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KR20210081394A - 항바이러스성 프로드러그 및 이의 나노제제 - Google Patents

항바이러스성 프로드러그 및 이의 나노제제 Download PDF

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KR20210081394A
KR20210081394A KR1020217015211A KR20217015211A KR20210081394A KR 20210081394 A KR20210081394 A KR 20210081394A KR 1020217015211 A KR1020217015211 A KR 1020217015211A KR 20217015211 A KR20217015211 A KR 20217015211A KR 20210081394 A KR20210081394 A KR 20210081394A
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KR
South Korea
Prior art keywords
prodrug
cab
drug
nanoparticles
hiv
Prior art date
Application number
KR1020217015211A
Other languages
English (en)
Inventor
하워드 이. 겐델만
벤슨 에다그와
Original Assignee
보드 오브 리젠츠 오브 디 유니버시티 오브 네브라스카
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by 보드 오브 리젠츠 오브 디 유니버시티 오브 네브라스카 filed Critical 보드 오브 리젠츠 오브 디 유니버시티 오브 네브라스카
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Abstract

본 발명은 프로드러그 및 이의 사용 방법을 제공한다.

Description

항바이러스성 프로드러그 및 이의 나노제제
본 출원은 35 U.S.C. §119(e)하에 2018년 10월 22일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/748,798호에 대한 우선권을 주장한다. 상기 출원은 본원에 참조로서 포함된다.
본 발명은 국립보건원에 의해 수여된 지원금 번호 R01 MH104147, P01 DA028555, R01 NS036126, P01 NS031492, R01 NS034239, P01 MH064570, P30 MH062261, P30 AI078498, R01 AG043540, 및 R56 AI138613하에 정부 지원으로 만들어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정한 권리를 갖는다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 치료제의 전달에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 질환 또는 질병의 치료를 위하여 환자에게 치료제를 전달하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.
인간 면역결핍 바이러스 1형(HIV-1)에 대한 효과적인 진단 및 치료의 개발에서 현저한 진보가 만들어졌다. 항레트로바이러스 요법(ART)은 현저하게 감소된 질환과 연관된 질병률 및 사망률을 갖고, 이는 감염된 사람들에게 거의 정상적인 삶의 질을 가질 수 있게 한다(Vittinghoff, et al.(1999) J. Infect Dis., 179(3):717-720; Lewden, et al.(2007) J. Acquir. Immune Defic. Syndr., 46(1):72-77). 그러나, ART는 바이러스 복제를 억제하고 AIDS 개시를 예방하기 위하여 평생에 걸친 치료를 필요로 한다. 게다가, ART의 효과는 HIV-1 내성, 약물 독성, 및 불량한 환자 이행도(adherence)에 의해 방해될 수 있다(Wensing, et al. (2014) Top. Antivir. Med., 22(3):642-650; Siliciano, et al. (2013) Curr. Opin. Virol., 3(5):487-494; Prosperi, et al. (2012) BMC Infect. Dis., 12:296-296; Van den Berk, et al. (2016) Abstract number: 948, In Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, 22-25; Siefried, et al. (2017) PLoS One 12(4):e0174613). 치료 피로, 재정적 및 사회적 지원의 부족, 공존하는 정신 증상, 및/또는 약물 남용은 중요 ART 요법을 이행하는데 실패를 야기할 수 있다(Tucker, et al.(2017) EBioMedicine, 17:163-171).
지속 작용성 비경구(LAP) 항레트로바이러스 약물은 개선된 요법 이행도를 갖는다(Spreen, et al.(2013) Curr. Opin. HIV AIDS, 8(6):565-571). 매일 내지 매월 또는 훨씬 덜 빈번한 투여로 치료 스케줄을 감소시키는 것은 더 큰 환자 사생활 및 만족을 제공하고, 요법 이행도를 개선시킨다(Sangaramoorthy, et al.(2017) J. Assoc. Nurses AIDS Care, 28(4):518-531; Carrasco, et al.(2017) Afr. J. AIDS Res. 16(1):11-18; Williams, et al.(2013) Nanomed. Lond. 8(11):1807-1813). 그러나, 오직 소수의 항레트로바이러스 약물만이 LAP로 성공적으로 재제제화되었다.
카보테그라비르(CAB)는 낮은 수용해도, 높은 융점, 높은 효력, 긴 반감기, 및 느린 대사 제거율을 갖는 인테그라제 억제제 또는 인테그라제 스트랜드 전달 억제제(INSTI)이다(Karmon, et al.(2015) J. Acquir. Immune Defic. Syndr., 68(3):39-41; Trezza, et al.(2015) Curr. Opin. HIV AIDS 10(4):239-245). 이러한 성질은 CAB를 200-mg/mL 현탁액(CAB LAP)으로 제제화하고, 근육내로 매월 또는 훨씬 덜 빈번하게 투여할 수 있게 한다(Margolis, et al.(2017) Lancet 390(10101):1499-1510; Spreen, W.W.(2014) J. Acquir. Immune Defic. Syndr., 67(5):481-486). 특히, CAB와 릴피비린(RPV)의 합은 매월 또는 격월 CAB 및 RPV LAP 제제가 유지 요법에 있어서 매일 경구 3-약물 조합과 비슷한 항레트로바이러스 활성을 증명한 첫번째 지속 작용 조합 ART 요법이다(Margolis, et al.(2017) Lancet 390(10101):1499-1510).
유리하게는, CAB는 유리딘 이인산 글루쿠론산전이효소(UGT) 1A1에 의해 주로 대사되고, 다른 항레트로바이러스 약물과 상호작용할 가능성이 낮다(Trezza, et al.(2015) Curr. Opin. HIV AIDS 10(4):239-245; Bowers, et al.(2016) Xenobiotica 46(2):147-162). CAB LAP는 비인간 영장류에서 직장, 질, 및 정맥내 원숭이/인간 면역결핍 바이러스(SHIV) 전염으로부터 매우 보호적이고, HIV 예방을 위한 임상 실험으로 발전하였다(NCT02720094)(Andrews, et al.(2014) Science 343(6175):1151-1154; Andrews, et al.(2015) Sci. Transl. Med., 7(270) 270ra4; Radzio, et al.(2015) Sci. Transl. Med., 7(270) 270ra5-270ra5; Andrews, et al.(2016) AIDS 2016:461-467). 그러나, CAB LAP의 투여 패턴은 한계점을 갖는다. 구체적으로, 2 mL 부피로 제공된 분할 주사가 필요하고, 이는 견딜 수 없는 주사 부위 반응으로 인한 치료 중지를 야기한다(Margolis, et al.(2017) Lancet 390(10101):1499-510; Markowitz, et al.(2017) Lancet HIV 4(8):331-340). 게다가, 최대 투여 간격은 겨우 8주이다. 최근에, 마카크(macaque)에서 새로운 감염으로부터 보호하는 것으로 증명된 농도인 4배 단백질 결합 조절된 90% 억제 농도(4×PA-IC90, 660 ng/mL)를 초과하는 혈장 CAB 농도의 유지를 목표로 12주마다 CAB LAP의 투여가 시험되었다(Spreen, W.W.(2014) J. Acquir. Immune Defic. Syndr., 67(5):481-486; Andrews, et al.(2014) Science 343(6175):1151-1154; Andrews, et al.(2015) Sci. Transl. Med., 7(270) 270ra4; Radzio, et al.(2015) Sci. Transl. Med., 7(270) 270ra5-270ra5; Andrews, et al.(2016) AIDS 2016:461-467; Markowitz, et al.(2017) Lancet HIV 4(8):331-340; Spreen, et al.(2014) J. Acquir. Immune Defic. Syndr., 67(5):487-492). 그러나, 참가자의 3분의 2가 12주에 4×PA-IC90의 목표 유효 농도 미만의 혈장 약물 농도를 야기하는 예상된 약물 흡수보다 더 빨랐다. 따라서, 요법 이행도를 개선시키기 위하여 투여 간격을 8주가 넘도록 확장하고 주사 부피를 감소시키는 방식이 매우 필요하다(Boyd, et al.(2017) Lancet 390(10101):1468-1470).
본 발명에 따라, 인테그라제 억제제의 프로드러그가 제공된다. 특정한 실시양태에서, 프로드러그는 지방족 또는 알킬 기(예를 들면, 약 3 내지 약 30개의 탄소를 포함하는 지방족 또는 알킬)를 포함하는 에스테르에 의해 개질된 인테그라제 억제제를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 지방족 또는 알킬 기는 적어도 하나의 헤테로원자로 임의로 치환된, 지방산의 알킬쇄 또는 포화 선형 지방족 쇄이다. 특정한 실시양태에서, 인테그라제 억제제는 카보테그라비르(CAB), 랄테그라비르(RAL), 엘비테그라비르(EVG), 돌루테그라비르(DTG), 및 빅테그라비르(BIC)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 적어도 하나의 프로드러그 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 본 발명의 적어도 하나의 프로드러그 및 적어도 하나의 중합체 또는 계면활성제를 포함하는 나노입자가 제공된다. 특정한 실시양태에서, 프로드러그는 결정질이다. 특정한 실시양태에서, 중합체 또는 계면활성제는 양친매성 블록 공중합체, 예를 들면, 폴리(옥시에틸렌)의 적어도 하나의 블록 및 폴리(옥시프로필렌)의 적어도 하나의 블록을 포함하는 양친매성 블록 공중합체(예를 들면, 폴록사머 407)이다. 나노입자는 적어도 하나의 표적화 리간드에 연결된 중합체 또는 계면활성제를 포함할 수 있다. 개별적인 나노입자는 표적화 및 비표적화 계면활성제를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 나노입자는 약 100 nm 내지 1 μm의 직경을 갖는다. 본 발명의 적어도 하나의 나노입자 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 이것이 필요한 대상체에서 질환 또는 질병을 치료, 억제, 및/또는 예방하는 방법이 제공된다. 방법은 대상체에게, 임의로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물 중의, 본 발명의 적어도 하나의 프로드러그 또는 나노입자를 투여하는 것을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 질환 또는 질병은 바이러스 감염(예를 들면, 레트로바이러스 감염)이다. 특정한 실시양태에서, 방법은 질환 또는 질병을 위한 적어도 하나의 추가의 치료제 또는 요법, 예를 들면, 적어도 하나의 추가의 항-HIV 화합물을 투여하는 것을 추가로 포함한다.
도 1a는 주사 전자 현미경에 의해 측정된 NM2CAB(상) 및 NCAB(하) 나노입자의 이미지를 제공한다. 도 1b는 표시된 기간 동안 25℃에서 NM2CAB 나노입자 안정성의 그래프를 제공한다. 특히, 나노입자 제타 전위(상), 다분산도(중), 및 입자 직경(하)은 동적 광산란에 의해 측정되었다.
도 2a는 인간 단핵구 유도된 대식세포(MDM)에 의한 UPLC-UV/Vis에 의해 측정된 바와 같은 약물 흡수의 그래프(상) 및 MDM에 의한 약물 체류의 그래프(하)를 제공하고, 이는 세포내 약물 분석을 위한 표시된 시간점에서 수집되었다. 도 2b는 약물의 표시된 농도에서 HIV-1 역전사효소 활성의 그래프(상) 및 약물로 처리되고 HIV-1ADA로 챌린지되고 처리 후 표시된 시간점에서 측정된, MDM에서 HIV-1 역전사효소 활성의 그래프(하)를 제공한다. 도 2c는 챌린지 후 p24 염색된 MDM 세포의 이미지를 제공한다.
도 3a는 암컷 NSG(NOD scid 감마 마우스) 마우스에서 NCAB, NMCAB 또는 NM2CAB의 단일 근육내(IM) 용량 후, 혈장 CAB 수준의 그래프를 제공한다. 투여된 용량은 45 mg CAB 당량(eq)/kg이었다. 상부 굵은 점선은 664 ng/ml의 혈장 CAB 4×PA-IC90를 나타내고, 하부 반점선은 166 ng/ml의 혈장 CAB 1×PA-IC90을 나타낸다. 도 3b는 암컷 NSG(NOD scid 감마 마우스) 마우스에서 NM3CAB의 단일 근육내(IM) 용량 후, 혈장 CAB 수준의 그래프를 제공한다. 투여된 용량은 45 mg CAB 당량(eq)/kg이었다. 상부 굵은 점선은 664 ng/ml의 혈장 CAB 4×PA-IC90을 나타내고, 하부 반점선은 166 ng/ml의 혈장 CAB 1×PA-IC90을 나타낸다.
도 4는 HIV-1 p24 항원에 대한 면역세포화학에 의한 10, 50 또는 100 μM 농도에서 NM2CAB의 항레트로바이러스 용량-반응의 이미지를 제공한다.
도 5는 프로드러그 수준의 그래프를 제공한다. 프로드러그(MCAB 또는 M2CAB)의 조직 및 혈액 생물분포(biodistribution)는 NMCAB 또는 NM2CAB의 단일 IM 주사 후, 14, 28, 42 및 364일에 평가되었다. 프로드러그 수준은 비장, 간, 장, 폐, 뇌, 직장 조직, 신장, 림프절-해부학적 관련 조직 및 혈액에서 측정되었다. 프로드러그 수준은 LC-MS/MS에 의해 측정되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. 제14일, 제28일 및 제42일 군에 있어서, 각 군의 동물 수는 N = 5이고, 제364일 군에 있어서, 동물 수는 N = 3(NMCAB), N = 4(NM2CAB)이었다. 일방향 ANOVA 후, 터키 사후 시험을 사용하여 세 가지 처리에서 조직에서의 약물 수준을 비교하였다(*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001).
도 6a 및 6b는 레수스 마카크(rhesus macaque)에서 NM2CAB의 약동학 및 생물분포의 그래프를 제공한다. 4마리의 레수스 마카크에 단일 IM 주사에 의한 NM2CAB의 45 mg/kg CAB-당량 용량을 투여하였다. 혈장 샘플을 수집하고, 제393일까지 CAB(상부 선) 및 M2CAB(하부 선) 수준에 대하여 분석하였다(도 6a). 직장, 림프절, 및 지방 조직 생검을 약물 투여 후 제204일에 수집하고, CAB(상) 및 M2CAB(하) 농도 둘 다에 대하여 분석하였다(도 6b). 혈장 및 조직 약물 농도는 둘 다 LCMS/MS로 측정되었다.
조직 감염성 부위에서 바이러스 로드의 최대 제한은 바이러스 박멸 전략을 가능하게 할 수 있다. 이는 계면활성제에 의해 안정화된 강한 친유성 및 소수성 항레트로바이러스 프로드러그 나노결정의 생성에 의해 달성될 수 있다. 소수성, 약물 가수분해율, 및 항레트로바이러스 효력은 최적의 치료 효과와 균형을 이루어야 한다. 여기서, 프로드러그의 소수성 및 친유성 탄소 쇄 길이의 크기의 조작은, 특히 지속 작용성 완효성 방출 항레트로바이러스 요법(LASER ART: long acting slow effective release antiretroviral therapy)과 관련하여, 치료 효능을 최적화할 수 있다는 것이 증명된다. LASER ART는 지질 꼬리를 갖는 나노결정 프로드러그로부터 생성된 지속 작용성 항레트로바이러스 약물을 나타낸다. 미리스토일화된 CAB 프로드러그 나노결정은 단일 45 mg/kg CAB 당량 근육내 주사 용량 후, 레수스 마카크에서 4개월 동안 PA-IC90에서 지속된 혈장 CAB 농도를 제공한다. 여기서, 추가의 화학적 개질은 예상외로 CAB 친유성 및 소수성을 향상시키고, 약물 효력을 개선시키고, 프로드러그 가수분해를 늦춰, 모 약물의 반감기를 광범위하게 확장시키는 역할을 하는 것으로 나타났다. 신규한 카보테그라비르 프로드러그(M2CAB)는 적절한 부형제 및 안정화제, 예를 들면, 폴록사머 407(P407)과 함께 약물 캡슐화를 향상시킨다. M2CAB 나노제제(NM2CAB)는 지속된 약물 방출 및 부위 특이적 항레트로바이러스 약물 전달을 제공한다. 프로드러그는 가수분해성 공유 결합을 통해 소수성 잔기에 컨쥬게이트된 네이티브 약물을 포함한다. NM2CAB 나노제제는 시험관내에서 30일 동안 지속된 약물 체류로 인간 단핵구 유도된 대식세포(MDM)에 의해 용이하게 흡수된 반면, 모 약물 나노제제(NCAB) 또는 1세대 미리스토일화된 카보테그라비르(NMCAB)는 각각 치료 1일 또는 20일 내에 MDM에서 HIV-1 돌파(breakthrough)를 보여주었다. 특히, NM2CAB로 처리된 MDM은 단일 약물 치료 후, 30일 이하 동안 HIV-1 챌린지에 따른 지속된 항레트로바이러스 활성을 나타냈다. HIV-1p24는 30일 이하 또는 초과 동안 5일 증분 시간점에서 NM2CAB 처리군에서 검출되지 않았다. 추가로, 암컷 NSG(NOD scid 감마 마우스) 마우스에 대한 45 mg CAB 당량/kg에서 NM2CAB의 단일 근육내(IM) 주사는 활성 CAB의 0차 방출 조절 동력학을 증명하였고, 5개월 초과 동안 4배 PA-IC90 초과로 약물 수준을 제공하였다. 여기서 NM2CAB 나노제제는 알약 부담을 감소시키고/거나 바이러스 반동의 위험을 낮추고/거나 독성을 제한하고/거나 바이러스 저장소로 약물 침투를 허용함으로써 다중 매일 투여를 필요로 하는 현재 조합 ART 요법을 개선시킨다. 중요하게는, NM2CAB는 또한 6개월마다 1회(또는 훨씬 덜 빈번하게)의 투여 간격을 가능하게 하여, 노출전 예방 또는 치료 요법의 효과를 최대화한다.
지속 작용성 완효성 방출 ART(LASER ART) 제제는 투여 간격을 확장하고, 전신 독성을 감소시키고, 약동학(PK) 및 약력학(PD) 프로파일을 개선시킬 수 있다(Sillman, et al., Nat. Commun.(2018) 9:443; Zhou, et al., Biomaterials(2018) 151:53-65; McMillan, et al., Antimicrob. Agents Chemother.(2018) 62:e01316-17). 여기서, 신규한 인테그라제 억제제 프로드러그, 이의 지속 작용성 완효성 방출 제제, 및 이의 합성 및 사용 방법이 제공된다. 인테그라제 억제제(인테그라제 스트랜드 전달 억제제(INSTI))는 숙주 세포의 DNA로 바이러스 게놈을 삽입하는 바이러스 효소인 인테그라제(예를 들면, HIV 인테그라제)의 작용을 차단하도록 디자인된 항레트로바이러스 약물의 한 부류이다. 인테그라제 억제제의 예는, 제한 없이, 카보테그라비르(CAB, GSK1265744), 랄테그라비르(RAL), 엘비테그라비르(EVG), 돌루테그라비르(DTG, GSK1349572), 빅테그라비르(BIC, GS-9883), BI 224436(Boehringer Ingelheim, 독일 잉겔하임 소재), 및 MK-2048(Merck, 미국 뉴저지주 케닐워스 소재)을 포함한다. 소수성 및 친유성 프로드러그 및 이의 완효성 방출 제제는 모 인테그라제 억제제와 비교하여 개선된 효력 및 효능, 증가된 세포 및 조직 침투 및 확장된 반감기를 나타낸다. 본 발명의 프로드러그 및 이의 제제 및 이의 조합은 바이러스(예를 들면, 레트로바이러스) 감염의 관리에 사용될 수 있다.
현재 이용 가능한 바이러스 감염, 특히 HIV 감염의 치료는 바이러스 침입, 뉴클레오사이드 역전사효소, 뉴클레오타이드 역전사효소, 인테그라제, 및 프로테아제의 억제제를 포함한다. 내성은 단축된 약물 반감기, 바이러스 생명 주기, 및 높은 유전적 변이성을 야기하는 빠른 돌연변이와 연결된다. "칵테일" 요법으로 간주되는 조합 요법, 예를 들면, 항레트로바이러스 요법(ART)은 상당한 주의를 끌었다. 이득은 감소된 바이러스 내성, 제한된 독성, 치료 요법에 대한 개선된 이행도 및 지속된 항레트로바이러스 효능을 포함한다. 조합 요법은 바이러스(예를 들면, HIV) 복제를 억제하고, 따라서 자연 내성 돌연변이를 감소시킴으로써 가능한 약물 내성을 최소화한다. 치료 실패는 부분적으로 짧은 약물 반감기로 인한 것이다. 추가로, 실패는 또한 부분적으로 조직 및 세포 바이러스 저장소에 대한 제한된 약물 접근, 따라서 바이러스 박멸 활동을 못하게 하는 것으로 인한 것일 수 있다. 이를 위해, 세포 및 조직 표적화된 나노제제화된 프로드러그(나노입자) 플랫폼의 개발은 바이러스(예를 들면, HIV) 감염의 관리에 상당한 흥미를 갖는다. 노출전 예방(PrEP)은 바이러스(예를 들면, HIV) 전염의 관리에서 사용되는 또 다른 전략이다. 예를 들면, TRUVADA®(테노포비르/엠트리시타빈)는 HIV 감염에 대한 노출전 예방에 대하여 승인을 받았다. 추가로, 라미부딘 및 지도부딘의 조합(COMBIVIR®)은 노출전 예방 및 노출후 예방으로서 사용되었다.
