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KR20210097153A - 인지질 및 지방산 염의 분산액을 포함하는 제제 - Google Patents

인지질 및 지방산 염의 분산액을 포함하는 제제 Download PDF

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KR20210097153A
KR20210097153A KR1020217019809A KR20217019809A KR20210097153A KR 20210097153 A KR20210097153 A KR 20210097153A KR 1020217019809 A KR1020217019809 A KR 1020217019809A KR 20217019809 A KR20217019809 A KR 20217019809A KR 20210097153 A KR20210097153 A KR 20210097153A
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omega
acid
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마르틴 실링
마리오 고메츠
보도 스펙만
안느 베네딕트
크리스티안 케슬러
노르베르트 빈답
이네스 오흐롬벨
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에보니크 오퍼레이션즈 게엠베하
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Abstract

본 발명은 적어도 1종의 인지질, 및 지방산으로부터 유래된 음이온과 양이온의 적어도 1종의 지방산 염의 혼합물을 포함하는 제제에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 이러한 제제의 제조 방법, 및 예를 들어 세포 및 조직 배양, 기관 보존, 인간 또는 동물 영양, 또는 화장품 분야에서 세포, 조직, 기관 또는 유기체에 다중불포화 지방산을 제공하기 위한 이러한 제제의 용도에 관한 것이다.

Description

인지질 및 지방산 염의 분산액을 포함하는 제제
본 발명은 인지질 및 오메가-3 지방산 염을 함유하는 조성물, 이러한 조성물을 리포솜 형태로 제조하기 위한 제제 및 방법, 및 그의 적용을 기재한다.
오메가-3 지방산, 특히 도데카헥사엔산 (DHA) 및 에이코사펜타엔산 (EPA)은 인간 건강에 다양한 유익한 효과를 갖는 것으로 공지되어 있고, 다양한 세포 구성성분의 중요한 빌딩 블록이고, 신호전달 분자에 대한 전구체로서 작용한다.
이들 화합물의 주요 공급원은 어유 및 조류 오일 뿐만 아니라 일부 식물 유래된 오일이며, 여기서 이들은 트리글리세리드의 형태로 존재한다. 다양한 오일 뿐만 아니라 오일 유래된 에틸 에스테르가 상업적으로 입수가능하다.
식품 또는 영양 보충제로의 이들 오메가-3 공급원의 매일 소비가 제한되기 때문에, 이들 지방산의 최대 생체이용률을 보장하는 것이 중요하다. 소화계에서 소수성 영양소의 생체이용률은 보통 낮고, 특히 보충제에 대한 문제를 나타내는데, 이는 이들이 빈번하게 캡슐 또는 환제의 형태로 식사로부터 독립적으로 소비되기 때문이다. 소화액 (담즙산, 인지질, 리파제)의 분비는 공복 상태에서 거의 또는 전혀 유도되지 않으며, 이는 지방 및 오일의 불완전한 효소 가수분해, 낮은 가용화 및 생체이용률을 초래한다.
진보된 제제화 기술을 사용하여 소화계의 일부를 건너뛰어 소화계의 하부, 예를 들어 소장 또는 대장에서 오메가-3 지방산을 방출할 때, 추가의 생체이용률 문제가 발생한다. 각각의 방출 중합체로 코팅된 캡슐 또는 정제가 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다. 이들 시스템에서, 상기 언급된 자연 가용화 메카니즘은 보다 덜 효과적이며, 이는 생체이용률을 감소시키고, 적절한 수단에 의해 보상되어야 한다.
이는, 예를 들어 무혈청 세포 배양 배지 조성물의 일부로서, 시험관내 배양을 위한 분리된 세포 및 조직으로의 오메가-3 지방산의 공급에 대해서도 마찬가지이다. 이들 적용에서, 소화관에서의 가용화는 바람직하게는 생체적합성 및 생체이용률을 최대화하기 위해 자연 시스템에 근접한 제제에 의해 모방된다. 세포 배양 배지에 첨가하기 위해, 지방산을 멸균 필터를 통한 최적 통과를 허용하는 방식으로 배지에 분산시키는 것이 또한 필수적이다.
제제화, 오메가-3 지방산의 화학적 변형 또는 둘 다에 의해 생체이용률 문제를 해결하기 위한 다양한 접근법이 개발되었다.
하나의 유망한 접근법은 오메가-3 지방산 에스테르의 가수분해 및 후속 비누화이며, 이는 자연 소화 과정의 일부를 모방하여 용해도를 증가시킨다. WO2016102323A1에는 산화에 대해 안정화될 수 있는 다중불포화 오메가-3 지방산 염을 포함하는 조성물이 기재되어 있다.
