KR20210149089A - 사전 포획 응집을 이용하는 것에 의한 면역글로불린의 친화성 크로마토그래피 개선 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포 배양 수확물로부터 면역글로불린을 정제하기 위한 신규 방법에 관한 것이다. 이 방법은 초기 포획 크로마토그래피 단계 이전의 세정 단계를 특징으로 한다. 바람직하게, 초기 포획 크로마토그래피는 친화성 크로마토그래피이며, 사전 포획 세정 효과는 응집 및 여과에 의해 얻어진다. 이러한 사전 포획 세정 단계를 이용함으로서, 포획 매트릭스로부터 용리된 면역글롤불린의 품질이 향상된다. 또한, 세포 배양액의 향상된 정화는 친화성 크로마토그래피 중에 침전을 감소시키고, 이에 따라 값비싼 친화성 수지의 수명을 증가시킨다. 이는 대규모 생산에서 면역글롤불린 정제를 위한 중요한 개선이다. 본 발명은 또한 고순도의 면역글로불린을 생성하는 포획 크로마토그래피의 다운스트림에서의 폴리싱 크로마토그래피 및 여과 단계에 관한 것이다.
Description
본 발명은 항체를 정제하기 위하여, 친화성 포획 크로마토그래피(affinity capture chromatography) 전에 응집(flocculation) 및 여과(filtration) 단계, 및 포획 단계 이후의 폴리싱(polishing) 단계를 이용하여, 세포 배양 유래 조성물로부터 항체의 친화성 크로마토그래피 중에 침전을 방지하는 방법에 관한 것이다.
재조합 DNA 기술에 의해 생산된 폴리펩타이드의 정제를 위한 효율적이고 경제적인 다운스트림 시퀀스(downstream sequences)의 선택은 치료용으로 의도되는 모든 새로운 생물약제 개발에서 중요한 단계이다. 최근, 의학 용도에서 예외적으로 높은 치료 용량으로 인해, 단일 클론 항체(mabs)에 대한 대규모 정제 프로세스에 대한 필요성이 향상된 세포 배양 방법의 이용에 의해 더욱 강화되어, 더 높은 세포 밀도, 더 높은 발현율 및 이에 따라 대상 재조합 항체의 10g/L를 초과하는 더 높은 역가(titer)를 초래한다. 생성물 및 오염물의 배양액에서의 농도가 증가함에 따라 포획 크로마토그래피, 그의 선행하는 샘플 정화(clarification) 단계, 및 후속되는 폴리싱 크로마토그래피에 대한 요구 사항이 높아진다. 전체 다운스트림 공정은 (ⅰ) 증가된 질량의 생성물을 관리하여야 하며, (ⅱ) 증가된 공정 관련 및 생성물 관련 불순물을 정의된 허용 기준 미만으로 효율적으로 제거하여야 하며, (ⅲ) 경제적 수율을 유지하여야 하며, (ⅳ) mab의 충분한 품질을 보장해야 한다. 일반적으로, 다운스트림 공정은 치료용 항체의 총 제조 비용의 대부분을 차지한다.
조 분획(crude fractions) 중의 mabs은 전형적으로 숙주 세포 단백질(host cell proteins, HCP), 숙주 세포 DNA(HCDNA), 내독소(endotoxins), 인슐린, 바이러스, 응집체(aggregates), 다른 원치 않는 생성물 변이체(variants) 및 공정 물질로부터의 다양한 침출수(leachates)와 같은 불순물과 관련된다. 이러한 불순물의 존재는 환자의 잠재적인 건강 위험이므로, 최종 생성물에서 이러한 불순물이 없는 것이 규제 요건이다. 매우 적은 잔량만이 허용될 것이다.
세포 배양 유래 폴리펩타이드를 정제하기 위한 전통적인 절차는 다운스트림 시퀀스의 다양한 위치에서, 포획-중간-폴리싱 크로마토그래피(capture-intermediate-polishing chromatographies)의 순서를 따르며, 여과, 농축 또는 투석(dialysis) 단계가 수반된다. 최근, mab 정제 분야에서 플랫폼 접근 방식(platform approaches)이 성공적으로 수립되었다. mabs은 통상적인 물리화학적 특성을 갖는 당단백질의 잘 정의된 클래스(class)이므로, 일반 플랫폼 프로세스(generic platform process)의 이용이 합리적이다(Kelly B 2009). 거의 생성물 특이적 조정(product-specific adaptions)을 갖는 그러한 일반적인 프로세스는 많은 mabs에 적용될 수 있으며, 특히, 동일한 클래스 또는 서브클래스(subclass)의 면역글로불린, 예를 들어 IgG1 또는 IgG2에 적용될 수 있다.
mab 정제에 이용되는 가장 빈번한 포획 단계의 하나는 단백질 A(Protein A)에 의한 친화성 크로마토그래피이다. 이 포획은 Fc 함유 분자에 대한 예외적인 선택성을 제공하므로, 단일 단계에서 99.5%가 넘는 오염물을 제거한다. 그러나, 그의 장점 외에, 두 가지 단점도 언급되어야 한다. 하나의 단점은 독성인 것으로 알려진 단백질 A 또는 단백질 A의 단편의 원치 않는 침출이다(Gagnon P 1996). 다른 단점은 특히 치료용 항체의 충분한 양을 정제하기 위하여 필요한 산업적 규모에서, 이러한 유형의 수지의 높은 비용이다. 단백질 A 수지는 이온 교환 수지보다 약 30배 더 비싸다. 10 ㎥ 세포 배양의 다운스트림 공정에 있어서, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 비용은 약 4~5백만 USD인 것으로 계산되었다(Farid SS 2009).
많은 경우, 포획 단계는 친화성 컬럼 수지의 오염(또는 불순물의 축적)을 유발할 수 있는 조 투입(로드) 물질(crude input (load) materials)에 의해 수행된다. 적절한 재생 단계가 없으면, 이는 포획 수지의 성공적인 재사용을 막을 수 있다. 지질, 산화제, 숙주 세포 단백질(HCP), 숙주 세포 DNA(HCDNA), 응집체 또는 입자, 금속 이온, 및 다른 물질과 같은 조 배양액 중의 오염물은 수지의 오염을 촉진시키고, 낮은 pH 용리 중에 침전 및 탁도(turbidity)를 유발할 수 있다(Shukla AA 2005). 바인딩 모이어티(binding moieties)에 대한 직접적인 효과 외에, 매트릭스도 비가역적으로 오염될 수 있다. 결과적으로, 배압(back pressure)이 증가하고, 실행(run) 사이에, 용량(capacities) 및 유속(flow rates)이 감소한다. 이 문제는 단백질 A 수지에만 국한되지 않는다: 작동 수명 동안 크로마토그래피 수지의 오염은 상업적인 생물학적 분리에 있어서 일반적인 중요한 문제이다. 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography) 및 혼합 모드 크로마토그래피(mixed-mode chromatography)에 이용되는 소수성 리간드는, 세포 배양 유래 면역글로불린에 대한 포획 단계로 이용되는 경우, 배양액으로부터 친유성 오염물을 붙잡는데 특히 민감하다. 실행 후(post-run) 세정 단계에 대한 정교한 프로토콜에도 불구하고, 포획 컬럼의 수명은 제한적이며, 사이클의 수, 실행 및 세정을 위한 작동 조건, 및 샘플의 조성 및 순도에 따라 달라진다.
심하게 오염된 배양액을 정화하고 사전 세정(pre-clean)하기 위하여, 세포 잔해 및 응집체의 대부분을 제거하는 기계적 분리 단계가 채용되었다. 원심분리(Centrifugation) 및 여과 트레인(filtration trains)은 포획 수지에 샘플을 로딩하기 전에 수행되는 가장 일반적인 전처리 단계이다. 대용량에 있어서, 세포 분리기를 이용하여 연속적인 원심분리를 수행한 후, 심층 필터(depth filters) 및/또는 정밀 필터(micro filters)를 이용하는 여과 단계를 수행한다. 수득된 배양액은 "정화된 세포 배양 상청액(clarified cell culture supernatant)"으로 나타내어진다(Liu HF 2010). 수확된 배양액을 단백질 A 수지 상에 직접 로딩하는 것이 자주 선택되는 방법이지만(Fahrner RL 2001), 다른 플랫폼 기술은 포획 컬럼을 보호하기 위하여 다양한 정화 단계, 즉, 원심분리, 심층 여과(depth filtration), 및/또는 정밀 여과(microfiltration)를 사용한다(Liu HF 2010, WO9522389, WO2001150110). 이는, 고체 및 입자에 의한 수지의 오염을 감소시키고, 포획 용출액(capture eluate)에서 항체의 순도를 향상시킨다.
원심분리/여과 단계에 더하여, 플로우 쓰루 모드(flow-through mode)로 수행되는 사전 포획 크로마토그래피(Pre-capture chromatography)는 면역글로불린의 대규모 정제에 대해 성공적으로 입증되었다(WO2015135884). 포획 크로마토그래피의 업스트림(upstream)에 추가적인 음이온 교환 크로마토그래피(음이온 교환 크로마토그래피) 단계를 통합함으로써 정제 프로세스의 전체 비용이 상당히 감소될 수 있음이 밝혀졌다. 사전 포획 음이온 교환 플로우 쓰루 크로마토그래피 단계는 비용 집약적인 포획 크로마토그래피 물질이 노출되는 불순물 부담을 감소시킨다.
탁한 용리 풀(Turbid elution pools) 및 높은 컬럼 배압은 단백질 A 크로마토그래피에서 산성 pH에 의해 mabs의 용리 중에 일반적이다. 조사는, 이러한 현상을 단백질 자기 결합(protein self-association)의 결과로 액체-액체 상분리와 연결하였다. pH, 온도, 이온 강도 및 단백질 농도를 포함하는 다수의 요인이 이러한 효과에 영향을 미친다. 온도, 유속, 버퍼(buffer) 및 염(salt)을 포함하는 프로세스 파라미터의 신중한 선택이 탁도 및 컬럼 배압을 모두 감소시킬 수 있다(Luo H 2017). 단백질 A 용리 풀의 탁도에서 나타나는 응집 및 미립자 형성의 문제를 피하기 위하여 유사한 전략이 취해졌다(Shukla AA 2005). 용리 버퍼에 첨가되는 염, 요소(urea) 및 아미노산과 같은 물질의 안정화, 낮은 온도, 세척 및 용리 버퍼의 pH 값의 조정, 또는 낮은 pH 값에서 침전될 수 있는 특정 불순물을 제거하기 위한 세포 배양 수확물의 사전 처리가 제안되었다. 사전 처리 방법 중에, 음이온 교환 크로마토그래피, 여과 및 오염물의 산 침전(acid precipitation)이 있다(Skhukla AA 2005).
응집은 화학 및 식품 산업, 또한 폐수 처리에 있어서 널리 실행되어왔던 프로세스이다. 침전 및 응집은 모두 세포 배양액의 정화에 성공적으로 사용된다. 침전이 고체 입자를 생성하기 위하여 표적 용질의 용해도를 낮추는 것에 의존하는 반면, 응집은 응집제(flocculating agent)에 의해 유도된 가교 효과(bridging effect)로 인한 입자(세포, 세포 잔해 또는 포유류 세포 배양에 있어서의 콜로이드)의 집합체(agglomeration)이다. 응집제는 분산된 미립자를 더 큰 크기의 클러스터에 부착시켜 평균 입자 크기 분포를 증가시킴으로써 바이오콜로이드 현탁액의 불안정화를 유발한다(Felo M 2015, Singh N 2016). 응집 방법은 음이온, 양이온 및 혼합 모드 응집으로 분류될 수 있다(Singh N 2016).
특히, 단순 산(simple acids), 2가 양이온, 다가 양이온 폴리머, 카프릴산(caprylic acid) 및 자극 반응성 폴리머(stimulus-responsive polymer)와 같은 응집제는 세포 배양 정화를 향상시키고, DNA, 숙주 세포 단백질(HCP) 및 바이러스의 수준을 감소시키는 능력에 대하여 평가되었다(Felo M 2015). 약 10년 동안, 응집 방법은 단일 클론 항체의 대규모 제조에 있어서도 그 유용성에 대하여 집중적으로 조사되었다.
pH가 조정되거나 조정되지 않고, 세포의 존재 하에, 다양한 양이온 및 음이온의 조합에 의한 응집은 단일 클론 항체의 정제에 성공적으로 적용되었다(WO2007035283). Ca2+ 및 포스페이트의 조합이 가장 바람직하다. 응집되지 않은 대조군에 비해 단백질 A 용리 피크에 있어서 HCP 및 탁도의 현저한 감소가 강조되었다.
다른 방법은 수확된 세포 배양액에서 불순물의 침전을 위해 폴리비닐설폰산, 폴리비닐설포네이트, 폴리스티렌설폰산, 폴리아크릴산, 폴리라이신, 또는 폴리아르기닌과 같은 폴리전해질(polyelectrolytes)을 사용한다(WO2008091740). 응집제(flocculant)로 카프릴산을 사용하는 유사한 방법이 오염물을 침전시키기 위하여 개발되었다(WO2010151632).
불순물의 침전 또는 응집은 종종 추가적인 pH 조작을 필요로 한다. 이는, Co2+ 또는 Ni2+와 같은 이가 양이온의 침전에 대하여(WO2008127305), 또는 덱스트란에 의한 침전에 대하여(WO2016153983) 개시되었다.
자극 반응성 폴리머로 나타내어지는 벤질화 폴리(알릴아민)을 사용하는 다른 응집 프로세스가 CHO 세포 배양으로부터 단일 클론 IgG1 정제를 위하여 개발되었다. 자극은 인산나트륨을 첨가함으로써 설정되었다(Kang YK 2013). 항체의 세포 배양 수확물의 정화에 있어서 자극 반응성 폴리머로 작용하는 추가 화합물이 공지된다(WO2011146394).
알란토인(allantoin)을 세포 함유 수확물에 첨가한 후, 에타크리딘(ethacridine)을 첨가하는 것에 의한 응집 단계가 후속적인 흡착 및 크로마토그래피 단계 이전에 컨디셔닝 방법으로 기재되었다(WO2014133459).
다른 응집 방법은 세포 배양 수확물의 정화를 위한 추가적인 기능성 기재와 조합된 C7-C10 지방산을 이용한다(WO2014196926). C7-C10 지방산 및 알란토인의 조합에 기초하는 유사한 프로세스가 적용되었다(WO2015130222).
더욱 복잡한 응집 방법은 세포 함유 수확물에서 오염물을 제거하기 위하여 알란토인, 양이온 폴리머 및 지방산의 조합에 의해 개시되었다. 3종의 응집제인 알란토인, 키토산 및 카프릴산의 혼합물이 가장 성공적이었다(WO2017217930).
(ⅰ) 오염물의 제거를 위한 침전 단계, (ⅱ) 단백질 A 크로마토그래피, 이어서, (ⅲ) 1 또는 2개의 플로우 쓰루 크로마토그래피를 포함하는 항체 또는 다른 표적 분자의 정제를 위한 전체 프로세스가 기재되었다(WO2014004281). 침전제(precipitant)가 세포 배양 수확물에 첨가되며, 추가적인 자극 반응 요소가 있거나 또는 없이, 응집제를 포함한다.
양이온 수용성 폴리머인 폴리 (디알릴디메틸암모늄 클로라이드)의 적용은 mab-생성 CHO 세포 배양 수확물의 정화에 대하여 조사되었다(McNerney T 2015). 저자는 응집제를 배양 브로스(culture broth)에 직접 첨가하였다. 원심분리는 여과 트레인을 위하여 생략되었다. 독성인 폴리 (디알릴디메틸암모늄 클로라이드)가 후속 단백질 A 포획 크로마토그래피 후에 검출 불가능한 수준으로 감소되었다.
세포의 존재 하에, 폴리 (디알릴메틸암모늄 클로라이드)에 기초하는 초기 응집 단계로 이루어진 대규모 세포 배양 수확 방법이 개발되었다(WO2013090820). 바람직한 응집 방법은 추가적인 응집 촉진제, 즉, 폴리에틸렌 글리콜 및 Triton X-100을 이용한다.
본 발명은 친화성 포획 크로마토그래피 매질로부터의 세포 배양으로부터 면역글로불린의 낮은 pH 용리 중에 침전 방지에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 효율적이고 비용 효과적인 방식으로, 만족스러운 순도 및 수율을 갖는 면역글로불린의 정제 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 포획 크로마토그래피 수지로부터 용리된 면역글로불린 용액의 순도를 향상시켜, 최종 생성물의 품질을 향상시키는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 다소 비용집약적인 크로마토그래피 물질의 재사용 측면, 특히 다운스트림 공정의 포획 단계에 이용되는 친화성 크로마토그래피 물질의 수명, 및 정제 프로세스의 기술적 복잡성을 감소시키면서 이를 증가시킬 수 있는 방법을 다룬다.
세포 배양액으로부터 면역글로불린의 정제를 위한 통상적인 다운스트림 크로마토그래피 프로세스는, 일반적으로 불순물과 함께 면역글로불린을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 포획하여야 하는 친화성 포획 크로마토그래피 단계로 시작된다. 불순물은 포획 크로마토그래피 수지에 결합하지 않아 플로우 쓰루(flow-through)에서 수득되는 반면, 포획 크로마토그래피 수지의 친화성 리간드에 대한 면역글로불린의 선택적인 결합 때문에 면역글로불린은 불순물로부터 분리되어 용출액(eluate)에서 수득된다.
친화성 포획 크로마토그래피는 단백질 A 친화성 크로마토그래피가 이용되는 경우 전체 다운스트림 공정의 40 내지 50%에 달하는, 면역글로불린의 정제에서 일반적으로 가장 비용이 많이 드는 단계이다. 면역글로불린의 정제에서 포획 크로마토그래피 단계로 이용될 수 있는 대체적인 친화성 크로마토그래피 컬럼에도 동일하게 적용된다.
많은 양의 세포 배양액 및 발효 브로스(fermentation broth)로부터, 및 그러한 배양액 또는 브로스로부터 유래된 정화된 샘플로부터, 면역글로불린의 비용 효과적인 정제에 대한 지속적인 요구가 있다. 특히, 비용 효과적이고 여전히 효율적이며, 순도 및 수율 측면에서 만족스러운 간단한 정제 방법에 대한 요구가 있다.
포획 크로마토그래피의 업스트림에 추가적인 크로마토그래피 단계를 통합시킴으로서, 정제 프로세스의 전체 비용을 상당히 감소시킬 수 있음이 밝혀졌다. 추가적인 크로마토그래피 단계는 비용 집약적인 포획 크로마토그래피 물질이 노출되는 불순물 부담을 감소시킨다. 이러한 소위 "사전 세정(pre-cleaning)" 단계는, 후속 포획 단계에서 사용되는 크로마토그래피 물질에 비하여 더 저렴하고 더 강력하며, 재생이 용이한 음이온 교환 또는 혼합 모드 크로마토그래피 물질을 사용하여 수행된다 (WO2015135884). 정제 프로세스를 가능한 한 간단하게 유지하기 위하여, 사전 세정 크로마토그래피는 플로우 쓰루 모드로 수행되며, 즉, 정제될 면역글로불린은 수지에 의해 결합되지 않고, 플로우 쓰루 분획에서 수득되는 반면, 불순물은 대부분 수지에 유지되어, 면역글로불린으로부터 분리된다. 단백질 A 포획 컬럼에 사전 세정 음이온 교환 컬럼을 직접적으로 연결함으로써, 사전 세정 단계의 플로우 쓰루는 수집 용기에 일시적으로 저장되지 않고 포획 크로마토그래피 수지로 즉시 통과되도록 하여, 이 방법을 더욱 단순화시킨다(WO2015135884).
그럼에도 불구하고, 사전 포획 정화 단계로 이용되는 음이온 교환 플로우 쓰루 크로마토그래피 과정은, 대규모 생산에서는 성공적으로 확립되었지만, 여전히 추가적인 개선 대상이다. 음이온 교환 크로마토그래피는 컬럼에 남아 있는 비특이적으로 흡착된 세포 잔해, 응집체, 지질 등과 함께 HCDNA 및 HCP와 같은 주로 음으로 하전된 물질을 고갈시킨다. 그러나, 양으로 하전된 HCP의 대다수 및 하전되지 않은 분자는 사전 세정 컬럼을 통과할 수 있다. 이는 단백질 A 용리 피크(elution peak)에서 원하지 않는 탁도를 유발할 수 있다. 또한, 높은 세포 밀도, 복잡한 배지 공급 전략 및 최첨단 포유류 세포 배양의 높은 발현율로 인하여 야기된 수요 증가로 인하여, 사전 세정 컬럼은 단백질 A 컬럼의 효율적인 보호 쉴드로서 작용하기 위하여 상당한 치수(dimension)를 필요로 한다. 이는 비용을 치르게 된다. 마지막으로, 음이온 교환 수지는 가혹하고 시간 소모적인 세정 및 재생 과정을 거쳐야 한다. 이는, 시리얼 배치(serial batches)의 캠패인에서 우선적으로 수행되는 일상적인 생산에서는 선호되지 않는다.
본 발명은 전술한 크로마토그래피 사전 세정의 문제점을 해결하기 위하여 사전 포획 단계로 이용되는 응집 단계의 실행가능성을 연구하였다. 치료용으로 의도된 면역글로불린에 대하여 요구되는 높은 순도를 달성하기 위하여, 2 이상의 크로마토그래피 폴리싱(polishing) 단계가 응집 단계 및 포획 크로마토그래피 단계 다음에 있다.
본 발명의 근본적인 문제는 세포 배양으로부터 면역글로불린의 정제 방법의 제공에 의해 해결되며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 응집-유도 화합물(flocculation-inducing compound)을 세포 배양액에 첨가하는 단계;
(b) 단계 (a)의 혼합물의 심층 여과 단계 ;
(c) 단계 (b)에서 수득된 여액(filtrate)을 친화성 크로마토그래피에 노출시키는 단계 - 여기서, 면역글로불린은 친화성 크로마토그래피 매질에 결합됨 -;
(d) 5 내지 9의 pH 값 및 0.1 내지 5.0 mol/ℓ의 이온 강도를 갖는 세척 버퍼(wash buffer)를 이용하여 친화성 크로마토그래피 매질을 세척하는 단계; 및
(e) 2.5 내지 4.5의 pH 값을 갖는 용리 버퍼(elution buffer)를 이용하여 친화성 크로마토그래피 수지로부터 면역글로불린을 용리시키는 단계.
