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KR20200111720A - 미생물 농도를 결정하기 위한 방법 - Google Patents

미생물 농도를 결정하기 위한 방법 Download PDF

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Publication number
KR20200111720A
KR20200111720A KR1020207023204A KR20207023204A KR20200111720A KR 20200111720 A KR20200111720 A KR 20200111720A KR 1020207023204 A KR1020207023204 A KR 1020207023204A KR 20207023204 A KR20207023204 A KR 20207023204A KR 20200111720 A KR20200111720 A KR 20200111720A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
microorganisms
concentration
suspension
sample
microbial
Prior art date
Application number
KR1020207023204A
Other languages
English (en)
Inventor
얀 그라베
마르쿠스 클린츠테트
Original Assignee
큐-리네아 에이비
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 큐-리네아 에이비 filed Critical 큐-리네아 에이비
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Abstract

본 발명은 미생물 및 포유동물 세포를 함유하는 시료로부터 온전한 미생물 현탁액을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 시료를 적어도 pH 6과 pH 9 미만의 pH를 갖는 완충 용액, 세정제 및 하나 이상의 프로테아제와 접촉시켜 포유동물 세포의 용균을 허용하는 단계; 미생물을 유지하기에 적합한 필터를 통해 혼합물을 여과하여 용균된 포유동물 세포를 제거하는 단계; 필터에 의해 유지되는 미생물을 액체에 재현탁하여 회수된 온전한 미생물을 포함하는 현탁액을 제공하는 단계; 및 i. 현탁액의 분취액을 가열하고/하거나 이를 알코올과 접촉시키는 단계; ii. 단계 (i) 이전, 동안 및/또는 이후에 현탁액의 하나 이상의 분취액을 선택적으로 희석하여 하나 이상의 희석된 분취액을 제공하는 단계; iii. 단계 (i) 또는 (ii)의 분취액의 적어도 일부를 DNA와 결합할 수 있는 단일 형광 염색제와 접촉시키는 단계; iv. 단계 (iii)의 혼합물을 형광 염색제의 방출 파장으로 이미지화하고 이미지화된 혼합물 내의 미생물에 상응하는 대상의 개수에 대한 이미지 분석 값을 결정하는 단계; 및 v. 이미지 분석 값을 소정의 보정 곡선과 비교하여 현탁액 내의 미생물의 농도를 결정하는 단계를 통해 현탁액 내의 미생물의 농도를 결정하는 단계를 포함한다.

Description

미생물 농도를 결정하기 위한 방법
본 발명은 일반적으로 시료 내의 미생물에 대한 검출 및 특성 분석에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 미생물 세포 및 비-미생물 세포 둘 모두를 함유하는 시료로부터 미생물을 회수하고 시료로부터 회수된 온전한 미생물의 농도를 신속하게 측정하기 위한 방법을 제공한다. 온전한 미생물은 생존 가능할 수 있다.
전통적으로, 시료 내의 미생물 성장 및 시료 내 미생물의 농도는 시료의 혼탁도(turbidity)와 같은 시료의 광학 파라미터를 측정함으로써 결정되었다. 예를 들어, 미생물학에서 시료의 혼탁도에 대한 참조로서 맥파틀랜드 표준(McFarland standard)을 사용하여 시료 내의 미생물(전형적으로는 박테리아)의 개수가 주어진 혼탁도 범위 내에 있을 것이고, 이 같은 표준은 시료 내의 미생물의 농도를 결정하기 위해 탁도계(nephelometer)에서 사용될 수 있다. 시료 내의 미생물의 농도를 측정하기 위해 분광 광도법을 포함하는 대안적인 기법이 사용될 수 있다. 그러나, 이 같은 기법이 신속하면서도 사용하기 용이할지라도 시료 내의 미생물 개수의 근사치만을 얻을 수 있다. 또한 광의 특정 파장의 혼탁도 또는 흡광도와 시료 내의 미생물의 농도 사이의 관계는 미생물 종에 따라 상이하며, 따라서 당해 미생물의 동질성이 알려져 있지 않는 경우에 미생물의 농도를 추정하기 어렵게 된다. 더욱이, 이 같은 기법은 오직 시료의 총 혼탁도 또는 흡광도를 측정할 수 있을 뿐이며, 따라서 시료 내의 온전한 미생물 또는 세포 잔해 또는 기타 잔해를 구별할 수 없다. 또한 시료 내의 미생물 농도의 혼탁도 측정은 민감도가 낮으며, 시료 내의 미생물의 농도를 측정할 수 있도록 비교적 높은 농도의 미생물이 요구된다. 이로 인해 이 같은 방식으로 측정되는 농도 저하가 방지되며, 또한 측정이 이루어질 수 있기 전에 장기간의 배양 단계가 요구된다.
시료 내의 온전한 미생물의 개수는 또한 고체 성장 배지 상에서 시료의 일부(또는 희석된 일부)를 도말하고, 시료를 배양하고, 형성되는 콜로니의 개수를 계수함으로써 보다 정량적으로 추정될 수 있다. 도말된 시료 내의 콜로니 형성 단위(CFU)의 개수는 살아 있는 미생물의 개수에 상응하는 것으로 여겨진다. 그러나, 이 같은 기법의 부정적인 측면은, 미생물 성장이 이루어지도록 충분한 시간을 주기 위해 장기간의 배양 단계가 필요하다는 것이다. 따라서, 이 같은 고전적인 기법은 시료 내의 미생물의 농도를 특정 시점에 측정하는데 유용하지만, 예를 들어 시료 내에 존재하는 미생물의 개수에 대해 사전 지식이 요구되는 이러한 시료 내의 미생물에 대한 시험 또는 검정을 수행하기 위한 온전한 미생물의 농도가 즉각적으로 요구되는 경우에 사용이 제한적이다.
생존 가능한(즉, 살아 있는) 세포가 또한 사멸 세포로부터 분화될 수 있으며, 이러한 목적을 위해 다수의 기법이 이용 가능하다는 것이 미생물 검출 분야에서 잘 알려져 있다. 당해 기술분야에 알려져 있는 방법은 핵산 염색제, 막 전위, 산화/환원 지표 또는 리포터 유전자에 초점을 맞추고 있다. 전형적으로는, 이들 기법은 생존 가능한 미생물의 막은 온전한 반면 사멸한 미생물의 막은 붕괴 및/또는 파괴되어 있다는 사실에 의존한다(문헌[Gregori et al. 2001. Appl. Environ. Microbiol. 67, 4662~4670]).
사멸 세포가 살아 있는 세포로부터 분화되도록 하는 특정 기법은 생사 염색(live/dead staining)이다. 막 불투과성인 염료 또는 염색제를 사용함으로써 붕괴된 막을 갖는 세포만이 염색되는 반면, 온전한 막을 갖는 세포는 염색되지 않는다. 따라서, 염료/염색제는 붕괴된 막을 갖는 이들 세포(즉, 사멸 세포)만이 이 같은 염료를 이용하여 염색되므로 사멸 세포용 마커로서 작용한다. 이러한 방식으로 사멸 세포를 검출하고, 또한 사멸한 총 세포의 비율을 계산할 수 있다. 이러한 분야에서의 추가의 발전은 2개의 별도의 염색제를 이용한 기법의 개발로 이어졌다: 제1 염색제는 세포 투과성이며, 살아 있는 세포 및 사멸 세포 둘 모두에 들어갈 수 있고; 제2 염색제는 세포 불투과성이고 사멸 세포에만 들어갈 수 있다. 따라서, 살아 있는 세포 및 사멸 세포는 차등 표지될 수 있으며, 따라서 구별 가능하다. 이러한 기법을 수행하기 위한 키트의 예로는 생사 BacLight 박테리아 생존능 키트(인비트로젠(Invitrogen))가 있으며, 상기 키트는 SYTO9 (세포 투과성) 염색제 및 프로피디움 요오드화물(PI) (세포 불투과성) 형광 염료를 포함한다. 이 같은 키트에 사용되는 제1 및 제2 염색제 둘 모두의 방출 파장에서 미생물 세포를 검출함으로써 이 같은 기법은 살아 있는 세포와 사멸 미생물 세포 사이를 구별하는데 특히 유용할 수 있어서, 시료 내에 존재하는 생존 가능한 미생물의 비율을 결정할 수 있다.
시료에서 차등적으로 염색되는 살아 있는 미생물 세포 및 사멸 미생물 세포를 구별하기 위해 다수의 상이한 검출 기법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 현미경의 시야에서 예를 들어 생존 가능 및 생존 불가능한 것으로 나타나 있는 시료 내의 미생물 세포를 직접 계수하고, 이러한 방식으로 시료 내에 존재하는 생존 가능한 미생물의 비율을 결정하는 것이 가능하다. 그러나, 이 같은 기법은 노동 및 시간 집약적이며, 생존 가능한 미생물의 농도를 정확하게 결정할 수가 없다. 유세포 분석법과 같은 자동화 세포 계수 방법은 또한 생사 염색 기법과 결합되는 경우에 시료 내의 생존 가능한 미생물의 비율을 측정하는데 사용될 수 있다(문헌[Berney et al. 2007. Applied and Environmental Microbiology 73, 3283~3290]). 그러나, 유세포 분석 방법에서는 복잡하고 고도로 전문적인 기기조작 및 정기적인 보정(예를 들어, 각각의 시료를 측정하기 전 별도의 보정)이 요구된다. 따라서, 이 같은 기법은 전형적으로 통상의 임상 실험실용으로 요구되는 바와 같은 강력한 검출 방법에 사용하기에는 적합하지 않으며, 이 같은 기법의 자동화가 어렵다. 따라서, 특히 임상용으로 시료 내의 온전한 미생물의 농도를 측정하기 위한 간단하고 신속하며 강력한 방법 및 기기에 대한 요구가 존재한다.
상기에서 토의된 바와 같이, 온전한 세포막을 갖는 미생물은 적합한 염료가 사용되는 경우에 세포막이 손상 또는 붕괴되어 있는 미생물과는 상이하게 염색될 수 있다. 따라서, 생사 염색에 의해 생존 가능한 세포를 검출하는 단계는 전형적으로 온전한 세포막을 갖는 세포를 검출하는 단계를 포함하며, 따라서 온전한 세포막을 갖는 세포는 시료 내의 생존 가능한 미생물 세포의 농도를 측정할 목적으로 생존 가능한 세포를 나타내는 것으로 여겨진다. 세포가 온전하다는 것과 세포가 생존 가능하다는 것 사이의 상관관계는 양호하며, 온전한 세포의 검출은 시료 내의 생존 가능한 세포의 양 또는 농도를 결정하기 위한 유효한 방식인 것으로 여겨진다.
본 발명자의 동시 계류 중인 출원 PCT/EP2018/077852는 시료 내의 온전한 미생물 세포의 농도를 결정하기 위해 "생사" 염색제 및 이미지화를 이용하는 방법에 관한 것이다. 이 같은 방법의 양태를 시료로부터 미생물 세포를 회수하고 회수된 세포를 전처리하는 특정의 단순한 방식과 조합함으로써, 본 출원의 발명자들은 단일 염료 또는 염색제만을 이용하여 시료로부터 회수된 온전한 미생물 세포의 농도를 결정하기 위한 방법을 발명하였으며, 이 방법은 개선되고 단순화된 기법을 제공한다.
상기에 언급된 바와 같이, 많은 경우, 미생물학에서는 미생물의 농도 및 특히 온전한 미생물의 농도를 결정하는 것이 바람직하다. 이는 미생물의 적합한 농도 또는 개수가 미생물의 특성 분석을 위한 검정용으로 제공하여 상기 검정이 정확하게 수행될 수 있도록 하거나, 실제로 시료가 특정 검정에 사용하기에 적합하다는 것을 보장하도록 하는 것이 바람직할 수 있다. 특히, 이는 표준(또는 표준화된) 배양액 또는 배양액을 위한 접종원의 제조를 포함할 수 있다. 이는 특히 미생물 감염을 검출 및 확인할 때 임상 목적을 위해 알려져 있거나 미리 결정된 농도 또는 표준 농도를 갖는 접종원이 요구되는 항생제 감수성 시험(AST)을 위한 표준화된 접종원의 제조를 포함한다. 그러나, 하기에 보다 상세하게 토의된 바와 같이, 기타 검정을 위해 시료 내의 미생물의 농도를 결정하거나 표준 배양액을 제공하는 것이 또한 바람직할 수 있다.
생물학 및 의학에서의 다수의 과정에서는 시료 내의 미생물(특히 온전한/생존 가능한 미생물)의 개수에 대한 정확한 결정 및 상기 결정에 기초한 접종원의 제조가 요구된다. 예를 들어, 이들로는 물 및 음식의 품질 관리 분석, 환경 시료 내의 미생물의 모니터링, 의료 기기 내 또는 기기 상의 생체 필름 형성 또는 환자에서의 생체 필름 형성, 및 실험용 미생물 연구를 들 수 있다. 특히, 시료 내의 생존 가능한 미생물 세포의 농도의 정확한 결정 및 이로부터 목적하는 농도의 미생물을 함유하는 접종원의 제조는 미생물 감염의 진단에 사용될 수 있다.
미생물 감염은 유의한 임상적 및 경제적 의의를 갖는 중요한 부류의 인간 및 동물 질환을 나타낸다. 미생물 감염을 치료 및/또는 예방하는데 다양한 부류 및 유형의 항균제가 이용 가능할지라도, 항균제 내성이 현대 의학에서 크면서도 점점 증가하는 문제이다. 따라서, 미생물 감염의 치료에 대한 맥락에서, 유효 처리를 보장하고 또한 불필요하거나 비효율적인 항생제의 사용을 감소시켜 항생제 내성 또는 보다 일반적으로 항균제 내성의 확산을 방지하는데 도움을 주도록 감염 미생물의 특성 및 이의 항균제 감수성 프로파일에 관한 정보를 갖는 것이 바람직할 수 있으며, 실제로는 중요할 수 있다. 이는, 신속한 유효 처리가 필수적인 심각하거나 생명을 위협하는 감염의 경우에 특히 그러하다.
심각한 감염에 의해 야기되는 잠재적으로 치명적인 전신 염증인 패혈증은 국가 전체의 병원비의 5%를 포함하는 미국에서의 병원비 중 가장 많이 드는 병태이자 동인이다. 심각한 패혈증의 경우에 적절히 치료하지 않으며 매 시간마다 사망률이 7% 증가하며, 항균제 내성 패혈증을 야기하는 균주, 특히 박테리아 균주의 유병률이 증가하면 패혈증에 대한 정확한 치료가 예측하기가 점점 어렵게 된다. 패혈증 또는 기타 감염을 야기하는 미생물의 진단을 위한 현재의 최적 기준은 감염 미생물의 단리 및 순수 배양액의 배양이 요구되는 표현형 및 생화학적 동정 기법에 기반을 두고 있다. 미생물 동정(ID) 및 항생제 감수성(AST) 시험을 실시하여 하나 이상의 항생제에 대해 내성을 나타낼 수 있는 미생물의 감염을 확인하고 이의 감수성 프로파일을 결정하는데 수일이 걸릴 수 있다. AST 검정은 미생물에 대해 시험된 각각의 항균제에 대한 '최소 억제 농도' 또는 'MIC' 값을 제공하며, 따라서 항균제가 미생물에 대해 효과적일 수 있는 정보를 제공할 수 있다. 이 같은 정보를 보다 신속하게 제공하는 것이 보다 좋으며, 따라서 신속한 AST 방법이 바람직하여, 개발되고 있다.
일반적으로 말하면, 임상 분야에서의 AST 결정용으로 수득된 결과는 상이한 방법들 사이 및/또는 상이한 임상 실험실 사이에서 비슷해야 한다. 이를 위해, AST 시험을 위해 지정 및 인지된 조건을 이용하는 것이 통상적이다. 이는 지정된 배지(예를 들어, 뮬러-힌튼(Muller-Hinton; MH) 배지) 및 배양 조건의 사용을 수반할 수 있다. 특히, 배양액 내의 박테리아의 개수 및 양이 설정 값이 되도록 AST 시험에서 실시되는 배양(즉, 성장을 위해 모니터링되는 배양)을 확립하기 위해 표준화된 미생물 역가(microbial titre; 즉, 미생물 세포의 표준화된 개수 (또는 표준 개수) 및 양(예를 들어, 농도))를 이용하는 것이 또한 통상적이다. 예를 들어, 맥파틀랜드 표준은 통상적으로 배양을 확립하기 위해 사용되는 배양액 제제 내의 미생물의 개수가 AST 시험을 표준화하기 위한 주어진 범위 내에 있도록 미생물 현탁액(특히 박테리아 현탁액)의 혼탁도를 조절하기 위한 기준으로서 사용된다. 맥파틀랜드 표준은 참조 현탁액의 혼탁도에 기초하여 설정되고, 미생물 현탁액은 선택된 맥파틀랜드 표준의 혼탁도와 일치하도록 농도(또는 박테리아 개수)가 조절된다.
통상적으로(예를 들어, 항균제의 MIC를 결정하기 위한 EUCAST 표준 방법(문헌[European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID), Clinical Microbiology and Infection, Vol. 9(8): ix~xv, 2003])에 대해 기술한 바와 같이), AST용 미생물 세포(예를 들어, 임상 시료 배양액 유래)를 도말하고 배양하여 단리된 콜로니를 수득한다. 이어서, 콜로니를 수집하고 이를 이용하여 AST 검정에 사용하기 위한 접종원으로서 사용하기 위한 미생물 세포 현탁액을 제조할 수 있다. 전형적으로, 그리고 상기에서 기술된 가이드라인에 기술된 바와 같이, 이렇게 제조된 현탁액 내의 미생물의 농도는 표준 및 소정의 수준, 예를 들어 0.5의 맥파틀랜드 단위로 설정되어, 미생물의 표준 농도가 AST 검정에서 사용될 수 있게 한다. 미생물 현탁액의 혼탁도는 사용 이전에는 0.5의 맥파틀랜드 단위로 조절될 수 있다. 대안적으로, 단리된 개개의 콜로니는 접종원을 제공하기 위해 배양될 수 있는 배양 배지를 접종하기 위해 사용될 수 있다. 배양액은 접종원으로서 사용되기 전에 목적하는 표준(0.5의 맥파틀랜드 단위)까지 성장하도록 할 수 있고/있거나, 필요한 경우에 이러한 표준으로 조절될 수 있다. 따라서, AST 이전에 박테리아의 농도를 정규화하기 전에 미생물 배양액은 전형적으로 0.5 맥파틀랜드 표준의 혼탁도 이상의 혼탁도까지 성장이 도달할 때까지 성장하도록 한다. 필요한 경우, 배양액은 0.5 맥파틀랜드 표준과 같은 혼탁도를 갖는 배양액을 얻기 위해 조절될 수 있다. 이어서, 이는 AST 검정을 확립하기 위해 사용되는 접종원으로서 사용될 수 있다. 이 시점에 수득된 접종원(즉, 대략 0.5의 맥파틀랜드 단위의 배양액 또는 현탁액)은 AST 배양용으로 사용되는 목적하는 표준화된 최종 세포수 및 세포 농도를 얻기 위해 브로스(broth)에서 희석된다. 참고로, 0.5의 맥파틀랜드 단위의 미생물 배양액/현탁액은 대략 1 x 108개의 CFU/㎖의 미생물 농도를 포함한다. 이 같은 미생물 배양액/현탁액은 전형적으로 AST 배양액이 확립된 경우에 약 200배 정도로 브로스에서 희석될 수 있다. 즉, 각각의 AST 배양 조건은 전형적으로 대략 5 x 105개의 CFU/㎖의 출발 미생물 농도를 포함할 수 있다.
패혈증과 같은 특정 미생물 감염에 있어서, 혈액 시료는 전형적으로 혈액 배양 플라스크에서 수집되고, 미생물 배양액(즉, 임상 시료 배양액)은 배양 모니터링 시스템에서 양성의 배양 결과가 수득될 때까지 성장하도록 한다. 예를 들어, Bactec 또는 Bact/Alert 시스템과 같은 자동 배양 검출 시스템에서, 양성으로 나타낼 필요가 있는 박테리아의 농도는 108개의 CFU/㎖와 109개의 CFU/㎖ 사이이며, 이는 (식염수에서 측정되는 경우) 0.5 내지 3.5의 맥파틀랜드 단위에 상응한다. (눈대중으로 또는 혼탁도 측정에 의해) 용이하게 검출 가능한 가장 낮은 맥파틀랜드 값은 대략 0.5의 맥파틀랜드 단위이다.
ID 시험 및 AST 결정은 일반적으로 양성의 배양 결과가 수득된 경우에 임상 시료 배양액을 이용하여 실시될 수 있다. AST 시험에 있어서, AST 시험 배양액용 접종원으로서 사용하거나 상기 접종원을 제조하기 위한 임상 시료 배양액(예를 들어, 양성 배양액)으로부터 추가의 배양액을 제조하고 이를 이용하여 AST 시험 배양액을 접종하기 전에 이 같은 접종원을 미리 설정된 미생물 농도 또는 맥파틀랜드 값(전형적으로 0.5의 맥파틀랜드 단위)으로 표준화하는 것이 전형적이다. 따라서, AST용 접종원은 전형적으로 맥파틀랜드 단위가 0.5인 배양액 또는 미생물 현탁액을 이용하거나 이를 출발 물질로 하여 제조된다. 이는 전형적으로 상술한 바와 같이 임상 시료 배양액 또는 이로부터 단리된 미생물을 도말함으로써 수득된 콜로니를 선택함으로써 당해 기술분야의 방법으로 이루어진다.
시료 내의 미생물의 농도만을 결정하기 위해 맥파틀랜드 표준과 비교할 필요가 있는 기법은 농도에 대한 근사치를 제공하며, 시료 내의 생존 가능한 미생물 세포의 농도에 대한 정보를 구체적으로 제공하지 못한다. 더욱이, 이 같은 기법은 농도가 측정되기 위해 비교적 높은 시료 내의 미생물 농도(예를 들어, 0.5의 맥파틀랜드 단위)에 의존한다.
따라서, 특히 AST 검정을 확립한다는 맥락에서 시료 내의 미생물의 농도를 결정하는 속도 및 민감도의 개선이 특별히 요구되고 있다. 특히, 신속하고 정확하면서도 민감한 미생물 농도 결정이 유세포 분석법을 포함하는 방법과 같이 복잡한 기기조작의 요구 없이 실시되도록 하는 강력하면서도 단순한 방법이 요구되고 있다. 본 발명에서는 미생물 접종원의 제조 시에 사용될 수 있는 미생물의 농도를 결정하기 위한 개선된 방법을 제공함으로써 이러한 요구를 해결하며, 추가로 AST를 실시하기 위한 개선된 업무 순서를 제공하기 위해 제공하며, 이는 미생물 현탁액 내의 미생물의 농도, 및 보다 유의하게는 미생물 현탁액 내의 온전한 미생물의 농도가 정확하고 신속하게 결정되도록 한다. 특히, 본 발명의 농도 결정 방법은 신속한 AST 검정이 수행되도록 할 수 있을 때의 값을 갖는다. 따라서, 본 발명은 미생물 제제 내의 미생물의 농도 및 보다 유의하게는 온전한 미생물의 농도를 결정하기 위한 신속하고 정확하면서도 정밀한 방법을 제공한다. 상기에 언급된 바와 같이, 온전한 미생물의 농도는 생존 가능한 미생물의 신뢰 가능한 지표로서 사용될 수 있다.
특히, 본 발명의 방법은 비-미생물(특히 포유동물) 세포로부터 미생물 세포를 분리할 때 특히 효과적인 방식으로 시료로부터의 미생물 세포의 회수에 기반을 두고 있으며, 이는 미생물 세포를 온전한(그리고 주로 또는 본질적으로 생존 가능한) 상태로 남겨둔 채로 비-미생물 세포를 용균하고, 회수된 미생물 현탁액 내의 온전한 미생물을 염색하고, 시료 내의 온전한 미생물에 상응하는 대상의 개수에 대한 값을 결정하기 위해 현탁액을 이미지화함으로써 이루어지지만, 소정의 표준물질에 대해 미생물을 직접 계수하거나 혼탁도법에 의해 미생물의 농도를 추정하거나 배양된 콜로니를 계수함으로써 존재하는 생존 가능한 미생물의 개수를 계수함으로써 이루어지는 것은 아니다. 소정의 표준 곡선을 이용함으로써 이미지화에 의해 검출된 대상의 개수에 대해 결정된 값은 현탁액 내에 존재하는 미생물의 농도와 관련이 있을 수 있다. 염색 과정을 보조 또는 원조하기 위해 염색 이전에 이 같은 적절한 (생존능 보존) 분리(미생물 단리) 기법을 회수된 미생물 세포를 알코올 및/또는 열로 전처리하는 단계와 조합함으로써, 놀랍게도, 단일 염색제만이 회수된 미생물 현탁액 내의 미생물의 농도를 검출 및 결정하기 위해 신뢰 가능하게 사용될 수 있는 것으로 밝혀져 있다. 이론과 결부되기를 원하지 않지만, 본 발명자들은 단리 단계에 의해 주로(예를 들어, 실질적으로 또는 본질적으로) 생존 가능한 시료(예를 들어, 생존 불가능한 미생물 세포가 낮은 비율로 존재함)로부터 매우 순수한 미생물 세포 제제가 수득되는데, 단일 염색제만의 사용을 허용한다는 것을 믿고 있다. 전처리와 함께 이러한 복합 효과는 특히 세포 투과성에 영향을 미치고, 이로 인해 염색제를 흡수 및/또는 유지하는 미생물의 능력에 영향을 미치는 내성 기구를 갖는 미생물, 특히 박테리아를 정량화하는데 유리하다. 이론과 결부되기를 원하지 않지만, 전처리 단계에 의해 미생물에서 유출 펌프(보통의 항균제 내성 기구)가 붕괴 또는 손상될 수 있으며, 이로 인해 내성 미생물 또는 실제로는 강력하거나 효과적인 유출 펌프를 갖는 임의의 미생물의 염색이 특히 향상될 수 있는 것으로 여겨진다. 다시 말해, 미생물(특히 항균제 내성 미생물)의 염색은 본원에서 기술된 전처리 단계를 사용함으로써 정규화될 수 있다. 이는, 내성 박테리아에 대한 AST에서의 오류가 부적절한 처리 위험성의 증가로 이어짐에 따라 박테리아가 단리되었던 환자에게 있어서 특히 해롭기 때문에 중요하다.
따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 미생물 및 포유동물 세포를 함유하는 시료로부터 온전한 미생물 현탁액을 제조하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은,
a. 미생물 및 포유동물 세포를 함유하는 시료를 제공하는 단계;
b. 상기 시료를 완충 용액, 세정제 및 하나 이상의 프로테아제와 접촉시키는 단계로서, 상기 완충 용액은 상기 시료 내에 존재하는 포유동물 세포의 용균을 허용하도록 적어도 pH 6과 pH 9 미만의 pH를 갖는 단계;
c. 온전한 미생물을 유지하기에 적합한 필터를 통해 단계 (b)에서 수득된 혼합물을 여과하는 단계로서, 상기 여과에 의해 혼합물로부터 용균된 포유동물 세포가 제거되는 단계;
d. 단계 (c)에서의 필터에 의해 유지되는 미생물을 회수하는 단계로서, 상기 회수는 미생물을 액체에 재현탁하여 회수된 온전한 미생물을 포함하는 현탁액을 제공하는 단계를 포함하는 단계; 및
e. 상기 현탁액 내의 미생물의 농도를 결정하는 단계로서, 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 상기 미생물의 농도를 결정하는 단계 :
i. 상기 현탁액의 분취액을 알코올과 접촉시키고/시키거나 상기 현탁액의 분취액을 가열하는 단계;
ii. 상기 현탁액의 하나 이상의 분취액을 선택적으로 희석하여 하나 이상의 희석된 분취액을 하나 이상의 희석 값으로 제공하는 단계로서, 상기 희석은 단계 (i)의 이전, 동안 및/또는 이후에 이루어지는 단계;
iii. 단계 (e)(i) 또는 (e)(ii)의 분취액 적어도 일부를 DNA와 결합할 수 있는 단일 형광 염색제와 접촉시켜 현탁액/염색제 혼합물을 제공하는 단계로서, 상기 염색제는 방출 파장을 갖는 단계;
iv. 단계 (e)(iii)의 현탁액/염색제 혼합물을 형광 염색제의 방출 파장에서 이미지화하고 이미지화된 혼합물 내의 미생물에 상응하는 대상의 개수에 대한 이미지 분석 값을 결정하는 단계; 및
v. 단계 (e)(iii)의 상기 분취액에 대해 단계 (e)(iv)에서 수득된 이미지 분석 값을 소정의 보정 곡선과 비교하여 현탁액 내의 미생물의 농도를 결정하는 단계를 포함한다.
단계 (b)가 시료 내에 존재하는 비-미생물 세포의 선택적인 용균 단계이며, 이로 인해 시료 내의 미생물 세포가 온전한 상태(또는 보다 구체적으로는 실질적으로 온전한 상태)로 남아 있는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 단계 (b)에서는 세정제가 비-미생물 세포를 용균시키는데 효과적인 양 또는 농도(또는 비-미생물 세포를 용균시키는 작용을 하거나 비-미생물 세포를 용균할 수 있는 양 또는 농도)로 사용되지만, 미생물 세포를 용균시키는데 효과적이지 않은 양 또는 농도(또는 비-미생물 세포를 용균시키는 작용을 하지 않거나 비-미생물 세포를 용균시킬 수 없는 양 또는 농도)로 사용된다.
상기에 언급된 바와 같이, 현탁액 내의 미생물을 알코올 및/또는 열로 전처리하는 단계 (e)(i)는 후속적인 염색을 용이하게 하는 작용을 한다. 이론과 결부되기를 원하지 않지만, 이는 적어도 부분적으로는 미생물의 세포벽 및/또는 세포막을 투과하거나 반대로 미생물의 구조에서의 형태적 변화를 초래하여 염색제의 진입 및/또는 유지를 용이하게 할 때의 전처리 효과 및/또는 예를 들어 염색제가 유출 펌프에 의해 미생물 세포로부터 제거되지 않도록 미생물을 불활성화시킬 때의 전처리 효과에 기인할 수 있다. 상기에 언급된 바와 같이, 이들이 존재하는 미생물 내의 유출 펌프의 불활성화는 상기 방법의 유익한 효과에 대한 중요한 기여자인 것으로 여겨진다. 따라서, 대안적으로 나타낸 경우에 단계 (e)(i)에서는 전처리가 염색을 정규화하는 작용을 할 수 있다.
