC의 이식 후 3-5주에 3마리의 대표적인 인간화 NSG 마우스에서 주당 2회 주사함으로써 수행되었다. CD8+ T 세포에서 특정 NKG2 패밀리 구성원의 성공적인 고갈은 이후 체중 감소, 면역-매개 탈모 및 사이토카인 IL-2, IL-15, 및 IFNγ의 순환 수준과 같은 주요 전신 GvHD 증상과 상관되었다.
실시예 16 - 면역-매개 탈모가 있는 인간화 NSG 마우스에 대한 인간 NKG2A+ CD8+ T-세포의 항체-매개 고갈 효과
NKG2A+ CD8+ T-세포가 NSG 마우스에서 huPBMC 이식 후 관찰된 체중 감소 및 탈모와 같은 전신 GvHD 증상에 인과적으로 연결되어 있는지 추가로 조사하기 위해, 체중과 염증성 사이토카인 IFNγ 및 γc-사이토카인 IL-2, IL-7 및 IL-15의 수준과 함께 NKG2A+ CD8+ T-세포 확장의 동역학에 대한 편집이 200만 huPBMC의 이식 후 1주 내지 6주에 3개의 대표적인 인간화 NSG 마우스로부터 매주 생성되었다. CD8+ T-세포 구획에서 NKG2A+ 세포의 증가와 IL-2, IL-15 및 IFNγ의 증가 사이에 명확한 상관관계가 관찰되었다(도 9a 참조).
인간화 NSG 마우스에서 전신 GvHD의 발병기전에 NKG2A+ CD8+ T-세포의 인과관계를 테스트하기 위해, 인간 NKG2A+ CD8+ T 세포의 항체-매개 고갈이 200만 huPBMC의 이식 후 3-5주에 3마리의 대표적인 인간화 NSG 마우스에서 50 ㎍/마우스의 항-NKG2A 항체(R & D Systems, Catalog # MAB1059, Clone 131411, Minneapolis, MN)를 주당 2회 주사함으로써 수행되었다. NKG2A+ CD8+ T-세포의 성공적인 고갈(도 9b 참조, huPBMC 이식 후 4-6주)은 주요 전신 GvHD 증상의 완화와 긍정적으로 연관되었으며, 항-NKG2A 항체 치료의 후 첫 주에 체중 감소 및 면역-매개 탈모는 개선되었다. IL-2, IL-15, 및 IFNγ의 감소는 인간 NKG2A+ CD8+ T-세포의 항체-매개 고갈과 직접적으로 상관관계가 있는 것으로 관찰되었다(도 9b 참조).
실시예 17 - 면역-매개 탈모가 있는 인간화 NSG 마우스에 대한 BNZ-γ의 효과
BNZ-γ의 효과를 테스트하기 위해 5마리의 인간화 NSG 마우스에 치료를 시작하기 전(200만 huPBMC 이식 후 약 4주)에 광범위한 탈모와 강한 GvHD가 발생하도록 허용했다. 2주 동안 PEG화된 BNZ-γ(0일, 2 mg/kg)를 주 2회 정맥 내(IV) 사용한 치료를 시작할 때 모든 동물이 매우 아픈 것처럼 보였다. 대조군 PBS로 처리된 동물은 대략 1-2주 이내에 사망했다. 21일까지 BNZ-γ로 처리된 동물은 상당히 체중이 증가했고, 피부가 더 건강해졌으며, 모피가 눈에 띄게 재생되었다. BNZ-γ의 효과는 2주 치료를 완료한 후 약 2주 동안 지속되었으며, BNZ-γ 처리된 동물은 이들 모피의 현저한 재성장이 나타났다(도 10a에 나타낸 결과). 임상 관찰을 뒷받침하기 위해, BNZ-γ는 순환 염증성 사이토카인(IL-6 및 IFNγ)의 수준에서 통계학적으로 유의한 감소하여, 2주의 치료 기간 동안 매주 2회 BNZ-γ 투여 요법 완료 후 NSG 마우스에서 정상 생리학적 범위로 돌아가거나 그 범위를 향하여 갔음을 확인했다.(도 10b 참조).