본원에서 제공된 프로드러그 및 나노제제화된 프로드러그(나노입자)는 예상외로 약물 반감기를 확장하고, 소수성 및 친유성을 증가시키고, 항레트로바이러스 효능을 개선시킨다. 이는 매일 고용량 또는 심지어 1일 수회 용량을 투여받는 사람들에게 이득일 것이고, 이는 더 적은 투여 빈도를 갖는 낮은 투여량은 부작용을 감소시킬 뿐만 아니라 환자에게도 편리하기 때문이다. 본원에서 제공된 프로드러그 및 나노제제화된 프로드러그(나노입자)는 또한 노출후 치료 및/또는 노출전 예방(예를 들면, 수축성 HIV-1의 고위험이 있는 사람들의 경우)으로서 사용될 수 있다. 다시 말해서, 본 발명의 프로드러그 및 나노입자 및 이의 조합은 바이러스 감염(예를 들면, HIV 감염)을 예방하고/거나 급성 또는 장기간 바이러스 감염(예를 들면, HIV 감염)을 치료하거나 억제하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 프로드러그 및 나노입자는 일반적으로 항-HIV 제제로서 기재되지만, 본 발명의 프로드러그 및 나노제제는 또한, 제한 없이, 레트로바이러스(예를 들면, 렌티바이러스), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스(HTLV), 특히 레트로바이러스를 포함하는 다른 바이러스 감염에도 효과적이다.
본 발명은 모 약물에 비하여 개선된 생물학적 활성을 갖는 신규하고 강력하고 광범위한 프로드러그를 기재한다. 효과적인 세포내 및 조직 전달 및 확장된 약물 반감기를 위하여 지속 작용성 완효성 제제로 프로드러그를 캡슐화하는 방법이 또한 제공된다. 본원에 기재된 지속 작용성 완효성 방출(LASER) 조성물은 향상된 효력을 나타내고, 바이러스 감염(예를 들면, 레트로바이러스 감염)에 대한 효과적인 치료적 또는 예방적 개입으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 프로드러그는 인테그라제 억제제의 유효한 세포내 전달을 가능하게 한다. 여기서, 화학적 잔기, 특히 산소 함유 잔기, 예를 들면, 하이드록실기가 소수성 및 친유성 절단 가능 잔기(예를 들면, 치료용 지방 알코올)를 포함하는 에스테르 잔기로 교체된 인테그라제 억제제의 유도체인 프로드러그가 제공된다. 소수성 및 친유성 절단 가능 잔기(예를 들면, 치료용 지방 알코올)는 외피 보유 바이러스에 대하여 항바이러스 활성을 나타낼 수 있다(Katz, et al., Ann. NY Acad. Sci.(1994) 724:472-88). 특히, 치료용 지방 알코올과 뉴클레오사이드 유사체 사이의 상승작용적 상호작용은 뉴클레오사이드의 항바이러스 효력을 실질적으로 향상시킬 수 있다(Marcelletti, et al., Antiviral Res.(2002) 56:153-66).
본원에 기재된 바와 같이, 프로드러그는 약물 효능을 개선시키고, 세포내 및 조직 침투, 단백질 결합, 및 생체이용률을 가속화시키기 위하여 불안정한 치료용 지방 알코올을 포함할 수 있다. 합성된 프로드러그의 소수성 성질은 개선된 생물약제학적 특징을 갖는 지속 작용성 완효성 방출 약물 나노결정으로의 캡슐화를 촉진한다. 본 발명의 나노제제는 무균 수성 현탁액 중에 분산되고 중합체성 부형제, 지질, 및/또는 계면활성제 또는 중합체에 의해 안정화된 프로드러그 입자로 구성될 수 있다. 이론과 결부되지 않고, 약물 방출의 메커니즘은 나노입자로부터의 프로드러그 용해 후, 2종의 생체활성 제제, 즉, 인테그라제 억제제 및 광범위한 항바이러스성 지방 알코올을 생성하는 유효한 절단을 포함한다.
본원에 기재된 시스템의 이득은, 제한 없이, 개선된 약물 효능, 생체이용률 및 환자의 편의성을 위한 확장된 반감기를 포함한다. 실제로, 본 발명에 기재된 나노제제는 단핵구 유도된 대식세포(MDM)에 의한 약물 흡수에서 유의미한 증가를 나타냈다. 또한, 개질된 약물 및 나노입자는 바이러스 복제의 증가되고 확장된 억제를 통해 개선된 효력를 나타냈다. 그러므로, 본 발명의 나노제제는 항바이러스 효력의 향상 및 감염의 해부학적 저장소로의 가속화된 약물 전달을 가능하게 한다.
본 발명에 따라, 인테그라제 억제제의 프로드러그가 제공된다. 특정한 실시양태에서, 프로드러그는 화학적 잔기, 예를 들면, 하이드록실기가 임의로 치환된 지방족 또는 알킬 기를 포함하는 에스테르로 교체된 인테그라제 억제제를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 에스테르는 탄화수소쇄, 특히 16 내지 20개의 탄소 원자의 길이 또는 18개의 탄소 원자의 길이(여기서 숫자는 에스테르의 C=O에서의 탄소를 포함한다)의 탄화수소쇄를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 인테그라제 억제제는 카보테그라비르(CAB), 랄테그라비르(RAL), 엘비테그라비르(EVG), 돌루테그라비르(DTG), 빅테그라비르(BIC), BI 224436, 및 MK-2048로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 실시양태에서, 인테그라제 억제제는 카보테그라비르(CAB), 랄테그라비르(RAL), 엘비테그라비르(EVG), 돌루테그라비르(DTG), 및 빅테그라비르(BIC)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 인테그라제 억제제의 화학적 구조의 예는 하기와 같다:
Figure pct00001
카보테그라비르(CAB),
Figure pct00002
돌루테그라비르(DTG),
Figure pct00003
빅테그라비르(BIC),
Figure pct00004
엘비테그라비르(EVG), 및
Figure pct00005
랄레그라비르(RAL).
특정한 실시양태에서, 본 발명의 프로드러그는 하기 군 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로부터 선택된다:
Figure pct00006
Figure pct00007
, 및
Figure pct00008
상기 식에서, R은 임의로 치환된 지방족 또는 알킬이다. 지방족 또는 알킬 기는 불포화 또는 포화일 수 있고, 적어도 하나의 헤테로원자(예를 들면, O, N, 또는 S)로 치환될 수 있다. 특정한 실시양태에서, R은 적어도 하나의 헤테로원자(예를 들면, O, N, 또는 S)로 치환될 수 있는 방향족 잔기를 함유할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 알킬 또는 지방족 기는 소수성이다. 특정한 실시양태에서, R은 임의로 치환된 탄화수소쇄, 특히 포화된 것이다. 특정한 실시양태에서, R은 포화 선형 지방족 쇄이다. 특정한 실시양태에서, 알킬 또는 지방족 기는 약 3 내지 약 30개의 탄소(예를 들면, 알킬 또는 지방족 기의 주쇄에서)를 포함하고, 이는 적어도 하나의 헤테로원자(예를 들면, O, N, 또는 S)로 치환될 수 있다. 특정한 실시양태에서, R은 C14-C21 불포화 또는 포화 알킬 또는 지방족 기이고, 이는 적어도 하나의 헤테로원자(예를 들면, O, N, 또는 S)로 치환될 수 있다. 특정한 실시양태에서, R은 C14-C19 불포화 또는 포화 알킬 또는 지방족 기이고, 이는 적어도 하나의 헤테로원자(예를 들면, O, N, 또는 S)로 치환될 수 있다. 특정한 실시양태에서, R은 C14-C17 불포화 또는 포화 알킬 또는 지방족 기이고, 이는 적어도 하나의 헤테로원자(예를 들면, O, N, 또는 S)로 치환될 수 있다. 특정한 실시양태에서, R은 C15-C21 불포화 또는 포화 알킬 또는 지방족 기이고, 이는 적어도 하나의 헤테로원자(예를 들면, O, N, 또는 S)로 치환될 수 있다. 특정한 실시양태에서, R은 C15-C19 불포화 또는 포화 알킬 또는 지방족 기이고, 이는 적어도 하나의 헤테로원자(예를 들면, O, N, 또는 S)로 치환될 수 있다. 특정한 실시양태에서, R은 C15-C17 불포화 또는 포화 알킬 또는 지방족 기이고, 이는 적어도 하나의 헤테로원자(예를 들면, O, N, 또는 S)로 치환될 수 있다. 특정한 실시양태에서, R은 C16-C21 불포화 또는 포화 알킬 또는 지방족 기이고, 이는 적어도 하나의 헤테로원자(예를 들면, O, N, 또는 S)로 치환될 수 있다. 특정한 실시양태에서, R은 C16-C19 불포화 또는 포화 알킬 또는 지방족 기이고, 이는 적어도 하나의 헤테로원자(예를 들면, O, N, 또는 S)로 치환될 수 있다. 특정한 실시양태에서, R은 C17-C21 불포화 또는 포화 알킬 또는 지방족 기이고, 이는 적어도 하나의 헤테로원자(예를 들면, O, N, 또는 S)로 치환될 수 있다. 특정한 실시양태에서, R은 C17-C19 불포화 또는 포화 알킬 또는 지방족 기이고, 이는 적어도 하나의 헤테로원자(예를 들면, O, N, 또는 S)로 치환될 수 있다. 특정한 실시양태에서, R은 C17 불포화 또는 포화 알킬 또는 지방족 기이고, 이는 적어도 하나의 헤테로원자(예를 들면, O, N, 또는 S)로 치환될 수 있다.
특정한 실시양태에서, R은 지방산(포화 또는 불포화), 특히 C16-C22 지방산, C16-C20 지방산, C16-C18 지방산, C18-C22 지방산, C18-C20 지방산, 또는 C18 지방산(여기서 숫자는 에스테르의 C=O에서의 탄소를 포함한다)의 알킬쇄이다.
특정한 실시양태에서, R은 적어도 14개의 탄소(예를 들면, 쇄에서 14 내지 21개의 탄소의 길이, 쇄에서 14 내지 19개의 탄소의 길이, 쇄에서 14 내지 17개의 탄소의 길이, 쇄에서 15 내지 21개의 탄소의 길이, 쇄에서 15 내지 19개의 탄소의 길이, 쇄에서 15 내지 17개의 탄소의 길이, 또는 쇄에서 17개의 탄소의 길이)의 포화 선형 지방족 쇄 또는 탄화수소쇄이다. 특정한 실시양태에서, R은 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21개의 탄소의 길이, 특히 14, 15, 16, 17, 18, 또는 19개의 탄소의 길이, 15, 16, 또는 17개의 탄소의 길이, 또는 17개의 탄소의 길이의 포화 선형 지방족 쇄 또는 탄화수소쇄이다. 특정한 실시양태에서, R은 길이가 17개의 탄소인 포화 선형 지방족 쇄 또는 탄화수소쇄이다.
특정한 실시양태에서, 본 발명의 프로드러그는
Figure pct00009
(M2CAB) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
본 발명은 또한 본 발명의 프로드러그를 포함하는 나노입자(때때로 본원에서 나노제제로 지칭됨)를 포함한다. 나노입자는 세포 또는 숙주(예를 들면, 시험관내 또는 생체내)로의 화합물의 전달을 위하여 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 나노입자는 대상체로의 항레트로바이러스 요법의 전달을 위하여 사용된다. 본 발명의 나노입자는 적어도 하나의 프로드러그 및 적어도 하나의 계면활성제 또는 중합체를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 나노입자는 대식세포 데포를 유지하기 위하여 약물 나노입자의 임의의 표적화를 유지하는 분광학적으로 정의된 계면활성제/중합체:약물 비를 포함한다. 나노입자의 이들 성분은 다른 임의의 성분과 함께 하기 기재된다.
본 발명의 나노입자의 합성 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 특정한 실시양태에서, 방법은 중합체 및/또는 계면활성제로 코팅된(부분적으로 또는 완전히) 프로드러그(예를 들면, 결정질 또는 무정형)를 포함하는 나노입자를 생성한다. 합성 방법의 예는, 제한 없이, 분쇄(예를 들면, 습식 분쇄), 균질화(예를 들면, 고압 균질화), 비습식 주형에서의 입자 복제(PRINT) 기술, 및/또는 초음파 기술을 포함한다. 예를 들면, 본원에 참조로서 포함된 미국 특허 출원 공보 제2013/0236553호는 본 발명의 나노입자를 합성하는데 적합한 방법을 제공한다. 특정한 실시양태에서, 중합체 또는 계면활성제를 먼저 표적화 리간드에 의해 화학적으로 개질한 다음, 직접적으로 사용하거나, 프로드러그 현탁액의 표면 상에 코트에 대한 특정한 몰비로 비표적화된 중합체 또는 계면활성제와 혼합하여, 예를 들면, 나노입자 합성 공정(예를 들면, 결정질 나노입자 합성 공정), 예를 들면, 분쇄(예를 들면, 습식 분쇄), 균질화(예를 들면, 고압 균질화), 비습식 주형에서의 입자 복제(PRINT) 기술, 및/또는 초음파 기술을 사용하여, 표적화된 나노제제를 제조한다. 추가의 정제를 회피하는 것이 나노입자의 더 빠른 제조에 바람직함에도 불구하고, 나노입자는 추가의 정제와 함께 또는 없이 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 나노입자는 분쇄 및/또는 균질화를 사용하여 합성된다. 표적화된 나노입자(예를 들면, 리간드(임의로 고분자량을 갖는)를 사용하여)는 물리적 또는 화학적 코팅 및/또는 중합체 또는 계면활성제 및/또는 약물 나노현탁액의 표면 상의 결합을 통해 발달될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 본 발명의 나노입자는 프로드러그(예를 들면, 결정)를 중합체 또는 계면활성제 용액에 가한 다음, 나노입자를 생성(예를 들면, 습식 분쇄 또는 고압 균질화에 의해)함으로써 합성된다. 프로드러그 및 중합체 또는 계면활성제 용액은 습식 분쇄 또는 고압 균질화 전에 교반될 수 있다.
본 발명의 나노입자는 본 발명의 적어도 하나의 프로드러그를 세포 또는 대상체(비인간 동물 포함)에게 전달하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 나노입자는 적어도 하나의 다른 제제 또는 화합물, 특히 생물활성제, 특히 치료제(예를 들면, 항바이러스성 화합물) 또는 진단제, 특히 적어도 하나의 항바이러스성 또는 항레트로바이러스성 제제를 추가로 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 나노입자는 적어도 2종의 치료제를 포함하고, 특히 여기서 적어도 하나는 본 발명의 프로드러그이다. 예를 들면, 나노입자는 본 발명의 인테그라제 억제제 프로드러그 및 적어도 하나의 다른 치료제(예를 들면, 항-HIV 제제)를 포함할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 본 발명의 나노입자는 중합체 또는 계면활성제에 의해 안정화된 나노크기의 프로드러그 결정(예를 들면, 계면활성제 코팅된 약물 결정; 나노제제)의 서브미크론 콜로이드성 분산액이다. 특정한 실시양태에서, 프로드러그는 결정질(결정의 특성을 갖는 고체) 또는 무정형일 수 있거나, 약물과 중합체 또는 계면활성제가 조합된 결정으로 형성된 프로드러그의 고체 상태 나노입자이다. 특정한 실시양태에서, 프로드러그는 결정질이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "결정질"은 정돈된 상태(즉, 비무정형) 및/또는 3차원으로 장범위 규칙을 나타내는 성분을 지칭한다. 특정한 실시양태에서, 프로드러그의 대다수(예를 들면, 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상) 및, 임의로 계면활성제의 소수성 부분은 결정질이다.
특정한 실시양태에서, 본 발명의 나노입자는 직경(예를 들면, z-평균 직경) 또는 이의 가장 긴 치수가 약 2 또는 3 μm 이하, 특히 약 1 μm 이하(예를 들면, 약 100 nm 내지 약 1 μm)이다. 예를 들면, 나노입자의 직경 또는 가장 긴 치수는 약 50 내지 약 800 nm일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 나노입자의 직경 또는 가장 긴 치수는 약 50 내지 약 750 nm, 약 50 내지 약 500 nm, 약 200 nm 내지 약 500 nm, 약 200 nm 내지 약 400 nm, 또는 약 250 nm 내지 약 350 nm이다. 나노입자는, 예를 들면, 막대 형상, 길쭉한 막대, 불규칙 또는 둥근 형상일 수 있다. 본 발명의 나노입자는 중성이거나 하전될 수 있다. 나노입자는 양성으로 또는 음성으로 하전될 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 나노입자는 적어도 하나의 중합체 또는 계면활성제를 포함한다. "계면활성제"는 흔히 습윤제, 세제, 분산제, 또는 유화제로 지칭되는 성분을 포함하는 표면활성제를 지칭한다. 계면활성제는 일반적으로 양친매성인 유기 화합물이다.
중합체 또는 계면활성제의 예는, 제한 없이, 합성 또는 천연 인지질, PEG화 지질(예를 들면, PEG화 인지질), 지질 유도체, 폴리소르베이트, 양친매성 공중합체, 양친매성 블록 공중합체, 폴리(에틸렌 글리콜)-co-폴리(락타이드-co-글리콜라이드)(PEG-PLGA), 이의 유도체, 리간드 컨쥬게이트된 유도체 및 이의 조합을 포함한다. 안정한 나노현탁액을 형성할 수 있고/거나 HIV 감염 가능한/감염된 CD4+ T 세포, 대식세포 및 수지상 세포의 표적화 리간드에 화학적으로/물리적으로 결합할 수 있는 다른 중합체 또는 계면활성제 및 이의 조합이 본 발명에서 사용될 수 있다. 중합체 또는 계면활성제의 추가의 예는, 제한 없이, 1) 비이온성 계면활성제(예를 들면, 페길화된 및/또는 폴리사카라이드 컨쥬게이트된 폴리에스테르 및 다른 소수성 중합체 블록, 예를 들면, 폴리(락타이드-co-글리콜라이드)(PLGA), 폴리락트산(PLA), 폴리카프로락톤(PCL), 기타 폴리에스테르, 폴리(프로필렌 옥사이드), 폴리(1,2-부틸렌 옥사이드), 폴리(n-부틸렌 옥사이드), 폴리(테트라하이드로푸란), 및 폴리(스티렌); 글리세릴 에스테르, 폴리옥시에틸렌 지방 알코올 에테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 소르비탄 에스테르, 글리세롤 모노스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 세틸 알코올, 세토스테아릴 알코올, 스테아릴 알코올, 아릴 알킬 폴리에테르 알코올, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체, 폴록사민, 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 하이드록실메틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 폴리사카라이드, 전분 및 이의 유도체, 하이드록시에틸전분, 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈, 및 이의 조합); 및 2) 이온성 계면활성제(예를 들면, 인지질, 양친매성 지질, 1,2-디알킬글리세로-3-알킬포스포콜린, 1,2-디스테아로일-sn-글레크로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[카복시(폴리에틸렌 글리콜)(DSPE-PEG), 디메틸아미노에탄카바모일 콜레스테롤(DC-Chol), N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄(DOTAP), 알킬 피리디늄 할라이드, 4급 암모늄 화합물, 라우릴디메틸벤질암모늄, 아실 카르니틴 하이드로클로라이드, 디메틸디옥타데실암모늄(DDAB), n-옥틸아민, 올레일아민, 벤즈알코늄, 세틸트리메틸암모늄, 키토산, 키토산 염, 폴리(에틸렌이민)(PEI), 폴리(N-이소프로필 아크릴아미드(PNIPAM), 및 폴리(알릴아민)(PAH), 폴리(디메틸디알릴암모늄 클로라이드)(PDDA), 알킬 설포네이트, 알킬 포스페이트, 알킬 포스포네이트, 칼륨 라우레이트, 트리에탄올아민 스테아레이트, 나트륨 라우릴 설페이트, 나트륨 도데실설페이트, 알킬 폴리옥시에틸렌 설페이트, 알긴산, 알긴산 염, 히알루론산, 히알루론산 염, 젤라틴, 디옥틸 나트륨 설포석시네이트, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 셀룰로스 설페이트, 덱스트란 설페이트 및 카복시메틸셀룰로스, 콘드로이틴 설페이트, 헤파린, 합성 폴리(아크릴산)(PAA), 폴리(메타크릴산)(PMA), 폴리(비닐 설페이트)(PVS), 폴리(스티렌 설포네이트)(PSS), 담즙산 및 이의 염, 콜산, 콜산, 데옥시콜산, 글리코콜산, 타우로콜산, 글리코데옥시콜산, 이의 유도체, 및 이의 조합)을 포함한다.
본 발명의 중합체 또는 계면활성제는 하전되거나 중성일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 중합체 또는 계면활성제는 중성이거나 음성으로 하전(예를 들면, 폴록사머, 폴리소르베이트, 인지질, 및 이의 유도체)될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 중합체 또는 계면활성제는 양친매성 블록 공중합체 또는 지질 유도체이다. 특정한 실시양태에서, 나노입자의 적어도 하나의 중합체 또는 계면활성제는 양친매성 블록 공중합체, 특히 폴리(옥시에틸렌)의 적어도 하나의 블록 및 폴리(옥시프로필렌)의 적어도 하나의 블록을 포함하는 공중합체이다. 특정한 실시양태에서, 중합체 또는 계면활성제는 트리블록 양친매성 블록 공중합체이다. 특정한 실시양태에서, 중합체 또는 계면활성제는 폴리에틸렌 글리콜의 2개의 친수성 블록이 측면에 있는 폴리프로필렌 글리콜의 중심 소수성 블록을 포함하는 트리블록 양친매성 블록 공중합체이다. 특정한 실시양태에서, 계면활성제는 폴록사머 407이다.