제제는 또한 생체이용률을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, WO2010103402는 계면활성제를 함유하는 자가-유화 오일 제제가 위에서의 분산을 증가시키고 생체이용률을 증가시키는 것으로 밝혀졌음을 개시하고 있다. 이러한 시스템의 단점은 이들이 소비자에 의해 지속적으로 소비되지 않고 점점 덜 받아들여지는 비-이온성 합성 계면활성제를 통상적으로 필요로 한다는 것이다. 또 다른 단점은 물에 분산 후 미세한 오일 액적을 생성하는데 필요한 오일 또는 에틸 에스테르에 비해 다량의 계면활성제 및 보조계면활성제이다. 마지막으로, 이들 시스템은 여전히 액체 상태이며, 이는 이들이 산화되기 쉽게 하고, 통상적으로 항산화제의 첨가 및 가공 및 포장과 관련된 특별한 예방책을 필요로 한다.
인지질, 예컨대 포스파티딜콜린 (레시틴)은 고도로 생체적합적이고 용이하게 소화가능한 자연 양친매성 물질 및 식품 성분이다. 이들은 수십년 동안 식품 산업에서 유화제로서 및 영양 보충제로서 사용되어 왔다. 따라서, 인지질이 오메가-3 지방산 형태를 제제화하는데 사용되어 왔다는 것은 놀랍지 않다. 예를 들어, 문헌 [Alaarg et al. (International Journal of Nanomedicine 2016:11 5027-5040) 및 Hadian et al. (Iranian Journal of Pharmaceutical Research (2014), 13 (2): 393-404)]은 오메가-3 유리 지방산 및 에스테르로부터 인지질 기재, 리포솜 제제를 제조하였다.
그러나, 오메가-3 에스테르 및 지방산의 인지질 기재, 리포솜 제제는 또한 여러 단점을 갖는다. 오메가-3 트리글리세리드 및 에틸 에스테르는 단지 소량만이 리포솜 이중층에 안정하게 분산될 수 있도록 낮은 극성을 갖는다. 이들은 또한 오일 및 일부 인지질의 점착성 특징 때문에 추가의 부형제의 첨가 없이 건조에 의해 보다 농축된 분말상 형태로 전환되는 것이 어렵다. 유리 지방산의 사용은 유리 지방산의 중화를 필요로 하며, 이는 가공을 복잡하게 하고, 보다 낮은 리포솜 품질 및 안정성 및 또한 도입된 반대-이온, 예컨대 나트륨 또는 칼륨 (NaOH 또는 KOH를 통함)을 초래할 수 있으며, 이는 영양 및 다른 적용에서 바람직하지 않다.
놀랍게도, 상기 언급된 문제를 극복하는 오메가-3 제제는 인지질과 오메가-3 지방산 염의 혼합물로부터 제조될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 특히 반대 이온으로서 염기성 아미노산을 갖는 염은 유익한 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 한 측면은 1종 이상의 인지질, 및 오메가-3 또는 오메가-6 지방산으로부터 유래된 음이온과 양이온의 1종 이상의 지방산 염의 분산액을 포함하는 제제이다.
본 발명에 따른 분산액은 IUPAC 정의에 따르면 하나 초과의 상을 포함하는 물질이며, 여기서 상 중 적어도 하나는 연속 상 전체에 걸쳐 분산된, 보통 콜로이드 크기 범위의 미분된 상 도메인으로 이루어진다. 2개의 상은 동일한 또는 상이한 상태의 물질일 수 있다. 이들은 용해된 분자가 용질과 별개의 상을 형성하지 않는 용액과 상이하다. 본 발명은 콜로이드 (미니에멀젼 또는 마이크로에멀젼) 또는 현탁액 (1 μm 초과의 입자 크기를 갖는 에멀젼)으로서의 액체 매질 중 액체 상의 분산액, 및 콜로이드 (졸) 또는 현탁액 (1 μm 초과의 p 입자 크기를 가짐)으로서의 액체 매질 중 고체 상의 분산액 둘 다를 지칭한다. 또한, 본 발명은 고체 졸로 지칭되는 고체 연속 매질 중 고체 상의 분산액에 관한 것이다.
콜로이드는 1 nm 내지 1 μm의 분산상을 갖는 분산액이고, 액체상이 액체 연속 매질에 분산될 때 에멀젼으로서, 고체상이 액체 연속 매질에 분산될 때 졸로서 및 고체상이 고체 연속 매질에 분산될 때 고체 졸로서 정의된다.
