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KR20210143839A - 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 콘주게이트와 parp 저해제의 조합 - Google Patents

항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 콘주게이트와 parp 저해제의 조합 Download PDF

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KR20210143839A
KR20210143839A KR1020217034025A KR20217034025A KR20210143839A KR 20210143839 A KR20210143839 A KR 20210143839A KR 1020217034025 A KR1020217034025 A KR 1020217034025A KR 20217034025 A KR20217034025 A KR 20217034025A KR 20210143839 A KR20210143839 A KR 20210143839A
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KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
amino acid
acid sequence
seq
heavy chain
Prior art date
Application number
KR1020217034025A
Other languages
English (en)
Inventor
나오야 하라다
미치코 기타무라
Original Assignee
다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 filed Critical 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
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Abstract

항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 콘주게이트와 PARP 저해제가, 조합되어 투여되는 것을 특징으로 하는 암의 치료를 위한 의약 조성물, 또는, 암 치료 방법.

Description

항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 콘주게이트와 PARP 저해제의 조합
본 발명은 특정한 항체-약물 콘주게이트와 PARP 저해제가 조합되어 투여되는 것을 특징으로 하는, 암 치료를 위한 의약 조성물 및 암 치료 방법에 관한 것이다.
항체-약물 콘주게이트 (Antibody-Drug Conjugate ; ADC) 는, 암 치료 등에 사용되고 있고, 예를 들어, 암 세포 표면에 발현하고 있는 항원에 결합하고, 그 결합에 의해서 항원을 세포 내에 내재화할 수 있는 항체에, 세포 상해 활성을 갖는 약물을 결합시킨 것이다. ADC 는, 암 세포에 효율적으로 약물을 송달함으로써, 암 세포 내에 약물을 축적시켜, 암 세포를 사멸시키는 것을 기대할 수 있다.
ADC 에 사용되는 약물로서 유용한 것의 하나로 피롤로벤조디아제핀 (PBD) 을 들 수 있다. PBD 는 DNA 소구 (小溝) 의 PuGPu 등에 결합함으로써 세포 독성을 나타낸다. 천연 유래의 PBD 인 anthramycin 은 1965년에 처음으로 발견되었고, 그 이후 여러 가지 천연 유래, 또 그 유연체의 PBD 가 발견되었다 (비특허문헌 1 ∼ 4).
PBD 의 일반적인 구조식은, 하기 식
[화학식 1]
Figure pct00001
으로 나타낸다. PBD 는 각각 A, C 고리부에 있어서 치환기의 수, 종류, 부위에 있어서 상이하고, 또, 각각 B, C 고리부의 불포화도가 상이한 것이 알려져 있다.
PBD 는 2 량체 구조로 함으로써, 비약적으로 세포 독성이 향상되는 것을 알려져 있고 (비특허문헌 5, 6), 2 량체 PBD 를 ADC 화한 것도 여럿 보고되어 있다 (특허문헌 1 ∼ 15). 그러나, C2 위치에 있어서 스피로 고리를 갖는 PBD 또는 그 ADC 체는 알려져 있지 않다.
폴리(ADP-리보스)폴리메라아제 (PARP) 저해제는, PARP (특히 PARP-1 및 PARP-2) 를 저해함으로써, 1 본쇄 절단의 수복을 방해하는 기능을 갖는 약제이다. 유암이나 난소암 등의 일부의 암에서는, 2 본쇄 절단의 수복에 이상이 있는 것이 알려져 있어, PARP 저해제는, 이들 암에 대해서 합성 치사에 의한 항종양 효과가 확인되었다 (비특허문헌 7 ∼ 11).
PARP 저해제로는, Olaparib (비특허문헌 12), Rucaparib (비특허문헌 13), Niraparib (비특허문헌 14), 및 Talazoparib (비특허문헌 15) 등이 알려져 있다.
PARP 저해제와 PBD 를 사용한 ADC 를 병용함으로써, 합성 치사와 유사한 효과가 얻어지는 것도 알려져 있다. 예를 들어, PARP 저해제가 유효성을 나타내는 BRCA2 녹아웃 DLD1 세포의 Xenograft 모델에 있어서 Olaparib 과 ADC 의 병용 효과가 확인되었다. 그러나, 친주의 DLD1 세포의 Xenograft 모델에서는 병용 효과는 확인되지 않았다 (비특허문헌 16). 또, 상기 스피로 고리를 갖는 PBD 나 그 항체-약물 콘주게이트에 대해서 PARP 저해제와의 병용 효과에 대해서는 알려져 있지 않다.
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본 발명은 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 콘주게이트와 PARP 저해제를 조합하여 투여되는 것을 특징으로 하는 암의 치료를 위한 의약, 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 콘주게이트와 PARP 저해제를 조합하여 투여되는 것을 특징으로 하는 암의 치료 방법을 제공한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토 바, 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 콘주게이트와 PARP 저해제가 조합되어 투여됨으로써, 우수한 항종양 효과를 나타내었다. 또, 당해 콘주게이트는, PARP 저해제가 감수성을 나타내지 않는 세포주 및 제노그래프트 종양에 대해서도 PARP 저해제와 조합되어 투여됨으로써, 우수한 항종양 효과를 나타내었다. 본 발명은 상기 지견을 기초하여 완성되었다.
즉, 본 발명은, 이하에 관한 것이다.
[1] 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 콘주게이트 및/또는 PARP 저해제를 함유하는 암 치료를 위한 의약 조성물로서, 그 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 콘주게이트와, 그 PARP 저해제가, 조합되어 투여되는 것을 특징으로 하고,
그 콘주게이트가, 다음 식 ;
[화학식 2]
Figure pct00002
[화학식 3]
Figure pct00003
[화학식 4]
Figure pct00004
, 또는,
[화학식 5]
Figure pct00005
으로 나타내고,
상기에서 나타내는 각각의 구조식에 있어서, m1 은 1 또는 2 의 정수이고,
Ab 는, 항체 또는 그 항체의 기능성 단편이며,
N297 당사슬은 다음 식으로 나타내는 구조를 갖는 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 혹은 그것들의 혼합물, 또는 N297-(Fuc)SG 이고,
[화학식 6]
Figure pct00006
[화학식 7]
Figure pct00007
[화학식 8]
Figure pct00008
식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
N297 당사슬 중의 L(PEG) 는, *-(CH2CH2-O)3-CH2CH2-NH- 인 것을 나타내며,
여기에서, 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 또는/및 1-6 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합을 통하여 결합하고 있고, 좌단의 애스터리스크 * 는, 상기 식 중의 트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내는 의약 조성물.
[2] 항체가, 종양 세포에 발현하고 있는 항원에 결합하여, 종양 세포 내에 흡수되어 내재화하는 것을 특징으로 하는, [1] 에 기재된 의약 조성물.
[3] 항체가, 항종양 효과를 갖는 것을 특징으로 하는, [1] 또는 [2] 에 기재된 의약 조성물.
[4] 항체가, 항 CLDN6 항체, 항 CLDN9 항체, 항 CLDN6/CLDN9 항체, 항 HER2 항체, 항 HER3 항체, 항 DLL3 항체, 항 FAP 항체, 항 CDH11 항체, 항 A33 항체, 항 CanAg 항체, 항 CD19 항체, 항 CD20 항체, 항 CD22 항체, 항 CD25 항체, 항 CD30 항체, 항 CD33 항체, 항 CD37 항체, 항 CD56 항체, 항 CD70 항체, 항 CD98 항체, 항 B7-H3 항체, 항 TROP2 항체, 항 CEA 항체, 항 Cripto 항체, 항 EphA2 항체, 항 FGFR2 항체, 항 G250 항체, 항 MUC1 항체, 항 GPNMB 항체, 항 Integrin 항체, 항 PSMA 항체, 항 Tenascin-C 항체, 항 SLC44A4 항체, 항 Mesothelin 항체, 항 EGFR 항체, 항 5T4 항체, 항 LRRC15 항체, 항 DR5 항체, 항 CDH3 항체, 항 PDPN 항체, 또는 항 CD123 항체인, [1] ∼ [3] 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
[5] 항체가, CLDN6 및/또는 CLDN9 에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, [1] ∼ [4] 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
[6] 항체가, 이하의 (a) 또는 (b) 에 기재된 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 을 포함하는 중사슬, 그리고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 을 포함하는 경사슬을 포함하여 이루어지는, [5] 에 기재된 의약 조성물 ;
(a) 서열 번호 9 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 10 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 11 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 그리고, 서열 번호 5 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 6 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 7 에 기재된 아미노산 서열 또는 그 아미노산 서열에 있어서 1 또는 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 또는,
(b) 서열 번호 15 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 16 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 17 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 그리고, 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3.
[7] 항체가, 이하의 (a) 또는 (b) 에 기재된 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 을 포함하는 중사슬, 그리고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 을 포함하는 경사슬을 포함하여 이루어지는, [6] 에 기재된 의약 조성물 ;
(a) 서열 번호 9 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 10 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 11 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 및, 서열 번호 5 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 6 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 7 에 기재된 아미노산 서열 또는 서열 번호 8 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 또는,
(b) 서열 번호 15 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 16 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 17 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 및, 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3.
[8] 항체가, 이하의 (a) 또는 (b) 에 기재된 중사슬 가변 영역, 및, 경사슬 가변 영역을 포함하는, [5] ∼ [7] 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물 ;
(a) 서열 번호 21 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및, 서열 번호 19 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역, 또는,
(b) 서열 번호 25 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및, 서열 번호 23 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역.
[9] 이하의 (a) ∼ (e) 로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및 (f) ∼ (k) 로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는, [5] ∼ [8] 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물 ;
(a) 서열 번호 54 에 기재된 아미노산 서열,
(b) 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열,
(c) 서열 번호 62 에 기재된 아미노산 서열,
(d) (a) ∼ (c) 의 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 대해서 적어도 95 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열,
(e) (a) ∼ (c) 의 서열에 있어서의 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열,
(f) 서열 번호 38 에 기재된 아미노산 서열,
(g) 서열 번호 42 에 기재된 아미노산 서열,
(h) 서열 번호 46 에 기재된 아미노산 서열,
(i) 서열 번호 50 에 기재된 아미노산 서열,
(j) (f) ∼ (i) 의 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 대해서 적어도 95 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 및,
(k) (f) ∼ (i) 의 서열에 있어서의 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열.
[10] 항체가, 이하의 (a) ∼ (e) 로 이루어지는 군에서 선택되는 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역을 포함하는, [9] 에 기재된 의약 조성물 ;
(a) 서열 번호 54 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 38 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
(b) 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 42 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
(c) 서열 번호 54 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 46 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
(d) 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 50 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역으로 이루어지는 경사슬 가변 영역, 및,
(e) 서열 번호 62 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 46 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역.
[11] 항체가, 키메라 항체인, [5] ∼ [10] 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
[12] 항체가, 인간화 항체인, [5] ∼ [10] 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
[13] 항체가, 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 의 중사슬 정상 영역을 포함하는, [5] ∼ [12] 중 어느 하나에 기재된 의약.
[14] 이하의 (a) ∼ (e) 로 이루어지는 군에서 선택되는 중사슬 및 경사슬을 포함하는, [12] 또는 [13] 에 기재된 의약 조성물 ;
(a) 서열 번호 52 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 36 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬,
(b) 서열 번호 56 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 40 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬,
(c) 서열 번호 52 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 44 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬,
(d) 서열 번호 56 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 48 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬, 및,
(e) 서열 번호 60 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 44 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬.
[15] 항체가, [6] ∼ [10] 및 [14] 중 어느 하나에 기재된 항체와, CLDN6 및/또는 CLDN9 에의 결합에 있어서 경합하거나, 또는, [6] ∼ [10] 및 [14] 중 어느 하나에 기재된 항체가 인식하는 CLDN6 및/또는 CLDN9 상의 부위에 결합하는, [5] 에 기재된 의약 조성물.
[16] 항체가, HER2 에 특이적으로 결합하는 [1] ∼ [4] 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
[17] 항체 의존성 세포 상해 (ADCC) 활성 및/또는 보체 (補體) 의존성 세포 상해 (CDC) 활성을 갖는 [16] 에 기재된 의약 조성물.
[18] 항체의 중사슬 정상 영역이 인간 IgG1 의 중사슬 정상 영역이고, ADCC 및/또는 CDC 활성의 저감을 초래하는 변이를 포함하는, [16] 에 기재된 의약 조성물.
[19] 항체의 중사슬 정상 영역이 인간 IgG1 의 중사슬 정상 영역이고, 그 중사슬 정상 영역에 있어서 EU Index 에 의해서 나타내어지는 234 위치 및 235 위치의 류신이 알라닌으로 치환되어 있는, [18] 에 기재된 의약 조성물.
[20] 서열 번호 65 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 64 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는 항체인, [16] 또는 [17] 에 기재된 의약 조성물.
[21] 서열 번호 75 의 아미노산 번호 20 ∼ 139 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 73 의 아미노산 번호 21 ∼ 127 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 항체인, [16], [18] 및 [19] 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
[22] 서열 번호 75 의 아미노산 번호 20 ∼ 469 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 73 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하는 항체인, [16], [18], [19] 및 [21] 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
[23] 서열 번호 77 의 아미노산 번호 20 ∼ 469 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 76 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하는 항체인, [16], [18], [19] 및 [21] 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
[24] 항체가, N-결합형 당사슬 부가, O-결합형 당사슬 부가, N 말단의 프로세싱, C 말단의 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성화, 메티오닌의 산화, N 말단에 있어서의 메티오닌 잔기의 부가, 프롤린 잔기의 아미드화, 및 중사슬의 카르복실 말단에 있어서의 1 개 또는 2 개의 아미노산 잔기의 결실로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 수식을 포함하는, [5] ∼ [23] 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
[25] 항체의 중사슬의 카르복실 말단에 있어서 1 개 또는 수 개의 아미노산 잔기가 결실되어 있는, [24] 에 기재된 의약 조성물.
[26] 항체의 2 개의 중사슬의 쌍방의 카르복실 말단에 있어서 1 개의 아미노산 잔기가 결실되어 있는, [24] 또는 [25] 에 기재된 의약 조성물.
[27] 항체의 중사슬의 카르복실 말단의 프롤린 잔기가 추가로 아미드화되어 있는, [24] ∼ [26] 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
[28] N297 당사슬이, N297-(Fuc)MSG1 인, [1] ∼ [27] 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
[29] m1 이, 1 의 정수인, [1] ∼ [28] 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
[30] 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 콘주게이트에 있어서의 항체 1 분자당 평균 약물 결합수가, 1 ∼ 3 또는 3 ∼ 5 인, [1] ∼ [29] 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
[31] PARP 저해제가, 올라파립, 루카파립, 니라파립, 혹은 탈라조파립, 또는 그것들의 약리상 허용되는 염인, [1] ∼ [30] 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
[32] 항체-약물 콘주게이트와, PARP 저해제가, 각각 다른 제제에 유효 성분으로서 함유되고, 동시에 또는 상이한 시간에 투여되는 것을 특징으로 하는 [1] ∼ [31] 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
[33] 폐암 (비소세포 폐암, 소세포 폐암 등), 신암, 요로 상피암, 대장암, 전립선암, 다형 신경 교아종, 난소암 (표층 상피성 종양, 간질성 종양, 배세포 종양 등), 췌암, 유암, 멜라노마, 간암, 방광암, 위암, 식도암, 자궁체암, 정소암 (세미노마, 비세미노마), 자궁경암, 태반 융모암, 뇌종양, 두경부암 그리고 그것들의 전이성 형태로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 암의 치료를 위한, [1] ∼ [32] 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
[34] 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 콘주게이트와, PARP 저해제가, 조합되어 투여되는 것을 특징으로 하는 암의 치료 방법으로서,
그 콘주게이트가, 다음 식 ;
[화학식 9]
Figure pct00009
[화학식 10]
Figure pct00010
[화학식 11]
Figure pct00011
, 또는,
[화학식 12]
Figure pct00012
로 나타내고,
상기에서 나타내는 각각의 구조식에 있어서, m1 은 1 또는 2 의 정수이고,
Ab 는, 항체 또는 그 항체의 기능성 단편이며,
N297 당사슬은 다음 식으로 나타내는 구조를 갖는 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 혹은 그것들의 혼합물, 또는 N297-(Fuc)SG 이고,
[화학식 13]
Figure pct00013
[화학식 14]
Figure pct00014
[화학식 15]
Figure pct00015
식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
N297 당사슬 중의 L(PEG) 는, *-(CH2CH2-O)3-CH2CH2-NH- 인 것을 나타내며,
여기에서, 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 또는/및 1-6 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합을 통하여 결합하고 있고, 좌단의 애스터리스크 * 는, 상기 식 중의 트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내는 치료 방법.
[35] 항체가, 종양 세포에 발현하고 있는 항원에 결합하여, 종양 세포 내에 흡수되어 내재화하는 것을 특징으로 하는, [34] 에 기재된 치료 방법.
[36] 항체가, 항종양 효과를 갖는 것을 특징으로 하는, [34] 또는 [35] 에 기재된 치료 방법.
[37] 항체가, 항 CLDN6 항체, 항 CLDN9 항체, 항 CLDN6/CLDN9 항체, 항 HER2 항체, 항 HER3 항체, 항 DLL3 항체, 항 FAP 항체, 항 CDH11 항체, 항 A33 항체, 항 CanAg 항체, 항 CD19 항체, 항 CD20 항체, 항 CD22 항체, 항 CD25 항체, 항 CD30 항체, 항 CD33 항체, 항 CD37 항체, 항 CD56 항체, 항 CD70 항체, 항 CD98 항체, 항 B7-H3 항체, 항 TROP2 항체, 항 CEA 항체, 항 Cripto 항체, 항 EphA2 항체, 항 FGFR2 항체, 항 G250 항체, 항 MUC1 항체, 항 GPNMB 항체, 항 Integrin 항체, 항체 PSMA 항체, 항 Tenascin-C 항체, 항 SLC44A4 항체, 항 Mesothelin 항체, 항 EGFR 항체, 항 5T4 항체, 항 LRRC15 항체, 항 DR5 항체, 항 CDH3 항체, 항 PDPN 항체, 또는 항 CD123 항체인, [34] ∼ [36] 중 어느 하나에 기재된 치료 방법.
[38] 항체가, CLDN6 및/또는 CLDN9 에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, [34] ∼ [37] 중 어느 하나에 기재된 치료 방법.
[39] 항체가, 이하의 (a) 또는 (b) 에 기재된 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 을 포함하는 중사슬, 그리고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 을 포함하는 경사슬을 포함하여 이루어지는, [38] 에 기재된 치료 방법 ;
(a) 서열 번호 9 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 10 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 11 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 그리고, 서열 번호 5 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 6 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 7 에 기재된 아미노산 서열 또는 그 아미노산 서열에 있어서 1 또는 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 또는,
(b) 서열 번호 15 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 16 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 17 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 그리고, 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3.
[40] 항체가, 이하의 (a) 또는 (b) 에 기재된 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 을 포함하는 중사슬, 그리고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 을 포함하는 경사슬을 포함하여 이루어지는, [39] 에 기재된 치료 방법 ;
(a) 서열 번호 9 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 10 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 11 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 및, 서열 번호 5 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 6 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 7 에 기재된 아미노산 서열 또는 서열 번호 8 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 또는,
(b) 서열 번호 15 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 16 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 17 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 및, 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3.
[41] 항체가, 이하의 (a) 또는 (b) 에 기재된 중사슬 가변 영역, 및, 경사슬 가변 영역을 포함하는, [38] ∼ [40] 중 어느 하나에 기재된 치료 방법 ;
(a) 항체가, 서열 번호 21 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및, 서열 번호 19 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역, 또는,
(b) 항체가, 서열 번호 25 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및, 서열 번호 23 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역.
[42] 이하의 (a) ∼ (e) 로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및 (f) ∼ (k) 로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는, [38] ∼ [41] 중 어느 하나에 기재된 치료 방법 ;
(a) 서열 번호 54 에 기재된 아미노산 서열,
(b) 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열,
(c) 서열 번호 62 에 기재된 아미노산 서열,
(d) (a) ∼ (c) 의 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 대해서 적어도 95 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열,
(e) (a) ∼ (c) 의 서열에 있어서의 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열,
(f) 서열 번호 38 에 기재된 아미노산 서열,
(g) 서열 번호 42 에 기재된 아미노산 서열,
(h) 서열 번호 46 에 기재된 아미노산 서열,
(i) 서열 번호 50 에 기재된 아미노산 서열,
(j) (f) ∼ (i) 의 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 대해서 적어도 95 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 및,
(k) (f) ∼ (i) 의 서열에 있어서의 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열.
[43] 항체가, 이하의 (a) ∼ (e) 로 이루어지는 군에서 선택되는 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역을 포함하는, [42] 에 기재된 치료 방법 ;
(a) 서열 번호 54 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 38 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
(b) 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 42 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
(c) 서열 번호 54 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 46 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
(d) 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 50 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역으로 이루어지는 경사슬 가변 영역, 및,
(e) 서열 번호 62 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 46 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역.
[44] 항체가, 키메라 항체인, [38] ∼ [43] 중 어느 하나에 기재된 치료 방법.
[45] 항체가, 인간화 항체인, [38] ∼ [43] 중 어느 하나에 기재된 치료 방법.
[46] 항체가, 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 의 중사슬 정상 영역을 포함하는, [38] ∼ [45] 중 어느 하나에 기재된 치료 방법.
[47] 이하의 (a) ∼ (e) 로 이루어지는 군에서 선택되는 중사슬 및 경사슬을 포함하는, [45] 또는 [46] 에 기재된 치료 방법 ;
(a) 서열 번호 52 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 36 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬,
(b) 서열 번호 56 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 40 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬,
(c) 서열 번호 52 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 44 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬,
(d) 서열 번호 56 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 48 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬, 및,
(e) 서열 번호 60 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 44 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬.
[48] 항체가, [39] ∼ [43] 및 [47] 중 어느 하나에 기재된 항체와, CLDN6 및/또는 CLDN9 에의 결합에 있어서 경합하거나, 또는, [39] ∼ [43] 및 [47] 중 어느 하나에 기재된 항체가 인식하는 CLDN6 및/또는 CLDN9 상의 부위에 결합하는, [38] 에 기재된 치료 방법.
[49] 항체가, HER2 에 특이적으로 결합하는 [34] ∼ [37] 중 어느 하나에 기재된 치료 방법.
[50] 항체 의존성 세포 상해 (ADCC) 활성 및/또는 보체 의존성 세포 상해 (CDC) 활성을 갖는 [49] 에 기재된 치료 방법.
[51] 항체의 중사슬 정상 영역이 인간 IgG1 의 중사슬 정상 영역이고, ADCC 및/또는 CDC 활성의 저감을 초래하는 변이를 포함하는, [49] 에 기재된 치료 방법.
[52] 항체의 중사슬 정상 영역이 인간 IgG1 의 중사슬 정상 영역이고, 그 중사슬 정상 영역에 있어서 EU Index 에 의해서 나타내어지는 234 위치 및 235 위치의 류신이 알라닌으로 치환되어 있는, [51] 에 기재된 치료 방법.
[53] 항체가, 서열 번호 65 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 64 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는, [49] 또는 [50] 에 기재된 치료 방법.
[54] 항체가, 서열 번호 75 의 아미노산 번호 20 ∼ 139 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 73 의 아미노산 번호 21 ∼ 127 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하여 이루어지는, [49], [51] 및 [52] 중 어느 하나에 기재된 치료 방법.
[55] 항체가, 서열 번호 75 의 아미노산 번호 20 ∼ 469 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 73 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는, [49], [51], [52] 및 [54] 중 어느 하나에 기재된 치료 방법.
[56] 항체가, 서열 번호 77 의 아미노산 번호 20 ∼ 469 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 76 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는, [49], [51], [52] 및 [54] 중 어느 하나에 기재된 치료 방법.
[57] 항체가, N-결합형 당사슬 부가, O-결합형 당사슬 부가, N 말단의 프로세싱, C 말단의 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성화, 메티오닌의 산화, N 말단에 있어서의 메티오닌 잔기의 부가, 프롤린 잔기의 아미드화, 및 중사슬의 카르복실 말단에 있어서의 1 개 또는 2 개의 아미노산 잔기의 결실로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 수식을 포함하는 [38] ∼ [56] 중 어느 하나에 기재된 치료 방법.
[58] 항체의 중사슬의 카르복실 말단에 있어서 1 개 또는 수 개의 아미노산 잔기가 결실되어 있는, [57] 에 기재된 치료 방법.
[59] 항체의 2 개의 중사슬의 쌍방의 카르복실 말단에 있어서 1 개의 아미노산 잔기가 결실되어 있는, [57] 또는 [58] 에 기재된 치료 방법.
[60] 항체의 중사슬의 카르복실 말단의 프롤린 잔기가 추가로 아미드화되어 있는, [57] ∼ [59] 중 어느 하나에 기재된 치료 방법.
[61] N297 당사슬이, N297-(Fuc)MSG1 인, [34] ∼ [60] 중 어느 하나에 기재된 치료 방법.
[62] m1 이, 1 의 정수인 [34] ∼ [61] 중 어느 하나에 기재된 치료 방법.
[63] 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 콘주게이트에 있어서의 항체 1 분자당 평균 약물 결합수가, 1 ∼ 3 또는 3 ∼ 5 인, [34] ∼ [62] 중 어느 하나에 기재된 치료 방법.
[64] PARP 저해제가, 올라파립, 루카파립, 니라파립, 혹은 탈라조파립, 또는 그것들의 약리상 허용되는 염인, [34] ∼ [63] 중 어느 하나에 기재된 치료 방법.
[65] 폐암 (비소세포 폐암, 소세포 폐암 등), 신암, 요로 상피암, 대장암, 전립선암, 다형 신경 교아종, 난소암 (표층 상피성 종양, 간질성 종양, 배세포 종양 등), 췌암, 유암, 멜라노마, 간암, 방광암, 위암, 식도암, 자궁체암, 정소암 (세미노마, 비세미노마), 자궁경암, 태반 융모암, 뇌종양, 두경부암 그리고 그것들의 전이성 형태로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 암의 치료를 위한, [34] ∼ [64] 중 어느 하나에 기재된 치료 방법.
[66] PARP 저해제와 병용하기 위한, [1] 에 기재된 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 콘주게이트를 포함하는 의약 조성물.
[67] PARP 저해제를 함유하고, [1] 에 기재된 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 콘주게이트와 병용함으로써, 그 콘주게이트의 작용을 상승시키는 의약 조성물.
[68] [1] 에 기재된 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 콘주게이트와 병용하기 위한, PARP 저해제를 함유하는 의약 조성물.
[69] [1] 에 기재된 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 콘주게이트를 포함하고, PARP 저해제와 병용함으로써, PARP 저해제의 작용을 상승시키는 의약 조성물.
[70] [1] 에 기재된 의약 조성물로서,
그 피롤로벤조디아제핀 유도체가 DNA 의 마이너 그루브에 있어서 크로스 링크를 형성하지 않는 의약 조성물.
[71] [1] 에 기재된 의약 조성물로서,
암이 PARP 저해제에 비감수성인 의약 조성물.
[72] [1] 에 기재된 의약 조성물로서,
암이, 상동적 재조합 (HR) 의존적 DNA 2 본쇄 파괴 (DSB) 수복 경로에 비의존적인 의약 조성물.
[73] [1] 에 기재된 항체-약물 콘주게이트와, PARP 저해제가, 각각 다른 제제에 유효 성분으로서 함유되고, 동시에 또는 상이한 시간에 투여되는 것을 특징으로 하는, [34] ∼ [64] 중 어느 하나에 기재된 치료 방법.
본 발명은 암 치료 방법, 및/또는 항암제로서 유용하다.
도 1 은, 인간 췌암 세포주 CFPAC-1 세포를 피하 이식한 마우스에 있어서의 항 HER2 항체-약물 콘주게이트 ADC2, 및 탈라조파립 각각의 단제 투여군, 그리고, HER2 항체-약물 콘주게이트 ADC2 와 탈라조파립의 병용 투여군의 종양 증식 억제 효과를 나타낸 도면이다.
도 2 는, 인간 유암주 JIMT-1 세포를 피하 이식한 마우스에 있어서의 항 HER2 항체-약물 콘주게이트 ADC2, 및 올라파립 각각의 단제 투여군, 그리고, HER2 항체-약물 콘주게이트 ADC2 와 올라파립의 병용 투여군의 종양 증식 억제 효과를 나타낸 도면이다.
도 3 은, 인간 유암주 JIMT-1 세포를 피하 이식한 마우스에 있어서의 항 HER2 항체-약물 콘주게이트 ADC2, 및 탈라조파립 각각의 단제 투여군, 그리고, 항 HER2 항체-약물 콘주게이트 ADC2 와 탈라조파립의 병용 투여군의 종양 증식 억제 효과를 나타낸 도면이다.
도 4 는, 인간 인두암 세포주 FaDu 를 피하 이식한 마우스에 있어서의 항 TROP2 항체-약물 콘주게이트 ADC3, 및 올라파립 각각의 단제 투여군, 그리고, 항 TROP2 항체-약물 콘주게이트 ADC3 과 올라파립의 병용 투여군의 종양 증식 억제 효과를 나타낸 도면이다.
도 5 는, 인간 인두암 세포주 FaDu 를 피하 이식한 마우스에 있어서의 항 TROP2 항체-약물 콘주게이트 ADC3, 및 탈라조파립 각각의 단제 투여군, 그리고, 항 TROP2 항체-약물 콘주게이트 ADC3 과 탈라조파립의 병용 투여군의 종양 증식 억제 효과를 나타낸 도면이다.
도 6 은, 인간 CLDN6 의 전체 길이 아미노산 서열 (서열 번호 1) 및 전체 길이 cDNA 의 염기 서열 (서열 번호 2) 을 나타낸다.
도 7 은, 인간 CLDN9 의 전체 길이 아미노산 서열 (서열 번호 3) 및 전체 길이 cDNA 의 염기 서열 (서열 번호 4) 을 나타낸다.
도 8 은, B1 항체 경사슬의 CDRL1 ∼ 3 의 아미노산 서열 (서열 번호 5 ∼ 7) 을 나타낸다.
도 9 는, 인간화 B1 항체 경사슬 L4 의 CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 8) 을 나타낸다.
도 10 은, B1 항체 중사슬의 CDRH1 ∼ 3 의 아미노산 서열 (서열 번호 9 ∼ 11) 을 나타낸다.
도 11 은, C7 항체 경사슬의 CDRL1 ∼ 3 의 아미노산 서열 (서열 번호 12 ∼ 14) 을 나타낸다.
도 12 는, C7 항체 중사슬의 CDRH1 ∼ 3 의 아미노산 서열 (서열 번호 15 ∼ 17) 을 나타낸다.
도 13 은, B1 항체 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 18) 및 B1 항체 경사슬의 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 19) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 14 는, B1 항체 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 20) 및 B1 항체 중사슬의 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 21) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 15 는, C7 항체 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 22) 및 C7 항체 경사슬의 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 23) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 16 은, C7 항체 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 24) 및 C7 항체 중사슬의 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 25) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 17 은, chB1 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 28) 및 chB1 경사슬의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편 (서열 번호 29) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 18 은, chB1 경사슬의 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 30) 및 chB1 경사슬 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 31) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 19 는, chB1 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 32) 및 chB1 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 33) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 20 은, chB1 중사슬의 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 34) 및 chB1 중사슬의 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 35) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 21 은, 인간화 항체 경사슬 hL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 36) 및 인간화 항체 경사슬 hL1 을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 37) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 22 는, 인간화 항체 경사슬 hL1 의 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 38) 및 인간화 항체 경사슬 hL1 의 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 39) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 23 은, 인간화 항체 경사슬 hL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 40) 및 인간화 항체 경사슬 hL2 를 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 41) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 24 는, 인간화 항체 경사슬 hL2 의 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 42) 및 인간화 항체 경사슬 hL2 의 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 43) 을 나타낸다.
도 25 는, 인간화 항체 경사슬 hL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 44) 및 인간화 항체 경사슬 hL3 를 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 45) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 26 은, 인간화 항체 경사슬 hL3 의 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 46) 및 인간화 항체 경사슬 hL3 의 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 47) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 27 은, 인간화 항체 경사슬 hL4 의 아미노산 서열 (서열 번호 48) 및 인간화 항체 경사슬 hL4 를 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 49) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 28 은, 인간화 항체 경사슬 hL4 의 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 50) 및 인간화 항체 경사슬 hL4 의 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 51) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 29 는, 인간화 항체 중사슬 hH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 52) 및 인간화 항체 중사슬 hH1 를 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 53) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 30 은, 인간화 항체 중사슬 hH1 의 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 54) 및 인간화 항체 중사슬 hH1 의 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 55) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 31 은, 인간화 항체 중사슬 hH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 56) 및 인간화 항체 중사슬 hH2 를 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 57) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 32 는, 인간화 항체 중사슬 hH2 의 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 58) 및 인간화 항체 중사슬 hH2 의 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 59) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 33 은, 인간화 항체 중사슬 hH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 60) 및 인간화 항체 중사슬 hH3 을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 61) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 34 는, 인간화 항체 중사슬 hH3 의 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 62) 및 인간화 항체 중사슬 hH3 의 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 63) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 35 는, B1 항체 및 C7 항체의 플로 사이토메트리에 의한 인간 CLDN6 및 패밀리 분자 CLDN3, CLDN4, CLDN9 에 대한 결합능을 나타낸다.
도 36 은, B1 항체 및 C7 항체의 Mab-ZAP 에 의한 항체 내재화 활성능을 나타낸다.
도 37 은, 인간화 항 CLDN6 항체 H1L1, H2L2, H1L3, H2L4, 및 H3L3 의 플로 사이토메트리에 의한 CLDN6 및 패밀리 분자에 대한 결합능을 나타낸다.
도 38 은, 트라스투주맙 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 64) 및 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 65) 을 나타낸다.
도 39 는, 트라스투주맙 변이체의 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 73) 및 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 75) 을 나타낸다.
도 40 은, 인간 키메라화 항 CLDN6 항체 chB1 의 중사슬인 chB1_H, 인간화 항체 중사슬인 hH1, hH2 및 hH3 의 아미노산 서열의 비교를 나타내는 도면. 「·」은 chB1_H 와 동일한 아미노산 잔기를 나타내고, 아미노산 잔기가 기재되어 있는 지점은 치환된 아미노산 잔기를 나타낸다.
도 41 은, 인간 키메라화 항 CLDN6 항체 chB1 의 경사슬인 chB1_L, 인간화 항체 경사슬인 hL1, hL2, hL3 및 hL4 의 아미노산 서열의 비교를 나타내는 도면. 「·」은 chB1_L 과 동일한 아미노산 잔기를 나타내고, 아미노산 잔기가 기재되어 있는 지점은 치환된 아미노산 잔기를 나타낸다.
도 42 는, 인간 난소암 세포주 OV-90 을 피하 이식한 마우스에 있어서의 항 CLDN6 항체-약물 콘주게이트 ADC1, 및 니라파립 각각의 단제 투여군, 그리고, 항 CLDN6 항체-약물 콘주게이트 ADC1 과 니라파립의 병용 투여군의 종양 증식 억제 효과를 나타낸 도면이다.
1. 항체-약물 콘주게이트
본 발명에 있어서 사용되는 항체-약물 콘주게이트는, 종양 세포에 발현하고 있는 항원을 인식 또는 당해 항원에 결합할 수 있는 항체에 링커 부분을 통하여 항종양성 화합물을 결합시킨 항종양성 약물이다.
본 발명의 콘주게이트는, 바람직하게는 다음 식 ;
[화학식 16]
Figure pct00016
으로 나타내고,
m1 은 1 또는 2 의 정수 (바람직하게는 1) 이고, D 는 약물, L 은 N297 당사슬과 D 를 연결하는 링커, Ab 는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, N297 당사슬은 상기 항체의 Asn297 의 측사슬에 결합하는 당사슬을 나타낸다. N297 당사슬은 리모델링된 당사슬이어도 된다.
＜약물＞
본 발명의 약물 D 는 항종양성 화합물인 것이 바람직하다. 본 항종양성 화합물은, 본 발명의 항체-약물 콘주게이트의 링커의 일부 또는 전부가 종양 세포 내에서 절단되고 항종양성 화합물 부분이 유리되어 항종양 효과가 발현된다. 본 발명의 약물 D 로서, 다음 식 ;
[화학식 17]
Figure pct00017
으로 나타내는 구조를 포함하는 PBD 유도체를 들 수 있다. 본 발명의 약물 D 로서, DNA 의 마이너 그루브에 있어서 크로스 링크를 형성하지 않는 PBD 유도체를 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다.
본 발명의 항체-약물 콘주게이트에 있어서의 약물 즉 PBD 유도체는, 바람직하게는 이하의 군에서 선택되는 어느 하나이고,
[화학식 18]
Figure pct00018
여기에서, 식 중, 애스터리스크 * 는 L 과 결합하고 있는 것을 나타낸다.
본 발명의 PBD 유도체는 하기 부분 구조 I(a) 또는 I(b) 로 나타내는 바와 같이, 11' 위치에 부제 탄소가 존재하기 때문에, 광학 이성체가 존재한다.
[화학식 19]
Figure pct00019
따라서, 상기한 본 발명의 PBD 유도체는, 각각, 광학 이성체 및 광학 이성체의 임의의 비율로의 혼합물을 포함한다. PBD 유도체의 11' 위치의 절대 입체 배치는 결정성의 생성물 또는 중간체 혹은 그것들의 유도체의 X 선 결정 구조 해석이나 Mosher 법 등의 NMR 에 의해서 결정할 수 있다. 그 때, 입체 배치가 이미 알려진 부제 중심을 갖는 시약으로 유도체화된 결정성의 생성물 또는 중간체를 사용하여 절대 입체 배치를 결정해도 된다. 입체 이성체는, 합성된 본 발명에 관련된 화합물을 원하는 바에 따라서 통상적인 광학 분할법 또는 분리법을 이용하여 단리함으로써 얻을 수 있다.
본 발명의 항체-약물 콘주게이트, 그 유리 약물 혹은 그 제조 중간체에는, 입체 이성체 혹은 부제 탄소 원자에서 유래하는 광학 이성체, 기하 이성체, 호변 이성체 또는 d 체, l 체, 아트로프 이성체 등의 광학 이성체가 존재하기도 하지만, 이들 이성체, 광학 이성체 및 이것들의 혼합물 모두 본 발명에 포함된다.
