KR20210153100A - 낮은 pH에서의 결합에 대한 증진된 특이성을 갖는 이필리무맙 변이체 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 낮은 pH에서 CTLA-4에 우선적으로 결합하는 항-CTLA-4 항체, 예컨대 이필리무맙의 변이체 형태를 제공한다. 이러한 항체 변이체는 종양 미세환경에서의 우선적 활성, 부작용 대비 항종양 반응의 증진된 비 및 증진된 치료 지수를 나타낸다.

Description

낮은 pH에서의 결합에 대한 증진된 특이성을 갖는 이필리무맙 변이체

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2019년 4월 18일에 출원된 미국 가출원 번호 62/835794를 우선권 주장하며, 이의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.

서열 목록

본원과 함께 전자 제출된 서열 목록은 또한 그 전문이 본원에 참조로 포함된다 (파일명: 20200401_SEQL_13177WOPCT_GB.txt; 생성된 날짜: 2020년 4월 1일; 파일 크기: 79 KB).

면역계는 종양 발생을 제어하고 종양 퇴행을 매개할 수 있다. 이는 종양 항원-특이적 T 세포의 생성 및 활성화를 필요로 한다. 다수의 T-세포 공동-자극 수용체 및 T-세포 음성 조절제 또는 공동-억제 수용체는 T-세포 활성화, 증식 및 이펙터 기능의 획득 또는 상실을 제어하기 위해 협력하여 작용한다. 가장 초기에 가장 잘 특징화된 T-세포 공동-자극 및 공동-억제 분자 중에 CD28 및 CTLA-4가 있다. 문헌 [Rudd et al. (2009) Immunol. Rev. 229:12]. CD28은 항원-제시 세포 상의 B7-1 및 B7-2 리간드에 결합함으로써 T-세포 수용체 결속에 대한 공동-자극 신호를 제공하는 한편, CTLA-4는 T-세포 증식 및 기능을 하향-조절하는 음성 신호를 제공한다. B7-1 (CD80) 및 B7-2 (CD86) 리간드에 또한 결합하지만 CD28보다 더 높은 친화도로 결합하는 CTLA-4는 세포 자율 (또는 내인성) 및 세포 비-자율 (또는 외인성) 경로 둘 다를 통해 T-세포 기능의 음성 조절제로서 작용한다. CD8 및 CD4 T 이펙터 (T_eff) 기능의 내인성 제어는 T-세포 활성화의 결과로서의 CTLA-4의 유도성 표면 발현 및 대향하는 세포 상의 B7 리간드의 다가 결속에 의한 T-세포 증식 및 시토카인 증식의 억제에 의해 매개된다. 문헌 [Peggs et al. (2008) Immunol. Rev. 224:141].

항-CTLA-4 항체는, 가교된 경우에, 시험관내에서 T 세포 기능을 억제한다. 문헌 [Krummel & Allison (1995) J. Exp. Med. 182:459; Walunas et al. (1994) Immunity 1:405]. CTLA-4를 구성적으로 발현하는 조절 T 세포 (T_reg)는 비-세포 자율 방식으로 이펙터 T 세포 (T_eff) 기능을 제어한다. CTLA-4가 결핍된 T_reg는 손상된 억제 능력을 갖고 (Wing et al. (2008) Science 322:271), B7과의 CTLA-4 상호작용을 차단하는 항체는 T_reg 기능을 억제할 수 있다 (Read et al. (2000) J. Exp. Med. 192:295; Quezada et al. (2006) J. Clin. Invest. 116:1935). 보다 최근에, T_eff는 또한 외인성 경로를 통해 T 세포 기능을 제어하는 것으로 제시되었다 (Corse & Allison (2012) J. Immunol. 189:1123; Wang et al. (2012) J. Immunol. 189:1118). T_reg 및 T_eff에 의한 T 세포 기능의 외인성 제어는 항원-제시 세포 상의 B7 리간드를 제거하는 CTLA-4-양성 세포의 능력을 통해 발생하여, 그의 공동-자극 잠재력을 제한한다. 문헌 [Qureshi et al. (2011) Science 332: 600; Onishi et al. (2008) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 105:10113]. 항체가 CTLA-4/B7 상호작용을 차단하는 것은 CTLA-4 결속에 의해 전송되는 음성 신호를 방해함으로써 T_eff 활성화를 촉진하는 것으로 생각되고; 이러한 T-세포 활성화 및 증식의 내인성 제어는 T_eff 및 T_reg 증식 둘 다를 촉진할 수 있다 (Krummel & Allison (1995) J. Exp. Med. 182:459; Quezada et al. (2006) J. Clin. Invest. 116:1935). 동물 모델을 사용한 초기 연구에서, 항체에 의한 CTLA-4 차단은 자가면역을 악화시키는 것으로 제시되었다. 문헌 [Perrin et al. (1996) J. Immunol. 157:1333; Hurwitz et al. (1997) J. Neuroimmunol. 73:57]. 종양 면역으로의 확장에 의해, 확립된 종양의 퇴행을 유발하는 항-CTLA-4의 능력은 CTLA-4 차단의 치료 잠재력의 극적인 예를 제공하였다. 문헌 [Leach et al. (1996) Science 271:1734].

전이성 흑색종의 치료를 위해 최초로 승인된 인간 항-인간 CTLA-4 모노클로날 항체인 이필리무맙은 이후 다른 암에서의 사용을 위해 승인되었고, 또 다른 암에서 임상 시험 중이다. 문헌 [Hoos et al. (2010) Semin. Oncol. 37:533; Hodi et al. (2010) N. Engl. J. Med. 363:711; Pardoll (2012) Nat. Immunol. 13(12): 1129]. 이필리무맙은 대부분의 인간 Fc 수용체에 가장 잘 결합하는 인간 IgG1 이소형을 갖고 (Bruhns et al. (2009) Blood 113:3716), 그가 결합하는 활성화 Fc 수용체의 유형과 관련하여 뮤린 IgG2a와 동등한 것으로 간주되지만, 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 또는 그가 도출하는 다른 이펙터 기능의 정도에서는 반드시 그렇지 않으며, 여기서 인간 IgG1은 마우스에서 IgG2a보다 훨씬 더 적은 ADCC를 유발할 수 있다. IgG1이 인간 NK 세포 및 단핵구에 의해 발현된 활성화 수용체 CD16 (FcγRIIIa)에 결합하기 때문에, 이필리무맙은 ADCC를 매개할 수 있다. IgG1-이소형 이필리무맙은 원래 하이브리도마로부터 직접 단리되었지만, 후속적으로 클로닝되고 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 발현되었다. ADCC 및/또는 CDC를 매개하는 이소형이 T 세포 상의 수용체를 표적화하여 면역 반응을 상향조절하고자 하는 항체에서 바람직하지 않을 수 있다는 고려에도 불구하고, 항체의 IgG1 이소형은, 부분적으로, 시노몰구스 원숭이에서 백신 반응을 증진시켰고 기능적인 것으로 간주되었기 때문에 유지되었다.

이필리무맙은, 예를 들어 치료후 CD4⁺ 및 CD8⁺ 세포의 표면 상에서의 HLA-DR의 발현의 유의한 증가뿐만 아니라 절대 림프구 수의 증가에 의해 입증된 바와 같이, 혈액 중 활성화된 T 세포의 수를 증가시키는 것으로 제시되었으며 (Ku et al. (2010) Cancer 116:1767; Attia et al. (2005) J. Clin. Oncol. 23:6043; Maker et al. (2005) J. Immunol. 175:7746; Berman et al. (2009) J. Clin. Oncol. 27(suppl):15s.3020; Hamid et al. (2009) J. Clin. Oncol. 27(suppl): 15s.9008), 이는 T 세포의 고갈이 인간의 말초에서 발생하지 않는다는 것을 나타낸다. 이필리무맙은 이펙터 세포로서 IL-2-활성화된 PBMC를 사용하여 활성화된 T 세포의 ADCC의 보통 수준만을 입증하였지만 (비공개); 표적으로서의 T_reg의 사용은 시험되지 않았다. 이필리무맙으로 치료된 환자의 혈액에서 말초 T_reg 빈도의 경미한 변화가 관찰되었지만 (Maker et al. (2005) J. Immunol. 175:7746), 종양내 T_reg에 대한 이필리무맙의 효과에 관한 정보는 거의 이용가능하지 않다. 그러나, 높은 CD8⁺ 대 T_reg 비와 이필리무맙으로 치료된 환자의 전이성 흑색종 병변으로부터의 생검에서의 종양 괴사 사이에 양의 상관관계가 기재되었다. 문헌 [Hodi et al. (2008) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 105:3005]. 추가로, 이필리무맙-치료된 방광암 환자로부터의 종양 조직은 비치료된 방광암 환자로부터의 종양보다 더 낮은 백분율의 CD4⁺ Foxp3⁺ T 세포를 가졌다. 문헌 [Liakou et al. (2008) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 105:14987]. 이들 결과는 이필리무맙이 종양 부위에서 T_reg 감소를 매개한다는 본원에 개시된 데이터와 일치한다.

대조적으로, 트레멜리무맙은 FcγRIIa 변이체 H131을 제외하고는 Fc 수용체에 효율적으로 결합하지 않는 IgG2 이소형이다. 문헌 [Bruhns et al. (2009) Blood 113:3716]. 트레멜리무맙은 CTLA-4와 B7 사이의 억제 상호작용을 차단함으로써 T 세포 반응을 증진시키는 능력을 가질 것이지만, 연구는 트레멜리무맙이 종양에서 T_reg의 고갈을 매개하는데 제한적일 수 있고, 이를 기초로 이필리무맙과 비교하여 감소된 항종양 활성을 나타낼 것으로 예상된다는 것을 시사한다. 이들 2종의 항체의 임상 활성은 각각에 대한 투여 요법이 상이하였기 때문에 직접 비교하기 어려웠다. 예를 들어, 문헌 [Ascierto et al. (2011) J. Transl. Med. 9:196]을 참조한다. 트레멜리무맙은 이필리무맙과 같이 입증가능한 항종양 활성을 갖는다. 문헌 [Ribas (2010) Semin. Oncol. 37(5):450]. 흥미롭게도, 트레멜리무맙의 작용 메카니즘에 대한 연구는, 면역조직화학에 의해 분석된 제한적 수의 샘플에서, 요법의 결과로서 종양-침윤 CD8 T 세포의 증가가 발생하는 반면, 요법 후 종양에서 Foxp3⁺ 세포의 수는 변화가 없다는 것을 보여준다. 문헌 [Comin-Anduix et al. (2008) J. Transl. Med. 6:22; Huang et al. (2011) Clin. Cancer Res. 17:4101]. 대안적으로, T_reg 기능의 억제는 CTLA-4/B7 상호작용을 차단함으로써 달성될 수 있다.

인간 CTLA-4에 대한 인간 항체인 이필리무맙 및 트레멜리무맙을 사용하여 CTLA-4-B7 상호작용을 억제하였고 (Keler et al. (2003) J. Immunol. 171:6251; Ribas et al. (2007) Oncologist 12:873), 이들을 다수의 악성종양에 대한 다양한 임상 시험에서 시험하였다. 문헌 [Hoos et al. (2010) Semin. Oncol. 37:533; Ascierto et al. (2011) J. Transl. Med. 9:196]. 종양 퇴행 및 질환 안정화가 빈번하게 관찰되었고, 이들 항체를 사용한 치료는 다양한 기관계에 영향을 미칠 수 있는 염증성 침윤물에 의한 유해 사건을 동반하였다. 2011년에, IgG1 불변 영역을 갖는 이필리무맙은 이전에 치료된 진행성 흑색종 환자의 III상 시험에서의 전체 생존의 개선에 기초하여 절제불가능한 또는 전이성 흑색종의 치료를 위한 것으로 미국 및 EU에서 승인되었다. 문헌 [Hodi et al. (2010) N. Engl. J. Med. 363:711].

이필리무맙은, 치료상 효과적일지라도, 용량-제한 독성을 나타내어 종양 근절에 있어서 보다 효과적일 수 있는 보다 높은 투여를 막는다. 보다 큰 치료 지수를 나타내는 개선된 형태의 이필리무맙에 대한 필요가 존재한다. 이러한 개선된 형태의 이필리무맙은 증진된 항종양 활성, 감소된 부작용 또는 둘 다를 나타낼 것이다.

본 발명은 중성 pH (예를 들어, pH 7.4)에서의 결합과 비교하여 낮은/산성 pH (예를 들어, pH 6.0)에서 표적 결합을 증진시키는 가변 도메인 내의 돌연변이를 갖는 항-인간 CTLA-4 항체 이필리무맙의 변이체를 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 이필리무맙의 변이체는 이필리무맙과 비교하여 중성 pH, 예컨대 pH 7.0, 7.2, 7.4, 7.5 또는 7.6에 비해 낮은 pH, 예컨대 pH 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6 또는 6.8에서 우선적 결합을 나타낸다. 한 실시양태에서, 낮은 pH에서의 우선적 결합은 "산성 pH 결합 선호도" (APBP)로서 표현되며, 이는 pH 6.0에서의 결합에 대한 해리 평형 상수 대비 pH 7.4에서의 결합에 대한 해리 평형 상수의 비, 즉 K_D-7.4 / K_D-6.0이다. 다양한 실시양태에서, APBP는 1.5, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 12, 15, 20, 25, 35, 50, 75 및 100 이상이다. 또 다른 실시양태에서, 낮은 pH에서의 우선적 결합은 "비교 산성 pH 결합 선호도" (CAPBP)로서 표현되며, 이는 변이체 형태에 관한 pH 6.0에서의 결합에 대한 해리 평형 상수 대비 pH 7.4에서의 결합에 대한 해리 평형 상수의 비를 이필리무맙에 관한 등가 값으로 나눈 것, 즉 [(K_D-7.4 / K_D-6.0)^변이체 / (K_D-7.4 / K_D-6.0)^ipi]이다. 다양한 실시양태에서, CLPBR은 1.5, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 12, 15, 20, 25, 35, 50, 75 및 100 이상이다. 본원에 기재된 바와 같이 이필리무맙에 대한 APBP는 본질적으로 1.0이며, 이는 CAPBP가 본원에 개시된 이필리무맙 변이체에 대한 APBP와 본질적으로 동일하다는 것을 의미한다.

다양한 실시양태에서, 본 발명의 항-CTLA-4 항체는 1, 2, 3개 또는 그 초과의 비-히스티딘 위치에서 치환된 히스티딘 (H)을 갖거나 또는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 중 2개 이상에 적어도 1개의 히스티딘 잔기를 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-CTLA-4 항체는 이전에 아스파르트산 또는 글루탐산이 아닌 1, 2, 3개 또는 그 초과의 위치에서 치환된 산성 잔기 (아스파르트산 또는 글루탐산; D/E)를 갖거나 또는 LCDR1에 1, 2, 3개 또는 그 초과의 아스파르트산 또는 글루탐산 잔기를 갖는 LCDR1 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-CTLA-4 항체는 상기 문장의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 둘 다를 포함한다.

일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 내의 1, 2 또는 3개의 히스티딘 (H) 치환은 성숙 중쇄 서열의 잔기 31, 56 및 99 중 1개 이상에 존재한다. 추가 실시양태에서, 경쇄 가변 영역 내의 1, 2 또는 3개의 산성 (D/E) 치환은 성숙 경쇄 서열의 잔기 28, 31, 32 및 33 중 1개 이상에 존재한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-CTLA-4 항체는 상기 문장의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 둘 다를 포함한다.

추가 실시양태에서, 본 발명의 개선된 항-CTLA-4 항체는, 예를 들어 서열식별번호: 31에 개시된 바와 같은 이필리무맙의 중쇄 가변 영역 내의 잔기 31, 56 및 99 중 1개 이상에서 또는 예를 들어 서열식별번호: 43에 개시된 바와 같은 트레멜리무맙의 중쇄 가변 영역 내의 잔기 30, 31, 52, 53, 54, 56, 101 및 103 중 1개 이상에서 1, 2 또는 3개의 히스티딘 (H) 치환을 포함한다. 추가 실시양태에서, 본 발명의 개선된 항-CTLA-4 항체는, 예를 들어 서열식별번호: 32에 개시된 바와 같은 이필리무맙의 경쇄 가변 영역 내의 잔기 28, 31 및 33 중 1개 이상에서 또는 예를 들어 서열식별번호: 44에 개시된 바와 같은 트레멜리무맙의 경쇄 가변 영역 내의 잔기 28, 30, 31 및 32 중 1개 이상에서 1, 2 또는 3개의 산성 (D/E) 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-CTLA-4 항체는 상기 문장의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 둘 다, 예컨대 서열식별번호: 31 및 32 또는 서열식별번호: 43 및 44를 포함하지만, 본 발명의 항체는 이필리무맙 (서열식별번호: 9 및 10) 또는 트레멜리무맙 (서열식별번호: 39 및 40)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 둘 다를 포함하지는 않는다.

다양한 실시양태에서, 본 발명의 낮은 pH에서 우선적으로 결합하는 이필리무맙 변이체는 서열식별번호: 15 및 21 (ipi.1); 서열식별번호: 16 및 21 (ipi.2); 서열식별번호: 17 및 21 (ipi.3); 서열식별번호: 18 및 21 (ipi.7); 서열식별번호: 11 및 24 (ipi.17); 서열식별번호: 11 및 25 (ipi.18); 서열식별번호: 11 및 26 (ipi.20); 서열식별번호: 11 및 29 (ipi.23); 서열식별번호: 11 및 30 (ipi.24); 서열식별번호: 11 및 22 (ipi.25); 서열식별번호: 11 및 27 (ipi.26); 서열식별번호: 12 및 21 (ipi.57); 서열식별번호: 19 및 21 (ipi.59); 서열식별번호: 12 및 22 (ipi.64); 서열식별번호: 19 및 22 (ipi.66); 서열식별번호: 13 및 21 (ipi.69); 서열식별번호: 13 및 22 (ipi.71); 서열식별번호: 20 및 21 (ipi.82); 서열식별번호: 14 및 21 (ipi.84); 서열식별번호: 20 및 22 (ipi.86); 서열식별번호: 14 및 22 (ipi.88); 서열식별번호: 20 및 23 (ipi.90); 서열식별번호: 14 및 23 (ipi.92); 서열식별번호: 11 및 23 (ipi.93); 서열식별번호: 12 및 23 (ipi.94); 서열식별번호: 13 및 23 (ipi.95); 서열식별번호: 12 및 27 (ipi.100); 서열식별번호: 13 및 27 (ipi.101); 서열식별번호: 13 및 28 (ipi.105); 및 서열식별번호: 14 및 28 (ipi.106)에 제공된 중쇄 및 경쇄 서열을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 본 발명의 낮은 pH에서 우선적으로 결합하는 이필리무맙 변이체는 중쇄 상에 C-말단 리신 (K) 잔기가 부가된 상기 제공된 중쇄 및 경쇄 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 낮은 pH에서 우선적으로 결합하는 이필리무맙 변이체는 감소된 푸코실화를 갖는 항체 제제, 저푸코실화된 항체 제제 또는 비푸코실화된 항체 제제에 존재한다. 일부 이러한 실시양태에서, 항체 제제는 95% 초과의 비-푸코실화 항체 중쇄를 포함한다. 다른 실시양태에서, 항체 제제는 80% 내지 95%의 비-푸코실화 항체 중쇄를 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체 제제는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 통상적인 수단에 의해 생산된 동일한 항체 제제의 ADCC 활성의 적어도 2배를 나타낸다. 추가 실시양태에서, 항체 제제는 GDP-푸코스 또는 그의 전구체의 생산에 수반되는 효소의 활성이 결핍된 포유동물 세포주, 예를 들어 비제한적으로 알파1,6-푸코실트랜스퍼라제 활성이 부분적으로 또는 총체적으로 결핍된 포유동물 세포주, 예컨대 완전히 불활성화된 FUT8 유전자를 갖는 포유동물 세포주에서 생산된다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 pH 감수성 항-인간 CTLA-4 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 핵산, 이들 핵산을 포함하는 발현 벡터, 이들 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포, 및 숙주 세포를 항체의 생산이 가능하도록 하는 조건 하에 배양하고 항체를 단리함으로써 본 발명의 pH 감수성 항-인간 CTLA-4 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 각각 항체의 중쇄 및 경쇄 서열을 코딩하는 서열을 포함하는 별개의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 항체의 중쇄 및 경쇄의 생산이 가능하도록 하는 조건 하에 배양하고 항체를 단리함으로써 본 발명의 pH 감수성 항-인간 CTLA-4 항체를 제조하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 인간 대상체에게 본 발명의 이필리무맙 변이체를 투여하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 치료는 절제불가능한 또는 전이성 흑색종을 포함하나 이에 제한되지는 않는 암의 치료이다.