일부 실시형태에서, 단계 (a)는 하기 단계를 포함한다:
- 세포 배양액의 원심분리 및/또는 여과 단계;
- 응집-유도 화합물을 상청액 또는 여액에 첨가하는 단계.
응집은 응집제로서 양이온성 화합물을 첨가하는 것에 의해 수행될 수 있다. 양이온성 화합물은 2가 금속 이온염, 수용성 유기 폴리머 및 수불용성 유기 폴리머로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, 2가 금속 이온염은 CaCl2이다.
일부 실시형태에서, 수용성 유기 폴리머는 폴리 (디알릴디메틸암모늄 클로라이드)이다. 다른 실시형태에서, 수불용성 유기 폴리머는 키토산이다.
특정 실시형태에서, 응집은 응집제로 폴리 (디알릴디메틸암모늄 클로라이드)에 의해 수행된다. 더욱 특히, 폴리 (디알릴디메틸암모늄 클로라이드)는 10 kDa 내지 10 000 kDa의 분자 질량(molecular mass)을 갖는다.
전형적으로, 폴리 (디알릴디메틸암모늄 클로라이드)는 0.01 내지 1.0 %(w/v)의 최종 농도로, 바람직하게 0.02 내지 0.1 %(w/v)의 최종 농도로, 더욱 바람직하게 0.03 내지 0.08 %(w/v)의 최종 농도로 첨가된다.
일부 실시형태에서, 응집을 수행하기 위하여 폴리 (디알릴디메틸암모늄 클로라이드)를 제외한 추가적인 물질은 첨가되지 않는다.
일부 실시형태에서, 폴리 (디알릴디메틸암모늄 클로라이드)에 의한 응집은 pH 또는 전도도(conductivity)의 추가적인 조정 없이 수행된다.
특정 실시형태에서, 응집은 교반 하에, 실온에서, 적어도 5분 동안, 바람직하게 적어도 15분 동안 수행된다.
바람직한 실시형태에서, 친화성 크로마토그래피는 단백질 A 크로마토그래피이다. 단백질 A 크로마토그래피 매질은 가교결합 아가로스 매트릭스(cross-linked agarose matrix)에 결합된, 리간드로서, 알칼리-내성(alkali-tolerant) 단백질 A 유도체, 바람직하게 단백질 A의 도메인 B의 알칼리-안정화된 테트라머 변이체(an alkali-stabilized tetramer variant of domain B of Protein A)이다.
일부 실시형태에서, 심층 여과 후에, 정밀 여과가 수행된다.
전형적으로 친화성 크로마토그래피는 심층 여과 후 최대 8시간 후, 바람직하게 심층 여과 후 최대 3시간 후 수행된다.
일부 실시형태에서, 세포 배양액은 면역글로불린을 발현하는 재조합 CHO 세포로부터 수득된다. 바람직하게, 면역글로불린은 IgG1 또는 IgG2이다. 더욱 바람직하게, IgG1 또는 IgG2의 Fc 부분은 인간이다.
본 명세서에 기재된 방법은 전술한 실시형태 중 어느 하나에 정의된 단계를 포함하고, 바이러스 불활성화(virus inactivation), 이온 교환 크로마토그래피, 혼합 모드 크로마토그래피(mixed-mode chromatography), 나노 여과(nanofiltration) 및 한외여과/정용여과(ultrafiltration/diafiltration)로부터 선택되는 일 이상의 추가 단계를 포함할 수 있다.
바람직하게, 전술한 방법은 하기 단계를 더 포함한다:
(f) 바이러스 불활성화를 위하여, 단계 (e)의 용출액을 2.5 내지 4.5의 낮은 pH 값에서 적어도 10분 동안 배양하는 단계;
(g) 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계;
(h) 혼합 모드 크로마토그래피 또는 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계;
(i) 단계 (h)의 용출액, 또는 그로부터 유래되고 단계 (h) 후에 수행된 일 이상의 추가적인 공정 단계 후에 수득된 조성물을 나노 여과에 노출시키는 단계; 및
(j)단계 (i)의 여액, 또는 그로부터 유래되고 단계 (i) 후에 수행된 일 이상의 추가적인 공정 단계 후에 수득된 조성물을 한외여과/정용여과에 노출시키는 단계.
추가적인 바람직한 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 응집-유도 화합물을 세포 배양액에 첨가하는 단계;
(b) 단계 (a)의 혼합물의 심층 여과 단계 ;
(c) 단계 (b)에서 수득된 여액을 친화성 크로마토그래피에 노출시키는 단계 - 여기서, 면역글로불린은 친화성 크로마토그래피 매질에 결합됨 -;
(d) 5 내지 9의 pH 값 및 0.1 내지 5.0 mol/ℓ의 이온 강도를 갖는 세척 버퍼를 이용하여 친화성 크로마토그래피 매질을 세척하는 단계;
(e) 2.5 내지 4.5의 pH 값을 갖는 용리 버퍼를 이용하여 친화성 크로마토그래피 수지로부터 면역글로불린을 용리시키는 단계;
(f) 바이러스 불활성화를 위하여, 단계 (e)의 용출액을 2.5 내지 4.5의 낮은 pH 값에서 적어도 10분 동안 배양하는 단계;
(g) 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계;
(h) 혼합 모드 크로마토그래피 또는 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계;
(i) 단계 (h)의 용출액, 또는 그로부터 유래되고 단계 (h) 후에 수행된 일 이상의 추가적인 공정 단계 후에 수득된 조성물을 나노 여과에 노출시키는 단계; 및
(j) 단계 (i)의 여액, 또는 그로부터 유래되고 단계 (i) 후에 수행된 일 이상의 추가적인 공정 단계 후에 수득된 조성물을 한외여과/정용여과에 노출시키는 단계;
여기서, 단계 g)는 결합-용리 모드(bind-elute mode)에서 수행되고, 단계 h)는 결합-용리 모드 또는 플로우 쓰루 모드에서 수행된다.
본 발명은 면역글로불린의 제조 과정에서 바이러스 안전성을 증가시키는 문제를 추가적으로 해결한다.
도 1: 면역글로불린에 대한 종래 정제 방법의 공정 계획
도 1a는 대용량의 세포 배양물로부터 면역글로불린의 정제를 위한 보편적인 공정 계획을 나타낸다. 수확된 배양액의 원심분리 및/또는 여과 후에 수득된 정화된 벌크 물질로 시작되는 이 공정은 단백질 A 포획 단계 및 2개의 후속적인 폴리싱 단계로 이루어진다. 이 계획은 두 가지의 전형적인 바이러스 안전성 단계도 포함한다. 바이러스 불활성화 단계는 낮은 pH에서 단백질 A 용출액을 유지시킴으로써 수행되고, 바이러스 제거를 위한 나노 여과 단계가 마지막 폴리싱 단계 후에 수행된다. 최종 단계는 일반적으로 면역글로불린 및 제형 성분의 원하는 농도를 설정하기 위한 접선 유동 한외여과 및/또는 정용여과(tangential flow ultrafiltration and/or diafiltration, UF/DF-TFF)이다.
도 1b는 3개의 크로마토그래피로 이루어진 대용량의 세포 배양물로부터 면역글로불린의 정제를 위한 전통적인 공정 계획을 나타낸다(예를 들어, Fahrner R.L. 2001 또는 Kelly B. 2009에 따름). 폴리싱 단계가 양이온 교환 크로마토그래피(폴리싱 단계 1)에 이어 음이온 교환 크로마토그래피(폴리싱 단계 2)인 것으로 개시되어 있는 점을 제외하고는 도 1a와 동일한 공정이다. 양이온 교환 크로마토그래피는 결합 모드(binding mode)에서 수행되는 반면, 음이온 교환 크로마토그래피는 플로우 쓰루 모드에서 수행된다는 점을 강조해야 한다. 이 전통적인 계획의 자주 적용되는 등가 변형은 단순히 폴리싱 단계 1 및 2의 순서를 변경하는 것임을 언급하여야 한다.
도 2: 사전 세정 단계를 이용하는 본 발명의 예시적인 공정 계획
도 2a는 세포의 존재 하에 수확물에서 직접적으로 사전 포획 응집 단계를 갖는 대규모 공정 계획을 나타낸다. 이어서, 응집된 물질은 원심분리에 이어서 심층 여과 및 정밀 여과에 의해 제거된다. 응집 단계는 양이온성 화합물을 첨가함으로써 수행된다. 정화된 배양액은 단백질 A인 포획 크로마토그래피 컬럼에 로딩된다. 2개의 폴리싱 단계는 양이온 교환 크로마토그래피(폴리싱 단계 1)에 이어서 혼합 모드 크로마토그래피(폴리싱 단계 2)이다. 양이온 교환 크로마토그래피는 결합 및 용리 모드(bind and elute mode)에서 수행된다. 혼합 모드 수지는 양으로 하전된 리간드를 가지며, 결합 및 용리 모드 또는 플로우 쓰루(FT) 모드에서 수행될 수 있다. 중간 바이러스 안전성 단계 및 최종 UF/DF-TFF는 도 1a에 설명된 바와 같다.
도 2b는 응집 단계가 세포 부재 하에 세포 분리 이후에 수행된다는 점을 제외하고는 도 2a의 공정과 유사한 대안적인 대규모 공정 계획을 나타낸다. 모든 다른 단계는 도 2a에 설명된 바와 같다.
도 2c는 최종 폴리싱 크로마토그래피가 플로우 쓰루(FT) 모드의 음이온 교환 크로마토그래피인 점을 제외하고는 도 2b의 공정과 유사한 대안적인 대구모 공정 계획을 나타낸다. 모든 다른 단계는 도 2a 및 도 2b에 설명된 바와 같다.
도 1a는 대용량의 세포 배양물로부터 면역글로불린의 정제를 위한 보편적인 공정 계획을 나타낸다. 수확된 배양액의 원심분리 및/또는 여과 후에 수득된 정화된 벌크 물질로 시작되는 이 공정은 단백질 A 포획 단계 및 2개의 후속적인 폴리싱 단계로 이루어진다. 이 계획은 두 가지의 전형적인 바이러스 안전성 단계도 포함한다. 바이러스 불활성화 단계는 낮은 pH에서 단백질 A 용출액을 유지시킴으로써 수행되고, 바이러스 제거를 위한 나노 여과 단계가 마지막 폴리싱 단계 후에 수행된다. 최종 단계는 일반적으로 면역글로불린 및 제형 성분의 원하는 농도를 설정하기 위한 접선 유동 한외여과 및/또는 정용여과(tangential flow ultrafiltration and/or diafiltration, UF/DF-TFF)이다.
도 1b는 3개의 크로마토그래피로 이루어진 대용량의 세포 배양물로부터 면역글로불린의 정제를 위한 전통적인 공정 계획을 나타낸다(예를 들어, Fahrner R.L. 2001 또는 Kelly B. 2009에 따름). 폴리싱 단계가 양이온 교환 크로마토그래피(폴리싱 단계 1)에 이어 음이온 교환 크로마토그래피(폴리싱 단계 2)인 것으로 개시되어 있는 점을 제외하고는 도 1a와 동일한 공정이다. 양이온 교환 크로마토그래피는 결합 모드(binding mode)에서 수행되는 반면, 음이온 교환 크로마토그래피는 플로우 쓰루 모드에서 수행된다는 점을 강조해야 한다. 이 전통적인 계획의 자주 적용되는 등가 변형은 단순히 폴리싱 단계 1 및 2의 순서를 변경하는 것임을 언급하여야 한다.
도 2: 사전 세정 단계를 이용하는 본 발명의 예시적인 공정 계획
도 2a는 세포의 존재 하에 수확물에서 직접적으로 사전 포획 응집 단계를 갖는 대규모 공정 계획을 나타낸다. 이어서, 응집된 물질은 원심분리에 이어서 심층 여과 및 정밀 여과에 의해 제거된다. 응집 단계는 양이온성 화합물을 첨가함으로써 수행된다. 정화된 배양액은 단백질 A인 포획 크로마토그래피 컬럼에 로딩된다. 2개의 폴리싱 단계는 양이온 교환 크로마토그래피(폴리싱 단계 1)에 이어서 혼합 모드 크로마토그래피(폴리싱 단계 2)이다. 양이온 교환 크로마토그래피는 결합 및 용리 모드(bind and elute mode)에서 수행된다. 혼합 모드 수지는 양으로 하전된 리간드를 가지며, 결합 및 용리 모드 또는 플로우 쓰루(FT) 모드에서 수행될 수 있다. 중간 바이러스 안전성 단계 및 최종 UF/DF-TFF는 도 1a에 설명된 바와 같다.
도 2b는 응집 단계가 세포 부재 하에 세포 분리 이후에 수행된다는 점을 제외하고는 도 2a의 공정과 유사한 대안적인 대규모 공정 계획을 나타낸다. 모든 다른 단계는 도 2a에 설명된 바와 같다.
도 2c는 최종 폴리싱 크로마토그래피가 플로우 쓰루(FT) 모드의 음이온 교환 크로마토그래피인 점을 제외하고는 도 2b의 공정과 유사한 대안적인 대구모 공정 계획을 나타낸다. 모든 다른 단계는 도 2a 및 도 2b에 설명된 바와 같다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "세포 배양액(cell culture fluid)"은수확된 세포 배양액, 세포 배양 상청액 또는 사전 처리된 세포 배양 상청액을 나타낸다. 세포 배양액은 면역글로불린을 생산하는 숙주 세포 또는 유기체로부터 직접 수득될 수 있다. 세포 배양액은 원심분리 및/또는 여과, 예를 들어, 정밀 여과, 정용여과, 한외여과 및 심층 여과에 의해 부분적으로 정화되거나 정제되었을 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "사전 처리된(pretreated)"은 원하는 크로마토그래피 성능을 달성하고 면역글로불린을 안정화시키도록 pH 및/또는 전도도 범위 및/또는 완충 용량을 조정하여 위하여, 예를 들어, 샘플에 대하여, 버퍼 교환, 희석, 염, 세제, 카오트로픽(chaotropic) 물질, 또는 유기 화합물의 첨가, pH 적정(titration) 또는 여과로 이루어진 일 이상의 조정을 수행함으로써, 예를 들어, 본 발명의 방법에 이용되는 크로마토그래피 단계를 위하여 제조되는 세포 배양 상청액이다. 포유류 세포로부터 발현된 면역글로불린은 배양 과정 중에 일반적으로 세포 배양액으로 분비되기 때문에, 배양 과정 마지막에서의 생성물 수확은 세포로부터 세포 배양액을 분리함으로써 이루어진다. 세포 분리 방법은 세포 잔해의 증가, 및 프로테아제 및 면역글로불린 생성물의 품질에 영향을 미칠 수 있는 다른 분자의 방출을 피하기 위하여 세포 파괴를 최소화하도록 부드럽게 이루어져야 한다. 일반적으로, 포유류 세포 배양물로부터의 수확물은 원심분리에 이어서 여과를 거친다. 확장층 흡착 크로마토그래피(Expanded bed adsorption chromatography)는 원심분리/여과 방법을 피하기 위한 대안적인 방법이다. 크로마토그래피 단계를 통한 정제 전 샘플의 다른 처리는 특정 면역글로불린 농도, pH 범위, 전도도 및 버퍼종(buffer species) 농도로 세포 배양 상청액을 농축 및/또는 정용여과하는 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "응집(flocculation)"(동의어 "응고(coagulation)" 및 "집합(agglomeration)")은 유체 내에 현탁된 고체가 응집-유도제와 상호작용하여 더 큰 크기의 응집체(aggregates) 또는 플록(flocs)을 형성하는 클러스터링 반응(clustering reaction)을 포함한다. 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있는 용어 "응집제(flocculants)" 및 "응집-유도제(flocculation-inducing agents)"는 양이온성 또는 음이온성 화합물일 수 있다. 바람직하게, 응집제는 양이온성 화합물이다. 더욱 바람직하게, 응집제는 양이온 수용성 폴리머이다. 본 발명에 적용되는 "응집 단계"는 포획 크로마토그래피에 대한 업스트림에서 사전 세정 단계로 기능한다. 응집은 세포의 존재 하에 수행될 수 있으며, 이는 응집제가 배양 마지막에 세포 배양물에 직접적으로 첨가되고, 세포를 포함하는 응집된 물질은 원심분리 및/또는 여과에 의해 세포 배양액으로부터 제거되거나, 또는 세포가 원심분리에 의해 제거된 후에 응집제가 세포 배양물에 첨가되고, 이어서 응집된 물질은 여과에 의해 제거되는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "양이온성 화합물(cationic compound)"은 금속 이온 및 양이온성 폴리머(폴리양이온)이다. "양이온성 폴리머"는 수용성 폴리머 또는 수불용성 폴리머일 수 있다. "수용성 폴리머"는 물에 용해되어 수성 시스템의 물리적 특성을 변형시키는 유기 물질을 포함한다. "수불용성 폴리머"는 물에 대한 제한적인 용해도를 갖는다. 이는 물에 분산되거나 팽윤되며, 바람직하게 수성 현탁액에서 응집제로 기능하는 친수성 폴리머를 포함한다. 수불용성 폴리머는 매우 낮거나 매우 높은 pH에서 물에 용해될 수 있다. 응집제로 이용되는 양이온성 화합물은 수성 매질에서 다양한 기능을 수행한다. 수용성 또는 수불용성 유기 폴리머는 천연 공급원으로부터, 또는 화학적 합성으로부터 유래된 광범위한 물질을 포함한다. 천연 수용성 또는 수불용성 유기 폴리머의 예로는 다당류(예를 들어, 펙틴, 덱스트란, 전분, 키토산 및 히알루론산), 잔탄검, 카라기난 등이 있다. 화학적으로 합성된 유기 폴리머의 예로는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐 피롤리돈(PVP), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리아크릴산(PPA), 폴리아크릴아미드 등이 있다(검토는 Kadajii VG 2011 참조). 본 발명의 과정에서, 수용성 폴리머는 가장 바람직한 응집제로 기능한다.
용어 "불순물(impurity)" 및 "오염물(contaminant)"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 관심 면역글로불린과 상이한 임의의 물질을 나타낸다. 예는, 세포 배지 성분, 세포 잔해, 숙주 세포 단백질, 내독소, 바이러스, 지질, DNA, RNA, 공정 물질로부터의 침출수, 및 그의 응집체 또는 단편일 수 있다. 응집체, 전하 변이체, 잘못 접힌(misfolded) 분자, 또는 정제될 관심 면역글로불린의 단편과 같은 생성물-관련 물질도 불순물로 간주된다.
용어 "침전(precipitation)"은 불용성 및/또는 불용성 상태인 불순물을 나타낸다. 침전은 샘플의 탁도를 유발할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "크로마토그래피 매질(chromatography media)" 또는 "크로마토그래피 매질(chromatography medium)"은 비드, 플레이트, 결정, 모노리스, 멤브레인, 섬유, 섬유의 메쉬워크, 또는 다른 임의의 고체상(solid phase) 형태인 크로마토그래피 물질 또는 매질로 이해되어야 한다. "매질(media)"은 "매트릭스(matrix)"로 나타내어지는 백본에 직접적으로 또는 스페이서를 통하여 결합된 "리간드(ligands)"로 나타내어지는 기능기를 함유한다. 전형적으로 부착된 리간드가 없는 크기 배제 크로마토그래피용 겔 크로마토그래피 수지는 예외이다. 용어 "매질"은 본 발명의 방법을 크로마토그래피 수지를 채용하는 컬럼 크로마토그래피에 제한하는 것이 아니며, 다른 형태의 크로마토그래피, 예를 들어, 막 흡착제를 사용하는 막 크로마토그래피도 포함한다. 특히, 이온 교환 크로마토그래피에서, 이온 크로마토그래피 교환 수지 또는 이온 교환 크로마토그래피 막 흡착제는 모두 본 발발명에 포함된다.
"수지(Resin)"는 단백질 또는 적어도 하나의 오염물과 상호작용할 수 있는 결합된 기능기(리간드)를 갖는 매트릭스를 포함하는 비드 형태의 임의의 크로마토그래피 물질 또는 매질을 의미한다. 전형적으로 부착된 리간드가 없는 크기 배제 크로마토그래피용 겔 크로마토그래피 수지는 예외이다. 수지는 상이한 크기의 비드로 공급되고, 컬럼 내에 충전될 수 있다. 대안으로, 프리팩(pre-packed) 컬럼을 구입할 수 있다.
용어 "매트릭스" 또는 "고체상"은 리간드가 부착될 수 있는 비수성 매트릭스를 의미한다. 본 명세서에서 관심 있는 매트릭스는 일반적으로 유리, 세라믹, 실리카, 셀룰로오스, 아가로스, 메타크릴레이트 폴리머 또는 폴리스티렌을 포함하는 것이다.
"리간드"는 단백질 또는 적어도 하나의 오염물질과 상호작용하고, "매트릭스"에 공유 결합되는 임의의 기능기를 의미한다.
용어 "결합 모드(binding mode)" 또는 "결합 및 용리 모드(bind and elute mode)"는 정제될 면역글로불린을 함유하는 샘플이 크로마토그래피 매질에 적용되는 크로마토그래피 조건을 나타내며, 여기서, 면역글로불린은 크로마토그래피 매질에 결합된다. 따라서, 면역글로불린은 크로마토그래피 매질에 유지되는 반면, 샘플의 불순물은 플로우 쓰루 분획으로도 지칭되는 비결합 분획(non-binding fraction)에 존재할 수 있다. 크로마토그래피 단계가 결합 모드에서 수행되는 경우, 크로마토그래피 매질에 대한 면역글로불린의 결합 후, 매질로부터 면역글로불린의 용리 전에, 일 이상의 세척 단계가 수행될 수 있다. 면역글로불린을 수득하기 위하여, 면역글로불린은 용리되고, 용출액에서 수득되며, 이는 원하는 경우 추가적인 크로마토그래피 단계에서 추가적으로 정제될 수 있다. 면역글로불린의 용리는 면역글로불린이 용리되는 동안 오염물이 매질에 결합된 상태로 남아 있도록 하는 선택적인 조건을 사용하여 수행될 수 있다.
