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KR20210003811A - 백신 접종을 위한 신규 rsv rna 분자 및 조성물 - Google Patents

백신 접종을 위한 신규 rsv rna 분자 및 조성물 Download PDF

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KR20210003811A
KR20210003811A KR1020207033015A KR20207033015A KR20210003811A KR 20210003811 A KR20210003811 A KR 20210003811A KR 1020207033015 A KR1020207033015 A KR 1020207033015A KR 20207033015 A KR20207033015 A KR 20207033015A KR 20210003811 A KR20210003811 A KR 20210003811A
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KR
South Korea
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utr
rna
sequence
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variant
Prior art date
Application number
KR1020207033015A
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English (en)
Inventor
요하네스 루츠
수잔 라우치
레지나 하이덴라이히
벤자민 페취
Original Assignee
큐어백 아게
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Filing date
Publication date
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Abstract

본 발명은 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV) 감염 또는 그러한 감염과 관련된 장애의 치료 및/또는 예방에 사용하기에 적합한 인공 핵산, 특히 인공 RNA에 관한 것이다. 본 발명은 또한 장애 또는 질병을 치료 또는 예방하는 방법, 인공 RNA, 조성물 및 백신의 제1 및 제2 의학적 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 인공 RNA, 조성물 및 백신을 포함하는 키트, 특히 부품들로 이루어진 키트에 관한 것이다.

Description

백신 접종을 위한 신규 RSV RNA 분자 및 조성물
본 발명은 신규 인공 RNA 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
도입(Introduction)
본 발명은 호흡기 세포 융합 바이러스 (Respiratory syncytial virus; RSV) 감염 또는 그러한 감염과 관련된 장애의 치료 또는 예방에 사용하기에 적합한 인공 RNA에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 인공 RNA는 적어도 하나의 이종 비번역 영역 (untranslated region; UTR), 바람직하게는 3'-UTR 및/또는 5'-UTR, 및 RSV로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질, 특히 RSV 융합 (F) 단백질로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 코딩 영역을 포함한다. 상기 인공 RNA는 바람직하게는 상기 UTR 요소에 작동 가능하게 연결된 코딩 영역의 증가된 발현 효능을 특징으로 한다. 본 발명은 또한 중합체성 담체, 다가 양이온성 단백질 또는 펩티드, 또는 지질 나노 입자 (lipid nanoparticle; LNP)와 함께 상기 인공 RNA를 포함하는 조성물 및 백신에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 인공 RNA 또는 조성물 또는 백신을 포함하는 키트, 특히 부품들로 이루어진 키트(kit of parts)에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 장애 또는 질병을 치료 또는 예방하는 방법, 및 인공 RNA, 조성물, 또는 백신의 제1 및 제2 의학적 용도에 관한 것이다.
호흡기 세포 융합 바이러스(RSV)는 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae), 뉴모바이러스속(Pneumovirus)의 외피 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스다. 이는 생후 첫해 어린이들 사이에서 세기관지염과 폐렴의 가장 흔한 원인이다. RSV는 또한 중증 하기도 질환을 포함하는 반복적인 감염을 유발하며, 이는 특히 노인이나 심장, 폐 또는 면역 체계가 손상된 사람들 사이에서 발생할 수 있다. 현재 수동 면역화는 특히 미숙아, 기관지폐형성이상 또는 선천성 심장 질환이 있는 영아에서 RSV 감염으로 인한 심각한 질병을 예방하기 위해 사용된다.
권장되는 RSV 세기관지염(bronchiolitis)의 치료는 주로 호흡기 지원(respiratory support) 및 수분 공급(hydration)으로 이루어진다. 특이적인 항-바이러스 요법은 권장되지 않는다. 중성화 단일클론 항체 팔리비주맙(Palivizumab)은 심각한 감염에 대하여 높은 위험성이 있는 유아에서의 예방을 위하여 사용되나, 보편적으로 사용하기에는 너무 비싸고 비실용적이다. 현재, 허가/승인된 RSV 백신이 없으며, 안전하고 효과적인 RSV 백신을 개발하는 것은 전 세계적인 공중 보건의 우선순위이다.
1960년대에 백신 실험에서, 유아 및 어린이들은 포르말린-비활성화된 전체 비리온 RSV 제제(FIRSV) 또는 동등한 파라믹소바이러스(paramyxovirus) 제제(FIPIV)로 면역화되었다. FI-PIV로 면역화되고 이후 다음 RSV 시즌 동안 RSV에 의해 자연적으로 감염된 피험자의 5%가 입원하였고; FI-RSV로 면역화되고 이후 RSV로 감염된 사람들 가운데 80%가 입원했고, 2명의 어린이가 사망하였다. 백신 접종에 의한 RSV 감염의 이러한 증진은 RSV 감염에 대한 백신의 개발에 대한 특이적인 문제이다.
따라서, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 감염은 선진국에서 필요한, 가장 크게 남아있는 충족되지 않은 유아 백신이며 세계적으로 필요한, 중요한 충족되지 않은 유아 백신이다. 40년 이상의 노력은 인간을 위해 허가된 RSV 백신을 아직까지 초래하지 못하였다.
상기 언급된 인간 적용된 단일클론 항체 팔리비주맙에도 불구하고, 약독화된(live-attenuated) 백신 바이러스가 개발되었으며, 이는 강한 면역 반응을 유도하지만, 특정한 타겟 그룹(유아, 어린이, 노인 및 면역력이 약화된 환자)에서 사용되는 것은 추천되지 않는다. 또한, B-세포 에피토프를 갖는 RSV F 단백질을 발현하는 DNA 벡터는 중성화 항체의 생산을 유도하는 데 사용되었다. 이러한 맥락에서, WO2008/077527 및 WO96/040945는 백신으로써 사용하기 위한 RSV F 단백질을 암호화(encoding)하는 DNA 서열을 포함하는 벡터를 개시한다. 그러나, 백신으로써 DNA의 용도는 유전체(genome)에 원치 않는 삽입으로 인해 위험할 수 있으며, 기능성 유전자 및 암의 방해 또는 항-DNA 항체 형성으로 이어질 수 있다.
WO2015/024668는 융합 단백질 F, 당단백질 G, 짧은 소수성 단백질 SH, 매트릭스 단백질 M, 핵단백질(nucleoprotein) N, 큰 중합 효소 L, M2-1 단백질, M2-2 단백질, 인단백질(phosphoprotein) P, 비구조 단백질 NS1 또는 비구조 단백질 NS2로부터 선택된 RSV 항원성 펩티드 및 단백질을 암호화하는 RNA 서열 및 피내 투여에 적합한 프로타민-복합 RNA를 포함하는 항원성 조성물을 개시한다.
WO2017/070622는 당단백질 F 및 당단백질 G로부터 선택된 RSV 항원성 펩티드 및 단백질을 암호화하는 RNA를 포함하는 백신을 개시하며, 여기서 상기 RNA는 지질 나노 입자로 제형화된다.
상기 언급한 몇 가지 접근법을 제외하고, RSV 감염의 예방 또는 치료를 위한 효율적인 백신에 대한 충족되지 않은 의학적 요구가 남아 있다.
따라서, 특히 유아, 신생아, 임산부, 노인 및 면역 저하 환자에서 RSV 감염의 예방 또는 치료를 위한 백신으로 사용하기 위한 RSV의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 신규 인공 RNA 및 상기 RNA를 포함하는 조성물/백신을 제공하는 것이 근본적인 발명의 목적이다.
또한 RNA 기반 조성물 또는 백신이 다음과 같은 유리한 특징 중 일부를 갖는 것이 바람직하다:
- 주사 부위 (예: 근육)에서 RNA 구조물의 번역 개선
- 매우 낮은 투여량 및 투여 요법에서 암호화된 항원 펩티드 또는 단백질에 대한 RSV 항원 특이적 면역 반응의 매우 효율적인 유도.
- 모성 예방 접종 적합성
- 유아 및/또는 신생아 예방 접종 적합성
- 근육 내 투여에 적합성
- RSV 특이적 기능성 체액성 면역 반응 유도
- RSV 특이적 B-세포 기억 유도
- RSV에 대한 면역 보호의 더 빠른 발현
- RSV에 대한 유도 면역 반응의 수명
- RSV에 대한 광범위한 세포성 T 세포 반응 유도
- (국소적 및 일시적인) 염증 유발 환경 유도
- 백신 투여 후 전신(systemic) 사이토 카인 또는 케모카인 반응 유도 없음
- 내약성, 부작용 없음, 무독성,
- 예방 접종으로 인한 RSV 감염 증강 없음
- 백신의 유리한 안정성 특성
- RSV 백신 생산의 속도, 적응성, 단순성 및 확장성
상기 설명된 목적은 특허청구된 대상(claimed subject matter)에 의해 해결된다.
정의(Definitions)
명확성과 가독성을 위해 다음 정의가 제공된다. 이러한 정의에 대해 언급된 모든 기술적 특징은 본 발명의 각각 및 모든 실시예에서 읽을 수 있다. 추가 정의 및 설명은 이러한 실시예의 맥락에서 구체적으로 제공될 수 있다.
숫자의 맥락에서 백분율은 각 항목의 총수에 상대적인 것으로 이해되어야 한다. 다른 경우 및 문맥에서 달리 지시하지 않는 한, 백분율은 중량 백분율 (wt.-%)로 이해되어야 한다.
적응 면역 반응: 본 명세서에서 사용된 용어 "적응 면역 반응"은 당 업계의 통상의 기술자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 면역계(적응 면역계)의 항원-특이적 반응을 지칭하는 것으로 의도된다. 항원-특이성은 특정 병원체 또는 병원체에 감염된 세포에 맞는 반응의 생성을 허용한다. 이러한 맞춤형 반응을 장착하는 능력은 일반적으로 "기억 세포"(B 세포)에 의해 신체에서 유지된다. 본 발명의 맥락에서, 상기 항원은 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 인공 RNA 코딩 서열에 의해 제공된다.
항원: 본 명세서에 사용된 용어 "항원"은 당 업계의 통상의 기술자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 면역계, 바람직하게는 적응 면역계에 의해 인식될 수 있는 물질을 지칭하는 것으로 의도되며, 예를 들어 적응 면역 반응의 일부로서 항체 및/또는 항원 특이적 T 세포의 형성에 의해 항원 특이적 면역 반응을 촉발할 수 있다. 전형적으로, 항원은 MHC에 의해 T-세포에 제시될 수 있는 펩티드 또는 단백질이거나 이를 포함할 수 있다. 또한, 예를 들어 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 RSV F 단백질로부터 유래된 펩티드 또는 단백질의 단편, 변이체 및 유도체는 본 발명의 맥락에서 항원으로 이해된다. 본 발명의 맥락에서, 항원은 본 명세서에 명시된 바와 같이 제공된 인공 RNA의 번역 산물일 수 있다.
항원성 펩티드 또는 단백질: 용어 "항원성 펩티드 또는 단백질"은 당 업계의 통상의 기술자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 신체의 적응 면역계를 자극하여 적응 면역 반응을 제공할 수 있는 (항원성) 단백질/폴리단백질에서 유래된 펩티드, 단백질 (또는 폴리단백질)을 지칭하는 것으로 의도된다. 따라서 "항원성 펩티드 또는 단백질"은 그것이 유래된 단백질의 적어도 하나의 에피토프(본 명세서에 정의된 바와 같음) 또는 항원(본 명세서에 정의된 바와 같음)을 포함한다 (예를 들어, 본 발명의 맥락에서, RSV 펩티드 또는 단백질, 바람직하게는 RSV F 단백질 또는 이의 변이체).
인공 핵산: 본 명세서에서 사용되는 용어 "인공 핵산"은 당 업계의 통상의 기술자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 자연적으로 발생하지 않는 인공 핵산 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 인공 핵산은 DNA 분자, RNA 분자 또는 DNA 및 RNA 부분을 포함하는 하이브리드 분자일 수 있다. 전형적으로, 인공 핵산은 원하는 인공 뉴클레오티드 서열 (이종(heterologous) 서열)에 상응하도록 유전 공학 방법에 의해 설계 및/또는 생성될 수 있다. 이와 관련하여 인공 서열은 보통 자연적으로 발생하지 않을 수 있는 서열, 즉 적어도 하나의 뉴클레오티드에 의해 야생형 서열과 상이한 서열이다. 본 명세서에서 사용된 용어 “야생형"은 당 업계의 통상의 기술자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 자연에서 발생하는 서열을 지칭하고자 하는 것이다. 또한, 용어 "인공 핵산"은 "하나의 단일 분자"를 의미하는 것으로 제한되지 않지만, 전형적으로 본질적으로 동일한 분자의 총체(ensemble)를 포함하는 것으로 이해된다.
인공 RNA: 본 명세서에서 사용된 용어 "인공 RNA"는 자연적으로 발생하지 않는 RNA를 지칭하는 것으로 의도된다. 즉, 인공 RNA는 비천연 핵산 분자로 이해될 수 있다. 이러한 RNA 분자는 이의 개별 서열 (자연적으로 발생하지 않는, 예를 들어 G/C 함량 변형된 코딩 서열, UTR) 및/또는 다른 변형, 예를 들어 자연적으로 발생하지 않는 뉴클레오티드의 구조적 변형으로 인해 비천연적일 수 있다. 일반적으로, 인공 RNA는 원하는 인공 뉴클레오티드 서열 (이종 서열)에 상응하도록 유전 공학 방법에 의해 설계 및/또는 생성될 수 있다. 이러한 맥락에서 인공 RNA 서열은 일반적으로 자연적으로 발생하지 않을 수 있는 서열, 즉 적어도 하나의 뉴클레오티드에 의해 야생형 서열과 상이한 서열이다. 용어 "인공 RNA"는 "하나의 단일 분자"를 의미하는 것으로 제한되지 않지만, 전형적으로 본질적으로 동일한 분자의 총체(ensemble)를 포함하는 것으로 이해된다. 따라서, 이는 부분 표본 또는 샘플에 포함된 본질적으로 동일한 복수의 RNA 분자와 관련될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 본 발명의 RNA는 본 명세서에 정의된 인공 RNA이다.
양이온성: 특정 문맥에서 다른 의미가 명확하지 않는 한, 용어 "양이온성(cationic)"은 각각의 구조가 영구적이거나 영구적이 아닌 pH와 같은 특정 조건에 반응하여 양전하를 띠는 것을 의미한다. 따라서, 용어 "양이온성"은 "영구 양이온성(permanently cationic)"및 "양이온화 가능(cationisable)" 모두를 포함한다.
양이온화 가능: 본 명세서에서 사용된 용어 "양이온화 가능(cationisable)" 은 화합물, 또는 기(group) 또는 원자가 더 낮은 pH에서 양으로 하전되고 그 환경의 더 높은 pH에서 하전되지 않음을 의미한다. 또한 pH값을 결정할 수 없는 비수성 환경에서, 양이온화 가능한 화합물, 기 또는 원자는 높은 수소 이온 농도에서 양전하를 띠고 수소 이온의 낮은 농도 또는 활성에서 하전되지 않는다. 이는 양이온화 가능 또는 다가양이온화 가능 화합물의 개별 특성, 특히 pH 또는 수소 이온 농도가 하전되거나 하전되지 않는 각각의 양이온화 가능기 또는 원자의 pKa에 의존한다. 희석된 수성 환경에서, 양이온화 가능한 화합물, 기 또는 양전하를 갖는 원자의 분율은 당 업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 소위 헨더슨-하셀바흐(Henderson-Hasselbalch) 방정식을 사용하여 추정될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 화합물 또는 모이어티가 양이온화 가능한 경우, 약 1 내지 9, 바람직하게는 4 내지 9, 5 내지 8 또는 심지어 6 내지 8의 pH 값, 더욱 바람직하게는 9 이하, 8 이하, 또는 7 이하의 pH 값, 가장 바람직하게는 생리적 조건 하에서, 특히 생체 내 세포의 생리적 염 조건 하에서, 예를 들어 약 7.3 내지 7.4의 생리적 pH 값에서 양으로 하전되는 것이 바람직하다. 다른 구현예에서, 양이온화 가능한 화합물 또는 모이어티는 생리적 pH 값, 예를 들어 약 7.0-7.4의 주로 중성인 것이 바람직지만 더 낮은 pH 값에서 양전하를 띠게 된다. 일부 구현예에서, 양이온화 가능한 화합물 또는 모이어티에 대한 바람직한 pKa 범위는 약 5 내지 약 7이다.
코딩 서열/코딩 영역: 본 명세서에 사용된 용어 "코딩 서열" 또는 "코딩 영역" 및 상응하는 약어 "cds"는 당 업계의 통상의 기술자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 펩티드 또는 단백질로 번역될 수 있는 여러 뉴클레오티드 삼중체의 서열을 의미하는 것으로 의도된다. 본 발명의 맥락에서 코딩 서열은 바람직하게는 시작 코돈으로 시작하고 바람직하게는 정지 코돈으로 끝나는 3 개로 나눌 수 있는 다수의 뉴클레오티드로 구성된 RNA 서열이다.
조성물: 본 발명의 맥락에서, "조성물(composition)"은 특정 성분 (예를 들어, LNP와 관련된 본 발명의 인공 RNA)이 임의의 추가 성분과 일반적으로 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제가 함께 혼입될 수 있는 임의의 유형의 조성물을 지칭한다. 따라서, 상기 조성물은 분말 또는 과립과 같은 건조 조성물 또는 동결 건조 형태 또는 정제와 같은 고체 단위일 수 있다. 대안적으로, 상기 조성물은 액체 형태일 수 있고, 각 구성 성분은 용해되거나 분산된 (예를 들어, 현탁 또는 유화된) 형태로 독립적으로 혼입될 수 있다.
화합물: 본 명세서에서 사용되는, "화합물(compound)"은 본질적으로 동일한 화학 구조 및 특성을 갖는 분자로 구성된 물질(material)인 화학 물질(substance)을 의미한다. 저분자 화합물의 경우, 상기 분자는 일반적으로 원자 구성 및 구조적 구성과 관련하여 동일하다. 거대 분자 또는 고분자 화합물의 경우, 화합물의 분자는 매우 유사하지만 모든 분자가 반드시 동일하지는 않다. 예를 들어, 50개의 단량체 단위로 구성되도록 지정된 중합체의 세그먼트(segment)는 또한 예를 들어 48 또는 53개의 단량체 단위를 갖는 개별 분자를 포함할 수 있다.
유래된: 핵산과 관련하여, 즉 핵산에서 "유래된" 핵산에 대해, 본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 용어 "유래된(derived from)"은 핵산에서 유래된 핵산이 그것이 유래된 핵산과 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 55%, 바람직하게는 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 더욱더 바람직하게는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 더욱더 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 및 특히 바람직하게는 적어도 98%, 99% 서열 동일성을 공유함을 의미한다. 통상의 기술자는 서열 동일성이 전형적으로 동일한 유형의 핵산, 즉 DNA 서열 또는 RNA 서열에 대해 계산된다는 것을 알고 있다. 따라서, DNA가 RNA에서 "유래"되거나 RNA가 DNA에서 "유래"되는 경우, 첫 번째 단계에서 RNA 서열이 상응하는 DNA 서열로 변환되는 것으로 이해되거나 (특히 서열 전체에 걸쳐 우라실 (U)이 티미딘 (T)으로 대체됨), 또는 그 반대의 경우 DNA 서열이 상응하는 RNA 서열로 변환되는 것으로 이해된다 (특히 서열 전체에 걸쳐 티미딘 (T)이 우라실 (U)로 대체됨). 그 후, DNA 서열의 서열 동일성 또는 RNA 서열의 서열 동일성이 결정된다. 바람직하게는, 핵산에서 "유래된" 핵산은 또한, 예를 들어 RNA 안정성을 더욱 증가시키고/증가시키거나 단백질 생산을 연장 및/또는 증가시키기 위해 그것이 유래된 핵산과 비교하여 변형되는 핵산을 지칭한다. 예를 들어 그것이 유래된 핵산과 비교하여 RNA 안정성을 손상시키지 않는 그러한 변형이 바람직하다는 것은 말할 필요도 없다. 아미노산 서열(예를 들어, 항원성 펩티드 또는 단백질)과 관련하여 용어 "유래된"은 (다른) 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열(예를 들어, RSV F 단백질)이 그것이 유래된 아미노산 서열과 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 55%, 바람직하게는 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 더욱더 바람직하게는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 더욱더 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 및 특히 바람직하게는 적어도 98%, 99% 서열 동일성을 공유함을 의미한다.
따라서, 항원성 펩티드 또는 단백질이 RSV 융합 (F) 단백질 "유래"인 경우, 상기 RSV F 단백질 "유래"인 항원성 펩티드 또는 단백질은 RSV F 단백질의 변이체 또는 단편, 예를 들어 F0 (전장(full-length) 전구체), F-del, F0_DSCav1, F_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut3 (본 명세서에 명시된 바와 같음)을 나타낼 수 있다. 더욱이, 상기 RSV F 단백질(예를 들어, F0, F-del, F0_DSCav1, F_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut3) "유래" 항원성 펩티드 또는 단백질은 아미노산 서열이 다를 수 있으며, 상기 정의된 특정 비율의 동일성을 공유할 수 있다. 항원성 펩티드 또는 단백질이 "유래"될 수 있는 RSV F 단백질의 적합한 추가 예는 표 1에 제공된다.
에피토프: 본 명세서에 사용된 용어 "에피토프(epitope)" (또한 "항원 결정요인(determinant)"으로도 불림)는 당 업계의 통상의 기술자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 T 세포 에피토프 및 B 세포 에피토프를 지칭하는 것으로 의도된다. T 세포 에피토프 또는 항원성 펩티드 또는 단백질의 일부는 바람직하게는 약 6 내지 약 20 개 또는 그 이상의 아미노산 길이를 갖는, 예를 들어 MHC 클래스 I 분자에 의해 가공되고 제시된 절편, 바람직하게는 약 8 내지 약 10개의 아미노산, 예를 들어 8, 9, 또는 10개 (또는 심지어 11, 또는 12개의 아미노산)의 길이를 갖는, 또는 MHC 클래스 II 분자에 의해 가공되고 제시된 절편, 바람직하게는 약 13 내지 20개 또는 그 이상의 아미노산의 길이를 갖는 절편을 포함할 수 있고, 여기서 이들 절편은 아미노산 서열의 임의의 부분으로부터 선택될 수 있다. 이들 절편은 전형적으로 펩티드 절편 및 MHC 분자로 이루어진 복합체의 형태로 T 세포에 의해 인식되고, 즉 상기 절편은 일반적으로 그들의 고유한 형태로 인식되지 않는다. B 세포 에피토프는 전형적으로 바람직하게는 5 내지 15개의 아미노산을 가지며, 보다 바람직하게는 5 내지 12개의 아미노산을 가지며, 더욱더 바람직하게는 6 내지 9개의 아미노산을 갖는, 항체, 즉 이들의 고유 형태에 의해 인식될 수 있는 (천연) 단백질 또는 펩티드 항원의 외부 표면에 위치한 절편이다. 이러한 단백질 또는 펩타이드의 에피토프는 나아가 이러한 단백질 또는 펩타이드의 본 발명에서 언급된 임의의 변이체로부터 선택될 수 있다. 이러한 맥락에서 항원 결정요인은 본 발명에서 정의된 단백질 또는 펩티드의 아미노산 서열 내 불연속적이지만 3차원 구조 또는 연속적 또는 단일 폴리펩타이드 사슬로 구성된 직선 에피토프를 묶는(brought together) 본 발명에서 정의된 단백질 또는 펩티드의 단편(segment)으로 이루어진 형태적(conformational) 또는 불연속적 에피토프일 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 에피토프는 본 명세서에 명시된 바와 같이 제공된 인공 RNA의 번역 산물일 수 있다.
절편: 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 관련하여 본 명세서 전체에서 사용되는 용어 "절편(fragment)"은 전형적으로 예를 들어 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 전장(full-length) 서열의 더 짧은 부분일 수 있다. 따라서, 단편은 전형적으로 전장 서열 내의 상응하는 스트레치와 동일한 서열로 구성된다. 본 발명의 맥락에서 서열의 바람직한 단편은, 상기 단편이 유래된 분자 내의 엔티티(entity)의 연속적인 스트레치에 상응하는 뉴클레오티드 또는 아미노산과 같은 엔티티의 연속적인 스트레치로 구성되며, 이는 상기 단편이 유래된 전체(즉, 전장) 분자(예를 들어, RSV F 단백질)의 적어도 5%, 10%, 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 보다 바람직하게는 적어도 40%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 더욱더 바람직하게는 적어도 60%, 더욱더 바람직하게는 적어도 70%, 및 가장 바람직하게는 적어도 80%를 나타낸다. 단백질 또는 펩티드와 관련하여 본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 용어 "절편"은 전형적으로 본 명세서에 정의된 단백질 또는 펩티드 서열을 포함할 수 있으며, 이는 그의 아미노산 서열 (또는 그의 암호화된 핵산 분자)과 관련하여, 본래 (천연) 단백질 (또는 그의 암호화된 핵산 분자)의 아미노산 서열에 비해 N-말단 및/또는 C-말단 절단된 것이다. 이러한 절단(truncation)은 따라서 아미노산 수준 또는 상응하는 핵산 수준에서 발생할 수 있다. 본 발명에서 정의된 바와 같이 이러한 절편에 대한 서열 동일성은 따라서 바람직하게는 본 발명에서 정의된 전체 단백질 또는 펩티드 또는 이러한 단백질 또는 펩티드의 전체 (코딩) 핵산 분자를 지칭할 수 있다. 항원과 관련하여 이러한 절편은 약 6 내지 약 20개 또는 그 이상의 아미노산의 길이를 가질 수 있으며, 예를 들어 바람직하게 약 8 내지 약 10개, 예를 들어 8, 9, 또는 10개의 아미노산(또는 심지어 6, 7, 11, 또는 12개 아미노산)의 길이를 갖는 MHC 클래스 I 분자에 의해 가공 및 제시되는 절편, 또는 바람직하게 약 13개 또는 그 이상의 아미노산, 예를 들어 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 아미노산의 길이를 갖는 MHC 클래스 II 분자에 의해 가공 및 제시되는 절편을 가질 수 있으며, 여기서 이들 절편은 아미노산 서열의 임의의 부분으로부터 선택될 수 있다. 이러한 단편은 일반적으로 펩티드 단편과 MHC 분자로 구성된 복합체의 형태로 T 세포에 의해 인식되고, 즉, 상기 단편은 일반적으로 이들의 고유한 형태로 인식되지 않는다. 단백질 또는 펩티드의 절편(예를 들어, 항원과 관련됨)은 이들 단백질 또는 펩티드의 적어도 하나의 에피토프를 포함할 수 있다. 게다가 또한, 세포외 도메인, 세포내 도메인 또는 막관통(transmembrane) 도메인과 같은 단백질의 도메인 및 단백질의 짧거나 절단된 버전(versions) 은 단백질의 절편을 포함하는 것으로 이해될 수 있다.
이종: 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 관련하여 본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 용어 "이종(heterologous)" 또는 "이종 서열(heterologous sequence)"은 당 업계의 통상의 기술자에 의해 인식되고 이해될 서열(예를 들어, DNA, RNA, 아미노산)을 지칭하며, 다른 유전자, 다른 대립 유전자, 다른 종에서 유래한 서열을 의미하는 것으로 의도된다. 2개의 서열은 동일한 유전자 또는 동일한 대립 유전자에서 유도될 수 없는 경우 일반적으로 "이종"으로 이해된다. 즉, 이종 서열이 동일한 유기체로부터 유래될 수 있지만, 자연적으로 (자연적에서) 동일한 RNA 또는 동일한 단백질과 같은 동일한 핵산 분자에서 발생하지 않는다.
체액성 면역 반응: 용어 "체액성 면역(humoral immunity)" 또는 "체액성 면역 반응(humoral immune response)"은 당 업계의 통상의 기술자에 의해 이해되고 인식될 것이며, 예를 들어 B-세포 매개 항체 생산 및 선택적으로 항체 생산에 수반되는 보조 과정을 지칭하는 것으로 의도된다. 체액성 면역 반응은 전형적으로 예를 들어 Th2 활성화 및 사이토카인 생산, 배중심 형성 및 이소타입 전환, 친 화성 성숙 및 기억 세포 생성에 의해 특징화될 수 있다. 체액성 면역은 또한 일반적으로 항체의 이펙터 기능을 지칭할 수 있으며, 이는 병원체 및 독소 중화, 고전 보체 활성화, 및 식균 작용 및 병원체 제거의 옵소닌 촉진을 포함한다.
(서열의) 동일성: 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 관련하여 본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 용어 "동일성(identity)"은 당 업계의 통상의 기술자에 의해 이해되고 인식될 것이며, 예를 들어 두 서열이 동일한 백분율을 의미하는 것으로 의도된다. 두 서열이 동일한 백분율을 결정하기 위해, 예를 들어 본 명세서에 정의된 핵산 서열 또는 아미노산 서열, 바람직하게는 본 명세서에 정의된 인공 핵산 서열 또는 아미노산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열 그 자체로, 연속적으로 서로 비교하기 위해 서열을 정렬할 수 있다. 따라서, 예를 들어 첫 번째 서열의 위치는 두 번째 서열의 해당 위치와 비교될 수 있다. 상기 첫 번째 시퀀스의 위치가 두 번째 시퀀스의 위치에 있는 경우와 동일한 구성 요소 (잔기)에 의해 점유되면, 두 시퀀스는 이 위치에서 동일하다. 그렇지 않은 경우, 이 위치에서 시퀀스가 다르다. 첫 번째 서열과 비교하여 두 번째 서열에서 삽입이 발생하면, 추가 정렬을 허용하기 위해 첫 번째 서열에 갭을 삽입할 수 있다. 첫 번째 서열과 비교하여 두 번째 서열에서 결실이 발생하면, 추가 정렬을 허용하기 위해 두 번째 서열에 갭이 삽입될 수 있다. 두 서열이 동일한 비율은 동일한 위치 수를 하나의 서열에서만 차지하는 위치를 포함하는 총 위치 수로 나눈 함수이다. 두 서열이 동일한 비율은 수학적 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있다. 사용할 수 있는 수학적 알고리즘의 바람직한 예이지만 제한적이지 않은 예로는 상기 알고리즘이 BLAST 프로그램에 통합된 것이다. 본 프로그램에 의해 본 발명의 서열과 어느 정도 동일한 서열을 확인할 수 있다.
면역원, 면역원성: 용어 "면역원(immunogen)" 또는 "면역원성(immunogenic)"은 당 업계의 통상의 기술자에 의해 이해되고 인식될 것이며, 예를 들어 면역 반응을 자극/유도할 수 있는 화합물을 의미한다. 바람직하게는 면역원은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질이다. 본 발명의 의미에서 면역원은 본 명세서에 정의된 RSV로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드, 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 제공된 인공 핵산, 바람직하게는 RNA의 번역 산물이다. 일반적으로, 면역원은 적응 면역 반응을 유도한다.
면역 반응: 용어 "면역 반응(immune response)"은 당 업계의 통상의 기술자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 특정 항원에 대한 적응 면역계의 특정 반응 (소위 특이적 또는 적응 면역 반응) 또는 선천 면역계의 비특이적 반응 (소위 비특이적 또는 선천 면역 반응) 또는 이들의 조합을 지칭하는 것으로 의도된다.
면역계: 용어 "면역계(immune system)"는 당 업계의 통상의 기술자에 의해 이해되고 인식될 것이며, 예를 들어 감염으로부터 유기체를 보호할 수 있는 유기체의 시스템을 의미하는 것으로 의도된다. 병원체가 유기체의 물리적 장벽을 통과하여 이 유기체에 들어가면, 선천 면역계는 즉각적이지만 비특이적인 반응을 제공한다. 병원체가 이 선천적 반응을 회피하면, 척추동물은 두 번째 보호층인 적응 면역계를 갖게 된다. 여기에서 상기 면역계는 감염 동안 그 반응을 적응 시켜 병원체에 대한 인식을 향상시킨다.이 개선된 반응은 상기 병원체가 제거된 후에도 면역학적 기억의 형태로 유지되고, 상기 적응 면역계가 이 병원체를 만날 때마다 더 빠르고 강력한 공격을 할 수 있도록 한다. 이에 따르면, 상기 면역계는 선천 및 적응 면역계를 포함한다. 이 두 부분은 각각 소위 체액성 및 세포성 구성요소를 포함한다.
선천성 면역계: 용어 "선천성 면역계(innate immune system)" (비특이적(non-specific) 또는 비특이적(unspecific)면역계라고도 함)는 당 업계의 통상의 기술자에 의해 이해되고 인식될 것이며, 예를 들어 비특이적 방식으로 다른 유기체에 의한 감염으로부터 숙주를 방어하는 세포 및 메커니즘을 전형적으로 포함하는 시스템을 지칭하는 것으로 의도된다. 이것은 선천성 시스템의 세포가 일반적인 방식으로 병원체를 인식하고 반응할 수 있지만, 적응 면역계와 달리 숙주에게 오래 지속되거나 보호 면역을 부여하지 않음을 의미한다. 선천 면역계는 예를 들어, Toll-유사 수용체 (TLRs)의 리간드 또는 리포폴리사카라이드, TNF-알파, CD40 리간드, 또는 사이토카인, 모노카인, 림포카인, 인터루킨 또는 케모카인, IL-1 내지 IL-33, IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-베타, TNF-알파, 성장 인자, 및 hGH, 인간 Toll-유사 수용체의 리간드 (예를 들어, TLR1 내지 TLR10), 쥐과(murine) Toll-유사 수용체의 리간드, (예를 들어g, TLR1 내지 TLR13), NOD-유사 수용체의 리간드, RIG-I 유사 수용체의 리간드, 면역자극 핵산, 면역자극 RNA (isRNA), CpG-DNA, 항균제, 또는 항바이러스제와 같은 기타 보조 물질에 의해 활성화될 수 있다.
리피도이드 화합물: 단순히 리피도이드(lipidoid)라고도 하는, 리피도이드 화합물은 지질 유사 화합물, 즉 지질과 유사한 물리적 특성을 가진 양친성 화합물이다. 본 발명의 맥락에서 용어 지질은 리피도이드 화합물을 포함하는 것으로 간주된다.
1가 백신, 1가 조성물: 용어 "1가 백신(monovalent vaccine)", "1가 조성물(monovalent composition)" "1가 백신 (univalent vaccine)" 또는 "1가 조성물(univalent composition)"은 당 업계의 통상의 기술자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 바이러스로부터의 항원 하나만을 포함하는 조성물 또는 백신을 지칭하는 것으로 의도된다. 따라서, 상기 백신 또는 조성물은 단일 유기체에 대한 단일 항원을 암호화하는 단 하나의 RNA 종을 포함한다. 용어 "1가 백신"은 단일 원자가에 대한 면역화를 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 1가 RSV 백신 또는 조성물은 하나의 특정 RSV (예를 들어, RSV F)로부터 유래된 하나의 단일 항원 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 인공 RNA를 포함할 것이다.
핵산: 용어 "핵산(nucleic acid)" 또는 "핵산 분자(nucleic acid molecule)"는 당 업계의 통상의 기술자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 핵산 성분을 포함하는, 바람직하게는 이로 이루어지는 분자를 의미하는 것으로 의도된다. 상기 용어 핵산 분자는 바람직하게는 DNA 또는 RNA 분자를 의미한다. 이는 바람직하게는 용어 폴리뉴클레오티드와 동의어로 사용된다. 바람직하게는, 핵산 또는 핵산 분자는 당/인산-백본(backbone)의 포스포디에스테르 결합에 의해 서로 공유결합된 뉴클레오티드 단량체를 포함하거나 이로 이루어진 중합체이다. 용어 "핵산 분자"는 또한 본 명세서에 정의된 염기 변형, 당 변형 또는 백본 변형 DNA 또는 RNA 분자와 같은 변형된 핵산 분자를 포함한다.
핵산 서열/ RNA 서열/ 아미노산 서열: 용어 "핵산 서열(nucleic acid sequence)", "RNA 서열(RNA sequence)" 또는 "아미노산 서열(amino acid sequence)"은 당 업계의 통상의 기술자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 각각의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 연속의 특정 및 개별 순서를 지칭하는 것으로 의도된다.
영구 양이온성: 본 명세서에서 사용된 용어 "영구 양이온성(permanently cationic)"은 당 업계의 통상의 기술자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 각각의 화합물 또는 기 또는 원자가 임의의 pH 값 또는 그 환경의 수소 이온 활동에서 양으로 하전됨을 의미한다. 일반적으로, 상기 양전하는 4 차 질소 원자의 존재로 인해 발생한다. 화합물이 다수의 이러한 양전하를 운반하는 경우, 영구 양이온성의 하위 범주인 영구 다가양이온성으로 지칭될 수 있다.
약제학적 유효량: 용어 "약제학적 유효량(pharmaceutically effective amount)" 또는 "유효량(effective amount)"은 당 업계의 통상의 기술자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 화합물 (예를 들어, 본 발명의 인공 RNA)의 양을 지칭하는 것으로 의도되고, 이는 본 발명의 맥락에서 (예를 들어, 본 명세서에 정의된 항원성 펩티드, 단백질, 다단백질(polyprotein)에 대한) 면역 반응과 같은 약제학적 효과를 유도하기에 충분하다.
다가/복합 다가 백신, 다가/복합 다가 조성물: 용어 "다가(polyvalent) 백신", "다가(polyvalent) 조성물" "복합 다가(multivalent) 백신" 또는 "복합 다가(multivalent) 조성물"은 당 업계의 통상의 기술자에 의해 이해되고 인식될 것이며, 예를 들어 하나 이상의 바이러스 균주로부터의 항원을 포함하거나 동일한 바이러스의 상이한 항원, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 조성물 또는 백신을 지칭하는 것으로 의도된다. 상기 용어는 상기 백신 또는 조성물이 하나 이상의 원자가를 가지고 있음을 설명한다. 본 발명의 맥락에서, 다가 RSV 백신은 몇 가지 상이한 RSV 균주로부터 유래된 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 인공 RNA를 포함하거나 동일한 RSV 균주로부터의 상이한 항원을 암호화하는 인공 RNA 또는 이들의 조합을 포함하는 백신을 포함할 것이다. 바람직한 구현예에서, 다가 RSV 백신 또는 조성물은 적어도 하나의 RSV의 상이한 항원성 펩티드 또는 단백질 (예를 들어 RSV F 및 RSV M 또는 RSV F 및 RSV N) 을 암호화하는 하나 이상, 바람직하게는 2, 3, 4개 또는 훨씬 더 상이한 인공 RNA 종을 포함한다. 다가 mRNA 백신을 생산하는 방법은 PCT 출원 PCT/EP2016/082487 또는 공개된 특허 출원 WO2017/1090134A1에 개시되어 있다.
안정화된 핵산 분자" 또는 "안정화된 RNA: 용어 "안정화된 핵산 분자(stabilized nucleic acid molecule)" 또는 "안정화된 RNA(stabilized RNA)"는 변형되지 않은 핵산 분자보다 예를 들어, 환경적 요인 또는 효소 분해, 예를 들어 엑소- 또는 엔도뉴클레아제 분해에 의한 분해(disintegration) 또는 분해(degradation)에 더 안정하도록 변형된 핵산 분자, 바람직하게는 RNA 분자를 지칭한다. 바람직하게는, 본 발명의 맥락에서 안정화된 핵산 분자, 예를 들어 안정화된 RNA는 원핵 또는 진핵 세포와 같은 세포, 바람직하게는 인간 세포와 같은 포유동물 세포에서 안정화된다. 안정화 효과는 또한 예를 들어, 안정화된 핵산 분자를 포함하는 약제학적 조성물을 위한 제조 공정에서, 예를 들어 완충액 등의 세포 외부에서 발휘될 수 있다.
T-세포 반응: 본 명세서에 사용되는 용어 "세포성 면역" 또는 "세포성 면역 반응" 또는 "세포성 T-세포 반응"은 당 업계의 통상의 기술자에 의해 이해되고 인식될 것이며, 예를 들어 대식세포, 자연 살해 세포(NK), 항원 특이적 세포독성 T-림프구의 활성화, 및 항원에 대한 반응으로 다양한 사이토카인의 방출을 의미한다. 보다 일반적인 용어로, 세포성 면역은 항체가 아니라 면역계 세포의 활성화에 기반한다. 전형적으로, 세포성 면역 반응은 예를 들어 세포, 예를 들어 수지상 세포 또는 다른 세포와 같은 특정 면역 세포에서 세포 자멸을 유도할 수 있는 항원-특이적 세포 독성 T-림프구를 활성화하여 이들 표면에 외래 항원의 에피토프를 표시함으로써 특성화될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 상기 항원은 적절하게는 T-세포 반응을 유도하는 RSV로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 인공 RNA에 의해 제공된다. 본 발명의 인공 RNA, 조성물, 백신은 RSV F 항원에 대한 세포성 T-세포 반응을 유도한다.
(서열의) 변이체: 핵산 서열과 관련해서 본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 용어 "변이체(variant)"는 당 업계의 통상의 기술자에 의해 이해되고 인식될 것이며, 예를 들어 핵산 서열의 기초를 형성하는 핵산 서열의 변이체를 지칭하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 변이체 핵산 서열은 변이가 유도된 핵산 서열에 비해 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 결실, 삽입, 첨가 및/또는 치환을 보일 수 있다. 바람직하게, 핵산 서열의 변이체는 변이가 유도된 핵산 서열과 적어도 40%, 바람직하게 적어도 50%, 더욱 바람직하게 적어도 60%, 더욱 바람직하게 적어도 70%, 더욱더 바람직하게 적어도 80%, 더욱더 바람직하게 적어도 90%, 가장 바람직하게 적어도 95% 동일하다. 바람직하게, 상기 변이체는 기능적 변이체이다. 핵산 서열의 "변이체"는 이러한 핵산 서열의 10, 20, 30, 50, 75 또는 100개 뉴클레오티드의 스트레치에 걸쳐 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 뉴클레오티드 상동성을 가질 수 있다.
단백질 또는 펩티드와 관련해서 본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 용어 "변이체"는 당 업계의 통상의 기술자에 의해 이해되고 인식될 것이며, 예를 들어 하나 이상의 돌연변이(들), 예를 들어 하나 이상의 치환, 삽입 및/또는 결실된 아미노산(들)과 같은 하나 이상의 돌연변이(들)에서 원래 서열과 다른 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드 변이체를 지칭하는 것으로 의도된다. 바람직하게는, 이들 단편 및/또는 변이체는 전장 천연 단백질과 비교하여 동일한 생물학적 기능 또는 특이 활성, 예를 들어 그의 특정 항원 특성을 갖는다. 본 발명의 맥락에서 정의된 단백질 또는 펩티드의 "변이체"는 천연, 즉 돌연변이되지 않은 생리적 서열과 비교하여 보존적 아미노산 치환(들)을 포함할 수 있다. 이들 아미노산 서열 및 이들의 코딩 뉴클레오티드 서열은 특히 본 명세서에 정의된 용어 변이체에 속한다. 동일한 부류에서 유래한 아미노산이 서로 교환되는 치환을 보존적 치환이라고 한다. 특히, 이들은 지방족 곁사슬, 양으로 또는 음으로 하전된 곁사슬, 곁사슬 또는 아미노산의 방향족기, 수소 가교로 들어갈 수 있는, 예를 들어 하이드록실기를 갖는 곁사슬을 갖는 아미노산이다. 이것은 예를 들어 극성 곁사슬을 갖는 아미노산이 유사한 극성 곁사슬을 갖는 다른 아미노산으로 대체되거나, 예를 들어 소수성 곁사슬을 특징으로 하는 아미노산이 유사한 소수성 곁사슬을 갖는 다른 아미노산으로 치환됨을 의미한다 (예를 들어, 세린(트레오닌)에서 트레오닌(세린) 또는 류신(이소류신)에서 이소류신(류신)). 삽입 및 치환은 특히 3차원 구조에 변형을 일으키지 않거나 결합 영역에 영향을 미치지 않는 서열 위치에서 가능하다. 삽입(들) 또는 삭제(들)에 의한 3차원 구조의 변형은 예를 들어 CD 스펙트럼 (원형 이색성 스펙트럼)을 사용하여 쉽게 결정될 수 있다. 단백질 또는 펩티드의 "변이체"는 이러한 단백질 또는 펩티드의 10, 20, 30, 50, 75 또는 100개 아미노산의 스트레치에 걸쳐 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 아미노산 동일성을 가질 수 있다. 바람직하게는, 단백질의 변이체는 단백질의 기능적 변이체를 포함하며, 이는 상기 변이체가 유래된 단백질과 동일한 효과 또는 기능을 발휘함을 의미한다.
3'-비번역 영역, 3'-UTR 요소, 3'-UTR: 용어 "3'-비번역 영역" 또는 "3'-UTR 요소"는 당 업계의 통상의 기술자에 의해 이해되고 인식될 것이며, 예를 들어 코딩 서열의 3' (즉, "하류(downstream"))에 위치하고 전형적으로 단백질로 번역되지 않는 핵산 분자의 일부를 지칭하는 것으로 의도된다. 일반적으로, 3'-UTR은 mRNA의 코딩 서열(cds) 및 폴리(A) 서열 사이에 위치한 mRNA의 일부이다. 본 발명의 맥락에서, 용어 3'-UTR은 또한 인공 RNA가 전사되는 DNA 주형에서 암호화되지 않지만, 성숙동안 전사 후에 추가되는 요소, 예를 들어 폴리(A) 서열을 포함할 수 있다.
5'-비번역 영역, 5'-UTR 요소, 5'-UTR: 용어 "5'-비번역 영역 (5'-UTR)"은 당 업계의 통상의 기술자에 의해 이해되고 인식될 것이며, 예를 들어 코딩 서열의 5' (즉, "상류(upstream"))에 위치하고 단백질로 번역되지 않는 핵산 분자의 일부를 지칭하는 것으로 의도된다. 일반적으로, 5'-UTR은 mRNA의 코딩 서열의 5'에 위치하는 메신저 RNA (mRNA)의 특정 부분으로 이해된다. 일반적으로, 상기 5'-UTR은 전사 시작 부위에서 시작하여 코딩 서열의 개시 코돈 전 하나의 뉴클레오티드에서 끝난다. 바람직하게는, 상기 5'-UTR은 20, 30, 40 또는 50개 이상의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 상기 5'-UTR은 조절 요소라고도 불리는 유전자 발현을 제어하기 위한 요소를 포함할 수 있다. 이러한 조절 요소는 예를 들어 리보솜 결합 부위일 수 있다. 상기 5'-UTR은 예를 들어 5'-캡(cap)을 추가하여 전사 후 변형될 수 있다.
5'-말단 올리고피리미딘 트랙트 (TOP), TOP-UTR: 용어 "5'-말단 올리고피리미딘 트랙트 (5'-terminal oligopyrimidine tract) (TOP)"는 핵산 분자의 5'-말단 영역, 예를 들어 특정 mRNA 분자의 5'-말단 영역 또는 특정 유전자의 기능적 엔티티, 예를 들어 전사된 영역의 5'-말단 영역에 위치한 피리미딘 뉴클레오티드의 스트레치로 이해되어야 한다. 상기 서열은 일반적으로 전사 시작 부위에 상응하는 시티딘으로 시작하고, 일반적으로 약 3 내지 30개의 피리미딘 뉴클레오티드의 스트레치로 이어진다. 예를 들어, 상기 TOP은 3-30개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 피리미딘 스트레치 및 따라서 5'-TOP는 TOP의 하류에 위치한 첫 번째 퓨린 뉴클레오티드에서 하나의 뉴클레오티드 5'를 종료한다. 5'-말단 올리고피리미딘 트랙트를 포함하는 메신저 RNA를 종종 TOP mRNA라고 한다. 따라서 이러한 메신저 RNA를 제공하는 유전자를 TOP 유전자라고한다. 용어 "TOP 모티프" 또는 "5'-TOP 모티프"는 상기 정의된 바와 같이 5'-TOP에 상응하는 핵산 서열로 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명의 맥락에서 TOP 모티프는 바람직하게는 3-30개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 피리미딘 뉴클레오티드의 스트레치이다. 바람직하게는, TOP-모티프는 적어도 3개의 피리미딘 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 4개의 피리미딘 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 5개의 피리미딘 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 적어도 6개의 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 적어도 7개의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 적어도 8개의 피리미딘 뉴클레오티드로 구성되며, 여기서 상기 피리미딘 뉴클레오티드의 스트레치는 바람직하게는 시토신 뉴클레오티드로 5'- 말단에서 시작한다. TOP 유전자 및 TOP mRNA에서, 상기 TOP 모티프는 바람직하게는 전사 시작 부위와 함께 5'-말단에서 시작하고 상기 유전자 또는 mRNA의 첫 번째 퓨린 잔기에서 하나의 뉴클레오티드 5'를 끝낸다. 본 발명의 의미에서 TOP 모티프는 바람직하게는 5'-UTR을 나타내는 서열의 5'-말단 또는 5'-UTR을 암호화하는 서열의 5'-말단에 위치한다. 따라서, 바람직하게는 3개 이상의 피리미딘 뉴클레오티드의 스트레치는 이 스트레치가 인공 핵산의 5'-UTR 요소, 또는 본 명세서에 기재된 TOP 유전자의 5'-UTR에서 유래된 핵산 서열의 각 서열의 5'-말단에 위치하는 경우, 본 발명의 의미에서 "TOP 모티프"라고 불린다. 즉, 5'-UTR 또는 5'-UTR 요소의 5'-말단에 위치하지 않고 5'-UTR 또는 5'-UTR 요소 내의 어느 곳에도 위치하지 않는 3개 이상의 피리미딘 뉴클레오티드의 스트레치는 바람직하게는 "TOP 모티프"로 지칭되지 않는다. 일부 구현예에서, TOP 유전자의 5'-UTR에서 유래된 5'-UTR 요소의 핵산 서열은 그것이 유래된 유전자 또는 RNA의 개시 코돈(예: A(U/T)G)의 상류 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10에 위치한 뉴클레오티드로 3'-말단에서 종결된다. 따라서 상기 5'-UTR 요소는 단백질 코딩 서열의 어떤 부분도 포함하지 않는다. 따라서, 바람직하게는 적어도 하나의 핵산 서열, 특히 RNA 서열의 유일한 단백질 코딩 부분은 코딩 서열에 의해 제공된다.
발명에 관한 간단한 설명(Short description of the invention)
본 발명은 본 발명의 인공 RNA에 의해 암호화된 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV) F 단백질로부터 유래된 하나 이상의 펩티드 또는 단백질이 포유동물 세포에서 효율적으로 발현될 수 있다는 본 발명자의 놀라운 발견에 기초한다. 더욱 예상치 못하게도, 본 발명자들은 본 발명의 인공 RNA가 예를 들어 목화나무쥐(cotton rat)에서 특정 기능 및 보호 면역 반응을 유도할 수 있음을 보여주었다 (예를 들어 실시예 2, 3 참조). RSV F 항원 설계의 다양한 최적화를 통해, 상기 면역 반응을 더욱 향상시킬 수 있다. 또한, 인공 핵산 RNA에 의해 암호화된 RSV F 항원의 발현은 적합한 이종 5' 비번역 영역 (UTR) 및 적합한 이종 3' 비번역 영역 (UTR)을 선택함으로써 증가될 수 있다 (예: 실시예 4 참조). 유리하게는, 유리한 3'-UTR/5'-UTR 조합을 포함하는 본 발명의 상기 인공 RNA는 암호화된 RSV F에 대해 매우 효율적인 항원-특이적 면역 반응을 유도한다. 또한, 지질 나노 입자 (LNP)에 포함된 본 발명의 인공 RNA는 매우 낮은 투여량 및 투여 요법에서 RSV F에 대한 항원-특이적 면역 반응을 매우 효율적으로 유도한다 (예를 들어, 실시예 3 참조). 추가로, 예를 들어, 실시예 8 및 실시예 12는 추가 항원을 암호화하는 추가 인공 RNA를 포함하는 조성물/백신을 제공하며, 여기서 추가 항원을 암호화하는 상기 인공 RNA는 T-세포 반응을 적절하게 유도하거나 향상시키고 잠재적인 RSV 백신의 중요한 전제조건으로 고려되는 Th1-편향 면역 반응을 초래한다 (Th2-편향 반응은 동물 모델에서 향상된 호흡기 질환 (ERD)과 관련 있다). 더욱이 상기 조성물은 T-세포 반응을 유도하는 데 적합하다. 따라서, 상기 인공 RNA 및 본 발명의 상기 인공 RNA를 포함하는 조성물/백신은 포유류 대상체에서 RSV F에 대한 면역 반응을 유도하는 데 적합하다. 따라서 상기 인공 RNA 및 상기 인공 RNA를 포함하는 조성물/백신은 백신, 예를 들어 인간 백신, 예를 들어 임산부 또는 유아용 백신으로 사용하기에 적합하다.
제1 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 5' 비번역 영역 (UTR) 및/또는 적어도 하나의 3' 비번역 영역 (UTR), 및 RSV F 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 상기 3'-UTR 및/또는 5'-UTR에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 인공 핵산, 바람직하게는 인공 RNA를 제공한다.
바람직한 구현예에서, 상기 인공 RNA는 ALB7 유전자, 알파글로빈 유전자, PSMB3, CASP1, COX6B1, GNAS, NDUFA1 및 RPS9로부터 선택된 유전자, 또는 이들 유전자 중 어느 하나의 상동체, 단편 또는 변이체로부터 선택된 유전자의 3'-UTR에서 유래된 적어도 하나의 핵산 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 상기 인공 RNA는 RPL32 유전자, HSD17B4, ASAH1, ATP5A1, MP68, NDUFA4, NOSIP, RPL31, SLC7A3, TUBB4B 및 UBQLN2로부터 선택된 유전자, 또는 이들 유전자 중 어느 하나의 상동체, 단편 또는 변이체로부터 선택된 유전자의 5'-UTR에서 유래된 적어도 하나의 핵산 서열을 포함한다.
적합하게는, 본 발명의 인공 RNA는 a-1 (HSD17B4/PSMB3), a-2 (Ndufa4/PSMB3), a-3 (SLC7A3/PSMB3), a-4 (NOSIP/PSMB3), a-5 (MP68/PSMB3), b-1 (UBQLN2/RPS9), b-2 (ASAH1/RPS9), b-3 (HSD17B4/RPS9), b-4 (HSD17B4/CASP1), b-5 (NOSIP/COX6B1), c-1 (NDUFA4/RPS9), c-2 (NOSIP/NDUFA1), c-3 (NDUFA4/COX6B1), c-4 (NDUFA4 /NDUFA1), c-5 (ATP5A1/PSMB3), d-1 (Rpl31/PSMB3), d-2 (ATP5A1/CASP1), d-3 (SLC7A3/GNAS), d-4 (HSD17B4/NDUFA1), d-5 (Slc7a3/Ndufa1), e-1 (TUBB4B/RPS9), e-2 (RPL31/RPS9), e-3 (MP68/RPS9), e-4 (NOSIP/RPS9), e-5 (ATP5A1/RPS9), e-6 (ATP5A1/COX6B1), f-1 (ATP5A1/GNAS), f-2 (ATP5A1/NDUFA1), f-3 (HSD17B4/COX6B1), f-4 (HSD17B4/GNAS), f-5 (MP68/COX6B1), g-1 (MP68/NDUFA1), g-2 (NDUFA4/CASP1), g-3 (NDUFA4/GNAS), g-4 (NOSIP/CASP1), g-5 (RPL31/CASP1), h-1 (RPL31/COX6B1), h-2 (RPL31/GNAS), h-3 (RPL31/NDUFA1), h-4 (Slc7a3/CASP1), h-5 (SLC7A3/COX6B1), i-1 (SLC7A3/RPS9), i-2 (RPL32/ALB7), 또는 i-3 (알파-글로빈 유전자)에서 선택된 3'-UTR 및 5'-UTR에 작동 가능하게 연결된 RSV F 단백질로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하고, 여기서 a-1 (HSD17B4/PSMB3), a-4 (NDUFA4/PSMB3), c-1 (NDUFA4/RPS9), e-4 ( NOSIP/RPS9), g-2 (NDUFA4/CASP1), i-2 (RPL32/ALB7), 또는 i-3 (알파-글로빈)이 특히 바람직하다.
RSV F 단백질로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질은 전장 F 단백질("F0"로 지칭됨, 아미노산(aa) 1-574) 또는 결실된 C-말단을 갖는 F 단백질("F-del"로 지칭됨, aa 1-553), 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다.
적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질은 추가로 항원을 전-형태(pre-conformation) 상태 /전-융합 형태(pre-fusion conformation)에서 안정화시키는 돌연변이, 바람직하게는 DSCav1 돌연변이 (S155C, S290C, S190F, 및 V207L) 또는 이의 단편 또는 변이체, 또는 기능적 변이체를 포함할 수 있다 ("DSCav1", 예를 들어 "F0_DSCav1" 또는 "F-del_DSCav1"로 지칭됨).
상기 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질은 단백질의 안정성을 향상시키기 위해 링커 (GS)를 통해 연결된 성숙 F의 2 개의 서브유닛 F1 및 F2를 단일 사슬로 포함하는 융합 단백질일 수 있다 (F(1-103)-GS-F(145-574); F(1-103)-GS-F(145-553)).
성숙 F의 2개의 서브유닛을 단일 사슬로 포함하는 단백질("F2-링커-F1"로 지칭됨), 예를 들어 (F(1-103)-GS-F(145-574); F(1-103)-GS-F(145-553))는 DSCav1 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다 (본 명세서에서 "mut0"로 지칭됨).
성숙 F의 2개의 서브유닛을 단일 사슬로 포함하는 단백질 ("F2-링커-F1"로 지칭됨)은 DSCav1 돌연변이에 추가적으로 프로토머 이황화 결합을 촉진하는 하나 이상의 추가 돌연변이를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 돌연변이는 (S46G, A149C, S215P, Y458C, K465Q; 본 명세서에서 "mut1"로 지칭됨), (S46G, E92D, A149C, S215P, Y458C, K465Q; 본 명세서에서 "mut2"로 지칭됨), 또는 (S46G, N67I, E92D, A149C, S215P, Y458C, K465Q; 본 명세서에서 "mut3"로 지칭됨), (A149C, Y458C; 본 명세서에서 "mut4"로 지칭됨), (N183GC, N428C; 본 명세서에서 "mut5"로 지칭됨), (Q98C, Q361C, S46G, E92D, L95M, S215P, I217P, I221M, R429K, K465Q; 본 명세서에서 "mut6"로 지칭됨), (Q98C, Q361C, L95M, I221M, R429K; 본 명세서에서 "mut7"로 지칭됨), 또는 (N183GC, N428C, S46G, N67I, E92D, S215P, K465Q; 본 명세서에서 "mut8"로 지칭됨)로부터 선택되거나 또는 이러한 돌연변이의 단편 또는 변이체, 또는 기능적 변이체로부터 선택된다.
본 발명의 인공 RNA에 의해 암호화되는 RSV F 단백질로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질은 F0, F-del, F0_DSCav1, F_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F_DSCav1_mut3, F_DSCav1_mut4, F_DSCav1_mut5, F_DSCav1_mut6, F_DSCav1_mut7, F_DSCav1_mut8, F_DSCav1_mut0, F-del_DSCav1, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut4, F-del_DSCav1_mut5, F-del_DSCav1_mut6, F-del_DSCav1_mut7, F-del_DSCav1_mut8, F-del_DSCav1_mut0가 바람직하게 선택될 수 있다.
상기 적어도 하나의 코딩 서열은 서열 번호: 68, 483, 898, 1267, 1636, 2005, 2374, 2743, 3112, 3481, 3850, 4219, 4588, 4957, 5326, 5695, 6064, 6433, 6802, 7171, 7540, 7909, 8279-9683, 11726, 12095, 12464, 12833, 13940, 14309, 14678, 15047, 15416, 15785, 13202, 13571, 16154, 16523, 16892, 17261, 17630, 17999, 18368, 18737, 19106, 19475 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체 중 어느 하나와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 암호화할 수 있다.
바람직하게는, 상기 인공 RNA는 서열 번호: 69-77, 484-492, 899-906, 1268-1275, 1637-1644, 2006-2013, 2375-2382, 2744-2751, 3113-3120, 3482-3489, 3851-3858, 4220-4227, 4589-4596, 4958-4965, 5327-5334, 5696-5703, 6065-6072, 6434-6441, 6803-6810, 7172-7179, 7541-7548, 7910-7917, 21363-21384, 11727-11734, 12096-12103, 12465-12472, 12834-12841, 13941-13948, 14310-14317, 14679-14686, 15048-15055, 15417-15424, 15786-15793, 13203-13210, 13572-13579, 16155-16162, 16524-16531, 16893-16900, 17262-17269, 17631-17638, 18000-18007, 18369-18376, 18738-18745, 19107-19114, 19476-19483. 21389-21410 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체 중 어느 하나와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코딩 서열 을 포함할 수 있다.
상기 인공 RNA는 C 최대화된 코딩 서열, CAI 최대화된 코딩 서열, 인간 코돈 사용 적합(adapted) 코딩 서열, G/C 함량 변형된 코딩 서열, 및 G/C 최적화된 코딩 서열, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 코돈 변형 코딩 서열을 포함할 수 있다.
상기 인공 RNA는 mRNA, 바이러스 RNA,자가 복제(self-replicating) RNA, 원형 RNA 또는 레플리콘(replicon) RNA일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 인공 RNA는 mRNA이다.
상기 인공 RNA, 바람직하게는 mRNA는 캡 구조, 폴리(A)서열, 폴리(C)서열, 히스톤-스템 루프, 및/또는 3'-말단 서열 요소로부터 선택된 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 인공 RNA는 바람직하게는 서열 번호 : 78-482, 11735-12094, 21415-21417, 21561-21563, 21489, 21490, 21635, 21636 또는 임의의 이들의 단편 또는 변이체(F0를 암호화함), 서열 번호: 493-897, 12104-12463, 21418-21420, 21564-21566, 21491, 21492, 21637, 21638 또는 임의의 이들의 단편 또는 변이체(F-del를 암호화함), 서열 번호: 907-1266, 12473-12832, 21421-21423, 21567-21569, 21493-21495, 21639-21641 또는 임의의 이들의 단편 또는 변이체(F0_DSCav1를 암호화함), 서열 번호: 1276-1635, 8278, 12842-13201, 21424-21426, 21570-21572, 21496-21498, 21642-21644 또는 임의의 이들의 단편 또는 변이체(F-del_DSCav1를 암호화함), 서열 번호: 1645-2004, 13949-14308, 21433-21435, 21579-21581, 21505-21507, 21651-21653 또는 임의의 이들의 단편 또는 변이체(F_DSCav1_mut1를 암호화함), 서열 번호: 2014-2373, 14318-14677, 21436-21438, 21582-21584, 21508-21510, 21654-21656 또는 임의의 이들의 단편 또는 변이체(F-del_DSCav1_mut1를 암호화함), 서열 번호: 2383-2742, 14687-15046, 21439-21441, 21585-21587, 21511-21513, 21657-21659 또는 임의의 이들의 단편 또는 변이체(F_DSCav1_mut2를 암호화함), 서열 번호: 2752-3111, 15056-15415, 21442-21444, 21588-21590, 21514-21516, 21660-21662 또는 임의의 이들의 단편 또는 변이체(F-del_DSCav1_mut2를 암호화함), 서열 번호: 3121-3480, 15425-15784, 21445-21447, 21591-21593, 21517-21519, 21663-21665 또는 임의의 이들의 단편 또는 변이체(F_DSCav1_mut3를 암호화함), 서열 번호: 3490-3849, 15794-16153, 21448-21450, 21594-21596, 21520-21522, 21666-21668 또는 임의의 이들의 단편 또는 변이체(F-del_DSCav1_mut3를 암호화함), 서열 번호: 3859-4218, 13211-13570, 21427-21429, 21573-21575, 21499-21501, 21645-21647 또는 임의의 이들의 단편 또는 변이체(F_DSCav1_mut0를 암호화함), 서열 번호: 4228-4587, 13580-13939, 21430-21432, 21576-21578, 21502-21504, 21648-21650 또는 임의의 이들의 단편 또는 변이체(F-del_DSCav1_mut0를 암호화함), 서열 번호: 4597-4956, 16163-16522, 21451-21453, 21597-21599, 21523-21525, 21669-21671 또는 임의의 이들의 단편 또는 변이체(F_DSCav1_mut4를 암호화함), 서열 번호: 4966-5325, 16532-16891, 21454-21456, 21600-21602, 21526-21528, 21672-21674 또는 임의의 이들의 단편 또는 변이체(F-del_DSCav1_mut4를 암호화함), 서열 번호: 5335-5694, 16901-17260, 21457-21459, 21603-21605, 21529-21531, 21675-21677 또는 임의의 이들의 단편 또는 변이체(F_DSCav1_mut5를 암호화함), 서열 번호: 5704-6063, 17270-17629, 21460-21462, 21606-21608, 21532-21534, 21678-21680 또는 임의의 이들의 단편 또는 변이체(F-del_DSCav1_mut5를 암호화함), 서열 번호: 6073-6432, 17639-17998, 21463-21465, 21609-21611, 21535-21537, 21681-21683 또는 임의의 이들의 단편 또는 변이체(F_DSCav1_mut6를 암호화함), 서열 번호: 6442-6801, 18008-18367, 21466-21468, 21612-21614, 21538-21540, 21684-21686 또는 임의의 이들의 단편 또는 변이체(F-del_DSCav1_mut6를 암호화함), 서열 번호: 6811-7170, 18377-18736, 21469-21471, 21615-21617, 21541-21543, 21687-21689 또는 임의의 이들의 단편 또는 변이체(F_DSCav1_mut7를 암호화함), 서열 번호: 7180-7539, 18746-19105, 21472-21474, 21618-21620, 21544-21546, 21690-21692 또는 임의의 이들의 단편 또는 변이체(F-del_DSCav1_mut7를 암호화함), 서열 번호: 7549-7908, 19115-19474, 21475-21477, 21621-21623, 21547-21549, 21693-21695 또는 임의의 이들의 단편 또는 변이체(F_DSCav1_mut8를 암호화함), 또는 서열 번호: 7918-8277, 19484-19843, 21478-21480, 21624-21626, 21550-21552, 21696-21698 또는 임의의 이들의 단편 또는 변이체(F-del_DSCav1_mut8를 암호화함)로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
제2 측면에서, 본 발명은 제1 측면의 인공 RNA를 포함하는 조성물을 제공한다.
바람직한 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA를 포함하는 조성물은 매트릭스 단백질 M, 핵단백질(nucleoprotein) N, M2-1 단백질, 및/또는 인단백질(phosphoprotein) P 또는 이들의 조합으로부터 선택된 RSV로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA를 포함한다.
매트릭스 단백질 M, 핵단백질 N, M2-1 단백질, M2-2 단백질 및/또는 인단백질 P는 적합한 T-세포 항원이며 피험자에게 투여될 때 상기 조성물 또는 백신의 효율적인 T-세포 반응을 촉진할 수 있다.
상기 추가 인공 RNA는 서열 번호: 9685-9692, 10135-10142, 10638-10645, 11184-11191, 21385-21388, 19845-19852, 20214-20221, 20583-20590, 20952-20959, 21411-21414 중 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함할 수 있다.
적합하게는, 상기 추가 인공 RNA는 서열 번호: 9693-10052, 10143-10502, 10646-11005, 11192-11551, 19853-20212, 20222-20581, 20591-20950, 20960-21319, 21481-21488, 21627-21634, 21553-21560, 21699-21706 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
적합하게는, 상기 조성물은 하나 이상의 지질과 복합체화되거나, 캡슐화되거나, 결합된 본 발명의 인공 RNA를 포함하여 지질 나노입자를 형성할 수 있다.