다양한 실시양태에서, 치료는 다른 면역조정제를 포함한 1종 이상의 다른 항종양 치료제와 조합된다. 일부 실시양태에서, 이러한 면역조정제는 PD1 또는 PD-L1에 대한 길항제 항체이다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 이필리무맙 변이체는 이필리무맙을 사용한 동일한 적응증의 치료에 대해 승인된 용량보다 더 낮거나 더 높은 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 이필리무맙 변이체는 절제불가능한 또는 전이성 흑색종을 치료하는데 사용되고, 총 4회 용량에 대해 q3w으로 90분에 걸쳐 3 mg/kg 초과, 예컨대 10 mg/kg, 20 mg/kg, 50 mg/kg 또는 그 초과의 용량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다.

다른 실시양태에서, 이필리무맙 변이체는 총 림프절절제술을 포함한 완전 절제를 받은, 1 mm 초과의 부위 림프절의 병리학적 침범이 있는 피부 흑색종을 갖는 환자에 대해 아주반트로서 사용되고, 총 4회 용량에 대해 q3w, 이어서 최대 3년 동안 또는 기록된 질환 재발 또는 허용되지 않는 독성이 있을 때까지 q12w로 90분에 걸쳐 10 mg/kg 초과, 예컨대 20 mg/kg, 50 mg/kg 또는 그 초과의 용량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다.

추가 실시양태에서, 이필리무맙 변이체는 중간 또는 불량한 위험의 이전에 비치료된 진행성 신세포 암종을 갖는 환자를 니볼루맙과 조합하여 치료하는데 사용되고, 총 4회 용량에 대해 q3w로 30분에 걸쳐 1 mg/kg 초과, 예컨대 3 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 50 mg/kg 또는 그 초과의 용량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다.

추가 실시양태에서, 이필리무맙 변이체는 플루오로피리미딘, 옥살리플라틴 또는 이리노테칸을 니볼루맙과 조합하여 사용한 치료 후에 진행된 미소위성체 불안정성-높은 (MSI-H) 또는 미스매치 복구 결핍 (dMMR) 전이성 결장직장암을 갖는 12세 이상의 성인 및 소아 환자를 치료하는데 사용되고, 예를 들어 총 4회 용량에 대해 q3w로 1 mg/kg 초과, 예컨대 3 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 50 mg/kg 또는 그 초과의 용량으로 투여된다.

본 발명의 별개의 실시양태에서, pH 감수성 항-CTLA-4 항체는 트레멜리무맙으로부터 유래된다. 다양한 실시양태에서, 항체는 히스티딘 (H)이 잔기 S30, S31, W52, Y53, D54, S56, N57, R101 및 A103 중 1개 이상에 존재하는 서열식별번호: 43의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 아스파르트산 (D) 또는 글루탐산 (E)이 잔기 S28, N30, S31 및 Y32 중 1개 이상에 존재하는 서열식별번호: 44의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열; 또는 둘 다를 포함한다.

도 1은 이필리무맙의 모든 3개의 중쇄 CDR (HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 제1 경쇄 CDR (LCDR1)에 대한 잔기 넘버링을 보여준다. 아미노산 서열은 통상적인 바와 같이 좌측에서 우측으로 아미노 말단에서 카르복시 말단까지 단일 문자 코드로 제공된다. HCDR1, HCDR2, HCDR3 및 LCDR1에 대한 서열은 각각 서열식별번호: 3-6에 제공된다. 상부 행의 숫자는 서열 목록에 사용된 바와 같은 엄격한 순차적 넘버링을 나타내며, 이는 달리 나타내지 않는 한 명세서 및 청구범위에서 서열 변이체를 기재하는데 사용된다. 중쇄 및 경쇄 CDR에 대한 잔기의 넘버링은 각각 서열식별번호: 9 및 10에 따른다. 하부 행의 숫자는 카바트 시스템 하의 넘버링을 나타내며, 이는 달리 나타내지 않는 한 도면에서 서열 변이체를 기재하는데 사용된다. 카바트 넘버링에서 생략된 숫자는 순차적 넘버링에서와 동일하다. 카바트 넘버링 시스템은 가변 도메인 내에 상이한 수의 아미노산 잔기를 갖는 항체에서 구조적으로 동등한 잔기들 사이의 비교를 용이하게 하기 위해 폭넓게 사용된다. 도 1에 제공된 숫자 일치는 동일한 서열에 대한 2개의 넘버링 규정의 사용으로부터 어떠한 모호성도 초래되지 않는다는 것을 보장한다.
도 2a는 이필리무맙의 중쇄 서열 변이체의 파일럿 라이브러리 내의 (상부에서 하부로) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3에 대한 서열 로고를 보여준다. 실시예 1을 참조한다. 도 2b는 실시예 1에 기재된 바와 같이 pH 6.0에서 (pH 7.4에서는 아님) huCTLA-4에 대한 파지 결합의 3 라운드의 선택 후 이들 동일한 CDR에 대한 서열 로고를 보여준다. HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 내의 가장 우세한 단일 서열은 각각 T33H, N56H 및 T95H (모두 카바트에 따른 넘버링)이다. 본원의 모든 서열 로고에서와 같이, 각각의 위치에서의 아미노산 잔기를 나타내는 문자의 크기는 그 라이브러리 내의 그 위치에서의 그 아미노산 잔기의 상대 빈도에 비례한다.
도 3a, 3b 및 3c는 인간 CTLA-4에 결합된 이필리무맙의 정전기적 모델링의 결과를 보여준다. 실시예 1을 참조한다. 도 3a는 pH 6에서의 전하 분포를 보여주고, 도 3b는 pH 7.5에서의 전하 분포를 보여주며, 여기서 HCDR1은 H1로 표지되고, LCDR1은 L1로 표지된다. 도 3c는 이필리무맙의 HCDR1 (예를 들어, 카바트 넘버링에 따른 잔기 T28, S30, S31 및 T33)과 인간 CTLA-4 (예를 들어, 잔기 E48, D64 및 D65) 사이의 접촉 표면에서의 정전기적 모델의 확대도를 보여준다.
도 4a 및 4b는 이필리무맙 서열 변이체의 사전-선택된 조합 라이브러리 (도 4a) 및 선택된 조합 라이브러리 (도 4b) 둘 다에서의 경쇄 CDR1 (LCDR1)에 대한 서열 로고를 보여준다. 도 4a의 출발 서열 세트로부터 도 4b의 서열을 생성한 선택 프로토콜은 실시예 2에 기재된다. 원래의 이필리무맙 잔기가 선호되는 다른 위치와 비교하여 위치 27a (S27aE) 및 30 (S30E)에서, 선택 후 천연 이필리무맙 서열로부터 극적인 이동이 관찰되었다.
도 5a 및 5b는 pH 7.4 (도 5a) 및 pH 6.0 (도 5b)에서의 ipi.25 (LCDR1 S27aE/S30D)에 대한 예시적인 표면 플라즈몬 공명 친화도 데이터를 보여준다. 실시예 2를 참조한다. 항체 ipi.25는 pH 7.4에서보다 pH 6.0에서 CTLA-4에 4 내지 5배 더 단단히 결합하며, 이와 비교하여 이필리무맙은 1.0배이다. 표 3 (실시예 2)을 참조한다.
도 6a, 6b 및 6c는 pH 6.0 및 pH 7.5에서 본 발명의 선택된 이필리무맙 서열 변이체, 구체적으로 항체 ipi.25 (LCDR1 S28E/S31D), ipi.57 (HCDR1 S31H) 및 ipi.64 (LCDR1 S28E/S31D 및 HCDR1 S31H)에 대한 결합 파라미터를 보여준다. 값은 본질적으로 실시예 3에 기재된 바와 같이 얻었다. 항체 ipi.64는 ipi.25 및 ipi.57의 돌연변이를 조합한다. 중쇄 및 경쇄 돌연변이의 조합은 개별 중쇄 및 경쇄 돌연변이와 비교하여 낮은 pH에서의 결합에 대한 증진된 선호도를 갖는 항체를 제공한다. CAPBP인, 이필리무맙에 대한 비 (1.0)에 대해 정규화된 해리 평형 결합 상수 (K_D)의 비는 ipi.25, ipi.57 및 ipi.64에 대해 각각 6.3, 5.5 및 27.2이다.
도 7a 및 7b는 pH 7.4 (도 7a) 및 pH 6.0 (도 7b)에서 CTLA-4에 대한 ipi.3 (HCDR3 T95H, 카바트 넘버링에 따름)의 결합에 대한 표면 플라즈몬 공명 센소그램 데이터를 보여준다. 이 돌연변이를 도입하여 pH 7.5에서의 이필리무맙의 친화도를 탈조정하였다. 실시예 4를 참조한다.
도 8a, 8b 및 8c는 pH 6.0 및 pH 7.4에서의 본 발명의 다양한 항체의 결합의 플롯을 제공한다. 도 8a 및 8b는 K_D 값을 보여주며, 여기서 보다 낮은 값은 증가된 친화도를 나타낸다. 이들 플롯 상에서 이필리무맙 아래에 있는 항체는 낮은 pH (pH 6.0)에서 증진된 결합을 갖는다. 이필리무맙의 위치에 기초하여 4분면으로 각각의 플롯의 하부 우측 4분면 쪽에 있는 항체는 이들이 또한 pH 7.4에서 감소된 친화도를 갖기 때문에 추가로 낮은 pH (pH 6.0)에서의 결합에 대한 증진된 선호도를 갖는다. 도 8b는 도 8a의 데이터의 확대도를 제시한다. 도 8c는 ln2/k_off로서 계산된, 본 발명의 항체와 CTLA-4의 복합체에 대한 반감기 값을 제공한다. 이 플롯의 경우, (다시 이필리무맙과 관련하여) 상부 좌측 4분면의 항체는 pH 6.0에서 증진된 안정성 및 pH 7.4에서 감소된 안정성을 나타낸다. 실시예 2를 참조한다.
도 9는 CTLA-4에 대한 본 발명의 선택된 이필리무맙 변이체의 결합의 pH 의존성을 보여준다. 결합은 pH의 함수로서 표면 플라즈몬 공명에서의 정상 상태 결합의 척도인 Req로서 제시되며, 데이터는 각각의 pH에서 (좌측에서 우측으로) 항체 ipi.64, ipi.71, ipi.92 및 ipi.95에 대해 제시된다. 이필리무맙에 대한 데이터는 범례에 나타낸 바와 같이 선으로서 제공된다. 모든 이필리무맙 서열 변이체에 대해, 친화도는 pH 증가에 따라 감소하며, 이와 비교하여 이필리무맙은 모든 측정된 pH에서 유사하게 결합한다. 실시예 2를 참조한다.
도 10a 및 10b는 pH 7.3 (도 10a) 및 pH 6.0 (도 10b)에서 58개의 α-β-CTLA-4/CD3 ζ 세포에 대한 Fab 단편으로서의 다양한 항체의 결합을 보여준다. 실시예 5를 참조한다. 이필리무맙 (IPI fab 야생형, ●)은 임의적 형광 강도 단위 (GMFI)에 의해 측정시 둘 다의 pH에서 유사하게 결합하는 반면 (pH 7.3에서 5.4 nM 및 pH 6.0에서 7.1 nM의 EC50), 이필리무맙 서열 변이체 ipi.64 (IPI.64 돌연변이 fab, ▲)는 pH 6.0에서는 잘 결합하지만 (3.3 nM), pH 7.3에서는 결합하더라도 불량하게 결합한다 (140 nM). 실시예 5를 참조한다.
도 11a 및 11b는 데이터가 pH보다는 항체에 의해 군분류되고 추가의 데이터가 pH 5.6에 대해 제공된다는 것을 제외하고는 도 10a 및 10b에 제시된 것과 유사한 결과를 보여준다. 도 10a 및 10b에서와 같이, 이필리무맙 서열 변이체 ipi.64는 pH 7.3 (●)과 비교하여 pH 6.0 (■)에서 훨씬 더 잘 결합하는 반면, 이필리무맙은 유사하게 결합한다는 것이 분명하다. 실시예 5를 참조한다.
도 12a, 12b 및 12c는 pH 6.3 (도 12a), pH 6.6 (도 12b) 및 pH 7.2 (도 12c)에서 58개의 α-β-CTLA-4/CD3 ζ 세포에 대한 Fab 단편으로서의 본 발명의 다양한 항체의 결합을 보여준다. 통상적으로, 이필리무맙 Fab (●)는 임의적 형광 강도 단위 (GMFI)에 의해 측정시 모든 pH에서 유사하게 결합하는 반면, 이필리무맙 Fab 서열 변이체 ipi.64 (■) 및 ipi.71 (▲)은 낮은 pH에서 우선적 결합을 나타낸다. 실시예 5를 참조한다. 이필리무맙 Fab 서열 변이체 ipi.64 (■) 및 ipi.71 (▲)에 대한 곡선은 도 12c에서 중첩된다.
도 13a, 13b 및 13c는 데이터가 Fab 단편보다는 전장 IgG 항체로 얻어진 것임을 제외하고는 도 12a, 12b 및 12c에 제시된 것과 유사한 결과를 보여준다. 예상되는 바와 같이, 2가 항체는 상응하는 Fab 단편보다 더 높은 결합력으로 결합한다. 이필리무맙 (●), ipi.64 (■) 및 ipi.71 (▲)은 모든 pH에서 서로 구별불가능하게 유사한 결합력으로 결합한다. 실시예 5를 참조한다. 항체 ipi.92 (▼) 및 ipi.95 (◆)는 표 4에서의 그의 높은 K_{D 7.4/6} (APBP) 값 (각각 >59 및 99)과 일치하게, 이 검정 포맷에서 낮은 pH에서 우선적 결합을 나타낸다.
도 14a, 14b 및 14c는 각각 평형 결합 상수 K_D, 회합/온-레이트 상수 k_on 및 해리/오프-레이트 상수 k_off를 제공하는, 표면 플라즈몬 공명 분광분석법에 의해 측정시 인간 CTLA-4에 대한 본 발명의 선택된 항체의 결합의 pH 적정을 보여준다. 이필리무맙 (●)은 pH에 대해 비교적 거의 의존성을 나타내지 않은 반면, ipi.64 (■), ipi.100 (▲), ipi.101 (▼), ipi.105 (◆) 및 ipi.106 (○)은 모두 pH에 대해 상당한 의존성을 나타낸다. 실시예 8을 참조한다.
도 15a, 15b 및 15c는 각각 평형 결합 상수 K_D, 회합/온-레이트 상수 k_on 및 해리/오프-레이트 상수 k_off를 제공하는, 표면 플라즈몬 공명 분광분석법에 의해 측정시 시노 CTLA-4 (시노몰구스 마카크 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)로부터의 CTLA-4)에 대한 본 발명의 선택된 항체의 결합의 pH 적정을 보여준다. 결과는, 비록 보다 낮은 친화도에서일지라도, 도 14a-c에 제시된 인간 CTLA-4를 사용하여 얻은 결과와 정성적으로 유사하다. 실시예 8을 참조한다.
도 16a, 16b 및 16c는 데이터가 본 발명의 추가의 항체에 대해 얻어진 것이고 모두 비-푸코실화된 것임을 제외하고는 도 13a, 13b 및 13c에 제시된 것과 유사한 결과를 보여준다. 실시예 5를 참조한다. 데이터는 이필리무맙 (○), ipi.64 (■), ipi.100 (▲), ipi.101 (▼), ipi.106 (

- 채워진 육각형) 및 ipi.105 (◆)에 대해 제공된다. 항체 ipi.105 및 ipi.106은 낮은 pH에서 우선적 결합을 나타낸다.
도 17a-f는 데이터가 비-푸코실화 전장 IgG1 항체보다는 Fab 단편으로 얻어진 것임을 제외하고는 도 16a-c에 제시된 것과 유사한 결과를 보여준다. 실시예 5를 참조한다. 도 17a 및 17b는 2개의 상이한 배율에서의 pH 7.2에 대한 결과를 보여주며, 도 17b는 ipi.106 및 ipi.105에 대한 데이터를 보다 잘 예시하기 위해 확대되어 있다. 도 17c 및 17d는 pH 6.7에 대한 유사한 결과를 보여주고, 도 17e 및 17f는 pH 6.2에 대한 유사한 결과를 보여준다. 데이터는 이필리무맙 (○), ipi.100 (■), ipi.101 (▲), ipi.105 (▼), ipi.106 (◆) 및 이소형 대조군 (

- 채워진 육각형)에 대해 제공된다. 항체 ipi.100 및 ipi.101은 pH 7.2에서 거의 이필리무맙만큼 잘 결합하고, pH 6.7 및 6.2에서 점진적으로 더 우수하다. 항체 ipi.105 및 ipi.106은 pH 7.2에서 이필리무맙보다 훨씬 더 불량하게 결합하지만, pH 6.7 및 6.2에서 극적으로 개선된 결합을 나타내며, ipi.105는 pH 6.2에서 이필리무맙의 친화도에 근접한다.
도 18a, 18b 및 18c는 각각 pH 7.2, 7.0 및 6.8에서 비-푸코실화 IgG1로서 발현된 본 발명의 선택된 항체에 대한 58αβ-hCTLA/mCD3ζ:rhB7-1 차단 검정의 결과를 보여준다. 데이터는 이필리무맙 (○), ipi.64 (■), ipi.100 (▲), ipi.101 (▼), ipi.105 (◆), ipi.106 (

