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KR20210097807A - 샘플의 형광단을 스펙트럼 분해하기 위한 방법 및 이를 위한 시스템 - Google Patents

샘플의 형광단을 스펙트럼 분해하기 위한 방법 및 이를 위한 시스템 Download PDF

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KR20210097807A
KR20210097807A KR1020217022992A KR20217022992A KR20210097807A KR 20210097807 A KR20210097807 A KR 20210097807A KR 1020217022992 A KR1020217022992 A KR 1020217022992A KR 20217022992 A KR20217022992 A KR 20217022992A KR 20210097807 A KR20210097807 A KR 20210097807A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sample
fluorophore
processor
light
fluorophores
Prior art date
Application number
KR1020217022992A
Other languages
English (en)
Inventor
피터 마지
키건 오슬리
Original Assignee
벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니 filed Critical 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니
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Abstract

본 개시의 측면은 샘플에서 중첩하는 형광 스펙트럼을 갖는 형광단으로부터의 광을 스펙트럼으로 분해하는 방법을 포함한다. 특정 실시 예에 따른 방법은 중첩하는 형광 스펙트럼을 갖는 복수의 형광단을 갖는 샘플로부터 광 검출 시스템으로 광을 검출하는 단계 및 샘플의 각 형광단으로부터 광을 스펙트럼 분해하는 단계를 포함한다. 일부 실시 예에서, 방법은 입자 상에서와 같이, 샘플에서 하나 이상의 형광단의 풍부도를 추정하는 단계를 포함한다. 특정 예에서, 방법은 각 형광단의 풍부도를 기반으로 샘플에서 입자를 식별하고 입자를 분류하는 단계를 포함한다. 일부 실시 예에 따른 방법은 각 형광단의 형광 스펙트럼에 대한 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산함으로써 각 형광단으로부터 광을 스펙트럼 분해하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법을 실행하기 위한 시스템 및 집적 회로 장치 (예를 들어, 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이)도 제공된다.

