KR20210134642A

KR20210134642A - 재조합 vwf (rvwf)를 이용한 예방 치료 방법

Info

Publication number: KR20210134642A
Application number: KR1020217027489A
Authority: KR
Inventors: 비외른 멜가르드; 브루스 에벤스타인
Original assignee: 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤
Priority date: 2019-02-01
Filing date: 2020-01-31
Publication date: 2021-11-10
Also published as: WO2020160460A1; CA3128498A1; IL285220A; JP2022524291A; US12128090B2; BR112021015068A2; EP3917557A1; CO2021011340A2; MX2021009114A; UA129590C2; EA202192140A1; AU2020216976A1; CN113645993A; SG11202108325YA; US20200261546A1; IL285220B1

Abstract

본 발명은 치료량의 재조합 폰 빌레브란트 인자(rVWF)를 대상체에게 투여하는 것을 포함하여 중증 폰빌레브란트 질병을 갖는 대상체에서 자연 출혈의 예방 치료 방법에 관한 것이다.

Description

재조합 VWF (RVWF)를 이용한 예방 치료 방법

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2019년 2월 1일에 출원된 미국 임시 특허출원 번호 62/800,370에 대한 우선권을 주장하며, 이는 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.

폰 빌레브란트 질병(von Willebrand Disease, VWD)과 같은 응고 질환은 일반적으로 응고 캐스케이드의 결핍으로 인해 발생한다. 폰 빌레브란트 질병(VWD)은 폰 빌레브란트 인자의 결핍으로 인해 발생하는 질병군을 지칭한다. 폰 빌레브란트 인자는 혈소판이 뭉쳐서 혈관벽에 달라붙는 것을 돕는데, 이는 정상적인 혈액 응고에 필요하다.

폰 빌레브란트 질병(VWD)은 추정된 유병률이 1%인 가장 흔한 유전성 출혈 장애이다(Veyradier A, 등, Medicine(Baltimore). 2016, 95(11):e3038). 그러나 경미한 형태의 질병을 제외하고, 단지 약 1/10,000의 환자 만이 실제로 치료가 필요하다. 이러한 응고장애에 대한 현재의 치료는 정상 응고 인자를 포함하는 약제학적 제제를 사용하는 대체 요법을 포함한다.

VWF는 크기가 약 500 내지 20,000kD 범위인 일련의 다량체로서 혈장에서 순환하는 당단백질이다. VWF의 cDNA 전체 길이가 복제되었고; 프로폴리펩타이드는 전장 프리프로(prepro)-VWF의 아미노산 잔기 23 내지 764에 해당한다(Eikenboom 등 (1995) Haemophilia 1, 7790). VWF의 다량체 형태는 이황화 결합에 의해 함께 연결된 250kD의 폴리펩타이드 서브유닛으로 구성된다. VWF는 강화된 지혈 활성을 나타내는 더 큰 다량체와 함께 손상된 혈관 벽의 내피하층에 대한 초기 혈소판 부착을 매개한다. 다량체화된 VWF는 VWF의 A1 도메인에서의 상호작용을 통해 혈소판 표면 당단백질 Gp1bα에 결합하여 혈소판 부착을 촉진한다. VWF의 다른 부위는 혈관 벽에 대한 결합을 매개한다. 따라서, VWF는 높은 전단 응력 조건에서 혈소판 부착 및 1차 지혈에 필수적인 혈소판 및 혈관벽 사이에 브릿지를 형성한다. 일반적으로 내피 세포는 큰 중합체 형태의 VWF를 분비하고 분자량이 더 낮은 형태의 VWF는 단백질 분해적 분열로 인해 발생한다. 예외적으로 큰 분자 질량의 다량체는 내피 세포의 바이벨-팰레이드(Weibel-Palade) 소체에 저장되고 트롬빈 및 히스타민과 같은 작용제의 자극에 의해 유리된다.

VWD 환자의 경우, 특히 대수술 및 기타 출혈 에피소드에 대한 반응으로 장기간 지혈이 필요한 경우 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor, VWF) 대체로 치료하는 것이 권장된다. 그러나, 예방 치료는 잘 설명되거나 알려져 있지 않다. 예방 치료 요법에 의해 이러한 출혈 에피소드의 사전에 환자를 도울 필요가 당업계에 남아 있다. 본 발명은 인간 rVWF를 사용한 VWD의 예방 치료 방법을 제공함으로써 이러한 요구를 충족시킨다.

발명의 간단한 요약

본 발명은 중증 폰 빌레브란트 질병(VWD)을 갖는 대상체에서 자연 출혈 에피소드를 예방적으로 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은 적어도 약 40IU/kg 내지 약 80IU/kg 범위의 재조합 폰 빌레브란트 인자(rVWF)의 적어도 1회 용량으로 매주 2회 대상체에게 투여하여 자연 출혈 에피소드의 빈도 및/또는 지속기간을 감소시키는 것을 포함한다.

일부 구현양태에서, rVWF의 적어도 1회 용량은 적어도 약 50IU/kg 내지 약 80IU/kg 범위이다.

일부 구현양태에서, 대상체는 20IU/dL 이하 범위의 기준선 VWF 리스토세틴 보조인자 활성(VWF:RCo)을 갖거나 타입 1 VWD로 진단된다. 일부 구현양태에서, 대상체는 타입 2A, 2B, 또는 2M VWD로 진단된다. 특정 구현양태에서, 대상체는 3 IU/dL 이상 범위의 VWF:항원 함량(VWF:Ag)을 갖거나 타입 3 VWD로 진단된다.

일부 구현양태에서, 대상체는 rVWF의 초기 투여 전 지난 12개월 이내에 혈장-유래 VWF(pdVWF)의 예방 치료를 투여받았다.

일부 구현양태에서, 대상체는 지난 12개월 이내에 적어도 3회의 자연 출혈 에피소드를 경험하였다.

방법의 일부 구현양태에서, rVWF의 투여는 3 내지 4일 마다 발생한다. 일부 구현양태에서, 투여는 7일 기간의 1일 및 5일, 2일 및 6일, 또는 3일 및 7일에 발생한다. 특정 구현양태에서, 투여는 적어도 24시간, 36시간, 48시간, 72시간 또는 84시간마다 발생한다. 일부 구현양태에서, 투여는 적어도 72시간마다 발생한다.

일부 구현양태에서, 약술된 바와 같은 방법은 대상체에게 적어도 1회 용량의 재조합 인자 VIII(rFVIII)를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현양태에서, 적어도 1회의 용량의 rFVIII의 투여는 적어도 1회의 용량의 rVWF와 동시에 또는 순차적으로 투여된다.

일부 구현양태에서, 대상체는 선택적 수술 또는 구강 수술을 받은 후 예방 치료를 재개한다. 일부 구현양태에서, 선택적 수술이 경미한 수술 또는 구강 수술이고 대상체가 적어도 0.4IU/mL 이상의 FVIII 활성(FVIII:C)을 갖는 경우, 대상체는 수술 전에 rFVIII 없이 rVWF를 투여받는다. 특정 구현양태에서, 선택적 수술이 대수술이고 대상체가 적어도 0.8IU/mL 이상의 FVIII 활성(FVIII:C)을 갖는 경우, 대상체는 수술 전에 rFVIII 없이 rVWF를 투여받는다.

일부 구현양태에서, 예방 치료 효능은 치료 전 연간 출혈률(annual bleeding rate, ABR)에 비해 rVWF 예방 동안 자연 출혈 에피소드에 대한 ABR의 ≥25% 감소로 표시된다.

일부 구현양태에서, 예방 치료 효능은 치료 전 ABR에 비해 rVWF 예방 동안 자연 출혈 에피소드에 대한 연간 출혈률(ABR)의 ≥25%, ≥30%, ≥35%, ≥40%, ≥45%, ≥50%, ≥55%, ≥60%, ≥65%, ≥70%, ≥75%, ≥80%, ≥85%, ≥90% 또는 ≥95%의 감소로 표시된다.

일부 구현양태에서, 예방 치료 효능은 rVWF로 예방 치료 전 및 후에 대상체로부터 수득된 샘플에서 VWF:RCo 및/또는 FVIII 활성을 조사함으로써 측정된다.

일부 구현양태에서, 예방 치료 효능은 rVWF로 예방 치료 전 및 후에 대상체로부터 수득된 샘플에서 FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, 및/또는 VWF 콜라겐-결합능 활성을 조사함으로써 측정된다.

일부 구현양태에서, FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, 및/또는 VWF 콜라겐-결합능 활성을 조사하기 위한 샘플은 rVWF로 예방 치료 후 15분, 30분, 60분, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간, 28시간, 32시간, 48시간, 72시간, 또는 96시간에 수득된다.

일부 구현양태에서, FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, 및/또는 VWF 콜라겐-결합능 활성을 조사하기 위한 샘플은 rVWF로 예방 치료 후 25 내지 31일에 수득된다.

일부 구현양태에서, 예방 치료 효능은 출혈 에피소드 후에 또는 동안에 결정되며, 여기서 FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, 및/또는 VWF 콜라겐-결합능 활성을 조사하기 위한 샘플은 출혈 에피소드 후에 수득되며, 및 추가로 샘플은 rVWF 투여 전, rVWF 투여 2시간 후, 및 그후 출혈 에피소드가 해소될 때까지 12-24시간마다 수득된다.

일부 구현양태에서, 예방 치료 효능은 rVWF로 예방 치료 전의 수준과 비교하여 rVWF로 예방 치료 후 FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag 및/또는 VWF 콜라겐-결합능 활성 수준의 개선에 의해 표시된다.

또한 본 발명은 중증 폰 빌레브란트 질병(VWD)을 갖는 대상체에서 자연 출혈 에피소드를 예방적으로 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은 상기 대상체에게 이전에 투여된 혈장-유래 VWF(pdVWF)의 상응하는 주간 용량과 실질적으로 동일한 주간 용량의 재조합 폰 빌레브란트 인자(rVWF)를 투여하여 자연 출혈 에피소드의 빈도 및/또는 지속기간을 감소시키는 것을 포함한다.

일부 구현양태에서, rVWF의 주간 용량은 pdVWF의 상응하는 주간 용량보다 약 10% 더 적다. 일부 구현양태에서, rVWF의 주간 용량은 pdVWF의 상응하는 주간 용량보다 약 10% 더 많다.

일부 구현양태에서, rVWF의 주간 용량은 별도의 날에 투여되는 2회의 개별 주입이다. 일부 구현양태에서, rVWF의 주간 용량은 별도의 날에 투여되는 3회의 개별 주입이다. 일부 구현양태에서, rVWF의 주간 용량은 단일 주입이다.

일부 구현양태에서, 각각의 개별 주입은 최대 80IU/kg rVWF를 포함한다.

일부 구현양태에서, 각각의 개별 주입은 80IU/kg rVWF를 포함한다.

일부 구현양태에서, 각각의 개별 주입은 50IU/kg rVWF를 포함한다.

일부 구현양태에서, 대상체는 20IU/dL 이하 범위의 기준선 VWF 리스토세틴 보조인자 활성(VWF:RCo)을 갖거나 타입 1 VWD로 진단된다. 일부 구현양태에서, 대상체는 타입 2A, 2B 또는 2M VWD로 진단된다. 일부 구현양태에서, 대상체는 3IU/dL 이상 범위의 VWF:항원 함량(VWF:Ag)을 갖거나 타입 3형 VWD로 진단된다.

일부 구현양태에서, 대상체는 적어도 12개월 동안 pdVWF의 예방 치료를 받았다.

일부 구현양태에서, 2개의 개별 주입은 7일 기간의 1일 및 5일, 또는 2일 및 6일, 또는 3일 및 7일에 투여된다. 특정 구현양태에서, 3회의 개별 주입은 7일 기간의 1일, 3일 및 6일에 투여된다. 일부 구현양태에서, 투여는 적어도 24시간, 36시간, 48시간, 72시간, 또는 84시간마다 발생한다. 특정 구현양태에서, 투여는 적어도 72시간마다 발생한다.

일부 구현양태에서, 본원에 제공된 방법은 대상체에게 적어도 1회 용량의 재조합 인자 VIII(rFVIII)를 투여하는 것을 추가로 포함한다.

일부 구현양태에서, rFVIII의 적어도 1회 용량의 투여는 rVWF의 주간 용량과 동시에 또는 순차적으로 투여된다.

일부 구현양태에서, 대상체는 선택적 수술 또는 구강 수술을 받은 후 예방 치료를 재개한다. 일부 구현양태에서, 선택적 수술이 경미한 수술 또는 구강 수술이고 대상체가 적어도 0.4IU/mL 이상의 FVIII 활성(FVIII:C)을 갖는 경우, 대상체는 수술 전에 rFVIII 없이 rVWF를 투여받는다. 일부 구현양태에서, 선택적 수술이 대수술이고 대상체가 적어도 0.8IU/mL 이상의 FVIII 활성(FVIII:C)을 갖는 경우, 대상체는 수술 전에 rFVIII 없이 rVWF를 투여받는다.

일부 구현양태에서, 예방 치료 효능은 치료 전 ABR에 비해 rVWF 예방 동안 자연 출혈 에피소드에 대한 연간 출혈률(ABR)의 ≥25% 감소에 의해 표시된다.

일부 구현양태에서, 예방 치료 효능은 치료 전 ABR에 비해 rVWF 예방 동안 자연 출혈 에피소드에 대한 연간 출혈률(ABR)의 ≥25%, ≥30%, ≥35%, ≥40%, ≥45%, ≥50%, ≥55%, ≥60%, ≥65%, ≥70%, ≥75%, ≥80%, ≥85%, ≥90%, 또는 ≥95%의 감소에 의해 표시된다.

일부 구현양태에서, 예방 치료 효능은 출혈 에피소드 후에 또는 동안에 결정되며, 여기서 FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, 및/또는 VWF 콜라겐-결합능 활성을 조사하기 위한 샘플은 출혈 에피소드 후에 수득되고, 및 추가로 샘플은 rVWF 투여 전, rVWF 투여 2시간 후 및 그후 출혈 에피소드가 해소될 때까지 12-24시간마다 수득된다.

일부 구현양태에서, 예방 치료 효능은 rVWF로 예방 치료 전의 수준과 비교하여 rVWF로 예방 치료 후 FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, 및/또는 VWF 콜라겐-결합능 활성 수준의 개선에 의해 표시된다.

일부 구현양태에서, 자연 출혈 또는 출혈 에피소드는 혈관절증, 비출혈, 근육 출혈, 구강 출혈 및 위장 출혈로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 포함한다.

기재된 임의의 방법의 일부 구현양태에서, 대상체는 타입 2N VWD 또는 가성 VWD로 진단되지 않는다.

본 발명의 다른 목적, 이점 및 구현양태는 하기의 상세한 설명으로부터 명백할 것이다.

도 1은 본원에 기재된 글로벌, 다기관, 공개-라벨, 3상 연구(NCT02973087, EudraCT no.: 2016-001478-14)에 대한 연구 설계를 보여준다.
도 2는 주요 연구 포함 및 배제 기준의 표를 보여준다.
도 3은 rVWF 예방을 위한 예시적인 투여 일정의 표를 보여준다.
도 4는 주요 연구 결과 측정 표를 보여준다.
도 5a 내지 도 5c는 인간 재조합 프리프로-VWF의 핵산 서열을 도시한다.
도 6a 내지 도 6j는 인간 재조합 프리프로-VWF의 아미노산 서열을 도시한다.
도 7a 내지 도 7g는 인간 재조합 성숙 VWF의 아미노산 서열을 도시한다.

도입

VWD 환자의 경우, 특히 대수술에서 장기간 지혈이 필요한 경우 폰 빌레브란트 인자(VWF) 대체로 치료하는 것이 권장된다(Mannucci PM 및 Franchini M., Haemophilia, 2017, 23(2):182-187; National Institutes of Health. National Heart, Lung, and Blood Institute. The Diagnosis, Evaluation, and Management of von Willebrand Disease NIH Publication No. 08-5832; December, 2007). 혈장- 유래 VWF 치료법은 인자 VIII(FVIII)를 함유하고 반복 투여 시 FVIII 축적 가능성이 있다.

미국에 대해 승인된 VONVENDI^® 및 이의 EU 승인된 동등물인 VEYVONDI^®는 각각 외인성 인간 또는 동물-유래 단백질의 첨가 없이 차이니스 햄스터 난소 세포주에서 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 재조합 폰 빌레브란트 인자(rVWF) 농축물을 포함한다(Turecek PL, 등. Hamostaseologie. 2009;29(suppl 1):S32-38; Mannucci PM, 등 Blood, 2013;122(5):648-657; Gill JC, 등 Blood, 2015;126(17):2038-2046, European Medicines Agency. VEYVONDI Summary of Product Characteristics). ADAMTS13, VWF-절단 단백질에 노출된 혈장-유래 VWF(pdVWF) 농축액에서 일반적으로 결핍된 초대형 다량체를 포함하는 전체 VWF 다량체 프로필을 rVWF는 함유한다.

VWD를 가진 대부분의 환자는 경증 내지 중간의 점막 출혈 및 외상 또는 수술 후 출혈을 나타내지만, 특히 중증 질환을 가진 환자의 경우 생명을 위협하는 출혈도 발생할 수 있다(Nichols 등, Haemophilia, 2008, 14:171-232; Leebeek FW 및 Eikenboom JC, N Engl J Med, 2016, 375:2067-80). 출혈 에피소드의 빈도와 지속기간을 줄이면 적혈구 수혈의 필요성이 감소하고 관절병증을 포함한 약화시키는 동반질환의 위험이 낮아질 것으로 예상된다.

중증 VWD를 갖는 환자는 VWF 및 FVIII 수준을 유지하기 위해 예방적 rVWF 치료로부터 이익을 얻을 수 있으므로 혈관절증, 비출혈 및 위장 출혈을 포함하는 자연 출혈 에피소드(BE)의 위험이 감소된다(Abshire TC, Thromb Res 2009, 124(suppl 1):S23-6; Berntorp E, Haemophilia 2008, 14(suppl 5):47-53; Berntorp E 및 Petrini P, Blood Coagul Fibrinolysis, 2005, 16(suppl 1): S23-6; Berntorp E, Semin Thromb Hemost, 2006, 32:621-5; Abshire 등, Haemophilia, 2013, 19:76-81; Abshire TC, J Thromb Haemost, 2015, 13:1585-9).

본 발명은 중증 폰 빌레브란트 질병(VWD)을 갖는 환자에서 자연 출혈을 예방적으로 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은 대상체에게 재조합 폰 빌레브란트 인자(rVWF)를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현양태에서, 대상체는 약 40-80IU/kg범위의 rVWF 주간 용량을 2회 투여받는다. 일부 구현양태에서, 대상체는 약 40- 80IU/kg 범위의 rVWF를 주간 용량으로 투여받는다. 어떤 경우에는, 주간 용량이 주 1회 단일 투여로 제공된다. 특정 경우에서, 주간 용량은 1주일에 걸쳐 상이한 날에 2회의 개별 투여로 제공된다. 다른 경우에, 주간 용량은 1주일에 걸쳐 서로 다른 날에 3회의 개별 투여로 제공된다.

PCT 출원 공개 번호 WO2012/171031의 개시 내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.

정의

본 발명을 추가로 설명하기 전에, 본 발명은 기재된 특정 구현양태로 제한되지 않으며, 물론 변경될 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구현양태를 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.

본원에 사용된 바와 같이, "rVWF"는 재조합 VWF를 지칭한다.

본원에 사용된 "rFVIII"은 재조합 FVIII를 지칭한다.

용어 "재조합"은, 예를 들어 세포, 또는 핵산, 단백질 또는 벡터와 관련하여 사용될 때, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산 또는 단백질의 도입에 의해 또는 천연 핵산 또는 단백질의 변화에 의해 변형되었거나, 또는 세포가 그렇게 변형된 세포로부터 유래되었음을 나타낸다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 천연(비-재조합) 형태 내에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 그렇지 않으면 비정상적으로 발현되거나, 과소 발현되거나 전혀 발현되지 않는 천연 유전자를 발현한다.

본원에 사용된 "재조합 VWF"는 재조합 DNA 기술을 통해 수득된 VWF를 포함한다. 특정 구현양태에서, 본 발명의 VWF 단백질은, 예를 들어 1986년 10월 23일자로 공개된 WO 1986/06096 및 1990년 7월 23일에 긴스버그(Ginsburg) 등의 이름으로 출원된 미국 특허 출원 번호 07/559,509에서 제조된 바와 같은, 구조물을 포함할 수 있으며, 이는 재조합 VWF를 생산하는 방법과 관련하여 본원에 참조로 포함된다. 본 발명에서 VWF는 단량체 및 다량체 형태를 포함하는 모든 잠재적 형태를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 조합에 사용되는 상이한 형태의 VWF를 포함한다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 본 발명의 VWF는 상이한 다량체, 상이한 유도체 및 생물학적 활성 유도체 및 생물학적 활성이 아닌 유도체 둘 모두를 포함할 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 재조합 VWF는, 예를 들어 영장류, 인간, 원숭이, 토끼, 돼지, 설치류, 마우스, 래트, 햄스터, 저빌, 개, 고양이 및 이들의 생물학적 활성 유도체과 같은 포유동물로부터의 VWF 계열의 임의의 구성원을 포함한다. VWF 단백질의 기능적 단편 및 융합 단백질과 마찬가지로, 활성을 갖는 돌연변이체 및 변이체 VWF 단백질도 포함된다. 또한, 본 발명의 VWF는 정제, 검출, 또는 둘 모두를 용이하게 하는 태그를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 VWF는 시험관내 또는 생체내에서 치료학적 모이어티 또는 영상화에 적합한 모이어티로 추가로 변형될 수 있다.

본원에 사용된 "혈장-유래 VWF" 또는 "pdVWF"는 생체내 안정화, 예를 들어 적어도 하나의 FVIII 분자의 결합 특성을 갖는 포유동물로부터 수득된 성숙 VWF를 포함하는 혈액에서 발견되는 모든 형태의 단백질을 포함한다.

"고도의 다량체 VWF" 또는 "고분자량 VWF"라는 용어는 적어도 10개의 서브유닛, 또는 12, 14, 또는 16개 내지 약 20, 22, 24 또는 26개 또는 그 이상까지의 서브유닛을 포함하는 VWF를 지칭한다. "서브유닛"이라는 용어는 VWF의 단량체를 지칭한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 더 큰 차수의 다량체를 형성하기 위해 중합하는 것은 일반적으로 VWF의 이량체이다(Turecek 등, Semin. Thromb. Hemost. 2010, 36(5):510-521, 이는 모든 목적을 위해 및 특히 VWF의 다량체 분석에 관한 모든 교시를 위해 전체적으로 본원에 참고로 포함된다).

본원에 사용된 용어 "인자 VIII" 또는 "FVIII"은 환자에게 내인성이든, 혈장으로부터 유래하든, 또는 재조합 DNA 기술의 사용으로 제조되든, 혈액 응고 인자 VIII의 전형적인 특성을 갖는 모든 형태의 인자 VIII 분자 및 모든 변형된 형태의 인자 VIII를 포함하여 지칭한다. 인자 VIII(FVIII)은 자연적으로 및 단일 유전자 생성물로부터 발생하는 폴리펩타이드의 불균질 분포로서 치료 제제에 존재한다(Andersson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:2979-2983(1986)). 인자 VIII를 함유하는 치료 제제의 상업적으로 구입가능한 예는 상표명 HEMOFIL M, ADVATE 및 RECOMBINATE으로 판매되는 것들을 포함한다(Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL, U.S.A.에서 구입가능).

본원에 사용된 "혈장 FVIII 활성" 및 "생체내 FVIII 활성"은 상호교환적으로 사용된다. 표준 검정을 사용하여 측정된 생체내 FVIII 활성은 내인성 FVIII 활성, 치료적으로 투여된 FVIII(재조합 또는 혈장 유래)의 활성, 또는 내인성 및 투여된 FVIII 활성 둘 모두 일 수 있다. 유사하게, "혈장 FVIII"은 내인성 FVIII 또는 투여된 재조합 또는 혈장 유래된 FVIII를 지칭한다.

본원에 사용된 "폰 빌레브란트 질병"은 폰 빌레브란트 인자의 결핍에 의해 야기되는 질병군을 지칭한다. 폰 빌레브란트 인자는 혈소판이 뭉쳐서 혈관벽에 달라붙는 것을 돕는데, 이는 정상적인 혈액 응고에 필요하다. 본원에 더 상세히 기술된 바와 같이, 타입 1, 2A, 2B, 2M 및 3을 포함하는 여러 유형의 폰 빌레브란트 질병이 있다.

용어 "분리된", "정제된" 또는 "생물학적으로 순수한"은 본래의 상태에서 발견되는 바와 같이 일반적으로 수반되는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질을 지칭한다. 순도 및 균질성은 일반적으로 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 분석 화학 기술을 사용하여 결정된다. VWF는 실질적으로 정제된 제제에 존재하는 주요 종이다. 일부 구현양태에서 용어 "정제된"은 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 본질적으로 하나의 밴드를 발생시키는 것을 의미한다. 다른 구현양태에서, 이는 핵산 또는 단백질이 적어도 50% 순수하고, 더욱 바람직하게는 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 순수하다. 다른 구현양태에서 "정제하다" 또는 "정제"는 정제될 조성물로부터 적어도 하나의 오염물을 제거하는 것을 의미한다. 이러한 의미에서, 정제는 정제된 화합물이 균질할 것을, 예를 들어 100% 순수할 것을 요구하지 않는다.

본원에 사용된 "투여하는"(및 모든 문법적 등가물)은 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 경구 투여, 좌제로서의 투여, 국소 접촉, 복강내, 병변내 또는 비강내 투여, 또는 서방형 장치, 예를 들어 미니-삼투 펌프를 대상체에게 이식하는 것을 포함한다. 투여는 비경구 및 경점막(예를 들어, 경구, 비강, 질, 직장 또는 경피)을 포함하는 임의의 경로에 의한 것이다. 비경구 투여는, 예를 들어 정맥내, 근육내, 세동맥내, 피내, 피하, 복강내, 뇌실내 및 두개내를 포함한다. 다른 전달 방식에는 리포솜 제형, 정맥내 주입, 경피 패치 등의 사용이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.

용어 "치료학적 유효량 또는 용량" 또는 "치료학적으로 충분한 양 또는 용량" 또는 "유효하거나 충분한 양 또는 용량"은 투여되는 치료 효과를 생성하는 용량을 지칭한다. 예를 들어, 혈우병 치료에 유용한 약물의 치료학적 유효량은 혈우병과 관련된 하나 이상의 증상을 예방하거나 완화할 수 있는 양일 수 있다. 정확한 용량은 치료의 목적에 따라 달라질 것이며, 공지된 기술을 사용하여 당업자에 의해 확인될 수 있을 것이다(Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms(vols.1-3, 1992);Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999); Pickar, Dosage Calculations(1999); 및 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins).

본원에 사용된 용어 "환자" 및 "대상체"는 상호교환적으로 사용되며 질병이 있거나 질병에 걸릴 가능성이 있는 포유동물(바람직하게는 인간)을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 특정 값으로부터 ±10%의 대략적인 범위를 나타낸다. 예를 들어, "약 20%"라는 언어는 18 내지 22%의 범위를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "반감기"는 붕괴되는 물질(또는 샘플 또는 환자로부터 제거)의 양이 절반으로 감소하는 데 걸리는 시간을 지칭한다.

I. 재조합 폰 빌레브란트 인자(rVWF)

본 발명은 중증 VWD를 갖는 대상체에서 자연 출혈 에피소드에 대한 예방 치료를 위해 폰 빌레브란트 인자(rVWF)를 포함하는 조성물을 이용한다. 일부 구현양태에서, 치료는 자연 출혈 에피소드의 중증도, 발생률(빈도) 및/또는 지속기간을 감소시킨다.

특정 구현양태에서, 본 발명의 VWF 단백질은, 예를 들어 1986년 10월 23일에 공개된 WO 1986/06096 및 1990년 7월 23일에 긴스버그(Ginsburg) 등의 이름으로 출원된 미국 특허 출원 번호 07/559,509에서와 같이 제조된 구조물을 포함할 수 있으며, 이는 재조합 VWF를 생산하는 방법과 관련하여 본원에 참고로 포함된다. 본 발명에 유용한 VWF는 단량체 및 다량체 형태를 비롯한 모든 잠재적 형태를 포함한다. VWF의 특히 유용한 형태 중 하나는 적어도 2개의 VWF의 동종다량체이다. VWF 단백질은 생물학적으로 활성인 유도체일 수 있거나, FVIII에 대한 안정화제로 단독으로 사용되는 경우 VWF는 생물학적으로 활성이 아닌 형태일 수 있다. 또한, 본 발명은 조합하여 사용되는 상이한 형태의 VWF를 포함한다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 본 발명에 유용한 조성물은 상이한 다량체, 상이한 유도체 및 생물학적 활성 유도체 및 생물학적 활성이 아닌 유도체 둘 모두를 포함할 수 있다.

일차 지혈에서 VWF는 혈소판 및 콜라겐과 같은 세포외 기질의 특정 성분 사이의 브릿지 역할을 한다. 이 과정에서 VWF의 생물학적 활성은 다양한 시험관내 검정에 의해 측정될 수 있다(Turecek 등, Semin. Thromb. Hemost. 28:149-160, 2002). 리스토세틴 보조인자 검정은 VWF의 존재 하에 항생제 리스토세틴에 의해 유도된 신선한 또는 포르말린-고정 혈소판의 응집을 기반으로 한다.

혈소판 응집 정도는 VWF 농도에 따라 달라지며 탁도측정법, 예를 들어 응집측정기를 사용하여 측정될 수 있다(Weiss 등, J. Clin. Invest. 52:2708-2716, 1973; Macfarlane 등, Thromb. Diath. Haemorrh. 34:306-308, 1975). 두 번째 방법은 ELISA 기술을 기반으로 하는 콜라겐 결합 검정이다(Brown et Bosak, Thromb. Res. 43:303-311, 1986; Favaloro, Thromb. Haemost. 83:127-135, 2000). 마이크로타이터 플레이트는 타입 I 또는 III 콜라겐으로 코팅된다. 그런 다음 VWF는 콜라겐 표면에 결합되고 이어서 효소-표지된 폴리클론 항체로 검출된다. 마지막 단계는 기질 반응으로, ELISA 판독기로 광도측정으로 모니터링될 수 있다. 본원에 제공된 바와 같이, 본 발명의 VWF의 특이적 리스토세틴 보조인자 활성(VWF:RCo)은 일반적으로 시험관내 검정을 사용하여 측정된 VWF의 mU/μg으로 기술된다.

pdVWF에 비해 본 발명의 rVWF 조성물의 이점은 rVWF가 pdVWF보다 더 높은 특이적 활성을 나타낸다는 것이다. 일부 구현양태에서, 본 발명의 rVWF는 적어도 약 20, 22.5, 25, 27.5, 30, 32.5, 35, 37.5, 40, 42.5, 45, 47.5, 50, 52.5, 55, 57.5, 60, 62.5, 65, 67.5, 70, 72.5, 75, 77.5, 80, 82.5, 85, 87.5, 90, 92.5, 95, 97.5, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150mU/μg 또는 그 이상의 특이적 활성을 갖는다.

