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KR20210018832A - 세포 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

세포 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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KR20210018832A
KR20210018832A KR1020207035524A KR20207035524A KR20210018832A KR 20210018832 A KR20210018832 A KR 20210018832A KR 1020207035524 A KR1020207035524 A KR 1020207035524A KR 20207035524 A KR20207035524 A KR 20207035524A KR 20210018832 A KR20210018832 A KR 20210018832A
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KR
South Korea
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gaba
composition
neurons
cells
inhibitor
Prior art date
Application number
KR1020207035524A
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English (en)
Inventor
그렉 닐리
네슬리 카론
존 마니온
Original Assignee
더 유니버시티 오브 시드니
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2018902072A external-priority patent/AU2018902072A0/en
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Abstract

본 발명은 GABA성 뉴런의 이식을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 GABA성 뉴런 및 이를 포함하는 조성물은 대상체의 신경계에서 중추 억제의 회복 또는 강화를 위한, 그리고 손상되거나 비정상적인 신경 기능과 연관된 신경적 병태, 질환 및 장애의 치료를 위한 세포-기반 요법에 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 이식 조성물은 GABA성 뉴런, GFR-알파 작용제, 및 적어도 하나의 세포사 억제제를 포함하고, 상기 GABA성 뉴런은 만능 줄기 세포, 또는 다분화능 줄기 또는 선조 세포를 분화시킴으로써 생성된다.

Description

세포 조성물 및 이의 용도
관련 출원에 대한 교차 참조
본원은 2018년 6월 8일에 출원된 호주 가출원 2018902072호에 대한 우선권을 주장하고, 그 전체 내용은 본 명세서에 교차 참조로서 포함되어 있다.
본 발명은 GABA성 뉴런의 이식을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 GABA성 뉴런 및 이를 포함하는 조성물은 대상체의 신경계에서 중추 억제의 회복 또는 강화를 위한, 그리고 손상되거나 비정상적인 신경 기능과 연관된 신경적 병태, 질환 및 장애의 치료를 위한 세포-기반 요법에 사용될 수 있다.
배경
만성 통증은 전세계적으로 수십억 명의 환자, 가족 및 돌보는 사람에게 삶의 질에 막대한 영향을 미치며, 현재 요법은 대부분의 환자에 대한 통증을 적절하게 다루지 못한다. 전세계적으로, 만성 통증은 암, 심장 질환, 또는 당뇨병의 비용과 유사하게, 연간 수조 달러의 비용이 드는 것으로 추정된다. 중요하게는, 만성 통증에 대한 효과적인 치료의 결여는 우리 사회, 예를 들어 오피오이드 유행병에서 녹-온 효과를 가졌으며, 여기서 2000, > 200,000명이 처방 오피오이드 과투여로부터 사망하였다. 중요하게는, 만성 통증의 발병률은 연령에 따라 증가하고 암 및 당뇨병과 같은 많은 연령-관련 질환과 관련이 있으며; 따라서, 노령화 사회에서 만성 통증은 명확하고 충족되지 않은 임상 문제를 나타낸다. 신경병증성 통증은 전기 충격과 품질이 가장 유사한 화끈거리는, 찌르는, 및 쏘는 통증으로 나타날 수 있다.
신경병증성 통증 (예를 들어, 좌골신경통, 요통, 암 통증, 당뇨성 통증, 우발적 손상)은 일반적으로 이용가능한 치료법에 대해 불응성이며, 여기서, 최전방 항-신경병증은 단지 ~25%의 환자에 대해 적절한 통증 완화를 제공한다. 모르핀에 의한 치료는 급성 환경에서 일부 통증 완화 또는 산만함을 제공할 수 있지만, 만성 모르핀 레지멘은 무시될 수 없는 중독 및 내성의 문제를 야기한다. 프레가발린 및 노르트립틸린과 같은 비아편제에 대해 일부 성공이 있었지만, 이들 약물은 다양한 효능을 가지며 통증 강도를 적절하게 다루지 않는다.
신경병성 통증에 기여하는 분자 및 생리학적 기전에 대한 수십 년의 연구에도 불구하고, 신경병적 통증의 원인이 되는 근본적인 병리를 치료하기 위해 표적화되어야 하는 것은 여전히 완전히 명확하지 않다. 만성 질환을 역전시키거나 심지어 해소할 수 있는 더 나은, 비-중독성 통증 요법이 요구된다.
또한, 대상체의 신경계에서 중추 억제의 회복 또는 강화를 위한 그리고 손상되거나 부적절한 억제성 개재뉴런 활성 또는 증가된 흥분성 뉴런 기능과 연관된 신경적 병태, 질환 및 장애의 치료를 위한 세포-기반 요법의 제공은 충족되지 않은 요구를 나타낸다.
발명의 요약
본 발명의 넘버링된 서술은 아래와 같다:
1. 포유동물에 투여하기 위한 이식 조성물로서, 상기 이식 조성물은 GABA성 뉴런의 집단, GFR알파 작용제, 아폽토시스 억제제, 및 괴사 억제제를 포함하되, 상기 GABA성의 뉴런은 세포가 GABA성 뉴런 표현형을 수득하고 GABA를 생산하도록 하는 조건 하에 시험관내에서 만능 줄기 세포, 또는 다분화능 줄기 또는 선조 세포를 분화시킴으로써 생성되는, 이식 조성물.
2. 서술 1에 있어서, 상기 GFR알파 작용제가 신경교 세포-유래된 신경친화성 인자 (GDNF), 뉴르투린 (NRTN), 아르테민 (ARTN) 및 페르세핀 (PSPN), 뇌-유래된 신경친화성 인자 (BDNF), NGF, GDNF 수용체 내인성 작용제, BT18, BT13, NT-3, NT-4, CNTF, GFR알파1 작용제, XIB4035, Trk 활성제, TrkA 작용제, 가모보긱 아민, 아미트립틸린, TrkB 작용제, N-아세틸세로토닌, 아미트립틸린, BNN-20BNN-27, 데옥시게두닌, 7,8-디하이드록시플라본, 4'-디메틸아미노-7,8-디하이드록시플라본, 디이소메틴, HIOC, LM22A-4, 뉴로트로핀-3, 뉴로트로핀-4, 노르우고닌, R7 (약물), 및 7,8,3'-트리하이드록시플라본으로 구성된 군으로부터 선택되는, 이식 조성물.
3. 서술 2에 있어서, 상기 GFR알파 작 작용제가 GDNF인, 이식 조성물.
4. 서술 3에 있어서, GDNF가 약 1 pM 내지 100 mM의 농도로 존재하는, 이식 조성물.
5. 서술 4에 있어서, GDNF가 약 10 ng/mL의 농도로 존재하는, 이식 조성물.
6. 이전의 서술 중 임의의 하나에 있어서, 상기 아폽토시스 억제제가 Boc-Asp(OMe) 플루오로메틸 케톤 IDN-8066, 7053, 7436 1965 6556 M867 IDN-5370 IDN-7866 프랄나카산 z-Vad-FMK, YVAD-FMK, c-DEVD-CHO, Ac-YVAD-CHO, Ac-DVAD-FMK Q-Vd-OPh, CrmA (카우폭스 바이러스 단백질), p35 (바콜루바이러스 단백질), Z-ATAD-FMK, INF-4E, Z-DQMD-FMK, Az 10417808, Z-LEED-FMK, ZVDK -FMK, z-IETD-FMK, INf-39, 벨나카산, Ac-DEVD-CHO, 및 엠리카산으로 구성된 군으로부터 선택된 카스파제 억제제; 또는 칼페인 억제제 1, 칼펩틴, E64, MDL28170, MG101, 아세틸-칼파스타틴, 및 PD 150606으로 구성된 군으로부터 선택되는 카스파제 활성제의 억제제 중 하나 이상으로부터 선택되는, 이식 조성물.
7. 서술 6에 있어서, 상기 아폽토시스 억제제가 Boc-Asp(OMe) 플루오로메틸 케톤 IDN-8066, 7053, 7436 1965 6556 M867 IDN-5370 IDN-7866 프랄나카산 z-Vad-FMK, YVAD-FMK, c-DEVD-CHO, Ac-YVAD-CHO, Ac-DVAD-FMK Q-Vd-OPh, CrmA (카우폭스 바이러스 단백질), p35 (바콜루바이러스 단백질), Z-ATAD-FMK, INF-4E, Z-DQMD-FMK, Az 10417808, Z-LEED-FMK, ZVDK -FMK, z-IETD-FMK, INf-39, 벨나카산, Ac-DEVD-CHO, 및 엠리카산으로 구성된 군으로부터 선택된 카스파제 억제제로 구성된 군으로부터 선택되는, 이식 조성물.
8. 서술 6에 있어서, 상기 아폽토시스 억제제가 넓은-스펙트럼 카스파제 억제제인, 이식 조성물.
9. 서술 8에 있어서, 상기 아폽토시스 억제제가 Boc-Asp(OMe) 플루오로메틸 케톤인, 이식 조성물.
10. 서술 9에 있어서, Boc-Asp(OMe) 플루오로메틸 케톤이 약 1 pM 내지 100 mM의 농도로 존재하는, 이식 조성물.
11. 서술 10에 있어서, Boc-Asp(OMe) 플루오로메틸 케톤이 약 20 nM의 농도로 존재하는, 이식 조성물.
12. 이전의 서술 중 임의의 하나에 있어서, 상기 괴사 억제제가 MS-1, IM-54, GSK-872, 7-Cl-O-Nec1, 네크로스타틴-1, 네크로설폰아미드로 구성된 군으로부터 선택되는, 이식 조성물.
13. 서술 12에 있어서, 상기 괴사 억제제가 MS-1, IM-54, GSK-872, 7-Cl-O-Nec1, 네크로스타틴-1, 네크로설폰아미드로 구성된 군으로부터 선택되는, 이식 조성물.
14. 서술 12에 있어서, 상기 괴사 억제제가 MLKL 억제제인, 이식 조성물.
15. 서술 14에 있어서, 상기 괴사 억제제는 네크로설폰아미드인, 이식 조성물.
16. 서술 15에 있어서, 네크로설폰아미드가 약 1 pM 내지 100 mM의 농도로 존재하는, 제15항에 따른 이식 조성물.
17. 서술 16에 있어서, 네크로설폰아미드가 약 50 nM의 농도로 존재하는, 제16항에 따른 이식 조성물.
18. 이전의 서술 중 임의의 하나에 있어서, 상기 만능 줄기 세포, 또는 다분화능 줄기 또는 선조 세포가 상기 포유동물로부터 수득되는, 이식 조성물.
19. 이전의 서술 중 임의의 하나에 있어서, 상기 GABA성 뉴런이 만능 줄기 세포로부터 생성되는, 이식 조성물.
20. 서술 19에 있어서, 상기 만능 줄기 세포가 iPSC인, 이식 조성물.
21. 서술 20에 있어서, 상기 iPSC가 포유동물로부터 수득된 생검으로부터 수득된 세포로부터 유래되는, 이식 조성물.
22. 서술 21에 있어서, 상기 생검으로부터 얻어진 세포가 진피 섬유모세포인, 이식 조성물.
23. 이전의 서술 중 임의의 하나에 있어서, GABA성 뉴런이 하기 존재 하에 상기 만능 줄기 세포, 또는 다분화능 줄기 또는 선조 세포를 배양함으로써 생성되는, 이식 조성물:
i. 약 0일째 내지 약 7일째의 적어도 2개의 SMAD 억제제;
ii. 약 0일째 내지 약 21일째의 소닉 헤지혹 경로의 활성화제;
iii. 약 0일째 내지 약 14일째의 wnt 억제제;
iv. 약 7일째 내지 약 14일째의 BMP 억제제;
v. 약 7일째 내지 약 21일째의 GABA성 종형성 인자; 및
vi. 21일째 내지 약 27일째의 BDNF, GDNF 및 감마 세크레타제 억제제를 포함하는 뉴런 성숙 성장 인자의 조합.
24. 서술 23에 있어서, 상기 적어도 2개의 SMAD 억제제가 헤스페레틴, SB431542, SB525334, 갈루니서팁, GW788388, LY2109761, SB505124, LDN-193189, LDN-193189 HCl, RepSox, A　83-01, DMH1, LDN-212854, ITD 1, LY364947, SD-208, EW-7197, ML347, K02288, 77-01, SIS3, LDN-214117, R-268712, 피르페니돈, 노긴, 코르딘, 그렘린, DAN 단백질, 및 GDF3으로 구성된 군으로부터 선택되는, 이식 조성물.
25. 서술 24에 있어서, 상기 적어도 2개의 SMAD 억제제가 LDN193189 및 SB431542인, 이식 조성물.
26. 서술 25에 있어서, LDN193189는 약 1pM 내지 100mM의 농도로 존재하고, 그리고 SB431542는 약 1pM 내지 100mM의 농도로 존재하는, 이식 조성물.
27. 서술 26에 있어서, LDN193189는 약 100 nM의 농도로 존재하고, 그리고 SB431542는 약 10 μM의 농도로 존재하는, 이식 조성물.
28. 서술 23 내지 27 중 임의의 하나에 있어서, 상기 소닉 헤지혹 신호전달의 활성화제가 소닉 헤지혹, GSA10, 퍼모파민, SAG, 및 SAG 디하이드로클로라이드로 구성된 군으로부터 선택되는, 이식 조성물.
29. 서술 28에 있어서, 상기 소닉 헤지혹 신호전달의 활성화제가 SAG인 이식 조성물.
30. 서술 29에 있어서, SAG는 약 1pM 내지 100mM의 농도로 존재하는, 이식 조성물.
31. 서술 30에 있어서, SAG는 약 0.1 μM의 농도로 존재하는, 이식 조성물.
32. 서술 23 내지 31 중 임의의 하나에 있어서, 상기 wnt 억제제가 ICG-001, 살리노마이신, IWR-1, Wnt-C59, ETC-159, iCRT3, IWP2, IWP-4, 피르니늄 파모에이트, iCRT14, FH535, CCT251545, KYA1797K, 우고닌, NCB-0846, 헥사크로로펜, PNU-74654, Ky0211, 트립토나이드, IWP12, 악신, GSK, WAY316606, Shizokaol D, BC2059, PKF115-584, ICG-01, 쿠에르세틴, DCA, LY2090314, CHIR99021, SB-216763, NSC668036, QS11, G007-LK, 및 G244LM으로 구성된 군으로부터 선택되는, 이식 조성물.
33. 서술 32에 있어서, 상기 wnt 억제제가 IWP2인, 이식 조성물.
34. 서술 33에 있어서, IWP2가 약 1pM 내지 100mM의 농도로 존재하는, 이식 조성물.
35. 서술 34에 있어서, IWP2가 약 5 μM의 농도로 존재하는, 이식 조성물.
36. 서술 23 내지 35 중 임의의 하나에 있어서, 상기 BMP 억제제가 헤스페레틴, SB431542, SB525334, 갈루니서팁, GW788388, LY2109761, SB505124, LDN-193189, LDN-193189 HCl, RepSox, A　83-01, DMH1, LDN-212854, ITD 1, LY364947, SD-208, EW-7197, ML347, K02288, 77-01, SIS3, LDN-214117, R-268712, 피르페니돈, 노긴, 코르딘, 그렘린, DAN 단백질, 및 GDF3으로 구성된 군으로부터 선택되는, 이식 조성물.
37. 서술 36에 있어서, 상기 BMP 억제제가 LDN-193189인, 이식 조성물.
38. 서술 37에 있어서, LDN-193189는 약 1pM 내지 100mM의 농도로 존재하는, 이식 조성물.
39. 서술 38에 있어서, LDN-193189는 약 100nM의 농도로 존재하는, 이식 조성물.
40. 서술 23 내지 39 중 임의의 하나에 있어서, 상기 GABA성 종형성 인자가 섬유모세포 성장 인자로 구성된 군으로부터 선택되는, 이식 조성물.
41. 서술 40에 있어서, 상기 GABA성 종형성 인자가 FGF8인, 이식 조성물.
42. 서술 41에 있어서, FGF8는 약 1pM 내지 100mM의 농도로 존재하는, 이식 조성물.
43. 서술 42에 있어서, FGF8이 약 100 ng/mL의 농도로 존재하는, 이식 조성물.
44. 서술 23 내지 43 중 임의의 하나에 있어서, 상기 감마 세크레타제 억제제가 DAPT, RO4929097, 사마게세스타트, 아바가세스타트, 디벤자지핀, Ly411575, IMR-1, L-685,458, FLI-06, 크레니가세스타트, 니로가세스타트, MK-0752, 베가세스타트, BMS299897, 컴파운드 W, DBZ, 플루리잔, JLK6, MRK560, 및 PF3084014 하이드로브로마이드로 구성된 군으로부터 선택되는, 이식 조성물.
45. 서술 44에 있어서, 상기 감마 세크레타제 억제제가 DAPT인, 이식 조성물.
46. 서술 45에 있어서, DAPT는 약 1pM 내지 100mM의 농도로 존재하는, 이식 조성물.
47. 서술 46에 있어서, DAPT는 약 2.5 μM의 농도로 존재하는, 이식 조성물.
48. 서술 23에 있어서, 상기 뉴런 성숙 성장 인자의 조합이 약 1pM 내지 100mM의 농도로 존재하는 BDNF, 약 1pM 내지 100mM의 농도로 존재하는 GDNF 및 약 1pM 내지 100mM의 농도로 존재하는 DAP를 포함하는, 이식 조성물.
49. 서술 48에 있어서, 상기 뉴런 성숙 성장 인자의 조합이 약 10 ng/mL의 농도로 존재하는 BDNF, 약 10 ng/mL의 농도로 존재하는 GDNF 및 약 2.5 μM의 농도로 존재하는 DAPT를 포함하는, 이식 조성물.
50. 서술 23 내지 49 중 임의의 하나에 있어서, 상기 만능 줄기 세포, 또는 다분화능 줄기 또는 선조 세포가 0일로부터의 Rock 억제제의 존재 하에 약 24시간의 기간 동안 배양되는, 이식 조성물.
51. 서술 1 내지 50 중 임의의 하나에 있어서, 상기 GABA성 뉴런이 유사분열 후인, 이식 조성물.
52. 서술 1 내지 51 중 임의의 하나에 있어서, 상기 GABA성 뉴런이 Nkx2.1, vGAT, GAD65, GAD67에 대한 전사체를 발현시키는, 이식 조성물.
53. 이전의 서술 중 임의의 하나에 있어서, 상기 GABA성 뉴런이 GAD65/67, GlyT2 및 VGAT를 발현시키는, 이식 조성물.
54. 이전의 서술 중 임의의 하나에 있어서, GABA성 뉴런 집단의 적어도 95%가 GAD65를 발현시키는, 이식 조성물.
55. 이전의 서술 중 임의의 하나에 있어서, GABA성 뉴런 집단의 적어도 95%가 VGAT 를 발현시키는, 이식 조성물.
56. 이전의 서술 중 임의의 하나에 있어서, 상기 GABA성 뉴런이 생체내에서 GABA를 분비할 수 있는, 이식 조성물.
57. 이전의 서술 중 임의의 하나에 있어서, 상기 GABA성 뉴런이 수령체의 신경계와 기능적으로 통합될 수 있는, 이식 조성물.
58. 이전의 서술 중 임의의 하나에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는, 이식 조성물.
59. 서술 58에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 담체가 식염수 또는 수성 완충액으로 구성된 군으로부터 선택되는, 이식 조성물.
60. 이전의 서술 중 임의의 하나에 있어서, 상기 조성물이 약 1000 내지 10 백만 개의 세포 / 마이크로리터의 농도로 GABA성 뉴런을 포함하는, 이식 조성물.
61. 이전의 서술 중 임의의 하나에 있어서, 상기 조성물이 약 100,000 세포/마이크로리터의 농도로 GABA성 뉴런을 포함하는, 이식 조성물.
62. 이전의 서술 중 임의의 하나에 있어서, 상기 GABA성 뉴런이 인간 세포인, 이식 조성물.
63. 포유동물의 신경계에서 중추 억제를 회복하거나 강화하는 방법으로서, 서술 1 내지 62 중 임의의 하나에 따른 이식 조성물을 상기 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
64. 포유동물에서 신경적 병태, 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 서술 1 내지 62 중 임의의 하나에 따른 이식 조성물을 상기 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
65. 서술 64에 있어서, 상기 신경적 병태, 질환 또는 장애가 부적절한 억제 개재뉴런 활성을 특징으로 하는, 방법.
66. 서술 64에 있어서, 상기 신경적 병태, 질환 또는 장애가 신경퇴행성 질환, 신경적 손상, 또는 신경병성 통증으로부터 선택되는 것인, 방법.
67. 서술 64에 있어서, 상기 신경적 병태, 질환 또는 장애는 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 방법: 만성 신경병성 통증, 만성 염증성 통증, 만성 기능이상 통증, 간질, 운동 뉴런 질환 (ALS, SMA), 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌졸중, 다발성 경화증, 타우병증 (진행성 핵상 마비, 피크병, 피질기저 퇴행증 (CBD), 전두측두엽 치매, ALS를 갖는 FTLD), 헌팅턴병, 알코올 금단 및 알코올중독, 당뇨병 유도된 뇌 손상, 두부 손상, 편두통, 두통, 군발성 두통, 척수 손상, 허혈성 손상, 화학요법 유도된 통증 및 화학요법 유도된 신경병증, 정신분열증, 만성 우울증, 자발성 운동장애, 양극성 장애, 및 신경병증.
68. 포유동물에서 신경병성 통증을 치료하는 방법으로서, 서술 1 내지 62 중 임의의 하나에 따른 이식 조성물을 상기 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
69. 서술 68에 있어서, 상기 신경병성 통증이 좌골신경통, 요통, 암 통증, 당뇨병성 통증, 우발적인 손상, 척수 손상, 말초 신경 손상과 연관된 것인, 방법.
70. 포유동물에서 이질통증을 치료하는 방법으로서, 서술 1 내지 62 중 임의의 하나에 따른 이식 조성물을 상기 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
71. 서술 63 내지 70 중 임의의 하나에 있어서, 상기 이식 조성물이 포유동물의 중추신경계에 투여되는, 방법.
72. 서술 63 내지 71 중 임의의 하나에 있어서, 상기 투여가 상기 이식 조성물을 상기 포유동물의 척수 내로 주사하는 것을 포함하는, 방법.
73. 서술 72에 있어서, 상기 주사가 뇌정위적 주사인, 방법.
74. 서술 63 -73 중 임의의 하나에 있어서, 상기 포유동물이 인간인, 방법.
75. GABA성 뉴런을 전달을 필요로 하는 대상체에게 전달하는 방법으로서, 다음의 단계들을 포함하는 방법:
a) 상기 대상체로부터 생검을 수득하고 상기 생검으로부터 세포를 단리하는 단계;
b) 단계 a)에서 단리된 세포로부터 iPSC를 생성하는 단계;
c) 단계 b)에서 생성된 iPSC를 GABA성 뉴런으로 분화시키는 조건 하에 배양하는 단계로서, 상기 GABA성 뉴런은 GABA성 뉴런 표현형을 발현시키고 GABA를 생성하는 단계;
d) 상기 대상체에게 주사하기에 적합한 이식 조성물을 제조하는 단계로서, 상기 이식 조성물은 단계 c)에서 생성된 GABA성 뉴런, GFR알파 효능제, 아폽토시스 억제제, 괴사 억제제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 단계;
e) 단계 d)에서 제조된 이식 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계.
76. 서술 75에 있어서, 상기 대상체가 부적절한 억제성 개재뉴런 활성 또는 증가된 흥분성 뉴런 기능을 갖는, 방법.
77. 서술 75에 있어서, 상기 대상체가 신경적 병태, 질환 또는 장애를 갖는, 방법.
78. 서술 77에 있어서, 상기 신경적 병태, 질환 또는 또는 장애가 부적절한 억제성 개재뉴런 활성을 특징으로 하는, 방법.
79. 서술 77에 있어서, 상기 신경적 병태, 질환 또는 장애가 신경퇴행성 질환, 신경적 손상, 또는 신경병성 통증으로부터 선택되는 것인, 방법.
80. 서술 77에 있어서, 상기 신경적 병태, 질환 또는 장애가 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법: 만성 신경병성 통증, 만성 염증성 통증, 만성 기능이상 통증, 간질, 운동 뉴런 질환 (ALS, SMA), 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌졸중, 다발성 경화증, 타우병증 (진행성 핵상 마비, 피크병, 피질기저 퇴행증 (CBD), 전두측두엽 치매, ALS를 갖는 FTLD), 헌팅턴병, 알코올 금단 및 알코올중독, 당뇨병 유도된 뇌 손상, 두부 손상, 편두통, 두통, 군발성 두통, 척수 손상, 허혈성 손상, 화학요법 유도된 통증 및 화학요법 유도된 신경병증, 정신분열증, 만성 우울증, 자발성 운동장애, 양극성 장애, 및 신경병증.