본 발명의 PBD 유도체의 부분 구조로는, 상기 I(a) 가 바람직하다. 바람직하게는, 이하의 군에서 선택되는 어느 하나이다.
[화학식 20]
Figure pct00020
여기에서, 식 중, 애스터리스크 * 는 L 과 결합하고 있는 것을 나타낸다.
＜링커 구조＞
본 발명의 링커 L 은, N297 당사슬과 D 를 연결하는 링커이다.
당해 링커 L 은, 다음 식으로 나타낸다.
-Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-*
애스터리스크 * 는, 약물 D 의 N10' 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고, Lb 는, La 와 N297 당사슬 또는 리모델링된 N297 당사슬을 결합하는 스페이서를 나타낸다.
B 는, 페닐기 또는 헤테로아릴기를 나타내고, 바람직하게는 1,4-페닐기, 2,5-피리딜기, 3,6-피리딜기, 2,5-피리미딜기, 2,5-티에닐기이고, 보다 바람직하게는 1,4-페닐기이다.
Lp 는, 생체 내 또는 표적 세포에 있어서 절단 가능한 아미노산 서열로 이루어지는 링커를 나타낸다. Lp 는, 예를 들어, 에스테라아제나 펩티다아제 등의 효소의 작용에 의해서 절단된다.
Lp 는, 2 내지 7 개 (바람직하게는 2 내지 4 개) 의 아미노산으로 구성되는 펩티드 잔기이다. 즉, 2 내지 7 개의 아미노산이 펩티드 결합한 올리고펩티드의 잔기에 의해서 구성된다.
Lp 는, N 말단에 있어서 Lb-La- 의 La 의 카르보닐기에 결합하고, C 말단에 있어서 링커의 -NH-B-CH2-O(C=O)- 부분의 아미노기 (-NH-) 와 아미드 결합을 형성한다. 상기 에스테라아제 등의 효소에 의해서, Lp 의 C 말단과 -NH- 간의 결합이 절단된다.
Lp 를 구성하는 아미노산은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, L- 또는 D-아미노산이고, 바람직하게는 L-아미노산이다. 또, α-아미노산 외에, β-알라닌, ε-아미노카프로산, γ-아미노부티르산 등의 구조의 아미노산이어도 되고, 나아가서는 예를 들어 N-메틸화된 아미노산 등의 비천연형의 아미노산이어도 된다.
Lp 의 아미노산 서열은 특별히 한정되지 않지만, 구성하는 아미노산으로서, 글리신 (Gly ; G), 발린 (Val ; V), 알라닌 (Ala ; A), 페닐알라닌 (Phe ; F), 글루탐산 (Glu ; E), 이소류신 (Ile ;I), 프롤린 (Pro ; P), 시트룰린 (Cit), 류신 (Leu ; L), 세린 (Ser ; S), 리신 (Lys ; K) 및 아스파르트산 (Asp ; D) 등을 들 수 있다. 이 중에서 바람직하게는 글리신 (Gly ; G), 발린 (Val ; V), 알라닌 (Ala ; A), 시트룰린 (Cit) 이다.
이들 아미노산은 중복되어도 되고, 임의로 선택된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 또, 아미노산의 종류에 따라서, 약물 유리의 패턴을 컨트롤할 수 있다.
링커 Lp 의 구체예로서,
-GGVA-, -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG-, -GGPI-, -GGVCit-, -GGVK-, -GG(D-)PI-, -GGPL-, -EGGVA, -PI-, -GGF-, -DGGF-, (D-)D-GGF-, -EGGF-, -SGGF-, -KGGF-, -DGGFG-, -GGFGG-, -DDGGFG-, -KDGGFG-, -GGFGGGF-
를 들 수 있다.
여기에서, 상기한「(D-)V」는 D-발린,「(D-)P」는 D-프롤린,「(D-)D」는 D-아스파르트산을 의미한다.
링커 Lp 는, 바람직하게는 이하의 것을 들 수 있다.
-GGVA-, -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG-, -GGPI-, -GGVCit-, -GGVK-, -GG(D-)PI-, -GGPL-
링커 Lp 는, 보다 바람직하게는 이하의 것을 들 수 있다.
-GGVA-, -GGVCit-, -VA-
La 는, 이하의 군에서 선택되는 어느 하나를 나타낸다.
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2)n3-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n3-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)n3-CH2CH2-C(=O)-, -(CH2)n4-O-C(=O)-
여기에서, 식 중, n2 는 1 ∼ 3 의 정수 (바람직하게는 1 또는 2), n3 은 1 ∼ 5 의 정수 (바람직하게는 2 ∼ 4 의 정수, 보다 바람직하게는 2 또는 4), n4 는 0 ∼ 2 의 정수 (바람직하게는 0 또는 1) 을 나타낸다.
La 는, 바람직하게는 이하의 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-,
-CH2-OC(=O)-, 및, -OC(=O)-
La 는, 보다 바람직하게는 -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-, 또는, -C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)- 이다.
Lb 의 스페이서는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 다음 식으로 나타내는 스페이서를 들 수 있다.
[화학식 21]
Figure pct00021
[화학식 22]
Figure pct00022
[화학식 23]
Figure pct00023
상기에서 나타내는 Lb 의 각각의 구조식에 있어서, 애스터리스크 * 는 La 의 좌단의 -(C=O), 또는 -(CH2)n4 와 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은 Ab 의 N297 당사슬 또는 리모델링된 N297 당사슬과 결합하고 있는 것을 나타낸다.
상기에서 나타내는 Lb (Lb-1, Lb-2 또는 Lb-3) 의 각각의 구조식에 있어서, 아지드기와 DBCO 의 click reaction 으로 형성되는 트리아졸 고리 부위는, 기하 이성 구조를 갖고, 하나의 Lb 중에, 이들 2 종류의 구조 중 어느 일방, 또는, 그것들의 혼합물로서 존재한다. 즉, 본 발명의 항체-약물 콘주게이트 1 분자 중에는 2 또는 4 개 (m1 은 1 또는 2) 의『-L-D』가 존재하고, 2 또는 4 개 각각의『-L-D』에 있어서의 L 중의 각각의 Lb (Lb-1, Lb-2 또는 Lb-3) 는, 이들 2 종류의 구조 중 어느 일방, 또는, 그 양방이 혼재하고 있다.
L 은, 바람직하게는, -Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-* 로 나타내고
B 는, 1,4-페닐기이며,
Lp 는, 이하의 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
-GGVA-, -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG-, -GGPI-, -GGVCit-, -GGVK-, -GGPL-
La 는, 이하의 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-, -CH2-OC(=O)-, -OC(=O)-
Lb 는, 상기에서 나타내는 Lb 중 어느 구조식을 나타낸다.
L 은, 보다 바람직하게는, 이하의 군에서 선택되는 어느 하나이다.
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GG-(D-)VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVK-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPL-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z3-CH2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-
여기에서, Z1 은, 상기 Lb 의 이하에서 나타내는 구조식 ;
[화학식 24]
Figure pct00024
을 나타내고, Z2 는, 상기 Lb 의 이하에서 나타내는 구조식 :
[화학식 25]
Figure pct00025
을 나타내고, Z3 은 상기 Lb 의 이하에서 나타내는 구조식 :
[화학식 26]
Figure pct00026
을 나타내고, B 는 1,4-페닐기이다.
L 은, 가장 바람직하게는 이하 중 어느 것이다.
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-, 및
-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-
여기에서, B 는 1,4-페닐기이고,
Z1 은 상기 Lb 의 이하에서 나타내는 구조식 :
[화학식 27]
Figure pct00027
이다.
＜유리 약물＞
본 발명의 항체-약물 콘주게이트의 유리 약물은, 이하의 군에서 선택되는 하나이다.
[화학식 28]
Figure pct00028
본 발명의 유리 약물은, 본 발명의 항체-약물 콘주게이트가 종양 세포 내로 이행한 후, 항체-약물 콘주게이트에 있어서의 링커 L 부분이 절단되어 생성된다. 당해 유리 약물은 항종양 세포 효과가 확인되었다.
＜항체＞
본 발명에 있어서,「암」과「종양」은 동일한 의미로 사용하고 있다.
본 발명에 있어서,「유전자」란, 단백질의 아미노산을 코드하는 뉴클레오티드 서열이 포함되는 뉴클레오티드 혹은 뉴클레오티드 서열, 또는 그 상보 사슬을 의미하고, 예를 들어, 단백질의 아미노산을 코드하는 뉴클레오티드 서열이 포함되는 뉴클레오티드 서열 또는 그 상보 사슬인 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, DNA, mRNA, cDNA, RNA 등은「유전자」의 의미에 포함된다. 「CLDN6 유전자」로는, 예를 들어, CLDN6 단백질의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열이 포함되는 DNA, mRNA, cDNA, cRNA 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서,「뉴클레오티드」,「폴리뉴클레오티드」또는「뉴클레오티드 서열」과「핵산」은 동일한 의미이고, 예를 들어, DNA, RNA, 프로브, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 프라이머 등도「뉴클레오티드」또는「뉴클레오티드 서열」의 의미에 포함된다.
본 발명에 있어서는,「폴리펩티드」,「펩티드」,「단백질」은 구별하지 않고 사용하고 있다.
본 발명에 있어서,「CLDN6」는, CLDN6 단백질과 동일한 의미로 사용하고 있다.
본 발명에 있어서,「세포」에는, 동물 개체 내의 세포, 배양 세포도 포함하고 있다.
본 발명에 있어서,「세포 상해 활성」이란, 어떠한 형태로, 세포에 병리적인 변화를 일으키는 것을 말하고, 직접적인 외상뿐만 아니라, DNA 의 절단이나 염기의 2 량체의 형성, 염색체의 절단, 세포 분열 장치의 손상, 각종 효소 활성의 저하 등 일체의 세포의 구조나 기능상의 손상을 일으키는 것을 말한다.
본 발명에 있어서,「항체의 기능성 단편」이란,「항체의 항원 결합 단편」이라고도 불리고, 항원과의 결합 활성을 갖는 항체의 부분 단편을 의미하며, Fab, F(ab')2, Fv, scFv, diabody, 선상 항체 및 항체 단편으로 형성된 다특이성 항체 등을 포함한다. 또, F(ab')2 를 환원 조건 하에서 처리한 항체의 가변 영역의 1 가의 단편인 Fab' 도 항체의 항원 결합 단편에 포함된다. 단, 항원과의 결합능을 갖고 있는 한, 이들 분자에 한정되지 않는다. 또, 이들 항원 결합 단편에는, 항체 단백질의 전체 길이 분자를 적당한 효소로 처리한 것뿐만 아니라, 유전자 공학적으로 개편된 항체 유전자를 사용하여 적당한 숙주 세포에 있어서 산생된 단백질도 포함된다.
본 발명의 기능성 단편은, IgG 중사슬의 Fc 영역에 있어서 잘 보존된 N 결합형 당사슬에 의한 수식을 수용하는 아스파라긴 (Asn297) 및 그 주변의 아미노산을 유지하며, 또한 항원과의 결합능을 갖고 있는 기능성 단편을 포함한다.
본 발명에 있어서,「에피토프」란, 특정한 항체 (예를 들어, 항 CLDN6 항체) 가 결합하는 항원의 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조 (예를 들어, CLDN6 의 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조) 를 의미한다. 상기한 부분 펩티드 (예를 들어, CLDN6 의 부분 펩티드) 인 에피토프는 면역 어세이법 등 당업자에게는 잘 알려져 있는 방법에 의해서 결정할 수 있다.
본 발명에 있어서의「CDR」이란, 상보성 결정 영역 (CDR : Complementarity determining region) 을 의미한다. 항체 분자의 중사슬 및 경사슬에는 각각 3 개 지점의 CDR 이 있는 것이 알려져 있다. CDR 은, 초가변 영역 (hypervariable region) 이라고도 불리고, 항체의 중사슬 및 경사슬의 가변 영역 내에 있으며, 1 차 구조의 변이성이 특히 높은 부위로서, 중사슬 및 경사슬의 폴리펩티드 사슬의 1 차 구조상에 있어서, 각각 3 개 지점으로 분리되어 있다. 본 명세서 중에 있어서는, 항체의 CDR 에 대해서, 중사슬의 CDR 을 중사슬 아미노산 서열의 아미노 말단측으로부터 CDRH1, CDRH2, CDRH3 으로 표기하고, 경사슬의 CDR 을 경사슬 아미노산 서열의 아미노 말단측으로부터 CDRL1, CDRL2, CDRL3 으로 표기한다. 이들 부위는 입체 구조 상으로 서로 근접하고, 결합하는 항원에 대한 특이성을 결정하고 있다.
본 발명에 있어서,「스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈한다」란, 시판되는 하이브리다이제이션 용액 ExpressHyb Hybridization Solution (클론테크사) 중, 68 ℃ 에서 하이브리다이즈하는 것, 또는 DNA 를 고정시킨 필터를 사용하여 0.7 - 1.0 M 의 NaCl 존재 하 68 ℃ 에서 하이브리다이제이션을 행한 후, 0.1 - 2 배 농도의 SSC 용액 (1 배 농도 SSC 란 150 mM NaCl, 15 mM 시트르산나트륨으로 이루어진다) 을 사용하여, 68 ℃ 에서 세정함으로써 동정할 수 있는 조건 또는 그것과 동등한 조건에서 하이브리다이즈하는 것을 말한다.
본 발명에 있어서,「1 ∼ 수 개」란, 1 ∼ 10 개, 1 ∼ 9 개, 1 ∼ 8 개, 1 ∼ 7 개, 1 ∼ 6 개, 1 ∼ 5 개, 1 ∼ 4 개, 1 ∼ 3 개 또는 1 ∼ 2 개를 의미한다.
본 발명에 있어서, CLDN6 혹은 CLDN6 및 CLDN9 를 인식하거나 또는 결합하는 항체를, 각각「항 CLDN6 항체」,「항 CLDN6/CLDN9 항체」라고 표기하는 경우가 있다. 이러한 항체에는, 키메라화 항체, 인간화 항체, 인간 항체 등이 포함된다. CLDN6 및 CLDN9 를 인식하거나 또는 결합하는 항체를,「항 CLDN6 항체」라고 표기하는 경우가 있다.
본 발명의 항체-약물 콘주게이트에 사용되는 항체는, 면역 글로블린을 의미하고, 항원과 면역 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자이다. 본 발명의 항체로서 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY 의 어느 클래스여도 되지만, IgG 가 바람직하다. 또, 서브 클래스로서 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2 중 어느 것이어도 되지만 IgG1, IgG2, IgG4 가 바람직하다. IgG1 또는 IgG4 를 사용하는 경우에는, 정상 영역의 아미노산 잔기의 일부를 치환함으로써, 이펙터 기능을 조정하는 것이 가능하다 (WO88/07089, WO94/28027, WO94/29351 참조).
또, 본 발명의 항체의 아이소타입으로서 IgG1 을 사용하는 경우에는, 정상 영역의 아미노산 잔기의 일부를 치환함으로써, 이펙터 기능을 조정하는 것이 가능하다. 이펙터 기능을 저감 또는 감약시킨 IgG1 의 변이체로는, IgG1 LALA (IgG1-L234A, L235A), IgG1 LAGA (IgG1-L235A, G237A) 등을 들 수 있고, 바람직하게는 IgG1 LALA 이다. 또한, 상기 L234A, L235A 는 EU index (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol.63, No.1 (May 15, 1969), pp.78-85) 에 의해서 특정되는 234 위치, 235 위치의 류신의 알라닌으로의 치환, G237A 는 EU index 에 의해서 특정되는 237 위치의 글리신의 알라닌으로의 치환을 나타낸다.
본 발명의 항체는, 바람직하게는 종양 세포를 표적으로 할 수 있는 항체이다.
본 발명의 항체-약물 콘주게이트는 항종양 효과를 발휘하는 화합물을 결합시켜 놓았기 때문에, 항체 자체가 항종양 효과를 갖는 것은 바람직하지만, 필수는 아니다. 항종양성 화합물의 세포 상해성을 종양 세포에 있어서 특이적·선택적으로 발휘시키는 목적에서는, 항체 또는 항체-약물 콘주게이트가 내재화하여 종양 세포 내로 이행하는 성질을 갖는 것이 중요하고, 바람직하다. 항종양 효과의 발휘면에서는 항체 또는 항체-약물 콘주게이트가 내재화하여 종양 세포 내로 이행하는 성질을 갖는 것이, 약물에 의해서 종양 세포를 특이적·선택적으로 상해를 주는 점에서 중요하고, 바람직하다. 항체의 항종양 활성은, 종양 세포에 대한 세포 상해 활성, 항세포 효과를 말한다. 공지된 in vitro 또는 In vivo 의 평가계를 사용하여, 항종양 활성을 확인할 수 있다. 항체의 내재화능은 공지된 평가계로 측정할 수 있다.
이와 같은 항체로서 종양 관련 항원에 대한 항체를 들 수 있고, 항 CLDN6 항체, 항 CLDN9 항체, 항 CLDN6/CLDN9 항체, 항 HER2 항체, 항 HER3 항체, 항 DLL3 (Delta like protein 3) 항체, 항 A33 항체, 항 CanAg 항체, 항 CD19 항체, 항 CD20 항체, 항 CD22 항체, 항 CD25 항체, 항 CD30 항체, 항 CD33 항체, 항 CD37 항체, 항 CD56 항체, 항 CD70 항체, 항 CD98 항체, 항 B7-H3 (CD276) 항체, 항 TROP2 항체, 항 CEA 항체, 항 Cripto 항체, 항 EphA2 항체, 항 FGFR2 항체 (WO201315206 등), 항 G250 항체, 항 MUC1 항체 (WO2011012309 등), 항 GPNMB 항체, 항 Integrin 항체, 항 PSMA 항체, 항 Tenascin-C 항체, 항 SLC44A4 항체, 항 Mesothelin 항체, 항 EGFR 항체, 항 5T4 (oncofetal antigen 5T4 : also TPBG and trophoblast glycoprotein) 항체, 항 LRRC15 (Leucine-rich repeat-containing protein 15) 항체, 항 DR5 항체, 항 CDH3 (cadherin 3) 항체, 항 PDPN (podoplanin) 항체, 또는 항 CD123 항체를 예시할 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다.
본 발명의 항체로서 바람직하게는 항 CLDN6 항체, 항 CLDN6/CLDN9 항체, 항 HER2 항체, 항 CD98 항체, 항 TROP2 항체이고, 더욱 바람직하게는 항 CLDN6 항체, 항 HER2 항체 (예를 들어, 트라스투주맙, 트라스투주맙 변이체, 트라스투주맙 변이체 2) 이다.
이하, 본 발명에 있어서 사용되는 항 CLDN6 항체에 대해서 설명한다.
1. CLDN6 및 CLDN9
CLDN6 은, Claudin 패밀리에 속하는, 220 아미노산으로 이루어지는 4 회 막관통형의 단백질이고, N 말단 및 C 말단을 세포 내에 갖는다.
인간 CLDN6 의 아미노산 서열 및 DNA 서열은 공적 데이터 베이스 상에 공개되어 있고, 예를 들어 NP_067018 (서열 번호 1), NM_021195 (서열 번호 2 (모두 NCBI) 등의 엑세션 번호에 의해서 참조 가능하다.
인간 CLDN6 단백질의 아미노산 서열 (이하,「CLDN6 아미노산 서열」) 에 대해서, 세포 외 영역은, 서열표의 서열 번호 1 의 아미노산 번호 29 ∼ 81 로 이루어지는 세포 외 도메인 (EC1), 아미노산 번호 138 ∼ 160 으로 이루어지는 세포 외 도메인 (EC2) 으로 구성되어 있다.
CLDN9 는, Claudin 패밀리에 속하는, 217 아미노산으로 이루어지는 4 회 막관통형의 단백질이고, N 말단 및 C 말단을 세포 내에 갖는다. CLDN9 는 CLDN6 과 높은 상동성을 갖는다.
인간 CLDN9 의 아미노산 서열 및 DNA 서열은 공적 데이터 베이스 상에 공개되어 있고, 예를 들어 NP_066192 (서열 번호 3), NM_020982 (서열 번호 4) (모두 NCBI) 등의 엑세션 번호에 의해서 참조 가능하다.
2. 항 CLDN6 항체
본 발명의 항 CLDN6 항체의 일례로서, 서열표의 서열 번호 1 에 나타내는 CLDN6 의 N 말단으로부터 29 내지 81 회째의 아미노산 서열, 및 138 내지 160 회째의 아미노산 서열의 2 개의 세포 외 영역으로 이루어지는 고차 구조를 인식하고, 또한 내재화 활성을 갖는 항 CLDN6 항체를 들 수 있다.
본 발명의 항 CLDN6 항체는 종양 세포를 표적으로 할 수 있는 항체이고, 즉 종양 세포를 인식할 수 있는 특성, 종양 세포에 결합할 수 있는 특성, 그리고 종양 세포 내에 흡수되어 내재화하는 특성 등을 구비하고 있다. 따라서, 본 발명의 항 CLDN6 항체와 항종양 활성을 갖는 화합물을, 링커를 개재하여 결합시켜 항체-약물 콘주게이트로 할 수 있다.
본 발명의 항 CLDN6 항체는 항종양 활성을 갖고 있어도 된다.
(1) 본 발명의 항 CLDN6 항체는, 이하 (a) 및 (b) 의 특성을 갖는다 ;
(a) CLDN 패밀리를 인식 또는 결합한다.
본 발명의 항체는 CLDN 패밀리를 인식한다. 바꿔 말하면, 본 발명의 항체는 CLDN 패밀리에 결합한다. 본 발명의 항체는, 바람직하게는 CLDN6 에 결합하고, 보다 바람직하게는 CLDN6 에 특이적으로 결합한다. 또한, 본 발명의 항체는 CLDN9 를 인식하거나 또는 CLDN9 에 결합해도 된다.
본 발명에 있어서「특이적 인식」, 즉「특이적 결합」이란, 비특이적 흡착이 아닌 결합을 의미한다. 결합이 특이적인지의 여부의 판정 기준으로는, 예를 들어, 해리 정수 (Dissociation Constant : 이하,「KD 라고 한다」) 들 들 수 있다. 본 발명의 바람직한 항체의 CLDN6 및/또는 CLDN9 에 대한 KD 값은 1 × 10-5 M 이하, 5 × 10-6 M 이하, 2 × 10-6 M 이하 또는 1 × 10-6 M 이하, 보다 바람직하게는 5 × 10-7 M 이하, 2 × 10-7 M 이하 또는 1 × 10-7 M 이하이다.
본 발명에 있어서의 항원과 항체의 결합은, ELISA 법, RIA 법, Surface Plasmon Resonance (이하,「SPR」이라고 한다) 해석법 등에 의해서 측정 또는 판정할 수 있다. 세포 표면 상에 발현하고 있는 항원과 항체의 결합은, 플로 사이토메트리법 등에 의해서 측정할 수 있다.
(b) CLDN6 및/또는 CLDN9 와 결합함으로써 CLDN6 및/또는 CLDN9 발현 세포에 내재화하는 활성을 갖는다.
(2) CLDN6 및/또는 CLDN9 가 인간 CLDN6 및/또는 인간 CLDN9 인 상기 (1) 에 기재된 항체.
본 발명의 항 CLDN6 모노클로날 항체는, 하이브리도마를 사용하는 방법 등으로 얻을 수 있다. 항 CLDN6 모노클로날 항체의 예로는, 마우스 항 CLDN6 항체 B1 및 C7 을 들 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서는, 당해「B1」을「B1 항체」, 당해「C7」을「C7 항체」로 표기하는 경우도 있다.
B1 항체의 중사슬 가변 영역의 염기 서열은, 서열표의 서열 번호 20 에, 아미노산 서열은 서열 번호 21 에 기재되어 있다. 또, B1 항체의 경사슬 가변 영역의 염기 서열은, 서열표의 서열 번호 18 에, 아미노산 서열은 서열 번호 19 에 기재되어 있다.
B1 항체의 CDRH1 의 아미노산 서열은 서열 번호 9 에, CDRH2 의 아미노산 서열은 서열 번호 10 에, CDRH3 의 아미노산 서열은 서열 번호 11 에, CDRL1 의 아미노산 서열은 서열 번호 5 에, CDRL2 의 아미노산 서열은 서열 번호 6 에, CDRL3 의 아미노산 서열은 서열 번호 7 에 기재되어 있다.
C7 항체의 중사슬 가변 영역의 염기 서열은, 서열표의 서열 번호 24 에, 아미노산 서열은 서열 번호 25 에 기재되어 있다. 또, C7 항체의 경사슬 가변 영역의 염기 서열은, 서열표의 서열 번호 22 에, 아미노산 서열은 서열 번호 23 에 기재되어 있다.
C7 항체의 CDRH1 의 아미노산 서열은 서열 번호 15 에, CDRH2 의 아미노산 서열은 서열 번호 16 에, CDRH3 의 아미노산 서열은 서열 번호 17 에, CDRL1 의 아미노산 서열은 서열 번호 12 에, CDRL2 의 아미노산 서열은 서열 번호 13 에, CDRL3 의 아미노산 서열은 서열 번호 14 에 기재되어 있다.
본 발명의 항 CLDN6 항체로서, B1 항체 또는 C7 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 들 수 있다. 그 항체가, B1 항체 또는 C7 항체가 결합하는 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조에 결합하면, 그 항체가 B1 항체 또는 C7 항체와 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 또, B1 항체 또는 C7 항체의 CLDN6 에 대한 결합에 대해서 그 항체가 경합하는 (즉, 그 항체가, B1 항체 또는 C7 항체와 CLDN6 의 결합을 방해하는) 것을 확인함으로써, 구체적인 에피토프의 서열 또는 구조가 결정되어 있지 않아도, 그 항체가 항 CLDN6 항체와 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 에피토프가 동일한 것이 확인된 경우, 그 항체가 B1 항체 또는 C7 항체와 동등한 항원 결합능, 생물 활성 및/또는 내재화 활성을 갖고 있는 것이 강하게 기대된다.
본 발명의 항체에는, 상기 CLDN6 에 대한 모노클로날 항체에 더하여, 인간에 대한 이종 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 하여 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체, 예를 들어, 키메라 (Chimeric) 항체, 인간화 (Humanized) 항체, 인간 항체 등도 포함된다. 이들 항체는, 이미 알려진 방법을 이용하여 제조할 수 있다.
(1) 키메라 항체
키메라 항체로는, 항체의 가변 영역과 정상 영역이 서로 이종인 항체, 예를 들어 마우스 또는 래트 유래 항체의 가변 영역을 인간 유래의 정상 영역에 접합한 키메라 항체를 들 수 있다.
본 발명의 키메라 항체로서 예시되는 마우스 항인간 CLDN6 항체 B1 항체 유래의 키메라 항체는, 서열 번호 21 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬 및 서열 번호 19 에 나타내는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬을 포함하는 항체이고, 임의의 인간 유래의 정상 영역을 갖고 있어도 된다.
마우스 항인간 CLDN6 항체 B1 항체 유래의 키메라 항체의 구체예로서, 마우스 항인간 CLDN6 항체 B1 항체 유래의 키메라 항체 chB1 항체 (이하,「chB1」이라고도 기재한다.) 를 들 수 있다. chB1 항체의 아미노산 서열은, 서열표의 서열 번호 32 의 20 ∼ 471 회째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 및 서열표의 서열 번호 28 의 21 ∼ 234 로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 경사슬을 포함하는 항체를 들 수 있다.
또한, 서열표의 서열 번호 32 에 나타내는 중사슬 서열 중에서, 1 ∼ 19 회째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 시그널 서열이고, 20 ∼ 141 회째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 중사슬 가변 영역이며, 142 ∼ 471 회째의 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 중사슬 정상 영역이다. 또, 서열표의 서열 번호 28 에 나타내는 경사슬 서열 중에서, 1 ∼ 20 회째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 시그널 서열이고, 21 ∼ 127 회째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 경사슬 가변 영역이며, 128 ∼ 234 회째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 경사슬 정상 영역이다.
chB1 항체의 중사슬 및 경사슬의 가변 영역의 아미노산 서열은 서열표의 서열 번호 34, 서열 번호 30 에 기재되어 있다.
chB1 항체의 중사슬 아미노산 서열은, 서열표의 서열 번호 33 에 나타내는 뉴클레오티드 서열에 의해서 코드되어 있다. 서열표의 서열 번호 33 에 나타내는 뉴클레오티드 서열의 1 ∼ 57 회째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 chB1 항체 중사슬의 시그널 서열을 코드하고 있고, 서열표의 서열 번호 33 에 나타내는 뉴클레오티드 서열의 58 ∼ 423 회째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 chB1 항체의 중사슬 가변 영역을 코드하고 있으며, 서열표의 서열 번호 33 에 나타내는 뉴클레오티드 서열의 424 ∼ 1413 회째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 chB1 항체의 중사슬 정상 영역을 코드하고 있다.
chB1 항체의 중사슬 가변 영역의 염기 서열은 서열표의 서열 번호 35 에 기재되어 있다.
chB1 항체의 경사슬 아미노산 서열은, 서열표의 서열 번호 29 에 나타내는 뉴클레오티드 서열에 의해서 코드되고 있다. 서열표의 서열 번호 29 에 나타내는 뉴클레오티드 서열의 26 ∼ 85 회째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 chB1 항체 경사슬의 시그널 서열을 코드하고 있고, 서열표의 서열 번호 29 에 나타내는 뉴클레오티드 서열의 86 ∼ 406 회째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 chB1 항체의 경사슬 가변 영역을 코드하고 있으며, 서열표의 서열 번호 29 에 나타내는 뉴클레오티드 서열의 407 ∼ 727 회째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 chB1 항체의 경사슬 정상 영역을 코드하고 있다.
chB1 항체의 경사슬 가변 영역의 염기 서열은 서열표의 서열 번호 31 에 기재되어 있다.
(2) 인간화 항체
인간화 항체로는, 상보성 결정 영역 (CDR ; complementarity determining region) 만을 인간 유래의 항체에 삽입한 항체 (Nature (1986) 321, p.522-525 참조), CDR 이식법에 의해서, CDR 의 서열에 더하여 일부의 프레임 워크의 아미노산 잔기도 인간 항체에 이식한 항체 (WO90/07861호), 또한, 항원에 대한 결합능을 유지하면서, 일부의 CDR 의 아미노산 서열을 개변한 항체를 들 수 있다.
CDR 의 아미노산 서열은, Kabat 의 정의, Chothia 의 정의, Abm 의 정의, IMGT 등 공지된 방법에 의해서 결정할 수 있지만, 본 발명에 있어서의 CDR 은 어느 방법에 의해서 정의된 것이어도 된다.
단, B1 항체 또는 C1 항체 유래의 인간화 항체로는, B1 항체 또는 C1 항체의 6 종 모든 CDR 서열을 유지하고, CLDN6 결합 활성을 갖는 한, 특정한 인간화 항체에 한정되지 않고, 또한 1 ∼ 수 개 (바람직하게는 1 ∼ 2 개, 보다 바람직하게는 1 개) 의 CDR 의 아미노산 서열을 개변한 인간화 항체 변이체도 CLDN6 단백질을 인식하거나 또는 그 항체의 CLDN6 단백질 결합 활성을 갖는 한, 특정한 인간화 항체에 한정되지 않는다.
본 발명의 항 CLDN6 인간화 항체 또는 그 기능성 단편으로는, 예를 들어,
서열표의 서열 번호 9 에 나타내는 아미노산 서열 또는 그 아미노산 서열의 1 ∼ 수 개 (바람직하게는 1 ∼ 2 개) 의 아미노산이 치환된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1,
서열표의 서열 번호 10 에 나타내는 아미노산 서열 또는 그 아미노산 서열의 1 ∼ 수 개 (바람직하게는 1 ∼ 2 개) 의 아미노산이 치환된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및,
서열표의 서열 번호 11 에 나타내는 아미노산 서열 또는 그 아미노산 서열의 1 ∼ 수 개 (바람직하게는 1 ∼ 2 개) 의 아미노산이 치환된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 가변 영역을 갖는 중사슬, 그리고,
서열표의 서열 번호 5 에 나타내는 아미노산 서열 또는 그 아미노산 서열의 1 ∼ 수 개 (바람직하게는 1 ∼ 2 개) 의 아미노산이 치환된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1,
서열표의 서열 번호 6 에 나타내는 아미노산 서열 또는 그 아미노산 서열의 1 ∼ 수 개 (바람직하게는 1 ∼ 2 개) 의 아미노산이 치환된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및,
서열표의 서열 번호 7 에 나타내는 아미노산 서열 또는 그 아미노산 서열의 1 ∼ 수 개 (바람직하게는 1 ∼ 2 개) 의 아미노산이 치환된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 가변 영역을 갖는 경사슬을 포함하고,
본 발명의 CLDN6 단백질을 인식하거나 또는 그 항체의 CLDN6 단백질 결합 활성을 유지하고 있는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 등을 들 수 있다.
상기 항 CLDN6 인간화 항체 또는 그 기능성 단편에 있어서의 CDR 의 아미노산 치환의 예로는, 바람직하게는 상기 CDRL3 의 1 ∼ 수 개 (바람직하게는 1 ∼ 2 개) 의 아미노산 치환을 들 수 있고, 서열표의 서열 번호 7 의 아미노산 번호 4 번과 5 번의 아미노산을 치환한 서열표의 서열 번호 8 에 나타내는 CDRL3 을 예시할 수 있다.
상기 CDRH를 갖는 인간화 항체의 중사슬 가변 영역으로서, 서열표의 서열 번호 54 에 나타내는 아미노산 서열, 서열표의 서열 번호 58 에 나타내는 아미노산 서열, 및 서열표의 서열 번호 62 에 나타내는 아미노산 서열을 예시할 수 있고, 상기 CDRL 을 갖는 인간화 항체의 경사슬 가변 영역으로서, 서열표의 서열 번호 38 에 나타내는 아미노산 서열, 서열표의 서열 번호 42 에 나타내는 아미노산 서열, 서열표의 서열 번호 46 에 나타내는 아미노산 서열, 및 서열표의 서열 번호 50 에 나타내는 아미노산 서열을 예시할 수 있다.
상기, 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역의 조합을 포함하는 인간화 항체로서,
서열표의 서열 번호 54 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및, 서열표의 서열 번호 38 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것으로 이루어지는 인간화 항체,
서열표의 서열 번호 58 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및, 서열표의 서열 번호 42 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것으로 이루어지는 인간화 항체,
서열표의 서열 번호 54 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및, 서열표의 서열 번호 46 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것으로 이루어지는 인간화 항체,
서열표의 서열 번호 58 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및, 서열표의 서열 번호 50 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것으로 이루어지는 인간화 항체,
서열표의 서열 번호 62 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및, 서열표의 서열 번호 46 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것으로 이루어지는 인간화 항체를 바람직하게 예시할 수 있다.
상기 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역의 조합을 포함하는 것으로 이루어지는 인간화 항체의 전체 길이 서열로서,
서열표의 서열 번호 52 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬, 및, 서열표의 서열 번호 36 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하는 것으로 이루어지는 인간화 항체 (H1L1),
서열표의 서열 번호 56 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬, 및, 서열표의 서열 번호 40 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하는 것으로 이루어지는 인간화 항체 (H2L2),
서열표의 서열 번호 52 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬, 및, 서열표의 서열 번호 44 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하는 것으로 이루어지는 인간화 항체 (H1L3),
서열표의 서열 번호 56 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬, 및, 서열표의 서열 번호 48 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하는 것으로 이루어지는 인간화 항체 (H2L4), 또는,
서열표의 서열 번호 60 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬, 및, 서열표의 서열 번호 44 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하는 것으로 이루어지는 인간화 항체 (H3L3) 를 예시할 수 있다.
또한, 서열표의 서열 번호 52, 56, 또는 60 에 나타내는 중사슬 아미노산 서열 중에서, 1 ∼ 19 회째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 시그널 서열이고, 20 ∼ 141 회째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 중사슬 가변 영역이며, 142 ∼ 471 회째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 중사슬 정상 영역이다.
또, 서열표의 서열 번호 36, 40, 44 또는 48 에 나타내는 경사슬 아미노산 서열 중에서, 1 ∼ 20 회째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 시그널 서열이고, 21 ∼ 127 회째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 경사슬 가변 영역이며, 128 ∼ 234 회째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 경사슬 정상 영역이다.
상기 인간화 항체 H1L1, H2L2, H1L3, H2L4, H3L3 의 중사슬의 카르복실 말단은, 후술하는 바와 같이, 1 또는 2 개의 아미노산이 결실되어 있어도 되고, 당해 결실체도 본 발명에 포함된다.
결실체의 중사슬로서, 서열표의 서열 번호 52, 56, 60 의 아미노산 번호 20 ∼ 470 회째에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중사슬을 들 수 있다.
당해 결실체로서,
서열표의 서열 번호 52 의 아미노산 번호 20 ∼ 470 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬, 및, 서열표의 서열 번호 36 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하는 것으로 이루어지는 인간화 항체 (H1L1),
서열표의 서열 번호 56 의 아미노산 번호 20 ∼ 470 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬, 및, 서열표의 서열 번호 40 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하는 것으로 이루어지는 인간화 항체 (H2L2),
서열표의 서열 번호 52 의 아미노산 번호 20 ∼ 470 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬, 및, 서열표의 서열 번호 44 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하는 것으로 이루어지는 인간화 항체 (H1L3),
서열표의 서열 번호 56 의 아미노산 번호 20 ∼ 470 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬, 및, 서열표의 서열 번호 48 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하는 것으로 이루어지는 인간화 항체 (H2L4), 또는,
서열표의 서열 번호 60 의 아미노산 번호 20 ∼ 470 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬, 및, 서열표의 서열 번호 44 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하는 것으로 이루어지는 인간화 항체 (H3L3) 를 예시할 수 있다.
상기 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역의 조합을 포함하는 것으로 이루어지는 항체, 또는, 상기 중사슬 및 경사슬의 조합을 포함하는 것으로 이루어지는 항체의 아미노산 서열과의 동일성 또는 상동성이 80 ％ 이상, 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 97 ％ 이상, 가장 바람직하게는 99 ％ 이상인 항체도 CLDN6 에의 결합 활성을 갖는 한, 본 발명의 항체에 포함된다.
또, 상기 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역의 조합을 포함하는 것으로 이루어지는 항체, 또는, 상기 중사슬 및 경사슬의 조합을 포함하는 것으로 이루어지는 항체의 CDR 과 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 CDR 을 가지며, 또한 그 항체의 CDR 의 아미노산 서열을 제외한 아미노산 서열의 동일성 또는 상동성이 80 ％ 이상, 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 97 ％ 이상, 가장 바람직하게는 99 ％ 이상인 항체도 CLDN6 에의 결합 활성을 갖는 한, 본 발명의 항체에 포함된다.
또한, 중사슬 또는 경사슬의 아미노산 서열에 1 ∼ 수 개의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열을 조합함으로써도, 상기한 각 항체와 동등한 생물 활성을 갖는 항체를 선택하는 것이 가능하다. 또, 본 명세서 중에 있어서의 아미노산의 치환으로는 보존적 아미노산 치환이 바람직하다 (WO2013154206).
보존적 아미노산 치환이란, 아미노산 측사슬에 관련이 있는 아미노산 그룹 내에서 일어나는 치환이다. 이러한 아미노산 치환은 원래의 아미노산 서열을 갖는 물질의 특성을 저하시키지 않는 범위에서 행하는 것이 바람직하다.
2 종류의 아미노산 서열간의 상동성은, Blast algorithm version 2.2.2 (Al tschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997),「Gapped BLAST and PSI-BLAST : a new generation of protein database search programs」, Nucleic Acids Res.25 : 3389-3402) 의 디폴트 파라미터를 사용함으로써 결정할 수 있다. Blast algorithm 은, 인터넷으로 www.ncbi.nlm.nih.gov/blast 에 액세스함으로써도 사용할 수 있다.
(3) 인간 항체
본 발명의 항체로는, 또한 CLDN6 및/또는 CLDN9 에 결합하는, 인간 항체를 들 수 있다. 항 CLDN6 및/또는 CLDN9 인간 항체란, 인간 염색체 유래의 항체의 유전자 서열만을 갖는 인간 항체를 의미한다. 항 CLDN6 인간 항체는, 공지된 방법에 의해서 얻을 수 있다 (Nature Genetics (1997) 16, p.133-143, Nucl. Acids Res. (1998) 26, p.3447-3448, Animal Cell Technology : Basic and Applied Aspects, vol.10, p.69-73, Kluwer Academic Publishers, 1999., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, p.722-727, Investigative Ophthal㏖ogy & Visual Science. (2002) 43 (7), p.2301-2308, Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), p.189-203, Ophthal㏖ogy (2002) 109 (3), p.427-431, WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438, WO95/15388, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, p.433-455,
Nature Biotechnology (2005) 23 (9), p.1105-1116) 도 알려져 있다.
이하에, 본 발명에 있어서 사용되는 항 HER2 항체에 대해서 설명한다.
본 발명의 항 HER2 항체는, 이하의 특성을 갖는다 ;
(1) 이하의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 항 HER2 항체 ;
(a) HER2 에 특이적으로 결합한다.
(b) HER2 와 결합함으로써 HER2 발현 세포에 내재화하는 활성을 갖는다.
(2) HER2 의 세포 외 도메인에 결합하는 상기 (1) 에 기재된 항체.
(3) 상기 항체가 모노클로날 항체인 상기 (1) 또는 (2) 에 기재된 항체.
(4) 항체 의존성 세포 상해 (ADCC) 활성 및/또는 보체 의존성 세포 상해 (CDC) 활성을 갖는 상기 (1) ∼ (3) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(5) 마우스 모노클로날 항체, 키메라 모노크로날 항체 또는 인간화 모노클로날 항체인, 상기 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(6) 중사슬 정상 영역이 인간 IgG1 의 중사슬 정상 영역이고, ADCC 및/또는 CDC 활성의 저감을 초래하는 변이를 포함하는, 상기 (1) ∼ (3) 및 (5) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(7) 중사슬 정상 영역이 인간 IgG1 의 중사슬 정상 영역이고, EU Index 에 의해서 나타내어지는 234 위치 및 235 위치의 류신이 알라닌으로 치환되어 있는, 상기 (6) 에 기재된 항체.
(8) 서열 번호 65 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 64 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는 항체인, 상기 (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(9) 서열 번호 75 의 아미노산 번호 20 ∼ 139 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 73 의 아미노산 번호 21 ∼ 127 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 항체인, 상기 (1) ∼ (3) 및 (5) ∼ (7) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(10) 서열 번호 75 의 아미노산 번호 20 ∼ 469 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 73 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는 항체인, 상기 (1) ∼ (3), (5) ∼ (7) 및 (9) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(11) 서열 번호 77 의 아미노산 번호 20 ∼ 469 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 76 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는 항체인, 상기 (1) ∼ (3), (5) ∼ (7) 및 (9) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(12) 중사슬 카르복실 말단에 있어서 1 또는 2 개의 아미노산이 결실되어 있는, 상기 (1) ∼ (11) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(13) 서열 번호 65 의 아미노산 번호 1 ∼ 449 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 64 의 아미노산 번호 1 ∼ 214 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함해서 이루어지는, 상기 (1) ∼ (5), (8) 및 (12) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(14) 서열 번호 75 의 아미노산 번호 20 ∼ 468 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 73 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함해서 이루어지는, 상기 (1) ∼ (3), (5) ∼ (7), (9), (10) 및 (12) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(15) 서열 번호 77 의 아미노산 번호 20 ∼ 468 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 76 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함해서 이루어지는, 상기 (1) ∼ (3), (5) ∼ (7), 및 (9), (11) 및 (12) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(16) 상기 (1) ∼ (15) 중 어느 하나에 기재된 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터에 의해서 형질 전환된 숙주 세포를 배양하는 공정 및 당해 공정에서 얻어진 배양물로부터 목적으로 하는 항체를 채취하는 공정을 포함하는 당해 항체의 제조 방법에 의해서 얻어지는 항체.
또한, 본원에 있어서, 트라스투주맙의 중사슬 정상 영역 (서열 번호 65) 의 EU Index 에 의해서 나타내어지는 234 위치 및 235 위치의 류신이 알라닌으로 치환되어 있는 항체를 트라스투주맙 변이체 또는 트라스투주맙 변이체 2 라고 한다.
본 발명의 항체에는 항체의 수식체도 포함된다. 당해 수식체란, 본 발명의 항체에 화학적 또는 생물학적인 수식이 실시되어 이루어지는 것을 의미한다. 화학적 수식체에는, 아미노산 골격에의 화학 부분의 결합, N-결합 또는 O-결합 탄수화물 사슬의 화학 수식체 등이 포함된다. 생물학적인 수식체에는, 번역 후 수식 (예를 들어, N-결합 또는 O-결합형 당사슬 부가, N 말단 또는 C 말단의 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성화, 메티오닌의 산화) 된 것, 원핵 생물 숙주 세포를 사용하여 발현시킴으로써 N 말단에 메티오닌 잔기가 부가된 것 등이 포함된다. 또, 본 발명의 항체 또는 항원의 검출 또는 단리를 가능하게 하기 위해서 표지된 것, 예를 들어, 효소 표지체, 형광 표지체, 어피니티 표지체도 이러한 수식체의 의미에 포함된다. 이와 같은 본 발명의 항체의 수식체는, 항체의 안정성 및 혈중 체류성의 개선, 항원성의 저감, 항체 또는 항원의 검출 또는 단리 등에 유용하다.
또, 본 발명의 항체에 결합하고 있는 당사슬 수식을 조절하는 것 (글리코실화, 탈푸코오스화 등) 에 의해서, 항체 의존성 세포 상해 활성을 증강하는 것이 가능하다. 항체의 당사슬 수식의 조절 기술로는, WO1999/54342, WO2000/61739, WO2002/31140, WO2007133855, WO2013120066 등이 알려져 있지만, 이것들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 항체에는 당해 당사슬 수식이 조절된 항체도 포함된다.
이러한 수식에는, 항체 또는 그 기능성 단편에 있어서의 임의의 위치에, 또는 원하는 위치에서도 실시되어도 되고, 1 개 또는 2 개 이상의 위치에 동일 또는 2 종 이상의 상이한 수식이 이루어져 있어도 된다.
본 발명에 있어서「항체 단편의 수식체」는「항체의 수식체의 단편」까지도 그 의미에 포함하는 것이다.
항체 유전자를 일단 단리한 후, 적당한 숙주에 도입하여 항체를 제작하는 경우에는, 적당한 숙주와 발현 벡터의 조합을 사용할 수 있다. 항체 유전자의 구체예로는, 본 명세서에 기재된 항체의 중사슬 서열 등을 코드하는 유전자, 및 경사슬 서열 등을 코드하는 유전자를 조합한 것을 들 수 있다. 숙주 세포를 형질 전환할 때에는, 중사슬 서열 유전자 등과 경사슬 서열 유전자 등은, 동일한 발현 벡터에 삽입되어 있는 것이 가능하고, 또 각각의 발현 벡터에 삽입되어 있는 것도 가능하다.
진핵 세포를 숙주로서 사용하는 경우, 동물 세포, 식물 세포, 진핵 미생물을 사용할 수 있다. 특히 동물 세포로는, 포유류 세포, 예를 들어, 원숭이의 세포인 COS 세포 (Cell (1981) 23, p.175-182, ATCC CRL-1650), 마우스 선유아세포 NIH3T3 (ATCC No.CRL-1658) 이나 차이니즈·햄스터 난소 세포 (CHO 세포, ATCC CCL-61) 의 디하이드로 엽산 환원 효소 결손주 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1980) 77, p.4126-4220), FreeStyle 293F 세포 (Invitrogen 사) 를 들 수 있다.
원핵 세포를 사용하는 경우에는, 예를 들어, 대장균, 고초균을 들 수 있다.
이들 세포에 목적으로 하는 항체 유전자를 형질 전환에 의해서 도입하고, 형질 전환된 세포를 in vitro 에서 배양함으로써 항체가 얻어진다. 당해 배양에 있어서는 항체의 서열에 의해서 수량이 상이한 경우가 있고, 동등한 결합 활성을 갖는 항체 중에서 수량을 지표로 의약으로서의 생산이 용이한 것을 선별하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 항체에는, 상기 형질 전환된 숙주 세포를 배양하는 공정, 및 당해 공정에서 얻어진 배양물로부터 목적으로 하는 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편을 채취하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 당해 항체의 제조 방법에 의해서 얻어지는 항체도 포함된다.
상기 항체 유전자는, 바람직하게는 이하의 (a) ∼ (e) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
(a) B1 혹은 C7 항체, chB1 항체, 인간화 항체 H1L1, H2L2, H1L3, H2L4, H3L3, 트라스투주맙 및 그 변이체 중 어느 하나의 항체의 중사슬 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 경사슬 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 조합,
(b) B1 혹은 C7 항체, chB1 항체, 및, 인간화 항체 H1L1, H2L2, H1L3, H2L4, H3L3, 트라스투주맙 및 그 변이체 중 어느 하나의 항체의 CDRH1 ∼ CDRH3 을 포함하는 중사슬 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 CDRL1 ∼ CDRL3 을 포함하는 경사슬 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 조합
(c) B1 혹은 C7 항체, chB1 항체, 및, 인간화 항체 H1L1, H2L2, H1L3, H2L4, H3L3, 트라스투주맙 및 그 변이체 중 어느 하나의 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 조합
(d) (a) ∼ (c) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드와 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈 하고, 또한, CDLN6 또는 HER2 에 결합하는 항체의 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및,
(e) (a) ∼ (c) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드에 있어서 1 ∼ 50 개, 1 ∼ 45 개, 1 ∼ 40 개, 1 ∼ 35 개, 1 ∼ 30 개, 1 ∼ 25 개, 1 ∼ 20 개, 1 ∼ 15 개, 1 ∼ 10 개, 1 ∼ 8 개, 1 ∼ 6 개, 1 ∼ 5 개, 1 ∼ 4 개, 1 ∼ 3 개, 1 혹은 2 개, 또는 1 개의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는 삽입되어 이루어지는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코드하며, 또한, CLDN6 또는 HER2 에 결합하는 항체의 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
본 발명은, 본 발명의 항체 혹은 그 기능성 단편 또는 그 수식체를 코드하는 뉴클레오티드, 그 유전자가 삽입된 재조합 벡터, 그 유전자 또는 그 벡터가 도입된 세포를 포함한다.
또, 본 발명은, 상기 세포를 배양하는 공정, 및, 그 배양물로부터 항체 혹은 그 기능성 단편 또는 그 수식체를 회수하는 공정을 포함하는, 항체 혹은 그 기능성 단편 또는 그 수식체의 제조 방법도 포함한다.