알코올 및/또는 열이 이 같은 효과적인 전처리를 제공하지만, 이는 또한 기타 수단에 의해 달성될 수 있으며, 예를 들어 미생물에 대한 유사한 효과(예를 들어, 투과 및/도는 불활성화 효과)를 달성할 수 있는 농도 또는 양으로 세정제를 사용함으로써 달성될 수 있다.
따라서, 제2 양태에서, 본 발명은 미생물 및 포유동물 세포를 함유하는 시료로부터 온전한 미생물 현탁액을 제조하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은,
a. 미생물 및 포유동물 세포를 함유하는 시료를 제공하는 단계;
b. 상기 시료를 완충 용액, 세정제 및 하나 이상의 프로테아제와 접촉시키는 단계로서, 상기 완충 용액은 상기 시료 내에 존재하는 포유동물 세포의 용균을 허용하도록 적어도 pH 6과 pH 9 미만의 pH를 갖는 단계;
c. 미생물을 유지하기에 적합한 필터를 통해 단계 (b)에서 수득된 혼합물을 여과하는 단계로서, 상기 여과에 의해 혼합물로부터 용균된 포유동물 세포가 제거되는 단계;
d. 단계 (c)에서의 필터에 의해 유지되는 미생물을 회수하는 단계로서, 상기 회수는 미생물을 액체에 재현탁하여 회수된 온전한 미생물을 포함하는 현탁액을 제공하는 단계를 포함하는 단계; 및
e. 상기 현탁액 내의 미생물의 농도를 결정하는 단계로서, 하기 방법에 의해 미생물의 농도가 결정되는 단계를 포함하되, 이 방법은,
i. 상기 현탁액의 분취액을 세정제와 접촉시키는 단계;
ii. 상기 현탁액의 하나 이상의 분취액을 선택적으로 희석하여 하나 이상의 희석된 분취액을 하나 이상의 희석 값으로 제공하는 단계로서, 단계 (i) 이전, 동안 및/또는 이후에 상기 희석이 이루어지는 단계;
iii. 단계 (e)(i) 또는 단계 (e)(ii)의 분취액의 적어도 일부를 DNA와 결합할 수 있는 단일 형광 염색제와 접촉시켜 현탁액/염색제 혼합물을 제공하는 단계로서, 상기 염색제는 방출 파장을 갖는 단계;
iv. 형광 염색제의 방출 파장에서 단계 (e)(iii)의 현탁액/염색제 혼합물을 이미지화하고 이미지화된 혼합물 내의 미생물에 상응하는 대상의 개수에 대한 이미지 분석 값을 결정하는 단계; 및
v. 단계 (e)(iii)의 상기 분취액에 대해 단계 (e)(iv)에서 수득된 이미지 분석 값을 소정의 보정 곡선과 비교하여 현탁액 내의 미생물이 농도를 결정하는 단계를 포함한다.
특히, 단계 (b)에서 세정제는 비-미생물 세포의 선택적인 용균을 구현하는데(또는 구현할 수 있게 하는데) 효과적이며, 즉 시료 내의 비-미생물 세포를 용균시키지만 미생물 세포를 용균하지 않는데 효과적인 반면, 단계 (e)(i)에서는 세정제가 미생물 세포, 특히 강력한 유출 펌프를 갖는 항균제 내성 미생물 세포 또는 미생물의 염색을 용이하게 하는데 효과적이며(용이하도록 작용하거나 용이하게 할 수 있으며), 예를 들어 상기 염색을 향상 또는 개선 또는 허용 또는 정규화할 수 있다. 따라서, 동일하거나 상이한 세정제가 단계 (b) 및 단계 (e)(i)에서 사용될지라도 세정제가 동일하면 단계 (b)와 비교하여 단계 (e)(i)에서 상이한 양(보다 높은 양)으로 사용될 것이다.
상술한 방법에서, 형광 염색제는 세포 투과성이거나 세포 불투과성일 수 있지만, 바람직한 실시형태에서는 이는 세포 투과성이다.
전처리 단계가 미생물의 세포막 및/또는 세포벽의 투과성에 영향을 줄 수 있고, 이로 인해 세포벽 및/또는 세포막의 온전성에 영향을 미칠 수 있는 동안에, 본 발명자들은 이러한 것이 미생물에 상응하는 대상의 개수를 산정하기 위해 미생물을 검출 및 이미지화할 수 있는 것을 손상시키지 않는다는 것을 발견하였다. 따라서, 미생물에 상응하는 대상을 확인하고 이미지화할 수 있다. 전처리 단계에서 세포벽 및/또는 세포막의 온전성이 어느 정도 붕괴될 수 있을지라도 이미지화된 대상은 단계 (d)에서 온전한 상태로 회수되는 미생물에 상응하는 것으로 확인될 수 있다. 따라서, 단계 (e)(iv)에서 수득된 이미지 분석 값은 회수된 온전한 미생물에 상응하는(이를 대표하는) 이미지화된 혼합물 내의 대상의 개수에 대한 값으로서 나타낼 수 있다. 따라서, 단계 (e)(v)에서의 비교 단계에 의해 현탁액(즉, 단계 (d)에서 제조된 현탁액) 내의 온전한 미생물의 농도가 결정하게 된다.
단계 (e)(v)에서 소정의 보정 곡선과 검출된 대상의 개수에 대한 이미지 분석 값의 비교에 의해 수득될 현탁액 내의 미생물(또는 보다 구체적으로는 온전한 미생물)의 개수를 보다 정확하게 측정할 수 있게 된다. 다양한 인자는 염색 방법에 의한 온전한 세포의 염색 및 또는 결정에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 생사 염색의 맥락에서 일부 경우에 생사 염색 검정에서 '생존 가능한' 것으로 나타나 있는 소정 비율의 미생물 세포가 온전한 세포막을 포함할 수 있을 지라도 이들은 사실 상 대사적으로 불활성이거나, 그렇지 않는 경우에 배양 불가능 할 수 있다(문헌[Trevors 2012. J Microbiol Meth 90, 25~8]). 더욱이, 영양 풍부 환경에서의 빠른 지수 성장 동안에 생존 가능한 미생물 세포의 막 온전성이 감소할 수 있으며, 그 결과 제2 형광 염료가 세포 내로 들어갈 수 있게 된다(문헌[Shi et al. 2007. Cytom Part A 71A, 592~298]). 따라서, 이 같은 세포는 제2 방출 파장에서 발광할 것이며, 제2 형광 염색제가 제1 형광 염색제의 형광을 켄칭하는 능력으로 인해 제1 방출 파장에서의 이 같은 세포의 형광이 감소할 수 있다. 추가적으로, 제1 (세포 투과성) 형광 염색제의 블리칭(bleaching) 및 예상보다 높은 흡수와 같은 문제로 인해 이 같은 방법의 정확성이 영향을 받을 수 있다(문헌[Stiefel et al. 2015. BMC Microbiology 15:36]). 본원에 개시된 방법에 의해 시료 내의 온전한 세포의 농도 결정에 악영향을 미칠 수 있는 이 같은 인자가 설명되며(즉, 임의의 이 같은 결정이 '고려됨'), 그 결과 미생물 생존능이 보다 정확하게 측정된다. 따라서, 온전한 미생물 세포에 대해 결정된 농도는 생존 가능한 미생물 세포의 농도를 나타내거나, 표시하거나, 상응하거나, 근사치를 나타내는 것으로 여겨진다. 구체적으로는, 단계 (e)(iv)에서 이미지화된 대상의 개수에 대한 이미지 분석 값을 소정의 보정 곡선과 비교함으로써, 현탁액 내에 존재하는 온전한 미생물 및 보다 구체적으로는 생존 가능한 미생물의 농도를 계산하려고 시도하여 현탁액 내의 온전한 또는 생존 가능한 미생물의 농도의 보다 정확한 결정이 이루어지게 하는 경우에 상기에서 토의된 생존 가능한 미생물 세포 및 생존 불가능한 미생물 세포의 부정확한 염색과 같은 인자가 설명될 수 있다.
본 발명은 시료(또는 대안적으로 회수된 미생물의 시료, 즉 "회수된 미생물 시료"로 표시됨)로부터 제조된 현탁액 내의 미생물의 농도를 결정하기 위한 신속하고 민감한 방법을 제공한다. 이는 다양하게 활용될 수 있으며, 다양한 상황에서 회수된 미생물 시료 내의 미생물 농도를 결정하기 위한 강력하고 단순한 방법을 구비하는 것이 유리할 수 있다. 미생물의 절대 농도를 정확하게 결정할 뿐만 아니라, 상기 방법은 시료 내의 미생물 부하를 표시할 때 활용할 수 있으며, 따라서 얼마나 많은 미생물 세포가 존재하는 지를 알거나 추정하거나, 이에 대해 알고 있는지 요구되는 임의의 방법 또는 맥락으로 사용될 수 있다. 따라서 이러한 방법이 사용될 수 있는 맥락이 제한되지 않는다. 실제로, 이러한 방법의 검출 하한을 고려할 때 이러한 방법은 시료가 미생물을 함유하는 지의 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 따라서 하나의 양태에서 본 발명은 시료 내의 미생물의 존재를 결정하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 개시된 상기 방법들 중 하나의 단계 (a) 내지 단계 (e)를 실시하는 단계; 및 미생물이 시료 내에 존재하는 지를 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 미생물 농도를 평가 또는 결정하는 것이 바람직한 상이한 시료 또는 현탁액의 맥락에 활용할 수 있다. 시료는 미생물 및 포유동물 세포 둘 모두를 함유하며, 따라서 이는 바람직하게는 포유동물에서 유래한다. 시료는 특히 하기에 추가로 토의된 바와 같이 임상 시료 또는 수의과용 시료일 수 있다. 방법은 충분하거나 적절한 농도의 세포가 시료로부터 회수되어 추가의 시험이 실시될 수 있게 하는 지를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 이는 AST 검정의 맥락에서 하기에 추가로 설명되지만, 이 방법은 시료 내의 미생물에 대한 임의의 후속적인 분석 단계 이전의 예비 단계로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 방법은 질량 분광 시험 및/또는 핵산 기반 시험 및/또는 미생물에 대한 임의의 기타 평가, 예를 들어, 성장 기반 연구를 실시하기 전에 시료 내의 온전한 (또한 생존 가능한) 미생물의 농도를 결정 또는 평가하기 위해 사용될 수 있다.
회수된 미생물 현탁액 내의 온전한 (또한 생존 가능한) 미생물의 농도가 결정되면, 이러한 정보는 알려져 있거나 목적하는 개수 또는 농도의 미생물을 함유하는 접종원을 정확하게 제조하기 위해 유리하게 사용될 수 있다.
따라서, 추가의 양태에서 본 발명은 미생물 접종원(또는 대안적으로 미생물 배양액을 제조할 때 사용하기 위한 접종원으로서 표시됨)을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에서 정의된 방법을 이용하여 현탁액 내의 미생물을 회수하고 이의 농도를 결정하는 단계; 및 이어서 현탁액의 적어도 분취액 또는 일부 내의 미생물 세포의 농도를 목적하는 농도로 조절하여 목적하는 농도의 미생물을 포함하는 접종원을 제공하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 상기 시료로부터 회수된 미생물을 포함하는 현탁액 내의 미생물의 농도가 결정되면 시료 내의 미생물을 특성 분석하기 위한 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명의 회수 및 농도 결정 방법은 미생물을 특성 분석하기 위한 검정과 함께 사용될 수 있다. 특히, 이는 알려져 있거나 소정의 농도 또는 개수의 미생물이 요구되는 검정일 수 있다.
따라서, 다른 양태에서 본 발명은 시료 내의 미생물을 특성 분석하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은,
(i) 미생물 및 포유동물 세포를 함유하는 시료를 제공하는 단계;
(ii) 상기 시료에 대해 상기에서 정의된 바와 같이 단계 (b) 내지 단계 (d)를 수행하여 온전한(예를 들어, 생존 가능한) 미생물의 현탁액을 수득하는 단계;
(iii) 상기에서 정의된 바와 같이 단계 (e)를 실시하여 현탁액 내의 미생물 세포의 농도를 결정하는 단계;
(iv) 필요한 경우 상기 현탁액 내의 미생물 세포의 농도를 목적하는 농도 또는 소정의 농도로 조절하는 단계; 및
(v) 현탁액 내의 미생물(및 이에 따른 시료 내의 미생물)을 특성 분석하는 단계를 포함한다.
따라서 본 발명에 따르면 검정, 특히 특정 농도 또는 개수의 미생물이 요구되는 검정을 실시하여 상기 미생물을 특성 분석하기 전에 회수된 미생물 제제(현탁액) 내의 미생물의 농도가 결정되도록 한다. 따라서, 이는 시료 또는 보다 구체적으로는 이로부터 제조된 현탁액이 주어진 검정에 사용하기에 적합한 지가 결정되도록 하고, 그렇지 않는 경우에 미생물의 농도가 적절히 조절되도록 한다.
본원에 개시된 방법들 중 임의의 것의 농도 조절 단계가 현탁액 내의 미생물에 대해 결정된 농도에 의해 유익하게 영향을 받을 수 있을지라도 농도 결정이 완료된 이후(예를 들어, 상술한 방법에서 단계 (iii) 이후)에 모든 농도 조절 단계가 이루어질 필요는 없다. 실시형태에서, 조절은 농도가 결정된 이후에 이루어질 수 있으며, 예를 들어 하나 이상의 희석 단계는 농도가 결정된 이후에 실시된다. 그러나, 기타 실시형태에서 초기(즉, 예비) 조절 단계는 농도 결정 단계가 완료되기 이전 또는 별도로, 예를 들어 농도 결정이 실시되는 동안 또는 그 이전에 이루어질 수 있다. 예를 들어, 현탁액 또는 이의 일부에 대한 예비 희석 단계는 농도가 결정되기 이전에 이루어질 수 있다. (이는 농도 결정 방법에서의 단계 (e)(ii)의 분취액의 선택적인 희석 단계와는 별개이다. 이어서, 이 같은 실시형태에서, 하나 이상의 추가의 희석 단계는 목적하는 농도에 도달하기 위해 농도가 결정된 이후에 이루어질 수 있다(즉, 이 같은 초기 (예비) 희석에 의해 얻어진 희석액을 추가로 희석할 수 있음). 이 같은 추가의 희석은 결정된 농도에 의해 영향을 받는다(또는 결정된 농도에 기반을 두고 있음). 이와 관련하여 이 같은 초기(또는 예비) 희석 단계(이는 "맹검(blind)" 희석 단계로서 간주될 수 있음)는 농도 결정이 실시된 현탁액의 분취액과는 상이한 현탁액의 일부에 대해 이루어질 것으로 이해될 것이다. 따라서, 현탁액의 나머지 부분(이는 농도 결정을 위해 분취액이 제거된 이후에 남아있는 현탁액임)은 예비 조절 단계에서 조절(예를 들어, 희석)될 수 있거나, 상기 현탁액(즉, 나머지 현탁액)의 별도의 일부 또는 분취액에 예비 조절 단계가 적용될 수 있다. 이는 방법 전체를 가속화시킬 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 시료 내의 미생물의 항균제 감수성을 결정하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은,
(i) 생존 가능한 미생물 및 포유동물 세포를 함유하는 시료를 제공하는 단계;
(ii) 상기 시료에 대해 상기에서 정의된 바와 같이 단계 (b) 내지 단계 (d)를 수행하여 생존 가능한 미생물 현탁액을 수득하는 단계;
(iii) 상기에서 정의된 바와 같이 단계 (e)를 실시하여 현탁액 내의 미생물 세포의 농도를 결정하는 단계;
(iv) 단계 (ii)의 현탁액을 이용하여 항생제 감수성 시험(AST)을 위한 일련의 시험 미생물 배양액을 접종하는 단계로서, 일련의 시험 미생물 배양액은 적어도 2개의 상이한 성장 조건을 포함하고, 상이한 성장 조건은 하나 이상의 상이한 항균제를 포함하며, 각각의 항균제는 2개 이상의 상이한 농도로 시험되는 단계; 및
(v) 각각의 성장 조건에서 미생물 성장 정도를 평가하는 단계를 포함하며,
상기 현탁액 또는 상기 시험 미생물 배양액 내의 미생물 세포의 농도는 필요한 경우에 목적하는 농도 또는 소정의 농도까지 조절되고;
각각의 성장 조건에서의 미생물 성장 정도는 적어도 하나의 항균제에 대한 시료 내의 미생물의 감수성을 나타내는 적어도 하나의 값을 결정하기 위해 사용된다.
일 실시형태에서, 적어도 하나의 MIC 및/또는 SIR 값이 결정될 수 있어서, 상기 시료 내의 상기 미생물의 항균제 감수성을 결정할 수 있다.
SIR은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 민감성, 중간 또는 내성을 의미하는 것으로 이해된다. SIR가 MIC보다 코스 점수(course scale)가 높은 경우, 이는 많은 경우에 임상적으로 이용된다.
따라서, 본 발명은 AST 검정을 수행하기 위한 보다 정확한 방법을 제공하는데, 이는 미생물의 농도가 시료의 혼탁도를 측정하는 것보다 높은 정확도로(예를 들어, 맥파틀랜드 표준의 혼탁도와 시료의 혼탁도를 단순히 비교함으로써) 결정되기 때문이다. 단일 염색제만이 사용되기 때문에 상기 방법은 2개의 "생사" 염색제를 이용하는 방법보다 더 간단하다. 본 발명의 추가의 이점은 내성 미생물의 농도를 결정할 수 있는데 있으며, 하나의 실시형태에서 미생물은 내성 미생물, 특히 내성 박테리아이다. 상기에 언급된 바와 같이, 항균제에 대한 미생물, 특히 박테리아 내의 내성 기구는 보다 내성인 세포벽 및/또는 세포막, 및/또는 미생물 세포로부터 항균제를 제거하는 유출 펌프를 포함할 수 있다. 이 같은 기구는 또한 미생물에 의한 염색제의 흡수 및/또는 유지를 방해하는 작용을 할 수 있다. 특히 전처리 단계를 포함하는 본 발명의 방법은 염색 과정(특히 항균제 내성 미생물 세포의 염색 과정)을 용이하게 하여 이 같은 내성 미생물이 검출 또는 측정되도록 할 수 있는 것으로 여겨진다. 달리 말하면, 본 발명의 방법, 특히 전처리 단계는 미생물 염색을 정규화할 수 있다. 본 발명자들은 전처리 유무에 따라 내성 및 비내성 박테리아 및 상이한 유형의 박테리아를 비교하고, 상이한 박테리아 사이의 염색(즉, 정규화된 염색)의 향상된 유사성을 관찰하였다. 따라서, 미생물의 동질성에 대한 지식 없이도 염색 및 본 발명의 방법을 실시할 수 있다.
따라서, 상술한 방법의 농도 결정 단계는 내성 미생물, 특히 내성 박테리아의 농도를 결정할 때 활용할 수 있으며, 임의의 미생물 현탁액 또는 제제 내의 미생물의 농도를 결정하는 보다 일반적인 응용을 가질 수 있다.
따라서, 본원에는 미생물 현탁액 내의 온전한 미생물의 농도를 결정하기 위한 방법이 개시되어 있으며, 상기 방법은,
(i) 미생물을 함유하는 현탁액을 제공하는 단계;
(ii) 상기 현탁액의 분취액을 알코올 및/또는 세정제와 접촉시키고/시키거나 상기 현탁액의 분취액을 가열하는 단계;
(iii) 상기 현탁액의 하나 이상의 분취액을 선택적으로 희석하여 하나 이상의 희석된 분취액을 하나 이상의 희석 값으로 제공하는 단계로서, 상기 희석은 단계 (ii) 이전, 동안 및/또는 이후에 이루어지는 단계;
(iv) 단계 (ii) 또는 (iii)의 분취액의 적어도 일부를 DNA와 결합할 수 있는 단일 형광 염색제와 접촉시켜 현탁액/염색제 혼합물을 제공하는 단계로서, 상기 염색제는 방출 파장을 갖는 단계;
(v) 단계 (iv)의 현탁액/염색제 혼합물을 형광 염색제의 방출 파장에서 이미지화하고 이미지화된 혼합물 내의 미생물에 상응하는 대상의 개수에 대한 이미지 분석 값을 결정하는 단계; 및
(vi) 단계 (iv)의 상기 분취액에 대해 단계 (v)에서 수득된 이미지 분석 값을 소정의 보정 곡선과 비교하여 현탁액 내의 미생물의 농도를 결정하는 단계를 포함한다.
상기 방법에 있어서, 단계 (v)에서 결정된 이미지 분석 값은 온전한 미생물에 상응하는 이미지화된 혼합물 내의 대상의 개수에 대한 것일 수 있으며, 그 결과로서 단계 (vi)에서 현탁액 내의 온전한 미생물의 농도가 결정될 수 있다.
게다가, 상기에 언급된 바와 같이, 이러한 방법의 실시형태에서 미생물은 내성 미생물, 보다 구체적으로는 내성 박테리아일 수 있다. 더욱이, 이 같은 방법은 AST 결정의 맥락에서 사용될 수 있어서, 이 방법은 상술한 바와 유사하게 시료 내의 미생물의 항균제 감수성을 결정하기 위한 방법의 일부로서 사용될 수 있다.
상술된 바와 같이, EUCAST 또는 CLSI 가이드라인에 따라 실시된 표준 AST 검정에서는 전형적으로 AST 검정을 확립하는 다음 단계에서 사용되도록 미생물이 충분히 성장할 시간이 요구된다. 예를 들어, 상기에 나열된 프로토콜에서는 임상 시료 배양액 내의 미생물의 농도가 임상 시료 배양액이 '양성'으로 간주되는 시점(즉, 이는 적어도 0.5의 맥파틀랜드 단위에 도달하는 시점)까지 증가하도록 배양 기간이 요구된다. 개개의 콜로니가 성장하도록 임상 시료 배양액을 도말한 이후에 추가의 배양 단계가 요구되며, 선택적으로 상기에 나열된 바와 같이 제조된 미생물 현탁액이 AST 검정이 준비될 수 있기 전에 0.5의 맥파틀랜드 단위에 도달하도록 부가적인 추가의 배양 단계가 요구된다.
더욱이, AST 검정을 준비하기 위한 상기에 나열된 프로토콜에서, 전형적으로 (임상 시료 배양액 내에 존재하는 미생물의 총 개수 대비) 오직 하나 또는 소수의 콜로니는 결과적으로 AST 검정을 확립하기 위해 사용되는 접종원을 제조하는데 사용된다. 따라서, 이 같은 프로토콜은 감염의 원인이 되는 미생물을 나타내는 사용된 콜로니 또는 콜로니들에 의존한다. 이는 그렇지 않지만, AST 검정의 결과는 사실상 감염의 원인이 되는 미생물의 항균제 감수성을 반영하지 않을 수 있으며, 따라서 이 같은 결과에 기반을 둔 임의의 임상적 중재에 의해 감염을 적절히 치료하지 못할 수 있다.
보다 광범위하게는, 본 발명은 상기 미생물을 특성 분석하기 위해 미생물의 적합한 농도 또는 개수가 정성적 또는 정량적 검정에서 사용되도록 하기 위해 시료로부터 회수된 현탁액 내의 온전한 미생물의 농도를 신속하고 정확하게 결정하기 위해 방법을 제공한다. 달리 말하면, 회수된 현탁액 내의 온전한 미생물의 농도는 미생물 세포의 적합한 농도 또는 개수가 특성 분석 방법용으로 제공되도록 하기 위해 미생물을 특성 분석하는 임의의 바람직한 방법 이전에 결정될 수 있다. 따라서, 이로 인해 임의의 이 같은 검정을 이용하여 미생물의 특성 분석이 허용된다.
시료로부터 회수된 미생물 현탁액 내의 온전한 미생물의 농도를 결정하는 것이 특히 유리할 수 있는 검정으로는, 예를 들어 질량 분석법(MALDI-TOF, ESI-MS 및 CyTOF를 포함함), 라만 분광법(Raman spectroscopy), 핵산 기반 시험(PCR, 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification; RCA), 리가아제 연쇄 반응(LCR), 및 미생물 및/또는 그 내부의 항균제 내성용 마커를 확인하는데 특히 유용할 수 있는 핵산 서열 기반 증폭(NASBA)을 포함함)을 들 수 있다. 본원의 다른 부분에서 보다 상세하게 기술된 바와 같이, AST 검정을 실시하기 전에 시료로부터 제조된 현탁액 내의 온전한 미생물의 농도를 결정하는데 특히 이로울 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "미생물 세포" 및 "미생물"이란 용어는 상호 교환 가능하며, 유사한 의미를 갖는 것, 즉 현미경 유기체인 것으로 간주된다. 상기 용어는 본원에서 단세포이든지 아니든지 간에 모든 범주의 미생물을 포함하도록 사용되며, 하기에서 보다 상세하게 토의되는 바와 같이 박테리아(마이코박테리아를 포함함), 고세균, 진균, 원생생물(원생동물을 포함함) 및 조류를 포함한다. 상기 방법이 실시되는 경우에 미생물의 동질성이 알려져 있거나 알려져 있지 않을 수 있다. 게다가, 시료는 하나의 미생물 유형 또는 종 또는 하나 이상의 미생물 유형 또는 종을 함유할 수 있다. 즉, 시료는 단일 유형의 미생물을 함유할 수 있거나, 미생물 혼합물을 함유할 수 있다.
더욱이, 미생물 세포와 관련하여 "세포 투과성" 및 "세포 불투과성" 염색제를 참고한다. 다시 말해, 본 발명의 방법에서 사용되는 염색제의 투과성은 상기 염색제에 대한 미생물의 투과성이다.
본 발명의 맥락에서 "생존 가능한" 이란 용어는 미생물이 성장 및/또는 재생 가능하다는 것을 지칭한다. 시료 내의 생존 가능한 미생물의 농도는 차등 염색에 의해 시료 내의 온전한 미생물의 농도를 결정함으로써 직접 결정될 수 있다. 따라서, 생존 가능한 미생물의 농도는 시료 내의 온전한 세포의 농도에서 유래한다. 본 발명의 방법은 시료 내의 온전한 미생물의 농도를 결정하기 위한 정확하고 신속한 방법을 제공한다. 생존 가능한 미생물을 함유하는 시료가 단계 (a)에서 사용되는 경우, 본 발명에 따른 온전한 미생물의 농도 결정은 생존 가능한 미생물의 농도의 표시를 반영 또는 제공한다.
시료 내에 존재하는 미생물 및 시료로부터 회수되어 제조된 현탁액 내에 존재하는 미생물의 맥락에서 "온전한"이란 용어는 이들의 온전성에 대한 실질적인 변화가 없는 미생물을 지칭한다. 이 같은 "온전한" 미생물은 일반적으로 붕괴되지 않은 세포막, 즉 반투과성이고 막 전위를 갖는 세포막(즉, 단백질 구배를 갖는 세포막)을 가질 것이다. 그러나, 상기에 언급된 바와 같이, 알코올 또는 열(또는 세정제)에 의한 전처리에 의해 투과 효과가 나타날 수 있으며, 이로 인해 전처리 이후에 미생물은 상술한 정의에 대한 엄격한 의미에서 온전하지 않을 수 있다. 그럼에도 불구하고, 이 같은 전처리된 미생물은 현탁액 내에 존재하는 온전한 미생물을 나타내며, 따라서 (단계 (e)(i)의) 전처리된 분취액 내의 이들 농도의 결정은 현탁액 내의 온전한 미생물의 농도를 표시한다. 더욱이, 존재하는 경우 전처리의 투과 효과는 비교적 약할 수 있으며, 미생물 세포를 붕괴하는데 전적으로 충분하지 않을 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 온전한 미생물 현탁액을 제조하는 방법을 제공한다. "현탁액"이란 용어는 당해 기술분야에 알려져 있는 이의 통상의 의미, 즉 입자를 함유하는 혼합물과 함께 본원에서 사용된다. 본 예에서, "입자"는 미생물이며, 본원의 방법에서 미생물 현탁액은 단순히 액체 중에 미생물을 포함하는 제제이다. 상술한 바와 같이, 현탁액은 미생물 및 포유동물 세포를 함유하는 시료로부터 제조된다.
본 발명의 방법에서는 다양한 가능한 미생물을 함유하는 다양한 시료를 분석할 수 있다. 상기에 언급한 바와 같이, 시료는 미생물 및 포유동물 세포를 함유한다. 그러나, 관심 있는 시료가 본 발명의 방법이 실시될 때까지 미생물을 함유하는 지를 결정하는 것이 가능하지 않을 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 시료는 바람직하게는 포유동물로부터 단리되지만, 이는 필수적인 것은 아니며, 시료는 다른 곳으로부터 유래할 수 있다. 예를 들어, 이는 환경 시료일 수 있다. 시료는 포유동물 세포를 함유하는 것으로 알려져 있을 수 있거나(예를 들어, 이것이 포유동물에서 유래하는 경우), 단순히 포유동물 세포를 함유하는 것으로 의심될 수 있거나, 시료가 포유동물 세포를 함유하는 것이 가능한 것으로 사료될 수 있다. 따라서, 본원에서 정의된 바와 같이,"미생물 및 포유동물 세포를 함유하는 시료"는 미생물 및 포유동물 세포를 함유하는 것으로 의심되는 시료일 수 있다.