본 발명의 rVWF는 약 10 내지 약 40개의 서브유닛을 포함하는 고도로 다량체이다. 추가 구현양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 생성된 다량체 rVWF는 약 10-30, 12-28, 14-26, 16-24, 18-22, 20-21개의 서브유닛을 포함한다. 추가 구현양태에서, rVWF는 이량체에서 40개 초과의 서브유닛(> 1천만 달톤)의 다량체까지 크기가 다양한 다량체로 존재한다. 가장 큰 다량체는 혈소판 수용체 및 손상의 내피하 기질 부위 모두와 상호작용할 수 있는 다중 결합 부위를 제공하며, VWF의 가장 지혈 활성인 형태이다. ADAMTS13의 적용은 시간이 지남에 따라 초대형 rVWF 다량체를 절단할 것이지만, 생산 동안(일반적으로 세포 배양물에서의 발현을 통해), 본 발명의 rVWF 조성물은 일반적으로 ADAMTS13에 노출되지 않고 이의 고도로 다량체 구조를 유지한다.

한 구현양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용되는 rVWF 조성물은 올리고머의 95%가 6개 내지 20개 서브유닛을 갖는 것을 특징으로 하는 rVWF 올리고머 분포를 갖는다. 다른 구현양태에서, rVWF 조성물은 95%의 올리고머가 WO 2012/171031의 표 2에서 발견되는 변이 458 내지 641로부터 선택되는 서브유닛의 범위를 갖는 것을 특징으로 하는 rVWF 올리고머의 분포를 가지며, 이는 모든 목적을 위해 전체가 본원에 참고로 포함된다.

한 구현양태에서, rVWF 조성물은 특정 더 고차 rVWF 다량체 또는 보다 큰 다량체로 존재하는 rVWF 분자의 백분율에 따라 특성화될 수 있다. 예를 들어, 한 구현양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용된 rVWF 조성물 중 적어도 20%의 rVWF 분자는 적어도 10개의 서브유닛의 올리고머 복합체로 존재한다. 또 다른 구현양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용된 rVWF 조성물 중 rVWF 분자의 적어도 20%가 적어도 12개의 서브유닛의 올리고머 복합체로 존재한다. 또 다른 구현양태에서, 본원에 제공된 방법에 사용된 rVWF 조성물은, 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 표 3 내지 표 5에서 발견된 변이 134 내지 457 중 어느 하나에 따른 특정 더 고차 rVWF 다량체 또는 더 큰 다량체(예를 들어, 적어도 Y 서브유닛의 다량체)에 존재하는 rVWF 분자의 최소 백분율(예를 들어, 적어도 X%)을 갖는다.

상기에 따르면, (FVIII와 함께 또는 없이) 대상체에게 투여되는 rVWF 조성물은 일반적으로 상당한 백분율의 고분자량(HMW) rVWF 다량체를 포함한다. 추가 구현양태에서, HMW rVWF 다량체 조성물은 적어도 10%-80% rVWF 데카머 또는 더 고차의 다량체를 포함한다. 추가 구현양태에서, 조성물은 약 10-95%, 20-90%, 30-85%, 40-80%, 50-75%, 60-70% 데카머 또는 더 고차 다량체를 포함한다. 추가 구현양태에서, HMW rVWF 다량체 조성물은 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%의 데카머 또는 더 고차의 다량체를 포함한다.

rVWF 다량체의 수 및 백분율의 평가는, 예를 들어 문헌(Cumming 등 J Clin Pathol. 1993 May;46(5):470-473, 이는 모든 목적, 및 특히 VWF 다량체의 평가와 관련된 모든 교시를 위해 그 전체가 참고로 본원에 포함된다)에 의해 논의된 바와 같이, 크기별로 VWF 다량체를 분리하기 위해 전기영동 및 크기 배제 크로마토그래피 방법을 사용하는 방법을 제한 없이 포함하는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 기술은 면역블롯팅 기술(예: 웨스턴 블롯)을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 겔은 VWF에 대한 방사성표지된 항체로 면역블롯팅된 후 화학발광 검출이 뒤따른다(Wen 등,(1993), J. Clin. Lab. Anal.,7:317-323, 이는 모든 목적, 특히 VWF 다량체의 평가와 관련된 모든 교시를 위해 그 전체가 참고로 본원에 포함된다). VWF에 대한 추가 검정에는 VWF:항원(VWF:Ag), VWF:리스토세틴 보조인자(VWF:RCof) 및 VWF:콜라겐 결합 활성 검정(VWF:CBA)이 포함되며, 이는 종종 폰 빌레브란트 질병의 진단 및 분류에 사용된다(Favaloro 등, Pathology, 1997, 29(4):341-456, 이는 모든 목적을 위해, 특히 VWF에 대한 검정과 관련된 모든 교시를 위해 그 전체가 참고로 본원에 포함된다).

추가 구현양태에서, 본 발명의 더 고차 rVWF 다량체는 투여 후 약 1 내지 약 90시간 동안 안정하다. 또 다른 구현양태에서, 더 고차 rVWF 다량체는 투여 후 약 5-80, 10-70, 15-60, 20-50, 25-40, 30-35시간 동안 안정하다. 또 다른 구현양태에서, 더 고차 rVWF 다량체는 투여 후 적어도 3, 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72시간 동안 안정하다. 특정 구현양태에서 rVWF 다량체의 안정성은 시험관내에서 평가된다.

한 구현양태에서, 본원에 제공된 조성물 및 방법에 사용된 더 고차 rVWF 다량체는 투여 후 적어도 12시간의 반감기를 갖는다. 또 다른 구현양태에서, 더 고차rVWF 다량체는 투여 후 적어도 24시간의 반감기를 갖는다. 또 다른 구현양태에서, 더 고차 rVWF 다량체는 WO 2012/171031의 표 6에서 발견되는 변이 642 내지 1045로부터 선택된 반감기를 가지며, 이는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

특정 측면에서, 본 발명에 따라 사용되는 rVWF(재조합 또는 혈장 유래)는 접합, 번역후 또는 공유 변형으로 변형되지 않는다. 특정 구현양태에서, 본 발명의 rVWF는 비제한적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 폴리시알산, 하이드록실 에틸 전분, 폴리-탄수화물 모이어티 등을 포함하는 수용성 중합체로 변형되지 않는다.

다른 측면에서, 본 발명에 따라 사용되는 rVWF(재조합 또는 혈장 유래)는 접합, 번역후 변형, 또는 N- 또는 C-말단 잔기의 변형을 포함한 공유 변형 뿐만 아니라, 예를 들어 유리 설프하이드릴기, 일차 아민 및 하이드록실기에서 선택된 측쇄의 변형을 통해 변형된다. 한 구현양태에서, 수용성 중합체는 라이신기 또는 다른 일차 아민에 의해 (직접적으로 또는 링커를 통해) 단백질에 연결된다. 한 구현양태에서, 본 발명의 rVWF 단백질은 비제한적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 폴리시알산, 하이드록실 에틸 전분, 폴리-탄수화물 모이어티 등을 포함하는 수용성 중합체의 접합에 의해 변형될 수 있다.

rVWF 및/또는 FVIII를 변형시키기 위해 사용될 수 있는 수용성 중합체는 선형 및 분지형 구조를 포함한다. 접합된 중합체는 본 발명의 응고 단백질에 직접 부착될 수 있거나, 대안적으로 연결 모이어티를 통해 부착될 수 있다. 수용성 중합체와의 단백질 접합의 비제한적인 예는 문헌에서 발견할 수 있다(U.S. Pat. No. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 및 4,179,337; 및Abuchowski 및 Davis "Enzymes as Drugs", Holcenberg and Roberts, Eds., pp. 367-383, John Wiley and Sons, New York(1981) 및 Hermanson G., Bioconjugate Techniques 2nd Ed.,Academic Press, Inc. 2008).

단백질 접합은 당업계에 잘 알려진 다수의 기술에 의해 수행될 수 있다(Hermanson G., Bioconjugate Techniques 2nd Ed., Academic Press, Inc. 2008). 예로는 응고 단백질 또는 수용성 중합체 모이어티 중 하나의 카르복실기 및 다른 하나의 아민기 사이의 펩티드 결합을 통한 연결, 또는 하나의 카르복실기와 다른 하나의 하이드록실기 사이의 에스테르 연결을 포함한다. 본 발명의 응고 단백질이 수용성 중합체 화합물에 접합될 수 있는 또 다른 연결은 쉬프 염기(Schiff base)를 통해서이며, 이는 과요오드산염 산화에 의해 중합체의 비-환원 말단에 형성된 알데히드기와 반응하는 중합체 모이어티의 유리 아미노기 사이이다(Jennings 및 Lugowski, J. Immunol. 1981;127:1011-8; Femandes 및 Gregonradis, Biochim Biophys Acta. 1997;1341;26-34). 생성된 쉬프 염기는 NaCNBH₃를 사용한 특이적 환원에 의해 안정화되어 2차 아민을 형성할 수 있다. 대안적인 접근법은 사전 산화 후 NH₄Cl로 환원적 아민화하여 중합체 상에 말단 유리 아미노기를 생성하는 것이다. 2개의 아미노 또는 2개의 하이드록실기를 연결하기 위해 이작용성 시약을 사용할 수 있다. 예를 들어, 아미노기를 함유하는 중합체는 BS3(비스(설포숙신이미딜)수베레이트/Pierce, Rockford, Ill.)와 같은 시약을 사용하여 응고 단백질의 아미노기에 커플링될 수 있다. 또한, 설포-EMCS(N-엡실론-말레이미도카프로일옥시)설포숙신이미드 에스테르/Pierce)와 같은 이종이작용성 가교결합제를 사용하여 아민과 티올기를 연결할 수 있다. 다른 구현양태에서, PEG 알콕사이드 + 브로모아세트알데하이드의 디에틸 아세탈과 같은 알데하이드 반응성 기; PEG + DMSO 및 아세트산 무수물, 및 PEG 염화물 + 4-하이드록시벤즈알데히드의 페녹사이드, 숙신이미딜 활성 에스테르, 활성화된 디티오카르보네이트 PEG, 2,4,5-트리클로로페닐클로로포르메이트 및 P-니트로페닐클로로포르메이트 활성화 PEG는 응고 단백질의 접합에 사용될 수 있다.

일부 측면에서, 본 발명의 방법에 사용된 rVWF는 푸린을 사용하여 시험관 내에서 성숙되었다. 추가 구현양태에서, 푸린은 재조합 푸린이다.

추가 측면에서, 본 발명의 방법에 사용되는 rVWF는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 포유동물 세포 배양물에서의 발현에 의해 생성된다. 특정 구현양태에서, 포유동물 배양물은 CHO 세포를 포함한다. 예시적인 구현양태에서, 본 발명의 rVWF는 CHO 세포 발현 시스템으로부터 분리된 rVWF 단백질을 포함한다. 추가의 구현양태에서, 프로펩타이드 제거는 프로-VWF의 푸린에 대한 노출을 통해 시험관내 매개된다. 또 다른 구현양태에서, 프로펩타이드 제거에 사용되는 푸린은 재조합 푸린이다. 또 다른 구현양태에서, 완전히 글리코실화된/ABO 혈액형 글리칸은 존재하지 않는다.

또 다른 구현양태에서, rVWF는 적합한 진핵 숙주 시스템에서의 발현에 의해 본 발명의 방법 및 조성물에 사용된다. 진핵 세포의 예는, 제한 없이 CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep 및 HepG2와 같은 포유동물 세포; 곤충 세포, 예를 들어 SF9 세포, SF21 세포, S2 세포 및 하이 파이브(High Five) 세포; 및 효모 세포, 예를 들어 사카로마이세스(Saccharomyces) 또는 시조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 세포를 포함한다. 한 구현양태에서, VWF는 효모 세포, 곤충 세포, 조류 세포, 포유동물 세포 등에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 인간 세포주, 햄스터 세포주 또는 뮤린 세포주에서 발현될 수 있다. 한 특정 구현양태에서, 세포주는 CHO, BHK 또는 HEK 세포주이다. 전형적으로, 포유동물 세포, 예를 들어 연속 세포주로부터의 CHO 세포를 사용하여 본 발명의 VWF를 발현할 수 있다.

특정 구현양태에서, VWF를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열은 벡터일 수 있다. 벡터는 바이러스에 의해 전달되거나 플라스미드일 수 있다. 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 특정 유전자 또는 이의 생물학적 기능적 부분일 수 있다. 한 구현양태에서, 단백질은 VWF의 적어도 생물학적 활성 부분이다. 매우 다양한 벡터가 VWF의 발현을 위해 사용될 수 있고 진핵생물 발현 벡터로부터 선택될 수 있다. 진핵생물 발현을 위한 벡터의 예는 다음을 포함한다: (i) 효모에서의 발현을 위해, AOX1, GAP, GAL1, AUG1 등과 같은 프로모터를 사용하는 pAO, pPIC, pYES, pMET와 같은 벡터; (ii) 곤충 세포에서의 발현을 위해, PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh 등과 같은 프로모터를 사용하는 pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC 등과 같은 벡터, 및 (iii) 포유동물 세포에서의 발현을 위해, pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV 등과 같은 벡터 및 CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV 및 β-액틴과 같은 프로모터를 사용하는 백시니아 바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스 등과 같은 바이러스 시스템에서 유래된 벡터.

본 발명의 일부 구현양태에서, 핵산 서열은 프로모터 서열, 인핸서, TATA 박스, 전사 개시 부위, 폴리링커, 제한 부위, 폴리-A-서열, 단백질 처리 서열, 선택 마커 및 당업자에게 일반적으로 알려진 것들 등과 같은 단백질의 제어된 발현에 적합한 다른 서열을 추가로 포함한다.

특정 구현양태에서, 본 발명의 세포 배양 방법은 미세담체(microcarrier)의 사용을 포함할 수 있다. 일부 구현양태에서, 구현양태의 세포 배양은 높은 세포 밀도 및 단백질 발현을 달성하기 위해 높은 부피-특이적 배양 표면적을 제공하기에 적합한 조건 하에 대형 생물반응기에서 수행될 수 있다. 이러한 성장 조건을 제공하기 위한 한 가지 수단은 교반 탱크 생물반응기에서 세포 배양을 위해 미세담체를 사용하는 것이다. 미세담체 상에 대한 세포 성장의 개념은 반 베젤(van Wezel, A. L., Nature 216:64-5(1967))에 의해 처음 기술되었으며, 성장 배지에 현탁된 작은 고체 입자의 표면 상에 세포 부착을 허용한다. 이러한 방법은 높은 표면 대 부피 비율을 제공하므로 효율적인 영양소 활용이 가능하다. 또한, 진핵 세포주에서 분비된 단백질의 발현을 위해, 증가된 표면 대 부피 비율은 더 높은 수준의 분비를 허용하고 따라서 배양물의 상청액에서 더 높은 단백질 수율을 허용한다. 마지막으로, 이러한 방법을 사용하면 진핵생물 발현 배양물을 쉽게 확장할 수 있다.

VWF를 발현하는 세포는 세포 배양 성장 동안 구형 또는 다공성 미세담체에 결합될 수 있다. 미세담체는 덱스트란, 콜라겐, 플라스틱, 젤라틴 및 셀룰로스 및 문헌(Butler, 1988. In: Spier & Griffiths, Animal Cell Biotechnology 3:283-303)에 기재된 바와 같은 기타를 기반으로 하는 미세담체의 군으로부터 선택된 미세담체일 수 있다. 구형 미세담체 상에서 세포를 바이오매스로 성장시키고 최종 발효기 바이오매스에 도달하고 다공성 미세담체 상에서 발현된 단백질을 생산하기 전에 세포를 하위배양하거나 그 반대의 경우도 가능하다. 적합한 구형 미세담체는 Cytodex™ 1, Cytodex™ 2, 및 Cytodex™ 3(GE Healthcare)와 같은 매끄러운 표면 미세담체 및 Cytopore™ 1, Cytopore™ 2, Cytoline™ 1 및 Cytoline™ 2(GE Healthcare)와 같은 거대다공성 미세담체를 포함할 수 있다.

특정 구현양태에서, rVWF는 고분자량 rVWF를 생산하는 세포 배양 배지에서 배양된 세포에서 발현된다. 용어 "세포 배양액", "세포 배양 배지 또는 배지" 및 "세포 배양 상청액"은 당업계에 일반적으로 잘 알려진 세포 배양 과정의 측면을 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 세포 배양액은 세포 배양 배지 및 세포 배양 상청액을 포함할 수 있다. 세포 배양 배지는 VWF를 발현하는 세포를 배양하기 위한 영양소 및 기타 성분을 제공하기 위해 임의로 보충제와 함께 세포 배양액에 외부적으로 첨가된다. 세포 배양 상청액은 세포 배양 배지로부터의 영양소 및 기타 성분뿐만 아니라 배양 동안 세포로부터 방출, 대사 및/또는 배설되는 생성물을 포함하는 세포 배양액을 지칭한다. 추가 구현양태에서, 배지는 동물성 단백질이 없고 화학적으로 한정될 수 있다. 동물성 단백질이 없고 화학적으로 한정된 배양 배지를 제조하는 방법은 당업계, 예를 들어 US 2008/0009040 및 US 2007/0212770에 공지되어 있으며, 이는 모든 목적 및 특히 세포 배양 배지와 관련된 모든 교시를 위해 모두 본원에 포함된다. "단백질이 없는" 및 관련 용어는 성장 동안 자연적으로 단백질을 흘리는 배양물 내의 세포에 대해 또는 세포 이외의 외인성 공급원으로부터의 단백질을 지칭한다. 다른 구현형태에서, 배양 배지는 폴리펩타이드가 없다. 또 다른 구현양태에서, 배양 배지는 무혈청이다. 다른 구현형태에서, 배양 배지는 동물성 단백질이 없다. 다른 구현형태에서, 배양 배지는 동물 성분이 없다. 또 다른 구현양태에서, 배양 배지는 단백질, 예를 들어 소태아 혈청과 같은 혈청으로부터의 동물 단백질을 함유한다. 또 다른 구현양태에서, 배양물은 외인성으로 첨가된 재조합 단백질을 갖는다. 또 다른 구현양태에서, 단백질은 인증된 병원균이 없는 동물로부터의 것이다. 본원에 사용된 용어 "화학적으로 한정된(chemically defined)"은 배지가, 예를 들어 동물 성분, 기관, 땀샘, 식물 또는 효모의 추출물과 같은 한정되지 않은 보충물을 포함하지 않음을 의미할 것이다. 따라서 화학적으로 한정된 배지의 각 구성 요소가 정확하게 한정된다. 바람직한 구현양태에서, 배지는 동물 성분이 없고 단백질이 없다.

추가 구현양태에서, 포유동물 세포 배양물로부터 정제한 후, rFVIII는 투여 전에 재구성된다. 또 다른 구현양태에서, rVWF는 재구성 전 또는 후에 푸린으로 처리된다. 추가 구현양태에서, 푸린은 재조합 푸린이다. 또 다른 구현양태에서, 본 발명의 rVWF는 ADAMTS13에 노출되지 않으며, 그 결과 초대형(즉, 10개 이상의 서브유닛을 포함하는)이 본 발명의 rVWF 조성물에 존재한다.

특정 측면에서, 본 발명의 방법에 사용되는 rVWF는 완충제, 당 및/또는 당 알코올(제한 없이 트레할로스 및 만니톨을 포함), 안정화제(예: 글리신), 및 계면활성제(예: 폴리소르베이트 80)를 함유하는 제형에 함유된다. 추가 구현양태에서, rFVIII를 함유하는 제형의 경우, 제형은 나트륨, 히스티딘, 칼슘 및 글루타티온을 추가로 포함할 수 있다.

한 측면에서, rVWF를 포함하는 제형은 투여 전에 동결건조된다. 동결건조는 당업계에서 통상적인 기술을 사용하여 수행되며 개발되는 조성물에 대해 최적화되어야 한다[Tang 등, Pharm Res. 21:191-200.(2004) 및 Chang 등, Pharm Res. 13:243-9(1996)].

약제학적 제형을 제조하는 방법은 하기 단계 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 동결건조 전에 본원에 기재된 바와 같은 안정화제를 상기 혼합물에 첨가하는 단계, 각각 본원에 기재된 바와 같은 증량제, 삼투압 조절제 및 계면활성제로부터 선택된 적어도 하나의 제제를 동결건조 전에 상기 혼합물에 첨가하는 단계. 한 측면에서, 동결건조된 제형은 완충제, 증량제 및 안정화제 중 하나 이상으로 적어도 구성된다. 이 측면에서, 계면활성제의 유용성은 동결건조 단계 또는 재구성 동안 응집이 문제가 되는 경우에 평가되고 선택된다. 동결건조 동안 pH의 안정한 영역 내에서 제형을 유지하기 위해 적절한 완충제가 포함된다.

동결건조된 재료에 대한 표준 재구성 방법은 일정량의 순수 또는 주사용 멸균수(WFI)(일반적으로 동결건조 동안 제거된 양과 동일)를 다시 추가하는 것이지만, 비경구 투여용 의약품의 생산에 항균제의 희석된 용액이 생산에 사용되는 경우가 있다[Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, 18:1311-1354(1992)]. 따라서, 본 발명의 동결건조된 재조합 VWF 조성물에 희석제를 첨가하는 단계를 포함하는 재구성된 재조합 VWF 조성물의 제조 방법이 제공된다.

동결건조된 재료는 수용액으로 재구성될 수 있다. 다양한 수성 담체, 예를 들어 주사용 멸균수, 다중 용량 사용을 위한 보존제가 포함된 물, 또는 적절한 양의 계면활성제가 포함된 물(예를 들어, 수성 현탁액의 제조에 적합한 부형제와 혼합하여 활성 화합물을 함유하는 수성 현탁액)이 있다. 다양한 측면에서, 이러한 부형제는 현탁제, 예를 들어 비제한적으로 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 검 및 아카시아 검과 같은 현탁제; 분산제 또는 습윤제는 천연 발생 포스파티드, 예를 들어 제한없이 레시틴, 또는 지방산과 알킬렌 옥사이드의 축합 생성물, 예를 들어 제한없이 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 또는 에틸렌 옥사이드와 장쇄 지방족 알코올의 축합 생성물, 예를 들어 비제한적으로 헵타데카에틸렌옥시세탄올, 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨로부터 유도된 부분 에스테르와 축합 생성물, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유도된 부분 에스테르와의 축합 생성물, 예를 들어 비제한적으로, 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레에이트이다. 다양한 측면에서, 수성 현탁액은 또한 하나 이상의 보존제, 예를 들어 비제한적으로 에틸, 또는 n-프로필, p-하이드록시벤조에이트를 함유한다.

특정 구현양태에서, 본 발명의 조성물은 주사기 또는 다른 저장 용기를 사용하여 투여하기 위한 액체 제형이다. 추가 구현양태에서, 이러한 액체 제형은 수용액으로서 재구성된 본원에 기재된 동결건조된 재료로부터 제조된다.

추가 측면에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다. "약학적으로" 또는 "약리학적으로" 허용되는 문구는 안정하고, 응집 및 절단 생성물과 같은 단백질 분해를 억제하고, 또한 하기에 기재된 당해 분야에 잘 알려진 경로를 사용하여 투여될 때 알레르기 또는 기타 이상반응을 일으키지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. "약학적으로 허용되는 담체"는 임의의 모든 임상적으로 유용한 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함하며, 이는 상기 기재된 제제를 포함한다.

Ⅱ. 재조합 VWF의 생산

본 발명의 유리 성숙 재조합 폰 빌레브란트 인자(rVWF)는 재조합적으로 생산될 수 있다. 당업자는 숙주 세포에서 재조합 단백질을 발현시키기 위한 유용한 방법을 인식한다. 일부 경우에, 상기 방법은 CHO 세포와 같은 숙주 세포에서 rVWF를 코딩하는 핵산 서열을 발현시키고 생성된 숙주 세포를 특정 조건 하에 배양하여 rVWF, 프리프로-VWF, 프로-VWF 등을 생산하는 것을 포함한다.

특정 구현양태에서, VWF를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열은 발현 벡터일 수 있다. 벡터는 바이러스에 의해 전달되거나 플라스미드일 수 있다. 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 특정 유전자 또는 이의 생물학적 기능적 부분일 수 있다. 한 구현양태에서, 단백질은 VWF의 적어도 생물학적 활성 부분이다. 핵산 서열은 프로모터 서열, 인핸서, TATA 박스, 전사 개시 부위, 폴리링커, 제한 부위, 폴리-A-서열, 단백질 처리 서열, 선택 마커, 및 당업자에게 일반적으로 알려진 것과 같은 단백질의 제어된 발현에 적합한 다른 서열을 추가로 포함할 수 있다.

VWF의 발현을 위해 매우 다양한 벡터가 사용될 수 있고 진핵생물 발현 벡터로부터 선택될 수 있다. 진핵생물 발현을 위한 벡터의 예는 다음을 포함한다:(i) 효모 발현을 위해, AOX1, GAP, GAL1, AUG1 등과 같은 프로모터를 사용하는 pAO, pPIC, pYES, pMET와 같은 벡터; (ii) 곤충 세포에서의 발현을 위해, PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh 등과 같은 프로모터를 사용하는 pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC 등과 같은 벡터, 및 (iii) 포유동물 세포에서의 발현을 위해, pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV 등과 같은 벡터 및 CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV 및 β-액틴과 같은 프로모터를 사용하는 백시니아 바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스 등과 같은 바이러스 시스템에서 유래된 벡터.

일부 측면에서, 본 발명의 방법에 사용되는 rVWF는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 포유동물 세포 배양물에서의 발현에 의해 생성된다. 특정 구현양태에서, 포유동물 배양물은 CHO 세포를 포함한다. 추가 구현양태에서, rVWF는 동일한 배양물에서 재조합 인자 VIII(rFVIII)와 공동-발현된다. 이러한 구현양태에서, rVWF 및 rFVIII는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 함께 정제(공동-정제)되거나 별도로 정제된다. 다른 구현양태에서, rVWF는 rFVIII를 함유하지 않는 배양물에서 발현된다.

일부 구현양태에서, rVWF는 발현되고 적합한 진핵생물 숙주 시스템으로부터 분리된다. 진핵 세포의 예는 제한 없이 CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep 및 HepG2와 같은 포유동물 세포; 곤충 세포, 예를 들어 SF9 세포, SF21 세포, S2 세포 및 하이 파이브 세포; 및 효모 세포, 예를 들어 사카로마이세스(Saccharomyces) 또는 시조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 세포를 포함한다. 한 구현양태에서, VWF는 효모 세포, 곤충 세포, 조류 세포, 포유동물 세포 등에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 인간 세포주, 햄스터 세포주 또는 뮤린 세포주에서. 한 특정 구현양태에서, 세포주는 CHO, BHK 또는 HEK 세포주이다. 전형적으로, 포유동물 세포, 예를 들어 연속 세포주로부터의 CHO 세포를 사용하여 본 발명의 VWF를 발현할 수 있다. 특정 예에서, VWF 단백질은 CHO 세포 발현 시스템으로부터 발현되고 분리된다.

VWF는 세포 배양 시스템에서 또는 당업자에 의해 인식되는 임의의 세포 배양 방법에 따라 생성될 수 있다. 일부 구현양태에서, 세포 배양은 높은 세포 밀도 및 단백질 발현을 달성하기 위해 높은 부피-특이적 배양 표면적을 제공하기에 적합한 조건 하에 대형 생물반응기에서 수행될 수 있다. 이러한 성장 조건을 제공하기 위한 한 가지 수단은 교반 탱크 생물반응기에서 세포 배양을 위해 미세담체를 사용하는 것이다. 미세담체 상에 대한 세포 성장의 개념은 반 베젤(van Wezel, A. L., Nature, 1967, 216:64-5)에 의해 처음 기술되었으며 성장 배지에 현탁된 작은 고체 입자의 표면 상에 세포 부착을 허용한다. 이러한 방법은 높은 표면 대 부피 비율을 제공하므로 효율적인 영양소 활용이 가능하다. 또한, 진핵 세포주에서 분비된 단백질의 발현을 위해, 증가된 표면 대 부피 비율은 더 높은 수준의 분비를 허용하고 따라서 배양물의 상청액에서 더 높은 단백질 수율을 허용한다. 마지막으로, 이러한 방법을 사용하면 진핵생물 발현 배양물을 쉽게 확장할 수 있다.

VWF를 발현하는 세포는 세포 배양 성장 동안 구형 또는 다공성 미세담체에 결합될 수 있다. 미세담체는 덱스트란, 콜라겐, 플라스틱, 젤라틴 및 셀룰로스 및 문헌(Butler, 1988.In: Spier & Griffiths, Animal Cell Biotechnology 3:283-303)에 기재된 바와 같이 기타를 기반으로 하는 미세담체의 군으로부터 선택된 미세담체일 수 있다. 구형 미세담체 상에서 세포를 바이오매스로 성장시키고 최종 발효기 바이오매스에 도달하고 다공성 미세담체 상에서 발현된 단백질을 생산하기 전에 세포를 하위배양하거나 그 반대의 경우도 가능하다. 적합한 구형 미세담체는 Cytodex™ 1, Cytodex™ 2 및 Cytodex™ 3(GE Healthcare)와 같은 매끄러운 표면 미세담체 및 Cytopore™ 1, Cytopore™ 2, Cytoline™ 1 및 Cytoline™ 2(GE Healthcare)과 같은 거대다공성 미세담체를 포함할 수 있다.

추가 구현양태에서, VWF 프로펩타이드는 푸린에 대한 프로-VWF의 노출을 통해 시험관내 비-성숙 VWF로부터 절단된다. 일부 구현양태에서, 프로펩타이드 절단에 사용되는 푸린은 재조합 푸린이다.

특정 구현양태에서, rVWF는 고분자량 rVWF를 생산하는 세포 배양 배지에서 배양된 세포에서 발현된다. 용어 "세포 배양액", "세포 배양 배지 또는 배지" 및 "세포 배양 상청액"은 당업계에 일반적으로 잘 알려진 세포 배양 과정의 측면을 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 세포 배양액은 세포 배양 배지 및 세포 배양 상청액을 포함할 수 있다. 세포 배양 배지는 VWF를 발현하는 세포를 배양하기 위한 영양소 및 기타 성분을 제공하기 위해 임의로 보충제와 함께 세포 배양액에 외부적으로 첨가된다. 세포 배양 상청액은 세포 배양 배지로부터의 영양소 및 기타 성분뿐만 아니라 배양 동안 세포로부터 방출, 대사 및/또는 배설되는 생성물을 포함하는 세포 배양액을 지칭한다. 추가 구현양태에서, 배지는 동물성 단백질이 없고 화학적으로 한정될 수 있다. 동물성 단백질이 없고 화학적으로 한정된 배양 배지를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 US 2006/0094104, US 2007/0212770, 및 US 2008/0009040에 있으며, 이들은 모두 모든 목적을 위해 및 특히 세포 배양 배지와 관련된 교시을 위해 본원에 포함된다. "단백질이 없는" 및 관련 용어는 성장 동안 자연적으로 단백질을 흘리는 배양물 내의 세포에 대해 또는 세포 이외의 외인성 공급원으로부터의 단백질을 지칭한다. 다른 구현형태에서, 배양 배지는 폴리펩타이드가 없다. 또 다른 구현양태에서, 배양 배지는 무혈청이다. 다른 구현형태에서, 배양 배지는 동물성 단백질이 없다. 다른 구현형태에서, 배양 배지는 동물 성분이 없다. 또 다른 구현양태에서, 배양 배지는 단백질, 예를 들어 소 태아 혈청과 같은 혈청으로부터의 동물 단백질을 함유한다. 또 다른 구현양태에서, 배양물은 외인성으로 첨가된 재조합 단백질을 갖는다. 또 다른 구현양태에서, 단백질은 인증된 병원균이 없는 동물로부터의 것이다. 본원에 사용된 용어 "화학적으로 한정된"은 배지가, 예를 들어 동물 성분, 기관, 땀샘, 식물 또는 효모의 추출물과 같은 한정되지 않은 보충물을 포함하지 않음을 의미할 것이다. 따라서, 화학적으로 한정된 매질의 각 구성 요소가 정확하게 한정된다. 바람직한 구현양태에서, 배지는 동물 성분이 없고 단백질이 없다.

