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KR20200095534A - 발효에 의한 (6e)-8-히드록시제라니올의 제조를 위해 조작된 생합성 경로 - Google Patents

발효에 의한 (6e)-8-히드록시제라니올의 제조를 위해 조작된 생합성 경로 Download PDF

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KR20200095534A
KR20200095534A KR1020207019339A KR20207019339A KR20200095534A KR 20200095534 A KR20200095534 A KR 20200095534A KR 1020207019339 A KR1020207019339 A KR 1020207019339A KR 20207019339 A KR20207019339 A KR 20207019339A KR 20200095534 A KR20200095534 A KR 20200095534A
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KR
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Application number
KR1020207019339A
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English (en)
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캐라 트레이스웰
스티븐 에드가
스테판 티모센코
알렉산더 시어러
Original Assignee
지머젠 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

본 개시는 (6E)-8-히드록시제라니올의 발효 생산을 위한 미생물 세포의 조작을 기술하고, 신규한 조작된 미생물 세포 및 배양물을 비롯하여 관련 (6E)-8-히드록시제라니올 제조 방법을 제공한다.

Description

발효에 의한 (6E)-8-히드록시제라니올의 제조를 위해 조작된 생합성 경로
관련 출원에 관한 교차 참조
본 출원은 2017년 12월 7일 출원된 미국 가출원 제62/596,013호의 우선권을 청구하고, 이의 전문을 참조로 본 명세서에 편입시킨다.
정부 지원 연구 및 개발 하에 수행된 본 발명의 권리에 관한 진술
본 발명은 DARPA가 수여하는 협약 번호 HR0011-15-9-0014 하의 정부 지원으로 수행되었다. 정부는 본 발명의 일정 권리를 갖는다.
서열 목록의 참조에 의한 편입
본 출원은 ASCII 형식으로 전자 제출된 서열 목록을 포함하고 그 전문을 참조로 본 명세서에 편입시킨다. 2018년 12월 5일 생성된 이 ASCII 사본은 명칭이 2018-12-05_ZMGNP007WO_SeqList_ST25.txt이고 크기는 327,680 바이트이다.
기술분야
본 개시는 일반적으로 발효에 의한 (6E)-8-히드록시제라니올의 제조를 위한 조작된 미생물 분야에 관한 것이다.
(6E)-8-히드록시제라니올 (8-히드록시제라니올)은 자연계에 존재하는 것으로 알려진 비환식 모노테르펜이다. 화학 합성에 의한 테르펜의 제조 방법은 공지되어 있다 (미국 특허 제4,107,219호). (6E)-8-히드록시제라니올은 핵심 대사산물 전구체 아세틸-CoA를 기반으로, 메발로네이트 생합성 경로로부터 유래된다 (도 1). 메발로네이트 생합성 경로에서 HMG-CoA 리덕타제는 피드백 억제를 겪는다 [1, 2]. 8-히드록시제라니올은 모노테르펜 인돌 알칼로이드 [3] 및 모노테르펜 글리코시드에 대한 전구체이다 (JP2013158298A [4]; 미국 특허 제9,518,282호). 테르펜은 신규한 폴리에스테르 물질을 제조하는데 사용되어 왔다 [5]. 열-봉합성 테르펜 중합체 필름이 제조되었다 (미국 특허 제3,278,646호). 수첨 테르펜은 중합체 블렌드에서 사용되었다 (미국 특허 제3,361,849호). 테르펜 수지 및 테르펜-페놀 수지가 제조되었고 자동차 산업용 코팅 보호 필름으로서 사용되었다 (미국 특허 제5,643,676호). 테르펜은 포장 필름 재료로서 사용을 위해 고수분 장벽 성질을 갖는 연신 폴리프로필렌 필름에 혼입되었다 (미국 특허 제5,500,282호).
본 개시는 하기를 포함하여, 조작된 미생물 세포, 미생물 세포의 배양물, 및 (6E)-8-히드록시제라니올의 제조 방법을 제공한다:
실시형태 1: 조작된 미생물 세포로서, 조작된 미생물 세포는 (a) 비천연 제라닐 디포스페이트 디포스파타제 (제라니올 신타제); 및 (b) 비천연 제라니올-8-히드록실라제를 발현하고; 조작된 미생물 세포는 (6E)-8-히드록시제라니올을 생산한다.
실시형태 2: 실시형태 1의 조작된 미생물 세포로서, 조작된 미생물 세포는 하나 이상의 상류 (6E)-8-히드록시제라니올 경로 효소(들) 또는 상류 경로 활성의 조절인자의 증가된 활성을 포함하고, 상기 증가된 활성은 대조군 세포에 비해서 증가되는 것이다.
실시형태 3: 실시형태 2의 조작된 미생물 세포로서, 하나 이상의 상류 (6E)-8-히드록시제라니올 경로 효소(들)는 ATP-시트레이트 신타제, 아세틸-CoA 신써타제, 티올라제, 히드록시메틸글루타릴 조효소 A 신타제 (HMG-CoA 신타제), 히드록시메틸글루타릴 조효소 A 리덕타제 (HMG-CoA 리덕타제), 메발로네이트 키나제, 포스포메발로네이트 키나제, 디포스포메발로네이트 디카복실라제, 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이소머라제, 및 제라닐 디포스페이트 신타제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시형태 4: 실시형태 3의 조작된 미생물 세포로서, 하나 이상의 상류 (6E)-8-히드록시제라니올 경로 효소(들)는 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이소머라제를 포함한다.
실시형태 5: 실시형태 1-4 중 어느 하나의 조작된 미생물 세포로서, 조작된 미생물 세포는 하나 이상의 (6E)-8-히드록시제라니올 경로 전구체를 소모하는 하나 이상의 효소(들)의 감소된 활성을 포함하고, 상기 감소된 활성은 대조군 세포에 비해서 감소되는 것이다.
실시형태 6: 실시형태 5의 조작된 미생물 세포로서, 하나 이상의 (6E)-8-히드록시제라니올 경로 전구체를 소모하는 하나 이상의 효소(들)는 이기능성 (2E,6E)-파르네실 디포스페이트 신타제/디메틸알릴트랜스트랜스퍼라제 및/또는 제라닐 파이로포스페이트 신타제를 포함한다.
실시형태 7: 실시형태 1-6 중 어느 하나의 조작된 미생물 세포로서, 조작된 미생물 세포는 피드백-탈조절 HMG-CoA 리덕타제를 추가로 발현한다.
실시형태 8: 실시형태 1-7 중 어느 하나의 조작된 미생물 세포로서, 조작된 미생물 세포는 대조군 세포에 비해서, 더 높은 속도의 아세틸-CoA 합성 및/또는 더 낮은 속도의 아세틸-CoA 분해에 기인하여, 아세틸-CoA의 증가된 이용률을 포함한다.