특정한 실시양태에서, 양친매성 블록 공중합체는 폴리(옥시에틸렌)의 적어도 하나의 블록 및 폴리(옥시프로필렌)의 적어도 하나의 블록를 포함하는 공중합체이다. 특정한 실시양태에서, 양친매성 블록 공중합체는 폴록사머이다. 폴록사머의 예는, 제한 없이, 플루로닉(Pluronic)® L31, L35, F38, L42, L43, L44, L61, L62, L63, L64, P65, F68, L72, P75, F77, L81, P84, P85, F87, F88, L92, F98, L101, P103, P104, P105, F108, L121, L122, L123, F127, 10R5, 10R8, 12R3, 17R1, 17R2, 17R4, 17R8, 22R4, 25R1, 25R2, 25R4, 25R5, 25R8, 31R1, 31R2, 및 31R4를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 폴록사머는 폴록사머 407(플루로닉® F127)이다.
본 발명의 특정한 실시양태에서, 중합체 또는 계면활성제는 약 0.0001 중량% 내지 약 10 중량% 또는 15 중량% 범위의 농도로 나노입자(본원에 기재된 바와 같음)를 합성하기 위하여 나노입자 및/또는 용액 중에 존재한다. 특정한 실시양태에서, 중합체 또는 계면활성제의 농도는 약 0.01 중량% 내지 약 15 중량%, 약 0.01 중량% 내지 약 10 중량%, 약 0.1 중량% 내지 약 10 중량%, 또는 약 0.1 중량% 내지 약 6 중량% 범위이다. 특정한 실시양태에서, 나노입자는 적어도 약 50 중량%, 75 중량%, 80 중량%, 85 중량%, 90 중량%, 95 중량%, 97 중량%, 98 중량%, 99 중량% 이상의 치료제(프로드러그)를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 나노입자는 정의된 약물:중합체/계면활성제 비를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 약물:중합체/계면활성제 비(예를 들면, 중량으로)는 약 10:6 내지 약 1000:6, 약 20:6 내지 약 500:6, 약 50:6 내지 약 200:6, 또는 약 100:6이다.
상기 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 중합체 또는 계면활성제는 표적화 리간드에 연결될 수 있다. 나노입자의 표적화(예를 들면, 대식세포에 대한)는 유리 약물 또는 비표적화된 나노입자와 비교하여 우수한 표적화, 감소된 배설률, 감소된 독성, 및 연장된 반감기를 제공할 수 있다. 표적화 리간드는 특이적 유형의 조직 또는 세포 유형에 특이적으로 결합하는(예를 들면, 원하는 표적:세포 비로) 화합물이다. 예를 들면, 표적화 리간드는 세포(예를 들면, 대사 분해로부터 벗어난 보호된 세포내 소기관 내의)로의 이의 흡수를 촉진할 수 있는 표적 세포(예를 들면, 대식세포) 표면 마커 또는 수용체의 체결 또는 결합에 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 표적화 리간드는 세포 표면 마커/수용체에 대한 리간드이다. 표적화 리간드는 표적화된 조직 또는 세포 유형 상에 우선적으로 또는 독점적으로 발현된 세포 표면 마커(예를 들면, 단백질 또는 탄수화물)에 면역학적으로 특이적인 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 표적화 리간드는 중합체 또는 계면활성제에 직접적으로 연결되거나 연결기를 통해 연결될 수 있다. 일반적으로, 연결기는 리간드를 중합체 또는 계면활성제에 공유적으로 결합시키는 공유 결합 또는 원자의 쇄를 포함하는 화학적 잔기이다. 연결기는 리간드 및 중합체 또는 계면활성제의 임의의 합성적으로 가능한 위치에 연결될 수 있다. 예시적인 연결기는 적어도 하나의 임의로 치환된 포화 또는 불포화 선형, 분지형 또는 환형 지방족기, 알킬기, 또는 임의로 치환된 아릴기를 포함할 수 있다. 연결기는 저급 알킬 또는 지방족일 수 있다. 연결기는 또한 폴리펩타이드(예를 들면, 약 1 내지 약 10개, 특히 약 1 내지 약 5개의 아미노산)일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 표적화 잔기는 중합체 또는 계면활성제의 한 말단 또는 양 말단에 연결된다. 연결기는 분해성이 아닐 수 있고, 생리학적 환경 또는 조건하에 실질적으로 절단될 수 없거나 전혀 절단될 수 없는 공유 결합 또는 임의의 다른 화학적 구조일 수 있다.
본 발명의 나노입자/나노제제는 표적화된 및/또는 비표적화된 중합체 또는 계면활성제를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 나노입자/나노제제 중에서 표적환된 및 비표적화된 중합체 또는 계면활성제의 몰비는 약 0.001 내지 100%, 약 1% 내지 약 99%, 약 5% 내지 약 95%, 약 10% 내지 약 90%, 약 25% 내지 약 75%, 약 30% 내지 약 60%, 또는 약 40%이다. 특정한 실시양태에서, 나노입자는 오직 표적화된 중합체 또는 계면활성제를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 나노입자/나노제제는 폴레이트 표적화된 중합체 또는 계면활성제 및 중합체 또는 계면활성제의 비표적화된 버전을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 나노입자/나노제제는 폴레이트-폴록사머 407(FA-P407) 및/또는 폴록사머 407을 포함한다.
표적화 리간드의 예는 대식세포 표적화 리간드, CD4+T 세포 표적화 리간드, 수지상 세포 표적화 리간드, 및 종양 표적화 리간드를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 특정한 실시양태에서, 표적화 리간드는 대식세포 표적화 리간드이다. 본 발명의 표적화된 나노제제는 나노입자를 HIV 조직 및 세포 성소/저장소(예를 들면, 중추 신경계, 장 관련 림프 조직(GALT), CD4+ T 세포, 대식세포, 수지상 세포 등)로 안내하기 위한 표적화 리간드를 포함할 수 있다. 대식세포 표적화 리간드는, 제한 없이, 폴레이트 수용체 리간드(예를 들면, 폴레이트(엽산) 및 폴레이트 수용체 항체 및 이의 단변(예를 들면, 문헌[Sudimack et al.(2000) Adv. Drug Del. Rev., 41:147-162)] 참조), 만노스 수용체 리간드(예를 들면, 만노스), 포밀 펩타이드 수용체(FPR) 리간드(예를 들면, N-formyl-Met-Leu-Phe(fMLF)), 및 터프트신(tuftsin)(테트라펩타이드 Thr-Lys-Pro-Arg)을 포함한다. 기타 표적화 리간드는, 제한 없이, 히알루론산, gp120 및 이의 펩타이드 단편, 및 CD4, CCR5, CXCR4, CD7, CD111, CD204, CD49a, CD29, CD19, CD20, CD22, CD171, CD33, Leis-Y, WT-1, ROR1, MUC16, MUC1, MUC4, 에스트로겐 수용체, 트랜스페린 수용체, EGF 수용체(예를 들면, HER2), 폴레이트 수용체, VEGF 수용체, FGF 수용체, 안드로겐 수용체, NGR, 인테그린, 및 GD2에 특이적인 리간드 또는 항체를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 표적화 리간드는 엽산이다.
상기 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 나노입자는 추가의 치료제를 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 프로드러그 및/또는 나노입자가 또 다른 치료제와 공동투여되는 치료 방법을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 치료제는, 특히 나노입자에 포함시, 소수성, 수불용성 화합물, 또는 수난용성 화합물이다. 예를 들면, 치료제는 물 또는 수성 매질 중에서 0 내지 14의 pH 범위에서, 바람직하게는 pH 4 내지 10에서, 특히 20℃에서 약 10 mg/ml 미만, 1 mg/ml 미만, 더 특히 약 100 μg/ml 미만, 더 특히 약 25 μg/ml 미만의 용해도를 가질 수 있다.
특정한 실시양태에서, 치료제는 항바이러스제 또는 항레트로바이러스제이다. 항레트로바이러스제은 렌티바이러스에 대항하거나 특이적인 효과를 가질 수 있다. 렌티바이러스는, 제한 없이, 인간 면역결핍 바이러스(HIV)(예를 들면, HIV-1, HIV-2), 소 면역결핍 바이러스(BIV), 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV), 및 말 전염성 빈혈 바이러스(EIA)이다. 특정한 실시양태에서, 치료제는 항-HIV 제제이다. 항-HIV 화합물 또는 항-HIV 제제는 HIV를 억제하는(예를 들면, HIV 복제 및/또는 감염을 억제하는) 화합물이다. 항-HIV 제제의 예는, 제한 없이, 하기를 포함한다:
(I) 뉴클레오사이드-유사체 역전사효소 억제제(NRTI). NRTI는 역전사효소, 특히 HIV-1 역전사효소의 활성을 억제하는 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드 및 이의 유사체를 지칭한다. NRTI는 당 및 염기를 포함한다. 뉴클레오사이드-유사체 역전사효소 억제제의 예는, 제한 없이, 아데포비르 디피복실, 아데포비르, 라미부딘, 텔비부딘, 엔테카비르, 테노포비르, 스타부딘, 아바카비르, 디다노신, 엠트리시타빈, 잘시타빈, 및 지도부딘.
(II) 비뉴클레오사이드 역전사효소 억제제(NNRTI). NNRTI는 역전사효소, 특히 HIV 역전사효소 상의 비기질 결합 부위에서 가역적으로 결합하고, 따라서 활성 부위의 형상을 변경하거나 폴리머라제 활성을 차단하는 알로스테릭 억제제이다. NNRTI의 예는, 제한 없이, 델라비르딘(DLV, BHAP, U-90152; Rescriptor®), 에파비렌즈(EFV, DMP-266, SUSTIVA®), 네비라핀(NVP, Viramune®), PNU-142721, 카프라비린(S-1153, AG-1549), 에미비린(+)-칼라놀리드 A(NSC-675451) 및 B, 에트라비린(ETR, TMC-125, Intelence®), 릴피비른(RPV, TMC278, Edurant™), DAPY(TMC120), 도라비린(Pifeltro™), BILR-355 BS, PHI-236, 및 PHI-443(TMC-278)을 포함한다.
(III) 프로테아제 억제제(PI). 프로테아제 억제제는 바이러스 프로테아제, 특히 HIV-1 프로테아제의 억제제이다. 프로테아제 억제제의 예는, 제한 없이, 다루나비르, 암프레나비르(141W94, AGENERASE®), 티프라니비르(PNU-140690, APTIVUS®), 인디나비르(MK-639; CRIXIVAN®), 사퀴나비르(INVIRASE®, FORTOVASE®), 포스암프레나비르(LEXIVA®), 로피나비르(ABT-378), 리토나비르(ABT-538, NORVIR®), 아타자나비르(REYATAZ®), 넬피나비르(AG-1343, VIRACEPT®), 라시나비르(BMS-234475/CGP-61755), BMS-2322623, GW-640385X(VX-385), AG-001859, 및 SM-309515를 포함한다.
(IV) 융합 또는 침입 억제제. 융합 또는 침입 억제제는 세포로의 HIV 침입을 차단하는(예를 들면, HIV 외피 단백질에 결합하고 숙주 세포와 융합하는 바이러스에 필요한 구조적 변화를 차단함으로써) 화합물, 예를 들면, 펩타이드이다. 융합 억제제의 예는, 제한 없이, CCR5 수용체 길항제(예를 들면, 마라비로크(Selzentry®, Celsentri)), 엔푸비르티드(INN, FUZEON®), T-20(DP-178, FUZEON®) 및 T-1249를 포함한다.
(V) 인테그라제 억제제(본 발명의 프로드러그 이외에). 인테그라제 억제제는 숙주 세포의 DNA로 바이러스 게놈을 삽입하는 바이러스 효소인 인테그라제(예를 들면, HIV 인테그라제)의 작용을 차단하도록 디자인된 항레트로바이러스 약물의 한 부류이다. 인테그라제 억제제의 예는, 제한 없이, 랄테그라비르, 엘비테그라비르, GSK1265744(카보테그라비르), GSK1349572(돌루테그라비르), GS-9883(빅테그라비르), 및 MK-2048을 포함한다.
항-HIV 화합물은 또한 성숙 억제제(예를 들면, 베비리매트)를 포함한다. 성숙 억제제는 전형적으로 HIV gag에 결합하고 바이러스의 성숙 동안 이의 진행을 방해하는 화합물이다. 항-HIV 화합물은 또한 HIV 백신, 예를 들면, 제한 없이, ALVAC® HIV(vCP1521), AIDSVAX®B/E(gp120), 및 이의 조합을 포함한다. 항-HIV 화합물은 또한 HIV 항체(예를 들면, gp120 또는 gp41에 대한 항체), 특히 광범위 중화 항체를 포함한다.
1종 이상의 항-HIV 제제, 특히 상이한 작용 메커니즘을 가진 제제(상기 기재된 바와 같음)가 사용될 수 있다. 예를 들면, NNRTI가 아닌 항-HIV 제제는 본 발명의 NNRTI 프로드러그와 조합될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 항-HIV 요법은 고활성 항레트로바이러스 요법(HAART)이다.
본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 프로드러그 및/또는 나노입자 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물(예를 들면, 약제학적 조성물)을 포함한다. 상기 본원에 기재된 바와 같이, 나노입자는 1종 이상의 치료제를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 약제학적 조성물은 제1 프로드러그를 포함하는 제1 나노입자 및 제2 프로드러그를 포함하는 제2 나노입자를 포함하고, 여기서 제1 및 제2 프로드러그는 상이하다. 특정한 실시양태에서, 제1 프로드러그는 본 발명의 프로드러그이고, 제2 프로드러그는 비뉴클레오사이드 역전사효소 억제제(NNRTI), 특히 릴피비린(RPV)의 프로드러그이다. 본 발명의 조성물(예를 들면, 약제학적 조성물)은 다른 치료제(예를 들면, 다른 항-HIV 화합물(예를 들면, 본원에 기재된 것들)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 질환 또는 질병의 예방, 억제, 및/또는 치료 방법을 포함한다. 방법은 본 발명의 프로드러그 및/또는 나노입자(임의로 조성물 중의)를 이것이 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 질환 또는 질병은 바이러스(예를 들면, 레트로바이러스) 감염이다. 바이러스 감염의 예는, 제한 없이, HIV, B형 간염, C형 간염, 및 HTLV를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 바이러스 감염은 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 감염, 특히 HIV 감염(예를 들면, HIV-1)이다.
본 발명의 프로드러그 및/또는 나노입자(임의로 조성물 중의)는 질환 또는 질병(예를 들면, 레트로바이러스 감염, 예를 들면, HIV 감염)을 치료/억제/예방하기 위하여 동물, 특히 포유동물, 더 특히 인간에게 투여될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 또한 적어도 하나의 다른 치료제, 예를 들면, 항바이러스성 제제, 특히 적어도 하나의 다른 항-HIV 화합물/제제를 포함할 수 있다. 추가의 항-HIV 화합물은 또한 본 발명의 프로드러그 또는 조성물로부터 분리된 약제학적 조성물로 투여될 수 있다. 약제학적 조성물은 동시에 또는 상이한 시간에(예를 들면, 순차적으로) 투여될 수 있다.
본 발명의 프로드러그, 나노입자, 및/또는 조성물의 투여를 위한 투여량 범위는 원하는 효과(예를 들면, 질환 또는 질병(예를 들면, HIV 감염), 이의 증상(예를 들면, AIDS, ARC), 또는 이에 대한 소인의 치유, 완화, 치료, 및/또는 예방)를 생성하는데 충분하게 많은 것이다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 대상체에게 약 5 μg/kg 내지 약 500 mg/kg의 양으로 투여된다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 대상체에게 약 5 μg/kg 초과, 약 50 μg/kg 초과, 약 0.1 mg/kg 초과, 약 0.5 mg/kg 초과, 약 1 mg/kg 초과, 또는 약 5 mg/kg 초과의 양으로 투여된다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 대상체에게 약 0.5 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 또는 약 15 mg/kg 내지 약 50 mg/kg의 양으로 투여된다. 투여량은 유의미한 부작용, 예를 들면, 원하지 않는 교차 반응, 아나필락시스 반응 등을 유발할 정도로 크면 안된다. 일반적으로, 투여량은 환자의 연령, 상태, 성별 및 질환의 정도에 따라 다양할 것이고, 당해 분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있다. 투여량은 임의의 사용 금지가 있는 경우에 개인 의사에 의해 조절될 수 있다.
본원에 기재된 프로드러그 및 나노입자는 일반적으로 환자에게 약제학적 조성물로서 투여될 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "환자"는 인간 또는 동물 대상체로 지칭된다. 이들 프로드러그 및 나노입자는 의사의 지도하에 치료적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 프로드러그 및/또는 나노입자를 포함하는 약제학적 조성물은 임의의 약제학적으로 허용되는 담체(들)와 함께 투여를 위해 편리하게 제제화될 수 있다. 예를 들면, 복합체는 허용 가능한 매질, 예를 들면, 물, 완충 식염수, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 디메틸 설폭사이드(DMSO), 오일, 세제, 현탁제, 또는 이의 적합한 혼합물, 특히 수성 용액과 함께 제제화될 수 있다. 선택된 매질 중의 프로드러그 및/또는 나노입자의 농도는 다양할 수 있고, 매질은 약제학적 조성물의 투여의 원하는 경로를 기준으로 선택될 수 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 투여되는 나노입자와 비혼화성인 경우를 제외하고, 약제학적 조성물에서 이의 사용이 고려된다.
특정한 환자에게 투여하는데 적합한 본 발명에 따른 프로드러그 및/또는 나노입자의 용량 및 투여량 요법은 환자의 연령, 성별, 중량, 일반적인 의학적 상태, 및 나노입자가 투여되는 특정한 상태 및 이의 중증도를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 의사는 투여 경로, 약제학적 담체, 및 나노입자의 생물학적 활성을 고려할 수 있다.
적합한 약제학적 조성물의 선택은 또한 선택된 투여 방식에 따라 좌우될 것이다. 예를 들면, 본 발명의 나노입자는 직접 주사 또는 정맥내에 의해 투여될 수 있다. 이러한 경우, 약제학적 조성물은 주사 부위와 혼화성인 매질 중에 분산된 프로드러그 및/또는 나노입자를 포함한다.
본 발명의 프로드러그 및/또는 나노입자는 임의의 방법에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 프로드러그 및/또는 나노입자는, 제한 없이, 비경구적으로, 피하로, 경구로, 국소적으로, 폐로, 직장으로, 질로, 정맥내로, 복강내로, 척추강내로, 대뇌내로, 경막외로, 근육내로, 피내로, 또는 경동맥내로 투여될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 프로드러그 및/또는 나노입자는 비경구적이다. 특정한 실시양태에서, 프로드러그 및/또는 나노입자는 경구적으로, 근육내로, 피하로, 또는 혈류로(예를 들면, 정맥내로) 투여된다. 특정한 실시양태에서, 프로드러그 및/또는 나노입자는 근육내로 또는 피하로 투여된다. 주사를 위한 약제학적 조성물은 당해 분야에 공지되어 있다. 주사가 프로드러그 및/또는 나노입자의 투여를 위한 방법으로서 선택되는 경우, 단계는 생물학적 효과를 생성하는데 충분한 양의 분자 또는 세포가 이들의 표적 세포에 도달하는 것을 보장하여야 한다. 경구 투여를 위한 제형은, 제한 없이, 정제(예를 들면, 코팅 및 무코팅, 츄어블), 젤라틴 캡슐(예를 들면, 연질 또는 경질), 로젠지, 트로키, 용액, 에멀젼, 현탁액, 시럽, 엘릭서제, 분말/과립(예를 들면, 재구성 가능한 또는 분산성) 검, 및 발포정을 포함한다. 비경구 투여를 위한 제형은, 제한 없이, 용액, 에멀젼, 현탁액, 분산액 및 재구성용 분말/과립을 포함한다. 국소 투여를 위한 제형은, 제한 없이, 크림, 젤, 연고, 살브, 패치 및 경피 전달 시스템을 포함한다.
약제학적으로 허용되는 담체와의 긴밀한 혼합물 중의 활성 성분으로서 본 발명의 프로드러그 및/또는 나노입자를 함유하는 약제학적 조성물은 통상적인 약제학적 조제 기술에 따라 제조될 수 있다. 담체는 투여, 예를 들면, 정맥내, 경구, 직접 주사, 두개내, 및 유리체내 투여를 위한 원하는 약제학적 조성물의 형태에 따라 광범위하게 다양한 형태를 가질 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 단일성을 위하여 단위 제형으로 제제화될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 단위 제형은 치료 중인 환자에게 적절한 약제학적 조성물의 물리적으로 개별적인 단위를 지칭한다. 각각의 투여량은 선택된 약제학적 담체와 관련하여 원하는 효과를 생성하도록 계산된 활성 성분의 양을 함유하여야 한다. 적절한 투여량 단위를 결정하는 과정은 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지되어 있다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 프로드러그 및/또는 나노입자는 이의 지속 작용성 치료 효과로 인하여 1 내지 12개월마다 1회 또는 훨씬 덜 빈번하게 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 나노제제는 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 18, 21, 24개월 또는 그 이상마다 1회 투여될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 프로드러그 및/또는 나노입자는 2개월마다 1회 미만으로 투여된다. 특정한 실시양태에서, 프로드러그 및/또는 프로드러그의 나노제제는 1개월마다 1회, 2개월마다 1회, 특히 3개월마다 1회, 4개월마다 1회, 5개월마다 1회, 6개월마다 1회, 7개월마다 1회, 8개월마다 1회, 9개월마다 1회, 10개월마다 1회, 11개월마다 1회, 12개월마다 1회, 또는 덜 빈번하게 투여된다.