특정 구현양태에서, VWF를 발현하는 세포의 배양물은 적어도 약 7일, 또는 적어도 약 14일, 21일, 28일, 또는 적어도 약 5주, 6주, 7주, 또는 적어도 약 2개월, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개월 이상 동안 유지될 수 있다. 재조합 VWF 단백질의 생산을 위해 세포 배양이 유지되는 세포 밀도는 단백질 발현에 사용되는 배양 조건 및 배지에 따라 달라질 것이다. 당업자는 VWF를 생성하는 세포 배양을 위한 최적의 세포 밀도를 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 한 구현양태에서, 배양물은 연장된 기간 동안 약 0.5x10⁶ 내지 4x10⁷ 세포/ml의 세포 밀도로 유지된다. 다른 구현양태에서, 세포 밀도는 연장된 기간 동안 약 1.0x10⁶ 내지 약 1.0x10⁷ 세포/ml의 농도로 유지된다. 다른 구현양태에서, 세포 밀도는 연장된 기간 동안 약 1.0x10⁶내지 약 4.0x10⁶세포/ml의 농도로 유지된다. 다른 구현양태에서, 세포 밀도는 연장된 기간 동안 약 1.0x10⁶내지 약 4.0x10⁶세포/ml의 농도로 유지된다. 또 다른 구현양태에서, 세포 밀도는 연장된 기간 동안 약 2.0x10⁶ 내지 약 4.0x10⁶, 또는 약 1.0x10⁶ 내지 약 2.5x10⁶, 또는 약 1.5x10⁶ 내지 약 3.5x10⁶, 또는 임의의 다른 유사한 범위의 농도로 유지될 수 있다. 세포 배양에서 적절한 시간 후, rVWF는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 발현 시스템으로부터 분리될 수 있다.

특정 구현양태에서, rVWF의 생산을 위한 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 연장된 기간 동안 2.5x10⁶ 세포/mL 이하의 농도로 유지된다. 다른 특정 구현양태에서, 세포 밀도는 2.0x10⁶ 세포/mL, 1.5x10⁶ 세포/mL, 1.0x10⁶ 세포/mL, 0.5x10⁶ 세포/mL 이하로 유지된다. 한 구현양태에서, 세포 밀도는 1.5x10⁶ 세포/mL 내지 2.5x10⁶ 세포/mL로 유지된다.

상기 기재된 세포 배양물의 한 구현양태에서, 세포 배양액은 구리를 포함하는 배지 보충물을 포함한다. 이러한 세포 배양액은, 예를 들어 미국 특허 번호8,852,888 및 미국 특허 번호 9,409,971에 기재되어 있으며, 이는 모든 목적, 특히 재조합 VWF 생산을 위한 세포 배양 방법 및 조성물과 관련된 모든 교시에 그 전체가 참고로 포함된다.

프리프로-VWF의 폴리뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 각각 서열번호: 1 및 서열번호: 2에 제시되어 있으며 젠뱅크(GenBank)에서 취득 번호 NM_000552(호모 사피엔스 폰 빌레브란트 인자(VWF) mRNA ) 및 NP_000543로 각각 구입가능하다. 성숙 VWF 단백질에 상응하는 아미노산 서열은 서열번호: 3에 제시되어 있다(전장 프리프로-VWF 아미노산 서열의 아미노산 764-2813에 상응). 일부 구현양태에서, VWF는 서열번호:3의 서열에 대한 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100% 동일성을 보인다. 일부 구현양태에서, 본 발명의 rVWF는 서열번호:3의 서열에 대한 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100% 동일성을 보인다. 예컨대, U.S. 특허 번호 8,597,910, U.S. 특허 공개 번호 2016/0129090 뿐만 아니라 도 5a-5c, 6a-6j 및 7a-7g 참조.

유용한 rVWF의 한 형태는 적어도 생체내 안정화 특성, 예를 들어, 적어도 하나의 인자 VIII(FVIII) 분자의 결합 및 임의로 약리학적으로 허용되는 글리코실화 패턴을 갖는다. 이의 구체적인 예는 A2 도메인이 없어서 단백질 분해에 내성을 갖는 VWF(Lankhof 등, Thromb. Haemost. 77:1008-1013, 1997), 및 당단백질 Ib-결합 도메인 및 콜라겐 및 헤파린에 대한 결합 부위를 포함하는 Val 449 내지 Asn 730까지의 VWF 단편(Pietu 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 164: 1339-1347, 1989)을 포함한다. 적어도 하나의 FVIII 분자를 안정화시키는 VWF의 능력의 결정은 한 측면에서 당업계에 공지된 방법에 따라 VWF-결핍 포유동물에서 수행된다.

본 발명의 rVWF는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다. 하나의 구체적인 예는 1986년 10월 23일에 공개된 WO86/06096 및 1990년 7월 23일에 출원된 미국 특허 출원 번호 07/559,509에 개시되어 있으며, 이는 재조합 VWF를 생산하는 방법과 관련하여 본원에 참고로 포함된다. 따라서, (i) 유전 공학에 의한, 예를 들어 RNA의 역전사 및/또는 DNA 증폭을 통해 재조합 DNA의 생산, (ii) 재조합 DNA를 형질감염에 의해, 예를 들어, 전기천공 또는 미세주입을 통해, 원핵 또는 진핵 세포에 도입, (iii) 형질전환된 세포를, 예를 들어, 연속적 또는 배치 방식으로 배양, (iv) VWF를, 예를 들어, 구성적으로 또는 유도시 발현시키고, (v) VWF를, 예를 들어 배양 배지로부터 또는 형질전환된 세포를 수확함으로써 분리하여 (vi) 예를 들어, 음이온 교환 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피를 통해 정제된 rVWF를 수득하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 한 측면에서, 재조합 VWF는 당업계에 널리 공지된 재조합 DNA 기술을 사용하여 형질전환된 숙주 세포에서 제조된다. 예를 들어, 폴리펩타이드를 코딩하는 서열은 적합한 제한 효소를 사용하여 DNA로부터 절단될 수 있다. 대안적으로, DNA 분자는, 또 다른 측면에서 포스포르아미데이트 방법과 같은 화학적 합성 기술을 사용하여 합성된다. 또한, 또 다른 측면에서, 이러한 기술의 조합이 사용된다.

본 발명은 또한 적절한 숙주에서 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 벡터를 제공한다. 벡터는 적절한 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드가 벡터에 삽입되기 전 또는 후에 이러한 작동적 연결을 수행하는 방법은 잘 알려져 있다. 발현 제어 서열은 프로모터, 활성화제, 인핸서, 오퍼레이터, 리보솜 결합 부위, 시작 신호, 정지 신호, 캡 신호, 폴리아데닐화 신호, 및 전사 또는 번역의 제어와 관련된 기타 신호를 포함한다. 내부에 폴리뉴클레오티드를 갖는 생성된 벡터를 사용하여 적절한 숙주를 형질전환시킨다. 이 형질전환은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 수행할 수 있다.

다수의 이용가능하고 잘 알려진 숙주 세포 중 임의의 것이 본 발명의 실시에 사용된다. 특정 숙주의 선택은, 예를 들어 선택된 발현 벡터와의 상용성, DNA 분자에 의해 코딩된 펩타이드의 독성, 형질전환 속도, 펩타이드의 회수 용이성, 발현 특성, 생체-안전성 및 비용을 포함하여 당업계에서 인정하는 다수의 요인에 따라 달라진다. 이러한 요인들의 균형은 모든 숙주 세포가 특정 DNA 서열의 발현에 동등하게 효과적인 것은 아니라는 이해와 함께 이루어져야 한다. 이러한 일반 지침 내에서, 유용한 미생물 숙주 세포는 제한 없이 박테리아, 효모 및 기타 진균, 곤충, 식물, 배양 중인 포유동물(인간 포함) 세포, 또는 당업계에 공지된 기타 숙주를 포함한다.

형질전환된 숙주 세포는 원하는 화합물이 발현되도록 통상적인 발효 조건 하에 배양된다. 이러한 발효 조건은 당업계에 잘 알려져 있다. 마지막으로, 폴리펩타이드는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 배양 배지 또는 숙주 세포 자체로부터 정제된다.

본 발명의 화합물을 발현하는 데 사용되는 숙주 세포에 따라, 탄수화물(올리고당)기는 단백질에서 글리코실화 부위로 알려진 부위에 임의로 부착된다. 일반적으로, O-연결 올리고당은 세린(Ser) 또는 트레오닌(Thr) 잔기에 부착되는 반면, N-연결 올리고당은 Asn-X-Ser/Thr 서열의 일부일 때 아스파라긴(Asn) 잔기에 부착되며, 여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다. X는 바람직하게는 프롤린을 포함하지 않는 19개의 자연 발생 아미노산 중 하나이다. N-연결 및 O-연결 올리고당의 구조와 각 유형에서 발견되는 당 잔기는 상이하다. N-연결 및 O-연결 올리고당 모두에서 일반적으로 발견되는 한 유형의 당은 N-아세틸뉴라민산(시알산이라고 함)이다. 시알산은 일반적으로 N-연결 및 O-연결 올리고당 둘 모두의 말단 잔기이고, 이의 음전하로 인해 한 측면에서 글리코실화된 화합물에 산성 특성을 부여한다. 이러한 부위(들)는 본 발명의 화합물의 링커에 포함될 수 있고 바람직하게는 폴리펩타이드 화합물의 재조합 생산 동안 세포에 의해 글리코실화된다(예를 들어, CHO, BHK, COS와 같은 포유동물 세포에서). 다른 측면에서, 이러한 부위는 당업계에 공지된 합성 또는 반-합성 절차에 의해 글리코실화된다.

일부 구현양태에서, 시알화(시알릴화로도 지칭된다)는 본원에 기재된 정제 절차(음이온 교환, 양이온 교환, 크기 배제 및/또는 면역친화성 방법 포함)의 일부로서 컬럼에서 수행될 수 있다. 일부 구현양태에서, 시알릴화는 시알릴화를 겪지 않은 rVWF와 비교하여 rVWF의 안정성을 증가시킨다. 일부 구현양태에서, 시알릴화는 시알릴화를 겪지 않은 rVWF와 비교하여 혈액 순환(예를 들어, 대상체에 투여 후)에서 rVWF의 안정성을 증가시킨다. 일부 구현양태에서, 시알릴화된 rVWF의 증가된 안정성은 시알릴화를 겪지 않은 rVWF와 비교하여 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 증가를 초래한다. 일부 구현양태에서, 시알릴화는 시알릴화를 겪지 않은 rVWF와 비교하여 rVWF에 대한 증가된 반감기를 초래한다. 일부 구현양태에서, 시알릴화는 시알릴화를 겪지 않은 rVWF와 비교하여 혈액 순환(예를 들어, 대상체에 투여 후)에서 rVWF의 반감기를 증가시킨다. 일부 구현양태에서, 시알릴화된 rVWF의 증가된 반감기는 시알릴화를 겪지 않은 rVWF와 비교하여 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 증가를 초래한다. 일부 구현양태에서, 시알릴화된 rVWF의 증가된 반감기는 시알릴화를 겪지 않은 rVWF와 비교하여 혈액 순환(예를 들어, 대상체에 투여 후)에서 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간 이상 동안 안정한 rVWF를 초래한다. 일부 구현양태에서, 시알릴화는 2,3 시알릴화 및/또는 2,6 시알릴화의 수를 증가시킨다. 일부 구현양태에서, 시알릴화는 추가 완충 단계로서 2,3 시알릴트랜스퍼라제 및/또는 2,6 시알릴트랜스퍼라제 및 CMP-NANA(시티딘-5'-모노포스포-N-아세틸뉴라민산 나트륨 염)의 첨가에 의해 증가된다. 일부 구현양태에서, 시알릴화는 추가 완충 단계로서 2,3 시알릴트랜스퍼라제 및 CMP-NANA(시티딘-5'-모노포스포-N-아세틸뉴라민산 나트륨 염)의 첨가에 의해 증가된다. 일부 구현양태에서, 2,3 시알릴화는 추가 완충 단계로서 2,3 시알릴트랜스퍼라제 및 CMP-NANA(시티딘-5'-모노포스포-N-아세틸뉴라민산 나트륨 염)의 첨가에 의해 증가된다.

일부 구현양태에서, 2,6 시알릴화는 추가 완충 단계로서 2,6 시알릴트랜스퍼라제 및 CMP-NANA(시티딘-5'-모노포스포-N-아세틸뉴라민산 나트륨 염)의 첨가에 의해 증가된다. 일부 구현양태에서, 2,3 시알릴화 및/또는 2,6 시알릴화는 추가 완충 단계로서 2,3 시알릴트랜스퍼라제 및/또는 2,6 시알릴트랜스퍼라제 및 CMP-NANA(시티딘-5'-모노포스포-N-아세틸뉴라민산 나트륨 염)의 첨가에 의해 증가된다. 일부 구현양태에서, CMP-NANA는 변형된 시알산을 잠재적인 유리 위치로 전달하도록 화학적으로 또는 효소적으로 변형된다. 일부 구현양태에서, 시알릴화는 rVWF를 수지 상에 로딩하고, 원치 않는 불순물을 고갈시키기 위해 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 완충제로 세척하고, 추가 시알릴화를 허용하는 조건에서 시알릴트랜스퍼라제 및 CMP-NANA를 함유하는 하나 이상의 완충제를 적용하고, 과량의 시알릴화 시약을 고갈시키기 위해 하나 이상의 완충제로 세척하고, 하나 이상의 완충제로 향상된 rVWF(예를 들어, 시알릴화가 증가된 rVWF)를 용리시킴으로써 수행된다. 일부 구현양태에서, 시알릴화 공정은 본원에 기재된 바와 같은 양이온 교환 방법, 음이온 교환 방법, 크기 배제 방법, 또는 면역친화성 정제 방법의 일부로서 수행된다.

대안적으로, 화합물은, 예를 들어 고체상 합성 기술을 사용하는 합성 방법에 의해 제조된다. 적합한 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 문헌에 기재된 것들을 포함한다(Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pp.335-61(Katsoyannis 및 Panayotis eds.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85:2149; Davis 등 (1985), Biochem. Intl. 10:394-414; Stewart 및 Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis; U.S. Pat. No. 3,941,763; Finn 등 (1976), The Proteins (3rd ed.) 2:105-253; 및 Erickson 등. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2:257-527). 고체상 합성은 작은 펩타이드를 만드는 가장 비용 효율적인 방법이기 때문에 개별 펩타이드를 만드는 데 선호되는 기술이다.

VWF의 단편, 변이체 및 유사체는 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 생성될 수 있다. 폴리펩타이드의 단편은, 제한 없이 효소 절단(예를 들어, 트립신, 키모트립신)을 사용하고 또한 특정 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 단편을 생성하기 위한 재조합 수단을 사용하여 제조할 수 있다. 다량체화 도메인 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 식별가능한 VWF 도메인과 같은 특정 활성을 갖는 단백질의 영역을 포함하는 폴리펩타이드 단편이 생성될 수 있다.

폴리펩타이드 유사체의 제조 방법도 잘 알려져 있다. 폴리펩타이드의 아미노산 서열 유사체는 치환, 삽입, 부가 또는 결실 유사체일 수 있다. 폴리펩타이드의 단편을 포함하는 결실 유사체에는 기능 또는 면역원성 활성에 필수적이지 않은 천연 단백질의 하나 이상의 잔기가 결여되어 있다. 삽입 유사체는, 예를 들어 폴리펩타이드의 비-말단 지점에서 아미노산(들)의 첨가를 포함한다. 이 유사체는, 예를 들어 제한 없이 면역반응성 에피토프 또는 단순히 단일 잔기의 삽입을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드의 단편을 포함하는 부가 유사체는 단백질의 한쪽 또는 양쪽 말단에서 하나 이상의 아미노산의 부가를 포함하고, 예를 들어 융합 단백질을 포함한다. 전술한 유사체의 조합도 고려된다.

치환 유사체는 전형적으로 단백질 내의 하나 이상의 부위에서 야생형의 하나의 아미노산을 다른 것으로 교환하고, 다른 기능 또는 특성의 완전한 손실 없이 폴리펩타이드의 하나 이상의 특성을 조절하도록 설계될 수 있다. 한 측면에서, 치환은 보존적 치환이다. "보존적 아미노산 치환"은 측쇄 또는 유사한 화학적 특성을 갖는 아미노산으로의 아미노산의 치환이다. 보존적 치환을 위한 유사한 아미노산은 산성 측쇄(글루탐산, 아스파르트산); 염기성 측쇄(아르기닌, 라이신, 히스티딘); 극성 아미드 측쇄(글루타민, 아스파라긴); 소수성, 지방족 측쇄(류신, 이소류신, 발린, 알라닌, 글리신); 방향족 측쇄(페닐알라닌, 트립토판, 티로신); 작은 측쇄(글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 메티오닌); 또는 지방족 하이드록실 측쇄(세린, 트레오닌)를 갖는 것들을 포함한다.

한 측면에서, 유사체는 이들이 유래된 재조합 VWF와 실질적으로 상동성이거나 실질적으로 동일하다. 유사체에는 야생형 폴리펩타이드의 생물학적 활성, 예를 들어 혈액 응고 활성의 적어도 일부를 보유하는 것들이 포함된다.

고려되는 폴리펩타이드 변이체에는 유비퀴틴화, 폴리시알화(또는 폴리시알릴화)를 포함하는 글리코실화, 치료제 또는 진단제에 대한 접합, 표지화, 페길화(폴리에틸렌 글리콜을 사용한 유도체화)와 같은 공유 중합체 부착, 비-가수분해성 결합의 도입, 및 인간 단백질에서는 일반적으로 발생하지 않는 오르니틴과 같은 아미노산의 화학적 합성에 의한 삽입 또는 치환과 같은 기술에 의해 화학적으로 변형된 폴리펩타이드가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 변이체는 본 발명의 비-변형된 분자와 동일하거나 본질적으로 동일한 결합 특성을 보유한다. 이러한 화학적 변형은 VWF 폴리펩타이드에 제제의 직접적 또는 간접적(예를 들어, 링커를 통한) 부착을 포함할 수 있다. 간접 부착의 경우, 링커는 가수분해성 또는 비-가수분해성일 수 있는 것으로 고려된다.

한 측면에서, 페길화된 폴리펩타이드 유사체의 제조는 (a) 결합 구조물 폴리펩타이드가 하나 이상의 PEG 기에 부착되는 조건 하에 폴리펩타이드를 폴리에틸렌 글리콜(예를 들어, PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체)과 반응시키는 단계, 및 (b) 반응 생성물(들)을 수득하는 단계를 포함할 것이다. 일반적으로 아실화 반응을 위한 최적의 반응 조건은 알려진 매개변수 및 원하는 결과를 기반으로 결정된다. 예를 들어, PEG:단백질의 비율이 클수록 폴리페길화된 생성물의 비율이 커진다. 일부 구현양태에서, 결합 구조물은 N-말단에 단일 PEG 모이어티를 갖는다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은, 예를 들어 생체 내에서 더 긴 반감기를 제공하기 위해 혈액 응고 인자에 부착될 수 있다. PEG기는 임의의 편리한 분자량을 가질 수 있고 선형 또는 분지형이다. PEG의 평균 분자량은 약 2킬로달톤("kD") 내지 약 100kDa, 약 5kDa 내지 약 50kDa, 또는 약 5kDa 내지 약 10kDa의 범위이다. 특정 측면에서, PEG기는 PEG 모이어티 상의 천연 또는 조작된 반응성기(예를 들어, 알데히드, 아미노, 티올 또는 에스테르기)를 통해 혈액 응고 인자 상의 반응성기(예를 들어, 알데히드, 아미노, 또는 에스테르 기)로의 아실화 또는 환원성 알킬화를 통해서 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 기술에 의해 혈액 응고 인자에 부착된다.

폴리시알릴화 폴리펩타이드를 제조하는 방법은 문헌에 기재되어 있다(미국 특허 공개 20060160948, Fernandes et Gregoriadis; Biochim. Biophys. Acta 1341: 26-34, 1997, 및 Saenko 등, Haemophilia 12:42-51, 2006). 간단히 말해서, 0.1M NaIO₄를 함유하는 콜로민산(CA) 용액을 암실에서 실온에서 교반하여 CA를 산화시킨다. 활성화된 CA 용액을 암실에서, 예를 들어 0.05M 인산나트륨 완충액, pH 7.2에 대해 투석하고 이 용액을 rVWF 용액에 첨가하고 실온에서 18시간 동안 암실에서 부드러운 진탕 하에 배양하였다. 유리 시약은, 예를 들어 한외여과/정용여과에 의해 rVWF-폴리시알산 접합체로부터 임의로 분리된다. rVWF와 폴리시알산의 접합은 가교결합제로서 글루타르알데히드를 사용하여 달성된다(Migneault 등, Biotechniques 37:790-796, 2004).

프리프로-VWF 및 프로-VWF 폴리펩타이드가 본 발명의 제형에서 치료학적 이점을 제공할 것이라는 것이 또 다른 측면에서 또한 고려된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 7,005,502는 시험관내에서 트롬빈 생성을 유도하는 상당한 양의 프로-VWF를 포함하는 약제학적 제제를 기술하고 있다. 자연-발생 성숙 VWF의 재조합, 생물학적 활성 단편, 변이체 또는 기타 유사체에 추가하여, 본 발명은 본원에 기술된 제형의 프리프로-VWF(서열번호: 2으로 제시) 또는 프로-VWF 폴리펩타이드(서열번호:2의 아미노산 잔기 23 내지 764), 또는 rVWF(서열번호: 3으로 제시)의 재조합 생물학적 활성 단편, 변이체 또는 유사체의 사용을 고려한다.

단편, 변이체 및 유사체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 자연-발생 분자와 동일하거나 유사한 생물학적 활성을 갖는 자연-발생 분자의 생물학적 활성 단편, 변이체 또는 유사체를 코딩하기 위해 당업자에 의해 용이하게 생성될 수 있다. 다양한 측면에서, 이들 폴리뉴클레오타이드는 PCR 기술, DNA 코딩 분자의 소화/결찰 등을 사용하여 제조된다. 따라서, 당업자는 부위-특이적 돌연변이유발을 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 변경된 코돈 및 미스센스 돌연변이를 야기하도록 DNA 가닥에서 단일 염기 변화를 생성할 수 있을 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, "중등의 엄격한 혼성화 조건"이라는 문구는, 예를 들어 50% 포름아미드에서 42℃에서 혼성화 및 0.1 x SSC, 0.1% SDS에서 60℃에서 세척을 의미한다. 이러한 조건의 변이는 혼성화될 서열의 길이 및 GC 뉴클레오타이드 염기 함량에 기초하여 발생한다는 것을 당업자는 이해한다. 당업계의 표준 공식은 정확한 혼성화 조건을 결정하는 데 적합하다(Sambrook 등, 9.47-9.51 in Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)).

A. VWF 다량체

rVWF 다량체의 수 및 백분율의 평가는, 예를 들어 문헌에 의해 논의된 바와 같이 VWF 다량체를 분리하기 위해 비제한적으로 전기영동 및 크기 배제 크로마토그래피 방법을 사용하는 방법을 포함하는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다(Cumming 등, J Clin Pathol., 1993 May;46(5):470-473, 이는 모든 목적, 특히 VWF 다량체의 평가와 관련된 모든 교시를 위해 그 전체가 참고로 본원에 포함된다). 이러한 기술은 면역블롯팅 기술(예: 웨스턴 블롯)을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 겔은 VWF에 대한 방사성표지된 항체로 면역블롯팅된 후 화학발광 검출이 뒤따른다(Wen 등, J. Clin. Lab. Anal., 1993, 7:317-323, 이는 모든 목적, 특히 VWF 다량체의 평가와 관련된 모든 교시를 위해 그 전체가 참고로 본원에 포함된다). VWF에 대한 추가 검정에는 VWF:항원(VWF:Ag), VWF:리스토세틴 보조인자(VWF:RCof) 및 VWF:콜라겐 결합 활성 검정(VWF:CBA)이 포함되며, 이는 종종 폰 빌레브란트 질병(Von Willebrand Disease)의 진단 및 분류에 사용된다(Favaloro 등, Pathology, 1997, 29(4):341-456; Sadler, JE, Annu Rev Biochem, 1998, 67:395-424; 및 Turecek 등, Semin Thromb Hemost, 2010, 36:510-521, 이는 모든 목적, 특히 VWF에 대한 검정과 관련된 모든 교시를 위해 그 전체가 참고로 본원에 포함된다). 일부 구현양태에서, 본 방법을 사용하여 수득된 rVWF는 rVWF의 로딩 샘플에 존재하는 임의의 다량체 패턴을 포함한다. 일부 구현양태에서, 본 방법을 사용하여 수득된 rVWF는 생리학적으로 발생하는 다량체 패턴뿐만 아니라 초대형 VWF-다량체 패턴을 포함한다.

b. VWF 검정

1차 지혈에서 VWF는 혈소판 및 콜라겐과 같은 세포외 기질의 특정 성분 사이의 브릿지 역할을 한다. 이 과정에서 VWF의 생물학적 활성은 다양한 시험관내 검정에 의해 측정될 수 있다(Turecek 등, Semin Thromb Hemost, 2010, 36:510-521).

VWF:리스토세틴 보조인자(VWF:RCo) 검정은 VWF의 존재 하에 항생제 리스토세틴에 의해 유도된 신선한 또는 포르말린-고정 혈소판의 응집을 기반으로 한다. 혈소판 응집의 정도는 VWF 농도에 따라 다르며 탁도측정법, 예를 들어 응집측정기를 사용하여 측정할 수 있다(Weiss 등, J. Clin. Invest., 1973, 52:2708-2716; Macfarlane 등, Thromb. Diath. Haemorrh., 1975, 34:306-308). 본원에 제공된 바와 같이, 본 발명의 VWF의 특이적 리스토세틴 보조인자 활성(VWF:RCo)은 일반적으로 시험관내 검정을 사용하여 측정된 VWF의 mU/μg으로 기술된다.

일부 구현양태에서, 본 발명의 방법에 따라 정제된 rVWF는 약 20, 22.5, 25, 27,5, 30, 32.5, 35, 37.5, 40, 42.5, 45, 47.5, 50, 52.5, 55, 57.5, 60, 62.5, 65, 67.5, 70, 72.5, 75, 77.5, 80, 82.5, 85, 87.5, 90, 92.5, 95, 97.5, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150mU/μg 또는 그 이상의 특이적활성을 갖는다. 일부 구현양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용된 rVWF는 20mU/μg 내지 150mU/μg의 특이적 활성을 갖는다. 일부 구현양태에서, rVWF는 30mU/μg 내지 120mU/μg의 특이적 활성을 갖는다. 일부 구현양태에서, rVWF는 40mU/μg 내지 90mU/μg의 특이적 활성을 갖는다. 일부 구현양태에서, rVWF는 하기 표 3에서 발견되는 변이 1 내지 133으로부터 선택된 특이적 활성을 갖는다.

표 3. 본원에 제공된 조성물에서 발견되고 방법에서 사용되는 rVWF의 특이적 활성에 대한 예시적인 구현양태.

Var. = 변이

본 발명의 rVWF는 약 10 내지 약 40개의 서브유닛을 포함하는 고도로 다량체이다. 추가 구현양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 생성된 다량체 rVWF는 약 10-30, 12-28, 14-26, 16-24, 18-22, 20-21개의 서브유닛을 포함한다. 일부 구현양태에서, rVWF는 이량체에서 40개 이상의 서브유닛( > 1천만 달톤)의 다량체까지 크기가 다양한 다량체로 존재한다. 가장 큰 다량체는 혈소판 수용체 및 손상의 내피하 기질 부위 모두와 상호작용할 수 있는 다중 결합 부위를 제공하며, VWF의 가장 지혈적으로 활성인 형태이다. 일부 구현양태에서, 본 발명의 rVWF는 초대형 다량체(ultralarge multimer, ULM)를 포함한다. 일반적으로 높고 초대형 다량체가 지혈에 가장 효과적인 것으로 간주된다(Turecek, P., Hamostaseologie, (Vol. 37): Supplement 1, pages S15-S25(2017)). 일부 구현양태에서, rVWF는 500kDa 내지 20,000kDa이다. 일부 구현양태에서, 기재된 방법을 사용하여 임의의 원하는 다량체 패턴을 수득할 수 있다. 일부 구현양태에서, 음이온 교환 및/또는 양이온 교환 방법이 사용될 때, 하나 이상의 세척 단계(들)에서의 완충제 또는 구배 완충제의 pH, 전도도 및/또는 반대이온 농도는 원하는 다량체 패턴을 얻도록 조작될 수 있다. 일부 구현양태에서, 크기 배제 크로마토그래피 방법이 사용되며, 수집 기준을 사용하여 원하는 다량체 패턴을 얻을 수 있다. 일부 구현양태에서, 기재된 다량체 패턴은 초대형 다량체를 포함한다. 일부 구현양태에서, 초대형 다량체는 적어도 10,000kDa, 적어도 11,000kDa, 적어도 12,000kDa, 적어도 13,000kDa, 적어도 14,000kDa, 적어도 15,000kDa, 적어도 16,000kDa, 적어도 17,000kDa, 적어도 18,000kDa, 최소 19,000kDa, 최소 20,000kDa이다. 일부 구현양태에서, 초대형 다량체는 약 10,000kDa 내지 20,000kDa이다. 일부 구현양태에서, 초대형 다량체는 약 11,000kDa 내지 20,000kDa이다. 일부 구현양태에서, 초대형 다량체는 약 12,000kDa 내지 20,000kDa이다. 일부 구현양태에서, 초대형 다량체는 약 13,000kDa 내지 20,000kDa이다. 일부 구현양태에서, 초대형 다량체는 약 14,000kDa 내지 20,000kDa이다. 일부 구현양태에서, 초대형 다량체는 약 15,000kDa 내지 20,000kDa이다. 일부 구현양태에서, 초대형 다량체는 약 16,000kDa 내지 20,000kDa이다. 일부 구현양태에서, 초대형 다량체는 약 17,000kDa 내지 20,000kDa이다. 일부 구현양태에서, 초대형 다량체는 약 18,000kDa 내지 20,000kDa이다. 일부 구현양태에서, 초대형 다량체는 약 19,000kDa 내지 20,000kDa이다. 일부 구현양태에서, 본 방법을 사용하여 수득된 rVWF는 rVWF의 로딩 샘플에 존재하는 임의의 다량체 패턴을 포함한다. 일부 구현양태에서, 본 방법을 사용하여 수득된 rVWF는 생리학적 발생 다량체 패턴 뿐만 아니라 초대형 VWF-다량체 패턴을 포함한다.

