KR20220004462A

KR20220004462A - 코로나19 바이러스에 특이적으로 결합하는 dna 압타머 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20220004462A
Application number: KR1020200082319A
Authority: KR
Inventors: 김민곤; 강주영; 박진주; 염규호
Original assignee: (주)에스비바이오사이언스
Priority date: 2020-07-03
Filing date: 2020-07-03
Publication date: 2022-01-11
Also published as: WO2022005048A1

Abstract

본 발명은 코로나19 바이러스에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머 및 이의 용도에 관한 것으로서, 본 발명의 변형된 SELEX(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment) 방법에 의해 선별된 압타머는 코로나19 바이러스 핵 단백질에 항체가 결합되는 부분과 다른 부위에 결합되기 때문에, 샌드위치 형태의 바이오센서와 같은 다양한 분야에 적용 가능하다. 나아가, 이와 같은 압타머는 기존의 항체를 포함하는 제제와 비교하여 안정성 및 민감도가 매우 우수할 뿐만 아니라, 화학적 합성 방법으로 단시간에 적은 비용으로 대량 생산이 가능하고, 결합력을 높이기 위해 다양한 변형이 용이하다는 장점이 존재한다.

Description

코로나19 바이러스에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머 및 이의 용도{A DNA APTAMER SPECIFICALLY BIDING TO COVID-19 VIRUS AND USES THEREOF}

본 발명은 코로나19 바이러스, 구체적으로 코로나19 바이러스 핵 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머 및 이의 용도에 관한 것이다.

2019년 12월에 중국 후베이성 우한시에서 바이러스 폐렴 양상의 원인미상 폐렴이 무리 지어 발생하기 시작하였다. 환자의 대부분이 화난 수산 시장을 방문한 이력이 있었고, 중국 당국은 2019년 12월 31일에 원인 미상의 폐렴이 우한시에서 유행하고 있다고 공식 발표하였다. 2020년 1월 7일에 중국 질병예방통제센터는 이 폐렴 환자들로부터 이전에 알려지지 않은 새로운 코로나바이러스를 검출하였고, 1월 11일에 새로운 코로나바이러스의 유전 정보를 전 세계에 공개하였다. 이 바이러스는 severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)로 명명되었으며, 세계보건기구는 이에 의한 질병을 2019년에 발생한 코로나바이러스가 일으키는 질병을 뜻하는 코로나바이러스감염증-19(coronavirus disease 2019, COVID-19)로 명명하였다.

코로나바이러스감염증-19는 감염자의 비말(침방울)이 호흡기나 눈·코·입의 점막으로 침투될 때 전염된다. 감염되면 약 2~14일(추정)의 잠복기를 거친 뒤 발열(37.5도) 및 기침이나 호흡곤란 등 호흡기 증상, 폐렴이 주증상으로 나타나지만 무증상 감염 사례도 드물게 나오고 있다.

신종 코로나바이러스인 코로나바이러스감염증-19는 현재까지 백신이 없기 때문에 예방 혹은 적절한 치료를 위해 초기 단계에서의 진단이 매우 중요하다.

신종코로나 바이러스에는 RNA를 감싸는 뉴클레오캡시드 단백질(Nucleocapsid Protein, NP)이 다수 존재하고, 뉴클레오캡시드 단백질은 바이러스에 다수 존재하며 상대적으로 돌연변이 확률이 적다. 따라서 바이러스 매개 질환 진단 시, 뉴클레오캡시드 단백질을 검출함으로써 높은 민감도 실현 가능하다. 비슷한 유형의 RNA 바이러스인 인플루엔자 바이러스의 경우, 바이러스 돌연변이로 인해 새로운 종이 나오더라도 뉴클레오캡시드 단백질의 구조 및 서열은 크게 다르지 않음이 밝혀졌다.

따라서, 최근 COVID-19를 진단하기 위해 다양한 업체 및 국가에서 뉴클레오캡시드 단백질를 바이오마커로 검출하는 LFA 키트를 개발하고 있는 실정이다.