실시형태 9: 조작된 미생물 세포로서, 조작된 미생물 세포는 (a) 비천연 천연 제라닐 디포스페이트 디포스파타제 (제라니올 신타제)를 발현시키기 위한 수단; 및 (b) 비천연 제라니올-8-히드록실라제를 발현시키기 위한 수단을 포함하고, 조작된 미생물 세포는 (6E)-8-히드록시제라니올을 생산한다.
실시형태 10: 실시예 9의 조작된 미생물 세포로서, 조작된 미생물 세포는 하나 이상의 상류 (6E)-8-히드록시제라니올 경로 효소(들) 또는 상류 경로 활성의 조절인자의 활성을 증가시키기 위한 수단을 포함한다.
실시형태 11: 실시형태 10의 조작된 미생물 세포로서, 하나 이상의 상류 (6E)-8-히드록시제라니올 경로 효소(들)는 ATP-시트레이트 신타제, 아세틸-CoA 신써타제, 티올라제, 히드록시메틸글루타릴 조효소 A 신타제 (HMG-CoA 신타제), 히드록시메틸글루타릴 조효소 A 리덕타제 (HMG-CoA 리덕타제), 메발로네이트 키나제, 포스포메발로네이트 키나제, 디포스포메발로네이트 디카복실라제, 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이소머라제, 및 제라닐 디포스페이트 신타제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시형태 12: 실시형태 11의 조작된 미생물 세포로서, 하나 이상의 상류 (6E)-8-히드록시제라니올 경로 효소(들)는 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이소머라제를 포함한다.
실시형태 13: 실시형태 9-12 중 어느 하나의 조작된 미생물 세포로서, 조작된 미생물 세포는 하나 이상의 (6E)-8-히드록시제라니올 경로 전구체를 소모하는 하나 이상의 효소(들)의 활성을 감소시키기 위한 수단을 포함하고, 상기 감소된 활성은 대조군 세포에 비해 감소되는 것이다.
실시형태 14: 실시형태 13의 조작된 미생물 세포로서, 하나 이상의 (6E)-8-히드록시제라니올 경로 전구체를 소모하는 하나 이상의 효소(들)는 이기능성 (2E,6E)-파르네실 디포스페이트 신타제/디메틸알릴트랜스트랜스퍼라제 및/또는 제라닐 파이로포스페이트 신타제를 포함한다.
실시형태 15: 실시형태 9-14 중 어느 하나의 조작된 미생물 세포로서, 조작된 미생물 세포는 피드백-탈조절 HMG-CoA 리덕타제를 발현시키기 위한 수단을 추가로 포함한다.
실시형태 16: 실시형태 9-15 중 어느 하나의 조작된 미생물 세포로서, 조작된 미생물 세포는 대조군 세포에 비해서, 더 높은 속도의 아세틸-CoA 합성 및/또는 더 낮은 속도의 아세틸-CoA 분해에 기인하여 아세틸-CoA의 이용률을 증가시키기 위한 수단을 포함한다.
실시형태 17: 실시형태 1-16 중 어느 하나의 조작된 미생물 세포로서, 조작된 미생물 세포는 진균 세포를 포함한다.
실시형태 18: 실시형태 17의 조작된 미생물 세포로서, 조작된 미생물 세포는 효모 세포를 포함한다.
실시형태 19: 실시형태 18의 조작된 미생물 세포로서, 효모 세포는 사카로마이세스 (Saccharomyces) 속의 세포이다.
실시형태 20: 실시형태 19의 조작된 미생물 세포로서, 효모 세포는 세레비지아 (cerevisiae) 종의 세포이다.
실시형태 21: 실시형태 18의 조작된 미생물 세포로서, 효모 세포는 야로위아 (Yarrowia) 속의 세포이다.
실시형태 22: 실시형태 21의 조작된 미생물 세포로서, 효모 세포는 리폴리티카 (lipolytica) 종의 세포이다.
실시형태 23: 실시형태 1-22 중 어느 하나의 조작된 미생물 세포로서, 비천연 제라니올 신타제는 페릴라 세토이엔시스 (Perilla setoyensis) 유래 제라니올 신타제와 적어도 70% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제라니올 신타제를 포함한다.
실시형태 24: 실시형태 1-22 중 어느 하나의 조작된 미생물 세포로서, 비천연 제라니올 신타제는 비티스 비니페라 (Vitis vinifera) 유래 제라니올 신타제와 적어도 70% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제라니올 신타제를 포함한다.
실시형태 25: 실시형태 1-23 중 어느 하나의 조작된 미생물 세포로서, 비천연 제라니올-8-히드록실라제는 파세올러스 안굴라리스 (Phaseolus angularis) 유래 제라니올-8-히드록실라제와 적어도 70% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제라니올-8-히드록실라제를 포함한다.
실시형태 26: 실시형태 4 또는 12-25 중 어느 하나의 조작된 미생물 세포로서, 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이소머라제의 증가된 활성은 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이소머라제를 이종으로 발현시켜 획득된다.
실시형태 27: 실시형태 26의 조작된 미생물 세포로서, 이종성 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이소머라제는 사카로마이세스 세레비지아 (Saccharomyces cerevisiae) 유래 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이소머라제와 적어도 70% 아미노산 서열 동일성을 갖는 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이소머라제를 포함한다.
실시형태 28: 실시형태 6, 및 14-27 중 어느 하나의 조작된 미생물 세포로서, 하나 이상의 (6E)-8-히드록시제라니올 경로 전구체를 소모하는 하나 이상의 효소(들)는 이기능성 (2E,6E)-파르네실 디포스페이트 신타제/디메틸알릴트랜스트랜스퍼라제를 포함한다.
실시형태 29: 실시형태 28의 조작된 미생물 세포로서, 이기능성 (2E,6E)-파르네실 디포스페이트 신타제/디메틸알릴트랜스트랜스퍼라제는 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli) 유래 이기능성 (2E,6E)-파르네실 디포스페이트 신타제/디메틸알릴트랜스트랜스퍼라제와 적어도 70% 아미노산 동일성을 가지고, 아미노산 치환 S80F를 포함한다.
실시형태 30: 실시형태 7, 또는 15-27 중 어느 하나의 조작된 미생물 세포로서, HMG-CoA 리덕타제는 에스. 세레비지아 (S. cerevisiae) HMG-CoA 리덕타제의 변이체이다.
실시형태 31: 실시형태 1-30 중 어느 하나의 조작된 미생물 세포로서, 배양했을 때, 조작된 미생물 세포는 (6E)-8-히드록시제라니올을 100 ㎍/배양 배지 L 를 초과하는 수준으로 생산한다.
실시형태 32: 실시형태 1-31 중 어느 하나에 따른 조작된 미생물 세포의 배양물.
실시형태 33: 실시형태 32의 배양물로서, 기질은 우레아, 암모늄 염, 암모니아, 및 이의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질소원, 및 탄소원을 포함한다.
실시형태 34: 실시형태 32-33 중 어느 하나의 배양물로서, 조작된 미생물 세포는 배양물이 10-500의 600 nm에서의 광학 밀도를 갖는 농도로 존재한다.