일부 구현양태에서, 본원에 기재된 정제 방법에 의해 제조된 rVWF 조성물은 올리고머의 95%가 6개 내지 20개 서브유닛을 갖는 것을 특징으로 하는 rVWF 올리고머의 분포를 갖는다. 일부 구현양태에서, rVWF 조성물은 올리고머의 95%가 표 4에서 발견되는 변이 458 내지 641로부터 선택된 서브유닛의 범위를 갖는 것을 특징으로 하는 rVWF 올리고머의 분포를 갖는다.

표 4. 본원에 제공된 조성물에서 발견되고 방법에서 사용되는 rVWF 올리고머의 분포에 대한 예시적인 구현양태.

일부 구현양태에서, 본원에 제공된 방법에 의해 제조된 rVWF 조성물은 특정 더 고차 rVWF 다량체 또는 보다 큰 다량체로 존재하는 rVWF 분자의 백분율에 따라 특성화될 수 있다. 예를 들어, 한 구현양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용된 rVWF 조성물 중 적어도 20%의 rVWF 분자는 적어도 10개의 서브유닛의 올리고머 복합체로 존재한다. 또 다른 구현양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용된 rVWF 조성물 중 적어도 20%의 rVWF 분자는 적어도 12개의 서브유닛의 올리고머 복합체로 존재한다. 또 다른 구현양태에서, 본원에 제공된 방법에 사용된 rVWF 조성물은 표 5 내지 표 7에서 발견된 변이 134 내지 457 중 어느 하나에 따른 특정 더 고차 rVWF 다량체 또는 더 큰 다량체(예를 들어, 적어도 Y 서브유닛의 다량체)로 존재하는 rVWF 분자의 최소 백분율(예를 들어, 적어도 X%를 갖는다)을 갖는다.

표 5. 본원에 제공된 조성물에서 발견되고 방법에서 사용되는 특정 더 고차 rVWF 다량체 또는 더 큰 다량체에 존재하는 rVWF 분자의 백분율에 대한 예시적인 구현양태.

Var. = 변이

표 6. 본원에 제공된 조성물에서 발견되고 방법에서 사용되는 특정 더 고차 rVWF 다량체 또는 더 큰 다량체에 존재하는 rVWF 분자의 백분율에 대한 예시적인 구현양태.

Var. = 변이

표 7. 본원에 제공된 조성물에서 발견되고 방법에서 사용되는 특정 더 고차 rVWF 다량체 또는 더 큰 다량체에 존재하는 rVWF 분자의 백분율에 대한 예시적인 구현양태.

Var. = 변이

상기에 따르면, rVWF는 상당한 백분율의 고분자량(HMW) rVWF 다량체를 포함한다. 추가 구현양태에서, HMW rVWF 다량체 조성물은 적어도 10%-80%의 rVWF 데카머 또는 더 고차 다량체를 포함한다. 추가 구현양태에서, 조성물은 약 10-95%, 20-90%, 30-85%, 40-80%, 50-75%, 60-70%의 데카머 또는 더 고차 다량체를 포함한다. 추가 구현양태에서, HMW rVWF 다량체 조성물은 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%의 데카머 또는 더 고차 다량체를 포함한다.

rVWF 다량체의 수 및 백분율의 평가는, 예를 들어 문헌에 의해 논의된 바와 같이, 전기영동 및 크기 배제 크로마토그래피 방법을 사용하여 크기별로 rVWF 다량체를 분리하는 방법을 비제한적으로 포함하는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다(Cumming 등, J Clin Pathol. 1993 May, 46(5):470-473, 이는 모든 목적 및 특히 rVWF 다량체의 평가와 관련된 모든 교시를 위해 그 전체가 참고로 본원에 포함된다). 이러한 기술은 면역블롯팅 기술(예: 웨스턴 블롯)을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 겔은 VWF에 대한 방사성표지된 항체로 면역블롯팅된 후 화학발광 검출이 수행된다(Wen 등, (1993), J. Clin. Lab. Anal.,7:317-323, 이는 모든 목적 및 특히 rVWF 다량체의 평가와 관련된 모든 교시를 위해 그 전체가 참고로 본원에 포함된다). VWF에 대한 추가 검정에는 VWF:항원(VWF:Ag), VWF:리스토세틴 보조인자(VWF:RCof) 및 VWF:콜라겐 결합 활성 검정(VWF:CBA)이 포함되며, 이는 종종 폰 빌레브란트 질병의 진단 및 분류에 사용된다(Favaloro 등, Pathology, 1997, 29(4):341-456 , 이는 모든 목적 및 특히 VWF에 대한 분석과 관련된 모든 교시를 위해 그 전체가 참고로 본원에 포함된다).

일부 구현양태에서, 본 발명의 방법에 따라 제조된 rVWF에 대한 rFVIII 친응고(procoagulant) 활성(IU rFVIII:C) 대 rVWF 리스토세틴 보조인자 활성(IU rVWF:RCo)의 비율은 3:1 내지 1:5이다. 추가 구현양태에서, 비는 2:1 내지 1:4이다. 또 다른 구현양태에서, 비는 5:2 내지 1:4이다. 추가 구현양태에서, 비는 3:2 내지 1:3이다. 또 다른 구현양태에서, 비는 약 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 2:1, 2:3, 2:4, 2:5, 3:1, 3:2, 3:4 또는 3:5이다. 추가 구현양태에서, 비는 1:1 내지 1:2이다. 또 다른 구현양태에서, 비는 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1, 또는 2:1이다. 특정 구현양태에서, 본원에 기재된 방법에 유용한 조성물에서 rFVIII 친응고 활성(IU rFVIII:C) 대 rVWF 리스토세틴 보조인자 활성(IU rVWF:RCo)의 비는 표 8에서 발견된 변이 1988 내지 2140으로부터 선택된다.

표 8. 본원에 제공된 방법에 사용되는 조성물에서 rFVIII 친응고 활성(IU rFVIII:C) 대 rVWF 리스토세틴 보조인자 활성(IU rVWF:RCo)의 비율에 대한 예시적인 구현양태.

Var. = 변이

한 구현양태에서, 본원에 제공된 조성물 및 방법에 사용된 더 고차 rVWF 다량체는 투여 후 적어도 12시간의 반감기를 갖는다. 또 다른 구현양태에서, 더 고차 rVWF 다량체는 투여 후 적어도 24시간의 반감기를 갖는다. 또 다른 구현양태에서, 더 고차 rVWF 다량체는 표 9에서 발견되는 변이 642 내지 1045로부터 선택된 반감기를 갖는다.

표 9. 본원에 제공된 방법에 의해 제조된 조성물에서 발견되는 더 고차 rVWF 다량체의 반감기에 대한 예시적인 구현양태

Var. = 변이

일부 구현양태에서, 본 발명에 따라 정제된 프로-VWF 및/또는 정제된 rVWF는 접합, 번역 후 또는 공유 변형으로 변형되지 않는다. 특정 구현양태에서, 본 발명의 프로-VWF 및/또는 정제된 rVWF는 비제한적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 폴리시알산, 하이드록실 에틸 전분, 폴리-탄수화물 모이어티 등을 포함하는 수용성 중합체로 변형되지 않는다.

일부 구현양태에서, 본 발명에 따라 정제된 프로-VWF 및/또는 정제된 rVWF는 N- 또는 C-말단 잔기의 변형 뿐만 아니라 선택된 측쇄, 예를 들어 유리 설프하이드릴기, 일차 아민 및 하이드록실기에서의 변형을 포함하는 접합, 번역후 변형, 또는 공유 변형을 통해 변형된다. 한 구현양태에서, 수용성 중합체는 라이신기 또는 다른 일차 아민에 의해 (직접적으로 또는 링커를 통해) 단백질에 연결된다. 일부 구현양태에서, 본 발명의 프로-VWF 및/또는 정제된 rVWF는 제한 없이 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 폴리시알산, 하이드록실 에틸 전분, 폴리-탄수화물 모이어티 등을 포함하는 수용성 중합체의 접합에 의해 변형될 수 있다.

프로-VWF 및/또는 정제된 rVWF를 변형시키는 데 사용될 수 있는 수용성 중합체는 선형 및 분지형 구조를 포함한다. 접합된 중합체는 본 발명의 응고 단백질에 직접 부착될 수 있거나 대안적으로 연결 모이어티를 통해 부착될 수 있다. 수용성 중합체와의 단백질 접합의 비제한적인 예는 문헌에서 발견할 수 있다(미국 특허 번호 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 및 4,179,337; Abuchowski 및 Davis "Enzymes as Drugs", Holcenberg and Roberts, Eds., pp. 367 383, John Wiley and Sons, New York(1981) 및 Hermanson G., Bioconjugate Techniques 2nd Ed., Academic Press, Inc. 2008).

단백질 접합은 당업계에 잘 알려진 다수의 기술에 의해 수행될 수 있다(Hermanson G., Bioconjugate Techniques 2nd Ed., Academic Press, Inc. 2008). 예로는 응고 단백질 또는 수용성 중합체 모이어티 중 하나의 카르복실기 및 다른 하나의 아민기 사이의 펩타이드 결합을 통한 연결, 또는 하나의 카르복실기 및 다른 하나의 하이드록실기 사이의 에스테르 연결을 통한 연결을 포함한다. 본 발명의 응고 단백질이 수용성 중합체 화합물에 접합될 수 있는 또 다른 연결은 쉬프 염기를 통해서이며, 이는 과요오드산염 산화에 의해 중합체의 비-환원 말단에 형성된 알데히드기와 반응하는 중합체 모이어티 상의 유리 아미노기 사이에 있 다(Jennings 및 Lugowski, J. Immunol. 1981;127:1011-8; Femandes 및 Gregonradis, Biochim Biophys Acta. 1997;1341;26-34). 생성된 쉬프 염기는 NaCNBH₃를 사용한 특이적 환원에 의해 안정화되어서 2차 아민을 형성할 수 있다. 대안적인 접근법은 사전 산화 후 NH₄Cl로 환원적 아민화하여 중합체 상에 말단 유리 아미노기를 생성하는 것이다. 2개의 아미노 또는 2개의 하이드록실기를 연결하기 위해 이작용성 시약을 사용할 수 있다. 예를 들어, 아미노기를 함유하는 중합체는 BS3(비스(설포숙신이미딜)수베레이트/Pierce, Rockford, Ill.)과 같은 시약을 사용하여 응고 단백질의 아미노기에 커플링될 수 있다. 또한, 설포-EMCS(N-ε-말레이미도카프로일옥시)설포숙신이미드 에스테르/Pierce)와 같은 이종이작용성 가교결합제를 사용하여 아민과 티올기를 연결할 수 있다. 다른 구현양태에서, PEG 알콕사이드 + 브로모아세트알데하이드의 디에틸 아세탈과 같은 알데하이드 반응성기; PEG + DMSO 및 아세트산 무수물, 및 PEG 클로라이드 + 4-하이드록시벤즈알데히드의 페녹사이드, 숙신이미딜 활성 에스테르, 활성화된 디티오카르보네이트 PEG, 2,4,5-트리클로로페닐클로로포르메이트 및 P-니트로페닐클로로포르메이트 활성화 PEG는 응고 단백질의 접합에 사용될 수 있다.

VWF의 생물학적 활성을 측정하는 또 다른 방법은 ELISA 기술을 기반으로 하는 콜라겐 결합 검정이다(Brown 및 Bosak, Thromb. Res., 1986, 43:303-311; Favaloro, Thromb. Haemost., 2000, 83 127-135). 마이크로타이터 플레이트는 타입 I 또는 III 콜라겐으로 코팅된다. 그런 다음 VWF는 콜라겐 표면에 결합되고 이어서 효소-표지된 폴리클론 항체로 검출된다. 마지막 단계는 기질 반응으로, ELISA 판독기로 광도를 모니터링할 수 있다.

폰 빌레브란트 인자의 면역학적 검정(VWF:Ag)은 혈장 내 VWF 단백질의 농도를 측정하는 면역검정이다. VWF 기능에 대한 표시는 없다. VWF:Ag를 측정하는 여러 가지 방법이 있으며, 여기에는 효소-결합 면역흡착 검정법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 또는 자동화된 라텍스 면역검정(latex immunoassay, LIA)이 포함된다. 현재 많은 실험실에서 완전 자동화된 라텍스 면역검정을 사용한다. 역사적으로 실험실에서는 로렐(Laurell) 전기면역검정 '로렐 로킷(Laurell Rockets)'을 포함하는 다양한 기술을 사용했지만, 오늘날 대부분의 실험실에서는 거의 사용되지 않는다.

III. 키트

추가 측면으로서, 본 발명은 대상체에 투여하기 위한 사용을 용이하게 하는 방식으로 포장된 하나 이상의 동결건조된 조성물을 포함하는 키트를 포함한다. 한 구현양태에서, 이러한 키트는 본원에 기재된 약제학적 제형(예를 들어, 치료 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 조성물)를 포함하고, 밀봉된 병 또는 용기와 같은 용기에 포장되고, 방법을 실행하는 데 있어 화합물 또는 조성물의 사용을 설명하는, 용기에 부착되거나 포장에 포함된 라벨을 포함한다. 한 구현양태에서, 약제학적 제형은 용기 내의 헤드스페이스의 양(예를 들어, 액체 제형과 용기의 상부 사이의 공기의 양)이 매우 작도록 용기에 포장된다. 바람직하게는, 헤드스페이스의 양은 무시할 수 있다(예를 들어, 거의 없음). 한 구현양태에서, 키트는 치료 단백질 또는 펩타이드 조성물을 갖는 제 1 용기 및 조성물에 대해 생리학적으로 허용되는 재구성 용액을 갖는 제 2 용기를 함유한다. 한 측면에서, 약제학적 제형은 단위 투여 형태로 포장된다. 키트는 특정 투여 경로에 따라 약제학적 제형을 투여하기에 적합한 장치를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 키트는 약제학적 제형의 사용을 설명하는 라벨을 함유한다.

IV. 중증 VWD 환자에서 자연 출혈의 예방 치료 방법을 위한 rVWF

자연 출혈 에피소드의 예방 치료를 위해 중증 VWD를 갖는 대상체에게 rVWF를 투여하는 것의 이점 중 하나는 pdVWF와 비교하여 rVWF의 더 높은 특이적 활성이 투여되는 rVWF의 양 및 대상체에게 재투여되는 횟수에 유연성을 허용한다는 점이다. 이해될 것이고 본원에서 추가로 상세히 논의되는 바와 같이, 공동-투여되는 FVIII는 재조합 또는 혈장 유래일 수 있다.

rVWF의 단일 또는 다중 투여는 치료 의사에 의해 선택되는 용량 수준 및 패턴으로 수행된다. 질병의 예방 또는 치료를 위해 적절한 용량은 치료할 질병의 유형(예: 폰 빌레브란트 질병), 질병의 중증도 및 경과, 약물이 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전 요법, 환자의 임상 병력 및 약물에 대한 반응, 주치의의 재량에 따라 달라진다.

일부 측면에서, rVWF는 40-80IU/kg의 범위, 예를 들어, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 40-80, 45-80, 50-80, 45-70, 45-60, 45-55, 45-50, 50-60, 55-60, 60-65, 55-65, 60-70, 65-70, 60-75, 70-80 또는 75-80IU/kg의 용량으로 대상체에게 예방적으로 투여된다. 일부 구현양태에서, 용량은 40IU/kg 내지 60IU/kg의 범위이다. 일부 구현양태에서, 용량은 45IU/kg 내지 55IU/kg의 범위이다. 일부 구현양태에서, 용량은 약 40IU/kg, 약 50IU/kg, 또는 약 60IU/kg이다. 일부 구현양태에서, 용량은 약 50 IU/kg이다. 일부 구현양태에서, 용량은 약 80IU/kg이다. 일부 구현양태에서, rVWF는 주 1회, 주 2회, 주 3회, 주 4회, 주 5회 또는 그 이상 투여된다. 일부 구현양태에서, rVWF는 주 2회 투여된다. 일부 구현양태에서, rVWF는 주 2회 투여된다. 일부 구현양태에서, rVWF는 40IU/kg 내지 60IU/kg 범위의 용량으로 주 2회 투여된다. 일부 구현양태에서, rVWF는 IV 주입에 의해 40IU/kg 내지 60IU/kg 범위의 용량으로 주 2회 투여된다.

일부 구현양태에서, VWF:Ag, VWF:RCo, VWF:CB 및 FVIII 활성 수준을 측정하기 위한 혈액 샘플을 투여 전, 약물 주입 후 15분, 30분 및 60분, 및 3시간, 6시간, 12시간, 24시간, 28시간, 32시간, 48시간, 72시간, 96시간에 채취하였다. 일부 구현양태에서, 예를 들어 혈액 샘플을 포함하는 샘플은 VWF:RCo 및 FVIII 활성을 조사하기 위해 수득될 수 있다. 일부 구현양태에서, FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, 및 VWF 콜라겐-결합능 활성에 대한 샘플은 rVWF를 사용한 예방 치료 전에 수득된다. 일부 구현양태에서, FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, 및 VWF 콜라겐-결합능 활성을 조사하기 위한 샘플은 rVWF를 사용한 예방 치료 후 15분, 30분, 60분, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간, 28시간, 32시간, 48시간, 72시간 또는 96시간에 수득된다. 일부 구현양태에서, FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, 및 VWF 콜라겐-결합능 활성을 조사하기 위한 샘플은 rVWF를 사용한 예방 치료 후 25 내지 31일에 수득된다. 일부 구현양태에서, FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag 및 VWF 콜라겐-결합능 활성에 대한 샘플을 출혈 에피소드 후에 수득하고, 이러한 구현양태에서 샘플은 rVWF 투여 전, 투여 2시간 후 및 그후 출혈 사건이 해소될 때까지 12-24시간마다 채취한다. 일부 구현양태에서, FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, 및 VWF 콜라겐-결합능 활성 대 시간 프로파일은 샘플에 기초하여 결정된다. 일부 구현양태에서, FVIII:C는 또한 1-단계 응고 검정 대 시간 프로파일에 의해 측정된다.

일부 구현양태에서, rVWF는 40-80IU/kg의 범위, 예를 들어, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 40-80, 45-80, 50-80, 45-70, 45-60, 45-55, 45-50, 50-60, 55-60, 60-65, 55-65, 60-70, 65-70, 60-75, 70-80 또는 75-80IU/kg을 초기(첫 번째) 투여로 대상체에게 투여한다. 일부 구현양태에서, rVWF는 40-80IU/kg의 범위, 예를 들어, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 40-80, 45-80, 50-80, 45-70, 45-60, 45-55, 45-50, 50-60, 55-60, 60-65, 55-65, 60-70, 65-70, 60-75, 70-80, 또는 75-80IU/kg을 두 번째 투여로 대상체에게 투여한다. 일부 구현양태에서, rVWF는 40-80IU/kg의 범위, 예를 들어, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 40-80, 45-80, 50-80, 45-70, 45-60, 45-55, 45-50, 50-60, 55-60, 60-65, 55-65, 60-70, 65-70, 60-75, 70-80, 또는 75-80IU/kg을 세 번째 투여로 대상체에게 투여한다. 일부 구현양태에서, rVWF는 40-80IU/kg의 범위, 예를 들어, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 40-80, 45-80, 50-80, 45-70, 45-60, 45-55, 45-50, 50-60, 55-60, 60-65, 55-65, 60-70, 65-70, 60-75, 70-80, 또는 75-80IU/kg을 후속 투여로 대상체에게 투여한다.

rVWF의 조성물은 본원에 기재된 바와 같이 약제학적 제형에 함유될 수 있다. 이러한 제형은 경구, 국소, 경피, 비경구, 흡입 스프레이, 질, 직장 또는 두개내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본원에 사용된 용어 비경구는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 수조내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 정맥내, 피내, 근육내, 유방내, 복강내, 척추강내, 구후 투여, 폐내 주사 및/또는 특정 부위에서의 외과적 이식에 의한 투여가 또한 고려된다. 일반적으로, 조성물에는 본질적으로 발열원 뿐만 아니라 수용자에게 해로울 수 있는 기타 불순물이 없다.

한 측면에서, 본 발명의 제형는 약물 제품의 치료적 순환 수준을 유지하기 위해 초기 볼루스 후 연속 주입에 의해 투여된다. 다른 실시예로서, 본 발명의 화합물은 1회 용량으로 투여된다. 당업자는 우수한 의료 행위 및 개별 환자의 임상 상태에 의해 결정되는 바와 같이 효과적인 투여량 및 투여 요법을 용이하게 최적화할 것이다. 투여 경로는 정맥내, 복강내, 피하 또는 근육내 투여일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 투여 빈도는 약제의 약동학적 매개변수 및 투여 경로에 따라 다르다. 최적의 약제학적 제형은 투여 경로 및 원하는 투여량에 따라 당업자에 의해 결정된다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042 pages 1435-1712, 이는 모든 목적 및 특히 의약품의 제형, 투여 경로 및 투여량과 관련된 모든 교시에서 전체가 참조로 포함된다). 이러한 제형은 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도 및 투여된 제제의 생체내 제거 속도에 영향을 미친다. 투여 경로에 따라 적절한 용량은 체중, 체표면적 또는 기관 크기에 따라 계산된다. 적절한 용량-반응 데이터와 함께 혈액 수준 용량을 결정하기 위해 확립된 검정을 사용하여 적절한 용량을 확인할 수 있다. 최종 투여 요법은 약물의 작용을 수정하는 다양한 요인, 예를 들어 약물의 특이적 활성, 손상의 중증도 및 환자의 반응성, 환자의 연령, 상태, 체중, 성별 및 식단, 감염의 중증도, 투여 시간 및 기타 임상 요인을 고려하여 주치의가 결정한다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 VWF의 전형적인 용량은 500μg/kg과 동일한 약 50IU/kg이다. 연구가 수행됨에 따라 다양한 질병 및 상태에 대한 적절한 투여량 수준 및 치료 기간에 관한 추가 정보가 나타날 것이다.

인간 또는 시험 동물에게 조성물을 투여하기 위해, 한 측면에서, 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. "약제학적으로" 또는 "약리학적으로" 허용되는 문구는 안정하고, 응집 및 절단 생성물과 같은 단백질 분해를 억제하고, 또한 아래에 설명된 바와 같이 당업계에 잘 알려진 경로를 사용하여 투여될 때 알레르기 또는 기타 부작용을 일으키지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. "약제학적으로 허용되는 담체"는 임의의 모든 임상적으로 유용한 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함하며, 이는 상기 기재된 제제를 포함한다.

약제학적 제형은 경구, 국소, 경피, 비경구, 흡입 스프레이, 질내, 직장 또는 두개내 주사에 의해 투여된다. 본원에 사용된 용어 비경구는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 수조내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 특정 부위에서의 정맥내, 피내, 근육내, 유방내, 복강내, 척추강내, 안구후 투여 및/또는 폐내 주사에 의한 투여가 또한 고려된다. 일반적으로, 조성물에는 본질적으로 발열원뿐만 아니라 수용자에게 해로울 수 있는 기타 불순물이 없다.

a. 동결건조된 VWF 제형

본 방법은 또한 본원에 제공된 치료 방법에 사용하기 위한 rVWF의 제형을 제공한다. 일부 구현양태에서, rVWF 조성물은 약제학적 조성물의 생산을 위해 사용된다. 일부 구현양태에서, rVWF는 동결건조 제형으로 제형화될 수 있다.

일부 구현양태에서, 본 발명의 VWF 폴리펩타이드를 포함하는 제형은 정제 후 및 대상체에 투여하기 전에 동결건조된다. 동결건조는 당업계에 일반적인 기술을 사용하여 수행되며 개발 중인 조성물에 대해 최적화되어야 한다(Tang 등, Pharm Res. 21:191-200, (2004) 및 Chang 등, Pharm Res. 13:243-9(1996)).

동결건조 사이클은 한 측면에서 동결, 1차 건조 및 2차 건조의 3단계로 구성된다(A. P. Mackenzie, Phil Trans R Soc London, Ser B, Biol 278:167(1977)). 동결 단계에서 용액이 냉각되어 얼음 형성이 시작된다. 또한, 이 단계는 증량제의 결정화를 유도한다. 얼음은 1차 건조 단계에서 승화되는데, 이 단계는 얼음의 증기압 이하로 챔버 압력을 낮추고, 진공을 사용하고 승화를 촉진하기 위해 열을 도입하여 수행된다. 마지막으로, 흡착되거나 결합된 물은 감소된 챔버 압력 및 상승된 저장 온도에서 2차 건조 단계에서 제거된다. 이 과정은 동결건조 케이크로 알려진 재료를 생산한다. 그 후 케이크는 멸균수 또는 주사용으로 적합한 희석제로 재구성될 수 있다.

동결건조 주기는 부형제의 최종 물리적 상태를 결정할 뿐만 아니라 재구성 시간, 외관, 안정성 및 최종 수분 함량과 같은 다른 매개변수에도 영향을 미친다. 동결 상태의 조성 구조는 특정 온도에서 발생하는 여러 전이(예를 들어, 유리 전이, 습윤화 및 결정화)를 통해 진행되며 구조를 사용하여 동결건조 과정을 이해하고 최적화할 수 있다. 유리 전이 온도(Tg 및/또는 Tg')는 용질의 물리적 상태에 대한 정보를 제공할 수 있으며 시차 주사 열량계(DSC)에 의해 결정될 수 있다. Tg 및 Tg'는 동결건조 주기를 설계할 때 반드시 고려해야 하는 중요한 매개변수이다. 예를 들어, Tg'는 1차 건조에 중요하다. 또한, 건조 상태에서 유리 전이 온도는 최종 제품의 보관 온도에 대한 정보를 제공한다.

b. 일반적인 약제학적 제형 및 부형제

부형제는 의약품(예를 들어, 단백질)의 안정성 및 운반성을 부여하거나 향상시키는 첨가제이다. 포함 이유에 관계없이 부형제는 제형의 필수 구성 요소이므로 환자에게 안전하고 잘 견딜 수 있어야 한다. 단백질 약물의 경우, 부형제의 선택은 약물의 효능과 면역원성에 영향을 줄 수 있기 때문에 특히 중요하다. 따라서, 단백질 제형은 적절한 안정성, 안전성 및 시장성을 제공하는 부형제를 적절하게 선택하여 개발해야 한다.

동결건조된 제형은, 한 측면에서, 완충제, 증량제 및 안정화제 중 적어도 하나 이상으로 구성된다. 이 측면에서, 계면활성제의 유용성은 동결건조 단계 또는 재구성 동안 응집이 문제가 되는 경우에 평가되고 선택된다. 동결건조 동안 pH의 안정한 영역 내에서 제형을 유지하기 위해 적절한 완충제가 포함된다. 액체 및 동결건조 단백질 제형에 대해 고려되는 부형제 성분의 비교가 표 10에 제공되어 있다.

표 10: 동결건조된 단백질 제형의 부형제 성분

단백질 제형 개발의 주요 과제는 제조, 운송 및 보관의 스트레스에 대해 제품을 안정화시키는 것이다. 제형 부형제의 역할은 이러한 스트레스에 대한 안정화를 제공하는 것이다. 부형제는 또한 전달을 가능하게 하고 환자 편의를 향상시키기 위해 고농도 단백질 제형의 점도를 감소시키는 데 사용된다. 일반적으로, 부형제는 다양한 화학적 및 물리적 스트레스에 대해 단백질을 안정화시키는 메커니즘에 따라 분류할 수 있다. 일부 부형제는 특정 스트레스의 영향을 완화하거나 특정 단백질의 특정 감수성을 조절하는 데 사용된다. 다른 부형제는 단백질의 물리적 및 공유적 안정성에 보다 일반적인 영향을 미친다. 본원에 기재된 부형제는 제형에서의 화학적 유형 또는 기능적 역할에 따라 체계화된다. 각 부형제 유형을 논의할 때 안정화 모드에 대한 간략한 설명이 제공된다.

본원에 제공된 교시 및 지침이 주어지면, 당해 분야의 숙련가는 생물약제(예를 들어, 단백질)의 안정성 유지를 촉진하는 본 발명의 생물약제 제형을 달성하기 위해 임의의 특정 제형에 포함될 수 있는 부형제의 양 또는 범위를 알 것이다. 예를 들어, 본 발명의 생물약제 제형에 포함될 염의 양 및 유형은 최종 용액의 원하는 삼투압몰농도(예를 들어 등장성, 저장성 또는 고장성) 및 제형에 포함될 기타 성분의 양 및 삼투압몰농도에 따라 선택된다.

예를 들어, 약 5% 소르비톨의 포함은 등장성을 달성할 수 있는 반면, 약 9%의 슈크로즈 부형제가 등장성을 달성하는 데 필요하다. 본 발명의 생물약제 제형 내에 포함될 수 있는 하나 이상의 부형제의 양 또는 농도 범위의 선택은 염, 폴리올 및 당을 참조하여 상기에 예시되었다. 그러나, 당업자는 본원에 기술되고 특정 부형제를 참조하여 추가로 예시된 고려사항이, 예를 들어 염, 아미노산, 기타 등장화제, 계면활성제, 안정화제, 증량제, 동결보호제, 동결건조보호제, 항산화제, 금속 이온, 킬레이트제 및/또는 보존제를 포함하는 부형제의 모든 유형 및 조합에 대해 동일하게 적용될 수 있음을 이해할 것이다.

추가로, 특정 부형제가 몰 농도로 보고되는 경우, 당업자는 용액의 등가 백분율(%) w/v(예를 들어, (용액 샘플 중 물질의 그램/용액의 mL) X 100 %)도 고려된다.

물론, 당업자는 본원에 기재된 부형제의 농도가 특정 제형 내에서 상호 의존성을 공유한다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 증량제의 농도는, 예를 들어 높은 단백질 농도가 있거나, 예를 들어 높은 안정화제 농도가 있는 곳에서 낮아질 수 있다. 또한, 당업자는 증량제가 없는 특정 제형의 등장성을 유지하기 위해 안정화제의 농도가 그에 따라 조정될 것임을 인식할 것이다(예: 안정화제의 "등장화"양의 사용). 일반적인 부형제는 당업계에 공지되어 있으며 문헌에서 발견할 수 있다(Powell 등, Compendium of Excipients for Parenteral Formulations (1998), PDA J. Pharm. Sci. Technology, 52:238-311).

c. 약제학적 완충제 및 완충화제

약리학적 활성 단백질 제형의 안정성은 일반적으로 좁은 pH 범위에서 최대인 것으로 관찰된다. 최적 안정성의 이 pH 범위는 제형화 전 연구 동안 초기에 확인해야 한다. 가속 안정성 연구 및 열량 측정 스크리닝 연구와 같은 여러 접근 방식이 이러한 노력에 유용하다(Remmele R.L. Jr., 등, Biochemistry, 38(16):5241-7 (1999)). 일단 제형이 완성되면, 단백질은 유통기한 내내 제조되고 유지되어야 한다. 따라서 완충제는 제형의 pH를 조절하기 위해 거의 항상 사용된다.

완충 종의 완충 용량은 pKa와 동일한 pH에서 최대이고 pH가 이 값에서 증가하거나 감소함에 따라 감소한다. 완충 용량의 90%는 pKa의 1 pH 단위 내에 존재한다. 완충 용량도 완충제 농도가 증가함에 따라 비례적으로 증가한다.

