KR20200098518A - δ3 γδ T-세포 집단의 선택적 증식을 위한 방법 및 이의 조성물 - Google Patents

Abstract

본 출원은 δ3 γδ TCR에 특이적인 에피토프에 결합하는 제제에 관한 것이다. 이러한 제제는 항체 또는 이의 단편일 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들어 δ3 γδ T 세포를 증식시키거나 선택적으로 증식시키는 제제를 사용하는 방법이 본원에 또한 기재된다. 증식된 δ3 γδ T 세포를 이를 필요로 하는 대상체의 치료를 위해 사용하는 방법이 본원에 또한 기재된다.

Description

δ3 γδ T-세포 집단의 선택적 발현을 위한 방법 및 이의 조성물

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 2017년 11월 15일로 출원된 미국 가출원 번호 제62/586,782호의 이익을 주장하며, 이의 내용은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 원용된다.

T 림프구에 의한 항원 인식은 고도로 다양한 이종이합체성 수용체인 T-세포 수용체(TCR: T-cell receptor)에 의해 달성될 수 있다. 혈액 및 림프구 장기에서의 대략 95%의 인간 T-세포는 이종이합체성 αβ TCR 수용체(αβ T-세포 계통)를 발현한다. 혈액 및 림프구 장기에서의 대략 5%의 인간 T-세포는 이종이합체성 γδ TCR 수용체(γδ T-세포 계통)를 발현한다. 이 T-세포 하위집단은 각각 'αβ' 및 'γδ' T-세포라 칭해질 수 있다. αβ 및 γδ T-세포는 기능이 상이하다. 이후, 항원 제시 세포(APC: antigen presenting cell)가 클래스 I/II MHC의 환경에서 항원을 제시할 때 αβ T-세포의 활성화가 발생한다. αβ T-세포와 반대로, γδ T-세포는 MHC 제한과 독립적인 항원을 인식할 수 있다. 또한, γδ T-세포는 선천성 및 입양 면역 인식 및 반응 둘 다를 조합한다.

γδ T 세포는 체세포 재배열된 가변(V), 다양성(D), 연결(J) 및 불변(C) 유전자의 뚜렷하게 다른 세트를 사용한다. γδ T 세포는 αβ T 세포보다 더 적은 V, D 및 J 분절을 함유한다. 생식선 Vγ 및 Vδ 유전자의 수가 Vα 및 Vβ TCR 유전자의 레퍼토리보다 더 제한되지만, TCR γ 및 δ 사슬 재배열 동안 더 광범위한 연결 다양성 과정은 αβ TCR의 것보다 가능성 있는 더 큰 γδ TCR 레퍼토리로 이어진다(Carding and Egan, Nat Rev Immunol (2002)　 2:336).

인간 γδ T-세포는 이의 TCR을 만들기 위해 3개의 주요 Vδ(Vδ1, Vδ2, Vδ3) 및 기껏해야 6개의 Vγ 영역 유전자를 사용한다(Hayday AC., Annu Rev Immunol. 2000;18, 975-1026). 2개의 주요 Vδ 하위집단은 Vδ1 및 Vδ2 γδ T 세포이다. 상이한 Vγ를 갖는 Vδ1 T 세포는 점막 γδ T 세포의 상피내 하위집단에서 지배적이고, 여기서 TCR은 상피 세포에서 스트레스 분자를 인식하는 것으로 보인다(Beagley KW, Husband AJ. Crit Rev Immunol. 1998;18(3):237-254). Vγ9를 일반적으로 동시발현하는 Vδ2 T 세포는 말초 혈액 및 림프계에 풍부하다.

이환된 세포에서 항원을 직접 인식하고 종양 세포를 사멸하는 고유한 능력을 나타내는 γδ T-세포의 능력은 γδ T-세포가 매력적인 치료학적 도구이도록 한다. Vγ9Vδ2 T 세포의 입양 전달은 암의 조사 치료에 대한 제한된 객관적인 임상 반응을 생성시키고(Kondo et al, Cytotherapy, 10:842- 856, 2008; Lang et al, Cancer Immunology, Immunotherapy: CII, 60: 1447-1460, 2011; Nagamine et al , 2009; Nicol et al, British Journal of Cancer, 105:778-786, 2011; Wilhelm et al, Blood. 2003 Jul 1;102(1):200-6), 이는 임상적으로 새로운 γδ T-세포 집단을 단리하고 시험할 필요성을 나타낸다.

개선된 순도로 그리고 임상적으로-관련된 수준에서 강력한 항종양 활성을 갖는 γδ T-세포 하위집단 집단을 선택적으로 증식(expansion)시키는 능력은 매우 바람직하다. 항체 및 사이토카인 칵테일이 γδ T 세포의 더 다양한 세트로 전파하도록 사용되지만, 충분한 순도 및 임상적으로-관련된 수준으로의 특정 γδ T-세포 하위집단의 활성화는 달성되지 않았다(Dokouhaki et al, 2010; Kang et al, 2009; Lopez et al, 2000; Kress, 2006). 따라서, 생체외 특정 γδ T 세포 하위집단을 증식시키기 위한 임상적으로-관련된 방법, 및 이에 의해 생산된 세포가 매우 필요하다.

본 발명은 일 양태에서 농후화된 γδ T 세포 집단을 생산하기 위한 생체외 방법을 제공한다. 농후화된 γδ T 세포 집단은 혼합된 세포 집단 또는 이의 정제된 분획을 δ3 TCR에 특이적인 에피토프에 결합하여 δ3 T 세포를 선택적으로 증식시키는 하나 이상의 제제과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 단리된 혼합된 세포 집단으로부터 생산될 수 있다. 증식된 T 세포 집단은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것에 의한 치료의 방법에서 예를 들어 개별적으로 또는 다른 T 세포 집단과 조합되어 사용될 수 있다. 일부 경우에, 상기 제제는 항체 또는 이의 단편이다.

제1 양태에서, 본 발명은 δ3 γδ TCR에 특이적인 에피토프에 선택적으로 결합하는 제제를 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 제제는 항체 또는 이의 단편이다. 일부 실시형태에서, 상기 제제는 δ3 γδ TCR에 특이적인 활성화 에피토프에 선택적으로 결합하는 활성화 제제(activating agent)이다.

일부 실시형태에서, 상기 제제(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)는 δ3-08, δ3-20, δ3-23, δ3-31, δ3-42, δ3-47 및 δ3-58로 이루어진 군으로부터 선택된 항체와 동일한 에피토프, 또는 본질적으로 동일한 에피토프에 결합한다(또는 이것과 경쟁한다). 일부 실시형태에서, 상기 제제(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)는 δ3-08, δ3-23, δ3-31, δ3-42, δ3-47 및 δ3-58로 이루어진 군으로부터 선택된 항체와 동일한 에피토프, 또는 본질적으로 동일한 에피토프에 결합한다(또는 이것과 경쟁한다). 일부 실시형태에서, 상기 제제(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)는 δ3-08, δ3-20, δ3-23, δ3-31, δ3-42, δ3-47 및 δ3-58로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 상보성 결정 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 제제(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)는 δ3-08, δ3-23, δ3-31, δ3-42, δ3-47 및 δ3-58로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 상보성 결정 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 상기 제제(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)는 δ3 TCR(예를 들어, γ2δ3 TCR)에 대한 항체 δ3-23, δ3-42, 및/또는 δ3-58의 결합과 경쟁한다. 일부 실시형태에서, 상기 제제(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)는 δ3 TCR(예를 들어, γ2δ3 TCR)에 대한 항체 δ3-08의 결합과 경쟁한다. 일부 실시형태에서, 상기 제제(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)는 δ3 TCR(예를 들어, γ2δ3 TCR)에 대한 항체 δ3-08, δ3-23, δ3-42, 및/또는 δ3-58의 결합과 경쟁한다. 일부 실시형태에서, 상기 제제(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)는 δ3 TCR(예를 들어, γ2δ3 TCR)에 대한 항체 δ3-31의 결합과 경쟁한다.

일부 실시형태에서, 상기 제제(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)는 γδ T 세포와 αβ T 세포를 포함하는 혼합된 세포 집단에서 αβ T 세포와 비교하여 δ3 γδ T 세포를 선택적으로 증식시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 제제(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)는 δ3 γδ TCR에 결합된다. 일부 실시형태에서, δ3 γδ TCR은 조작된 δ3 γδ T 세포의 표면에서 발현된다. 일부 실시형태에서, δ3 γδ TCR은 비조작된 δ3 γδ T 세포, 예컨대 선택적으로 증식된 비조작된 δ3 γδ T 세포의 표면에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 상기 제제(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)는 δ3 γδ T 세포의 표면에서 발현된 δ3 γδ TCR에 결합된다. 일부 경우에, δ3 γδ T 세포의 표면에서 발현된 δ3 γδ TCR에 결합된 상기 제제(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)는 δ3 γδ T 세포와 단리된 복합체를 형성하거나, 대상체에 있거나, 생체외 또는 시험관내 배양에 있거나, 용기에 있다. 일부 실시형태에서, 상기 제제(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)는 생체외 증식 배양에서 δ3 γδ T 세포의 표면에서 발현된 δ3 γδ TCR에 결합된다.

일부 실시형태에서, 상기 제제(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)는 항원 제시 세포(APC)의 세포외 표면에 결합된다. 일부 실시형태에서, 상기 제제(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)는 APC의 막에 고정된다. 일부 실시형태에서, 상기 제제(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)의 Fc 영역은 APC에 의해 발현된 Fc-수용체에 결합된다. 일부 경우에, APC는 인공 APC(aAPC)이다. 일부 경우에, APC는 대상체에 있거나, 단리되거나, 생체외 또는 시험관내 배양에 있거나, 용기에 있다.

일부 경우에, 상기 제제(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)는 Vδ3의 γ-사슬 결합 계면에 원위인 영역에 결합한다. 일부 경우에, 상기 제제(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)는 IMGT 명명법에 따라 γδ TCR의 Vδ3의 β 가닥 D 및 E에 결합한다. 일부 경우에, 상기 제제(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)는 IMGT 명명법에 따라 γδ TCR의 Vδ3의 β 가닥 C'' 및 D 및 β 가닥 E와 F 사이의 루프에 결합한다. 일부 경우에, 상기 제제(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)는 IMGT 명명법에 따라 γδ TCR의 Vδ3의 β 가닥 A, B, D 및 E에 결합한다.

일부 경우에, 상기 제제(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)는 Vδ3의 아미노산 K79 및 H88(IMGT 명명법)에 결합한다. 일부 경우에, 상기 제제(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)는 Vδ3의 아미노산 R75 및 R95(IMGT 명명법)에 결합한다. 일부 경우에, 상기 제제(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)는 Vδ3의 아미노산 K79, E18 및 H88(IMGT 명명법)에 결합한다. 일부 경우에, 상기 제제(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)는 Vδ3의 아미노산 E67, D70, R75, R95 및 E97(IMGT 명명법)에 결합한다. 일부 경우에, 상기 제제(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)는 Vδ3의 아미노산 K3, K79 및 H88(IMGT 명명법)에 결합한다. 일부 경우에, 상기 제제(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)는 Vδ3의 아미노산 K79, L82 및 H88(IMGT 명명법)에 결합한다. 통상적으로, 상기 제제는 Vδ3 γδ T 세포의 표면에서 발현된 Vδ3 γδ TCR과 같은 Vδ3 γδ TCR의 맥락에서 기술된 아미노산 또는 이의 그룹에 결합한다.

제2 양태에서, 본 발명은 상기 제제(예를 들어, 항체 또는 이의 단편) 중 임의의 하나를 암호화하는 핵산을 제공한다. 일부 경우에, 핵산은 이종성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 제3 항태에서, 본 발명은 상기 제제들 중 어느 하나 또는 상기 핵산들 중 어느 하나를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 경우에, 숙주 세포는 인공 항원 제시 세포(aAPC)이다.

제4 항태에서, 본 발명은 δ3 γδ TCR에 특이적인 에피토프에 결합하는 제제(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)를 생산하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 항체 또는 이의 단편을 생산하기에 충분한 조건 하에 상기 숙주 세포들 중 어느 하나를 배양하는 단계를 포함한다.

제5 양태에서, 본 발명은 농후화된 γδ T 세포 집단을 생산하기 위한 생체외 방법을 제공하고, 상기 방법은 γδ T 세포를 포함하는 제1 세포 집단을 상기 제제(예를 들어, 항체 또는 이의 단편) 중 하나 이상과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 세포 집단은 αβ T 세포와 γδ T 세포(예를 들어, δ3 γδ T 세포)를 포함하는 단리된 혼합된 세포 집단이다. 일부 실시형태에서, 제1 세포 집단은 말초 혈액 샘플, 백혈구세포채집술 샘플, 제대혈 샘플, 종양 샘플 또는 조직 샘플로부터 선택된다. 일부 경우에, 제1 세포 집단은 단일 공여자로부터 단리된 샘플이다. 일부 경우에, 제1 세포 집단은 다수의 공여자로부터 단리된 샘플이다. 일부 경우에, 제1 세포 집단은 PBMC 샘플이다. 일부 경우에, 제1 세포 집단은 단일 공여자로부터 단리된 PBMC의 샘플이다. 일부 경우에, 제1 세포 집단은 다수의 공여자로부터 단리된 PBMC의 샘플이다.

일부 실시형태에서, 상기 방법은 단리된 혼합된 세포 집단을 상기 제제(예를 들어, 항체 또는 이의 단편) 중 하나 이상과 직접 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 세포 집단은 하나 이상의 조작된 γδ T 세포를 포함하는 집단이다. 일부 실시형태에서, 제1 세포 집단은 증식된 γδ T 세포의 제1 집단이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 제1 γδ T 세포 증식 및 제2 γδ T 세포 증식을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 적어도 10⁸개의 δ3 γδ T 세포를 포함하는 농후화된 γδ T 세포 집단을 생산하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 10⁸개의 δ3 γδ T 세포를 포함하는 농후화된 γδ T 세포 집단은 12일 내지 21일 내에 생산된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 제1 세포 집단에서의 γδ T 세포를 적어도 1,000배 증식시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1,000배 증식은 12일 내지 21일 내에 달성된다.

제6 양태에서, 본 발명은 a) γδ T 세포를 포함하는 제1 세포 집단을 γδ T 세포를 활성화하고 증식시키는 하나 이상의 제1 활성화 제제와 접촉시켜 증식된 제1 γδ T 세포 집단을 생산하는 단계; 및 b) 증식된 제1 γδ T 세포 집단을 γδ T 세포를 활성화하고 증식시키는 하나 이상의 제2 활성화 제제와 접촉시켜 농후화된 γδ T 세포 집단을 생산하는 단계를 포함하되, 하나 이상의 제1 활성화 제제 중 적어도 하나 또는 하나 이상의 제2 활성화 제제 중 적어도 하나는 제1 양태에 따른 제제(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)인 농후화된 γδ T 세포 집단을 생산하기 위한 생체외 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 a) 후에 및 b) 전에 증식된 제1 γδ T 세포 집단을 단리시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, a)는 항원 제시 세포(APC) 및 하나 이상의 제1 활성화 제제의 존재 하에 제1 세포 집단을 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, b)는 항원 제시 세포(APC) 및 하나 이상의 제2 활성화 제제의 존재 하에 활성화된 γδ T 세포 집단을 배양하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 제1 세포 집단은 αβ T 세포와 γδ T 세포를 포함하는 단리된 혼합된 세포 집단이다. 일부 실시형태에서, 제1 세포 집단은 말초 혈액 샘플, 백혈구세포채집술 샘플, 제대혈 샘플, 종양 샘플 또는 조직 샘플으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 제1 세포 집단은 조작된 γδ T 세포의 집단이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 증식된 제1 γδ T 세포 집단을 유전적으로 변형시키거나 농후화된 γδ T 세포 집단을 유전적으로 변형시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 적어도 10⁸개의 δ3 γδ T 세포를 포함하는 농후화된 γδ T 세포 집단을 생산하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 10⁸개의 δ3 γδ T 세포를 포함하는 농후화된 γδ T 세포 집단은 12일 내지 21일 내에 생산된다.

일부 실시형태에서, 상기 방법은 제1 세포 집단에서의 γδ T 세포를 적어도 1,000배 증식시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1,000배 증식은 12일 내지 21일 내에 달성된다.

일부 실시형태에서, 하나 이상의 제1 활성화 제제 중 적어도 하나는 하나 이상의 제2 활성화 제제 중 적어도 하나와 구조적으로 동일하다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 제1 활성화 제제 중 적어도 하나는 하나 이상의 제2 활성화 제제 중 적어도 하나와 구조적으로 다르다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 제1 활성화 제제 중 적어도 하나 또는 하나 이상의 제2 활성화 제제 중 적어도 하나는 부동화된다. 일부 실시형태에서, 부동화된 활성화 제제는 배양 용기의 표면에 부동화된다. 일부 실시형태에서, 부동화된 활성화 제제는 항원 제시 세포(APC)의 표면에 부동화된다. 일부 실시형태에서, 부동화된 활성화 제제는 δ3 γδ TCR에 특이적인 에피토프에 결합하는 제제(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)이다.

제7 양태에서, 본 발명은 (예를 들어, δ3 γδ T 세포에 대한 양성 또는 음성 선택 전에) 증식된 γδ T 세포 집단을 제공하고, 여기서 증식된 γδ T 세포의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 또는 80% 초과는 δ3 γδ T 세포이다. 일부 실시형태에서, 증식된 γδ T 세포의 10% 내지 80%는 (예를 들어, δ3 γδ T 세포에 대한 양성 또는 음성 선택 전에) δ3 γδ T 세포이다. 일부 실시형태에서, 증식된 γδ T 세포의 10% 내지 60%는 (예를 들어, δ3 γδ T 세포에 대한 양성 또는 음성 선택 전에) δ3 γδ T 세포이다. 일부 실시형태에서, 증식된 γδ T 세포의 10% 내지 40%는 (예를 들어, δ3 γδ T 세포에 대한 양성 또는 음성 선택 전에) δ3 γδ T 세포이다. 일부 실시형태에서, 증식된 γδ T 세포의 20% 내지 80%는 (예를 들어, δ3 γδ T 세포에 대한 양성 또는 음성 선택 전에) δ3 γδ T 세포이다. 일부 실시형태에서, 증식된 γδ T 세포의 20% 내지 60%는 (예를 들어, δ3 γδ T 세포에 대한 양성 또는 음성 선택 전에) δ3 γδ T 세포이다. 일부 실시형태에서, 증식된 γδ T 세포의 20% 내지 50%는 (예를 들어, δ3 γδ T 세포에 대한 양성 또는 음성 선택 전에) δ3 γδ T 세포이다. 일부 실시형태에서, 증식된 γδ T 세포의 20% 내지 40%는 (예를 들어, δ3 γδ T 세포에 대한 양성 또는 음성 선택 전에) δ3 γδ T 세포이다.

일부 실시형태에서, 증식된 γδ T 세포 집단은 다중클론 TCR 다양성을 포함한다. 일부 실시형태에서, 증식된 γδ T 세포 집단에서의 δ3 γδ T 세포의 30%, 40%, 50%, 60% 또는 70% 초과는 표현형 CD45RA+/CD27+ 및/또는 CD45RA-/CD27+를 발현한다. 일부 실시형태에서, 증식된 γδ T 세포 집단에서의 δ3 γδ T 세포의 20% 내지 70%는 표현형 CD45RA+/CD27+ 및/또는 CD45RA-/CD27+를 발현한다. 일부 실시형태에서, 증식된 γδ T 세포 집단에서의 δ1^-/δ2^- γδ T 세포의 30%, 40%, 50%, 60% 또는 70% 초과는 표현형 CD45RA+/CD27+ 및/또는 CD45RA-/CD27+를 발현한다. 일부 실시형태에서, 증식된 γδ T 세포 집단에서의 δ1^-/δ2^- γδ T 세포의 20% 내지 70%는 표현형 CD45RA+/CD27+ 및/또는 CD45RA-/CD27+를 발현한다.

일부 실시형태에서, 증식된 γδ T 세포 집단은 피부와 같은 조직으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 증식된 γδ T 세포 집단은 종양 침윤 림프구로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 증식된 γδ T 세포 집단은 내인성 또는 이종성 종양 인식 모이어티를 발현하는 γδ T-세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 집단은 치료학적 유효량(예를 들어, 10⁸개 초과)의 γδ T-세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, γδ T 세포 집단은 NKp30 활성, NKp44 활성, 및/또는 NKp46 활성과 독립적인 항종양 세포독성을 포함한다. 일부 실시형태에서, γδ T 세포 집단은 NKp30 활성-의존적 항종양 세포독성, NKp44 활성-의존적 항종양 세포독성, 및/또는 NKp46 활성-의존적 항종양 세포독성을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, γδ T 세포의 40% 미만은 (예를 들어, 단백질 또는 mRNA로서) 검출 가능한 수준의 NKp30, NKp44, 및/또는 NKp46을 발현한다.

제8 양태에서, 본 발명은 상기 방법들 중 어느 하나에 의해 생산된 증식된 γδ T 세포 집단을 제공한다. 제9 양태에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 암, 염증성 질병 또는 자가면역 질병을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 δ3 γδ T 세포의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계, δ3 γδ T 세포에서 농후화된 γδ T 세포 집단의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계, 또는 본원에 기재된 방법에 의해 얻은 γδ T 세포 집단의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

제10 양태에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 암, 염증성 질병 또는 자가면역 질병을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 a) 상기 증식된 γδ T 세포 집단들 중 어느 하나로부터 단리된 δ3 γδ T 세포의 치료학적 유효량을 제공하는 단계; 및 δ3 γδ T 세포의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 증식된 γδ T 세포 집단을 상이한 증식된 γδ T 세포 집단과 혼합하여 혼합된 집단을 형성하는 단계 및 혼합된 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에서, 상이한 증식된 γδ T 세포 집단은 증식된 δ1 γδ T 세포의 양, 및/또는 증식된 δ2 γδ T 세포의 양을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상이한 증식된 γδ T 세포 집단은 5% 초과의 δ1(예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 초과의 δ1) 또는 5% 초과의 δ2(예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 초과의 δ2) γδ T 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상이한 증식된 γδ T 세포 집단은 약, 또는 적어도 약, 60% 내지 약 90%의 δ1 γδ T 세포, 또는 약, 또는 적어도 약, 60% 내지 약 80%의 δ1 γδ T 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상이한 증식된 γδ T 세포 집단은 약, 또는 적어도 약, 60% 내지 약 90%의 δ2 γδ T 세포, 약, 또는 적어도 약, 70% 내지 약 80%의 δ2 γδ T 세포, 또는 약, 또는 적어도 약, 80% 내지 약 90%의 δ2 γδ T 세포를 포함한다.

일부 실시형태에서, 혼합된 γδ T 세포 집단은 δ1 γδ T 세포의 양, 및/또는 δ2 γδ T 세포의 양, 및 δ3 γδ T 세포의 양을 포함한다. 일부 실시형태에서, 혼합된 γδ T 세포 집단은 5% 초과의 δ1(예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 초과의 δ1) 또는 5% 초과의 δ2(예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 초과의 δ2) γδ T 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혼합된 γδ T 세포 집단은 5% 초과의 δ3(예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 초과의 δ3) γδ T 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혼합된 γδ T 세포 집단은 약, 또는 적어도 약, 5% 내지 약 90%의 δ3 γδ T 세포, 약, 또는 적어도 약, 10% 내지 약 90%의 δ3 γδ T 세포, 약, 또는 적어도 약, 20% 내지 약 90%의 δ3 γδ T 세포, 약, 또는 적어도 약, 30% 내지 약 90%의 δ3 γδ T 세포, 약, 또는 적어도 약, 40% 내지 약 90%의 δ3 γδ T 세포, 약, 또는 적어도 약, 50% 내지 약 90%의 δ3 γδ T 세포, 약, 또는 적어도 약, 60% 내지 약 90%의 δ3 γδ T 세포, 약, 또는 적어도 약, 70% 내지 약 90%의 δ3 γδ T 세포, 또는 약, 또는 적어도 약, 80% 내지 약 90%의 δ3 γδ T 세포를 포함한다.

일부 실시형태에서, 혼합된 γδ T 세포 집단은 약, 또는 적어도 약, 5% 내지 약 90%의 δ1 γδ T 세포, 약, 또는 적어도 약, 10% 내지 약 90%의 δ1 γδ T 세포, 약, 또는 적어도 약, 20% 내지 약 90%의 δ1 γδ T 세포, 약, 또는 적어도 약, 30% 내지 약 90%의 δ1 γδ T 세포, 약, 또는 적어도 약, 40% 내지 약 90%의 δ1 γδ T 세포, 약, 또는 적어도 약, 50% 내지 약 90%의 δ1 γδ T 세포, 약, 또는 적어도 약, 60% 내지 약 90%의 δ1 γδ T 세포, 약, 또는 적어도 약, 70% 내지 약 90%의 δ1 γδ T 세포, 또는 약, 또는 적어도 약, 80% 내지 약 90%의 δ1 γδ T 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혼합된 γδ T 세포 집단은 약, 또는 적어도 약, 5% 내지 약 90%의 δ2 γδ T 세포, 약, 또는 적어도 약, 10% 내지 약 90%의 δ2 γδ T 세포, 약, 또는 적어도 약, 20% 내지 약 90%의 δ2 γδ T 세포, 약, 또는 적어도 약, 30% 내지 약 90%의 δ2 γδ T 세포, 약, 또는 적어도 약, 40% 내지 약 90%의 δ2 γδ T 세포, 약, 또는 적어도 약, 50% 내지 약 90%의 δ2 γδ T 세포, 약, 또는 적어도 약, 60% 내지 약 90%의 δ2 γδ T 세포, 약, 또는 적어도 약, 70% 내지 약 90%의 δ2 γδ T 세포, 또는 약, 또는 적어도 약, 80% 내지 약 90%의 δ2 γδ T 세포를 포함한다.

참고로 원용됨

본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 공보, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참고로 원용된 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에서 참고로 포함된다.

본 발명의 신규의 특징은 첨부된 청구범위에 특별히 기재되어 있다. 본 발명의 특징 및 이점의 더 우수한 이해는 본 발명의 원칙이 사용되는 예시적인 실시형태를 기재한 하기 상세한 설명 및 첨부된 도면(본원에서 "도면" 및 "도"라고도 함)을 참고하여 얻어질 것이고, 이 도면에서
도 1은 δ3-특이적 항-γδ TCR 항체의 가변 영역 서열을 보여준다. 상부 중쇄 가변 영역의 서열. 하부 경쇄 가변 영역의 서열.
도 2는 대상체를 치료하기 위한 방법을 도식적으로 예시한다.
도 3은 조작된 γδ T 세포의 집단을 대상체에 투여하기 위한 방법을 도식적으로 예시한다.
도 4a 내지 도 4b는 21일 증식 배양 프로토콜을 사용한 Vδ3 γδ T 세포의 선택적 증식을 예시한다. 배수-증식(fold-expansion)은 21일에 측정된다. a) PBMC는 공여자 1로부터 단리되고, 표시된 항체를 사용하여 직접 활성화되고 증식된다. b) PBMC는 공여자 2로부터 단리되고, 표시된 항체를 사용하여 직접 활성화되고 증식된다
도 5a 내지 도 5b는 도 4a 내지 도 4b에 예시된 증식된 세포 집단에서의 Vδ1^-/Vδ2^- γδ T 세포의 비율을 예시한다.
도 6a 내지 도 6b는 도 4a 내지 도 4b에 예시된 증식된 세포 집단에서의 γδ T 세포의 표현형을 예시한다. 증식 배양의 21일 후 표시된 항체로 활성화되고 증식된 Vδ3 T-세포의 표현형은 주로 (50% 초과의) CD27+CD45RA+(미경험) 및 CD27+CD45RA-(중앙 기억)이다.
도 7은 γ2δ3TCR- hFc 재조합 단백질에 대한 표시된 δ3 γδ TCR 특이적 항체의 결합에 대한 경쟁 검정의 결과를 예시한다.
도 8a 내지 도 8c는 Vδ3 γδ T 세포의 선택적 증식을 예시한다. a. 비형질도입된 및 항-CD20 CAR Vδ3 γδ T 세포는 대략 10,000배 증식된다. Vδ3 γδ T 세포는 각각 δ1, δ2, 및 δ3 하위유형에 특이적인 항체를 사용하여 δ1-, δ2-, 및 δ3+로서 검출되다. b. αβ T 세포 고갈 전에, Vδ3 γδ T 세포는 증식된 세포 배양의 적은 분획을 나타낸다. c. 항-CD20 CAR 작제물은 증식된 및 형질도입된 Vδ3 γδ T 세포의 표면에서 발현된다.
도 9는 활성화된 증식된 Vδ3 γδ T 세포의 배양물로부터의 αβ T 세포의 성공적인 고갈을 예시한다(왼쪽 세포는 항-CD20 CAR 작제물에 의해 형질도입되고; 오른쪽 세포는 비형질도입됨).
도 10은 Vδ1 및 Vδ2(왼쪽 패널) 또는 Vδ3(오른쪽 패널)의 표면 발현을 검출하기 위한 γδ T 세포의 활성화되고 증식되고 αβ T 세포 고갈된 집단의 염색에서 얻은 결과를 예시한다.
도 11은 CD20+ Raji 세포에 대해 활성화되고 증식된 Vδ3 γδ T 세포의 세포독성을 예시한다. 비형질도입된 Vδ3 γδ T 세포는 1 초과의 효과기:표적(E/T) 비율에서 CD20+ Raji 세포에 대한 약간의 세포독성을 나타내고, 5 초과의 E/T 비율에서 보통의 세포독성 활성을 나타냈다. 항-CD20 CAR 형질도입된 Vδ3 γδ T 세포는 0.5의 E/T에서 보통의 세포독성 활성을 나타내고, 0.75 초과의 E/T 비율에서 강한 세포독성 활성을 나타낸다.
도 12는 IMGT 명명법에 따라 넘버링된 Vδ3의 아미노산 서열을 예시한다.
도 13은 실시예 7에 기재된 바와 같은 돌연변이유발을 통해 우수한 에피토프 맵핑에 의해 확인된 항원 결합 핫스팟의 3D 모델의 3가지 상이한 투영을 예시한다.
도 14a 내지 도 14c는 IMGT 진주 목걸이(Collier de Perles)를 예시하고, 항원 결합에 기여하는 우수한 에피토프 맵핑에 의해 보여진 잔기는 어두운 이중 원에 의해 강조된다. a. K79 및 H88은 δ3-23, δ3-42 및 δ3-58의 항원 결합에 기여한다. b. E67 및 D70은 δ3-31의 항원 결합에 기여하고; R75 및 R95는 또한 δ3-31의 항원 결합에 기여하고; E67, D70, R75, R95 및 E97의 조합은 δ3-31 및 δ3-42의 항원 결합에 기여한다. c. E18은 δ3-58의 항원 결합에 기여하고; K3은 δ3-08의 항원 결합에 기여한다.

본 발명의 다양한 실시형태가 본원에 도시되고 기재되어 있지만, 이러한 실시형태가 오직 예로 주어진다는 것이 당업자에게 명확할 것이다. 본 발명에서 벗어나지 않으면서 다양한 변형, 변화 및 치환이 당업자에게 발생할 수 있다. 본원에 기재된 발명의 실시형태에 다양한 대안이 사용될 수 있다고 이해되어야 한다.

정의

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본원에 기재된 발명이 속하는 분야의 당업자에게 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서를 설명할 목적을 위해, 하기 정의가 적용될 것이고, 적절할 때마다 단수로 사용된 용어는 복수를 또한 포함하고, 그 반대도 그럴 것이다. 기재된 임의의 정의가 본원에 참고로 원용된 임의의 문헌과 상충하는 경우에, 하기 기재된 정의가 지배한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "γδ T 세포(감마 델타 T 세포)"는 이의 표면에서 하나의 γ-사슬 및 하나의 δ-사슬로 이루어진 명확히 구별되는 T-세포 수용체(TCR)인 γδ TCR를 발현하는 T-세포의 하위집단을 지칭한다. 용어 "γδ T 세포"는 구체적으로 제한 없이 Vδ3 γδ T 세포뿐만 아니라, 미경험, 효과기 기억, 중앙 기억, 및 말단 분화된 γδ T-세포를 포함하는 γδ T 세포의 모든 하위집단 및 이들의 조합을 포함한다. 추가의 예로서, 용어 "γδ T-세포"는 Vδ1, Vδ2, Vδ3, Vδ4, Vδ5, Vδ7 및 Vδ8 γδ T 세포뿐만 아니라, Vγ2, Vγ3, Vγ5, Vγ8, Vγ9, Vγ10 및 Vγ11 γδ T 세포를 포함한다. 추가의 예로서, 용어 "γδ T-세포"는 Vδ3γ2 T 세포를 포함하고, 선택적으로 Vδ3γ8 T 세포를 포함할 수 있거나 이를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "T 림프구" 또는 "T 세포"는 CD3(CD3+) 및 T 세포 수용체(TCR+)를 발현하는 면역 세포를 지칭한다. T 세포는 세포-매개된 면역에서 중추적인 역할을 한다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "TCR" 또는 "T 세포 수용체"는 알파-베타 또는 감마-델타 수용체를 형성하는 이합체성 이종성 세포 표면 신호전달 단백질을 지칭한다. αβ TCR은 MHC 분자에 의해 제시된 항원을 인식하는 반면, γδ TCR은 MHC 제시와 독립적으로 항원을 인식한다.

용어 "MHC"(주요 조직적합성 복합체)는 세포-표면 항원-제시 단백질을 암호화하는 유전자의 하위집단을 지칭한다. 인간에서, 이 유전자는 인간 백혈구 항원(HLA: human leukocyte antigen) 유전자라 칭해진다. 본원에서, 약어 MHC 또는 HLA는 상호교환되어 사용된다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "말초 혈액 림프구(들)" 또는 "PBL(들)"은 광의로 사용되고, 분화 및 기능 단계의 범위의 T 세포 및 B 세포를 포함하는 백혈구(들), 혈장 세포, 단핵구, 대식세포, 천연 살해 세포, 호염구, 호산구 등을 지칭한다. 말초 혈액에서의 T 림프구의 범위는 약 20% 내지 80%이다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "세포 집단"은 직접적으로 적합한 소스로부터, 보통 포유류로부터 단리에 의해 얻은 다수의 세포를 지칭한다. 단리된 세포 집단은 후속하여 시험관내 배양될 수 있다. 당업자는 세포 집단을 단리하고 배양하기 위한 다양한 방법이 본 발명과 사용하기에 적합하고, 세포 집단에서의 매우 많은 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다는 것을 이해할 것이다. 세포 집단은 균일성, 실질적인 균일성으로 정제되거나, 기술된 세포 유형에 대해 다양한 배양 기법 및/또는 음성 또는 양성 선택에 의해 하나 이상의 세포 유형(예를 들어, αβ T 세포)을 고갈시키도록 정제될 수 있다. 세포 집단은 예를 들어 말초 혈액 샘플, 제대혈 샘플, 종양, 줄기 세포 전구체, 종양 생검, 조직, 림프, 피부, 종양 침윤 림프구 또는 이 림프구를 함유하는 샘플로부터, 또는 외부 환경과 직접 접촉하는 대상체의 상피 부위로부터 유래(예를 들어, 직접 단리)되거나, 줄기 전구체 세포로부터 유래된 혼합된 불균질한 세포 집단일 수 있다. 대안적으로, 혼합된 세포 집단은 말초 혈액 샘플, 제대혈 샘플, 종양, 줄기 세포 전구체, 종양 생검, 조직, 림프, 피부, 종양 침윤 림프구 또는 이 림프구를 함유하는 샘플로부터, 또는 외부 환경과 직접 접촉하는 대상체의 상피 부위로부터 확립된 포유류 세포의 시험관내 배양물로부터 유래되거나, 줄기 전구체 세포로부터 유래될 수 있다.