- 채워진 육각형), 이소형 대조군 (□) 및 항체 부재 (X)에 대해 제공된다. 항체 ipi.64, ipi.100 및 ipi101은 모두, 모든 pH에서 IL-2 분비의 억제에 의해 반영되는 바와 같이 B7-1에 대한 CTLA-4 결합을 차단하는데 있어서 거의 이필리무맙만큼 효과적이며, 일반적으로 보다 낮은 pH에서 개선된 차단을 갖는다. ipi.105는 pH 7.2에서 이필리무맙만큼 효과적이지 않지만, pH 6.8에서는 거의 동등한 차단을 나타낸다. ipi.106은 pH 7.2에서 활성이 있긴 하지만 거의 없으며, pH 6.8에서는 보통의 활성을 나타낸다. 실시예 9를 참조한다.
도 19a-19m은 MC38 마우스 종양 모델에서 각각 비-푸코실화 IgG1로서 발현된 본 발명의 선택된 pH 감수성 항-CTLA-4 항체의 효과를 보여준다. 인간 CTLA-4 녹-인 마우스를 사용하였다. 실시예 7을 참조한다. 종양 부피 (mm³)는 이식 후 일수의 함수로서 제공되며, 각각의 트레이스는 실험당 10마리 마우스 중 1마리를 나타낸다. 도 19a, 19b 및 19c는 각각 1 mg/kg (mpk), 3 mpk 및 10 mpk로 투여된 이필리무맙에 대한 결과를 보여준다. 도 19d, 19e 및 19f는 ipi.64에 대한 유사한 결과를 보여준다. 도 19g, 19h 및 19i는 ipi.106에 대한 유사한 결과를 보여주고, 도 19j, 19k 및 19l은 ipi.105에 대한 유사한 결과를 보여준다. 도 19m은 10 mpk에서 이소형 대조군으로 처리된 마우스에 대한 유사한 결과를 보여준다. 비-푸코실화 이필리무맙은 1 내지 10 mpk에서 용량-의존성 방식으로 종양 성장을 억제하는데 효과적이며, 완전한 억제는 3 및 10 mpk에서이다. ipi.64, ipi.106 및 ipi.105는 용량-의존성 방식으로 유사하게 효과적이다.
도 20a 및 20b는 본 발명의 선택된 pH 감수성 항-CTLA-4 항체로 처리된 마우스 종양 모델에서, 각각 비장 및 종양에서의 모든 CD4+ T 세포 중 FoxP3+ 세포의 백분율로서 표현된 조절 T 세포의 수준을 보여준다. 실시예 7을 참조한다. 두 도면에서 원형 (●)은 1 mpk 투여를 나타내고, 사각형 (■)은 3 mpk를 나타내고, 삼각형 (▲)은 10 mpk를 나타낸다. 마우스에 종양 세포를 이식하고, 도 19a-19m을 참조하여 기재된 바와 같이 본 발명의 선택된 항체로 처리하였다. 비장 및 종양으로부터의 샘플을 수득하고, 모든 CD4+ T 세포 중 FoxP3+ 세포의 백분율을 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. 비-푸코실화 이필리무맙은 이소형 대조군과 비교하여 비장에서의 Treg의 수준을 약간 증가시키는 반면, 본 발명의 pH 감수성 항체 (ipi.64, ipi.106 및 ipi.105)는 이들이 Treg의 수준을 증가시키긴 하지만 거의 증가시키지 않는다는 점에서 이소형 대조군과 더 유사하다. 도 20a. 대조적으로, 비-푸코실화 이필리무맙은 이소형 대조군과 비교하여 종양에서의 Treg의 수준을 극적으로 감소시키고, 본 발명의 pH 감수성 항체는 동일한 효과를 갖는다. 도 20b.
도 21a 및 21b는 도 20a 및 20b와 관련하여 기재된 바와 같이 본 발명의 선택된 pH 감수성 항-CTLA-4 항체로 처리된 마우스 종양 모델에서의 비장에서, ICOS+인 조절 T 세포의 백분율에 의해 측정된 T 세포 활성화 및 Ki-67+인 조절 T 세포의 백분율에 의해 측정된 증식을 보여준다. 실시예 7을 참조한다. 두 도면에서 원형 (●)은 1 mpk 투여를 나타내고, 사각형 (■)은 3 mpk를 나타내고, 삼각형 (▲)은 10 mpk를 나타낸다. 비-푸코실화 pH 감수성 이필리무맙 변이체는, 특히 비-푸코실화 이필리무맙의 효과가 보다 분명한 보다 높은 용량에서, 활성화 및 증식 마커 ICOS 및 Ki-67에 의해 나타난 바와 같이, 비장에서 비-푸코실화 이필리무맙과 비교하여 감소된 말초 활성을 나타낸다.

정의

본 개시내용이 보다 용이하게 이해될 수 있도록, 특정 용어가 먼저 정의된다. 본원에 달리 명백하게 제공된 경우를 제외하고는, 본 출원에 사용된 각각의 하기 용어는 하기 제시된 의미를 가질 것이다. 추가의 정의는 본 출원 전반에 걸쳐 제시된다.

"투여하는"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법 및 전달 시스템 중 임의의 것을 사용하여 치료제를 포함하는 조성물을 대상체에게 물리적으로 도입하는 것을 지칭한다. 본 발명의 항체에 대한 바람직한 투여 경로는 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 척수 또는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 것을 포함한다. 본원에 사용된 어구 "비경구 투여"는 통상적으로 주사에 의한, 경장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 비제한적으로, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 림프내, 병변내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입, 뿐만 아니라 생체내 전기천공을 포함한다. 대안적으로, 본 발명의 항체는 비-비경구 경로, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들어 비강내로, 경구로, 질로, 직장으로, 설하로 또는 국소로 투여될 수 있다. 투여는 또한, 예를 들어 1회, 복수회 및/또는 1회 이상의 연장된 기간에 걸쳐 수행될 수 있다. 투여는 의사, 간호사, 또 다른 건강관리 제공자 또는 환자 그 자신 또는 그녀 자신을 포함하나 이에 제한되지는 않는 1명 이상의 개체에 의해 수행될 수 있다.

"항체" (Ab)는, 비제한적으로, 항원에 특이적으로 결합하고 디술피드 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질 이뮤노글로불린 또는 그의 항원-결합 부분을 포함할 것이다. 각각의 H 쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 V_H로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 V_L로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인 C_L로 구성된다. V_H 및 V_L 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 V_H 및 V_L은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다.

본원에 사용된 바와 같이, 통상적인 해석에 따라, "한" 중쇄 및/또는 "한" 경쇄를 포함하는 것으로 기재된 항체는 "적어도 1개"의 언급된 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 항체를 의미하고, 따라서 2개 이상의 중쇄 및/또는 경쇄를 갖는 항체를 포괄할 것이다. 구체적으로, 이와 같이 기재된 항체는 2개의 실질적으로 동일한 중쇄 및 2개의 실질적으로 동일한 경쇄를 갖는 통상적인 항체를 포괄할 것이다. 항체 쇄는 이들이 번역후 변형, 예컨대 리신 잔기의 C-말단 절단, 대안적 글리코실화 패턴 등으로 인해 상이한 경우에 전체적으로 동일하지는 않지만 실질적으로 동일할 수 있다.

달리 나타내지 않는 한 또는 문맥으로부터 명확하지 않는 한, 표적 특이성에 의해 정의되는 항체 (예를 들어 "항-CTLA-4 항체")는 그의 인간 표적 (예를 들어 인간 CTLA-4)에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 이러한 항체는 다른 종으로부터의 CTLA-4에 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있다.

이뮤노글로불린은 IgA, 분비형 IgA, IgG 및 IgM을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 통상적으로 공지된 이소형으로부터 유래될 수 있다. IgG 이소형은 특정 종에서 하위부류로 분류될 수 있다: 인간에서 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 및 마우스에서 IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3. IgG 항체는 본원에서 기호 감마 (γ) 또는 간단히 "G"로 지칭될 수 있고, 예를 들어 IgG1은 문맥으로부터 명확할 바와 같이 "γ1" 또는 "G1"로 표현될 수 있다. "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 부류 (예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 지칭한다. "항체"는, 예로서, 자연 발생 및 비-자연 발생 항체 둘 다; 모노클로날 및 폴리클로날 항체; 키메라 및 인간화 항체; 인간 또는 비인간 항체; 완전 합성 항체; 및 단일 쇄 항체를 포함한다. 달리 나타내지 않는 한 또는 문맥으로부터 명확하지 않는 한, 본원에 개시된 항체는 인간 IgG1 항체이다.

"단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다 (예를 들어, CTLA-4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 CTLA-4 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 그러나, CTLA-4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원, 예컨대 상이한 종으로부터의 CTLA-4 분자와 교차-반응할 수 있다. 더욱이, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다. 비교하자면, "단리된" 핵산은 자연에 존재하는 바와 같은 핵산과 현저하게 상이한, 즉 독특한 화학적 정체, 성질 및 유용성을 갖는 물질의 핵산 조성물을 지칭한다. 예를 들어, 단리된 DNA는, 천연 DNA와 달리, 천연 DNA의 독립된 부분이고, 자연에서 발견되는 보다 큰 구조적 복합체인 염색체의 필수 부분이 아니다. 추가로, 단리된 DNA는, 천연 DNA와 달리, 특히 질환을 진단하거나 치료제의 효능을 예측하기 위해 유전자 발현을 측정하고 바이오마커 유전자 또는 돌연변이를 검출하기 위한 PCR 프라이머 또는 혼성화 프로브로서 사용될 수 있다. 단리된 핵산은 또한 관련 기술분야에 널리 공지된 표준 기술을 사용하여 다른 세포 성분 또는 다른 오염물, 예를 들어 다른 세포 핵산 또는 단백질이 실질적으로 없도록 정제될 수 있다.

용어 "모노클로날 항체" ("mAb")는 단일 분자 조성의 항체 분자, 즉 1차 서열이 본질적으로 동일하고 특정한 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타내는 항체 분자 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체는 하이브리도마, 재조합, 트랜스제닉 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 기술에 의해 생산될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "비-푸코실화"는 N-연결된 글리칸이 푸코스 잔기를 함유하지 않는 개별 항체 중쇄를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "비푸코실화"는 비-푸코실화 중쇄를 갖고, 달리 나타내지 않는 한 95% 초과의 비-푸코실화 중쇄를 갖는 항체를 함유하는 항체 제제를 지칭한다. 이러한 항체 제제는 치료 조성물로서 사용될 수 있다.

"인간" 항체 (HuMAb)는 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다가 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 추가로, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우에, 불변 영역은 또한 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 그라프팅된 항체는 포함하지 않는 것으로 의도된다. 용어 "인간" 항체 및 "완전 인간" 항체는 동의어로 사용된다.

"항체 단편"은 무손상 항체에 의해 결합된 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 무손상 항체의 "항원-결합 부분" ("항원-결합 단편"), 또는 FcR 결합 능력을 보유하는 항체의 Fc 영역을 일반적으로 포함하는 전체 항체의 부분을 지칭한다. 예시적인 항체 단편은 Fab 단편 및 단일 쇄 가변 도메인 (scFv) 단편을 포함한다.

본원에 사용된 "낮은 pH"는 전형적 인간 대상체에서의 정상 생리학적 pH, 예컨대 정상 인간 혈액 또는 혈청의 pH, 예를 들어 pH 7.4 미만의 임의의 pH를 지칭한다. 구체적 실시양태에서, "낮은 pH"는 본 발명의 항체로 치료될 인간 대상체에서 종양 내의 종양 미세환경에서의 pH, 예컨대 pH 7.0, 6.8, 6.6, 6.4, 6.2, 6.0 또는 그 미만을 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한 또는 문맥으로부터 명확하지 않는 한, 정상 또는 생리학적 pH는 pH 7.4이고, 낮은 pH는 pH 6.0이다. 언급된 pH 값은 관련 샘플에서의 pH의 결정을 위한 전형적 오차 범위 내의 값을 포괄하는 것으로 의도된다. 일부 실험에서, pH 값 7.3 및 7.5는 생리학적 pH에 대한 대용물로서 사용되었다. pH 값 7.4 및 6.0은 본 발명의 개선된 항체를 선택하기 위해 본원에 기재된 실험에 대한 예시적인 pH 값으로서 선택되지만, 이러한 개선된 항체는 종양 미세환경이 비-종양 조직보다 더 낮은 pH를 갖는 임의의 상황에서 사용될 것이다. 본 발명의 항체의 사용은 그의 선택에 사용된 임의의 특정 pH 값에 결코 제한되지 않는다.

"산성 pH 결합 선호도" (APBP)는 pH 6.0에서의 결합에 대한 해리 평형 상수 대비 pH 7.4에서의 결합에 대한 해리 평형 상수의 비, 즉 K_D-7.4 / K_D-6.0이다. 달리 나타내지 않는 한 또는 문맥으로부터 명확하지 않는 한, K_D 값은 표면 플라즈몬 공명에 의해, 예를 들어 비아코어(BIACORE)® 표면 플라즈몬 공명 장치 (지이 헬스케어(GE Healthcare), 일리노이주 시카고) 또는 등가의 방법을 사용하여 결정된다. 보다 높은 APBP는 낮은 pH에서의 결합에 대한 보다 큰 선호도를 나타내고, 따라서 보다 낮은 APBP 값을 갖는 항체에 비해 개선된 항체를 나타낸다. 높은 APBP는 중성 pH에서의 감소된 결합과 산성 pH에서의 증진된 결합, 중성 pH에서의 약간 증진된 결합과 산성 pH에서의 고도로 증진된 결합, 또는 중성 pH에서의 고도로 감소된 결합과 산성 pH에서의 약간 감소된 결합으로부터 비롯될 수 있다. 본 발명의 유용한 항체는 임의의 이들 시나리오 하에 발생할 수 있다.

본 발명의 항체는 이필리무맙의 것보다 더 큰 임의의 APBP를 나타낼 수 있다. 이러한 비교를 용이하게 하기 위해, APBP 값은 "비교 산성 pH 결합 선호도" (CAPBP)로서 이필리무맙의 것에 대해 정규화될 수 있다. CAPBP는 이필리무맙의 특정한 변이체 형태에 관한 pH 6.0에서의 결합에 대한 해리 평형 상수 대비 pH 7.4에서의 결합에 대한 해리 평형 상수의 비를 이필리무맙에 관한 등가 값으로 나눈 것, 즉 [(K_D-7.4 / K_D-6.0)^변이체 / (K_D-7.4 / K_D-6.0)^ipi]이다. 다양한 실시양태에서, CAPBP는 1.5, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 12, 15, 20, 25, 35, 50, 75 및 100 이상이다.

"항체-의존성 세포-매개 세포독성" ("ADCC")은 FcR을 발현하는 비특이적 세포독성 세포 (예를 들어, 자연 킬러 (NK) 세포, 대식세포, 호중구 및 호산구)가 표적 세포 상의 표면 항원에 결합된 항체를 인식하고, 후속적으로 표적 세포의 용해를 유발하는 시험관내 또는 생체내 세포-매개 반응을 지칭한다. 원칙적으로, 활성화 FcR을 갖는 임의의 이펙터 세포는 ADCC를 매개하도록 촉발될 수 있다.

"암"은 체내에서 비정상 세포의 비제어된 성장을 특징으로 하는 다양한 질환의 광범위한 군을 지칭한다. 비조절된 세포 분열 및 성장은 분열 및 성장하여 이웃 조직을 침습하는 악성 종양 또는 세포의 형성을 유발하고, 또한 림프계 또는 혈류를 통해 신체의 원위 부분으로 전이할 수 있다.

"세포 표면 수용체"는 신호를 수신하고 이러한 신호를 세포의 형질 막을 가로질러 전달할 수 있는 분자 및 분자의 복합체를 지칭한다.

"이펙터 세포"는 1종 이상의 FcR을 발현하고 1종 이상의 이펙터 기능을 매개하는 면역계의 세포를 지칭한다. 바람직하게는, 세포는 적어도 한 유형의 활성화 Fc 수용체, 예를 들어 인간 FcγRIII를 발현하고, ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), NK 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구 및 호산구를 포함한다.

"이펙터 기능"은 항체 Fc 영역과 Fc 수용체 또는 리간드의 상호작용 또는 그로부터 발생하는 생화학적 사건을 지칭한다. 예시적인 "이펙터 기능"은 Clq 결합, 보체 의존성 세포독성 (CDC), Fc 수용체 결합, FcγR-매개 이펙터 기능, 예컨대 ADCC 및 항체 의존성 세포-매개 식세포작용 (ADCP), 및 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향-조절을 포함한다. 이러한 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합될 것을 요구한다.

"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 이뮤노글로불린의 Fc 영역에 결합하는 수용체이다. IgG 항체에 결합하는 FcR은 FcγR 패밀리의 수용체 (이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태 포함)를 포함한다. FcγR 패밀리는 3종의 활성화 (마우스에서 FcγRI, FcγRIII 및 FcγRIV; 인간에서 FcγRIA, FcγRIIA 및 FcγRIIIA) 수용체 및 1종의 억제 (FcγRIIB) 수용체로 이루어진다. 인간 FcγR의 다양한 특성이 표 1에 요약된다. 대다수의 선천성 이펙터 세포 유형은 1종 이상의 활성화 FcγR 및 억제 FcγRIIB를 공동-발현하는 반면, 자연 킬러 (NK) 세포는 1종의 활성화 Fc 수용체 (마우스에서 FcγRIII 및 인간에서 FcγRIIIA)를 선택적으로 발현하지만, 마우스 및 인간에서 억제 FcγRIIB는 발현하지 않는다.

"Fc 영역" (결정화가능 단편 영역) 또는 "Fc 도메인" 또는 "Fc"는 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 상에 위치한 Fc 수용체 또는 전형적 보체계의 제1 성분 (C1q)에 대한 결합을 포함한, 숙주 조직 또는 인자에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개하는 항체의 중쇄의 C-말단 영역을 지칭한다. 따라서, Fc 영역은 제1 불변 영역 이뮤노글로불린 도메인을 제외한 항체의 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드이다. IgG, IgA 및 IgD 항체 이소형에서, Fc 영역은 항체의 2개의 중쇄의 제2 (C_H2) 및 제3 (C_H2) 불변 도메인으로부터 유래된 2개의 동일한 단백질 단편으로 구성되고; IgM 및 IgE Fc 영역은 각각의 폴리펩티드 쇄에 3개의 중쇄 불변 도메인 (C_H 도메인 2-4)을 함유한다. IgG의 경우, Fc 영역은 이뮤노글로불린 도메인 Cγ2 및 Cγ3 및 Cγ1과 Cγ2 사이의 힌지를 포함한다. 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로 위치 C226 또는 P230에서의 아미노산 잔기로부터 중쇄의 카르복시-말단까지의 스트레치로 정의되며, 여기서 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스에 따른다. 인간 IgG Fc 영역의 C_H2 도메인은 약 아미노산 231에서 약 아미노산 340까지에 이르는 반면, C_H3 도메인은 Fc 영역 내의 C_H2 도메인의 C-말단 측에 위치하며, 즉 이는 IgG의 약 아미노산 341에서 약 아미노산 447까지에 이른다. 본원에 사용된 Fc 영역은 천연 서열 Fc 또는 변이체 Fc일 수 있다. Fc는 또한 단리된 상태의 이 영역 또는 Fc-포함 단백질 폴리펩티드, 예컨대 "Fc 융합 단백질" (예를 들어, 항체 또는 이뮤노어드헤신)로도 지칭되는 "Fc 영역을 포함하는 결합 단백질"과 관련하여 이 영역을 지칭할 수 있다.

표 1

인간 FcγR의 특성

"면역 반응"은 외래 작용제에 대한 척추동물 내에서의 생물학적 반응을 지칭하며, 이 반응은 이들 작용제 및 그에 의해 유발된 질환에 대해 유기체를 보호한다. 면역 반응은 침입 병원체, 병원체로 감염된 세포 또는 조직, 암성 또는 다른 비정상 세포, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우에 정상 인간 세포 또는 조직의 선택적 표적화, 그에 대한 결합, 그에 대한 손상, 그의 파괴 및/또는 그의 척추동물 신체로부터의 제거를 유발하는, 면역계의 세포 (예를 들어, T 림프구, B 림프구, 자연 킬러 (NK) 세포, 대식세포, 호산구, 비만 세포, 수지상 세포 또는 호중구) 및 이들 세포 중 임의의 것 또는 간에 의해 생산된 가용성 거대분자 (항체, 시토카인 및 보체 포함)의 작용에 의해 매개된다.

"면역조정제" 또는 "면역조절제"는 면역 반응을 조정, 조절 또는 변형시키는데 수반될 수 있는 신호전달 경로의 성분을 지칭한다. 면역 반응의 "조정", "조절" 또는 "변형"은 면역계의 세포에서 또는 이러한 세포의 활성에서의 임의의 변경을 지칭한다. 이러한 조정은 다양한 세포 유형의 수의 증가 또는 감소, 이들 세포의 활성의 증가 또는 감소, 또는 면역계 내에서 발생할 수 있는 임의의 다른 변화에 의해 나타날 수 있는 면역계의 자극 또는 억제를 포함한다. 억제 및 자극 면역조정제 둘 다가 확인되었으며, 이들 중 일부는 종양 미세환경에서 증진된 기능을 가질 수 있다. 개시된 발명의 바람직한 실시양태에서, 면역조정제는 T 세포의 표면 상에 위치한다. "면역조정 표적" 또는 "면역조절 표적"은 물질, 작용제, 모이어티, 화합물 또는 분자에 의한 결합에 대해 표적화되고, 그의 결합에 의해 활성이 변경되는 면역조정제이다. 면역조정 표적은, 예를 들어 세포 표면 상의 수용체 ("면역조정 수용체") 및 수용체 리간드 ("면역조정 리간드")를 포함한다.