81. 서술 75에 있어서, 상기 대상체가 신경병성 통증을 갖는, 방법.
82. 서술 81에 있어서, 상기 신경병성 통증이 염증, 좌골신경통, 요통, 암 통증, 당뇨병성 신경병증, 우발적인 손상, 척수 손상, 말초 신경 손상과 연관된 것인, 방법.
83. 서술 75에 있어서, 상기 대상체가 이질통증을 갖는, 방법.
84. 서술 75 내지 83 중 임의의 하나에 있어서, 상기 이식 조성물이 대상체의 중추신경계에 투여되는, 방법.
85. 서술 75 내지 84 중 임의의 하나에 있어서, 상기 투여가 상기 이식 조성물을 상기 대상체의 척수 내로 주사하는 것을 포함하는, 방법.
86. 서술 85에 있어서, 상기 주사가 뇌정위적 주사를 통한 것인, 방법.
87. 서술 75 내지 86 중 임의의 하나에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
88. 서술 75 내지 87 중 임의의 하나에 있어서, 상기 GFR알파 작용제가 신경교 세포-유래된 신경친화성 인자 (GDNF), 뉴르투린 (NRTN), 아르테민 (ARTN) 및 페르세핀 (PSPN), 뇌-유래된 신경친화성 인자 (BDNF), NGF, GDNF 수용체 내인성 작용제, BT18, BT13, NT-3,NT-4, CNTF, GFR알파1 작용제, XIB4035, Trk 활성제, TrkA 작용제, 가모보긱 아민, 아미트립틸린, TrkB 작용제, N-아세틸세로토닌, 아미트립틸린, BNN-20BNN-27, 데옥시게두닌, 7,8-디하이드록시플라본, 4'-디메틸아미노-7,8-디하이드록시플라본, 디이소메틴, HIOC, LM22A-4, 뉴로트로핀-3, 뉴로트로핀-4, 노르우고닌, R7 (약물), 및 7,8,3'-트리하이드록시플라본으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
89. 서술 88에 있어서, 상기 GFR알파 작용제가 GDNF인, 방법.
90. 서술 89에 있어서, GDNF가 약 1 pM 내지 100 mM의 농도로 존재하는, 방법.
91. 서술 90에 있어서, GDNF가 약 10 ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
92. 서술 75 내지 91 중 임의의 하나에 있어서, 상기 아폽토시스 억제제가 Boc-Asp(OMe) 플루오로메틸 케톤 IDN-8066, 7053, 7436 1965 6556 M867 IDN-5370 IDN-7866 프랄나카산 z-Vad-FMK, YVAD-FMK, c-DEVD-CHO, Ac-YVAD-CHO, Ac-DVAD-FMK Q-Vd-OPh, CrmA (카우폭스 바이러스 단백질), p35 (바콜루바이러스 단백질), Z-ATAD-FMK, INF-4E, Z-DQMD-FMK, Az 10417808, Z-LEED-FMK, ZVDK -FMK, z-IETD-FMK, INf-39, 벨나카산, Ac-DEVD-CHO, 및 엠리카산으로 구성된 군으로부터 선택된 카스파제 억제제; 또는 칼페인 억제제 1, 칼펩틴, E64, MDL28170, MG101, 아세틸-칼파스타틴, 및 PD 150606로 구성된 군으로부터 선택되는 카스파제 활성제의 억제제 중 하나 이상으로부터 선택되는, 방법.
93. 서술 92에 있어서, 상기 아폽토시스 억제제가 Boc-Asp(OMe) 플루오로메틸 케톤 IDN-8066, 7053, 7436 1965 6556 M867 IDN-5370 IDN-7866 프랄나카산 z-Vad-FMK, YVAD-FMK, c-DEVD-CHO, Ac-YVAD-CHO, Ac-DVAD-FMK Q-Vd-OPh, CrmA (카우폭스 바이러스 단백질), p35 (바콜루바이러스 단백질), Z-ATAD-FMK, INF-4E, Z-DQMD-FMK, Az 10417808, Z-LEED-FMK, ZVDK -FMK, z-IETD-FMK, INf-39, 벨나카산, Ac-DEVD-CHO, 및 엠리카산으로 구성된 군으로부터 선택된 카스파제 억제제로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
94. 서술 93에 있어서, 상기 아폽토시스 억제제가 넓은-스펙트럼 카스파제 억제제인, 방법.
95. 서술 94에 있어서, 상기 아폽토시스 억제제가 Boc-Asp(OMe) 플루오로메틸 케톤인, 방법.
96. 서술 95에 있어서, Boc-Asp(OMe) 플루오로메틸 케톤이 약 1 pM 내지 100 mM의 농도로 존재하는, 방법.
97. 서술 96에 있어서, Boc-Asp(OMe) 플루오로메틸 케톤이 약 20 μM의 농도로 존재하는, 방법.
98. 서술 75 내지 97 중 임의의 하나에 있어서, 상기 괴사 억제제가 MS-1, IM-54, GSK-872, 7-Cl-O-Nec1, 네크로스타틴-1, 네크로설폰아미드로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
99. 서술 98에 있어서, 상기 괴사 억제제가 MS-1, IM-54, GSK-872, 7-Cl-O-Nec1, 네크로스타틴-1, 네크로설폰아미드로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
100. 서술 99에 있어서, 상기 괴사 억제제가 MLKL 억제제인, 방법.
101. 서술 100에 있어서, 상기 괴사 억제제가 네크로설폰아미드인, 방법.
102. 서술 101에 있어서, 네크로설폰아미드가 약 1 pM 내지 100 mM의 농도로 존재하는, 방법.
103. 서술 102에 있어서, 네크로설폰아미드가 약 50 nM의 농도로 존재하는, 방법.
104. 서술 21에 있어서, 상기 생검으로부터 수득된 세포가 진피 섬유모세포인, 방법.
105. 이전의 서술 중 임의의 하나에 있어서, 상기 단계 c)에서 생성된 GABA성 뉴런이 하기의 존재에서 상기 iPSC를 배양시킴으로써 생성되는, 방법:
i. 약 0일째 내지 약 7일째의 적어도 2개의 SMAD 억제제;
ii. 약 0일째 내지 약 21일째의 소닉 헤지혹 경로의 활성제;
iii. 약 0일째 내지 약 14일째의 wnt 억제제;
iv. 약 7일째 내지 약 14일째의 BMP 억제제;
v. 약 7일째 내지 약 21일째의 GABA성 종형성 인자; 및
vi. 21일째 내지 약 27일째의 BDNF, GDNF 및 감마 세크레타제 억제제를 포함하는 뉴런 성숙 성장 인자의 조합.
106. 서술 105에 있어서, 상기 적어도 2개의 SMAD 억제제가 헤스페레틴, SB431542, SB525334, 갈루니서팁, GW788388, LY2109761, SB505124, LDN-193189, LDN-193189 HCl, RepSox, A　83-01, DMH1, LDN-212854, ITD 1, LY364947, SD-208, EW-7197, ML347, K02288, 77-01, SIS3, LDN-214117, R-268712, 피르페니돈, 노긴, 코르딘, 그렘린, DAN 단백질, 및 GDF3으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
107. 서술 106에 있어서, 상기 적어도 2개의 SMAD 억제제가 LDN193189 및 SB431542인, 방법.
108. 서술 107에 있어서, LDN193189는 약 1pM 내지 100mM의 농도로 존재하고, 그리고 SB431542는 약 1pM 내지 100mM의 농도로 존재하는, 방법.
109. 서술 108에 있어서, LDN193189는 약 100 nM의 농도로 존재하고, 그리고 SB431542는 약 10 μM의 농도로 존재하는, 방법.
110. 서술 105 내지 109 중 임의의 하나에 있어서, 상기 소닉 헤지혹 신호전달의 활성제가 소닉 헤지혹, GSA10, 퍼모파민, SAG, 및 SAG 디하이드로클로라이드로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
111. 서술 110에 있어서, 상기 소닉 헤지혹 신호전달의 활성화제가 SAG 인, 방법.
112. 서술 111에 있어서, SAG는 약 1pM 내지 100mM의 농도로 존재하는, 방법.
113. 서술 112에 있어서, SAG는 약 0.1 μM의 농도로 존재하는, 방법.
114. 서술 105 내지 113 중 임의의 하나에 있어서, 상기 wnt 억제제가 ICG-001, 살리노마이신, IWR-1, Wnt-C59, ETC-159, iCRT3, IWP2, IWP-4, 피르니늄 파모에이트, iCRT14, FH535, CCT251545, KYA1797K, 우고닌, NCB-0846, 헥사크로로펜, PNU-74654, Ky0211, 트립토나이드, IWP12, 악신, GSK, WAY316606, Shizokaol D, BC2059, PKF115-584, ICG-01, 쿠에르세틴, DCA, LY2090314, CHIR99021, SB-216763, NSC668036, QS11, G007-LK, 및 G244LM으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
115. 서술 114에 있어서, 상기 wnt 억제제가 IWP2인, 방법.
116. 서술 115에 있어서, IWP2는 약 1pM 내지 100mM의 농도로 존재하는, 방법.
117. 서술 116에 있어서, IWP2는 약 5 μM의 농도로 존재하는, 방법.
118. 서술 105 내지 117 중 임의의 하나에 있어서, 상기 BMP 억제제가 헤스페레틴, SB431542, SB525334, 갈루니서팁, GW788388, LY2109761, SB505124, LDN-193189, LDN-193189 HCl, RepSox, A　83-01, DMH1, LDN-212854, ITD 1, LY364947, SD-208, EW-7197, ML347, K02288, 77-01, SIS3, LDN-214117, R-268712, 피르페니돈, 노긴, 코르딘, 그렘린, DAN 단백질, 및 GDF3으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
119. 서술 118에 있어서, 상기 BMP 억제제가 LDN-193189인, 방법.
120. 서술 119에 있어서, LDN-193189는 약 1pM 내지 100mM의 농도로 존재하는, 방법.
121. 서술 120에 있어서, LDN-193189는 약 100nM의 농도로 존재하는, 방법.
122. 서술 105 내지 121 중 임의의 하나에 있어서, 상기 GABA성 종형성 인자가 섬유모세포 성장 인자로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
123. 서술 122에 있어서, 상기 GABA성 종형성 인자가 FGF8인, 방법.
124. 서술 124에 있어서, FGF8는 약 1pM 내지 100mM의 농도로 존재하는, 방법.
125. 서술 124에 있어서, FGF8는 약 100 ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
126. 서술 105 내지 125 중 임의의 하나에 있어서, 상기 감마 세크레타제 억제제가 DAPT, RO4929097, 사마게세스타트, 아바가세스타트, 디벤자지핀, Ly411575, IMR-1, L-685,458, FLI-06, 크레니가세스타트, 니로가세스타트, MK-0752, 베가세스타트, BMS299897, 컴파운드 W, DBZ, 플루리잔, JLK6, MRK560, 및 PF3084014 하이드로브로마이드로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
127. 서술 126에 있어서, 상기 감마 세크레타제 억제제가 DAPT인, 방법.
128. 서술 127에 있어서, DAPT는 약 1pM 내지 100mM의 농도로 존재하는, 방법.
129. 서술 128에 있어서, DAPT는 약 2.5 μM의 농도로 존재하는, 방법.
130. 서술 105에 있어서, 상기 뉴런 성숙 성장 인자의 조합이 약 1pM 내지 100mM의 농도로 존재하는 BDNF, 약 1pM 내지 100mM의 농도로 존재하는 GDNF 및 약 1pM 내지 100mM의 농도로 존재하는 DAP를 포함하는, 방법.
131. 서술 105 내지 130 중 임의의 하나에 있어서, 상기 뉴런 성숙 성장 인자의 조합이 약 10 ng/mL의 농도로 존재하는 BDNF, 약 10 ng/mL의 농도로 존재하는 GDNF 및 약 2.5 μM의 농도로 존재하는 DAPT를 포함하는, 방법.
132. 서술 105 내지 131 중 임의의 하나에 있어서, 상기 iPSC는 약 24시간의 기간 동안 0일째로부터의 Rock 억제제의 존재 하에 배양되는, 방법.
133. 서술 75 내지 132 중 임의의 하나에 있어서, 상기 GABA성 뉴런이 유사분열후인, 방법.
134. 서술 75 내지 133 중 임의의 하나에 있어서, 상기 GABA성 뉴런이 Nkx2.1, vGAT, GAD65, GAD67에 대한 전사체를 발현시키는, 방법.
135. 서술 75 내지 134 중 임의의 하나에 있어서, 상기 GABA성 뉴런이 GAD65/67, GlyT2 및 VGAT를 발현시키는, 방법.
136. 서술 75 내지 135 중 임의의 하나에 있어서, GABA성 뉴런 집단의 적어도 95%가 GAD65을 발현하는, 방법.
137. 서술 75 내지 136 중 임의의 하나에 있어서, GABA성 뉴런 집단의 적어도 95%가 VGAT를 발현시키는, 방법.
138. 서술 75 내지 137 중 임의의 하나에 있어서, 상기 GABA성 뉴런이 생체내에서 GABA를 분비할 수 있는, 방법.
139. 서술 75 내지 138 중 임의의 하나에 있어서, 상기 GABA성 뉴런이 수용자의 신경계와 기능적으로 통합될 수 있는, 방법.
140. 서술 75 내지 139 중 임의의 하나에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 담체가 식염수 또는 수성 완충액으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
141. 서술 75 내지 141 중 임의의 하나에 있어서, 상기 이식 조성물이 약 1000 내지 10 백만 개의 세포 / 마이크로리터의 농도로 GABA성 뉴런을 포함하는, 방법.
142. 서술 141에 있어서, 상기 조성물이 약 100,000 세포/마이크로리터의 농도로 GABA성 뉴런을 포함하는, 방법.
143. 서술 1 내지 62 중 임의의 하나에 있어서, 대상체에서 부적절한 억제성 개재뉴런 활성 또는 증가된 흥분성 뉴런 기능의 치료를 위한, 이식 조성물.
144. 서술 1 내지 62 중 임의의 하나에 있어서, 대상체에서 신경적 병태, 질환 또는 장애의 치료를 위한, 이식 조성물.
145. 서술 1 내지 62 중 임의의 하나에 있어서, 서술 144에 따른 용도로 사용되되, 상기 신경적 병태, 질환 또는 장애는 활성을 특징으로 하는, 이식 조성물.
146. 서술 1 내지 62 중 임의의 하나에 따른 이식 조성물로서, 서술 144에 따른 용도로 사용되되 상기 신경적 병태, 질환 또는 장애가 신경퇴행성 질환, 신경적 손상, 또는 신경병성 통증으로부터 선택되는, 용도.
147. 서술 1 내지 62 중 임의의 하나에 있어서, 서술 144에 따른 용도로 사용되되, 상기 신경적 병태, 질환 또는 장애는 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는, 이식 조성물: 만성 신경병성 통증, 만성 염증성 통증, 만성 기능이상 통증, 간질, 운동 뉴런 질환 (ALS, SMA), 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌졸중, 다발성 경화증, 타우병증 (진행성 핵상 마비, 피크병, 피질기저 퇴행증 (CBD), 전두측두엽 치매, ALS를 갖는 FTLD), 헌팅턴병, 알코올 금단 및 알코올중독, 당뇨병 유도된 뇌 손상, 두부 손상, 편두통, 두통, 군발성 두통, 척수 손상, 허혈성 손상, 화학요법 유도된 통증 및 화학요법 유도된 신경병증, 정신분열증, 만성 우울증, 자발성 운동장애, 양극성 장애, 및 신경병증.
148. 서술 1 내지 62 중 임의의 하나에 있어서, 대상체에서 신경병성 통증의 치료를 위한, 이식 조성물.
149. 서술 1 내지 62 중 임의의 하나에 있어서, 서술 148에 따른 용도로 사용되되, 상기 신경병성 통증이 염증, 좌골신경통, 요통, 암 통증, 당뇨병성 신경병증, 우발적인 손상, 척수 손상, 말초 신경 손상과 관련된, 이식 조성물.
150. 서술 1 내지 62 중 임의의 하나에 있어서, 대상체에서의 이질통증의 치료를 위한, 이식 조성물.
151. 서술 1 내지 62 중 임의의 하나에 있어서, 서술 143 내지 150 중 임의의 하나에 따른 용도로 사용되되, 상기 투여가 상기 이식 조성물을 상기 대상체의 척수 내로 주사하는 것을 포함하는, 이식 조성물.
152. 서술 1 내지 62 중 임의의 하나에 있어서, 서술 151에 따른 용도로 사용되되, 상기 주사가 정위 주사를 통한 것인, 이식 조성물.
153. 서술 1 내지 62 중 임의의 하나에 있어서, 서술 143 내지 152 중 임의의 하나에 따른 용도로 사용되되, 상기 대상체는 인간인, 이식 조성물.
154. 서술 1 내지 62 중 임의의 하나에 따른 이식 조성물의 용도로서, 대상체에서 신경적 병태, 질환 또는 장애의 치료용 약제의 제조를 위한 용도.
155. 서술 154에 있어서, 상기 신경적 병태, 질환 또는 장애가 부적절한 억제성 개재뉴런 활성을 특징으로 하는, 용도.
156. 서술 154 또는 155에 있어서, 상기 신경적 병태, 질환 또는 장애가 신경퇴행성 질환, 신경적 손상 또는 신경병성 통증으로부터 선택되는, 용도.
157. 서술 156에 있어서, 상기 신경적 병태, 질환 또는 장애는 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는, 용도: 만성 신경병성 통증, 만성 염증성 통증, 만성 기능이상 통증, 간질, 운동 뉴런 질환 (ALS, SMA), 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌졸중, 다발성 경화증, 타우병증 (진행성 핵상 마비, 피크병, 피질기저 퇴행증 (CBD), 전두측두엽 치매, ALS를 갖는 FTLD), 헌팅턴병, 알코올 금단 및 알코올중독, 당뇨병 유도된 뇌 손상, 두부 손상, 편두통, 두통, 군발성 두통, 척수 손상, 허혈성 손상, 화학요법 유도된 통증 및 화학요법 유도된 신경병증, 정신분열증, 만성 우울증, 자발성 운동장애, 양극성 장애, 및 신경병증.
158. 서술 1 내지 62 중 임의의 하나에 따른 이식 조성물의 용도로서, 대상체에서 신경병증성 통증의 치료용 약제의 제조를 위한, 용도.
159. 서술 158에 있어서, 상기 신경병성 통증이 염증, 좌골신경통, 요통, 암 통증, 당뇨병성 신경병증, 우발적인 손상, 척수 손상, 말초 신경 손상과 연관된, 용도.
160. 서술 1 내지 62 중 임의의 하나에 따른 이식 조성물의 용도로서, 대상체에서 이질통증의 치료용 약제의 제조를 위한, 용도.
161. 서술 154 내지 161 중 임의의 하나에 있어서, 상기 약제가 상기 대상체의 중추 신경계로의 투여를 위해 제형화되는, 용도.
162. 서술 154 내지 161 중 임의의 하나에 있어서, 상기 약제가 상기 대상체의 척수로의 주사를 위해 제형화되는, 용도.
163. 서술 162에 있어서, 상기 주사가 정위 주사인 용도.
164. 서술 154 내지 163 중 임의의 하나에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 용도.
도면의 간단한 설명
도 1. 드로소필라 는 부상 후 열 이질통증을 나타낸다. (A) 부상입지 않은 야생형 동물은 온도 ≥42℃에 반응하여 탈출 행동을 나타낸다; 이 반응은 무통증 및 TrpA1, (n=12, 복제당 10마리 동물)에 의존한다. (B) 본 연구에서 사용된 절단 부상. (C) 부상 후 이질통증 반응의 시간 경과 (38℃). (D) 부상 14일 후 온도에 대한 용량-반응, (n=9, 복제당 10마리 동물). (E) Canton S 데이터에서 부상 7일 후 부상입지 않은 온전한 대조군 또는 동물에 대한 평균 이동 속도는 평균 ± SEM으로서 제시된다. *** p<0.001; ns, 유의미하지 않음, 2-웨이 ANOVA 다음에 A, C-D에 대한 투키(Tukey) 사후 검증, 및 E에 대한 스튜던츠 t-시험.
도 2. TrpA1 은 부상 후 이질통증에 대한 ppk + 감각 뉴런에서 요구된다. (A) 파리 다리에서 ppk+ 감각 뉴런 투사. (B) 다리에서 Lamin-GFP로 표지된 ppk+ 세포체. (C) 절개된 다리로부터 VNC 및 뇌로의 ppk+ 감각 뉴런 투사. (D) ppk+ 감각 뉴런에서 활성 파상풍 독소(TNT)의 발현은 모든 성인 열 자극 거동을 차단하지만 불활성 파상력 독소(iNT)는 차단하지 않는다, (n=9 동물, 복제당 10마리 동물). (E) TrpA1 및 무통증 돌연변이체는 열 이질통증에 대해 내성이다 (38℃). (F) TrpA1는 특히 부상 후 이질통증에 대한 ppk+ 감각 뉴런에서 요구된다, (n=9, 복제당 10마리 동물). (G) ppk+ 감각 뉴런에서 특이적인 TrpA1의 재도입은 이질통증 반응을 구제한다, (n=9, 복제당 10마리 동물). 데이터는 평균 ± SEM으로서 제시된다. *** p<0.001; ns, 유의미하지 않음, ANOVA 다음에 투키 사후 검증.
도 3. 말초 부상은 감각 신경병증, 중심 감작 및 통각성 탈출 회로의 증대를 야기한다. (A-B) (A) 온전한 중간 다리로부터의 자극, (n≥7), (B) 절단 7일 후 다친 다리의 자극, (n≥7) 후 거대 섬유 시스템의 출력인 DLM으로부터의 전기생리학적 기록. (C) ppk+ 감각 신경병증은 다리 절단 후 관찰된다. (D) 경시적으로 절단된 다리에서의 감각 신경병증 (ppk1+ 투영 길이)의 정량화, (n≥7). (E) 부상 후 성인 통각성 전기생리학 제제. (F-H) 다리 절단은 (F, G) 탈출 회로 속도 증가 (심홍색에서 강조된 속도 차이), (F, H) 탈출 반응의 기간 증가 (녹색에서 강조된 다친 기간)에 의한 탈출 반응 회로의 반대측 감작을 초래한다 (n≥9). 데이터는 평균 ± SEM으로서 제시된다. ** p<0.01; *** p< 0.001, 2-웨이 ANOVA 다음에 D에 대한 투키 사후, 및 G 및 H에 대한 Mann-Whitney-Wilcoxon 시험.
도 4. GABA는 말초 활동을 게이팅하고; 말초 신경 부상은 GABA성 기능을 감소시킨다. (A) 복부 신경삭 (VNC)에 대한 ppk+ 감각 뉴런 투사. 항-GABA 및 ppk-Gal4>UAS-CD8-GFP 공동국재화에 인접한 복부 최상부 뷰, 및 항-GABA 및 ppk-Gal4>UAS-CD8-GFP 공동국재화에 인접한 접선 측면 뷰를 나타내는 ppk-Gal4>UAS-CD8-GFP (황색), 항-GABA(녹색), nc82 콘트라스트 얼룩(심홍색). (B) 복부 최상부 뷰 폐쇄를 나타내는, 부상입지 않은 동물 및 다친 동물(다리 절단 후 7일)로부터 GABA 및 nc82에 대해 염색된 VNC의 부상 후 GAGABA 면역반응성의 감소. (C) ppk-Gal4>TNT를 발현시키는 파리의 nc82 및 GABA에 대해 염색된 VNC에서 GABA성 개재뉴런의 영상화. (D) 핵-표지된 Lamin-GFP (Gad1-Gal4>UAS-Lamin-GFP) 및 활성 카스파제 항체를 사용한 VNC의 영상화. (E) 카스파제 억제제 p35의 이소성 발현은 다리 부상 후 GABA성 세포사를 차단한다. (F-G) p35 (Gad1-Gal4>UAS-p35)의 GABA성-특이적 발현은 (F) 탈출 회로 속도, (G) 탈출 반응 기간에 의해 측정된 탈출 반응 회로의 반대측 감작을 구조하였다, (n≥9). (H) UAS-p35의 Gad1-Gal4 유도된 발현에 의한 GABA성 세포사의 차단은 신경병성 이질통증 행동을 예방한다, (n=9, 복제당 10마리 동물). (I) GABA 수용체 D-GABA-B-R2의 통각성 감각 뉴런-특이적 (ppk-Gal4) 녹다운은 부상입지 않은 파리에서 열 이질통증 (38℃)을 유발하는데 충분한 것을 보여준다, (n≥9, 복제당 10마리 동물). 데이터는 평균 ± SEM으로서 제시된다. ** p<0.01; ns, 유의미하지 않음, 2-웨이 ANOVA 다음에 투키 사후 검증.