또한, 포유류 배양 세포에서 생산되는 항체의 중사슬의 카르복실 말단의 리신 잔기가 결실되는 것이 알려져 있고 (Journal of Chromatography A, 705 : 129-134 (1995)), 또, 동일하게 중사슬 카르복실 말단의 글리신, 리신의 2 아미노산 잔기가 결실되고, 새로 카르복실 말단에 위치하는 프롤린 잔기가 아미드화되는 것이 알려져 있다 (Analytical Biochemistry, 360 : 75-83 (2007)). 그러나, 이들 중사슬 서열의 결실 및 수식은, 항체의 항원 결합능 및 이펙터 기능 (보체의 활성화나 항체 의존성 세포 상해 작용 등) 에는 영향을 미치지 않는다. 따라서, 본 발명에 관련된 항체에는, 당해 수식을 받은 항체 및 당해 항체의 기능성 단편도 포함되고, 중사슬 카르복실 말단에 있어서 1 또는 2 개의 아미노산이 결실된 결실체, 및 아미드화된 당해 결실체 (예를 들어, 카르복실 말단 부위의 프롤린 잔기가 아미드화된 중사슬) 등도 포함된다. 단, 항원 결합능 및 이펙터 기능이 유지되고 있는 한, 본 발명에 관련된 항체의 중사슬의 카르복실 말단의 결실체는 상기한 종류에 한정되지 않는다. 본 발명에 관련된 항체를 구성하는 2 개의 중사슬은, 완전체 길이 및 상기한 결실체로 이루어지는 군에서 선택되는 중사슬 중 어느 1 종이어도 되고, 어느 하나 2 종을 조합한 것이어도 된다. 각 결실체의 양비는 본 발명에 관련된 항체를 산생하는 포유류 배양 세포의 종류 및 배양 조건에서 영향을 받을 수 있지만, 본 발명에 관련된 항체의 주성분으로는 2 개의 중사슬의 쌍방에서 카르복실 말단의 1 개의 아미노산 잔기가 결실되어 있는 경우를 들 수 있다.
얻어진 항체는, 균일하게 정제할 수 있다. 항체의 분리, 정제는 통상적인 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법을 이용하면 된다. 예를 들어 칼럼 크로마토그래피, 필터 여과, 한외 여과, 염석, 투석, 조제용 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동, 등전점 전기 영동 등을 적절히 선택, 조합, 항체를 분리, 정제할 수 있지만 (Strategies for Protein Purification and Characterization : A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996) ; Antibodies : A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), 이것들에 한정되는 것은 아니다.
＜N297 당사슬＞
최근, 불균일한 항체의 당 단백질을, 효소 반응 등에 의해서 리모델링하고, 관능기를 갖는 당사슬을 균일하게 도입하는 방법이 보고되어 있다 (ACS Chemical Biology 2012, 7, 110, ACS Medicinal Chemistry Letters 2016, 7, 1005, Bioconjugate Chemistry 2015, 26, 2233, Angew. CheM. InT. Ed. 2016, 55, 2361-2367, US2016361436).
본 발명의 당사슬의 리모델링은 먼저 가수분해 효소를 사용하여, 단백질 (항체 등) 에 부가되어 있는 불균일한 당사슬을 말단의 GlcNAc 만 남기고 절제하여, GlcNAc 가 부가된 균일한 단백질 부분을 조제한다 (이하,「억셉터」라고 한다). 다음으로, 별도 조제한 임의의 당사슬을 준비하고 (이하,「도너」라고 한다), 이 억셉터와 도너를 당전이 효소를 사용하여 연결한다. 이로써, 임의의 당사슬 구조를 갖는 균일한 당단백질을 합성할 수 있다.
본 발명에 있어서,「당사슬」이란, 2 이상의 단당이 글리코사이드 결합에 의해서 결합된 구조 단위를 의미한다. 구체적인 단당이나 당사슬을, 예를 들어 "GlcNAc-", "MSG-" 와 같이, 약호로서 표기하는 경우가 있다. 구조식 중에서 이들 약호로 기재한 경우, 환원 말단에서 다른 구조 단위와의 글리코사이드 결합에 귀속하는 산소 원자 또는 질소 원자는, 특별한 정의가 있는 경우를 제외하고, 당해 당사슬을 나타내는 약호에는 포함되지 않는 것으로서 표시된다.
본 발명에 있어서, 당사슬의 기본 단위가 되는 단당의 기재는, 별도로 정하는 경우를 제외하고, 편의상, 그 고리 구조에 있어서, 고리를 구성하는 산소 원자에 결합하며, 또한, 수산기 (또는 글리코사이드 결합에 귀속하는 산소 원자) 와 직접 결합한 탄소 원자를 1 위치 (시알산에 있어서만 2 위치) 로서 표기한다. 실시예 화합물의 명칭은, 화학 구조 전체로서 붙여진 것으로, 이 룰은 반드시 적용되지 않는다.
본 발명에 있어서, 당사슬을 기호 (예를 들어, GLY, SG, MSG, GlcNAc 등) 로서 기재하는 경우, 별도로 정의되는 경우를 제외하고, 환원 말단의 탄소까지를 당해 기호에 포함시키는 것으로 하고, N- 또는 O-글리코사이드 결합에 귀속하는 N 또는 O 는, 당해 기호에는 포함되지 않는 것으로 한다.
본 발명에 있어서, 특별한 기재가 없는 한, 아미노산의 측사슬에 있어서 당사슬과 연결한 경우의 부분 구조는, 측사슬 부분을 괄호로 표시하고, 예를 들어,「(SG-)Asn」와 같이 표기하는 것으로 한다.
본 발명의 항체-약물 콘주게이트는, 다음 식 ;
[화학식 29]
Figure pct00029
으로 나타내고, 항체 Ab 또는 그 기능성 단편은, N297 당사슬 또는 리모델링된 N297 당사슬로부터 L 에 결합하고 있고, 바람직하게는 Ab 가 리모델링된 당사슬로부터 L 에 결합하고 있다.
본 발명에 있어서의 Ab 의 당사슬은, N 결합형 당사슬이나 O 결합형 당사슬이고, 바람직하게는 N 결합형 당사슬이다.
N 결합형 당사슬은, N 글리코사이드 결합, O 결합형 당사슬은 O 글리코사이드 결합에 의해서, 항체의 아미노산 측사슬과 결합하고 있다.
IgG 는 그 중사슬의 Fc 영역에 있어서의 297 회째의 아스파라긴 잔기 (이하,「Asn297 또는 N297」이라고 한다) 에 잘 보존된 N 결합형 당사슬을 갖고 있고, 항체 분자의 활성이나 동태 등에 기여하는 것이 알려져 있다 (Biotechnol. Prog., 2012, 28, 608-622, Anal. Chem., 2013, 85, 715-736).
IgG 의 정상 영역에 있어서의 아미노산 서열은 잘 보존되어 있고, Edelman et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol.63, No.1 (May 15, 1969), p.78-85) 에 있어서, 각각의 아미노산이 Eu 번호 (Eu INDEX) 로 특정되어 있다. 예를 들어, Fc 영역에 있어서 N 결합형 당사슬이 부가하는 Asn297 은, Eu 번호에 있어서 297 위치에 상당하는 것이고, 분자의 단편화나 영역 결손에 의해서 실제의 아미노산 위치가 변동한 경우여도 Eu 번호로 표시함으로써 아미노산이 일의적으로 특정된다.
본 발명의 항체-약물 콘주게이트에 있어서, 바람직하게는 항체 또는 그 기능성 단편은 그 Asn297 의 측사슬에 결합하는 당사슬 (이하,「N297 당사슬」이라고 한다) 로부터 L 에 결합하고 있고, 보다 바람직하게는, 항체 또는 그 기능성 단편은 상기 N297 당사슬로부터 L 에 결합하고 있으며, 당해 N297 당사슬이 리모델링된 당사슬이다.
SGP 는 Sialyl GlycoPeptide 의 약자이고, N 결합형 복합 당사슬의 대표적인 것이다. 계란의 난황으로부터, SGP 는, 예를 들어, WO2011/0278681 에 기재된 방법에 따라서 단리, 정제할 수 있다. 또, SGP 의 정제품이 시판 (토쿄 화성 (주), (주) 후시미 제약소) 되고 있어, 구입할 수 있다. SG 의 당사슬 부분에 있어서 환원 말단의 GlcNAc 가 1 개 결손된 당사슬 (이하,「SG(10)」) 만으로 이루어지는 디시알로옥타사카라이드 (토쿄 화성 (주)) 등이 시판되고 있다.
본 발명에 있어서, SG(10) 의 β-Man 의 분기 사슬의 어느 일방만에서 비환원 말단의 시알산이 결실된 당사슬 구조를 MSG(9) 로 하고, 분기 사슬의 1-3 당사슬에만 시알산을 갖는 것을 MSG1, 분기 사슬의 1-6 당사슬에만 시알산을 갖는 것을 MSG2 로 각각 표기하는 것으로 한다.
본 발명의 리모델링된 당사슬은, N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 혹은 N297-(Fuc)MSG1 과 N297-(Fuc)MSG2 의 혼합물, 또는 N297-(Fuc)SG 이고, 바람직하게는 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 또는 N297-(Fuc)SG 이며, 보다 바람직하게는 N297-(Fuc)MSG1 또는 N297-(Fuc)MSG2 이다.
N297-(Fuc)MSG1 은 이하의 구조식 또는 서열식으로 나타낸다.
[화학식 30]
Figure pct00030
[화학식 31]
Figure pct00031
상기 식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, *-(CH2CH2-O)3-CH2CH2-NH- 를 나타내고, 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합을 통하여 결합하고 있고, 좌단의 애스터리스크 * 는, 상기 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내며, n5 는 2 ∼ 10 의 정수이고, 바람직하게는 2 ∼ 5 의 정수이다.
N297-(Fuc)MSG2 는 이하의 구조식 또는 서열식으로 나타낸다.
[화학식 32]
Figure pct00032
[화학식 33]
Figure pct00033
상기 식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, *-(CH2CH2-O)3-CH2CH2-NH- 를 나타내고, 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-6 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합을 통하여 결합하고 있으며, 좌단의 애스터리스크 * 는, 상기 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고, n5 는 2 ∼ 10 의 정수이고, 바람직하게는 2 ∼ 5 의 정수이다.
N297-(Fuc)SG 는 이하의 구조식 또는 서열식으로 나타낸다.
[화학식 34]
Figure pct00034
[화학식 35]
Figure pct00035
상기 식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, *-(CH2CH2-O)3-CH2CH2-NH- 를 나타내고, 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 및 1-6 사슬측의 양방의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합하고 있는 것을 나타내며, 좌단의 애스터리스크 * 는, 상기 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고, n5 는 2 ∼ 10 의 정수이고, 바람직하게는 2 ∼ 5 의 정수이다.
본 발명의 항체-약물 콘주게이트에 있어서의 항체의 N297 당사슬이, N297-(Fuc)MSG1 혹은 N297-(Fuc)MSG2 또는 그것들의 혼합물인 경우, 항체는 2 량체이기 때문에, 항체-약물 콘주게이트는 2 개의 약물 링커 (-L-D) 가 결합된 분자 (상기 m1 = 1) 가 된다 (도 1 참조).
예를 들어, 실시예 19 : ADC1 은 N297 당사슬이 N297-(Fuc)MSG1 인 경우이다.
본 발명의 항체-약물 콘주게이트에 있어서의 항체의 N297 당사슬이, N297-(Fuc)SG 인 경우, 항체는 2 량체이기 때문에, 항체-약물 콘주게이트는 4 개의 약물 링커 (-L-D) 가 결합된 분자 (상기 m1 = 2) 가 된다.
N297 당사슬은, 바람직하게는 N297-(Fuc)MSG1 혹은 N297-(Fuc)MSG2 또는 N297-(Fuc)SG 이고, 보다 바람직하게는 N297-(Fuc)MSG1 혹은 N297-(Fuc)MSG2 이며, 가장 바람직하게는 N297-(Fuc)MSG1 이다.
본 발명의 항체-약물 콘주게이트에 있어서의 항체의 N297 당사슬이 N297-(Fuc)MSG1 혹은 N297-(Fuc)MSG2 또는 N297-(Fuc)SG 인 경우, 균일한 품질의 ADC 를 취득할 수 있다.
본 발명은, 이하 i) ∼ iii) 의 공정을 포함하는 당사슬 리모델링 항체 또는 그 항체의 기능성 단편의 제조 방법을 제공한다.
i) 상기 서술한 숙주 세포 (예를 들어, 동물 세포 (CHO 세포 등)) 를 배양하고, 얻어진 배양물로부터 목적으로 하는 항체를 채취하는 공정,
ii) 공정 i) 에서 얻어진 항체를 가수분해 효소로 처리하고, N297 당사슬이 (Fucα1,6)GlcNAc 인 항체 ((Fucα1,6)GlcNAc-항체) 를 제조하는 공정 (도 3a),
바람직하게는, 추가로 당해 반응액을, 하이드록시 아파타이트 칼럼에 의한 정제를 함유하는 공정에 의해서 (Fucα1,6)GlcNAc-항체를 정제하는 공정, 및,
iii) MSG(9) 또는 SG(10) 의 시알산의 2 위치의 카르복실산의 카르보닐기에 아지드기를 갖는 PEG 링커 -(N3-L(PEG)) 를 도입하고, 또한, 환원 말단을 옥사졸린화한 당사슬 도너 분자와 당전이 효소 존재 하에서 (Fucα1,6)GlcNAc-항체를 반응시켜, 시알산에 아지드기가 도입된 당사슬 리모델링 항체를 합성하는 공정.
또, 이러한 제조 방법에 의해서 얻어진 당사슬 리모델링 항체 혹은 그 기능성 단편, 또는 그들의 수식체도 본 발명에 포함된다.
상기 본 항체-약물 콘주게이트의 제조 중간체는 DBCO (Dibenzocyclooctyne) 등의 아지드기와 반응하는 알킨 구조를 갖는다 (실시예 2-1, 화합물 3-14 참조). 따라서, 당해 제조 중간체를 상기 i) ∼ iii) 의 공정에서 얻어지는 당사슬의 시알산에 아지드기를 갖는 PEG 링커가 도입된 MSG1 형, MSG2 형 또는 SG 형 당사슬 리모델링 항체 또는 그 항체의 기능성 단편과 반응시킴으로써, 본 발명의 항체-약물 콘주게이트를 제조할 수 있다.
본 발명의 N297 당사슬에 있어서, 환원 말단의 푸코오스 부가한 GlcNAc-(Fucα1,6)GlcNAc) 는, 동물 세포로 산생된 항체에서 유래하고, 그것으로부터 비환원 말단측의 당사슬은, 상기 서술한 MSG (MSG1, MSG2) 또는 SG 와 동일한 당사슬 구조로 리모델링된 것이 바람직하다. 모두 그 비환원 말단의 시알산 2 위치에 결합한 카르복실산을 이용하여, L(PEG) 와 결합하고 있다.
이와 같은 MSG (MSG1, MSG2) 또는 SG 형 N297 당사슬을 갖는 당사슬 리모델링 항체는, 예를 들어 WO2013/120066 등에 기재된 방법에 준하여, 도 3 에 나타내는 바와 같은 방법으로 제조할 수 있다. 공지된 방법에 준하여 숙주로서 동물 세포를 사용하고, 유전자 조작 단백질로서 항체를 산생시킨 경우 (상기 공정 i), N297 당사슬은, 기본 구조로서 푸코오스 부가한 N 결합형 당사슬 구조를 갖지만, 비환원 말단의 구조나 구성당에 다양한 수식이 된 여러 가지 구조로 이루어지는 당사슬을 갖는 항체 또는 그 단편의 혼합물로서 얻어진다 (도 3a 의 IV). 이와 같이 동물 세포로 산생된 항체는, EndoS 등의 가수분해 효소로 처리함으로써, 환원 말단의 키토비오스 구조의 GlcNAcβ1-4GlcNAc 사이의 글리코사이드 결합이 가수분해되고, N297 당사슬로서 (Fucα1,6)GlcNAc 만을 갖는 단일한 당사슬 구조를 갖는 항체 분자 (「(Fucα1,6)GlcNAc-항체」라고 한다, 도 2 의 A 참조) 가 얻어진다 (도 3a) (상기 공정 ii)).
N297 당사슬의 가수분해 반응에 사용하는 효소로는, Endo S 또는 그 가수분해 활성을 유지한 변이 효소 등을 사용할 수 있다.
상기한 가수분해 반응에 의해서 얻어진 (Fucα1,6)GlcNAc-항체를 당사슬 억셉터 분자로서, EndoS D233Q 또는 EndoS D233Q/Q303L 변이체와 같은 당전이 효소 (WO2017010559 등) 를 사용하여 MSG (MSG1, MSG2) 또는 SG 형 당사슬 도너 분자와 반응시킴으로써, 상기 서술한 구조로 이루어지는 MSG (MSG1, MSG2) 또는 SG 형 N297 당사슬을 갖는 항체 (도 2 의 B 참조) 를 얻을 수 있다 (도 3b) (상기 공정 iii)-1, iii)-2).
항체-약물 콘주게이트에 있어서의 항체 1 분자당 약물 결합수 m1 이 1 인 경우, 당사슬로서 MSG (MSG1, MSG2) 를 갖는 당사슬 도너 분자를 채용한다. 이와 같은 당사슬은, 시판되는 monosialo-Asn free (1S2G/1G2S-10NC-Asn, (주) 당사슬 공학 연구소, 이하,「(MSG-)Asn」이라고 한다) 를 원료로 실시예 3 에 기재된 방법에 준하여 (MSG-)Asn1 또는 (MSG2-)Asn 을 분리하여 채용할 수도 있고, 분리하지 않고 혼합물로서 채용할 수도 있다.
항체-약물 콘주게이트에 있어서의 항체 1 분자당 약물 결합수 m1 이 2 인 경우, 이 당전이 반응에는 당사슬로서 SG(10) 을 갖는 당사슬 도너 분자를 사용한다. 이와 같은 SG(10) 당사슬은, 예를 들어 SGP 로부터 가수분해 등에 의해서 취득된 것을 사용해도 되고, 시판되는 디시알로옥타사카라이드 (토쿄 화성 공업 (주)) 와 같은 SG(10) 당사슬을 사용해도 된다.
도너 분자에 포함되는 MSG (MSG1, MSG2) 또는 SG 형 당사슬은 그 시알산의 2 위치에 아지드기를 함유하는 PEG 링커 (N3-L(PEG)) 를 갖는다.
도너 분자에 포함되는 MSG (MSG1, MSG2) 또는 SG 형 당사슬의 환원 말단의 GlcNAc 는, 예를 들어 2-클로로-1,3-디메틸-1H-벤즈이미다졸-3-이움-클로라이드 처리에 의한 옥사졸린화와 같은 형태로 활성화된 것을 사용하는 것이 바람직하다 (J. Org. Chem., 2009, 74 (5), 2210-2212).
당전이 반응에 사용하는 효소 (당전이 효소) 로는, N297 당사슬에 복합형 당사슬을 전이시키는 활성을 갖는 것이면 다양한 것을 채용할 수 있지만, 바람직한 것은 EndoS 의 233 회째의 Asp 를 Gln 으로 치환함으로써 가수분해 반응을 억제한 개변체인 EndoS D233Q 이다. EndoS D233Q 를 사용한 당전이 반응에 대해서는, WO2013/120066 등에 기재되어 있다. 또, EndoS D233Q 에 대해서, 추가로 변이를 가한 EndoS D233Q/Q303L 과 같은 개변체 효소 (WO2017010559) 를 이용해도 된다.
항체의 당사슬 리모델링 (당가수분해, 및 당사슬 전이 반응) 후의 항체의 정제 조작은, 반응에 사용한 저분자 화합물 및 효소와의 분리를 목적으로 하고, 이와 같은 정제에는, 통상적으로, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피 등이 사용되지만, 추가로 하이드록시 아파타이트 칼럼에 의한 추가 정제를 행해도 된다. 즉, 본 발명은, 항체의 당가수분해 후의 반응액으로부터의 중간체의 정제 공정에 있어서, 추가로 하이드록시 아파타이트 칼럼에 의한 정제 공정을 포함하는, 항체-약물 콘주게이트의 제조 방법을 제공한다. 당사슬 리모델링 보고예 (JACS. 2012, 134, 12308-12318., Angew. CheM. InT. Ed. 2016, 55, 2361-2367) 에 따르면, 항체를 가수분해 효소로 처리한 반응액을 프로테인 A 칼럼 (어피니티 크로마토그래피 칼럼) 으로 정제할 뿐이지만, 이 정제 방법에서는, 가수분해 효소 (EndoS 등) 를 완전히는 제거할 수 없고, 잔류 효소가 영향을 주어, 다음의 당전이 반응에 영향을 주는 것이 판명되었다. 여기에서, 정제법을 검토한 결과, 항체를 가수분해 효소로 처리한 반응액을 프로테인 A 칼럼, 하이드록시 아파타이트 칼럼 (CHT 칼럼, Bio-Rad Laboratories, Inc.) 의 순으로 정제함으로써, 잔류 효소의 영향 없이, 다음의 당사슬 전이 반응의 반응 효율이 향상되었다.
본 발명의 항체-약물 콘주게이트는, 가장 바람직하게는, 다음의 군에서 선택되는 하나의 항체-약물 콘주게이트이다.
[화학식 36]
Figure pct00036
[화학식 37]
Figure pct00037
[화학식 38]
Figure pct00038
[화학식 39]
Figure pct00039
상기에서 나타내는 각각의 구조식에 있어서, m1 은 1 또는 2 의 정수 (바람직하게는 m1 은 1 의 정수) 인 것을 나타내고,
항체 Ab 는, 항 CLDN6 항체, 항 CLDN9 항체, 항 CLDN6/CLDN9 항체, 항 HER2 항체, 항 HER3 항체, 항 DLL3 항체, 항 FAP 항체, 항 CDH11 항체, 항 A33 항체, 항 CanAg 항체, 항 CD19 항체, 항 CD20 항체, 항 CD22 항체, 항 CD25 항체, 항 CD30 항체, 항 CD33 항체, 항 CD37 항체, 항 CD56 항체, 항 CD70 항체, 항 CD98 항체, 항 B7-H3 항체, 항 TROP2 항체, 항 CEA 항체, 항 Cripto 항체, 항 EphA2 항체, 항 FGFR2 항체, 항 G250 항체, 항 MUC1 항체, 항 GPNMB 항체, 항 Integrin 항체, 항 PSMA 항체, 항 Tenascin-C 항체, 항 SLC44A4 항체, 항 Mesothelin 항체, 항 EGFR 항체, 항 5T4 항체, 항 LRRC15 항체, 항 DR5 항체, 항 CDH3 항체, 항 PDPN 항체, 또는 항 CD123 항체 (바람직하게는 상기 항 CLDN6 항체 또는 항 HER2 항체) 이고,
N297 당사슬은, N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 혹은 그것들의 혼합물 또는 N297-(Fuc)SG (바람직하게는 N297-(Fuc)MSG1) 중 어느 하나인 것을 나타내고,
L(PEG) 는, *-(CH2CH2-O)3-CH2CH2-NH- 인 것을 나타내고, 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 또는/및 1-6 사슬측 (바람직하게는 1-3 사슬측) 의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합을 통하여 결합하고 있고, 좌단의 애스터리스크는, 상기 구조식 중의 트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타낸다.
편의상, 상기 가장 바람직한 항체-약물 콘주게이트로서, 콘주게이트 1 분자 중에「N297 당사슬이 L 중의 Lb 의 트리아졸 고리 상의 1 위치의 질소 원자와 결합한『-(N297 당사슬)-L-D』(『(N297 당사슬)-(N1Lb)L-D』) 를 2 또는 4 개 (m2 = 1 또는 2) 갖거나,「3 위치의 질소 원자와 결합한『-(N297 당사슬)-L-D』 (『(N297 당사슬)-(N3Lb)L-D』)」를 2 또는 4 개 (m2 = 1 또는 2) 갖는 구조를 기재하고 있지만, 콘주게이트 1 분자 중에『(N297 당사슬)-(N1Lb)L-D』(m2 = 1 인 경우, 1 개, m2 = 2 인 경우, 1,2,3 개) 및『(N297 당사슬)-(N3Lb)L-D』(m2 = 1 인 경우, 1 개, m2 = 2 인 경우, 3,2,1 개) 의 양방을 갖는 항체-약물 콘주게이트도 포함한다. 즉, 콘주게이트 1 분자 중에『(N297 당사슬)-(N1Lb)L-D』나『(N297 당사슬)-(N3Lb)L-D』의 어느 일방만, 또는, 그 양방이 혼재하고 있다.
본 발명의 항체-약물 콘주게이트, 그 유리 약물 혹은 그 제조 중간체에는, 입체 이성체 혹은 부제 탄소 원자에서 유래하는 광학 이성체, 기하 이성체, 호변 이성체 또는 d 체, l 체, 아트로프 이성체 등의 광학 이성체가 존재하기도 하지만, 이들 이성체, 광학 이성체 및 이것들의 혼합물 모두가 본 발명에 포함된다.
본 발명의 항체-약물 콘주게이트는, 강한 종양 활성 (in vivo 항종양 활성, in vitro 항세포 활성), 양호한 체내 동태 및 물성을 나타내며, 또한 안전성이 높기 때문에, 의약품으로서 유용하다.
본 발명의 항체-약물 콘주게이트에 있어서, 항체 1 분자에의 약물의 결합수는, 그 유효성, 안전성에 영향을 주는 중요 인자이다. 항체-약물 콘주게이트의 제조는, 약물의 결합수가 일정한 수가 되도록, 반응시키는 원료·시약의 사용량 등의 반응 조건을 규정하여 실시되지만, 저분자 화합물의 화학 반응과는 달리, 상이한 수의 약물이 결합한 혼합물로서 얻어지는 것이 통상이다. 항체 1 분자에의 약물의 결합수는 평균치, 즉, 평균 약물 결합수 (DAR : Drug to Antibody Ratio) 로서 특정할 수 있다. 항체 분자에의 피롤로벤조디아제핀 유도체의 결합수는 컨트롤 가능하고, 1 항체당 평균 약물 결합수 (DAR) 로서, 1 내지 10 의 범위의 피롤로벤조디아제핀 유도체를 결합시킬 수 있지만, 바람직하게는 1 내지 8 개이고, 보다 바람직하게는 1 내지 5 개이다.
본 발명의 항체-약물 콘주게이트에 있어서, 항체가, 항체의 리모델링된 당사슬로부터 L 에 결합하고 있는 경우, 항체 약물 콘주게이트에 있어서의 항체 1 분자당 약물 결합수 m2 는 1 또는 2 의 정수이다. 당해 당사슬이 N297 당사슬이고, 당사슬이 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 또는 N297-(Fuc)MSG1 과 N297-(Fuc)MSG2 의 혼합물인 경우, m2 는 1 이고, DAR 은 1 ∼ 3 의 범위 (바람직하게는 1.0 ∼ 2.5 의 범위, 보다 바람직하게는 1.2 ∼ 2.2 혹은 1.6 ∼ 2.2 의 범위) 이다. N297 당사슬이, N297-(Fuc)SG 의 경우, m2 는 2 이고, DAR 은 3 ∼ 5 의 범위 (바람직하게는 3.2 ∼ 4.8 의 범위이고, 보다 바람직하게는 3.5 ∼ 4.2 의 범위) 이다.
또한, 당업자이면 본원의 실시예의 기재로부터 항체에 필요한 수의 약물을 결합시키는 반응을 설계할 수 있어, 피롤로벤조디아제핀 유도체의 결합수를 컨트롤 한 항체를 취득할 수 있다.
또한, 본 발명의 항체-약물 콘주게이트, 유리 약물 또는 제조 중간체는, 대기 중에 방치하거나, 또는 재결정함으로써, 수분을 흡수하여, 흡착수가 부착되거나 수화물이 되는 경우가 있고, 그와 같은 물을 포함하는 화합물 및 염도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 항체-약물 콘주게이트, 유리 약물 또는 제조 중간체가, 아미노기 등의 염기성기를 갖는 경우, 원하는 바에 따라서 의약적으로 허용되는 염으로 할 수 있다. 그와 같은 염으로는, 예를 들어 염산염, 요오드화수소산염 등의 할로겐화수소산염 ; 질산염, 과염소산염, 황산염, 인산염 등의 무기산염 ; 메탄술폰산염, 트리플루오로메탄술폰산염, 에탄술폰산염 등의 저급 알칸술폰산염 ; 벤젠술폰산염, p-톨루엔술폰산염 등의 아릴술폰산염 ; 포름산, 아세트산, 말산, 푸마르산염, 숙신산염, 시트르산염, 타르타르산염, 옥살산염, 말레산염 등의 유기산염 ; 및 오르니틴산염, 글루탐산염, 아스파르트산염 등의 아미노산염을 들 수 있다.
본 발명의 항체-약물 콘주게이트, 유리 약물 또는 제조 중간체가, 카르복실기 등의 산성기를 갖는 경우, 일반적으로 염기 부가염을 형성하는 것이 가능하다. 의약적으로 허용되는 염으로는, 예를 들어, 나트륨염, 칼륨염, 리튬염 등의 알칼리 금속염 ; 칼슘염, 마그네슘염 등의 알칼리 토금속염 ; 암모늄염 등의 무기염 ; 디벤질아민염, 모르폴린염, 페닐글리신알킬에스테르염, 에틸렌디아민염, N-메틸글루카민염, 디에틸아민염, 트리에틸아민염, 시클로헥실아민염, 디시클로헥실아민염, N,N'-디벤질에틸렌디아민염, 디에탄올아민염, N-벤질-N-(2-페닐에톡시)아민염, 피페라진염, 테트라메틸암모늄염, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄염 등의 유기 아민염 등을 들 수 있다.
본 발명의 항체-약물 콘주게이트, 유리 약물 또는 제조 중간체는, 공기 중의 수분을 흡수하는 것 등에 의해서 수화물로서 존재하기도 한다. 본 발명의 용매화물로는, 의약적으로 허용할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 구체적으로는, 수화물, 에탄올 수화물, 2-프로판올 수화물 등이 바람직하다. 또, 본 발명의 항체-약물 콘주게이트, 유리 약물 또는 제조 중간체 중에 질소 원자가 존재하는 경우에는 N-옥사이드체로 되어 있어도 되고, 이들 용매화물 및 N-옥사이드체도 본 발명의 범위에 포함된다.
또, 본 발명에는, 여러 가지의 방사성 또는 비방사성 동위체로 라벨된 화합물도 포함된다. 본 발명의 항체-약물 콘주게이트, 유리 약물 또는 제조 중간체를 구성하는 원자의 1 이상에, 원자 동위체의 비천연 비율도 함유할 수 있다. 원자 동위체로는, 예를 들어, 중수소 (2H), 트리튬 (3H), 요오드-125 (125I) 또는 탄소-14 (14C) 등을 들 수 있다. 또, 본 발명 화합물은, 예를 들어, 트리튬 (3H), 요오드-125 (125I) 또는 탄소-14 (14C) 와 같은 방사성 동위체로 방사성 표지될 수 있다. 방사성 표지된 화합물은, 치료 또는 예방제, 연구 시약, 예를 들어, 어세이 시약, 및 진단제, 예를 들어, 인비보 화상 진단제로서 유용하다. 본 발명의 항체-약물 콘주게이트의 모든 동위체 변이종은, 방사성인지의 여부를 불문하고, 본 발명의 범위에 포함된다.
[제조 방법]
R 법 : 항체의 조제
당사슬 리모델링 항체, 예를 들어 WO2013/120066 등에 기재된 방법에 준하여, 도 3 에 나타내는 바와 같은 방법으로 제조할 수 있다.
상기한 당사슬 리모델링 항체의 조제에 있어서, 항체 수용액의 농축, 농도 측정, 버퍼 교환은 이하의 공통 조작 A 내지 C 에 따라서 행할 수 있다.
(공통 조작 A : 항체 수용액의 농축)
Amicon Ultra (30,000 내지 50,000 MWCO, Millipore Co.) 의 용기 내에 항체 또는 항체-약물 콘주게이트 용액을 넣고, 원심기 (Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.) 를 사용한 원심 조작 (2000G 내지 4000G 로 5 내지 20 분간 원심) 으로, 항체 및 후술하는 항체-약물 콘주게이트 용액을 농축하였다.
(공통 조작 B : 항체의 농도 측정)
UV 측정기 (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.) 를 사용하여, 메이커 규정의 방법에 따라서, 항체 농도의 측정을 행하였다. 그 때, 항체마다 상이한 280 ㎚ 흡광 계수 (1.3 ㎖㎎-1㎝-1 내지 1.8 ㎖㎎-1㎝-1) 를 사용하였다.
(공통 조작 C : 항체의 버퍼 교환)
항체 수용액은 완충 용액 (인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0), 인산 완충액 (pH 6.0) 등) 을 첨가하고 공통 조작 A 를 이용하여 농축하였다. 이 조작을 수 회 행한 후, 공통 조작 B 를 이용하여 항체 농도의 측정을 행하고, 완충 용액 (인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0), 인산 완충액 (pH 6.0) 등) 을 사용하여 10 ㎎/㎖ 로 항체 농도를 조정하였다.
S 법 : 콘주게이션
본 제조법은, 상기 서술한 당사슬 리모델링 항체와 제조 중간체 (2) 를 SPAAC 반응 (strain-promoted alkyne azide cycloaddition : JACS. 2004, 126, 15046-15047) 에 의해서 결합시켜, 항체-약물 콘주게이트를 제조하는 방법이다.
[화학식 40]
Figure pct00040
식 중 Ab 는 당사슬 리모델링 항체를 나타내고,
La', Lp', B' 는, La, Lp, B 와 동일한 의미이며,
J 는, 이하에서 나타내는 어느 하나의 구조식을 나타내고,
식 중, 애스터리스크는 La' 와 결합하고 있는 것을 나타낸다.
[화학식 41]
Figure pct00041
J-La'-Lp'-NH-B'-CH2-O(C=O)-PBD 는 실시예 2-1 ∼ 2-6 에 기재된 방법 등에 의해서 합성할 수 있다.
항체 Ab 의 완충 용액 (아세트산나트륨 용액, 인산나트륨, 붕산나트륨 용액 등 또는 그것들의 혼합물) 과, 화합물 (2) 를 적당한 용매 (디메틸술폭사이드 (DMSO), 디메틸포름아미드 (DMF), 디메틸아세트아미드 (DMA), N-메틸-2-피리돈 (NMP), 프로필렌글리콜 (PG) 등 또는 그것들의 혼합물) 에 용해시킨 용액을 혼합함으로써, SPAAC 반응은 진행한다.
항체 1 몰에 대해서, 화합물 (2) 는 2 몰 내지 과잉 몰, 바람직하게는 1 몰내지 30 몰이고, 유기 용매의 비율은, 항체의 완충액에 대해서 1 내지 200 ％v/v 가 바람직하다. 반응 온도는 0 ℃ 내지 37 ℃, 바람직하게는 10 ℃ 내지 25 ℃ 이고, 반응 시간은 1 내지 150 시간, 바람직하게는 6 시간 내지 100 시간이다. 반응시의 pH 는 5 내지 9 가 바람직하다.
항체-약물 콘주게이트는, 전술한 공통 조작 A 내지 C 및 후술하는 공통 조작 D 내지 F 에 의해서 버퍼 교환, 정제, 항체 농도, 및 항체 1 분자당 약물 평균 결합수의 측정을 행하고, 항체-약물 콘주게이트 화합물 (ADC) 의 동정을 행할 수 있다.
공통 조작 D : 항체-약물 콘주게이트의 정제
시판되는 Sorbitol (5 ％) 을 포함하는 아세트산 완충액 (10 mM, pH 5.5 ; 본 명세서에서 ABS 로 칭한다) 으로 NAP-25 칼럼을 평형화시켰다. 이 NAP-25 칼럼에, 항체-약물 콘주게이트 반응 수용액 (약 1.5 ∼ 2.5 ㎖) 을 얹고, 메이커 규정의 양의 완충액으로 용출시킴으로써, 항체 획분을 분취하였다. 이 분취 획분을 다시 NAP-25 칼럼에 얹고, 완충액으로 용출시키는 겔 여과 정제 조작을 합계 2 내지 3 회 반복함으로써, 미결합의 약물 링커나 디메틸술폭사이드, 프로필렌글리콜을 제거한 항체-약물 콘주게이트를 얻었다. 필요에 따라서, 공통 조작 A 및 C 에 의해서 항체-약물 콘주게이트 용액의 농도를 조정하였다.
공통 조작 E : 항체-약물 콘주게이트에 있어서의 항체 농도의 측정
항체-약물 콘주게이트에 있어서의 결합 약물 농도는, 하기에 나타내는 램버트·비어의 법칙을 이용하여 산출할 수 있다.
이하에 램버트·비어의 법칙을 이용한 식 (I) 을 나타낸다.
Figure pct00042
여기에서, A280 는 항체-약물 콘주게이트 수용액의 280 ㎚ 에 있어서의 흡광도를 나타내고, ε280 은 항체-약물 콘주게이트의 280 ㎚ 에 있어서의 몰 흡광 계수를 나타내고, C(㏖·L-1) 는 항체-약물 콘주게이트의 몰 농도를 나타낸다.
상기 식 (I) 로부터 항체-약물 콘주게이트의 몰 농도 C(㏖·L-1) 는 이하의 식 (II) 로 구한다.
Figure pct00043
또한 양변에 항체-약물 콘주게이트의 몰질량 MW (g·㏖-1) 를 곱함으로써, 항체-약물 콘주게이트의 중량 농도 C' (㎎·㎖-1) 를 구할 수 있다 (식 (III)).
Figure pct00044
이하에, 상기 식에 사용하여 본 실시예에 적용한 각 값에 대해서 기재한다.
흡광도 A280 은, 항체-약물 콘주게이트 수용액의 280 ㎚ 에 있어서의 UV 흡광도의 실측값을 사용하였다. 몰질량 MW (g·㏖-1) 는 항체의 아미노산 서열로부터 구해지는 항체 분자량의 계산 추정값을 항체-약물 콘주게이트의 몰질량의 근사값으로서 사용하고 있다. 광로 길이 l (㎝) 은 1 ㎝ 로 측정하였다.
항체 약물 콘주게이트의 몰 흡광 계수 ε280 은, 이하의 식 (IV) 에 의해서 구할 수 있다.
Figure pct00045
여기에서, εAb,280 은 280 ㎚ 에 있어서의 항체의 몰 흡광 계수를 나타내고, εDL,280 은 280 ㎚ 에 있어서의 약물의 몰 흡광 계수를 나타낸다.
εAb,280 은 항체의 아미노산 서열로부터, 이미 알려진 계산 방법 (Protein Science, 1995, vol.4, 2411-2423) 에 의해서 추정할 수 있다. 실시예에 있어서, 트라스투주맙의 몰 흡광 계수는 εAb,280 = 215400 (계산 추정값) 을 사용하였다. CLDN6 항체의 몰 흡광 계수는, εAb,280 = 221340 (계산 추정값), TROP2 항체의 몰 흡광 계수는 εAb,280 = 226400 (계산 추정값), CD98 항체의 몰 흡광 계수는 εAb,280 = 240400 (계산 추정값), LPS 항체의 몰 흡광 계수는 εAb,280 = 230300 (계산 추정값) 을, 트라스투주맙 변이체의 몰 흡광 계수는 εAb,280 = 215057 (계산 추정값) 을 사용하였다.
εDL,280 은, 매회 UV 측정으로 얻은 실측값으로부터 산출한 것을 사용하였다. 즉, 콘주게이트 전구체 (약물) 를 어느 몰 농도로 용해시킨 용액의 흡광도를 측정하고, 램버트·비어의 법칙, 식 (I) 을 적용함으로써 얻어지는 값을 사용하였다.
(공통 조작 F : 항체-약물 콘주게이트에 있어서의 항체 1 분자당 약물 평균 결합수의 측정)
항체-약물 콘주게이트에 있어서의 항체 1 분자당 약물 평균 결합수는, 이하의 방법을 이용하는 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 분석에 의해서 구할 수 있다.
[F-1. HPLC 분석용 샘플의 조제 (항체-약물 콘주게이트의 환원)]
항체-약물 콘주게이트 용액 (약 1 ㎎/㎖, 60 ㎕) 을 디티오트레이톨 (DTT) 수용액 (100 mM, 15 ㎕) 과 혼합한다. 혼합물을 37 ℃ 에서 30 분 인큐베이트함으로써, 항체-약물 콘주게이트의 L 사슬 및 H 사슬 간의 디술파이드 결합을 절단한 샘플을, HPLC 분석에 사용한다.
[F-2. HPLC 분석]
HPLC 분석을, 하기의 측정 조건에서 행한다.
HPLC 시스템 : Agilent 1290 HPLC 시스템 (Agilent Technologies)
검출기 : 자외 흡광도계 (측정 파장 : 280 ㎚, 329 ㎚)
칼럼 : BEH Phenyl (2.1 × 50 ㎜, 1.7 ㎛, Waters Acquity)
칼럼 온도 : 75 ℃
이동상 A : 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 (TFA), 15 ％ 이소프로필알코올 수용액
이동상 B : 0.075 ％ TFA, 15 ％ 이소프로필알코올아세토니트릴 용액
그레이디언트 프로그램 : 14 ％ - 36 ％ (0 분 - 15 분), 36 ％ - 80 ％ (15 - 17 분), 80 ％ - 14 ％ (17 분 - 17.1 분), 14 ％ - 14 ％ (17.1 분 - 23 분)
샘플 주입량 : 5 ㎕
[F-3. 데이터 해석]
[F-3-1] 약물이 결합하고 있지 않은 항체의 H 사슬 ((H0)) 에 대해서, 약물이 결합한 H 사슬 (약물이 1 개 결합한 H 사슬 : H1, 약물이 2 개 결합한 H 사슬 : H2) 은, 결합한 약물의 수에 비례하여 소수성이 증가하여 유지 시간이 커지는 점에서, L0, H0, H1, H2 의 순으로 용출된다. L0, 및 H0 의 유지 시간 비교에 의해서 검출 피크를 L0, H0, H1, H2 중 어느 것에 할당할 수 있다. 또 약물의 결합은, 약물의 특징적인 329 ㎚ 의 파장 흡수에서도 확인할 수 있다.
[F-3-2] 약물 링커에 UV 흡수가 있기 때문에, 약물 링커의 결합수에 따라서, L 사슬, H 사슬 및 약물 링커의 몰 흡광 계수를 사용하여 하기 식에 따라서 피크 면적치를 보정한다.
Figure pct00046
여기에서, 각 항체에 있어서의 L 사슬 및 H 사슬의 몰 흡광 계수 (280 ㎚) 는, 이미 알려진 계산 방법 (Protein Science, 1995, vol.4, 2411-2423) 에 의해서, 각 항체의 L 사슬 및 H 사슬의 아미노산 서열로부터 추정되는 값을 사용할 수 있다. 트라스투주맙의 경우, 그 아미노산 서열에 따라서 H 사슬의 몰 흡광 계수로서 81290 을 추정값으로서 사용하였다. 동일하게, CLDN6 항체의 경우 H 사슬의 몰 흡광 계수로서 77280 을, TROP2 항체의 경우 H 사슬의 몰 흡광 계수로서 68990 을, CD98 항체의 경우 H 사슬의 몰 흡광 계수로서 78500 을, LPS 항체의 경우 H 사슬의 몰 흡광 계수로서 77470 을, 트라스투주맙 변이체의 경우 H 사슬의 몰 흡광 계수로서 81488 을, 약물 링커의 몰 흡광 계수 (280 ㎚) 는, 콘주게이트 전구체인 화합물 (1) 의 실측의 몰 흡광 계수 (280 ㎚) 를 사용하였다.
[F-3-3] 피크 면적 보정치 합계에 대한 각 사슬 피크 면적비 (％) 를 하기 식에 따라서 계산한다.
Figure pct00047
[F-3-4] 항체-약물 콘주게이트에 있어서의 항체 1 분자당 약물 평균 결합수를, 하기 식에 따라서 계산한다.
Figure pct00048
2. PARP 저해제
본 발명에 있어서「PARP 저해제」란, PARP (폴리아데노신5'2인산 (ADP) 리보스폴리메라아제) 를 저해함으로써, 1 본쇄 절단의 수복을 방해하는 기능을 갖는 약제이다 (Benafif S, et al., Onco. Targets Ther. (2015) 8, 519-528.) (Fong PC, et al., N. Engl. J. Med. (2009) 361, 123-134.) (Gelmon KA, et al., Lancet Oncol. (2011) 12, 852-861.). PARP 에는 복수의 서브 타입이 존재하지만, 본 발명에 있어서의 PARP 저해제는, 바람직하게는 PARP-1 및 PARP-2 를 저해한다. 본 발명에 있어서의 PARP 저해제는, PARP 를 저해함으로써, 1 본쇄 절단의 수복을 방해하는 기능을 갖는 약제이면 한정은 되지 않지만, 바람직하게는 올라파립 (Olaparib) (Menear KA, et al., J. Med. Chem. (2008) 51, 6581-6591.), 루카파립 (Rucaparib) (Gillmore AT, et al., Org. Process Res. Dev. (2012) 16, 1897-1904.), 니라파립 (Niraparib) (Jones P, et al., J. Med. Chem. (2009) 52, 7170-7185.), 탈라조파립 (Talazoparib) (Shen Y, et al., Clin. Cancer Res. (2013) 19 (18), 5003-15.), 벨리파립 (Veliparib), 파미파립 (㎩miparib), 및 플루조파립 (Fluzoparib), 그리고 그것들의 약리상 허용되는 염을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 올라파립, 루카파립, 니라파립, 및 탈라조파립, 그리고 그것들의 약리상 허용되는 염을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 PARP 저해제의「약리상 허용되는 염」은, 산 부가염과 염기 부가염 중 어느 것이어도 되지만, 바람직하게는 산 부가염이고, 예를 들어, 캄실산염 (캠퍼술폰산염), 메탄술폰산염, 트리플루오로메탄술폰산염, 및 에탄술폰산염 등의 저급 알칸술폰산염 ; 토실산염 (p-톨루엔술폰산염), 및 벤젠술폰산염 등의 아릴술폰산염 ; 인산염, 질산염, 과염소산염, 및 황산염 등의 무기산염 ; 염산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염, 및 불화수소산염 등의 할로겐화수소산염 ; 아세트산염, 말산염, 푸마르산염, 숙신산염, 시트르산염, 타르타르산염, 옥살산염, 및 말레산염 등의 유기산염 ; 그리고 오르니틴산염, 글루탐산염, 및 아스파르트산염 등의 아미노산염을 들 수 있다.
또, PARP 저해제 및 그 약리상 허용되는 염은, 용매화물로서 존재하기도 하고, 이들 용매화물도 본 발명에 있어서의 PARP 저해제 및 그 약리상 허용되는 염에 포함된다.
3. 의약
이하, 본 발명에 관련된 항체-약물 콘주게이트와 PARP 저해제가 조합되어 투여되는 것을 특징으로 하는 의약 조성물 및 치료 방법 (예방도 포함한다) 에 대해서 설명한다.
본 발명의 의약 조성물 및 치료 방법은, 항체-약물 콘주게이트와, PARP 저해제가, 각각 다른 제제에 유효 성분으로서 함유되고, 동시에 또는 상이한 시간에 투여되는 것을 특징으로 하는 것이어도 되며, 항체-약물 콘주게이트와 PARP 저해제가, 단일한 제제에 유효 성분으로서 함유되고, 투여되는 것을 특징으로 하는 것이어도 된다.
본 발명의 의약 조성물 및 치료 방법은, 암의 치료를 위해서 사용할 수 있고, 바람직하게는 유암, 위암 (위선암이라고 부르는 경우도 있다), 대장암 (결장 직장암이라고 부르는 경우도 있고, 결장암 및 직장암을 포함한다), 폐암 (소세포 폐암 및 비소세포 폐암을 포함한다), 식도암, 두경부암 (타액선암 및 인두암을 포함한다), 위식도 접합부 선암, 담도암 (담관암을 포함한다), 파제트병, 췌암, 난소암, 자궁암 육종, 요로 상피암, 전립선암, 방광암, 위장 간질 종양, 소화관 간질 종양, 자궁경암, 편평 상피암, 복막암, 간암, 간세포암, 자궁체암, 신암, 외음부암, 갑상선암, 음경암, 백혈병, 악성 림프종, 형질 세포종, 골수종, 다형 신경 교아종, 골육종, 및 멜라노마로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 치료를 위해서 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 유암, 위암, 대장암, 폐암, 식도암, 타액선암, 위식도 접합부 선암, 담도암, 페제트병, 췌암, 난소암, 방광암, 전립선암, 및 자궁암 육종으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 암의 치료를 위해서 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 항체-약물 콘주게이트 중, 특히 어떠한 항체를 갖는 항체-약물 콘주게이트가 바람직한지는, 암의 종류나, 종양 마커를 검사함으로써 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항 CLDN6 항체-약물 콘주게이트가 적용되는 암의 종류로는, 폐암 (비소세포 폐암, 소세포 폐암 등), 신암, 요로 상피암, 대장암, 전립선암, 다형 신경 교아종, 난소암 (표층 상피성 종양, 간질성 종양, 배세포 종양 등), 췌암, 유암, 멜라노마, 간암, 방광암, 위암, 식도암, 자궁체암, 정소암 (세미노마, 비세미노마), 자궁경암, 태반 융모암, 뇌종양, 두경부암 그리고 그것들의 전이성 형태 등, 항 HER2 항체-약물 콘주게이트가 적용되는 암의 종류로는, 폐암, 요로 상피암, 대장암, 전립선암, 난소암, 췌암, 유암, 방광암, 위암, 위장 간질 종양, 자궁경암, 식도암, 편평 상피암, 복막암, 간암, 간세포암, 결장암, 직장암, 결장 직장암, 자궁 내막암, 자궁암, 타액선암, 신암, 외음부암, 갑상선암, 또는 음경암 그리고 그것들의 전이성 형태 등을 들 수 있지만, 치료 대상이 되는 세포에 있어서 항체-약물 콘주게이트 중의 항체를 인식할 수 있는 단백질을 발현하고 있는 암 세포이면 이것들에 한정되는 경우는 없다.
몇 가지의 실시형태에 있어서, 암은, 상동적 재조합 (HR) 의존적 DNA 2 본쇄 파괴 (DSB) 수복 경로에 비의존적이다. DSB 수복 경로에 비의존적이라는 것은, DSB 수복 경로가 야생형이거나 변이형 (HR 의 기능이 결손 또는 저감한다) 중 어느 것이어도 되는 것을 의미한다. HR 에 있어서 기능할 수 있는 유전자로는, BRCA1, BRCA2, BLM, RBBP8, DNA 폴리메라아제 δ (POLD1 ∼ 4), POLH, DNA2, EME1, ERCC1, EXO1, FANCM, GEN1, MRE11, MUS81, NBS1, PALB2, PCNA, RAD50, RAD51, RAD51AP1, RAD51B, RAD51C, RAD51D, RAD54, RAD54B, RM11, RM12, RPA, RTEL1, SLX1, SLX2, SLX4, TOP2A, XPF, XRCC2, XRCC3 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 암은 BRCA1 또는 BRCA2 에 비의존적이다.
본 발명의 항체-약물 콘주게이트와 PARP 저해제는 조합하여 투여됨으로써, DSB 수복 경로의 변이의 유무에 관계없이, 세포 증식 억제 효과를 나타낸다.
한 종류의 실시형태에 있어서, 암은 PARP 저해제에 비감수성이거나, 암은 PARP 저해제에 비감수성이며 또한 상동적 재조합 (HR) 의존적 DNA 2 본쇄 파괴 (DSB) 수복 경로에 비의존적이다.
다른 실시형태에 있어서, DNA 마이너 그루브에 있어서 크로스 링크를 형성하지 않는 PBD 유도체를 포함하는 항체-약물 콘주게이트와 PARP 저해제를 조합하여 투여하는 것을 특징으로 하는 암 치료를 위한 의약 조성물 또는 암의 치료 방법으로서,
암은 PARP 저해제에 비감수성이거나, 상동적 재조합 (HR) 의존적 DNA 2 본쇄 파괴 (DSB) 수복 경로에 비의존적이거나, PARP 저해제에 비감수성이며 또한 상동적 재조합 (HR) 의존적 DNA 2 본쇄 파괴 (DSB) 수복 경로에 비의존적이다.
본 발명의 의약 조성물 및 치료 방법은, 포유 동물에 대해서 바람직하게 사용할 수 있지만, 보다 바람직하게는 인간에 대해서 사용할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물 및 치료 방법의 항종양 효과는, 예를 들어, 암 세포를 피검 동물에게 이식한 모델을 제작하고, 본 발명의 의약 조성물 및 치료 방법을 실시하는 것에 의한 종양 체적의 감소나 연명 효과를 측정함으로써 확인할 수 있다. 그리고, 본 발명에서 사용되는 항체-약물 콘주게이트 및 PARP 저해제 각각의 단독 투여에서의 항종양 효과와 비교함으로써, 본 발명에서 사용되는 항체-약물 콘주게이트 및 PARP 저해제의 병용 효과를 확인할 수 있다.
또, 본 발명의 의약 조성물 및 치료 방법의 항종양 효과는, 임상 시험에 있어서, Response Evaluation Criteriain Solid Tumors (RECIST) 평가법, WHO 평가법, Macdonald 평가법, 체중 측정, 및 그 밖의 수법에 의해서 확인할 수 있고, 완전 효과 (Complete response ; CR), 부분 주효 (奏效) (㎩rtial response ; PR), 진행 (Progressive disease ; PD), 주효율 (Objective Response Rate ; ORR), 주효 기간 (Duration of response ; DoR), 무진행 생존 기간 (Progression-Free Survival ; PFS), 전체 생존 기간 (Overall Survival ; OS) 등의 지표에 의해서 판정할 수 있다.
상기 서술한 방법에 의해서, 본 발명의 의약 조성물 및 치료 방법의 항종양 효과에 대해서, 기존의 암 치료용 의약 조성물 및 치료 방법에 대한 우위성을 확인할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물 및 치료 방법은, 암 세포의 성장을 지연시켜 증식을 억제하고, 나아가서는 암 세포를 파괴할 수 있다. 이들 작용에 의해서, 암 환자에 있어서, 암에 의한 증상으로부터의 해방이나, QOL 의 개선을 달성할 수 있고, 암 환자의 생명을 유지하여 치료 효과를 달성된다. 암 세포의 파괴에는 이르지 않는 경우여도, 암 세포의 증식 억제나 컨트롤에 의해서 암 환자에 있어서 보다 높은 QOL 을 달성하면서 보다 장기의 생존을 달성시킬 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은, 환자에 대해서는 전신 요법으로서 적용하는 것 외에, 암조직에 국소적으로 적용하여 치료 효과를 기대할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은, 1 종 이상의 약학적으로 적합성의 성분을 함유하여 투여될 수 있다. 약학적으로 적합성의 성분은, 본 발명에서 사용되는 항체-약물 콘주게이트 및 PARP 저해제의 투여량이나 투여 농도 등에 따라서, 이 분야에서 통상적으로 사용되는 제제 첨가물, 기타로부터 적절히 선택하여 적용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 사용되는 항체-약물 콘주게이트는, 히스티딘 완충제 등의 완충제, 수크로오스 또는 트레할로스 등의 부형제, 그리고 폴리소르베이트 80 또는 20 등의 계면 활성제를 함유하는 의약 조성물로서 투여될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항체-약물 콘주게이트를 포함하는 의약 조성물은, 바람직하게는 주사제로서 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 수성 주사제 또는 동결 건조 주사제로서 사용할 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 동결 건조 주사제로서 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 항체-약물 콘주게이트를 포함하는 의약 조성물이 수성 주사제인 경우, 바람직하게는 적절한 희석액으로 희석한 후, 정맥 내에 점적 투여할 수 있다. 희석액으로는, 포도당 용액이나, 생리 식염액 등을 들 수 있고, 바람직하게는 포도당 용액을 들 수 있으며, 보다 바람직하게는 5 ％ 포도당 용액을 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 항체-약물 콘주게이트를 포함하는 의약 조성물이 동결 건조 주사제인 경우, 바람직하게는 주사용수에 의해서 용해한 후, 필요량을 적절한 희석액으로 희석한 후, 정맥 내에 점적 투여할 수 있다. 희석액으로는, 포도당 용액이나, 생리 식염액 등을 들 수 있고, 바람직하게는 포도당 용액을 들 수 있으며, 보다 바람직하게는 5 ％ 포도당 용액을 들 수 있다.
본 발명의 의약 조성물을 투여하기 위해서 사용될 수 있는 도입 경로로는, 예를 들어, 정맥 내, 피내, 피하, 근육 내, 및 복강 내의 경로를 들 수 있고, 바람직하게는 정맥 내의 경로를 들 수 있다.
의약 조성물의 조성 및 농도는 투여 방법에 따라서도 변화되지만, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항체-약물 콘주게이트는, 항체-약물 콘주게이트의 항원에 대한 친화성, 즉, 항원에 대한 해리 정수 (Kd 값) 의 관점에서, 친화성이 높을 (Kd 값이 낮을) 수록, 소량의 투여량이어도 약효를 발휘시킬 수 있다. 따라서, 항체-약물 콘주게이트의 투여량의 결정에 있어서는, 항체-약물 콘주게이트와 항원의 친화성의 상황에 기초하여 투여량을 설정할 수도 있다. 본 발명의 항체-약물 콘주게이트를 인간에 대해서 투여할 때에는, 예를 들어, 약 0.001 ∼ 100 ㎎/㎏ 을 1 회 혹은 1 ∼ 180 일 동안 1 회의 간격으로 복수 회 투여하면 된다.
본 발명에 관련된 PARP 저해제는, 인간에 대해서, 1 ∼ 7 일에 1 ∼ 2 회의 간격으로 투여할 수 있고, 바람직하게는 1 일에 1 회, 또는 1 일에 2 회의 간격으로 투여할 수 있다. 또, 본 발명에서 사용되는 PARP 저해제는, 1 회당 0.1 ㎎ ∼ 3000 ㎎ 의 투여량으로 투여할 수 있고, 바람직하게는 1 회당 0.25 ㎎ ∼ 600 ㎎ 의 투여량으로 투여할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 PARP 저해제가 올라파립 또는 그 약리상 허용되는 염인 경우, 바람직하게는 1 회당, 100 ㎎, 150 ㎎, 200 ㎎, 또는 300 ㎎ 의 투여량을 1 일에 2 회의 간격으로 경구 투여할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 PARP 저해제가 루카파립 또는 그 약리상 허용되는 염인 경우, 바람직하게는 1 회당, 200 ㎎, 250 ㎎, 300 ㎎, 400 ㎎, 500 ㎎ 또는 600 ㎎ 의 투여량을 1 일에 2 회의 간격으로 경구 투여할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 PARP 저해제가 니라파립 또는 그 약리상 허용되는 염인 경우, 바람직하게는 1 회당, 100 ㎎, 200 ㎎, 또는 300 ㎎ 의 투여량을 1 일에 1 회의 간격으로 경구 투여할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 PARP 저해제가 탈라조파립 또는 그 약리상 허용되는 염인 경우, 바람직하게는 1 회당, 0.25 ㎎, 0.5 ㎎, 또는 1 ㎎ 의 투여량을 1 일에 1 회의 간격으로 경구 투여할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물 및 치료 방법은, 본 발명에 관련된 항체-약물 콘주게이트 및 PARP 저해제 이외의 암 치료제를 추가로 포함하고 있어도 된다. 본 발명의 의약 조성물 및 치료 방법은, 다른 암 치료제와 병용하여 투여할 수도 있고, 이로써 항종양 효과를 증강시킬 수 있다. 이와 같은 목적에서 사용되는 다른 암 치료제는, 본 발명의 의약 조성물과 동시에, 따로 따로, 혹은 연속하여 개체에 투여되어도 되고, 각각의 투여 간격을 변경하여 투여되어도 된다. 이와 같은 암 치료제로는, 항종양 활성을 갖는 약제이면 한정되지는 않는데, 예를 들어, 이리노테칸 (Irinotecan, CPT-11), 시스플라틴 (Cisplatin), 카르보플라틴 (Carboplatin), 옥살리플라틴 (Oxaliplatin), 플루오로우라실 (Fluorouracil, 5-FU), 젬시타빈 (Gemcitabine), 카페시타빈 (Capecitabine), 독소루비신 (Doxorubicin), 에피루비신 (Epirubicin), 시클로포스파미드 (Cyclophosphamide), 마이토마이신C (MitomycinC), 테가푸르 (Tegafur)·기메라실 (Gimeracil)·오테라실 (Oteracil) 배합제, 세툭시맙 (Cetuximab), 파니투무맙 (㎩nitumumab), 베바시주맙 (Bevacizumab), 라무시르맙 (Ramucirumab), 레고라페닙 (Regorafenib), 트리플루리딘 (Trifluridine)·티피라실 (Ti piracil) 배합제, 게피티닙 (Gefitinib), 에를로티닙 (Erlotinib), 아파티닙 (Afatinib), 메토트렉세이트 (Methotrexate), 페멕트렉시드 (Pemetrexed), 트라스투주맙, 페르투주맙, 및 라파티닙으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 들 수 있다.
본 발명의 의약 조성물 및 치료 방법은, 방사선 요법과 조합하여 사용할 수도 있다. 예를 들어, 암 환자는, 본 발명의 의약 조성물에 의한 치료를 수용하기 전 및/또는 후, 혹은 동시에 방사선 요법을 받는다.
본 발명의 의약 조성물 및 치료 방법은, 외과 수술과 조합하여 보조 화학 요법으로서 사용할 수도 있다. 본 발명의 의약 조성물은 외과 수술전에 종양의 크기를 줄이는 목적에서 투여되어도 되고 (수술전 보조 화학 요법, 또는 네오아쥬반트 요법이라고 한다), 외과 수술후에, 종양의 재발을 방지하는 목적에서 투여되어도 된다 (수술후 보조 화학 요법, 또는 아쥬반트 요법이라고 한다).
실시예
이하에 나타내는 예에 의해서 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이것들에 한정되는 것은 아니다. 또, 이것들은 어떠한 의미에서도 한정적으로 해석되는 것은 아니다.
참고예 1 : 항 HER2 항체 트라스투주맙
항 HER2 항체는 US5821337 을 참조하여 제조하였다. 트라스투주맙의 경사슬 및 중사슬의 아미노산 서열을 서열 번호 64 및 서열 번호 65 에 나타내었다.
참고예 2 : 항 TROP2 항체 hRS7
항 TROP2 항체는 WO2003/074566, WO2015/098099 (참고예 1) 를 참조하여 제조하였다. hRS7 의 경사슬 및 중사슬의 아미노산 서열을 서열 번호 68 및 서열 번호 69 에 나타내었다.
[제조 중간체 (약물 링커) 의 합성]
실시예 1
[실시예 1-1 : 중간체 1]
[화학식 42]
Figure pct00049
공정 1 : 벤질(6S)-6-(하이드록시메틸)-5-아자스피로[2.4]헵탄-5-카르복실레이트 (1-2)
5-벤질6-메틸(6S)-5-아자스피로[2.4]헵탄-5,6-디카르복실레이트 (1-1) (104 m㏖, WO2012087596) 의 테트라하이드로푸란 (500 ㎖) 용액에, 수소화붕소리튬 (4.30 g, 178 m㏖) 을 0 ℃ 에서 소량씩 첨가하였다. 0 ℃ 에서 30 분 교반한 후, 실온에서 2 시간 교반하였다. 0 ℃ 에서 물 (180 ㎖), 2 규정 염산 (186 ㎖) 을 첨가하여 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 아세트산에틸로 4 회 추출하고, 유기층을 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물 (1-2) (27.9 g, 90 ％) 를 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
공정 2 : 벤질(6S)-6-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-5-아자스피로[2.4]헵탄-5-카르복실레이트 (1-3)