현재의 COVID-19 진단법은 검체에서 바이러스를 분리하고, 검체에서 특이 유전자를 Real-time PCR을 통하여 검출하는 방법이 주로 사용되고 있으며, 이는 무증상 감염자의 경우 진단 검사를 받기 어렵다는 점과, 초기 감염 단계인 환자의 경우 바이러스 분리가 어렵다는 단점이 있다.

상기 방법 이외에 유전자 검출법, 효소면역측정법, 간접면역항체검출법 등이 사용되고 있으나, 위 진단법들의 경우 바이러스 돌연변이에 취약하며, 다시 개발하게 될 경우 항체 생성 기간 및 스크리닝 과정이 필요하기 때문에 긴 시간이 소요되며, 현재까지 바이러스에 의한 면역반응으로 항체가 생성된다는 연구결과는 신뢰성이 부족하다는 단점이 존재한다.

현재 시판되는 대부분의 제품들은 타겟 특이적인 항체를 이용, 항체 개발 과정이 따로 필요하다. 그러나 항체 개발은 주로 동물실험에 의해 이루어지며 많은 시간과 비용이 소요된다. 이에 따라, 항체의 단점을 보완할 수 있는 '바이오리셉터'로서 압타머를 이용한 진단법들이 많이 연구되고 있다.

대한민국 등록특허 제10-2113078호

본 발명은 신종코로나바이러스인 코로나19에 존재하는 다수의 뉴클레오캡시도 단백질과 높은 친화성으로 상호작용하는 압타머를 개시하며, 상기 압타머를 이용하는 코로나19 바이러스 검출용 키트, 코로나19 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에서는 압타머를 제공한다.

본 발명의 상기 압타머는 코로나19 바이러스의 핵 단백질의 핵 단백질에 특이적으로 결합하고, 76개의 염기서열을 포함한다.

본 발명의 상기 "압타머"란, 종래의 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 짝짓기 이외의 상호작용을 통해, 단일 클론 항체와 필적하는, 높은 특이성 및 친화도를 가지는 분자 표적에 결합하게 하는, 특이적 3차 구조를 채택한 단일 가닥 핵산 사슬을 의미한다. 상기 압타머는 핵산인 DNA 또는 RNA일 수 있고, 바람직하게는 단일 가닥 DNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 압타머가 RNA인 경우에는, T7 RNA 중합효소 또는 변형된 T7 RNA 중합효소를 이용하여 DNA 라이브러리를 시험관 내(In vitro)에서 전사시킴으로써 생산할 수 있다.

본 발명의 "핵산"이란, 임의의 유형의 핵산, 예컨대 DNA 및 RNA, 및 이의 변이체, 예컨대 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid: PNA), 잠긴 핵산(locked nucleic acid: LNA), 및 이들의 조합, 이들의 변형, 예컨대 변형 뉴클레오타이드 등을 의미한다. 용어 "핵산" 및 "올리고뉴클레오타이드" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 상호교환되어 사용된다. 상기 핵산은 재조합 발현 시스템을 사용하여 제조되고, 임의로, 정제된, 화학적으로 합성된 기타 등등의 천연 소스로부터 정제될 수 있다. 화학적으로 합성된 분자의 경우에, 핵산은 뉴클레오사이드 유사체, 예컨대 화학적으로 변형된 염기 또는 당, 골격의 변형 등을 가지는 유사체를 포함할 수 있다. 핵산의 염기서열은 달리 표시되지 않은 한 5'-3' 방향으로 표시된다.

본 발명의 상기 코로나19 바이러스는 유전물질인 RNA를 감싸는 핵산 단백질(Nucleocapsid Protein; NP)가 다수 존재한다. 상기 핵산 단백질은 상대적으로 돌연변이 확률이 적고, 바이러스가 변종되는 경우에도 그 구조 및 서열의 변화가 적기 때문에, 이와 같은 핵산 단백질을 특이적으로 검출함으로써 민감도 및 특이성을 현저하게 높일 수 있다.