도 5: 순수 GABA성 뉴런은 hiPSC로부터 효율적으로 유래될 수 있다. (A) 도식적, 말초 신경 부상은 마우스에서 통증 게이트의 억제를 유도한다. 잠재적인 정상 통증의 회복을 위한 잠재적인 임상 전략은 보라색에서 iPSC-유래 GABA 뉴런의 주사이다. (B) 내측 신경절 융기 유형 GABA성 뉴런의 유도에 대한 분화 프로토콜. (C) 분화 동안 GABA 뉴런의 브라이트필드 이미지. 전형적인 마커, 핵 DAPI, TUBB3, GAD65/67을 발현시키는 성숙한 GABA성 뉴런의 DIV28 이미지 및 순도를 나타내는 병합 채널. (D) 분화의 DIV25에서 hiPSC-유래 GABA 뉴런의 FACS 분석. 왼쪽: 자주색에서 TUBB3+ 세포를 나타내는 히스토그램 (회색, 동형 대조군 항체). 중간: 보라색에서 GAD65 발현 세포 (회색, 동형 대조군 항체). 오른쪽: GAD65에 대한 hiPSC-유래 GABA 뉴런, TUBB3의 도트 플롯. (E) GABA성 뉴런 대 hiPSC의 RNASeq 정규화된 FKPM n=3 hiPSC 및 n=4 GABA성 뉴런 (독립적인 분화로부터). (F) hiPSC에 대해 DIV25 뉴런 상에서 수행된 프로테오믹스 (그룹당 n=3), 정규화된 iBAQ 강도의 히트맵. (J) Ki67 염색은, 일부 증식 세포가 DIV25에 남아 있음을 입증한다. (H-I) DIV25 뉴런의 영상화. (H) 뉴런은 VGAT를 발현시키고, 그리고 (I)는 GABA 면역반응성이다.
도 6: 인간 iPSC 유래 GABA성 뉴런은 시험관내에서 기능적이다. (A) DIV25 GABA성 뉴런의 배지 중 GAGABA 농도. (B) 이오노트로픽 글루타메이트 수용체 서브유닛 발현의 정규화된 FPKM. (C) 글루타메이트 및 KCl의 첨가 후 칼슘 과도현상의 대표적인 이미지 (D) 세포에 의해 나타나는 칼슘 과도현상의 정량화 (n=50).
도 7: 인간 iPSC 유래 GABA성 뉴런의 척수 이식은 촉각 이질통증을 완화시킨다. (A) 여분의 신경 부상 (말초 신경병성 통증 모델) 및 생체내 실험의 타임라인 후에 L1 내로의 GABA성 뉴런의 척추 삽입에 기초한 추궁절제 전략의 개략도. (B) 신경 부상 및 GABA성 뉴런의 척추 이식 후 다친 마우스의 정상화된 폰 프로이 역치. (n=21 비히클, 29 GABA성 뉴런) (C) 2개월에 신경 부상 마우스에 대한 자극 반응 곡선 (n=12 비히클 및 n=16 GABA성 뉴런) (D-E) 개 개방 필드 패러다임을 사용한 실험 후 마우스의 개방 필드 운동 분석 및 (F) 동측 변형된 바소 마우스 보행 분석 척도 점수. 이들 실험에 대해 n=9 비히클, GABA성 뉴런 뉴런 이식에 대해 n=13. (G) 아세톤 저온 이질통증 반응. (H) 미접촉 마우스에서 실험 후 정규화된 폰 프레이 역치. (n=11) (I) 신경 부상 및 iSensory Neurons의 주사 후 정규화된 폰 프레이 역치. n=7. D, E F, G, H,I에 대한 본페로니 정정과 함께 반복된 측정 ANOVA을 사용하여 수행된 다중 비교. 본페로니 정정과 함께 B에 대한 투웨이 ANOVA. *p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001.
도 8: 인간 iPSC-유래 GABA성 이식물은 생존하고 내인성 회로와 통합된다. (A) 여분의 신경 부상 (말초 신경병성 통증 모델) 후 hiPSC-유래 GABA성 뉴런의 척추 주사의 도식 및 타임라인. (B-C) 이식된 인간 GABA성 뉴런은 인간 핵 (적색), 항-IB4 (청색), 및 CGRP (녹색) (B-B")에 대한 항체 또는 인간 핵 (적색) 및 시냅신 (녹색) (C-C")에 대한 항체와 함께 염색된 주사된 동측 배면각에서 확인된다. (D-D") 이식된 인간 핵 (적색)은 GABA 합성 마커 GAD65/67 (녹색)와 공동국재화된다. (E-E") GABA성 뉴런은 TUBB3 및 인간 NCAM 공동국재화에 의해 평가되는 바와 같이 이식시 뉴런 표현형을 유지한다. (F-F"') 인간 세포질 (녹색)는 마우스 특이적 바손 (적색)에 병렬되고, 이는 마우스 시냅스전 활성 구역을 표지하고 인간 이식 시냅스에 대한 추정 마우스를 보여준다.
도 8: 인간 iPSC-유래 GABA성 이식물은 생존하고 10주 후에 내인성 회로와 통합될 수 있다. (A) 세포는 광범위하게 이동한다. (B) 세포는 배면각 내에 위치한다. (C) 인간 핵은 NeuN과 공동-위치한다. (D) 인간 뉴런 접착 분자는 MAP2와 공동-위치한다. (E) 인간 세포질은 TUBB3 분자는 MAP2와 공동-위치한다. (F) GABA는 인간 세포질 양성 세포에서 발견된다. (G) GAD65/67는 추정 인간 시냅스에서 발견된다. (H) 인간 세포 위치한 시냅스 소포는 VGAT에 대해 양성이다. (I) 인간 세포는 마우스 바손(Mouse Basson), RIM2에 병렬된다. (J) 전압 게이팅된 칼슘 채널 (VGCC)는 인간 세포에서 발견된다. (K) 리프린(Liprin)은 추정 인간 시냅스에서 발견된다. (L-N) 인간 세포질 위치한 시냅신은 시냅스 발달 후를 제안하는 게피린에 병렬되어 위치한다. (O) SST는 인간 세포에서 발견된다. (P) 파브알부민은 인간 세포에서 발견된다. (Q-R) 척수의 인간 핵이 아니라 양성 대조군 마우스 피부에서 Ki67 염색.
도 10: 부상은 복부 신경삭 (VNC) 및 뇌에 대한 지속적인 이질통증 및 ppk+ 감각 뉴런 투사를 유발한다. (A-B) 온도에 대한 이질통증의 용량-반응, 부상 후 (A) 1일, (B) 7일, (n=9, 복제당 10마리 동물). (C) 복부 최상부 뷰 및 (D) VNC (최하부 패널)의 두 번째 엽의 복부 최상부 및 접선 측면 뷰로 ppk-Gal4 (ppk-Gal4>UAS-CD8-GFP) (황색)에 의해 유도되고 nc82 (심홍색)에 대해 공염색된 CD8-GFP를 발현시키는 파리의 뇌 및 부착된 VNC; n=6. (E) 연결된 뇌, 부착된 VNC, 및 ppk-Gal4>UAS-CD8-GFP 파리 (GFP는 녹색임)의 대퇴골 분절의 일부, n=5.
도 11: 말초 부상은 통각성 탈출 회로의 전기생리학적 특성의 변화를 야기한다. (A-B) 거대 섬유 반응은 고차 뇌 기능을 필요로 한다. (A) 머리가 제거된 파리에서 거대 섬유 뉴런으로부터의 직접 자극, (n≥7). (B) 머리가 제거된 파리에서 온전한 중간 다리로부터의 자극, (n≥7). (C) 다친 파리의 머리로부터의 하행 자극은 여전히 줄어든 반응 잠복을 보여준다, (n≥9). (D) 말초 부상 후 중추 GABA성 개재뉴런 손실의 영상화; 온전한 부상입지 않은 동물 및 다친 동물 (다리 절단후 7일)로부터의 GABA(녹색) 및 nc82(심홍색)에 대해 염색된 VNC의 접선 뷰. (E-F) (E) Canton S, 및 ppk-Gal4>TNT를 발현시키는 파리의 동측 및 반대측으로부터 온전한 및 다친 VNC에서 항-GABA 초점의 정량화, 데이터는 평균 ± SEM으로서 제시된다. * p<0.05, ** p<0.01 C에 대한 Mann-Whitney-Wilcoxon 시험, 및 E 및 F에 대한 스튜던트t-시험.
도 12: VNC에서 GABA 면역반응성의 말초 부상 감소, 그러나 뇌는 제외 (A - C) 항-GABA (녹색)으로 염색되고 대조군 온전한 및 다친 파리에서 심홍색의 항-nc82로 공염색된 VNC 및 뇌로부터의 GABA 초점의 영상화 및 정량화. (A) 부상입지 않은 및 다친 동물로부터 첫 번째 VNC 엽의 복부 상면도. (B) 않은 및 다친 동물로부터의 세 번째 VNC 엽. (C) 부상입지 않은 및 다친 동물로부터의 뇌, 그룹당 n ≥≥7 동물. (D) 핵-표지된 Lamin-GFP (Gad1-Gal4>UAS-Lamin-GFP) 를 발현시키는 파리의 VNC 두 번째 엽에서 GABA성 개재뉴런의 정량화. (E) 핵-표지된 Lamin-GFP를 발현시키는 파리의 대조군 온전한 및 다친 VNC로부터의 GABA/활성 카스파제 이중 양성 세포의 정량화. (F). 다리 부상 후 GABA성 세포사를 차단하는 카스파제 억제제 p35을 발현시키는 파리의 VNC 두 번째 엽에서 GABA 초점의 정량화. (G) Grd, GABA-B-R1, 또는 GABA-B-R3이 아닌 Rdl의 녹다운은 부상입지 않은 파리에서 이질통증을 유발한다, (n≥9, 복제당 10마리의 파리). 데이터는 평균 ± SEM으로서 제시된다. * p<0.05, ** p<0.01; ns, 유의미하지 않음, A-C에 대한 스튜던츠 t-시험, D-F; ANOVA 다음에 G에 대한 투키 사후.
도 13: hiPSC 및 hiPSC 유래 감각 뉴런과 비교된 GABA성 뉴런의 RNASeq. (A) RNAseq 샘플의 계층적 클러스터링은 예상된 클러스터를 산출했다. (B) RNAseq는, GABA성 뉴런이 GABA의 합성 및 방출에 필요한 모든 성분을 발현시킴을 보여준다. (C) GABA 뉴런은 AMPA 및 NMDA 유형 둘 모두를 포함하는 다중 이온이동성 글루타메이트 수용체를 발현시킨다. (D) GABA성 뉴런은 만능분화능 마커 및 세포 주기 및 증식 세포 마커에 대해 고갈된다. (E) GABA성 뉴런은 희소돌기세포의 전사 마커에 대해 풍부하지만 희소돌기세포의 다른 마커 또는 별아교세포 또는 미세아교세포의 마커를 발현시키지 않는다. (F) 선택 GABA 합성 유전자의 qPCR에 의한 검증.
도 14: 차별화 서명 및 아형 분류. (A) GABA성 사양의 이질성을 나타내는 GABA성의 분화의 개략도. (B) 반정량적으로 발현된 발현을 갖는 RNASeq (정규화된)에 의한 분류 마커의 측정. (C) 뉴런은 이 발달 단계에서 주로 PVALB -ve / SST+ve 표현형이었다. 이들은 다중 표현형으로 하위분류한다. 일부 명확하게 얻어진 CGE 마커 및 아형 분류는 CGE에 대해 도시된다.
도 15: hiPSC에 대한 GABA성 뉴런의 단백체 분석. (A) 주성분 분석은 예상된 샘플 클러스터링을 얻었다. (B) 프로테오믹스 데이터의 볼카노(Volcano) 플롯. (C) GABA성 뉴런에서 차별적으로 발현된 유전자의 리액톰(Reactome) 경로 분석. (D) GABA 합성 경로 정상화된 iBAQ 값. (E) GABA성 마커 GAD65 및 글리시네성 마커 GlyT2의 확인의 웨스턴 블랏. 그룹당 N=3.
도 16: 이식의 행동 특성규명. (a) 3주째 및 4주째에 현저한 통각상실증 을 나타내는 자극 반응 곡선. (b) GABA성 이식 (왼쪽), 미접촉 이식 (중간) 및 감각 이식 (오른쪽)의 데이터 분포, (c) 감각 뉴런 이식 3주 후 자극 반응 곡선. 감각 뉴런 이식은 하지만 배지는 통각과민증을 유발하지 않았다. (d) 미접촉 마우스로의 GABA성 뉴런의 주사는 효과가 없었다.
도 17: 신경병성 마우스에서 통증을 경감시키지 위한 SST vs PAVB (풍부) hiPSC-GABA 뉴런의 효능. (A-B) 3주째에 BMP4로 처리되거나 처리되지 않은 DIV25 hiPSC-GABA 뉴런에서 (A) PAVB 및 (B) SST 발현의 qPCR 분석. (C) BMP4로 처리된 hiPSC-GABA성 개재뉴런은 폰 프로이 역치(von Frey threshold)에 의해 평가되는 바와 같이 신경 부상 마우스에 이식되는 경우 더 큰 진통 효과를 나타낸다; (D) 이식된 iGABA성 PAVB 풍부 뉴런은 이식 5주후의 각각의 기준선 대조군과 비교하여 유의한 차이를 나타내지 않는다(즉, 통증은 SNI 동물에서 정상으로 완전히 돌아간다). 폰 프레이 역치는 50% 발 회피 역치이다. (달리 언급하지 않는 한 처리된 배지와 비교된 투웨이 ANOVA, 시닥(Sidak) 다중 비교 시험, P<0.05, *, P<0.0001, ****)
구현예의 설명
정의
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "세포"는 단일 세포뿐만 아니라 (즉, 하나 초과의) 세포의 집단을 지칭한다. 집단은 뉴런 세포의 집단 또는 미분화 줄기 세포의 집단과 같은 하나의 세포 유형을 포함하는 순수한 집단일 수 있다. 대안적으로, 집단은 하나 초과의 세포 유형, 예를 들어 혼합된 세포 집단을 포함할 수 있다. 이는 집단에서 세포의 수를 제한하는 것을 의미하지 않으며, 예를 들어, 혼합된 세포 집단은 적어도 하나의 분화된 세포를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 혼합된 집단은 적어도 하나의 분화된 집단을 포함할 수 있다. 본 발명에서, 세포 집단이 포함할 수 있는 세포 유형의 수에는 제한이 없다.
본원에서 사용된 바와 같이, 분화 세포 시스템에서 세포에 대해 사용되는 용어 "분화"는, 세포가 하나의 세포 유형 (예를 들어, 다능성, 만능성 또는 만능성 분화가능한 세포)으로부터 표적 분화된 세포와 같은 다른 세포 유형으로 분화되는 과정을 지칭한다. 따라서, 본원에서 사용되는 용어 "세포 분화"는, 보다 덜 특화된 세포 (예를 들어, 줄기 세포)가 보다 뚜렷한 형태 및 기능을 갖도록 발달 또는 성숙하는 (즉, 보다 특화된) 특수화 과정 또는 경로를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 세포와 관련하여 사용된 바와 같은 용어 "탈분화" 또는 "탈분화된"은 더 뚜렷한 형태 및 기능, 및/또는 제한된 자가-재생 및/ 또는 증식 능력을 갖는 더 특화된 세포가 덜 특화되고 더 큰 자가-재생 및/또는 증식 능력 또는 분화 능력 (예를 들어, 다능성, 만능 등)을 획득하는 과정을 지칭한다. 유도 만능 줄기 세포(iPSC)는 탈분화된 세포의 예이다. 따라서, 탈분화는 세포 재프로그래밍의 과정을 지칭할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 세포와 관련하여 용어 "신경 분화 유도"는 디폴트 세포 유형 (유전자형 및/또는 표현형)을 비-디폴트 세포 유형(유전자형 또는 표현형)으로 변화시키는 것을 지칭한다. 따라서 세포가 뉴런 표현형을 수득하도록 하는 "세포에서 뉴런 분화를 유도하는" 또는 "분화 세포"는, 세포가 뉴런 특성을 갖도록 유도하는 것, 또는 세포가 세포의 최초 동일성과 상이한 뉴런 특성을 갖는 자손 세포로 분열하도록 유도하는 것을 포함하며, 이는 유전자형 (즉, PCR 또는 마이크로어레이와 같은 유전자 분석에 의해 결정된 바와 같은 유전자 발현의 변화) 및/또는 표현형 (예를 들어, β-III 튜불린과 같은 단백질, 또는 β-III 튜블린, 마이크로튜불 연관 단백질 2 (MAP2), 시냅신, 뉴로필라멘트-L, 네스틴 및 N-Cam, Tuj1, GAD65/67, TUJ1, GlyT2 및 VGAT 중 둘 이상의 조합을 포함하는 복수의 단백질의 형태, 기능 및/또는 발현에서의 변화)이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "뉴런"은 성숙한 유사분열후 뉴런의 기능적 및/또는 표현형 특성을 나타내는 신경 계통의 분화된 계통 수임 세포, 또는 성숙한 유사분열후의 뉴런의 추가의 기능적 및(또는) 표현형적 특징들을 나타내기 위해, 생체내 또는 시험관내에서 추가의 성숙을 필요로 하는 신경 계통들의 분화된 계열 위탁 세포를 지칭한다. 뉴런은 다음의 마커 중 하나 이상을 발현시킬 수 있다: β-III 튜불린, 미세소관 관련된 단백질 2 (MAP2), 시냅신, 신경필라멘트-L, 네스틴 및 N-Cam, Tuj1, GAD65/67, TUJ1, GlyT2 및 VGAT. "GABA성 뉴런 표현형" 또는 "GABA성 뉴런"은 성숙한 유사분열후 뉴런의 기능적 및/또는 표현형적 특징을 나타내고, β-III 튜불린, 미세소관 관련된 단백질 2 (MAP2), 시냅신, 신경필라멘트-L, 네스틴 및 N-Cam, Tuj1, GAD65/67, TUJ1, GlyT2 및 VGAT 중 하나 이상을 발현시키고 GABA를 생산하는 신경 계통의 분화된 계통 수임 세포를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "억제하다", "억제하는" 및 "억제"는 활성 또는 양의 감소(reduction), 하락(decrease), 불활성화, 하향-조절, 제거 또는 억제를 지칭한다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "억제제"는 분자의 유전자 또는 단백질 발현 및/또는 분자의 활성 및/ 또는 기능을 방해하는(즉, 감소, 하락 또는 불활성화, 하향조절, 제거 또는 억제하는) 제제를 지칭한다. 예를 들어, SMAD 신호전달의 억제제와 같은 신호전달 분자 또는 신호전달 분자의 경로를 억제하는 것과 관련하여, 억제제는 SMAD 신호 경로에 관여하는 독립체의 유전자 또는 단백질 발현 및/또는 신호전달 분자의 활성 및/또는 기능 또는 분자 또는 경로의 신호전달 기능을 방해하는 제제를 지칭한다. 유사하게, BMP, wnt, 감마 세크레타제 등의 억제제와 관련하여, 억제제는 BMP, Wnt, 감마 세크레타아제 등의 발현 또는 활성 또는 기능을 방해하는 제제를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 본 발명에 의해 정의된 바와 같은 화합물과 세포를 "접촉시키는"이라는 용어는 "접촉된" 세포를 생산하기 위해 세포를 접촉시킬 수 있는 위치에 화합물을 배치하는 것을 지칭한다. 접촉은 임의의 적합한 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 접촉은 세포의 용기 (예를 들어, 튜브, 바이알 또는 배양 플라스크 또는 배양 접시 등)에 화합물을 첨가함하는 것이다. 접촉은 또한 세포의 배양물에 화합물을 첨가함으로써 달성될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "줄기 세포"는 분화전능성 또는 만능 또는 다분화능이고, 하나 이상의 상이한 세포 유형, 예컨대 배아 줄기 세포, 기관으로부터 단리된 줄기 세포로 분화할 수 있는 세포를 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "성체 줄기 세포"는 출생 후 유기체로부터 유래된 줄기 세포를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "신경 줄기 세포" 또는 "NSC" 또는 "신경 전구체 세포" 또는 "신경 선조 세포"는 생체내에서 뉴런, 별아교세포, 희소돌기아교세포 및 신경교 세포가 될 수 있는 세포, 및 배양에서 뉴런 세포 자손 및 신경교 자손을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "만능"은 임의의 (또는 다수의) 분화된 세포 유형(들)으로 분화할 수 있는 세포주를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "다분화능" 적어도 2개의 분화된 세포 유형으로 분화할 수 있는 세포주를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "일차 세포"는 배양의 부재 하에 동물의 조직 (예를 들어, 혈액) 또는 기관으로부터 직접 수득되는 세포이다. 전형적으로, 반드시 그런 것은 아니지만, 일차 세포는 노화 및/또는 증식의 중단 전에 시험관내에서 10개 이하의 계대배양을 수행할 수 있다.
"유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 또는 (iPS 세포)"는 예를 들어 체세포에 덜 분화된 표현형을 부여하는 외인성 유전자를 도입함으로써 재프로그램되거나 "탈분화된" 체세포에 속하는 지정이다. 이어서, 이들 세포를 유도하여 덜 분화된 자손으로 분화시킬 수 있게 된다. IPS 세포는 2006년에 원래 발견된 접근법의 변형을 사용하여 유래되었다 (Yamanaka, S. 등, Cell Stem Cell, 1:39-49 (2007)). 예를 들어, 일 사례에서, iPS 세포를 생성하기 위해, 과학자들은 피부 세포로 시작한 다음, 레트로바이러스를 사용하여 표준 실험실 기술에 의해 변형되어 유전자를 세포 DNA 내로 삽입하였다. 일 사례에서, 삽입된 유전자는 Oct4, Sox2, Lif4, 및 c-myc이었고, 이들은 세포를 배아 줄기 세포-유사 상태로 유지하기 위한 천연 조절제로서 함께 작용하는 것으로 알려져 있다. 이들 세포는 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, Wernig 등, PNAS, 105:5856-5861(2008); Jaenisch 등, Cell, 132:567-582 (2008); Hanna 등, Cell, 133:250-264 (2008); 및 Brambrink 등, Cell Stem Cell, 2:151-159 (2008)을 참고한다. 또한, 이러한 세포는 특정 배양 조건(특정 제제에 대한 노출)에 의해 생성될 수 있고, 또한 다양한 상이한 출발 세포 유형으로부터 생성될 수 있다. 이들 참고문헌 모두는 IPSC 및 이들의 제조 방법을 교시하기 위해 참고로 편입되어 있다.
iPS 세포는 배아 줄기 세포의 많은 특징적인 특징을 갖는다. 예를 들어, 이들은 생식 계열 전달 및 사배체 상보성을 갖는 키메라를 생성하는 능력을 가지며, 또한 3개의 배아 생식층으로부터 다양한 세포 유형을 함유하는 기형종을 형성할 수 있다. 다른 한편으로는, 이들은 일부 보고서가 입증하는 것과 동일하지 않을 수 있다. 예를 들어, 유도된 만능 줄기 세포 및 배아 줄기 세포가 유전자 발현 서명에 의해 구별될 수 있음을 보여주는 Chin et al., Cell Stem Cell 5:111-123 (2009)을 참고한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "세포주"는 일차 세포주, 유한 세포주, 연속 세포주 및 형질전환된 세포주를 포함하는 시험관내에서 배양된 세포를 지칭하지만, 세포가 배양에서 무한한 수의 계대가 될 수 있는 것을 필요로 하지 않는다. 세포주는 자발적으로 또는 형질전환에 의해 생성될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "세포 배양물"은 세포의 임의의 시험관내 배양물을 지칭한다. 용어 "배양하는"은 세포를 성장 및/또는 유지 및/또는 조작하는 과정을 지칭한다. 이 용어 내에 연속 세포주 (예를 들어, 불멸 표현형을 가짐), 일차 세포 배양물, 유한 세포주 (예컨대, 형질전환되지 않은 세포), 및 난모세포 및 배아를 포함하는 시험관내에서 유지되는 임의의 다른 세포 집단이 포함된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "일차 세포 배양물" 및 "일차 배양물"은 생체내 세포로부터, 예컨대 동물 또는 인간으로부터의 조직 표본 또는 생검으로부터 직접 수득된 세포 배양물을 지칭한다. 이들 배양물은 성인 및 태아 조직으로부터 유래될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어들 "배양 배지", 및 "세포 배양 배지"는 시험관내에서 세포의 성장을 지원하기에 적합한 배지(즉, 세포 배양물, 세포주 등)를 지칭한다. 상기 용어는 임의의 특정 배양 배지로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 예를 들어, 정의는 유지 배지 뿐만 아니라 세포의 분화 또는 특수화를 위한 다른 배지를 포괄하는 것으로 의도된다. 사실상, 상기 용어는 관심 세포 배양물 및 세포의 성장에 적합한 임의의 배양 배지를 포괄하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "키트"는 물질을 전달하기 위한 임의의 전달 시스템을 지칭한다. 세포 분화의 문맥에서, 키트는 줄기 세포를 접촉시키기 위한 물질의 조합을 지칭할 수 있으며, 이러한 전달 시스템은 한 위치에서 다른 위치로 적절한 용기 (예를들면, 튜브 등) 및/또는 지지 물질 (예를 들면, 완충액, 세포 분화를 수행하기 위한 기재된 지침 등)에서 반응 시약 (예를 들어, 화합물, 단백질, 검출제 (예를 들면, 프로브 또는 항체) 등의 저장, 수송 또는 전달을 허용하는 시스템을 포함한다. 예를 들어, 키트는 관련된 반응 시약 (예컨대 억제제 (예를 들어 SB431542 및 LDN193189 wnt 억제제, bmp 억제제, 아폽토시스 억제제, 괴사 억제제) 및 성장 인자 및 사이토카인 (예를 들어 GDNF, BDNF)) 및/또는 지지 물질을 함유하는 하나 이상의 봉입체 (예를 들어, 박스, 또는 백, 및 기타 동종의 것)을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "시험관내"는 인공 환경 및 인공 환경 내에서 일어나는 공정 또는 반응을 지칭한다. 시험관내 환경은, 비제한적으로, 시험관 및 세포 배양물배양물로 구성될 수 있다. 용어 "생체내"는 천연 환경 (예를 들어, 동물 또는 세포) 및 천연 환경 내에서 일어나는는 과정 또는 반응을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "마커" 또는 "세포 마커"는 특정 세포 또는 세포 유형을 식별하는 유전자 또는 단백질을 지칭한다. 세포에 대한 마커는 하나의 마커로 제한되지 않을 수 있고; 마커는, 마커의 지정된 그룹이 다른 세포 또는 세포 유형으로부터 세포 또는 세포 유형을 식별할 수 있도록 마커의 "패턴"을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 뉴런은 뉴런을 구별하는 하나 이상의 마커, 예를 들어 β-III 튜불린, 네스틴, N-Cam, Tuj1, GAD65/67, TUJ1, GlyT2 및 VGAT를 발현시킨다.