"결합 모드"에서 크로마토그래피 단계를 수행하는 것은 반드시 관심 면역글로불린의 100%가 결합된다는 것을 의미하지는 않는다. 본 발명의 맥락에서, "크로마토그래피 수지에 결합된" 또는 "크로마토그래피 매질에 결합된"은 면역글로불린의 적어도 50%가 수지 또는 매질에 결합되고, 바람직하게 면역글로불린의 적어도 75%가 수지 또는 매질에 결합되고, 더욱 바람직하게 면역글로불린의 적어도 85%가 수지 또는 매질에 결합되고, 가장 바람직하게 면역글로불린의 95% 넘게 수지 또는 매질에 결합된다.
본 발명의 맥락에서, 포획 크로마토그래피 단계 및 중간 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 모두 결합 모드에서 수행되며, 포획 단계는 결합 모드에서 수행되는 제1 크로마토그래피 단계로 간주되는 것으로 이해된다. 본 발명의 최종 폴리싱혼합 모드 크로마토그래피 단계는 결합 및 용리 모드에서, 또는 플로우 쓰루 모드에서 수행된다. 혼합 모드 크로마토그래피 대신에, 플로우 쓰루 모드의 음이온 교환 크로마토그래피가 최종 폴리싱 단계로 이용될 수 있음이 추가적으로 이해된다.
용어 "플로우 쓰루 모드(flow-through mode)"는 관심 면역글로불린을 함유하는 샘플이 크로마토그래피 매질에 적용되는 크로마토그래피 조건을 나타내며, 여기서, 면역글로불린은 크로마토그래피 수지에 결합되지 않고 수지 또는 매질에 결합되지 않은 분획에 주로 존재하여, 플로우 쓰루에 함유된다. 개발된 본 발명의 중간 크로마토그래피는 플로우 쓰루 모드를 이용하지 않는다. 그러나, 본 발명의 방법은 플로우 쓰루 모드의 추가적인 폴리싱 크로마토그래피에 의해 보완될 수 있다. 불순물은 이 모드에서 수지 또는 매질에 결합될 수 있다.
"세척 단계(wash step)"는 샘플이 크로마토그래피 컬럼에 로딩된 후 단백질이 컬럼으로부터 용리되기 전에, 결합 모드의 크로마토그래피에서 수행되는 단계이다. 세척 단계는 수지로부터 관심 면역글로불린을 상당히 용리시키지 않으면서 매트릭스, 면역글로불린, 및/또는 리간드에 덜 단단히, 또는 비특이적으로 결합된 오염물을 추가적으로 제거한다. 세척 단계에서, 수지는 원하는 세척 버퍼로 세척된다(예를 들어, 컬럼 출구에서 측정된 UV 흡수가 기준선으로 돌아올 때까지 세척 버퍼는 크로마토그래피 컬럼을 통과한다).
용어 "용리(elution)"는 버퍼 성분이 크로마토그래피 수지의 리간드 부위에 대하여 관심 분자와 경쟁하도록 용액 조건을 변경함으로써 크로마토그래피 수지로부터 관심 면역글로불린을 탈착시키는 과정으로 이해된다. 다른 용리 모드가 예를 들어, 단백질 A를 이용하는 친화성 크로마토그래피에서 일어난다. 이 경우, 용리 버퍼는 리간드 또는 면역글로불린의 형태를 변경하여 결합을 느슨하게 할 수 있다. 관심 면역글로불린은, 이동상의 버퍼 이온이 이온 교환 수지의 하전된 이온 부위에 대하여 분자와 경쟁하도록 이온 교환 물질을 둘러싸는 버퍼의 이온 강도를 변경함으로써 이온 교환 수지로부터 용리될 수 있다. 대안적으로, pH의 변화는 양쪽성 단백질에 영향을 미치고, 이후 단백질의 pI를 초과하는 pH 증가는 양이온 교환 수지에 대한 결합을 방지하고 단백질은 용리된다. pH가 단백질의 pI 미만으로 감소하는 경우 음이온 교환 크로마토그래피 수지에서도 동일한 효과가 발생한다. 본 명세서에서 이해되는 바와 같이, 용어 "용리"는 선행하는 세척 단계를 갖거나, 또는 갖지 않는, 등용매 용리(isocratic elution), 단일 단계 용리(single step elution) 및 구배 용리(gradient elution)를 포함한다. 관심 면역글로불린의 용리는 버퍼 용액에서 염 농도의 증가에 의해 영향 받는 이동상에서의 이온 강도 또는 전도도를 증가시킴으로써 수행될 수 있다. 대안적으로, pH 값의 증가 또는 감소가 적합할 수 있다. 불연속 단계 구배, 선형 구배, 비선형 구배 또는 그러한 구배의 적합한 조합이 사용될 수 있다.
세척 및 용리에 적합한 버퍼는 아세테이트, 시트레이트, 석시네이트, 말레에이트, 말로네이트, Tris-HCl, Tris-아세테이트, Tris-글리신, 포스페이트, 석시네이트, 말로네이트, MES, MOPS, PIPES, PHEPES, 비스트리스(bistris), 글리신, 및 포스페이트, 설페이트, 또는 NaCl 또는 KCl과 같은 클로라이드와 같은 염이 첨가된 다른 적합한 버퍼로부터 선택될 수 있다. 용리가 이루어지는 이온 강도 및 염 농도는 버퍼 용액의 pH 값 및 단백질의 pI에 따라 달라진다. 세척 버퍼는 세제(예를 들어, 폴리소르베이트), 용매(예를 들어, 헥실렌 글리콜, 이소프로판올, 또는 에탄올), 또는 폴리머(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)을 더 포함할 수 있다. 또한, 세척 버퍼는 카오트로픽 시약(예를 들어, 요소 또는 아르기닌) 및/또는 프로테아제 억제제(예를 들어, EDTA)를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "버퍼(buffer)"는 산-염기 컨주게이트 성분의 작용에 의해 pH 변화에 저항하는 용액을 나타낸다.
용어 "면역글로불린" 및 "항체"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 면역글로불린은 단일 클론 항체, 폴리 클론 항체, 다중 특이적 항체(multispecific antibody)(예를 들어, 이중 특이적 항체), 및 원하는 항원 결합 활성을 나타내는 그의 단편일 수 있다. 자연적으로 발생하는 항체는 다양한 구조를 갖는 분자이다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성된, 약 150,000 달톤의 헤테로 테트라머 당단백질이다. N-말단에서 C-말단으로, 각각의 중쇄는 가변 중 도메인(variable heavy domain) 또는 중쇄 가변 도메인(heavy chain variable domain)으로도 지칭되는 가변 도메인(variable domain, VH)에 이어서 3개 또는 4개의 불변 도메인(constant domains)(CH1, CH2, CH3 및 선택적으로 CH4)을 갖는다. 유사하게, N-말단에서 C-말단으로, 각각의 경쇄는 가변 경 도메인(variable light domain) 또는 경쇄 가변 도메인(light chain variable domain)으로도 지칭되는 가변 도메인(VL)을 갖는다. 항체의 경쇄는 그 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파(κ) 및 람다(λ)로 지칭되는 두 가지 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
"항체 단편(Antibody fragments)"은 전장 항체의 일부, 일반적으로 이의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 단일 사슬 항체 분자; 디아바디(diabodies); 선형 항체; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체를 포함한다.
바람직하게, 면역글로불린은 단일 클론 항체이다. 용어 "단일 클론 항체"는, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 나타내며, 집단을 구성하는 개별적인 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 전형적으로 상이한 결정 인자(에피토프)에 대해 향하는 상이한 항체를 포함하는, 통상적인 (폴리 클론) 항체 제제와 달리, 각각의 단일 클론 항체는 항원 상의 단일 결정 인자에 대하여 향한다. 수식어 "단일 클론"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다.
면역글로불린은 쥣과 계통(murine class) IgG1, IgG2a, IgG2b, IgM, IgA, IgD 또는 IgE, 인간 계통 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD 또는 IgE, 또는 그 조합 또는 단편일 수 있다.
면역글로불린은 하기 항원: CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1), CD79b, CD86 (B7.2), CD147, CD152, IL-la, IL-1ß, IL-1, IL-2, IL-3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-23, IL23a, IL-2 수용체, IL-4 수용체, IL-6 수용체, IL-12 수용체, IL-13 수용체, IL-18 수용체 서브유닛, PDGF-β 및 그의 유사체, PLGF, VEGF, TGF, TGF-β2, TGF-p1, EGF 수용체, PLGF 수용체, VEGF 수용체, 혈소판 수용체 gpⅡb/Ⅲa, 트롬보포이에틴(thrombopoeitin) 수용체, 아포토시스(apoptosis) 수용체 PD-1, 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor), 오스테오프로테게린 리간드(osteoprotegerin ligand), 인터페론 알파(interferon alpha), 인터페론 베타(interferon beta), 인터페론 감마(interferon gamma), B 림프구 자극인자 BLyS(B lymphocyte stimulator BLyS), T-세포 활성화 조절인자 CTLA-4(T-cell activation regulator CTLA-4), C5 보체(C5 complement), IgE, 종양 항원 CA125, 종양 항원 MUC1, PEM 항원, ErbB2/HER-2, 환자의 혈청에서 상승된 수준으로 존재하는 종양-관련 에피토프, 유방, 결장, 편평 세포(squamous cell), 전립선, 췌장, 폐, 및/또는 신장 암 세포에서, 및/또는 흑색종(melanoma), 신경교종(glioma), 또는 신경모세포종(neuroblastoma) 세포에서 발현되는 암-관련 에피토프 또는 단백질, 종양의 괴사 코어(the necrotic core of a tumour), 인테그린 알파 4 베타 7(integrin alpha 4 beta 7), 인테그린 VLA-4, B2 인테그린, α4β1 및 α4β7 인테그린, TRAIL 수용체 1,2,3, 및 4, RANK, RANK 리간드(RANKL), TNF-α, 부착 분자(adhesion molecule) VAP-1, 상피 세포 부착 분자(EpCAM), 세포간 부착 분자-3(ICAM-3), 류코인테그린 어드헤신(leukointegrin adhesin), 혈소판 당단백질 gp Ⅱb/Ⅲa, 심장 미오신 중쇄(cardiac myosin heavy chain), 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone), 스클레로스틴(sclerostin), MHC I, 암 태아성 항원(carcinoembryonic antigen, CEA), 칼시토닌 유전자-관련 펩타이드(calcitonin gene-related peptide, CGRP), 알파-태아 단백질(alpha-fetoprotein, AFP), 종양 괴사 인자(tumour necrosis factor, TNF), Fc-y-1 수용체, HLA-DR 10 베타, HLA-DR 항원, L-셀렉틴(selectin), 칼리크레인(Kallikrein), 키린(Kirin) 및 IFN-γ을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 단백질의 임의의 하나 또는 조합을 인식할 수 있다.
면역글로불린은 예를 들어, 아펠리모맙(afelimomab), 압식시맙(abciximab), 아달리무맙(adalimumab), 아도-트라스투주맙(ado-trastuzumab), 아두카누맙(aducanumab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 알리로쿠맙(alirocumab), 아니프로루맙(anifrolumab), 아르시투모맙(arcitumomab), 아테졸리주맙(atezolizumab), 아벨루맙(avelumab), 바실릭시맙(basiliximab), 벨리무맙(belimumab), 벤랄리주맙(benralizumab), 베바시주맙(bevacizumab), 베즈로톡수맙(bezlotoxumab), 블리나투모맙(blinatumomab), 보코지주맙(bocozizumab), 브라지쿠맙(brazikumab), 브렌툭시맘(brentuximab), 브로달루맙(brodalumab), 브롤루시주맙(brolucizumab), 카나키누맙(canakinumab), 카플라시주맙(caplacizumab), 카프로맙(capromab), 세미플리맙(cemiplimab), 세르톨리주맙(certolizumab), 세툭시맙(cetuximab), 클레놀릭시맙(clenoliximab), 클라우딕시맙(claudiximab), 크리잘리주맙(crizalizumab), 다클리주맙(daclizumab), 다라투무맙(daratumumab), 데노수맙(denosumab), 디누툭시맙(dinutuximab), 두필루맙(dupilumab), 두르발루맙(durvalumab), 에쿨리주맙(eculizumab), 에드레콜로맙(edrecolomab), 엘로투주맙(elotuzumab), 에미시주맙(emicizumab), 엡티네주맙(eptinezumab), 에레누맙(erenumab), 에비나쿠맙(evinacumab), 에볼로쿠맙(evolocumab), 프레마네주맙(fremanezumab), 포라비루맙(foravirumab), 갈카네주맙(galcanezumab), 갈릭시맙(galiximab), 젬투주맙(gemtuzumab), 골리무맙(golimumab), 구셀쿠맙(guselkumab), 이발리주맙(ibalizumab), 이브리투모맙(ibritumomab), 임시로맙(imciromab), 이다루시주맙(idarucizumab), 이네빌리주맙(inebilizumab), 인필릭시맙(infliximab), 이노투주맙(inotuzumab), 이필리무맙(ipilimumab), 익세키주맙(ixekizumab), 켈릭시맙(keliximab), 라나델루맙(lanadelumab), 레브리키주맙(lebrikizumab), 렉사투무맙(lexatumumab), 마브릴리무맙(mavrilimumab), 메폴리주맙(mepolizumab), 미리키주맙(mirikizumab), 모가물리주맙(mogamulizumab), 모수네투주맙(mosunetuzumab), 무로모납-CD3(muromonab-CD3), 나탈리주맙(natalizumab), 네시투무맙(necitumumab), 니볼루맙(nivolumab), 노페투모맙(nofetumomab), 오비누투주맙(obinutuzumab), 오크렐리주맙(ocrelizumab), 오파투무맙(ofatumumab), 올라라투맙(olaratumab), 오말리주맙(omalizumab), 팔리비주맙(palivizumab), 파니투무맙(panitumumab), 펨브롤리주맙(pembrolizumab), 페르투주맙(pertuzumab), 폴라투주맙(polatuzumab), 라무시루맙(ramucirumab), 라니비주맙(ranibizumab), 라불리주맙(ravulizumab), 레스티주맙(restizumab), 리산키주맙(risankizumab), 리툭시맙(rituximab), 로모소주맙(romosozumab), 로발피투주맙(rovalpituzumab), 사시투주맙(sacituzumab), 사릴루맙(sarilumab), 사트랄리주맙(satralizumab), 세쿠키누맙(secukinumab), 시루쿠맙(sirukumab), 타네쿠맙(tanecumab), 테제펠루맙(tezepelumab), 테졸리주맙(tezolizumab), 토실리주맙(tocilizumab), 토시투모맙(tositumomab), 트랄로키누맙(tralokinumab), 트라스투주맙(trastuzumab), 트레멜리무맙(tremelimumab), 우블리툭시맙(ublituximab), 우스테키누맙(ustekinumab) 및 베돌리주맙(vedolizumab)일 수 있다.
본 발명의 면역글로불린은 바람직하게 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 분자와 같은 IgG 분자이다. 더욱 바람직하게, 면역글로불린은 IgG1 또는 IgG2이다. 더욱 더 바람직하게, 면역글로불린은 적어도 Fc 부분이 인간인 IgG1 또는 IgG2이다. 면역글로불린은 IgG1의 Fc 부분이 인간인 쥣과-인간 키메라(murine-human chimeric) IgG1일 수 있다. 가장 바람직하게, 키메라 면역글로불린은 리툭시맙 또는 인플릭시맙이다.
리툭시맙은 예를 들어, WO9411026에 상세하게 기재된 키메라 항-CD20 항체이다.
인플릭시맙은 예를 들어, WO9216553에 상세하게 기재된 키메라 항-TNFα 항체이다.
면역글로불린은 인간화(humanized) IgG1 형태의 쥣과 프로제니터이다. 가장 바람직하게, 인간화 항체는 트라스투주맙 또는 베바시주맙이다.
트라스투주맙은 예를 들어, WO9222653에 상세하게 기재된 인간화 항-HER2 항체이다.
베바시주맙은 예를 들어, WO9845331에 상세하게 기재된 인간화 항-VEGF 항체이다.
면역글로불린은 완전 인간(fully human) IgG1 또는 IgG2 항체이다. 가장 바람직하게, 인간 항체는 아달리무맙(IgG1) 또는 데노수맙(IgG2)이다.
아달리무맙은 예를 들어, WO9729131에 상세하게 기재된 인간 항-TNFα 항체이다.
데노수맙은 예를 들어, WO03002713에 상세하게 기재된 인간 항-RANKL 항체이다.
일 실시형태에서, 면역글로불린은 베바시주맙, 트라스투주맙 또는 데노수맙이다.
본 명세서에서 단일 클론 항체는 특히 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래된 항체 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 시퀀스와 동일하거나 상동이며, 사슬의 나머지는 다른 종으로부터 유래된 항체 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체, 및 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 그러한 항체의 단편의 상응하는 시퀀스와 동일하거나 상동인 "키메라(chimeric)" 항체(면역글로불린)를 포함한다.
또한, 본 명세서에서 단일 클론 항체는 "인간화" 항체를 포함한다. 그러한 항체는 비인간(예를 들어, 쥣과) 항체의 "인간화"에 의해 수득되며, 동물 면역글로불린으로부터 유래된 최소한의 시퀀스만을 함유한다. 분자의 대부분은 인간 시퀀스이다. 인간 수용자 항체(human recipient antibody)의 초가변 영역(hypervariable region)으로부터의 잔기는 원하는 결합 특성을 갖는 비인간 공여자 항체(non-human donor antibody)의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체된다.
마지막으로, 본 명세서에서 단일 클론 항체는 인간 항체 유전자 라이브러리의 스크리닝에 의해 얻어질 수 있는 완전 인간 항체를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 샘플은 재조합 CHO 세포 배양으로부터 얻어지는 세포 배양액으로부터 유래된다. 바람직하게, 세포 배양액은 성장기(growing phase)의 재조합 세포 배양으로부터 얻어진다.
본 발명의 방법은 소규모 및 대규모 면역글로불린 정제에 이용될 수 있다. 바람직하게, 본 방법은 대규모로 수행된다.
"실험실 규모"로도 나타내어지는 "소규모"는 50g 미만의 면역글로불린, 10g 미만의 면역글로불린, 또는 1g 미만의 면역글로불린을 함유하는 샘플의 정제를 나타낸다. "소규모"는 또한 포획 단계의 컬럼으로부터 용리되는 단백질이 50g 미만의 면역글로불린, 10g 미만의 면역글로불린, 또는 1g 미만의 면역글로불린에 이르는 정제 공정을 나타낸다.
"생산 규모" 또는 "제조 규모" 또는 "상업적 규모"로도 나타내어지는 "대규모"는 50g 초과의 면역글로불린, 100g 초과의 면역글로불린, 200g 초과의 면역글로불린 또는 300g 초과의 면역글로불린을 함유하는 샘플의 정제를 나타낸다. "대규모"는 또한 포획 단계의 컬럼으로부터 용리되는 단백질이 50g 초과의 면역글로불린, 100g 초과의 면역글로불린, 200g 초과의 면역글로불린 또는 300g 초과의 면역글로불린에 이르는 정제 공정을 나타낸다.
용어 "추가적인 공정 단계"는 여과, 투석, 바이러스 불활성화, 희석, 농축, pH 조정, 전도도 조정, 중간 크로마토그래피 단계 또는 임의의 목적을 위한 유지 단계와 같이 단백질 정제 프로토콜 내에서 일반적으로 적용되는 임의의 단계를 나타낸다. 추가적인 공정 단계는 본 발명의 모든 크로마토그래피 단계 사이에 적용될 수 있다. 중간 크로마토그래피 단계는 임의의 크로마토그래피 단계 사이에 적용될 수 있다. 특히, 용어 "추가적인 공정 단계"는 포획 크로마토그래피와 양이온 교환 크로마토그래피 사이에 적용되는 중간 크로마토그래피 단계를 나타낸다. 중간 크로마토그래피 단계는 임의의 모드에서 임의의 크로마토그래피 매질에 의해 수행될 수 있다. 중간 크로마토그래피 단계는 컬럼 크로마토그래피 및 막 크로마토그래피를 포함하는 임의의 크로마토그래피 형태를 이용할 수 있다.
추가적인 중간 단계 또는 폴리싱 단계로서, 다른 크로마토그래피 형태도 이용될 수 있다. 예를 들어, 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피 및 음이온 교환 막 크로마토그래피가 폴리싱 단계로 이용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 플로우 쓰루 모드이다. 다른 가능성은 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 특히 결합 모드의 세라믹 하이드록시아파타이트를 적용하는 것이다.
본 발명의 제1 측면은 세포 배양액으로부터 면역 글로불린의 포획 친화성 크로마토그래피 과정에서 침전을 방지하는 방법으로서, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 응집-유도 화합물을 세포 배양액에 첨가하는 단계;
(b) 단계 (a)의 혼합물의 심층 여과 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 여액을 친화성 크로마토그래피에 노출시키는 단계 - 여기서, 면역글로불린은 친화성 크로마토그래피 매질에 결합됨 -;
(d) 5 내지 9의 pH 값 및 0.1 내지 5.0 mol/ℓ의 이온 강도를 갖는 세척 버퍼를 이용하여 친화성 크로마토그래피 매질을 세척하는 단계; 및
(e) 2.5 내지 4.5의 pH 값을 갖는 용리 버퍼를 이용하여 친화성 크로마토그래피 수지로부터 면역글로불린을 용리시키는 단계.