완충제를 선택할 때 몇 가지 요인을 고려해야 한다. 무엇보다도 완충 종과 그 농도는 pKa 및 원하는 제형 pH를 기반으로 정의해야 한다. 마찬가지로 중요한 것은 완충제가 단백질 및 기타 제형 부형제와 양립할 수 있고 분해 반응을 촉매화하지 않는지 확인하는 것이다. 고려해야 할 세 번째 중요한 측면은 투여 시 완충제가 유발할 수 있는 따끔거림 및 자극의 감각이다. 예를 들어, 시트레이트는 주사 시 따끔거림을 유발하는 것으로 알려져 있다(Laursen T, 등, Basic Clin Pharmacol Toxicol., 98(2):218-21(2006)). 따끔거림과 자극의 가능성은 피하(SC) 또는 근육내(IM) 경로를 통해 투여되는 약물의 경우 더 크고, 여기서 투여시 제형이 혈액으로 빠르게 희석되는 IV 경로에 의해 투여될 때보다 약물 용액은 상대적으로 더 긴 기간 동안 부위에 남아 있다. 직접 IV 주입으로 투여되는 제형의 경우, 완충제(및 기타 제형 성분)의 총량을 모니터링해야 한다. 인산칼륨 완충제 형태로 투여되는 칼륨 이온은 환자에게 심혈관계 영향을 줄 수 있으므로 특히 주의해야 한다(Hollander-Rodriguez JC, 등, Am. Fam. Physician., 73(2):283-90(2006)).

동결건조된 제형을 위한 완충제는 추가 고려가 필요하다. 인산나트륨과 같은 일부 완충제은 동결 중에 pH 이동을 초래해서 단백질 무정형을 결정화시킬 수 있다. 아세테이트 및 이미다졸과 같은 다른 일반적인 완충제는 동결건조 과정 동안 승화하거나 증발할 수 있으므로 동결건조 중 또는 재구성 후에 제형의 pH를 이동시킬 수 있다.

조성물에 존재하는 완충 시스템은 생리학적으로 적합하고 약제학적 제형의 원하는 pH를 유지하도록 선택된다. 한 구현양태에서, 용액의 pH는 pH 2.0 내지 pH 12.0이다. 예를 들어, 용액의 pH는 2.0, 2.3, 2.5, 2.7, 3.0, 3.3, 3.5, 3.7, 4.0, 4.3, 4.5, 4.7, 5.0, 5.3, 5.5, 5.7, 6.0, 6.3, 6.5, 6.7, 7.0, 7.3, 7.5, 7.7, 8.0, 8.3, 8.5, 8.7, 9.0, 9.3, 9.5, 9.7, 10.0, 10.3, 10.5, 10.7, 11.0, 11.3, 11.5, 11.7, 또는 12.0일 수 있다.

pH 완충 화합물은 제형의 pH를 예정된 수준으로 유지하기에 적합한 임의의 양으로 존재할 수 있다. 한 구현양태에서, pH 완충 농도는 0.1mM 내지 500mM(1M)이다. 예를 들어, pH 완충제는 적어도 0.1, 0.5, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.5, 1.7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 또는 500mM인 것으로 고려된다.

본원에 기술된 제형을 완충하기 위해 사용되는 예시적인 pH 완충제는 유기산, 글리신, 히스티딘, 글루타메이트, 숙시네이트, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 트리스, HEPES, 및 비제한적으로 아스파테이트, 히스티딘 및 글리신을 포함하는 아미노산 또는 아미노산 혼합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 한 구현양태에서, 완충제는 시트레이트이다.

d. 약제학적 안정화제 및 증량제

본 약제학적 제형의 한 측면에서, 저장-유도된 응집 및 화학적 분해를 방지하거나 감소시키기 위해 안정화제(또는 안정화제의 조합)가 첨가된다. 재구성 시 흐릿하거나 탁한 용액은 단백질이 침전되었거나 적어도 응집되었음을 나타낸다. 용어 "안정화제"는 수성 상태에서 화학적 분해(예를 들어, 자가분해, 탈아미드화, 산화 등)를 포함하여 응집 또는 물리적 분해를 방지할 수 있는 부형제를 의미한다. 고려되는 안정화제는 수크로스, 트레할로스, 만노스, 말토스, 락토스, 글루코스, 라피노스, 셀로비오스, 겐티오비오스, 이소말토스, 아라비노스, 글루코사민, 프룩토스, 만니톨, 소르비톨, 글리신, 아르기닌 HCL, 덱스트란, 전분, 하이드록시에틸 전분, 사이클로덱스트린, N-메틸 피롤리덴, 셀룰로오스 및 히알루론산과 같은 다당류를 포함하는 폴리-하이드록시 화합물, 염화나트륨을 포함하나 이에 제한되지는 않는다(Carpenter 등, Develop. Biol. Standard 74:225,(1991)). 본 제형에서, 안정화제는 약 0.1, 0.5, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.5, 1.7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, 900, 또는 1000mM의 농도로 혼입된다. 본 발명의 한 구현양태에서, 만니톨 및 트레할로오스가 안정화제로 사용된다.

원하는 경우, 제형은 또한 적절한 양의 증량제 및 삼투압몰농도 조절제를 포함한다. 증량제는, 예를 들어 만니톨, 글리신, 수크로스, 중합체, 예를 들어 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시메틸셀룰로스, 락토스, 소르비톨, 트레할로스 또는 자일리톨을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 한 구현양태에서, 증량제는 만니톨이다. 증량제는 약 0.1, 0.5, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.5, 1.7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, 900, 또는 1000mM의 농도로 혼입된다.

e. 약제학적 계면활성제

단백질은 표면과 상호작용하는 경향이 높아 공기-액체, 바이알-액체, 및 액체-액체(실리콘 오일) 경계면에서 흡착 및 변성되기 쉽다. 이 분해 경로는 단백질 농도에 반비례하는 것으로 관찰되었으며 가용성 및 불용성 단백질 응집체의 형성 또는 표면에 대한 흡착을 통해 용액으로부터 단백질 손실을 초래한다. 용기 표면 흡착 외에도, 표면-유도 분해는 제품의 운송 및 취급 중에 경험하게 되는 물리적 교반으로 악화된다.

계면활성제는 일반적으로 표면-유도 분해를 방지하기 위해 단백질 제형에 사용된다. 계면활성제는 계면 위치에 대해 단백질을 능가하는 능력을 가진 양극성 분자이다. 계면활성제 분자의 소수성 부분은 계면 위치(예를 들어, 공기/액체)를 차지하는 반면, 분자의 친수성 부분은 벌크 용매를 향해 배향된 상태로 유지된다. 충분한 농도(일반적으로 세제의 임계 미셀 농도 부근)에서, 계면활성제 분자의 표면층은 단백질 분자가 계면에서 흡착되는 것을 방지하는 역할을 한다. 따라서 표면 유도-분해가 최소화된다. 본원에서 고려되는 계면활성제는 비제한적으로 소르비탄 폴리에톡실레이트의 지방산 에스테르, 예를 들어 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80을 포함한다. 둘은 각각 분자, C-12 및 C-18에 소수성 특성을 부여하는 지방족 사슬의 길이만 상이하다. 따라서, 폴리소르베이트-80은 폴리소르베이트-20 보다 표면 활성이 더 높고 임계 미셀 농도가 더 낮다.

세제는 또한 단백질의 열역학적 형태 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 여기서도 주어진 세제 부형제의 효과는 단백질 특이적일 것이다. 예를 들어, 폴리소르베이트는 일부 단백질의 안정성을 감소시키고 다른 단백질의 안정성을 증가시키는 것으로 나타났다. 단백질의 세제 탈안정화는 부분적으로 또는 전체적으로 펼쳐진 단백질 상태와 특이적 결합에 관여할 수 있는 세제 분자의 소수성 꼬리 측면에서 합리화될 수 있다. 이러한 유형의 상호작용은 보다 확장된 단백질 상태로 입체형태 평형의 이동을 유발할 수 있다(예를 들어, 결합 폴리소르베이트에 대한 보완으로 단백질 분자의 소수성 부분의 노출 증가). 대안적으로, 단백질 천연 상태가 일부 소수성 표면을 나타내는 경우, 천연 상태에 결합하는 세제가 그 형태를 안정화시킬 수 있다.

폴리소르베이트의 또 다른 측면은 본질적으로 산화성 분해에 민감하다는 것이다. 종종 원료로서 단백질 잔기 측쇄, 특히 메티오닌의 산화를 유발하기에 충분한 양의 과산화물을 함유한다. 안정제의 첨가로 인한 산화 손상의 가능성은 가장 낮은 유효 농도의 부형제가 제형에 사용되어야 한다는 점을 강조한다. 계면활성제의 경우, 주어진 단백질의 유효 농도는 안정화 메커니즘에 따라 달라질 것이다.

계면활성제는 또한 동결 및 건조 동안 표면 관련 응집 현상을 방지하기 위해 적절한 양으로 첨가된다(Chang, B, J. Pharm. Sci. 85:1325,(1996)). 따라서, 예시적인 계면활성제는 비제한적으로 음이온성, 양이온성, 비이온성, 쯔비터이온성, 및 천연 발생 아미노산으로부터 유래된 계면활성제를 포함하는 양쪽성 계면활성제를 포함한다. 음이온성 계면활성제에는 나트륨 라우릴 설페이트, 디옥틸 나트륨 설포숙시네이트 및 디옥틸 나트륨 설포네이트, 케노데옥시콜산, N-라우로일사르코신 나트륨 염, 리튬 도데실 설페이트, 1-옥탄설폰산 나트륨 염, 나트륨 콜레이트 수화물, 나트륨 데옥시콜레이트, 및 글리코데옥시콜린산 나트륨 염을 포함하나, 이로 제한되지 않는다. 양이온성 계면활성제는 벤잘코늄 클로라이드 또는 벤제토늄 클로라이드, 세틸피리디늄 클로라이드 일수화물, 및 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 쯔비터이온성 계면활성제는 CHAPS, CHAPSO, SB3-10 및 SB3-12를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 비이온성 계면활성제는 디지토닌, 트리톤(Triton) X-100, 트리톤 X-114, 트윈(TWEEN)-20 및 트윈-80을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 계면활성제는 또한 라우로마크로골 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 수소첨가 피마자유 10, 40, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 40, 60, 65 및 80, 대두 레시틴 및 디올레일 포스파티딜 콜린(DOPC), 디미리스토일포스파티딜 글리세롤(DMPG), 디미리스토일포스파티딜 콜린(DMPC), 및 (디올레일 포스파티딜 글리세롤) DOPG과 같은 기타 인지질; 슈크로스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로오스 및 카르복시메틸 셀룰로오스을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 따라서 개별적으로 또는 상이한 비율의 혼합물로서 이들 계면활성제를 포함하는 조성물이 추가로 제공된다. 본 발명의 한 구현양태에서, 계면활성제는 트윈-80이다. 본 제형에서, 계면활성제는 약 0.01 내지 약 0.5g/L의 농도로 혼입된다. 제공된 제형에서, 계면활성제 농도는 0.005, 0.01, 0.02, 0.03, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0g/L이다.

f. 약제학적 염

염은 종종 제형의 이온 강도를 증가시키기 위해 첨가되며, 이는 단백질 용해도, 물리적 안정성 및 등장성에 중요할 수 있다. 염은 다양한 방식으로 단백질의 물리적 안정성에 영향을 줄 수 있다. 이온은 단백질 표면 상의 하전된 잔기에 결합하여 단백질의 고유 상태를 안정화할 수 있다. 대안적으로, 염은 단백질 백본(-CONH-)을 따라 펩타이드기에 결합함으로써 변성된 상태를 안정화시킬 수 있다. 염은 또한 단백질 분자 내의 잔기 사이의 반발성 정전기 상호작용을 차폐함으로써 단백질 천연 형태를 안정화시킬 수 있다. 단백질 제형의 염은 또한 단백질 응집 및 불용성을 유발할 수 있는 단백질 분자 간의 인력성 정전기 상호작용을 차폐할 수 있다. 제공된 제형에서, 염 농도는 0.1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 300, 및 500mM이다.

g. 기타 일반적인 부형제 성분: 약제학적 아미노산

아미노산은 완충제, 증량제, 안정화제 및 항산화제로서 단백질 제형에서 다양한 용도를 발견했다. 따라서, 한 측면에서 히스티딘 및 글루탐산은 각각 5.5 - 6.5 및 4.0 - 5.5의 pH 범위에서 단백질 제형을 완충하기 위해 사용된다. 히스티딘의 이미다졸기는 pKa = 6.0이고 글루탐산 측쇄의 카르복실기는 4.3의 pKa를 가지므로 이들 아미노산은 각각의 pH 범위에서 완충에 적합하다. 글루탐산은 이러한 경우에 특히 유용하다. 히스티딘은 일반적으로 시판되는 단백질 제형에서 발견되며, 이 아미노산은 주사시 따끔거리는 것으로 알려진 완충제인 시트레이트에 대한 대안을 제공한다. 흥미롭게도, 히스티딘은 액체 및 동결건조 제제 모두에서 고농도로 사용될 때 응집과 관련하여 안정화 효과가 있는 것으로 보고되었다(Chen B, 등, Pharm Res., 20(12):1952-60(2003)). 히스티딘은 또한 고단백질 농도 제형의 점도를 감소시키는 것으로 다른 사람들에 의해 관찰되었다. 그러나 동일한 연구에서 저자는 스테인리스 스틸 용기에서 항체의 동결-해동 연구 동안 히스티딘 함유 제형에서 증가된 응집 및 변색을 관찰했다. 히스티딘에 대한 또다른 주의 사항은 금속 이온의 존재 하에 광산화를 겪는다는 것이다(Tomita M, 등, Biochemistry, 8(12):5149-60 (1969)). 제형에서 항산화제로서 메티오닌의 사용은 유망한 것으로 보이며; 이는 다수의 산화 스트레스에 대해 효과적인 것으로 관찰되었다(Lam XM, 등, J Pharm ScL, 86(11):1250-5(1997)).

다양한 측면에서, 하나 이상의 아미노산 글리신, 프롤린, 세린, 아르기닌 및 알라닌을 포함하는 제형이 제공되며, 이는 우선적 배제의 메카니즘에 의해 단백질을 안정화시키는 것으로 나타났다. 글리신은 또한 동결건조 제형에서 일반적으로 사용되는 증량제이다. 아르기닌은 응집을 억제하는 데 효과적인 제제로 나타났으며 액체 및 동결건조 제형 모두에 사용되었다. 제공된 제형에서, 이 아미노산 농도는 0.1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 300, 및 500mM이다. 본 발명의 한 구현양태에서, 아미노산은 글리신이다.

h. 기타 일반적인 부형제 성분: 약제학적 항산화제

단백질 잔기의 산화는 다수의 상이한 공급원으로부터 발생한다. 특정 항산화제를 추가하는 것 외에도 산화성 단백질 손상을 방지하려면 제조 공정 및 제품 보관 전반에 걸쳐 대기 산소, 온도, 빛 노출 및 화학적 오염과 같은 여러 요인을 주의 깊게 제어해야 한다. 따라서, 본 발명은 환원제, 산소/유리-라디칼 제거제, 또는 킬레이트제를 포함하나 이에 제한되지 않는 약제학적 항산화제의 사용을 고려한다. 치료 단백질 제형의 항산화제는, 한 측면에서 수용성이고 제품 저장 수명 내내 활성을 유지한다. 환원제 및 산소/유리-라디칼 제거제는 용액에서 활성 산소 종을 제거함으로써 작동한다. EDTA와 같은 킬레이트제는 유리-라디칼 형성을 촉진하는 미량 금속 오염 물질을 결합함으로써 효과적이다. 예를 들어, EDTA는 산성 섬유아세포 성장 인자의 액체 제형에서 시스테인 잔기의 금속 이온 촉매화된 산화를 억제하는 데 사용되었다.

단백질 산화를 방지하기 위한 다양한 부형제의 효과에 더하여, 항산화제 자체가 단백질에 대한 다른 공유 또는 물리적 변화를 유도할 가능성이 우려된다. 예를 들어, 환원제는 분자내 이황화 결합의 붕괴를 일으켜 이황화 셔플링을 유발할 수 있다. 전이금속 이온의 존재 하에서, 아스코르브산 및 EDTA는 많은 단백질 및 펩타이드에서 메티오닌 산화를 촉진하는 것으로 나타났다(Akers MJ, 및 Defelippis MR. Peptides and Proteins as Parenteral Solutions. In: Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins. Sven Frokjaer, Lars Hovgaard, editors. Pharmaceutical Science. Taylor 및 Francis, UK(1999)); Fransson J.R.,/.Pharm. Sci. 86(9):4046-1050(1997); Yin J, 등, Pharm Res., 21(12):2377-83(2004)). 나트륨 티오설페이트는 rhuMab HER2에서 빛 및 온도 유도된 메티오닌-산화 수준을 감소시키는 것으로 보고되었다; 그러나, 티오설페이트-단백질 부가물의 형성도 이 연구에서 보고되었다(Lam XM, Yang JY, 등, J Pharm Sci. 86(11):1250-5(1997)). 단백질의 특정 스트레스 및 민감도에 따라 적절한 항산화제를 선택한다. 특정 측면에서 고려되는 항산화제는 환원제 및 산소/유리-라디칼 제거제, EDTA, 및 나트륨 티오설페이트를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

i. 기타 일반적인 부형제 성분: 약제학적 금속 이온

일반적으로, 전이 금속 이온은 단백질에서 물리적 및 화학적 분해 반응을 촉매할 수 있기 때문에 단백질 제형에서 바람직하지 않다. 그러나 특정 금속 이온이 단백질에 대한 보조인자인 경우 제형에 포함되고, 배위 복합체를 형성하는 단백질의 현탁액 제형(예: 인슐린의 아연 현탁액)에 포함된다. 최근, 아스파르트산의 이소아스파르트산으로의 이성질화를 억제하기 위해 마그네슘 이온(10-120mM)의 사용이 제안되었다(WO 2004039337).

금속 이온이 단백질에서 안정성 또는 증가된 활성을 부여하는 두 가지 예는 인간 데옥시리보뉴클레아제(rhDNase, Pulmozyme®) 및 인자 VIII이다. rhDNase의 경우, Ca⁺² 이온(최대 100mM)은 특정 결합 부위를 통해 효소의 안정성을 증가시켰다(Chen B, 등, Pharm Sci., 88(4):477-82(1999)). 실제로 EGTA를 갖는 용액에서 칼슘 이온을 제거하면 탈아미드화 및 응집이 증가했다. 그러나 이 효과는 Ca⁺² 이온에서만 관찰되었고; 다른 2가 양이온 Mg⁺², Mn⁺² 및 Zn⁺²는 rhDNase를 탈안정화시키는 것으로 관찰되었다. 인자 VIII에서도 유사한 효과가 관찰되었다. Ca⁺² 및 Sr⁺² 이온은 단백질을 안정화시키는 반면, Mg⁺², Mn⁺² 및 Zn⁺², Cu⁺² 및 Fe⁺²와 같은 다른 이온은 효소를 탈안정화시켰다(Fatouros, A., 등, Int. J. Pharm., 155, 121-131(1997)). 인자 VIII에 대한 별도의 연구에서, Al⁺³ 이온의 존재 하에서 응집 속도의 상당한 증가가 관찰되었다(Derrick TS, 등/.Pharm. Sci., 93(10):2549-57(2004)). 저자들은 완충염과 같은 다른 부형제가 종종 Al⁺³ 이온으로 오염된다는 점에 주목하고 제형화된 제품에서 적절한 품질의 부형제를 사용할 필요성을 설명한다.

j. 기타 일반적인 부형제 성분: 약제학적 보존제

보존제는 동일한 용기에서 한번 이상의 추출을 포함하는 다중-사용 비경구 제형을 개발할 때 필요하다. 이들의 주요 기능은 미생물 성장을 억제하고 의약품의 유통 기한 또는 사용 기간 동안 제품 무균성을 보장하는 것이다. 일반적으로 사용되는 보존제는 제한 없이 벤질 알코올, 페놀 및 m-크레졸을 포함한다. 보존제는 오랜 사용 역사를 가지고 있지만 보존제가 포함된 단백질 제형의 개발은 어려울 수 있다. 보존제는 거의 항상 단백질에 탈안정화 효과(응집)를 가지며, 이는 다중-용량 단백질 제형에서의 사용을 제한하는 주요 요인이 되어왔다(Roy S, 등, J Pharm ScL, 94(2):382-96(2005)).

현재까지 대부분의 단백질 약물은 일회용으로만 제형화되었다. 그러나 다중-용량 제형이 가능한 경우 환자의 편의를 도모하고 시장성을 높일 수 있는 장점이 있다. 좋은 예는 인간 성장 호르몬(hGH)의 경우이며, 보존된 제형의 개발로 보다 편리하고 다중-사용 주사 펜 제제가 상용화되었다. hGH의 보존된 제형을 함유하는 적어도 4개의 이러한 펜 장치가 현재 시장에서 이용가능하다. Norditropin®(액체, Novo Nordisk), Nutropin AQ®(액체, Genentech) 및 Genotropin(동결 건조-이중 챔버 카트리지, Pharmacia & Upjohn)에는 페놀이 포함되어 있고, Somatrope®(Eli Lilly)에는 m-크레졸이 포함되어 있다.

보존된 투여 형태의 제형 개발 동안 여러 측면을 고려해야 한다. 의약품에서 효과적인 보존제 농도는 최적화되어야 한다. 이를 위해서는 단백질 안정성을 손상시키지 않으면서 항균 효과를 부여하는 농도 범위로 투여 형태에서 주어진 보존제를 테스트해야 한다. 예를 들어, 시차 주사 열량계(DSC)를 사용하여 인터루킨-1 수용체(타입 I)에 대한 액체 제형 개발에서 세 가지 보존제가 성공적으로 선별되었다. 보존제는 시판 제품에 일반적으로 사용되는 농도에서 안정성에 미치는 영향을 기준으로 순위가 매겨졌다(Remmele RL Jr., 등, Pharm Res., 15(2):200-8(1998)).

보존제를 함유하는 액체 제형의 개발은 동결건조 제형보다 더 어렵다. 동결건조 제품은 보존제 없이 동결건조하여 사용시 보존제가 함유된 희석제로 재구성할 수 있다. 이것은 보존제가 단백질과 접촉하는 시간을 단축하여 관련 안정성 위험을 크게 최소화한다. 액체 제형의 경우, 보존 효과 및 안정성이 전체 제품 유통 기간(18-24개월) 동안 유지되어야 한다. 주목해야 할 중요한 점은 활성 약물 및 모든 부형제 성분을 함유하는 최종 제형에서 보존 효과가 입증되어야 한다는 것이다.

일부 보존제는 주사 부위 반응을 유발할 수 있으며, 이는 보존제를 선택할 때 고려해야 할 또 다른 요소이다. 노르디트로핀(Norditropin)에서 보존제 및 완충제 평가에 초점을 맞춘 임상 시험에서 m-크레졸을 함유하는 제형에 비해 페놀 및 벤질 알코올을 함유하는 제형에서 통증 인식이 더 낮은 것으로 관찰되었다(Kappelgaard AM, Horm Res. 62 Suppl 3:98-103(2004)). 흥미롭게도 일반적으로 사용되는 보존제 중에서, 벤질 알코올은 마취 특성을 가지고 있다(Minogue SC, 및 Sun DA., AnesthAnalg., 100(3):683-6(2005)). 다양한 측면에서 보존제의 사용은 부작용을 능가하는 이점을 제공한다.

k. 약제학적 제형의 제조 방법

본 발명은 약제학적 제형의 제조 방법을 추가로 고려한다.

본 방법은 하기 단계 중 하나 이상을 추가로 포함한다: 동결건조 전에 본원에 기재된 바와 같은 안정화제를 상기 혼합물에 첨가하는 단계, 각각 본원에 기재된 바와 같은 증량제, 삼투압몰농도 조절제 및 계면활성제로부터 선택된 적어도 하나의 제제를 동결건조 전에 상기 혼합물에 첨가하는 단계.

때로 항균제의 희석된 용액이 비경구 투여를 위한 약제 생산에 사용되는 경우가 있을 지라도(Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, 18:1311-1354 (1992)), 동결건조된 재료에 대한 표준 재구성 방법은 일정량의 순수 또는 주사용 멸균수(WFI)를 다시 추가하는 것이다(일반적으로 동결건조 동안 제거된 부피와 동일). 따라서, 본 발명의 동결건조된 rVWF 조성물에 희석제를 첨가하는 단계를 포함하는 재구성된 rVWF 조성물의 제조 방법이 제공된다.

동결건조된 재료는 수용액으로 재구성될 수 있다. 다양한 수성 담체, 예를 들어 주사용 멸균수, 다중 용량 사용을 위한 보존제가 포함된 물, 또는 적절한 양의 계면활성제가 포함된 물(예를 들어, 수성 현택액의 제조에 적합한 부형제와 혼합하여 활성 화합물을 함유하는 수성 현탁액)이 있다. 다양한 측면에서, 이러한 부형제는 현탁제, 예를 들어 제한없이, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 검 및 아카시아 검과 같은 현탁제; 분산제 또는 습윤제는 천연-발생 포스파티드, 예를 들어 비제한적으로 레시틴, 또는 알킬렌 옥사이드와 지방산의 축합 생성물, 예를 들어 제한 없이 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 또는 에틸렌 옥사이드와 장쇄 지방족 알코올의 축합 생성물, 예를 들어 비제한적으로 헵타데카에틸렌옥시세탄올, 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨로부터 유도된 부분 에스테르의 축합 생성물, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트, 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유도된 부분 에스테르의 축합 생성물, 예를 들어 비제한적으로 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레에이트이다. 다양한 측면에서, 수성 현탁액은 또한 하나 이상의 보존제, 예를 들어 비제한적으로 에틸, 또는 n-프로필, p-하이드록시벤조에이트를 함유한다.

l. 투여를 위한 예시적인 rVWF 제형

일부 구현양태에서, 본 방법은 치료용 부피(100IU/ml 내지 10000IU/ml)를 감소시키기 위해 높은 효능(높은 rVWF 농도 및 향상된 장기간 안정성)을 갖는 최종 생성물을 허용하는 향상된 제형을 제공한다. 일부 구현양태에서, 투여용 제형 중 rVWF 농도는 약 100IU/ml 내지 10000IU/ml이다. 일부 구현양태에서, 투여용 제형 중 rVWF 농도는 약 500IU/ml 내지 10000IU/ml이다. 일부 구현양태에서, 투여용 제형 중 rVWF 농도는 약 1000IU/ml 내지 10000IU/ml이다. 일부 구현양태에서, 투여용 제형 중 rVWF 농도는 약 2000IU/ml 내지 10000IU/ml이다. 일부 구현양태에서, 투여용 제형 중 rVWF 농도는 약 3000IU/ml 내지 10000IU/ml이다. 일부 구현양태에서, 투여용 제형 중 rVWF 농도는 약 4000IU/ml 내지 10000IU/ml이다. 일부 구현양태에서, 투여용 제형 중 rVWF 농도는 약 5000IU/ml 내지 10000IU/ml이다. 일부 구현양태에서, 투여용 제형 중 rVWF 농도는 약 6000IU/ml 내지 10000IU/ml이다. 일부 구현양태에서, 투여용 제형 중 rVWF 농도는 약 7000IU/ml 내지 10000IU/ml이다. 일부 구현양태에서, 투여용 제형 중 rVWF 농도는 약 8000IU/ml 내지 10000IU/ml이다. 일부 구현양태에서, 투여용 제형 중 rVWF 농도는 약 9000IU/ml 내지 10000 IU/ml이다.

일부 구현양태에서, 투여용 제형은, 예를 들어 히스티딘, 글리신, 아르기닌과 같은 아미노산을 포함하는 하나 이상의 쯔비터이온성 화합물을 포함한다. 일부 구현양태에서, 투여용 제형은, 예를 들어 폴리소르베이트 80, 옥틸피라노시드, 디펩타이드, 및/또는 양극성 펩타이드를 포함하는, 최소 하나의 소수성 및 하나의 친수성기를 갖는 양극성 특성을 갖는 성분을 포함한다. 일부 구현양태에서, 투여용 제형은, 예를 들어 소르비톨, 만니톨, 수크로스, 또는 트레할로스를 포함하는 비환원당 또는 당 알코올 또는 이당류를 포함한다. 일부 구현양태에서, 투여용 제형은생리학적 삼투압몰농도를 초래하는, 예를 들어 염화나트륨을 포함하는 비독성 수용성 염을 포함한다. 일부 구현양태에서, 투여용 제형은 6.0 내지 8.0 범위의 pH를 포함한다. 일부 구현양태에서, 투여용 제형은 약 6.0, 약 6.5, 약 7, 약 7.5 또는 약 8.0의 pH를 포함한다. 일부 구현양태에서, 투여용 제형은, 예를 들어 Ca2+, Mg2+, Zn2+, Mn2+ 및/또는 이들의 조합을 포함하는 rVWF를 안정화하는 하나 이상의 2가 양이온을 포함한다. 일부 구현양태에서, 투여용 제형은 pH가 약 7.0이고 투여 시점에서 생리학적 삼투압몰농도를 갖는, 약 1mM 내지 약 50mM 글리신, 약 1mM 내지 약 50mM 히스티딘, 약 0 내지 약 300mM 염화나트륨(예를 들어, 300mM 미만의 나트륨), 약 0.01% 내지 약 0.05% 폴리소르베이트 20(또는 폴리소르베이트 80), 및 약 0.5% 내지 약 20%(w/w)의 수크로스를 포함한다.

일부 구현양태에서, 투여용 제형은 동결 건조될 수 있다. 일부 구현양태에서, 투여용 제형은 안정하고 약 2℃ 내지 약 8℃, 뿐만 아니라 약 18℃ 내지 약 25℃에서 액체 상태로 저장될 수 있다. 일부 구현양태에서, 투여용 제형은 안정하고 약 2℃ 내지 약 8℃에서 액체 상태로 저장될 수 있다. 일부 구현양태에서, 투여용 제형은 안정하고 약 18℃ 내지 약 25℃에서 액체 상태로 저장될 수 있다.

V. 중증 VWD 환자의 예방 치료 방법을 위한 rVWF 투여

일부 구현양태에서, 본 발명은 중증 폰 빌레브란트 질병(VWD)을 갖는 대상체에서 자연 출혈 에피소드의 예방 치료를 제공한다. 일부 구현양태에서, 예방 치료는 자연 출혈 에피소드의 빈도 및/또는 지속기간을 감소시키기 위해 대상체에게 재조합 폰 빌레브란트 인자(rVWF)를 투여하는 것을 포함한다.

일부 구현양태에서, 자연 출혈 에피소드는 외상과 관련되지 않은 임의의 에피소드를 포함한다. 일부 구현양태에서, 치료의 효능은 자연 출혈 에피소드 횟수의 감소에 의해 표시된다. 일부 구현양태에서, 자연 출혈 에피소드의 횟수의 감소는 연간 출혈률(ABR)의 감소에 의해 표시된다. 일부 구현양태에서, 치료 전 ABR은 하기 공식에 기초하여 결정된다: 출혈 횟수/치료 요법이 아닌 날수. 일부 구현양태에서, 치료 전 ABR은 하기 공식에 기초하여 결정된다: 출혈 횟수/rVWF를 사용한 예방 치료 전 12개월. 일부 구현양태에서, 예방적 ABR(예방 치료 후 ABR)은 하기 공식에 기초하여 결정된다: 출혈 횟수/치료 요법 날수.