본원에 개시된 임의의 세포와 관련하여 이루어지는 경우, 용어 "로부터 유래된" 또는 "로부터 확립된", 또는 "으로부터 분화된"은, 예를 들어 단백질, 화학물질, 방사선, 바이러스에 의한 감염, DNA 서열에 의한 형질감염, 예컨대 모르포겐, 등에 의한 형질감염, 배양된 모 세포에 함유된 임의의 세포의 선택 (예컨대 연속 배양에 의한)을 사용하여 단일 세포 단리, 생체내 배양, 처리 및/또는 돌연변이유발을 포함하는 임의의 조작을 사용하여 세포주, 조직, 또는 유체에서 모 세포로부터 수득된 (예를 들어, 단리된, 정제된 등) 세포를 지칭한다. 유도된 세포는 성장 인자, 사이토카인, 사이토킨 치료의 선택된 진행, 부착성, 부착성 결여, 분류 절차, 및 기타 동종의 것에 대한 반응으로 혼합 집단으로부터 선택될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어들 "신경퇴행성 장애" 및 "신경퇴행성 질환"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되고, 비정상적인 세포 사멸을 특징으로 하는 신경계(예를 들어, 중추 신경계 또는 말초 신경계)의 질환을 의미한다. 신경변성 병태의 예는 알츠하이머 질환, 다운 증후군, 전두측두 치매, 진행성 핵상 마비, 피크병, 니만-피크병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 치상핵적핵담창구시상하핵 위축증, 케네디병 (또한 일명 척수연수 근육 위축증), 및 척수소뇌 운동실조증 (예를 들어, 1형, 유형 2, 유형 3 (또한 일명 마카도-조셉병), 유형 6, 유형 7, 및 유형 17)), 취약한 X (Rett) 증후군, 취약한 XE 정신 지체, 프리드리히 운동실조증, 근긴장성 이상증, 척수소뇌 운동실조증 유형 8, 및 척수소뇌 운동실조증 유형 12, 알렉산더병, 알퍼스병, 근위축 측삭 경화증 (또는 운동 뉴런 질환), 유전성 강직성 대마비, 미토콘드리아 질환, 혈관확장성 운동실조증, 바텐병 (또한 일명 스필마이어-보그트-쇼그렌- 바텐병), 카나반병, 코케인 증후군, 피질기저 퇴행증, 크로이펠츠-야콥병, 허혈성 뇌졸중, 크라베병, 루이체 치매, 다발성 경화증, 다계통 위축증, 펠리제우스-메르츠바하병, 피크병, 일차 측삭 경화증, 레프섬병, 샌드호프병, 실더병, 척수 부상, 척추 근육 위축증, 스틸-리차드슨-올스제위스키 질환, 및 척수매독을 포함한다.
용어들 "치료", "치료하는", "치료한다" 등은 일반적으로 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 효과는 질환 또는 그의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 측면에서 예방적일 수 있고/있거나 질환에 대한 부분적 또는 완전한 안정화 또는 치유 및/또는 질환에 기인하는 역효과의 측면에서 치료적일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 "치료"는 포유동물, 특히 인간에서 질환의 임의의 치료를 포괄하며 다음을 포함한다: (a) 질환 또는 증상에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 질환 또는 증상을 갖는 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질환 또는 증상이 발생하는 것을 방지하는 것; (b) 질환 증상을 억제하는 것, 즉 그의 발달을 저지하는 것; 또는 (c) 질환 증상의 완화, 즉 질환 또는 증상의 퇴행을 유발하는 것.
용어들 "개체", "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 진단, 치료 또는 요법이 요망되는 임의의 포유동물 대상체, 특히 인간을 지칭한다.
당업자에 의해 이해될 바와 같이, 임의의 및 모든 목적을 위해, 특히 기재된 설명을 제공하는 관점에서, 본원에 개시된 모든 범위는 또한 임의의 및 모든 가능한 하위범위 및 그의 하위범위의 조합을 포함한다. 임의의 열거된 범위는, 동일한 범위가 적어도 동일한 절반, 1/3, 1/4, 1/5, 1/10, 등으로 분할되는 것을 충분히 설명하고 가능하게 하는 것으로 쉽게 인식될 수 있다. 비제한적인 예로서, 본원에서 논의된 각각의 범위는 하부 1/3, 중간 1/3 및 상부 1/3, 등으로 쉽게 분할될 수 있다. 또한 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 모든 언어 예컨대 "최대", "적어도"', "초과", "미만", 및 기타 동종의 것은 인용된 수를 포함하고 후속적으로 하위범위 상기에 논의된 바와 같은 하위 범위로 분할될 수 있는 범위를 지칭한다.
용어 "포함하다(comprise)", "포함하다(comprises)", "포함된" 또는 "포함하는"이 본 명세서(청구항을 포함)에서 사용되는 경우, 이들은 언급된 특징, 정수, 단계 또는 성분의 존재를 명시하는 것으로 해석되어야 하지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계, 또는 성분, 또는 이들의 그룹의 존재를 배제하는 것은 아니다.
종래 기술로서 주어지는 특허 문헌 또는 다른 사항에 대한 본원의 참조는, 그 문헌 또는 사항이 알려져 있거나 또는 그것이 포함하는 정보가 임의의 청구항의 우선일에서와 같은 일반적인 지식의 일부라는 것을 인정하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
GABA성 뉴런 이식 조성물
통각은 동물이 잠재적으로 부상을 입는 자극을 검출하고 탈출할 수 있게 하는 감각이다. 포유동물에서, 통각성 감각 정보는 중추 신경계에서 통합되고 처리되며, 이때 "통증"이 경험된다. 이 시스템은 먼저 500백 만년 전에 진화하였고, 통각의 유전적 아키텍처는 강한 선택적 압력 하에 있는 것으로 보인다. 파리 유층 통각 행동 패러다임은 급성 통각의 핵심 보존된 유전적 아키텍처를 정의하기 위한 강력한 도구였다. 파리 유충에서 급성 또는 일시적 통각성 감작을 특성화하는 많은 작업이 수행되었지만, 만성 통각성 상태의 조사는 아직 가능하지 않았다.
신경병성 부상은 만성 통각수용 감작을 유발하며, 여기서 무해한 자극은 통증을 유발할 수 있다("이질통증"으로 지칭됨). 통증 질환을 치료하기 위해 표적화될 수 있는 핵심 근본적인 메카니즘을 확인하기 위해, 본 발명자들은 초파리에서 신경병성 "통증" 반응을 조사하였다. 놀랍게도, 본 발명자들은 온전한 동물이 42℃ 초과의 온도에 대해 강력한 탈출 반응을 나타내었지만, 부상 후, 동물이 유해하지 않은 온도 (즉, 열 이질통증)에 대해 공격적인 반응을 보였다는 것을 발견하였다. 이러한 반응의 체계적인 유전적 분리를 통해, 본 발명자들은 열 이질통증이 보존된 TRP 채널 TrpA1에 의존하였고, 중추 GABA성 억제의 손실이 이질통증과에 필요하고 충분하다는 것을 발견하였다. 신경병성 통증의 문맥에서 척추 억제를 회복시키는 치료 가능성을 연구함으로써, 본 발명자들은 놀랍게도 신경병적 대상체에게 이식될 때 인간 유도된 만능 줄기 세포 (hiPSC)로부터 생성된 억제 GABA성 뉴런 이식이 수령체의 신경계 (예를 들어, 중추 신경계) 내에서 생존 및 통합할 뿐만 아니라, 중요하게는 부작용 없이 신경병성인 통증으로부터 오래 지속되는 완화를 제공하였다는 것을 발견하였다.
본 발명은 본 발명에 따른 GABA성 뉴런의 집단을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 GABA성 뉴런의 생성 방법을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 따라 생성된 GABA성 뉴런의 집단을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
약제학적 조성물은 일반적으로 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 및/또는 승인된 담체, 첨가제, 항생제, 보존제, 아쥬반트, 희석제 및/또는 안정화제를 포함할 수 있다. 그와 같은 보조 물질은 물, 염수, 글리세롤, 에탄올, 습윤 또는 유화제, pH 완충 물질, 등일 수 있다. 적합한 담체는 전형적으로 큰, 서서히 대사작용된 분자 예컨대 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체, 지질 응집체 등이다. 이 약제학적 조성물은 추가의 첨가제 예컨대 만니톨, 덱스트란, 당, 글리신, 락토스 또는 폴리비닐피롤리돈 또는 다른 첨가제 예컨대 산화방지제 또는 불활성 가스, 안정화제 또는 생체내 투여에 적합한 재조합 단백질 (예를 들어 인간 혈청 알부민)을 함유할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용가능한"은 적절한 경우 포유동물, 특히 인간에게 투여될 때 유해, 알레르기 또는 다른 불리한 반응을 생성하지 않는 분자 독립체 및 조성물을 지칭한다. 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제는 임의의 유형의 무독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 제제화 보조제를 지칭한다.
일 측면에서, 본 발명은 대상체에서 통증의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 GABA성 뉴런의 집단을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 통증은 신경병성 통증이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 GABA성 뉴런의 집단을 포함하는 약제학적 조성물의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 통증의 치료 방법에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 통증은 신경병성 통증이다.
본 발명의 또 다른 측면은 신경퇴행성 질환 또는 중추 또는 말초 신경계에 대한 부상을 치료하는데 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 GABA성 뉴런의 집단에 관한 것이다 본 발명은 또한 신경퇴행성 질환 또는 중추 또는 말초 신경계에 대한 부상을 치료하는 방법에 관한 것이되, 상기 방법은 상기 기재된 바와 같은 뉴런 집단을 치료 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 문맥에서, 본원에 사용된 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 병리의 개시를 지연 또는 예방하고, 병리의 증상의 진행, 악화 또는 저하를 역전시키거나, 완화시키거나, 억제시키거나, 늦추거나, 중단시키고, 병리 증상의 개선을 초래하고/거나, 병리를 치유하는 것을 목표로 하는 방법을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료 유효량"은 의도된 목적을 달성하기에 충분한 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 이식 조성물 또는 GABA성 뉴런(또는 그의 집단 또는 그의 약제학적 조성물)의 수의 임의의 양을 지칭한다. 효과적인 투여량 및 투여 레지멘은 대상체의 병리의 성질에 기초하여 양호한 의학적 실시에 의해 용이하게 결정될 수 있고, 병리의 증상의 정도 및 관심 조직 또는 기관의 부상 또는 퇴행의 정도, 및 대상체의 특성 (예를 들어, 연령, 체중, 성별, 전반적인 건강 등)을 포함하나 이에 제한되지 않는 수많은 인자에 따라 달라질 것이다.
일 구현예에서 본 발명은 GABA성 뉴런의 집단, GFR알파 작용제, 및 적어도 하나의 세포사 억제제를 포함하는 이식 조성물에 관한 것이며, 상기 GABA성의 뉴런은, 세포가 GABA성 뉴런 표현형을 수득하고 GABA를 생산하도록 하는 조건 하에 시험관내에서 만능 줄기 세포, 또는 다분화능 줄기 또는 선조 세포를 분화시켜 생성된다.
일 구현예에서 본 발명은 GABA성 뉴런의 집단, GFR알파 작용제, 아폽토시스 억제제, 및 괴사 억제제를 포함하는 이식 조성물에 관한 것이고, 상기 GABA성 뉴런은, 세포가 GABA성 뉴런 표현형을 수득하고 GABA를 생성하도록 하는 조건 하에 시험관내에서 만능 줄기 세포, 또는 다분화능 줄기 또는 선조 세포를 분화시킴으로써 생성된다.
요법을 위해, 본원에 기재되고 예시된 방법에 따라 생산된 iPSC-유래 GABA성 뉴런 및 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 임의의 적절한 경로를 통해 투여될 수 있다. 투여 용량 및 투여 횟수는 알려진 방식으로 당업자에 의해 최적화될 수 있다.
예를 들어, 투약량은 약 100; 500; 1,000; 2,500; 5,000; 10, 000; 20,000; 50,000; 100,000; 500,000; 1,000,000; 5,000,000 내지 10,000,000개 세포 또는 그 초과 (또는 이들 사이의 임의의 적분 값)을 변할 수 있고; 투여 빈도는, 예를 들어, 체중, 투여 경로, 질환의 중증도 등에 따라 예를 들어, 일당 1회, 주당 2회, 주당 1회, 매월 2회, 매월 1회, 매년 1회, 매년 2회, 2, 3, 4 또는 5개월마다 1회이다. 일 구현예에서, 바람직한 용량은 100,000 세포/마이크로리터이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 2.5백만개의 세포를 포함한다.
본원에 기재된 세포는 이식을 위해 생리학적으로 적합한 담체에 현탁될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "생리학적으로 양립가능한 담체"는 제형의 다른 성분과 양립가능하고 그의 수령체에게 유해하지 않은 담체를 지칭한다. 당업자는 생리학적으로 적합한 담체에 친숙하다. 적합한 담체의 예는 세포 배양 배지 (예를 들어, 이글스(Eagle's) 최소 필수 배지), 포스페이트 완충 염수, 한크(Hank's) 평형 염류 용액 +/- 글루코스 (HBSS), 및 다중 전해질 용액, 예컨대 Plasma-LyteTM A (Baxter)를 포함한다.
일 구현예에서, 이식 조성물 중의 GFR알파 작용제는 다음으로 구성된 군 중 임의의 하나 이상로부터 선택된다: GDNF, 뇌-유래된 신경친화성 인자 (BDNF), NGF, 뉴르투린, 아르테민, 페르세핀, GDNF 수용체 내인성 작용제, BT18, BT13, NT-3, NT-4, CNTF, GFR알파1 작용제, XIB4035, Trk 활성제, TrkA 작용제, 가모보긱 아민, 아미트립틸린, TrkB 작용제, N-아세틸세로토닌, 아미트립틸린, BNN-20BNN-27, 데옥시게두닌, 7,8-디하이드록시플라본, 4'-디메틸아미노-7,8-디하이드록시플라본, 디이소메틴, HIOC, LM22A-4, 뉴로트로핀-3, 뉴로트로핀-4, 노르우고닌, R7 (약물), 및 7,8,3'-트리하이드록시플라본. 일 구현예에서, GFR알파 작용제는 신경교 세포-유래된 신경친화성 인자 (GDNF), 뉴르투린 (NRTN), 아르테민 (ARTN) 및 페르세핀 (PSPN)으로 구성된 군로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, GFR알파 작용제는 GDNF이다.
일 구현예에서, 이식 조성물 중의 아폽토시스 억제제는 Boc-Asp(OMe) 플루오로메틸 케톤 IDN-8066, 7053, 7436 1965 6556 M867 IDN-5370 IDN-7866 프랄나카산 z-Vad-FMK, YVAD-FMK, c-DEVD-CHO, Ac-YVAD-CHO, Ac-DVAD-FMK Q-Vd-OPh, CrmA (카우폭스 바이러스 단백질), p35 (바콜루바이러스 단백질), Z-ATAD-FMK, INF-4E, Z-DQMD-FMK, Az 10417808, Z-LEED-FMK, ZVDK -FMK, z-IETD-FMK, INf-39, 벨나카산, Ac-DEVD-CHO, 및 엠리카산으로 구성된 군으로부터 선택된 카스파제 억제제; 또는 칼페인 억제제 1, 칼펩틴, E64, MDL28170, MG101, 아세틸-칼파스타틴, PD 150606로 구성된 군으로부터 선택된 카스파제 활성제의 억제제 중 하나 이상으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 아폽토시스 억제제는 Boc-Asp(OMe) 플루오로메틸 케톤이다.
또 다른 구현예에서, 카스파제 유전자 및 경로의 직접적인 억제는 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 GABA성 뉴런 또는 이들이 유래되는 세포, 예컨대 by-TALENS, CRISPR-Cas9, 또는 RNAi의 유전자 조작에 의해 달성되어 세포 생존을 촉진시킬 수 있다.
일 구현예에서, 이식 조성물 중의 괴사 억제제는 MS-1, IM-54, GSK-872, 7-Cl-O-Nec1, 네크로스타틴-1, 네크로설폰아미드 중 하나 이상으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 괴사 억제제는 네크로설폰아미드이다.
또 다른 구현예에서, 괴사 유전자 및 경로 및 경로의 직접적인 억제는 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 GABA성 뉴런 또는 이들이 유래되는 세포, 예컨대 by-TALENS, CRISPR-Cas00071, 또는 RNAi의 유전자 조작에 의해 달성되어 세포 생존을 촉진할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 이식 조성물은 아만타딘, 메만틴, 케타민 하이드로클로라이드, 페티딘, 트라마돌, 메타돈, 덱트로폭시펜, 아산화질소, 덱스트로메토르판, AP5, AP7, CPPene, 셀포텔, 에탄올, 미노사이클린, 아토목세틴, AZD6765, 아그마틴, 클로로포름, 덱스트랄로판, 덱스트로판, 디페니딘, 디조실핀, 에티사이클리딘, 가사이클리딘, 케타민 (다른 형태), 마그네슘, 메톡세티민, 니토르메만틴, PD-137899, 펜사이클리딘, 롤리사이클리딘, 테노사이클리딘, 틸레타민, 네라멕산, 엘리프라돌, 에톡사드롤, 덱속사드롤, WMS-2539, NEFA, 델루세민, 8A-PDHQ, 압티가넬, HU-211, 후페리진 A, 이보가인, 레마세마이드, 린코파일린, 가바펜틴, 라파스티넬, NRX-1074, 7-클로르키뉴렌산, 4-클로르키우누레닌, 5,7-디클로로키뉴렌산, 키뉴렌산, TK-40, 1-아미노사이클로프로판카복실산, L-페닐알라닌, 및 크세논로 구성된 군으로부터 선택된 흥분독성 유도된 아폽토시스 또는 네크롭토시스의 하나 이상의 억제제; 부피바카인, 리도카인, 코카인, 라모트리진, 파르알데하이드, 스티리펜톨, 페노바비톨, 프리미돈, 메틸페노바비톨, 펜토바르비탈, 벤조디아제핀 (클로바잠, 클로나제팜, 클로라제페이트, 디아제팜, 미다졸람, 로라제팜, 니트라제팜, 테마제팜, 니메타제팜)브롬화칼륨, 펠바메이트, 카복사미드 (카밤아제핀, 옥스카르브아제핀, 에슬리카바제핀 아세테이트, 발프로에이트 (발프로산, 나트륨 발프로에이트, 디발프로엑스 나트륨, 비가바트린, 프로가바이드, 티아가빈, 토피라메이트, 프레가발린, 에토토인, 페나이토인, 메페나이토인, 포스페나이토인, 파라메타돈, 트리메타디온, 에타디온, 베칼라미드, 프리미돈, 브리바라세탐, 에티라세탐, 레베티르세템, 슬렉트라세템, 에토석시마이드, 펜숙시미드, 메숙시미드, 아세타졸라미드, 설티암, 메타졸아미드, 조니사마이드, 페네투라이드, 페나세미드, 발프로미드, 발록타미드, 페람파넬, 스티리펜톨, 파이록시딘, 이소플루란, 레보플루란, CNV1014802, 푸나피드, 프릴로카인, 이온토카인, 레보부피바카인, 부타닐리카인, 카티카인, 디부카인, 에티도카인, 메피바카인, 프릴로카인, 트리메카인, 아밀로카인, 사이클로메틸카인, 알파-유카인, 베타-유카인, 헥실카인, 이소부카인, 피페로카인, 오르토카인, 벤조카인, 부타미베, 클로로프로카인, 루카인, 디메토카인, 메프릴카인, 루카인, 니트로카인, 오르토카인, 프로폭시카인, 노보카인, 프록시메타카인, 리소카인, 테트라카인. 락사트라이진, 삼환형 항우울제 (아미트립틸린, 노르트립틸린, DSP-2230, 멕실리틴, 플루피르틴, 지코노타이드; 또는 아편 및 오피오이드, 비-스테로이드 항-염증제, 파라세타몰, 아세테날리다이드, 캡사이신, 멘톨, 칸나비스 및 칸니비노이드를 포함하는, 주변 활성을 억제하는 임의의 약물로부터 선택된 흥분성의 하나 이상의 억제제를 포함하거나 그것들과 함께 투여될 수 있다.
공급되어야 하는 상기 언급된 작용제 및 억제제 각각의 양은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 카스파제 또는 카스파제 신호전달의 억제 수준 및/또는 아폽토시스 또는 괴사의 정도는 통상적인 검정에 의해 결정될 수 있다. 이식 조성물 및 방법(세포 배양 배지 및 키트를 포함하나 이에 한정되지 않음)에 사용되는 GFR알파 작용제, 아폽토시스 억제제 및 괴사 억제제의 농도는 뉴런 세포 생존력 및 기능과 관련하여 쉽게 확인될 수 있으며, 이들 둘 모두는 본원에 기재된 검정과 함께 당업자에게 알려진 검정을 사용하여 쉽게 평가될 수 있고, 이에 따라 조정될 수 있다.
본 발명의 구현예들에서, 상기 언급된 억제제 및 작용제는 피코몰 내지 마이크로몰 농도 범위의 농도로 존재할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 이식 조성물의 GABA성 뉴런은 β-III 튜불린, 미세소관 관련된 단백질 2 (MAP2), 시냅신, 신경필라멘트-L, 네스틴 및 N-Cam, Tuj1, GAD65/67, TUJ1, GlyT2 및 VGAT 중 하나 이상을 발현시킨다. 바람직한 구현예에서, GABA성 뉴런은 VGAT를 발현시킨다. 또 다른 구현예에서, GABA성 뉴런은 Glyt2 및 GAD65 및 GAD67을 발현시킨다. 또 다른 구현예에서, GABA성 뉴런은 VGAT, Glyt2 및 GAD65 및 GAD67을 발현시킨다.
또 다른 구현예에서, GABA성 뉴런은 생체내에서 GABA를 생성한다. 또 다른 구현예에서, GABA성 뉴런은 본원에 기재된 실시예에 기재된 농도에서 GABA를 분비한다.
또 다른 측면에서 본 발명은 본 발명의 이식 조성물의 투약 형태를 제공한다. 일부 구현예에서, 이러한 투약 형태는 즉시 투여가능한 조성물을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "즉시 투여가능한"은, 약물 용액이 멸균되고 직접 정맥내 주입 또는 주사에 적합하며, 환자에게 약물 용액을 비경구 투여하기 전에 희석 또는 재구성의 중간 단계가 요구되지 않음을 의미한다. 약물 수용액은 투약 형태의 용기로부터 비경구로 직접 투여될 수 있다. 용어 "즉시 투여가능한"는 "즉시 주입가능한(ready-to-infuse)" 또는 즉시 투여가능한 (ready-to-inject)"과 동의어이다.
GABA성 뉴런의 제조 방법
본 발명은 또한 GABA성 뉴런의 생성 방법에 관한 것이고, 하기 측면 및 구현예는 개별적으로 또는 임의의 적합한 조합으로 함께 사용될 수 있다.