"면역요법"은 면역 반응을 유도하거나, 증진시키거나, 억제하거나 또는 달리 변형시키는 것을 포함하는 방법에 의해 질환을 앓거나, 질환에 걸릴 위험이 있거나 또는 질환의 재발을 앓고 있는 대상체를 치료하는 것을 지칭한다.

"내인성 면역 반응을 강화시키는 것"은 대상체에서 기존 면역 반응의 유효성 또는 효력을 증가시키는 것을 의미한다. 이러한 유효성 및 효력의 증가는, 예를 들어 내인성 숙주 면역 반응을 억제하는 메카니즘을 극복함으로써 또는 내인성 숙주 면역 반응을 증진시키는 메카니즘을 자극함으로써 달성될 수 있다.

"단백질"은 쇄의 길이에 대한 상한치 없이 적어도 2개의 연속적으로 연결된 아미노산 잔기를 포함하는 쇄를 지칭한다. 단백질 내의 1개 이상의 아미노산 잔기는 변형, 예컨대 비제한적으로 글리코실화, 인산화 또는 디술피드 결합 형성을 함유할 수 있다. 용어 "단백질"은 본원에서 "폴리펩티드"와 상호교환가능하게 사용된다.

"대상체"는 임의의 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다. 용어 "비-인간 동물"은 척추동물, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 토끼, 설치류, 예컨대 마우스, 래트 및 기니 피그, 조류 종, 예컨대 닭, 양서류 및 파충류를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 대상체는 포유동물, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 토끼, 페릿 또는 설치류이다. 개시된 발명의 임의의 측면의 보다 바람직한 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.

약물 또는 치료제, 예컨대 본 발명의 Fc 융합 단백질의 "치료 유효량" 또는 "치료 유효 투여량"은 단독으로 또는 또 다른 치료제와 조합되어 사용되는 경우에 질환 증상의 중증도의 감소, 질환 무증상 기간의 빈도 및 지속기간의 증가, 또는 질환 고통으로 인한 손상 또는 장애의 방지에 의해 입증되는 질환 퇴행을 촉진하는 약물의 임의의 양이다. 약물의 치료 유효량 또는 유효 투여량은 "예방 유효량" 또는 "예방 유효 투여량"을 포함하며, 이는 질환이 발생할 위험 또는 질환의 재발을 앓을 위험이 있는 대상체에게 단독으로 또는 또 다른 치료제와 조합되어 투여되는 경우에 질환의 발생 또는 재발을 억제하는 약물의 임의의 양이다. 질환 퇴행을 촉진하거나 질환의 발생 또는 재발을 억제하는 치료제의 능력은 숙련된 진료의에게 공지된 다양한 방법을 사용하여, 예컨대 임상 시험 동안 인간 대상체에서, 인간에서의 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서, 또는 시험관내 검정에서 작용제의 활성을 검정함으로써 평가될 수 있다.

예로서, 항암제는 대상체에서 암 퇴행을 촉진한다. 바람직한 실시양태에서, 약물의 치료 유효량은 암을 제거하는 지점까지 암 퇴행을 촉진한다. "암 퇴행을 촉진하는 것"은 유효량의 약물을 단독으로 또는 항신생물제와 조합하여 투여하여 환자에서 종양 성장 또는 크기의 감소, 종양의 괴사, 적어도 1종의 질환 증상의 중증도의 감소, 질환 무증상 기간의 빈도 및 지속기간의 증가, 질환 고통으로 인한 손상 또는 장애의 방지, 또는 달리 질환 증상의 호전을 유발하는 것을 의미한다. 추가로, 치료와 관련하여 용어 "유효한" 및 "유효성"은 약리학적 유효성 및 생리학적 안전성 둘 다를 포함한다. 약리학적 유효성은 환자에서 암 퇴행을 촉진하는 약물의 능력을 지칭한다. 생리학적 안전성은 약물의 투여로부터 유발되는 세포, 기관 및/또는 유기체 수준에서의 독성 또는 다른 유해 생리학적 효과 (유해 효과)의 수준을 지칭한다.

종양의 치료에 대한 예로서, 치료 유효량 또는 유효 투여량의 약물은 바람직하게는 세포 성장 또는 종양 성장을 비치료 대상체에 비해 적어도 약 20%, 보다 바람직하게는 적어도 약 40%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 60%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 80%만큼 억제한다. 가장 바람직한 실시양태에서, 치료 유효량 또는 유효 투여량의 약물은 세포 성장 또는 종양 성장을 완전히 억제하고, 즉 바람직하게는 세포 성장 또는 종양 성장을 100%만큼 억제한다. 종양 성장을 억제하는 화합물의 능력은 인간 종양에서의 효능을 예측하는 동물 모델 시스템, 예컨대 본원에 기재된 CT26 결장 선암종, MC38 결장 선암종 및 Sa1N 섬유육종 마우스 종양 모델에서 평가될 수 있다. 대안적으로, 이러한 조성물의 특성은 세포 성장을 억제하는 화합물의 능력을 검사함으로써 평가될 수 있고, 이러한 억제는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 검정에 의해 시험관내에서 측정될 수 있다. 본 발명의 다른 바람직한 실시양태에서, 종양 퇴행은 적어도 약 20일, 보다 바람직하게는 적어도 약 40일 또는 보다 더 바람직하게는 적어도 약 60일의 기간 동안 관찰되고 계속될 수 있다.

대상체의 "치료" 또는 "요법"은 질환과 연관된 증상, 합병증, 상태 또는 생화학적 징후의 발병, 진행, 발달, 중증도 또는 재발을 역전시키거나, 완화시키거나, 호전시키거나, 억제하거나, 늦추거나 또는 방지할 목적으로 대상체에 대해 수행되는 임의의 유형의 개입 또는 과정 또는 대상체에게 활성제를 투여하는 것을 지칭한다.

낮은 pH에서의 결합에 대한 증진된 선호도를 갖는 항-CTLA-4 항체

한 측면에서, 본 발명은 정상 조직에서의 pH 7.2 내지 7.4와 비교하여, 낮은 pH에서, 예컨대 pH 6.5 내지 6.9를 가질 수 있는 종양 미세환경에서의 결합에 대한 증진된 선호도를 갖는 개선된 항-CTLA-4 항체, 예컨대 개선된 형태의 이필리무맙을 제공한다. 도 14a-14c를 참조한다. 이러한 항체는 이필리무맙과 비교하여 개선된 치료 지수를 나타낼 것으로 예상될 것이며, 즉 이들은 부작용 (말초 비-종양 조직에서의 결합에 의해 매개됨) 대비 항종양 활성 (다른 낮은 pH 구획의 종양 미세환경에서의 결합을 요구함)의 개선된 비를 가질 것이다. 부작용의 감소는 특히 보다 높은 용량에서 항-CTLA-4 요법에 의해 관찰된 유해 사건의 수준에 비추어 유의한 이점을 나타낼 수 있다. 문헌 [Ribas et al. (2013) J. Clin. Oncology 31:616; Feng et al. (2013) Clin. Cancer 19:3977].

낮은 및 생리학적 pH에서의 구체적인 K_D 값에 따라, 본 발명의 개선된 항체는 이필리무맙에 사용되는 것보다 더 높거나, 더 낮거나 또는 동등한 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 항체는 모두 반드시 1.0 초과의 CAPBP를 가지며, 다음 3가지 카테고리에 속한다: 낮은 및 생리학적 pH 둘 다에서 증진된 친화도 (유형 I); 낮은 및 생리학적 pH 둘 다에서 더 낮은 친화도 (유형 II); 및 낮은 pH에서 증진된 친화도이지만 생리학적 pH에서 더 낮은 친화도 (유형 III). 유형 I 항체는 항종양 효능을 보유하면서, 예를 들어 이필리무맙보다 더 낮게 투여될 수 있다. 유형 III 항체는 부작용의 증가 없이, 예를 들어 이필리무맙보다 더 높게 투여될 수 있다. 유형 II 항체는 목표가 각각 안전성을 최대화하는 것인지, 효능을 최대화하는 것인지 또는 이들 둘 사이에 균형을 이루는 것인지에 따라, 예를 들어 이필리무맙보다 더 낮게, 더 높게 또는 그와 동일하게 투여될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 항체는 목적하는 효능 및 안전성을 제공하는 모든 용량으로 투여될 수 있고, 가능한 용량의 범위는 그의 증진된 치료 지수로 인해 이필리무맙보다 더 폭넓을 것이다.

다른 항체는 더 낮은 pH에서의 결합을 선택적으로 변경시키도록 조작되었다. 토실리주맙 (항-IL-6R)은, pH 6.0에서 선택적으로 결합을 감소시켜 산성 엔도솜에서 결합된 IL-6R로부터의 해리를 증진시키고, 항체를 혈장 내로의 방출을 위해 유리시켜 또 다른 IL-6R에 결합하도록 변형되었다. 문헌 [Igawa et al. (2010) Nat. Biotechnol. 28:1203]. 항-PCSK-9 항체 (Chaparro-Riggers et al. (2012) J. Biol. Chem. 287:11090), IL-6 항체 (Devanaboyina et al. (2013) mAbs 5:851), 항-보체 C5 mAb (Fukuzawa et al. (2017) Sci. Reports 7:1080) 및 항-TNFα 항체 아달리무맙 (Schroeter et al. (2015) mAbs 7:138)을 사용하여 유사한 접근법을 취하였다. 각각의 이들 경우는, 본 발명과 달리, 항체 재순환을 증진시키기 위해 중성/생리학적 pH와 비교하여 낮은 pH에서 상대 친화도를 감소시키는 것을 수반하였다.

이필리무맙과 비교하여 낮은 pH에서 우선적 결합 친화도를 갖는 다양한 항-인간 CTLA-4 항체를 본원의 도면 및 실시예에 예시된 바와 같이 설계하고 선택하였다. 간략하게, 아미노산을 이필리무맙의 CDR 내로 도입하여 그의 결합의 pH 감수성을 증가시키도록 핵산의 라이브러리를 설계하고, 낮은 pH에서 우선적 결합의 목적하는 특성을 갖는 항체를 선택하였다. 항체의 특성 및 서열은 표 4, 5, 6, 7에 및 표 8에 요약된 서열 목록에 제공된다. 본 발명의 항-인간 CTLA-4 항체에 의한 낮은 pH에서의 결합에 대한 선호도는 도 8a-8c로부터 가시적으로 분명하며, 여기서 항체는 낮은 pH에서의 우선적 결합에 상응하는 플롯의 4분면에서 클러스터링되어 있고, 도 9 및 가장 명확하게는 도 14a에서 가시적으로 분명하다. 항체는 또한 시노 CTLA-4에 대한 낮은 pH 결합을 선호하는 동일한 경향을 나타내며 (도 15a), 이는 시노몰구스 마카크가 우수한 독성학 모델일 것임을 시사한다.

본 발명의 항체는 SPR 실험에서 뿐만 아니라 세포 표면 상에서 발현되는 경우에 huCTLA-4에 결합하는 것으로 제시된다 (도 10a-10b, 11a-11b, 12a-12c, 13a-13c, 16a-16c, 17a-17f 및 18a-18c). 본 발명의 선택된 항체 (ipi.64, ipi.106 및 ipi.105)는 또한 모든 항체가 비푸코실화 IgG1로서 발현된 경우에, huCTLA-4 녹-인 마우스를 사용한 마우스 종양 모델에서 종양 성장을 억제하는데 있어서 이필리무맙만큼 효과적인 것으로 나타났다 (도 19a-19m). 이들 항체는 또한 종양 미세환경에서 Treg 수준을 이필리무맙만큼 잘 감소시키면서 (도 20b) 말초에서 더 적은 증진 효과를 갖는 것으로 나타났으며 (도 20a), 이는 이들이 말초 T 세포 활성화로부터 유발되는 것으로 공지된 부작용을 환자에서 더 적게 도출할 수 있다는 것을 시사한다. 이들 동일한 항체는 또한 말초 Treg에서 더 적은 활성화 (도 21a) 및 증식 (도 21b)을 도출하는 것으로 나타났으며, 이는 본 발명의 pH 감수성 항-huCTLA-4 항체, 예컨대 ipi.106 및 ipi.105 (푸코실화 또는 비-푸코실화)가 감소된 말초 독성을 가지면서 이필리무맙의 항종양 효능을 보유할 수 있다는 관점과 일치한다. 이러한 개선된 항체는 일반적으로 독성에 의해 투여가 제한되는 이필리무맙보다 더 높은 용량으로 투여되어 증진된 효능을 제공할 수 있거나, 또는 동등한 효능을 갖지만 더 큰 안전성/내약성을 가지면서 이필리무맙과 동일하게 투여될 수 있다.

표적화된 항원 결합

다양한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 항원 결합이 유해할 조직 및 환경에서는 항원 결합을 선택적으로 차단하지만, 유익할 항원 결합은 허용하도록 변형된다. 한 실시양태에서, 항체의 항원 결합 표면에 특이적으로 결합하고 항원 결합을 방해하는 차단 펩티드 "차폐물"이 생성되고, 이 차폐물은 펩티다제 절단가능한 링커에 의해 항체의 각각의 결합 아암에 연결된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 8,518,404 (시톰엑스(CytomX))를 참조한다. 또한, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2018/085555를 참조한다. 이러한 구축물은 비-종양 조직과 비교하여 종양 미세환경에서 프로테아제 수준이 크게 증가된 암의 치료에 유용하다. 종양 미세환경에서의 절단가능한 링커의 선택적 절단은 차폐/차단 펩티드의 해리를 가능하게 하여, 항원 결합이 원치않는 부작용을 유발할 수 있는 말초 조직에서보다는 종양에서 선택적으로 항원 결합을 가능하게 한다. 이러한 변형은 말초와 비교하여 낮은 pH 및 종양-특이적 프로테아제를 갖는 종양 부위에 대한 이필리무맙 활성의 특이성을 추가로 증진시킬 것이기 때문에 본 발명의 항체의 낮은 pH 선호도의 이익을 증진시킬 것이다.

대안적으로, 관련 실시양태에서, (2가) 항체의 둘 다의 항원 결합 표면에 결합하고 항원 결합을 방해하는 2개의 항원 결합 도메인을 포함하는 2가 결합 화합물 ("차폐 리간드")이 개발되며, 여기서 2개의 결합 도메인 차폐물은, 예를 들어 펩티다제에 의해 절단가능한, 절단가능한 링커에 의해 서로에 (항체에는 아님) 연결된다. 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2010/077643 (테고팜 코포레이션(Tegopharm Corp.))을 참조한다. 차폐 리간드는 항체가 결합하고자 의도하는 항원을 포함할 수 있거나 또는 이로부터 유래될 수 있거나 또는 독립적으로 생성될 수 있다. 이러한 차폐 리간드는 비-종양 조직과 비교하여 종양 미세환경에서 프로테아제 수준이 크게 증가된 암의 치료에 유용하다. 종양 미세환경에서의 절단가능한 링커의 선택적 절단은 2개의 결합 도메인 서로의 해리를 가능하게 하여, 항체의 항원-결합 표면에 대한 결합력을 감소시킨다. 그 결과 항체로부터 차폐 리간드의 해리는 항원 결합이 원치않는 부작용을 유발할 수 있는 말초 조직에서보다는 종양에서 선택적으로 항원 결합을 가능하게 한다.

본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자

본 개시내용의 또 다른 측면은 본 발명의 임의의 개선된 항-CTLA-4 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 핵산은 전세포, 세포 용해물 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은, 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있고, 인트론 서열을 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있다. 특정 실시양태에서, DNA는 게놈 DNA, cDNA 또는 합성 DNA, 즉 실험실에서, 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 또는 화학적 합성에 의해 합성된 DNA이다.

증진된 이펙터 기능을 갖는 pH 감수성 항-CTLA-4 항체

항체의 Fc 영역에 대한 다양한 변형이 이펙터 기능을 증진시키는 것으로 밝혀졌다. 마우스에서, 활성화 Fc 감마 수용체에 대한 증진된 결합 및 Fc 감마 억제 수용체에 대한 감소된 결합은 다음 계층을 따른다: mIgG2a >> mIgG2b >> mIgG1-D265A. 이 계층은 문헌 [Nimmerjahn & Ravetch (2005) Science 310:1510]에 의해 정의되고 ADCC 기능을 매개하는 항체에 대해 결정된, 활성화 Fc 수용체 대 억제 Fc 수용체에 대한 이뮤노글로불린 Fc 영역의 결합의 활성 비 (A/I 비로 공지됨)를 따른다.

특정 측면에서, 본 발명의 pH 감수성 항-CTLA-4 항체는 인간 IgG1 항체이다. 본 발명의 항-CTLA-4 항체에서의 ADCC 활성은, 예를 들어 Fc 영역에 1개 이상의 아미노산 치환을 도입하거나, N-연결된 글리칸에서의 글리코실화 패턴을 변경시키거나 또는 둘 다에 의해 증진될 수 있다.

이펙터 기능을 증진시키는 Fc 돌연변이

일부 실시양태에서, 본 발명의 pH 감수성 항-CTLA-4 항체의 ADCC 활성은 Fc 영역의 아미노산 서열을 변형시킴으로써, 예를 들어 ADCC를 증진시키기 위해 자연 발생 인간 IgG1 서열에 돌연변이를 부가함으로써 증가된다. ADCC 활성과 관련하여, 인간 IgG1

IgG3 ≫ IgG4

IgG2이므로, IgG2 또는 IgG4보다는 IgG1 불변 도메인이 ADCC를 증진시키기 위한 출발점으로서 선택될 수 있다. 본원에 정의된 바와 같이, 이필리무맙에서 발생하는 바와 같은 비변형된 인간 IgG1은 증진된 ADCC를 갖지 않는다. Fc 영역은 하기 위치: 234, 235, 236, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 313, 315, 320, 322, 324, 325, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 433, 434, 435, 436, 437, 438 또는 439에서 1개 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 증가시키고/거나 Fcγ 수용체 (FcγR)에 대한 친화도를 증가시키도록 변형될 수 있다. WO 2012/142515를 참조하고; 또한 WO 00/42072를 참조한다. 예시적인 개별 치환은 236A, 239D, 239E, 268D, 267E, 268E, 268F, 324T, 332D 및 332E를 포함한다. 예시적인 변이체 클러스터는 239D/332E, 236A/332E, 236A/239D/332E, 268F/324T, 267E/268F, 267E/324T 및 267E/268F/324T를 포함한다. 예를 들어, 임의로 I332E와 조합될 수 있는 G236A 변이체를 포함하는 인간 IgG1Fc는 FcγIIA / FcγIIB 결합 친화도 비를 대략 15배 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 문헌 [Richards et al. (2008) Mol. Cancer Therap. 7:2517; Moore et al. (2010) mAbs 2:181]. FcyR 및 보체 상호작용을 증진시키기 위한 다른 변형은 치환 298A, 333A, 334A, 326A, 247I, 339D, 339Q, 280H, 290S, 298D, 298V, 243L, 292P, 300L, 396L, 305I 및 396L을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이들 및 다른 변형은 문헌 [Strohl (2009) Current Opinion in Biotechnology 20:685-691]에서 검토된다. 구체적으로, ADCC 및 CDC 둘 다는 IgG1의 위치 E333에서의 변화, 예를 들어 E333A에 의해 증진될 수 있다. 문헌 [Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591]. IgG1에서 이펙터 기능을 증진시키기 위한 P247I 및 A339D/Q 돌연변이의 사용은 WO 2006/020114에 개시되어 있고, D280H, K290S ± S298D/V는 WO 2004/074455에 개시되어 있다. K326A/W 및 E333A/S 변이체는 인간 IgG1에서, E333S는 IgG2에서 이펙터 기능을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 문헌 [Idusogie et al. (2001) J. Immunol. 166:2571]. 다른 실험은 G236A/S239D/A330L/I332E가 FcRIIa 및 FcRIIIa에 대한 증진된 결합을 유발하는 것으로 제시하였다. 문헌 [Smith et al. (2012) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 109:6181; Bournazos et al. (2014) Cell 158:1243].