이러한 분산액의 제조 방법은 개선되고 단순화될 수 있다. 조성물은 보다 우수한 품질 및 안정성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 바람직하지 않은 무기 반대이온, 예컨대 나트륨의 함량은 감소될 수 있다. 액체 형태의 멸균 여과는 오메가-3 지방산의 다른 형태에 비해 본 발명의 조성물에 의해 유의하게 촉진되었다. 본 발명의 조성물로부터 제조된 건조 분말은 가공을 용이하게 하는 보다 우수한 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
또한, 이러한 제제는 인간 세포를 포함한 미생물 및 동물에 대한 오메가-3 지방산의 생체이용률을 강하게 개선시키는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 조성물은 이중층을 형성할 수 있는 인지질 및 오메가-3 지방산의 염, 바람직하게는 오메가-3 지방산의 아미노산 염으로 이루어진다. 인지질은 복합 혼합물 (예를 들어, 탈유된 레시틴), 지방산 조성의 변화를 갖는 규정된 백본 (예를 들어, 불포화 또는 수소화된 지방산을 갖는 포스파티딜콜린) 또는 정제 및 규정된 화합물 (예를 들어, 디올레일포스파티딜 콜린, DOPC)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구성에서, 지방산은 에이코사펜타엔산 (EPA), 도코사헥사엔산 (DHA), 아라키돈산 (ARA), 알파 리놀렌산, 스테아리돈산, 에이코사테트라엔산, 도코사펜타엔산, 리놀레산, γ-리놀렌산 및/또는 그의 유도체로부터 선택되고, 바람직하게는 오메가-3 지방산 EPA 및 DHA로부터 선택된다.
추가의 바람직한 구성에서, 지방산 염에서의 양이온은 리신, 아르기닌, 오르니틴, 콜린 및 이들의 혼합물 중 하나로부터 유래된 유기 양이온이다.
본 발명의 대안적 구성에서, 인지질은 40 중량% 초과, 바람직하게는 70 중량% 초과, 바람직하게는 90 중량% 초과의 포스파티딜콜린 함량 및 5 중량% 미만, 바람직하게는 1 중량% 미만의 포스파티딜에탄올아민 함량을 포함하는 탈유 인지질이다.
대안적 실시양태에서, 인지질은 총 지방산의 70 중량% 초과의 올레산 및/또는 리놀레산 함량을 갖는 비-수소화 인지질이다.
본 발명의 추가의 바람직한 구성에서, 지방산 염에 대한 인지질의 질량비는 0.005 초과, 바람직하게는 0.01 초과, 보다 바람직하게는 0.09 초과, 가장 바람직하게는 0.39 초과이다.
대안적 실시양태에서, 제제는 pH 6.5 내지 7.5의 pH 값에서 물과 혼합될 때 1 μm 미만, 바람직하게는 500 nm 미만, 가장 바람직하게는 250 nm 미만의 평균 입자 크기를 갖는 콜로이드성 분산액을 생성하는 분말 또는 액체의 형태이다.
또 다른 실시양태에서, 성분은 서로 미세하게 분산되어 인지질 및 지방산 염 둘 다가 100 μg 이하의 양으로 존재하고 검출가능하도록 한다.
본 발명의 추가의 대상은 청구항 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 제제를 포함하는 배양 배지, 예컨대 세포 배양 배지이다.
바람직한 실시양태에서, 배양 배지는 액체 형태, 겔, 분말, 과립, 펠릿 형태 또는 정제 형태이다.
다른 바람직한 실시양태에서, 배양 배지는, 사용 중인 상기 배지의 농도에 비해, 2배, 3배, 3.33배, 4배, 5배 또는 10배 농축된 형태 (부피/부피)의 액체 배지이다. 이는 상기 농축된 배지를 각각의 부피의 멸균 수로 간단히 희석시킴으로써 "즉시 사용가능한" 배양 배지의 제조를 가능하게 한다. 이러한 본 발명의 배지의 농축된 형태는 또한, 예를 들어 공급 배치식 배양 방법에서 배양물에 이를 부가함으로써 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 적어도
a. 인지질 및 지방산 염을 함께 수혼화성 용매에 용해시키고, 소량의 물을 첨가하여 염을 완전히 용해시키는 단계;
b. 용액을 수성 시스템에 첨가하여 지질 분산액을 제조하는 단계;
c. 초음파처리 또는 균질화를 통해 지질 분산액의 입자 크기를 500 nm 미만, 바람직하게는 250 nm 미만의 평균 입자 크기로 감소시키는 단계;
d. 임의로, 바람직하게는 분무 또는 동결 건조를 통해 제제를 건조시키는 단계
를 포함하는, 본 발명에 따른 제제를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방법의 대안적 실시양태는 적어도
a. 인지질을 수혼화성 용매에 용해시키는 단계;
b. 지방산 염을 수성 시스템에 용해시키고 인지질 용액을 첨가하여 지질 분산액을 제조하는 단계;
c. 초음파처리 또는 균질화를 통해 지질 분산액의 입자 크기를 500 nm 미만, 바람직하게는 250 nm 미만의 평균 입자 크기로 감소시키는 단계;
d. 임의로, 바람직하게는 분무 또는 동결 건조를 통해 제제를 건조시키는 단계
를 포함한다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 수혼화성 용매는 하기 에탄올, 글리세롤 및 프로필렌 글리콜 중 하나 이상으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 제제의, 바람직하게는 세포 및 조직 배양, 기관 보존, 인간 또는 동물 영양, 제약 또는 화장품 분야에서 세포, 조직, 기관 또는 유기체에 다중불포화 지방산을 제공하기 위한 용도에 관한 것이다.