사전 세정 단계: 응집
본 발명으로 이어진 실험에서, 세포-무함유 수확물질(정화된 상청액)이 정제될 면역글로불린과 함께 포획 수지에 강하게 결합하는 몇몇 물질을 여전히 함유한다는 것이 관찰되었다. 이는 포획 수지로부터의 용리 후에 수지의 재사용과 면역글로불린의 품질에 영향을 미친다. 이는 플로우 쓰루 모드의 음이온 교환 크로마토그래피에 기초한 추가적인 사전 세정 크로마토그래피에 향상될 수 있었다(WO2015135884). HCDNA 및 HCP 수준의 현저한 감소에도 불구하고, 여전히 추가적인 개선에 대한 요구가 있다. 단백질 A 용출액은 여전히 탁도를 향하는 경향이 있으며, 이는 면역글로불린 자체보다는 불순물에 의해 야기되는 것으로 관찰되었다. 용리에 필요한 낮은 pH, 불순물의 상대적인 양 및 높은 단백질 농도는 탁도를 촉진한다. 탁한 용리 풀 외에도 증가된 컬럼 배압이 관찰되었다. 증가된 점도가 이를 가장 잘 설명한다. 또한, 사전 세정 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 매우 높은 로딩(load)의 오염물에 필요한 상대적으로 큰 크기로 인하여 선호되지 않는 비용 요인이다. 후자는 더 높은 mab 역가 및 이에 따른 경제적 생산에 필요한 연장된 발효(fermentation) 시간에 의해 향상된다. 음이온 교환 수지의 필터 효과는 주로 음으로 하전된 분자의 보유에 국한되고, 탁도-유발 불순물의 일부는 여전히 빠져나가기 때문에, 더 간단하고 더욱 효과적인 사전 포획 세정 전략에 대한 요구가 있었다. 본 발명의 결과에 따르면, 적합한 사전 세정 응집 방법의 삽입은 놀랍게도 수확된 배양액의 신속하고 간단한 정제를 위한 우수한 솔루션을 나타낸다. 추가적인 불순물의 제거에 의해, 개발된 응집 방법은 샘플의 순도를 향상시키고, 중요한 오염을 감소시켜, 포획 매질의 낮은 pH 용리 중에 탁도를 촉진하고, 값비싼 친화성 컬럼을 보호한다. 본 발명의 응집 방법은 간단하고, 신속하며, 생성물의 손실이 없으며, 가격도 합리적이다. 또한, 응집 방법은 (ⅰ) 세포가 존재하는 것을 의미하는 세포가 세포 배양액으로부터 제거되기 전에, 또는 (ⅱ) 세포가 존재하지 않는 것을 의미하는 세포가 세포 배양액으로부터 제거된 후에, 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 단백질 A 단계 전후의 면역글로불린의 순도는 두 방법에 있어서 비슷하다. 전자의 방법에 의해, 세포를 포함하는 응집된 물질은 원심분리에 의해 분리되고, 상청액은 여과 트레인에 의해 추가적으로 정화된다. 후자의 방법에서, 세포는 원심분리에 의해 침전되고, 상청액은 응집이 이루어진다. 그런 다음, 여과 트레인은 응집된 물질을 제거한다. 가장 간단한 모드의 여과 트레인은 심층 필터(depth filter)로 이루어진다. 그러나, 더욱 바람직한 것은 직렬로 연결된 심층 필터 및 정밀 필터(micro filter)이다. 실제 규모의 생산으로 스케일업하는 과정에서, 세포 분리 후의 응집이 선택 방법이 되는 것으로 밝혀졌다. 응집이 세포 배양에서 직접 수행되었을 때, 발효기 및 분리기로부터 전체 세포 덩어리를 포함하는 플록(floc)의 제거는 매우 시간 소모적이었다.
상이한 응집제를 사용하는 다수의 상이한 응집 방법이 알려져 있고, 단일 클론 항체를 발현하는 포유류 세포의 정화에 효과적인 것으로 실험적으로 입증되었다. 대부분의 방법은 물질의 조합 및/또는 배양액의 추가적인 조작, 예를 들어, pH 조정을 필요로 한다. 또한, 많은 공개된 방법은 원심분리 단계 대신에 응집을 이용한다. 이와 달리, 본 발명은 배양액의 최적 정화를 위하여 하기 순서로 1) 원심분리 또는 여과에 의한 세포 분리, 2) 응집 및 3) 심층 여과의 3가지 방법을 결합한다.
배양액의 pH가 정제될 항체의 pI보다 낮은 경우, 항체는 순(net) 양전하를 띠게 된다. 이 조건 하에서, 양이온성 전해질은 불순물, 잔류 세포 및 세포 잔해를 응집 또는 침전시키고, 항체를 용액에 남길 수 있다. 그런 다음, 플록은 원심분리 및/또는 심층 여과에 의해 제거될 수 있으며, 선택적으로 정밀 여과가 이어질 수 있다.
본 발명은 응집을 유도하기 위하여 2가 금속 이온, 수용성 유기 폴리머, 또는 수불용성 유기 폴리머와 같은 단일 양이온성 화합물을 이용한다. 자극 반응성 폴리머 또는 염(stimulus responsive polymers or salts)과 같은 추가적인 물질은 본 발명의 응집 단계를 수행하는데 있어서 필요하지 않다. 마찬가지로, 본 발명의 응집 방법은 pH 또는 전도도의 추가적인 조정 없이 수행된다.
용어 "하기 순서로"는 언급된 공정 단계가 열거된 순서로 수행되는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 추가적인 공정 단계가 열거된 공정 단계 전에, 후에, 및 사이에 포함될 수 있다.
크로마토그래피 매질은 일회용이거나 또는 재사용 가능하다. 일 실시형태에서, 크로마토그래피 수지는 재사용 가능하다. 특정 실시형태에서, 단계 (b), (c) 및 (d)의 크로마토그래피 수지는 재사용 가능하다.
재사용 가능한 크로마토그래피 매질은 일회용으로 구성된 크로마토그래피 매질에 비하여 비용 효과적이다. 특히, 포획 크로마토그래피에 있어서, 대용량의 크로마토그래피 매질이 이용된다. 따라서, 포획 단계에 있어서 재사용 가능한 크로마토그래피 매질, 예를 들어, 빈번한 재사용이 가능한 친화성 크로마토그래피 수지를 이용하는 것이 특히 유리하다. 본 발명의 사전 세정 단계의 이용은 값비싼 친화성 포획 컬럼의 확실한 다운스케일링(downscaling) 및 증가된 수명을 가능하게 하고, 이에 따라 전체 상품 비용을 감소시킨다.
본 명세서에 사용된 용어 "재사용 가능"은 매질 또는 수지가 1회를 초과하는 정제 사이클, 즉, 적어도 2회, 5회, 10회, 50회, 100회, 200회, 300회, 400회, 500회 초과의 정제 사이클 동안 재사용되도록 구성되는 것을 의미한다. 각각의 사이클 사이에, 크로마토그래피 매질 또는 수지는 세척 및/또는 재생 및/또는 멸균 및/또는 보관될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 응집제로 이용되는 양이온성 화합물은 2가 금속 이온염, 수용성 유기 폴리머 및 수불용성 유기 폴리머로부터 선택된다. 수용성 유기 폴리머가 더욱 바람직하다.
2가 금속 이온염은 예를 들어, CaCl2일 수 있다. 수용성 유기 폴리머는 예를 들어, 폴리 (디알릴디메틸암모늄 클로라이드)일 수 있다. 수불용성 유기 폴리머는 예를 들어, 키토산일 수 있다. 더욱 더 바람직하게, 응집제는 폴리 (디알릴디메틸암모늄 클로라이드)이다.
일 실시형태에서, 수용성 유기 폴리머는 0.01 내지 1.0 %(w/v), 바람직하게 0.02 내지 0.15 %(w/v), 더욱 바람직하게 0.025 내지 0.090 %(w/v)의 최종 농도로 적용된다. 바람직한 실시형태에서, 수용성 유기 폴리머는 0.0375 내지 0.075 %(w/v)의 최종 농도로 첨가된다. 더 바람직한 실시형태에서, 수용성 유기 폴리머는 0.015 내지 0.05%(w/v)의 최종 농도로 첨가된다.
바람직한 실시형태에서, 응집을 유도하기 위하여 수용성 유기 폴리머는 10 kDa 내지 10 000 kDa의 분자 질량을 갖는 폴리 (디알릴디메틸암모늄 클로라이드)이다. 다른 바람직한 실시형태에서, 응집 단계는 적어도 10 분 동안, 적어도 15 분 동안, 또는 적어도 20 분 동안, 바람직하게 적어도 30 분 동안, 실온에서, 교반 하에 수행된다. 본 발명에서 실온은 15-25℃, 20-25℃, 바람직하게 18-22℃를 의미한다. 교반(Stirring)은 연속적인 교반(continuous agitation) 및/또는 적합한 기계적 장치를 이용하는 교반을 의미한다.
더 바람직한 실시형태에서, 응집을 유도하기 위하여 배양액에 첨가되는 폴리 (디알릴디메틸암모늄 클로라이드) 출발 용액은 5-15%(w/v), 바람직하게 9-11%(w/v), 더욱 바람직하게 10%(w/v)의 농도를 갖는다. 0.1% 미만의 디알릴암모늄 클로라이드를 갖고, 10 CFU/㎖ 미만의 미생물 수(microbial count)를 갖고, 소듐 클로라이드가 없는 중성 pH의 용액이 가장 바람직하다.
본 발명의 일 실시형태에서, 응집 단계는 배양 기간의 마지막에 응집제를 발효기에 직접 첨가함으로써 세포 배양액으로부터 세포를 제거하기 전에 수행된다. 다르게 말하면, 이러한 실시형태에서, 응집 단계 전에 추가적인 원심분리 및/또는 여과 단계가 이루어지지 않는다. 그런 다음, 세포를 포함하는 플록은 원심분리기에서, 바람직하게 대용량에 적합한 디스크 스택 원심분리기에서 침강(sedimentation)에 의해 제거된다. 수득된 상청액은 심층 여과에 의해 추가적으로 정화될 수 있으며, 선택적으로 정밀 여과가 이어질 수 있다.
다른 실시형태에서, 단계 (a)는 하기 단계를 포함한다:
(a1) 세포 배양액의 원심분리 및/또는 여과 단계; 및
(a2) 응집-유도 화합물을 단계 (a1)에서 수득된 상청액 또는 여액에 첨가하는 단계.
다르게 말하면, 응집 단계는 원심분리 및/또는 여과 단계가 수행된 후에 응집제를 상청액에 첨가함으로써 세포 배양액으로부터 세포를 제거한 후에 수행된다.
따라서, 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a1) 세포 배양액의 원심분리 및/또는 여과 단계;
(a2) 응집-유도 화합물을 단계 (a1)에서 수득된 상청액 또는 여액에 첨가하는 단계;
(b) 단계 (a2)의 혼합물의 심층 여과 단계 ;
(c) 단계 (b)에서 수득된 여액을 친화성 크로마토그래피에 노출시키는 단계 - 여기서, 면역글로불린은 친화성 크로마토그래피 매질에 결합됨 -;
(d) 5 내지 9의 pH 값 및 0.1 내지 5.0 mol/ℓ의 이온 강도를 갖는 세척 버퍼를 이용하여 친화성 크로마토그래피 매질을 세척하는 단계; 및
(e) 2.5 내지 4.5의 pH 값을 갖는 용리 버퍼를 이용하여 친화성 크로마토그래피 수지로부터 면역글로불린을 용리시키는 단계.
바람직하게, 단계 (a2)의 플록은 심층 여과에 의해 제거되며, 선택적으로 정밀 여과가 이어진다.
바람직하게, 폴리 (디알릴디메틸암모늄 클로라이드)를 제외하고, 응집을 수행하기 위하여 추가적인 물질이 첨가되지 않는다. 다르게 말하면, 단계 (a)에서, 폴리 (디알릴디메틸암모늄 클로라이드)를 제외한 추가적인 응집-유도 화합물이 첨가되지 않는다.
바람직하게, 폴리 (디알릴디메틸암모늄 클로라이드)에 의한 응집은 pH 또는 전도도의 추가적인 조정 없이 수행된다. 이는 친화성 크로마토그래피 전의 응집 단계 및 후속적인 여과 단계에서, 특히 응집 단계 (a2)에서, pH 또는 전도도가 조정되지 않음을 의미한다.
따라서, 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a1) 세포 배양액의 원심분리 및/또는 여과 단계;
(a2) 응집-유도 화합물을 단계 (a1)에서 수득된 상청액 또는 여액에 첨가하는 단계;
(b) 단계 (a2)의 혼합물의 심층 여과 단계 ;
(c) 단계 (b)에서 수득된 여액을 친화성 크로마토그래피에 노출시키는 단계 - 여기서, 면역글로불린은 친화성 크로마토그래피 매질에 결합됨 -;
(d) 5 내지 9의 pH 값 및 0.1 내지 5.0 mol/ℓ의 이온 강도를 갖는 세척 버퍼를 이용하여 친화성 크로마토그래피 매질을 세척하는 단계; 및
(e) 2.5 내지 4.5의 pH 값을 갖는 용리 버퍼를 이용하여 친화성 크로마토그래피 수지로부터 면역글로불린을 용리시키는 단계,
여기서, 폴리 (디알릴디메틸암모늄 클로라이드)를 제외하고, 응집을 수행하기 위하여 추가적인 물질이 첨가되지 않으며, 폴리 (디알릴디메틸암모늄 클로라이드)에 의한 응집은 pH 또는 전도도의 추가적인 조정 없이 수행된다.
친화성 포획 크로마토그래피 단계: 단백질 A 크로마토그래피
용어 "포획 단계(capture step)"는 결합 모드에서 수행되는 제1 크로마토그래피 단계로 이해된다. 배양액으로부터 면역글로불린의 정제를 위한 포획 단계는 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계로 수행된다. 단백질 A 또는 그의 유도체 또는 유사체는 대부분 친화성 포획으로 이용된다. 본 발명에 따르면, 친화성 크로마토그래피는 면역글로불린을 포획하는데 성공적으로 사용되었다. 본 발명에 있어서, 용어 "친화성 크로마토그래피"는 리간드와 면역글로불린 사이의 높은 특이적 상호작용에 기초하여 배양액으로부터 면역글로불린을 선택적으로 결합하는 방법을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피"는 리간드로서 미생물 기원(예를 들어, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 펩토스트렙토코쿠스 마그너스(Peptostreptococcus magnus))의 재조합 단백질 또는 그로부터 유래된 변이체, 또는 면역글로불린에 결합하는 능력을 갖는 미생물 기원일 수 있는 합성 펩타이드를 이용하는 친화성 크로마토그래피를 나타낸다. 면역글로불린 결합 단백질의 예는 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 또는 단백질 A/G일 수 있다. 미생물 기원 단백질로부터의 이러한 결합 단백질 또는 Fc 감마 A 수용체(FcR-ⅢA)로부터 유래된 펩타이드도 친화성 리간드의 예이다. 바람직하게, 면역글로불린 결합 단백질 또는 펩타이드는 단백질 A이다. 리간드는 단백질 A의 E, D, A, B 및 C 도메인의 일 이상을 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게, 리간드는 단백질 A 또는 조작된 단백질 Z의 도메인 B를 포함한다. 리간드로 이용되는 수지의 예는 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)에 의해 재조합적으로 제조된 14 kD 펩타이드인 IgSelect(GE Healthcare)이다. 추가적인 정보가 없는 이 리간드는 인간 IgG-Fc의 모든 서브 클래스에 대하여 높은 친화성을 위하여 특별히 설계되었다.
사전 세정 응집 단계 후에 포획 단계로서 단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계를 이용함으로써, 본 발명의 방법은 면역글로불린의 정제에서 단백질 A 친화성 크로마토그래피의 현저한 결합 특이성을 이용하면서 비용 효과적인 면역글로불린 정제 방법을 제공한다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 응집-유도 화합물을 세포 배양액에 첨가하는 단계;
(b) 단계 (a)의 혼합물의 심층 여과 단계 ;
(c) 단계 (b)에서 수득된 여액을 단백질 A 크로마토그래피에 노출시키는 단계 - 여기서, 면역글로불린은 단백질 A 크로마토그래피 매질에 결합됨 -;
(d) 5 내지 9의 pH 값 및 0.1 to 5.0 mol/ℓ의 이온 강도를 갖는 세척 버퍼를 이용하여 단백질 A 크로마토그래피 매질을 세척하는 단계; 및
(e) 2.5 내지 4.5의 pH 값을 갖는 용리 버퍼를 이용하여 친화성 크로마토그래피 수지로부터 면역글로불린을 용리시키는 단계.
바람직한 실시형태에서, 포획 단계에 이용되는 단백질 A 크로마토그래피 수지는 고도로 가교결합된 아가로스에 결합된 알칼리-내성 단백질 A 유도체를 리간드로서 포함한다. 더욱 바람직한 실시형태에서, 알칼리-내성 단백질 A 유도체는 단백질 A의 도메인 B의 알칼리-안정화된 테트라머 변이체이다.
단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지를 가혹한 세정 조건에 더 잘 견디게 하고, 실행(run) 간 교차 오욤 효과에 대한 보호를 제공하기 위하여, 알칼리 내성, 높은 결합 용량 및 낮은 리간드 누출을 보장하도록 특별히 조작된 리간드를 포함하는 개선된 단백질 A 친화성 수지를 이용하는 것이 오늘날 일반적이다. 그러나, 이러한 개선된 수지의 한 가지 주요 단점은 종래의 단백질 A 수지보다 훨씬 비싸다는 것이다. 본 발명의 방법의 중요한 이점은 종래의 단백질 A 수지뿐 아니라 보다 최근의 차세대 단백질 A 수지 제품을 모두 이용할 수 있다는 것이다. 단백질 A 수지는 더 낮은 불순물 부담에 노출되기 때문에, 다소 온화한 재생 조건에 대한 제한에도 불구하고, 종래의 저렴한 단백질 A 수지도 허용된다. 그러나, 본 발명의 사전 세정 단계의 결과로, 선택된 단백질 A 수지와 독립적으로, 종래의 수지 및 차세대 수지 모두 더 긴 수명에 걸쳐 사용될 수 있다. 또한, 단백질 A 컬럼의 세정이 더 용이해진다는 사실에 기인하여, 공정도 더욱 경제적이 된다.
본 발명의 목적을 위하여 사용될 수 있는 일반적인 단백질 A 수지의 예는 Unosphere SUPrA(Bio-Rad), Protein A Ceramic HyperD F(Pall Corporation), Poros MabCapture A(Applied Biosystems), ProSep HC, ProSep Ultra, 및 ProSep Ultra Plus(EMD Millipore), Protein A Sepharose FF, rProtein A Sepharose FF, rmp Protein A Sepharose FF, IgSelect, MAbSelect, MAbSelect SuRe, MAbSelect SuRe LX, MabSelect Xtra, MabSelect PrismA(GE Healthcare), Praesto A, Praesto AP, Praesto APc, Praesto Jetted A50(Purolite Life Sciences) 및 Toyopearl rProtein A(Tosoh Bioscience)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용되는 경우, 용어 "단백질 A"는 그의 천연 공급원으로부터 회수된 단백질 A, 합성 또는 생합성으로 제조된 단백질 A(예를 들어, 펩타이드 합성에 의해, 또는 재조합 기술에 의해), 및 CH2/CH3 및/또는 Fc 영역을 갖는 단백질에 결합하는 능력을 보유한 그의 변이체를 포함한다. 바람직하게, 높은 결합 용량 및/또는 알칼리 안정성을 갖는 수지가 이용될 수 있다. 예를 들어, 단백질 A, 단백질 A 유도체, 또는 알칼리-안정화 단백질 A-유래 친화성 매질이 이용될 수 있다. 바람직하게, 알칼리-안정화 단백질 A-유래(대장균(E.coli), 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)) 리간드가 이용될 수 있다. 알칼리-안정화, 단백질 A-유래 리간드는 고도로 가교결합된 아가로스 매트릭스에 결합될 수 있으며, 바람직하게 화학적으로 안정한 티오-에테르 결합에 의해 고정화된다. 하나의 예는 GE Healthcare Life Sciences로부터의 MabSelect SuRe이며, 이는 0.5 M 이하의 NaOH에 의해 실행 후 신속하고 효율적으로 세정될 수 있다. MabSelect SuRe의 알칼리-안정화 리간드는 단백질 A의 B-도메인으로부터 유래되며, VH3 결합 도메인이 없어 더 높은 용리 pH를 제공한다. 바람직한 제품은 MabSelect SuRe보다 더 높은 결합 용량을 갖는 MabSelect SuRe LX이다.
단백질 A 친화성 컬럼 상의 샘플 로딩과 단백질 A 컬럼으로부터 면역글로불린의 용리 사이에 하나의 또는 몇몇 세척 단계가 특별한 세척 버퍼를 사용하여 포함될 수 있다. 세척 버퍼는 단백질 A에 결합된 관심 면역글로불린의 상당한 양을 제거하지 않고, 단백질 A 수지로부터 불순물을 제거하는데 사용되는 버퍼이다. 세척 버퍼는 염 및 세제(예를 들어, 폴리소르베이트); 염 및 용매(예를 들어, 헥실렌 글리콜); 고농도 염(예를 들어, 고몰농도 Tris 버퍼); 또는 염 및 폴리머(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)을 포함할 수 있다. 또한, 세척 버퍼는 카오트로픽 시약(chaotropic reagents)(예를 들어, 요소 또는 아르기닌) 및/또는 프로테아제 억제제(예를 들어, EDTA)를 포함할 수 있다. 마지막으로, 세척 버퍼는 로딩 버퍼(loading buffer)로서 더 낮은 pH를 가질 수 있으며, 및/또는 용리 버퍼로서 더 높은 pH를 가질 수 있다.
단백질 A 컬럼으로부터 관심 면역글로불린의 용리를 위하여, 용리 버퍼가 적용된다. 바람직하게, 용리 버퍼는 낮은 pH를 가지며, 이에 의해 단백질 형태를 변화시켜 단백질 A와 관심 면역글로불린 사이의 상호작용을 방해한다. 바람직하게, 낮은 pH 용리 버퍼는 약 2 내지 약 5의 범위, 가장 바람직하게 약 3 내지 약 4의 범위의 pH를 갖는다. 이 범위 내에서 pH를 제어할 버퍼의 예는 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 글리신 및 암모늄 버퍼, 및 그 조합을 포함한다.
이러한 바람직한 버퍼는 시트레이트 및 아세테이트 버퍼, 가장 바람직하게 소듐 시트레이트 또는 소듐 아세테이트 버퍼이다. 관심 면역글로불린을 용리하기 위하여, 높은 pH 버퍼(예를 들어, 9 이상의 pH를 갖는 버퍼) 또는 MgCl2(2mM)와 같은 화합물 또는 조성물을 포함하는 버퍼를 포함하는 다른 용리 버퍼가 고려된다.
단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지는 0.1 내지 0.5 NaOH에 의해 재생될 수 있으며, 바람직하게 컬럼 내에서 재생될 수 있다(제자리 세정(cleaning in place)).
중간/폴리싱 크로마토그래피 단계: 양이온 교환 크로마토그래피
본 명세서에 기재된 방법은 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 더 포함할 수 있다.
양이온 교환 크로마토그래피는 샘플의 단백질과 수지에 고정된 전하 사이의 전하-전하 상호작용에 의존한다. 양이온 교환 크로마토그래피에서, 결합될 분자는 양전하를 띠고, 고정된 기능기(리간드)는 음전하를 띤다. 일반적으로 이용되는 양이온 교환 수지는 S-수지(설포네이트), SP 수지(설포프로필), SiB 수지(설포이소부틸), SE 수지(설포에틸) 및 CM 수지(카르복시메틸)이다.
