KR20210148565A - 콜라겐 전구체 프로콜라겐i의 합성 촉진 효과와 콜라겐 분해 효소의 발현 억제 효과를 동시에 갖는 피부 개선용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규 콜라겐 합성 촉진 효과 및 콜라겐 분해효소 저해 효과가 우수한 펩타이드를 함유하는 피부재생 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 펩타이든 우수한 콜라겐 합성 촉진 기능을 보여 주름개선용 및 피부노화 경감 조성물로 용이하게 사용 가능하다. 특히 다이머 형태로 제조된 본 발명의 펩타이드는 모노머 펩타이드 조성물에 비해, 콜라겐 합성 촉진 효과 및 콜라겐 분해효소 저해 효과가 우수하고 사용상의 안정성 및 안전성이 높다.

Description

콜라겐 전구체 프로콜라겐I의 합성 촉진 효과와 콜라겐 분해 효소의 발현 억제 효과를 동시에 갖는 피부 개선용 화장료 조성물 {A COSMETIC COMPOSITION FOR IMPROVING THE SKIN THAT BOTH THE STIMULATION EFFECT OF COLLAGEN PRECURSOR PROCOLLAGEN I AND THE INHIBITORY EFFECT OF MMP-1}

본 발명은 펩타이드와 어성초, 사철쑥을 함유하는 피부 개선 화장료 조성물 및 주름 예방, 개선 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 펩타이드와 어성초, 사철쑥을 유효성분으로 함유하여 콜라겐 생성 촉진 효과 및 콜라겐 저해 효소 억제 및 피부 주름 개선 등 피부 개선을 목적으로 하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

세포외 기질(matrix)의 주요 구성 성분인 콜라겐은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질로서 세포 외 간질에 존재하고, 생체 단백질 총 중량의 약 30%를 차지하는 중요한 단백질로 견고한 3중 나선구조를 가지고 있다. 콜라겐은 피부, 건(tendon), 뼈 및 치아의 유기 물질의 대부분을 형성하는데, 특히 뼈와 피부 (진피)에 그 함유량이 높다. 대부분의 다른 체 구조물에서는 섬유성 봉입체로서 존재한다. 콜라겐은 비교적 약한 면역원인데, 콜라겐의 나선 구조에 의한 잠재성 항원 결정인자의 차폐가 그 일부 원인이고, 이 나선 구조는 또한 콜라겐이 단백질 분해에 대한 내성을 갖도록 한다. 콜라겐의 주된 기능으로는 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포 접착의 지탱, 세포 분할과 분화(유기체의 성장 혹은 상처 치유시)의 유도 등이 알려져 있다(Van der Rest M et al., Biomaterials, 1990, 11:28-31). 이처럼 생체에 있어 중요한 기능을 갖는 콜라겐은 섬유아세포에서 생합성 되는데 고령화 및 자외선 조사에 의한 광노화에 의해 감소하며, 일반적으로 정상인의 경우 피부에 존재하는 콜라겐의 양이 20세에서 80세에 이르는 동안 65% 정도 감소하여 피부의 두께를 얇게 만든다고 알려져 있다(Shuster S et al., Br J Dermatol, 1975, 93(6):639-43; Arthur K. Balin, Raven Press, 1989, 372). 콜라겐의 대사 회전율은 연령 증가에 따라 저하되어 세포외 기질 경화의 원인이 된다. 또한 콜라겐은 상처 치유에 있어서 중요한 역할을 담당하여 손상된 상피에서 콜라겐의 합성을 촉진시켜서 상처를 신속하게 흉터 없이 회복시킬 수 있다.

또한 근래에 들어 소득수준이 높아지고 노령화사회로 접어들면서 피부 노화에 대한 광범위한 연구가 발전되면서 피부에서의 콜라겐의 중요한 기능이 밝혀지고 있다. 이와 같은 연구들로부터, 피부 내 콜라겐의 합성 촉진에 의해 콜라겐 대사가 활발해지면 진피 매트릭스의 성분이 증가되어 주름개선, 탄력증진, 피부강화, 상처치유의 효과를 기대할 수 있다는 주장이 나오게 되었다. 이러한 주장에 따라 콜라겐합성 촉진물질인 레티논산(retinoic acid), TGF(transforming growth factor), 동물유래 태반(placenta), 베투린산(betulinic acid), 클로렐라추출물 등을 피부강화용 화장료 조성물로 사용한 제품들이 많이 출시되었다. 그러나 이러한 콜라겐합성 촉진물질들은 크게 각광을 받지 못하였다. 또한 콜라겐을 피부 보호용 화장품 조성물로 하는 콜라겐을 배합한 제품들이 다수 판매되고 있으나, 피부 표면에 도포하는 화장품은 고분자인 콜라겐의 경피흡수가 어려워 피부의 보습작용을 기대하기 어렵다는 지적이 있다. 본 발명은 여기에 착안하여 경피흡수율이 우수하고 피부보호에 우수한 효과를 가지는 콜라겐 합성 촉진 펩타이드를 개발하여 피부보호용 조성물로 제공하고자 한다.

본 발명과 관련된 종래기술로는 곽향, 첨호 추출물(국내공개특허 제10-1998-0036067호), 상륙, 토사자, 백자강잠 추출물(국내공개특허 제10-1998-0032537호), 해산물 유래 콜라겐(국내공개특허 제10-2013-0010913호), 어류 및 축산물로부터 추출한 콜라겐 펩타이드(국내등록특허 제10-0829389호), 우피, 돈피, 소뼈, 어류 등에서 추출한 콜라겐 펩타이드(국내공개특허 제10-2003-0060997호) 등이 콜라겐 합성 촉진용 조성물로서 알려져 있다. 그러나 이들 종래기술은 원료로부터 콜라겐이나 콜라겐 펩타이드를 추출하는 방법으로서 본 발명과 기술적 구성이 다른 것이다.