투여량 단위는 환자의 체중에 비례하여 증가하거나 감소할 수 있다. 특정한 병리 조건의 경감을 위한 적절한 농도는 당해 분야에 공지된 바와 같이 투여량 농도 곡선 계산에 의해 결정될 수 있다.
본 발명에 따라, 나노입자의 투여를 위한 적절한 투여량 단위는 동물 모델에서 분자 또는 세포의 독성을 평가함으로써 결정될 수 있다. 약제학적 조성물 중의 나노입자의 다양한 농도는 마우스로 투여될 수 있고, 최소 및 최대 투여량은 치료의 결과로서 관찰된 유리한 결과 및 부작용을 기반으로 결정될 수 있다. 적절한 투여량 단위는 또한 다른 표준 약물과 조합으로 나노입자의 치료의 효능을 평가함으로써 결정될 수 있다. 나노입자의 투여량 단위는 검출된 효과에 따라 개별적으로 또는 각각의 치료와 조합으로 결정될 수 있다.
나노입자를 포함하는 약제학적 조성물은 병리적 증상이 감소하거나 경감될 때까지 적절한 간격으로 투여될 수 있고, 그 후, 투여량은 유지 수준으로 감소될 수 있다. 특정한 경우에 적절한 간격은 일반적으로 환자의 상태에 따라 좌우될 것이다.
본 발명은 이것이 필요한 대상체에게 본 발명의 프로드러그 및/또는 나노입자 및, 바람직하게는, 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 질환/질병의 치료 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 대상체가 생체외 요법을 통해 치료되는 방법을 포함한다. 특히, 방법은 세포를 대상체로부터 제거하고, 세포를 시험관내에서 본 발명의 나노입자에 노출/접촉시키고, 세포를 대상체로 돌려놓는 것을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 세포는 대식세포를 포함한다. 본 발명의 방법과 조합될 수 있는 질환 또는 질병의 다른 치료 방법은 본 발명의 약제학적 조성물과 함께 공동투여될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 나노입자를 시험관내에서(예를 들면, 배양에서) 세포로 전달하는 것을 포함한다. 나노입자는 적어도 하나의 담체 중에서 세포로 전달될 수 있다.
정의
하기 정의는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제공된다.
단수형("a," "an," 및 "the")은 문맥에서 달리 명확하게 기재되지 않는 한, 복수의 대상을 포함한다.
"약제학적으로 허용되는"은 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의한 승인을 나타내거나, 동물, 및 더 특히 인간에서 사용에 대하여 미국 약전 또는 다른 보편적으로 인정되는 약전에 열거된 것이다.
"담체"는, 예를 들면, 희석제, 애쥬번트, 보존제(예를 들면, 티메르솔(Thimersol), 벤질 알코올), 항산화제(예를 들면, 아스코르브산, 나트륨 메타비설파이트), 가용화제(예를 들면, 폴리소르베이트 80), 유화제, 완충제(예를 들면, 트리스 HCl, 아세테이트, 포스페이트), 항균제, 증량 성분(예를 들면, 락토스, 만니톨), 부형제, 보조제 또는 비히클을 지칭하고, 이는 본 발명의 활성제와 함께 투여된다. 약제학적으로 허용되는 담체는 무균 액체, 예를 들면, 물, 및 페트롤륨, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 것들을 포함하는 오일일 수 있다. 물 또는 수성 식염 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 바람직하게는 담체로서, 특히 주사 가능한 용액을 위하여 사용된다. 적합한 약제학적 담체는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin(Mack Publishing Co., Easton, PA); Gennaro, A. R., Remington: The Science and Practice of Pharmacy,(Lippincott, Williams and Wilkins); Liberman, et al., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y.; and Kibbe, et al., Eds., Handbook of Pharmaceutical Excipients, American Pharmaceutical Association, Washington]에 기재되어 있다.
용어 "프로드러그"는 전형적으로 투여 후 생물학적 활성 또는 더 활성 화합물 또는 약물로 대사되거나 그렇지 않으면 전환되는 화합물을 지칭한다. 약물과 관련하여 프로드러그는 약물에 비해 덜 활성, 본질적으로 불활성, 또는 불활성을 부여하는 방식으로 화학적으로 개질된다. 그러나, 화학적 개질은 전형적으로 프로드러그가 투여된 후, 상응하는 약물이 대사적 또는 다른 생물학적 과정에 의해 생성되도록 한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "치료하다"는 환자의 병태(예를 들면, 하나 이상의 증상)의 개선, 병태의 진행의 지연 등을 포함하는 질환에 걸린 환자에게 이득을 부여하는 임의의 유형의 치료를 지칭한다. 특정한 실시양태에서, 레트로바이러스 감염의 치료는 감염된 세포의 수 및/또는 검출 가능한 바이러스 수준의 적어도 억제/감소를 야기한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "예방하다"는 대상체가 병태를 발달시킬 확률의 감소를 야기하는 병태(예를 들면, HIV 감염)의 발달 위험이 있는 대상체의 예방적 치료를 지칭한다.
화합물 또는 약제학적 조성물의 "치료적 유효량"은 특정한 질병 또는 질환의 증상을 예방, 억제, 치료 또는 경감하는데 유효한 양을 지칭한다. 본원에서 미생물 감염(예를 들면, HIV 감염)의 치료는 미생물 감염, 이의 증상(들), 또는 이에 대한 소인의 치유, 완화, 및/또는 예방을 지칭할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료제"는, 제한 없이, 병태, 질환, 또는 질병을 치료하거나 병태, 질환, 또는 질병의 증상을 감소시키는데 사용될 수 있는 핵산, 펩타이드, 단백질, 및 항체를 포함하는 화학적 화합물 또는 생물학적 분자를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "소분자"는 상대적인 저분자량(예를 들면, 4,000 미만, 2,000 미만, 특히 1 kDa 또는 800 Da 미만)을 갖는 성분 또는 화합물을 지칭한다. 전형적으로, 소분자는, 이들이 아미노산 또는 디펩타이드일 수 있음에도 불구하고, 단백질, 폴리펩타이드, 또는 핵산이 아닌 유기물이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "항균제"는 미생물, 예를 들면, 박테리아, 진균류, 바이러스, 또는 또는 원생동물을 사멸하거나 이의 성장을 억제하는 성분을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항바이러스제"은 바이러스를 파괴하고/거나 바이러스의 복제(생식)을 억제하는 성분을 지칭한다. 예를 들면, 항바이러스제는 바이러스 입자의 생성, 바이러스 입자의 성숙, 바이러스 부착, 세포로의 바이러스 흡수, 바이러스 조립, 바이러스 방출/발아, 바이러스 통합 등을 억제하고/거나 예방할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "고활성 항레트로바이러스 요법"(HAART)은 뉴클레오사이드 역전사효소 억제제, 비뉴클레오사이드 역전사효소 억제제, HIV 프로테아제 억제제, 및 융합 억제제와 같은 치료제의 다양한 조합을 갖는 HIV 요법을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "양친매성"은 물 및 지질/무극성 환경 ŠPㄹ 다에 용해되는 능력을 의미한다. 전형적으로, 양친매성 화합물은 친수성 부분 및 소수성 부분을 포함한다. "소수성"은 무극성 환경에 대한 선호(예를 들면, 소수성 성분 또는 잔기는 물보다 비극성 용매, 예를 들면, 탄화수소 중에 더 용이하게 용해되거나 이에 의해 습윤됨)를 나타낸다. "소수성" 화합물은 대부분 물에 불용성이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "친수성"은 물 중에 용해될 수 있는 능력을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "중합체"는 2개 이상의 반복 단위 또는 단량체의 화학적 조합으로부터 형성된 분자를 나타낸다. 용어 "블록 공중합체"는 대부분 단순하게 적어도 2개의 상이한 중합체 분절의 컨쥬게이트를 지칭하고, 여기서 각각의 중합체 분절은 동일한 종류의 2개 이상의 인접한 단위를 포함한다.
"항체" 또는 "항체 분자"는 특이적 항원에 결합하는 항체 및 이의 단편(예를 들면, scFv)을 포함한 임의의 면역글로불린이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 항체 또는 항체 분자는 온전한 면역글로불린 분자, 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분의 융합을 고려한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역학적으로 특이적인"은 흥미 있는 단백질 또는 화합물의 하나 이상의 에피토프에 결합하지만, 항원성 생물학적 분자의 혼합된 집단을 함유하는 샘플에서 다른 분자를 실질적으로 인식하고 결합하지 않는 단백질/폴리펩타이드, 특히 항체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "표적화 리간드"는, 특히 다른 유형의 조직 또는 세포 유형에 실질적으로 결합하지 않으면서, 특정한 유형의 조직 또는 세포 유형에 특이적으로 결합하는 임의의 화합물을 지칭한다. 표적화 리간드의 예는, 제한 없이, 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 항체, 항체 단편, 호르몬, 리간드, 탄수화물, 스테로이드, 핵산 분자, 및 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
용어 "지방족"은 비방향족 탄화수소 기반의 잔기를 지칭한다. 지방족 화합물은 비환형(예를 들면, 선형 또는 분지형) 또는 환형 잔기(예를 들면, 사이클로알킬)일 수 있고, 포화 또는 불포화(예를 들면, 알킬, 알케닐, 및 알키닐)일 수 있다. 지방족 화합물은 주로 탄소 주쇄(예를 들면, 1 내지 약 30개의 탄소)를 포함할 수 있고, 헤테로원자 및/또는 치환기(하기 참조)를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "알킬"은 정상/주쇄에서 1 내지 약 30개의 탄소를 함유하는 포화 또는 불포화, 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소를 포함한다. 알킬기의 탄화수소쇄는 하나 이상의 헤테로원자(예를 들면, 산소, 질소, 또는 황)에 의해 중단될 수 있다. 알킬(또는 지방족)은 임의로 치환될 수 있다(예를 들면, 약 8개 미만, 약 6개 미만, 또는 1 내지 약 4개의 치환기로). 용어 "저급 알킬" 또는 "저급 지방족"은 각각 탄화수소쇄에서 1 내지 3개의 탄소를 함유하는 알킬 또는 지방족을 지칭한다. 알킬 또는 지방족 치환기는, 제한 없이, 알킬(예를 들면, 저급 알킬), 알케닐, 할로(예를 들면, F, Cl, Br, I), 할로알킬(예를 들면, CCl3 또는 CF3), 알콕시, 알킬티오, 하이드록시, 메톡시, 카복실, 옥소, 에폭시, 알킬옥시카보닐, 알킬카보닐옥시, 아미노, 카바모일(예를 들면, NH2C(=O)- 또는 NHRC(=O)-, 여기서 R은 알킬이다), 우레아(-NHCONH2), 알킬우레아, 아릴, 에테르, 에스테르, 티오에스테르, 니트릴, 니트로, 아미드, 카보닐, 카복실레이트 및 티올을 포함한다. 주쇄에서 적어도 약 5개의 탄소를 갖는 지방족 및 알킬 기는 일반적으로 소수성이고, 친수성 치환기에 의한 과도한 치환은 부재한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "아릴"은 고리 부분에서 6 내지 10개의 탄소를 함유하는 단환형 및 이환형 방향족기를 지칭한다. 아릴기의 예는, 제한 없이, 페닐 또는 나프틸, 예를 들면, 1-나프틸 및 2-나프틸, 또는 인데닐을 포함한다. 아릴기는 임의로 사이클로알킬 고리 또는 헤테로사이클릭 고리에 융합된 1 내지 3개의 추가 고리를 포함할 수 있다. 아릴기는 이용 가능한 탄소 원자를 통해, 예를 들면, 수소, 할로, 알킬, 폴리할로알킬, 알콕시, 알케닐, 트리플루오로메틸, 트리플루오로메톡시, 알키닐, 아릴, 헤테로사이클로, 아르알킬, 아릴옥시, 아릴옥시알킬, 아르알콕시, 아릴티오, 아릴아조, 헤테로사이클로옥시, 하이드록시, 니트로, 시아노, 설포닐 음이온, 아미노, 또는 치환된 아미노로부터 선택된 1, 2, 또는 3개의 기로 치환될 수 있다. 아릴기는 헤테로아릴일 수 있다. "헤테로아릴"은 적어도 1개, 바람직하게는 1 내지 약 4개의 황, 산소, 또는 질소 헤테로원자 고리 멤버를 포함하는, 임의로 치환된 단환형, 이환형, 삼환형, 또는 다른 다환형 방향족 고리 시스템을 지칭한다. 헤테로아릴기는, 예를 들면, 약 3 내지 약 50개의 탄소 원자(및 범위의 모든 조합 및 하위조합 및 그 안의 탄소 원자의 특정한 수)를 가질 수 있고, 약 4 내지 약 10개의 탄소가 바람직하다.
하기 실시예는 본 발명을 실시하는 예시적인 방법을 제공하고, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하는 것을 의도하지 않는다.
실시예 1
뇌, 림프절, 골수, 장 관련 림프 조직 및 생식관을 포함하는 이의 조직 성소 부위로부터 잔여 HIV-1의 최대 감소는 지속 작용성 저장소 표적화된 약의 발달에 의해 달성될 수 있다. 빈번하지 않은 투여 간격의 이득 이외에, 지속 작용성 주사 가능한 약물 제제는 수용체 매개된 공정을 이용하여 개선된 세포 표적화, 확장된 약물 반감기, 및 향상된 조직 생물분포를 달성하도록 디자인될 수 있다. CAB는 강력한 바이러스 인테그라제 억제제이고, 단일 근육내 용량 후, 인간에서 지속된 혈장 약물 수준을 증명하는 LAP(CAB-LAP)로서 제제화되었다. 릴피비린 및 CAB-LAP의 지속 작용성 주사 가능한 나노제제는 이미 1개월마다 1회 주사로 HIV 억제 및 예방이 가능하였다(Andrews, et al.(2014) Science 343(6175):1151-1154; Cohen, J.(2014) Science 343(6175):1067; Spreen, et al.(2013) Curr. Opin. HIV AIDS, 8(6):565-571). 기존의 나노제제의 주요 한계점은 높은 용량 및 높은 주사 부피에 대한 요건을 포함한다. 이를 위하여, 지속 작용성 완효성 방출 항레트로바이러스 요법(LASER ART)은 생리학적 장벽을 통과하는 신속한 약물 침투를 허용하는 친유성 및 소수성 프로드러그 나노결정을 합성함으로써 개발되었다. LASER ART는 확장성 및 장기간 저장을 유지하면서 제한된 부형제 사용과 함께 약물 로딩을 최대화한다. 미리스토일화된 프로드러그는 폴록사머 계면활성제와 함께 제제화되었다. CAB의 개선된 효력, 생체이용률, 및 조직 분포는 단일 45 mg/kg CAB 당량 근육내 주사 후, 레수스 마카크에서 4개월 동안 PA-IC90에서 혈장 CAB 농도를 지속시키는 약물 친유성을 증가시킴으로써 증명되었다. 여기서, 바이러스 저장소 표적화 및 약물 활성을 개선하면서 투여 빈도를 감소시키는 개선된 프로드러그 및 나노제제가 합성되었다.
덜 빈번한 투여, 예를 들면, 6 내지 12개월마다 1회 투여 간격 또는 훨씬 덜 빈번한 투여로 LASER ART 제제의 사용을 허용하는 물리화학적 성질을 갖는 CAB의 강력한 에스테르 프로드러그가 본원에서 제공된다. 최적의 CAB 프로드러그 후보의 선택에서 평가 기준은 약물 효능, 친유성 프로파일, 최소 전신 프로드러그 순환과 함께 CAB로의 유효한 생체내 전환, 및 프로드러그 제제의 단일 근육내 주사 후, 6개월 또는 그 이상의 기간 동안 4배 PA-IC90 초과로 지속된 CAB 농도를 포함하였다. 놀랍게도, 본 발명은 지방 에스테르 프로드러그의 탄화수소쇄 길이에서의 변화가 활성 약물 방출 및 체류를 극적으로 개선시킨다는 것을 증명하였다. 이는 MCAB 또는 다른 지방산 탄화수소쇄 길이와 비교시, CAB의 예상외로 우수한 제어된 방출 동력학을 갖는 CAB의 18-탄소 지방 에스테르 프로드러그인 M2CAB의 확인에 이르렀다.
본 발명의 프로드러그는 소수성 절단 가능 잔기에 컨쥬게이트된 CAB와 같은 인테그라제 억제제의 유도체이다. 따라서, 소수성 모 화합물은 더 소수성인 에스테르 유도체로 전환된다. 이는 약물 단백질 결합 및 생체이용률을 개선시킬 수 있는 지방산 잔기의 부착을 통해 달성된다. 인테그라제 억제제(예를 들면, CAB)와 유도체화 잔기 사이의 에스테르 연결기는 효소적 또는 가수분해적 절단의 경향이 있다. 입자로부터의 약물 방출의 메커니즘은 부형제로부터 프로드러그의 용해 후, 활성 모 화합물을 생성하는 유효한 에스테르 분해를 포함한다. 개발된 NM2CAB는 30일 관찰 기간 동안 지속된 약물 체류와 함께 MDM에 의한 약물 흡수를 유의미하게 개선시킨 반면, NCAB 또는 NMCAB 제제는 치료 1일 또는 20일 후, 대식세포로부터 제거되었다. 유사하게, NM2CAB로 처리된 MDM은 단일 약물 처리 후, 30일 이하 동안 HIV-1로 챌린지하는 경우, NCAB 또는 NMCAB와 비교하여 개선되고 지속된 항레트로바이러스 활성을 나타냈다. HIV-1p24는 임의의 이들 시간점에서 NM2CAB 처리군에서 검출되지 않았다. 시스템의 이득은 예상외로 개선된 약물 생체이용률 및 확장된 반감기를 포함한다. NM2CAB 연장된 혈장 및 조직 CAB 농도는 유효한 6개월마다 1회 투여 간격이 달성될 수 있다는 것을 증명한다.
M2CAB의 합성
M2CAB 프로드러그의 합성이 도시된 바와 같이 수행되었다:
Figure pct00010
간략하게, M2CAB 프로드러그의 제조는 1) 적합한 염기, 예를 들면, N,N-디이소프로필에틸아민에 의한 페놀 작용기의 탈양성자화; 및 2) 알킬 지방산의 아실 클로라이드 또는 활성화된 카복실산과의 반응에 의해 수행되었다.
단계 1 및 2는 둘 다 단일 용기에서 수행하였다. 구체적으로, 적절한 시약을 사용하여 하이드록실기를 탈양성자화하였다. 그 다음, 알코올 음이온을 지방 아실 클로라이드 또는 활성화된 카복실산과 커플링하여 프로드러그를 생성하였다. 카복실산을 활성화하는데 사용될 수 있는 커플링 시약의 예는, 제한 없이, 우라늄 염, 카보디이미드 시약, 및 포스포늄 염을 포함한다. 커플링 반응에서 사용될 수 있는 염기의 예는, 제한 없이, N,N 디이소프로필에틸아민(DIEA)이다. 사용될 수 있는 극성 비양성자성 용매의 예는, 제한 없이, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 테트라하이드로푸란(THF), 및 아세토니트릴을 포함한다. 시약을 0℃에서 혼합하고, 12-24시간 동안 온도로 점진적으로 가열하였다. 최종 화합물을 실리카 컬럼 크로마토그래피 상에서 정제하고, 질량 분석법과 동시에 핵 자기 공명 분광법 및 고성능 액체 크로마토그래피로 특성화하였다.
하이드록실기 탈양성자화 및 지방산에 대한 커플링
무수 디메틸포름아미드(20 mL) 중의 CAB(2 g, 4.93 mmol, 1.0 당량) 용액을 0℃로 아르곤하에 냉각하였다. 그 다음, N,N 디이소프로필에틸아민(1.7 mL, 9.86 mmol, 2.0 당량)을 약물의 미리 냉각된 용액에 적가하였다. 그 다음, 스테아로일 클로라이드(3.3 mL, 9.86 mmol, 2.0 당량)를 탈양성자화된 페놀 용액에 가하였다. 혼합물을 16시간 동안 교반하에 실온으로 점진적으로 가열하고, 농축하고, 80 내지 90% EtOAc/Hex응로 용리되는 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 프로드러그를 90%의 화학적 수율로 수득하였다. M2CAB의 1H-NMR 스펙트럼은 1.20-1.50 ppm에서 브로드 피크의 존재 및 지방산 잔기 상의 지방족 양성자에 상응하는 것들을 나타낸다.