"농후화된" 세포 집단 또는 제제는 출발 집단에서의 세포 유형의 백분율보다 더 높은 백분율의 특정 세포 유형을 함유하는 출발 혼합된 세포 집단으로부터 유래된 세포 집단을 지칭한다. 예를 들어, 출발 혼합된 세포 집단은 특정 γδ T-세포 집단에 대해 농후화될 수 있다. 일 실시형태에서, 농후화된 γδ T-세포 집단은 출발 집단에서의 세포 유형의 백분율보다 더 높은 백분율의 δ3 세포를 함유한다. 다른 예로서, 농후화된 γδ T-세포 집단은 출발 집단에서의 세포 유형의 백분율보다 더 높은 백분율의 δ1 세포 및 더 높은 백분율의 δ3 세포 둘 다를 함유할 수 있다. 또 다른 예로서, 농후화된 γδ T-세포 집단은 출발 집단에서의 세포 유형의 백분율보다 더 높은 백분율의 δ3 세포 및 더 높은 백분율의 δ4 세포 둘 다를 함유할 수 있다. 또 다른 예로서, 농후화된 γδ T-세포 집단은 출발 집단에서의 세포 유형의 백분율보다 더 높은 백분율의 δ1 T 세포, δ3 T 세포, δ4 T 세포 및 δ5 T 세포를 함유할 수 있다. 다른 실시형태에서, 농후화된 γδ T 세포 집단은 출발 집단에서의 세포 유형의 백분율보다 더 높은 백분율의 δ2 T 세포 및 δ3 T 세포를 함유한다. 보다 다른 실시형태에서, 농후화된 γδ T 세포 집단은 출발 집단에서의 세포 유형의 백분율보다 더 높은 백분율의 δ1 T 세포 δ2 T 세포 및 δ3 T 세포를 함유한다. 모든 실시형태에서, 농후화된 γδ T 세포 집단은 출발 집단에서의 αβ T 세포의 백분율보다 더 적은 백분율의 αβ T 세포를 함유한다.

본원에 사용된 바와 같은 "증식된"이란 농후화된 제제에서의 원하는 또는 표적 세포 유형(예를 들어, δ3 T 세포)의 수가 초기 또는 출발 세포 집단에서의 수보다 많다는 것을 의미한다. "선택적으로 증식시킨다"란 표적 세포 유형(예를 들어, δ3 T 세포)이 하나 이상의 다른 비표적 세포 유형, 예를 들어 αβ T-세포, NK 세포, 및/또는 선택적 증식에 사용된 선택적 활성화 제제에 의해 증식되지 않은 하나 이상의 γδ T 세포 하위집단에 비해 우선적으로 증식된다는 것을 의미한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 활성화 제제는 αβ T 세포의 증식 없이 또는 유의미한 증식 없이 예를 들어 조작된 또는 비조작된 δ3 T-세포를 선택적으로 증식시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 활성화 제제는 δ1 T 세포의 증식 없이 또는 유의미한 증식 없이 예를 들어 조작된 또는 비조작된 δ3 T-세포를 선택적으로 증식시킨다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 활성화 제제는 δ2 T 세포의 증식 없이 또는 유의미한 증식 없이 예를 들어 조작된 또는 비조작된 δ3 T 세포를 선택적으로 증식시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 활성화 제제는 δ1 T 세포 및 δ2 T 세포의 증식 없이 또는 유의미한 증식 없이 예를 들어 조작된 또는 비조작된 δ3 T-세포를 선택적으로 증식시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 활성화 제제는 δ2 T 세포의 증식 없이 또는 유의미한 증식 없이 예를 들어 조작된 또는 비조작된 δ1 및 δ3 T 세포를 선택적으로 증식시킨다. 이 맥락에서, 용어 "유의미한 증식 없이"는 우선적으로 증식된 세포 집단이 기준 세포 집단보다 적어도 10배, 바람직하게는 100배 및 더 바람직하게는 1,000배 더 증식된다는 것을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "혼합물"은 혼합된 불균질한 세포 집단으로부터 유래된 2개 이상의 단리된 농후화된 세포 집단의 조합을 지칭한다. 소정의 실시형태에 따르면, 본 발명의 세포 집단은 단리된 γδ T 세포 집단이다.

용어 "단리된"은 세포 집단에 적용되면서 생체내 또는 시험관내 상기 세포 집단과 연관된 하나 이상의 세포 집단이 실질적으로 없는 인간 또는 동물 신체로부터 단리된 세포 집단을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 세포 집단의 맥락에서 용어 "접촉시킨다"는 단리된 세포 집단과 예를 들어 항체, 사이토카인, 리간드, 미토겐, 또는 비드 또는 세포 중 어느 하나에 연결될 수 있는 동시자극 분자와 같은 시약과의 항온처리를 지칭한다. 항체 또는 사이토카인은 가용성 형태일 수 있거나, 이것은 부동화될 수 있다. 일 실시형태에서, 부동화된 항체 또는 사이토카인은 비드 또는 플레이트에 단단히 결합되거나 공유 결합된다. 일 실시형태에서, 항체는 Fc-코팅된 웰에 부동화된다. 일 실시형태에서, 항체는 항원 제시 세포(APC) 또는 인공 항원 제시 세포(aAPC)와 같은 세포의 표면에 부동화된다. 바람직한 실시형태에서, 접촉은 생체외(예를 들어, 시험관내) 또는 생체내 발생한다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린(Ig) 분자, 즉 항원에 특이적으로 결합하는(이것과 면역반응하는) 항원 결합 부위를 함유하는 분자의 면역학적 활성 부분을 지칭한다. "특이적으로 결합한다" 또는 "면역반응한다" 또는 "지향된다"는 항체가 원하는 항원의 하나 이상의 항원 결정부위와 반응하고, 다른 폴리펩타이드와 반응하지 않거나, 훨씬 더 낮은 친화도(10^-6 몰 초과의 K_D)로 결합한다는 것을 의미한다. 항체는 다중클론성, 단일클론성, 키메라성 sdAb(중쇄 또는 경쇄 단일 도메인 항체), 단일 사슬, F_ab, F_ab' 및 F_(ab')2 단편, scFv, 다이아바디, 미니바디, 나노바디 및 F_ab 발현 라이브러리를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

기본적인 항체 구조 단위는 사합체를 포함하는 것으로 공지되어 있다. 각각의 사합체는 폴리펩타이드 사슬의 2개의 동일한 쌍으로 이루어지는데, 각각의 쌍은 1개의 "경쇄"(약 25 kDa)와 1개의 "중쇄"(약 50 내지 70 kDa)를 갖는다. 각각의 사슬의 아미노 말단 부분은 항원 인식을 주로 담당하는 약 100개 내지 110개 또는 이것 초과의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각각의 사슬의 카복시 말단 부분은 효과기 기능을 주로 담당하는 불변 영역을 한정한다. 일반적으로, 인간에서 얻은 항체 분자는 분자에 존재하는 중쇄의 성질이 서로 다른 임의의 종류 IgG, IgM, IgA, IgE 및 IgD를 지칭한다. 소정의 종류는 또한 IgG₁, IgG₂ 및 기타와 같은 하위종류를 갖는다. 더욱이, 인간에서, 경쇄는 카파 사슬 또는 람다 사슬일 수 있다.

용어 "Fab"는 H 사슬의 가변 영역 도메인(V_H) 및 하나의 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)과 함께 전체 L 사슬(V_L 및 C_L)로 이루어진 항체 단편을 지칭한다. 온전한 항체의 파파인 소화는 2개의 Fab 단편을 생성하도록 사용될 수 있고, 이들의 각각은 단일의 항원-결합 부위를 함유한다. 통상적으로, 파파인 소화에 의해 생성된 Fab의 L 사슬 및 H 사슬 단편은 사슬간 디설파이드 결합에 의해 연결된다.

용어 "Fc"는 디설파이드 결합에 의해 함께 보유된 H 사슬 둘 다(CH2 및 CH3)의 카복시-말단 부분과 힌지 영역의 부분을 포함하는 항체 단편을 지칭한다. 항체의 효과기 기능은 Fc 영역에서의 서열에 의해 결정되고; 이 영역은 또한 소정의 유형의 세포에서 발견되는 Fc 수용체(FcR)에 의해 인식된 부분이다. 1개의 Fc 단편은 온전한 항체의 파파인 소화에 의해 얻어질 수 있다.

용어 "F(ab')₂"는 온전한 항체의 펩신 소화에 의해 생산된 항체 단편을 지칭한다. F(ab')₂ 단편은 디설파이드 결합에 의해 함께 보유된 2개의 Fab 단편과 힌지 영역의 부분을 함유한다. F(ab')₂ 단편은 2가 항원-결합 활성을 갖고, 항원을 가교결합시킬 수 있다.

용어 Fab'는 F(ab')₂ 단편의 환원의 산물인 항체 단편을 지칭한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 CH1 도메인의 카복시 말단에서 몇몇 추가 잔기를 가져서 Fab 단편과 다르다. Fab'-SH는 본원에서 지칭 Fab'이고, 여기서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)는 유리 티올기를 보유한다.

용어 "Fv"는 단단한 비공유 회합으로 1개의 중쇄 가변 영역 및 1개의 경쇄 가변 영역 도메인의 이합체로 이루어진 항체 단편을 지칭한다. 항원 결합을 위해 아미노산 잔기에 기여하고 항체에 항원 결합 특이성을 부여하는 6개의 초가변 루프(H 및 L 사슬로부터 각각 3개의 루프)가 이들 2개의 도메인의 폴딩으로부터 나온다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 오직 3개의 CDR을 포함하는 Fv의 절반)은 대개 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도에서이지만 항원을 인식하고 이에 결합하는 능력을 갖는다.

"sFv" 또는 "scFv"라고도 축약되는 용어 "단일-사슬 Fv"는 단일 폴리펩타이드 사슬에 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편을 지칭한다. 통상적으로, scFv 폴리펩타이드는 scFv가 항원 결합에 대한 원하는 구조를 형성하게 하는 VH 도메인과 VL 도메인 사이의 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토를 위해, 예를 들어 Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); 및 Malmborg et al., J. Immunol. Methods 183:7-13, 1995를 참조한다.

표현 "선형 항체"는 항원 결합 영역의 쌍을 형성하는 탠덤 V_H-C_H1 분절의 쌍(V_H-C_H1-V_H-C_H1)을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭하도록 사용된다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있고, 예를 들어 Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)에 의해 기재되어 있다.

용어 "가변"은 가변 도메인의 소정의 부분이 항체들 중에서 서열이 아주 많이 다르고, 이의 특정 항원에 대해 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인에 걸쳐 균등하게 분배되지 않는다. 이것은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다에서 초가변 영역이라 분리는 3개의 분절에 집중된다. 가변 도메인의 더 고도로 보존적인 부분은 프레임워크 영역(FR)이라 불린다. 자연적인 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FR을 포함하는데, 이들은 베타-시트 구조를 연결하고 일부 경우에는 이의 일부를 형성하는 루프를 형성하는, 3개의 초가변 영역에 의해 연결된, 베타-시트 구성을 주로 취한다. 각각의 사슬에서의 초가변 영역은 FR에 의해 아주 가깝게 함께 보유되고, 다른 사슬로부터의 초가변 영역과 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다(Kabat et al (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. 참조). 불변 도메인은 항원에 항체를 결합시키는 데 직접 관여되지 않고, 항체 의존적 세포 세포독성(ADCC: antibody dependent cellular cytotoxicity)에서 항체의 참가와 같은 다양한 효과기 기능을 나타낸다.

용어 "항원-결합 부위" 또는 "결합 부분"은 항원 결합에 참여하는 면역글로불린 분자의 부분을 지칭한다. 항원 결합 부위는 중쇄("H") 및 경쇄("L")의 N-말단 가변("V") 영역의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. "초가변 영역"이라 칭하는 중쇄 및 경쇄의 V 영역 내의 3개의 고도로 분기하는 스트레치는 "프레임워크 영역" 또는 "FR"로 공지된 더 보존된 측접하는 스트레치들 사이에 끼워진다. 따라서, 용어 "FR"은 면역글로불린에서 초가변 영역들 사이에 자연에서 발견되고 이에 인접한 아미노산 서열을 지칭한다. 항체 분자에서, 경쇄의 3개의 초가변 영역 및 중쇄의 3개의 초가변 영역은 항원-결합 표면을 형성하기 위해 3차원 공간으로 서로에 대해 배치된다. 항원-결합 표면은 결합된 항원의 3차원 표면에 상보성이고, 중쇄 및 경쇄의 각각의 3개의 초가변 영역은 "상보성-결정 영역" 또는 "CDR"이라 칭해진다. 각각의 도메인에 대한 아미노산의 배정은 Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 및 1991)), 또는 Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989)의 정의에 따른다.

용어 "초가변 영역", "HVR" 또는 "HV"는 서열이 초가변이고/이거나 구조적으로 한정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 VH에서의 3개(H1, H2, H3) 및 VL에서의 3개(L1, L2, L3)의 6개의 HVR을 포함한다. 자연적인 항체에서, H3 및 L3은 6개의 HVR의 가장 큰 다양성을 나타내고, H3은 특히 항체에 우수한 특이성을 부여하는 데 고유한 역할을 한다고 생각된다. 예를 들어 Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003)를 참조한다. 실제로, 오직 중쇄로 이루어진 자연 발생 카멜리드 항체는 경쇄의 부재 하에 기능적이고 안정하다. 예를 들어 Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)을 참조한다.

"프레임워크 영역"(FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각각의 가변 도메인은 통상적으로 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 확인된 4개의 FR을 갖는다. CDR이 Kabat에 따라 정의되면, 경쇄 FR 잔기는 약 1번 내지 23번(LCFR1), 35번 내지 49번(LCFR2), 57번 내지 88번(LCFR3) 및 98번 내지 107번(LCFR4) 잔기에 배치되고, 중쇄 FR 잔기는 중쇄 잔기에서 약 1번 내지 30번(HCFR1), 36번 내지 49번(HCFR2), 66번 내지 94번(HCFR3) 및 103번 내지 113번(HCFR4) 잔기에 배치된다. CDR이 초가변 루프로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 경우, 경쇄 FR 잔기는 경쇄에서 약 1번 내지 25번(LCFR1), 33번 내지 49번(LCFR2), 53번 내지 90번(LCFR3) 및 97번 내지 107번(LCFR4) 잔기에 배치되고, 중쇄 FR 잔기는 중쇄 잔기에서 약 1번 내지 25번(HCFR1), 33번 내지 52번(HCFR2), 56번 내지 95번(HCFR3) 및 102번 내지 113번(HCFR4) 잔기에 배치된다. 일부 경우에, CDR이 Kabat에 의해 정의된 것과 같은 CDR 둘 다로부터의 아미노산 및 초가변 루프의 것을 포함할 때, FR 잔기는 이에 따라 조정될 것이다. 예를 들어, CDRH1이 아미노산 H26-H35를 포함할 때, 중쇄 FR1 잔기는 1번 내지 25번 위치에 있고, FR2 잔기는 36번 내지 49번 위치에 있다.

"인간 공통 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 공통으로 발생 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열은 가변 도메인 서열의 하위그룹으로부터 선택된다. 일반적으로, 서열의 하위그룹은 Kabat에서와 같은 하위그룹이다. 소정의 경우에, VL에 대해, 하위그룹은 Kabat에서와 같은 하위그룹 카파 I이다. 소정의 경우에, VH에 대해, 하위그룹은 Kabat에서와 같은 하위그룹 III이다.

본원에 기재된 항체는 인간화될 수 있다. 비인간(예를 들어, 설치류) 항체의 "인간화된" 형태는 비인간 항체로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대개는, 인간화된 항체는 수혜자의 초가변 영역로부터의 잔기가 원하는 항체 특이성, 친화도 및 역량을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류과 같은 비인간 종(공여자 항체)의 초가변 영역으로부터의 잔기에 대체된 인간 면역글로불린(수혜자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비인간 잔기에 의해 대체된다. 더욱이, 인간화된 항체는 수혜자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함한다. 이 변형은 항체 성능을 추가로 개선하도록 만들어진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프가 비인간 면역글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR이 인간 면역글로불린 서열의 것인 적어도 1개 및 통상적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것이다. 인간화된 항체는 선택적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 통상적으로 인간 면역글로불린의 것을 또한 포함할 것이다. 추가의 상세내용에 대해, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)를 참조한다. 또한 하기 리뷰 논문 및 여기 인용된 참고문헌을 참조한다: Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma and Immunol., 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions, 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech., 5:428-433 (1994).

"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 보유하고/하거나, 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체를 만들기 위한 임의의 기법을 사용하여 만들어진 것이다. 인간 항체의 이 정의는 구체적으로 비인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 배제한다. 인간 항체는 파지-디스플레이 라이브러리를 포함하는 당해 분야에 공지된 다양한 기법을 사용하여 생산될 수 있다. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). 인간 단일클론 항체의 제조를 위해 Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)에 기재된 방법이 또한 이용 가능하다. 또한 van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)을 참조한다. 인간 항체는 항원 시험감염에 반응하여 이러한 항체를 생산하도록 변형되지만, 내인성 유전좌위가 망가진 형질전환 동물, 예를 들어 면역화된 제노마우스(xenomice)(예를 들어 XENOMOUSE™ 기술과 관련하여 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호 참조)에 항원을 투여하여 제조될 수 있다. 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체와 관련하여 또한 예를 들어 Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)을 참조한다.

본원에 사용된 바와 같은, "Kd" 또는 "Kd 값"은 CM5 칩이 약 10 반응 단위(RU: response unit)에서 항원 또는 항체와 부동화되어 25℃에서 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용하여, 예를 들어 BIAcore.TM.-2000 또는 BIAcore.TM.-3000(BIAcore, Inc., 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하여 측정된 해리 상수를 지칭한다. 2가 또는 다른 다가 항체에 대해, 통상적으로 항체는 해리 상수의 측정에 의한 결합활성 유도된 간섭을 피하도록 부동화된다. 추가의 상세내용을 위해, 예를 들어 Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)를 참조한다.

"또는 더 양호한"은 결합 친화도를 지칭하기 위해 본원에 사용될 때 분자와 이의 결합 파트너 사이의 더 강한 결합으르 지칭한다. "또는 더 양호한"은 본원에 사용될 때 더 작은 숫자 K_D 값에 의해 표시된 더 강한 결합을 지칭한다. 예를 들어, 항원에 대한 친화도가 "0.6 nM 또는 더 양호한" 항체에 대해, 항원에 대한 항체의 친화도는 0.6 nM 이하, 즉 0.59 nM, 0.58 nM, 0.57 nM 등 또는 0.6 nM 이하의 임의의 값이다.

용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정부위, 지질 또는 탄수화물 결정부위를 포함한다. 에피토프 결정부위는 보통 아미노산, 지질 또는 당 부사슬과 같은 분자의 활성 표면 그룹화로 이루어지고, 보통 특정 3차원 구조 특징, 및 특정 전하 특징을 갖는다. 항체는 평형 해리 상수(K_D)가 10^-6 내지 10^-12M, 또는 더 양호한 범위 내일 때 항원에 특이적으로 결합한다고 말해진다. 특이적 결합은 다른 비표적 에피토프에 대한 결합에 대해 해리 상수와 비교하여 적어도 10배; 바람직하게는 100배; 또는 더 바람직하게는 1,000배 더 단단한 해리 상수(더 낮은 K_D)로 표적 에피토프에 결합함을 지칭할 수 있다. 일부 경우에, 표적 에피토프는 델타-3 TCR의 델타-3 사슬의 에피토프이다. 일부 경우에, 비표적 에피토프는 αβ TCR이다. 일부 경우에, 비표적 에피토프는 델타-3이 아닌 δ-TCR의 델타 사슬이다. 예를 들어, 일부 경우에, 비표적 에피토프는 δ-TCR의 델타-1, 델타-2, 델타-4, 델타-5 또는 델타-8 사슬일 수 있다. 결합의 특이성은 (예를 들어, ELISA 플레이트에 부동화된 Fc 융합체로서 또는 세포에 발현된 바대로) γδ-TCR 및/또는 αβ-TCR의 세포외 영역에 대한 결합의 맥락에서 결정될 수 있다.

"활성화 에피토프"는 결합 시 특정 γδ T-세포 집단의 활성화를 할 수 있다. T 세포 증대(proliferation)는 T 세포 활성화 및 증식을 나타낸다.

항체는 2개의 항체가 동일한 또는 입체적으로 중첩하는 에피토프를 인식할 때 기준 항체와 "본질적으로 동일한 에피토프"에 결합한다. 2개의 에피토프가 동일한 또는 입체적으로 중첩하는 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위한 가장 널리 사용되고 빠른 방법은 표지된 항원 또는 표지된 항체를 사용하여 다수의 상이한 형식으로 구성될 수 있는 경쟁 검정이다. 일부 실시형태에서, 항원은 96웰 플레이트에 부동화되고, 표지된 항체의 결합을 차단하는 비표지된 항체의 능력은 방사성 또는 효소 표지를 사용하여 측정된다. 대안적으로, 표지된 항체 및 비표지된 항체를 사용한 경쟁 연구는 항원-발현 세포에서 유세포분석법을 사용하여 수행된다.

"에피토프 맵핑"은 표적 항원에서 항체의 결합 부위 또는 에피토프를 확인하는 과정이다. 항체 에피토프는 선형 에피토프 또는 입체형태 에피토프일 수 있다. 선형 에피토프는 단백질에서의 아미노산의 연속 서열에 의해 형성된다. 입체형태 에피토프는 단백질 서열이 불연속이지만, 이의 3차원 구조로 단백질의 폴딩 시 함께 묶인 아미노산으로 형성된다.

본원에 정의된 바와 같은 "에피토프 비닝(epitope binning)"은 이것이 인식하는 에피토프에 기초하여 항체를 그룹화하는 과정이다. 보다 특히, 에피토프 비닝은 에피토프 인식 특성에 기초하여 항체를 클러스터링하기 위한 컴퓨터 과정과 조합된 상이한 항체의 에피토프 인식 특성을 식별하고, 결합 특이성이 다른 항체를 확인하기 위한 방법 및 시스템을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "키메라 항원 수용체(CAR)"는 예를 들어 인공 T-세포 수용체, T-바디, 단일-사슬 면역수용체, 키메라 T-세포 수용체 또는 키메라 면역수용체를 지칭할 수 있고, 특정 면역 효과기 세포에 인공 특이성을 그래프팅하는 조작된 수용체를 포괄한다. CAR은 T 세포에 단일클론 항체의 특이성을 부여하도록 사용될 수 있어서, 예를 들어 입양 세포 치료에 사용하기 위한 매우 많은 수의 특정 T 세포가 생성되게 한다. 특정 실시형태에서, CAR은 예를 들어 종양 연관된 항원에 세포의 특이성을 지향시킨다. 일부 실시형태에서, CAR은 세포내 활성화 도메인(T 세포가 표적화 모이어티의 표적 세포, 예컨대 표적 종양 세포와의 관여 시 활성화하도록 함), 막관통 도메인 및 길이가 변할 수 있고 질병- 또는 장애-연관된, 예를 들어 종양-항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 특정 양태에서, CAR은 CD3-제타 막관통 도메인 및 엔도도메인에 융합된 단일클론 항체로부터 유래된 단일-사슬 가변 단편(scFv)의 융합체를 포함한다. 다른 CAR 설계의 특이성은 수용체의 리간드(예를 들어, 펩타이드) 또는 패턴-인식 수용체, 예컨대 덱틴(Dectin)으로부터 유래될 수 있다. 소정의 경우에, 항원-인식 도메인의 간격은 활성화-유도된 세포사를 감소시키도록 변형될 수 있다. 소정의 경우에, CAR은 추가 동시자극 신호전달을 위한 도메인, 예컨대 CD3-제타, FcR, CD27, CD28, CD137, DAP 10/12, 및/또는 OX40, ICOS, TLR 등을 포함한다. 일부 경우에, 분자는 동시자극 분자, 영상화(예를 들어, 양전자 방출 단층촬영)를 위한 리포터 유전자, 전구약물의 첨가 시 T 세포를 조건적으로 제거하는 유전자 산물, 귀소 수용체, 케모카인, 케모카인 수용체, 사이토카인 및 사이토카인 수용체를 포함하는 CAR과 동시발현될 수 있다.

본 발명에 따른 "제제" 또는 "화합물"은 소분자, 폴리펩타이드, 단백질, 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 소분자는 본 발명의 맥락에서 일 실시형태에서 분자량이 1000 달톤 미만, 특히 800 달톤 미만, 보다 특히 500 달톤 미만인 화학물질을 의미한다. 용어 "치료 제제"는 생물학적 활성을 갖는 제제를 지칭한다. 용어 "항암 제제"는 암 세포에 생물학적 활성을 갖는 제제를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "세포 배양"은 임의의 시험관내 세포 배양을 지칭한다. 연속 세포주(예를 들어, 불멸 표현형을 가짐), 1차 세포 배양, 유한 세포주(예를 들어, 비형질전환된 세포), 및 줄기 세포, 혈액 세포, 배아 제대혈 세포, 종양 세포, 형질도입된 세포 등을 포함하는 시험관내 유지되는 임의의 다른 세포 집단이 이 용어 내에 포함된다.

용어 "치료한다" 또는 "치료"는 치료학적 치료 및 예방학적 또는 예방적 조치 둘 다를 지칭하고, 여기서 그 목적은 원치 않는 생리학적 변화 또는 장애를 예방하거나 느리게 한다(줄인다). 유리한 또는 원하는 임상 결과는, 검출 가능하든 또는 검출 불가능하든, 증상의 경감, 질병 정도의 감소(예를 들어, 종양 크기, 종양 부담 또는 종양 분포의 감소), 안정화된(즉, 악화하지 않는) 질병 상태, 질병 진행의 지연 또는 느려짐, 질병 상태의 경감 또는 완화, 및 (부분이든 또는 완전이든) 관해를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. "치료"는 또한 치료를 받지 않는 경우의 기대 생존과 비교하여 생존을 연장시키는 것을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 사람은 질환 또는 장애를 이미 가진 사람, 및 질환 또는 장애를 갖기 쉬운 사람 또는 질환 또는 장애가 예방되어야 하는 사람을 포함한다.

하나 이상의 추가의 치료 제제와 "조합된" 투여는 동시(병행) 투여 및 임의의 순서의 연속 투여를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "동일한"은 동일한 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 또한, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로 동일한"은 비교 윈도우, 또는 비교 알고리즘을 사용하여 또는 수동 정렬 및 시각 검사에 의해 측정된 바와 같은 지정된 영역에 걸쳐 최대 관련성에 대해 비교되고 정렬될 때 동일한 순차적인 단위의 백분율을 갖는 2개 이상의 서열을 지칭한다. 오직 예로서, 2개 이상의 서열은 순차적인 단위가 기재된 영역에 비해 약 60% 동일한, 약 65% 동일한, 약 70% 동일한, 약 75% 동일한, 약 80% 동일한, 약 85% 동일한, 약 90% 동일한, 또는 약 95% 동일한 경우 "실질적으로 동일"할 수 있다. 이러한 백분율은 2개 이상의 서열의 "동일성 백분율"을 기재하는 것이다. 서열의 동일성은 적어도 약 75개 내지 100개의 길이의 순차적인 단위인 영역 위로, 약 50개의 길이의 순차적인 단위인 영역 위로 또는 기술되지 않은 경우 전체 서열에 걸쳐 존재할 수 있다. 이 정의는 또한 시험 서열의 보체를 지칭한다. 또한, 오직 예로서, 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열은 핵산 잔기가 동일할 때 동일하지만, 핵산 잔기가 기술된 영역에 걸쳐 약 60% 동일한, 약 65% 동일한, 약 70% 동일한, 약 75% 동일한, 약 80% 동일한, 약 85% 동일한, 약 90% 동일한, 또는 약 95% 동일한 경우 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열은 "실질적으로 동일하다". 동일성은 적어도 약 75개 내지 약 100개의 길이의 핵산인 영역 위로, 약 50개의 길이의 핵산인 영역 위로 또는 기술되지 않은 경우 폴리뉴클레오타이드 서열의 전체 서열에 걸쳐 존재할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 비제한적인 예로서 화합물의 생물학적 활성 또는 특성을 무효화하지 않고, 비교적 비독성인 염, 담체 또는 희석제를 포함하는 제제를 지칭하고, 즉 상기 제제는 원치 않는 생물학적 효과를 야기하지 않거나 이것이 함유된 조성물의 임의의 성분과 해로운 방식으로 상호작용하지 않으면서 개체에게 투여될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "대상체" 또는 "환자"는 척추동물을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 척추동물은 포유류이다. 포유류는 인간, 비인간 영장류, 농장 동물(예컨대, 소), 스포츠 동물, 및 애완동물(예컨대, 고양이, 개 및 말)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 특정 실시형태에서, 포유류는 인간이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료학적 유효량"은 치료되는 질병, 장애 또는 질환의 증상들 중 하나 이상을 어느 정도로 치유하거나 적어도 부분적으로 저지하거나 경감시키기에 충분한 질병, 장애 또는 질환을 이미 겪는 대상체, 예를 들어 인간 환자에게 투여되는 본 발명의 증식된 세포 집단 및/또는 혼합물을 함유하는 조성물의 양을 지칭한다. 이러한 조성물의 유효성은 비제한적인 에로서 질병, 장애 또는 질환의 중증도 및 전개, 과거의 치료, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응, 및 주치의의 판단을 포함하는 조건에 따라 달라진다. 오직 예로서, 치료학적 유효량은 비제한적인 예로서 용량 상승 임상 실험을 포함하는 일상적인 실험에 의해 결정될 수 있다.

용어 항원 제시 세포(APC)는 야생형 APC, 또는 조작된 또는 인공 항원 제시 세포(aAPC)를 지칭한다. APC는 조사된 APC 집단으로 제공될 수 있다. APC는 불활화된 세포주(예를 들어, 불활화된 세포주로부터 유래된 조작된 aAPC 또는 K562)로부터 또는 공여자로부터의 세포 분획(예를 들어, PBMC)으로 제공될 수 있다.

단백질 또는 이의 폴리펩타이드 단편, 예컨대 항체 또는 에피토프와 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "구조적으로 상이한" 및 "구조적으로 구별되는"은 적어도 2개의 상이한 단백질, 이의 폴리펩타이드 단편 또는 에피토프 사이의 공유(즉, 구조) 차이를 지칭한다. 예를 들어, 2개의 구조적으로 상이한 단백질(예를 들어, 항체)은 상이한 1차 아미노산 서열을 갖는 2개의 단백질을 지칭할 수 있다. 일부 경우에, 구조적으로 상이한 활성화 제제는 구조적으로 상이한 에피토프, 예컨대 상이한 1차 아미노산 서열을 갖는 에피토프에 결합한다.

기술된 수용체 활성(예를 들어, NKp30 활성, NKp44 활성, 및/또는 NKp46 활성)과 "독립적인", 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "항종양 세포독성"은 기술된 수용체 또는 기술된 수용체 조합이 세포에 의해 발현되든 또는 아니든 나타나거나 세포용해를 매개시키도록 기능성인 항종양 세포독성을 지칭한다. 그러므로, NKp30 활성, NKp44 활성, 및/또는 NKp46 활성과 독립적인 항종양 세포독성을 나타내는 γδ T 세포는 NKp30 활성-의존적 항종양 세포독성, NKp44 활성-의존적 항종양 세포독성, 및/또는 NKp46 활성-의존적 항종양 세포독성을 또한 나타낼 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "NKp30 활성-의존적 항종양 세포독성", "NKp44 활성-의존적 항종양 세포독성" 및 "NKp46 활성-의존적 항종양 세포독성"은 기술된 수용체의 기능적 발현을 요하는 항종양 세포독성을 지칭한다. 이러한 수용체 의존적 항종양 세포독성의 존재 또는 부재는 기술된 수용체에 대한 길항제의 존재 또는 부재 하에 표준 시험관내 세포독성 검정을 수행하여 결정될 수 있다. 예를 들어, NKp30 활성-의존적 항종양 세포독성의 존재 또는 부재는 항-NKp30 길항제의 존재 하에 시험관내 세포독성 검정의 결과를 항-NKp30 길항제의 부재 하에 얻은 결과와 비교하여 결정될 수 있다.

항종양 세포독성의 적어도 기술된 "%"가 기술된 수용체 활성(예를 들어, NKp30 활성, NKp44 활성, 및/또는 NKp46 활성)과 "독립적인", 항종양 세포독성을 포함하는 본원에 사용된 바와 같은 γδ T-세포 집단은 기술된 수용체의 차단이 숫자 % 값 이하로 측정된 항종양 세포독성을 감소시키는 세포를 지칭한다. 따라서, 항종양 세포독성의 적어도 50%가 NKp30 활성과 독립적인 항종양 세포독성을 포함하는 γδ T-세포 집단은 NKp30 길항제의 부재와 비교하여 NKp30 길항제의 존재 하에 시험관내 항종양 세포독성의 50% 이하의 감소를 나타낼 것이다.

개관

인간에서, γδ T-세포(들)는 선천성 면역 반응과 적응 면역 반응 사이의 연관을 제공하는 T-세포의 하위집단이다. 이 세포는 항원-특이적 γδ T-세포 수용체(γδ TCR) 및 γδ T-세포(들)를 생성시키도록 V-(D)-J 분절 재배열을 겪고, γδ TCR 또는 다른 비-TCR 단백질에 의한 항원의 인식을 통해 직접 활성화될 수 있어, γδ T-세포 효과기 기능을 활성화하도록 독립적으로 또는 함께 작용한다. γδ T-세포는 포유류에서 전체 T-세포 집단의 작은 분획, 말초 혈액 및 림프구 장기에서의 T-세포의 대략 1% 내지 5%를 나타내고, 이것은 피부, 간, 소화, 호흡 및 생식 기관과 같은 상피 세포-농후 구획에 주로 있는 것으로 보인다. 주요 조직접합성 복합체 분자(MHC: major histocompatibility complex molecule)에 결합된 항원을 인식하는 αβ TCR과 달리, γδ TCR은 박테리아 항원, 바이러스 항원, 이환된 세포에 의해 발현된 스트레스 항원, 및 온전한 단백질 또는 비펩타이드 화합물의 형태의 종양 항원을 직접 인식할 수 있다.

δ3-08, δ3-20, δ3-23, δ3-31, δ3-42, δ3-47 및 δ3-58은 γδ T 세포를 활성화하고 증식시킬 수 있고, 일부 실시형태에서 δ3 γδ T 세포를 예를 들어 임상적으로 관련된 수준으로 우선적으로 활성화하고 증식시키도록 사용될 수 있다. 이론에 의해 구속됨이 없이, 상이한 공여자로부터 기원하는 배양물의 활성화 및 증식의 상이한 수준은 공여자 γδ 가변 TCR 레퍼토리 및 항체 결합 에피토프의 특이성으로 인할 수 있다. 특정 γδ T-세포 하위집단에 결합하는 모든 제제가 특정 γδ T-세포를 활성화할 수 있고, 특히 특정 γδ T-세포 집단을 임상적으로-관련된 수준으로, 즉 농후화된 배양물에서 10⁸개 초과의 표적 γδ T 세포로 활성화하고 증식시킬 수 있지는 않다는 것이 발견되었다. 유사하게, γδ T-세포 집단의 모든 결합 에피토프가 활성화 에피토프가 아니고, 즉 결합 시 특정 γδ T-세포 집단을 활성화할 수 있는 것이 아니다.