특정 실시양태는 본 발명에 따른 제제의, 중간엽 줄기 세포의 증식의 배양 및 자극을 위한 용도에 관한 것이다.
대안적 실시양태는 본 발명에 따른 제제의, 사료 또는 식품 보충제로서의 또는 제약 제품으로서의 용도를 지칭한다.
본 발명의 추가의 대상은 본 발명에 따른 제제 및 적어도 1종의 추가의 사료 또는 식품 구성요소, 바람직하게는 단백질, 탄수화물, 지방, 추가의 프로바이오틱스, 프리바이오틱스, 효소, 비타민, 면역 조절제, 우유 대체품, 미네랄, 아미노산, 항콕시디아증제, 산-기반 제품, 의약, 및 그의 조합으로부터 선택된 것을 함유하는 사료- 또는 식료품 조성물이다.
본 발명에 따른 사료- 또는 식료품 조성물은 또한 환제, 캡슐, 정제 또는 액체 형태의 식이성 보충제를 포함한다.
본 발명의 추가의 대상은 본 발명에 따른 제제 및 제약상 허용되는 담체를 함유하는 제약 조성물이다.
본 발명에 따른 제제는, 동물 또는 인간에게 투여되는 경우에, 바람직하게는 동물 또는 인간의 건강 상태, 특히 장 건강, 심혈관 건강, 심장-대사 건강, 폐 건강, 관절 건강, 눈 건강, 정신 건강, 구강 건강 또는 면역 건강을 개선시킨다.
따라서, 본 발명의 추가의 대상은 동물 또는 인간의 건강 상태, 특히 장 건강, 심혈관 건강, 심장-대사 건강, 폐 건강, 관절 건강, 눈 건강, 정신 건강, 구강 건강 또는 면역 건강을 개선시키기 위한 본 발명에 따른 조성물이고, 본 발명의 일부이다.
작업 실시예
오메가-3 지방산의 제제를 하기 방법으로 특징화하였다:
1.1 입자 크기 결정
동적 광 산란 (DLS) 측정 (제타사이저 나노 (Zetasizer Nano) ZS, 말번)을 통해 입자 크기를 결정하였다.
1.2 탁도 측정
제제의 탁도를 1 cm 광 경로를 갖는 큐벳에서 600 nm의 광도계에서 물로 100x 희석한 후에 측정하였다.
1.3 멸균 여과 특성
액체 제제 5 ml를 0.2 μm 멸균 시린지 필터를 통해 여과하였다. 여과의 용이성은 역압 증가 또는 완전한 막힘을 통해 평가하였다. 여과 전후에 600 nm에서의 광도측정을 통한 탁도 측정을 평가하였다. 보다 높은 탁도는 보다 큰 입자 크기와 상관관계가 있다. 탁도의 감소는 여과를 통한 물질 손실의 징후이며, 이는 샘플의 조성이 가능한 적게 변화되어야 하기 때문에 바람직하지 않다.
1.4 건조 및 분말의 특성 평가
제제를 동결 건조시키고, 건조 제제를 점조도 및 유동거동성에 대해 정성적으로 평가하였다.
실시예 1: 포스페이트 완충제 중 디올레일포스파티딜콜린 (DOPC)을 갖는 오메가-3 지방산 분산액의 제제 및 특징규명
오메가-3 지방산 분산액의 제제를 제조하기 위해 0.8 g의 디올레일포스파티딜콜린 (DOPC, 리포이드 게엠베하 (Lipoid GmbH))을 1 ml 에탄올 중에 용해시켰다. 0.2 g의 어유 (오메가-3 (Omega-3) 1400, 도펠헤르츠 (Doppelherz)®), 오메가-3 에틸 에스테르 (프로노바퓨어 (PronovaPure)® 500:200 EE, 바스프 (BASF)), 오메가-3 리신 염 형태의 유리 오메가-3 지방산의 리신 염 (아바일옴 (AvailOm)®, 에보닉 (Evonik)), 오메가-3 지방산 오르니틴 염, 또는 오메가-3 지방산 아르기닌 염을 첨가하고 용해시켰다. 리신 염은 에탄올에 용해되지 않았지만, 추가로 20 μl의 증류수가 첨가되었을 때 용해될 수 있음이 발견되었다.