무수한 치료 적용에서 줄기 세포로부터 유래된 분화된 세포의 잠재력 때문에, 배양에서 줄기 세포의 특정 체세포 운명을 향한 분화를 유도하거나 촉진하는 것은 큰 관심사이다. 인간 줄기 세포는 세포-대체 요법 및 치료제에 대한 세포 스크리닝에 대한 큰 가능성을 제공한다. 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로의 체세포 재프로그래밍에서의 최근의 진보는 재생 의학 및 질병 모델링을 위한 환자-특정 세포를 생성하는 것에 대한 문을 열었다.
놀랍게도, GABA성 뉴런 표현형으로의 분화 또는 성숙을 겪고 있는 세포를 BMP 신호전달을 활성화하는 작용제와 접촉시키는 것은 선조 세포의 GABA성 뉴런 형질로의 분화를 촉진시키며, 상기 세포는 소마토스타틴의 감소된 발현 및 파브알부민의 증가된 발현을 갖는 것으로 이제 밝혀졌다. 환언하면, BMP 신호전달을 유도하는 이들 인자는 줄기 또는 선조 세포의 GABA성 뉴런으로의 분화를 더욱 유리한 억제성 표현형으로 유도하거나 향하게 한다. 따라서, 억제성 GABA성 뉴런 표현형을 향해 줄기 또는 선조 세포의 분화를 유도하기 위한 배양 시스템에서 BMP 신호전달을 증가시키는 인자의 사용이 고려되었다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 증가된 파브알부민 발현을 갖는 GABA성 뉴런을 제조하는 방법이 제공되되, 상기 방법은, BMP 신호전달이 유도되지 않는 조건 하에 배양된 세포와 비교하여 증가된 파브알부민 발현을 가진 GABA성 뉴런 표현형을 갖는 세포로 세포 집단을 분화시키기에 충분한 세포 집단에서 BMP 신호전달을 유도하기에 충분한 시간 및 조건 하에 뉴런 분화를 겪는 세포 집단을 배양하는 단계를 포함한다.
세포 내에서 BMP 신호전달을 유도하는 다수의 작용제가 알려져 있지만, 바람직한 구현예에 따르면, 분화하는 세포의 집단은, 세포의 집단을 BMP 신호 전달을 유도하는 하나 이상의 작용제와 접촉시킴으로써, 세포의 집단에서 세포의 집단을 GABA성 뉴런 표현형 및 파브알부민의 상승된 발현을 갖는 세포로 분화시키기에 충분한 BMP 신호전달의 유도에 충분한 시간 및 조건 하에 배양된다. 바람직하게는, 하나 이상의 제제는 BMP 유형 I 및/또는 유형 II 수용체(들)에 대한 표준 리간드로부터 선택되고, 하나 또는 둘 모두의 수용체에 대한 결합을 통해 BMP 신호전달을 활성화시킨다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 제제는 BMP 유형 I 수용체 (BMPR-I) 및 BMP 유형 II 수용체 (BMPR-II)에 결합하고/거나 SMAD1/5/8 신호전달 경로를 활성화시킨다.
일 구현예에서, BMP 신호전달을 유도하는 하나 이상의 제제는 BMP4를 포함한다. 바람직한 구현예에서, BMP 신호전달을 유도하는 제제는 BMP4이다. 또 다른 구현예에서, BMP 신호전달을 유도하는 하나 이상의 제제는 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다: SJ000291942, SJ000063181 및 SJ000370178로 구성된 군으로부터 선택된 벤트로모핀, 이소리퀴리티게닌 (SJ000286237), BMP 감작제 (PD407824), BMP2, BMP5, BMP4 BMP6, BMP7, BMP9, BMP10, BMP15, BMP 공-활성제 FK506 (타크롤리무스) 및 CK2.3 (CK2 억제제), 조작된 BMP, 내인성 BMP 길항제 노긴 및 코르딘의 억제제 (중화 항체 예컨대 항-노긴, 항-코르딘 항체를 포함함), 파수딜 하이드로클로라이드, 로바스타틴, 심바스타틴 (MPB 발현을 향상시킬 수 있음), 펜톡시파일린, 실데나필, 롤리프람 (포스포디에스테라제 억제를 통해 BMP의 효과를 향상시킴).
또 다른 구현예에서, 활성화되는 하나 이상의 제제는 BMP 신호전달을 유도하고/거나 SMAD1/5/8 신호전달은 SMURF1 (SMURF1의 내인성 억제제)을 억제한다.
세포 집단을 뉴런 분화를 겪는 세포로 분화시키기에 충분한 망막 선조 세포 집단에서 BMP 신호전달의 유도를 수행하기 위해 사용될 수 있는 제제(들)의 농도는 본원에 기재된 방법에 따라 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 일 구현예에서, 세포 집단은 약 1pM 내지 약 100 μM의 농도로 존재하는 BMP 신호전달을 유도하는 하나 이상의 제제를 포함하는 세포 배양 배지에서 배양된다. 또 다른 구현예에서, BMP 신호전달을 유도하는 하나 이상의 제제는 약 5 ng/mL 내지 약 50 ng/ml의 농도로 존재한다. 더 바람직하게는, BMP 신호전달을 유도하는 하나 이상의 제제는 약 10 ng/mL의 농도로 존재한다. 바람직한 구현예에서, BMP4는 10 ng/mL의 양으로 존재한다.
iPSC의 집단으로부터 GABA성 뉴런을 제조하는 방법에서, 하기에 보다 상세히 설명되는 바와 같이, 본 발명자들은 놀랍게도, 배양의 약 14일째 내지 약 21일째의 기간 동안 BMP 신호전달을 활성화하는 제제로 GABA성 뉴런 표현형을 향해 뉴런 분화 또는 성숙을 겪는 세포의 노출이, 약 14일째 내지 약 28일째 또는 약 21일째 내지 약 28일째 동안 처리되거나 처리되지 않은 세포와 비교하여 파브알부민 발현의 6-배수 증가 및 소마토스타틴의 50% 감소를 입증했음을 발견하였다.
GABA성 뉴런 표현형을 향하여 분화 또는 성숙을 겪고 있는 세포가 배양의 약 14일째 내지 약 21일째의 기간 동안 BMP 신호전달을 활성화하는 하나 이상의 작용제와 접촉될 때, 이러한 세포는 통증의 치료를 위해 치료적으로 사용될 때 상당히 더 강력한 장기 진통 반응을 나타낸다는 것이 추가로 놀랍게도 발견되었다.
따라서, 또 다른 구현예에서, GABA성 뉴런 표현형으로의 분화 또는 성숙을 겪고 있는 세포를 배양의 약 14일째 내지 약 21일의 기간 동안 BMP 신호전달을 활성화하는 하나 이상의 제제와 접촉시킨다. 또 다른 구현예에서, GABA성 뉴런 표현형으로의 분화 또는 성숙을 겪고 있는 세포를 배양의 약 14일째 내지 약 21일째의 기간 동안 BMP 신호전달을 활성화하는 하나 이상의 제제와 접촉시킨다. 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 제제는 BMP 를 포함한다. 또 다른 구현예에서, GABA성 뉴런 표현형으로의 분화 또는 성숙을 겪고 있는 세포를 배양의 약 14일째 내지 약 21일째에 BMP4와 접촉시킨다.
일 구현예에서, 본 발명의 GABA성 뉴런은 하기 절차에 따라 제조된다:
hiPSC는 TripLE(Invitrogen)로 해리되고, 2주 동안 현탁액에서 초저부착 결합 플레이트로 성장하여 배상체(EB)를 형성한다. 신경 유도를 위해, 세포를 SMAD 억제제 LDN193189 (100 nM, 0일째 내지 14일째) 및 SB431542 (10 μM, 0일째 내지 10일째)로 처리하였다. MGE (내측 Glanglionic 융기) 유도를 위해, 세포를 Wnt 억제제 IWP2 (5 μM, 0일째 내지 7일째), SHH 활성제 SAG (부드럽게하다ed 작용제 - 0.1 μM, 0일째 내지 21일째) 및 성장 인자 FGF8 (100 ng/mL, 8일째 내지 21일째)로 처리하였다. Rock 억제제는 분화 첫날에 첨가된다. 현탁액에서 2주 후, EB를 폴리오르니틴 (PLO) 및 파이브로넥틴 (FN) 코팅된 표면으로 옮긴다. 21일째에, EB를 해리시키고, 세포를 추가 분화 및 성숙을 위해 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF 및 2.5 μM 감마 세크레타제 억제제 DAPT를 함유하는 분화 배지 상의 PLO/FN 코팅된 플레이트 상에 재플레이팅하였다.
상기 절차에 따라, hiPSC는 초-저 부착 24 웰 플레이트 (각 웰 = 1.9 cm2)에서 분화하도록 유도될 수 있다. 최적의 세포 밀도는 약 600,000 세포/웰이다. 배양체는 d14 (3.8 cm2)에서 피브로넥틴-코팅된 12 웰 플레이트에 플레이팅된다. EB의 최적 개수/웰은 약 10이다. 이어서, 세포를 해리시키고 d21 (12 웰 플레이트)에서 재플레이팅한다. 최적의 세포 밀도는 약 30,000 세포/웰이다. 당업자는 세포의 최적 밀도, 또는 EB가 상이한 포맷 및 크기의 배양 용기 (예를 들어, 조직 배양 플라스크, 페트리 접시 등)에 적용될 수 있음을 쉽게 인식할 것이다.
GABA의 생성의 확인은 GABA와 관련된 전사체의 분석 및 세포 배양 배지로의 GABA의 분비를 포함하는 본원에 기재되고 예시된 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
치료 방법
본 발명의 또 다른 측면은 포유동물에서 신경적 병태, 질환 또는 장애를 치료하는데 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 GABA성 뉴런의 집단을 포함하는 본 발명의 이식 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 이식 조성물의 치료 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 신경적 병태, 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 포유동물에서 신경적 병태, 질환 또는 장애를 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, 본원에 기재된 바와 같은 이식 조성물, 또는 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 GABA성 뉴런의 집단의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 문맥에서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 병리의 개시를 지연 또는 예방하고, 병리의 증상의 진행, 악화 또는 저하를 역전시키거나, 완화시키거나, 억제시키거나, 늦추거나, 중단시키고, 병리 증상의 개선을 유도하고/거나, 병리를 치유하는 것을 목표로 하는 방법을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료 유효량"은 의도된 목적을 달성하기에 충분한 본 발명에 따른 이식 조성물의 임의의 양을 지칭한다. 효과적인 투약량 및 투여 레지멘은 대상체의 병리의 특성에 기초하여 양호한 의료 실시에 의해 용이하게 결정될 수 있고, 병리의 증상의 정도 및 관심 조직 또는 장기의 부상 또는 퇴행의 정도, 및 대상체의 특성 (예를 들어, 연령, 체중, 성별, 전반적인 건강 등)을 포함하나 이에 제한되지 않는 수많은 인자에 따라 달라질 것이다.
요법을 위해, 본 발명에 따른 이식 조성물은 임의의 적절한 경로를 통해 투여될 수 있다. 투여량 및 투여 횟수는 알려진 방식으로 당업자에 의해 최적화될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 포유동물에서 신경적 병태, 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 신경학적 질환 장애 또는 상태는 억제의 회복 또는 강화를 필요로 하는 흥분독성과 관련된다. 일 구현예에서, 신경적 병태, 질환 또는 장애는 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다: 신경병성 통증 (만성 신경병성 통증 포함), 만성 염증성 통증, 만성 기능이상 통증, 간질, 운동 뉴런 질환 (ALS, SMA), 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌졸중, 다발성 경화증, 타우병증 (진행성 핵상 마비, 피크병, CBD, FTLD, ALS를 갖는 FTLD), 헌팅턴병, 알코올 금단 및 알코올중독, 당뇨병 유도된 뇌 부상, 두부 부상, 편두통, 두통, 군발성 두통, 척수 부상, 허혈성 부상, 화학 유도된 통증 및 화학 유도된 신경병증, 정신분열증, 만성 우울증, 자발성 운동장애, 양극성 장애, 및 신경병증.
일 구현예에서, 본원에서 기재된 바와 같은 GABA성 뉴런 또는 본원에서 기재된 바와 같은 이식 조성물 또는 GABA성 뉴런의 집단은 대상체의 중추 신경계에 투여된다. 일 구현예에서, 이식 조성물 또는 GABA성 뉴런의 집단은 대상체의 척수에 투여된다. 또 다른 구현예에서, 이식 조성물 또는 GABA성 뉴런의 집단은 대상체의 뇌에 투여된다. 또 다른 구현예에서, 이식 조성물 또는 GABA성 뉴런의 집단은 대상체의 배근 신경절에 투여된다.
본 발명은 포유동물에서 신경적 병태, 질환 또는 장애를 치료하는데 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 GABA성 뉴런의 집단, 또는 본원에 기재된 것과 같은 GABA성의 뉴런의 집단을 포함하는 본 발명의 이식 조성물, 또는 포유동물에서 신경적 병태, 질환 또는 장애의 치료용 약제의 제조를 위한 용도에 관한 것이되, 상기 조성물 또는 약제는 대상체의 중추 신경계로의 투여를 위해 제형화될 수 있다. 일 구현예에서, 이식 조성물 또는 약제는 대상체의 척수에 투여하기 위해 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 이식 조성물 또는 약제는 대상체의 뇌로의 투여를 위해 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 이식 조성물 또는 약제는 대상체의 배근 신경절에 투여하기 위해 제형화된다.
일 구현예에서, 본 발명은 필요로 하는 대상체에서 통증을 치료하는 방법을 제공하되, 상기 방법은 본원에서 기재된 방법에 따라 제조된 집단 GABA성 뉴런 또는 본원에서 기재된 바와 같은 이식 조성물의 치료 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 통증의 치료를 위한 본원에서 기재된 방법에 따라 제조된 GABA성 뉴런의 집단 또는 본원에서 기재된 바와 같은 이식 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 통증의 치료용 약제의 제조를 위한, 본원에서 기재된 방법에 따라 제조된 GABA성 뉴런의 집단 또는 본원에서 기재된 바와 같은 이식 조성물의 용도를 제공한다. 바람직한 구현예에서, 통증은 신경병성 통증이다.
일 구현예에서, 본 발명은 필요로 하는 대상체에서 뉴런 흥분성과 연관된 질환 및 장애를 치료하는 방법을 제공하되, 상기 방법은 본원에서 기재된 방법에 따라 제조된 집단 GABA성 뉴런 또는 본원에서 기재된 바와 같은 이식 조성물의 치료 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명은 필요로 하는 대상체에서 뉴런 흥분성과 관련된 질환 또는 장애의 치료를 위한 본원에서 기재된 방법에 따라 제조된 GABA성 뉴런의 집단 또는 본원에서 기재된 바와 같은 이식 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 필요로 하는 대상체에서 뉴런 흥분성과 관련된 질환 또는 장애의 치료용 약제의 제조를 위한, 본원에서 기재된 방법에 따라 제조된 GABA성 뉴런의 집단 또는 본원에서 기재된 바와 같은 이식 조성물의 용도를 제공한다.
키트
본 발명은 본원에 기재된 이식 조성물의 제조를 위한 키트를 제공한다. 일 구현예에서, 키트는 GABA성 뉴런의 집단과 함께 적어도 적어도 하나의 GFR알파 작용제 및 적어도 하나의 세포사 억제제를 제공한다. 일 구현예에서, 키트는 GABA성 뉴런의 집단과 함께 적어도 하나의 GFR알파 작용제, 적어도 하나의 아폽토시스 억제제, 및 적어도 하나의 괴사 억제제를 제공된다.
또 다른 구현예에서 키트는 GABA성 뉴런의 집단 대신 만능 줄기 세포, 또는 다분화능 줄기 또는 선조 세포를, 세포를 분화시켜 GAGABA 저항성 뉴런 표현형을 수득하고 GABA를 생산하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 세포 배양 시약과 함께 포함한다. 또 다른 구현예에서, 키트는 BMP 신호전달을 활성화하는 하나 이상의 제제를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, BMP 신호전달을 유도하는 하나 이상의 제제는 BMP4를 포함한다. 바람직한 구현예에서, BMP 신호전달을 유도하는 제제는 BMP4이다. 또 다른 구현예에서, BMP 신호전달을 유도하는 하나 이상의 제제는 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다: SJ000291942, SJ000063181 및 SJ000370178로 구성된 군으로부터 선택된 벤트로모핀, 이소리퀴리티게닌 (SJ000286237), BMP 감작제 (PD407824), BMP2, BMP5, BMP4 BMP6, BMP7, BMP9, BMP10, BMP15, BMP 공-활성제 FK506 (타크롤리무스) 및 CK2.3 (CK2 억제제), 조작된 BMP, 내인성 BMP 길항제 노긴 및 코르딘의 억제제 (중화 항체 예컨대 항-노긴, 항-코르딘 항체를 포함함), 파수딜 하이드로클로라이드, 로바스타틴, 심바스타틴 (MPB 발현을 향상시킬 수 있음), 펜톡시파일린, 실데나필, 롤리프람 (포스포디에스테라제 억제를 통해 BMP의 효과를 향상시킴).
또 다른 구현예에서, 활성화되는 하나 이상의 제제는 BMP 신호전달을 유도하고/거나 SMAD1/5/8 신호전달은 SMURF1 (SMURF1의 내인성 억제제)을 억제한다.
또 다른 구현예에서, 키트는 본원에 기재된 방법에 따른 만능 줄기 세포, 또는 다분화능 줄기 또는 선조 세포로부터의 GABA성 뉴런의 분화를 위한 지침 및 이러한 GABA성 뉴런을 포함하는 이식 조성물의 제조를 위한 지침을 추가로 포함한다.
억제제 및 작용제에 더하여, 본 발명의 키트는 배양 배지, 적어도 하나의 세포 배양 배지 보충물, 하나 이상의 유전자 산물의 발현을 억제 또는 증가시키기 위한 제제, 및 뉴런 분화의 마커의 발현을 검출하기 위한 적어도 하나의 제제 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 키트 중의 GFR알파 작용제는 다음으로 구성된 군 중 임의의 하나로부터 선택된다: GDNF, 뇌-유래된 신경친화성 인자 (BDNF), NGF, 뉴르투린, 아르테민, 페르세핀, GDNF 수용체 내인성 작용제, BT18, BT13, NT-3, NT-4, CNTF, GFR알파1 작용제, XIB4035, Trk 활성제, TrkA 작용제, 가모보긱 아민, 아미트립틸린, TrkB 작용제, N-아세틸세로토닌, 아미트립틸린, BNN-20BNN-27, 데옥시게두닌, 7,8-디하이드록시플라본, 4'-디메틸아미노-7,8-디하이드록시플라본, 디이소메틴, HIOC, LM22A-4, 뉴로트로핀-3, 뉴로트로핀-4, 노르우고닌, R7 (약물), 및 7,8,3'-트리하이드록시플라본. 일 구현예에서, GFR알파 작용제는 신경교 세포-유래된 신경친화성 인자 (GDNF), 뉴르투린 (NRTN), 아르테민 (ARTN) 및 페르세핀 (PSPN)으로 구성된 군로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, GFR알파 작용제는 GDNF이다.
일 구현예에서, 이식 조성물 중의 아폽토시스 억제제는 Boc-Asp(OMe) 플루오로메틸 케톤 IDN-8066, 7053, 7436 1965 6556 M867 IDN-5370 IDN-7866 프랄나카산 z-Vad-FMK, YVAD-FMK, c-DEVD-CHO, Ac-YVAD-CHO, Ac-DVAD-FMK Q-Vd-OPh, CrmA (카우폭스 바이러스 단백질), p35 (바콜루바이러스 단백질), Z-ATAD-FMK, INF-4E, Z-DQMD-FMK, Az 10417808, Z-LEED-FMK, ZVDK -FMK, z-IETD-FMK, INf-39, 벨나카산, Ac-DEVD-CHO, 및 엠리카산으로 구성된 군으로부터 선택된 카스파제 억제제; 또는 칼페인 억제제 1, 칼펩틴, E64, MDL28170, MG101, 아세틸-칼파스타틴, PD 150606로 구성된 군으로부터 선택된 카스파제 활성제의 억제제 중 하나 이상으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 아폽토시스 억제제는 Boc-Asp(OMe) 플루오로메틸 케톤이다.
또 다른 구현예에서, 카스파제 유전자 및 경로의 직접적인 억제는 세포 생존을 촉진하기 위해 GABA성 뉴런 예컨대 by-TALENS, CRISPR-Cas9, 또는 RNAi의 유전자 조작에 의해 달성될 수 있다.
일 구현예에서, 키트 중의 괴사 억제제는 MS-1, IM-54, GSK-872, 7-Cl-O-Nec1, 네크로스타틴-1, 네크로설폰아미드 중 하나 이상으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 괴사 억제제는 네크로설폰아미드이다.
또 다른 구현예에서, 네크롭토시스 유전자 및 경로 및 경로의 직접적인 억제는 세포 생존을 촉진하기 위해 GABA성 뉴런 예컨대 by-TALENS, CRISPR-Cas9, 또는 RNAi의 유전자 조작에 의해 달성될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 키트는 아만타딘, 메만틴, 케타민 하이드로클로라이드, 페티딘, 트라마돌, 메타돈, 덱트로폭시펜, 아산화질소, 덱스트로메토르판, AP5, AP7, CPPene, 셀포텔, 에탄올, 미노사이클린, 아토목세틴, AZD6765, 아그마틴, 클로로포름, 덱스트랄로판, 덱스트로판, 디페니딘, 디조실핀, 에티사이클리딘, 가사이클리딘, 케타민 (다른 형태), 마그네슘, 메톡세티민, 니토르메만틴, PD-137899, 펜사이클리딘, 롤리사이클리딘, 테노사이클리딘, 틸레타민, 네라멕산, 엘리프라돌, 에톡사드롤, 덱속사드롤, WMS-2539, NEFA, 델루세민, 8A-PDHQ, 압티가넬, HU-211, 후페리진 A, 이보가인, 레마세마이드, 린코파일린, 가바펜틴, 라파스티넬, NRX-1074, 7-클로르키뉴렌산, 4-클로르키우누레닌, 5,7-디클로로키뉴렌산, 키뉴렌산, TK-40, 1-아미노사이클로프로판카복실산, L-페닐알라닌, 및 크세논로 구성된 군으로부터 선택된 흥분독성 유도된 아폽토시스 또는 네크롭토시스의 하나 이상의 억제제; 부피바카인, 리도카인, 코카인, 라모트리진, 파르알데하이드, 스티리펜톨, 페노바비톨, 프리미돈, 메틸페노바비톨, 펜토바르비탈, 벤조디아제핀 (클로바잠, 클로나제팜, 클로라제페이트, 디아제팜, 미다졸람, 로라제팜, 니트라제팜, 테마제팜, 니메타제팜)브롬화칼륨, 펠바메이트, 카복사미드 (카밤아제핀, 옥스카르브아제핀, 에슬리카바제핀) 아세테이트, 발프로에이트 (발프로산, 나트륨 발프로에이트, 디발프로엑스 나트륨, 비가바트린, 프로가바이드, 티아가빈, 토피라메이트, 프레가발린, 에토토인, 페나이토인, 메페나이토인, 포스페나이토인, 파라메타돈, 트리메타디온, 에타디온, 베칼라미드, 프리미돈, 브리바라세탐, 에티라세탐, 레베티르세템, 슬렉트라세템, 에토석시마이드, 펜숙시미드, 메숙시미드, 아세타졸라미드, 설티암, 메타졸아미드, 조니사마이드, 페네투라이드, 페나세미드, 발프로미드, 발록타미드, 페람파넬, 스티리펜톨, 파이록시딘, 이소플루란, 레보플루란, CNV1014802, 푸나피드, 프릴로카인, 이온토카인, 레보부피바카인, 부타닐리카인, 카티카인, 디부카인, 에티도카인, 메피바카인, 프릴로카인, 트리메카인, 아밀로카인, 사이클로메틸카인, 알파-유카인, 베타-유카인, 헥실카인, 이소부카인, 피페로카인, 오르토카인, 벤조카인, 부타미베, 클로로프로카인, 루카인, 디메토카인, 메프릴카인, 루카인, 니트로카인, 오르토카인, 프로폭시카인, 노보카인, 프록시메타카인, 리소카인, 테트라카인. 락사트라이진, 삼환형 항우울제 (아미트립틸린, 노르트립틸린, DSP-2230, 멕실리틴, 플루피르틴, 지코노타이드; 또는 아편 및 오피오이드, 비-스테로이드 항-염증제, 파라세타몰, 아세테날리다이드, 캡사이신, 멘톨, 칸나비스 및 칸니비노이드를 포함하는, 주변 활성을 억제하는 임의의 약물로부터 선택된 하나 이상의 흥분성 억제제를 포함한다.
추가 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 치료 방법에 따라 사용되는 경우 키트를 제공한다.
본 발명의 이들 및 다른 측면은 하기 비제한적인 실시예에 의해 예시된다. 일부 측면에서, 실시예에 기재된 하나 이상의 구현예는 일반적으로 상기 기재된 하나 이상 구현예와 조합하여 적용가능할 수 있음이 이해되어야 한다.