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (1-2) (27.9 g, 107 m㏖) 와 이미다졸 (14.5 g, 214 m㏖) 의 디클로로메탄 (300 ㎖) 용액에, 실온에서 tert-부틸디메틸실릴클로라이드 (24.2 g, 160 m㏖) 를 첨가하여, 실온에서 18 시간 교반하였다. 반응 용액을 포화 시트르산 수용액, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시킨 후, 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 50 : 50 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (1-3) (32.5 g, 81 ％) 을 얻었다.
Figure pct00050
공정 3 : (6S)-6-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-5-아자스피로[2.4]헵탄 (1-4)
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (1-3) (32.5 g, 86.5 m㏖) 의 에탄올 (400 ㎖) 용액에, 실온에서 7.5 ％ 팔라듐탄소 촉매 (54 ％ 수분, 5.00 g) 를 첨가하여, 실온, 수소 분위기 하에서 6 시간 교반하였다. 반응 용액을 셀라이트 여과하고, 여과액을 감압 증류 제거하여, 목적물 (1-4) (21.3 g, 정량적) 를 얻었다.
Figure pct00051
공정 4 : [(6S)-6-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일](5-메톡시-2-니트로-4-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}페닐)메탄온 (1-5)
5-메톡시-2-니트로-4-{트리(프로판-2-일)실릴]옥시}벤조산 (52.2 g, 141 m㏖, US20150283262) 과 1-하이드록시벤조트리아졸 1 수화물 (23.8 g, 155 m㏖) 의 디클로로메탄 (500 ㎖) 용액에, 빙랭 하에서 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (35.0 g, 170 m㏖) 를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 카르복실산 소실 후, -60 ℃ 에서 상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (1-4) (34.1 g, 141 m㏖) 와 트리에틸아민 (29.4 ㎖, 212 m㏖) 의 디클로로메탄 (100 ㎖) 용액을 천천히 적하하였다. 반응 용액을 실온에서 하룻밤 교반한 후, 반응 혼합물에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 물 및 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물에 아세트산에틸과 디에틸에테르를 첨가하고, 고체 성분을 여과에 의해서 제거하고, 여과액을 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 25 : 75 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (1-5) (55.0 g, 66 ％) 를 얻었다.
Figure pct00052
공정 5 : (2-아미노-5-메톡시-4-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}페닐)[(6S)-6-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]메탄온 (1-6)
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (1-5) (55.0 g, 92.8 m㏖) 의 에탄올 (300 ㎖) 용액에, 질소 분위기 하에서, 7.5 ％ 팔라듐탄소 (10.0 g) 를 첨가하였다. 질소 풍선을 즉시 수소 풍선으로 교체 부착하고, 반응 혼합물을 수소 분위기 하, 실온에서 격렬하게 교반하였다. 원료 소실 후, 반응 혼합물을 여과하고, 여과액을 감압 증류 제거하고, 얻어진 목적물 (1-6) (52.2 g, 100 ％) 을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
Figure pct00053
공정 6 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]카르보닐}-4-메톡시-5-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}페닐)카르바모일]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드 (1-7)
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (1-6) (18.6 g, 33.0 m㏖) 및 트리에틸아민 (6.26 ㎖, 45.2 m㏖) 의 THF (300 ㎖) 용액에, 에탄올-빙욕 상에서, 트리포스겐 (4.22 g, 14.2 m㏖) 을 천천히 첨가하였다. 첨가 후, 빙랭한 반응 혼합물에, N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-[4-(하이드록시메틸)페닐]-L-알라닌아미드 (11.4 g, 30.2 m㏖, WO2011130598) 와 트리에틸아민 (6.26 ㎖, 45.2 m㏖) 의 테트라하이드로푸란 (100 ㎖), N,N-디메틸포름아미드 (30 ㎖) 혼합 용액을 천천히 적하하였다. 적하 후, 빙욕을 제거하고, 반응 혼합물을, 질소 분위기 하, 40 ℃ 에서 교반하였다. 원료 소실 후, 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 반응 혼합물을 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 여과 후, 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 40 : 60 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (1-7) (23.5 g, 74 ％) 을 얻었다.
Figure pct00054
공정 7 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-(하이드록시메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]카르보닐}-4-메톡시-5-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}페닐)카르바모일]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드 (1-8)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (1-7) (23.5 g, 24.3 m㏖) 의 테트라하이드로푸란 (50 ㎖), 메탄올 (50 ㎖), 물 (44 ㎖) 용액에, 실온 하에서 아세트산 (200 ㎖) 을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 원료 소실 후, 반응 혼합물을 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 물 및 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 여과 후, 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 0 : 100 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (1-8) (18.0 g, 87 ％) 을 얻었다.
Figure pct00055
공정 8 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-8'-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드 (1-9)
디메틸술폭사이드 (3.75 ㎖, 52.8 m㏖) 의 디클로로메탄 (300 ㎖) 용액에, 질소 분위기 하, -78 ℃ 에서, 염화옥살릴 (2.17 ㎖, 25.3 m㏖) 을 천천히 적하하였다. 적하 후, 반응 혼합물을 -78 ℃ 에서 교반하였다. 반응 혼합물에, 상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (1-8) (18.0 g, 21.1 m㏖) 의 디클로로메탄 (50.0 ㎖) 용액을 천천히 적하하였다. 반응 용액에 -78 ℃ 에서, 트리에틸아민 (14.6 ㎖, 105 m㏖) 을 첨가하였다. 첨가 후, 냉매욕을 제거하고, 실온까지 천천히 승온하였다. 원료 소실 후, 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 반응 혼합물을 클로로포름 (200 ㎖) 으로 추출하였다. 유기층을 물 및 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 여과 후, 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 0 : 60 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (1-9) (16.5 g, 92 ％) 를 얻었다.
Figure pct00056
공정 9 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-5'-옥소-8'-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드 (1-10)
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (1-9) (12.0 g, 14.1 m㏖) 및 2,6-루티딘 (6.58 ㎖, 56.5 m㏖) 의 디클로로메탄 (200 ㎖) 용액에, 질소 분위기 하, 0 ℃ 에서, 트리플루오로메틸술폰산 tert-부틸디메틸실릴 (9.73 ㎖, 42.3 m㏖) 을 천천히 적하하였다. 빙랭 하, 10 분간 교반한 후에, 빙욕을 제거하고, 실온에서 교반하였다. 원료 소실 후, 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 반응 혼합물을 클로로포름으로 추출한 물 및 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 여과 후, 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 25 : 75 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (1-10) (8.12 g, 60 ％) 을 얻었다.
Figure pct00057
공정 10 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-8'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드 (1-11)
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (1-10) (8.12 g, 8.42 m㏖) 의 N,N-디메틸포름아미드 (90 ㎖), 물 (2 ㎖) 용액에, 아세트산리튬 (0.611 g, 9.26 m㏖) 을 첨가하여, 실온 하에서 교반하였다. 원료 소실 후, 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 반응 혼합물을 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 물 및 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 여과 후, 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 0 : 100 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (1-11) (5.48 g, 81 ％) 을 얻었다.
Figure pct00058
Figure pct00059
화합물 (1-11) 에 대해서 selective 1D ROESY 스펙트럼으로 얻어진 상관 (하기 도면) 으로부터, 11' 위치의 절대 입체 배치의 해석을 행하였다. 1'α-H 와 11'-H, 3'α-H 와 11'-H, 및 1'β-H 와 3'β-H 사이에 상관이 확인되는 점에서, 11' 위치의 절대 입체 배치는 S 배치인 것을 알 수 있다.
[화학식 43]
Figure pct00060
따라서, 화합물 (1-11), 그것과 동일한 절대 입체 배치를 갖는 화합물 (1-9) 및 화합물 (1-10), 화합물 (1-11) 을 사용하여 합성된 화합물 (3-11), 화합물 (3-12), 화합물 (3-13) 및 약물 링커 1 (화합물 (3-14)), 화합물 (4-9), 화합물 (4-10), 화합물 (4-11) 및 약물 링커 2 (화합물 (4-12)), 그리고, 화합물 (6-10), 화합물 (6-11), 화합물 (6-12) 및 약물 링커 4 (화합물 (6-13)) 에 있어서의 11' 위치의 절대 입체 배치는 S 배치인 것을 알 수 있다. 또, 동일한 합성 수법으로 얻어지는 화합물 (5-9), 화합물 (5-10) 및 약물 링커 3 (화합물 (5-11)) 의 11' 위치의 절대 입체 배치는 S 배치로 결정하였다.
[실시예 1-2 : 중간체 2]
[화학식 44]
Figure pct00061
공정 1 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리신 (2-2)
글리실글리신 (0.328 g, 2.49 m㏖), N,N-디이소프로필에틸아민 (0.433 ㎖, 2.49 m㏖) 의 N,N-디메틸포름아미드 (20 ㎖) 용액에, 1-{[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]옥시}피롤리딘-2,5-디온 (2-1) (1.00 g, 2.49 m㏖, Click Chemistry Tools), 물 (10 ㎖) 을 실온에서 첨가하고, 동 온도에서 하룻밤 교반하였다. 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 ∼ 클로로포름 : 메탄올 : 물 = 7 : 3 : 1 (v/v/v) 의 분배 유기층] 로 정제하여, 목적물 (0.930 g, 89 ％) 을 얻었다.
Figure pct00062
실시예 2
[실시예 2-1 : 약물 링커 1]
[화학식 45]
Figure pct00063
공정 1 : (2R,11aS)-2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-8-하이드록시-7-메톡시-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-2,3-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온 (3-2)
(2R,11aS)-8-(벤질옥시)-2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-메톡시-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-2,3-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온 (3-1) (25.5 g, 41.6 m㏖, WO2016149546) 의 테트라하이드로푸란 (150 ㎖), 에탄올 (150 ㎖) 용액에, 질소 분위기 하, 5 ％ 팔라듐탄소 (54 ％ 수분, 10.0 g) 를 첨가한 후, 반응 용액을 수소 분위기 하, 실온에서 3 일간 교반하였다. 반응 용액에 클로로포름을 첨가하고, 셀라이트 여과한 후, 여과액을 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 50 : 50 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (3-2) (19.4 g, 89 ％) 를 얻었다.
Figure pct00064
공정 2 : (2R,11aS)-8-[(5-브로모펜틸)옥시]-2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-메톡시-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-2,3-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온 (3-3)
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (3-2) (10.8 g, 20.7 m㏖) 의 N,N-디메틸포름아미드 (30 ㎖) 용액에, 1,5-디브로모펜탄 (23.8 g, 103 m㏖), 탄산칼륨 (3.43 g, 24.8 m㏖) 을 실온에서 첨가하였다. 실온에서 3 시간 교반한 후, 반응 용액에 물을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 얻어진 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 황산나트륨으로 건조시킨 후, 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 90 : 10 (v/v) ∼ 50 : 50 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (3-3) (14.5 g, 정량적) 을 얻었다.
Figure pct00065
공정 3 : (2R,11aS)-8-[(5-브로모펜틸)옥시]-2-하이드록시-7-메톡시-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-2,3-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온 (3-4)
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (3-3) (21.5 m㏖) 의 테트라하이드로푸란 (40 ㎖) 용액에, 1 ㏖/ℓ 의 테트라부틸암모늄플로라이드 테트라하이드로푸란 용액 (28.0 ㎖, 28.0 m㏖) 을 0 ℃ 에서 첨가하였다. 실온에서 30 분간 교반한 후, 반응 용액에 물을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하여, 얻어진 유기층을 포화 식염수로 세정하였다. 황산나트륨으로 건조시킨 후, 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 : 메탄올 = 97.5 : 2.5 (v/v) ∼ 92.5 : 7.5 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (3-4) (11.3 g, 94 ％) 를 얻었다.
Figure pct00066
공정 4 : (11aS)-8-[(5-브로모펜틸)옥시]-7-메톡시-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2,5,11(3H,10H,11aH)-트리온 (3-5)
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (3-4) (11.3 g, 20.2 m㏖), 테트라부틸암모늄브로마이드 (0.325 g, 1.01 m㏖), 브롬화칼륨 (0.240 g, 2.02 m㏖,) 을 포화 탄산수소나트륨 수용액 (60 ㎖), 디클로로메탄 (60 ㎖) 에 용해시키고, nor-AZADO (0.0279 g, 0.202 m㏖), 차아염소산나트륨 5수화물 (2.03 g, 27.2 m㏖) 을 0 ℃ 에서 첨가하고, 0 ℃ 에서 30 분간 교반하였다. 원료가 잔존했기 때문에, 차아염소산나트륨 5수화물 (1.00 g, 13.4 m㏖) 을 0 ℃ 에서 첨가하고, 0 ℃ 에서 15 분 교반하였다. 추가로 차아염소산나트륨 5수화물 (0.300 g, 4.03 m㏖) 을 0 ℃ 에서 첨가하고, 0 ℃ 에서 15 분 교반하여, 원료의 소실을 TLC 로 확인하였다. 반응 용액에 티오황산나트륨 수용액을 첨가하고, 클로로포름으로 추출하여, 얻어진 유기층을 황산나트륨으로 건조시켰다. 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 75 : 25 (v/v) ∼ 40 : 60 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (3-5) (9.74 g, 87 ％) 를 얻었다.
Figure pct00067
공정 5 : (11aS)-8-[(5-브로모펜틸)옥시]-7-메톡시-5,11-디옥소-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2-일 트리플루오로메탄술포네이트 (3-6)
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (3-5) (9.74 g, 17.5 m㏖) 의 디클로로메탄 (160 ㎖) 용액에, 2,6-루티딘 (8.17 ㎖, 70.1 m㏖) 을 -40 ℃ 에서 첨가하고, -40 ℃ 에서 10 분간 교반하였다. 반응 용액에 무수 트리플루오로메탄술폰산 (8.85 ㎖, 52.6 m㏖) 을 -40 ℃ 에서 첨가하고, -40 ℃ 에서 30 분간 교반하였다. 반응 용액에 10 ％ 시트르산 수용액을 첨가하고, 클로로포름으로 추출하여, 얻어진 유기층을 황산나트륨으로 건조시켰다. 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 95 : 5 → 70 : 35] 로 정제한 후, NH2 실리카 겔 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 95 : 5 (v/v) ∼ 65 : 35 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (3-6) (7.10 g, 59 ％) 을 얻었다.
Figure pct00068
공정 6 : (11aS)-8-[(5-브로모펜틸)옥시]-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온 (3-7)
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (3-6) (2.00 g, 2.91 m㏖), 4-메톡시페닐보론산 (0.884 g, 5.82 m㏖), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (0.336 g, 0.291 m㏖), 탄산나트륨 (1.23 g, 11.6 m㏖) 의 혼합물에 톨루엔 (20 ㎖), 에탄올 (10 ㎖), 물 (10 ㎖) 을 실온에서 첨가하였다. 반응 용액을 실온에서 30 분 교반한 후, 반응 용액을 아세트산에틸로 추출하고, 물, 포화 식염수로 세정하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조 후, 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 90 : 10 (v/v) ∼ 50 : 50 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (3-7) (1.71 g, 91 ％) 을 얻었다.
Figure pct00069
공정 7 : (11aS)-8-[(5-브로모펜틸)옥시]-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-1,11a-디하이드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온 (3-8)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (3-7) (0.789 g, 1.22 m㏖) 을 에탄올 (10 ㎖), 테트라하이드로푸란 (10 ㎖) 으로 용해하고, 2.0 M 의 수소화붕소리튬테트라하이드로푸란 용액 (6.11 ㎖, 12.2 m㏖) 을 0 ℃ 에서 첨가하고, 0 ℃ 에서 3 시간 교반하였다. 반응 용액에 물을 첨가하고, 클로로포름으로 추출하여, 얻어진 유기층을 황산나트륨으로 건조시켰다. 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 디클로로메탄 (10 ㎖), 에탄올 (20 ㎖), 물 (10 ㎖) 로 용해하고, 실리카 겔 (4 g) 을 실온에서 첨가하여, 실온에서 4 일간 교반하였다. 실리카 겔을 여과에 의해서 제거하고, 물을 첨가하고, 클로로포름으로 추출하여, 얻어진 유기층을 황산나트륨으로 건조시켰다. 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 60 : 40 (v/v) ∼ 25 : 75 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (3-8) (0.496 g, 81 ％) 을 얻었다.
Figure pct00070
공정 8 : (11aS)-8-[(5-브로모펜틸)옥시]-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-1,10,11,11a-테트라하이드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온 (3-9)
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (3-8) (0.496 g, 0.992 m㏖) 의 디클로로메탄 (20 ㎖) 용액에 나트륨트리아세톡시보로하이드라이드 (0.421 g, 1.99 m㏖) 를 0 ℃ 에서 첨가하였다. 실온에서 2 시간 교반한 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 감압 증류 제거한 후, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 60 : 40 (v/v) ∼ 25 : 75 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (3-9) (0.426 g, 86 ％) 를 얻었다.
Figure pct00071
공정 9 : 프로프-2-엔-1-일 (11aS)-8-[(5-브로모펜틸)옥시]-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-11,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 (3-10)
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (3-9) (0.426 g, 0.849 m㏖) 의 디클로로메탄 (30 ㎖) 용액에, 피리딘 (0.102 ㎖ 1.27 m㏖), 클로로포름산알릴 (0.374 ㎖, 3.54 m㏖) 을 0 ℃ 에서 첨가하고, 0 ℃ 에서 15 분간 교반하였다. 반응 용액에 10 ％ 시트르산 수용액을 첨가하고, 클로로포름으로 추출하여, 얻어진 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정 후, 황산나트륨으로 건조시켰다. 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 90 : 10 (v/v) ∼ 50 : 50 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (3-10) (0.465 g, 94 ％) 을 얻었다.
Figure pct00072
공정 10 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-8'-{[5-({(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일}옥시)펜틸]옥시}-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드 (3-11)
실시예 1-1 공정 10 에서 얻어진 화합물 (1-11) (0.130 g, 0.161 m㏖) 과 상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (3-10) (0.104 g, 0.177 m㏖) 의 N,N-디메틸포름아미드 (3 ㎖) 용액에 탄산칼륨 (0.0266 g, 0.193 m㏖) 을 실온에서 첨가하여, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응 용액을 아세트산에틸로 희석하고, 물, 포화 식염수로 세정한 후, 황산나트륨으로 건조시켰다. 감압 증류 제거한 후, 얻어진 잔류물을 NH2-실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 70 : 30 (v/v) ∼ 0 : 100 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (3-11) (0.184 g, 87 ％) 을 얻었다.
Figure pct00073
공정 11 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-{[5-({(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일}옥시)펜틸]옥시}-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드 (3-12)
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (3-11) (0.1837 g, 0.140 m㏖) 과 아세트산 (0.048 ㎖, 0.840 m㏖) 의 테트라하이드로푸란 (5.00 ㎖) 용액에 1 ㏖/ℓ 의 테트라부틸암모늄플로라이드 테트라하이드로푸란 용액 (0.700 ㎖, 0.700 m㏖) 을 실온에서 첨가하여, 실온에서 3 시간 교반하였다. 반응 용액을 아세트산에틸로 희석하고, 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정한 후, 황산나트륨으로 건조시켰다. 감압 증류 제거한 후, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 [클로로포름 : 메탄올 = 99.5 : 0.5 (v/v) ∼ 95 : 5 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (3-12) (0.178 g, 정량적) 를 얻었다.
Figure pct00074
공정 12 : L-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드 (3-13)
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 (3-12) (0.140 m㏖) 의 디클로로메탄 (2 ㎖) 용액에, 실온에서 피롤리딘 (0.0579 ㎖, 0.700 m㏖), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (0.0162 g, 0.0140 m㏖) 을 첨가하여, 실온에서 15 분 교반하였다. 감압 증류 제거한 후, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 [클로로포름 : 메탄올 = 99.5 : 0.5 (v/v) ∼ 92.5 : 7.5 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (3-13) (0.143 g, 99 ％) 을 얻었다.
Figure pct00075
공정 13 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드 (3-14)
실시예 1-2 공정 1 에서 얻어진 화합물 (2-2) (0.0640 g, 0.153 m㏖), N-에톡시카르보닐-2-에톡시-1,2-디하이드로퀴놀린 (0.0446 g, 0.180 m㏖) 의 혼합물에 디클로로메탄 (2 ㎖) 을 실온에서 첨가하여, 실온에서 15 분 교반하였다. 반응 용액에 상기 공정 12 에서 얻어진 화합물 (3-13) (0.143 g, 0.139 m㏖) 의 디클로로메탄 (2 ㎖) 용액을 첨가하여, 실온에서 5 시간 교반한 후, 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 [클로로포름 : 메탄올 = 99.5 : 0.5 (v/v) ∼ 92.5 : 7.5 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (3-14) (0.103 g, 52 ％) 를 얻었다.
Figure pct00076
[실시예 2-2 : 약물 링커 2]
[화학식 46]
Figure pct00077
공정 1 : (2R,11aS)-8-(3-브로모프로폭시)-2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-메톡시-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-2,3-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온 (4-1)
실시예 2-1 공정 1 에서 얻어진 화합물 (3-2) (5.06 g, 9.67 m㏖) 와 1,3-디브로모프로판 (4.93 ㎖, 48.4 m㏖) 을, 실시예 2-1 공정 2 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (4-1) (4.85 g, 78 ％) 을 얻었다.
Figure pct00078
공정 2 : (2R,11aS)-8-(3-브로모프로폭시)-2-하이드록시-7-메톡시-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-2,3-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온 (4-2)
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (4-1) (4.85 g, 7.54 m㏖) 을, 실시예 2-1 공정 3 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (4-2) (4.05 g, 정량적) 를 얻었다.
Figure pct00079
공정 3 : (11aS)-8-(3-브로모프로폭시)-7-메톡시-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2,5,11(3H,10H,11aH)-트리온 (4-3)
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (4-2) (7.54 m㏖) 를, 실시예 2-1 공정 4 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (4-3) (3.73 g, 93 ％) 을 얻었다.
Figure pct00080
공정 4 : (11aS)-8-(3-브로모프로폭시)-7-메톡시-5,11-디옥소-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2-일 트리플루오로메탄술포네이트 (4-4)
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (4-3) (3.73 g, 7.08 m㏖) 을, 실시예 2-1 공정 5 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (4-4) (3.27 g, 70 ％) 를 얻었다.
Figure pct00081
공정 5 : (11aS)-8-(3-브로모프로폭시)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온 (4-5)
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (4-4) (3.27 g, 4.96 m㏖) 를, 실시예 2-1 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (4-5) (2.49 g, 81 ％) 를 얻었다.
Figure pct00082
공정 6 : (11aS)-8-(3-브로모프로폭시)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-1,11a-디하이드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온 (4-6)
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (4-5) (2.49 g, 4.04 m㏖) 를, 실시예 2-1 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (4-6) (1.59 g, 84 ％) 을 얻었다.
Figure pct00083
공정 7 : (11aS)-8-(3-브로모프로폭시)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-1,10,11,11a-테트라하이드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온 (4-7)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (4-6) (1.59 g, 3.38 m㏖) 을, 실시예 2-1 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (4-7) (1.39 g, 87 ％) 을 얻었다.
Figure pct00084
공정 8 : 프로프-2-엔-1-일 (11aS)-8-(3-브로모프로폭시)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-11,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 (4-8)
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (4-7) (1.40 g, 2.95 m㏖) 을, 실시예 2-1 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (4-8) (0.885 g, 54 ％) 을 얻었다.
Figure pct00085
공정 9 : N-{[(프로프-2-엔-1-일)옥시]카르보닐}-L-발릴-N-[4-({[(11'S,11'aS)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-{[(프로프-2-엔-1-일)옥시]카르보닐}-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11'a-디하이드로-1'H,3'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드 (4-9)
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (4-8) (0.0381 g, 0.0683 m㏖) 과 실시예 1-1 공정 10 에서 얻어진 화합물 (1-11) (0.0552 g, 0.0683 m㏖) 을, 실시예 2-1 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (4-9) (0.0712 g, 81 ％) 를 얻었다.
Figure pct00086
공정 10 : N-{[(프로프-2-엔-1-일)옥시]카르보닐}-L-발릴-N-[4-({[(11'S,11'aS)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-{[(프로프-2-엔-1-일)옥시]카르보닐}-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11'a-디하이드로-1'H,3'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드 (4-10)
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (4-9) (0.0712 g, 0.0554 m㏖) 를, 실시예 2-1 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (4-10) (0.0671 g, 정량적) 을 얻었다.
Figure pct00087
공정 11 : L-발릴-N-[4-({[(11'S,11'aS)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11'a-디하이드로-1'H,3'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드 (4-11)
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (4-10) (0.0571 m㏖) 을, 실시예 2-1 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (4-11) (0.0574 g, 99 ％) 을 얻었다.
Figure pct00088
공정 12 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-[4-({[(11'S,11'aS)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11'a-디하이드로-1'H,3'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드 (4-12)
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 (4-11) (0.189 g, 0.189 m㏖) 과 실시예 1-2 공정 1 에서 얻어진 화합물 (2-2) (0.087 g, 0.207 m㏖) 를, 실시예 2-1 공정 13 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (4-12) (0.169 g, 64 ％) 를 얻었다.
Figure pct00089
[실시예 2-3 : 약물 링커 3]
[화학식 47]
Figure pct00090
공정 1 : 디메틸(6S,6'S)-5,5'-{1,5-펜탄디일비스[옥시(5-메톡시-2-니트로벤젠-4,1-디일)카르보닐]}비스(5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실레이트) (5-2)
4,4'-[1,5-펜탄디일비스(옥시)] 비스(5-메톡시-2-니트로벤조산) (5-1) (5.41 g, 10.9 m㏖, Journal of Medicinal Chemistry 2004, 47, 1161) 의 디클로로메탄 (50 ㎖) 용액에, 0 ℃ 에서 염화옥살릴 (5.63 ㎖, 65.7 m㏖) 을 첨가하고, N,N-디메틸포름아미드 (0.0844 ㎖, 1.09 m㏖) 를 적하하였다. 반응 용액을 실온까지 승온하고, 2 시간 교반하였다. 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을 디클로로메탄 (100 ㎖) 으로 용해하고, 메틸(6S)-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실레이트염산염 (4.28 g, 24.1 m㏖, Tetrahedron Letters 2012. 53. 3847) 과 트리에틸아민 (6.07 ㎖, 43.8 m㏖) 의 디클로로메탄 용액 (100 ㎖) 에 질소 분위기 하, -40 ℃ 에서 적하하였다. 반응 용액을 0 ℃ 로 승온하여 2 시간 교반하였다. 반응 혼합물에 1 규정 염산 (100 ㎖) 을 첨가하고, 유기층을 물, 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 감압 증류 제거하여, 목적물 (5-2) (8.40 g, 정량적) 를 얻었다.
Figure pct00091
공정 2 : ｛1,5-펜탄디일비스[옥시(5-메톡시-2-니트로벤젠-4,1-디일)]}비스{[(6S)-6-(하이드록시메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]메탄온} (5-3)
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (5-2) (8.40 g, 10.9 m㏖) 의 테트라하이드로푸란 (100 ㎖) 용액에, 수소화붕소리튬 (714 ㎎, 32.8 m㏖) 을 첨가하고, 0 ℃ 에서 30 분 교반하고, 실온으로 승온시켜 1 시간 교반하였다. 0 ℃ 에서 1 규정 염산을 첨가한 후, 아세트산에틸로 추출하고, 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 감압 하에서 용매 증류 제거하여, 목적물 (5-3) (7.70 g, 99 ％) 을 얻었다.
Figure pct00092
공정 3 : 펜탄-1,5-디일비스[옥시(5-메톡시-2-니트로벤젠-4,1-디일)카르보닐(6S)-5-아자스피로[2.4]헵탄-5,6-디일메탄디일]디아세테이트 (5-4)
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (5-3) (7.70 g, 10.8 m㏖) 을 피리딘 (20 ㎖) 및 무수 아세트산 (10 ㎖, 105.9 m㏖) 에 용해하고, 실온에서 교반하였다. 감압 증류 제거하여, 목적물 (5-4) (8.38 g, 97 ％) 를 얻었다.
Figure pct00093
공정 4 : 1,5-펜탄디일비스[옥시(2-아미노-5-메톡시벤젠-4,1-디일)카르보닐(6S)-5-아자스피로[2.4]헵탄-5,6-디일메탄디일]디아세테이트 (5-5)
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (5-4) (8.28 g, 10.4 m㏖) 의 N,N-디메틸포름아미드 (100 ㎖) 용액에, 5 ％ 팔라듐탄소 (54 ％ 수분, 1.00 g) 를 첨가한 후, 반응 용액을 수소 분위기 하, 실온에서 6 시간 격렬하게 교반하였다. 셀라이트 여과한 후, 여과액을 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 : 메탄올 = 100 : 0 (v/v) ∼ 90 : 10 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (5-5) (5.05 g, 66 ％) 를 얻었다.
Figure pct00094
공정 5 : {(6S)-5-[4-({5-[4-({(6S)-6-[(아세틸옥시)메틸]-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일}카르보닐)-5-아미노-2-메톡시페녹시]펜틸}옥시)-5-메톡시-2-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}벤조일]-5-아자스피로[2.4]헵트-6-일}메틸아세테이트(모노알릴옥시카르보닐체) (5-6)
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (5-5) (5.05 g, 6.85 m㏖) 의 디클로로메탄 (100 ㎖) 용액에, 피리딘 (1.10 ㎖, 13.7 m㏖) 을 첨가하고, 질소 분위기 하, -78 ℃ 에서 클로로포름산알릴 (0.725 ㎖, 6.85 m㏖) 을 첨가하고, 2 시간 교반하였다. 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 70 : 30 (v/v) ∼ 100 : 0 (v/v), 클로로포름 : 메탄올 = 100 : 0 (v/v) ∼ 90 : 10 (v/v)] 로 정제하여, 목적물인 모노알릴옥시카르보닐체 (5-6) (2.63 g, 47 ％) 을 얻었다.
Figure pct00095
공정 6 : N-[(2-프로펜-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[2-({(6S)-6-[(아세틸옥시)메틸]-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일}카르보닐)-5-({5-[4-({(6S)-6-[(아세틸옥시)메틸]-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일}카르보닐)-2-메톡시-5-{[(2-프로펜-1-일옥시)카르보닐]아미노}페녹시]펜틸}옥시)-4-메톡시페닐]카르바모일}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드 (5-7)
상기 공정 5 에서 얻어진 모노알릴옥시카르보닐체 (5-6) (2.00 g, 2.44 m㏖) 와 N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-[4-(하이드록시메틸)페닐]-L-알라닌아미드 (1.10 g, 2.92 m㏖, WO2011130598) 를, 실시예 1-1 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (5-7) (2.64 g, 89 ％) 을 얻었다.
Figure pct00096
공정 7 : N-[(2-프로펜-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-(하이드록시메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]카르보닐}-5-{[5-(4-{[(6S)-6-(하이드록시메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]카르보닐}-2-메톡시-5-{[(2-프로펜-1-일옥시)카르보닐]아미노}페녹시)펜틸]옥시}-4-메톡시페닐)카르바모일]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드 (5-8)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (5-7) (2.64 g, 2.16 m㏖) 의 메탄올 (10 ㎖) 용액에, 탄산칼륨 (1.49 g, 10.8 m㏖) 을 첨가하여, 실온에서 3 시간 교반하였다. 반응 혼합물에 포화 염화암모늄 수용액 (100 ㎖) 을 첨가하여, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 감압 증류 제거하여, 목적물 (5-8) (2.21 g, 90 ％) 을 얻었다.
Figure pct00097
공정 8 : N-[(2-프로펜-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-하이드록시-8'-{[5-({(11'S,11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-10'-[(2-프로펜-1-일옥시)카르보닐]-5',10',11',11a'-테트라하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일}옥시)펜틸]옥시}-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드 (5-9)
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (5-8) (2.03 g, 1.78 m㏖) 의 디클로로메탄 (50 ㎖) 용액에, 데스마틴퍼아이오디난 (1.59 g, 3.74 m㏖) 을 첨가하여, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응 혼합물에 포화 탄산수소나트륨 수용액 (100 ㎖) 을 첨가하고, 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 : 메탄올 = 100 : 0 (v/v) ∼ 90 : 10 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (5-9) (2.05 g, 정량적) 를 얻었다.
Figure pct00098
공정 9 : L-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-5',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드 (5-10)
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (5-9) (2.05 g, 1.80 m㏖) 를, 실시예 2-1 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (5-10) (1.02 g, 60 ％) 을 얻었다.
Figure pct00099
공정 10 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-5',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드 (5-11)
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (5-10) (0.710 g, 0.747 m㏖) 과 실시예 1-2 공정 1 에서 얻어진 화합물 (2-2) (0.313 g, 0.747 m㏖) 를 디클로로메탄 (1.5 ㎖) 과 메탄올 (0.1 ㎖) 의 혼합 용매에 용해하였다. 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드 (0.264 g, 0.897 m㏖) 를 첨가하여, 실온에서 1 시간 교반하였다. 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 : 메탄올 = 100 : 0 (v/v) ∼ 80 : 20 (v/v)] 로 정제하여 목적물 (5-11) (0.671 g, 66 ％) 을 얻었다.
Figure pct00100
[실시예 2-4 : 약물 링커 4]
[화학식 48]
Figure pct00101
공정 1 : 메틸(6S)-5-[4-(벤질옥시)-5-메톡시-2-니트로벤조일]-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실레이트 (6-2)
4-(벤질옥시)-5-메톡시-2-니트로벤조산 (6-1) (6.07 g, 20.0 m㏖, Tetrahedron 1995, 51, 5617), N,N-디메틸포름아미드 (1.08 ㎖, 13.9 m㏖) 의 디클로로메탄 (100 ㎖) 용액에, 빙랭 하에서 염화옥살릴 (3.43 ㎖, 40.0 m㏖) 을 5 분간 걸쳐서 적하하였다. 실온에서 반응 용액을 5 시간 교반한 후, 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 디클로로메탄 (20 ㎖) 에 용해시켜, 감압 증류 제거하였다. 이 조작을 3 회 반복한 후에, 잔류물을 디클로로메탄 (5 ㎖) 에 현탁시켜, 이것에 과잉된 디에틸에테르와 헥산을 첨가하고, 여과하여, 감압 하에 건조시킴으로써 미정제 클로라이드를 얻었다. 얻어진 산 클로라이드를 디클로로메탄에 용해시켜, -40 ℃ (드라이아이스-아세토니트릴욕) 로 냉각시키고, 메틸(6S)-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실레이트염산염 (4.22 g, 22.0 m㏖, Tetrahedron Letters 2012. 53. 3847), 트리에틸아민 (3.36 ㎖, 24.2 m㏖) 을 서서히 첨가하였다. 반응 혼합물을 하룻밤에 걸쳐서 실온까지 승온하였다. 반응 혼합물에 1 규정 염산을 첨가하고, 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 물, 포화 탄산수소나트륨 수용액 및 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 ∼ 50 : 50] 로 정제하여, 목적물 (6-2) (6.55 g, 80 ％) 를 얻었다.
Figure pct00102
공정 2 : (11a'S)-8'-(벤질옥시)-7'-메톡시-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5',11'(10'H,11a'H)-디온 (6-3)
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (6-2) (6.55 g, 16.0 m㏖) 의 에탄올 (150 ㎖), 테트라하이드로푸란 (150 ㎖) 용액에 질소 분위기 하, 라니 니켈 (7.00 g) 을 첨가하였다. 반응 혼합물에 히드라진 1 수화물 (7 ㎖) 을 첨가하고, 50 ℃ 까지 서서히 승온하였다. 50 ℃ 에서 2 시간 교반한 후에 라니 니켈 (3.00 g), 히드라진 1 수화물 (3 ㎖) 을 첨가하고, 1 시간 교반하였다. 반응 혼합물에 THF (100 ㎖) 를 첨가하고, 셀라이트 여과하였다. 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 ∼ 25 : 75] 로 정제하여, 목적물 (6-3) (4.42 g, 73 ％) 을 얻었다.
Figure pct00103
공정 3 : (11a'S)-8'-(벤질옥시)-7'-메톡시-10'-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5',11'(10'H,11a'H)-디온 (6-4)
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (6-3) (10.0 g, 26.4 m㏖) 의 테트라하이드로푸란 (150 ㎖) 용액에 -40 ℃ 에서, 2.6 ㏖/ℓ 의 노르말부틸리튬노르말헥산 용액 (12.0 ㎖, 31.8 m㏖) 을 천천히 적하하였다. 반응 용액을 -40 ℃ 에서 15 분간 교반한 후, 2-(클로로메톡시)에틸트리메틸실란 (5.57 ㎖, 31.7 m㏖) 을 천천히 적하하였다. 반응 용액을 실온에서 3 시간 교반한 후, 물을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 물 및 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 ∼ 30 : 70] 로 정제하여, 목적물 (6-4) (11.8 g, 88 ％) 를 얻었다.
Figure pct00104
공정 4 : (11a'S)-8'-하이드록시-7'-메톡시-10'-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5',11'(10'H,11a'H)-디온 (6-5)
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (6-4) (18.7 g, 36.8 m㏖) 의 테로라하이드로푸란 (50 ㎖), 에탄올 (100 ㎖) 용액에, 질소 분위기 하에서 5 ％ 의 팔라듐탄소 촉매 (5.00 g) 를 첨가하였다. 즉시 질소 풍선을 수소 풍선으로 교체 부착하고, 반응 혼합물을 수소 분위기 하에서 6 시간 교반하였다. 반응 혼합물에 클로로포름을 첨가하고, 희석하여, 셀라이트 여과를 한 후, 여과액을 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 ∼ 25 : 75] 로 정제하여, 목적물 (6-5) (15.1 g, 98 ％) 를 얻었다.
Figure pct00105
공정 5 : (11a'S)-8'-[(5-브로모펜틸)옥시]-7'-메톡시-10'-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5',11'(10'H,11a'H)-디온 (6-6)
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (6-5) (2.77 g, 6.62 m㏖) 를, 실시예 2-1 공정 2 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (6-6) (3.31 g, 88 ％) 을 얻었다.
Figure pct00106
공정 6 : (11a'S)-8'-[(5-브로모펜틸)옥시]-7'-메톡시-1',11a'-디하이드로-5'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5'-온 (6-7)
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (6-6) (3.31 g, 5.83 m㏖) 을, 실시예 2-1 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (6-7) (1.11 g, 45 ％) 을 얻었다.
Figure pct00107
공정 7 : (11a'S)-8'-[(5-브로모펜틸)옥시]-7'-메톡시-1',10',11',11a'-테트라하이드로-5'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5'-온 (6-8)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (6-7) (2.56 g, 6.08 m㏖) 을, 실시예 2-1 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (6-8) (1.15 g, 45 ％) 을 얻었다.
Figure pct00108
공정 8 : 프로프-2-엔-1-일 (11a'S)-8'-[(5-브로모펜틸)옥시]-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르복실레이트 (6-9)
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (6-8) (1.15 g, 2.72 m㏖) 을, 실시예 2-1 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (6-9) (1.14 g, 82 ％) 를 얻었다.
Figure pct00109
공정 9 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-8'-{[5-({(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-10'-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5',10',11',11a'-테트라하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일}옥시)펜틸]옥시}-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드 (6-10)
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (6-9) (0.374 g, 0.737 m㏖) 와 실시예 1-1 공정 10 에서 얻어진 화합물 (1-11) (0.452 g, 0.56 m㏖) 을, 실시예 2-1 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (6-10) (0.589 g, 65 ％) 을 얻었다.
Figure pct00110