Description

샘플의 형광단을 스펙트럼 분해하기 위한 방법 및 이를 위한 시스템
본 출원은 2018년 12월 28일에 출원된 미국 예비 특허 출원 번호 62/786,186; 2019년 2월 11일에 출원된 미국 예비 특허 출원 일련 번호 62/803,975; 및 2019년 10월 23일에 제출된 미국 예비 특허 출원 일련 번호 62/924,999에 관련되며, 이들 출원의 개시 내용은 본원에 참조로 포함되고 있다.
유세포 분류 분석기와 같은 유량형 입자 분류 시스템은 입자의 적어도 하나의 측정된 특성을 기반으로 유체 샘플의 입자를 분류하는 데 사용된다. 유량형 입자 분류 시스템에서, 유체 현탁액에 있는 분자, 분석물 결합 비드 또는 개별 세포(셀, cell)와 같은 입자는 센서가 분류될 유형의 스트림에 포함된 입자를 감지하는 감지 영역만큼 스트림 내에서 통과된다. 센서는, 분류될 유형의 입자를 감지할 때, 관심있는 입자를 선택적으로 분리하는 분류 메커니즘을 트리거한다.
입자 감지는 일반적으로 입자가 하나 이상의 레이저로부터 조사되는 광에 노출되는 감지 영역을 통해 유체 스트림을 통과시킴으로써 수행되고, 입자의 광 산란 및 형광 특성이 측정된다. 그 입자 또는 성분은 검출을 용이하게 하기 위해 형광 염료로 라벨링될 수 있으며, 다양한 입자 또는 성분을 라벨링하기 위해 스펙트럼적으로 구별되는 형광 염료를 사용하여 다수의 상이한 입자 또는 성분을 동시에 검출 할 수 있다. 검출은 하나 이상의 광 센서를 사용하여 수행되어 각 개별적인 형광 염료의 형광단의 독립적인 측정을 용이하게 할 수 있다.
샘플의 입자를 분류하기 위해서, 드롭 충전 메커니즘은 유동 스트림의 분리 지점에서 전하로 분류되는 입자 유형을 포함하는 유동 스트림의 액적을 충전한다. 액적은 정전기 장을 통과하여 액적의 극성 및 전하 크기에 기초하여 하나 이상의 수집 용기로 편향된다. 충전되지 않은 액적은 정전기 장에 의해 편향되지 않는다.
본 개시의 측면은 샘플에 중첩하는 형광 스펙트럼을 갖는 형광단으로부터 광을 스펙트럼 분해하는 방법을 포함한다. 특정 실시 예에 따른 방법은 중첩하는 형광 스펙트럼을 갖는 복수의 형광단을 갖는 샘플로부터 광 검출 시스템으로 광을 검출하는 단계 및 샘플에 있는 각 형광단으로부터의 광을 스펙트럼 분해하는 단계를 포함한다. 일부 실시 예에서, 방법은 입자에서와 같이, 샘플에 있는 하나 이상의 형광단의 풍부도를 추정하는 단계를 포함한다. 특정 예에서, 방법은 각 형광단의 풍부도를 기반으로 샘플에서 입자를 식별하고 입자를 분류하는 단계를 포함한다. 일부 실시 예에 따른 방법은 각 형광단의 형광 스펙트럼에 대한 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산함으로써 각 형광단으로부터 광을 스펙트럼 분해하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법을 실행하기 위한 시스템 및 집적 회로 장치 (예를 들어, 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이)도 제공된다.
일부 실시 예에서, 관심 샘플은 각 형광단의 형광 스펙트럼이 샘플에 있는 적어도 하나의 다른 형광단의 형광 스펙트럼과 중첩하는 복수의 형광단을 포함한다. 특정의 경우, 각 형광단의 형광 스펙트럼은 샘플에 있는 하나 이상의 다른 형광단의 형광 스펙트럼과 예를 들어 25 nm 이상 및 50 nm 이상을 포함하여, 10nm 이상 중첩한다. 일부 경우에, 예를 들어, 10nm 이상, 예를 들어 25nm 이상 및 50nm 이상을 포함하여, 샘플에 있는 하나 이상의 형광단의 형광 스펙트럼은 샘플에 있는 두 개의 다른 형광단의 형광 스펙트럼과 중첩한다. 다른 실시 예에서, 관심 샘플은 비중첩 형광 스펙트럼을 갖는 복수의 형광단을 포함한다. 이들 실시 예에서, 각 형광단의 형광 스펙트럼은 예를 들어 9 nm 이하, 예를 들어 8 nm 이하, 예를 들어 7 nm 이하, 예를 들어 6 nm 이하, 예를 들어 5 nm 이하, 예를 들어 4 nm 이하, 예를 들어 3 nm 이하, 2nm 이하, 1nm 이하를 포함하여, 10 nm 이하 내에서 적어도 하나의 다른 형광단에 인접한다.
일부 실시 예에서, 방법은 샘플에 있는 각 형광단의 형광 스펙트럼에 대한 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산함으로써 각 형광단으로부터 빛을 스펙트럼 분해하는 단계를 포함한다. 일부 경우, 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하는 단계는 가중 최소 제곱 알고리즘을 사용하는 단계를 포함한다. 일부 경우에 가중 최소 제곱 알고리즘은 다음에 따라 계산된다:
Figure pct00001
여기서 y는 각 세포에 대한 광 검출 시스템의 복수의 광 검출기로부터 측정된 검출기 값이고;
Figure pct00002
는 추정되는 형광단 풍부도이고; X는 스필오버이고; W는
Figure pct00003
이다. 일부 실시예에서, 각
Figure pct00004
는
Figure pct00005
에 따라 계산되고,
여기서 σi 2는 검출기 i에서의 분산이고; yi는 검출기 i에서의 신호이고; λi는 검출기 i에서 일정한 노이즈이다. 특정 실시예에서, 스펙트럼 비 혼합 행렬은 (XTWX)-1XTW에 따라 계산된다. 일부 경우에, (XTWX)는 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하기 위해 광 검출 시스템에 의해 검출된 각 세포에 대해 역전된다.
특정 실시 예에서, 방법은 광 검출 시스템에 의해 검출된 각 세포에 대한 가중 최소 제곱 알고리즘에서 (XTWX)의 역을 근사하는 단계를 포함한다. 일부 실시 예에서, (XTWX)을 역전하는 단계는 다음에 따라 반복적인 뉴턴-랩슨 계산법을 사용하여 (XTWX)를 근사화하는 단계를 포함한다:
A-1 = (XTWX)-1;
A0 -1 = (XTWGX)-1;
Figure pct00006
여기서 WG는 광 검출 시스템에서 각 광 검출기의 분산으로부터 결정되는 W의 미리 결정된 근사치이다(즉, 입자에 의한 형광단의 부재시). 일부 실시 예에서, 방법은 각 광 검출기의 분산을 추정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 예에서, 방법은 단일 오염 대조 샘플을 사용하여 광 검출기 노이즈 성분 (예를 들어, 전자 노이즈, 배경 광 등)을 결정하는 단계를 포함한다. 특정 예에서, 방법은 샘플을 광원으로 조사하기 전에 각 광 검출기의 분산을 결정하는 단계를 포함한다. 다른 경우에, 방법은 샘플에 광원을 조사하기 전에 미리 결정된 W의 근사치, WG를 결정하는 단계를 포함한다. 특정 실시 예에서, 방법은 미리 결정된 WG로 A0 -1을 사전 계산하는 단계를 포함한다. 이러한 실시 예에서, 미리 계산된 A0 -1은 광 검출 시스템에 의해 검출된 각 입자에 대한 A-1의 첫 번째 근사치로 사용될 수 있다.
다른 실시 예에서, 각각의 형광단으로부터의 광을 스펙트럼 분해하는 방법은 셔먼-모리슨 업데이터를 사용하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 셔먼-모리슨 공식을 사용하여 A를 계산하는 단계를 포함한다:
Figure pct00007
특정 경우에, 방법은 셔먼-모리슨 공식을 사용하여 A0의 섭동의 역을 계산하기 위해 A0 -1을 사전 계산하는 단계를 포함한다. 일부 실시 예에서, A0의 역은 공식 XTW0X에 의해 계산되고 A의 역은 공식 XTWX에 의해 계산된다. 일부 경우에, 방법은 다음에 따라 각 반복 W과 열 벡터의 곱으로 △A (즉, A-A0)를 계산하는 단계를 포함한다:
Figure pct00008
및
Figure pct00009
여기서,
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
및
Figure pct00013
및
Figure pct00014
실시 예에 따르면,
Figure pct00015
이고, 여기서 A는 다음과 같이 표현될 수 있다:
Figure pct00016
(1)
Figure pct00017
(2)
이들 실시 예에서, 각각의 A는 각각의 wi에 대한 변경을 사용하여 각각의 새로운 가중치 행렬 W (즉, W0와 다른 값을 사용)로 A0로부터 재계산될 수 있다. 일부 실시 예에서, 방법은 다음에 따라 스펙트럼 비 혼합 행렬을 근사화하기 위해 셔먼-모리슨 반복 역 업데이터를 수행하는 단계를 포함한다:
Figure pct00018
(3)
Figure pct00019
(4)
Figure pct00020
(5)
Figure pct00021
(6)
Figure pct00022
(7)
Figure pct00023
(8)
일부 실시 예에서, A0 -1에 대한 사전 계산된 값이 A1 -1을 계산하는 데 사용된다. 그런 다음 미리 계산된 A1 -1을 사용하여 A2 -1을 계산한다. 값 A-1은 i = 1에서 ND까지 각 (Ai-1)-1을 사용하여 Ai -1을 반복 계산하여 계산할 수 있다.
일부 실시 예에서, 각 형광단으로부터의 광을 스펙트럼 분해하기 위한 방법은 행렬 분해 (즉, 인수분해)에 의해 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 예를 들어 행렬이 하부 삼각(L) 행렬와 상부 삼각(U) 행렬의 곱으로 분해되는 경우와 같이, LU 행렬 분해를 포함한다. 특정 경우에, LU 분해에는 가우스 제거가 포함된다. 다른 경우에, LU 분해는 수정된 촐레스키 분해, LDL 분해를 포함하며 여기서 D는 대각 행렬이다. 특정 실시 예에서, 가중 최소 제곱 알고리즘 (a)은 다음에 따라 수정된 촐레스키(촐레스키) 분해를 사용하여 계산된다:
XTWXa = XTWy
Aa = B
LDLTa = B LDL 분해
Lz = B 여기서 z = DLTa 하부 삼각 행렬 솔루션
Dx = z 여기서 x = LTa 대각선 행렬 솔루션
LTa = x 상부 삼각 행렬 솔루션
다른 실시 예에서, 각각의 형광단으로부터의 빛을 스펙트럼 분해하는 방법은 QR 분해에 의해 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하는 단계를 포함한다. 일부 사례에서 QR 분해는 직교 (Q) 행렬과 상부 삼각 (R) 행렬의 곱인 행렬이다. 일부 실시 예에서, 가중 최소 제곱 알고리즘 (a)은 다음에 따라 QR 분해를 사용하여 계산된다:
Figure pct00024
또 다른 실시 예에서, 각 형광단으로부터 광을 스펙트럼 분해하는 방법은 특이값 분해(SVD)에 의해 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하는 단계를 포함한다. 어떤 경우에는 특이 값 분해는 곱
Figure pct00025
의 행렬이며 여기서 U와 V는 직교 행렬이고 Σ는
Figure pct00026
의 특이 값을 포함하는 대각 행렬이다. 특정 경우에 가중 최소 제곱 알고리즘 (a)은 다음에 따라 특이 값 분해를 사용하여 계산된다:
Figure pct00027
일부 실시 예에서, 샘플 (예를 들어, 입자상의)에 있는 하나 이상의 형광단의 풍부도는 각 형광단으로부터의 광을 스펙트럼 분해하여 결정된다. 일부 실시 예에서, 샘플에 있는 각 형광단으로부터의 광을 스펙트럼 분해하는 단계는 (예를 들어, 대상 입자 상의) 형광단의 형광 스펙트럼에 대한 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하는 단계를 포함한다. 일부 예에서, 방법은 입자에 대한 하나 이상의 형광단의 풍부도를 추정하고 각 형광단의 추정된 풍부도를 기반으로 샘플에서 입자를 식별하는 단계를 포함한다. 특정 예에서, 샘플에서 확인된 입자 (예를 들어, 생물학적 샘플의 세포)가 분류된다.
본 발명의 방법을 실행하기 위한 시스템도 제공된다. 특정 실시 예에 따른 시스템은 중첩하는 형광 스펙트럼을 갖는 복수의 형광단을 갖는 샘플을 조사하도록 구성된 광원; 복수의 광 검출기를 포함하는 광 검출 시스템; 및 프로세서에 작동 가능하게 결합된 메모리를 가진 프로세서를 포함하며, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때 상기 프로세서로 하여금 샘플의 각 형광단으로부터 빛을 스펙트럼으로 분해하게 하는 명령을 저장한다. 일부 실시 예에서, 프로세서는 프로세서에 의해 실행될 때, 프로세서로 하여그 샘플에 있는 각 형광단의 형광 스펙트럼에 대한 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산함으로써 각 형광단으로부터 형광을 스펙트럼 분해하도록 하는 명령을 저장하는 메모리를 포함한다. 일부 경우, 가중 최소 제곱 알고리즘은 다음에 따라 계산된다:
Figure pct00028
여기서 y는 각 세포에 대한 광 검출 시스템의 복수의 광 검출기로부터 측정된 검출기 값이고;
Figure pct00029
는 추정되는 형광단 풍부도이고; X는 스필오버이고; W는
Figure pct00030
이다. 일부 실시 예에서, 각 Wii는 다음에 따라 계산된다:
Figure pct00031
여기에서 σi 2는 검출기 i에서의 분산이고; yi는 검출기 i에서의 신호이고; λi는 검출기 i에서 일정한 노이즈이다. 특정 실시 예에서, 스펙트럼 비 혼합 행렬은 (XTWX)-1XTW에 따라 계산된다. 일부 경우, (XTWX)은 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하기 위해 광 검출 시스템에 의해 검출된 각 입자에 대해 역전된다.
특정 실시 예에서, 시스템은 컴퓨터 프로그램이 저장된 컴퓨터 판독 가능 저장 매체를 갖는 컴퓨터를 포함하고, 컴퓨터에 로드될 때 컴퓨터 프로그램은 샘플의 세포를 실시간으로 분류하기 위해 광 검출 시스템에 의해 검출된 각 세포에 대한 가중 최소 제곱 알고리즘에서 (XTWX)의 역을 근사하도록 하는 명령을 더 포함한다. 일부 실시 예에서, (XTWX)의 역은 다음에 따라 반복적인 뉴턴-랩슨 계산법을 사용하여 근사화된다:
A-1 = (XTWX)-1;
A0 -1 = (XTWGX)-1;
Figure pct00032
여기서 WG는 광 검출 시스템의 각 광 검출기의 분산으로부터 결정되는 미리 결정된 W의 근사치이다. 일부 실시 예에서 분산은 광 검출기 노이즈 성분을 갖는다. 예를 들어, 광 검출기 노이즈 성분은 전자 노이즈 및 광학적 배경 광 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시 예에서, 광 검출기의 분산은 광 검출기에 의해 측정 된 광의 강도에 비례한다. 일부 실시 예에서, 광 검출기 노이즈 성분은 단일 오염 대조 샘플을 사용하여 추정된다. 특정 실시 예에서, 메모리는 프로세서에 의해 실행될 때 프로세서로 하여금 광원으로 샘플을 조사하기 전에 각 광 검출기의 분산을 자동으로 결정하게 하는 명령을 저장한다. 다른 실시 예에서, 메모리는 프로세서에 의해 실행될 때, 프로세서로 하여금 샘플에 광원을 조사하기 전에 WG를 자동으로 미리 결정하도록 하는 명령을 저장한다. 특정 실시 예에서, 메모리는 프로세서에 의해 실행될 때 프로세서로 하여금 미리 결정된 WG로 A0 -1을 미리 계산하게 하는 명령를 저장하고 있다. 이러한 실시 예에서, 사전 계산된 A0 -1은 메모리에 저장되고 광 검출 시스템에 의해 검출된 각 입자에 대한 A-1의 제 1 근사치로서 프로세서에 의해 사용될 수 있다.
다른 실시 예에서, 시스템은 프로세서에 동작 가능하게 결합된 메모리를 갖는 프로세서를 포함하며, 여기서 메모리는 프로세서에 의해 실행될 때 프로세서가 셔먼-모리슨 반복 역 업데이터를 사용하여 각 입자에 대해 가중치가 적용된 최소 제곱 알고리즘을 근사하게 하는 명령을 저장하고 있다. 일부 경우, 메모리는 셔먼-모리슨 공식을 사용하여 A를 계산하기 위한 명령을 포함한다:
Figure pct00033
특정 경우에, 메모리는 셔먼-모리슨 공식을 사용하여 A0의 섭동의 역을 계산하기 위해 A0 -1을 사전 계산하기 위한 명령을 포함한다. 일부 실시 예에서, A0의 역은 공식 XTW0X에 의해 계산되고 A의 역은 공식 XTWX에 의해 계산된다. 일부 경우에, 메모리는 다음에 따라 각 반복 W를 갖는 열 벡터의 곱으로 △A (즉, A-A0)를 계산하기 위한 명령을 포함한다:
Figure pct00034
및
Figure pct00035
여기서,
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
및
Figure pct00039
및
Figure pct00040
실시 예에 따르면,
Figure pct00041
이고, 여기서 A는 다음과 같이 표현될 수 있다:
Figure pct00042
(1)
Figure pct00043
(2)
이들 실시 예에서, 각각의 A는 각각의 wi에 대한 변경을 사용하여 각각의 새로운 가중치 행렬 W (즉, W0와 다른 값을 사용)로 A0로부터 재 계산될 수 있다. 일부 실시 예에서, 시스템은 프로세서에 동작 가능하게 결합된 메모리를 갖는 프로세서를 포함하며, 여기서 메모리는 프로세서에 의해 실행될 때 프로세서로 하여금 다음에 따라 스펙트럼 비 혼합 행렬을 근사화하기 위해 셔먼-모리슨 반복 역 업데이터를 수행하게 하는 명령을 저장한다:
Figure pct00044
(3)
Figure pct00045
(4)
Figure pct00046
(5)
Figure pct00047
(6)
Figure pct00048
(7)
Figure pct00049
(8)
일부 실시 예에서, A0 -1에 대해 사전 계산된 값이 A1 -1을 계산하는 데 사용된다. 그런 다음 미리 계산된 A1 -1을 사용하여 A2 -1을 계산한다. 값 A-1은 i = 1에서 ND까지 각 (Ai-1)-1을 사용하여 Ai -1을 반복 계산하여 계산할 수 있다.
다른 실시 예에서, 시스템은 프로세서에 동작 가능하게 결합된 메모리를 갖는 프로세서를 포함하며, 여기서 메모리는 프로세서에 의해 실행될 때 프로세서가 행렬 분해에 의해 각 입자에 대해 가중치가 적용된 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 하는 명령이 저장되어 있다. 일부 경우에, 메모리는 예를 들어, 행렬이 하부 삼각 (L) 행렬와 상부 삼각 (U) 행렬의 곱으로 분해되는 것과 같이, LU 행렬 분해를 위한 명령을 포함한다. 특정 경우에, LU 분해에는 가우스 제거가 포함된다. 다른 경우에, LU 분해는 수정된 촐레스키 분해, LDL 분해를 포함하며 여기서 D는 대각 행렬이다. 특정 실시 예에서, 시스템은 프로세서에 동작 가능하게 결합된 메모리를 갖는 프로세서를 포함하며, 여기서 메모리는 프로세서에 의해 실행될 때 프로세서로 하여금 다음에 따라 수정된 촐레스키 분해를 사용하여 가중 최소 제곱 알고리즘 (a)을 계산하게 하는 명령을 저장한다:
XTWXa = XTWy
Aa = B
LDLTa = B LDL 분해
Lz = B 여기서 z = DLTa 하부 삼각 행렬 솔루션
Dx = z 여기서 x = LTa 대각선 행렬 솔루션
LTa = x 상부 삼각 행렬 솔루션
다른 실시 예에서, 시스템은 프로세서에 동작 가능하게 결합된 메모리를 갖는 프로세서를 포함하며, 여기서 메모리는 프로세서에 의해 실행될 때 프로세서로 하여금 QR 분해에 의해 가중치가 적용된 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 하는 명령을 저장한다. 일부 경우에 QR 분해는 직교 (Q) 행렬과 상부 삼각 (R) 행렬의 곱인 행렬이다. 일부 실시 예에서, 메모리는 다음에 따라 QR 분해를 사용하여 가중 최소 제곱 알고리즘 (a)을 계산하기 위한 명령을 포함한다:
Figure pct00050
또 다른 실시 예에서, 시스템은 프로세서에 동작 가능하게 결합된 메모리를 갖는 프로세서를 포함하며, 여기서 메모리는 프로세서에 의해 실행될 때 프로세서로 하여금 특이 값 분해(SVD)에 의해 가중치가 적용된 최소 제곱 알고리즘을 계산도록 하는 명령을 저장하고 있다. 어떤 경우에, 특이 값 분해는 곱
Figure pct00051
인 행렬이 되고, 여기서 U와 V는 직교 행렬이고 Σ는
Figure pct00052
의 특이 값을 포함하는 대각 행렬이다. 특정 경우에, 메모리는 다음에 따라 특이 값 분해를 사용하여 가중 최소 제곱 알고리즘 (a)을 계산하기 위한 명령을 포함한다:
z = UTy
Σw = z
a = Vw
일부 실시 예에서, 시스템은 작동 가능하게 연결된 메모리를 가진 프로세서를 포함하고, 메모리는 프로세서에 의해 실행될 때 프로세서로 하여금 계산된 스펙트럼 비 혼합 행렬을 기반으로 샘플에서 하나 이상의 형광단의 풍부도를 추정하도록 하는 명령을 저장한다. 특정 예에서, 메모리는 샘플의 입자에 있는 하나 이상의 형광단의 풍부도를 추정하기 위한 명령을 포함한다. 일부 실시 예에서 메모리는 입자상의 각 형광단의 추정된 풍부도에 기초하여 샘플에서 입자를 식별하기 위한 명령을 포함한다.
집적 회로 장치는 샘플에 있는 복수의 형광단에서 나오는 빛을 스펙트럼 분해하도록 프로그래밍되어 있다. 실시 예에서, 집적 회로 장치는 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이(FPGA), 주문형 지적 회로(ASIC) 또는 복합 프로그래머블 로직 장치(CPLD) 또는 일부 다른 집적 회로 장치일 수 있다. 일부 실시 예에서, 집적 회로 장치는 샘플에 있는 각 형광단의 형광 스펙트럼에 대한 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산함으로써 각 형광단으로부터 형광을 스펙트럼 분해하도록 프로그래밍된다. 일부 경우에, 가중 최소 제곱 알고리즘은 다음에 따라 계산된다:
Figure pct00053
여기서 y는 각 세포에 대한 광 검출 시스템의 복수의 광 검출기로부터 측정된 검출기 값이고;
Figure pct00054
는 추정되는 형광단 풍부도이고; X는 스필오버이고; W는
Figure pct00055
이다. 일부 실시 예에서, 각 Wii는 다음에 따라 계산된다:
Figure pct00056
여기에서 σi 2는 검출기 i에서의 분산이고; yi는 검출기 i에서의 신호이고; λi는 검출기 i에서 일정한 노이즈이다. 특정 실시 예에서, (XTWX)-1XTW에 따라 스펙트럼 비 혼합 행렬은 계산된다. 일부 경우에, 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하기 위해 광 검출 시스템에 의해 검출된 각 세포에 대해 (XTWX)가 역전된다.
일부 경우에, 집적 회로 장치는 샘플 내의 세포를 실시간으로 분류하기 위해 광 검출 시스템에 의해 검출된 각 분자에 대한 가중 최소 제곱 알고리즘에서 (XTWX)의 역을 근사화하도록 프로그래밍된다. 일부 경우, 다음에 따라 반복적인 뉴턴-랩슨 계산법을 사용하여 (XTWX)의 역이 근사화된다:
A-1 = (XTWX)-1;
A0 -1 = (XTWGX)-1;
Figure pct00057
여기서 WG는 광 검출 시스템의 각 광 검출기의 분산으로부터 결정되는 W의 미리 결정된 근사치이다. 일부 실시 예에서, 집적 회로는 각각의 광 검출기의 분산을 추가로 추정하도록 프로그래밍된다. 특정 경우, 집적 회로는 단일 오염 대조 샘플을 기반으로 하는 광 검출기 노이즈 성분의 추정치로 프로그래밍된다. 다른 경우에 각 광 검출기의 분산은 샘플에 광원이 조사되기 전에 집적 회로에 프로그래밍된다. 또 다른 경우에, 반복적인 뉴턴-랩슨 계산법에서 W의 미리 결정된 근사값, WG는 샘플이 광원으로 조사되기 전에 집적 회로에 프로그래밍된다. 특정 실시 예에서, 집적 회로 장치는 미리 결정된 WG로 A0 -1을 미리 계산하도록 프로그래밍된다. 이러한 실시 예에서, 사전 계산된 A0 -1은 집적 회로 장치에 프로그래밍되고 광 검출 시스템에 의해 검출된 각 입자에 대한 A-1의 제 1 근사치로서 사용될 수 있다.
다른 실시 예에서, 관심 집적 회로 장치는 셔먼-모리슨 반복 역 업데이터를 사용하여 각 입자에 대한 가중 최소 제곱 알고리즘을 근사하도록 프로그래밍된다. 일부 경우에, 집적 회로 장치는 셔먼-모리슨 공식을 사용하여 A를 계산하도록 프로그래밍된다:
Figure pct00058
특정 경우에, 집적 회로 장치는 셔먼-모리슨 공식을 사용하여 A0의 섭동의 역을 계산하기 위해 A0 -1을 사전 계산하도록 프로그래밍된다. 일부 실시 예에서, A0의 역은 수식 XTW0X에 의해 계산되고 A의 역은 수식 XTWX에 의해 계산된다. 일부 경우에, 집적 회로 장치는 다음에 따라 열 벡터와 각 반복 W의 곱으로 △A (즉, A-A0)를 계산하도록 프로그래밍된다:
Figure pct00059
및
Figure pct00060
여기서,
Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
및
Figure pct00064
및
Figure pct00065
실시 예에 따르면,
Figure pct00066
이고, 여기서 A는 다음과 같이 표현될 수 있다:
Figure pct00067
(1)
Figure pct00068
(2)
이들 실시 예에서, 각각의 A는 각각의 wi에 대한 변경을 사용하여 각각의 새로운 가중치 행렬 W (즉, W0와 다른 값을 사용)로 A0로부터 재계산될 수 있다. 일부 실시 예에서, 집적 회로 장치는 다음에 따른 스펙트럼 비 혼합 행렬을 근사하기 위한 셔먼-모리슨 반복 역 업데이터를 수행하도록 프로그래밍된다:
Figure pct00069
(3)
Figure pct00070
(4)
Figure pct00071
(5)
Figure pct00072
(6)
Figure pct00073
(7)
Figure pct00074
(8)
일부 실시 예에서, A0 -1에 대한 사전 계산된 값이 A1 -1을 계산하는 데 사용된다. 그런 다음 미리 계산된 A1 -1을 사용하여 A2 -1을 계산한다. 값 A-1은 i = 1에서 ND까지 각 (Ai-1)-1을 사용하여 Ai -1을 반복 계산하여 계산할 수 있다.
다른 실시 예에서, 관심 집적 회로 장치는 행렬 분해에 의해 각 입자에 대한 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 프로그래밍된다. 일부 경우에, 집적 회로 장치는 예를 들어, 행렬이 하부 삼각 (L) 행렬와 상부 삼각 (U) 행렬의 곱으로 분해되는 경우와 같이, LU 행렬 분해를 위한 명령을 위해 프로그래밍된다. 특정 경우에 LU 분해에는 가우스 제거가 포함된다. 다른 경우에, LU 분해는 수정된 촐레스키 분해, LDL 분해를 포함하며 여기서 D는 대각 행렬이다. 특정 실시 예에서, 집적 회로 장치는 다음에 따라 수정된 촐레스키 분해를 사용하여 가중 최소 제곱 알고리즘 (a)을 계산하도록 프로그래밍된다.
XTWXa = XTWy
Aa = B
LDLTa = B LDL 분해
Lz = B 여기서 z = DLTa 하부 삼각 행렬 솔루션
Dx = z 여기서 x = LTa 대각선 행렬 솔루션
LTa = x 상부 삼각 행렬 솔루션
다른 실시 예에서, 집적 회로 장치는 QR 분해를 통해 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 프로그래밍되어 있다. 일부 사례에서 QR 분해는 직교 (Q) 행렬과 상부 삼각 (R) 행렬의 곱인 행렬이다. 일부 실시 예에서, 집적 회로 장치는 다음에 따라 QR 분해를 사용하여 가중 최소 제곱 알고리즘 (a)을 계산하도록 프로그래밍된다:
Figure pct00075
또 다른 실시예에서, 집적 회로 장치는 특이 값 분해(SVD)에 의해 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 프로그래밍되어 있다. 어떤 경우에, 특이 값 분해는 곱
Figure pct00076
인 행렬이고 여기서 U와 V는 직교 행렬이고 Σ는
Figure pct00077
의 특이 값을 포함하는 대각 행렬이다. 특정 경우, 집적 회로 장치는 다음에 따라 특이 값 분해를 사용하여 가중 최소 제곱 알고리즘 (a)을 계산하도록 프로그래밍된다:
z = UTy
Σw = z
a = Vw
일부 실시 예에서, 집적 회로 장치는 계산된 스펙트럼 비 혼합 행렬을 기반으로 샘플에서 하나 이상의 형광단의 풍부도를 추정하도록 프로그램된다. 특정 경우, 집적 회로 장치는 샘플의 입자에 있는 하나 이상의 형광단의 풍부도를 추정하도록 프로그래밍된다. 일부 실시 예에서, 집적 회로 장치는 입자상의 각 형광단의 추정된 풍부도에 기초하여 샘플 내의 입자를 식별하도록 프로그래밍된다. 특정 예에서, 집적 회로 장치는 샘플에서 식별된 입자를 분류하도록 프로그래밍된다.
본 발명은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 다음의 상세한 설명으로부터 가장 잘 이해될 수 있다. 도면에는 다음 도면들이 포함되어 있다:
도 1은 a) 통상적인 스펙트럼 중첩 보상; b) 일반적인 최소 제곱 알고리즘을 사용하여 계산된 스펙트럼 비 혼합에 의해; 및 c) 특정 실시 예에 따라 실시간으로 각 세포에 대해 근사되는 가중치 인자(W)로 가중 최소 제곱 알고리즘을 사용하여 계산된 스펙트럼 비 혼합에 의해, 형광단 풍부도를 결정하는 단계의 비교를 설명한다;
도 2는 특정 실시 예에 따라 실시간으로 세포를 분류하기 위해 가중 최소 제곱 알고리즘 및 가중치 인자 (W)의 근사에 의한 스펙트럼 비 혼합의 비교를 설명한다.
본 개시의 측면은 샘플에서 중첩된 형광 스펙트럼을 갖는 형광단으로부터 광을 스펙트럼 분해하는 방법을 포함한다. 특정 실시 예에 따른 방법은 중첩 형광 스펙트럼을 갖는 복수의 형광단을 갖는 샘플로부터 광 검출 시스템으로 광을 검출하는 단계 및 샘플의 각 형광단으로부터의 광을 스펙트럼 분해하는 단계를 포함한다. 일부 실시 예에서, 방법은 입자에서와 같이 샘플에서 하나 이상의 형광단의 풍부도를 추정하는 단계를 포함한다. 특정 예에서, 방법은 각 형광단의 풍부도를 기반으로 샘플에서 입자를 식별하고 입자를 분류하는 단계를 포함한다. 일부 실시 예에 따른 방법은 각 형광단의 형광 스펙트럼에 대한 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산함으로써 각 형광단으로부터의 광을 스펙트럼 분해하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법을 실행하기위한 시스템 및 집적 회로 장치 (예를 들어, 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이)도 제공된다.
본 발명이 더 상세하게 설명되기 전에, 본 발명은 설명된 특정 실시 예에 제한되지 않고, 당연히 달라질 수 있음을 이해해야 한다. 본 발명의 범위는 첨부된 청구 범위에 의해서만 제한되는 것이므로, 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정 실시 예를 설명하기 위한 것이지 제한하려는 의도가 아님을 것임을 이해해야 한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥에서 달리 명시하지 않는 한, 그 범위의 상한과 하한 사이에서, 하한 단위의 10 분의 1까지의 각각의 개재 값과 그 명시된 범위의 임의의 다른 명시된 또는 개재 값이 본 발명에 포함되는 것으로 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있으며, 또한 언급된 범위에서 특별히 배제된 제한에 따라 본 발명에 포함된다. 명시된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 포함된 한계 중 하나 또는 둘 다를 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.
특정 범위는 "약"이라는 용어가 앞에 숫자 값으로 표시된다. 용어 "약"은 용어가 선행하는 숫자에 가깝거나 대략적인 숫자뿐만 아니라 앞에 오는 정확한 숫자에 대한 문자적인 지원을 제공하기 위해 사용된다. 숫자가 구체적으로 인용된 숫자에 가깝거나 근사하는지의 여부를 결정할 때, 근처의 인용하지 않은 수는 그것이 제시되는 맥락에서, 구체적으로 인용된 숫자와 실질적으로 동등한 것을 제공하는 숫자일 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에 사용될 수도 있지만, 대표적인 예시적인 방법 및 재료가 이제 설명된다.
이 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허는 각 개별 간행물 또는 특허가 구체적으로 개별적으로 참조로 통합된 것으로 표시된 바와 같이 본 명세서에서 참조로 포함되며 문헌이 인용되는 방법 및/또는 물질을 개시하고 설명하기 위해 본원에 참고로 포함된다. 모든 간행물의 인용은 출원일 이전의 공개를위한 것이며 본 발명이 선행 발명으로 인해 그러한 간행물보다 선행 할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 또한, 제공되는 발행일은 개별적으로 확인이 필요한 실제 발행일과 다를 수 있다.
본 명세서 및 첨부된 청구 범위에서 사용된 바와 같이, 문맥에서 달리 명시하지 않는 한, 단수 형태는 복수 대상을 포함한다는 점에 유의한다. 청구 범위는 임의의 선택적 요소를 배제하기 위해 작성될 수 있다는 점에 유의한다. 따라서,이 진술은 클레임 요소의 인용 또는 "부정적" 제한의 사용과 관련하여 "유일한", "단독" 등과 같은 배타적 용어 사용에 대한 선행 기반으로 사용되도록 의도되었다.
본 개시 내용을 읽을 때 당업자에게 명백한 바와 같이, 본 명세서에 설명되고 예시된 각각의 개별적인 실시 예는 본 발명의 범위 또는 사상을 벗어나지 않고 다른 몇몇 실시 예의 특징으로부터 쉽게 분리되거나 그 특징과 결합될 수 있는 별개의 구성 요소 및 특징을 갖는다. 언급된 모든 방법은 언급된 이벤트의 순서 또는 논리적으로 가능한 다른 순서로 수행될 수 있다.
장치 및 방법은 기능적 설명과 함께 문법적 유동성을 위해 설명되거나 설명될 예정이지만, 35 U.S.C. §112 하에서 명시적으로 공식화되지 않는 한, 청구 범위는 "수단" 또는 "단계" 제한의 구성에 의해 어떤 방식으로든 반드시 제한되는 것으로 해석되는 것이 아니고, 등가물의 법적 원칙에 따라 청구 범위에 의해 제공된 정의의 의미와 균등물의 전체 범위가 부여되며, 청구 범위가 35 U.S.C. §112 하에서 명시적으로 공식화되는 경우 35 U.S.C.§112하에서 완전한 법적 등가물로 부여된다는 것이 분명히 이해해야 한다.
샘플에서 중첩하는 형광 스펙트럼을 갖는 형광체의 빛을 스펙트럼 분해하는 방법
본 개시 내용의 측면은 샘플에서 중첩된 형광 스펙트럼을 갖는 광을 포함하여 형광단으로부터의 광을 스펙트럼 분해하는 방법을 포함한다. 용어 "스펙트럼 분해"는 본 명세서에서 통상적인 의미로 사용되어 각 기여 형광단에 광의 중첩 파장을 할당하거나 기여함으로써 샘플에서 각 형광단을 스펙트럼으로 구별하는 것을 의미한다. 실시 예에서, 각 형광단에 기인하는 형광의 중첩 스펙트럼 성분은 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하여 결정된다 (아래에서 더 자세히 설명됨). 일부 실시 예에서, 관심 샘플은 각각의 형광단의 형광 스펙트럼이 샘플에서 적어도 하나의 다른 형광단의 형광 스펙트럼과 중첩되는 복수의 형광단을 갖는다. 일부 예에서, 각 형광단의 형광 스펙트럼은 샘플에서 적어도 하나의 다른 형광단의 형광 스펙트럼과 5nm 이상, 예를 들어 10nm 이상, 예를 들어 25nm 이상 및 50nm 포함 이상 중첩한다. 특정 예에서, 샘플에 있는 하나 이상의 형광단의 형광 스펙트럼은, 예를 들어, 형광 스펙트럼의 각각의 중첩이 예를 들어 10nm 이상, 예를 들어 25nm 이상 및 50nm 이상과 같이 5nm 이상인 경우와 같이, 샘플에있는 둘 이상의 다른 형광단의 형광 스펙트럼과 중첩한다. 다른 실시 예에서, 관심 샘플은 비 중첩 형광 스펙트럼을 갖는 복수의 형광단을 포함한다. 이러한 구체 예에서, 각 형광단의 형광 스펙트럼은 예를 들어 9 nm 이하, 8 nm 이하, 예를 들어 7 nm 이하, 예를 들어 6 nm 또는 5 nm 이하, 예를 들어 4 nm 이하, 3 nm 이하, 예를 들어 2 nm 이하 및 1 nm 이하를 포함하여, 10 nm 이하 내에서 적어도 하나의 다른 형광단에 인접한다.
본 방법을 실행함에 있어서, 샘플은 광원으로 조사되고 샘플의 광은 복수의 광 검출기를 가진 광 검출 시스템으로 검출된다. 일부 구현에서, 샘플은 생물학적 샘플이다. 용어 "생물학적 샘플"은, 특정 사례에서 혈액, 점액, 림프액, 활액, 뇌척수액, 타액, 기관지 폐포 세척, 양수, 양수 혈액, 소변, 질액 및 정액에서 발견될 수 있는, 전체 유기체, 식물, 진균 또는 동물 조직, 세포 또는 구성 부분의 하위 집합을 지칭하기 위해 통상적인 의미로 사용된다. 이와 같이, "생물학적 샘플"은 천연 유기체 또는 그 조직의 서브 세트뿐만 아니라 유기체 또는 그 조직의 서브 세트로부터 제조된 균질물, 용해물 또는 추출물을 모두 지칭하며, 예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, 혈장, 혈청, 척수액, 림프액, 피부 절편, 호흡기, 위장관, 심혈관 및 비뇨관, 눈물, 타액, 우유, 혈액 세포, 종양, 기관을 포함한다. 생물학적 샘플은 건강한 조직과 병든 조직 (예를 들어, 암성, 악성, 괴사성 등)을 포함한 모든 유형의 유기체 조직일 수 있다. 특정 실시 예에서, 생물학적 샘플은 혈액 또는 이의 유도체, 예를 들어 혈장, 눈물, 소변, 정액 등과 같은 액체 샘플이고, 일부 사례에서 샘플은 정맥 천자 또는 핑거 스틱에서 얻은 혈액과 같은 전혈을 포함한 혈액 샘플이다 (이 때 혈액은 분석 전에 방부제, 항응고제 등과 같은 시약과 결합되거나 결합되지 않을 수 있음).
특정 실시 예에서, 샘플의 공급원은 "포유 동물" 또는 "포유류"이고, 이러한 용어는 육식 동물 (예를 들어, 개와 고양이), 설치류 (예를 들어, 생쥐, 기니피그, 쥐) 및 영장류(예를 들어, 인간, 침팬지, 원숭이).를 포함하여 포유류 계열에 속하는 유기체를 설명하기 위해 광범위하게 사용된다. 어떤 사례에서, 피험자가 인간이다. 이 방법은 성별 및 모든 발달 단계 (즉, 신생아, 유아, 어린이, 청소년, 성인)의 인간 피험자로부터 얻은 샘플에 적용될 수 있으며, 특정 실시 예에서 인간 대상체는 청소년, 청소년 또는 성인이다. 본 발명은 인간 피험자의 샘플에 적용될 수 있지만, 방법은 또한 새, 생쥐, 쥐, 개, 고양이, 가축과 말과 같은 다른 동물 피험자 (즉, "인간이 아닌 피험자")의 샘플에 대해서도 수행될 수 있음을 이해해야 한다.
본 방법을 실행함에 있어서, (예를 들어, 유세포 분석기의 유동 스트림 내의) 샘플에는 광원의 빛이 조사된다. 일부 실시 예에서, 광원은 광대역 광원이며, 50nm 이상, 100nm 이상, 150nm 이상, 200nm 이상, 250 nm 이상, 300 nm 이상, 350 nm 이상, 400 nm 이상, 및 500 nm 이상을 포함하여, 넓은 범위의 파장을 갖는 빛을 방출한다. 예를 들어, 하나의 적합한 광대역 광원은 200 nm 내지 1500 nm의 파장을 갖는 광을 방출한다. 적합한 광대역 광원의 또 다른 예는 400 nm 내지 1000 nm의 파장을 갖는 광을 방출하는 광원을 포함한다. 방법이 광대역 광원으로 조사하는 경우, 관심있는 광대역 광원 프로토콜은 제한하는 것은 아니지만, 할로겐 램프, 중수소 아크 램프, 크세논 아크 램프, 안정화된 광섬유 결합 광대역 광원, 연속 스펙트럼을 갖는 광대역 LED, 초 발광 발광 다이오드, 반도체 발광 다이오드, 넓은 스펙트럼 LED 백색 광원, 다중 LED 통합 백색 광원, 다른 광대역 광원 또는 이들의 조합을 포함한다.