일부 구현양태에서, 치료전 ABR에 비해 rVWF 예방 치료 동안 자연 출혈 에피소드에 대한 연간 출혈률(ABR)의 ≥25% 감소는 예방적 치료 효능을 나타낸다. 일부 구현양태에서, 치료전 ABR에 비해 rVWF 예방 치료 동안 자연 출혈 에피소드에 대한 연간 출혈률(ABR)의 ≥30% 감소는 예방 치료 효능을 나타낸다. 일부 구현양태에서, 치료전 ABR에 비해 rVWF 예방 치료 동안 자연 출혈 에피소드에 대한 연간 출혈률(ABR)의 ≥35% 감소는 예방적 치료 효능을 나타낸다. 일부 구현양태에서, 치료전 ABR에 비해 rVWF 예방 치료 동안 자연 출혈 에피소드에 대한 연간 출혈률(ABR)의 ≥40% 감소는 예방 치료 효능을 나타낸다. 일부 구현양태에서, 치료전 ABR에 비해 rVWF 예방 치료 동안 자연 출혈 에피소드에 대한 연간 출혈률(ABR)의 ≥45% 감소는 예방적 치료 효능을 나타낸다. 일부 구현양태에서, 치료 전 ABR에 비해 rVWF 예방 치료 동안 자연 출혈 에피소드에 대한 연간 출혈률(ABR)의 ≥50% 감소는 예방 치료 효능을 나타낸다. 일부 구현양태에서, 치료전 ABR에 비해 rVWF 예방 치료 동안 자연 출혈 에피소드에 대한 연간 출혈률(ABR)의 ≥55% 감소는 예방적 치료 효능을 나타낸다. 일부 구현양태에서, 치료 전 ABR에 비해 rVWF 예방 치료 동안 자연 출혈 에피소드에 대한 연간 출혈률(ABR)의 ≥60% 감소는 예방 치료 효능을 나타낸다. 일부 구현양태에서, 치료전 ABR에 비해 rVWF 예방 치료 동안 자연 출혈 에피소드에 대한 연간 출혈률(ABR)의 ≥65% 감소는 예방적 치료 효능을 나타낸다. 일부 구현양태에서, 치료 전 ABR에 비해 rVWF 예방 치료 동안 자연 출혈 에피소드에 대한 연간 출혈률(ABR)의 ≥70% 감소는 예방 치료 효능을 나타낸다. 일부 구현양태에서, 치료전 ABR에 비해 rVWF 예방 치료 동안 자연 출혈 에피소드에 대한 연간 출혈률(ABR)의 ≥75% 감소는 예방적 치료 효능을 나타낸다. 일부 구현양태에서, 치료 전 ABR에 비해 rVWF 예방 치료 동안 자연 출혈 에피소드에 대한 연간 출혈률(ABR)의 ≥80% 감소는 예방 치료 효능을 나타낸다. 일부 구현양태에서, 치료전 ABR에 비해 rVWF 예방 치료 동안 자연 출혈 에피소드에 대한 연간 출혈률(ABR)의 ≥85% 감소는 예방적 치료 효능을 나타낸다. 일부 구현양태에서, 치료 전 ABR에 비해 rVWF 예방 치료 동안 자연 출혈 에피소드에 대한 연간 출혈률(ABR)의 ≥90% 감소는 예방 치료 효능을 나타낸다.

일부 구현양태에서, 예방 치료 효능은 rVWF를 사용한 예방 치료 전 및 후에 샘플을 수득하고 vWF:RCo 및/또는 FVIII 활성을 조사함으로써 측정될 수 있다. 일부 구현양태에서, FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, 및/또는 VWF 콜라겐-결합능 활성을 조사하기 위한 샘플은 rVWF를 사용한 예방 치료 전 및 rVWF를 사용한 예방 치료 후에 수득된다. 일부 구현양태에서, FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, 및 VWF 콜라겐-결합능 활성을 조사하기 위한 샘플은 rVWF를 사용한 예방 치료 후 15분, 30분, 60분, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간, 28시간, 32시간, 48시간, 72시간 또는 96시간에 수득된다. 일부 구현양태에서, FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, 및 VWF 콜라겐-결합능 활성을 조사하기 위한 샘플은 rVWF를 사용한 예방 치료 후 25 내지 31일에 수득된다. 일부 구현양태에서, FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag 및 VWF 콜라겐-결합능 활성에 대한 샘플은 출혈 에피소드 이후 또는 동안에 수득되고, 이러한 구현양태에서, 샘플은 rVWF 투여 전, 투여 후 2시간 및 그후 출혈 사건이 해소될 때까지 12-24시간 마다 채취된다. 일부 구현양태에서, 치료 효능은 출혈 에피소드 이후 또는 동안에 결정되고, 이러한 구현양태에서, FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag 및 VWF 콜라겐-결합능 활성을 조사하기 위한 샘플은 출혈 에피소드 이후에 수득되고, 샘플은 rVWF 투여 전, 투여 후 2시간 및 그후 출혈 사건이 해소될 때까지 12-24시간 마다 채취된다. 일부 구현양태에서, FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, 및 VWF 콜라겐-결합능 활성 대 시간 프로파일은 rVWF를 사용한 예방 치료에 대한 치료 효능을 모니터링하기 위해 샘플에 기초하여 결정된다. 일부 구현양태에서, FVIII:C는 또한 rVWF를 사용한 예방 치료에 대한 치료 효능을 모니터링하기 위해 1-단계 응고 검정 대 시간 프로파일에 의해 측정된다. 일부 구현양태에서, FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, 및/또는 VWF 콜라겐-결합능 활성 수준은 rVWF를 사용한 예방 치료 전의 수준과 비교하여 rVWF를 사용한 예방 치료 후에 개선된다. 일부 구현양태에서, FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, 및/또는 VWF 콜라겐-결합능 활성 수준은 rVWF에 의한 예방 치료 전 수준과 비교하여 rVWF에 의한 예방 치료 후 개선되고 이에 따른 개선은 치료 효능을 나타낸다. 일부 구현양태에서, 예방 치료 효능은 rVWF를 사용한 예방 치료 전의 수준과 비교하여 rVWF를 사용한 예방 치료 후 FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, 및/또는 VWF 콜라겐-결합능 활성 수준의 개선에 의해 표시된다. 일부 구현양태에서, FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, 및/또는 VWF 콜라겐-결합능 활성 수준의 개선은 활성 수준이 정상 수준, 예를 들어 VWD가 없는 대상체의 수준에 더 가깝도록 활성 수준의 변화를 포함한다.

일부 측면에서, rVWF 투여의 예방 치료 효능은 출혈 에피소드 이후 또는 동안에 결정된다. 일부 구현양태에서, FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, 및/또는 VWF 콜라겐-결합능 활성을 조사하기 위한 샘플은 출혈 에피소드 후에 수득된다. 일부 구현양태에서, FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, 및/또는 VWF 콜라겐-결합능 활성을 검사하기 위한 샘플은 출혈 에피소드 동안 수득된다. 일부 예에서, FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, 및/또는 VWF 콜라겐-결합능 활성이 샘플을 사용하여 결정될 수 있도록 샘플은 출혈 에피소드 동안 환자로부터 수득된다. 다른 경우에, 샘플은 출혈 에피소드 후에 환자로부터 수득된다. 일부 구현양태에서, 샘플은 rVWF 투여 전에 수득된다. 일부 구현양태에서, 샘플은 rVWF 투여 후에 수득된다. 일부 구현양태에서, 샘플은 rVWF 투여 2시간 후에 수득된다. 일부 구현양태에서, 샘플은출혈 에피소드가 해소될 때까지 12-24시간마다 수득된다. 일부 구현양태에서, 샘플은 rVWF 투여 전 및 rVWF 투여 2시간 후에 수득된다. 일부 구현양태에서, 샘플은 rVWF 투여 전 및 출혈 에피소드가 해소될 때까지 12-24시간마다 수득된다. 다른 구현양태에서, 샘플은 rVWF 투여 전, rVWF 투여 2시간 후 및 출혈 에피소드가 해소될 때까지 12-24시간마다 수득된다. 이와 같이, 샘플은 rVWF 투여 전 및 출혈 에피소드 전에 수득될 수 있다. 일부 구현양태에서, 샘플은 rVWF 투여 후 및 출혈 에피소드 전에 수득된다. 일부 구현양태에서, 샘플은 rVWF 투여 후 및 출혈 에피소드 동안 수득된다. 특정 구현양태에서, 샘플은 rVWF 투여 후 및 출혈 에피소드의 해소 후에 수득된다.

일부 측면에서, rVWF는 40-80IU/kg의 범위, 예를 들어 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 40-100, 40-80, 50-80, 60-80, 70-80, 40-50, 40-60, 40-70, 40-50, 50-60, 60-70, 또는 70-80IU/kg으로 대상체에게 투여된다. 일부 구현양태에서, rVWF는 자연 출혈 에피소드를 예방하기 위해 적어도 주 1회 투여된다. 어떤 경우에는 대상체에게 rVWF를 단일 투여한다. 일부 경우에, 대상체는 rVWF의 단일 주입으로 투여된다.

일부 측면에서, rVWF는 40-80IU/kg의 범위, 예를 들어 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 40-100, 40-80, 50-80, 60-80, 70-80, 40-50, 40-60, 40-70, 40-50, 50-60, 60-70, 또는 70-80IU/kg으로 대상체에게 투여된다. 일부 구현양태에서, 용량은 40IU/kg 내지 60IU/kg 범위이다. 일부 구현양태에서, 용량은 45IU/kg 내지 55IU/kg 범위이다. 일부 구현양태에서, 용량은 약 40IU/kg, 약 50IU/kg, 약 60IU/kg이다. 일부 구현양태에서, rVWF는 자연 출혈 에피소드를 예방하기 위해 매주 적어도 2회 투여된다. 다른 구현양태에서, rVWF는 자연 출혈 에피소드를 예방하기 위해 적어도 주당 2회 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5회 또는 그 이상 투여된다. 어떤 경우에는 대상체는 rVWF를 2회 투여받는다. 일부 예에서, 대상체는 rVWF를 2회 주입받는다. 일부 구현양태에서, rVWF는 주 2회 투여된다. 일부 구현양태에서, rVWF는 40IU/kg 내지 60IU/kg 범위의 주입 용량으로 주 2회 투여된다. 일부 구현양태에서, rVWF는 IV 주입에 의해 40IU/kg 내지 60IU/kg 범위의 주입 용량으로 주 2회 투여된다. 각각의 주입은 약 40-80 IU/kg rVWF, 예를 들어, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 40-80, 50-80, 60-80, 70-80, 40-50, 40-60, 40-70, 40-50, 50-60, 60-70 또는 70-80IU/kg rVWF의 범위를 포함할 수 있다. 일부 구현양태에서, 각각의 주입은 40IU/kg 내지 60IU/kg의 범위이다. 일부 구현양태에서, 각각의 주입은 45IU/kg 내지 55IU/kg의 범위이다. 일부 구현양태에서, 각각의 주입은 약 40IU/kg, 약 50IU/kg, 또는 약 60IU/kg이다. 일부 구현양태에서, 주입량은 실질적으로 동일할 수 있다. 예를 들어, 첫 번째 주입과 두 번째 주입은 양이 실질적으로 동일할 수 있다. 일부 구현양태에서, 대상체에게 투여되는 rVWF의 총 용량은 약 40-160IU/kg, 예를 들어 40-150, 40-125, 40-100, 40-90, 40-75, 50-150, 50-100, 75-150, 100-125 또는 100-160IU/kg이다.

일부 측면에서, rVWF는 40-80IU/kg의 범위, 예를 들어 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 40-100, 40-80, 50-80, 60-80, 70-80, 40-50, 40-60, 40-70, 40-50, 50-60, 60-70, 또는 70-80IU/kg으로 대상체에게 투여된다. 일부 구현양태에서, rVWF는 자연 출혈 에피소드를 예방하기 위해 매주 적어도 2회 투여된다. 일부 구현양태에서, rVWF는 자연 출혈 에피소드를 예방하기 위해 매주 적어도 3회 투여된다. 다른 구현양태에서, rVWF는 자연 출혈 에피소드를 예방하기 위해 주당 3회 이상, 예를 들어 3, 4, 5회 또는 그 이상 투여된다. 어떤 경우에는 대상에게 rVWF를 3회 투여한다. 일부 예에서, 대상체는 rVWF를 3회 주입받는다. 각각의 주입은 약 40-80IU/kg rVWF, 예를 들어, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 40-80, 50-80, 60-80, 70-80, 40-50, 40-60, 40-70, 40-50, 50-60, 60-70 또는 70-80IU/kg rVWF의 범위를 포함할 수 있다. 일부 구현양태에서, 주입량은 실질적으로 동일할 수 있다. 예를 들어, 첫 번째 주입, 두 번째 주입, 및 세 번째 주입은 양이 실질적으로 동일할 수 있다. 일부 구현양태에서, 대상체에게 투여되는 rVWF의 총 용량은 약 80-240IU/kg, 예를 들어 120-240, 140-240, 140-200, 160-240, 180-240, 200-240, 80-120, 80-160, 80-200, 120-220, 또는 220-240IU/kg이다. 일부 구현양태에서, 대상체에게 투여되는 rVWF의 총 용량은 주당 약 160IU/kg 미만이다. 일부 구현양태에서, 대상체에게 투여되는 rVWF의 총 용량은 주당 약 240IU/kg 미만이다.

일부 구현양태에서, rVWF는 매주 적어도 1회, 매주 적어도 2회(2회), 매주 적어도 3회(3회), 매일, 격일로, 2-3일마다, 2-4일마다, 2-5일마다 등으로 투여된다. 일부 예에서, rVWF는 7일 기간 동안 총 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일 동안 투여된다. 일부 구현양태에서, rVWF는 비연속적인 날에 투여된다. 일부 구현양태에서, rVWF는 연속적인 날에 투여된다.

일부 구현양태에서, rVWF는 적어도 매 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 84시간, 또는 96시간마다 투여된다. 일부 예에서, rVWF는 적어도 매60시간, 72시간 또는 84시간마다 투여된다. 일부 경우에, rVWF는 적어도 매 72시간마다 투여된다.

일부 구현양태에서, 재조합 인자 VIII(rFVIII)는 또한 중증 VWD를 갖는 대상체에게 투여되어 자연 출혈 에피소드의 빈도 및/또는 지속기간을 예방하거나 감소시킨다. 일부 경우에, 투여된 치료는 rVWF 및 rFVIII를 포함한다. 다른 경우에, 투여된 치료에는 rFVIII가 포함되지 않는다. 일부 구현양태에서, rFVIII는 약 10-70 IU/kg, 예를 들어, 10-70, 10-60, 10-50, 10-40, 10-30, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60 또는 60-70IU/kg의 범위로 대상체에게 투여된다. 일부 경우에, rFVIII는 초기(첫 번째) 투여 또는 초기(첫 번째) 주입으로 투여된다. 일부 경우에, rFVIII는 초기(첫 번째) 투여 또는 초기(첫 번째) 주입으로 투여되지 않는다. 일부 경우에, rFVIII는 2차 투여 또는 2차 주입의 일부로 투여된다. 일부 경우에, rFVIII는 2차 투여 또는 2차 주입의 일부로 투여되지 않는다. 일부 경우에, rFVIII는 3차 투여 또는 3차 주입의 일부로 투여된다. 어떤 경우에는 rFVIII가 3차 투여 또는 3차 주입의 일부로 투여되지 않는다.

일부 구현양태에서, 자연 출혈 에피소드를 가질 위험이 있는 VWD를 갖는 대상체는 rVWF 및 rFVIII의 단일 주입이 투여된다. 일부 구현양태에서, rVWF의 2차 투여는 FVIII와 함께 투여되지 않는다. 일부 구현양태에서, rVWF의 3차 투여는 FVIII와 함께 투여되지 않는다.

일부 구현양태에서, 자연 출혈 에피소드를 가질 위험이 있는 VWD를 갖는 대상체는 rVWF 및 rFVIII의 단일 주입이 투여된다. 일부 구현양태에서, rVWF의 2차 투여는 FVIII와 함께 투여된다. 일부 구현양태에서, rVWF의 3차 투여는 FVIII와 함께 투여되지 않는다.

일부 구현양태에서, 자연 출혈 에피소드를 가질 위험이 있는 VWD를 갖는 대상체는 rVWF 및 rFVIII의 단일 주입이 투여된다. 일부 구현양태에서, rVWF의 2차 투여는 FVIII와 함께 투여된다. 일부 구현양태에서, rVWF의 3차 투여는 FVIII와 함께 투여된다.

일부 구현양태에서, 자연 출혈 에피소드를 가질 위험이 있는 VWD를 갖는 대상체는 rVWF 단일 주입이 투여되고, rFVIII는 투여되지 않는다. 일부 구현양태에서, rVWF의 2차 투여는 FVIII와 함께 투여된다. 일부 구현양태에서, rVWF의 3차 투여는 FVIII와 함께 투여된다.

일부 구현양태에서, 자연 출혈 에피소드를 가질 위험이 있는 VWD를 갖는 대상체는 rVWF 단일 주입이 투여되고, rFVIII는 투여되지 않는다. 일부 구현양태에서, rVWF의 2차 투여는 FVIII와 함께 투여되지 않는다. 일부 구현양태에서, rVWF의 3차 투여는 FVIII와 함께 투여된다.

일부 구현양태에서, 자연 출혈 에피소드를 가질 위험이 있는 VWD를 갖는 대상체는 rVWF 단일 주입이 투여되고, rFVIII는 투여되지 않는다. 일부 구현양태에서, rVWF의 2차 투여는 FVIII와 함께 투여된다. 일부 구현양태에서, rVWF의 3차 투여는 FVIII와 함께 투여되지 않는다.

일부 구현양태에서, 자연 출혈 에피소드를 가질 위험이 있는 VWD를 갖는 대상체는 rVWF의 1차 주입 및 2차 주입이 투여된다. 일부 구현양태에서, rVWF의 1차 및/또는 2차 주입은 FVIII와 함께 투여된다.

일부 구현양태에서, 자연 출혈 에피소드를 가질 위험이 있는 VWD를 갖는 대상체는 rVWF의 1차 주입, 2차 주입, 3차 주입이 투여된다. 일부 구현양태에서, rVWF의 1차, 2차 및/또는 3차 주입이 FVIII와 함께 투여된다.

방법의 일부 구현양태에서, rVWF 및 FVIII가 함께 투여되는 경우, rVWF 대 FVIII 비는 약 1.5:0.8이다. 방법의 일부 구현양태에서, rVWF 및 FVIII가 함께 투여되는 경우, rVWF 대 FVIII 비는 약 1.3:1이다. 방법의 일부 구현양태에서, rVWF 및 FVIII가 함께 투여되는 경우, rVWF 대 FVIII 비는 약 1.1:0.8이다. 방법의 일부 구현양태에서, rVWF 및 FVIII가 함께 투여되는 경우, rVWF 대 FVIII 비는 약 1.5:1이다. 방법의 일부 구현양태에서, rVWF 및 FVIII가 함께 투여되는 경우, rVWF 대 FVIII 비는 약 1.1:1.2이다.

일부 구현양태에서, 약 40IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 투여된다. 일부 구현양태에서, 약 45IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 투여된다. 일부 구현양태에서, 약 50IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 투여된다. 일부 구현양태에서, 약 55IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 투여된다. 일부 구현양태에서, 약 60IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 투여된다. 일부 구현양태에서, 약 65IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 투여된다. 일부 구현양태에서, 약 70IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 투여된다. 일부 구현양태에서, 약 75IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 투여된다. 일부 구현양태에서, 약 80IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 투여된다. 일부 구현양태에서, 약 40IU/kg-80IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 투여된다. 일부 구현양태에서, 약 50IU/kg-80IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 투여된다. 일부 구현양태에서, 약 40IU/kg-70IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 투여된다. 일부 구현양태에서, 약 50IU/kg-80IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 투여된다. 일부 구현양태에서, 약 40IU/kg-60IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 투여된다. 일부 구현양태에서, 약 50IU/kg-80IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 투여된다.

일부 구현양태에서, 40-80IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 주 2회 투여된다. 일부 구현양태에서, 50-80IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 주 2회 투여된다. 일부 구현양태에서, 40IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 주 2회 투여된다. 일부 구현양태에서, 45IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 주 2회 투여된다. 일부 구현양태에서, 50IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 주 2회 투여된다. 일부 구현양태에서, 55IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 주 2회 투여된다. 일부 구현양태에서, 60IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 주 2회 투여된다. 일부 구현양태에서, 65IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 주 2회 투여된다. 일부 구현양태에서, 70IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 주 2회 투여된다. 일부 구현양태에서, 75IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 주 2회 투여된다. 일부 구현양태에서, 80IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 주 2회 투여된다.

일부 구현양태에서, 40-80IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 주 3회 투여된다. 일부 구현양태에서, 50-80IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 주 3회 투여된다. 일부 구현양태에서, 40IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 주 3회 투여된다. 일부 구현양태에서, 45IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 주 3회 투여된다. 일부 구현양태에서, 50IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 주 3회 투여된다. 일부 구현양태에서, 55IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 주 3회 투여된다. 일부 구현양태에서, 60IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 주 3회 투여된다. 일부 구현양태에서, 65IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 주 3회 투여된다. 일부 구현양태에서, 70IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 주 3회 투여된다. 일부 구현양태에서, 75IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 주 3회 투여된다. 일부 구현양태에서, 80IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 주 3회 투여된다. 일부 구현양태에서, 50IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 적어도 매 72시간마다 투여된다.

일부 구현양태에서, 40-80IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 2일 또는 3일 마다 투여된다. 일부 구현양태에서, 50-80IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 2일 또는 3일 마다 투여된다. 일부 구현양태에서, 40IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 2일 또는 3일 마다 투여된다. 일부 구현양태에서, 45IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 2일 또는 3일 마다 투여된다. 일부 구현양태에서, 50IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 2일 또는 3일 마다 투여된다. 일부 구현양태에서, 55IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 2일 또는 3일 마다 투여된다. 일부 구현양태에서, 60IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 2일 또는 3일 마다 투여된다. 일부 구현양태에서, 65IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 2일 또는 3일 마다 투여된다. 일부 구현양태에서, 70IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 2일 또는 3일 마다 투여된다. 일부 구현양태에서, 75IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 2일 또는 3일 마다 투여된다. 일부 구현양태에서, 80IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 2일 또는 3일 마다 투여된다.

일부 구현양태에서, 40-80IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 3일 또는 4일 마다 투여된다. 일부 구현양태에서, 50-80IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 3일 또는 4일 마다 투여된다. 일부 구현양태에서, 40IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 3일 또는 4 마다 투여된다. 일부 구현양태에서, 45IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 3일 또는 4일 마다 투여된다. 일부 구현양태에서, 50IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 3일 또는 4일 마다 투여된다. 일부 구현양태에서, 55IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 3일 또는 4일 마다 투여된다. 일부 구현양태에서, 60IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 3일 또는 4일 마다 투여된다. 일부 구현양태에서, 65IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 3일 또는 4일 마다 투여된다. 일부 구현양태에서, 70IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 3일 또는 4일 마다 투여된다. 일부 구현양태에서, 75IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 3일 또는 4일 마다 투여된다. 일부 구현양태에서, 80IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 3일 또는 4일 마다 투여된다.

일부 구현양태에서, 40-80IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 7일(주)의 기간의 1일 및 5일, 2일 및 6일, 또는 3일 및 7일에 1회 투여된다. 일부 구현양태에서, 50-80IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 7일(주)의 기간의 1일 및 5일, 2일 및 6일, 또는 3일 및 7일에 1회 투여된다. 일부 구현양태에서, 40IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 7일(주)의 기간의 1일 및 5일, 2일 및 6일, 또는 3일 및 7일에 1회 투여된다. 일부 구현양태에서, 45IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 7일(주)의 기간의 1일 및 5일, 2일 및 6일, 또는 3일 및 7일에 1회 투여된다. 일부 구현양태에서, 50IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 7일(주)의 기간의 1일 및 5일, 2일 및 6일, 또는 3일 및 7일에 1회 투여된다. 일부 구현양태에서, 55IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 7일(주)의 기간의 1일 및 5일, 2일 및 6일, 또는 3일 및 7일에 1회 투여된다. 일부 구현양태에서, 60IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 7일(주)의 기간의 1일 및 5일, 2일 및 6일, 또는 3일 및 7일에 1회 투여된다. 일부 구현양태에서, 65IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 7일(주)의 기간의 1일 및 5일, 2일 및 6일, 또는 3일 및 7일에 1회 투여된다. 일부 구현양태에서, 70IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 7일(주)의 기간의 1일 및 5일, 2일 및 6일, 또는 3일 및 7일에 1회 투여된다. 일부 구현양태에서, 75IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 7일(주)의 기간의 1일 및 5일, 2일 및 6일, 또는 3일 및 7일에 1회 투여된다. 일부 구현양태에서, 80IU/kg의 rVWF가 자연 출혈의 예방을 위해 7일(주)의 기간의 1일 및 5일, 2일 및 6일, 또는 3일 및 7일에 1회 투여된다.

일부 구현양태에서, 대상체는 적어도 1개월 동안 자연 출혈의 예방적 치료를 받는다. 일부 구현양태에서, 대상체는 적어도 6개월 동안 자연 출혈의 예방적 치료를 받는다. 일부 구현양태에서, 대상체는 적어도 1년 동안 자연 출혈의 예방적 치료를 받는다. 일부 구현양태에서, 대상체는 적어도 2년 동안 자연 출혈의 예방적 치료를 받는다. 일부 구현양태에서, 대상체는 적어도 5년 동안 자연 출혈의 예방적 치료를 받는다. 일부 구현양태에서, 대상체는 적어도 10년 동안 자연 출혈의 예방적 치료를 받는다.

일부 구현양태에서, 중증 VWD를 갖는 대상체는 자연 출혈 에피소드의 예방 치료를 위해 주간 용량의 rVWF를 투여받는다. 일부 구현양태에서, 혈장-유래 VWF(pdVWF)의 주간 용량과 실질적으로 동일한 rVWF의 주간 용량이 자연 출혈의 예방을 위해 대상체에게 투여된다. 일부 구현양태에서, 혈장-유래 VWF(pdVWF)의 주간 용량과 기능적으로 동등한 rVWF의 주간 용량이 자연 출혈의 예방을 위해 대상체에게 투여된다. 일부 구현양태에서, 혈장-유래 VWF(pdVWF)의 주간 용량보다 약 10% 적은 rVWF의 주간 용량이 자연 출혈의 예방을 위해 대상체에게 투여된다. 일부 구현양태에서, 혈장-유래 VWF(pdVWF)의 주간 용량보다 약 10% 많은 rVWF의 주간 용량이 자연 출혈의 예방을 위해 대상체에게 투여된다.

일부 구현양태에서, rVWF의 주간 용량은 적어도 2회의 개별 용량 또는 적어도 2회의 주입으로 투여된다. 일부 구현양태에서, 대상체는 주당 적어도 2회 용량을 제공받는다. 일부 구현양태에서, rVWF의 주간 용량은 2회 주입으로 투여된다. 일부 구현양태에서, rVWF의 주간 용량은 2회의 정맥내 주입으로 투여된다. 어떤 경우에는 대상체에게 rVWF의 주간 용량을 2회 투여하거나 다시 말해서 rVWF를 주 2회 투여한다. 일부 구현양태에서, rVWF의 주간 용량은 2회 정맥내 주입으로 투여된다. 일부 구현양태에서, rVWF는 대상체에게 매주 2회 투여된다. 일부 구현양태에서, rVWF는 대상체에게 매 3일 또는 4일마다 투여된다. 일부 구현양태에서, rVWF의 1차 주입이 투여되고 rVWF의 2차 주입이 7일 기간에 걸쳐 4일 후에 투여된다. 일부 구현양태에서, rVWF는 자연 출혈의 예방 치료를 위해 7일 기간(1주)의 1일 및 5일에 1회 투여된다. 일부 구현양태에서, 대상체는 대상체가 1주의 기간의 1일째에 1차 주입 및 5일째에 2차 주입을 받도록 2회 주입으로 분할되는 주간 용량을 투여받는다. 일부 구현양태에서, rVWF는 자연 출혈의 예방 치료를 위해 1주 기간의 2일 및 6일에 1회 투여된다. 일부 구현양태에서, 대상체는 대상체가 1주의 기간의 2일째에 1차 주입을 받고 6일째에 2차 주입을 받도록 2회의 주입으로 분할되는 주간 용량을 투여받는다. 일부 구현양태에서, rVWF는 자연 출혈의 예방 치료를 위해 1주의 기간 중 3일 및 7일에 1회 투여된다. 일부 구현양태에서, 대상체는 대상체가 1주의 기간의 3일째에 1차 주입을 받고 7일째에 2차 주입을 받도록 2회의 주입으로 분할되는 주간 용량을 투여받는다. 일부 구현양태에서, rVWF의 주간 용량은 각 주입당 최대 80IU/kg의 rVWF이다. 일부 구현양태에서, rVWF의 주간 용량은 각 주입당 최대 80IU/kg의 rVWF의 2회의 정맥내 주입으로 분할된다.

일부 구현양태에서, rVWF의 주간 용량은 적어도 3회의 개별 용량 또는 적어도 3회의 주입으로 투여된다. 일부 구현양태에서, 대상체는 주당 적어도 3회 용량을 제공받는다. 일부 구현양태에서, rVWF의 매주 용량은 3회의 정맥내 주입으로 투여된다. 어떤 경우에는, 대상체에게 rVWF의 주간 용량을 3회 투여하거나 다시 말해서 rVWF를 주 3회 투여한다. 일부 구현양태에서, rVWF는 대상체에게 매주 3회 투여된다. 일부 구현양태에서, rVWF의 주간 용량은 각각의 주입이 다른 날에 투여되도록 3회의 정맥내 주입으로 투여된다. 일부 구현양태에서, rVWF는 대상체에게 매 2일 또는 3일마다 투여된다. 일부 구현양태에서, 7일 기간에 걸쳐 rVWF의 1차 주입이 투여되고, rVWF의 2차 주입이 2일 후에 투여되고, rVWF의 3차 주입이 3일 후에 투여된다. 일부 구현양태에서, rVWF는 자연 출혈의 예방 치료를 위해 7일 기간(주)의 1일, 3일 및 6일에 1회 투여된다. 일부 구현양태에서, 대상체는 대상체가 주의 기간의 1일째에 1차 주입, 3일째 2차 주입 및 6일째에 3차 주입을 받도록 3회 주입으로 분할되는 주간 용량을 투여받는다. 일부 구현양태에서, rVWF는 자연 출혈의 예방 치료를 위해 주 기간의 1일, 3일 및 6일에 1회 투여된다. 일부 구현양태에서, 대상체는 대상체가 주의 기간의 2일째에 1차 주입을 받고 4일째에 2차 주입을 받고, 7일째에 3차 주입을 받도록 3회의 주입으로 분할되는 주간 용량을 투여받는다. 일부 구현양태에서, rVWF는 자연 출혈의 예방 치료를 위해 1주의 기간 중 2일, 4일 및 7일에 1회 투여된다. 일부 구현양태에서, rVWF의 주간 용량은 각 주입당 최대 80IU/kg의 rVWF이다. 일부 구현양태에서, rVWF의 주간 용량은 각 주입당 최대 80IU/kg의 rVWF의 3회의 정맥내 주입으로 분할된다.

일부 구현양태에서, rVWF의 주간 용량은 단일 용량 또는 단일 주입으로 투여된다. 일부 구현양태에서, rVWF의 주간 용량은 단일 주입으로 투여된다. 일부 구현양태에서, rVWF의 주간 용량은 단일 정맥내 주입으로 투여된다. 일부 구현양태에서, 대상체가 이전에 pdVWF의 주간 용량을 1회 받은 경우, 대상체에게 rVWF의 주간 용량을 1회 투여된다. 일부 실시양태에서, 이러한 주입을 위한 rVWF의 주간 용량은최대 80IU/kg의 rVWF이다.