제제 합성
M2CAB 나노결정을 폴록사머 407(P407), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[카복시(폴리에틸렌 글리콜)-2000(DSPE-PEG), 및/또는 폴리비닐 알코올(PVA)로 코팅하였다. 나노결정을 또한 폴리소르베이트 및 폴리에틸렌 글리콜 계면활성제로 안정화시킬 수 있다. 양성자 NMR 분광법 데이터를 기반으로, 100:6 중량의 약물 대 계면활성제 비를 사용하여 나노제제화된 M2CAB, MCAB 및 CAB를 제조하였다. 간략하게, 1 - 5%(w/v) M2CAB, MCAB 또는 CAB 및 0.06 - 0.3%(w/v) P407을 내독소가 없는 물 중에서 혼합하였다. 미리 혼합된 현탁액을 원하는 크기 및 다분산도(PDI)가 달성될 때까지 습식 분쇄 또는 20,000 psi 압력에서 고압 균질화로 제제화하였다. 나노제제를 입자 크기, 다분산도(PDI) 및 동적 광산란에 의한 제타 전위(도 1)로 특성화하였다. 이는 말번 제타사이저(Malvern Zetasizer), 나노 시리즈 나노-ZS(Nano Series Nano-ZS, Malvern Instruments Inc, 미국 매사추세츠주 웨스트버러 소재)를 사용하여 수행하였다. 나노입자 형태학은 주사 전자 현미경(SEM)으로 결정하였다. UPLC MS/MS를 약물 정량에 사용하였다.
대식세포 흡수 및 체류
인간 단핵구를 HIV-1/2 및 B형 간염 혈청반응음성 공여자로부터의 백혈구성분채집술로 수득한 다음, 역류 원심분리 세정으로 정제하였다(Balkundi et al., Intl. J. Nanomed.(2011) 6:3393-3404; Nowacek et al., Nanomed.(2009) 4(8):903-917). 10% 열 불활성화된 풀링된 인간 혈청, 1% 글루타민, 10 μg/mL 시프로플록사신, 및 50 μg/mL 젠타마이신로 보충된 DMEM을 사용하여 인간 단핵구를 12-웰 플레이트에 웰당 1.0 × 106 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 세포를 37℃에서 5% CO2 배양기에서 유지하였다. 1000 U/mL 재조합 인간 대식세포 집락 자극 인자(MCSF)의 존재하에 분화 7-10일 후, MDM을 다양한 나노제제 및 네이티브 약물로 처리하였다. 약물의 흡수는 처리 후 다양한 시간점에서 세포내 약물 농도의 측정에 의해 평가하였다. 약물 체류 연구를 위하여, 세포를 8시간 동안 처리한 다음, PBS로 세척하고, 지시된 시간점에서 수집될 때까지 격일로 배지 절반 변화를 유지하였다. 두 연구에 있어서, 부착성 MDM을 PBS(3 × 1 mL)로 세척한 다음, 새로운 PBS 1 mL로 긁어내고, 카운테스(Countess)™ 자동화 세포 계수기(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재)를 사용하여 지시된 시간점에서 계수하였다. 세포를 4℃에서 8분 동안 950 x g으로 원심분리하여 펠렛화하였다. 세포 펠렛을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 등급 메탄올 200 μl 중에 재구성하고, 프로브 초음파 후, 20분 동안 20,000 x g에서 원심분리하였다. HPLC를 사용하여 약물 함량에 대하여 상청액을 분석하였다.
도 2a에 도시된 바와 같이, NM2CAB는 NMCAB보다 통계적으로 더 높은 수준으로 MDM에 의해 흡수되었다. 게다가, MDM은 NMCAB보다 더 긴 기간 동안 통계적으로 더 높은 수준으로 NM2CAB를 보유하였다(도 2a).
항레트로바이러스 활성
항레트로바이러스 효능은 HIV 역전사효소(RT) 활성의 측정으로 결정하였다(도 2b 및 2c). 항레트로바이러스 효능을 평가하기 위하여, MDM을 100 μM CAB-LAP, NMCAB 또는 NM2CAB로 8시간 동안 처리하였다. 처리 후, 세포를 PBS로 세척하여 과량의 유리 약물 및 나노입자를 제거하고, 세포를 새로운 배지에서 배양하고, 격일로 배지의 절반을 교환하였다. MDM을 30일 이하 동안 0.01 감염성 바이러스 입자/세포의 MOI에서 HIV-1ADA로 챌린지하였다. 자손 비리온 생성을 배양 배지에서 RT 활성으로 측정하였다(Kalter, et al.(1992) J. Clin. Microbiol., 30(4):993-995). HIV-1 p24 단백질 항원 발현을 평가하였다(Guo, et al.(2014) J. Virol., 88(17):9504-9513). MDM을 PBS로 세척하고, 4% 파라포름알데히드로 15분 동안 실온에서 고정하였다. 30분 동안 실온에서 PBS 중의 1% 트리톤(Triton) X-100을 함유한 10% BSA를 사용하여 세포를 차단하였다. 차단 후, 세포를 HIV-1 p24 마우스 단일클론 항체(1:50; Dako, 미국 캘리포니아주 카핀테리아 소재)와 함께 밤새 4℃에서 배양한 다음, 실온에서 1시간 동안 배양하였다. HRP-표지화된 중합체 항-마우스 2차 항체(Dako EnVision® System)를 가하였다(1 방울/웰). 헤마톡실린을 가하여 핵을 대조염색하고, 20X 대물렌즈로 니콘(Nikon) TE300 현미경을 사용하여 이미지를 캡쳐하였다. 도 2b 및 2c에서 볼 수 있듯이, 나노제제화된 CAB 또는 MCAB와 비교하여 예상외로 우수한 항레트로바이러스 효능이 나노제제화된 M2CAB에 있어서 관찰되었다.
약동학/생물분포 연구
암컷 NSG 마우스에 NM2CAB, NMCAB 또는 NCAB의 단일 IM 45 mg/kg CAB 당량 용량을 투여하였다. 혈장 및 조직으로부터의 약물 수준을 UPLC-MS/MS로 평가하였다. 혈장의 약물 수준을 매주 모니터링하였다. NM2CAB의 단일 IM 주사는 NMCAB 또는 NCAB와 비교하여 4배 PA-IC90 초과로 남아 있는 활성 CAB의 0차 제어된 방출 동력학을 증명한다(도 3). 주사 후 제364일에, 혈장 CAB 수준은 NM2CAB에 있어서 345.2 ng/ml이었고, NMCAB에 있어서 8.5 ng/ml이었고, NCAB에 있어서는 검출 가능하지 않은 값이었다(0.5 ng/ml의 검출 한계).
마우스에 또한 NM3CAB(C22)의 단일 IM 45 mg/kg CAB 당량 용량을 투여하였다. 혈장의 약물 수준을 매주 모니터링하였다. 주사 후 제28일에, 혈장 CAB 수준은 233.2 ng/ml이었다(도 3b). 따라서, NM2CAB(C18)는 약물의 장기간 효과적인 방출을 유지하는데 있어서 더 짧은 NMCAB(C14) 및 더 긴 NM3CAB(C22)보다 통계적으로 더 우수하였다는 것이 분명하다.
CAB의 소수성은 M2CAB 프로드러그로 유도체화된 경우에 크게 개선되었다. M2CAB의 개선된 소수성은 높은 약물 로딩 수용력을 갖는 안정한 제제의 제조를 용이하게 만들었다. 게다가, CAB의 더 소수성인 M2CAB로의 전환 및 나노입자 형성은 나노제제화된 CAB 또는 MCAB와 비교하여 약물의 세포내 축적을 유의미하게 개선하였다. MDM 체류 및 항레트로바이러스 효능에서의 유의미한 개선이 또한 나노제제화된 CAB 또는 MCAB와 비교하여 나노제제화된 M2CAB에 있어서 관찰되었다. 암컷 NSG 마우스에서 45 mg CAB 당량/kg에서 NM2CAB의 단일 IM 주사는 또한 예상외로 5개월 이상 동안 4배 PA-IC90 초과의 혈장 CAB 농도를 증명하였고, 이는 나노제제화된 CAB 또는 MCAB보다 유의미하게 크다.
실시예 2
현재 항레트로바이러스 약물(ARV) 치료 요법은 강력하면서 동시에 내약성이 좋아서 인간 면역결핍 바이러스 1형(HIV-1)의 일생 동안 지속되는 억제를 가능한다(Fauci, et al., JAMA(2019) 321:844-845). 그러나, 바이러스 복제의 이러한 제어는 반드시 요법 이행도와 연걸되어야 하고, 이는 결국 공존하는 동반질병, 사회적인 오명, 행동, 공존하는 불법 약물 사용 및 비용의 영향을 받는다(Fauci, et al., JAMA(2019) 321:844-845). 그럼에도 불구하고, 심지어 매일 투여에 대한 엄격한 이행은 약물 독성, 약물-약물 상호작용 및 바이러스-약물 내성의 발생을 흔히 야기한다. 모든 약물 요법은 바이러스 제거를 배제한다(Dash, et al., Nat. Commun.(2019) 10:2753). 이는 모든 요법이 HIV-1 억제를 지속하고 질환을 완화시키기 위하여 일생 동안의 이행을 필요로 한다는 사실을 강조한다. 이들은 과학자들이 지속 작용성(LA) 치료 접근을 개발하도록 이끌었다. 모두 요법 이행도 및 약물 효능을 개선하는데 집중하였다(Gendelman, et al., Trends Microbiol.(2019) 27:593-606). 가장 활성인 2개이고 미국 식품의약청 임상 허가에 근접한 것은 ARV LA 주사 가능하고, 이식 가능한 약물 장치는 계속 개발 중이다(Margolis, et al., Lancet(2017) 390:1499-1510; Taylor, et al., Topics Antiviral Med.(2019) 27:50-68).
지금까지, 수행된 연구는 광범위한 인간 사용을 위하여 LA 주사 가능에 상당한 유망성을 유지하였다(Margolis, et al., Lancet(2017) 390:1499-1510; Taylor, et al., Topics Antiviral Med.(2019) 27:50-68; Kerrigan, et al., PloS One(2018) 13:e0190487). 그 결과, 2-약물 조합으로서 카보테그라비르(CAB) 및 릴피비린(RPV)의 LA 주사 가능한 나노제제는 2019년 말까지 매월 투여에 대하여 허가를 받을 가능성이 있는 것으로 보인다(Margolis, et al., Lancet(2017) 390:1499-1510; Taylor, et al., Topics Antiviral Med.(2019) 27:50-68; Kerrigan, et al., PloS One(2018) 13:e0190487). "지속 작용 억제로서의 항레트로바이러스 요법"(ATLAS) 및 "제1 지속 작용 주사 가능 요법"(FLAIR)은 둘 다 약속된 안정성, 효능 및 내약성을 증명하였다(Taylor, et al., Topics Antiviral Med.(2019) 27:50-68). 조합 치료는 치료를 표준 경구 3-약물 요법과 비교시 열등하지 않다고 확인해주었다(Taylor, et al., Topics Antiviral Med.(2019) 27:50-68). 마찬가지로, 약물 이식이 또한 유망한 것으로 나타났다(Kovarova, et al., Nat. Commun.(2018) 9:4156; Gunawardana, et al., Antimicrob. Agents Chemother.(2015) 59:3913-3919; Flexner, C., Curr. Opin. HIV AIDS(2018) 13:374-380; Barrett, et al., Antimicrob. Agents Chemother.(2018) 62(10):e01058-18.). 그러나, 두 접근법은 모두 주사 부위 반응, 큰 주사 부피, 투여 빈도, 바이러스 저장소로의 제한된 침투를 포함한 한계점이 많다(Margolis, et al., Lancet(2017) 390:1499-1510; Markowitz, et al., Lancet HIV(2017) 4:e331-e340; Zhou, et al., Biomaterials(2018) 151:53-65). 게다가, 이들 더 신규한 치료 접근법은 주사 그 자체의 제공 또는 이식물 삽입 및 제거의 수행에 의해 빈번한 전문가의 건강 관리 서비스를 필요로 한다. 조직 및 혈장 약물-수준의 측정은 점막, 림프 조직 및 중추신경계로의 약물 침투를 포함하는 LA ARV 효능 뿐만 아니라 장기간 안정성과도 상관관계가 있다. 이러한 알려지지 않은 정도를 기반으로, LA ARV 요법에서 추가의 개선에 대한 즉각적인 요구가 존재한다. 임의의 미래의 LA ARV는 전신 독성 없이 감소된 부피로 투여될 필요가 있다. 달성되는 경우, ARV 요법은 또한 ARV 백신 모방을 반영하는 방식으로 행동할 수 있다. 성공은 새로운 감염을 예방하고 새로운 전염을 감소시킬 것이고, 이러한 방식으로 기능적인 HIV-1 치유를 달성할 수 있다.
이를 위하여, LA ARV 라이브러리가 광범위한 항레트로바이러스제에 대하여 생성되었다(Zhou, et al., Biomaterials(2018) 151:53-65; Hilaire, et al., J. Control Release(2019) 311-312:201-211; Ibrahim, et al., Int. J. Nanomedicine(2019) 14:6231-6247; Lin, et al., Chem. Commun.(Camb) (2018) 54:8371-8374; McMillan, et al., Antimicrob. Agents Chemother.(2017) 62: e01316-17; McMillan, et al., AIDS(2019) 33:585-588; Sillman, et al., Nat. Commun.(2018) 9:443; Smith, et al., Biomaterials(2019) 223:119476; Soni, et al., Biomaterials(2019) 222:119441). 여기서, CAB 프로드러그는 가수분해의 엄격한 제어를 가하면서 약물의 겉보기 반감기 및 항레트로바이러스 활성의 연장을 목표로 생성되었다. 14, 18 및 22개의 탄소 연결기 암(각각 MCAB, M2CAB, 및 M3CAB)을 갖는 CAB의 3종의 프로드러그의 합성 및 포괄적인 물리화학적 특성화는 이들의 각각의 나노제제(NMCAB, NM2CAB, 및 NM3CAB)의 완전한 평가와 함께 기록된다. 이들 분석은 1세대 CAB 프로드러그, MCAB의 사전 시험을 확장하였다(Zhou, et al., Biomaterials(2018) 151:53-65; McMillan, et al., AIDS(2019) 33:585-588). C18 나노제제, NM2CAB는 단핵구-대식세포에서 CAB의 흡수 및 체류를 향상시켰고, HIV-1 감염 챌린지에 대하여 장기간 매월 보호를 보여주었다. NM2CAB는 52주 동안 166 ng/mL의 단백질 관련 억제제 농도(PA-IC90)의 90% 초과의 CAB 혈장 농도를 생성하였다. 이는 단일 비경구 주사 후, 유의미한 림프, 점막 및 장 생물분포 수준과 상관관계가 있다. 전신 부작용은 보고되지 않았다. 약물 주사된 정상 및 면역결핍 마우스 및 레수스 원숭이에서 평행 약물 혈장 농도는 예방 및 치료 요법을 위한 장기간 지속된 약물 방출을 확인해주었다. 결과를 합하면 프로드러그가 HIV-1에 대하여 예방용 백신의 동일한 목적으로 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
물질 및 방법
시약
CAB는 비오씨 사이언시스(BOC sciences, 미국 뉴욕주 셜리 소재)로부터 구입하였다. 피리딘, 디메틸포름아미드(DMF), N,N-디이소프로필에틸아민(DIEA), 미리스토일 클로라이드, 스테아로일 클로라이드, 베헨산, 폴록사머 407(P407), 시프로플록사신, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT), 디메틸 설폭사이드(DMSO), 파라포름알데히드(PFA), 및 3,3'-디아미노벤지딘(DAB)은 시그마 알드리치(Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스 소재)로부터 구입하였다. 디에틸 에테르, 에틸 아세테이트, 헥산, 아세토니트릴(ACN), 메탄올, LC-MS-등급의 물, 세포 배양 등급의 물(내독소 무함유), 젠타마이신, 일염기성 인산칼륨(KH2PO4), 소 혈청 알부민(BSA), 트리톤™ X-100, 및 TRIzol® 시약은 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific, 미국 뉴햄프셔주 햄프턴 소재)으로부터 구입하였다. 단일클론 마우스 항-인간 HIV-1 p24(클론 Kal-1), 및 중합체 기반의 HRP-컨쥬게이트된 항-마우스 엔비젼(EnVision)™+ 2차는 다코(Dako, 미국 캘리포니아주 카핀테리아 소재)로부터 구입하였다. 열 불활성화된 풀링된 인간 혈청은 이노베이티브 바이올로직스(Innovative Biologics, 미국 버지니아주 헤른던 소재)로부터 구입하였다. 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)는 코닝 라이프 사이언시스(Corning Life Sciences, 미국 매사추세츠주 튜크스베리 소재)로부터 구입하였다.
CAB 프로드러그의 합성 및 특성화
일련의 3종의 프로드러그는 CAB의 10-하이드록실기를 에스테르화하여 MCAB, M2CAB, 및 M3CAB라고 명명된 14, 18 및 22개의 탄소 연결기를 갖는 친유성 프로드러그를 수득하여 합성하였다. 초기에, CAB를 무수 피리딘으로부터 건조시킨 다음, 무수 DMF 중에 현탁하였다. 혼합물을 아르곤하에 0℃로 냉각하였다. DIEA(2 당량)를 사용하여 CAB의 10-하이드록실기를 탈양성자화하고, 이를 24시간 동안 2 당량 미리스토일 클로라이드 또는 스테아로일 클로라이드와 추가로 반응시켜 각각 MCAB 또는 M2CAB를 수득하였다. M3CAB 합성은 2단계 공정이었다. 제1 단계에서, 베헨산의 카복실산기를 무수 클로로포름 중에서 4 당량 티오닐 클로라이드를 사용하여 염화시켜 베헤닐 클로라이드를 합성하였다. 무수 피리딘로부터 건조되고 4 당량 트리에틸아민의 존재하에 무수 DMF 중에 재현탁된 CAB를 아르곤하에 0℃에서 DMF 중의 베헤닐 클로라이드에 추가로 가한 다음, 50℃에서 24시간 동안 반응을 가열하였다. 모든 반응물 프로드러그를 초기 분획에 있어서 4:1 에틸 아세테이트:헥산의 초기 이동상 후, 나머지에 있어서 9:1 에틸 아세테이트:헥산을 사용하는 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 마지막으로, 프로드러그를 침전시키고, 디에틸 에테르로 세척하고, 진공하에 건조시켜 85-95%의 평균 수율로 백색 분말을 수득하였다. 프로드러그의 성공적인 합성은 500MHz, 11.7 T의 자기장 강도에서 작동하는 브루커 아밴스-III HD(Bruker Avance-III HD, 미국 매사추세츠주 밀레리카 소재)에 의해 기록된 양성자 및 탄소 핵 자기 공명(1H 및 13C NMR) 스펙트럼에 의해 확인하였다. 푸리에 변환 자외선 분석(FT-IR: Fourier Transform Infrared analysis)은 범용 감쇠전반사(UATR) 스펙트럼 2(PerkinElmer, 미국 매사추세츠주 월섬 소재)에서 수행하였다. 분말 X선 회절(XRD)에 의한 CAB 및 프로드러그의 비교 결정학적 분석은 40 kV, 45 mA 설정에서 Cu-Kα 방사선(1.5418 Å)으로 파날리티컬 엠피리언(PANalytical Empyrean) 회절계(PANalytical Inc., 미국 매사추세츠주 웨스트버러 소재)를 사용하여 1°/s 의 속도로 2-70°의 2θ 범위에서 수행하였다. 분자 질량은 워터스(Waters) TQD 질량 분석계로의 직접 주입에 의해 결정하였다.
CAB, MCAB, M2CAB, 및 M3CAB의 UPLC-UV/Vis 정량
TUV 검출기가 있는 워터스 ACQUITY 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC) H-클래스 시스템 및 엠파워(Empower) 3 소프트웨어(미국 매사추세츠주 밀포드 소재)를 사용하여 약물 농도를 측정하였다. CAB, MCAB, M2CAB, 및 M3CAB 샘플을 페노메넥스 키네텍스(Phenomenex Kinetex) 5 μm C18 컬럼(150 × 4.6 mm)(미국 캘리포니아주 토런스 소재)에서 분리하였다. 65% 50 mM 일염기성 인산칼륨(KH2PO4), pH3.2, 및 35% 아세토니트릴(ACN)로 구성된 이동상 및 1.0 mL/분의 유속을 사용하여, CAB를 254 nm에서 검출하였다. 각각 90% ACN 및 10% 물, 95% ACN 및 5% 물, 98% ACN 및 2% 물로 구성된 이동상 및 1.0 mL/분의 유속을 사용하여, MCAB, M2CAB, 및 M3CAB를 230 nm에서 검출하였다. 약물 함량은 메탄올 중의 약물 표준(0.05-50 μg/mL)으로부터의 피크 면적에 상대적으로 결정하였다.
약물 제제 수용해도의 측정
최적의 물 중의 CAB, MCAB, M2CAB 및 M3CAB의 수용해도는 물 1 mL에 과량의 약물 또는 프로드러그 분말을 가하여 포화 수용액을 만들어 측정하였다. 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 추가로, 용액을 14000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 용해되지 않은 분말을 펠렛화하였다. UPLC UV/Vis에 의한 약물 함량 분석을 위하여, 상청액을 수집하고 동결건조하고 메탄올 중에 용해시켰다.
화학적 안정성
실온 및 상승된 온도(37℃)에서 산성(pH 1), 염기성(pH 11) 및 중성(pH 7) 조건에서 MCAB, M2CAB 및 M3CAB의 안정성을 측정하였다. 각각의 프로드러그의 스톡 용액을 DMSO 중에 1 mg/mL의 농도로 제조하였다. 산성, 염기성 및 중성 검정을 위하여, 각각의 프로드러그의 스톡 용액 100 μL를 각각 0.1 M HCl, 0.1 M NaOH 또는 최적 등급의 물(7로 조절된 pH) 1900 μL에 가하였다. 그 다음, 샘플을 교반 조건(이노바(innova)® 42 쉐이커 배양기, 150 rpm)하에 실온 및 40℃에서 배양하였다. 샘플을 0, 2, 4, 8 및 24시간에 빼내고, -80℃에서 저장하였다. 그 후, 샘플을 UPLC-UV/Vis에 의해 약물 함량에 대하여 분석하였다.