달리 나타내지 않는 한 또는 문맥으로부터 명확하지 않는 한, 항체의 Fc 영역 내의 아미노산 잔기 넘버링은 EU 넘버링 규정에 따르며 (문헌 [Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD]에서와 같은 EU 인덱스; 또한 미국 특허 출원 공개 번호 2008/0248028의 도 3c-3f 참조), 단 서열 목록에서의 서열 내의 잔기를 구체적으로 언급하는 경우는 제외하고, 이 경우 넘버링은 반드시 연속적이다. 예를 들어, Fc 영역 내의 아미노산 치환의 효과에 관한 참고 문헌은 전형적으로 EU 넘버링을 사용할 것이며, 이는 항체의 Fc 영역 내의 임의의 주어진 잔기를 그것이 부착되는 가변 도메인의 길이와 관계없이 동일한 번호에 의해 언급되도록 한다. 드문 경우, 언급된 정확한 Fc 잔기를 확인하기 위해 언급된 문서를 참조하는 것이 필요할 수 있다.

구체적으로, FcγR1, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위가 맵핑되었고, 개선된 결합을 갖는 변이체가 기재되었다. 문헌 [Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604]. 조합 돌연변이체 T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A 및 S298A/E333A/K334A를 포함한, 위치 256, 290, 298, 333, 334 및 339에서의 특정 돌연변이가 FcγRIII에 대한 결합을 개선시키는 것으로 제시되었다 (증진된 FcγRIIIa 결합 및 ADCC 활성을 가짐). S239D/I332E 및 S239D/I332E/A330L 돌연변이를 갖는 변이체를 포함한, FcγRIIIa에 대한 강하게 증진된 결합을 갖는 다른 IgG1 변이체가 확인되었으며, 이는 시노몰구스 원숭이에서 FcγRIIIa에 대한 친화도의 최대 증가, FcγRIIb 결합의 감소 및 강한 세포독성 활성을 나타냈다. 문헌 [Lazar et al. (2006) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 103:4005; Awan et al. (2010) Blood 115:1204; Desjarlais & Lazar (2011) Exp. Cell Res. 317:1278]. 항체, 예컨대 알렘투주맙 (CD52-특이적), 트라스투주맙 (HER2/neu-특이적), 리툭시맙 (CD20-특이적) 및 세툭시맙 (EGFR-특이적) 내로의 삼중 돌연변이의 도입은 시험관내에서 크게 증진된 ADCC 활성으로 번역되었고, S239D/I332E 변이체는 마카크에서 B 세포를 고갈시키는 증진된 능력을 나타냈다. 문헌 [Lazar et al. (2006) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 103:4005]. 추가로, B 세포 악성종양 및 유방암 모델에서 인간 FcγRIIIa를 발현하는 트랜스제닉 마우스에서 FcγRIIIa에 대한 증진된 결합 및 수반하여 증진된 ADCC 활성을 나타낸 L235V, F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P396L 돌연변이를 함유하는 IgG1 돌연변이체가 확인되었다. 문헌 [Stavenhagen et al. (2007) Cancer Res. 67:8882; 미국 특허 번호 8,652,466; Nordstrom et al. (2011) Breast Cancer Res. 13:R123].

상이한 IgG 이소형은 또한 차등 CDC 활성을 나타낸다 (IgG3>IgG1>>IgG2

IgG4). 문헌 [Dangl et al. (1988) EMBO J. 7:1989]. 증진된 CDC를 목적으로 하는 사용을 위해, C1q에 대한 결합을 증가시키는 돌연변이를 도입하는 것이 또한 가능하다. 보체를 동원하는 능력 (CDC)은 보체 캐스케이드의 제1 성분인 C1q에 대한 결합을 증가시키기 위한 IgG2 내의 K326 및/또는 E333에서의 돌연변이, 예컨대 K326W (ADCC 활성을 감소시킴) 및 E333S에 의해 증진될 수 있다. 문헌 [Idusogie et al. (2001) J. Immunol. 166:2571]. 인간 IgG1 내로 S267E / H268F / S324T를 (단독으로 또는 임의의 조합으로) 도입하는 것은 C1q 결합을 증진시킨다. 문헌 [Moore et al. (2010) mAbs 2:181]. 문헌 [Natsume et al. (2008) Cancer Res. 68:3863] (그 안의 도 1)의 IgG1/IgG3 하이브리드 이소형 항체 "113F"의 Fc 영역은 또한 증진된 CDC를 부여한다. 또한, 문헌 [Michaelsen et al. (2009) Scand. J. Immunol. 70:553 및 Redpath et al. (1998) Immunology 93:595]을 참조한다.

이펙터 기능을 증가 또는 감소시킬 수 있는 추가의 돌연변이가 문헌 [Dall'Acqua et al. (2006) J. Immunol. 177:1129]에 개시되어 있다. 또한, 문헌 [Carter (2006) Nat. Rev. Immunol. 6:343; Presta (2008) Curr. Op. Immunol. 20:460]을 참조한다.

감소된 푸코실화, 비푸코실화 및 저푸코실화

본 발명의 항체와 FcγR의 상호작용은 또한 각각의 Fc 단편에 N297 잔기에서 부착된 글리칸 모이어티를 변형시킴으로써 증진될 수 있다. 특히, 코어 푸코스 잔기의 부재는 항원 결합 또는 CDC를 변경시키지 않으면서 활성화 FcγRIIIA에 대한 IgG의 개선된 결합을 통해 ADCC를 강하게 증진시킨다. 문헌 [Natsume et al. (2009) Drug Des. Devel. Ther. 3:7]을 참조한다. 비-푸코실화 종양-특이적 항체가 생체내 마우스 모델에서 증진된 치료 활성으로 번역된다는 확실한 증거가 존재한다. 문헌 [Nimmerjahn & Ravetch (2005) Science 310:1510; Mossner et al. (2010) Blood 115:4393].

항체 글리코실화의 변형은, 예를 들어 변경된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포에서 항체를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 증진된 ADCC를 나타내는, 감소된 또는 제거된 푸코실화를 갖는 항체가 본 발명의 방법에 특히 유용하다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 관련 기술분야에서 기재되었고, 본 개시내용의 재조합 항체를 발현시켜 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생산하기 위한 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포주 Ms704, Ms705 및 Ms709는 푸코실트랜스퍼라제 유전자 FUT8 (α-(1,6) 푸코실트랜스퍼라제)이 결여되어 있어서 (미국 특허 출원 공개 번호 20040110704; 문헌 [Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol. Bioeng. 87: 614] 참조), 이들 세포주에서 발현된 항체는 그의 탄수화물 상에 푸코스가 결여되어 있다. 또 다른 예로서, EP 1176195는 또한 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주, 뿐만 아니라 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-아세틸글루코사민에 푸코스를 부가하는 활성이 거의 또는 전혀 없는 세포주, 예를 들어 래트 골수종 세포주 YB2/0 (ATCC CRL 1662)을 기재한다. PCT 공개 WO 03/035835는 Asn(297)-연결된 탄수화물에 푸코스를 부착시키는 능력이 감소된 변이체 CHO 세포주 Lec13, 또한 이로 인해 그 숙주 세포에서 발현된 항체의 저푸코실화를 기재한다. 또한, 문헌 [Shields et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733]을 참조한다. 변형된 글리코실화 프로파일을 갖는 항체는 또한 PCT 공개 번호 WO 2006/089231에 기재된 바와 같이 계란에서 생산될 수 있다. 대안적으로, 변형된 글리코실화 프로파일을 갖는 항체는 식물 세포, 예컨대 렘나에서 생산될 수 있다. 예를 들어, 미국 공개 번호 2012/0276086을 참조한다. PCT 공개 번호 WO 99/54342는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제 (예를 들어, 베타(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주, 이에 따라 조작된 세포주에서 발현된 항체가 항체의 증가된 ADCC 활성을 유발하는 증가된 양분성 GlcNac 구조를 나타낸다는 것을 기재한다. 또한, 문헌 [Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176]을 참조한다. 대안적으로, 항체의 푸코스 잔기는 푸코시다제 효소를 사용하여 절단될 수 있다. 예를 들어, 효소 알파-L-푸코시다제는 항체로부터 푸코실 잔기를 제거한다. 문헌 [Tarentino et al. (1975) Biochem. 14:5516]. 감소된 푸코실화를 갖는 항체는 또한 미국 특허 번호 8,642,292에 기재된 바와 같이 기질로서 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥실로스를 사용하는 효소, 예컨대 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥실로스 리덕타제 (RMD)를 코딩하는 재조합 유전자를 보유하는 세포에서 생산될 수 있다. 대안적으로, 세포는 푸코스 유사체를 함유하는 배지에서 성장될 수 있으며, 이는 푸코스 잔기가 N-연결된 글리칸 또는 당단백질, 예컨대 그 배지에서 성장된 세포에 의해 생산된 항체에 부가되는 것을 차단한다. 미국 특허 번호 8,163,551; WO 09/135181.

비-푸코실화 항체는 푸코실화 항체와 비교하여 크게 증진된 ADCC를 나타내기 때문에, 항체 제제는 본 발명의 방법에 유용하기 위해 푸코실화 중쇄가 완전히 없을 필요는 없다. 푸코실화 중쇄의 잔류 수준은 실질적으로 비-푸코실화 중쇄의 제제의 ADCC 활성을 유의하게 방해하지 않을 것이다. 그럼에도 불구하고, 코어 푸코스를 N-글리칸에 부가하는데 완전히 적격인 통상적인 CHO 세포에서 생산된 항체는 수 퍼센트 내지 최대 15%의 비-푸코실화 항체를 포함할 수 있다. 비-푸코실화 항체는 CD16에 대해 10배 더 높은 친화도 및 ADCC 활성의 최대 30배 내지 100배 증진을 나타낼 수 있고, 따라서 비-푸코실화 항체의 비율의 작은 증가조차도 제제의 ADCC 활성을 극적으로 증가시킬 수 있다. 배양물 중 정상 CHO 세포에서 생산될 것보다 더 많은 비-푸코실화 항체를 포함하는 임의의 제제는 일부 수준의 증진된 ADCC를 나타낼 수 있다. 이러한 항체 제제는 본원에서 감소된 푸코실화를 갖는 제제로 지칭된다. 정상 CHO 세포로부터 수득된 비-푸코실화의 원래 수준에 따라, 감소된 푸코실화 제제는 적게는 50%, 30%, 20%, 10% 및 심지어 5%의 비-푸코실화 항체를 포함할 수 있다. 감소된 푸코실화는 정상 CHO 세포에서 제조된 항체와 비교하여 ADCC의 2배 이상의 증진을 나타내는 제제로서 기능적으로 정의되며, 비-푸코실화 종의 임의의 고정된 백분율에 관하여서는 그렇지 않다.

다른 실시양태에서, 비푸코실화의 수준은 구조적으로 정의된다. 본원에 사용된 비푸코실화 항체 제제는 95% 초과의 비-푸코실화 항체 중쇄 (100% 포함)를 포함하는 항체 제제이다. 저푸코실화 항체 제제는 95% 이하의 푸코스 결여 중쇄를 포함하는 항체 제제, 예를 들어 중쇄의 80 내지 95%, 예컨대 85 내지 95% 및 90 내지 95%에 푸코스가 결여된 항체 제제이다. 달리 나타내지 않는 한, 저푸코실화는 중쇄의 80 내지 95%에 푸코스가 결여된 항체 제제를 지칭하고, 비푸코실화는 중쇄의 95% 초과에 푸코스가 결여된 항체 제제를 지칭하고, "저푸코실화 또는 비푸코실화"는 중쇄의 80% 이상에 푸코스가 결여된 항체 제제를 지칭한다.

일부 실시양태에서, 저푸코실화 또는 비푸코실화 항체는 푸코실화에 필수적인 효소, 예컨대 FUT8에 의해 코딩되는 알파1,6-푸코실트랜스퍼라제가 결여된 세포 (예를 들어 미국 특허 번호 7,214,775), 또는 외인성 효소가 푸코실화를 위한 대사 전구체의 풀을 부분적으로 고갈시키는 세포 (예를 들어 미국 특허 번호 8,642,292), 또는 푸코실화에 수반되는 효소의 소분자 억제제의 존재 하에 배양된 세포 (예를 들어 WO 09/135181)에서 생산된다.

항체 제제 중 푸코실화의 수준은 겔 전기영동, 액체 크로마토그래피 및 질량 분광측정법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 달리 나타내지 않는 한, 본 발명의 목적상, 항체 제제 중 푸코실화의 수준은 본질적으로 실시예 3에 기재된 바와 같이 친수성 상호작용 크로마토그래피 (또는 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피, HILIC)에 의해 결정된다. 항체 제제의 푸코실화 수준을 결정하기 위해, 샘플을 PNGase F로 변성 처리하여 N-연결된 글리칸을 절단하고, 이어서 이를 푸코스 함량에 대해 분석한다. 전장 항체 쇄의 LC/MS는 항체 제제의 푸코실화 수준을 검출하는 대안적 방법이지만, 질량 분광분석법은 본질적으로 덜 정량적이다.

제약 조성물

본 발명의 개선된 항-CTLA-4 항체는 결합 단백질, 예를 들어 항체 또는 그의 단편 및 제약상 허용되는 담체를 함유하는 조성물, 예를 들어 제약 조성물 중에 구성될 수 있다. 본원에 사용된 "제약상 허용되는 담체"는 생리학상 상용성인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 피하, 근육내, 비경구, 척수 또는 표피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의함)에 적합하다. 본 발명의 제약 조성물은 1종 이상의 제약상 허용되는 염, 항산화제, 수성 및 비-수성 담체 및/또는 아주반트, 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 포함할 수 있다.

투여 요법은 최적의 목적하는 반응, 예를 들어 치료 반응 또는 최소 유해 효과를 제공하도록 조정된다. 본 발명의 개선된 항체는 이필리무맙과 동일한 투여량으로, 그러나 개선된 안전성을 가지면서 투여될 수 있다. 대안적으로, 이들은, 예를 들어 해당 항체가 대략 pH 7.4인 말초 조직에서 보다 낮은 친화도 (또는 달리 보다 불량한 결합 활성 및/또는 활성)를 나타내는 경우에, 이필리무맙보다 더 높은 용량으로 투여될 수 있다. 전이성 또는 절제불가능한 흑색종의 경우, 예르보이(YERVOY)® (이필리무맙)는 총 4회 용량에 대해 3주마다 90분에 걸쳐 3 mg/kg으로 정맥내로 투여된다. 흑색종에서 아주반트로서의 사용을 위해, 예르보이® (이필리무맙)는 10 mg/kg으로 정맥내로 투여된다. 진행성 신세포 암종 또는 미소위성체 불안정성-높은 (MSI-H) 또는 미스매치 복구 결핍 (dMMR) 전이성 결장직장암을 위해 항-PD1 항체 옵디보(OPDIVO)® (니볼루맙)와 조합하여 사용하는 경우, 예르보이® (이필리무맙)는 1 mg/kg으로 정맥내로 투여된다.

일부 실시양태에서, 예를 들어 본 발명의 항-CTLA-4 항체 이필리무맙이 유형 I 항체인 경우에, 이는 이필리무맙에 대해 승인된 용량보다 더 낮은 용량으로 투여된다. 이러한 더 낮은 용량은 비변형된 이필리무맙을 사용한 치료와 비교하였을 때 유의하게 증진된 부작용 없이 등가의 또는 심지어 증진된 항종양 효능을 나타낼 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 이들은 절제불가능한 또는 전이성 흑색종을 치료하기 위해 3 mg/kg 미만, 예컨대 2 mg/kg, 1 mg/kg, 0.5 mg/kg 또는 그 미만으로 투여된다. 다른 실시양태에서, 이들은 총 림프절절제술을 포함한 완전 절제를 받은, 1 mm 초과의 부위 림프절의 병리학적 침범이 있는 피부 흑색종을 갖는 환자의 아주반트 치료를 위해 10 mg/kg 미만, 예컨대 5 mg/kg, 3mg/kg, 1 mg/kg, 0.5 mg/kg 또는 그 미만으로 투여된다. 본 발명의 개선된 이필리무맙 변이체는 또한 이필리무맙이 사용되는 적어도 임의의 조합 요법 또는 이중특이적 시약에, 예를 들어 PD1 또는 PD-L1 길항제와 조합되어 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 예를 들어 본 발명의 항-CTLA-4 항체 이필리무맙이 유형 III 항체인 경우에, 이필리무맙 변이체는 절제불가능한 또는 전이성 흑색종을 치료하는데 사용되고, 3 mg/kg 초과, 예컨대 10 mg/kg, 20 mg/kg, 50 mg/kg 또는 그 초과의 용량으로 투여된다. 다른 실시양태에서, 유형 III 이필리무맙 변이체는 총 림프절절제술을 포함한 완전 절제를 받은, 1 mm 초과의 부위 림프절의 병리학적 침범이 있는 피부 흑색종을 갖는 환자에 대해 아주반트로서, 10 mg/kg 초과의 용량, 예컨대 20 mg/kg, 50 mg/kg 또는 그 초과의 용량으로 투여된다.

추가 실시양태에서, 유형 III 이필리무맙 변이체는 중간 또는 불량한 위험의 이전에 비치료된 진행성 신세포 암종을 갖는 환자를 니볼루맙과 조합하여 치료하는데 사용되고, 총 4회 용량에 대해 q3w로 30분에 걸쳐 1 mg/kg 초과, 예컨대 3 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 50 mg/kg 또는 그 초과의 용량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다. 추가 실시양태에서, 유형 III 이필리무맙 변이체는 플루오로피리미딘, 옥살리플라틴 또는 이리노테칸을 니볼루맙과 조합하여 사용한 치료 후에 진행된, 미소위성체 불안정성-높은 (MSI-H) 또는 미스매치 복구 결핍 (dMMR) 전이성 결장직장암을 갖는 12세 이상의 성인 및 소아 환자를 치료하는데 사용되고, 예를 들어총 4회 용량에 대해 q3w로 1 mg/kg 초과, 예컨대 3 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 50 mg/kg 또는 그 초과의 용량으로 투여된다.

본 발명의 제약 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 과도하게 독성이 아니면서 특정한 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 목적하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양을 수득하도록 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용되는 본 발명의 특정한 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정한 화합물의 배출 속도, 치료 지속기간, 사용되는 특정한 조성물과 조합되어 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전반적 건강 및 과거 병력, 및 의학 기술분야에 널리 공지된 기타 인자를 포함한 다양한 약동학적 인자에 좌우될 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 대상체의 크기, 대상체의 증상의 중증도 및 선택된 특정한 조성물 또는 투여 경로와 같은 인자에 기초하여 적절한 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명의 조성물은 관련 기술분야에 널리 공지된 다양한 방법 중 1종 이상을 사용하여 1종 이상의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다.

본 발명의 치료 용도 및 방법

본 개시내용은 암을 앓는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 임의의 개선된 항-CTLA-4 항체를 투여하는 것을 포함하는, 암을 앓는 대상체에서 암 면역요법, 예를 들어 내인성 면역 반응을 강화시켜 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.

본 면역요법 방법의 바람직한 실시양태에서, 대상체는 인간이다.