본 발명의 상기 코로나19 바이러스의 핵산 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 압타머는 하기 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다. 하기 서열번호 2의 염기서열에서, N은 40개의 정수인 염기서열이고, 상기 염기는 A(아데닌), C(시토신), G(구아닌), 우라실(U) 및 T(티민)으로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다:

5'-ATC CAG AGT GAC GCA GCA -[NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN]- TG GAC ACG GTG GCT TAG T-3'(서열번호 2)

본 발명의 상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서, 상기 N은 하기 서열번호 3일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:

AACCCAAGCAAACTACCTCTATACCCTTCGACCTTCATCA (서열번호 3)

바람직하게는 본 발명의 상기 압타머는 하기 서열번호 4로 표시될 수 있다:

5'-ATC CAG AGT GAC GCA GCA AAC CCA AGC AAA CTA CCT CTA TAC CCT TCG ACC TTC ATC ATG GAC ACG GTG GCT TAG T-3'(서열번호 2)

본 발명의 상기 압타머의 3' 말단 또는 5' 말단에 검출 가능한 표지가 결합할 수 있다. 이와 같은 검출 가능한 표지는 당업계에 알려진 검출 방법에 의해 검출될 수 있는 모이어티로서, 통상의 방법에 따라 압타머의 특정 염기, 특정 구조에 결합될 수 있다.

본 발명의 상기 검출 가능한 표지는 예를 들면, 광학적 표지, 전기화학적 표지, 방사성 동위원소로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 표지일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 광학적 표지는 형광 물질 또는 효소일 수 있다.

본 발명의 상기 형광 물질은 플로로세인(fluorescein), 비오틴(Biotin), 6-FAM, 로다민, 텍사스 레드(Texas Red), 테트라메틸로다민, 카르복시로다민, 카르복시로타민6G, 카르복시로돌, 카르복 시로다민110, 캐스케이드 블루(Cascade Blue), 캐스케이트 옐로우(Cascade Yellow), 코마린, Cy2(cyanine 2), Cy3(cyanine 3), Cy3.5(cyanine 3.5), Cy5(cyanine 5), Cy5.5(cyanine 5.5), Cy-크롬, 피코에리트린, PerCP(페리디닌 클로로필-a 단백질), PerCP-Cy5.5, JOE(6-카 르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레신), NED, ROX(5-(및-6)-카르복시-X-로다민), HEX, 루시퍼 옐로 우(Lucifer Yellow), 마리나 블루(Marina Blue), 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린 500, 오레곤 그린 514, 알렉사 플로어, 7-아미노-4-메틸코마린-3-아세트산, 보디피(BODIPY) FL, 보디피 FL-Br 2, 보디피 530/550, 이의 콘쥬게이트화물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 효소는 효소결합면역흡착검사(ELISA)에 사용되는 효소일 수 있고, 예를 들면, 알카라인 포스파타제, 홀스레디쉬 페록시다제, 루시퍼라제, 또는 글루코즈 옥시다제일 수 있다. 상기 광학적 표지로 효소를 사용할 경우, 화학 발광 반응을 유도하기 위하여 바람직하게는 화학발광물질로서 루미놀(luminol), 스트렙티비딘(Streptividin), 이소루미놀(isoluminol), 루시퍼린(luciferin), 루시게닌(lucigenin), 3-(2'-Spiroadamantane)-4-methoxy-4-(3''-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxetane(AMPPD), Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2'-(5'-chloro)tricyclo[3.3.1.13,7]decan}-4-yl)phenyl phosphate(CSPD) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 광학적 표지란, 적절한 거리에 의하여 이격되어 있는 형광 도너 발색소 및 형광 수용자 발색소를 포함하고 도너의 형광 발광이 수용자에 의하여 억제되어 있는 형광공명에너지전달(fluorescence resonance energy transfer: FRET) 쌍일 수 있다. 도너 발색소는 FAM, TAMRA, VIC, JOE, Cy3, Cy5 및 Texas Red를 포함할 수 있고, 바람직하게는 FAM일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 방사성 동위원소는 예를 들면, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹¹¹In, ^99mTc, ³²P 및 ³⁵S으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 “특이적으로 결합”이란, 본 발명의 상기 압타머와 그 표적 단백질인 코로나19 바이러스의 핵 단백질 간의 비공유 물리적 결합을 의미한다. 본 발명의 상기 압타머와 상기 표적 단백질 간의 결합 시에, 해리상수(K_d) 값이 0.1 nM 내지 5 nM일 수 있고, 바람직하게는 0.5 nM 내지 4 nM일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 0.5 nM 미만 또는 5 nM 초과의 해리상수를 갖는 경우에는 표적 단백질의 검출하기에 용이하지 않을 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 압타머는 표적 단백질에 항체가 결합하는 부위 이외의 부위에 결합되기 때문에 다양한 형태의 바이오센서에 적용될 수 있다.