실시형태 35: 실시형태 32-34 중 어느 하나의 배양물로서, 배양물은 (6E)-8-히드록시제라니올을 포함한다.
실시형태 36: 실시형태 32-35 중 어느 하나의 배양물로서, 배양물은 (6E)-8-히드록시제라니올을 100 ㎍/배양 배지 L를 초과하는 수준으로 포함한다.
실시형태 37: 실시형태 1-31 중 어느 하나에 따른 조작된 미생물 세포를 배양하는 방법으로서, 방법은 (6E)-8-히드록시제라니올을 생산하는데 적합한 조건 하에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
실시형태 38: 실시형태 37의 방법으로서, 방법은 1-100 g/L 범위의 초기 글루코스 수준에 이어서, 제어된 당 공급이 후속되는, 유가 배양을 포함한다.
실시형태 39: 실시형태 37 또는 실시형태 38의 방법에서, 발효 기질은 우레아, 암모늄 염, 암모니아, 및 이의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질소원, 및 글루코스를 포함한다.
실시형태 40: 실시형태 37-39 중 어느 하나의 방법에서, 배양물은 배양 단계 동안 pH-제어된다.
실시형태 41: 실시형태 37-40 중 어느 하나의 방법에서, 배양물은 배양 단계 동안 통기된다.
실시형태 42: 실시형태 37-41 중 어느 하나의 방법에서, 조작된 미생물 세포는 (6E)-8-히드록시제라니올을 100 ㎍/배양 배지 L를 초과하는 수준으로 생산한다.
실시형태 43: 실시형태 37-42 중 어느 하나의 방법에서, 방법은 (6E)-8-히드록시제라니올을 배양물로부터 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
실시형태 44: (6E)-8-히드록시제라니올을 생산하도록 조작된 미생물 세포를 사용하여 (6E)-8-히드록시제라니올을 제조하는 방법으로서, 방법은 (a) 비천연 제라닐 디포스페이트 디포스파타제 (제라니올 신타제)를 미생물 세포를 발현시키는 단계; (b) 비천연 제라니올-8-히드록실라제를 미생물 세포에서 발현시키는 단계; (c) 미생물 세포를 미생물 세포가 (6E)-8-히드록시제라니올을 생산할 수 있게 하는 조건 하의 적합한 배양 배지에서 배양시키는 단계로서, (6E)-8-히드록시제라니올이 배양 배지로 방출되는 것인 단계; 및 (d) (6E)-8-히드록시제라니올을 배양 배지로부터 단리하는 단계를 포함한다.
도 1: 발효에 의해 (6E)-8-히드록시제라니올을 생산하기 위한 경로.
도 2: 1차 라운드의 조작된 숙주 사카로마이세스 세레비지아에 의한 발효 후 세포외 액체배지에서 측정된 (6E)-8-히드록시제라니올 역가 (또한 실시예 1, 표 1 참조).
도 3: 2차 라운드의 조작된 숙주 에스. 세레비지아에 의한 발효 후 세포외 액체배지에서 측정된 (6E)-8-히드록시제라니올 역가 (또한 실시예 1, 표 2 참조).
도 4: 1차 라운드의 조작된 숙주 야로위아 리폴리티카에 의한 발효 후 세포외 액체배지에서 측정된 (6E)-8-히드록시제라니올 역가 (또한 실시예 2, 표 4 참조).
도 5: 숙주 평가를 위해 에스. 세레비지아에서 발효 후 세포외 액체배지에서 측정된 (6E)-8-히드록시제라니올 역가 (또한 실시예 3, 표 5 참조).
도 6: 4차 (개선) 라운드 균주에 대한 에스. 세레비지아에서 발효 후 세포외 액체배지에서 측정된 (6E)-8-히드록시제라니올 역가 (또한 실시예 1, 표 3 참조).
도 7: 에스. 세레비지아 및 야로위아 리폴리티카로 프로모터-유전자-종결인자의 통합.
도 8: 에스. 세레비지아 및 와이. 리폴리티카에서 프로모터 치환.
도 9: 에스. 세레비지아 및 와이. 리폴리티카에서 표적화 유전자 결실.
생물학적 발효에 의한 (6E)-8-히드록시제라니올과 같은 디-알콜의 생산은 단량체를 오래된 것뿐만 아니라, 새롭게 확인된 재료 응용분야에 경제적으로 접근가능하게 만들 수 있다. 디-알콜 함유 중합체는 신규 재료 응용분야에 매력적인 성질을 갖는다.
우리는 산업적 숙주 유기체에서 물질대사 경로가 (6E)-8-히드록시제라니올을 생산할 수 있게 하는 효소를 동정하기 위해 물질대사 검색 [1]을 수행하였다 (표 1 참조). (6E)-8-히드록시제라니올의 생산을 조작하기 위해서 산업 미생물은 DNA 서열을 조작하기 위한 방법 및 유전자 조작 도구를 요구하였다 (도 7-9 참조). 다음으로, 미생물 물질대사는 단일-유전자 및 단일-유전자 변형을 사용한 반복적인 고속 대량 (HTP) 균주 조작을 통해서, 모든 생화학적 반응 또는 물질대사 조절 방식이 특징규명되지 않은 산업 숙주를 포함하여, (6E)-8-히드록시제라니올을 생산하도록 조직적으로 재조작되었다 (예를 들어, HTP 균주 조작 방법의 경우, 공동 소유의 공계류 중인 미국 공개 특허 출원 제0170159045호를 참조하고, 또한, 티라민 생산을 위한 미생물의 조작을 예시하는 공동 소유의 공계류중인 미국 특허 출원 제62/455,428호 참조).
상기 언급된 바와 같이, (6E)-8-히드록시제라니올은 테르페노이드 경로로부터 물질대사적으로 생산되는 모노테르펜이다. 미생물에는 2종의 테르페노이드 생합성 경로: 메발로네이트 경로 및 비-메발로네이트 경로가 존재한다. 사카로마이세스 세레비지아 및 야로위아 리폴리티카 둘 모두는 테르펜의 생산을 위해 메발로네이트 경로를 사용한다 [2].
본 개시는 (6E)-8-히드록시제라니올의 발효 생산을 위한 미생물 세포의 조작을 기술하고 신규의 조작된 미생물 세포 및 배양물을 비롯하여, 관련된 (6E)-8-히드록시제라니올 제조 방법을 제공한다.
정의
청구항 및 명세서에서 사용되는 용어는 달리 명시하지 않으면 하기 기재된 대로 정의된다.
용어 "발효"는 임의의 화학적 전환 단계를 필요로 하지 않고, 하나 이상의 생물학적 전환 단계를 통해서, 미생물 세포가 하나 이상의 기질(들)을 바람직한 생성물 (예컨대 (6E)-8-히드록시제라니올)로 전환시키는 과정을 의미하고자 본 명세서에서 사용된다.