또한, 상기에 기술된 피부개선 유효성분들은 빛, 수분, 공기, 열 등에 쉽게 산화되는 불안정한 성질이 있어 화장료의 원료로 사용하기에는 문제점을 포함한다. 특히, 재조합 단백질 원료의 경우 고가의 비용이 소요되며, 천연 추출물의 경우 재현성이 떨어지는 단점이 있다. 또한, 천연 추출물은 유래 물질에 따라 유효성분이 달라지는 문제점도 가지고 있다.

이에 본 발명자들은 고체상 합성방법을 이용한 비용 절감 및 피부 투과성이 높은 펩타이드를 최적의 배합비로 혼합하여 화장료 조성물을 제조함으로써 콜라겐 합성을 촉진하고 콜라겐 분해효소에 대해 저해 효과가 우수하여 현저한 피부 재생 및 보습 효과를 발휘할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

'Fibril-associated collagen', Van der Rest M et al., Biomaterials, 1990, 11:28-31. 'The influence of age and sex on skin thickness, skin collagen and density', Shuster S et al., Br J Dermatol, 1975, 93(6):639-43. 'Aging and the skin', Arthur K. Balin, Raven Press, 1989, 372. 음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 펩타이드, 어성초, 사철쑥으로 이루어진 혼합물을 함유하여 콜라겐 합성을 촉진하거나 콜라겐 분해를 억제하는 것을 목적으로 한다. 구체적으로, 상기 콜라겐 합성 촉진용 조성물을 이용하여 피부 주름 예방, 개선, 또는 치료하기 위한 화장료, 의약외품 또는 약학 조성물을 제공하는 것이다.

[Cys-Glu-Asp-His-Arg-Gln-Arg] 화합물1

[Cys-Gln-Asp-His-Arg-Gln-Arg] 화합물2

[Cys-Asp-Asp-His-Arg-Gln-Arg] 화합물3

[Cys-Met-Asp-His-Arg-Gln-Arg] 화합물4

[Cys-Glu-Glu-His-Arg-Gln-Arg] 화합물5

[Cys-Glu-Gln-His-Arg-Gln-Arg] 화합물6

[Cys-Glu-Asp-His-Arg-Gln-Arg] 화합물7

[Cys-Glu-Met-His-Arg-Gln-Arg] 화합물8

[Cys-Glu-Asp-Glu-Arg-Gln-Arg] 화합물9

[Cys-Glu-Asp-Gln-Arg-Gln-Arg] 화합물10

[Cys-Glu-Asp-Asp-Arg-Gln-Arg] 화합물11

[Cys-Glu-Asp-Met-Arg-Gln-Arg] 화합물12

[Cys-Glu-Asp-His-Glu-Gln-Arg] 화합물13

[Cys-Glu-Asp-His-Gln-Gln-Arg] 화합물14

[Cys-Glu-Asp-His-Asp-Gln-Arg] 화합물15

[Cys-Glu-Asp-His-Met-Gln-Arg] 화합물16

[Cys-Glu-Asp-His-Met-Glu-Arg] 화합물17

[Cys-Glu-Asp-His-Met-Gln-Arg] 화합물18

[Cys-Glu-Asp-His-Met-Asp-Arg] 화합물19

[Cys-Glu-Asp-His-Met-Met-Arg] 화합물20

상기 화합물 1 내지 20의 펩타이드에서 1종 이상 선택되는 펩타이드와 어성초, 사철쑥 각각의 추축물을 혼합하여 주름 개선용 약학적 조성물을 제공할 수 있다. 상기 혼합물을 약학적 조성물에 0.0001 내지 20 중량%로 포함될 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 고체상에 일정하게 결합된 아미노산 골격에 하나 이상의 아미노산 또는 적합하게 보호된 아미노산을 연속적으로 아미드 결합을 형성하는 식으로 제조할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 펩타이드는 안정성을 크게 저하시키지 않는 범위에서 다른 아미노산의 삽입, 치환, 삭제가 가능하며, 이 또한 본 발명의 범주에 속한다.

또한, 본 발명의 펩타이드의 세포내 이동을 촉진하는 세포 투과성 펩타이드(cell permeable peptide)를 펩타이드 C-말단 또는 N-말단에 결합하여 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 세포 투과성 펩타이드에는 TAT 펩타이드(Arg-Lys-Lys -Arg-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg) 및 Tat-PTD 펩타이드(Gly-Arg-Lys-Lys-Arg -Arg-Gln-Arg-Arg-Arg:Tat PTD)일 수 있으나, 본 발명이 이에 국한되는 것은 아니며, 당업계에 공지된 세포 투과성 펩타이드가 본 발명에 따른 펩타이드의 활성을 저해하지 않는 범위 내의 것이라면 어느 것이라도 사용가능하다.