공정 10 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-{[5-({(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-10'-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5',10',11',11a'-테트라하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일}옥시)펜틸]옥시}-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드 (6-11)
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (6-10) (0.589 g, 0.477 m㏖) 을, 실시예 2-1 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (6-11) (0.382 g, 71 ％) 을 얻었다.
Figure pct00111
공정 11 : L-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-5',10',11',11a'-테트라하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드 (6-12)
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (6-11) (0.382 g, 0.341 m㏖) 을, 실시예 2-1 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (6-12) (0.200 g, 62 ％) 를 얻었다.
Figure pct00112
공정 12 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-5',10',11',11a'-테트라하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드 (6-13)
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 (6-12) (0.0560 g, 0.0588 m㏖) 와 실시예 1-2 공정 1 에서 얻어진 화합물 (2-2) (0.022 g, 0.053 m㏖) 를, 실시예 2-1 공정 13 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (6-13) (0.0500 g, 63 ％) 을 얻었다.
Figure pct00113
[당사슬 도너의 합성]
실시예 3 : [N3-PEG(3)]-MSG1-Ox
[화학식 49]
Figure pct00114
공정 1 : (MSG1-)Asn
시판품인 monosialo-Asn free (1S2G/1G2S-10NC-Asn, (주) 당사슬 공학 연구소 제조) (「(MSG-)Asn」이라고 한다) (500 ㎎) 를 이하의 조건에서 역상 HPLC 분리 정제하고, 1st 메인 피크로서 용출되는 (MSG1-)Asn (유지 시간 15 ∼ 19 분 부근) 과 2nd 메인 피크로서 용출되는 (MSG2-)Asn (유지 시간 21 ∼ 26 분 부근) 으로 분리하였다. 0.1 ％ 포름산 수용액을 용리액으로서 사용하고, 장치에는 ELS-PDA 트리거 분취 시스템 (닛폰 분광 주식회사 제조) 을 사용하고, 칼럼에는 Inertsil ODS-3 (10 um, 30Φ x 250 ㎜, GL 사이언스사 제조) 을 사용하여, 유속을 30 ㎖/분으로 하였다. 용출 중에 UV 검출 (210 ㎚) 된 최초의 피크를 분취하고, 동결 건조시켜, 목적물 (238 ㎎) 을 얻었다.
공정 2 : MSG1
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (229 ㎎) 을 200 mM 인산 완충 용액 (pH 6.25) (1145 ㎕) 에 용해시키고, EndoM (토쿄 화성 공업 (주) 제조, 1 U/㎖) 수용액 (100 ㎕) 을 첨가하여, 35 ℃ 에서 6 일간 인큐베이트하였다. 반응 종료 후, 반응액을 VIVASPIN 15R (Hydrosart 막, 30K, 6,000 xG) 을 사용하여 한외 여과하고, 얻어진 통과액을 역상 HPLC 분리 정제하였다. 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액을 용리액으로서 사용하고, 장치에는 ELS-PDA 트리거 분취 시스템 (닛폰 분광 주식회사 제조), 칼럼에는 Inertsil ODS-3 (GL 사이언스사 제조) 을 사용하였다. 용출 중에 UV 검출 (210 ㎚) 된 목적물의 피크를 분취하고, 동결 건조시켜, 목적물 (117 ㎎) 을 얻었다.
공정 3 : [N3-PEG(3)]-MSG1
5 ㎖ 샘플링 튜브 ((주) 이나·옵티카) 에, 11-아지드-3,6,9-트리옥사운데칸-1-아민 (0.108 ㎖, 0.541 m㏖) 과 상기 공정 2 에서 얻어진 MSG1 (117 ㎎, 0.068 m㏖) 의 수용액 (1.2 ㎖) 을 첨가하고, 1 시간 교반한 후에, 동결 건조시켰다. 동결 건조 후의 5 ㎖ 샘플링 튜브에, O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스파이트 (103 ㎎, 0.27 m㏖) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (1.2 ㎖) 과 디이소프로필에틸아민 (0.046 ㎖, 0.27 m㏖) 을 첨가하고, 37 ℃ 에서 3 시간 교반하였다. 반응 종료 후, 미리 디에틸에테르 (20 ㎖) 를 첨가한 원심관 (50 ㎖) 으로 반응액을 옮겼다. 소형 원심기 (히타치 공기, CF16RX) 를 이용하여, 고형물을 침전시키고, 상청을 제거하였다. 추가로 디에틸에테르 (10 ㎖) 를 첨가하고, 원심 분리 조작 후, 데칸테이션을 행하였다. 계속해서, 아세토니트릴 (10 ㎖) 을 첨가하여 원심 분리 후, 데칸테이션하는 조작을 2 회 반복한 후, 감압 하 건조시켜, 미정제 생성물을 얻었다. 얻어진 고형물을 상기 공정 2 와 동일한 조건에서 역상 HPLC 정제를 행하고, 목적물 (94.2 ㎎) 을 얻었다.
공정 4 : [N3-PEG(3)]-MSG1-Ox
5 ㎖ 샘플링 튜브 ((주) 이나·옵티카 제조) 에, 상기 공정 3 에서 합성한 화합물 (100 ㎎), 2-클로로-1,3-디메틸-1H-벤즈이미다졸-3-이움-클로라이드 (후시미 제약소 제조, 56 ㎎, 0.257 m㏖) 의 수용액 (520 ㎕) 을 첨가하였다. 빙랭 후의 반응액에 인산 3 칼륨 (165 ㎎, 0.78 m㏖) 의 수용액 (520 ㎕) 을 첨가하고, 빙랭 하에서 3 시간 교반하였다. 얻어진 반응액을, 아미콘 울트라 (울트라 셀 30K, Merck Millipore 제조) 를 사용하여 한외 여과하고, 고형물을 제거하였다. 그 통과액을, 겔 여과 크로마토그래피로 정제하였다. 장치에는 Purif-Rp2 (쇼코 사이언티픽 제조) 를 사용하고, 칼럼에는 HiPrep 26/10 Desalting (GE 헬스케어 제조) 을 사용하며, 이동상에 0.03 ％ NH3 수용액을 사용하고, 유속을 10 ㎖/분, 분획 용량을 10 ㎖ 로 하였다. 용출 중에 UV 검출 (220 ㎚) 된 목적물을 포함하는 프랙션을 하나로 모으고, 1N 수산화나트륨 수용액 (104 ㎕, 0.104 m㏖) 을 첨가하고, 동결 건조시켜, 목적물 (84 ㎎) 을 얻었다.
실시예 4 : [N3-PEG(3)]-MSG-Ox
[화학식 50]
Figure pct00115
공정 1 : (MSG-)Asn 의 조제
시판품인 1S2G/1G2S-10NC-Asn-Fmoc ((주) 당사슬 공학 연구소 제조) (「Fmoc-(MSG-)Asn」이라고 부른다) (1000 ㎎) 를 에탄올/물 (1/1) (10 ㎖) 에 용해시키고, 1 규정의 수산화나트륨 수용액 (1.75 ㎖, 4 당량) 을 첨가하여, 실온에서 3 시간 교반하였다. 반응 종료 후, 반응액을 아미콘 울트라 (30K, 밀리포어사 제조) 를 사용하여 한외 여과하고, 고형물을 제거하고, 얻어진 통과액에 1N 염산 (832 ㎕, 1.9 당량) 을 첨가하였다. 고속 농축 장치 V-10 (Biotage 사 제조) 을 사용하여, 용매를 제거하였다. 아세토니트릴을 첨가하고, 고속 농축 장치 V-10 (Biotage 사 제조) 를 사용하여, 용매를 제거한 후에, 역상 HPLC 분리 정제하였다. 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 하고, 장치에는 Purif-Rp2 (쇼코 사이언티픽 제조) 를 사용하고, 칼럼에는 Inertsil ODS-3 (GL 사이언스 제조) 을 사용하였다. 용출 중에 UV 검출 (220 ㎚) 된 목적물을 포함하는 프랙션을 하나로 모으고, 동결 건조시켰다. 다시, 순수에 용해시키면, pH 시험지로 산성인 것이 확인되었기 때문에, 18 ％ 암모니아수 (150 ㎕) 를 첨가하여, pH 시험지로 염기성이 된 것을 확인하고, 다시 동결 건조시켰다. 얻어진 목적물 (840 ㎎) 을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
공정 2 : MSG 의 합성
공정 1 에서 얻어진 화합물 (840 ㎎) 을 200 mM 인산 완충 용액 (pH 6.25) (6000 ㎕) 에 용해시키고, EndoM (토쿄 화성 공업 (주) 제조, 1 U/㎖) 수용액 (200 ㎕) 을 첨가하고, 28 ℃ 에서 26 시간 인큐베이트하였다. 반응이 완료되어 있지 않기 때문에, EndoM (토쿄 화성 공업 (주) 제조, 1 U/㎖)) 수용액 (50 ㎕) 을 첨가하고, 28 ℃ 에서 2 시간 인큐베이트한 후에, 반응이 완료될 때까지 실온에서 방치하였다. 반응 종료 후, 반응액을 아미콘 울트라 (30K, 밀리포어사 제조) 를 사용하여 한외 여과하였다. 얻어진 통과액에 트리플루오로아세트산 (80 ㎕) 첨가하고, 역상 HPLC 분리 정제하였다. 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 하고, 장치에는 Purif-Rp2 (쇼코 사이언티픽 제조) 를 사용하고, 칼럼에는 Inertsil ODS-3 (GL 사이언스 제조) 을 사용하였다. 용출 중에 UV 검출 (220 ㎚) 된 목적물을 포함하는 프랙션을 하나로 모으고, 동결 건조시켰다. 잔류 트리플루오로아세트산을 제거할 목적에서, 다시 순수에 용해시켜, 목적 화합물 (618 ㎎) 을 무색 고체로서 얻었다.
Figure pct00116
공정 3 : [N3-PEG(3)]-MSG 의 합성
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (120 ㎎) 을 사용하여, 실시예 3 공정 3 과 동일한 수법에 따라서, 목적물 (88.6 ㎎) 을 얻었다.
Figure pct00117
공정 4 [N3-PEG(3)]-MSG-Ox 의 합성
상기 공정 3 에서 얻어진 합성한 화합물 (100 ㎎) 을 사용하여, 실시예 3 공정 4 와 동일한 수법에 따라서, 목적물 (88 ㎎) 을 얻었다.
실시예 5 : [N3-PEG(3)]2-SG(10)-Ox
[화학식 51]
Figure pct00118
공정 1 : [N3-PEG(3)]2-SG(10)
5 ㎖ 샘플링 튜브 ((주) 이나·옵티카) 에, 11-아지드-3,6,9-트리옥사운데칸1-아민 (0.096 ㎖, 0.485 m㏖), 디시알로옥타사카라이드 (50 ㎎, 0.24 m㏖) 의 수용액 (0.5 ㎖) 을 첨가하고, 1 시간 교반한 후에, 동결 건조시켰다. 동결 건조 후의 5 ㎖ 샘플링 튜브에, O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스파이트 (92 ㎎, 0.24 m㏖) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (0.6 ㎖) 과 디이소프로필에틸아민 (0.042 ㎖, 0.24 m㏖) 을 첨가하고, 37 ℃ 에서 4 시간 교반하였다. 반응 종료 후, 미리 디에틸에테르 (20 ㎖) 를 첨가한 원심관 (50 ㎖) 으로 반응액을 옮겼다. 소형 원심기 (히타치 공기, CF16RX) 를 이용하여, 고형물을 침전시키고, 상청을 제거하였다. 디에틸에테르 (20 ㎖) 를 첨가하여, 데칸테이션하였다. 계속해서, 아세토니트릴 (20 ㎖) 을 첨가하고, 데칸테이션한 후에, 감압 하 건조시켜, 미정제 생성물을 얻었다. 얻어진 고형물을 적당량의 0.2 ％ 트리플루오로아세트산 수용액에 용해시키고, 역상 HPLC 분리 정제하였다. 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 하고, 장치에는 Purif-Rp2 (쇼코 사이언티픽 제조) 를 사용하고, 칼럼에는 Inertsil ODS-3 (GL 사이언스 제조) 을 사용하였다. 용출 중에 UV 검출 (220 ㎚) 된 목적물을 포함하는 프랙션을 하나로 모으고, 동결 건조시켜, 목적물 (42 ㎎) 을 얻었다.
공정 2 : [N3-PEG(3)]2-SG(10)-Ox
5 ㎖ 샘플링 튜브 ((주) 이나·옵티카 제조) 에, 상기 공정 1 에서 합성한 화합물 (40 ㎎), 2-클로로-1,3-디메틸-1H-벤즈이미다졸-3-이움-클로라이드 (후시미 제약소 제조, 17.9 ㎎, 0.083 m㏖) 의 수용액 (200 ㎕) 을 첨가하였다. 빙랭 후의 반응액에 인산 3 칼륨 (52.6 ㎎, 0.25 m㏖) 의 수용액 (200 ㎕) 을 첨가하고, 빙랭 하에서 2 시간 교반하였다. 얻어진 반응액을, 아미콘 울트라 (울트라 셀 30K, Merck Millipore 제조) 를 사용하여 한외 여과하고, 고형물을 제거하였다. 그 통과액을, 겔 여과 크로마토그래피로 정제하였다. 장치에는 Purif-Rp2 (쇼코 사이언티픽 제조) 를 사용하고, 칼럼에는 HiPrep 26/10 Desalting (GE 헬스케어 제조) 를 사용하고, 이동상에 0.03 ％ NH3 수용액을 사용하고, 유속을 10 ㎖/분, 분획 용량을 10 ㎖ 로 하였다. 용출 중에 UV 검출 (220 ㎚) 된 목적물을 포함하는 프랙션을 하나로 모으고, 1N 수산화나트륨 수용액 (33 ㎕, 0.033 m㏖) 을 첨가하여 동결 건조시켜, 목적물 (34 ㎎) 을 얻었다.
실시예 6 : 마우스 항 CLDN6 항체 B1 산생 하이브리도마 (218B1) 및 마우스 항 CLDN6 항체 C7 산생 하이브리도마 (218C7)
6-1. 마우스의 면역과 하이브리도마의 취득
1-1) 마우스 면역에 사용하는 세포의 준비
2 × 106 개 혹은 5 × 106 개의 NOR-P1 세포 (인간 췌암 세포주, RIKENRCB-2139) 를 RPMI-1640 (Roswell ㎩rk Memorial Institute-1640) 10 ％ FBS (소 태아 혈청) (＋) 배지 (10 ㎖ 혹은 20 ㎖) 에서 5 일간 배양 후에 회수하고, PBS (인산 완충 생리 식염수) 로 2 회 세정하고, PBS (300 ㎕) 중에 재현탁하였다.
1-2) 마우스에의 면역
BALB/c 마우스 (12 주령) 에 대해서, 1 ∼ 5 회째의 면역은 약 1 주일 간격으로 NOR-P1 세포 (2 × 106 개) 를 복강 내에 면역하였다. 5 회째의 면역으로부터 약 2 주일 후에 NOR-P1 세포 (5 × 106 개) 를 복강 내에 면역하였다. 6 회째의 면역으로부터 약 3 주일 후에 NOR-P1 세포 (2 × 106 개) 를 복강 내에 면역하였다. 8 ∼ 10 회째는 약 2 주일 간격으로 2 × 106 개의 NOR-P1 세포를 복강 내에 면역하였다. 10 회째의 약 3 주일 후 (11 회째) 및 그 3 일 후 (12 회째, 최종 면역) 에서는, 5 × 106 개의 NOR-P1 세포를 복강 내에 면역하였다. 비장 세포는 최종 면역으로부터 3 일 후에 적출하였다.
1-3) 면역 한 마우스의 비장 세포의 준비
면역이 완료된 마우스의 비장을 적출하고, 갈아서 으깨어 RPMI1640 10 ％ FBS(＋) 배지에 현탁하였다. 세포 현탁액을 셀 스트레이너 (70 ㎛, BD Falcon 사) 에 통과시킨 후, 1500 rpm 으로 5 분간, 실온에서 원심하여 상청을 폐기하였다. Tris-NH4Cl 용액 (20 mM Tris-HCl pH 7.2, 77.6 mM NH4Cl ; 20 ㎖) 을 첨가하여, 실온에서 5 분간 처리하였다. PBS (20 ㎖) 를 첨가하여, 1500 rpm 으로 5 분간, 실온에서 원심하였다. 상청을 폐기한 후에, RPMI1640 FBS(＋) 배지 (10 ㎖) 를 첨가하였다.
1-4) 미엘로마 세포의 준비
P3U1 세포 (마우스 미엘로마 세포주) 를 RPMI1640 FBS(＋) 배지에서 5 일간 배양한 후에 회수하고, RPMI1640 FBS(＋) 배지 (20 ㎖) 에 재현탁하였다.
1-5) 세포 융합
비장 세포와 미엘로마 세포를 5 : 1 이 되도록 혼합하고, 1500 rpm 으로 5 분간, 실온에서 원심하였다. RPMI1640 FBS(-) 배지 (10 ㎖) 에서 2 회 세정한 후에, 원심 분리 (1500 rpm, 5 분간) 하였다. 얻어진 침전 획분의 세포군을 잘 푼 후, 교반하면서, 폴리에틸렌글리콜-1500 (PEG-1500 ; 1 ㎖) 을 약 1 분에 걸쳐서 서서히 첨가하였다. 3 분 30 초 동안 교반한 후에, 30 초 동안 실온에서 정치 (靜置) 하였다. 그 후, 그 세포액에 1 분에 걸쳐서 RPMI 배지 10 ％ Low IgG FBS(＋) (10 ㎖) 를 첨가하였다. 그 세포 현탁액을 원심 분리 (1500 rpm, 5 분간) 하고, 얻어진 침전 획분의 세포를 천천히 푼 후, HAT 배지 (10 ％ Low IgG FBS, HAT Media Supplement, 5 ％ BriClone 을 포함하는 RPMI1640 배지 ; 200 ㎖) 중에 천천히 현탁하였다. 그 현탁액을 96 웰 배양용 플레이트에 200 ㎕/웰씩 분주하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 인큐베이터 중에서, 6 일간 배양하였다.
1-6) 하이브리도마의 스크리닝·프로브의 준비
항체의 내재화 및 이뮤노톡신 활성의 측정을 목적으로 리콤비넌트 복합 단백질인 DT3C 를 제조하였다. 이 DT3C 는, 디프테리아 독소 (DT) 의 촉매 영역과 연쇄 구균 프로테인 G 의 항체 결합 영역을 유전자 공학적으로 융합시킨 단백질이다. DT3C 는 항체의 Fc 부분에 특이적으로 결합하고, 세포 내에 흡수되면 단백질 합성 저해에 의해서 세포사를 유도한다. 이 계를 사용함으로써 항체의 내재화와 이뮤노톡신에 의한 살세포 효과를 동시에 관찰할 수 있다 (Yamaguchi, M. et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 454 (2014) 600-603).
1-7) DT3C 에 의한 하이브리도마의 스크리닝
96 웰 플레이트에 4 ㎍/㎖ 의 DT3C (25 ㎕) 를 첨가하고, 추가로 공정 1-5 에서 취득된 하이브리도마의 배양 상청 (25 ㎕) 을 첨가하여, 실온에서 30 분 인큐베이션하였다. 2 × 105 개/㎖ (RPMI 배지 10 ％ Low IgG FBS(＋)) 의 NOR-P1 세포 (50 ㎕) 를 파종하고, 37 ℃ CO2 인큐베이터로 3 일간 배양하였다. 배양 후의 현미경 관찰에 의해서, 음성 대조 항체를 사용했을 때의 부착 세포수의 약 25 ％ 이하의 부착 세포수를 나타낸 웰을 양성으로 판정하였다. 선발한 클론은 1 ∼ 2 회 서브 클로닝을 행하여, 모노클로날한 하이브리도마 세포주 8 주를 수립하였다.
6-2 : 하이브리도마의 산생하는 항체의 결합하는 항원의 동정
실시예 6-1 에 있어서 조제된 하이브리도마의 산생하는 항체 중 2 개의 클론 218B1 및 218C7 에 대해서 항원의 동정을 행하였다.
2-1) 비오틴 라벨한 세포 표면 단백질의 218B1 항체 및 218C7 항체를 사용한 면역 침강
2 × 106 개의 NTERA-2 세포 (인간 정소암 세포주, ATCC CRL-1973) 의 배양 상청을 제거하고, PBS 로 2 회 세정하였다. EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin (Thermo Fisher SCIENTIFIC 사) 을 0.1 ㎎/㎖ 의 농도로 PBS 에 현탁하였다. PBS 를 제거한 후에, Biotin/PBS 용액을 첨가하고, 30 분간 진탕기 상에서 인큐베이션한 후에 100 mM 글리신/PBS 용액 (25 ㎖) 으로 2 회 세정하고, 그 후, PBS (10 ㎖) 로 1 회 세정하였다. 세정 후의 세포를 200 ㎕ 의 용해 버퍼 (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 ％ DDM, Protease inhibitor, Complete EDTA free (Roche 사) 1 입/50 ㎖) 중에 재현탁하고, 4 ℃ 에서 30 분간 처리하였다. 원심 분리 (13000 rpm, 20 분간, 4 ℃) 하여 세포 용해액을 조제하였다. Protein G Sepharose (Protein G Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare 사)) 의 버퍼를 용해 버퍼로 치환하여 얻어진 Protein G Sepharose/용해 버퍼 (50 ％ 슬러리 ; 30 ㎕) 를 세포 용해액에 첨가하고, 4 ℃ 에서 30 분간 로테이트한 후에 4 ℃ 에서 1 분간 원심하여, 상청을 회수하였다. 이 상청에 218B1 항체 혹은 218C7 항체 (약 3 ㎍ 을 첨가하고, 4 ℃ 에서 30 분간 로테이트한 후에 Protein G Sepharose/용해 버퍼 (50 ％ 슬러리 ; 60 ㎕) 를 첨가하여, 4 ℃ 에서 1 시간 로테이트하였다. 용해 버퍼 (1 ㎖) 로 Protein G Sepharose 를 6 회 세정한 후에 1 × SDS 샘플 버퍼 (BioRad 사) 에 재현탁하였다. 100 ℃ 에서 5 분간 현탁액을 처리한 후, 용액을 회수하여, SDS-PAGE (폴리아크릴아미드겔 전기 영동) 를 위한 샘플로 하였다.
2-2) SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅
2-1) 에서 조제한 SDS-PAGE 샘플을 SuperSep Ace 5-20 ％ (Wako 사) 를 사용하여, 50 ㎷ 로 30 분간 스태킹한 후에, 200 ㎷ 로 1 시간 영동한 후, 겔로부터 멤브레인에 12 ㎷ 로 47 분간 블로팅하였다. 멤브레인을 PBS-T (PBS(-)-0.02 ％ Tween20) 로 세정한 후, 1 시간 블로킹을 행하였다. 멤브레인을 PBS-T 로 5 분간 3 회 세정한 후에 Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (GE Healthcare 사 ; PBS-T 로 2000 배로 희석하여 사용) 와 1 시간 반응시켰다. 멤브레인을 PBS-T 로 5 분간 2 회 세정한 후에, 목적으로 하는 밴드를 enhanced chemiluminecscence (ECL) 법을 이용하여 검출하였다. 218B1 항체 및 218C7 항체를 사용한 어느 경우에 있어서도, DTT 의 첨가의 유무에 관계없이 분자량 18 kDa 의 밴드가 검출되었다.
2-3) 세포 단백질의 218B1 항체 및 218C7 항체를 사용한 면역 침강 산물의 질량 분석
2 × 107 개의 NTERA-2 세포를 회수하고, PBS 로 2 회 세정하였다. 셀 스크레이퍼를 사용하여 세포를 회수하고, 1500 rpm, 5 분간 원심하였다. 상청을 제거한 후에 2 ㎖ 의 용해 버퍼 중에 재현탁하고, 4 ℃ 에서 30 분간 처리하였다. 원심 분리 (13000 rpm, 20 분간, 4 ℃) 하여 세포 용해액을 조제하였다. Protein G Sepharose/용해 버퍼 (50 ％ 슬러리 ; 180 ㎕) 를 세포 용해액에 첨가하고, 4 ℃ 에서 30 분간 로테이트한 후에 4 ℃ 에서 1 분간 원심하여, 상청을 회수하였다. 이 상청에 218B1 항체 (약 9 ㎍) 를 첨가하고, 4 ℃ 에서 30 분간 로테이트한 후에 Protein G Sepharose/용해 버퍼 (50 ％ 슬러리 ; 180 ㎕) 를 첨가하고, 4 ℃ 에서 1 시간 로테이트하였다. 용해 버퍼 (1 ㎖) 로 Protein G Sepharose 를 6 회 세정한 후에 1 × SDS 샘플 버퍼에 재현탁하였다. 100 ℃ 에서 5 분간 현탁액을 처리한 후, 용액을 회수하여, SDS-PAGE 를 위한 샘플로 하였다. 2-2) 와 동일한 방법으로 SDS-PAGE 를 행하고, 영동 겔을 CBB 염색하였다. 영동 겔로부터 18 kDa 에 상당하는 부분을 잘라 내고, 질량 분석에 제공하였다. 질량 분석의 결과, 그 겔편은 Claudin-6 을 포함하는 것이 판명되었다.
2-4) FACS 해석
질량 분석으로부터 218B1 항체 및 218C7 항체의 항원이 Claudin-6 인 것을 예측할 수 있었기 때문에, cDNA 의 유전자 도입에 의한 강제 발현 해석을 행하였다. FACS 해석의 결과, 인간 Claudin-6 발현 CHO-K1 세포에서는 218B1 항체 및 218C7 항체는 강양성 반응을 나타냈기 때문에, 218B1 항체 및 218C7 항체의 항원은 Claudin-6 인 것이 나타났다.
2-5) 하이브리도마 배양 상청으로부터의 항체의 정제
마우스 항 CLDN6 항체 B1 산생 하이브리도마 (218B1) 및 마우스 항 CLDN6 항체 C7 산생 하이브리도마 (218C7) 를, 10 ％ 의 Fetal Bovine Serum, Ultra-Low IgG (Thermo Fisher Scientific) 를 포함하는 Hybridoma-SFM (Thermo Fisher Scientific) 에서 배양하였다. 배양 상청을 원심에 의해서 회수하고 0.45 ㎛ 의 필터 (Corning 사 제조) 로 여과하였다. rProtein A 어피니티 크로마토그래피 (4 ∼ 6 ℃ 하) 1 단계 공정에서, 배양 상청으로부터 항체를 정제하였다. rProtein A 어피니티 크로마토그래피 정제 후의 버퍼 치환 공정은 4 ∼ 6 ℃ 하에서 실시하였다. 먼저, 배양 상청을 PBS 로 평형화한 MabSelectSuRe (GE Healthcare Bioscience 사 제조) 가 충전된 칼럼에 어플라이하였다. 배양액이 칼럼에 모두 들어간 후, 칼럼 용량 2 배 이상의 PBS 로 칼럼을 세정하였다. 다음으로, 2 M 아르기닌염산염 용액 (pH 4.0) 으로 용출하고, 항체가 포함되는 획분을 모았다. 그 획분을 투석 (Thermo Scientific 사, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해서 PBS(-) 로의 액치환을 행하였다. 마지막으로, Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (분획 분자량 UF10K, Sartorius 사, 4 ℃ 하) 으로 농축하고, IgG 농도를 1 ㎎/㎖ 이상으로 조제하였다. Minisart-Plusfilter (Sartorius 사) 로 여과하여, 정제 샘플로 하였다.
실시예 7 : 마우스 항 CLDN6 항체 B1 및 C7 의 invitro 평가
7-1 : 플로 사이토메트리에 의한 마우스 항 CLDN6 항체의 결합능 평가
실시예 6 에서 제조한 마우스 항 CLDN6 항체의 인간 CLDN6 및 패밀리 분자 CLDN3, CLDN4, CLDN9 결합성을 플로 사이토메트리법에 의해서 평가하였다. Origene 사부터 구입한 human CLDN3/pCMV6-Entry, human CLDN4/pCMV6-Entry, human CLDN6/pCMV-Entry, human CLDN9/pCMV6-Entry, 또는 pCMV6-Entry 를, 293T 세포 (Thermo Fisher Scientific HCL4517) 에 Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) 을 사용하여 일과성으로 도입하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건 하에서 하룻밤 배양한 후, 세포 현탁액을 조제하였다. 유전자 도입한 293T 세포 현탁액을 원심하고, 상청을 제거한 후, 마우스 항 CLDN6 항체 (클론 번호는 B1, C7), 또는 마우스 IgG1 컨트롤 항체 (R&D Systems) 를 최종 농도 30 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 3.3 ㎍/㎖, 1.1 ㎍/㎖ 로 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 정치하였다. 5 ％ 의 소 태아 혈청 (Hyclone) 을 포함하는 Dulbecco's phosphate buffered saline (Sigma-Aldrich) (이하, 5 ％ FBS 함유 PBS) 로 2 회 세정한 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 로 500 배 희석한 FLUORESCEIN-CONJUGATED GOAT IGG FRACTION TO MOUSE IGG (WHOLE MOLECULE) (MP BIOMEDICALS) 를 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 정치하였다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 플로 사이토미터 (FC500 ; Beckman Coulter) 로 검출을 행하였다. 데이터 해석은 FlowJo (TreeStar) 로 행하였다. 또한, 각 유전자 도입의 확인은, 세포를 0.25 ％ Tween20 함유 PBS 로 투과 처리한 후에 마우스 항 FLAG 항체 (Sigma-Aldrich) 를 사용하여 행하였다. 결과를 도 11 에 나타낸다. 도 11 의 그래프에 있어서, 세로축은 항체 결합량을 나타내는 FITC 의 형광 강도, 가로축은 항체 농도를 나타낸다. 제조한 마우스 항 CLDN6 항체는 인간 CLDN6 과 인간 CLDN9 에 동일한 정도로 결합하고, 인간 CLDN3, 인간 CLDN4 에는 결합하지 않았다. 마우스 컨트롤 IgG1 은 어느 세포에도 결합하지 않았다.
7-2 : 항체 내재화 활성
마우스 항 CLDN6 항체 B1 및 C7 의 내재화 활성은, 단백질 합성을 저해하는 독소 (사포린) 를 결합시킨 항마우스 IgG 시약 Mab-ZAP (ADVANCED TARGETING SYSTEMS) 를 사용하여 평가하였다. 이 평가에서는, 마우스 항 CLDN6 항체의 내재화 활성에 의존하여 Mab-ZAP 가 세포 내에 흡수되고, 단백질 합성을 저해하는 사포린이 세포 내로 방출됨으로써, 세포 증식이 억제된다.
인간 CLDN6 양성 세포의 인간 융모암주인 JEG-3 (ATCC HTB-36), 인간 CLDN6 양성 세포의 인간 난소암주인 NIH : OVCAR-3 (ATCC HTB-161), 또는 인간 CLDN6 음성 세포의 인간 췌장암주인 BxPC-3 (ATCC CRL-1687) 을 2 x 103 세포/웰로 96 웰 세포 배양용 마이크로 플레이트에 파종하고 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건 하에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, 마우스 항 CLDN6 항체, 또는 마우스 IgG1 항체 (R＆D Systems) 를 최종 농도 1 nM 이 되도록, Mab-ZAP (최종 농도 : 0.5 nM), 또는 독소를 결합하고 있지 않는 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ Fragment Specific (Jackson ImmunoResearch) (최종 농도 : 0.5 nM) 과 혼합한 혼합 용액을 첨가하여, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건 하에서 5 일간 배양하였다. 생존 세포수는, CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) 를 사용한 ATP 활성의 정량으로 측정하였다. 항 CLDN6 항체 첨가에 의한 세포 증식 억제 작용은, 혼합 용액 비첨가 웰의 값을 100 ％ 로 하는 상대 생존률로 구하였다. 도 12 에 결과를 나타낸다. 마우스 항 CLDN6 항체 (B1, C7) 는 인간 CLDN6 양성 세포주 JEG-3 과 NIH : OVCAR-3 에 대해서 세포 증식 억제 효과를 확인하였다. 한편, 인간 CLDN6 음성 세포주 BxPC-3 에 대해서는 세포 증식 억제 효과를 확인하지 않았다. 또, 마우스 IgG1 항체는 어느 세포주에 대해서도 세포 증식 억제 효과를 확인하지 않았다. 이 결과, 제조한 항 CLDN6 항체 (B1, C7) 는 내재화 활성을 가져, 항체-약물 콘주게이트용의 항체로서 적합하다고 생각된다.
실시예 8 : 마우스 항 CLDN6 항체 B1 및 C7 의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열의 결정
8-1 : B1 항체의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열의 결정
8-1-1 : B1 항체 산생 하이브리도마의 total RNA 의 조제
B1 항체의 가변 영역을 코드하는 cDNA 를 증폭하기 위해서, B1 항체 산생 하이브리도마보다 TRIzol Reagent (Ambion 사) 를 사용하여 total RNA 를 조제하였다.
8-1-2 : 5'-RACE PCR 에 의한 B1 항체의 경사슬 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 증폭과 서열의 결정
경사슬 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 증폭은, 실시예 8-1-1 에서 조제한 total RNA 의 약 1 ㎍ 과 SMARTer RACE 5'/3' Kit (Clontech 사) 를 사용하여 실시하였다. B1 항체의 경사슬 유전자의 가변 영역을 코드하는 cDNA 를 PCR 로 증폭하기 위한 프라이머로서, UPM (Universal Primer A Mix : SMARTer RACE 5'/3' Kit 에 부속), 및 공지된 마우스 경사슬의 정상 영역의 서열로부터 설계한 프라이머를 사용하였다.
5'-RACE PCR 로 증폭한 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 를 플라스미드에 클로닝하고, 다음으로 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열의 시퀀스 해석을 실시하였다.
결정된 B1 항체의 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 18 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 19 에 나타낸다.
8-1-3 : 5'-RACE PCR 에 의한 B1 항체의 중사슬 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 증폭과 서열의 결정
중사슬 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 증폭은, 실시예 8-1-1 에서 조제한 total RNA 의 약 1 ㎍ 과 SMARTer RACE 5'/3' Kit (Clontech 사) 를 사용하여 실시하였다. LB1 항체의 중사슬 유전자의 가변 영역을 코드하는 cDNA 를 PCR 로 증폭하기 위한 프라이머로서, UPM (Universal Primer A Mix : SMARTer RACE 5'/3' Kit 에 부속), 및 공지된 마우스 중사슬의 정상 영역의 서열로부터 설계한 프라이머를 사용하였다.
5'-RACE PCR 로 증폭한 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 를 플라스미드에 클로닝하고, 다음으로 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열의 시퀀스 해석을 실시하였다. 결정된 B1 항체의 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 20 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 21 에 나타낸다.
8-2 : C7 항체의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열의 결정
실시예 8-1 과 동일한 방법으로 실시하였다. 결정된 C7 항체의 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 22 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 23 에 나타낸다. 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 24 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 25 에 나타낸다.
실시예 9 : 키메라화 항 CLDN6 항체 chB1 의 제작
9-1 : 키메라화 항 CLDN6 항체 chB1 의 발현 벡터의 구축
9-1-1 : 키메라화 및 인간화 경사슬 발현 벡터 pCMA-LK 의 구축
플라스미드 pcDNA3.3-TOPO/LacZ (Invitrogen 사) 를 제한 효소 XbaI 및 PmeI 로 소화하여 얻어지는 약 5.4 kb 의 프래그먼트와, 서열 번호 26 에 나타내는 인간 경사슬 시그널 서열 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (Clontech 사) 를 사용하여 결합하고, pcDNA3.3/LK 를 제조하였다. pcDNA3.3/LK 로부터 네오마이신 발현 유닛을 제거함으로써 pCMA-LK 를 구축하였다.
9-1-2 : 키메라화 및 인간화 IgG1LALA 타입 중사슬 발현 벡터 pCMA-G1LALA 의 구축
pCMA-LK 를 XbaI 및 PmeI 로 소화하여 경사슬 시그널 서열 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 제거한 DNA 단편과, 서열 번호 27 로 나타내는 인간 중사슬 시그널 서열 및 인간 IgG1LALA 정상 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (Clontech 사) 를 사용하여 결합하고, pCMA-G1LALA 를 구축하였다.
9-1-3 : 키메라화 chB1 중사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 33 에 나타내는 chB1 중사슬의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 36 내지 440 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (Clontech 사) 를 사용하고, pCMA-G1LALA 를 제한 효소 BlpI 로 절단한 지점에 합성한 DNA 단편을 삽입함으로써 chB1 중사슬 발현 벡터를 구축하였다. chB1 중사슬의 아미노산 서열을 서열 번호 32 에 나타낸다.
9-1-4 : 키메라화 chB1 경사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 29 에 나타내는 chB1 경사슬을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (Clontech 사) 를 사용하여, 합성한 DNA 단편과 pCMA-LK 를 XbaI 및 PmeI 로 소화하여 경사슬 시그널 서열 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 제거한 DNA 단편을 결합함으로써, chB1 경사슬 발현 벡터를 구축하였다. chB1 경사슬의 아미노산 서열을 서열 번호 28 에 나타낸다.
9-2 : 키메라화 항 CLDN6 항체 chB1 의 생산 및 정제
9-2-1 : 키메라화 항체 chB1 의 생산
FreeStyle 293F 세포 (Invitrogen 사) 는 매뉴얼에 따라서, 계대, 배양을 행하였다. 대수 증식기의 1.2 × 109 개의 FreeStyle 293F 세포 (Invitrogen 사) 를 3L Fernbach Erle㎚eyer Flask (CORNING 사) 에 파종하고, FreeStyle 293 expression medium (Invitrogen 사) 으로 희석하여 2.0 × 106 세포/㎖ 로 조제하였다. 40 ㎖ 의 Opti-Pro SFM 배지 (Invitrogen 사) 에 0.24 ㎎ 의 중사슬 발현 벡터와 0.36 ㎎ 의 경사슬 발현 벡터와 1.8 ㎎ 의 Polyethyleneimine (Polyscience ＃24765) 을 첨가하여 천천히 교반하고, 추가로 5 분간 방치한 후에 FreeStyle 293F 세포에 첨가하였다. 37 ℃, 8 ％ CO2 인큐베이터로 4 시간, 90 rpm 으로 진탕 배양 후에 600 ㎖ 의 EX-CELLVPRO 배지 (SAFC Biosciences 사), 18 ㎖ 의 GlutaMAX I (GIBCO 사), 및 30 ㎖ 의 Yeastolate Ultrafiltrate (GIBCO 사) 를 첨가하고, 37 ℃, 8 ％ CO2 인큐베이터로 7 일간, 90 rpm 으로 진탕 배양하여 얻어진 배양 상청을 Disposable Capsule Filter (Advantec ＃CCS-045-E1H) 로 여과하였다. 취득한 키메라화 항 CLDN6 항체를「chB1」로 명명하였다.
9-2-2 : 키메라화 항체 chB1 의 정제
실시예 9-2-1 에서 얻어진 배양 상청으로부터 항체를 rProtein A 어피니티 크로마토그래피의 1 단계 공정에서 정제하였다. 배양 상청을 PBS 로 평형화한 MabSelectSuRe 가 충전된 칼럼 (GE Healthcare Bioscience 사 제조) 에 어플라이한 후에, 칼럼 용량의 2 배 이상의 PBS 로 칼럼을 세정하였다. 다음으로 2 M 아르기닌염산염 용액 (pH 4.0) 으로 용출하고, 항체가 포함되는 획분을 모았다. 그 획분을 투석 (Thermo Scientific 사, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해서 PBS(-) 로의 버퍼 치환을 행하였다. Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (분획 분자량 UF10K, Sartorius 사) 로 항체를 농축하고, IgG 농도를 1 ㎎/㎖ 이상으로 조제하였다. 마지막으로 Minisart-Plusfilter (Sartorius 사) 로 여과하여, 정제 샘플로 하였다.
실시예 10 : 인간화 항 CLDN6 항체의 제작
10-1 : 항 CLDN6 항체의 인간화체 디자인
10-1-1 : 키메라화 항체 chB1 의 가변 영역의 분자 모델링
chB1 의 가변 영역의 분자 모델링은, 호몰로지 모델링으로서 공지된 방법 (Methods in Enzy㏖ogy, 203, 121-153, (1991)) 을 이용하였다. chB1 의 중사슬과 경사슬의 가변 영역에 대해서 높은 서열 동일성을 갖는 Protein Data Bank (Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007)) 에 등록되어 있는 구조 (PDB ID : 1XIW) 를 주형으로, 시판되는 단백질 입체 구조 해석 프로그램 BioLuminate (Schrodinger 사 제조) 를 사용하여 행하였다.
10-1-2 : 인간화 아미노산 서열의 설계
chB1 은, CDR 그래프팅 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)) 에 의해서 인간화하였다. Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) 에 있어서 기정되는 인간의 gamma 사슬 서브 그룹 1 및 kappa 사슬 서브 그룹 1 의 콘센서스 서열이, chB1 의 프레임 워크 영역에 대해서 높은 동일성을 갖는 점에서, 각각, 중사슬과 경사슬의 억셉터로서 선택되었다. 억셉터 상에 이입해야 할 도너 잔기는, Queen etal. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)) 에 의해서 부여되는 기준 등을 참고로 삼차원 모델을 분석함으로써 선택되었다. 또한, CDRL3 이 소수적인 아미노산이 풍부하기 때문에, CDRL3 에 변이를 도입한 인간화 경사슬도 설계하였다.
10-2 : chB1 중사슬의 인간화
설계된 3 종의 중사슬을 hH1, hH2 및 hH3 으로 명명하였다. hH1 의 중사슬 전체 길이 아미노산 서열을, 서열 번호 52 에 기재한다. 서열 번호 52 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을, 서열 번호 53 에 기재한다. hH2 의 중사슬 전체 길이 아미노산 서열을, 서열 번호 56 에 기재한다. 서열 번호 56 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을, 서열 번호 57 에 기재한다. hH3 의 중사슬 전체 길이 아미노산 서열을, 서열 번호 60 에 기재한다. 서열 번호 60 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을, 서열 번호 61 에 기재한다.
10-3 : chB1 경사슬의 인간화
설계된 4 종의 경사슬을 hL1, hL2, hL3 및 hL4 로 명명하였다. hL1 의 경사슬 전체 길이 아미노산 서열을, 서열 번호 36 에 기재한다. 서열 번호 36 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을, 서열 번호 37 에 기재한다. hL2 의 경사슬 전체 길이 아미노산 서열을, 서열 번호 40 에 기재한다. 서열 번호 40 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을, 서열 번호 41 에 기재한다. hL3 의 경사슬 전체 길이 아미노산 서열을, 서열 번호 44 에 기재한다. 서열 번호 44 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열은, 서열 번호 45 에 기재한다. hL4 의 경사슬 전체 길이 아미노산 서열을, 서열 번호 48 에 기재한다. 서열 번호 48 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을, 서열 번호 49 에 기재한다.
10-4 : 중사슬 및 경사슬의 편성에 의한 인간화 항체의 설계
hH1 및 hL1 로 이루어지는 항체를「H1L1 항체」또는「H1L1」로 칭한다. hH2 및 hL2 로 이루어지는 항체를「H2L2 항체」또는「H2L2」로 칭한다. hH1 및 hL3 으로 이루어지는 항체를「H1L3 항체」또는「H1L3」으로 칭한다. hH2 및 hL4 로 이루어지는 항체를「H2L4 항체」또는「H2L4」로 칭한다. hH3 및 hL3 으로 이루어지는 항체를「H3L3 항체」또는「H3L3」으로 칭한다.
10-5 : 인간화 항 CLDN6 항체의 제작
10-5-1 : 인간화 중사슬 발현 벡터의 구축
10-5-1-1 : hH1 발현 벡터의 구축
서열 번호 53 에 나타내는 hH1 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 36 내지 440 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). 실시예 9-1-3 과 동일한 방법으로 hH1 발현 벡터를 구축하였다.
10-5-1-2 : hH2 발현 벡터의 구축
서열 번호 57 에 나타내는 hH2 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 36 내지 440 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). 실시예 9-1-3 과 동일한 방법으로 hH2 발현 벡터를 구축하였다.
10-5-1-3 : hH3 발현 벡터의 구축
서열 번호 61 에 나타내는 hH2 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 36 내지 440 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). 실시예 9-1-3 과 동일한 방법으로 hH3 발현 벡터를 구축하였다.
10-5-2 : 인간화 경사슬 발현 벡터의 구축
10-5-2-1 : hL1 발현 벡터의 구축
서열 번호 37 에 나타내는 hL1 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 37 내지 402 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (Clontech 사) 를 사용하여, pCMA-LK 를 제한 효소 BsiWI 로 절단한 지점에 합성한 DNA 단편을 삽입함으로써 hL1 발현 벡터를 구축하였다.
10-5-2-2 : hL2 발현 벡터의 구축
서열 번호 41 에 나타내는 hL2 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 37 내지 402 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). 실시예 10-5-2-1 과 동일한 방법으로 hL2 발현 벡터를 구축하였다.
10-5-2-3 : hL3 발현 벡터의 구축
서열 번호 45 에 나타내는 hL3 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 37 내지 402 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). 실시예 10-5-2-1 과 동일한 방법으로 hL3 발현 벡터를 구축하였다.
10-5-2-4 : hL4 발현 벡터의 구축
서열 번호 49 에 나타내는 hL4 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 37 내지 402 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). 실시예 10-5-2-1 과 동일한 방법으로 hL4 발현 벡터를 구축하였다.
10-5-3 : 인간화 항체의 조제
10-5-3-1 : 인간화 항체 H1L1, H2L2, H1L3, H2L4, 및 H3L3 의 생산
실시예 9-2-1 과 동일한 방법으로 생산하였다. 실시예 10-4 에 나타낸 중사슬과 경사슬의 편성에 대응하는 중사슬 발현 벡터와 경사슬 발현 벡터의 조합에 의해서, H1L1, H2L2, H1L3, H2L4, 및 H3L3 을 생산하였다.
10-5-3-2 : 인간화 항체 H1L1, H2L2, H1L3, H2L4, 및 H3L3 의 2 step 정제
실시예 10-5-3-1 에서 얻어진 배양 상청을 rProtein A 어피니티 크로마토그래피와 세라믹 하이드록시 아파타이트의 2 단계 공정으로 정제하였다. 배양 상청을 PBS 로 평형화한 MabSelectSuRe 가 충전된 칼럼 (GE Healthcare Bioscience 사 제조) 에 어플라이한 후에, 칼럼 용량의 2 배 이상의 PBS 로 칼럼을 세정하였다. 다음으로 2 M 아르기닌염산염 용액 (pH 4.0) 으로 항체를 용출하였다. 항체가 포함되는 획분을 투석 (Thermo Scientific 사, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해서 PBS 에 대한 버퍼 치환을 행하고, 5 mM 인산나트륨/50 mM MES/pH 7.0 의 버퍼로 5 배 희석한 후에, 5 mM NaPi/50 mM MES/30 mM NaCl/pH 7.0 의 버퍼로 평형화한 세라믹 하이드록시 아파타이트 칼럼 (닛폰 바이오라드, Bio-Scale CHT Type-1 Hydroxyapatite Column) 에 어플라이하였다. 염화나트륨에 의한 직선적 농도 구배 용출을 실시하고, 항체가 포함되는 획분을 모았다. 그 획분을 투석 (Thermo Scientific 사, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해서 HBSor (25 mM 히스티딘/5 ％ 소르비톨, pH6.0) 로의 버퍼 치환을 행하였다. Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (분획 분자량 UF10K, Sartorius 사) 으로 항체를 농축하고, IgG 농도를 50 ㎎/㎖ 로 조제하였다. 마지막으로 Minisart-Plus filter (Sartorius 사) 로 여과하여, 정제 샘플로 하였다.
실시예 11 : 플로 사이토메트리에 의한 인간화 항 CLDN6 항체의 결합능 평가
실시예 10 에서 제조한 인간화 항 CLDN6 항체의 인간 CLDN6 및 패밀리 분자 CLDN3, CLDN4, CLDN9 결합성을 플로 사이토메트리법에 의해서 평가하였다. 실시예 7-1 과 동일한 수법으로 일과성으로 유전자 도입한 293T 세포를 사용하였다. 인간 CLDN6 또는 인간 CLDN9 유전자를 도입한 세포에는, 인간화 항 CLDN6 항체 H1L1, H2L2, H1L3, H2L4, 및 H3L3, 또는 인간 IgG1 컨트롤 항체 (CALBIOCHEM) 를 최종 농도 100 nM, 20 nM, 4 nM, 0.8 nM 으로 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 30 분 정치하였다. 인간 CLDN3, 인간 CLDN4 유전자, 또는 빈 벡터를 도입한 세포에는, 인간화 항 CLDN6 항체 H1L1, H2L2, H1L3, H2L4, 및 H3L3 을 최종 농도 100 nM 으로 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 30 분 정치하였다. 5 ％ 의 소 태아 혈청 (Hyclone) 을 포함하는 Dulbecco's phosphate buffered saline (Sigma-Aldrich) (이하, 5 ％ FBS 함유 PBS) 으로 세정한 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 로 150 배 희석한 FITC AffiniPureF (ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG (H＋L) (Jackson ImmunoResearch) 를 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 30 분 정치하였다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 세정한 후, 플로 사이토미터 (FC500 ; Beckman Coulter) 로 검출을 행하였다. 데이터 해석은 FlowJo (TreeStar) 로 행하고, 항체의 결합량을 나타내는 FITC 의 평균 형광 강도 (MFI) 를 산출하였다. 결과를 도 13 에 나타낸다. 도 13 의 그래프에 있어서, 가로축은 항체 농도, 세로축은 MFI 를 나타낸다. 제조한 인간화 항 CLDN6 항체는 인간 CLDN6 과 인간 CLDN9 에 동일한 정도로 결합하고, 인간 CLDN3, 인간 CLDN4 에는 결합하지 않았다. 인간 컨트롤 IgG1 은 어느 세포에도 결합하지 않았다.
[당사슬 리모델링 항체의 조제]
실시예 12 : 당사슬 변환 1 (T-SG)
[화학식 52]
Figure pct00119
공정 1 : (Fucα1,6)GlcNAc-트라스투주맙의 조제
참고예 3 에서 조제한 트라스투주맙 용액 22 ㎎/㎖ (25 mM 히스티딘 용액 (pH 6.0), 5 ％ 소르비톨 용액) (45.5 ㎖) 를 공통 조작 C 를 사용하여, 50 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 에 대한 완충액 교환을 2 회로 나누어 행하였다. 얻어진 28.1 ㎎/㎖ 의 트라스투주맙 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (18 ㎖) 과 28.0 ㎎/㎖ 의 동 용액 (18 ㎖) 에, 2.0 ㎎/㎖ 야생형 EndoS 용액 (PBS) 을 각각 1.26 ㎖, 1.27 ㎖ 첨가하고, 37 ℃ 에서 4 시간 인큐베이트하였다. 반응의 진행 정도를 Experion 전기 영동 스테이션 (BIO-RAD 제조) 을 사용하여 확인하였다. 반응 종료 후, 이하의 방법에 따라서, 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제와 하이드록시 아파타이트 칼럼에 의한 정제를 행하였다.
(1) 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제
정제 장치 : AKTA pure150 (GE 헬스케어 제조)
칼럼 : HiTrapr Protein A FF (5 ㎖) (GE 헬스케어 제조)
유속 : 5 ㎖/분 (차지시에는 1.25 ㎖/분)
상기에서 얻은 반응액을 복수 회로 나누어 정제하였다. 칼럼은 2 연결되어, 칼럼에의 결합시에는, 반응액을 칼럼 상부에 첨가하고, 결합 버퍼 (20 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) 를 1.25 ㎖/분으로 2 CV 흘리고, 추가로 5 ㎖/분으로 5 CV 흘렸다. 중간 세정시에는, 세정 용액 (20 mM 인산 완충액 (pH 7.0), 0.5 M 염화나트륨 용액) 을 15 CV 흘렸다. 용출시에는, 용출 버퍼 (ImmunoPure IgG Eution buffer, PIERCE 제조) 를 6 CV 흘렸다. 용출액을 1 M 트리스 완충액 (pH 9.0) 으로 즉시 중화하였다. 용출 중에 UV 검출 (280 ㎚) 된 프랙션에 대해서, 미량 분광 광도계 Xpose (Trinean 제조), 및 Experion 전기 영동 스테이션 (BIO-RAD 제조) 을 사용하여 확인하였다. 목적물을 포함하는 프랙션을 공통 조작 C 를 사용하여, 5 mM 인산 완충액 50 mM 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES) 용액 (pH 6.8) 에 대한 완충액 교환을 행하였다.
(2) 하이드록시 아파타이트 크로마토그래피에 의한 정제
정제 장치 : AKTA avant25 (GE 헬스케어 제조)
칼럼 : Bio-Scale Mini CHT Type I 카트리지 (5 ㎖) (BIO-RAD 제조)
유속 : 5 ㎖/분 (차지시에는 1.25 ㎖/분)
칼럼을 2 연결하고, 상기 (1) 에서 얻어진 용액을 복수 회로 나누어 정제하였다. 용액을 칼럼의 상부에 첨가하고, A 액 (5 mM 인산 완충액 50 mM-모르폴리노에탄술폰산 (MES) 용액 (pH 6.8)) 을 1.25 ㎖/분으로 2 CV 흘리고, 추가로 5 ㎖/분으로 3 CV 흘렸다. 그 후, A 액과 B 액 (5 mM 인산 완충액 50 mM-모르폴리노에탄술폰산 (MES) 용액 (pH 6.8), 2 M 염화나트륨 용액) 을 사용하여, 용출하였다. 용출 조건은, A 액 : B 액 = 100 : 0 ∼ 0 : 100 (15 CV) 이다. 또한, 세정 용액 (500 mM 인산 완충액 (pH 6.5)) 을 5 CV 흘렸다.
목적물을 포함하는 프랙션을 공통 조작 C 를 사용하여 완충액 교환을 행하고, 25.5 ㎎/㎖ 의 (Fucα1,6)GlcNAc-트라스투주맙 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (35 ㎖) 을 얻었다.
공정 2 : 트라스투주맙 [SG-(N3)2]2 의 조제
상기 공정 1 에서 얻어진 23.9 ㎎/㎖ (Fucα1,6)GlcNAc-트라스투주맙 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (3.37 ㎖) 에, 실시예 5 공정 2 에서 합성한 화합물 (12.9 ㎎) 의 50 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 용액 (0.258 ㎖), 4.90 ㎎/㎖ 의 EndoS D233Q/Q303L 용액 (PBS) (0.328 ㎖) 을 첨가하고, 30 ℃ 에서 4.5 시간 인큐베이트하였다. 이상의 조작을 2 로트 행하였다. 반응의 진행 정도를 Experion 전기 영동 스테이션 (BIO-RAD 제조) 을 사용하여 확인하였다. 반응 종료 후, 상기 공정 1 과 동일하게 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제와 하이드록시 아파타이트 크로마토그래피에 의한 정제를 행한 후, 목적물을 포함하는 프랙션을 공통 조작 C 를 사용하여 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 에 완충액 교환을 행하고, 10.0 ㎎/㎖ 의 트라스투주맙 [SG-(N3)2]2 용액 (인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0)) (15.5 ㎖) 을 얻었다.
실시예 13 : 당사슬 변환 2 (T-MSG)
[화학식 53]
Figure pct00120
공정 1 : 트라스투주맙 [MSG-N3]2
이하의 조작을 5 로트 행하였다. 실시예 12 공정 1 에서 얻어진 화합물 (20 ㎎/㎖, 15.0 ㎖) 을 사용하고, 실시예 4 공정 4 에서 얻어진 화합물 (25.5 ㎎) 를 당사슬 공여체로서 사용하고, 30 ℃ 에서 3 시간 인큐베이트하여, 실시예 12 공정 2 와 동일한 조작을 행하였다. 5 로트 합쳐서, 14.4 ㎎/㎖ 트라스투주맙 [MSG-N3]2 용액 (인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0)) (93.5 ㎖) 을 얻었다.
실시예 14 : 당사슬 변환 3 (T-MSG1)
[화학식 54]
Figure pct00121
공정 1 : 트라스투주맙 [MSG1-N3]2
이하의 조작을 2 로트 행하였다. 실시예 12 공정 1 에서 얻어진 화합물 (25.5 ㎖, 7.8 ㎖) 을 사용하고, 실시예 3 공정 4 에서 얻어진 화합물 (25.5 ㎎) 를 당사슬 공여체로서 사용하여, 30 ℃ 에서 3 시간 인큐베이트하고, 실시예 12 공정 2 와 동일한 조작을 행하였다. 2 로트 합쳐서, 10.6 ㎎/㎖ 트라스투주맙 [MSG1-N3]2 용액 (인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0)) (31 ㎖) 을 얻었다.