상기 조성물은 바람직하게는 하나 이상의 지질과 복합체화된 본 발명의 인공 RNA를 포함하여 지질 나노입자 (LNP)를 형성할 수 있으며, 여기서 상기 LNP는
(i) 본 명세서에 정의된 하나 이상의 양이온성 지질, 바람직하게는 화학식 (III)의 지질, 더욱 바람직하게는 지질 III-3;
(ii) 본 명세서에 정의된 중성 지질, 바람직하게는 1,2- 디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC);
(iii) 본 명세서에 정의된 스테로이드 또는 스테로이드 유사체, 바람직하게는 콜레스테롤; 및
(iv) 본 명세서에 정의된 PEG-지질, 예를 들어 PEG-DMG 또는 PEG-cDMA, 바람직하게는 화학식 (Iva)의 PEG화된 지질로 필수적으로 이루어지며;
여기서 (i) 내지 (iv)는 약 20-60% 양이온성 지질 : 5-25% 중성 지질 : 25-55% 스테롤; 0.5-15 % PEG-지질의 몰비이다.
본 발명은 또한 상기 인공 RNA 또는 상기 조성물을 포함하는 RSV 백신에 관한 것이다.
본 발명은 또한 RSV 감염의 치료 또는 예방에서 상기 인공 RNA, 조성물 및 백신의 용도에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 RSV 감염 또는 이러한 감염과 관련된 장애의 치료 또는 예방에 있어서 상기 인공 RNA, 조성물 및 백신의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 피험자의 장애 또는 질병을 치료 또는 예방하는 방법, 상기 인공 RNA, 조성물 및 백신의 제1 및 제2 의학적 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 인공 RNA, 조성물 및 백신을 포함하는 키트, 특히 부품들로 이루어진 키트에 관한 것이다.
발명의 상세한 설명(Detailed Description of the invention)
본 출원은 본 출원의 발명의 설명의 일부인 전자 형식의 서열 목록과 함께 제출된다 (WIPO 표준 ST.25). 본 출원과 함께 제출된 서열 목록의 전자 형식에 포함된 정보는 그 전문이 본 명세서에 인용문헌으로 포함된다. 본 명세서에서 "서열 번호"가 언급되는 경우, 각각의 식별자를 갖는 서열 목록에서 상응하는 핵산 서열 또는 아미노산 (amino acid, aa) 서열이 언급된다. 많은 서열의 경우, 서열 목록은 또한 특정 구조적 특징, 서열 최적화, GenBank 식별자, 또는 그의 코딩 능력에 관한 추가의 상세한 정보를 제공한다. 특히, 이러한 정보는 WIPO 표준 ST.25 서열 목록에서 숫자 식별자 <223> 아래에 제공된다. 따라서, 상기 숫자 식별자 <223> 하에 제공된 정보는 본 명세서에 그 전체가 명백하게 포함되며, 본 발명의 설명의 필수적인 부분으로 이해되어야 한다.
인공 핵산:
제1 측면에서, 본 발명은
a) 적어도 하나의 이종 5' 비번역 영역 (5'-UTR) 및/또는 적어도 하나의 이종 3' 비번역 영역 (3'-UTR); 및
b) 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV) 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 상기 3'-UTR 및/또는 5'-UTR에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 인공 핵산에 관한 것이다.
제1 측면의 바람직한 구현예에서, 본 발명은
a) 적어도 하나의 이종 5' 비번역 영역 (5'-UTR) 및/또는 적어도 하나의 이종 3' 비번역 영역 (3'-UTR); 및
b) RSV 융합 (F) 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 상기 3'-UTR 및/또는 5'-UTR에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 인공 RNA, 바람직하게는 백신 접종에 적합한 RNA에 관한 것이다.
일반적으로, 본 발명의 RNA는 단백질 코딩 영역과 5'- 및/또는 3'-비번역 영역 (UTR)으로 구성될 수 있다. 상기 3'-UTR은 순서와 크기가 다양하고; 정지 코돈과 폴리 (A) 테일 사이에 있다. 중요하게, 상기 3'-UTR 서열은 RNA 턴오버(turnover), 안정성 및 국소화(localization)를 결정하는 여러 조절 모티프를 보유하고 있으므로 전사 후 조절의 여러 측면을 지배한다. RNA의 의학적 적용 (예를 들어, 면역 요법 적용, 백신 접종)에서 단백질로의 RNA 번역 조절은 치료 안전성과 효능에 가장 중요하다. 본 발명자들은 놀랍게도 3'-UTR 및/또는 5'-UTR의 특정 조합이 함께 작용하여 RSV 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 상승적으로 향상시킨다는 것을 발견했다. 본 발명의 UTR 조합을 보유하는 인공 RNA 분자는 유리하게는 RSV F로부터 유래된 다량의 RSV 항원성 펩티드 또는 단백질의 신속하고 일시적인 발현을 가능하게 한다. 따라서, 본 명세서에 제공된 인공 RNA는 특히 유용하고 RSV에 대한 백신 접종을 포함하여 생체 내 다양한 적용에 적합하다.
적합하게는, 상기 인공 RNA는 적어도 하나의 이종 5'-UTR 및/또는 적어도 하나의 이종 3'-UTR을 포함할 수 있다. 이러한 맥락에서, 본 발명의 UTR은 임의의 자연 발생 유전자 또는 이의 단편, 상 동체 또는 변이체의 5'-UTR 또는 3'-UTR로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 바람직하게는, 본 발명의 5'-UTR 또는 3'-UTR은 RSV F로부터 유래된 하나 이상의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열에 대해 이종이다. 적합한 이종 5'-UTR 또는 이종 3'-UTR은 자연 발생 유전자 (RSV에서 파생되지 않음)에서 파생된다. 다른 구현예에서, 합성으로 조작된 5'-UTR 또는 3'-UTR이 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 적어도 하나의 인공 RNA는 적어도 하나의 이종 3'-UTR을 포함한다.
바람직하게는, 상기 적어도 하나의 3'-UTR은 척삭동물 유전자, 바람직하게는 척추동물 유전자, 보다 바람직하게는 포유동물 유전자, 가장 바람직하게는 인간 유전자의 3’-UTR, 또는 척삭동물 유전자, 바람직하게는 척추동물 유전자, 보다 바람직하게는 포유동물 유전자, 가장 바람직하게는 인간 유전자의 3’-UTR 변이체로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
바람직하게는, 본 발명의 인공 RNA는 3'-UTR을 포함하며, 이는 향상된 반감기를 갖는 RNA (안정한 RNA를 제공함)와 관련된 유전자, 예를 들어 하기에 정의되고 기재된 3'-UTR로부터 유도될 수 있다.
바람직하게는, 상기 적어도 하나의 이종 3'-UTR은 바람직하게는 안정한 mRNA를 암호화하는 유전자의 3'-UTR, 또는 상기 유전자의 상동체, 단편 또는 변이체로부터 유래된 핵산 서열을 포함한다.
제1 측면의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 인공 RNA는 적어도 하나의 이종 3’-UTR을 포함하며, 여기서 상기 적어도 하나의 이종 3'-UTR은 PSMB3, ALB7, 알파-글로빈 (“muag”로 지칭됨), CASP1, COX6B1, GNAS, NDUFA1 및 RPS9에서 선택된 유전자의 3’-UTR, 또는 이들 유전자 중 어느 하나의 상동체, 단편 또는 변이체로부터 유래된 핵산 서열을 포함한다.
ALB7-유래 3'-UTR: 바람직한 구현예에서, 상기 3'-UTR은 척추동물 알부민 유전자의 3'-UTR 또는 이의 변이체, 바람직하게는 포유동물 알부민 유전자의 3'-UTR 또는 이의 변이체, 보다 바람직하게는 인간 알부민 유전자의 3'-UTR 또는 이의 변이체, 더욱더 바람직하게는 GenBank 접근 번호 NM_000477.5에 따른 인간 알부민 유전자의 3'-UTR, 또는 이의 상동체, 단편 또는 변이체로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 따라서 본 발명의 인공 RNA는 ALB7 유전자에서 유래된 3'-UTR을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 ALB7 유전자로부터 유래된 3'-UTR은 서열 번호: 35 또는 36 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
알파-글로빈 유전자-유래 3'-UTR: 바람직한 구현예에서, 상기 3’-UTR은 척추동물 알파-글로빈 유전자("muag"라고 함)의 3'-UTR 또는 이의 변이체, 바람직하게는 포유동물 알파-글로빈 유전자의 3'-UTR 또는 이의 변이체, 보다 바람직하게는 인간 알파-글로빈 유전자의 3'-UTR 또는 이의 변이체, 더욱더 바람직하게는 인간 알파-글로빈 유전자의 3'-UTR로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 따라서 본 발명의 인공 RNA는 알파-글로빈 유전자에서 유래된 3'-UTR을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 알파-글로빈 유전자로부터 유래된 3'-UTR은 서열 번호: 37 또는 38 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
PSMB3-유래 3'-UTR: 본 발명의 인공 RNA는 프로테아좀 서브유닛 베타 타입-3 (PSMB3) 단백질을 암호화하는 유전자의 3'-UTR, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체로부터 유래된 3'-UTR을 포함할 수 있다. 이러한 3'-UTR은 바람직하게는 프로테아좀 서브유닛 베타 타입-3 (PSMB3) 유전자, 바람직하게는 척추동물, 보다 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간 프로테아좀 서브유닛 베타 타입-3 (PSMB3) 유전자의 3'-UTR, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 상기 유전자는 바람직하게는 인간 프로테아좀 서브유닛 베타 타입-3 (PSMB3) 단백질에 상응하는 프로테아좀 서브유닛 베타 타입-3 (PSMB3) 단백질을 암호화할 수 있다(UniProt 참조 번호 P49720, 2017년 8월 30일 엔트리 버전 #183). 따라서, 본 발명의 인공 RNA는 PSMB3 유전자로부터 유래된 3'-UTR을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 PSMB3 유전자로부터 유래된 3'-UTR은 서열 번호: 23 또는 24 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
CASP1-유래 3'-UTR: 본 발명의 인공 RNA는 카스파제-1 (CASP1) 단백질을 암호화하는 유전자의 3'-UTR, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체로부터 유래된 3'-UTR을 포함할 수 있다. 이러한 3'-UTR은 바람직하게는 카스파제-1 (CASP1) 유전자, 바람직하게는 척추동물, 보다 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간 카스파제-1 (CASP1) 유전자의 3'-UTR, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 따라서, 본 발명의 RNA는 CASP1 유전자로부터 유래된 3'-UTR을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 CASP1 유전자로부터 유래된 3'-UTR은 서열 번호: 25 또는 26 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
COX6B1-유래 3'-UTR: 본 발명의 인공 RNA는 시토크롬 c 옥시다아제 서브유닛 6B1 (COX6B1) 단백질을 암호화하는 유전자의 3'-UTR, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체로부터 유래된 3'-UTR을 포함할 수 있다. 이러한 3'-UTR은 바람직하게는 시토크롬 c 옥시다아제 서브유닛 6B1 (COX6B1) 유전자, 바람직하게는 척추동물, 보다 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간 시토크롬 c 옥시다아제 서브유닛 6B1 (COX6B1) 유전자의 3'-UTR, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 상기 유전자는 바람직하게는 인간 시토크롬 c 옥시다아제 서브유닛 6B1 (COX6B1) 단백질에 상응하는 시토크롬 c 옥시다아제 서브유닛 6B1 (COX6B1) 단백질을 암호화할 수 있다 (UniProt 참조 번호 P14854, 2017년 8월 30일의 엔트리 버전 #166). 따라서, 본 발명의 인공 RNA는 COX6B1 유전자로부터 유래된 3'-UTR을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 COX6B1 유전자로부터 유래된 3'-UTR은 서열 번호: 27 또는 28 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
GNAS-유래 3'-UTR: 본 발명의 인공 RNA는 구아닌 뉴클레오티드-결합 단백질 G(s) 서브유닛 알파 동형 짧은 (GNAS) 단백질을 암호화하는 GNAS 유전자의 3'-UTR 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체로부터 유래된 3'-UTR을 포함할 수 있다. 이러한 3'-UTR은 바람직하게는 구아닌 뉴클레오티드-결합 단백질 G(s) 서브유닛 알파 동형 짧은 (GNAS) 유전자, 바람직하게는 척추동물, 보다 바람직하게는 포유동물 구아닌 뉴클레오티드-결합 단백질 G(s) 서브유닛 알파 동형 짧은 (GNAS) 유전자의 3'-UTR, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 상기 유전자는 바람직하게는 인간 구아닌 뉴클레오티드-결합 단백질 G(s) 서브유닛 알파 동형 짧은 (GNAS) 단백질에 상응하는 구아닌 뉴클레오티드-결합 단백질 G(s) 서브유닛 알파 동형 짧은 (GNAS) 단백질을 암호화할 수 있다 (UniProt 참조 번호 P63092, 2017년 8월 30일의 엔트리 버전 #153). 따라서, 본 발명의 인공 RNA는 GNAS 유전자로부터 유래된 3'-UTR을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 GNAS 유전자로부터 유래된 3'-UTR은 서열 번호: 29 또는 30 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
NDUFA1-유래 3'-UTR: 본 발명의 인공 RNA는 NADH 탈수소효소 [유비퀴논] 1 알파 서브 복합체 서브유닛 1 (NDUFA1) 단백질을 암호화하는 유전자의 3'-UTR 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체로부터 유래된 3'-UTR을 포함할 수 있다. 이러한 3'-UTR은 바람직하게는 NADH 탈수소효소 [유비퀴논] 1 알파 서브 복합체 서브유닛 1 (NDUFA1) 유전자, 바람직하게는 척추동물, 보다 바람직하게는 포유동물 NADH 탈수소효소 [유비퀴논] 1 알파 서브 복합체 서브유닛 1 (NDUFA1) 유전자의 3'-UTR, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 상기 유전자는 바람직하게는 인간 NADH 탈수소효소 [유비퀴논] 1 알파 서브 복합체 서브유닛 1 (NDUFA1) 단백질에 상응하는 NADH 탈수소효소 [유비퀴논] 1 알파 서브 복합체 서브유닛 1 (NDUFA1) 단백질을 암호화할 수 있다 (UniProt 참조 번호 O15239, 2017년 8월 30일의 엔트리 버전 # 152). 따라서, 본 발명의 인공 RNA는 NDUFA1 유전자로부터 유래된 3'-UTR을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 NDUFA1 유전자로부터 유래된 3'-UTR은 서열 번호: 31 또는 32 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
RPS9-유래 3'-UTR: 본 발명의 인공 RNA는 40S 리보솜 단백질 S9 (RPS9) 단백질을 암호화하는 유전자의 3'-UTR 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체로부터 유래된 3'-UTR을 포함할 수 있다. 이러한 3'-UTR은 바람직하게는 40S 리보솜 단백질 S9 (RPS9) 유전자, 바람직하게는 척추동물, 보다 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간 40S 리보솜 단백질 S9 (RPS9) 유전자의 3'-UTR, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 상기 유전자는 바람직하게는 인간 40S 리보솜 단백질 S9 (RPS9) 단백질에 상응하는 40S 리보솜 단백질 S9 (RPS9) 단백질을 암호화할 수 있다 (UniProt 참조 번호 P46781, 2017년 8월 30일의 엔트리 버전 #179). 따라서, 본 발명의 인공 RNA는 RPS9 유전자로부터 유래된 3'-UTR을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 RPS9 유전자로부터 유래된 3'-UTR은 서열 번호: 33 또는 34 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
추가 3'-UTR들:
구현예에서, 본 명세서에 정의된 인공 RNA는 WO2016/107877에 기재된 3'-UTR을 포함한다. 이와 관련하여, 3'-UTR 서열에 관한 WO2016/107877의 개시는 본 명세서에 참조로 포함된다. 특히 적합한 3'-UTR은 특허 출원 WO2016/107877의 서열 번호: 1 내지 24 및 서열 번호: 49 내지 318, 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체이다. 따라서, 본 발명의 인공 RNA의 3'-UTR은 특허 출원 WO2016/107877의 서열 번호: 1 내지 24 및 서열 번호: 49 내지 318에 따른 핵산 서열의 상응하는 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 다른 구현 예에서, 본 명세서에 정의된 인공 RNA는 WO2017/036580에 기재된 3'-UTR을 포함한다. 이러한 맥락에서, 3'-UTR 서열에 관한 WO2017/036580의 개시는 본 명세서에 참조로 포함된다. 특히 적합한 3'-UTR은 특허 출원 WO2017/036580의 서열 번호: 152 내지 204, 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체이다. 따라서, 본 발명의 인공 RNA의 3'-UTR은 특허 출원 WO2017/036580의 서열 번호: 152 내지 204에 따른 핵산 서열의 상응하는 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면, 상기 인공 RNA는 적어도 하나의 이종 5'-UTR을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 명세서에 정의된 적어도 하나의 인공 핵산, 특히 본 명세서에 정의된 RNA는 적어도 하나의 이종 5'-UTR을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 적어도 하나의 5'-UTR은 척삭동물 유전자, 바람직하게는 척추동물 유전자, 보다 바람직하게는 포유동물 유전자, 가장 바람직하게는 인간 유전자의 5'-UTR, 또는 척삭동물 유전자, 바람직하게는 척추동물 유전자, 보다 바람직하게는 포유동물 유전자, 가장 바람직하게는 인간 유전자의 5'-UTR 변이체로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
바람직하게는, 본 발명의 인공 RNA는 5'-UTR을 포함하며, 이는 향상된 반감기를 갖는 RNA (안정한 RNA를 제공함)와 관련된 유전자, 예를 들어 하기 정의되고 기재된 5'-UTR로부터 유도될 수 있다.
바람직하게는, 상기 적어도 하나의 이종 5'-UTR은 바람직하게는 안정한 mRNA를 암호화하는 유전자의 5'-UTR, 또는 상기 유전자의 상동체, 단편 또는 변이체로부터 유래된 핵산 서열을 포함한다.
제1 측면의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 인공 RNA는 적어도 하나의 이종 5'-UTR을 포함하며, 여기서 상기 적어도 하나의 이종 5'-UTR은 HSD17B4, RPL32, ASAH1, ATP5A1, MP68, NDUFA4, NOSIP, RPL31, SLC7A3, TUBB4B, 및 UBQLN2에서 선택된 유전자의 5'-UTR, 또는 이들 유전자 중 어느 하나의 상동체, 단편 또는 변이체로부터 유래된 핵산 서열을 포함한다.
RPL32-유래 5'-UTR: 본 발명의 인공 RNA는 60S 리보솜 단백질 L32를 암호화하는 유전자의 5'-UTR, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체에서 유래된 5'-UTR을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 5'-UTR은 바람직하게는 5'TOP 모티프가 결여되어 있다. 이러한 5'-UTR은 바람직하게는 60S 리보솜 단백질 L32 (RPL32) 유전자, 바람직하게는 척추동물, 보다 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간 60S 리보솜 단백질 L32 (RPL32) 유전자의 5'-UTR, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며, 여기서 상기 5'-UTR은 바람직하게는 상기 유전자의 5'TOP를 포함하지 않는다. 상기 유전자는 바람직하게는 인간 60S 리보솜 단백질 L32 (RPL32)에 상응하는 60S 리보솜 단백질 L32 (RPL32)를 암호화할 수 있다 (UniProt 참조 번호. P62899, 2017년 8월 30일의 엔트리 버전 #138). 따라서, 본 발명의 인공 RNA는 RPL32 유전자에서 유래된 5'-UTR을 포함할 수 있고, 여기서 상기 RPL32 유전자로부터 유래된 5'-UTR은 서열 번호: 21 또는 22와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
HSD17B4-유래 5'-UTR: 본 발명의 인공 RNA는 17-베타-하이드록시스테로이드 탈수소효소 4를 암호화하는 유전자의 5'-UTR, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체에서 유래된, 바람직하게는 5'TOP 모티프가 없는 5'-UTR을 포함할 수 있다. 이러한 5'-UTR은 바람직하게는 17-베타-하이드록시스테로이드 탈수소효소 4 (퍼 옥시좀 다기능성 효소 2형이라고도 함), 바람직하게는 척추동물, 보다 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간 17-베타-하이드록시스테로이드 탈수소효소 4 (HSD17B4) 유전자의 5'-UTR, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며, 여기서 바람직하게는 상기 5'-UTR은 상기 유전자의 5'TOP를 포함하지 않는다. 상기 유전자는 바람직하게는 인간 17-베타-하이드록시스테로이드 탈수소효소 4에 상응하는 17-베타-하이드록시스테로이드 탈수소효소 4 단백질, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체를 암호화할 수 있다 (UniProt 참조 번호. Q9BPX1, 2017년 8월 30일의 엔트리 버전 #139). 따라서, 본 발명의 인공 RNA는 HSD17B4 유전자에서 유래된 5'-UTR을 포함할 수 있고, 여기서 상기 HSD17B4 유전자로부터 유래된 5'-UTR은 서열 번호: 1 또는 2 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
ASAH1-유래 5'-UTR: 본 발명의 인공 RNA는 산 세라미데이스 (ASAH1)를 암호화하는 유전자의 5'-UTR, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체에서 유래된 5'-UTR을 포함할 수 있다. 이러한 5'-UTR은 바람직하게는 산 세라미데이스 (ASAH1) 유전자, 바람직하게는 척추동물, 보다 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간 산 세라미데이스 (ASAH1) 유전자의 5'-UTR, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 상기 유전자는 바람직하게는 인간 산 세라미데이스 (ASAH1)에 상응하는 산 세라미데이스 (ASAH1) 단백질, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체를 암호화할 수 있다 (UniProt 참조 번호. Q13510, 2017년 6월 7일의 엔트리 버전 #177). 따라서, 본 발명의 인공 RNA는 ASAH1 유전자에서 유래된 5'-UTR을 포함할 수 있고, 여기서 상기 ASAH1 유전자로부터 유래된 5'-UTR은 서열 번호: 3 또는 4 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
ATP5A1-유래 5'-UTR: 본 발명의 인공 RNA는 미토콘드리아 ATP 신타아제 서브유닛 알파(ATP5A1)를 암호화하는 유전자의 5'-UTR, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체에서 유래된 5'-UTR을 포함할 수 있고, 여기서 상기 5'-UTR은 바람직하게는 5'TOP 모티프가 결여되어 있다. 이러한 5'-UTR은 바람직하게는 미토콘드리아 ATP 신타아제 서브유닛 알파(ATP5A1) 유전자, 바람직하게는 척추동물, 보다 바람직하게는 포유동물 및 가장 바람직하게는 인간 미토콘드리아 ATP 신타아제 서브유닛 알파(ATP5A1) 유전자의 5'-UTR, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 여기서 상기 5'-UTR은 바람직하게는 상기 유전자의 5'TOP를 포함하지 않는다. 상기 유전자는 바람직하게는 인간 산 미토콘드리아 ATP 신타아제 서브유닛 알파에 상응하는 미토콘드리아 ATP 신타아제 서브유닛 알파단백질, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체를 암호화할 수 있다(UniProt 참조 번호. P25705, 2017년 8월 30일의 엔트리 버전 #208). 따라서, 본 발명의 인공 RNA는 ATP5A1 유전자에서 유래된 5'-UTR을 포함할 수 있고, 여기서 상기 ATP5A1 유전자로부터 유래된 5'-UTR은 서열 번호: 5 또는 6 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
MP68-유래 5'-UTR: 본 발명의 인공 RNA는 MP68를 암호화하는 유전자의 5'-UTR, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체에서 유래된 5'-UTR을 포함할 수 있다. 이러한 5'-UTR은 바람직하게는 6.8 kDa 미토콘드리아 프로테오리피드 (MP68) 유전자, 바람직하게는 척추동물, 보다 바람직하게는 포유동물 6.8 kDa 미토콘드리아 프로테오리피드 (MP68) 유전자의 5'-UTR, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 상기 유전자는 바람직하게는 인간 6.8 kDa 미토콘드리아 프로테오리피드 (MP68) 단백질에 상응하는 6.8 kDa 미토콘드리아 프로테오리피드 (MP68) 단백질을 암호화할 수 있다 (UniProt 참조 번호. P56378, 2017년 2월 15일의 엔트리 버전 #127). 따라서, 본 발명의 인공 RNA는 MP68 유전자에서 유래된 5'-UTR을 포함할 수 있고, 여기서 상기 MP68 유전자로부터 유래된 5'-UTR은 서열 번호: 7 또는 8 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
NDUFA4-유래 5'-UTR: 본 발명의 인공 RNA는 시토크롬 c 옥시데이스 서브유닛(NDUFA4)을 암호화하는 유전자의 5'-UTR, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체에서 유래된 5'-UTR을 포함할 수 있다. 이러한 5'-UTR은 바람직하게는 시토크롬 c 옥시데이스 서브유닛(NDUFA4) 유전자, 바람직하게는 척추동물, 보다 바람직하게는 포유동물 시토크롬 c 옥시데이스 서브유닛(NDUFA4) 유전자의 5'-UTR, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 상기 유전자는 바람직하게는 인간 시토크롬 c 옥시데이스 서브유닛(NDUFA4) 단백질에 상응하는 시토크롬 c 옥시데이스 서브유닛(NDUFA4) 단백질을 암호화할 수 있다 (UniProt 참조 번호. O00483, 2017년 8월 30일의 엔트리 버전 #149). 따라서, 본 발명의 인공 RNA는 NDUFA4 유전자에서 유래된 5'-UTR을 포함할 수 있고, 여기서 상기 NDUFA4 유전자로부터 유래된 5'-UTR은 서열 번호: 9 또는 10 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
NOSIP-유래 5'-UTR: 본 발명의 인공 RNA는 산화질소 신타아제-상호작용 (NOSIP) 단백질을 암호화하는 유전자의 5'-UTR, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체에서 유래된 5'-UTR을 포함할 수 있다. 이러한 5'-UTR은 바람직하게는 산화질소 신타아제-상호작용 단백질 (NOSIP) 유전자, 바람직하게는 척추동물, 보다 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간 산화질소 신타아제-상호작용 단백질 (NOSIP) 유전자의 5'-UTR, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 상기 유전자는 바람직하게는 인간 산화질소 신타아제-상호작용 단백질 (NOSIP) 단백질에 상응하는 산화질소 신타아제-상호작용 단백질 (NOSIP) 단백질을 암호화할 수 있다 (UniProt 참조 번호. Q9Y314, 2017년 6월 7일의 엔트리 버전 #130). 따라서, 본 발명의 인공 RNA는 NOSIP 유전자에서 유래된 5'-UTR을 포함할 수 있고, 여기서 상기 NOSIP 유전자로부터 유래된 5'-UTR은 서열 번호: 11 또는 12 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
RPL31-유래 5'-UTR: 본 발명의 인공 RNA는 60S 리보솜 단백질 L31를 암호화하는 유전자의 5'-UTR, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체에서 유래된 5'-UTR을 포함할 수 있고, 여기서 상기 5'-UTR은 바람직하게는 5'TOP 모티프가 결여되어 있다. 이러한 5'-UTR은 바람직하게는 60S 리보솜 단백질 L31 (RPL31) 유전자, 바람직하게는 척추동물, 보다 바람직하게는 포유동물60S 리보솜 단백질 L31 (RPL31) 유전자의 5'-UTR, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 여기서 상기 5'-UTR은 바람직하게는 상기 유전자의 5'TOP를 포함하지 않는다. 상기 유전자는 바람직하게는 인간 60S 리보솜 단백질 L31 (RPL31)에 상응하는 60S 리보솜 단백질 L31 (RPL31)을 암호화할 수 있다(UniProt 참조 번호. P62899, 2017년 8월 30일의 엔트리 버전 #138). 따라서, 본 발명의 인공 RNA는 RPL31 유전자에서 유래된 5'-UTR을 포함할 수 있고, 여기서 상기 RPL31 유전자로부터 유래된 5'-UTR은 서열 번호: 13 또는 14 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
SLC7A3-유래 5'-UTR: 본 발명의 인공 RNA는 양이온성 아미노산 트랜스포터 3 (용질 운반체 패밀리 7 멤버 3, SLC7A3) 단백질을 암호화하는 유전자의 5'-UTR, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체에서 유래된 5'-UTR을 포함할 수 있다. 이러한 5'-UTR은 바람직하게는 양이온성 아미노산 트랜스포터 3 (SLC7A3) 유전자, 바람직하게는 척추동물, 보다 바람직하게는 포유동물 양이온성 아미노산 트랜스포터 3 (SLC7A3) 유전자의 5'-UTR, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 상기 유전자는 바람직하게는 인간 양이온성 아미노산 트랜스포터 3 (SLC7A3) 단백질에 상응하는 양이온성 아미노산 트랜스포터 3 (SLC7A3) 단백질을 암호화할 수 있다 (UniProt 참조 번호. Q8WY07, 2017년 8월 30일의 엔트리 버전 #139). 따라서, 본 발명의 인공 RNA는 SLC7A3 유전자에서 유래된 5'-UTR을 포함할 수 있고, 여기서 상기 SLC7A3 유전자로부터 유래된 5'-UTR은 서열 번호: 15 또는 16 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
TUBB4B-유래 5'-UTR: 본 발명의 인공 RNA는 튜불린 베타-4B 사슬 (TUBB4B) 단백질을 암호화하는 유전자의 5'-UTR, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체에서 유래된 5'-UTR을 포함할 수 있다. 이러한 5'-UTR은 바람직하게는 튜불린 베타-4B 사슬 (TUBB4B) 유전자, 바람직하게는 척추동물, 보다 바람직하게는 포유동물 및 가장 바람직하게는 인간 튜불린 베타-4B 사슬 (TUBB4B) 유전자의 5'-UTR, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 상기 유전자는 바람직하게는 인간 튜불린 베타-4B 사슬 (TUBB4B) 단백질에 상응하는 튜불린 베타-4B 사슬 (TUBB4B) 단백질을 암호화할 수 있다(UniProt 참조 번호. Q8WY07, 2017년 8월 30일의 엔트리 버전 #142). 따라서, 본 발명의 인공 RNA는 TUBB4B 유전자에서 유래된 5'-UTR을 포함할 수 있고, 여기서 상기 TUBB4B 유전자로부터 유래된 5'-UTR은 서열 번호: 17 또는 18 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
UBQLN2-유래 5'-UTR: 본 발명의 인공 RNA는 유비퀼린-2 (UBQLN2) 단백질을 암호화하는 유전자의 5'-UTR, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체에서 유래된 5'-UTR을 포함할 수 있다. 이러한 5'-UTR은 바람직하게는 유비퀼린-2 (UBQLN2) 유전자, 바람직하게는 척추동물, 보다 바람직하게는 포유동물 유비퀼린-2 (UBQLN2) 유전자의 5'-UTR, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 유도체로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 상기 유전자는 바람직하게는 UniProt 참조 번호. Q9UHD9, 2017년 8월 30일의 엔트리 버전 #151에 상응하는 유비퀼린-2 (UBQLN2) 단백질을 암호화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 인공 RNA는 UBQLN2 유전자에서 유래된 5'-UTR을 포함할 수 있고, 여기서 상기 UBQLN2 유전자로부터 유래된 5'-UTR은 서열 번호: 19 또는 20 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
추가 5'-UTR들: 구현예에서, 본 명세서에 정의된 인공 RNA는 WO2013/143700에 기재된 5'-UTR을 포함한다. 이와 관련하여, 5'-UTR 서열에 관한 WO2013/143700의 개시는 본 명세서에 참조로 포함된다. 특히 적합한 5'-UTR은 특허 출원 WO2013/143700의 서열 번호: 1-1363, 서열 번호: 1395, 서열 번호: 1421, 및 서열 번호: 1422로부터 유래된 핵산 서열 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체이다. 이와 관련하여, 본 발명의 인공 RNA의 5'-UTR은 특허 출원 WO2013/143700의 서열 번호: 1-1363, 서열 번호: 1395, 서열 번호: 1421, 및 서열 번호: 1422에 따른 핵산 서열의 상응하는 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것이 바람직하다. 다른 구현예에서, 본 발명의 인공 RNA는 WO2016/107877에 기재된 바와 같이 5'-UTR을 포함한다. 이러한 맥락에서, 5'-UTR 서열에 관한 WO2016/107877의 개시는 본 명세서에 참조로 포함된다. 특히 적합한 5'-UTR은 특허 출원 WO2016/107877의 서열 번호: 25 내지 30 및 서열 번호: 319 내지 382, 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체이다. 이와 관련하여, 인공 RNA의 5'-UTR은 특허 출원 WO2016/107877의 서열 번호: 25 내지 30 및 서열 번호: 319 내지 382에 따른 핵산 서열의 상응하는 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것이 바람직하다. 다른 구현예에서, 본 발명의 인공 RNA는 WO2017/036580에 기재된 바와 같이 5'-UTR을 포함한다. 이러한 맥락에서, 5'-UTR 서열에 관한 WO2017/036580의 개시는 본 명세서에 참조로 포함된다. 특히 바람직한 5'-UTR은 특허 출원 WO2017/036580의 서열 번호: 1 내지 151에 따른 핵산 서열 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체이다. 이와 관련하여, 상기 인공 RNA의 5'-UTR은 특허 출원 WO2017/036580의 서열 번호: 1 내지 151에 따른 핵산 서열의 상응하는 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명자들은 적어도 하나의 이종 5'-UTR 및/또는 적어도 하나의 이종 3'-UTR의 특정 조합이 유리하게는 표적 조직(예를 들어, 근육, 진피)에서 RSV F 단백질로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 상기 3'-UTR 및/또는 5'-UTR에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 코딩 서열의 번역을 증가시킨다는 것을 관찰했다.
따라서, 본 명세서에 정의된 하나 이상의 이종 5'-UTR 및 본 명세서에 정의된 하나 이상의 이종 3'-UTR이 본 발명의 인공 RNA로부터 항원성 펩티드 또는 단백질의 생산(즉, 번역)을 증가시키기 위해 상승 작용을 하는 것이 바람직하다. 5’-UTR 및 3’-UTR의 이러한 유리한 조합은 다음과 같다. 아래에 소개된 각 약어, 즉 “a-1”, “a-2”, “a-3”, “a-4”, “a-5”, “b-1”, “b-2”, “b-3”, “b-4”, “b-5”, “c-1”, “c-2”, “c-3”, “c-4”, “c-5”, “d-1”, “d-2”, “d-3”, “d-4”, “d-5”, “e-1”, “e-2”, “e-3”, “e-4”, “e-5”, “e-6”, “f-1”, “f-2”, “f-3”, “f-4”, “f-5”, “g-1”, “g-2”, “g-3”, “g-4”, “g-5”, “h-1”, “h-2”, “h-3”, “h-4”, “h-5”, “i-1”, “i-2”, “i-3”은 본 발명의 명세서 전체에 사용되며 본 발명의 5'-UTR 및/또는 3'UTR의 하나의 유리한 조합을 나타낸다.
따라서, 제1 측면의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 인공 RNA는
a-1. HSD17B4 유전자의 5'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 PSMB3 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
a-2. NDUFA4 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 PSMB3 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
a-3. SLC7A3 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 PSMB3 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
a-4. NOSIP 유전자의 5'-UTR로부터, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체로부터 하나 이상의 5'-UTR 및 PSMB3 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
a-5. MP68 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 PSMB3 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
b-1. UBQLN2 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 RPS9 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
b-2. ASAH1 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 RPS9 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
b-3. HSD17B4 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 RPS9 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
b-4. HSD17B4 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 CASP1 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
b-5. NOSIP 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 COX6B1 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
c-1. NDUFA4 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 RPS9 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
c-2. NOSIP 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 NDUFA1 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
c-3. NDUFA4 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 COX6B1 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
c-4. NDUFA4 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 NDUFA1 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
c-5. ATP5A1 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 PSMB3 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
d-1. RPL31 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 PSMB3 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
d-2. ATP5A1 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 CASP1 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
d-3. SLC7A3 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 GNAS 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
d-4. HSD17B4 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 NDUFA1 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
d-5. SLC7A3 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 NDUFA1 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
e-1. TUBB4B 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 RPS9 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
e-2. RPL31 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 RPS9 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
e-3. MP68 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 RPS9 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
e-4. NOSIP 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 RPS9 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
e-5. ATP5A1 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 RPS9 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
e-6. ATP5A1 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 COX6B1 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
f-1. ATP5A1 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 GNAS 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
f-2. ATP5A1 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 NDUFA1 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
f-3. HSD17B4 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 COX6B1 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
f-4 HSD17B4 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 GNAS 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
f-5. MP68 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 COX6B1 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR; 또는
g-1. MP68 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 NDUFA1 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
g-2. NDUFA4 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 CASP1 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
g-3. NDUFA4 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 GNAS 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
g-4. NOSIP 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 CASP1 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
g-5. RPL31 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 CASP1 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
h-1. RPL31 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 COX6B1 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
h-2. RPL31 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 GNAS 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
h-3. RPL31 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 NDUFA1 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
h-4. SLC7A3 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 CASP1 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
h-5. SLC7A3 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 COX6B 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체; 또는
i-1. SLC7A3 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 RPS9 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체.
i-2. RPL32 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 5'-UTR 및 ALB7 유전자의 3'-UTR에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체.
i-3. 알파-글로빈 유전자 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 하나 이상의 3'-UTR를 포함한다.
적합하게는, 본 발명의 인공 RNA는 a-1 (HSD17B4/PSMB3), a-2 (Ndufa4/PSMB3), a-3 (SLC7A3/PSMB3), a-4 (NOSIP/PSMB3), a-5 (MP68/PSMB3), b-1 (UBQLN2/RPS9), b-2 (ASAH1/RPS9), b-3 (HSD17B4/RPS9), b-4 (HSD17B4/CASP1), b-5 (NOSIP/COX6B1), c-1 (NDUFA4/RPS9), c-2 (NOSIP/NDUFA1), c-3 (NDUFA4/COX6B1), c-4 (NDUFA4 /NDUFA1), c-5 (ATP5A1/PSMB3), d-1 (Rpl31/PSMB3), d-2 (ATP5A1/CASP1), d-3 (SLC7A3/GNAS), d-4 (HSD17B4/NDUFA1), d-5 (Slc7a3/Ndufa1), e-1 (TUBB4B/RPS9), e-2 (RPL31/RPS9), e-3 (MP68/RPS9), e-4 (NOSIP/RPS9), e-5 (ATP5A1/RPS9), e-6 (ATP5A1/COX6B1), f-1 (ATP5A1/GNAS), f-2 (ATP5A1/NDUFA1), f-3 (HSD17B4/COX6B1), f-4 (HSD17B4/GNAS), f-5 (MP68/COX6B1), g-1 (MP68/NDUFA1), g-2 (NDUFA4/CASP1), g-3 (NDUFA4/GNAS), g-4 (NOSIP/CASP1), g-5 (RPL31/CASP1), h-1 (RPL31/COX6B1), h-2 (RPL31/GNAS), h-3 (RPL31/NDUFA1), h-4 (Slc7a3/CASP1), h-5 (SLC7A3/COX6B1), i-1 (SLC7A3/RPS9), i-2 (RPL32/ALB7), 또는 i-3 (알파-글로빈 유전자)에서 선택된 3'-UTR 및 5'-UTR에 작동 가능하게 연결된 본 명세서에 명시된 RSV F 단백질로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함한다.
제1 측면의 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 인공 RNA는 a-1 (HSD17B4/PSMB3), a-4 (NDUFA4/PSMB3), c-1 (NDUFA4/RPS9), e-4 (NOSIP/RPS9), g-2 (NDUFA4/CASP1), i-2 (RPL32/ALB7), 또는 i-3 (알파-글로빈 (muag))에 따른 UTR 요소를 포함한다.
제1 측면의 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 인공 RNA는 a-1 (HSD17B4/PSMB3)에 따른 UTR 요소를 포함한다.
본 발명은 상기 정의된 적어도 하나의 이종 5'-UTR 및/또는 상기 정의된 적어도 하나의 이종 3'-UTR 및 상기 3'-UTR 및/또는 5'-UTR과 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 인공 RNA, 바람직하게는 백신 접종에 적합한 RNA에 관한 것이며, 여기서 상기 코딩 서열은 호흡기 세포 융합 바이러스 ("RSV"), 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화한다.
본 명세서에 사용된 용어 "호흡기 세포 융합 바이러스" 또는 상응하는 약어 "RSV"는 임의의 기원의 임의의 호흡기 세포 융합 바이러스를 포함하는 특정 바이러스 균주, 변이체, 항원형 또는 분리주 등에 제한되지 않는다.
다양한 구현예에 따르면, 상기 인공 RNA, 바람직하게는 인공 RNA의 코딩 서열은 아래 목록 1에 제공된 NCBI 분류 ID ("NCBI-ID")를 갖는 바이러스로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
목록 1: RSV 바이러스 균주:
인간 오쏘뉴모바이러스(orthopneumovirus), HRSV (NCBI-ID 11250); 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 A, HRSV-A, 호흡기 세포 융합 바이러스 group A (NCBI-ID 208893); 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 A 균주 Long, 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 (하위그룹 A / 균주 Long) (NCBI-ID 11260); 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 A2, 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 (균주 A2), HRSVA (NCBI-ID 11259); 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 (균주 RSB1734), (NCBI-ID 11253); 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 (균주 RSB5857) (NCBI-ID 11254); 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 (균주 RSB6190), (NCBI-ID 11255); 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 (균주 RSB6256), (NCBI-ID 11256); 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 (균주 RSB642), (NCBI-ID 11252); 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 (균주 RSB6614), (NCBI-ID 11257); 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 B, HRSV-B, 호흡기 세포 융합 바이러스 그룹 B, (NCBI-ID 208895); 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 9320 (NCBI-ID 253182); 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 B1 (NCBI-ID 79692); 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 (하위그룹 B / 균주 18537), (NCBI-ID 11251); 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 (하위그룹 B / 균주 8/60), (NCBI-ID 11258); 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 S2, (NCBI-ID 410078); 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 균주 RSS-2, (NCBI-ID 11261); 분류되지 않은 인간 호흡기 세포 융합 바이러스, (NCBI-ID 410233); 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 (균주 RSP112/스웨덴/02-03), (NCBI-ID 410237); 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 (균주 RSP120/스웨덴/02-03), (NCBI-ID 410238); 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 (균주 RSP121/스웨덴/02-03), (NCBI-ID 410239); 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 (균주 RSP122/스웨덴/02-03), (NCBI-ID 410247); 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 (균주 RSP13/스웨덴/02-03), (NCBI-ID 410241); 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 (균주 RSP140/스웨덴/02-03), (NCBI-ID 410248); 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 (균주 RSP16/스웨덴/02-03), (NCBI-ID 410242); 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 (균주 RSP171/스웨덴/02-03), (NCBI-ID 410246); 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 (균주 RSP183/스웨덴/02-03), (NCBI-ID 410249); 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 (균주 RSP191/스웨덴/02-03), (NCBI-ID 410240); 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 (균주 RSP199/스웨덴/02-03), (NCBI-ID 410250); 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 (균주 RSP212/스웨덴/02-03), (NCBI-ID 410251); 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 (균주 RSP41/스웨덴/02-03), (NCBI-ID 410234); 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 (균주 RSP45/스웨덴/02-03), (NCBI-ID 410235); 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 (균주 RSP56/스웨덴/02-03), (NCBI-ID 410243); 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 (균주 RSP58/스웨덴/02-03), (NCBI-ID 410236); 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 (균주 RSP67/스웨덴/02-03), (NCBI-ID 410244); 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 (균주 RSP94/스웨덴/02-03) (NCBI-ID 410245); 호흡기 세포 융합 바이러스 분리주 RSV 멤피스-37, (균주 멤피스-37) (NCBI-ID 12814).
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질은 호흡기 세포 융합 바이러스 분리주 RSV 멤피스-37 (균주 멤피스-37) (NCBI-ID: 12814)에서 유래한다. ST25 서열 목록에 포함된 정보를 포함하여 본 발명 전체에서, 특히 상기 바람직한 RSV 바이러스에 대해 약어 "HRSV(Memphis-37)"가 사용된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질은 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 A2, 인간 호흡기 세포 융합 바이러스 (균주 A2) (NCBI-ID: 11259)에서 유래한다. ST25 서열 목록에 포함된 정보를 포함하여 본 발명 전체에서, 특히 상기 바람직한 RSV 바이러스에 대해 약어 "HRSV(A2)"가 사용된다.
통상의 기술자는 또한 본 발명의 교시를 적용하고 본 발명에 따른 RNA 구조물, 조성물, 및 백신을 얻기 위해 목록 1에 제공된 임의의 RSV 균주로부터 유래된 아미노산 서열 및 핵산 서열을 사용할 수 있음을 이해하여야 한다.
다양한 구현예에서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질은 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV)의 융합 단백질 (F), 당 단백질 G, 짧은 소수성 단백질 SH, 매트릭스 단백질 M, 핵단백질 N, 큰 중합 효소 L, M2-1 단백질, M2-2 단백질, 인단백질 P, 비구조 단백질 NS1, 또는 비구조 단백질 NS2 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체로부터 선택될 수 있다.
제1 측면의 특히 바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질은 RSV 융합 (F) 단백질로부터 유래된다. 이러한 맥락에서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열은 RSV 융합 단백질 F 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체로부터 유래된 임의의 펩티드 또는 단백질로부터 선택될 수 있다.
RSV F 단백질은 처음에 (숙주 세포의 감염 후) 단일 폴리펩티드 전구체로서 발현되며, 전장 융합 단백질 F (본 명세서에서 "F0"로 지칭됨)로 지정된다. F0는 소포체에서 삼량체를 형성하고 두 개의 보존 부위에서 세포/숙주 퓨린 유사 프로테아제에 의해 처리되어 F1, F2 및 Pep27 폴리펩티드를 생성한다. 상기 Pep27 폴리펩티드는 절제되고 성숙한 F 단백질의 일부를 형성하지 않는다. 상기 F2 폴리펩티드는 F0 전구체의 N-말단 부분에서 유래하고 2개의 이황화 결합을 통해 F1 폴리펩티드에 연결된다. 상기 F1 폴리펩티드는 F0 전구체의 C- 말단 부분에서 유래하고 세포질 꼬리에 연결된 막관통 도메인을 통해 막에 성숙한 F 단백질을 고정한다. 3개의 F2-F1 이종이량체 단위 ( "프로토머(protomers)")가 조립되어 성숙한 F 단백질을 형성한다. 처음에, 상기 성숙 F 단백질은 준안정 형태 (여기서는 "전 융합 형태"라고 함)이다. 촉발되면, 바이러스와 표적 세포막을 융합하는 극적이고 비가역적인 형태 변화 (이하 "융합 후 형태"라고 함)를 겪는다.
따라서, 제1 측면의 인공 RNA, 바람직하게는 백신 접종에 적합한 인공 RNA는 RSV F 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화한다.
바람직한 구현예에서, RSV F 단백질에서 유래된 하나 이상의 항원성 펩티드 또는 단백질은 아래 목록 2에 제공된 다음 아미노산 서열 (NCBI 단백질 접근(Accession) 번호) 중 어느 하나에서 유래될 수 있다.
목록 2: RSV 융합 (F) 단백질의 NCBI 단백질 접근 번호:
접근 번호. 단백질, AJF44801.1, AJF44759.1, AJF44661.1, AJF44602.1, 2207424A, AAB38520.1, AAB38517.1, AAB38519.1, AAB38518.1, AVQ93587.1, AVQ93599.1, AVQ93571.1, AVQ93568.1, AVQ93589.1, AVQ93597.1, AVQ93563.1, AVQ93594.1, AVQ93606.1, AVQ93601.1, AVQ93562.1, AVQ93561.1, AVQ93607.1, AVQ93588.1, AVQ93575.1, AVQ93468.1, AVQ93467.1, AVQ93590.1, AVQ93552.1, AVQ93556.1, AVQ93471.1, AVQ93458.1, AVQ93494.1, AVQ93470.1, AVQ93489.1, AVQ93542.1, AVQ93472.1, AVQ93514.1, AVQ93485.1, AVQ93533.1, AVQ93481.1, AVQ93546.1, AVQ93512.1, AVQ93554.1, AVQ93551.1, AVQ93547.1, AVQ93558.1, AVQ93461.1, AVQ93500.1, AVQ93426.1, AVQ93398.1, AVQ93401.1, AVQ93361.1, AVQ93408.1, AVQ93443.1, AVQ93429.1, AVQ93359.1, AVQ93365.1, AVQ93366.1, AVQ93402.1, AVQ93377.1, AVQ93412.1, AVQ93391.1, AVQ93457.1, AVQ93372.1, AVQ93455.1, AVQ93364.1, AVQ93378.1, AVQ93393.1, AVQ93362.1, AVQ93585.1, ART28504.1, AVQ93404.1, AOS49123.1, AOS48496.1, AMT78271.1, AHX57174.1, AHW81390.1, AHV81506.1, AFX60128.1, AFX60129.1, AEQ63389.1, ARB66328.1, ANZ80034.1, AMN91253.1, P03420.1, AIO08046.1, NP_056863.1, AFX60234.1, AFX60231.1, AFX60232.1, AFX60222.1, AFX60219.1, AFX60215.1, AFX60214.1, AFX60212.1, AFX60208.1, AFX60202.1, AFX60220.1, AFX60213.1, AFX60190.1, AFX60187.1, AFX60201.1, AFX60173.1, AFX60169.1, AFX60162.1, AFX60156.1, AFX60151.1, AFX60150.1, AFX60148.1, AFX60141.1, AFX60127.1, AFX60137.1, AFX60135.1, AFV46420.1, AFX60200.1, AFV46419.1, AFV46417.1, AFV46413.1, AFV46414.1, AFV46410.1, AFV46403.1, AFV46409.1, AFP99061.1, AFM95400.1, AFV46401.1, AFP99064.1, AFM95376.1, AFX60138.1, AFP99060.1, AFM95365.1, AFM55563.1, AFM55530.1, AFM55442.1, AFM55420.1, AFM55552.1, AFM55365.1, AFP99059.1, AFM95385.1, AFM55354.1, AFM55343.1, AFM55387.1, AFM55299.1, AFM55288.1, AFM55266.1, AFM55277.1, AFM55255.1, AFM55222.1, AFM55211.1, AFI25262.1, AFD34266.1, AFM55332.1, AFD34264.1, AFD34262.1, AFD34265.1, AFD34261.1, AFD34260.1, AFD34259.1, AEQ63641.1, AEQ63487.1, AEQ63520.1, AEQ63378.1, AEQ63367.1, 4CCF_A, AEQ63334.1, AEO45949.1, AEO45939.1, AEQ63312.1, AEQ63586.1, AEO45919.1, AEO45909.1, AEO45889.1, AEO45879.1, AEO45869.1, AEO45929.1, AEO45850.1, AEO45859.1, AEQ63444.1, AEO23054.1, AEO23052.1, AEO23051.1, AEC32087.1, ADZ95785.1, AEC32085.1, ADZ95784.1, ADZ95783.1, ADZ95782.1, ADZ95781.1, ADZ95779.1, ADZ95780.1, ADZ95777.1, ADZ95778.1, ADZ95776.1, ADZ95775.1, ACY68435.1, ACO83302.1, ABI35685.1, AFI25251.1, AAX23994.1, AAQ97026.1, AAR14266.1, AAQ97027.1, AAQ97030.1, AAQ97028.1, AAC57027.1, AAQ97029.1, AAQ97031.1, AAM68160.1, AAM44851.1, P11209.2, P13843.1, AAO72325.1, AAM68157.1, CAA26143.1, 1512372A, AAB86664.1, AAO72324.1, AAB82446.1, AAO72323.1, AAM68154.1, AAA47410.1, P12568.1, ARB07894.1, AGG39517.1, BBC54612.1, BBC54636.1, BBC54627.1, BBC54621.1, BBC54570.1, BBC54579.1, BBC54595.1, BBC54555.1, BBC54552.1, BBC54564.1, BBC54581.1, BBC54571.1, BBC54553.1, BBC54565.1, BBC54245.1, BBC54243.1, BBC54238.1, BBC54242.1, BBC54239.1, BBC54235.1, BBC54234.1, BBC54236.1, BBC54244.1, BBC54186.1, BBC54178.1, BBC54202.1, 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AGN28792.1, AGN28781.1, AGN28759.1, AGN28748.1, AGN28693.1, AGN28638.1, AGN28627.1, AGN28539.1, AGN28528.1, AGN28462.1, AGN28440.1, AGL96787.1, AGL96786.1, AGL96784.1, AAS93662.1, AAS93657.1, AAS93656.1, AAS93659.1, AAS93660.1, AAS93663.1, AAS93664.1, AAS93655.1, CUS01869.1, AHG54517.1, ASF87348.1, ASF87341.1, ASF87344.1, ASF87351.1, ASF87338.1, ASF87342.1, ASF87352.1, ASF87337.1, ASF87336.1, AEQ98756.1, AEQ98757.1, AEQ98755.1, AEQ98752.1, AEQ98753.1, AEQ98747.1, ASF87325.1, ASF87326.1, 5W23_A, 5EA3_F, 5UDD_A, 5EA8_F, AHG54458.1, AEN74947.1, AHG54485.1, AHG54477.1, AHG54451.1, AHG54463.1, AHG54445.1, AEO12131.1, AEN74945.1, AEN74944.1, ASF87335.1, AHG54515.1, AHA61605.1, AHV81660.1, AHG54441.1 또는 AIY60640.1.
본 발명의 맥락에서, "RSV F 단백질", "RSV 융합 단백질 (F)", "RSV F", 또는 "F"는 가장 넓은 의미로 이해될 수 있으며 F0 (F 폴리펩티드 전구체), F1, F2 및 Pep27 폴리펩티드, F2-F1 이종이량체, 또는 성숙한 F 단백질 (3개의 F2-F1 이종이량체 포함), 또는 이들 중 임의의 단편 및 변이체을 지칭한다. 따라서, 용어 "RSV 융합 (F) 단백질로부터 유래된 펩티드 또는 단백질"은 예를 들어, F0 (F 단백질 폴리펩티드 전구체), F1, F2 및 Pep27 폴리펩티드, F2-F1 이종이량체, 또는 성숙한 F 단백질로부터 유래된 펩티드, 단백질, 단편 또는 변이체를 지칭한다. 추가로, 용어 "RSV 융합 (F) 단백질로부터 유래된 펩티드 또는 단백질"은 상기 정의된 "RSV F 단백질" 또는 "RSV 융합 단백질 (F)"로부터 유래된 펩티드, 단백질, 단편 또는 변이체를 지칭하며, 이는 특정 단백질 요소(세포질 꼬리, 퓨린 절단 부위, Pep27)가 부족하거나 추가 요소(링커 요소, 이종 신호 펩티드 등)를 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 예를 들어, 용어 "RSV 융합 (F) 단백질에서 유래된 펩티드 또는 단백질"은 F0, F-del, F0_DSCav1, F_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F_DSCav1_mut3, F_DSCav1_mut4, F_DSCav1_mut5, F_DSCav1_mut6, F_DSCav1_mut7, F_DSCav1_mut8, F_DSCav1_mut0, F-del_DSCav1, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut4, F-del_DSCav1_mut5, F-del_DSCav1_mut6, F-del_DSCav1_mut7, F-del_DSCav1_mut8, F-del_DSCav1_mut0에서 유래된 펩티드, 단백질, 단편 또는 변이체를 지칭한다 (구조물에 관한 설명은 표 1 참조). 제1 측면의 RNA에 의해 암호화될 수 있는 특히 적합한 F 단백질 변이체는 하기에 명시되고 표 1에 제공된다.
RSV F 단백질에서 아미노산 (aa) 잔기 및 이들의 위치에 대한 언급이 있는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 임의의 번호는 상응하는 HRSV(A2)의 상응하는 F0 전구체 단백질 (서열 번호: 68) 또는 HRSV(멤피스-37)의 상응하는 F0 전구체 단백질 (서열 번호: 8937 또는 11726)에서 각각의 aa 잔기의 위치와 관련 있음을 유의해야 하고 여기서 위치 "1"은 첫 번째 aa 잔기, 즉 HRSV(A2) F0 전구체 단백질 또는 HRSV(멤피스-37) F0 전구체 단백질의 N-말단의 aa 잔기와 상응한다.
바람직한 구현예에서, 제1 측면의 RNA의 적어도 하나의 코딩 서열은 RSV F 단백질로부터의 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하며, 여기서 RSV F 단백질은 전장 F 단백질 (F0) 또는 결실된 C-말단을 갖는 F 단백질 (F-del), 또는 이의 단편 또는 변이체이다.
이러한 맥락에서, 임의의 RSV F 전장 단백질 (전구체 단백질, "F0"으로 지칭됨)이 적합한 항원으로 사용될 수 있으며 바람직하게는 목록 2에 제공된 임의의 NCBI 단백질 접근 번호로부터 유도되거나 서열 번호: 68, 8279-8967 또는 11726 중 임의의 하나에서 선택될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 HRSV(A2) (서열 번호: 68)의 전장 F 단백질 (F0)이 적합하게 사용되며, 개요 표 1을 참조한다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 상기 HRSV(멤피스-37) (서열 번호: 8937 또는 11726)의 전장 F 단백질 (F0)이 적합하게 사용되며, 개요 표 1을 참조한다.
이러한 맥락에서, 결실된 C-말단 (F-del)을 갖는 임의의 RSV F는 적합한 항원으로 사용될 수 있고 바람직하게는 목록 2에 제공된 임의의 NCBI 단백질 접근 번호로부터 유래될 수 있거나 서열 번호: 483, 8968-9683 또는 12095 중 임의의 하나로부터 선택될 수 있다. 이러한 결실 돌연변이의 예는(Oomens et al. 2006. J. Virol. 80(21):10465-77) 에 따른 RSV-Fdel554-574 단백질이며, 여기서 전장 F0 단백질의 aa 잔기 554-574가 제거된다. F0의 세포질 꼬리 (aa 554-574)의 주요 부분의 결실은 시험관 내 세포내 트래피킹/세포 표면 수송을 개선하고 RSV F의 세포 표면 발현을 상당히 증가시킨다. 증가된 세포 표면 제시는 개선된 B 세포 인식을 초래한다 (공개된 데이터에 따라; WO2015024668 참조). 본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 명세서에서 "F-del"(서열 번호: 483, 9653 또는 12095)로 지칭되는 결실된 C-말단을 갖는 F 단백질이 적합하게 사용된다 (개요 표 1 참조). 서로 다른 RSV 균주들 사이에서 RSV F 단백질의 높은 수준의 구조적 보존에 비추어 볼 때 (예를 들어 Hause et al., 2017, PLOS ONE 12(6): e0180623 참조), aa 554-574의 결실은 상이한 RSV 분리주의 상이한 RSV F 단백질 서열에 적용 가능하다.
특히 바람직한 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA는 RSV F 단백질로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하며, 여기서 상기 RSV F 단백질은 전 융합 형태에서 항원을 안정화하도록 설계된다. 전 융합 형태는 중화 항체를 위한 몇몇 잠재적 에피토프가 단지 상기 단백질 형태에서 접근 가능하기 때문에 효율적인 RSV 백신과 관련하여 특히 유리하다.
여러 구현예에서, 상기 RSV F 단백질은 전 융합 형태에서 F 단백질을 안정화시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 전 융합 형태에서 F 단백질의 막 원위 부분을 안정화시키는 치환 (F1 폴리펩티드의 N-말단 영역 포함)을 포함한다. 예를 들어, 상기 아미노산 치환은 비천연 이황화 결합을 도입할 수 있거나 공동 충진(cavity-filling) 아미노산 치환일 수 있다.
따라서, 여러 구현예에서, 바람직한 RSV F 단백질은 전 융합 형태; 즉, 하나 이상의 전 융합 규격(specification) 항체에 특이적으로 결합하고, 및/또는 전 융합 형태에 존재하지만 RSV F 단백질의 융합 후 형태에는 존재하지 않는 적합한 항원 부위를 제공하는 형태에서 단백질을 안정화시키는 비천연 이황화 결합을 형성하는 S155C 및 S290C 치환을 포함한다. 추가 구현예에서, 상기 재조합 RSV F 단백질은 위치 190, 위치 207, 또는 위치 190 및 207에서 F, L, W, Y, H 또는 M 치환을 추가로 포함 할 수 있다.
전-융합 형태에서 항원을 안정화하도록 설계된 RSV F 단백질의 예는 DSCav1 돌연변이 (S155C, S290C, S190F, 및 V207L) 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 RSV F 단백질이다. 이러한 RSV F DSCav1 단백질은 당 업계에 기술되어 있다 (WO2014160463).
따라서, 특히 바람직한 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA는 RSV F 단백질로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하며, 여기서 상기 RSV F 단백질은 DSCav1 돌연변이 (S155C, S290C, S190F 및 V207L) 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
본 발명의 맥락에서 임의의 RSV F가 위치 S155C, S290C, S190F, 및 V207L에서 전 융합 형태에서 단백질을 안정화시키기 위해 돌연변이될 수 있고 본 발명의 맥락에서 적합하게 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 상기 제공된 임의의 NCBI 단백질 접근 번호, 또는 서열 번호: 68, 8279-8967, 483, 8968-9683, 12095, 또는 11726로부터 선택된 임의의 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 다양한 RSV F DSCav1 단백질을 생성하기 위해 S155C, S290C, S190F, 및 V207L에 따른 이러한 아미노산 변화를 도입하기 위해 통상의 기술자에 의해 선택될 수 있다.
바람직한 구현예에서, HRSV(A2) (서열 번호: 68)의 RSV F 전장 단백질 (전구체 단백질, "F0")을 사용하여 S155C, S290C, S190F 및 V207L 아미노산 변화를 도입하여 서열 번호: 898에 따른 아미노산 서열을 유도한다. 이러한 RSV F 단백질은 본 명세서에서 본 발명 전체에 걸쳐 "FO_DSCav1"로 지칭된다 (개요 표 1 (바람직한 RSV F 단백질 항원 설계) 참조).
다른 바람직한 구현예에서, HRSV(A2) (서열 번호: 483)의 RSV F_del 단백질 (결실된 세포질 꼬리 (aa 554-574))은 S155C, S290C, S190F 및 V207L 아미노산 변화를 도입하는 데 사용되어 서열 번호: 1267에 따른 아미노산 서열로 이어진다. 이러한 RSV F 단백질은 본 명세서에서 본 발명 전체에 걸쳐 "F-del_DSCav1"로 지칭된다 (개요 표 1 참조 (바람직한 RSV F 단백질 항원 설계)).
바람직한 구현예에서, HRSV(멤피스-37) (서열 번호: 8937 또는 11726)의 RSV F 전장 단백질 (전구체 단백질, “F0”)은 S155C, S290C, S190F 및 V207L 아미노산 변화를 도입하는 데 사용되어 서열 번호: 12464에 따른 아미노산 서열로 이어진다. 이러한 RSV F 단백질은 본 명세서에서 본 발명 전체에 걸쳐 "FO_DSCav1"로 지칭된다 (개요 표 1 참조 (바람직한 RSV F 단백질 항원 설계)).
다른 바람직한 구현예에서, HRSV(멤피스-37) (서열 번호: 9653 또는 12095)의 RSV F_del 단백질 (결실된 세포질 꼬리(tail) (aa 554-574))은 S155C, S290C, S190F 및 V207L 아미노산 변화를 도입하는 데 사용되어 서열 번호: 12833에 따른 아미노산 서열로 이어진다. 이러한 RSV F 단백질은 본 명세서에서 본 발명 전체에 걸쳐 "F-del_DSCav1"로 지칭된다 (개요 표 1 참조 (바람직한 RSV F 단백질 항원 설계)).
바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질은 단일 폴리펩티드 사슬로서 성숙 F의 2개의 서브유닛, F1 및 F2를 포함하는 조작된 단백질일 수 있고, 여기서 F2 및 F1은 바람직하게는 링커 (GS)를 통해 연결된다. 상기 조작된 F2-링커-F1 융합 단백질 (예를 들어, F(1-103)-GS-F(145-574) 또는 F(1-103)-GS-F(145-553))의 예는 당 업계에 기술되어 있다 (Joyce, M. Gordon, et al. "Iterative structure-based improvement of a fusion-glycoprotein vaccine against RSV." Nature structural & molecular biology 23.9 (2016): 811; WO2017172890). 상기 F2-링커-F1 RSV F 단백질은 aa104-144 (퓨린 절단 부위 및 Pep27 포함)가 없고 F2 폴리펩티드와 F1 폴리펩티드 사이에 링커 요소(예를 들어 GS 링커)를 포함한다. 상기 F2-링커-F1 단백질은 안정성 및/또는 항원성 측면에서 우수한 특성을 나타낼 수 있다.
따라서, 바람직한 구현예에서, 상기 RSV F 단백질은 단일 폴리펩티드 사슬로 융합된 2 개의 서브 유닛 F2 및 F1을 포함하며, 여기서 F2 및 F1은 링커 요소, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 GS 링커를 통해 연결되며, 바람직하게는 안정한 F2-링커-F1 단백질을 생성한다.
바람직하게는, 상기 F2-링커-F1 융합 단백질, 예를 들어 F(1-103)-GS-F(145-574) 또는 F(1-103)-GS-F(145-553)는 추가로 개괄된 바와 같이 DScav1 돌연변이를 포함한다 (본 명세서에서 "mut0"로 지칭됨; 예를 들어, 서열 번호: 3850, 4219 또는 13940, 14309).
특히 바람직한 구현예에서, 상기 RSV F 단백질은 (S46G, A149C, S215P, Y458C, K465Q), (S46G, E92D, A149C, S215P, Y458C, K465Q), (S46G, N67I, E92D, A149C, S215P, Y458C, K465Q), (A149C, Y458C), (N183GC, N428C), (Q98C, Q361C, S46G, E92D, L95M, S215P, I217P, I221M, R429K, K465Q), (Q98C, Q361C, L95M, I221M, R429K), 또는 (N183GC, N428C, S46G, N67I, E92D, S215P, K465Q) 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 선택된 적어도 하나의 추가 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 상기 F2-링커-F1 단백질 (F(1-103)-GS-F(145-574) 또는 F(1-103)-GS-F(145-553))은 바람직하게는 DSCav1에 추가하여 추가로 S46G, A149C, S215P, Y458C, K465Q, 본 명세서에서 “mut1”로 지칭됨, 예를 들어, 서열 번호: 1636, 2005, 또는 14678, 15047; 또는 S46G, E92D, A149C, S215P, Y458C, K465Q, 본 명세서에서 “mut2”로 지칭됨, 예를 들어, 서열 번호: 2374, 2743 또는 15416, 15785; 또는 S46G, N67I, E92D, A149C, S215P, Y458C, K465Q, 본 명세서에서 “mut3”로 지칭됨, 예를 들어, 서열 번호: 3112, 3481 또는 13202, 13571, 또는 이들 중 임의의 단편 또는 변이체로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함할 수 있다 (개요 표 1 참조 (바람직한 RSV F 단백질 항원 설계)).
다른 구현예에서, 상기 F2-링커-F1 단백질 (F(1-103)-GS-F(145-574) 또는 F(1-103)-GS-F(145-553))은 바람직하게는 DSCav1에 추가하여 추가로 A149C, Y458C, "mut4" 로 지칭됨, 예를 들어, 서열 번호: 4588, 4957 또는 16154, 16523; 또는 N183GC, N428C, "mut5" 로 지칭됨, 예를 들어, 서열 번호: 5326, 5695 또는 16892, 17261; 또는 Q98C, Q361C, S46G, E92D, L95M, S215P, I217P, I221M, R429K, K465Q, "mut6" 로 지칭됨, 예를 들어, 서열 번호: 6064, 6433 또는 17630, 17999; 또는 Q98C, Q361C, L95M, I221M, R429K, "mut7" 로 지칭됨, 예를 들어, 서열 번호: 6802, 7171 또는 18368, 18737; 또는 N183GC, N428C, S46G, N67I, E92D, S215P, K465Q, "mut8" 로 지칭됨, 예를 들어, 서열 번호: 7540, 7909 또는 19106, 19475로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다.