실시예 18 - 인간화된 NSG 마우스에서 생존, 면역-매개 탈모 및 사이토카인 수준에 대한 BNZ-γ, 항-IL-2 항체, 항-IL-15 항체, 및 항-IL-2 및 항-IL-15 조합 항체 치료의 비교
본 실험에서 NSG 마우스는 연구 0일째에 200만 개의 huPBMC로 이식되었으며, 이식 후 35일째에 치료를 시작하였다. 마우스에는 4주의 치료 기간 동안 35일에 시작하여 PBS 대조군(n=5), 2 mg/kg의 BNZ-γ(n=5), 5 mg/kg의 항-IL-2 항체(n=3), 5 mg/kg의 IL-15 항체(n=3), 또는 각각 5 mg/kg(n=3)으로 항-IL-2 및 항-IL-15 항체 조합을 IV 주사로 매주 2회 처리하였다. PBS 대조군 마우스는 처리 개시 직후 죽기 시작하는 반면, 단일 항체-처리 동물은 처리가 중단된 후 죽기 시작하여 미처리 대조군과 통계적으로 다르지 않았다(p>0.05). 항-IL-2와 항-IL-15 항체의 조합은 단일 항체 치료(p=0.014)와 비교하여 유의하게 더 효과적이었고, 치료 중단 후 몇 주 동안 지속되는 생존 이점이 있었지만 BNZ- γ(p=0.001)보다는 덜 효과적이었다(결과는 도 11a에 나타냄).
이식 후 35일째에 치료를 시작할 때 마우스는 상당한 탈모를 겪었다. 처리가 완료된 후 약 2주(~63일)에 항-IL-15 항체로 처리된 동물에서 모발 재성장이 눈에 띄게 개선되었으며, 이는 항-IL-2에 비해 더 효과적인 것으로 나타났다. 결합 항체 치료는 항-IL-15 항체 단독과 비교하여 모발 재성장에 대해 유의한 차이가 나타나지 않았다. 그러나 BNZ-γ 처리된 마우스는 4가지 처리군 모두에서 모발 재성장 정도가 가장 높은 것으로 나타났으며, 이는 최대 치료 반응을 달성하기 위해 IL-9의 차단이 중요할 수 있음을 시사할 수 있다(결과는 도 11b에 나타냄).
IL-6 및 IFNγ의 수준도 본 실험에서 측정하였다. 두 염증성 사이토카인은 PBS 대조군 NSG 마우스에서 상당한 상승을 보였다. 4가지 모든 활성 치료는 각 사이토카인의 수준을 다양한 정도로 감소시켰으며, BNZ-γ와 결합 항체가 가장 효과적이었다. 이러한 데이터는 IFNγ가 IL-15에 의해 조절되는 다운스트림 사이토카인이며, IL-15 차단이 IFNγ 발현을 차단한다는 이전 보고서와 일치한다(문헌[Fehniger et al. 2000 J. Immunol. 164:1643-7]). 각각 치명적으로 아프기 전에 혈액 샘플이 수집되었는지 보장하기 위해, 항-IL-2 항체 처리군의 동물 1마리(45일째 수집), PBS 대조군 비처리군의 마우스 1마리(45일째 수집), 및 PBS 대조군 비처리군에서 마우스 2마리(40일째 수집)를 제외하고, 사이토카인 수준을 50일째에 수집된 혈청을 사용하여 결정하였다.(도 11c에 나타낸 결과).