그러나, 일반적으로, 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 상업적으로 이용가능한 모든 일반적인 양이온 교환 수지 또는 막에 의해 수행될 수 있다. 양이온 교환 수지는 기능기, 예를 들어, 설폰산이 고정된 프리팩 컬럼 또는 막의 형태로 이용될 수 있다. 대안으로, 수지는 사용자에 의해 충전되는 벌크 물질 및 컬럼으로 구입할 수 있다. 일반적인 것 외에 컬럼의 용량 및 치수에 대한 특별한 제한은 없다. 당해 기술분야의 통상의 기술자는 이용되는 양이온 교환 수지의 양 및 컬럼의 크기를 알고 있다. 이는 공정의 전체 규모에 따라 달라진다.
전형적인 상업적으로 이용가능한 제품은, 예를 들어, Macro-Prep High S, Macro-Prep CM, Unosphere Rapid S, Unosphere Rapid S40, Nuvia S 및 Nuvia HR-S(Bio-Rad, California, USA), Toyopearl CM, Toyopearl SP, Toyopearl 설페이트 650 F 및 Toyopearl GigaCap S(Tosoh Bioscience, Germany), Millipore ProRes S, Fractogel EMD COO-, Fractogel EMD SO3-, Fractogel EMD SE Hicap, Eshmuno CPX(Merck KGaA, Germany), Biosepra CM Ceramic HyperD, Biosepra S Ceramic HyperD, S HyperCel(Pall Corperation, New York, USA), Poros HS, Poros XS(Applied Biosystems, Germany), BioPro IEX SmartSep S, BioPro IEX S75 (YMC Europe), Praesto SP, Praesto Jetted SP35(Purolite Life Sciences, Europe), CM-Sepharose FF, SP-Sepharose FF, S-Sepharose FF, SP-Sepharose HP, SP-Sepharose XL, SP-Sepharose Big Beads, CM-Sephadex, Capto S, Capto SP ImpRes 및 Source S(모두 GE Healthcare, Germany)를 포함한다.
일반적으로, 양이온 교환 크로마토그래피는 4 내지 7의 pH 값에서 버퍼를 이용하여 수행된다.
본 발명의 바람직한 양이온 교환 수지는 설포네이트, 설포프로필, 또는 설포이소부틸 리간드를 이용하는 강한(strong) 양이온 교환기이다. 고도로 가교결합된(highly cross-linked) 아가로스, 또는 폴리(스티렌비닐벤젠), 예를 들어, Poros 50 HS, 또는 폴리메타크릴레이트, 예를 들어, Fractogel EMD SO3-와 같은 경질(rigid) 매트릭스에 연결된 설포네이트 또는 설포프로필 리간드가 가장 바람직하다. 가장 바람직한 양이온 교환 수지는 가교결합된 폴리(스티렌디비닐벤젠) 매트릭스에 결합된 설포프로필 (-CH2CH2CH2SO3 -) 리간드를 갖는 Poros HS 50이다.
양이온 교환 크로마토그래피는 약 pH 4 내지 약 pH 8의 pH를 갖는 버퍼에 의해 평형화될 수 있다. 버퍼 농도는 10mM 내지 100mM 범위, 바람직하게 20mM 내지 50mM의 범위일 수 있다.
양이온 교환 크로마토그래피에 이용되는 버퍼의 예는 시트르산, 락트산, 석신산, 포름산, 부탄디오산(butanedioic acid), 아세트산, 말론산, 글리신, MES, PIPES, 포스페이트, 비스트리스(bistris), 또는 그 혼합물이다.
양이온 교환 크로마토그래피 단계는 면역글로불린의 전하 변이체를 분리할 수 있으며, 잔류 숙주 세포 단백질, DNA, 응집체, 단편, 바이러스, 내독소, 응집제 및 침출된 단백질 A를 고갈시킬 수 있다.
면역글로불린은 면역글로불린의 등전점(isoelectric point, pI) 미만의 pH 값 및 낮은 전도도에서 수지에 결합할 수 있다.
단백질의 등전점 또는 pI는 단백질이 0과 동일한 순 전체 전하(net overall charge)를 갖는 pH, 즉 단백질이 동일한 수의 양전하 및 음전하를 갖는 pH를 나타낸다. pI의 결정은 등전점 전기영동(isoelectric focusing)과 같이, 당해 기술분야에서 수립된 기술에 따라 이루어질 수 있다.
낮은 전도도는 2 mS/㎝ 미만을 의미한다.
용리에 있어서, 단일 단계 또는 구배에 의해 제공되는 용리 버퍼의 이온 강도의 증가가 이용될 수 있다. 양이온 교환 크로마토그래피의 용리에 이용되는 염의 예는 클로라이드 염, 설페이트 염, 포스페이트 염, 시트레이트 염, 포르메이트 염, 또는 아세테이트 염이다. 바람직하게, NaCl 또는 KCl이 이용된다. 이온 강도는 1M까지 증가할 수 있다.
대안으로, 단일 단계 또는 구배에 의해 제공되는 용리 버퍼의 pH의 증가가 이용될 수 있다.
양이온 교환 크로마토그래피 성능을 위한 바람직한 실시형태는 4 내지 6의 pH 작동 범위, 더욱 바람직하게 4.5 내지 5.5의 pH 범위이다. 버퍼 물질로 탄산 또는 아미노산이 이용될 수 있으며, 시트르산 또는 글리신이 가장 바람직하다.
더 바람직한 실시형태에서, 양이온 교환 수지에 결합된 면역글로불린의 용리는 pH 값의 변화, 즉 pH의 증가에 의해 수행된다. 이는 2개의 상이한 버퍼 용액의 혼합에 의해 제공되는 낮은 pH에서 높은 pH로의 구배에 의해 달성될 수 있다. 낮은 pH를 위한 시트레이트 버퍼 및 높은 pH를 위한 포스페이트 버퍼가 바람직하다. 바람직한 실시형태에서, pH 구배는 약 pH 5 내지 6의 시트레이트 버퍼를 약 pH 7 내지 9의 포스페이트 버퍼와 혼합함으로써 형성된다. 버퍼는 10 내지 50mM 농도의 산의 소듐염을 이용하여 제조될 수 있다. pH 구배의 바람직한 범위는 5.0 내지 7.5이다. 다른 바람직한 실시형태에서, pH 구배는 pH 8.7 및 pH 10.5의 글리신 버퍼를 혼합함으로써 형성된다. 선택적으로, 최종 크로마토그래피 컬럼에 로딩되기 전에, 용리 풀의 pH는 예를 들어, 아세트산에 의해 조정된다.
대안으로, 단일 단계 또는 구배에 의해 제공되는 용리 버퍼의 pH 및 이온 강도 모두의 증가가 용리를 위하여 이용될 수 있다.
일 실시형태에서 단백질 A 크로마토그래피의 용출액은 양이온 교환 크로마토그래피에 노출된다.
전형적으로, 단백질 A 크로마토그래피의 용출액은 바이러스 불활성화 단계에 노출된 후, 양이온 교환 크로마토그래피가 이어질 것이다.
따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함할 수 있다:
(a) 응집-유도 화합물을 세포 배양액에 첨가하는 단계;
(b) 단계 (a)의 혼합물의 심층 여과 단계 ;
(c) 단계 (b)에서 수득된 여액을 친화성 크로마토그래피에 노출시키는 단계 - 여기서, 면역글로불린은 친화성 크로마토그래피 매질에 결합됨 -;
(d) 5 내지 9의 pH 값 및 0.1 내지 5.0 mol/ℓ의 이온 강도를 갖는 세척 버퍼를 이용하여 친화성 크로마토그래피 매질을 세척하는 단계;
(e) 2.5 내지 4.5의 pH 값을 갖는 용리 버퍼를 이용하여 친화성 크로마토그래피 수지로부터 면역글로불린을 용리시키는 단계 ;
(f) 바이러스 불활성화를 위하여 단계 (e)의 용출액을 2.5 내지 4.5의 낮은 pH 값에서, 적어도 10분 동안 배양하는 단계; 및
(g) 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계.
양이온 교환 크로마토그래피 수지는 3 내지 5 컬럼 부피(column volumes)에 대하여 1M NaCl에 의해 재생될 수 있다. 또한, 하기 단계를 포함하는 제자리 세정 과정이 적용될 수 있다: (a) 1M NaOH, 1M NaCl의 1 내지 5 컬럼 부피로 세척하는 단계, (b) 1M 아세트산 또는 TFA의 1 내지 5 컬럼 부피로 세척하는 단계; (c) 재평형(re-equilibration).
폴리싱 크로마토그래피 단계: 혼합 모드 크로마토그래피
본 발명의 방법은 폴리싱 단계로서 혼합 모드 크로마토그래피 단계를 더 포함할 수 있으며, 이는 친화성 크로마토그래피 후에 순서대로(단일 단계로서, 또는 몇몇 단계의 하나로서) 수행된다.
혼합 모드 매질 또는 수지로 나타내어지는 매질은 하전된 소수성 이온 교환 리간드, 또는 하이드록시아파타이트 또는 플루오르아파타이트(fluorapatite)와 같은 결정질 미네랄로 이루어진 기능기를 갖는 크로마토그래피 매질이다. "혼합 모드 크로마토그래피" 대신에 용어 "다중 모드(multi modal) 크로마토그래피" 또는 특정 과정과 관련하여 "소수성 전하 유도 크로마토그래피(hydrophobic charge induction chromatography)"가 때때로 이용되었다. 혼합 모드 크로마토그래피는 소수성 상호작용 및 이온 교환, 또는 금속 친화성 상호작용 및 이온 교환의 적어도 2개의 원칙의 상호작용이다. 혼합 모드 크로마토그래피는 각각 이온 교환 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피와 같은 단일 모드 크로마토그래피 방법에 의해 재현될 수 없는 덜 예측가능한 선택성을 제공한다. 양전하를 띤 소수성 리간드는 음이온 교환기 혼합 모드(예를 들어, CaptoAdhere)의 그룹에 속하며, 음전하를 띤 리간드는 양이온 교환기 혼합 모드(예를 들어, Capto MMC)에 속한다. 일부 혼합 모드 매질은 즈비터이온(zwitterionic) 특성을 갖는다(예를 들어, Bakerbond ABx). 다른 혼합 모드 매질은 이온화될 수 있으며, pH를 낮춤으로써 전하를 띠지 않은 상태에서 양전하를 띤 상태로 전환되는 소수성 리간드를 갖는다(예를 들어, MEP HyperCel). 마지막으로, 하이드록시아파타이트및 플루오르아파타이트 매질은 양전하를 띤 칼슘 이온 및 음전하를 띤 포스페이트기를 가짐으로써 더 복잡한 혼합 모드 기능을 갖는다.
바람직한 실시형태에서, 폴리싱 단계로 이용되는 혼합 모드 크로마토그래피는 소수성 및 음이온 교환 기능을 갖는 수지를 이용한다. 고도로 가교결합된 아가로스 매트릭스에 결합된 양전하를 띤 N-벤질-N-메틸 에탄올아민 리간드를 함유하는 혼합 모드 수지가 더욱 바람직하다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 응집-유도 화합물을 세포 배양액에 첨가하는 단계;
(b) 단계 (a)의 혼합물의 심층 여과 단계 ;
(c) 단계 (b)에서 수득된 여액을 친화성 크로마토그래피에 노출시키는 단계 - 여기서, 면역글로불린은 친화성 크로마토그래피 매질에 결합됨 -;
(d) 5 내지 9의 pH 값 및 0.1 내지 5.0 mol/ℓ의 이온 강도를 갖는 세척 버퍼를 이용하여 친화성 크로마토그래피 매질을 세척하는 단계;
(e) 2.5 내지 4.5의 pH 값을 갖는 용리 버퍼를 이용하여 친화성 크로마토그래피 수지로부터 면역글로불린을 용리시키는 단계 ;
(f) 바이러스 불활성화를 위하여 단계 (e)의 용출액을 2.5 내지 4.5의 낮은 pH 값에서 적어도 10분 동안 배양하는 단계;
(g) 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및
(h) 혼합 모드 크로마토그래피를 수행하는 단계.
바람직하게, 혼합 모드 크로마토그래피 단계는 양이온 교환 크로마토그래피 후에 이루어진다. 더욱 바람직하게, 양이온 교환 크로마토그래피 후의 혼합 모드 크로마토그래피 단계는 양전하를 띤 리간드를 포함하는 매질에 의해 수행된다. 더욱 바람직하게, 양전하를 띤 리간드는 N-벤질-N-메틸 에탄올 아민이며, 리간드는 고도로 가교결합된 아가로스에 결합된다.
결합 및 용리 모드에서 양전하를 띤 혼합 모드 크로마토그래피 수지를 로딩하는 경우, 하기 조건이 적용될 수 있다: pH 6 내지 pH 9, 바람직하게 pH 7.0 내지 8.5; 전도도 0.5 내지 10mS/㎝, 바람직하게 1 내지 4mS/㎝. 일 이상의 세척 단계가 이용될 수 있다. 조건은 면역글로불린의 pI에 따라 달라지며, 원하는 분리에 따라 구체적으로 조정될 수 있다.
폴리싱 단계 (d)에 이용되는 가장 바람직한 가장 바람직한 혼합 모드 수지는 CaptoAdhere(GE Healthcare Life Science)이다.
결합 모드에서 CaptoAdhere 크로마토그래피에 대한 바람직한 로딩 조건은 하기와 같을 수 있다: 수지는 pH 8.2의 0.5M Na-포스페이트, 이어서 pH 8.2의 20mM Na-포스페이트에 의해 평형화된다. 샘플(양이온 교환 풀)은 pH 8.0-8.5 및 1-4 mS/㎝의 전도도로 조정되고, 컬럼에 로딩된다. 평형 버퍼인 pH 8.2의 20mM Na-포스페이트로 세척한 후, 관심 면역글로불린은 예를 들어, pH 5 내지 7, 우선적으로 pH 5.5 내지 6.5의 20mM Na-포스페이트에 의해 CaptoAdhere 수지로부터 용리될 수 있다.
대안으로, CaptoAdhere 크로마토그래피는 플로우 쓰루 모드에서 수행될 수 있다. 이에 의해, pH 및 이온 강도는 면역글로불린이 혼합 모드 리간드에 결합하지 않으면서 정화될 잔류 오염물(DNA, 응집체, 침출된 단백질 A, 숙주 세포 단백질)이 결합된 상태로 남게 되는 방식으로 조정되어야 한다. 조건은 면역글로불린의 pI에 따라 달라진다. 바람직하게, 포스페이트 또는 Tris 버퍼는 6.5 내지 8.5의 pH 범위, 더욱 바람직하게 pH 7 내지 8의 범위에서 이용된다. 전도도는 NaCl과 같은 염에 의해, 또는 버퍼 농도에 의해 조정된다. 50 내지 200mM의 농도 범위의 NaCl이 보충된 10 내지 50mM의 농도 범위의 Na-포스페이트 버퍼가 가장 바람직하다. 높은 염 농도는 이온 상호작용을 제거하지만, 리간드와의 소수성 상호작용을 촉진한다는 점을 고려하여야 한다.
혼합 모드 수지에 대한 재생(제자리 세정)은 낮은 pH, 높은 염 및 높은 pH에 의해, 예를 들어, 10 내지 200mM 시트르산, 0.5-2M NaCl 및 10mM 내지 1M NaOH에 의해 수행될 수 있다.
바람직한 재생 과정은 용액 A-D로 연속하여 세척함으로써 수행된다: 용액 A: 100mM 시트르산, 2M NaCl; 용액 B: 2M NaCl; 용액 C: 1M NaOH; 용액 D: 10mM NaOH. 수지의 보관은 용액 D에서 수행될 수 있다.
더 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
- 응집-유도 화합물을 세포 배양액에 첨가하는 단계;
- 심층 여과 단계;
- 친화성 크로마토그래피 단계 - 여기서, 면역글로불린은 친화성 크로마토그래피 매질에 결합됨 -;
- 5 내지 9의 pH 값 및 0.1 내지 5.0 mol/ℓ의 이온 강도를 갖는 세척 버퍼를 이용하여 친화성 크로마토그래피 매질을 세척하는 단계;
- 2.5 내지 4.5의 pH 값을 갖는 용리 버퍼를 이용하여 친화성 크로마토그래피 수지로부터 면역글로불린을 용리시키는 단계; 및
- 강한 양이온 교환 크로마토그래피 - 여기서, 면역글로불린은 강한 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 및 강한 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 면역글로불린을 탈착시켜 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계; 및
- 양전하를 띤 혼합 모드 크로마토그래피 단계 - 여기서, 수지는 pH 8 내지 8.5의 포스페이트 버퍼로 평형화되며, 면역글로불린은 양전하를 띤 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합되고, 면역글로불린의 용리는 pH 5 내지 7의 포스페이트 버퍼에 의해 수행됨 -.
폴리싱 크로마토그래피 단계: 음이온 교환 크로마토그래피
본 발명의 방법은 폴리싱 단계로서 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 더 포함할 수 있으며, 이는 친화성 크로마토그래피 후에 순서대로(단일 단계로서 또는 몇몇 단계의 하나로서) 수행된다.
음이온 교환 매질 또는 수지로 나타내어지는 매질은 양전하를 띤 이온 교환 리간드로 이루어진 기능기를 갖는 크로마토그래피 매질이다. 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 음이온 교환 막을 포함하는 강한 또는 약한 음이온 교환 크로마토그래피 매질일 수 있다.
음이온 교환 크로마토그래피에서, 결합될 분자는 음전하를 띠고, 고정된 기능기(리간드)는 양전하를 띤다. 일반적으로 이용되는 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 Q 매질(4급 아민 리간드), TMAE 수지(트리메틸아미노에틸 리간드) 및 DEAE 수지(디에틸아미노에틸 리간드)이다. 그러나, 일반적으로, 음이온 교환 크로마토그래피 단계는 상업적으로 이용가능한 모든 음이온 교환 매질에 의해 수행될 수 있다. 음이온 교환 매질은 프리팩 컬럼 형태 또는 막으로서 이용될 수 있다. 대안으로, 수지는 사용자에 의해 충전되는 벌크 물질 및 컬럼으로 구입될 수 있다. 일반적인 것 외에 컬럼의 용량 및 치수에 대한 특별한 제한은 없다. 당해 기술분야의 통상의 기술자는 이용될 음이온 교환 크로마토그래피 매질의 양 및 컬럼의 크기를 알고 있다. 이는 공정의 전체 규모에 따라 달라진다.
특히, 강한 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 잔류 불순물을 제거하는데 효과적인 것으로 밝혀졌다.
바람직하게, 4급 아미노에틸(QAE) 모이어티, 4급 암모늄 모이어티 및 트리메틸암모늄 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되는 리간드를 포함하는 강한 음이온 교환 크로마토그래피 매질이 이용된다.
본 발명의 목적을 위하여 이용될 수 있는 전형적인 강한 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 4급 아미노에틸 (QAE) 모이어티와 같은 기능기를 포함하고, 수지는 예를 들어, Toyopearl QAE(available from Tosoh Bioscience, Germany), Selectacel QAE(Polysciences Inc., Pennsylvania USA로부터 이용가능한 셀룰로오스의 4급 아미노에틸 유도체), QAE Sephadex (available from GE Healthcare, Germany) 등을 포함하며; 4급 암모늄 (Q) 모이어티와 같은 기능기를 포함하고, 수지는 예를 들어, Q Sepharose XL, Q Sepharose FF, Q Sepharose HP, Q Sepharose CL-4B, Q Sepharose Big Beads , Source Q, Resource Q, Capto Q, Capto Q ImPres(모두 GE Healthcare, Germany로부터 이용가능함), Poros HQ(Applied Biosystems, Germany), Q HyperCel, Biosepra Q Ceramic HyperD(Pall, New York, USA로부터 이용가능함) Macro Prep High Q(Bio-Rad, California, USA), Toyopearl Super Q(Tosoh Bioscience, Germany로부터 이용가능함), UNOsphere Q(Bio-Rad, California, USA로부터 이용가능함), BioPro IEX SmartSep Q(YMC Europe), Praesto Q, Praesto Jetted Q35(Purolite Life Sciences, Europe)를 포함하며; 트리메틸암모늄에틸(TMAE)은 예를 들어, Fractogel EMD TMAE(Merck KgaA, Germany)를 포함하고, 트리메틸암모늄 수지는 예를 들어, Nuvia Q(Bio-Rad, California, USA로부터 이용가능함)를 포함한다.
더욱 바람직하게, 음이온 교환 크로마토그래피는 고도로 가교결합된 아가로스에 결합된 -N(CH3)3 + (트리메틸암모늄)을 갖는 강한 음이온 교환 크로마토그래피 수지(예를 들어, GE Health Care, Germany로부터 이용가능한 Capto Q) 또는 유사한 특성을 갖는 매질을 이용하여 수행되는 강한 음이온 교환 크로마토그래피일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 응집-유도 화합물을 세포 배양액에 첨가하는 단계;
(b) 단계 (a)의 혼합물의 심층 여과 단계 ;
(c) 단계 (b)에서 수득된 여액을 친화성 크로마토그래피에 노출시키는 단계 - 여기서, 면역글로불린은 친화성 크로마토그래피 매질에 결합됨 -;
(d) 5 내지 9의 pH 값 및 0.1 내지 5.0 mol/ℓ의 이온 강도를 갖는 세척 버퍼를 이용하여 친화성 크로마토그래피 매질을 세척하는 단계;
(e) 2.5 내지 4.5의 pH 값을 갖는 용리 버퍼를 이용하여 친화성 크로마토그래피 수지로부터 면역글로불린을 용리시키는 단계 ;
(f) 바이러스 불활성화를 위하여 단계 (e)의 용출액을 2.5 내지 4.5의 낮은 pH 값에서 적어도 10분 동안 배양하는 단계;
(g) 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및
(h) 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계.
다른 바람직한 실시형태는 결합 모드의 양이온 교환 크로마토그래피 단계 후에 플로우 쓰루 모드의 음이온 교환 크로마토그래피를 포함한다.