용어 "조작된"은 천연 발생 세포와 조작된 세포를 구별하는 사람에 의해 도입된 적어도 하나의 표적화된 유전자 변경을 세포가 함유한다는 것을 의미하고자, 세포를 참조하여, 본 명세서에서 사용된다.
용어 "천연"은 특정한 세포에서 천연적으로 존재하는, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 같은 세포 성분을 의미하고자 본 명세서에서 사용된다. 천연 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 세포에 내생적이다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 참조하여 사용될 때, 용어 "비천연"은 특정 세포에서 천연적으로 존재하지 않은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다.
유전자가 발현되는 상황을 참조하여 사용될 때, 용어 "비천연"은 천연적으로 발현되는 게놈 및 세포 상황 이외의 임의 상황에서 발현되는 유전자를 의미한다. 비천연 방식으로 발현되는 유전자는 숙주 세포에서 상응하는 유전자와 동일한 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있지만, 천연 유전자의 유전자좌와 상이한 게놈 내 통합점 또는 벡터로부터 발현될 수 있다.
용어 "이종성"은 숙주 세포로 도입되는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 설명하고자 본 명세서에서 사용된다. 이 용어는 숙주 세포와 상이한 유기체, 종 또는 균주로부터 유래되는, 각각 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 포괄한다. 이러한 경우에, 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 동일한 숙주 세포에 존재하는 임의 서열(들)과 상이한 서열을 갖는다. 그러나, 이 용어는 또한 숙주 세포에 존재하는 서열과 동일한 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 포괄하고, 여기서 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 천연 서열과 상이한 상황에서 존재한다 (예를 들어, 이종성 폴리뉴클레오티드는 상이한 프로모터에 연결될 수 있고 천연 서열과 상이한 게놈 위치에 삽입될 수 있음). 따라서 "이종성 발현"은 숙주 세포에 비천연인 서열의 발현을 비롯하여, 비천연 상황에서 숙주 세포에 천연인 서열의 발현을 포괄한다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 참조하여 사용시, 용어 "야생형"은 분자의 공급원과 무관하게, 뉴클레오티드 서열을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드, 또는 아미노산을 갖는 폴리펩티드, 천연 발생 유기체 유래 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 존재하는 서열을 의미하고; 다시 말해서, 용어 "야생형"은 분자가 천연 공급원으로 정제되거나; 재조합적으로 발현 후 정제되거나; 또는 합성되거나 여부와 무관한, 서열 특징을 의미한다. 용어 "야생형"은 또한 천연 발생 세포를 의미하고자 사용된다.
"대조군 세포"는 조작된 세포와 동일한 속 및 종인 것을 포함하여, 시험되는 조작된 세포와 동일하지만, 조작된 세포에서 시험되는 특이적 유전자 변이(들)는 결여된 세포이다.
효소는 본 명세서에서 그들이 촉매하는 반응으로 식별되고, 달리 표시하지 않으면, 식별되는 반응을 촉매할 수 있는 임의의 폴리펩티드를 의미한다. 달리 표시하지 않으면, 효소는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있고 천연 또는 돌연변이 아미노산 서열을 가질 수 있다. 충분히 공지된 바와 같이, 효소는 때때로 그들이 유래되는 유기체 공급원에 따라서, 복수의 기능 및/또는 복수의 명칭을 가질 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 효소 명칭은 하나 이상의 추가적인 기능 또는 상이한 명칭을 가질 수 있는 효소를 포함하여, 오솔로그를 포괄한다.
용어 "피드백-탈조절"은 특정 세포에서 정상적으로 효소 경로의 하류 생성물에 의해 음성적으로 조절 (즉, 피드백-억제)되는 효소를 참조하여 본 명세서에서 사용된다. 이러한 문맥에서, "피드백-탈조절" 효소는 세포에 천연인 천연 효소에 비해 피드백-억제에 덜 민감한 효소의 형태이다. 피드백-탈조절 효소는 천연 효소에 하나 이상의 돌연변이를 도입시켜 생성시킬 수 있다. 대안적으로, 피드백-탈조절 효소는 단순히, 특정한 미생물 세포에 도입되었을 때, 천연의, 천연 효소만큼 피드백-억제에 민감하지 않은 이종성, 천연 효소일 수 있다. 일부 실시형태에서, 피드백-탈조절 효소는 미생물 세포에서 피드백-억제를 보이지 않는다.
용어 "(6E)-8-히드록시제라니올"은 (2E,6E)-2,6-디메틸-2,6-옥타디엔-1,8-디올 (CAS#26488-97-1)을 의미한다.
둘 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 문맥에서 용어 "서열 동일성"은 서열 비교 알고리즘 또는 육안 검사를 사용하여 측정시, 최대 상응도로 비교 및 정렬했을 때, 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 명시된 백분율을 갖거나 또는 동일한 둘 이상의 서열을 의미한다.
뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 동일성의 백분율을 결정하기 위한 서열 비교의 경우에, 전형적으로 한 서열은 "시험" 서열이 비교되는 "기준 서열"로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우에, 시험 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력하고, 하위서열 좌표를 필요하다면 지정하며, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수를 지정한다. 그 다음으로 서열 비교 알고리즘이 지정된 프로그램 매개변수를 기반으로, 기준 서열에 대한 시험 서열의 서열 동일성 백분율을 계산한다. 비교를 위한 서열의 알고리즘은 디폴트 매개변수로 설정된 BLAST를 사용하여 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "역가"는 미생물 세포의 배양물을 배양 부피로 나눈 생성된 생성물 (예를 들어, (6E)-8-히드록시제라니올)의 질량을 의미한다.
세포 배양물로부터 (6E)-8-히드록시제라니올의 회수를 참조하여 본 명세서에서 사용시, "회수하는"은 세포 배양 배지의 적어도 하나의 다른 성분으로부터 (6E)-8-히드록시제라니올의 분리를 의미한다.
(6E)-8-히드록시제라니올 생산을 위해 조작된 미생물
(6E)-8-히드록시제라니올 생합성 경로
(6E)-8-히드록시제라니올은 핵심 대사산물 전구체 아세틸-CoA를 기반으로, 메발로네이트 생합성 경로로부터 유래된다. 이 경로는 도 1에 예시되어 있다. 메발로네이트 생합성 경로에서 HMG-CoA 리덕타제는 피드백 억제를 겪는다. 많은 미생물, 예컨대 사카로마이세스 세레비지아는 이 경로의 최종 2개 단계를 촉매하는 효소, 즉 제라닐 디포스페이트 디포스파타제 (제라니올 신타제) 및 제라니올-8-히드록실라제를 촉매하는 효소가 결여되어 있다. 이러한 미생물 숙주에서 (6E)-8-히드록시제라니올의 생산은 적어도 하나의 이종성 제라니올 신타제 효소 및 적어도 하나의 이종성 제라니올-8-히드록실라제의 첨가를 요구한다.