실시예 19 - BNZ-γ로 처리된 인간화 NSG 마우스 피부 조직의 면역조직화학
피부 조직 및 모낭 주변의 면역 공격 특성을 특성화하기 위해 인간화된 NSG 마우스의 피부 조직에 대한 면역 조직 화학 연구를 200만 huPBMC 이식 후 3주(pre-BNZ-γ) 및 7주(BNZ-γ 치료 여부에 관계없이) 수행하였다. 조직을 4% 포르말린(Sigma)에서 24시간 동안 고정한 다음 처리하기 전에 적어도 24시간 동안 70% 에탄올로 옮겼다. 그런 다음 조직을 70%, 90% 및 100% 에탄올에서 각각 2시간씩 2회 탈수한 후 파라핀에 포매한 다음 자일렌에서 각각 2시간씩 2회 세척하고, 60C에서 2시간 동안 용융된 파라플라스트 플러스를 2회 침투시켰다. 파라핀 포매된 조직은 절편 및 염색 전에 실온에 보관하였다. 항-인간 CD8 항체(BioCare Medical CRM 311C) 또는 이소형 대조군을 IHC에 대한 표준 절차를 기반으로 하는 조직 염색에 사용했다.
이식 후 3주에 인간화 NSG 마우스의 피부 조직에서 인간 CD8 T 세포의 유입이 관찰되었다. CD8 T 세포는 BNZ-γ 처리 없이 이식 후 7주에 비슷한 수준으로 유지되었다. 그러나 BNZ-γ 처리로 이식 후 7주째에 침윤된 CD8 세포의 수가 현저하게 감소하는 것이 관찰되었다. 데이터는 도 12에 나타냈다.
실시예 20 - 치료 화합물의 투여에 의한 인간 환자의 탈모 치료 방법
탈모증(원형 탈모증, 전체 탈모증, 부분 탈모증, 범탈모증, 확산성 탈모증, 사선형 원형 탈모증)을 앓고 있는 인간 환자를 확인한다. 치료 화합물, 예를 들면, 항-CD8 항체, 항-IL-2 항체, 항-IL-15 항체, 항-NKG2A 항체, 맞춤형 유도체 γc-길항제 펩티드, 예를 들면, BNZ-γ의 서열을 포함하는 복합 펩티드, 이의 유도체, 또는 상기 치료 화합물의 조합의 유효 용량(의사가 결정한 대로)은 의사가 결정한 기간 동안 환차에게 투여된다. 환자의 증상이 호전되거나 질병의 진행이 멈추거나 느려지면 치료가 효과적인 것으로 판단한다.
실시예 21 - 치료 화합물의 투여에 의한 인간 환자의 백반증 치료 방법
백반증(백반증 및 주사비 백반증)으로 고통받는 인간 환자를 확인한다. 치료 화합물, 예를 들면, 항-CD8 항체, 항-IL-2 항체, 항-IL-15 항체, 항-NKG2A 항체, 맞춤형 유도체 γc-길항제 펩티드, 예를 들면, BNZ-γ의 서열을 포함하는 복합 펩티드, 이의 유도체, 또는 상기 치료 화합물의 조합의 유효 용량(의사가 결정한 대로)은 의사가 결정한 기간 동안 환차에게 투여된다. 환자의 증상이 호전되거나 질병의 진행이 멈추거나 느려지면 치료가 효과적인 것으로 판단한다.
실시예 22 - 치료 화합물의 투여에 의한 인간 환자의 건선 치료 방법
건선(건선, 심상성 건선, 두부 건선, 방울 건선, 역성 건선, 건선성 관절염)으로 고통받는 인간 환자를 확인한다. 치료 화합물, 예를 들면, 항-CD8 항체, 항-IL-2 항체, 항-IL-15 항체, 항-NKG2A 항체, 맞춤형 유도체 γc-길항제 펩티드, 예를 들면, BNZ-γ의 서열을 포함하는 복합 펩티드, 이의 유도체, 또는 상기 치료 화합물의 조합의 유효 용량(의사가 결정한 대로)은 의사가 결정한 기간 동안 환차에게 투여된다. 환자의 증상이 호전되거나 질병의 진행이 멈추거나 느려지면 치료가 효과적인 것으로 판단한다.