본 발명과 관련하여 임의의 RSV F는 2개의 서브유닛, F1 및 F2가 단일 폴리펩티드 사슬에 포함되는 방식으로 적응될 수 있다는 것을 이해해야 하고, 여기서 F2 및 F1은 링커, 예를 들어 (GS) 링커를 통해 연결되어, F0 폴리펩티드 사슬(상기 설명된 바와 같음)의 aa104-144를 결실시킴으로써, 상기 설명된 바와 같이 F2 및 F1 사이의 링커 요소를 도입시킴으로써, 및 상기 설명된 바와 같이 아미노산 치환을 도입함으로써 돌연변이 "mut1", "mut2" 및 "mut3"에 대해 설명된 바와 같이 단백질의 안정성을 증가시킬 수 있다. 따라서, 상기 제공된 임의의 NCBI 단백질 접근 번호 (목록 2 참조), 또는 서열 번호: 68, 8279-8967, 483, 8968-9683, 11726, 12095에서 선택된 임의의 단백질 또는 이들의 단편 또는 변이체는 본 명세서에 요약된 바와 같이 F2-링커-F1 융합 단백질을 생성하기 위해 통상의 기술자에 의해 조정될 수 있고, (S46G, A149C, S215P, Y458C, K465Q), (S46G, E92D, A149C, S215P, Y458C, K465Q), (S46G, N67I, E92D, A149C, S215P, Y458C, K465Q), (A149C, Y458C), (N183GC, N428C), (Q98C, Q361C, S46G, E92D, L95M, S215P, I217P, I221M, R429K, K465Q), (Q98C, Q361C, L95M, I221M, R429K), 또는 (N183GC, N428C, S46G, N67I, E92D, S215P, K465Q) aa 치환 및/또는 DSCav1 돌연변이를 도입함으로써 추가적으로 적응될 수 있다. 더욱이, 상기 개요된 GS 링커를 사용하는 것 외에, 통상의 기술자는 물론 유사하고 비슷하게 적합한 RSV F 단백질 변이체 (예를 들어(예를 들어 특허 출원 WO2017/172890의 서열 번호: 117-162로부터 선택되거나 WO2017/081082의 서열 번호: 1509-1565로부터 선택되거나, 이들 서열의 단편 또는 변이체) 에 도달하기 위해 다양한 공지된 링커 요소 중에서 선택할 수 있다.
바람직한 구현예에서, F2-링커-F1 단백질 (F(1-103)-GS-F(145-574) 또는 F(1-103)-GS-F(145-553)은 F_DSCav1_mut0 또는 F-del_DSCav1_mut0로 지칭되는 상기 개요된 바와 같은 DSCav-1 돌연변이를 포함한다. 바람직한 구현예에서, F2-링커-F1 단백질 (F(1-103)-GS-F(145-574) 또는 F(1-103)-GS-F(145-553)은 상기 개요된 DSCav-1 돌연변이, 및 추가로 본 명세서에서 F_DSCav1_mut1 또는 F-del_DSCav1_mut1로 지칭되는 상기 정의된 아미노산 치환 mut1을 포함한다. 바람직한 구현예에서, F2-링커-F1 단백질 (F(1-103)-GS-F(145-574) 또는 F(1-103)-GS-F(145-553)은 상기 개요된 DSCav-1 돌연변이, 및 추가로 본 명세서에서 F_DSCav1_mut2 또는 F-del_DSCav1_mut2로 지칭되는 상기 정의된 아미노산 치환 mut2을 포함한다. 바람직한 구현예에서, F2-링커-F1 단백질 (F(1-103)-GS-F(145-574) 또는 F(1-103)-GS-F(145-553)은 상기 개요된 DSCav-1 돌연변이, 및 추가로 본 명세서에서 F_DSCav1_mut3 또는 F-del_DSCav1_mut3로 지칭되는 상기 정의된 아미노산 치환 mut3을 포함한다. 바람직한 구현예에서, F2-링커-F1 단백질 (F(1-103)-GS-F(145-574) 또는 F(1-103)-GS-F(145-553)은 상기 개요된 DSCav-1 돌연변이, 및 추가로 본 명세서에서 F_DSCav1_mut4 또는 F-del_DSCav1_mut4로 지칭되는 상기 정의된 아미노산 치환 mut4을 포함한다. 바람직한 구현예에서, F2-링커-F1 단백질 (F(1-103)-GS-F(145-574) 또는 F(1-103)-GS-F(145-553)은 상기 개요된 DSCav-1 돌연변이, 및 추가로 본 명세서에서 F_DSCav1_mut5 또는 F-del_DSCav1_mut5로 지칭되는 상기 정의된 아미노산 치환 mut5을 포함한다. 바람직한 구현예에서, F2-링커-F1 단백질 (F(1-103)-GS-F(145-574) 또는 F(1-103)-GS-F(145-553)은 상기 개요된 DSCav-1 돌연변이, 및 추가로 본 명세서에서 F_DSCav1_mut6 또는 F-del_DSCav1_mut6 로 지칭되는 상기 정의된 아미노산 치환 mut6을 포함한다. (. 바람직한 구현예에서, F2-링커-F1 단백질 (F(1-103)-GS-F(145-574) 또는 F(1-103)-GS-F(145-553)은 상기 개요된 DSCav-1 돌연변이, 및 추가로 본 명세서에서 F_DSCav1_mut7 또는 F-del_DSCav1_mut7로 지칭되는 상기 정의된 아미노산 치환 mut7을 포함한다. 바람직한 구현예에서, F2-링커-F1 단백질 (F(1-103)-GS-F(145-574) 또는 F(1-103)-GS-F(145-553)은 상기 개요된 DSCav-1 돌연변이, 및 추가로 본 명세서에서 F_DSCav1_mut8 또는 F-del_DSCav1_mut8로 지칭되는 상기 정의된 아미노산 치환 mut8을 포함한다.
특히 바람직한 RSV F 단백질에 대한 자세한 설명은 표 1에서 제공된다.
표 1에서 아미노산 (aa) 잔기 및 RSV F 단백질에서 이들의 위치에 대한 모든 언급은 HRSV(A2) (서열 번호: 68) 또는 HRSV(멤피스-37) (SEQ ID NO: 8937 또는 11726)의 상응하는 F0 전구체 단백질에서 각각의 aa 잔기의 위치와 관련된다. 더욱이, 표 1의 적합한 RSV F 단백질 항원 설계에 대한 약어는 본 발명의 설명 전반에 걸쳐 사용된다 (예를 들어, "F0", "F-del", "F0_DSCav1", "F-del_ DSCav1", "F_DSCav1_mut1", "F-del_DSCav1_mut1", "F_DSCav1_mut2", "F-del_DSCav1_mut2", "F_DSCav1_mut3", "F-del_DSCav1_mut3", "F_DSCav1_mut4", "F-del_DSCav1_mut4", "F_DSCav1_mut5", "F-del_DSCav1_mut5", "F_DSCav1_mut6", "F-del_DSCav1_mut6", "F_DSCav1_mut7", "F-del_DSCav1_mut7 ", "F_DSCav1_mut8", "F-del_DSCav1_mut8", "F_DSCav1_mut0", "F-del_DSCav1_mut0"). 표 1의 컬럼 A는 HRSV(A2)로부터 유래된 각각의 RSV F 단백질 항원 설계의 단백질 서열 번호를 제공하고; 표 1의 컬럼 B는 HRSV(멤피스-37)에서 유래된 각각의 RSV F 단백질 항원 설계의 단백질 서열 번호를 제공한다. 특히, 본 발명의 설명은 본 출원의 ST25 서열 목록의 <223> 식별자에 제공된 정보를 명시적으로 포함한다.
표 1: 바람직한 RSV F 단백질 항원 설계
항원 이름 단백질 설계 설명 A B
F0 aa1-574,전장 RSV F0 전구체 68 8937,
11726
F-del aa1-553,C-말단의 aa 554-574의 결실 483 9653,
12095
F0_DSCav1 aa1-574, aa 치환: S155C, S290C, S190F, 및 V207L 898 12464
F-del_ DSCav1 aa1-553,C-말단의 aa 554-574의 결실,
aa 치환: S155C, S290C, S190F, 및 V207L		 1267 12833
F_DSCav1_mut0 aa1-103 - GS(링커) - aa145-574F2-링커-F1 구조물
aa 치환: S155C, S290C, S190F, 및 V207L		 3850 13940
F-del_DSCav1_mut0 aa1-103 - GS(링커) - aa145-553C-말단의 aa 554-574의 결실,
F2-링커-F1 구조물
aa 치환: S155C, S290C, S190F, 및 V207L		 4219 14309
F_DSCav1_mut1 aa1-103 - GS(링커) - aa145-574,F2-링커-F1 구조물,
aa 치환: S155C, S290C, S190F, 및 V207L;
S46G, A149C, S215P, Y458C, K465Q		 1636 14678
F-del_DSCav1_mut1 aa1-103 - GS(링커) - aa145-553C-말단의 aa 554-574의 결실,
F2-링커-F1 구조물,
aa 치환: S155C, S290C, S190F, 및 V207L;
S46G, A149C, S215P, Y458C, K465Q		 2005 15047
F_DSCav1_mut2 aa1-103 - GS(링커) - aa145-574F2-링커-F1 구조물,
aa 치환: S155C, S290C, S190F, 및 V207L;
S46G, E92D, A149C, S215P, Y458C, K465Q		 2374 15416
F-del_DSCav1_mut2 aa1-103 - GS(링커) - aa145-553C-말단의 aa 554-574의 결실,
F2-링커-F1 구조물,
aa 치환: S155C, S290C, S190F, 및 V207L;
S46G, E92D, A149C, S215P, Y458C, K465Q		 2743 15785
F_DSCav1_mut3 aa1-103 - GS(링커) - aa145-574F2-링커-F1 구조물,
aa 치환: S155C, S290C, S190F, 및 V207L;
S46G, N67I, E92D, A149C, S215P, Y458C, K465Q		 3112 13202
F-del_DSCav1_mut3 aa1-103 - GS(링커) - aa145-553C-말단의 aa 554-574의 결실,
F2-링커-F1 구조물,
aa 치환: S155C, S290C, S190F, 및 V207L;
S46G, N67I, E92D, A149C, S215P, Y458C, K465Q		 3481 13571
F_DSCav1_mut4 aa1-103 - GS(링커) - aa145-574F2-링커-F1 구조물,
aa 치환: S155C, S290C, S190F, 및 V207L;
A149C, Y458C		 4588 16154
F-del_DSCav1_mut4 aa1-103 - GS(링커) - aa145-553C-말단의 aa 554-574의 결실,
F2-링커-F1 구조물,
aa 치환: S155C, S290C, S190F, 및 V207L;
A149C, Y458C		 4957 16523
F_DSCav1_mut5 aa1-103 - GS(링커) - aa145-574F2-링커-F1 구조물,
aa 치환: S155C, S290C, S190F, 및 V207L;
N183GC, N428C		 5326 16892
F-del_DSCav1_mut5 aa1-103 - GS(링커) - aa145-553C-말단의 aa 554-574의 결실,
F2-링커-F1 구조물,
aa 치환: S155C, S290C, S190F, 및 V207L;
N183GC, N428C		 5695 17261
F_DSCav1_mut6 aa1-103 - GS(링커) - aa145-574F2-링커-F1 구조물,
aa 치환: S155C, S290C, S190F, 및 V207L;
Q98C, Q361C, S46G, E92D, L95M, S215P, I217P, I221M, R429K, K465Q		 6064 17630
F-del_DSCav1_mut6 aa1-103 - GS(링커) - aa145-553C-말단의 aa 554-574의 결실,
F2-링커-F1 구조물,
aa 치환: S155C, S290C, S190F, 및 V207L;
Q98C, Q361C, S46G, E92D, L95M, S215P, I217P, I221M, R429K, K465Q		 6433 17999
F_DSCav1_mut7 aa1-103 - GS(링커) - aa145-574F2-링커-F1 구조물,
aa 치환: S155C, S290C, S190F, 및 V207L;
Q98C, Q361C, L95M, I221M, R429K		 6802 18368
F-del_DSCav1_mut7 aa1-103 - GS(링커) - aa145-553C-말단의 aa 554-574의 결실,
F2-링커-F1 구조물,
aa 치환: S155C, S290C, S190F, 및 V207L;
Q98C, Q361C, L95M, I221M, R429K		 7171 18737
F_DSCav1_mut8 aa1-103 - GS(링커) - aa145-574F2-링커-F1 구조물,
aa 치환: S155C, S290C, S190F, 및 V207L;
N183GC, N428C, S46G, N67I, E92D, S215P, K465Q		 7540 19106
F-del_DSCav1_mut8 aa1-103 - GS(링커) - aa145-553C-말단의 aa 554-574의 결실,
F2-링커-F1 구조물,
aa 치환: S155C, S290C, S190F, 및 V207L;
N183GC, N428C, S46G, N67I, E92D, S215P, K465Q		 7909 19475
특히 바람직한 구현예에서, 제1 측면에 따른 인공 RNA는 RSV 융합 (F) 단백질로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하며, 여기서 상기 RSV F 단백질은 F0, F-del, F0_DSCav1, F_DSCav1_mut0, F_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F_DSCav1_mut3, F_DSCav1_mut4, F_DSCav1_mut5, F_DSCav1_mut6, F_DSCav1_mut7, F_DSCav1_mut8, F-del_DSCav1, F-del_DSCav1_mut0, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut4, F-del_DSCav1_mut5, F-del_DSCav1_mut6, F-del_DSCav1_mut7, F-del_DSCav1_mut8, 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 선택된다 (예: 표 1 참조).
본 발명의 맥락에서 특히 바람직하고 유리한 것은 F-del_DSCav1, F-del_DSCav1_mut0, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut4, F-del_DSCav1_mut5, F-del_DSCav1_mut6, F-del_DSCav1_mut7, F-del_DSCav1_mut8, 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 선택된 RSV F 단백질이다 (예를 들어, 표 1 참조).
바람직한 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA는 서열 번호: 68, 483, 898, 1267, 1636, 2005, 2374, 2743, 3112, 3481, 3850, 4219, 4588, 4957, 5326, 5695, 6064, 6433, 6802, 7171, 7540, 7909, 11726, 12095, 12464, 12833, 13940, 14309, 14678, 15047, 15416, 15785, 13202, 13571, 16154, 16523, 16892, 17261, 17630, 17999, 18368, 18737, 19106, 19475 (예를 들어 표 1 참조), 또는 8279-9683 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체 중 어느 하나와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함한다. RSV 단백질을 암호화하는 이들 적합한 아미노산 서열 각각에 관한 추가 정보는 서열 목록, 특히 다음에 설명된 바와 같이 식별자 <223> 아래에 제공된 세부 사항으로부터 유래될 수도 있다.
바람직한 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA는 서열 번호: 68, 483, 898, 1267, 1636, 2005, 2374, 2743, 3112, 3481, 3850, 4219, 4588, 4957, 5326, 5695, 6064, 6433, 6802, 7171, 7540, 7909, 11726, 12095, 12464, 12833, 13940, 14309, 14678, 15047, 15416, 15785, 13202, 13571, 16154, 16523, 16892, 17261, 17630, 17999, 18368, 18737, 19106, 19475 (예를 들어 표 1 참조), 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체 중 어느 하나와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함한다. RSV 단백질을 암호화하는 이들 적합한 아미노산 서열 각각에 관한 추가 정보는 서열 목록, 특히 다음에 설명된 바와 같이 식별자 <223> 아래에 제공된 세부 사항으로부터 유래될 수도 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA는 서열 번호: 1267, 2005, 2743, 3481, 4219, 4957, 5695, 6433, 7171, 7909, 12833, 14309, 15047, 15785, 13571, 16523, 17261, 17999, 18737, 19475 (예를 들어 표 1 참조) 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체 중 어느 하나와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함한다. RSV 단백질을 암호화하는 이들 적합한 아미노산 서열 각각에 관한 추가 정보는 서열 목록, 특히 다음에 설명된 바와 같이 식별자 <223> 아래에 제공된 세부 사항으로부터 유래될 수도 있다.
다른 구현예에서, 제1 측면에 따른 인공 RNA는 서열 번호: 8279-9683 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체 중 어느 하나와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 명세서에 정의된 인공 RNA는 특허 출원 WO2014/160463의 서열 번호: 1-1428 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체 중 어느 하나와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RSV로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함한다. 이와 관련하여, 특허출원 WO2014/160463의 서열 번호: 1-1428 및 이와 관련된 개시 내용이 본 명세서에 참조로 포함된다.
다른 구현예에서, 본 명세서에 정의된 인공 RNA는 특허 출원 WO2015/024668의 서열 번호: 1-11 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체 중 어느 하나와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RSV로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함한다. 이와 관련하여, 특허출원 WO2015/024668의 서열 번호: 1-11 및 이와 관련된 개시 내용이 본 명세서에 참조로 포함된다.
다른 구현예에서, 본 명세서에 정의된 인공 RNA는 특허 출원 WO2017/070622의 서열 번호: 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 243, 또는 245 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체 중 어느 하나와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RSV로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함한다. 이와 관련하여, 특허출원 WO2017/070622의 서열 번호: 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 243, 또는 245 및 이와 관련된 개시 내용이 본 명세서에 참조로 포함된다.
다른 구현예에서, 본 명세서에 정의된 인공 RNA는 특허 출원 WO2017/172890의 서열 번호: 1-65, 81-95, 110-116 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체 중 어느 하나와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RSV로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함한다. 이와 관련하여, 특허출원 WO2017/172890의 서열 번호: 1-65, 81-95, 110-116 및 이와 관련된 개시 내용이 본 명세서에 참조로 포함된다.
다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 인공 RNA는 상기 정의된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하고 추가로 적어도 하나의 추가 이종 펩티드 또는 단백질 요소를 암호화할 수 있다.
적합하게는, 적어도 하나의 추가 펩티드 또는 단백질 요소는 본 발명의 암호화된 항원성 펩티드 또는 단백질(예를 들어 분비 신호 서열을 통해)의 분비를 촉진하고, 원형질막에서 본 발명의 암호화된 항원성 펩티드 또는 단백질의 고정을 촉진하고(예를 들어 막관통 요소를 통해), 항원 복합체의 형성을 촉진하고(예를 들어 다중화 도메인을 통해), 바이러스 유사 입자 형성을 촉진(VLP 형성 서열)할 수 있다. 게다가, 본 발명에 따른 인공 핵산 서열은 펩티드 링커 요소, 자가 절단 펩티드, 면역 보조제 서열 또는 수지상 세포 표적 서열을 추가로 암호화할 수 있다. 적합한 다중화 도메인은 특허 출원 WO2017/081082의 서열 번호: 1116-1167에 따른 아미노산 서열 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체의 목록에서 선택될 수 있다. 삼량체화 및 사량체화 요소는 예를 들어, 엔지니어링된 류신 지퍼 (평행 삼량체 상태를 채택하는 엔지니어링된 α-나선 코일드(coiled) 코일 펩티드), 장내 박테리아 파지 T4, GCN4pII, GCN4-pLI 및 p53의 피브리틴 폴돈 도메인으로부터 선택될 수 있다. 그러한 맥락에서, 장내 박테리아 파지 T4, GCN4pII, GCN4-pLI, 및 p53으로부터의 피브리틴 폴돈 도메인이 바람직하다. 적합한 막관통 요소는 특허 출원 WO2017/081082의 서열 번호: 1228-1343에 따른 아미노산 서열 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체의 목록에서 선택될 수 있다. 적합한 VLP 형성 서열은 특허 출원 WO2017/081082의 서열 번호: 1168-1227에 따른 아미노산 서열 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체의 목록에서 선택될 수 있다. 적합한 펩티드 링커는 특허 출원 WO2017/081082의 서열 번호: 1509-1565에 따른 아미노산 서열 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체의 목록에서 선택될 수 있다. 적합한 자가 절단 펩티드는 특허 출원 WO2017/081082의 서열 번호: 1434-1508에 따른 아미노산 서열 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체의 목록에서 선택될 수 있다. 적합한 면역 보조제 서열은 특허 출원 WO2017/081082의 서열 번호: 1360-1421에 따른 아미노산 서열 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체의 목록에서 선택될 수 있다. 적합한 수지상 세포 (DC) 표적화 서열은 특허 출원 WO2017/081082의 서열 번호: 1344-1359에 따른 아미노산 서열 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체의 목록에서 선택될 수 있다. 적합한 분비 신호 펩티드는 특허 출원 WO2017/081082의 서열 번호: 1-1115 및 서열 번호: 1728에 따른 아미노산 서열 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체의 목록에서 선택될 수 있다. 핵산 수준에서, 그러한 아미노산 서열을 암호화하는 임의의 핵산 서열 (예를 들어 RNA 서열)이 선택될 수 있다. 이러한 맥락에서, WO2017/081082의 개시 내용은 여기에 참조로 포함된다. 상기 이종 분비 신호 서열은 암호화된 항원성 펩티드 또는 단백질의 분비를 증가시킬 수 있다.
구현예에 따르면, 상기 분비 신호 서열은 서열 번호: 21329-21362 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체 중 어느 하나와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 분비 신호 서열을 암호화하는 이들 적합한 아미노산 서열 각각에 관한 추가 정보는 서열 목록, 특히 다음에 설명된 바와 같이 식별자 <223> 아래에 제공된 세부 사항으로부터 유래될 수도 있다.
바람직한 구현예에 따르면, 상기 인공 핵산, 특히 상기 인공 RNA는 본 명세서에 정의된 RSV로부터 유래된, 바람직하게는 RSV F 단백질, 또는 이의 단편 및 변이체로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함한다. 그러한 맥락에서, RSV로부터 유래된, 바람직하게는 RSV F 단백질, 또는 이의 단편 및 변이체로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 임의의 코딩 서열은 적합한 코딩 서열로 이해될 수 있고 따라서 제1 측면의 인공 RNA에 포함될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA는 RSV F 단백질로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는, 바람직하게는 서열 번호: 68, 483, 898, 1267, 1636, 2005, 2374, 2743, 3112, 3481, 3850, 4219, 4588, 4957, 5326, 5695, 6064, 6433, 6802, 7171, 7540, 7909, 11726, 12095, 12464, 12833, 13940, 14309, 14678, 15047, 15416, 15785, 13202, 13571, 16154, 16523, 16892, 17261, 17630, 17999, 18368, 18737, 19106, 19475 또는 이의 단편 또는 변이체 중 어느 하나를 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 핵산 수준에서, 서열 번호: 68, 483, 898, 1267, 1636, 2005, 2374, 2743, 3112, 3481, 3850, 4219, 4588, 4957, 5326, 5695, 6064, 6433, 6802, 7171, 7540, 7909, 11726, 12095, 12464, 12833, 13940, 14309, 14678, 15047, 15416, 15785, 13202, 13571, 16154, 16523, 16892, 17261, 17630, 17999, 18368, 18737, 19106, 19475 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 임의의 핵산 서열, 특히, 임의의 RNA 서열 또는 서열 번호: 68, 483, 898, 1267, 1636, 2005, 2374, 2743, 3112, 3481, 3850, 4219, 4588, 4957, 5326, 5695, 6064, 6433, 6802, 7171, 7540, 7909, 11726, 12095, 12464, 12833, 13940, 14309, 14678, 15047, 15416, 15785, 13202, 13571, 16154, 16523, 16892, 17261, 17630, 17999, 18368, 18737, 19106, 19475 또는 이의 단편 또는 변이체 중 어느 하나와 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 임의의 핵산 서열 (예를 들어, DNA 서열, RNA 서열)이 선택될 수 있고 이에 따라 적합한 코딩 서열로 이해될 수 있으며 따라서 본 발명의 제1 측면의 인공 RNA에 포함될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
다른 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA는 서열 번호: 8279-9683 또는 이의 단편 또는 변이체 중 어느 하나를 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 핵산 수준에서, 서열 번호: 8279-9683 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 임의의 핵산 서열, 특히 임의의 RNA 서열 또는 서열 번호:8279-9683 또는 이의 단편 또는 변이체와 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 임의의 핵산 서열 (예를 들어 DNA 서열, RNA 서열)이 선택될 수 있고 이에 따라 적합한 코딩 서열로 이해될 수 있으며 따라서 본 발명의 제1 측면의 인공 RNA에 포함될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
다른 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA는 특허 출원 WO2014/160463의 서열 번호: 1-1428 또는 이의 단편 또는 변이체 중 어느 하나를 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 핵산 수준에서, 특허 출원 WO2014/160463의 서열 번호: 1-1428 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 임의의 핵산 서열, 특히 임의의 RNA 서열 또는 특허 출원 WO2014/160463의 서열 번호: 1-1428 또는 이의 단편 또는 변이체와 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 임의의 핵산 서열 (예를 들어 DNA 서열, RNA 서열)이 선택될 수 있고 이에 따라 적합한 코딩 서열로 이해될 수 있으며 따라서 본 발명의 제1 측면의 인공 RNA에 포함될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
다른 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA는 특허 출원 WO2015/024668의 서열 번호: 1-11 또는 이의 단편 또는 변이체 중 어느 하나를 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 핵산 수준에서, 특허 출원 WO2015/024668의 서열 번호: 1-11 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 임의의 핵산 서열, 특히 임의의 RNA 서열 또는 특허 출원 WO2015/024668의 서열 번호: 1-11 또는 이의 단편 또는 변이체와 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 임의의 핵산 서열 (예를 들어 DNA 서열, RNA 서열)이 선택될 수 있고 이에 따라 적합한 코딩 서열로 이해될 수 있으며 따라서 본 발명의 제1 측면의 인공 RNA에 포함될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
다른 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA는 특허 출원 WO2017/070622의 서열 번호: 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 243, 또는 245 또는 이의 단편 또는 변이체 중 어느 하나를 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 핵산 수준에서, 특허 출원 WO2017/070622의 서열 번호: 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 243, 또는 245 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 임의의 핵산 서열, 특히 임의의 RNA 서열 또는 특허 출원 WO2015/024668의 서열 번호: 1-11 또는 이의 단편 또는 변이체와 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 임의의 핵산 서열 (예를 들어 DNA 서열, RNA 서열)이 선택될 수 있고 이에 따라 적합한 코딩 서열로 이해될 수 있으며 따라서 본 발명의 제1 측면의 인공 RNA에 포함될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
다른 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA는 특허 출원 WO2017/172890의 서열 번호: 1-65, 81-95, 110-116 또는 이의 단편 또는 변이체 중 어느 하나를 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 핵산 수준에서, 특허 출원 WO2017/172890의 서열 번호: 1-65, 81-95, 110-116 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 임의의 핵산 서열, 특히 임의의 RNA 서열 또는 특허 출원 WO2017/172890의 서열 번호: 1-65, 81-95, 110-116 또는 이의 단편 또는 변이체와 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 임의의 핵산 서열 (예를 들어 DNA 서열, RNA 서열)이 선택될 수 있고 이에 따라 적합한 코딩 서열로 이해될 수 있으며 따라서 본 발명의 제1 측면의 인공 RNA에 포함될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
적합하게는, 특히 바람직한 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA는 상기 5'-UTR과 상기 3'-UTR 사이, 바람직하게는 상기 5'-UTR의 하류 및 상기 3'-UTR의 상류 사이에 위치한 코딩 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA는 서열 번호: 69-482, 484-897, 899-1266, 1268-1635, 1637-2004, 2006-2373, 2375-2742, 2744-3111, 3113-3480, 3482-3849, 3851-4218, 4220-4587, 4589-4956, 4958-5325, 5327-5694, 5696-6063, 6065-6432, 6434-6801, 6803-7170, 7172-7539, 7541-7908, 7910-8277, 8278, 11727-12094, 12096-12463, 12465-12832, 12834-13201, 13941-14308, 14310-14677, 14679-15046, 15048-15415, 15417-15784, 15786-16153, 13203-13570, 13572-13939, 16155-16522, 16524-16891, 16893-17260, 17262-17629, 17631-17998, 18000-17998, 18369-18736, 18738-19105, 19107-19474, 19476-19843, 21363-21706, 또는 이의 단편 또는 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 코딩 서열을 포함한다 (또한 표 3-6 참조). 이들 적합한 핵산 서열 각각에 관한 추가 정보는 서열 목록, 특히 다음에 설명된 바와 같이 식별자 <223> 아래에 제공된 세부 사항으로부터 유래될 수도 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA는 서열 번호: 69-77, 484-492, 899-906, 1268-1275, 1637-1644, 2006-2013, 2375-2382, 2744-2751, 3113-3120, 3482-3489, 3851-3858, 4220-4227, 4589-4596, 4958-4965, 5327-5334, 5696-5703, 6065-6072, 6434-6441, 6803-6810, 7172-7179, 7541-7548, 7910-7917, 21363-21384, 11727-11734, 12096-12103, 12465-12472, 12834-12841, 13941-13948, 14310-14317, 14679-14686, 15048-15055, 15417-15424, 15786-15793, 13203-13210, 13572-13579, 16155-16162, 16524-16531, 16893-16900, 17262-17269, 17631-17638, 18000-18007, 18369-18376, 18738-18745, 19107-19114, 19476-19483, 21389-21410, 또는 이의 단편 또는 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 코딩 서열을 포함한다 (또한 표 3 및 4 참조). 이들 적합한 핵산 서열 각각에 관한 추가 정보는 서열 목록, 특히 다음에 설명된 바와 같이 식별자 <223> 아래에 제공된 세부 사항으로부터 유래될 수도 있다.
다른 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA는 특허 출원 WO2014/160463의 서열 번호: 383-388 또는 이의 단편 또는 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 코딩 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA는 특허 출원 WO2015/024668의 서열 번호: 12-22 또는 이의 단편 또는 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 코딩 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA는 특허 출원 WO2017/070622의 서열 번호: 1, 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 242, 244, 246, 257, 258-280 또는 이의 단편 또는 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 코딩 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA는 특허 출원 WO2017/172890의 서열 번호: 96-99 또는 이의 단편 또는 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 코딩 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에 따르면, 상기 인공 RNA는 변형 및/또는 안정화된 인공 RNA이다.
바람직한 구현예에 따르면, 따라서, 본 발명의 인공 RNA는 "안정화된 인공 RNA", 즉 생체 내 분해에 대해 개선된 내성을 나타내는 RNA 및/또는 생체 내에서 개선된 안정성을 나타내는 인공 RNA, 및/또는 생체 내 개선된 번역 가능성을 나타내는 인공 RNA로써 제공될 수 있다. 다음에서, 인공 RNA를 "안정화"하기에 적합하게 특정 적합한 변형이 이러한 맥락에서 설명된다.
이러한 안정화는 본 명세서에 명시된 "건조된 RNA" 및/또는 "정제된 RNA"를 제공함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로 또는 그에 추가하여, 이러한 안정화는 예를 들어 본 발명의 인공 RNA의 변형된 인산염 백본에 의해 수행될 수 있다. 본 발명과 관련된 백본 변형은 RNA에 포함된 뉴클레오티드의 백본의 인산염이 화학적으로 변형된 변형이다. 이와 관련하여 바람직하게 사용될 수 있는 뉴클레오티드는 예를 들어 포스포로티오에이트-개질된 포스페이트 백본, 바람직하게는 황 원자로 대체되는 포스페이트 백본에 함유된 포스페이트 산소 중 적어도 하나를 함유한다. 안정화된 RNA는 추가로 예를 들어 비이온성 포스페이트 유사체, 예를 들어, 하전된 포스포네이트 산소가 알킬 또는 아릴 그룹으로 치환된 알킬 및 아릴 포스포네이트, 또는 포스포디에스테르 및 알킬포스포트리에스테르를 포함할 수 있으며, 상기 하전된 산소 잔기는 알킬화된 형태로 존재한다. 이러한 백본 변형은 전형적으로 메틸포스 포네이트, 포스포라미데이트 및 포스포로티오에이트로 구성된 군으로부터의 변형 (예를 들어, 시티딘-5´-O-(1-티오포스페이트))을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
다음에서, 본 발명의 인공 RNA를 "안정화"할 수 있는 적합한 변형이 설명된다.
구현예에 따르면, 본 발명에 따른 인공 RNA는 변형된 인공 RNA이며, 여기서 상기 변형은 백본 변형뿐만 아니라 당 변형 또는 염기 변형을 포함하는 화학적 변형을 의미한다.
이러한 맥락에서, 본 명세서에 정의된 변형 인공 RNA는 뉴클레오티드 유사체/변형, 예를 들어 백본 변형, 당 변형 또는 염기 변형을 포함할 수 있다. 본 발명과 관련된 백본 변형은 핵산, 예를 들어 인공 RNA에 포함된 뉴클레오티드 백본의 포스페이트가 화학적으로 변형되는 변형이다. 본 발명과 관련된 당 변형은 본 명세서에 정의된 RNA의 뉴클레오티드 당의 화학적 변형이다. 또한, 본 발명과 관련된 염기 변형은 RNA 뉴클레오티드의 염기 모이어티의 화학적 변형이다. 이러한 맥락에서, 뉴클레오타이드 유사체 또는 변형은 바람직하게는 전사 및/또는 번역에 적용 가능한 뉴클레오티드 유사체로부터 선택된다.
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 본 명세서에 기술된 바와 같이 변형된 핵산 또는 특히 변형된 RNA에 통합될 수 있는 뉴클레오티드 유사체/변형은 바람직하게는 2-아미노-6-클로로퓨린리보시드-5'-트리포스페이트, 2-아미노-6-클로로퓨린리보시드-5’-트리포스페이트, 2-아미노퓨린-리보시드-5'-트리포스페이트; 2-아미노아데노신-5’-트리포스페이트, 2’-아미노-2’-디옥시시티딘-트리포스페이트, 2-티오시티딘-5’-트리포스페이트, 2-티오우리딘-5’-트리포스페이트, 2’-플루오로티미딘-5’-트리포스페이트, 2’-O-메틸-이노신-5’-트리포스페이트 4-티오우리딘-5’-트리포스페이트, 5-아미노알릴시티딘-5’-트리포스페이트, 5-아미노알릴우리딘-5’-트리포스페이트, 5-브로모시티딘-5’-트리포스페이트, 5-브로모우리딘-5’-트리포스페이트, 5-브로모-2’-디옥시시티딘-5’-트리포스페이트, 5-브로모-2’-디옥시우리딘-5’-트리포스페이트, 5-아이오도시티딘-5’-트리포스페이트, 5-아이오도-2’-디옥시시티딘-5’-트리포스페이트, 5-아이오도우리딘-5’-트리포스페이트, 5-아이오도-2’-디옥시우리딘-5’-트리포스페이트, 5-메틸시티딘-5’-트리포스페이트, 5-메틸우리딘-5’-트리포스페이트, 5-프로피닐-2’-디옥시시티딘-5’-트리포스페이트, 5-프로피닐-2’-디옥시우리딘-5’-트리포스페이트, 6-아자시티딘-5’-트리포스페이트, 6-아자우리딘-5’-트리포스페이트, 6-클로로퓨린리보시드-5’-트리포스페이트, 7-디아자아데노신-5’-트리포스페이트, 7-디아자구아노신-5’-트리포스페이트, 8-아자아데노신-5’-트리포스페이트, 8-아지도아데노신-5’-트리포스페이트, 벤지미다졸-리보시드-5’-트리포스페이트, N1-메틸아데노신-5’-트리포스페이트, N1-메틸구아노신-5’-트리포스페이트, N6-메틸아데노신-5’-트리포스페이트, O6-메틸구아노신-5’-트리포스페이트, 슈도우리딘-5’-트리포스페이트, 또는 퓨로마이신-5’-트리포스페이트, 잔토신-5’-트리포스페이트로부터 선택된다. 5-메틸시티딘-5’-트리포스페이트, 7-디아자구아노신-5’-트리포스페이트, 5-브로모시티딘-5’-트리포스페이트, 및 슈도우리딘-5’-트리포스페이트, 피리딘-4-온 리보뉴클레오시드, 5-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-하이드록시우리딘, 3-메틸우리딘, 5-카복시메틸-우리딘, 1-카복시메틸-슈도우리딘, 5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 5-타우리노메틸우리딘, 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘, 1-타우리노메틸-4-티오-우리딘, 5-메틸-우리딘, 1-메틸-슈도우리딘, 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-디아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-1-디아자-슈도우리딘, 디하이드로우리딘, 디하이드로슈도우리딘, 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-메톡시우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 및 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 5-아자-시티딘, 슈도이소시티딘, 3-메틸-시티딘, N4-아세틸시티딘, 5-포르밀시티딘, N4-메틸시티딘, 5-하이드록시메틸시티딘, 1-메틸-슈도이소시티딘, 피롤로-시티딘, 피롤로-슈도이소시티딘, 2-티오-시티딘, 2-티오-5-메틸-시티딘, 4-티오-슈도이소시티딘, 4-티오-1-메틸-슈도이소시티딘, 4-티오-1-메틸- 1-디아자-슈도이소시티딘, 1-메틸-1-디아자-슈도이소시티딘, 제부라린, 5-아자-제부라린, 5-메틸-제부라린, 5-아자-2-티오-제부라린, 2-티오-제부라린, 2-메톡시-시티딘, 2-메톡시-5-메틸-시티딘, 4-메톡시-슈도이소시티딘, 및 4-메톡시-1-메틸-슈도이소시티딘, 2-아미노퓨린, 2, 6-디아미노퓨린, 7-디아자-아데닌, 7-디아자-8-아자-아데닌, 7-디아자-2-아미노퓨린, 7-디아자-8-아자-2-아미노퓨린, 7-디아자-2,6-디아미노퓨린, 7-디아자-8-아자-2,6-디아미노퓨린, 1-메틸아데노신, N6-메틸아데노신, N6-이소펜테닐아데노신, N6-(시스-하이드록시이소펜테닐)아데노신, 2-메틸티오-N6-(시스-하이드록시이소펜테닐) 아데노신, N6-글리시닐카바모일아데노신, N6-트레오닐카바모일아데노신, 2-메틸티오-N6-트레오닐 카바모일아데노신, N6,N6-디메틸아데노신, 7-메틸아데닌, 2-메틸티오-아데닌, 및 2-메톡시-아데닌, 이노신, 1-메틸-이노신, 와이오신, 위부토신, 7-디아자-구아노신, 7-디아자-8-아자-구아노신, 6-티오-구아노신, 6-티오-7-디아자-구아노신, 6-티오-7-디아자-8-아자-구아노신, 7-메틸-구아노신, 6-티오-7-메틸-구아노신, 7-메틸이노신, 6-메톡시-구아노신, 1-메틸구아노신, N2-메틸구아노신, N2,N2-디메틸구아노신, 8-옥소-구아노신, 7-메틸-8-옥소-구아노신, 1-메틸-6-티오-구아노신, N2-메틸-6-티오-구아노신, 및 N2,N2-디메틸-6-티오-구아노신, 5’-O-(1-티오포스페이트)-아데노신, 5’-O-(1-티오포스페이트)-시티딘, 5’-O-(1-티오포스페이트)-구아노신, 5’-O-(1-티오포스페이트)-우리딘, 5’-O-(1-티오포스페이트)-슈도우리딘, 6-아자-시티딘, 2-티오-시티딘, 알파-티오-시티딘, 슈도-이소-시티딘, 5-아미노알릴-우리딘, 5-아이오도-우리딘, N1-메틸-슈도우리딘, 5,6-디하이드로우리딘, 알파 -티오-우리딘, 4-티오-우리딘, 6-아자-우리딘, 5-하이드록시-우리딘, 디옥시-티미딘, 5-메틸-우리딘, 피롤로-시티딘, 이노신, 알파 -티오-구아노신, 6-메틸-구아노신, 5-메틸-시티딘(cytdine), 8-옥소-구아노신, 7-디아자-구아노신, N1-메틸-아데노신, 2-아미노-6-클로로-퓨린, N6-메틸-2-아미노-퓨린, 슈도-이소-시티딘, 6-클로로-퓨린, N6-메틸-아데노신, 알파 -티오-아데노신, 8-아지도-아데노신, 7-디아자-아데노신로 구성된 염기 변형된 뉴클레오티드 그룹으로부터 선택된 염기 변형을 위한 뉴클레오티드가 특히 바람직하다. 본 발명의 맥락에서 특히 바람직하고 적합한 것은 슈도우리딘 (ψ), N1- 메틸슈도우리딘 (m1ψ), 5-메틸시토신, 및 5-메톡시우리딘이다. 따라서, 본 발명에 정의된 인공 RNA는 슈도우리딘 (ψ), N1- 메틸슈도우리딘 (m1ψ), 5-메틸시토신, 및 5-메톡시우리딘으로부터 선택된 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 인공 RNA는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 코딩 서열은 슈도우리딘 (ψ) 변형 코딩 서열이다.
따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 인공 RNA 또는 적어도 하나의 코딩 서열은 핵산 서열을 포함하며, 여기서 적어도 하나 또는 하나 이상, 바람직하게는 여기서 모든 우라실 뉴클레오티드가 슈도우리딘 (ψ) 뉴클레오티드로 대체된다
추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 인공 RNA는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 코딩 서열은 N1-메틸슈도우리딘 (m1ψ) 변형 코딩 서열이다.
따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 인공 RNA 또는 적어도 하나의 코딩 서열은 핵산 서열을 포함하며, 여기서 적어도 하나 또는 하나 이상, 바람직하게는 여기서 모든 우라실 뉴클레오티드가 N1-메틸슈도우리딘 (m1ψ) 뉴클레오티드로 대체된다
바람직한 구현예에서, 본 발명의 인공 RNA는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 코딩 서열은 코돈 변형 코딩 서열이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 적어도 하나의 코딩 서열은 코돈 변형 코딩 서열이고, 여기서 적어도 하나의 코돈 변형 코딩 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열은 바람직하게는 상응하는 야생형 코딩 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열과 비교하여 변형되지 않는다.
용어 "코돈 변형 코딩 서열"은 상응하는 야생형 코딩 서열과 비교하여 적어도 하나의 코돈 (하나의 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드의 트리플렛)이 상이한 코딩 서열에 관한 것이다. 적합하게는, 본 발명의 맥락에서 코돈 변형 코딩 서열은 생체 내 분해에 대한 개선된 내성 및/또는 개선된 생체 내 안정성, 및/또는 개선된 생체 내 번역성을 나타낼 수 있다. 가장 넓은 의미에서 코돈 변형은 유전 코드의 축퇴성을 이용하는 데, 여기서 다수의 코돈은 동일한 아미노산을 암호화할 수 있고, 위에서 설명한 바와 같이 생체 내 적용을 위한 코딩 서열을 최적화/변형하기 위해 상호 교환적으로 사용될 수 있다 (표 2 참조).
특히 제1 측면의 바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 서열은 코돈 변형 코딩 서열이고, 여기서 상기 코돈 변형 코딩 서열은 C 최대화된 코딩 서열, CAI 최대화된 코딩 서열, 인간 코돈 사용 적합 코딩 서열, G/C 함량 변형된 코딩 서열, 및 G/C 최적화된 코딩 서열, 또는 이들의 임의의 조합, 또는 이들의 임의의 조합에서 선택된다.
바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 인공 RNA는 변형될 수 있으며, 여기서 적어도 하나의 코딩 서열의 C 함량은 상응하는 야생형 코딩 서열의 C 함량과 비교하여 증가, 바람직하게는 최대화될 수 있다 (본 명세서에서 "C 최대화된 코딩 서열"로 지칭됨). RNA의 C 최대화된 코딩 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열은 바람직하게는 각각의 야생형 핵산 코딩 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열에 비해 변형되지 않는다. C 최대화된 핵산 서열의 생성은 WO2015/062738에 따른 변형 방법을 사용하여 적절하게 수행될 수 있다. 이러한 맥락에서, WO2015/062738의 개시가 여기에 참조로 포함된다. 서열 목록의 <223> 식별자를 포함하는 본 발명의 개시 전체에 걸쳐, 적합한 RSV 핵산 서열의 C 최대화된 코딩 서열은 약어 "opt2"로 표시된다.
구현예에 따르면, 본 발명의 인공 RNA는 변형될 수 있으며, 여기서 본 발명의 적어도 하나의 코딩 서열의 G/C 함량은 상응하는 야생형 코딩 서열의 G/C 함량과 비교하여 변형될 수 있다 (이하 "G/C 함량 변형된 코딩 서열"). 이러한 맥락에서, 용어 "G/C 최적화" 또는 "G/C 함량 변형"은 상응하는 야생형 핵산 서열과 비교하여 변형된, 바람직하게는 증가된 수의 구아노신 및/또는 시토신 뉴클레오티드를 포함하는 핵산, 바람직하게는 본 발명의 인공 핵산과 관련된다. 이러한 증가된 수는 아데노신 또는 티미딘 뉴클레오티드를 함유하는 코돈을 구아노신 또는 시토신 뉴클레오티드를 함유하는 코돈으로 치환함으로써 생성될 수 있다. 풍부한 G/C 함량이 DNA 또는 RNA의 코딩 시퀀스에서 발생하면 유전 코드의 퇴화(degeneracy)를 이용한다. 특히 RNA의 경우 증가된 G (구아노신)/C (시토신) 함량을 갖는 서열은 A (아데노신)/U (우라실) 함량이 증가한 서열보다 안정적이다. 핵산 서열의 G/C 함량 변형된 코딩 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열은 바람직하게는 각각의 야생형 핵산 코딩 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열에 비해 변형되지 않는다. 바람직하게는, 인공 핵산 서열, 예를 들어 본 발명의 RNA 서열의 코딩 서열의 G/C 함량은 상응하는 야생형 핵산(예를 들어, RNA 서열)의 코딩 서열의 G/C 함량과 비교하여 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 더 바람직하게는 적어도 30%, 가장 바람직하게는 적어도 40% 증가되고, 이는 본 명세서에 정의된 RSV 항원 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화한다.
바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 인공 RNA는 변형될 수 있으며, 여기서 본 발명의 적어도 하나의 코딩 서열의 G/C 함량은 상응하는 야생형 코딩 서열의 G/C 함량과 비교하여 최적화될 수 있다 (본 명세서에서 "G/C 함량 최적화된 코딩 서열"). 그와 관련하여 "최적화된"은 G/C 함량이 바람직하게는 본질적으로 가능한 가장 높은 G/C 함량으로 증가되는 코딩 서열을 지칭한다. 핵산 서열의 G/C 함량 최적화된 코딩 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열은 바람직하게는 각각의 야생형 핵산 코딩 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열에 비해 변형되지 않는다. G/C 함량 최적화된 핵산 RNA 서열의 생성은 WO2002/098443에 따른 G/C 함량 최적화 방법을 사용하여 적절하게 수행될 수 있다. 이러한 맥락에서, WO2002/098443의 개시는 본 발명의 전체 범위에 포함된다. 서열 목록의 <223> 식별자를 포함하는 본 발명의 개시를 통해, 적합한 RSV 핵산 서열의 G/C 최적화된 코딩 서열은 약어 "opt1, opt5, opt6, opt11"로 표시된다.
구현예에 따르면, 본 발명의 인공 RNA는 변형될 수 있으며, 여기서 본 발명의 적어도 하나의 코딩 서열 내의 코돈은 인간 코돈 사용에 적합할 수 있다 (본 명세서에서 "인간 코돈 사용 적합 코딩 서열"로 지칭됨). 동일한 아미노산을 암호화하는 코돈은 대상체, 예를 들어 인간에서 다른 빈도로 발생한다. 따라서, 인공 RNA의 코딩 서열은 바람직하게는 동일한 아미노산을 암호화하는 코돈의 빈도가 예를 들어 표 2에 나타낸 바와 같이 인간 코돈 사용에 따라 그 코돈의 자연 발생 빈도에 상응하도록 변형된다. 예를 들어, 아미노산 Ala의 경우, 야생형 코딩 서열은 바람직하게는 코돈 "GCC"가 0.40의 빈도로 사용되고, 코돈 "GCT"가 0.28의 빈도로 사용되고, 코돈 "GCA"는 0.22의 빈도로 사용되고 및 코돈 "GCG"는 0.10 등의 빈도로 사용되는 방식으로 조정된다 (표 2 참조). 따라서, 이러한 절차 (Ala에 대해 예시됨)는 인간 코돈 사용에 적합한 서열을 얻기 위해 본 발명의 인공 핵산의 코딩 서열에 의해 암호화된 각 아미노산에 적용된다. 서열 목록의 <223> 식별자를 포함하는 본 발명의 개시 전체에 걸쳐, 적합한 RSV 핵산 서열의 인간 코돈 사용 적합 코딩 서열은 약어 "opt3"로 표시된다.
표 2: 각 아미노산에 대한 빈도가 표시된 인간 코돈 사용 표
아미노산 코돈 빈도 아미노산 코돈 빈도
Ala GCG 0.10 Pro CCG 0.11
Ala GCA 0.22 Pro CCA 0.27
Ala GCT 0.28 Pro CCT 0.29
Ala GCC* 0.40 Pro CCC* 0.33
Cys TGT 0.42 Gln CAG* 0.73
Cys TGC* 0.58 Gln CAA 0.27
Asp GAT 0.44 Arg AGG 0.22
Asp GAC* 0.56 Arg AGA* 0.21
Glu GAG* 0.59 Arg CGG 0.19
Glu GAA 0.41 Arg CGA 0.10
Phe TTT 0.43 Arg CGT 0.09
Phe TTC* 0.57 Arg CGC 0.19
Gly GGG 0.23 Ser AGT 0.14
Gly GGA 0.26 Ser AGC* 0.25
Gly GGT 0.18 Ser TCG 0.06
Gly GGC* 0.33 Ser TCA 0.15
His CAT 0.41 Ser TCT 0.18
His CAC* 0.59 Ser TCC 0.23
Ile ATA 0.14 Thr ACG 0.12
Ile ATT 0.35 Thr ACA 0.27
Ile ATC* 0.52 Thr ACT 0.23
Lys AAG* 0.60 Thr ACC* 0.38
Lys AAA 0.40 Val GTG* 0.48
Leu TTG 0.12 Val GTA 0.10
Leu TTA 0.06 Val GTT 0.17
Leu CTG* 0.43 Val GTC 0.25
Leu CTA 0.07 Trp TGG* 1
Leu CTT 0.12 Tyr TAT 0.42
Leu CTC 0.20 Tyr TAC* 0.58
Met ATG* 1 Stop TGA* 0.61
Asn AAT 0.44 Stop TAG 0.17
Asn AAC* 0.56 Stop TAA 0.22
*: 가장 빈번한 인간 코돈
구현예에 따르면, 본 발명의 인공 RNA는 변형될 수 있으며, 여기서 코돈 적응 지수 (CAI)는 본 발명의 적어도 하나의 코딩 서열에서 증가되거나 바람직하게 최대화될 수 있다 (본 명세서에서 "CAI 최대화된 코딩 서열"로 지칭됨). 따라서, 예를 들어 인간 세포에서 비교적 드문 야생형 핵산 서열의 모든 코돈은 예를 들어 인간 세포에서 빈번한 각각의 코돈으로 교환되는 것이 바람직하며, 여기서 상기 빈번한 코돈은 비교적 희귀한 코돈과 동일한 아미노산을 암호화한다. 적합하게는, 가장 빈번한 코돈이 각 암호화된 아미노산에 사용된다 (표 2 참조, 가장 빈번한 인간 코돈은 별표로 표시됨). 적합하게는, 본 발명의 인공 RNA는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하고, 여기서 상기 적어도 하나의 코딩 서열의 코돈 적응 지수 (CAI)는 적어도 0.5, 적어도 0.8, 적어도 0.9 또는 적어도 0.95이다. 가장 바람직하게는, 적어도 하나의 코딩 서열의 코돈 적응 지수 (CAI)는 1이다. 예를 들어, 아미노산 Ala의 경우, 가장 빈번한 인간 코돈 "GCC"가 항상 상기 아미노산에 사용되는 방식으로 야생형 코딩 서열이 조정된다. 따라서, 이러한 절차 (Ala에 대해 예시됨)는 CAI 최대화된 코딩 서열을 수득하기 위해 본 발명의 인공 RNA의 코딩 서열에 의해 암호화된 각 아미노산에 적용된다. 서열 목록의 <223> 식별자를 포함하는 본 발명의 개시 전체에서, 적합한 RSV 핵산 서열의 CAI 최대화된 코딩 서열은 약어 "opt4"로 표시된다.
따라서, 특히 바람직한 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA는 서열 번호: 70-77, 485-492, 899-906, 1268-1275, 1637-1644, 2006-2013, 2375-2382, 2744-2751, 3113-3120, 3482-3489, 3851-3858, 4220-4227, 4589-4596, 4958-4965, 5327-5334, 5696-5703, 6065-6072, 6434-6441, 6803-6810, 7172-7179, 7541-7548, 7910-7917, 11728-11734, 12097-12103, 12465-12472, 12834-12841, 13941-13948, 14310-14317, 14679-14686, 15048-15055, 15417-15424, 15786-15793, 13203-13210, 13572-13579, 16155-16162, 16524-16531, 16893-16900, 17262-17269, 17631-17638, 18000-18007, 18369-18376, 18738-18745, 19107-19114, 19476-19483, 21363-21384, 21389-21410 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 코돈 변형 핵산 서열과 동일한 또는 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코돈 변형 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함한다 (예를 들어 표 3 및 4 참조). 이들 적합한 핵산 서열 각각에 관한 추가 정보는 서열 목록, 특히 다음에 설명된 바와 같이 식별자 <223> 아래에 제공된 세부 사항으로부터 유래될 수도 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA는 서열 번호: 70-71, 75-77, 485-486, 490-492, 899-900, 904-906, 1268-1269, 1273-1275, 1637-1638, 1642-1644, 2006-2007, 2011-2013, 2375-2376, 2380-2382, 2744-2745, 2749-2751, 3113-3114, 3118-3120, 3482-3483, 3487-3489, 3852, 4221, 4590, 4959, 5328, 5697, 6066, 6435, 6804, 7173, 7542, 7911, 3856-3858, 4225-4227, 4594-4596, 4963-4965, 5332-5334, 5701-5703, 6070-6072, 6439-6441, 6808-6810, 7177-7179, 7546-7548, 7915-7917, 11728, 11732-11734, 12097, 12101-12103, 12465, 12466, 12470-12472, 12834, 12835, 12839-12841, 13941, 13942, 13946-13948, 14310, 14311, 14315-14317, 14679, 14680, 14684-14686, 15048, 15049, 15053-15055, 15417, 15418, 15422-15424, 15786, 15787, 15791-15793, 13203, 13204, 13208-13210, 13572, 13573, 13577-13579, 16155, 16156, 16160-16162, 16524, 16525, 16529-16531, 16893, 16894, 16898-16900, 17262, 17263, 17267-17269, 17631, 17632, 17636-17638, 18000, 18001, 18005-18007, 18369, 18370, 18374-18376, 18738, 18739, 18743-18745,19107, 19108, 19112-19114, 19476, 19477, 19481-19483, 21363-21384, 21389-21410 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체에 따른 G/C 최적화된 또는 G/C 함량 변형된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코돈 변형된 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함한다 (또한 예를 들어 표 3 및 4; opt1, 5, 6, 11 참조). 이들 적합한 핵산 서열 각각에 관한 추가 정보는 서열 목록, 특히 다음에 설명된 바와 같이 식별자 <223> 아래에 제공된 세부 사항으로부터 유래될 수도 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 인공 RNA는 서열 번호: 73, 488, 902, 1271, 1640, 2009, 2378, 2747, 3116, 3485, 3854, 4223, 4592, 4961, 5330, 5699, 6068, 6437, 6806, 7175, 7544, 7913, 11730, 12099, 12468, 12837, 13944, 14313, 14682, 15051, 15420, 15789, 13206, 13575, 16158, 16527, 16896, 17265, 17634, 18003, 18372, 18741, 19110, 19479 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체에 따른 인간 코돈 사용 적합 핵산 서열과 동일하거나 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코돈 변형된 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함한다 (또한 표 3 및 4; opt3 참조). 이들 적합한 핵산 서열 각각에 관한 추가 정보는 서열 목록, 특히 다음에 설명된 바와 같이 식별자 <223> 아래에 제공된 세부 사항으로부터 유래될 수도 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA는 서열 번호: 72, 487, 901, 1270, 1639, 2008, 2377, 2746, 3115, 3484, 3853, 4222, 4591, 4960, 5329, 5698, 6067, 6436, 6805, 7174, 7543, 7912, 11729, 12098, 12467, 12836, 13943, 14312, 14681, 15050, 15419, 15788, 13205, 13574, 16157, 16526, 16895, 17264, 17633, 18002, 18371, 18740, 19109, 19478 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체에 따른 C 최대화된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코돈 변형된 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함한다 (또한 표 3 및 4; opt2 참조). 이들 적합한 핵산 서열 각각에 관한 추가 정보는 서열 목록, 특히 다음에 설명된 바와 같이 식별자 <223> 아래에 제공된 세부 사항으로부터 유래될 수도 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 인공 RNA는 서열 번호 74, 489, 903, 1272, 1641, 2010, 2379, 2748, 3117, 3486, 3855, 4224, 4593, 4962, 5331, 5700, 6069, 6438, 6807, 7176, 7545, 7914, 11731, 12100, 12469, 12838, 13945, 14314, 14683, 15052, 15421, 15790, 13207, 13576, 16159, 16528, 16897, 17266, 17635, 18004, 18373, 18742, 19111, 19480 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체에 따른 CAI 최대화된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 코돈 변형된 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함한다 (또한 표 3 및 4; opt4 참조). 이들 적합한 핵산 서열 각각에 관한 추가 정보는 서열 목록, 특히 다음에 설명된 바와 같이 식별자 <223> 아래에 제공된 세부 사항으로부터 유래될 수도 있다.
구현예에서, 인공 핵산, 특히 본 발명의 인공 RNA의 리보솜 결합 부위의 환경에서 A/U 함량은 각각의 야생형 핵산의 리보솜 결합 부위 환경에서 A/U 함량에 비해 증가할 수 있다. 이러한 변형 (리보솜 결합 부위 주변의 증가된 A/U 함량)은 핵산, 바람직하게는 RNA에 대한 리보솜 결합의 효율성을 증가시킨다. 리보솜의 리보솜 결합 부위에 대한 효과적인 결합은 차례로 RNA의 효율적인 번역 효과를 갖는다. 따라서, 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 인공 핵산은 서열 번호: 41, 42 또는 이의 단편 또는 변이체 중 어느 하나와 동일하거나 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 동일한 "코작(Kozak) 서열"이라고도 하는 리보솜 결합 부위를 포함한다.
바람직한 RSV 폴리펩티드 및 핵산 코딩 서열 ("cds")은 표 3A 및 3B 및 표 4A 및 4B에 제공된다.
표 3A 및 3B에서, 컬럼 A 내지 J는 RSV 융합 (F) 단백질로부터 유래된 본 발명의 특정한 적합한 구조물을 나타내고, 여기서 컬럼 A는 F0에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 B는 F-del에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 C는 F0_DSCav1에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 D는 F-del_DSCav1에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 E는 F_DSCav1_mut1에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 F는 F-del_DSCav1_mut1에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 G는 F_DSCav1_mut2에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 H는 F-del_DSCav1_mut2에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 I는 F_DSCav1_mut3에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 J는 F-del_DSCav1_mut3에 적합한 서열을 제공한다. 서열 목록에서 제공된 특정 단백질 서열 번호는 2열 ("PRT")에 있다. 상응하는 야생형/비변형 코딩 서열의 서열 번호는 3열 ("wt")에 제공된다. 각 단백질 구조물에 대한 상응하는 코돈 변형된 코딩 서열의 서열 번호는 4열 내지 10열에 제공된다 (“opt1”, “opt2”, “opt3”, “opt4”, “opt5”, “opt6”, “opt11”). 표 3A에서, HRSV(A2)에서 유래된 코딩 서열이 제공되고, 표 3B에서 HRSV(Memphis-37)에서 유래된 코딩 서열이 제공된다. 추가 정보는 서열 목록에서 각각의 서열 번호 각각에 대한 <223> 식별자에 제공된다.
[표 3A]
표 3A: HRSV(A2)에서 유래된 RSV F (컬럼 A-J)를 암호화하는 바람직한 코딩 서열
Figure pct00001
[표 3B]
표 3B: HRSV(멤피스-37)에서 유래된 RSV F (컬럼 A-J)를 암호화하는 바람직한 코딩 서열
Figure pct00002
표 4A 및 4B에서, 컬럼 K 내지 V는 RSV 융합 (F) 단백질로부터 유래된 본 발명의 특정 적합한 구조물을 나타내며, 여기서 컬럼 K는 F_DSCav1_mut0에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 L는 F-del_DSCav1_mut0에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 M는 F_DSCav1_mut4에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 N는 F-del_DSCav1_mut4에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 O는 F_DSCav1_mut5에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 P는 F-del_DSCav1_mut5에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 Q는 F_DSCav1_mut6에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 R는 F-del_DSCav1_mut6에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 S는 F_DSCav1_mut7에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 T는 F-del_DSCav1_mut7에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 U는 F_DSCav1_mut8에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 V는 F-del_DSCav1_mut8에 적합한 서열을 제공한다. 서열 목록에서 제공된 특정 단백질 서열 번호는 2열 ("PRT")에 있다. 각 단백질 구조물에 대한 상응하는 코돈 변형 코딩 서열의 서열 번호는 3열 내지 9열에 제공된다 (“opt1”, “opt2”, “opt3”, “opt4”, “opt5”, “opt6”, “opt11”). 표 4A에서, HRSV(A2)에서 유래된 코딩 서열이 제공되고, 표 4B에서 HRSV(멤피스-37)에서 유래된 코딩 서열이 제공된다. 추가 정보는 서열 목록의 각각의 서열 번호 각각에 대한 <223> 식별자에 제공된다.
[표 4A]
표 4A: HRSV(A2)에서 유래된 RSV F (컬럼 K-V)를 암호화하는 바람직한 코딩 서열
Figure pct00003
[표 4B]
표 4B: HRSV(멤피스-37)에서 유래된 RSV F (컬럼 K-V)를 암호화하는 바람직한 코딩 서열
Figure pct00004
구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA는 모노시스트론, 바이시스트론 또는 멀티시스트론이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 인공 RNA는 모노시스트론이다.
용어 "모노시스트론 핵산(monocistronic nucleic acid)"또는 "모노시스트론 핵산(monocistronic nucleic acid)"은 당 업계의 통상의 기술자에 의해 이해되고 인식될 것이며, 예를 들어 본 명세서에 정의된 단지 하나의 코딩 서열을 포함하는 인공 RNA를 지칭하도록 의도된다. 본 명세서에 사용된 용어 "바이시스트론 핵산, 멀티시스트론 핵산(bicistronic nucleic acid, multicistronic nucleic acid)" 또는 "모노시스트론 RNA"는 당 업계의 통상의 기술자에 의해 이해되고 인식될 것이며, 예를 들어 2 개 (바이시스트론) 또는 그 이상 (멀티시스트론)의 코딩 서열을 가질 수 있는 인공 RNA를 지칭하도록 의도된다.
구현예에서, 본 발명의 인공 RNA는 모노시스트론이고 상기 모노시스트론 인공 RNA의 코딩 서열은 본 명세서에 정의된 RSV F로부터 유래된 적어도 2개의 상이한 항원성 펩티드 또는 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화한다. 따라서, 모노시스트론 인공 RNA의 적어도 하나의 코딩 서열은 아미노산 링커 서열과 함께 또는 없이 연결된 RSV, 바람직하게는 본 명세서에 정의된 RSV F로부터 유래된 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 이상의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화할 수 있고, 여기서 상기 링커 서열은 상기 정의된 견고한 링커, 유연한 링커, 절단 가능한 링커 (예를 들어, 자가-절단 펩티드), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다 (본 명세서에서 "다중-항원-구조물/핵산"으로 지칭됨).
구현예에서, 본 발명의 인공 RNA는 바이시스트론 또는 멀티시스트론이고 적어도 2개의 코딩 서열을 포함하며, 여기서 적어도 2개의 코딩 서열은 RSV, 바람직하게는 본 명세서에 정의된 RSV F로부터 유래된 2개 이상의 상이한 항원성 펩티드 또는 단백질, 또는 이들 중 임의의 단편 또는 변이체를 암호화한다. 따라서, 바이시스트론 또는 멀티시스트론 인공 RNA의 코딩 서열은 본 명세서에 정의된 별개의 항원성 단백질 또는 펩티드 또는 이의 단편 또는 변이체를 적합하게 암호화한다. 바람직하게는, 상기 바이시스트론 또는 멀티시스트론 인공 RNA의 코딩 서열은 적어도 하나의 IRES (내부 리보솜 진입 부위) 서열에 의해 분리될 수 있다. 따라서, "2개 이상의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는"이라는 용어는 이에 제한되지 않고 바이시스트론 또는 멀티시스트론 인공 RNA가 본 명세서에서 제공된 정의 내에서 상이한 RSV 또는 이들의 단편 또는 변이체의 예를 들어 적어도 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 (바람직하게는 상이한) 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 것을 의미할 수 있다. 대안적으로, 상기 바이시스트론 또는 멀티시스트론 인공 RNA는 예를 들어 본 명세서에 제공된 정의 내의 동일한 RSV 또는 단편 또는 변이체로부터 유래된 적어도 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 (바람직하게는 상이한) 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화할 수 있다. 그와 관련하여, 적합한 IRES 서열은 특허 출원 WO2017/081082의 서열 번호: 1566-1662에 따른 핵산 서열, 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체의 목록으로부터 선택될 수 있다. 이와 관련하여, IRES 서열에 관한 WO2017/081082의 개시는 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명의 맥락에서, 코딩 서열의 특정 조합은 본 명세서에 정의된 다중 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 핵산 조성물을 얻기 위해 모노시스트론, 바이시스트론 및 멀티시스트론 인공 핵산 및/또는 다중-항원-구조물/핵산의 임의의 조합에 의해 생성될 수 있음을 이해해야 한다.
바람직하게는, 본 명세서에 정의된 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 인공 RNA는 전형적으로 약 50 내지 약 20000, 또는 500 내지 약 20000 뉴클레오티드, 또는 약 500 내지 약 20000 뉴클레오티드, 또는 약 500 내지 약 10000 뉴클레오티드, 또는 약 1000 내지 약 10000 뉴클레오티드의, 또는 바람직하게는 약 1000 내지 약 5000 뉴클레오티드의, 또는 더욱더 바람직하게는 약 1000 내지 약 2500 뉴클레오티드의 길이를 포함한다.
바람직한 구현예에 따르면, 제1 측면의 인공 RNA는 mRNA, 자가 복제 RNA, 원형 RNA 또는 레플리콘 RNA일 수 있다.
구현예에서, 상기 인공 RNA는 원형 RNA이다. 본 명세서에 사용된, "원형 RNA" 또는 "circRNA"는 본 명세서에서 정의된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화할 수 있는 원형 폴리뉴클레오티드로 이해되어야 한다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 상기 원형 RNA는 본 명세서에 정의된 RSV 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함한다. circRNA의 생산은 당 업계에 제공된 다양한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, US6210931은 자발적 절단 및 자가 원형화 능력을 갖는 서열을 포함하는 플라스미드에 DNA 단편을 삽입하여 circRNA를 합성하는 방법을 교시한다. US5773244는 RNA 시클라제 리보자임을 암호화하는 DNA 구조물을 만들고, DNA 구조물을 RNA로 표현하고, 그 후 RNA가 자가 스플라이스를 하도록 하여 circRNA를 생산한느 방법을 교시하며, 이는 시험관 내 인트론이 없는 circRNA를 생성한다. WO1992/001813은 선형 폴리뉴클레오티드를 합성하고, 선형 뉴클레오티드를 혼성화 조건 하에서 상보적 결합한 올리고뉴클레오티드와 결합하고, 선형 폴리뉴클레오티드를 연결(ligating)함으로써 단일가닥 원형 핵산을 만드는 과정을 교시한다. 통상의 기술자는 또한 WO2015/034925 또는 WO2016/011222에 제공된 방법을 사용하여 원형 RNA를 생산할 수 있다. 따라서, US6210931, US5773244, WO1992/001813, WO2015/034925 및 WO2016/011222에 제공된 바와 같은 원형 RNA를 생산하는 방법은 본 명세서에 참조로 포함된다.