미생물 (6E)-8-히드록시제라니올 생산을 위한 조작
조작되는 미생물 세포에서 활성인 임의의 제라니올 신타제 및 제라니올-8-히드록실라제는 전형적으로 표준 유전자 조작 기술을 사용하여 효소를 코딩하는 유전자를 도입시키고 발현시켜서 세포로 도입될 수 있다. 적합한 제라니올 신타제 및 제라니올-8-히드록실라제는 식물, 고세균, 진균, 그람 양성 박테리아, 및 그람 음성 박테리아 공급원을 포함한, 임의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 예시적인 공급원은 제한없이, 페릴라 세토이엔시스 (Perilla setoyensis), 파세올러스 안굴라리스 (Phaseolus angularis), 비티스 비니페라 (Vitis vinifera) (포도), 스워티아 무소티 (Swertia mussotii) (용담), 포풀러스 트리코카르파 (Populus trichocarpa) (서부 발삼 포플러) (포풀러스 발사미페라 (Populus balsamifera) subsp. 트리코카르파 (Trichocarpa)), 파파베르 솜니페럼 (Papaver somniferum), 페트로셀리넘 크리스펌 (Petroselinum crispum), 오리자 사티바 (Oryza sativa), 메타노스파에룰라 팔루스트리스 (Methanosphaerula palustris), 메타노칼도코커스 잔나스키 (Methanocaldococcus jannaschii), 자이고사카로마이세스 바일리 (Zygosaccharomyces bailii), 페니실리움 마르네페이 (Penicillium marneffei), 탈라로마이세스 스티피타터스 (Talaromyces stipitatus), 트리코피톤 에퀴넘 (Trichophyton equinum), 프로피오니박테리움 (Propionibacterium) sp. 경구군, 엔테로코커스 패시움 (Enterococcus faecium), 스트렙토마이세스 히그로스코피커스 (Streptomyces hygroscopicus), 스트렙토마이세스 스비세우스 (Streptomyces sviceus), 모데스토박터 마리너스 (Modestobacter marinus), 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida), 시노리조비움 프레디 (Sinorhizobium fredii), 카타탄터스 로세아우스 (Cathatanthus roseaus), 제아 마이스 (Zea mays), 카타란터스 로세우스 (Catharanthus roseus) (마다가스카르 페리윙클 (Madagascar periwinkle)) (일일초 (Vinca rosea)), 페릴라 프루테센스 var. 크리스파 (Perilla frutescens var. crispa), 페릴라 프루테센스 var. 힐텔라 (Perilla frutescens var. hirtella), 신나모멈 테누이필 (Cinnamomum tenuipile) (알세오다프테 몰리스 (Alseodaphne mollis)), 오시멈 바실리컴 (Ocimum basilicum) (스위트 바질), 페릴라 시트리오도라 (Perilla citriodora), 올레아 유로파에아 (Olea europaea) (일반 올리브), 필라 둘시스 (Phyla dulcis) (아즈텍 스위트 허브) (리피아 둘시스 (Lippia dulcis)), 로사 루고사 (Rosa rugosa) (해당화), 캄프토테카 아쿠미나타 (Camptotheca acuminata) (행운목), 시트러스 잠비리 (Citrus jambhiri) (러프 레몬), 피크로리자 쿠루아 (Picrorhiza kurrooa), 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) (애기장대), 글리신 막스 (Glycine max) (대두) (글리신 히스피다 (Glycine hispida)), 베타 불가리스 (Beta vulgaris) (사탕무), 몰루고 베르티실라타 (Mollugo verticillata) (녹색 큰석류풀), 암보렐라 트리코포다 (Amborella trichopoda), 솔라넘 튜버로섬 (Solanum tuberosum) (감자), 글리신 소자 (Glycine soja) (돌콩), 반다 코에룰레아 (Vanda coerulea), 오리자 바르티 (Oryza barthii), 히페리컴 안드로사에멈 (Hypericum androsaemum) (툿산 (Tutsan), 솔라넘 리코퍼시컴 (Solanum lycopersicum) (토마토) (리코퍼시콘 에스쿨렌텀 (Lycopersicon esculentum)), 및 코페아 카네포라 (Coffea canephora) (로부스타 커피)를 포함한다.
제라니올 신타제 및 제라니올-8-히드록실라제 유전자 각각의 하나 이상의 카피가 선택된 미생물 숙주 세포에 도입될 수 있다. 하나 초과의 유전자 카피가 도입되면, 그 카피들은 동일하거나 또는 상이한 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종성 유전자(들) 중 하나 또는 둘 모두는 강력한, 항상성 프로모터로부터 발현된다. 일부 실시형태에서, 이종성 제라니올 신타제 및/또는 이종성 제라니올-8-히드록실라제 유전자는 유도성 프로모터로부터 발현된다. 이종성 유전자는 선택된 미생물 숙주 세포에서의 발현을 증강시키기 위해 임의로는 코돈 최적화될 수 있다.
실시예 1에서, 에스. 세레비지아는 페릴라 세토이엔시스 유래 제라니올 신타제 (UniProt ID C0KWV4) (SEQ ID NO:5) 및 파세올러스 안굴라리스 유래 제라니올-8-히드록실라제 (UniProt ID C6J436) (SEQ ID NO:11)를 발현시키도록 조작되어, 유전자 조작의 1차 라운드에서 37.5 ㎍/L의 (6E)-8-히드록시제라니올 역가를 산출하였다 (하기 표 1). 이러한 역가는 이소펜테닐-디포스페이트 델타3-델타2-이소머라제 (UniProt ID P15496) (SEQ ID NO:25)의 3개 카피를 추가로 발현시킨 균주에서 2차 라운드에 122.9 ㎍/L로 증가되었다.
실시예 2에서, 와이. 리폴리티카는 페릴라 세토이엔시스 유래 제라니올 신타제 (UniProt ID C0KWV4) (SEQ ID NO:99), 파세올러스 안굴라리스 유래 제라니올 8-히드록실라제 (UniProt ID A0A0L9UT99) (SEQ ID NO:115), 및 에스 세레비지아 유래 이소펜테닐-디포스페이트 델타3-델타2-이소머라제 (UniProt ID P15496) (SEQ ID NO:126)를 발현시키도록 조작되어, 310 마이크로그램/L의 (6E)-8-히드록시제라니올 역가를 산출하였다.
실시예 3에서, 에스. 세레비지아는 페릴라 세토이엔시스 유래 제라니올 신타제 (UniProt ID C0KWV4) (SEQ ID NO:99), 파세올러스 안굴라리스 유래 제라니올-8-히드록실라제 (UniProt ID C6J436), 및 에스. 세레비지아 유래 이소펜테닐-디포스페이트 델타3-델타2-이소머라제 (UniProt ID P15496) (SEQ ID NO:126)를 발현하도록 조작되어, 217 마이크로그램/L의 역가를 산출하였다.