본 개시내용의 면역요법 방법을 사용하여 치료될 수 있는 다른 암의 예는 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 유방암, 폐암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 신암, 자궁암, 난소암, 결장직장암, 결장암, 직장암, 항문부암, 위암, 고환암, 자궁암, 난관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연부 조직 육종, 요도암, 음경암, 혈액 악성종양, 소아기 고형 종양, 림프구성 림프종, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신우 암종, 중추 신경계 (CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관신생, 척수축 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 표피양암, 편평 세포암, 석면에 의해 유발된 것을 포함한 환경적으로 유발된 암, 전이성 암 및 상기 암의 임의의 조합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 암은 MEL, RCC, 편평 NSCLC, 비-편평 NSCLC, CRC, CRPC, 두경부의 편평 세포 암종 및 식도, 난소, 위장관 및 유방의 암종으로부터 선택된다. 본 방법은 또한 전이성 암의 치료에 적용가능하다.

다른 암은 혈액 악성종양, 예컨대, 예를 들어 다발성 골수종, B-세포 림프종, 호지킨 림프종/원발성 종격 B-세포 림프종, 비-호지킨 림프종, 급성 골수성 림프종, 만성 골수 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 여포성 림프종, 미만성 대 B-세포 림프종, 버킷 림프종, 면역모세포성 대세포 림프종, 전구체 B-림프모구성 림프종, 외투 세포 림프종, 급성 림프모구성 백혈병, 균상 식육종, 역형성 대세포 림프종, T-세포 림프종 및 전구체 T-림프모구성 림프종 및 상기 암의 임의의 조합을 포함한다.

조합 요법

암 환자를 치료하는 이들 방법의 특정 실시양태에서, 본 발명의 개선된 항-CTLA-4 항체는 대상체에게 단독요법으로서 투여되는 반면, 다른 실시양태에서, 면역조정 표적의 자극 또는 차단은 화학치료 요법, 방사선, 수술, 호르몬 박탈 및 혈관신생 억제제를 포함한 표준 암 치료와 효과적으로 조합될 수 있다. 개선된 항-CTLA-4 항체는 항신생물제에 연결될 수 있거나 (면역접합체로서) 또는 작용제와 별개로 투여될 수 있다. 후자의 경우에 (별개 투여), 항체는 작용제 전에, 후에 또는 그와 공동으로 투여될 수 있거나 또는 다른 공지된 치료제와 공-투여될 수 있다. 화학요법 약물은 특히 독소루비신 (아드리아마이신(ADRIAMYCIN)®), 시스플라틴, 카르보플라틴, 블레오마이신 술페이트, 카르무스틴, 클로람부실 (류케란(LEUKERAN)®), 시클로포스파미드 (시톡산(CYTOXAN)®; 네오사르(NEOSAR)®), 레날리도미드 (레블리미드(REVLIMID)®), 보르테조밉 (벨케이드(VELCADE)®), 덱사메타손, 미톡산트론, 에토포시드, 시타라빈, 벤다무스틴 (트레안다(TREANDA)®), 리툭시맙 (리툭산(RITUXAN)®), 이포스파미드, 빈크리스틴 (온코빈(ONCOVIN)®), 플루다라빈 (플루다라(FLUDARA)®), 탈리도미드 (탈로미드(THALOMID)®), 알렘투주맙 (캄파트(CAMPATH)®, 오파투무맙 (아르제라(ARZERRA)®), 에베롤리무스 (아피니토르(AFINITOR)®, 조르트레스(ZORTRESS)®) 및 카르필조밉 (키프롤리스(KYPROLIS)™)을 포함한다. 상이한 메카니즘을 통해 작동하는 항암제의 공-투여는 약물에 대한 내성의 발생 또는 종양 세포의 항원성의 변화를 극복하는 것을 도울 수 있다.

본 발명의 개선된 항-CTLA-4 항체는 또한 다른 면역조정제, 예컨대 다른 면역조정 수용체 또는 그의 리간드에 대한 항체와 조합되어 사용될 수 있다. T 세포 반응을 조절하는 여러 다른 공동-자극 및 억제 수용체 및 리간드가 확인되었다. 자극 수용체의 예는 유도성 T 세포 공동-자극제 (ICOS), CD137 (4-1BB), CD134 (OX40), CD27, 글루코코르티코이드-유도된 TNFR-관련 단백질 (GITR) 및 헤르페스바이러스 진입 매개체 (HVEM)를 포함하는 반면, 억제 수용체의 예는 프로그램화된 사멸-1 (PD-1), B 및 T 림프구 감쇠자 (BTLA), T 세포 이뮤노글로불린 및 뮤신 도메인-3 (TIM-3), 림프구 활성화 유전자-3 (LAG-3), 아데노신 A2a 수용체 (A2aR), 킬러 세포 렉틴-유사 수용체 G1 (KLRG-1), 자연 킬러 세포 수용체 2B4 (CD244), CD160, Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체 (TIGIT), 및 T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제자 (VISTA)에 대한 수용체를 포함한다. 문헌 [Mellman et al. (2011) Nature 480:480; Pardoll (2012) Nat. Rev. Cancer 12: 252; Baitsch et al. (2012) PloS One 7:e30852]. 항-PD-1 항체 옵디보® (니볼루맙) 및 키트루다® (펨브롤리주맙)는 암을 치료하는데 사용하기 위해 승인되었고, 본 발명의 개선된 항-CLTA-4 항체와 조합될 수 있다. 이들 수용체 및 그의 리간드는 면역 반응의 억제를 자극하거나 방지하여 종양 세포를 공격하도록 설계된 치료제를 위한 표적을 제공한다. 문헌 [Weber (2010) Semin. Oncol. 37:430; Flies et al. (2011) Yale J. Biol. Med. 84:409; Mellman et al. (2011) Nature 480:480; Pardoll (2012) Nat. Rev. Cancer 12:252]. 자극 수용체 또는 수용체 리간드는 효능제 작용제에 의해 표적화되는 반면, 억제 수용체 또는 수용체 리간드는 차단제에 의해 표적화된다. 면역요법 항종양 활성을 증진시키기 위한 가장 유망한 접근법 중에는 소위 "면역 체크포인트"의 차단이 있으며, 이는 면역계를 조절하고, 자기-관용을 유지하는데 및 측부 조직 손상을 최소화하기 위해 말초 조직에서의 생리학적 면역 반응의 지속기간 및 진폭을 조정하는데 결정적인 다수의 억제 신호전달 경로를 지칭한다. 예를 들어, 문헌 [Weber (2010) Semin. Oncol. 37:430; Pardoll (2012) Nat. Rev. Cancer 12:252]을 참조한다. 많은 면역 체크포인트가 리간드-수용체 상호작용에 의해 개시되기 때문에, 이들은 항체에 의해 용이하게 차단될 수 있거나 또는 재조합 형태의 리간드 또는 수용체에 의해 조정될 수 있다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 제한적인 것으로 해석되어서는 안된다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 도면 및 모든 참고문헌, 특허 및 공개 특허 출원의 내용은 명백하게 본원에 참조로 포함된다.

실시예 1

낮은 pH 결합에 대한 증진된 선호도를 갖는 이필리무맙 중쇄 CDR 서열 변이체의 파일럿 선택

pH-최적화된 서열 변이체를 선택하는 과정을 시험하기 위해서, 중쇄당 총 3개의 아미노산 치환을 위해 이필리무맙 중쇄의 각각의 CDR 내로 1개의 돌연변이를 도입하였다. CDR을 HCDR1의 위치 28, 30, 31, 32 및 33; HCDR2의 위치 52, 52a, 53, 54, 55 및 56; 및 HCDR3의 위치 95, 97, 98 (모두 카바트에 따른 넘버링)에서 히스티딘 (H)으로 변형시켰다. 도 1을 참조한다. 경쇄는 변경시키지 않았다.

낮은/산성 pH에서의 결합에 대한 증진된 선호도를 갖는 서열 변이체의 선택을 본질적으로 문헌 [Hornsby et al. (2015) Mol. Cell. Proteomics 14:2833]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간략하게, 1개 이상의 서열 변경을 함유하는 이필리무맙 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 서열을 M13 파지미드 벡터 내로 클로닝하고, 클로닝된 scFv 단편이 코트 단백질의 융합체로서 파지의 표면 상에 발현되도록 파지를 생산하였다. 이필리무맙 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 올리고뉴클레오티드는 선택된 핵산 잔기에서 축중성 변경을 포함하였기 때문에 (이 경우에 각각의 중쇄 CDR에서 1개의 천연 잔기 대신에 1개의 히스티딘 코돈을 변화시킴), 생성된 파지 집단은 이필리무맙 scFv 서열 변이체의 라이브러리를 포함하였다. 이러한 사전-선택 라이브러리 내의 변이체 이필리무맙 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산을 서열분석하였다. 서열 변이체의 라이브러리 내의 CDR 서열의 분포는 도 2a에서 서열 로고에 의해 나타내어진다.

이 파지 라이브러리를 각각 pH 6.0 및 pH 7.4에서의 결합/비-결합에 대한 4 라운드의 선택/역-선택에 적용하였다. 간략하게, 비오티닐화 인간 CTLA-4를 자기 스트렙타비딘 비드에 결합시켰다. 파지 라이브러리를 pH 6.0에서 부드럽게 혼합하면서 1시간 동안 비드에 노출시키고, 비드를 자기 분리기를 사용하여 끌어내리고, pH 6.0에서 세척하고, pH 7.4에서 용리시켰다. 이어서, pH 7.4에서 방출된 파지를 박테리아 세포에서 밤새 증식시켰다. 이들 밤새 박테리아 배양물로부터 수득된 파지를 상기 기재된 제1 라운드와 유사한 추가 라운드의 선택에 적용하되, 예외로 스트렙타비딘 자기 비드 상의 항원 (huCTLA-4) 농도를 각각의 후속 라운드의 선택에 대해 체계적으로 감소시켜 선택의 엄격도를 증가시켰다.

그 결과 4 라운드의 선택 후에 선택된 파지 라이브러리를 사용하여 박테리아를 감염시킨 다음, 이를 플레이팅하여 클론 선택을 가능하게 하였다. 개별 콜로니를 골라내고, 변이체 이필리무맙 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산을 서열분석하였다. 생성된 서열 변이체의 수집물 내의 CDR 서열의 분포는 도 2b에서 서열 로고에 의해 나타내어지며, 여기서 각각의 CDR에서 우세한 변이체는 도 2a에 예시된 서열 변이체의 사전-선택 라이브러리 내의 가장 큰 문자와 비교하여 가장 큰 문자에 의해 나타내어진다.

이어서, 각각의 우세한 변이체를 개별적으로 (T33H, N56H 및 T95H, 카바트 넘버링에 따름) 및 모든 3개를 함께 (T33H/N56H/T95H) 사용하여 이필리무맙 중쇄 가변 도메인 (Fab 구축물)을 생산함으로써, 각각 ipi.1, ipi.2, ipi.3 및 ipi.4로 명명된 항체를 생성하였다. 인간 CTLA-4에 대한 각각의 이들 항체의 결합 파라미터가 표 2에 제공된다. 결합 파라미터는 실시예 3에 기재된 바와 같이 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 결정하였다.

표 2

이필리무맙의 선택된 중쇄 가변 도메인 서열 변이체의 결합

HCDR1 및 HCDR2 내의 돌연변이는 결합 친화도를 2 내지 3배 증진시킨 반면 (감소된 K_D에 의해 측정됨), HCDR3 내의 돌연변이는 결합을 유의하게 감소시켰고, 모든 3개의 돌연변이의 조합은 K_D를 10배 개선시켰다. 그러나, 모든 이들 결과는 pH 6.0 및 pH 7.4에서 본질적으로 동일하며, 이는 선택이 증진된 친화도를 갖는 항체 (즉, 친화도 성숙 항체)를 제공하였지만, 항체가 산성 pH에서의 결합에 대한 증진된 선호도를 갖지는 않았다는 것을 의미한다.

정전기적 모델링

CTLA4의 정전기적 표면을 몰레큘라 오퍼레이팅 인바이런먼트 (MOE) (케미칼 컴퓨팅 그룹(Chemical Computing Group), 캐나다 몬트리올)을 사용하여 모델링하였다. 결과는 도 3a, 3b 및 3c에 제시된다. 이필리무맙의 HCDR1에 근접하는, 잔기 E48, D64 및 D65로 구성된 CTLA4 내의 전기음성 패치가 존재한다. 도 3c를 참조한다. 위치 T33H가 조합 라이브러리를 사용한 선택 후에 HCDR1에서 풍부화되었더라도, 본 발명자들은 T33H의 단일 치환이 pH 6.0 및 pH 7.4 둘 다에서 동일하게 친화도를 증진시켰지만 증진된 낮은-pH 특이성을 갖지는 않았고 (표 2), 따라서 추가의 개발을 위한 구축물에서 그를 원치않았다는 것을 관찰하였다. HCDR1 내의 다른 잔기, 예컨대 CTLA4 내의 전기음성 패치 근처에 위치하여 그의 측쇄를 갖는 S31에 히스티딘을 풍부화시켰다. S31H 변이체를 생산하여 ipi.57을 생성하였으며, 이는 pH 7.4와 비교하여 pH 6.0에서 결합에 대한 선호도를 나타냈다 (표 4). 이 실험은 단지 항체의 친화도 성숙으로부터 생성된 임의의 돌연변이가 아니라, pH 7.4와 비교하여 pH 6.0에서 결합의 비를 증진시키는 서열 변이체만이 본 발명의 방법에 사용된다는 원리를 입증한다.

실시예 2

낮은 pH 결합에 대한 증진된 선호도를 갖는 이필리무맙 CDR 서열 변이체의 조합 라이브러리

파일럿 중쇄 가변 스크린 (실시예 1) 후에, 모든 6개의 CDR에서의 변형을 고려하기 위해 전체 조합 접근법을 고안하였다. pH 7.4에서의 결합과 비교하여 pH 6.0에서 증진된 선호도 결합을 갖는 이필리무맙의 서열 변이체를 수득하기 위해, 중쇄 및 경쇄 CDR 내의 선택된 위치에 돌연변이를 도입하였다. CDR을 HCDR1의 위치 T28, S30, S31, Y32, T33; HCDR2의 F50, S52, Y52a, D53, G54, N55, N56, Y58; HCDR3의 T95, W97, L98; 및 LCDR1의 Q27, S27a, S30, S31, Y32; LCDR2의 F52, S53, T56; LCDR3의 Q90, Y91, W96에서 변형시켰다. LCDR1에 대해 각각의 위치를 H (His) 뿐만 아니라 D (Asp) 또는 E (Glu)로 치환하였으며, CDR당 1 내지 3개의 돌연변이, 쇄당 1 내지 3개의 돌연변이, scFv당 총 2 내지 6개의 돌연변이가 존재하였다. 모든 잔기 넘버링은 도 1에 예시된 바와 같이 카바트에 따른다.

간략하게, 목적하는 돌연변이된 이필리무맙 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 조합하여 CDR당 최대 3개의 돌연변이 및 각각의 중쇄 가변 도메인에 1 내지 3개의 돌연변이를 갖는 scFv 이필리무맙 변이체를 생성하였다. 이들 올리고뉴클레오티드 구축물을 M13 파지미드 벡터 내로 클로닝하여, 클로닝된 scFv 단편이 코트 단백질의 융합체로서 파지의 표면 상에 발현되도록 하였다.

경쇄 결과

사전-선택 및 선택-후 파지 라이브러리를 서열분석하여, 중쇄와 관계없이 경쇄에서 어떤 서열이 우선적으로 풍부화되었는지를 결정하였다. 예시적인 결과가 도 4a 및 4b에 서열 로고로서 제공되며, 여기서 LCDR1 내의 각각의 아미노산 잔기의 상대 존재비는 상응하는 단일 문자 코드의 크기에 의해 나타내어진다. 사전-선택 라이브러리는 주로 돌연변이된 위치에서 원래의 이필리무맙 잔기를 함유하지만, 선택-후 라이브러리는 특정 위치에서 상이한 잔기, 예컨대 LCDR1 돌연변이 S28E 및 S31E (또는 S31D) (순차적 넘버링)가 고도로 풍부화된다는 것이 분명하다. 도 4b를 참조한다.

비아코어® 표면 플라즈몬 공명 분광계 (비아코어 아베(Biacore AB), 스웨덴 웁살라)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 위치 28 및 31 (카바트 넘버링에 따라 27a 및 30)에서의 선택된 LCDR1 변이체를 연구하여 pH 7.4 및 pH 6.0에서의 온 및 오프 레이트 상수 (및 따라서 평형 결합 상수)를 결정하였다. 실시예 3을 참조한다. 항체를 1가 Fab 단편으로서 시험하여 분석을 단순화하였다. 결과는 표 3 (상부 행)에 ipi.17 (S28E), ipi.18 (S31D) 및 ipi.25 (S28E/S31D)에 대해 제공되고, ipi.25에 대한 예시적인 센소그램이 도 5a 및 5b에 제공된다. 별개의 실험을 수행하여 LCDR1 위치 28 및 31 (카바트 넘버링으로 28E, 28D: 31E, 31D; 또는 27aE, 27aD: 30E, 30D)에서의 변이체 서열의 모든 쌍별 조합을 시험하였다. 결과는 표 3 (하부 행)에 제공된다. S28E 및 S31D의 조합 (ipi.25)은 pH 7.4와 비교하여 pH 6.0에서 결합에 대한 가장 높은 선호도를 나타냈다 (K_D-7.4 / K_D-6.0 = 4.0).

표 3

이필리무맙의 선택된 LCDR1 서열 변이체의 결합

모든 선택된 항체 변이체는 온 및 오프 레이트 상수 둘 다에서 2배 미만의 변화로 pH 7.4에서 CTLA-4에 대해 다소 불량한 결합제이다. 그러나, pH 6.0에서의 결합은 유사한 k_a 값을 나타내지만, 더 낮은 k_d 값 (더 단단한 결합)을 나타낸다. 동일한 실험에서 이필리무맙의 비에 대해 정규화된 해리 평형 결합 상수 (K_D)의 비는 상기 제1 실험에서 각각 ipi.17, ipi.18 및 ipi.25에 대해 1.4, 3.2 및 4.0이고, 상기 제2 실험에서 각각 ipi.23, ipi.24, ipi.25 및 ipi.26에 대해 5.1, 4.1, 6.3 및 4.3이다.

선택된 변이체의 특징화

인간 CTLA-4에 대한 선택된 변이체의 결합을 본질적으로 실시예 3에 기재된 바와 같이 결정하였다. 결과는 표 4에 제공된다. 이들 항체에 대한 명명법 및 서열은 표 6 및 7에 및 표 8에 요약된 바와 같은 서열 목록에 제공된다.

표 4

본 발명의 선택된 항체에 대한 결합 파라미터

선택된 항체에 대한 결합 데이터의 플롯이 도 8a-8c에 제공된다. 이러한 플롯은 pH 6.0 및 pH 7.4에서의 상대 결합 선호도의 편리한 시각적 평가를 제공한다. 본 발명의 여러 항체, 예컨대 ipi.64, ipi.71, ipi.92 및 ipi.95는 pH 7.4와 비교하여 pH 6.0에서 결합에 대한 극적으로 증진된 선호도를 나타냈다. 도 9를 참조한다. 이들 항체 모두는 LCDR1 S30D (카바트 넘버링에 따름)를 포함하고, 이는 S30E가 선택에서 선호됨에도 불구하고 선택되었으며 (도 4a 및 4b), 이는 경쇄 S27aE S30D가 pH 7.4와 비교하여 pH 6.0에서 결합에 대한 5배 선호도 (K_D에 의해 측정됨)를 갖는 반면 S27aE S30E는 단지 3.4배 선호도를 가졌기 때문이다. 그럼에도 불구하고, LCDR1에 S30D보다 S30E 돌연변이를 갖는 ipi.64, ipi.71, ipi.92 및 ipi.95의 변이체가 각각 ipi.100, ipi.101, ipi.106 및 ipi.105로서 제공된다. LCDR1 내의 위치 30 (카바트에 따름)에서 D에서 E로의 복귀가 이루어져 원치않는 이성질체화를 일으키는 서열 ("DS")을 제거하였다.