본 발명의 압타머는 이종 샌드위치 구조의 면역분석법에서 검출 프로브(probe)로 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 압타머의 서열은 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 용이하게 변형될 수 있다. 따라서, 본 발명의 상기 서열번호 3 내지 서열번호 5와 높은 상동성을 갖는 염기서열, 예를 들면 상동성이 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상인 경우의 염기서열로 본 발명의 염기서열에 모두 포함될 수 있다.

본 발명의 상기 "상동성"이란, 염기서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 염기서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성은 두 서열을 육안으로 비교하여 결정할 수도 있으나, 비교대상이 되는 서열을 나란히 배열하여 상동성 정도를 분석해 주는 생물정보 알고리즘(bioinformatic algorithm)을 사용하여 결정할 수 있다. 상기 두 개의 아미노산 서열 사이의 상동성은 백분율로 표시될 수 있다. 유용한 자동화된 알고리즘은 Wisconsin Genetics Software Package(Genetics Computer Group, Madison, W, USA)의 GAP, BESTFIT, FASTA와 TFASTA 컴퓨터 소프트웨어 모듈에서 이용 가능하다. 상기 모듈에서 자동화된 배열 알고리즘은 Needleman & Wunsch와 Pearson & Lipman과 Smith & Waterman 서열 배열 알고리즘을 포함한다. 다른 유용한 배열에 대한 알고리즘과 상동성 결정은 FASTP, BLAST, BLAST2, PSIBLAST와 CLUSTAL W를 포함하는 소프트웨어에서 자동화될 수 있다.

본 발명의 상기 압타머는 혈청 내 안정성을 증진시키거나 신장 클리어런스(renal clearance)를 조절하기 위하여, 5' 말단, 3' 말단, 중간 또는 양 말단 모두를 변형시킬 수 있다. 상기 변형은 5' 말단, 3' 말단, 그 중간 또는 양 말단에 PEG(polyethylene glycol), idT(inverted deoxythymidine), LNA(Locked Nucleic Acid), 2'-메톡시뉴클레오사이드, 2'-아미노뉴클레오사이드, 2'F-뉴클레오사이드, 아민 링커, 티올 링커, 및 콜레스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나가 결합되어 변형된 것일 수 있다.

본 발명의 상기 “idT(inverted deoxythymidine)”란, 일반적으로 뉴클레아제에 대한 내성이 약한 압타머의 뉴클레아제에 의한 분해를 막기 위하여 사용되는 분자 중 하나로서, 핵산 단위체는 앞 단위체의 3'-OH와 다음 단위체의 5'-0H와 결합하여 사슬을 이루지만 idT는 앞 단위체의 3'-OH에 다음 단위체의 3'-OH를 결합하여 3'-OH가 아닌 5'-OH가 노출이 되도록 인위적인 변화를 가함으로써 뉴클레아제의 일종인 3' 엑소뉴클레아제(3' exonuclease)에 의한 분해를 억제하는 효과를 일으키는 분자이다.