혈장 절단 약물 가수분해 동역학
MCAB, M2CAB 및 M3CAB의 가수분해 동역학 및 활성 약물의 상대적인 방출을 상이한 종(마우스, 래트, 토끼, 원숭이, 개, 및 인간)의 혈장에서 측정하였다. MCAB, M2CAB 또는 M3CAB(1 μM)를 100 μL 혈장 중에서 37℃에서 배양하였다. 상이한 시간점에서, 1 mL 산성화된 메탄올(프로드러그 가수분해를 피하기 위한 0.1% 포름산 및 25 mM 포름산암모늄)을 각각의 샘플에 가하고, 3분 동안 보텍싱하여 반응을 중단시켰다. 0분 시간점에 있어서, 얼음처럼 차가운 혈장 100 μL를 프로드러그 스톡 용액과 혼합하고, 얼음처럼 차가운 산성 메탄올 1 ml를 즉시 가하였다. 메탄올의 첨가 후, 샘플을 15,000 g에서 10분 동안 원심분리하고, 수집된 상청액을 UPLC-MS/MS(Waters Xevo TQ-XS)에 의해 약물 함량에 대하여 분석하였다.
나노입자 합성 및 특성화
모 CAB의 나노제제(NCAB) 및 이의 프로드러그의 나노제제(NMCAB, NM2CAB 및 NM3CAB)를 폴록사머 계면활성제, 407(P407)을 사용하여 고압 균질화로 제조하였다. 약물/프로드러그 및 P407를 내독소 무함유 물 중에서 24시간 동안 2%-20% w/v 약물/프로드러그 및 0.2-2% w/v P407의 농도 범위로 예비 혼합하였다(10:1 w/w). 예비 혼합물을 ~18,000 psi에서 아베스틴(Avestin) 에멀시플렉스-C3(EmulsiFlex-C3) 고압 균질화기(캐나다 온타리오주 오타와 소재)을 사용하여 추가로 균질화하여 원하는 입자 크기의 균질한 나노결정을 생성하였다. 말번 나노-ZS(Nano-ZS)(영국 우스터셔 소재)를 사용하하는 동적 광산란(DLS)에 의해 입자 크기(Deff), 다분산도(PDI), 및 제타 전위에 대하여 나노입자를 특성화하였다. 나노제제의 안정성은 4, 25 및 37℃에서 3개월 동안 모니터링하였다. 나노제제 중의 약물/프로드러그 함량은 나노제제를 메탄올(희석률 범위: 1000-10000) 중에 용해시켜 측정하고, UPLC UV/Vis로 분석하였다. 하기 식을 사용하여 캡슐화 효율을 계산하였다. 캡슐화 효율(%) = (제제 중의 약물의 중량 / 첨가된 약물의 초기 중량) × 100. 나노입자의 형태학은 주사 전자 현미경(SEM)으로 평가하였다. 나노입자를 4℃에서 24시간 동안 0.1 M 소렌슨 인산염 완충제(pH 7.2) 중의 2% 글루타르알데히드, 2% 파라포름알데히드의 용액 중에 고정하고, 이미지를 위하여 처리하였다. 간략하게, 나노현탁액을 금/팔라듐 합금 약 50 nm로 코팅된 SEM 샘플 스터브 및 스퍼터 상에 삽입된 유리 커버슬립 상에서 공기 건조시켰다. 5.0 kV에서 작동된 FEI 콴타(Quanta) 200 주사 전자 현미경(미국 오리건주 힐즈버러 소재)을 사용하여 샘플을 검정하였다(Sillman, et al., Nat. Commun.(2018) 9:443).
대식세포로부터 유래된 인간 단핵구(MDM)
인간 단핵구를 HIV-1/2 및 B형 간염 혈청반응음성 공여자로부터의 백혈구성분채집술로 수득한 후, 역류 원심분리 세정으로 정제하였다(Gendelman, et al., J. Exper. Med.(1988) 167:1428-1441). 단핵구를 10% 열 불활성화된 풀링된 인간 혈청, 50 μg/mL 젠타마이신, 및 10 μg/mL 시프로플록사신으로 보충된 4.5 g/L 글루코스, L-글루타민, 및 나트륨 피루베이트를 함유한 DMEM 배지에서 배양하였다. 세포를 37℃에서 5% CO2 배양기에서 유지하였다. 재조합 인간 대식세포 집락 자극 인자(MCSF, 1000 U/mL)를 첫 7일 동안 배양 배지에 가하여 단핵구 유도된 대식세포(MDM) 분화를 촉진하였다. 배양 배지의 절반을 새로운 배지로 격일마다 교체하였다. 분화 후, MDM을 하기 시험관내 검정에 사용하였다.
세포독성 검정
나노입자에 의한 처리 후, MTT 검정을 수행하여 세포 생존능을 평가하였다. 웰당 0.08 x 106 세포의 밀도로 96-웰 플레이트에 플레이팅된 인간 MDM을 10, 25, 50, 100, 200, 또는 400 μM NCAB, NMCAB, NM2CAB 또는 NM3CAB로 24시간 동안 처리하였다. 처리되지 않은 세포를 대조군으로 사용하였다. 각각의 군에 있어서 샘플은 4중으로 수행하였다. 세포를 PBS로 세척하고, MTT 용액(5 mg/mL) 100 μL/웰과 함께 45분 동안 37℃에서 배양하였다. 배양 후, MTT 용액을 제거하고, 세포를 PBS로 세척하였다. 그 다음, DMSO 200 μL를 각각의 웰에 가하고, 흡광도를 소프트맥스 프로(SoftMax Pro) 6.2 소프트웨어(미국 캘리포니아주 서니베일 소재)와 함께 몰러큘 디바이시스 스펙트라맥스(Molecular Devices SpectraMax)® M3 플레이트 리더에서 490 nm에서 측정하였다.
약물 입자 MDM 흡수, 체류 및 방출의 연구
MDM 흡수 및 체류 연구를 투명한 평저 12-웰 플레이트에서 웰당 1.0 × 106 세포의 밀도로 수행하였고, 각각의 처리군은 3중으로 완료하였다. 세포 흡수 연구를 위하여, MDM을 100 μM NCAB, NMCAB, NM2CAB 또는 NM3CAB로 처리하였다. MDM을 처리 후 2, 4, 8 및 24시간에 수집하여 세포내 약물 및 프로드러그 수준을 측정하였다. 체류 연구에 있어서, MDM을 100 μM NCAB, NMCAB, NM2CAB, 또는 NM3CAB으로 8시간 동안 처리한 다음, 인산염 완충 식염수(PBS)로 2회 세척하였다. 새로운 배양 배지를 가하고, 배지의 절반을 격일마다 교체하였다. MDM을 1, 5, 10, 15, 20, 25 및 30일에 수집하여 세포내 약물 및 프로드러그 농도를 검정하였다. 두 연구 모두에 있어서, 기재된 시간점에서, 부착성 MDM을 PBS로 2회 세척하였다. 그 다음, 세포를 PBS로 긁어내고, 인비트로겐(Invitrogen) 카운테스™ 자동화 세포 계수기(미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재)를 사용하여 계수하였다. PBS 중의 세포 현탁액을 3,000 rpm에서 8분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 세포 펠렛을 프로브 초음파기를 사용하여 메탄올 200 μL 중에서 초음파 처리하여 세포내 약물을 추출하였다. 결과물을 20,000 g에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하여 약물 함유 상청액으로부터 세포 파편을 분리하였다. 샘플을 UPLC-UV/Vis로 약물 및 프로드러그 함량에 대하여 추가로 분석하였다. 방출 연구에 있어서, MDM에 의해 방출된 약물 및 프로드러그의 정량을 위하여, 체류 연구에서의 시간점과 유사한 시간점에서 배양 배지를 수집하였다. 배양 배지를 메탄올과 혼합하여 배양 배지 중에 용해되지 않은 성분을 침전시키고, 약물 및 프로드러그를 추출하였다. 혼합물을 17,000 g에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하여 불용성 침전물을 분리하였다. 상청액을 새로운 튜브로 옮겨 속도 진공에서 건조시켰다. 건조된 내용물을 UPLC-UV/Vis에 의한 추가의 분석을 위하여 메탄올 중에 현탁하였다.
투과 전자 현미경(TEM)에 의한 입자 특성화
MDM을 NCAB, NMCAB, NM2CAB 또는 NM3CAB로 100 μM의 농도로 8시간 동안 처리한 다음, PBS로 2회 세척하였다. 새로운 배양 배지를 가하고, 배지의 절반을 격일마다 교체하였다. MDM 배양 상청액을 약물 입자 처리 후 0, 15, 및 30일에 수집하고, TEM로 분석하여 세포내 나노입자를 이미지화하였다. 제0일에, 8시간 처리 기간 직후에 세포를 수집하였다. 기재된 시간점에서, 세포를 세척하고, PBS로 긁어내고, 3000 rpm에서 8분 동안 실온에서 펠렛화하고, 0.1 M 소렌슨 인산염 완충제(pH 6.2) 중의 2% 글루타르알데히드, 2% 파라포름알데히드 용액 중에서 고정시켰다. 고정된 세포 현탁액 1 방울을 포름바/실리콘 모녹사이드 200 메쉬 구리 그리드에 놓고, 2분 동안 자리잡도록 두었다. 과량의 용액을 윅킹(wicking)하고 건조되도록 두었다. 나노반(NanoVan) 바나듐 음성 염색 1방울을 그리드에 1분 동안 놓은 다음, 윅킹하고, 건조되도록 두었다. 그리드를 80 kV로 작동되는 FEI 테크나이(Tecnai) G2 스피릿(Spirit) TWIN 투과 전자 현미경(미국 오리건주 힐즈버러 소재)에서 시험하였다. 이미지를 AMT 디지털 이미징 시스템(미국 매사추세츠주 워번 소재)으로 디지털로 획득하였다(Sillman, et al., Nat. Commun.(2018) 9:443).
HIV-1 감염 및 감염된 세포액에서 역전사효소(RT) 활성의 측정
MDM을 투명한 평저 24-웰 플레이트에 0.8 × 106 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. MDM을 100 μM NCAB, NMCAB, NM2CAB 또는 NM3CAB로 8시간 동안 처리하였다. 처리 후, 세포를 PBS로 세척하고, 새로운 배양 배지에서 격일로 배지의 절반을 교체하면서 배양하였다. 처리 후, 1, 5, 10, 15, 20, 25 및 30일에, 세포를 16시간 동안 웰당 0.1 전염성 입자의 감염(MOI)의 다중도로 HIV-1ADA(대식세포 열대 바이러스 균주)로 감염시켰다. 감염 기간 후, MDM을 PBS로 세척하고, 새로운 배지로 보충하였다. 세포를 다음 10일 동안 배지의 절반을 격일마다 교체하면서 배양하고, 제8일에 배지 전체를 교체하였다. HIV-1 RT 활성의 측정을 위하여 배양 배지를 감염 후 제10일에 수집하였다(Kalter, et al., J. Immunol.(1991) 146:3396-3404; Nowacek, et al., J. Neuroimmune Pharm.(2010) 5:592-601). 감염의 정도는 처리되지 않은 감염된 MDM에 대한 RT 활성의 퍼센트로서 표시하였다. 세포를 2% PFA 중에서 고정하고, HIV-1 p24 항원의 발현을 면역세포화학으로 측정하였다(Nowacek, et al., J. Neuroimmune Pharm.(2010) 5:592-601).
절반 최대 유효 농도(EC 50 ) 검정
MDM을 투명한 평저 96-웰 플레이트(0.08 × 106 세포/웰)로 플레이팅하였다. 세포를 4시간 동안 다양한 약물 농도, 0.01-1000 nM CAB, MCAB, M2CAB, M3CAB, NCAB, NMCAB, NM2CAB, 또는 NM3CAB로 HIV-1ADA(세포당 0.1 전염성 입자의 MOI)로 감염 전 1시간 동안 처리하였다. 바이러스 챌린지 4시간 후, 세포를 세척하고, 약물(0.1-1000 nM)을 함유한 새로운 배지를 제공하였다. 후속적으로, 세포 상청액을 10일 후 수집하고, 상기 기재된 바와 같은 HIV-1 RT 활성에 대하여 검정하였다.
표준으로서 CEM-ss 세포를 사용하는 CD4+ T 세포에서 나노입자 흡수
CEM-ss CD4+ T 세포를 10% 소 태아 혈청, 100 U/mL 페닐실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 중에 현탁시켰다. 세포 현탁액(1 mL/웰)을 1시간 동안 폴리-L-리신 용액(증류수 중의 500 μg/mL)으로 미리 코팅된 투명한 평저 12-웰 플레이트에 가하였다. 웰 표면에 대한 부착 후, 세포를 25 μM NCAB, NMCAB, NM2CAB 또는 NM3CAB로 처리하였다. 2, 4 및 8시간에, 세포를 세척하고, PBS로 긁어냈다. 세포 현탁액을 200 g에서 5분 동안 원심분리하고, 세포내 약물 및 프로드러그 농도를 워터스 TQD 질량 분광계로 정량하였다. CEM-ss CD4+ T 세포주에서 나노입자의 흡수는 25 μM 농도로 처리 8시간 후 TEM 이미지화에 의해 확인되었다. TEM 이미지화를 위한 샘플 처리는 상기 기재되어 있다.
약동학(PK) 및 생물분포(BD) 마우스 연구
NSG 마우스(암컷, 6-8주, Jackson Labs, 미국 메인주 바 하버 소재)에 40 μL/25 g 마우스로 단일 근육내(IM, 꼬리 허벅지 근육) 주사로 NCAB, NMCAB, NM2CAB 또는 NM3CAB 45 mg/kg CAB-당량을 투여하였다. 주사 후, 투여 후 제1일에, 그 다음, 제364일까지 매주 뺨 천자(하악 정맥, MEDIpoint, Inc., 미국 뉴욕주 미네올라 소재)로 혈액 샘플을 헤파린 처리된 튜브에 수집하였다. 수집된 혈액(25 μL)을 ACN 1 mL로 즉시 희석하고, -80℃에서 약물 측정까지 저장하였다. 잔여 혈액 샘플을 혈장 수집을 위하여 2,000 g에서 8분 동안 원심분리하였다. 혈장을 수집하고, -80℃에서 약물 함량의 분석을 위하여 저장하였다. 하기 투여 후 제14일, 제28일, 제42일 및 제364일에, 동물을 이소플루란 흡입 후, 경부 탈구로 인도적으로 안락사시켰다. CAB 및 프로드러그 농도의 정량을 위하여 비장, 림프절, 간, 폐, 장, 신장, 뇌, 질 조직, 및 직장 조직을 수집하였다. 제보(Xevo) TQ-S 마이크로 질량 분석계에 연결된 워터스 ACQUITY H-클래스 UPLC(Waters, 미국 매사추세츠주 밀퍼드 소재)를 사용하여 UPLC-MS/MS로 CAB, MCAB, M2CAB 및 M3CAB를 마우스 혈장, 혈액 및 조직에서 정량하였다. 샘플 처리 및 UPLC-MS/MS 분석을 위한 모든 용매는 LCMS-등급(Fisher)이었다. 혈장 및 혈액 샘플에 있어서, 샘플 25 μL를 내부 표준(IS) 10 μL와 혼합된 아세토니트릴(ACN) 1 mL에 가하였다. d3-돌루테그라비르(d3-DTG), 미리스토일화된 돌루테그라비르(MDTG), 및 스테아로일화된 다루나비르(SDRV)를 각각 200, 20 및 20 ng/mL의 최종 농도로 IS로서 각각 CAB, MCAB 및 M2CAB/M3CAB 분석에 사용하였다. 샘플을 보텍싱하고, 17,000 Х g에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 상청액을 수집하고, 스피드백(SpeedVac)®을 사용하여 건조시키고, 80% 메탄올 100 μL 중에 재구성하고; 10 μL를 MCAB, M2CAB, 및 M3CAB UPLC-MS/MS 분석을 위하여 주입하였다. CAB, MCAB, M2CAB, 및 M3CAB에 있어서 0.2-2000 ng/mL 범위로 표준 곡선을 블랭크 마우스 혈장/혈액 중에서 제조하였다. 조직 약물 정량을 위하여, 샘플 3-200 mg을 90% 메탄올을 함유한 0.1% v/v 포름산 및 2.5 mM 포름산암모늄의 4-29 부피 중에서 균질화하였다. 조직 균질액 100 μL에 0.1% 포름산 및 2.5 mM 포름산암모늄, 80% 메탄올(10 μL), 및 IS(10 μL)를 함유한 메탄올 280 μl를 가한 후, 3분 동안 보텍싱하고, 17,000 Х g에서 15분 동안 원심분리하였다. MCAB, M2CAB 및 M3CAB 분석을 위하여, 상청액 85 μl를 물 15 μl와 혼합하였다. CAB 분석을 위하여, 상청액 20 μl를 50% ACN 80 μl와 혼합하였다. 이들 분취액을 보텍싱하고, 17,000 x g에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액 10 μl를 LC-MS/MS 분석에 사용하였다. 혼합 용액(CAB/MCAB/M2CAB/M3CAB, 50% ACN 중의 5-20,000 ng/mL) 10 μL를 갖는 블랭크 조직 균질액을 유사하게 사용하여 표준을 제조하였다. CAB 정량을 위하여, 0.25 mL/분의 유속으로 이동상 A(포름산을 사용하여 pH 3로 조절된, 물 중의 7.5 mM 포름산암모늄) 및 이동상 B(100% ACN)의 10분 구배를 사용하여, CAB 샘플 10 μL의 크로마토그래피 분리를 워터스 ACQUITY UPLC BEH 쉴드 RP18 컬럼(1.7 μm, 2.1 mm x 100 mm)에서 수행하였다. 처음 3.5분 동안, 이동상 조성물은 35% B이고, 0.5분 동안 95% B로 증가하고, 1.5분 동안 일정하게 유지되었다. 그 다음, 이동상 B는 0.5분 동안 35%로 재설정되고, 컬럼은 다음 주사 전에 1분 동안 평형 상태가 되었다. MCAB 및 M2CAB 정량을 위하여 크로마토그래피 분리를 8분 구배 방법으로 0.28 mL/분의 유속으로 더 짧은 30 mm 컬럼(PN) 상에서 달성하였다. 초기 이동상 조성물은 처음 2분 동안 80% B이고, 4분 동안 95% B로 증가하고, 0.75분 동안 일정하게 유지되고, 0.25분 동안 80%로 재설정되고, 컬럼은 다음 주사 전에 1분 동안 평형 상태가 되었다. M3CAB 정량을 위하여 크로마토그래피 분리는 또한 8분 구배 방법으로 0.35 mL/분의 유속으로 더 짧은 30 mm 컬럼에서 달성되었다. 초기 이동상 조성물은 처음 5분 동안 88% B이고, 0.25분 동안 95% B로 증가하고, 1.5분 동안 일정하게 유지되고, 0.25분 동안 88%로 재설정되고, 컬럼은 다음 주사 전에 1분 동안 평형 상태가 되었다. CAB, MCAB, M2CAB, 및 M3CAB는 양성 이온화 모드에서 각각 10 V, 24 V, 2 V 및 20 V의 콘 전압 및 각각 24 V, 18 V, 24 V 및 26 V의 충돌 에너지에서 검출되었다. CAB, MCAB, M2CAB, M3CAB, d3-DTG, MDTG 및 SDRV를 위하여 사용된 다중 반응 모니터링(MRM) 전이는 각각 406.04 > 126.93, 616.28 > 406.09, 672.34 > 406.07, 728.47>406.09, 422.84 > 129.99, 630.20 > 420.07 및 814.52 > 658.44이었다. 매스링크스(MassLynx) 소프트웨어 버젼 4.1으로 스펙트럼을 분석하고 정량하였다. 모든 정량은 분석물 피크 면적 대 내부 표준 피크 면적 비를 사용하여 측정하였다. NSG 마우스에서 PK 및 BD 분석 후, 모든 제제 중에서 우수한 NM2CAB를 마우스, BALB/cJ(숫컷, 6-8주, Jackson Labs)의 또 다른 계통에서 다시 평가하였다. NCAB를 대조군으로 사용하였다. NM2CAB가 주사된 마우스를 투여 후 제280일에 인도적으로 안락사시켰다. 수집된 혈장 및 조직에서 약물 및 프로드러그 정량은 상기와 유사하였다. NSG 마우스에서 연구를 위하여 피닉스 윈놀린-8.0(Phoenix WinNonlin-8.0)(Certara, 미국 뉴저지주 프린스턴 소재)을 사용하여, 혈장 CAB에 대한 비구획적 PK 분석을 수행하였다.
레수스 원숭이(RM)에서 PK 및 BD
4마리의 숫컷 RM(4.4-6.7 kg; PrimeGen)을 케타민(10 mg/kg)으로 마취하고, 후속적으로 45 mg/kg CAB-당량의 NM2CAB 및 실험실 제조된 RPV 프로드러그를 IM 주사(사두근 대퇴근, 0.5 mL/kg)로 투여하였다. 완전한 혈액 계수(CBC), 대사 프로파일을 위하여, 혈액 샘플을 칼륨-EDTA 코팅된 튜브에 수집하였다. 약물 측정을 위하여 혈장을 분리하였다. 약물 정량을 위하여 주사 후 제204일에 림프절, 지방 및 직장 조직의 조직 생검을 수집하였다. 혈장 및 조직에서 약물 및 프로드러그를 위한 정량 방법은 마우스 연구에 상기 기재된 바와 유사하였다.