다른 실시 예에서, 방법은 예를 들어 40nm 이하, 예를 들어 30nm 이하, 예를 들어 25nm 이하, 예를 들어 20nm 이하, 예를 들어 15nm 이하, 예를 들어 10nm 이하, 예를 들어 5nm 이하, 예를 들어 2nm 이하, 및 특정 파장의 빛 (즉, 단색광)을 방출하는 광원을 포함하여, 50nm 이하의 범위와 같이, 좁은 범위의 파장에서 광을 방출하는 광원으로, 특정 파장 또는 좁은 범위의 파장을 방출하는 협 대역 광원으로 조사하는 단계를 포함한다. 방법이 협 대역 광원으로 조사하는 것을 포함하는 경우, 관심있는 협 대역 광원 프로토콜은 제하하는 것은 아니지만, 하나 이상의 광학 대역 통과 필터, 회절 격자, 모노크로메이터 또는 이들의 임의의 조합에 결합된 좁은 파장 LED, 레이저 다이오드 또는 광대역 광원을 포함할 수 있다.
특정 실시 예에서, 방법은 하나 이상의 레이저로 샘플을 조사하는 단계를 포함한다. 위에서 설명한 것처럼, 레이저의 유형과 수는 수집된 원하는 광 뿐만 아니라 샘플에 따라 달라지며 헬륨-네온 레이저, 아르곤 레이저, 크립톤 레이저, 크세논 레이저, 질소 레이저, CO2 레이저, CO 레이저, 아르곤-불소 (ArF) 엑시머 레이저, 크립톤-불소 (KrF) 엑시머 레이저, 크세논 염소 (XeCl) 엑시머 등 레이저 또는 크세논-불소 (XeF) 엑시머 레이저 또는 이들의 조합과 같은 가스 레이저일 수 있다. 다른 경우에, 방법은 스틸벤, 쿠마린 또는 로다민 레이저와 같은 염료 레이저로 유동 스트림을 조사하는 단계를 포함한다. 또 다른 경우에서, 방법은 헬륨-카드뮴 (HeCd) 레이저, 헬륨-수은 (HeHg) 레이저, 헬륨-셀레늄 (HeSe) 레이저, 헬륨-은 (HeAg) 레이저, 스트론튬 레이저, 네온-구리 (NeCu) 레이저, 구리 레이저 또는 금과 같은 레이저 및 이들의 조합과 같은, 금속-증기 레이저로 유동 스트림을 조사하는 단계를 포함한다. 또 다른 사례에서, 방법은 루비 레이저, Nd:YAG 레이저, NdCrYAG 레이저, Er:YAG 레이저, Nd:YLF 레이저, Nd:YVO4 레이저, Nd:YCa4O(BO3)3 레이저, Nd:YCOB 레이저, 티타늄 사파이어 레이저, 툴림 YAG 등 레이저, 이테르븀 YAG 레이저, ytterbium2O3 레이저 또는 세륨 도핑된 레이저 및 이들의 조합과 같은, 고체 레이저로 유동 스트림을 조사하는 단계를 포함한다.
샘플은 예를 들어, 2개 이상의 광원, 3 개 이상의 광원, 4 개 이상의 광원, 5 개 이상의 광원, 및 10 개 이상의 광원을 포함하여, 상기한 광원 중 하나 이상으로 조사될 수 있다. 광원은 임의의 유형의 광원 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시 예에서, 방법은 하나 이상의 가스 레이저, 하나 이상의 염료 레이저 및 하나 이상의 고체 레이저를 갖는 어레이와 같은, 레이저 어레이로 유동 스트림의 샘플을 조사하는 단계를 포함한다.
샘플은 예를 들어 250 nm 내지 1250 nm, 예를 들어 300 nm 내지 1000 nm, 예를 들어 350 nm 내지 900 nm, 및 예를 들어 400 nm 내지 800 nm을 포함하여, 200 nm 내지 1500 nm 범위의 파장으로 조사될 수 있다. 예를 들어, 광원이 광대역 광원 인 경우 샘플은 200nm 내지 900nm의 파장으로 조사될 수 있다. 다른 사례에서, 광원이 복수의 협 대역 광원을 포함하는 경우, 샘플은 200 nm 내지 900 nm 범위의 특정 파장으로 조사될 수 있다. 예를 들어, 광원은 각각 독립적으로 200 nm 내지 900 nm 범위의 파장을 갖는 광을 방출하는 복수의 협 대역 LED (1 nm-25 nm)일 수 있다. 다른 실시 예에서, 협 대역 광원은 하나 이상의 레이저 (예를 들어, 레이저 어레이)를 포함하고, 샘플은 위에서 설명한 바와 같이 가스 레이저, 엑시머 레이저, 염료 레이저, 금속 증기 레이저 및 고체 레이저를 갖는 레이저 어레이와 같이, 200nm 내지 700nm 범위의 특정 파장으로 조사된다.
하나 이상의 광원이 사용되는 경우, 샘플은 광원으로 동시에 또는 순차적으로 또는 이들의 조합으로 조사될 수 있다. 예를 들어, 샘플는 각각의 광원으로 동시에 조사될 수 있다. 다른 실시 예에서, 유동 스트림은 각각의 광원으로 순차적으로 조사된다. 하나 이상의 광원을 사용하여 샘플을 순차적으로 조사하는 경우, 각 광원이 샘플를 조사하는 시간은 독립적으로 예를 들어 0.01 마이크로 초 이상, 예를 들어 0.1 마이크로 초 이상, 예를 들어 1 마이크로 초 이상, 예를 들어 5 마이크로 초 이상, 예를 들어 10 마이크로 초 이상, 예를 들어 30 마이크로 초 이상 및 예를 들어 60 마이크로 초 이상을 포함하여, 0.001 마이크로 초 이상일 수 있다. 예를 들어, 방법은 예를 들어 0.01 마이크로 초 내지 75 마이크로 초, 예를 들어 0.1 마이크로 초 내지 50 마이크로 초, 예를 들어 1 마이크로 초 내지 25 마이크로 초, 및 예를 들어 5 마이크로 초 내지 10 마이크로 초를 포함하여, 0.001 마이크로 초 내지 100 마이크로 초의 범위의 기간 동안 광원 (예를 들어, 레이저)으로 샘플을 조사하는 단계를 포함할 수 있다. 샘플이 2 개 이상의 광원으로 순차적으로 조사되는 실시 예에서, 각 광원에 의해 샘플이 조사되는 기간은 동일하거나 상이할 수 있다.
각 광원에 의한 조사 사이의 시간은 예를 들어 0.01 마이크로 초 이상, 예를 들어 0.1 마이크로 초 이상, 예를 들어 1 마이크로 초 이상, 예를 들어 5 마이크로 초 이상, 예를 들어 10 마이크로 초 이상, 예를 들어 15 마이크로 초 이상, 예를 들어 30 마이크로 초 또는 예를 들어 60 마이크로 초 이상을 포함하여, 0.001 마이크로 초 이상의 지연에 의해 독립적으로 분리되어 필요에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 각 광원에 의한 조사 사이의 시간은 예를 들어 0.01 마이크로 초 내지 50 마이크로 초, 예를 들어 0.1 마이크로 초 내지 35 마이크로 초, 예를 들어 1 마이크로 초 내지 25 마이크로 초, 및 예를 들어 5 마이크로 초 내지 10 마이크로 초를 포함하여, 0.001 마이크로 초에서 60 마이크로 초의 범위일 수 있다. 특정 실시 예에서, 각 광원에 의한 조사 사이의 시간은 10 마이크로 초이다. 샘플이 2 개 이상의 (즉, 3 개 이상의) 광원에 의해 순차적으로 조사되는 실시 예에서, 각 광원에 의한 조사 간의 지연은 동일하거나 상이할 수 있다.
샘플은 연속적으로 또는 이산 간격으로 조사될 수 있다. 일부 사례에서, 방법은 샘플의 샘플을 광원으로 연속적으로 조사하는 단계를 포함한다. 다른 경우에, 샘플은 0.001 밀리 초마다, 0.01 밀리 초마다, 0.1 밀리 초마다, 1 밀리 초마다, 10 밀리 초마다, 100 밀리 초마다, 1000 밀리 초마다를 포함하여, 불연속적인 간격으로, 또는 일부 다른 간격으로 광원으로 조사된다.
광원에 따라 샘플은 예를 들어 0.01mm 이상, 예를 들어 0.05mm 이상, 예를 들어 0.1mm 이상, 예를 들어 0.5mm 이상, 예를 들어 1mm 이상, 예를 들어 2.5mm 이상, 예를 들어 5mm 이상, 10mm 이상, 예를 들어 15mm 이상, 예를 들어 25mm 이상 및 50mm 이상을 포함하여, 다양한 거리에서 조사될 수 있다. 또한 각도 또는 조사도 예를 들어 15 ° 내지 85 °, 20 ° 내지 80 °, 25 ° 내지 75 °, 30 ° 내지 60 °를 포함하여, 10 °에서 90 °의 범위에서 다양할 수 있으며, 예를 들어, 90 °각도일 수 있다.
특정 실시 예에서, 방법은 주파수 편이 광의 2 개 이상의 빔으로 샘플을 조사하는 단계를 포함한다. 전술한 바와 같이, 레이저 광을 주파수 이동시키기 위한 음향 광학 장치 및 레이저를 갖는 광 빔 생성기 구성 요소가 사용될 수 있다. 이러한 실시 예에서, 방법은 음향 광학 장치를 레이저로 조사하는 단계를 포함한다. 출력 레이저 빔에서 생성된 원하는 빛의 파장에 따라 (예를 들어, 유동 스트림에서 샘플을 조사하는 데 사용), 레이저는 예를 들어 250 nm 내지 1250 nm, 예를 들어 300 nm 내지 1000 nm, 예를 들어 350 nm 내지 900 nm 및 400 nm 내지 800 nm을 포함하여, 200nm에서 1500nm까지 다양한 특정 파장을 가질 수 있다. 음향 광학 장치는 예를 들어 2 개 이상의 레이저, 예를 들어 3 개 이상의 레이저, 예를 들어 4 개 이상의 레이저, 예를 들어 5 개 이상의 레이저 및 예를 들어 10 개 이상의 레이저를 포함하여, 하나 이상의 레이저로 조사될 수 있다. 레이저는 레이저 유형의 임의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시 예에서, 방법은 하나 이상의 가스 레이저, 하나 이상의 염료 레이저 및 하나 이상의 고체 레이저를 갖는 어레이와 같은, 레이저의 어레이로 음향 광학 장치를 조사하는 단계를 포함한다.
하나 이상의 레이저가 사용되는 경우, 음향 광학 장치는 레이저로 동시에 또는 순차적으로 또는 이들의 조합으로 조사될 수 있다. 예를 들어, 음향 광학 장치는 각각의 레이저로 동시에 조사될 수 있다. 다른 실시 예에서, 음향 광학 장치는 각각의 레이저로 순차적으로 조사된다. 음향 광학 장치를 순차적으로 조사하기 위해 하나 이상의 레이저가 사용되는 경우, 각 레이저가 음향 광학 장치를 조사하는 시간은 독립적으로 예를 들어 0.01 마이크로 초 이상, 예를 들어 0.1 마이크로 초 이상, 예를 들어 1 마이크로 초 이상, 예를 들어 5 마이크로 초 이상, 예를 들어 10 마이크로 초 이상, 예를 들어 30 마이크로 초 이상 및 예를 들어 60 마이크로 초 이상을 포함하여, 0.001 마이크로 초 이상일 수 있다. 예를 들어, 방법은 예를 들어 0.01 마이크로 초 내지 75 마이크로 초, 예를 들어 0.1 마이크로 초 내지 50 마이크로 초, 예들어 1 마이크로 초 내지 25 마이크로 초, 및 예를 들어 5 마이크로 초 내지 10 마이크로 초를 포함하여, 들어 0.001 마이크로 초 내지 100 마이크로 초 범위의 기간 동안 레이저로 음향 광학 장치를 조사하는 단계를 포함할 수 있다.
각 레이저에 의한 조사 사이의 시간은 원하는대로, 예를 들어 0.01 마이크로 초 이상, 예를 들어 0.1 마이크로 초 이상, 예를 들어 1 마이크로 초 이상, 예를 들어 5 마이크로 초 이상, 예를 들어 10 마이크로 초 이상, 예를 들어 15 마이크로 초 이상, 예를 들어 30 마이크로 초 이상 및 예를 들어 60 마이크로 초 이상을 포함하여, 0.001 마이크로 초 이상의 지연에 의해 독립적으로 분리되어 달라질 수 있다. 예를 들어, 각 광원에 의한 조사 사이의 시간은 예를 들어 0.01 마이크로 초 내지 50 마이크로 초, 예를 들어 0.1 마이크로 초 내지 35 마이크로 초, 예를 들어 1 마이크로 초 내지 25 마이크로 초, 및 예를 들어 5 마이크로 초 내지 10 마이크로 초를 포함하여, 0.001 마이크로 초 내지 60 마이크로 초의 범위일 수 있다. 특정 실시 예에서, 각 레이저에 의한 조사 사이의 시간은 10 마이크로 초이다. 음향 광학 장치가 2 개 이상의 (즉, 3 개 이상) 레이저에 의해 순차적으로 조사되는 실시 예에서, 각 레이저에 의한 조사 사이의 지연은 동일하거나 다를 수 있다. 음향 광학 장치가 2 개 이상의 레이저로 순차적으로 조사되는 실시 예에서, 음향 광학 장치가 각 레이저에 의해 조사되는 기간은 동일하거나 상이할 수 있다.
음향 광학 장치는 연속적으로 또는 이산 간격으로 조사 될 수 있다. 일부 경우, 방법은 음향 광학 장치에 레이저를 연속적으로 조사하는 단계를 포함한다. 다른 경우에, 음향 광학 장치는 0.001 밀리 초마다, 0.01 밀리 초마다, 0.1 밀리 초마다, 1 밀리 초마다, 10 밀리 초마다, 100 밀리 초마다 및 1000 밀리 초마다를 포함하여 다른 간격으로, 또는 일부 다른 간격으로 레이저로 조사된다.
레이저에 따라, 음향 광학 장치는 예를 들어 0.01mm 이상, 예를 들어 0.05mm 이상, 예를 들어 0.1mm 이상, 예를 들어 0.5mm 이상, 예를 들어 1mm 이상, 예를 들어 2.5mm 이상, 예를 들어 5mm 이상, 예를 들어 10mm 이상, 예를 들어 15mm 이상, 예를 들어 25mm 이상 및 예를 들어 50mm 이상을 포함하여, 다양한 거리 떨여져 조사될 수 있다. 또한 각도 또는 조사는 예를 들어 15° 내지 85 , 예를 들어 20° 내지 80 , 예를 들어 25 ° 내지 75 °, 예를 들어 30 ° 내지 60 °를 포함하여, 10 °내지 90 °의 범위에서 다양할 수 있으며, 예를 들어 90 °의 각도일 수 있다.
실시 예에서, 방법은 각도로 편향된 레이저 빔을 생성하기 위해 음향 광학 장치에 고주파 구동 신호를 적용하는 단계를 포함한다. 2 개 이상의 무선 주파수 구동 신호는, 예를 들어 3 개 이상의 고주파 구동 신호, 예를 들어 4 개 이상의 고주파 구동 신호, 예를 들어 5 개 이상의 고주파 구동 신호, 예를 들어 6 개 이상의 고주파 구동 신호, 예를 들어 7 개 이상의 고주파 구동 신호, 예를 들어 8 개 이상의 고주파 구동 신호, 예를 들어 9 개 이상의 고주파 구동 신호, 예를 들어 10 개 이상의 고주파 구동 신호, 예를 들어 15 개 이상의 고주파 구동 신호, 예를 들어 25 개 이상의 고주파 구동 신호, 예를 들어 50 개 이상의 고주파 구동 신호 및 100 개 이상의 고주파 구동 신호를 포함하여, 원하는 수의 각도로 편향된 레이저 빔을 갖는 출력 레이저 빔을 생성하기 위해 음향 광학 장치에 적용될 수 있다.
고주파 구동 신호에 의해 생성된 각도 편향된 레이저 빔은 각각 인가된 고주파 구동 신호의 진폭에 기초한 강도를 갖는다. 일부 실시 예에서, 방법은 원하는 강도로 각도 편향된 레이저 빔을 생성하기에 충분한 진폭을 갖는 무선 주파수 구동 신호를 적용하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 적용된 각각의 고주파 구동 신호는 독립적으로 예를 들어 약 0.005 V 내지 약 400 V, 예를 들어 약 0.01 V 내지 약 300 V, 예를 들어 약 0.05 V 내지 약 200 V, 예를 들어 약 0.1 V 내지 약 100 V, 예를 들어 약 0.5 V 약 75V, 예를 들어 약 1V 내지 50V, 예를 들어 약 2V 내지 40V, 예를 들어 3V 내지 약 30V 및 예를 들어 약 5V 내지 약 25V를 포함하여, 약 0.001V에서 약 500V의 진폭을 가진다. 각각의 적용된 무선 주파수 구동 신호는 일부 실시 예에서 예를 들어 약 0.005MHz 내지 약 400MHz, 예를 들어 약 0.01MHz 내지 약 300MHz, 예를 들어 약 0.05MHz 내지 약 200MHz, 예를 들어 약 0.1MHz 내지 약 100MHz, 예를 들어 약 0.5MHz 약 90MHz, 예를 들어 약 1MHz 내지 약 75MHz, 예를 들어 약 2MHz 내지 약 70MHz, 예를 들어 약 3MHz 내지 약 65MHz, 예를 들어 약 4MHz 내지 약 60MHz 및 예를 들어 약 5MHz에서 약 50MHz를 포함하여, 약 0.001MHz 내지 약 500MHz의 주파수를 가진다.
이러한 실시 예에서, 출력 레이저 빔의 각도 편향 레이저 빔은 공간적으로 분리된다. 적용된 고주파 구동 신호와 출력 레이저 빔의 원하는 조사 프로파일에 따라, 각도로 편향된 레이저 빔은, 예를 들어 0.005μm 이상, 예를 들어 0.01μm 이상, 예를 들어 0.05μm 이상, 예를 들어 0.1μm 이상, 예를 들어 0.5μm 이상, 예를 들어 1μm 이상, 예를 들어 5μm 이상, 예를 들어 10μm 이상, 예를 들어 100μm 이상, 예를 들어 500μm 이상, 예를 들어 1000μm 이상, 및 5000μm 이상을 포함하여, 0.001μm 이상 분리될 수 있다. 일부 실시 예에서, 각도 편향 레이저 빔은 출력 레이저 빔의 수평 축을 따라 인접한 각도 편향 레이저 빔과 같이 중첩된다. 인접한 각도로 편향된 레이저 빔 사이의 중첩 (예를 들어, 빔 스폿 중첩)은 예를 들어 0.005μm 이상의 중첩, 예를 들어 0.01μm 이상의 중첩, 예를 들어 0.05μm 이상의 중첩, 예를 들어 0.1μm 이상의 중첩, 예를 들어 0.5μm 이상의 중첩, 예를 들어 1μm 이상의 중첩, 예를 들어 5μm 이상의 중첩, 예를 들어 10μm 이상의 중첩 및 100μm 이상의 중첩을 포함하여, 0.001μm 이상의 중첩일 수 있다.
특정 예에서, Diebold 등의 Nature Photonics Vol. 7(10); 806-810 (2013) 뿐만 아니라, 미국 특허 번호 9,423,353, 9,784,661 및 10,006,852 및 미국 특허 공개 번호 2017/0133857 및 2017/0350803에 설명되는 바와 같이, 유동 스트림은 주파수 편이된 빛의 복수의 빔으로 조사되고 유동 스트림의 세포는 주파수 인코딩된 이미지를 생성하기 위해 고주파 태그 방출 (FIRE)을 사용하는 형광 이미징에 의해 이미지화되며, 그 개시 내용은 본원에 참조로 포함된다.
위에서 논의된 바와 같이, 실시 예들에서 조사된 샘플로부터의 광은 아래에서 더 상세히 설명되고 복수의 광 검출기에 의해 측정되는 광 검출 시스템으로 전달된다. 일부 실시 예에서, 방법은 파장 범위 (예를 들어, 200 nm-1000 nm)에 걸쳐 수집된 광을 측정하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 방법은 200 nm-1000 nm의 파장 범위 중 하나 이상에 걸쳐 빛의 스펙트럼을 수집하는 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 실시 예에서, 방법은 하나 이상의 특정 파장에서 수집된 광을 측정하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 수집된 빛은 450 nm, 518 nm, 519 nm, 561 nm, 578 nm, 605 nm, 607 nm, 625 nm, 650 nm, 660 nm, 667 nm, 670 nm, 668 nm, 695 nm, 710 nm, 723 nm, 780 nm, 785 nm, 647 nm, 617 nm 및 이들의 조합중 하나 이상에서 측정될 수 있다. 특정 실시 예에서, 방법은 형광단의 형광 피크 파장에 상응하는 빛의 파장을 측정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 예에서, 방법은 샘플에서 각 형광단의 전체 형광 스펙트럼에 걸쳐 수집된 빛을 측정하는 단계를 포함한다.
수집된 빛은 연속적으로 또는 이산 간격으로 측정될 수 있다. 일부 경우에 방법은 연속적으로 빛을 측정하는 단계를 포함한다. 다른 경우에, 빛은 0.001 밀리 초마다, 0.01 밀리 초마다, 0.1 밀리 초마다, 1 밀리 초마다, 10 밀리 초마다, 100 밀리 초마다 그리고 1000 밀리 초마다 또는 다른 간격을 포함하여 빛을 측정하는 것과 같이 개별 간격으로 측정된다.
수집된 광의 측정은 대상 방법 동안 1 회 이상, 예를 들어 2 회 이상, 예를 들어 3 회 이상, 예를 들어 5 회 이상 및 10 회 이상을 포함할 수 있다. 특정 실시 예에서, 광 전파는 2 회 이상 측정되며, 특정 경우의 데이터는 평균화된다.
샘플의 빛은 예를 들어 5 개 이상의 다른 파장, 10 개 이상의 다른 파장, 25 개 이상의 다른 파장, 50 개 이상의 다른 파장, 100 개 이상의 다른 파장, 200 또는 300 개 이상의 다른 파장 및 400 개 이상의 다른 파장에서 수집된 광을 측정하는 단계를 포함하여, 하나 이상의 파장에서 측정될 수 있다.
실시 예에서, 방법은 샘플의 각 형광단에서 나오는 빛을 스펙트럼 분해하는 단계를 포함한다. 일부 실시 예에서, 각각의 상이한 형광단 사이의 중첩이 결정되고 중첩 형광에 대한 각 형광단의 기여도가 계산된다. 일부 실시 예에서, 각각의 형광단으로부터의 광을 스펙트럼 분해하는 단계는 광 검출 시스템에 의해 검출된 샘플에서 중첩된 형광을 갖는 복수의 형광단 각각에 대한 형광 스펙트럼에 대한 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하는 단계를 포함한다. 아래에서 더 자세히 설명하는 바와 같이, 각 형광단의 빛을 스펙트럼 분해하고 각 형광단에 대한 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하는 단계는 샘플에서 각 형광단의 풍부도를 추정하는 데에 사용될 수 있다. 특정 구체 예에서, 표적 입자와 관련된 각 형광단의 풍부도가 결정될 수 있다. 표적 입자와 관련된 각 형광단의 풍부도는 입자를 식별하고 분류하는 데 사용될 수 있다. 일부 경우 식별되거나 분류된 입자는 샘플에서 표적 입자 (예를 들어, 세포)를 분류하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시 예에서, 예를 들어 스펙트럼 비 혼합을 계산함으로써 샘플에서 형광단을 스펙트럼 분해하는 단계는, 광 검출 시스템에 의한 검출 후 실시간으로 입자를 분류하기에 충분히 선별이 빠르도록 수행된다.
일부 실시 예에서, 중첩 형광을 갖는 각 형광단으로부터의 광을 스펙트럼 분해하는 단계는 가중 최소 제곱 알고리즘을 사용하여 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하는 단계를 포함한다. 일부 경우에 가중 최소 제곱 알고리즘은 다음에 따라 계산된다:
Figure pct00078
여기서 y는 각 세포에 대한 광 검출 시스템의 복수의 광 검출기로부터 측정된 검출기 값이고;
Figure pct00079
는 추정되는 형광단 풍부도이고; X는 스필오버이고; W는
Figure pct00080
이다. 일부 실시예에서, 각
Figure pct00081
는
Figure pct00082
에 따라 계산되고,
여기서 σi 2는 검출기 i에서의 분산이고; yi는 검출기 i에서의 신호이고; λi는 검출기 i에서 일정한 노이즈이다. 특정 실시예에서, 스펙트럼 비 혼합 행렬은 (XTWX)-1XTW에 따라 계산된다. 일부 경우에, 방법은 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하기 위해 광 검출 시스템에 의해 검출된 각 세포에 대해 (XTWX)을 역전하는 단계를 포함한다.
특정 실시 예에서, 방법은 광 검출 시스템에 의해 검출된 각 세포에 대한 가중 최소 제곱 알고리즘에서 (XTWX)의 역을 근사하는 단계를 포함한다. 일부 실시 예에서, (XTWX)을 역전하는 단계는 다음에 따라 반복적인 뉴턴-랩슨 계산법을 사용하여 (XTWX)를 근사화하는 단계를 포함한다:
A-1 = (XTWX)-1;
A0 -1 = (XTWGX)-1;
Figure pct00083
여기서 WG는 광 검출 시스템의 각 광 검출기의 분산으로부터 결정되는 W의 미리 결정된 근사치이다. 일부 실시 예에서, 방법은 각 광 검출기의 분산을 추정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 예에서, 방법은 단일 오염 대조 샘플을 사용하여 광 검출기 노이즈 성분 (예를 들어, 전자 노이즈, 배경 광 등)을 결정하는 단계를 포함한다. 특정 예에서, 방법은 샘플을 광원으로 조사하기 전에 각 광 검출기의 분산을 결정하는 단계를 포함한다. 다른 경우에, 방법은 샘플에 광원을 조사하기 전에 미리 결정된 W의 근사치, WG를 결정하는 단계를 포함한다. 특정 실시 예에서, 방법은 미리 결정된 WG로 A0 -1을 사전 계산하는 단계를 포함한다. 이러한 실시 예에서, 미리 계산된 A0 -1은 광 검출 시스템에 의해 검출된 각 입자에 대한 A-1의 첫 번째 근사치로 사용될 수 있다.
다른 실시 예에서, 각각의 형광단으로부터의 광을 스펙트럼 분해하는 방법은 셔먼-모리슨 반복적 역 업데이터를 사용하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 셔먼-모리슨 공식을 사용하여 A를 계산하는 단계를 포함한다:
Figure pct00084
특정 경우에, 방법은 셔먼-모리슨 공식을 사용하여 A0의 섭동의 역을 계산하기 위해 A0 -1을 사전 계산하는 단계를 포함한다. 일부 실시 예에서, A0의 역은 공식 XTW0X에 의해 계산되고 A의 역은 공식 XTWX에 의해 계산된다. 일부 경우에, 방법은 다음에 따라 각 반복 W과 열 벡터의 곱으로 △A (즉, A-A0)를 계산하는 단계를 포함한다:
Figure pct00085
및
Figure pct00086
여기서,
Figure pct00087
Figure pct00088
Figure pct00089
및
Figure pct00090
및
Figure pct00091
실시 예에 따르면,
Figure pct00092
이고, 여기서 A는 다음과 같이 표현될 수 있다:
Figure pct00093
(1)
Figure pct00094
(2)
이들 실시 예에서, 각각의 A는 각각의 wi에 대한 변경을 사용하여 각각의 새로운 가중치 행렬 W (즉, W0와 다른 값을 사용)로 A0로부터 재계산될 수 있다. 일부 실시 예에서, 방법은 다음에 따라 스펙트럼 비 혼합 행렬을 근사화하기 위해 셔먼-모리슨 반복 역 업데이터를 수행하는 단계를 포함한다:
Figure pct00095
(3)
Figure pct00096
(4)
Figure pct00097
(5)
Figure pct00098
(6)
Figure pct00099
(7)
Figure pct00100
(8)
일부 실시 예에서, A0 -1에 대한 사전 계산된 값이 A1 -1을 계산하는 데 사용된다. 그런 다음 미리 계산된 A1 -1을 사용하여 A2 -1을 계산한다. 값 A-1은 i = 1에서 ND까지 각 (Ai-1)-1을 사용하여 Ai -1을 반복 계산하여 계산할 수 있다.
일부 실시 예에서, 각 형광단으로부터의 광을 스펙트럼 분해하기 위한 방법은 행렬 분해 (즉, 인수분해)에 의해 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 예를 들어 행렬이 하부 삼각(L) 행렬와 상부 삼각(U) 행렬의 곱으로 분해되는 경우와 같이, LU 행렬 분해를 포함한다. 특정 경우에, LU 분해에는 가우스 제거가 포함된다. 다른 경우에, LU 분해는 수정된 촐레스키 분해, LDL 분해를 포함하며 여기서 D는 대각 행렬이다. 특정 실시 예에서, 가중 최소 제곱 알고리즘 (a)은 다음에 따라 수정된 촐레스키(촐레스키) 분해를 사용하여 계산된다:
XTWXa = XTWy
Aa = B
LDLTa = B LDL 분해
Lz = B 여기서 z = DLTa 하부 삼각 행렬 솔루션
Dx = z 여기서 x = LTa 대각선 행렬 솔루션
LTa = x 상부 삼각 행렬 솔루션
다른 실시 예에서, 각각의 형광단으로부터의 빛을 스펙트럼 분해하는 방법은 QR 분해에 의해 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하는 단계를 포함한다. 일부 사례에서 QR 분해는 직교 (Q) 행렬과 상부 삼각 (R) 행렬의 곱인 행렬이다. 일부 실시 예에서, 가중 최소 제곱 알고리즘 (a)은 다음에 따라 QR 분해를 사용하여 계산된다:
Figure pct00101
또 다른 실시 예에서, 각 형광단으로부터의 광을 스펙트럼 분해하는 방법은 특이값 분해(SVD)에 의해 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하는 단계를 포함한다. 어떤 경우에는 특이 값 분해는 곱
Figure pct00102
의 행렬이며 여기서 U와 V는 직교 행렬이고 Σ는
Figure pct00103
의 특이 값을 포함하는 대각 행렬이다. 특정 경우에 가중 최소 제곱 알고리즘 (a)은 다음에 따라 특이 값 분해를 사용하여 계산된다:
Figure pct00104
일부 실시 예에서, 방법은 각 형광단으로부터 스펙트럼 분해된 광으로부터 샘플에서 하나 이상의 형광단의 풍부도를 계산하는 단계를 포함한다. 특정 경우에, 표적 입자와 연관된 (예를 들어, 화학적으로 결합된 (즉, 공유적으로, 이온적으로) 또는 물리적으로 결합된) 형광단의 풍부도는 입자와 연관된 각 형광단으로부터 스펙트럼 분해된 빛으로부터 계산된다. 예를 들어, 하나의 예에서 표적 입자와 관련된 각 형광단의 상대적 풍부도는 각 형광단으로부터 스펙트럼 분해된 빛으로부터 계산된다. 또 다른 예에서, 표적 입자와 관련된 각 형광단의 절대 풍부도는 각 형광단의 스펙트럼 분해 빛으로부터 계산된다. 특정 실시 예에서, 입자는 입자와 결합된 것으로 결정된 각 형광단의 상대적 풍부도에 기초하여 확인되거나 분류될 수 있다. 이들 실시 예에서, 입자는, 입자와 관련된 각 형광단의 상대적 또는 절대적 존재비를 알려진 동일성의 입자를 갖는 대조군 샘플과 비교하거나, 관련 형광단의 계산된 상대적 또는 절대적 풍부도를 갖는 입자 집단 (예를 들어, 세포)의 분광 또는 기타 분석을 수행하는 등에 의해서, 임의의 편리한 프로토콜에 의해 식별되거나 분류될 수 있다.
특정 실시 예에서, 방법은 입자와 연관된 형광단의 추정된 풍부도에 기초하여 확인된 샘플의 입자 (예를 들어, 세포) 중 하나 이상을 분류하는 단계를 포함한다. 용어 "분류"는 기존의 의미로 샘플의 성분(예를 들어, 세포를 포함하는 액적, 생물학적 거대 분자와 같은 비 세포 입자를 포함하는 액적)을 분리하고, 일부 경우, 분리된 구성 성분을 하나 이상의 샘플 수집 용기에 전달하는 것을 말하는 데에 사용된다. 예를 들어, 방법은, 샘플의 예를 들어 3 개 이상의 구성 성분, 예를 들어 4 개 이상의 구성 성분, 예를 들어 5 개 이상의 구성 성분, 예를 들어 15 개 이상의 구성 성분, 예를 들어 15 개 이상의 구성 성분, 및 예를 들어 25 개 이상의 구성 성분의 분류를 포함하여, 샘플의 2 개 이상의 성분을 분류하는 단계를 포함할 수 있다.
입자와 관련된 형광단의 양을 기준으로 식별된 입자를 분류할 때, 방법은 컴퓨터와 같은 데이터 수집, 분석 및 기록을 포함하며, 여기서 다중 데이터 채널은 입자와 관련된 복수의 형광단의 중복 스펙트럼을 얻는 데 사용되는 각 검출기의 데이터를 기록한다. 이러한 실시 예에서, 분석은 입자와 연관된 중첩 스펙트럼을 갖는 복수의 형광단으로부터의 광을 스펙트럼 분해하고 (예를 들어, 스펙트럼 비 혼합 행렬 계산하여) 입자와 연관된 각 형광단의 추정된 풍부도에 기초하여 입자를 식별하는 단계를 포함한다. 이 분석은 입자 분류를 기반으로 디지털화된 매개 변수 세트를 생성하도록 구성된 분류 시스템으로 전달될 수 있다.
일부 실시 예에서, 샘플의 성분을 분류하는 방법은 예를 들어, 2017년 3월 28일에 출원된 미국 특허 공개 번호 2017/0299493에 설명되어 있는 바와 같이, 편향 판이 있는 입자 분류 모듈을 사용하여 입자 (예를 들어, 생물학적 샘플의 세포)를 분류하는 단계를 포함하며, 그 개시 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다. 특정 실시 예에서, 샘플의 세포는 2019년 2월 8일에 출원된 미국가 특허 출원 번호 62/803,264에 설명된 것과 같이, 복수의 분류 결정 유닛이 있는 분류 결정 모듈을 사용하여 분류되고, 그 개시 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
샘플에서 중첩 형광 스펙트럼을 갖는 형광체에서 나오는 빛을 스펙트럼 분해하기 위한 시스템
상기 요약된 바와 같이, 본 개시의 측면은 샘플에서 중첩된 형광 스펙트럼을 갖는 형광단으로부터의 광을 스펙트럼 분해하기 위한 시스템을 포함한다. 전술한 바와 같이, 용어 "스펙트럼 분해"는 본 명세서에서 통상적인 의미로 사용되어 각 기여 형광단에 빛의 중첩 파장을 할당하거나 기여함으로써 샘플에서 각 형광단을 스펙트럼으로 구별하는 것을 의미한다. 실시 예에서, 각 형광단에 기인하는 형광의 중첩 스펙트럼 성분은 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산함으로써 결정된다. 실시 예에서, 대상 시스템은 각 형광단의 형광 스펙트럼이 샘플에서 적어도 하나의 다른 형광단의 형광 스펙트럼과 중첩하는 복수의 형광단을 갖는 샘플을 특성화하는 데 사용된다. 일부 경우에, 각 형광단의 형광 스펙트럼은 샘플의 적어도 하나의 다른 형광단의 형광 스펙트럼과 예를 들어 10nm 이상, 예를 들어 25nm 이상 및 50nm 이상을 포함하여, 5nm 이상 중첩한다. 특정 경우에, 샘플에 있는 하나 이상의 형광단의 형광 스펙트럼은 예를 들어, 형광 스펙트럼에서 각각의 중첩이 예를 들어 10nm 이상, 예를 들어 25nm 이상 및 50nm 이상을 포함하여, 5nm 이상인 경우와 같이, 샘플에 있는 둘 이상의 다른 형광단의 형광 스펙트럼과 중첩한다. 실시 예에서, 시스템은 각 형광단의 형광 스펙트럼이 샘플에서 적어도 하나의 다른 형광단의 형광 스펙트럼과 중첩되는 복수의 형광단을 가진 샘플을 조사하도록 구성된 광원을 포함한다. 실시 예들에서, 광원은 임의의 적절한 광대역 또는 협 대역 광원일 수 있다. 샘플의 구성 성분 (예를 들어, 세포, 비드, 비 세포 입자 등)에 따라 광원은 250 nm 내지 1250 nm, 300 nm 내지 1000 nm, 350 nm 내지 900 nm 및 400 nm 내지 800 nm 포함하는 것과 같이, 200nm에서 1500nm까지 다양한 빛의 파장을 방출하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 광원은 200nm 내지 900nm의 파장을 갖는 광을 방출하는 광대역 광원을 포함할 수 있다. 다른 경우, 광원은 200 nm 내지 900 nm 범위의 파장을 방출하는 협 대역 광원을 포함한다. 예를 들어, 광원은 200 nm 내지 900 nm 범위의 파장을 갖는 광을 방출하는 협 대역 LED (1 nm 내지 25 nm) 일 수 있다. 특정 실시 예에서, 광원은 레이저이다. 일부 사례에서, 대상 시스템에는 헬륨-네온 레이저, 아르곤 레이저, 크립톤 레이저, 크세논 레이저, 질소 레이저, CO2 레이저, CO 레이저, 아르곤-불소 (ArF) 엑시머 레이저, 크립톤-불소 (KrF) 엑시머 레이저, 크세논 염소 (XeCl) 엑시머 등 레이저 또는 크세논-불소 (XeF) 엑시머 레이저 또는 이들의 조합과 같은, 가스 레이저를 포함한다. 다른 경우에, 대상 시스템은 스틸 벤, 쿠마린 또는 로다민 레이저와 같은 염료 레이저를 포함한다. 또 다른 경우에, 관심있는 레이저는 헬륨-카드뮴 (HeCd) 레이저, 헬륨-수은 (HeHg) 레이저, 헬륨-셀레늄 (HeSe) 레이저, 헬륨-은 (HeAg) 레이저, 스트론튬 레이저, 네온-구리 (NeCu) 레이저, 구리 레이저 또는 금과 같은 레이저 및 이들의 조합과 같은, 금속 증기 레이를 포함한다. 또 다른 경우에, 대상 시스템는 루비 레이저, Nd:YAG 레이저, NdCrYAG 레이저, Er:YAG 레이저, Nd:YLF 레이저, Nd:YVO4 레이저, Nd:YCa4O(BO3)3 레이저, Nd:YCOB 레이저, 티타늄 사파이어 레이저, 툴림 YAG 레이저, 이테르븀 YAG 레이저, 이테르븀2O3 레이저 또는 세륨 도핑된 레이저 및 이들의 조합와 같은, 고체 레이저이다.
다른 실시 예에서, 광원은 제한하는 것은 아니지만, 할로겐 램프, 중수소 아크 램프, 크세논 아크 램프를 포함하는, 램프와 같은, 비 레이저 광원, 연속 스펙트럼을 갖는 광대역 LED, 초 발광 발광 다이오드, 반도체 발광 다이오드와 같은 발광 다이오드, 광 스펙트럼 LED 백색 광원, 통합된 다중 LED를 포함한다. 일부 경우, 비 레이저 광원은 다른 광원 또는 이들의 임의의 조합 중에서 안정화된 섬유 결합 광대역 광원, 백색 광원이다.
광원은 유동 스트림으로부터 0.005mm 이상, 0.01mm 이상, 0.05mm 이상, 0.1mm 이상, 0.5mm 이상, 1mm 이상, 5mm 이상, 10mm 이상, 25mm 이상 및 100mm 이상을 포함하여, 0.001mm 이상의 거리, 샘플 (예를 들어, 유량 분석기의 유동 스트림)에서 적절한 거리에 위치할 수 있다. 또한 광원은 10 ° 내지 90 ° 범위의 각도, 예를 들어 15 ° 내지 85 °, 20 ° 내지 80 °, 25 ° 내지 75 ° 및 30 ° 내지 60 ° 및 90 ° 각도를 포함하여, 임의의 적절한 각도 (예를 들어, 유동 스트림의 수직 축에 대해 상대적)로 샘플을 조사한다.
광원은 샘플을 연속적으로 또는 이산 간격으로 조사하도록 구성될 수 있다. 일부 사례에서 시스템은 예를 들어, 유세포 분석기의 조사 지점에서 유동 스트림을 지속적으로 조사하는 연속파 레이저를 사용하는 것과 같이, 샘플을 지속적으로 조사하도록 구성된 광원을 포함한다. 다른 경우에, 관심있는 시스템은 0.001 밀리 초마다, 0.01 밀리 초마다, 0.1 밀리 초마다, 1 밀리 초마다, 10 밀리 초마다, 100 밀리 초마다 (1000 밀리 초마다 또는 기타 간격 포함)와 같은, 개별 간격으로 샘플을 조사하도록 구성된 광원을 포함한다. 광원이 개별 간격으로 샘플을 조사하도록 구성된 경우, 시스템은 광원으로 샘플을 간헐적으로 조사하기 위해 하나 이상의 추가 구성 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 실시 예의 대상 시스템은 샘플을 광원에 차단하고 노출하기 위한 하나 이상의 레이저 빔 초퍼, 수동 또는 컴퓨터 제어식 빔 정지 장치를 포함할 수 있다.
일부 실시 예에서, 광원은 레이저이다. 관심있는 레이저는 펄스 레이저 또는 연속파 레이저를 포함할 수 있다. 예를 들어, 레이저는 헬륨-네온 레이저, 아르곤 레이저, 크립톤 레이저, 크세논 레이저, 질소 레이저, CO2 레이저, CO 레이저, 아르곤-불소 (ArF) 엑시머 레이저, 크립톤-불소 (KrF) 엑시머 레이저, 크세논 염소 (XeCl) 엑시머 레이저 또는 크세논-불소 (XeF) 엑시머 레이저 또는 이들의 조합과 같은, 가스 레이저; 스틸벤, 쿠마린 또는 로다민 레이저와 같은 색소 레이저; 헬륨-카드뮴 (HeCd) 레이저, 헬륨-수은 (HeHg) 레이저, 헬륨-셀레늄 (HeSe) 레이저, 헬륨-은 (HeAg) 레이저, 스트론튬 레이저, 네온-구리 (NeCu) 레이저, 구리 레이저 또는 금 레이저 및 그 조합과 같은 금속 증기 레이저 레이저; 루비 레이저, Nd:YAG 레이저, NdCrYAG 레이저, Er:YAG 레이저, Nd:YLF 레이저, Nd:YVO4 레이저, Nd:YCa4O(BO3)3 레이저, Nd:YCOB 레이저, 티타늄 사파이어 레이저, 툴림 YAG 등 레이저, 이테르븀 YAG 레이저, ytterbium2O3 레이저 또는 세륨 도핑된 레이저 및 이들의 조합과 같은 고체 레이저; 광학적으로 펌핑된 반도체 레이저 (OPSL) 반도체 다이오드 레이저; 또는 상기 언급된 임의의 레이저의 주파수 2 배 또는 주파수 3 배 구현을 포함한다.
특정 실시 예에서, 광원은 2 개 이상의 주파수 편이된 광 빔을 생성하도록 구성된 광 빔 생성기이다. 일부 경우, 광 빔 생성기는 2 개 이상의 각도로 편향된 레이저 빔을 생성하기 위해 음향 광학 장치에 무선 주파수 구동 신호를 적용하도록 구성된 무선 주파수 생성기인 레이저를 포함한다. 이들 실시 예에서, 레이저는 펄스 레이저 또는 연속파 레이저일 수 있다. 예를 들어 관심있는 광선 발생기의 레이저는, 헬륨-네온 레이저, 아르곤 레이저, 크립톤 레이저, 크세논 레이저, 질소 레이저, CO2 레이저, CO 레이저, 아르곤-불소 (ArF) 엑시머 레이저, 크립톤-불소 (KrF) 엑시머 레이저, 크세논 염소 (XeCl) 엑시머 레이저 또는 크세논-불소 (XeF) 엑시머 레이저 또는 이들의 조합과 같은, 가스 레이저; 스틸벤, 쿠마린 또는 로다민 레이저와 같은 색소 레이저; 헬륨-카드뮴 (HeCd) 레이저, 헬륨-수은 (HeHg) 레이저, 헬륨-셀레늄 (HeSe) 레이저, 헬륨-은 (HeAg) 레이저, 스트론튬 레이저, 네온-구리 (NeCu) 레이저, 구리 레이저 또는 금 레이저 및 그 조합과 같은 금속 증기 레이저; 루비 레이저, Nd:YAG 레이저, NdCrYAG 레이저, Er:YAG 레이저, Nd:YLF 레이저, Nd:YVO4 레이저, Nd:YCa4O(BO3)3 레이저, Nd:YCOB 레이저, 티타늄 사파이어 레이저, 툴림 YAG 등 레이저, 이테르븀 YAG 레이저, ytterbium2O3 레이저 또는 세륨 도핑된 레이저 및 이들의 조합과 같은 고체 레이저일 수 있다.