미생물은 임의의 미생물(예를 들어, 임의의 박테리아성 또는 진균성 미생물) 또는 원생동물일 수 있으며, 특히 임의의 병원성 미생물 또는 신체에서 감염을 야기하는 임의의 미생물일 수 있으며, 따라서 본 발명의 방법은 특히 시험 개체의 신체의 임의의 일부분 내 또는 상의 미생물 감염(즉, 임의의 미생물 감염)을 검출 또는 진단한다는 맥락에서 미생물의 농도를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로 말하면, 본 발명은 임상적으로 관련이 있는 미생물을 함유하는 시료(상기 미생물을 함유하는 것으로 의심되는 시료)의 분석과 관련이 있지만, 미생물은 병원성 또는 비병원성일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 미생물이란 용어는 "미생물"의 범주 내에 있을 수 있는 임의의 유기체를 포함한다. 반드시 그러한 것은 아니지만, 미생물은 단세포성일 수 있거나, 단세포 생애 단계를 가질 수 있다. 미생물은 원핵성 또는 진핵성일 수 있으며, 일반적으로 박테리아, 고세균, 진균, 조류 및 원생생물(특히 원생동물을 포함함)을 포함할 것이다. 그람 양성 또는 그람 음성 또는 그람 비결정적(gram-indeterminate) 또는 그람 무반응(gram-non-responsive)일 수 있는 박테리아, 및 진균(예를 들어, 효모)이 특히 관심의 대상이다.
박테리아는 호기성 또는 혐기성일 수 있다. 박테리아는 마이코박테리아일 수 있거나, 이를 포함할 수 있다.
특히 임상적으로 관련이 있는 박테리아 속으로는 스타필로코쿠스(Staphylococcus; 응고효소(coagulase) 음성 스타필로코쿠스를 포함함), 클로스트리듐(Clostridium), 에세리키아(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로피오니박테륨(Propionibacterium), 바실러스(Bacillus), 락토바실러스(Lactobacillus), 레지오넬라(Legionella), 마이코박테리움(Mycobacterium), 마이크로코쿠스(Micrococcus), 푸소박테륨(Fusobacterium), 모락셀라(Moraxella), 프로테우스(Proteus), 에세리키아, 크렙시엘라(Klebsiella), 아시네토박터(Acinetobacter), 부르크홀데리아(Burkholderia), 엔테로코쿠스(Enterococcus), 엔테로박터(Enterobacter), 시트로박터(Citrobacter), 헤모필루스(Haemophilus), 나이세리아(Neisseria), 세라티아(Serratia), 스트렙토코쿠스(Streptococcus; 알파-용혈성 및 베타-용혈성 스트렙토코시(Streptococci))를 포함함), 박테로이데스(Bacteriodes), 여시니아(Yersinia) 및 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas), 및 실제로는 임의의 기타 장 또는 대장균형 박테리아를 들 수 있다. 베타-용혈성 스트렙토코시로는 A군, B군, C군, D군, E군, F군, G군 및 H군 스트렙토코시를 들 수 있다.
임상적으로 관련이 있는 그람 양성 박테리아의 비제한적 예로는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus;메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스(MRSA)를 포함함), 스타필로코쿠스 헤몰리티쿠스(Staphylococcus haemolyticus), 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코쿠스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus), 스타필로코쿠스 루그두넨시스(Staphylococcus lugdunensis), 스타필로코쿠스 스크레이페리(Staphylococcus schleiferi), 스타필로코쿠스 카프라에(Staphylococcus caprae), 스트렙토코쿠스 살리바리우스(Streptococcus Salivarius), 스트렙토코쿠스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스 안지노수스(Streptococcus anginosus), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코쿠스 상귀니스(Streptococcus sanguinis), 스트렙토코쿠스 미티스(Streptococcus mitis), 스트렙토코쿠스 에쿠이누스(Streptococcus equinus), 스트렙토코쿠스 보비스(Streptococcus bovis), 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 소르델리이(Clostridium sordellii), 클로스트리듐 노비이(Clostridium novyi), 클로스트리듐 보툴리늄(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis) 및 엔테로코쿠스패시움(Enterococcus faecium)을 들 수 있다. 임상적으로 관련이 있는 그람 음성 박테리아의 비제한적 예들로는 에세리키아 콜라이(Escherichia coli), 살모넬라 본고리(Salmonella bongori), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 시트로박터 코세리(Citrobacter koseri), 시트로박터 프룬디이(Citrobacter freundii), 크렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 크렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis), 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae), 엔테로박터 애로제네스(Enterobacter aerogenes), 세라티아 마르체센스(Serratia marcescens), 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia), 모르가넬라 모르가니이(Morganella morganii), 박테로이데스 프라질리스(Bacteriodes fragilis), 아시네토박터 바우마니이(Acinetobacter baumannii) 및 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis)를 들 수 있다.
임상적으로 관련이 있는 진균의 비제한적인 예로는 특히 칸디다(Candida) 속의 효모, 및 아스페르길루스(Aspergillus), 푸사리움(Fusarium), 페니실리움(Penicilium), 뉴모시스티스(Pneumocystis), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 코시디오데스(Coccidiodes), 말라세지아(Malassezia), 트리코스포론(Trichosporon), 아크레모늄(Acremonium), 리조푸스(Rhizopus), 무코르(Mucor) 및 압시디아(Absidia) 속의 진균을 들 수 있다. 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 두블리니엔시스(Candida dubliensis), 칸디다 파라프실로시스(Candida parapsilosis) 및 칸디다 크루세이(Candida krusei)를 포함한 칸디다 및 아스페르길루스가 특별한 관심의 대상이다.
임상적으로 관련이 있는 원생동물의 비제한적인 예로는 엔타모에바 히스토리티카(Entamoeba histolytica), 지아르디아 람블리아(Giardia lamblia), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 베스노이티아 베스노이티(Besnoitia besnoiti), 베스노이티아 베네티(Besnoitia bennetti), 베스노이티아 타란디(Besnoitia tarandi), 이소스포라 카니스(Isospora canis), 에이메리아 테넬라(Eimeria tenella), 크립토스포리디움 파르븀(Cryptosporidium parvum), 하몬디아 헤이도르니(Hammondia heydorni), 톡소플라스모사 곤디이(Toxoplasmosa gondii), 네오스포라 카니늄(Neospora caninum), 헤파토준 카니스(Hepatozoon canis), 플라스모듐 팔키파룸(Plasmodium falciparum), 플라스모듐 비박스(Plasmodium vivax), 플라스모듐 오발레(Plasmodium ovale), 플라스모듐 말라리아에(Plasmodium malariae) 및 플라스모듐 놀레시(Plasmodium knowlesi)를 들 수 있다.
"포유동물 세포"란 용어는 포유동물 유래의 임의의 세포를 포함한다. 세포는 임의의 포유동물, 특히 인간에서 유래할 수 있다(즉, 이는 인간 세포일 수 있음). 세포는 가축, 예를 들어 말, 원숭이, 양, 돼지, 염소 또는 소와 같은 농장 동물에서 유래할 수 있으며, 흔히 고양이, 개, 마우스, 래트, 토끼, 기니아피그 또는 친친라와 같은 애완동물로서 길러진 동물에서 유래할 수 있다. 세포는 임의의 유형의 세포일 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포는 혈액 세포, 예를 들어 호중구, 단핵구 또는 림프구와 같은 적혈구 세포(erythrocyte) 또는 백혈구 세포(leukocyte)일 수 있다. 혈소판은 본원에서 혈액 세포로 간주된다.
상기에 언급된 바와 같이, 미생물 및 포유동물 세포를 포함하는 시료는 임의의 이 같은 시료 일 수 있지만, 특히 임상 시료 또는 수의과용 시료이거나 이러한 시료에서 유래한다. 임상 시료는 인간에서 유래한 임의의 시료이다. 따라서, 이는 임의의 신체 조직, 세포 또는 유체 시료일 수 있거나, 신체에서 유래하는 임의의 시료, 예를 들어 면봉 채취 시료, 세척액, 흡입물 또는 세정액 등 일 수 있다. 적합한 임상 시료로는 혈액, 혈청 또는 혈장, 혈액 분획, 관절 체액, 소변, 정액, 타액, 배설물, 뇌척수액, 위 내용물, 질 분비물, 점액, 조직 생검 시료, 조직 분쇄물, 골수 흡입물, 뼈 분쇄물, 가래, 호흡기 시료, 상처 삼출물, 면봉 채취 시료 및 면봉 세정액, 예를 들어 코인두의 면봉 채취 시료, 기타 체액 등의 시료를 들 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 수의과용 시료는 비인간 동물, 이 경우에는 비인간 포유동물에서 유래하는 유사한 시료이다. 하기에 추가로 토의되는 바와 같이, 시료는 또한 임상용 또는 수의과용 시료의 배양액, 예를 들어 혈액 배양액일 수 있다.
임상용 또는 수의과용 시료의 특성은 감염 또는 의심되는 감염의 증상의 발현 또는 개체의 일반적인 임상 조건에 따라 결정 될 수 있다. 임의의 미생물 감염을 포함할지라도, 본 발명의 방법은 특히 패혈증 또는 의심되는 패혈증의 검출 또는 진단(또는 보다 일반적으로는 패혈증의 관리)에 특별히 활용할 수 있거나 패혈증이 의심되는 곳에 활용할 수 있다. 따라서, 상기 임상용 또는 수의과용 시료는 패혈증을 갖거나, 패혈증을 가진 것으로 의심이 되거나, 패혈증에 걸릴 위험이 있는 개체에서 유래할 수 있다. 이 같은 경우, 시료는 일반적으로 혈액 또는 혈액 유래 시료일 것이다. 전형적으로, 패혈증의 경우 시료는 혈액일 것이거나, 혈액을 포함할 것이지만, 상기에 나열된 것과 같은 기타 유형의 시료가 배제되지 않는다.
임상 시료는 배양 배지를 포함하는 배양 용기에 도입될 수 있다. 이는 당해 기술분야에 잘 알려져 있고 문헌에 광범위하게 기술되어 있는 표준 절차에 따라 실시될 수 있는 표준 단계이다. 따라서, 임상 시료는 배양하도록 할 수 있으며, 그 결과 상기 발명에 사용된 시료는 임상 시료(또는 상응하게는 수의과용 시료)의 배양액일 수 있다. 하기에는 임상 시료의 맥락에서 토의되어 있지만, 이는 유사하게는 수의과용 시료를 지칭하는 것으로 이해될 것이다.
임상 시료는 미생물 세포를 배양하기에 적합한 배양 배지를 함유하는 용기에 수집될 수 있다. 일부 실시형태에서, 임상 시료를 배양 플라스크에 도입하고, 추가의 시험(예를 들어, AST 시험) 이전에 배양 플라스크에 연속 배양을 적용하면서 즉시 또는 짧은 배양 기간 이후에 시험(예를 들어, 미생물 ID)용 플라스크로부터 임상 시료/배양 배지 혼합물의 분취액을 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 이 같은 방법은 WO 2015/189390에 기술되어 있다.
배양 용기는 미생물 세포의 배양용으로 적합한 임의의 용기 또는 컨테이너, 예를 들어, 플레이트, 웰, 튜브, 병, 플라스크 등을 포함할 수 있다. 편의 상, 임상 시료가 혈액 또는 혈액 유래 시료인 경우, 배양 용기는 혈액 배양 플라스크이거나, 실제로는 혈액 샘플링용, 특히 미생물을 검출하기 위한 배양 목적으로 알려져 있는 임의의 튜브, 플라스크 또는 병이다. 따라서, 시료는 혈액 배양 시료일 수 있다.
편의 상, 배양 용기에는 그 내부에 이미 담겨 있는 배양 배지가 제공될 수 있다. 그러나, 배양 배지는 임상 시료가 첨가되기 이전, 동시 또는 이후에 배양 용기 내로 별도로 제공 및 도입될 수 있다.
배양 배지는 임의의 적합한 배지일 수 있으며, 임상 시료 및/또는 의심되는 미생물의 특성 및/또는 시료가 유래하는 개체의 임상 조건 등에 따라 선택될 수 있다. 이 같은 용도에 적합한 많은 상이한 미생물 배양 배지가 알려져 있다. 전형적으로, 배양 배지는 당해 기술분야에 알려져 있는 바와 같이 미생물의 빠른 성장을 조장하기에 충분한 영양분을 함유할 수 있다. 많은 경우, 적절한 배지는 복합 성장 배지로서, 당해 기술분야에 알려져 있는 다목적 성장 배지뿐만 아니라 뮬러-힌튼(MH) 배지, MH - 난배양(MHF) 배지, 용균된 말 혈액이 보충된 뮬러-힌튼 배지, 라이소제니 브로스(LB), 2X YT 배지, 트립톤 처리 대두 배지(tryptic soy broth; TSB), 콜럼비아 브로스(Columbia broth), 뇌/심장 침출(BHI) 브로스 및 브루셀라 브로스(Brucella broth)와 같은 배지를 포함하며, 특정 성장 인자 또는 보충물이 첨가된 것을 포함할 수 있다. 배양액을 교반하거나 교반하지 않을 수 있다. 배양 배지는 액체, 고체 및 현탁액 등을 포함하는 다양한 형태로 이용 가능하며, 이들 중 임의의 것이 사용될 수 있지만, 편의 상 배지는 액체 배지일 것이다. 배양 용기가 즉시 사용 가능한 혈액 배양 플라스크인 경우, 상기에서 기술된 바와 같이 이들 용기는 특히 매우 다양한 미생물이 성장하도록 개질된 전용 배지를 함유할 수 있다. 전형적으로, 제조사에 의해 혈액 배양 플라스크 내에 공급된 배지는 시험 개체로부터 채취된 임상 시료 내에 존재하는 임의의 항생제의 존재를 중화시키기 위해 약제 또는 첨가제를 함유할 것이다. 이 같은 중화제를 함유하거나 함유하지 않은 플라스크가 사용될 수 있으며, 중화제는 필요한 경우에 배양 용기에 첨가될 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 임상 시료는 혈액 또는 혈액 유래 시료이고, 혈액 배양 플라스크(BCF) 내에 수집된다. 혈액 배양 플라스크의 예로는 BacT/ALERT(바이오메리(Biomerieux)) 혈액 배양 플라스크, Bactec 혈액 배양 플라스크(벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)) 또는 VersaTrek 혈액 배양 플라스크(써모 피셔(Thermo Fisher)), 또는 실제로는 혈액 샘플링용, 특히 미생물을 검출하기 위한 배양 목적으로 알려져 있는 임의의 튜브, 플라스크 또는 병을 들 수 있다.
이 같은 혈액 배양 플라스크 등은 수지를 함유할 수 있으며, 따라서 방법은, 예를 들어 여과에 의해 시료로부터 수지를 제거하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 이 같은 수지 전여과 단계는 상기 방법의 단계 (b)를 실시하기 전에 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 시료는 배양 배지 중의 임상 시료를 포함할 수 있다. 게다가, 시료는 임상 시료 배양액(즉, 소정의 기간 동안 배양된 임상 시료)일 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 방법에 적용되는 시료는 수집 또는 제조되는 복합 시료의 일부일 수 있는 것으로 알게 될 것이다. 따라서, 하나의 실시형태에서 본 발명의 방법의 시료는 배양 기간(즉, 배양) 이전, 동안 또는 이후이든지 간에 시료, 예를 들어 임상 시료 또는 기타 시료를 함유하는 배양 용기(플라스크)의 내용물로부터 채취 또는 제거된 분취액(예를 들어, 시험 분취액)일 수 있다.
따라서, 하나의 실시형태에서 단계 (a)에서 제공된 시료는 (예를 들어, 임상 시료 배양액 시스템에서) 미생물 성장에 대해 양성으로 나타나 있는 임상 시료의 배양액일 수 있다. 따라서, 이는 양성 혈액 배양 플라스크일 수 있다. 그러나, 본 발명의 방법에 따르면 임상 시료 배양액이 양성으로 나타날 필요는 없으며, 이 같은 임상 배양 시료는 양성으로 나타나기 이전 단계에서 사용될 수 있으며, 예를 들어 이것이 양성으로 나타나기에 필요한 기간보다 짧은 기간 동안 배양된 경우 사용될 수 있다. 따라서, 시료는 비-양성 혈액 배양 플라스크(예를 들어, 플라스크가 양성으로 나타나도록 요구되는 것보다 적은 미생물 세포를 함유하거나 보다 짧은 기간 동안 배양된 혈액 배양 플라스크)일 수 있다. 실제로, 일부 임상 시료의 경우에 임상 시료 배양액의 시료는 임의의 배양이 이루어지기 전(예를 들어, 임상 시료 배양액이 확립된 경우)에 본 발명의 방법에서 인출 및 사용될 수 있다.
특정 미생물은 배양하기 어려우며, 임상적 맥락에서 이 같은 미생물은 전통적이거나 통상적인 방법, 예를 들어 배양 단계에 기반을 둔 임상적 검출 또는 진단 방법에서 검출되지 않을 수 있는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 특정 박테리아는 진단 방법에서 흔히 사용되는 고체 배지에서 성장하기 어렵다. 따라서, 임상적으로 관련이 있는 미생물의 개수는 현재 전형적으로 시험되고 분석되고 있는 것보다 훨씬 초과할 수 있다. 여전히 표준 배양 방법을 이용 불가능한 이 같은 "배양 불가능한" 미생물(예를 들어, 박테리아)은, 예를 들어 다양한 보충물 또는 첨가제, 예를 들어 혈청 또는 기타 혈액 성분 또는 BHI 등이 있는 특정 액체 배지에서 성장할 수 있다. 그러나, 이 같은 보충물 또는 첨가제는 농도 결정 방법을 방해하여, 제거될 필요가 있을 수 있다. 본원에 개시된 방법은 이 같은 상황에서 적용 가능성을 가질 수 있으며, 따라서 시료는 이 같은 미생물 배양액 시료일 수 있다. 미생물은 배양이 이루어진 임상용 또는 수의과용 시료(예를 들어, 보충물 또는 첨가제를 함유하는 전용 배양 배지) 내에 존재할 수 있다. 그러나, 본원에 개시된 다른 실시형태에서 배양액은 미생물 단리체(예를 들어, 다른 배양액으로부터의 단리체)일 수 있으며, 이로 인해 이 같은 상황에서 시료는 필수적으로 포유동물 세포를 포함하지 않을 수 있다. 이 같은 시료는 본원에 개시된 바와 같이 현탁액 내의 미생물의 농도를 결정하기 위한 방법(즉, 미생물 및 포유동물 세포를 함유하는 시료를 제공하는 단계 및 이로부터 미생물을 회수하는 단계를 포함하지 않는 방법)의 맥락에서 사용될 수 있다.
미생물 및 포유동물 세포를 포함하는 시료로부터 미생물을 회수하는 단계를 포함하는 방법에서, 시료는 완충 용액, 세정제 및 하나 이상의 프로테아제와 접촉한다. 이들 시약과 시료가 접촉하면 시료 내에 존재하는 포유동물 세포의 용균이 야기된다. 시약은 포유동물 세포의 용균을 야기하지만, 미생물 세포의 용균을 야기하지 않는다. 특히, 시약은 박테리아 세포의 용균을 야기하지 않는다. 바람직하게는, 시약은 또한 진균 세포의 용균을 야기하지 않으며; 바람직하게는 시약은 또한 비-포유동물 진핵 미생물 세포, 예를 들어 원생생물의 용균을 야기하지 않는다. 시약은 일반적으로 포유동물 세포막을 가용화함으로써 작용한다. 비-미생물 세포의 선택적인 용균으로 인해 미생물 세포가 시료 내에 존재할 수 있는 기타 성분으로부터 분리되도록 한다. "용균하기"이란 용어는 세포의 파괴를 의미한다. 특히, 세포는 파괴되어 세포 내용물을 방출한다. "선택적으로 용균하기" 또는 "선택적인 용균"이란 용어는 시료 내에 존재하는 세포의 특정 하위세트의 용균을 의미한다. 현재의 경우, 임상용 또는 수의과용 시료 내에 존재하는 미생물 세포를 실질적으로 용균하지 않으면서 비-미생물 세포만을 선택적으로 용균하거나, 보다 구체적으로는 임상용 또는 수의과용 시료 내에 존재하는 시험 중인 개체에서 유래하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 선택적으로 용균시키는 것이 바람직하다. 더욱이, 본 발명의 특정 방법에 따르면 시료로부터 수득된 미생물 세포가 성장하고 재생할 수 있는 것이 바람직하며(성장은 항균제 감수성을 결정하기 위해 요구됨), 따라서 성장 및/또는 (생존능을) 재생하는 미생물 세포의 능력은 시료 내에 존재하는 비-미생물 세포 또는 시험 개체 유래 세포의 선택적인 용균에 의해 영향을 받지 않는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 시료 내에 존재하는 모든(즉, 100%) 또는 실질적으로 모든 미생물 세포는 포유동물 세포의 선택적 용균 이후에 온전한 상태로 나타나 있거나, 보다 구체적으로는 생존 가능한 상태로 남아 있으며, 시료 내의 미생물 세포 중 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90%가 선택적인 용균 단계 이후에 온전한 상태 또는 생존 가능한 상태로 남아 있는 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명의 방법에서 회수된 미생물 시료 내의 온전하거나 생존 가능한 미생물의 농도의 결정이 요구됨에 따라 미생물 세포의 적어도 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% 또는 10%가 생존 가능한 상태로 남아 있는 이벤트(event)에서도 여전히 항생제 감수성을 평가할 수 있다. 따라서, 이 같은 방법은 포유동물 세포의 선택적 용균 이후에 미생물의 임의의 특정 생존능 수준으로 제한되지 않는다.
완충 용액은 적어도 pH 6와 최대 pH 9의 pH를 갖는다. 즉, 완충 용액은 pH 6 내지 pH 9 범위의 pH를 갖는다. 특정 실시형태에서, 완충 용액은 pH 6.0 내지 pH 8.5, pH 6 내지 pH 8, pH 6.5 내지 pH 8.0 또는 pH 7 내지 pH 8 범위의 pH를 갖는다. 최적으로는, 완충 용액은 약 7.5의 pH를 갖는다.
완충 용액은 표적 세포(즉, 포유동물 세포)의 용균을 증가시키기 위한 카오트로프(chaotrope) 또는 카오트로픽제(chaotropic agent), 예를 들어 우레아, 구아니디늄 하이드로클로라이드, 과염소산리튬, 아세트산리튬, 페놀 또는 티오우레아를 포함할 수 있다. 그러나, 특정 실시형태에서 완충 용액은 카오트로프 또는 카오트로픽제를 포함하지 않는다. 특정 실시형태에서, 이 같은 약제는 시료로부터 미생물의 회수 과정 동안에 사용되지 않을 수 있고/거나(보다 구체적으로는, 선택적인 용균 단계 동안에 사용되지 않음), 본 발명의 농도 결정 방법의 과정 동안에 사용되지 않을 수 있다.
완충 용액은 바람직하게는 알코올을 포함하지 않는다. 완충 용액은 환원제(예를 들어, 2-메르캅토에탄올 또는 디티오트레이톨(DTT)), 안정화제(예를 들어, 마그네슘 또는 피루빈산염), 습윤제 및/또는 킬레이트제(예를 들어, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA))를 더 포함할 수 있다.
추가적으로, 완충 용액은 NaCl, KCl, MgCl2, KH2PO4, K2HPO4, Na2HPO4 및 NaH2PO4를 포함하는 임의의 적합한 염을 포함할 수 있다. 이 같은 염은 포유동물 세포 용균 또는 미생물 세포의 후속적인 처리에 도움이 될 수 있다. 염이 존재하는 경우 사용된 완충제 및 시료의 부피와 같은 인자에 따라 임의의 적합한 농도, 예를 들어 적어도 0.01 M, 0.02 M, 0.05 M, 0.1 M, 0.2 M, 0.5 M, 1 M, 2 M 또는 5 M의 농도로 존재할 수 있다.
특정 실시형태에서, 완충 용액은 PBS(인산 완충 식염수) 완충제이다. PBS는 인산수소이나트륨(Na2HPO4), NaCl 및 선택적으로는 KCl 및/또는 제1인산칼륨(KH2PO4)을 포함한다. PBS는 제조사, 예를 들어 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) 또는 써모 피셔 사이언티픽으로부터 구입 가능하거나, 이의 구성성분으로부터 용이하게 제조될 수 있다. 1x PBS에 대한 예시적인 제조법은 137 mM의 NaCl, 2.7 mM의 KCl, 10 mM의 Na2HPO4, 1.8 mM의 KH2HPO4이며; pH는 NaOH 또는 HCl를 이용하여 각각 상향 또는 하향 조절될 수 있다.
시료에 첨가된 완충 용액은 이의 사용 농도보다 높은 농도일 수 있으며, 예를 들어 첨가된 완충 용액은 5x 또는 10x 농도일 수 있고, 시료와 혼합할 때 이를 이의 사용을 위한 농도까지 희석된다.
세정제는 이온성 세정제, 비이온성 세정제 또는 양쪽성 세정제일 수 있다. 이온성 세정제는 양성(양이온성 세정제) 또는 음성(음이온성 세정제)일 수 있는 전하를 갖고 있다. 양쪽성 세정제는 다중의 하전된 기를 갖고 있으며; 일반적으로 양쪽성 세정제는 동일한 개수의 양전하 및 음전하를 가지며, 따라서 순 영전하(net zero charge)를 갖는다. 비이온성 세정제는 하전되지 않는 친수성 헤드기(headgroup)를 갖는다.
사용 가능한 예시적인 이온성 세정제로는 알킬벤젠설포네이트, N-라우로일사르코신, 디옥시콜산(또는 이의 염, 예를 들어 데옥시콜산나트륨), 세트리모늄브로마이드(CTAB) 및 소듐 도데실 설페이트(SDS)를 들 수 있다.
사용 가능한 예시적인 양쪽성 세정제로는 CHAPS, 설포베타인(예를 들어, SB 3-10 및 SB 3-12), 아미도설포베타인(예를 들어, ASB-14 및 ASB-16) 및 C7BzO를 들 수 있다.
바람직하게는, 세정제는 비이온성 세정제이다. 사용 가능한 예시적인 비이온성 세정제로는 트리톤 세정제 시리즈(예를 들어, 트리톤 X100-R 및 트리톤 X-114), NP-40, Genapol C-100, Genapol X-100, Igepal CA 630, Arlasolve 200, Brij 세정제 시리즈(예를 들어, Brij-O10, Brij-97, Brij-98, Brij-58 및 Brij-35), 옥틸 β-D-글루코피라노시드, 폴리소르베이트(예를 들어, 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80) 및 Pluronic 세정제 시리즈(예를 들어, Pluronic L64 및 Pluronic P84)를 들 수 있다. 하나의 실시형태에서, 폴리옥시에틸렌 세정제가 사용될 수 있다. 폴리옥시에틸렌 세정제는 C12-18/E9-10 구조를 포함할 수 있으며, 이때 C12-18은 12개 내지 18개의 탄소 원자의 탄소 사슬 길이를 나타내고, E9-10은 9개 내지 10개의 옥시에틸렌 친수성 헤드기를 나타낸다. 특정 실시형태에서, 세정제는, 예를 들어 시그마-알드리치(제품 번호: P6136)로부터 수득될 수 있는 Brij-O10이다. Brij-O10은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00001
상기 식에서, n은 약 10, 바람직하게는 10이다.
세정제는 적합한 혼합 농도(resultant concentration)까지 첨가된다. 이 같은 농도는 당업자에게 알려져 있거나, 임의의 선택된 세정제의 경우에 통상의 최적화에 의해 확인될 수 있다. 특정 실시형태에서, 세정제는 0.1% 내지 5%(w/v), 예를 들어 0.1%와 1%(w/v) 사이의 농도(즉, 세정제를 시료에 첨가한 이후의 혼합 농도)로 시료와 접촉하게 된다. 특정 실시형태에서, 세정제는 약 0.45%(w/v)의 농도로 시료와 접촉하게 된다.
프로테아제는 임의의 적합한 프로테아제일 수 있다. 이는 엔도펩티다아제(endopeptidase) 또는 엑소펩티다아제(exopeptidase)일 수 있으며, 이는 임의의 단백질 가수분해 기구를 이용할 수 있으며, 예를 들어 이는 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파틸 프로테아제, 메탈로프로테아제 등일 수 있다. 본 발명의 방법에 사용 가능한 예시적인 프로테아제 효소로는 XXIII형 프로테이나아제, 프로테이나아제 K, 펩신, 트립신, 케모트립신, 파파인, 엘라스타아제(elastase) 및 카텝신(cathepsin)을 들 수 있다. 바람직하게는, 프로테아제는 엔도펩티다아제이다. 특정 실시형태에서, 프로테아제는 프로테이나아제 K이다. 당업자라면 사용된 시료, 프로테아제 등에 따라 본 발명의 방법에서 사용될 프로테아제의 적절한 농도를 결정할 수 있다. 예를 들어, 프로테이나아제 K는 20 ㎍/㎖ 내지 200 ㎍/㎖, 예를 들어, 50 ㎍/㎖ 내지 150 ㎍/㎖ 또는 50 ㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖ 범위의 최종 농도로 사용될 수 있다. 바람직하게는, 프로테이나아제 K는 약 50 ㎍/㎖ 내지 80 ㎍/㎖의 최종 농도로 사용된다.
또한 시료는 단계 (b)에서의 포유동물 세포의 용균을 도와주기 위한 추가적인 효소, 예를 들어 뉴클레아제 효소(예를 들어, DNase 또는 RNase), 리파아제, 뉴라미니다아제(neuraminidase)와 같은 글리코시드 하이드롤라아제(glycoside hydrolase), 아밀라아제 등과 접촉할 수 있다.
단계 (b)에서, 시료는 완충 용액, 세정제 및 적어도 하나의 프로테아제와 개별적으로 접촉할 수 있다. 대안적으로, 상기 3개의 성분(완충제, 세정제, 프로테아제)은 시료와의 접촉 이전에 하나 이상의 조합으로 제조될 수 있다(예를 들어, 결합 조성으로 예비 제조되거나 사용 시에 사용됨). "접촉"이란 용어는 본원에서 임의의 순서로 시약과 시약을 접촉시키는 임의의 수단을 포함하는 것으로 광범위하게 사용된다. 따라서, 시료는 성분(예를 들어, 반응 용기에 이미 존재하는 성분)에 첨가될 수 있거나, 성분이 시료(예를 들어, 반응 용기에 이미 존재하는 시료)에 첨가될 수 있다. 3개의 성분 중 3개 또는 임의의 2개의 성분을 결합 조성물로서 예비 제조하여 시료와 접촉할 수 있거나, 시료와 접촉하기 전에 성분을 순차적으로 (예를 들어, 반응 용기)에 첨가할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 세정제는 상술한 완충 용액에 용해되어 있는 세정제를 포함하는 용균 완충제 내에 제공된다. 이어서, 적어도 하나의 프로테아제는 용균 완충제에 첨가될 수 있으며, 얻어진 조성물은 시료에 첨가되어(또는 그 반대로 첨가되어)시료가 완충 용액, 세정제 및 프로테아제와 동시에 접촉하게 된다. 특정 실시형태에서, 용균 완충제는 PBS(pH 7.5) 및 0.45%(w/v)의 Brij-O10을 포함한다. 특정 실시형태에서, 시료는 (i) PBS(pH 7.5) 및 0.45%(w/v)의 Brij-O10을 포함하는 용균 완충제 및 (ii) 프로테이나아제 K를 포함하는 조성물과 접촉한다.