일부 구현양태에서, 대상체는 본원에 기재된 예방 치료를 받을 때 자연 출혈 사건에 대한 연간 출혈율(ABR)에서 적어도 5% 감소(예를 들어, 5%, 7%, 10%, 12%, 14%, 15%, 17%, 20%, 22%, 24%, 25%, 27%, 30%, 32%, 34%, 35%, 37%, 40%, 42%, 44%, 45%, 47%, 50% 또는 그 이상 감소)를 경험한다. 일부 구현양태에서, 대상체는 예방 치료를 받은 후 자연 출혈 사건에 대한 ABR에서 적어도 25% 감소(예를 들어, 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 그 이상 감소)를 경험한다. 일부 구현양태에서, 자연 출혈 에피소드의 횟수의 감소는 연간 출혈률(ABR)의 감소에 의해 표시된다. 일부 구현양태에서, 치료 전 ABR은 하기 공식에 기초하여 결정된다: 출혈 횟수/치료 요법이 아닌 날수. 일부 구현양태에서, 치료 전 ABR은 하기 공식에 기초하여 결정된다: 출혈 횟수/rVWF를 사용한 예방 치료 전 12개월. 일부 구현양태에서, 예방적 ABR(예방 치료 후 ABR)은 하기 공식에 기초하여 결정된다: 출혈 횟수/치료 요법의 날수.

일부 구현양태에서, 대상체는 rVWF를 사용한 예방 치료 과정 동안 자연 출혈 사건을 경험하지 않는다. 일부 구현양태에서, 대상체는 rVWF를 사용한 예방 치료 과정 동안 1 내지 2회의 자연 출혈 사건을 경험한다. 일부 구현양태에서, 대상체는 rVWF를 사용한 예방 치료 과정 동안 1-3회의 자연 출혈 사건을 경험한다. 일부 구현양태에서, 대상체는 rVWF를 사용한 예방 치료 과정 동안 3-5회의 자연 출혈 사건을 경험한다. 일부 구현양태에서, 대상체는 rVWF를 사용한 예방 치료 과정 동안 1-5회의 자연 출혈 사건을 경험한다. 일부 구현양태에서, 대상체는 rVWF를 사용한 예방적 치료 과정 동안 5회 초과의 자연 출혈 사건을 경험한다.

일부 구현양태에서, rVWF의 투여는 자연 출혈 사건의 수를 연간 0으로 감소시킨다. 일부 구현양태에서, rVWF의 투여는 자연 출혈 사건의 수를 연간 1회로 감소시킨다. 일부 구현양태에서, rVWF의 투여는 자연 출혈 사건의 수를 연간 2회로 감소시킨다. 일부 구현양태에서, rVWF의 투여는 자연 출혈 사건의 수를 연간 3회로 감소시킨다. 일부 구현양태에서, rVWF의 투여는 자연 출혈 사건의 수를 연간 4회로 감소시킨다. 일부 구현양태에서, rVWF의 투여는 자연 출혈 사건의 수를 연간 5회로 감소시킨다. 일부 구현양태에서, rVWF의 투여는 자연 출혈 사건의 수를 연간 5회 초과로 감소시킨다. 일부 구현양태에서, rVWF의 투여는 자연 출혈 사건의 수를 연간 1-5회로 감소시킨다. 일부 구현양태에서, rVWF의 투여는 자연 출혈 사건의 수를 연간 3-5회로 감소시킨다. 일부 구현양태에서, rVWF의 투여는 자연 출혈 사건의 수를 연간 1-3회으로 감소시킨다. 일부 구현양태에서, rVWF의 투여는 자연 출혈 사건의 수를 연간 5회 미만으로 감소시킨다. 일부 구현양태에서, rVWF의 투여는 자연 출혈 사건의 수를 연간 4회 미만으로 감소시킨다. 일부 구현양태에서, rVWF의 투여는 자연 출혈 사건의 수를 연간 3회 미만으로 감소시킨다. 일부 구현양태에서, rVWF의 투여는 자연 출혈 사건의 수를 연간 2회 미만으로 감소시킨다. 일부 구현양태에서, rVWF의 투여는 자연 출혈 사건의 수를 연간 1회 미만으로 감소시킨다.

일부 구현양태에서, 예방 치료는 자연 출혈 에피소드의 중증도(예를 들어, 경증, 보통 및 중증 출혈 에피소드), 발병률, 빈도 또는 지속기간을 감소시키거나 줄인다. 일부 구현양태에서, rVWF가 투여된 대상체는 예방 치료를 받지 않은 대조군 대상체보다 더 적은 자연 출혈 에피소드를 갖는다. 일부 구현양태에서, rVWF가 투여된 대상체는 치료를 시작하기 전과 비교하여 치료 과정에 걸쳐 더 적은 자연 출혈 에피소드를 갖는다.

일반적으로, 타입 1 VWD는 <30 IU/dL VWF:RCo, <30 IU/dL VWF:Ag, 낮거나 정상 FVIII, 및 >0.5-0.7IU/dL VWF:RCo/VWF:Ag 비율로 표시된다. 일부 구현양태에서, 타입 1 VWD로 진단된 대상체는 <20IU/dL VWF:RCo를 갖는다. 타입 2A VWD는 < 30IU/dL VWF:RCo, <30-200IU/dL VWF:Ag, 낮거나 정상 FVIII, 및 <0.5-0.7IU/dL VWF:RCo/VWF:Ag 비율로 표시된다. 타입 2B VWD는 <30-200IU/dL VWF:RCo, <30IU/dL VWF:Ag, 낮거나 정상 FVIII, 및 일반적으로 <0.5-0.7IU/dL VWF:RCo/VWF:Ag 비율로 표시된다. 타입 2M VWD는 <30IU/dL VWF:RCo, <30-200IU/dL VWF:Ag, 낮거나 정상 FVIII, 및 <0.5-0.7IU/dL VWF:RCo/VWF:Ag 비율로 표시된다. 타입 2N VWD는 30-2000 IU/dL VWF:RCo, 30-200IU/dL VWF:Ag, 매우 낮은 FVIII, 및 >0.5-0.7IU/dL VWF:RCo/VWF:Ag 비율로 표시된다. 타입 3 VWD는 <3IU/dL VWF:RCo, <3IU/dL VWF:Ag, 극히 낮은(<10IU/dL) FVIII로 표시되며, VWF:RCo/VWF:Ag 비율은 적용되지 않는다. 일부 구현양태에서, 타입 3 VWD로 진단된 대상체는 <3IU/dL VWF:Ag를 갖는다. 정상은 50-200IU/dL VWF:RCo, 50-200IU/dL VWF:Ag, 정상 FVIII, 및 >0.5-0.7IU/dL VWF:RCo/VWF:Ag 비율로 표시된다. 일부 구현양태에서, 대상체는 타입 3 VWD를 갖는다. 일부 구현양태에서, 대상체는 중증 타입 1 VWD를 갖는다. 일부 구현양태에서, 대상체는 중증 타입 2 VWD를 갖는다. 일부 구현양태에서, 대상체는 중증 타입 2A VWD를 갖는다. 일부 구현양태에서, 대상체는 중증 타입 2B VWD를 갖는다. 일부 구현양태에서, 대상체는 중증 타입 2M VWD를 갖는다. 일부 구현양태에서, 대상체는 중증 타입 3 VWD를 갖는다.

일부 구현양태에서, 예방 치료 효능은 타입 1 VWD를 갖는 환자에서 rVWF를 사용한 예방 치료 전의 수준과 비교하여 rVWF를 사용한 예방 치료 후 FVIII, VWF:RCo 및/또는 VWF:Ag 활성 수준의 개선에 의해 표시된다. 일부 구현양태에서, FVIII, VWF:RCo 및/또는 VWF:Ag 활성 수준의 개선은 활성 수준이 정상 수준, 예를 들어 타입 1 VWD가 없는 대상체의 수준에 더 근접하도록 활성 수준의 변화를 포함한다. 일부 구현양태에서, 예방 치료 효능은 중증 타입 1 VWD를 갖는 환자에서 rVWF를 사용한 예방 치료 전의 수준과 비교하여 rVWF를 사용한 예방 치료 후 FVIII, VWF:RCo 및/또는 VWF:Ag 활성 수준의 개선에 의해 표시된다. 일부 구현양태에서, FVIII, VWF:RCo, 및/또는 VWF:Ag 활성 수준의 개선은 활성 수준이 정상 수준, 예를 들어 중증 타입 1 VWD가 없는 대상체의 수준에 더 근접하도록 활성 수준의 변화를 포함한다. 일부 구현양태에서, 예방 치료 효능은 타입 2A VWD를 갖는 환자에서 rVWF를 사용한 예방 치료 전 수준과 비교하여 rVWF로 예방 치료 후 FVIII, VWF:RCo 및/또는 VWF:Ag 활성 수준의 개선에 의해 표시된다. 일부 구현양태에서, FVIII, VWF:RCo, 및/또는 VWF:Ag 활성 수준의 개선은 활성 수준이 정상 수준, 예를 들어 타입 2A VWD가 없는 대상체의 수준에 더 근접하도록 활성 수준의 변화를 포함한다. 일부 구현양태에서, 예방 치료 효능은 중증 타입 2A VWD를 갖는 환자에서 rVWF를 사용한 예방 치료 전 수준과 비교하여 rVWF로 예방 치료 후 FVIII, VWF:RCo 및/또는 VWF:Ag 활성 수준의 개선에 의해 표시된다. 일부 구현양태에서, FVIII, VWF:RCo, 및/또는 VWF:Ag 활성 수준의 개선은 활성 수준이 정상 수준, 예를 들어 중증 타입 2A VWD가 없는 대상체의 수준에 더 근접하도록 활성 수준의 변화를 포함한다. 일부 구현양태에서, 예방 치료 효능은 타입 2M VWD를 갖는 환자에서 rVWF를 사용한 예방 치료 전 수준과 비교하여 rVWF로 예방 치료 후 FVIII, VWF:RCo 및/또는 VWF:Ag 활성 수준의 개선에 의해 표시된다. 일부 구현양태에서, FVIII, VWF:RCo, 및/또는 VWF:Ag 활성 수준의 개선은 활성 수준이 정상 수준, 예를 들어 타입 2M VWD가 없는 대상체의 수준에 더 근접하도록 활성 수준의 변화를 포함한다. 일부 구현양태에서, 예방 치료 효능은 중증 타입 2M VWD를 갖는 환자에서 rVWF를 사용한 예방 치료 전 수준과 비교하여 rVWF로 예방 치료 후 FVIII, VWF:RCo 및/또는 VWF:Ag 활성 수준의 개선에 의해 표시된다. 일부 구현양태에서, FVIII, VWF:RCo, 및/또는 VWF:Ag 활성 수준의 개선은 활성 수준이 정상 수준, 예를 들어 중증 타입 2M VWD이 없는 대상체의 수준에 더 근접하도록 활성 수준의 변화를 포함한다. 일부 구현양태에서, 예방 치료 효능은 타입 2N VWD를 갖는 환자에서 rVWF를 사용한 예방 치료 전 수준과 비교하여 rVWF로 예방 치료 후 FVIII, VWF:RCo 및/또는 VWF:Ag 활성 수준의 개선에 의해 표시된다. 일부 구현양태에서, FVIII, VWF:RCo, 및/또는 VWF:Ag 활성 수준의 개선은 활성 수준이 정상 수준, 예를 들어 타입 2N VWD가 없는 대상체의 수준에 더 근접하도록 활성 수준의 변화를 포함한다. 일부 구현양태에서, 예방 치료 효능은 중증 타입 2N VWD를 갖는 환자에서 rVWF를 사용한 예방 치료 전 수준과 비교하여 rVWF로 예방 치료 후 FVIII, VWF:RCo 및/또는 VWF:Ag 활성 수준의 개선에 의해 표시된다. 일부 구현양태에서, FVIII, VWF:RCo, 및/또는 VWF:Ag 활성 수준의 개선은 활성 수준이 정상 수준, 예를 들어 중증 타입 2N VWD이 없는 대상체의 수준에 더 근접하도록 활성 수준의 변화를 포함한다. 일부 구현양태에서, 예방 치료 효능은 타입 3 VWD를 갖는 환자에서 rVWF를 사용한 예방 치료 전 수준과 비교하여 rVWF로 예방 치료 후 FVIII, VWF:RCo 및/또는 VWF:Ag 활성 수준의 개선에 의해 표시된다. 일부 구현양태에서, FVIII, VWF:RCo, 및/또는 VWF:Ag 활성 수준의 개선은 활성 수준이 정상 수준, 예를 들어 타입 3 VWD이 없는 대상체의 수준에 더 근접하도록 활성 수준의 변화를 포함한다. 일부 구현양태에서, 예방 치료 효능은 중증 타입 3 VWD를 갖는 환자에서 rVWF를 사용한 예방 치료 전 수준과 비교하여 rVWF로 예방 치료 후 FVIII, VWF:RCo 및/또는 VWF:Ag 활성 수준의 개선에 의해 표시된다. 일부 구현양태에서, FVIII, VWF:RCo, 및/또는 VWF:Ag 활성 수준의 개선은 활성 수준이 정상 수준, 예를 들어 중증 타입 3 VWD이 없는 대상체의 수준에 더 근접하도록 활성 수준의 변화를 포함한다. 일부 구현양태에서, FVIII, VWF:RCo, 및/또는 VWF:Ag 활성 수준의 개선은 활성 수준이 정상 수준, 예를 들어 어떠한 형태의 VWD도 갖지 않는 대상체의 수준에 더 근접하도록 활성 수준의 변화를 포함한다.

일부 구현양태에서, 대상체는 VWD 진단을 받았다. 일부 예에서, VWD 진단은 유전자 검사, 다량체 분석, 환자 병력 또는 이들의 조합에 의해 확인된다.

일부 구현양태에서, 대상체는 이전 12개월 이내에 적어도 1회의 자연 출혈 사건에 대해 치료를 받았다. 일부 구현양태에서, 대상체는 이전 12개월 이내에 1회 초과의 자연 출혈 사건에 대해 치료를 받았다. 일부 구현양태에서, 대상체는 이전 12개월 이내에 적어도 3회의 자연 출혈 사건에 대해 치료를 받았다. 일부 구현양태에서, 대상체는 이전 12개월 이내에 3회 이상의 자연 출혈 사건에 대해 치료를 받았다.

일부 구현양태에서, 대상체는 현재 자연 출혈 사건(예를 들어, 에피소드)에 대한 주문형 치료를 받고 있다. 일부 구현양태에서, 대상체는 현재 자연 출혈 사건을 치료하기 위해 VWF 요법(예를 들어, rVWF 또는 pdVWF 요법)을 받고 있다. 일부 구현양태에서, 대상체는 현재 자연 출혈 사건(예를 들어, 에피소드)에 대한 주문형 치료를 받고 있지 않다. 일부 구현양태에서, 대상체는 현재 자연 출혈 사건을 치료하기 위해 VWF 요법(예를 들어, rVWF 또는 pdVWF 요법)을 받고 있지 않다.

일부 구현양태에서, 대상체는 이전 12개월 이내에 pdVWF의 투여에 의해 자연 출혈에 대해 예방적으로 치료받았다. 일부 구현양태에서, 대상체는 이전 12개월 동안 pdVWF의 투여에 의해 자연 출혈에 대해 예방적으로 치료받았다. 일부 구현양태에서, 대상체는 적어도 이전 12개월 동안 pdVWF의 투여에 의해 자연 출혈에 대해 예방적으로 치료받았다. 일부 구현양태에서, 대상체는 이전 12개월 이내에 pdVWF의 투여에 의해 자연 출혈에 대해 예방적으로 치료받지 않았다. 일부 구현양태에서, 대상체는 이전 12개월 동안 pdVWF의 투여에 의해 자연 출혈에 대해 예방적으로 치료받지 않았다. 일부 구현양태에서, 대상체는 적어도 이전 12개월 동안 pdVWF의 투여에 의해 자연 출혈에 대해 예방적으로 치료받지 않았다.

일반적으로, 경미한 출혈은 대출혈에 대한 기준을 충족하지 않고 출혈로 인해 입원하게 된 급성 또는 아급성 임상적으로 명백한 출혈, 출혈에 대한 의사의 지시에 따른 의학적 또는 외과적 치료, 또는 출혈(Aristotle 임상 정의)에 대한 항혈전 치료법( 연구 약물 포함)의 변경을 특징으로 한다; 기타 모든 출혈(대 및 ICH 제외)(RE-LY 임상 정의); 대출혈의 기준을 충족하지 않지만 의학적 개입이 필요하고, 의사와 예정에 없던 접촉(방문 또는 전화), 연구 약물의 일시적 중단(즉, 투여 지연), 통증 또는 일상 활동 장애) Rocket-AF 임상 정의) 명백한 출혈; 임상적으로 관련된 출혈은 피부 혈종 > 25 cm², 지속 시간 > 5분의 자연 코피, 육안적 혈뇨, 자연 직장 출혈, >5분 동안의 치은 출혈, 입원으로 이어지는 모든 출혈, < 2U 수혈로 이어지는 모든 출혈 또는 조사자가 관련이 있다고 간주하는 기타 출혈(Petro 임상 정의)로 정의되고; 및/또는 CRNM(임상적으로 관련된 비-대출혈)은 급성 또는 아급성, 임상적으로 명백하고 대출혈은 아니고 출혈로 인해 입원, 출혈에 대한 의사의 지시에 따른 의학적 또는 외과적 치료 또는 항혈전 치료법의 변경 뿐만 아니라 대출혈 또는 CRNM 출혈에 대한 기준을 충족하지 않는 급성 임상적으로 명백한 사건으로 정의되는 경미한 출혈 사건으로 정의된다(Aristotle-J 임상 정의)(Wells G, Coyle D, Cameron C, 등. Safety, Effectiveness, and Cost-Effectiveness of New Oral Anticoagulants Compared with Warfarin in Preventing Stroke and Other Cardiovascular Events in Patients with Atrial Fibrillation [Internet]. Ottawa (ON): Canadian Agency for Drugs and Technologies in Health; 2012 Apr 9.3, CLINICAL REVIEW. www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK169813/). 경미한 출혈은 대출혈 또는 임상적으로 상당한 출혈의 기준을 충족하지 않는 것으로 정의된 사건; 상처로부터의 경미한 출혈(주사 부위의 출혈, 비출혈 또는 수술적 감압을 필요로 하지 않는 상처 혈종); 대출혈의 기준을 충족하지 않고 다음 중 1 이상과 관련된 명백한 출혈: 5분 초과 동안 지속되거나 개입이 필요한 비출혈, 최대 치수가 >5cm인 반상출혈 또는 혈종, 요도 카테터 관련 외상과 관련이 없는 혈뇨, NG 튜브의 삽관 또는 배치와 관련되지 않은 GI 출혈, 상처 혈종 또는 합병증, 약물 중단을 필요로 하는 결막하 출혈; GI 또는 요로의 경미한 출혈 및 주사 부위의 혈종; 및/또는 대출혈의 기준을 충족하지 않는 명백한 출혈을 포함할 수 있다. 예컨대 Sobieraj DM, Coleman CI, Tongbram V, 등. Venous Thromboembolism Prophylaxis in Orthopedic Surgery [인터넷]. Rockville (MD): Agency for Healthcare Research and Quality(US); 2012 Mar.(Comparative Effectiveness Reviews, No. 49.) Appendix F, Additional Evidence Tables. www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92309/ 참조.

일반적으로 대출혈은 혈전 및 지혈에 대한 국제 학회(ISTH) 표준에 의해 특징지어지며, 임의의 생명을 위협하는 및/또는 치명적인 출혈; 중요 부위 또는 장기로의 증상성 출혈을 포함하고 대출혈은 두개내(뇌내, 경막하) 및 두개외(GI, 비-GI) 출혈로 분리되었고(RE-LY 임상 정의); 중요한 해부학적 부위로의 증상성 출혈(Rocket-AF 임상 정의); 생명을 위협하는 복막후, 두개내, 안구내 또는 척수내 출혈; 또는 수술이 필요한 출혈(Artistotle-J 임상 정의)을 포함한다. 대출혈 사건에는 헤모글로빈이 적어도 20g/L 떨어지거나 전혈의 > 2 단위의 수혈(생명을 위협하는 출혈 정의에 언급된 밀집 세포; 생명을 위협하는 출혈에 대한 RE-LY 정의: 다음 기준의 하나 이상: (1) 치명적이고 증상성 두개내 출혈; (2) 헤모글로빈 수준이 적어도 5.0g/L의 감소; (3) 혈액 또는 밀집 세포의 적어도 4U의 수혈; (4) 정맥 수축 촉진제의 사용이 필요한 관련 저혈압; 또는 (5) 필요한 외과 개입); >2g/dL의 헤모글로빈 감소 또는 >2 단위 이상의 전혈/적혈구 수혈(ISTH 또는 Rocket-AF 임상 정의); 및/또는 수술 또는 ≥2U의 수혈이 필요한 출혈 또는 ≥2.0g/L 에피소드의 헤모글로빈 감소와 관련된 출혈이 있는 경우가 포함될 수 있다. 예컨대 Wells G, Coyle D, Cameron C, 등, Safety, Effectiveness, and Cost-Effectiveness of New Oral Anticoagulants Compared with Warfarin in Preventing Stroke and Other Cardiovascular Events in Patients with Atrial Fibrillation [인터넷]. Ottawa (ON): Canadian Agency for Drugs and Technologies in Health; 2012 Apr 9. 3, CLINICAL REVIEW. www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK169813/ 참조. 대출혈에는 >20g/L의 Hb 감소와 관련된 임상적으로 명백한 출혈; >2U 밀집 세포 또는 전혈의 수혈로 이어지는 임상적으로 명백한 출혈; 치명적, 후복막, 두개내, 안구내 또는 척수내 출혈; 치료 중단을 정당화하거나 재수술로 이어지는 출혈; 치명적, 후복막, 두개내 또는 척수내 출혈; 다른 중요한 기관과 관련된 출혈; 재수술로 이어지는 출혈; 출혈 지수가 ≥2인 명백한 출혈; 상처로부터의 대출혈(수술적 감압이 필요한 상처 혈종), 또는 상처와 관련이 없는 대출혈(위장관 또는 뇌내 출혈); Hb ≥2g/dL의 감소 또는 ≥2U RBC의 수혈 필요와 관련된 임상적으로 명백한 출혈; 두개내 또는 후복막(항응고제의 영구 중단으로 이어짐)이 포함될 수 있다. 예컨대 Sobieraj DM, Coleman CI, Tongbram V, 등. Venous Thromboembolism Prophylaxis in Orthopedic Surgery[Internet]. Rockville(MD): Agency for Healthcare Research and Quality (US);2012 Mar.(Comparative Effectiveness Reviews, No. 49.) Appendix F, Additional Evidence Tables. www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92309/ 참조.

rVWF의 조성물은 본원에 기재된 바와 같이 약제학적 제형에 함유될 수 있다. 이러한 제형은 경구, 국소, 경피, 비경구, 흡입 스프레이, 질, 직장 또는 두개내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본원에 사용된 용어 비경구는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 수조내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 일부 구현양태에서, rVWF는 정맥내 투여된다. 정맥내, 피내, 근육내, 유방내, 복강내, 척추강내, 안구후, 폐내 주사 및/또는 특정 부위에서의 외과적 이식에 의한 투여가 또한 고려된다. 일반적으로, 조성물에는 본질적으로 발열원 뿐만 아니라 수용자에게 해로울 수 있는 기타 불순물이 없다.

한 측면에서, 본 발명의 제형은 약물 제품의 치료적 순환 수준을 유지하기 위해 초기 볼루스 투여 후 연속 주입에 의해 투여된다. 다른 예로서, 본 발명의 화합물은 1회 용량으로 투여된다. 당업자는 우수한 의료 행위 및 개별 환자의 임상 상태에 의해 결정되는 바와 같이 효과적인 투여량 및 투여 요법을 용이하게 최적화할 것이다. 투여 경로는 정맥내, 복강내, 피하 또는 근육내 투여일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 투여 빈도는 약제의 약동학적 매개변수 및 투여 경로에 따라 다르다. 최적의 약제학적 제형은 투여 경로 및 원하는 투여량에 따라 당업자에 의해 결정된다. 예컨대 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042 pages 1435-1712 참조하고, 이의 개시 내용은 모든 목적, 특히 제제, 투여 경로 및 약제학적 제품의 투여량과 관련된 모든 교시를 위해 그 전체가 참고로 본원에 포함된다. 이러한 제형은 투여된 제제의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도 및 생체내 제거 속도에 영향을 미친다. 투여 경로에 따라, 적절한 용량은 체중, 체표면적 또는 기관 크기에 따라 계산된다. 적절한 용량-반응 데이터와 함께 혈액 수준 투여량을 결정하기 위해 확립된 검정법을 사용하여 적절한 투여량을 확인할 수 있다. 최종 투여량 치료법은 약물의 작용, 예를 들어 약물의 특이적 활성, 손상의 중증도 및 환자의 반응성, 환자의 연령, 상태, 체중, 성별 및 식이, 감염의 중증도, 투여 시간 및 기타 임상 요인을 수정하는 다양한 요인을 고려하여 주치의가 결정한다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 VWF의 전형적인 용량은 500μg/kg과 동일한 약 50IU/kg이다. 연구가 수행됨에 따라, 다양한 질병 및 상태에 대한 적절한 투여량 수준 및 치료 기간에 관한 추가 정보가 나타날 것이다.

본 발명의 실행은 달리 명시되지 않는 한, 유기 화학, 중합체 기술, 분자 생물학(재조합 기술 포함), 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 기술 및 설명을 사용할 수 있으며, 이들은 당해 기술내에 있다. 이러한 통상적인 기술은 중합체 배열 합성, 혼성화, 결찰 및 표지를 사용한 혼성화의 검출을 포함한다. 적합한 기술의 구체적인 예시는 아래의 예를 참조하여 얻을 수 있다. 그러나, 다른 동등한 통상적인 절차도 물론 사용될 수 있다. 이러한 기존 기술 및 설명은 게놈 분석와 같은 표준 실험실 매뉴얼에서 찾을 수 있다: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV), Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cells: A Laboratory Manual, PCR Primer: A Laboratory Manual, and Molecular Cloning: A Laboratory Manual (all from Cold Spring Harbor Laboratory Press), Stryer, L. (1995) Biochemistry (4th Ed.) Freeman, Highly stabilized York, Gait, "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" 1984, IRL Press, London, Nelson and Cox(2000), Lehninger, Principles of Biochemistry 3rd Ed., W. H. Freeman Pub., Highly stabilized York, N.Y. and Berg 등(2002) Biochemistry, 5th Ed., W. H. Freeman Pub., Highly stabilized York, N.Y., 이들 모두는 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.

본원 및 첨부된 청구범위에서 사용된 단수형 "하나"는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어 "하나의 항체"에 대한 언급은 복수의 이러한 항체를 포함하고 "하나의 숙주 세포"에 대한 언급은 당업자에게 공지된 하나 이상의 숙주 세포 및 그의 등가물에 대한 언급을 포함한다. 청구 범위는 임의의 요소를 제외하도록 작성될 수 있음을 추가로 유의한다. 이와 같이, 이 진술은 청구 요소의 인용 또는 "부정적" 제한의 사용과 관련하여 "단독", "오직" 등의 배타적 용어 사용에 대한 선행 근거로 사용하기 위한 것이다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 언급된 모든 간행물은 본원에 기재되어 있고 현재 기재된 발명과 관련하여 사용될 수 있는 장치, 조성물, 제형 및 방법론을 기술하고 개시하기 위한 목적으로 본원에 참고로 포함된다.

값의 범위가 제공되는 경우, 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한, 해당 범위의 상한 및 하한과 기타 명시된 또는 언급된 범위의 중간 값은 본 발명에 포함된다. 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 더 작은 범위에 독립적으로 포함될 수 있으며 또한 언급된 범위에서 구체적으로 배제된 제한에 따라 본 발명에 포함된다. 명시된 범위가 제한 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 포함된 제한 중 하나를 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.

상기 설명에서, 본 발명의 보다 완전한 이해를 제공하기 위해 다수의 특정 세부사항이 제시된다. 그러나, 본 발명이 이러한 특정 세부사항 중 하나 이상 없이도 실시될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 다른 예에서, 당업자에게 잘 공지된 잘 알려진 특징 및 절차는 본 발명을 모호하게 하는 것을 피하기 위해 설명되지 않았다.

본 발명이 주로 특정 구현양태를 참조하여 설명되었지만, 다른 구현양태가 본 개시내용을 읽을 때 당업자에게 명백해질 것이라는 것도 구상되고, 그러한 구현양태는 본 독창적인 방법에 포함되도록 의도된다.

실시예

실시예 1: 중증 폰 빌레브란트 질병(VWD)에서 재조합 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 사용한 예방의 효능 및 안전성: 전향적 설계, 3상, 공개-라벨, 국제 다기관 연구

도입

폰 빌레브란트 질병(VWD)을 갖는 환자는 혈소판 응집을 매개하고 순환에서 혈액 응고 인자 VIII(FVIII)를 안정화시키는 주요 지혈 기능을 갖는 거대 다량체 혈장 당단백질인 폰 빌레브란트 인자(VWF)의 양적 또는 질적 결핍으로 인해 지혈 장애가 있다(1-3). VWD를 가진 대부분의 환자는 경증에서 중간의 점막 출혈 및 외상이나 수술 후 출혈을 나타내지만, 특히 중증 질병이 있는 환자의 경우 생명을 위협하는 출혈이 발생할 수도 있다(1,2).

재조합 VWF(rVWF, vonicog alfa, VEYVONDI™; Baxalta Innovations GmbH, Takeda company, a Takeda company, Vienna, Austria)는 외인성 인간 또는 동물-유래 단백질의 첨가 없이 차이니즈 햄스터 난소 세포주에서 재조합 DNA 기술에 의해 제조된다(4). VWF-절단 프로테아제인 ADAMTS13에 노출된 혈장-유래 VWF(pdVWF) 농축액이 일반적으로 결핍된 초대형 다량체를 포함하는 전체 VWF 다량체 프로필을 VWF는 함유한다(5-7).

중증 VWD를 갖는 환자는 VWF 및 FVIII 수준을 유지하기 위해 예방 rVWF 치료로부터 이익을 얻을 수 있어서, 혈관절증, 비출혈 및 위장 출혈을 포함하는 자연 출혈 에피소드(BE)의 위험이 감소된다(8-13).

BE의 빈도 및 지속기간을 줄이면 적혈구 수혈의 필요성이 감소하고 관절병증을 포함하는 쇠약 동반 질환의 위험이 낮아질 수 있다(8,9).

연구 목적

본 연구의 목적은 중증 VWD를 갖는 환자에서 rVWF를 사용한 장기간 예방 치료의 효능 및 안전성을 조사하는 것이었다.

연구 설계

등록 전 연도에 BE를 조절하기 위해 pdVWF로 치료가 필요한 중증 VWD(기준선 VWF 리스토세틴 보조인자 활성 [VWF:RCo] <20 IU/dL)를 가진 성인 환자에서 rVWF를 사용한 지속적인 예방 치료의 효능, 안전성 및 약동학을 전향적으로 평가하기 위한 글로벌, 다기관, 공개-라벨, 3상 연구(NCT02973087, EudraCT no.: 2016-001478-14)가 본원에 설명되어 있다(도 1).