본 발명의 본 발명자들은 δ3 γδ T 세포 아형의 강력한 활성화 및 증식과 연관된 특정 γδ TCR 결합 영역을 확인하였다. 일부 경우에, 결합 영역은 δ3 가변 영역 내에 있거나 이것과 중첩한다. 따라서, 이 활성화 영역에 결합하는 제제는 δ3 γδ T 세포 아형을 선택적으로 활성화하고 증식시키도록 개발되고 사용될 수 있다. 예시적인 활성화 제제는 본원에 기재되어 있다. 따라서, 본 발명은 환자에게 투여될 수 있는 순도가 증가된 고도로 농후화된 δ3 γδ T-세포 집단 및 이들의 혼합물의 임상적으로 관련된 수준을 생산하는 δ3 γδ T 세포 아형의 특이적 활성화 및 증식을 가능하게 한다. 이러한 혼합물은 다른 증식된 γδ T 세포 하위집단, 예컨대 δ1 및/또는 δ2 γδ T 세포의 혼합물을 포함할 수 있다. δ3 γδ T 세포 아형의 활성화 및 증식의 향상을 유도할 수 있는 활성화 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 신규의 활성화 리간드가 또한 고려되고 본원에 추가로 기재된다. 본원에 기재된 활성화 리간드, 방법 및 조성물은, 생체외 증식 및/또는 증식 후 단리에 의해 δ1, δ2, δ3, δ4, 및/또는 δ8(예를 들어, δ1, δ2, 및 δ3) 조작된 또는 비조작된 γδ T 세포의 임의의 원하는 비율을 본질적으로 포함하는, 증식된 γδ T 세포 집단, 및 이의 혼합물, 및/또는 정제된 분획을 얻고 사용하기 위해 본원에 그 전문이 참고로 원용된 PCT/US17/32530에 기재된 활성화 리간드, 방법 및 조성물과 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 하나 이상의 δ3 특이적 γδ T 세포 활성화 리간드는 생체외 증식을 위해 PCT/US17/32530에 기재된 δ1 특이적 및/또는 δ2 특이적 γδ T 세포 활성화 리간드의 하나 이상과 조합되어 배양 배지에 사용될 수 있다. 다른 예로서, 본원에 기재된 활성화 리간드, 방법 또는 조성물은 제1 또는 제2 생체외 γδ T 세포 증식 단계에 사용될 수 있고, PCT/US17/32530에 기재된 활성화 리간드, 방법 또는 조성물은 후속하는 또는 이전의 생체외 γδ T 세포 증식 단계에 사용될 수 있다. 활성화 리간드는 양성 또는 음성 선택에 의해 기술된 γδ T 세포 집단의 정제에 또한 사용될 수 있다.

일부 경우에, 본 발명의 방법을 사용한 임상적으로 관련된 수준(즉, 10⁸ 초과)의 γδ T 세포의 생산은 비교적 적은 용적의 배양 배지에 의해 얻어질 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 임상적으로 관련된 수준의 γδ T 세포는 대략 25 ℓ; 20 ℓ; 10 ℓ; 5 ℓ; 3 ℓ; 2 ℓ; 1,500 ㎖; 1,000 ㎖; 500 ㎖; 200 ㎖; 150 ㎖; 100 ㎖ 이하(예를 들어, 약 10 ㎖ 내지 약 100 ㎖, 약 100 ㎖ 내지 약 500 ㎖, 약 500 ㎖ 내지 약 5,000 ㎖, 또는 약 5 ℓ 내지 약 25 ℓ)의 최종 배양 용적에서 세포 집단(예를 들어, 단리된 혼합된 세포 집단)의 증식으로부터 얻어질 수 있다. 다른 예로서, 일부 실시형태에서, 임상적으로 관련된 수준의 γδ T 세포는 1명의 공여자 또는 다수의 공여자들로부터 얻은 단리된 혼합된 세포 집단으로부터의 증식이 약 50 ℓ, 25 ℓ, 20 ℓ, 10 ℓ, 5 ℓ, 1 ℓ 또는 750 ㎖ 미만(예를 들어, 약 750 ㎖ 내지 약 50 ℓ 미만, 약 100 ㎖ 내지 약 750 ㎖, 약 750 ㎖ 내지 약 5 ℓ, 약 1 ℓ 내지 약 10 ℓ, 약 10 ℓ 내지 약 50 ℓ, 또는 약 10 ℓ 내지 약 25 ℓ)의 배양 배지의 총 용적을 사용하여 달성될 수 있는 조건 하에 얻어질 수 있다.

예를 들어, 비표적 세포 유형의 이전의 고갈 없이 직접적으로 단리된 혼합된 세포 집단으로부터 γδ T 세포 아형(예를 들어, δ3 γδ T 세포)을 선택적으로 활성화하고 증식시켜 세포독성 특성을 갖는 농후화된 γδ T 세포 집단(들)의 임상적으로-관련된 수준을 제공하기 위한 방법이 본원에 기재된다. 특정 γδ 세포 집단(들)의 활성화 γδ 가변 TCR 에피토프가 또한 기재되어 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 농후화된 γδ T 세포 집단(들)을 포함하는 조성물에 의한 치료 방법을 제공한다.

γδ T 세포(예를 들어, δ3 γδ T 세포)의 하나 이상의 특정 하위집단을 포함하는, 조작된 또는 비조작된 γδ T 세포의 임상적으로 관련된 수준(10⁸ 초과)을 생산하거나 제공하는 방법이 본원에 기재된다. 이러한 방법은 단일 공여자의 단일 샘플을 포함하여 단일 공여자로부터 이러한 임상적으로 관련된 수준을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 더욱이, 이러한 방법은 10⁸개 초과의 조작된 또는 비조작된 γδ T 세포를 유의미하게 생산하도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, γδ T 세포(예를 들어, δ3 γδ T 세포)의 하나 이상의 특정 하위집단을 포함하여, 약, 또는 적어도 약, 10⁹개, 10¹⁰개, 10¹¹개 또는 10¹²개의 조작된 또는 비조작된 γδ T 세포는 본원에 기재된 방법에서 생산될 수 있다. 일부 경우에, 이러한 집단 크기는 겨우 14일 내지 30일, 19일 내지 30일 또는 21일 내지 30일에, 및/또는 약 1 ℓ 미만의 사용된 배양 배지의 총 용적으로 달성될 수 있다.

γδ T-세포의 단리

일부 양태에서, 본 발명은 조작된 또는 비조작된 γδ T 세포의 증식을 위한 생체외 방법을 제공한다. 일부 경우에, 상기 방법은 γδ T 세포, 예컨대 IL-4, IL-2, 또는 IL-15, 또는 이들의 조합의 특정 집단의 증식을 선호하는 사이토카인을 포함하지 않는 하나 이상(예를 들어, 제1 및/또는 제2)의 증식 단계를 사용한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 단리된 혼합된 세포 집단으로부터 농후화된 γδ T 세포 집단을 생산하기 위한 생체외 방법을 제공하고, 상기 방법은 농후화된 γδ T 세포 집단을 제공하도록 혼합된 세포 집단을 δ3 TCR(예를 들어, δ3 γδ TCR)에 특이적인 에피토프에 결합하여 δ3 T 세포를 선택적으로 증식시키는 하나 이상의 제제와 접촉시키는 단계를 포함한다.

다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체로부터 단리된 γδ T 세포의 유전자 조작에 대한 방법을 제공한다. 농후화, 활성화, 증식 또는 유전자 조작의 방법은 임의의 순서로 단독으로 또는 조합되어 수행될 수 있다. 일 실시형태에서, γδ T 세포는 단리되고, 유전자 조작되고, 이후 활성화되고 증식될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, γδ T 세포는 단리될 수 있고, 단리된 세포는 직접적으로 활성화되고 증식되고, 선택적으로 정제되고, 이후 선택적으로 유전자 조작될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 활성화되고 증식되고, 이후 유전자 조작된 γδ T 세포는 추가로 활성화되고/되거나 증식되고/되거나 정제될 수 있다.

예를 들어, 비조작된, γδ T 세포 집단은 대상체의 복잡한 샘플로부터 증식될 수 있다. 복잡한 샘플은 말초 혈액 샘플(예를 들어, PBL 또는 PBMC), 백혈구세포채집술 샘플, 제대혈 샘플, 종양, 줄기 세포 전구체, 종양 생검, 조직, 림프이거나, 외부 환경과 직접 접촉하는 대상체의 상피 부위 기원이거나, 줄기 전구체 세포로부터 유래될 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용은 Vδ3⁺ 세포의 선택적 증식을 위한 방법을 제공한다. 일부 경우에, 본 개시내용은 Vδ1⁺ 세포, Vδ2⁺ 세포, Vδ1⁺ 세포 및 Vδ3⁺ 세포, Vδ1⁺ 세포 및 Vδ4⁺ 세포, Vδ1⁺ 세포, Vδ3⁺ 세포, Vδ4⁺ 세포 및 Vδ5⁺ 세포, 또는 이들의 임의의 그룹의 증식과 조합된 Vδ3⁺ 세포의 증식을 위한 방법을 제공한다.

말초 혈액 단핵 세포는 예를 들어 Ficoll-Paque™ PLUS(GE Healthcare) 시스템을 포함하는 성분채집술 기계, 또는 다른 적합한 장치/시스템으로 대상체로부터 수집될 수 있다. γδ T 세포(들) 또는 γδ T 세포(들)의 원하는 하위집단은 예를 들어 유세포분석법 기법으로 수집된 샘플로부터 정제될 수 있다. 제대혈 세포는 또한 대상체의 출생 동안 제대혈로부터 얻어질 수 있다. PBMC 단리, γδ T 세포 활성화 및 증식, 및 γδ T 세포 활성화 제제의 제조 및 사용을 위한 방법 및 조성물을 비제한적으로 포함하는, 모든 목적을 위해 본원에 그 전문이 참고로 원용된, WO 2016/081518을 참조한다.

γδ T 세포는 예를 들어 제1 농후화 단계에서 농후화된 γδ T 세포 집단을 제공하도록 혼합된 세포 집단을 δ3 γδ TCR의 에피토프에 특이적으로 결합하여 γδ T 세포를 증식시키는 하나 이상의 제제와 접촉시켜 시험관내 배양된 단리된 복잡한 샘플 또는 혼합된 세포 집단으로부터 증식될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 특정 세포 집단, 예컨대 하나 이상의 또는 모든, αβ T 세포, B 세포 및 NK 세포인, 비-γδ T 세포 단핵구의 이전의 고갈 없이 전체 PBMC 집단에 포함된 γδ T 세포는 활성화되고 증식될 수 있어 농후화된 γδ T 세포 집단을 생성시킨다. 일부 양태에서, γδ T 세포의 활성화 및 증식은 자연적인 또는 조작된 APC의 존재 없이 수행된다. 일부 양태에서, γδ T 세포의 활성화 및 증식은 자연적인 또는 조작된 APC의 존재 하에 수행된다. 일부 양태에서, γδ T 세포의 활성화 및 증식은 제1 단계 또는 제2 단계에서 자연적인 또는 조작된 APC의 존재 하에 수행되고, 활성화 및 증식은 자연적인 또는 조작된 APC 없이 하나의 (제1 또는 제2) 단계에서 또한 수행된다. 일부 양태에서, 예를 들어 종양 시편으로부터의, γδ T 세포의 단리 및 증식은 γδ TCR(예를 들어, δ3⁺ TCR)의 활성화 에피토프에 특이적인 항체를 포함하는 부동화된 γδ T 세포 미토겐, 및 예를 들어 본원에 제공된 γδ TCR의 활성화 에피토프에 결합할 수 있는 렉틴을 포함하는 다른 활성화 제제를 사용하여 수행될 수 있다.

특정 실시형태에서, 단리된 혼합된 세포 집단은 약, 또는 적어도 약, 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일, 약 17일, 약 19일, 약 21일, 약 25일, 약 29일, 약 30일 또는 이것 내의 임의의 범위 동안 δ3 γδ T 세포를 증식(예를 들어, 선택적으로 증식)시키는 하나 이상의 제제와 접촉한다. 예를 들어, 단리된 혼합된 세포 집단은 제1 농후화된 γδ T 세포 집단을 제공하도록 약 1일 내지 약 4일, 약 2일 내지 약 4일, 약 2일 내지 약 5일, 약 3일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 21일, 약 5일 내지 약 19일, 약 5일 내지 약 15일, 약 5일 내지 약 10일 또는 약 5일 내지 약 7일 동안 δ3 γδ T 세포를 증식(예를 들어, 선택적으로 증식)시키는 하나 이상의 제제와 접촉한다. 다른 예로서, 단리된 혼합된 세포 집단은 제1 농후화된 γδ T-세포 집단을 제공하도록 약 7일 내지 약 21일, 약 7일 내지 약 19일, 약 7일 내지 약 23일 또는 약 7일 내지 약 15일 동안 δ3 γδ T 세포를 증식(예를 들어, 선택적으로 증식)시키는 하나 이상의 제제와 접촉한다.

일부 경우에, 정제 또는 단리 단계는 제1 증식 단계와 제2 증식 단계 사이에 수행된다. 일부 경우에, 단리 단계는 하나 이상의 활성화 제제의 제거를 포함한다. 일부 경우에, 단리 단계는 γδ T 세포, 또는 이의 아형(예를 들어, δ3 γδ T 세포)의 특이적 단리를 포함한다. 일부 경우에, 하나 이상의(예를 들어, 모든) 활성화 제제(예를 들어, 혈청 성분 및/또는 IL-2와 같은 세포 배양 배지의 공통 성분이 아닌 모든 활성화 제제)는 제1 증식 단계와 제2 증식 단계 사이에 제거되지만, γδ T-세포는 다른 세포 유형(αβ T-세포)으로부터 특이적으로 단리되지 않는다. 일부 경우에, 하나 이상의(예를 들어, 모든) 가용성 활성화 제제는 제1 증식 단계와 제2 증식 단계 사이에 제거되지만, γδ T-세포는 다른 세포 유형(αβ T-세포)으로부터 특이적으로 단리되지 않는다.

일부 실시형태에서, 제1 농후화 단계 및 선택적으로 제2 농후화 단계에서 γδ TCR의 활성화 에피토프에 결합하는 활성화 제제를 사용한 γδ T 세포의 활성화 및 증식 이후에, 예를 들어 본 발명의 제1 농후화된 γδ T 세포 집단(들)은 제2, 제3, 제4, 제5 등의 농후화 단계에서 제2 또는 추가의 농후화된 γδ T 세포 집단(들)을 얻기 위해 당해 분야에 공지된 기법을 사용하여 추가로 농후화되거나 정제될 수 있다. 예를 들어, 제1 농후화된 γδ T 세포 집단(들)은 αβ T 세포, B 세포 및 NK 세포가 고갈될 수 있다. 수집된 γδ T 세포(들)에서 발현된 세포 표면 마커의 양성 및/또는 음성 선택은 예를 들어 제1 농후화된 γδ T-세포 집단(들)으로부터 유사한 세포 표면 마커를 발현하는 γδ T 세포 또는 γδ T 세포(들)의 집단을 직접 단리시키도록 사용될 수 있다. 예를 들어, γδ T 세포는 CD2, CD3, CD4, CD8, CD24, CD25, CD44, Kit, TCR α, TCR β, TCR γ(하나 이상의 TCR γ 하위유형을 포함), TCR δ(하나 이상의 TCR δ 하위유형을 포함), NKG2D, CD70, CD27, CD28, CD30, CD16, OX40, CD46, CD161, CCR7, CCR4, NKp30, NKp44, NKp46, DNAM-1, CD242, JAML과 같은 마커, 및 다른 적합한 세포 표면 마커의 양성 또는 음성 발현에 기초하여 농후화된 γδ T 세포 집단(예를 들어, 증식의 제1 단계 및/또는 제2 단계 후)으로부터 단리될 수 있다.

일부 실시형태에서, 증식의 제1 단계 후(예를 들어, 증식의 제1 단계에 후속하여 수행된 단리 단계 후), 증식된 세포는 증식의 제2 단계에서 선택적으로 희석되고 배양된다. 바람직한 실시형태에서, 증식의 제2 단계는 배양 배지가 제2 증식 단계에서 약 1일 내지 2일, 1일 내지 3일, 1일 내지 4일, 1일 내지 5일, 2일 내지 5일, 2일 내지 4일, 또는 2일 내지 3일마다 보충되는 조건 하에 수행된다. 일부 실시형태에서, 증식의 제2 단계는 세포가 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 초과로 추가의 γδ T 세포 증식을 지지하는 밀도로 희석되거나 조정되는 조건 하에 수행된다. 일부 경우에, 세포 밀도 조정은 배양 배지의 보충과 동시에(즉, 동일한 일자에 또는 동일한 시간에) 수행된다. 예를 들어, 세포 밀도는 제2 증식 단계에서 1일 내지 2일, 1일 내지 3일, 1일 내지 4일, 1일 내지 5일, 2일 내지 5일, 2일 내지 4일, 또는 2일 내지 3일마다 조정될 수 있다. 추가의 γδ T 세포 증식을 지지하는 통상적인 세포 밀도는 약 1 x 10⁵개, 2 x 10⁵개, 3 x 10⁵개, 4 x 10⁵개, 5 x 10⁵개, 6 x 10⁵개, 7 x 10⁵개, 8 x 10⁵개, 9 x 10⁵개, 1 x 10⁶개, 2 x 10⁶개, 3 x 10⁶개, 4 x 10⁶개, 5 x 10⁶개의 세포/㎖, 10 x 10⁶개의 세포/㎖, 15 x 10⁶개의 세포/㎖, 20 x 10⁶개의 세포/㎖, 또는 30 x 10⁶개의 세포/㎖의 배양을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

일부 실시형태에서, 세포 밀도는 약 0.5 x 10⁶개 내지 약 1 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 0.5 x 10⁶개 내지 약 1.5 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 0.5 x 10⁶개 내지 약 2 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 0.75 x 10⁶개 내지 약 1 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 0.75 x 10⁶개 내지 약 1.5 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 0.75 x 10⁶개 내지 약 2 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 1 x 10⁶개 내지 약 2 x 10⁶개의 세포/㎖, 또는 약 1 x 10⁶개 내지 약 1.5 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 1 x 10⁶개 내지 약 2 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 1 x 10⁶개 내지 약 3 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 1 x 10⁶개 내지 약 4 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 1 x 10⁶개 내지 약 5 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 1 x 10⁶개 내지 약 10 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 1 x 10⁶개 내지 약 15 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 1 x 10⁶개 내지 약 20 x 10⁶개의 세포/㎖, 또는 약 1 x 10⁶개 내지 약 30 x 10⁶개의 세포/㎖의 밀도로 조정된다.

일부 실시형태에서, 증식의 제2 단계는 세포가 미리 결정된 세포 밀도(또는 밀도 간격)로 모니터링되고 유지되고/되거나 미리 결정된 글루코스 함량을 갖는 배양 배지에서 유지되는 조건 하에 수행된다. 예를 들어, 세포는 약 0.5 x 10⁶개 내지 약 1 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 0.5 x 10⁶개 내지 약 1.5 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 0.5 x 10⁶개 내지 약 2 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 0.75 x 10⁶개 내지 약 1 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 0.75 x 10⁶개 내지 약 1.5 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 0.75 x 10⁶개 내지 약 2 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 1 x 10⁶개 내지 약 2 x 10⁶개의 세포/㎖, 또는 약 1 x 10⁶개 내지 약 1.5 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 1 x 10⁶개 내지 약 3 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 1 x 10⁶개 내지 약 4 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 1 x 10⁶개 내지 약 5 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 1 x 10⁶개 내지 약 10 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 1 x 10⁶개 내지 약 15 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 1 x 10⁶개 내지 약 20 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 1 x 10⁶개 내지 약 30 x 10⁶개의 세포/㎖의 생존가능 세포 밀도로 유지될 수 있다.

일부 경우에, 세포는 적어도 증식의 일부 동안 더 높은 농도에서 유지될 수 있다. 예를 들어, 제1 증식 또는 제2 증식의 제1 부분에 대해, 세포 생존능력은 더 높은 세포 농도에서 향상될 수 있다. 다른 예로서, 제1 증식 또는 제2 증식의 최종 부분에 대해 배양 용적은 더 높은 세포 농도에서 가장 효율적으로 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 세포는 제1 증식 배양 또는 제2 증식 배양의 적어도 일부 또는 제1 증식 배양 또는 제2 증식 배양의 모두에 대해 약 1 x 10⁶개의 세포/㎖ 내지 약 20 x 10⁶개의 세포/㎖의 생존가능 세포 밀도로 유지될 수 있다.

다른 예로서, 세포는 글루코스 함량이 약 0.5 g/ℓ 내지 약 1 g/ℓ, 약 0.5 g/ℓ 내지 약 1.5 g/ℓ, 약 0.5 g/ℓ 내지 약 2 g/ℓ, 약 0.75 g/ℓ 내지 약 1 g/ℓ, 약 0.75 g/ℓ 내지 약 1.5 g/ℓ, 약 0.75 g/ℓ 내지 약 2 g/ℓ, 약 1 g/ℓ 내지 약 1.5 g/ℓ, 약 1 g/ℓ 내지 약 2 g/ℓ, 1 g/ℓ 내지 3 g/ℓ, 또는 1 g/ℓ 내지 4 g/ℓ인 배양 배지에서 유지될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 글루코스 함량이 약 1.25 g/ℓ인 배양 배지에서 유지될 수 있다. 일부 경우에, 예컨대 높은 세포 밀도 배양이 유지는 경우에, 세포는 글루코스 함량이 약 1 g/ℓ 내지 약 5 g/ℓ, 약 1 g/ℓ 내지 약 4 g/ℓ, 약 2 g/ℓ 내지 약 5 g/ℓ, 또는 약 2 g/ℓ 내지 약 4 g/ℓ인 배양 배지에서 유지될 수 있다.

통상적으로, 글루코스 함량은 배양물에 새로운 혈청 함유 또는 무혈청 배양 배지를 첨가하여 유지된다. 일부 실시형태에서, 세포는, 예를 들어 각각의 매개변수를 모니터링하고 미리 결정된 제한 내에 그 매개변수를 유지시키기 위해 새로운 배지를 첨가하여, 미리 결정된 생존가능 세포 밀도 간격에서 및 미리 결정된 글루코스 함량 간격을 갖는 배양 배지에서 유지될 수 있다. 일부 실시형태에서, 글루코스 함량은 세포를 내부에 보유하면서 관류 생물반응기에서 소비된 배지를 제거하면서 배양물에 새로운 혈청 함유 또는 무혈청 배양 배지를 첨가하여 유지된다. 일부 실시형태에서, 제한 없이 pH, O₂의 분압, O₂ 포화도, CO₂의 분압, CO₂ 포화도, 락테이트, 글루타민, 글루타메이트, 암모늄, 나트륨, 칼륨 및 칼슘 중 하나 이상을 포함하는 추가 매개변수는 γδ T 세포 증식(예를 들어, 선택적 γδ T 세포 증식) 동안 또는 본원에 기재된 γδ T 세포 증식(예를 들어, 선택적 γδ T 세포 증식)의 제1 단계 또는 제2 단계 동안 모니터링되고/되거나 유지된다.

δ3 γδ T 세포 집단은 예를 들어 제1 농후화 단계에서 농후화된 γδ T-세포 집단을 제공하도록 혼합된 세포 집단을 δ3 TCR의 에피토프에 특이적으로 결합하여 δ3 T-세포를 선택적으로 증식시키는 하나 이상의 제제와 접촉시켜 시험관내 배양된 단리된 복잡한 샘플 또는 혼합된 세포 집단으로부터 선택적으로 증식될 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 제제는 δ3J1, δ3J2, 또는 δ3J3 TCR, δ3J4 TCR, 또는 이들의 2개, 또는 이들의 3개, 또는 이들의 모두에 특이적으로 결합한다.

일부 실시형태에서, 단핵구, αβ T 세포, B 세포 및 NK 세포와 같은 특정 세포 집단의 이전의 고갈 없이 전체 PBMC 집단에서의 δ3 γδ 세포는 활성화되고 증식되어 농후화된 γδ T 세포 집단(예를 들어, 농후화된 δ3 γδ T 세포 집단)을 생성시킬 수 있다. 일부 양태에서, δ3 γδ T 세포의 활성화 및 증식은 자연적인 또는 조작된 APC의 존재 없이 수행된다. 일부 양태에서, 종양 시편으로부터의 γδ T 세포의 단리 및 증식은 δ3 TCR; δ1 TCR; δ1, δ3, δ4 및 δ5 TCR, δ1 및 δ4 TCR; 또는 δ2 TCR, 및 예를 들어 δ3 TCR에 특이적인 활성화 에피토프에 결합하는 렉틴을 포함하는 다른 활성화 제제; δ1 TCR; δ1, δ3, δ4 및 δ5 TCR; δ1 및 δ4 TCR; 또는 본원에 제공된 δ2 TCR에 특이적인 활성화 에피토프에 특이적인 항체를 포함하는 부동화된 γδ T 세포 미토겐을 사용하여 수행될 수 있다.

특정 실시형태에서, 단리된 혼합된 세포 집단은 약 5일, 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일 또는 이것 내의 임의의 범위 동안 δ3 T 세포를 선택적으로 증식시키는 하나 이상의 제제와 접촉한다. 예를 들어, 단리된 혼합된 세포 집단은 제1 농후화된 γδ T-세포 집단을 제공하도록 약 1일 내지 약 3일, 약 1일 내지 약 4일, 약 1일 내지 약 5일, 약 2일 내지 약 3일, 약 2일 내지 약 4일, 약 2일 내지 약 5일, 약 3일 내지 약 4일, 약 3일 내지 약 5일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 15일 또는 약 5일 내지 약 7일 동안 δ3 T 세포를 선택적으로 증식시키는 하나 이상의 제제와 접촉한다. 일부 실시형태에서, 선택적으로 증식된 γδ T 세포는 본원에 기재된 바와 같은 증식의 제2 단계에서 추가로 증식된다.

특정 실시형태에서, 시작되는 단리된 혼합된 세포 집단, 예를 들어 말초 혈액 샘플은 약 20 내지 80%의 범위의 T 림프구를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 농후화된 γδ T-세포 집단(들)에서의 잔여 αβ T 세포 및 NK 세포의 백분율은 각각 약 2.5% 및 1%, 또는 약 이들 미만이다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 농후화된 γδ T-세포 집단(들)에서의 잔여 αβ T 세포 또는 NK 세포의 백분율은 약 1%, 0.5%, 0.4%, 0.2%, 0.1%, 또는 0.01%, 또는 약 이들 미만이다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 농후화된 γδ T 세포 집단(들)에서의 잔여 αβ T 세포의 백분율은 약 0.4%, 0.2%, 0.1% 또는 0.01%, 또는 약 이들 미만이다(예를 들어, γδ T 세포 또는 이의 하위유형, 예컨대 δ3 γδ T 세포에 대한 양성 선택의 단계 후 또는 αβ T 세포의 고갈 후). 일부 실시형태에서, αβ T 세포는 고갈되지만, NK 세포는 제1 및/또는 제2 γδ T-세포 증식 전에 또는 후에 고갈되지 않는다. 소정의 양태에서, 단리된 혼합된 세포 집단은 단일 공여자로부터 유래된다. 다른 양태에서, 단리된 혼합된 세포 집단은 1명 초과의 공여자 또는 다수의 공여자(예를 들어, 2명, 3명, 4명, 5명, 또는 2명 내지 5명, 2명 내지 10명, 또는 5명 내지 10명의 공여자 또는 초과)로부터 유래된다.

그러므로, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 1명만큼 적은 공여자로부터 임상적으로 관련된 수(10⁸ 초과, 10⁹ 초과, 10¹⁰ 초과, 10¹¹ 초과 또는 10¹² 초과, 또는 약 10⁸개 내지 약 10¹²개)의 증식된 γδ T-세포를 제공할 수 있다. 일부 경우에, 본 발명의 방법은 공여자 샘플을 얻은 시간으로부터 19일, 21일 또는 30일 미만 내에 임상적으로 관련된 수(10⁸ 초과, 10⁹ 초과, 10¹⁰ 초과, 10¹¹ 초과 또는 10¹² 초과, 또는 약 10⁸개 내지 약 10¹²개)의 증식된 γδ T-세포를 제공할 수 있다.

δ3 TCR에 특이적인 활성화 에피토프에 결합하는 활성화 제제를 사용한 특정 γδ T 세포 하위집단의 특이적 활성화 및 증식 이후에, 제1 농후화 단계에서, 본 발명의 제1 농후화된 γδ T 세포 집단(들)은 제2, 제3, 제4, 제5 등의 농후화 단계에서 제2 또는 추가의 농후화된 γδ T 세포 집단(들)을 얻기 위해 당해 분야에 공지된 기법을 사용하여 추가로 농후화되거나 정제될 수 있다. 예를 들어, 제1 농후화된 γδ T 세포 집단(들)은 αβ T 세포, B 세포 및/또는 NK 세포가 고갈될 수 있다. 수집된 γδ T 세포(들)에서 발현된 세포 표면 마커의 양성 및/또는 음성 선택은 제1 농후화된 γδ T 세포 집단(들)으로부터 유사한 세포 표면 마커를 발현하는 γδ T 세포 또는 γδ T 세포(들)의 집단을 직접 단리시키도록 사용될 수 있다. 예를 들어, γδ T 세포는 CD2, CD3, CD4, CD8, CD24, CD25, CD44, Kit, TCR α, TCR β, TCR γ(또는 하나 이상의 이들의 아형), TCR δ(또는 하나 이상의 이들의 아형), NKG2D, CD70, CD27, CD28, CD30, CD16, OX40, CD46, CD161, CCR7, CCR4, DNAM-1, JAML과 같은 마커, 및 다른 적합한 세포 표면 마커의 양성 또는 음성 발현에 기초하여 제1 농후화된 γδ T 세포 집단으로부터 단리될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 제1 γδ T 세포 증식, 제1 농후화 단계, 제2 γδ T-세포 증식, 및/또는 제2 농후화 단계 이후에, 농후화된 γδ T 세포 집단은 예를 들어 10 ㎖, 25 ㎖, 50 ㎖, 100 ㎖, 150 ㎖, 200 ㎖, 500 ㎖, 750 ㎖, 1 ℓ, 2 ℓ, 3 ℓ, 4 ℓ, 5 ℓ, 10 ℓ, 20 ℓ 또는 25 ℓ 미만의 배양 용적에서 10⁸개 초과의 세포의 γδ T 세포 하위집단의 임상적으로-관련된 수준을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 10 내지 100 ㎖; 25 내지 100 ㎖; 50 내지 100 ㎖; 75 내지 100mL; 10 내지 150 ㎖; 25 내지 150 ㎖; 50 내지 150 ㎖; 75 내지 150 ㎖; 100 내지 150 ㎖; 10 내지 200 ㎖; 25 내지 200 ㎖; 50 내지 200 ㎖; 75 내지 200 ㎖, 100 내지 200 ㎖; 10 내지 250 ㎖; 25 내지 250 ㎖; 50 내지 250 ㎖; 75 내지 250 ㎖, 100 내지 250 ㎖; 150 내지 250 ㎖; 5 내지 1,000 ㎖; 10 내지 1,000 ㎖, 또는 100 내지 1,000 ㎖; 150 내지 1,000 ㎖; 200 내지 1,000 ㎖; 250 내지 1,000 ㎖, 400 ㎖ 내지 1 ℓ, 1 ℓ 내지 2 ℓ, 2 ℓ 내지 5 ℓ, 2 ℓ 내지 10 ℓ, 4 ℓ 내지 10 ℓ, 4 ℓ 내지 15 ℓ, 4 ℓ 내지 20 ℓ, 또는 4 ℓ 내지 25 ℓ의 용적을 갖는 증식 배양에서 10⁸개 초과의 γδ T 세포 하위집단의 임상적으로-관련된 수준을 제공할 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 제2, 제3, 제4, 제5 등의 농후화 단계 이후에, 농후화된 γδ T-세포 집단은 하나 이상의 γδ T 세포 하위집단의 10⁸ 초과(예를 들어, δ3 γδ T 세포의 10⁸ 초과)의 임상적으로-관련된 수준을 포함한다.

일부 실시형태에서, γδ T 세포(들)는 하나 이상의 항원과의 접촉에 반응하여 빠르게 증식할 수 있다. 일부 γδ T 세포(들), 예컨대 Vγ9Vδ2⁺ γδ T 세포(들)는 조직 배양 동안 일부 항원, 예컨대 프레닐-피로포스페이트, 알킬 아민 및 대사물질 또는 미생물 추출물과의 접촉에 반응하여 시험관내 빠르게 증식한다. 또한, 일부 야생형 γδ T 세포(들), 예컨대 Vγ2Vδ2⁺ γδ T 세포(들)는 소정의 유형의 백신접종(들)에 반응하여 인간에서 생체내 빠르게 증식한다. 자극된 γδ T 세포는 복잡한 샘플로부터 γδ T-세포(들)의 단리를 용이하게 할 수 있는 많은 항원-제시, 동시자극 및 세포부착 분자를 나타낼 수 있다. 복잡한 샘플 내의 γδ T-세포(들)는 예를 들어 본원에 기재된 선택적 γδ T-세포 증식 제제, 예컨대 항체 또는 부동화된 항체에 의한 증식과 조합되어, 이것 전에 또는 이것 후에 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 약 5일 내지 15일, 5일 내지 10일 또는 5일 내지 7일 또는 다른 적합한 시간 기간 동안 적어도 하나의 항원으로 시험관내 자극될 수 있다. 적합한 항원에 의한 γδ T 세포의 자극은 생체외 또는 시험관내 γδ T 세포 집단을 증식시킬 수 있다.

시험관내 복잡한 샘플로부터 γδ T-세포(들)의 증식을 자극하기 위해 사용될 수 있는 항원의 비제한적인 예는 프레닐-피로포스페이트, 예컨대 이소펜테닐 피로포스페이트(IPP), 알킬-아민, 인간 미생물 병원균의 대사물질, 공생 박테리아의 대사물질, -메틸-3-부테닐-1-피로포스페이트(2M3B1PP), (e)-4-하이드록시-3-메틸-부트-2-엔일 피로포스페이트(HMB-PP), 에틸 피로포스페이트(EPP), 파르네실 피로포스페이트(FPP), 디메틸알릴 포스페이트(DMAP), 디메틸알릴 피로포스페이트(DMAPP), 에틸-아데노신 트리포스페이트(EPPPA), 게라닐 피로포스페이트(GPP), 게라닐게라닐 피로포스페이트(GGPP), 이소펜테닐-아데노신 트리포스페이트(IPPPA), 모노에틸 포스페이트(MEP), 모노에틸 피로포스페이트(MEPP), 3-포밀-1-부틸-피로포스페이트(TUBAg 1), X-피로포스페이트(TUBAg 2), 3-포밀-1-부틸-우리딘 트리포스페이트(TUBAg 3), 3-포밀-1-부틸-데옥시티미딘 트리포스페이트(TUBAg 4), 모노에틸 알킬아민, 알릴 피로포스페이트, 크로토일 피로포스페이트, 디메틸알릴-γ-우리딘 트리포스페이트, 크로토일-γ-우리딘 트리포스페이트, 알릴-γ-우리딘 트리포스페이트, 에틸아민, 이소부틸아민, sec-부틸아민, 이소-아밀아민 및 질소 함유 비스포스포네이트를 포함한다.

γδ T-세포의 활성화 및 증식은 특정 γδ T 세포 증대 및 지속적인 집단을 촉발하도록 본원에 기재된 활성화 및 동시자극 제제를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상이한 배양물로부터의 γδ T 세포의 활성화 및 증식은 상이한 배양 조건, 예컨대 상이한 활성화 제제 또는 이들의 혼합물을 사용하여 구별되는 클론성 또는 혼합된 다중클론성 집단 하위집단을 달성할 수 있다. 일부 경우에, 구별되는 집단 하위집단은 추가 클론성 또는 혼합된 다중클론성 집단 하위집단을 생산하도록 정제되고/되거나 혼합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상이한 작용 제제는 특정 γδ T 세포 활성화 신호를 제공하는 제제를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 일 양태에서, 특정 γδ T 세포 활성화 신호를 제공하는 제제는 γδ TCR에 지향된 상이한 단일클론 항체(MAb: monoclonal antibody)일 수 있다.

일 양태에서, MAb는 δ TCR 및/또는 γ TCR의 불변 또는 가변 영역에서 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 일 양태에서, MAb는 pan γδ TCR MAb를 포함할 수 있다. 일 양태에서, pan γδ TCR MAb는 δ3⁺ 세포 집단을 포함하여 γ 또는 δ 사슬 또는 둘 다에서 상이한 γ 및 δ TCR이 공유한 도메인을 인식할 수 있다. 일 양태에서, 항체는 5A6.E9(Thermo scientific), B1(Biolegend), IMMU510 및/또는 11F2(11F2)(Beckman Coulter)일 수 있다. 일 양태에서, MAb는 γ 사슬의 가변 영역에 고유한 특정 도메인(7A5 Mab, Vγ9 TCR에 지향됨(Thermo Scientific TCR1720호)), 또는 Vδ1 가변 영역에서의 도메인(Mab TS8.2(Thermo scientific TCR1730호; MAb TS-1(ThermoFisher TCR 1055호), MAb R9.12(Beckman Coulter IM1761호)), 또는 Vδ2 사슬(MAb 15D(Thermo Scientific TCR1732호 또는 Life technologies TCR2732호) B6(Biolegend 331402호), PCT/US17/32530에 기재된 δ1-# 항체의 하나 이상, PCT/US17/32530에 기재된 δ2-# 항체의 하나 이상, 또는 δ3-08, δ3-20, δ3-23, δ3-31, δ3-42, δ3-47 및 δ3-58의 하나 이상에 지향될 수 있다.