따라서, 본 발명의 바람직한 실시형태는 하기 단계를 하기 순서로 갖는 방법을 제공한다:
- 응집-유도 화합물을 세포 배양액에 첨가하는 단계;
- 심층 여과 단계;
- 친화성 크로마토그래피 단계 - 여기서, 면역글로불린은 친화성 크로마토그래피 매질에 결합됨 -;
- 5 내지 9의 pH 값 및 0.1 내지 5.0 mol/ℓ의 이온 강도를 갖는 세척 버퍼를 이용하여 친화성 크로마토그래피 매질을 세척하는 단계;
- 2.5 내지 4.5의 pH 값을 갖는 용리 버퍼를 이용하여 친화성 크로마토그래피 수지로부터 면역글로불린을 용리시키는 단계 ; 및
- 강한 양이온 교환 크로마토그래피 - 여기서, 면역글로불린은 강한 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 - 및 강한 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 면역글로불린을 탈착시켜 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계; 및
- 강한 음이온 교환 크로마토그래피 단계 - 여기서, 면역글로불린은 강한 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않음 - 및 플로우 쓰루에서 면역글로불린을 수득하는 단계.
가장 바람직한 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 Capto Q(GE Health Care, Germany)이다. 플로우 쓰루 모드에서 Capto Q 크로마토그래피의 바람직한 로딩 조건은 하기와 같다: 수지는 pH 8의 25mM Tris 버퍼로 평형화되고, 크로마토그래피는 동일한 버퍼에 의해 수행된다.
바람직한 재생 과정은 용액 A-C에 의해 연속적으로 세척함으로써 수행된다: 용액 A: 2M NaCl; 용액 B: 1M NaOH; 용액 C: 10mM NaOH. 수지의 보관은 용액 C에서 수행될 수 있다.
심층 여과
또한, 본 발명의 방법은 일 이상의 심층 여과 단계를 포함할 수 있다. 막 표면에 입자를 보유함으로써 분리하는 막 필터와 달리, 심층 필터는 섬유 또는 비드의 매트릭스로 이루어지며, 분리는 그 표면이 아닌 매트릭스 전체에서 이루어진다.
심층 필터의 예는 Pall SXL 시리즈(예를 들어, SXLP700416 및 SXLPDE2408SP 필터 캡슐, Pall HP 시리즈(예를 들어, PDD1, PDE2, PDH4, PDK5, PEKM) (Pall Corporation), Millistak 시리즈(예를 들어, XOHC, FOHC, DOHC, AlHC 및 BlHC Pod 필터), HC-Pro 시리즈, Clarisolve 시리즈(예를 들어, 40 MS)(EMD Millipore), 또는 Zeta Plus 시리즈(90ZB08, 30ZA/60ZA, 60ZN90ZA, delipid, VR07 및 VR05 필터 캡슐)(3M)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게, 심층 필터는 사전 추출된(pre-extracted) 무기 필터 보조제, 셀룰로오스, 및 필터 매트릭스에 강한 양전하를 부여하는 수지 시스템, 예를 들어, 3M, United Kingdom으로부터의 Zeta Plus로 구성된다.
다른 바람직한 필터 모듈은 음이온 교환 기능을 갖는 심층 필터인 Emphaze AEX Hybrid purifier(3M)이다.
본 발명에 이용되는 가장 바람직한 심층 필터는 Pall Corporation으로부터의 PDE2, PDH4 및 P700 시리즈의 필터 캡슐이다.
심층 여과를 수행하기 위한 공정 파라미터는 100 내지 2000 L/㎡, 바람직하게 200 내지 1500 L/㎡, 더욱 바람직하게 1200 L/㎡ 미만, 가장 바람직하게 400 내지 1000 L/㎡의 용적 부하(volumetric load), 0.2 내지 2.0 bar, 바람직하게 0.4 내지 0.6 bar의 압력, 및 실온을 포함한다.
추가적인 실시형태에서, 정제는 제1 크로마토그래피 단계 전에 일 이상의 여과 단계를 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 정제는 하나의 원심분리 단계 및 일 이상의 여과 단계를 포함할 수 있다. 다른 바람직한 실시형태에서, 제1 크로마토그래피 단계에 앞서, 응집 후에 수행되는 심층 여과 및 정밀 여과 단계가 수행된다. 더욱 바람직한 실시형태에서, 제1 크로마토그래피 단계에 앞서, 세포 분리 단계, 응집 단계, 심층 여과 단계 및 정밀 여과 단계가 수행된다. 양전하를 띤 및/또는 음전하를 띤 막을 이용하는 추가적인 여과 단계가 응집 후, 포획 크로마토그래피 단계 전에, 샘플을 정화하는 여과 트레인에 포함될 수 있다. 하전된 및 하전되지 않은 상이한 물질을 결합하는 필터 모듈도 바람직한 실시형태에 포함된다.
바람직하게, 심층 여과 필터는 1층이 넘는 층을 포함한다. 예를 들어 이중층 필터가 심층 여과에 이용될 수 있다.
한외여과, 바이러스 여과, 정밀 여과
또한, 본 발명의 방법은 일 이상의 정밀 여과, 한외여과 및/또는 나노 여과 단계를 포함한다. 한외여과는 반투과성 막에 대해 액체를 강제하는 막 여과의 형태이다. 현탁된 고체 및 고분자량의 용질은 보유되는 반면, 물 및 저분자량 용질은 막을 통과한다. 한외여과는 거대분자 용액, 특히 단백질 용액의 분리, 정제 및 농축에 일반적으로 이용되는 방법이다. 한외여과는 정용여과와 결합될 수 있다. 이 모드는 반복되거나 연속적인 희석 및 재농축을 통하여 용액으로부터 염 및 다른 미세종을 제거하기 위한 버퍼 교환에 적합하다. 한외여과는 접선 유동 또는 교차 유동 시스템에서 적층된 막에 의해 수행될 수 있으며(TFF 또는 TF-UF), 특히 다량의 샘플을 처리할 수 있다. 대안으로, 중공 섬유 시스템이 한외여과를 위하여 일반적으로 이용된다. 막 컷오프(cut-off) 크기는 약 1 내지 300kD의 범위이다. 면역글로불린에 있어서, 한외여과막에 대한 전형적인 컷오프는 10-100kD이다. 본 발명의 틀 내에서, UF막에 대한 30 또는 50kD의 분자량 컷오프가 바람직하다.
정밀 여과는 약 0.1 내지 10㎛의 기공 크기를 갖는 막을 이용하는 입자 여과 방법이다. 환경에 대한 특별한 요구사항을 요구하는 멸균 여과에 있어서, 약 0.2㎛의 기공 크기를 갖는 멸균 정밀 필터가 이용된다. 더 큰 기공 크기(0.45㎛, 3㎛)를 갖는 추가적인 사전 필터(pre-filter)의 이용이 일반적이다. 이는 작은 기공 크기를 갖는 필터의 빠른 차단에 의한 흐름 감소를 방지한다.
마지막으로, 생물약제 제조에서, 나노 여과는 주로 바이러스 여과에 사용되며, 포유류 세포 배양에서 생산되는 치료 단백질의 안전성을 위하여 요구된다. 나노 여과 단계는 일반적으로 정제된 면역글로불린의 벌크 충전에 가까운 다운스트림 종료 시에 수행된다. 자주 이용되는 나노필터의 기공 크기는 15 내지 35 ㎚의 범위이다(Planova, Asahi Kasei, Japan; 또는 Viresolve, EMD-Millipore, Germany).
본 발명의 범위 내에서, 용어 "나노 여과" 및 "바이러스 여과"는 동의어로 사용된다.
본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 세포 배양액으로부터 면역글로불린을 정제하는 추가적인 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
- 세포 배양액의 원심분리 및/또는 여과 단계;
- 응집-유도 화합물을 상청액 또는 여액에 첨가하는 단계;
- 심층 여과 단계;
- 정밀 여과 단계;
- 친화성 크로마토그래피 단계 - 여기서, 면역글로불린은 친화성 크로마토그래피 매질에 결합됨 -;
- 5 내지 9의 pH 값 및 0.1 내지 5.0 mol/ℓ의 이온 강도를 갖는 세척 버퍼를 이용하여 친화성 크로마토그래피 매질을 세척하는 단계; 및
- 2.5 내지 4.5의 pH 값을 갖는 용리 버퍼를 이용하여 친화성 크로마토그래피 수지로부터 면역글로불린을 용리시키는 단계 .
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 정제 방법은 일 이상의 한외여과/정용여과 및/또는 나노 여과 단계를 포함한다. 이 여과 단계는 상업적으로 이용가능한 여과 장치, 예를 들어, Pall Corporation, GE Healthcare, EMD-Millipore, 또는 Sartorius로부터 이용가능한 여과 장치를 이용하여 수행될 수 있다.
추가적인 실시형태에서, 본 방법은 친화성 크로마토그래피 또는 폴리싱 단계로부터 수득된 용출액, 또는 이로부터 유래되고 상기 크로마토그래피 단계 후에 수행된 일 이상의 추가적인 공정 단계 후에 수득된 조성물을 나노 여과에 노출시키는 추가적인 단계를 포함한다. 바람직하게, 파보바이러스를 보유할 수 있는 필터, 가장 바람직하게 15-35 ㎚의 기공 크기를 갖는 필터가 나노 여과에 적용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 세포 배양액으로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
- 응집-유도 화합물을 세포 배양액에 첨가하는 단계;
- 심층 여과 단계;
- 친화성 크로마토그래피 단계 - 여기서, 면역글로불린은 친화성 크로마토그래피 매질에 결합됨 -;
- 5 내지 9의 pH 값 및 0.1 내지 5.0 mol/ℓ의 이온 강도를 갖는 세척 버퍼를 이용하여 친화성 크로마토그래피 매질을 세척하는 단계;
- 2.5 내지 4.5의 pH 값을 갖는 용리 버퍼를 이용하여 친화성 크로마토그래피 수지로부터 면역글로불린을 용리시키는 단계 ;
- 양이온 교환 크로마토그래피 - 여기서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 - 및 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 면역글로불린을 탈착시킴으로써 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
- 혼합 모드 크로마토그래피 - 여기서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 - 및 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 탈착시킴으로써 용출액에서 면역글로불린을 수득하거나, 또는 혼합 모드 크로마토그래피 - 여기서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합되지 않음 - 및 플로우 쓰루에서 면역글로불린을 수득하는 단계; 및
- 바이러스 필터를 통한 용출액의 여과 단계, 선택적으로 한외여과/정용여과 단계가 이어짐.
추가적인 실시형태에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 세포 배양액으로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
- 응집-유도 화합물을 세포 배양액에 첨가하는 단계;
- 심층 여과 단계;
- 친화성 크로마토그래피 단계 - 여기서, 면역글로불린은 친화성 크로마토그래피 매질에 결합됨 -;
- 5 내지 9의 pH 값 및 0.1 내지 5.0 mol/ℓ의 이온 강도를 갖는 세척 버퍼를 이용하여 친화성 크로마토그래피 매질을 세척하는 단계;
- 2.5 내지 4.5의 pH 값을 갖는 용리 버퍼를 이용하여 친화성 크로마토그래피 수지로부터 면역글로불린을 용리시키는 단계;
- 양이온 교환 크로마토그래피, - 여기서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 - 및 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 면역글로불린을 탈착시킴으로써 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
- 음이온 교환 크로마토그래피 - 여기서, 면역글로불린은 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않음 - 및 플로우 쓰루에서 면역글로불린을 수득하는 단계; 및
- 바이러스 필터를 통한 용출액의 여과 단계, 선택적으로 한외여과/정용여과 단계가 이어짐.
바람직한 실시형태에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 세포 배양액으로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
- 응집-유도 화합물을 세포 배양액에 첨가하는 단계;
- 혼합물의 심층 여과 단계;
- 여액을 친화성 크로마토그래피 단계에 노출시키는 단계 - 여기서, 면역글로불린은 친화성 크로마토그래피 매질에 결합됨 -;
- 5 내지 9의 pH 값 및 0.1 내지 5.0 mol/ℓ의 이온 강도를 갖는 세척 버퍼를 이용하여 친화성 크로마토그래피 매질을 세척하는 단계;
- 2.5 내지 4.5의 pH 값을 갖는 용리 버퍼를 이용하여 친화성 크로마토그래피 수지로부터 면역글로불린을 용리시키는 단계 ;
- 양이온 교환 크로마토그래피, - 여기서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 - 및 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 탈착시킴으로써 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
- 혼합 모드 크로마토그래피, - 여기서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 - 및 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 탈착시킴으로써 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
- 나노 여과 단계; 및
- 한외여과/정용여과 단계.
추가적인 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 세포 배양액으로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
- 응집-유도 화합물을 세포 배양액에 첨가하는 단계;
- 심층 여과 단계;
- 친화성 크로마토그래피 단계 - 여기서, 면역글로불린은 친화성 크로마토그래피 매질에 결합됨 -;
- 5 내지 9의 pH 값 및 0.1 내지 5.0 mol/ℓ의 이온 강도를 갖는 세척 버퍼를 이용하여 친화성 크로마토그래피 매질을 세척하는 단계;
- 2.5 내지 4.5의 pH 값을 갖는 용리 버퍼를 이용하여 친화성 크로마토그래피 수지로부터 면역글로불린을 용리시키는 단계 ;
- 양이온 교환 크로마토그래피 - 여기서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 - 및 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 면역글로불린을 탈착시킴으로써 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
- 음이온 교환 크로마토그래피 - 여기서, 면역글로불린은 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않음 - 및 플로우 쓰루에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
- 나노 여과 단계; 및
- 한외여과/정용여과 단계.
바이러스 불활성화
세포 배양에 의해 제조되는 단일 클론 항체와 같은 재조합 단백질 약물의 생산 과정에서, 원료 또는 생산 단계에서 우발적으로 바이러스가 오염될 우려가 있기 때문에, 바이러스 제거 및/또는 불활성화가 요구된다. 결과적으로, 모든 제조 공정의 바이러스 안전성에 대한 상당한 규제 요구가 있으며, 이는 세포 배양으로부터 생물학적 치료 단백질에 이르게 된다.
바이러스 불활성화 단계는 낮은 pH에서 용출액을 유지시킴으로써 친화성 포획 크로마토그래피 후에 이루어진다. 친화성 매트릭스로부터 낮은 pH 용리의 이점이 있다. 그러한 수성의 산성 환경에서, 많은 바이러스, 특히 외피형(enveloped type) 바이러는 불안정하고 분해된다.
낮은 pH는 2 내지 5, 바람직하게 2.5 내지 4.5, 더욱 바람직하게 3 내지 4의 pH 값을 의미한다.
바람직한 실시형태에서, 바이러스 불활성화를 위한 배양 시간은 10 분 내지 2 시간, 더욱 바람직하게 30 분 내지 90 분, 가장 바람직하게 45 분 내지 75 분이다.
바람직한 실시형태에서, 바이러스 불활성화는 교반 하에 실온에서 수행되고, pH는 배양 후에 상승된다.
본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 세포 배양액으로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a1) 침강에 의해 세포 배양액으로부터 세포를 분리하는 단계;
(a) 응집-유도 화합물을 세포 배양액에 첨가하는 단계;
(b) 단계 (a)의 혼합물의 심층 여과 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 여액을 친화성 크로마토그래피에 노출시키는 단계 - 여기서, 면역글로불린은 친화성 크로마토그래피 매질에 결합됨 -;
(d) 5 내지 9의 pH 값 및 0.1 내지 5.0 mol/ℓ의 이온 강도를 갖는 세척 버퍼를 이용하여 친화성 크로마토그래피 매질을 세척하는 단계;
(e) 2.5 내지 4.5의 pH 값을 갖는 용리 버퍼를 이용하여 친화성 크로마토그래피 수지로부터 면역글로불린을 용리시키는 단계 ;
(f) 바이러스 불활성화를 위하여 단계 (e)의 용출액을 2.5 내지 4.5의 낮은 pH에서 적어도 10분 동안 배양하는 단계;
(g) 단계 (f)에서 바이러스 불활성화 후의 용출액, 또는 이로부터 유래되고 단계 (f) 후에 수행된 일 이상의 추가적인 공정 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 및 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 탈착시킴으로써 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(h) 단계 (g)에서 수득된 용출액, 또는 이로부터 유래되고 단계 (g) 후에 수행된 일 이상의 추가적인 공정 단계 후에 수득된 조성물을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 및 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 탈착시킴으로써 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(ⅰ) 단계 (h)에서 수득된 용출액, 또는 그로부터 유래되고 단계 (h) 후에 수행된 일 이상의 추가적인 공정 단계 후에 수득된 조성물을 나노 여과에 노출시키는 단계; 및
(j) 단계 (i)의 여액, 또는 그로부터 유래되고 단계 (i) 후에 수행된 일 이상의 추가적인 공정 단계 후에 수득된 조성물을 한외여과/정용여과에 노출시키는단계.
추가적인 실시형태에서, 단계 h)는 하기와 같다:
(h) 단계 (g)에서의 용출액, 또는 이로부터 유래되고 단계 (g) 후에 수행된 일 이상의 추가적인 공정 단계 후에 수득된 조성물을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합되지 않음 -, 및 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터의 플로우 쓰루에서 면역글로불린을 수득하는 단계.
또는, 대안으로, 혼합 모드 크로마토그래피 대신에, 음이온 교환 크로마토그래피가 이용될 수 있으며, 단계 h)는 하기와 같다:
(h) 단계 (g)에서의 용출액, 또는 이로부터 유래되고 단계 (g) 후에 수행된 일 이상의 추가적인 공정 단계 후에 수득된 조성물을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기서, 면역글로불린은 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않음 -, 및 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터의 플로우 쓰루에서 면역글로불린을 수득하는 단계.
바람직한 실시형태에서, 한외여과/정용여과는 면역글로불린 정제의 마지막 단계이며, 단계 (c), (g) 및 (h)에 대한 추가적인 크로마토그래피는 이루어지지 않는다.
실시예
면역글로불린을 정제하기 위한 본 발명의 방법은 하기 실시예를 참조하여 뒷받침되고 예시된다. 이러한 실시예는 결코 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다는 것이 강조되어야 한다.
실시예 1: 면역글로불린 및 세포 배양
본 발명의 방법은 면역글로불린의 발현에 이용되는 특정 항체 또는 특정 숙주 세포에 의존하지 않는다. 수확물에서 최대 수율을 위하여 최적화된 발현 모드 및 선택된 배양 조건에 대해서도 마찬가지이다. 본 발명의 방법 개발 중에 상이한 단일 클론 항체가 사용되었다. 이는 본 발명의 방법에 따라 다양한 규모로 성공적으로 정제되었다. 표에 제시된 선택된 실험의 대부분은 인간화, 항-VEGF, IgG1 항체인 베바시주맙으로 수행되었다. 또한, 일부 다른 실험은 인간화, 항-HER2, IgG1 항체인 트라스투주맙 및 완전 인간 항-RANKL IgG2 항체인 데노수맙으로 수행되었다. 3개 항체 모두 CHO 세포에서 재조합적으로 발현되었으며, 이는 상이한 규모의 유가식 배양(fed-batch cultures)에서 증식되었다. 개발 단계에서 응집 실험의 대부분은 10 L의 실험실 규모 또는 100 L 또는 200 L의 파일럿 규모의 배양액으로 수행되었다. 실시예에 사용된 생산 규모 및 최대 배양 부피는 5000 L이었다. 일부 실험은 1000 L의 더 작은 생산 규모를 이용하여 수행되었다. 다르게 특정되지 않는 한, 규모는 항상 배양 부피(culture volume)를 나타낸다.
실시예 2: 상이한 응집제의 비교(표 1 내지 3)
표 1 내지 3의 응집 실험은 IgG1 서브클래스의 인간화 항체(베바시주맙)를 생산하는 CHO 세포의 파일럿 규모(100 L) 배양을 이용하여 상이한 시리즈로 수행되었다. 항체의 역가는 1.16 내지 1.52 g/L이었다. 응집제는 세포 분리 전, 발효 종료 시에 세포 배양 브로스(broth)의 20 ㎖ 앨리쿼트(aliquots)에 첨가되었다. 세 가지 상이한 양이온 물질이 상이한 농도에서 시험되었다. 1) pDADMAC = 폴리 (디알릴디메틸암모늄 클로라이드), 2) 키토산 및 3) 칼슘 클로라이드. pDADMAC를 10%(w/v) 용액으로 구입하였다(EMD Millipore). 키토산을 고체 물질로 구입하였고(Sigma), 1 %(w/v)를 0.1 M 아세트산에 용해시켰다. 키토산의 pH 작동 범위는 약 4.5 내지 5.0이다. 칼슘 클로라이드를 수성 스톡 용액을 사용하여 첨가하였다.
실험은 하기 단계 순서에 따라 수행되었다:
- 발효 브로스로부터 20 ㎖의 앨리쿼트 수집
- 응집제 첨가
- 교반 하에 실온에서 15 분 동안 배양
- 원심분리(4600 rpm/10 분)(Thermo Scientific Table Centrifuge)
- 정밀 여과(PVDF, 0.2 ㎛, EMD Millipore)
- 탁도, HCDNA 및 HCP 분석
상이한 농도에서 상이한 응집제의 직접적인 효과를 평가하기 위하여, 심층 여과는 수행되지 않았다. 원심분리 단계는 플록, 세포 및 세포 잔해를 제거한다. 후속적인 정밀 여과는 잔류 입자를 제거한다. 대조군(0 값)에 있어서, 응집제는 첨가되지 않았고, 배양이 이루어지지 않았다. 그러나, 분석 전에 샘플을 원심분리하고, 여과하였다. 단백질 A-기반 HPLC 방법으로 항체 농도를 결정하였다.
[표 1a: HCDNA 및 탁도 감소에 대한 pDADMAC에 의한 응집의 효과]
[표 1b: HCDNA 및 탁도 감소에 대한 키토산에 의한 응집의 효과]
[표 1c: HCDNA 및 탁도 감소에 대한 CaCl2에 의한 응집의 효과]
표 1a 내지 1c는 세 가지 상이한 응집제를 사용하여 HCDNA 및 탁도 감소에 대한 응집 결과를 나타낸다. HCDNA는 Quant-iT™ High-Sensitivity dsDNA Assay Kit(Thermo Fisher) 및 qPCR(PrepSEQ™ Residual DNA Sample Preparation Kit 및 resDNASEQ™ Quantitative CHO DNA Kit, Thermo Fisher)에 의해 결정되었다. 탁도 측정은 Hach Turbidimeter 2100Q에서 수행되었으며, Formazin Nephelometric Units(FNU)로 표시되었다. 기기는 입사 적외선으로부터 90도 각도에에서 샘플로부터 산란된 빛을 측정하고 있다.