단계 (b)의 접촉(즉, 완충 용액, 세정제 및 하나 이상의 프로테아제와 시료 접촉(또는 배양)은 적합한 시간 동안 수행된다. 예를 들어, 접촉은 최대 1시간, 예를 들어, 최대 30분, 최대 20분 또는 최대 10분 동안 이루어질 수 있다. 접촉은 적합한 온도, 예를 들어 적어도 4℃, 예를 들어 20℃ 내지 40℃, 예를 들어 25℃ 내지 37℃의 온도에서 수행된다. 분취액은 5분 내지 20분, 바람직하게는 5분 내지 10분 동안 가열될 수 있다.
단계 (b)에서 수득된 혼합물은 여과된다. 여과 과정에 의해 온전한 미생물 세포, 포유동물 세포의 용균 생성물 및 선택적으로는 시료 내에 존재하는 임의의 기타 잔해 또는 물질의 분리가 허용된다. 온전한 미생물 세포는 포유동물 세포의 용균 생성물이 폐기를 위해 통과하는 동안에 필터에 포획되며, 따라서 용균된 포유동물 세포가 현탁액으로부터 제거된다. 여과는 임의의 미생물 세포를 포획하기 위해 적합한 공극 크기를 포함하는 필터를 이용하여 수행된다. 필터는 0.5 ㎛ 이하의 공극 크기를 가질 수 있으며; 바람직하게는 필터는 0.25 ㎛ 이하의 공극 크기를 갖는다. 필터는 임의의 적합한 재료로 만들어질 수 있으며, 예를 들어 다수의 적절한 필터는 PTFE(폴리테트라플루오로에틸렌)로 만들어진다. 적합한 필터는, 예를 들어 메르크(Merck)로부터 상업적으로 구매할 수 있다. 일부 실시형태에서 사용된 필터는 필터가 미생물에 의해 막히는 것을 방지하기 위해 이를 통해 여과되는 시료의 부피에 비해 넓은 표면적을 갖는다. 예를 들어, 필터는 30 ㎜ 내지 100 ㎜, 30 ㎜ 내지 80 ㎜ 또는 30 ㎜ 내지 75 ㎜(예를 들어, 50 ㎜)의 크기 범위를 가질 수 있다. 그러나, 임의의 크기, 예를 들어 4 ㎜ 내지 100 ㎜, 4 ㎜ 내지 80 ㎜ 또는 4 ㎜ 내지 75 ㎜ 범위의 크기를 갖는 필터가 사용될 있다. 이는 시료의 특성 및 시료 내의 미생물의 양에 의존할 수 있다. 예를 들어, 양성 혈액 배양액은 임상적 소변 시료보다 훨씬 많은 미생물을 함유할 수 있으며, 이는 보다 큰 크기의 필터를 사용하는데 유리할 수 있다. 적절한 필터 크기는 통상의 시행착오에 의해 결정될 수 있다.
여과 이후, 단리된 미생물 세포(즉, 필터 상 또는 내에 포획된 세포)를 세척하여 잔류 용균 완충제, 포유동물 세포 잔해 등을 제거할 수 있다. 세척이 실시되는 경우 단계 (c)와 단계 (d) 사이에서 이루어진다. 세척은 필터를 통해 세척액 완충제를 흘러 보냄으로써 수행될 수 있다. 필터는 당업자에게 알려져 있는 바와 같이 임의의 적절한 세척액 완충제로 세척될 수 있다. 적합한 세척액 완충제로는, 예를 들어 상기에서 기술된 바와 같은 완충 용액, 예를 들어 PBS를 들 수 있다. 특정 실시형태에서, 세척액 완충제는 상기에서 기술된 바와 같은 완충 용액일 수 있으며, 특정 실시형태에서는 단계 (b)에서 사용된 완충 용액과 동일할 수 있다. 그러나, 기타 실시형태에서 세척액 완충제는 프로테아제(선택적으로는 세정제를 포함하지 않음) 또는 세정제(선택적으로는 프로테아제를 포함하지 않음)를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 세척액 완충제는 카오트로프를 포함할 수 있는 반면, 기타 실시형태에서 이는, 예를 들어 상술한 바와 같이 카오트로프를 포함하지 않을 수 있다. 또 다른 추가의 실시형태에서, 세척액 완충제는 상술한 바와 같이 배양 배지일 수 있다. 특정 실시형태에서, 세척액 완충제는, 예를 들어 시그마-알드리치로부터 구입할 수 있는 양이온으로 조절된 뮬러-힌튼 브로스(CAMHB)이다. CAMHB는 뮬러-힌튼 브로스 2로서 대안적으로 알려져 있다. 필터(단리된 미생물 세포를 포함함)는, 필터로부터 포유동물 세포 잔해를 제거하는데 요구되는 바와 같이, 1회 이상 세척될 수 있으며, 예를 들어 필터는 2회, 3회, 4회 또는 5회 또는 그 이상 세척될 수 있다.
여과 및 선택적인 세척 이후, 필터로부터 미생물 세포를 회수한다. 미생물 세포의 회수는 세포를 액체에 재현탁하여 회수된 미생물 현탁액을 제공하는 단계를 포함한다. 액체를 이용하여 반복적으로 피펫팅(pipetting)함으로써 필터 표면으로부터 세포를 재현탁할 수 있다. 본 발명의 하나의 바람직한 실시형태에서, 미생물 세포를 재현탁하기 위해 필터를 통해 (즉, 여과액이 여과되는 반대 방방으로) 액체를 역류(back-flushing)시킨다. 다른 실시형태에서, 미생물은 필터를 통해 다시 인출된 세척 용액의 마지막 분획에서 회수된다. 대안적으로, 미생물 세포는 전체 필터를 이용하여, 예를 들어 액체를 필터에 첨가하거나 필터를 용기 내의 액체와 접촉시킴으로써 회수될 수 있다.
미생물 세포가 재현탁되는 액체는 임의의 적합한 액체, 예를 들어 완충제 또는 배양 배지일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 미생물 세포는 배양 배지(즉, 미생물 배양에 적합한 액체 성장 배지)에 재현탁된다. 배양 배지가 미생물 세포를 재현탁하기 위해 사용되는 경우, 배양 배지는 일반적으로 말해 AST 검정에 사용하기 위해 승인 또는 인정된 배양 배지이다. 하나의 실시형태에서, 이는 뮬러-힌튼(MH) 배지 또는 뮬러-힌튼 난배양(MHF) 배지이거나 양이온으로 조절된 뮬러-힌튼 배지(CAMHB)이다. 비표준 AST의 경우, 흔히 알려져 있는 임의의 기타 배지가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. '비표준' 배양 배지를 이용하여 AST 검정을 수행함으로써 수득된 MIC 값을 조절(보정)하여 표준 AST 결과를 얻을 수 있다. 기타 실시형태에서, 재현탁 액체는 PBS 또는 기타 완충제일 수 있다. 추가의 실시형태에서, 재현탁 액체는 물(예를 들어, 수돗물, 지하수 또는 멸균수)이 아니다. 더욱이, 특정 실시형태에서 미생물 세포가 재현탁되는 액체는 단백질 가수분해 효소(예를 들어, 파파인, 트립신), 뉴트라아제(neutrase), 서브틸리신(subtilisin) 또는 서브틸리신 유사 효소, 또는 로자임(Rhozyme)을 포함하지 않을 수 있다.
미생물 세포가 회수되고 회수된 미생물 시료가 수득되면, 회수된 미생물 시료 내에 존재하는 미생물 세포의 농도가 본 발명의 방법에 따라 결정된다. 하나의 특정 실시형태에서, 상기에 언급된 바와 같이, 이는 특히 AST 검정을 수행할 목적이며, 즉 미생물의 농도는 AST 검정이 수행되기 전에 결정될 수 있다.
유리하게는, 회수된 미생물 시료를 이용하여 AST 검정을 수행하면 보다 신속한 AST 검정이 수행될 수 있다. 특히, 임상 시료 또는 임상 시료 배양액으로부터 직접 미생물 세포를 회수하여 회수된 미생물 시료를 수득함으로써 임의의 오염물질이 없는 균질한 시료가 제공된다.
특정 시료, 예를 들어 식품 또는 환경 시료는 특히 시료 내의 온전한 미생물의 농도를 결정하기 전에 제거되는 것이 바람직할 수 있는 입자성 물질을 포함할 수 있다. 추가적으로, 상업적으로 이용 가능한 특정 배양 용기(예를 들어, 혈액 배양 플라스크)에는 수지 비드가 제공되며, 이때 수지는 배양액에서의 미생물 세포의 성장을 용이하게 하기 위해 임상 시료 내에 존재하는 임의의 항균제(즉, 시험 중인 개체에 투여되는 항균제)의 효과를 중화시킨다. 따라서, 바람직한 실시형태에서 시료를 여과하여 시료 내에 존재할 수 있는 임의의 큰 입자를 제거할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 여과 단계는 실질적으로 시험 분취액으로부터 임의의 세포성 물질을 제거하지 못하지만 상기 입자를 제거할 수 있는 공극 크기, 예를 들어 적어도 100 ㎛, 200 ㎛ 또는 300 ㎛의 공극 크기를 갖지만 최대 1000 ㎛일 수 있는 공극 크기를 갖는 필터를 이용할 것이다. 이 같은 여과 단계는 본 발명의 방법의 임의의 시점에 이루어질 수 있다. 특정 실시형태에서, 이 같은 단계는 임의의 이 같은 임자가 이미지화되는 것을 피하기 위해 단계 (e)(iv)에서 현탁액/염색제 혼합물을 이미지화하기 전에 이루어질 수 있다. 따라서, 이 같은 단계는 단계 (e)(iii) 또는 단계 (e)(i) 이전에 이루어질 수 있으며, 보다 구체적으로는 단계 (e) 이전에 이루어질 수 있다. 보다 구체적으로는, 이 같은 단계는 단계 (c) 또는 단계 (b) 이전에 이루어질 수 있으며, 더욱 더 구체적으로는 단계 (a) 이전에 이루어질 수 있다. 특정 실시형태에서, 단계 (a)에서 제공된 시료에는 입자성 물질을 제거하기 위해 이 같은 여과 단계가 적용될 수 있었다. 현탁액 내의 온전한 미생물 세포의 농도를 결정하기 위해, 먼저 현탁액을 분취한다. 즉, 이를 하나 이상의 보다 작은 부분/시료로 나눈다. 현탁액의 분취액(즉, 부분)은 먼저 (단계 (e)(i)에서) 처리하여 염색 과정을 향상시킨다. 처리(또는 "전처리") 단계는 분취액을 알코올, 예를 들어 에탄올과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 기타 적합한 알코올로는 메탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올(임의의 이성질체 형태를 가짐) 등을 들 수 있다. 당업자라면 적절한 알코올을 선택할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 분취액은 에탄올과 접촉한다. 특정 실시형태에서, 분취액은 알코올과 접촉하여 25% 내지 45%(v/v)의 알코올, 예를 들어 25% 내지 35%(v/v)의 알코올, 30% 내지 40%(v/v)의 알코올 또는 30% 내지 35%(v/v)의 알코올 (예를 들어, 에탄올)을 포함하는 혼합물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 분취액은 알코올과 접촉하여 30%(v/v)의 알코올(예를 들어, 에탄올)을 포함하는 혼합물을 제공한다. 다른 특정 실시형태에서, 분취액은 알코올과 접촉하여 35%(v/v)의 알코올(예를 들어, 에탄올)을 포함하는 혼합물을 제공한다.
대안적인 실시형태에서, 처리 단계는 현탁액의 분취액을 가열하는 단계를 포함한다. 분취액은 50℃ 내지 90℃, 예를 들어 60℃ 내지 80℃ 또는 65℃ 내지 75℃ 범위의 온도까지 가열될 수 있다. 특정 실시형태에서, 분취액은 약 70℃의 온도까지 가열된다. 분취액은 사용된 온도에 적합한 양의 시간 동안 가열될 수 있으며, 즉 선택된 온도가 높을수록 요구되는 가열 시간을 짧다(선택된 온도가 낮을수록 요구되는 가열 시간을 길다). 실시형태에서, 분취액은 30초 내지 최대 20분 또는 최대 10분 동안 가열된다. 따라서, 분취액은 0.5분 내지 20분 또는 0.5분 내지 15분 또는 0.5분 내지 10분(적절한 온도에서의 시간으로 측정된 시간, 즉 램핑 시간(ramping time)은 아님) 동안 가열될 수 있다. 당업자라면 주어진 가열 온도에 대해 적절한 가열 시간을 선택할 수 있다. 가열은, 예를 들어 배양기, 가열 블록, 오븐, 열 순환기 또는 임의의 기타 적합한 수단 내에서 수행될 수 있다.
특정 실시형태에서, 알코올에 의한 처리는 동시에 또는 별도로(예를 들어, 순차적으로) 열처리 단계와 결합될 수 있다.
다른 대안적인 실시형태에서, 처리 단계는 현탁액의 분취액을 세정제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 적합한 세정제는 단계 (b)의 용균 완충제와 관련하여 상기에 기술되어 있다. 미생물 세포 현탁액이 단계 (e)(i)에서 세정제와 접촉하는 경우, 단계 (b)에서 기술된 바와 같은 세정제가 사용될 수 있지만, 단계 (b)에서 사용된 것보다 훨씬 높은 농도로 사용되었다. 따라서, 단계 (b)의 완충 용액 내의 세정제가, 예를 들어 0.1% 내지 5%(w/v), 예를 들어 0.1%와 1%(w/v) 사이의 농도로 존재할 수 있는 반면, 상기에서 기술된 바와 같이, 단계 (e)(i)에서 사용된 세정제는 이보다 훨씬 높은 농도, 바람직하게는 5배 내지 20배 더 높은 농도, 예를 들어 10배 더 높은 농도로 사용된다. 세정제는 단계 (e)(i)에서 0.5% 내지 50%(w/v), 바람직하게는 1% 내지 10%(w/v), 예를 들어 약 5%(w/v)의 농도로 사용될 수 있다.
현탁액의 분취액이 알코올 또는 세정제로 처리되는 실시형태에서, 처리는 실온 또는 대략 실온에서 이루어질 수 있으며, 예를 들어 처리는 20℃ 내지 37℃, 예를 들어, 20℃ 내지 30℃, 25℃ 내지 30℃ 또는 30℃ 내지 35℃ 범위의 온도에서 이루어질 수 있다. 대안적으로, 상기에 언급된 바와 같이, 이는 가열 단계와 결합될 수 있다. 접촉은 선택된 농도의 알코올 또는 세정제와 선택된 온도에서 배양 도중에 수행될 수 있다. 배양은 30초 내지 최대 1시간, 예를 들어 최대 30분, 최대 20분, 최대 10분 또는 최대 5분 동안 지속될 수 있다. 정확한 시간은 시료, 시료 내에 존재하는 미생물, 및/또는 열처리 단계의 포함 여부에 의존할 것이다. 바람직한 실시형태에서, 배양은 5분 내지 10분, 바람직하게는 약 5분 동안 지속된다.
특정 실시형태에서, 처리 단계는 시료를 알데히드 또는 케톤과 접촉시키는 단계를 포함하지 않는다. 특히, 처리 단계는 시료를 포름알데히드, 에탄올, 프로파날(propanal), 프로파논, 부타날(butanal) 또는 부타논과 접촉시키는 단계를 포함하지 않을 수 있다. 또 다른 추가의 실시형태에서, 처리 단계는 시료를 메탄산, 에탄산, 옥살산, 프로판산, 말론산, 부탄산 또는 숙신산과 같은 카르복실산과 접촉시키는 단계를 포함하지 않을 수 있다. 추가의 특정 실시형태에서, 처리 단계는 열처리 단계와 함께 및/또는 시료를 알코올 및/또는 세정제와 접촉시키는 단계와 함께 시료를 알데히드, 케톤 또는 카르복실산(예를 들어, 상기에 나열된 바와 같음)과 접촉시키는 단계를 포함하지 않는다. 또 다른 추가의 실시형태에서, 처리 단계는 시료를 항생제, 특히 박테리아 성장을 허용할 수 있지만, 세포 분열을 억제할 수 있는 항생제(예를 들어, 클로람페니콜 및 페니실린(예를 들어, 암피실린, 벤자임 페니실린, 클록사실린(cloxacillin), 디클록사실린) 또는 이들의 조합)와 접촉시키는 단계를 포함하지 않는다.
본 발명의 방법에 의해 분석되는 시료는 매우 다양한 미생물을 가능한 상이한 농도로 함유할 수 있으며, 이 같은 농도 범위가 정확하게 결정되도록 하기 위해 단일 보정 곡선의 준비가 필요하지 않을 수 있다. 따라서, 단계 (e)(iv)에서 결정된 대상의 개수에 대한 이미지 분석 값이 소정의 보정 곡선의 범위 내에 있도록 본 발명의 방법을 수행하는 과정 동안에 미생물을 함유하는 시료의 분취액을 희석하는 것이 유리할 수 있다.
더욱이, 현탁액의 특성 및/또는 처리에 따라 시료(즉, 단계 (e)에서의 농도를 결정하기 위해 채취된 현탁액의 분취액)를 희석하여 농도 결정이 수행될 수 있도록 하는 것이 바람직할 수 있으며, 예를 들어 농도 결정 방법을 방해할 수 있는 오염물질 또는 성분을 희석하는 것(또는 이들의 양을 최소화 또는 감소시키는 것)이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 특정 배지(예를 들어, 뮬러-힌튼 배지)는 형광 결정을 방해할 수 있는 성분을 함유하며, 시료가 이 같은 배지를 함유하는 배양 시료인 경우 또는 회수된 미생물이 이 같은 배지에 재현탁되는 경우, 희석 단계가 바람직할 수 있다. 유사하게, 알코올 또는 세정제를 이용하여 처리가 수행되는 경우, 희석 단계가 바람직할 수 있다. 대안적으로, 미생물이 완충제, 예를 들어 PBS 중의 필터로부터 재현탁되는 경우, 희석 단계 또는 보다 구체적으로는 초기 희석 단계는 필수적인 것은 아닐 수 있다. 이는 미생물이 현탁액 내에 낮은 농도(적은 양)로 존재하는 방법의 맥락에서 적절할 수 있으며, 이 같은 상황에서 회수된 미생물은 PBS와 같은 완충액에 재현탁되는 것이 바람직할 수 있다.
희석이 이루어져야 하는 경우, 즉 단계 (e)(ii)에서 시료의 분취액을 희석하여 희석된 분취액을 희석 값으로 제공하는 경우, 이 같은 희석은 단계 (i) 이전, 동안 또는 이후에 수행될 수 있다. 따라서, 시료의 분취액은 단계 (e)(i)에서의 처리 이전, 동안 또는 이후에 염색제와 접촉하기 전에 희석될 수 있다. 이 같은 상황에서, 희석 배지는 완충제일 수 있거나, 하기에 보다 상세하게 토의되는 바와 같이 식염수 또는 물 또는 기타 수용액 등일 수 있다.
일 실시형태에서, 단계 (e)(i) 이전의 희석은 수행되지 않는다(즉, 알코올(또는 세정제) 또는 열과의 접촉 이전에 희석은 존재하지 않는다). 다시 말해, 희석은 단계 (e)(i) 동안 또는 이후에 이루어질 수 있다.
다른 실시형태에서, 단계 (e)(i)의 "전처리"가 알코올 또는 세정제와의 접촉을 수반하는 경우, 접촉 그 자체가 희석 단계를 제공할 수 있다. 이는 단계 (e)(i) 동안에 희석 단계로 간주될 수 있다.
기타 실시형태에서, 본원의 방법은 단계 (e)(i)의 접촉/가열 이후, 예를 들어 알코올과의 접촉 이후에 수행되는 희석 단계를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 방법은 단계 (e)(i) 동안 및 이후에 단계 (e)(ii)의 희석을 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 분취액의 희석은 단계 (e)(i) 동안, 즉 알코올과의 접촉 동안 이루어질 수 있으며, 추가의 희석은 알코올과의 접촉 이후에 이루어질 수 있다.
2개 이상의 분취액을 준비하여 각각의 분취액을 상이한 정도로 희석한다. 다시 말해, 각각의 분취액을 상이한 희석 배율 또는 희석 값으로 희석할 수 있다. 이 같은 실시형태에서, 제1 분취액(즉, 제1 희석 값을 가짐)은 시료의 분취액일 수 있으며, 제2 분취액(또는 후속적인 분취액)은 제2(또는 후속적인) 희석 값을 갖는 희석된 분취액일 수 있다. 대안적으로, 2개의 별도의 희석이 수행될 수 있다. 희석된 분취액 중 하나 이상은 연속 희석에 의해 희석될 수 있다. 따라서, 희석 시리즈(dilution series)는, 요구된 바와 같이, 한 세트의 연속, 별도 또는 동시 단계에 의해 준비될 수 있다.
열을 이용하여 단계 (e)(i)에서 분취액을 처리하는 경우, 현탁액의 희석이 요구되면 이는 가열 이전, 동안 또는 이후에 수행될 수 있다(즉, 단계 (e)(ii)의 희석은 단계 (e)(i)의 처리 단계 이전, 동안 또는 이후에 수행될 수 있음). 그러나, 분취액을 처리하기 위해 알코올 또는 세정제를 사용하면, 하나의 실시형태에서는 알코올 또는 세정제를 희석하여 염색/이미지화 과정을 향상시키기 위해 분취액의 희석이 단계 (e)(i)의 처리 단계 이후에 수행되는 것이 바람직하다. 특히, 에탄올은 청구된 방법의 염색 과정을 방해할 수 있으며, 이로 인해 현탁액의 분취액을 처리하기 위해 에탄올이 사용되면 이는 에탄올 농도를 낮추기 위해 이미지화 이전에 희석되는 것이 바람직하다.
2개 이상의 분취액이 제조되는 본 발명의 특정 실시형태에서, 각각의 상기 분취액은 염색제와의 접촉 단계 (e)(iii) 이전에 동시(또는 실질적으로 동시(순차적인 단계 또는 일련의 단계를 포함함))에 제조될 수 있다. 이 같은 이벤트에서, 단계 (e)(iv) 및 단계 (e)(v)는 각각의 분취액에 대해 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있다. 다시 말해, 각각의 분취액은 동시에(즉, 동시에) 또는 순차적으로 이미지화될 수 있으며, 각각의 분취액으로부터 수득된 개개의 이미지 분석 값은 소정의 보정 곡선과 비교할 수 있다. 단계 (e)(iv) 및 단계 (e)(v)는 대안적으로 제1 분취액에 대해 수행될 수 있으며, 상기 분취액으로부터 수득된 이미지 분석 값이 소정의 표준 보정 곡선의 범위 내에 있으면, 제2 또는 추가의 분취액에 대한 단계 (e)(iv) 및 단계 (e)(v)가 필요 없게 된다. 분취액은 단계 (e)(i)의 처리된 현탁액의 상기 분취액 또는 다른 분취액 또는 단계 (e)(ii)의 희석된 분취액일 수 있다.
그러나, 대안적인 실시형태에서, 희석된 분취액(또는 제2 또는 추가의 희석된 분취액)은 제1 분취액(단계 (e)(i)의 처리된 현탁액의 상기 분취액 또는 다른 분취액 또는 단계 (e)(ii)의 희석된 분취액일 수 있음)에 대해 방법의 단계가 수행되는 경우에만 제조될 수 있다. 예를 들어, 이미지 분석 값이 소정의 보정 곡선의 범위 내에 있지 않으면 이 같은 실시형태가 바람직할 수 있다. 이 같은 실시형태에서, 본 발명의 방법이 제2(또는 추가의) 분취액에 대해 상이한 희석 값으로 반복되는 것이 필수적일 수 있다. 이 같은 이벤트에서, 2개의(또는 추가의) 분취액 각각은 순차적으로 제조되며, 즉 예를 들어 제1 분취액에 대해 단계 (e)(iv) 및/또는 단계 (e)(v)가 수행된 이후에 제조된다는 것을 알게 될 것이다.
따라서, 단계 (e)(iv) 및/또는 단계 (e)(v)는 하나 초과의 분취액이 제조될지라도 하나의 분취액(이는 전처리되지만 희석되거나 희석되지 않은 분취액)에 대해 수행될 수 있거나, 2개 이상의 분취액(이는 희석된 분취액일 수 있거나 희석되지 않은 분취액을 포함할 수 있음)에 대해 수행될 수 있다.
따라서, 2개 이상의 분취액 중 각각의 분취액에 대해 단계 (e)(iii) 및 단계 (e)(iv)가 수행되어 각각의 분취액 내의 생존 가능한 미생물에 상응하는 대상의 개수에 대한 이미지 분석 값을 결정할 수 있다. 2개 이상의 분취액 각각에 대해 2개 이상의 이미지 분석 값이 수득되는 경우, 단계 (e)(v)는 소정의 보정 곡선의 범위 내의 이미지 분석 값을 포함하는 분취액을 확인하는 단계; 및 상기 분취액에 대한 이미지 분석 값을 소정의 보정 곡선과 비교하여 상기 시료 내의 미생물의 농도를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 이 같은 이벤트에서, 각각의 분취액에 대해 단계 (e)(iii) 및 단계 (e)(iv)가 순차적으로 또는 동시에 수행될 수 있다. 상기에 언급된 바와 같이, 분취액은 희석된 분취액일 수 있거나, 이들은 희석되지 않은 분취액을 포함할 수 있다.
희석은 시료의 분취액을 소정 부피의 적합한 멸균 완충제 또는 수용액(예를 들어, 식염수 또는 염 용액) 또는 실제로 임의의 적합한 희석제와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 분취액은 단계 (d)에서 미생물 현탁액을 형성하는데 사용된 동일한 액체, 예를 들어 배양 배지를 이용하여 희석될 수 있다. 바람직하게는, 현탁액의 분취액을 희석하기 위해 완충제가 사용된다. 완충제는 당해 기술분야에 알려져 있는 임의의 완충제, 예를 들어 PBS, HBS(HEPES-완충 식염수), 트리스 완충제(예를 들어, 트리스-HCl 또는 TBS(트리스-완충 식염수)) 또는 MOPS 완충제일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 현탁액의 분취액은 PBS로 희석된다.
단계 (e)(i)에서 분취액이 열 또는 알코올로 처리되면, 희석제는 세정제를 포함할 수 있다. 세정제는 세정제의 동질성 및 농도 측면 둘 모두에서 단계 (b)의 용균 완충제에 대해 상기에 기술된 바와 같을 수 있다. 희석제 내의 세정제가 낮은 농도로 사용되면, 박테리아 클러스터를 분리함으로써 미생물의 농도를 계산하는데 도움이 되어, 이미지 분석에 도움이 된다.
이어서, 현탁액의 처리되고 선택적으로 희석된 분취액은 염색제와 접촉하여, 현탁액/염색제 혼합물을 제공한다. 본 발명의 방법에서 사용된 염색제는 DNA에 결합할 수 있는 형광 염색제이다. 염색제는 세포 투과성 또는 세포 불투과성일 수 있다. "세포 투과성"은 생존 가능한 세포의 온전한 막을 가로지를 수 있는 약제를 의미하고; "세포 불투과성"은 생존 가능한 세포의 온전한 막을 가로지를 수 없는 약제를 의미한다. 이론과 결부되기를 원하지 않지만, 단계 (e)(i)에서의 세포의 처리에 의해 세포의 용균 없이 이들의 세포막(및 관련이 있는 경우에 세포벽)이 붕괴되는 것으로 여겨진다. 따라서, 처리 이후에 세포 불투과성 염색제는 물론 세포 투과성 염색제와 같이 세포로 들어가서 세포를 염색시킬 수 있다. 염색제가 형광성인 경우 형광 검출기를 이용하여 검출될 수 있는 방출 파장을 가지며, 따라서 염색된 세포의 확인을 가능케 한다.
DNA와 결합할 수 있는 특정 염색제는 또한 용액에 유리된 상태로 존재하는 경우와 비교하여 DNA에 결합된 경우에 향상된 형광을 갖는 것으로 알려져 있다. 선택된 형광 염색제가 이러한 특징을 나타내는 것은 바람직하다. 다시 말해, 바람직한 실시형태에서는 염색제가 DNA에 결합되어 있는 경우에 염색제의 형광 세기는 향상된다. 이러한 특징을 갖는 염색제의 선택에 의해 방출 파장에서의 검출 동안에 생성되는 배경 신호 수준을 감소시키는 데 도움이 될 수 있다. 특히, DNA에 결합되어 있지 않는 경우(즉, 용액에 유리되어 있는 경우)에 낮은 형광을 갖는 염색제가 선택될 수 있다. 예를 들어, 용액에 유리되어 있는 경우 염색제는 50% 미만, 또는 보다 바람직하게는 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만 또는 10% 미만의 형광을 나타낼 수 있거나, 보다 바람직하게는 10% 미만, 예를 들어, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만의 형광(이는 DNA에 결합되어 있는 경우에 나타냄)을 나타낼 수 있거나, 0.9% 미만, 0.8% 미만, 0.7% 미만, 0.6% 미만, 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만 또는 0.1% 미만의 형광을 나타낼 수 있다.
염색제는 350 ㎚ 내지 700 ㎚의 파장에서 여기 및 방출 파장을 가질 수 있다. 이러한 범위 내에서 방출 파장을 갖는 다양한 적합한 형광 염색제가 당해 기술분야에서 흔히 알려져 있으며, 예시적인 형광 염색제는 하기에 기술되어 있다. 형광 염색제는 녹색 형광 염색제, 즉 510 ㎚의 파장을 갖는 광 또는 광 주변에서 피크 형광 방출 세기를 갖는 녹색 형광 염색제일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 염색제는 세포 투과성 염색제이다.