음향 광학 장치는 적용된 음향 파를 사용하여 레이저 광을 주파수 이동하도록 구성된 임의의 편리한 음향 광학 프로토콜일 수 있다. 특정 실시 예에서, 음향 광학 장치는 음향 광학 편향기이다. 대상 시스템의 음향 광학 장치는 레이저의 빛과 적용된 고주파 구동 신호로부터 각도로 편향된 레이저 빔을 생성하도록 구성된다. 무선 주파수 구동 신호는 직접 디지털 합성기 (DDS), 임의 파형 발생기 (AWG) 또는 전기 펄스 발생기와 같은, 임의의 적절한 무선 주파수 구동 신호 소스와 함께 음향 광학 장치에 적용될 수 있다.
실시 예에서, 제어기는, 4 개 이상의 고주파 구동 신호, 5 개 이상의 고주파 구동 신호, 6 개 이상의 고주파 구동 신호, 7 개 이상의 고주파 구동 신호, 8 개 이상의 고주파 구동 신호, 9 개 이상의 고주파 구동 신호, 10 개 이상의 무선 주파수 구동 신호, 15 개 이상의 무선 주파수 구동 신호, 25 개 이상의 무선 주파수 구동 신호, 50 개 이상의 무선 주파수 구동 신호 및 100 개 이상의 무선 주파수 구동 신호를 포함하여, 3 개 이상의 무선 주파수 구동 신호를 적용하도록 구성되는 것과 같이, 출력 레이저 빔에서 원하는 수의 각도로 편향된 레이저 빔을 생성하기 위해 음향 광학 장치에 고주파 구동 신호를 적용하도록 구성된다.
일부 경우에, 출력 레이저 빔에서 각도로 편향된 레이저 빔의 강도 프로파일을 생성하기 위해, 제어기는, 예를 들어, 약 0.005 V 내지 약 400 V, 약 0.01 V 내지 약 300 V, 약 0.05 V 내지 약 200 V, 약 0.1 V 내지 약 100 V, 약 0.5 V 약 75V, 약 1V 내지 50V, 약 2V 내지 40V, 3V 내지 약 30V 및 약 5V 내지 약 25V를 포함하여, 약 0.001MHz 내지 약 500MHz 까지 다양한 진폭을 갖는 무선 주파수 구동 신호를 적용하도록 구성된다. 각각의 적용된 무선 주파수 구동 신호는 일부 실시 예에서, 예를 들어, 약 0.005MHz 내지 약 400MHz, 약 0.01MHz 내지 약 300MHz, 약 0.05MHz 내지 약 200MHz, 약 0.1MHz 내지 약 100MHz, 약 0.5MHz 약 90MHz, 약 1MHz 내지 약 75MHz, 약 2MHz 내지 약 70MHz, 약 3MHz 내지 약 65MHz, 약 4MHz 내지 약 60MHz 및 약 5MHz에서 약 50MHz을 포함하여, 약 0.001MHz 내지 약 500MHz의 주파수를 가진다.
특정 실시 예에서, 컨트롤러는 메모리가 프로세서에 의해 실행될 때 프로세서가 원하는 강도 프로파일을 갖는 각도로 편향된 레이저 빔을 사용하여 출력 레이저 빔을 생성하도록 하는 명령을 저장하고 있도록 프로세서에 작동 가능하게 결합된 메모리를 갖는 프로세서를 갖는다. 예를 들어, 메모리는, 3 개 이상, 4 개 이상, 5 개 이상, 10 개 이상, 25 개 이상, 50 개 이상 및 100 개 이상의 각도 편향된 레이저 빔을 생성하는 하는 명령을 포함하는 것과 같이, 동일한 강도로 2 개 이상의 각도 편향된 레이저 빔을 생성하는 명령을 포함할 수 있다. 다른 실시 예에서, 메모리는, 3 개 이상, 4 개 이상, 5 개 이상, 10 개 이상, 25 개 이상, 50 개 이상, 및 100 개 이상의 각도 편향된 레이저 빔을 생성하는 명령을 포함하여, 상이한 강도를 갖는 2 개 이상의 각도로 편향된 레이저 빔을 생성하기 위한 명령을 포함할 수 있다.
특정 실시 예에서, 컨트롤러는 작동 가능하게 결합된 메모리를 갖는 프로세서를 구비하므로, 메모리는 프로세서에 의해 실행될 때, 프로세서로 하여금 수평 축을 따라 출력 레이저 빔의 가장자리에서 중앙까지 증가하는 강도를 갖는 출력 레이저 빔을 생성하게 하는 명령을 저장한다. 이러한 경우에, 출력 빔의 중심에서 각도가 편향된 레이저 빔의 강도는, 예를 들어 수평 축을 따라 출력 레이저 빔의 가장자리에서 각도로 편향된 레이저 빔 강도의 0.5 % 내지 약 95 %, 예를 들어 1 % 내지 약 90 %, 예를 들어 약 2 % 내지 약 85 %, 예를 들어 약 3 % 내지 약 80 %, 예를 들어 약 4 % 내지 약 75 %, 예를 들어 약 5 % 내지 약 70 %, 예를 들어 약 6 % 내지 약 65 %, 예를 들어 약 7 % 내지 약 60 %, 예를 들어 약 8 % 내지 약 55 %, 및 약 10 % 내지 약 50 %를 포함하여, 수평 축을 따라 출력 레이저 빔의 가장자리에서 각도로 편향된 레이저 빔의 강도의 0.1 % 내지 약 99 % 범위일 수 있다. 다른 실시 예에서, 컨트롤러는 작동 가능하게 결합된 메모리를 갖는 프로세서를 구비하므로 메모리는 프로세서에 의해 실행될 때, 프로세서로 하여금 수평축을 따라 출력 레이저 빔의 가장자리에서 중앙까지 증가하는 강도를 갖는 출력 레이저 빔을 생성하도록 하는 명령을 저장하고 있다. 이들 경우에, 출력 빔의 가장자리에서 각도로 편향된 레이저 빔의 강도는, 예를 들어 수평축을 따라 출력 레이저 빔의 중앙에서 각도로 편향된 레이저 빔 강도의 0.5 % 내지 약 95 %, 예를 들어 1 % 내지 약 90 %, 예를 들어 약 2 % 내지 약 85 %, 예를 들어 약 3 % 내지 약 80 %, 예를 들어 약 4 % 내지 약 75 %, 예를 들어 약 5 % 내지 약 70 %, 예를 들어 약 6 % 내지 약 65 %, 예를 들어 약 7 % 내지 약 60 %, 예를 들어 약 8 % 내지 약 55 % 및 약 10 % 내지 약 50 %을 포함하여, 수평 축을 따라 출력 레이저 빔의 중심에서 각도로 편향된 레이저 빔의 강도의 0.1 % 내지 약 99 % 범위 일 수 있다. 또 다른 실시 예에서, 컨트롤러는 메모리가 프로세서에 의해 실행될 때, 프로세서가 수평 축을 따라 가우시안 분포를 갖는 강도 프로파일을 갖는 출력 레이저 빔을 생성하도록 하는 명령이 저장되어 있도록 프로세서에 작동 가능하게 결합된 메모리를 갖는 프로세서를 갖는다. 또 다른 실시 예에서, 컨트롤러는 작동 가능하게 결합된 메모리를 갖는 프로세서를 구비하므로 이 메모리는 프로세서에 의해 실행될 때, 프로세서로 하여금 수평 축을 따라 탑햇 강도 프로파일을 갖는 출력 레이저 빔을 생성하도록 하는 명령을 저장한다.
실시 예에서, 관심있는 광 빔 생성기는 공간적으로 분리된 출력 레이저 빔에서 각도로 편향된 레이저 빔을 생성하도록 구성될 수 있다. 적용된 고주파 구동 신호와 출력 레이저 빔의 원하는 조사 프로파일에 따라, 각도로 편향된 레이저 빔은 예를 들어 0.005 ㎛ 이상, 예를 들어 0.01 ㎛ 이상, 예를 들어 0.05 ㎛ 이상, 예를 들어 0.1 ㎛ 이상, 예를 들어 0.5 ㎛ 이상, 예를 들어 1 ㎛ 이상, 예를 들어 5 ㎛ 이상, 예를 들어 10 ㎛ 이상, 100 ㎛ 이상, 예를 들어 500 ㎛ 이상, 예를 들어 1000 ㎛ 이상, 5000 ㎛ 이상을 포함하여, 0.001 ㎛ 이상 분리될 수 있다. 일부 실시 예에서, 시스템은 출력 레이저 빔의 수평 축을 따라 인접한 각도 편향된 레이저 빔과 같이 중첩되는 출력 레이저 빔에서 각도 편향된 레이저 빔을 생성하도록 구성된다. 인접한 각도로 편향된 레이저 빔 사이의 중첩 (예를 들어, 빔 스폿 중첩)은 0.005 ㎛ 이상의 중첩, 예를 들어, 0.01 ㎛ 이상의 중첩, 예를 들어, 0.05 ㎛ 이상의 중첩, 예를 들어, 0.1 ㎛ 이상의 중첩, 예를 들어, 0.5 ㎛ 이상, 예를 들어 1 ㎛ 이상의 중첩, 예를 들어 5 ㎛ 이상의 중첩, 예를 들어 10 ㎛ 이상의 중첩 및 100 ㎛ 이상의 중첩을 포함하여, 0.001 ㎛ 이상의 중첩일 수 있다.
특정 경우에, 두 개 이상의 주파수 편이 광선을 생성하도록 구성된 광선 발생기는 미국 특허 번호 9,423,353; 9,784,661 및 10,006,852 및 미국 특허 공개 번호 2017/0133857 및 2017/0350803에서 설명되는 바와 같이, 레이저 여기 모듈을 포함하며, 그 개시 내용은 본원에 참조로 포함된다. 실시 예에서, 시스템은 복수의 광 검출기를 갖는 광 검출 시스템을 포함한다. 관심있는 광 검출기는 다른 광 검출기 중에서, 활성 픽셀 센서 (APS), 애벌랜치 포토 다이오드, 이미지 센서, 전하 결합 장치 (CCD), 강화 전하 결합 장치 (ICCD), 발광 다이오드, 광자 계수기, 볼로미터, 초전 검출기, 포토 레지스터, 광전지, 광 다이오드, 광전자 증배관, 광 트랜지스터, 양자점 광 전도체 또는 광 다이오드 및 이들의 조합과 같은 광학 센서를 포함할 수 있지만 이에 국한되지는 않습니다. 특정 실시 예에서, 샘플의 빛은 전하 결합 장치(CCD), 반도체 전하 결합 장치 (CCD), 액티브 픽셀 센서 (APS), 상보 형 금속 산화물 반도체 (CMOS) 이미지 센서 또는 N 형 금속 산화물 반도체 (NMOS) 이미지 센서로 측정된다.
일부 실시 예에서, 관심있는 광 검출 시스템은 복수의 광 검출기를 포함한다. 일부 경우, 광 검출 시스템은 포토 다이오드와 같은 복수의 고체 검출기를 포함한다. 특정 경우, 광 검출 시스템은 광 다이오드 어레이와 같은 광 검출기 어레이를 포함한다. 이러한 실시 예에서, 광 검출기 어레이는 예를 들어 10 개 이상의 광 검출기, 예를 들어 25 개 이상의 광 검출기, 예를 들어 50 개 이상의 광 검출기, 예를 들어 250 개 이상의 광 검출기, 예를 들어 500 개 이상의 광 검출기, 예를 들어 750 개 이상의 광 검출기 및 1000 개 이상의 광 검출기를 포함하여, 4 개 이상의 광 검출기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 검출기는 예를 들어 10 개 이상의 포토 다이오드, 예를 들어 25 개 이상의 포토 다이오드, 예를 들어 50 개 이상의 포토 다이오드, 예를 들어 100 개 이상의 포토 다이오드, 예를 들어 250 개 이상의 포토 다이오드, 예를 들어 500 개 이상의 포토 다이오드, 예를 들어 750 개 이상의 포토 다이오드, 및 1000 개 이상의 포토 다이오드를 포함하여, 4 개 이상의 포토 다이오드를 갖는 포토 다이오드 어레이일 수 있다.
광 검출기는 원하는대로 임의의 기하학적 구성으로 배열될 수 있으며, 관심 배열은 정사각형 구성, 직사각형 구성, 사다리꼴 구성, 삼각형 구성, 육각형 구성, 7 각형 구성, 팔각형 구성, 비각형 구성, 10 각형 구성, 12 각형 구성, 원형 구성, 타원형 구성 뿐만 아니라 불규칙한 패턴 구성을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 광 검출기 어레이의 광 검출기는 예를 들어 15 ° 내지 170 °, 예를 들어 20 ° 내지 160 °, 예를 들어 25 ° 내지 150 °, 예를 들어 30 ° 내지 120 ° 및 45 ° 내지 90 °를 포함하여, 10 ° 내지 180 ° 범위의 각도로 다른 (X-Z 평면에서 참조된)에 대해 배향될 수 있다. 광 검출기 어레이는 임의의 적절한 모양 일 수 있고, 예를 들어 정사각형, 직사각형, 사다리꼴, 삼각형, 육각형 등, 곡선 모양과 같은 직선 모양, 예를 들어 원, 타원형과 같은 곡선 모양, 뿐만 아니라, 예를 들어 평평한 상부 부분에 결합된 포물선 형 바닥 부분과 같은 불규칙한 형태일 수 있다. 특정 실시 예에서, 광 검출기 어레이는 직사각형 모양의 활성 표면을 갖는다.
어레이의 각 광 검출기 (예를 들어, 광 다이오드)는 폭이 예를 들어 10 ㎛ 내지 225 ㎛, 예를 들어 15 ㎛ 내지 200 ㎛, 예를 들어 20 ㎛ 내지 175 ㎛, 예를 들면 25 ㎛ 내지 150 ㎛, 예를 들어 30 ㎛ 내지 125, 예를 들어, 50 ㎛ 내지 100 ㎛를 포함하여, 5 ㎛ 내지 250 ㎛ 사이의 폭, 및 예를 들어 10 ㎛에서 225 ㎛, 예를 들어 15 ㎛에서 200 ㎛, 예를 들어 20 ㎛에서 175 ㎛, 예를 들면 25 ㎛에서 150 ㎛, 예를 들어 30 ㎛ ~ 125 ㎛ 및 50 ㎛에서 100 ㎛을 포함하여, 5 ㎛에서 250 ㎛ 범위의 길이를 갖는 활성 표면을 가질 수 있다. 여기서 어레이에 있는 각 광 검출기 (예를 들어, 포토다이오드)의 표면적은, 예를 들어 50 ㎛2 내지 9000 ㎛2, 예를 들어, 75 ㎛2 내지 8000 ㎛2, 예를 들어, 100 ㎛2 내지 7000 ㎛2, 예를 들어, 150 ㎛2 내지 6000 ㎛2 및 200 ㎛2 내지 5000 ㎛2를 포함하여, 25 ㎛2 내지 10000 ㎛2의 범위에 있다.
광 검출기 어레이의 크기는 빛의 양과 강도, 광 검출기 수 및 원하는 감도에 따라 달라질 수 있으며 길이는 예를 들어 0.05mm 내지 90mm, 예를 들어 0.1mm 내지 80mm, 예를 들어 0.5mm 내지 70mm, 예를 들어 1mm 내지 60mm, 예를 들어 2mm 내지 50mm, 예를 들어 3mm 내지 40mm, 예를 들어 4mm 내지 30mm 및 5mm 내지 25mm 포함하여, 0.01mm 내지 100mm 범위일 수 있다. 광 검출기 어레이의 폭은 예를 들어 0.05mm 내지 90mm, 예를 들어 0.1mm 내지 80mm, 예를 들어 0.5mm 내지 70mm, 예를 들어 1mm 내지 60mm, 예를 들어 2mm 내지 50mm, 예를 들어 3mm 내지 40mm, 예를 들어 4mm 내지 30mm 및 5mm 내지 25mm를 포함하여, 0.01mm 내지 100m로 다양할 수 있다. 따라서 광 검출기 어레이의 활성 표면은 0.5 mm2 내지 5000 mm2, 1 mm2 내지 1000 mm2, 5 mm2 내지 500 mm2, 및 1mm2 내지 100 mm2를 포함하여, 0.1 mm2 내지 10000 mm2의 범위가 될 수 있다.
해당 광 검출기는 예를 들어 2 개 이상의 파장, 예를 들어 5 개 이상의 다른 파장, 예를 들어 10 개 이상의 다른 파장, 예를 들어 25 개 이상의 다른 파장, 예를 들어 50 개 이상의 다른 파장, 예를 들어 100 개 이상 다른 파장, 예를 들어 200 개 이상의 다른 파장, 예를 들어 300 개 이상의 다른 파장 및 400 개 이상의 다른 파장에서 유동 스트림에서 샘플에 의해 방출되는 빛을 측정하는 것을 포함하여, 하나 이상의 파장에서 수집된 빛을 측정하도록 구성된다.
일부 실시 예에서, 광 검출기는 파장 범위 (예를 들어, 200 nm 내지 1000 nm)에 걸쳐 수집된 빛을 측정하도록 구성된다. 특정 실시 예에서, 관심 광 검출기는 파장 범위에 걸쳐 광 스펙트럼을 수집하도록 구성된다. 예를 들어, 시스템은 200 nm 내지 1000 nm의 파장 범위 중 하나 이상에 걸쳐 빛의 스펙트럼을 수집하도록 구성된 하나 이상의 검출기를 포함할 수 있다. 또 다른 실시 예에서, 관심 검출기는 하나 이상의 특정 파장에서 유동 스트림에서 샘플의 빛을 측정하도록 구성된다. 예를 들어, 시스템은 450 nm, 518 nm, 519 nm, 561 nm, 578 nm, 605 nm, 607 nm, 625 nm, 650 nm, 660 nm, 667 nm, 670 nm, 668 nm, 695 nm, 710 nm, 723 nm, 780 nm, 785 nm, 647 nm, 617 nm 및 이들의 조합 중 하나 이상에서 빛을 측정하도록 구성된 하나 이상의 검출기를 포함할 수 있다. 특정 실시 예에서, 광 검출기는 형광 분석에서 샘플과 함께 사용되는 것과 같은 특정 형광단과 쌍을 이루도록 구성될 수 있다. 일부 실시 예에서, 광 검출기는 샘플에서 각 형광단의 전체 형광 스펙트럼에 걸쳐 수집된 빛을 측정하도록 구성된다.
빛 감지 시스템은 빛을 연속적으로 또는 이산 간격으로 측정하도록 구성된다. 일부 경우에, 관심있는 광 검출기는 수집된 빛을 지속적으로 측정하도록 구성된다. 다른 경우에, 빛 감지 시스템은, 0.001 밀리 초마다, 0.01 밀리 초마다, 0.1 밀리 초마다, 1 밀리 초마다, 10 밀리 초마다, 100 밀리 초마다, 1000 밀리 초마다를 포함하는 개별 간격 또는 기타 다른 간격에서, 빛을 측정하는 것과 같이 개별 간격에서 측정을 수행하도록 구성되어 있다.
실시 예에서, 시스템은 조사된 샘플의 빛을 분석하고 샘플의 각 형광단에서 나오는 빛을 스펙트럼 분해하도록 구성된다. 일부 실시 예에서, 시스템은 샘플에서 각각의 상이한 형광단 사이의 중첩을 결정하고 중첩 형광에 대한 각 형광단의 기여도를 계산하기 위한 명령이 저장된 메모리를 포함한다. 특정 실시 예에서, 시스템은 광 검출 시스템에 의해 검출된 샘플에서 중첩 형광을 갖는 복수의 형광단의 형광 스펙트럼에 대한 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하도록 구성된다. 아래에서 더 자세히 설명하는 바와 같이, 시스템은 샘플에 있는 각 형광단의 풍부도을 추정하도록 구성될 수도 있다. 특정 구체 예에서, 표적 입자와 관련된 각 형광단의 풍부도가 결정될 수 있다. 시스템은 표적 입자와 관련된 각 형광단의 풍부도에 기초하여 표적 입자를 식별하고 분류하도록 구성될 수 있다. 일부 사례에서 시스템은 식별되거나 분류된 입자를 분류하도록 구성된다. 이러한 실시 예에서, 시스템은 컴퓨터 제어 시스템을 포함할 수 있으며, 여기서 시스템은 본 명세서에서 설명된 방법을 실행하기위한 시스템의 완전한 자동화 또는 부분 자동화를 위한 하나 이상의 컴퓨터를 더 포함한다. 일부 실시 예에서, 시스템은 컴퓨터 프로그램이 저장된 컴퓨터 판독 가능 저장 매체를 갖는 컴퓨터를 포함하고, 여기에서 컴퓨터에 로드될 때 컴퓨터 프로그램은 유동 스트림에 샘플이 있는 유동 세포를 광원으로 조사하고 유동 세포로부터의 빛을 복수의 광 검출기를 갖는 광 검출 시스템으로 검출하고, 광 검출 시스템에 의해 검출된 각 입자에 대한 복수의 형광단의 형광 스펙트럼에 대한 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하고, 스펙트럼 비 혼합 행렬을 사용하여 각 형광단의 풍부도를 추정하고; 및 추정된 형광단 풍부도를 기반으로 샘플의 입자를 분류하기 위한 명령을 포함한다.
일부 실시 예에서, 시스템은 컴퓨터 프로그램이 저장된 컴퓨터 판독 가능 저장 매체를 갖는 컴퓨터를 포함하고, 여기서 컴퓨터 프로그램은 컴퓨터에 로드될 때 가중치가 적용된 최소 제곱 알고리즘을 사용하여 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산함으로써 중첩 형광을 갖는 각 형광단으로부터의 빛을 스펙트럼 분해하기 위한 명령을 더 포함한다. 일부 경우에, 가중 최소 제곱 알고리즘은 다음에 따라 계산된다:
Figure pct00105
여기서 y는 각 세포에 대한 광 검출 시스템의 복수의 광 검출기로부터 측정된 검출기 값이고;
Figure pct00106
는 추정되는 형광단 풍부도이고; X는 스필오버이고; W는
Figure pct00107
이다. 일부 실시 예에서, 각 Wii는 다음에 따라 계산된다:
Figure pct00108
여기에서 σi 2는 검출기 i에서의 분산이고; yi는 검출기 i에서의 신호이고; λi는 검출기 i에서 일정한 노이즈이다. 특정 실시 예에서, 스펙트럼 비 혼합 행렬은 (XTWX)-1XTW에 따라 계산된다. 일부 경우에, 본 발명의 시스템은 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하기 위해 광 검출 시스템에 의해 검출된 각 세포에 대해 (XTWX)을 역전시키는 명령을 갖는 메모리를 포함한다. 특정 실시 예에서, 시스템은 컴퓨터 프로그램이 저장된 컴퓨터 판독 가능 저장 매체를 갖는 컴퓨터를 포함하고, 컴퓨터에 로드될 때 컴퓨터 프로그램은 샘플의 세포를 실시간으로 분류하기 위해 광 검출 시스템에 의해 검출된 각 세포에 대한 가중 최소 제곱 알고리즘에서 (XTWX)의 역을 근사화하는 명령을 더 포함한다. 일부 실시 예에서, 컴퓨터에 로드될 때 컴퓨터 프로그램은 (XTWX)을 역전하고 다음에 따라 반복적인 뉴턴-랩슨 계산법을 사용하여 (XTWX)를 근사하기 위한 명령을 추가로 포함한다:
A-1 = (XTWX)-1;
A0 -1 = (XTWGX)-1;
Figure pct00109
여기서 WG는 광 검출 시스템의 각 광 검출기의 분산으로부터 결정되는 미리 결정된 W의 근사치이다.
일부 실시 예에서, 시스템은 컴퓨터 프로그램이 저장된 컴퓨터 판독 가능 저장 매체를 갖는 컴퓨터를 포함하며, 여기서 컴퓨터에 로드될 때 컴퓨터 프로그램은 각 광 검출기의 분산을 추정하기 위한 명령을 더 포함한다. 일부 예에서, 명령은 단일 오염 대조 샘플을 사용하여 광 검출기 노이즈 성분 (예를 들어, 전자 노이즈, 배경 조명 등)을 결정하는 것을 포함한다. 다른 경우에, 명령은 샘플에 광원을 조사하기 전에 각 광 검출기의 분산을 결정하는 것을 포함한다. 또 다른 예에서, 명령은 샘플을 광원으로 조사하기 전에 미리 결정된 W의 근사치, WG를 결정하는 것을 포함한다. 특정 실시 예에서, 메모리는 프로세서에 의해 실행될 때 프로세서로 하여금 미리 결정된 WG로 A0 -1을 미리 계산하게 하는 명령를 저장하고 있다. 이러한 실시 예에서, 사전 계산된 A0 -1은 메모리에 저장되고 광 검출 시스템에 의해 검출된 각 입자에 대한 A-1의 제 1 근사치로서 프로세서에 의해 사용될 수 있다.
다른 실시 예에서, 시스템은 프로세서에 동작 가능하게 결합된 메모리를 갖는 프로세서를 포함하며, 여기서 메모리는 프로세서에 의해 실행될 때 프로세서가 셔먼-모리슨 반복 역 업데이터를 사용하여 각 입자에 대해 가중치가 적용된 최소 제곱 알고리즘을 근사하게 하는 명령을 저장하고 있다. 일부 경우 메모리는 셔먼-모리슨 공식을 사용하여 A를 계산하기 위한 명령을 포함한다:
Figure pct00110
특정 예에서, 메모리는 셔먼-모리슨 공식을 사용하여 A0의 섭동의 역을 계산하기 위해 A0 -1을 사전 계산하기 위한 명령을 포함한다. 일부 실시 예에서, A0의 역은 공식 XTW0X에 의해 계산되고 A의 역은 공식 XTWX에 의해 계산된다. 일부 경우에, 메모리는 다음에 따라 각 반복 W를 갖는 열 벡터의 곱으로 △A (즉, A-A0)를 계산하기 위한 명령을 포함한다:
Figure pct00111
및
Figure pct00112
여기서,
Figure pct00113
Figure pct00114
Figure pct00115
및
Figure pct00116
및
Figure pct00117
실시 예에 따르면,
Figure pct00118
이고, 여기서 A는 다음과 같이 표현될 수 있다:
Figure pct00119
(1)
Figure pct00120
(2)
이들 실시 예에서, 각각의 A는 각각의 wi에 대한 변경을 사용하여 각각의 새로운 가중치 행렬 W (즉, W0와 다른 값을 사용)로 A0로부터 재 계산될 수 있다. 일부 실시 예에서, 시스템은 프로세서에 동작 가능하게 결합된 메모리를 갖는 프로세서를 포함하며, 여기서 메모리는 프로세서에 의해 실행될 때 프로세서가 다음에 따라 스펙트럼 비 혼합 행렬을 근사화하기 위해 셔먼-모리슨 반복 역 업데이터를 수행하게 하는 명령이 저장되어 있다:
Figure pct00121
(3)
Figure pct00122
(4)
Figure pct00123
(5)
Figure pct00124
(6)
Figure pct00125
(7)
Figure pct00126
(8)
일부 실시 예에서, A0 -1에 대한 사전 계산된 값이 A1 -1을 계산하는 데 사용된다. 그런 다음 미리 계산된 A1 -1을 사용하여 A2 -1을 계산한다. 값 A-1은 i = 1에서 ND까지 각 (Ai-1)-1을 사용하여 Ai -1을 반복 계산하여 계산할 수 있다. 특정 실시 예에서, 대상 시스템은 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이를 포함하고 스펙트럼 비 혼합 알고리즘은 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이에서 실시간으로 각 세포에 대해 계산된다.
다른 실시 예에서, 시스템은 프로세서에 동작 가능하게 결합된 메모리를 갖는 프로세서를 포함하며, 여기서 메모리는 프로세서에 의해 실행될 때 프로세서가 행렬 분해에 의해 각 입자에 대해 가중치가 적용된 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 하는 명령이 저장되어 있다. 일부 경우에, 메모리는 예를 들어, 행렬이 하부 삼각 (L) 행렬와 상부 삼각 (U) 행렬의 곱으로 분해되는 것과 같이, LU 행렬 분해를 위한 명령을 포함한다. 특정 경우에, LU 분해에는 가우스 제거가 포함된다. 다른 경우에, LU 분해는 수정된 촐레스키 분해, LDL 분해를 포함하며 여기서 D는 대각 행렬이다. 특정 실시 예에서, 시스템은 프로세서에 동작 가능하게 결합된 메모리를 갖는 프로세서를 포함하며, 여기서 메모리는 프로세서에 의해 실행될 때 프로세서가 다음에 따라 수정된 촐레스키 분해를 사용하여 가중 최소 제곱 알고리즘 (a)을 계산하게 하는 명령이 저장되어 있다:
XTWXa = XTWy
Aa = B
LDLTa = B LDL 분해
Lz = B 여기서 z = DLTa 하부 삼각 행렬 솔루션
Dx = z 여기서 x = LTa 대각선 행렬 솔루션
LTa = x 상부 삼각 행렬 솔루션
다른 실시 예에서, 시스템은 프로세서에 동작 가능하게 결합된 메모리를 갖는 프로세서를 포함하며, 여기서 메모리는 프로세서에 의해 실행될 때 프로세서로 하여금 QR 분해에 의해 가중치가 적용된 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 하는 명령을 저장하고 있다. 일부 경우에 QR 분해는 직교 (Q) 행렬과 상부 삼각 (R) 행렬의 곱인 행렬이다. 일부 실시 예에서, 메모리는 다음에 따라 QR 분해를 사용하여 가중 최소 제곱 알고리즘 (a)을 계산하기 위한 명령을 포함한다:
Figure pct00127
또 다른 실시 예에서, 시스템은 프로세서에 동작 가능하게 결합된 메모리를 갖는 프로세서를 포함하며, 여기서 메모리는 프로세서에 의해 실행될 때 프로세서로 하여금 특이 값 분해(SVD)에 의해 가중치가 적용된 최소 제곱 알고리즘을 계산도록 하는 명령을 저장하고 있다. 어떤 경우에, 특이 값 분해는 곱
Figure pct00128
인 행렬이 되고, 여기서 U와 V는 직교 행렬이고 Σ는
Figure pct00129
의 특이 값을 포함하는 대각 행렬이다. 특정 경우에, 메모리는 다음에 따라 특이 값 분해를 사용하여 가중 최소 제곱 알고리즘 (a)을 계산하기 위한 명령을 포함한다:
z = UTy
Σw = z
a = Vw
일부 실시 예에서, 시스템은 컴퓨터 프로그램이 저장된 컴퓨터 판독 가능 저장 매체를 갖는 컴퓨터를 포함하고, 컴퓨터에 로드될 때 컴퓨터 프로그램은 각 형광단으로부터 스펙트럼 분해된 빛으로부터 샘플에 있는 하나 이상의 형광단의 풍부도를 계산하기 위한 명령을 추가로 포함한다. 특정 경우에, 표적 입자와 연관된 (예를 들어, 화학적으로 결합된 (즉, 공유적으로, 이온적으로) 또는 물리적으로 결합된) 형광단의 풍부는 입자와 연관된 각 형광단으로부터 스펙트럼 분해된 빛으로부터 계산된다. 예를 들어, 하나의 예에서 표적 입자와 관련된 각 형광단의 상대적 풍부도는 각 형광단의 스펙트럼 분해 광으로부터 계산된다. 또 다른 예에서, 표적 입자와 관련된 각 형광단의 절대적 풍부도는 각 형광단의 스펙트럼 분해 빛으로부터 계산된다.
특정 실시 예에서, 시스템은 입자와 연관되는 것으로 결정된 각 형광단의 상대적 풍부도에 기초하여 입자를 식별하거나 분류하도록 구성된다. 이들 실시 예에서, 대상 시스템은 입자와 관련된 각 형광단의 상대적 또는 절대적 존재비를 알려진 동일성의 입자를 갖는 대조군 샘플과 비교하거나; 관련 형광단의 계산된 상대적 또는 절대적 풍부도를 갖는 입자 집단 (예를 들어, 세포)의 분광 또는 기타 분석 분석을 수행하는 것과 같이, 편리한 프로토콜에 의해 입자를 식별하거나 분류하도록 구성될 수 있다.
일부 실시 예에 따른 시스템은 디스플레이 및 조작자 입력 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 조작자 입력 장치는 키보드, 마우스 등일 수 있다. 처리 모듈은 본 방법의 단계를 수행하기 위한 명령어가 저장된 메모리에 액세스하는 프로세서를 포함한다. 처리 모듈은 운영 체제, 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) 컨트롤러, 시스템 메모리, 메모리 저장 장치 및 입출력 컨트롤러, 캐시 메모리, 데이터 백업 장치 및 기타 많은 장치를 포함할 수 있다. 프로세서는 시중에서 구입할 수 있는 프로세서이거나 사용 가능하거나 곧 사용 가능하게 될 다른 프로세서 중 하나일 수 있다. 프로세서는 운영 체제를 실행하고 운영 체제는 잘 알려진 방식으로 펌웨어 및 하드웨어와 인터페이스하며, 당업계에서 알려지 바와 같이, Java, Perl, C++, 기타 고수준 또는 저수준 언어뿐만 아니라 이들의 조합과 같은, 다양한 프로그래밍 언어로 작성될 수 있는 다양한 컴퓨터 프로그램의 기능을 조정하고 실행할 때 프로세서를 용이하게 한다. 운영 체제는 일반적으로 프로세서와 협력하여 컴퓨터의 다른 구성 성분의 기능을 조정하고 실행한다. 운영 체제는 또한 알려진 기술에 따라 스케줄링, 입출력 제어, 파일 및 데이터 관리, 메모리 관리, 통신 제어 및 관련 서비스를 제공한다. 프로세서는 임의의 적합한 아날로그 또는 디지털 시스템일 수 있다. 일부 실시 예에서, 프로세서는 예를 들어 네거티브 피드백 제어와 같은 피드백 제어를 제공하는 아날로그 전자 장치를 포함한다.
시스템 메모리는 다양한 알려진 또는 미래의 메모리 저장 장치 중 하나 일 수 있다. 예를 들어 일반적으로 사용 가능한 임의 액세스 메모리 (RAM), 상주 하드 디스크나 테이프와 같은 자기 매체, 읽기 및 쓰기 컴팩트 디스크와 같은 광학 매체, 플래시 메모리 장치, 또는 다른 메모리 저장 장치를 포함한다. 메모리 저장 장치는 컴팩트 디스크 드라이브, 테이프 드라이브, 이동식 하드 디스크 드라이브 또는 디스켓 드라이브를 포함하여 알려진 또는 미래의 다양한 장치일 수 있다. 이러한 유형의 메모리 저장 장치는 일반적으로 각각 콤팩트 디스크, 자기 테이프, 이동식 하드 디스크 또는 플로피 디스켓과 같은 프로그램 저장 매체 (도시되지 않음)로부터 읽기 및/또는 기록한다. 이러한 프로그램 저장 매체 또는 현재 사용 중이거나 나중에 개발될 수 있는 다른 매체는 컴퓨터 프로그램 제품으로 간주될 수 있다. 이해되는 바와 같이, 이러한 프로그램 저장 매체는 일반적으로 컴퓨터 소프트웨어 프로그램 및/또는 데이터를 저장한다. 컴퓨터 제어 로직이라고도 하는 컴퓨터 소프트웨어 프로그램은 일반적으로 시스템 메모리 및/또는 메모리 저장 장치와 함께 사용되는 프로그램 저장 장치에 저장된다.
일부 실시 예에서, 제어 로직 (프로그램 코드를 포함하는 컴퓨터 소프트웨어 프로그램)이 저장된 컴퓨터 사용 가능 매체를 포함하는 컴퓨터 프로그램 제품이 설명된다. 제어 로직은 프로세서에 의해 컴퓨터가 실행될 때 프로세서로 하여금 본 명세서에 설명된 기능을 수행하도록 한다. 다른 실시 예에서, 일부 기능은 예를 들어 하드웨어 상태 머신을 사용하여 주로 하드웨어로 구현된다. 본 명세서에 설명된 기능을 수행하기위한 하드웨어 상태 머신의 구현은 관련 기술 분야의 당업자에게 명백할 것이다.
메모리는 자기, 광학 또는 고체 저장 장치와 같이, 프로세서가 데이터를 저장하고 검색할 수 있는 적절한 장치일 수 있다 (자기 또는 광 디스크, 테이프 또는 RAM 또는 기타 적절한 장치 (고정 또는 휴대용) 포함). 프로세서는 필요한 프로그램 코드를 운반하는 컴퓨터 판독 가능 매체로부터 적절하게 프로그래밍된 범용 디지털 마이크로 프로세서를 포함할 수 있다. 프로그래밍은 통신 채널을 통해 프로세서에 원격으로 제공될 수 있거나 메모리 또는 메모리와 관련하여 이러한 장치를 사용하는 다른 휴대용 또는 고정 컴퓨터 판독 가능 저장 매체와 같은 컴퓨터 프로그램 제품에 이미 저장되어 있다. 예를 들어, 자기 또는 광 디스크는 프로그래밍을 수행 할 수 있으며 디스크 기록기/판독기에 의해 판독될 수 있다. 본 발명의 시스템은 또한 예를 들어 컴퓨터 프로그램 제품의 형태로, 전술 한 방법을 실행하는데 사용하기위한 알고리즘을 포함한다. 본 발명에 따른 프로그래밍은 컴퓨터 판독 가능 매체, 예를 들어 컴퓨터에 의해 직접 판독 및 액세스될 수 있는 임의의 매체에 기록될 수 있다. 이러한 매체는 플로피 디스크, 하드 디스크 저장 매체 및 자기 테이프와 같은 자기 저장 매체; CD-ROM과 같은 광학 저장 매체; RAM 및 ROM과 같은 전기 저장 매체; 휴대용 플래시 드라이브; 및 자기/광학 저장 매체와 같은 범주의 하이브리드를 포함한다.
프로세서는 또한 원격 위치에서 사용자와 통신하기 위해 통신 채널에 액세스 할 수 있다. 원격 위치라는 것은 광역 네트워크 ("WAN"), 전화 네트워크, 위성 네트워크 또는 휴대 전화 (예: 스마트폰)를 포함한 기타 적절한 통신 채널에 연결된 컴퓨터와 같이, 사용자가 시스템과 직접 접촉하지 않고 외부 장치에서 입력 관리자에게 입력 정보를 전달하는 것을 의미한다.
일부 실시 예에서, 본 개시에 따른 시스템은 통신 인터페이스를 포함하도록 구성될 수 있다. 일부 실시 예에서, 통신 인터페이스는 네트워크 및/또는 다른 장치와 통신하기위한 수신기 및/또는 송신기를 포함한다. 통신 인터페이스는 무선 주파수 (RF) 통신 (예를 들어, 무선 주파수 식별 (RFID), 지그비 통신 프로토콜, WiFi, 적외선, 무선 범용 직렬 버스(USB), 울트라와이드 대역 (UWB), Bluetooth® 통신 프로토콜) 및 코드 분할 다중 액세스(CDMA) 또는 모바일 통신용 글로벌 시스템(GSM)과 같은 셀룰러 통신을 포함하여, 유선 또는 무선 통신으로 구성될 수 있다.
일 실시 예에서, 통신 인터페이스는 하나 이상의 통신 포트, 예를 들어, 물리적 포트 또는 USB 포트, RS-232 포트와 같은 인터페이스, 또는 유사한 보완 데이터 통신을 위해 구성된 (예를 들어, 의사의 사무실 또는 병원 환경에서) 컴퓨터 단말기와 같은 다른 외부 장치와 대상 시스템 사이의 데이터 통신을 허용하는 다른 적절한 전기 연결 포트를 포함하도록 구성된다.
일 실시 예에서, 통신 인터페이스는 대상 시스템이 컴퓨터 단말기 및/또는 네트워크, 통신 가능 이동 전화, 개인용 디지털 보조장치 또는 사용자가 함께 사용할 수 있는 기타 통신 장치와 같은 다른 장치와 통신할 수 있도록 하기 위해서, 적외선 통신, Bluetooth® 통신 또는 기타 적절한 무선 통신 프로토콜을 위해 구성된다.
일 실시 예에서, 통신 인터페이스는 인터넷에 연결된 로컬 영역 네트워크(LAN) 또는 WiFi 핫스팟에서 인터넷에 대한 WiFi 연결시, 휴대폰 네트워크, 단문 메시지 서비스(SMS), 개인용 컴퓨터 (PC)에 무선 연결을 통해 인터넷 프로토콜 (IP)을 사용하는 데이터 전송을 위한 연결을 제공하도록 구성된다.
일 실시 예에서, 대상 시스템은 예를 들어, 802.11 또는 Bluetooth® RF 프로토콜 또는 IrDA 적외선 프로토콜과 같은 공통 표준을 사용하여, 통신 인터페이스를 통해 서버 장치와 무선으로 통신하도록 구성된다. 서버 장치는 스마트 폰, 개인 디지털 보조 장치(PDA) 또는 노트북 컴퓨터와 같은 또는 데스크톱 컴퓨터, 기기 등과 같은 더 큰 장치와 같은, 다른 휴대용 장치일 수 있다. 일부 실시 예에서, 서버 장치는 LCD (액정 디스플레이)와 같은 디스플레이 뿐만 아니라, 버튼, 키보드, 마우스 또는 터치 스크린과 같은 입력 장치를 구비한다.
일부 실시 예에서, 통신 인터페이스는 예를 들어, 위에서 설명된 통신 프로토콜 및/또는 메커니즘 중 하나 이상을 사용하는 네트워크 또는 서버 장치와 함께 선택적인 데이터 저장 장치에서, 대상 시스템에 저장된 데이터를 자동 또는 반자동으로 통신하도록 구성된다.
출력 컨트롤러는 사람이든 기계이든, 로컬이든 원격이든, 사용자에게 정보를 제공하기 위한 다양한 알려진 디스플레이 장치에 대한 컨트롤러를 포함할 수 있다. 디스플레이 장치 중 하나가 시각적 정보를 제공하는 경우, 이 정보는 일반적으로 픽쳐 요소의 배열로 논리적 및/또는 물리적으로 구성될 수 있다. 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) 컨트롤러는 시스템과 사용자 사이에 그래픽 입력 및 출력 인터페이스를 제공하고 사용자 입력을 처리하기 위한 다양한 알려진 또는 미래의 소프트웨어 프로그램을 포함할 수 있다. 컴퓨터의 기능 요소는 시스템 버스를 통해 서로 통신할 수 있다. 이들 통신 중 일부는 네트워크 또는 다른 유형의 원격 통신을 사용하는 대안적인 실시 예에서 달성될 수 있다. 출력 관리자는 처리 모듈에 의해 생성된 정보를 원격 위치의 사용자에게 제공할 수도 있다. 예를 들어, 알려진 기술에 따라 인터넷, 전화 또는 위성 네트워크를 통해, 출력 관리자에 의한 데이터의 표현은 공지된 다양한 기술에 따라 구현될 수 있다.
일부 예로서, 데이터에는 SQL, HTML 또는 XML 문서, 이메일 또는 기타 파일 또는 다른 형식의 데이터가 포함될 수 있다. 데이터는 사용자가 원격 소스에서 추가 SQL, HTML, XML 또는 기타 문서나 데이터를 검색할 수 있도록 인터넷 URL 주소가 포함할 수 있다. 대상 시스템에 존재하는 하나 이상의 플랫폼은 일반적으로 서버라고 하는 컴퓨터 클래스에 속할 것이지만, 알려진 컴퓨터 플랫폼의 모든 유형 또는 향후 개발될 유형일 수 있다. 그러나 메인 프레임 컴퓨터, 워크스테이션 또는 기타 컴퓨터 유형일 수도 있다. 이들은 알려진 또는 미래 유형의 케이블링 또는 네트워크로 연결된 무선 시스템을 포함한 기타 통신 시스템을 통해 연결될 수 있다. 그들은 같은 위치에 있거나 물리적으로 분리되어 있을 수 있다. 선택한 컴퓨터 플랫폼의 유형 및/또는 제조업체에 따라 다양한 운영 체제가 임의의 컴퓨터 플랫폼에 사용될 수 있다. 적절한 운영 체제는 Windows 10, Windows NT®, Windows XP, Windows 7, Windows 8, iOS, Sun Solaris, Linux, OS/400, Compaq Tru64 Unix, SGI IRIX, Siemens Reliant Unix, Ubuntu, Zorin OS 등을 포함한다.
특정 실시 예에서, 대상 시스템은 샘플 상에 조사된 광 (예를 들어, 레이저로부터) 또는 샘플로부터 수집된 광 (예를 들어, 산란, 형광)과 같은 빛을 조정하기위한 하나 이상의 광학적 조정 구성 요소를 포함한다. 예를 들어, 광학적 조정은 빛의 크기, 빛의 초점을 늘리거나 빛을 시준하는 것일 수 있다. 일부 경우에서, 광학적 조정은 예를 들어, 치수를 에를 들어 5 % 이상, 예를 들어 10 % 이상, 예를 들어 25 % 이상, 예를 들어 50 % 이상, 75 % 이상을 포함하여 빔의 크기를 늘리는 것과 같이, 빛의 크기 (예를 들어, 빔 스폿)를 늘리기 위한 확대 프로토콜이다. 다른 실시 예에서, 광학적 조정은 예를 들어 5 % 이상, 예를 들어 10 % 이상, 예를 들어 25 % 이상, 예를 들어 50 % 이상 및 75 % 이상을 포함하여, 빔 스폿의 크기를 줄이는 것과 같이, 광 치수를 감소시키기 위해 광을 포커싱하는 단계를 포함한다. 특정 실시 예에서, 광학적 조정은 광을 시준하는 것을 포함한다. 용어 "시준"은 기존의 의미로 광 전파의 공선성을 광학적으로 조정하거나, 공통 전파 축으로부터의 빛에 의한 발산을 줄이는 것을 지칭하기 위해 사용된다. 일부 경우에, 시준은 광선의 공간적 단면을 좁히는 단계를 포함한다 (예를 들어, 레이저의 빔 프로파일 감소).