상류 효소의 활성 증가
이러한 생산을 할 수 있는 미생물 세포에서 (6E)-8-히드록시제라니올 생산을 증가시키기 위한 한가지 접근법은 (6E)-8-히드록시제라니올 생합성 경로에서 하나 이상의 상류 효소의 활성을 증가시키는 것이다. 상류 경로 효소는 공급원료로부터 모든 마지막 천연 대사산물 (즉, 에스. 세레비지아의 경우 제라닐 디포스페이트)로의 전환에 관여되는 모든 효소를 포함한다. 일정 실시형태에서, 상류 경로 효소는 특별히 (6E)-8-히드록시제라니올로 이어지는 경로에서 핵심 전구체의 제라닐 디포스페이트로의 전환에 관여하는 효소를 의미한다. 이러한 유전자는 ATP-시트레이트 신타제, 아세틸-CoA 신써타제, 티올라제, 히드록시메틸글루타릴 조효소 A 신타제 (HMG-CoA 신타제), 히드록시메틸글루타릴 조효소 A 리덕타제 (HMG-CoA 리덕타제), 메발로네이트 키나제, 포스포메발로네이트 키나제, 디포스포메발로네이트 디카복실라제, 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이소머라제 (체계명: 이소펜테닐-디포스페이트 델타2-델타3-이소머라제), 및 제라닐 디포스페이트 신타제를 코딩하는 것들을 포함한다. 적합한 상류 경로 유전자는 예를 들어 이종성 제라니올 신타제 또는 제라니올-8-히드록실라제 유전자에 대한 공급원으로서 상기 기술된 것들을 포함한, 임의 공급원으로부터 유래될 수 있다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 상류 경로 효소의 활성은 천연 효소(들)의 발현 또는 활성을 조절하여 증가된다. 이러한 접근법의 예는 (1) (6E)-8-히드록시제라니올 경로 전구체 제라닐 디포스페이트의 수준을 증가시키기 위한 HMG-CoA 리덕타제의 과발현 및/또는 제라닐 디포스페이트 신타제의 항상적 과발현, 및/또는 (2) 아세틸-Coa의 이용률을 개선시키기 위한 ATP-시트레이트 신타제 (P53396) 및/또는 아세틸-CoA 신써타제 (ACS, Q8ZKF6)의 과발현을 포함한다.
천연 상류 경로 효소의 발현은 상류 경로 활성의 하나 이상의 천연 조절인자를 통해서 증가될 수 있다. 예를 들어, 이소프레노이드 경로 효소의 발현을 개선시키기 위해서, 스테롤 흡수 제어 단백질, UPC2 (UniProt ID Q12151, 사카로마이세스 세레비지아 S288c 유래, G888D 또는 G888R 함유 [이들 명칭은 아미노산에 대한 표준 1-글자 코드를 사용한 아미노산 치환을 의미하는 것으로서, 첫번째 글자는 야생형 잔기를 표시하고 마지막 글자를 치환 잔기를 표시하고, 번호는 번역된 단백질에서 아미노산 치환의 위치를 표시함]) [6, 7]의 변이체를 도입시킬 수 있고, 임의로는 과발현시킬 수 있다. 스테롤 흡수 제어 단백질 UPC2는 스테롤 합성을 조절하고 C-말단 아미노산 치환은 이러한 전사 인자의 활성을 증가시킨다. 예를 들어, ERG8의 상류 UPC2 결합 구성요소는 다른 스테롤 생합성 경로 유전자이외에도 ERG8의 UPC2 전사를 활성화시킬 수 있다 [7].
대안적으로, 또는 추가로, 하나 이상의 프로모터는 예를 들어 도 5에 예시된 바와 같은 기술을 사용하여 천연 프로모터를 대체할 수 있다. 일정 실시형태에서, 대체 프로모터는 천연 프로모터보다 강력하고/하거나 항상성 프로모터이다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 상류 경로 효소의 활성은 제라니올 신타제- 및 제라니올-8-히드록실라제-발현 미생물 숙주 세포로 하나 이상의 상응하는 유전자를 도입시켜 보충된다. 실시예 1은 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이소머라제를 코딩하는 도입된 유전자와 함께, 이종성 제라니올 신타제 및 이종성 제라니올-8-히드록실라제를 발현하기 위한 미생물 숙주 세포의 성공적인 조작을 설명한다.
도입된 상류 경로 유전자는 숙주 세포 이외의 유기체로부터 유래될 수 있거나 또는 단순히 천연 유전자의 추가 카피일 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 이러한 유전자는 (6E)-8-히드록시제라니올을 생산할 수 있는 미생물 숙주 세포로 도입되고 강력한 항상성 프로모터로부터 발현되고/되거나 선택된 미생물 숙주 세포에서 발현을 증강시키기 위해 임의로는 코돈 최적화될 수 있다.
다양한 실시형태에서, 하나 이상의 상류 경로 효소의 활성을 증가시키기 위한 (6E)-8-히드록시제라니올-생산 미생물 세포의 조작은 (6E)-8-히드록시제라니올 역가를 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90% 또는 적어도 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 5.5배, 6배, 6.5배, 7배, 7.5배, 8배, 8.5배, 9배, 9.5배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 21배, 22배, 23배, 24배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배, 55배, 60배, 65배, 70배, 75배, 80배, 85배, 90배, 95배, 또는 100배까지 증가시킨다. 다양한 실시형태에서, (6E)-8-히드록시제라니올 역가의 증가는 10% 내지 100배, 2배 내지 50배, 5배 내지 40배, 10배 내지 30배의 범위이다 (본 명세서에서 범위는 그들 종결점을 포함함). 이들 증가는 상류 경로 효소 활성의 임의 증가가 결여된 (6E)-8-히드록시제라니올-생산 미생물 세포에서 관찰되는 (6E)-8-히드록시제라니올 역가에 대해서 결정된다. 이러한 기준 세포는 (6E)-8-히드록시제라니올 생산 증가를 목적으로 하는 하나 이상의 다른 유전자 변경을 가질 수 있으며, 예를 들어 세포는 피드백-탈조절 효소를 발현할 수 있다.
다양한 실시형태에서, 하나 이상의 상류 경로 유전자의 활성을 증가시켜 획득된 (6E)-8-히드록시제라니올 역가는 적어도 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 또는 900 ㎍/L, 또는 적어도 1, 10, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 또는 900 mg/L 또는 적어도 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 또는 10 gm/L이다. 다양한 실시형태에서, 역가는 100 ㎍/L 내지 10 gm/L, 200 ㎍/L 내지 5 gm/L, 500 ㎍/L 내지 4 gm/L, 1 mg/L 내지 3 gm/L, 500 mg/L 내지 2 gm/L의 범위 또는 상기 열거된 임의 값으로 경계된 임의 범위이다.