구현예에서, 상기 인공 RNA는 레플리콘 RNA이다. 용어 "레플리콘 RNA(replicon RNA)"는 당 업계의 통상의 기술자에 의해 이해되고 인식될 것이며, 예를 들어 최적화된 자가 복제 인공 RNA 구조물을 의도한 것이다. 이러한 구조물은 알파바이러스로부터 유래된 복제 요소 (복제효소) 및 관심 인공 핵산으로 구조적 바이러스 단백질의 치환 (본 발명과 관련하여, RSV에서 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 인공 핵산)을 포함한다. 대안적으로, 상기 복제효소는 예를 들어 셈 리키 포레스트 바이러스 (SFV), 신드비스 바이러스 (SIN), 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEE), 로스-리버 바이러스 (RRV) 또는 기타 알파바이러스 패밀리에 속하는 바이러스로부터 유래된 복제효소 RNA 서열을 포함하는 독립적인 구조물 상에 제공될 수 있다. 복제효소의 하류에는 본 발명의 인공 핵산, 즉 RSV로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 인공 핵산의 복제를 제어하는 서브-게놈 프로모터가 있다.
바람직한 구현예에서 제1 측면의 인공 RNA는 mRNA이다.
용어 "RNA" 및 "mRNA" 당 업계의 통상의 기술자에 의해 이해되고 인식될 것이며, 예를 들어 리보 핵산 분자, 즉 뉴클레오티드로 구성된 중합체로 의도된다. 이러한 뉴클레오티드는 일반적으로 소위 백본을 따라 서로 연결된 아데노신-모노포스페이트, 우리딘-모노포스페이트, 구아노신-모노포스페이트 및 시티딘-모노 포스페이트 단량체이다. 상기 백본은 제1의 당, 즉 리보스와 인접한 제2 단량체의 포스페이트 모이어티 사이의 포스포디에스테르 결합에 의해 형성된다. 단량체의 특정 연속을 RNA-서열이라고 한다. mRNA (메신저 RNA)는 일반적으로 특정 펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열로 번역될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 제공한다.
상기 인공 RNA, 바람직하게는 본 발명의 mRNA는 예를 들어 고체상 RNA 합성과 같은 화학적 합성뿐만 아니라 RNA 시험관 내 전사 반응과 같은 시험관 내 방법을 포함하는 당 업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 인공 RNA, 바람직하게는 mRNA는 RNA 시험관 내 전사에 의해 얻어진다.
따라서, 본 발명의 RNA는 바람직하게는 시험관 내 전사된 RNA이다.
용어 "RNA 시험관 내 전사" 또는 "시험관 내 전사"는 RNA가 무세포 시스템 (시험관 내)에서 합성되는 과정과 관련된다. RNA는 본 발명에 따라 선형화된 플라스미드 DNA 주형 또는 PCR 증폭된 DNA 주형인 적절한 DNA 주형의 DNA 의존적 시험관 내 전사에 의해 얻을 수 있다. RNA 시험관 내 전사를 제어하기 위한 프로모터는 임의의 DNA 의존성 RNA 중합 효소에 대한 임의의 프로모터일 수 있다. DNA 의존성 RNA 중합 효소의 특정 예는 T7, T3, SP6 또는 Syn5 RNA 중합 효소이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 DNA 주형은 RNA 시험관 내 전사에 적용되기 전에 적합한 제한 효소로 선형화된다.
RNA 시험관 내 전사에 사용되는 시약은 일반적으로 다음을 포함한다: 박테리오파지 암호화된 RNA 중합 효소 (T7, T3, SP6, 또는 Syn5)와 같은 각각의 RNA 중합 효소에 대해 높은 결합 친화성을 갖는 프로모터 서열을 가진 DNA 주형 (선형화된 플라스미드 DNA 또는 PCR 산물); 4개의 염기 (아데닌, 시토신, 구아닌 및 우라실)에 대한 리보뉴클레오티드 트리포스페이트 (NTP); 선택적으로, 본 명세서에 정의된 캡 유사체 (예를 들어, m7G(5’)ppp(5’)G (m7G, m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG 또는 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG)); 선택적으로, 본 명세서에 정의된 추가 변형된 뉴클레오티드; DNA 주형 내의 프로모터 서열에 결합할 수 있는 DNA-의존적 RNA 중합 효소 (예를 들어, T7, T3, SP6, 또는 Syn5 RNA 중합 효소); 선택적으로, 잠재적으로 오염될 수 있는 리보뉴클레아제 (RNase) 억제자를 비활성화하는 RNase; 선택적으로, RNA 시험관 내 전사를 억제할 수 있는 파이로포스페이트를 분해하는 파이로포스파타제; 중합 효소의 보조 인자로 Mg2+ 이온을 공급하는 MgCl2; 또한 항산화제 (예를 들어 DTT), 및/또는 최적 농도의 스페르미딘과 같은 폴리아민을 포함할 수 있는 적절한 pH 값을 유지하기 위한 완충제 (TRIS 또는 HEPES), 예를 들어 WO2017/109161에 개시된 TRIS-시트레이트를 포함하는 버퍼 시스템.
구현예에서, RNA 시험관 내 전사에 사용되는 뉴클레오티드 혼합물은 본 명세서에 정의된 변형된 뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 그러한 맥락에서, 바람직한 변형된 뉴클레오티드는 슈도우리딘 (ψ), N1-메틸슈도우리딘 (m1ψ), 5-메틸시토신, 및/또는 5-메톡시우리딘을 포함한다.
바람직한 구현예에서, RNA 시험관 내 전사 반응에 사용되는 뉴클레오티드 혼합물 (즉, 상기 혼합물에서 각 뉴클레오티드의 분획)은 바람직하게는 WO2015/188933에 기재된 바와 같이 주어진 RNA 서열에 대해 최적화될 수 있다.
본 명세서에 정의된 하나 이상의 상이한 인공 RNA가 생성되어야 하는 구현예에서, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 상이한 인공 RNA가 생산되어야 하는 경우 (예를 들어, 상이한 RSV F 항원 또는 예를 들어 RSV F와 RSV G의 조합을 암호화함; 제2 측면 참조), WO2017/109134에 기재된 절차가 적합하게 사용될 수 있다.
RNA 백신 생산과 관련하여, GMP 등급 RNA를 제공해야할 수도 있다. GMP 등급 RNA는 규제 당국에서 승인한 제조 공정을 사용하여 생산할 수 있다. 따라서, 특히 바람직한 구현예에서, RNA 생산은 바람직하게는 WO2016/180430에 따라 DNA 및 RNA 수준에 대한 다양한 품질 관리 단계를 구현하는 현재의 GMP (good manufacturing practice)에서 수행된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 RNA는 GMP 등급 RNA, 특히 GMP 등급 mRNA이다.
상기 수득된 RNA 생성물은 바람직하게는 PureMessenger® (CureVac, 튀빙엔, 독일; WO2008/077592에 따른 RP-HPLC) 및/또는 접선유동여과 (tangential flow filtration) (WO2016/193206에서 설명됨)를 사용하여 정제된다.
추가의 바람직한 구현예에서, 상기 RNA, 특히 정제된 RNA는 본 명세서에 정의된 바와 같이 온도에 안정한 건조 인공 RNA (분말)를 생성하기 위해 WO2016/165831 또는 WO2011/069586에 따라 동결 건조된다.본 발명의 RNA, 특히 정제된 RNA는 또한 본 명세서에 정의된 온도 안정 RNA (분말)를 생성하기 위해 WO2016/184575 또는 WO2016184576에 따른 분무 건조 또는 분무 동결 건조를 사용할 수 있다. 따라서, RNA 제조 및 정제와 관련하여, WO2017/109161, WO2015/188933, WO2016/180430, WO2008/077592, WO2016/193206, WO2016/165831, WO2011/069586, WO2016/184575, 및 WO2016/184576의 개시 내용이 본 명세서에 참조로 포함된다.
따라서, 바람직한 구현예에서, 상기 RNA는 건조된 RNA, 특히 건조된 mRNA이다.
본 명세서에 사용된 용어 "건조된 RNA(dried RNA)"는 온도에 안정한 건조된 RNA (분말)를 얻기 위해 상기 정의된 바와 같이 동결 건조, 또는 분무 건조 또는 분무 동결 건조된 RNA로 이해되어야 한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 인공 RNA는 정제된 RNA, 특히 정제된 mRNA이다.
본 명세서에 사용된 용어 "정제된 RNA" 또는 "정제된 mRNA"는 출발 물질 (예를 들어, 시험관 내 전사된 RNA)보다 특정 정제 단계 (예를 들어, HPLC, TFF, 올리고 d(T) 정제, 침전 단계) 후 순도가 높은 RNA로 이해해야 한다. 정제된 RNA에 본질적으로 존재하지 않는 전형적인 불순물은 펩티드 또는 단백질 (예를 들어, DNA 의존성 RNA 시험관 내 전사에서 유래된 효소, 예를 들어 RNA 중합 효소, RNase, 피로포스파타아제, 제한 엔도뉴클레아제, DNase), 스페르미딘, BSA, 미숙(abortive) RNA 서열, RNA 단편 (짧은 이중 가닥 RNA 단편, 미숙 서열 등), 유리 뉴클레오티드 (변형된 뉴클레오티드, 기존 NTP, 캡 유사체), 주형 DNA 단편, 완충 성분 (HEPES, TRIS, MgCl2) 등을 포함한다. 예를 들어 발효 절차에서 유래될 수 있는 다른 잠재적 불순물에는 박테리아 불순물 (바이오버든, 박테리아 DNA) 또는 정제 절차에서 유래된 불순물 (유기 용매 등)이 포함된다. 따라서, 이와 관련하여 "RNA 순도의 정도"는 가능한 한 100%에 가까운 것이 바람직하다. 전장 RNA 전사체의 양이 가능한 한 100%에 가까운 것이 RNA 순도의 정도에 대해서도 바람직하다. 따라서 본 명세서에서 사용되는 "정제된 RNA"는 75%, 80%, 85% 이상, 가장 특별히 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 가장 바람직하게는 99% 또는 그 이상의 순도를 갖는다. 상기 순도의 정도는 예를 들어 분석 HPLC에 의해 결정될 수 있으며, 여기서 상기 제공된 백분율은 표적 RNA에 대한 피크 면적과 부산물을 나타내는 모든 피크의 총면적 사이의 비율에 해당한다. 대안적으로, 상기 순도의 정도는 예를 들어 분석 아가로스 겔 전기영동 또는 모세관 겔 전기영동에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에 정의된 "건조된 RNA" 및 본 명세서에 정의된 "정제된 RNA" 또는 본 명세서에 정의된 "GMP 등급 mRNA"는 우수한 안정성 특성 (시험관 내, 생체내) 및 개선된 효율 (예를 들어 mRNA 생체내의 더 나은 번역 가능성)을 가질 수 있고 따라서 본 발명과 관련하여 특히 적합함을 이해해야 한다. 더욱이, 본 명세서에 정의된 "건조된 RNA" 및 본 명세서에 정의된 "정제된 RNA" 또는 "GMP-등급 mRNA"는 본 명세서에 정의된 의학적 용도에 특히 적합할 수 있다.
상기 인공 RNA는 5'-캡 구조의 추가에 의해 적절하게 변형될 수 있으며, 이는 바람직하게는 본 명세서에 기재된 바와 같이 핵산을 안정화시킨다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA는 5'-캡 구조, 바람직하게는 m7G, 캡0 (예를 들어, m7G(5’)ppp(5’)G), 캡1 (예를 들어, m7G(5')ppp(5')(2'OMeG) 또는 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)), 캡2, 변형된 캡0, 또는 변형된 캡1 구조 (아래 정의된 캡 유사체를 사용하여 생성됨)를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "5'-캡 구조"는 당 업계의 통상의 기술자에 의해 이해되고 인식될 것이며, 예를 들어 RNA 분자, 예를 들어 mRNA 분자의 5'-말단에 추가된 변형된 뉴클레오티드 (캡 유사체), 특히 구아닌 뉴클레오티드를 의미하는 것으로 의도된다. 바람직하게는, 상기 5'-캡은 5'-5'-트리포스페이트 결합 (또한 m7GpppN으로 명명됨)을 사용하여 첨가된다. 5'-캡 구조의 추가 예시들은 글리세릴, 역 디옥시 무염기 잔기 (모이어티), 4’,5’ 메틸렌 뉴클레오티드, 1-(베타-D-에리스로푸라노실) 뉴클레오티드, 4’-티오 뉴클레오티드, 카보사이클릭 뉴클레오티드, 1,5-안하이드로헥시톨 뉴클레오티드, L-뉴클레오티드s, 알파-뉴클레오티드, 변형된 염기 뉴클레오티드, 스레오-펜토푸라노실 뉴클레오티드, 무고리 3’,4’-세코 뉴클레오티드, 무고리 3,4-디하이드록시부틸 뉴클레오티드, 무고리 3,5 디하이드록시펜틸 뉴클레오티드, 3’-3’-역 뉴클레오티드 모이어티, 3’-3’-역 무염기 모이어티, 3’-2’-역 뉴클레오티드 모이어티, 3’-2’-역 무염기 모이어티, 1,4-부탄디올 포스페이트, 3’-포스포라미데이트, 헥실포스페이트, 아미노헥실 포스페이트, 3’-포스페이트, 3’포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 또는 가교 또는 비가교 메틸포스포네이트 모이어티를 포함한다.
본 발명의 맥락에서 적합할 수 있는 추가 5'-캡 구조는 캡1 (m7GpppN의 인접 뉴클레오티드의 리보스의 추가적인 메틸화), 캡2 (m7GpppN의 하류의 두 번째 뉴클레오티드의 리보스의 추가적인 메틸화), 캡3 (m7GpppN의 하류의 세 번째 뉴클레오티드의 리보스의 추가적인 메틸화), 캡4 (m7GpppN의 하류의 네 번째 뉴클레오티드의 리보스의 추가적인 메틸화), ARCA (항역전사 캡 유사체), 변형된 ARCA (예를 들어, 포스포티오에이트 변형된 ARCA), 이노신, N1-메틸-구아노신, 2’-플루오로-구아노신, 7-디아자-구아노신, 8-옥소-구아노신, 2-아미노-구아노신, LNA-구아노신, 및 2-아지도-구아노신이다.
5'-캡 (캡0 또는 캡1) 구조는 화학적 RNA 합성 또는 바람직하게는 캡 유사체를 사용하는 RNA 시험관 내 전사 (공동 전사 캡핑)에서 형성될 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “캡 유사체(cap analogue)”는 당 업계의 통상의 기술자에 의해 이해되고 인식될 것이며, 예를 들어, 이는 번역 또는 국소화를 촉진하고, 및/또는 핵산 분자의 5'-말단에 혼입될 때 핵산 분자, 바람직하게는 RNA 분자의 분해를 방지한다는 점에서 캡 기능성을 갖는 중합 불가능한 디뉴클레오티드를 지칭하는 것으로 의도된다. 중합 불가능이란 5' 트리포스페이트가 없어서 주형 의존성 중합 효소, 특히 주형 의존성 RNA 중합 효소에 의해 3'-방향으로 확장될 수 없기 때문에 캡 유사체가 5'-말단에만 통합된다는 것을 의미한다. 캡 유사체의 예는 m7GpppG, m7GpppA, m7GpppC; 비메틸화된 캡 유사체 (예를 들어, GpppG); 디메틸화된 캡 유사체 (예를 들어, m2,7GpppG), 트리메틸화된 캡 유사체 (예를 들어, m2,2,7GpppG), 디메틸화된 대칭 캡 유사체 (예를 들어, m7Gpppm7G), 또는 안티 리버스 캡 유사체 (예를 들어, ARCA; m7,2’OmeGpppG, m7,2’dGpppG, m7,3’OmeGpppG, m7,3’dGpppG 및 이들의 테트라포스페이트 유도체)로 이루어진 군에서 선택되는 화학 구조를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 추가 캡 유사체는 이전에 설명되었다 (WO2008/016473, WO2008/157688, WO2009/149253, WO2011/015347, 및 WO2013/059475). 이러한 맥락에서 추가로 적합한 캡 아날로곤(analogon)은 WO2017/066793, WO2017/066781, WO2017/066791, WO2017/066789, WO2017/053297, WO2017/066782, WO2018075827 및 WO2017/066797에 기재되어 있으며 여기서 캡 유사체를 언급하는 개시 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
5'-캡 구조는 본 명세서에 정의된 RNA 시험관 내 전사 반응에서 본 명세서에 정의된 캡-유사체를 사용하여 적절하게 공동 전사적으로 첨가될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 변형된 캡1 구조는 WO2017/053297, WO2017/066793, WO2017/066781, WO2017/066791, WO2017/066789, WO2017/066782, WO2018075827 및 WO2017/066797에 개시된 바와 같이 캡 유사체를 사용하여 생성된다. 특히, WO2017/053297의 청구항 1-5에 개시된 구조로부터 유도될 수 있는 임의의 캡 구조는 변형된 캡1 구조를 공동 전사적으로 생성하는 데 적합하게 사용될 수 있다. 또한, WO2018075827의 청구항 1 또는 청구항 21에 정의된 구조로부터 유도될 수 있는 임의의 캡 구조는 변형된 캡1 구조를 공동 전사적으로 생성하는 데 적합하게 사용될 수 있다.
바람직한 캡-유사체는 캡0 구조를 공동 전사적으로 생성하기 위한 디뉴클레오티드 캡 유사체 m7G(5’)ppp(5’)G (m7G) 또는 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G이다. 특히 바람직한 캡-유사체는 캡1 구조를 공동 전사적으로 생성하기 위한 트리-뉴클레오티드 캡 유사체 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG 또는 m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG이다.
이러한 맥락에서, 본 발명의 RNA는 상기 정의된 캡1 구조를 포함하는 것이 바람직하며, 이는 바람직하게는 예를 들어 높은 캡핑 효율 및 증가된 번역 효율을 통해 증가된 단백질 발현을 초래한다. 더욱 적합하게는, 캡1 구조를 포함하는 본 발명의 RNA는 동일한 핵산 서열의 캡0 구조에 비해 선천 면역계의 감소된 자극을 나타낸다. 통상의 기술자는 번역 효율, 캡핑 정도 및 면역 자극을 결정하는 방법을 알고 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 제1 측면의 인공 RNA는 캡1 구조를 포함하며, 여기서 상기 캡1 구조는 효소적으로 또는 공동 전사적으로 형성될 수 있다 (예를 들어, m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG 또는 m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG 유사체를 사용함).
바람직한 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA는 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG 캡 구조를 포함한다. 이러한 구현예에서, 상기 코딩 RNA는 5' 말단 m7G 캡, 및 m7GpppN의 인접한 뉴클레오티드의 리보스의 추가 메틸화, 이 경우 2'O 메틸화 아데노신을 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA는 m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG 캡 구조를 포함한다. 이러한 구현예에서, 상기 코딩 RNA는 5' 말단 m7G 캡, 및 인접한 뉴클레오티드의 리보스의 추가 메틸화, 이 경우 2'O 메틸화 구아노신을 포함한다.
따라서, 본 발명의 맥락에서 적합한 RNA 또는 mRNA 서열이 언급될 때마다, 상기 RNA 또는 mRNA 서열의 첫 번째 뉴클레오티드, 즉 m7G(5')ppp 구조의 하류 뉴클레오티드는 2'O 메틸화 구아노신 또는 2'O 메틸화 아데노신일 수 있다.
따라서, 다른 구현예에서, 본 발명의 인공 RNA는 서열 번호: 43 또는 21321에 따른 5'-캡 서열 요소, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 캡0 또는 캡1 또는 캡2 구조를 생성하기 위해 캡핑 효소 (예를 들어 우두 바이러스 캡핑 효소, 시판되는 캡핑 키트)를 사용하는 효소 캡핑을 통해 5'-캡 구조를 추가한다.다른 구현예에서, 상기 5'-캡 구조 (캡0, 캡1)는 고정화된 캡핑 효소, 예를 들어 캡핑 반응기(WO2016/193226)를 사용하여 효소 캡핑을 통해 추가된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 인공 RNA는 폴리(A) 서열, 바람직하게는 30 내지 150개의 아데노신 뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 폴리(A) 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 상기 폴리(A) 서열, 3' 말단에 적합하게 위치한 폴리(A) 서열은 10 내지 500 아데노신 뉴클레오티드, 10 내지 200 아데노신 뉴클레오티드, 40 내지 200 아데노신 뉴클레오티드 또는 40 내지 150 아데노신 뉴클레오티드를 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 상기 폴리(A) 서열은 약 64 아데노신 뉴클레오티드를 포함한다. 더욱 특히 바람직한 구현예에서, 상기 폴리(A) 서열은 75 아데노신 뉴클레오티드를 포함한다. 더욱 특히 바람직한 구현예에서, 상기 폴리(A) 서열은 약 100 아데노신 뉴클레오티드를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “폴리(A) 서열”, “폴리(A) 테일(tail)” 또는 “3'-폴리(A) 테일”은 당 업계의 통상의 기술자에 의해 이해되고 인식될 것이며, 예를 들어 전형적으로 1000 아데노신 뉴클레오티드 이하의 RNA의 3'-말단에 위치한 아데노신 뉴클레오티드의 서열로 의도된다. 바람직하게는, 상기 폴리(A) 서열은 본질적으로 동종중합체성, 예를 들어 본질적으로 100개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 100 아데노신 뉴클레오티드의 폴리(A) 서열이다. 다른 구현예에서, 상기 폴리(A) 서열은 아데노신 뉴클레오티드, 예를 들어, 100 뉴클레오티드 이상의 길이를 가질 수 있는 100 아데노신 뉴클레오티드의 폴리(A) 서열과 다른 적어도 하나의 뉴클레오티드에 의해 중단될 수 있다 (100 아데노신 뉴클레오티드 및 추가로 아데노신 뉴클레오티드와 다른 상기 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함함).
본 발명과 관련하여, 폴리(A) 서열은 예를 들어 DNA 벡터를 전사함으로써 mRNA 또는 임의의 다른 핵산 분자, 예를 들어 DNA 벡터, 예를 들어 RNA, 바람직하게는 mRNA의 생성을 위한 주형 역할을 하는 벡터에 위치할 수 있다.
바람직하게는, 인공 RNA의 폴리(A) 서열은 RNA 시험관 내 전사 동안 DNA 주형으로부터 얻어진다. 다른 구현 예에서, 폴리(A) 서열은 DNA 주형에서 반드시 전사되지 않고 일반적인 화학적 합성 방법에 의해 시험관 내에서 얻어진다. 다른 구현예에서, 폴리(A) 서열은 시판되는 폴리아데닐화 키트 및 당 업계에 공지된 상응하는 프로토콜을 사용하여 RNA의 효소적 폴리아데닐화(RNA 시험관 내 전사 후)에 의해 생성되거나, 대안적으로, 고정된 폴리(A) 중합 효소를 사용하여, 예를 들어 폴리아데닐화 반응기(WO2016/174271에 개시됨)를 사용하여 생성된다.
구현예에서, 본 발명의 인공 RNA는 벡터로부터 유래된 폴리(A) 서열을 함유할 수 있고, 예를 들어 효소적 폴리아데 닐화, 예를 들어 WO2016/091391에 개시된 효소적 폴리아데닐화에 의해 생성된 적어도 하나의 추가 폴리(A) 서열을 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 인공 RNA는 적어도 하나의 폴리(C) 서열을 포함하며, 바람직하게는 10 내지 40 개의 시토신 뉴클레오티드를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 3'-말단에 위치한 적합한 상기 폴리 (C) 서열은 10 내지 200 시토신 뉴클레오티드, 10 내지 100 시토신 뉴클레오티드, 20 내지 70 시토신 뉴클레오티드, 20 내지 60 시토신 뉴클레오티드, 또는 10 내지 40 시토신 뉴클레오티드를 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 상기 폴리(C) 서열은 약 30 시토신 뉴클레오티드를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “폴리(C) 서열”은 당 업계의 통상의 기술자에 의해 이해되고 인식될 것이며, 예를 들어 전형적으로 RNA의 3'-말단에 위치하는 시토신 뉴클레오티드, 최대 약 200개의 시토신 뉴클레오티드의 서열로 의도된다. 본 발명과 관련하여, 폴리(C) 서열은 mRNA 또는 임의의 다른 핵산 분자 내, 예를 들어, DNA 벡터, 예를 들어, 벡터의 전사에 의해 RNA, 바람직하게는 mRNA의 생성을 위한 주형 역할을 하는 벡터 내에 위치할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 RNA 서열에서 폴리(C) 서열은 RNA 시험관 내 전사에 의해 DNA 주형으로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 폴리(C) 서열은 DNA 주형에서 반드시 전사되지 않고 일반적인 화학적 합성 방법에 의해 시험관 내에서 획득된다.
다른 구현예에서, 본 발명의 인공 RNA는 본 명세서에 정의된 폴리(C) 서열을 포함하지 않는다.
바람직한 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA는 적어도 하나의 히스톤 스템-루프를 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "히스톤 스템-루프(histone stem-loop)"는 당 업계의 통상의 기술자에 의해 이해되고 인식될 것이며, 예를 들어 히스톤 mRNA에서 우세하게 발견되는 핵산 서열을 지칭하는 것으로 의도된다. 예시적인 히스톤 스템-루프 서열은 Lopez et al. (Davila Lopez et al, (2008), RNA, 14(1))에 기재되어 있다. 상기 히스톤 사전-mRNA의 스템-루프는 일반적으로 히스톤 하류 요소 (HDE)로 알려진 퓨린이 풍부한 서열이 뒤따른다. 이러한 pre-mRNA는 U7 snRNA와 HDE의 염기 쌍을 통해 U7 snRNP에 의해 촉매되는 스템 루프의 하류에서 약 5개 뉴클레오티드의 단일 내핵 분해 절단에 의해 핵에서 처리된다.
히스톤 스템-루프 서열/구조는 WO2012/019780에 개시된 히스톤 스템-루프 서열로부터 적절하게 선택될 수 있으며, 히스톤 스템-루프 서열/구조에 관한 개시는 본 명세서에 참조로 포함된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 히스톤 스템-루프 서열은 바람직하게는 특허 출원 WO2012/019780의 화학식 (I) 또는 (II)로부터 유래될 수 있다. 추가의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 명세서에 정의된 RNA는 특허 출원 WO2012/019780의 특정 화학식 (Ia) 또는 (IIa) 중 적어도 하나로부터 유래된 적어도 하나의 히스톤 스템-루프 서열을 포함할 수 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 인공 RNA는 적어도 하나의 히스톤 스템-루프를 포함하고, 여기서 상기 히스톤 스템-루프는 서열 번호: 39 또는 40에 따른 핵산 서열 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
다른 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA는 본 명세서에 정의된 히스톤 스템-루프를 포함하지 않는다.
추가 구현예에서, 본 발명의 인공 RNA는 3'-말단 서열 요소를 포함한다. 상기 3'-말단 서열 요소는 폴리(A) 서열 및 히스톤-스템-루프 서열을 포함하는 서열 요소로서 이해되어야 하며, 여기서 상기 서열 요소는 본 발명의 인공 RNA의 3' 말단에 위치한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 인공 RNA는 서열 번호: 44-63 또는 21322-21328에 따른 3'-말단 서열 요소 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 인공 RNA는 적어도 하나의 슈도우리딘 (ψ) 변형 코딩 서열을 포함한다.
따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 인공 RNA 또는 적어도 하나의 코딩 서열은 핵산 서열을 포함하며, 여기서 적어도 하나 또는 하나 이상, 바람직하게는 여기서 모든 우라실 뉴클레오티드가 슈도우리딘 (ψ) 뉴클레오티드로 대체된다.
추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 인공 RNA는 적어도 하나의 N1-메틸슈도우리딘 (m1ψ) 변형 코딩 서열을 포함한다.
따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 인공 RNA 또는 적어도 하나의 코딩 서열은 핵산 서열을 포함하며, 여기서 적어도 하나 또는 하나 이상, 바람직하게는 여기서 모든 우라실 뉴클레오타이드가 N1-메틸슈도우리딘 (m1ψ) 뉴클레오티드로 대체된다
제1 측면의 바람직한 구현예에서, 상기 인공 RNA, 바람직하게는 mRNA는 다음 요소 a)-i)를 바람직하게는 5'-에서 3'- 방향으로 포함한다:
a) 5’-캡 구조, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 5'-캡 구조 ;
b) 선택적으로, 본 명세서에 명시된 5'-UTR, 바람직하게는 서열 번호: 1-22로부터 선택된 적어도 하나인 5'-UTR;
c) 리보솜 결합 부위, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 리보솜 결합 부위
d) 본 명세서에 명시된 코딩 서열, 바람직하게는 표 3 및 표 4에 명시된 적어도 하나의 코딩 서열;
e) 본 명세서에 명시된 3'-UTR, 바람직하게는 서열 번호: 23-38로부터 선택된 적어도 하나인 3'-UTR;
f) 선택적으로, 폴리(A) 서열, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 폴리(A) 서열 ;
g) 선택적으로, 폴리(C) 서열, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 폴리(C) 서열 ;
h) 선택적으로, 히스톤 스템-루프, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 히스톤 스템-루프;
i) 선택적으로, 3'-말단 서열 요소, 바람직하게는 서열 번호: 44-63, 또는 21322-21328에 따른 따른 본 명세서에 명시된 3'-말단 서열 요소; 및
여기서 선택적으로 적어도 하나 또는 하나 이상, 바람직하게는 여기서 모든 우라실 뉴클레오티드가 슈도우리딘 (ψ) 뉴클레오티드 또는 N1-메틸슈도우리딘 (m1ψ) 뉴클레오티드로 대체된다.
제1 측면의 추가적인 바람직한 구현예에서, 상기 인공 RNA, 바람직하게는 mRNA는 다음 요소를 바람직하게는 5'-에서 3'- 방향으로 포함한다:
a) 5'-캡 구조, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 5'-캡 구조, 가장 바람직하게는 캡1 구조;
b) 본 명세서에 명시된 a-1, a-4, c-1, e-4, g-2, i-2, 또는 i-3에 따른 3'-UTR 및 5'-UTR 요소;
c) 리보솜 결합 부위, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 리보솜 결합 부위;
d) 본 명세서에 명시된 적어도 하나의 코딩 서열, 여기서 상기 코딩 서열은 상기 5'-UTR 및 상기 3'-UTR 사이, 바람직하게는 상기 5'-UTR의 하류 및 상기 3'-UTR의 상류 사이에 위치하며, 여기서 상기 코딩 서열은 바람직하게는 표 3 및 표 4에 명시된 어느 하나에서 선택되며;
e) 선택적으로, 폴리(A) 서열, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 폴리(A) 서열 ;
f) 선택적으로, 폴리(C) 서열, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 폴리(C) 서열 ;
g) 선택적으로, 히스톤 스템-루프, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 히스톤 스템-루프;
h) 선택적으로, 3’-말단 서열 요소, 바람직하게는 서열 번호: 44-63, 또는 21322-21328에 따라 본 명세서에 명시된 3’-말단 서열 요소; 및
여기서 선택적으로 적어도 하나 또는 하나 이상, 바람직하게는 여기서 모든 우라실 뉴클레오티드가 슈도우리딘 (ψ) 뉴클레오티드 또는 N1-메틸슈도우리딘 (m1ψ) 뉴클레오티드로 대체된다.
제1 측면의 추가적인 바람직한 구현예에서, 상기 인공 RNA, 바람직하게는 mRNA는 다음 요소를 바람직하게는 5'-에서 3'- 방향으로 포함한다:
a) 5'-캡 구조, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 5'-캡 구조, 가장 바람직하게는 캡1 구조;
b) 본 명세서에 명시된 a-1 또는 i-3에 따른 3'-UTR 및 5'-UTR 요소;
c) 리보솜 결합 부위, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 리보솜 결합 부위
d) 본 명세서에 명시된 적어도 하나의 코딩 서열, 여기서 상기 코딩 서열은 상기 5'-UTR 및 상기 3'-UTR 사이, 바람직하게는 상기 5'-UTR의 하류 및 상기 3'-UTR의 상류 사이에 위치하며, 여기서 상기 코딩 서열은 바람직하게는 표 3 및 표 4에 명시된 어느 하나에서 선택되며;
e) 선택적으로, 히스톤 스템-루프, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 히스톤 스템-루프;
f) 폴리(A) 서열, 바람직하게는 약 100개의 아데노신 뉴클레오티드를 포함하는 폴리(A) 서열;
g) 선택적으로, 본 명세서에 명시된 3'-말단 서열 요소, 바람직하게는 서열 번호: 21322-21328에 따른 3'-말단 서열 요소; 및
여기서 선택적으로 적어도 하나 또는 하나 이상, 바람직하게는 여기서 모든 우라실 뉴클레오티드가 슈도우리딘 (ψ) 뉴클레오티드 또는 N1-메틸슈도우리딘 (m1ψ) 뉴클레오티드로 대체된다.
제1 측면의 추가적인 바람직한 구현예에서 상기 인공 RNA, 바람직하게는 mRNA는 다음 요소를 바람직하게는 5'-에서 3'- 방향으로 포함한다:
a) 5'-캡 구조, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 5'-캡 구조, 가장 바람직하게는 캡1 구조;
b) 본 명세서에 명시된 a-1, a-4, c-1, e-4, g-2, i-2, 또는 i-3에 따른 3'-UTR 및 5'-UTR 요소;
c) 리보솜 결합 부위, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 리보솜 결합 부위;
d) 본 명세서에 명시된 적어도 하나의 코딩 서열, 여기서 상기 코딩 영역은 상기 5'-UTR과 상기 3'-UTR 사이, 바람직하게는 상기 5'-UTR의 하류 및 상기 3'-UTR의 상류 사이에 위치하며, 여기서 상기 코딩 서열은 바람직하게는 서열 번호: 69-77, 484-492, 899-906, 1268-1275, 1637-1644, 2006-2013, 2375-2382, 2744-2751, 3113-3120, 3482-3489, 3851-3858, 4220-4227, 4589-4596, 4958-4965, 5327-5334, 5696-5703, 6065-6072, 6434-6441, 6803-6810, 7172-7179, 7541-7548, 7910-7917, 11727-11734, 12096-12103, 12465-12472, 12834-12841, 13941-13948, 14310-14317, 14679-14686, 15048-15055, 15417-15424, 15786-15793, 13203-13210, 13572-13579, 16155-16162, 16524-16531, 16893-16900, 17262-17269, 17631-17638, 18000-18007, 18369-18376, 18738-18745, 19107-19114, 19476-19483, 21363-21384, 21389-21410 중 어느 하나(또는 이의 단편 또는 변이체)로부터 선택되고;
e) 약 64개의 아데노신을 포함하는 폴리(A) 서열;
f) 약 30개의 시스테인을 포함하는 폴리(C) 서열;
g) 서열 번호: 39 또는 40에 따른 히스톤 스템-루프, 및
여기서 선택적으로 적어도 하나 또는 하나 이상, 바람직하게는 여기서 모든 우라실 뉴클레오티드가 슈도우리딘 (ψ) 뉴클레오티드 또는 N1-메틸슈도우리딘 (m1ψ) 뉴클레오티드로 대체된다.
제1 측면의 추가적인 바람직한 구현예에서 상기 인공 RNA, 바람직하게는 mRNA는 다음 요소를 바람직하게는 5'-에서 3'- 방향으로 포함한다:
a) 5’-캡 구조, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 5'-캡 구조, 가장 바람직하게는 캡1 구조;
b) 본 명세서에 명시된 a-1, a-4, c-1, e-4, g-2, i-2, 또는 i-3 에 따른 3'-UTR 및 5'-UTR 요소;
c) 리보솜 결합 부위, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 리보솜 결합 부위;
d) 본 명세서에 명시된 적어도 하나의 코딩 서열, 여기서 상기 코딩 영역은 상기 5'-UTR과 상기 3'-UTR 사이, 바람직하게는 상기 5'-UTR의 하류 및 상기 3'-UTR의 상류 사이에 위치하며, 여기서 상기 코딩 서열은 바람직하게는 서열 번호: 69-77, 484-492, 899-906, 1268-1275, 1637-1644, 2006-2013, 2375-2382, 2744-2751, 3113-3120, 3482-3489, 3851-3858, 4220-4227, 4589-4596, 4958-4965, 5327-5334, 5696-5703, 6065-6072, 6434-6441, 6803-6810, 7172-7179, 7541-7548, 7910-7917, 11727-11734, 12096-12103, 12465-12472, 12834-12841, 13941-13948, 14310-14317, 14679-14686, 15048-15055, 15417-15424, 15786-15793, 13203-13210, 13572-13579, 16155-16162, 16524-16531, 16893-16900, 17262-17269, 17631-17638, 18000-18007, 18369-18376, 18738-18745, 19107-19114, 19476-19483, 21363-21384, 21389-21410 중 어느 하나(또는 이의 단편 또는 변이체)로부터 선택되고;
e) 약 64개의 아데노신을 포함하는 폴리(A) 서열;
f) 서열 번호: 39 또는 40에 따른 히스톤 스템-루프, 및
여기서 선택적으로 적어도 하나 또는 하나 이상, 바람직하게는 여기서 모든 우라실 뉴클레오티드가 슈도우리딘 (ψ) 뉴클레오티드 또는 N1-메틸슈도우리딘 (m1ψ) 뉴클레오티드로 대체된다.
바람직한 RSV 폴리펩티드, 핵산 및 mRNA 서열은 표 5A, 5B 및 표 6A, 6B에 제공된다.
표 5A 및 5B에서 단백질 설계는 1행에 표시된다. 여기서, 컬럼 A 내지 J는 RSV 융합 (F) 단백질로부터 유래된 본 발명의 특정 적합한 구조물을 나타내며, 여기서 컬럼 A는 F0에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 B는 F-del에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 C는 F0_DSCav1에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 D는 F-del_DSCav1에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 E는 F_DSCav1_mut1에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 F는 F-del_DSCav1_mut1에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 G는 F_DSCav1_mut2에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 H는 F-del_DSCav1_mut2에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 I은 F_DSCav1_mut3에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 J은 F-del_DSCav1_mut3에 적합한 서열을 제공한다.
상기 단백질 설계는 1행 (컬럼 A 내지 J)에 표시되고, 서열 목록에 제공된 특정 단백질 서열 번호는 2행 ( "단백질")에 있다. 각 단백질 구조물에 대한 상응하는 코딩 서열의 서열 번호는 3행에 제공된다 ("cds", 상이한 cds 최적화에 대해 표 3과 비교). 예를 들어, 코돈 변형 코딩 서열의 유형 (opt1, opt2, opt3, opt4, opt5, opt6, opt11 등)에 관한 추가 정보는 서열 목록 및 표 3의 각 서열 번호의 <223> 식별자에 제공된다. 본 발명에 따른 상기 코딩 서열 및 적합한 3'-UTR 및 5'-UTR을 포함하는 상응하는 mRNA 구조물의 서열 번호는 4행 내지 47행에 제공된다(본 명세서에 명시된 mRNA 설계 a-1 내지 i-3). 표 5A에는 HRSV(A2)에서 유래된 mRNA 서열이 제공되고, 표 5B에서는 HRSV(Memphis-37)에서 유래된 mRNA 서열이 제공된다. 예를 들어 mRNA 구조물에 포함된 코딩 서열의 유형 (wt, opt1, opt2, opt3, opt4, opt5, opt6, opt11 등)에 관한 추가 정보는 서열 목록의 각 서열 번호의 <223> 식별자에 제공된다.
[표 5A]
표 5A: HRSV(A2)에서 유래된 RSV F (컬럼 A-J)를 암호화하는 바람직한 mRNA 구조물
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
[표 5B]
표 5B: HRSV(멤피스-37)에서 유래된 RSV F (컬럼 A-J)를 암호화하는 바람직한 mRNA 구조물
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
표 6A 및 6B에서 단백질 설계는 1행에 표시된다. 여기서, 컬럼 K 내지 V는 RSV 융합 (F) 단백질로부터 유래된 본 발명의 특정 적합한 구조물을 나타내며, 여기서 컬럼 K는 F_DSCav1_mut0에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 L은 F-del_DSCav1_mut0에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 M은 F_DSCav1_mut4에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 N은 F-del_DSCav1_mut4에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 O는 F_DSCav1_mut5에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 P는 F-del_DSCav1_mut5에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 Q은 F_DSCav1_mut6에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 R은 F-del_DSCav1_mut6에 적합한 시퀀스를 제공하고, 컬럼 S은 F_DSCav1_mut7에 적합한 시퀀스를 제공하고, 컬럼 T은 F-del_DSCav1_mut7에 적합한 시퀀스를 제공하고, 컬럼 U은 F_DSCav1_mut8에 적합한 시퀀스를 제공하고, 컬럼 V는 F-del_DSCav1_mut8에 적합한 시퀀스를 제공한다.
상기 단백질 설계는 1행 (컬럼 K 내지 V)에 표시되고, 서열 목록에 제공된 특정 단백질 서열 번호는 2행 ( "PRT")에 있다. 각 단백질 구조물에 대한 상응하는 코딩 서열의 서열 번호는 3행, "cds"에 제공된다 (상이한 cds 최적화에 대해 표 4와 비교). 예를 들어, 코돈 변형 코딩 서열의 유형 (opt1, opt2, opt3, opt4, opt5, opt6, opt11 등)에 관한 추가 정보는 서열 목록 및 표 4의 각 서열 번호의 <223> 식별자에 제공된다. 본 발명에 따른 상기 코딩 서열 및 적합한 3'-UTR 및 5'-UTR을 포함하는 상응하는 mRNA 구조물의 서열 번호는 각각의 다음 행에 제공된다(본 명세서에 명시된 mRNA 설계 "a-1" 내지 "i-3"). 표 6A에는 HRSV(A2)에서 유래된 mRNA 서열이 제공되고, 표 6B에서는 HRSV(Memphis-37)에서 유래된 mRNA 서열이 제공된다. 예를 들어 mRNA 구조물에 포함된 코딩 서열의 유형 (wt, opt1, opt2, opt3, opt4, opt5, opt6, opt11 등)에 관한 추가 정보는 서열 목록의 각 서열 번호의 <223> 식별자에 제공된다
예를 들어 mRNA 구조물에 포함된 코딩 서열의 유형에 관한 추가 정보는 서열 목록의 각 서열 번호의 <223> 식별자에 제공된다.
[표 6A]
표 6A: HRSV(A2)에서 유래된 RSV F (컬럼 K-V)를 암호화하는 바람직한 mRNA 구조물
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
[표 6B]
표 6B: HRSV(멤피스-37)에서 유래된 RSV F (컬럼 K-V)를 암호화하는 바람직한 mRNA 구조물
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
바람직한 구현예에서, 상기 인공 RNA는 서열 번호: 78-482, 493-897, 907-1266, 1276-1635, 1645-2004, 2014-2373, 2383-2742, 2752-3111, 3121-3480, 3490-3849, 3859-4218, 4228-4587, 4597-4956, 4966-5325, 5335-5694, 5704-6063, 6073-6432, 6442-6801, 6811-7170, 7180-7539, 7549-7908, 7918-8277, 8278, 21415-21480, 21561-21626, 11735-12094, 12104-12463, 12473-12832, 12842-13201, 13949-14308, 14318-14677, 14687-15046, 15056-15415, 15425-15784, 15794-16153, 13211-13570, 13580-13939, 16163-16522, 16532-16891, 16901-17260, 17270-17629, 17639-17998, 18008-18367, 18377-18736, 18746-19105, 19115-19474, 19484-19843, 21489-21552, 21635-21698 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 여기서, 선택적으로, 적어도 하나 또는 하나 이상, 또는 모든 우라실 뉴클레오티드가 슈도우리딘 (ψ) 뉴클레오티드 또는 N1-메틸슈도우리딘 (m1ψ) 뉴클레오티드로 대체된다.
바람직한 구현예에서, 상기 인공 RNA는 (a) 하나 이상의 이종 5' 비번역 영역 (5'-UTR) 및/또는 하나 이상의 이종 3' 비번역 영역 (3'-UTR) 및
(b) RSV F또는 이의 단편 또는 변이체로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 상기 3'-UTR 및/또는 5'-UTR에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 코딩 서열을 포함하고, 여기서
- 상기 인공 RNA는 서열 번호: 78-482, 11735-12094, 21415-21417, 21561-21563, 21489, 21490, 21635, 21636 (F0를 암호화함) 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
- 상기 인공 RNA는 서열 번호: 493-897, 12104-12463, 21418-21420, 21564-21566, 21491, 21492, 21637, 21638 (F-del를 암호화함) 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
- 상기 인공 RNA는 서열 번호: 907-1266, 12473-12832, 21421-21423, 21567-21569, 21493-21495, 21639-21641 (F0_DSCav1를 암호화함) 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
- 상기 인공 RNA는 서열 번호: 1276-1635, 8278, 12842-13201, 21424-21426, 21570-21572, 21496-21498, 21642-21644 (F-del_DSCav1를 암호화함) 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
- 상기 인공 RNA는 서열 번호: 1645-2004, 13949-14308, 21433-21435, 21579-21581, 21505-21507, 21651-21653 (F_DSCav1_mut1를 암호화함) 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
- 상기 인공 RNA는 서열 번호: 2014-2373, 14318-14677, 21436-21438, 21582-21584, 21508-21510, 21654-21656 (F-del_DSCav1_mut1를 암호화함) 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
- 상기 인공 RNA는 서열 번호: 2383-2742, 14687-15046, 21439-21441, 21585-21587, 21511-21513, 21657-21659 (F_DSCav1_mut2를 암호화함) 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
- 상기 인공 RNA는 서열 번호: 2752-3111, 15056-15415, 21442-21444, 21588-21590, 21514-21516, 21660-21662 (F-del_DSCav1_mut2를 암호화함) 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
- 상기 인공 RNA는 서열 번호: 3121-3480, 15425-15784, 21445-21447, 21591-21593, 21517-21519, 21663-21665 (F_DSCav1_mut3를 암호화함) 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
- 상기 인공 RNA는 서열 번호: 3490-3849, 15794-16153, 21448-21450, 21594-21596, 21520-21522, 21666-21668 (F-del_DSCav1_mut3를 암호화함) 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
- 상기 인공 RNA는 서열 번호: 3859-4218, 13211-13570, 21427-21429, 21573-21575, 21499-21501, 21645-21647 (F_DSCav1_mut0를 암호화함) 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
- 상기 인공 RNA는 서열 번호: 4228-4587, 13580-13939, 21430-21432, 21576-21578, 21502-21504, 21648-21650 (F-del_DSCav1_mut0를 암호화함) 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
- 상기 인공 RNA는 서열 번호: 4597-4956, 16163-16522, 21451-21453, 21597-21599, 21523-21525, 21669-21671 (F_DSCav1_mut4를 암호화함) 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
- 상기 인공 RNA는 서열 번호: 4966-5325, 16532-16891, 21454-21456, 21600-21602, 21526-21528, 21672-21674 (F-del_DSCav1_mut4를 암호화함) 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
- 상기 인공 RNA는 서열 번호: 5335-5694, 16901-17260, 21457-21459, 21603-21605, 21529-21531, 21675-21677 (F_DSCav1_mut5를 암호화함) 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
- 상기 인공 RNA는 서열 번호: 5704-6063, 17270-17629, 21460-21462, 21606-21608, 21532-21534, 21678-21680 (F-del_DSCav1_mut5를 암호화함) 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
- 상기 인공 RNA는 서열 번호: 6073-6432, 17639-17998, 21463-21465, 21609-21611, 21535-21537, 21681-21683 (F_DSCav1_mut6를 암호화함) 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
- 상기 인공 RNA는 서열 번호: 6442-6801, 18008-18367, 21466-21468, 21612-21614, 21538-21540, 21684-21686 (F-del_DSCav1_mut6를 암호화함) 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
- 상기 인공 RNA는 서열 번호: 6811-7170, 18377-18736, 21469-21471, 21615-21617, 21541-21543, 21687-21689 (F_DSCav1_mut7를 암호화함) 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
- 상기 인공 RNA는 서열 번호: 7180-7539, 18746-19105, 21472-21474, 21618-21620, 21544-21546, 21690-21692 (F-del_DSCav1_mut7를 암호화함) 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
- 상기 인공 RNA는 서열 번호: 7549-7908, 19115-19474, 21475-21477, 21621-21623, 21547-21549, 21693-21695 (F_DSCav1_mut8를 암호화함) 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
- 상기 인공 RNA는 서열 번호: 7918-8277, 19484-19843, 21478-21480, 21624-21626, 21550-21552, 21696-21698 (F-del_DSCav1_mut8를 암호화함) 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 및
여기서, 선택적으로, 적어도 하나 또는 하나 이상, 또는 여기서 모든 우라실 뉴클레오티드가 슈도우리딘 (ψ) 뉴클레오티드 또는 N1-메틸슈도우리딘 (m1ψ) 뉴클레오티드로 대체된다.
특히 바람직한 구현예에서, 상기 인공 RNA는 (a) 적어도 하나의 이종 5' 비번역 영역 (5'-UTR) 및/또는 적어도 하나의 이종 3' 비번역 영역 (3'-UTR)을 포함하고
(b) 상기 3'-UTR 및/또는 5'-UTR에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 코딩 서열은 RSV F 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하며, 여기서 상기 인공 RNA는 서열 번호: 5704-6063, 17270-17629, 21460-21462, 21606-21608, 21532-21534, 21678-21680 (F-del_DSCav1_mut5를 암호화함) 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
명세서 전반에 걸쳐 개요된 바와 같이, 적합한 아미노산 서열 또는 핵산 서열 (코딩 서열, mRNA 서열)에 관한 추가 정보는 서열 목록, 특히 다음에 설명된 바와 같이 식별자 <223>에 제공된 세부 사항으로부터 유래될 수도 있다.
예를 들어, 서열 번호: 68의 서열 목록에서 숫자 식별자 <223>은 다음과 같다:
"HRSV(A2)_F0로부터 유래된 및/또는 변형된 단백질 서열 (인공)". 서열 목록 전체에서 숫자 식별자 <223> 아래에 제공된 정보는 동일한 구조를 따른다는 점에 유의해야 한다: "<구조물_식별자(CONSTRUCT_IDENTIFIER)>의 <서열_설명어(SEQUENCE_DESCRIPTOR)>". 상기 <SEQUENCE_DESCRIPTOR>는 서열의 유형(예를 들어, “유래된 및/또는 변형된 단백질 서열”, “유래된 및/또는 변형된 CDS” “유래된 및/또는 변형된 서열을 포함하는 mRNA 제품 설계 a-1”, 또는 “유래된 및/또는 변형된 서열을 포함하는 mRNA 제품 설계”, 또는 “유래된 및/또는 변형된 서열을 포함하는 mRNA 제품 설계”, 또는 “유래된 및/또는 변형된 서열을 포함하는 mRNA 제품 설계 g-4” 등) 및 서열이 야생형 서열 ("wt")을 포함하거나 이로 이루어지는지 또는 상기 서열이 서열-최적화된 서열(예를 들어 “opt1”, “opt2”, “opt3”, “opt4”, “opt5”, “opt6”, “opt11”; 서열 최적화는 아래에서 더욱 자세히 설명된다)을 포함하거나 이로 이루어지는지 여부와 관련된다. 예를 들어, 서열 번호: 68의 숫자 식별자 <223> 하에 제공된 <SEQUENCE_DESCRIPTOR>는 다음과 같이 읽는다: "유래된 및/또는 변형된 단백질 서열 (인공)". 숫자 식별자 <223> 아래에 제공된 <CONSTRUCT_IDENTIFIER>의 구조는 다음과 같다: (“유기체__구조물 명칭(organism__construct name)”, 또는 “유기체__접근 번호__구조물 명칭(organism__accession number__construct name)”) 및 통상의 기술자가 본 발명에 따른 동일한 RSV 단백질을 암호화하는 적합한 핵산 서열 (예를 들어, RNA, mRNA)을 명시적으로 유도하도록 돕기 위한 것이다. 예를 들어, 서열 번호: 68의 숫자 식별자 <223>에 제공된 <CONSTRUCT_IDENTIFIER>는 다음과 같이 읽는다: “HRSV(A2) _F0”. 그 예에서, 각각의 단백질 서열은 "HRSV(A2)" (유기체)에서 유래되며, 여기서 상기 단백질은 구조적 요소 "F0"(구성 이름, 전장 F)를 포함한다. 통상의 기술자가 서열 번호: 68의 구성 식별자, 즉 "HRSV(A2)_F0"를 사용하는 경우, 해당 사람은 적합한 핵산 코딩 서열, 예를 들어 본 발명의 서열 목록으로부터 쉽게 검색할 수 있는 RNA 코딩 서열 및 mRNA 서열의 목록에 쉽게 도달할 수 있다.
조성물:
제2 측면은 제1 측면의 하나 이상의 인공 RNA를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
제2 측면의 바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 제1 측면의 적어도 하나의 인공 RNA 및 선택적으로 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 바람직하게는 조성물의 액체 또는 비액체 기반(basis)을 포함한다. 조성물이 액체 형태로 제공되는 경우, 상기 담체는 바람직하게는 물, 전형적으로 발열원이 없는(pyrogen-free) 물; 등장성 식염수 또는 완충 (수성) 용액, 예를 들어 인산염, 구연산염 등 완충액일 수 있다. 나트륨염, 바람직하게는 적어도 50mM의 나트륨염, 칼슘염, 바람직하게는 적어도 0.01mM의 칼슘염, 및 선택적으로 칼륨염, 바람직하게는 적어도 3mM의 칼륨염을 함유하는 물, 또는 바람직하게는 완충액, 보다 바람직하게는 수성 완충액이 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면, 나트륨염, 칼슘염 및 선택적으로 칼륨은 할로겐화물, 예를 들어 염화물, 요오드화물 또는 브롬화물의 형태로 수산화물, 탄산염, 탄산 수소 또는 황산염 등의 형태로 발생할 수 있다. 이에 제한되지 않고, 나트륨염의 예는 예를 들어 NaCl, NaI, NaBr, Na2CO3, NaHCO3, Na2SO4을 포함하고, 선택적 칼륨염의 예는 예를 들어 KCl, KI, KBr, K2CO3, KHCO3, K2SO4을 포함하고, 칼슘염의 예는 예를 들어 CaCl2, CaI2, CaBr2, CaCO3, CaSO4, Ca(OH)2를 포함한다. 또한, 전술한 양이온의 유기 음이온이 완충액에 포함될 수 있다.
구현예에서, 본 명세서에 정의된 조성물은 본 발명의 제1 측면 또는 제2 측면과 관련하여 정의된 인공 RNA 중 복수개 또는 적어도 하나 이상을 포함할 수 있다.
구현예에서, 조성물에 포함된 적어도 하나의 RNA는 동일한 RSV 및/또는 다른 RSV에서 유래된 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 별개의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 바이- 또는 멀티시스트론 핵산, 특히 본 명세서에 정의된 바이- 또는 멀티시스트론 핵산이다.
구현예에서, 상기 조성물은 유전적으로 동일한 RSV 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 유래된 각각 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 본 발명의 제1 측면과 관련하여 정의된 바와 같이 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 상이한 인공 RNA를 포함할 수 있다. 바이러스와 관련하여 사용되는 용어 "동일한" 또는 "동일한 RSV", 예를 들어 "동일한 바이러스"는 유전적으로 동일한 것으로 이해되어야 한다. 특히, 상기 (유전적으로) 동일한 바이러스는 동일한 단백질 또는 펩티드를 발현하며, 여기서 모든 단백질 또는 펩티드는 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 특히, 상기 (유전적으로) 동일한 RSV는 본질적으로 동일한 단백질, 펩티드 또는 폴리단백질을 발현하며, 여기서 이들 단백질, 펩티드 또는 폴리단백질은 바람직하게는 아미노산 서열(들)이 다르지 않다. 예시적인 RSV 바이러스의 비제한적인 목록은 목록 1에 제공된다.
구현예에서, 상기 조성물은 유전적으로 상이한 RSV 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 유래된 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 본 발명의 제1 측면과 관련하여 정의된 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 상이한 RNA를 포함할 수 있다. 바이러스, 예를 들어 "상이한" 바이러스와 관련하여 본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 용어 "상이한" 또는 "상이한 RSV"는 적어도 2개의 각각의 바이러스 사이의 차이로 이해되어야 하며, 여기서 상기 차이는 각각의 상이한 바이러스의 RNA 게놈에서 나타난다. 특히, 상기 (유전적으로) 상이한 RSV는 적어도 하나의 다른 단백질, 펩티드 또는 폴리단백질을 발현하며, 여기서 적어도 하나의 상이한 단백질, 펩티드 또는 폴리단백질은 바람직하게는 적어도 하나의 아미노산이 다르다.
다른 구현예에서, 상기 조성물은 당 단백질 G, 짧은 소수성 단백질 SH, 매트릭스 단백질 M, 핵단백질 N, 큰 중합 효소 L, M2-1 단백질, M2-2 단백질, 인단백질 P, 비 구조 단백질 NS1 또는 비 구조 단백질 NS2, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 RSV 항원을 암호화하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 추가 RNA 구조물을 포함한다.
RSV를 암호화하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 추가 RNA 구조물을 포함하는 조성물의 생산을 위해, PCT 출원 PCT/EP2016/082487 또는 공개 특허 출원 WO2017/1090134A1에 개시된 방법이 바람직하게 사용되고 이에 따라 적용된다.
바람직한 구현예에서, 제2 측면의 조성물은 제1 측면의 적어도 하나의 인공 RNA 및 매트릭스 단백질 M, 핵단백질 N, M2-1 단백질 및/또는 인단백질 P 또는 이들의 조합으로부터 선택된 RSV에서 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA를 포함한다. RSV M, N, M2-1 및/또는 인단백질 P (또는 이들의 조합)로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 추가 인공 RNA의 첨가는 예를 들어 T 세포 면역 반응을 촉진하는 데 특히 유리하다.
특히, 제1 측면의 인공 RNA와 관련된 구현예는 마찬가지로 제2 측면의 적어도 하나의 추가 인공 RNA의 적합한 구현예 (예를 들어, UTR 조합, cds 최적화, 히스톤 스템 루프, PolyA, PolyC, 캡 구조, mRNA 구조, mRNA 생산 및 mRNA 정제 등에 관한 구현예)에서 판독되고 이해될 수 있다.
따라서, 제2 측면의 조성물은 RSF F를 암호화하는 제1 측면의 적어도 하나의 인공 RNA 및 RSV 매트릭스 단백질 M로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA를 적합하게 포함할 수 있다.
대안적으로, 제2 측면의 조성물은 RSF F를 암호화하는 제1 측면의 적어도 하나의 인공 RNA 및 RSV N로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA를 적합하게 포함할 수 있다.
대안적으로, 제2 측면의 조성물은 RSF F를 암호화하는 제1 측면의 적어도 하나의 인공 RNA 및 RSV M2-1로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA를 적합하게 포함할 수 있다.
대안적으로, 제2 측면의 조성물은 RSF F를 암호화하는 제1 측면의 적어도 하나의 인공 RNA 및 RSV P로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA를 적합하게 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 제2 측면의 조성물은 매트릭스 단백질 M, 핵단백질 N, M2-1 및 인단백질 P로부터 선택된 RSV로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 각각 포함하는 2개의 추가 인공 RNA 종을 포함한다.
따라서, 제2 측면의 조성물은 적합하게는 RSF F를 암호화하는 제1 측면의 적어도 하나의 인공 RNA, RSV M로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA, 및 RSV N에서 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA를 포함할 수 있다.
따라서, 제2 측면의 조성물은 적합하게는 RSF F를 암호화하는 제1 측면의 적어도 하나의 인공 RNA, RSV N에서 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA, RSV M2-1에서 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA를 포함할 수 있다.
따라서, 제2 측면의 조성물은 적합하게는 RSF F를 암호화하는 제1 측면의 적어도 하나의 인공 RNA, RSV P에서 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA, 및 RSV M2-1에서 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA를 포함할 수 있다.
따라서, 제2 측면의 조성물은 적합하게는 RSF F를 암호화하는 제1 측면의 적어도 하나의 인공 RNA, RSV P에서 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA, 및 RSV N에서 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA를 포함할 수 있다.
따라서, 제2 측면의 조성물은 적합하게는 RSF F를 암호화하는 제1 측면의 적어도 하나의 인공 RNA, RSV M 및 RSV M2-1에서 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA에서 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA를 포함할 수 있다.
따라서, 제2 측면의 조성물은 적합하게는 RSF F를 암호화하는 제1 측면의 적어도 하나의 인공 RNA, RSV M 및 RSV P에서 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA, 및 RSV P에서 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA를 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 제2 측면의 조성물은 적합하게는 매트릭스 단백질 M, 핵단백질 N, M2-1 및 인단백질 P로부터 선택된 RSV로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 3개의 추가 인공 RNA 종을 각각 포함하는 3개의 추가 인공 RNA 종을 각각 포함한다.
따라서, 제2 측면의 조성물은 적합하게는 RSF F를 암호화하는 제1 측면의 적어도 하나의 인공 RNA, RSV M에서 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA, RSV N에서 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA, 및 RSV P에서 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA를 포함할 수 있다.
따라서, 제2 측면의 조성물은 적합하게는 RSF F를 암호화하는 제1 측면의 적어도 하나의 인공 RNA, RSV M2-1에서 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA, RSV N에서 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA, 및 RSV P에서 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA를 포함할 수 있다.
따라서, 제2 측면의 조성물은 적합하게는 RSF F를 암호화하는 제1 측면의 적어도 하나의 인공 RNA, RSV M2-1에서 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA, RSV M에서 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA, 및 RSV P에서 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA를 포함할 수 있다.
따라서, 제2 측면의 조성물은 적합하게는 RSF F를 암호화하는 제1 측면의 적어도 하나의 인공 RNA, RSV M2-1에서 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA, RSV M에서 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA, 및 RSV N에서 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA를 포함할 수 있다.
따라서, 제2 측면의 조성물은 적합하게는 RSF F를 암호화하는 제1 측면의 적어도 하나의 인공 RNA 및 RSV M2-1에서 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA를 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 제2 측면의 조성물은 매트릭스 단백질 M, 핵단백질 N, M2-1 및 인단백질 P로부터 선택된 RSV로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 각각 포함하는 3개의 추가 인공 RNA 종을 포함하는 4개의 추가 인공 RNA 종을 각각 포함한다.
따라서, 제2 측면의 조성물은 적합하게는 RSF F를 암호화하는 제1 측면의 적어도 하나의 인공 RNA, RSV M에서 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA, RSV N에서 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA, RSV P에서 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA, 및 RSV M2-1에서 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA를 포함할 수 있다.
제2 측면의 바람직한 구현예에서, 추가 인공 RNA의 코딩 서열은 서열 번호: 9684, 10053-10133, 10134, 10503-10636, 10637, 11006-11182, 11183, 11552-11725, 19844, 20213, 20582, 20951 또는 이들 서열 중 어느 하나의 단편 또는 변이체 중 어느 하나의 동일한 또는 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 암호화한다. RSV 단백질을 암호화하는 이들 적합한 아미노산 서열 각각에 관한 추가 정보는 서열 목록, 특히 다음에 설명된 바와 같이 식별자 <223> 아래에 제공된 세부 사항으로부터 유래될 수도 있다.
제2 측면의 추가 구현예에서, 추가 인공 RNA의 코딩 서열은 본 명세서에 정의된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질 및 추가로 이종 분비 신호 서열 또는 이종 분비 신호 펩티드를 암호화한다. 상기 이종 분비 신호 서열은 암호화된 항원성 펩티드 또는 단백질의 분비를 증가시킬 수 있다.
적합한 분비 신호 펩티드는 특허 출원 WO2017/081082의 서열 번호: 1-1115 및 서열 번호: 1728에 따른 아미노산 서열 목록, 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체로부터 선택될 수 있다. 핵산 수준에서, 그러한 아미노산 서열을 암호화하는 임의의 핵산 서열 (예를 들어, RNA 서열)이 선택될 수 있다. 이러한 맥락에서, WO2017/081082의 개시 내용은 여기에 참조로 포함된다.
구현예에 따르면, 상기 분비 신호 서열은 서열 번호: 21329-21362 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체 중 어느 하나와 동일한 또는 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 분비 신호 서열을 암호화하는 이들 적합한 아미노산 서열 각각에 관한 추가 정보는 서열 목록, 특히 다음에 설명된 바와 같이 식별자 <223> 아래에 제공된 세부 사항으로부터 유래될 수도 있다.
바람직한 구현예에서, 조성물의 추가 인공 RNA는
a) 하나 이상의 이종 5' 비 번역 영역 (5'-UTR) 및/또는 하나 이상의 이종 3' 비 번역 영역 (3'-UTR); 및
b) RSV M, N, M2-1, 및/또는 인단백질 P 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는, 바람직하게는 서열 번호: 9684, 10053-10133, 10134, 10503-10636, 10637, 11006-11182, 11183, 11552-11725, 19844, 20213, 20582, 20951 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 암호화하는 상기 3'-UTR 및/또는 5'-UTR과 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 코딩 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 조성물의 추가 인공 RNA는
a) 하나 이상의 이종 5' 비 번역 영역 (5'-UTR) 및/또는 하나 이상의 이종 3' 비 번역 영역 (3'-UTR); 및
b) RSV M2-1 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는, 바람직하게는 서열 번호: 11183, 20953, 21414 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 암호화하는 상기 3'-UTR 및/또는 5'-UTR과 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 코딩 서열을 포함한다.
적합하게는, 조성물의 추가 인공 RNA는 a-1, a-2, a-3, a-4, a-5, b-1, b-2, b-3, b-4, b-5, c-1, c-2, c-3, c-4, c-5, d-1, d-2, d-3, d-4, d-5, e-1, e-2, e-3, e-4, e-5, e-6, f-1, f-2, f-3, f-4, f-5, g-1, g-2, g-3, g-4, g-5, h-1, h-2, h-3, h-4, h-5, i-1, i-2, 또는 i-3에서 선택된 3'-UTR 및 5'-UTR (제1 측면의 맥락에서 정의됨)에 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 포함한다.
적합하게는, 조성물의 추가 인공 RNA는 적어도 하나 또는 하나 이상, 또는 바람직하게는 모든 우라실 뉴클레오타이드가 슈도우리딘 (ψ) 뉴클레오티드 또는 N1-메틸슈도우리딘 (m1ψ) 뉴클레오티드로 대체되는 코딩 서열을 포함한다.
따라서, 다른 구현예에서, 조성물의 추가 인공 RNA는 서열 번호: 43 또는 21321에 따른 5'-캡 서열 요소, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다.
제2 측면의 바람직한 구현예에서, 추가 RNA의 코딩 서열은 서열 번호: 9685-9692, 10135-10142, 10638-10645, 11184-11119, 19845-19852, 20214-20221, 20583-20590, 20952-20959, 21385-21388, 21411-21414 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 단편 또는 변이체또는 단편 중 어느 하나와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 핵산 서열을 포함한다 (제1 측면과 관련하여 정의된 cds 최적화). RSV 단백질을 암호화하는 이들 적합한 아미노산 서열 각각에 관한 추가 정보는 서열 목록, 특히 다음에 설명된 바와 같이 식별자 <223> 아래에 제공된 세부 사항으로부터 유래될 수도 있다.
제2 측면의 바람직한 구현예에서, 상기 조성물의 추가 인공 RNA, 바람직하게는 추가 mRNA는 바람직하게는 5'- 에서 3'- 방향으로 하기 요소 a) -i)를 포함한다:
a) 5'-캡 구조, 바람직하게는 제1 측면과 관련하여 명시된 5'-캡 구조, 가장 바람직하게는 캡1 구조;
b) 선택적으로, 제1 측면과 관련하여 명시된, 바람직하게는 서열 번호: 1-22로부터 선택된 적어도 하나인 5'-UTR;
c) 리보솜 결합 부위, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 리보솜 결합 부위;
d) 서열 번호: 9685-9692, 10135-10142, 10638-10645, 11184-11119, 19845-19852, 20214-20221, 20583-20590, 20952-20959, 21385-21388, 21411-21414에서 선택된 적어도 하나의 코딩 서열;
e) 제1 측면과 관련하여 명시된, 바람직하게는 서열 번호: 23-38로부터 선택된 적어도 하나인 3'-UTR;
f) 선택적으로, 폴리(A) 서열, 바람직하게는 제1 측면과 관련하여 명시된 폴리(A) 서열;
g) 선택적으로, 폴리(C) 서열, 바람직하게는 제1 측면과 관련하여 명시된 폴리(C) 서열;
h) 선택적으로, 히스톤 스템-루프, 바람직하게는 제1 측면과 관련하여 명시된 히스톤 스템-루프;
i) 선택적으로, 제1 측면과 관련하여 명시된 3'-말단 서열 요소, 바람직하게는 서열 번호: 44-63, 또는 21322-21328에 따른 따른 3'-말단 서열 요소, 및
여기서 선택적으로 적어도 하나 또는 하나 이상, 바람직하게는 여기서 모든 우라실 뉴클레오티드가 슈도우리딘 (ψ) 뉴클레오티드 또는 N1-메틸슈도우리딘 (m1ψ) 뉴클레오티드로 대체된다.