실시예 3

본 발명의 항체에 대한 결합 파라미터의 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 분광학적 결정

표면 플라즈몬 공명 분광분석법 (SPR)을 사용하여 본질적으로 하기와 같이 인간 CTLA-4에 대한 본 발명의 다양한 이필리무맙 서열 변이체의 결합 파라미터를 결정하였다. 달리 나타내지 않는 한, 비아코어® SPR 표면 플라즈몬 공명 분광계 (비아코어 아베, 스웨덴 웁살라)를 사용하여 실험을 수행하였다. 항체를 1가 Fab 단편으로서 시험하여 분석을 단순화하였다. 데이터는 도 5a, 5b, 7a 및 7b에서와 같이 센소그램으로서 제공되거나 또는 결합 파라미터, 예컨대 평형 해리 결합 상수 (K_D), 회합/온-레이트 상수 (k_a, k_on), 해리/오프-레이트 상수 (k_d, k_off) 및/또는 반감기 (t_1/2)로서 요약될 수 있다.

간략하게, 본 발명의 이필리무맙 변이체를 Fab 단편으로서 생산하고, 고정화된 항-인간 카파 폴리클로날 포획 항체를 사용하여 비아코어® CM4 칩 상에 포획하였다. 단량체 인간 CTLA-4를 분석물로서 최대 2μM 최고 농도로 유동시켰다. 사이클 사이에 포획 표면을 75mM 인산으로 재생시켰다. 37℃에서 비아코어® T200 기기 상에서 실험을 실행하였다. 실행 완충제는 pH 7.4 실험의 경우 HEPES 완충 염수 및 더 낮은 pH 실험의 경우 비스-트리스 완충 염수였다. 모든 완충제를 0.05% 트윈-20 및 1g/L BSA로 보충하였다. 이중 참조 센소그램을 질량 수송 하에 1:1 랭뮤어 결합 모델에 피팅하여 평형 해리 상수 (K_D), 뿐만 아니라 적절한 경우에 회합 (k_a) 및 해리 (k_d) 속도 상수를 결정하였다.

실시예 4

일반적으로 친화도를 감소시키는 돌연변이

HCDR3 내의 T95H 치환 (카바트 넘버링에 따름)은 CTLA-4에 대한 이필리무맙의 친화도를 탈조정 (일반적으로 감소)시켜 항체 ipi.3을 생성하는 것으로 발견되었다. 예시적인 센소그램이 도 7a (pH 7.4) 및 7b (pH 6.0)에 제공된다. 표 2로부터 분명한 바와 같이, T95H는 pH 6.0 및 7.4 둘 다에서 친화도를 대략 4배 감소시켜 (증가된 K_D), 낮은 pH에서의 우선적 결합의 증진을 거의 유도하지 않았으며, K_D-7.4 / K_D-6.0은 이필리무맙에 대한 1.0과 비교하여 0.9였다. 그럼에도 불구하고, 이 돌연변이를 낮은 pH에서의 결합에 대한 선호도를 증가시킨 본 발명의 다양한 항체 내의 다른 돌연변이와 조합하였다 (즉, ipi.57, ipi.69, ipi. 64, ipi.71, ipi.94, ipi.95 및 ipi.105는 각각 ipi.82, ipi.84, ipi.86, ipi.88, ipi.90, ipi.92 및 ipi.106이 되었음). 표 7을 참조한다. 이론에 의해 제한되는 것을 의도하지는 않지만, T95H 치환의 혼입은 이러한 치환이 또한 (종양 미세환경 내) 낮은 pH에서 친화도에 영향을 미쳤더라도 용량-제한 독성 (아마도 pH 7.4에서의 결합에 의해 구동됨)을 완화시킬 수 있는 것으로 가정되었다.

실시예 5

세포 상의 CTLA-4에 대한 본 발명의 항체의 결합

추가의 실험을 수행하여 본 발명의 선택된 항체가 세포의 표면 상에 결합하고 낮은 pH에서의 결합에 대한 증진된 선호도를 나타낸다는 것을 확인하였다 (시험관내 결합 검정에서만은 아님). 간략하게, 항체 ipi.64를 Fab 단편 및 IgG로서 발현시키고, pH 6.3, 6.6 및 7.2에서 연속 희석물로 58개의 α-β-CTLA-4/CD3 ζ 세포에 결합시켰다. 세포를 항체와 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 각각의 완충제 중에서 세척하고, 결합된 항체를 검출하였다. 결과는 도 10a (pH 7.3) 및 도 10b (pH 6.0)에 제공된다. 항체 ipi.64는 이필리무맙 Fab와 비교하여 pH 7.3에서 결합을 크게 감소시켰지만, pH 6.0에서는 결합을 증진시켰다. 도 11a 및 11b를 참조한다. 이러한 이필리무맙 서열 변이체는 산성 종양 미세환경에서 친화도 및 활성을 보유 (또는 심지어 개선)하면서, 이필리무맙과 비교하여 더 낮은 말초 결합 및 따라서 더 적은 독성 부작용을 나타낼 것으로 예상될 것이다. 이러한 항체는 증진된 안전성의 예상 하에 이필리무맙과 동일한 용량 (예를 들어 대략 3 mg/kg)으로 투여될 수 있거나 또는 용량-제한 독성에 도달하기 전에 더 높은 (더 효과적인) 용량 (예를 들어 10 mg/kg 이상)으로 투여될 수 있다. 이필리무맙은 10 mg/kg에서 보다 효과적인 것으로 공지되어 있지만, 독성으로 인해 절제불가능한 또는 전이성 흑색종 상황에서는 이 수준으로 투여되지 않는다 (그러나 흑색종 아주반트 사용을 위해서는 10 mg/kg으로 투여됨).

유사한 실험을 수행하여 pH 6.3, 6.6 및 7.2에서 결합 항체 ipi.64 및 ipi.71을 비교하였다. 항체의 Fab 단편을 사용한 결과는 도 12a, 12b 및 12c에 제공되고, 반면에 전장 IgG mAb를 사용한 결과는 도 13a, 13b 및 13c에 제공된다.

도 12a, 12b 및 12c에 예시된 바와 같이, pH-최적화된 이필리무맙 변이체를 Fab 단편으로서 1가 형태로 연구한 경우에, 변이체 ipi.64 및 ipi.71은 낮은 pH에서 이필리무맙만큼 잘 결합하였지만, 더 높은 pH에서는 그렇지 않았다.

대조적으로, 도 13a, 13b 및 13c에 예시된 바와 같이, pH-최적화된 이필리무맙 변이체를 완전 항체 (IgG)로서 2가 형태로 연구한 경우에, 변이체 ipi.64 및 ipi.71은 높은 pH에서 그의 높은 친화도를 유지하여 임의의 pH 선호도를 차폐한 반면, 변이체 ipi.95 및 ipi.92는 (특히) 높은 pH에서 불량하게 결합하였다.

추가의 실험을 수행하여 58αβ-CTLA4/mCD3ζ 세포에 대한 ipi.64, ipi.100, ipi.101, ipi.106 및 ipi.105의 비-푸코실화 IgG1 형태의 결합의 pH 의존성을 결정하였다. 항체를 pH-특이적 완충제 중 100 μg/mL로부터 12 포인트에 걸쳐 1:4 희석으로 적정하고, 30-60분 동안 인큐베이션하였다. 완충제는 HBSS, 2% FBS^HI, 0.02% 아지드화나트륨, 2 mM EDTA 및 인산나트륨 완충제 (pH 5.4)를 함유하였다. 인산나트륨 완충제를 목적하는 pH (7.2, 6.7, 6.2)에 도달할 때까지 첨가하였다. 대략 3e5개 세포/웰을 각각의 세포주에 대해 시험하였다. 모든 결합 및 세척 단계를 그의 각각의 pH-특이적 완충제 중에서 수행하였다. 알렉사647에 접합된 1가 항-h카파 2차 나노바디를 사용하여 검출을 수행하고, 1:2000의 희석으로 사용하였다. 세포를 BD 픽스 용액 I로 30분 동안 고정시킨 후, pH-특이적 완충제 중에 재현탁시키고, 세포측정기 (BD 포르테사(BD Fortessa)) 상에서 판독하였다. 결과는 도 16a (pH 7.2), 16b (pH 6.7) 및 16c (pH 6.2)에 제공되고, EC50 및 Cmax 값은 표 5에 제공된다. 항체 ipi.105 및 ipi.106은 pH 감소에 따라 증가된 결합을 나타낸다.

표 5

본 발명의 선택된 항체에 대한 결합 파라미터

추가의 실험을 수행하여 58αβ-CTLA4/mCD3ζ 세포에 대한 ipi.100, ipi.101, ipi.106 및 ipi.105의 Fab 형태의 결합의 pH 의존성을 결정하였다. 실험 프로토콜은 도 16a-c의 데이터를 수득하는데 사용된 것과 동일하였다. 결과는 도 17a 및 17b (pH 7.2), 17c 및 17d (pH 6.7) 및 17e 및 17f (pH 6.2)에 제공된다. 다른 결합 검정에서와 같이, 이필리무맙은 pH에 관계없이 매우 유사한 결합 곡선을 나타낸다. 항체 ipi.100 및 ipi.101은 보다 낮은 pH에서 증진된 결합을 나타내며, 친화도는 일반적으로 이필리무맙의 친화도에 근사하거나 그를 초과한다. 항체 ipi.105 및 ipi.106은 또한 보다 낮은 pH에서 증진된 결합을 나타내지만, 친화도는 이필리무맙의 친화도보다 더 낮다.

실시예 6

Sa1N 섬유육종 종양 모델에서 본 발명의 이필리무맙 변이체의 항종양 활성

본 발명의 낮은 pH에서의 결합에 대한 증진된 선호도를 갖는 이필리무맙 서열 변이체의 항종양 활성을 면역원성 Sa1N 섬유육종 종양 모델에서 평가하였다. 인간 CTLA-4 녹-인 A/J 마우스에게 이식당 2 x 10⁶개 Sa1N 종양 세포를 피하로 주사하였다. 7일 후, 종양을 측정하고, 마우스를 대등한 평균 종양 부피 (예를 들어 130-150 mm³/2)를 갖도록 처리군으로 무작위화하였다. 본 발명의 이필리무맙 서열 변이체, 뿐만 아니라 대조군으로서의 이필리무맙을 200 μl의 부피로 용량당 200 μg으로 제7일, 제11일 및 제14일에 IP 투여하였다. 종양 부피 및 말초 항-CTLA-4 활성의 마커를 제7일 후에 주기적 간격으로 연구 완료까지 측정하였다. 마우스 종양 모델에서의 말초 항-CTLA-4 활성은, 이러한 말초 활성이 항-CTLA-4 항체로 치료된 환자에서 용량-제한 부작용을 담당하기 때문에 인간 대상체에서의 독성에 대한 대용물로서 간주된다.

i) 종양 성장을 적어도 대략 이필리무맙만큼 잘 감소시키고 ii) 이필리무맙보다 더 적은 말초 항-CTLA-4 활성을 나타내는 항체는 이필리무맙이 승인되어 있거나 달리 치료상 유효한 임의의 장애에 대한 개선된 인간 치료제로서의 개발을 위한 후보이다.

실시예 7

MC38 종양 모델에서 본 발명의 이필리무맙 변이체의 항종양 활성

본 발명의 낮은 pH에서의 결합에 대한 증진된 선호도를 갖는 이필리무맙 서열 변이체의 항종양 활성을 하기와 같이 MC38 종양 모델에서 평가하였다.

종양 모델

간략하게, 16 내지 18주령의 수컷 및 암컷 인간 CTLA-4 녹-인 C57BL/6 마우스에게 1x10⁶개 MC38 세포를 피하로 주사하였다. 마우스를 종양 이식 8일 후에 종양이 150 mm³의 평균 부피에 도달하였을 때 처리군으로 무작위화하였다. PBS 중에 제제화된 ipi 및 pH 감수성 ipi 항체를 이식 9일 후에 마우스당 20, 60 또는 200 μg의 단일 용량으로 각각의 처리군에 정맥내로 투여하였다. 본 실시예에서 투여된 모든 항-CTLA-4 항체는 비-푸코실화 IgG1 항체였다. 대조군 마우스는 인간 IgG1-NF 이소형을 갖는 200 μg 항-키홀 림펫 헤모시아닌 항체로 처리하였다. 종양을 2 내지 5일마다 측정하고, 궤양화된 종양 및 2000 mm³ 초과의 종양을 갖는 마우스를 연구로부터 제거하였다. 림프구 염색 분석을 위한 마우스를 선택하기 위해, 처리된 마우스를 무작위화하고, 이식 14일 후에 안락사시켰다. 2회 이상의 연속 측정 동안 측정불가능한 종양을 갖는 마우스를 무종양으로 간주하였다.

도 19a-19m은 pH 감수성 항체 ipi.64, ipi.106 및 ipi.105가 용량 의존성 방식으로 종양 성장을 억제하는데 있어서 이필리무맙만큼 효과적이라는 것을 보여준다.

림프구 염색 분석

마우스 종양 모델에서의 말초 항-CTLA-4 활성은, 이러한 말초 활성이 항-CTLA-4 항체로 치료된 환자에서 용량-제한 부작용을 담당하기 때문에 인간 대상체에서의 독성에 대한 대용물로서 간주된다. 선택된 pH 감수성 ipi 항체로 상기와 같이 처리된 마우스에서 종양 및 비장으로부터 샘플을 취하여 2가지 환경에서의 항체의 상대 활성을 하기와 같이 평가하였다.

종양 및 비장을 처리 5일 후에 마우스로부터 수거하였다. 5% 열-불활성화 FBS (VWR, 미국 펜실베니아주 래드너) 및 5 mM CaCl₂ (VWR)로 보충된 HBSS 중 250 U/mL 콜라게나제 IV (워싱턴 바이오케미칼(Worthington Biochemical), 미국 뉴저지주 레이크우드) 및 100 μg/mL DNase I (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미국 미주리주 세인트 루이스)을 함유한 gentleMACS C 튜브 (밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec), 독일 베르기쉬 글라트바흐)에서 종양을 해리시켰다. 비장을 gentleMACS C 튜브 (밀테니 바이오텍)에서 기계적으로 해리시키고, 적혈구 용해 완충제 (시그마-알드리치)로 처리하였다. 세포를 70 μm 필터에 통과시키고, 완전 T 세포 배지 (10% 열-불활성화 FBS, 50 U/mL 페니실린/스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 50 μM β-메르캅토에탄올, 2 mM 피루브산나트륨 및 10mM HEPES로 보충된 RPMI-1640) 중에 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 좀비(Zombie) NIR 고정성 생존능 키트 (바이오레전드(Biolegend), 미국 캘리포니아주 샌디에고)로 염색하고, 트루스테인(TruStain) FcX (항-마우스 CD16/32) 항체 (바이오레전드)로 처리하여 Fc 수용체 결합을 차단하였다. 세포 표면 염색을 위해, 세포를 이바이오사이언스(eBioscience) 유동 세포측정법 염색 완충제 (써모피셔(ThermoFisher), 미국 매사추세츠주 월섬) 중에서 CD45 (30-F11, BD 바이오사이언시스(BD Biosciences), 미국 캘리포니아주 산호세), CD19 (6D5, 바이오레전드), CD4 (GK1.5, BD 바이오사이언시스), CD8 (53-6.7, 바이오레전드) 및 ICOS (7E.17G9, BD 바이오사이언시스)에 대해 염색하였다. 모든 세포를 고정시키고, Foxp3 / 전사 인자 염색 완충제 세트 (써모피셔)로 투과시키고, FoxP3 (FJK-16s, 써모피셔), Ki-67 (16A8, 바이오레전드) 및 인간 CTLA4 (BNI3, 바이오레전드, 미국 캘리포니아주 샌디에고)에 대해 염색하였다. 샘플을 LSR포르테사(LSRFortessa)® 유동 세포측정기 (BD 바이오사이언시스) 상에서 분석하였다. 플로우조(FlowJo)® 유동 세포측정법 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 형광 마이너스 1 대조군에 기초한 게이트로 유동 데이터를 분석하였다.

항-CTLA-4 항체를 사용한 CTLA-4 차단은 말초 부위, 예컨대 비장 또는 림프절에서 Treg의 확장을 유발하며, 이는 독성에 대한 대용물로서 작용한다. 문헌 [Selby et al. (2013) Cancer Immunol. Res. 1:32; Quezada et al. (2006) J. Clin. Invest. 116:1935]. 도 20a 및 20b는 pH 감수성 항체 ipi.64, ipi.106 및 ipi.105가 종양에서 Treg 수준을 이필리무맙만큼 효과적으로 감소시키지만 (도 20b), 이들은 말초 (비장)에서 Treg 수준을 이필리무맙만큼 많이 증진시키지 않는다는 것을 입증한다 (도 20a, 특히 10 mpk로 투여되는 경우). 추가로, 도 21a 및 21b는 이들 동일한 pH 감수성 항-CTLA-4 항체가 이필리무맙보다 말초 (비장)에서 ICOS 발현에 의해 측정시 Treg의 더 적은 활성화를 유도하고, Ki-67 발현에 의해 측정시 Treg의 더 낮은 증식을 유도한다는 것을 보여준다. 각각 도 21a 및 21b를 참조한다.

i) 종양 성장을 적어도 대략 이필리무맙만큼 잘 감소시키고 ii) Ki-67 (Selby et al. (2013) Cancer Immunol. Res. 1:32) 및 ICOS (Liakou et al. (2008) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 105:14987)의 발현에 의해 측정시 이필리무맙보다 더 적은 말초 항-CTLA-4 활성을 나타내는 항체는 이필리무맙이 승인되어 있거나 달리 치료상 유효한 임의의 장애에 대한 개선된 인간 치료제로서의 개발을 위한 후보이다. 항체 ipi.64, ipi.106 및 ipi.105는 이들 유리한 특성을 공유한다.

실시예 8

본 발명의 이필리무맙 변이체의 결합 파라미터의 pH 의존성

인간 CTLA-4 및 시노 CTLA-4에 대한 본 발명의 선택된 항체의 결합의 pH 의존성을 본질적으로 실시예 3에 기재된 바와 같이 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 분광분석법에 의해 측정하였다. 간략하게, 항체를 1가 Fab 단편으로서 연구하였다. 항-인간 카파 폴리클로날 포획 항체 (서던 바이오테크(Southern Biotech), 미국 알라바마주)를 비아코어 T200 표면 플라즈몬 공명 시스템에서 에틸렌디아민-차단된 CM4 센서 칩 상에 고정화시켰다. 이어서, 본 발명의 선택된 항체의 Fab 단편을 각각 하나의 유동 셀 상에 포획하였다. 단량체 인간 CTLA4 또는 시노 CTLA-4를 분석물로서 각각의 완충제 조건에 대해 2μM, 400nM, 80nM 및 16nM 공칭 농도로 유동시켰다. 실행 완충제는 pH 5.5 내지 7.4 범위에서 0.1-0.2 pH 단위 간격 (총 12개)으로 20mM 비스트리스, 150mM NaCl, 0.05% 트윈-20, 1g/L BSA였다. 사이클 사이에 표면을 1/200 H₃PO₄로 재생시켰다. 모든 데이터를 이중-참조하고, 비아코어 T200 평가 소프트웨어를 사용하여 수송 제한 하에 1:1 랭뮤어 결합 모델에 피팅하였다. 필요한 경우에, 포획 수준 및 동일한 Fab에 대한 다른 피트로부터의 겉보기 활성에 기초하여 예상된 결합을 계산함으로써 R_max를 고정시켰다.