오메가-3 리신 염 형태의 유리 오메가-3 지방산의 리신 염 (아바일옴®, 에보닉)은 약 67 %의 지방산 및 다량의 오메가-3 지방산 EPA 및 DHA 및 소량의 오메가-3 지방산 도코사펜타엔산 및 오메가-6 지방산 아라키돈산, 도코사테트라엔산 및 도코사엔산 이성질체를 함유한다.
1 ml의 각각의 용액을 45 ℃의 온도에서 강하게 교반하면서 20 ml의 0.1 M 포스페이트 완충제, pH=8에 적가하였다. pH를 필요한 경우에 NaOH를 사용하여 pH= 8로 조정하였다. 그 후, 분산액을 얼음 상에 놓고, 15 분 동안 초음파처리하여 (브랜슨 소니파이어 (Branson Sonifier), 100 % 진폭, 50 % 임펄스) 나노미터 규모 분산액, 아마도 리포솜을 생성하였다. 분산액을 0.2 μm 시린지 필터를 통해 멸균 여과하였다. 탁도 및 입자 크기를 1.2에 기재된 바와 같이 멸균 여과 전후에 측정하였다. 제제는 40 g/l 인지질 및 10 g/l 오메가-3 지방산 또는 에스테르를 함유하였다. 최종 단계에서, 분산액을 동결-건조시키고, 수득된 제제의 외관을 시각적으로 분석하였다.
놀랍게도, 오메가-3 지방산 리신, 아르기닌 또는 오르니틴 염을 사용하여 수득된 제제는 보다 작은 입자 크기를 가졌고, 최상의 여과 특성을 나타내었고, 동결-건조 후에 실질적으로 보다 덜 점착성인 분말을 생성한 것으로 밝혀졌다. 비교 실시예 (비교예)로서의 트리글리세리드 및 에틸 에스테르 및 지방산 리신, 아르기닌 및 오르니틴 염 (본 발명에 따름)에 대한 결과를 표 1에 요약하였다.
Figure pct00001
실시예 2: 물 중 DOPC를 사용한 오메가-3 지방산 및 오메가-3 지방산 리신 염 분산액의 제제
포스페이트 완충제 대신에 물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1에 기재된 바와 같이 제제를 제조하였다. 오메가-3 지방산 리신 염 (아베일옴®, 에보닉) 이외에도, 상응하는 오메가-3 유리 지방산을 사용하여 두 형태 사이의 차이를 결정하였다. 지질을 물에 첨가한 후 pH 전극을 사용한 pH 측정은 유리 산을 갖는 제제가 다소 산성이고, 적절한 분산을 얻기 위해 초음파처리 전에 NaOH를 사용하여 조정되어야 하는 반면, 각각의 염의 첨가는 염기의 첨가 없이 초음파처리를 통해 분산될 수 있는 적절한 pH를 갖는 제제를 생성하였음을 보여주었다. 놀랍게도, 오메가-3 지방산 리신 염 (2.2)을 함유하는 동결-건조된 생성물은 오메가-3 유리 지방산 (2.1 비교예)을 가공함으로써 수득된 분말보다 더 우수하게 유동하고 덜 점착성이었으며, 따라서 이러한 분말의 가공에 관한 이익을 제공한다. 결과를 표 2에 나타내었다.
Figure pct00002
실시예 3: 다양한 지방산 염 대 인지질의 비의 DOPC를 사용한 오메가-3 지방산 리신 염 분산액의 제제 및 특징규명
포스페이트 완충제 대신에 물을 사용하고, 상이한 비의 오메가-3 지방산 염 대 인지질을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1에 기재된 바와 같이 제제를 제조하였다. 수득된 수성 분산액은 모두 10 g/l의 오메가-3 지방산 염을 함유하였지만, 상이한 농도의 DOPC를 함유하였다. 인지질이 없는 오메가-3 지방산 염의 수성 콜로이드성 용액을 또한 비교를 위해 제조하였다. 수득된 분산액 5 ml를 pH= 7, 20 mM 포스페이트 완충제 45 ml 중에 희석하여, 입자 크기 및 탁도 측정을 통해 생리학적 pH에서의 분산 특성을 평가하였다. 희석된 분산액의 탁도를 마이크로플레이트 판독기 (테칸 인피니트 (Tecan Infinite) 200 프로)에서 100 μl의 액체 부피로 600 nm에서 96-웰 마이크로타이터 (well microtiter) 플레이트에서 측정하였다. 놀랍게도, 이미 소량의 DOPC가 인지질을 첨가하지 않은 오메가-3 지방산 염에 비해 오메가-3 지방산 염의 분산을 개선하기에 충분하다는 것이 밝혀졌다. 이는 감소된 탁도 및 보다 작은 입자 크기에 의해 입증될 수 있었다. 결과는 표 3에 요약되어 있다.