실시예 23 - 치료 화합물의 투여에 의한 인간 환자의 수포창 치료 방법
수포창(수포창, 심상성 포창, 낙엽성 천포창, 증식성 천포창, 홍반성 천포창)을 앓고 있는 인간 환자를 확인한다. 치료 화합물, 예를 들면, 항-CD8 항체, 항-IL-2 항체, 항-IL-15 항체, 항-NKG2A 항체, 맞춤형 유도체 γc-길항제 펩티드, 예를 들면, BNZ-γ의 서열을 포함하는 복합 펩티드, 이의 유도체, 또는 상기 치료 화합물의 조합의 유효 용량(의사가 결정한 대로)은 의사가 결정한 기간 동안 환차에게 투여된다. 환자의 증상이 호전되거나 질병의 진행이 멈추거나 느려지면 치료가 효과적인 것으로 판단한다.
실시예 24 - 치료 화합물의 투여에 의한 인간 환자의 천포창을 치료하는 방법
천포창(점막 천포창, 흉터성 점막 천포창, 수포성 천포창)을 앓고 있는 인간 환자를 확인한다. 치료 화합물, 예를 들면, 항-CD8 항체, 항-IL-2 항체, 항-IL-15 항체, 항-NKG2A 항체, 맞춤형 유도체 γc-길항제 펩티드, 예를 들면, BNZ-γ의 서열을 포함하는 복합 펩티드, 이의 유도체, 또는 상기 치료 화합물의 조합의 유효 용량(의사가 결정한 대로)은 의사가 결정한 기간 동안 환차에게 투여된다. 환자의 증상이 호전되거나 질병의 진행이 멈추거나 느려지면 치료가 효과적인 것으로 판단한다.
실시예 25 - 치료 화합물의 투여에 의한 인간 환자에서 GvHD를 치료하는 방법
GvHD로 고통받는 인간 환자를 확인한다. 치료 화합물, 예를 들면, 항-CD8 항체, 항-IL-2 항체, 항-IL-15 항체, 항-NKG2A 항체, 맞춤형 유도체 γc-길항제 펩티드, 예를 들면, BNZ-γ의 서열을 포함하는 복합 펩티드, 이의 유도체, 또는 상기 치료 화합물의 조합의 유효 용량(의사가 결정한 대로)은 의사가 결정한 기간 동안 환차에게 투여된다. 환자의 증상이 호전되거나 질병의 진행이 멈추거나 느려지면 치료가 효과적인 것으로 판단한다.
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본 명세서에 개시된 모든 참조문헌은 그 전문이 참고로서 본원에 통합된다.
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Claims (49)

  1. 조성물로서:
    하나 이상의 γc-사이토카인 패밀리 구성원에 의한 신호전달을 조절함으로써 하나 이상의 탈모 관련 문제증상(alopecia related disorder)을 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방하기에 충분한 양의 치료 화합물; 및
    약학적으로 허용 가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)를 포함하는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 탈모 관련 문제증상은 탈모증(alopecia), 수포창(pemphigus), 천포창(pemphigoid), 건선(psoriasis), 백반증(vitiligo), 이식편대숙주질환(graft-versus-host disease), 및 면역-매개 탈모(immune-mediated hair loss)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 γc-사이토카인 패밀리 구성원은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 치료 화합물은 γc-사이토카인 길항제 펩티드, γc-사이토카인 길항제 펩티드 유도체, 항-CD8 항체, 항-IL-2 항체, 항-IL-15 항체, 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 조합 중 적어도 하나인, 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 γc-사이토카인 길항제 펩티드는 적어도 2개의 γc-사이토카인 패밀리 구성원 각각의 γc-박스 D-나선 영역의 부분 서열을 포함하는, 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 부분 서열은 적어도 2개의 γc-사이토카인 패밀리 구성원 각각의 γc-박스 D-나선 영역의 적어도 5개의 아미노산의 연속 블록을 포함하는, 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 부분 서열은 적어도 2개의 γc-사이토카인 패밀리 구성원 각각의 γc-박스 D-나선 영역의 1-10개의 아미노산의 연속 블록을 포함하는, 조성물.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 2개의 γc-사이토카인 패밀리 구성원 각각의 γc-박스 D-나선 영역은 IL-15, IL-2, IL-21, IL-4, IL-9 및 IL-7로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  9. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 γc-사이토카인 길항제 펩티드는 11 내지 50개의 아미노산을 포함하는, 조성물.