한편, 본 발명의 펩타이드는 염의 형태로 존재할 수도 있다. 본 발명에 사용 가능한 염의 형태는 화합물의 최종분리 및 정제 동안 또는 아미노기를 적절한 산과 반응 시키는 것에 의해 만들어지는 것일 수 있다. 예를 들면, 산 부가염으로 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 시트레이트, 아스파테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트,바이설페이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 디글루코네이트, 글리세로 포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 포르메이트, 푸마레이트, 하이드로 클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로요 오다이드, 2-하이드록시에탄 설포네이트, 락테이트, 말레에이트, 메시틸렌설포네이트, 메탄설포네이트, 나프틸렌설포네이트, 니코티네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 옥살레이트, 파모에이트, 펙티네 이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 트리클로로아테이트, 트리플루오로아세테이트, 포스페이 트, 글루타메이트, 바이카보네이트, 파라-톨루엔설포네이트 및 운데카노에이트 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 산 부가염을 형성하기 위해 사용될 수 있는 산의 예로는 염산, 브롬화수소산, 황산 및 인산과 같은 무기산 및 옥살산, 말레 산, 숙신산 및 시트르산과 같은 유기산일 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이 때, 트리플로로아세테이트 염 또는 아세테이트 염을 함유한 펩타이드 형태가 가장 바람직하다.

본 발명의 펩타이드 제조를 위해 이용되는 아미노산의 아미노기 또는 카복실기는 적합한 보호기에 의해 보호될수 있다. 보호된 아미노산은 고체 지지체에 부착되거나 아미드 결합을 형성하기에 적합한 조건하에서 다음의 아미노산을 첨가함으로써 용 액 중에서 반응이 이루어질 수 있다. 또한, 보호기는 적합한 보호기로 보호된 아미 노산을 첨가하기 이전에 완전히 제거될 수 있다. 모든 아미노산이 목적하는 바에 따라 연결된 후, 유리된 잔류 보호기 및 유리된 고형 지지체로부터 연속적으로 또는 동시에 분리하여 최종 목적하는 펩타이드를 얻을 수 있다.

본 발명에서는 키랄 센터가 라세미화되지 않는 조건하에서 적합하게 보호된 테트라 펩타이드를 적절하게 보호된 또 다른 디펩타이드와 축합시켜 아미드결합을 형성시 킨 후 탈보호하여 목적하는 헥사펩타이드를 합성하여 얻는 절편 축합반응 기술을 이용하여 펩타이드를 제조할 수 있다.

본 발명의 펩타이드 화합물을 제조하기 위한 가장 바람직한 합성 방법으로는 고체 상 폴리머 지체를 이용하여 합성하는 고체상 펩타이드 합성방법을 이용할 수 있으 며, 상기 방법을 통해 제조된 펩타이드의 α-아미노기는 산 또는 염기 민감성 작용기 에 의해 보호될 수 있다. 이 때의 아미노산의 보호기는 펩타이드 축합반응 조건에서 안정한 성질을 가져야만 하고, 연장되는 펩타이드 사슬의 파괴 없이 또는 거기에 함 유된 임의의 키랄 센터의 라세미체화 없이 용이하게 제거 가능한 성질을 가져야만 한다. 따라서, 적합한 보호기들로는 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc), t-부톡시카 보닐(Boc), 벤질옥시카보닐(Cbz), 비페닐이소프로필-옥시카보닐, t-아밀옥시카보닐, 이소보르닐옥시카보닐, (α,α)-디메틸-3,5-디메톡시벤질옥시카보닐, O-니트로페닐설페 닐, 2-시아노-t-부틸옥시카보닐 등일 수 있으며, 이러한 목적으로 당업계에 알려진 적합한 다른 보호기들 또한 본 발명의 범위 내에서 사용가능하다.

본 발명의 펩타이드 합성에서 사용된 아미노산의 가장 바람직한 보호기로는 9-플루 오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc) 보호기가 사용할 수 있다.

특히, 본 발명의 펩타이드 합성에서 사용되는 아미노산 잔기의 보호기로는 N-메틸 글루타민산의 경우, t-부틸(t-Bu)이고; 라이신의 경우, t-부톡시카보닐(Boc)이고; 세 린의 경우, 7t-부틸(t-Bu)이고; 트레오닌 및 알로트레오닌의 경우, t-부틸(t-Bu)이고; 시스테인의 경우, 트리틸(Trt)인 것이 바람직하지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

고체상 펩타이드 합성 방법에서, C-말단 아미노산은 적합한 고형 지지체 또는 수지 에 부착될 수 있다. 상기 합성을 위해 유용한 적합한 고형 지지체로는 단계적 축합 -탈보호 반응의 시약 및 반응 조건에 불활성이고 사용되는 매질에 불용성인 물질이 바람직하며, 예를 들면, 링크 아미드(rink amid) 또는 링크 아미드 4-메틸벤질히드

릴아민 수지(rink amid MBHA resin)일 수 있다.

특히, C-말단 아미드 펩타이드에 대해 바람직한 고형 지지체는 Novabiochem Cor poration으로부터 시판되는 링크아미드 4-메틸벤질히드릴아민 수지일 수 있다.

C-말단 아미드(amide)는 디클로로메탄, N-메틸피리돈(NMP) 또는 DMF와 같은 용 매 중에서 10℃ 내지 50℃의 온도에서, 바람직하게는 30℃의 온도조건에서, 1 내지 24시간 동안 4-디메틸아미노피리딘(DMAP), 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt), N- 메틸모르폴린(NMM),벤조트리아졸-1-일옥시-트리스(디메틸아미노)포스포늄-헥사플루오로포스페이트(BOP) 또는　비스(2-옥소-3-옥사졸리디닐)포스핀클로라이드(BOP　CI)의 존재 또는 부재하에서 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(DCC),　N,N'-디이　소프로필카보디이미(DIC), [O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로　늄헥사플루로포스페이트](HATU) 또는　O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라　메틸우로늄헥사플루오로포스페이트(HBTU)에 카르복실산을 활성화시켜 축합을 통해 수지 또는 고체상 지지체에 축합(결합, 커플링)될 수 있다.