일부 실시 예에서, 광학적 조정 구성 요소는 예를 들어 0.2 내지 0.9의 배율, 예를 들어 0.3 내지 0.85의 배율, 예를 들어 0.35 내지 0.8의 배율, 예를 들어 0.5 내지 0.75의 배율 및 0.55 내지 0.7의 배율을 포함하여, 예를 들어 0.6의 배율과 같이, 0.1 내지 0.95의 배율을 갖는 포커싱 렌즈이다. 예를 들어, 포커싱 렌즈는 특정 경우에 약 0.6의 배율을 갖는 이중 무채색 축소 렌즈이다. 초점 렌즈의 초점 거리는 예를 들어 6mm ~ 19mm, 예를 들어 7mm ~ 18mm, 예를 들어 8mm ~ 17mm, 예를 들어 9mm ~ 16mm 및 10mm ~ 15mm 범위의 초점 거리를 포함하여, 5mm에서 20mm까지 다양하다. 특정 실시 예에서, 포커싱 렌즈는 약 13mm의 초점 거리를 갖는다.
다른 실시 예에서, 광학적 조정 구성 요소는 시준기이다. 시준기는 하나 이상의 거울 또는 곡면 렌즈 또는 이들의 조합과 같은, 임의의 편리한 시준 프로토콜 일 수 있다. 예를 들어, 시준기는 특정 경우 단일 시준 렌즈이다. 다른 경우에, 시준기는 조준 거울이다. 또 다른 경우에, 시준기는 두 개의 렌즈를 포함한다. 또 다른 경우에 시준기는 거울과 렌즈를 포함한다. 시준기가 하나 이상의 렌즈를 포함하는 경우, 시준 렌즈의 초점 거리는 예를 들어 6mm 내지 37.5mm, 예를 들어 7mm 내지 35mm, 예를 들어 8mm 내지 32.5mm, 예를 들어 9mm 내지 30mm, 예를 들어 10mm 내지 27.5mm, 예를 들어 12.5mm 내지 25mm, 15 mm 내지 20 mm 범위의 초점 거리를 포함하여, 5mm에서 40mm까지 다양 할 수 있다.
일부 실시 예에서, 본 시스템은 유동 세포 노즐을 통해 유동 스트림을 유동시키도록 구성된 노즐 오리피스를 갖는 유동 세포 노즐을 포함한다. 본 발명의 유동 세포 노즐은 유체 샘플을 샘플 조사 영역으로 전파하는 오리피스를 가지며, 일부 실시 예에서, 유동 세포 노즐은 길이 방향 축을 정의하는 근위 원통형 부분 및 길이 방향 축에 대해 횡단하는 노즐 오리피스를 갖는 평평한 표면에서 종결되는 원위 절두 원추 부분을 포함한다. 근위 원통형 부분의 길이 (세로 축을 따라 측정됨)는 예를 들어 1.5mm ~ 12.5mm, 예를 들어 2mm ~ 10mm, 예를 들어 3mm ~ 9mm 및 4mm ~ 8mm을 포함하여, 1mm에서 15mm까지 다양할 수 있다. 원위 절두 원뿔형 부분의 길이 (세로 축을 따라 측정됨)는 예를 들어 2mm ~ 9mm, 예를 들어 3mm ~ 8mm 및 4mm ~ 7mm을 포함하여 1 mm에서 10mm까지 다양 할 수 있다. 유동 세포 노즐 챔버의 직경은 일부 실시 예에서 예를 들어, 2mm 내지 9mm 범위, 예를 들어, 예를 들어, 3mm 내지 8mm 범위 및 예를 들어, 4mm 내지 7mm를 포함하여, 1mm 내지 10mm 범위에 있을 수 있다.
특정 예에서, 노즐 챔버는 원통형 부분을 포함하지 않고 전체 유동 세포 노즐 챔버는 절두 원뿔형상으로 되어 있다. 이러한 실시 예에서, 절두 원추형 노즐 챔버의 길이 (노즐 오리피스를 가로지르는 종축을 따라 측정됨)는 예를 들어 1.5mm 내지 12.5mm, 예를 들어 2mm 내지 10mm, 예를 들어 3mm 내지 9mm 및 4mm 내지 8mm을 포함하여, 1mm 내지 15mm 범위일 수 있다. 절두 원추형 노즐 챔버의 근위 부분의 직경은 예를 들어 2mm 내지 9mm, 예를 들어 3mm 내지 8mm 및 4mm 내지 7mm을 포함하여, 1mm 내지 10mm 범위일 수 있다.
실시 예에서, 샘플 유동 스트림은 유동 세포 노즐의 원위 단부에 있는 오리피스에서 방출된다. 유동 스트림의 원하는 특성에 따라, 유동 세포 노즐 오리피스는 임의의 적절한 모양이 될 수 있으며, 관심 단면 모양은 제한하는 것은 아니지만, 직선 단면 모양 (예를 들어, 정사각형, 직사각형, 사다리꼴, 삼각형, 육각형 등), 곡선형 단면 모양 (예를 들어, 원, 타원) 뿐만 아니라, 불규칙한 형태, 예를 들어 평평한 상부 부분에 결합된 포물선형 바닥 부분을 포함한다. 특정 실시 예에서, 관심 유동 세포 노즐은 원형 오리피스를 갖는다. 노즐 오리피스의 크기는 다양할 수 있으며, 일부 실시 예에서는 예를 들어 2 ㎛ ~ 17500 ㎛, 예를 들어 5 ㎛ ~ 15000 ㎛, 예를 들어 10 ㎛ ~ 12500 ㎛, 예를 들어 15 ㎛ ~ 10000 ㎛, 예를 들어, 25 ㎛ 내지 7500 ㎛, 예를 들어 50 ㎛ 내지 5000 ㎛, 예를 들어 75 ㎛ 내지 1000㎛, 예를 들어 100 ㎛ 내지 750 ㎛, 및 150 ㎛ 내지 500 ㎛를 포함하여, 1 ㎛ 내지 20000 ㎛ 범위에 있다. 특정 실시 예에서, 노즐 오리피스는 100㎛이다.
일부 실시 예에서, 유동 세포 노즐은 유동 세포 노즐에 샘플을 제공하도록 구성된 샘플 주입 포트를 포함한다. 실시 예에서, 샘플 주입 시스템은 유동 세포 노즐 챔버로의 적절한 샘플의 유동을 제공하도록 구성된다. 원하는 유동 스트림의 특성에 따라, 샘플 주입 포트를 통해 유동 세포 노즐 챔버로 이송되는 샘플의 속도는 예를 들어, 2μL/sec 이상, 예를 들어, 3μL/sec 이상, 예를 들어 5μL/sec 이상, 예를 들어 10μL/sec 이상, 예를 들어 15μL/sec 이상, 예를 들어 25μL/초 이상, 예를 들어 50μL/초 이상, 예를 들어 100μL/초 이상, 예를 들어 150μL/초 이상, 예를 들어 200μL/초 이상, 예를 들어 250μL/sec 이상, 예를 들어 300μL/초 이상, 예를 들어 350μL/초 이상, 예를 들어 400μL/초 이상, 예를 들어 450μL/초 이상 500 μL/sec 이상을 포함하여, 1 μL/sec 이상일 수 있다. 샘플 유속은 예를 들어 2μL/초 내지 약 450μL/초, 예를 들어 3μL/초 내지 약 400μL/초, 예를 들어 4μL/초 내지 약 350μL/초, 예를 들어 5μL/sec 내지 약 300μL/sec, 예를 들어 6μL/sec 내지 약 250μL/sec, 예를 들어 7μL/sec 내지 약 200 μL/sec, 예를 들어 8 μL/초 내지 약 150μL/초, 예를 들어 9 μL/초 내지 약 125μL/초, 10 μL/초 내지 약 100 μL/초를 포함하여, 1 μL/초 내지 약 500 μL/초의 범위가 될 수 있다.
샘플 주입 포트는 노즐 챔버의 벽에 위치한 오리피스이거나 노즐 챔버의 근위 단부에 위치한 도관일 수 있다. 샘플 주입 포트가 노즐 챔버의 벽에 위치한 오리피스인 경우, 샘플 주입 포트 오리피스는 관심 단면 모양이 제한하는 것은 아니지만, 직사각형, 직사각형, 사다리꼴, 삼각형, 육각형 등과 같은 직선 단면 모양, 원형, 타원형 등과 같은 곡선형 단면 모양뿐만 아니라 불규칙한 모양, 예를 들어 포물선형 바닥 부분 평면 상단 부분을 포함하는 임의의 적절한 모양일 수 있다. 특정 구체 예에서, 샘플 주입 포트는 원형 오리피스를 가지고 있다. 샘플 주입 포트 오리피스의 크기는 모양에 따라 달라질 수 있으며, 특정 경우에는 예를 들어 0.2 내지 3.0mm, 예를 들어 0.5mm 내지 2.5mm, 예를 들어 0.75mm 내지 2.25mm, 예를 들어, 1mm 내지 2mm 및 1.25mm 내지 1.75mm를 포함하고, 예를 들어 1.5mm인, 0.1mm ~ 5.0mm의 범위 크기의 개구를 갖는다.
특정 경우, 샘플 주입 포트는 유동 세포 노즐 챔버의 근위 단부에 위치한 도관이다. 예를 들어, 샘플 주입 포트는 유동 세포 노즐 오리피스와 일직선으로 샘플 주입 포트의 오리피스를 갖도록 배치된 도관일 수 있다. 샘플 주입 포트가 유동 세포 노즐 오리피스와 일렬로 배치된 도관인 경우, 샘플 주입 튜브의 단면 모양은 관심 단면 모양은 제한하는 것은 아니지만, 직선 단면 모양 (예를 들어, 정사각형, 직사각형, 사다리꼴, 삼각형, 육각형 등), 곡선형 단면 모양 (예를 들어, 원, 타원) 뿐만 아니라 불규칙한 형태, 예를 들어 평평한 상부 부분에 결합된 포물선 형 바닥 부분을 포함하는 임의의 적절한 모양일 수 있다. 도관의 구멍은 모양에 따라 달라질 수 있으며, 특정 경우에는 예를 들어, 0.2 내지 3.0 mm, 예를 들어 0.5 mm 내지 2.5 mm, 예를 들어 0.75 mm 내지 2.25 mm, 예를 들어 1 mm 내지 2 mm 및 1.25 mm 내지 1.75 mm를 포함하며, 예를 들어 1.5 mm인, 0.1mm에서 5.0mm 범위 크기의 개구부를 갖는다. 샘플 주입 포트의 끝 모양은 샘플 주입 튜브의 단면 모양과 같거나 다를 수 있다. 예를 들어, 샘플 주입 포트의 오리피스는 예를 들어 2 °내지 9 °의 범위, 예를 들어 3 ° 내지 8 °의 범위, 예를 들어 4 ° 내지 7 °의 범위 및 5 °의 베벨 각도를 포함하여, 1 °내지 10 ° 범위의 베벨 각도를 갖는 베벨 팁을 포함할 수 있다.
일부 실시 예에서, 유동 세포 노즐은 또한 유동 세포 노즐에 시스(sheath) 유체를 제공하도록 구성된 시스 유체 주입 포트를 포함한다. 실시 예에서, 외장 유체 주입 시스템은, 예를 들어, 샘플 유동 스트림을 둘러싸는 외장 유체의 적층 유동 스트림을 생성하기 위해 샘플와 함께 유동 세포 노즐 챔버에 외장 유체 스트림을 제공하도록 구성된다. 유동 스트림의 원하는 특성에 따라에 의해 유동 세포 노즐 챔버로 전달되는 시스 유체의 속도는 예를 들어 50 μL/초 이상, 예를 들어 75 μL/초 이상, 예를 들어 100 μL/초 이상, 예를 들어 250 μL/초 이상, 예를 들어 500 μL/초 이상, 예를 들어 750 μL/sec 이상, 예를 들어 1000 μL/sec 이상 및 2500 μL/sec 이상을 포함하여, 25 μL/sec 이상일 수 있다. 예를 들어, 시스 유체 유속은 예를 들어 2 μL/초 내지 약 450 μL/초, 예를 들어 3 μL/초 내지 약 400 μL/초, 예를 들어 4 μL/초 내지 약 350 μL/초, 예를 들어 5 μL/sec 내지 약 300 μL/sec, 예를 들어 6 μL/sec 내지 약 250 μL/sec, 예를 들어 7 μL/sec 내지 약 200 μL/sec, 예를 들어 8 μL/초 ~ 약 150 μL/초, 예를 들어 9 μL/초 내지 약 125 μL/초, 10 μL/초 내지 약 100 μL/초를 포함하여, 1 μL/초 내지 약 500 μL/초의 범위일 수 있다.
일부 실시 예에서, 시스 유체 주입 포트는 노즐 챔버의 벽에 위치한 오리피스이다. 시스 유체 주입 포트 오리피스는 임의의 적절한 형상일 수 있으며 관심 단면 형상은 제한하는 것은 아니지만, 직선 단면 형상, 예를 들어, 정사각형, 직사각형, 사다리꼴, 삼각형, 육각형 등, 곡선형 단면 형상, 예를 들어, 원, 타원, 뿐만 아니라 불규칙한 형태, 예를 들어 평평한 상부 부분에 결합된 포물선형 바닥 부분을 포함한다. 샘플 주입 포트 오리피스의 크기는 모양에 따라 달라질 수 있으며, 특정 경우에 예를 들어, 0.2 내지 3.0 mm, 예를 들어 0.5 mm 내지 2.5 mm, 예를 들어 0.75 mm 내지 2.25 mm, 예를 들어 1 mm 내지 2 mm 및 1.25 mm 내지 1.75 mm를 포함하며, 예를 들어, 1.5 mm인, 0.1mm에서 5.0mm 범위 크기의 개구를 갖는다.
특정 경우, 본 발명의 시스템은 유동 세포 노즐 오리피스와 유체 연통하는 샘플 검사 영역을 포함한다. 이들 경우, 샘플 유동 스트림은 유동 세포 노즐의 원위 단부에 있는 오리피스에서 방출되고 유동 스트림의 입자는 샘플 검사 영역에서 광원으로 조사될 수 있다. 검사 영역의 크기는 노즐 오리피스의 크기 및 샘플 주입 포트 크기와 같은 유량 노즐의 특성에 따라 달라질 수 있다. 실시 예에서, 검사 영역은 예를 들어 0.05mm 이상, 예를 들어 0.1mm 이상, 예를 들어 0.5mm 이상, 예를 들어 1mm 이상, 예를 들어 2mm 이상, 예를 들어 3mm 이상, 예를 들어 5mm 이상 및 10mm 이상을 포함하여, 0.01mm 이상의 폭을 가질 수 있다. 검사 영역의 길이는 경우에 따라 예를 들어 0.1mm 이상, 예를 들어 0.5mm 이상, 예를 들어 1mm 이상, 예를 들어 1.5mm 이상, 예를 들어 2mm 이상, 예를 들어 3mm 이상, 예를 들어 5mm 이상, 10 이상, 예를 들어 15mm 이상, 예를 들어 20mm 이상, 예를 들어 25mm 이상 및 50mm 이상을 포함하여, 0.01mm 이상 달라질 수 있다.
검사 영역은 방출되는 유동 스트림의 평면 단면의 조사를 용이하게하도록 구성될 수 있거나 또는 미리 결정된 길이의 확산 필드 (예를 들어, 확산 레이저 또는 램프를 사용하여)의 조사를 용이하게 하도록 구성될 수 있다. 일부 실시 예에서, 검사 영역은 예를 들어 1mm 이상, 예를 들어 2mm 이상, 예를 들어 3mm 이상, 예를 들어 4mm 이상, 예를 들어 5mm 이상 및 10mm 이상을 포함하여, 미리 결정된 길이의 방출 유동 스트림의 조사를 용이하게 하는 투명 창을 포함한다. 발산하는 유동 스트림 (아래 설명)을 조사하는 데 사용되는 광원에 따라 검사 영역은 예를 들어 150 nm에서 1400 nm, 예를 들어 200 nm에서 1300 nm, 예를 들어 250 nm에서 1200 nm, 예를 들어 300 nm에서 1100 nm, 예를 들어 350 nm에서 1000 nm, 예를 들어 400 nm 900 nm 및 500 nm 내지 800 nm를 포함하여, 100nm에서 1500nm 범위의 빛을 통과하도록 구성될 수 있다. 따라서, 검사 영역은 원하는 파장 범위를 통과하는 투명 재료로 형성될 수 있으며, 이들 재료는 제한하는 것은 아니지만, 광학 유리, 붕규산 유리, 파이렉스 유리, 자외선 석영, 적외선 석영, 사파이어 뿐만 아니라, 다른 고분자 플라스틱 재료 중에서 폴리 카보네이트, 폴리 염화비닐(PVC), 폴리 우레탄, 폴리 에테르, 폴리아미드, 폴리이미드와 같은 플라스틱, 또는 PETG (글리콜 개질 폴리에틸렌 테레프탈레이트)와 같은 이들 열가소성 수지의 공중합체, 폴리에스터를 포함하고, 관심있는 폴리 에스터는 제한하는 것은 아니지만, 폴리 (에틸렌 테레프탈레이트) (PET)와 같은 폴리 (알킬렌 테레프탈레이트), 바틀-그레이드 PET (모노에틸렌 글리콜, 테레프탈산 및 이소프탈산, 시클로헥센 디메탄올 등과 같은 기타 공단량체를 기반으로 하는 공중합체), 폴리 (부틸렌 테레프탈레이트) (PBT) 및 폴리(헥사메틸렌 테레프탈레이트); 폴리(에틸렌 아디페이트), 폴리(1,4-부틸렌 아디페이트) 및 폴리 (헥사메틸렌 아디페이트)와 같은 폴리 (알킬렌 아디페이트); 폴리(에틸렌 수베레이트)와 같은 폴리(알킬렌 수베레이트); 폴리(에틸렌 세바케이트)와 같은 폴리(알킬렌 세바케이트); 폴리(ε-카프로락톤) 및 폴리(β-프로피오락톤); 폴리(에틸렌 이소프탈레이트)와 같은 폴리(알킬렌 이소프탈레이트); 폴리(에틸렌 2,6-나프탈렌-디카르 복실레이트)와 같은 폴리(알킬렌 2,6-나프탈렌-디카르복실레이트); 폴리(에틸렌 술포닐-4,4'-디벤조에이트)와 같은 폴리(알킬렌 술포닐-4,4'-디벤조에이트); 폴리(p-페닐렌 에틸렌 디카르복실레이트)와 같은 폴리 (p-페닐렌 알킬렌 디카르복실레이트); 폴리(trans-1,4-시클로헥산 디일에틸렌 디카르복실레이트)와 같은 폴리(trans-1,4-시클로 헥산디일 알킬렌 디카르복실레이트); 폴리(1,4-시클로헥산-디메틸렌 에틸렌 디카르복실레이트)와 같은 폴리(1,4-시클로헥산디메틸렌알킬렌 디카르복실레이트); 폴리([2.2.2]-비시클로옥탄-1,4-디메틸렌 에틸렌 디카르복실레이트)와 같은 폴리([2.2.2]-비시클로옥탄-1,4-디메틸렌 알킬렌 디카르복실레이트); (S)-폴리락타이드, (R,S)-폴리락타이드, 폴리(테트라 메틸글리콜라이드) 및 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)와 같은 락트산 중합체 및 공중합체; 및 비스페놀 A,3,3'-디메틸비스페놀 A, 3,3',5,5'-테트라클로로비스페놀 A, 3,3',5,5'-테트라메틸비스페놀 A의 폴리카보네이트; 폴리(p-페닐렌 테레프탈아미드)와 같은 폴리아미드; 폴리에스테르, 예를 들어, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, MylarTM 폴리에틸렌 테레프탈레이트; 등을 포함한다. 일부 구현에서, 대상 시스템은 샘플 질문 영역에 위치한 큐벳(cuvette)을 포함한다. 실시 예에서, 큐벳은 예를 들어 150 nm 내지 1400 nm, 예를 들어 200 nm 내지 1300 nm, 예를 들어 250 nm 내지 1200 nm, 예를 들어 300 nm 내지 1100 nm, 예를 들어 350 nm 내지 1000 nm, 예를 들어 400 nm 내지 900 nm 및 500 nm 내지 800 nm을 포함하여, 100nm 내지 1500nm 범위의 빛을 통과시킬 수 있다.
특정 실시 예에서, 대상 시스템은 샘플 (예를 들어, 생물학적 샘플의 세포)에서 입자를 분석하고 분류하기 위해 상기 기재된 가중 최소 제곱 알고리즘을 사용하는 유세포 분석 시스템이다. 적합한 유세포 분석 시스템은 제한하는 것은 아니지만, Ormerod (ed.), 유세포 분석: 실용적인 방법, 옥스포드대학교 출판 (1997); Jaroszeski 등의 (eds.), 유세포 분석 프로토콜, 분자 생물학의 방법 No. 91, Humana 출판 (1997); 실용적인 유세포 분석, 3rd ed., Wiley-Liss (1995); Virgo 등의(2012) Ann Clin Biochem. Jan, 49(pt 1):17-28; Linden 등의 Semin Throm Hemost. 2004년 10월, 30(5):502-11; Alison 등의 J Pathol, 2010 Dec;222(4):335-344; 및 Herbig 등의 (2007) Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 24(3):203-255을 포함하며, 그 개시 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다. 특정 예에서, 관심 유세포 분석 시스템에는 BD Biosciences FACSCantoTM II 유세포 분석기, BD AccuriTM 유세포 분석기, BD Biosciences FACSCelestaTM 유세포 분석기, BD Biosciences FACSLyricTM 유세포 분석기, BD Biosciences FACSVerseTM 유세포 분석기, BD Biosciences FACSymphonyTM 유세포 분석기 BD Biosciences LSRFortessaTM 유세포 분석기, BD Biosciences LSRFortessTM X-20 유세포 분석기 및 BD Biosciences FACSCaliburTM 세포 분류기, BD Biosciences FACSCountTM 세포 분류기, BD Biosciences FACSLyricTM 세포 분류기 및 BD Biosciences ViaTM 세포 분류기 BD Biosciences InfluxTM 세포 분류기, BD Biosciences JazzTM 세포 분류기, BD Biosciences AriaTM 세포 분류기 및 BD Biosciences FACSMelodyTM 세포 분류기 등을 포함한다.
일부 실시 예에서, 대상 입자 분류 시스템은 미국 특허 No. 9,952,076; 9,933,341; 9,726,527; 9,453,789; 9,200,334; 9,097,640; 9,095,494; 9,092,034; 8,975,595; 8,753,573; 8,233,146; 8,140,300; 7,544,326; 7,201,875; 7,129,505; 6,821,740; 6,813,017; 6,809,804; 6,372,506; 5,700,692; 5,643,796; 5,627,040; 5,620,842; 5,602,039에 기재되어 있으며, 이들의 개시 내용은 본 명세서에서 전체 참조되고 있다.
특정 실시 예에서, 본 시스템은 전술 한 바와 같이 입자와 연관된 형광단의 추정된 풍부도를 기초로 확인된 샘플의 입자 (예를 들어, 세포) 중 하나 이상을 분류하도록 구성된다. 용어 "분류"는 샘플의 구성 성분 (예를 들어, 세포, 생물학적 거대 분자와 같은 비 세포 입자)를 분리하고 일부 경우에는 분리된 구성 성분을 하나 이상의 샘플 수집 용기에 전달하는 것을 의미하는 일반적인 의미로 사용된다. 예를 들어, 대상 시스템은 예를 들어 3 개 이상의 구성 성분, 예를 들어 4 개 이상의 구성 성분, 예를 들어 5 개 이상의 구성 성분, 예를 들어 10 개 이상의 구성 성분, 예를 들어 15 개 이상의 구성 성분 및 25 개 이상의 구성 성분을 갖는 샘플을 포함하여, 2 개 이상의 구성 성분을 갖는 샘플을 분류하도록 구성될 수 있다. 2 개 이상의 샘플 구성 성분, 3 개 이상의 샘플 구성 성분, 4 개 이상의 샘플 구성 성분, 5 개 이상의 샘플 구성 성분, 10 개 이상의 샘플 구성 성분, 15 개 이상의 샘플 구성 성분을 포함하여, 하나 이상의 샘플 구성 성분이 샘플에서 분리되어 샘플 수집 용기로 전달될 수 있다.
일부 실시 예에서, 관심있는 입자 분류 시스템은 2017년 3월 28일에 출원된 미국 특허 공개 번호 2017/0299493에 설명된 것과 같은, 밀폐된 입자 분류 모듈을 사용하여 입자를 분류하도록 구성되며, 그 개시 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다. 특정 실시 예에서, 샘플의 입자 (예를 들어, 세포)는 2019년 2월 8일에 출원된 미국 예비 특허 출원 번호 62/803,264에 설명된 것과 같은, 복수의 분류 결정 유닛을 갖는 분류 결정 모듈을 사용하여 분류되고, 그 개시 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다. 일부 실시 예에서, 샘플의 성분을 분류하는 방법은, 2017년 3월 28일에 출원된 미국 특허 공개 번호 2017/0299493에 설명된 것과 같이, 편향 판이 있는 입자 분류 모듈을 사용하여 입자 (예를 들어, 생물학적 샘플의 세포)를 분류하는 단계를 포함하며, 그 개시 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
집적 회로 장치
본 개시의 측면은 또한 중첩된 형광 스펙트럼을 갖는 복수의 형광단을 포함하는 샘플의 각 형광단으로부터의 광을 스펙트럼 분해하도록 프로그래밍된 집적 회로 장치를 포함한다. 일부 실시 예에서, 관심 집적 회로 장치는 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이(FPGA)를 포함한다. 다른 실시 예에서, 집적 회로 장치는 주문형 집적 회로 (ASIC)를 포함한다. 또 다른 실시 예에서, 집적 회로 장치는 복합 프로그래밍 가능 로직 디바이스(CPLD)를 포함한다. 일부 실시 예에서, 본 집적 회로 장치는 샘플에서 각각의 상이한 형광단 사이의 중첩을 결정하고 중첩 형광에 대한 각 형광단의 기여도를 계산하도록 프로그래밍된다. 특정 실시 예에서, 집적 회로는 복수의 광 검출기를 갖는 광 검출 시스템에 의해 검출된 샘플에서 중첩된 형광을 갖는 복수의 형광단의 형광 스펙트럼에 대한 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하도록 프로그래밍된다. 특정 구현 예에서, 특정 구현 예에 따른 집적 회로 장치는 샘플의 각 세포에 대한 복수의 형광단의 형광 스펙트럼에 대한 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하도록 프로그래밍된다. 아래에서 더 자세히 설명하는 바와 같이, 집적 회로 장치는 샘플에서 각 형광단의 풍부도을 추정하도록 프로그래밍될 수 있다. 특정 구체 예에서, 대상 입자와 관련된 각 형광단의 풍부도가 결정될 수 있다. 집적 회로는 대상 입자와 관련된 각 형광단의 풍부도에 기초하여 대상 입자를 식별하고 분류하도록 프로그래밍될 수 있다. 일부 사례에서, 집적 회로는 식별되거나 분류된 입자를 분류하도록 구성된다.
일부 실시 예에서, 집적 회로는 가중 최소 제곱 알고리즘을 사용하여 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하도록 프로그래밍된다. 일부 경우에, 집적 회로는 다음에 따라 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 프로그래밍된다:
Figure pct00130
여기서 y는 각 세포에 대한 광 검출 시스템의 복수의 광 검출기로부터 측정된 검출기 값이고;
Figure pct00131
는 추정되는 형광단 풍부도이고; X는 스필오버이고; W는
Figure pct00132
이다. 일부 실시 예에서, 각 Wii는 다음에 따라 계산된다:
Figure pct00133
여기에서 σi 2는 검출기 i에서의 분산이고; yi는 검출기 i에서의 신호이고; λi는 검출기 i에서 일정한 노이즈이다. 특정 실시 예에서, 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이는 (XTWX)-1XTW에 따라 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하도록 구성된다. 일부 경우에, 방법은 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하기 위해 광 검출 시스템에 의해 검출된 각 세포에 대해 (XTWX)을 역전하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 집적 회로는 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하기 위해 광 검출 시스템에 의해 검출된 각 세포에 대해 (XTWX)를 역전하도록 프로그래밍된다.
특정 실시 예에서, 집적 회로는 샘플 내의 세포를 실시간으로 분류하기 위해 검출된 각 세포에 대한 가중 최소 제곱 알고리즘에서 (XTWX)의 역을 근사화하도록 프로그래밍된다. 일부 실시 예에서, 집적 회로는 다음에 따라 반복적인 뉴턴-랩슨 계산법을 사용하여 (XTWX)를 근사화하여 (XTWX)를 역전하도록 구성된다:
A-1 = (XTWX)-1;
A0 -1 = (XTWGX)-1;
Figure pct00134
여기서 WG는 광 검출 시스템의 각 광 검출기의 분산으로부터 결정되는 W의 미리 결정된 근사치이다. 일부 실시 예에서, 집적 회로는 각각의 광 검출기의 분산을 추가로 추정하도록 프로그래밍된다. 특정 경우, 집적 회로는 단일 오염 대조 샘플을 기반으로 하는 광 검출기 노이즈 성분의 추정치로 프로그래밍된다. 다른 경우에 각 광 검출기의 분산은 샘플에 광원이 조사되기 전에 집적 회로에 프로그래밍된다. 또 다른 경우에, 반복적인 뉴턴-랩슨 계산법에서 W의 미리 결정된 근사값, WG는 샘플이 광원으로 조사되기 전에 집적 회로에 프로그래밍된다. 특정 실시 예에서, 집적 회로 장치는 미리 결정된 WG로 A0 -1을 미리 계산하도록 프로그래밍된다. 이러한 실시 예에서, 사전 계산된 A0 -1은 집적 회로 장치에 프로그래밍되고 광 검출 시스템에 의해 검출된 각 입자에 대한 A-1의 제 1 근사치로서 사용될 수 있다.
다른 실시 예에서, 관심 집적 회로 장치는 셔먼-모리슨 반복 역 업데이터를 사용하여 각 입자에 대한 가중 최소 제곱 알고리즘을 근사하도록 프로그래밍된다. 일부 경우에, 집적 회로 장치는 셔먼-모리슨 공식을 사용하여 A를 계산하도록 프로그래밍된다:
Figure pct00135
특정 예에서, 집적 회로 장치는 셔먼-모리슨 공식을 사용하여 A0의 섭동의 역을 계산하기 위해 A0 -1을 사전 계산하도록 프로그래밍된다. 일부 실시 예에서, A0의 역은 수식 XTW0X에 의해 계산되고 A의 역은 수식 XTWX에 의해 계산된다. 일부 경우에, 집적 회로 장치는 다음에 따라 열 벡터와 각 반복 W의 곱으로 △A (즉, A-A0)를 계산하도록 프로그래밍된다:
Figure pct00136
및
Figure pct00137
여기서,
Figure pct00138
Figure pct00139
Figure pct00140
및
Figure pct00141
및
Figure pct00142
실시 예에 따르면,
Figure pct00143
이고, 여기서 A는 다음과 같이 표현될 수 있다:
Figure pct00144
(1)
Figure pct00145
(2)
이들 실시 예에서, 각각의 A는 각각의 wi에 대한 변경을 사용하여 각각의 새로운 가중치 행렬 W (즉, W0와 다른 값을 사용)로 A0로부터 재계산될 수 있다. 일부 실시 예에서, 집적 회로 장치는 다음에 따른 스펙트럼 비 혼합 행렬을 근사하기 위한 셔먼-모리슨 반복 역 업데이터를 수행하도록 프로그래밍된다:
Figure pct00146
(3)
Figure pct00147
(4)
Figure pct00148
(5)
Figure pct00149
(6)
Figure pct00150
(7)
Figure pct00151
(8)
일부 실시 예에서, A0 -1에 대한 사전 계산된 값이 A1 -1을 계산하는 데 사용된다. 그런 다음 미리 계산된 A1 -1을 사용하여 A2 -1을 계산한다. 값 A-1은 i = 1에서 ND까지 각 (Ai-1)-1을 사용하여 Ai -1을 반복 계산하여 계산할 수 있다.
다른 실시 예에서, 관심 집적 회로 장치는 행렬 분해에 의해 각 입자에 대한 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 프로그래밍된다. 일부 경우에, 집적 회로 장치는 예를 들어, 행렬이 하부 삼각 (L) 행렬와 상부 삼각 (U) 행렬의 곱으로 분해되는 경우와 같이, LU 행렬 분해를 위한 명령을 위해 프로그래밍된다. 특정 경우에 LU 분해에는 가우스 제거가 포함된다. 다른 경우에, LU 분해는 수정된 촐레스키 분해, LDL 분해를 포함하며 여기서 D는 대각 행렬이다. 특정 실시 예에서, 집적 회로 장치는 다음에 따라 수정된 촐레스키 분해를 사용하여 가중 최소 제곱 알고리즘 (a)을 계산하도록 프로그래밍된다.
XTWXa = XTWy
Aa = B
LDLTa = B LDL 분해
Lz = B 여기서 z = DLTa 하부 삼각 행렬 솔루션
Dx = z 여기서 x = LTa 대각선 행렬 솔루션
LTa = x 상부 삼각 행렬 솔루션
다른 실시 예에서, 집적 회로 장치는 QR 분해를 통해 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 프로그래밍되어 있다. 일부 사례에서 QR 분해는 직교 (Q) 행렬과 상부 삼각 (R) 행렬의 곱인 행렬이다. 일부 실시 예에서, 집적 회로 장치는 다음에 따라 QR 분해를 사용하여 가중 최소 제곱 알고리즘 (a)을 계산하도록 프로그래밍된다:
Figure pct00152
또 다른 실시예에서, 집적 회로 장치는 특이 값 분해(SVD)에 의해 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 프로그래밍되어 있다. 어떤 경우에, 특이 값 분해는 곱
Figure pct00153
인 행렬이고 여기서 U와 V는 직교 행렬이고 Σ는
Figure pct00154
의 특이 값을 포함하는 대각 행렬이다. 특정 경우, 집적 회로 장치는 다음에 따라 특이 값 분해를 사용하여 가중 최소 제곱 알고리즘 (a)을 계산하도록 프로그래밍된다:
z = UTy
Σw = z
a = Vw
일부 실시 예에서, 관심 집적 회로는 각 형광단으로부터 스펙트럼 분해된 빛으로부터 샘플에서 하나 이상의 형광단의 풍부도를 계산하도록 프로그래밍된다. 특정 경우에, 대상 입자와 연관된 (예를 들어, 화학적으로 결합된 (즉, 공유적으로, 이온적으로) 또는 물리적으로 결합된) 형광단의 풍부도는 입자와 연관된 각 형광단으로부터의 스펙트럼 분해된 빛으로부터 계산된다. 예를 들어, 하나의 예에서 집적 회로는 각 형광단에서 스펙트럼 분해된 빛으로부터 표적 입자와 관련된 각 형광단의 상대적 풍부도를 계산하도록 프로그래밍된다. 또 다른 예에서, 집적 회로는 각 형광단으로부터 스펙트럼 분해된 빛으로부터 대상 입자와 관련된 각 형광단의 절대 풍부도를 계산하도록 프로그래밍된다.
특정 실시 예에서, 집적 회로는 입자와 연관되는 것으로 결정된 각각의 형광단의 상대적 풍부도에 기초하여 입자를 식별하거나 분류하도록 프로그래밍된다. 이러한 실시 예에서, 집적 회로는 입자와 관련된 각 형광단의 상대적 또는 절대적 존재비를 알려진 동일성의 입자를 갖는 대조군 샘플과 비교하거나; 관련 형광단의 계산된 상대적 또는 절대적 풍부도를 갖는 입자(예를 들어, 세포) 군의 분광 또는 기타 분석을 수행하는 등과 같이 임의의 편리한 프로토콜에 의해 입자를 식별하거나 분류하도록 프로그래밍될 수 있다.
키트
본 개시의 양태는 키트를 추가로 포함하며, 여기서 키트는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 집적 회로를 포함한다. 일부 실시 예에서, 키트는 컴퓨터 판독 가능 매체 (예를 들어, 플래시 드라이브, USB 스토리지, 컴팩트 디스크, DVD, 블루레이 디스크 등)의 형태와 같은 대상 시스템을 위한 프로그래밍 또는 인터넷 웹 프로토콜 또는 클라우드 서버에서 프로그래밍을 다운로드하기 위한 명령을 포함한다. 키트는 본 방법을 실행하기 위한 명령을 추가로 포함할 수 있다. 이들 명령은 다양한 형태로 대상 키트에 존재할 수 있으며, 그중 하나 이상이 키트에 존재할 수 있다. 이러한 명령이 존재할 수 있는 한 가지 형태는 적절한 매체 또는 기판, 예를 들어, 정보가 인쇄된 종이 조각에, 키트 포장에, 포장 삽입물 등에 인쇄된 정보이다. 이러한 명령의 또 다른 형태는 정보가 기록된 컴퓨터 판독 가능 매체, 예를 들어 디스켓, 컴팩트 디스크 (CD), 휴대용 플래시 드라이브 등이다. 이러한 명령의의 또 다른 형태는 제거된 사이트의 정보에 액세스하기 위해 인터넷을 통해 사용할 수 있는 웹 사이트 주소이다.
유용성
본 발명의 시스템, 방법 및 컴퓨터 시스템은 생물학적 샘플과 같은 유체 매질에서 샘플의 입자 구성 성분을 분석하고 분류하는 것이 바람직한 다양한 응용 분야에서 사용된다. 일부 실시 예에서, 본원에 기술된 시스템 및 방법은 형광 태그로 표지된 생물학적 샘플의 유세포 분석 특성화를 이용하게 되었다. 다른 실시 예에서, 시스템 및 방법은 방출된 광의 분광학을 이용한다. 또한, 대상 시스템 및 방법은 샘플 (예를 들어, 유동 스트림 내)에서 수집된 빛으로부터 획득 가능한 신호를 증가시키는 데 사용된다. 특정 예에서, 본 개시는 유세포 분석기의 유동 스트림에서 조사되는 샘플로부터 수집된 빛의 측정을 향상시키는 데 이용된다. 본 개시의 실시 예에서는 개선된 세포 분류 정확도, 개선된 입자 수집, 입자 충전 효율, 보다 정확한 입자 충전 및 세포 분류 동안 개선된 입자 편향을 갖는 유세포 분석기를 제공하는 것이 바람직하다.
본 개시 내용의 실시 예는 또한 생물학적 샘플로부터 제조된 세포가 연구, 실험실 테스트 또는 치료에 사용하기에 바람직할 수 있는 응용 분야에서 이용된다. 일부 실시 예에서, 본 발명의 방법 및 장치는 대상 유체 또는 조직 생물학적 샘플로부터 준비된 개별 세포를 얻는 것을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법 및 시스템은 암과 같은 질병에 대한 연구 또는 진단 표본으로 사용되는 유체 또는 조직 샘플에서 세포를 얻는 것을 용이하게 한다. 마찬가지로, 본 발명의 방법 및 시스템은 치료에 사용될 유체 또는 조직 샘플로부터 세포를 얻는 것을 용이하게 할 수 있다. 본 개시의 방법 및 장치는 기존의 유세포 분석 시스템에 비해 향상된 효율성 및 낮은 비용으로 생물학적 샘플 (예를 들어, 장기, 조직, 조직 단편, 유체)로부터 세포를 분리하고 수집하는 것을 가능하게 한다.
본 명세서에서 기재된 주제의 실시 예를 포함하는 측면은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 측면 또는 실시 예와 조합하여 유용할 수 있다. 설명을 제한하지 않고, 1-320으로 번호 매겨진 특정한 비 제한적인 측면이 아래에 제공된다. 본 개시 내용을 읽을 때 당업자에게 명백한 바와 같이, 개별적으로 번호가 매겨진 측면들 각각은 이전 또는 이후에 개별적으로 번호 매겨진 양태들 중 임의의 것과 사용되거나 조합될 수 있다. 이는 이러한 모든 형태의 조합에 대한 지원을 제공하기 위한 것이며 아래에 명시적으로 제공된 측면의 조합으로 제한되지 않는다:
1. 중첩된 형광 스펙트럼을 갖는 복수의 형광단을 포함하는 샘플로부터 광 검출 시스템으로 광을 검출하는 단계; 및
상기 샘플의 각 형광단에서 나오는 빛을 스펙트럼 분해하는 단계
를 포함하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 각 형광단의 상기 형광 스펙트럼은 상기 샘플에서 적어도 하나 다른 형광단의 상기 형광 스펙트럼과 중첩하는, 방법.
3. 제 2 항에 있어서, 각 형광단의 상기 형광 스펙트럼은 상기 샘플에 있는 하나 이상의 다른 형광단의 형광 스펙트럼과 10nm 이상 중첩하는, 방법.
4. 제 2 항에 있어서, 각 형광단의 상기 형광 스펙트럼은 상기 샘플에 있는 하나 이상의 다른 형광단의 상기 형광 스펙트럼과 25nm 이상 중첩하는, 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 샘플에 있는 적어도 하나의 형광단의 상기 형광 스펙트럼은 상기 샘플에 있는 두 개의 다른 형광단의 상기 형광 스펙트럼과 중첩하는, 방법.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 샘플에 있는 적어도 하나의 형광단의 상기 형광 스펙트럼이 상기 샘플에 있는 두 개의 다른 형광단의 상기 형광 스펙트럼과 10nm 이상 중첩하는, 방법.
7. 제 5 항에 있어서, 상기 샘플에 있는 적어도 하나의 형광단의 상기 형광 스펙트럼이 상기 샘플에 있는 두 개의 다른 형광단의 형광 스펙트럼과 25nm 이상 중첩하는, 방법.
8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 각 형광단으로부터의 광을 스펙트럼 분해하는 단계는 상기 샘플의 각 형광단의 상기 형광 스펙트럼에 대한 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하는 단계를 포함하는, 방법.
9. 제 8 항에 있어서, 상기 방법은 가중 최소 제곱 알고리즘을 사용하여 상기 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하는 단계를 포함하는, 방법.
10. 제 8 항에 있어서, 상기 가중 최소 제곱 알고리즘은:
Figure pct00155
에 따라 계산되고,
여기서 y는 각 세포에 대한 상기 광 검출 시스템의 상기 복수의 광 검출기로부터 측정된 검출기 값이고;
Figure pct00156
는 추정되는 형광단 풍부도이고;
X는 스필오버이고;
W는
Figure pct00157
인, 방법.
11. 제 10 항에 있어서, 각 Wii는 다음에 따라 계산되고;
Figure pct00158
여기서 σi 2는 검출기 i에서의 분산이고;
yi는 검출기 i에서의 신호이고;
λi는 검출기 i에서 일정한 노이즈인, 방법.
12. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은
(XTWX)-1XTW
에 따라 상기 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하는 단계를 포함하는, 방법.