본 발명의 다른 구현 예에서는 코로나19 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 검출용 조성물은 본 발명에 따른 상기 압타머를 포함한다.

본 발명의 검출용 조성물에서, 압타머와 관련된 내용은 상기 압타머에 기재된 바와 동일하여 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략한다.

본 발명의 상기 조성물에 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 비정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예에서는 코로나19 바이러스 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 상기 키트는 상기 검출용 조성물을 포함한다.

본 발명의 상기 키트에서, 압타머 및 조성물에 관련된 내용은 상기 압타머 및 조성물에 기재된 바와 동일하여 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략한다.

본 발명의 상기 키트는 본 발명에 따른 상기 압타머가 고정화되어 있는 기판을 포함하는, 예를 들면 어레이 형태일 수 있다.

본 발명의 상기 “어레이”는 복수 개의 특정 분자가 기판상의 일정 부분에 고정화되어 있는 것으로서, 상기 어레이는 기판 및 상기 기판에 형성된 압타머를 포함하는 고정화 영역을 포함할 수 있다. 상기 압타머는 상기 고정화 영역 내에 공유적으로 부착된 것일 수 있다. 상기 압타머는 공유적으로 부착시킬 수 있는 관능기를 갖는 복수의 화합물을 더 포함할 수 있다. 상기 관능기는 상기 압타머를 부착할 수 있도록 하는 것이라면 제한되지 아니하고 모두 사용될 수 있고, 예를 들면, 알데히드, 에폭시, 카르복시 또는 아민기가 될 수 있으며, 상기 화합물은 말단에 알데히드, 에폭시, 카르복시 또는 아민기를 갖는 실록산이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 기판의 재질은 예를 들면, 유리, 실리콘, 폴리프로필렌 및 폴리에틸렌과 같은 물질이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현 예에서는 코로나19 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 방법은 본 발명의 상기 검출용 조성물과 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료를 배양하는 단계; 및 상기 검출용 조성물과 코로나19 바이러스의 핵 단백질의 결합 정도를 확인하는 단계;를 포함한다.

본 발명의 상기 검출용 조성물과 중증열성혈소판감수증후군 바이러스의 핵 단백질의 결합 정도가 정상 대조군에 비하여 높은 경우, 코로나19 바이러스에 감염된 것으로 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 검출하는 방법에서, 압타머 및 조성물에 관련된 내용은 상기 압타머 및 조성물에 기재된 바와 동일하여 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략한다.

본 발명의 상기 생물학적 시료는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 예를 들면, 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma) 및 혈청(serum)을 포함하는) 혈액, 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 골반 내 유체액(pelvic fluids), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 압타머는 코로나19 바이러스 핵 단백질에 항체가 결합되는 부분 이외의 다른 부위에 결합되기 때문에, 샌드위치 형태의 바이오센서와 같은 다양한 분야에 적용 가능하다. 나아가, 이와 같은 압타머는 기존의 항체를 포함하는 제제와 비교하여 안정성 및 민감도가 매우 우수할 뿐만 아니라, 화학적 합성 방법으로 단시간에 적은 비용으로 대량 생산이 가능하고, 결합력을 높이기 위해 다양한 변형이 용이하다는 장점이 존재한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 변형된 SELEX 방법의 각 단계의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 변형된 SELEX 방법에 따라 선별된 압타머의 표적 결합력을 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<준비예 1> 단일 가닥 DNA 압타머(ssDNA) 라이브러리 디자인