고형 지지체가 링크 아미드 4-메틸벤질히드릴아민 수지인 경우, 바람직한　보호기로　서 Fmoc 작용기는 C-말단 아미노산으로 축합하기 전에 2급 아민 용액,　바람직하　게는 20%의 피페리딘 DMF 용액을 과량 사용하여 절단한다.　상기 탈보호된　4-(2'　,4'-디메톡시페닐-Fmoc-아미노메틸)페녹시아세트아미도에틸 수지에 목적하는 아미　노산을 축합시키는데 사용되는 바람직한 시약들로는 적합하게 보호된 아미노산에 대하여 DMF 용매 중에서 N-메틸모르폴린　(NMM),　1-하이드록시벤조트리아졸(H　OBt) 및 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스　페이트](HATU),O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트　(HBTU), N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(DCC) 또는N,N'-디이소프로　필카보디이미드(DIC)와 같은 축합 반응 시약들이다.

본 발명에서 수행되는 연속적인 아미노산의 축합은 관련 기술 분야에서 널리 알려져 있는 자동 펩타이드 합성기를 이용하거나 또는 수동으로 직접 수행할 수 있다. 바람직한 합성 반응의 조건으로는 Fmoc 그룹으로 보호된 α-아미노산을 2급 아민 용액, 바람직하게 피페리딘으로 처리하여 탈보호시킨 후, 충분히 과량의 용매로 세척하고 축합을 원하는 또 다른 각각의 보호된 아미노산을 이어서 3~7배 몰 과량 첨가하여, 바람직하게는 DMF 용매 중에서 반응을 수행할 수 있다.

본 발명의 고체상 수지를 이용한 펩타이드의 합성 마지막 단계에서는 펩타이드를 연속적으로 또는 1회 조작으로 수지로부터 얻고자 하는 펩타이드를 제거하고 각각 아미노산의 잔기를 보호하고 있는 보호 그룹들을 탈보호시킬수 있다. 수지로부터 펩 타이드의 제거 및 잔기에 존재하는 보호기들의 탈보호 조건으로는 일반적으로 수 지-펩타이드 간의 결합을 절단하는 절단 시약 칵테일, 예를 들어, 트리플루오로아 세트산(TFA), 트리이소프로필실란(TIS), 티오아니졸, 물 또는 에탄디티올(EDT)등으로 구성된 디클로로메탄 혼합 칵테일 용액을 처리하여 얻을 수 있다. 이렇게 얻어진 혼합 용액은 냉장 보관된 디에틸에테르 용매를 과량 처리하므로써 침전물을 생성　시킬 수　있다. 이상과 같이 얻어진 침전물을 원심분리시켜 완전히 침전시키고　과량의 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실란, 티오아니졸, 물 및 에탄디티올 등　을 일차 제거하고 이상의 절차를 2회 이상 반복하여 고형화시킨 침전물을 얻을 수 있다. 이 때, 완전히 탈보호된 펩타이드 염은 물과 아세트나이트릴 용매로 구성된 혼합 용매 및　역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 분리 정제할 수 있다. 분리 정제된 펩타이드 용액은 동결건조를 이용하여 완전히 농축건조함으로써 고형의 펩타이드를 얻을 수 있다.

혼합물의 어성초, 사철쑥은 각각 1~10 : 1~10의 중량 비율로 혼합하고, 화합물 1 내지 20의 펩타이드는 0.01~1의 중량비율로 혼합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 그 유효성분인 펩타이드와 사철쑥, 어성초 뿐만 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제,　비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 또한, 상기 담체로서, 정제수, 일가 알코올류(에탄올 또는 프로필 알코올), 다가알코올류　(글리세롤, 1,3-부티렌글리콜 또는 프로필렌글리콜), 고급지방산류(팔미틸산 또는　리　놀렌산), 유지류(소맥 배아유, 동백기름, 호호바유, 올리브유, 스쿠알렌, 해바라기유,　마카데미아땅콩유, 아보가드유, 또는 지방산 글리세라이드) 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 필요에 따라, 계면활성제, 보습제, 방부제,　산화방지제 등을 첨가할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 사용될 수 있는 계면활성제로는, 음이온계 계면활성제로서, 알킬벤젠설폰산염, 폴리옥시알킬렌알킬황산 에스테르염, 알킬황산 에스테르염, 올레핀설폰산염, 알킬인산염, 폴리옥시알킬렌알킬에테르인산염, 디알킬설포석신산염, 지방산염 등을 들 수 있고, 비이온성 계면활성제로서, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌지방산 에스테르, 다가 알콜지방산 부분 에스테르, 폴리옥시에틸렌 다가 알콜지방산 부분 에스테르, 폴리글리세린지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 유도체, 지방산디에탄올아미드 등을 들 수 있다. 또한, 양이온성 계면활성 제로서는, 3급 지방족 아민염, 알킬트리메틸암모늄할라이드, 디알킬디메틸암모늄할라이드 등을 들 수 있고, 양쪽성 계면활성제로서는, 아미드베타인형, 이미다졸리늄　베타인형, 설포베타인형 등을들 수 있다. 상기 보습제로서는, 글리세린,　프로필렌　글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨 등을 들 수 있다. 상기 방부 제로서는, 벤조산, 데하이드로아세트산, 파라옥시벤조산에스테르(파라옥시벤조산메틸,파라옥시벤조산부틸 등), 페녹시에탄올 등을 들 수 있다. 또한, 상기 산화방지제로서는, 아스코르브산, BHA 등을 들 수 있으며, 이외에도, 자외선 흡수제, 소염제 및 청량제 등을 첨가할 수 있다.