특히 제2 측면의 바람직한 구현예에서, 상기 조성물의 추가 인공 RNA, 바람직하게는 추가 mRNA는 바람직하게는 5'- 에서 3'- 방향으로 하기 요소 a) -i)를 포함한다:
a) 5'-캡 구조, 바람직하게는 제1 측면과 관련하여 명시된 5'-캡 구조, 가장 바람직하게는 캡1 구조;
b) 선택적으로, 제1 측면과 관련하여 명시된, 바람직하게는 서열 번호: 1-22로부터 선택된 적어도 하나인 5'-UTR;
c) 리보솜 결합 부위, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 리보솜 결합 부위;
d) 서열 번호: 11185-11191, 21388, 20952-20959, 21414로부터 선택된 적어도 하나의 코딩 서열;
e) 제1 측면과 관련하여 명시된, 바람직하게는 서열 번호: 23-38로부터 선택된 적어도 하나인 3'-UTR;
f) 선택적으로, 폴리(A) 서열, 바람직하게는 제1 측면과 관련하여 명시된 폴리(A) 서열;
g) 선택적으로, 폴리(C) 서열, 바람직하게는 제1 측면과 관련하여 명시된 폴리(C) 서열;
h) 선택적으로, 히스톤 스템-루프, 바람직하게는 제1 측면과 관련하여 명시된 히스톤 스템-루프;
i) 선택적으로, 제1 측면과 관련하여 명시된, 바람직하게는 서열 번호: 44-63, 또는 21322-21328에 따른 따른 3'-말단 서열 요소, 및
여기서 선택적으로 적어도 하나 또는 하나 이상, 바람직하게는 여기서 모든 우라실 뉴클레오티드가 슈도우리딘 (ψ) 뉴클레오티드 또는 N1-메틸슈도우리딘 (m1ψ) 뉴클레오티드로 대체된다.
그러한 맥락에서, 제2 측면의 바람직한 RSV 폴리펩티드, 핵산 및 mRNA 서열이 표 7A에 제공된다.
표 7A에서, 컬럼 A 내지 D는 RSV 단백질로부터 유래된 제2 측면의 특정 적합한 구조물을 나타내며, 여기서 컬럼 A는 M에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 B는 N에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 C는 P에 적합한 서열을 제공하고, 컬럼 D는 M2-1에 적합한 서열을 제공한다.
단백질 명칭/설계는 행 1 (컬럼 A ~ D)에 표시되고, 서열 목록에 제공된 단백질 서열 번호는 행 2 ("PRT")에 있다. HRSV(A2)의 바람직한 단백질 서열 번호는 행 3 ("HRSV(A2) PRT")에 제공된다. 각각의 표시된 HRSV(A2) 단백질에 대한 상응하는 코딩 서열의 서열 번호는 행 4-11에 제공된다 (각각 “cds wt”, “cds opt1”, “cds opt2”, “cds opt3”, “cds opt4”, “cds opt5”, “cds opt6”, “cds opt11”). 상기 코딩 서열 및 본 발명에 따른 적합한 3'-UTR 및 5'-UTR을 포함하는 상응하는 mRNA 구조물의 서열 번호는 행 12 행 내지 55에 제공된다 (본 명세서에 명시된 "mRNA 설계 a-1" 내지 "mRNA 설계 i-3").
HRSV(멤피스-37)의 바람직한 단백질 서열 번호는 행 56 ("멤피스-37 PRT")에 제공된다. 각각의 표시된 HRSV(멤피스-37) 단백질에 대한 상응하는 코딩 서열의 서열 번호는 행 57-64에 제공된다(각각 “cds wt”, “cds opt1”, “cds opt2”, “cds opt3”, “cds opt4”, “cds opt5”, “cds opt6”, “cds opt11”). 본 발명에 따른 상기 코딩 서열 및 적합한 3'-UTR 및 5'-UTR을 포함하는 상응하는 mRNA 구조물의 서열 번호는 행 65 내지 108에 제공된다 (본 명세서에 명시된 "mRNA 설계 a-1" 내지 "mRNA 설계 i-3").
추가 정보 예를 들어, 표시된 mRNA 구조물에 포함된 코딩 서열의 유형에 관한 정보는 서열 목록에서 각 서열 번호의 <223> 식별자에 제공된다.
[표 7A]
표 7A: 조성물 또는 백신의 바람직한 추가 코딩 서열 및 mRNA 구조물
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
따라서, 바람직한 구현예에서, 제2 측면의 조성물은 매트릭스 단백질 M, 핵단백질 N, M2-1 단백질, 인단백질 P로부터 선택된 RSV로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA를 포함하고, 여기서 상기 추가 인공 RNA는 서열 번호: 9693-10052, 10143-10502, 10646-11005, 11192-11551, 19853-20212, 20222-20581, 20591-20950, 20960-21319, 21481-21488, 21627-21634, 21553-21560, 21699-21706 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며, 여기서, 선택적으로, 적어도 하나 또는 하나 이상, 또는 모든 우라실 뉴클레오티드가 슈도우리딘 (ψ) 뉴클레오티드 또는 N1-메틸슈도우리딘 (m1ψ) 뉴클레오티드로 대체된다. RSV 단백질을 암호화하는 이들 적합한 아미노산 서열 각각에 관한 추가 정보는 서열 목록, 특히 다음에 설명된 바와 같이 식별자 <223> 아래에 제공된 세부 사항으로부터 유래될 수 있다.
특히 제2 측면의 바람직한 구현예에서, 제2 측면의 조성물은
- 서열 번호: 78-482, 493-897, 907-1266, 1276-1635, 1645-2004, 2014-2373, 2383-2742, 2752-3111, 3121-3480, 3490-3849, 3859-4218, 4228-4587, 4597-4956, 4966-5325, 5335-5694, 5704-6063, 6073-6432, 6442-6801, 6811-7170, 7180-7539, 7549-7908, 7918-8277, 8278, 11735-12094, 12104-12463, 12473-12832, 12842-13201, 13949-14308, 14318-14677, 14687-15046, 15056-15415, 15425-15784, 15794-16153, 13211-13570, 13580-13939, 16163-16522, 16532-16891, 16901-17260, 17270-17629, 17639-17998, 18008-18367, 18377-18736, 18746-19105, 19115-19474, 19484-19843, 21415-21480, 21561-21626, 21489-21552, 21635-21698 (제1 측면에서 정의된 바와 같이 RSV F를 암호화함)로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 적어도 하나의 인공 RNA 및 서열 번호: 9693-10052, 19853-20212, 21481, 21482, 21627, 21628, 21553, 21554, 21699, 21700 (RSV M을 암호화함)로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 추가 인공 RNA; 또는
- 서열 번호: 78-482, 493-897, 907-1266, 1276-1635, 1645-2004, 2014-2373, 2383-2742, 2752-3111, 3121-3480, 3490-3849, 3859-4218, 4228-4587, 4597-4956, 4966-5325, 5335-5694, 5704-6063, 6073-6432, 6442-6801, 6811-7170, 7180-7539, 7549-7908, 7918-8277, 8278, 11735-12094, 12104-12463, 12473-12832, 12842-13201, 13949-14308, 14318-14677, 14687-15046, 15056-15415, 15425-15784, 15794-16153, 13211-13570, 13580-13939, 16163-16522, 16532-16891, 16901-17260, 17270-17629, 17639-17998, 18008-18367, 18377-18736, 18746-19105, 19115-19474, 19484-19843, 21415-21480, 21561-21626, 21489-21552, 21635-21698 (제1 측면에서 정의된 바와 같이 RSV F를 암호화함)으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 적어도 하나의 인공 RNA 및 서열 번호: 10143-10502, 20222-20581, 21483, 21484, 21629, 21630, 21555, 21556, 21701, 21702 (RSV N을 암호화함)로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 추가 인공 RNA; 또는
- 서열 번호: 78-482, 493-897, 907-1266, 1276-1635, 1645-2004, 2014-2373, 2383-2742, 2752-3111, 3121-3480, 3490-3849, 3859-4218, 4228-4587, 4597-4956, 4966-5325, 5335-5694, 5704-6063, 6073-6432, 6442-6801, 6811-7170, 7180-7539, 7549-7908, 7918-8277, 8278, 11735-12094, 12104-12463, 12473-12832, 12842-13201, 13949-14308, 14318-14677, 14687-15046, 15056-15415, 15425-15784, 15794-16153, 13211-13570, 13580-13939, 16163-16522, 16532-16891, 16901-17260, 17270-17629, 17639-17998, 18008-18367, 18377-18736, 18746-19105, 19115-19474, 19484-19843, 21415-21480, 21561-21626, 21489-21552, 21635-21698 (제1 측면에서 정의된 바와 같이 RSV F를 암호화함)으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 적어도 하나의 인공 RNA 및 서열 번호: 10646-11005, 20591-20950, 21485, 21486, 21631, 21632, 21557, 21558, 21703, 21704 (RSV P를 암호화함)로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 적어도 하나의 추가 인공 RNA; 또는
- 서열 번호: 78-482, 493-897, 907-1266, 1276-1635, 1645-2004, 2014-2373, 2383-2742, 2752-3111, 3121-3480, 3490-3849, 3859-4218, 4228-4587, 4597-4956, 4966-5325, 5335-5694, 5704-6063, 6073-6432, 6442-6801, 6811-7170, 7180-7539, 7549-7908, 7918-8277, 8278, 11735-12094, 12104-12463, 12473-12832, 12842-13201, 13949-14308, 14318-14677, 14687-15046, 15056-15415, 15425-15784, 15794-16153, 13211-13570, 13580-13939, 16163-16522, 16532-16891, 16901-17260, 17270-17629, 17639-17998, 18008-18367, 18377-18736, 18746-19105, 19115-19474, 19484-19843, 21415-21480, 21561-21626, 21489-21552, 21635-21698 (제1 측면에서 정의된 바와 같이 RSV F를 암호화함)으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 적어도 하나의 인공 RNA 및 서열 번호: 11192-11551, 20960-21319, 21487, 21488, 21633, 21634, 21559, 21560, 21705, 21706 (RSV M2-1를 암호화함)로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 적어도 하나의 추가 인공 RNA; 또는
- 서열 번호: 78-482, 493-897, 907-1266, 1276-1635, 1645-2004, 2014-2373, 2383-2742, 2752-3111, 3121-3480, 3490-3849, 3859-4218, 4228-4587, 4597-4956, 4966-5325, 5335-5694, 5704-6063, 6073-6432, 6442-6801, 6811-7170, 7180-7539, 7549-7908, 7918-8277, 8278, 11735-12094, 12104-12463, 12473-12832, 12842-13201, 13949-14308, 14318-14677, 14687-15046, 15056-15415, 15425-15784, 15794-16153, 13211-13570, 13580-13939, 16163-16522, 16532-16891, 16901-17260, 17270-17629, 17639-17998, 18008-18367, 18377-18736, 18746-19105, 19115-19474, 19484-19843, 21415-21480, 21561-21626, 21489-21552, 21635-21698 (제1 측면에서 정의된 바와 같이 RSV F를 암호화함)으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 적어도 하나의 인공 RNA 및 서열 번호: 9693-10052, 19853-20212, 21481, 21482, 21627, 21628, 21553, 21554, 21699, 21700 (RSV M을 암호화함)로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 추가 인공 RNA 및 서열 번호: 10646-11005, 20591-20950, 21485, 21486, 21631, 21632, 21557, 21558, 21703, 21704 (RSV P를 암호화함)로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 추가 인공 RNA;
- 서열 번호: 78-482, 493-897, 907-1266, 1276-1635, 1645-2004, 2014-2373, 2383-2742, 2752-3111, 3121-3480, 3490-3849, 3859-4218, 4228-4587, 4597-4956, 4966-5325, 5335-5694, 5704-6063, 6073-6432, 6442-6801, 6811-7170, 7180-7539, 7549-7908, 7918-8277, 8278, 11735-12094, 12104-12463, 12473-12832, 12842-13201, 13949-14308, 14318-14677, 14687-15046, 15056-15415, 15425-15784, 15794-16153, 13211-13570, 13580-13939, 16163-16522, 16532-16891, 16901-17260, 17270-17629, 17639-17998, 18008-18367, 18377-18736, 18746-19105, 19115-19474, 19484-19843, 21415-21480, 21561-21626, 21489-21552, 21635-21698 (제1 측면에서 정의된 바와 같이 RSV F를 암호화함)으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 적어도 하나의 인공 RNA 및 서열 번호: 9693-10052, 19853-20212, 21481, 21482, 21627, 21628, 21553, 21554, 21699, 21700 (RSV M을 암호화함)로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 추가 인공 RNA 및 서열 번호: 10646-11005, 20591-20950, 21485, 21486, 21631, 21632, 21557, 21558, 21703, 21704 (RSV P를 암호화함)로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 추가 인공 RNA 및 서열 번호: 10143-10502, 20222-20581, 21483, 21484, 21629, 21630, 21555, 21556, 21701, 21702 (RSV N를 암호화함)로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 추가 인공 RNA, 또는
- 서열 번호: 78-86, 21415-21417, 21561-21563, 474-482, 11735-11742, 21489, 21490, 21635, 21636, 12087-12094, 493-501, 21418-21420, 21564-21566, 889-897, 12104-12111, 21491, 21492, 21637, 21638, 12456-12463, 907-914, 21421-21423, 21567-21569, 1259-1266, 12473-12480, 21493-21495, 21639-21641, 12825-12832, 1276-1283, 21424-21426, 21570-21572, 1628-1635, 12842-12849, 21496-21498, 21642-21644, 13194-13201, 1645-1652, 21433-21435, 21579-21581, 1997-2004, 13949-13956, 21505-21507, 21651-21653, 14301-14308, 2014-2021, 21436-21438, 21582-21584, 2366-2373, 14318-14325, 21508-21510, 21654-21656, 14670-14677, 2383-2390, 21439-21441, 21585-21587, 2735-2742, 14687-14694, 21511-21513, 21657-21659, 15039-15046, 2752-2759, 21442-21444, 21588-21590, 3104-3111, 15056-15063, 21514-21516, 21660-21662, 15408-15415, 3121-3128, 21445-21447, 21591-21593, 3473-3480, 15425-15432, 21517-21519, 21663-21665, 15777-15784, 3490-3497, 21448-21450, 21594-21596, 3842-3849, 15794-15801, 21520-21522, 21666-21668, 16146-16153, 3859-3866, 21427-21429, 21573-21575, 4211-4218, 13211-13218, 21499-21501, 21645-21647, 13563-13570, 4228-4235, 21430-21432, 21576-21578, 4580-4587, 13580-13587, 21502-21504, 21648-21650, 13932-13939, 4597-4604, 21451-21453, 21597-21599, 4949-4956, 16163-16170, 21523-21525, 21669-21671, 16515-16522, 4966-4973, 21454-21456, 21600-21602, 5318-5325, 16532-16539, 21526-21528, 21672-21674, 16884-16891, 5335-5342, 21457-21459, 21603-21605, 5687-5694, 16901-16908, 21529-21531, 21675-21677, 17253-17260, 5704-5711, 21460-21462, 21606-21608, 6056-6063, 17270-17277, 21532-21534, 21678-21680, 17622-17629 (제1 측면에서 정의된 바와 같이 RSV F를 암호화함)으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 적어도 하나의 인공 RNA 및 서열 번호: 11192-11551, 20960-21319, 21487, 21488, 21633, 21634, 21559, 21560, 21705, 21706 (RSV M2-1를 암호화함)로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 적어도 하나의 추가 인공 RNA를 포함하고,
여기서, 선택적으로, 적어도 하나 또는 하나 이상, 또는 여기서 모든 우라실 뉴클레오티드가 슈도우리딘(ψ) 뉴클레오티드 또는 N1-메틸슈도우리딘(m1ψ) 뉴클레오티드로 대체된다.
다양한 구현예에서, RSV F (F0, F-del, F0_DSCav1, F-del_DSCav1, F_DSCav1_mut0, F-del_DSCav1_mut0, F_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut2, F_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut3, F_DSCav1_mut4, F-del_DSCav1_mut4, F_DSCav1_mut5, F-del_DSCav1_mut5, F_DSCav1_mut6, F-del_DSCav1_mut6, F_DSCav1_mut7, F-del_DSCav1_mut7, F_DSCav1_mut8, F-del_DSCav1_mut8) RNA 구조물 및 RSV T-세포 항원 RNA 구조물 (RSV M, N, M2-1, 또는 P)의 상이한 조합이 상기 조성물에 적합하게 포함된다 (표 7B에 개시된 바와 같음; 조합 1-64). 상기 조합 49-64가 바람직하고, 조합 64가 특히 바람직하다.
[표 7B]
표 7B: RSV F를 암호화하는 RNA 구조물 및 T-세포 항원을 암호화하는 RNA 구조물의 적절한 조합
Figure pct00020
Figure pct00021
표 7B는 제1 측면에서 정의된 균주 A2로부터 RSV F를 암호화하는 적어도 하나의 RNA 및 매트릭스 단백질 M, 핵단백질 N, M2-1 단백질, 인단백질 P로부터 선택된 균주 A2로부터 RSV로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA를 포함하는 제2 측면의 조성물을 개시한다. 본 발명의 추가 구현예에서, 표 7B에 개시된 모든 조성물은 RSV 분리주 멤피스-37 (균주 멤피스-37)으로부터 유래된 항원성 펩티드 또는 단백질에도 적용 가능하다.
특히 바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 하나의 RSV F RNA 구조물(F0, F-del, F0_DSCav1, F-del_DSCav1, F_DSCav1_mut0, F-del_DSCav1_mut0, F_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut2, F_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut3, F_DSCav1_mut4, F-del_DSCav1_mut4, F_DSCav1_mut5, F-del_DSCav1_mut5, F_DSCav1_mut6, F-del_DSCav1_mut6, F_DSCav1_mut7, F-del_DSCav1_mut7, F_DSCav1_mut8, F-del_DSCav1_mut8) 및 추가로 하나의 RSV M2-1 RNA 구조물, 바람직하게는 F-del_DSCav1_mut5 및 M2-1을 포함한다.
특히 바람직한 구현예에서, 서열 번호: 5704-5711, 21460-21462, 21606-21608, 17270-17277, 21532-21534, 21678-21680로부터 선택된, RSV F를 암호화하는 하나의 RNA 구조물 및 서열 번호: 11192-11199, 21487, 21488, 21633, 21634, 20960-20967, 21559, 21560, 21705, 21706로부터 선택된 M2-1을 암호화하는 하나의 RNA 구조물이 본 발명의 조성물에 포함된다.
다양한 구현예에서, 제1 측면의 하나 이상의 인공 RNA 및 본 명세서에 명시된 하나 이상의 추가 인공 RNA는 동일한 RSV 바이러스 (예를 들어, 목록 1에서 선택된 임의의 바이러스)로부터 유래된다.
바람직한 구현예에서, 제1 측면의 적어도 하나의 인공 RNA는 HRSV(A2)로부터 유래되고 본 명세서에 명시된 적어도 하나의 추가 인공 RNA는 HRSV(A2)로부터 유래된다.
바람직한 구현예에서, 제1 측면의 적어도 하나의 인공 RNA는 HRSV(멤피스-37)로부터 유래되고 본 명세서에 명시된 적어도 하나의 추가 인공 RNA는 HRSV(멤피스-37)로부터 유래된다.
본 발명의 맥락에서, 코딩 서열의 특정 조합은 본 명세서에 정의된 다중 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 핵산 조성물을 얻기 위해 모노시스트론, 바이시스트론 및 멀티시스트론 인공 핵산 및/또는 다중-항원-구조물/핵산의 임의의 조합에 의해 생성될 수 있음을 이해해야 한다.
또한, 하나 이상의 양립 가능한 고체 또는 액체 충전제 또는 희석제 또는 캡슐화 화합물이 사용될 수 있으며, 이는 사람에게 투여하기에 적합하다. 본 명세서에 사용된 용어 "양립 가능성(compatible)"은 조성물의 구성 성분이 상호 작용이 발생하지 않는 방식으로 조성물의 적어도 하나의 RNA 및 선택적으로 추가 인공 RNA와 혼합될 수 있음을 의미하며, 이는 실질적으로 일반적인 사용 조건 하에서 조성물의 생물학적 활성 또는 약제학적 효과를 감소시킨다. 약제학적으로 허용되는 담체, 충전제 및 희석제는 치료할 사람에게 투여하기에 적합하도록 충분히 고순도 및 충분히 낮은 독성을 가져야 한다. 약제학적으로 허용되는 담체, 충전제 또는 이의 구성 성분으로 사용될 수 있는 화합물은 예를 들어 락토스, 글루코스, 트레할로스 및 수크로스와 같은 당; 예를 들어 옥수수 전분 또는 감자 전분과 같은 전분; 덱스트로스; 예를 들어 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 및 이의 유도체; 분말형 트라가칸스; 말트; 젤라틴; 탤로; 예를 들어, 스테아릭 애씨드, 마그네슘 스테아레이트와 같은 고체 활택제(glidant); 칼슘 설페이트; 예를 들어 땅콩유, 목화씨유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 테오브로마유와 같은 식물성 오일; 예를 들어, 폴리프로필렌 글리콜, 글리세롤, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; 알긴산이다.
조성물에 포함될 수 있는 추가 첨가제는 예를 들어 Tween과 같은 유화제; 예를 들어, 소듐 라우릴 설페이트와 같은 습윤제, 착색제; 미각 부여제; 약제학적 담체; 정제 형성제; 안정화제; 항산화제; 방부제이다.
복합체화:
제2 측면의 바람직한 구현예에서, 제1 측면의 적어도 하나의 인공 RNA 및 선택적으로 제2 측면의 추가 인공 RNA는 하나 이상의 양이온성 또는 다가양이온성 화합물, 바람직하게는 양이온성 또는 다가양이온성 중합체, 양이온성 또는 다가양이온성 폴리사카라이드, 양이온성 또는 다가양이온성 지질, 양이온성 또는 다가양이온성 단백질, 양이온성 또는 다가양이온성 펩티드, 또는 이들의 조합과 복합체화되거나 결합되거나 적어도 부분적으로 복합체화되거나 부분적으로 결합된다.
본 명세서에 사용된 용어 “양이온성 또는 다가양이온성 화합물”은 당 업계의 통상의 기술자에 의해 이해되고 인식될 것이며, 예를 들어, 약 1 내지 9 범위의 pH 값에서, 약 3 내지 8 범위의 pH 값에서, 약 4 내지 8 범위의 pH 값에서, 약 5 내지 8 범위의 pH 값에서, 보다 바람직하게는 약 6 내지 8 범위의 pH 값에서, 더욱더 바람직하게는 약 7 내지 8 범위의 pH 값에서, 가장 바람직하게는 생리학적 pH, 예를 들어 약 7.2 내지 7.5 범위의 생리학적 pH에서 양전하를 띤 하전된 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 따라서, 양이온성 성분, 예를 들어 양이온성 펩티드, 양이온성단백질, 양이온성 중합체, 양이온성 폴리사카라이드, 양이온성 지질은 생리학적 조건 하에서 양으로 하전된 임의의 양으로 하전된 화합물 또는 폴리머일 수 있다. “양이온성 또는 다가양이온성 펩티드 또는 단백질”은 예를 들어, Arg, His, Lys 또는 Orn로부터 선택된 적어도 하나의 양으로 하전된 아미노산, 또는 하나 이상의 양으로 하전된 아미노산을 포함할 수 있다. 따라서, "다가양이온성" 성분은 또한 주어진 조건 하에서 하나 이상의 양전하를 나타내는 범위 내에 있다.
이러한 맥락에서 특히 바람직한 양이온성 또는 다가양이온성 화합물은 다음의 양이온성 또는 다가양이온성 펩티드 또는 단백질 또는 이의 단편의 다음 목록으로부터 선택될 수 있다: 프로타민, 뉴클레올린, 스페르민 또는 스페르미딘, 또는 폴리-L-리신 (PLL), 폴리-아르기닌, 염기성 폴리펩티드, HIV-결합 펩티드, HIV-1 Tat (HIV), Tat-유래 펩티드, 페네트라틴, VP22 유래 또는 아날로그 펩티드, HSV VP22 (헤르페스 심플렉스), MAP, KALA 또는 단백질 형질도입 도메인 (PTDs)을 포함하는 세포 침투 펩티드 (CPPs), PpT620, 프롤린-풍부 펩티드, 아르기닌-풍부 펩티드, 리신-풍부 펩티드, MPG-펩티드(들), Pep-1, L-올리고머, 칼시토닌 펩티드(들), 안테나피디아-유래 펩티드, pAntp, pIsl, FGF, 락토페린, 트랜스포탄(Transportan), 부포린(Buforin)-2, Bac715-24, SynB, SynB(1), pVEC, hCT-유래 펩티드, SAP, 또는 히스톤과 같은 기타 양이온성 펩티드 또는 단백질. 보다 바람직하게는, 본 명세서에 정의된 핵산, 바람직하게는 본 명세서에 정의된 mRNA는 하나 이상의 폴리양이온, 바람직하게는 프로타민 또는 올리고펙타민, 가장 바람직하게는 프로타민과 복합체화된다.
제2 측면의 바람직한 구현예에서, 제1 측면의 적어도 하나의 인공 RNA 및 선택적으로 제2 측면의 추가 인공 RNA는 프로타민과 복합체화된다
형질주입 또는 착화제로 사용할 수 있는 추가 바람직한 양이온성 또는 다가양이온성 화합물은 양이온성 폴리사카라이드, 예를 들어 키토산, 폴리브렌 등; 양이온성 지질, 예를 들어 DOTMA, DMRIE, 디-C14-아미딘, DOTIM, SAINT, DC-Chol, BGTC, CTAP, DOPC, DODAP, DOPE: 디올레오일 포스파티딜에탄올-아민, DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS, DIMRI, DOTAP, DC-6-14, CLIP1, CLIP6, CLIP9, 올리고펙타민; 또는 양이온성 또는 다가양이온성 중합체, 예를 들어 베타-아미노산-중합체 또는 개질된 폴리아마이드 등과 같은 변형된 폴리아미노산, PVP 등과 같은 변형된 폴리에틸렌, pDMAEMA 등과 같은 변형된 아크릴레이트, pAMAM 등과 같은 변형된 아미도아민, 디아민 말단 변형된 1,4 부탄디올 디아크릴레이트-코-5-아미노-1-펜타놀 중합체 등과 같은 변형된 폴리베타아미노에스터 (PBAE), 폴리프로필아민 덴드리머 또는 pAMAM 기초 덴드리머와 같은 덴드리머, PEI, 폴리(프로필렌이민) 등과 같은 폴리이민(들), 폴리알릴아민, 사이클로덱스트린 기반 중합체, 덱스트란 기반 중합체 등과 같은 당 백본 기반 중합체, 예를 들어 PMOXA-PDMS 코폴리머 등과 같은 실란 백본 기반 폴리머, 하나 이상의 양이온성 블록 (예를 들어 상기 언급된 양이온성 중합체로부터 선택됨) 및 하나 이상의 친수성 또는 소수성 블록 (예를 들어 폴리에틸렌글리콜); 등의 조합으로 이루어진 블록폴리머를 포함할 수 있다.
이러한 맥락에서, 본 명세서에 정의된 적어도 하나의 인공 RNA 및 선택적으로 제2 측면의 추가 인공 RNA는 양이온성 또는 다가양이온성 화합물 및/또는 중합체 담체, 바람직하게는 양이온성 단백질 또는 펩티드와 복합체화되거나 적어도 부분적으로 복합체화되는 것이 특히 바람직하다. 이러한 맥락에서, WO2010/037539 및 WO2012/113513의 개시 내용이 여기에 참조로 포함된다. 부분적으로는 인공 핵산의 일부만이 양이온성 화합물과 복합체화되고 나머지 인공 핵산이 복합체화되지 않은 형태 ("자유") (본 발명의 (약학) 조성물에 포함됨)임을 의미한다.
제2 측면의 바람직한 구현예에서, 제1 측면의 적어도 하나의 인공 RNA 및 선택적으로 제2 측면의 추가 인공 RNA는 하나 이상의 양이온성 또는 다가양이온성 화합물, 바람직하게는 프로타민, 및 제1 측면의 적어도 하나의 유리 인공 RNA 및 선택적으로 제2 측면의 추가 RNA와 와 복합체화된다.
이러한 맥락에서, 본 명세서에 정의된 적어도 하나의 인공 RNA, 및 선택적으로 제2 측면의 추가 인공 RNA가 프로타민과 복합체화되거나 적어도 부분적으로 복합체화되는 것이 특히 바람직하다. 바람직하게는, 프로타민-복합체 RNA의 핵산, 바람직하게는 RNA 대 유리 RNA의 몰비는 약 1:1의 비를 포함하는 약 0.001:1 내지 약 1:0.001의 몰비로부터 선택될 수 있다. 적합하게는, 복합체화된 RNA는 2:1의 RNA:프로타민 중량 대 중량비 (w/w)로 RNA 샘플에 프로타민-트레할로스 용액을 첨가함으로써 프로타민과 복합체화된다.
복합체화에 사용될 수 있는 추가로 바람직한 양이온성 또는 다가양이온성 단백질 또는 펩티드는 특허 출원 WO2009/030481 또는 WO2011/026641의 화학식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x로부터 유래될 수 있고, 그와 관련된 WO2009/030481 또는 WO2011/026641의 개시는 본 명세서에 참조로 포함된다.
제2 측면의 바람직한 구현예에서, 제1 측면의 적어도 하나의 인공 RNA 및 선택적으로 제2 측면의 추가 인공 RNA는 바람직하게는 서열 번호: 64-67, 21320에서 선택되는 적어도 하나의 양이온성 또는 다가양이온성 단백질 또는 펩티드 또는 이의 임의의 조합과 복합체화되거나 적어도 부분적으로 복합체화된다.
구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 본 명세서에 정의된 RNA 및 중합체성 담체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "중합체성 담체(polymeric carrier)"는 당 업계의 통상의 기술자에 의해 이해되고 인식될 것이며, 예를 들어 다른 화합물 (운반물(cargo))의 수송 및/또는 복합체화를 촉진하는 화합물을 의미한다. 중합체성 담체는 일반적으로 폴리머로 형성된 담체이다. 중합체성 담체는 공유 또는 비공유 상호 작용에 의해 운반물 (핵산, RNA)과 연관될 수 있다.
적합한 중합체성 담체는 이황화 가교결합된 양이온성 화합물에 의해 형성된 중합체성 담체일 수 있다. 이황화 가교결합된 양이온성 화합물은 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 상기 중합체성 담체는 또한 추가 성분을 함유할 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 중합체성 담체는 (-SH 기를 통해) 이황화 결합에 의해 가교결합된 양이온성 펩티드, 단백질 또는 중합체 및 선택적으로 본 명세서에 정의된 추가 성분의 혼합물을 포함할 수 있다.
이와 관련하여, 특허 출원 WO2012/013326의 화학식 {(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa')x(Cys)y} 및 화학식 Cys,{(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x}Cys2에 따른 중합체성 담체가 바람직하며, 이와 관련된 WO2012/013326의 개시 내용이 참조로 포함된다.
구현예에서, 본 명세서에 정의된 바와 같이 RNA를 복합체화하는 데 사용되는 중합체성 담체는 특허 출원 WO2011/026641의 화학식 (L-P1-S-[S-P2-S]n-S-P3-L)에 따른 중합체성 담체 분자로부터 유래될 수 있고, 이와 관련된 WO2011/026641의 개시가 여기에 참조로 포함된다.
구현예에서, 상기 중합체성 담체 화합물은 펩티드 요소 CysArg12Cys (서열 번호: 64) 또는 CysArg12 (서열 번호: 65) 또는 TrpArg12Cys (서열 번호: 66)에 의해 형성되거나 이를 포함하거나 이로 이루어진다. 특히 바람직한 구현예에서, 상기 중합체성 담체 화합물은 (R12C)-(R12C) 이량체, (WR12C)-(WR12C) 이량체, 또는 (CR12)-(CR12C)-(CR12) 삼량체로 구성되며, 여기서 이량체(예를 들어, (WR12C)) 또는 삼량체 (예를 들어, (CR12))의 개별 펩티드 요소는 -SH 기를 통해 연결된다.
제2 측면의 바람직한 구현예에서, 제1 측면의 하나 이상의 인공 RNA 및 선택적으로 제2 측면의 추가 인공 RNA는 HO-PEG5000-S-(S-CHHHHHHRRRRHHHHHHC-S-)7-S-PEG5000-OH (펩티드 단량체로서 서열 번호: 67)를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜/펩티드 중합체와 복합체화되거나 결합된다.
제2측면의 추가적인 바람직한 구현예에서, 제1 측면의 하나 이상의 인공 RNA 및 선택적으로 제2 측면의 추가 인공 RNA는 HO-PEG5000-S-(S-CHHHHHHRRRRHHHHHHC-S-)4-S-PEG5000-OH (펩티드 단량체로서 서열 번호: 67)를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜/펩티드 중합체와 복합체화되거나 결합된다.
제2측면의 추가적인 바람직한 구현예에서, 제1 측면의 하나 이상의 인공 RNA 및 선택적으로 제2 측면의 추가 인공 RNA는 HO-PEG5000-S-(S-CGHHHHHRRRRHHHHHGC-S-)7-S-PEG5000-OH (펩티드 단량체로서 서열 번호: 21320)를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜/펩티드 중합체와 복합체화되거나 결합된다.
제2측면의 추가적인 바람직한 구현예에서, 제1 측면의 하나 이상의 인공 RNA 및 선택적으로 제2 측면의 추가 인공 RNA는 HO-PEG5000-S-(S-CGHHHHHRRRRHHHHHGC-S-)4-S-PEG5000-OH (펩티드 단량체로서 서열 번호: 21320)를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜/펩티드 중합체와 복합체화되거나 결합된다.
다른 구현예에서, 상기 조성물은 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 인공 RNA, 및 선택적으로 제2 측면의 추가 인공 RNA를 포함하며, 여기서 상기 적어도 하나의 인공 RNA, 및 선택적으로 제2 측면의 추가 인공 RNA는 중합체성 담체 및 선택적으로 공개된 PCT 출원 WO2017/212008A1, WO2017/212006A1, WO2017/212007A1, 및 WO2017/212009A1에 기재된 바와 같이 적어도 하나의 지질 성분과 복합체화되거나 결합된다. 이러한 맥락에서, WO2017/212008A1, WO2017/212006A1, WO2017/212007A1, 및 WO2017/212009A1의 개시 내용은 본 명세서에 인용문헌으로 포함된다.
특히 바람직한 구현예에서, 상기 중합체성 담체는 펩티드 중합체, 바람직하게는 상기 정의된 폴리에틸렌 글리콜/펩티드 중합체 및 지질 성분, 바람직하게는 리피도이드 성분, 더욱 바람직하게는 리피도이드 성분이다.
제2 측면의 바람직한 구현예에서, 제1 측면의 하나 이상의 인공 RNA 및 선택적으로 제2 측면의 추가 인공 RNA는 중합체성 담체, 바람직하게는 상기 정의된 폴리에틸렌 글리콜/펩티드 중합체 및 리피도이드 성분과 복합체화되거나 결합되고, 여기서 상기 리피도이드 성분은 화학식 A 에 따른 화합물 또는 이의 약제학상 허용되는 염이고
Figure pct00022
(화학식 A)
여기서
- RA는 각각의 경우에 비치환, 사이클릭 또는 비사이클릭, 분지 또는 비분지 C1-20 지방족 그룹; 치환 또는 비치환, 사이클릭 또는 비사이클릭, 분지 또는 비분지 C1-20 헤테로지방족기; 치환 또는 비치환된 아릴; 치환 또는 비치환된 헤테로아릴로 독립적으로 선택되며;
Figure pct00023
여기서 적어도 하나의 RA는
Figure pct00024
- R5는 각각의 경우에 비치환, 사이클릭 또는 비사이클릭, 분지 또는 비분지 C8-16 지방족; 치환 또는 비치환된 아릴; 또는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택되고;
-x의 각 항목은 1에서 10까지의 정수이고;
-y의 각 항목은 1에서 10까지의 정수이다.
바람직한 구현예에서, 상기 리피도이드 성분은 화학식 B에 따른 3-C12-OH이다
Figure pct00025
(화학식 B)
바람직한 구현예에서, 상기 명시된 리피도이드 3-C12-OH를 포함하는 펩티드 중합체는 약 0.1 내지 약 20, 또는 약 0.2 내지 약 15, 또는 약 2 내지 약 15, 또는 약 2 내지 약 12의 N/P 비를 갖는 복합체를 형성하기 위해 제1 측면의 RNA 및 선택적으로 제2 측면의 추가 인공 RNA를 복합체화하는 데 사용되며, 여기서 상기 N/P비는 양이온성 펩티드 또는 중합체의 염기성 기의 질소 원자 대 인공 핵산의 인산염 기의 몰비로 정의된다. 이와 관련하여, WO2017/212009A1, 특히 WO2017/212009A1의 청구항 1 내지 10의 개시 및 그와 관련된 특정 개시가 본 명세서에 참조로 포함된다.
LNP에서 캡슐화/복합체화:
제2 측면의 바람직한 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA 및 선택적으로 제2 측면의 추가 인공 RNA는 하나 이상의 지질과 복합체화되거나 결합되어 리포좀, 지질 나노 입자 (LNP), 리포플렉스 및/또는 나노 리포좀을 형성한다.
본 명세서에 정의된 하나 이상의 인공 RNA 구조물 (예를 들어, F-del 및 M2-1)을 포함하는 조성물의 경우, 상기 구조물은 각각의 조성물을 형성하기 위해 예를 들어 LNP에서 공동-제형화될 수 있다.
대안적으로, 상기 하나 이상의 인공 RNA 구조물은 개별적으로 제형화될 수 있고, 후속적으로 조합되어 각각의 조성물을 형성할 수 있다.
이러한 맥락에서, 용어 "복합된"또는 "연관된"은 공유결합 없이 더 큰 복합체 또는 어셈블리로의 하나 이상의 지질과 함께 제1 측면의 인공 RNA 및 선택적으로 제2 측면의 추가 인공 RNA의 본질적으로 안정한 조합을 의미한다.
"LNP"라고도 하는 용어 "지질 나노 입자"는 임의의 특정 형태로 제한되지 않으며, 양이온성 지질 및 선택적으로 하나 이상의 추가 지질이 예를 들어 수성 환경 및/또는 RNA의 존재 하에서 조합될 때 생성되는 임의의 형태를 포함한다. 예를 들어, 리포좀, 지질 복합체, 리포플렉스 등은 지질 나노 입자 (LNP)의 범위 내에 있다.
따라서, 제2 측면의 바람직한 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA 및 선택적으로 제2 측면의 추가 인공 RNA는 하나 이상의 지질과 복합체화되어 지질 나노 입자 (LNP)를 형성한다.
LNP는 전형적으로 양이온성 지질 및 중성 지질, 하전된 지질, 스테로이드 및 중합체 접합 지질 (예를 들어, PEG화 지질)로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 포함한다. 상기 RNA는 LNP의 지질 부분 또는 LNP의 일부 또는 전체 지질 부분에 의해 둘러싸인 수성 공간에 캡슐화될 수 있다. RNA 또는 이의 일부는 또한 LNP와 결합되고 복합체화될 수 있다. LNP는 핵산이 부착되거나 하나 이상의 핵산이 캡슐화되는 입자를 형성할 수 있는 임의의 지질을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 핵산을 포함하는 LNP는 하나 이상의 양이온성 지질 및 하나 이상의 안정화 지질을 포함한다. 안정화 지질에는 중성 지질과 PEG화 지질이 포함된다.
LNP의 양이온성 지질은 양이온화 가능할 수 있고, 즉 그것은 pH가 지질의 이온화 가능한 기의 pK 아래로 낮아짐에 따라 양성자가되지만, 더 높은 pH 값에서는 점진적으로 더 중성이다. pK 미만의 pH 값에서 지질은 음으로 하전된 핵산과 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 양이온성 지질은 pH 감소에서 양전하를 가정하는 양쪽이온성 지질을 포함한다.
상기 LNP는 임의의 추가 양이온성 또는 양이온화 가능한 지질, 즉 생리학적 pH와 같은 선택적 pH에서 순 양전하를 운반하는 다수의 지질 종을 포함할 수 있다.
이러한 지질은 N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄클로라이드 (DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄브로마이드 (DDAB), 1,2-디올레오일트리메틸 암모늄 프로판 클로라이드 (DOTAP) (N-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 및 1,2-디올레일옥시-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염으로도 알려져 있음), N-(1-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드 (DOTMA), N,N-디메틸-2,3-디올레일옥시)프로필아민 (DODMA), 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLinDMA), 1,2-디리놀레닐옥시N,N-디메틸아미노프로판 (DLenDMA), 1,2-디-일리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (γ1,2-디리놀레일카르바모일옥시-3-디메틸아미노프로판 (DLin-C-DAP), 1,2-디리놀레일옥시-3-(디메틸아미노)아세톡시프로판 (DLin-DAC), 1,2-디리놀레이옥시-3-모르폴리노프로판 (DLin-MA), 1,2-디리놀레오일-3-디메틸아미노프로판 (DLinDAP), 1,2-디리놀레일티오-3-디메틸아미노프로판 (DLin-S- DMA), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판 (DLin2-DMAP), 1,2-디리놀레일옥시-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염 (DLin-TMA.Cl), 1,2-디리놀레오일-3-트리메틸-아미노프로판 클로라이드 염 (DLin-TAP.Cl), 1,2-디리놀레일옥시-3-(N-메틸피 페라지노)프로판 (DLinMPZ), 또는 3-(N,N-디리놀레일아미노)-1,2-프로판디올 (DLinAP), 3-(N,N-디올레일아미노)-1,2-프로판디오(DOAP), 1,2-디리놀레일옥소-3-(2-N,N-디메틸아미노)에톡시프로판 (DLin-EG-DM A), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K-DMA) 또는 이의 유사체, (3aR,5s,6aS)-N,N-디메틸-2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)테트라하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-5-아민, (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노)부타노에이트 (MC3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)에틸)(2-하이드록시도데실)아미노)에틸)(2-하이드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸아제인디일)디도데칸-2-올(C12-200), 2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K-C2-DMA), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K-DMA), (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트 (DLin-M-C3-DMA), 3-((6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일옥시)-N,N-디메틸프로판-1-아민 (MC3 에테르), 4-((6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일옥시)-N,N-디메틸부탄-1-아민 (MC4 에테르), LIPOFECTIN® (DOTMA 및 1,2-디올레일-sn-3포스포에탄올아민 (DOPE)을 포함하는 GIBCO/BRL, Grand Island, N.Y.으로부터 상업적으로 입수 가능한 양이온성 리포좀); LIPOFECTAMINE® (N-(1-(2,3디올레일옥시)프로필)-N-(2-(스페르민카복사미도)에틸)-N,N-디메틸암모늄 트리플루오로아세테이트 (DOSPA) 및 (DOPE)을 포함하는 GIBCO/BRL로부터 상업적으로 입수 가능한 양이온성 리포좀); 및 TRANSFECTAM® (에탄올에 디옥타데실아미도글리실 카르복시스페르민 (DOGS)을 포함하는 Promega Corp., Madison, Wis.로부터 상업적으로 입수 가능한 양이온성 지질) 또는 전술한 것의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 구현예에서, 상기 지질은 98N12-5, C12-200 및 ckk-E12로 구성된 군으로부터 선택된다.
한 구현예에서, 상기 추가 양이온성 지질은 아미노 지질이다.
대표적인 아미노 지질은 1,2-디리놀레일옥시-3-(디메틸아미노)아세톡시프로판 (DLin-DAC), 1,2-디리놀레이옥시-3-모르폴리노프로판 (DLin-MA), 1,2-디리놀레오일-3-디메틸아미노프로판 (DLinDAP), 1,2-디리놀레일티오-3-디메틸아미노프로판 (DLin-S-DMA), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판 (DLin2-DMAP), 1,2-디리놀레일옥시-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염 (DLin-TMA.Cl), 1,2-디리놀레오일-3-트리메틸-아미노프로판 클로라이드 염 (DLin-TAP.Cl), 1,2-디리놀레일옥시-3-(N-메틸피 페라지노)프로판 (DLin-MPZ), 또는 3-(N,N-디리놀레일아미노)-1,2-프로판디올 (DLinAP), 3-(N,N-디올레일아미노)-1,2-프로판디오(DOAP), 1,2-디리놀레일옥소-3-(2-N,N-디메틸아미노)에톡시프로판 (DLin-EG-DMA), 및 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K-DMA), 2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[l,3]-디옥솔란 (DLin-KC2-DMA); 디리놀레일-메틸-4-디메틸아미노부티레이트 (DLin-MC3-DMA); MC3 (US20100324120)을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA 및, 선택적으로 제2 측면의 추가 인공 RNA는 아미노알콜 리피도이드로 제형화될 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 아미노알콜 리피도이드는 그 전체가 참조로 포함된 U.S. 특허 번호 제8,450,298호에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다. 적합한 (이온화 가능한) 지질은 또한 표 1, 2 및 3에 개시되고 본 명세서에 참조로 포함된 WO2017/075531A1의 청구항 1-24에 정의된 화합물일 수 있다.
다른 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 또한 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된 WO2015/074085A1 (즉 ATX-001 내지 ATX-032 또는 청구항 1-26에 명시된 화합물), U.S. 출원 번호 61/905,724 및 15/614,499 또는 U.S. 특허 번호 9,593,077 및 9,567,296에 개시된 화합물일 수 있다.
이러한 맥락에서, 일반 화학식 (X1)에서 유래된 임의의 지질은
Figure pct00026
여기서, Ri 및 R2는 동일하거나 상이하고, 각각 1 내지 9개 탄소로 구성된 선형 또는 분지형 알킬, 2 내지 11개 탄소로 구성된 알케닐 또는 알키닐이며, Li 및 L2는 동일하거나 상이하고, 각각 5 내지 18개 탄소로 구성된 선형 알키닐렌 또는 알케닐렌, 또는 N과 헤테로사이클을 형성하고, Xi는 결합이거나 -CO-O-이고, 이에 따라 -L2-CO-O-R2가 형성되고, X2는 S 또는 O이고, L3는 결합이거나 1 내지 6개 탄소로 구성된 선형 또는 분지형 알킬렌이거나 N과 헤테로사이클을 형성하고, R3는 1 내지 6개 탄소로 구성되는 선형 또는 분지형 알킬렌이고, R4 및 R 5는 동일하거나 상이하고, 각각 수소 또는 1 내지 6개 탄소의 선형 또는 분지형 알킬이고; 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 적합하게 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, 적합한 양이온성 지질은 또한 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된WO2017/117530A1에 개시된 화합물(즉, 지질 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 청구범위에 명시된 화합물) 일 수 있다.
그러한 맥락에서, 임의의 지질은 일반 화학식 (X2) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로부터 유래되었고
Figure pct00027
여기서
X는 선형 또는 분지형 알킬렌 또는 알케닐렌, 모노사이클릭, 바이사이클릭 또는 트라이사이클릭 아렌 또는 헤테로아렌이고;
Y는 결합, 에텐, 또는 비치환 또는 치환된 방향족 또는 헤테로방향족 고리이고; Z는 S 또는 0이고;
L은 탄소수 1 내지 6의 선형 또는 분지형 알킬렌이고;
R-3 및 R4는 독립적으로 탄소수 1 내지 6의 선형 또는 분지형 알킬이고;
Ri 및 R2는 독립적으로 탄소수 1 내지 20의 선형 또는 분지형 알킬 또는 알케닐이고; r은 0 내지 6이고; 및
m, n, p 및 q는 독립적으로 1 내지 18이고;
여기서 n=q, m=p 및 Ri=R2일 때, X와 Y는 상이하고;
여기서 X=Y, n=q, m=p일 때, Ri 및 R2는 상이하고;
여기서 X=Y, n=q 및 Ri=R2일 때, m과 p는 상이하고; 및
여기서 X=Y, m=p 및 Ri=R2일 때, n과 q는 상이하다.
바람직한 구현예에서, 화학식 (X2)로부터 유래된 지질이 사용될 수 있으며, 여기서, X는 결합, 선형 또는 분지형 알킬렌, 알케닐렌, 또는 모노사이클릭, 바이사이클릭, 또는 트리사이클릭 아렌 또는 헤테로아렌이고; Y는 모노사이클릭, 바이사이클릭, 또는 트리사이클릭 아렌 또는 헤테로아렌이고; Z는 S 또는 O이고; L은 1 내지 6개 탄소의 선형 또는 분지형 알킬렌이고; R3 및 R4는 독립적으로 1 내지 6개 탄소의 선형 또는 분지형 알킬이고; Ri 및 R2는 독립적으로 1 내지 20개 탄소의 선형 또는 분지형 알킬 또는 알케닐이고; r은 0 내지 6이고; 및 m, n, p, 및 q는 독립적으로 1 내지 18이고; 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 적합하게 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 또한 PCT 출원 PCT/EP2017/077517에 개시된 지질 화합물(즉 PCT/EP2017/077517의 화학식 I, II, 및 III에서 유래된 지질 화합물 또는 PCT/EP2017/077517의 청구항 1 내지 12에 개시된 지질 화합물)로부터 선택될 수 있다. 이러한 맥락에서, PCT/EP2017/077517의 표 7에 개시된 지질 화합물 (예를 들어, 화학식 I-1 내지 I-41에서 유래된 지질 화합물) 및 PCT/EP2017/077517의 표 8에 개시된 지질 화합물 (예를 들어, 화학식 II-1 내지 II-36에서 유래된 지질 화합물)은 본 발명과 관련하여 적합하게 사용될 수 있다. 따라서, PCT/EP2017/077517의 화학식 I-1 내지 화학식 I-41 및 화학식 II-1 내지 화학식 II-36, 및 그와 관련된 특정 개시는 본 명세서에 참조로 포함된다.
제2 측면의 특히 바람직한 구현예에서, 적합한 지질은 화학식 (III)에 따른 양이온성 지질
Figure pct00028
또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 토토머(tautomer), 프로드러그(prodrug) 또는 입체이성질체(stereoisomer)일 수 있고, 여기서 R1, R2, R3, L1, L2, G1, G2, 및 G3은 하기와 같다.
화학식(III)은 추가로 다음과 같이 정의된다:
L1 또는 L2 중 하나는 -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)x-, -S-S-, -C(=O)S-, SC(=O)-, -NRaC(=O)-,
-C(=O)NRa-, -NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)NRa- 또는 -NRaC(=O)O-, 및 L1 또는 L2 중 다른 하나는 -O(C=O)-, -(C=O)O-,
-C(=O)-, -O-, -S(O)x-, -S-S-, -C(=O)S-, SC(=O)-, -NRaC(=O)-, -C(=O)NRa-, -NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)NRa- 또는 -NRaC(=O)O- 또는 직접(direct) 결합이고;
G1 및 G2는 각각 독립적으로 비치환된 C1-C12 알킬렌 또는 C1-C12 알케닐렌이고;
G3 는 C1-C24 알킬렌, C1-C24 알케닐렌, C3-C8 사이클로알킬렌, C3-C8 사이클로알케닐렌이고;
Ra는 H 또는 C1-C12 알킬이고;
R1 및 R2는 각각 독립적으로 C6-C24 알킬 또는 C6-C24 알케닐이고;
R3 는 H, OR5, CN, -C(=O)OR4, -OC(=O)R4 또는 -NR5C(=O)R4이고;
R4 는 C1-C12 알킬이고;
R5는 H 또는 C1-C6 알킬이고; 및
x는 0, 1 또는 2이다.
화학식 (III)의 전술한 구현예 중 일부에서, 상기 지질은 다음 구조 (IIIA) 또는 (IIIB) 중 하나를 갖는다:
Figure pct00029
(IIIA) 또는
Figure pct00030
(IIIB)
여기서:
A는 3 내지 8원 사이클로알킬 또는 사이클로알킬렌 고리이고; R6은 각각의 경우 독립적으로 H, OH 또는 C1-C24 알킬이고; n은 1에서 15 사이의 정수이다.
화학식 (III)의 전술한 구현예 중 일부에서, 상기 지질은 다음 구조 (IIIA), 및 다른 구현예에서, 상기 지질은 구조 (IIIB)를 갖는다.
화학식 (III)의 다른 구현예에서, 상기 지질은 다음 구조 (IIIC) 또는 (IIID) 중 하나를 갖는다:
Figure pct00031
(IIIC) 또는
Figure pct00032
(IIID)
여기서 y 및 z는 각각 독립적으로 1 내지 12 범위의 정수이다.
화학식 (III)의 상기 구현예 중 어느 하나에서, L1 또는 L2 중 하나는 -O(C=O)-이다. 예를 들어, 일부 구현예에서 L1 및 L2 각각은 -O(C=O)-이다. 전술한 임의의 일부 상이한 구현예에서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 -(C=O)O- 또는 -O(C=O)-. 예를 들어, 일부 구현예에서 각각의 L1 및 L2는
-(C=O)O-이다.
제2 측면의 바람직한 구현예에서, 상기 LNP의 양이온성 지질은 화학식 III의 화합물이며, 여기서:
L1 및 L2는 각각 독립적으로 -O(C=O)- 또는 (C=O)-O-이고;
G3 는 C1-C24 알킬렌 또는 C1-C24 알케닐렌이고; 및
R3 는 H 또는 OR5이다.
화학식 (III)의 일부 다른 구현예에서,상기 지질은 다음 구조 (IIIE) 또는 (IIIF) 중 하나를 갖는다:
Figure pct00033
(IIIE) 또는
Figure pct00034
(IIIF)
화학식 (III)의 일부 다른 구현예에서,상기 지질은 다음 구조 (IIIG), (IIIH), (IIII), 또는 (IIIJ) 중 하나를 갖는다:
Figure pct00035
(IIIG);
Figure pct00036
(IIIH);
Figure pct00037
(IIII) 또는
Figure pct00038
(IIIJ)
화학식 (III)의 앞선 일부 구현예에서, n은 2 내지 12, 예를 들어 2 내지 8 또는 2 내지 4 범위의 정수이다. 일부 구현예에서, n은 3, 4, 5 또는 6이다. 일부 구현예에서, n은 3이다. 일부 구현예에서, n은 4이다. 일부 구현예에서, n은 5이다. 일부 구현예에서, n은 6이다. 화학식 (III)의 전술한 구현예 중 일부 다른 경우, y 및 z는 각각 독립적으로 2 내지 10 범위의 정수이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, y 및 z는 각각 독립적으로 4 내지 9 또는 4 내지 6 범위의 정수이다. 화학식 (III)의 일부 다른 구현예에서, R6는 H이다. 전술한 구현예의 다른 경우, R6는 C1-C24 알킬이다. 다른 구현예에서, R6는 OH이다. 화학식 (III)의 일부 구현예에서, G3는비치환된다. 다른 구현예에서, G3는 치환된다. 다양한 다른 구현예에서, G3은 선형 C1-C24 알킬렌 또는 선형 C1-C24 알케닐렌이다. 화학식 (III)의 일부 다른 전술한 구현예에서, R1 또는 R2, 또는 둘 다는 C6-C24 알케닐이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, R1 및 R2 각각은, 독립적으로 다음의 구조를 갖는다:
Figure pct00039
,
여기서:
R7a 및 R7b은, 각 경우에, 독립적으로 H 또는 C1-C12 알킬이며; 및 a는 2 내지 12의 정수이고, 여기서 R7a, R7b 및 a는 각각 R1 및 R2 각각 독립적으로 6 내지 20개의 탄소 원자를 포함하도록 선택된다. 예를 들어, 일부 구현예에서 a는 5 내지 9 또는 8 내지 12 범위의 정수이다. 화학식 (III)의 일부 다른 구현예에서, 적어도 하나의 경우 R7a는 H이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, R7a는 각 경우에서 H이다. 전술한 것의 다른 상이한 구현예에서, R7b의 적어도 하나의 경우는 C1-C8 알킬이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, C1-C8 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소-부틸, 터트-부틸, n-헥실 또는 n-옥틸이다.
화학식 (III)의 다른 구현예에서, R1 또는 R2, 또는 둘 다는 다음 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00040
제2 측면의 바람직한 구현예에서, 상기 LNP의 양이온성 지질은 화학식 III의 화합물이며, 여기서:
L1 및 L2는 각각 독립적으로 -O(C=O)- 또는 (C=O)-O-이고; 및
R1 및 R2는 각각 독립적으로 다음 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00041
화학식 (III)의 일부 다른 구현예에서, R3는 OH, CN, -C(=O)OR4, -OC(=O)R4 또는 -NHC(=O)R4이다. 일부 구현예에서, R4는 메틸 또는 에틸이다.
제2 측면의 바람직한 구현예에서, 상기 LNP의 양이온성 지질은 화학식 III의 화합물이고, 여기서 R3는 OH이다.
제2 측면의 특히 바람직한 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA 및 선택적으로 제2 측면의 추가 인공 RNA는 하나 이상의 지질과 복합체를 형성하여 지질 나노입자 (LNP)를 형성하며, 여기서 상기 LNP는 구조 III-1 내지 III-36로부터 선택된다 (표 8 참조).
[표 8]
표 8: 화학식 (III)에서 유래된 대표적인 지질 화합물
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
일부 구현예에서, 상기 LNP는 화학식 (III)의 지질, 제1 측면의 인공 RNA, 및 선택적으로 제2 측면의 추가 인공 RNA, 및 중성 지질, 스테로이드 및 PEG화 지질로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 화학식 (III)의 지질은 화합물 III-3이다. 일부 구현예에서 화학식 (III)의 지질은 화합물 III-7이다.
바람직한 구현예에서, 상기 LNP는
Figure pct00047
,
Figure pct00048
,
Figure pct00049
및
Figure pct00050
로부터 선택된 양이온성 지질을 포함한다.
제2 측면의 특히 바람직한 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA 및 선택적으로 제2 측면의 추가 인공 RNA는 하나 이상의 지질과 복합체화되어 지질 나노입자 (LNP)를 형성하며, 여기서 상기 LNP는하기 양이온성 지질 (표 8의 화학식 III-3에 따른 지질)을 포함한다:
Figure pct00051
특정 구현예에서, 본 명세서에 정의된 양이온성 지질, 바람직하게는 표 8에 개시된 양이온성 지질, 더욱 바람직하게는 양이온성 지질 화합물 III-3은 LNP의 총 지질 함량에 대해 약 30 내지 약 95 몰 퍼센트의 양으로 LNP에 존재한다. 하나 이상의 양이온성 지질이 LNP 내에 포함되는 경우, 이러한 백분율은 결합된 양이온성 지질에 적용된다.
일 구현예에서, 상기 양이온성 지질은 약 30 내지 70 몰 퍼센트의 양으로 LNP에 존재한다. 일 구현예에서, 상기 양이온성 지질은 각각 약 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 또는 60 몰 퍼센트와 같은 약 40 내지 약 60 몰 퍼센트의 양으로 LNP에 존재한다. 구현예에서, 상기 양이온성 지질은 각각 약 47.0, 47.1, 47.2, 47.3, 47.4, 47.5, 47.6, 47.7, 47.8, 47.9, 50.0 몰 퍼센트와 같은 약 47 내지 약 48 몰 퍼센트의 양으로 LNP에 존재하며, 여기서 47.7 몰 퍼센트가 특히 바람직하다.
일부 구현예에서, 상기 양이온성 지질은 LNP에 존재하는 총 지질의 약 20몰% 내지 약 70 또는 75몰% 또는 약 45 내지 약 65몰% 또는 약 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 또는 약 70몰%의 비율로 존재한다. 추가 구현예에서, 상기 LNP는 양이온성 지질 몰 기준으로 약 25% 내지 약 75% , 예를 들어 몰 기준으로 약 20 내지 약 70%, 약 35 내지 약 65%, 약 45 내지 약 65%, 약 60%, 약 57.5%, 약 57.1%, 약 50% 또는 약 40%를 포함한다 (지질 나노입자 내 지질의 총 몰수 100% 기준). 일부 구현예에서, 양이온성 지질 대 핵산, 바람직하게는 제1 측면의 인공 RNA, 및 선택적으로 제2 측면의 추가 인공 RNA의 비는 약 5 내지 약 13 또는 약 7 내지 약 11과 같은 약 3 내지 약 15이다.
본 발명의 일부 구현예에서 상기 LNP는 상기 기재된 임의의 지질의 조합 또는 혼합물을 포함한다.
다른 적합한 (양이온성) 지질은 WO2009/086558, WO2009/127060, WO2010/048536, WO2010/054406, WO2010/088537, WO2010/129709, WO2011/153493, US2011/0256175, US2012/0128760, US2012/0027803, US8158601, WO2016/118724, WO2016/118725, WO2017/070613, WO2017/070620, WO2017/099823, 및 WO2017/112865에 개시되어 있다. 그와 관련하여, 특히 LNP에 적합한 (양이온성) 지질과 관련된 WO2009/086558, WO2009/127060, WO2010/048536, WO2010/054406, WO2010/088537, WO2010/129709, WO2011/153493, US2011/0256175, US2012/0128760, US2012/0027803, US8158601, WO2016/118724, WO2016/118725, WO2017/070613, WO2017/070620, WO2017/099823, 및 WO2017/112865의 개시 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 상기 지질은 98N12-5, C12-200 및 ckk-E12로 이루어진 군에서 선택된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 정의된 아미노 또는 양이온성 지질은 적어도 하나의 양성자성 또는 탈양성자성기를 가지며, 따라서 상기 지질은 생리학적 pH (예를 들어 pH 7.4) 이하의 pH에서 양으로 하전되고 제2 pH, 바람직하게는 생리학적 pH 이상에서 중성이다. 물론 pH의 함수로서 양성자의 추가 또는 제거는 평형 과정이며, 하전 또는 중성 지질에 대한 언급은 우세한 종의 특성을 나타내며 모든 지질은 하전 또는 중성 형태로 존재해야 하는 것을 요구하지 않는다는 것을 이해할 것이다. 하나 이상의 양성자성 또는 탈양성자성기를 갖거나 양쪽 이온성인 지질은 배제되지 않으며 마찬가지로 본 발명과 관련하여 적합할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 양성자성 지질은 약 4 내지 약 11, 예를 들어 약 5 내지 약 7의 pKa의 범위의 양성자성기의 pKa를 갖는다.
LNP는 둘 이상의 (상이한) 양이온성 지질을 포함할 수 있다. 상기 양이온성 지질은 상이한 유리한 특성에 기여하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 아민 pKa, 화학적 안정성, 순환 반감기, 조직 반감기, 조직의 순축적 또는 독성과 같은 특성이 상이한 양이온성 지질이 LNP에 사용될 수 있다. 특히, 상기 양이온성 지질은 혼합 LNP의 특성이 개별 지질의 단일 LNP의 특성보다 더 바람직하도록 선택될 수 있다.
영구적 양이온성 지질 또는 리피도이드의 양은 핵산 카고(cargo)의 양을 고려하여 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 이러한 양은 나노 입자(들) 또는 조성물의 N/P 비율이 약 0.1 내지 약 20 범위가 되도록 선택된다. 이와 관련해서, 상기 N/P 비율은 지질 또는 리피도이드의 염기성 질소 함유 기의 질소 원자 ("N") 대 RNA의 카고로 사용된 RNA의 인산염 기 ("P")의 몰비로 정의된다. 상기 N/P 비율은 예를 들어, 1μg RNA가 일반적으로 약 3nmol 포스페이트 잔기를 포함한다는 것을 기준으로 계산할 수 있으며, 단, RNA가 염기의 통계적 분포를 나타낸다. 지질 또는 리피도이드의 "N"값은 그것의 분자량 및 영구적인 양이온성 및 -존재하는 경우- 양이온화 가능한 기의 상대적 함량을 기준으로 계산될 수 있다.
LNP 생체 내 특성 및 거동은 친수성 폴리머 코팅, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 입체 안정화를 부여하기 위해 LNP 표면에서 추가하여 수정할 수 있다. 또한, LNP는 리간드 (예를 들어, 항체, 펩티드 및 탄수화물)를 표면 또는 부착된 PEG 사슬의 말단 끝에 (예를 들어 PEG화된 지질을 통해) 부착하여 특정 표적화에 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 LNP는 중합체 접합 지질을 포함한다. 용어 "중합체 접합 지질"은 지질 부분 및 중합체 부분 모두를 포함하는 분자를 지칭한다. 고분자 접합 지질의 예는 PEG화된 지질이다. 용어 "PEG화된 지질"은 지질 부분 및 폴리에틸렌 글리콜 부분 모두를 포함하는 분자를 지칭한다. PEG화된 지질은 당 업계에 공지되어 있으며 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤 (PEG-s-DMG) 등을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 LNP는 폴리에틸렌 글리콜-지질 (PEG화 지질)인 추가적인 안정화 지질을 포함한다. 적합한 폴리에틸렌 글리콜-리피드는 PEG-변형된 포스파티딜에탄올아민, PEG-변형된 포스파티딕 산, PEG-변형된 세라마이드 (예를 들어 PEG-CerC14 또는 PEG-CerC20), PEG-변형된 디알킬아민, PEG-변형된 디아실글리세롤, PEG-변형된 디알킬글리세롤을 포함한다. 대표적인 폴리에틸렌 글리콜-지질은 PEG-c-DOMG, PEG-c-DMA, 및 PEG-s-DMG를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 폴리에틸렌 글리콜-지질은 N-[(메톡시 폴리(에틸렌 글리콜))2000)카바밀]-1,2-디미리스토일옥실프로필-3-아민 (PEG-c-DMA)이다. 바람직한 구현예에서, 상기 폴리에틸렌 글리콜-지질은 PEG-2000-DMG이다. 일 구현예에서, 상기 폴리에틸렌 글리콜-지질은 PEG-c-DOMG)이다. 다른 구현예에서, 상기 LNP는 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤 (PEG-DMG)와 같은 PEG화된 디아실글리세롤 (PEG-DAG), PEG화된 포스파티딜에탄올로아민 (PEG-PE), 4-O-(2’ ,3’-디(테트라데칸오일옥시)프로필-1-O-(ω-메톡시(폴리에톡시)에틸)부탄디오에이트 (PEG-S-DMG)와 같은 PEG 숙시네이트 디아실글리세롤 (PEG-S-DAG), PEG화된 세라마이드 (PEG-cer), 또는 ω-메톡시(폴리에톡시)에틸-N-(2,3디(테트라데칸옥시)프로필)카바메이트 또는 2,3-디(테트라데칸옥시)프로필-N-(ω-메톡시(폴리에톡시)에틸)카바메이트와 같은 PEG 디알콕시프로필카바메이트를 포함한다.
제2 측면의 바람직한 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA 및 선택적으로 제2 측면의 추가 인공 RNA는 하나 이상의 지질과 복합체를 형성하여 지질 나노입자 (LNP)를 형성하며, 여기서 상기 LNP는 추가로 화학식 (IV) 또는 이의 약제학상 허용되는 염, 토토머 또는 입체 이성질체를 갖는 PEG화된 지질을 포함하고:
Figure pct00052
(IV)
여기서 R8 및 R9는 각각 독립적으로 10 내지 30개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이고, 여기서 상기 알킬 사슬은 선택적으로 하나 이상의 에스테르 결합에 의해 끊어지고; w는 30 내지 60 범위의 평균값을 가진다.