피드백-탈조절 효소의 도입
(6E)-8-히드록시제라니올 생합성이 피드백 억제를 겪으므로, (6E)-8-히드록시제라니올을 생산하도록 조작된 미생물 세포에서 (6E)-8-히드록시제라니올을 증가시키기 위한 다른 접근법은 정상적으로 피드백 조절을 겪는 하나 이상의 효소의 피드백-탈조절 형태를 도입시키는 것이다. HMG-CoA 리덕타제가 그러한 효소이다. 피드백-탈조절 형태는 특정 미생물 숙주 세포에서 천연 효소에 비해서 피드백 억제에 덜 민감한 이종성, 천연 효소일 수 있다. 대안적으로, 피드백-탈조절 형태는 상응하는 천연 효소에 비해서 피드백 억제에 덜 민감하게 만드는 하나 이상의 돌연변이 또는 절단을 갖는 천연 또는 이종성 효소의 변이체일 수 있다. 후자의 예는 N-말단 절단을 갖는 변이체 HMG-CoA 리덕타제 (에스. 세레비지아 유래) (SEQ ID NO:27)를 포함한다. 숙주 세포에서 이러한 피드백-탈조절 HMG-CoA 리덕타제의 발현은 에스. 세레비지아 [3] 및 다른 유기체에서 메발로네이트 경로 유동성을 개선시키는 것으로 확인되었다 (예를 들어, 식물의 유전자 조작을 기술하는 PCT 공개 특허 출원 번호 WO2001031027A1을 참조함).
다양한 실시형태에서, 피드백-탈조절 효소를 발현시키기 위한 (6E)-8-히드록시제라니올-생산 미생물 세포의 조작은 (6E)-8-히드록시제라니올 역가를 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90% 또는 적어도 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 5.5배, 6배, 6.5배, 7배, 7.5배, 8배, 8.5배, 9배, 9.5배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 21배, 22배, 23배, 24배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배, 55배, 60배, 65배, 70배, 75배, 80배, 85배, 90배, 95배, 또는 100배까지 증가시킨다. 다양한 실시형태에서, (6E)-8-히드록시제라니올 역가의 증가는 10% 내지 100배, 2배 내지 50배, 5배 내지 40배, 10배 내지 30배 범위, 또는 상기 열거된 임의 값을 경계로하는 임의 범위이다. 이들 증가는 피드백-탈조절 효소를 발현하지 않는 (6E)-8-히드록시제라니올-생산 미생물 세포에서 관찰된 (6E)-8-히드록시제라니올 역가에 대해서 결정된다. 이러한 기준 세포는 (6E)-8-히드록시제라니올 생산을 증가시키는 목적으로 다른 유전자 변경을 (그럴 필요는 없지만) 가질 수 있고, 다시 말해서 세포는 피드백-불감성 이외의 일부 수단에 의한 상류 경로 효소의 증가된 활성을 가질 수 있다.
다양한 실시형태에서, (6E)-8-히드록시제라니올 생합성 경로를 통해 유동성을 증가시키기 위해 피드백-탈조절 효소를 사용해 획득된 (6E)-8-히드록시제라니올 역가는 적어도 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 또는 900 ㎍/L, 또는 적어도 1, 10, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 또는 900 mg/L 또는 적어도 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 또는 10 g/L이다. 다양한 실시형태에서, 역가는 100 ㎍/L 내지 10 g/L, 200 ㎍/L 내지 5 g/L, 500 ㎍/L 내지 4 g/L, 1 mg/L 내지 3 g/L, 500 mg/L 내지 2 g/L의 범위 또는 상기 열거된 임의 값으로 경계되는 임의 범위이다.
하나 이상의 천연 효소의 활성을 보충하고/하거나 하나 이상의 피드백-탈조절 효소를 도입하는 접근법을 제라니올 신타제-발현 미생물 세포에서 조합하여 보다 더 높은 (6E)-8-히드록시제라니올 생산 수준을 달성할 수 있다.
전구체 소모 감소
이러한 생산을 할 수 있는 미생물 세포에서 (6E)-8-히드록시제라니올 생산을 증가시키기 위한 다른 접근법은 (6E)-8-히드록시제라니올 생합성의 하나 이상의 전구체를 하나 이상의 부경로 (즉, (6E)-8-히드록시제라니올 이외의 다른 생성물로 이르게 하는 경로)로 이동하게 하는 하나 이상의 효소의 활성을 감소시키는 것이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 부-경로 효소의 활성은 천연 효소(들)의 발현 또는 활성을 조절하여 감소된다. 예시적인 부-경로 효소는 이기능성 (2E,6E)-파르네실 디포스페이트 신타제/ 디메틸알릴트랜스트랜스퍼라제, 제라닐제라닐 파이로포스페이트 신타제, 및 아세틸 Co-A를 소모하는 임의의 부-경로 효소를 포함한다. 이러한 효소의 활성은 예를 들어 상응하는 유전자(들)의 천연 프로모터를 덜 활성이거나 또는 불활성인 프로모터로 치환시키거나 또는 상응하는 유전자(들)를 결실시켜 감소시킬 수 있다. 예를 들어 에스. 세레비지아에서 각각 프로모터 치환 및 표적화된 유전자 결실의 계획에 대해 도 5 및 6을 참조한다.
천연 이기능성 (2E,6E)-파르네실 디포스페이트 신타제/ 디메틸알릴트랜스트랜스퍼라제는 이기능성이고 제라닐 디포스페이트를 형성할 수 있고 이후에 제2 반응은 제라닐 디포스페이트를 (2E,6E)-파르네실 디포스페이트로 전환시킬 수 있다. 천연 효소는 이들 2종의 활성을 보유하고 중간체가 (6E)-8-히드록시제라니올 경로 대사산물이기 때문에, 천연 이기능성 (2E,6E)-파르네실 디포스페이트 신타제/ 디메틸알릴트랜스트랜스퍼라제의 발현을 낮추는 것이 유익하다. 그러나, S80F 아미노산 치환을 보유하는 효소의 발현은 측정가능한 분량의 모노테르페노이드를 생산한다 [4] (또한 미국 특허 제8,715,962호 참조). 예를 들어, 스테롤로의 추가 유동을 방지하기 위해서, 에스. 세레비지아에서 ERG9에 의해 코딩되는 이기능성 파르네실-디포스페이트 파르네실트랜스퍼라제 (EC 2.5.1.21) 및/또는 에스. 세레비지아에서 ERG20에 의해 코딩되는 (2E,6E)-파르네실 디포스페이트 신타제 (EC 2.5.1.10)의 발현 또는 활성은 (6E)-8-히드록시제라니올 생합성을 위한 제라닐 디포스페이트 풀을 최대화하도록 저하된다.
에스. 세레비지아의 예시적인 실시형태에서, (1) 이기능성 (2E,6E)-파르네실 디포스페이트 신타제/디메틸알릴트랜스트랜스퍼라제 (ERG20, YJL167W)를 위한 프로모터는 (6E)-8-히드록시제네니올 경로 대사산물 제라닐 디포스페이트를 소모하는 이러한 천연 효소의 발현을 저하시키도록 에스. 세레비지아 pRnr1 프로모터로 치환될 수 있다; (2) 제라닐제라닐 파이로포스페이트 신타제 (Bts1, YPL069C)를 위한 프로모터는 역시 제라닐 디포스페이트를 소모하는 이러한 천연 효소의 발현을 저하시키도록 에스. 세레비지아 pPsp2로 치환될 수 있다; 그리고/또는 Pdc5 (YLR134W), Pdc6 (YGR087C) 및 Pdc1 (YLR044C) 중 하나 이상은 아세틸-CoA 소모를 감소시키도록 결실될 수 있다.