특히, 상기에서 기술한 바람직한 특징 모두를 갖는 바람직한 염색제는 SYTO 녹색 형광 핵산 염색제(몰레큘라 프로브스(Molecular Probes)를 포함한다. SYTO 염색제는 비대칭 시아닌 염료의 예이며, 따라서 비대칭 시아닌 염료는 바람직하게는 본 발명의 방법에서 염색제로서 사용될 수 있다. 이용 가능한 SYTO 염료의 구조는 US US5658751, US 6291203, US 5863753, US 5534416 및 US 5658751에 제공되어 있다. 본 발명의 방법에서 사용할 수 있는 SYTO 9, SYTO 11, SYTO 12, SYTO 13, SYTO 14, SYTO 16, SYTO 21 및 SYTO 24를 포함하는 다수의 상이한 SYTO 염색제가 이용 가능하다. SYTO 9 및/또는 SYTO 13, 또는 염료의 혼합물인 SYTO BC가 특히 바람직하다. SYTO BC 염색제 혼합물은 473 ㎚ 내지 491 ㎚에서 여기 파장을 갖고, 502 ㎚ 내지 561 ㎚에서 방출 파장을 갖는다.
대안적으로, 형광 염색제는 적색 형광을 낼 수 있는, 즉 650 ㎚의 파장을 갖는 광 또는 광 주변에서 피크형광 방출 세기를 갖는 세포 불투과성 염색제일 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 바람직한 적색 형광 염색제는 프로피디움 요오드화물(PI)이다.
그러나, 염색제는 핵산을 염색할 수 있는 임의의 형광 염색제일 수 있다. 이들은 SYBR Green, SYBR Gold, SYBR Green II, PicoGreen, RiboGreen, DAPI, Hoechst 3342, Vybrant 염료 등을 포함할 수 있거나, 실제로는 써모 피셔로부터 상업적으로 이용 가능한 임의의 염료를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 참고로 포함된 써모 피셔 웹사이트(https://www.thermofisher.com/se/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/nucleic-acid-detection-and-genomics-technology/nucleic-acid-stains.html)에서 이용 가능한 기술 참고 도서관에 있는 분자 프로브 안내서(Molecular Probes Handbook)의 단락 8.1에 언급된 염료(핵산 염색제)를 참고한다.
분취액은 현탁액/염색제 혼합물 내의 세포에 유해하지 않고 염색이 이루어지도록 하는 온도에서 염색제와 접촉할 수 있다. 적합한 온도는, 예를 들어 시료의 특성, 그 내부에 있는 미생물의 동질성 또는 사용된 염색제의 특성에 기초하여 선택될 수 있다. 그러나, 전형적으로는 시료 내의 미생물의 손상을 피하기 위해 37℃ 이하의 온도가 사용된다. 따라서, 35℃ 이하, 30℃ 이하 또는 25℃ 이하의 온도가 사용될 수 있다. 4℃ 이상의 온도, 예를 들어 5℃ 이상, 10℃ 이상 또는 15℃ 이상의 온도가 사용되는 것이 또한 바람직하다. 바람직한 실시형태에서, 시료는 20℃ 내지 30℃, 보다 구체적으로는 20℃ 내지 25℃에서 염색제와 접촉한다. 따라서, 특정 실시형태에서 시료는 실온에서 염색제와 접촉할 수 있다.
염색제의 방출 파장에서 형광 신호를 검출함으로써 대상이 온전한 미생물에 상응하는 것으로 확인된다. 따라서, 온전한 미생물 세포에 상응하는 대상은 시료 내의 기타 대상과는 상이한 형광 특성을 가지며, 시료 내의 기타 대상(예를 들어, 시료 내에 존재하는 온전하지 않은 미생물, 세포 잔해 또는 기타 입자에 상응하는 대상)과 구별될 수 있으며, 이로 인해 온전한 미생물 세포에 상응하는 대상의 개수가 결정되도록 할 수 있다. 바람직하게는, 시료 내의 온전한 미생물에 상응하는 염색된 미생물만이 형광을 나타내고, 어떠한 기타 대상도 형광 이미지화 동안에 검출되지 않는다.
현탁액/염색제 혼합물의 이미지화는 시각적 검출 수단에 의해 수행된다. 현탁액/염색제 혼합물의 확대 이미지를 수득하고 분석하여 온전한 미생물에 상응하는 대상을 검출한다.
온전한 미생물에 상응하는 대상이 전처리 이후에 온전할 수 있거나 온전할 수 없는 미생물 세포일 수 있는 반면, 이는 또한 2개 이상의 세포의 클러스터, 예를 들어 클러스터로서 성장하는 클론 및/또는 비클론성 세포의 집성체일 수 있다. 따라서, 대상은 미생물 세포 또는 세포 클러스터일 수 있다. 상이한 미생물은 상이한 방식, 예를 들어 클러스터링 또는 비-클러스터링 방식으로 성장할 수 있거나, 상이한 패턴 또는 형태로 성장할 수 있으며, 주어진 미생물에 있어서 이는 또한 성장 조건, 예를 들어 항미생물제의 존재 또는 양에 따라 달라 질 수 있다. 이미지를 분석하고, 대상을 계수한 후, 대상의 개수를 미생물 농도와 상호 연관시킴으로써 이 같은 상이한 성장 패턴 및/또는 형상 등이 설명될 수 있다. 따라서, 이미지는 대상의 개수를 계수하고, 예를 들어 (예를 들어 세포의 클러스터 또는 응집체를 설명하기 위해) 대상의 크기 및/또는 세기에 기초하여 개수를 조절하여 대상의 개수에 대한 이미지 분석 값을 제공함으로써 분석될 수 있으며, 이는 이어서 보정 곡선을 이용하여 온전한 미생물의 농도와 상호 연관될 수 있다. 상기에 언급된 바와 같이, 낮은 농도의 세정제는 클러스터링을 감소시키기 위해 시료 분취액에 첨가될 수 있다.
현탁액/염색제 혼합물의 이미지화는 미생물에 유해하지 않는 온도에서 이루어질 수 있다. 전형적으로는, 기타 온도, 예를 들어 적어도 4℃ 내지 최대 37℃(즉 37℃ 이하)의 온도가 또한 사용될 수 있을지라도 이는 실온, 즉 20℃ 내지 25℃에서 이루어질 것이다.
이미지화는 염색제의 방출 파장에서 수행되는데, 즉 형광 염색제에 의해 염색되는 대상을 검출하기 위해 수행된다. 상기에서 기술된 바와 같이, 이는 온전한 미생물에 상응하는 대상이 시료 내에 존재할 수 있는 기타 대상과 구별될 수 있도록 하기에 충분한 정보를 제공한다.
형광 이외에도, 이미지화는 명시야, 경사 시야(oblique field), 암시야를 포함하는 현미경 검사의 사용, 분산 염색, 위상차, 차등 간섭 대비, 공초점 현미경 검사, 단일 평면 조사, 광 시트 및/또는 광시야 다광자 현미경 검사를 포함할 수 있다.
미생물은 이미지화를 위한 검출 표면 상에 접촉 또는 결합, 연결 또는 흡수되도록 허용될 수 있다. 그러나, 바람직한 실시형태에서 이미지화는 표면에 부착되거나 표면 상에 또는 표면에 고정되어 있는 미생물이 아닌 미생물, 즉 적합한 배지 또는 완충제 내에 있는 미생물의 현탁액에 대해 수행된다. 다시 말해, 소정 부피의 현탁액/염색제 혼합물에 대해 이미지화될 수 있다. 미생물 현탁액에 대한 이미지화가 수행되는 경우, 현탁액을 통과하는 하나 이상의 초점면(focal plane)에서 이미지를 수득할 수 있다. 이미지가 현탁액을 통과하는 2개 이상의 (상이한) 초점면(예를 들어, 현탁액/염색제 혼합물을 통과하는 상이한 깊이 또는 단면)에서 수득되는 것이 바람직할 수 있다. 다시 말해, 이미지화될 부피의 별도의 하부 부피가 이미지화될 수 있다(즉, 이미지는 현탁액/염색제 혼합물의 부피의 별도의 하부 부피에서 수득될 수 있음). 대안적으로, 이미지는 상이한 장소, 예를 들어 시료 챔버 내의 상이한 장소에서 수득될 수 있으며, 예를 들어 높이가 낮은 시료 챔버 내의 상이한 X-Y 위치에서 수득될 수 있다. 이 같은 배치에서, 대부분의 미생물은 각각의 위치에서 단일 초점면 내에 있을 것이다. 따라서, 다수(즉, 2개 이상)의 비중첩 이미지가 수득될 수 있다. 이 같은 다수의 이미지는 적어도 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상, 80개 이상, 90개 이상 또는 100개 이상의 이미지를 포함할 수 있다. 이미지를 분석하여 상기에 설명된 바와 같이 현탁액 내에 존재하는 온전한 미생물을 나타내거나 표시하기 위해 채취될 수 있는 미생물에 상응하는 대상을 검출 및/또는 확인한다. 이로 인해, 대상의 개수에 대한 이미지 분석 값은 수득된다. 현탁액에서 수득된 모든 이미지에서 검출되는 대상은 현탁액 내의 대상의 총 개수를 제공할 수 있다.
이미지화 단계를 수행하기 위해, 단계 (e)(iii)의 현탁액/염색제 혼합물 또는 이의 일부 또는 분취액은 이미지화가 이루어질 수 있는 용기 또는 컨테이너, 예를 들어 플레이트의 웰(well) 또는 이미지화에 적합한 캐리어의 구획에 제공된다(예를 들어, 옮겨짐). 이 같은 웰 또는 구획은 광학적 시야 영역 또는 공간, 즉 현미경(또는, 보다 구체적으로는, 이의 대물(objective))에 접속 가능하고 현미경적 시각화 및 이미지화를 허용하도록 광학 품질을 갖는 시야(또는 가시) 영역 또는 공간을 가질 것이다. 웰/구획의 기하구조(geometry)에 의해 정의되거나 목적하는 크기(예를 들어, 적어도 2 ㎜ x 2 ㎜)를 갖는 가시 영역이 제공될 수 있으며, 이때 이는 부피가 이미지화되도록 하기에 적합하거나 목적하는 액체 높이(예를 들어, 적어도 2 ㎜의 액체 높이)를 갖는다. 대물은 웰 또는 구획 내의 평면 상에, 예를 들어 바닥으로부터 소정의 거리(예를 들어, 바닥으로부터 약 0.1 ㎜ 내지 0.5 ㎜, 예를 들어 0.2 ㎜의 거리)로 이격되어 바닥과 평행하게 초점이 맞춰질 수 있으며, 현미경은 이미지화 시간 동안에 액체를 통해 연속적으로(예를 들어, 현탁액을 통해 상방으로) 초점면을 이동시키거나 이미지 획득 시간(예를 들어, 10초 내지 60호 또는 20초 내지 30초) 동안에 총 1 ㎜ 내지 3 ㎜(예를 들어, 1.5 ㎜)의 거리로 이동시키도록 구성될 수 있다.
특히 바람직한 실시형태에서, 이미지화는 광축을 따라 일련의 2D 이미지를 수득하는 단계를 포함할 수 있으며, 이때 각각의 이미지는 현탁액의 부피를 통해 광축을 따라 상이한 위치에서 수득된다. 특정 실시형태에서, 각각의 이미지는 광축에 수직으로 배열될 수 있다(본원에서는 xy 배열로 지칭됨). 분취액-시료 혼합물의 특정 영역은 xy축으로 배열된 단일 이미지로 덮여있고, 이의 크기는 이미지화 장치의 광학 특징에 의존한다. xy 공간 내 각각의 위치에 있어서, 하나 이상의 2D 이미지는 광학축 또는 z축을 따라 상이한 간격으로 수집될 수 있다. 따라서, 하나의 실시형태에서 시료 부피에 대한 3D 정보를 제공하기 위해 사용될 수 있는 일련의 또는 많은 2D 이미지를 생성할 수 있다. 대안적으로, 2D 정보를 제공하는 다수의 개개의 이미지를 사용할 수 있다. 시료로부터 3D 정보를 추출하는 대안적인 방법은 유니센서(Unisensor; 예를 들어 US 8780181 참조)에 의해 이용되는 방법으로, 이 방법에서는 광축이 xy 평면에 대해 기울어져 있고, 시료 또는 검출기는 x 또는 y 평면 중 하나를 따라 이동한다. 여기서, xy 공간 이외에도 z 공간 내로 확장되어 있는 일련의 이미지가 획득된다. 이미지 데이터의 후속적인 변환을 통해 xy 평면에 수직으로 배열되어 있는 다수의 2D 이미지가 이러한 방법에 의해 또한 구현될 수 있다. 이러한 방식으로, 일련의 이미지 각각은 별도의 영역(별도의 단면)을 갖는 이미지이거나, 대안적으로는 별도의 부피인 것으로 간주될 수 있다(단면은 z 방향에서 소정의 부피를 가지며, 따라서 각각의 이미지에 대해 깊이 z를 갖는 xy 공간을 포함하는 부피가 제공될 수 있음).
일단 추출되면, 2D 이미지 스택에 고유한 3D 정보는 시료 내의 온전한 미생물에 상응하는 대상을 확인하기 위해 이용될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 2D 이미지는, 예를 들어 z 스택을 하나의 2D 이미지(사출된 2D 이미지)로 사출함으로써 3D 정보로부터 생성될 수 있다. 이어서, 얻어진 2D 이미지를 이용하여 분석을 수행할 수 있다. 대안적으로, 현탁액의 부피를 통해 수득된 각각의 이미지에 대해 분석을 수행할 수 있으며, 분석 결과는 시료에서 수득된 모든 2D 이미지에 걸쳐 통합될 수 있다. 또 다른 추가의 대안으로서, 수득된 개개의 2D 이미지) 각각에 대해 별도로 분석을 수행할 수 있고(즉, 대상은 각각의 2D 이미지에서 별도로 결정할 수 있음), 이로부터 수집된 정보는 결합될 수 있다. 조사 중인 시야, 예를 들어 이미지 또는 사출된 2D 이미지 내의 온전한 미생물을 나타내는 형광 세기의 점 또는 영역으로서 대상을 결정할 수 있다. 형광 이미지에 대한 분석을 수행할 수 있으며, 이를 위한 많은 대안적인 알고리즘이, 예를 들어 셀프로파일러(Cellprofiler)에 존재하며, 또한 대부분의 상업적인 이미지 분석 시스템 내에 존재한다.
다른 실시형태에서, xy 공간 내의 각각의 위치 위로 뻗어있는 z 공간에서의 세기 변화가 기재되어 있으며, 이는 특정 위치에서의 미생물 질량을 나타낸다. xy 공간 전체에 대해 통합하면, 이는 총 미생물 부피의 척도를 나타낸다. 이러한 절차를 위한 알고리즘은 흔히 이용 가능한 이미지 분석 소프트웨어, 예를 들어 프리웨어 셀프로파일러에 또한 존재한다.
대안적으로, 현미경은 현탁액/염색제 혼합물(또는 시야) 내의 상이한 장소에서, 예를 들어 X-방향(Z 방향에 반대 방향)에서 이미지를 얻도록(상기 상이한 장소로 대물이 이동하도록) 구성될 수 있다.
온전한 미생물에 상응하는 대상(즉, 형광 염색제의 방출 파장에서 검출된 대상)이 이미지화에 의해 검출되는 경우, 이렇게 수득된 정보는 분취액에 대한 이미지 분석 값을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 대상(예를 들어, 각각의 대상)의 형광 세기 및/또는 크기, 및 선택적으로는 대상(예를 들어, 각각의 대상)의 형태에 대해 이미지를 분석할 수 있다. 대상의 원형성(circularity), 대상에서의 형광 세기의 균일성 또는 최대 형광 세기(예를 들어, 그 내부의 픽셀의 최대 세기), 대상에서의 모달 형광 세기(modal fluorescence intensity), 중간 또는 평균 형광 세기 및/또는 이미지화에 의해 검출되는 각각의 대상의 영역과 같은 인자가 결정될 수 있다. 특정 실시형태에서, 주어진 범위 내에서 이들 파라미터들 중 하나 이상을 갖는 이들 대상만이 분석에 포함(예를 들어 계수 및 산정)될 수 있어서, 이미지 분석 값을 생성할 수 있다. 이미지 분석 값은 대상의 개수를 나타내거나 이에 상응한다는 점에서 확인된 대상에 대해 결합된 값, 즉 총수일 수 있다. 대상 영역은 각각의 대상에 함유된 인접한 픽셀의 개수에 기초하여 결정될 수 있으며, 적어도 특정 개수 또는 그 이상의 픽셀을 함유하는 이들 대상만이 분석에 포함될 수 있다. 특정 실시형태에서, 대상 영역 x 세기에 대한 파생된 값에 기초하여 대상이 확인 및 검출될 수 있으며, 특정 범위의 파라미터 내에 있는 특성을 갖는 대상만이 계수 또는 산정될 수 있어서, 이미지 분석 값을 생성할 수 있다. 다시 말해, 이미지 분석 값은 특정 범위의 파라미터 내에 있는 특징을 갖는 온전한 미생물에 상응하는 대상의 개수를 나타내거나, 다시 말해 온전한 미생물에 상응하는 대상의 보정(또는 조절)된 개수를 나타낸다.
각각의 대상에 대해 결정된 인자(예를 들어, 상기에 기술한 인자들 중 임의의 것) 또는 모든 대상에 대한 대상 영역 x 세기와 같은 파생된 값은 또한 결합되어 이미지화된 대상의 개체군에 대한 정보, 즉 대상의 총체에 대한 정보를 제공할 수 있다. 이러한 방식으로, 예를 들어 이미지화된 대상(또는, 보다 구체적으로는, 한 세트 또는 그룹의 이미지화된 대상)의 최대, 모달 또는 중간 형광 세기가 결정될 수 있다. 대안적으로, 이미지화된 대상의 형광 세기 또는 이미지화된 대상에 대한 대상 영역 x 세기와 같은 파생된 값의 분포가 결정될 수 있다. 따라서, 각각의 대상은 이에 할당된 값(예를 들어, 영역, 최대 형광 세기, 총, 중간 또는 평균 세기)을 가질 수 있으며, 이미지화된 대상의 개체군에 대해 상기 인자들 중 하나 이상의 중간 값 또는 평균 값 또는 변이 또는 표준 편차가 확립될 수 있다. 하기에 보다 상세하게 기술되어 있는 바와 같이, 이 같은 정보는 현탁액 내의 미생물의 특성을 나타낼 수 있으며, 그 내부에 있는 온전한 미생물의 농도를 결정하는데 사용하기에 적합한 보정 곡선을 선택할 때 사용될 수 있다. 더욱이, 이 같은 정보는 현탁액 내의 미생물의 염색 효율성에 대한 정보를 제공할 수 있으며, 검출 한계 미만의 형광 세기를 갖는 미생물 개체군을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
배경 제거(background subtraction) 또는 정규화 단계는 선택적으로 초기 단계로서, 즉 본원에서 기술된 임의의 후속적인 이미지 분석 단계 이전에 이미지에 대해 수행될 수 있다. 이는 알려져 있는 임의의 편리한 표준 방법, 예를 들어 롤링볼 제거(rolling ball subtraction)를 이용하여 수행될 수 있다.
이미지 분석 값은 경계화(thresholding)를 수행한 이후에 결정될 수 있다. 다시 말해, 임계값은 대상이 검출되는 지를 결정하기 위해 설정될 수 있다. 경계화는 현탁액의 이미지용으로 수득된 신호의 세기에서 하한을 설정하기 위해 수행되며, 이때 하한 미만의 대상은 고려되지 않는다. 본 발명의 방법의 맥락에서, 경계화는 방출 파장에서 낮을 형광 세기를 갖는 대상(즉, 염색제에 의해 강하게 염색되지 않는 대상)이 임의의 추후 분석으로부터 폐기되도록 한다. 임계값은 하나 이상의 수준으로 설정될 수 있으며, 대상은 상이한 임계값으로 계수될 수 있다.
특정 실시형태에서, 전역 경계화가 수행될 수 있으며, 즉 이미지 전체(또는 이미지 세트)에 대해 단일 임계값이 설정될 수 있다. 그러나, 대안적인 실시형태에서 (예를 들어, 조사 및/또는 배경 신호가 이미지 전반에서 균일하지 않으면) 국부 경계화가 수행될 수 있다. 국부 경계화에 의해 이웃 픽셀의 그레이스케일 정보(greyscale information)에 따라 주어진 픽셀에 대한 임계값 값이 추정된다.
게다가, 이미지를 그레이스케일(여기서, 형광 세기는 그레이스케일 수준으로서 판독될 수 있음)로 변환하고/하거나, (예를 들어, 롤링볼 방법을 이용하여) 배경을 제거하기 위해, 이미지 분석 값을 결정하기 전에 당해 기술분야에 알려져 있는 기법에 따라 기타 이미지 분석 작업을 수행할 수 있다.
예를 들어, 미생물이 클러스터링 또는 비-클러스터링 미생물이든지 간에 이미지화로부터 수득된 정보에 기초하여 현탁액을 특성 분석할 수 있다. 유리하게는, 이러한 과정에 적합한 보정 곡선의 선택은, 예를 들어 현탁액에서 검출되는 특정 비율의 대상이 특정 영역 및/또는 최대 세기를 갖든지 간에 현탁액 내의 대상의 출연(appearance)에만 기반을 둘 수 있으며, 본 발명의 방법에 의해 온전한 미생물의 농도가 결정될 수 있기 전에 상기 현탁액 내의 미생물의 동질성이 알려질 필요는 없을 수 있다. 따라서, 클러스터링 또는 비-클러스터링 미생물에 대해 미리 결정된 보정 곡선이 선택될 수 있다.
현탁액 내의 온전한 미생물의 농도와 이미지 분석 값 사이의 관계는 상기 현탁액 내의 미생물에 관한 다수의 파라미터, 예를 들어 미생물의 크기 및 형태 및/또는 클러스터 또는 생체 필름을 형성하려는 미생물의 성향에 의존할 수 있다. 따라서, 현탁액 내의 대상의 개수는 각각의 대상이 2개 이상의 미생물에 상응할 수 있으므로 현탁액 내의 온전한 미생물의 농도를 결정하는데 직접 사용되지는 않는다. 더욱이, 미생물 또는 미생물의 클러스터는 이미지화가 2개 이상의 초점면에서 수행되는 본 발명의 실시형태에서 상이한 초점면에서 채취되는 경우에 2개의 별도의 이미지에서 나타날 수 있으며, 따라서 2개의 별도의 대상으로 검출될 수 있다. 따라서, 현탁액 내의 미생물의 동질성은 현탁액 내의 미생물의 농도와 본 발명의 방법의 단계 (e)(iv)에서 이미지화된 대상의 개수 사이의 관계에 영향을 미칠 수 있다.
이들 인자, 및 (예를 들어, 온전한 미생물의 불완전한 염색을 통해) 현탁액 내의 생존 가능한 미생물의 농도를 결정하는 방법의 정확성에 영향을 미치는 것으로 당해 기술분야에서 이전에 확인된 인자와 같은 인자는 보정 곡선의 사용을 통해 본 발명의 방법에서 극복될 수 있다.
보정 곡선은 알려져 있는 농도의 미생물을 함유하는 일련의 시료(예를 들어, 제제)(또는, 대안적으로는 "참조 현탁액"으로 지칭됨), 즉 미생물의 농도가 대안적인 방법에 의해 결정되어 있는 시료(현탁액)에 대해 본 발명의 농도 결정 방법의 단계 (e)(iii) 및 단계 (e)(iv)를 수행함으로써 준비될 수 있다. 따라서, 온전한 미생물에 상응하는 대상의 개수는 상이한 농도의 미생물을 함유하는 시료 각각에 대해 결정될 수 있으며, 따라서 상기 대상의 개수 및 미생물의 농도 사이의 관계가 확립될 수 있다.
보정 곡선이 본 발명의 농도 결정 방법을 수행하기 전에 준비된다는 점에서 이는 미리 결정되어 있는 것이다. 따라서, 보정 곡선은 주어진(모든) 시료로부터 수득되는 현탁액 내의 미생물의 농도를 결정하기 전에 별도로 준비될 수 있다. 그러나, 다수의 현탁액 내의 온전한 미생물의 농도를 결정하기 위해 보정 곡선을 준비하고 사용할 수 있거나, 달리 말해 동일한 보정 곡선을 이용하여 다수의 현탁액 내의 온전한 미생물의 농도를 결정할 수 있다는 것이 바람직하다. 다시 말해, 상기 방법이 보정 곡선의 생성을 포함하는 것이 필수적인 것은 아니며; 사전에 준비된 보정 곡선이 사용될 수 있으며, 각각의 시료/현탁액에 대해 별도의 보정 곡선이 생성될 필요는 없다. 새롭고 신규한 보정 곡선이 주기적으로, 예를 들어 매일, 매주 또는 매달 준비될 수 있거나, 예를 들어 새로운 염색제의 배치(batch)가 사용되기 전에 배치식으로 준비될 수 있으며, 상기 새로운 보정 곡선은 새로운 보정 곡선이 준비되어야할 필요가 있을 때까지 온전한 미생물의 농도를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
그러나, 주어진 미생물 또는 임의의 유형의 미생물의 농도를 결정하는데 적합한 보정 곡선은 본 발명의 방법을 수행할 때 제공될 수 있으며, 따라서 상이한 미생물 또는 상이한 특징, 예를 들어 상이한 성장 패턴을 갖는 미생물 유형에 대한 별도의 보정 곡선을 준비하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 이는 필연적으로 특정 미생물 속 또는 종의 수준에서 있을 필요는 없지만, 예를 들어 미생물의 형태 및/또는 성장 패턴에 의존할 수 있다.
현탁액 내의 온전한 미생물의 농도를 결정할 때 사용하기 위한 보정 곡선의 적합성은 일부 경우에 상기 미생물의 동질성에 의존할 수 있으며, 보정 곡선에서는 온전한 미생물의 농도가 이미지 분석 값으로부터 얼마나 정확하게 결정되는 지를 결정할 것이다. 예를 들어, 특정 미생물을 이용하여 생성된 단일 보정 곡선은 다양한 상이한 미생물, 예를 들어 단일 과 또는 속 내에 있는 미생물의 농도를 결정하는데 적합할 수 있다는 것이 가능할 수 있으며, 이러한 방식으로 본 발명의 방법에 사용하기 위한 단일 보정 곡선을 준비하는 것만이 필수적일 수 있다. 대안적으로, 이를 위한 보정 곡선은 상이한 과, 속, 종 또는 균주의 미생물, 및/또는 유사한 특징 및 형태를 갖는 상이한 미생물로부터 수득된 이미지화 데이터를 이용하여 준비할 수 있으며, 이로부터 수득된 데이터를 조합하여 단일 보정 곡선을 제공할 수 있다.
예를 들어, 비-클러스터링 그람 음성 박테리아의 상이한 종으로부터 데이터를 수집하여 보정 곡선을 준비하는 것이 가능할 수 있다. 따라서, 이렇게 준비된 보정 곡선은 많은 상이한(적합한) 미생물, 즉 이미지화된 대상의 개수와 현탁액 내의 미생물의 농도 사이의 만족스러운(즉 대표적인) 상관관계가 입증된 미생물의 농도를 결정할 때 사용될 수 있다.
대안적으로, 특정 미생물이 불규칙적이고 특이한 특성을 나타내는 경우, 현탁액 내의 미생물의 농도를 결정하기 위해 이러한 특정 미생물에 대한 별도의 보정 곡선을 생성하는 것이 필수적일 수 있다.
따라서, 각각이 상이하게 선택된 미생물의 농도를 결정하는데 사용하기에 적합한 다수의 상이한 보정 곡선이 제공될 수 있다(즉, 본 발명의 농도 결정 방법을 수행하기 전에 준비될 수 있음). 따라서, 예를 들어 비-클러스터링 그람 음성 박테리아, 비-클러스터링 그람 양성 박테리아, 클러스터링 그람 음성 박테리아 또는 효모에 대한 별도의 보정 곡선이 제공될 수 있다. 따라서, 시료 내의 특정 미생물의 농도를 결정하기 위해 적합한 보정 곡선이 선택될 수 있다. 따라서, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 또는 그 이상의 상이한 보정 곡선이 준비될 수 있으며, 미생물의 이미지화가 수행되면 이로부터 적합한 보정 곡선이 선택될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 이미지화 단계 (e)(iv)에서 수득된 정보로 인해 특정 시료로부터 제조된 미생물 현탁액 내의 생존 가능한 미생물의 농도를 결정하기 위해 선택되어야 하는 보정 곡선의 선택에 대해 알 수 있다. 상기에 개시된 대상의 파라미터(즉, 상기에 개시된 바와 같은 대상의 최대 세기, 모달 세기 및/또는 면적 또는 파생된 값) 중 하나 이상은 선택적으로는 배경 제거 및/또는 경계화 단계 이후에 단계 (e)(iv)에서 검출된 대상에 대해 결정될 수 있으며, 이 같은 정보는 이러한 시료에 적합한 보정 곡선을 선택하기 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는, 클러스터링 또는 비-클러스터링 미생물에 대해 사전에 결정된 보정 곡선이 사용된다.
시료 또는 현탁액의 특성, 미생물이 재현탁되는 배지, 및 시료 및/또는 현탁액이 저장 또는 배양되는 조건과 같은 인자 모두는 또한 현탁액 내의 미생물의 농도와 본 발명의 단계 (e)(iv)에서 이미지화된 대상의 개수 사이의 관계에 영향을 미칠 수 있으며, 따라서 보정 곡선은 바람직하게는 현탁액/염색제 혼합물이 이미지화되는 조건과 유사하거나 동일한 조건 하에 준비된다.