화학식 (IV)에 따른 PEG화 지질의 전술한 구현예 중 일부에서, w가 42일 때 R8 및 R9는 둘 다 n-옥타데실이 아니다. 일부 다른 구현예에서, R8 및 R9는 각각 독립적으로 10 내지 18 개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이다. 일부 구현예에서, R8 및 R9는 각각 독립적으로 12 내지 16 개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이다. 일부 구현예에서, R8 및 R9는 각각 독립적으로 12 개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이다. 일부 구현예에서, R8 및 R9는 각각 독립적으로 14 개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이다. 다른 구현예에서, R8 및 R9는 각각 독립적으로 16 개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이다.더 많은 구현예에서, R8 및 R9는 각각 독립적으로 18 개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이다. 또 다른 구현예에서, R8은 12 개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이고 R9는 14 개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이다.
다양한 구현예에서, w는 화학식 (IV)에 따른 PEG화된 지질의 PEG 부분이 약 400 내지 약 6000 g/mol의 평균 분자량을 갖도록 선택되는 범위에 걸쳐있다. 일부 구현예에서, 평균 w는 약 50이다.
제2 측면의 바람직한 구현예에서, 화학식 (IV)에 따른 PEG화된 지질의 R8 및 R9는 포화 알킬 사슬이다.
제2 측면의 특히 바람직한 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA 및 선택적으로 제2 측면의 추가 인공 RNA는 하나 이상의 지질과 복합체화되어 지질 나노입자 (LNP)를 형성하며, 여기서 상기 LNP는 PEG화된 지질을 추가로 포함하며, 여기서 상기 PEG 지질은 화학식 (IVa)이고
Figure pct00053
(IVa),
여기서 n은 약 28 내지 약 32, 약 30 내지 약 34, 32 내지 약 36, 약 34 내지 약 38, 36 내지 약 40, 약 38 내지 약 42, 40 내지 약 44, 약 42 내지 약 46, 44 내지 약 48, 약 46 내지 약 50, 48 내지 약 52, 약 50 내지 약 54, 52 내지 약 56, 약 54 내지 약 58, 56 내지 약 60, 약 58 내지 약 62와 같은 30 내지 60 범위의 평균값을 갖는다. 바람직한 구현예에서, n은 약 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54이다. 가장 바람직한 구현예에서 n은 49의 평균값을 갖는다.
다른 구현예에서, 상기 PEG화된 지질은 다음 구조 중 하나를 갖고:
Figure pct00054
여기서 n은 PEG화된 지질의 평균 분자량이 약 2500g/mol, 가장 바람직하게는 n이 약 49가 되도록 선택된 정수이다.
그와 관련하여 적합한 PEG-지질의 추가 예는 US2015/0376115A1 및 WO2015/199952에 제공되며, 이들 각각은 그 전체가 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, LNP는 LNP에서 지질의 총 몰을 기준으로 약 3, 2 또는 1 몰 퍼센트 미만의 PEG 또는 PEG-변형된 지질을 포함한다. 추가 구현예에서, LNP는 몰 기준으로 PEG-변형된 지질의 약 0.1% 내지 약 20%, 예를 들어 몰 기준으로 약 0.5 내지 약 10%, 약 0.5 내지 약 5%, 약 10%, 약 5%, 약 3.5%, 약 3%, 약 2,5%, 약 2%, 약 1.5%, 약 1%, 약 0.5%, 또는 약 0.3%을 포함한다 (LNP에서 지질의 총 몰수 100% 기준). 바람직한 구현예에서, LNP는 몰 기준으로 PEG-변형된 지질의 약 1.0% 내지 약 2.0%, 예를 들어, 약 1.2 내지 약 1.9%, 약 1.2 내지 약 1.8%, 약 1.3 내지 약 1.8%, 약 1.4 내지 약 1.8%, 약 1.5 내지 약 1.8%, 약 1.6 내지 약 1.8%, 특히 약 1.4%, 약 1.5%, 약 1.6%, 약 1.7%, 약 1.8%, 약 1.9%, 가장 바람직하게는 1.7%을 포함한다 (LNP에서 지질의 총 몰수 100% 기준). 다양한 구현예에서, 양이온성 지질 대 PEG화된 지질의 몰비는 약 100:1 내지 약 25:1 범위이다.
바람직한 구현예에서, 상기 LNP는 입자 형성동안 입자의 형성을 안정화시키는 하나 이상의 추가 지질 (예를 들어, 중성 지질 및/또는 하나 이상의 스테로이드 또는 스테로이드 유사체)을 추가로 포함한다.
제2 측면의 바람직한 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA 및 선택적으로 제2 측면의 추가 인공 RNA는 하나 이상의 지질과 복합체화되어 지질 나노입자 (LNP)를 형성하며, 여기서 상기 LNP는 추가적으로 하나 이상의 중성 지질 및/또는 하나 이상의 스테로이드 또는 스테로이드 유사체를 포함한다.
적합한 안정화 지질은 중성 지질 및 음이온성 지질을 포함한다. 용어 "중성 지질"은 생리학적 pH에서 하전되지 않은 또는 중성 양쪽성 이온 형태로 존재하는 다수의 지질 종 중 임의의 하나를 지칭한다. 대표적인 중성 지질에는 디아실포스파티딜콜린, 디아실포스파티딜에탄올아민, 세라마이드, 스핑고미엘린, 디히드로 스 핑고미엘린, 세팔린 및 세레브로시드가 포함된다.
제2 측면의 구현예에서, 상기 LNP는 추가적으로 하나 이상의 중성 지질을 포함하며, 여기서 상기 중성 지질은 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린 (DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤 (DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤 (DPPG), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린 (POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민 (POPE) 및 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1카르복실레이트 (DOPE-mal), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민 (DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민 (DMPE), 디스테아로일-포스파티딜에탄올아민 (DSPE), 16-O-모노메틸 PE, 16-O-디메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, 1-스테아리오일-2-올레오일포스파티디에탄올 아민 (SOPE), 및 1,2-디엘라이도일-sn-글리세로-3-포포에탄올아민 (transDOPE)을 포함하는 군에서 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 LNP는 DSPC, DPPC, DMPC, DOPC, POPC, DOPE 및 SM로부터 선택된 중성 지질을 포함한다. 다양한 구현예에서, 양이온성 지질 대 중성 지질의 몰비는 약 2:1 내지 약 8:1 범위이다.
제2 측면의 바람직한 구현예에서, 상기 중성 지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC)이다. 양이온성 지질 대 DSPC의 몰비는 약 2:1 내지 8:1 범위일 수 있다.
제2 측면의 바람직한 구현예에서, 상기 스테로이드는 콜레스테롤이다. 양이온성 지질 대 콜레스테롤의 몰비는 약 2:1 내지 1:1 범위일 수 있다.
상기 스테롤은 지질 입자의 약 10 mol % 내지 약 60 mol % 또는 약 25 mol % 내지 약 40 mol %일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 스테롤은 지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 약 60 몰 %이다. 다른 구현예에서, 상기 LNP는 상기 스테롤의 몰 기준으로 약 5% 내지 약 50%, 예를 들어 몰 기준으로 약 15% 내지 약 45%, 약 20% 내지 약 40%, 약 48%, 약 40%, 약 38.5%, 약 35%, 약 34.4%, 약 31.5% 또는 약 31%을 포함한다 (지질 나노입자의 지질 총 몰 100% 기준).
바람직하게는, 지질 나노입자 (LNP)는 다음을 포함한다: (a) 제1 측면의 적어도 하나의 인공 RNA, 및 선택적으로 제2 측면의 추가 인공 RNA, (b) 양이온성 지질, (c) 응집 감소제 (예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 지질 또는 PEG-변형된 지질), (d) 선택적으로 비양이온성 지질 (예컨대 중성 지질), 및 (e) 선택적으로 스테롤.
다른 바람직한 구현예에서, 지질 나노 입자 (LNP)는 다음을 포함한다: (a) 제1 측면의 F를 암호화하는 적어도 하나의 인공 RNA 또는 이의 유도체 또는 단편 및 제2 측면의 N, M, P, 또는 M2-1을 암호화하는 적어도 하나의 인공 RNA 또는 이의 유도체 또는 단편, (b) 양이온성 지질, (c) 응집 감소제 (예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 지질 또는 PEG-변형된 지질), (d) 선택적으로 비양이온성 지질 (예컨대 중성 지질) 및 (e) 선택적으로 스테롤.
일부 구현예에서, 상기 LNP는 화학식 (III)의 지질, 본 명세서에 정의된 인공 RNA, 중성 지질, 스테로이드 및 PEG화된 지질을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 화학식 (III)의 지질은 지질 화합물 III-3이고, 중성 지질은 DSPC이고, 스테로이드는 콜레스테롤이고, PEG화된 지질은 화학식 (IVa)의 화합물이다.
제2 측면의 바람직한 구현예에서, 상기 LNP는 약 20-60%의 양이온성 지질: 5-25% 중성 지질: 25-55% 스테롤; 0.5-15% PEG-지질의 몰비에서 본질적으로 (i) 적어도 하나의 양이온성 지질; (ii) 중성 지질; (iii) 스테롤, 예를 들어, 콜레스테롤; 및 (iv) PEG- 지질, 예를 들어 PEG-DMG 또는 PEG-cDMA로 이루어진다.
특히 제2 측면의 바람직한 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA 및 선택적으로 제2 측면의 추가 인공 RNA는 하나 이상의 지질과 복합체를 형성하여 지질 나노 입자 (LNP)를 형성하며, 여기서 상기 LNP는 본질적으로
(i) 본 명세서에 정의된 적어도 하나의 양이온성 지질, 바람직하게는 화학식 (III)의 지질, 더욱 바람직하게는 지질 III-3;
(ii) 본 명세서에 정의된 중성 지질, 바람직하게는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC);
(iii) 본 명세서에 정의된 스테로이드 또는 스테로이드 유사체, 바람직하게는 콜레스테롤; 및
(iv) 본 명세서에 정의된 PEG-지질, 예를 들어 PEG-DMG 또는 PEG-cDMA, 바람직하게는 화학식 (IVa)의 PEG화된 지질로 이루어지며,
여기서 (i) 내지 (iv)는 약 20-60% 양이온성 지질: 5-25% 중성 지질: 25-55% 스테롤; 0.5-15% PEG-지질의 몰비이다.
하나의 바람직한 구현예에서, 상기 지질 나노 입자는 다음을 포함한다: 화학식 (III)의 양이온성 지질 및/또는 화학식 (IV)의 PEG 지질, 선택적으로 중성 지질, 바람직하게는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포 콜린 (DSPC) 및 선택적으로 스테로이드, 바람직하게는 콜레스테롤, 여기서 상기 양이온성 지질 대 DSPC의 몰비는 선택적으로 약 2:1 내지 8:1의 범위에 있고, 여기서 양이온성 지질 대 콜레스테롤의 몰비는 선택적으로 약 2:1 내지 1:1 범위에 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 제1 측면의 인공 RNA 및 선택적으로 제2 측면의 추가 인공 RNA를 포함하는 제2 측면의 조성물은 대략 50:10:38.5:1.5, 바람직하게는 47.5:10:40.8:1.7 또는 보다 바람직하게는 47.4:10:40.9:1.7의 몰비(즉, 양이온성 지질(바람직하게는 지질 III-3), DSPC, 콜레스테롤 및 PEG-지질 ((바람직하게는 n = 49인 화학식 (IVa)의 PEG-지질; 에탄올에 용해됨)를 갖는 지질 나노입자(LNP)를 포함한다.
특히 바람직한 구현예에서, 제2 측면의 조성물은 대략 50:10:38.5:1.5, 바람직하게는 47.5:10:40.8:1.7 또는 보다 바람직하게는 47.4:10:40.9:1.7의 몰비(즉, 양이온성 지질(바람직하게는 지질 III-3), DSPC, 콜레스테롤 및 PEG-지질 ((바람직하게는 n = 49인 화학식 (IVa)의 PEG-지질; 에탄올에 용해됨)를 갖는 지질 나노입자(LNP)를 포함한다. 여기서 상기 지질 나노입자는 F (F0, F-del, F0_DSCav1, F-del_DSCav1, F_DSCav1_mut0, F-del_DSCav1_mut0, F_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut2, F_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut3, F_DSCav1_mut4, F-del_DSCav1_mut4, F_DSCav1_mut5, F-del_DSCav1_mut5, F_DSCav1_mut6, F-del_DSCav1_mut6, F_DSCav1_mut7, F-del_DSCav1_mut7, F_DSCav1_mut8, 또는 F-del_DSCav1_mut8)를 암호화하는 적어도 하나의 RNA, 및 M, N, M2-1 또는 P를 암호화하는 적어도 하나의 RNA를 포함한다.
특히 바람직한 구현예에서, 제2 측면의 조성물은 대략 50:10:38.5:1.5, 바람직하게는 47.5:10:40.8:1.7 또는 보다 바람직하게는 47.4:10:40.9:1.7의 몰비(즉, 양이온성 지질(바람직하게는 지질 III-3), DSPC, 콜레스테롤 및 PEG-지질 ((바람직하게는 n = 49인 화학식 (IVa)의 PEG-지질; 에탄올에 용해됨)를 갖는 지질 나노입자(LNP)를 포함하고, 여기서 상기 지질 나노입자는 F(F0, F-del, F0_DSCav1, F-del_DSCav1, F_DSCav1_mut0, F-del_DSCav1_mut0, F_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut2, F_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut3, F_DSCav1_mut4, F-del_DSCav1_mut4, F_DSCav1_mut5, F-del_DSCav1_mut5, F_DSCav1_mut6, F-del_DSCav1_mut6, F_DSCav1_mut7, F-del_DSCav1_mut7, F_DSCav1_mut8, 또는 F-del_DSCav1_mut8)를 암호화하는 적어도 하나의 RNA, 및 M, N, M2-1 또는 P를 암호화하는 적어도 하나의 RNA를 포함한다.
지질 나노입자의 총 RNA 양은 다양할 수 있으며 예를 들어 RNA 대 총 지질 w/w 비율에 따라 정의된다. 본 발명의 일 구현예에서 상기 인공 RNA 대 총 지질의 비는 0.06 w/w 미만, 바람직하게는 0.03 w/w와 0.04 w/w 사이이다.
다양한 구현예에서, 본 명세서에 정의된 LNP는 약 50 nm 내지 약 200nm, 약 60nm 내지 약 200nm, 약 70nm 내지 약 200nm, 약 80nm 내지 약 200nm, 약 90nm 내지 약 200nm, 약 90nm 내지 약 190nm, 약 90nm 내지 약 180nm, 약 90nm 내지 약 170nm, 약 90nm 내지 약 160nm, 약 90nm 내지 약 150nm, 약 90nm 내지 약 140nm, 약 90nm 내지 약 130nm, 약 90nm 내지 약 120nm, 약 90nm 내지 약 100nm, 약 70nm 내지 약 90nm, 약 80nm 내지 약 90nm, 약 70nm 내지 약 80nm, 또는 약 30nm, 35nm, 40nm, 45nm, 50nm, 55nm, 60nm, 65nm, 70nm, 75nm, 80nm, 85nm, 90nm, 95nm, 100nm, 105nm, 110nm, 115nm, 120nm, 125nm, 130nm, 135nm, 140nm, 145nm, 150nm, 160nm, 170nm, 180nm, 190nm, 또는 200nm의 평균 직경을 가지고, 실질적으로 무독성이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 평균 직경은 당 업계에 일반적으로 알려진 동적 광 산란에 의해 결정된 z-평균으로 나타낼 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 지질 나노 입자는 각각 약 50nm 내지 약 300nm, 또는 약 60nm 내지 약 250nm, 약 60nm 내지 약 150nm, 또는 약 60nm 내지 약 120nm 범위의 유체 역학적 직경을 갖는다.
추가 구현예에 따르면, 제2 측면의 조성물은 적어도 하나의 보조제를 포함 할 수 있다. 적합하게는, 상기 보조제는 바람직하게는 조성물의 면역 자극 특성을 향상시키기 위해 첨가된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "보조제(adjuvant)"는 당 업계의 통상의 기술자에 의해 이해되고 인식될 것이며, 다른 작용제의 효과 (여기서: 본 발명의 인공 핵산의 효과)를 변형, 예를 들어 개선시킬 수 있거나 조성물의 투여 및 전달을 지원하는 데 적합할 수 있는 약리학적 및/또는 면역학적 작용제를 지칭하는 것으로 의도된다. 용어 "보조제"는 광범위한 물질을 의미한다. 일반적으로 이러한 물질은 항원의 면역원성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 보조제는 선천 면역계에 의해 인식될 수 있으며, 예를 들어 선천 면역 반응 (즉, 비특이적 면역 반응)을 유도할 수 있다. "보조제"는 일반적으로 적응 면역 반응을 유도하지 않는다. 본 발명의 맥락에서, 보조제는 본 명세서에 정의된 인공 핵산 또는 본 명세서에 정의된 폴리단백질에 의해 제공되는 항원성 펩티드 또는 단백질의 효과를 향상시킬 수 있다.
그와 관련하여, 적어도 하나의 보조제는 통상의 기술자에게 공지되고 본 경우에 적합한 임의의 보조제로부터 선택될 수 있으며, 즉, 대상체, 예를 들어 인간 대상체에서 면역 반응의 유도를 지원할 수 있다.
따라서, 제2 측면의 조성물은 적어도 하나의 보조제를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 적어도 하나의 보조제는 공개된 PCT 출원 WO2016/203025에서 제공된 임의의 보조제로부터 적절하게 선택될 수 있다. WO2016/203025의 제2항 내지 제17항 중 어느 한 항에 개시된 보조제, 바람직하게는 WO2016/203025의 제17항에 개시된 보조제가 특히 적합하며, 이와 관련된 특정 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
제2 측면의 조성물은 본 명세서에 명시된 구성 요소 외에 추가 항원 (예를 들어, 펩티드 또는 단백질 형태) 또는 추가 항원-암호화 핵산; 추가 면역 치료제; 하나 이상의 보조 물질 (모노카인, 림포카인, 인터루킨 또는 케모카인과 같은 사이토카인); 또는 인간 Toll-유사 수용체에 대한 (리간드로서) 결합 친화성으로 인해 면역을 자극하는 것으로 알려진 임의의 추가 화합물; 및/또는 보조제 핵산, 바람직하게는 면역 자극 RNA (isRNA), 예를 들어 CpG-RNA 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있는 적어도 하나의 추가 구성 요소를 포함할 수 있다.
폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드를 포함하는 조성물
제3 측면에서, 본 발명은 폴리펩티드, 바람직하게는 항원성 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 제1 측면의 인공 RNA에 의해 암호화된 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함한다.
구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 68, 483, 898, 1267, 1636, 2005, 2374, 2743, 3112, 3481, 3850, 4219, 4588, 4957, 5326, 5695, 6064, 6433, 6802, 7171, 7540, 7909, 11726, 12095, 12464, 12833, 13940, 14309, 14678, 15047, 15416, 15785, 13202, 13571, 16154, 16523, 16892, 17261, 17630, 17999, 18368, 18737, 19106, 19475 또는 임의의 이들 폴리펩티드의 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
바람직한 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1267, 2005, 2743, 3481, 4219, 4957, 5695, 6433, 7171, 7909, 12833, 14309, 15047, 15785, 13571, 16523, 17261, 17999, 18737, 19475 또는 임의의 이들 폴리펩티드의 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
네 번째 측면에서, 본 발명은 제3 측면의 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 제4 측면의 조성물은 본 명세서에 정의된 적어도 하나의 약제 학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 제4 측면의 조성물은 제1 측면의 적어도 하나의 인공 RNA 및 선택적으로, 제2 측면의 적어도 하나의 추가 인공 RNA, 또는 제2 측면의 RNA 조성물을 추가로 포함할 수 있다.
특히, 제2 측면의 조성물 또는 제5 측면의 백신에 관한 구현예는 마찬가지로 제4 측면의 조성물의 적합한 구현예에서 판독되고 이해될 수 있다.
백신:
제5 측면에서, 본 발명은 상기 백신이 제1 측면의 RNA, 및 임의로 제2 측면의 조성물, 제3 측면의 폴리펩티드, 또는 제4 측면의 조성물을 포함하는 백신을 제공한다.
특히, 제2 측면의 조성물 또는 제4 측면의 조성물에 관한 구현예는 마찬가지로 제5 측면의 백신의 적합한 구현예에서 판독되고 이해될 수 있다. 또한, 제5 측면의 백신과 관련된 구현예는 마찬가지로 제2 측면의 조성물 (제1 측면의 RNA 및 선택적으로 제2 측면의 추가 인공 RNA를 포함함) 또는 제4 측면의 조성물 (제3 측면의 폴리펩티드)의 적합한 구현예에서 판독되고 이해될 수 있다.
용어 "백신"은 당 업계의 통상의 기술자에 의해 이해되고 인식될 것이며, 예를 들어 적어도 하나의 에피토프 또는 항원, 바람직하게는 면역원을 제공하는 예방 또는 치료 물질로 의도된다. 본 발명의 맥락에서 항원 또는 항원 기능은 제1 측면의 본 발명의 RNA (RSV F 단백질에서 유래된 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 코딩 서열을 포함하는 상기 RNA), 제2 측면의 조성물(제1 측면의 RNA 및 선택적으로 제2 측면의 추가 인공 RNA를 포함함), 제3 측면의 폴리펩티드, 또는 제4 측면의 조성물 (상기 폴리펩티드를 포함함)에 의해 제공된다.
제5 측면의 바람직한 구현예에서, 상기 백신은 제1 측면의 RNA, 제2 측면의 조성물 (제1 측면의 RNA 및 선택적으로 제2 측면의 추가 인공 RNA를 포함함), 제3 측면의 폴리펩티드 또는 제4 측면의 조성물을 포함하며 여기서 상기 RNA, 상기 제2 측면의 조성물, 상기 폴리펩티드 또는 상기 제4 측면의 조성물 (상기 폴리펩티드를 포함함)은 적응 면역 반응을 유도한다.
특히 바람직한 구현예에서, 상기 백신은 제1 측면의 RNA 또는 제2 측면의 조성물을 포함하며, 여기서 상기 RNA 또는 상기 조성물은 적응 면역 반응, 바람직하게는 RSV에 대한 적응 면역 반응을 유도한다.
특히 바람직한 구현예에서, 상기 백신은 제1 측면의 RNA 또는 제2 측면의 조성물을 포함하며, 여기서 상기 RNA 또는 상기 조성물은 T 세포 면역 반응을 유도한다,
제5 측면의 바람직한 구현예에 따르면, 본 명세서에 정의된 백신은 약제학상 허용되는 담체 및 임의로 제2 측면의 맥락에서 특정된 바와 같은 적어도 하나의 보조제를 추가로 포함할 수 있다.
그러한 맥락에서 적합한 보조제는 WO2016/203025의 청구항 17에 개시된 보조제로부터 선택될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 백신은 1가 백신이다.
구현예에서 상기 백신은 제1 측면과 관련하여 정의된 복수 또는 적어도 하나 이상의 인공 RNA, 및 선택적으로 제2 측면과 관련하여 정의된 적어도 하나 이상의 추가 인공 RNA를 포함하는 다가(polyvalent) 백신이다. 제2 측면과 관련하여 개시된 다가 조성물에 관한 구현예는 마찬가지로 제5 측면의 다가 백신의 적합한 구현예에서 판독되고 이해될 수 있다.
제5 측면의 백신은 전형적으로 안전하고 유효한 양의 제1 측면의 RNA 및 선택적으로 제2 측면의 추가 RNA를 포함한다. 본 명세서에 사용된 "안전하고 유효한 양"은 RSV 감염과 관련된 질환 또는 장애의 양성 변형을 유의하게 유도하기에 충분한 RNA의 양을 의미한다. 동시에 "안전하고 유효한 양"은 심각한 부작용을 피할 수 있을 만큼 적다. 본 발명의 백신 또는 조성물과 관련하여, "안전하고 유효한 양"이라는 표현은 바람직하게는 과도하거나 손상을 주는 면역 반응이 달성되지 않으나, 바람직하게는 측정 가능한 수준 이하의 그러한 면역 반응도 발생하지 않는 방식으로 적응 면역계를 자극하는 데 적합한 RNA의 양을 의미한다.
상기 정의된 조성물 또는 백신의 RNA의 "안전하고 유효한 양"은 동반 의사의 지식과 경험 내에서 치료할 특정 상태 및 치료할 환자의 연령 및 신체 상태, 상태의 중증도, 치료 기간, 동반 요법의 특성, 사용된 특정 약제학적으로 허용되는 담체 및 유사한 요인과 관련하여 더욱 다양할 것이다. 더욱이, RNA, 조성물, 백신의 "안전하고 유효한 양"은 적용 경로 (피내, 근육 내), 적용 장치 (제트 주입, 바늘 주입, 미세 바늘 패치) 및/또는 복합체 (프로타민 복합체 또는 LNP 캡슐화)에 따라 달라질 수 있다. 더욱이, 인공 RNA의 "안전하고 유효한 양", 조성물, 백신은 치료 대상체 (유아, 임산부, 면역 저하된 인간 대상체 등)의 상태에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 적절한 "안전하고 유효한 양"은 그에 따라 조정되어야 하며 통상의 기술자에 의해 선택되고 정의될 것이다.
상기 백신은 약제학적 조성물 또는 백신으로 본 발명에 따라 인간 의료 목적 및 수의학적 의료 목적 (포유동물, 척추동물, 조류종)을 위해 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 RNA, 조성물 (상기 RNA 및 선택적으로 추가 RNA를 포함함), 폴리펩티드, 조성물 (상기 폴리펩티드를 포함함) 또는 백신은 동결 건조된 형태로 제공된다 (예를 들어, WO2016/165831, WO2011/069586, WO2016/184575 또는 WO2016/184576에 개시된 동결 건조 방법을 사용함). 바람직하게는, 동결 건조된 RNA, 동결 건조된 조성물, 동결 건조된 폴리펩티드, 폴리펩티드를 포함하는 동결 건조된 조성물, 또는 동결 건조된 백신은 투여 전에 유리하게는 수성 담체에 기초하여 적합한 완충액, 예를 들어 링거-락테이트 용액 또는 포스페이트 완충액에서 재구성된다.
따라서, 본 명세서에 사용된 약제학적으로 허용되는 담체는 바람직하게는 본 발명의 백신의 액체 또는 비액체 기반(basis)을 포함한다. 본 발명의 백신이 액체 형태로 제공되는 경우, 담체는 물, 일반적으로 발열원이 없는 물; 등장성 식염수 또는 완충 (수성) 용액, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트 등의 완충액을 포함한다. 바람직하게는, 링거-락테이트 용액은 WO2006/122828에 기재된 바와 같이 본 발명에 따른 백신 또는 조성물에 대한 액체 기반으로 사용되며, 이는 본 명세서에 참조로 포함된 적합한 완충액에 관한 개시이다.
본 명세서에 정의된 약제학적으로 허용되는 담체의 선택은 원칙적으로 본 발명에 따른 약제학적 조성물(들) 또는 백신이 투여되는 방식에 의해 결정된다. 상기 백신은 예를 들어, 전신 또는 국소적으로 투여할 수 있다. 일반적으로 전신 투여를 위한 경로는 예를 들어, 피하, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 피내 및 복강 내 주사 및/또는 비강 내 투여 경로를 포함하는 경피, 경구, 비경구 경로를 포함한다. 일반적으로 국소 투여 경로는 예를 들어, 국소 투여 경로뿐만 아니라 피내, 경피, 피하 또는 근육 내 주사 또는 병변 내, 두개 내, 폐내, 심장 내, 관절 내 및 설하 주사를 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물 또는 백신은 피내, 피하 또는 근육 내 경로, 바람직하게는 주사에 의해 투여될 수 있으며, 이는 무 바늘 및/또는 바늘 주사일 수 있다. 따라서 조성물/백신은 바람직하게는 액체 또는 고체 형태로 제형화된다. 투여될 본 발명에 따른 백신 또는 조성물의 적절한 양은 일상적인 실험, 예를 들어 동물 모델을 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 모델에는 토끼, 양, 마우스, 쥐, 개 및 비인간 영장류 모델이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 주사를 위한 바람직한 단위 투여 형태는 물, 생리 식염수 또는 이들의 혼합물의 멸균 용액을 포함한다. 이러한 용액의 pH는 약 7.4로 조정되어야 한다. 주사에 적합한 담체는 하이드로겔, 제어 또는 지연 방출 장치, 폴리락트산 및 콜라겐 매트릭스를 포함한다. 국소 적용에 적합한 약제학적으로 허용되는 담체는 로션, 크림, 겔 등에 사용하기에 적합한 것들을 포함한다. 본 발명의 조성물 또는 백신이 경구 투여되는 경우, 정제, 캡슐 등이 바람직한 단위 투여 형태이다. 경구 투여에 사용될 수 있는 단위 투여 형태의 제조를 위한 약제학적으로 허용되는 담체는 선행 기술에 잘 알려져 있다. 이의 선택은 맛, 비용 및 저장 가능성과 같은 2차 고려 사항에 의존할 것이며, 이는 본 발명의 목적에 중요하지 않고 당 업계의 통상의 기술자에 의해 어려움 없이 이루어질 수 있다.
본 명세서에 정의된 본 발명의 백신 또는 조성물은 면역원성을 추가로 증가시키기 위해 상기 정의된 하나 이상의 보조 물질을 추가로 함유할 수 있다. 상기 기재된 본 발명의 백신 또는 조성물과 선택적으로 공동 제형화 (또는 별도 제형화)될 수 있는 본 발명 조성물에 함유된 핵산 및 보조 물질의 상승 작용이 바람직하게는 이에 의해 달성된다. 이러한 면역원성 증가제 또는 화합물은 개별적으로 제공될 수 있고 (본 발명의 백신 또는 조성물과 함께 제형화되지 않음) 개별적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 백신 또는 조성물에 포함될 수 있는 추가 첨가제는 예를 들어 Tween과 같은 유화제; 예를 들어 소듐 라우릴 설페이트와 같은 습윤제; 착색제; 미각 부여제, 약제학적 담체; 정제 형성제; 안정화제; 항산화제; 방부제이다.
키트 또는 부품들로 이루어진 키트(kit of parts), 적용, 의학적 용도, 치료 방법:
제6 측면에서, 본 발명은 키트 또는 부품들로 이루어진 키트를 제공하며, 여기서 상기 키트 또는 부품들로 이루어진 키트는 제1 측면의 RNA, 제2 측면의 조성물 (상기 RNA를 포함함), 제3 측면의 폴리펩티드, 제4 측면의 조성물 (상기 폴리펩티드를 포함함), 및/또는 제5 측면의 백신, 선택적으로 가용화를 위한 액체 비히클, 및 선택적으로 구성 요소의 투여 및 투여량에 관한 정보를 제공하는 기술 지침서를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 제6 측면의 키트는 적어도 다음 구성 요소를 포함하고
a) 제1 측면의 적어도 하나의 RNA, 바람직하게는 RSV 융합 (F) 단백질에서 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 RNA (바람직하게는 표 5 또는 표 6에 선택된 RNA 서열), 여기서 상기 인공 RNA는 바람직하게는 하나 이상의 지질과 복합체화되어 지질 나노입자 (LNP)를 형성하며; 및
b) M, N, M2-1 또는 P에서 선택된 RSV에서 유래된 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 1, 2, 또는 3개의 추가 인공 RNA (바람직하게는 표 7에서 선택된 RNA 서열), 여기서 상기 추가 RNA는 바람직하게는 하나 이상의 지질과 복합체화되어 지질 나노 입자 (LNP)를 형성하며,
여기서 구성 요소 a) 및 b)는 별도의 엔티티(entity) 또는 단일 엔티티로 제공된다.
바람직한 구현예에서, 제6 측면의 키트는 적어도 다음 구성 요소를 포함하고
a) 제1 측면의 적어도 하나의 RNA, 바람직하게는 RSV 융합 (F) 단백질에서 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 RNA (바람직하게는 표 5 또는 표 6에 선택된 RNA 서열), 여기서 상기 인공 RNA는 바람직하게는 하나 이상의 지질과 복합체화되어 지질 나노입자 (LNP)를 형성하며; 및
b) M 에서 선택된 RSV에서 유래된 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA (바람직하게는 표 7A, 컬럼 A에서 선택된 RNA 서열), 여기서 상기 추가 RNA는 바람직하게는 하나 이상의 지질과 복합체화되어 지질 나노 입자 (LNP)를 형성하며; 및
c) P 에서 선택된 RSV에서 유래된 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA (바람직하게는 표 7A, 컬럼 C에서 선택된 RNA 서열), 여기서 상기 추가 RNA는 바람직하게는 하나 이상의 지질과 복합체화되어 지질 나노 입자 (LNP)를 형성하고,
여기서 구성 요소 a), b) 및 c)는 별도의 엔티티 또는 단일 엔티티로 제공된다.
바람직한 구현예에서, 제6 측면의 키트는 적어도 다음 구성 요소를 포함하고
a) 제1 측면의 적어도 하나의 RNA, 바람직하게는 RSV 융합 (F) 단백질에서 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 RNA (바람직하게는 표 5 또는 표 6에 선택된 RNA 서열), 여기서 상기 인공 RNA는 바람직하게는 하나 이상의 지질과 복합체화되어 지질 나노입자 (LNP)를 형성하며; 및
b) M 에서 선택된 RSV에서 유래된 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA (바람직하게는 표 7A, 컬럼 A에서 선택된 RNA 서열), 여기서 상기 추가 RNA는 바람직하게는 하나 이상의 지질과 복합체화되어 지질 나노 입자 (LNP)를 형성하며; 및
c) P 에서 선택된 RSV에서 유래된 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA (바람직하게는 표 7A, 컬럼 C에서 선택된 RNA 서열), 여기서 상기 추가 RNA는 바람직하게는 하나 이상의 지질과 복합체화되어 지질 나노 입자 (LNP)를 형성하며; 및
d) P 에서 선택된 RSV에서 유래된 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA (바람직하게는 표 7A, 컬럼 B에서 선택된 RNA 서열), 여기서 상기 추가 RNA는 바람직하게는 하나 이상의 지질과 복합체화되어 지질 나노 입자 (LNP)를 형성하고,
여기서 구성 요소 a), b), c) 및 d)는 별도의 엔티티 또는 단일 엔티티로 제공된다.
상기 키트는 제2 측면의 조성물, 제3 측면의 폴리펩티드, 제4 측면의 조성물, 및/또는 제5 측면의 백신과 관련하여 기재된 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다.
상기 키트의 기술 지침서는 투여 및 투여량 및 환자 그룹에 대한 정보를 포함할 수 있다. 이러한 키트, 바람직하게 부품들로 이루어진 키트는 예를 들어 본 명세서에 언급된 임의의 적용 또는 용도, 바람직하게는 제1 측면의 RNA, 제2 측면의 조성물, 제3 측면의 폴리펩티드, 제4 측면의 조성물, 또는 제5 측면의 백신의 용도, RSV 또는 그와 관련된 질환에 의해 유발되는 감염 또는 질병의 치료 또는 예방을 위해 적용될 수 있다. 바람직하게는, 제1 측면의 RNA, 제2 측면의 조성물, 제3 측면의 폴리펩티드, 제4 측면의 조성물 또는 제5 측면의 백신은 키트의 별도 부분에 제공되며, 여기서 제1 측면의 RNA, 제2 측면의 조성물, 제3 측면의 폴리펩티드, 제4 측면의 조성물, 또는 제5 측면의 백신은 바람직하게는 동결 건조된다. 상기 키트는 제1 측면의 RNA, 제2 측면의 조성물, 제3 측면의 폴리펩티드, 제4 측면의 조성물, 또는 제5 측면의 백신을 가용화하기 위한 비히클 (예를 들어 완충액)을 일부로서 추가로 함유할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 명세서에 정의된 키트 또는 부품들로 이루어진 키트는 링거 락테이트(Ringer lactate) 용액을 포함한다.
상기 키트 중 임의의 것은 본 명세서에 정의된 바와 같이 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 키트 중 임의의 것이 백신, 바람직하게는 본 명세서에 정의된 바와 같이 RSV에 의해 야기되는 감염에 대한 백신으로 사용될 수 있다.
의학적 용도:
추가 측면에서, 본 발명은 제1 측면의 RNA, 제2 측면의 조성물, 제3 측면의 폴리펩티드, 제4 측면의 조성물, 제5 측면의 백신 또는 제6 측면의 키트 또는 부품들로 이루어진 키트의 제1 의학적 용도에 관한 것이다.
따라서, 제1 측면의 RNA, 제2 측면의 조성물, 제3 측면의 폴리펩티드, 제4 측면의 조성물, 제5 측면의 백신 또는 제6 측면의 키트 또는 부품들로 이루어진 키트는 약제로 사용하기 위한 것이다.
본 발명은 또한 제1 측면의 RNA, 제2 측면의 조성물, 제3 측면의 폴리펩티드, 제4 측면의 조성물, 제5 측면의 백신 또는 제6 측면의 키트 또는 부품들로 이루어진 키트의 여러 응용 및 용도를 제공한다.
특히, 상기 RNA, 조성물 (상기 RNA를 포함), 폴리펩티드, 조성물 (상기 폴리펩티드를 포함), 백신, 또는 키트 또는 부품들로 이루어진 키트는 인간 의료 목적 및 또한 수의학 목적, 바람직하게 인간 의료 목적으로 사용될 수 있다.
특히, 상기 RNA, (상기 RNA를 포함하는) 조성물, 폴리펩티드, (상기 폴리펩티드를 포함하는) 조성물, 백신, 또는 키트 또는 부품들로 이루어진 키트는 인간 의료 목적을 위한 약제로 사용하기 위한 것일 수 있으며, 여기서 상기 RNA, (상기 RNA를 포함하는) 조성물, 폴리펩티드, (상기 폴리펩티드를 포함하는) 조성물, 백신, 또는 키트 또는 부품들로 이루어진 키트는 특히 영유아, 신생아, 면역 저하 환자(recipient), 임산부 및 모유 수유 여성 및 노인에게 적합할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 제1 측면의 RNA, 제2 측면의 조성물, 제3 측면의 폴리펩티드, 제4 측면의 조성물, 제5 측면의 백신, 또는 제6 측면의 키트 또는 부품들로 이루어진 키트의 제2 의학적 용도에 관한 것이다.
따라서, 제1 측면의 RNA, 제2 측면의 조성물, 제3 측면의 폴리펩티드, 제4 측면의 조성물, 제5 측면의 백신, 또는 제6 측면의 키트 또는 부품들로 이루어진 키트는 병원균 (예를 들어 바이러스) 감염, 특히 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV) 또는 이러한 감염과 관련된 장애의 치료 또는 예방에 사용된다.
특히, 제1 측면의 RNA, 제2 측면의 조성물, 제3 측면의 폴리펩티드, 제4 측면의 조성물, 제5 측면의 백신, 또는 제6 측면의 키트 또는 부품들로 이루어진 키트는 바이러스, 특히 RSV에 의한 감염, 또는 인간에 대한 이러한 감염과 관련된 장애의 치료 또는 예방에 사용될 수 있으며, 또한 수의학 목적, 바람직하게는 인간 의학적 목적을 위해 사용될 수 있다.
특히, 상기 RNA, (상기 RNA를 포함하는) 조성물, 폴리펩티드, (상기 폴리펩티드를 포함하는) 조성물, 백신, 또는 키트 또는 부품들로 이루어진 키트는 RSV 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위해 특히 영유아, 신생아, 면역 저하 환자, 임산부 및 모유 수유 여성 및 노인에게 적합할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "RSV 감염과 관련된 장애"는 바람직하게는 전형적인 증상 또는 RSV 감염의 합병증을 포함 할 수 있다.
제1 측면의 인공 RNA, 제2 측면의 조성물, 제3 측면의 폴리펩티드, 제4 측면의 조성물, 제5 측면의 백신, 또는 제6 측면의 키트 또는 부품들로 이루어진 키트는 RSV로 인한 감염의 예방 (노출 전 예방 또는 노출 후 예방) 및/또는 치료 방법에 사용될 수 있다.
본 명세서에 정의된 조성물 또는 백신은 바람직하게는 국소 투여될 수 있다. 특히, 조성물 또는 백신은 피내, 피하, 비강 또는 근육 내 경로로 투여될 수 있다. 따라서 본 발명 조성물 또는 본 발명의 백신은 바람직하게는 액체 (또는 때때로 고체) 형태로 제형화된다. 구현예에서, 본 발명의 백신은 통상적인 바늘 주사 또는 바늘 없는 제트 주사로 투여될 수 있다. 그와 관련하여 바람직하게는 상기 RNA, 조성물, 백신은 근육 내 주사에 의해 투여된다.
본 명세서에 사용된 용어 "제트 주입"은 바늘이 없는 주입 방법을 지칭하며, 여기서 예를 들어 제1 측면의 적어도 하나의 RNA를 포함하는 유체 (백신, 본 발명의 조성물)는 오리피스(orifice)를 통해 강제되어 주사 설정에 따라 포유동물 피부, 피하 조직 또는 근육 조직을 통과할 수 있는 고압의 초미세 액체 흐름을 생성한다. 원칙적으로 상기 액체 흐름은 피부를 뚫고, 상기 액체 흐름이 대상 조직으로 밀려난다. 바람직하게는, 제트 주사는 본 명세서에 개시된 RNA, 조성물, 백신의 피내, 피하 또는 근육 내 주사에 사용된다.
구현예에서, 본 명세서에 정의된 조성물 또는 백신에 포함된 RNA는 약 100ng 내지 약 500μg의 양, 약 1μg 내지 약 200μg의 양, 약 1μg 내지 약 100μg의 양, 약 5μg 내지 약 100μg의 양, 바람직하게는 약 10μg 내지 약 50μg의 양, 특히, 약 5μg, 10μg, 15μg, 20μg, 25μg, 30μg, 35μg, 40μg, 45μg, 50μg, 55μg, 60μg, 65μg, 70μg, 75μg, 80μg, 85μg, 90μg, 95μg 또는 100μg의 양으로 제공된다.
적용 경로 (피내, 근육 내, 비강 내), 적용 장치 (제트 주입, 바늘 주입, 미세 바늘 패치) 및/또는 복합체 (바람직하게는 LNP 캡슐화)에 따라 적절한 양이 적절하게 조정되어야 하며 통상의 기술자에 의해 선택되고 정의될 것이다.
본 명세서에 정의된 감염의 치료 또는 예방을 위한 면역화 프로토콜, 즉 RSV에 대한 대상체의 면역화는 전형적으로 일련의 단일 용량 또는 용량의 조성물 또는 백신을 포함한다. 본 명세서에 사용된 단일 투여량은 각각 초기/첫 번째 투여량, 두 번째 투여량 또는 임의의 추가 투여량을 지칭하며, 이는 바람직하게는 면역 반응을 "증대"하기 위해 투여된다.
일 구현예에서, 본 명세서에 정의된 바와 같이 감염의 치료 또는 예방을 위한 면역화 프로토콜, 즉 RSV에 대한 피험자의 면역화는 단일 용량의 조성물 또는 백신을 포함한다.
바람직한 구현예에서, RSV 감염 예방을 위한 면역 프로토콜은 하나 이상의 단일 용량의 본 명세서에 정의된 조성물 또는 백신을 포함하며, 여기서 상기 하나 이상의 단일 용량은 산모 예방 접종을 위해 임산부에게 투여되어 태아의 면역화를 달성하고 및/또는 여기서 상기 하나 이상의 단일 용량은 모유 수유 중인 여성에게 투여되어 모유 수유 받는 아이의 수동 면역화를 달성한다.
상기 정의된 치료 또는 예방은 추가 활성 약제학적 성분의 투여를 포함할 수 있다. 제1 측면의 인공 RNA에 기초한 본 발명의 백신 또는 조성물의 경우, 폴리펩티드, 바람직하게는 제3 측면의 폴리펩티드가 추가 활성 약제학적 성분으로서 공동 투여될 수 있다.
예를 들어, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 RSV 단백질 또는 펩티드, 또는 이의 단편 또는 변이체는 면역 반응을 유도 또는 향상시키기 위해 공동 투여될 수 있다. 추가로, 제1 측면의 2개의 별개의 인공 RNA 및 선택적으로 제2 측면의 추가 RNA는 상이한 시점에, 바람직하게는 프라임-부스트 시나리오에서, 예를 들어 프라임 백신 접종으로서 적어도 하나의 RSV 폴리펩티드를 포함하는 조성물 및 부스트 백신 접종으로서 제1 측면의 적어도 하나의 인공 RNA를 포함하는 조성물/백신을 사용하여 투여될 수 있다.
적합하게는, 상기 정의된 치료 또는 예방은 추가 활성 약제학적 성분의 투여를 포함하며, 여기서 상기 추가 활성 약제학적 성분은 면역글로불린, 바람직하게는 IgG, 단일클론 또는 다중클론 항체, 다중클론 혈청(serum) 또는 혈청(sera) 등, 가장 바람직하게는 본 명세서에 정의된 RSV 단백질 또는 펩티드에 대한 면역글로불린으로부터 선택될 수 있는 면역 치료제일 수 있다. 바람직하게는, 이러한 추가 면역 치료제는 펩티드/단백질로써 제공되거나 핵산, 바람직하게는 DNA 또는 RNA, 더욱 바람직하게는 mRNA에 의해 암호화될 수 있다. 이러한 면역 치료제는 본 발명의 인공 RNA 또는 본 발명의 폴리펩티드에 의해 촉발된 백신 접종을 활성화시키기 위해 추가로 수동 백신을 제공할 수 있게 한다.
치료 방법 및 용도, 진단 방법 및 용도:
또 다른 측면에서, 본 발명은 장애를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 장애를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 제1 측면의 RNA, 제2 측면의 조성물, 제3 측면의 폴리펩티드, 제4 측면의 조성물, 제5 측면의 백신, 또는 제6 측면의 키트 또는 부품들로 이루어진 키트를 적용하거나 투여하는 것을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 상기 장애는 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV) 감염 또는 그러한 감염과 관련된 장애이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 장애를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 이를 필요로하는 대상체에게 제1 측면의 RNA, 제2 측면의 조성물, 제3 측면의 폴리펩티드, 제4 측면의 조성물, 제5 측면의 백신, 또는 제6 측면의 키트 또는 부품들로 이루어진 키트를 적용 또는 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 필요한 대상체는 바람직하게는 포유동물 대상체이다. 특히 바람직한 구현예에서, 포유동물 대상체는 인간 대상체, 특히 유아, 신생아, 임산부, 모유 수유 중인 여성, 노인 또는 면역 저하된 인간 대상체다.
특히, 이러한 방법은 바람직하게는 다음 단계를 포함할 수 있다:
a) 제1 측면의 RNA, 제2 측면의 조성물, 제3 측면의 폴리펩티드, 제4 측면의 조성물, 제5 측면의 백신, 또는 제6 측면의 키트 또는 부품들로 이루어진 키트를 제공하는 단계;
b) 상기 제1 측면의 RNA, 제2 측면의 조성물, 제3 측면의 폴리펩티드, 제4 측면의 조성물, 제5 측면의 백신, 또는 제6 측면의 키트 또는 부품들로 이루어진 키트를 조직 또는 유기체에 적용 또는 투여하는 단계;
c) 선택적으로, RSV에 대해 면역글로불린 (IgGs)을 투여하는 단계;
d) 선택적으로, 추가 물질 (보조제(adjuvant), 보조 물질(auxiliary substance), 추가 항원)을 투여하는 단계.
추가 측면에 따르면, 본 발명은 또한 RSV, 이의 단편 또는 변이체로부터 유래된 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩티드의 발현 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 바람직하게는 다음 단계를 포함한다:
a) 제1 측면의 RNA 또는 제2 측면의 조성물을 제공하는 단계; 및
b) 상기 RNA 또는 조성물을 발현 시스템 (세포), 조직, 유기체에 적용하거나 투여하는 단계.
상기 방법은 실험실, 연구, 진단, 펩티드 또는 단백질의 상업적 생산 및/또는 치료 목적으로 적용될 수 있다. 상기 방법은 또한 특정 질병의 치료, 특히 감염성 질병, 특히 RSV 감염의 치료와 관련하여 수행될 수 있다.
마찬가지로, 다른 측면에 따르면, 본 발명은 또한 예를 들어 무세포 발현 시스템, 세포 (예를 들어, 발현 숙주 세포 또는 체세포), 조직 또는 유기체로 예를 들어 상기 RNA, 상기 RNA를 포함하는 조성물, 상기 RNA를 포함하는 백신을 적용하거나 투여함으로써 바람직하게는 진단 또는 치료 목적용, 예를 들어 암호화된 RSV 항원성 펩티드 또는 단백질의 발현을 위한 제1 측면의 인공 RNA, 제2 측면의 조성물, 제3 측면의 폴리펩티드, 제4 측면의 조성물, 제5 측면의 백신, 또는 제6 측면의 키트 또는 부품들로 이루어진 키트를 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 RNA, 상기 RNA를 포함하는 조성물, 상기 RNA를 포함하는 백신을 조직 또는 유기체에 적용 또는 투여한 다음, 예를 들어 유도된 RSV F 항체, 예를 들어 RSV F 특이 (단클론성) 항체를 얻는 단계가 이어진다.
상기 용도는 (진단) 실험실, 연구, 진단, 펩티드, 단백질 또는 RSV 항체의 상업적 생산 및/또는 치료 목적으로 적용될 수 있다. 상기 용도는 시험관 내, 생체내 또는 생체외에서 수행될 수 있다. 상기 용도는 또한 특정 질환의 치료, 특히 RSV 감염 또는 관련 장애의 치료와 관련하여 수행될 수 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 약제로 사용하기 위한, 치료 또는 예방, 바람직하게는 RSV 감염 또는 관련 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 또는 백신으로 사용하기 위한 제1 측면의 RNA, 제2 측면의 조성물, 제3 측면의 폴리펩티드, 제4 측면의 조성물, 제5 측면의 백신, 또는 제6 측면의 키트 또는 부품들로 이루어진 키트를 제공한다.
목록 및 표의 간단한 설명(Brief description of lists and tables)
목록 1: 적합한 RSV 바이러스 균주
목록 2: 적합한 RSV 융합 (F) 단백질의 NCBI 단백질 접근 번호
표 1: 바람직한 RSV F 단백질 항원 설계
표 2: 각 아미노산에 대한 빈도가 표시된 인간 코돈 사용 표
표 3A: HRSV(A2)에서 유래된 RSV F (컬럼 A-J)를 암호화하는 바람직한 코딩 서열
표 3B: HRSV(멤피스-37)에서 유래된 RSV F (컬럼 A-J)를 암호화하는 바람직한 코딩 서열
표 4A: HRSV(A2)에서 유래된 RSV F (컬럼 K-V)를 암호화하는 바람직한 코딩 서열
표 4B: HRSV(멤피스-37)에서 유래된 RSV F (컬럼 K-V)를 암호화하는 바람직한 코딩 서열
표 5A: HRSV(A2)에서 유래된 RSV F (컬럼 A-J)를 암호화하는 바람직한 mRNA 구조물
표 5B: HRSV(멤피스-37)에서 유래된 RSV F (컬럼 A-J)를 암호화하는 바람직한 mRNA 구조물
표 6A: HRSV(A2)에서 유래된 RSV F (컬럼 K-V)를 암호화하는 바람직한 mRNA 구조물
표 6B: HRSV(멤피스-37)에서 유래된 RSV F (컬럼 K-V)를 암호화하는 바람직한 mRNA 구조물
표 7A: 조성물 또는 백신의 바람직한 추가 코딩 서열 및 mRNA 구조물
표 7B: RNA 구조물의 적절한 조합
표 8: 화학식 (III)에서 유래된 대표적인 지질 화합물
표 9: 본 실시예에서 사용된 mRNA 구조물 (실시예 섹션 참조)
표 10: 실시예 2의 동물 그룹 및 백신 접종 일정 (실시예 섹션 참조)
표 11: 실시예 3의 동물 그룹 및 백신 접종 일정 (실시예 섹션 참조)
표 12: 실시예 4의 상이한 UTR 조합을 갖는 mRNA 구조물 (실시예 섹션 참조)
표 13: 실시예 5의 동물 그룹 및 백신 접종 일정 (실시예 섹션 참조)
표 14: 실시예 6의 동물 그룹 및 백신 접종 일정 (실시예 섹션 참조)
표 15: 실시예 7의 동물 그룹 및 백신 접종 일정 (실시예 섹션 참조)
표 15: 실시예 7의 동물 그룹 및 백신 접종 일정 (실시예 섹션 참조)
표 16: 실시예 8에서 사용된 mRNA 구조물의 개요 (실시예 섹션 참조)
표 17: 실시예 9의 동물 그룹 및 백신 접종 일정 (실시예 섹션 참조)
표 18: 실시예 10의 동물 그룹 및 백신 접종 일정 (실시예 섹션 참조)
표 19: 실시예 11에서 사용된 mRNA 구조물의 개요 (실시예 섹션 참조)
표 20: 실시예 12의 동물 그룹 및 백신 접종 일정 (실시예 섹션 참조)
본 발명의 인공 핵산, 특히 인공 RNA는 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV) 감염 또는 그러한 감염과 관련된 장애의 치료 및/또는 예방에 효과적이다. 특히, 본 발명의 신규 인공 RNA 및 상기 RNA를 포함하는 조성물/백신은 유아, 신생아, 임산부, 노인 및 면역 저하 환자에서 RSV 감염의 예방 또는 치료에 효과적이다.
도 1은 RSV F-단백질 (F-del_DSCav1)을 암호화하는 LNP-제형화된 mRNA가 근육(i.m) 및 피내(i.d.) 백신 접종 후 목화나무쥐의 혈청에서 높은 바이러스 중화 역가 (VNT)를 유도함을 보여준다. 프로타민-제형화된 mRNA를 사용한 백신 접종은 약한 반응만을 유도한다. 백신 접종 일정은 표 10을 참조한다.
도 2는 RSV F-단백질 (F-del_DSCav1)을 암호화하는 LNP-제형화된 mRNA가 근육 및 피내 백신 접종 후 목화나무쥐의 폐의 RSV 감염을 감소시킴을 보여준다. 백신 접종 일정은 표 10을 참조한다. 추가 세부 사항은 실시예 2에 제공된다.
도 3은 실시예 2에 기술된 RSV 목화나무쥐 접종(challenge) 연구로부터의 폐 조직 병리학 분석 결과를 보여준다. LNP-제형화된 mRNA로 백신 접종된 동물은 포르말린-비활성화된 RSV 바이러스 백신으로 백신 접종하는 것과 대조적으로 바이러스 접종 후 증가된 폐 조직 병리학/향상된 염증반응을 나타내지 않는다.백신 접종 일정은 표 10을 참조한다. 추가 세부 사항은 실시예 2에 제공된다.
도 4는 RSV F-단백질 (F0, F-del 및 F-del_DSCav1)을 암호화하는 LNP-제형화된 mRNA가 2번의 근육 백신 접종 후 목화나무쥐의 혈청에서 높은 VNT(바이러스 중화 역가)를 유도함을 보여준다. 결정된 VNT는 48 일에 수행되었다. 백신 접종 일정은 표 11을 참조한다. 추가 세부 사항은 실시예 3에 제공된다.
도 5는 RSV F-단백질 (F0, F-del 및 F-del_DSCav1)을 암호화하는 LNP-제형화된 mRNA가 RSV-F 단백질에 대한 목화나무쥐에서 특정 체액성 면역 반응을 유도함을 보여준다. 실험은 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행되었고 항체 총 IgG 역가는 ELISA에 의해 결정되었다. RSV-F (LNP로 제형화) 및 RSV-F-del (LNP로 제형화) 백신은 생 바이러스보다 1차 백신 접종 (28일) 후 이미 더 높은 역가의 RSV-F 특이적 IgG를 유도한다. 도 5a : 49일에 결정된 항체 역가; 도 5b 및 5c: RSV F-단백질 (F, F-del 및 F-del_DSCav1)을 암호화하는 10μg mRNA (도 5b) 또는 100μg mRNA (도 5c)의 혈청 내 시간 의존적 IgG 역가. 백신 접종 일정은 표 11을 참조한다. 추가 세부 사항은 실시예 3에 제공된다.
도 6은 RSV F-단백질 (F0, F-del 및 F-del_DSCav1)을 암호화하는 LNP-제형화된 mRNA가 근육 백신 접종 후 목화나무쥐에서 폐의 RSV 감염을 감소시킨다는 것을 보여준다. 실험은 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행되었다. mRNA 백신으로 백신 접종된 모든 동물 그룹은 바이러스 폐 역가 측면에서 백신 접종된 목화나무쥐의 보호를 보여주는 검출 수준 미만의 바이러스 역가를 나타냈다. mRNA 백신과 비교하여 포르말린 비활성화 바이러스에 기반한 백신은 폐에서 바이러스 역가를 예방할 수 없었다. 백신 접종 일정은 표 11을 참조한다. 추가 세부 사항은 실시예 3에 제공된다.
도 7은 RSV F-단백질 (F0, F-del 및 F-del_DSCav1)을 암호화하는 LNP-제형화된 mRNA가 근육 백신 접종 후 목화나무쥐의 코에서 RSV 역가를 감소시킨다는 것을 보여준다. 실험은 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행되었다. mRNA 백신으로 백신 접종한 모든 동물 그룹은 바이러스 접종 감염 실험에서 비강 조직의 바이러스 역가가 크게 감소했다. mRNA 백신과 비교하여 포르말린 비활성화 바이러스를 기반으로 한 백신은 비강 바이러스 역가를 줄일 수 없었다. 백신 접종 일정은 표 11을 참조한다. 추가 세부 사항은 실시예 3에 제공된다.
도 8은 실시예 3에 기술된 RSV 목화나무쥐 접종 연구로부터의 폐 조직 병리학 분석 결과를 보여준다. LNP-제형화된 mRNA로 백신 접종된 동물은 포르말린-비활성화된 RSV 바이러스 백신으로 백신 접종하는 것과 대조적으로 바이러스 접종 후 증가된 폐 조직 병리학/향상된 염증을 나타내지 않는다. 백신 접종 일정은 표 11을 참조한다. 추가 세부 사항은 실시예 3에 제공된다.
도 9는 본 발명에 따른 UTR 조합이 시험관 내 RSV F-단백질의 발현을 증가시킨다는 것을 보여준다. HEK 293T 세포를 서로 다른 리포펙타민-제형화된 mRNA 구조물로 형질주입시켰으며, 이들은 모두 융합 전 안정화된 절단 RSV-F (F-del_DSCav1)를 암호화하는 동일한 코딩 서열을 포함하지만 5' 및 3'-UTR의 서로 다른 조합을 사용한다 (표 12 참조). RSV-F 발현은 유세포 분석에 의해 분석되었다. 값은 감지된 RSV-F 신호의 %를 나타낸다. 값은 기준 mRNA 구조물 (UTR 조합 RPL32/ALB7)의 발현에 따라 100%로 정규화되었다. 주사용증류수 (WFI)는 대조군 N=2로 사용된다. 추가 세부 사항은 실시예 4에 제공된다.
도 10은 RSV F-단백질(도 10a: F0, F-del, F0_DSCav1, F-del_DSCav1, F_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut2, F_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut3, Fig10b: F0, F-del, F0_DSCav1, F-del_DSCav1, F_DSCav1_mut0, F-del_DSCav1_mut0, F_DSCav1_mut4, F-del_DSCav1_mut4, F_DSCav1_mut5, F-del_DSCav1_mut5)을 암호화하는 사용된 mRNA 구조물이 검출 가능한 세포 내 RSV F 단백질 발현뿐만 아니라 세포 표면에서 검출 가능한 단백질 발현을 유도함을 보여준다. 추가 세부 사항은 표 16 및 실시예 8에 제공된다.
도 11은 상이한 RSV F 단백질을 암호화하는 모든 시험된 LNP-제형화된 mRNA 구조물이 RSV-F 단백질(F0, F0_DSCav1, F_DSCav1_mut3, F_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F-del, F-del_DSCav1, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2)에 대해 목화나무쥐에서 체액성 면역 반응을 유도함을 보여준다. 항체 총 IgG 역가는 ELISA에 의해 결정되었다. 백신 접종 일정은 표 17을 참조한다. 추가 세부 사항은 실시예 9에 제공된다.
도 12는 높은 바이러스 중화 항체 역가에 의해 나타난 바와 같이 모든 LNP-제형화된 RSV-F (F0, F0_DSCav1, F_DSCav1_mut3, F_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F-del, F-del_DSCav1, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2) mRNA 백신이 목화나무쥐에서 RSV 특이적 기능성 항체의 형성을 유도했음을 보여준다. 백신 접종 일정은 표 17을 참조한다. 추가 세부 사항은 실시예 9에 제공된다.
도 13은 RSV 목화나무쥐 접종 연구로부터의 폐 조직 병리학 분석을 보여준다. mRNA 백신 접종 그룹은 포르말린 비활성화 RSV 백신을 사용하여 백신을 접종한 그룹의 경우처럼 향상된 폐 병리를 나타내지 않았다. 백신 접종 일정은 표 17을 참조한다. 추가 세부 사항은 실시예 9에 제공된다.
도 14는 RSV 바이러스로 접종된 목화나무쥐에서 폐 바이러스 역가 (도 14a) 및 코 바이러스 역가 (도 14b)의 분석 결과를 보여준다. 백신 접종 일정은 표 17을 참조한다. 추가 세부 사항은 실시예 9에 제공된다.
도 15는 상이한 RSV F 단백질(F-del, F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut0, F-del_DSCav1_mut5, F-del_DSCav1_mut4)을 암호화하는 모든 시험된 LNP-제형화된 mRNA 구조물이 RSV-F 단백질에 대한 목화나무쥐에서 체액성 면역 반응을 유도한다는 것을 보여준다. 항체 총 IgG 역가는 ELISA에 의해 결정되었다. 백신 접종 일정은 표 18을 참조한다. 추가 세부 사항은 실시예 10에 제공된다.
도 16은 높은 바이러스 중화 항체 역가에 의해 나타난 바와 같이 모든 LNP-제형화된 RSV-F (F-del, F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut0, F-del_DSCav1_mut5, F-del_DSCav1_mut4) mRNA 백신이 목화나무쥐에서 RSV 특이적 기능성 항체의 형성을 유도했음을 보여준다. 전 융합 안정화를 위한 LNP-제형화된 구조체는 F-del보다 더 높거나 유사한 반응을 유도한다. 백신 접종 일정은 표 18을 참조한다. 추가 세부 사항은 실시예 10에 제공된다.
도 17은 RSV 목화나무쥐 접종 연구로부터의 폐 조직 병리학 분석을 보여준다. mRNA 백신 접종 그룹은 포르말린 비활성화 RSV 백신을 사용하여 백신을 접종한 그룹의 경우처럼 향상된 폐 병리를 나타내지 않았다. 백신 접종 일정은 표 18을 참조한다. 추가 세부 사항은 실시예 10에 제공된다.
도 18은 RSV 바이러스로 접종된 목화나무쥐에서 폐 바이러스 역가 (도 18a) 및 코 바이러스 역가 (도 18b)의 분석 결과를 보여준다. 백신 접종 일정은 표 18을 참조한다. 추가 세부 사항은 실시예 10에 제공된다.
도 19는 RSV 매트릭스 단백질 M, 인단백질 P, 핵단백질 N 및 매트릭스 단백질 M2-1 단백질을 암호화하는, 사용된 mRNA 구조물이 토끼 망상적혈구 용해물 시스템을 사용하여 검출 가능한 단백질 발현을 유도했음을 보여준다. 추가 세부 사항은 표 19 및 실시예 11에 제공된다.
도 20은 마우스 (ELISA)에서 면역원성 연구의 결과를 보여준다. 체액성 면역 반응은 도 20a: 항-RSV F IgG 및도 20b: 항-RSV F IgG2a에서 볼 수 있다. 모든 그룹은 체액성 면역 반응을 유도했다. 일반적으로, IgG2a 역가는 IgG1 역가보다 10 배 높으며, 이는 우세한 Th1 반응을 나타낸다. 백신 접종 일정은 표 20을 참조한다. 추가 세부 사항은 실시예 12에 제공된다.
도 21은 적용된 mRNA 구조물이 특정 체액성 면역 반응을 유도하기에 적합하다는 것을 나타내는 면역화된 마우스의 혈청에서 특정 항원 IgG가 검출되었음을 보여준다. 백신 접종 일정은 표 20을 참조한다. 추가 세부 사항은 실시예 12에 제공된다.
도 22는 높은 바이러스 중화 항체 역가에 의해 나타난 바와 같이 모든 LNP-제형화된 mRNA 백신 (F, M+F, P+F, N+F, M2-1+F)이 마우스에서 RSV 특이적 기능성 항체의 형성을 유도했음을 보여준다. 백신 접종 일정은 표 20을 참조한다. 추가 세부 사항은 실시예 12에 제공된다.
도 23은 RSV F, RSV M2-1 또는 둘 다를 포함하는 모든 백신이 놀랍게도 근육 내 면역시 폐에서 조직 상주 기억 T 세포 (TRM) 반응을 유도했음을 보여준다 (도 23a). 비장 세포 분석은 RSV F 및 특히 RSV M2-1을 사용한 면역화가 IFN-γ 및 TNF를 분비하는 항원 특이적 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 증가로 이어져서 부위 특이적 반응 외에 전신 T 세포 반응의 유도를 나타내는 것으로 밝혀졌다 (도 23b 및 도 23c).
실시예
다음에서, 본 발명의 다양한 구현예 및 측면을 예시하는 특정 실시예가 제시된다. 그러나, 본 발명은 여기에 설명된 특정 구현예에 의해 범위가 제한되지 않아야 한다. 하기 제조 및 실시예는 통상의 기술자가 본 발명을 보다 명확하게 이해하고 실시할 수 있도록 제공된다. 그러나, 본 발명은 단지 본 발명의 단일 측면의 예시로서 의도된 예시된 구현예에 의해 범위가 제한되지 않으며, 기능적으로 동등한 방법은 본 발명의 범위 내에 있다. 실제로, 본 명세서에 기술된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명, 첨부 도면 및 하기 실시예로부터 통상의 기술자에게 쉽게 명백해질 것이다. 그러한 모든 수정은 첨부된 청구항의 범위에 속한다.
실시예 1: 시험관 내 및 생체내 실험을 위한 DNA 및 mRNA 구조물 및 조성물의 제조
본 실시예는 본 발명의 인공 RNA를 얻는 방법뿐만 아니라 본 발명의 조성물 또는 백신을 생성하는 방법을 제공한다.
1.1. DNA 및 mRNA 구조물의 제조:
본 실시예의 경우, 상이한 RSV F 단백질 (예를 들어 F0, F-del, F-del_DSCav1, F-del_DSCav1_mut5 등)을 암호화하는 DNA 서열을 제조하여 후속 RNA 시험관 내 전사 반응에 사용하였다. 상기 DNA 서열은 안정화를 위해 G/C 최적화된 코딩 서열 (예를 들어, "cds opt1")을 도입함으로써 야생형 코딩 DNA 서열을 변형함으로써 제조되었다. 서열은 PSMB3, ALB7, 알파-글로빈, CASP1, COX6B1, GNAS, NDUFA1 및 RPS9에서 선택된 유전자의 3'-UTR로부터 유래된 3'-UTR 서열 및 HSD17B4, RPL32, ASAH1, ATP5A1, MP68, NDUFA4, NOSIP, RPL31, SLC7A3, TUBB4B 및 UBQLN2에서 선택된 유전자의 5'-UTR로부터 유래된 5'-UTR 서열을 안정화시키는 것을 포함하고, 추가로 아데노신의 스트레치(예를 들어, 64A 또는 A100), 및 히스톤-스템-루프 구조 (hSL), 및 선택적으로 표 9에 열거된 30개의 시토신의 스트레치(예를 들어 C30)를 포함하도록 pUC19 유래 벡터에 도입되었다.