실시예
실험 모델 및 대상체 세부사항
동물
마우스는 10주로 노화되고 2주 동안 설비 및 장비에 습관화된 ARC(동물 자원 센터(Antimal Resource Centre), ARC)로부터 수득된 수컷 NOD.PRKDSCID.ARC이다. 모든 동물 실험은 치료할 때까지 맹검으로 수행되었고, 치료 그룹에 대한 할당을 행동 데이터 및 건강 상태에 대한 실험자 맹검에 의해 의사 무작위로 수행되었다. 마우스는 12시간 명암 사이클 상에 수용되었고, 모든 단계에서 표준 음식 및 물이 자유롭게 제공되었다. 모든 마우스는 특정 병원체가 없는 시설로 유지되었고, 무균 기술은 모든 취급 및 실험에 사용하였다. 모든 행동은 단일 남성 연구자에 의해 수행되었다. 모든 실험은 동물 윤리 프로토콜 938 하에 시드니 동물 윤리 위원회(Sydney Animal Ethics Committee)에 의해 승인되었다. 실험 설계 및 기록은 ARRIVE 가이드라인에 의해, 그리고 호주 국립 보건 및 의학 연구 협회(Australian National Health and Medical Research Council) 가이드라인에 따라 유도되었다.
드로소필라 스톡
파리는 표준 옥수수 가루, 효모 및 수크로스 아가 배지에서 25℃에 12시간:12시간 명:암 주기 하에 사육되었다. 칸톤(Canton) S (BDSC 64349), 무통증 (EP(2)2451) (BDSC 27895), ppk-Gal4 (BDSC 12), UAS-CD8-GFP (BDSC 5130), UAS-Dcr2, USA-파상풍 독소 (활성, BDSC 28838 및 불활성 BDSC 28839) 및 UAS-p35 (BDSC 5072), 및 USA-라민-GFP (BDSC 7376) 파리는 BDSC 라이브러리로부터 수득되었다. w1118 (VDCR 60000), UAS-TrpA1-RNAi (VDRC 37249), UAS-RDL-RNAi (VDRC 41101), UAS-GRD-RNAi (VDRC 5329), UAS-D-GABA-B-R1-RNAi (VDRC 101440), UAS-D-GABA-B-R2-RNAi (VDRC 110268 및 VDRC 1785), UAS-D-GABA-B-R3-RNAi (VDRC 50176), UAS-LCCH3-RNAi (VDRC 37408) 파리는 VDRC RNAi 라이브러리로부터 수득되었다.
인간 만능 줄기 세포주
ATCC-BXS0116 hiPSC 주는 본 연구에서 사용되었다 (ATCC, ACS1030).
실험 방법
성체 열 통각 검정 시스템
성체 열 통각 검정 시스템은 투명한 폴리스티렌 시험 챔버 (0.3 cm 높이, 5.5 cm 직경의 투명한 플라스틱 뚜껑), 가변성 가열 요소 (모델 AHP-1200DCP, 파트 번호 9-34KB-1-0A1, ThermoElectric Cooling America (TECA) Corp., IL, USA), 영화 녹화 셋업 및 행동 분석 소프트웨어로 이루어진다. 영화는 상부로부터 단일 카메라로 녹화되었고 (Canon EOS, 700D, 18-55mm 렌즈); 영화는 10마리 파리의 행동 흔적을 담고 있다.
파리 부상 모델
우측 중간 다리는 반나스 가위를 사용하여 퇴절 분절에서 절단되었다. 파리는 다리가 절단되었을 때 7일령이었으며, 1, 7 또는 14일 후에 시험되었다. 10마리 파리의 각 세트는 행동 챔버에 배치되기 전에 얼음 상에서 약하게 마취되었다. 표면은 초기에 25℃로 설정되었다. 파리는 시험 챔버에 순응하게 되었고, 이어서 기준선 25℃ 반응은 기록되었다. 표면 온도는 25℃에서 2분 동안 유지된 다음, 30℃로 2분간 상승된 다음, 35℃와 유사하게 2 분 동안, 38℃를 2 분 동안, 마지막으로 42℃에 1 분 동안 상승되었다. 29 fps 이미지/초로 설정되고 장치 위에 위치된 비디오 녹화 카메라는 파리의 관찰을 녹화하는데 사용되었다. 점핑 행동은 녹화된 비디오를 사용한 처리에 대해 수작업으로 맹검으로 채점되었다. 이동 속도는 Ctrax 소프트웨어 그리고 개별 파리를 추적하는 패키지를 사용하여 측정되었다. 각 실험에 대하여, 10마리 파리의 3개 배치는 시험되었고, 그 다음 3개의 독립적인 군으로 반복되었다 (n = 9). 통계 분석은 단일 비교를 위하여 t-시험 그리고 ANOVA에 이어 다중 비교를 위하여 사후 터키 시험을 사용하여 수행되었다.
전기생리학적 기록
파리는 얼음을 사용하여 마취되었고, 왁스 지지체 배쪽 아래로 고정되었다. 자극기(Constant Voltage Isolated Stimulator, 모델 DS2A-Mk.II, Digitimer)에 연결된 텅스텐으로 제조된 2개의 자극 전극은 양쪽 눈에 배치되어 거대 섬유 시스템 (GFS)를 활성화시켰다. 유사하게, 2개의 텅스텐 자극 전극은 또한 우측(동측) 또는 좌측(반대측) 다리의 퍼미스(fermis) 분절의 중간에 배치되어, 다리를 통해 통각성 GFS 탈출을 활성화시켰다. 눈을 통한 GFS의 경우, 파리에는 15V보다 작은 최대 자극 강도를 갖는 20 개의 단일 자극물이 주어졌다. 다리 자극 통각성 탈출의 경우, 최대 자극 강도는 60V 미만이었다. 모든 실험에 대하여, 자극 지속기간은 10 μs로 일정하게 유지되었다. 텅스텐 접지 전극은 파리 복부에 배치되었다. (벤치탑 전원 공급장치, PSU 130-LASCAR이 있는) 수산화 나트륨 5M에서 예리해진, 텅스텐 기록 전극은 등쪽 세로 근육 섬유 (Dorsal Longitudinal Muscle fibre; DLM)에서 파리의 좌측 배면에 배치되어 시냅스후 전위 (post-synaptic potential; PSP)를 기록하였다. 각 그룹에 대하여 적어도 9마리 파리의 PSP는 0,5kHz에서 여과된 그리고 1kHz에서 디지털화된 미세전극 AC 증폭기, 모델 1800(A-M System)으로 기록되었다. PSP는 AxoGraph 소프트웨어 (AxoGraph Scientific, Berkeley, CA)를 사용하여 분석되었다. 다리를 자극함으로써 측정된 반응이 중추 신경계에 의해 매개되었는지 결정하기 위해, 기록을 위하여 유사한 셋업은 사용되었고, 파리의 머리가 제거되었다. 만-휘트니(Mann-Whitney) 랭크 합계 테스트는 반응 지연 및 지속기간의 차이를 결정하는데 사용되었다.
면역조직화학 연구 및 이미지형성
파리 뇌 및 VNC 상의 면역형광은 기재된 바와 같이 수행되었다. 항-GABA (A2052, SigmaAldrich)는 1:500의 희석으로 사용되었고, nc82 항체 (Developmental studys Hybridoma Bank)는 1:75의 희석으로 사용되었고, 절단된 카스파제-3 항체 (Asp175, Cell Signaling Technology)는 1:500 희석으로 사용되었다. 2차 항체 (Thermo Fisher로부터의 Alexa 488, Alexa 555 및 Alexa 647)은 1/500의 희석으로 사용되었다. 공초점 구획은 0.6 μm 간격으로 40X NA 1.30 오일 대물렌즈를 갖는 Leica DMI 6000 SP8 공초점 현미경을 사용하여 획득되었다. 평면 화상들은 ImageJ (NIH; http://rsbweb.nih.gov/ij/)에서 이미지 스택들의 최대 투영들을 수행함으로써 제조되었고; 접선면 이미지들은 ImageJ 및 Leica Application Suite X, LASX 소프트웨어를 사용하여 제조되었다. GABA 초점은 ImageJ에서 3D-물체 카운터 함수를 사용하여 정량화되었다. 동일한 공초점 현미경의 2.34 μm 간격으로 16X/0.5 IMM 대물 렌즈에서 다리 이미지형성은 수행되었고, 0.6 μm 간격의 40X 오일 대물 렌즈에서 부절 분절 이미지형성은 획득되었다. 다리에서 ppk+ 뉴런의 신경병증은 ImageJ를 사용하여 다리에 보유된 수지상 길이를 측정함으로써 평가되었다.
HiPSC 배양 및 GABA 개재뉴런 또는 감각 뉴런으로의 분화
HiPSC는 mTESR1 매질(Stem Cell technologies)에서 매트리겔 코팅된 표면 상에서 유지되었다.
HiPSC는 Kim TG 등, Stem Cells, 2014에 의해 기재된 프로토콜의 순응된 버전을 사용하여 GABA 개재뉴런에서 분화되었다. 간단히, hiPSC는 TripLE (Invitrogen)으로 해리되었고, 2주 동안 현탁액 중에서 초저 부착 결합 플레이트로 성장되어 배상체 (EB)를 형성시켰다. 신경 유도를 위하여, 세포는 SMAD 억제제 LDN193189 (100 nM, 0일째 내지 14일째) 및 SB431542 (10 μM, 0일째 내지 10일째)로 처리되었다. MGE (중앙 글란글리온성 융기(Medial Glanglionic eminence)) 유도를 위하여, 세포는 Wnt 억제제 IWP2 (5 μM, 0일째 내지 7일째), SHH 활성제 SAG (평활화된 작용제 - 0.1 μM, 0일째 내지 21일째) 및 성장 인자 FGF8 (100 ng/mL, 8일째 내지21일째)로 처리되었다. 록(Rock) 억제제는 분화의 첫날에만 첨가된다. 현탁액에서 2주 후, EB는 폴리오르니틴(PLO) 및 피브로넥틴(FN) 코팅된 표면으로 이전되었다. 21일째에, EB는 해리되었고, 세포는 추가 분화 및 성숙을 위하여 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF 및 2.5 μM 감마 세크레타제 억제제 DAPT를 함유하는 분화 배지 상의 PLO/FN 코팅된 플레이트 상에 재플레이팅되었다.
HiPSC는, 미토마이신 C가 생략된 것을 제외하고는, Young GT 등, Molecular Therapy, 2014에 기재된 프로토콜에 따라 감각 뉴런에서 분화되었다.
이식용 세포 제제
HiPSC-유래 GABA 개재뉴런은 분화의 25일에 해리되었고, 10 ng/mL GDNF, 20 μM Boc-Asp(OMe) 플루오로메틸 케톤 (광범위 스펙트럼 카스파제 억제제 - 아폽토시스 억제제) 및 50 nM 네크로설폰아미드 (MLKL 억제제 - 괴사 억제제)를 갖는 항크(Hank) 균형 염 용액 (HBSS)로 제조된 주사 배지에서 마이크로리터 당 100,000 세포의 최종 농도로 재현탁되었다.
오픈 필드
마우스는 그들의 홈 케이지에서 2개의 상향 조명원을 갖는 균일하게 조명된 어두운 방으로 습관되었다. 박스의 각 코너에서의 광은 이동 전화 조명계(Motorola)에 의해 측정되었다. 마우스 행동은 각 시험 시기에 5분 동안 기록되었다. 이어서, 행동은 탑스캔 행동 분석 소프트웨어에 의해 분석되었다.
SNI 변형된 바소 마우스 스케일
바소의 변형된 형태는 이식 후 보행을 평가하는데 사용되었다. 간단히 마우스는 발목 이동 (3중에서, 결코 = 0, 때때로 = 1, 대부분 = 2, 항상 = 3) 발바닥 스텝핑 (3중에서, 결코 = 0, 때로는 = 1, 대부분 = 2, 항상 = 1) 조율 (3중에서, 결코 = 0, 때때로 = 1, 대부분 = 2, 항상 = 3) 및 발의 회전(평행 = 2, 회전 = 1, 걷지 않음 = 0)에 대하여 채점되었다. 마우스는 비디오로부터 양측으로 채점되었다.
폰 프레이
마우스는 3 별도 일에서 습관화되었다. 통증의 기준선 평가를 위하여, 마우스는 3상이한 날에 시험되었다. 기준선 역치는 시험의 마지막 2일 동안의 역치의 평균으로서 정의된다. 폰 프레이 필라멘트는 풋패드의 비복 부분에 적용되었고 각 자극 역치 (0.04 내지 2.0g)에서 10회 적용되었다. 각 필라멘트에 대한 반응은 100% 반응에 도달할 때까지 기록되었다. 역치는 시험의 50%에서 반응을 일으키는 최저 필라멘트로서 보고된다. 마우스는 신경 부분 부상 6일 후 및 그 다음 매주 평가되었다.
아세톤
한 방울의 아세톤은 1ml 인슐린 주사기로부터 약 30ul의 방출을 사용하여 마우스 뒷발에 적용되었다. 1분 동안 핥기 및 물기에 걸린 시간은 기록되었다.
신경 부분 부상
마우스는 유도를 위하여 0.8L/분 산소에서 3%를 갖는 이소플루란으로 이어서 유지를 위하여 2% 이소플루란으로 마취되었다. 마취의 깊이는 발가락 반사 및 눈꺼풀 반사의 부재로 확인되었다. 눈에는 각막에 대한 부상을 방지하기 위해 윤활이 제공되었다. 피부는 외과용메스로 절개되었고, 근육은 무디게 해부되어 좌골 신경을 분리시켰다. 신경의 경골 부분 및 총 비골 부분은 에틸론(Ethilon) 4-0 나일론 봉합재 (Johnson and Johnson International)와 결찰되었고, 신경의 일부는 비복 신경과 접촉하지 않도록 주의하여 제거되었다. 이어서, 절개는 상처 클립 (Reflex, FineScience Tools)로 폐쇄되었다. NOD SCID 마우스는 7일 동안 피하 주사에 의해 매일 정상 식염수0.9% (Pfizer) 중 2.5mg/kg 엔로플록사신(Baytril, Bayer)가 제공되었다. 운동 행동은 4 내지 5일 후에 평가되었고, 통증 행동은 6일에 평가되었다.
생체내 추궁절제술 및 척수 세포 주사
마우스는 케타민 (Ketamil)/크실라진 칵테일 (100mg/8mg/kg)으로 복강내 주사에 의해 마취되었다. 마취 깊이는 발가락 핀치 및 눈꺼풀 반사의 부재에 의해 규칙적으로 모니터링된다. 호흡 속도, 체온 및 점막 재관류는 또한 모니터링된다. 체온은 37℃ 가열 플레이트로 유지되었고, 저체온 및 저산소증을 각각 방지하기 위한 절차 동안 산소 0.8 내지 1 L/분은 제공되었다. 절개는 후면을 따라 이루어지고, L1은 안과용 반나스 스프링 가위(World Precision Instruments)를 사용하여 신중한 척추 해부에 의해 제거된다. 요추 후각을 표적하는 2 μl 주사는 후부 중심 척추 동맥을 랜드마크로서 사용하여 부상에 대해 동측성으로 맞춤 설계된 바늘 (포인트 스타일 4 및 30°각도, 1.5-인치 길이를 갖는 29 게이지)를 갖는 해밀턴 주사기 및 정위 장치 (Kopf)를 사용하여 제조되었다. 간단히 바늘은 경막이 초기에 천공될 때까지 전진된 다음, 디지털 정위 모니터링 기기를 사용하여 하강되었다. 2 μl의 용액은 서서히 주입되었고, 5분 동안 제 위치에 두어 유출을 방지하였다. 표면 근막은 비크릴(Vicryl) 5-0 역절단 봉합사 (Johnson and Johnson)을 사용하여 봉합되었고, 절개는 2-3개의 상처 클립으로 폐쇄되었다. 부피바카인 8mg/kg (Pfizer)는 주사되었고 상처 가장자리 주위에 피하/피부로 관주되었고 엔로플록사신은 10일 동안 매일 제공되었다. 통증 행동은 수술 이후 6일에 먼저 평가되었다. 마우스는 실험의 지속기간 동안 매일 모니터링되었다. 마우스는 절차 직후에 40℃ 가온된 정상 식염수 (Pfizer)가 제공되었다. 마우스는 절차 후 2시간마다 모니터링되었고 완전 회복까지 가온이 제공되었다.
관류
심하게 마취된 마우스는 신경 부상 후 4주에 취득되었다. 흉부는 개방되었고 심장은 노출되었고, 날개형 카테터(Griener Bio-one)는 좌심실에 삽입되었다. 마우스는 25ml 0.1M 포스페이트 완충액 (PB, pH 7.4, Sigma), 이어서 주사기 드라이버를 사용하여 0.1 M PB내 25 ml 4%(w/v) 파라포름알데하이드 (PFA, Sigma)에 의해 관류되었다. 척수 조직은 적어도 2mm를 부리모양으로 그리고 꼬리모양으로 주사 부위에 제거되었다 조직은 PFA에서 2-4시간 동안 고정한 다음 30%(w/v) 수크로스에서 밤새 동결보호되었다. 생성된 조직은 절단되어 냉동몰드에 맞춰졌고, O.C.T (VWR)에 매립된채 플래시 냉동되었다. 척수는 저온유지장치 (Thermo Fisher) 상에서 16 내지 20 μm로 절제되었다.
항체 염색
세포는 실온에서 15분 동안 10% 포르말린 (Sigma-Aldrich, HT5011)으로 고정되었고, 열거된 항체 및 희석물을 사용하여 특정 뉴런성 마커에 염색되었다. 적절한 Alexa Fluor 2차 항체 (Thermo Fisher Scientific Life Sciences; 1:500)은 사용되었고, 핵은 Hoechst 33342 (1:5,000; Thermo Fisher Scientific Life Sciences 카탈로그 번호 H3570)으로 가시화되었다.
척수 염색을 위하여, 동결절편은 20분 동안 실온으로 평형화하게 되었다. 이어서, 절편은 5분 동안 PBS에서 3회 린스되었다. 슬라이드는 실온에서 차단 용액 (PBS, 소 혈청 알부민 (2%) 및 0.3% Triton X100)에서 1시간 동안 차단되었다. 1차 항체는 차단 용액에서 희석되었고, 가습된 챔버에서 4℃에 밤새 인큐베이션되었다. 적절한 2차 항체는 열거된 희석물에 첨가되었다. 마지막으로, 슬라이드는 각각 15분 동안 PBS에서 3회 세정되었고 슬라이드는 벡타실드(Vectashield) 안티페이드 마운팅 용액으로 커버슬립되었다.
RNA 추출
전체 RNA는 Favorgen Blood/Cultured Cell Total RNA 키트 (Favorgen Biotech Corp.)를 사용함으로써 hiPSC 및 GABA성 뉴런 배양물로부터 수확되었다. RNA는 온-컬럼 DNase I Digestion Set (Sigma)를 사용하여 용액내 DNase로 처리되었고, 샘플 당 Ribosafe RNase 억제제 (Bioline) 40U로 유지되었다. RNA의 품질 및 수량은 흡광도 분광법 (Nanodrop, Thermo Fisher Scientific Life Sciences), Agilent Bio-analyser 및 아가로스 겔 전기영동에 의해 평가되었다.
qPCR
정량화 후, 1 μg의 RNA는 qRT-PCR에 대하여 Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix (Thermo Fisher Scientific Life Sciences)로 역전사되었다. 총 2 μl의 cDNA는 SYBR Select Master Mix를 사용하여 qPCR에 사용되었다. 실시간 PCR은 라이트사이클러(LightCycler) 480 Instrument II (Roche Life Science)에서 수행되었다. 모든 유전자에 대하여 사이클링 프로그램은 다음과 같다:
- 1. 95℃ 10' 초기 변성 단계
- 2. 95℃ 30"
- 3. 58℃ 30"
- 4. 72℃ 30'는 35 사이클 동안 2로 진행한다.
- 5. 용융 곡선 분석.
프라이머 서열은 다음과 같다:
GAD1 FWD: CACAAGGCGACTCTTCTCTTC
GAD1 RVR: GCGGACCCCAATACCACTAAC
GAD2 FWD: TTTTGGTCTTTCGGGTCGGAA
GAD2 RVR: TTCTCGGCGTCTCCGTAGAG
VGAT FWD: ACGTCCGTGTCCAACAAGTC
VGAT RVR: AAAGTCGAGGTCGTCGCAAT
SST FWD ACCCAACCAGACGGAGAATGA
SST RVR GCCGGGTTTGAGTTAGCAGA
SOX 6 FWD: GGATGCAATGACCCAGGATTT
SOX6 RVR: GGATGCAATGACCCAGGATTT
카트레닌 FWD: ACTTTGACGCAGACGGAAATG
칼트레닌 RVR: GAAGTTCTCTTCGGTTGGCAG
칼빈딘 FWD: GGCTCCATTTCGACGCTGA
칼빈딘 RVR: GCCCATACTGATCCACAAAAGTT
TUBB3 FWD: GGCCAAGGGTCACTACACG
TUBB3 RVR: GCAGTCGCAGTTTTCACACTC
LHX6 FWD: GGGCGCGTCATAAAAAGCAC
LHX6 RVR: TGAACGGGGTGTAGTGGATGT
OLIG2 FWD: CCAGAGCCCGATGACCTTTTT
OLIG2 RVR: CACTGCCTCCTAGCTTGTCC
NKX2.1 FWD: AGCACACGACTCCGTTCTC
NKX2.1 RVR: GCCCACTTTCTTGTAGCTTTCC
PAX6 FWD: TGGGCAGGTATTACGAGACTG
PAX6 RVR: ACTCCCGCTTATACTGGGCTA
RNA 시퀀싱
노보겐(Novogene)은 하우스 방법에서 이들의 표준에 따라 RNA 시퀀싱을 수행하였다. 라이브러리 제조는 Illumina를 위하여 NEBNext Ultra RNA 라이브러리 프렙(prep) 키트를 사용하여 수행되었다. 지수 코딩된 샘플은 HiSeq PE Cluster Kit cBot-HS (illumina)를 사용하여 클러스터링되었고, 생성된 라이브러리는 일루민 히세크(hiseq) 플랫폼 상에서 시퀀싱되었고, 125/150BP 페어링된 단말 판독물을 생성되었다.
RNA 시퀀싱 분석
깨끗한 판독물은 어댑터, 폴리-N 및 저품질 판독물을 함유하는 판독물을 제거함으로써 수득되었다. 모든 다운스트림 데이터 분석은 깨끗한 데이터에서 수행되었다. 참조 게놈의 지수는 보타이(Bowtie) v2.2.3을 사용하여 생산되었고, 페어링된 단말 깨끗한 판독물은 TopHat v2.0.12을 사용하여 참조 게놈에 정렬되었다. HTSeq v0.6.1은 각 유전자에 맵핑된 판독 수를 카운트하는데 사용된 후, FPKM은 유전자 길이 및 유전자에 맵핑하는 판독 카운트에 기초하여 계산되었다. 미가공 판독 카운트는 R 내의 DESeq2 패키지 속에 입력되었고, 차등 발현은 평가되었다. 시각화를 위해, 히트맵 FPKM은 가장 큰 값 FPKM으로 정상화되었다. 생성된 p 값은 벤자마니 호크베르크(Benjamani Hochberg)에 의해 조정되었고, 0.05 미만의 조정된 p 값을 갖는 유전자는 차별적으로 발현된 것으로 평가되었다.
유세포측정 분석
세포는 TryPLE (Invitrogen)으로 해리되었고, 10% 포르말린 (Sigma-Aldrich, HT5011)으로 20분 동안 고정되었고, 차단 완충액 (3% BSA 및 0.3% Triton X를 갖는 PBS)로 인큐베이션되었다. 차단된 세포는 차단 완충액에서 30분 동안 1차 항체 (접합된 항-β3 투불린 항체-Alexa Fluor 488, Abcam 또는 항-GAD65 항체, Abcam)으로 인큐베이션되었다. 세포는 PBS로 3회 세정되었고, Alexa Fluor 594-접합된 2차 항체 (Abcam)으로 또 다른 30분 동안 인큐베이션되었다. PBS로 세정 후, 세포는 3% BSA를 갖는 PBS에 재현탁되었고 분석되었다. GAD-65를 위한 마우스 IgG 아이소타입 대조군 항체는 동일한 조건 하에서 사용되었다. 표지되지 않은 대조군은 또한 대조군으로서 사용되었다. 10,000 사건의 획득은 FACSAria (BD Biosciences)를 사용하여 수집되었다. 플로우조(Flowjo) 소프트웨어는 미가공 데이터를 분석하는데 사용되었다.