통계 분석
그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 7.0 소프트웨어(미국 캘리포니아주 라호이아 소재)를 사용하여 통계 분석을 만들었다. 시험관내 연구의 데이터는 최소 3개의 생물학적 복제물로 평균 ± SEM로 표시하고, 생체내 연구 결과는 최소 3개의 생물학적 복제물로 평균 ± SEM로 표시하였다. 2개의 군 사이의 비교를 위하여, 스튜던트 t 시험(양측)을 사용하였다. 일방향 ANOVA 후, 터키 시험을 사용하여 3개 이상의 군을 비교하였다. 통계적 유의도는 하기와 같이 기재하였다: *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.
연구 승인
모든 동물 연구는 실험실 동물의 관리 및 사용 지침(National Research Council of the National Academies, 2011)에 포함된 표준에 따라 네브라스카 대학 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 승인되었다. 인간 단핵구는 승인된 UNMC 기관 감사 위원회 면제 프로토콜에 따라 HIV-1/2 및 B형 간염 혈청반응음성 공여자로부터 백혈구성분채집술로 단리하였다.
결과
프로드러그 합성 및 특성화
14, 18, 및 22개의 다양한 탄소 길이의 지방산 쇄을 부착함으로써 화학적으로 CAB를 개질하여 각각 에스테르 MCAB, M2CAB, 및 M3CAB를 제조하였다. 프로드러그를 핵 자기 공명(NMR)으로 추가로 특성화하여 합성을 확인하였다. 모든 3종의 프로드러그의 1H NMR 스펙트럼은 0.86-0.89, 1.77-1.78 및 2.66-2.70 ppm의 범위에서 삼중항 및 지방산 알킬쇄의 말단 메틸 및 반복 메틸렌 양성자에 상응하는 1.24-1.25 ppm 범위에서 넓은 단일항을 나타냈다. 11.5 ppm에서 페놀 양성자 피크의 부재는 지방 아실 잔기에 의한 CAB의 하이드록실 양성자의 치환을 확인해주었다. 각각의 프로드러그의 13C NMR 스펙트럼은 컨쥬게이트된 지방족 쇄의 탄소 원자를 확인해주었다. 전자분무 이온화 질량 분석법(ESI-MS)은 모든 프로드러그의 분자량을 확인해주었다. MCAB에 대한 ESI-MS 주입은 616.28 m/z에서 강한 신호를 생성하였고, M2CAB에 대한 ESI-MS 주입은 672.34 m/z에서 강한 신호를 생성하였고, M3CAB에 대한 ESI-MS 주입은 728.47 m/z에서 강한 신호를 생성하였다. 푸리에 변환 자외선 분광법(FTIR) 프로드러그 특성화는 2908-2935 및 1748-1775 cm-1 범위에서 CAB에 대하여 관찰되지 않은 밴드를 생성하였다. 이들은 각각 지방족 메틸렌기에서 C-H 스트레치 및 에스테르 결합에서 카복실기에 상응하는 C=O 스트레치에 상응한다. 2θ=2-70°상의 XRD 스펙트럼은 프로드러그 MCAB, M2CAB 및 M3CAB의 결정질 특징을 보여주었다. M2CAB의 나노입자는 프로드러그의 결정질 성질을 유지하였다. MCAB(2.83 ± 1.37 μg/mL), M2CAB(1.91 ± 0.23 μg/mL) 및 M3CAB(1.51 ± 0.7 μg/mL)의 수용해도에서 유의미한 순차적인 감소가 CAB(12.12 ± 0.41 μg/mL)와 비교하여 관찰되었다. 게다가, CAB(0.09 ± 0.002 mg/mL)와 비교하여, MCAB(2.31 ± 28.15 mg/mL), M2CAB(2.64 ± 0.02 mg/mL) 및 M3CAB의 1-옥탄올 용해도에서 평행하고 유의미한 증가가 관찰되었다. 이들 결과는 지방산 컨쥬게이트에 의한 화학적 개질의 결과로서 CAB와 비교하여 프로드러그의 소수성 및 친유성의 증가를 확인해주었다.
프로드러그는 생리학적 조건에서 활성 약물로 생물전환되기 위하여 효소적 또는 가수분해적 활성화가 필요한 약물학적으로 불활성인 화합물이다. 따라서, MCAB, M2CAB 및 M3CAB 및 후속적인 CAB 형성의 가수분해 동역학을 상이한 종(마우스, 래트, 토끼, 원숭이, 개, 및 인간)의 혈장에서 평가하였다. 시험된 모든 종의 혈장에서의 배양을 기반으로, MCAB는 30분 내에 85% 초과의 절단을 나타냈고, M2CAB는 2시간까지 평균 75%의 절단을 나타냈고, 6시간까지 80% 절단을 나타냈다. M3CAB는 혈장에서 배양 24시간 후, 남아있는 약 50% 프로드러그로 가장 느린 절단율을 나타냈다. 이들 연구는 MCAB가 CAB로 신속하게 전환되었다는 것을 보여주었고, M3CAB는 CAB로 가장 적은 전환을 보여주었다. M2CAB 가수분해로부터의 CAB 형성은 6시간까지 평균 71.1%이었고, 이는 생리학적 조건에서 안정성 및 활성 약물 형성의 관점에서 M2CAB가 최적의 프로드러그인 것을 의미한다. 다양한 동물 종의 혈장 중에서 프로드러그 가수분해의 속도에서 일부 차이가 존재하였다. 시험된 종 중에서 혈장 CAB 농도의 변동성은 프로드러그 가수분해를 위하여 작동하는 체지방 분포, 근육량, 물리적 활성 및 혈장 카복실에스테라제 효소에서의 차이의 결과일 수 있다(Trezza, et al., Curr. Opin. HIV AIDS(2015) 10:239-245; Bahar, et al.(2012) J. Pharm. Sci.(2012) 101:3979-3988; Wang, et al., Acta Pharmaceutica Sinica. B(2018) 8:699-712). 게다가, M2CAB의 화학적 안정성을 24시간 동안 산성(pH 1), 중성(pH 7), 및 염기성 조건(pH 11)에서 실온 및 상승된 온도(37℃)에서 측정하여 다양한 저장 조건에서 프로드러그 나노제제의 장기간 안정성을 측정하였다. 실온에서, 24시간에서, 산성 조건에서 19% 가수분해, 및 중성 조건에서 24% 가수분해가 측정되었다. 그러나, 염기성 조건에서 M2CAB는 완전하게 가수분해되었고, 검출되지 않았다. 37℃에서, 24시간에, 약 >95% 프로드러그가 산성 조건에서 가수분해되었고, 28% 프로드러그가 중성 조건에서 가수분해되었다. 반면, 염기성 조건에서 M2CAB는 2시간 내에 완전히 가수분해되었다. 프로드러그, MCAB, M2CAB 및 M3CAB의 절반 최대 유효 농도(EC50) 값을 CAB와 비교하여, 만약에 있다면, 화학적 개질로 인한 항레트로바이러스 활성에서의 변화를 측정하였다. HIV-1ADA로 감염된 MDM의 배양 배지의 HIV-1 RT 활성 측정은 CAB(28.39 nM), MCAB(34.19 nM), M2CAB(44.71 nM), 및 M3CAB(51.15 nM)의 EC50 값이 유사하다는 것을 증명하였고, 이는 약물 활성에 대한 유의미한 효과가 없음을 나타낸다.
나노제제 제조 및 특성화
고압 균질화를 이용하여 탑 다운(top down) 합성으로 CAB(NCAB), MCAB(NMCAB), M2CAB(NM2CAB) 및 M3CAB(NM3CAB)의 나노제제를 제조하였다. 약물 또는 임의의 프로드러그의 캡슐화 효율은 >85%이었다. 폴록사머 407(P407) 계면활성제는 입자 표면 안정화를 제공하였다. 나노입자 크기, 다분산도(PDI), 및 제타 전위는 실온(RT), 4℃, 및 37℃에서 DLS로 측정하였다. 모든 제제는 98일까지 안정하게 남아 있었고, 이는 이들 제제가 다양한 저장 조건에서 이들의 물리적 완전성을 유지할 수 있다는 것을 의미한다. 게다가, 온도 변이는 연구 기간 동안 임의의 제제의 물리화학적 성질에 영향을 미치지 않았다. 제조일에, NCAB에 대한 평균 입자 크기, PDI 및 제타 전위는 294.5 ± 1.8 nm, 0.23 ± 0.01, -28.3 ± 0.21 mV이고; NMCAB에 대한 것은 302.1 ± 10.8 nm, 0.23 ± 0.01, -31.1 ± 1.1 mV이고; NM2CAB에 대한 것은 359.7 ± 3.63 nm, 0.23 ± 0.02, -31.3 ± 0.1 mV이고; NM3CAB에 대한 것은 268.47 ± 6.9 nm, 0.23 ± 0.03, -31.1 ± 0.06 mV이었다. 제조 후 제98일에, NCAB에 대한 물리화학적 파라미터는 327.5 ± 4.9 nm, 0.21 ± 0.04, -18.2 ± 0.25 mV이고; NMCAB에 대한 것은 388.7 ± 6.4 nm, 0.22 ± 0.03, -24.8 ± 2.87 mV이고; NM2CAB에 대한 것은 369.5 ± 2.5 nm, 0.19 ± 0.03, -19.6 ± 0.53 mV이고; NM3CAB에 대한 것은 245.6 ± 2.6 nm, 0.27 ± 0.06, -25.7 ± 0.56 mV이었다. SEM 이미지는 NCAB, NMCAB, NM2CAB 및 NM3CAB 나노입자가 균일한 막대 형상의 형태학을 가졌다는 것을 보여주었다. 재현성의 확인을 위하여, NM2CAB 제제를 11개의 분리된 배치에서 제조하였다(표 1). 나노입자 크기는 좁은 PDI(0.18 ± 0.03 내지 0.33 ± 0.03)를 갖는 243.00 ± 2.48 내지 378.00 ± 1.90 nm로 다양하였다.
Figure pct00011
프로드러그의 항레트로바이러스 활성에 대한 나노제제의 효과(EC50)를 측정하였다. NCAB, NMCAB, NM2CAB, 또는 NM3CAB의 항바이러스성 활성을 다양한 농도(0.01-1000 nM)에서 MDM 중에서 측정하고, 0.1의 MOI에서 HIV-1ADA로 바이러스 챌린지 후, HIV-1 역전사효소 활성에 의해 측정하였다. EC50 값은 나노제제화되지 않은 약물 또는 프로드러그와 비교하여 증가하였고, 이는 아마도 프로드러그의 절단 전에 나노입자의 필요한 용해로 인한 것으로 보인다. EC50 값은 NCAB(39.83 nM), NMCAB(89.67 nM), NM2CAB(37.02 nM) 중에서 유사하였다. 그러나, NM3CAB에 대한 EC50 값은 유의미하게 증가하였다(~1.78E+06 nM). 이는 프로드러그 및 활성 CAB의 후속 세대의 더 느린 절단 뿐만 아니라 나노제제의 세포내 안정성의 효과일 수 있다. 프로드러그 나노제제의 추가의 특성화 및 시험관내 연구를 위한 처리 농도의 결정을 위하여, 세포 활력을 MTT 검정으로 MDM 및 CEM-ss CD4+ T 세포에서 평가하였다. MDM에서, 세포독성은 모든 나노제제에 있어서 시험된 범위의 농도(10-400 μM)에서 보이지 않았다. CEM-ss CD4+ T 세포에서, 세포독성은 50 μM 이상의 농도에서 측정되었다. 따라서, 모든 나노제제에 대한 처리 농도는 MDM에서 검정에 있어서 100 μM이고, CEM-ss CD4+ T 세포에서 연구에 있어서 25 μM이었다.
MDM 및 CEM-ss CD4+ T 세포에서 시험관내 스크리닝
대식세포를 세포 약물 데포 및 담체로서 성공적으로 이용할 수 있다. 이들의 식세포 성질 및 신체 전반에서 이동하는 능력 때문에(Zhou, et al., Biomaterials(2018) 151:53-65; Darville, et al., J. Pharm. Sci.(2014) 103:2072-2087; Aderem, et al., Ann. Rev. Immunol.(1999) 17:593-623; Dou, et al., 혈액(2006) 108:2827-2835), MDM은 바이러스 저장소로의 약물 전달 시스템의 역할을 할 수 있다. 그러므로, MDM을 시험관내 시스템으로서 사용하여 나노제제를 평가하였다(Zhou, et al., Biomaterials(2018) 151:53-65; Hilaire, et al., J. Control Release(2019) 311-312:201-211; Ibrahim, et al., Int. J. Nanomedicine(2019) 14:6231-6247; Lin, et al., Chem. Commun.(2018) 54:8371-8374; Sillman, et al., Nat. Commun.(2018) 9:443; Smith, et al., Biomaterials(2019) 223:119476; Soni, et al., Biomaterials(2019) 222:119441).
24시간까지 100 μM NCAB, NMCAB, NM2CAB 또는 NM3CAB로 처리한 후 약물 및 프로드러그 수준을 측정하여 MDM에서 흡수 검정을 수행하였다. NMCAB, NM2CAB 및 NM3CAB에 대하여 측정된 세포내 프로드러그 수준은 24시간까지 각각 61.69 ± 0.78, 84.07 ± 5.82, 및 73.34 ± 13.59 nmoles/106 세포이고; 각각 NCAB, NMCAB, NM2CAB 또는 NM3CAB에 대하여 세포내 CAB 수준은 0.58 ± 0.11, 12.31 ± 0.46, 17.79 ± 2.92, 및 7.97 ± 1.76 nmoles/106 세포이었다. 그 후, 세포 약물 및 프로드러그를 보유하는 대식세포의 수용력을 단일 치료 후 30일의 기간 동안 평가하였다. MDM을 8시간 동안 100 μM NCAB, NMCAB, NM2CAB 또는 NM3CAB로 처리하였다. 세포내 프로드러그 수준은 단일 처리 후, 30일까지 지속되었다. 구체적으로, NMCAB, NM2CAB 및 NM3CAB에 대하여 제30일에 측정된 세포내 프로드러그의 양은 0.41 ± 0.09, 14.21 ± 2.28, 및 26.70 ± 3.29 nmoles/106 세포이었다. 유사하게, 프로드러그 절단으로부터 형성된 세포내 CAB 수준을 30일까지 측정하였다. NM2CAB 및 NM3CAB에 대하여 제30일에 측정된 세포내 CAB 수준의 양은 1.71 ± 0.35 및 2.05 ± 0.10 nmoles/106 세포이었다. 반면, 세포내 CAB 수준은 NCAB 처리 후 24시간 내에 정량의 한계 아래로 떨어졌고, NMCAB 처리 후 세포내 CAB 농도는 제25일까지 측정하였고(0.09 ± 0.04 nmoles/106 세포), 제30일에는 검출 가능하지 않았다. 체류 검정과 동시에, 배양액으로 방출된 CAB를 30일 동안 측정하였다. NM2CAB는 제30일에 1.0 ± 0.10 nmoles/106 세포의 약물 수준으로 가장 많은 지속된 CAB 방출을 보여주었다. CAB는 NCAB 및 NM3CAB 처리와 함께 검출되지 않았다. 프로드러그는 임의의 처리에 있어서 배양 배지에서 검출되지 않았고, 이는 프로드러그 생물전환을 나타낸다.
그 다음, MDM의 TEM 이미지를 8시간 동안 나노제제에 의한 처리 후 제0일, 제15일, 제30일에 수득하여 세포질 소포에서 나노입자의 존재를 평가하였다. TEM 이미지는 MDM에서 제30일까지 프로드러그 나노제제(NM2CAB 및 NM3CAB)의 존재를 확인해주었고, 이는 MDM의 약물-데포 성질을 의미하고; 흡수, 체류 및 방출 결과를 입증하였다. MDM에서 관찰된 것을 반영한 25 μM 농도에서 처리 후 CD4+ T 세포에서 NCAB, NMCAB, NM2CAB 또는 NM3CAB의 흡수를 측정되었다. 8시간 동안 NCAB, NMCAB, NM2CAB 또는 NM3CAB의 단일 처리 후 CEM-ss CD4+ T 세포 상에서 수행된 TEM 이미지화는 세포질 구획에서 나노입자의 존재를 확인해주었다.
MDM에서 지속된 약물 체류가 HIV-1 감염으로부터 보호할 것인지 여부를 시험하기 위하여, 세포를 100 μM NCAB, NMCAB 또는 NM2CAB로 8시간 처리 후 30일까지 HIV-1ADA로 챌린지하고, HIV-1 RT 활성에 대하여 정량적으로 검정할 뿐만 아니라 HIV-1 p24 항원 발현에 대하여 정성적으로 검정하였다. NM3CAB는 원하는 EC50 값에서 유의미한 보호를 나타내지 않았기 때문에 이러한 연구에 대하여 선택되지 않았다. NM2CAB 처리는 HIV-1 RT 활성을 제30일까지 억제하고, 이는 HIV-1 p24 발현의 부재에 의해 확인되었다. 대조적으로, 완전한 바이러스 돌파는 NCAB 처리 후 제1일 및 NMCAB 처리 후 제20일에 발생하였다. 그러므로, NM2CAB에 의해 나타난 향상된 MDM 약물 체류는 NACB 및 NMCAB와 비교하여 HIV-1 챌린지로부터 우수한 보호를 제공하였다. 추가로, NM2CAB의 용량 반응 항레트로바이러스 활성을 측정하였다(도 4). MDM을 10, 50 또는 100 μM NM2CAB로 8시간 동안 처리하고, HIV-1ADA로 챌린지하였다. 상기와 유사하게, 항레트로바이러스 활성을 30일까지 측정하였다. 완전한 바이러스 억제가 50 및 100 μM NM2CAB 처리에서 관찰되었고, 57% 보호가 30일 후 10 μM 처리에서 나타났고, HIV-1 p24 발현에 의해 입증되었다(도 4).
약동학(PK) 및 생물분포
PK 및 생물분포 프로파일을 평가하기 위하여, 암컷 NSG 마우스에 NCAB 또는 NMCAB 또는 NM2CAB의 45 mg/kg CAB-당량의 단일 용량을 IM 주사하였다. 평가를 위하여 면역결핍 암컷 NSG 마우스를 사용하여 면역 보상의 질환 병리를 모사하고, 비뇨생식기관에서 생물 분포를 평가하였다. NCAB는 두 제제가 모두 BALB/cJ 마우스에 투여 후 제49일까지 유사한 혈장 CAB 수준을 수득하기 때문에 CAB-LA에 유효한 동등한 제제이다.
주사 후 제1일에, NCAB 처리는 NMCAB 및 NM2CAB 둘 다와 비교하여 더 높은 혈장 CAB 농도를 생성하였고, NM2CAB와 비교하여 연구 기간 동안 더 빠른 붕괴 동역학을 보여주었다. NCAB 처리에 의해, 혈장 CAB 농도는 제35일(792.7 ng/mL)까지 4배 단백질-조절된 90% 억제 농도(4×PA-IC90; 664 ng/mL) 초과로 유지되었고, 그 다음, 제49일(75 ng/mL)까지 PA-IC90(166 ng/mL) 미만으로 빠르게 감소한 후, 제126일까지 정량 한계(0.5 ng/mL)까지 떨어졌다. NMCAB 처리는 더 느린 붕괴를 보여주었고, 혈장 CAB 수준을 제91일(673.8 ng/mL)까지 4×PA-IC90을 초과하여 유지하였고, 제168일(186.7 ng/mL)까지 PA-IC90을 초과하여 유지하였다. NMCAB 처리 후 제364일에, CAB 수준은 8.5 ng/mL로 정량되었다. 현저하게 대조적으로, NM2CAB 처리는 제364일까지 NCAB 및 NMCAB 둘 다와 비교하여 더 느린 혈장 붕괴 동역학을 제공하였고, 제231일(702 ng/mL)까지 4×PA-IC90을 초과하고, 제364일(354.2 ng/mL)까지 PA-IC90 초과하여 지속된 혈장 CAB 농도를 유지하였다. CAB에 대한 혈장 약동학 파라미터는 모든 처리군에 대하여 나노구획 분석을 사용하여 측정하였다. PK 파라미터의 정량은 NM2CAB 처리 후 겉보기 CAB 반감기(131.56일)가 NCAB의 것(7.80일) 및 NMCAB의 것(44.40일)보다 각각 17배 및 3배 더 크다는 것을 증명하였다. 유사하게, NM2CAB의 CAB 평균 잔류 시간(MRT)은 NCAB보다 21배 더 길고(각각 201.94 대 9.79일), NMCAB보다 7배 더 길었다(각각 201.94일 대 30.76일).