상기에 언급된 바와 같이, 본 발명의 농도 결정 방법은 AST 검정을 수행한다는 맥락 및 특히 이를 위한 접종원 내의 미생물의 농도를 결정한다는 맥락에서 시료로부터 제조된 현탁액 내의 온전한 미생물(및 따라서 생존 가능한 미생물)의 농도를 결정하는데 특별히 활용한다. 따라서, 본 발명은 미생물의 항균제 감수성을 결정하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기에 나열된 바와 같이 시료로부터 미생물 현탁액을 제조하고 현탁액 내의 생존 가능한 미생물의 농도를 결정하는 단계, 및 AST 검정을 수행하는 단계를 포함한다.
유리하게는, 본 발명은 임상 시료 또는 임상 시료 배양액을 출발 물질로 하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 임상 시료 또는 임상 시료 배양액으로부터 생존 가능한 미생물을 회수(또는 단리)하는 단계, 회수된 미생물 현탁액 내의 온전한 미생물(및 이로 인해 생존 가능한 것으로 나타난 미생물)의 농도를 결정하는 단계, 및 선택적으로는 현탁액으로부터 접종원을 제조하는 단계(이는 현탁액 또는 이의 일부 또는 분취액 내의 미생물의 농도를 조절하는 단계를 포함할 수 있음)를 포함한다. 회수된 미생물 현탁액 및 이로부터 제조된 접종원은 AST 검정에서 제조된 AST 미생물 시험 배양액을 위한 접종원으로서 사용될 수 있다.
하기에 추가로 기술되어 있는 바와 같이, AST 검정은 임의의 편리하거나 목적하는 방식으로 수행될 수 있다. 따라서, 미생물 성장은 상이한 항균제(예를 들어, 항생제)의 존재 하에 및/또는 항균제(예를 들어, 항생제)의 양 또는 농도로 평가(또는 결정)될 수 있다. 성장은 직접 평가하거나, 성장 마커를 평가(결정)함으로써 평가할 수 있다.
일반적으로 말하면, AST 검정은 미생물 성장에 미치는 항균제의 효과를 모니터링함으로써 수행된다. 미생물을 함유하는 시료는 일련의 적어도 2개의 배양 용기 내의 배양 배지를 접종하기 위해(즉, 적어도 2개의 AST 미생물 시험 배양액을 확립하기 위해) 사용되며, 이때 각각은 상이한 농도의 항균제를 포함하며, 미생물은 소정의 기간 동안 배양된다. 이러한 방식으로, 미생물 성장을 방지하기 위해 요구되는 약제의 양(예를 들어, 최소 억제 농도(MIC))를 결정하기 위해 일련의 적어도 2개의 상이한 농도의 항균제를 시험한다. 이렇게 수득된 항균제 감수성 값(예를 들어, MIC 값 및/또는 SIR 값)은 미생물이 개개의 항균제에 대해 내성 또는 민감성인지의 표시를 제공한다.
상이한 농도의 항균제를 포함하는 적어도 2개의 AST 미생물 시험 배양액을 접종하는 것 이외에도, AST 검정은 미생물이 생존 가능하고 AST 검정을 위해 제공된 성장 배지에서 성장할 수 있다는 것을 확인하기 위해 양성 대조 조건(항균제를 포함하지 않는 배양 배지)을 가지며, 성장 배지가 임상 시료로부터 수득되지 않은 미생물로 오염되지 않았다는 것을 확인하기 위해 음성 대조 조건(미생물 배양액으로 접종되지 않았으며 항균제를 포함하지 않는 배양 배지)을 가질 것이다. 따라서, 시료 내의 미생물의 항균제 감수성을 결정하기 위한 방법의 단계 (iii)은 일반적으로 적어도 2개의 상이한 성장 조건 이외에도 적합한 양성 및 음성 대조 조건을 설정하는 단계를 포함할 것이다.
일부 실시형태에서 양성 대조 시료는 항균제의 제1 농도(즉, 0 M의 농도)를 제공하는 것으로 간주될 수 있으며, 항균제를 포함하는 제2 조건만이 설정될 수 있다. 이 같은 실시형태에서, 양성 대조 조건 및 항균제를 포함하는 조건에서의 성장은 항균제 감수성을 결정하기 위해 평가될 수 있다. 따라서, "각각의 항균제가 2개 이상의 상이한 농도로 시험되는 적어도 2개의 상이한 성장 조건"은 항균제를 단일 성장 조건에만 첨가하는 실시형태를 포함하는 것으로 여겨질 수 있으며, 양성 대조 조건은 항균제의 제2 농도를 나타낸다.
바람직한 양태에서, 1개 초과(즉 2개 이상)의 상이한 항균제를 시험하여, 항생제 감수성에 대한 2개 이상의 상이한 값(예를 들어, MIC 값 및/또는 SIR 값)을 상이한 항균제 각각에 대해 하나씩 제공한다. 상이한 값(예를 들어, 상이한 MIC 및/또는 SIR 값)의 조합에 의해 주어진 미생물의 항균제 감수성 프로파일, 즉 미생물이 항균제 집단에 대해 내성을 나타내고, 미생물이 항균제 집단에 대해 민감성을 나타내는 항균제 감수성 프로파일을 제공한다. 필요한 경우, 시험 중인 각각의 별도의 항균제에 대해 별도의 양성 및 음성 대조 조건이 설정될 수 있지만, 단일 양성 및 단일 음성 대조 조건이 다수의 상이한 항균제가 시험되는 경우에 충분할 것이다.
AST 방법에서의 미생물 성장은 당해 기술분야에 알려져 있는 임의의 수단을 포함하는 임의의 목적하거나 적합한 수단에 의해 평가될 수 있다. 보다 구체적으로는, 미생물 성장은 미생물 및/또는 미생물 콜로니 또는 집성체의 양 및/또는 개수 및/또는 크기를 결정함으로써 평가될 수 있다. 하기에서 보다 상세하게 토의되는 바와 같이, 특정 바람직한 실시형태에서 미생물 성장은 이미지화에 의해 평가(결정)되거나, 미생물을 시각화함으로써 대안적으로 나타낸다. 따라서, 세포의 응집체 또는 군생(clump; 클러스터) 또는 미생물 콜로니를 포함할 수 있는 미생물 세포는 성장을 결정(또는 평가 또는 모니터링)하는 수단으로서 시각화 또는 이미지화될 수 있다. 이는 세포 또는 콜로니를 계수하는 단계를 포함할 수 있지만, 이 같은 방법에 제한되지 않으며, 미생물 세포, 콜로니 또는 집성체("집성체"란 용어는 물리적으로 인접한 임의의 세포의 군집, 예를 들어 군생 또는 클러스터를 포함하며; 이는 함께 집성 또는 부착하게 되는 세포(예를 들어, 클론성 콜로니뿐만 아니라 집성체를 형성하게 되는 이웃하는 세포)의 비클론성 군생/클러스터를 포함할 수 있음)의 크기, 면적, 형상, 형태 및/또는 개수를 평가(또는 결정)함으로써 미생물 성장량을 시각적으로 평가하는 임의의 수단을 포함한다.
미생물 성장을 측정하기 위해 사용되는 파라미터는 미생물의 동질성 및 사용된 항균제에 따라 달라질 수 있지만, 반드시 그러한 것은 아니다. 실제로, 사용된 유기체 및 항균제에 따라 세포의 형태 또는 성장 패턴이 영향을 받을 수 있으며, 이는, 예를 들어 항균제의 부재 하에 "정상" 또는 "전형적인" 형태 또는 성장 패턴으로부터 변경 또는 변화될 수 있다. 일부 AST 성장 모니터링 방법이 이 같은 변화에 의존할 수 있는 반면, 본 발명에 따르면 이 같은 변화를 설명하는 것이 필수적인 것은 아니며, 미생물 성장량(예를 들어, 면적) 또는 생물량은 형태 및/또는 성장 패턴과 무관하게 결정될 수 있다. 따라서, 동일한 성장 모니터링 방법이 사용된 미생물 세포 및/또는 항균제와는 무관하게 사용될 수 있다. AST 검정을 수행하기 위한 방법이 하기에 추가로 기술되어 있다.
본 발명은 현탁액 내의 온전하거나 생존 가능한 미생물의 농도를 결정하는 방법을 제공하며, 이러한 정보는 시험 미생물 배양액 내의 미생물 세포의 특정 농도를 정확하게 제공하기 위해 사용될 수 있다. 현탁액의 적어도 일부 내의 미생물의 농도는, 단계 (iii)에서 시험 미생물 배양액을 접종하기 위한 접종원을 제공하기 위해 농도가 결정되면 조절될 수 있다. 그러나, 상기에서 토의된 바와 같이, 이는 농도가 결정되기 전에 추가적인 예비 조절을 배제하지 않는다. 따라서, 현탁액 내의 미생물 세포의 농도는, 예를 들어 선택적으로 또는 필요한 경우에 AST 검정에 사용하기에 적합한 범위 내에 있도록 조절될 수 있다. 이러한 조절은 모든 경우에 요구될 수 있는 것이 아니며, 즉 현탁액은 단계 (iii)에서 확립된 일련의 시험 미생물 배양액을 접종하기 위해 직접 사용될 수 있다(즉, 현탁액은 직접, 즉 임의의 추가의 조절 없이 사용될 수 있음). 대안적으로, 현탁액(또는 이의 분취액)은 목적하는 농도 또는 소정의 농도까지 조절될 수 있다. 더욱 더 대안적으로는, 현탁액은 일련의 시험 미생물 배양액을 접종하기 위해 직접(즉, 조절 없이) 사용될 수 있으며, 시험 미생물 배양액 내의 미생물의 농도는 필요한 경우에 목적하는 농도 또는 소정의 농도까지 조절될 수 있다. 임의의 이 같은 조절은 농도 결정 방법에서 결정된 생존 가능한 미생물의 농도(즉, 현탁액 내의 미생물의 농도)에 기반을 둘 것이다.
따라서, 본 발명의 방법은 현탁액 또는 이의 일부 및/또는 시험 미생물 배양액 내의 미생물 세포의 농도를 조절하는 단계 (f)를 더 포함할 수 있다. 보다 구체적으로는, 농도는 미생물 세포의 개수 또는 농도를 증가 또는 감소시키도록 조절될 수 있다. 이 같은 조절은 상기에서 토의된 바와 같이 AST 검정의 맥락에서 이루어질 수 있지만, 추가의 분석(예를 들어, 유전자 분석), 저장(예를 들어, 동결) 등을 위해 회수된 미생물을 분취하기 위해 임의의 목적하는 이유로 인해 임의의 다른 맥락에서 이루어질 수도 있다.
상기에서 토의된 바와 같이, 특정 실시형태에서 방법은 현탁액 내의 미생물의 농도가 결정되기 전에 초기 조절, 바람직하게는 초기 희석을 포함할 수 있다. 이는 조절 단계의 일부(예를 들어, 초기 또는 예비 또는 조절)로서 간주될 수 있다. 대안적으로, 이는 상기 농도가 결정된 이후에 수행되는 임의의 조절 단계와는 무관하게 수행되는 별도의 초기(예비 또는 맹검) 조절로서 간주될 수 있다. 현탁액 내의 미생물의 농도가 결정되면, 본 발명의 단계 (e)(v)에서 결정된 미생물의 농도 측면에서, 필요한 경우, (예를 들어, AST 검정에 사용하기에 적합한 범위 내에 있도록) 미생물의 농도에 대한 추가의 조절이 수행될 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서 방법은 단계 (e)에서 농도가 결정된 이후에 현탁액의 적어도 일부 내의 미생물의 농도를 조절하는 추가적인 단계 (f)를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 방법은 농도가 결정되기 전에 현탁액의 적어도 일부 내의 미생물 농도에 대한 초기 조절을 수행하는 단계, 및 이어서 단계 (e)에서 농도가 결정된 이후에 상기 조절된 현탁액 또는 이의 일부에 대한 추가의 조절을 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 단계 (f)는 이 같은 추가의 조절을 수행하는 단계로서 간주될 수 있다. 유익하게는, (예를 들어, 현탁액 내의 미생물 세포의 농도를 조절하는 과정에서의) 이 같은 초기 조절을 수행하는 단계는 단계 (e)(v)에서 현탁액 내의 미생물의 농도가 결정되면 목적하는 미생물 농도를 갖는 현탁액(예를 들어, 접종원)을 제조하기 위해 요구되는 시간을 줄일 수 있다.
따라서, 하나의 실시형태에서 미생물 농도는 현탁액의 적어도 일부에서 조절된다. 미생물 농도가 조절되는 현탁액의 적어도 일부는 바람직하게는 단계 (e)(iii)에서 염색되지 않는, 단계 (d)에서 수득된 현탁액의 일부이며, 즉 이는 현탁액의 염색되지 않은 일부이다.
현탁액의 적어도 일부의 농도에 대한 조절에 의해 단계 (iii)에서 시험 미생물 배양액을 접종하기 위한 접종원이 제공될 수 있다. 따라서, 예를 들어 접종원 내의 미생물 세포의 농도는, 예를 들어 미생물 세포가 성장하도록 하도록 소정의 기간 동안시료를 배양함으로써 증가시킬 수 있거나, 예를 들어 시험 미생물 배양액을 접종하기 전에, 또는 시험 배양액을 확립하기 위해 사용되는 적절한 양(예를 들어, 부피)을 선택하거나, 또는 고체(예를 들어, 냉동 건조 또는 진공 건조된 항생제와 같은 건조된 항균제)에 첨가함으로써, 예를 들어 시험 미생물 배양액을 접종하는 과정에 희석에 의해 감소시킬 수 있으며, 접종원의 일부 또는 분취액을 AST 시험을 위한 소정의 부피의 항생제 및/또는 배양 배지에 첨가하는 경우에 희석에 의해 감소시킬 수 있다. 따라서, 시험 미생물 배양액에는 현탁액(또는 이의 분취액) 또는 이로부터 조절(예를 들어, 희석)된 접종원이 접종될 수 있다.
현탁액이 목적하는 것보다 높은 미생물 농도, 예를 들어 AST 검정에서 사용되기에는 너무 높은 미생물 농도를 포함하는 하나의 실시형태에서, 미생물 배양액은 세포 밀도를 적합한 수준, 예를 들어 AST가 수행되기에 적합한 수준까지 감소시키기 위해 적절한 완충제 또는 배양 배지(예를 들어, 액체 배양 배지)를 이용하여 희석한다. AST 검정의 경우, 희석은 바람직하게는 AST 검정을 수행하기 위해 사용되어야 하는 배양 배지를 이용하여 수행된다. 하나의 실시형태에서, 이는 뮬러-힌튼(MH) 브로스를 이용하여 수행될 수 있다. 농도의 조절은 AST 방법의 단계 (ii)에서 결정된 농도에 기반을 둔 희석을 포함한다.
현탁액이 AST 검정에서 사용되기에 너무 낮은 미생물 농도를 포함하는 대안적인 실시형태에서, 현탁액은 그 내부에 존재하는 미생물이 성장하여 개체수를 증가시키도록 하기 위해 소정의 기간 동안 배양(또는 추가로 배양)될 수 있다. 현탁액 내에 존재하는 미생물 세포의 농도는 미생물의 농도가 AST 검정을 수행할 수 있도록 충분히 높은 세포 밀도에 도달할 때까지 연속 적으로 또는 일련의 개개의 시점에 모니터링될 수 있다. 이 단계에서의 미생물 배양액의 성장은 AST 검정 그 자체에서 성장을 모니터링하기 위한, 예를 들어 세포 또는 콜로니를 이미지화 또는 계수하기 위한 본원에서 기술된 방법들 중 임의의 것에 의해 모니터링될 수 있고/있거나, 본 발명의 농도 결정 방법은 성장 기간 이후에 수행될 수 있다.
따라서, 하나의 실시형태에서 본 발명은 AST 검정에 사용된 시험 배양액을 접종하기 위해 표준 미생물 농도(예를 들어, 0.5의 맥파틀랜드 단위 또는 108개의 CFU/㎖) 또는 이의 영역 내의 농도를 갖는 접종원(예를 들어, 현탁액 또는 희석된 현탁액)을 이용한다. 현탁액 내에 존재하는 미생물 세포의 농도는 선택적으로 또는 필요한 경우에 표준 농도를 갖는 현탁액을 수득하기 위해 시료 내에 존재하는 세포의 개수에 따라 조절, 증가 또는 감수될 수 있다. 대안적으로, 현탁액 내에 존재하는 미생물 세포의 농도는 조절 단계가 수행될 필요 없이도 표준 범위 내에 있을 수 있다. 여하튼, 현탁액 내에 존재하는 미생물 세포의 농도는 본 발명의 방법에 의해 결정되며, 필요한 만큼 그리고 필요한 경우에 표준 농도를 갖는 현탁액을 수득하기 위해 조절될 수 있다. 대안적으로, 현탁액은 조절 없이 사용될 수 있으며, 시험 미생물 배양액 내의 미생물 세포의 농도는 현탁액 내에서 결정된 미생물의 농도에 기초하여 (예를 들어, 시험 배양액을 확립하기 위한 적절한 희석 배율 또는 적절한 부피를 선택함으로써) 조절될 수 있다.
AST 검정은 전형적으로는 하나의 시료로부터 수득되거나 하나의 장소에서 수득된 결과가 다른 곳에서 수득된 결과와 비교하도록 하기 위해 설정된 밀도(또는 표준 밀도 또는 표준화된 세포) 또는 미생물 농도를 갖는 미생물 배양액을 이용하는데, 이는 항균제에 대한 미생물의 반응이 항균제 그 자체의 유형 및 농도뿐만 아니라 시료 내의 미생물의 농도와 함께 변하는 것으로 알려져 있기 때문이다. 항균제의 투여 및 환자에게 지정된 치료 요법과 같이 임상 결과에 영향을 미치는 인자는 설정된 표준 기준에 따라 수행된 AST 검정으로부터 수득된 결과에 기반을 두고 있다.
'비표준' 미생물 배양액(또는 "비표준화된" 미생물 배양액)을 이용하여 수행된 AST 검정에서 수득된 결과(미생물의 항균제 감수성 프로파일 또는 한 세트의 MIC 및/또는 SIR 값 및/또는 항균제 감수성을 나타내는 임의의 기타 값)는 표준 기준에 따라, 예를 들어 '표준' 미생물 배양액을 이용하여 수행된 AST 검정에서 수득된 결과와는 상이할 수 있다. 그러나, 비표준 미생물 배양액을 이용하여 수득된 항균제 감수성 값이 표준 미생물 배양액을 이용하여 수득된 항균제 감수성 값과 다른 정도는 AST 시험 배양액을 접종하기 위해 사용된 현탁액 또는 접종원 내의 미생물 세포의 농도가 알려져 있는 경우에 결정될 수 있다. 이로 인해, 비표준 미생물 배양액을 이용하여 수득된 항균제 감수성 값으로부터 이론적 '표준' 항균제 감수성 값(예를 들어, MIC 및/또는 SIR 값)을 계산하는 것이 가능하다.
비표준 미생물 배양액을 이용하여 수득된 감수성 값이 '표준' MIC 값과 다른 정도는 미생물의 특성 및 항균제에 따라 달라질 수 있으며, 예를 들어 시험 중인 각각의 상이한 항균제 및 상이한 농도의 미생물 세포를 포함하는 미생물 배양액에 대해 별도로 결정될 수 있다.
따라서, 본 발명은 비표준 농도의 미생물 세포를 포함하는 접종원을 이용하여 미생물의 항균제 감수성 프로파일을 결정하기 위한 방법을 제공하며, 이때 시험 미생물 배양액 내의 미생물 세포의 농도는 AST 검정이 수행되기 전(즉, 현탁액 내의 미생물 세포의 농도가 결정되기 전)에 (상기 시험 미생물 배양액을 접종하거나 접종원을 제조하기 위해 사용되는 현탁액 내의 미생물 세포의 농도를 측정함으로써 간접적으로) 측정되며, AST 검정에서 수득된 감수성 값(예를 들어, MIC 및/또는 SIR 값)은 이로부터 제조된 시험 미생물 배양액 내의 미생물 세포의 농도에 기초하여 조절되어 표준 값(예를 들어, MIC 및/또는 SIR 값)을 제공할 수 있다.
상기에서 기술된 바와 같이, 선행 기술분야의 방법에서 AST 시험 검정을 확립하기 위해 사용되는 표준 접종원은 전형적으로는 대략 0.5의 맥파틀랜드 단위이다. 상기에서 언급된 바와 같이, 이는 대략 108개의 CFU/㎖에 상응한다. 이는 전형적으로 1:200 희석으로 희석하여 대략 5 x 105개의 CFU/㎖을 포함하는 시험 미생물 배양액을 제공한다. 그러나, 본 발명의 방법에서 이들 표준 값이 사용될 수 있고, AST 시험에서 접종된 미생물 시험 배양액 내의 미생물의 농도가 4.5 x 105 ± 80% 또는 5 x 105 ± 60%의 범위 내에 있는 것이 일반적으로 바람직할 지라도, 본 발명의 방법에서 접종원(예를 들어, 현탁액 및 이로부터 제조된 접종원) 및/또는 시험 미생물 배양액이 미생물 세포를 임의의 한정되거나 소정의 농도로 포함하는 것이 가능하며, 단 AST 값을 수득하기 위해 사용되는 시험 미생물 배양액 내의 미생물 세포의 농도는 알려져 있다. 따라서, 기타 실시형태에서 AST 시험에서 접종된 미생물 시험 배양액 내의 미생물의 농도는 1 x 105 ± 80% 또는 5 x 104 ± 80% 또는 5 x 104 ± 60%의 범위 등일 수 있다.
따라서, 현탁액 내의 미생물 세포의 농도는 AST 방법에서 미생물 시험 배양액을 확립하기에 적합한 임의의 목적하는 농도 또는 소정의 농도일 수 있다. 따라서, 이는 적어도 10개, 102개, 103개, 104개, 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 1010개, 5 x 1010개 또는 1011개의 CFU/㎖일 수 있다. 바람직하게는, 현탁액 내의 미생물 세포의 농도는 10개 내지 1011개, 102개 내지 1011개, 103개 내지 1011개, 104개 내지 1011개의 CFU/㎖, 105개 내지 1011개의 CFU/㎖, 106개 내지 1011개의 CFU/㎖, 107개 내지 1011개의 CFU/㎖, 5 x 106개 내지 1011개의 CFU/㎖, 2 x 106개 내지 1011개의 CFU/㎖, 106개 내지 1011개의 CFU/㎖, 5 x 106개 내지 5 x 1010개의 CFU/㎖, 2 x 106개 내지 5 x 1010개의 CFU/㎖ 또는 106개 내지 5 x 1010개의 CFU/㎖일 것이다.
낮은 미생물 농도를 갖는 접종원을 이용하여 수행된 AST 검정의 통계적 신뢰성은 접종원이 보다 높은 농도의 미생물을 함유하는 실시형태보다 더 나쁘다. 따라서, 특정 실시형태에서 현탁액에서 미생물의 특히 낮은 농도가 결정되면, 이 단계에서 AST 검정을 계속하지 않는 것이 바람직하거나 유리할 수 있다. 따라서, 현탁액 내의 미생물의 농도가 1 x 103개의 CFU/㎖보다 낮거나, 보다 바람직하게는 1 x 104개, 1 x 105개 또는 1 x 106개의 CFU/㎖보다 낮은 특정 실시형태에서, AST 검정은 현탁액을 이용하여 수행되지 않을 수 있다(즉, AST 방법이 단계 (ii)를 넘어서 수행되지 않음). 선택적으로, 현탁액 내의 미생물의 농도는 농도 결정 방법이 반복되기 전(예를 들어, 배양 단계 이후)에 증가하도록 할 수 있으며, 현탁액이 이 이후 단계에서 충분히 높은 농도의 미생물을 함유하는 경우, AST 검정을 계속하는 것이 가능할 수 있다.
비표준 농도가 AST 시험에서 사용되도록 하는 본 발명의 AST 방법은, 현탁액 내의 미생물 세포의 농도가 표준 농도보다 낮은 경우에 특별한 활용성을 가지며, 이는 현탁액 내의 미생물 세포의 농도가, 예를 들어 표준 농도보다 높은 수준까지 증가하도록 하기 위해 상기 현탁액을 소정의 기간 동안 배양할 필요성을 회피하기 때문이다.
본원에 제시된 AST 방법은 비표준 미생물 배양액을 이용하여 AST 검정을 수행함으로써 수득된 감수성(예를 들어, MIC 및/또는 SIR) 값을 조절함으로써 미생물의 '표준' 항균제 감수성 프로파일을 결정하기 위한 방법으로서 간주될 수 있다. 다른 방식으로 보면, 이는 AST 검정에서 사용되는 시험 배양액을 접종하기 위해 사용되는 미생물 세포의 농도를 조절하여 미생물의 항균제 감수성을 계산하기 위한 이론적인 방식을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 시험 배양액을 접종하기 위해 비표준 시료를 사용하는 것이 가능할지라도, 대안적인 실시형태에서 본 발명은 표준 AST 검정을 수행할 수 있기 위해서는 시험 미생물 배양액 내의 미생물 세포의 농도가 표준 농도 또는 표준화된 농도(예를 들어, 약 5 x 105개의 CFU/㎖)에 상응하도록 현탁액 및/또는 시험 미생물 배양액 내에 존재하는 미생물 세포의 농도를 물리적으로 조절하기 위한 방법을 제공한다.
현탁액 또는 이로부터 제조된 접종원은 시험 미생물 배양액을 접종하기 위해 사용된다. 상기에서 토의된 바와 같이, 현탁액은 배양 배지에 첨가될 수 있으며, 즉 현탁액은 시험 미생물 배양액을 확립하는 단계(AST 방법의 단계 (iii))에서 희석될 수 있거나 추가로 희석될 수 있다. 따라서, 시험 미생물 배양액은 임의의 목적하는 농도 또는 소정의 농도를 포함하도록 이 시점에 조절될 수 있다. 따라서, 시험 미생물 배양액은 CFU/㎖의 미생물 세포의 초기 농도를 적어도 10개, 101개, 102개, 103개, 104개, 105개, 106개, 107개, 108개 또는 109개의 CFU/㎖, 바람직하게는 102개 내지 108개의 CFU/㎖, 103개 내지 107개의 CFU/㎖ 또는 104개-106개로 포함할 것이다. 따라서, 상기에 언급된 바와 같이, 시험 미생물 배양액은 5 x 104 ± 80%, 1 x 104 ± 80%, 4 x 105 ± 80%, 4.5 x 105 ± 80% 또는 5 x 105 ± 80%의 최종 농도까지 설정될 수 있다.
그러나, '표준' 시료를 구성하는 것이 미생물의 동질성에 따라 달리질 수 있으며, 즉 현탁액 내에 존재하는 미생물 세포의 농도가 미생물의 동질성에 의존할 수 있는 것으로 주지된다. 바람직하게는, 현탁액 내의 미생물 세포의 농도는 10개 내지 1011개의 CFU/㎖, 10개 내지 1010개의 CFU/㎖, 10개 내지 109개의 CFU/㎖, 102개 내지 109개의 CFU/㎖, 103개 내지 109개의 CFU/㎖, 104개 내지 109개의 CFU/㎖, 105개 내지 109개의 CFU/㎖, 106개 내지 109개의 CFU/㎖, 107개 내지 109개의 CFU/㎖일 것이다.
AST 검정을 위해 인지 및 지정된 조건이 존재하며, 기타 실험실에서 수행된 시험과 비교할 만하거나 이와 비교될 수 있는 용이하게 비교할 만한 결과가 수득될 수 있기 위해 상기 조건을 따를 수 있다.
이는, 예를 들어 지정된 배지 및 배양 조건의 이용을 수반할 수 있다. 특정 실시형태에서, 미생물 배양액용 배지는 액체 배지일 수 있으며, 즉 배양 배지는 액체일 수 있다.
특정 실시형태에서, 상이한 미생물의 성장을 위해 상이한 배지를 갖는 시험 미생물 배양액을 동시에 확립하는 것이 유리하거나 바람직할 수 있다. 이는, 예를 들어 시료(및 이로 인해 현탁액) 내의 미생물의 동질성이 알려져 있지 않는 경우 또는 이들의 성장 패턴 또는 요건이 완전히 특성 분석되지 있지 않는 경우에 유용할 수 있다. 따라서, 예를 들어, AST 방법에서는 성장 배지 내에 난배양 보충물을 함유하거나 함유하지 않는 병렬형 미생물 시험 배양액이 확립될 수 있거나, 다시 말해 난배양 또는 비-난배양 배지 내의 병렬형 미생물 시험 배양액이 확립될 수 있다. 난배양 배지는 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 사전에 준비된 난배양 배지 및 난배양 보충물 둘 모두는 광범위하면서도 상업적으로 이용 가능하다. 난배양 보충물은, 예를 들어 용균된 혈액 제제(예를 들어, 용균된 말 혈액), 혈청, 다양한 비타민 및/또는 무기물, 보조 인자 등, 예를 들어 베타-니코틴아미드를 포함한다. 편의 상, 난배양 보충물은 희석 프로토콜의 일부로서 배양 배지에 첨가될 수 있다. 더욱이, 난배양 배지 또는 보충물이 사용되는 지의 여부는 현탁액에 대해 결정된 미생물 세포의 농도에 의존할 수 있다. 예를 들어, 농도가 낮은 경우, 예를 들어 현탁액 내의 미생물 세포가 2 x 106개의 CFU/㎖ 미만으로 존재하는 경우, 난배양 배지/보충물과 함께 미생물 시험 배양액을 사용하는 것은 AST 방법에서 생략될 수 있다.
특정 실시형태에서, 특정 항균제에 대한 감수성을 시험하도록 최적화된 상이한 배지를 갖는 시험 미생물 배양액을 동시에 확립하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 항생제용으로 필요한 첨가제가 시험 미생물 배양액에 포함될 수 있다 예를 들어, 폴리소르베이트 80이 포함될 수 있고/있거나, 특정 시험 미생물 배양액 내에는 증가된 칼슘 농도가 제공될 수 있다.
미생물은 다양한 향균제의 존재 하에 성장하여 주어진 항균제에 대한 이들의 감수성을 결정할 수 있다. 항균제는 알려져 있는 경우 미생물의 동질성에 기초하여 선택될 수 있으며, 바람직하게는 미생물 내에서 확인된 임의의 유전적 항균제 내성 마커의 특성에 기초하여 또한 선택될 수 있다. 또한, 항균제 및 사용될 양은 현재 선택되는 용인 및 인정된 항균 처리에 대한 미생물의 감수성을 평가할 수 있도록 현재의 임상 실습에 따라, 예를 들어 동정된 미생물을 처리하기 위해 현재 실습에 사용되는 항균제에 따라 선택될 수 있다.