  10. 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 γc-사이토카인 길항제 펩티드는 N-말단, C-말단, 측면 잔기, 또는 이들의 조합에 접합체(conjugate)를 추가로 포함하는, 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 접합체는 소 혈청 알부민(BSA), 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), IgG의 Fc 영역, 스캐폴드로서 기능하는 생물학적 단백질, 세포-특이적 항원에 대한 항체, 수용체, 리간드, 금속 이온, 및 폴리 에틸렌 글리콜(PEG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 모이어티를 포함하는, 조성물.
  12. 제4항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 γc-사이토카인 길항제 펩티드는 단일 펩티드를 추가로 포함하는, 조성물.
  13. 제4항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 γc-사이토카인 길항제 펩티드는 아미노산 서열 D/E-F-L-E/Q/N-S/R-X-I/K-X-L/I-X-Q(서열 번호: 2)를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산을 나타내는, 조성물.
  14. 제4항에 있어서, 상기 γc-사이토카인 길항제 펩티드 유도체는 서열 번호: 2의 펩티드와 적어도 약 50%의 동일성을 공유하는, 조성물.
  15. 제4항에 있어서, 상기 γc-사이토카인 길항제 펩티드 유도체는 서열 번호: 2의 펩티드와 적어도 약 90%의 동일성을 공유하는, 조성물.
  16. 제4항에 있어서, 상기 γc-사이토카인 길항제 펩티드 유도체는 서열 번호: 2의 펩티드와 적어도 약 95%의 동일성을 공유하는, 조성물.
  17. 제4항에 있어서, 상기 γc-사이토카인 길항제 펩티드는 서열 번호: 1(BNZ-γ)의 서열을 포함하는, 조성물.
  18. 제4항에 있어서, 상기 γc-사이토카인 길항제 펩티드는 서열 번호: 1의 서열로 구성되는, 조성물.
  19. 제4항에 있어서, 상기 γc-사이토카인 길항제 펩티드 및 상기 γc-길항제 펩티드 유도체는 유사한 물리-화학적 특성을 갖지만, 별개의 생물학적 활성을 갖는, 조성물.
  20. 제4항에 있어서, 상기 γc-사이토카인 길항제 펩티드 유도체는 서열 번호: 1의 펩티드와 적어도 약 50%의 동일성을 공유하는, 조성물.
  21. 제4항에 있어서, 상기 γc-사이토카인 길항제 펩티드 유도체는 서열 번호: 1의 펩티드와 적어도 약 90%의 동일성을 공유하는, 조성물.
  22. 제4항에 있어서, 상기 γc-사이토카인 길항제 펩티드 유도체는 서열 번호: 1의 펩티드와 적어도 약 95%의 동일성을 공유하는, 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 국소(topical), 경구(oral) 및/또는 비경구(parenteral) 전달을 위해 제형화되는, 조성물.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 국소 전달을 위해 제형화되는, 조성물.
  25. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 경구 전달을 위해 제형화되는, 조성물.
  26. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 비경구 전달을 위해 제형화되는, 조성물.
  27. 하나 이상의 탈모 관련 문제증상의 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방을 위한 방법으로서, 상기 방법은:
    제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계, 및
    상기 하나 이상의 탈모 관련 문제증상을 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 하나 이상의 탈모 관련 문제증상은 탈모증, 수포창, 천포창, 건선, 백반증, 이식편대숙주질환, 및 면역-매개 탈모로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  29. 하나 이상의 탈모 관련 문제증상을 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방하는, 하나 이상의 γc-사이토카인 패밀리 구성원에 의한 신호전달을 조절 및/또는 차단하도록 구성된 γc 사이토카인 길항제 펩티드 및/또는 이의 유도체를 설계하는 방법으로서, 상기 방법은:
    컴퓨터를 사용하여 아미노산 서열 데이터베이스로부터 하나 이상의 γc-사이토카인 패밀리 구성원의 아미노산 서열을 얻는 단계,
    하나 이상의 γc-사이토카인 패밀리 구성원의 서열을 기초로 γc-사이토카인 길항제 펩티드 및/또는 이의 유도체를 어셈블링하는 단계를 포함하며,
    상기 γc-사이토카인 길항제 펩티드 및/또는 이의 유도체는 상기 하나 이상의 γc-사이토카인 패밀리 구성원에 의한 신호전달을 조절 및/또는 차단하는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 하나 이상의 γc-사이토카인 패밀리 구성원은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  31. 제29항에 있어서, 상기γc-사이토카인 길항제 펩티드는 적어도 2개의 γc-사이토카인 패밀리 구성원 각각의 γc-박스 D-나선 영역의 부분 서열을 포함하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 서열은 적어도 2개의 γc-사이토카인 패밀리 구성원 각각의 γc-박스 D-나선 영역의 적어도 5개의 아미노산의 연속 블록을 포함하는, 방법.