일부 실시형태에서, γδ TCR의 상이한 도메인에 대한 항체(pan 항체 및 하위집단 집단에서 특정 가변 영역 에피토프를 인식하는 항체)는 γδ T 세포 및/또는 하나 이상의 이들의 하위집단의 향상된 활성화 및 증식에 대한 이의 능력을 평가하고 사용하도록 조합될 수 있다. 일부 실시형태에서, γδ T 세포 활성자는 γδ TCR-결합 제제, 예컨대 MICA, NKG2D에 대한 작용제 항체, 예를 들어 Fc 태그, MICA, ULBP1 또는 ULBP3의 융합 단백질(R&D systems 미네소타주 미니애폴리스) ULBP2, 또는 ULBP6(Sino Biological 중국 베이징)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포 아네르기 및 아폽토시스의 유도 없이 특정 γδ T 세포 증대를 촉발하는 것을 돕는 동반 동시자극 제제는 본 발명의 방법 및 조성물에서 확인되고 사용될 수 있다. 이 동시자극 제제는 γδ 세포에서 발현된 수용체에 대한 리간드, 예컨대 하기의 하나 이상에 대한 리간드(들)를 포함할 수 있다: NKG2D, CD161, CD70, JAML, DNAX, CD81 보조 분자-1(DNAM-1) ICOS, CD27, CD196, CD137, CD30, HVEM, SLAM, CD122, DAP 및 CD28. 일부 양태에서, 동시자극 제제는 CD2 및 CD3 분자에서 고유한 에피토프에 특이적인 항체일 수 있다. CD2 및 CD3은 αβ 또는 γδ T 세포(들)에서 발현될 때 상이한 입체형태 구조를 가질 수 있고, 일부 경우에 CD3 및 CD2에 특이적인 항체는 γδ T-세포의 선택적 활성화 및 증식을 초래할 수 있다.

γδ T 세포의 집단(예를 들어, δ3 γδ T 세포를 포함하는 집단)은 γδ T 세포의 조작 전에 생체외 증식될 수 있다. 시험관내 γδ T 세포 집단의 증식을 용이하게 하도록 사용될 수 있는 시약의 비제한적인 예는 항-CD3 또는 항-CD2, 항-CD27, 항-CD30, 항-CD70, 항-OX40 항체, IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-12, IL-15, IL-18, IL-19, IL-21, IL 23, IL-33, IFNγ, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF: granulocyte-macrophage colony stimulating factor), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF: granulocyte colony stimulating factor), CD70(CD27 리간드), 콘카발린 A(ConA: concavalin A), 포크위드(PWM), 단백질 땅콩 응집소(PNA: peanut agglutinin), 대두 응집소(SBA: soybean agglutinin), 레스 쿨리나리스 응집소(LCA: Les Culinaris Agglutinin), 피슘 사티붐 응집소(PSA: Pisum Sativum Agglutinin), 헬릭스 포마티아 응집소(HPA: Helix pomatia agglutinin), 비시아 그라미네아 렉틴(VGA: Vicia graminea Lectin), 파세올루스 불가리스 에리쓰로아글루티닌(PHA-E: Phaseolus Vulgaris Erythroagglutinin), 파세올루스 불가리스 류코아글루티닌(PHA-L: Phaseolus Vulgaris Leucoagglutinin), 삼부쿠스 니그라 렉틴(Sambucus Nigra Lectin)(SNA, EBL), 마키아 아무렌시스(Maackia Amurensis), 렉틴 II(MAL II), 소포라 야포니카 응집소(SJA: Sophora Japonica Agglutinin), 돌리코스 비플로루스 응집소(DBA: Dolichos Biflorus Agglutinin), 렌즈 쿨리나리스 응집소(LCA: Lens Culinaris Agglutinin), 위스테리아 플로리분다 렉틴(Wisteria Floribunda Lectin)(WFA, WFL) 또는 T 세포 증대를 자극할 수 있는 다른 적합한 미토겐을 포함한다.

γδ T 세포(들)의 유전자 조작은 생체외 및 생체내 T-세포 증대, 생존 및 기능을 향상시키기 위해 단리된 γδ T-세포, 사이토카인(예를 들어, IL-15, IL-12, IL-2, IL-7, IL-21, IL-18, IL-19, IL-33, IL-4, IL-9, IL-23 또는 IL-1β)의 게놈으로 αβ TCR, γδ TCR, 항체를 암호화하는 CAR, 이의 항원 결합 단편, 및/또는 림프구 활성화 도메인과 같은 종양 인식 모이어티를 발현하는 작제물을 안정하게 통합시키는 것을 포함할 수 있다. 단리된 γδ T-세포의 유전자 조작은 또한 단리된 γδ T-세포의 게놈, 예컨대 MHC 유전좌위(유전좌위들)에서의 하나 이상의 내인성 유전자로부터의 유전자 발현을 결실시키거나 파괴시키는 것을 포함할 수 있다.

γδ T-세포의 생체외 증식

다른 양태에서, 본 개시내용은 입양 전달 치료를 위해 비조작된 및 조작된 γδ T 세포의 집단의 생체외 증식을 위한 방법을 제공한다. 본 개시내용의 비조작된 또는 조작된 γδ T 세포는 생체외 증식될 수 있다. 본 개시내용의 비조작된 또는 조작된 γδ T 세포는 APCS에 의한 활성화 없이 또는 APC 및/또는 아미노포스포네이트와의 동시배양 없이 시험관내 증식될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 본 개시내용의 비조작된 또는 조작된 γδ T 세포는 APC 및/또는 하나 이상의 아미노포스포네이트에 의한 활성화 또는 이들과의 동시배양을 포함하는 적어도 하나의 증식 단계에 의해 시험관내 증식될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 개시내용의 비조작된 또는 조작된 γδ T 세포는 제1 γδ T 세포 증식에서 APC에 의한 활성화 없이 시험관내 증식되고, 이후 제2 γδ T 세포 증식에서 APC에 의한 활성화에 의해 시험관내 증식될 수 있다. 일부 경우에, 제1 γδ T 세포 증식은 γδ T 세포를 (a) γδ T 세포를 증식시키는, 또는 (b) δ3 TCR에 특이적인 활성화 에피토프에 결합하여 δ3 T 세포를 선택적으로 증식시키는 하나 이상의 제제와 접촉시키는 것을 포함한다.

일부 경우에, 제2 γδ T 세포 증식은 제1 γδ T 세포 증식에 사용된 하나 이상의 제제들이 없거나 제1 γδ T 세포 증식에 사용된 하나 이상의 제제들 중 하나가 없는 배양 배지에서 수행된다. 일부 경우에, 제2 γδ T 세포 증식은 (a) T 세포를 증식시키는, (b) (예를 들어, αβ T 세포, B 세포 또는 NK 세포와 비교하여) γδ T 세포를 선택적으로 증식시키는, 또는 (c) δ3 TCR에 특이적인 활성화 에피토프에 결합하여 δ3 T 세포를 선택적으로 증식시키는 하나 이상의 제2 제제를 함유하는 배양 배지에서 수행된다.

일부 경우에, 제2 제제는 제1 γδ T 세포 증식에 사용된 제제와 비교하여 상이하다(예를 들어, 상이한 1차 아미노산 서열을 갖고/갖거나, 구조적으로 상이한 γδ TCR 에피토프에 결합함). 일부 경우에, 제2 제제는 중첩하는 γδ TCR 에피토프, 동일한 γδ TCR 에피토프에 결합하거나, 제1 γδ T-세포 증식에 사용된 제제 중 하나 이상과 γδ TCR에 대한 결합에 대해 경쟁할 수 있다. 일부 경우에, 제2 제제는 APC의 세포 표면에서 발현된다. 일부 경우에, 제2 제제는 예를 들어 제2 제제의 불변 영역과 APC의 표면 위의 Fc-수용체 사이의 결합 상호작용에 의해 APC의 표면에 결합된다. 일부 경우에, 제2 제제는 가용성이다. 일부 경우에, 제2 γδ T 세포 증식은 가용성 제2 제제 및 APC를 함유하는 배양 배지에서 수행되고, 선택적으로 APC는 이의 세포 표면에서 발현하거나, γδ T 세포 집단을 증식시키거나 선택적으로 증식시키는 제제를 이의 세포 표면에 결합시킨다. 표면 위에서 발현되거나 APC의 표면에 결합된 제제과 가용성 제2 제제는 동일하거나 상이할 수 있고, 예를 들어 γδ TCR 위의 동일한 또는 상이한 에피토프에 결합한다.

일부 경우에, 제1 γδ T 세포 증식은 APC 없이 수행되고, 제2 γδ T 세포 증식은 APC와 수행된다. 일부 경우에, 제2 γδ T 세포 증식은 APC 및 (a) T 세포를 증식시키거나, (b) γδ T 세포를 선택적으로 증식시키거나, 또는 (c) δ3 TCR에 특이적인 활성화 에피토프에 결합하여 δ3 T 세포를 선택적으로 증식시키는 하나 이상의 제2 제제를 사용하여 수행된다.

당업자는 특정 실시형태에서 본원에 기재된 제2 증식 단계의 방법이 제1 증식 단계로서 수행될 수 있고, 본원에 기재된 제1 단계의 방법이 제2 증식 단계로서 수행될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일례로서 제한 없이 일부 실시형태에서, 혼합된 세포 집단(예를 들어, PBMC)은 제1 단계에서 APC와 접촉하여 증식될 수 있고, 이후 예를 들어 제1 증식 단계로부터의 증식된 집단을 δ3 TCR에 특이적인 활성화 에피토프에 결합하여 δ3 T-세포를 선택적으로 증식시키는 부동화된 제제과 접촉시킴으로써 APC의 부재 하에 증식될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 다양한 γδ T 세포 집단, 예컨대 Vγ1^+, Vγ2⁺, 또는 Vγ3⁺ γδ T-세포 집단을 증식시킬 수 있다.

일부 경우에, γδ T 세포 집단은 36일 미만, 35일 미만, 34일 미만, 33일 미만, 32일 미만, 31일 미만, 30일 미만, 29일 미만, 28일 미만, 27일 미만, 26일 미만, 25일 미만, 24일 미만, 23일 미만, 22일 미만, 21일 미만, 20일 미만, 19일 미만, 18일 미만, 17일 미만, 16일 미만, 15일 미만, 14일 미만, 13일 미만, 12일 미만, 11일 미만, 10일 미만, 9일 미만, 8일 미만, 7일 미만, 6일 미만, 5일 미만, 4일 미만 또는 3일 미만에 시험관내 증식될 수 있다.

일부 양태에서, 혼합된 세포 집단으로부터의 γδ T 세포를 활성화 제제와 접촉시켜 조작된 및 비조작된 γδ T 세포를 포함하는 다양한 γδ T 세포를 선택적으로 증식시키는 방법이 제공된다. 일부 경우에, 활성화 제제는 γδ T 세포의 세포-표면 수용체 위의 특이적 에피토프에 결합한다. 활성화 제제는 항체, 예컨대 단일클론 항체일 수 있다. 활성화 제제, 또는 이들의 조합은 하나 이상의 유형의 γδ T-세포, 예컨대 δ3, δ2, δ1, δ1 및 δ4, 또는 δ1 및 δ3 세포 집단의 증식을 특이적으로 활성화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 활성화 제제는 농후화된 δ3 T 세포 집단을 제공하도록 δ3 세포 집단의 증식을 특이적으로 활성화한다.

활성화 제제는 빠른 성장 속도로 조작된 및 비조작된 γδ T 세포(예를 들어, δ3 γδ T 세포)의 증식을 자극할 수 있다. 예를 들어, 제제는 30시간 미만에 1개의 세포 분열, 29시간 미만에 1개의 세포 분열, 28시간 미만에 1개의 세포 분열, 27시간 미만에 1개의 세포 분열, 26시간 미만에 1개의 세포 분열, 25시간 미만에 1개의 세포 분열, 24시간 미만에 1개의 세포 분열, 23시간 미만에 1개의 세포 분열, 22시간 미만에 1개의 세포 분열, 21시간 미만에 1개의 세포 분열, 20시간 미만에 1개의 세포 분열, 19시간 미만에 1개의 세포 분열, 18시간 미만에 1개의 세포 분열, 17시간 미만에 1개의 세포 분열, 16시간 미만에 1개의 세포 분열, 15시간 미만에 1개의 세포 분열, 14시간 미만에 1개의 세포 분열, 13시간 미만에 1개의 세포 분열, 12시간 미만에 1개의 세포 분열, 11시간 미만에 1개의 세포 분열, 10시간 미만에 1개의 세포 분열, 9시간 미만에 1개의 세포 분열, 8시간 미만에 1개의 세포 분열, 7시간 미만에 1개의 세포 분열, 6시간 미만에 1개의 세포 분열, 5시간 미만에 1개의 세포 분열, 4시간 미만에 1개의 세포 분열, 3시간 미만에 1개의 세포 분열, 2시간 미만에 1개의 세포 분열의 평균 속도로 γδ T-세포 집단의 증식을 자극할 수 있다. 일부 경우에, 빠른 증식 속도는 배양의 적어도 약 8시간(예를 들어, 8 내지 24시간, 또는 1일 내지 3일, 1일 내지 4일, 1일 내지 8일, 2일 내지 3일, 2일 내지 4일, 또는 2일 내지 8일 또는 약 19일, 21일 또는 30일 미만) 동안 유지될 수 있다.

일부 경우에, 활성화 제제는 약 4시간마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 5시간마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 6시간마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 7시간마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 8시간마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 9시간마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 10시간마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 11시간마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 12시간마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 13시간마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 14시간마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 15시간마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 16시간마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 17시간마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 18시간마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 19시간마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 20시간마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 21시간마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 22시간마다 약 1개 분열의 속도, 약 23시간마다 약 1개 분열의 속도, 약 24시간마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 25시간마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 26시간마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 27시간 약 1개 분열의 평균 속도, 약 28시간마다 약 1개 분열의 속도, 약 29시간마다 약 1개 분열의 속도, 약 30시간마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 31시간마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 32시간마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 33시간마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 34시간마다 약 1개 분열의 속도, 약 35시간마다 약 1개 분열의 속도, 약 36시간마다 약 1개 분열의 평균 속도로 조작된 및 비조작된 γδ T 세포(예를 들어, δ3 γδ T 세포)의 증식을 자극할 수 있다. 일부 경우에, 빠른 증식 속도는 배양의 적어도 약 8시간(예를 들어, 8시간 내지 24시간, 또는 1일 내지 3일, 1일 내지 4일, 1일 내지 8일, 2일 내지 3일, 2일 내지 4일, 또는 2일 내지 8일 또는 약 19일, 21일 또는 30일 미만) 동안 유지될 수 있다.

일부 경우에, 활성화 제제는 γδ T 세포 증식 배양(예를 들어, δ3 γδ T 세포 증식 배양)에서 조작된 및/또는 비조작된 γδ T 세포(예를 들어, δ3 γδ T 세포)의 빠른 증식을 자극할 수 있고, 여기서 빠른 증식은 세포 분열의 상기 평균 속도 중 어느 하나에 있고, 연속 약 1일 내지 연속 약 19일, 연속 약 1일 내지 연속 약 14일, 연속 약 1일 내지 연속 약 7일, 연속 약 1일 내지 연속 약 5일, 연속 약 2일 내지 연속 약 19일, 연속 약 2일 내지 연속 약 14일, 연속 약 2일 내지 연속 약 7일, 연속 약 2일 내지 연속 약 5일, 연속 약 4일 내지 연속 약 19일, 연속 약 4일 내지 연속 약 14일, 연속 약 4일 내지 연속 약 7일 또는 연속 약 4일 내지 연속 약 5일 동안 유지된다.

일부 경우에, 활성화 제제는 약 12시간(예를 들어, 10시간 내지 12시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 13시간(예를 들어, 10시간 내지 13시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 14시간(예를 들어, 10시간 내지 14시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 15시간(예를 들어, 10시간 내지 15시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 16시간(예를 들어, 10시간 내지 16시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 17시간(예를 들어, 10시간 내지 17시간 또는 12시간 내지 17시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 18시간(예를 들어, 10시간 내지 18시간 또는 12시간 내지 18시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 19시간(예를 들어, 10시간 내지 19시간 또는 12시간 내지 19시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 20시간(예를 들어, 12시간 내지 20시간, 16시간 내지 20시간 또는 18시간 내지 20시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 21시간(예를 들어, 12시간 내지 21시간, 16시간 내지 21시간 또는 18시간 내지 21시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 22시간(예를 들어, 12시간 내지 22시간, 16시간 내지 22시간 또는 18시간 내지 22시간)마다 약 1개 분열의 속도, 약 23시간 이하(예를 들어, 12시간 내지 23시간, 16시간 내지 23시간 또는 18시간 내지 23시간)마다 약 1개 분열의 속도, 약 24시간(예를 들어, 12시간 내지 24시간, 16시간 내지 24시간 또는 18시간 내지 24시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도로 연속 약 2일 내지 약 7일 또는 연속 약 2일 내지 약 5일 동안 유지된 γδ T 세포 증식 배양(예를 들어, δ3 γδ T 세포 증식 배양)에서 조작된 및/또는 비조작된 γδ T 세포(예를 들어, δ3 γδ T 세포)의 증식을 자극할 수 있다.

일부 경우에, 활성화 제제는 약 25시간(예를 들어, 12시간 내지 25시간, 16시간 내지 25시간 18시간 내지 25시간, 또는 20시간 내지 25시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 26시간(예를 들어, 12시간 내지 26시간, 16시간 내지 26시간 18시간 내지 26시간, 또는 20시간 내지 26시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 27시간(예를 들어, 12시간 내지 27시간, 16시간 내지 27시간 18시간 내지 27시간, 또는 20시간 내지 27시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 28시간(예를 들어, 12시간 내지 28시간, 16시간 내지 28시간 18시간 내지 28시간, 20시간 내지 28시간, 또는 22시간 내지 28시간)마다 약 1개 분열의 속도, 약 29시간(예를 들어, 16시간 내지 29시간 18시간 내지 29시간, 20시간 내지 29시간, 또는 22시간 내지 29시간)마다 약 1개 분열의 속도, 약 30시간(예를 들어, 16시간 내지 30시간 18시간 내지 30시간, 20시간 내지 30시간, 또는 22시간 내지 30시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 31시간(예를 들어, 16시간 내지 31시간 18시간 내지 31시간, 20시간 내지 31시간, 22시간 내지 31시간, 또는 24시간 내지 31시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 32시간(예를 들어, 18시간 내지 32시간, 20시간 내지 32시간, 22시간 내지 32시간, 또는 24시간 내지 32시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 33시간(예를 들어, 18시간 내지 33시간, 20시간 내지 33시간, 22시간 내지 33시간, 또는 24시간 내지 33시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 34시간(예를 들어, 18시간 내지 34시간, 20시간 내지 34시간, 22시간 내지 34시간, 또는 24시간 내지 34시간)마다 약 1개 분열의 속도, 약 35시간(예를 들어, 18시간 내지 35시간, 20시간 내지 35시간, 22시간 내지 35시간, 또는 24시간 내지 35시간)마다 약 1개 분열의 속도, 약 36시간(예를 들어, 18시간 내지 36시간, 20시간 내지 36시간, 22시간 내지 36시간, 또는 24시간 내지 36시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도로 연속 약 2일 내지 약 7일 또는 연속 약 2일 내지 약 5일 유지된 γδ T 세포 증식 배양(예를 들어, δ3 γδ T 세포 증식 배양)에서 조작된 및/또는 비조작된 γδ T 세포(예를 들어, δ3 γδ T 세포)의 증식을 자극할 수 있다.

일부 경우에, 활성화 제제는 약 12시간(예를 들어, 10시간 내지 12시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 13시간(예를 들어, 10시간 내지 13시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 14시간(예를 들어, 10시간 내지 14시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 15시간(예를 들어, 10시간 내지 15시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 16시간(예를 들어, 10시간 내지 16시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 17시간(예를 들어, 10시간 내지 17시간 또는 12시간 내지 17시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 18시간(예를 들어, 10시간 내지 18시간 또는 12시간 내지 18시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 19시간(예를 들어, 10시간 내지 19시간 또는 12시간 내지 19시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 20시간(예를 들어, 12시간 내지 20시간, 16시간 내지 20시간 또는 18시간 내지 20시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 21시간(예를 들어, 12시간 내지 21시간, 16시간 내지 21시간 또는 18시간 내지 21시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 22시간(예를 들어, 12시간 내지 22시간, 16시간 내지 22시간 또는 18시간 내지 22시간)마다 약 1개 분열의 속도, 약 23시간 이하(예를 들어, 12시간 내지 23시간, 16시간 내지 23시간 또는 18시간 내지 23시간)마다 약 1개 분열의 속도, 약 24시간(예를 들어, 12시간 내지 24시간, 16시간 내지 24시간 또는 18시간 내지 24시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도로 연속 적어도 14일 동안 유지된 γδ T 세포 증식 배양(예를 들어, δ3 γδ T 세포 증식 배양)에서 조작된 및/또는 비조작된 γδ T 세포(예를 들어, δ3 γδ T 세포)의 증식을 자극할 수 있다.

일부 경우에, 활성화 제제는 약 25시간(예를 들어, 12시간 내지 25시간, 16시간 내지 25시간 18시간 내지 25시간, 또는 20시간 내지 25시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 26시간(예를 들어, 12시간 내지 26시간, 16시간 내지 26시간 18시간 내지 26시간, 또는 20시간 내지 26시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 27시간(예를 들어, 12시간 내지 27시간, 16시간 내지 27시간 18시간 내지 27시간, 또는 20시간 내지 27시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 28시간(예를 들어, 12시간 내지 28시간, 16시간 내지 28시간 18시간 내지 28시간, 20시간 내지 28시간, 또는 22시간 내지 28시간)마다 약 1개 분열의 속도, 약 29시간(예를 들어, 16시간 내지 29시간 18시간 내지 29시간, 20시간 내지 29시간, 또는 22시간 내지 29시간)마다 약 1개 분열의 속도, 약 30시간(예를 들어, 16시간 내지 30시간 18시간 내지 30시간, 20시간 내지 30시간, 또는 22시간 내지 30시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 31시간(예를 들어, 16시간 내지 31시간 18시간 내지 31시간, 20시간 내지 31시간, 22시간 내지 31시간, 또는 24시간 내지 31시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 32시간(예를 들어, 18시간 내지 32시간, 20시간 내지 32시간, 22시간 내지 32시간, 또는 24시간 내지 32시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 33시간(예를 들어, 18시간 내지 33시간, 20시간 내지 33시간, 22시간 내지 33시간, 또는 24시간 내지 33시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 34시간(예를 들어, 18시간 내지 34시간, 20시간 내지 34시간, 22시간 내지 34시간, 또는 24시간 내지 34시간)마다 약 1개 분열의 속도, 약 35시간(예를 들어, 18시간 내지 35시간, 20시간 내지 35시간, 22시간 내지 35시간, 또는 24시간 내지 35시간)마다 약 1개 분열의 속도, 약 36시간(예를 들어, 18시간 내지 36시간, 20시간 내지 36시간, 22시간 내지 36시간, 또는 24시간 내지 36시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도로 연속 적어도 14일 동안 유지된 γδ T 세포 증식 배양에서 조작된 및/또는 비조작된 γδ T 세포(예를 들어, δ3 γδ T 세포)의 증식을 자극할 수 있다.

일부 경우에, 활성화 제제는 약 12시간(예를 들어, 10시간 내지 12시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 13시간(예를 들어, 10시간 내지 13시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 14시간(예를 들어, 10시간 내지 14시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 15시간(예를 들어, 10시간 내지 15시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 16시간(예를 들어, 10시간 내지 16시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 17시간(예를 들어, 10시간 내지 17시간 또는 12시간 내지 17시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 18시간(예를 들어, 10시간 내지 18시간 또는 12시간 내지 18시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 19시간(예를 들어, 10시간 내지 19시간 또는 12시간 내지 19시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 20시간(예를 들어, 12시간 내지 20시간, 16시간 내지 20시간 또는 18시간 내지 20시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 21시간(예를 들어, 12시간 내지 21시간, 16시간 내지 21시간 또는 18시간 내지 21시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 22시간(예를 들어, 12시간 내지 22시간, 16시간 내지 22시간 또는 18시간 내지 22시간)마다 약 1개 분열의 속도, 약 23시간 이하(예를 들어, 12시간 내지 23시간, 16시간 내지 23시간 또는 18시간 내지 23시간)마다 약 1개 분열의 속도, 약 24시간(예를 들어, 12시간 내지 24시간, 16시간 내지 24시간 또는 18시간 내지 24시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도로 연속 적어도 19일 동안 유지된 γδ T 세포 증식 배양에서 조작된 및/또는 비조작된 γδ T 세포(예를 들어, δ3 γδ T 세포)의 증식을 자극할 수 있다.

일부 경우에, 활성화 제제는 약 25시간(예를 들어, 12시간 내지 25시간, 16시간 내지 25시간, 18시간 내지 25시간, 또는 20시간 내지 25시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 26시간(예를 들어, 12시간 내지 26시간, 16시간 내지 26시간 18시간 내지 26시간, 또는 20시간 내지 26시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 27시간(예를 들어, 12시간 내지 27시간, 16시간 내지 27시간 18시간 내지 27시간, 또는 20시간 내지 27시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 28시간(예를 들어, 12시간 내지 28시간, 16시간 내지 28시간 18시간 내지 28시간, 20시간 내지 28시간, 또는 22시간 내지 28시간)마다 약 1개 분열의 속도, 약 29시간(예를 들어, 16시간 내지 29시간 18시간 내지 29시간, 20시간 내지 29시간, 또는 22시간 내지 29시간)마다 약 1개 분열의 속도, 약 30시간(예를 들어, 16시간 내지 30시간 18시간 내지 30시간, 20시간 내지 30시간, 또는 22시간 내지 30시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 31시간(예를 들어, 16시간 내지 31시간 18시간 내지 31시간, 20시간 내지 31시간, 22시간 내지 31시간, 또는 24시간 내지 31시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 32시간(예를 들어, 18시간 내지 32시간, 20시간 내지 32시간, 22시간 내지 32시간, 또는 24시간 내지 32시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 33시간(예를 들어, 18시간 내지 33시간, 20시간 내지 33시간, 22시간 내지 33시간, 또는 24시간 내지 33시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도, 약 34시간(예를 들어, 18시간 내지 34시간, 20시간 내지 34시간, 22시간 내지 34시간, 또는 24시간 내지 34시간)마다 약 1개 분열의 속도, 약 35시간(예를 들어, 18시간 내지 35시간, 20시간 내지 35시간, 22시간 내지 35시간, 또는 24시간 내지 35시간)마다 약 1개 분열의 속도, 약 36시간(예를 들어, 18시간 내지 36시간, 20시간 내지 36시간, 22시간 내지 36시간, 또는 24시간 내지 36시간)마다 약 1개 분열의 평균 속도로 연속 적어도 19일 동안 유지된 γδ T 세포 증식 배양(예를 들어, δ3 γδ T 세포 증식 배양)에서 조작된 및/또는 비조작된 γδ T 세포(예를 들어, δ3 γδ T 세포)의 증식을 자극할 수 있다.

활성화 제제는 상이한 성장 속도로 조작된 또는 비조작된 γδ T-세포의 하위집단의 증식을 자극할 수 있다. 예를 들어, 제제는 배양의 1일 내지 90일의 기간(예를 들어, 배양의 약 1일 내지 약 19, 21, 또는 23일)에 걸쳐, 다른 γδ T 세포 집단, 예컨대 δ1 또는 δ2 집단에 비해; 증식 전의 γδ T 세포의 출발 수에 비해; 증식 전의 γδ3 T 세포의 출발 수에 비해; 또는 배양물에서의 αβ T 세포 집단에 비해 증식이 약 10배 초과, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1,000배, 10,000배, 20,000배, 30,000배, 50,000배, 70,000배, 100,000배 또는 1,000,000배의 증식을 발생시키게 하는 더 빠른 속도로 δ3 세포 집단의 성장을 자극할 수 있다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 빠른 속도로, 예컨대 30시간마다 약 1개의 세포 분열의 속도로 또는 더 빠르게 γδ T 세포 집단의 증식을 자극하는 제제과 접촉된 조작된 또는 비조작된 γδ T 세포 집단(예를 들어, δ3 γδ T 세포 집단)을 제공하다. 일부 경우에, 상기 제제는 δ3 T 세포의 증대를 선택적으로 자극할 수 있다. γδ T 세포 집단은 비조작된 γδ T-세포의 양 및 조작된 γδ T 세포의 양을 포함할 수 있다. 일부 경우에, γδ T 세포 집단은 상이한 백분율의 δ1, δ2, δ3, 및/또는 δ4 T-세포를 포함한다. 일부 경우에, γδ T 세포 집단은 상이한 백분율의 δ1, δ2, δ3, 및/또는 δ4 T-세포를 포함하고, 임의의 다른 γδ T 세포 하위집단보다 더 많은 δ3 γδ T 세포를 함유하고/하거나, 주로 (50% 초과의) δ3 γδ T 세포를 함유한다. 조작된 또는 비조작된 γδ T-세포 집단은 예를 들어 90% 미만의 δ3 T-세포, 80% 미만의 δ3 T-세포, 70% 미만의 δ3 T-세포, 60% 미만의 δ3 T-세포, 50% 미만의 δ3 T-세포, 40% 미만의 δ3 T-세포, 30% 미만의 δ3 T-세포, 20% 미만의 δ3 T-세포, 10% 미만의 δ3 T-세포, 또는 5% 미만의 δ3 T-세포를 포함할 수 있다. 대안적으로, 조작된 또는 비조작된 γδ T-세포 집단은 5% 초과의 δ3 T-세포, 10% 초과의 δ3 T-세포, 20% 초과의 δ3 T-세포, 30% 초과의 δ3 T-세포, 40% 초과의 δ3 T-세포, 50% 초과의 δ3 T-세포, 60% 초과의 δ3 T-세포, 70% 초과의 δ3 T-세포, 80% 초과의 δ3 T-세포, 또는 90% 초과의 δ3 T-세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 제제는 본원에 기재된 선택적 증식 제제들 중 하나이다. 일부 경우에, 상기 제제는 세포 배양 표면 또는 APC의 표면과 같은 표면에 부동화된다(예를 들어, APC의 표면에서 발현되거나 APC의 표면에서 발현된 Fc 수용체에 결합됨).

조작된 또는 비조작된 γδ T 세포 집단은 예를 들어 90% 미만의 δ2 T-세포, 80% 미만의 δ2 T-세포, 70% 미만의 δ2 T-세포, 60% 미만의 δ2 T-세포, 50% 미만의 δ2 T-세포, 40% 미만의 δ2 T-세포, 30% 미만의 δ2 T-세포, 20% 미만의 δ2 T-세포, 10% 미만의 δ2 T-세포, 또는 5% 미만의 δ2 T-세포를 포함할 수 있다. 대안적으로, 조작된 또는 비조작된 γδ T-세포 집단은 5% 초과의 δ2 T-세포, 10% 초과의 δ2 T-세포, 20% 초과의 δ2 T-세포, 30% 초과의 δ2 T-세포, 40% 초과의 δ2 T-세포, 50% 초과의 δ2 T-세포, 60% 초과의 δ2 T-세포, 70% 초과의 δ2 T-세포, 80% 초과의 δ2 T-세포, 또는 90% 초과의 δ2 T-세포를 포함할 수 있다.

조작된 또는 비조작된 γδ T-세포 집단은 예를 들어 90% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포, 80% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포, 70% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포, 60% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포, 50% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포, 40% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포, 30% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포, 20% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포, 10% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포, 또는 5% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포를 포함할 수 있다. 대안적으로, 조작된 또는 비조작된 γδ T-세포 집단은 5% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 10% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 20% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 30% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 40% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 50% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 60% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 70% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 80% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 또는 90% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포를 포함할 수 있다.

조작된 또는 비조작된 γδ T-세포 집단은 예를 들어 90% 미만의 δ4 T-세포, 80% 미만의 δ4 T-세포, 70% 미만의 δ4 T-세포, 60% 미만의 δ4 T-세포, 50% 미만의 δ4 T-세포, 40% 미만의 δ4 T-세포, 30% 미만의 δ4 T-세포, 20% 미만의 δ4 T-세포, 10% 미만의 δ4 T-세포, 또는 5% 미만의 δ4 T-세포를 포함할 수 있다. 대안적으로, 조작된 또는 비조작된 γδ T-세포 집단은 5% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 10% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 20% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 30% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 40% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 50% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 60% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 70% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 80% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 또는 90% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포를 포함할 수 있다. 조작된 또는 비조작된 γδ T-세포 집단은 예를 들어 90% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포, 80% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포, 70% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포, 60% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포, 50% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포, 40% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포, 30% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포, 20% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포, 10% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포, 또는 5% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포를 포함할 수 있다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 10% 내지 90%의 δ3 T-세포와 90% 내지 10%의 δ2 T-세포를 포함하는 증식된 γδ T-세포 집단의 혼합물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 10% 내지 90%의 δ3 T-세포와 90% 내지 10%의 δ1 T-세포를 포함하는 증식된 γδ T-세포 집단의 혼합물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 10% 내지 90%의 δ1 및 δ3 T-세포와 90% 내지 10%의 δ2 T-세포를 포함하는 증식된 γδ T-세포 집단의 혼합물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 10% 내지 90%의 δ3 및 δ2 T-세포와 90% 내지 10%의 δ1 T-세포를 포함하는 증식된 γδ T-세포 집단의 혼합물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 10% 내지 90%의 δ1, δ3, δ4 및 δ5 T-세포와 90% 내지 10%의 δ2 T-세포를 포함하는 증식된 γδ T-세포 집단의 혼합물을 제공한다.

하나 이상의 활성화 제제는 γδ T 세포(예를 들어, γδ TCR과 같은 γδ T 세포의 표면 위의 수용체에 결합하는 활성자)와 접촉할 수 있고, 이후 공동자극 분자는 추가의 자극을 제공하고 γδ T 세포를 증식시키도록 γδ T 세포와 접촉할 수 있다. 일부 실시형태에서, 활성화 제제 및/또는 동시자극 제제는 식물 또는 비식물 기원의 렉틴, γδ T-세포를 활성화하는 단일클론 항체, 및 다른 비렉틴/비항체 제제일 수 있다. 다른 경우에, 식물 렉틴은 콘카나발린 A(ConA)일 수 있지만, 예컨대 다른 식물 렉틴을 사용할 수 있다. 다른 렉틴 예는 단백질 땅콩 응집소(PNA), 대두 응집소(SBA), 레스 쿨리나리스 응집소(LCA), 피슘 사티붐 응집소(PSA), 헬릭스 포마티아 응집소(HPA), 비시아 그라미네아 렉틴(VGA), 파세올루스 불가리스 에리쓰로아글루티닌(PHA-E), 파세올루스 불가리스 류코아글루티닌(PHA-L), 삼부쿠스 니그라 렉틴(SNA, EBL), 마키아 아무렌시스, 렉틴 II(MAL II), 소포라 야포니카 응집소(SJA), 돌리코스 비플로루스 응집소(DBA), 렌즈 쿨리나리스 응집소(LCA) 및 위스테리아 플로리분다 렉틴(WFA, WFL)을 포함한다.