본 발명의 펩타이드, 어성초, 사철쑥의 혼합물을 화장료 조성물 총중량에 대하여 바람직하게는 0.0001 ~1.0 중량%, 더 바람직하게는 0.001~1.0 중량%, 가장 바람직하게는 0.001~0.01% 중량%가 함유될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 화장료의 종류는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 화장수, 유액, 젤, 크림, 에센스, 팩, 앰플, 로션, 세정료, 비누, 바디제품류, 비누, 오일 등의 스킨케어 화장료, 립스틱, 파운데이션 등의 메이크업 화장료 등을 들 수 있고, 그 제형은 특별히 제한되지 않는다.

본 발명의 화장료 조성물은 매일 사용할 수 있으며 또한 정해지지 않은 기간 동안 에도 사용할 수 있다. 바람직하게는 사용자의 연령, 피부상태 또는 피부타입, 따라 사용량, 사용횟수 및 기간을 조절할 수 있다.

본 발명은 펩타이드, 어성초, 사철쑥의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 피부 개선용 화장료 조성물을 제공함으로써, 세포독성이 없고, 콜라겐 전구체인 프로콜라겐 I을 증가시키고, 콜라겐 분해효소인 MMP-1을 억제하여 콜라겐을 증가시킬 수 있다. 또한 사람에 발라보았을 때 피부 주름을 예방, 개선 및 치료할 수 있음으로써 피부 주름 개선용 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 화합물 1내지 20의 펩타이드들과 추출물 그리고 혼합물의 프로콜라겐 I의 증가효과를 도식화 한 것이다.
도 2은 화합물 1내지 20의 펩타이드들과 추출물 그리고 혼합물의 콜라겐 분해효소 MMP-1 억제효과를 도식화 한 것이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여 기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분 히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1-1. 화합물 1의 합성>

본 발명에 사용되는 아미노산의 명명 및 약어는 아래와 같이 표기한다.

Cys : 시스테인 / Glu : 글루타믹애씨드 / Asp : 아스파틱애씨드 / His : 히스티딘 / Arg : 알지닌 / Gln : 글루타민

Novabiochem corporation으로부터 구입한 2-chlorotrityl chloride resin(g당 1.4mmol이 로딩된 수지)을 71.4㎎(0.10mmol) 측량하여 반응용기에 넣었다. 수지를 3㎖의 DMF로 용매화시키고 5분간 충분히 반응(sweeling)시킨 다음, 20%(w/v) 피페리딘 DMF 용액을 3㎖ 첨가하고 20분간 교반(shaking)하고 피페리딘 DMF 용액을 제거한 후, 10㎖의 DMF 용매를 이용하여 5회 세척하였다(10㎖씩 5회 세척) * DMF : 디메틸포름아미드.

Fmoc-Arg(Trt)-OH(468.6㎎, 0.80mmol), HOBt(108.1㎎, 0.80mmol) 및 DIC(0.124㎖, 0.80mmol)를 2㎖의 DMF 용매에 완전히 녹인 후, 수지에 첨가하였다. 반응액을 실온에서 8시간 동안 교반(shaking)한 후, 10㎖의 DMF 용매로 5회 세척하였다. 20%(w/v) 피페리딘 DMF 용액을 3㎖ 첨가하고 10분간 교반(shaking)하고 피페리딘 용액을 제거한 후, 다시 20%(w/v) 피페리딘 DMF 용액을 첨가하여 20분간 반응시켜 수지에 보호되어 있는 Fmoc 보호기를 완전히 제거하고 10㎖의 DMF 용매를 이용하여 5회 세척하였다(10㎖씩 5회 세척). 이 단계에서 Fmoc 보호기의 탈보호 반응 여부를 Kaiser test[E. Kaiser et al. Anal. Biochem., 1970, 34(2), 595~598.]를 실시하여 확인하였다. * Fmoc : 9-플루오레닐메틸옥시카보닐 / HOBt : 1-하이드록시벤조트리아졸 / DIC : N,N'-디이소프로필카보디이미드.

다음으로는 아래와 동일한 합성 주기에 따라 연속적으로 펩타이드를 축합(커플링) 시켰다.

(1) DMF 용매(10㎖)로 5회 세척 ;

(2) 20%(w/v) 피페리딘 DMF 용액(3㎖)을 사용하여 10분간 2회 탈보호 ;

(3) DMF 용매(10㎖)로 5회 세척 ;

(4) Fmoc-아미노산 첨가 ;

(5) 축합 시약을 첨가하여 아미노산 활성화 및 2시간 축합 ;

(6) DMF 용매(10㎖)로 5회 세척 ;

상기 (1) 내지 (6)은 계속 반복하였으며, 이 때, Fmoc-Cys(Trt)-OH 이후의 Fmoc으로 보호된 아미노산(0.80mmol)은 상기 기술된 순서로 수지 반응용기에 첨가하여 축합시켰다.

Fmoc-Cys(Trt)-OH 축합 후의 (7) 이후에는, 마지막으로, 20% 피페리딘 DMF 용액(3㎖)을 처리하였다.