Figure pct00003
실시예 4: 물 중 레시틴을 갖는 오메가-3 지방산 분산액의 제제 및 특징규명
>90 중량%의 포스파티딜콜린 함량을 갖는 0.8 g의 탈유된 해바라기 레시틴/포스파티딜콜린 (리포이드(Lipoid) H 100)을 DOPC 대신에 사용한 것을 제외하고는, 실시예 3에 기재된 바와 같이 제제를 제조하였다. pH= 7의 포스페이트 완충제 중 희석물을 제조하고, 탁도를 실시예 3에 기재된 바와 같이 측정하였다. 결과는 표 4에 나타냈고, DOPC로 수득된 것과 대등하였다. 이미 소량의 인지질은 보다 낮은 탁도에 의해 나타난 바와 같이 이 pH 값에서 지방산 염의 훨씬 더 미세한 분산을 초래하였다. 차이는 또한 시각적으로 관찰하기가 용이하였다. 반면에 4.6은 다소 우윳빛으로 보였지만, 인지질 함유 조성물은 거의 투명하였고 단지 약간 탁하였다.
Figure pct00004
실시예 5: 물 중 디올레일포스파티딜콜린을 갖는 오메가-3 지방산 염 분산액을 제조하는 대안적 방법
본 발명에 따른 제제는 방법을 단순화하고 오메가-3 지방 유리 지방산 형태 또는 각각의 에스테르에 적합하지 않은 혼합 순서로 제조될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 오메가-3 지방산 리신 염을 인지질과 함께 에탄올 중에 용해시키는 대신에, 이를 10 g/l의 농도로 물에 직접 용해시키고, 에탄올계 인지질 용액을 후속적으로 첨가하였다. 그 후, 분산액을 상기 실시예에 기재된 바와 같이 초음파처리하고 멸균 여과하였다.
실시예 6: 균주 비. 메가테리움 ( B. megaterium ) DSM 32963에서 18-히드록시-에이코사펜타엔산 (18-HEPE)의 생산의 자극
그의 낮은 극성으로 인해, 오메가-3 지방산의 생체이용률은 보통 충분하지 않고, 단지 소량이 실제로 사용되고 생화학적 반응에서 세포에 의해 전환된다. 본 발명에 기재된 제제는 미생물 세포의 오메가-3 지방산의 생체이용률 및 대사 전환을 증진시키며, 이는 영양 적용, 예컨대 마이크로바이옴 이용 및 조정과 관련된다는 것을 나타낼 수 있다.
바실루스 메가테리움 DSM 32963은 자연적으로 발생한 분리물의 스크리닝에 의해 확인되었다. 이는 이전에 에보닉 데구사 게엠베하 (Evonik Degussa GmbH)의 명칭으로 언급된 수탁 번호 하에 특허 절차의 목적상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 규정 하에 2018년 11월 27일에 DSMZ에 기탁되었다.
표 1에 기재된 제제를 진탕 플라스크 내의 액체 배양물 내의 바실루스 메가테리움 DSM 32963의 미생물 배양물에 첨가하였다. 비교 목적을 위해, 동일한 오메가-3 지방산 농도를 갖는 물 중 오메가-3 지방산 리신 염 용액을 또한 첨가하였다. 바실루스 메가테리움 DSM 32963은 에이코사펜타엔산 (EPA)의 생물활성 18-히드록시-에이코사펜타엔산 (18-HEPE)으로의 전환을 촉매하는 것으로 밝혀졌다.
0.1 % 글루코스 (LBG)를 함유하는 루리아 베르타미 (Luria Bertami) 브로쓰 (LB, 써모 피셔 사이언티픽 (Thermo Fisher Scientific)) 10 ml로부터 비. 메가테리움 DSM 32963의 배양물을 100 ml 플라스크에서 24 시간 동안 30 ℃ 및 200 rpm에서 성장시켰다. 완전 배양물을 LBG 중 200 ml 주 배양물로 옮겼다. 주 배양물을 2 l 플라스크에서 30 ℃ 및 200 rpm에서 6 시간 동안 성장시켰다. 이어서, 세포 배양물을 10 ml 부분으로 수확하고, 상청액을 원심분리 (15 분, 4000 rpm, 실온)에 의해 제거하고, 세포 펠릿을 타우로콜레이트, 인지질 및 담즙 계면활성제를 모의하도록 설계된 다른 성분의 혼합물인 9.76 g/l FeSSIF-V2 (biorelevant.com)를 함유하는 10 ml LBG 또는 LBG 중에 재현탁시키고, 각각 실시예 2의 멸균 여과된 제제로부터 제조된 2 ml의 지질 원액을 첨가하여 각각의 실험 (표 5)에서 동일한 EPA 농도를 수득하였다. 추가로, 보충물을 또한 세포가 없는 진탕 플라스크 내의 상이한 배지에 각각 첨가하고, 동일한 조건 하에 처리하여 비-생화학적 생성물 형성을 제어하였다. 이들 배양물 및 각각의 대조군을 100 ml 진탕 플라스크에서 16 시간 동안 30 ℃ 및 200 rpm에서 인큐베이션하였다.