활성화 제제 및 동시자극 분자의 비제한적인 예는 본원에 기재된 δ 또는 γ-사슬 또는 이의 아형에 선택적인 임의의 하나 이상의 항체, 5A6.E9, B1, TS8.2, 15D, B6, B3, TS-1, γ3.20, 7A5, IMMU510, R9.12, 11F2와 같은 항체, 또는 이들의 조합을 포함한다. 활성화 제제 및 동시자극 분자의 다른 예는 졸레드로네이트, 포르볼 12-미리스테이트-13-아세테이트(TPA), 머저레인, 스타필로코커스 장독소 A(SEA: staphylococcal enterotoxin A), 스트렙토코커스 단백질 A, 또는 이들의 조합을 포함한다.

다른 경우에, 활성화 제제 및/또는 동시자극 제제는 α TCR, β TCR, γ TCR, δ TCR, CD277, CD28, CD46, CD81, CTLA4, ICOS, PD-1, CD30, NKG2D, NKG2A, HVEM, 4-1 BB(CD137), OX40(CD134), CD70, CD80, CD86, DAP, CD122, GITR, FcεRIγ, CD1, CD16, CD161, DNAX, 보조 분자-1(DNAM-1), 하나 이상의 NCR(예를 들어, NKp30, NKp44, NKp46), SLAM, 콕사키 바이러스 및 아데노바이러스 수용체 또는 이들의 조합에 대한 항체 또는 리간드일 수 있다.

조작된 γδ T 세포

조작된 γδ T 세포(예를 들어, δ3 γδ T 세포)는 당해 분야에 공지된 다양한 방법으로 생성될 수 있다. 조작된 γδ T-세포는 특정 종양 인식 모이어티를 안정하게 발현하도록 설계될 수 있다. 종양 인식 또는 다른 유형의 인식 모이어티를 포함하는 발현 카세트를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 전이인자/유전자전위효소 시스템 또는 바이러스-기반 유전자 전달 시스템, 예컨대 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 시스템, 또는 다른 적합한 방법, 예컨대 형질주입, 전기천공, 형질도입, 리포펙틴, 인산칼슘(CaPO₄), 나노조작 제제, 예컨대 오모실(Ormosil), 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노 관련 바이러스를 포함하는 바이러스의 전달 방법, 또는 다른 적합한 방법에 의해 γδ T-세포로 안정하게 도입될 수 있다. αβ 또는 γδ 중 어느 하나인 항원 특이적 TCR은 γδ T-세포의 게놈으로 항원 특이적 TCR에 대한 유전자 코드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 안정하게 삽입하여 조작된 γδ T-세포로 도입될 수 있다. 종양 인식 모이어티를 갖는 CAR를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 γδ T-세포의 게놈으로 폴리뉴클레오타이드를 안정하게 삽입하여 조작된 γδ T-세포로 도입될 수 있다. 일부 경우에, 조작된 종양 인식 모이어티는 조작된 T-세포 수용체이고, 조작된 γδ T-세포의 게놈으로 도입된 발현 카세트는 조작된 TCR α(TCR 알파) 유전자, 조작된 TCR β(TCR 베타) 유전자, TCR δ(TCR 델타) 유전자, 또는 조작된 TCR γ(TCR 감마) 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 경우에, 조작된 γδ T-세포의 게놈으로 도입된 발현 카세트는 항체 단편 또는 이의 항원 결합 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 경우에, 항체 단편 또는 이의 항원 결합 단편은, 키메라 항원 수용체(CAR: Chimeric Antigen Receptor) 작제물, 또는 CAR 및 T-세포 수용체(TCR)를 포함하는 이중특이적 작제물, 또는 항체들이 상이한 항원들에 지향된 CAR의 일부로서 세포 표면 종양 항원에 결합하는, 전체 항체, 항체 단편, 단일-사슬 가변 단편(scFv), 단일 도메인 항체(sdAb), Fab, F(ab)₂, Fc, 항체 상의 경쇄 또는 중쇄, 항체의 가변 또는 불변 영역, 또는 임의의 이들의 조합을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드는 인간 또는 다른 종으로부터 유래된다. 비인간 종으로부터 유래된 항체 단편 또는 항원 결합 단편 폴리뉴클레오타이드는 인간에서 자연에서 생산된 항체 변이체와의 이의 유사성을 증가시키도록 변형될 수 있고, 항체 단편 또는 항원 결합 단편은 부분적으로 또는 완전히 인간화될 수 있다. 항체 단편 또는 항원 결합 단편 폴리뉴클레오타이드는 또한 키메라, 예를 들어 마우스-인간 항체 키메라일 수 있다. CAR을 발현하는 조작된 γδ T-세포는 종양 인식 모이어티에 의해 인식된 항원에 리간드를 발현하도록 또한 조작될 수 있다.

당해 분야에 공지된 다양한 기법은 조작된 γδ T-세포의 게놈 내에 특정 위치로 종양 인식 모이어티에 대한 유전자 코드를 포함하는 클리닝되거나 합성으로 조작된 핵산을 도입하도록 사용될 수 있다. 각각 본원에 그 전문이 참고로 원용된 WO201409370, WO2003087341, WO2014134412 및 WO2011090804에 의해 각각 기재된 바대로, 미생물의 주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 회문구조 반복서열(CRISPR: clustered regularly interspaced short palindromic repeat) 시스템으로부터의 RNA-가이드된 Cas9 뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN: zinc finger nuclease), 전사 활성자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN: transcription activator-like effector nuclease) 및 메가뉴클레아제 기술은 γδ T-세포(들)에서 효율적인 게놈 조작을 제공하도록 사용될 수 있다. 본원에 기재된 기술은 하나의 유전자의 넉아웃(knock-out) 및 다른 유전자의 넉인(knock-in)을 동시에 제공하는 게놈 위치로 발현 카세트를 삽입하도록 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 MHC 유전자를 암호화하는 게놈 영역으로 삽입될 수 있다. 이러한 조작은 하나 이상의 유전자, 예를 들어 발현 카세트에 포함된 유전자의 넉인 및 다른 유전자, 예를 들어 MHC 유전좌위의 넉아웃을 동시에 제공할 수 있다.

일 경우에, 종양 인식 모이어티를 암호화하는 핵산을 포함하는 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty) 전이인자는 조작되는 세포 γδ T-세포로 도입된다. 야생형 슬리핑 뷰티, 예컨대 본원에 그 전문이 참고로 원용된 US 7,985,739에 기재된 바와 같은 유전자전위효소와 비교하여 향상된 통합을 제공하는 돌연변이체 슬리핑 뷰티 유전자전위효소는 조작된 γδ T-세포에서 폴리뉴클레오타이드를 도입하도록 사용될 수 있다.

일부 경우에, 바이러스 방법은 조작된 γδ T-세포의 게놈으로 종양 인식 모이어티를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 도입하도록 사용된다. 다수의 바이러스 방법은 인간 유전자 치료, 예컨대 본원에 그 전문이 원용된 WO 1993020221에 기재된 방법에 사용된다. γδ T-세포를 조작하도록 사용될 수 있는 바이러스 방법의 비제한적인 예는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 렌티바이러스, 단순 포진 바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스 바이러스 또는 아데노-바이러스 관련 바이러스 방법을 포함한다.

종양 인식 모이어티에 대한 유전자 코드를 함유하는 폴리뉴클레오타이드는 조작된 γδ T-세포 또는 종양 세포에 특이적인 항원, 예컨대 고환-특이적 암 항원의 성장, 증대, 활성화 상태에 영향을 미치는 돌연변이 또는 다른 전이유전자를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 γδ T-세포는 TCR-CD3 복합체에서의 분자 또는 동시자극 인자와 같은 항원 인식 모이어티에 연결된 활성화 도메인을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하도록 조작될 수 있다. 조작된 γδ T-세포는 T-림프구 활성화 도메인인 세포내 신호전달 도메인을 발현할 수 있다. γδ T-세포는 세포내 활성화 도메인 유전자 또는 세포내 신호전달 도메인을 발현하도록 조작될 수 있다. 세포내 신호전달 도메인 유전자는 예를 들어 CD3ζ, CD28, CD2, ICOS, JAML, CD27, CD30, OX40, NKG2D, CD4, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, FcεRIγ, IL-2RB/CD 122, IL- 2RG/CD132, DAP 분자, CD70, 사이토카인 수용체, CD40, 또는 임의의 이들의 조합일 수 있다. 일부 경우에, 조작된 γδ T-세포는 사이토카인, 항원, 세포 수용체, 또는 다른 면역조절 분자를 발현하도록 또한 조작된다.

조작된 γδ T-세포에 의해 발현되는 적절한 종양 인식 모이어티는 치료될 질병에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 종양 인식 모이어티는 TCR이다. 일부 경우에, 종양 인식 모이어티는 암 세포에서 발현된 리간드에 대한 수용체이다. 적합한 수용체의 비제한적인 예는 NKG2D, NKG2A, NKG2C, NKG2F, LLT1, AICL, CD26, NKRP1, CD244(2B4), DNAM-1, NKp30, NKp44, NKp46 및 NKp80을 포함한다. 일부 경우에, 종양 인식 모이어티는 리간드, 예를 들어 IL-13 리간드, 또는 종양 항원에 대한 리간드 모방체, 예컨대 IL13R에 대한 IL-13 모방체를 포함할 수 있다.

γδ T-세포는 NKG2D, NKG2A, NKG2C, NKG2F, LLT1, AICL, CD26, NKRP1, CD244(2B4), DNAM-1로부터 유래된 리간드 결합 도메인, 또는 항종양 항체, 예컨대 항-Her2neu 또는 항-EGFR, 및 CD3-ζ, Dap 10, Dap 12, CD28, 41BB 및 CD40L로부터 얻은 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 종양 인식 모이어티를 발현하도록 조작될 수 있다. 일부 예에서, 키메라 수용체는 MICA, MICB, Her2neu, EGFR, EGFRvIII, 메소텔린, CD38, CD20, CD19, BCMA, PSA, RON, CD30, CD22, CD37, CD38, CD56, CD33, CD138, CD123, CD79b, CD70, CD75, CA6, GD2, 알파태아단백질(AFP: alphafetoprotein), CS1, 암배아 항원(CEA: carcinoembryonic antigen), CEACAM5, CA-125, MUC-16, 5T4, NaPi2b, ROR1, ROR2, PLIF, Her2/Neu, EGFRvIII, GPMNB, LIV-1, 당지질F77, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP: fibroblast activation protein), PSMA, STEAP-1, STEAP-2, c-Met, CSPG4, CD44v6, PVRL-4, VEGFR2, C4.4a, PSCA, 엽산 결합 단백질/수용체, SLC44A4, Cripto, CTAG1B, AXL, IL-13Rα2, IL-3R, EPHA3, SLTRK6, gp100, MART1, 티로시나아제, SSX2, SSX4, NYESO-1, 상피 종양 항원(ETA: epithelial tumor antigen), MAGEA 패밀리 유전자(예컨대, MAGEA3. MAGEA4), KKLC1, 돌연변이된 ras(H, N, K), BRaf, p53, β카테닌, EGFRT790, MHC 클래스 I 사슬-관련된 분자 A(MICA: MHC class I chain-related molecule A), 또는 MHC 클래스 I 사슬-관련된 분자 B(MICB: MHC class I chain-related molecule B), 또는 HPV, CMV 또는 EBV의 하나 이상의 항원에 결합한다.

일부 경우에, 종양 인식 모이어티는 종양-연관된 펩타이드와 복합체로 MHC 클래스 I 분자(HLA-A, HLA-B 또는 HLA-C)를 표적화한다. MHC 클래스 I 분자와 복합체로 종양-연관된 펩타이드를 표적화하는 종양 인식 모이어티를 생성하고 사용하기 위한 방법 및 조성물은 Weidanz et al., Int. Rev. Immunol. 30:328-40, 2011; Scheinberg et al, Oncotarget. 4(5):647-8, 2013; Cheever et al, Clin. Cancer Res. 15(17):5323-37, 2009; Dohan & Reiter Expert Rev Mol Med. 14:e6, 2012; Dao et al., Sci Transl Med. 2013 Mar 13;5(176):176ra33; U.S. 9,540,448; 및 WO 2017/011804에 기재된 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 MHC 복합체의 표적화된 종양-연관된 펩타이드는 윌름스 종양 단백질 1(WT1: Wilms' tumor protein 1)의 펩타이드, 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT: human telomerase reverse transcriptase), 서비빈, 마우스 이중 미세 2 동족체(MDM2: mouse double minute 2 homolog), 사이토크롬 P450(CYP1B), KRAS 또는 BRAF이다.

2개 이상의 종양 인식 모이어티는 조작된 γδ T-세포로부터 안정하게 발현된 유전적으로 상이한, 실질적으로 상이한, 또는 실질적으로 동일한, αβ TCR 폴리뉴클레오타이드로부터 또는 조작된 γδ T-세포에서 안정하게 도입된 유전적으로 구별되는 αβ TCR 폴리뉴클레오타이드로부터 γδ T-세포에서 발현될 수 있다. 유전적으로 구별되는 αβ TCR(들)의 경우에, 동일한 조건과 연관된 상이한 항원을 인식하는 αβ TCR(들)이 사용될 수 있다. 하나의 바람직한 실시형태에서, γδ T-세포는 상이한 MHC 단상형의 맥락에서 동일한 항원을 인식하는 하나 이상의 발현 카세트로부터 인간 또는 마우스 기원으로부터 상이한 TCR을 발현하도록 조작된다. 다른 바람직한 실시형태에서, γδ T-세포는 상이한 MHC 단상형과 복합체화된 주어진 항원으로부터 동일한 또는 상이한 펩타이드에 지향된 1개의 TCR 및 2개 이상의 항체를 발현하도록 조작된다. 일부 경우에, 조작된 γδ T-세포에 의한 단일 TCR의 발현은 적절한 TCR 쌍 짓기를 용이하게 한다. 상이한 TCR을 발현하는 조작된 γδ T-세포는 보편적 동종이계 조작된 γδ T-세포를 제공할 수 있다. 제2 바람직한 실시형태에서, γδ T-세포는 펩타이드-MHC 복합체에 지향된 하나 이상의 상이한 항체를 발현하도록 조작되는데, 상기 복합체는 동일한 또는 상이한 MHC 단상형과 복합체화된 동일한 또는 상이한 펩타이드에 각각 지향된다. 일부 경우에, 종양 인식 모이어티는 펩타이드-MHC 복합체에 결합하는 항체일 수 있다.

γδ T-세포는 상이한 MHC 단상형의 맥락에서 동일한 항원을 인식하는 하나 이상의 발현 카세트로부터 TCR을 발현하도록 조작될 수 있다. 일부 경우에, 조작된 γδ T-세포는 조작된 세포 내에 TCR 미스페어링의 가능성을 최소화하기 위해 단일 TCR 또는 CAR과 조합된 TCR을 발현하도록 설계된다. 2개 이상의 발현 카세트로부터 발현된 종양 인식 모이어티는 바람직하게는 상이한 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖고, 예를 들어 상이한 HLA 단상형의 맥락에서 동일한 표적의 상이한 에피토프를 인식하는 종양 인식 모이어티를 암호화한다. 이러한 상이한 TCR 또는 CAR을 발현하는 조작된 γδ T-세포는 보편적 동종이계 조작된 γδ T-세포를 제공할 수 있다.

일부 경우에, γδ T-세포는 하나 이상의 종양 인식 모이어티를 발현하도록 조작된다. 2개 이상의 종양 인식 모이어티는 γδ T-세포에서 조작된 유전적으로 동일한, 또는 실질적으로 동일한, 항원-특이적 키메라(CAR) 폴리뉴클레오타이드로부터 발현될 수 있다. 2개 이상의 종양 인식 모이어티는 γδ T-세포에서 조작된 유전적으로 구별되는 CAR 폴리뉴클레오타이드로부터 발현될 수 있다. 유전적으로 구별되는 CAR(들)은 동일한 조건과 연관된 상이한 항원을 인식하도록 설계될 수 있다.

γδ T-세포는 대안적으로 이중특이적일 수 있다. 이중특이적 조작된 γδ T-세포는 2개 이상의 종양 인식 모이어티를 발현할 수 있다. 이중특이적 조작된 γδ T-세포는 TCR 및 CAR 종양 인식 모이어티 둘 다를 발현할 수 있다. 이중특이적 조작된 γδ T-세포는 동일한 조건과 연관된 상이한 항원을 인식하도록 설계될 수 있다. 조작된 γδ T-세포는 동일한 또는 실질적으로 동일한 항원을 인식하는 2개 이상의 CAR/TCR(들) 이중특이적 폴리뉴클레오타이드를 발현할 수 있다. 조작된 γδ T-세포는 구별되는 항원을 인식하는 2개 이상의 CAR/TCR(들) 이중특이적 작제물을 발현할 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 이중특이적 작제물은 표적 세포의 활성화 도메인 및 불활성화 도메인에 결합하여 증가된 표적 특이성을 제공한다. γδ T-세포는 적어도 1개의 종양 인식 모이어티, 적어도 2개의 종양 인식 모이어티, 적어도 3개의 종양 인식 모이어티, 적어도 4개의 종양 인식 모이어티, 적어도 5개의 종양 인식 모이어티, 적어도 6개의 종양 인식 모이어티, 적어도 7개의 종양 인식 모이어티, 적어도 8개의 종양 인식 모이어티, 적어도 9개의 종양 인식 모이어티, 적어도 10개의 종양 인식 모이어티, 적어도 11개의 종양 인식 모이어티, 적어도 12개의 종양 인식 모이어티 또는 다른 적합한 수의 종양 인식 모이어티를 발현하도록 조작될 수 있다.

적절한 TCR 기능은 ITAM 모티프를 포함하는 2개의 작용화 ζ(제타) 단백질에 의해 향상될 수 있다. 적절한 TCR 기능은 또한 αβ 또는 γδ 활성화 도메인, 예컨대 CD3ζ, CD28, CD2, CTLA4, ICOS, JAML, PD-1, CD27, CD30, 41-BB, OX40, NKG2D, HVEM, CD46, CD4, FcεRIγ, IL-2RB/CD122, IL-2RG/CD132, DAP 분자 및 CD70의 발현에 의해 향상될 수 있다. 발현된 폴리뉴클레오타이드는 종양 인식 모이어티, 링커 모이어티 및 활성화 도메인에 대한 유전자 코드를 포함할 수 있다. 조작된 γδ T-세포에 의한 폴리뉴클레오타이드의 번역은 단백질 링커에 의해 연결된 종양 인식 모이어티 및 활성화 도메인을 제공할 수 있다. 대개는, 링커가 종양 인식 모이어티 및 활성화 도메인의 폴딩을 방해하지 않는 아미노산을 포함한다. 링커 분자는 적어도 약 5개의 아미노산, 약 6개의 아미노산, 약 7개의 아미노산, 약 8개의 아미노산, 약 9개의 아미노산, 약 10개의 아미노산, 약 11개의 아미노산, 약 12개의 아미노산, 약 13개의 아미노산, 약 14개의 아미노산, 약 15개의 아미노산, 약 16개의 아미노산, 약 17개의 아미노산, 약 18개의 아미노산, 약 19개의 아미노산 또는 약 20개의 아미노산 길이일 수 있다. 일부 경우에, 링커에서의 적어도 50%, 적어도 70% 또는 적어도 90%의 아미노산은 세린 또는 글리신이다.

일부 경우에, 활성화 도메인은 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 적합한 돌연변이는 예를 들어 활성화 도메인이 구성적으로 활성이 되게 하는 돌연변이일 수 있다. 하나 이상의 핵산의 동일성의 변경은 번역된 아미노산의 아미노산 서열을 변화시킨다. 핵산 돌연변이는 암호화된 아미노산이 극성, 비극성, 염기성 또는 산성 아미노산으로 변형되도록 만들어질 수 있다. 핵산 돌연변이는 종양 인식 모이어티가 종양으로부터 에피토프를 인식하도록 최적화되게 이루어질 수 있다. 조작된 종양 인식 모이어티, 조작된 활성화 도메인 또는 γδ T-세포의 다른 조작된 성분은 1개 초과의 아미노산 돌연변이, 2개의 아미노산 돌연변이, 3개의 아미노산 돌연변이, 4개의 아미노산 돌연변이, 5개의 아미노산 돌연변이, 6개의 아미노산 돌연변이, 7개의 아미노산 돌연변이, 8개의 아미노산 돌연변이, 9개의 아미노산 돌연변이, 10개의 아미노산 돌연변이, 11개의 아미노산 돌연변이, 12개의 아미노산 돌연변이, 13개의 아미노산 돌연변이, 14개의 아미노산 돌연변이, 15개의 아미노산 돌연변이, 16개의 아미노산 돌연변이, 17개의 아미노산 돌연변이, 18개의 아미노산 돌연변이, 19개의 아미노산 돌연변이, 20개의 아미노산 돌연변이, 21개의 아미노산 돌연변이, 22개의 아미노산 돌연변이, 23개의 아미노산 돌연변이, 24개의 아미노산 돌연변이, 25개의 아미노산 돌연변이, 26개의 아미노산 돌연변이, 27개의 아미노산 돌연변이, 28개의 아미노산 돌연변이, 29개의 아미노산 돌연변이, 30개의 아미노산 돌연변이, 31개의 아미노산 돌연변이, 32개의 아미노산 돌연변이, 33개의 아미노산 돌연변이, 34개의 아미노산 돌연변이, 35개의 아미노산 돌연변이, 36개의 아미노산 돌연변이, 37개의 아미노산 돌연변이, 38개의 아미노산 돌연변이, 39개의 아미노산 돌연변이, 40개의 아미노산 돌연변이, 41개의 아미노산 돌연변이, 42개의 아미노산 돌연변이, 43개의 아미노산 돌연변이, 44개의 아미노산 돌연변이, 45개의 아미노산 돌연변이, 46개의 아미노산 돌연변이, 47개의 아미노산 돌연변이, 48개의 아미노산 돌연변이, 49개의 아미노산 돌연변이 또는 50개의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.

일부 경우에, 본 개시내용의 γδ T-세포는 하나 이상의 MHC 분자를 발현하지 않는다. 조작된 γδ T-세포에서의 하나 이상의 MHC 유전좌위의 결실은 조작된 γδ T-세포가 숙주 면역계에 의해 인식될 가능성을 감소시킬 수 있다. 인간 백혈구 항원(HLA: human leukocyte antigen) 시스템으로 공지된 인간 주요 조직적합성 복합체(MHC: Major Histocompatibility Complex) 유전좌위는 γδ T-세포를 포함하는 항원 제시 세포에서 발현된 큰 유전자 패밀리를 포함한다. HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 분자는 항원 제시 세포에 대한 항원으로서 세포내 펩타이드를 제시하도록 작용한다. HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ 및 HLA-DR 분자는 항원 제시 세포에 대한 항원으로서 세포외 펩타이드를 제시하도록 작용한다. HLA 유전자의 일부 대립유전자는 GVHD, 자가면역 장애 및 암과 연관된다. 본원에 기재된 조작된 γδ T-세포는 하나 이상의 HLA 유전자의 유전자 발현을 결여시키거나 파괴하도록 추가로 조작될 수 있다. 본원에 기재된 조작된 γδ T-세포는 MHC 복합체의 하나 이상의 성분의 유전자 발현을 결여시키거나 파괴하도록 추가로 조작될 수 있는데, 예컨대 하나 이상의 MHC 유전자의 완전한 결실, 특정 엑손의 결실 또는 β₂ 마이크로글로불린(B2m)의 결실이다. 적어도 하나의 HLA 유전자의 유전적 절제 또는 유전적 파괴는 숙주-대-이식편 질병을 야기하지 않으면서 임의의 HLA 단상형을 갖는 대상체에게 투여될 수 있는 임상적으로 치료학적인 γδ T-세포를 제공할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 조작된 γδ T-세포는 임의의 HLA 단상형을 갖는 인간 대상체에 대한 보편적 공여자일 수 있다.

γδ T-세포는 하나의 또는 다양한 HLA 유전좌위(유전좌위들)를 결여시키도록 조작될 수 있다. 조작된 γδ T-세포는 HLA-A 대립유전자, HLA-B 대립유전자, HLA-C 대립유전자, HLA-DR 대립유전자, HLA-DQ 대립유전자 또는 HLA-DP 대립유전자를 결여시키도록 조작될 수 있다. 일부 경우에, HLA 대립유전자는 자가면역 질환과 같은 인간 질환과 연관된다. 예를 들어, HLA-B27 대립유전자는 관절염 및 포도막염과 연관되고, HLA-DR2 대립유전자는 전신 홍반 루푸스 및 다발성 경화증과 연관되고, HLA-DR3 대립유전자는 21-하이드록실라제 결핍증과 연관되고, HLA-DR4는 류마티스성 관절염 및 1형 당뇨병과 연관된다. 예를 들어 HLA-B27 대립유전자가 결실된 조작된 γδ T-세포는 대상체의 면역계에 의해 용이하게 인식되지 않으면서 관절염으로 고통받는 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 HLA 유전좌위의 결실은 임의의 HLA 단상형을 갖는 임의의 대상체에 대한 보편적 공여자인 조작된 γδ T-세포를 제공한다.

일부 경우에, γδ T-세포의 조작은 γδ T-세포 게놈의 부분의 결실을 필요로 한다. 일부 경우에, 게놈의 결실된 부분은 MHC 유전좌위(유전좌위들)의 부분을 포함한다. 일부 경우에, 조작된 γδ T-세포는 야생형 인간 γδ T-세포로부터 유래되고, MHC 유전좌위는 HLA 유전좌위이다. 일부 경우에, 게놈의 결실된 부분은 MHC 복합체에서 단백질에 상응하는 유전자의 부분을 포함한다. 일부 경우에, 게놈의 결실된 부분은 β2 마이크로글로불린 유전자를 포함한다. 일부 경우에, 게놈의 결실된 부분은 면역 관문 유전자, 예컨대 PD-1, CTLA-4, LAG3, ICOS, BTLA, KIR, TIM3, A2aR, B7-H3, B7-H4 및 CECAM-1을 포함한다. 일부 경우에, 조작된 γδ T-세포는 T-세포 활성화 및 세포독성을 향상시키는 활성화 도메인을 발현하도록 설계될 수 있다. 조작된 γδ T-세포에 의해 발현될 수 있는 활성화 도메인의 비제한적인 예는 CD2, ICOS, 4-1 BB(CD137), OX40(CD134), CD27, CD70, CD80, CD86, DAP 분자, CD122, GITR, FcεRIγ을 포함한다.

조작된 γδ T-세포의 게놈의 임의의 부분은 내인성 γδ T-세포 유전자의 발현을 파괴시키도록 결실될 수 있다. γδ T-세포의 게놈에서 결실되거나 파괴될 수 있는 게놈 영역의 비제한적인 예는 프로모터, 활성자, 인핸서, 엑손, 인트론, 비암호화 RNA, 마이크로-RNA, 소핵 RNA, 가변수 일렬 반복부(VNTR: variable number tandem repeat), 단편 일렬 반복(STR: short tandem repeat), SNP 패턴, 초가변 영역, 미소부수체, 디뉴클레오타이드 반복부, 트리뉴클레오타이드 반복부, 테트라뉴클레오타이드 반복부 또는 단순 서열 반복부를 포함한다. 일부 경우에, 게놈의 결실된 부분은 1개의 핵산 내지 약 10개의 핵산, 1개의 핵산 내지 약 100개의 핵산, 1개의 핵산 내지 약 1,000개의 핵산, 1개의 핵산 내지 약 10,000개의 핵산, 1개의 핵산 내지 약 100,000개의 핵산, 1개의 핵산 내지 약 1,000,000개의 핵산 또는 다른 적합한 범위의 범위이다.

조작된 γδ T-세포에서의 HLA 유전자 발현은 또한 당해 분야에 공지된 다양한 기법에 의해 파괴될 수 있다. 일부 경우에, 큰 유전좌위 유전자 편집 기술은 조작된 γδ T-세포 게놈로부터의 유전자를 절제하도록, 또는 조작된 γδ T-세포에서 적어도 하나의 HLA 유전좌위의 유전자 발현을 파괴시키도록 사용될 수 있다. 조작된 γδ T-세포의 게놈에서의 원하는 유전좌위를 편집시키도록 사용될 수 있는 유전자 편집 기술의 비제한적인 예는 각각 WO201409370, WO2003087341, WO2014134412 및 WO 2011090804에 의해 기재된 바대로 주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 회문구조 반복서열(CRISPR)-Cas, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN) 및 메가뉴클레아제 기술을 포함하고, 이들의 각각은 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.

γδ T-세포는 종양 인식 모이어티를 이미 발현하는 단리된 비조작된 γδ T-세포로부터 조작될 수 있다. 조작된 γδ T-세포는, 예를 들어 종양 샘플의 종양 침윤 림프구로부터 단리되는, 단리된 야생형 γδ T-세포에 의해 내인성으로 발현된 종양 세포 인식 모이어티를 보유할 수 있다. 일부 경우에, 조작된 γδ T-세포 종양 세포 인식 모이어티는 야생형 γδ TCR을 대신한다.

γδ T-세포는 하나 이상의 귀소 분자, 예컨대 림프구 귀소 분자를 발현하도록 조작될 수 있다. 귀소 분자는 예를 들어 림프구 귀소 수용체 또는 세포 부착 분자일 수 있다. 귀소 분자는 대상체에 대한 조작된 γδ T-세포의 투여 시 조작된 γδ T-세포가 이동하고 표적화된 고형 종양을 포함하는 고형 종양을 침윤시키는 것을 도울 수 있다. 귀소 수용체의 비제한적인 예는 CCR 패밀리의 구성원, 예를 들어 CCR2, CCR4, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CLA, CD44, CD103, CD62L, E-셀렉틴, P-셀렉틴, L-셀렉틴, 인테그린, 예컨대 VLA-4 및 LFA-1을 포함한다. 세포 부착 분자의 비제한적인 예는 ICAM, N-CAM, VCAM, PE-CAM, L1-CAM, 넥틴(PVRL1, PVRL2, PVRL3), LFA-1, 인테그린 알파X베타2, 알파v베타7, 대식세포-1 항원, CLA-4, 당단백질 IIb/IIIa를 포함한다. 세포 부착 분자의 추가 예는 칼슘 의존적 분자, 예컨대 T-카드헤린 및 기질 금속단백분해효소(MMP: matrix metaloproteinase), 예컨대 MMP9 또는 MMP2에 대한 항체를 포함한다.

T-세포 성숙, 활성화, 증대 및 기능에 관여된 단계는 면역 관문 단백질을 통해 동시자극 및 억제 신호를 통해 조절될 수 있다. 면역 관문은 면역계에 고유한 동시자극 및 억제 요소이다. 면역 관문은 면역계가 세포 형질전환 또는 감염과 같은 질병 조건에 반응할 때 자가-관용성을 유지시키는 것 및 조직에 대한 손상을 방지하도록 생리학적 면역 반응의 기간 및 규모를 조절하는 것을 돕는다. γδ 및 αβ T-세포로부터 면역 반응을 조절하기 위해 사용된 동시자극 신호와 억제 신호 사이의 평형은 면역 관문 단백질에 의해 조절될 수 있다. 면역 관문 단백질, 예컨대 PD1 및 CTLA4는 T-세포의 표면에 존재하고, 면역 반응을 "키거나" 또는 "끄도록" 사용될 수 있다. 종양은 특히 종양 항원에 특이적인 T-세포에 대해 면역-저항 기전으로 관문 단백질 기능을 이상조절할 수 있다. 본 개시내용의 조작된 γδ T-세포는 하나 이상의 면역 관문 유전좌위(유전좌위들), 예컨대 PD-1, CTLA-4, LAG3, ICOS, BTLA, KIR, TIM3, A2aR, CEACAM1, B7-H3 및 B7-H4를 결여시키도록 추가로 조작될 수 있다. 대안적으로, 본 개시내용의 조작된 γδ T-세포에서의 내인성 면역 관문 유전자의 발현은 유전자 편집 기술에 의해 파괴될 수 있다.

면역학적 관문은 본 개시내용의 조작된 γδ T-세포에서 억제성 신호전달 경로를 조절하는 분자(CTLA4, PD1 및 LAG3으로 예시됨) 또는 자극 신호전달 경로를 조절하는 분자(ICOS로 예시됨)일 수 있다. 연장된 면역글로불린 슈퍼패밀리에서의 몇몇 단백질은 면역학적 관문에 대한 리간드일 수 있다. 면역 관문 리간드 단백질의 비제한적인 예는 B7-H4, ICOSL, PD-L1, PD-L2, MegaCD40L, MegaOX40L 및 CD137L을 포함한다. 일부 경우에, 면역 관문 리간드 단백질은 종양에 의해 발현된 항원이다. 일부 경우에, 면역 관문 유전자는 CTLA-4 유전자이다. 일부 경우에, 면역 관문 유전자는 PD-1 유전자이다.

PD1은 CD28/CTLA4 패밀리에 속하는 억제 수용체이고, 활성화된 T 림프구, B 세포, 단핵구, DC 및 T-reg에서 발현된다. 자가-반응성 림프구를 억제하고 TAA-특이적 세포독성 T 림프구(CTL: cytotoxic T lymphocyte)의 효과기 기능을 억제하도록 기능하는 T 세포, APC 및 악성 세포에서 발현된 PD1, PD-L1 및 PD-L2에 대한 2개의 공지된 리간드가 있다. 따라서, PD1이 결여된 조작된 γδ T-세포는 종양 세포에 의한 PD-L1 및 PD-L2의 발현과 무관하게 이의 세포독성 활성을 보유할 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 조작된 γδ T-세포는 PD-1 유전자에 대한 유전자 유전좌위가 결여된다. 일부 경우에, 조작된 γδ T-세포에서의 PD-1 유전자의 발현은 유전자 편집 기술에 의해 파괴된다.

CTLA4(세포독성 T-림프구 항원 4)는 CD152(분화 클러스터 152)로도 공지되어 있다. CTLA4는 동시자극 분자 CD28과 서열 상동성 및 리간드(CD80/B7-1 및 CD86/B7-2)를 공유하지만, 수용체로서 CTLA4를 발현하는 T-세포에 억제 신호를 전달함으로써 다르다. CTLA4는 리간드 둘 다에 훨씬 더 높은 전체 친화도를 갖고, 리간드 밀도가 제한일 때 결합에 대해 CD28을 능가할 수 있다. CTLA4는 대개 CD8⁺ 효과기 T-세포의 표면에서 발현되고, 미경험 및 기억 T-세포 둘 다의 초기 활성화 단계에서 기능적 역할을 한다. CTLA4는 T-세포 활성화의 초기 단계 동안 CD80 및 CD86에 대한 증가된 친화도를 통해 CD28의 활성에 대응한다. CTLA4의 주요 기능은 헬퍼 T-세포의 하향조절 및 조절 T-세포 면역억제 활성의 향상을 포함한다. 일부 경우에, 본 개시내용의 조작된 γδ T-세포는 CTLA4 유전자가 결여된다. 일부 경우에, 조작된 γδ T-세포에서의 CTLA4 유전자의 발현은 유전자 편집 기술에 의해 파괴된다.

LAG3(림프구-활성화 유전자 3)은 활성화된 항원-특이적 세포독성 T-세포에서 발현되고, 조절 T-세포의 기능을 향상시킬 수 있고 독립적으로 CD8⁺ 효과기 T-세포 활성을 억제할 수 있다. LAG3은 MHC 클래스 II 단백질에 높은 친화도 결합을 갖는 CD-4-유사 음성 조절 단백질이고, 이는 일부 상피 암에서 상향조절되어, T 세포 증대의 관용성 및 항성성을 발생시킨다. LAG-3-IG 융합 단백질을 사용한 LAG-3/클래스 II 상호작용의 감소는 항종양 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 조작된 γδ T-세포는 LAG3 유전자에 대한 유전자 유전좌위가 결여된다. 일부 경우에, 조작된 γδ T-세포에서의 LAG3 유전자의 발현은 유전자 편집 기술에 의해 파괴된다.