  33. 제31항에 있어서, 상기 서열은 적어도 2개의 γc-사이토카인 패밀리 구성원 각각의 γc-박스 D-나선 영역의 1-10개의 아미노산의 연속 블록을 포함하는, 방법.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 2개의 γc-사이토카인 패밀리 구성원 각각의 γc-박스 D-나선 영역은 IL-15, IL-2, IL-21, IL-4, IL-9 및 IL-7로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  35. 제29항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 γc-사이토카인 길항제 펩티드는 11 내지 50개의 아미노산을 포함하는, 방법.
  36. 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 γc-사이토카인 길항제 펩티드는 N-말단, C-말단, 측면 잔기, 또는 이들의 조합에 접합체를 추가로 포함하는, 방법.
  37. 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 γc-사이토카인 길항제 펩티드는 단일 펩티드를 추가로 포함하는, 방법.
  38. 제29항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 γc-사이토카인 길항제 펩티드는 아미노산 서열 D/E-F-L-E/Q/N-S/R-X-I/K-X-L/I-X-Q(서열 번호: 2)를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산을 나타내는, 방법.
  39. 제29항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 γc-사이토카인 길항제 펩티드 유도체는 서열 번호: 2의 펩티드와 적어도 약 50%의 동일성을 공유하는, 방법.
  40. 제29항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 γc-사이토카인 길항제 펩티드 유도체는 서열 번호: 2의 펩티드와 적어도 약 90%의 동일성을 공유하는, 방법.
  41. 제29항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 γc-사이토카인 길항제 펩티드 유도체는 서열 번호: 2의 펩티드와 적어도 약 95%의 동일성을 공유하는, 방법.
  42. 제29항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 γc-사이토카인 길항제 펩티드는 서열 번호: 1(BNZ-γ)의 서열을 포함하는, 방법.
  43. 제29항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 γc-사이토카인 길항제 펩티드는 서열 번호: 1의 서열로 구성되는, 방법.
  44. 제29항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 γc-사이토카인 길항제 펩티드 유도체는 서열 번호: 1의 펩티드와 적어도 약 50%의 동일성을 공유하는, 방법.
  45. 제29항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 γc-사이토카인 길항제 펩티드 유도체는 서열 번호: 1의 펩티드와 적어도 약 90%의 동일성을 공유하는, 방법.
  46. 제29항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 γc-사이토카인 길항제 펩티드 유도체는 서열 번호: 1의 펩티드와 적어도 약 95%의 동일성을 공유하는, 방법.
  47. 제29항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 γc-사이토카인 길항제 펩티드 및 이의 유도체는 유사한 물리-화학적 특성을 갖지만, 별개의 생물학적 활성을 갖는, 방법.
  48. 하나 이상의 탈모 관련 문제증상을 억제, 개선, 상기 문제증상의 중증도 감소, 치료, 이의 발병 지연 또는 예방하는 키트로서:
    제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는, 키트.
  49. 제48항에 있어서, 상기 하나 이상의 탈모 관련 문제증상은 탈모증, 수포창, 천포창, 건선, 백반증, 이식편대숙주질환, 및 면역-매개 탈모로 이루어진 군으로부터 선택되는, 키트.
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