수득된 플라스미드 DNA 구조물을 당 업계에 공지된 일반적인 프로토콜을 사용하여 박테리아에서 형질전환 및 증식시켰다. 결국, 상기 플라스미드 DNA 구조물을 추출하고 정제하여 후속 RNA 시험관 내 전사에 사용했다 (섹션 1.2 참조).
대안적으로, 단락 1에 따라 제조된 DNA 플라스미드는 PCR 기반 증폭을 위한 DNA 주형으로 사용된다. 결과적으로 생성된 PCR 산물은 정제되어 후속 RNA 시험관 내 전사에 사용된다 (섹션 1.3 참조).
1.2. 플라스미드 DNA 주형에서 RNA 시험관 내 전사:
단락 1.1에 따라 제조된 DNA 플라스미드는 EcoRI 또는 SapI를 사용하여 효소적으로 선형화되었으며 뉴클레오티드 혼합물 (ATP/GTP/CTP/UTP) 및 캡 유사체(예를 들어, m7GpppG, m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG, 또는 m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG))의 존재 하에 적절한 완충 조건 하에서 T7 RNA 중합 효소를 사용하여 DNA 의존성 RNA 시험관 내 전사에 사용되었다. 수득된 mRNA 구조물은 RP-HPLC (PureMessenger®, CureVac AG, 튀빙엔, 독일; WO2008/077592)를 사용하여 정제하고 시험관 내 및 생체내 실험에 사용했다. 임상 개발을 위한 RNA (실시예 6 참조)는 예를 들어 WO2016/180430에 따라 현재의 우수 제조 관행 하에서 생산되어 DNA 및 RNA 수준에서 다양한 품질 관리 단계를 구현한다. 생성된 RNA 서열/구조물은 암호화된 F 단백질 및 그 안에 표시된 각각의 UTR 요소와 함께 표 9에 제공된다. 표 9에 제공된 정보 외에도, 특정 mRNA 구조물 서열 번호와 관련된 추가 정보는 ST.25 서열 목록에 제공된 <223> 식별자에 제공된 정보에서 파생될 수 있다.
대안적으로, EcoRI 또는 SapI 선형화된 DNA는 변형된 뉴클레오티드 혼합물 (ATP, GTP, CTP, N(1)-메틸슈도우리딘 (m1Ψ) 또는 슈도우리딘 (Ψ)) 및 캡 유사체 (m7GpppG, m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG, 또는 m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG)의 존재 하에 적절한 완충 조건 하에서 RNA 중합 효소를 사용하여 DNA 의존성 RNA 시험관 내 전사에 사용되었다. 수득된 m1Ψ 또는 Ψ-변형된 mRNA는 RP-HPLC (PureMessenger®, CureVac, 튀빙엔, 독일; WO2008/077592)를 사용하여 정제하고 추가 실험에 사용되었다.
일부 mRNA 구조물은 캡 유사체가 없는 상태에서 시험관 내에서 전사되었다. 캡 구조 (캡1)는 당 업계에 일반적으로 알려진 캡핑 효소를 사용하여 효소적으로 첨가된다. 요컨대, 시험관 내 전사된 mRNA는 캡1-캡핑된 mRNA를 얻기 위해 2'-O-메틸트랜스퍼라제와 함께 m7G 캡핑 키트를 사용하여 캡핑되었다. 캡1-캡핑된 mRNA는 RP-HPLC (PureMessenger®, CureVac, 튀빙엔, 독일; WO2008/077592)를 사용하여 정제되고 추가 실험에 사용되었다.
1.3. PCR 증폭된 DNA 주형에서 RNA 시험관 내 전사:
단락 1.1에 따라 제조된 정제된 PCR 증폭 DNA 주형은 적절한 완충 조건 하에서 뉴클레오티드 혼합물 (ATP/GTP/CTP/UTP) 및 캡 유사체 (m7GpppG)의 존재 하에 DNA 의존성 T7 RNA 중합 효소를 사용하여 시험관 내에서 전사되었다. 대안적으로, PCR 증폭된 DNA는 변형된 뉴클레오티드 혼합물 (ATP, GTP, CTP, N(1)-메틸슈도우리딘 (m1Ψ)) 및 캡 유사체 (m7GpppG)의 존재 하에 적절한 완충 조건 하에서 DNA 의존성 T7 RNA 중합 효소를 사용하여 시험관 내에서 전사되었다. 일부 mRNA 구조물은 캡 유사체가 없는 상태에서 시험관 내 전사되고 캡 구조 (캡1)는 당 업계에 일반적으로 공지된 캡핑 효소를 사용하여, 예를 들어 2'-O-메틸트랜스퍼라제와 함께 m7G 캡핑 키트를 사용하여 효소적으로 추가된다. 상기 수득된 mRNA는 예를 들어 RP-HPLC (PureMessenger®, CureVac, 튀빙엔, 독일; WO2008/077592)를 사용하여 정제되고 시험관 내 및 생체내 실험에 사용되었다.
표 9: 본 실시예에서 사용된 mRNA 구조물
RNA ID 항원 이름 5'-UTR/3'-UTR;
UTR 설계 		3'-말단 요소 (3'-말단) 서열 번호:
RNA 		서열 번호:
단백질
R6939/
R7003		 F0 -/muag; i-3 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 475 68
R3737/
R3938		 F0 RPL32/ALB7; i-2 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 466 68
R6940 F-del -/muag; i-3 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 890 483
R3738/
R3939		 F-del RPL32/ALB7; i-2 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 881 483
R6808 F0_DSCav1 -/muag; i-3 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1259 898
R5453 F-del_DSCav1 -/muag; i-3 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1628 1267
R6122 F-del_DSCav1 RPL32/ALB7; i-2 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1620 1267
R4745/
R5717		 F-del_DSCav1 HSD17B4/ALB7; i-4 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 8278 1267
R6771 F_DSCav1_mut1 -/muag; i-3 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1997 1636
R6774 F-del_DSCav1_mut1 -/muag; i-3 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 2366 2005
R6772 F_DSCav1_mut2 -/muag; i-3 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 2735 2374
R6773 F-del_DSCav1_mut2 -/muag; i-3 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 3104 2743
R6770 F_DSCav1_mut3 -/muag; i-3 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 3473 3112
R6775 F-del_DSCav1_mut3 -/muag; i-3 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 3842 3481
　 F-del_DSCav1 HSD17B4/PSMB3; a-1 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1276 1267
　 F-del_DSCav1 Ndufa4/PSMB3; a-2 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1284 1267
　 F-del_DSCav1 Slc7a3/PSMB3; a-3 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1292 1267
　 F-del_DSCav1 Nosip/PSMB3; a-4 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1300 1267
　 F-del_DSCav1 Mp68/PSMB3; a-5 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1308 1267
　 F-del_DSCav1 Ubqln2/RPS9; b-1 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1316 1267
　 F-del_DSCav1 ASAH1/RPS9; b-2 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1324 1267
　 F-del_DSCav1 HSD17B4/RPS9; b-3 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1332 1267
　 F-del_DSCav1 HSD17B4/CASP1; b-4 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1340 1267
　 F-del_DSCav1 Nosip/COX6B1; b-5 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1348 1267
　 F-del_DSCav1 Ndufa4/RPS9; c-1 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1356 1267
　 F-del_DSCav1 Nosip/Ndufa1; c-2 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1364 1267
　 F-del_DSCav1 Ndufa4/COX6B1; c-3 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1372 1267
　 F-del_DSCav1 Ndufa4/Ndufa1; c-4 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1380 1267
　 F-del_DSCav1 ATP5A1/PSMB3; c-5 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1388 1267
　 F-del_DSCav1 Rpl31/PSMB3; d-1 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1396 1267
　 F-del_DSCav1 ATP5A1/CASP1; d-2 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1404 1267
　 F-del_DSCav1 Slc7a3/Gnas; d-3 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1412 1267
　 F-del_DSCav1 HSD17B4/Ndufa1; d-4 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1420 1267
　 F-del_DSCav1 Slc7a3/Ndufa1; d-5 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1428 1267
　 F-del_DSCav1 TUBB4B/RPS9; e-1 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1436 1267
　 F-del_DSCav1 Rpl31/RPS9; e-2 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1444 1267
　 F-del_DSCav1 Mp68/RPS9; e-3 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1452 1267
　 F-del_DSCav1 Nosip/RPS9; e-4 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1460 1267
　 F-del_DSCav1 ATP5A1/RPS9; e-5 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1468 1267
　 F-del_DSCav1 ATP5A1/COX6B1; e-6 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1476 1267
　 F-del_DSCav1 ATP5A1/Gnas; f-1 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1484 1267
　 F-del_DSCav1 ATP5A1/Ndufa1; f-2 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1492 1267
　 F-del_DSCav1 HSD17B4/COX6B1; f-3 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1500 1267
　 F-del_DSCav1 HSD17B4/Gnas; f-4 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1508 1267
　 F-del_DSCav1 Mp68/COX6B1; f-5 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1516 1267
　 F-del_DSCav1 Mp68/Ndufa1; g-1 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1524 1267
　 F-del_DSCav1 Ndufa4/CASP1; g-2 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1532 1267
　 F-del_DSCav1 Ndufa4/Gnas; g-3 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1540 1267
　 F-del_DSCav1 Nosip/CASP1; g-4 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1548 1267
　 F-del_DSCav1 Rpl31/CASP1; g-5 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1556 1267
　 F-del_DSCav1 Rpl31/COX6B1; h-1 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1564 1267
　 F-del_DSCav1 Rpl31/Gnas; h-2 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1572 1267
　 F-del_DSCav1 Rpl31/Ndufa1; h-3 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1580 1267
　 F-del_DSCav1 Slc7a3/CASP1; h-4 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1588 1267
　 F-del_DSCav1 Slc7a3/COX6B1; h-5 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1596 1267
　 F-del_DSCav1 Slc7a3/RPS9; i-1 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1604 1267
　 F-del_DSCav1 RPL32(32L4)/ALB7; i-2 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 1612 1267
R7454 F_DSCav1_mut0 -/muag; i-3 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 4211 3850
R7455 F-del_DSCav1_mut0 -/muag; i-3 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 4580 4219
R7458 F_DSCav1_mut4 -/muag; i-3 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 4949 4588
R7459 F-del_DSCav1_mut4 -/muag; i-3 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 5318 4957
R7456 F_DSCav1_mut5 -/muag; i-3 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 5687 5326
R7457 F-del_DSCav1_mut5 -/muag; i-3 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 6056 5695
F_DSCav1_mut6 -/muag; i-3 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 6425 6064
F-del_DSCav1_mut6 -/muag; i-3 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 6794 6433
F_DSCav1_mut7 -/muag; i-3 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 7163 6802
F-del_DSCav1_mut7 -/muag; i-3 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 7532 7171
F_DSCav1_mut8 -/muag; i-3 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 7901 7540
F-del_DSCav1_mut8 -/muag; i-3 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 8270 7909
R7595 M -/muag; i-3 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 10046 9684
R7597 N -/muag; i-3 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 10496 10134
R7598 M2-1 -/muag; i-3 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 11545 11183
R7596 P -/muag; i-3 A64-N5-C30-히스톤SL-N5 10999 10637
1.4. LNP 제형화된 mRNA 조성물의 제조:
지질 나노 입자 (LNP), 양이온성 지질 및 중합체 접합 지질 (PEG-지질)을 제조하고 본질적으로 본 명세서에 전문이 참조로 포함된 WO2015/199952, WO2017/004143 및 WO2017/075531에 기술된 일반 절차에 따라 테스트했다. LNP 제형화된 mRNA는 이온화 가능한 아미노 지질 (양이온성 지질), 인지질, 콜레스테롤 및 PEG화된 지질을 사용하여 준비되었다. 간단히 말하면, 화학식 III-3의 양이온성 지질 화합물, DSPC, 콜레스테롤 및 화학식 IVa의 PEG-지질은 약 50:10:38.5:1.5 또는 47.4:10:40.9:1.7의 몰비 (%)로 에탄올에 용해시켰다. 화학식 III-3의 양이온성 지질 화합물 및 화학식 IVa의 PEG-지질 화합물을 포함하는 LNP는 0.03-0.04 w/w의 총 지질에 대한 mRNA의 비로 제조되었다. 상기 mRNA는 10mM 내지 50mM 시트레이트 완충액, pH4에서 0.05mg/mL 내지 0.2mg/mL로 희석되었다. 주사기 펌프를 사용하여 총 유속 15ml/min을 초과하는 에탄올 지질 용액과 mRNA 수용액을 약 1:5 내지 1:3 (vol/vol)의 비율로 혼합하였다. 그 후 에탄올을 제거하고 외부 완충액을 투석에 의해 수크로스를 포함하는 PBS 완충액으로 대체하였다. 마지막으로, 상기 지질 나노 입자를 0.2um 기공 멸균 필터를 통해 여과하고 LNP 제형화된 mRNA 조성물을 약 1mg/ml 총 mRNA로 조정하였다. Malvern Zetasizer Nano (몰번, UK)를 사용한 준탄성 광산란에 의해 결정된 지질 나노 입자의 입자 직경 크기는 60-90nm였다. 본 명세서에 언급된 다른 양이온성 지질 화합물의 경우, 제형화 과정은 본질적으로 유사하다. 수득된 LNP-제형화된 mRNA 조성물 (1mg/ml 총 mRNA)은 생체 내 적용 전에 식염수를 사용하여 원하는 목표 농도로 희석되었다.
1.5. 프로타민 복합 mRNA 조성물의 제조:
mRNA 구조물은 생체내 면역 실험에서 사용하기 전에 프로타민과 복합체화되었다. mRNA 제형은 2:1의 중량비로 50% 유리 mRNA 및 50% 프로타민과 복합체화된 mRNA의 혼합물로 구성되었다. 첫째, mRNA에 프로타민-링거 락테이트 용액을 mRNA에 첨가하여 프로타민과 복합체화시켰다. 10분간 배양 후, 상기 복합체가 안정적으로 생성되면 유리 mRNA를 첨가하고 링거 락테이트 용액으로 최종 농도를 조정하였다.
실시예 2: RSV-F를 암호화하는 LNP-제형화된 mRNA로 목화나무쥐의 백신 접종 및 RSV 목화나무쥐 접종 연구
본 실시예는 RSV-F를 암호화하는 LNP-제형화된 mRNA가 목화나무쥐에서 강력하고 기능적인 면역 반응을 유도함을 보여준다.
RSV 백신의 개발을 위해 목화나무쥐는 특히 접종 감염에 대해 허용되는 동물 모델이다. 포르말린 불활성화 RSV 바이러스 백신 제제를 받은 목화나무쥐는 향상된 폐 병리로 RSV 감염에 반응한다. 이를 통해 향상된 질병 현상의 관점에서 백신 접종의 안전성을 평가할 수 있다.
RSV-특이적 면역 반응을 최적화하기 위해, 전 융합 안정화된 RSV F 단백질 F-del_DSCav를 암호화하는 mRNA 백신은 실시예 1에 따라 제조되었고, LNP(실시예 1.4. 참조) 또는 0일 및 28일에 표 10에 나타낸 바와 같이 상이한 용량의 RNA를 사용하여 프로타민(실시예 1.5. 참조)과 함께 제형화되었고 근육 내(intramuscularly (i.m.)) 또는 피내(intradermally (i.d))에 적용하였다. 대조군 동물은 0일에 105 pfu 생RSV/A2 바이러스를 비강 내로 1회 백신 접종하거나, 0일 및 28일에 포르말린 비활성화 RSV 바이러스 (FI-RSV)를 근육 내로 2회 백신 접종하였다. 추가 대조군 동물은 완충액만 받았다. 본 실시예에서, UTR 조합 HSD17B4/ALB7이 사용되었으며, 여기서는 "i-4"라고 한다.
표 10: 실시예 2의 동물 그룹 및 백신 접종 일정
군 목화나무쥐 처리 mRNA 복용량 경로 볼륨
1 5 mRNA/LNP R4745 10μg i.m. 1x100uL
2 5 mRNA/LNP R4745 2μg i.m. 1x100uL
3 5 mRNA/LNP R4745 10μg i.d. 2x50uL
4 5 mRNA/LNP R4745 2μg i.d. 2x50uL
5 5 mRNA/프로타민 R5717 80μg i.m. 1x100uL
6 5 mRNA/프로타민 R5717 80μg i.d. 2x50uL
7 5 생존 RSV/A2 바이러스 105 pfu i.n. 1x100uL
8 5 FI-RSV 1:100 i.m. 1x100uL
9 5 완충액 - i.m 1x100uL
10 5 미처리/미감염 - -
바이러스 중화 역가의 결정:
49일째에 혈청이 수집되었고 RSV 바이러스 중화 역가 (VNT)가 플라그 감소 중화 테스트 (PRNT)를 사용하여 측정되었다. 희석된 혈청 샘플을 RSV/A2와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고 24개 웰 플레이트에서 융합성 HEp-2 단층에 이중으로 접종하였다. 5% CO2 인큐베이터 내 37°C에서 1 시간 인큐베이션한 후, 웰을 0.75% 메틸셀룰로오스 배지로 덮었다. 4일의 배양 후, 오버레이를 제거하고 세포를 고정하고 염색하였다. 상응하는 상호 중화 항체 역가는 바이러스 대조군의 60% 감소 종점에서 결정되었다.
목화나무쥐 접종 연구:
백신 접종된 동물은 63일에 100uL의 105 pfu 살아있는 RSV/A2 바이러스로 비강 내 공격받았다. 한 대조군은 미치료 및 미감염 상태로 유지되었다 (그룹 10). 68일에 모든 동물을 희생시키고 비강 조직과 폐를 수확하였다.
접종된 목화나무쥐의 폐에서 RSV 역가:
동물의 폐를 68일 (즉, 105 pfu 생존 RSV/A2 바이러스로 비강 내 접종 후 5일 후)에 수집하였고, RSV/A2 역가를 플라크 분석에 의해 한 엽(lobe)에서 정량화하였다. 폐 균질물은 원심 분리에 의해 정화되고 EMEM에서 희석되었다. 융합성 HEp-2 단층을 24 웰 플레이트에서 희석된 균질물로 중복 감염시켰다. 5% CO 인큐베이터에서 37°C에서 1 시간 인큐베이션한 후, 웰을 0.75% 메틸셀룰로스 배지로 덮었다. 4일 동안 배양한 후, 오버레이를 제거하고 세포를 고정하고 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 1시간 동안 염색한 다음 헹구고 공기 건조시켰다. 플라크를 계수하고 바이러스 역가를 조직 그램당 플라크 형성 단위로 표현하였다. 바이러스 역가는 주어진 시간에 그룹의 모든 동물에 대한 기하 평균 ± 표준 오차로 계산되었다.
접종된 목화나무쥐의 폐 조직 병리학:
동물의 폐를 68일 (즉, 105pfu 생존 RSV/A2 바이러스로 비강 내 접종 후 5일 후)에 수집하였고, 하나의 엽을 조직 병리학에 의해 분석하였다. 폐를 절개하고 10% 중성 완충 포르말린으로 정상 부피로 부풀린 다음 동일한 고정 용액에 담갔다. 고정 후, 폐를 파라핀에 묻고, 절편화하고 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색했다. 폐 염증의 네 가지 매개 변수가 평가되었다: 세기관지염 (세기관지 주변의 염증 세포 침윤), 혈관 주위염 (소 혈관 주변의 염증 세포 침윤), 간질성 폐렴 (염증 세포 침윤 및 폐포 벽 비후), 폐포 염 (폐포 공간 내 세포). 슬라이드는 0-4 심각도 척도로 맹목적으로 채점되었다. 점수는 후속적으로 0-100% 조직 병리학 척도로 변환되었다.
결과:
도 1에서 볼 수 있듯이, 상기 LNP 제형화된 RSV-F (F-del_DSCav1) mRNA 백신은 높은 바이러스 중화 항체 역가 (그룹 1-4)로 나타낸 바와 같이 목화나무쥐에서 RSV 특이적 기능성 항체의 형성을 유도한다. 프로타민-제형화된 mRNA를 사용한 백신 접종은 약한 반응만을 유도한다.
도 2에서 볼 수 있듯이, 상기 LNP-제형화된 RSV-F (F-del_DSCav1) mRNA 백신은 RSV 바이러스 접종된 목화나무쥐에서 폐 바이러스 역가를 감소시켜 폐의 RSV 감염을 제한한다 (그룹 1-4). LNP 백신으로 제형화된 mRNA로 백신 접종된 모든 동물 그룹은 바이러스 폐 역가 측면에서 백신 접종된 목화나무쥐의 보호를 입증하는 수행된 바이러스 적정의 검출 수준 미만의 바이러스 역가를 나타냈다. 대조적으로, 프로타민 제형화된 mRNA 백신 (i.m. 투여) 및 포르말린 불활성화 바이러스 백신은 완충제 대조군에 비해 폐 바이러스 역가를 최소한으로만 감소시켰다.
도 3에서 볼 수 있듯이, RSV 목화나무쥐 접종 연구의 폐 조직 병리학 분석은 다양한 동물 그룹에 대해 다른 병리학 점수를 나타낸다. 조직 병리학에서 mRNA 백신 접종 그룹 중 어느 것도 포르말린 비활성화 RSV 백신을 사용하여 백신 접종한 그룹의 경우처럼 향상된 폐 병리를 나타내지 않았다는 결론을 내릴 수 있다. 기관지염, 혈관 주위염, 내장성 폐렴 및 폐포 염에 대한 평균 병리학 점수는 포르말린이 비활성화된 RSV를 가진 그룹 (그룹 8)에 비해 mRNA로 백신을 접종한 모든 그룹 (그룹 1-6)에서 훨씬 낮다.
실시예 3: RSV-F를 암호화하는 LNP-제형화된 mRNA로 목화나무쥐의 백신 접종 및 RSV 목화나무쥐 접종 연구
본 실시예는 UTR 조합 RPL32/ALB7 (i-2)을 갖는 mRNA 구조물에 대해 상이한 RSV-F 항원을 암호화하는 LNP-제형화된 mRNA가 목화나무쥐에서 강력하고 기능적인 면역 반응을 유도함을 보여준다.
이 실험은 전장 RSV F0, 절단된 RSV F-del 및 융합 전 안정화된 절단된 F-del_DSCav1의 세 가지 다른 RSV-F 변이체를 암호화하는 mRNA-LNP를 비교했다. 상기 mRNA-LNP 백신은 실시예 1에 따라 제조되었다. 목화나무쥐는 0 일과 28 일에 mRNA-LNP 백신으로 두 번의 근육 내 백신 접종을 받았다. 각 용량은 10μg 또는 100μg mRNA-LNP로 구성되었다. 대조군 동물은 0 일에 105 pfu 생존 RSV/A2 바이러스를 비강 내로 1 회 백신 접종하거나, 0 일 및 28 일에 포르말린 비활성화 RSV 바이러스 (FI RSV)를 근육 내로 2 회 백신 접종하였다. 추가 대조군 동물은 완충액만 받았다 (표 11 참조).
표 11: 실시예 3의 동물 그룹 및 백신 접종 일정
그룹 실험 아이템 RNA ID 복용량 경로
1 F0을 암호화하는 RNA
LNP-제형화		 R3737 10μg i.m.
2 F0을 암호화하는 RNALNP-제형화 R3737 100μg i.m.
3 F-del을 암호화하는 RNALNP-제형화 R3738 10μg i.m.
4 F-del을 암호화하는 RNALNP-제형화 R3738 100μg i.m.
5 F-delDSCav1을 암호화하는 RNALNP-제형화 R6122 10μg i.m.
6 F-delDSCav1을 암호화하는 RNALNP-제형화 R6122 100μg i.m.
7 생존 RSV/A2 바이러스 　 105 pfu i.n.
8 FI RSV 　 1:100 i.m.
9 완충액 　 - i.m.
10 미처리/미감염 　 - -
ELISA에 의한 항-RSV F 단백질 항체의 결정:
혈액 샘플은 항-RSV F 항체 역가의 결정을 위해 28, 49 및 63일에 수집되었다. ELISA 플레이트는 재조합 인간 RSV 융합 당 단백질 (동결 건조된 분말로 제공되는 바큐로바이러스(Baculovirus) 인섹트(Insect) 세포에서 발현되는 C-말단에서 폴리히스티딘 태그와 융합된 인간 RSV 융합 당 단백질 (529)의 세포 외 도메인)으로 코팅된다. 코팅된 플레이트는 주어진 혈청 희석액을 사용하여 배양된다. F 단백질에 대한 특이적 항체의 결합은 ABTS 기질과 함께 스트렙타비딘-HRP (홀스래디시 과산화 효소)와 조합된 비오틴화된 이소타입 특이적 항-마우스 항체를 사용하여 검출된다.
바이러스 중화 역가의 결정:
49일째에 혈청이 수집되었고 RSV 바이러스 중화 역가 (VNT)가 플라그 감소 중화 테스트 (PRNT)를 사용하여 측정되었다. 희석된 혈청 샘플을 RSV/A2와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고 24개 웰 플레이트에서 융합성 HEp-2 단층에 이중으로 접종하였다. 5% CO2 인큐베이터 내 37°C에서 1 시간 인큐베이션한 후, 웰을 0.75% 메틸셀룰로오스 배지로 덮었다. 4일의 배양 후, 오버레이를 제거하고 세포를 고정하고 염색하였다. 상응하는 상호 중화 항체 역가는 바이러스 대조군의 60% 감소 종점에서 결정되었다.
목화나무쥐 접종 연구:
백신 접종된 동물은 63일에 100uL의 105pfu 살아있는 RSV/A2 바이러스로 비강 내 공격받았다. 한 대조군은 미치료 및 미감염 상태로 유지되었다. 68일에 모든 동물을 희생시키고 비강 조직과 폐를 수확하였다.
접종된 목화나무쥐의 폐에서 RSV 역가:
상기 기재된 바와 같이 동물의 폐를 68일 (즉, 105 pfu 생존 RSV/A2 바이러스로 비강 내 접종 후 5일 후)에 수집하였고, RSV/A2 역가를 플라크 분석에 의해 한 엽(lobe)에서 정량화하였다.
접종된 목화나무쥐의 비강 조직에서 RSV 역가
동물의 비강 조직을 68일 (즉, 105 pfu 생존 RSV/A2 바이러스로 비강 내 접종 후 5일 후)에 수집하였다. 비강 균질물은 폐 균질물과 같이 원심 분리에 의해 정화되고 EMEM에서 희석되었다. 융합성 HEp-2 단층을 24 웰 플레이트에서 희석된 균질물로 중복 감염시켰다. 5% CO 인큐베이터에서 37°C에서 1 시간 인큐베이션한 후, 웰을 0.75% 메틸셀룰로스 배지로 덮었다. 4일 동안 배양한 후, 오버레이를 제거하고 세포를 고정하고 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 1시간 동안 염색한 다음 헹구고 공기 건조시켰다. 플라크를 계수하고 바이러스 역가를 조직 그램당 플라크 형성 단위로 표현하였다. 바이러스 역가는 주어진 시간에 그룹의 모든 동물에 대한 기하 평균 ± 표준 오차로 계산되었다.
접종된 목화나무쥐의 폐 조직 병리학:
상기 기재된 바와 같이 동물의 폐를 68일 (즉, 105pfu 생존 RSV/A2 바이러스로 비강 내 접종 후 5일 후)에 수집하였고, 하나의 엽을 조직 병리학에 의해 분석하였다.
결과:
도 4에서 볼 수 있듯이, 모든 LNP-제형화된 RSV-F (F0, F-del, F-del_DSCav1) mRNA 백신은 높은 바이러스 중화 항체 역가에 의해 나타난 바와 같이 목화나무쥐에서 RSV 특이적 기능성 항체의 형성을 유도했다.
도 5a, 5b 및 5c는 RSV F-단백질 (F0, F-del 및 F-del_DSCav1)을 암호화하는 LNP-제형화된 mRNA가 RSV-F 단백질에 대한 목화나무쥐에서 체액성 면역 반응을 유도함을 보여준다. 항체 총 IgG 역가는 ELISA에 의해 결정되었다. 도 5a: 49 일에 결정된 항체 역가; 도 5b 및 5c: RSV F-단백질 (F0, F-del 및 F-del_DSCav1)을 암호화하는 10μg mRNA (도 5b) 또는 100μg mRNA (도 5c)를 사용하는 혈청에서 시간 의존적 igG 역가. 10μg 및 100μg의 두 용량 모두에서, F0 및 F-del 백신은 생존 바이러스를 사용한 백신 접종에 비해 1차 접종 (28 일) 후 이미 더 높은 역가의 RSV-F 특이 IgG를 유도한다. 부스트 백신 접종 후 테스트된 모든 LNP-제형화된 RSV-F (F0, F-del, F-del_DSCav1) mRNA 백신은 ELISA로 측정된 체액성 면역 반응을 유도하는 데, 이는 대조군 백신 접종의 반응보다 더 두드러진다.
도 6에서 볼 수 있듯이, LNP-제형화된 RSV-F (F0, F-del, F-del_DSCav1) mRNA 백신은 RSV 바이러스 접종된 목화나무쥐에서 폐 바이러스 역가를 감소시켜 폐의 RSV 감염을 제한한다. LNP 백신으로 제형화된 mRNA로 백신 접종된 모든 동물 그룹은 수행된 바이러스 적정의 검출 수준보다 낮은 바이러스 역가를 나타냈다. 결과는 바이러스성 폐 역가 측면에서 백신 접종된 목화나무쥐의 보호를 입증한다. 대조적으로, 포르말린 비활성화 바이러스 백신 (FI RSV)은 완충제 대조군에 비해 폐 바이러스 역가를 최소한으로만 감소시켰다.
도 7에서 볼 수 있듯이, LNP-제형화된 RSV-F (F0, F-del, F-del_DSCav1) mRNA 백신은 RSV 바이러스 접종된 목화나무쥐의 비강 조직에서 바이러스 역가를 크게 감소시켜 코의 RSV 감염을 감소시킨다. mRNA 백신과 비교하여 포르말린 비활성화 바이러스 (FI RSV) 기반 백신은 비강 바이러스 역가를 감소시킬 수 없었다.
도 8에서 볼 수 있듯이, RSV 목화나무쥐 접종 연구의 폐 조직 병리학 분석은 다양한 동물 그룹에 대해 서로 다른 병리학 점수를 나타낸다. 조직 병리학에서 mRNA 백신 접종 그룹 중 어느 것도 포르말린 비활성화 RSV 백신을 사용하여 백신 접종한 그룹의 경우처럼 향상된 폐 병리를 나타내지 않았다는 결론을 내릴 수 있다. 기관지염, 혈관 주위염, 내장성 폐렴 및 폐포 염에 대한 평균 병리학 점수는 포르말린 비활성화 RSV 그룹에 비해 mRNA로 백신을 접종한 모든 그룹에서 훨씬 낮다.
mRNA 기반 백신의 효율성을 더욱 향상시키고자, mRNA의 번역 효율성을 잠재적으로 증가시키기 위해 다른 UTR 조합을 포함하는 여러 대체 RSV-F mRNA 구조물이 설계되었다. 이들 mRNA 구조물은 다음 실시예에서 볼 수 있는 바와 같이 테스트되었다.
실시예 4: RSV-F mRNA 구조물의 시험관 내 발현 스크린
본 실시예는 본 발명에 따른 UTR 조합이 예를 들어 실시예 3 (UTR 조합 RPL32/ ALB7 (i-2))에서 사용된 기준 mRNA 구조물 (하버링 RPL32/ALB7 UTR)과 비교하여 상기 mRNA 구조물의 발현 성능을 강력하게 개선함을 보여준다.
RSV-F mRNA의 발현 성능을 더욱 향상시키기 위해, 본 발명에 따른 유리한 UTR 조합을 확인하기 위해 스크리닝 실험을 수행하였다. 상이한 UTR 조합을 포함하는 RSV-F mRNA 구조물의 단백질 발현 성능을 결정하기 위해, HEK 293T 세포를 상이한 리포펙타민-제형화된 mRNA 구조물로 형질 주입시켰으며, 이들은 모두 융합 전 안정화된 절단된 F-del_DSCav1을 암호화하는 동일한 코딩 서열을 포함하지만 상이한 5'- 및 3'-UTR을 사용한다 (표 12 참조). RSV-F 발현은 유세포 분석에 의해 형질 주입 24 시간 후에 분석되었다.
표 12: 실시예 4의 상이한 UTR 조합을 갖는 mRNA 구조물
항원 UTR 설계 서열 번호: RNA 서열 번호: 단백질
F-del_DSCav1 HSD17B4/PSMB3; a-1 1276 1267
F-del_DSCav1 Ndufa4/PSMB3; a-2 1284 1267
F-del_DSCav1 Slc7a3/PSMB3; a-3 1292 1267
F-del_DSCav1 Nosip/PSMB3; a-4 1300 1267
F-del_DSCav1 Mp68/PSMB3; a-5 1308 1267
F-del_DSCav1 Ubqln2/RPS9; b-1 1316 1267
F-del_DSCav1 ASAH1/RPS9; b-2 1324 1267
F-del_DSCav1 HSD17B4/RPS9; b-3 1332 1267
F-del_DSCav1 HSD17B4/CASP1; b-4 1340 1267
F-del_DSCav1 Nosip/COX6B1; b-5 1348 1267
F-del_DSCav1 Ndufa4/RPS9; c-1 1356 1267
F-del_DSCav1 Nosip/Ndufa1; c-2 1364 1267
F-del_DSCav1 Ndufa4/COX6B1; c-3 1372 1267
F-del_DSCav1 Ndufa4/Ndufa1; c-4 1380 1267
F-del_DSCav1 ATP5A1/PSMB3; c-5 1388 1267
F-del_DSCav1 Rpl31/PSMB3; d-1 1396 1267
F-del_DSCav1 ATP5A1/CASP1; d-2 1404 1267
F-del_DSCav1 Slc7a3/Gnas; d-3 1412 1267
F-del_DSCav1 HSD17B4/Ndufa1; d-4 1420 1267
F-del_DSCav1 Slc7a3/Ndufa1; d-5 1428 1267
F-del_DSCav1 TUBB4B/RPS9; e-1 1436 1267
F-del_DSCav1 Rpl31/RPS9; e-2 1444 1267
F-del_DSCav1 Mp68/RPS9; e-3 1452 1267
F-del_DSCav1 Nosip/RPS9; e-4 1460 1267
F-del_DSCav1 ATP5A1/RPS9; e-5 1468 1267
F-del_DSCav1 ATP5A1/COX6B1; e-6 1476 1267
F-del_DSCav1 ATP5A1/Gnas; f-1 1484 1267
F-del_DSCav1 ATP5A1/Ndufa1; f-2 1492 1267
F-del_DSCav1 HSD17B4/COX6B1; f-3 1500 1267
F-del_DSCav1 HSD17B4/Gnas; f-4 1508 1267
F-del_DSCav1 Mp68/COX6B1; f-5 1516 1267
F-del_DSCav1 Mp68/Ndufa1; g-1 1524 1267
F-del_DSCav1 Ndufa4/CASP1; g-2 1532 1267
F-del_DSCav1 Ndufa4/Gnas; g-3 1540 1267
F-del_DSCav1 Nosip/CASP1; g-4 1548 1267
F-del_DSCav1 Rpl31/CASP1; g-5 1556 1267
F-del_DSCav1 Rpl31/COX6B1; h-1 1564 1267
F-del_DSCav1 Rpl31/Gnas; h-2 1572 1267
F-del_DSCav1 Rpl31/Ndufa1; h-3 1580 1267
F-del_DSCav1 Slc7a3/CASP1; h-4 1588 1267
F-del_DSCav1 Slc7a3/COX6B1; h-5 1596 1267
F-del_DSCav1 Slc7a3/RPS9; i-1 1604 1267
F-del_DSCav1 RPL32(32L4)/ALB7; i-2 1612 1267
형질 주입 및 유세포 분석에 관한 자세한 설명:
293T 세포를 6-웰 플레이트에 200000개 세포/웰 (200000개 세포/2ml)의 밀도로 접종하였다. 각 RNA는 Opti-MEM에서 20분 동안 1/1.5 (w/v)의 비율로 리포펙타민2000과 복합체화되었다. 그런 다음 리포복합체화된(Lipocomplexed) mRNA를 세포에 첨가하여 총 부피 500uL의 웰당 2μg의 RNA로 형질 주입시켰다. 형질 주입 시작 4시간 후에 형질 주입 용액을 2000uL/웰의 완전 배지로 교환하였다. FACS 분석을 수행하기 전에 세포를 37°C, 5% CO2에서 추가로 유지했다.
형질 주입 24시간 후, 관심 항원의 발현은 표준 절차를 사용하여 FACS 분석에 의해 정량화되었다. 간단히 말해서, 세포를 분리하고 (40mM Tris HCl pH 7.5 150mM NaCl, 1mM EDTA in H20; 실온에서 5분) PBS로 세척하고 RSV-F에 대한 마우스 항체 (Millipore, Cat: MAB8262) 및 형광 표지된 염소 항-마우스 IgG 항체 (Sigma, Cat: F5262)로 표면을 염색했다. 세포를 100uL PFEA 완충액 (PBS+ 2% FCS+ 2mM EDTA+ 0.01 % NaN3)에 재현탁하고 BD FACS Canto II를 사용하여 분석했다. 생존/사멸 염색은 아쿠아 형광 반응성 염료 (Invitrogen)로 수행되었다.
결과를 100% 수준으로 설정한 RPL32/ALB7 UTR-조합 (서열 번호: 1612)을 포함하는 실시예 3의 기준 구조물로부터의 발현과 비교하였다. 분석 결과는 도 9에 나와 있다.
결과
도 9에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 UTR 조합을 포함하는 mRNA 구조물의 발현 성능은 기준 UTR 조합 (RPL32/ALB7; i-2)을 포함하는 구조물에 비해 크게 증가하였다.
실시예 5: RSV-F를 암호화하는 LNP-제형화된 mRNA로 목화나무쥐의 백신 접종 및 목화나무쥐 접종 연구
실시예 4의 UTR 스크린 결과를 바탕으로, mRNA 발현 최적화를 위한 UTR 조합을 갖는 mRNA 구조물을 백신 접종 실험에 사용하였다.
이 실험에서, 본 발명에 따른 상이한 UTR 조합을 갖는 RSV-F (F, F-del 또는 F-del_DSCav1)를 암호화하는 mRNA 백신이 비교된다. 상기 mRNA-LNP 백신은 실시예 1에 따라 제조된다. 목화나무쥐는 0일과 28일에 mRNA-LNP 백신으로 두 번의 근육 내 백신 접종을 받는다. 각 용량은 2μg 또는 10μg mRNA-LNP로 구성된다. 대조군 동물은 0일에 105 pfu 생존 RSV/A2 바이러스를 비강 내로 또는 포르말린-불활성화된 RSV 바이러스를 근육 내로 단일 백신 접종한다. 추가 대조군 동물은 완충액만 받는다 (표 13 참조).
표 13: 실시예 5의 동물 그룹 및 백신 접종 일정
그룹 실험 아이템 5'-UTR/3'-UTR; 서열 번호: RNA 복용량 경로
1 F0, F-del 또는 F-del_DSCav1 Nosip/RPS9; e-4 286, 701 또는 1460 10μg i.m.
2 F0, F-del 또는 F-del_DSCav1 Nosip/RPS9; e-4 286, 701 또는 1460 2μg i.m.
3 F0, F-del 또는 F-del_DSCav1 Ndufa4/CASP1; g-2 367, 782 또는 1532 10μg i.m.
4 F0, F-del 또는 F-del_DSCav1 Ndufa4/CASP1; g-2 367, 782 또는 1532 2μg i.m.
5 F0, F-del 또는 F-del_DSCav1 Ndufa4/RPS9; c-1 169, 584 또는 1356 10μg i.m.
6 F0, F-del 또는 F-del_DSCav1 Ndufa4/RPS9; c-1 169, 584 또는 1356 2μg i.m.
7 F0, F-del 또는 F-del_DSCav1 Ndufa4/PSMB3; a-2 88, 503 또는 1284 10μg i.m.
8 F0, F-del 또는 F-del_DSCav1 Ndufa4/PSMB3; a-2 88, 503 또는 1284 2μg i.m.
9 F0, F-del 또는 F-del_DSCav1 HSD17B4/PSMB3; a-1 79, 494 또는 1276 10μg i.m.
10 F0, F-del 또는 F-del_DSCav1 HSD17B4/PSMB3; a-1 79, 494 또는 1276 2μg i.m.
11 F0, F-del 또는 F-del_DSCav1 -/muag; i-3 475, 890 또는 1628 (R6939, R6940 또는 R5453) 10μg i.m.
12 F0, F-del 또는 F-del_DSCav1 -/muag; i-3 475, 890 또는 1628 (R6939, R6940 또는 R5453) 2μg i.m.
13 생존 RSV/A2 바이러스 　 　 5.0Log IM i.n.
14 UV-Inact. RSV/A2 　 　 5.0Log IM i.m.
15 FI-RSV 　 　 1:100 i.m.
16 완충액 　 　 　 i.m.
17 미처리/미감염 　 　 　 　
ELISA 또는 PRNT를 사용한 항 RSV 면역 반응의 결정
항-RSV 면역 반응의 유도는 앞서 설명한 대로 결정된다.
목화나무쥐 접종 연구
백신 접종된 동물은 63일에 100uL의 10exp5 pfu 살아있는 RSV/A2 바이러스로 비강 내 공격받았다. 한 대조군은 미치료 및 미감염 상태로 유지되었다. 68일에 모든 동물을 희생시키고 비강 조직과 폐를 수확하였다.
접종된 목화나무쥐의 폐에서 RSV 역가
상기 정의된 바와 같이 동물의 폐를 68일 (즉, 10exp5 pfu 생존 RSV/A2 바이러스로 비강 내 접종 후 5일 후)에 수집하였고, RSV/A2 역가를 플라크 분석에 의해 한 엽(lobe)에서 정량화하였다. 또한, RSV 바이러스 게놈 카피 수 (RSV NS-1 유전자의 카피 수 측정) 및 사이토카인 mRNA 수준은 정량적 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)에 의해 결정되었다.
접종된 목화나무쥐의 비강 조직에서 RSV 역가
동물의 비강 조직은 68일 (즉, 105 pfu 생존 RSV/A2 바이러스로 비강 내 접종 후 5 일)에 수집된다. 바이러스 역가는 위에서 설명한 대로 정량화된다. 또한, RSV 바이러스 게놈 카피 수 (RSV NS-1 유전자의 카피 수 측정) 및 사이토카인 mRNA 수준은 정량적 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)에 의해 결정되었다.
접종된 목화나무쥐의 폐 조직 병리학
상기 기재된 바와 같이 동물의 폐를 68일 (즉, 105 pfu 생존 RSV/A2 바이러스로 비강 내 접종 후 5일 후)에 수집하였고, 하나의 엽을 조직 병리학에 의해 분석하였다.
실시예 6: RSV-F를 암호화하는 LNP-제형화된 mRNA로 목화나무쥐의 백신 접종 및 목화나무쥐 접종 연구
이 실험에서 RSV-F를 암호화하는 mRNA 백신 (F_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut3 (및/또는 선택적으로 F_DSCav1_mut0, _mut4, _mut5, _mut6, _mut7, _mut8 및/또는 F-del_DSCav1_mut0, _mut4, _mut5, _mut6, _mut7, _mut8) 이 비교된다. 상기 mRNA-LNP 백신은 실시예 1에 따라 제조된다. 목화나무쥐는 0일과 28일에 mRNA-LNP 백신으로 두 번의 근육 내 백신 접종을 받는다. 각 용량은 2μg 또는 10μg mRNA-LNP로 구성된다. 대조군 동물은 0일에 105 pfu 생존 RSV/A2 바이러스를 비강 내로 또는 포르말린-불활성화된 RSV 바이러스를 근육 내로 단일 백신 접종한다. 추가 대조군 동물은 완충액만 받는다 (표 14 참조).
표 14: 실시예 6의 동물 그룹
그룹 실험 아이템 RNA ID 서열 번호: RNA 서열 번호: 단백질 경로
1 F_DSCav1_mut1 R6771 1997 1636 i.m.
2 F-del_DSCav1_mut1 R6774 2366 2005 i.m.
3 F_DSCav1_mut2 R6772 2735 2374 i.m.
4 F-del_DSCav1_mut2 R6773 3104 2743 i.m.
5 F_DSCav1_mut3 R6770 3473 3112 i.m.
6 F-del_DSCav1_mut3 R6775 3842 3481 i.m.
7 생존 RSV/A2 바이러스 　 　 i.n.
8 UV-Inact. RSV/A2 　 　 i.m.
9 FI-RSV 　 　 i.m.
10 완충액 　 　 　 i.m.
11 미처리/미감염 　 　 　 　
ELISA 또는 PRNT를 사용한 항 RSV 면역 반응의 결정
항-RSV 면역 반응의 유도는 앞서 설명한 대로 결정된다.
목화나무쥐 접종 연구
백신 접종된 동물은 63일에 100uL의 10exp5 pfu 살아있는 RSV/A2 바이러스로 비강 내 공격받았다. 한 대조군은 미치료 및 미감염 상태로 유지되었다. 68일에 모든 동물을 희생시키고 비강 조직과 폐를 수확하였다.
접종된 목화나무쥐의 폐에서 RSV 역가
상기 정의된 바와 같이 동물의 폐를 68일 (즉, 10exp5 pfu 생존 RSV/A2 바이러스로 비강 내 접종 후 5일 후)에 수집하였고, RSV/A2 역가를 플라크 분석에 의해 한 엽(lobe)에서 정량화하였다. 또한, RSV 바이러스 게놈 카피 수 (RSV NS-1 유전자의 카피 수 측정) 및 사이토카인 mRNA 수준은 정량적 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)에 의해 결정되었다.
접종된 목화나무쥐의 비강 조직에서 RSV 역가
동물의 비강 조직은 68일 (즉, 105 pfu 생존 RSV/A2 바이러스로 비강 내 접종 후 5 일)에 수집된다. 바이러스 역가는 위에서 설명한 대로 정량화된다. 또한, RSV 바이러스 게놈 카피 수 (RSV NS-1 유전자의 카피 수 측정) 및 사이토카인 mRNA 수준은 정량적 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)에 의해 결정되었다.
접종된 목화나무쥐의 폐 조직 병리학
상기 기재된 바와 같이 동물의 폐를 68일 (즉, 105 pfu 생존 RSV/A2 바이러스로 비강 내 접종 후 5일 후)에 수집하였고, 하나의 엽을 조직 병리학에 의해 분석하였다.
실시예 7: RSV-F 및 추가 RSV 항원을 암호화하는 LNP-제형화된 mRNA로 목화나무쥐의 백신 접종 및 목화나무쥐의 접종 연구
RSV 특이적 면역 반응을 확장하고 최적화하기 위해, 특히 T 세포 의존성 면역 반응을 증가시키기 위해, 다양한 RSV 단백질(RSV F (F0, F, F-del, F_DSCav1 F-del_DSCav1, 또는 F_DSCav1mut0-mut8 또는 F-del_DSCav1mut0-mut8)을 암호화하는 mRNA 백신은 실시예 1에 따라 제조된다. 단일 또는 복합 백신의 효과를 평가하기 위해, 이들 백신은 표 9에 나타낸 바와 같이 단독 또는 조합으로 투여된다. 목화나무쥐는 0 일과 28 일에 각 항원에 대해 2μg 또는 10μg mRNA을 사용하는 mRNA-LNP 백신으로 두 번의 근육 내 (i.m.) 백신 접종을 받는다. 추가 그룹은 면역원성을 mRNA 백신과 비교하기 위해 포르말린 비활성화 RSV 및/또는 생존 RSV/A2로 근육 내 (i.m.) 면역화된다. 추가 대조군 동물은 완충액만 받는다 (표 15 참조). RSV 특이적 면역 반응은 Elisa 또는 세포 내 사이토 카인 염색 (ICS)에 의해 결정된다.
표 15: 실시예 7의 동물 그룹
그룹 실험 아이템 서열 번호: RNA 경로
1 F 475, 890, 1259, 1628, 1997, 2366, 2735, 3104, 3473, 3842, 4211, 4580, 4949, 5318, 5687, 6056, 6425, 6794, 7163, 7532, 7901, 또는 8270 i.m.
2 M 10046 i.m.
3 N 10496 i.m.
4 M2-1 11545 i.m.
5 P 10999 i.m.
6 F + M F (서열 번호: 475, 890, 1259, 1628, 1997, 2366, 2735, 3104, 3473, 3842, 4211, 4580, 4949, 5318, 5687, 6056, 6425, 6794, 7163, 7532, 7901, 또는 8270)+ M (서열 번호: 10046) i.m.
7 F+N F (서열 번호: 475, 890, 1259, 1628, 1997, 2366, 2735, 3104, 3473, 3842, 4211, 4580, 4949, 5318, 5687, 6056, 6425, 6794, 7163, 7532, 7901, 또는 8270)
+ N (서열 번호: 10496)		 i.m.
8 F + M2-1 F (서열 번호: 475, 890, 1259, 1628, 1997, 2366, 2735, 3104, 3473, 3842, 4211, 4580, 4949, 5318, 5687, 6056, 6425, 6794, 7163, 7532, 7901, 또는 8270)+ M2-1 (서열 번호: 11545) i.m.
9 F+P F (서열 번호: 475, 890, 1259, 1628, 1997, 2366, 2735, 3104, 3473, 3842, 4211, 4580, 4949, 5318, 5687, 6056, 6425, 6794, 7163, 7532, 7901, 또는 8270)+ P (서열 번호: 10999) i.m.
10 F + M + P F (서열 번호: 475, 890, 1259, 1628, 1997, 2366, 2735, 3104, 3473, 3842, 4211, 4580, 4949, 5318, 5687, 6056, 6425, 6794, 7163, 7532, 7901, 또는 8270)+ P (서열 번호: 10999) + M (서열 번호: 10046). i.m.
11 F + M + N + P F (서열 번호: 475, 890, 1259, 1628, 1997, 2366, 2735, 3104, 3473, 3842, 4211, 4580, 4949, 5318, 5687, 6056, 6425, 6794, 7163, 7532, 7901, 또는 8270)
+ P (서열 번호: 10999) + M (서열 번호: 10046)
+ N (서열 번호: 10496)		 i.m.
12 생존 RSV/A2 바이러스 　 i.n.
13 UV-Inact. RSV/A2 　 i.m.
14 FI-RSV 　 i.m.
15 완충액 　 i.m.
16 미처리/미감염 　 　
실시예 7의 백신 접종 실험을 위해, 다가 mRNA 조성물/백신은 적어도 2개의 상이한 서열 최적화된 DNA 주형 (각각은 실시예 1에 설명된 바와 같이 생성됨)을 사용하여 PCT 출원 WO2017/109134에 개시된 절차에 따라 생성된다 (예를 들어 그룹 6-10). 요컨대, DNA 구조물 혼합물 (각각 상이한 코딩 서열 및 T7 프로모터를 포함함)은 mRNA 구조물의 혼합물을 생성하기 위해 시험관 내 동시 RNA 전사를 위한 주형으로 사용된다. 그 후 얻어진 RNA 혼합물은 RP-HPLC를 이용한 공동 정제에 사용된다. 그 후, 수득된 정제된 RNA 혼합물은 다가 LNP-제형화된 RNA 조성물/백신을 생성하기 위해 LNP (섹션 1.4에 설명됨)로 제형화된다.
ELISA PRNT를 사용한 항 RSV 면역 반응의 결정:
항-RSV 면역 반응의 유도는 검출에 적합한 재조합 단백질 또는 펩티드를 사용하여 이전에 설명한 대로 결정된다.
세포 내 사이토카인 염색 (ICS):
백신 접종된 마우스 및 대조군 마우스의 비장 세포는 표준 프로토콜에 따라 분리된다. 간단히 말해서, 분리된 비장은 세포 스트레이너(strainer)를 통해 분쇄되고 PBS/1%FBS에서 세척된 후 적혈구 용해가 이어진다. PBS/1%FBS로 광범위한 세척 단계 후 비장 세포를 96 웰 플레이트 (2x106 세포/웰)에 시딩한다. 다음날 세포는 GolgiPlug™/GolgiStop™ (각각 브레펠딘 A 및 모넨신을 포함하는 단백질 수송 억제제; BD Biosciences)혼합물의 존재 하에 37°C에서 6시간 동안 적절한 RSV 펩티드 또는 관련 없는 대조군 펩티드와 2.5μg/ml의 항-CD28 항체 (BD Biosciences)로 자극된다. 자극 후 세포를 세척하고 제조업체의 지침에 따라 Cytofix/Cytoperm 시약 (BD Biosciences)을 사용하여 세포 내 사이토 카인에 대해 염색한다. 다음 항체가 염색에 사용된다: CD8-PECy7 (1:200), CD3-FITC (1:200), IL2-PerCP-Cy5.5 (1:100), TNFα-PE (1:100), IFNγ-APC (1:100) (eBioscience), CD4-BD Horizon V450 (1:200) (BD Biosciences) 및 1:100 희석된 Fcγ-블록과 함께 배양되었다. Aqua Dye는 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하는 데 사용된다 (Invitrogen). Canto II 유세포 분석기 (Beckton Dickinson)를 사용하여 세포를 수집한다. FlowJo 소프트웨어 (Tree Star, Inc.)를 사용하여 유세포 분석 데이터를 분석한다.
목화나무쥐 접종 연구:
백신 접종된 동물은 63일에 100uL의 10exp5 pfu 살아있는 RSV/A2 바이러스로 비강 내 공격받았다. 한 대조군은 미치료 및 미감염 상태로 유지되었다. 68일에 모든 동물을 희생시키고 비강 조직과 폐를 수확하였다.
목화나무쥐 접종 연구:
백신 접종된 동물은 63일에 100uL의 10exp5 pfu 살아있는 RSV/A2 바이러스로 비강 내 공격받았다. 한 대조군은 미치료 및 미감염 상태로 유지되었다. 68일에 모든 동물을 희생시키고 비강 조직과 폐를 수확하였다. 49일째에 혈청이 수집되었고 RSV 바이러스 중화 역가 (VNT)가 실시예 2에 기재된 바와 같이 플라그 감소 중화 테스트 (PRNT)를 사용하여 측정되었다.
접종된 목화나무쥐의 폐에서 RSV 역가:
상기 기재된 바와 같이 동물의 폐를 68일 (즉, 10exp5 생존 RSV/A2 바이러스로 비강 내 접종 후 5일 후)에 수집하였고, RSV/A2 역가를 플라크 분석에 의해 한 엽(lobe)에서 정량화하였다. 또한, RSV 바이러스 게놈 카피 수 (RSV NS-1 유전자의 카피 수 측정) 및 사이토카인 mRNA 수준은 정량적 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)에 의해 결정되었다.
접종된 목화나무쥐의 비강 조직에서 RSV 역가:
동물의 비강 조직은 68일 (즉, 105 pfu 생존 RSV/A2 바이러스로 비강 내 접종 후 5 일)에 수집된다. 바이러스 역가는 위에서 설명한 대로 정량화된다. 또한, RSV 바이러스 게놈 카피 수 (RSV NS-1 유전자의 카피 수 측정) 및 사이토카인 mRNA 수준은 정량적 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)에 의해 결정되었다.
접종된 목화나무쥐의 폐 조직 병리학:
상기 기재된 바와 같이 동물의 폐를 68일 (즉, 105 pfu 생존 RSV/A2 바이러스로 비강 내 접종 후 5일 후)에 수집하였고, 하나의 엽을 조직 병리학에 의해 분석하였다.
실시예 8: HeLa 세포에서 상이한 RSV F 단백질의 발현 및 FACS에 의한 분석
mRNA 구조물의 시험관 내 단백질 발현을 결정하기 위해 HeLa 세포를 RSV F 항원을 암호화하는 mRNA로 일시적으로 형질 주입시키고 적합한 항-F 단백질 항체 (마우스에서 발생)를 사용하여 RSV 융합을 위해 염색하고 FITC 결합 2차 항-마우스 항체 (Sigma의 F5262)로 대조 염색했다. HeLa 세포를 형질 주입 24시간 전에 세포 배양 배지 (RPMI, 10% FCS, 1% L-글루타민, 1% Pen/Strep)에서 400,000 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 접종했다. HeLa 세포는 리포펙타민 2000 (Invitrogen)을 사용하여 2μg 비정형 mRNA로 형질 주입되었다. 실시예 1에 따라 제조되고 표 16에 열거된 mRNA 구조물을 음성 대조군 (주사용수)을 포함하여 실험에 사용하였다 (표 9 참조). 형질 주입 24시간 후, HeLa 세포를 적합한 항 RSV-F 항체 (마우스에서 증식, 1:500) 및 항-마우스 FITC 표지된 2 차 항체 (1:500)로 염색한 다음 FACS Diva 소프트웨어를 사용하는 BD FACS Canto II에서 유세포 분석 (FACS)으로 분석했다. 형광 FITC 신호의 정량 분석은 FlowJo 소프트웨어 패키지 (Tree Star, Inc.)를 사용하여 수행되었다. 세포는 세포 내 또는 대안적으로 세포 표면에 염색되었다. 결과는 두 개의 서로 다른 독립적인 실험을 나타내는 도 10a 및 10b에 표시된다.
표 16: 실시예 8에서 사용된 mRNA 구조물의 개요
RNA ID 항원 UTR 설계 서열 번호: RNA 서열 번호: 단백질 참조 도면
R6939 F0 -/muag; i-3 475 68 10a, 10b
R6808 F0_DSCav1 -/muag; i-3 1259 898 10a, 10b
R6770 F_DSCav1_mut3 -/muag; i-3 3473 3112 10a
R6771 F_DSCav1_mut1 -/muag; i-3 1997 1636 10a
R6772 F_DSCav1_mut2 -/muag; i-3 2735 2374 10a
R6940 F-del -/muag; i-3 890 483 10a, 10b
R5453 F-del_DSCav1 -/muag; i-3 1628 1267 10a, 10b
R6775 F-del_DSCav1_mut3 -/muag; i-3 3842 3481 10a
R6774 F-del_DSCav1_mut1 -/muag; i-3 2366 2005 10a
R6773 F-del_DSCav1_mut2 -/muag; i-3 3104 2743 10a
R7454 F_DSCav1_mut0 -/muag; i-3 4211 3850 10b
R7456 F_DSCav1_mut5 -/muag; i-3 5687 5326 10b
R7458 F_DSCav1_mut4 -/muag; i-3 4949 4588 10b
R7455 F-del_DSCav1_mut0 -/muag; i-3 4580 4219 10b
R7457 F-del_DSCav1_mut5 -/muag; i-3 6056 5695 10b
R7459 F-del_DSCav1_mut4 -/muag; i-3 5318 4957 10b
결과:
상기 결과는 사용된 mRNA 구조물이 검출 가능한 세포 내 RSV F 단백질 발현뿐만 아니라 세포 표면에서 검출 가능한 단백질 발현을 유도함을 보여준다. 결실된 C-말단 (F-del)을 갖는 RSV F 구조물 (예를 들어, R6940, R5453, R6775, R6774, R6773, R7455, R7457, R7459)은 F 전장 구조물에 비해 증가된 세포 표면 단백질 발현을 나타낸다. F-del_DSCav1_mut0 (R7455)을 암호화하는 구조물은 가장 높은 발현을 나타낸다.
상기 결과는 F 단백질(F0, F-del, F0_DSCav1, F-del_DSCav1, F_DSCav1_mut0, F-del_DSCav1_mut0, F_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut2, F_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut3, F_DSCav1_mut4, F-del_DSCav1_mut4, F_DSCav1_mut5, F-del_DSCav1_mut5)을 암호화하는 본 발명의 mRNA가 세포에서 번역되고 세포 표면에 존재한다는 것을 예시하며, 이는 mRNA 기반 RSV 백신의 전제 조건이다.
실시예 9: RSV-F를 암호화하는 LNP-제형화된 mRNA로 목화나무쥐의 백신 접종 및 RSV 목화나무쥐 접종 연구
본 실시예는 상이한 전-융합 안정화된 RSV-F 항원을 암호화하는 본 발명에 따른 LNP-제형화된 mRNA가 목화나무쥐에서 강력하고, 기능적이며 보호적인 면역 반응을 유도함을 보여준다.
이 실험은 서로 다른 전 융합 안정화된 RSV-F 변이체 (mut 1, mut2, mut3)를 암호화하는 mRNA-LNP를 전장 F 또는 잘린 F (F-del)와 비교했다. 상기 mRNA-LNP 백신은 실시예 1에 따라 제조되었다. 목화나무쥐는 0 일과 28 일에 mRNA-LNP 백신으로 두 번의 근육 내 백신 접종을 받았다. 각 용량은 100μg mRNA-LNP로 구성되었다. 대조군 동물은 105 pfu 생존 RSV/A2 바이러스 또는 UV 불활성화된 RSV/A2 바이러스로 0 일에 단일 백신 접종을 받거나, 0 일 및 28 일에 포르말린-불활성화된 RSV 바이러스 (FI RSV)를 근육 내로 2 회 백신 접종받았다. 추가 대조군 동물은 완충액만 받았다 (표 17 참조).
표 17: 실시예 9의 동물 그룹 및 백신 접종 일정
그룹 실험 아이템 RNA ID 서열 번호: RNA 서열 번호: 단백질 복용량 경로
1 F0을 암호화하는 mRNA
LNP-제형화		 R6939 475 68 100μg i.m.
2 F0_DSCav1을 암호화하는 mRNALNP-제형화 R6808 1259 898 100μg i.m.
3 F_DSCav1_mut3을 암호화하는 mRNALNP-제형화 R6770 3473 3112 100μg i.m.
4 F_DSCav1_mut1을 암호화하는 mRNALNP-제형화 R6771 1997 1636 100μg i.m.
5 F_DSCav1_mut2을 암호화하는 mRNALNP-제형화 R6772 2735 2374 100μg i.m.
6 F-del을 암호화하는 mRNALNP-제형화 R6940 890 483 100μg i.m.
7 F-del_DSCav1을 암호화하는 mRNALNP-제형화 R5453 1628 1267 100μg i.m.
8 F-del_DSCav1_mut3을 암호화하는 mRNALNP-제형화 R6775 3842 3481 100μg i.m.
9 F-del_DSCav1_mut1을 암호화하는 mRNALNP-제형화 R6774 2366 2005 100μg i.m.
10 F-del_DSCav1_mut2을 암호화하는 mRNLNP-제형화 R6773 3104 2743 100μg i.m.
11 생존 RSV/A2 바이러스 　 105 i.m.
12 UV-inact. RSV/A2 　 105 i.m.
13 FI RSV 　 1:100 i.m.
14 완충액 　 i.m.
15 미처리/미감염 　 i.m.
ELISA에 의한 항-RSV F 단백질 항체의 결정:
혈액 샘플은 항-RSV F 항체 역가의 측정을 위해 0, 28, 49 및 63일에 수집되었다. ELISA 플레이트를 RSV/A2-감염된 HEp-2 세포 또는 메탄올/ 아세톤 고정 RSV/B 감염된 HEp-2 세포에서 추출한 정제된 F 단백질로 코팅했다. 코팅된 플레이트는 주어진 혈청 희석액을 사용하여 배양되었다. F 단백질에 대한 특이적 항체의 결합은 TMB 기질과 함께 스트렙타비딘-HRP (홀스래디시 퍼옥시다제)와 조합된 이소 타입 특이적 항-면(anti-cotton) 랫트 항체를 사용하여 검출되었다.
바이러스 중화 역가의 결정:
0, 28, 49 및 63일째에 혈청이 수집되었고 RSV 바이러스 중화 역가 (VNT)가 플라그 감소 중화 테스트 (PRNT)를 사용하여 측정되었다. 희석된 혈청 샘플을 RSV/A2 또는 RSV/B (25-50 PFU)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고 24개 웰 플레이트에서 융합성 HEp-2 단층에 이중으로 접종하였다. 5% CO2 인큐베이터 내 37°C에서 1 시간 인큐베이션한 후, 웰을 0.75% 메틸셀룰로오스 배지로 덮었다. 4일의 배양 후, 오버레이를 제거하고 세포를 고정하고 염색하였다. 상응하는 상호 중화 항체 역가는 바이러스 대조군의 60% 감소 종점에서 결정되었다.
목화나무쥐 접종 연구:
백신 접종된 동물은 63일에 100uL의 105pfu pfu 살아있는 RSV/A2 바이러스로 비강 내 공격받았다. 한 대조군은 미치료 및 미감염 상태로 유지되었다. 68일에 모든 동물을 희생시키고 비강 조직과 폐를 수확하였다.
접종된 목화나무쥐의 비강 조직에서 RSV 역가
동물의 폐 및 비강 조직을 68일 (즉, 105 pfu 생존 RSV/A2 바이러스로 비강 내 접종 후 5일 후)에 수집하였다. 비강 균질물은 폐 균질물과 같이 원심 분리에 의해 정화되고 EMEM에서 희석되었다. 융합성 HEp-2 단층을 24 웰 플레이트에서 희석된 균질물로 중복 감염시켰다. 5% CO 인큐베이터에서 37°C에서 1 시간 인큐베이션한 후, 웰을 0.75% 메틸셀룰로스 배지로 덮었다. 4일 동안 배양한 후, 오버레이를 제거하고 세포를 고정하고 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 1시간 동안 염색한 다음 헹구고 공기 건조시켰다. 플라크를 계수하고 바이러스 역가를 조직 그램당 플라크 형성 단위로 표현하였다.
폐 조직 병리학
폐를 절개하고 10% 중성 완충 포르말린으로 정상 부피로 부풀린 다음 동일한 고정 용액에 담근다. 고정 후, 폐를 파라핀에 묻고, 절편화하고 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색했다. 폐 염증의 네 가지 매개 변수가 평가되었다: 세기관지염 (세기관지 주변의 염증 세포 침윤), 혈관 주위염 (소 혈관 주변의 염증 세포 침윤), 간질성 폐렴 (염증 세포 침윤 및 폐포 벽 비후), 폐포 염 (폐포 내 세포 공간). 슬라이드는 0-4 심각도 척도로 블라인드로 평가된다. 이후 점수는 0-100 % 조직 병리학 척도로 변환된다.
결과:
도 11은 본 발명에 따른 상이한 RSV F 단백질(F0, F0_DSCav1, F_DSCav1_mut3, F_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F-del, F-del_DSCav1, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2)을 암호화하는 모든 시험된 LNP-제형화된 mRNA 구조물이 RSV-F 단백질에 대한 목화나무쥐에서 체액성 면역 반응을 유도함을 보여준다. 항체 총 IgG 역가는 ELISA에 의해 결정되었다.
절단된 F (F-del) (F-del, F-del_DSCav1, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2)를 암호화하는 mRNA 구조물은 d28에 전장 F 서열을 갖는 구조물보다 높고 빠른 반응을 유도했으며, 나중 시점에서 유의한 차이가 검출되지 않았다. 안정화된 구조물 (F0_DSCav1, F_DSCav1_mut3, F_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2)은 처음에 야생형 구조물 (F0 및 F-del)보다 낮은 ELISA 역가를 생성한다. 수준은 나중 시점에서 크게 다르지 않다.
100μg의 용량으로, 안정화되고 절단된 F 단백질 (F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2)을 암호화하는 구조물은 생존 바이러스를 사용한 백신 접종과 비교하여 1차 백신 접종 (28일) 후 이미 더 높은 역가의 RSV-F 특이 IgG를 유도한다. 부스트 백신 접종 후 테스트된 모든 LNP-제형화된 RSV-F mRNA 백신은 ELISA로 측정된 체액성 면역 반응을 유도하는 데, 이는 대조군 백신의 반응보다 더 두드러진다.
도 12에서 볼 수 있듯이, 모든 LNP-제형화된 RSV-F (F0, F0_DSCav1, F_DSCav1_mut3, F_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F-del, F-del_DSCav1, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2) mRNA 백신은 높은 바이러스 중화 항체 역가에 의해 나타난 바와 같이 목화나무쥐에서 RSV 특이적 기능성 항체의 형성을 유도했다. 상기 LNP-제형화된 RSV-F 절단 구조 (F-del, F-del_DSCav1, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2)는 F 전장 구조보다 높고 빠른 반응을 유도했다. 본 발명에 따른 전 융합 안정화를 위한 구조물(F_DSCav1_mut3, F_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2)은 F0, F0_DSCav1, F-del, F-del_DSCav1보다 더 높은 반응을 유도한다.