압타머의 선별 방법에서, 초기 라운드에서는 무작위로 40개의 염기 서열에 해당하는 핵심 서열을 포함하고 있는 ssDNA 올리고 뉴클레오티드 라이브러리(서열번호 2: 5'- ATC CAG AGT GAC GCA GCA [핵심서열; (N X 40)] TG GAC ACG GTG GCT TAG T -3')를 사용하였다. 본 연구에서 사용된 모든 올리고뉴클레오티드는 Integrated DNA Technologies Inc. (Coralville, IA, USA)로부터 구입하였다. 이때, 상기 ssDNA 라이브러리를 결합 완충액 (50 mM 트리스-염산, pH 7.4, 100 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂)에 넣고, 90℃에서 5 분간 가열함으로써 변성시킨 뒤, 0.01 % Tween 20으로 세척하고, 바로 얼음상에서 10분 동안 냉각시키는 과정을 수행한 뒤에 사용하였다.

<준비예 2> 코로나19 바이러스 핵 단백질

코로나19 바이러스 핵 단백질(서열번호 1)은 Sino Biological(Cat.no: 40588-V08B)에서 구매하였다.

[서열번호 1]

MSDNGPQNQR NAPRITFGGP SDSTGSNQNG ERSGARSKQR RPQGLPNNTA SWFTALTQHG KEDLKFPRGQ GVPINTNSSP DDQIGYYRRA TRRIRGGDGK MKDLSPRWYF YYLGTGPEAG LPYGANKDGI IWVATEGALN TPKDHIGTRN PANNAAIVLQ LPQGTTLPKG FYAEGSRGGS QASSRSSSRS RNSSRNSTPG SSRGTSPARM AGNGGDAALA LLLLDRLNQL ESKMSGKGQQ QQGQTVTKKS AAEASKKPRQ KRTATKAYNV TQAFGRRGPE QTQGNFGDQE LIRQGTDYKH WPQIAQFAPS ASAFFGMSRI GMEVTPSGTW LTYTGAIKLD DKDPNFKDQV ILLNKHIDAY KTFPPTEPKK DKKKKADETQ ALPQRQKKQQ TVTLLPAADL DDFSKQLQQS MSSADSTQA

<실시예 1> 압타머의 선별

(1) 압타머의 선별 방법의 각 단계

도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명의 압타머의 선별 방법을 수행하여, 코로나19 바이러스에 특이적으로 결합할 수 있는 압타머를 선별하였다. 구체적으로, 변형된 압타머의 선별 방법은 다음과 같다.

1) 항체 고정화 및 차단 단계

항체 고정화 단계: 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 항체를 pH 9.5, 0.1M 카르보네이트 완충액(carbonate buffer)에 희석한 뒤에 96웰 플레이트에 넣고 4℃에서 밤새도록 반응시켜, 상기 항체를 96웰 플레이트에 코팅시켰다.

차단 단계; 이후, 코팅된 플레이트에 200 ㎕의 세척 완충액(0.01%의 트윈(Tween)이 포함된 PBS(Potassium phosphate buffer)을 넣고 세척하였다. 상기 세척이 완료된 플레이트에 1% BSA(Bovine serum albumin)을 넣고 실온에서 1시간 동안 반응시킴으로써, ssDNA가 항체와 결합하여 나타날 수 있는 비 특이적인 결합 반응을 차단하였다.

1-1) 회수 단계;

상기 1) 단계에서, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 이외의 단백질과 ssDNA 간의 비특이적인 결합 가능성을 줄이기 위하여, 상기 ssDNA 라이브러리가 포함된 완충액을 상기 BSA를 이용하여 차단된 플레이트에 넣고 30분 동안 배양한 뒤, 항체와 결합되지 않은 ssDNA 라이브러리만이 포함된 상등액(이하, '상등액'이라 함)을 얻는 회수 단계를 추가적으로 수행하였다.

2) 제1 반응 단계; 항원-항체 반응

상기 1) 단계에서 항체 고정화 및 차단이 완료된 플레이트에 1 ㎍/mL의 농도로 PBS에 희석된 상기 실시예 1의 단백질 넣고 실온에서 2시간 동안 배양하였다.