13. 제 9 항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하기 위해 각 세포에 대한 (XTWX)을 역전하는 단계를 포함하는, 방법.
14. 제 13 항에 있어서, (XTWX)을 역전하는 단계는:
Figure pct00159
에 따라 반복적인 뉴턴-랩슨 계산법을 사용하여 (XTWX)를 근사화하는 단계를 포함하고,
여기서 WG는 광 검출 시스템의 각 광 검출기의 분산으로부터 결정되는 미리 결정된 W의 근사치인, 방법.
15. 제 14 항에 있어서, 상기 광원으로 상기 샘플을 조사하기 전에 WG를 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
16. 제 15 항에 있어서, 상기 계산된 WG 값으로 A0 -1을 미리 계산하는 단계를 더 포함하는, 방법.
17. 제 9 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은:
Figure pct00160
에 따른 셔먼-모리슨 반복 역 업데이터를 사용하여 (XTWX)를 근사화하는 단계를 포함하는, 방법.
18. 제 17 항에 있어서,
Figure pct00161
이고, 여기에서
Figure pct00162
(1)
Figure pct00163
(2)
인, 방법.
19. 제 18 항에 있어서,
Figure pct00164
(3)
Figure pct00165
(4)
Figure pct00166
(5)
Figure pct00167
(6)
Figure pct00168
(7)
Figure pct00169
(8)
에 따라 스펙트럼 비 혼합 행렬을 근사화하는 단계를 더 포함하는, 방법.
20. 제 19 항에 있어서, A0 -1에 대한 미리 계산된 값은 A1 -1을 계산하는 데 사용되고 A-1은 i = 1에서 ND까지 각 (Ai -1)-1을 사용하여 Ai -1을 반복 계산하여 계산되는, 방법.
21. 제 9 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가중 최소 제곱 알고리즘은 행렬 분해에 의해 계산되는, 방법.
22. 제 21 항에 있어서, 상기 행렬 분해는 LU 분해를 포함하는, 방법.
23. 제 22 항에 있어서, 상기 가중 최소 제곱 알고리즘은,
XTWXa = XTWy
Aa = B
LDLTa = B
Lz = B 여기서 z = DLTa
Dx = z 여기서 x = LTa
LTa = x
에 따라 수정된 촐레스키 분해를 사용하여 계산되는, 방법.
24. 제 21 항에 있어서, 상기 가중 최소 제곱 알고리즘은 QR 분해에 의해 계산되는, 방법.
25. 제 24 항에 있어서, 상기 가중 최소 제곱 알고리즘은:
Figure pct00170
에 따라 QR 분해를 사용하여 계산되는, 방법.
26. 제 21 항에 있어서, 상기 가중 최소 제곱 알고리즘은 특이 값 분해로 계산되는, 방법
27. 제 26 항에 있어서, 상기 가중 최소 제곱 알고리즘은:
z = UTy
Σw = z
a = Vw
에 따라 특이 값 분해를 사용하여 계산되고,
여기서 U와 V는 직교 행렬이고 Σ는
Figure pct00171
의 특이 값을 포함하는 대각 행렬인, 방법.
28. 제 13 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스펙트럼 비 혼합 행렬은 전계 프로그래밍 가능한 게이트 배열에서 계산되는, 방법.
29. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 광원으로 상기 샘플을 조사하는 단계를 더 포함하는, 방법.
30. 제 29 항에 있어서, 상기 광원은 레이저를 포함하는, 방법.
31. 제 30 항에 있어서, 상기 광원은 복수의 레이저를 포함하는, 방법.
32. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광원은 복수의 광 검출기를 포함하는, 방법.
33. 제 32 항에 있어서, 상기 광 검출기는 하나 이상의 광전자 증배관을 포함하는, 방법.
34. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광 검출 시스템은 광 검출기 어레이를 포함하는, 방법.
35. 제 34 항에 있어서, 상기 광 검출기 어레이는 광 다이오드를 포함하는, 방법.
36. 제 34 항에 있어서, 상기 광 검출기 어레이는 전하 결합 장치를 포함하는, 방법.
37. 중첩된 형광 스펙트럼을 갖는 복수의 형광단을 포함하는 샘플을 조사하도록 구성된 광원;
복수의 광 검출기를 포함하는 광 검출 시스템; 및
상기 프로세서에 작동 가능하게 연결된 메모리를 포함하는 프로세서
를 포함하고,
상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때 상기 프로세서로 하여금 샘플의 각 형광단으로부터 광을 스펙트럼 분해하도록 하는 명령을 저장하고 있는, 시스템.
38. 제 37 항에 있어서, 각 형광단의 상기 형광 스펙트럼은 상기 샘플에 있는 적어도 하나 다른 형광단의 상기 형광 스펙트럼과 중첩하는, 시스템.
39. 제 38 항에 있어서, 각 형광단의 상기 형광 스펙트럼은 상기 샘플에 있는 적어도 하나의 다른 형광단의 형광 스펙트럼과 10nm 이상 중첩되는, 시스템.
40. 제 38 항에 있어서, 각 형광단의 상기 형광 스펙트럼은 상기 샘플에 있는 하나 이상의 다른 형광단의 상기 형광 스펙트럼과 25nm 이상 중첩되는, 시스템.
41. 제 37 항에 있어서, 상기 샘플에 있는 적어도 하나의 형광단의 상기 형광 스펙트럼은 상기 샘플에 있는 두 개의 다른 형광단의 상기 형광 스펙트럼과 중첩하는, 시스템.
42. 제 41 항에 있어서, 상기 샘플에 있는 적어도 하나의 형광단의 상기 형광 스펙트럼이 상기 샘플에 있는 두 개의 다른 형광단의 상기 형광 스펙트럼과 10nm 이상 중첩하는, 시스템.
43. 제 41 항에 있어서, 상기 샘플에 있는 적어도 하나의 형광단의 상기 형광 스펙트럼이 상기 샘플에 있는 두 개의 다른 형광단의 형광 스펙트럼과 25nm 이상 중첩하는, 시스템.
44. 제 37 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금 상기 샘플의 각 형광단의 상기 형광 스펙트럼에 대한 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하도록 하는 명령을 저장하는, 시스템.
45. 제 44 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금 가중 최소 제곱 알고리즘에 의해 상기 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하도록 하는 명령을 저장하는, 시스템.
46. 제 45 항에 있어서, 상기 가중 최소 제곱 알고리즘은:
Figure pct00172
에 따라 계산되고,
여기서 y는 각 세포에 대한 상기 광 검출 시스템의 상기 복수의 광 검출기로부터 측정된 검출기 값이고;
Figure pct00173
는 추정되는 형광단 풍부도이고;
X는 스필오버이고;
W는
Figure pct00174
인, 시스템.
47. 제 46 항에 있어서, 각 Wii는:
Figure pct00175
에 따라 계산되고, 여기서
σi 2는 검출기 i에서의 분산이고;
yi는 검출기 i에서의 신호이고;
λi는 검출기 i에서 일정한 노이즈인, 시스템.
48. 제 45 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금:
(XTWX)-1XTW
에 따라 상기 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하도록 하는 명령을 포함하는, 시스템.
49. 제 48 항에 있어서, (XTWX)는 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하기 위해 상기 광 검출 시스템에 의해 검출된 각 세포에 대해 역전되는, 시스템.
50. 제 49 항에 있어서, (XTWX)의 역은:
Figure pct00176
에 따라 반복적인 뉴턴-랩슨 계산법을 사용하여 근사화되고,
여기서 WG는 광 검출 시스템의 각 광 검출기의 분산으로부터 결정되는 미리 결정된 W의 근사치인, 시스템.
51. 제 50 항에 있어서, 상기 광 검출기의 분산은 광 검출기 노이즈 성분을 포함하는, 시스템.
52. 제 51 항에 있어서, 상기 광 검출기 노이즈 성분은 전자 노이즈 및 광학적 배경 광 중 하나 이상을 포함하는, 시스템.
53. 제 51 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광 검출기의 분산은 상기 광 검출기에 의해 측정된 광의 강도에 비례하는, 시스템.
54. 제 51 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광 검출기 노이즈 성분은 단일 오염 대조 샘플을 사용하여 추정되는, 시스템.
55. 제 51 항 내지 제 54 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금 광원으로 샘플을 조사하기 전에 각 광 검출기의 분산을 자동으로 결정하게 하는 명령을 포함하는, 시스템.
56. 제 51 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금 상기 광원으로 상기 샘플을 조사하기 전에 WG 값을 자동으로 결정하도록 하는 명령을 포함하는, 시스템.
57. 제 56 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금 상기 결정된 WG 값을 기초로 하여 A0 -1을 계산하도록 하는 명령을 포함하는, 시스템.
58. 제 44 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금:
Figure pct00177
에 따른 셔먼-모리슨 반복 역 업데이터를 사용하여 (XTWX)를 근사화하도록 하는 명령을 포함하는, 시스템.
59. 제 58 항에 있어서,
Figure pct00178
이고, 여기에서
Figure pct00179
(1)
Figure pct00180
(2)
인, 시스템.
60. 제 59 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금:
Figure pct00181
(3)
Figure pct00182
(4)
Figure pct00183
(5)
Figure pct00184
(6)
Figure pct00185
(7)
Figure pct00186
(8)
에 따라 스펙트럼 비 혼합 행렬을 근사화하도록 하는 명령을 포함하는, 시스템.
61. 제 60 항에 있어서, A0 -1에 대해 사전 계산된 값이 A1 -1을 계산하는 데 사용되고 A-1은 i = 1에서 ND까지 각 (Ai -1)-1을 사용하여 Ai -1을 반복 계산하여 계산되는, 시스템.
62. 제 44 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금 행렬 분해에 의해 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 하는 명령을 포함하는, 시스템.
63. 제 62 항에 있어서, 상기 행렬 분해는 LU 분해를 포함하는, 시스템.
64. 제 63 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금:
XTWXa = XTWy
Aa = B
LDLTa = B
Lz = B 여기서 z = DLTa
Dx = z 여기서 x = LTa
LTa = x
에 따라 수정된 촐레스키 분해를 사용하여 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 하는 명령을 포함하는, 시스템.
65. 제 62 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금 QR 분해에 의해 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 하는, 명령을 포함하는, 시스템.
66. 제 65 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금:
Figure pct00187
에 따라 QR 분해를 사용하여 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 하는 명령을 포함하는, 시스템.
67. 제 62 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금 특이 값 분해에 의해 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 하는 명령을 저장하는, 시스템
68. 제 67 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금:
z = UTy
Σw = z
a = Vw
에 따라 특이 값 분해를 사용하여 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 하는 명령을 포함하고,
여기서 U와 V는 직교 행렬이고 Σ는
Figure pct00188
의 특이 값을 포함하는 대각 행렬인, 시스템.
69. 제 37 항 내지 제 68 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스펙트럼 비 혼합 행렬은 전계 프로그래밍 가능한 게이트 배열에서 계산되는, 시스템.
70. 제 37 항 내지 제 69 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광원은 레이저를 포함하는, 시스템.
71. 제 70 항에 있어서, 상기 광원은 복수의 레이저를 포함하는, 시스템.
72. 제 37 항 내지 제 71 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광 검출 시스템은 광전자 증배관을 포함하는, 시스템.
73. 제 37 항 내지 제 72 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광 검출 시스템은 광 검출기 어레이를 포함하는, 시스템.
74. 제 73 항에 있어서, 상기 광 검출기 어레이는 광 다이오드를 포함하는, 시스템.
75. 제 74 항에 있어서, 상기 광 검출기는 전하 결합 장치를 포함하는, 시스템.
76. 중첩된 형광 스펙트럼을 갖는 복수의 형광단을 포함하는 샘플의 각 형광단에서 나오는 빛을 스펙트럼 분해하도록 프로그래밍된 집적 회로.
77. 제 76 항에 있어서, 각 형광단의 상기 형광 스펙트럼은 상기 샘플에서 적어도 하나 다른 형광단의 상기 형광 스펙트럼과 중첩하는, 집적 회로.
78. 제 77 항에 있어서, 각 형광단의 상기 형광 스펙트럼은 상기 샘플에 있는 하나 이상의 다른 형광단의 형광 스펙트럼과 10nm 이상 중첩되는, 집적 회로.
79. 제 77 항에 있어서, 각 형광단의 상기 형광 스펙트럼은 상기 샘플에 있는 하나 이상의 다른 형광단의 상기 형광 스펙트럼과 25nm 이상 중첩되는, 집적 회로.
80. 제 76 항에 있어서, 상기 샘플에서 적어도 하나의 형광단의 상기 형광 스펙트럼은 상기 샘플에서 두 개의 다른 형광단의 상기 형광 스펙트럼과 중첩하는, 집적 회로.
81. 제 80 항에 있어서, 샘플에 있는 적어도 하나의 형광단의 상기 형광 스펙트럼이 상기 샘플에 있는 두 개의 다른 형광단의 상기 형광 스펙트럼과 10nm 이상 중첩하는, 집적 회로.
82. 제 80 항에 있어서, 상기 샘플에 있는 적어도 하나의 형광단의 상기 형광 스펙트럼이 상기 샘플에 있는 두 개의 다른 형광단의 형광 스펙트럼과 25nm 이상 중첩하는, 집적 회로.
83. 제 76 항 내지 제 82 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 집적 회로는 상기 샘플의 각 형광단의 상기 형광 스펙트럼에 대한 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하도록 하는 명령을 저장하고 있는, 집적 회로.
84. 제 83 항에 있어서, 상기 집적 회로는 가중 최소 제곱 알고리즘에 의해 상기 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하도록 프로그래밍되는, 집적 회로.
85. 제 84 항에 있어서, 상기 가중 최소 제곱 알고리즘은:
Figure pct00189
에 따라 계산되고,
여기서 y는 각 세포에 대한 상기 광 검출 집적 회로의 상기 복수의 광 검출기로부터 측정된 검출기 값이고;
Figure pct00190
는 추정되는 형광단 풍부도이고;
X는 스필오버이고;
W는
Figure pct00191
인, 집적 회로.
86. 제 85 항에 있어서, 각 Wii는;
Figure pct00192
에 따라 계산되고,
여기서 σi 2는 검출기 i에서의 분산이고;
yi는 검출기 i에서의 신호이고;
λi는 검출기 i에서 일정한 노이즈인, 집적 회로.
87. 제 84 항 내지 제 86 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 집적 회로는:
(XTWX)-1XTW
에 따라 상기 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하도록 프로그래밍되는, 집적 회로.
88. 제 87 항에 있어서, (XTWX)는 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하기 위해 상기 광 검출 집적 회로에 의해 검출된 각 세포에 대해 역전되는, 집적 회로.
89. 제 88 항에 있어서, (XTWX)의 역은:
Figure pct00193
에 따라 반복적인 뉴턴-랩슨 계산법을 사용하여 근사화되고,
여기서 WG는 상기 샘플의 상기 형광단으로부터 형광을 검출하기 위한 광 검출 시스템에서 각 광 검출기의 분산으로 결정되는 미리 결정된 W의 근사치인, 집적 회로.
90. 제 89 항에 있어서, 상기 집적 회로는 상기 광원으로 상기 샘플을 조사하기 전에 WG 값을 자동으로 결정하도록 프로그래밍되는, 집적 회로.
91. 제 90 항에 있어서, 상기 집적 회로는 상기 결정된 WG 값을 기초로 하여 A0 -1을 계산하도록 프로그래밍되는, 집적 회로.
92. 제 83 항 내지 제 88 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 집적 회로는:
Figure pct00194
에 따른 셔먼-모리슨 반복 역 업데이터를 사용하여 (XTWX)를 근사화하도록 프로그래밍되는, 집적 회로.
93. 제 92 항에 있어서,
Figure pct00195
이고, 여기에서
Figure pct00196
(1)
Figure pct00197
(2)
인, 집적 회로.
94. 제 93 항에 있어서, 상기 집적 회로는:
Figure pct00198
(3)
Figure pct00199
(4)
Figure pct00200
(5)
Figure pct00201
(6)
Figure pct00202
(7)
Figure pct00203
(8)
에 따라 스펙트럼 비 혼합 행렬을 근사화하도록 프로그래밍되는, 집적 회로.
95. 제 94 항에 있어서, A0 -1에 대해 사전 계산된 값이 A1 -1을 계산하는 데 사용되고 A-1은 i = 1에서 ND까지 각 (Ai -1)-1을 사용하여 Ai -1을 반복 계산하여 계산되는, 집적 회로.
96. 제 84 항에 있어서, 상기 집적 회로는 행렬 분해에 의해 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 프로그래밍되는, 집적 회로.
97. 제 96 항에 있어서, 상기 행렬 분해는 LU 분해를 포함하는, 집적 회로.
98. 제 97 항에 있어서, 상기 집적 회로는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금:
XTWXa = XTWy
Aa = B
LDLTa = B
Lz = B 여기서 z = DLTa
Dx = z 여기서 x = LTa
LTa = x
에 따라 수정된 촐레스키 분해를 사용하여 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 프로그래밍되는, 집적 회로.
99. 제 96 항에 있어서, 상기 집적 회로는 QR 분해에 의해 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 프로그래밍되는, 집적 회로.
100. 제 99 항에 있어서, 상기 집적 회로는:
Figure pct00204
에 따라 QR 분해를 사용하여 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 하는 명령을 포함하는, 집적 회로.
101. 제 96 항에 있어서, 상기 집적 회로는 특이 값 분해에 의해 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 하는, 집적 회로
102. 제 101 항에 있어서, 상기 집적 회로는:
z = UTy
Σw = z
a = Vw
에 따라 특이 값 분해를 사용하여 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 프로그래밍되고,
여기서 U와 V는 직교 행렬이고 Σ는
Figure pct00205
의 특이 값을 포함하는 대각 행렬인, 집적 회로.
103. 제 76 항 내지 제 102 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 집적 회로는 전계 프로그래밍 가능한 게이트 배열(FPGA)에서 계산되는, 집적 회로.
104. 제 76 항 내지 제 102 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 집적 회로는 주문형 집적 회로(ASIC)를 포함하는, 집적 회로.
105. 제 62 항 내지 제 102 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 집적 회로는 복합 프로그래밍 가능 로직 장치(CPLD)인, 집적 회로.
106. 복수의 형광단을 포함하는 샘플로부터 광 검출 시스템으로 광을 검출하는 단계 - 상기 형광단은 중첩된 형광 스펙트럼을 가짐 - ; 및
상기 샘플의 입자 상의 상기 형광단 중 하나 이상의 풍부도를 예측하는 단계
를 포함하는 방법.
107. 제 106 항에 있어서, 각 형광단의 상기 형광 스펙트럼은 상기 샘플에서 적어도 하나 다른 형광단의 상기 형광 스펙트럼과 중첩하는, 방법.
108. 제 107 항에 있어서, 각 형광단의 상기 형광 스펙트럼은 상기 샘플에 있는 하나 이상의 다른 형광단의 형광 스펙트럼과 10nm 이상 중첩하는, 방법.
109. 제 107 항에 있어서, 각 형광단의 상기 형광 스펙트럼은 상기 샘플에 있는 하나 이상의 다른 형광단의 상기 형광 스펙트럼과 25nm 이상 중첩하는, 방법.
110. 제 106 항에 있어서, 상기 샘플에서 적어도 하나의 형광단의 상기 형광 스펙트럼은 상기 샘플에 있는 두 개의 다른 형광단의 상기 형광 스펙트럼과 중첩하는, 방법.
111. 제 110 항에 있어서, 상기 샘플에 있는 적어도 하나의 형광단의 상기 형광 스펙트럼이 상기 샘플에 있는 두 개의 다른 형광단의 상기 형광 스펙트럼과 10nm 이상 중첩하는, 방법.
112. 제 111 항에 있어서, 상기 샘플에 있는 적어도 하나의 형광단의 상기 형광 스펙트럼이 상기 샘플에 있는 두 개의 다른 형광단의 형광 스펙트럼과 25nm 이상 중첩하는, 방법.
113. 제 106 항 내지 제 112 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형광단의 풍부도를 예측하는 단계는 상기 입자 상의 각 형광단으로부터 상기 광을 스펙트럼 분해하는 단계를 포함하는, 방법.
114. 제 113 항에 있어서, 각 형광단으로부터 광을 스펙트럼 분해하는 단계는 상기 입자 상의 각 형광단의 상기 형광 스펙트럼에 대한 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하는 단계를 포함하는, 방법.
115. 제 114 항에 있어서, 상기 방법은 가중 최소 제곱 알고리즘을 사용하여 상기 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하는 단계를 포함하는, 방법.
116. 제 115 항에 있어서, 상기 가중 최소 제곱 알고리즘은:
Figure pct00206
에 따라 계산되고,
여기서 y는 각 세포에 대한 상기 광 검출 시스템의 상기 복수의 광 검출기로부터 측정된 검출기 값이고;
Figure pct00207
는 추정되는 형광단 풍부도이고;
X는 스필오버이고;
W는
Figure pct00208
인, 방법.
117. 제 116 항에 있어서, 각 Wii는;
Figure pct00209
에 따라 계산되고, 여기서
σi 2는 검출기 i에서의 분산이고;
yi는 검출기 i에서의 신호이고;
λi는 검출기 i에서 일정한 노이즈인, 방법.
118. 제 115 항 내지 제 117 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은:
(XTWX)-1XTW
에 따라 상기 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하는 단계를 포함하는, 방법.
119. 제 115 항 내지 제 117 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하기 위해 각 세포에 대한 (XTWX)을 역전하는 단계를 포함하는, 방법.
120. 제 119 항에 있어서, (XTWX)을 역전하는 단계는:
Figure pct00210
에 따라 반복적인 뉴턴-랩슨 계산법을 사용하여 (XTWX)를 근사화하는 단계를 포함하고,
여기서 WG는 광 검출 시스템의 각 광 검출기의 분산으로부터 결정되는 미리 결정된 W의 근사치인, 방법.
121. 제 120 항에 있어서, 상기 광원으로 상기 샘플을 조사하기 전에 WG를 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
122. 제 121 항에 있어서, 상기 계산된 WG 값으로 A0 -1을 미리 계산하는 단계를 포함하는, 방법.
123. 제 114 항 내지 제 119 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은:
Figure pct00211
에 따른 셔먼-모리슨 반복 역 업데이터를 사용하여 (XTWX)를 근사화하는 단계를 포함하는, 방법.
124. 제 123 항에 있어서,
Figure pct00212
이고, 여기에서
Figure pct00213
(1)
Figure pct00214
(2)
인, 방법.
125. 제 124 항에 있어서,
Figure pct00215
(3)
Figure pct00216
(4)
Figure pct00217
(5)
Figure pct00218
(6)
Figure pct00219
(7)
Figure pct00220
(8)
에 따라 상기 스펙트럼 비 혼합 행렬을 근사화하는 단계를 더 포함하는, 방법.
126. 제 125 항에 있어서, A0 -1에 대해 사전 계산된 값은 A1 -1을 계산하는 데 사용되고 A-1은 i = 1에서 ND까지 각 (Ai -1)-1을 사용하여 Ai -1을 반복 계산하여 계산되는, 방법.
127. 제 114 항 내지 제 119 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가중 최소 제곱 알고리즘은 행렬 분해에 의해 계산되는, 방법.
128. 제 127 항에 있어서, 상기 행렬 분해는 LU 분해를 포함하는, 방법.
129. 제 128 항에 있어서, 상기 가중 최소 제곱 알고리즘은:
XTWXa = XTWy
Aa = B
LDLTa = B
Lz = B 여기서 z = DLTa `
Dx = z 여기서 x = LTa
LTa = x
에 따라 수정된 촐레스키 분해를 사용하여 계산되는, 방법.
130. 제 127 항에 있어서, 상기 가중 최소 제곱 알고리즘은 QR 분해에 의해 계산되는, 방법.
131. 제 130 항에 있어서, 상기 가중 최소 제곱 알고리즘은:
Figure pct00221
에 따라 QR 분해를 사용하여 계산되는, 방법.
132. 제 131 항에 있어서, 상기 가중 최소 제곱 알고리즘은 특이 값 분해로 계산되는, 방법
133. 제 132 항에 있어서, 상기 가중 최소 제곱 알고리즘은:
z = UTy
Σw = z
a = Vw
에 따라 특이 값 분해를 사용하여 계산되고,
여기서 U와 V는 직교 행렬이고 Σ는
Figure pct00222
의 특이 값을 포함하는 대각 행렬인, 방법.
134. 제 114 항 내지 제 133 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스펙트럼 비 혼합 행렬은 전계 프로그래밍 가능한 게이트 배열에서 계산되는, 방법.
135. 제 106 항 내지 제 134 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입자에 있는 각 형광단의 상기 추정된 풍부도를 기반으로 상기 샘플에서 상기 입자를 식별하는 단계를 더 포함하는, 방법.
136. 제 106 항 내지 제 135 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입자는 세포인, 방법.
137. 제 106 항 내지 제 136 항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 형광단은 생체 분자에 접합되는, 방법.
138. 제 137 항에 있어서, 상기 생체 분자는 폴리펩티드, 핵산 및 다당류로 구성된 군에서 선택된 화합물인, 방법.
139. 제 106 항 내지 제 138 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입자에 있는 각 형광단의 상기 추정된 풍부도를 기준으로 입자를 분류하는 단계를 더 포함하는, 방법.
140. 제 106 항 내지 제 139 항 중 어느 한 항에 있어서, 광원으로 상기 샘플을 조사하는 단계를 더 포함하는, 방법.
141. 제 140 항에 있어서, 상기 광원은 레이저를 포함하는, 방법.
142. 제 141 항에 있어서, 상기 광원은 복수의 레이저를 포함하는, 방법.
143. 제 106 항 내지 제 142 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광원은 복수의 광 검출기를 포함하는, 방법.
144. 제 143 항에 있어서, 상기 광 검출기는 하나 이상의 광전자 증배관을 포함하는, 방법.
145. 제 106 항 내지 제 142 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광 검출 시스템은 광 검출기 어레이를 포함하는, 방법.
146. 제 145 항에 있어서, 상기 광 검출기 어레이는 광 다이오드를 포함하는, 방법.
147. 제 146 항에 있어서, 상기 광 검출기 어레이는 전하 결합 장치를 포함하는, 방법.
148. 중첩된 형광 스펙트럼을 갖는 복수의 형광단을 포함하는 샘플을 조사하도록 구성된 광원;
복수의 광 검출기를 포함하는 광 검출 시스템; 및
상기 프로세서에 작동 가능하게 연결된 메모리를 포함하는 프로세서
를 포함하고,
상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때 상기 프로세서로 하여금 상기 샘플의 입자 상의 상기 형광단 중 하나 이상의 풍부도를 예측하도록 하는 명령을 저장하고 있는, 시스템.
149. 제 148 항에 있어서, 각 형광단의 상기 형광 스펙트럼은 상기 샘플에서 적어도 하나 다른 형광단의 상기 형광 스펙트럼과 중첩하는, 시스템.
150. 제 149 항에 있어서, 각 형광단의 상기 형광 스펙트럼은 상기 샘플에 있는 하나 이상의 다른 형광단의 형광 스펙트럼과 10nm 이상 중첩하는, 시스템.
151. 제 149 항에 있어서, 각 형광단의 상기 형광 스펙트럼은 상기 샘플에 있는 하나 이상의 다른 형광단의 상기 형광 스펙트럼과 25nm 이상 중첩하는, 시스템.
152. 제 148 항에 있어서, 상기 샘플에 있는 적어도 하나의 형광단의 상기 형광 스펙트럼은 상기 샘플에 있는 두 개의 다른 형광단의 상기 형광 스펙트럼과 중첩하는, 시스템.
153. 제 152 항에 있어서, 상기 샘플에서 적어도 하나의 형광단의 상기 형광 스펙트럼이 상기 샘플에 있는 두 개의 다른 형광단의 상기 형광 스펙트럼과 10nm 이상 중첩하는, 시스템.
154. 제 152 항에 있어서, 상기 샘플에서 적어도 하나의 형광단의 상기 형광 스펙트럼이 상기 샘플에 있는 두 개의 다른 형광단의 형광 스펙트럼과 25nm 이상 중첩하는, 시스템.
155. 제 148 항 내지 제 154 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때 상기 프로세서로 하여금 입자상의 각 형광단으로부터의 광을 스펙트럼 분해함으로써 형광단의 상기 풍부도를 추정하도록 하는 명령을 저장하는, 시스템.
156. 제 155 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금 상기 샘플의 각 형광단의 상기 형광 스펙트럼에 대한 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하도록 하는 명령을 저장하고 있는, 시스템.
157. 제 156 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금 가중 최소 제곱 알고리즘에 의해 상기 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하도록 하는 명령을 저장하는, 시스템.
158. 제 157 항에 있어서, 상기 가중 최소 제곱 알고리즘:
Figure pct00223
에 따라 계산되고,
여기서 y는 각 세포에 대한 상기 광 검출 시스템의 상기 복수의 광 검출기로부터 측정된 검출기 값이고;
Figure pct00224
는 추정되는 형광단 풍부도이고;
X는 스필오버이고;
W는
Figure pct00225
인, 시스템.
159. 제 158 항에 있어서, 각 Wii는:
Figure pct00226
에 따라 계산되고,
여기서 σi 2는 검출기 i에서의 분산이고;
yi는 검출기 i에서의 신호이고;
λi는 검출기 i에서 일정한 노이즈인, 시스템.
160. 제 157 항 내지 제 159 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금:
(XTWX)-1XTW
에 따라 상기 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하도록 하는 명령을 포함하는, 시스템.
161. 제 160 항에 있어서, (XTWX)는 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하기 위해 상기 광 검출 시스템에 의해 검출된 각 세포에 대해 역전되는, 시스템.
162. 제 161 항에 있어서, (XTWX)의 역은 :
Figure pct00227
에 따라 반복적인 뉴턴-랩슨 계산법을 사용하여 근사화되고,
여기서 WG는 광 검출 시스템의 각 광 검출기의 분산으로부터 결정되는 미리 결정된 W의 근사치인, 시스템.
163. 제 162 항에 있어서, 상기 광 검출기의 분산은 광 검출기 노이즈 성분을 포함하는, 시스템.
164. 제 163 항에 있어서, 상기 광 검출기 노이즈 성분은 전자 노이즈 및 광학적 배경 광 중 하나 이상을 포함하는, 시스템.
165. 제 163 항 내지 제 164 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광 검출기의 분산은 광 검출기에 의해 측정된 빛의 강도에 비례하는, 시스템.
166. 제 163 항 내지 제 164 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광 검출기 노이즈 성분은 단일 오염 대조 샘플을 사용하여 추정되는, 시스템.
167. 제 165 항 내지 제 166 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금 광원으로 샘플을 조사하기 전에 각 광 검출기의 분산을 자동으로 결정하게 하는 명령을 포함하는, 시스템.
168. 제 164 항 내지 제 167 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금 상기 광원으로 상기 샘플을 조사하기 전에 WG 값을 자동으로 결정하도록 하는 명령을 포함하는, 시스템.
169. 제 168 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금 상기 결정된 WG 값을 기초로 하여 A0 -1을 계산하도록 하는 명령을 포함하는, 시스템.
170. 제 156 항 내지 제 161 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금:
Figure pct00228
에 따른 셔먼-모리슨 반복 역 업데이터를 사용하여 (XTWX)를 근사화하도록 하는 명령을 포함하는, 시스템.
171. 제 170 항에 있어서,
Figure pct00229
이고, 여기에서
Figure pct00230
(1)
Figure pct00231
(2)
인, 시스템.
172. 제 171 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금:
Figure pct00232
(3)
Figure pct00233
(4)
Figure pct00234
(5)
Figure pct00235
(6)
Figure pct00236
(7)
Figure pct00237
(8)
에 따라 스펙트럼 비 혼합 행렬을 근사화하도록 하는 명령을 포함하는, 시스템.
173. 제 172 항에 있어서, A0 -1에 대해 사전 계산된 값이 A1 -1을 계산하는 데 사용되고 A-1은 i = 1에서 ND까지 각 (Ai -1)-1을 사용하여 Ai -1을 반복 계산하여 계산되는, 시스템.
174. 제 156 항 내지 제 161 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금 행렬 분해에 의해 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 하는 명령을 포함하는, 시스템.
175. 제 174 항에 있어서, 상기 행렬 분해는 LU 분해를 포함하는, 시스템.
176. 제 175 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금:
XTWXa = XTWy
Aa = B
LDLTa = B
Lz = B 여기서 z = DLTa
Dx = z 여기서 x = LTa
LTa = x
에 따라 수정된 촐레스키 분해를 사용하여 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 하는 명령을 포함하는, 시스템.
177. 제 174 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금 QR 분해에 의해 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 하는 명령을 포함하는, 시스템.
178. 제 177 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금:
Figure pct00238
에 따라 QR 분해를 사용하여 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 하는 명령을 포함하는, 시스템.
179. 제 174 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금 특이 값 분해에 의해 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 하는, 시스템
180. 제 179 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금:
z = UTy
Σw = z
a = Vw