상기와 같은 합성 종결 즉시, 펩타이드가 축합된 수지를 3시간 동안 트리플루오로아세트산/티오아니졸/에탄디티올/트리이소프로필실래인/물(95:5:2.5:2.5:2.5)의 혼합물을 사용(10㎖)하여, 수지로부터 펩타이드를 절단하였다. 이렇게 얻어진 혼합 용액에 냉장 보관된 디에틸에테르 용매를 100㎖ 처리함으로써 침전물을 생성시켰다. 얻어진 침전물을 원심분리하여 완전히 침전시키고 트리플루오로아세트산, 티오아니졸 및 에탄디티올을 1차 제거하고 이상의 절차(디에틸에테르 용매를 100㎖ 첨가하여 침전물을 세척하고 원심분리하는 단계 - 1차 제거를 시도했던 트리플루오로아세트산, 티오아니졸 및 에탄디티올을 제거하기 위한 작업)를 2회 반복하여 고형화시킨 침전물을 얻었다. 상기 침전물(펩타이드)을 C-18 칼럼을 사용하여 50분에 걸쳐 0.01% 트리플루오르아세트산을 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물 농도구배 용매 시스템을 사용하는 HPLC로 정제하였다. 순수 정제된 분획물을 동결건조시켜 백색 분말형의 트리플루오로아세테이트염으로서 콜라겐 합성촉진 펩타이드 H₂N-[Cys-Glu-Asp-His-Arg-Gln-Arg]-CO₂H(70㎎)을 얻었다.

<실시예 1-2. 화합물 2~20의 합성>

상기 실시예 1-1과 동일한 제조 과정을 이용하되, Fmoc으로 보호된 아미노산의 순서를 달리하여 하기의 화합물 2~20의 펩타이드를 제조하였다.

<실시예 2. 어성초 및 사철쑥 추출물의 제조>

시판되는 어성초, 사철쑥을 구입하여 음지에서 건조하고 숙성시킨 후 분쇄한 뒤, 200g을 10배 가량의 70% (v/v) 에탄올 수용액으로 4시간 가온 열수 추출하고 냉첨하였다. 그 다음 100 마이크로미터 여과포로 여과한 후 60℃ 이하에서 감압농축 한 후 동결건조기를 이용하여 어성초 추출물 15g, 사철쑥 추출물 22g을 수득하였다.

실험예 1 : 펩타이드, 어성초 및 사철쑥의 콜라겐 합성 촉진 효과 조사 (in vitro)

인간 피부 섬유아세포(HDF: Human dermal fibroblast, Thermo사 제조)를 5.0*?*⁴세포/㎖ 농도로 12웰 플레이트에 1 ㎖씩 분주하고, 37℃, 5% C0₂, 가습 조건하에서 2일 배양을 실시하였다. 배양액은, DMEM medium(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco사 제조)에 FBS(Gibco사 제조)를 10%로 함유한 배지를 각 웰당 1 ㎖씩 사용하였다.

이어서, FBS(Gibco)가 포함되지 않은 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Sigma사 제조)으로 교환하고, 다시 1 ㎖의 PBS(Phosphate Buffered Saline, Sigma사 제조)로 세척 한 후 본 발명의 화합물을 100 uM 처리하여 배양하였다. 상기 화합물을 용해하지 않는 PBS를 100㎕ 첨가한 것을 대조군으로서 사용하였다.

콜라겐 생산 촉진 시험에 있어서는, 3일 배양한 후, 배양액을 채취하여, 배양액 중에 분비된 타입 I 프로 콜라겐의 농도를, 효소 결합 면역 측정법(ELSIA, Procollagen type I c-peptide EIA Kit; R&D system 제조)으로 정량하였다.

정량 결과를 기초로, 합성된 타입 I 프로 콜라겐의 양(pg/㎖)을 측정하고, 하기 수학식 1에 따라 타입 I 프로 콜라겐 생성율을 계산하였으며, 그 결과를 [표 1] 및 [도 1]에 나타내었다.

[수학식 1]

타입 I 프로 콜라겐 생성율(%) = (실험군 타입 I 프로 콜라겐 양 / 대조군 타입 I 프로 콜라겐 양) * 100

구분	피부 섬유아세포 콜라겐 생산량(%)
화합물 1	127.5292
화합물 2	100.2602
화합물 3	95.2104
화합물 4	111.7741
화합물 5	138.8514
화합물 6	107.6235
화합물 7	121.7056
화합물 8	107.3086
화합물 9	111.2389
화합물 10	107.2547
화합물 11	112.8343
화합물 12	69.28763
화합물 13	58.76608
화합물 14	57.11992
화합물 15	99.53982
화합물 16	100.054
화합물 17	94.13207
화합물 18	95.50212
화합물 19	95.06072
화합물 20	93.09387
어성초 추출물 (1%)	102.7365
사철쑥 추출물 (1%)	100.7015
어성초 추물물 (1%) + 사철쑥 추출물 (1%)	106.8535
화합물 1 + 어성초 추물물 (1%) + 사철쑥 추출물 (1%)	139.5335
화합물 5 + 어성초 추물물 (1%) + 사철쑥 추출물 (1%)	143.2463
비타민 C (0.0005%)	129.2127

* 화합물 1 내지 20은 모두 100 ppm

상기 표 1 및 도 1을 참고하면 본 발명의 화합물과 추출물은 콜라겐 생성 촉진 효과를 보이며, 특히 화합물 5와 어성초 추출물 (1%) 및 사철쑥 추출물 (1%)를 혼합처리하였을 때 콜라겐 생성량이 현저히 증가되었으며, 기존에 알려진 콜라겐 합성 촉진물질인 비타민C와 비교하여 동등 이상의 강력한 콜라겐 합성 촉진효과가 있음을 알 수 있었다.

실험예 2 : 펩타이드의 콜라겐 분해효소 (MMP-1) 저해 효과 (in vitro)

인간 피부 섬유아세포(HDF: Human dermal fibroblast, Thermo사 제조)를 5.0*?*⁴세포/㎖ 농도로 12웰 플레이트에 1 ㎖씩 분주하고, 37℃, 5% C0₂, 가습 조건하에서 2일 배양을 실시하였다. 배양액은, DMEM medium(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco사 제조)에 FBS(Gibco사 제조)를 10%로 함유한 배지를 각 웰당 1 ㎖씩 사용하였다.