환자는 연구 등록 전에 받은 VWF 요법의 유형에 따라 1개 또는 2개의 코호트에 속한다: 주문형 치료(주문형 코호트) 및 pdVWF 제품을 사용한 예방 치료(스위치 코호트). 두 코호트의 환자는 1년 동안 예방 rVWF 치료를 받는다.

환자

출혈을 조절하기 위해 VWF 치료가 필요한 중증 VWD(기준선 VWF:RCo<20 IU/dL)로 진단된 18세 이상의 환자(주요 연구 적격성 기준은 도 2에 자세히 설명되어 있다). 연구 프로토콜은 관련 지역 윤리 위원회에 의해 승인되었고 모든 환자는 등록 전에 서면 동의서가 제공되어야 할 것이다.

연구 치료

환자는 하기에 기술된 바와 같이 rVWF 예방을 받았다.

주문형 코호트의 경우, 50±10IU/kg rVWF:RCo의 표준 예방 용량을 정맥내 주입에 의해 투여하였다. 용량은 최대 80IU/kg까지 증량할 수 있다.

모든 환자는 주 2회 투여를 시작하였다(도 3, 일정 A).

스위치 코호트의 경우, 이전에 받은 주간 pdVWF 용량의 ±10%와 동일한 주간 rVWF 용량을 주입당 최대 80IU/kg까지 2회의 정맥내 주입으로 나누었다(도 3, 일정 A). 임상적 판단에 따라 주간 용량을 3회 주입하였다(도 3, 일정 B); 주 1회 투여는 환자가 이전에 pdVWF로 주 1회 투여를 받은 경우에만 허용되었다.

rVWF 용량은 약동학 데이터, BE의 이력, 및 임상 및 실험실 평가로부터의 결과에 기초하여 명시된 범위로 추가로 개별화될 수 있었다. VWF 치료가 필요한 BE를 경험한 환자는 출혈을 치료하기 위해 rVWF를 받았다. 체중-조절된 투여량은 BE의 유형 및 중증도, 및 적절한 임상 및 실험실 측정을 기반으로 해야 한다. 재조합 FVIII(항혈우병 인자[재조합][ADVATE; Baxalta US Inc., a Takeda company, Lexington, MA])는 FVIII 수준의 즉각적인 증가가 임상적으로 표시되는 경우 투여되었다.

연구 동안 선택적 수술 또는 치과 시술이 필요한 환자는 rVWF로 치료하여 외과적 출혈을 관리한 다음 예방적 rVWF 치료 일정을 재개했다. 수술 전, FVIII 활성(FVIII:C) 수준이 경미한 또는 구강 수술의 경우 ≥0.4IU/mL, 또는 대수술의 경우 ≥0.8IU/mL의 권장 목표 수준인 경우, 재조합 FVIII 없이 rVWF를 투여했다.

연구 결과 측정 및 통계 분석

주요 연구 결과 측정은 도 4(표 3)에 나열되어 있다.

통계적 분석은 각각의 연구 코호트에서 타입 3 VWD를 갖는 적어도 5명의 환자 및 적어도 8명의 환자를 포함하는 대략 22명의 환자를 포함하였고; 공식적인 표본 크기 계산은 수행되지 않았다.

예방 rVWF 치료를 받은 모든 환자에 대해 일차 효능 분석을 수행했다. 자연 ABR은 각 연구 코호트(주문형 코호트 또는 스위치 코호트)에 대해 음의 이항 회귀를 사용하여 추정될 것이다. 연구 전 및 연구 중 자연 ABR의 비교는 스위치 코호트의 환자를 기반으로 했다. 평가는 일반화된 선형 혼합-효과 모델을 사용할 것이다. ABR 비율은 각 연구 코호트에 대해 양측 95% 신뢰 구간으로 보고되었다.

연구 현황 및 결론

이제 연구 등록이 완료되었다.

이 전향적 3상 연구의 결과는 중증 VWD를 갖는 환자에서 자연 출혈에 대한 예방을 위한 rVWF의 효능 및 안전성에 대한 데이터를 제공했다.

예방 rVWF 치료의 연구 기간은 1년이었고, 일차 효능 결과 측정은 자연(비외상성) 출혈에 대한 ABR이다.

일차 결과 측정

(rVWF)를 사용한 예방 치료 동안 자연(외상과 관련이 없는) 출혈 에피소드에 대한 전향적으로 기록된 연간 출혈률(ABR) 및 주문형 치료 동안 자연 출혈 에피소드에 대한 참가자의 과거 ABR(시간 프레임: 약 1년 ).

수정된 이차 결과 측정

주문형 치료 동안 참가자 자신의 과거 ABR에 비해 예방 동안 자연(외상과 관련이 없는) 출혈 에피소드에 대한 연간 출혈률(ABR)이 감소한 참가자의 수(시간 프레임: 약 1년).

재조합 폰 빌레브란트 인자(rVWF)를 사용한 예방 치료 동안 출혈이 0인 참가자의 수(시간 프레임: 약 1년).

예방 치료 동안 뿐만 아니라 주문형 치료 동안 월별 재조합 폰 빌레브란트 인자(rVWF) 및 ADVATE의 주입 횟수(시간 프레임: 약 1년).

예방 치료 동안 뿐만 아니라 주문형 치료 동안 연간 재조합 폰 빌레브란트 인자(rVWF) 및 ADVATE의 주입 횟수(시간 프레임: 약 1년).

예방 치료 동안 뿐만 아니라 주문형 치료 동안 월별 재조합 폰 빌레브란트 인자(rVWF) 및 ADVATE의 총 체중 조절된 소비(시간 프레임: 약 1년).

예방 치료 동안 뿐만 아니라 주문형 치료 동안 연간 재조합 폰 빌레브란트 인자(rVWF) 및 ADVATE의 총 체중 조절된 소비(시간 프레임: 약 1년).

혈전색전증 사건의 발생률(시간 프레임: 대략 22개월의 연구 기간 전체).

중증 과민 반응의 발생률(시간 프레임: 대략 22개월의 연구 기간 전체).

재조합 폰 빌레브란트 인자(rVWF) 및 인자 VIII(FVIII)에 대한 중화 항체를 발현시킨 참가자의 수(시간 프레임: 대략 22개월의 연구 기간 전체).

재조합 폰 빌레브란트 인자(rVWF) 및 인자 VIII(FVIII)에 대한 총 결합 항체를 발현시킨 참가자의 수(시간 프레임: 대략 22개월의 연구 기간 전체).

차이니즈 햄스터 난소(CHO) 단백질, 마우스 면역글로불린 G(IgG) 및 r푸린에 대한 항체를 발현시킨 참가자의 수(시간 프레임: 대략 22개월의 연구 기간 전체).

약동학 - 점진적 회복(IR)(시간 프레임: 주입 전 30분, 주입 후 30분 및 1, 6, 12, 24. 48, 및 72시간).

약동학 - 최종 반감기(T1/2)(시간 프레임: 주입 전 30분, 주입 후 30분 및 1, 6, 12, 24. 48, 및 72시간).

약동학 - 평균 체류 시간(MRT)(시간 프레임: 주입 전 30분, 주입 후 30분 및 1, 6, 12, 24. 48, 및 72시간).

약동학 - 곡선 아래 면적/용량(AUC/용량)(시간 프레임: 주입 전 30분, 주입 후 30분 및 1, 6, 12, 24. 48, 및 72시간).

약동학 - 모멘트 곡선 아래 면적/용량(AUMC/용량)(시간 프레임: 주입 전 30분, 주입 후 30분 및 1, 6, 12, 24. 48, 및 72시간).

약동학 - 정상 상태에서의 분포 부피(Vss)(시간 프레임: 주입 전 30분 및 주입 후 30분 및 1, 6, 12, 24. 48, 및 72시간).

약동학 - 제거(CL)(시간 프레임: 주입 전 30분, 주입 후 30분 및 1, 6, 12, 24. 48, 및 72시간).

자연 출혈 에피소드(BE) 당 재조합 폰 빌레브란트 인자(rVWF) 및 ADVATE(rFVIII)의 주입 횟수(시간 프레임: 연구 기간 전체, 최대 약 22개월).

외상성 출혈 에피소드(BE) 당 재조합 폰 빌레브란트 인자(rVWF) 및 ADVATE(rFVIII)의 주입 횟수(시간 프레임: 연구 기간 전체, 최대 약 22개월).

자연 출혈 에피소드(BE) 당 재조합 폰 빌레브란트 인자(rVWF) 및 ADVATE(rFVIII)의 체중-조절된 소비(시간 프레임: 연구 기간 전체, 최대 약 22개월).

외상성 출혈 에피소드(BE) 당 재조합 폰 빌레브란트 인자(rVWF) 및 ADVATE(rFVIII)의 체중-조절된 소비(시간 프레임: 연구 기간 전체, 최대 약 22개월).

출혈 해소 시 전반적인 지혈 효능 등급(시간 프레임: 연구 기간 전체, 최대 약 22개월). 4-점 척도를 사용: 우수, 양호, 보통, 없음.

수술이 필요한 경우, 수술 중 실제 혈액 손실 대 예상 혈액 손실(시간 프레임: 0일(수술 완료 시)). 수술 완료 시 수술 의사에 의한 평가.

수술이 필요한 경우, 수술 중 지혈 효능(시간 프레임: 0일(수술 완료 시)). 수술 완료 시 수술 외과의에 의한 평가-우수, 양호, 보통 또는 없음 척도의 점수.

선택적 수술의 경우: 24시간 및 rVWF의 마지막 수술기주위 주입 후 7일 및 14일에 지혈 효능의 전체 평가(시간 프레임: 24시간 및 rVWF의 마지막 수술기주위 주입 후 7일 및 14일). 우수, 양호, 보통 또는 없음의 척도로 점수.

매일의 수술 중 및 수술 후 체중-조절된 용량(시간 프레임: 수술 후 0일(수술일)부터 수술 후 14일까지). ADVATE를 포함하거나 포함하지 않는 rVWF의 수술 중 및 수술 후 체중-조절된 용량.

원래의 2차 결과 측정

주문형 치료 동안 참가자 자신의 과거 ABR에 비해 예방 동안 자연(외상과 관련되지 않는) 출혈 에피소드에 대한 연간 출혈률(ABR)이 감소한 참가자의 수(시간 프레임: 약 1년).

주문형 치료 동안 재조합 폰 빌레브란트 인자(rVWF) 및 ADVATE의 월별 주입 횟수(시간 프레임: 약 1년).

주문형 치료 동안 재조합 폰 빌레브란트 인자(rVWF) 및 ADVATE의 연간 주입 횟수(시간 프레임: 약 1년).

주문형 치료 동안 재조합 폰 빌레브란트 인자(rVWF) 및 ADVATE의 월별 총 체중-조절된 소비(시간 프레임: 약 1년).

주문형 치료 동안 재조합 폰 빌레브란트 인자(rVWF) 및 ADVATE의 연간 총 체중-조절된 소비(시간 프레임: 약 1년).

재조합 폰 빌레브란트 인자(rVWF) 및 인자 VIII(FVIII)에 대한 중화 항체를 발현시킨 참가자의 수(시간 프레임: 약 22개월의 연구 기간 전체).

외상성 출혈 에피소드(BE) 당 재조합 폰 빌레브란트 인자(rVWF) 및 ADVATE(rFVIII)의 체중-조절된 소비(기간: 연구 기간 전체, 최대 약 22개월).

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본 발명의 예시적인 구현양태가 여기에 제시되고 설명되었지만, 그러한 구현양태는 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 수많은 변형, 변경 및 대체가 이제 본 발명을 벗어나지 않고 당업자에게 발생할 것이다. 본원에 기술된 본 발명의 구현양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 이용될 수 있음을 이해해야 한다. 다음 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하고 이러한 청구범위 및 그 균등물의 범위 내의 방법 및 구조는 이에 의해 포함되는 것으로 의도된다.

위에 기재된 실시예는 본 발명의 조성물, 시스템 및 방법의 구현양태를 만들고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제공되며, 발명가가 자신의 발명으로 간주하는 범위를 제한하려는 의도가 아니다. 당업자에게 자명한 본 발명을 수행하기 위한 전술한 모드의 수정은 다음 청구범위의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 명세서에 언급된 모든 특허 및 간행물은 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자의 기술 수준을 나타낸다. 본 개시내용에 인용된 모든 참고문헌은 마치 각각의 참고문헌이 그 전체가 개별적으로 참고로 포함된 것과 동일한 정도로 참고로 포함된다.

모든 제목 및 섹션 지정은 명확성과 참조 목적으로만 사용되며 어떤 식으로든 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 예를 들어, 당업자는 여기에 기술된 본 발명의 사상 및 범위에 따라 적절하게 상이한 표제 및 섹션의 다양한 측면을 결합하는 유용성을 인식할 것이다.

본원에 인용된 모든 참고 문헌은 마치 각 개별 간행물 또는 특허 또는 특허 출원이 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

당업자에게 명백한 바와 같이, 본 출원의 많은 수정 및 변형이 그 정신 및 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다. 여기에 설명된 특정 구현양태 및 실시예 는 단지 예로서 제공되며, 그 적용은 청구범위가 부여된 균등물의 전체 범위와 함께 첨부된 청구범위의 항에 의해서만 제한되어야 한다.

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Cys Ala Asp Thr Arg 260 265 270 Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met 275 280 285 Lys Gln Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val 290 295 300 Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val 305 310 315 320 Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala Cys 325 330 335 Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln His Gly 340 345 350 Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln Ser Cys Glu 355 360 365 Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu Trp Arg Tyr Asn 370 375 380 Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln His Pro Glu Pro Leu 385 390 395 400 Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys His Ala His Cys Pro Pro 405 410 415 Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp 420 425 430 Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys 435 440 445 Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys 450 455 460 Asp Val Val Asn Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu 465 470 475 480 Val Val Pro Pro Thr Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val 485 490 495 Glu Asp Ile Ser Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu 500 505 510 Leu Asp Leu Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala 515 520 525 Glu Phe Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu 530 535 540 Arg Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp 545 550 555 560 Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser Glu 565 570 575 Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln Val Ala 580 585 590 Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile Phe Ser Lys 595 600 605 Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Thr Leu Leu Leu Met Ala Ser 610 615 620 Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val Arg Tyr Val Gln Gly 625 630 635 640 Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro Val Gly Ile Gly Pro His 645 650 655 Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn 660 665 670 Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp 675 680 685 Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro 690 695 700 Thr Leu Pro Pro Asp Met Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu 705 710 715 720 Gly Val Ser Thr Leu Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val 725 730 735 Ala Phe Val Leu Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn 740 745 750 Arg Ser Lys Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly 755 760 765 Gln Asp Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr 770 775 780 Val Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln 785 790 795 800 Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr Gly 805 810 815 Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser Gln Gly 820 825 830 Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr Gly Asn Pro 835 840 845 Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile Gln Val Val Pro 850 855 860 Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu Leu Glu Arg Ile Gly 865 870 875 880 Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp Phe Glu Thr Leu Pro Arg 885 890 895 Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu 900 905 910 Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp 915 920 925 Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe 930 935 940 Asp Glu Met Lys Ser Phe Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile 945 950 955 960 Gly Pro Arg Leu Thr Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr 965 970 975 Thr Ile Asp Val Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu 980 985 990 Ser Leu Val Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly 995 1000 1005 Asp Ala Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly 1010 1015 1020 Ala Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr Asp Val 1025 1030 1035 1040 Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn Arg 1045 1050 1055 Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala Ala Gln 1060 1065 1070 Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn Val Val Lys Leu 1075 1080 1085 Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val Thr Leu Gly Asn Ser Phe 1090 1095 1100 Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile Cys Met Asp Glu Asp 1105 1110 1115 1120 Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp Val Trp Thr Leu Pro Asp Gln Cys 1125 1130 1135 His Thr Val Thr Cys Gln Pro Asp Gly Gln Thr Leu Leu Lys Ser His 1140 1145 1150 Arg Val Asn Cys Asp Arg Gly Leu Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln 1155 1160 1165 Ser Pro Val Lys Val Glu Glu Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro 1170 1175 1180 Cys Val Cys Thr Gly Ser Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp Gly 1185 1190 1195 1200 Gln Asn Phe Lys Leu Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn 1205 1210 1215 Lys Glu Gln Asp Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro 1220 1225 1230 Gly Ala Arg Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val Lys His Ser Ala 1235 1240 1245 Leu Ser Val Glu Leu His Ser Asp Met Glu Val Thr Val Asn Gly Arg 1250 1255 1260 Leu Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu Val Asn Val Tyr 1265 1270 1275 1280 Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe Asn His Leu Gly His Ile Phe 1285 1290 1295 Thr Phe Thr Pro Gln Asn Asn Glu Phe Gln Leu Gln Leu Ser Pro Lys 1300 1305 1310 Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly Ile Cys Asp Glu Asn 1315 1320 1325 Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly Thr Val Thr Thr Asp Trp 1330 1335 1340 Lys Thr Leu Val Gln Glu Trp Thr Val Gln Arg Pro Gly Gln Thr Cys 1345 1350 1355 1360 Gln Pro Ile Leu Glu Glu Gln Cys Leu Val Pro Asp Ser Ser His Cys 1365 1370 1375 Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu Phe Ala Glu Cys His Lys Val Leu Ala 1380 1385 1390 Pro Ala Thr Phe Tyr Ala Ile Cys Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu 1395 1400 1405 Gln Val Cys Glu Val Ile Ala Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn 1410 1415 1420 Gly Val Cys Val Asp Trp Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser Cys 1425 1430 1435 1440 Pro Pro Ser Leu Val Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro Arg His 1445 1450 1455 Cys Asp Gly Asn Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser Glu Gly Cys 1460 1465 1470 Phe Cys Pro Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser Cys Val Pro Glu 1475 1480 1485 Glu Ala Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln Phe 1490 1495 1500 Leu Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro Cys Gln Ile Cys Thr Cys 1505 1510 1515 1520 Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys Pro Thr Ala 1525 1530 1535 Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg Leu Arg Gln Asn 1540 1545 1550 Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val Cys Asp Pro Val Ser 1555 1560 1565 Cys Asp Leu Pro Pro Val Pro His Cys Glu Arg Gly Leu Gln Pro Thr 1570 1575 1580 Leu Thr Asn Pro Gly Glu Cys Arg Pro Asn Phe Thr Cys Ala Cys Arg 1585 1590 1595 1600 Lys Glu Glu Cys Lys Arg Val Ser Pro Pro Ser Cys Pro Pro His Arg 1605 1610 1615 Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr Gln Cys Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala 1620 1625 1630 Cys Asn Cys Val Asn Ser Thr Val Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala 1635 1640 1645 Ser Thr Ala Thr Asn Asp Cys Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro 1650 1655 1660 Asp Lys Val Cys Val His Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe 1665 1670 1675 1680 Trp Glu Glu Gly Cys Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala 1685 1690 1695 Val Met Gly Leu Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp 1700 1705 1710 Ser Cys Arg Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys 1715 1720 1725 Gly Arg Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro Arg 1730 1735 1740 Gly Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp Ala Ser 1745 1750 1755 1760 Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val Lys Glu Glu 1765 1770 1775 Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln Leu Glu Val Pro 1780 1785 1790 Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys Thr Ser Ala Cys Cys 1795 1800 1805 Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala Cys Met Leu Asn Gly Thr 1810 1815 1820 Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val Met Ile Asp Val Cys Thr Thr Cys 1825 1830 1835 1840 Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val Ile Ser Gly Phe Lys Leu Glu Cys 1845 1850 1855 Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro Cys Pro Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn 1860 1865 1870 Asn Thr Gly Glu Cys Cys Gly Arg Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile 1875 1880 1885 Gln Leu Arg Gly Gly Gln Ile Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu 1890 1895 1900 Gln Asp Gly Cys Asp Thr His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu 1905 1910 1915 1920 Tyr Phe Trp Glu Lys Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His 1925 1930 1935 Lys Cys Leu Ala Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys 1940 1945 1950 Cys Asp Thr Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu 1955 1960 1965 Gln Tyr Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp Ile 1970 1975 1980 His Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser Ile Asp 1985 1990 1995 2000 Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro Thr Arg Thr 2005 2010 2015 Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His Cys Thr Asn Gly Ser Val Val Tyr 2020 2025 2030 His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys Ser Pro Arg Lys Cys 2035 2040 2045 Ser Lys 2050

Claims

적어도 약 40IU/kg 내지 약 80IU/kg 범위의 재조합 폰 빌레브란트 인자(rVWF)의 적어도 1회 용량을 매주 2회 대상체에게 투여함으로써 자연 출혈 에피소드의 빈도 및/또는 지속기간을 감소시키는 단계를 포함하는, 중증 폰 빌레브란트 질병(VWD)을 갖는 대상체에서 자연 출혈 에피소드를 예방적으로 치료하는 방법.
제 1항에 있어서, rVWF의 적어도 1회의 용량이 적어도 약 50IU/kg 내지 약 80IU/kg 범위인, 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 대상체가 20IU/dL 이하 범위의 기준선 VWF 리스토세틴 보조인자 활성(VWF:RCo)을 가지거나 타입 1 VWD로 진단되는, 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 대상체가 타입 2A, 2B 또는 2M VWD로 진단되는, 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 대상체가 3IU/dL 이상 범위의 VWF:항원 함량(VWF:Ag)을 가지거나 타입 3 VWD로 진단되는, 방법.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 rVWF의 초기 투여 전 지난 12개월 이내에 혈장-유래 VWF(pdVWF)의 예방 치료를 투여받은, 방법.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 지난 12개월 이내에 적어도 3회의 자연 출혈 에피소드를 경험한, 방법.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 3 내지 4일마다 발생하는, 방법.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 7일 기간의 1일 및 5일, 2일 및 6일, 또는 3일 및 7일에 발생하는, 방법.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 싱기 투여가 적어도 24시간, 36시간, 48시간, 72시간 또는 84시간마다 발생하는, 방법.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 적어도 72시간마다 발생하는, 방법.
제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 인자 VIII(rFVIII)의 적어도 1회 용량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제 12항에 있어서, 적어도 1회의 용량의 rFVIII의 투여가 적어도 1회의 용량의 rVWF의 투여와 동시에 또는 순차적으로 투여되는, 방법.
제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 선택적 수술 또는 구강 수술을 받은 후 예방 치료를 재개하는, 방법.
제 14항에 있어서, 상기 선택적 수술이 경미한 수술 또는 구강 수술이고 상기 대상체가 적어도 0.4IU/mL 이상의 FVIII 활성(FVIII:C)을 갖는 경우, 상기 대상체는 수술 전에 rFVIII 없이 rVWF를 투여받는, 방법.
제 14항에 있어서, 상기 선택적 수술이 대수술이고 상기 대상체가 적어도 0.8IU/mL 이상의 FVIII 활성(FVIII:C)을 갖는 경우, 상기 대상체는 수술 전에 rFVIII 없이 rVWF를 투여받는, 방법.
제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 예방 치료 효능이 치료 전 ABR에 비해 rVWF 예방 동안 자연 출혈 에피소드에 대한 연간 출혈률(ABR)의 ≥25% 감소에 의해 표시되는, 방법.
제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 예방 치료 효능이 치료 전 ABR에 비해 rVWF 예방 동안 자연 출혈 에피소드에 대한 연간 출혈률(ABR)의 ≥25%, ≥30%, ≥35%, ≥40%, ≥45%, ≥50%, ≥55%, ≥60%, ≥65%, ≥70%, ≥75%, ≥80%, ≥85%, ≥90%, 또는 ≥95% 감소에 의해 표시되는, 방법.
제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 예방 치료 효능이 rVWF를 사용한 예방 치료 전 및 후에 상기 대상체로부터 수득된 샘플에서 VWF:RCo 및/또는 FVIII 활성을 조사함으로써 측정되는, 방법.
제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 예방 치료 효능이 rVWF를 사용한 예방 치료 전 및 후에 상기 대상체로부터 수득된 샘플에서 FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, 및/또는 VWF 콜라겐-결합능 활성을 조사함으로써 측정되는, 방법.
제 19항 또는 제 20항에 있어서, FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag 및/또는 VWF 콜라겐-결합능 활성을 조사하기 위한 샘플은 rVWF를 사용한 예방 치료 후 15분, 30분, 60분, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간, 28시간, 32시간, 48시간, 72시간 또는 96시간에 수득되는, 방법.
제 19항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, 및/또는 VWF 콜라겐-결합능 활성을 조사하기 위한 샘플은 rVWF를 사용한 예방 치료 후 25 내지 31일에 수득되는, 방법.
제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 예방 치료 효능이 출혈 에피소드 이후 또는 동안에 결정되고, FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, 및/또는 VWF 콜라겐-결합능 활성을 조사하기 위한 샘플은 출혈 에피소드 후에 수득되고, 추가로 샘플은 rVWF 투여 전, rVWF 투여 2시간 후, 및 그후 출혈 에피소드가 해소될 때까지 12-24시간마다 수득되는, 방법.
제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 예방 치료 효능이 rVWF를 사용한 예방 치료 전의 수준과 비교하여 rVWF를 사용한 예방 치료 후 FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, 및/또는 VWF 콜라겐-결합능 활성 수준의 개선에 의해 표시되는, 방법.
이전에 대상체에게 투여된 혈장-유래 VWF(pdVWF)의 상응하는 주간 용량과 실질적으로 동일한 재조합 폰 빌레브란트 인자(rVWF)의 주간 용량을 상기 대상체에게 투여함으로써 자연 출혈 에피소드의 빈도 및/또는 지속기간을 감소시키는 단계를 포함하는, 중증 폰 빌레브란트 질병(VWD)을 갖는 대상체에서 자연 출혈 에피소드를 예방적으로 치료하는 방법.
제 25항에 있어서, rVWF의 주간 용량이 pdVWF의 상응하는 주간 용량보다 약 10% 더 적은, 방법.
제 25항에 있어서, rVWF의 주간 용량이 pdVWF의 상응하는 주간 용량보다 약 10% 더 많은, 방법.
제 25항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, rVWF의 주간 용량이 별도의 날에 투여되는 2회의 개별 주입인, 방법.
제 25항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, rVWF의 주간 용량이 별도의 날에 투여되는 3회의 개별 주입인, 방법.
제 25항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, rVWF의 주간 용량이 단일 주입인, 방법.
제 28항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 개별 주입이 최대 80 IU/kg rVWF를 포함하는, 방법.
제 28항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 개별 주입이 80 IU/kg rVWF를 포함하는, 방법.
제 28항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 개별 주입이 50 IU/kg rVWF를 포함하는, 방법.
제 25항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 20IU/dL 이하 범위의 기준선 VWF 리스토세틴 보조인자 활성(VWF:RCo)을 가지거나 타입 1 VWD로 진단되는, 방법.
제 25항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 타입 2A, 2B, 또는 2M VWD로 진단되는, 방법.
제 25항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 3IU/dL 이상 범위의 VWF:항원 함량(VWF:Ag)을 갖거나 타입 3 VWD로 진단되는, 방법.
제 25항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 적어도 12개월 동안 pdVWF의 예방 치료를 받은, 방법.
제 28항 및 제 31항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 2회의 개별 주입이 7일 기간의 1일 및 5일, 또는 2일 및 6일, 또는 3일 및 7일에 투여되는, 방법.
제 27항 및 제 31항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 3회의 개별 주입이 7일 기간의 1일, 3일 및 6일에 투여되는, 방법.
제 25항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 적어도 24시간, 36시간, 48시간, 72시간 또는 84시간마다 발생하는, 방법.
제 25항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 적어도 72시간마다 발생하는, 방법.
제 25항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1회 용량의 재조합 인자 VIII(rFVIII)를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제 42항에 있어서, 적어도 1회의 용량의 rFVIII의 투여가 rVWF의 주간 용량과 동시에 또는 순차적으로 투여되는, 방법.
제 25항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 선택적 수술 또는 구강 수술을 받은 후 예방 치료를 재개하는, 방법.
제 44항에 있어서, 상기 선택적 수술이 경미한 수술 또는 구강 수술이고 상기 대상체가 적어도 0.4IU/mL 이상의 FVIII 활성(FVIII:C)을 갖는 경우, 상기 대상체는 수술 전에 rFVIII 없이 rVWF를 투여받는, 방법.
제 44항에 있어서, 상기 선택적 수술이 대수술이고 상기 대상체가 적어도 0.8IU/mL 이상의 FVIII 활성(FVIII:C)을 갖는 경우, 상기 대상체는 수술 전에 rFVIII 없이 rVWF를 투여받는, 방법.
제 25항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 있어서, 예방 치료 효능이 치료 전 ABR에 비해 rVWF 예방 동안 자연 출혈 에피소드에 대한 연간 출혈률(ABR)의 ≥25% 감소에 의해 표시되는, 방법.
제 25항 내지 제 47항 중 어느 한 항에 있어서, 예방 치료 효능이 치료 전 ABR에 비해 rVWF 예방 동안 자연 출혈 에피소드에 대한 연간 출혈률(ABR)의 ≥25%, ≥30%, ≥35%, ≥40%, ≥45%, ≥50%, ≥55%, ≥60%, ≥65%, ≥70%, ≥75%, ≥80%, ≥85%, ≥90% 또는 ≥95% 감소에 의해 표시되는, 방법.
제 25항 내지 제 48항 중 어느 한 항에 있어서, 예방 치료 효능이 rVWF를 사용한 예방 치료 전 및 후에 대상체로부터 수득된 샘플에서 VWF:RCo 및/또는 FVIII 활성을 조사함으로써 측정되는, 방법.
제 25항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 예방 치료 효능이 rVWF를 사용한 예방 치료 전 및 후 대상체로부터 수득된 샘플에서 FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, 및/또는 VWF 콜라겐-결합능 활성을 조사함으로써 측정되는, 방법.
제 49항 또는 제 50항에 있어서, FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag 및/또는 VWF 콜라겐-결합능 활성을 조사하기 위한 샘플은 rVWF를 사용한 예방 치료 후 15분, 30분, 60분, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간, 28시간, 32시간, 48시간, 72시간 또는 96시간에 수득되는, 방법.
제 49항 내지 제 51항 중 어느 한 항에 있어서, FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, 및/또는 VWF 콜라겐-결합능 활성을 조사하기 위한 샘플은 rVWF를 사용한 예방 치료 후 25 내지 31일에 수득되는, 방법.
제 25항 내지 제 52항 중 어느 한 항에 있어서, 예방 치료 효능이 출혈 에피소드 이후 또는 동안에 결정되고, FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, 및/또는 VWF 콜라겐-결합능 활성을 검사하기 위한 샘플은 출혈 에피소드 후에 수득되고, 추가로 샘플은 rVWF 투여 전, rVWF 투여 2시간 후, 및 그후 출혈 에피소드가 해소될 때까지 12-24시간마다 수득되는, 방법.
제 25항 내지 제 53항 중 어느 한 항에 있어서, 예방 치료 효능이 rVWF를 사용한 예방 치료 전의 수준과 비교하여 rVWF를 사용한 예방 치료후 FVIII, FVIII:C, VWF:RCo, VWF:Ag, 및/또는 VWF 콜라겐-결합능 활성 수준의 개선에 의해 표시되는, 방법.
제 1항 내지 제 54항 중 어느 한 항에 있어서, 자연 출혈이 혈관절증, 비출혈, 근육 출혈, 구강 출혈, 및 위장 출혈로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 포함하는, 방법.
제 1항 내지 제 55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 타입 2N VWD 또는 가성 VWD로 진단되지 않는, 방법.