비조작된 및 조작된 γδ T-세포의 표현형

조작된 γδ T-세포는 대상체의 신체에서의 특정한 물리적 위치로 귀소할 수 있다. 조작된 γδ T 세포의 이동 및 귀소는 특정 케모카인 및/또는 세포부착 분자의 조합된 발현 및 작용에 의존적일 수 있다. 조작된 γδ T 세포의 귀소는 케모카인과 이의 수용체 사이의 상호작용에 의해 제어될 수 있다. 예를 들어, 비제한적인 예로서 CXCR3(이의 리간드는 IP-10/CXCL10 및 6Ckine/SLC/CCL21에 의해 표시됨) CCR4+ CXCR5+(RANTES, MIP-1α, MIP-1β에 대한 수용체), CCR6+ 및 CCR7을 포함하는 사이토카인은 조작된 γδ T 세포의 귀소에 영향을 미친다. 일부 경우에, 조작된 γδ T-세포는 보수 기능을 수행하도록 염증 및 손상의 부위 및 이환된 세포로 귀소할 수 있다. 일부 경우에, 조작된 γδ T-세포는 암으로 귀소할 수 있다. 일부 경우에, 조작된 γδ T-세포는 흉선, 골수, 피부, 후두, 기관, 흉막, 폐, 식도, 복부, 위, 소장, 대장, 간, 췌장, 신장, 요도, 방광, 고환, 전립선, 정관, 난소, 자궁, 유선, 부갑상선, 비장 또는 대상체의 신체의 다른 부위로 귀소할 수 있다. 조작된 γδ T-세포는 하나 이상의 귀소 모이어티, 예컨대 특정 TCR 대립유전자 및/또는 림프구 귀소 분자를 발현할 수 있다.

조작된 γδ T-세포는 특정 표현형을 가질 수 있고, 표현형은 세포-표면 마커 발현의 면에서 기재될 수 있다. 다양한 유형의 γδ T-세포는 본원에 기재된 바와 같이 조작될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 조작된 γδ T-세포는 인간으로부터 유래되지만, 조작된 γδ T-세포는 또한 상이한 소스, 예컨대 포유류 또는 합성 세포로부터 유래될 수 있다.

증식된 세포 집단의 면역표현형은 비제한적인 예로서 CD27, CD45RA, CD45RO, CCR7 및 CD62L을 포함하는 마커를 사용하여 결정될 수 있다(Klebanoff et al., Immunol Rev.211: 214 2006). CD45RA는 항원 조우 시 CD45RO에 의해 대체된 미경험 T 림프구에서 발현되지만 후기 효과기 세포에서 재발현되고(Michie et al., Nature 360, 264 - 265 (1992)); CD62L은 2차 림프구 조직에 들어가는 귀소 분자로 작용하고 T-세포가 효과기 기능을 획득할 때 T-세포 활성화 후 소실되는 세포 부착 분자이고(Sallusto et al., Nature. 401:708 (1999)); CD27은 T-세포 분화 동안 소실되는 동시자극 마커이다(Appay et al., Nat Med.8:379 (2002); Klebanoff et al., Immunol Rev.211: 214 2006).

항원

본원에 개시된 발명은 항원 인식 모이어티를 발현하는 조작된 γδ T-세포를 제공하고, 여기서 항원 인식 모이어티는 질병-특이적 에피토프를 인식한다. 항원은 면역 반응을 유발하는 분자일 수 있다. 이 면역 반응은 항체 생산, 특정 면역학적-적격 세포의 활성화, 또는 둘 다를 수반할 수 있다. 항원은 예를 들어 펩타이드, 단백질, 합텐, 지질, 탄수화물, 박테리아, 병원균 또는 바이러스일 수 있다. 항원은 종양 항원일 수 있다. 종양 에피토프는 종양 세포의 표면에서 MHC I 또는 MHC II 복합체에 의해 제시될 수 있다. 에피토프는 세포 표면에서 발현되고 종양 인식 모이어티에 의해 인식된 항원의 부분일 수 있다.

조작된 γδ T-세포에 의해 인식된 항원의 비제한적인 예는 CD19, CD20, CD30, CD22, CD37, CD38, CD56, CD33, CD138, CD123, CD79b, CD70, CD75, CA6, GD2, 알파태아단백질(AFP), 암배아 항원(CEA), RON, CEACAM5, CA-125, MUC-16, 5T4, NaPi2b, ROR1, ROR2, PLIF, Her2/Neu, EGFRvIII, GPMNB, LIV-1, 당지질F77, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), PSMA, STEAP-1, STEAP-2, 메소텔린, c-Met, CSPG4, PVRL-4, VEGFR2, PSCA, CLEC12a, L1CAM, GPC2, GPC3, 엽산 결합 단백질/수용체, SLC44A4, Cripto, CTAG1B, AXL, IL-13R, IL-3Rα2, SLTRK6, gp100, MART1, 티로시나아제, SSX2, SSX4, NYESO-1, WT-1, PRAME, 상피 종양 항원(ETA), MAGEA 패밀리 유전자(예컨대, MAGEA3. MAGEA4), KKLC1, 돌연변이된 ras,

, p53, MHC 클래스 I 사슬-관련된 분자 A(MICA), 또는 MHC 클래스 I 사슬-관련된 분자 B(MICB), 또는 HPV, CMV 또는 EBV의 하나 이상의 항원을 포함한다.

항원은 세포의 세포내 구획 또는 세포외 구획에서 발현될 수 있고, 조작된 γδ T-세포는 세포내 종양 항원 또는 세포외 종양 항원을 인식할 수 있다. 일부 경우에, 조작된 γδ T-세포에서의 αβ TCR은 세포내 종양 항원 또는 세포외 종양 항원으로부터 유래된 펩타이드를 인식한다. 예를 들어, 항원은 바이러스에 의해 감염된 세포에 의해 세포내 또는 세포외 생산된 단백질, 예컨대 HIV, EBV, CMV 또는 HPV 단백질일 수 있다. 항원은 또한 암성 세포에 의해 세포내 또는 세포외 발현된 단백질일 수 있다.

항원 인식 모이어티는 암성 세포 또는 바이러스에 의해 감염된 세포와 같은 곤경에 있는 세포로부터의 항원을 인식할 수 있다. 예를 들어, 인간 MHC 클래스 I 사슬-관련된 유전자(MICA 및 MICB)는 염색체 6의 HLA 클래스 I 영역 내에 위치한다. MICA 및 MICB 단백질은 인간 상피조직에서 "스트레스"의 마커인 것으로 생각되고, 공통 천연 살해-세포 수용체(NKG2D)를 발현하는 세포에 대한 리간드로서 작용한다. 스트레스 마커로서, MICA 및 MICB는 암성 세포로부터 고도로 발현될 수 있다. 조작된 γδ T-세포는 MICA 또는 MICB 종양 에피토프를 인식할 수 있다.

종양 인식 모이어티는 소정의 결합활성으로 항원을 인식하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, TCR 또는 CAR 작제물에 의해 암호화된 종양 인식 모이어티는 적어도 적어도 10 fM, 적어도 100 fM, 적어도 1 피코몰(pM), 적어도 10 pM, 적어도 20 pM, 적어도 30 pM, 적어도 40 pM, 적어도 50 pM, 적어도 60 pM, 적어도 7 pM, 적어도 80 pM, 적어도 90 pM, 적어도 100 pM, 적어도 200 pM, 적어도 300 pM, 적어도 400 pM, 적어도 500 pM, 적어도 600 pM, 적어도 700 pM, 적어도 800 pM, 적어도 900 pM, 적어도 1 나노몰(nM), 적어도 2 nM, 적어도 3 nM, 적어도 4 nM, 적어도 5 nM, 적어도 6 nM, 적어도 7 nM, 적어도 8 nM, 적어도 9 nM, 적어도 10 nM, 적어도 20 nM, 적어도 30 nM, 적어도 40 nM, 적어도 50 nm, 적어도 60 nM, 적어도 70 nM, 적어도 80 nM, 적어도 90 nM, 적어도 100 nM, 적어도 200 nM, 적어도 300 nM, 적어도 400 nM, 적어도 500 nM, 적어도 600 nM, 적어도 700 nM, 적어도 800 nM, 적어도 900 nM, 적어도 1 μM, 적어도 2 μM, 적어도 3 μM, 적어도 4 μM, 적어도 5 μM, 적어도 6 μM, 적어도 7 μM, 적어도 8 μM, 적어도 9 μM, 적어도 10 μM, 적어도 20 μM, 적어도 30 μM, 적어도 40 μM, 적어도 50 μM, 적어도 60 μM, 적어도 70 μM, 적어도 80 μM, 적어도 90 μM, 또는 적어도 100 μM의 해리 상수로 항원을 인식할 수 있다.

일부 경우에, 종양 인식 모이어티는 기껏해야 10 fM, 기껏해야 100 fM, 기껏해야 1 피코몰(pM), 기껏해야 10 pM, 기껏해야 20 pM, 기껏해야 30 pM, 기껏해야 40 pM, 기껏해야 50 pM, 기껏해야 60 pM, 기껏해야 7 pM, 기껏해야 80 pM, 기껏해야 90 pM, 기껏해야 100 pM, 기껏해야 200 pM, 기껏해야 300 pM, 기껏해야 400 pM, 기껏해야 500 pM, 기껏해야 600 pM, 기껏해야 700 pM, 기껏해야 800 pM, 기껏해야 900 pM, 기껏해야 1 나노몰(nM), 기껏해야 2 nM, 기껏해야 3 nM, 기껏해야 4 nM, 기껏해야 5 nM, 기껏해야 6 nM, 기껏해야 7 nM, 기껏해야 8 nM, 기껏해야 9 nM, 기껏해야 10 nM, 기껏해야 20 nM, 기껏해야 30 nM, 기껏해야 40 nM, 기껏해야 50 nm, 기껏해야 60 nM, 기껏해야 70 nM, 기껏해야 80 nM, 기껏해야 90 nM, 기껏해야 100 nM, 기껏해야 200 nM, 기껏해야 300 nM, 기껏해야 400 nM, 기껏해야 500 nM, 기껏해야 600 nM, 기껏해야 700 nM, 기껏해야 800 nM, 기껏해야 900 nM, 기껏해야 1 μM, 기껏해야 2 μM, 기껏해야 3 μM, 기껏해야 4 μM, 기껏해야 5 μM, 기껏해야 6 μM, 기껏해야 7 μM, 기껏해야 8 μM, 기껏해야 9 μM, 기껏해야 10 μM, 기껏해야 20 μM, 기껏해야 30 μM, 기껏해야 40 μM, 기껏해야 50 μM, 기껏해야 60 μM, 기껏해야 70 μM, 기껏해야 80 μM, 기껏해야 90 μM, 또는 기껏해야 100 μM의 해리 상수로 항원을 인식하도록 조작될 수 있다.

신규의 활성화 제제

본 발명의 발명자들은 특정 γδ TCR 아형에 결합하고 이로써 특정 γδ T 세포 집단을 활성화하고 증식시키는 활성화 제제를 확인하였다. 일 양태에서, 본 발명은 본원에서 실시예 1 및 2, 및 도 1에 확인되고 기재된 신규의 활성화 에피토프에 결합하는 신규의 활성화 제제를 제공한다. 활성화 제제는 MAb δ3-08, δ3-20, δ3-23, δ3-31, δ3-42, δ3-47 및 δ3-58을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 특정 실시형태에서, 활성화 제제(예를 들어, 항체)는 하나 이상의 γδT-세포 집단(예를 들어, δ3 T 세포)을 증식시키고/시키거나 활성화한다.

이 활성화 제제는 동일한 에피토프에 결합하거나, δ3-08, δ3-20, δ3-23, δ3-31, δ3-42, δ3-47 및 δ3-58로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 MAb와 경쟁하는 활성화 제제를 추가로 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

이 활성화 제제는 δ3-08, δ3-20, δ3-23, δ3-31, δ3-42, δ3-47 및 δ3-58로 이루어진 군으로부터 선택된 MAb의 상보성 결정 영역(CDR) 및/또는 가변 영역을 함유하는 활성화 제제를 추가로 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

본 발명은 또한 (i) δ3-08, δ3-20, δ3-23, δ3-31, δ3-42, δ3-47 및 δ3-58로 이루어진 군으로부터 선택된 MAb의 상보성 결정 영역(CDR) 및/또는 가변 영역을 함유하거나; (ii) 이것과 동일한 에피토프에 결합하거나 이것과 경쟁하거나; 또는 (iii) 이 MAb인 활성화 제제를 암호화하는 핵산을 제공한다. 일부 경우에, 핵산은 숙주 세포(예를 들어, 이종성 숙주 세포)에 있다. 일부 경우에, 핵산은 이종성 프로모터에 작동 가능하게 연결되거나, 이종성 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결된다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "이종성"은 자연에서 함께 천연으로 존재하지 않는 2개의 성분을 지칭한다.

본 발명은 또한 하나 이상의 상기 활성화 제제를 생산하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 활성화 제제를 암호화하는 핵산을 함유하는 숙주 세포는 하나 이상의 상기 활성화 제제를 생산하도록 배양될 수 있다.

APC

조작된 또는 비조작된 γδ T-세포, 예컨대 하나 이상의 γδ T-세포 하위집단의 증식을 위한 APC가 본원에 또한 기재된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 상기 활성화 제제를 암호화하는 이종성 핵산을 함유하는 APC가 본원에 기재된다. 일부 실시형태에서, 세포 표면에서 하나 이상의 상기 활성화 제제를 발현하는 APC가 본원에 기재된다. 일부 실시형태에서, 세포 표면에서 하나 이상의 Fc 수용체를 발현하는 APC가 본원에 기재되고, 여기서 Fc 수용체(들)는 하나 이상의 상기 활성화 제제와 접촉하고/하거나 이것에 결합된다.

일부 경우에, APC(예를 들어, 세포 표면에서 발현되거나 세포 표면에서 발현된 Fc 수용체에 결합된 하나 이상의 상기 활성화 제제를 갖는 APC)는 HLA 클래스 I, HLA 클래스 I, 불변 사슬, 및/또는 HLA-DM을 발현하지 않거나 이의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 경우에, APC는 세포부착 분자, 예컨대 세포간 세포부착 분자-1, CD11a, CD18, CD54, 및/또는 백혈구 기능-연관된 항원-3을 발현한다. 일부 경우에, APC는 Fc 수용체, 예컨대 본원에 기재된 γδ T-세포 증식 방법에서 사용된 활성화 제제의 아이소타입에 특이적인 Fc 수용체를 발현한다. 일부 경우에, APC는 CD64, CD32A, CD32B, CD32C, CD16A, CD16B, FcRn, TRIM21 또는 CD307로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 Fc 수용체, 또는 더 높은 친화도 또는 변경된 특이성을 갖는 이의 조작된 변이체를 발현한다.

하나 이상의 상기 APC를 포함하는 배양물이 본원에 또한 기재되어 있다. 배양물은 증식된 또는 비증식된, 조작된 또는 비조작된, γδ T-세포를 추가로 함유할 수 있다. 배양물은 본원에 기재된 γδ T-세포 활성화 제제들 중 어느 하나를 포함하는 선택적 또는 비선택적 γδ T-세포 활성화 제제를 추가로 또는 대안적으로 함유할 수 있다. 일부 경우에, 배양물은 IL-21을 함유하지 않는다. 일부 경우에, 배양물은 IL-4, IL-2 또는 IL-15, 또는 이들의 조합을 함유하지 않는다. 일부 경우에, 배양물은 γδ T 세포의 하위집단을 선택적으로 증식시키는 사이토카인을 함유하지 않는다.

에피토프 확인

본 발명의 발명자들은 γδ TCR 활성화 MAb δ3-08, δ3-20, δ3-23, δ3-31, δ3-42, δ3-47 및 δ3-58의 에피토프 내에 결합 영역을 확인하였다. 예시적인 에피토프는 γδ TCR 활성화 MAb δ3-08, δ3-20, δ3-23, δ3-31, δ3-42, δ3-47 및 δ3-58의 에피토프를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 에피토프는 하나 이상의 γδ TCR 활성화 MAb δ3-08, δ3-20, δ3-23, δ3-31, δ3-42, δ3-47 및 δ3-58에 의해 특이적으로 결합된 에피토프이다.

일 양태에서, 본 개시내용은 빠른 성장 속도에서 조작된 및 비조작된 γδ T-세포의 증식을 자극하는 제제의 에피토프를 확인하는 방법을 제공한다. 에피토프는 고유한 공간 입체형태에서 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개의 아미노산을 포함할 수 있다. 에피토프는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치된 인접 아미노산 또는 비인접 아미노산 둘 다로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 통상적으로 변성 용매에 대한 노출에서 보유될 수 있는 한편, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 변성 용매에 의한 처리에서 통상적으로 소실될 수 있다.

에피토프 맵핑은 선형 또는 비선형, 불연속 아미노산 서열(들), 즉 δ3-08, δ3-20, δ3-23, δ3-31, δ3-42, δ3-47 및 δ3-58, 항체와 같은 관심 대상의 활성화 제제에 의해 (예를 들어, 특이적으로) 인식된 에피토프를 확인하도록 수행될 수 있다. 에피토프 맵핑을 위한 일반적인 접근법은 일반적으로 이종성 발현 시스템에서 관심 대상의 항체 또는 리간드에 의해 인식된 전장 폴리펩타이드 서열, 및 다양한 단편, 즉 절두된 형태의 폴리펩타이드 서열의 발현을 필요로 할 수 있다. 이후, 이 다양한 재조합 폴리펩타이드 서열 또는 이의 단편(예를 들어, N-말단 단백질과 융합됨(예를 들어, GFP))은 관심 대상의 항체 또는 리간드가 하나 이상의 절두된 형태의 폴리펩타이드 서열에 결합할 수 있는지를 결정하기 위해 사용될 수 있다.

일부 실시형태에서, 재조합 폴리펩타이드 서열은 2개 이상의 상동성 모 폴리펩타이드의 연결된 단편을 함유하는 키메라이고, 여기서 적어도 하나의 모 폴리펩타이드는 관심 대상의 활성화 제제에 결합하고, 적어도 하나의 모 폴리펩타이드는 관심 대상의 활성화 제제에 결합하지 않는다. 예를 들어, 인간 δ3 사슬 유전자의 분절은 상동성 돌고래(또는 다른 비인간 동물) δ 사슬 유전자의 분절과 연결되고, 재조합 발현 시스템에서 키메라 TCR을 생성하는 능력에 대해 시험될 수 있다. 인간 δ3 사슬 유전자의 다른 분절은 상이한 δ 사슬 아형의 분절과 연결될 수 있다. 이후, 예를 들어, 세포 표면에서 pan-γδ-TCR 항체에 의한 검출에 의해 표시된 바와 같이 TCR을 형성하는 키메라 TCR 유전자는 관심 대상의 활성화 제제에 대한 결합에 대해 시험될 수 있다.

중첩하는 아미노산 영역을 갖는 재조합 폴리펩타이드 서열의 반복하는 절두 및 생성의 사용을 통해, 관심 대상의 항체에 의해 인식된 폴리펩타이드 서열의 영역을 확인할 수 있다(예를 들어 Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996) 참조). 그 방법은 에피토프 라이브러리, 예컨대 막 지지체에서 합성 펩타이드 어레이로부터 유래된 에피토프 라이브러리, 조합 파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리로부터 재생성된 서열에 결합하는 관심 대상의 항체와 같은 제제의 능력에 의존한다. 이후, 에피토프 라이브러리는 항체에 대해 스크리닝되는 가능성의 범위를 제공한다. 추가로, 에피토프의 하나 이상의 잔기를 표적화하는, 부위 특이적 돌연변이유발 또는 랜덤 Ala 스캔은 에피토프의 동일성을 확인하도록 추구될 수 있다.

에피토프의 라이브러리는 cDNA 작제물로서 γδ T-세포 수용체(γδ TCR)의 다양한 가능한 재조합을 합성으로 설계하고 이를 적합한 시스템에서 발현시킴으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, Jδ1, Jδ2 및 Jδ3 유전자 분절을 포함하는, Jδ 영역이 다른 복수의 Vδ3 유전자 분절이 합성으로 설계될 수 있다. 이러한 Vδ3J 분절들은 예를 들어 합성 유전자로서 순서화되고 적합한 벡터에 클로닝될 수 있다. Vδ3J1, Vδ3J2, Vδ3J3, 또는 Vδ3J4 사슬과 같은 복수의 합성으로 클로닝된 δ3 TCR 사슬은 Vγ2, Vγ3, Vγ4,Vγ5,Vγ8, Vγ9 및 Vγ10 합성으로 설계된 유전자 분절과 같은 합성으로 클로닝된 γ TCR 사슬과 숙주 시스템에 동시형질주입될 수 있다. 다른 경우에, δ TCR 사슬은 인간 정상 및 악성 조직으로부터 단리된 인간 PBMC 또는 γδ T-세포로부터 추출된 전체 RNA에서 증폭될 수 있다.

숙주 시스템은 임의의 적합한 발현 시스템, 예컨대 293 세포, 곤충 세포, 또는 적합한 시험관내 번역 시스템일 수 있다. 숙주 시스템으로 형질주입된 합성으로 설계된 γδ T-세포 분절의 복수의 다양한 가능한 조합은 예를 들어, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개 또는 90개 초과의 γδ TCR의 가능한 쌍짓기 조합을 제공할 수 있다. 이전에 기재된 라이브러리에서의 에피토프의 하나에 대한 제제의 결합은 표지된 항체, 예컨대 δ3-08, δ3-20, δ3-23, δ3-31, δ3-42, δ3-47 및 δ3-58을 라이브러리의 에피토프와 접촉시키고, 표지로부터의 신호를 검출하여 검출될 수 있다. 대안적으로, 제제의 결합은 표지된 2차 항체, 예컨대 항-마우스 항체를 사용하여 검출될 수 있다.

에피토프 맵핑을 위해, 입체형태 불연속 에피토프를 맵핑하는 것으로 나타난 컴퓨터 알고리즘이 또한 개발되었다. 입체형태 에피토프는 예를 들어 x선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명을 포함하는 방법에 의해 아미노산의 공간 입체형태를 결정하여 확인될 수 있다. 항원:항체 복합체의 결정의 x선 분석과 같은 일부 에피토프 맵핑 방법은 에피토프의 원자 해상을 제공할 수 있다. 다른 경우에, 에피토프 맵핑을 위한 컴퓨터 조합 방법은 δ3-08, δ3-20, δ3-23, δ3-31, δ3-42, δ3-47 또는 δ3-58 항체와 같은 항체의 서열에 기초한 가능한 에피토프를 모델링하도록 사용될 수 있다. 이러한 경우에, 항체의 항원 결합 부분은 서열분석되고, 계산 모델은 항체의 가능한 결합 부위를 재구성하고 예측하도록 사용된다.

일부 경우에, 본 개시내용은 (a) γδ T-세포 수용체로부터 에피토프의 라이브러리를 제조하는 단계; (b) 에피토프의 라이브러리를 항체와 접촉시키는 단계; 및 (b) 항체에 의해 결합된 에피토프의 라이브러리에서 적어도 하나의 에피토프의 아미노산 서열을 확인하는 단계를 포함하는 γδ T-세포 수용체의 에피토프를 결정하는 방법을 제공한다. 일부 경우에, 항체는 δ3-08, δ3-20, δ3-23, δ3-31, δ3-42, δ3-47 및 δ3-58, 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 경우에, 항체는 고체 지지체에 부착된다. 에피토프의 라이브러리는 T-세포 수용체, 예컨대 γ TCR 또는 δ TCR의 연속 및 불연속 에피토프에 상응하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 에피토프의 라이브러리는 약 10개의 아미노산 내지 약 30개의 아미노산 길이, 약 10개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산 길이, 또는 약 5개의 아미노산 내지 약 12개의 아미노산 길이의 범위의 γδ T-세포 수용체로부터의 단편을 포함한다. 일부 경우에, 항체는 표지되고, 표지는 방사성 분자, 발광 분자, 형광 분자, 효소 또는 비오틴이다.

δ3 에피토프 빈

일부 실시형태에서, 관심 대상의 활성화 제제는 하나 이상의 빈(Bin) 1A 항체 δ3-23, δ3-42, 및/또는 δ3-58의 γ2δ3TCR에 대한 결합에 경쟁한다. 일부 실시형태에서, 관심 대상의 활성화 제제는 빈 1B 항체 δ3-08의 γ2δ3TCR에 대한 결합에 경쟁한다. 일부 실시형태에서, 관심 대상의 활성화 제제는 하나 이상의 빈 1(Bin1A 및 Bin1B) 항체 δ3-23, δ3-42, δ3-58, 및/또는 δ3-08의 γ2δ3TCR에 대한 결합에 경쟁한다. 일부 실시형태에서, 관심 대상의 활성화 제제는 빈 2 항체 δ3-31의 γ2δ3TCR에 대한 결합에 경쟁한다.

일반적으로, 본원에 기재된 δ3-특이적 항체는 γδ-TCR의 맥락에서 입체형태 에피토프를 인식한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 δ3-특이적 항체는 각각 γδ3- TCR의 하나 이상의 쌍에 특이적이다. 예를 들어, 일부 경우에, 본원에 기재된 δ3- 특이적 항체는 γ2δ3-TCR에 특이적이다.

치료 방법

본원에 기재된 바와 같은 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물을 함유하는 약제학적 조성물은 예방학적 및/또는 치료학적 치료를 위해 투여될 수 있다. 치료학적 분야에서, 이 조성물은 질병 또는 질환의 증상을 치유하거나 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로 질병 또는 질환을 이미 겪는 대상체에게 투여될 수 있다. 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 질환을 발생시키거나 걸리게 하거나 악화시킬 가능성을 줄이도록 또한 투여될 수 있다. 치료학적 사용을 위한 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물의 집단의 유효량은 질병 또는 질환의 중증도 및 전개, 이전의 치료, 대상체의 건강 상태, 체중, 및/또는 약물에 대한 반응, 및/또는 주치의의 판단에 따라 변할 수 있다.

본 개시내용의 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 질환의 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 질환의 예는 암, 감염성 질병, 자가면역 장애 및 패혈증을 포함한다. 대상체는 인간, 비인간 영장류, 예컨대 침팬지, 및 다른 유인원 및 원숭이 종; 농장 동물, 예컨대 소, 말, 양, 염소, 돼지; 가축, 예컨대 토끼, 개 및 고양이; 래트, 마우스 및 기니 피그 등과 같은 설치류를 포함하는 실험실 동물일 수 있다. 대상체는 임의의 연령일 수 있다. 대상체는 예를 들어 노인, 성인, 청소년, 청소년전, 소아, 걸음마 아이 또는 영아일 수 있다.

본 발명의 농후화된 γδ T-세포 집단에 의해 대상체에서 질환(예를 들어, 질병)을 치료하는 방법은 치료학적 유효량의 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 다양한 요법(예를 들어, 시기, 농도, 투약량, 치료 사이의 간격, 및/또는 제제)으로 투여될 수 있다. 대상체는 본 개시내용의 농후화된 γδ T-세포 집단 및/또는 이들의 혼합물을 받기 전에 예를 들어 화학요법, 방사선, 또는 둘 다의 조합에 의해 또한 예비컨디셔닝될 수 있다. 치료의 일부로서, 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 제1 요법에서 대상체에게 투여될 수 있고, 대상체는 제1 요법에서의 치료가 치료학적 효능의 주어진 수준을 충족시키는지를 결정하기 위해 모니터링될 수 있다. 일부 경우에, 조작된 γδ T-세포 또는 다른 조작된 γδ T-세포는 제2 요법에서 대상체에게 투여될 수 있다. 도 2는 대상체를 치료하는 방법을 도식적으로 예시한다. 제1 조작(201)에서, 적어도 하나의 조작된 γδ T-세포는 주어진 질환(예를 들어, 암)을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 투여된다. 조작된 γδ T-세포는 제1 요법에서 투여될 수 있다. 제2 조작(202)에서, 대상체는 예를 들어 건강관리 제공자(예를 들어, 주치의 또는 간호사)에 의해 모니터링될 수 있다. 일부 예에서, 대상체는 대상체의 질환을 치료하는 데 조작된 γδ T-세포의 효능을 결정하거나 측정하기 위해 모니터링된다. 일부 상황에서, 대상체는 또한 대상체에서의 γδ T-세포 집단의 생체내 증식을 결정하도록 모니터링될 수 있다. 다음에, 제3 조작(203)에서, 적어도 하나의 다른 조작된 γδ T-세포는 제2 요법에서 대상체에게 투여된다. 제2 요법은 제1 요법과 동일하거나 제1 요법과 상이할 수 있다. 일부 상황에서, 제3 조작(203)은 예를 들어 제1 조작(201)에서의 조작된 γδ T-세포의 투여가 효과적인 것(예를 들어, 단일 회차의 투여는 질환을 치료하기에 충분할 수 있음)으로 발견되는 경우 수행되지 않는다. 이의 동종이계 및 보편적 공여자 특징으로 인해, 조작된 γδ T-세포의 집단은 상이한 MHC 단상형을 갖는 다양한 대상체에게 투여될 수 있다. 조작된 γδ T-세포는 대상체에게 투여되기 전에 동결되거나 냉동보존될 수 있다.

γδ T-세포(즉, 조작된 또는 비조작된)의 농후화된 집단 및/또는 이들의 혼합물은 대상체에게 투여되기 전에 또한 동결되거나 냉동보존될 수 있다. 특정 실시형태에서, 조작된, 농후화된 γδ T-세포의 집단은 동일한 종양 인식 모이어티, 상이한 종양 인식 모이어티, 또는 동일한 종양 인식 모이어티와 상이한 종양 인식 모이어티의 조합을 발현하는 2개 이상의 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 조작된, 농후화된 γδ T-세포의 집단은 상이한 항원 또는 동일한 항원의 상이한 에피토프를 인식하도록 설계된 몇몇 구별되는 조작된 γδ T-세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 흑색종으로 고통받는 인간 세포는 NY-ESO-1 종양유전자를 발현할 수 있다. 인간 내의 감염된 세포는 NY-ESO-1 종양단백질을 더 작은 단편으로 처리하고 항원 인식을 위해 NY-ESO-1 단백질의 다양한 부분을 제시할 수 있다. 조작된, 농후화된 γδ T-세포의 집단은 NY-ESO-1 단백질의 상이한 부분을 인식하도록 설계된 상이한 종양 인식 모이어티를 발현하는 다양한 조작된 γδ T-세포를 포함할 수 있다. 도 3은 흑색종 항원 NY-ESO-1의 상이한 에피토프를 인식하는 조작된 γδ T-세포의 집단으로 대상체를 치료하는 방법을 도식적으로 예시한다. 제1 조작(301)에서, 동일한 항원의 상이한 에피토프를 인식하는 조작된 γδ T-세포의 집단이 선택된다. 예를 들어, 조작된 γδ T-세포의 집단은 NY-ESO-1단백질의 상이한 부분을 인식하는 상이한 종양 인식 모이어티를 발현하는 2개 이상의 세포를 포함할 수 있다. 제2 조작(302)에서, 조작된 γδ T-세포의 집단은 제1 요법에서 투여될 수 있다. 제2 조작(303)에서, 대상체는 예를 들어 건강관리 제공자(예를 들어, 주치의 또는 간호사)에 의해 모니터링될 수 있다.

본 개시내용의 농후화된 γδ T-세포 집단, 즉 비조작된 또는 조작된, 및/또는 이들의 혼합물은 다양한 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 고형 종양 및 혈액학적 악성종양을 포함하는 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 암의 비제한적인 예는 급성 림프아구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 부신피질 암종, AIDS-관련된 암, AIDS-관련된 림프종, 항문암, 충수암, 성상세포종, 신경모세포종, 기저 세포 암종, 담관암, 방광암, 골암, 뇌 종양, 예컨대 소뇌 성상세포종, 대뇌 성상세포종/악성 신경교종, 상의세포종, 수모세포종, 천막상부 원시 신경외배엽 종양, 시각 경로 및 시상하부 신경교종, 유방암, 기관지 선종, 버킷 림프종, 불명 원발성 기원의 암종, 중추 신경계 림프종, 소뇌 성상세포종, 자궁경부암, 소아암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 골수증식성 장애, 결장암, 피부 T-세포 림프종, 결합조직성 소원형 세포 종양, 자궁내막암, 상의세포종, 식도암, 유잉 육종, 생식 세포 종양, 담낭암, 위암, 위장 카르시노이드 종양, 위장관 기질 종양, 신경교종, 털 세포 백혈병, 두경부암, 심장암, 간세포(간)암, 호지킨 림프종, 하인두암, 눈내 흑색종, 췌도 세포 암종, 카포시 육종, 신장암, 후두암, 구순 및 구강암, 지방육종, 간암, 폐암, 예컨대 비소세포 및 소세포 폐암, 림프종, 백혈병, 마크로글로불린혈증, 골/골육종의 악성 섬유성 조직구증, 수모세포종, 흑색종, 중피종, 잠재 원발성의 전이성 편평 경부암, 구강암, 다발성 내분비 신생물 증후군, 골수이형성 증후군, 골수성 백혈병, 비강 및 부비동암, 비인두 암종, 신경모세포종, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 경구암, 구강인두암, 골육종/골의 악성 섬유성 조직구증, 난소암, 난소 상피암, 난소 생식 세포 종양, 췌장암, 췌장암 췌도 세포, 부비동 및 비강암, 부갑상선암, 음경암, 인두암, 갈색세포종, 송과체 성상세포종, 송과체 배아세포종, 뇌하수체 선종, 가슴막 폐 모세포종, 혈장 세포 신생물, 원발성 중추 신경계 림프종, 전립선암, 직장암, 신장 세포 암종, 신우 및 요관 이행성 세포암, 망막모세포종, 횡문근육종, 침샘암, 육종, 피부암, 피부 암종 머켈 세포, 소장암, 연조직 육종, 편평 세포 암종, 위암, T-세포 림프종, 목암, 흉선종, 흉선 암종, 갑상선암, 영양막 종양(임신성), 불명 원발성 부위의 암, 요도암, 자궁 육종, 질암, 외음부암, 발텐스트롬 마크로글로불린혈증 및 윌름스 종양을 포함한다.

일부 경우에, 본 개시내용의 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 감염성 질병을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 감염성 질병은 예를 들어 병원균성 박테리아에 의해 또는 바이러스에 의해 야기될 수 있다. 다양한 병원균성 단백질, 핵산, 지질 또는 이들의 단편은 이환된 세포에 의해 발현될 수 있다. 항원 제시 세포는 예를 들어 식세포작용으로 또는 수용체-매개된 내포작용에 의해 이 병원균성 분자를 내재화하고, 적절한 MHC 분자에 결합된 항원의 단편을 디스플레이할 수 있다. 예를 들어, 병원균성 단백질의 다양한 9합체 단편은 APC에 의해 디스플레이될 수 있다. 본 개시내용의 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단은 병원균성 박테리아 또는 바이러스의 다양한 항원 및 항원 단편을 인식하도록 설계될 수 있다. 병원균성 박테리아의 비제한적인 예는 a) 보르데텔라(Bordetella) 속, 예컨대 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis) 종; b) 보렐리아(Borrelia) 속, 예컨대 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi) 종; c) 브루셀리아(Brucelia) 속, 예컨대 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus), 브루셀라 카니스(Brucella canis), 브루셀라 멜리테리시스(Brucela meliterisis), 및/또는 브루셀라 수이스(Brucella suis) 종; d) 캄필로박터(Campylobacter) 속, 예컨대 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 종; e) 클라미디아(Chlamydia) 및 클라미도필라(Chlamydophila) 속, 예컨대 클라미디아 뉴모니아(Chlamydia pneumonia), 클라미디아 트라초마티스(Chlamydia trachomatis), 및/또는 클라미도필라 시타시(Chlamydophila psittaci) 종; f) 클로스트리듐(Clostridium) 속, 예컨대 클로스트리듐 보톨리늄(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리듐 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani) 종; g) 코리네박테륨(Corynebacterium) 속, 예컨대 코리네박테륨 디프테리아(Corynebacterium diphtheria) 종; h) 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 예컨대 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 및/또는 엔테로코커스 폐슘(Enterococcus faecium) 종; i) 에스체리치아(Escherichia) 속, 예컨대 에스체리치아 콜라이(Escherichia coli) 종; j) 프란시셀라(Francisella) 속, 예컨대 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis) 종; k) 헤모필루스(Haemophilus) 속, 예컨대 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza) 종; l) 헬리코박터(Helicobacter) 속, 예컨대 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 종; m) 레지오넬라(Legionella) 속, 예컨대 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila) 종; n) 렙토스피라(Leptospira) 속, 예컨대 렙토스피라 인터로간스(Leptospira interrogans) 종; o) 리스테리아(Listeria) 속, 예컨대 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 종; p) 마이코박테륨(Mycobacterium) 속, 예컨대 마이코박테륨 레프라에(Mycobacterium leprae), 마이코박테륨 투베르쿨로시스(mycobacterium tuberculosis), 및/또는 마이코박테륨 울서란스(mycobacterium ulcerans) 종; q) 마이코플라스마(Mycoplasma) 속, 예컨대 마이코플라스마 뉴모니아(Mycoplasma pneumonia) 종; r) 나이세리아(Neisseria) 속, 예컨대 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhoeae) 및/또는 나이세리아 메닝기티디아(Neisseria meningitidia) 종; s) 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 예컨대 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 종; t) 리케치아(Rickettsia) 속, 예컨대 리케치아 리케치(Rickettsia rickettsii) 종; u) 살모넬라(Salmonella) 속, 예컨대 살모넬라 티피(Salmonella typhi) 및/또는 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium) 종; v) 쉬겔라(Shigella) 속, 예컨대 쉬겔라 손네이(Shigella sonnei) 종; w) 스타필로코커스(Staphylococcus) 속, 예컨대 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피데르미디스(Staphylococcus epidermidis), 및/또는 스타필로코커스 사프로파이티쿠스(Staphylococcus saprophyticus) 종; x) 스트렙토코커스(Streptpcoccus) 속, 예컨대 스트렙토코커스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 및/또는 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 종; y) 트레포네마(Treponema) 속, 예컨대 트레포네마 팔리듐(Treponema pallidum) 종; z) 비브리오(Vibrio) 속, 예컨대 비브리오 콜레라(Vibrio cholera); 및/또는 aa) 예르시니아(Yersinia) 속, 예컨대 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis) 종에서 발견될 수 있다.