이어서, FBS(Gibco)가 포함되지 않은 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Sigma사 제조)으로 교환하고, 다시 1 ㎖의 PBS(Phosphate Buffered Saline, Sigma사 제조)로 세척 한 후 본 발명의 화합물을 100 uM 처리하여 배양하였다. 상기 화합물을 용해하지 않는 PBS를 100㎕ 첨가한 것을 대조군으로서 사용하였다.

MMP-1 억제율 시험에 있어서는, 3일 배양한 후, 배양액을 채취하여, 배양액 중에 분비된 MMP-1의 농도를, 효소 결합 면역 측정법(ELSIA, MMP-1 EIA Kit; R&D system 제조)으로 정량하였다.

정량 결과를 기초로, 합성된 MMP-1의 양(pg/㎖)을 측정하고, 하기 [수학식 2]에 따라 MMP-1 억제율을 계산하였으며, 그 결과를 [표 2] 및 [도 2]에 나타내었다.

[수학식 2]

MMP-1 생성 억제율(%) = (실험군 MMP-1 양 / 대조군 MMP-1 양) * 100

구분	피부 섬유아세포 MMP-1 생성 억제율(%)
화합물 1	52.4105
화합물 2	87.5895
화합물 3	90.3151
화합물 4	94.1028
화합물 5	38.4737
화합물 6	109.9675
화합물 7	80.4433
화합물 8	94.5358
화합물 9	93.4081
화합물 10	84.1788
화합물 11	95.5226
화합물 12	105.4126
화합물 13	103.1721
화합물 14	111.0109
화합물 15	98.5146
화합물 16	90.4742
화합물 17	97.5496
화합물 18	89.6045
화합물 19	107.5892
화합물 20	84.0757
어성초 추출물 (1%)	38.0968
사철쑥 추출물 (1%)	24.7869
어성초 추물물 (1%) + 사철쑥 추출물 (1%)	22.0125
화합물 1 + 어성초 추물물 (1%) + 사철쑥 추출물 (1%)	21.8535
화합물 5 + 어성초 추물물 (1%) + 사철쑥 추출물 (1%)	20.9637

* 화합물 1 내지 20은 모두 100 ppm

상기 표 1 및 도 1을 참고하면 본 발명의 화합물과 추출물은 콜라겐 분해효소인 MMP-1 발현 억제효과를 보이며, 특히 화합물 5와 어성초 추출물 (1%) 및 사철쑥 추출물 (1%)를 혼합처리하였을 때 그 효능이 현저하게 증가되었다. 실험예 1 및 2를 통하여 화합물과 어성초 및 사철쑥 혼합물은 콜라겐 합성 촉진과 분해 억제 효과를 모두 갖는 것으로 확인되어 우수한 주름 개선용 화장료 조성물로 활용이 가능하다.

실험예 3 : 콜라겐 생성 펩타이드의 안전성 확인 (in vitro)

인간 피부 섬유아세포(HDF: Human dermal fibroblast, Thermo사 제조)를 2.0*?*⁵세포/㎖ 농도로 96웰 플레이트에 100 ul씩 분주하고, 37℃, 5% C0₂, 가습 조건하에서 2일 배양을 실시하였다. 배양액은, DMEM medium(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco사 제조)에 FBS(Gibco사 제조)를 10%로 함유한 배지를 각 웰당 100 ul씩 사용하였다.

이어서, FBS(Gibco)가 포함되지 않은 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Sigma사 제조)으로 교환하고, 다시 100 ul의 PBS(Phosphate Buffered Saline, Sigma사 제조)로 세척 한 후 본 발명의 화합물을 100 uM 처리하여 배양하였다. 상기 화합물을 용해하지 않는 PBS를 100㎕ 첨가한 것을 대조군으로서 사용하였다.

시험 시료를 넣고 72시간 배양 후, MTT를 처리하고 2시간 동안 배양하였다. 이후에 배양액은 제거하고 DMSO를 넣고 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정 값을 기초로, [수학식 3]에 따라 세포 생존율을 계산하였으며, 그 결과를 [표 3] 및 [도 4]에 나타내었다.

[수학식 3]

세포 생존율(%) = (실험군 540 nm 흡광도 / 대조군 540 nm 흡광도) * 100

구분	세포생존율(%)
화합물 1	99.88423
화합물 2	99.92592
화합물 3	96.86219
화합물 4	98.78731
화합물 5	92.4199
화합물 6	90.58217
화합물 7	105.8431
화합물 8	90.05098
화합물 9	105.9849
화합물 10	107.1949
화합물 11	102.7548
화합물 12	101.2763
화합물 13	102.9543
화합물 14	99.63757
화합물 15	99.68455
화합물 16	99.08721
화합물 17	94.86219
화합물 18	100.7813
화합물 19	99.08721
화합물 20	98.23362
어성초 추출물 (1%)	102.0385
사철쑥 추출물 (1%)	94.8689
어성초 추물물 (1%) + 사철쑥 추출물 (1%)	98.2431
화합물 1 + 어성초 추물물 (1%) + 사철쑥 추출물 (1%)	98.4688
화합물 5 + 어성초 추물물 (1%) + 사철쑥 추출물 (1%)	97.9049

* 화합물 1 내지 20은 모두 100 ppm상기 [표 3] 참고하면, 본 발명의 화합물과 추출물은 적용하였을 때 모두 높은 세포 생존율을 확인하였다. 본 실험 결과를 통해, 본 발명의 화합물과 추출물은 모두 인간 피부 섬유아세포를 포함하는 동물세포에서 안전성이 확인되었다.