Figure pct00005
후속적으로, 세포를 원심분리 (15 분, 4000 rpm, 실온)에 의해 분리하고, 상청액을 취출하여 오메가-3 대사물의 존재에 대해 분석하였다. 상청액을 물/아세토니트릴 혼합물로 이루어진 용매 (상청액:용매의 비는 1:2였음, 용매 조성: 65 % H2O, pH 8 및 35 % MeCN)로 희석하였다.
희석된 상청액 샘플을 여과한 다음, m/z 318에서의 양성 SIM-모드 뿐만 아니라 m/z 302에서의 전구체 화합물 EPA에서의 LC/ESI-MS 분석 (애질런트 (Agilent) QQQ 6420, 제미니 (Gemini) 3μ C6-페닐)에 의한 18-히드록시-에이코사펜타엔산 (18-HEPE)의 검출에 사용하였다.
담즙 염의 존재 및 부재 하에, 오메가-3 지방산이 인지질과 함께 제제화된 오메가-3 리신 염으로서 바실루스 메가테리움 DSM 32963 세포에 제공된 경우에 18-HEPE가 형성되었고, 상청액에서 가장 효과적으로 검출되었다. 결과는 표 6에 요약되어 있다.
Figure pct00006
실시예 7: 인지질 분산된 오메가-3 지방산 염의 첨가에 의한 인간 골수 중간엽 기질 세포의 자극된 확장
인간 골수 중간엽 기질 세포 (MSC)는 의학적 목적을 위해 세포 요법의 형태로, 및 조직 공학을 위한, 예를 들어 시험관내 연골을 제조하기 위한 연골세포의 생성을 위한 특이적 세포 및 조직 유형을 유도하는데 사용된다. 이를 위해, 분리된 세포의 효율적인 확장/증식을 허용하는 적합한 배지 조성물을 필요로 한다. 일반적으로, 무혈청의 화학적으로 규정된 배지가 사용되는 경우 지질이 보충될 필요가 있는 것으로 가정된다. 기질 세포를 효율적으로 확장시키는 본 발명에 기재된 지질 제제의 적합성을 하기 구절에 기재된 바와 같이 평가하였다.
화학적으로 규정된 세포 배양 배지를 문헌 [Jung et al. (Cytotherapy, 2010; 12: 637-657)]에 기재된 바와 같이 제조하였다. 배지의 조성을 표 7에 나타내었다.
Figure pct00007
화학적으로 규정된 지질 농축물은 써모 피셔 사이언티픽 (카탈로그 번호 11905031)에 의해 수득되었고, 비-이온성 계면활성제 (폴리소르베이트 (Polysorbate) 80 및 플루로닉 (Pluronic) F-68)와 함께 제제화된 지방산 및 콜레스테롤의 혼합물로 이루어졌다.
화학적으로 규정된 지질 농축물이 없는 1개 및 화학적으로 규정된 지질 농축물이 DOPC로 제제화된 오메가-3 리신 염의 제제 (실시예 1.3)로 대체된 1개의 이 배지의 2개의 추가의 배치를 제조하였다. 액체 제제 0.1 ml를 1000x 희석에 상응하는 세포 배양 배지 100 ml에 첨가하여 약 10 mg/l의 지방산 농도를 생성하였다.
골수 단핵 세포로부터의 화학적으로 규정된 배지에서 유래된 인간 골수 중간엽 기질 세포를 스템셀 테크놀로지스 (StemCell Technologies)로부터 입수하고, 공급업체에 의해 권장된 바와 같이 해동시키고, 3가지 상이한 배지 버전으로 확장시켰다. 배지를 150,000개 세포/ml의 세포 밀도로 접종하고, 세포를 CO2 인큐베이터 내의 T25 세포 배양 플라스크에서 확장시켰다. 배지를 2-3일마다 교체하고, 세포를 조밀해지기 전에 계대접종하였다. 세포를 아큐타제 (Accutase)TM (스템셀 테크놀로지스)로 탈착시키고, 생존 세포 농도를 결정하고, 신선한 배지에 각 계대에서 150,000개 세포/ml를 접종하였다.