3) 제2 반응 단계; ssDNA 라이브러리와 결합 단계

상기 제1 반응 단계가 완료된 플레이트에 상기 1-1)의 상등액을 넣고 실온에서 1시간 동안 반응시킨 뒤에 200 ㎕의 세척 완충액을 이용하여 5회 세척하였다.

4) 제1 용출 단계; ssDNA 용출 및 증폭 단계

상기 2) 단계에서 세척이 완료된 플레이트에 결합 완충액을 첨가하고, 80℃에서 10분 동안 반응시켜 상기 실시예 1의 단백질에 결합된 ssDNA를 용출시켰다.

5) 증폭 단계; 제2-1 반응 단계; 및 제2 용출 단계

상기 4) 제1 용출 단계의 상기 ssDNA 용출액을 PCR 정제 키트를 사용하여 제조사에서 제공하는 방법에 따라 정제한 뒤, 정제된 ssDNA를 30 ㎕의 멸균수에 용해시켰다. 상기 정제된 ssDNA에 1 μM의 프라이머쌍, 2.5 mM dNTP 혼합물 및 1.2 U의 Pfu 폴리머라제를 혼합하여 최종 볼륨이 50 ㎕가 되도록 한 뒤에 중합효소연쇄반응을 수행하여 증폭된 ssDNA를 수득하였다. 이때, 중합효소연쇄반응의 경우, 95℃에서 5분; 95℃에서 30초; 57℃에서 20초; 72℃에서 20초의 조건으로 25 사이클만큼 수행하였으며, 마지막 연장은 72℃에서 5분의 조건으로 수행하였다.

그런 다음, 상기 증폭된 ssDNA를 상기 '3) 제2 반응 단계'와 동일한 방법으로 제2-1 반응 단계를 수행하고, 상기 '4) 제1 용출 단계'와 동일한 방법으로 제2 용출 단계를 수행하였으며, 상기 증폭 단계; 제2-1 반응 단계 및 제2 용출 단계는 최소 10번 이상 진행하였다. 이와 같은 과정을 통해 최종적으로 3개의 ssDNA 서열을 선별하였다.

(2) ssDNA 서열 분석

상기 방법에 의하여 선별된 7종의 상기 ssDNA 서열을 상기 방법과 동일한 중합효소연쇄반응을 통해 증폭시킨 뒤, 증폭된 산물을 pETHis6 TEVLIC 클로닝 벡터(Addgene, 미국)에 각각 삽입하였다. 이후, 상기 벡터를 E. Coli DH5α에 형질전환시킨 뒤, 형질전환체로부터 증폭된 플라스미드를 분리하여 DNA 서열 분석을 수행하였다. 여기서, DNA 서열 분석을 마크로젠(한국)에서 수행하였으며, ssDNA인 압타머의 2차 구조를 Zuker 알고리즘에 기초한 Mfold 프로그램을 사용하여 예측하였다.

그 결과 선별된 압타머는 서열번호 2의 5'- ATC CAG AGT GAC GCA GCA -[핵심 서열; (N X 40)]- TG GAC ACG GTG GCT TAG T -3'의 염기서열을 가지며, 핵심 서열은 하기 [표 1]에 기재된 것과 같았다.

서열번호	핵심 서열
서열번호 3	AACCCAAGCAAACTACCTCTATACCCTTCGACCTTCATCA

< 실시예 2> 선별된 압타머의 표적 결합력 확인

Direct ELONA를 수행하여 상기 압타머와 표적 간의 결합력을 확인하였다. 96 웰 플레이트에 2 ug/mL (45 nM) 의 NP를 코팅한 후, 상기 실시예 1의 압타머의 5' 끝단에 biotin을 라벨링한 각 후보군들을 0 내지 1000 nM의 농도로 플레이트에 넣고 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 이후, 1 ug/mL의 STA-HRP를 넣고 30분간 반응시킨 뒤 TMB substrate를 추가하여 20분 뒤 650 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다 (Cytation 5.0 Plate Reader, Biotek / Gen5 버전 2.09.1). y축의 흡광도 값은 농도가 증가되는 x축에 대해 플롯팅 한 뒤에 포화 원-사이트 (saturation one-site) 피팅 모델을 이용하여 해리 상수(K_d)를 측정하고, 그 결과를 [표 2] 및 도 2에 나타내었다.