NM2CAB는 또한 1년까지 유의미하게 더 높은 CAB 조직 수준을 이끌어냈다. CAB의 조직 생물분포는 질 조직, 직장 조직, 비장, 간, 장, 뇌, 신장, 폐, 및 림프절 해부학적 관련 조직에서 단일 IM 주사 후 제14일, 제28일, 제42일 및 제364일에 평가하였다. 림프절에서 약물 수준은 면역결핍 NSG 마우스에서 이의 미성숙 상태로 인하여 오직 제28일 및 제364일에만 림프절과 관련된 해부학적 영역에서 측정되었다. 특히, MCAB 수준은 제14일, 제28일 및 제42일에 M2CAB보다 낮았고, 제364일에 검출 가능하지 않았다. NM2CAB의 경우, 제364일에, 프로드러그 수준은 3414.8 ng/g(비장), 909.8 ng/g(간), 52.7 ng/g(폐), 50.3 ng/g(뇌), 3.9 ng/g(신장) 및 18710.1 ng/g(림프절)이었다. 제28일에, 모든 조직에서 CAB 수준은 NCAB와 NM2CAB 사이에서 유사하였다. 그러나, 제42일까지, NCAB 처리 후 시험된 모든 조직에서 CAB 수준은 NM2CAB 처리 후의 것들과 비교하여 유의미하게 낮았다(질 조직, 비장, 장, 뇌, 신장, 폐, 직장 조직 및 뇌). 반면, 제42일까지 NMCAB 처리 후 조직에서 CAB 수준은 NCAB 및 NM2CAB 처리와 비교하여 유의미하게 더 높았다. NM2CAB 처리 후 제364일에, CAB 농도는 다른 제제와 비교하여 모든 시험된 조직에서 유의미하게 더 높았고, CAB 수준은 27 ng/g(질 조직), 19.7 ng/g(직장), 41.1 ng/g(비장), 67.62 ng/g(림프절 해부학적 관련 조직), 123.9 ng/g(간), 10.3 ng/g(장), 7.5 ng/g(뇌), 33.2 ng/g(신장) 및 35.5 ng/g(폐)에서 측정하였다. 대조적으로, CAB 수준은 NCAB 또는 NMCAB 처리 후 제364일에 모든 조직에서 정량 한계(0.5 ng/g)보다 유의미하게 낮거나 그 미만이었다.
혈액 및 모든 조직에서 프로드러그(MCAB 또는 M2CAB) 농도를 또한 시험하였다(도 5). 혈액에서 두 프로드러그 모두의 농도는 MCAB의 경우 22 ng/mL 및 M2CAB의 경우 31.3 ng/mL로 주사 후 1일에 낮았고, 빠르게 정량 한계 미만을 떨어졌고, 이는 프로드러그의 활성 모 약물로의 생물전환을 의미한다. 모든 스크리닝된 조직은 M2CAB에 대한 실질적인 데포이고, 연구 기간 전반에 걸쳐 M2CAB의 지속된 수준을 가졌다. 암컷 NSG 마우스에서 NM3CAB의 단일 IM 주사(45 mg/kg CAB-당량)는 NCAB(41237.6 ng/mL), NMCAB(30148.9 ng/mL) 및 NM2CAB(7076.1 ng/mL)와 비교하여 투여 후 제1일에 혈장 CAB의 낮은 수준(2248 ng/mL)을 생성하였다. 혈장 CAB 수준은 처리 후 28일 내에 약 PA-IC90(233.2 ng/mL)에 도달하였다. CAB 및 M3CAB의 혈장 및 조직 수준을 제28일에 측정하였다. M3CAB의 더 느린 가수분해를 입증하기 위하여, 동일한 투여량으로 NM3CAB의 단일 IM 주사 후 BALB/cJ 마우스에서 PK 평가를 반복하였다. NSG 마우스에서 PK 결과와 유사하게, NM3CAB는 투여 후 제1일에 혈장 CAB의 낮은 수준을 생성하고(777.8 ng/mL); 혈장 CAB 수준은 28일 내에 1배 PA-IC90 미만으로 떨어졌다(98.9 ng/mL). 이러한 데이터는 M3CAB 프로드러그의 더 느린 프로드러그 가수분해 및 CAB로의 후속적인 생물전환을 확인해주었다.
모든 제제 중에서 NM2CAB의 우수한 PK 및 BD 프로파일은 마우스의 또 다른 균주, BALB/cJ(숫컷)에서 확인되었다. 여기서, 야생형 마우스를 사용하여 면역결핍 NSG 마우스로부터의 결과를 입증하였다. NM2CAB에 있어서 혈장 및 조직에서 PK 및 BD 측정은 NSG 마우스에서의 것들과 평행하였다. 특히, 혈장 CAB 농도는 NM2CAB에 있어서 제231일에 PA-IC90 초과였고(170.8 ng/mL), 이는 약물 겉보기 반감기에서의 개선을 확인해주었다. NCAB를 대조군으로서 사용하였고, 여기서 CAB 수준은 제28일에 PA-IC90 미만으로 떨어졌다(12.28 ng/mL).
설치류에서 나타난 결과를 입증하기 위하여, 레수스 마카크에 NM2CAB의 45 mg/kg CAB-당량의 단일 용량을 IM 주사하였다. 혈장 CAB 및 프로드러그(M2CAB) 수준을 제393일까지 측정하였다. 마우스에서의 결과와 유사하게, NM2CAB 처리는 더 느린 혈장 붕괴 동역학을 제공하였고, 제393일까지 지속된 혈장 CAB 농도를 유지하였다. 제393일에, CAB 수준은 평균 56.1 ng/mL로 측정되었다. 예상대로, 혈장 M2CAB 농도는 CAB 수준과 비교하여 연구 전반에 걸쳐 더 낮았고, 이는 프로드러그의 이의 활성 모 약물로의 생물전환을 의미한다(도 6a). 직장, 림프절, 및 지방 조직 생검을 NM2CAB 투여 후 제204일에 수집하고, CAB 및 M2CAB 수준에 대하여 분석하였다. 직장, 림프절 및 지방 조직에서 CAB 농도는 각각 10.12 ng/g, 22.7 ng/g 및 29.5 ng/g이었다(도 6b). M2CAB는 림프절 및 지방 조직(각각 33.3 ng/g 및 233.2 ng/g)에서 높은 수준을 나타내고, 직장 조직에서 낮은 수준(1.7 ng/g)을 나타냈다(도 6c).
독성 평가
NM2CAB 투여 후, 독성학 검정을 마우스 및 레수스 마카크 둘 다에서 수행하였다. NSG 마우스에서 독성 평가를 위하여, 동물 체중을 1년 동안 매주 및 연구 결론(제364일)에 기록하고, 각각 대사 프로파일 및 조직병리학을 위하여 혈장 및 조직을 수집하였다. 연령이 맞춰진 미처리 마우스를 대조군으로 사용하였다. 모든 그룹으로부터의 동물 중에서 체중 차이는 관찰되지 않았다. 베트스캔(VetScan) 포괄적인 진단 프로파일 디스크 및 베트스캔 VS-2 장치를 사용하여 포괄적인 혈청 화학 파라미터를 정량하였다. 시험된 파라미터는 알라닌 아미노트랜스페라제(ALT), 알부민(ALB), 알칼리 포스파타제(ALP), 아밀라제(AMY) 총 칼슘 (CA++), 크레아티닌(CRE), 글로불린(GLOB), 글루코스(GLU), 인(PHOS), 칼륨(K+), 나트륨(NA+), 총 빌리루빈(TBIL), 총 단백질(TP), 및 우레아 질소(BUN)이었다. 대조군과 NM2CAB 처리군 사이의 유의미한 차이는 관찰되지 않았고, 이는 NM2CAB가 조직 기관의 기능에 부정적인 영향을 미치지 않았다는 것을 나타낸다. 공인된 병리학자에 의해 H&E로 염색된 조직 부분(간, 폐, 장, 비장, 신장 및 뇌)의 조직학 시험은 NM2CAB 처리된 동물에서 비정상적인 병리학을 드러내지 않았다. 게다가, 제제는 마우스의 두 균주(NSG 및 BALB/cJ)에 대하여 내약성이 좋았고, 주사 부위 반응 및 행동 또는 이동에서의 변화가 관찰되지 않았다.
레수스 마카크에서 평가를 위하여, 제제의 예비 투여로부터 시작하여 체중을 기록하고, 혈장 및 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 NM2CAB 완전한 혈액 계수 및 대사 프로파일을 위하여 투여 후 제393일까지 수집하였다. 혈액학(호중구, 림프구, 단핵구) 및 대사(ALT, 알칼리 포스파타제, BUN/크레아티닌) 프로파일 둘 다를 측정함으로써 전신 독성을 평가하였다. 주사 후 어떠한 동물에서도 체중 변화가 기록되지 않았다. 주사 부위에서 관찰된 초기 가벼운 붉음은 모든 동물에서 3일까지 해결되었다. 주사 후 3일 동안 염증 또는 볼루스가 관찰되지 않았다. 호중구, 림프구 및 단핵구를 NM2CAB 투여 전과 후에 계수하고, 혈액 세포의 수는 일정하였다. 주사 후 제1일에 호중구 수의 증가가 기록되었고, 이는 모든 동물에서 2주 내에 정상이 되었다. 이러한 변화는 주사와 관련될 수 있고 약물과는 연관되지 않을 수 있다. 간 및 신장 대사 프로파일은 처리 후 모든 동물에서 변하지 않았다. 전체적으로, NM2CAB 투여 후 부작용이 관찰되지 않았다.
약물-약물 상호작용
약물-약물 상호작용은 상이한 부류의 약물인 CAB(INSTI) 및 릴피비린(RPV; NNRTI)의 2개의 프로드러그 나노제제(NM2CAB 및 NM3PRV) 사이에서 평가하였다. RPV는 지속 작용성 CAB 및 RPV 나노제제의 조합의 현재 임상 개발로 인하여 CAB와 함께 약물로 선택되었다. NM3RPV는 RPV의 지속 작용성 제제이다(Hilaire, et al., J. Control Release(2019) 311-312:201-211). BALB/cJ 마우스를 NM2CAB 단독(45 mg/kg CAB-당량), NM3RPV 단독(45 mg/kg RPV-당량) 또는 두 프로드러그 나노제제(NM2CAB 및 NM3RPV, 45 mg/kg 약물-당량)의 동시 투여의 단일 용량으로 IM 처리하였다. CAB 및 RPV의 혈장 수준을 측정하였고, 단독 제제 또는 조합으로 처리된 동물 간에 활성 약물 수준의 차이는 관찰되지 않았고, 이는 치료 또는 예방을 위한 다중 프로드러그 나노제제의 조합의 사용을 의미한다.
위험이 있는 사람을 위하여 HIV 감염 보호 백신 및 노출전 예방(PrEP)을 근절할 수 없기 때문에, 장기간 ART는 질환을 예방하고 새로운 감염 및 바이러스 전염을 중단시키는데 이용 가능한 단독 접근법이다. 이는 감염 위험이 있는 사람들을 위한 '예방으로서의 치료'가 강조된다. 주사 가능한 LA ARV의 개발의 초점은 긴 반감기를 갖는 약물을 생성하는데 맞춰진다. PrEP를 위하여, LA ARV는 HIV 노출 후 감염을 불가능하게 하는 '커버리지(coverage)'를 필요로 한다. 바이러스 감염은 보호 ARV 수준이 혈장에서 검출되는 기간 동안 중단될 필요가 있다. 약물은 또한 반드시 위장 독성 및 임의의 중요한 약물-약물 상호작용을 포함하는 뜻밖의 부작용 없이 제공되어야 한다. 현재, LA 제제는 바이러스 감염의 오명을 제거하고, 일부는 2 내지 3개월마다 빈번하지 않게 투여되는, 매일보다 적은 투여 간격이 필요하다는 잠재적인 이점으로 잠재적인 사용자들에게서 환영 받고 있다. 피하 또는 근육내 경로에 의해 투여된 LA ARV는 매우 효과적이고, 이미 향상된 삶의 질 및 장수를 증명하였다(May, et al., AIDS(2014) 28:1193-1202; Antiretroviral Therapy Cohort, Lancet(2017) HIV 4:e349-e356). 이들은 주요 처리 과제로 남아 있는 약에 대한 지행도의 부족을 피하도록 돕는다(Shubber, et al., PLoS Med.(2016) 13:e1002183; Osterberg, et al., New Eng. J. Med.(2005) 353:487-497). 실제로, 치료 실패, 약물 내성 돌연변이, 및 새로운 바이러스 전염을 야기하는 ARV 요법에 대한 임의의 불량한 순응도는 개선된 이행도에 의해 제거될 수 있다. LA ARV에 대한 기존의 플랫폼을 개선시키려는 시도에서, 지속 작용성 완효성 방출 항레트로바이러스 요법(LASER ART) 프로드러그가 개발되었다. 이들 새로운 제제는 더 긴 기간 동안 ARV의 지속된 치료적 수준을 유지하면서 주사의 빈도를 감소시키는 역할을 한다(Edagwa, et al., Exp. Opinion Drug Del.(2017) 14:1281-1291). LASER ART는 느린 네이티브 약물 용해, 불량한 수용해도, 생물학적 세포막 뿐만 아니라 조직 저장소를 통한 향상된 침투, 및 제한된 전신 비표적화 독성을 제공하는 기존의 ARV의 화학적 개질을 통해 프로드러그 합성을 포함한다. 프로드러그 합성은 중합체 부형제에 의해 안정화된 ARV 나노결정의 형성을 가능하게 한다. LASER ART 제제의 PK 및 효능(PD)은 돌루테그라비르(DTG), CAB, 아바카비르(ABC), 라미부딘(3TC) 및 엠트리시타빈(FTC)을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 ARV에 대하여 확립되었다(Zhou, et al., Biomaterials(2018) 151:53-65; Hilaire, et al., J. Control Release(2019) 311-312:201-211; Ibrahim, et al., Int. J. Nanomed.(2019) 14:6231-6247; Lin, et al., Chem. Commun.(2018) 54:8371-8374; McMillan, et al., Antimicrob. Agents Chemother.(2018) 62: e01316-17; McMillan, et al., AIDS(2019) 33:585-588; Sillman, et al., Nat. Commun.(2018) 9:443; Smith, et al., Biomaterials(2019) 223:119476; Soni, et al., Biomaterials(2019) 222:119441).
CAB는 HIV-1 인테그라제 스트랜드 전달 억제제(INSTI)이고, 현재 경구 및 LA 주사 가능 둘 다로 개발 중이다(McPherson, et al., Expert Opin. Investig. Drug(2018) 27:413-420). 이의 고유한 내재적 성질, 예를 들면, 소수성 성질, 긴 전신 반감기(경구 투여 후 약 40시간), 높은 효력, 내성 프로파일, 낮은 매일 경구 투여 필요성(≤ 30 mg/일), 및 제한된 약물-약물 상호작용은 이를 LA 주사 가능으로 개발하는데 매력적인 후보로 만든다(Trezza, et al., Curr. Opin. HIV AIDS(2015) 10:239-245). 여기서, NM2CAB의 단일 주사는 NCAB, NMCAB, 또는 NM3CAB와 비교하여 지속된 약물 혈장 농도 및 조직 생물분포에 의해 반영되는 약물 내구성에서의 예상외로 우수한 개선을 생성한다는 것이 증명된다. NM2CAB는 단일 주사 후 364일 동안 166 ng/mL의 PA-IC90 초과의 약물 수준을 유지하면서 지속된 혈장 붕괴를 제공하였다.
현재 임상 허가에 근접한 CAB LA는 레수스 마카크에서 널리 연구되었고, 노출전 예방(PrEP) 연구에 있어서 주사 가능한 ARV로서 사용을 위한 이의 능력을 확인해주었다(Edagwa, et al., Exp. Opin. Drug Del.(2017) 14:1281-1291; Stellbrink, et al., Curr. Opin. HIV AIDS(2018) 13:334-340). 이들 연구는 SHIV 균주에 의한 질, 직장, 정맥내 및 음경 챌린지에 대하여 과도한 보호를 제공하였다는 것을 증명하고, 이는 HIV 노출의 높은 위험이 있는 사람을 위하여 PrEP로서 및 정맥내 약물 사용자를 위한 이의 미래 사용을 지지한다. 3×PA-IC90 초과의 혈장 수준은 100% 보호를 제공하고, PA-IC90 초과의 농도는 바이러스 챌린지에 대하여 97% 보호를 제공하였다(Edagwa, et al., Exp. Opin. Drug Del.(2017) 14:1281-1291; Stellbrink, et al., Curr. Opin. HIV AIDS(2018) 13:334-340). 여기서, NM2CAB 투여는 6개월 이상 동안 PA-IC90 초과의 혈장 CAB 농도를 생성하였고, 이는 PrEP로서 이의 우월성 및 이의 임상 효능을 의미한다.
전체적으로, HIV-1 감염된 환자를 위한 효과적인 항레트로바이러스 약물(ARV) 치료 및 예방 수단의 개발은 확실한 죽음인 것에서 관리 가능한 일생 동안 지속되는 만성 질병으로 변하였다. 37.9로 추정되는 사람들이 세계적으로 감염되어 있기 때문에 세계적 유행병인 HIV-1의 제어에 대한 필요가 존재한다. LA ARV의 출현은 차선의 약물 이행도의 과제를 극복하기 위한 선택사항을 확실히 확장시킬 것이고, HIV 감염의 부담을 감소시킬 것이다. 이제까지, HIV 항레트로바이러스제에 의한 화학적예방은 테노포비르 디소프록실 푸마레이트(TDF) 함유 화합물에 의해 가장 큰 척도로 증명되었다. 그러나, 매일 또는 거의 매일 경구 정제에 대하여 필요한 이행 수준은 어려운 것으로 증명되었다. LA 제제는 안전성, 내약성 및 효능이 치료 결과 평가의 부분으로 계속될 것을 조건으로 예방을 달성하기 위한 더 나은 선택을 제공한다. 매월 또는 덜 빈번한 기준으로 투여될 수 있는 LA ARV는 치료 이행도를 개선시키고 PrEP에 대한 기회를 확장시킬 것이다.
다수의 문헌 및 특허 문서는 본 발명과 관련이 있는 최신 기술을 설명하기 위하여 상기 명세서 전반에 걸쳐 기재된다. 각각의 이들 인용의 전체 개시내용은 본원에 참조로서 포함된다.
본 발명의 특정한 바람직한 실시양태가 상기 기재되고 구체적으로 예시화되었지만, 본 발명을 이러한 실시양태로 한정하는 것은 의도되지 않는다. 하기 청구항에 기재된 바와 같이, 본 발명의 범위 및 취지를 벗어나지 않고 이에 대한 다양한 변형이 만들어질 수 있다.

Claims (24)

  1. 인테그라제 억제제의 프로드러그로서, 상기 프로드러그가 상기 인테그라제 억제제에 컨쥬게이트된 지방족 또는 알킬 기를 포함하는 에스테르 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 프로드러그.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인테그라제 억제제가 카보테그라비르(CAB), 랄테그라비르(RAL), 엘비테그라비르(EVG), 돌루테그라비르(DTG), 빅테그라비르(BIC), BI 224436, 및 MK-2048로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 프로드러그.
  3. 제1항에 있어서, 상기 인테그라제 억제제가 카보테그라비르(CAB), 랄테그라비르(RAL), 엘비테그라비르(EVG), 돌루테그라비르(DTG), 및 빅테그라비르(BIC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 프로드러그.
  4. 제1항에 있어서, 하기 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 프로드러그:
    Figure pct00012

    Figure pct00013
    , 및
    Figure pct00014

    상기 식에서, R은 임의로 치환된 지방족 또는 알킬이다.
  5. 제4항에 있어서, R이 지방산의 알킬쇄인 프로드러그.
  6. 제4항에 있어서, R이 적어도 15개의 탄소의 주쇄를 갖는 것인 프로드러그.
  7. 제4항에 있어서, R이 15 내지 19개의 탄소 길이의 포화 선형 지방족 쇄인 프로드러그.
  8. 제4항에 있어서, R이 15 내지 17개의 탄소 길이의 포화 선형 지방족 쇄인 프로드러그.
  9. 제4항에 있어서, R이 17개의 탄소 길이의 포화 선형 지방족 쇄인 프로드러그.
  10. 제1항에 있어서, 상기 프로드러그가
    Figure pct00015

    또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인 프로드러그.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 프로드러그 및 적어도 하나의 중합체 또는 계면활성제를 포함하는 나노입자.
  12. 제11항에 있어서, 상기 프로드러그가 결정질인 나노입자.
  13. 제11항에 있어서, 상기 중합체 또는 계면활성제가 양친매성 블록 공중합체인 나노입자.
  14. 제13항에 있어서, 상기 양친매성 블록 공중합체가 폴리(옥시에틸렌)의 적어도 하나의 블록 및 폴리(옥시프로필렌)의 적어도 하나의 블록을 포함하는 것인 나노입자.
  15. 제11항에 있어서, 중합체 또는 계면활성제가 P407인 나노입자.
  16. 제11항에 있어서, 상기 나노입자가 적어도 하나의 표적화 리간드에 연결된 중합체 또는 계면활성제를 추가로 포함하는 것인 나노입자.
  17. 제11항에 있어서, 나노입자의 직경이 약 100 nm 내지 1 μm인 나노입자.
  18. 제11항의 적어도 하나의 나노입자 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  19. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 프로드러그 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  20. 질환 또는 질병의 치료, 억제, 및/또는 예방이 필요한 대상체에게 제1항의 프로드러그 또는 제11항의 나노입자를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 질환 또는 질병을 치료, 억제, 및/또는 예방하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 질환 또는 질병이 바이러스 감염인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 질환 또는 질병이 레트로바이러스 감염인 방법.
  23. 제21항에 있어서, 바이러스 감염이 HIV 감염인 방법.
  24. 질환 또는 질병의 치료에 사용하기 위한 제1항의 프로드러그 또는 제11항의 나노입자.
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