실시예 4 : 화장품 제형의 제조

상기 콜라겐 합성 촉진 펩타이드를 포함하는 화장료의 효과를 평가하기 위하여, 하기의 [표 4]과 같은 성분들을 배합하여 크림의 화장품 제형을 제조하였다.

성분	실험예 1(중량%)	비교예 1(중량%)
화합물 5 (0.01%) + 어성초 추물물 (1%) + 사철쑥 추출물 (1%)	1.0	-
부틸렌글리콜	5.0	5.0
글리세린	5.0	5.0
카프릭 글리세라이드	4.5	4.5
유동파라핀	3.5	3.5
세틸알코올	2.0	2.0
바셀린	2.0	2.0
스테아린산	1.5	1.5
폴리솔베이트 60	1.5	1.5
피이지-100 스테아레이트	1.0	1.0
글리세릴모노스테아레이트	0.5	0.5
솔비탄세스퀴올레이트	0.5	0.5
카보머	0.2	0.2
트리에탄올아민	0.2	0.2
방부제, 색소, 향료	적량	적량
정제수	잔량 전부	잔량 전부
합 계	100.0	100.0

실험예 4 : 피부 개선 효과 조사 : 진피 치밀도

상기 실시예 4 및 비교예 1의 크림을 이용하여 피부 주름 개선효과에 대한 패널테스트를 실시하였다. 만 30세에서 60세의 건강한 성인 여성으로, 피부 질환이나 알레르기가 없는 최종 20명이 시험을 완료하였다. 실시예 4의 크림을 안면부에 1일 1회 2주간 도포하도록 하였다. 2주 후 피부 개선정도를 조사하고자 Skincscanner를 이용하여 진피 치밀도를 측정하고, 사용 전 후의 변화정도를 계산하였다. 제품 사용 전과 비교하여 2주 후 진피치밀도가 통계적으로 유의하게 증가하였다.

구분	사용 전	사용 2주 후
진피치밀도	1156.20±206.32	1486.65±222.53

상기 [표 5]에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 4의 크림을 사용한 경우 진피 치밀도 개선효과가 우수하여 피부 개선에 도움을 주는 것으로 확인된다.

실험예 5 : 피부 개선 효과 조사 : 주름 완화

상기 실시예 4 및 비교예 1의 크림을 이용하여 피부 주름 개선효과에 대한 패널테스트를 실시하였다. 만 30세에서 60세의 건강한 성인 여성으로, 피부 질환이나 알레르기가 없는 최종 20명이 시험을 완료하였다. 실시예 4의 크림을 안면부에 1일 1회 4주간 도포하도록 하였다. 4주 후 피부 개선정도를 조사하고자 3차원 영상 촬영장치 Antera를 이용하여 주름의 변화 정도를 계산하였다.

구분	사용 전	사용 2주 후
진피치밀도	10.15±1.65	9.30±1.57

상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 4의 크림을 사용한 경우 주름이 감소하는 것으로 확인되었다.

Claims (4)

1. 펩타이드와 사철쑥, 어성초로 이루어진 혼합물을 이용하는 함유하는 피부 개선 화장료 조성물
2. 제 1항에 있어서, 펩타이드는 하기 화합물 1 내지 20 중 어느 하나 이상을 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물
   [Cys-Glu-Asp-His-Arg-Gln-Arg] 화합물1
   [Cys-Gln-Asp-His-Arg-Gln-Arg] 화합물2
   [Cys-Asp-Asp-His-Arg-Gln-Arg] 화합물3
   [Cys-Met-Asp-His-Arg-Gln-Arg] 화합물4
   [Cys-Glu-Glu-His-Arg-Gln-Arg] 화합물5
   [Cys-Glu-Gln-His-Arg-Gln-Arg] 화합물6
   [Cys-Glu-Asp-His-Arg-Gln-Arg] 화합물7
   [Cys-Glu-Met-His-Arg-Gln-Arg] 화합물8
   [Cys-Glu-Asp-Glu-Arg-Gln-Arg] 화합물9
   [Cys-Glu-Asp-Gln-Arg-Gln-Arg] 화합물10
   [Cys-Glu-Asp-Asp-Arg-Gln-Arg] 화합물11
   [Cys-Glu-Asp-Met-Arg-Gln-Arg] 화합물12
   [Cys-Glu-Asp-His-Glu-Gln-Arg] 화합물13
   [Cys-Glu-Asp-His-Gln-Gln-Arg] 화합물14
   [Cys-Glu-Asp-His-Asp-Gln-Arg] 화합물15
   [Cys-Glu-Asp-His-Met-Gln-Arg] 화합물16
   [Cys-Glu-Asp-His-Met-Glu-Arg] 화합물17
   [Cys-Glu-Asp-His-Met-Gln-Arg] 화합물18
   [Cys-Glu-Asp-His-Met-Asp-Arg] 화합물19
   [Cys-Glu-Asp-His-Met-Met-Arg] 화합물20
3. 제 1항에 있어서, 화합물 1내지 20, 사철쑥, 어성초를 각각 0.01~1.0 : 1~10 : 1~10 중량 비율로 혼합하여 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물
4. 제 1항에 있어서, 상기 혼합물은 화장료 조성물 전체 중량 대비 0.0001 내지 20 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물로서, 화장료 조성물로 화장수, 유액, 젤, 크림, 에센스, 팩, 앰플, 로션, 세정료, 비누, 바디 제품류, 비누, 오일, 립스틱 및 파운데이션에서 선택되는 것을 특징으로 하는 주름개선용 화장료 조성물

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