ELISA
25 DIV에서 GABA성 뉴런은 3일 동안 배지에 방치되었다. 배지는 흡인되었고, 랫트 감마-아미노 부티르산 (Rat Gamma-Amino Butyric Acid) ELISA (MyBioSource)를 사용하여 시험되었다. 흡광도 값은 GraphPad Prism을 사용하는 4 포인트 로지스틱 회귀를 사용하여 제조자의 지시에 따라 전환되었다.
GABA 대 유도 만능 줄기 세포 프로테오믹스
GABA 뉴런은 본원에 기재된 방법에 의해 유래되었다. 25 DIV에서 이들은 빙냉 포스페이트 완충 식염수에서 3회 완만한 세정에 의해 용해되었다. 변성 용해 완충액 (4% SDS, 20 mM 인산나트륨 6.0, 100 mM NaCl, 완전 프로테아제 억제제 (EDTA Free, Roche), 10 mM NaF, 10mM 나트륨 파이로포스페이트, 2mM 나트륨 오르토바나데이트, 60mM B-글리세로포스페이트)는 웰에 첨가되었고, 이들은 세포 스크레이퍼를 사용하여 긁어졌고, 샘플은 65℃에 10분 동안 가열되었다. 이어서, 샘플은 Q.Sonica 800 상에서 초음파처리하였다 (30초 초음파처리 온/오프 사이클링, 10분 총 초음파처리, 18℃에서 80% 진폭).
단백질 분해, 펩타이드 정화 및 정량화-단백질(100ug)는 트리스카복시에틸포스핀 (TCEP)를 10 mM의 최종 농도로 첨가함으로써 감소되었다. 단백질 샘플은 ThermoMixer-C (Eppendorf)에서 1000 rpm에 10분 동안 65℃로 가열되었다. 일단 실온으로 냉각되면, N-에틸말레이미드 (NEM)은 20 mM의 최종 농도로 분획에 첨가되었고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하게 되었다. 상기 분획은 완충액 교환되었고, 이전에 기재된 SP3 방법을 사용하여 트립신 소화되었다 (상자성 비드 기술을 사용한 초민감성 단백체 분석. Hughes CS, Foehr S, Garfield DA, Furlong EE, Steinmetz LM, Krijgsveld J. Mol Syst Biol. 2014 Oct 30;10:757. doi: 10.1525.20145625/msb.20145625).
LC-MS/MS 및 스펙트럼의 분석
Thermo Fisher Scientific EasyLC 1000 UHPLC를 사용하여, 4% (vol/vol) 포름산 중의 펩티드 (주입 부피 3 μL, 대략 1000 ng 펩티드)는 1.9 μm 입자 (Dr. Maisch GmbH)를 갖는 50 cm x 75 μm 역상 C18 컬럼에 통합 이미터로 직접 주사되었다. 펩티드는 300 nL 분-1의 유속으로 90 분에 걸쳐 5% 아세토니트릴부터 30% 아세토니트릴까지의 구배에 걸쳐 분리되었다. 펩티드는 +2.3 kV에 전기분무 이온화에 의해 이온화되었다. 탠덤 질량 분광 분석은 HCD 단편화를 사용하여 Q-Exactive 질량 분광계(Thermo Fisher Scientific)에서 수행되었다. 데이터-의존성 획득 방법은 구배 동안 임의의 한 지점에 상부 20개의 가장 풍부한 이온에서 획득된 MS/MS 스펙트럼을 사용하였다. 모든 RAW MS 데이터는 데이터 세트 식별자 PXD00XXX, 사용자명: reviewerXXXX@ebi.ac.uk, 패스워드: XXXXX를 갖는 PRIDE 파트너 저장소를 통해 ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org)에 기탁되었다. 질량 분광계에 의해 생성된 RAW 데이터는 MaxQuant를 사용하여 분석하였다. 펩티드 및 단백질 수준 확인은 둘 다 표적-유인 기반 전략을 사용하여 1%의 잘못된 발견 속도로 설정되었다. 펩티드 식별을 위하여 검색 엔진에 공급된 데이터베이스는 2017년 9월 30일에 다운로드된 인간 스위스프로트 데이터베이스이었다. 질량 공차는 전구체 이온에 대하여 4.5 ppm으로 설정되었고, MS/MS 질량 공차는 20 ppm으로 설정되었다. 효소는 최대 2개의 누락된 절단을 갖는 트립신 (R/K에 대한 C-말단 절단)으로 설정되었다. N/Q의 탈아미드화, M의 산화, N-말단 피로-E/Q, 단백질 N-말단 아세틸화는 가변적 변형으로서 설정되었다. C 상의 N-에틸말레이미드는 고정 변형으로서 검색되었다. MaxQuant로부터의 출력은 또한 상기 주어진 동일한 식별자 하에서 ProteomeXchange Consortium에 업로드되었다.
단백질 분석
샘플 단백질 농도는 제조자의 지침(Thermo Scientific)에 따라 비신코닌산 단백질 검정을 사용하여 측정되었다.
웨스턴 블롯
추출된 인간 줄기 세포 단백질 10 μg 및 사다리 (참조 Blue Plus 2 Prestained, ThermoFisher Cat #. LC5925)는 8-12% (w/v) SDS-폴리아크릴아미드 겔 (S5) 상에서 전기영동되었다 (1 시간, 150 V). 이어서, 분리된 단백질은 1.5시간 동안 35V에 니트로셀룰로스 막 (Li-Cor)로 습식 이전된 다음, PBS 중 5%(w/v) 건조된 탈지유에서 차단되었고, 4℃에서 밤새 5%, BSA, 0.1% PBS Tween-20 및 0.02% 아지드화나트륨 차단 완충액 (표XXX)에 용해된 1차 항체에서 인큐베이션되었다. 세정 후, 니트로셀룰로스 막은 적절한 형광단-접합된 2차 항체로 인큐베이션되었다 (참조 표). 블롯은 Odyssey® 적외선 이미지형성 시스템 (Li-Cor Biosciences)를 사용하여 가시화되었다. 쿠마시 (Coomassie) 염색 (InstaBlue Commassie, Sigma Aldrich, Cat #. ISB1L)를 위하여 10 μg의 단백질은 피브로넥틴 및 매트리겔 대조군과 함께 1 시간 동안 150 V에서 전기영동되었고, 실온에서 쿠마시 염색으로 밤새 인큐베이션되었다. 탈색 2시간 후, 겔은 Odyssey® 적외선 이미지형성 시스템을 사용하여 이미지형성되었다.
데이터 분석
프로테오믹스 데이터는 스튜던트 t-시험에 의해 분석되었고, 벤자마니 호크베르그 절차로 거짓 발견에 대하여 조정되었다.
실시예 1. 신경병적 "통증"은 부상에 대한 보존된 반응이다.
유전적으로 다루기 쉬운 무척추동물에서 만성 "통증"을 조사하기 위해, 본 발명자들은 성체 초파리에 신경 부상 모델을 확립하였다. 파리에서, 표면 온도 ≥42℃는 강한 통각성 회피 반응 또는 수분 이내에 사망을 유발한다. 이러한 행동을 전개하면, 본 발명자들은 통각성 역치를 조사하기 위해 파리 핫 플레이트 탈출 패러다임을 개발하였다. 야생형(칸톤 S) 초파리는 표면이 25 내지 38℃로 설정되었을 때 최소 탈출 반응을 나타냈다 (도 1a, 및 도시되지 않음). 그러나, 동물이 유해 가열 (42℃)에 노출되었을 때, 부상되지 않은 파리는 ~3 탈출 반응/파리/분을 나타내는 동물로 강력한 통각성 탈출 반응을 나타냈다(도1a,). 드로소필라 TrpA 패밀리 구성원 TrpA1 (Neely 등, 2011; Zhong 등, 2012) 및 무통증 (Neely 등, 2010; Tracey 등, 2003)은 유충 및 성체 파리에서 급성 가열 통각에 필요해지기 때문에, 본 발명자들은 이들 수용체가 또한 이러한 반응에 관여되는지를 시험하였다. 실제로, TrpA1 및 무통증 둘 모두는 유해성 (42℃) 온도에서 급성 탈출 행동에 필요해졌다 (도 1a).
본 발명자들은 다음에 부상을 입었고 부상이 열 탈출 반응 프로파일을 변경했는지를 질문하였다. 본 발명자들은 야생형 동물의 우측 중간 다리를 절단하였고(도 1b), 동물이 회복되도록 허용한 다음, 상이한 온도에서 탈출 반응을 평가하였다. 온전한 동물이 38℃ 표면에 노출되었을 때 최소 탈출 시도를 나타냈지만, 절단 후, 파리는 상당히 더 많은 탈출 행동을 나타냈다 (도 1c). 이러한 반응은 부상 직후에 부재하였고, 먼저 부상 후 ~7일에 명백해졌으며, 14일에 지난 후 지속되었다 (도 1c, 도 S1A 및 B). 부상은, 통각과민성 반응으로 간주되는, 유해 온도 (42℃)에서 탈출 반응을 변경시키지 않았지만, 열 이질통증과 일치하는, 준유해 감작 (38℃)으로 제한되었으며; 여기서 "고통스러운" 행동성 반응은 무해한 자극물에 의해 유발된다 (도 1d, 도 S1A 및 B). 전체 속도의 분석은, 관찰된 표현형이 활성의 일반화된 차이로 인한 것이 아님을 나타내는, 사지 절단 후 움직임의 총 변화 없음을 나타냈다 (도 1e). 함께, 이들 데이터는 초파리가 심각한 부상에 반응하여 이질통증을 나타낸다는 것을 보여준다.
실시예 2. 이질통증은 ppk+ 감각 뉴런에서 TrpA1 에 의해 매개된다
유충에서, ppk+ 감각 뉴런은 동물의 신체를 타일링하고 급성 유해 가열 반응을 변환시킨다 (Zhong 등, 2010). 성체 파리에서, 본 발명자들은 다리에서 아마도 감각 구조로 조직화된 ppk+ 뉴런을 관찰하였고 (도 2a), 다리를 따라 위치한 ppk+ 세포체 (도2b) 및 ppk+ 뉴런은 복부 신경 삭 (VNC) 및 뇌를 향해 그리고 말초로 돌출부를 전달한다 (도 2c, 도8c-e). 중요하게는, 본 발명자들이 UAS-파상풍 독소로 ppk+ 뉴런으로부터의 시냅스성 출력을 차단한 경우, 동물은 부상 후 더 이상 이질통증을 나타내지 않았지만 (도 2d), 달리 비교할만한 이동성을 나타냈다 (도시되지 않음). 또한, 대조 동물이 부상 후 38℃에 감작된 탈출 반응을 나타냈지만, 무통증 및 TrpA1 돌연변이체 동물은 모두 이러한 효과에 완전히 저항성이었고 (도 2e), 42℃에 감작을 심지어 나타내지 않았다. 마지막으로, ppk+ 감각 뉴런에서 TrpA1 RNAi를 구동하는 것은 이질통증을 차단하기에 충분하였고 (도 2f), 감작은 TrpA1 돌연변이체 배경 상에서 ppk+ 감각 뉴런에서 특이적으로 TrpA1을 재도입함으로써 완전히 구제되었다 (도 2g). 따라서, 파리에서, 신경병적 이질통증은 ppk+ 통각성 감각 뉴런에서 특이적으로 발현된 보존 통각성 TRP 채널 TrpA1을 필요로 한다.
실시예 3. 말초 신경병적 부상은 중추 기전을 통해 이질통증을 야기한다
파리가 고온 표면 상에 배치될 때 "점핑" 탈출 반응을 나타내고, 이러한 반응이 부상 후 감작을 나타내기 때문에, 본 발명자들은 다음에 다리에서 감각 뉴런을 활성화시키는 것이 탈출 반응 회로를 직접적으로 촉발시킬 수 있는지를 조사하였다. 본 발명자들은 온전한 파리의 중간 다리에서 통각성 감각소를 자극하였고, 드로소필라 탈출 반응 회로에서의 최종 단계인, 등쪽 세로 근육 (DLM)으로부터의 세포내 기록에 의한 탈출 반응을 평가하였다 (도 3a). 온전한 다리의 자극은 강건한 탈출 반응을 유발하였다 (도 3a). 거대 섬유 반응은 뇌로부터의 참여 없이 발생할 수 있다 (도 9a). 그러나, 본 발명자들은 탈출 반응을 초래하는 다리 자극이 국소 반사가 아니라 고차 뇌 기능을 필요로 한다는 것을 발견하였다 (도 9b). 흥미롭게도, 중간 다리의 절단이 무해한 가열에 대한 행동성 감작을 야기하였지만, 본 발명자들이 부상된 다리를 직접적으로 자극한 경우 본 발명자들은 반응을 관찰하지 못했다 (도 3b). 따라서, 본 발명자들은 부상된 다리에서 근위 ppk+ 감각 뉴런의 점진적인 신경병증을 7일에 걸쳐 보았고 (도 3c, D로 정량화됨), 포유동물에서 말초 신경 절단 후 축색된 뉴런의 퇴화의 유사한 손실은 관찰된다 (Tandrup 등, 2000).
손상된 다리의 나머지 부분이 심각한 감각 신경병증을 나타내고 자극에 반응하지 않기 때문에, 본 발명자들은 대신 절단된 파리의 반대측 부상되지 않은 다리를 자극하였고 탈출 반응의 활성화를 평가하였다 (도 3e). 현저하게, 부상 7일 후, 본 발명자들은 반대측 다리를 자극할 때 명백한 변화를 관찰하였는데, 전체 탈출 반응 속도는 0.2 ms 더 빠르게 발생하였고 (도 3f G로 정량화됨), 반응 지속기간은 0.2ms 더 오래 지속되었다 (도 3f H로 정량화됨). 부상 후의 변화는 이러한 통각성 탈출 회로의 상승 및 하강 성분 모두에서 발생하였던 것은, 본 발명자들이 구심성 감각 입력을 우회하였고 하강 탈출 회로를 직접 자극하였을 때 본 발명자가 여전히 총 향상된 반응 속도의 50%를 관찰하였기 때문이다 (0.1ms 더 빠름; 도 9c). 함께, 이들 데이터는 말초 부상이 감각 신경병증, 반대측 감작, 및 통각성 탈출 회로의 경험-구동된 가소성을 유도한다는 것을 보여준다.
실시예 4. GABA성 억제의 중추 손실은 신경병적 이질통증을 야기한다
ppk+ 감각 뉴런은 다리로부터 드로소필라 CNS의 전"각"으로 돌출한다 (도 2a-c, 도 8c-e). 통각성 (ppk+) 및 GABA성 뉴런을 공동-표지함으로써, 본 발명자들은 VNC에서 이들 2개의 집단 사이의 밀접한 상호작용을 관찰하였다. 중요하게는, 부상 7일 후, 본 발명자들은 2차 VNC 엽의 동측 및 반대측 절편 모두에서 GABA 면역반응성의 극적인 ~40% 감소를 관찰하였는데 (도 4a-b; 평면, 도 9d; 횡단면, 9e로 정량화됨), 이러한 손실은 주로 VNC 중간선을 따라 발생한다. GABA 병소에서 상당하지만 덜 심각한 감소는 VNC의 제1 및 제3 엽에서 또한 발생하였지만 (도 10a-b), GABA 병소의 수에서 차이는 부상된 동물의 뇌에서 관찰되지 않았다 (도10c), 즉 GABA 면역반응성의 손실은 VNC에 국한되었다. GABA성 뉴런의 손실이 이들 세포의 직접적인 부상으로 인한 것이 아닌 것은, GABA성 핵 또는 돌출부가 파리 다리 (도시되지 않음)에서 관찰되지 않았기 때문이다. TrpA1은 GABA성 병소의 손실에 필요하지는 않았지만 (도시되지 않음), ppk+ 감각 뉴런 (UAS-파상풍 독소를 구동하는 ppk-Gal4)로부터 시냅스성 출력을 차단하는 것은 이러한 부상의 신경병적 성질을 확인하는 VNC GABA 병소 (도 4c 9f에서 정량화됨)의 손실을 완전히 방지하였다.
카스파제의 약리학적 억제가 설치류에서 GABA 손실을 예방하고 신경병적 통증의 생성을 억제할 수 있기 때문에 (Scholz 등, 2005), 본 발명자들은 파리에서 중추 GABA를 조절하는데 카스파제의 역할을 평가하였다. 온전한 동물은 VNC에서 GABA/활성 카스파제 공동-표지화가 거의 없음을 나타냈다 (Gad1-Gal4>>UAS-라민-GFP로 표지된 GABA성 뉴런; 도 4d 10e에서 정량화됨). 부상 후, VNC에서 GABA성 핵의 총 수는 크게 감소되었고 (10d에서 정량화됨), 반면에 Gad1/활성 카스파제 이중 양성 세포의 수는 상당히 증가되었다(도 4d; 10e에서 정량화됨). GABA성 세포 손실이 카스파제-의존성 사건인지를 직접적으로 시험하기 위해, 본 발명자들은 특이적으로 GABA성 뉴런에서 카스파제 억제제 p35의 발현을 구동시켰다 (Gad1-Gal4 > UAS-p35). 카스파제를 차단하는 것이 파리 VNC에서 GABA 병소의 기준선 수를 변경시키지 않았지만, Gad1+ GABA성 뉴런에서 p35의 이소성 발현은 신경 부상 후 GABA 병소의 손실을 완전히 차단하였다 (도 4e, 10f에서 정량화됨). 다음으로, 본 발명자들은 GABA성 (+) 세포 손실을 차단하는 것이 부상된 동물에서 전체적 통각성 회로에 기능적 결과를 갖는지를 시험하였다. 통각성 탈출 회로가 친계 제어 라인 (UAS-p35/+)에서 향상된 반응 지연 및 지속기간을 나타냈지만, GABA성 세포 사멸을 억제 (Gad1-Gal4 > UAS-p35)하는 것은 부상 후 통각성 탈출 회로에서 모든 변화를 완전히 차단하였다 (도 4f-g). 중요하게는, 친계 대조군은 다리 절단 후 신경병적 이질통증을 나타냈고, 반면 카스파제-매개 GABA성 세포 사멸을 차단하는 것은 이러한 반응을 완전히 억제하였다 (도 4h). 반대로, 디엘드린(dieldrin)에 내성(Rdl)인 이오노트로픽 (ionotropic) GAGABA/글리신 수용체 서브유닛 또는 대사성 GABA-B-R2의 통각수용체 특이적 (ppk-Gal4) RNAi 녹다운은 이질통증을 촉진시킬 수 있고, 부상되지 않은 동물에서 준유해 온도 (38℃)에 반응하여 탈출 행동을 향상시킬 수 있다 (도 4i, 도 10g). 함께, 이들 데이터는, 파리에서, 중앙 GABA의 손실이 열 이질통증에 필요하고 충분하다는 것을 보여준다.
실시예 5: iPSC-유래 GABA성 이식물은 신경병적 통증을 치료적으로 처치할 수 있다
본 발명자들의 파리 신경병적 연구는 신경병적 통증을 구동하는 핵심 근본적인 병리학으로서 중추 억제의 손실을 강조한다. 유사하게, 포유동물 통증 지각에서, GABA를 생산하는 억제성 개재뉴런은 척수에서 통증의 중심 게이팅에서 중요한 역할을 한다. 이를 위해, 본 발명자들은 이러한 접근법의 치료적 생존력을 평가하기 위해 전임상 GABA성 이식물 프로토콜을 개발하였다. 세포 대체 요법은 자가 물질의 이식을 필요로 할 것이며, 따라서 본 발명자들은 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)의 잠재적 유용성을 조사하였다.
GABA성 뉴런은 상기 기재된 바와 같은 프로토콜을 통해 hiPSC로부터 시험관내 분화되었다 (도 5b에 도시됨). hiPSC는 TripLE(Invitrogen)로 해리되고, 2주 동안 현탁액에서 초저 부착 결합 플레이트로 성장되어 배상체 (EB)를 형성한다. 신경 유도를 위하여, 세포는 SMAD 억제제 LDN193189 (100 nM, 0일째 내지 14일째) 및 SB431542 (10 μM, 0일째 내지 10일째)로 처리되었다. MGE (중앙 글란글리온성 융기) 유도를 위하여, 세포는 Wnt 억제제 IWP2 (5 μM, 0일째 내지 7일째), SHH 활성제 SAG (평활화된 작용제 - 0.1 μM, 0일째 내지 21일째) 및 성장 인자 FGF8 (100 ng/mL, 8일째 내지 21일째)로 처리되었다. 록 억제제는 분화의 첫날에 첨가된다. 현탁액에서 2주 후, EB는 폴리오르니틴(PLO) 및 피브로넥틴(FN) 코팅된 표면으로 이전된다. 21일째에, EB는 해리되었고, 세포는 추가의 분화 및 성숙을 위하여 10 ng/mL BDNF, 10 ng/ml GDNF 및 2.5 μM 감마 세크레타제 억제제 DAPT를 함유하는 분화 배지 상의 PLO/FN 코팅된 플레이트 상에 재플레이팅되었다. 분화 프로토콜은 28일 이내에 hiPSC의 GABA성 (GAD65/67+) 뉴런 (TUBB3+)로의 분화를 효율적으로 구동시켰다 (도 5c).
FACS에 의해, 분화 조건은 TUBB3 발현 프로파일 및 GAD65+ 세포의 순수 집단에서 전체적 시프트를 촉진하였다 (~95% 순수, 도 5d). 이식물 물질의 분자 프로파일을 추가로 특성규명하기 위해, RNA 시퀀싱은 DIV25 hiPSC-유래 GABA성 뉴런 뿐만 아니라 친계 hiPSC에서 수행되었다. GABA성 특이성을 확인하기 위해, hiPSC-유래 감각 뉴런의 전사체는 또한 분석되었다. 분화된 GABA성 뉴런은 GAB-특이적 전사물 및 소마토스타틴 아형 마커를 발현하였다 (도 5e, 도 13b). HiPSC-유래 GABA성 뉴런은 또한 증식 또는 만능성 마커를 하향조절하였고 (도 5e, 도 13d), 글루타메이트 수용체를 상향조절하였고(도 13c), 아마 미분화된 전구체 세포로 인해 OLIG2를 발현시켰다 (도5e, 도 13e). 분화된 GABA성 뉴런은 주로 피질 또는 선조 소마토스타틴 (+) 뉴런과 가장 밀접하게 관련된 외투하부 MGE 및 CGE 분화 상태를 나타낸다. 그러나, 일부 수준의 LGE-특이적 전사물은 관찰되었다 (도 14). 재현성은 계층적 클러스터링 (도 13a)에 의해 증명되고 qPCR (도13f)에 의해 입증되는 바와 같이 생물학적 복제물 내에서 강력하였다. 질량 분석법에 의해 평가된 단백질 발현은 시냅스성 및 GABA성 기계류의 발현, 뉴런 마커, 및 iPSC-유래 GABA성 뉴런 내의 세포 주기 성분의 하향조절을 강조하였다 (도 5f, 도 15a-e). 리액토메(Reactome) 경로 분석은 GABA 합성 및 방출 기계류에 대하여 강력한 농축을 강조하였다 (도 15c, d). 더욱이, hiPSC-유래 GABA성 뉴런은 Ki67 (도 5g)의 증식 (도시되지 않음) 및 하향조절된 발현이 아니라 GAD65 (도 15e), 뿐만 아니라 글리신성 뉴런-특이적 마커 글리신 수송체 GlyT2 (도 15e), GABA 방출에 필요한 GABA 수송체 (소포성 GABA/글리신 수송체 VGAT) (도 5h)를 발현하였고, GABA를 생산하였다 (도 5i).
iPSC-유래 GABA성 (iGABA성) 뉴런이 GABA성 마커 및 기계류를 발현하기 때문에, 본 발명자들은 GABA 분비를 평가하였고, iGABA성 뉴런이 ELISA에 의해 GABA를 분비하는 것을 확인하였다 (도6a). 또한, iGABA성 뉴런은 카이네이트, NMDA 및 AMPA 글루타메이트 수용체 서브클래스의 서브유닛을 발현한다 (도 6b). 세포가 반응성인지를 시험하기 위해, 본 발명자들은 세포를 글루타메이트로 자극하고 칼슘 이미지형성을 수행하였다. 본 발명자들은 강한 칼슘 변동 및 대부분의 세포가 글루타메이트 및 염화칼륨 둘 모두에 반응한다는 것을 관찰하였다 (도 6c, d).
Figure pct00001
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통증 질환을 치료하기 위한 iGABA성 뉴런에 대하여 번역 가능성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 신경병적 통증의 신경 부분 부상 (SNI) 모델을 수행한 후 (Decosterd and Woolf, 2000), iGABA성 뉴런을 부상된 마우스의 척수의 동측 후각 (요추 확대)에 이식하였다 (도 6a). 이종이식 반응을 피하기 위해, 본 발명자들은 면역 부상된 (NODSCID) 수령체를 사용하였다. 예상된 SNI가 6일 이내에 NOD scid 마우스에서 촉각 및 저온 이질통증을 유발하였고; 폰 프레이 라이트 터치 검정, 및 아세톤 반응에 의해 각각 평가되었다. 이식 후 2주부터, 2개월 동안 지속된 강력한 진통 (연구의 종말점)이 관찰되었고, 이는 촉각 이질통증의 감소 및 자극물 반응 곡선의 시프트로서 나타났다 (도 7b-c).