일부 경우에, 본 개시내용의 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 감염성 질병을 치료하기 위해 사용될 수 있고, 감염성 질병은 바이러스에 의해 야기될 수 있다. 바이러스의 비제한적인 예는 바이러스의 하기 과에서 발견될 수 있고, 예시적인 종으로 예시된다: a) 아데노비리다에(Adenoviridae) 과, 예컨대 아데노바이러스(Adenovirus) 종; b) 헤르페스비리다에(Herpesviridae) 과, 예컨대 단순 포진 1형, 단순 포진 2형, 바리셀라-조스터 바이러스(Varicella-zoster virus), 엡스타인-바 바이러스(Epstein-barr virus), 인간 사이토메갈로바이러스(Human cytomegalovirus), 인간 헤르페스바이러스 8형 종; c) 파필로마비리다에(Papillomaviridae) 과, 예컨대 인간 파필로마바이러스(Human papillomavirus) 종; d) 폴리오마비리다에(Polyomaviridae) 과, 예컨대 BK 바이러스, JC 바이러스 종; e) 폭스비리다에(Poxviridae) 과, 예컨대 스몰폭스(Smallpox) 종; f) 헤파드나비리다에(Hepadnaviridae) 과, 예컨대 B형 간염 바이러스 종; g) 파르보비리다에(Parvoviridae) 과, 예컨대 인간 보카바이러스(Human bocavirus), 파르보바이러스 B19(Parvovirus B19) 종; h) 아스트로비리다에(Astroviridae) 과, 예컨대 인간 아스트로바이러스(Human astrovirus) 종; i) 칼리시비리다에(Caliciviridae) 과, 예컨대 노워크 바이러스(Norwalk virus) 종; j) 플라비비리다에(Flaviviridae) 과, 예컨대 C형 간염 바이러스(HCV), 황열 바이러스, 뎅기 바이러스, 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus) 종; k) 토가비리다에(Togaviridae) 과, 예컨대 루벨라 바이러스(Rubella virus) 종; l) 헤페비리다에(Hepeviridae) 과, 예컨대 E형 간염 바이러스 종; m) 레트로비리다에(Retroviridae) 과, 예컨대 인간 면역결핍증 바이러스(HIV: Human immunodeficiency virus) 종; n) 오르쏘믹소비리다에(Orthomyxoviridaw) 과, 예컨대 인플루엔자 바이러스(Influenza virus) 종; o) 아레나비리다에(Arenaviridae) 과, 예컨대 구아나리토 바이러스(Guanarito virus), 후닌 바이러스(Junin virus), 라사 바이러스(Lassa virus), 마추포 바이러스(Machupo virus), 및/또는 사비아 바이러스(

virus) 종; p) 분야비리다에(Bunyaviridae) 과, 예컨대 크레멘-콩고 출혈열 바이러스(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus) 종; q) 필로비리다에(Filoviridae) 과, 예컨대 에볼라 바이러스(Ebola virus) 및/또는 마르부르그 바이러스(Marburg virus) 종; 파라믹소비리다에(Paramyxoviridae) 과, 예컨대 홍역 바이러스(Measles virus), 볼거리 바이러스(Mumps virus), 파라인플루엔자 바이러스(Parainfluenza virus), 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory syncytial virus), 인간 메타뉴모바이러스(Human metapneumovirus), 헨드라 바이러스(Hendra virus) 및/또는 니파 바이러스(Nipah virus) 종; r) 랍도비리다에(Rhabdoviridae) 속, 예컨대 광견병 바이러스(Rabies virus) 종; s) 레오비리다에(Reoviridae) 과, 예컨대 로타바이러스(Rotavirus), 오르비바이러스(Orbivirus), 콜티바이러스(Coltivirus) 및/또는 반나 바이러스 종(Banna virus). 일부 예에서, 바이러스는 바이러스 과, 예컨대 D형 간염에 배정되지 않는다.

일부 경우에, 본 개시내용의 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 면역 질병, 예컨대 자가면역 질병을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 자가면역 질병을 포함하는 염증성 질병은 또한 B-세포 장애와 연관된 질병의 종류이다. 자가면역 질환을 포함하는 면역 질병 또는 질환의 예는 류마티스성 관절염, 류마티스 열, 다발성 경화증, 실험적 자가면역 뇌척수염, 건선, 포도막염, 진성 당뇨병, 전신 홍반 루프스(SLE: systemic lupus erythematosus), 낭창성 신염, 습진, 피부경화증, 다발근염/피부경화증, 다발근염/피부근육염, 궤양성 직장염, 중증 복합 면역결핍증(SCID: severe combined immunodeficiency), 디조지 증후군(DiGeorge syndrome), 모세혈관확장성-운동실조증, 계절성 알레르기, 통년성 알레르기, 식품 알레르기, 아나필락시스, 비만세포증, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 파킨슨병, 알츠하이머, 비기능항진증, 백혈구 부착 결핍증, X-연관 림프구증식성 질병, X-연관 무감마글로불린혈증, 선택적 면역글로불린 A 결핍증, 고IgM 증후군, HIV, 자가면역 림프구증식성 증후군, 비스코트-올드리치 증후군(Wiskott-Aldrich syndrome), 만성 육아종 질병, 공통 가변 면역결핍증(CVID: common variable immunodeficiency), 과면역글로불린 E 증후군, 하시모토 갑상선염, 급성 특발성 혈소판감소성 자반증, 만성 특발성 혈소판감소성 자반증, 피부근육염, 시드남 무도병, 중증 근무력증, 다선성 증후군, 수포성 유사천포창, 헤노흐-숀라인 자반병(Henoch-Schonlein purpura), 연쇄구균감염후 신장염, 결절성 홍반, 다형 홍반, gA 신장병증, 타카야수 동맥염, 애디슨병, 사르코이드증, 궤양성 대장염, 결절다발 동맥염, 강직성 척추염, 굿패스쳐 증후군, 폐색성 혈전혈관염, 쇼그렌 증후군, 원발성 담즙성 간경변, 하시모토 갑상선염, 갑상선중독증, 만성 활동성 간염, 다발연골염, 천포창 불가리스, 베게너 육아종증, 막성 신장병증, 근위축성 측색 경화증, 척수 매독, 거대 세포 동맥염,/다발근육통증, 악성 빈혈, 빠르게 진행성인 사구체신염, 건선, 섬유성 폐렴 및 암을 포함한다.

본 개시내용의 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물에 의한 치료는 임상 질환 발병 전에, 동안에 및 후에 대상체에게 제공될 수 있다. 치료는 임상 질병 발병 후 1일, 1주, 6달, 12달 또는 2년 후 대상체에게 제공될 수 있다. 치료는 임상 질병 발병 후 1일, 1주, 1달, 6달, 12달, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년 또는 초과 동안 대상체에게 제공될 수 있다. 치료는 임상 질병 발병 후 1일, 1주, 1달, 6달, 12달 또는 2년 미만 동안 대상체에게 제공될 수 있다. 치료는 또한 임상 실험에서 인간을 치료하는 것을 포함할 수 있다. 치료는 본 개시내용의 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물을 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.

일부 경우에, 대상체에 대한 본 개시내용의 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물의 투여는 대상체의 신체에서 내인성 림프구의 활성을 조절한다. 일부 경우에, 대상체에 대한 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물의 투여는 내인성 T-세포에 대한 항원을 제공하고, 면역 반응을 증강시킬 수 있다. 일부 경우에, 기억 T-세포는 CD4⁺ T-세포이다. 일부 경우에, 기억 T-세포는 CD8⁺ T-세포이다. 일부 경우에, 대상체에 대한 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물의 투여는 다른 면역 세포의 세포독성을 활성화한다. 일부 경우에, 다른 면역 세포는 CD8+ T-세포이다. 일부 경우에, 다른 면역 세포는 천연 살해 T-세포이다. 일부 경우에, 대상체에 대한 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물의 투여는 조절 T-세포를 억제한다. 일부 경우에, 조절 T-세포는 Fox3+ Treg 세포이다. 일부 경우에, 조절 T-세포는 Fox3- Treg 세포이다. 본 개시내용의 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물에 의해 활성이 조절될 수 있는 세포의 비제한적인 예는 조혈 줄기 세포; B 세포; CD4; CD8; 적혈구; 백혈구; 수지상 항원 제시 세포를 포함하는 수지상 세포; 백혈구; 대식세포; 기억 B 세포; 기억 T-세포; 단핵구; 천연 살해 세포; 호중구 과립구; T-헬퍼 세포; 및 T-살해 세포를 포함한다.

대부분의 골수 이식 동안, 사이클로포스파미드와 전신 조사의 조합은 종래에 대상체의 면역계에 의한 이식에서 조혈 줄기 세포(HSC: hematopietic stem cell)의 거부를 방지하기 위해 사용된다. 일부 경우에, 생체외 공여자 골수와 인터류킨-2(IL-2)의 항온처리는 공여자 골수에서 살해 림프구의 생성을 향상시키도록 수행된다. 인터류킨-2(IL-2)는 야생형 림프구의 성장, 증대 및 분화에 필요한 사이토카인이다. 인간에 대한 γδ T-세포의 입양 전달의 현재의 연구는 γδ T-세포 및 인터류킨-2의 동시투여를 필요로 할 수 있다. 그러나, 저투약량 및 고투약량 둘 다의 IL-2는 고도로 독성인 부작용을 가질 수 있다. IL-2 독성은 다중 장기/시스템, 가장 중요하게는 심장, 폐, 신장 및 중추 신경계에서 나타날 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용은 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물을 사이토카인, 예컨대 IL-2, IL-15, IL-12 또는 IL-21의 동시투여 없이 대상체에게 투여하는 방법을 제공한다. 일부 경우에, 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 IL-2의 동시투여 없이 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 경우에, 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 IL-2의 동시투여 없이 골수 이식과 같은 시술 동안에 대상체에게 투여된다.

투여 방법

본 발명의 하나 또는 다수의 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 임의의 순서로 또는 동시에 대상체에게 투여될 수 있다. 동시인 경우에 본 발명의 다수의 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 단일의 통일된 형태, 예컨대 정맥내 주사로 또는 다수의 형태로, 예를 들어 다수의 정맥내 점적주사, 피하(s.c), 주사 또는 환제로서 제공될 수 있다. 본 발명의 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 단일 패키지에서 또는 복수의 패키지에서 함께 또는 별개로 패킹될 수 있다. 본 발명의 하나의 또는 모든 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 다회 용량으로 주어질 수 있다. 동시가 아닌 경우에 다회 용량 사이의 시기는 약 1주, 1달, 2달, 3달, 4달, 5달, 6달 또는 약 1년만큼 길게 변할 수 있다. 일부 경우에, 본 발명의 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 대상체의 신체 내에서, 생체내, 대상체에 대한 투여 후 증식할 수 있다. 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 동일한 세포 제제에 의한 다수의 치료에 대해 세포를 제공하도록 동결될 수 있다. 본 개시내용의 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물, 및 이를 포함하는 약제학적 조성물은 키트로서 패키징될 수 있다. 키트는 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물, 및 이를 포함하는 조성물의 사용에 대한 설명서(예를 들어, 서면 설명서)를 포함할 수 있다.

일부 경우에, 암을 치료하는 방법은 치료학적 유효량의 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 투여가 암을 치료한다. 일부 실시형태에서, 치료학적 유효량의 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 적어도 약 10초, 30초, 1분, 10분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 12시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 1달, 2달, 3달, 4달, 5달, 6달 또는 1년 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 치료학적 유효량의 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 적어도 1주 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 치료학적 유효량의 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 적어도 2주 동안 투여된다.

본원에 기재된 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 질병 또는 질환의 발생 전에, 그 동안에 또는 그 후에 투여될 수 있고, 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물을 함유하는 약제학적 조성물의 투여 시기는 변할 수 있다. 예를 들어, 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 예방학적으로 사용될 수 있고, 질병 또는 질환의 발생 가능성을 줄이도록 질환 또는 질병의 경향을 갖는 대상체에게 연속적으로 투여될 수 있다. 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 증상 발병 동안에 또는 그 이후 가능한 빨리 대상체에게 투여될 수 있다. 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물의 투여는 증상 발병 내에 바로, 증상 발병 처음 3시간 내에, 증상 발병 처음 6시간 내에, 증상 발병 처음 24시간 내에, 증상 발병 48시간 내에 또는 증상 발병으로부터의 임의의 시간 기간 내에 개시될 수 있다. 초기 투여는 유용한 임의의 경로를 통해, 예컨대 본원에 기재된 임의의 경로에 의해 본원에 기재된 임의의 제제를 사용하여 일어날 수 있다. 일부 예에서, 본 개시내용의 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물의 투여는 정맥내 투여이다. 하나의 또는 다수의 투약량의 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 암, 감염성 질병, 면역 질병, 패혈증 발병 후 가능한 유용한 때에 또는 골수 이식으로 및 예를 들어 약 24시간 내지 약 48시간, 약 48시간 내지 약 1주, 약 1주 내지 약 2주, 약 2주 내지 약 1달, 약 1달 내지 약 3달과 같은 면역 질병의 치료에 필요한 시간 동안 투여될 수 있다. 암 치료를 위해, 하나의 또는 다수의 투약량의 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 암 발병 후 및 다른 치료 전 또는 후의 년에 투여될 수 있다. 일부 예에서, 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 적어도 약 10분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 12시간, 24시간, 적어도 48시간, 적어도 72시간, 적어도 96시간, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4주, 적어도 1달, 적어도 2달, 적어도 3달, 적어도 4달, 적어도 5달, 적어도 6달, 적어도 7달, 적어도 8달, 적어도 9달, 적어도 10달, 적어도 11달, 적어도 12달, 적어도 1년, 적어도 2년 적어도 3년, 적어도 4년 또는 적어도 5년 동안 투여될 수 있다. 치료 길이는 각각의 대상체에 대해 변할 수 있다.

투약량

본원에 개시된 바와 같은 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 정확한 투약량의 단일 투여에 적합한 단위 투여형으로 제형화될 수 있다. 일부 경우에, 단위 투여형은 추가 림프구를 포함한다. 단위 투여형에서, 제형은 적절한 분량의 하나 이상의 화합물을 함유하는 단위 용량으로 분할된다. 단위 투약량은 별개의 분량의 제형을 함유하는 패키지의 형태일 수 있다. 비제한적인 예는 정제 또는 캡슐, 및 바이알 또는 앰플 중 패키징된 분말이다. 수성 현탁액 조성물은 단일-용량 비재밀폐형 용기에 패키징될 수 있다. 다중-용량 재밀폐형 용기는 예를 들어 보존제와 조합되어 또는 보존제 없이 사용될 수 있다. 일부 예에서, 약제학적 조성물은 보존제를 포함하지 않는다. 비경구 주사를 위한 제형은 보존제와 단위 투여형, 예를 들어 앰플에 또는 다중-용량 용기에 존재할 수 있다.

본원에 기재된 바와 같은, 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 적어도 5개의 세포, 적어도 10개의 세포, 적어도 20개의 세포, 적어도 30개의 세포, 적어도 40개의 세포, 적어도 50개의 세포, 적어도 60개의 세포, 적어도 70개의 세포, 적어도 80개의 세포, 적어도 90개의 세포, 적어도 100개의 세포, 적어도 200개의 세포, 적어도 300개의 세포, 적어도 400개의 세포, 적어도 500개의 세포, 적어도 600개의 세포, 적어도 700개의 세포, 적어도 800개의 세포, 적어도 900개의 세포, 적어도 1 x 10³개의 세포, 적어도 2 x 10³개의 세포, 적어도 3 x 10³개의 세포, 적어도 4 x 10³개의 세포, 적어도 5 x 10³개의 세포, 적어도 6 x 10³개의 세포, 적어도 7 x 10³개의 세포, 적어도 8 x 10³개의 세포, 적어도 9 x 10³개의 세포, 적어도 1 x 10⁴개의 세포, 적어도 2 x 10⁴개의 세포, 적어도 3 x 10⁴개의 세포, 적어도 4 x 10⁴개의 세포, 적어도 5 x 10⁴개의 세포, 적어도 6 x 10⁴개의 세포, 적어도 7 x 10⁴개의 세포, 적어도 8 x 10⁴개의 세포, 적어도 9 x 10⁴개의 세포, 적어도 1 x 10⁵개의 세포, 적어도 2 x 10⁵개의 세포, 적어도 3 x 10⁵개의 세포, 적어도 4 x 10⁵개의 세포, 적어도 5 x 10⁵개의 세포, 적어도 6 x 10⁵개의 세포, 적어도 7 x 10⁵개의 세포, 적어도 8 x 10⁵개의 세포, 적어도 9 x 10⁵개의 세포, 적어도 1 x 10⁶개의 세포, 적어도 2 x 10⁶개의 세포, 적어도 3 x 10⁶개의 세포, 적어도 4 x 10⁶개의 세포, 적어도 5 x 10⁶개의 세포, 적어도 6 x 10⁶개의 세포, 적어도 7 x 10⁶개의 세포, 적어도 8 x 10⁶개의 세포, 적어도 9 x 10⁶개의 세포, 적어도 1 x 10⁷개의 세포, 적어도 2 x 10⁷개의 세포, 적어도 3 x 10⁷개의 세포, 적어도 4 x 10⁷개의 세포, 적어도 5 x 10⁷개의 세포, 적어도 6 x 10⁷개의 세포, 적어도 7 x 10⁷개의 세포, 적어도 8 x 10⁷개의 세포, 적어도 9 x 10⁷개의 세포, 적어도 1 x 10⁸개의 세포, 적어도 2 x 10⁸개의 세포, 적어도 3 x 10⁸개의 세포, 적어도 4 x 10⁸개의 세포, 적어도 5 x 10⁸개의 세포, 적어도 6 x 10⁸개의 세포, 적어도 7 x 10⁸개의 세포, 적어도 8 x 10⁸개의 세포, 적어도 9 x 10⁸개의 세포, 적어도 1 x 10⁹개의 세포, 또는 초과의 양으로 조성물에 존재할 수 있다.

본 발명의 치료학적 유효 용량의 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 약 1개의 세포 내지 약 10개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 100개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 10개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 20개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 30개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 40개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 50개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 60개의 세포, 약 1개의 세포 약 70개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 80개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 90개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 100개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 1 x 10³개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 2 x 10³개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 3 x 10³개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 4 x 10³개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 5 x 10³개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 6 x 10³개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 7 x 10³개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 8 x 10³개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 9 x 10³개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 1 x 10⁴개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 2 x 10⁴개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 3 x 10⁴개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 4 x 10⁴개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 5 x 10⁴개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 6 x 10⁴개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 7 x 10⁴개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 8 x 10⁴개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 9 x 10⁴개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 1 x 10⁵개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 2 x 10⁵개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 3 x 10⁵개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 4 x 10⁵개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 5 x 10⁵개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 6 x 10⁵개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 7 x 10⁵개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 8 x 10⁵개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 9 x 10⁵개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 1 x 10⁶개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 2 x 10⁶개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 3 x 10⁶개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 4 x 10⁶개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 5 x 10⁶개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 6 x 10⁶개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 7 x 10⁶개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 8 x 10⁶개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 9 x 10⁶개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 1 x 10⁷개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 2 x 10⁷개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 3 x 10⁷개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 4 x 10⁷개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 5 x 10⁷개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 6 x 10⁷개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 7 x 10⁷개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 8 x 10⁷개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 9 x 10⁷개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 1 x 10⁸개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 2 x 10⁸개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 3 x 10⁸개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 4 x 10⁸개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 5 x 10⁸개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 6 x 10⁸개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 7 x 10⁸개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 8 x 10⁸개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 9 x 10⁸ 세포, 또는 약 1개의 세포 내지 약 1 x 10⁹ 세포일 수 있다.

일부 경우에, 본 발명의 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물의 치료학적 유효 용량은 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 2 x 10³개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 3 x 10³개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 4 x 10³개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 5 x 10³개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 6 x 10³개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 7 x 10³개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 8 x 10³개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 9 x 10³개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 1 x 10⁴개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 2 x 10⁴개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 3 x 10⁴개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 4 x 10⁴개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 5 x 10⁴개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 6 x 10⁴개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 7 x 10⁴개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 8 x 10⁴개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 9 x 10⁴개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 1 x 10⁵개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 2 x 10⁵개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 3 x 10⁵개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 4 x 10⁵개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 5 x 10⁵개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 6 x 10⁵개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 7 x 10⁵개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 8 x 10⁵개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 9 x 10⁵개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 1 x 10⁶개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 2 x 10⁶개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 3 x 10⁶개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 4 x 10⁶개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 5 x 10⁶개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 6 x 10⁶개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 7 x 10⁶개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 8 x 10⁶개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 9 x 10⁶개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 1 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 2 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 3 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 4 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 5 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 6 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 7 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 8 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 9 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 1 x 10⁸개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 2 x 10⁸개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 3 x 10⁸개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 4 x 10⁸개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 5 x 10⁸개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 6 x 10⁸개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 7 x 10⁸개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 8 x 10⁸개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 9 x 10⁸개의 세포, 또는 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 1 x 10⁹개의 세포일 수 있다.

일부 경우에, 본 발명의 비조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농후화된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물의 치료학적 유효 용량은 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 2 x 10⁶개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 3 x 10⁶개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 4 x 10⁶개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 5 x 10⁶개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 6 x 10⁶개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 7 x 10⁶개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 8 x 10⁶개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 9 x 10⁶개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 1 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 2 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 3 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 4 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 5 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 6 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 7 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 8 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 9 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 1 x 10⁸개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 2 x 10⁸개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 3 x 10⁸개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 4 x 10⁸개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 5 x 10⁸개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 6 x 10⁸개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 7 x 10⁸개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 8 x 10⁸개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 9 x 10⁸개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 1 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 2 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 3 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 4 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 5 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 6 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 7 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 8 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 9 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁷개의 세포 내지 약 1 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁷개의 세포 내지 약 2 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁷개의 세포 내지 약 3 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁷개의 세포 내지 약 4 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁷개의 세포 내지 약 5 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁷개의 세포 내지 약 6 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁷개의 세포 내지 약 7 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁷개의 세포 내지 약 8 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁷개의 세포 내지 약 9 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁸개의 세포 내지 약 1 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁸개의 세포 내지 약 2 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁸개의 세포 내지 약 3 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁸개의 세포 내지 약 4 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁸개의 세포 내지 약 5 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁸개의 세포 내지 약 6 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁸개의 세포 내지 약 7 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁸개의 세포 내지 약 8 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁸개의 세포 내지 약 9 x 10⁹개의 세포, 또는 약 1 x 10⁹개의 세포 내지 약 1 x 10¹⁰개의 세포일 수 있다.

보존

일부 실시형태에서, 농후화된 γδ T 세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 동결 매질에 제형화되고, 적어도 약 1달, 2달, 3달, 4달, 5달, 6달, 1년, 2년, 3년 또는 적어도 5년의 장기간 저장을 위해 액체 질소 동결기(-195℃) 또는 초저온 동결기(-65℃, -80℃ 또는 -120℃)와 같은 극저온 저장 단위에 배치될 수 있다. 동결 매질은 약 6.0 내지 약 6.5, 약 6.5 내지 약 7.0, 약 7.0 내지 약 7.5, 약 7.5 내지 약 8.0 또는 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 유지시키도록 생리학적 pH 완충제와 함께 디메틸 설폭사이드(DMSO), 및/또는 염화나트륨(NaCl), 및/또는 덱스트로스, 및/또는 황산덱스트란 및/또는 하이드록시에틸 전분(HES)을 함유할 수 있다. 냉동보존된 γδ T 세포는 해동되고 본원에 기재된 바와 같은 항체, 단백질, 펩타이드, 및/또는 사이토카인에 의한 자극에 의해 더 처리될 수 있다. 냉동보존된 γδ T 세포는 해동되고 본원에 기재된 바와 같은 바이러스 벡터(레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터를 포함) 또는 비바이러스 수단(RNA, DNA 및 단백질을 포함)으로 유전자 변형될 수 있다. 대안적으로, 비조작된 γδ T 세포는 본원에 기재된 방법에 의해 증식되고, 유전자 변형되고 냉동보존될 수 있다.

따라서, 유전자 조작된 및/또는 비조작된 γδ T 세포는 동결 매질에서 1 ㎖당 약 적어도 10¹개, 10²개, 10³개, 10⁴개, 10⁵개, 10⁶개, 10⁷개, 10⁸개, 10⁹개 또는 적어도 약 10¹⁰개의 세포로 적어도 약 1, 5, 10, 100, 150, 200, 500 바이알의 분량으로 세포 뱅크를 생성하도록 더 냉동보존될 수 있다. 냉동보존된 세포 뱅크는 이의 작용성을 보유할 수 있고, 해동되고 더 자극되고 증식될 수 있다. 일부 양태에서, 해동된 세포는 동종이계 세포 산물로서 세포의 분량을 생성하도록 적합한 밀폐 용기, 예컨대 세포 배양 백 및/또는 생물반응기에서 자극되고 증식될 수 있다. 냉동보존된 γδ T 세포는 극저온 저장 조건 하에 적어도 약 6달, 7달, 8달, 9달, 10달, 11달, 12달, 13달, 15달, 18달, 20달, 24달, 30달, 36달, 40달, 50달 또는 적어도 약 60달 동안 이의 생물학적 기능을 유지할 수 있다. 일부 양태에서, 보존제가 제형에 사용되지 않는다. 냉동보존된 γδ T 세포는 해동되고 동종이계 표준재고 세포 산물로서 다수의 환자에게 인퓨징될 수 있다.

본원에 언급된 모든 공보 및 특허는 예를 들어 현재 기재된 발명과 연결되어 사용되는 공보에 기재된 작제물 및 방법론을 기재하고 개시할 목적을 위해 그 전체내용이 본원에 참고로 원용된다. 본원에 기술된 공보는 본 출원의 출원일 전에 오직 본 개시내용을 위해 제공된다. 본원에서 어떤 것도 본원에 기재된 발명자들이 종래 발명에 의해 또는 임의의 다른 이유로 이러한 개시내용에 선행하도록 권한부여되지 않는다는 인정으로 해석되지 않아야 한다.

본 발명은 하기 비제한적인 예에 의해 더 자세히 설명된다.

실시예

실시예 1. δ3 TCR에 특이적으로 결합하는 항체의 생성

쥣과 항체 형태의 γδ TCR 활성자를 인간 IgG1FC에 융합된 γδ TCR 사슬의 성숙 ECD를 함유하는 재조합 인간 가용성 γ2δ3TCR- FC의 면역화에 의해 제조하였다. 마우스의 3개의 균주(Balb/c, CD-1 및 FVB)를 고친화도, 쥣과 단일클론 항체 활성자를 분비하는 하이브리도마를 제공하도록 인간 재조합 γδ TCR과 접종하였다.

PCR 증폭에 의해 γδ TCR-Fc 융합 작제물을 생성하였다. 장막으로의 전이로부터의 악성 난소 세포의 새로운 시편으로부터 추출된 종양 침윤 γδ 림프구로부터 단리된 RNA로부터 γ2δ3 TCR 사슬을 증폭시켰다. 일시적으로 형질주입된 HEK 293 세포의 상청액으로부터 가용성 δ3TCR-FC를 정제하였다. 10 ㎍의 가용성 TCR을 동일 용적의 TITERMAX® Gold(Sigma Aldrich) 또는 Imject Alum Adjuvant(Thermo Fisher)로 유화시키고, 각각의 마우스의 면역화에 사용하였다. 이후, 생성된 에멀션을 발바닥 경로(footpad route)를 통해 3마리의 마우스(각각 1마리: Balb/c, CD-1 및 FVB)에 주사하였다.

인간 γδ3 TCR에 특이적인 마우스 IgG 항체에 대한 마우스 혈청을 스크리닝하도록 고상 ELISA 검정을 사용하였다. 간단히 말하면, 96웰 플레이트(VWR International, 카탈로그 610744호)를 밤새 ELISA 코팅 완충액 중 1 ㎍/㎖의 재조합 γδ3 TCR-로 코팅하였다. 0.02%(v/v) Tween 20을 함유하는 PBS로 세척한 후, 웰을 실온(RT)에서 1시간 동안 200 ㎕/웰의 PBS 중 3%(w/v) BSA로 차단하였다. 마우스 혈청을 적정하고(1:100, 1:200, 1:400 및 1:800), 50 UL/웰로 γδ TCR 코팅된 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 세척하고, 이후 실온에서 1시간 동안 PBS 중 3% BSA-PBS 또는 2% FCS에 1:10,000 희석된 50 ㎕/웰의 HRP-표지된 염소 항-마우스 IgG와 항온처리하였다. 다시 플레이트를 세척하고, 40 ㎕/웰의 TMB 기질 용액(Thermo Scientific 34028)을 실온에서 15분 동안 첨가하였다. 전개 후, 동일 용적의 2N H₂SO₄를 첨가하여 기질 전개를 중단시키고, 플레이트를 OD 450에서 분광광도계에 의해 분석하였다.

혈청-양성 면역화된 마우스를 희생시키고, 배수 림프절(슬와 및 서혜부)을 절제하고, 항체 생산 세포에 대한 소스로서 사용하였다. B 세포의 단일 세포 현탁액(766 x 106 세포)을 전기융합에 의해 1:1의 비로 비분비 P3x63Ag8.653 골수종 세포(ATCC CRL-1580호)와 융합하였다. 전기융합을 제조사의 지시에 따라 BTX Hybrimmune™ System(BTX Harvard Apparatus)을 사용하여 수행하였다. 융합 후, 세포를 아자세린이 보충된 하이브리도마 선택 배지(Sigma A9666호), 15% Fetal Clone I 혈청(Hyclone), 10% BM Condimed(Roche Applied Sciences), 4 mM L-글루타민, 100 IU 페니실린-스트렙토마이신 및 50 μM 2-머캅토에탄올을 함유하는 나트륨 피루베이트를 갖는 고글루코스 DMEM 배지(Cellgro 카탈로그 15-017-CM호)에 재현탁시키고, 이후 플라스크마다 50 ㎖의 선택 배지에서 3개의 T150 플라스크에서 플레이팅하였다. 이후, 플라스크를 6일 내지 7일 동안 5% CO₂ 및 95% 공기를 함유하는 습윤 37℃ 항온처리기에 배치하였다.

성장 6일 후, T150 플라스크에서 벌크로 성장한 세포로 이루어진 라이브러리를 Aria II 세포 분류기를 사용하여 Falcon 384웰 평편 바닥 플레이트에서 웰마다 1개의 세포로 플레이팅하였다. 이후, 선택된 하이브리도마를 15% Fetal Clone I 혈청(Hyclone), 10% BM-Condimed(Roche Applied Sciences), 1 mM 나트륨 피루베이트, 4 mM L-글루타민, 100 IU 페니실린-스트렙토마이신, 50 μM 2-머캅토에탄올 및 100 μM 하이폭산틴을 함유하는 90 ㎕의 배양 배지에서 성장시켰다. 미래의 라이브러리 시험을 위해 임의의 남은 사용되지 않은 하이브리도마 라이브러리 세포를 동결시켰다. 성장 10일 후, ELISA에 의해 δ3 TCR에 반응성인 항체에 대해 플레이팅된 세포의 각각의 웰로부터의 상청액을 평가하였다.

고결합 ELISA 96웰 플레이트를 하기 γδ TCR 사슬을 쌍 짓기하여 생성된 가용성 γδ TCR 단백질로 코팅하였다: γ8δ1, γ2δ1 및 γ2δ3. 가용성 TCR을 희석하고, 4℃에서 밤새 탄산나트륨 완충액 중에 1 ㎍/㎖로 사용하였다. 플레이트를 세척하고, 37℃에서 1시간 동안 PBS/Tween 중 3% BSA로 차단하고, 바로 사용하거나 4℃에서 유지시켰다. 비희석된 하이브리도마 상청액을 실온에서 1시간 동안 플레이트에서 항온처리하였다. 플레이트를 세척하고, 실온에서 1시간 동안 3% BSA-PBS에 1:10,000 희석된 HRP 표지된 염소 항-마우스 IgG로 프로빙하였다. 이후, 플레이트를 상기 기재된 바와 같은 기질 용액과 항온처리하고, OD 450에서 판독하였다. 배경 위의 신호에 의해 결정된 바와 같은 인간 δ3 TCR 사슬에 우선적으로 결합된 면역글로불린을 함유하는 웰을 이동시키고 증식시켰다.

생성된 δ3TCR 특이적 클론성 하이브리도마를 CS-10 동결 매질(Biolife Solutions)에서 냉동보존하고, 액체 질소에서 저장하였다.

실시예 2. δ3 TCR에 특이적으로 결합하는 쥣과 항체의 서열분석

ELISA 결합 검정에 기초하여 서열분석 및 추가의 분석을 위해 δ3 가용성 TCR에 특이적으로 결합하는 다수의 예시적인 구별되는 단일클론 항체를 선택하였다. 도 1에 표 방식으로 도시된 것처럼, 실시예 1에서 생성된 선택된 단일클론 항체의 경쇄 가변 영역(도면) 및 중쇄 가변 영역(도면)의 서열 분석은 신규의 상보성 결정 영역 및 신규의 VDJ 배열의 디스플레이를 확인시켜 주었다. 상보성 결정 영역은 카밧에 의해 정의된 바대로 도 1에 도시되어 있다.

RNeasy 단리 키트(RNeasy Mini Kit Qiagen 74106호)를 사용하여 선택된 하이브리도마 세포로부터 전체 RNA를 추출하였다. 10⁴개의 하이브리도마 세포를 350 ㎕의 RLT 완충액에 용해시키고, 동일 용적의 70% 에탄올을 첨가하고, 샘플을 RNeasy Mini 스핀 칼럼에 로딩하였다. 칼럼을 2회 세척하고, RNA를 스핀 칼럼 막에 바로 로딩된 100 ㎕의 RNase-비함유 물에 의해 용리시켰다. 사용까지 -80℃로 저장하기 전에 1% 아가로스 겔에서 3 ㎕를 분별화하여 RNA 준비물의 품질을 결정하였다.