따라서, 항균제는 동정된 미생물에 대해 효과적인 것으로 알려져 있는 것 또는 미생물을 치료하기 위해 현재 실습에서 사용되고 있는 것에 기초하여 선택될 수 있으며, 내성 마커의 존재에 기초하여 내성이 예상될 수 있는 임의의 약제를 제외하거나, 이 같은 약제를 포함할 수 있고, 사용된 양은 내성 마커의 존재에도 불구하고 효과적일 수 있는 항균제의 양 또는 농도의 결정을 허용하도록 선택될 수 있다. 항균제는 다양한 최종 농도 또는 양까지 배양 배지에 첨가된다. 본 발명의 하나의 실시형태에서, 항균제의 희석이 수행될 수 있다. 본 발명의 바람직한 형식에서, 용해한 이후에 소정의 농도를 얻기 위해 AST 이전에 미생물과 함께 배양 배지가 첨가된 웰에 향균제를 소정의 양으로 미리 넣어둔다. 미리 넣어둔 항균제는 바람직하게는 건조된 제형, 예를 들어 동결 건조 또는 진공 건조된 제형이다.
AST 검정에서 이로부터 현탁액/미생물을 성장 또는 배양하는 단계는 임의의 알려져 있거나 편리한 수단에 의해 이루어질 수 있다. 고체상 또는 액체상 배양액이 사용될 수 있다.
따라서, 예를 들어 하나의 바람직한 실시형태에서, 미생물은 플레이트 또는 기타 고체 배지 상 또는 그 내에서 배양될 수 있거나, 항균제를 함유하는 액체 배지가 담겨 있는 용기(예를 들어, 플레이트의 웰) 내에서 배양될 수 있으며, 미생물 성장은 미생물을 시각화함으로써(즉, 플레이트 등을 이미지화함으로) 결정될 수 있다. 따라서, 배양액은 성장을 모니터링 또는 평가하는 수단으로서 직접 시각화 또는 이미지화된다. 따라서, 하나의 바람직한 실시형태에서 배양액은 성장을 모니터링/평가하기 위해 직접 분석된다. 예를 들어, 배양액은 플레이트의 웰 또는 캐리어 기재의 구획 내에서 성장할 수 있으며, 웰/구획을 이미지화할 수 있다.
대안적으로, 시료(또는 분취액)는 간격을 두고 또는 상이한 시점에 AST 시험 배양액으로부터 제거(또는 채취)될 수 있으며, 제거된 시료(분취액)는 미생물 성장에 대해 분석할 수 있다. 이는 분자 시험, 예를 들어 핵산 기반 시험을 포함하는 임의의 수단에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 미생물 세포에 결합하거나 미생물 세포로부터 방출 또는 분리된 성분에 결합하는 검출 프로브 및/또는 프라이머가 사용될 수 있다. 이는, 예를 들어 미생물 DNA와 혼성화할 수 있는 핵산 프로브 또는 프라이머를 포함할 수 있다. 기타 실시형태에서, 미생물 세포는, 예를 들어 하기에 보다 상세하게 기술되는 바와 같이 염색에 의해 직접 검출될 수 있다.
각각의 항균제는, 미생물이 임의의 항균제의 부재 하에 성장하도록 하는 양성 대조군뿐만 아니라 시험 분취액의 첨가 없이 배양되는 적어도 하나의 음성 대조군 이외에도 적어도 2개의 농도로 사용될 수 있다. 예를 들어, 항균제는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개 또는 그 이상의 농도로 사용된다. 희석 시리즈에서 사용되는 용도는 개개의 농도 사이에는 2배의 차이가 있을 수 있다.
항균제란 용어는 미생물을 살해하거나 이들의 성장을 억제하는 임의의 약제를 포함한다. 본 발명의 항균제는 특히 항생제 및 항진균제를 포함할 수 있다. 항균제는 살균성 또는 정균성(microbiostatic)일 수 있다. 진균 또는 특히 다양한 그룹의 진균에 대해 활성인 항생제를 포함한 다양한 상이한 부류의 항생제가 알려져 있으며, 이들 모두가 사용될 수 있다. 항생제는 베타-락탐 항생제, 세팔로스포린(cephalosporin), 폴리믹신(polymyxin), 리파마이신(rifamycin), 리피아마이신(lipiarmycin), 퀴놀론(quinolone), 설폰아미드(sulphonamide), 매크롤라이드(macrolide), 린코사마이드(lincosamide), 테트라사이클린(tetracycline), 아미노글리토시드, 글리코펩티드, 환형 리포펩티드, 글리실사이클린(glycylcycline), 옥사졸리디논(oxazolidinone), 리피아마이신(lipiarmycin) 또는 카르바페넴(carbapenem)을 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 항진균제는 폴리엔, 이미다졸, 트리아졸 및 티아졸, 알릴아민 또는 에키노칸딘(echinocandin)을 포함할 수 있다. 항균제는 계속해서 개발되고 있으며, 본 발명에 의해 미래의 항균제를 분석하는 것이 또한 가능한 것으로 이해된다.
바람직하게는, 시험 미생물 배양액 중 적어도 하나는 난배양 배지를 포함한다. 보다 바람직하게는, 시험 미생물 배양액들 중 적어도 2개, 예를 들어 동일한 항균제를 상이한 농도로 포함하는 상이한 성장 조건들 중 적어도 2개는 특정 항균제에 대한 미생물의 항균제 감수성이 난배양 성장 조건 하에 있도록 난배양 배지를 포함할 수 있다.
항균제 감수성은 현탁액으로부터 미생물을 배양하고 다양한 시점에 걸쳐 AST 배양액을 분석함으로써 결정될 수 있다.
미생물 성장을 모니터링하기 위해 다수의 시점에 AST 배양액을 분석할 수 있다. 예를 들어, 배양을 억제한 후 0시간, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간 또는 24시간의 시점에 배양액을 분석할 수 있다. 배양의 억제 직후(t = 0)에 배양액을 분석할 수 있다. 또한 배양의 억제 후 24시간을 지난 기간에 배양액을 분석할 수 있다. 전형적으로, 배양의 억제 후 0시간, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 6시간 및 24시간에 배양액을 분석할 수 있다. 그러나, 상기 방법을 이용하여 수득된 결과에 따르면 짧은 배양 시간 예를 들어 4시간이 차등 미생물 성장을 검출하는데 충분할 수 있는 것으로 나타난다. 따라서, 최대 8시간, 7시간, 6시간, 5시간, 4시간, 3시간 또는 2시간의 보다 짧은 총 배양 시간이 또한 사용될 수 있으며, 예를 들어 매시간, 2시간 마다 또는 90분 마다 분석할 수 있다. 상기에 언급된 바와 같이, 일반적으로 2개 이상의 시점, 예를 들어 2개 이상의 시점 내지 배양 최대 4시간, 5시간 또는 6시간까지 배양액을 분석한다. 특정 실시형태에서, 보다 빈번한 시점에 AST 배양액을 분석할 수 있다. t = 0에 AST 배양액을 분석할 수 있으며, 후속적으로 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 10분, 15분, 20분, 25분 또는 30분의 간격으로 배양액을 분석할 수 있다. 따라서, 이 같이 짧은 분석 간격이 사용되는 경우에 요구되는 총 배양 시간이 또한 유리하게 감소될 수 있으며, 이로 인해 최대 10분, 15분, 20분, 25분, 30분 또는 60분의 보다 짧은 배양 시간이 사용될 수 있다.
AST 검정에서의 미생물 성장의 모니터링 또는 평가는 연속적으로 또는 소정의 기간에 걸쳐 간격(예를 들어, 최대 10분, 15분, 20분, 25분 또는 30분 또는 최대 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간 또는 8시간)을 두고 성장을 모니터링함으로써 이루어질 수 있거나, AST 성장 배양(시험 미생물 배양)이 시작되는 시간(t0)에서의 미생물 세포 물질의 양을 이후의 시점(예를 들어, 최대 10분, 15분, 20분, 25분 또는 30분 또는 최대 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 또는 8시간)에서의 미생물 세포 물질의 양과 비교함으로써 이루어질 수 있으며, 즉 상기 성장은 중간 기간에 이루어졌다. 대안적으로, 미생물 세포 물질의 양은 2개 이상의 상이한 시점에 결정될 수 있으며(예를 들어, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 10분, 15분, 20분, 25분 또는 30분 또는 1시간, 2시간, 3시간 또는 4시간 이후의 제1 시점을 측정하고, 제1 시점 이후 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 10분, 15분, 20분, 25분 또는 30분 또는 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간 또는 7시간째의 제2 시점 또는 배양 시작 이후 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 35분, 40분, 45분, 50분 또는 55분 또는 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간 또는 8시간째의 제2 시점을 측정함), 그 결과 성장량이 결정될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 미생물의 성장 정도는 하나 초과의 시점, 즉 적어도 2개의 시점에 결정될 수 있다.
다른 실시형태에서, 오직 하나의 시점, 예를 들어 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간 또는 8시간에 항생제의 부재 하에 성장한 시험 미생물 배양액(예를 들어, 양성 대조군)과 함께 항생제의 존재 하에 성장한 시험 미생물 배양액에서 성장을 평가한다. AST 성장 배양이 개시 이후 하나의 시점(또는 2개 이상의 시점)에서 성장을 모니터링을 하면 유리하게는 보다 정확한 결과가 미생물 성장의 지연기 동안 성장의 측정을 회피함으로써 달성될 수 있도록 할 수 있는데, 이는 이 기간 동안에 상이한 조건 하의 미생물 성장 사이의 임의의 차이가 작으며 검출하기 어렵기 때문이다. 제1 측정은 30분 또는 1시간, 2시간, 3시간 또는 4시간 이후에 이러한 방법에 따라 이루어질 수 있으며, 제2 측정은 제1 시점 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간 또는 8시간 이후에 이루어질 수 있다.
그러나, 특정 미생물, 예를 들어 특정 혐기성 생물, 마이코박테리아 또는 진균에 있어서 미생물 성장은 속도가 덜 빠를 수 있으며, 그 결과 AST 검정은 보다 긴 기간 동안 수행할 필요가 있을 수 있다는 것이 자명할 것이다. 따라서, 본 발명의 특정 실시형태에 따르면 8시간, 9시간, 10시간, 11시간 또는 12시간 또는 그 이상, 예를 들어 12시간, 18시간 또는 24시간 동안 미생물 성장을 측정함으로써 AST 검정을 수행하는 것이 필수적이거나 바람직할 수 있다. 따라서, 하나 이상의 시점에 적합한 측정이 이루어질 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 성장은 각각의 성장 조건에서의 미생물 세포의 초기 개수(양 또는 농도) 대비 적어도 2개의 성장 조건(예를 들어, 각각의 성장 조건)에서 측정될 수 있다.
시험 미생물 배양액의 배양은 미생물 성장을 조장하는 임의의 온도, 예를 들어, 약 20℃와 40℃ 사이 또는 20℃ 내지 37℃, 바람직하게는 약 25℃와 37℃ 사이, 보다 바람직하게는 약 30℃와 37℃ 사이 또는 30℃ 내지 35℃의 온도에서 이루어질 수 있다. 하나의 실시형태에서, AST 배양액은 약 35℃에서 배양할 수 있다.
미생물 성장을 모니터링 또는 평가하기 위한 많은 방법이 알려져 있으며, 예를 들어 혼탁도 측정, 비색 결정, 광 검출, 관 산란, pH 측정, 분광 측정, 형광 검출을 포함하는 AST 검정에서 사용되며, 이때 이는 항생제 또는 항균제의 분해 산물을 측정하거나, 핵산 함량을 측정하거나, 가스, 예를 들어 CO2의 생성을 측정함으로써 이루어진다. 이들 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면 성장은 이미지화 방법에 의해 미생물 세포의 개수 및/또는 양 및/또는 크기 및/또는 영역을 결정 또는 평가함으로써 검출 및 평가할 수 있다. 상기에 언급된 바와 같이, 미생물 세포는 콜로니 및/또는 집성체 내의 세포를 포함할 수 있다. 이는, 미생물을 측정 또는 검출하기 위해 알려져 있는 방법들 중 임의의 것에 의해 항균제의 존재 하의 성장 이전 및/또는 이후에 존재하는 미생물의 개수 또는 양을 평가 또는 결정함으로써 달성될 수 있다. 이 같은 결정은 미생물 세포, 집성체 및/또는 콜로니의 개수 및/또는 크기를 결정하는 단계를 수반할 수 있다. 게다가, 이를 위한 기법이 알려져 있으며, 이용 가능하다. 따라서, 성장은 미생물 및/또는 미생물 세포 및/또는 콜로니 및/또는 집성체의 개수 및/또는 양 및/또는 크기를 시간이 지남에 따라 모니터링함으로써 측정될 수 있다. 이는 직접 또는 간접적으로 측정될 수 있다. 미생물의 개수 또는 양은 혈구 측정법, 유세포 분석법 또는 자동화 현미경 검사에 의해 직접 측정될 수 있다. 미생물은 검출 이전에 고정 및/또는 투과성화될 수 있다. 대안적으로, 미생물은 생체 내 조건 하에 검출될 수 있다.
유세포 분석법을 이용한 박테리아 세포수 모니터링에 의한 AST 검정을 위한 방법은 문헌[Broeren et al., 2013, Clin. Microbiol. Infect. 19. 286~291]에 기술되어 있다. 박테리아가 성장하여 다중 채널 유체 카세트에서의 자동화 현미경 검사에 의해 산정되는 AST 검정을 수행하기 위한 방법은 문헌[Price et al., 2014, J. Microbiol. Met. 98, 50~58] 및 문헌[Metzger et al., 2014. J. Microbiol. Met. 79, 160~165]에 기술되어 있으며, 악셀러레이트 다이어그노스틱스(Accelerate Diagnostics; 예를 들어 WO 2014/040088 A1, US 2014/0278136 A1 및 US 8,460,887 B2 참조)에 의해 기술되어 있다. 이들 방법에서, 표면 상에 박테리아를 고정하여 성장시키고 2개 이상의 시점에 표면을 이미지화함으로써 생존능 및/또는 성장에 대해 개개의 박테리아 및/또는 콜로니를 평가한다(콜로니의 성장을 측정하는 단계를 포함함). 이 같은 방법은 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 기타 알려져 있는 방법은 문헌[Fredborg et al., J Clin Microbiol. 2013, 51(7): 2047~53]에 의해 기술되고, 용액의 일련의 중첩된 이미지(대상 평면)를 촬영하고 시료 내에 존재하는 박테리아를 계수함으로써 명시야 현미경 검사를 이용하여 박테리아를 용액에서 이미지화한 유니센서(US 8780181)에 의해 기술된 바와 같다.
본원에서 기술되거나 당해 기술분야에 알려져 있는, 미생물 성장을 모니터링하기 위한 이미지화의 이용에 기반을 둔 방법들 중 임의의 것은 AST를 결정하기 위해 본원에 개시된 임의의 방법의 AST 단계(상기에 개시된 AST 방법의 단계 (iv))에서 사용될 수 있다. 그러나, 특정 실시형태에서 AST 방법에서의 미생물 성장 결정 단계(즉, 미생물 성장 정도를 평가하는 단계 (iv))는 개개의 세포의 계수 또는 개개의 세포 또는 콜로니 성장의 모니터링(예를 들어, 악셀러레이트 다이어그노스틱스 인코포레이티드의 방법에 따른 개개의 세포 또는 콜로니의 크기 증가의 모니터링)에 의존하지 않는다. 따라서 본 발명에 개시된 방법은 AST 배양액 또는 AST 배양 시료를 이미지화하기 위한 고정 위치의 사용에 제한되지 않는다(그리고, 특정 실시형태에서는 고정 위치의 사용을 수반하지 않는다). 오히려, 예를 들어 시야 내의 벌크 세포를 이미지화함으로써 AST 배양액 내의 세포의 벌크 성장을 모니터링하는 것이 바람직하다. 시야 내의 미생물 세포 물질(생물량)의 양(예를 들어, 영역)은 이미지화에 의해 결정될 수 있다. 세포/미생물 생물량은 명시야 현미경 검사를 이용하여 (예를 들어, 현미경 또는 카메라 등에 의해) 직접 검출될 수 있거나, 미생물 세포는, 예를 들어 소정의 또는 요구되는 성장 기간 이후에 염색제를 AST 배양액 또는 배양 시료에 첨가함으로써 검출용으로 염색될 수 있다. 그러나, 기타 방법에서 개개의 세포를 계수할 수 있거나, 개개의 세포 또는 콜로니의 성장을 모니터링할 수 있다. 따라서, 본원에 구체적으로 개술되고 증명된 방법을 제외한 기타 방법은 AST 시험 배양액에서 미생물 성장을 결정 또는 평가하기 위해 사용될 수 있으며, 미생물 현탁액을 제조하고/하거나 그 내부의 미생물 농도를 결정하기 위한 본원에 개시된 방법은 기타 AST 방법에 활용할 수 있다.
따라서, 미생물 시험 배양액에서의 성장을 평가하는 단계 (iv)에서 이는 바람직하게는 이미지화에 이용 가능한 배양액의 대부분(유의하거나 실질적인 부분)에 대한 시험 배양액을 이미지화함으로써 수행된다. 더욱이, 단계 (iv)에서 이미지화는 이미지화를 위한 시험 배양액의 개체군 또는 일부를 미리 선택하지 않도록 이루어질 수 있다. 액체(브로스) 배양액에 대한 시간 경과에 따른 이미지를 생성할 수 있다.
추가의 특정 실시형태에서, AST 배양액은, 미생물 세포의 고정 없이 또는 표면으로의 이들 세포의 전달 또는 활성적 전송 없이, 예를 들어 세포를 검출 장소 또는 이미지화를 위한 표면으로 국부화하기 위한 전기영동과 같은 힘의 인가 없이 직접 이미지화 또는 시각화 할 수 있다.
이 같은 이미지화 방법에서, 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 방법 및 원리에 따라 이미지로부터 미생물 성장량에 대한 값을 결정하기 위해 알고리즘이 적용될 수 있다. 따라서, 이미지 내의 미생물 세포 물질/생물량의 개수, 크기 및/또는 영역(예를 들어, 이미지/시야 내의 모든 미생물 세포 물질, 예를 들어 이미지화된 총 세포 물질의 양)에 기초하여 미생물 세포의 이미지에 통계적 방법을 적용할 수 있다. 미생물의 동질성 및 배양액 내에 존재하는 항생제에 기초하여 상이한 성장 패턴 및/또는 형태를 설명하기 위해 알고리즘이 문서화되어 있을 수 있다. 시료 내의 미생물 생물량의 양을 측정하고, 따라서 미생물 성장을 측정하는데 사용하기 위한 예시적인 이미지 분석 알고리즘(경계화와 텍스쳐 필터링(texture filtering)이 결합되어 있음)은 공계류 중인 출원 WO 2017/216312에 기술되어 있으며, 이 같은 방법은 본 발명의 AST 방법에서 미생물 성장을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 이 같은 계수 또는 이미지화 방법에 의해 AST 검정에서 미생물의 디지털 표현형 분석이 허용된다. 이 같은 디지털 표현형 결정에 의해 참조 기법(예를 들어, 마이크로브로스(microbroth) 희석)의 값과 유사한 MIC 값이 제공된다는 것을 보여주는 데이터가 수득되었다.
이 같은 방법을 이용하는 특별한 이점은, 미생물을 광범위한 범위의 농도 또는 양으로 포함하는 시험 미생물 배양액에 대해 항균제 감수성 시험이 수행된다는 것이고, 항균제 감수성 시험을 수행하기 전에 표준화된 미생물 역가를 이용하는 것이 필수적인 것은 아니다. 본 발명의 유용한 특징은 상이한 농도의 미생물을 이용하는 능력이다. 적어도 103개의 CFU/㎖를 포함하는 시험 미생물 배양액 또는 시료가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있으며, 예를 들어 적어도 103개, 104개, 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 1010개 또는 1011개의 CFU/㎖를 포함하는 시료(AST 시험 시료)가 사용될 수 있다. 대안적으로, 103개 미만의 CFU/㎖, 예를 들어 102개 미만의 CFU/㎖를 포함하는 시험 미생물 배양액 또는 시료가 사용될 수 있다. 102개 미만의 CFU/㎖를 포함하는 시험 미생물 배양액 또는 시료가 본 발명의 방법에서 또한 사용될 수 있다.
명시야 이미지화가 시험 미생물 배양액 내의 미생물 세포의 농도를 검정하기 위한 하나의 형식을 나타낼지라도, 본 발명의 하나의 실시형태에서 미생물은 AST 시험 배양액 내의 미생물의 개수 또는 양을 결정하기 전에 미생물을 염색하는 마커(즉, 염색제 또는 염료)를 첨가함으로써 검출되거나, 예를 들어 위상차와 같은 미생물의 고유 특성을 이용하는 방법 또는 시료 내의 박테리아의 개수를 정량화하기 위한 당해 기술분야에 알려져 있는 임의의 기타 방법에 의해 검출될 수 있다. 적합한 염색제는 미생물을 시각화하는 수단으로서 컬러 또는 형광 염료, 예를 들어 그람 염색 또는 펩티도글리칸용 기타 염색 또는 DNA 염색을 포함할 수 있다. 본 발명의 하나의 특정 실시형태에서, 미생물 내의 DNA는 Vybrant® DyeCycleTM을 이용하여 염색될 수 있다. 기타 DNA 염색제가 잘 알려져 있으며, 이용 가능하다. 실제로, 박테리아 염색용으로 당해 기술분야에서 이용 가능한 염색제의 개수는 광대하며, 상당수의 이 같은 염색제가 표준 참고서를 비롯하여 문서로 기록되어 있으며, 예를 들어 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)로부터 상업적으로 이용 가능하다. 염색에 의한 미생물의 직접 표지는 수행하기가 용이하고, 편리하고, 비용 효율적이며, 따라서 바람직한 실시형태를 나타낸다.
따라서, 예를 들어 미생물은 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)의 웰에서의 AST 검정용으로 성장할 수 있으며(즉, 각각의 시험 미생물 배양액은 플레이트의 웰 내에 있을 수 있음), 성장 기간이 끝날 무렵에 염료 또는 염색제를 첨가하고, 플레이트의 웰을 이미지화할 수 있으며, 예를 들어 계수 또는 이미지화에 의해 미생물 세포, 집성체 또는 콜로니의 개수 및/또는 크기를 결정함으로써 미생물 또는 미생물 세포 물질의 개수 또는 양을 평가할 수 있다. 대안적으로, 유세포 분석기 또는 유사한 유형의 기기, 예를 들어 미국 특허 제10112194호에 기술되어 있는 바와 같이 예를 들어 큐-리네아 에이비(Q-linea AB; 스웨덴)의 Aquila 400 기기를 이용하여 미생물을 산정할 수 있다.
이미지 분석용 알고리즘이 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 이용 가능하여 이미지를 분석하고 미생물 생물량의 양에 대한 값 등을 유추 또는 수득할 수 있다. 상기에서 언급된 바와 같이, 하나의 이 같은 이미지 분석 기법은 WO 2017/216312에 기술되어 있으며, 이는 AST 시험에서 미생물 성장을 평가 및 결정하는 바람직한 수단을 나타낸다.
시료 내의 미생물용의 하나 이상의 항생제에 대한 항균제 감수성 값(예를 들어, MIC 및/또는 SIR 값)을 유추하기 위해 추가의 알고리즘을 사용할 수 있다. 이와 관련하여, 미생물에 대한 확인은 AST 시험을 확립하는데 도움을 줄 수 있을 지라도, 이는 방법의 전제 조건은 아니며, 미생물 ID는 방법을 수행하거나 확립하는 경우에 알 필요는 없다. 따라서, 시험 결과의 속도 측면에서 AST 방법은 시료 내의 미생물의 동질성(ID)이 알려져 있지 않는 경우에 시작될 수 있지만, ID는 결과의 해석 시, 예를 들어 AST 미생물 시험 배양액을 이미지화 하는 경우 및/또는 이미지화 결과를 분석하는 경우에 사용될 수 있다. 항균제 감수성 값(예를 들어, MIC 값)은 미생물 ID 없이 수득될 수 있지만, ID 정보는 미생물에 대한 SIR(감수성/중간/내성) 정보를 결정 또는 해석하는데 중요하다. 이미지화 분석으로부터 수득된 성장 데이터로부터 MIC 및/또는 SIR 정보를 유추 또는 수득하기 위한 데이터 가공 기법이 당해 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있으며, 이용 가능하다.
대안적인 실시형태에서, 미생물은 미생물 내에 또는 미생물 상에 생물학적 특징을 통해 특이적으로 표지될 수 있다. "생물학적 특징"은, 예를 들어 미생물 내 또는 미생물 상의 분자, 예를 들어 세포 표면 상에 발현되거나 위치하는 단백질 또는 기타 생체 분자일 수 있다. 예를 들어, 표지, 예를 들어 컬러 또는 형광 표지는 특정 생물학적 특징부에 특이적으로 결합하는 단백질 또는 친화도 결합 분자에 결합될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 단백질은 렉틴, 어피바디(affibody) 또는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 이러한 방식으로 표지된 미생물은 앞서 기술된 바와 같이 검출, 예를 들어 산정될 수 있다.
추가의 실시형태에서, 미생물 내 또는 미생물 상의 특정 생물학적 특징을 검출하기 위해 근접 프로브(proximity probe)를 사용할 수 있다.
본 발명의 추가의 대안적인 실시형태에서, 패드록 프로브(padlock probe) 및 RCA 기반 증폭 단일 분자 검출(ASMD) 방법을 이용하여 시험 미생물 배양액 내의 미생물을 검출 및 산정할 수 있다. 이 같은 방법은 단일 미생물 세포가 검출 및 계수 가능케 한다. 따라서, 패드록 프로브의 결합에 의해 미생물을 검출할 수 있으며, 미생물의 개수는 원형화된 패드록 프로브에 대한 RCA를 통해 생성된 증폭 신호에 의해 간접적으로 측정될 수 있다. 각각의 RCA 생성물(블롭(blob))은 단일 미생물을 나타낼 수 있다. 미생물은 용균될 수 있으며, 미생물의 하나 이상의 뉴클레오티드 서열과 혼성화하도록 설계된 패드록 프로브가 사용될 수 있다. 이는 DNA를 분리하는 단계 및 미생물 DNA를 선택적으로 분리 또는 부유화하는 단계를 포함할 수 있다. AST 검정에서 시험 미생물 배양액이 통상 초기 시료보다 덜 복잡하므로 미생물 DNA를 분리 또는 부유화하기 위한 간소화된 프로토콜이 사용될 수 있으며, 이때 이는, 예를 들어 미생물을 분리하기 위한 여과 및 미생물 세포 용균 또는 단순한 직접 미생물 세포 용균을 수반한다.
대안적으로, 미생물 상 또는 용균된 미생물 내에 존재하는 하나 이상의 분자에 결합하는 친화도 결합 분자가 사용될 수 있으며, 이때 이 같은 친화도 프로브에는 패드록 프로브가 혼성화할 수 있는 핵산 표지 또는 태그가 제공되는데, 즉 이는 면역 RCA 검출 절차에 유사하다. 유사하게, 미생물 내 또는 미생물 사의 표적에 결합하도록 인접 프로브가 사용될 수 있으며, 패드록 프로브의 결찰(ligation)을 템플레이팅(templating)하도록 인접 프로브의 핵산 도메인이 사용될 수 있으며, 선택적으로는 RCA에 의한 이의 증폭을 프라이밍(priming)한다. 이를 위한 절차는 널리 알려져 있으며, 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, 문헌[Dahl et al., 2004, PNAS USA, 101, 4548~4553] 및 WO 03/012199에 기술되어 있는 바와 같은 원 대 원 증폭(circle-to-circle amplification; C2CA)은 신호 증폭용으로 사용될 수 있다. 따라서, 시료 내의 미생물의 개수는 시료 내의 블롭에 대해 상기에 기술된 바와 같이 표지될 수 있는, 예를 들어 형광 표지될 수 있는 블롭의 개수를 계수함으로써 추정될 수 있다. 따라서, 이는 디지털 표현형 감수성 판독을 구현하는 다른 편리한 수단을 제공한다.
일반적으로 말하면, 시험 중인 미생물 배양액이 순수한 것, 즉 단일 미생물이 존재하는 것이 AST 검정을 수행할 때 유리하다. 그러나, 이는 본질적인 특징이 아니며, AST 검정을 수행하기 위한 시각화 또는 이미지화에 기반을 둔 미생물 검출 방법, 예를 들어 용액 내에서가 아닌 표면 상의 박테리아의 이미지화를 이용하는, 악셀러레이트 다이어그노스틱스에 의해 제공된 바와 같은 방법, 또는 실제로는 표지된 미생물이 상기에 토의된 유체 시스템, 예를 들어 문헌[Price et al., 2014, J. Microbiol. Met. 98, 50~58] 및 문헌[Metzger et al., 2014. J. Microbiol. Met. 79, 160~165]의 자동화 현미경 검사 유체 카세트 기반 시스템에서 검출되는 방법을 이용하는 것이 가능하다. 임의의 세포별 검출 또는 형상 인지 및/또는 확인 방법은 1개 초과의 미생물을 함유하는 시료에 대한 AST 검정용으로 사용될 수 있다. 상이한 미생물이 동일한 항생제에 의해 상이하게 영향을 받을 수 있으며, 따라서 특정 항생제를 이용한 처리 시에 유기체의 출연이 공배양액 내의 각각의 미생물에 대한 확인 및 AST 결정용으로 사용될 수 있는 것이 추가로 알려져 있다.