인간 CTLA-4에 대한 결과는 도 14a (K_D), 14b (k_on) 및 14c (k_off)에 제공된다. 도 14a는 pH의 함수로서 본 발명의 다양한 항체의 Fab 단편의 결합 친화도 (K_D)를 보여준다. 이필리무맙은 예상된 바와 같이 pH의 함수로서 거의 변화를 나타내지 않는다. 항체 ipi.64, ipi.100, ipi.101, ipi.105 및 ipi.106은 모두 보다 높은 pH에서 친화도의 체계적 감소를 나타낸다. ipi.105는 pH 5.5 내지 7.5에서 가장 큰친화도 차이를 나타내며, 친화도는 일반적으로 이필리무맙보다 더 높다. ipi.106은 또한 pH에 따라 거의 동등한 친화도 변화를 나타내지만, 전체 범위에 걸쳐 친화도가 훨씬 더 낮으며, pH 6.5 초과에서 이필리무맙보다 친화도가 더 낮다.

도 14b 및 도 14c는 pH의 함수로서 동일한 Fab 단편에 대한 회합/온-레이트 및 해리/오프-레이트 동역학 상수 (k_on 및 k_off)를 보여준다. 전체 친화도의 경우, 이필리무맙은 pH의 함수로서 어느 하나의 상수에서도 거의 차이를 나타내지 않는다. 대조적으로, 본 발명의 항체는 모두 pH 증가에 따라 k_on에서 유사한 감소를 나타내지만, pH에 대한 k_off의 의존성에서 실질적으로 상이하며, 항체 ipi.105, 특히 항체 ipi.106은 보다 높은 pH에서 k_off의 극적인 증가를 나타낸다. 이들 동역학 결과는 ipi.64, ipi.100, ipi.101과 비교하여 ipi.105 및 ipi.106의 경우 pH에 대한 K_D의 더 큰 의존성이 그의 증가된 k_off에 의해 구동된다는 것을 보여준다.

시노 CTLA-4에 대한 유사한 결과가 도 15a (K_D), 15b (k_on) 및 15c (k_off)에 제공된다. 결과는 인간 CTLA-4에서 관찰된 것과 정성적으로 유사하지만, 일반적으로 보다 낮은 친화도에서 도 14a는 주로 증가된 k_off로부터 발생하는 pH의 함수로서의 본 발명의 다양한 항체의 Fab 단편의 결합 친화도 (K_D)를 보여준다. 인간 및 시노 CTLA-4에 대한 결합의 유사한 pH 의존성은 시노몰구스 마카크가 본 발명의 항체를 사용한 독성학 및 다른 연구를 위한 우수한 동물이라는 것을 입증한다. 실시예 10을 참조한다.

실시예 9

58αβ-hCTLA/mCD3ζ:rhB7-1 차단 검정에서 본 발명의 이필리무맙 변이체의 생물학적 활성

본 발명의 선택된 pH 감수성 이필리무맙 변이체의 생물학적 활성을 하기와 같이 58αβ-hCTLA/mCD3ζ:rhB7-1 차단 검정에서 평가하였다. 검정을 실행하기 1일 전에, rhB7-1을 1X PBS 중에 희석하고, 96-웰 편평-바닥 플레이트에 1.2 μg/mL로 50 μL/웰로 플레이팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이필리무맙 pH 변이체 (Ipi.64, Ipi.100, Ipi.101, Ipi.105, Ipi.106)를 IgG1-NF 변이체로서 발현시키고, 58αβ-hCTLA4/mCD3ζ 세포 및 플레이트-결합된 rhB7-1의 차단에 대해 시험하였다. Ipi-pH 변이체를 pH-특이적 배지에서 8 포인트에 걸쳐 1:4 희석으로 15 μg/mL의 최종 최고 농도에 대해 적정하였다. 배지는 RPMI-1640, 10% FBS^HI, 중탄산나트륨 및 인산나트륨 완충제 (pH 5.4)를 함유한다. 인산나트륨 완충제를 목적 pH (7.2, 7.0, 6.8)에 도달할 때까지 첨가하였다. 1e6개 세포/mL의 120 μL의 세포 및 60 μL의 항체 적정물을 96-웰 둥근-바닥 플레이트에서 합하고, 37℃, 8% CO₂에서 20분 동안 인큐베이션하여 pH를 평형화시켰다. 코팅된 플레이트를 PBS로 세척하고, 150 μL 세포/항체 혼합물을 플레이트로 옮겼다. 플레이트를 37℃, 8% CO₂에서 18시간 동안 인큐베이션하고, 상청액을 제거하고, ELISA (BD)에 의해 mIL-2 생산에 대해 시험하였다. 결과는 도 18a-18c에 제공된다.

실시예 10

시노몰구스 마카크에서의 독성 평가

미국 식품 의약품국의 비임상 실험실 연구에 대한 우수 실험실 관리기준 규정 (21 C.F.R. 파트 58), USDA 동물 복지법 (9 C.F.R., 파트 1, 2, 3) 및 미국 국립 보건원의 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침 (ILAR 공개 1996)에 따라, 시노몰구스 원숭이에서 4주 연구를 수행하여 본 발명의 pH 감수성 이필리무맙 변이체의 독성을 이필리무맙과 비교하여 평가하였다.

30마리의 목적-사육 시노몰구스 원숭이 마카카 파시쿨라리스; 5마리/성별/군을 유사한 군 평균 체중을 달성하도록 설계된 계층화 무작위화 방식에 의해 3개의 군에 배정하고, 군을 무작위로 치료에 배정하였다. 군에 1) 염수 대조군, 2) 이필리무맙 50 mg/kg 또는 3) 본 발명의 pH 감수성 이필리무맙 변이체 50 mg/kg을 총 4회 용량에 대해 매주 1회 (제1일, 제8일, 제15일 및 제22일) 정맥내로 (IV) 투여하였다. 동물을 임상 징후 및 체중의 변화에 대해 평가하고, 심혈관 평가를 수행하였다. 문헌 [Selby et al. (2016) PLoS One 11:e0167251].

표 6

산 pH에서 잠재적 우선적 결합을 갖는 이필리무맙의 변이체*

* - 각각 ipi HC (서열식별번호: 11) 및 LC 변이체 9 (서열식별번호: 29) 또는 LC 변이체 10 (서열식별번호: 30)을 포함하는 추가의 변이체 ipi.23 및 ipi.24는 단지 공간상의 이유로 표 6에 포함되지 않고, 표 7에 포함된다.

표 7

산 pH에서 잠재적 우선적 결합을 갖는 이필리무맙 변이체의 CDR 서열

표 8

서열 목록의 요약

항체 서열과 관련하여, 서열 목록은 중쇄 및 경쇄의 성숙 가변 영역의 서열을 제공하며, 즉 서열은 신호 펩티드를 포함하지 않는다. 사용되는 생산 세포주에 사용하기에 적합한 임의의 신호 서열이 본 발명의 항체의 생산에 사용될 수 있다. 중쇄 아미노산 서열은 C-말단 리신 잔기 없이 제공되지만, 일부 실시양태에서 이러한 잔기는 항체에 대한 핵산 구축물에 코딩된다. 명세서 및 도면에서의 넘버링은 종종 카바트 넘버링 시스템에 따르고, 따라서 서열 목록에서의 넘버링에 상응하지 않을 수 있지만, 임의의 모호성은 도 1을 참조하여 해소될 수 있다.

등가물:

관련 기술분야의 통상의 기술자는 상용 실험만을 사용하여 본원에 개시된 구체적 실시양태의 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> Bristol-Myers Squibb Company <120> IPILIMUMAB VARIANTS WITH ENHANCED SPECIFICITY FOR BINDING AT LOW PH <130> 13177-WO-PCT <150> 62/835,794 <151> 2019-04-18 <160> 44 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 223 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala 1 5 10 15 Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro 20 25 30 Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala 35 40 45 Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly 50 55 60 Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln 65 70 75 80 Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr 85 90 95 Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val 100 105 110 Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile 115 120 125 Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly 130 135 140 Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp 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Xaa is T or H <400> 31 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Xaa Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Xaa Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Xaa Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ipilimumab (human sequence) with up to three modifications <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is S, D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa is S, D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Xaa is Y, D or E <400> 32 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Xaa Val Gly Xaa Ser 20 25 30 Xaa Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His 1 5 10 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 <210> 35 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 36 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr Leu Asp 1 5 10 <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr 1 5 <210> 39 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 40 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr 20 25 30 Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 41 <211> 450 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser 130 135 140 Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 170 175 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys 195 200 205 Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu 210 215 220 Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly 450 <210> 42 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr 20 25 30 Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 43 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human sequence with one or more His modifications <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa is S or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa is S or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> Xaa is W or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53) <223> Xaa is Y or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(54) <223> Xaa is D or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(56) <223> Xaa is S or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (57)..(57) <223> Xaa is N or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (101)..(101) <223> Xaa is R or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (103)..(103) <223> Xaa is A or H <400> 43 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Xaa Xaa Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro Xaa Gly Xaa Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 44 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human sequence with one or more Asp or Glu modifications <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is S, D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa is N, D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa is S, D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa is Y, D or E <400> 44 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Xaa Ile Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

Claims (30)

1. 중성 pH에서의 결합과 비교하여 산성 pH에서의 결합에 대한 산성 pH 결합 선호도 (APBP)가 1.5, 1.5, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 12, 15, 20, 25, 35, 50, 75 또는 100 이상인 항-인간 CTLA-4 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
2. 제1항에 있어서, 산성 pH가 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6 또는 6.8이고, 중성 pH가 7.0, 7.2, 7.4, 7.5 또는 7.6인 항-인간 CTLA-4 항체 또는 단편.
3. 제2항에 있어서, 산성 pH가 6.0이고, 중성 pH가 7.4인 항-인간 CTLA-4 항체 또는 단편.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열을 포함하며, 여기서
   a. HCDR1은 적어도 2개의 히스티딘 (H) 잔기를 포함하고/거나;
   b. HCDR2는 적어도 1개의 히스티딘 (H) 잔기를 포함하고/거나;
   c. HCDR3은 적어도 1개의 히스티딘 (H) 잔기를 포함하는 것인
   항-인간 CTLA-4 항체 또는 단편.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 각각 아스파르트산 (D) 및 글루탐산 (E)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 산성 잔기를 포함하는 LCDR1 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-인간 CTLA-4 항체 또는 단편.
6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 31H, 55H 및 95H (카바트에 따른 넘버링)로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-인간 CTLA-4 항체 또는 단편.
7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 27aD, 27aE, 30D, 30E, 31D, 31E, 32D 및 32E (카바트에 따른 넘버링)로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-인간 CTLA-4 항체 또는 단편.
8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 히스티딘 (H)이 잔기 31, 56 및 99 중 1개 이상에 존재하는 서열식별번호: 31의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-인간 CTLA-4 항체 또는 단편.
9. 제1항 내지 제3항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 아스파르트산 (D) 또는 글루탐산 (E)이 잔기 28, 31 및 33 중 1개 이상에 존재하는 서열식별번호: 32의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-인간 CTLA-4 항체 또는 단편.
10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 히스티딘 (H)이 잔기 31, 56 및 99 중 2개 이상에 존재하는 서열식별번호: 31의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-인간 CTLA-4 항체 또는 단편.
11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 아스파르트산 (D) 또는 글루탐산 (E)이 잔기 28, 31 및 33 중 2개 이상에 존재하는 서열식별번호: 32의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-인간 CTLA-4 항체 또는 단편.
12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 아스파르트산 (D) 또는 글루탐산 (E)이 각각의 잔기 28, 31 및 33에 존재하는 서열식별번호: 32의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-인간 CTLA-4 항체 또는 단편.
13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 14의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-인간 CTLA-4 항체 또는 단편.
14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 서열식별번호: 15의 잔기 1-118 및 서열식별번호: 21의 잔기 1-108 (ipi.1);
    b) 서열식별번호: 16의 잔기 1-118 및 서열식별번호: 21의 잔기 1-108 (ipi.2);
    c) 서열식별번호: 17의 잔기 1-118 및 서열식별번호: 21의 잔기 1-108 (ipi.3);
    d) 서열식별번호: 18의 잔기 1-118 및 서열식별번호: 21의 잔기 1-108 (ipi.7);
    e) 서열식별번호: 11의 잔기 1-118 및 서열식별번호: 24의 잔기 1-108 (ipi.17);
    f) 서열식별번호: 11의 잔기 1-118 및 서열식별번호: 25의 잔기 1-108 (ipi.18);
    g) 서열식별번호: 11의 잔기 1-118 및 서열식별번호: 26의 잔기 1-108 (ipi.20);
    h) 서열식별번호: 11의 잔기 1-118 및 서열식별번호: 29의 잔기 1-108 (ipi.23);
    i) 서열식별번호: 11의 잔기 1-118 및 서열식별번호: 30의 잔기 1-108 (ipi.24);
    j) 서열식별번호: 11의 잔기 1-118 및 서열식별번호: 22의 잔기 1-108 (ipi.25);
    k) 서열식별번호: 11의 잔기 1-118 및 서열식별번호: 27의 잔기 1-108 (ipi.26);
    l) 서열식별번호: 12의 잔기 1-118 및 서열식별번호: 21의 잔기 1-108 (ipi.57);
    m) 서열식별번호: 19의 잔기 1-118 및 서열식별번호: 21의 잔기 1-108 (ipi.59);
    n) 서열식별번호: 12의 잔기 1-118 및 서열식별번호: 22의 잔기 1-108 (ipi.64);
    o) 서열식별번호: 19의 잔기 1-118 및 서열식별번호: 22의 잔기 1-108 (ipi.66);
    p) 서열식별번호: 13의 잔기 1-118 및 서열식별번호: 21의 잔기 1-108 (ipi.69);
    q) 서열식별번호: 13의 잔기 1-118 및 서열식별번호: 22의 잔기 1-108 (ipi.71);
    r) 서열식별번호: 20의 잔기 1-118 및 서열식별번호: 21의 잔기 1-108 (ipi.82);
    s) 서열식별번호: 14의 잔기 1-118 및 서열식별번호: 21의 잔기 1-108 (ipi.84);
    t) 서열식별번호: 20의 잔기 1-118 및 서열식별번호: 22의 잔기 1-108 (ipi.86);
    u) 서열식별번호: 14의 잔기 1-118 및 서열식별번호: 22의 잔기 1-108 (ipi.88);
    v) 서열식별번호: 20의 잔기 1-118 및 서열식별번호: 23의 잔기 1-108 (ipi.90);
    w) 서열식별번호: 14의 잔기 1-118 및 서열식별번호: 23의 잔기 1-108 (ipi.92);
    x) 서열식별번호: 11의 잔기 1-118 및 서열식별번호: 23의 잔기 1-108 (ipi.93);
    y) 서열식별번호: 12의 잔기 1-118 및 서열식별번호: 23의 잔기 1-108 (ipi.94);
    z) 서열식별번호: 13의 잔기 1-118 및 서열식별번호: 23의 잔기 1-108 (ipi.95);
    aa) 서열식별번호: 12의 잔기 1-118 및 서열식별번호: 27의 잔기 1-108 (ipi.100);
    bb) 서열식별번호: 13의 잔기 1-118 및 서열식별번호: 27의 잔기 1-108 (ipi.101);
    cc) 서열식별번호: 13의 잔기 1-118 및 서열식별번호: 28의 잔기 1-108 (ipi.105); 및
    dd) 서열식별번호: 14의 잔기 1-118 및 서열식별번호: 28의 잔기 1-108 (ipi.106)
    로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열 쌍을 포함하는 항-인간 CTLA-4 항체 또는 단편.
15. 제14항에 있어서,
    a) 서열식별번호: 15 및 21 (ipi.1);
    b) 서열식별번호: 16 및 21 (ipi.2);
    c) 서열식별번호: 17 및 21 (ipi.3);
    d) 서열식별번호: 18 및 21 (ipi.7);
    e) 서열식별번호: 11 및 24 (ipi.17);
    f) 서열식별번호: 11 및 25 (ipi.18);
    g) 서열식별번호: 11 및 26 (ipi.20);
    h) 서열식별번호: 11 및 29 (ipi.23);
    i) 서열식별번호: 11 및 30 (ipi.24);
    j) 서열식별번호: 11 및 22 (ipi.25);
    k) 서열식별번호: 11 및 27 (ipi.26);
    l) 서열식별번호: 12 및 21 (ipi.57);
    m) 서열식별번호: 19 및 21 (ipi.59);
    n) 서열식별번호: 12 및 22 (ipi.64);
    o) 서열식별번호: 19 및 22 (ipi.66);
    p) 서열식별번호: 13 및 21 (ipi.69);
    q) 서열식별번호: 13 및 22 (ipi.71);
    r) 서열식별번호: 20 및 21 (ipi.82);
    s) 서열식별번호: 14 및 21 (ipi.84);
    t) 서열식별번호: 20 및 22 (ipi.86);
    u) 서열식별번호: 14 및 22 (ipi.88);
    v) 서열식별번호: 20 및 23 (ipi.90);
    w) 서열식별번호: 14 및 23 (ipi.92);
    x) 서열식별번호: 11 및 23 (ipi.93);
    y) 서열식별번호: 12 및 23 (ipi.94);
    z) 서열식별번호: 13 및 23 (ipi.95);
    aa) 서열식별번호: 12 및 27 (ipi.100);
    bb) 서열식별번호: 13 및 27 (ipi.101);
    cc) 서열식별번호: 13 및 28 (ipi.105); 및
    dd) 서열식별번호: 14 및 28 (ipi.106)
    로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 서열 및 경쇄 서열 쌍을 포함하는 항-인간 CTLA-4 항체.
16. 제15항에 있어서, 서열식별번호: 13 및 28 (ipi.105)의 중쇄 서열 및 경쇄 서열을 포함하는 항-인간 CTLA-4 항체 또는 단편.
17. 제15항에 있어서, 서열식별번호: 14 및 28 (ipi.106)의 중쇄 서열 및 경쇄 서열을 포함하는 항-인간 CTLA-4 항체 또는 단편.
18. 감소된 푸코실화를 갖거나, 저푸코실화되거나 또는 비푸코실화된, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항-인간 CTLA-4 항체의 제제.
19. 제18항에 있어서, 항체가 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 활성이 결여된 포유동물 세포주에서 생산되는 것인 항-인간 CTLA-4 항체의 제제.
20. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항-인간 CTLA-4 항체 또는 단편의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 핵산.
21. 제20항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
22. 제21항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
23. 제22항의 숙주 세포를 항-인간 CTLA-4 항체의 생산이 가능하도록 하는 조건 하에 배양하고, 항-인간 CTLA-4 항체를 단리하는 것을 포함하는, 항-인간 CTLA-4 항체를 제조하는 방법.
24. 인간 대상체에게 치료량의 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 단편 또는 항-인간 CTLA-4 항체의 제제를 투여하는 것을 포함하는, 인간 대상체에서 질환을 치료하는 방법.
25. 제24항에 있어서, 질환이 암인 방법.
26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 치료 또는 치료하는 것이 PD1 또는 PD-L1에 결합하는 길항제 항체 또는 그의 단편과 조합되어 수행되는 것인 방법.
27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 암이 절제불가능한 또는 전이성 흑색종인 방법.
28. 제27항에 있어서, 항체가 3 mg/kg 초과, 예컨대 10 mg/kg, 20 mg/kg, 50 mg/kg 또는 그 초과의 용량으로 투여되는 것인 방법.
29. 제25항 또는 제26항에 있어서, 암이 흑색종이고, 항체가 총 림프절절제술을 포함한 완전 절제를 받은, 1 mm 초과의 부위 림프절의 병리학적 침범이 있는 피부 흑색종을 갖는 환자에게 아주반트로서 투여되는 것인 방법.
30. 제29항에 있어서, 항체가 10 mg/kg 초과, 예컨대 20 mg/kg, 50 mg/kg 또는 그 초과의 용량으로 투여되는 것인 방법.

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