모든 마우스 Ig 아이소타입에 특이적인 3' 마우스 Cγ 프라이머와 조합하여, 완전한 마우스 VH 레퍼토리를 표적화하도록 설계된, 32개의 마우스 특이적 리더 서열 프라이머를 포함하는 5' 프라이머 믹스를 사용하여 각각의 하이브리도마의 Ig 중쇄의 가변 영역을 증폭시켰다. 동일한 PCR 프라이머를 사용하여 말단 둘 다로부터 VH의 400 bp PCR 단편을 서열분석하였다. 유사하게, 마우스 카파 불변 영역에 특이적인 단일 역방향 프라이머와 조합된 각각의 Vκ 마우스 패밀리를 증폭시키도록 설계된 32개의 5' Vκ 리더 서열 프라이머의 믹스를 사용하여 카파 경쇄를 증폭시키고 서열분석하였다. 역전사효소 중합효소 사슬 반응(RT-PCR)을 사용하여 100 ng의 총 RNA로부터 VH 및 VL 전사체를 증폭시켰다.

각각의 하이브리도마에 대해 총 8개의 RT-PCR 반응을 실행하였다: Vκ 경쇄에 대해 4개 및 Vγ 중쇄에 대해 4개. One Step OneStep Ahead RT-PCR 키트를 증폭에 사용하였다(Qiagen 220213호). 이 키트는 Sensiscript 및 Omniscript Reverse Transcriptase, QuantiNova HotStarTaq DNA Polymerase, dNTP 믹스, 완충액 및 Q-Solution, 임의의 RNA 주형의 효율적인 증폭을 가능하게 하는 신규의 첨가제의 블렌드를 제공한다. 5 ㎕의 RNA, 0.5의 100 μM의 중쇄 또는 카파 경쇄 프라이머(IDT에 의해 주문 합성됨) 중 하나, 12.5 ㎕의 DNA 중합효소와의 마스터 믹스, 완충액, dNTP, 1 ㎕의 역전사효소 및 DNA 중합효소를 함유하는 효소 믹스, 및 0.4 ㎕의 리보뉴클레아제 억제제 RNasin(1 단위)를 포함하는 반응 혼합물을 제조하였다. 반응 혼합물은 역전사 및 PCR 둘 다에 필요한 모든 시약을 함유한다. 온도순환기 프로그램은 RT 단계 10분 동안 50℃, 5분 동안 95℃, 이어서 30회 PCR 사이클(30초 동안 95℃, 30초 동안 58℃, 1분 동안 72℃)에 설정되었다. 이후, 10분 동안 72℃에서의 최종 항온처리가 있었다.

직접적인 DNA 서열분석에 대한 PCR 산물을 제조하기 위해, 제조사의 프로토콜에 따라 QIAquick™ PCR Purification Kit(Qiagen)를 사용하여 이것을 정제하였다. DNA를 50 ㎕의 무균수를 사용하여 스핀 칼럼으로부터 용리시키고, 이후 가닥 둘 다로부터 직접 서열분석하였다. 추출된 PCR 산물을 특정 V 영역 프라이머를 사용하여 직접 서열분석하였다. 가장 높은 서열 상동성을 갖는 생식선 V. D 및 J 유전자 구성원을 확인하기 위해 VBase2를 사용하여 뉴클레오타이드 서열을 분석하였다.

주석화된 서열은 도 1에 도시되어 있다. 보다 구체적으로, 도 1(상부)는 δ3 TCR 특이적 항체로부터의 7개의 신규 쥣과 중쇄 가변 영역의 인접 아미노산 서열을 도시하고, 도 1(하부)은 δ3 TCR 특이적 항체로부터의 상응하는 경쇄 가변 영역의 인접 아미노산 서열을 도시한다.

종합하면, 도 1은 7개의 쥣과 항-δ3 TCR 항체(δ3-08, δ3-20, δ3-23, δ3-31, δ3-42, δ3-47 및 δ3-58이라 칭함)의 주석화된 서열을 제공한다.

실시예 3. δ3-특이적 항체에 의한 γδ T 세포 증식

24웰 플레이트(Corning)를 밤새 5 ㎍/㎖로 300 ㎕의 염소 항-마우스 IgG 항체로 코팅하였다. 다음날 웰을 PBS로 1회 세척하고, 37℃에서 1시간 동안 PBS 중 5% FBS로 차단하였다. Vδ3 항체를 2% FBS를 함유하는 PBS 중 1 ㎍/㎖로 제조하였다. 300 ㎕의 항체 용액을 각각의 웰에 분산시키고, 포획을 위해 실온에서 2시간 동안 항온처리하였다.

건강한 개체로부터의 인간 PBMC를 10% FBS, 2mM 글루타민, 100 IU/㎖의 rhIL-2를 함유하고 항생제가 보충된 RPMI-1640 배지에서 1x10⁶/㎖/웰로 포획된 Vδ3 항체와 웰로 플레이팅하였다. 배양물 중 세포를 배지 보충에 의해 2일 내지 3일마다 공급하였다. 7일에 세포를 수확하고 활성화 항체 없이 새로운 플레이트로 1x10⁶/㎖로 재플레이팅하고, 2일 내지 3일마다 공급하여 더 증식시켰다. 세포를 14일에 1x10⁶/㎖ 세포 밀도로 재플레이팅하였다. 비-Vδ1(R9 Vd1 특이적 항체로 결정된 바대로, Beckman-Coulter) 및 비-Vδ2(B6 Vd2 특이적 항체로 결정된 바대로, BioLegend) 세포의 순도 및 배수 증식을 결정하도록 세포 분석(계수 및 유세포분석법)을 21일마다 수행하였다. 도 4a 내지 도 4b는 2개의 공여자의 PBMC 배양물에서 비-Vδ1/비-Vδ2 세포의 배수 증식을 보여준다. Vδ3 특이적 항체는 Vδ3 항체에 따라 8531배까지(공여자 1) 및 6621배까지(공여자 2)의 증식을 유도하였다.

21일에 증식된 배양물에서의 비-Vδ1/비-Vδ2 세포의 순도는 2개의 공여자에 대해 도 5a 내지 도 5b에 도시되어 있다. 21일에 세포 배양물의 41%까지는 δ3-23 항체로 증식된 공여자 1 PBMC에 대해 비-Vδ1/비-Vδ2 γδ T 세포로 구성되었다.

21일에 증식된 δ1^-/δ2^- T 세포의 표현형을 CD27 및 CD45 표면 마커 발현에 의해 평가하였다. 도 6a 내지 도 6b는 21일에 MAb에 의해 활성화된 δ1^-/δ2^- T-세포의 표현형이 주로 (50% 초과의) CD27+CD45RA+(미경험) 및 CD27+CD45RA-(중앙 기억)라는 것을 보여준다.

실시예 4. γ2δ3TCR-hFc에 대한 경쟁 결합에 의한 Vδ3 항체의 에피토프 그룹화

ForteBio Octet 장치 및 항-인간 Fc AHC 바이오센서(ForteBio, Pall Corporation, 캘리포니아주 프레몬트)를 사용하여 쌍 지은 경쟁 패턴에 기초하여 선택된 Vδ3 항체를 에피토프 빈으로 그룹화하였다. 간단히 말하면, γ2δ3TCR- hFc 재조합 단백질 및 모든 Vδ3 항체를 20 ㎍/㎖의 BSA를 함유하는 HBS-PB 완충액(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.005% Tween-20, pH 7.4)에 5 ㎍/㎖로 희석하였다. 모든 샘플(300 ㎕)을 96웰 플레이트에서 배열하고, 경쟁 실험을 제조사의 제안에 따라 Octet 384 장치를 사용하여 수행하였다. 처음에, γ2δ3TCR- hFc를 5분 동안 항-인간 Fc 바이오센서에서 포획하였다. 이후, 항체의 쌍이 γ2δ3TCR- hFc에 대한 결합 부위에 대해 경쟁하는지를 결정하기 위해 Vδ3 항체의 쌍이 연속하여 포화로 γ2δ3TCR-hFc에 결합하게 하였다(10분의 각각의 회합 단계). 제2 항체가 결합하지 않는 경우, 2개의 항체는 동일한 에피토프 빈에 있고, 동일하거나 매우 유사하거나 또는 대부분 중첩하는 에피토프를 인식한다고 생각되었다. Vδ3 항체들 사이의 경쟁을 결정하도록 ForteBio HT9.0 데이터 분석 도구를 적용하였다.

5개의 항-Vδ3 항체의 경쟁 패턴이 도 7에 제시되어 있다. 시험된 항-Vδ3 항체를 3개의 에피토프 빈으로 그룹화하였다. δ3-23, δ3-42 및 δ3-58은 모두 쌍 지은 결합 검정에서 서로 경쟁하고 1A라 지칭된 1개의 에피토프 빈을 구성하는 것으로 발견되었다. δ3-31은 별개의 Bin 2에 이것을 배치한 임의의 시험된 항체와 경쟁하지 않았다. δ3-08 항체는 δ3-31 항체와 경쟁하지 않지만, δ3-23, δ3-42 및 δ3-58를 대신하는 것으로 나타나서, δ3-08 항체가 아마도 중첩하는 에피토프를 갖지만 δ3-08 친화도가 더 낮을 수 있다는 것을 제안한다. δ3-08의 에피토프는 Bin 1B라 지칭된다.

실시예 5. Vδ3 γδ T 세포의 활성화, 형질도입 및 선택적 증식

12웰 플레이트(Corning, CellBIND®)를 4℃에서 밤새 600 ㎕/웰로 PBS 중에 1 ㎍/㎖로 정제된 δ3-08 또는 δ3-23 항체로 직접 코팅하였다. 다음날 웰을 PBS로 세척하고, 2명의 공여자(공여자 3 및 공여자 4)로부터의 PBMC(2 x 10⁶개의 총 세포)를 10% FBS, 2mM 글루타민, 100 IU/㎖의 rhIL-2(Peprotech)가 보충된 RPMI-1640 배지에서 1 x 10⁶개 세포/㎖로 활성화를 위해 첨가하였다. Vδ3 세포를 함유하는 Vδ1, Vδ2, 및 비-Vδ1/Vδ2 γδ T(DN, 이중 음성) 분획의 함량에 대해 출발 PBMC를 유세포분석법에 의해 규명하였다. 비-Vδ1/Vδ2 γδ T 세포 함량은 총 세포의 0.5% 미만이었다. 2일 및 4일에 데미-교환에 의해 rhIL-2가 보충된 새로운 배지를 세포 배양물에 공급하였다.

5일에, 세포를 HBSS에 세척하고, 항-CD20(Rituxan) 키메라 항원 수용체 ACT2(CD28 막관통, 동시자극 도메인 및 CD3ζ에 연결된 scFv)를 암호화하는 레트로바이러스 작제물로 형질도입하였다. 간단히 말하면, 12웰 비조직 배양 처리된 플레이트의 웰을 10 ㎍/㎖로 Retronectin®(TaKaRa Bio)로 예비코팅하고, 2 x 10⁶개의 활성화된 PBMC를 웰에 첨가한 후(공여자마다, 활성화 항체마다), 적절한 용적의 바이러스 상청액을 첨가하여 MOI=1를 달성하였다. 배지의 총 용적은 2 ㎖가 되어 1 x 10⁶개 세포/㎖의 세포 농도가 달성되고, rhIL-2는 보충되어 100 IU/㎖가 되었다. 세포의 일부는 형질도입되지 않았고, CAR 형질도입된 세포(비형질도입된, 모의 형질도입)와 동일한 조작을 겪었다.

다음날 증식을 위해 세포를 6웰 플레이트로 옮기고, 배지 데미-교환에 의해 격일로 공급하여 추가 11일 동안 유지시켰다. 증식의 종료 시, 세포를 수확하고, 세척하고, Vδ3 배수 증식, 순도 및 CAR 발현에 대해 유세포분석법에 의해 분석하였다(도 8a 내지 도 8c). 간단히 말하면, 세포를 TCRαβ(Clone IP26), 항-TCRγδ(Immuno510, Beckman Coulter), 항-Vδ2(B6, Biolegend), 항-Vδ1(R9.12, Beckman Coulter), 항-CD16 및 항-CD56(둘 다 BioLegend)에 대한 항체로 염색하고, BD FACS Canto II에서 분석하였다. 항-CD20 CAR 형질도입 효율을 결정하기 위해, 세포를 래트 항-리툭시맙-FITC 접합체(BioRad, 도 8c)로 염색하였다. 데이터를 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. LS 칼럼에 의해 수동 절차를 사용하여 αβ T 세포 고갈 키트(Miltenyi Biotec)를 사용하여 배양물에서의 αβ T 세포를 고갈시켰다. αβ T 세포 고갈 후 순도 및 CAR 발현을 유세포분석법에 의해 확인하고, 세포를 세포독성 검정에 사용하였다. 잔여 αβ T 세포의 백분율은 모든 샘플에서 1% 미만이었고; Vδ3 세포의 순도는 Vδ3 세포 증식에 사용된 공여자 및 항체에 따라 70% 초과였다(도 9).

δ3-08 및 δ3-23 MAb 둘 다를 사용하여 증식된 공여자 4로부터의 비형질도입된 세포는 잔여 αβ T 세포가 고갈되고, δ3-23 MAb, 및 다른 T 세포 마커(TCRαβ, 항-Vδ1, 항-Vδ2)로 염색되었다. 도 10에 도시된 것처럼, αβ T 세포 고갈 후 세포의 대부분(90% 이상)은 비-Vδ1/비-Vδ2 세포(왼쪽 패널)이고, 이들 중 95% 이상은 δ3-23 MAb로 Vδ3에 대해 양성 염색되었다(오른쪽 패널).

실시예 6. 조작된 Vδ3 γδ T 세포에 의한 세포독성 검정

공여자 3으로부터의 인간 PBMC를 실시예 5에 기재된 바대로 δ3-08 및 δ3-23 MAb를 사용하여 활성화하고, CD20 CAR 작제물과 형질도입하였다. 실시예 5에 기재된 바대로, 증식의 종료 시, 세포는 순도 및 형질도입 효율에 대해 규명되고, αβ T 세포가 고갈되었다. 이후, CD20+ Raji-NucLight Red 세포에 대해 αβ T 세포 고갈된 배양물을 세포독성 검정에 사용하였다. CD20+ Raji-NucLight Red 세포를 IncuCyte® NucLight Red 렌티바이러스 입자와 형질도입하되, IncuCyte® 플랫폼에서 Raji 세포의 형광 검출을 허용하였다.

CD20 CAR-형질도입된 또는 비형질도입된 Vδ3 세포를 384웰 플레이트에서 10% FBS, 2mM 글루타민이 보충된 RPMI-1640 배지에서 6시간 동안 다양한 E/T 비로 Raji-NucLight Red 세포와 동시항온처리하였다. Raji-NucLight Red 세포 생존능력을 6시간 시점에 전체 웰로부터 정량화된 총 형광으로 평가하였다. 도 11에 도시된 것처럼, δ3-08(A) 또는 δ3-23(B) MAb를 사용하여 공여자 3으로부터 증식된 항-CD20 CAR 형질도입된 및 비형질도입된 Vδ3 세포 둘 다는 CD20+ Raji-NucLight Red 세포에 대해 세포독성을 나타냈다. 형질도입된 Vδ3 세포는 비형질도입된 증식된 Vδ3 세포와 비교하여 CD20+ Raji-NucLight Red 세포에 대해 세포독성을 유의미하게 증강시켰다.

실시예 7. 돌연변이유발에 의한 항-Vδ3 항체의 우수한 에피토프 맵핑

Vδ3 항체의 결합에 중요한 인간 γδTCR의 가변 Vδ3 영역에서의 아미노산 잔기를 결정하기 위해, 몇몇 점 돌연변이 또는 이들의 조합을 δ3 사슬로 도입하고, Luminex를 사용하여 MAb 결합을 평가하였다. 간단히 말하면, PDB(수탁 번호 1HXM 및 1TVD)에 기탁된 Vδ2Vγ9 TCR의 결정 구조를 사용하여 Vδ3Vγ9 이합체 분자의 컴퓨터 모델을 생성하였다. 표 1에 기재된 바와 같은 가능한 면역원성에 기초하여 Vδ3 사슬의 야생형 서열내로 치환을 도입하였다. Vδ3 아미노산의 잔기 넘버링은 도 12에 도시된 바와 같다. 표 1에 표시된 돌연변이된 Vδ3 사슬은 실시예 1에 기재된 바대로 293 Expi 세포에서 인간-Fc 이종이합체 융합 단백질로서 Vγ2 사슬과 동시발현되고, 단백질 A에서 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제되었다. 돌연변이체 및 야생형 δ3γ2-hFc 단백질을 염소-항-인간 Fc 다중클론 항체와 접합된 Luminex® 비드에 포획하고, 다양한 Vδ3 항체의 EC₅₀ 결합을 결정하였다. 특정 돌연변이체 δ3γ2-TCR 융합에 대한 EC₅₀ 결합의 소실 또는 하강은 항원 결합에 대한 돌연변이된 아미노산의 기여를 결정하도록 모니터링되었다. 이론에 구속되고자 바라지 않으면서, 돌연변이 시 결합 감소를 나타내는 잔기가 Vδ3 γδ TCR에 결합될 때 δ3-특이적 항체와 접촉한다고 가설제기된다.

본원에 기재된 우수한 에피토프 맵핑에 의해 항원 결합에 기여하는 것으로 나타난 선택된 잔기의 가까운 그룹화는 도 13 및 도 14a 내지 도 14c에 예시되어, 본원에 기재된 항체에 의해 인식된 δ3-특이적 에피토프가 적어도 부분적으로 또는 전체적으로 입체형태 및/또는 비선형일 수 있다는 것을 제안한다. 도 13에 의해 표시된 것처럼, δ3-특이적 γδ TCR 결합 항체는 Vδ3의 γ-사슬 결합 계면에서 원위인 Vδ3의 에피토프에 결합할 수 있다.

표 1 및 도 13 내지 도 14c에 보이는 것처럼, δ3-특이적 항체를 2개의 주요 에피토프 결합 그룹으로 그룹화할 수 있고, 여기서 δ3-08, δ3-23, δ3-42 및 δ3-58은 제1 그룹을 형성하고, δ3-31은 제2 그룹을 형성한다. 제1 주요 그룹은 2개의 하위그룹으로 분리될 수 있고, δ3-23, δ3-42 및 δ3-58은 하위그룹 1A를 형성하고, δ3-08은 하위그룹 1B를 형성한다. 이 결과는 도 7에 예시된 경쟁 결합 데이터와 매우 일치한다. 그러나, 항원 결합에 관여된 특정 잔기를 강조하는 것 이외에, 우수한 맵핑은 항체 δ3-31 및 δ3-42에 의해 형성된 제3 그룹화를 알아내고, 이들 둘 다는 E67Q, D70N, R75Q, R95Q, E97Q 돌연변이체 Vδ3 γδ TCR에 대한 결합 감소를 보여준다.

도 14a 내지 도 14c는 δ3-특이적 항체의 항원 결합에 대한 핫스팟으로서 β 시트 가닥 D 및 E(IMGT 명명법)를 또한 강조한다. 따라서, 일부 경우에, δ3-특이적 항체는 Vδ3의 β 시트 가닥 D 및 E에서의 잔기에 결합하는 것(IMGT 명명법); 추가로 또는 대안적으로 β 시트 가닥 C'' 및 D에서의 잔기 및 Vδ3의 Vδ3의 β 가닥 E와 F 사이의 루프에서의 잔기에 결합하는 것(IMGT 명명법); 및/또는 Vδ3의 β 시트 가닥 A, B, D 및 E에서의 잔기에 결합하는 것(IMGT 명명법)을 포함할 수 있다.

아미노산 수준에서, 일부 δ3 γδ TCR 특이적 항체가 Vδ3의 잔기 K79 및 H88에 결합한다는 것이 가설제기된다(IMGT 명명법). 추가로 또는 대안적으로, 일부 δ3 γδ TCR 특이적 항체가 Vδ3의 잔기 R75 및 R95에 결합한다(IMGT 명명법). 추가로 또는 대안적으로, 일부 δ3 γδ TCR 특이적 항체는 Vδ3의 잔기 K79, E18 및 H88에 결합한다(IMGT 명명법). 추가로 또는 대안적으로, 일부 δ3 γδ TCR 특이적 항체는 Vδ3의 잔기 E67, D70, R75, R95 및 E97에 결합한다(IMGT 명명법). 추가로 또는 대안적으로, 일부 δ3 γδ TCR 특이적 항체는 Vδ3의 잔기 K3, K79 및 H88에 결합한다(IMGT 명명법). 추가로 또는 대안적으로, 일부 δ3 γδ TCR 특이적 항체는 Vδ3의 잔기 K79, L82 및 H88에 결합한다(IMGT 명명법).

SEQUENCE LISTING <110> ADICET BIO, INC. <120> METHODS FOR SELECTIVE EXPANSION OF DELTA3 GAMMADELTA T-CELL POPULATIONS AND COMPOSITIONS THEREOF <130> ADC-0003-WO <140> PCT/US2018/061384 <141> 2018-11-15 <150> 62/586,782 <151> 2017-11-15 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 1 Glu Glu Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ile Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Gln Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Met Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Glu Arg Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 2 <211> 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Claims (72)

1. 항체 또는 이의 단편으로서,
   δ3 γδ TCR에 특이적인 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 단편.
2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은
   a) δ3-08, δ3-20, δ3-23, δ3-31, δ3-42, δ3-47 및 δ3-58로 이루어진 군으로부터 선택된 항체;
   b) δ3-08, δ3-23, δ3-31, δ3-42, δ3-47 및 δ3-58로 이루어진 군으로부터 선택된 항체;
   c) δ3-08, δ3-23, δ3-42 및 δ3-58로 이루어진 군으로부터 선택된 항체;
   d) δ3-23, δ3-42 및 δ3-58로 이루어진 군으로부터 선택된 항체;
   e) δ3-31 및 δ3-42로 이루어진 군으로부터 선택된 항체;
   f) 항체 δ3-08; 또는
   g) 항체 δ3-31과 본질적으로 동일한 에피토프에 결합하는, 항체 또는 이의 단편.
3. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은
   a) δ3-08, δ3-20, δ3-23, δ3-31, δ3-42, δ3-47 및 δ3-58로 이루어진 군으로부터 선택된 항체;
   b) δ3-08, δ3-23, δ3-31, δ3-42, δ3-47 및 δ3-58로 이루어진 군으로부터 선택된 항체;
   c) δ3-08, δ3-23, δ3-42 및 δ3-58로 이루어진 군으로부터 선택된 항체;
   d) δ3-23, δ3-42 및 δ3-58로 이루어진 군으로부터 선택된 항체;
   e) δ3-31 및 δ3-42로 이루어진 군으로부터 선택된 항체;
   f) 항체 δ3-08; 또는
   g) 항체 δ3-31과 동일한 에피토프에 결합하는, 항체 또는 이의 단편.
4. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은
   a) δ3-08, δ3-20, δ3-23, δ3-31, δ3-42, δ3-47 및 δ3-58로 이루어진 군으로부터 선택된 항체;
   b) δ3-08, δ3-23, δ3-31, δ3-42, δ3-47 및 δ3-58로 이루어진 군으로부터 선택된 항체;
   c) δ3-08, δ3-23, δ3-42 및 δ3-58로 이루어진 군으로부터 선택된 항체;
   d) δ3-23, δ3-42 및 δ3-58로 이루어진 군으로부터 선택된 항체;
   e) δ3-31 및 δ3-42로 이루어진 군으로부터 선택된 항체;
   f) 항체 δ3-08; 또는
   g) 항체 δ3-31의 상보성 결정 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 단편.
5. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 γδ TCR의 Vδ3에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 단편.
6. 제5항에 있어서, 상기 항체는 Vδ3의 γ-사슬 결합 계면에 원위인 영역에 결합하는, 항체.
7. 제5항에 있어서, 상기 항체는 IMGT 명명법에 따라 γδ TCR의 Vδ3의 β 가닥 D 및 E에 결합하는, 항체.
8. 제5항에 있어서, 상기 항체는 IMGT 명명법에 따라 γδ TCR의 Vδ3의 β 가닥 C'' 및 D 및 β 가닥 E와 F 사이의 루프에 결합하는, 항체.
9. 제5항에 있어서, 상기 항체는 IMGT 명명법에 따라 γδ TCR의 Vδ3의 β 가닥 A, B, D, 및 E에 결합하는, 항체.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 γδ T 세포와 αβ T 세포를 포함하는 혼합된 세포 집단에서의 αβ T 세포와 비교하여 δ3 γδ T 세포를 선택적으로 증식시키는, 항체 또는 이의 단편.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 δ3 γδ TCR에 결합된, 항체 또는 이의 단편.
12. 제11항에 있어서, 상기 δ3 γδ TCR은 δ3 γδ T 세포의 표면에서 발현된, 항체 또는 이의 단편.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 인공 항원 제시 세포(aAPC: artificial antigen presenting cell)와 같은 항원 제시 세포(APC: antigen presenting cell)의 세포외 표면에 결합된, 항체 또는 이의 단편.
14. 제13항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 상기 APC 또는 aAPC의 막(membrane)에 고정된, 항체 또는 이의 단편.
15. 제13항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편의 Fc 영역은 상기 APC 또는 aAPC에 의해 발현된 Fc-수용체에 결합된, 항체 또는 이의 단편.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은
    a) δ3-08, δ3-20, δ3-23, δ3-31, δ3-42, δ3-47 및 δ3-58로 이루어진 군으로부터 선택된 항체;
    b) δ3-08, δ3-23, δ3-31, δ3-42, δ3-47 및 δ3-58로 이루어진 군으로부터 선택된 항체;
    c) δ3-08, δ3-23, δ3-42 및 δ3-58로 이루어진 군으로부터 선택된 항체;
    d) δ3-23, δ3-42 및 δ3-58로 이루어진 군으로부터 선택된 항체;
    e) δ3-31 및 δ3-42로 이루어진 군으로부터 선택된 항체;
    f) 항체 δ3-08; 또는
    g) 항체 δ3-31에 대한 결합에 대해 경쟁하는, 항체 또는 이의 단편.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 δ3 γδ T 세포의 특이적 활성자인, 항체 또는 이의 단편.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편 중 어느 하나를 암호화하는 핵산으로서,
    상기 핵산은 이종성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 핵산.
19. 숙주 세포로서,
    제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편 중 어느 하나 또는 제18항에 따른 핵산을 포함하는 숙주 세포.
20. 제19항에 있어서, 상기 숙주 세포는 인공 항원 제시 세포(aAPC)인, 숙주 세포.
21. δ3 γδ TCR에 특이적인 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 생산하는 방법으로서,
    제19항의 숙주 세포를 상기 항체 또는 이의 단편을 생산하기에 충분한 조건 하에 배양하는 단계를 포함하는 방법.
22. 농후화된(enriched) γδ T 세포 집단을 생산하기 위한 생체외 방법으로서,
    γδ T 세포를 포함하는 제1 세포 집단을 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 항체 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
23. 제22항에 있어서, 상기 제1 세포 집단은 αβ T 세포와 γδ T 세포를 포함하는 단리된 혼합된 세포 집단인, 방법.
24. 제23항에 있어서, 상기 제1 세포 집단은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC: peripheral blood mononuclear cell)의 샘플이거나 이를 포함하는, 방법.
25. 제23항에 있어서, 상기 제1 세포 집단은 말초 혈액 샘플, 백혈구세포채집술 샘플, 제대혈 샘플, 종양 샘플 또는 조직 샘플로부터 선택되는, 방법.
26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 세포 집단은 1% 미만의 δ3 γδ T 세포를 포함하는, 방법.
27. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 세포 집단은 비배양된 1차 세포 또는 비계대배양된 1차 세포를 포함하는, 방법.
28. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 단리된 혼합된 세포 집단을 상기 하나 이상의 항체 또는 이의 단편과 직접 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
29. 제22항에 있어서, 상기 제1 세포 집단은 하나 이상의 조작된 γδ T 세포를 포함하는 집단인, 방법.
30. 제22항 또는 제29항에 있어서, 상기 제1 세포 집단은 증식된 γδ T 세포의 제1 집단인, 방법.
31. 제30항에 있어서, 상기 방법은 제1 γδ T 세포 증식 및 제2 γδ T 세포 증식을 포함하는, 방법.
32. 제22항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 적어도 10⁸개의 δ3 γδ T 세포를 포함하는 농후화된 γδ T 세포 집단을 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
33. 제32항에 있어서, 적어도 10⁸개의 δ3 γδ T 세포를 포함하는 농후화된 γδ T 세포 집단은 12일 내지 21일 내에 생산되는, 방법.
34. 제22항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 제1 세포 집단에서의 δ3 γδ T 세포를 적어도 1,000배, 바람직하게는 적어도 5,000배, 더 바람직하게는 적어도, 또는 약, 또는 적어도 약, 10,000배 증식시키는 단계를 포함하는, 방법.
35. 제34항에 있어서, 기재된 배수 증식은 12일 내지 21일 내에 달성되는, 방법.
36. 농후화된 γδ T 세포 집단을 생산하기 위한 생체외 방법으로서,
    a) γδ T 세포를 포함하는 제1 세포 집단을 γδ T 세포를 활성화하고 증식시키는 하나 이상의 제1 활성화 제제와 접촉시켜 증식된 제1 γδ T 세포 집단을 생산하는 단계; 및
    b) 상기 증식된 제1 γδ T 세포 집단을 γδ T 세포를 활성화하고 증식시키는 하나 이상의 제2 활성화 제제와 접촉시켜 상기 농후화된 γδ T 세포 집단을 생산하는 단계를 포함하고,
    상기 하나 이상의 제1 활성화 제제 중 적어도 하나 또는 상기 하나 이상의 제2 활성화 제제 중 적어도 하나는 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편인, 방법.
37. 제36항에 있어서, 상기 방법은 a) 후에 및 b) 전에 상기 증식된 제1 γδ T 세포 집단을 단리시키는 단계를 포함하는, 방법.
38. 제36항 또는 제37항에 있어서, a)는 항원 제시 세포(APC) 및 상기 하나 이상의 제1 활성화 제제의 존재 하에 상기 제1 세포 집단을 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
39. 제36항 또는 제37항에 있어서, b)는 항원 제시 세포(APC) 및 상기 하나 이상의 제2 활성화 제제의 존재 하에 상기 증식된 제1 γδ T 세포 집단을 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
40. 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 세포 집단은 αβ T 세포와 γδ T 세포를 포함하는 단리된 혼합된 세포 집단인, 방법.
41. 제40항에 있어서, 상기 제1 세포 집단은 말초 혈액 샘플, 백혈구세포채집술 샘플, 제대혈 샘플, 종양 샘플 또는 조직 샘플로부터 선택되는, 방법.
42. 제40항에 있어서, 상기 제1 세포 집단은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 샘플이거나 이를 포함하는, 방법.
43. 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 세포 집단은 비배양된 1차 세포, 비계대배양된 1차 세포를 포함하는, 방법.
44. 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 세포 집단은 조작된 γδ T 세포의 집단인, 방법.
45. 제36항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 증식된 제1 γδ T 세포 집단을 유전적으로 변형시키거나 상기 농후화된 γδ T 세포 집단을 유전적으로 변형시키는 단계를 포함하는, 방법.
46. 제36항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 적어도 10⁸개의 δ3 γδ T 세포를 포함하는 농후화된 γδ T 세포 집단을 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
47. 제46항에 있어서, 적어도 10⁸개의 δ3 γδ T 세포를 포함하는 농후화된 γδ T 세포 집단은 12일 내지 21일 내에 생산되는, 방법.
48. 제36항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 제1 세포 집단에서의 δ3 γδ T 세포를 적어도 1,000배, 바람직하게는 적어도 5,000배, 더 바람직하게는 적어도, 또는 약, 또는 적어도 약, 10,000배 증식시키는 단계를 포함하는, 방법.
49. 제48항에 있어서, 기재된 배수 증식은 12일 내지 21일 내에 달성되는, 방법.
50. 제36항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 활성화 제제 중 적어도 하나는 상기 하나 이상의 제2 활성화 제제 중 적어도 하나와 구조적으로 동일한, 방법.
51. 제36항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 활성화 제제 중 적어도 하나는 상기 하나 이상의 제2 활성화 제제 중 적어도 하나와 구조적으로 상이한, 방법.
52. 제36항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 활성화 제제 중 적어도 하나 또는 상기 하나 이상의 제2 활성화 제제 중 적어도 하나는 부동화된, 방법.
53. 제52항에 있어서, 부동화된 활성화 제제는 배양 용기의 표면에 부동화된, 방법.
54. 제52항에 있어서, 부동화된 활성화 제제는 항원 제시 세포(APC) 또는 인공 항원 제시 세포(aAPC)의 표면에 부동화된, 방법.
55. 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 부동화된 활성화 제제는 δ3 γδ TCR에 특이적인 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 단편인, 방법.
56. 제22항 내지 제35항 또는 제36항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 αβ T 세포 고갈 전에 또는 이의 부재 하에 30% 초과, 바람직하게는 40% 초과의 δ3 γδ T 세포를 달성하는, 방법.
57. 증식된 γδ T 세포 집단으로서, 상기 증식된 γδ T 세포의 30% 초과, 바람직하게는 40% 초과, 더 바람직하게는 60% 초과, 훨씬 더 바람직하게는 70% 초과, 더욱 더 바람직하게는 80% 초과가 δ3 γδ T 세포인, 증식된 γδ T 세포 집단.
58. 제57항에 있어서, 상기 증식된 γδ T 세포 집단은 다중클론 TCR 다양성을 포함하는, 증식된 γδ T 세포 집단.
59. 제58항에 있어서, δ3 T-세포의 60% 또는 70% 초과는 표현형 CD45RA+/CD27+ 및/또는 CD45RA-/CD27+를 발현하는, 증식된 γδ T 세포 집단.
60. 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 침윤 림프구로부터 유래된, 증식된 γδ T 세포 집단.
61. 제57항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 γδ T-세포는 내인성 또는 이종성 종양 인식 모이어티를 발현하는, 증식된 γδ T 세포 집단.
62. 제57항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 집단은 치료학적 유효량의 γδ T-세포를 포함하는, 증식된 γδ T 세포 집단.
63. 제57항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 γδ T 세포 집단은 NKp30 활성, NKp44 활성, 및/또는 NKp46 활성에 독립적인 항종양 세포독성을 포함하는, 증식된 γδ T 세포 집단.
64. 제63항에 있어서, 상기 γδ T 세포 집단은 NKp30 활성-의존적 항종양 세포독성, NKp44 활성-의존적 항종양 세포독성, 및/또는 NKp46 활성-의존적 항종양 세포독성을 포함하지 않는, 증식된 γδ T 세포 집단.
65. 제57항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 γδ T 세포의 40% 미만이 검출 가능한 수준의 NKp30, NKp44, 및/또는 NKp46을 발현하는, 증식된 γδ T 세포 집단.
66. 증식된 γδ T 세포 집단으로서,
    a) 제22항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 방법; 또는
    b) 제36항 내지 제56항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산된, 증식된 γδ T 세포 집단.
67. 암, 염증성 질병 또는 자가면역 질병의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암, 염증성 질병 또는 자가면역 질병을 치료하는 방법으로서, 치료학적 유효량의 δ3 γδ T 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
68. 암, 염증성 질병 또는 자가면역 질병의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암, 염증성 질병 또는 자가면역 질병을 치료하는 방법으로서,
    a) 제57항 내지 제66항 중 어느 한 항에 따른 δ3 γδ T 세포의 치료학적 유효량을 제공하는 단계; 및
    b) 상기 δ3 γδ T 세포의 치료학적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
69. 제68항에 있어서, 상기 방법은 증식된 γδ T 세포 집단을 제2 증식된 γδ T 세포 집단과 혼합하여 혼합된 집단을 형성하는 단계 및 상기 혼합된 집단을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
70. 제69항에 있어서, 상기 제2 증식된 γδ T 세포 집단은 60% 초과의 δ1 또는 60% 초과의 δ2 γδ T 세포를 포함하는, 방법.
71. 제69항에 있어서, 혼합된 γδ T 세포 집단은 60% 초과의 δ1 또는 60% 초과의 δ2 γδ T 세포를 포함하는, 방법.
72. 제69항에 있어서, 혼합된 γδ T 세포 집단은 60% 초과의 δ3 γδ T 세포를 포함하는, 방법.

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