성장 성능의 지표로서 누적 집단 배가 (CPD)를 계대 횟수 및 측정된 세포 농도로부터 계산하였다. 놀랍게도, 문헌에 기재된 바와 같은 화학적으로 규정된 지질 농축물은 지질이 첨가되지 않은 배지 (CPD= 4.77)에 비해 CPD (CPD= 4.63)에 대해 긍정적인 효과를 갖지 않는 것으로 밝혀졌다. 이와 대조적으로, DOPC로 제제화된 오메가-3 리신 염의 첨가는 긍정적 효과를 가졌고, 7.37의 증가된 CPD를 초래하였다.

Claims (16)

  1. 적어도 1종의 인지질, 및
    오메가-3 또는 오메가-6 지방산으로부터 유래된 음이온과 양이온의 적어도 1종의 지방산 염
    의 분산액을 포함하는 제제.
  2. 제1항에 있어서, 지방산이 에이코사펜타엔산 (EPA), 도코사헥사엔산 (DHA), 아라키돈산 (ARA), 알파 리놀렌산, 스테아리돈산, 에이코사테트라엔산, 도코사펜타엔산, 리놀레산, γ-리놀렌산 및/또는 그의 유도체로부터 선택되고, 바람직하게는 오메가-3 지방산 EPA 및 DHA로부터 선택된 것인 제제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 지방산 염에서의 양이온이 리신, 아르기닌, 오르니틴, 콜린 및 이들의 혼합물 중 하나로부터 유래된 유기 양이온인 제제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인지질이 40 중량% 초과, 바람직하게는 70 중량% 초과, 보다 바람직하게는 90 중량% 초과의 포스파티딜콜린 함량 및 5 중량% 미만, 바람직하게는 1 중량% 미만의 포스파티딜에탄올아민 함량을 포함하는 탈유 인지질인 제제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 인지질이 총 지방산의 70 중량% 초과의 올레산 및/또는 리놀레산 함량을 갖는 비-수소화 인지질인 제제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 지방산 염에 대한 인지질의 질량비가 0.005 초과, 바람직하게는 0.01 초과, 보다 바람직하게는 0.09 초과, 가장 바람직하게는 0.39 초과인 제제.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, pH 6.5 내지 7.5의 pH 값에서 물과 혼합될 때 1 μm 미만, 바람직하게는 500 nm 미만, 가장 바람직하게는 250 nm 미만의 평균 입자 크기를 갖는 콜로이드성 분산액을 생성하는 분말 또는 액체의 형태인 제제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 성분이 서로 미세하게 분산되어 인지질 및 지방산 염 둘 다가 100 μg 이하의 양으로 존재하고 검출가능하도록 하는 것인 제제.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 제제를 포함하는 세포 배양 배지와 같은 배양 배지.
  10. 제9항에 있어서, 액체 형태, 겔, 분말, 과립, 펠릿 형태 또는 정제 형태인 배양 배지.
  11. 적어도
    a. 인지질 및 지방산 염을 함께 수혼화성 용매에 용해시키고, 소량의 물을 첨가하여 염을 완전히 용해시키는 단계;
    b. 용액을 수성 시스템에 첨가하여 지질 분산액을 제조하는 단계;
    c. 초음파처리 또는 균질화를 통해 지질 분산액의 입자 크기를 500 nm 미만, 바람직하게는 250 nm 미만의 평균 입자 크기로 감소시키는 단계;
    d. 임의로, 바람직하게는 분무 또는 동결 건조를 통해 제제를 건조시키는 단계
    를 포함하는, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 제제의 제조 방법.
  12. 적어도
    a. 인지질을 수혼화성 용매에 용해시키는 단계;
    b. 지방산 염을 수성 시스템에 용해시키고 인지질 용액을 첨가하여 지질 분산액을 제조하는 단계;
    c. 초음파처리 또는 균질화를 통해 지질 분산액의 입자 크기를 500 nm 미만, 바람직하게는 250 nm 미만의 평균 입자 크기로 감소시키는 단계;
    d. 임의로, 바람직하게는 분무 또는 동결 건조를 통해 제제를 건조시키는 단계
    를 포함하는, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 제제의 제조 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 수혼화성 용매가 에탄올, 글리세롤 및 프로필렌 글리콜 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 제제의, 바람직하게는 세포 및 조직 배양, 기관 보존, 인간 또는 동물 영양, 제약 또는 화장품 분야에서 세포, 조직, 기관 또는 유기체에 다중불포화 지방산을 제공하기 위한 용도.
  15. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 제제의, 중간엽 줄기 세포의 증식의 배양 및 자극을 위한 용도.
  16. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 제제의, 사료 또는 식품 보충제로서의 또는 제약 제품으로서의 용도.
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