표 1a는 0.09 %(w/v) 이하의 pDADMAC의 효과를 나타낸다. 이미 가장 낮은 농도(0.025 % w/v)로 HCDNA가 거의 완전히 제거되었다(감소 99.9%, 1000배(three orders of magnitude)). 87%의 탁도 감소는 0.075%(w/v) pDADMAC에 의해 도달될 수 있었다. 이 실험에서 더 높은 pDADMAC 농도에 의해 탁도의 추가적인 감소가 도달될 수 없었다.
표 1b에 나타내어진 키토산에 의한 결과는 pDADMAC에 필요한 더 높은 농도에서 효과적인 HCDNA 제거를 개시하였다. 약 91.5% 감소가 0.4 %(w/v)에서 얻어졌다. 탁도 감소와 관련하여, 19% 이하의 감소가 측정되었다.
CaCl2 실험의 결과는 표 1c에 나타내어진다. 또한, 이 응집제에 대해서도, 매우 효과적인 HCDNA 감소가 얻어졌다 99% 감소가 70 mM에서 측정되었으며, 99.9% 감소가 120 mM CaCl2에서 측정되었다. 탁도의 감소는 키토산에서보다 컸으나, pDADMAC에서보다는 낮았다. 120 mM에서 약 63% 감소가 달성될 수 있었다. 더 높은 CaCl2 농도는 시험되지 않았다.
결론(표 1a 내지 1c): HCDNA(즉, 응집이 없는 대조군)의 초기 농도는 각각 62.9 ㎍/㎖ 세포 배양 상청액 및 51.1 ㎎/g IgG 이었다. 총 단백질 또는 항체의 손실은 시험된 모든 응집제 및 농도에서 검출되지 않았다. 마찬가지로, 응집에 의해 야기된 증가된 세포 파열은 관찰되지 않았다. 놀랍게도, HCDNA가 한다고 하더라도 탁도에 거의 기여하지 않는다는 것이 분명하다. 예를 들어, 0.4%(w/v) 키토산에 의해, 약 91.5%의 HCDNA가 응집되어 제거된 반면, 탁도는 거의 감소하지 않고 대조군의 82%로 유지되었다(표 1b). HCDNA 및 탁도를 모두 감소시키기 위하여, 응집제 pDADMAC가 우수하다.
[표 2a: HCP 감소에 대한 pDADMAC에 의한 응집의 효과]
[표 2b: HCP 감소에 대한 키토산에 의한 응집의 효과]
[표 2c: HCP 감소에 대한 칼슘 클로라이드에 의한 응집의 효과]
표 2a 내지 2c는 세 가지 상이한 응집제를 사용하여 HCP 감소에 대한 응집 결과를 나타낸다. HCP는 CHO HCP ELISA Kit, 3G(Cygnus technologies)를 사용하여 측정되었다.
표 2a는 HCP 제거에 대한 pDADMAC의 효과를 나타낸다. 시험된 최고 농도(0.09 % w/v)에서도 감소는 약 10.8%에 불과하였다.
표 2b에 나타내어진 바와 같이, HCP 감소에 대한 응집제로서 키토산의 효과는 미미하였다. 가장 높은 감소는 0.2%(w/v)에서 약 8.1%로 측정되었다.
HCP의 더 높은 감소가 표 2c에 나타내어진 CaCl2 실험에서 얻어졌다. 29.1% 감소가 70 mM에서 측정되었다. 더 높은 농도가 더 나은 감소를 초래할 수 있으나, 시험되지 않았다.
결론(표 2a 내지 2c): HCP의 초기 농도는 1.4 내지 2.3 ㎎/㎖이었다. 질량으로, 이는 HCDNA의 로드보다 약 20배 내지 40배 더 높다. 다시 말하지만, HCP도 탁도에 거의 기여하지 않는다는 것이 분명하다. 예를 들어, 0.075%(w/v) pDADMAC는 탁도를 약 87% 만큼 감소시키는 반면(표 1a), HCP 감소는 약 9%에 불과하였다(표 2a). 응집에 의해 HCP를 감소시키기 위하여, CaCl2이 우수하였다. 하기 표 3a 내지 3c는 HCDNA, 탁도 및 HCP의 감소에 대하여 시험된 세 가지 응집제의 유리한 농도를 요약한다.
[표 3a: HCDNA 감소에 대한 상이한 응집제의 유리한 농도]
[표 3b: 탁도 감소에 대한 상이한 응집제의 유리한 농도]
[표 3c: HCP 감소에 대한 상이한 응집제의 유리한 농도]
세 가지 응집제 모두 그들의 양이온성으로 인하여 HCDNA를 효율적으로 제거할 수 있었다. 본 발명의 초기 과제는 단백질 A 용리 풀에서 관찰되는 탁도와 주로 관련되므로, pDADMAC는 가장 적합한 응집제로 선택되었다. 이 폴리머는 더 낮은 농도에서 사용될 수 있으며, 놀랍게도 시험된 이미 가장 낮은 농도에서 HCDNA가 거의 완전히 제거되었다.
실시예 3: pDADMAC에 의한 추가적인 응집 실험(표 4 내지 6)
후속적인 더욱 확장된 시험 시리즈에서, HCDNA 및 탁도 감소에 대한 pDADMAC 효과는 베바시주맙을 발현하는 6개의 상이한 세포 배양물로부터의 샘플을 이용하여 병렬 실험에서 조사되었다. 시험 방법은 실시예 2와 동일하였다. 비응집 상청액(대조군)의 범위는 44.3 내지 62.9 ㎍/㎖ HCDNA, 19.9 내지 29.1 FNU 탁도 및 1.24 내지 2.14 ㎎/㎖ HCP이었다. 항체 역가는 1.16 내지 1.52 ㎎/㎖이었다. 5개의 상이한 pDADMAC 농도가 시험되었으며, %로 감소의 평균값이 계산되었다.
[표 4a: 상이한 세포 배양 배치에서 HCDNA의 감소에 대한 pDADMAC 농도의 효과]
표 4a의 결과는 HCDNA 응집에 대한 양이온성 폴리머 pDADMAC의 높은 잠재력을 다시 한번 확인시켜준다. 시험된 가장 낮은 농도(0.025 % w/v)에 의해, 이미 거의 100% 감소가 6개의 세포 배양물 모두에서 얻어졌다. 다운스트림 공정의 초기 단계에서 HCDNA의 거의 정량적인 제거는 매우 유리하며, 후속적인 여과 및 포획 크로마토그래피의 부담을 덜어준다.
탁도의 감소는 사전 세정 단계의 개발에 대한 가장 중요한 요구이다. IgG1 또는 IgG2 항체(예를 들어, 베바시주맙, 트라스투주맙 및 데노수맙)를 발현하는 몇몇 세포 배양물에 있어서, 포획 크로마토그래피 컬럼으로부터 용리된 농축 용액에서 탁도가 발생한다. 본 발명의 실험에서, 공정 단계가 중단 없이 수행되면, 사전 세정 단계에서 탁도의 감소가 포획 크로마토그래피 후의 탁도도 방지하는 것으로 관찰되었다. 단백질 A 용리 풀에서 탁도가 다시 나타나는 것은 관찰되지 않았다.
[표 4b: 상이한 세포 배양 배치에서 탁도의 감소에 대한 pDADMAC 농도의 효과]
표 4b의 결과는 응집제로서 pDADMAC의 이용을 지지한다. 0.05%(w/v)에 의해, 세포 배양에서 평균 감소가 80%를 넘었다. 0.075%(w/v)의 농도에 의해, 평균 감소는 약 88%이었다. 더 높은 농도(0.09% w/v)가 추가적인 증가를 제공하지 않았다.
다른 연구에서, 고밀도 세포 배양 피드 스트림(feed streams)의 1차 정화를 위하여 pDADMAC 응집(후속적인 심층 여과 없이)이 평가되었다. 이전 실험과 달리, 세포 배양 샘플은 베바시주맙을 발현하는 선택된 1000 L 발효 규모(세포 밀도 9.3 x 106 세포/㎖)의 앨리쿼트이었다.
실험은 하기 단계 순서에 따라 수행되었다:
- 발효 브로스로부터 40 ㎖의 앨리쿼트 수집(50 ㎖ 튜브)
- 상이한 농도의 응집제 첨가
- 부드럽게 교반하면서 실온에서 15 분 동안 배양
- 원심분리(3000 rpm / 2000 g / 5 분)
- 정밀 여과 (Millex Filter, 0.2 ㎛, EMD Millipore)
- 탁도의 즉각적인 분석
- mab 농도, HCDNA 및 HCP에 대한 후속적인 분석
표 5는 이 연구의 결과를 요약한다. 탁도는 Hach Turbidimeter 2100Q에서 측정되었으며, 이전 실험과 달리, Nephelometric Turbidity Units(NTU)로 표시되었다. 기기는 입사 백색광으로부터 90도 각도에서 샘플로부터 산란되는 빛을 측정하고 있다.
[표 5: pDADMAC의 용량(Dose) 결정]
표 5에 나타내어진 결과는 HCDNA, 탁도 및 HCP의 감소에 대한 이전 결과를 확인시켜준다(표 1a, 2a, 4a 및 4b 참조). pDADMAC의 최적 용량은 상청액의 탁도를 현저하게 감소키는 폴리머의 최소 농도로 정의된다. 더 높은 농도의 pDADMAC를 첨가하는 것은 유익하지 않을 수 있다. 더 높은 농도는 탁도 수준을 약간 낮아지게 하거나(표 5 참조, 0.1 % w/v pDADMAC), 또는 잠재적으로 상청액에서 관심 생성물의 농도가 약간 감소하거나(0.1 % w/v pDADMAC까지 관찰되지 않음), 탁도의 빠른 복귀를 촉진할 수 있다(표 6 참조). 더 높은 농도는 또한 심층 필터를 돌파할 수 있는 더 작은 응집체 집단의 생성으로 이어질 수 있다. 최적 pDADMAC 농도는 0.0375 내지 0.075 %(w/v)의 범위이다. 이는 본 실험 조건 하에서 약 40 내지 80 pg/세포를 나타낸다. 이 범위 내에서, HCDNA 감소는 100 %, 탁도 감소는 약 92-97 %, 및 HCP 감소는 7-8 %이었다. 응집은 mab의 검출가능한 손실을 일으키지 않았음을 강조해야 한다.
표 5의 실험에 사용된 동일한 출발 물질을 사용하여 추가적인 실험을 수행하였으며, 여기서 응집, 원심분리 및 정밀 여과를 수행한 후 탁도의 안정성을 모니터링하였다. 실시예 1에 기재된 것과 동일한 방법이 적용되었다. 세 가지 농도의 pDADMAC(0.0375 % w/v, 0.075 % w/v 및 0.09 % w/v)에 의한 응집 후에, 멸균 여과된 상청액의 탁도를 실온에서 24시간 동안 측정하였다. 병렬 조사(parallel investigations)에 의해, 원심분리 및 정밀 여과가 잔류하는 유리 pDADMAC를 제거하지 않았음이 밝혀졌다. 그에 반하여, 크로마토그래피 단계(예를 들어, 단백질 A)는 폴리머를 정량적으로 제거하였다. 표 6은 안정성 실험의 결과 및 탁도의 재출현 동역학을 나타낸다.
[표 6: pDADMAC에 의한 응집 후 여과된 배양액의 안정성]
놀랍게도, 3시간 후에 탁도 수준이 증가하여 침전이 진행중임을 나타내었다. 효과는 pDADMAC 농도에 크게 의존한다. 3시간 후의 탁도 증가는 0.0375 %(w/v)에 있어서 25%이지만, 0.09 %(w/v)에 있어서 약 75%이다. 24시간 후, 가장 높은 pDADMAC 농도에서 탁도는 응집되지 않은(대조군) 값에 도달하였다(표 4b 참조). 응집에 의한 탁도의 초기 감소는 없어졌다.
이러한 결과로부터, 1) 응집 및 여과된 상청액은 신속한 추가적인 프로세싱(심층 여과, 단백질 A 크로마토그래피)을 필요로 하며, 2) pDADMAC의 가장 낮은 유효량이 선택되어야 한다는 결론을 내렸다. 0.075 %(w/v)와 비교하여, 0.0375%(w/v) 상청액의 안정성은 훨씬 우수하며, 8시간까지 거의 증가하지 않았다. 이는 일상적인 생산에 있어서 허용가능한 시간대(time window)이다.
실시예 4: 응집이 있거나 또는 없는 심층 여과 실험
대규모(5,000 L)의 발효액에서 0.0375 - 0.075 %(w/v) pDADMAC에 의한 응집을 수행하는 경우, 플록과 세포를 제거하는 세포 분리기는 많은 부하가 걸리고, 실행 후 세정이 다소 시간 소모적이었다. 이는, 잔류 플록을 제거해야 하는 발효기의 경우에도 마찬가지이다. 따라서, 추가 실험을 통해 이러한 단점을 극복하기 위한 대안적인 사전 세정 전략을 테스트하였다.
첫 번째로, 응집 단계가 생략될 수 있고, 2단계 심층 여과를 포함하는 상이한 셋업의 심층 필터에 의해 대체될 수 있는지 조사하였다. 사전 필터를 포함하는 몇몇 잘 수립된 필터 시스템이 여러 조합으로 시험되었으나, 결과는 만족스럽지 않았다. 즉, 세포 분리 및 심층 여과 후 탁도는 약 10 FNU로 유지되었고, 단백질 A 용리 풀에서의 후속적인 침전은 최상의 필터 셋업에 있어서 약 30 FNU의 탁도로 나타났다. 또한, 심층 필터는 HCDNA 및 HCP를 감소시키지 않았다.
두 번째로, 심층 필터만을 이용하는 경우 응집 후 분리기가 생략될 수 있는지를 조사하였다. 실제로, 일부 필터 셋업은 응집된 세포 배양액을 허용가능한 낮은 플로우 쓰루 탁도(1-2 FNU)로 충분한 방식에 의해 정화하였다. 이 전략은 유망한 제거에 이르렀지만, 요구되는 필터 크기가 다소 크고, 공정 시간이 다소 길어, 상당한 경제적인 요인이 되었다. 이 전략은 추구되지 않았다.
실시예 5: 세포 무함유 배양 상청액에 의한 응집 실험
바람직한 하나의 사전 세정 전략이 이 실시예에서 상세히 설명된다. 사전 세정 단계의 순서는 하기와 같았다(또한, 도 2b 참조):
- 세포 배양액의 수확
- 세포 분리/원심분리
- pDADMAC (0.0375% w/v - 0.075% w/v)에 의한 응집
- 심층 여과
- 정밀 여과 (0.2 ㎛)
- 단백질 A 크로마토그래피 (MabSelect SuRe LX)
실시예 2 및 3과 비교하여, 응집은 세포 분리/원심분리 후에 수행되었고, 심층 여과가 이어졌다. 이 방법은 1 L, 10 L, 100 L 및 5000 L 배양액 (베바시주맙)에 의해 수행되었으며, 심층 여과에 대한 몇몇 파라미터가 비교 및 최적화되었다. 응집 전 상청액의 탁도는 5000 L 규모에서 30-100 FNU의 범위였다.
하기 유형의 심층 필터가 조사되었다:
- Pall Supercap 50 PDH4
- Pall Supercap 50 PDE2
- Pall Supercap 50 PDD1
- Pall Supercap 50 PEKM
- Pall Supercap 50 PEKX
- 3M BC25 90ZB08A
- 3M BV8 Emphaze AEX hybrid purifyer
다시, HCDNA, 탁도, HCP 및 mab 농도를 분석하였으며(방법은 이전 실시예 참조), 이러한 결과로부터, PEKM, PDD1 및 PDE2가 허용가능한 비율로 응집된 상청액을 정화하는데 가장 적합하다. 이중층 구성으로 인하여, PDD1 및 PDE2는 PEKM(단일층)보다 더 강력한 프로세싱을 나타내었으며, 따라서 플록 제거를 위한 바람직한 심층 필터이었다. 심층 필터 뒤의 플로우 쓰루 탁도는 1-2 FNU이었다. 여과 시간은 250-500 L/㎡의 로드에서 80 내지 240 분이었다. PDD1 및 PDE2 여액 모두 24시가 동안 약간의 탁도 증가만을 나타내었으며, 두 여액 모두 단백질 A에 대한 추가적인 프로세싱에 충분히 안정적인 것으로 간주된다.
결론: 세포 무함유 상청액에 의한 응집(분리/원심분리 후)은 바람직한 사전 세정 전략이며, 면역글로불린의 대규모 생산에 매우 적합한 것으로 밝혀졌다. 30-100 FNU의 탁도를 갖는 응집된 상청액은 PDD1 및 PDE2와 같은 이중층 심층 필터에 의해 성공적으로 프로세싱될 수 있었다. 이러한 유형의 필터는 적어도 500 L/㎡ 로딩될 수 있다. 더 높은 탁도(>100 FNU)를 갖는 상청액의 경우, 연장된 프로세싱 시간을 피하기 위하여 유효한 필터 면적을 증가시킬 수 있다. 최종적으로 선택된 pDADMAC 농도는 0.0375 %(w/v)이었으며, 심층 여과가 없는 세포 존재 하의 소규모 응집 실험과 완전히 일치한다(실시예 1-3).
실시예 6: 상이한 pDADMAC 농도를 이용하는 더 높은 IgG 농도를 갖는 세포 배양 상청액의 응집
이 실험에서, 서로 다른 양의 IgG2 항체(데노수맙)를 축적하는 서로 다른 2개의 소규모 세포 배양이 비교되었다. 배양 부피는 10 L이었으며, 출발 물질에 있어서 2개의 10 L 배양물이 결합되었다. 배양물은 각각 8일 및 10일 후에 수확되었다. 풀링된(pooled) 8일 배양물은 3.86 ㎎/㎖ IgG, 42.4 ㎍/㎖ HCDNA 및 0.454 ㎎/㎖ HCP를 가졌다. 10일 배양물은 5.79 ㎎/㎖ IgG (+50%), 85. ㎍/㎖ HCDNA(+102%) 및 0.506 ㎎/㎖ HCP (+11%)를 가졌다. 세포 배양 상청액은 실시예 1에 기재된 바와 같이, 원심분리되었고(4600 rpm에서 10 분), 응집되었다(15 분 배양).
[표 7: pDADMAC 응집에 의한 불순물 감소에 대한 상이한 출발 물질의 비교]
놀랍게도, 2개의 매우 상이한 배양물은 응집 실험에서 다소 유사하게 거동하였다. 다시, HCDNA 제거에 대한 pDADMAC의 높은 가능성을 다시 한번 확인하였다. 0.025% pDADMAC에 의해, 이미 HCDNA 감소가 100%이었다(약 100,000배). 탁도를 보면, 감소는 0.0375% 및 0.075% pDADMAC에 있어서 97-98%에 도달하였다. 이 범위에서, HCP는 각각 22% 및 28% 감소하였다. 놀랍게도, 응집 사전 세정 전략은 항체의 유형, 세포 밀도 및 mab 역가와 관련하여 다소 강력한 것으로 밝혀졌다. 배양물-특이적 화학량론적 투여(culture-specific stoichiometric dosing)는 필요하지 않았다.
실시예 7: 단백질 A에 의한 친화성 포획 후 불순물에 대한 응집의 효과(표 8 내지 10)
이 실시예는 단백질 A 용리 풀에서 잔류 불순물에 대한 응집 효과를 보여준다. 출발 물질은 파일럿 규모(200 L, 표 8))에서 트라스투주맙(IgG1) 및 전체 규모(full scale)(5000 L, 표 9)에서 베바시주맙을 발현하는 세포 배양물이다. 단백질 A 크로마토그래피는 실시예 8.2에 기재된 바와 같이 수행되었다. pDADMAC 농도는 0.0375 %(w/v)이었으며, 심층 필터는 Pall Supercap 50 PDE2이었다.
[표 8: 선행하는 pDADMAC 응집에 의한 단백질 A 용출액에서 불순물의 감소]
단백질 A 용출액의 IgG 농도는 비응집 대조군에 있어서 20.36 ㎎/㎖이었으며, 응집 프로세스에 있어서 23.32 ㎎/㎖이었다. 대조 프로세스에서, 응집이 수행되지 않았으며, 원심분리 후 상청액은 직접적으로 심층 여과되고, 단백질 A 상에서 크로마토그래피되었다. 단백질 A 용리 풀은 대조군에 있어서 약 43 FNU의 탁도 측면에서 상당한 침전을 나타내었다. 이와 달리, pDADMAC 응집 프로세스에서, 탁도는 약 80%까지 크게 감소되었다. HCDNA는 거의 검출할 수 없는 0.076 ppm의 매우 낮은 수준까지 90% 넘게 감소되었다. 잔류 HCP는 204 ppm으로 더욱 두드러졌으며, 이는 출발 물질에서 100-1000배 더 높은 로드를 반영한다. 그 농도는 대조군과 비교하여 약 절반이었다. 이러한 결과는 단백질 A 용출액에서 생성물 순도에 대한 pDADMAC 응집의 현저한 긍정적인 효과를 분명히 보여준다.
하기 표 표 9a 및 9b에서, 2개의 생성물 배치(5000 L 베바시주맙)의 일상적인 공정 중 제어 데이터(in-process control data)가 단백질 A 크로마토그래피 전후에 불순물의 높은 감소를 추가적으로 보여주는 것으로 나타났다. 단백질 A 크로마토그래피는 값비싼 수지의 컬럼 부피를 줄이기 위하여 총 부피의 50%로 2회 연속적 실행으로 수행되었다. 바이러스 불활성화를 위한 후속적인 배양은 실시예 9.3에 기재된 바와 같이 수행되었다.
[표 9a: pDADMAC 응집을 이용하는 대규모 공정: HCDNA 농도]
* 단백질 A 크로마토그래피는 총 부피의 50% 부분에 의한 2회 연속적 실행으로 수행되었다.
n.d.: 검출되지 않음, 시험된 방법의 검출 한계 미만
[표 9b: pDADMAC 응집을 이용하는 대규모 공정: HCP 농도]
HCDNA는 응집 후 이미 거의 검출되지 않았으며, 후속 단계에서 검출 한계 미만이었다(표 9a). 응집 및 심층 여과는 HCP를 약 15%만 감소시켰다(표 9b). 그러나, 단백질 A 크로마토그래피는 IgG-Fc에 대한 높은 선택성으로 인하여 HCP 불순물을 99.9% 넘게 감소시켰다. 그럼에도 불구하고, 단백질 A 크로마토그래피 후 160-270 ppm의 잔류 HCP 농도는 인간 용도를 위한 치료 항체의 경우 추가적인 폴리싱 단계가 필요함을 나타낸다.