	K_d value (nM)	Std.Error
압타머	2.324	0.47

상기 결과를 통해 본 발명에 따라 선별된 압타머는 2.324 nM의 해리 상수를 나타내므로, 코로나19 바이러스 핵 단백질에 대하여 상기 압타머의 결합 친화도가 매우 우수한 것을 알 수 있다.

<110> Gwangju Institute of Science and Technology <120> A DNA APTAMER SPECIFICALLY BIDING TO COVID-19 VIRUS AND USES THEREOF <130> GPn-0022 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 419 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> COVID-19 VIRUS NP <400> 1 Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr 1 5 10 15 Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg 20 25 30 Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn 35 40 45 Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu 50 55 60 Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro 65 70 75 80 Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly 85 90 95 Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr 100 105 110 Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp 115 120 125 Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp 130 135 140 His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln 145 150 155 160 Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser 165 170 175 Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn 180 185 190 Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala 195 200 205 Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu 210 215 220 Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln 225 230 235 240 Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys 245 250 255 Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln 260 265 270 Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp 275 280 285 Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile 290 295 300 Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile 305 310 315 320 Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala 325 330 335 Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu 340 345 350 Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro 355 360 365 Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln 370 375 380 Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu 385 390 395 400 Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser 405 410 415 Thr Gln Ala <210> 2 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Nucleic acid construct) <220> <221> misc_feature <222> (19)..(58) <223> each n is A, T, U, G or C <400> 2 atccagagtg acgcagcann nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnntg 60 gacacggtgg cttagt 76 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APTAMER CORE SEQUENCE <400> 3 aacccaagca aactacctct atacccttcg accttcatca 40 <210> 4 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COVID-19 VIRUS NP APTAMER FULL SEQUENCE <400> 4 atccagagtg acgcagcaaa cccaagcaaa ctacctctat acccttcgac cttcatcatg 60 gacacggtgg cttagt 76

Claims

코로나19 바이러스의 핵 단백질에 특이적으로 결합하고,
하기 서열번호 2의 염기서열로 이루어지며,
5＇-ATC CAG AGT GAC GCA GCA - [N]₄₀- TG GAC ACG GTG GCT TAG T- 3＇ (서열번호 2)
상기 N은 하기 서열번호 3으로 이루어진 압타머,
AACCCAAGCAAACTACCTCTATACCCTTCGACCTTCATCA (서열번호 3).
제1항에 있어서,
상기 코로나19 바이러스의 핵 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 압타머.
제1항에 있어서,
상기 압타머의 3' 말단 또는 5' 말단에 검출 가능한 표지가 결합된 압타머.
제3항에 있어서,
상기 검출 가능한 표지는 광학적 표지, 전기화학적 표지, 방사성 동위원소로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 압타머.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 압타머를 포함하는 코로나19 바이러스 검출용 조성물.
제5항의 검출용 조성물을 포함하는 코로나19 바이러스 검출용 키트.
제5항의 검출용 조성물과 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료를 배양하는 단계; 및
상기 검출용 조성물과 코로나19 바이러스의 핵 단백질의 결합 정도를 확인하는 단계;를 포함하는 코로나19 바이러스를 검출하는 방법.
제7항에 있어서,
상기 검출용 조성물과 코로나19 바이러스의 핵 단백질의 결합 정도가 정상 대조군에 비하여 높은 경우, 코로나19 바이러스에 감염된 것으로 확인하는 단계를 더 포함하는, 코로나19 바이러스를 검출하는 방법.