실시예 15 : 당사슬 변환 4 (CLDN6-MSG1 (H1L1))
[화학식 55]
Figure pct00122
공정 1 : (Fucα1,6)GlcNAc-항 CLDN6 항체 (H1L1)
실시예 10 에서 조제한 항 CLDN6 항체 (H1L1) 용액 ca. 37.7 ㎎/㎖ (25 mM 히스티딘 용액 (pH 6.0), 5 ％ 소르비톨 용액) (2.5 ㎖) 을 사용하고, 실시예 12 공정 1 에서 동일한 조작을 행하여, 19.2 ㎎/㎖ 의 (Fucα1,6)GlcNAc-항 CLDN6 항체 (H1L1) 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (4.8 ㎖) 을 얻었다.
공정 2 : 항 CLDN6 항체 (H1L1)-[MSG1-N3]2
상기 공정 1 에서 얻어진 19.2 ㎎/㎖ (Fucα1,6)GlcNAc-항 CLDN6 (H1L1) 항체 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (4.8 ㎖) 을 사용하고, 실시예 3 공정 4 에서 얻어진 화합물 (25.5 ㎎) 을 당사슬 공여체로서 사용하여, 실시예 12 공정 2 와 동일한 조작을 행함으로써, 10.2 ㎎/㎖ 항 CLDN6 항체 (H1L1)-[MSG1-N3]2 용액 (인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0)) (7.2 ㎖) 를 얻었다.
실시예 16 : 당사슬 변환 5 (CLDN6-MSG1 (H2L2))
공정 1 : (Fucα1,6)GlcNAc-항 CLDN6 항체 (H2L2)
실시예 10 에서 조제한 항 CLDN6 항체 (H2L2) 용액 ca. 20 ㎎/㎖ (25 mM 히스티딘 용액 (pH 6.0), 5 ％ 소르비톨 용액) (6 ㎖) 을 사용하고, 실시예 12 공정 1 과 동일한 조작을 행하여, 21.84 ㎎/㎖ 의 (Fucα1,6)GlcNAc-항 CLDN6 항체 (H2L2) 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (5.7 ㎖) 을 얻었다.
공정 2 : 항 CLDN6 항체 (H2L2)-[MSG1-N3]2
상기 공정 1 에서 얻어진 21.8 ㎎/㎖ (Fucα1,6)GlcNAc-항 CLDN6 (H2L2) 항체 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (5.7 ㎖) 을 사용하고, 실시예 3 공정 4 에서 얻어진 화합물 (25.5 ㎎) 를 당사슬 공여체로서 사용하여, 실시예 12 공정 2 와 동일한 조작을 행함으로써, 10.2 ㎎/㎖ 항 CLDN6 항체 (H2L2)-[MSG1-N3]2 용액 (인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0)) (11.1 ㎖) 을 얻었다.
실시예 17 : 당사슬 변환 6 (CLDN6-MSG1 (H1L3))
공정 1 : (Fucα1,6)GlcNAc-항 CLDN6 항체 (H1L3)
실시예 10 에서 조제한 항 CLDN6 항체 (H1L3) 용액 ca. 39.4 ㎎/㎖ (25 mM 히스티딘 용액 (pH 6.0), 5 ％ 소르비톨 용액) (3 ㎖) 을 사용하고, 실시예 12 공정 1 과 동일한 조작을 행하여, 39.2 ㎎/㎖ 의 (Fucα1,6)GlcNAc-항 CLDN6 항체 (H1L3) 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (4.5 ㎖) 을 얻었다.
공정 2 : 항 CLDN6 항체 (H1L3)-[MSG1-N3]2
상기 공정 1 에서 얻어진 39.2 ㎎/㎖ (Fucα1,6)GlcNAc-항 CLDN6 (H1L3) 항체 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (4.5 ㎖) 을 사용하고, 실시예 3 공정 4 에서 얻어진 화합물 (25.5 ㎎) 를 당사슬 공여체로서 사용하여, 실시예 12 공정 2 와 동일한 조작을 행함으로써, 9.83 ㎎/㎖ 항 CLDN6 항체 (H1L3)-[MSG1-N3]2 용액 (인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0)) (7.2 ㎖) 를 얻었다.
실시예 18 : 당사슬 변환 7 (TROP2-MSG1)
공정 1 : (Fucα1,6)GlcNAc-항 Trop2 항체
참고예 2 에서 조제한 항 Trop2 항체 용액 ca. 20 ㎎/㎖ (25 mM 히스티딘 용액 (pH 6.0), 5 ％ 소르비톨 용액) (6 ㎖) 을 사용하고, 실시예 12 공정 1 과 동일한 조작을 행하여, 21.69 ㎎/㎖ 의 (Fucα1,6)GlcNAc-항 Trop2 항체 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (3.3 ㎖) 을 얻었다.
공정 2 : 항 Trop2 항체-[MSG1-N3]2
상기 공정 1 에서 얻어진 21.69 ㎎/㎖ (Fucα1,6)GlcNAc-항 Trop2 항체 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (3.35 ㎖) 을 사용하고, 실시예 3 공정 4 에서 얻어진 화합물 (25.5 ㎎) 를 당사슬 공여체로서 사용하여, 실시예 12 공정 2 와 동일한 조작을 행함으로써, 10.3 ㎎/㎖ 의 항 Trop2 항체-[MSG1-N3]2 용액 (인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0)) (6.4 ㎖) 를 얻었다.
[ADC 의 합성]
실시예 19 ∼ 23 에 ADC1 ∼ ADC 6 의 조제 방법을 나타낸다. 실시예 19 ∼ 23 의 반응식 중의 R 기는 모두 다음 식에 나타내는 것이다.
[화학식 56]
Figure pct00123
(실시예 19 ∼ 23 각각의 공정 1 에서 얻어지는 화합물은, 상기 식으로 나타내는 바와 같이 트리아졸 고리의 기하 이성체를 갖고, 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 드러그 링커를 혼합하여 보유한다.)
실시예 19 : ADC1
[화학식 57]
Figure pct00124
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘주게이션
실시예 15 공정 2 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.2 ㎎/㎖, 2.50 ㎖) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (2.29 ㎖), 실시예 2-1 공정 13 에서 얻어진 화합물 (3-14) 를 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.206 ㎖ ; 항체 1 분자에 대해서 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 사용하여 정제를 행하고, 목적으로 하는 화합물을 갖는 용액을 14.5 ㎖ 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기의 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.54 ㎎/㎖, 항체 수량 : 22.3 ㎎ (89 ％), 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n) : 1.9
실시예 20 : ADC2
[화학식 58]
Figure pct00125
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘주게이션
실시예 14 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.2 ㎎/㎖, 1.00 ㎖) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 ㎖), 실시예 2-1 공정 13 에서 얻어진 화합물 (3-14) 를 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 ㎖ ; 항체 1 분자에 대해서 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 2 일간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 사용하여 정제를 행하고, 목적으로 하는 화합물을 갖는 용액을 6.00 ㎖ 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기의 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.41 ㎎/㎖, 항체 수량 : 8.45 ㎎ (85 ％), 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n) : 1.9
실시예 21 : ADC3
[화학식 59]
Figure pct00126
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘주게이션
실시예 18 공정 2 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10 ㎎/㎖, 1.00 ㎖) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 ㎖), 실시예 2-1 공정 13 에서 얻어진 화합물 (3-14) 를 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 ㎖ ; 항체 1 분자에 대해서 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 2 일간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 사용하여 정제를 행하고, 목적으로 하는 화합물을 갖는 용액을 6.00 ㎖ 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기의 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.47 ㎎/㎖, 항체 수량 : 8.8 ㎎ (88 ％), 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n) : 1.9
실시예 22 : ADC4
[화학식 60]
Figure pct00127
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘주게이션
실시예 16 공정 2 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (9.96 ㎎/㎖, 2.50 ㎖) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (2.29 ㎖), 실시예 2-1 공정 13 에서 얻어진 화합물 (3-14) 를 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.206 ㎖ ; 항체 1 분자에 대해서 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 사용하여 정제를 행하고, 목적으로 하는 화합물을 갖는 용액을 14.5 ㎖ 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기의 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.52 ㎎/㎖, 항체 수량 : 22.0 ㎎ (88 ％), 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n) : 1.9
실시예 23 : ADC5
[화학식 61]
Figure pct00128
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘주게이션
실시예 17 공정 2 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (9.83 ㎎/㎖, 2.50 ㎖) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (2.29 ㎖), 실시예 2-1 공정 13 에서 얻어진 화합물 (3-14) 를 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.206 ㎖ ; 항체 1 분자에 대해서 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 사용하여 정제를 행하고, 목적으로 하는 화합물을 갖는 용액을 14.5 ㎖ 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기의 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.45 ㎎/㎖, 항체 수량 : 21.0 ㎎ (84 ％), 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n) : 1.9
[피롤로벤조디아제핀 유도체의 합성]
실시예 24 : 피롤로벤조디아제핀 유도체 A
약물 1 을 하기의 스킴에 따라서 합성하였다.
[화학식 62]
Figure pct00129
공정 1 : 화합물 7-1
실시예 1-1 공정 5 에서 얻어진 화합물 (1-6) (4.59 g, 8.15 m㏖) 을, 실시예 2-1 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (7-1) (4.86 g, 92 ％) 을 얻었다.
Figure pct00130
공정 2 : 화합물 7-2
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (7-1) (4.86 g, 7.51 m㏖) 을, 실시예 1-1 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (7-2) (3.42 g, 86 ％) 를 얻었다.
Figure pct00131
공정 3 : 화합물 7-3
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (7-2) (6.68 g, 12.5 m㏖) 를, 실시예 1-1 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (7-3) (6.44 g, 97 ％) 을 얻었다.
Figure pct00132
공정 4 : 화합물 7-4
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (7-3) (3.24 g, 6.10 m㏖) 을, 실시예 1-1 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (7-4) (3.86 g, 98 ％) 를 얻었다.
Figure pct00133
공정 5 : 화합물 7-5
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (7-4) (4.49 g, 6.96 m㏖) 를, 실시예 1-1 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (7-5) (3.24 g, 95 ％) 를 얻었다.
Figure pct00134
공정 6 : 화합물 7-6
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (7-5) (0.080 g, 0.164 m㏖) 를, 실시예 2-1 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (7-6) (0.160 g, 98 ％) 을 얻었다.
Figure pct00135
공정 7 : 화합물 7-7
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (7-6) (160 ㎎, 0.161 m㏖) 을, 실시예 2-1 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (7-7) (141 ㎎, 정량적) 을 얻었다.
Figure pct00136
공정 8 : (11a'S)-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}펜틸)옥시]-1',11a'-디하이드로-5'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5'-온 (7-8)
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (7-7) (141 ㎎, 0.161 m㏖) 을, 실시예 2-1 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (7-8) (109.8 ㎎, 99 ％) 을 얻었다.
Figure pct00137
실시예 27 : 피롤로벤조디아제핀 유도체 B
[화학식 63]
Figure pct00138
공정 1 : 화합물 8-1
실시예 2-4 공정 1 에서 얻어진 화합물 (6-2) (6.49 g, 14.7 m㏖) 의 테트라하이드로푸란 (147 ㎖) 용액에, 수소화붕소리튬 (0.642 g, 29.5 m㏖) 을 0 ℃ 에서 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반하였다. 반응 용액에 1 규정 염산을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 얻어진 유기층을, 포화 식염수로 세정하고, 황산마그네슘으로 건조시킨 후, 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물 (6.94 g, 정량적) 은 정제하지 않고 다음 공정에서 사용하였다.
Figure pct00139
공정 2 : 화합물 8-2
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (8-1) (4.50 g, 11.0 m㏖) 을, 실시예 1 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (8-2) (1.94 g, 43 ％) 를 얻었다.
Figure pct00140
공정 3 : 화합물 8-3
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (8-2) (1.94 g, 4.73 m㏖) 의 테트라하이드로푸란 (25 ㎖), 아세트산에틸(25 ㎖), 메탄올 (25 ㎖) 의 혼합 용액에, 질소 분위기 하, 5 ％ 팔라듐탄소 (54 ％ 수분, 1.0 g) 를 첨가한 후, 반응 용액을 수소 분위기 하, 실온에서 22 시간 교반하였다. 반응 용액을 셀라이트 여과한 후, 여과액을 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 80 : 20 (v/v) ∼ 0 : 100 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (8-3) (1.20 g, 93 ％) 을 얻었다.
Figure pct00141
공정 4 : 화합물 8-4
24 공정 5 에서 얻어진 화합물 (7-5) (0.300 g, 0.614 m㏖) 를, 실시예 2-1 공정 2 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (8-4) (0.388 g, 99 ％) 를 얻었다.
Figure pct00142
공정 5 : 화합물 8-5
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (8-4) (0.203 g, 0.318 m㏖) 와 상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (0.131 g, 0.478 m㏖) 을, 실시예 2-1 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (8-5) (0.0880 g, 33 ％) 를 얻었다.
Figure pct00143
공정 6 : 화합물 8-6
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (8-5) (0.0880 g, 0.106 m㏖) 를, 실시예 2-1 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (8-6) (0.0500 g, 66 ％) 을 얻었다.
Figure pct00144
공정 7 : (11a'S)-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-5',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일]옥시}펜틸)옥시]-1',10',11',11a'-테트라하이드로-5'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5'-온 (8-7)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (8-6) (0.0500 g, 0.0698 m㏖) 을 실시예 2-1 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (8-7) (0.0330 g, 77 ％) 을 얻었다.
Figure pct00145
실시예 28 : 피롤로벤조디아제핀 유도체 C
[화학식 64]
Figure pct00146
공정 1 : 화합물 (9-1)
실시예 2-1 공정 1 에서 얻어진 화합물 (3-2) (5.00 g, 9.66 m㏖) 를 실시예 2-1 공정 3 과 동일하게 반응시켜 목적물 (9-1) (3.95 g, 100 ％) 을 얻었다.
Figure pct00147
공정 2 : 화합물 (9-2)
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (9-1) (3.95 g, 9.67 m㏖) 의 디클로로메탄 (97 ㎖) 용액에, 이미다졸 (1.65 g, 24.2 m㏖), 트리이소프로필실릴클로라이드 (2.46 ㎖, 11.6 m㏖) 와 디메틸포름아미드 (5 ㎖) 를 첨가하여, 실온에서 21 시간 교반하였다. 반응 용액에 물을 첨가하고, 클로로포름으로 추출하여, 얻어진 유기층을 물로 세정하고, 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 20 : 80 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (9-2) (4.78 g, 87 ％) 를 얻었다.
Figure pct00148
공정 3 : 화합물 (9-3)
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (9-2) (4.78 g, 8.43 m㏖) 를, 실시예 2-1 공정 4 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (9-3) (2.36 g, 50 ％) 을 얻었다.
Figure pct00149
공정 4 : 화합물 (9-4)
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (9-3) (1.53 g, 2, 72 m㏖) 을 실시예 2-1 공정 5 와 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (9-4) (1.27 g, 69 ％) 를 얻었다.
Figure pct00150
공정 5 : 화합물 (9-5)
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (9-4) (0.519 g, 0.747 m㏖) 를, 실시예 2-1 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (9-5) (0.511 g, 정량적) 를 얻었다.
Figure pct00151
공정 6 : 화합물 (9-6)
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (9-5) (0.178 g, 0.272 m㏖) 를, 실시예 2-1 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (9-6) (0.094 g, 68 ％) 을 얻었다.
Figure pct00152
공정 7 : 화합물 (9-7)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (9-6) (0.063 g, 0.124 m㏖) 을 사용하여, 실시예 2-1 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (9-7) (0.046 g, 72 ％) 을 얻었다.
Figure pct00153
공정 8 : 화합물 (9-8)
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (10-7) (0.046 g, 0.090 m㏖) 을 사용하여, 실시예 2-1 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (9-8) (0.03 g, 56 ％) 을 얻었다.
Figure pct00154
공정 9 : 화합물 (9-9)
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (10-8) (0.030 g, 0.050 m㏖) 을 실시예 2-1 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (9-9) (0.015 g, 0.034 m㏖) 를 얻었다.
Figure pct00155
공정 10 : 화합물 (9-10)
실시예 7 공정 5 에서 얻어진 화합물 (7-5) (0.131 g, 0.268 m㏖) 를 실시예 2-2 공정 1 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (9-10) (0.086 g, 52 ％) 을 얻었다.
Figure pct00156
공정 11 : 화합물 (9-11)
상기 공정 10 에서 얻어지는 화합물 (10-10) (0.015 g, 0.034 m㏖) 과, 상기 공정 9 에서 얻어지는 화합물 (10-9) (0.030 g, 0.048 m㏖) 를 사용하여, 실시예 2-1 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (9-11) (0.032 g, 96 ％) 을 얻었다.
Figure pct00157
공정 12 : 화합물 (9-12)
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 (9-11) (0.031 g, 0.032 m㏖) 을 실시예 2-1 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (9-12) (0.026 g, 95 ％) 를 얻었다.
Figure pct00158
공정 13 : (11a'S)-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-1',11a'-디하이드로-5'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5'-온 (9-13)
상기 공정 12 에서 얻어진 화합물 (10-12) (0.026 g, 0.030 m㏖) 을 실시예 2-1 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (9-13) (0.018 g, 88 ％) 을 얻었다.
Figure pct00159
실시예 29 : 세포 증식 저해 시험 (1)
ATCC (American Type Culture Collection) 로부터 입수한 인간 폐암 세포주 Calu-6 을 평가에 사용하였다. 10 ％ 의 소 태아 혈청 (GE Healthcare) 과 MEM Non-Essential Amino Acids Solution (Thermo Fisher Scientific) 및 Sodium Pyruvate (Thermo Fisher Scientific) 를 포함하는 MEM (Thermo Fisher Scientific ; 이하, EMEM 배지) DM로 1.25 × 104 세포/㎖ 가 되도록 조제하고, 96 웰 세포 배양용 마이크로 플레이트에 80 ㎕ 씩 첨가하였다. 세포 첨가 후, 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 하룻밤 배양하였다.
다음날, EMEM 배지로 100 pM, 50 pM, 25 pM, 12.5 pM, 6.25 pM, 3.13 pM, 1.56 pM, 0.78 pM 으로 희석한 피롤로벤조디아제핀 유도체 A, B, 또는 C 를 마이크로 플레이트에 10 ㎕ 씩 첨가하였다. 피롤로벤조디아제핀 유도체의 비첨가 웰에는 EMEM 배지를 10 ㎕ 씩 첨가하였다. 또한, EMEM 배지로 2 μM 로 조제한 올라파립을 마이크로 플레이트에 10 ㎕ 씩 첨가하였다. 올라파립 비첨가 웰에는 EMEM 배지를 10 ㎕ 씩 첨가하였다. 그 후, 마이크로 플레이트를 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 6 일간 배양하였다. 배양 후, 마이크로 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 실온에서 30 분간 정치하였다. 배양액과 등량의 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) 를 첨가하여 플레이트 믹서로 교반하였다. 실온에서 10 분간 정치 후에 플레이트 리더 (PerkinElmer) 로 발광량을 계측하였다.
유도체 A, B, 또는 C 첨가 웰의 생세포율은 다음 식으로 산출하였다.
생세포율 (％) = a ÷ b × 100
a : 유도체 A, B, 또는 C 첨가 웰의 발광량의 평균치
b : 배지 첨가 웰의 발광량의 평균치
IC50 값은 다음 식으로 산출하였다.
IC50 (nM) = antilog((50 - d) × (LOG10(b) - LOG10(a)) ÷ (d - c) ＋ LOG10(b))
a : 유도체 A, B, 또는 C 의 농도 a
b : 유도체 A, B, 또는 C 의 농도 b
c : 농도 a 의 유도체 A, B, 또는 C 를 첨가했을 때의 생세포율
d : 농도 b 의 유도체 A, B, 또는 C 를 첨가했을 때의 생세포율
a, b 는 생세포율 50 ％ 를 사이에 두는 2 점에서 a ＞ b.
또 유도체 A, B, 또는 C 와 올라파립 2 μM 동시 첨가 웰의 생세포율은 다음 식으로 산출하였다.
생세포율 (％) = a ÷ b × 100
a : 유도체 A, B, 또는 C 와 올라파립 2 μM 동시 첨가 웰의 발광량의 평균치
b : 올라파립 2 μM 첨가 웰의 발광량의 평균치
IC50 값은 다음 식으로 산출하였다.
IC50 (nM) = antilog((50 - d) × (LOG10(b) - LOG10(a)) ÷ (d - c) ＋ LOG10(b))
a : 유도체 A, B, 또는 C 의 농도 a
b : 유도체 A, B, 또는 C 의 농도 b
c : 농도 a 의 유도체 A, B, 또는 C 와 올라파립 2 μM 을 첨가했을 때의 생세포율
d : 농도 b 의 유도체 A, B, 또는 C 와 올라파립 2 μM 을 첨가했을 때의 생세포율
a, b 는 생세포율 50 ％ 를 사이에 두는 2 점에서 a ＞ b.
Calu-6 세포에 대해서 올라파립 2 μM 은 증식 억제 효과를 나타내지 않았다 (증식 억제율 10 ％ 미만). 한편, 유도체 A, B, 또는 C 는 단독 첨가시에 각각 IC50 값 6.8 pM, 119.8 pM, 113.0 pM, 올라파립 2 μM 동시 첨가시에 각각 IC50 값 4.3 pM, 79.4 pM, 89.4 pM 의 증식 억제 효과를 나타내었다. 병용에서는, 개개의 약제 단독과 비교해서 우수한 증식 억제 효과를 나타내었다.
실시예 30 : 세포 증식 저해 시험 (2)
ATCC (American Type Culture Collection) 로부터 입수한 인간 인두암 세포주 FaDu 를 평가에 사용하였다. 10 ％ 의 소 태아 혈청 (GE Healthcare) 과 MEM Non-Essential Amino Acids Solution (Thermo Fisher Scientific) 및 Sodium Pyruvate (Thermo Fisher Scientific) 를 포함하는 MEM (Thermo Fisher Scientific ; 이하, EMEM 배지) 으로 6.25 × 103 세포/㎖ 가 되도록 조제하고, 96 웰 세포 배양용 마이크로 플레이트에 80 ㎕ 씩 첨가하였다. 세포 첨가 후, 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 하룻밤 배양하였다.
다음날, EMEM 배지로 100 pM, 50 pM, 25 pM, 12.5 pM, 6.25 pM, 3.13 pM, 1.56 pM, 0.78 pM 으로 희석한 피롤로벤조디아제핀 유도체 A, B, 또는 C 를 마이크로 플레이트에 10 ㎕ 씩 첨가하였다. 피롤로벤조디아제핀 유도체의 비첨가 웰에는 EMEM 배지를 10 ㎕ 씩 첨가하였다. 또한, EMEM 배지로 1 μM 에 조제한 올라파립을 마이크로 플레이트에 10 ㎕ 씩 첨가하였다. 올라파립 비첨가 웰에는 EMEM 배지를 10 ㎕ 씩 첨가하였다. 그 후, 마이크로 플레이트를 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 6 일간 배양하였다. 배양 후, 마이크로 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 실온에서 30 분간 정치하였다. 배양액과 등량의 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) 를 첨가하여 플레이트 믹서로 교반하였다. 실온에서 10 분간 정치 후에 플레이트 리더 (PerkinElmer) 로 발광량을 계측하였다.
유도체 A, B, 또는 CD첨가 웰의 생세포율은 다음 식으로 산출하였다.
생세포율 (％) = a ÷ b × 100
a : 유도체 A, B, 또는 C 첨가 웰의 발광량의 평균치
b : 배지 첨가 웰의 발광량의 평균치
IC50 값은 다음 식으로 산출하였다.
IC50 (nM) = antilog((50 - d) × (LOG10(b) - LOG10(a)) ÷ (d - c) ＋ LOG10(b))
a : 유도체 A, B, 또는 C 의 농도 a
b : 유도체 A, B, 또는 C 의 농도 b
c : 농도 a 의 유도체 A, B, 또는 C 를 첨가했을 때의 생세포율
d : 농도 b 의 유도체 A, B, 또는 C 를 첨가했을 때의 생세포율
a, b 는 생세포율 50 ％ 를 사이에 두는 2 점에서 a ＞ b.
또 유도체 A, B, 또는 C 와 올라파립 1 μM 동시 첨가 웰의 생세포율은 다음 식으로 산출하였다.
생세포율 (％) = a ÷ b × 100
a : 유도체 A, B, 또는 C 와 올라파립 1 μM 동시 첨가 웰의 발광량의 평균치
b : 올라파립 1 μM 첨가 웰의 발광량의 평균치
IC50 값은 다음 식으로 산출하였다.
IC50 (nM) = antilog((50 - d) × (LOG10(b) - LOG10(a)) ÷ (d - c) ＋ LOG10(b))
a : 유도체 A, B, 또는 C 의 농도 a
b : 유도체 A, B, 또는 C 의 농도 b
c : 농도 a 의 유도체 A, B, 또는 C 와 올라파립 1 μM 을 첨가했을 때의 생세포율
d : 농도 b 의 유도체 A, B, 또는 C 와 올라파립 1 μM 을 첨가했을 때의 생세포율
a, b 는 생세포율 50 ％ 를 사이에 두는 2 점에서 a ＞ b.
FaDu 세포에 대해서 올라파립 1 μM 은 증식 억제 효과를 나타내지 않았다 (증식 억제율 10 ％ 미만). 한편, 유도체 A, B, 또는 C 는 단독 첨가시에 각각 IC50 값 8.6 pM, 123.2 pM, 73.2 pM, 올라파립 1 μM 동시 첨가시에 각각 IC50 값 4.4 pM, 71.9 pM, 44.5 pM 의 증식 억제 효과를 나타내었다. 병용에서는, 개개의 약제 단독과 비교해서 우수한 증식 억제 효과를 나타내었다.
실시예 31 : 세포 증식 저해 시험 (3)
ATCC (American Type Culture Collection) 로부터 입수한 인간 인두암 세포주 FaDu 를 평가에 사용하였다. 10 ％ 의 소 태아 혈청 (GE Healthcare) 과 MEM Non-Essential Amino Acids Solution (Thermo Fisher Scientific) 및 Sodium Pyruvate (Thermo Fisher Scientific) 를 포함하는 MEM (Thermo Fisher Scientific ; 이하, EMEM 배지) 로 6.25 × 103 세포/㎖ 가 되도록 조제하고, 96 웰 세포 배양용 마이크로 플레이트에 80 ㎕ 씩 첨가하였다. 세포 첨가 후, 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 하룻밤 배양하였다.
다음날, EMEM 배지로 100 pM, 50 pM, 25 pM, 12.5 pM, 6.25 pM, 3.13 pM, 1.56 pM, 0.78 pM 으로 희석한 피롤로벤조디아제핀 유도체 A, B, 또는 C 를 마이크로 플레이트에 10 ㎕ 씩 첨가하였다. 피롤로벤조디아제핀 유도체의 비첨가 웰에는 EMEM 배지를 10 ㎕ 씩 첨가하였다. 또한, EMEM 배지로 2 nM 으로 조제한 탈라조파립을 마이크로 플레이트에 10 ㎕ 씩 첨가하였다. 탈라조파립 비첨가 웰에는 EMEM 배지를 10 ㎕ 씩 첨가하였다. 그 후, 마이크로 플레이트를 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 6 일간 배양하였다. 배양 후, 마이크로 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 실온에서 30 분간 정치하였다. 배양액과 등량의 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) 를 첨가하여 플레이트 믹서로 교반하였다. 실온에서 10 분간 정치 후에 플레이트 리더 (PerkinElmer) 로 발광량을 계측하였다.
유도체 A, B, 또는 C 첨가 웰의 생세포율은 다음 식으로 산출하였다.
생세포율 (％) = a ÷ b × 100
a : 유도체 A, B, 또는 C 첨가 웰의 발광량의 평균치
b : 배지 첨가 웰의 발광량의 평균치
IC50 값은 다음 식으로 산출하였다.
IC50 (nM) = antilog((50 - d) × (LOG10(b) - LOG10(a)) ÷ (d - c) ＋ LOG10(b))
a : 유도체 A, B, 또는 C 의 농도 a
b : 유도체 A, B, 또는 C 의 농도 b
c : 농도 a 의 유도체 A, B, 또는 C 를 첨가했을 때의 생세포율
d : 농도 b 의 유도체 A, B, 또는 C 를 첨가했을 때의 생세포율
a, b 는 생세포율 50 ％ 를 사이에 두는 2 점에서 a ＞ b.
또 유도체 A, B, 또는 C 와 탈라조파립 2 nM 동시 첨가 웰의 생세포율은 다음 식으로 산출하였다.
생세포율 (％) = a ÷ b × 100
a : 유도체 A, B, 또는 C 와 탈라조파립 2 nM 동시 첨가 웰의 발광량의 평균치
b : 탈라조파립 2 nM 첨가 웰의 발광량의 평균치
IC50 값은 다음 식으로 산출하였다.
IC50 (nM) = antilog((50 - d) × (LOG10(b) - LOG10(a)) ÷ (d - c) ＋ LOG10(b))
a : 유도체 A, B, 또는 C 의 농도 a
b : 유도체 A, B, 또는 C 의 농도 b
c : 농도 a 의 유도체 A, B, 또는 C 와 탈라조파립 2 nM 을 첨가했을 때의 생세포율
d : 농도 b 의 유도체 A, B, 또는 C 와 탈라조파립 2 nM 을 첨가했을 때의 생세포율
a, b 는 생세포율 50 ％ 를 사이에 두는 2 점에서 a ＞ b.
FaDu 세포에 대해서 탈라조파립 2 nM 은 증식 억제 효과를 나타내지 않았다 (증식 억제율 10 ％ 미만). 한편, 유도체 A, B, 또는 C 는 단독 첨가시에 각각 IC50 값 7.7 pM, 121.2 pM, 83.1 pM, 탈라조파립 2 nM 동시 첨가시에 각각 IC50 값 4.7 pM, 82.1 pM, 51.2 pM 의 증식 억제 효과를 나타내었다. 병용에서는, 개개의 약제 단독과 비교해서 우수한 증식 억제 효과를 나타내었다.
실시예 32 : 세포 증식 저해 시험 (4)
ATCC (American Type Culture Collection) 로부터 구입한 인간 난소암주 SK-OV-3 세포를 평가에 사용하였다. 10 ％ 의 소 태아 혈청 (GE Healthcare) 을 포함하는 McCoy's5A (Modified) Medium (Thermo Fisher Scientific ; 이하, McCoy's 5A 배지) 으로 1.25 × 104 세포/㎖ 가 되도록 조제하고, 96 웰 세포 배양용 마이크로 플레이트에 80 ㎕ 씩 첨가하였다. 세포 첨가 후, 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 하룻밤 배양하였다.
다음날, McCoy's 5A 배지로 100 pM, 50 pM, 25 pM, 12.5 pM, 6.25 pM, 3.13 pM, 1.56 pM, 0.78 pM 으로 희석한 피롤로벤조디아제핀 유도체 A 를 마이크로 플레이트에 10 ㎕ 씩 첨가하였다. 피롤로벤조디아제핀 유도체 A 비첨가 웰에는 McCoy's 5A 배지를 10 ㎕ 씩 첨가하였다. 또한, McCoy's 5A 배지로 5 nM 으로 조제한 탈라조파립을 마이크로 플레이트에 10 ㎕ 씩 첨가하였다. 탈라조파립 비첨가 웰에는 McCoy's 5A 배지를 10 ㎕ 씩 첨가하였다. 그 후, 마이크로 플레이트를 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 6 일간 배양하였다. 배양 후, 마이크로 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 실온에서 30 분간 정치하였다. 배양액과 등량의 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) 를 첨가하여 플레이트 믹서로 교반하였다. 실온에서 10 분간 정치 후에 플레이트 리더 (PerkinElmer) 로 발광량을 계측하였다.
유도체 A 첨가 웰의 생세포율은 다음 식으로 산출하였다.
생세포율 (％) = a ÷ b × 100
a : 유도체 A 첨가 웰의 발광량의 평균치
b : 배지 첨가 웰의 발광량의 평균치
IC50 값은 다음 식으로 산출하였다.
IC50 (nM) = antilog((50 - d) × (LOG10(b) - LOG10(a)) ÷ (d - c) ＋ LOG10(b))
a : 유도체 A 의 농도 a
b : 유도체 A 의 농도 b
c : 농도 a 의 유도체 A 를 첨가했을 때의 생세포율
d : 농도 b 의 유도체 A 를 첨가했을 때의 생세포율
a, b 는 생세포율 50 ％ 를 사이에 두는 2 점에서 a ＞ b.
또 유도체 A 와 탈라조파립 5 nM 동시 첨가 웰의 생세포율은 다음 식으로 산출하였다.
생세포율 (％) = a ÷ b × 100
a : 유도체 A 와 탈라조파립 5 nM 동시 첨가 웰의 발광량의 평균치
b : 탈라조파립 5 nM 첨가 웰의 발광량의 평균치
IC50 값은 다음 식으로 산출하였다.
IC50 (nM) = antilog((50 - d) × (LOG10(b) - LOG10(a)) ÷ (d - c) ＋ LOG10(b))
a : 유도체 A 의 농도 a
b : 유도체 A 의 농도 b
c : 농도 a 의 유도체 A 와 탈라조파립 5 nM 을 첨가했을 때의 생세포율
d : 농도 b 의 유도체 A 와 탈라조파립 5 nM 을 첨가했을 때의 생세포율
a, b 는 생세포율 50 ％ 를 사이에 두는 2 점에서 a ＞ b.
SK-OV-3 세포에 대해서 탈라조파립 5 nM 은 증식 억제 효과를 나타내지 않았다 (증식 억제율 10 ％ 미만). 한편, 유도체 A 는 단독 첨가시에 IC50 값 8.1 pM, 탈라조파립 5 nM 동시 첨가시에 IC50 값 4.6 pM 의 증식 억제 효과를 나타내었다. 병용에서는, 개개의 약제 단독과 비교해서 우수한 증식 억제 효과를 나타내었다.
실시예 33 : 항종양 시험 (1)
마우스 : 5-6 주령의 암컷 BALB/c 누드 마우스 (닛폰 찰스·리버사) 를 실험에 제공하였다.
측정·계산식 : 모든 연구에 있어서, 종양의 장경 및 단경을 전자식 디지털 캘리퍼 (CD-15CX, Mitutoyo Corp.) 로 1 주간에 2 회 측정하고, 종양 체적 (㎣) 을 계산하였다. 계산식은 이하에 나타내는 바와 같다.
종양 체적 (㎣) = 1/2 × 장경 (㎜) × [단경 (㎜)]2
항 CLDN6 항체-약물 콘주게이트 ADC1, 항 HER2 항체-약물 콘주게이트 ADC2 및 항 TROP2 항체-약물 콘주게이트 ADC3 은 ABS buffer (10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5), 5 ％ 소르비톨) 로 희석하고, 10 ㎖/㎏ 의 액량을 꼬리 정맥 내 투여하였다. 올라파립은 Dimethyl sulfoxide (DMSO) 로 용해하고, 10 ％ 2-hydroxy-propyl-β-cyclodextrin (SIGMA-ALDRICH)/Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline 으로 희석한 후에 10 ㎖/㎏ 의 액량을 복강 내 투여하였다. 탈라조파립은 DMSO 로 용해하고, 10 ％ N,N-디메틸아세트아미드/5 ％ Kolliphor HS15 (SIGMA-ALDRICH)/Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline 으로 희석하고, 10 ㎖/㎏ 의 액량을 경구 투여하였다. 니라파립은 DMSO 로 용해하고, 0.5 ％ methylcellulose 로 희석하여, 10 ㎖/㎏ 의 액량을 경구 투여하였다. 이상의 방법은, 실시예 34 ∼ 37 에서 공통이다.
ATCC (American Type Culture Collection) 로부터 구입한 인간 췌암 세포주 CFPAC-1 을 생리 식염수에 현탁하고, 5.0 × 106 세포를 암컷 누드 마우스의 우체 측부 (側部) 에 피하 이식하고, 이식 10 일 후에 무작위로 군나누기를 실시하였다 (Day0). ADC2 는 Day0 에 0.2 ㎎/㎏ 의 용량으로 투여하였다. 탈라조파립은 Day0 부터 5 일간, 0.8 ㎎/㎏ 의 용량으로 투여하였다. 각각의 단제 투여군과 병용 투여군 및, 컨트롤군으로서 약물 처치 없음 (No treatment) 의 군을 설정하였다.
ADC2 와 탈라조파립의 병용 효과를 도 1 에 나타낸다. 도면 중, 가로축은 세포 이식 후의 날짜, 세로축은 종양 체적을 나타낸다. 탈라조파립 단제 투여의 시험 마지막 날 (Day35) 에 있어서의 종양 증식 억제율 (Tumor Growth Inhibition, TGI) 은 17 ％ 였다. ADC2 의 단제 투여에 의한 TGI 는 94 ％ 였다. 한편, ADC2 와 탈라조파립와의 병용 투여에서는, 탈라조파립 단제 투여보다 유의하게 우수한 종양 증식 억제 효과가 확인되었다 (P ＜ 0.005. Dunnett's test 에 의해서 산출. 이하 동일.). 또, ADC2 단제 투여보다 유의하게 우수한 종양 증식 억제 효과가 확인되어 (P ＜ 0.05), 종양 증식 억제율은 (TGI, 99 ％) 이었다. 또, 어느 단제 및 병용 투여군에 있어서, 체중 감소 등의 특별히 눈에 띄는 소견은 확인되지 않았다.
실시예 34 : 항종양 시험 (2)
DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) 로부터 구입한 인간 유암주 JIMT-1 세포를 생리 식염수에 현탁하여 5 × 106 세포를 암컷 누드 마우스의 우체 측부에 피하 이식하고, 이식 10 일 후에 무작위로 군나누기를 실시하였다 (Day0). 항 HER2 항체-약물 콘주게이트 ADC2 는 Day0 에 0.2 ㎎/㎏ 의 용량으로 투여하였다. PARP 저해제는 올라파립을 50 ㎎/㎏ 의 용량 또는 탈라조파립을 0.8 ㎎/㎏ 의 용량으로 Day0 부터 5 일간 투여하였다. 각각의 단제 투여군, ADC2 와 PARP 저해제의 병용 투여군 및, 컨트롤군으로서 ABS buffer 투여군을 설정하였다.
ADC2 와 올라파립의 병용 효과를 도 2 에 나타낸다. 도면 중, 가로축은 세포 이식 후의 날짜, 세로축은 종양 체적을 나타낸다. 올라파립 단제 투여에서는 종양 증식 억제 효과를 확인하지 않았다. ADC2 의 단제 투여에 의한 시험 마지막 날 (Day43) 에 있어서의 종양 증식 억제율 (Tumor Growth Inhibition, TGI) 은 75 ％ 였다. 한편, ADC2 와 올라파립의 병용 투여에서는, 올라파립 단제 투여보다 유의하게 우수한 종양 증식 억제 효과가 확인되었다 (P ＜ 0.005). 또, ADC2 단제 투여보다 종양 증식 억제율은 높아 (TGI, 82 ％), 강한 병용 효과가 확인되었다. 또, 어느 단제 및 병용 투여군에 있어서, 체중 감소 등의 특별히 눈에 띄는 소견은 확인되지 않았다.
ADC2 와 탈라조파립의 병용 효과를 도 3 에 나타낸다. 도면 중, 가로축은 세포 이식 후의 날짜, 세로축은 종양 체적을 나타낸다. 탈라조파립 단제 투여에서는 종양 증식 억제 효과를 확인하지 않았다. ADC2 의 단제 투여에 의한 시험 마지막 날 (Day43) 에 있어서의 종양 증식 억제율 (Tumor Growth Inhibition, TGI) 은 75 ％ 였다. 한편, ADC2 와 탈라조파립의 병용 투여에서는, 탈라조파립 단제 투여보다 유의하게 우수한 종양 증식 억제 효과가 확인되었다 (P ＜ 0.005). 또, ADC2 단제 투여보다 유의하게 우수한 종양 증식 억제 효과가 확인되어 (P ＜ 0.05), 종양 증식 억제율은 (TGI, 91 ％) 이었다. 또, 어느 단제 및 병용 투여군에 있어서, 체중 감소 등의 특별히 눈에 띄는 소견은 확인되지 않았다.
실시예 35 : 항종양 시험 (3)
ATCC (American Type Culture Collection) 로부터 입수한 인간 인두암 세포주 FaDu 를 생리 식염수에 현탁하고, 3.0 × 106 세포를 암컷 누드 마우스의 우체 측부에 피하 이식하고, 이식 10 일 후에 무작위로 군나누기를 실시하였다 (Day0). 항 TROP2 항체-약물 콘주게이트 ADC3 은 Day0 에 0.2 ㎎/㎏ 의 용량으로 투여하였다. PARP 저해제는 올라파립을 50 ㎎/㎏ 의 용량 또는 탈라조파립을 0.8 ㎎/㎏ 의 용량으로 Day0 부터 5 일간 투여하였다. 각각의 단제 투여군, ADC3 과 PARP 저해제의 병용 투여군 및, 컨트롤군으로서 ABS buffer 투여군을 설정하였다.
ADC3 과 올라파립의 병용 효과를 도 4 에 나타낸다. 도면 중, 가로축은 세포 이식 후의 날짜, 세로축은 종양 체적을 나타낸다. 올라파립 단제 투여의 시험 마지막 날 (Day25) 에 있어서의 종양 증식 억제율 (Tumor Growth Inhibition, TGI) 은 7 ％ 였다. ADC3 의 단제 투여에 의한 시험 마지막 날에 있어서의 종양 증식 억제율 (Tumor Growth Inhibition, TGI) 은 67 ％ 였다. 한편, ADC3 과 올라파립의 병용 투여에서는, 올라파립 단제 투여보다 유의하게 우수한 종양 증식 억제 효과가 확인되었다 (P ＜ 0.005). 또, ADC3 단제 투여보다 유의하게 우수한 종양 증식 억제 효과가 확인되어 (P ＜ 0.05), 종양 증식 억제율은 (TGI, 76 ％) 이었다. 또, 어느 단제 및 병용 투여군에 있어서, 체중 감소 등의 특별히 눈에 띄는 소견은 확인되지 않았다.
ADC3 과 탈라조파립의 병용 효과를 도 5 에 나타낸다. 도면 중, 가로축은 세포 이식 후의 날짜, 세로축은 종양 체적을 나타낸다. 탈라조파립 단제 투여의 시험 마지막 날 (Day25) 에 있어서의 종양 증식 억제율 (Tumor Growth Inhibition, TGI) 은 33 ％ 였다. ADC3 의 단제 투여에 의한 시험 마지막 날에 있어서의 종양 증식 억제율 (Tumor Growth Inhibition, TGI) 은 67 ％ 였다. 한편, ADC3 과 탈라조파립와의 병용 투여에서는, 탈라조파립 단제 투여보다 유의하게 우수한 종양 증식 억제 효과가 확인되었다 (P ＜ 0.005). 또, ADC3 단제 투여보다 유의하게 우수한 종양 증식 억제 효과가 확인되어 (P ＜ 0.005), 종양 증식 억제율은 (TGI, 83 ％) 이었다. 또, 어느 단제 및 병용 투여군에 있어서, 체중 감소 등의 특별히 눈에 띄는 소견은 확인되지 않았다.
실시예 36 : 항종양 시험 (4)
ATCC (American Type Culture Collection) 로부터 구입한 인간 난소암 세포주 OV-90 을 마트리겔 (CORNING) 에 현탁하고, 2.5 × 106 세포를 암컷 누드 마우스의 우체 측부에 피하 이식하고, 이식 18 일 후에 무작위로 군나누기를 실시하였다 (Day0). 항 CLDN6 항체-약물 콘주게이트 ADC1 은 Day0 에 0.3 ㎎/㎏ 의 용량으로 투여하였다. 니라파립은 Day0 부터 5 일간, 75 ㎎/㎏ 의 용량으로 투여하였다. 각각의 단제 투여군과 병용 투여군 및, 컨트롤군으로서 약물 처치 없음 (No treatment) 의 군을 설정하였다.
ADC1 과 니라파립의 병용 결과를 도 42 에 나타낸다. 도면 중, 가로축은 세포 이식 후의 날짜, 세로축은 종양 체적을 나타낸다. 니라파립 단제 투여에 의한 Day21 시점의 종양 증식 억제율 (Tumor Growth Inhibition, TGI) 은 1 ％ 로, Day21 시점에서 체중 감소 등의 눈에 띄는 소견은 확인되지 않았다. ADC1 단제 투여군 및 ADC1 과 니라파립의 병용 투여군에 있어서의 Day21 시점의 TGI 는 모두 96 ％ 이고, Day21 시점에서 체중 감소 등의 눈에 띄는 소견은 확인되지 않았다. 한편, Day53 시점에서는 ADC1 과 니라파립의 병용 투여에서는, ADC1 단제 투여와 비교해서 종양 증식 억제 효과가 확인되었다. Day53 시점에서 ADC1 단제 투여, 및 ADC1 과 니라파립의 병용 투여에 의한 체중 감소 등의 눈에 띄는 소견은 확인되지 않았다.
또한, 본 실시예에서 사용한 ADC1 은, 항 CLDN6 (H1L1) 항체를 사용하여, 실시예 15 및 실시예 19로 동일한 방법을 따라서 제조하였다.
실시예 37 : 항종양 시험 (5)
ATCC (American Type Culture Collection) 로부터 구입한 인간 난소암 세포주 OV-90 을 마트리겔 (CORNING) 에 현탁하고, 2.5 × 106 세포를 암컷 누드 마우스의 우체 측부에 피하 이식하고, 이식 13 ∼ 18 일 후에 무작위로 군나누기를 실시한다 (Day0). 항 CLDN6 항체-약물 콘주게이트 ADC1 은 Day0 에 0.2 ㎎/㎏ 의 용량으로 투여한다. PARP 저해약은 올라파립을 50 ㎎/㎏ 의 용량 또는 탈라조파립을 0.8 ㎎/㎏ 의 용량으로 Day0 부터 5 일간 투여한다. 각각의 단제 투여군, ADC1 과 PARP 저해약의 병용 투여군 및, 컨트롤군으로서 약물 처치 없음 (No treatment) 의 군을 설정한다.
실시예 38 : 트라스투주맙 변이체-[MSG1-N3]2 또는 트라스투주맙 변이체2-[MSG1-N3]2
공정 1 : (Fucα1,6)GlcNAc-트라스투주맙 변이체의 조제
트라스투주맙 변이체 (경사슬 : 서열 번호 73, 중사슬 : 서열 번호 75) 용액 ca.22.3 ㎎/㎖ (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (2.69 ㎖) 에, 7.7 ㎎/㎖ 야생형 EndoS 용액 (PBS) 을 0.156 ㎖ 첨가하고, 37 ℃ 에서 4 시간 인큐베이트하였다. 반응의 진행 정도를 Experion 전기 영동 스테이션 (BIO-RAD 제조) 을 사용하여 확인하였다. 반응 종료 후, 이하의 방법에 따라서, 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제와 하이드록시 아파타이트 칼럼에 의한 정제를 행하였다.
(1) 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제
정제 장치 : AKTA avant (GE 헬스케어 제조)
칼럼 : HiTrap rProtein A FF (5 ㎖) (GE 헬스케어 제조)
유속 : 5 ㎖/분 (차지시에는 1.25 ㎖/분)
상기에서 얻은 반응액을 복수 회로 나누어 정제하였다. 칼럼에의 결합시에는, 반응액을 칼럼 상부에 첨가하고, 결합 버퍼 (20 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) 를 1.25 ㎖/분으로 4 CV (Column Volume) 흘리고, 추가로 5 ㎖/분으로 5 CV 흘렸다. 중간 세정시에는, 세정 용액 (20 mM 인산 완충액 (pH 7.0), 0.5 M 염화나트륨 용액) 을 15 CV 흘렸다. 용출시에는, 용출 버퍼 (ImmunoPure IgG Eution buffer, PIERCE 제조) 를 6 CV 흘렸다. 용출액을 1 M 트리스 완충액 (pH 9.0) 으로 즉시 중화하였다. 목적물을 포함하는 프랙션을 공통 조작 C 를 사용하여, 5 mM 인산 완충액 50 mM-모르폴리노에탄술폰산 (MES) 용액 (pH 6.8) 에 대한 완충액 교환을 행하였다.
(2) 하이드록시 아파타이트 크로마토그래피에 의한 정제
정제 장치 : AKTA avant (GE 헬스케어 제조)
칼럼 : Bio-Scale Mini CHT Type I 카트리지 (5 ㎖) (BIO-RAD 제조)
유속 : 5 ㎖/분 (차지시에는 1.25 ㎖/분)
상기 (1) 에서 얻어진 용액을 칼럼의 상부에 첨가하고, A 액 (5 mM 인산 완충액 50 mM-모르폴리노에탄술폰산 (MES) 용액 (pH 6.8)) 을 1.25 ㎖/분으로 4 CV 흘리고, 추가로 5 ㎖/분으로 3 CV 흘렸다. 그 후, A 액과 B 액 (5 mM 인산 완충액 50 mM-모르폴리노에탄술폰산 (MES) 용액 (pH 6.8), 2 M 염화나트륨 용액) 을 사용하여, 용출하였다. 용출 조건은, A 액 : B 액 = 100 : 0 ∼ 0 : 100 (15 CV) 이다. 또한, 세정 용액 (500 mM 인산 완충액 (pH 6.5)) 을 5 CV 흘렸다.
목적물을 포함하는 프랙션을 공통 조작 C 를 사용하여 완충액 교환을 행하고, 6.08 ㎎/㎖ 의 (Fucα1,6)GlcNAc-트라스투주맙 변이체 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (6.10 ㎖) 을 얻었다.
공정 2 : Trasutuzumab 변이체-[MSG1-N3]2 의 조제
상기 공정 1 에서 얻어진 6.08 ㎎/㎖ (Fucα1,6)GlcNAc-Trasutuzumab 변이체 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (6.10 ㎖) 을 사용하고, 실시예 3 공정 4 에서 합성한 화합물 (9.78 ㎎) 의 50 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 용액 (0.200 ㎖), 5.80 ㎎/㎖ 의 EndoS D233Q/Q303L 용액 (PBS) (0.128 ㎖) 을 첨가하고, 30 ℃ 에서 3 시간 인큐베이트하였다. 반응의 진행 정도를 Experion 전기 영동 스테이션 (BIO-RAD 제조) 을 사용하여 확인하였다. 반응 종료 후, 상기 공정 1 과 동일하게 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제와 하이드록시 아파타이트 크로마토그래피에 의한 정제를 행한 후, 목적물을 포함하는 프랙션을 공통 조작 C 를 사용하여 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 에 완충액 교환을 행하고, 10.2 ㎎/㎖ 의 Trasutuzumab 변이체-[MSG1-N3]2 용액 (인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0)) (3.65 ㎖) 을 얻었다.
트라스투주맙 변이체 2 (경사슬 : 서열 번호 76, 중사슬 : 77) 를 사용하여, 실시예 38 의 공정 1 및 2 와 동일한 조작을 행함으로써 Trasutuzumab 변이체2-[MSG1-N3]2 를 얻었다.
실시예 39 : ADC6
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘주게이션
실시예 38 공정 2 에서 얻어진 트라스투주맙 변이체-[MSG1-N3]2 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 ㎎/㎖, 0.40 ㎖) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.767 ㎖), 실시예 2-1 공정 13 에서 얻어진 화합물 (3-14) 의 10 mM 디메틸술폭사이드 용액 (0.033 ㎖ ; 항체 1 분자에 대해서 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 후술하는 공통 조작 D 를 사용하여 정제를 행하고, 목적으로 하는 화합물을 갖는 용액을 7.00 ㎖ 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기의 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 0.48 ㎎/㎖, 항체 수량 : 3.39 ㎎ (85 ％), 항체 1 분자당 평균 약물 결합수 (n) : 1.7
실시예 40 : ADC7
공정1-1 : 항체와 약물 링커의 콘주게이션 (ADC 7)