에 따라 특이 값 분해를 사용하여 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 하는 명령을 포함하고,
여기서 U와 V는 직교 행렬이고 Σ는
Figure pct00239
의 특이 값을 포함하는 대각 행렬인, 시스템.
181. 제 156 항 내지 제 180 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스펙트럼 비 혼합 행렬은 전계 프로그래밍 가능한 게이트 배열에서 계산되는, 시스템.
182. 제 148 항 내지 제 181 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때 상기 프로세서로 하여금 상기 입자상의 각 형광단의 상기 추정된 풍부도에 기초하여 샘플 내의 입자를 식별하도록 하는 명령을 저장하는, 시스템.
183. 제 148 항 내지 제 182 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입자는 세포인, 시스템.
184. 제 148 항 내지 제 183 항 중 어느 한 항에 있어서, 각 형광단은 생체 분자에 접합되는, 시스템.
185. 제 184 항에 있어서, 상기 생체 분자는 폴리펩티드, 핵산 및 다당류로 구성된 군에서 선택된 화합물인, 방법.
186. 제 182 항 내지 제 185 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때 상기 프로세서로 하여금 상기 입자에 있는 각 형광단의 상기 추정된 풍부도를 기준으로 입자를 분류하도록 하는 명령을 저장하는, 시스템.
187. 제 148 항 내지 제 186 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광원은 레이저를 포함하는, 시스템.
188. 제 187 항에 있어서, 상기 광원은 복수의 레이저를 포함하는, 시스템.
189. 제 148 항 내지 제 188 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광 검출 시스템은 광전자 증배관을 포함하는, 시스템.
190. 제 148 항 내지 제 189 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광 검출 시스템은 광 검출기 어레이를 포함하는, 시스템.
191. 제 190 항에 있어서, 상기 광 검출기 어레이는 광 다이오드를 포함하는, 시스템.
192. 제 190 항에 있어서, 상기 광 검출기는 전하 결합 장치를 포함하는, 시스템.
193. 중첩된 형광 스펙트럼을 갖는 복수의 형광단을 포함하는 샘플의 입자 상의 형광단 중 하나 이상의 풍부도를 예측하도록 프로그래밍된 집적 회로.
194. 제 193 항에 있어서, 각 형광단의 상기 형광 스펙트럼은 상기 샘플에서 적어도 하나 다른 형광단의 상기 형광 스펙트럼과 중첩하는, 집적 회로.
195. 제 194 항에 있어서, 각 형광단의 상기 형광 스펙트럼은 상기 샘플에 있는 하나 이상의 다른 형광단의 형광 스펙트럼과 10nm 이상 중첩하는, 집적 회로.
196. 제 194 항에 있어서, 각 형광단의 상기 형광 스펙트럼은 상기 샘플에 있는 하나 이상의 다른 형광단의 상기 형광 스펙트럼과 25nm 이상 중첩하는, 집적 회로.
197. 제 193 항에 있어서, 상기 샘플에 있는 적어도 하나의 형광단의 상기 형광 스펙트럼은 상기 샘플에 잇는 두 개의 다른 형광단의 상기 형광 스펙트럼과 중첩하는, 집적 회로.
198. 제 197 항에 있어서, 샘플에 있는 적어도 하나의 형광단의 상기 형광 스펙트럼이 상기 샘플에 있는 두 개의 다른 형광단의 상기 형광 스펙트럼과 10nm 이상 중첩하는, 집적 회로.
199. 제 197 항에 있어서, 상기 샘플에 있는 적어도 하나의 형광단의 상기 형광 스펙트럼이 상기 샘플에 있는 두 개의 다른 형광단의 형광 스펙트럼과 25nm 이상 중첩하는, 집적 회로.
200. 제 193 항 내지 제 199 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 집적 회로는 상기 입자에 있는 각 형광단으로부터의 광을 스펙트럼 분해하여 형광단의 풍부도를 추정하도록 프로그래밍되어 있는, 집적 회로.
201. 제 193 항 내지 제 199 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 집적 회로는 상기 샘플의 각 형광단의 상기 형광 스펙트럼에 대한 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하도록 하는 명령을 저장하고 있는, 집적 회로.
202. 제 201 항에 있어서, 상기 집적 회로는 상기 가중 최소 제곱 알고리즘에 의해 상기 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하도록 프로그래밍되는, 집적 회로.
203. 제 202 항에 있어서, 상기 가중 최소 제곱 알고리즘은:
Figure pct00240
에 따라 계산되고:
여기서 y는 각 세포에 대한 상기 광 검출 집적 회로의 상기 복수의 광 검출기로부터 측정된 검출기 값이고;
Figure pct00241
는 추정되는 형광단 풍부도이고;
X는 스필오버이고;
W는
Figure pct00242
인, 집적 회로.
204. 제 202 항에 있어서, 각 Wii는:
Figure pct00243
에 따라 계산되고,
여기서 σi 2는 검출기 i에서의 분산이고;
yi는 검출기 i에서의 신호이고;
λi는 검출기 i에서 일정한 노이즈인, 집적 회로.
205. 제 202 항 내지 제 204 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 집적 회로는:
(XTWX)-1XTW
에 따라 상기 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하도록 프로그래밍되는, 집적 회로.
206. 제 205 항에 있어서, (XTWX)는 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하기 위해 상기 광 검출 집적 회로에 의해 검출된 각 세포에 대해 역전되는, 집적 회로.
207. 제 205 항에 있어서, (XTWX)의 역은:
Figure pct00244
에 따라 반복적인 뉴턴-랩슨 계산법을 사용하여 근사화되고,
여기서 WG는 상기 샘플의 상기 형광단으로부터 형광을 검출하기 위한 광 검출 시스템에서 각 광 검출기의 분산으로 결정되는 미리 결정된 W의 근사치인, 집적 회로.
208. 제 207 항에 있어서, 상기 집적 회로는 상기 광원으로 상기 샘플을 조사하기 전에 WG 값을 자동으로 결정하도록 프로그래밍되는, 집적 회로.
209. 제 208 항에 있어서, 상기 집적 회로는 상기 결정된 WG 값을 기초로 하여 A0 -1을 계산하도록 프로그래밍되는, 집적 회로.
210. 제 201 항 내지 제 206 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 집적 회로는:
Figure pct00245
에 따른 셔먼-모리슨 반복 역 업데이터를 사용하여 (XTWX)를 근사화하도록 프로그래밍되는, 집적 회로.
211. 제 210 항에 있어서,
Figure pct00246
이고, 여기에서
Figure pct00247
(1)
Figure pct00248
(2)
인, 집적 회로.
212. 제 211 항에 있어서, 상기 집적 회로는:
Figure pct00249
(3)
Figure pct00250
(4)
Figure pct00251
(5)
Figure pct00252
(6)
Figure pct00253
(7)
Figure pct00254
(8)
에 따라 스펙트럼 비 혼합 행렬을 근사화하도록 프로그래밍되는, 집적 회로.
213. 제 212 항에 있어서, A0 -1에 대해 사전 계산된 값이 A1 -1을 계산하는 데 사용되고 A-1은 i = 1에서 ND까지 각 (Ai -1)-1을 사용하여 Ai -1을 반복 계산하여 계산되는, 집적 회로.
214. 제 201 항 내지 제 206 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 집적 회로는 행렬 분해에 의해 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 프로그래밍되는, 집적 회로.
215. 제 214 항에 있어서, 상기 행렬 분해는 LU 분해를 포함하는, 집적 회로.
216. 제 215 항에 있어서, 상기 집적 회로는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금:
XTWXa = XTWy
Aa = B
LDLTa = B
Lz = B 여기서 z = DLTa
Dx = z 여기서 x = LTa
LTa = x
에 따라 수정된 촐레스키 분해를 사용하여 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 프로그래밍되는, 집적 회로.
217. 제 214 항에 있어서, 상기 집적 회로는 QR 분해에 의해 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 프로그래밍되는, 집적 회로.
218. 제 217 항에 있어서, 상기 집적 회로는:
Figure pct00255
에 따라 QR 분해를 사용하여 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 ㅎ하는 명령을 포함하는, 집적 회로.
219. 제 218 항에 있어서, 상기 집적 회로는 특이 값 분해에 의해 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 하는, 집적 회로
220. 제 219 항에 있어서, 상기 집적 회로는:
z = UTy
Σw = z
a = Vw
에 따라 특이 값 분해를 사용하여 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 프로그래밍되고,
여기서 U와 V는 직교 행렬이고 Σ는
Figure pct00256
의 특이 값을 포함하는 대각 행렬인, 집적 회로.
221. 제 193 항 내지 제 220 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 집적 회로는 상기 입자에 있는 각 형광단의 상기 추정된 풍부도를 기반으로 샘플의 입자를 식별하도록 프로그래밍되는, 집적 회로.
222. 제 221 항에 있어서, 상기 집적 회로는 상기 입자에 있는 각 형광단의 상기 추정된 풍부도를 기반으로 상기 입자를 분류하도록 프로그래밍되는, 집적 회로.
223. 제 193 항 내지 제 222 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 집적 회로는 전계 프로그래밍 가능한 게이트 배열(FPGA)에서 계산되는, 집적 회로.
224. 제 193 항 내지 제 222 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 집적 회로는 주문형 집적 회로(ASIC)를 포함하는, 집적 회로.
225. 제 193 항 내지 제 222 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 집적 회로는 복합 프로그래밍 가능 로직 장치(CPLD)인, 집적 회로.
226. 중첩된 복수의 형광단을 포함하는 샘플을 조사하도록 구성된 광원;
복수의 광 검출기를 포함하는 광 검출 시스템; 및
상기 프로세서에 작동 가능하게 연결된 메모리를 포함하는 프로세서
를 포함하고,
상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때 상기 프로세서로 하여금:
상기 광 검출기에 의해 검출된 각 세포에 대해 상기 복수의 형광단의 상기 형광 스펙트럼에 대해 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하고;
상기 스펙트럼 비 혼합 행렬을 이용하여 각 형광단의 풍부도를 추정하도록
하는 명령을 저장하는, 시스템.
227. 제 226 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금 가중 최소 제곱 알고리즘에 의해 상기 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하도록 하는 명령을 저장하는, 시스템.
228. 제 227 항에 있어서, 상기 가중 최소 제곱 알고리즘은:
Figure pct00257
에 따라 계산되고,
여기서 y는 각 세포에 대한 상기 광 검출 시스템의 상기 복수의 광 검출기로부터 측정된 검출기 값이고;
Figure pct00258
는 추정되는 형광단 풍부도이고;
X는 스필오버이고;
W는
Figure pct00259
인, 시스템.
229. 제 228 항에 있어서, 각 Wii는:
Figure pct00260
에 따라 계산되고, 여기서
σi 2는 검출기 i에서의 분산이고;
yi는 검출기 i에서의 신호이고;
λi는 검출기 i에서 일정한 노이즈인, 시스템.
230. 제 228 항에 있어서, 상기 스펙트럼 비 혼합 행렬은:
(XTWX)-1XTW
에 따라 계산되는, 시스템.
231. 제 228 항에 있어서, (XTWX)는 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하기 위해 상기 광 검출 시스템에 의해 검출된 각 세포에 대해 역전되는, 시스템.
232. 제 231 항에 있어서, (XTWX)의 역은:
Figure pct00261
에 따라 반복적인 뉴턴-랩슨 계산법을 사용하여 근사화되고,
여기서 WG는 광 검출 시스템의 각 광 검출기의 분산으로부터 결정되는 미리 결정된 W의 근사치인, 시스템.
233. 제 232 항에 있어서, 상기 광 검출기의 분산은 광 검출기 노이즈 성분을 포함하는, 시스템.
234. 제 233 항에 있어서, 상기 광 검출기 노이즈 성분은 전자 노이즈 및 광학적 배경 광 중 하나 이상을 포함하는, 시스템.
235. 제 233 항 내지 제 234 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광 검출기의 분산은 광 검출기에 의해 측정된 빛의 강도에 비례하는, 시스템.
236. 제 233 항 내지 제 235 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광 검출기 노이즈 성분은 단일 오염 대조 샘플을 사용하여 추정되는, 시스템.
237. 제 233 항 내지 제 236 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금 광원으로 샘플을 조사하기 전에 각 광 검출기의 분산을 자동으로 결정하게 하는 명령을 포함하는, 시스템.
238. 제 232 항 내지 제 237 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금 상기 광원으로 상기 샘플을 조사하기 전에 WG 값을 자동으로 결정하도록 하는 명령을 포함하는, 시스템.
239. 제 238 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때 상기 프로세서로 하여금 상기 결정된 WG 값을 기반으로 A0 -1을 계산하도록 하는 명령을 저장하는, 시스템.
240. 제 239 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금 상기 결정된 WG 값을 기초로 하여 A0 -1을 계산하도록 하는 명령을 포함하는, 시스템.
241. 제 227 항 내지 제 231 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금:
Figure pct00262
에 따른 셔먼-모리슨 반복 역 업데이터를 사용하여 (XTWX)를 근사화하도록 하는 명령을 포함하는, 시스템.
242. 제 241 항에 있어서,
Figure pct00263
이고, 여기에서
Figure pct00264
(1)
Figure pct00265
(2)
인, 시스템.
243. 제 242 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금:
Figure pct00266
(3)
Figure pct00267
(4)
Figure pct00268
(5)
Figure pct00269
(6)
Figure pct00270
(7)
Figure pct00271
(8)
에 따라 스펙트럼 비 혼합 행렬을 근사화하도록 하는 명령을 포함하는, 시스템.
244. 제 243 항에 있어서, A0 -1에 대해 사전 계산된 값이 A1 -1을 계산하는 데 사용되고 A-1은 i = 1에서 ND까지 각 (Ai -1)-1을 사용하여 Ai -1을 반복 계산하여 계산되는, 시스템.
245. 제 227 항 내지 제 231 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금 행렬 분해에 의해 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 하는 명령을 포함하는, 시스템.
246. 제 245 항에 있어서, 상기 행렬 분해는 LU 분해를 포함하는, 시스템.
247. 제 246 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금:
XTWXa = XTWy
Aa = B
LDLTa = B
Lz = B 여기서 z = DLTa
Dx = z 여기서 x = LTa
LTa = x
에 따라 수정된 촐레스키 분해를 사용하여 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 하는 명령을 포함하는, 시스템.
248. 제 245 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금 QR 분해에 의해 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 하는, 명령을 포함하는, 시스템.
249. 제 248 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금:
Figure pct00272
에 따라 QR 분해를 사용하여 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 하는 명령을 포함하는, 시스템.
250. 제 245 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금 특이 값 분해에 의해 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 하는 명령을 포함하는, 시스템
251. 제 250 항에 있어서, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금:
z = UTy
Σw = z
a = Vw
에 따라 특이 값 분해를 사용하여 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 하는 명령을 포함하고,
여기서 U와 V는 직교 행렬이고 Σ는
Figure pct00273
의 특이 값을 포함하는 대각 행렬인, 시스템.
252. 제 226 항 내지 제 251 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스펙트럼 비 혼합 행렬은 전계 프로그래밍 가능한 게이트 배열에서 계산되는, 시스템.
253. 제 226 항 내지 제 252 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광원은 레이저를 포함하는, 시스템.
254. 제 253 항에 있어서, 상기 광원은 복수의 레이저를 포함하는, 시스템.
255. 제 226 항 내지 제 254 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광 검출 시스템은 광전자 증배관을 포함하는, 시스템.
256. 제 226 항 내지 제 255 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광 검출 시스템은 광 검출기 어레이를 포함하는, 시스템.
257. 제 256 항에 있어서, 상기 광 검출기 어레이는 광 다이오드를 포함하는, 시스템.
258. 제 256 항에 있어서, 상기 광 검출기는 전하 결합 장치를 포함하는, 시스템.
259. 제 226 항 내지 제 258 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 분류 구성 성분은 액적 편향기를 포함하는, 시스템.
260. 제 226 항 내지 제 259 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은:
오리피스를 포함하는 유동 세포 노즐; 및
상기 샘플을 상기 광원으로 조사하기 위해 상기 유동 세포 노즐 오리피스와 유체 연통하는 샘플 검사 영역
을 더 포함하는, 시스템.
261. 제 260 항에 있어서, 상기 샘플 검사 영역에 위치한 큐벳을 더 포함하는, 시스템.
262. 샘플의 세포를 분류하는 방법에 있어서, 상기 방법은:
중첩된 복수의 형광단을 포함하는 샘플로부터 방사된 광을 검출하는 단계; 및
상기 광 검출 시스템에 의해 검출된 각 세포에 대한 상기 복수의 형광단의 상기 형광 스펙트럼에 대한 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하는 단계;
상기 스펙트럼 비 혼합 행렬을 이용하여 각 형광단의 풍부도를 추정하는 단계; 및
상기 추정된 형광단 풍부도를 기반으로 상기 샘플의 세포를 분류하는 단계
를 포함하는, 방법.
263. 제 262 항에 있어서, 상기 방법은 가중 최소 제곱 알고리즘을 사용하여 상기 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하는 단계를 포함하는, 방법.
264. 제 263 항에 있어서, 상기 가중 최소 제곱 알고리즘은:
Figure pct00274
에 따라 계산되고,
여기서 y는 각 세포에 대한 상기 광 검출 시스템의 상기 복수의 광 검출기로부터 측정된 검출기 값이고;
Figure pct00275
는 추정되는 형광단 풍부도이고;
X는 스필오버이고;
W는
Figure pct00276
인, 방법.
265. 제 264 항에 있어서, 각 Wii는:
Figure pct00277
에 따라 계산되고,
여기서 σi 2는 검출기 i에서의 분산이고;
yi는 검출기 i에서의 신호이고;
λi는 검출기 i에서 일정한 노이즈인, 방법.
266. 제 264 항에 있어서, 상기 방법은
(XTWX)-1XTW
에 따라 상기 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하는 단계를 포함하는, 방법.
267. 제 264 항에 있어서, 상기 방법은 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하기 위해 상기 광 검출 시스템에 의해 검출된 각 세포에 대해 (XTWX)을 역전하는 단계를 포함하는, 방법.
268. 제 267 항에 있어서, (XTWX)을 역전하는 단계는
Figure pct00278
에 따라 반복적인 뉴턴-랩슨 계산법을 사용하여 (XTWX)를 근사화하는 단계를 포함하고,
여기서 WG는 광 검출 시스템의 각 광 검출기의 분산으로부터 결정되는 미리 결정된 W의 근사치인, 방법.
269. 제 268 항에 있어서, 상기 계산된 WG 값으로 A0 -1을 미리 계산하는 단계를 포함하는, 방법.
270. 제 263 항 내지 제 267 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은:
Figure pct00279
에 따른 셔먼-모리슨 반복 역 업데이터를 사용하여 (XTWX)를 근사화하는 단계를 포함하는, 방법.
271. 제 270 항에 있어서,
Figure pct00280
이고, 여기에서
Figure pct00281
(1)
Figure pct00282
(2)
인, 방법.
272. 제 271 항에 있어서,
Figure pct00283
(3)
Figure pct00284
(4)
Figure pct00285
(5)
Figure pct00286
(6)
Figure pct00287
(7)
Figure pct00288
(8)
에 따라 스펙트럼 비 혼합 행렬을 근사화하는 단계를 더 포함하는, 방법.
273. 제 272 항에 있어서, A0 -1에 대한 사전 계산된 값이 A1 -1을 계산하는 데 사용되고 A-1은 i = 1에서 ND까지 각 (Ai -1)-1을 사용하여 Ai -1을 반복 계산하여 계산되는, 방법.
274. 제 263 항 내지 제 267 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가중 최소 제곱 알고리즘은 행렬 분해에 의해 계산되는, 방법.
275. 제 274 항에 있어서, 상기 행렬 분해는 LU 분해를 포함하는, 방법.
276. 제 275 항에 있어서, 상기 가중 최소 제곱 알고리즘은:
XTWXa = XTWy
Aa = B
LDLTa = B
Lz = B 여기서 z = DLTa
Dx = z 여기서 x = LTa
LTa = x
에 따라 수정된 촐레스키 분해를 사용하여 계산되는, 방법.
277. 제 274 항에 있어서, 상기 가중 최소 제곱 알고리즘은 QR 분해에 의해 계산되는, 방법.
278. 제 277 항에 있어서, 상기 가중 최소 제곱 알고리즘은:
Figure pct00289
에 따라 QR 분해를 사용하여 계산되는, 방법.
279. 제 274 항에 있어서, 상기 가중 최소 제곱 알고리즘은 특이 값 분해로 계산되는, 방법
280. 제 279 항에 있어서, 상기 가중 최소 제곱 알고리즘은:
z = UTy
Σw = z
a = Vw
에 따라 특이 값 분해를 사용하여 계산되고,
여기서 U와 V는 직교 행렬이고 Σ는
Figure pct00290
의 특이 값을 포함하는 대각 행렬인, 방법.
281. 제 268 항에 있어서, 상기 광 검출기의 분산은 광 검출기 노이즈 성분을 포함하는, 방법.
282. 제 281 항에 있어서, 상기 광 검출기 노이즈 성분은 전자 노이즈 및 광학적 배경 광 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
283. 제 281 항 내지 제 282 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광 검출기의 분산은 광 검출기에 의해 측정된 빛의 강도에 비례하는, 방법.
284. 제 281 항 내지 제 283 항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 오염 대조 샘플을 사용하여 상기 광 검출기 노이즈 성분을 추정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
285. 제 281 항 내지 제 284 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광원으로 상기 샘플을 조사하기 전에 각 광 검출기의 분산을 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
286. 제 268 항 내지 제 285 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광원으로 상기 샘플을 조사하기 전에 WG를 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
287. 제 262 항 내지 제 286 항 중 어느 한 항에 있어서, 스펙트럼 비 혼합 행렬은 전계 프로그래밍 가능한 게이트 배열에서 계산되는, 방법.
288. 제 262 항 내지 제 287 항 중 어느 한 항에 있어서, 광원으로 상기 샘플을 조사하는 단계를 더 포함하는, 방법.
289. 제 288 항에 있어서, 상기 광원은 레이저를 포함하는, 방법.
290. 제 289 항에 있어서, 상기 광원은 복수의 레이저를 포함하는, 방법.
291. 제 262 항 내지 제 290 항 중 어느 한 항에 있어서, 방출된 광은 광전자 증배관을 포함하는 복수의 광 검출기로 검출되는, 방법.
292. 제 262 항 내지 제 290 항 중 어느 한 항에 있어서, 방출된 광은 광 검출기 어레이로 검출되는, 방법.
293. 제 292 항에 있어서, 상기 광 검출기 어레이는 광 다이오드를 포함하는, 방법.
294. 제 292 항에 있어서, 상기 광 검출기 어레이는 전하 결합 장치를 포함하는, 방법.
295. 복수의 광 검출기를 갖는 광 검출 시스템에 의해 검출된 샘플에서 각 세포에 대한 복수의 형광단의 형광 스펙트럼에 대한 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하고; 및
스펙트럼 비 혼합 행렬을 사용하여 각 형광단의 풍부도를 예측하도록
프로그래밍된 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이.
296. 제 295 항에 있어서, 상기 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이는 가중 최소 제곱 알고리즘을 사용하여 상기 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하도록 구성되는, 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이.
297. 제 296 항에 있어서, 상기 가중 최소 제곱 알고리즘은:
Figure pct00291
에 따라 계산되고:
여기서 y는 각 세포에 대한 상기 광 검출 집적 회로의 상기 복수의 광 검출기로부터 측정된 검출기 값이고;
Figure pct00292
는 추정되는 형광단 풍부도이고;
X는 스필오버이고;
W는
Figure pct00293
인, 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이.
298. 제 297 항에 있어서, 각 Wii는:
Figure pct00294
에 따라 계산되고,
여기서 σi 2는 검출기 i에서의 분산이고;
yi는 검출기 i에서의 신호이고;
λi는 검출기 i에서 일정한 노이즈인, 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이.
299. 제 295 항에 있어서, 상기 전계 프로그래밍 가능 게이터 어레이는:
(XTWX)-1XTW
에 따라 상기 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하도록 구성되는, 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이.
300. 제 297 항에 있어서, 상기 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이는 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하기 위해 (XTWX)를 역전하도록 구성되는, 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이.
301. 제 300 항에 있어서, 상기 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이는:
Figure pct00295
에 따라 반복적인 뉴턴-랩슨 계산법을 사용하여 (XTWX)를 근사화함으로써 (XTWX)를 역전하도록 구성되고,
여기서 WG는 상기 샘플의 상기 형광단으로부터 형광을 검출하기 위한 광 검출 시스템에서 각 광 검출기의 분산으로 결정되는 미리 결정된 W의 근사치인, 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이.
302. 제 301 항에 있어서, 상기 집적 회로는 상기 광원으로 상기 샘플을 조사하기 전에 WG 값을 자동으로 결정하도록 프로그래밍되는, 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이.
303. 제 302 항에 있어서, 상기 집적 회로는 상기 결정된 WG 값을 기초로 하여 A0 -1을 계산하도록 프로그래밍되는, 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이.
304. 제 296 항 내지 제 300 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이는:
Figure pct00296
에 따른 셔먼-모리슨 반복 역 업데이터를 사용하여 (XTWX)를 근사화하도록 프로그래밍되는, 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이.
305. 제 304 항에 있어서,
Figure pct00297
이고, 여기에서
Figure pct00298
(1)
Figure pct00299
(2)
인, 집적 회로.
306. 제 305 항에 있어서, 상기 집적 회로는:
Figure pct00300
(3)
Figure pct00301
(4)
Figure pct00302
(5)
Figure pct00303
(6)
Figure pct00304
(7)
Figure pct00305
(8)
에 따라 스펙트럼 비 혼합 행렬을 근사화하도록 프로그래밍되는, 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이.
307. 제 306 항에 있어서, A0 -1에 대해 사전 계산된 값이 A1 -1을 계산하는 데 사용되고 A-1은 i = 1에서 ND까지 각 (Ai -1)-1을 사용하여 Ai -1을 반복 계산하여 계산되는, 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이.
308. 제 296 항 내지 제 300 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 집적 회로는 행렬 분해에 의해 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 프로그래밍되는, 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이.
309. 제 308 항에 있어서, 상기 행렬 분해는 LU 분해를 포함하는, 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이.
310. 제 309 항에 있어서, 상기 집적 회로는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금:
XTWXa = XTWy
Aa = B
LDLTa = B
Lz = B 여기서 z = DLTa
Dx = z 여기서 x = LTa
LTa = x
에 따라 수정된 촐레스키 분해를 사용하여 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 프로그래밍되는, 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이.
311. 제 310 항에 있어서, 상기 집적 회로는 QR 분해에 의해 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 프로그래밍되는, 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이.
312. 제 311 항에 있어서, 상기 집적 회로는:
Figure pct00306
에 따라 QR 분해를 사용하여 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 프로그래밍되는, 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이.
313. 제 312 항에 있어서, 상기 집적 회로는 특이 값 분해에 의해 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 프로그래밍되는, 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이.
314. 제 313 항에 있어서, 상기 집적 회로는:
z = UTy
Σw = z
a = Vw
에 따라 특이 값 분해를 사용하여 상기 가중 최소 제곱 알고리즘을 계산하도록 프로그래밍되고,
여기서 U와 V는 직교 행렬이고 Σ는
Figure pct00307
의 특이 값을 포함하는 대각 행렬인, 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이.
315. 제 301 항에 있어서, 상기 광 검출기의 분산은 광 검출기 노이즈 성분을 포함하는, 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이.
316. 제 315 항에 있어서, 상기 광 검출기 노이즈 성분은 전자 노이즈 및 광학적 배경 광 중 하나 이상을 포함하는, 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이.
317. 제 295 항 내지 제 316 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광 검출기의 분산은 광 검출기에 의해 측정된 광의 강도에 비례하는, 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이.
318. 제 295 항 내지 제 316 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이는 단일 오염 대조 샘플을 기반으로 하는 광 검출기 노이즈 성분의 추정치로 프로그래밍되는, 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이.
319. 제 295 항 내지 제 316 항 중 어느 한 항에 있어서, 각 광 검출기의 상기 분산은 샘플이 광원으로 조사되기 전에 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이에 프로그래밍되는, 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이.
320. 제 295 항 내지 제 316 항 중 어느 한 항에 있어서, WG는 상기 샘플에 광원이 조사되기 전에 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이에 프로그래밍되는, 전계 프로그래밍 가능 게이트 어레이.
전술한 발명이 이해를 명료하게 하기 위해 예시 및 예를 통해 상세하게 설명되었지만, 본 발명의 개시에 비추어 당업자에게는 첨부된 청구 범위의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고 특정 변경 및 수정이 이루어질 수 있다는 것이 명백하다.
따라서, 전술한 내용은 단지 본 발명의 원리를 예시한 것이다. 당업자라면 본 명세서에서 명시적으로 설명되거나 도시되지 않았지만, 본 발명의 원리를 구현하고 그 정신 및 범위 내에 포함되는 다양한 배열을 고안할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 또한, 본 명세서에서 인용된 모든 예 및 조건부 언어는 주로 독자가 본 발명의 원리 및 본 발명자들이 기술을 발전시키는 데 기여한 개념을 이해하는 데 도움을 주기 위한 것이며, 이러한 구체적으로 언급된 예 및 조건에 제한되지 않는 것으로 해석되어야 한다. 더욱이, 본 발명의 원리, 측면 및 실시 예뿐만 아니라 그 특정 예를 언급하는 모든 진술은, 이들의 구조적 및 기능적 등가물을 모두 포함하도록 의도된다. 또한, 이러한 등가물에는 현재 알려진 등가물과 추후 개발될 등가물, 즉 구조에 관계없이 동일한 기능을 수행하는 개발된 모든 요소가 모두 포함된다. 더욱이, 이러한 공개가 청구 범위에서 명시적으로 언급되는지 여부에 관계없이 본 명세서에 개시된 어떠한 것도 일반인을 위한 것은 아니다.
따라서, 본 발명의 범위는 여기에 도시되고 설명된 예시적인 실시 예들로 제한되도록 의도되지 않는다. 오히려, 본 발명의 범위 및 사상은 첨부된 청구 범위에 의해 구체화된다. 청구범위에서, 35 U.S.C.§112(f) 또는 35 U.S.C.§112(6)은 청구범위의 조건부의 시작 부분에 정확한 문구 "수단" 또는 정확한 문구 "단계"가 인용된 경우에만 청구범위의 조건부를 위해 호출되는 것으로 명시적으로 정의되고; 이러한 정확한 문구가 청구 범위의 조건부에 사용되지 않으면, 35 U.S.C.§112(f) 또는 35 U.S.C.§112(6)이 불러오지 않는다.