표 10의 기초가 되는 실험에서, 단백질 A 용리 풀에서 침출된 단백질 A에 대하여 세 가지 상이한 공정이 비교되었다. 공정 C는 실시예 7/표 8(200 L 트라스투주맙)에 기재된 바와 동일한 조건 하에서 pDADMAC 응집을 이용하는 본 발명에 따른 공정이다. 2회의 실행 결과는 단백질 A 단계 전에 음이온 교환 플로우 쓰루 크로마토그래피 (Nuvia Q)를 이용하는 이전된 수립된 공정(공정 B)과 비교되었다. 공정 A는 사전 세정 단계가 없는(원심분리 및 여과 제외) 추가적인 대조군이다. 공정 A 및 B는 WO2015135884에 기재되어 있다. 모든 공정은 실온에서 수행되었다. 단백질 A 크로마토그래피는 실시예 8.2에 기재된 바와 같이 수행되었다.
[표 10: 상이한 공정에 있어서 침출된 단백질 A의 비교]
공정 A: 세포 분리 → 심층 여과 → 정밀 여과 → 단백질 A
공정 B: 세포 분리 → 심층 여과 → 정밀 여과 → 음이온 교환 크로마토그래피(Nuvia Q, 플로우 쓰루) → 단백질 A (WO2015135884에 기재됨)
공정 C: 세포 분리 → 응집(pDADMAC) → 심층 여과 → 정밀 여과 → 단백질 A
공정 C에서 침출된 단백질은, 대조 공정 A와 비교하여 침출된 단백질 A를 낮추기 위해 이미 가치 있는 개선인 공정 B를 사용한 것보다 상당히 낮았다. 공정 C에서 침출된 단백질의 감소는 공정 B에 비하여 약 48% 및 공정 A에 비하여 약 79%이었다. 따라서, HCDNA 및 탁도의 두드러진 감소 외에도, pDADMAC 응집은 침출된 단백질 A를 현저한 정도로 추가적으로 감소시킨다.
실시예 8: 다운스트림 공정 - 사전 세정된 배양 상청액으로부터 면역글로불린의 정제
하기에서, 소규모로 개발되고 처음에 베바시주맙 (IgG1)의 100 L 파일럿 규모에 적용된 방법이 설명된다. 약간의 조정만 적용된 동일한 방법이 나중에 5000 L까지 성공적으로 확장되었다. 추가적인 일부 조정 후에, 이 공정은 트라스투주맙(IgG1) 및 데노수맙(IgG2)에 대해서도 수립되었다.
실시예 8.1: 크로마토그래피 수지의 선택(표 11)
WO2015135884에 개시된 포획, 중간 및 폴리싱 단계를 위하여 일반적으로 이용되는 크로마토그래피 매질의 확장된 스크리닝 후에, 하기 크로마토그래피 수지가 면역글로불린의 다운스트림 공정을 위하여 선택되었다(표 11).
[표 11: 바람직한 크로마토그래피 수지]
CEX = 양이온 교환 크로마토그래피; AEX = 음이온 교환 크로마토그래피; MMC = 혼합 모드 크로마토그래피
크로마토그래피 실행은 실온에서 Akta Purifier System(GE Healthcare)으로 수행되었다.
실시예 8.2: 단백질 A 크로마토그래피
단백질 A 포획 크로마토그래피는 MabSelect SuRe LX에 의해 수행되었다(표 11). 실시예 5에 기재된 바와 같이, 응집된 상청액의 심층 여과 및 정밀 여과 후에 샘플을 채취하였다. 컬럼 치수는 20 ㎝ 직경 × 10.4 cm 층 높이(충전 부피(packed volume) 약 3.3 L)이었다. 단백질 A 컬럼은 pH 7.2의 20 mM Tris-아세테이트 버퍼로 평형화되었다. 15.8 내지 40.6 단백질/L 수지를 생성물 용액(약 49.5 L)에 로딩하였다. 컬럼을 평형 버퍼(2 CV)로 세척하고, 이어서 40 mM Na-포스페이트, 1.5 M NaCl, 2 M 요소, pH 7.4의 10 mM EDTA로 세척하였다. 용리는 pH 3.5의 100 mM Na-시트레이트에 의해 수행되었다. 유속은 210 ㎝/h이었다. MabSelect SuRe LX 수지의 재생은 (ⅰ) 0.2 M NaOH (2 CV), (ⅱ) WFI (2 CV), 3.5% 아세트산, 100 mM Na-설페이트 (2 CV) 및 (ⅲ) WFI (2 CV)로 역방향으로 연속적으로 세척함으로써 수행되었다. 컬럼은 다음 실행을 위하여 재평형화되거나, 또는 20% 에탄올에 보관되었다. 수율은 94-98%이었다.
실시예 8.3: 바이러스 불활성화
도 1 및 2에 나타내어진 바와 같이, 바이러스 불활성화 단계가 단백질 A 친화성 크로마토그래피 후에 이루어진다. 친화성 매트릭스로부터 낮은 pH 용리의 이점이 있다. 이러한 수성의 산성 환경에서, 많은 바이러스, 특히 외피형 바이러스는 불안정하고 분해된다. 본 발명에 있어서 개발된 단백질 A 방법은 3.5의 pH를 갖는 용출액을 생성한다(실시예 8.2 참조). 단일 클론 항체는 pH 3.5의 100 mM Na-시트레이트 버퍼에서 단백질 A 컬럼으로부터 바이러스 불활성화 탱크로 직접 용리된다. 용출액은 탱크 A에서 직접 WFI에 의해 약 2배 희석되었다. 용액의 pH는 필요에 따라 100 mM 시트르산에 의해 3.5로 제어 및 재조정되었으며, 이어서 용액을 바이러스 불활성화 탱크 B로 옮겨 60분 동안 20-24℃의 온도에서 65rpm으로 교반하였다. 그런 다음, 용액의 pH를 100 mM NaOH에 의해 pH 4.5로 조정하여 후속 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 위한 출발 조건을 제공하였다.
실시예 8.4: Poros 50 HS를 이용하는 양이온 교환 크로마토그래피
HCP 및 침출된 단백질과 같은 오염물, 및 전하 변이체 및 응집체와 같은 생성물 관련 물질의 분리는 중간 단계로 사용된 설포프로필 (SP) 리간드 (표 11)에 의한 강한 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 수행되었다. Poros 50 HS 수지가 충전된 컬럼(치수 = 14 ㎝ 직경 × 41 ㎝ 층 높이, 충전 부피 약 6.3 L)은 (ⅰ) WFI(주사용 증류수, 2 CV) 및 (ⅱ) pH 4.9의 20 mM Na-시트레이트(2 CV)에 의해 연속적으로 평형화되었다. 실시예 8.3에 기재된 바와 같이 바이러스 불활성화 및 샘플 조정(pH 4.5) 후에 수득된 생성물 용액을 약 7.3 내지 17.1 g 단백질/L 수지를 갖는 컬럼에 로딩하여, 0.45 ㎛ Kleenpak Nova 사전 필터(Pall Corporation)를 통과시켰다. 구배 용리가 이어지기 전에, 컬럼을 WFI (1 CV) 및 평형 버퍼 (2 CV)로 세척하였다. 구배는 상이한 기울기를 갖는 두 부분으로 이루어진다. 구배는 하기 비율 및 순서로 pH 4.9의 20 mM Na-시트레이트(버퍼 A) 및 pH 7.2의 40 mM Na-포스페이트(버퍼 B)를 혼합함으로서 형성되었다: (ⅰ) 100% A(0.2 CV), (ⅱ) 40% A + 60% B까지 선형 구배(2 CV); (ⅲ) 100% B까지 선형 구배(10 CV); (ⅳ) 100% B(2 CV). 유속은 구배 중에 75 ㎝/h이었고, 그렇지 않은 경우 150 ㎝/h이었다. 용출액은 특정 풀링을 가능하도록 하기 위하여 분획으로 분리되었다. 구배 용리 중의 분획 수집은 A280 이 0.1 AU를 초과하는 값으로 오를 때 시작되었다. 분획 부피는 약 2 L이었다. 총 약 20개의 분획이 수집되었다. Poros 50 HS 수지의 재생은 (ⅰ) 1 M NaCl(2 CV) 및 (ⅱ)1M NaOH (2 CV)로 연속적으로 세척함으로써 수행되었다. 그 후, 컬럼을 10 mM NaOH에 보관하였다. 선택된 풀에서의 수율은 상당한 양의 생성물 관련 불순물의 고갈로 인하여 약 62-68%이었다.
실시예 8.5: CaptoAdhere를 이용하는 혼합 모드 크로마토그래피
최종 폴리싱 단계가 리간드 N-벤질-N-메틸 에탄올아민을 이용하는 CaptoAdhere 혼합 모드 수지에 의해 수행되었다(표 11). 리간드는 양전하를 띤 기능기를 함유하므로, 소수성 상호작용 외에 음이온 교환 기능도 제공한다. 크로마토그래피는 HCDNA, HCP 및 기본 전하 변이체(basic charge variants)와 같은 오염물의 나머지 미량을 감소시킬 수 있다. 잔류 침출된 단백질 A, 생성물 응집체 및 생성물 단편도 이 단계에 의해 제거될 수 있다. CaptoAdhere 폴리싱 단계는 결합 모드에서 수행되었으며, 이는 선택된 최종 버퍼로의 버퍼 교환의 이점을 제공한다.
실시예 8.4에 기재된 과정 후에 수득된 Poros 50 HS 풀의 pH는 100 mM NaOH를 첨가하여 pH 7.2로 조정되었다. 충전된 컬럼 크기는 14 ㎝ 직경 × 23 ㎝ 층 높이(충전 부피 약 3.5 L)이었다. 수지는 pH 7.2의 50.48 mM Na-포스페이트(3 CV)로 평형화되었다. 생성물 용액을 6.3 내지 17.8 g 단백질/L 수지를 갖는 컬럼에 로딩한 후, 평형 버퍼(3 CV)를 로딩하였다. 용리는 pH 5.0의 50.48 mM Na-포스페이트로 수행되었다. 유속은 240 ㎝/h이었다. 수율은 87 내지 98%의 범위이었다. 컬럼은 역흐름으로 2 M NaCl + 100 mM 시트르산 (2 CV) 및 1 M NaOH (2 CV)에 의해 재생되었다.
실시예 8.6: Capto Q를 이용하는 음이온 교환 크로마토그래피
혼합 모드 크로마토그래피 대신에, Capto Q 음이온 교환 크로마토그래피가 본 실시예에서 최종 폴리싱 단계로 수행되었다. 음이온 교환 크로마토그래피는 플로우 쓰루 모드에서 수행되었다. 컬럼 로딩 전에, 양이온 교환 크로마토그래피의 풀링된 분획은 아세트산을 이용하여 pH 8.0으로 pH 조정을 거쳤다. Capto Q 컬럼을 pH 8.0의 25 mM Tris 버퍼로 평형화하였다. 샘플 로딩 후에, 크로마토그래피는 동일한 버퍼에 의해 수행되엇다. 면역글로불린은 크로마토그래피 수지에 결합되지 않고, 플로우 쓰루에서 수득된다.
실시예 8.7: 바이러스 여과
나노 여과는 최종 바이러스 제거 단계를 구성하며, 나노미터 범위에서의 크기 배제를 기반으로 작동하는 가장 요구가 많고 가장 신뢰성 있는 바이러스 제거 방법이다. 바이러스 여과는 Na-포스페이트에 의해 pH 6.2로, 또는 아세트산에 의해 pH 5.0으로 pH가 조정된 후, 실시예 8.5의 CaptoAdhere 용리 풀 또는 실시예 8.6의 Capto Q 플로우 쓰루 풀을 이용하여 혼합 모드 크로마토그래피 후에 직접 수행되었다. 바이러스 제거 여과는 QuattroFlow 150 다이어프램 펌프(diaphragm pump)를 이용하는 Viresolve Pro Modus 1.1 Device (EMD Millipore)에 의해 실온에서 수행되었다. 0.1 ㎛ 기공 크기를 갖는 Opticap XL 150 PES 필터(EMD Millipore)가 응집체에 의한 바이러스 필터의 막힘을 방지하기 위하여 바이러스 필터 전에 배치되었다. 필터는 1.5 L의 포뮬레이션 버퍼, 예를 들어, pH 6.2의 50.48 mM Na-포스페이트 버퍼 또는 pH 5,2의 18 mM Na-아세테이트 버퍼로 컨디셔닝되었다. 압력 설정 포인트는 여과 과정 중에 2 ± 0.2 bar이었다. 약 500-600 L/㎡의 로딩 후에, 약 0.5-1 L 부피의 포뮬레이션 버퍼, 예를 들어, pH 6.2의 50.48 mM Na-포스페이트 버퍼가 필터 트레인으로부터 잔류 mab를 세척하기 위하여 사용되었다. 바이러스 필터는 3.4 bar 압력 및 1 분 테스트 기간으로 무결성 테스트를 거쳤다.
실시예 8.8: 접선 유동 한외여과/정용여과(TF-UF/DF)
최종 한외여과/정용여과 단계의 역할은 단백질 용액의 농도를 조정하고, 필요한 경우 의약품 벌크 포뮬레이션으로 버퍼 교환을 수행하는 것이다. 최종 폴리싱 단계가 결합 모드의 혼합 모드 크로마토그래피인 경우, 버퍼 교환은 결합 모드에 의해 가능한 혼합 모드 크로마토그래피 수준에서 이미 수행되었다(실시예 8.5 참조). 또한, 버퍼 외에, 계면활성제, 안정화제 및/또는 동결보존제와 같은 최종 벌크 포뮬레이션의 다른 성분은 정용여과를 통하여 도입될 수 있다. 대안으로, 농축된 mab 용액은 이러한 물질로 직접 보충된다.
실시예 8.7의 나노 여과된 생성물 용액을 UF/DF 스키드 탱크에 수집하고, Omega Centrasette 막 카세트(Pall Corporation, 30 kD cutoff)를 이용하여 약 40 +/- 2 g/L로 농축하였다. 공급 압력은 QuattroFlow 150 다이어프램 펌프로 제공되었다. 막간 압력차(Transmembrane pressure)는 1 bar로 설정되었고, 공급 및 잔류 압력(feed and retentate pressure)은 각각 1.0 및 0.6 bar이었다. 이 단계 중에 mab의 손실은 없었다. 농축된 생성물 용액에 폴리소르베이트 20 및 트레할로스 또는 소르비톨이 보충되었다. mab의 최종 벌크 농도는 예를 들어, 30 +/- 2 g/L 또는 80 +/- 5 g/L로 조정되었다. 최종 정밀 여과(멸균 여과)가 0.2㎛ Mini Kleenpak 필터 캡슐(Pall Corporation)을 이용하여 수행되었다.
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32. WO9729131
33. WO9845331
Claims (30)
- 하기 단계를 하기 순서로 포함하는, 세포 배양액으로부터 면역글로불린의 포획 친화성 크로마토그래피(capture affinity chromatography) 중에 침전을 방지하는 방법.
(a) 응집-유도 화합물(flocculation-inducing compound)을 세포 배양액에 첨가하는 단계;
(b) 단계 (a)의 혼합물의 심층 여과(depth filtration) 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 여액(filtrate)을 친화성 크로마토그래피에 노출시키는 단계 - 여기서 상기 면역글로불린은 친화성 크로마토그래피 매질에 결합됨 -;
(d) 5 내지 9의 pH 값 및 0.1 내지 5.0 mol/ℓ의 이온 강도를 갖는 세척 버퍼(washing buffer)를 이용하여 친화성 크로마토그래피 매질을 세척하는 단계; 및
(e) 2.5 내지 4.5의 pH 값을 갖는 용리 버퍼(elution buffer)를 이용하여 친화성 크로마토그래피 수지로부터 면역글로불린을 용리시키는 단계.
- 제1항에 있어서,
단계 (a)는 하기 단계:
(a1) 세포 배양액의 원심분리 및/또는 여과 단계;
(a2) 응집-유도 화합물을 단계 (a1)에서 수득된 상청액 또는 여액에 첨가하는 단계를 포함하는
방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 응집-유도 화합물은 양이온성 화합물(cationic compound)인
방법.
- 제3항에 있어서,
상기 양이온성 화합물은 2가 금속 이온염, 수용성 유기 폴리머 및 수불용성 유기 폴리머로 이루어진 군으로부터 선택되는
방법.
- 제4항에 있어서,
상기 2가 금속 이온염은 CaCl2인
방법.
- 제4항에 있어서,
상기 수불용성 유기 폴리머는 키토산인
방법.
- 제4항에 있어서,
상기 수용성 유기 폴리머는 폴리 (디알릴디메틸암모늄 클로라이드)인
방법.
- 제7항에 있어서,
상기 폴리 (디알릴디메틸암모늄 클로라이드)는 10 kDa 내지 10 000 kDa의 분자 질량을 갖는
방법.
- 제7항 또는 제8항에 있어서,
상기 폴리 (디알릴디메틸암모늄 클로라이드)는 0.01 내지 1.0 %(w/v)의 최종 농도로, 바람직하게 0.02 내지 0.1 %(w/v)의 최종 농도로, 더욱 바람직하게 0.03 to 0.08 %(w/v)의 최종 농도로 첨가되는
방법.
- 제7항 내지 제9항에 있어서,
상기 폴리 (디알릴디메틸암모늄 클로라이드)를 제외하고, 응집을 수행하기 위하여 추가적인 물질이 첨가되지 않는
방법.
- 제7항 내지 제10항에 있어서,
폴리 (디알릴디메틸암모늄 클로라이드)에 의한 응집은 pH 또는 전도도의 추가적인 조정 없이 수행되는
방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 응집은 적어도 5분 동안, 바람직하게 적어도 15분 동안, 실온에서, 교반 하에 수행되는
방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 친화성 크로마토그래피는 단백질 A 크로마토그래피인
방법.
- 제13항에 있어서,
상기 단백질 A 크로마토그래피 매질은 리간드로서, 가교결합 아가로스 매트릭스(cross-linked agarose matrix)에 결합된, 알칼리-내성 단백질 A 유도체(alkali-tolerant Protein A derivative), 바람직하게 단백질 A의 도메인 B의 알칼리-안정화된 테트라머 변이체(alkali-stabilized tetramer variant)를 포함하는
방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (b)에서 심층 여과를 위한 필터는 1개를 넘는 층, 바람직하게 2개 층을 포함하는
방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (b)와 단계 (c) 사이에, 정밀 여과(microfiltration)가 수행되는
방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (c)는 단계 (b) 후 최대 8시간, 바람직하게 단계 (b) 후 최대 3시간 후에 수행되는
방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포 배양액은 면역글로불린을 발현하는 재조합 CHO 세포로부터 수득되는
방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 면역글로불린은 IgG1 또는 IgG2인
방법.
- 제19항에 있어서,
상기 IgG1 또는 IgG2의 Fc 부분은 인간인
방법.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 정의된 단계를 포함하고, 친화성 크로마토그래피 후에, 바이러스 불활성화(virus inactivation), 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography), 양이온 교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography), 혼합 모드 크로마토그래피(mixed-mode chromatography), 나노 여과(nanofiltration) 및 한외여과/정용여과(ultrafiltration/diafiltration)로루터 선택되는 일 이상의 추가적인 단계를 포함하는
면역글로불린의 정제 방법.
- 제21항에 있어서,
상기 일 이상의 추가적인 단계는
(f) 바이러스 불활성화를 위하여 단계 (e)의 용출액을 적어도 10분 동안 2.5 내지 4.5의 낮은 pH 값에서 배양하는 단계를 포함하는
방법.
- 제21항에 있어서,
상기 일 이상의 추가적인 단계는
(f) 바이러스 불활성화를 위하여 단계 (e)의 용출액을 적어도 10분 동안 2.5 내지 4.5의 낮은 pH 값에서 배양하는 단계;
(g) 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계;
(h) 혼합 모드 크로마토그래피 또는 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계;
(i) 단계 (h)의 용출액, 또는 그로부터 유래되고 단계 (h) 후에 수행된 일 이상의 추가적인 공정 단계 후에 수득된 조성물을 나노 여과에 노출시키는 단계; 및
(j) 단계 (i)의 여액, 또는 그로부터 유래되고 단계 (i) 후에 수행된 일 이상의 추가적인 공정 단계 후에 수득된 조성물을 한외여과/정용여과에 노출시키는 단계를 포함하는
방법.
- 제23항에 있어서,
상기 양이온 교환 크로마토그래피 (g)는 결합-용리 모드(bind-elute mode)에서 수행되며, 선택적으로 일 이상의 세척 단계를 포함하는
방법.
- 제23항에 있어서,
단계 (h)에서 상기 혼합 모드 크로마토그래피는 결합-용리 모드에서 수행되며, 선택적으로 일 이상의 세척 단계를 포함하는
방법.
- 제23항에 있어서,
상기 크로마토그래피 (h)는 플로우 쓰루 모드(flow through mode)에서 수행되는
방법.
- 제23항에 있어서,
단계 (g)의 상기 양이온 교환 크로마토그래피는, 강한 양이온 교환 매질(strong cation exchange medium)을 포함하는 매질에 의해, 바람직하게 리간드로서 설포프로필 (-CH2CH2CH2SO3-)을 갖는 강한 양이온 교환 매질을 포함하는 매질에 의해 수행되는
방법.
- 제27항에 있어서,
설포프로필 (-CH2CH2CH2SO3-)은 가교결합된 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 매트릭스에 결합되는
방법.
- 제23항에 있어서,
단계 (h)의 상기 혼합 모드 크로마토그래피 매질은, 가교결합 아가로스 매트릭스에 결합된, 양전하를 띤 혼합 모드 매질, 바람직하게 리간드로서 N-벤질-N-메틸 에탄올아민을 포함하는 양전하를 띤 혼합 모드 매질에 의해 수행되는
방법.
- 제23항에 있어서,
단계 (h)의 상기 음이온 교환 크로마토그래피 매질은, 가교결합 아가로스 매트릭스에 결합된, 강한 음이온 교환 매질(strong anion exchange medium), 바람직하게 리간드로서 트리메틸암모늄(-N+(CH3)3)을 갖는 강한 음이온 교환 매질에 의해 수행되는
방법.
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