실시예 38 에서 얻어진 트라스투주맙 변이체2-[MSG1-N3]2 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 ㎎/㎖, 0.50 ㎖) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.486 ㎖), 실시예 2-1 공정 13 에서 얻어진 화합물 (3-14) 의 10 mM 디메틸술폭사이드 용액 (0.014 ㎖ ; 항체 1 분자에 대해서 4 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 40 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 후술하는 공통 조작 D 를 사용하여 정제를 행하고, 목적으로 하는 화합물을 갖는 용액을 2.50 ㎖ 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기의 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.12 ㎎/㎖, 항체 수량 : 2.80 ㎎ (56 ％), 항체 1 분자당 평균 약물 결합수 (n) : 1.8
산업상 이용가능성
본 발명의 항체-약물 콘주게이트, 항체 및/또는 PBD 유도체 등을 사용함으로써, 각종 암의 치료 또는 예방이 가능해진다.
배열표 프리 텍스트
서열 번호 1 : 인간 CLDN6 의 아미노산 서열
서열 번호 2 : 인간 CLDN6 의 아미노산 서열을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 3 : 인간 CLDN9 의 아미노산 서열
서열 번호 4 : 인간 CLDN9 의 아미노산 서열을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 5 : B1 항체 경사슬의 CDRL1 의 아미노산 서열
서열 번호 6 : B1 항체 경사슬의 CDRL2 의 아미노산 서열
서열 번호 7 : B1 항체 경사슬의 CDRL3 의 아미노산 서열
서열 번호 8 : 인간화 B1 항체 경사슬 L4 의 CDRL3 의 아미노산 서열
서열 번호 9 : B1 항체 중사슬의 CDRH1 의 아미노산 서열
서열 번호 10 : B1 항체 중사슬의 CDRH2 의 아미노산 서열
서열 번호 11 : B1 항체 중사슬의 CDRH3 의 아미노산 서열
서열 번호 12 : C7 항체 경사슬의 CDRL1 의 아미노산 서열
서열 번호 13 : C7 항체 경사슬의 CDRL2 의 아미노산 서열
서열 번호 14 : C7 항체 경사슬의 CDRL3 의 아미노산 서열
서열 번호 15 : C7 항체 중사슬의 CDRH1 의 아미노산 서열
서열 번호 16 : C7 항체 중사슬의 CDRH2 의 아미노산 서열
서열 번호 17 : C7 항체 중사슬의 CDRH3 의 아미노산 서열
서열 번호 18 : B1 항체 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 19 : B1 항체 경사슬의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 20 : B1 항체 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 21 : B1 항체 중사슬의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 22 : C7 항체 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 23 : C7 항체 경사슬의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 24 : C7 항체 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 25 : C7 항체 중사슬의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 26 : 인간 경사슬 시그널 서열 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편
서열 번호 27 : 인간 중사슬 시그널 서열 및 인간 IgG1LALA 정상 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편
서열 번호 28 : chB1 경사슬의 아미노산 서열
서열 번호 29 : chB1 경사슬의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편
서열 번호 30 : chB1 경사슬의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 31 : chB1 경사슬 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 32 : chB1 중사슬의 아미노산 서열
서열 번호 33 : chB1 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 34 : chB1 중사슬의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 35 : chB1 중사슬의 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 36 : 인간화 항체 경사슬 hL1 의 아미노산 서열
서열 번호 37 : 인간화 항체 경사슬 hL1 을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 38 : 인간화 항체 경사슬 hL1 의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 39 : 인간화 항체 경사슬 hL1 의 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 40 : 인간화 항체 경사슬 hL2 의 아미노산 서열
서열 번호 41 : 인간화 항체 경사슬 hL2 를 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 42 : 인간화 항체 경사슬 hL2 의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 43 : 인간화 항체 경사슬 hL2 의 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 44 : 인간화 항체 경사슬 hL3 의 아미노산 서열
서열 번호 45 : 인간화 항체 경사슬 hL3 를 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 46 : 인간화 항체 경사슬 hL3 의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 47 : 인간화 항체 경사슬 hL3 의 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 48 : 인간화 항체 경사슬 hL4 의 아미노산 서열
서열 번호 49 : 인간화 항체 경사슬 hL4 를 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 50 : 인간화 항체 경사슬 hL4 의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 51 : 인간화 항체 경사슬 hL4 의 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 52 : 인간화 항체 중사슬 hH1 의 아미노산 서열
서열 번호 53 : 인간화 항체 중사슬 hH1 를 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 54 : 인간화 항체 중사슬 hH1 의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 55 : 인간화 항체 중사슬 hH1 의 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 56 : 인간화 항체 중사슬 hH2 의 아미노산 서열
서열 번호 57 : 인간화 항체 중사슬 hH2 를 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 58 : 인간화 항체 중사슬 hH2 의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 59 : 인간화 항체 중사슬 hH2 의 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 60 : 인간화 항체 중사슬 hH3 의 아미노산 서열
서열 번호 61 : 인간화 항체 중사슬 hH3 을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 62 : 인간화 항체 중사슬 hH3 의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 63 : 인간화 항체 중사슬 hH3 의 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 64 : 트라스투주맙 경사슬의 아미노산 서열
서열 번호 65 : 트라스투주맙 중사슬의 아미노산 서열
서열 번호 66 : 항 LPS 항체 (h#1 G5-H1L1) 경사슬의 아미노산 서열
서열 번호 67 : 항 LPS 항체 (h#1 G5-H1L1) 중사슬의 아미노산 서열
서열 번호 68 : 항 TROP2 항체 (hRS7) 경사슬의 아미노산 서열
서열 번호 69 : 항 TROP2 항체 (hRS7) 중사슬의 아미노산 서열
서열 번호 70 : 항 CD98 항체 (hM23-H1L1) 경사슬의 아미노산 서열
서열 번호 71 : 항 CD98 항체 (hM23-H1L1) 중사슬의 아미노산 서열
서열 번호 72 : 트라스투주맙 변이체 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 73 : 트라스투주맙 변이체 경사슬의 아미노산 서열
서열 번호 74 : 트라스투주맙 변이체 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 75 : 트라스투주맙 변이체 중사슬의 아미노산 서열
서열 번호 76 : 트라스투주맙 변이체 2 경사슬의 아미노산 서열
서열 번호 77 : 트라스투주맙 변이체 2 중사슬의 아미노산 서열
SEQUENCE LISTING <110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED <120> Combination of Antibody-Pyrrolobenzodiazepine Derivative Conjugate and PARP inhibitor <130> SAP-860-PCT <141> 2020-03-26 <150> JP 2019061761 <151> 2019-03-27 <160> 77 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of human CLDN6 <400> 1 Met Ala Ser Ala Gly Met Gln Ile Leu Gly Val Val Leu Thr Leu Leu 1 5 10 15 Gly Trp Val Asn Gly Leu Val Ser Cys Ala Leu Pro Met Trp Lys Val 20 25 30 Thr Ala Phe Ile Gly Asn Ser Ile Val Val Ala Gln Val Val Trp Glu 35 40 45 Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys 50 55 60 Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala 65 70 75 80 Arg Ala Leu Cys Val Ile Ala Leu Leu Val Ala Leu Phe Gly Leu Leu 85 90 95 Val Tyr Leu Ala Gly Ala Lys Cys Thr Thr Cys Val Glu Glu Lys Asp 100 105 110 Ser Lys Ala Arg Leu Val Leu Thr Ser Gly Ile Val Phe Val Ile Ser 115 120 125 Gly Val Leu Thr Leu Ile Pro Val Cys Trp Thr Ala His Ala Ile Ile 130 135 140 Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Glu Ala Gln Lys Arg Glu Leu 145 150 155 160 Gly Ala Ser Leu Tyr Leu Gly Trp Ala Ala Ser Gly Leu Leu Leu Leu 165 170 175 Gly Gly Gly Leu Leu Cys Cys Thr Cys Pro Ser Gly Gly Ser Gln Gly 180 185 190 Pro Ser His Tyr Met Ala Arg Tyr Ser Thr Ser Ala Pro Ala Ile Ser 195 200 205 Arg Gly Pro Ser Glu Tyr Pro Thr Lys Asn Tyr Val 210 215 220 <210> 2 <211> 663 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> nucleotide sequence of cDNA encoding amino acid sequence of human CLDN6 <400> 2 atggcctctg ccggaatgca gatcctggga gtcgtcctga cactgctggg ctgggtgaat 60 ggcctggtct cctgtgccct gcccatgtgg aaggtgaccg ctttcatcgg caacagcatc 120 gtggtggccc aggtggtgtg ggagggcctg tggatgtcct gcgtggtgca gagcaccggc 180 cagatgcagt gcaaggtgta cgactcactg ctggcgctgc cacaggacct gcaggctgca 240 cgtgccctct gtgtcatcgc cctccttgtg gccctgttcg gcttgctggt ctaccttgct 300 ggggccaagt gtaccacctg tgtggaggag aaggattcca aggcccgcct ggtgctcacc 360 tctgggattg tctttgtcat ctcaggggtc ctgacgctaa tccccgtgtg ctggacggcg 420 catgccatca tccgggactt ctataacccc ctggtggctg aggcccaaaa gcgggagctg 480 ggggcctccc tctacttggg ctgggcggcc tcaggccttt tgttgctggg tggggggttg 540 ctgtgctgca cttgcccctc gggggggtcc cagggcccca gccattacat ggcccgctac 600 tcaacatctg cccctgccat ctctcggggg ccctctgagt accctaccaa gaattacgtc 660 tga 663 <210> 3 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of human CLDN9 <400> 3 Met Ala Ser Thr Gly Leu Glu Leu Leu Gly Met Thr Leu Ala Val Leu 1 5 10 15 Gly Trp Leu Gly Thr Leu Val Ser Cys Ala Leu Pro Leu Trp Lys Val 20 25 30 Thr Ala Phe Ile Gly Asn Ser Ile Val Val Ala Gln Val Val Trp Glu 35 40 45 Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys 50 55 60 Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala 65 70 75 80 Arg Ala Leu Cys Val Ile Ala Leu Leu Leu Ala Leu Leu Gly Leu Leu 85 90 95 Val Ala Ile Thr Gly Ala Gln Cys Thr Thr Cys Val Glu Asp Glu Gly 100 105 110 Ala Lys Ala Arg Ile Val Leu Thr Ala Gly Val Ile Leu Leu Leu Ala 115 120 125 Gly Ile Leu Val Leu Ile Pro Val Cys Trp Thr Ala His Ala Ile Ile 130 135 140 Gln Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Glu Ala Leu Lys Arg Glu Leu 145 150 155 160 Gly Ala Ser Leu Tyr Leu Gly Trp Ala Ala Ala Ala Leu Leu Met Leu 165 170 175 Gly Gly Gly Leu Leu Cys Cys Thr Cys Pro Pro Pro Gln Val Glu Arg 180 185 190 Pro Arg Gly Pro Arg Leu Gly Tyr Ser Ile Pro Ser Arg Ser Gly Ala 195 200 205 Ser Gly Leu Asp Lys Arg Asp Tyr Val 210 215 <210> 4 <211> 654 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> nucleotide sequence of cDNA encoding amino acid sequence of human CLDN9 <400> 4 atggcttcga ccggcttaga actgctgggc atgaccctgg ctgtgctggg ctggctgggg 60 accctggtgt cctgcgccct gcccctgtgg aaggtgaccg ccttcatcgg caacagcatc 120 gtggtggccc aggtggtgtg ggagggcctg tggatgtcct gcgtggtgca gagcacgggc 180 cagatgcagt gcaaggtgta cgactcactg ctggctctgc cgcaggacct gcaggccgca 240 cgtgccctct gtgtcattgc cctcctgctg gccctgcttg gcctcctggt ggccatcaca 300 ggtgcccagt gtaccacgtg tgtggaggac gaaggtgcca aggcccgtat cgtgctcacc 360 gcgggggtca tcctcctcct cgccggcatc ctggtgctca tccctgtgtg ctggacggcg 420 cacgccatca tccaggactt ctacaacccc ctggtggctg aggccctcaa gcgggagctg 480 ggggcctccc tctacctggg ctgggcggcg gctgcactgc ttatgctggg cggggggctc 540 ctctgctgca cgtgcccccc gccccaggtc gagcggcccc gcggacctcg gctgggctac 600 tccatcccct cccgctcggg tgcatctgga ctggacaaga gggactacgt gtga 654 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of CDRL1 of B1 antibody light chain <400> 5 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of CDRL2 of B1 antibody light chain <400> 6 Phe Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of CDRL3 of B1 antibody light chain <400> 7 Gln Gln Gly Tyr Pro Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized antibody <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of CDRL3 of humanized B1 antibody light chain L4 <400> 8 Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of CDRH1 of B1 antibody heavy chain <400> 9 Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Met His 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of CDRH2 of B1 antibody heavy chain <400> 10 Gly Val Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Ser 1 5 10 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of CDRH3 of B1 antibody heavy chain <400> 11 Pro Gly Gly Tyr Asp Val Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of CDRL1 of C7 antibody light chain <400> 12 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of CDRL2 of C7 antibody light chain <400> 13 Ser Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of CDRL3 of C7 antibody light chain <400> 14 Gln Gln Gly Tyr Pro Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of CDRH1 of C7 antibody heavy chain <400> 15 Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Met His 1 5 10 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of CDRH2 of C7 antibody heavy chain <400> 16 Gly Val Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Ser 1 5 10 <210> 17 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of CDRH3 of C7 antibody heavy chain <400> 17 Pro Gly Gly Tyr Asp Val Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 18 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> nucleotide sequence of cDNA encoding variable region of B1 antibody light chain <400> 18 gatatccaga tgacacagac tgcatcctcc ctgtctgcct ctcttggaga cagagtcacc 60 atcagttgca gggcaagtca ggacattaac aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120 gatggaactg ttaaactcct gatctacttc acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tggaacacat tattctctca ccattactaa cctggaacaa 240 gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggttatccgc ttccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaaac tggaaatcaa a 321 <210> 19 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of variable region of B1 antibody light chain <400> 19 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Ala Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr His Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr Pro Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 20 <211> 366 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> nucleotide sequence of cDNA encoding variable region of B1 antibody heavy chain <400> 20 gaggtccagc ttcaacagtc tggacctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60 tcctgcaaga cttctggata cacattcact gaatacacca tgcactgggt gcagcagagc 120 catggaaaga gccttgagtg gattggaggt gttaatccta atagtggtga tactagctac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgttgaca agtcctccag cacagcctac 240 atggagctcc gcagcctgac atctgaggat tctgcagtct attactgtgc aagacccggg 300 gggtacgacg tgggttacta tgctatggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 21 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of variable region of B1 antibody heavy chain <400> 21 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Gln Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Val Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Gly Gly Tyr Asp Val Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 22 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> nucleotide sequence of cDNA encoding variable region of C7 antibody light chain <400> 22 gatatccaga tgacacagac tgcatcctcc ctgtctgcct ctcttggaga cagagtcacc 60 atcagttgca gggcaagtca ggacattaac aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120 gatggaactg ttaaactcct gatctactcc acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tggaacacat tattctctca ccattactca cctggaacaa 240 gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggttatccgc ttccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaaac tggaaatcaa a 321 <210> 23 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of variable region of C7 antibody light chain <400> 23 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Ala Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr His Tyr Ser Leu Thr Ile Thr His Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr Pro Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 24 <211> 366 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> nucleotide sequence of cDNA encoding variable region of C7 antibody heavy chain <400> 24 gaggtccagc ttcaacagtc tggacctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60 tcctgcaaga cttctggata cacattcact gaatacacca tgcactgggt gcagcagagc 120 catggaaaga gccttgagtg gattggaggt gttaatccta atagtggtga tactagctac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgttgaca agtcctccag cacagcctac 240 atggagctcc gcagcctgac atctgaggat tctgcagtct attactgtgc aagacccggg 300 gggtacgacg tgggttacta tgctatggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 25 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of variable region of C7 antibody heavy chain <400> 25 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Gln Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Val Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Gly Gly Tyr Asp Val Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 26 <211> 449 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> DNA fragment comprising DNA sequence encoding human light chain signal sequence and human ??chain constant region <400> 26 gcctccggac tctagagcca ccatggtgct gcagacccag gtgttcatct ccctgctgct 60 gtggatctcc ggcgcgtacg gcgatatcgt gatgattaaa cgtacggtgg ccgccccctc 120 cgtgttcatc ttccccccct ccgacgagca gctgaagtcc ggcaccgcct ccgtggtgtg 180 cctgctgaat aacttctacc ccagagaggc caaggtgcag tggaaggtgg acaacgccct 240 gcagtccggg aactcccagg agagcgtgac cgagcaggac agcaaggaca gcacctacag 300 cctgagcagc accctgaccc tgagcaaagc cgactacgag aagcacaagg tgtacgcctg 360 cgaggtgacc caccagggcc tgagctcccc cgtcaccaag agcttcaaca ggggggagtg 420 ttaggggccc gtttaaacgg gggaggcta 449 <210> 27 <211> 1137 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> DNA fragment comprising DNA sequence encoding human heavy chain signal sequence and human IgG1 LALA constant region <400> 27 ccagcctccg gactctagag ccaccatgaa acacctgtgg ttcttcctcc tgctggtggc 60 agctcccaga tgggtgctga gccaggtgca attgtgcagg cggttagctc agcctccacc 120 aagggcccaa gcgtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg cggcacagcc 180 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaacccg tgaccgtgag ctggaactca 240 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc cccgctgtcc tgcagtcctc aggactctac 300 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 360 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 420 gacaaaactc acacatgccc accctgccca gcacctgaag ccgcgggggg accctcagtc 480 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 540 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 600 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccccgggagg agcagtacaa cagcacgtac 660 cgggtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 720 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 780 ggccagcccc gggaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 840 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 900 tgggagagca atggccagcc cgagaacaac tacaagacca cccctcccgt gctggactcc 960 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggc 1020 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac ccagaagagc 1080 ctctccctgt ctcccggcaa atgagatatc gggcccgttt aaacggggga ggctaac 1137 <210> 28 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric antibody <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of chB1 light chain <400> 28 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Ala Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Ile Asn Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Tyr Ser Leu Thr Ile Thr 85 90 95 Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr 100 105 110 Pro Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Ala Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 29 <211> 752 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric antibody <220> <221> misc_feature <223> DNA fragment comprising DNA sequence encoding amino acid sequence of chB1 light chain <400> 29 ccagcctccg gactctagag ccaccatggt gctgcagacc caggtgttca tcagcctgct 60 gctgtggatc agcggcgcct acggcgacat ccagatgacc cagacagcca gcagcctgag 120 cgccagcctg ggcgatagag tgaccatcag ctgcagagcc agccaggaca tcaacaacta 180 cctgaactgg tatcagcaga aacccgacgg caccgtgaag ctgctgatct acttcaccag 240 cagactgcac agcggcgtgc ccagcagatt ttctggcagc ggctctggca cccactacag 300 cctgaccatc accaacctgg aacaggaaga tatcgctacc tacttctgtc agcaaggcta 360 ccccctgccc tggacctttg gcggcggaac aaagctggaa atcaagcggg ccgtggccgc 420 tccctccgtg ttcatctttc cacccagcga cgagcagctg aagtccggca cagctagcgt 480 cgtgtgcctg ctgaacaact tctacccccg cgaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa 540 tgccctgcag agcggcaaca gccaggaaag cgtgaccgag caggacagca aggactccac 600 ctactccctg agcagcaccc tgaccctgag caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta 660 cgcctgcgaa gtgacccacc agggcctgtc tagccccgtg accaagagct tcaaccgggg 720 cgagtgttga gtttaaacgg gggaggctaa ct 752 <210> 30 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric antibody <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of variable region of chB1 light chain <400> 30 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Ala Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 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sequence of chB1 heavy chain <400> 32 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Glu Tyr Thr Met His Trp Val Gln Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Gly Val Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Gly Gly Tyr Asp Val Gly Tyr Tyr Ala Met 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 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tggcagcagg gcaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1380 acccagaaga gcctctccct gtctcccggc aaa 1413 <210> 34 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric antibody <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of variable region of chB1 heavy chain <400> 34 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Gln Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Val Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Gly Gly Tyr Asp Val Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 35 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric antibody <220> <221> misc_feature <223> nucleotide sequence encoding variable region of chB1 heavy chain <400> 35 gaagtgcagc tgcagcagtc tggccccgag ctcgtgaaac ctggcgcctc cgtgaagatc 60 agctgcaaga ccagcggcta caccttcacc gagtacacca tgcactgggt gcagcagagc 120 cacggcaaga gcctggaatg gatcggcggc gtgaacccca acagcggcga caccagctac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccaccctg accgtggaca agagcagcag caccgcctac 240 atggaactgc ggagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgtgc cagacctggc 300 ggctacgacg tgggctacta cgccatggat tactggggcc agggcaccag cgtgaccgtc 360 agctca 366 <210> 36 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized antibody <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of humanized antibody light chain hL1 <400> 36 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Ile Asn Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Arg Leu 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gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420 tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480 cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600 ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660 ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702 <210> 42 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized antibody <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of variable region of humanized antibody light chain hL2 <400> 42 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr His Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr 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cctcctccaa gagcacctct 480 ggcggcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc cgtgaccgtg 540 agctggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tccccgctgt cctgcagtcc 600 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 720 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccctgcc cagcacctga agccgcgggg 780 ggaccctcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccccggga ggagcagtac 960 aacagcacgt accgggtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080 tccaaagcca aaggccagcc ccgggaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1140 gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200 atcgccgtgg agtgggagag caatggccag cccgagaaca actacaagac cacccctccc 1260 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga 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cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccctgcc cagcacctga agccgcgggg 780 ggaccctcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccccggga ggagcagtac 960 aacagcacgt accgggtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080 tccaaagcca aaggccagcc ccgggaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1140 gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200 atcgccgtgg agtgggagag caatggccag cccgagaaca actacaagac cacccctccc 1260 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1320 tggcagcagg gcaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1380 acccagaaga gcctctccct gtctcccggc aaa 1413 <210> 58 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized antibody <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of variable region of humanized antibody 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accgggtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080 tccaaagcca aaggccagcc ccgggaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1140 gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200 atcgccgtgg agtgggagag caatggccag cccgagaaca actacaagac cacccctccc 1260 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1320 tggcagcagg gcaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1380 acccagaaga gcctctccct gtctcccggc aaa 1413 <210> 62 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized antibody <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of variable region of humanized antibody heavy chain hH3 <400> 62 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Val Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Ser Tyr 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<223> humanized antibody <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of Trastuzumab light chain <400> 64 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 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MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of anti-CD98 antibody (hM23-H1L1) light chain <400> 70 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Gln Arg Tyr Tyr Gly Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 130 135 140 Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 145 150 155 160 Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 165 170 175 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln 180 185 190 Asp 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acagccgtgg cttggtatca gcagaagcct 180 ggcaaggccc ctaagctgct gatctacagc gccagctttc tgtacagcgg cgtgcccagc 240 agattcagcg gctctagaag cggcaccgac ttcaccctga ccataagcag tctgcagccc 300 gaggacttcg ccacctacta ctgtcagcag cactacacca cacctccaac ctttggccag 360 ggcaccaagg tggaaatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420 tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480 cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600 ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660 ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702 <210> 73 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized antibody <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of Trastuzumab mutant light chain <400> 73 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr 100 105 110 Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 74 <211> 1407 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized antibody <220> <221> misc_feature <223> nucleotide sequence encoding Trastuzumab mutant heavy chain <400> 74 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagcgag 60 gtgcagctgg ttgaatctgg cggaggactg gttcagcctg gcggatctct gagactgtct 120 tgtgccgcca gcggcttcaa catcaaggac acctacatcc actgggtccg acaggcccct 180 ggcaaaggac ttgaatgggt cgccagaatc taccccacca acggctacac cagatacgcc 240 gactctgtga agggcagatt caccatcagc gccgacacca gcaagaacac cgcctacctg 300 cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacc gccgtgtact actgttctag atggggaggc 360 gacggcttct acgccatgga ttattggggc cagggcaccc tggttaccgt tagctcagcc 420 tccaccaagg gcccaagcgt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctggcggc 480 acagccgccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aacccgtgac cgtgagctgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttccccg ctgtcctgca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagcccaaa 720 tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccc tgcccagcac ctgaagccgc ggggggaccc 780 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 840 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 900 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagcccc gggaggagca gtacaacagc 960 acgtaccggg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1020 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080 gccaaaggcc agccccggga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1140 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200 gtggagtggg agagcaatgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc tcccgtgctg 1260 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320 cagggcaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacccag 1380 aagagcctct ccctgtctcc cggcaaa 1407 <210> 75 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized antibody <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of Trastuzumab mutant heavy chain <400> 75 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile 35 40 45 Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 210 215 220 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys 225 230 235 240 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 245 250 255 Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 260 265 270 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 275 280 285 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 290 295 300 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 305 310 315 320 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 325 330 335 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 340 345 350 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 355 360 365 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 370 375 380 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 385 390 395 400 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 405 410 415 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 420 425 430 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 435 440 445 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 450 455 460 Leu Ser Pro Gly Lys 465 <210> 76 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized antibody <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of Trastuzumab mutant 2 light chain <400> 76 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr 100 105 110 Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 77 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized antibody <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of Trastuzumab mutant 2 heavy chain <400> 77 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile 35 40 45 Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 210 215 220 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 225 230 235 240 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 245 250 255 Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 260 265 270 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 275 280 285 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 290 295 300 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 305 310 315 320 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 325 330 335 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 340 345 350 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 355 360 365 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 370 375 380 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 385 390 395 400 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 405 410 415 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 420 425 430 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 435 440 445 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 450 455 460 Leu Ser Pro Gly Lys 465