GABA성 뉴런이 또한 운동 회로에 포함되기 때문에, 본 발명자들은 오픈 필드 시험을 사용하여 운동 행동을 평가하였다. 이동의 최대 속도 또는 평균 속도 어느 하나에서 그룹들 간에 차이는 관찰되지 않았다 (도 7d-e). 또한, 마우스의 보행은 변형된 바소 마우스 스케일을 사용하여 평가하였다. SNI는 혼합된 운동/감각 좌골 신경에 부상으로 인해 예상된 대로 보행에 효과를 가졌다. 그러나, 이식 이후 그룹들 사이 보행의 총 변화는 관찰되지 않았고, 함께 운동 행동과의 주요 간섭이 없음을 시사한다 (도 7f). 해부학적 근접이 가까움으로 인해, 요추 후각에 이식된 GABA성 뉴런은 척수에 위치한 자율 신경계 핵에 영향을 줄 가능성이 있다. 그러나, 마우스에서 방광 운동 또는 배변의 문제는 관찰되지 않았다.
관찰된 효과가 운동 행동과 관련이 없다는 것을 추가로 확인하기 위해, iGABA성 뉴런은 미접촉 마우스에 이식되었다. 촉각 민감도의 감소를 위하여 신경 부상이 필요하다는 것을 시사하는 자극물 반응 및 금단 역치에서는 변화가 관찰되지 않았다 (도 7h 및 도 16). 이들 결과는 또한 이식물이 임의의 자극물이 인식되는 토닉 역치를 단순히 증가시키지 않는다는 것을 확인하였다 (도 16b). 마지막으로, 본 발명자들은 치료의 특이성을 확인하였으며, 이는 신경 부상 이후 후각에의 hiPSC 유래 감각 뉴런 (i감각 뉴런)의 이식이 진통을 유발할 수 없기 때문이다 (도 7i 및 도 16c). 종합하면, 성숙한 iGABA성 뉴런 이식물을 사용하여 억제를 향상시키는 것은 말초적으로 유도된 신경병적 통증으로부터 장기간 진통을 촉진시킨다.
뉴런이 척수에 생착할 가능성을 평가하기 위해, 세포 생존, 통합 및 시냅스 통합의 가능성은 평가되었다 (도 8). 이식 3주 후, 본 발명자들은 후각 층 I (CGRP+) 및 II (IB4+) 뿐만 아니라 방사상 이동을 통한 다른 후각 층에서 hiPSC-유래 GABA성 뉴런을 확인하였다 (도 8). 초기에, iGABA성 뉴런은 복측 또는 반대측 척수로 이동하지 않았고 (도 8), 뉴런성 및 GABA성 마커 발현을 보유하였으며, 시냅스 통합 가능성의 조기 증거를 나타냈다 (도8). 그러나, 10주 후 실질적인 이동은 관찰되었다. 이식된 세포는 인간 NCAM1, MAP2, TUBB3의 동시-발현에 의해 평가된 바와 같이 그들의 뉴런 동일성을 보유하였고, 최종 분화를 제안하는 NeuN을 발현하였다 (도 9c-e). iGABA성 뉴런은 GABA에 면역반응성이었고, 이식된 iGABA성 뉴런이 GABA를 합성, 포장 및 방출하는 능력을 보유한다는 것을 나타내는 시냅신 발현 그리고, GAD65/67, VGAT를 보유하였다 (도 9f-h). 추가로, (바순을 표적화하고 시냅스전 단백질 RIM2와 동시-국재화하는 마우스-특이적 항체에 의해 표시된) 마우스 시냅스전 밀도는 (인간 특이적 세포질 항체, HuCytoplasm에 의해 표시된) iGABA성 뉴런에 직접 부착되었는데, 이는 이식물과 수령체 조직 사이 시냅스를 형성할 가능성을 시사한다 (도 9i). iGABA성 뉴런은 중요한 시냅스전 단백질, 리프린을 발현하였고, 범-전압 게이팅된 칼슘 채널 항체에 면역반응성이었다 (도 9k-l). 마지막으로, 인간 시냅신과 억제성 시냅스후 마커 게피린의 부착을 본 발명자들이 관찰하였으며, 이는 억제성 시냅스의 존재를 시사한다 (도 9m-n). 주목할 것은, 이식된 억제성 뉴런은 주로 소마토스타틴 또는 파르브알부민 하위부류 (도 9o-p)이었다. 중요하게는, 기형종 또는 기타 관련 이상에 대한 형태학적 증거는 관찰되지 않았으며 iGABA성 뉴런의 증식 증거가 확인될 수 없었으며 (세포가 활성 세포 주기 단백질 Ki67을 발현하지 않았음) (도 9r-s), 이는 절차의 안전성을 강조한다.
실시예 6. 신경병적 마우스에서 통증을 경감시키기 위한 hiPSC-GABA 뉴런의 향상된 분화.
iGABA성 뉴런은 실시예 5에 기재된 방법의 순응에 따라 제조되었다. GABA성 분화 프로토콜 동안, hiPSC는 3주차 동안만 (즉, 약 DIV14 내지 약 DIV21), 4주차 동안만 (즉, DIV21 내지 DIV28) 또는 3 주차 및 4 주차 동안 (즉, 약 DIV14 내지 약 DIV28) BMP4에 노출되었다. 분화 후(즉, DIV28), iGABA성 뉴런은 소마토스타틴 (SST) 및 파르브알부민 (PVALB)의 발현에 대하여 평가되었다. 이어서, BMP4 처리된 세포는 신경병적 통증을 역전시키는 그들의 능력에 대하여 시험되었고, 상기 기재된 바와 같은 SNI 모델을 사용하여 처리되지 않은 iGABA성 뉴런과 비교되었다.
놀랍게도, 4 주차 또는 3주차 및 4 주차가 아닌, 3 주차 동안 hiPSC의 BMP4에의 노출이 PAVB 발현의 6배 증가를 초래한다는 것이 발견되었다. 분화 프로토콜에서 3주차 및 4주차 중 하나 또는 둘 모두 동안 hiPSC의 노출은 qPCR에 의해 나타낸 SST 발현의 50% 감소를 초래하였다 (도 17a, b).
놀랍게도, (파르브알부민 풍부한) 분화 프로토콜의 3주차 동안 BMP4에 노출된 iGABA성 뉴런이 SNI 마우스에 이식된 경우, SNI 마우스가 BMP4에 노출되지 않은 iGABA성 뉴런으로 처리된 경우에 비해 부상 후 5 주에 상당히 더 강력한 장기 진통 반응이 관찰된다는 것이 또한 발견되었다 (도 17c). 실제로, 파르브알부민 풍부한 iGABA성 뉴런으로 처리된 동물은 이식 후 5주 그들의 각각의 기준선 대조군과 비교하여 유의미한 차이를 나타내지 않았다 (즉, 통증은 SNI 동물에서 정상으로 완전히 돌아온다) (도 17c).
신경병적 통증에서 핵심 기전으로서 중추 탈억제를 위한 핵심 역할을 활용하면, 본 발명자들은 hiPSC-유래 GABA성 배양물이 신경병적 포유동물의 척수 내로 이식되어 장기 지속성 질환 완화를 촉진할 수 있음을 보여준다. 본원에 기재된 연구에서, hiPSC-유래 GABA성 뉴런 이식에 명백한 행동적 또는 생리학적 역 반응은 관찰되지 않았다. 또한, GABA성 뉴런은 분열하지 않았고, 하향조절된 세포 주기 및 만능성 마커를 나타내었으며, 수령체 동물에 이식되는 경우 종양 또는 기형종을 형성하지 않아서, 본 발명의 조성물 및 방법의 효능 뿐만 아니라 안전성을 강조하였다.
이와 함께, 이들 데이터는, 중추 억제가 일부 형태의 신경병성 통증에 중요한 핵심적인 원시적 병리상태이고, 항-신경병성 GABA성 이식을 통한 중추 억제 긴장을 강화하는 것이 장기적이고 잠재적으로 신경병성인 통증으로부터 치유적 완화를 촉진할 수 있음을 보여준다. 기존의 진통제는 수 시간 동안 작용하고, 일부는 심각한 부작용을 갖는다. 이러한 요법은 더 오래 지속되는 무통증을 제공하고 부작용 없이 신경병성 통증을 효과적으로 완화시키는 단일 절차의 가능성을 나타낸다.

Claims (52)

  1. 포유동물에 투여하기 위한 이식 조성물로서, 상기 이식 조성물은 GABA성 뉴런의 집단, GFR알파 작용제 및 적어도 하나의 세포 사멸 억제제를 포함하되, 상기 GABA성의 뉴런은, 세포가 GABA성 뉴런 표현형을 수득하고 GABA를 생산하도록 하는 조건 하에 시험관내에서 만능 줄기 세포, 또는 다분화능 줄기 세포 또는 선조 세포를 분화시킴으로써 생성되는, 이식 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 아폽토시스 억제제 및 괴사 억제제를 포함하는, 이식 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, GABA성 뉴런은 상기 만능 줄기 세포 또는 다분화능 줄기 또는 선조 세포를, 이하의 존재 하에 배양함으로써 생성되는, 이식 조성물:
    i. 약 0일째 내지 약 7일째의 적어도 2개의 SMAD 억제제;
    ii. 약 0일째 내지 약 21일째의 소닉 헤지혹 경로의 활성제;
    iii. 약 0일째 내지 약 14일째의 wnt 억제제;
    iv. 약 7일째 내지 약 14일째의 BMP 억제제;
    v. 약 7일째 내지 약 21일째의 GABA성 종형성 인자; 및
    vi. 약 21일째 내지 약 27일째의 BDNF, GDNF 및 감마 세크레타제 억제제를 포함하는 뉴런 성숙 성장 인자의 조합.
  4. 제3항에 있어서, 상기 만능 줄기 세포, 또는 다분화능 줄기 또는 선조 세포가 약 14일째 내지 약 21일째의 기간 동안 BMP 신호전달을 활성화시키는 하나 이상의 제제의 존재 하에 배양되는, 이식 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 BMP 신호전달을 활성화시키는 하나 이상의 제제가 BMP4를 포함하는, 이식 조성물.
  6. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 줄기 세포, 또는 다분화능 줄기 또는 선조 세포가 상기 포유동물로부터 수득되는, 이식 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GABA성 뉴런이 만능 줄기 세포로부터 생성되는, 이식 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 만능 줄기 세포가 iPSC인, 이식 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GFR알파 작용제가 신경교 세포-유래된 신경친화성 인자 (GDNF), 뉴르투린 (NRTN), 아르테민 (ARTN) 및 페르세핀 (PSPN), 뇌-유래된 신경친화성 인자 (BDNF), NGF, GDNF 수용체 내인성 작용제, BT18, BT13, NT-3, NT-4, CNTF, GFR알파1 작용제, XIB4035, Trk 활성제, TrkA 작용제, 가모보긱 아민, 아미트립틸린, TrkB 작용제, N-아세틸세로토닌, 아미트립틸린, BNN-20BNN-27, 데옥시게두닌, 7,8-디하이드록시플라본, 4'-디메틸아미노-7,8-디하이드록시플라본, 디이소메틴, HIOC, LM22A-4, 뉴로트로핀-3, 뉴로트로핀-4, 노르우고닌, R7 (약물), 및 7,8,3'-트리하이드록시플라본으로 구성된 군으로부터 선택되는, 이식 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, GFR알파 작용제가 GDNF인, 이식 조성물.
  11. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아폽토시스 억제제가 Boc-Asp(OMe) 플루오로메틸 케톤 IDN-8066, 7053, 7436 1965 6556 M867 IDN-5370 IDN-7866 프랄나카산 z-Vad-FMK, YVAD-FMK, c-DEVD-CHO, Ac-YVAD-CHO, Ac-DVAD-FMK Q-Vd-OPh, CrmA (카우폭스 바이러스 단백질), p35 (바콜루바이러스 단백질), Z-ATAD-FMK, INF-4E, Z-DQMD-FMK, Az 10417808, Z-LEED-FMK, ZVDK -FMK, z-IETD-FMK, INf-39, 벨나카산, Ac-DEVD-CHO, 및 엠리카산으로 구성된 군으로부터 선택되는 카스파제 억제제; 또는 칼페인 억제제 1, 칼펩틴, E64, MDL28170, MG101, 아세틸-칼파스타틴, 및 PD 150606으로 구성된 군으로부터 선택된 카스파제 활성제의 억제제 중 하나 이상으로부터 선택되는, 이식 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 상기 아폽토시스 억제제가 넓은-스펙트럼 카스파제인, 이식 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 아포토시스 억제제가 Boc-Asp(OMe) 플루오로메틸 케톤인, 이식 조성물.
  14. 제2항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 괴사 억제제가 MS-1, IM-54, GSK-872, 7-Cl-O-Nec1, 네크로스타틴-1, 및 네크로설폰아미드로 구성된 군으로부터 선택되는, 이식 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 괴사 억제제가 MLKL 억제제인, 이식 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 괴사 억제제가 네크로술폰아미드인, 이식 조성물.
  17. GABA성 뉴런의 집단을 생성하는 방법으로서, 시험관내에서 만능 줄기 세포, 또는 다분화능 줄기 세포 또는 선조 세포를,
    i. 약 0일째 내지 약 7일째의 적어도 2개의 SMAD 억제제;
    ii. 약 0일째 내지 약 21일째의 소닉 헤지혹 경로의 활성제;
    iii. 약 0일째 내지 약 14일째의 wnt 억제제;
    iv. 약 7일째 내지 약 14일째의 BMP 억제제;
    v. 약 7일째 내지 약 21일째의 GABA성 종형성 인자; 및
    vi. 약 21일째 내지 약 27일째의 BDNF, GDNF 및 감마 세크레타제 억제제를 포함하는 뉴런 성숙 성장 인자의 조합
    의 존재에서 배양하여,
    상기 세포가 GABA성 뉴런 표현형을 얻고 GABA를 생성하는 것을 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 만능 줄기 세포, 또는 다분화능 줄기 또는 선조 세포가 약 14일째 내지 약 21일째의 기간 동안 BMP 신호전달을 활성화시키는 하나 이상의 제제의 존재 하에 배양되는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, BMP 신호전달을 활성화시키는 하나 이상의 제제가 BMP4를 포함하는, 방법.
  20. 제1항 내지 제16항, 또는 제17항 내지 제19항 어느 한 항에 žx어서, 상기 GABA성 뉴런이 유사분열 후인, 이식 조성물 또는 방법.
  21. 제1항 내지 제16항 또는 제20항 또는 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GABA성 뉴런이 Nkx2.1, vGAT, GAD65, GAAD67에 대한 전사체를 발현시키는, 이식 조성물, 또는 방법.
  22. 제1항 내지 제16항 또는 제20항 내지 제21항, 또는 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GABA성 뉴런이 GAD65/67, GlyT2 및 VGAT를 발현시키는, 이식 조성물, 또는 방법.
  23. 제1항 내지 제16항 또는 제20항 내지 제22항, 또는 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GABA성 뉴런 집단의 적어도 95%가 GAD65을 발현시키는, 이식 조성물, 또는 방법.
  24. 제1항 내지 제16항 또는 제20항 내지 제23항, 또는 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GABA성 뉴런 집단의 적어도 95%가 VGAT를 발현시키는, 이식 조성물, 또는 방법.
  25. 제1항 내지 제16항 또는 제20항 내지 제24항, 또는 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GABA성 뉴런이 생체내에서 GABA를 분비할 수 있는 이식 조성물, 또는 방법.
  26. 제3항 내지 제16항 또는 제20항 내지 제25항, 또는 제17항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 2개의 SMAD 억제제가 헤스페레틴, SB431542, SB525334, 갈루니서팁, GW788388, LY2109761, SB505124, LDN-193189, LDN-193189 HCl, RepSox, A　83-01, DMH1, LDN-212854, ITD 1, LY364947, SD-208, EW-7197, ML347, K02288, A 77-01, SIS3, LDN-214117, R-268712, 피르페니돈, 노긴, 코르딘, 그렘린, DAN 단백질, 및 GDF3으로 구성된 군으로부터 선택되는, 이식 조성물, 또는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 적어도 2개의 SMAD 억제제가 LDN193189 및 SB431542 인, 이식 조성물, 또는 방법.
  28. 제3항 내지 제16항 또는 제20항 내지 제27항, 또는 제17항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소닉 헤지혹 신호전달의 활성제가 소닉 헤지혹, GSA10, 퍼모파민, SAG, 및 SAG 디하이드로클로라이드로 구성된 군으로부터 선택되는, 이식 조성물, 또는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 소닉 헤지혹 신호전달의 활성제가 SAG인, 이식 조성물, 또는 방법.
  30. 제3항 내지 제16항 또는 제20항 내지 제29항, 또는 제17항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 wnt 억제제가 ICG-001, 살리노마이신, IWR-1, Wnt-C59, ETC-159, iCRT3, IWP2, IWP-4, 피르니늄 파모에이트, iCRT14, FH535, CCT251545, KYA1797K, 우고닌, NCB-0846, 헥사크로로펜, PNU-74654, Ky0211, 트립토나이드, IWP12, 악신, GSK, WAY316606, Shizokaol D, BC2059, PKF115-584, ICG-01, 쿠에르세틴, DCA, LY2090314, CHIR99021, SB-216763, NSC668036, QS11, G007-LK, 및 G244LM으로 구성된 군으로부터 선택되는, 이식 조성물, 또는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 wnt 억제제가 IWP2인, 이식 조성물, 또는 방법.
  32. 제3항 내지 제16항 또는 제20항 내지 제31항, 또는 제17항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BMP 억제제가 헤스페레틴, SB431542, SB525334, 갈루니서팁, GW788388, LY2109761, SB505124, LDN-193189, LDN-193189 HCl, RepSox, A　83-01, DMH1, LDN-212854, ITD 1, LY364947, SD-208, EW-7197, ML347, K02288, A 77-01, SIS3, LDN-214117, R-268712, 피르페니돈, 노긴, 코르딘, 그렘린, DAN 단백질, 및 GDF3으로 구성된 군으로부터 선택되는, 이식 조성물, 또는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 BMP 억제제는 LDN-193189인, 이식 조성물 또는 방법.
  34. 제3항 내지 제16항 또는 제20항 내지 제33항, 또는 제17항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GABA성 종형성 인자가 섬유모세포 성장 인자로 구성된 군으로부터 선택되는, 이식 조성물, 또는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 GABA성 종형성 인자가 FGF8인, 이식 조성물, 또는 방법.
  36. 제3항 내지 제16항 또는 제20항 내지 제35항, 또는 제17항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 감마 세크레타제 억제제가 DAPT, RO4929097, 사마게세스타트, 아바가세스타트, 디벤자지핀, Ly411575, IMR-1, L-685,458, FLI-06, 크레니가세스타트, 니로가세스타트, MK-0752, 베가세스타트, BMS299897, 컴파운드 W, DBZ, 플루리잔, JLK6, MRK560, 및 PF3084014 하이드로브로마이드로 구성된 군으로부터 선택되는, 이식 조성물, 또는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 감마 세크레타제 억제제가 DAPT인, 이식 조성물, 또는 방법.
  38. 제3항 내지 제16항 또는 제20항 내지 제37항, 또는 제17항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 줄기 세포, 또는 다분화능 줄기 세포 또는 선조 세포약 24시간의 기간 동안 0일째로부터의 Rock 억제제의 존재 하에 배양되는 이식 조성물, 또는 방법.
  39. 제17항 내지 제38항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생성된 세포 집단.
  40. 포유동물의 신경계에서 중추 억제를 회복하거나 강화하는 방법으로서, 제1항 내지 제16항 또는 제20항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 이식 조성물, 또는 제17항 내지 제38항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생성된 세포 집단의 치료 유효량을 상기 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  41. 포유동물에서 신경적 병태, 질환 또는 장애, 또는 이질통증을 치료하는, 방법으로서, 제1항 내지 제16항 또는 제20항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 이식 조성물, 또는 제17항 내지 제38항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생산된 세포 집단의 치료 유효량을 상기 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  42. 대상체에서 부적절한 억제성 개재뉴런 활성 또는 증가된 흥분성 뉴런 기능의 치료를 위한, 제1항 내지 제16항 또는 제20항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 이식 조성물, 또는 제17항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 생성된 세포 집단의 치료 유효량.
  43. 대상체에서 신경적 병태, 질환 또는 장애, 또는 이질통증의 치료를 위한, 제1항 내지 제16항 또는 제20항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 이식 조성물, 또는 제17항 내지 제38항 중 임의의 한 항의 방법에 따라 생성된 세포 집단의 치료 유효량.
  44. 대상체에서 신경적 병태, 질환 또는 장애, 또는 이질통증의 치료용 약제의 제조를 위한, 제1항 내지 제16항 또는 제20항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 이식 조성물, 또는 제17항 내지 제38항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생성된 세포 집단의 치료 유효량의 용도.
  45. 제1항 내지 제38항, 제41항 또는 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경적 병태, 질환 또는 장애가 신경퇴행성 질환, 신경적 손상, 또는 신경병성 통증으로부터 선택되는, 방법, 제43항의 용도를 위한 이식 조성물 또는 생성된 세포 집단의 치료 유효량, 또는 용도.
  46. 제1항 내지 제38항, 제41항 또는 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경적 병태, 질환 또는 장애는 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법, 제43항의 용도를 위한 이식 조성물 또는 생성된 세포 집단의 치료 유효량, 또는 용도: 만성 신경병성 통증, 만성 염증성 통증, 만성 기능이상 통증, 간질, 운동 뉴런 질환 (ALS, SMA), 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌졸중, 다발성 경화증, 타우병증 (진행성 핵상 마비, 피크병, 피질기저 퇴행증 (CBD), 전두측두엽 치매, ALS를 갖는 FTLD), 헌팅턴병, 알코올 금단 및 알코올중독, 당뇨병 유도된 뇌 손상, 두부 손상, 편두통, 두통, 군발성 두통, 척수 손상, 허혈성 손상, 화학요법 유도된 통증 및 화학요법 유도된 신경병증, 정신분열증, 만성 우울증, 자발성 운동장애, 양극성 장애, 및 신경병증.
  47. 제1항 내지 제38항, 제41항 또는 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경병성 통증은 좌골신경통, 요통, 암 통증, 당뇨병성 통증, 우발적인 손상, 척수 손상, 말초 신경 손상과 연관되는, 방법, 제45항의 용도를 위한 이식 조성물 또는 생성된 세포 집단의 치료 유효량, 또는 용도.
  48. 제1항 내지 제38항, 제40항, 제41항, 또는 제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이식 조성물, 상기 세포 집단의 치료 유효량 또는 상기 약제는 포유동물의 중추신경계에 투여하거나 투여하기 위해 제형화하는, 방법, 제42항, 제43항, 또는 제45항 내지 제47항의 용도를 위한 이식 조성물 또는 생성된 세포 집단의 치료 유효량, 또는 용도.
  49. 제1항 내지 제38항, 제40항, 제41항, 또는 제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이식 조성물, 상기 세포 집단의 치료 유효량 또는 상기 약제는 상기 포유동물의 척수 내로 주사되거나 또는 주사를 위해 제형화되는, 방법, 제42항, 제43항, 또는 제45항 내지 제47항의 용도를 위한 이식 조성물 또는 생성된 세포 집단의 치료 유효량, 또는 용도.
  50. 제1항 내지 제38항, 또는 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 주사는 뇌정위적 주사인, 방법, 제49항의 용도를 위한 이식 조성물 또는 생성된 세포 집단의 치료 유효량, 또는 용도.
  51. 제1항 내지 제38항, 제40항, 제41항, 제43항 또는 제44항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인, 방법, 제42항, 제43항, 또는 제45항 내지 제50항의 용도를 위한 이식 조성물 또는 생성된 세포 집단의 치료 유효량, 또는 용도.
  52. GABA성 뉴런을 전달을 필요로 하는 대상체에게 전달하는 방법으로서, 다음의 단계들을 포함하는, 방법:
    a) 상기 대상체로부터 생검을 수득하고 상기 생검으로부터 세포를 단리하는 단계;
    b) 단계 a)에서 단리된 세포로부터 iPSC를 생성하는 단계;
    c) 단계 b)에서 생성된 iPSC를 GABA성 뉴런으로 분화시키는 조건 하에 배양하는 단계로서, 상기 GABA성 뉴런은 GABA성 뉴런 표현형을 발현시키고 GABA를 생성하는 단계;
    d) 상기 대상체에게 주사하기에 적합한 이식 조성물을 제조하는 단계로서, 상기 이식 조성물은 단계 c)에서 생성된 GABA성 뉴런, GFR알파 효능제, 아폽토시스 억제제, 괴사 억제제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 단계;
    e) 단계 d)에서 제조된 이식 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계.
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