도 13에서 볼 수 있듯이, RSV 목화나무쥐 접종 연구의 폐 조직 병리학 분석은 다양한 동물 그룹에 대해 다른 병리학 점수를 나타낸다. 조직 병리학에서 mRNA 백신 접종 그룹 중 어느 것도 포르말린 비활성화 RSV 백신을 사용하여 백신 접종한 그룹의 경우처럼 향상된 폐 병리를 나타내지 않았다는 결론을 내릴 수 있다. 기관지염에 대한 평균 병리학 점수는 포르말린 비활성화 RSV를 가진 그룹에 비해 mRNA로 백신을 접종한 모든 그룹에서 더 낮다. 상기 LNP-제형화된 RSV-F 절단된 구조 (F-del, F-del_DSCav1, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2)는 F 전장 구조물보다 일반적으로 더 낮은 병리학 점수를 나타냈다. 본 발명에 따른 전 융합 안정화를 위한 구조물 (F_DSCav1_mut3, F_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2)은 F0, F0_DSCav1, F-del, F-del_DSCav1보다 더 나은 반응 (더 낮은 병리학 점수)을 나타냈다.
도 14a에서 볼 수 있듯이, 이 실험에서 테스트한 모든 LNP-제형화된 RSV-F mRNA 백신은 RSV 바이러스로 접종된 목화나무쥐에서 폐 바이러스 역가를 감소시켜 폐의 RSV 감염을 제한했다. LNP 백신으로 제형화된 mRNA로 백신 접종된 모든 동물 그룹은 수행된 바이러스 적정의 검출 수준보다 낮은 바이러스 역가를 나타냈다. 결과는 바이러스성 폐 역가 측면에서 백신 접종된 목화나무쥐의 보호를 입증한다. 대조적으로, 포르말린 비활성화 바이러스 백신 (FI RSV) 및 UV 비활성화 RSV/A2 바이러스 대조군은 완충제 대조군에 비해 폐 바이러스 역가를 최소한으로만 감소시켰다.
도 14b에서 볼 수 있듯이, LNP-제형화된 RSV-F mRNA 백신은 RSV 바이러스 접종된 목화나무쥐의 비강 조직에서 바이러스 역가를 강력하게 감소시켜 코의 RSV 감염을 감소시킨다. mRNA 백신과 비교하여 포르말린 비활성화 바이러스 (FI RSV) 및 UV 비활성화 RSV/A2 바이러스 대조군에 기반한 백신은 비강 바이러스 역가를 감소시킬 수 없었다. 코의 완전한 보호는 본 발명에 따른 전 융합 안정화에 의해서만 달성되었다 (F_DSCav1_mut3, F_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2).
결론적으로, 상기 결과는 RSV-F 절단된 단백질 (F-del, F-del_DSCav1, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2)을 암호화하는 LNP-제형화된 RNA 구조물이 일반적으로 전장 F 단백질을 암호화하는 RNA 구조물보다 더 면역원성이 있음을 보여준다. Ds-Cav1 돌연변이만을 특징으로 하는 구조물 (F0_DSCav1 및 F-del_DSCav1)은 본 발명에 따라 추가로 안정화된 F 단백질을 암호화하는 구조물과 비교하여 mRNA 기반 백신으로서 차선책이다.
mRNA 기반 백신의 효율성을 더욱 향상시키기 위해, 유익한 절단 F-del 단백질과 조합하여 전 융합 형태를 안정화시키는 추가 돌연변이를 포함하는 여러 대체 RSV-F mRNA 구조물을 설계했다. 이들 mRNA 구조물은 다음 실시예에서 볼 수 있는 바와 같이 테스트되었다.
실시예 10: RSV-F를 암호화하는 LNP-제형화된 mRNA로 목화나무쥐의 백신 접종 및 RSV 목화나무쥐 접종 연구
본 실시예는 상이한 전-융합 안정화된 RSV-F 항원을 암호화하는 본 발명에 따른 LNP-제형화된 mRNA가 목화나무쥐에서 강력하고, 기능적이며 보호적인 면역 반응을 유도함을 보여준다.
상기 mRNA-LNP 백신은 실시예 1에 따라 제조되었다. 목화나무쥐는 0 일 또는 0 일과 28 일에 mRNA-LNP 백신으로 1 또는 2 회의 근육 내 백신 접종을 받았다. 각 용량은 100μg mRNA-LNP로 구성되었다. 대조군 동물은 28 일에 105 pfu 생존 RSV/A2 바이러스 또는 포르말린 비활성화 RSV 바이러스 (FI RSV)를 근육 내로 단일 백신 접종을 받았다. 추가 대조군 동물은 완충액만 받았다 (표 18 참조).
표 18: 실시예 10의 동물 그룹 및 백신 접종 일정
그룹 실험 아이템 RNA ID 서열 번호: RNA 서열 번호: 단백질 복용량 예방 접종 경로
1 (1) F-del을 암호화하는 mRNA
LNP-제형화		 R6940 890 483 100μg day 0, day 28 i.m.
2 (2) F-del_DSCav1_mut2을 암호화하는 mRNALNP-제형화 R6773 3104 2743 100μg day 0, day 28 i.m.
3 (3) F-del_DSCav1_mut0을 암호화하는 mRNALNP-제형화 R7455 4580 4219 100μg day 0, day 28 i.m.
4 (4) F-del_DSCav1_mut5을 암호화하는 mRNALNP-제형화 R7457 6056 5695 100μg day 0, day 28 i.m.
5 (5) F-del_DSCav1_mut4을 암호화하는 mRNALNP-제형화 R7459 5318 4957 100μg day 0, day 28 i.m.
6 (1) F-del을 암호화하는 mRNALNP-제형화 R6940 890 483 100μg day 28 i.m.
7 (2) F-del_DSCav1_mut2을 암호화하는 mRNALNP-제형화 R6773 3104 2743 100μg day 28 i.m.
8 (3) F-del_DSCav1_mut0을 암호화하는 mRNALNP-제형화 R7455 4580 4219 100μg day 28 i.m.
9 (4) F-del_DSCav1_mut5을 암호화하는 mRNALNP-제형화 R7457 6056 5695 100μg day 28 i.m.
10 (5) F-del_DSCav1_mut4을 암호화하는 mRNALNP-제형화 R7459 5318 4957 100μg day 28 i.m.
11 생존 RSV/A2 바이러스 　 105 day 28 i.m.
12 FI RSV 　 1:100 day 28 i.m.
13 완충액 　 day 0, day 28 i.m.
14 미처리/미감염 　 i.m.
ELISA 및 바이러스 중화 역가에 의한 항-RSV F 단백질 항체 측정
이전에 기재된 바와 같이 플라크 감소 중화 테스트 (PRNT)를 사용하여 측정된 항-RSV F 항체 역가 및 RSV 바이러스 중화 역가 (VNT)의 결정을 위해 혈액 샘플을 0, 28, 49 및 63일에 수집하였다 (실시예 9 참조).
목화나무쥐 접종 연구:
백신 접종된 동물은 63일에 100uL의 105pfu pfu 살아있는 RSV/A2 바이러스로 비강 내 공격받았다. 한 대조군은 미치료 및 미감염 상태로 유지되었다. 68일에 모든 동물을 희생시키고 비강 조직과 폐를 수확하였다. 접종된 목화나무쥐의 비강 조직에서의 RSV 역가 및 폐 조직 병리학은 상술한 바와 같이 분석된다 (실시예 9 참조).
결과:
도 15는 본 발명에 따른 상이한 RSV F 단백질(F-del, F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut0, F-del_DSCav1_mut5, F-del_DSCav1_mut4)을 암호화하는 모든 시험된 LNP-제형화된 mRNA 구조물이 RSV-F 단백질에 대해 목화나무쥐에서 체액성 면역 반응을 유도함을 보여준다. 항체 총 IgG 역가는 ELISA에 의해 결정되었다. 안정화된 F 단백질을 암호화하는 RNA 구조물 (F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut0, F-del_DSCav1_mut5, F-del_DSCav1_mut4)은 초기에 절단된 야생형 F 단백질인 F-del을 암호화하는 구조물보다 더 낮은 ELISA 역가를 생성한다. 이 경향은 ELISA에 대해 더 높은 혈청 희석액을 사용하여 나중에 감지할 수도 있다 (데이터는 표시되지 않음). 상기 IgG 반응은 두 번째 면역화에 의해 상당히 증가될 수 있다.
도 16에서 볼 수 있는 바와 같이, 모든 LNP-제형화된 RSV-F (F-del, F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut0, F-del_DSCav1_mut5, F-del_DSCav1_mut4) mRNA 백신은 높은 바이러스 중화 항체 역가에 의해 나타난 바와 같이 목화나무쥐에서 RSV 특이적 기능성 항체의 형성을 유도했다. 본 발명에 따른 전 융합 안정화를 위한 LNP-제형화된 구조물 (F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut0, F-del_DSCav1_mut5, F-del_DSCav1_mut4)은 F-del보다 더 높거나 유사한 반응을 유도한다. 전 융합 안정화된 단백질 F-del_DSCav1_mut5를 암호화하는 RNA 구조물 R7457은 가장 높은 VNT를 유도한다 (이전 실험에서 최고의 전 융합 안정화된 구조물에 의해 유도된 최상의 결과와 비교할 수 있음 (실시예 9, R6773).
상기 폐 조직 병리학 분석 결과는 mRNA 백신 접종 그룹 중 어느 것도 포르말린 비활성화 RSV 백신을 사용하여 백신 접종된 그룹의 경우처럼 향상된 폐 병리를 나타내지 않았음을 보여준다(도 17a (기관지 주위염 및 혈관 주위염) 및 도 17b (간질성 폐렴 및 폐포염) 참조). 본 발명에 따른 전 융합 안정화를 위한 구조물 (F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut0, F-del_DSCav1_mut5, F-del_DSCav1_mut4)은 F-del보다 더 나은 반응 (더 낮은 병리학 점수)을 나타냈다. 두 번의 백신 접종을 받은 동물은 한 번만 접종한 동물에 비해 병리학 점수가 더 낮았다.
도 18a에서 볼 수 있듯이, 이 실험에서 테스트한 모든 LNP-제형화된 RSV-F mRNA 백신은 RSV 바이러스로 접종된 목화나무쥐에서 폐 바이러스 역가를 감소시켜 폐의 RSV 감염을 제한했다. 단 한 번의 예방 접종을 받은 그룹의 경우에도 마찬가지이다. 상기 결과는 바이러스성 폐 역가 측면에서 백신 접종된 목화나무쥐의 보호를 입증한다. 대조적으로, 상기 포르말린 비활성화 바이러스 백신 (FI RSV)은 완충제 대조군에 비해 폐 바이러스 역가를 최소한으로만 감소시켰다.
도 18b에서 볼 수 있듯이, LNP-제형화된 RSV-F mRNA 백신은 RSV 바이러스로 접종된 목화나무쥐의 비강 조직에서 바이러스 역가를 강력하게 감소시켜 코의 RSV 감염을 감소시킨다. mRNA 백신과 비교하여 포르말린 비활성화 바이러스 (FI RSV) 기반 백신은 비강 바이러스 역가를 감소시킬 수 없었다. 코의 완전한 보호는 두 번의 백신 접종을 받은 일부 그룹에서만 달성되었다 (예를 들어 R7457 (F-del_DSCav_mut4) 및 R7459 (F-del_DSCav_mut5)).
결론적으로, 상기 결과는 전 융합 안정화된 RSV-F 절단 단백질(F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut0, F-del_DSCav1_mut5, F-del_DSCav1_mut4)을 암호화하는 LNP-제형화된 RNA 구조물이 일반적으로 더 높은 기능적 역가로 생성되었고 야생형 절단된 F 단백질 F_del을 암호화하는 RNA 구조물과 비교하여 감염에 대해 더 뚜렷한 보호를 달성했음을 보여준다. 가장 좋은 결과는 F-del_DSCav1_mut2 또는 F-del_DSCav1_mut5 (R6773, R7457)를 암호화하는 RNA 구조물에 의해 달성되었다.
실시예 11: 토끼 망상 적혈구 용해물 시스템을 사용한 다양한 RSV T 세포 항원의 발현
본 발명의 제2 측면에 따른 mRNA 구조물(RSV 매트릭스 단백질 M, 인단백질 P, 핵단백질 N 및 매트릭스 단백질 M2-1 단백질을 암호화하는 mRNA 구조물)의 시험관 내 단백질 발현을 결정하기 위해, 제형화되지 않은 RNA (실시예 1에 따라 제조됨)을 제조 프로토콜에 따라 Promega Rabbit Reticulocyte Lysate System의 구성 요소와 혼합했다. 상기 용해물에는 단백질 합성에 필요한 세포 성분 (tRNA, 리보솜, 아미노산, 개시, 신장 및 종결 인자)이 포함되어 있다. 양성 대조군으로 Lysate System Kit의 루시퍼라제 RNA를 사용했다. 번역 결과는 SDS-Page 및 Western Blot 분석 (IRDye 800CW 스트렙타비딘 항체 (1 : 2000))으로 분석되었다.
표 19는 시험된 RNA 구조물을 요약한 것이다.
표 19: 실시예 11에서 사용된 mRNA 구조물의 개요
RNA ID 항원 UTR 설계 서열 번호: RNA 서열 번호: 단백질 예측된 kDa
R7595 M -/muag; i-3 10046 9684 28.7
R7596 P -/muag; i-3 10999 10637 27.1
R7597 N -/muag; i-3 10496 10134 43.4
R7598 M2-1 -/muag; i-3 11545 11183 22.1
Luc 61
결과:
그 결과 (도 19 참조)는 사용된 mRNA 구조물이 mRNA 기반 RSV 백신의 전제 조건인 검출 가능한 단백질 발현을 유도했음을 보여준다 (겔에서 RSV P 및 M2-1의 크기 이동은 예를 들어 Richard et al., 2018 또는 Hardy and Wertz, 2000 PMIDs: 29489893 및 10846068에 개시된 인산화 때문일 수 있음).
실시예 12: 상이한 RSV T-세포 항원을 단독으로 및 RSV F (F-del)와 조합하여 암호화하는 LNP-제형화된 mRNA로 마우스 백신 접종
본 실시예는 상이한 RSV T-세포 항원을 단독으로 또는 절단된 RSV F를 암호화하는 LNP 제형화된 mRNA와 조합하여 암호화하는 LNP-제형화된 mRNA를 분석한다. 상기 mRNA-LNP 백신은 실시예 1에 따라 제조되었다. Balb/c 마우스는 0 일과 28 일에 mRNA-LNP 백신으로 두 번의 근육 내 백신 접종을 받았다. 각 용량은 5μg, 2.5μg 또는 2.5μg+2.5μg mRNA-LNP로 구성되었다 (다른 항원을 암호화하는 mRNA를 받는 그룹의 경우 LNP를 별도로 제형화하고 투여 전에 혼합했다). 대조군 동물은 완충액만 받았다 (표 20 참조). ). 체액성, 세포 면역 반응 및 중화 항체는 ELISA, FACS, PRNT 및 ICS에 의해 분석되었다.
표 20: 실시예 12의 동물 그룹 및 백신 접종 일정
그룹 실험 아이템 RNA ID 서열 번호: RNA 서열 번호: 단백질 복용량 경로
1 NaCl 완충액 - - - i.m.
2 M: RSV M을 암호화하는 mRNA LNP-제형화 R7595 10046 9684 5μg i.m.
3 P: RSV P을 암호화하는 mRNALNP-제형화 R7596 10999 10637 5μg i.m.
4 N: RSV N을 암호화하는 mRNA LNP-제형화 R7597 10496 10134 5μg i.m.
5 M2-1: M2-1을 암호화하는 mRNALNP-제형화 R7598 11545 11183 5μg i.m.
6 F: F-del을 암호화하는 mRNA LNP-제형화 R6940 890 483 2.5 μg i.m.
7 F+M: F-del을 암호화하는 mRNA + RSV M을 암호화하는 mRNA
LNP-제형화		 R7595 + R6940 890 +
10046 		483+
9684		 2.5 μg + 2.5 μg i.m.
8 F+P: F-del을 암호화하는 mRNA + RSV P을 암호화하는 mRNA
LNP-제형화		 R7596 + R6940 890+
10999		 483+
10637		 2.5 μg + 2.5 μg i.m.
9 F+N: F-del을 암호화하는 mRNA + RSV N을 암호화하는 mRNA
LNP-제형화		 R7597 + R6940 890+
10496		 483+
10134		 2.5 μg + 2.5 μg i.m.
10 F+M2-1: F-del을 암호화하는 mRNA + RSV M2-1을 암호화하는 mRNA
LNP-제형화		 R7598 + R6940 890+
11545		 483+
11183		 2.5 μg + 2.5 μg i.m.
ELISA에 의한 항-RSV F 단백질 항체의 결정:
혈액 샘플은 항-RSV F 항체 역가의 측정을 위해 0, 14, 28 및 49 일에 수집되었다. ELISA 플레이트는 재조합 인간 RSV 융합 당 단백질 (hRSV F 단백질 (A2; His-tag; Sino Biological; Cat : 11049-V08B))로 코팅되었다. 코팅된 플레이트는 주어진 혈청 희석액을 사용하여 배양되었다. F 단백질에 대한 특이적 항체의 결합은 스트렙타비딘-HRP (홀스래디시 퍼옥시다제) 및 Amplex® UltraRed 시약 (Invitrogen (참조 번호. A36006)과 함께 이소타입 특이적 항 마우스 래트 항체를 사용하여 검출되었다.
FACS에 의해 측정된 항원 특이적 체액성 항체 반응의 검출
Hela 세포는 리포펙타민을 사용하여 2μg RSV mRNA 구조물 (R7595, R7596, R7597, R7598)로 형질 주입되었다. 형질 주입 후 20 시간에 세포를 수확하고, 96 웰 플레이트에 웰당 1x105로 시딩하였다. 상기 세포를 백신 접종된 마우스의 상응하는 혈청 (28 일 및 49 일의 혈청, 1:50으로 희석)과 함께 인큐베이션한 다음 FITC-접합된 항-마우스 IgG 항체 염색을 수행하였다. DIVA 소프트웨어를 사용하여 BD FACS Canto II에서 세포를 획득하고 FlowJo로 분석했다. 상기 결과는 도 21a (28 일) 및 도 21b (49 일)에 표시된다. 판독할 때 FITC 양성 세포 (살아있는 세포에서 제외)의 백분율이 사용되었다.
바이러스 중화 역가의 결정:
49일째에 혈청이 수집되었고 RSV 바이러스 중화 역가 (VNT)가 플라그 감소 중화 테스트 (PRNT)를 사용하여 측정되었다. 희석된 혈청 샘플을 RSV/A2 (25-50 PFU)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고 24개 웰 플레이트에서 융합성 HEp-2 단층에 이중으로 접종하였다. 5% CO2 인큐베이터 내 37°C에서 1 시간 인큐베이션한 후, 웰을 0.75% 메틸셀룰로오스 배지로 덮었다. 4일의 배양 후, 오버레이를 제거하고 세포를 고정하고 염색하였다. 상응하는 상호 중화 항체 역가는 바이러스 대조군의 60% 감소 종점에서 결정되었다.
FACS를 사용하여 ICS에 의한 마우스의 세포 면역 반응 측정
백신 접종 마우스 및 대조군 마우스의 비장 세포 및 폐 세포를 표준 프로토콜에 따라 분리하였다. 간단히 말해서, 분리된 비장은 세포 스트레이너를 통해 분쇄되고 PBS (1% FCS)에서 세척되었다. 원심 분리 후, 세포 펠렛을 나머지 상청액으로 재현탁하고 적혈구 용해 완충액으로 처리하고 PBS (1% FCS)로 반복적으로 세척하였다. 마지막으로, 비장 세포를 FCS/10% DMSO에 재현탁하고 냉동기로 옮겨 -80°C에 보관했다. 폐를 RPMI-1640 배지 (10% FCS; 2mM 글루타민; 1 % Pen/Strep)를 사용하여 관류하고, 수확한 다음, 제조업체의 지침에 따라 Miltenyi Biotec의 Lung Dissociation Kit 마우스를 사용하여 폐 세포가 분리될 때까지 4°C에서 RPMI-1640 배지(10% FCS; 2 mM glutamine; 1% Pen/Strep)에 보관했다. ICS의 경우, 2 x 106 세포 (비장 세포 또는 폐 세포) 를 둥근 바닥 플레이트에 중복으로 시딩하고 RSV M2-1 특이적 (VYNTVISYI, SYIGSINNI, SYIESNRKN, KSIDTLSEI), RSV F 특이적 (FYQSTCSAV, TYMLTNSEL, KYKNAVTEL, KIMTSKTDV), RSV M 특이적 (KHTATRFAI, AQMPSKFTI, KYIKPQSQF, TYLRSISVR), RSV P 특이적 (SPITSNSTI, SYEEINDQT), 또는 RSV N 특이적 (SYKKMLKEM, FYHILNNPK, KYTIQRSTG, GYHVKANGV) 펩티드로 자극했다. 골지 블록 (GolgiPlug 1/1000) 및 세포 내 사이토카인 축적을 위한 배양 후, 세포를 Aqua-dye를 사용하여 생존/사멸 염색을 실시하였다. 그런 다음, 세포는 비장 세포에 대한 항체 α-CD8-APC-H7 (1/100), α-CD4-BD-Horizon V450 (1/200), α-Thy1.2-FITC (1/300), 및 α-CD107a PE-Cy7 (1/100) 및 폐 세포에 대한 α-CD8-APC-H7 (1/100), α-CD4-BD-Horizon V450 (1/200), α-Thy1.2-FITC (1/300), α-CD69-PE (1/100), 및 α-CD103-PE-Cy7 (1/60) 를 이용하여 표면 염색되었다. Cytofix/Cytoperm으로 처리한 후, 폐 세포는 α-IFNα-APC (1/100)로 세포 내 염색하고 추가적으로 α-TNFα-PE (1/100)로 비장 세포를 염색했다. 마지막으로 DIVA 소프트웨어를 사용하여 BD FACS Canto II에서 세포를 획득하고 FlowJo에 의해 분석했다.
결과:
마우스의 면역원성 연구 결과, 예를 들어 체액성 면역 반응은 도 20에서 볼 수 있다 (도 20a: 항-RSV F IgG, 도 20b: 항-RSV F IgG2a). 일반적으로, 모든 그룹은 F-del 단독과 F-del + T- 세포 항원 그룹 사이에 유의한 차이 없이 체액성 면역 반응을 유도했다. RSV F-del을 암호화하는 mRNA 백신에 T-세포 항원 M, P, N, 및 M2-1의 첨가는 RSV F에 대한 면역 반응에 영향을 주거나 방해하지 않았다. 이러한 발견은 T 세포 항원의 공동 발현이 RSV F에 의해 유도된 항체 반응에 영향을 미치지 않음을 나타낸다. 상기 면역 반응은 두 번째 예방 접종에 의해 강화될 수 있다 (49 일에 반응 참조). 일반적으로, IgG2a 역가는 IgG1 역가보다 10 배 높으며, 이는 우세한 Th1 반응을 나타낸다. Th2 편향 반응은 동물 모델에서 향상된 호흡기 질환 (ERD)과 관련되어 있기 때문에 Th1 편향 면역 반응은 잠재적인 RSV 백신의 중요한 전제 조건으로 간주된다.
도 21a 및 도 21b에 도시된 바와 같이, 면역화된 마우스의 혈청에서 특이적 항원 IgG가 검출되었는데, 이는 적용된 mRNA 구조물이 특정 체액성 면역 반응을 유도하기에 적합하다는 것을 나타낸다. 또한, 상기 결과는 N 및 M2-1에 대한 항원 특이적 항체 반응의 유도가 28 일에 이미 검출될 수 있는 반면, M 및 P 면역화의 경우 추가 백신 접종이 필요함을 보여준다. RSV F 동시 면역화 후 항원 특이적 항체 반응이 감소한 것은 면역 용량이 다르기 때문일 수 있다 (5 μg vs, 2.5 μg).
도 22에서 볼 수 있듯이, 모든 LNP-제형화된 mRNA 백신 (F, M+F, P+F, N+F, M2-1+F)은 높은 바이러스 중화 항체 역가에 의해 나타난 바와 같이 마우스에서 RSV 특이적 기능성 항체의 형성을 유도했다. RSV/A2에 대한 혈청 중화 항체 역가 분석은 면역화 그룹 간에 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다.
도 23 (도 23a 폐 ICS CD8, 도 23b, 비장 ICS CD8, 도 23c 비장 ICS CD4)에서 볼 수 있는 바와 같이, RSV F, RSV M2-1 또는 둘 모두를 포함하는 모든 백신은 F 또는 특히 M2-1에 특이적인 CD8+ TRM 세포의 증가가 관찰될 수 있기 때문에 근육 내 면역시 폐에서 조직 상주 기억 T 세포 (TRM) 반응을 놀랍게도 유도했다. 폐 TRM 세포 (CD69+ 및 CD103+)가 RSV 감염으로부터 보호하기 위해 제안되기 때문에 폐에서 TRM 세포 반응의 유도는 잠재적인 RSV 백신에 유리할 수 있다. RSV F 및 특히 RSV M2-1로 면역화하는 것으로 나타난 비장 세포 분석은 부위 특이적 반응 외에 전신 T 세포 반응의 유도를 나타내는 IFNγ 및 TNF를 분비하는 항원-특이적 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 증가를 나타낸다.
결론적으로, 결과는 RSV M2-1이 RSV F에 의해 유도된 항체 반응에 영향을 주지 않고 가장 유망한 T 세포 면역 반응을 유도한다는 것을 보여준다. 따라서 RSV M2-1과 함께 RSV F를 암호화하는 mRNA를 포함하는 백신은 RSV 감염에 대한 보호 효능을 증가시킬 수 있다.
실시예 13: RSV mRNA 백신 조성물의 임상 개발:
RSV mRNA 백신 조성물의 안전성과 효율성을 입증하기 위해 임상 시험 (1상)이 시작된다. 임상 개발을 위해 GMP 조건 하에서 생산된 RNA가 사용된다 (예를 들어 WO2016/180430에 설명된 절차 사용).
임상 시험에서, 건강한 인간 지원자의 코호트(cohort)는 유리한 UTR 조합을 포함하는 각각의 LNP 제형화된 백신 조성물로 근육 내 주사된다.
본 발명에 따른 백신 조성물의 안전성 프로파일을 평가하기 위해, 대상체는 투여 후 모니터링된다 (생명 신호, 백신 접종 부위 내성 평가, 혈액학적 분석). 면역화의 효능은 백신 접종된 대상체의 혈청에서 바이러스 중화 역가 (VNT)를 측정하여 분석한다. 혈액 샘플은 기준선으로 0 일에 그리고 백신 접종을 완료한 후 수집된다. 혈청은 바이러스 중화 항체에 대해 분석된다.

Claims (68)

  1. a) 적어도 하나의 이종 5' 비번역 영역 (5'-UTR) 및/또는 적어도 하나의 이종 3' 비번역 영역 (3'-UTR); 및
    b) RSV 융합 (F) 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 상기 3'-UTR 및/또는 5'-UTR에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 인공 RNA.
  2. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종 3'-UTR은 PSMB3, ALB7, 알파-글로빈, CASP1, COX6B1, GNAS, NDUFA1 및 RPS9로부터 선택된 유전자, 또는 이들 유전자 중 어느 하나의 상동체, 단편 또는 변이체로부터 선택된 유전자의 3'-UTR로부터 유래된 핵산 서열을 포함하는, 인공 RNA.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종 5'-UTR은 HSD17B4, RPL32, ASAH1, ATP5A1, MP68, NDUFA4, NOSIP, RPL31, SLC7A3, TUBB4B 및 UBQLN2로부터 선택된 유전자, 또는 이들 유전자 중 어느 하나의 상동체, 단편 또는 변이체로부터 선택된 유전자의 5'-UTR로부터 유래된 핵산 서열을 포함하는, 인공 RNA.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    a-1. HSD17B4 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 PSMB3 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    a-2. NDUFA4 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 PSMB3 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    a-3. SLC7A3 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 PSMB3 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    a-4. NOSIP 유전자의 5'-UTR로부터, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체로부터 적어도 하나의 5'-UTR 및 PSMB3 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    a-5. MP68 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 PSMB3 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    b-1. UBQLN2 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 RPS9 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    b-2. ASAH1 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 RPS9 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    b-3. HSD17B4 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 RPS9 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    b-4. HSD17B4 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 CASP1 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    b-5. NOSIP 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 COX6B1 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    c-1. NDUFA4 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 RPS9 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    c-2. NOSIP 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 NDUFA1 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    c-3. NDUFA4 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 COX6B1 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    c-4. NDUFA4 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 NDUFA1 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    c-5. ATP5A1 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 PSMB3 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    d-1. RPL31 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 PSMB3 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    d-2. ATP5A1 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 CASP1 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    d-3. SLC7A3 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 GNAS 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    d-4. HSD17B4 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 NDUFA1 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    d-5. SLC7A3 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 NDUFA1 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    e-1. TUBB4B 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 RPS9 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    e-2. RPL31 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 RPS9 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    e-3. MP68 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 RPS9 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    e-4. NOSIP 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 RPS9 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    e-5. ATP5A1 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 RPS9 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    e-6. ATP5A1 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 COX6B1 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    f-1. ATP5A1 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 GNAS 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    f-2. ATP5A1 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 NDUFA1 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    f-3. HSD17B4 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 COX6B1 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    f-4. HSD17B4 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 GNAS 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    f-5. MP68 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 COX6B1 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    g-1. MP68 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 NDUFA1 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    g-2. NDUFA4 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 CASP1 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    g-3. NDUFA4 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 GNAS 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    g-4. NOSIP 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 CASP1 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    g-5. RPL31 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 CASP1 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    h-1. RPL31 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 COX6B1 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    h-2. RPL31 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 GNAS 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    h-3. RPL31 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 NDUFA1 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    h-4. SLC7A3 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 CASP1 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    h-5. SLC7A3 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 COX6B1 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR; 또는
    i-1. SLC7A3 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 RPS9 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR.
    i-2. RPL32 유전자의 5'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 5'-UTR 및 ALB7 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR.
    i-3. 알파-글로빈 유전자 유전자의 3'-UTR에서 유래된, 또는 이의 상응하는 RNA 서열, 상동체, 단편 또는 변이체에서 유래된 적어도 하나의 3'-UTR을 포함하는, 인공 RNA.
  5. 제4항에 있어서, a-1 (HSD17B4/PSMB3), a-4 (NDUFA4/PSMB3), c-1 (NDUFA4/RPS9), e-4 (NOSIP/RPS9), g-2 (NDUFA4/CASP1), i-2 (RPL32/ALB7), 또는 i-3 (알파-글로빈), 바람직하게는 a-1 (HSD17B4/PSMB3)에 따른 UTR 요소를 포함하는 인공 RNA.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서
    - 상기 HSD17B4 유전자로부터 유래된 5'-UTR은 서열 번호: 1 또는 2 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 ASAH1 유전자로부터 유래된 5'-UTR은 서열 번호: 3 또는 4 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 ATP5A1 유전자로부터 유래된 5'-UTR은 서열 번호: 5 또는 6 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 MP68 유전자로부터 유래된 5'-UTR은 서열 번호: 7 또는 8 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 NDUFA4 유전자로부터 유래된 5'-UTR은 서열 번호: 9 또는 10 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 NOSIP 유전자로부터 유래된 5'-UTR은 서열 번호: 11 또는 12 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 RPL31 유전자로부터 유래된 5'-UTR은 서열 번호: 13 또는 14 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 RPL32 유전자로부터 유래된 5'-UTR은 서열 번호: 21 또는 22 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 SLC7A3 유전자로부터 유래된 5'-UTR은 서열 번호: 15 또는 16 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 TUBB4B 유전자로부터 유래된 5'-UTR은 서열 번호: 17 또는 18 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 UBQLN2 유전자로부터 유래된 5'-UTR은 서열 번호: 19 또는 20 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 PSMB3 유전자로부터 유래된 3'-UTR은 서열 번호: 23 또는 24 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 CASP1 유전자로부터 유래된 3'-UTR은 서열 번호: 25 또는 26 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 COX6B1 유전자로부터 유래된 3'-UTR은 서열 번호: 27 또는 28 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 GNAS 유전자로부터 유래된 3'-UTR은 서열 번호: 29 또는 30 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 NDUFA1 유전자로부터 유래된 3'-UTR은 서열 번호: 31 또는 32 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 RPS9 유전자로부터 유래된 3'-UTR은 서열 번호: 33 또는 34 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 ALB7 유전자로부터 유래된 3'-UTR은 서열 번호: 35 또는 36 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 알파-글로빈 유전자로부터 유래된 3'-UTR은 서열 번호: 37 또는 38 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 인공 RNA.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 RSV F 단백질로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질은 전장 F 단백질 (F0) 또는 결실된 C-말단을 갖는 F 단백질 (F-del) 또는 이의 단편 또는 변이체인, 인공 RNA.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RSV F 단백질은 전 융합 형태에서 항원을 안정화시키도록 설계된, 인공 RNA.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RSV F 단백질은 DSCav1 돌연변이 (S155C, S290C, S190F, 및 V207L), 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는, 인공 RNA.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RSV F 단백질은 단일 폴리펩티드 사슬에 2개의 서브유닛 F2 및 F1을 포함하고, 여기서 F2 및 F1은 링커 요소, 바람직하게는 GS 링커를 통해 연결되어 안정한 F2-링커-F1 단백질을 생성하며, 여기서 상기 F2-링커-F1 단백질은 바람직하게는 아미노산 104-아미노산 144가 결여된, 인공 RNA.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RSV F 단백질은 (S46G, A149C, S215P, Y458C, K465Q), (S46G, E92D, A149C, S215P, Y458C, K465Q), (S46G, N67I, E92D, A149C, S215P, Y458C, K465Q), (A149C, Y458C), (N183GC, N428C), (Q98C, Q361C, S46G, E92D, L95M, S215P, I217P, I221M, R429K, K465Q), (Q98C, Q361C, L95M, I221M, R429K), 또는 (N183GC, N428C, S46G, N67I, E92D, S215P, K465Q)로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 돌연변이 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는, 인공 RNA.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RSV F 단백질은 F0, F-del, F0_DSCav1, F_DSCav1_mut0, F_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F_DSCav1_mut3, F_DSCav1_mut4, F_DSCav1_mut5, F_DSCav1_mut6, F_DSCav1_mut7, F_DSCav1_mut8, F-del_DSCav1, F-del_DSCav1_mut0, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut4, F-del_DSCav1_mut5, F-del_DSCav1_mut6, F-del_DSCav1_mut7, F-del_DSCav1_mut8 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 선택되는, 인공 RNA.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 코딩 서열은 서열 번호: 68, 483, 898, 1267, 1636, 2005, 2374, 2743, 3112, 3481, 3850, 4219, 4588, 4957, 5326, 5695, 6064, 6433, 6802, 7171, 7540, 7909, 8279-9683, 11726, 12095, 12464, 12833, 13940, 14309, 14678, 15047, 15416, 15785, 13202, 13571, 16154, 16523, 16892, 17261, 17630, 17999, 18368, 18737, 19106, 19475 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체 중 어느 하나와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열을 암호화하는, 인공 RNA.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 코딩 서열은 서열 번호: 69-77, 484-492, 899-906, 1268-1275, 1637-1644, 2006-2013, 2375-2382, 2744-2751, 3113-3120, 3482-3489, 3851-3858, 4220-4227, 4589-4596, 4958-4965, 5327-5334, 5696-5703, 6065-6072, 6434-6441, 6803-6810, 7172-7179, 7541-7548, 7910-7917, 11727-11734, 12096-12103, 12465-12472, 12834-12841, 13941-13948, 14310-14317, 14679-14686, 15048-15055, 15417-15424, 15786-15793, 13203-13210, 13572-13579, 16155-16162, 16524-16531, 16893-16900, 17262-17269, 17631-17638, 18000-18007, 18369-18376, 18738-18745, 19107-19114, 19476-19483, 21363-21384, 21389-21410 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는, 인공 RNA.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 코딩 서열은 코돈 변형 코딩 서열이고, 여기서 상기 적어도 하나의 코돈 변형 코딩 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열은 바람직하게는 상응하는 야생형 코딩 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열에 비해 변형되지 않는, 인공 RNA.
  16. 제15항에 있어서, 상기 적어도 하나의 코돈 변형 코딩 서열은 C 최대화된 코딩 서열, CAI 최대화된 코딩 서열, 인간 코돈 사용 적합 코딩 서열, G/C 함량 변형된 코딩 서열, 및 G/C 최적화된 코딩 서열, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된, 인공 RNA.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 적어도 하나의 코딩 서열은 서열 번호: 70-77, 485-492, 899-906, 1268-1275, 1637-1644, 2006-2013, 2375-2382, 2744-2751, 3113-3120, 3482-3489, 3851-3858, 4220-4227, 4589-4596, 4958-4965, 5327-5334, 5696-5703, 6065-6072, 6434-6441, 6803-6810, 7172-7179, 7541-7548, 7910-7917, 11728-11734, 12097-12103, 12465-12472, 12834-12841, 13941-13948, 14310-14317, 14679-14686, 15048-15055, 15417-15424, 15786-15793, 13203-13210, 13572-13579, 16155-16162, 16524-16531, 16893-16900, 17262-17269, 17631-17638, 18000-18007, 18369-18376, 18738-18745, 19107-19114, 19476-19483, 21363-21384, 21389-21410 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체 중 어느 하나와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 코돈 변형 코딩 서열을 포함하는, 인공 RNA.
  18. 제15항 내지 제17항에 있어서, 상기 적어도 하나의 코딩 서열은 서열 번호: 70-71, 75-77, 485-486, 490-492, 899-900, 904-906, 1268-1269, 1273-1275, 1637-1638, 1642-1644, 2006-2007, 2011-2013, 2375-2376, 2380-2382, 2744-2745, 2749-2751, 3113-3114, 3118-3120, 3482-3483, 3487-3489, 3852, 4221, 4590, 4959, 5328, 5697, 6066, 6435, 6804, 7173, 7542, 7911, 3856-3858, 4225-4227, 4594-4596, 4963-4965, 5332-5334, 5701-5703, 6070-6072, 6439-6441, 6808-6810, 7177-7179, 7546-7548, 7915-7917, 11728, 11732-11734, 12097, 12101-12103, 12465, 12466, 12470-12472, 12834, 12835, 12839-12841, 13941, 13942, 13946-13948, 14310, 14311, 14315-14317, 14679, 14680, 14684-14686, 15048, 15049, 15053-15055, 15417, 15418, 15422-15424, 15786, 15787, 15791-15793, 13203, 13204, 13208-13210, 13572, 13573, 13577-13579, 16155, 16156, 16160-16162, 16524, 16525, 16529-16531, 16893, 16894, 16898-16900, 17262, 17263, 17267-17269, 17631, 17632, 17636-17638, 18000, 18001, 18005-18007, 18369, 18370, 18374-18376, 18738, 18739, 18743-18745,19107, 19108, 19112-19114, 19476, 19477, 19481-19483, 21363-21384, 21389-21410 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체 중 어느 하나와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 코돈 변형 코딩 서열을 포함하는, 인공 RNA.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA가 mRNA, 자가 복제 RNA, 원형 RNA, 또는 레플리콘 RNA인, 인공 RNA.
  20. 제19항에 있어서, 상기 RNA는 mRNA인, 인공 RNA.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA는 5'-캡 구조, 바람직하게는 m7G, 캡0, 캡1, 캡2, 변형된 캡0 또는 변형된 캡1 구조를 포함하는, 인공 RNA.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA는 적어도 하나의 폴리(A) 서열, 바람직하게는 30 내지 150개의 아데노신 뉴클레오티드를 포함하는, 더욱 바람직하게는 100개의 아데노신 뉴클레오티드를 포함하는 폴리(A) 서열 및/또는 적어도 하나의 폴리(C) 서열, 바람직하게는 10 내지 40개의 시토신 뉴클레오티드를 포함하는 폴리(C) 서열을 포함하는, 인공 RNA.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA는 적어도 하나의 히스톤 스템-루프를 포함하고, 여기서 상기 히스톤 스템-루프는 바람직하게는 서열 번호: 39 또는 40에 따른 핵산 서열 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는, 인공 RNA.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 다음 요소, 바람직하게는 5'- 에서 3'-방향으로 다음 요소를 포함하는 인공 RNA:
    a) 5'-캡 구조, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 5'-캡 구조;
    b) 선택적으로, 본 명세서에 명시된, 바람직하게는 서열 번호: 1-22로부터 선택된 적어도 하나인 5'-UTR;
    c) 리보솜 결합 부위, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 리보솜 결합 부위
    d) 본 명세서에 명시된, 바람직하게는 표 3 및 표 4에 명시된 적어도 하나의 코딩 서열;
    d) 본 명세서에 명시된, 바람직하게는 서열 번호: 23-38로부터 선택된 적어도 하나인 3'-UTR;
    e) 선택적으로, 폴리(A) 서열, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 폴리(A) 서열;
    f) 선택적으로, 폴리(C) 서열, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 폴리(C) 서열;
    g) 선택적으로, 히스톤 스템-루프, 바람직하게는 본 명세서에 명시된 히스톤 스템-루프;
    h) 선택적으로, 본 명세서에 명시된 3'-말단 서열 요소, 바람직하게는 서열 번호: 44-63, 또는 21322-21328에 따른 3'-말단 서열 요소; 및
    여기서 선택적으로 적어도 하나 또는 하나 이상, 바람직하게는 여기서 모든 우라실 뉴클레오티드가 슈도우리딘 (ψ) 뉴클레오티드 또는 N1-메틸슈도우리딘 (m1ψ) 뉴클레오티드로 대체됨.
  25. 제1항 내지 제24항에 있어서, 다음 요소, 바람직하게는 5'- 에서 3'- 방향으로 다음 요소를 포함하는 인공 RNA:
    a) 5'-캡 구조, 바람직하게는 청구항 21에 정의된, 가장 바람직하게는 캡1 구조;
    b) a-1, a-4, c-1, e-4, g-2, i-2, 또는 i-3에 따른 5'-UTR 및/또는 3'-UTR;
    c) 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 정의된 또는 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 정의된 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열 또는;
    d) 선택적으로, 폴리(A) 서열, 바람직하게는 제22항에 정의된 폴리(A) 서열;
    e) 선택적으로, 폴리(C) 서열, 바람직하게는 제22항에 정의된 폴리(C) 서열;
    f) 선택적으로, 히스톤 스템-루프, 바람직하게는 제23항 중 어느 한 항에 정의된 히스톤 스템-루프;
    g) 선택적으로, 서열 번호: 44-63, 21322-21328에 따른 3'-말단 서열 및
    여기서 선택적으로 적어도 하나 또는 하나 이상, 바람직하게는 여기서 모든 우라실 뉴클레오티드가 슈도우리딘 (ψ) 뉴클레오티드 또는 N1-메틸슈도우리딘 (m1ψ) 뉴클레오티드로 대체됨.
  26. 제1항 내지 제25항에 있어서, 다음 요소를 5'- 에서 3'- 방향으로 포함하는, 인공 RNA:
    a) 5'-캡 구조, 바람직하게는 청구항 21에 정의된 5'-캡 구조, 가장 바람직하게는 캡1 구조;
    b) a-1, a-4, c-1, e-4, g-2, i-2, 또는 i-3, 바람직하게는 a-1에 따른 5'-UTR 및/또는 3'-UTR;
    c) 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 정의된 또는 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 정의된 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열, 여기서 상기 코딩 서열은 상기 5'-UTR 및 상기 3'-UTR 사이, 바람직하게는 상기 5'-UTR의 하류 및 상기 3'-UTR의 상류 사이에 위치하며;
    d) 히스톤 스템-루프, 바람직하게는 제23항 중 어느 한 항에 정의된 히스톤 스템-루프
    e) 폴리(A) 서열, 바람직하게는 제22항에 정의된 폴리(A) 서열
    f) 서열 번호: 21322-21328에 따른 3'-말단 서열
    여기서 선택적으로 적어도 하나 또는 하나 이상, 바람직하게는 여기서 모든 우라실 뉴클레오티드가 슈도우리딘 (ψ) 뉴클레오티드 또는 N1-메틸슈도우리딘 (m1ψ) 뉴클레오티드로 대체됨.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인공 RNA는 서열 번호: 78-482, 493-897, 907-1266, 1276-1635, 1645-2004, 2014-2373, 2383-2742, 2752-3111, 3121-3480, 3490-3849, 3859-4218, 4228-4587, 4597-4956, 4966-5325, 5335-5694, 5704-6063, 6073-6432, 6442-6801, 6811-7170, 7180-7539, 7549-7908, 7918-8277, 8278, 11735-12094, 12104-12463, 12473-12832, 12842-13201, 13949-14308, 14318-14677, 14687-15046, 15056-15415, 15425-15784, 15794-16153, 13211-13570, 13580-13939, 16163-16522, 16532-16891, 16901-17260, 17270-17629, 17639-17998, 18008-18367, 18377-18736, 18746-19105, 19115-19474, 19484-19843, 21415-21480, 21561-21626, 21489-21552, 21635-21698 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 인공 RNA.
  28. 제27항에 있어서, 여기서
    - 상기 인공 RNA는 서열 번호: 78-482, 11735-12094, 21415-21417, 21561-21563, 21489, 21490, 21635, 21636 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 인공 RNA는 서열 번호: 493-897, 12104-12463, 21418-21420, 21564-21566, 21491, 21492, 21637, 21638 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 인공 RNA는 서열 번호: 907-1266, 12473-12832, 21421-21423, 21567-21569, 21493-21495, 21639-21641 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 인공 RNA는 서열 번호: 1276-1635, 8278, 12842-13201, 21424-21426, 21570-21572, 21496-21498, 21642-21644 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 인공 RNA는 서열 번호: 1645-2004, 13949-14308, 21433-21435, 21579-21581, 21505-21507, 21651-21653 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 인공 RNA는 서열 번호: 2014-2373, 14318-14677, 21436-21438, 21582-21584, 21508-21510, 21654-21656 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 인공 RNA는 서열 번호: 2383-2742, 14687-15046, 21439-21441, 21585-21587, 21511-21513, 21657-21659 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 인공 RNA는 서열 번호: 2752-3111, 15056-15415, 21442-21444, 21588-21590, 21514-21516, 21660-21662 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 인공 RNA는 서열 번호: 3121-3480, 15425-15784, 21445-21447, 21591-21593, 21517-21519, 21663-21665 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 인공 RNA는 서열 번호: 3490-3849, 15794-16153, 1448-21450, 21594-21596, 21520-21522, 21666-21668 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 인공 RNA는 서열 번호: 3859-4218, 13211-13570, 21427-21429, 21573-21575, 21499-21501, 21645-21647 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 인공 RNA는 서열 번호: 4228-4587, 13580-13939, 21430-21432, 21576-21578, 21502-21504, 21648-21650 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 인공 RNA는 서열 번호: 4597-4956, 16163-16522, 21451-21453, 21597-21599, 21523-21525, 21669-21671 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 인공 RNA는 서열 번호: 4966-5325, 16532-16891, 21454-21456, 21600-21602, 21526-21528, 21672-21674 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 인공 RNA는 서열 번호: 5335-5694, 16901-17260, 21457-21459, 21603-21605, 21529-21531, 21675-21677 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 인공 RNA는 서열 번호: 5704-6063, 17270-17629, 21460-21462, 21606-21608, 21532-21534, 21678-21680 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 인공 RNA는 서열 번호: 6073-6432, 17639-17998, 21463-21465, 21609-21611, 21535-21537, 21681-21683 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 인공 RNA는 서열 번호: 6442-6801, 18008-18367, 21466-21468, 21612-21614, 21538-21540, 21684-21686 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 인공 RNA는 서열 번호: 6811-7170, 18377-18736, 21469-21471, 21615-21617, 21541-21543, 21687-21689 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 인공 RNA는 서열 번호: 7180-7539, 18746-19105, 21472-21474, 21618-21620, 21544-21546, 21690-21692 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 인공 RNA는 서열 번호: 7549-7908, 19115-19474, 21475-21477, 21621-21623, 21547-21549, 21693-21695 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    - 상기 인공 RNA는 서열 번호: 7918-8277, 19484-19843, 21478-21480, 21624-21626, 21550-21552, 21696-21698 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 인공 RNA.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 정의된 적어도 하나의 인공 RNA를 포함하는 조성물이며, 여기서 상기 조성물은 선택적으로 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 매트릭스 단백질 M, 핵단백질 N, M2-1 단백질, 및/또는 인단백질 P 또는 이들의 조합, 바람직하게는 M2-1으로부터 선택된 RSV로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 인공 RNA를 포함하는, 조성물.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 매트릭스 단백질 M, 핵단백질 N, M2-1 및 인단백질 P로부터 선택된 RSV로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 각각 포함하는 2개의 추가 인공 RNA 종을 포함하는, 조성물.
  32. 제29항 또는 제30항에 있어서, 매트릭스 단백질 M, 핵단백질 N, M2-1 및 인단백질 P로부터 선택된 RSV로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 각각 포함하는 3개의 추가 인공 RNA 종을 포함하는, 조성물.
  33. 제30항 내지 제32항에 있어서, 상기 추가 인공 RNA의 코딩 서열은 서열 번호: 9684, 10053-10133, 10134, 10503-10636, 10637, 11006-11182, 11183, 11552-11725, 19844, 20213, 20582, 20951 중 어느 하나와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 아미노산 서열 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체를 암호화하는, 조성물.
  34. 제30항 내지 제33항에 있어서, 상기 코딩 서열은 a-1, a-2, a-3, a-4, a-5, b-1, b-2, b-3, b-4, b-5, c-1, c-2, c-3, c-4, c-5, d-1, d-2, d-3, d-4, d-5, e-1, e-2, e-3, e-4, e-5, e-6, f-1, f-2, f-3, f-4, f-5, g-1, g-2, g-3, g-4, g-5, h-1, h-2, h-3, h-4, h-5, i-1, i-2, 또는 i-3로부터 선택된 3'-UTR 및 5'-UTR에 작동 가능하게 연결된, 조성물.
  35. 제30항 내지 제34항에 있어서, 상기 코딩 서열은 서열 번호: 9685-9692, 10135-10142, 10638-10645, 11184-11191, 19845-19852, 20214-20221, 20583-20590, 20952-20959, 21385-21388, 21411-21414 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는, 조성물.
  36. 제30항 내지 제35항에 있어서, 상기 추가 인공 RNA는 서열 번호: 9693-10052, 10143-10502, 10646-11005, 11192-11551, 19853-20212, 20222-20581, 20591-20950, 20960-21319, 21481-21634, 21553-21706 또는 임의의 이들 서열의 단편 또는 변이체로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 RNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 조성물.
  37. 제29항 내지 제36항에 있어서,
    - 서열 번호: 78-482, 493-897, 907-1266, 1276-1635, 1645-2004, 2014-2373, 2383-2742, 2752-3111, 3121-3480, 3490-3849, 3859-4218, 4228-4587, 4597-4956, 4966-5325, 5335-5694, 5704-6063, 6073-6432, 6442-6801, 6811-7170, 7180-7539, 7549-7908, 7918-8277, 8278, 11735-12094, 12104-12463, 12473-12832, 12842-13201, 13949-14308, 14318-14677, 14687-15046, 15056-15415, 15425-15784, 15794-16153, 13211-13570, 13580-13939, 16163-16522, 16532-16891, 16901-17260, 17270-17629, 17639-17998, 18008-18367, 18377-18736, 18746-19105, 19115-19474, 19484-19843, 21415-21480, 21561-21626, 21489-21552, 21635-21698으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 인공 RNA 및 서열 번호: 9693-10052, 19853-20212, 21481, 21482, 21627, 21628, 21553, 21554, 21699, 21700로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 추가 인공 RNA; 또는
    - 서열 번호: 78-482, 493-897, 907-1266, 1276-1635, 1645-2004, 2014-2373, 2383-2742, 2752-3111, 3121-3480, 3490-3849, 3859-4218, 4228-4587, 4597-4956, 4966-5325, 5335-5694, 5704-6063, 6073-6432, 6442-6801, 6811-7170, 7180-7539, 7549-7908, 7918-8277, 8278, 11735-12094, 12104-12463, 12473-12832, 12842-13201, 13949-14308, 14318-14677, 14687-15046, 15056-15415, 15425-15784, 15794-16153, 13211-13570, 13580-13939, 16163-16522, 16532-16891, 16901-17260, 17270-17629, 17639-17998, 18008-18367, 18377-18736, 18746-19105, 19115-19474, 19484-19843, 21415-21480, 21561-21626, 21489-21552, 21635-21698으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 인공 RNA 및 서열 번호: 10143-10502, 20222-20581, 21483, 21484, 21629, 21630, 21555, 21556, 21701, 21702로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 추가 인공 RNA; 또는
    - 서열 번호: 78-482, 493-897, 907-1266, 1276-1635, 1645-2004, 2014-2373, 2383-2742, 2752-3111, 3121-3480, 3490-3849, 3859-4218, 4228-4587, 4597-4956, 4966-5325, 5335-5694, 5704-6063, 6073-6432, 6442-6801, 6811-7170, 7180-7539, 7549-7908, 7918-8277, 8278, 11735-12094, 12104-12463, 12473-12832, 12842-13201, 13949-14308, 14318-14677, 14687-15046, 15056-15415, 15425-15784, 15794-16153, 13211-13570, 13580-13939, 16163-16522, 16532-16891, 16901-17260, 17270-17629, 17639-17998, 18008-18367, 18377-18736, 18746-19105, 19115-19474, 19484-19843, 21415-21480, 21561-21626, 21489-21552, 21635-21698으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 인공 RNA 및 서열 번호: 10646-11005, 20591-20950, 21485, 21486, 21631, 21632, 21557, 21558, 21703, 21704로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 추가 인공 RNA; 또는
    - 서열 번호: 78-482, 493-897, 907-1266, 1276-1635, 1645-2004, 2014-2373, 2383-2742, 2752-3111, 3121-3480, 3490-3849, 3859-4218, 4228-4587, 4597-4956, 4966-5325, 5335-5694, 5704-6063, 6073-6432, 6442-6801, 6811-7170, 7180-7539, 7549-7908, 7918-8277, 8278, 11735-12094, 12104-12463, 12473-12832, 12842-13201, 13949-14308, 14318-14677, 14687-15046, 15056-15415, 15425-15784, 15794-16153, 13211-13570, 13580-13939, 16163-16522, 16532-16891, 16901-17260, 17270-17629, 17639-17998, 18008-18367, 18377-18736, 18746-19105, 19115-19474, 19484-19843, 21415-21480, 21561-21626, 21489-21552, 21635-21698으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 인공 RNA 및 서열 번호: 11192-11551, 20960-21319; 21487, 21488, 21633, 21634, 21559, 21560, 21705, 21706로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 추가 인공 RNA 또는
    - 서열 번호: 78-482, 493-897, 907-1266, 1276-1635, 1645-2004, 2014-2373, 2383-2742, 2752-3111, 3121-3480, 3490-3849, 3859-4218, 4228-4587, 4597-4956, 4966-5325, 5335-5694, 5704-6063, 6073-6432, 6442-6801, 6811-7170, 7180-7539, 7549-7908, 7918-8277, 8278, 11735-12094, 12104-12463, 12473-12832, 12842-13201, 13949-14308, 14318-14677, 14687-15046, 15056-15415, 15425-15784, 15794-16153, 13211-13570, 13580-13939, 16163-16522, 16532-16891, 16901-17260, 17270-17629, 17639-17998, 18008-18367, 18377-18736, 18746-19105, 19115-19474, 19484-19843, 21415-21480, 21561-21626, 21489-21552, 21635-21698으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 인공 RNA 및
    서열 번호: 9693-10052, 19853-20212, 21481, 21482, 21627, 21628, 21553, 21554, 21699, 21700로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 추가 인공 RNA 및 서열 번호: 10646-11005, 20591-20950, 21485, 21486, 21631, 21632, 21557, 21558, 21703, 21704로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 추가 인공 RNA; 또는
    - 서열 번호: 78-482, 493-897, 907-1266, 1276-1635, 1645-2004, 2014-2373, 2383-2742, 2752-3111, 3121-3480, 3490-3849, 3859-4218, 4228-4587, 4597-4956, 4966-5325, 5335-5694, 5704-6063, 6073-6432, 6442-6801, 6811-7170, 7180-7539, 7549-7908, 7918-8277, 8278, 11735-12094, 12104-12463, 12473-12832, 12842-13201, 13949-14308, 14318-14677, 14687-15046, 15056-15415, 15425-15784, 15794-16153, 13211-13570, 13580-13939, 16163-16522, 16532-16891, 16901-17260, 17270-17629, 17639-17998, 18008-18367, 18377-18736, 18746-19105, 19115-19474, 19484-19843, 21415-21480, 21561-21626, 21489-21552, 21635-21698으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 인공 RNA 및 서열 번호: 9693-10052, 19853-20212, 21481, 21482, 21627, 21628, 21553, 21554, 21699, 21700로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 추가 인공 RNA 및 서열 번호: 10646-11005, 20591-20950, 21485, 21486, 21631, 21632, 21557, 21558, 21703, 21704로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 추가 인공 RNA 및 서열 번호: 10143-10502, 20222-20581, 21483, 21484, 21629, 21630, 21555, 21556, 21701, 21702로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 추가 인공 RNA를 포함하는, 조성물.
  38. 제29항 내지 제37항에 있어서, 상기 적어도 하나의 인공 RNA 및, 선택적으로, 상기 추가 인공 RNA는 하나 이상의 양이온성 또는 다가양이온성 화합물, 바람직하게는 양이온성 또는 다가양이온성 중합체, 양이온성 또는 다가양이온성 다당류, 양이온성 또는 다가양이온성 지질, 양이온성 또는 다가양이온성 단백질, 양이온성 또는 다가양이온성 펩티드, 또는 이들의 임의의 조합과 복합체화되거나 결합되거나 또는 적어도 부분적으로 복합체화되거나 부분적으로 결합되는, 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 상기 인공 RNA 및, 선택적으로, 상기 추가 인공 RNA는 하나 또는 그 이상의 지질과 복합체화되거나 결합되어, 리포솜, 지질 나노입자, 리포플렉스 및/또는 나노리포솜을 형성하는, 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 상기 인공 RNA 및, 선택적으로, 상기 추가 인공 RNA는 하나 또는 그 이상의 지질과 복합체화되어 지질 나노입자 (LNP)를 형성하는, 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 상기 LNP는 화학식 III의 양이온성 지질 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 토토머(tautomer), 프로드러그(prodrug) 또는 입체 이성질체(stereoisomer)를 포함하며,
    Figure pct00055
    (III)
    여기서:
    L1 또는 L2는 각각 독립적으로 -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)x-, -S-S-, -C(=O)S-, -SC(=O)-, -NRaC(=O)-, -C(=O)NRa-, -NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)NRa- 또는 -NRaC(=O)O-이고, 바람직하게는 L1 또는 L2는 -O(C=O)- 또는 -(C=O)O-이고;
    G1 및 G2는 각각 독립적으로 비치환된 C1-C12 알킬렌 또는 C1-C12 알케닐렌이고;
    G3 는 C1-C24 알킬렌, C1-C24 알케닐렌, C3-C8 사이클로알킬렌, 또는 C3-C8 사이클로알케닐렌이고;
    Ra는 H 또는 C1-C12 알킬이고;
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 C6-C24 알킬 또는 C6-C24 알케닐이고;
    R3 는 H, OR5, CN, -C(=O)OR4, -OC(=O)R4 또는 -NR5C(=O)R4이고;
    R4 는 C1-C12 알킬이고;
    R5는 H 또는 C1-C6 알킬이고; 및
    x는 0, 1 또는 2인, 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 화학식 III의 화합물이며, 여기서:
    L1 및 L2는 각각 독립적으로 -O(C=O)- 또는 (C=O)-O-이고;
    G3 는 C1-C24 알킬렌 또는 C1-C24 알케닐렌이고; 및
    R3 는 H 또는 OR5인, 조성물.
  43. 제41항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 화학식 III의 화합물이며, 여기서:
    L1 및 L2는 각각 독립적으로 -O(C=O)- 또는 (C=O)-O-이고; 및
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 다음 구조 중 하나를 갖는,
    Figure pct00056

    조성물.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 화학식 III의 화합물이고, 여기서 R3는 OH인, 조성물.
  45. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 구조 III-1 내지 III-36로부터 선택된, 조성물
    Figure pct00057

    Figure pct00058

    Figure pct00059

    Figure pct00060

    Figure pct00061
    .
  46. 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온성 지질은
    Figure pct00062
    (III-3)인, 조성물.
  47. 제40항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP는 화학식 (IV)의 PEG 지질을 포함하며,
    Figure pct00063

    여기서 R8 및 R9는 각각 독립적으로 10 내지 30개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이고, 여기서 상기 알킬 사슬은 선택적으로 하나 이상의 에스테르 결합에 의해 끊어지고;
    그리고 w는 30 내지 60 범위의 평균값을 갖는, 조성물.
  48. 제47항에 있어서, 상기 PEG 지질에서 R8 및 R9는 포화 알킬 사슬인, 조성물.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 상기 PEG 지질은
    Figure pct00064
    이고,
    여기서 n은 30 내지 60 범위의 평균값을 가지며, 바람직하게는 여기서 n은 약 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54의 평균값을 가지며, 가장 바람직하게는 여기서 n은 49의 평균값을 갖는 것인, 조성물.
  50. 제40항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP는 하나 또는 그 이상의 중성 지질 및/또는 스테로이드 또는 스테로이드 유사체를 포함하는, 조성물.
  51. 제50항에 있어서, 상기 중성 지질은 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린 (DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤 (DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤 (DPPG), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린 (POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민 (POPE) 및 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1카르복실레이트 (DOPE-mal), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민 (DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민 (DMPE), 디스테아로일-포스파티딜에탄올아민 (DSPE), 16-O-모노메틸 PE, 16-O-디메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, 1-스테아리오일-2-올레오일포스파티디에탄올 아민 (SOPE), 및 1,2-디엘라이도일-sn-글리세로-3-포포에탄올아민 (transDOPE)을 포함하는 군에서 선택된, 조성물.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 상기 중성 지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC)이며, 여기서 양이온성 지질 대 DSPC의 몰비는 선택적으로 약 2:1 내지 8:1 범위인, 조성물.
  53. 제50항에 있어서, 상기 스테로이드는 콜레스테롤이며, 여기서 양이온성 지질 대 콜레스테롤의 몰비는 선택적으로 약 2:1 내지 1:1 범위인, 조성물.
  54. 제40항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP는
    (i) 적어도 하나의 양이온성 지질, 바람직하게는 제41항 내지 제46항 중 어느 한 항에 정의된 적어도 하나의 양이온성 지질;
    (ii) 중성 지질, 바람직하게는 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 정의된 중성 지질;
    (iii) 스테로이드 또는 스테로이드 유사체, 바람직하게는 제53항에 정의된 스테로이드 또는 스테로이드 유사체; 및
    (iv) PEG-지질, 예를 들어 PEG-DMG 또는 PEG-cDMA, 바람직하게는 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 정의된 PEG-지질로 필수적으로 이루어지며,
    여기서 (i) 내지 (iv)는 약 20-60% 양이온성 지질, 5-25% 중성 지질, 25-55% 스테롤 및 0.5-15% PEG-지질의 몰비인, 조성물.
  55. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 인공 RNA로 암호화되는 폴리펩티드로,
    바람직하게는 서열 번호: 1267, 2005, 2743, 3481, 4219, 4957, 5695, 6433, 7171, 7909, 12833, 14309, 15047, 15785, 13571, 16523, 17261, 17999, 18737, 19475 또는 임의의 이들 폴리펩티드의 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는, 폴리펩티드.
  56. 제55항에 정의된 폴리펩티드를 포함하는 조성물이며, 여기서 상기 조성물은 선택적으로 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 정의된 적어도 하나의 인공 RNA, 또는 제29항 내지 제54항 중 어느 한 항에 정의된 조성물을 포함하는, 조성물.
  57. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 정의된 인공 RNA, 제29항 내지 제54항 중 어느 한 항에 정의된 조성물, 제55항에 정의된 폴리펩티드, 또는 제56항에 정의된 조성물을 포함하는, 백신.
  58. 제49항에 있어서, 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 정의된 인공 RNA, 제29항 내지 제54항 중 어느 한 항에 정의된 조성물, 제55항에 정의된 폴리펩티드, 또는 제56항에 정의된 조성물이 적응 면역 반응을 유도하는, 백신.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 상기 백신은 약제학상 허용되는 담체 및 선택적으로 적어도 하나의 보조제(adjuvant)를 추가로 포함하는, 백신.
  60. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 정의된 인공 RNA, 제29항 내지 제54항 중 어느 한 항에 정의된 조성물, 제55항에 정의된 폴리펩티드, 제56항에 정의된 조성물, 및/또는 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 정의된 백신, 선택적으로 용해를 위한 액체 비히클, 및 선택적으로 성분의 투여 및 투여량에 관한 정보를 제공하는 기술 지침서를 포함하는, 키트 또는 부품들로 이루어진 키트.
  61. 제60항에 있어서, 적어도 다음의
    a) RSV 융합 (F) 단백질로부터 유래된 적어도 하나의 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 제1항 내지 제28항 중 어느 하나에 정의된 적어도 하나의 인공 RNA, 여기서 상기 인공 RNA는 바람직하게는 하나 이상의 지질과 복합체화되어 지질 나노 입자 (LNP)를 형성하며; 및
    b) M, N, M2-1 또는 P에서 선택된 RSV에서 유래된 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 1, 2, 또는 3개의 추가 인공 RNA 종, 여기서 상기 추가 인공 RNA 종 각각은 바람직하게는 하나 이상의 지질과 복합체화되어 지질 나노입자 (LNP)를 형성하는; 성분을 포함하며,
    여기서 성분 a) 및 b)는 별도의 엔티티(entity) 또는 단일 엔티티로 제공되는, 키트 또는 부품들로 이루어진 키트.
  62. 제60항 또는 제61항에 있어서, 링거 락테이트 용액을 추가로 포함하는, 키트 또는 부품들로 이루어진 키트.
  63. 약제(medicament)로 사용하기 위한 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 정의된 인공 RNA, 제29항 내지 제54항 중 어느 한 항에 정의된 조성물, 제55항에 정의된 폴리펩티드, 제56항에 정의된 조성물, 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 정의된 백신, 또는 제60항 내지 제62항에 정의된 키트 또는 부품들로 이루어진 키트.
  64. 바이러스, 바람직하게는 RSV에 의한 감염 또는 그러한 감염과 관련된 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 정의된 인공 RNA, 제29항 내지 제54항 중 어느 한 항에 정의된 조성물, 제55항에 정의된 폴리펩티드, 제56항에 정의된 조성물, 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 정의된 백신, 또는 제60항 내지 제62항에 정의된 키트 또는 부품들로 이루어진 키트.
  65. 장애를 치료 또는 예방하는 방법이며, 상기 방법은 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 정의된 인공 RNA, 제29항 내지 제54항 중 어느 한 항에 정의된 조성물, 제55항에 정의된 폴리펩티드, 제56항에 정의된 조성물, 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 정의된 백신, 또는 제60항 내지 제62항에 정의된 키트 또는 부품들로 이루어진 키트를 이를 필요로 하는 대상체에게 적용 또는 투여하는 것을 포함하는, 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 장애는 RSV에 의한 감염 또는 이러한 감염과 관련된 장애인, 방법.
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서, 상기 필요로 하는 대상체는 포유동물 대상체인, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 포유동물 대상체는 인간 대상체, 바람직하게는 신생아, 임산부, 모유 수유 중인 여성, 노인 및/또는 면역 저하 인간 대상체인, 방법.
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