Claims (73)

  1. 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 콘주게이트 및/또는 PARP 저해제를 함유하는 암 치료를 위한 의약 조성물로서, 그 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 콘주게이트와, 그 PARP 저해제가, 조합되어 투여되는 것을 특징으로 하고,
    그 콘주게이트가, 다음 식 ;
    Figure pct00160

    Figure pct00161

    Figure pct00162

    또는,
    Figure pct00163

    으로 나타내고,
    상기에서 나타내는 각각의 구조식에 있어서, m1 은 1 또는 2 의 정수이고,
    Ab 는, 항체 또는 그 항체의 기능성 단편이며,
    N297 당사슬은 다음 식으로 나타내는 구조를 갖는 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 혹은 그것들의 혼합물, 또는 N297-(Fuc)SG 이고,
    Figure pct00164

    Figure pct00165

    Figure pct00166

    식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
    N297 당사슬 중의 L(PEG) 는, *-(CH2CH2-O)3-CH2CH2-NH- 인 것을 나타내며,
    여기에서, 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 또는/및 1-6 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합을 통하여 결합하고 있고, 좌단의 애스터리스크 * 는, 상기 식 중의 트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내는 의약 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    항체가, 종양 세포에 발현하고 있는 항원에 결합하여, 종양 세포 내에 흡수되어 내재화하는 것을 특징으로 하는, 의약 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    항체가, 항종양 효과를 갖는 것을 특징으로 하는, 의약 조성물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가, 항 CLDN6 항체, 항 CLDN9 항체, 항 CLDN6/CLDN9 항체, 항 HER2 항체, 항 HER3 항체, 항 DLL3 항체, 항 FAP 항체, 항 CDH11 항체, 항 A33 항체, 항 CanAg 항체, 항 CD19 항체, 항 CD20 항체, 항 CD22 항체, 항 CD25 항체, 항 CD30 항체, 항 CD33 항체, 항 CD37 항체, 항 CD56 항체, 항 CD70 항체, 항 CD98 항체, 항 B7-H3 항체, 항 TROP2 항체, 항 CEA 항체, 항 Cripto 항체, 항 EphA2 항체, 항 FGFR2 항체, 항 G250 항체, 항 MUC1 항체, 항 GPNMB 항체, 항 Integrin 항체, 항 PSMA 항체, 항 Tenascin-C 항체, 항 SLC44A4 항체, 항 Mesothelin 항체, 항 EGFR 항체, 항 5T4 항체, 항 LRRC15 항체, 항 DR5 항체, 항 CDH3 항체, 항 PDPN 항체, 또는 항 CD123 항체인, 의약 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가, CLDN6 및/또는 CLDN9 에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 의약 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    항체가, 이하의 (a) 또는 (b) 에 기재된 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 을 포함하는 중사슬, 그리고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 을 포함하는 경사슬을 포함하여 이루어지는, 의약 조성물 ;
    (a) 서열 번호 9 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 10 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 11 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 그리고, 서열 번호 5 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 6 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 7 에 기재된 아미노산 서열 또는 그 아미노산 서열에 있어서 1 또는 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 또는,
    (b) 서열 번호 15 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 16 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 17 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 그리고, 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3.
  7. 제 6 항에 있어서,
    항체가, 이하의 (a) 또는 (b) 에 기재된 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 을 포함하는 중사슬, 그리고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 을 포함하는 경사슬을 포함하여 이루어지는, 의약 조성물 ;
    (a) 서열 번호 9 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 10 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 11 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 및, 서열 번호 5 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 6 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 7 에 기재된 아미노산 서열 또는 서열 번호 8 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 또는,
    (b) 서열 번호 15 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 16 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 17 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 및, 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3.
  8. 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가, 이하의 (a) 또는 (b) 에 기재된 중사슬 가변 영역, 및, 경사슬 가변 영역을 포함하는, 의약 조성물 ;
    (a) 서열 번호 21 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및, 서열 번호 19 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역, 또는,
    (b) 서열 번호 25 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및, 서열 번호 23 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역.
  9. 제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이하의 (a) ∼ (e) 로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및 (f) ∼ (k) 로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는, 의약 조성물 ;
    (a) 서열 번호 54 에 기재된 아미노산 서열,
    (b) 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열,
    (c) 서열 번호 62 에 기재된 아미노산 서열,
    (d) (a) ∼ (c) 의 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 대해서 적어도 95 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열,
    (e) (a) ∼ (c) 의 서열에 있어서의 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열,
    (f) 서열 번호 38 에 기재된 아미노산 서열,
    (g) 서열 번호 42 에 기재된 아미노산 서열,
    (h) 서열 번호 46 에 기재된 아미노산 서열,
    (i) 서열 번호 50 에 기재된 아미노산 서열,
    (j) (f) ∼ (i) 의 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 대해서 적어도 95 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 및,
    (k) (f) ∼ (i) 의 서열에 있어서의 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열.
  10. 제 9 항에 있어서,
    항체가, 이하의 (a) ∼ (e) 로 이루어지는 군에서 선택되는 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역을 포함하는, 의약 조성물 ;
    (a) 서열 번호 54 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 38 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
    (b) 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 42 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
    (c) 서열 번호 54 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 46 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
    (d) 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 50 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역으로 이루어지는 경사슬 가변 영역, 및,
    (e) 서열 번호 62 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 46 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역.
  11. 제 5 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가, 키메라 항체인, 의약 조성물.
  12. 제 5 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가, 인간화 항체인, 의약 조성물.
  13. 제 5 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가, 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 의 중사슬 정상 영역을 포함하는, 의약 조성물.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
    이하의 (a) ∼ (e) 로 이루어지는 군에서 선택되는 중사슬 및 경사슬을 포함하는, 의약 조성물 ;
    (a) 서열 번호 52 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 36 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬,
    (b) 서열 번호 56 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 40 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬,
    (c) 서열 번호 52 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 44 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬,
    (d) 서열 번호 56 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 48 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬, 및,
    (e) 서열 번호 60 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 44 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬.
  15. 제 5 항에 있어서,
    항체가, 제 6 항 내지 제 10 항 및 제 14 항 중 어느 한 항에 기재된 항체와, CLDN6 및/또는 CLDN9 에의 결합에 있어서 경합하거나, 또는, 제 6 항 내지 제 10 항 및 제 14 항 중 어느 한 항에 기재된 항체가 인식하는 CLDN6 및/또는 CLDN9 상의 부위에 결합하는, 의약 조성물.
  16. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가, HER2 에 특이적으로 결합하는 의약 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서,
    항체 의존성 세포 상해 (ADCC) 활성 및/또는 보체 의존성 세포 상해 (CDC) 활성을 갖는 의약 조성물.
  18. 제 16 항에 있어서,
    항체의 중사슬 정상 영역이 인간 IgG1 의 중사슬 정상 영역이고, ADCC 및/또는 CDC 활성의 저감을 초래하는 변이를 포함하는, 의약 조성물.
  19. 제 18 항에 있어서,
    항체의 중사슬 정상 영역이 인간 IgG1 의 중사슬 정상 영역이고, 그 중사슬 정상 영역에 있어서 EU Index 에 의해서 나타내어지는 234 위치 및 235 위치의 류신이 알라닌으로 치환되어 있는, 의약 조성물.
  20. 제 16 항 또는 제 17 항에 있어서,
    서열 번호 65 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 64 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는 항체인, 의약 조성물.
  21. 제 16 항, 제 18 항 및 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열 번호 75 의 아미노산 번호 20 ∼ 139 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 73 의 아미노산 번호 21 ∼ 127 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 항체인, 의약 조성물.
  22. 제 16 항, 제 18 항, 제 19 항 및 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열 번호 75 의 아미노산 번호 20 ∼ 469 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 73 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하는 항체인, 의약 조성물.
  23. 제 16 항, 제 18 항, 제 19 항 및 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열 번호 77 의 아미노산 번호 20 ∼ 469 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 76 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하는 항체인, 의약 조성물.
  24. 제 5 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가, N-결합형 당사슬 부가, O-결합형 당사슬 부가, N 말단의 프로세싱, C 말단의 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성화, 메티오닌의 산화, N 말단에 있어서의 메티오닌 잔기의 부가, 프롤린 잔기의 아미드화, 및 중사슬의 카르복실 말단에 있어서의 1 개 또는 2 개의 아미노산 잔기의 결실로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 수식을 포함하는, 의약 조성물.
  25. 제 24 항에 있어서,
    항체의 중사슬의 카르복실 말단에 있어서 1 개 또는 수 개의 아미노산 잔기가 결실되어 있는, 의약 조성물.
  26. 제 24 항 또는 제 25 항에 있어서,
    항체의 2 개의 중사슬의 쌍방의 카르복실 말단에 있어서 1 개의 아미노산 잔기가 결실되어 있는, 의약 조성물.
  27. 제 24 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체의 중사슬의 카르복실 말단의 프롤린 잔기가 추가로 아미드화되어 있는, 의약 조성물.
  28. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
    N297 당사슬이, N297-(Fuc)MSG1 인, 의약 조성물.
  29. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    m1 이, 1 의 정수인, 의약 조성물.
  30. 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 콘주게이트에 있어서의 항체 1 분자당 평균 약물 결합수가, 1 ∼ 3 또는 3 ∼ 5 인, 의약 조성물.
  31. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
    PARP 저해제가, 올라파립, 루카파립, 니라파립, 혹은 탈라조파립, 또는 그것들의 약리상 허용되는 염인, 의약 조성물.
  32. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체-약물 콘주게이트와, PARP 저해제가, 각각 다른 제제에 유효 성분으로서 함유되고, 동시에 또는 상이한 시간에 투여되는 것을 특징으로 하는, 의약 조성물.
  33. 제 1 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,
    폐암 (비소세포 폐암, 소세포 폐암 등), 신암, 요로 상피암, 대장암, 전립선암, 다형 신경 교아종, 난소암 (표층 상피성 종양, 간질성 종양, 배세포 종양 등), 췌암, 유암, 멜라노마, 간암, 방광암, 위암, 식도암, 자궁체암, 정소암 (세미노마, 비세미노마), 자궁경암, 태반 융모암, 뇌종양, 두경부암 그리고 그것들의 전이성 형태로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 암의 치료를 위한, 의약 조성물.
  34. 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 콘주게이트와, PARP 저해제가, 조합되어 투여되는 것을 특징으로 하는 암의 치료 방법으로서,
    그 콘주게이트가, 다음 식 ;
    Figure pct00167

    Figure pct00168

    Figure pct00169

    또는,
    Figure pct00170

    으로 나타내고,
    상기에서 나타내는 각각의 구조식에 있어서, m1 은 1 또는 2 의 정수이고,
    Ab 는, 항체 또는 그 항체의 기능성 단편이며,
    N297 당사슬은, 다음 식으로 나타내는 구조를 갖는 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 혹은 그것들의 혼합물, 또는 N297-(Fuc)SG 이고,
    Figure pct00171

    Figure pct00172

    Figure pct00173

    식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
    N297 당사슬 중의 L(PEG) 는, *-(CH2CH2-O)3-CH2CH2-NH- 인 것을 나타내며,
    여기에서, 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 또는/및 1-6 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합을 통하여 결합하고 있고, 좌단의 애스터리스크 * 는, 상기 식 중의 트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내는, 치료 방법.
  35. 제 34 항에 있어서,
    항체가, 종양 세포에 발현하고 있는 항원에 결합하여, 종양 세포 내에 흡수되어 내재화하는 것을 특징으로 하는, 치료 방법.
  36. 제 34 항 또는 제 35 항에 있어서,
    항체가, 항종양 효과를 갖는 것을 특징으로 하는, 치료 방법.
  37. 제 34 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가, 항 CLDN6 항체, 항 CLDN9 항체, 항 CLDN6/CLDN9 항체, 항 HER2 항체, 항 HER3 항체, 항 DLL3 항체, 항 FAP 항체, 항 CDH11 항체, 항 A33 항체, 항 CanAg 항체, 항 CD19 항체, 항 CD20 항체, 항 CD22 항체, 항 CD25 항체, 항 CD30 항체, 항 CD33 항체, 항 CD37 항체, 항 CD56 항체, 항 CD70 항체, 항 CD98 항체, 항 B7-H3 항체, 항 TROP2 항체, 항 CEA 항체, 항 Cripto 항체, 항 EphA2 항체, 항 FGFR2 항체, 항 G250 항체, 항 MUC1 항체, 항 GPNMB 항체, 항 Integrin 항체, 항체 PSMA 항체, 항 Tenascin-C 항체, 항 SLC44A4 항체, 항 Mesothelin 항체, 항 EGFR 항체, 항 5T4 항체, 항 LRRC15 항체, 항 DR5 항체, 항 CDH3 항체, 항 PDPN 항체, 또는 항 CD123 항체인, 치료 방법.
  38. 제 34 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가, CLDN6 및/또는 CLDN9 에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 치료 방법.
  39. 제 38 항에 있어서,
    항체가, 이하의 (a) 또는 (b) 에 기재된 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 을 포함하는 중사슬, 그리고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 을 포함하는 경사슬을 포함하여 이루어지는, 치료 방법 ;
    (a) 서열 번호 9 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 10 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 11 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 그리고, 서열 번호 5 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 6 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 7 에 기재된 아미노산 서열 또는 그 아미노산 서열에 있어서 1 또는 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 또는,
    (b) 서열 번호 15 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 16 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 17 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 그리고, 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3.
  40. 제 39 항에 있어서,
    항체가, 이하의 (a) 또는 (b) 에 기재된 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 을 포함하는 중사슬, 그리고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 을 포함하는 경사슬을 포함하여 이루어지는, 치료 방법 ;
    (a) 서열 번호 9 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 10 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 11 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 및, 서열 번호 5 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 6 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 7 에 기재된 아미노산 서열 또는 서열 번호 8 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 또는,
    (b) 서열 번호 15 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 16 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 17 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 및, 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3.
  41. 제 38 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가, 이하의 (a) 또는 (b) 에 기재된 중사슬 가변 영역, 및, 경사슬 가변 영역을 포함하는, 치료 방법 ;
    (a) 항체가, 서열 번호 21 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및, 서열 번호 19 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역, 또는,
    (b) 항체가, 서열 번호 25 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및, 서열 번호 23 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역.
  42. 제 38 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이하의 (a) ∼ (e) 로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및 (f) ∼ (k) 로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는, 치료 방법 ;
    (a) 서열 번호 54 에 기재된 아미노산 서열,
    (b) 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열,
    (c) 서열 번호 62 에 기재된 아미노산 서열,
    (d) (a) ∼ (c) 의 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 대해서 적어도 95 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열,
    (e) (a) ∼ (c) 의 서열에 있어서의 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열,
    (f) 서열 번호 38 에 기재된 아미노산 서열,
    (g) 서열 번호 42 에 기재된 아미노산 서열,
    (h) 서열 번호 46 에 기재된 아미노산 서열,
    (i) 서열 번호 50 에 기재된 아미노산 서열,
    (j) (f) ∼ (i) 의 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 대해서 적어도 95 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 및,
    (k) (f) ∼ (i) 의 서열에 있어서의 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열.
  43. 제 42 항에 있어서,
    항체가, 이하의 (a) ∼ (e) 로 이루어지는 군에서 선택되는 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역을 포함하는, 치료 방법 ;
    (a) 서열 번호 54 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 38 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
    (b) 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 42 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
    (c) 서열 번호 54 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 46 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
    (d) 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 50 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역으로 이루어지는 경사슬 가변 영역, 및,
    (e) 서열 번호 62 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 46 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역.
  44. 제 38 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가, 키메라 항체인, 치료 방법.
  45. 제 38 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가, 인간화 항체인, 치료 방법.
  46. 제 38 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가, 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 의 중사슬 정상 영역을 포함하는, 치료 방법.
  47. 제 45 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이하의 (a) ∼ (e) 로 이루어지는 군에서 선택되는 중사슬 및 경사슬을 포함하는, 치료 방법 ;
    (a) 서열 번호 52 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 36 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬,
    (b) 서열 번호 56 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 40 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬,
    (c) 서열 번호 52 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 44 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬,
    (d) 서열 번호 56 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 48 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬, 및,
    (e) 서열 번호 60 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 44 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬.
  48. 제 38 항에 있어서,
    항체가, 제 39 항 내지 제 43 항 및 제 47 항 중 어느 한 항에 기재된 항체와, CLDN6 및/또는 CLDN9 에의 결합에 있어서 경합하거나, 또는, 제 39 항 내지 제 43 항 및 제 47 항 중 어느 한 항에 기재된 항체가 인식하는 CLDN6 및/또는 CLDN9 상의 부위에 결합하는, 치료 방법.
  49. 제 34 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가, HER2 에 특이적으로 결합하는 치료 방법.
  50. 제 49 항에 있어서,
    항체 의존성 세포 상해 (ADCC) 활성 및/또는 보체 의존성 세포 상해 (CDC) 활성을 갖는 치료 방법.
  51. 제 49 항에 있어서,
    항체의 중사슬 정상 영역이 인간 IgG1 의 중사슬 정상 영역이고, ADCC 및/또는 CDC 활성의 저감을 초래하는 변이를 포함하는, 치료 방법.
  52. 제 51 항에 있어서,
    항체의 중사슬 정상 영역이 인간 IgG1 의 중사슬 정상 영역이고, 그 중사슬 정상 영역에 있어서 EU Index 에 의해서 나타내어지는 234 위치 및 235 위치의 류신이 알라닌으로 치환되어 있는, 치료 방법.
  53. 제 49 항 또는 제 50 항에 있어서,
    항체가, 서열 번호 65 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 64 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는, 치료 방법.
  54. 제 49 항, 제 51 항 및 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가, 서열 번호 75 의 아미노산 번호 20 ∼ 139 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 73 의 아미노산 번호 21 ∼ 127 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하여 이루어지는, 치료 방법.
  55. 제 49 항, 제 51 항, 제 52 항 및 제 54 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가, 서열 번호 75 의 아미노산 번호 20 ∼ 469 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 73 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는, 치료 방법.
  56. 제 49 항, 제 51 항, 제 52 항 및 제 54 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가, 서열 번호 77 의 아미노산 번호 20 ∼ 469 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 76 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는, 치료 방법.
  57. 제 38 항 내지 제 56 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가, N-결합형 당사슬 부가, O-결합형 당사슬 부가, N 말단의 프로세싱, C 말단의 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성화, 메티오닌의 산화, N 말단에 있어서의 메티오닌 잔기의 부가, 프롤린 잔기의 아미드화, 및 중사슬의 카르복실 말단에 있어서의 1 개 또는 2 개의 아미노산 잔기의 결실로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 수식을 포함하는, 치료 방법.
  58. 제 57 항에 있어서,
    항체의 중사슬의 카르복실 말단에 있어서 1 개 또는 수 개의 아미노산 잔기가 결실되어 있는, 치료 방법.
  59. 제 57 항 또는 제 58 항에 있어서,
    항체의 2 개의 중사슬의 쌍방의 카르복실 말단에 있어서 1 개의 아미노산 잔기가 결실되어 있는, 치료 방법.
  60. 제 57 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체의 중사슬의 카르복실 말단의 프롤린 잔기가 추가로 아미드화되어 있는, 치료 방법.
  61. 제 34 항 내지 제 60 항 중 어느 한 항에 있어서,
    N297 당사슬이, N297-(Fuc)MSG1 인, 치료 방법.
  62. 제 34 항 내지 제 61 항 중 어느 한 항에 있어서,
    m1 이, 1 의 정수인, 치료 방법.
  63. 제 34 항 내지 제 62 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 콘주게이트에 있어서의 항체 1 분자당 평균 약물 결합수가, 1 ∼ 3 또는 3 ∼ 5 인, 치료 방법.
  64. 제 34 항 내지 제 63 항 중 어느 한 항에 있어서,
    PARP 저해제가, 올라파립, 루카파립, 니라파립, 혹은 탈라조파립, 또는 그것들의 약리상 허용되는 염인, 치료 방법.
  65. 제 34 항 내지 제 64 항 중 어느 한 항에 있어서,
    폐암 (비소세포 폐암, 소세포 폐암 등), 신암, 요로 상피암, 대장암, 전립선암, 다형 신경 교아종, 난소암 (표층 상피성 종양, 간질성 종양, 배세포 종양 등), 췌암, 유암, 멜라노마, 간암, 방광암, 위암, 식도암, 자궁체암, 정소암 (세미노마, 비세미노마), 자궁경암, 태반 융모암, 뇌종양, 두경부암 그리고 그것들의 전이성 형태로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 암의 치료를 위한, 치료 방법.
  66. PARP 저해제와 병용하기 위한, 제 1 항에 기재된 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 콘주게이트를 포함하는 의약 조성물.
  67. PARP 저해제를 함유하고, 제 1 항에 기재된 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 콘주게이트와 병용함으로써, 그 콘주게이트의 작용을 상승시키는 의약 조성물.
  68. 제 1 항에 기재된 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 콘주게이트와 병용하기 위한, PARP 저해제를 함유하는 의약 조성물.
  69. 제 1 항에 기재된 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 콘주게이트를 포함하고, PARP 저해제와 병용함으로써, PARP 저해제의 작용을 상승시키는 의약 조성물.
  70. 제 1 항에 기재된 의약 조성물로서,
    그 피롤로벤조디아제핀 유도체가 DNA 의 마이너 그루브에 있어서 크로스 링크를 형성하지 않는 의약 조성물.
  71. 제 1 항에 기재된 의약 조성물로서,
    암이, PARP 저해제에 비감수성인 의약 조성물.
  72. 제 1 항에 기재된 의약 조성물로서,
    암이, 상동적 재조합 (HR) 의존적 DNA 2 본쇄 파괴 (DSB) 수복 경로에 비의존적인 의약 조성물.
  73. 제 34 항 내지 제 64 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 항에 기재된 항체-약물 콘주게이트와, PARP 저해제가, 각각 다른 제제에 유효 성분으로서 함유되고, 동시에 또는 상이한 시간에 투여되는 것을 특징으로 하는, 치료 방법.
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