Claims (15)

  1. 중첩하는 형광 스펙트럼을 갖는 복수의 형광단을 포함하는 샘플로부터 광 검출 시스템으로 광을 검출하는 단계; 및
    상기 샘플의 각 형광단의 상기 형광 스펙트럼에 대한 스펙트럼 비 혼합 행렬(spectral unmixing matrix)을 계산하여 상기 샘플의 각 형광단으로부터의 광을 스펙트럼 분해하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 스펙트럼 비 혼합 행렬은 가중 최소 제곱 알고리즘을 이용하여 계산되는, 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 가중 최소 제곱 알고리즘은:
    Figure pct00308

    에 따라 계산되고,
    y는 각 세포에 대한 상기 광 검출 시스템의 상기 복수의 광 검출기로부터 측정된 검출기 값이고;
    Figure pct00309
    는 추정되는 형광단 풍부도이고;
    X는 스필오버이고;
    W는
    Figure pct00310
    이고,
    각 Wii는;
    Figure pct00311

    에 따라 계산되고,
    σi 2는 검출기 i에서의 분산이고;
    yi는 검출기 i에서의 신호이고;
    λi는 검출기 i에서 일정한 노이즈인, 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 방법은
    (XTWX)-1XTW
    에 따라 상기 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하는 단계를 포함하고,
    상기 방법은 상기 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하기 위해 각 세포에 대한 (XTWX)을 역전하는 단계를 포함하고;
    상기 (XTWX)을 역전하는 단계는:
    Figure pct00312

    에 따라 반복적인 뉴턴-랩슨 계산법을 사용하여 (XTWX)를 근사화하는 단계를 포함하고,
    WG는 광 검출 시스템의 각 광 검출기의 분산으로부터 결정되는 미리 결정된 W의 근사치인, 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 방법은:
    Figure pct00313

    에 따른 셔먼-모리슨 반복 역 업데이터를 사용하여 (XTWX)를 근사화하는 단계를 포함하는, 방법.
  6. 제 2 항에 있어서, 상기 가중 최소 제곱 알고리즘은 행렬 분해로 계산되고, 상기 행렬 분해는:
    LU 분해;
    QR 분해; 및
    특이 값 분해
    중에서 선택되는, 방법.
  7. 시스템에 있어서,
    중첩하는 형광 스펙트럼을 갖는 복수의 형광단을 포함하는 샘플을 조사하도록 구성된 광원;
    복수의 광 검출기를 포함하는 광 검출 시스템; 및
    상기 프로세서에 작동 가능하게 연결된 메모리를 포함하는 프로세서
    를 포함하고,
    상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서로 하여금 상기 샘플의 각 형광단의 상기 형광 스펙트럼에 대해 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산함으로써 상기 샘플에 있는 각 형광단으로부터의 광을 스펙트럼 분해하도록 하는 명령을 포함하는, 시스템.
  8. 샘플에 있는 각 형광단의 형광 스펙트럼에 대한 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산함으로써 중첩하는 형광 스펙트럼을 갖는 복수의 형광단을 포함하는 상기 샘플에 있는 각 형광단으로부터 광을 스펙트럼 분해하도록 프로그래밍된, 집적 회로.
  9. 복수의 형광단을 포함하는 샘플로부터 광 검출 시스템으로 광을 검출하는 단계 - 상기 형광단은 중첩하는 형광 스펙트럼을 가짐 - ;
    상기 샘플에 있는 각 형광단의 상기 형광 스펙트럼에 대한 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하여 상기 샘플에 있는 입자 상의 상기 형광단 중 하나 이상의 풍부도를 추정하는 단계; 및
    상기 추정된 형광단의 풍부도를 기반으로 상기 샘플에 있는 세포를 분류하는 단계
    를 포함하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하는 단계는:
    Figure pct00314

    에 따라 계산되는 가중 최소 제곱 알고리즘을 이용하는 단계를 포함하고,
    y는 각 세포에 대한 상기 광 검출 시스템의 상기 복수의 광 검출기로부터 측정된 검출기 값이고;
    Figure pct00315
    는 추정되는 형광단 풍부도이고;
    X는 스필오버이고;
    W는
    Figure pct00316
    이고,
    각 Wii는:
    Figure pct00317

    에 따라 계산되고,
    σi 2는 검출기 i에서의 분산이고;
    yi는 검출기 i에서의 신호이고;
    λi는 검출기 i에서 일정한 노이즈인, 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 방법은:
    (XTWX)-1XTW
    에 따라 상기 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하는 단계를 포함하고,
    상기 방법은 상기 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하기 위해 각 세포에 대한 (XTWX)을 역전하는 단계를 포함하고;
    상기 (XTWX)을 역전하는 단계는:
    Figure pct00318

    에 따라 반복적인 뉴턴-랩슨 계산법을 사용하여 (XTWX)를 근사화하는 단계를 포함하고,
    WG는 상기 광 검출 시스템의 각 광 검출기의 분산으로부터 결정되는 미리 결정된 W의 근사치인, 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 방법은:
    Figure pct00319

    에 따른 셔먼-모리슨 반복 역 업데이터를 사용하여 (XTWX)를 근사화하는 단계를 포함하는, 방법.
  13. 제 10 항에 있어서, 상기 가중 최소 제곱 알고리즘은 행렬 분해로 계산되고, 상기 행렬 분해는:
    LU 분해;
    QR 분해; 및
    특이 값 분해
    중에서 선택되는, 방법.
  14. 중첩하는 형광 스펙트럼을 갖는 복수의 형광단을 포함하는 샘플을 조사하도록 구성된 광원;
    복수의 광 검출기를 포함하는 광 검출 시스템; 및
    상기 프로세서에 작동 가능하게 연결된 메모리를 포함하는 프로세서
    를 포함하고,
    상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때 상기 프로세서로 하여금 상기 샘플의 각 형광단의 상기 형광 스펙트럼에 대한 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산하여 상기 샘플에 있는 입자 상의 상기 형광단 중 하나 이상의 풍부도를 추정하도록 하는 명령을 저장하는, 시스템.
  15. 샘플에 있는 각 형광단의 형광 스펙트럼에 대한 스펙트럼 비 혼합 행렬을 계산함으로써, 중첩하는 형광 스펙트럼을 갖는 복수의 형광단을 포함하는 샘플에 있는 입자 상의 상기 형광단 중 하나 이상의 풍부도를 추정하도록 프로그래밍된 집적 회로.
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Patent event date: 20210720

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Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20221201

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