편의 상, 본 발명의 방법은 자동화될 수 있다. 상기 단계들 중 임의의 하나 이상이 자동화될 수 있으며, 바람직하게는 단계 (a) 내지 단계 (e) 중 임의의 것 또는 모두가 자동화될 수 있다. 상기에서 토의된 다양한 특정 단계 또는 바람직한 단계는 그 자체가 AST 검정 및 시료로부터 미생물의 회수뿐만 아니라, 충분히 자동화에 적합하며, 예를 들어 분취액을 염색제와 접촉시키고/거나, 현탁액의 분취액을 희석하고/하거나, 본 발명의 농도 결정 방법에서 분취액/염색제 혼합물을 이미지화하는데 적합하다. 혈액 배양 방법을 비롯하여 자동 배양 방법은 이미 개발되어 있으며, 이들은, 예를 들어 본 발명에 따라 사용하기 위한 자동화 농도 결정 및/또는 AST 검정과 결합될 수 있다. 자동화는 작동 속도 및 작동 용이성의 이점을 제공할 뿐만 아니라, 다중화 능력(multiplexing ability)을 제공할 수 있으며, 이는 임상 실험실 환경에 중요하며, 패혈증의 진단에 특히 중요하다.
본 발명의 방법 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 방법은 하기 도면을 참고하여 하기 실시예에서 보다 상세하게 개시될 것이다. 도면에서:
도 1은 본 발명의 방법을 이용하여 시료 희석액과 계산된 미생물 농도 사이의 선형 관계가 존재한다는 것을 보여준다. 엔테로코쿠스 패칼리스의 농도의 계산이 예시되어 있다.
도 2는 미생물의 검출 시에 세포의 고정을 위해 사용되는 에탄올 농도 변경에 따른 효과를 보여준다. 2개의 프로테우스 미라빌리스 균주의 검출이 나타나 있다(20170927crl1은 위쪽 선임).
도 3은 실시예 2에 기술된 바와 같은 프로테우스 미라빌리스에 대한 분석 결과를 보여준다. 수직 파선은 하한이고; 수직 실선은 하위 2.5% 백분위이고; 결과에 대한 정규 분포 또한 나타나 있다. 개개의 점은 개개의 측정점에 상응한다(도말 및 콜로니 계수에 의해 계산했을 때의 단위: CFU/㎖). 표시된 수치 데이터는 하기 그래프에 나타나 있다.
도 4 내지 도 12는 도 3과 동일한 데이터를 보여주지만, 크렙시엘라 뉴모니아에(도 4), 헤모필루스 인플루엔자에(도 5), 에세리키아 콜라이(도 6), 엔테로박터 클로아카에(도 7), 아시네토박터 바우마니이(도 8), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(도 9), 슈도모나스 에루지노사(도 10), 스타필로코쿠스 에피더미디스(도 11) 및 스타필로코쿠스 아우레우스(도 12)에 대한 데이터를 보여준다.
도 13은 상이한 양성 혈액 배양 플라스크 내에 존재하는 미생물의 농도 범위 및 농도 결정 단계 및 농도 조절 단계를 실시할 때와 비교하여 고정 희석 배율이 분취액에 적용되는 경우에 얻어진 미생물의 농도를 보여준다. BCF 시료 미생물 농도는 속이 채워진 사각형으로서 나타나 있고, 고정 희석 시료 농도는 속이 빈 사각형으로 나타나 있으며, 미생물의 농도가 결정/조절되어 있는 시료는 원형으로 나타나 있다. 5 x 105 개의 CFU/㎖ ± 60%에는 파선이 나타나 있다(EUCAST, CLSI 및 ICO 표준).
도 14는 상이한 조건 하에서의 배양 동안에 시간의 지남에 따른 크렙시엘라 뉴모니아에의 임상 단리체에 대한 미생물 생물량을 보여준다. 30분, 90분, 150분, 210분, 270분 및 330분의 시점(t)에 자동화 현미경 검사 이미지를 수득하였다. 도 14a는 트리메소프림(trimethoprim)/설파메톡사졸(sulfamethoxasole)에 대한 희석 시리즈가 존재할 때의 미생물 생물량을 보여준다. 도 14b는 피페라실린(piperacillin)/타조박탐(tazobactam)에 대한 희석 시리즈가 존재할 때의 미생물 생물량을 보여준다. 항생제 농도는 ㎎/ℓ 단위로 측정된다.
실시예
실시예 1: 미생물 농도 결정
재료의 준비
혈액 용균 완충제:
0.45%의 Brij-O10(시그마-알드리치, P6136) 용액을 PBS(10x PBS(시그마-알드리치, P7059); ddH2O로 1x까지 희석됨: pH 7.5)에서 제조하였다.
프로테이나아제 K:
프로테이나아제 K(메르크, 539480-1GM)를 50 mM의 트리스-HCl(pH 8)에서 2.1 mg/㎖의 농도가 되도록 용해하여 프로테이나아제 K 저장 용액을 얻었다.
SYTO BC:
5 mM의 SYTO BC(써모 피셔 사이언티픽, S34855)를 1x PBS에 첨가하여 20 μM의 SYTO BC 저장 용액을 얻었다.
농도 결정 프로토콜
1 ㎖의 용균 완충제를 50 ㎕의 프로테이나아제 K 저장 용액과 혼합하였다. 얻어진 용균 완충제/프로테이나아제 K 혼합물을 500 ㎕의 박테리아 시료에 첨가하고, 혼합하였다. 혼합물을 35℃에서 7분 동안 배양한 후, 0.2 μM의 공극 크기를 갖는 50 ㎜ 직경의 필터를 통해 4 ㎖/분의 속도로 여과하였다.
단리된 박테리아를 2 ㎖의 CAMBH(써모 피셔 사이언티픽, T3462)에서 세척한 후, 4 ㎖/분의 속도로 필터를 통해 2.5 ㎖의 CAMBH를 역류시킴으로써 재현탁하였다. 이어서, 재현탁물을 혼합하였다.
이어서, 20 ㎕의 재현탁물을 0 ㎕ 내지 20 ㎕의 70% 에탄올과 혼합하고; ddH2O를 이용하여 재현탁물/에탄올 혼합물의 부피를 40 ㎕로 만들어서, 에탄올의 혼합 농도가 0% 내지 35%가 되도록 하였다. 혼합물을 35℃에서 5분 동안 배양하였다. 이어서, 60 ㎕의 PBS를 첨가하고, 20 ㎕의 얻어진 희석 혼합물을 사용하여 10배 연속 희석을 실시하였다.
각각의 희석 시료의 15 ㎕ 분취액을 15 ㎕ 의 SYTO BC 저장 용액과 혼합하고, 염색제-시료 혼합물을 35℃에서 5분 동안 배양하였다. 이어서, 염색제-시료 혼합물을 플레이트로 전달하고, 에툴라마(Etulama) 플레이트 판독기에서 판독하였다.
판독 동안, 509 ㎚에서 SYTO BC 방출 피크를 검출하기 위해 502 ㎚ 내지 561 ㎚에서 방출 필터를 이용하여 광축 방향으로 30 ㎛ 이격되어 있는 각 웰에 대해 현탁액 내의 미생물에 대한 50개의 이미지를 수득하였다. 수득된 이미지는 경계화하고, 분석하여 온전한 미생물에 상응하는 각각의 대상의 크기, 형광 세기 및 선택적으로는 형태를 결정하여 각각의 분취액에 대한 이미지 분석 값을 수득하였다. 시료 내의 미생물의 특징은 농도 결정 단계에서 사용하기 위한 소정의 보정 곡선을 선택하기 위해(예를 들어, 시료가 클러스터링 또는 비-클러스터링 미생물인 지를 결정하기 위해) 사용되었다. 소정의 보정 곡선의 범위 내에서 이미지 분석 값을 갖는 희석된 분취액들 중 하나를 확인하였다. 상기 선택된 희석된 분취액에 대한 이미지 분석 값을 소정의 보정 곡선과 비교함으로써 시료 내의 온전한 미생물의 농도를 결정하였다.
보정 곡선의 준비
다수의 상이한 미생물에 대해, 그리고 상이한 농도의 에탄올을 고정액으로 사용하여 상기와 같이 이미지화 데이터를 수집하였으며, 계수된 대상의 개수와 온전한 미생물의 농도 사이의 관계를 그래프 상에 작도하였다. 도 1(35% 에탄올을 고정액으로 사용함)에서 엔테로코쿠스 패칼리스에 대해 예시된 바와 같이, 주어진 농도의 에탄올을 고정액으로 사용하는 경우에 대다수의 미생물 종에 있어서 계수된 대상의 개수와 온전한 미생물의 농도 사이에는 선형의 관계가 존재한다.
다양한 미생물 종 및 균주에 대해 고정액으로서의 에탄올의 최적의 농도가 결정되었다. 시험된 많은 종 및 균주에 있어서, 대략 35%의 최적의 에탄올 농도가 확인되었으며, 이는 최대의 미생물 염색을 가능케 하며, 이로 인해 검출이 개선되고 농도 결정 정확성이 증가한다. 다양한 농도의 에탄올을 고정액으로 사용하여 2개의 프로테우스 미라빌리스 종에 대한 농도 결정을 보여주는 예시적인 그래프가 도 2에 나타나 있다. 사용된 에탄올의 각각의 농도에 대해 시료 내에는 동일한 농도의 박테리아가 존재한다. 도시된 바와 같이, 에탄올 농도가 30% 내지 35%이면 2개의 균주 모두에 대한 최적의 검출이 제공된다.
실시예 2: 다양한 박테리아 종에 대한 분석
하기 종을 포함하는 시료를 실시예 1의 방법에 따라 분석하였다: 프로테우스 미라빌리스(도 3), 크렙시엘라 뉴모니아에(도 4), 헤모필루스 인플루엔자에(도 5), 에세리키아 콜라이(도 6), 엔테로박터 클로아카에(도 7), 아시네토박터 바우마니이(도 8), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(도 9), 슈도모나스 에루지노사(도 10), 스타필로코쿠스 에피더미디스(도 11) 및 스타필로코쿠스 아우레우스(도 12).
이 같은 종을 포함하는 10개와 36개 사이의 시료를 도면에 나타나 있는 바와 같이 분석하였다("N" 값 참조). 각각의 시료의 박테리아 농도는 포말 이후에 CFU를 계수함으로써 결정되었다. 정규 분포는 데이터에 맞추었으며, 각각의 데이터 세트에 대해서는 2개의 값이 표시되어 있다: 본 발명의 방법을 이용한 검출 하한에서의 하위 2.5% 백분위 및 박테리아 농도(1.5 x 106개의 CFU/㎖에 상응함).
본 발명의 방법의 정확성을 보장하기 위해, 정확한 농도 결정 제한치와 각각의 종에 대한 시료의 하위 2.5% 백분위의 농도 사이에는 적어도 한 자릿수의 차이가 존재하는 것이 바람직하다. 도 3 내지 도 12에 나타나 있는 바와 같이, 이는 P. 에루지노사, S. 에피더미디스 및 S. 아우레우스를 제외한 모든 종에 대해 나타난다. P. 에루지노사 및 S. 에피더미디스의 경우, 한 자릿수보다 조금 적은 차이가 존재하며; 이것이 최적을 아닐지라도 본 발명의 방법은 그럼에도 불구하고 이들 종의 농도를 측정할 때 매우 정확할 것으로 예상될 수 있다. S. 아우레우스에 있어서, 정확한 농도 결정 제한치는 4% 백분위 정도이다. 이는 S. 아우레우스의 클러스터링에 기인하며, 예를 들어 세정제 또는 적절한 알고리즘의 사용에 의한 S. 아우레우스 클러스터의 분리에 의해 이러한 어려움은 극복될 것으로 여겨진다.
실시예 3: 양성 혈액 배양 플라스크로부터 접종원의 제조
본 발명자들은 다양하고 상이한 그람 양성 미생물 종(스트렙토코쿠스 뉴모니아에, 스트렙토코쿠스 안지노수스, 스트렙토코쿠스 미티스, 스트렙토코쿠스 피오게네스, 스타필로코쿠스 에피더미디스, 스타필로코쿠스 아우레우스, 스타필로코쿠스 루그두넨시스, 스타필로코쿠스 캐피티스(Staphylococcus capitis), 스타필로코쿠스 호미니스(Staphylococcus hominis), 엔테로코쿠스 패칼리스, 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 및 리스테리아 그레이이(Listeria Grayi)를 포함하는 양성 혈액 배양 플라스크 내의 미생물의 농도의 가변성을 조사하였다. 각각의 양성 혈액 배양 플라스크에 대한 생존 가능한 세포수를 결정하고, 각각의 혈액 배양 플라스크 내의 미생물의 평균 농도에 기초하여 고정 희석 배율을 결정하였다. 각각의 양성 혈액 배양 플라스크에서 유래한 분취액을 고정 희석 배율로 희석하였다.
각각의 양성 혈액 배양 플라스크로부터 미생물 현탁액을 제조하고, 각각의 재현탁물에 대해 생존 가능한 세포수를 결정하였다. 또한 미생물을 2.8 ㎖의 CAMBH에서 재현탁한다는 것을 제외하고 상기 실시예 1에 개시된 방법에 의해 각각의 양성 혈액 배양 플라스크로부터 수득된 재현탁물에 대해 미생물의 농도를 결정하였다. 결정된 미생물의 농도에 기초하여 각각의 시료에 대한 접종원을 제조하였다. 각각의 접종원에 제공된 생존 가능한 세포의 실제 농도를 하기 식에 따라 계산하였다:
Figure pct00002
AST의 경우에 고정 희석 배율로 희석된 양성 혈액 배양 시료의 28%만이 표준 5 x 105개의 CFU/㎖ ± 60% 범위 내에 있는 농도로 생존 가능한 세포를 함유하고 있는 반면, 87%의 시료(농도 결정 방법에 기초하여 조절됨)에 대해 제조된 접종원은 이러한 범위 내에 있는 것으로 밝혀졌다. 결과는 표 1 및 도 13에 나타나 있다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
실시예 4: 크렙시엘라 뉴모니아에의 임상 단리체를 이용한 스파이크형(spiked) 양성 혈액 배양 플라스크의 단리, 농도 결정 및 항생제 감수성
재료의 준비
양성 혈액 배양 시료의 제조
아가 플레이트 상에서 성장한 임상 단리체를 개별적으로 PBS에서 현탁하고, 0.5의 맥파틀랜드 단위로 조절하였다. 이의 1:100 희석액을 건강한 기증자로부터의 9 ㎖의 혈액과 함께 혈액 배양 플라스크(비디 백텍크 플러스 에어로브(BD Bactec Plus Aerob))에 첨가하고, 혈액 배양 캐비넷(blood culture cabinet)에서 하룻밤 동안 배양하였다. 오전에, BCF가 양성으로 바뀐 후에 500 ㎕의 양성 BCF의 분취액을 후속적인 분석용으로 사용하였다.
시료의 제조:
500 ㎕의 양성 BCF를 자동화 시료 제조 및 농도 조절을 가능케 하는 소모품에 첨가하였으며, 미생물을 2.8 ㎖의 CAMBH에 재현탁한다는 것을 제외하고 실시예 1에 기술된 바와 같은 방법을 수행하여 자동화 시스템에서 미생물의 농도를 결정하였다. 소모품을 이용한 이 같은 시스템의 작동은 본 발명자의 공계류 중인 출원 GB 1806505.2에 보다 상세하게 기술되어 있다. 농도 결정 값을 소정의 표준 곡선과 비교하고, 회수된 현탁액 내의 미생물의 농도를 목적하는 농도(5 x 105개의 CFU/㎖)로 자동으로 조절하였다. 본 실험에 있어서, 생존 가능한 세포수를 결정하기 위해 농도가 조절된 박테리아의 분취액을 아가 플레이트 상에 도말하여 상기 과정에 대한 제어 척도(control measure)를 제공한다.
Figure pct00007
AST
자동화 피펫을 이용하여 CAMBH에서 농도가 조절된 시료를 336-웰 AST 디스크에 중앙 접속 포트를 통해 다양한 농도로 첨가하였다.
각각의 웰은 20 ㎕의 시료를 함유하고 있으며, 35℃에서 배양하였다. 초기 판독은 30분 이후에 이루어졌다(판독 0). 후속적인 판독(판독 1 내지 판독 6)은 자동화 현미경 검사에 의한 이미지화에 의해 최대 5.5시간의 총 AST 시간 동안 매 시간 이루어졌다. 사용된 바와 같은 자동화 현미경은 본 발명자의 공계류 중인 출원 PCT/EP2018/085692에 보다 상세하게 기술되어 있다.
MIC 소명
WO 2017/216312에 기술된 바와 같이, 이미지를 소명된 생물량 값 및 MIC로 전환함으로써 이미지를 분석하였다. 예를 들어, 도 14a(트리메소프림/설파메톡사졸) 및 도 14b(피페라실린/타조박탐)에 도시된 바와 같이, 상이한 항생제에 대해 상이한 농도의 항생제(㎎/ℓ) 하의 각각의 시점에서의 미생물 생물량을 결정하였다.
결과
다양한 항생제에 대해 MIC 항생제 농도(㎎/ℓ 단위로 측정됨)를 결정하였다. 각각의 항생제는 AST에서 3개의 세트로 존재하며, 이들은 본 실험에서 소모성이었다. 결과는 표 2에 나타나 있다.
Figure pct00008

Claims (51)

  1. 미생물 및 포유동물 세포를 함유하는 시료로부터 온전한 미생물 현탁액을 제조하는 방법으로서,
    a. 미생물 및 포유동물 세포를 함유하는 시료를 제공하는 단계;
    b. 상기 시료를 완충 용액, 세정제 및 하나 이상의 프로테아제와 접촉시키는 단계로서, 상기 완충 용액은 상기 시료 내에 존재하는 포유동물 세포의 용균을 허용하도록 적어도 pH 6과 pH 9 미만의 pH를 갖는 단계;
    c. 미생물을 유지하기에 적합한 필터를 통해 상기 단계 (b)에서 수득된 상기 혼합물을 여과하는 단계로서, 상기 여과에 의해 상기 혼합물로부터 상기 용균된 포유동물 세포를 제거하는 단계;
    d. 상기 단계 (c)에서의 상기 필터에 의해 유지되는 미생물을 회수하는 단계로서, 상기 회수는 상기 미생물을 액체에 재현탁하여 상기 회수된 온전한 미생물을 포함하는 현탁액을 제공하는 단계를 포함하는 단계; 및
    e. 상기 현탁액 내의 미생물의 농도를 결정하는 단계로서, 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 상기 미생물의 농도를 결정하는 단계:
    i. 상기 현탁액의 분취액을 알코올과 접촉시키고/시키거나 상기 현탁액의 분취액을 가열하는 단계;
    ii. 상기 현탁액의 하나 이상의 분취액을 선택적으로 희석하여 하나 이상의 희석된 분취액을 하나 이상의 희석 값으로 제공하는 단계로서, 상기 희석은 상기 단계 (i)의 이전, 동안 및/또는 이후에 이루어지는 단계;
    iii. 상기 단계 (e)(i) 또는 (e)(ii)의 분취액 적어도 일부를 DNA와 결합할 수 있는 단일 형광 염색제와 접촉시켜 현탁액/염색제 혼합물을 제공하는 단계로서, 상기 염색제는 방출 파장을 갖는 단계;
    iv. 상기 단계 (e)(iii)의 현탁액/염색제 혼합물을 상기 형광 염색제의 방출 파장에서 이미지화하고 상기 이미지화된 혼합물 내의 미생물에 상응하는 대상의 개수에 대한 이미지 분석 값을 결정하는 단계; 및
    v. 상기 단계 (e)(iii)의 상기 분취액에 대해 단계 (e)(iv)에서 수득된 이미지 분석 값을 소정의 보정 곡선과 비교하여 상기 현탁액 내의 미생물의 농도를 결정하는 단계를 포함하는, 시료로부터 온전한 미생물 현탁액을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 방법은 단계 (f)로서 상기 현탁액의 적어도 일부에서 상기 미생물의 농도를 조절하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 단계 (f)는 상기 현탁액 내의 상기 미생물의 농도를 결정하기 전에 상기 현탁액의 적어도 일부에서 상기 미생물의 농도를 조절하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 단계 (f)는 상기 단계 (e)에서 상기 농도가 결정된 이후에 상기 현탁액의 적어도 일부에서 상기 미생물의 농도를 조절하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 농도는 희석에 의해 조절되는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (e)(iii)의 염색제는 세포 투과성 염색제인 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시료는 임상용 또는 수의과용 시료 또는 임상용 또는 수의과용 시료의 배양액인 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충 용액은 pH 6.5 내지 pH 8.5의 pH를 갖거나, pH 6.5 내지 pH 8 또는 pH 7 내지 pH 8의 pH를 갖는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충 용액은 pH 7.5의 pH를 갖는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세정제는 비이온성 세정제인 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 비이온성 세정제는 Brij-O10인 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세정제의 농도는 0.1%(w/v) 내지 5%(w/v) 또는 0.1%(w/v) 내지 1%(w/v)인 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 세정제의 농도는 0.45%(w/v)인 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제는 프로테이나아제 K인 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 상기 시료를 (i) PBS(pH 7.5) 및 0.45%(w/v)의 Brij-O10을 포함하는 용균 완충제 및 (ii) 프로테이나아제 K를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 여과 단계 (c)는 0.5 ㎛ 미만, 바람직하게는 0.25 ㎛ 미만의 공극 크기를 갖는 필터를 이용하여 상기 혼합물을 여과하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 필터로부터 미생물을 회수하는 단계는 상기 필터를 통해 액체를 역류(back-flushing)시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (d)에서 상기 미생물 세포는 미생물을 배양하기에 적합한 액체 성장 배지에 재현탁되는 것인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 필터는 단계 (c)와 단계 (d) 사이에서 세척되는 것인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (e)(i)의 알코올은 에탄올인 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 단계 (e)(i)에서 에탄올은 얻어진 농도가 30%(v/v) 내지 40%(v/v), 바람직하게는 35%(v/v)가 되도록 상기 현탁액에 첨가되는 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (e)(ii)에서 상기 현탁액은 완충제로 희석되는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 완충제는 PBS인 것인 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방출 파장에서의 상기 형광 염색제의 형광 세기는 상기 염색제가 핵산에 결합되어 있는 경우에 향상되는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 형광 염색제는 비대칭 시아닌 염료인 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형광 염색제는 350 ㎚ 내지 700 ㎚의 파장 범위에서 여기 및 방출 파장을 갖는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 형광 염색제는 녹색 형광 염색제인 것인 방법.
  28. 제24항 또는 제27항에 있어서, 상기 형광 염색제는 SYTO 염색제인 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 SYTO 염색제는 SYTO BC인 것인 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 현탁액의 분취액을 희석하여 2개 이상의 희석된 분취액을 상이한 희석 값으로 제공하는 단계를 포함하며, 상기 2개 이상의 분취액은 단계 (e)(ii) 동안에 동시에 또는 순차적으로 제조되고, 제2 또는 추가의 희석된 분취액은 단계 (e)(iv) 및/또는 단계 (e)(v) 이후에 제조되는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 단계 (e)(iii) 및 단계 (e)(iv)는 2개 이상의 분취액에 대해 상이한 희석 값으로 수행되고, 상기 단계 (e)(v)는 소정의 보정 곡선 범위 내에서 이미지 분석 값을 포함하는 분취액을 확인하는 단계 및 상기 분취액에 대한 이미지 분석 값을 상기 소정의 보정 곡선과 비교하여 상기 현탁액 내의 온전한 미생물의 농도를 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 단계 (e)(iii) 및 단계 (e)(iv)는 각각의 분취액에 대해 동시에 수행되는 것인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 상기 단계 (e)(iii) 및 단계 (e)(iv)는 각각의 분취액에 대해 순차적으로 수행되는 것인 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 이미지는 상기 현탁액/염색제 혼합물을 통해 하나 이상의 초점면(focal plane)에 수득되는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 이미지화는 광축을 따라 일련의 2D 이미지를 수득하는 단계를 포함하며, 상기 각각의 이미지는 소정 부피의 상기 현탁액/염색제 혼합물을 통해 상기 광축을 따라 상이한 위치에서 수득되는 것인 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염색제와의 접촉 단계 (e)(iii)은 4℃ 초과의 온도에서 수행되는 것인 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (e)(iii)의 접촉 시에 상기 분취액 또는 희석된 분취액 또는 이들의 일부는 1분 내지 20분의 기간 동안 상기 염색제와 함께 배양되는 것인 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (e)(iv)에서의 이미지화는 실온에서 실시되는 것인 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (e)(iv)의 이미지화 시에 미생물이 클러스터링형인지 또는 비-클러스터링형인 지를 확인하고, 클러스터링 또는 비-클러스터링 미생물에 대해 미리 정해져 있는 보정 곡선을 사용하는 것인 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이미지는 각각의 나열된 대상의 형광 세기 및/또는 크기 및 선택적으로는 각각의 나열된 대상의 형태에 대해 분석하는 것인 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이미지는 각각의 나열된 대상의 최대 형광 세기, 중간 형광 세기 및/또는 면적에 대해 분석하는 것인 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이미지는 상기 대상의 개체군의 최대, 중간 및/또는 평균 형광 세기 및/또는 면적에 대해 분석하는 것인 방법.
  43. 시료 내의 미생물의 항균제 감수성을 결정하기 위한 방법으로서,
    (i) 생존 가능한 미생물 및 포유동물 세포를 함유하는 시료를 제공하는 단계;
    (ii) 상기 시료에 대해 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 단계 (b) 내지 단계 (d)를 수행하여 상기 생존 가능한 미생물의 현탁액을 얻는 단계;
    (iii) 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 단계 (e)를 수행하여 상기 현탁액 내의 미생물 세포의 농도를 결정하는 단계;
    (iv) 상기 단계 (ii)의 현탁액을 이용하여 항생제 감수성 시험(AST)용의 일련의 시험 미생물 배양액을 접종하는 단계로서, 상기 일련의 시험 미생물 배양액은 적어도 2개의 상이한 성장 조건을 포함하되, 상기 상이한 성장 조건은 하나 이상의 상이한 항균제를 포함하며, 각각의 항균제는 2개 이상의 상이한 농도에서 시험되는 단계; 및
    (v) 각각의 성장 조건에서 상기 미생물의 성장 정도를 평가하는 단계를 포함하며,
    상기 현탁액 또는 상기 시험 미생물 배양액 내의 미생물 세포의 농도는 필요한 경우 목적하는 농도 또는 소정의 농도로 조절되고;
    상기 각각의 성장 조건에서의 미생물의 성장 정도는 적어도 하나의 항균제에 대한 상기 시료 내의 미생물의 감수성을 나타내는 적어도 하나의 값을 결정하기 위해 사용되는 것인 시료 내의 미생물의 항균제 감수성을 결정하기 위한 방법.
  44. 제43항에 있어서, 적어도 하나의 MIC 및/또는 SIR 값은 상기 시료 내의 상기 미생물의 항균제 감수성을 측정하기 위해 결정되는 것인 방법.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 단계 (iii)에서 결정된 농도에 기초하여, 상기 단계 (ii)의 현탁액의 적어도 일부의 농도를 조절하여 상기 단계 (iv)에서 상기 시험 미생물 배양액을 접종하기 위한 접종원을 제공하는 것인 방법.
  46. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 농도를 조절하는 단계는 상기 단계 (iii)에서 결정된 농도에 기반을 둔 희석을 포함하는 것인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 단계 (iii) 이후, 상기 단계 (ii)의 현탁액의 적어도 일부를 희석하여 단계 (iv)용 접종원을 제공하는 것인 방법.
  48. 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접종된 미생물 시험 배양액 내의 미생물의 농도는 4.5 x 105 ± 80% 또는 5 x 105 ± 60% 범위인 것인 방법.
  49. 제43항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험 미생물 배양액 중 적어도 하나는 난배양 배지(fastidious medium)를 포함하는 것인 방법.
  50. 제43항 내지 제45항 또는 제48항 또는 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 농도 조절은 상기 현탁액을 배양하거나 추가로 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  51. 제43항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 현탁액 내의 미생물의 농도가 미생물이 1 x 106개 미만인 경우에 AST 검정은 상기 현탁액을 이용하여 수행되지 않는 것인 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20240030398A (ko) * 2022-08-30 2024-03-07 가천대학교 산학협력단 항균물질의 정량적 항균력 측정방법

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201806509D0 (en) 2018-04-20 2018-06-06 Q Linea Ab Analysis instrument
US11541105B2 (en) 2018-06-01 2023-01-03 The Research Foundation For The State University Of New York Compositions and methods for disrupting biofilm formation and maintenance
CN110940646B (zh) * 2019-11-01 2022-08-12 江苏美克医学技术有限公司 一种阴道微生物检测双重荧光染色液及其应用
CN112342152B (zh) * 2020-06-28 2022-05-20 南昌大学 一种表达脂肪酶的山羊葡萄球菌株ncu s6
CN114112534B (zh) * 2021-12-06 2024-03-22 长春工业大学 一种适用于微生物悬浮液和固体培养基的智能取样及检测装置

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040115692A1 (en) * 2000-04-03 2004-06-17 Cytyc Corporation Methods, compositions and apparatuses for detecting a target in a preservative solution
US6803208B2 (en) * 2001-07-30 2004-10-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Automated epifluorescence microscopy for detection of bacterial contamination in platelets
CA2912900A1 (en) * 2006-04-13 2007-10-25 The Regents Of The University Of Michigan Nanoemulsion vaccines
EP2364356B1 (en) * 2008-10-31 2019-06-19 Biomerieux, Inc Methods for detection and identification of microorganisms
CA2839794A1 (en) * 2011-05-20 2012-11-29 Advandx, Inc. Selective ultrasonic lysis of blood and other biological fluids and tissues
ES2396820B1 (es) * 2011-07-26 2014-01-31 Universidad Autónoma de Madrid Método para evaluar la integridad de la pared celular bacteriana.
CA2865744A1 (en) * 2012-02-29 2013-09-06 President And Fellows Of Harvard College Rapid antibiotic susceptibility testing
CA2865582C (en) * 2012-02-29 2021-03-16 Becton, Dickinson And Company Formulations and process for isolating viable microorganism from positive blood cultures
EP3351642B1 (en) * 2014-06-13 2019-09-11 Q-Linea AB Method for detecting and characterising a microorganism
GB201511129D0 (en) * 2015-06-24 2015-08-05 Linea Ab Q Method of determining antimicrobial susceptibility of a microorganism

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20240030398A (ko) * 2022-08-30 2024-03-07 가천대학교 산학협력단 항균물질의 정량적 항균력 측정방법

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