다양한 실시형태에서, 하나 이상의 부경로에 의해 전구체 소모를 감소시키기 위한 (6E)-8-히드록시제라니올-생산 미생물 세포의 조작은 (6E)-8-히드록시제라니올 역가를 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90% 또는 적어도 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 5.5배, 6배, 6.5배, 7배, 7.5배, 8배, 8.5배, 9배, 9.5배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 21배, 22배, 23배, 24배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배, 55배, 60배, 65배, 70배, 75배, 80배, 85배, 90배, 95배, 또는 100배까지 증가시킨다. 다양한 실시형태에서, (6E)-8-히드록시제라니올 역가의 증가는 10% 내지 100배, 2배 내지 50배, 5배 내지 40배, 10배 내지 30배 범위, 또는 상기 열거된 임의 값이 경계가 되는 임의 범위이다. 이들 증가는 전구체 소모를 감소시키기 위한 유전자 변경을 포함하지 않는 (6E)-8-히드록시제라니올-생산 미생물 세포에서 관찰된 (6E)-8-히드록시제라니올 역가에 대해 결정된다. 이러한 기준 세포는 (그럴 필요는 없지만) (6E)-8-히드록시제라니올 생산을 증가시키기 위한 목적으로 다른 유전자 변경을 가질 수 있으며, 다시 말해 세포는 상류 경로 효소의 증가된 활성을 가질 수 있다.
다양한 실시형태에서, 하나 이상의 부경로에 의한 전구체 소모의 감소를 통해 획득된 (6E)-8-히드록시제라니올 역가는 적어도 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 또는 900 ㎍/L, 또는 적어도 1, 10, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 또는 900 mg/L 또는 적어도 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 또는 10 g/L이다. 다양한 실시형태에서, 역가는 100 ㎍/L 내지 10 g/L, 200 ㎍/L 내지 5 gm/L, 500 ㎍/L 내지 4 g/L, 1 mg/L 내지 3 g/L, 500 mg/L 내지 2 g/L 범위 또는 상기 열거된 임의 값이 경계되는 임의 범위이다.
하나 이상의 천연 효소의 활성을 증가시키고/시키거나 하나 이상의 피드백-탈조절 효소를 도입시키고/시키거나 하나 이상의 부경로에 의해 전구체 소모를 감소시키는 접근법을 조합하여 더 높은 (6E)-8-히드록시제라니올 생산 수준을 획득할 수 있다.
미생물 숙주 세포
도입된 유전자를 발현시키는데 사용할 수 있는 임의 미생물은 상기 기술된 바와 같이 (6E)-8-히드록시제라니올의 발효 생산을 위해 조작될 수 있다. 일정 실시형태에서, 미생물은 (6E)-8-히드록시제라니올의 발효 생산을 천연적으로 할 수 없는 것이다. 일부 실시형태에서, 미생물은 쉽게 배양되는 것으로서, 예컨대, 예를 들어 관심 화합물의 발효 생산에서 숙주 세포로서 유용하다고 알려진 미생물이다. 그람 양성 또는 그람 음성 박테리아를 포함한, 박테리아 세포가 상기 기술된 대로 조작될 수 있다. 예에는 씨. 글루타미컴 (C. glutamicum) 세포이외에도, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilus), 비. 리체니포르미스 (B. licheniformis), 비. 렌터스 (B. lentus), 비. 브레비스 (B. brevis), 비. 스테아로써모필러스 (B. stearothermophilus), 비. 알칼로필러스 (B. alkalophilus), 비. 아밀로리켄파시엔스 (B. amyloliquefaciens), 비. 클라우시 (B. clausii), 비. 할로두란스 (B. halodurans), 비. 메가테리움 (B. megaterium), 비. 코아굴란스 (B. coagulans), 비. 실쿨란스 (B. circulans), 비. 라우터스 (B. lautus), 비. 투린지엔시스 (B. thuringiensis), 에스. 알버스 (S. albus), 에스. 리비단스 (S. lividans), 에스. 코엘리콜로르 (S. coelicolor), 에스. 그리세우스 (S. griseus), 슈도모나스 (Pseudomonas) sp., 피. 알칼리제네스 (P. alcaligenes), 피. 시트레아 (P. citrea), 락토바실리스 (Lactobacilis) spp. (예컨대 엘. 락티스 (L. lactis), 엘. 플란타럼 (L. plantarum)), 엘. 그라이 (L. grayi), 이. 콜라이 (E. coli), 이. 패시움 (E. faecium), 이. 갈리나럼 (E. gallinarum), 이. 카셀리플라버스 (E. casseliflavus), 및/또는 이. 패칼리스 (E. faecalis) 세포가 포함된다.
본 명세서에 기술된 방법에서 미생물 숙주 세포로서 사용할 수 있는 수많은 유형의 혐기성 세포가 존재한다. 일부 실시형태에서, 미생물 세포는 절대 혐기성 세포이다. 절대 혐기성균은 전형적으로 산소가 존재하는 조건이라면 전혀 잘 성장하지 못한다. 소량의 산소가 존재할 수도 있고, 다시 말해 절대 혐기성균이 낮은 수준의 산소에 대해 가지는 내성 수준의 어느 정도 수준이 존재한다는 것을 이해해야 한다. 상기 기술된 바와 같이 조작된 절대 혐기성균은 실질적으로 산소-무함유 조건 하에서 성장될 수 있으며, 존재하는 산소의 양은 혐기성균의 성장, 유지 및/또는 발효에 유해하지 않다.
대안적으로, 본 명세서에 기술된 방법에서 사용되는 미생물 숙주 세포는 통성 혐기성 세포일 수 있다. 통성 혐기성균은 산소가 존재한다면 호기성 호흡 (예를 들어, TCA 사이클의 활용)에 의해 세포의 ATP를 발생시킬 수 있다. 그러나, 통성 혐기성균은 또한 산소 부재 하에서도 성장할 수 있다. 상기 기술된 바와 같이 조작된 통성 혐기성균은 실질적으로 산소-무함유 조건 하에서 성장할 수 있으며, 존재하는 산소의 양이 혐기성균의 성장, 유지 및/또는 발효에 유해하지 않거나, 또는 더 많은 양의 산소 존재 하에서 대안적으로 성장할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법에서 사용되는 미생물 숙주 세포는 사상 진균 세포이다 (예를 들어, [Berka & Barnett, Biotechnology Advances, (1989), 7(2):127-154] 참조). 예에는 트리코더마 론지프라키아텀 (Trichoderma longibrachiatum), 티. 비리데 (T. viride), 티. 코닌지 (T. koningii), 티. 하르지아넘 (T. harzianum), 페니실리움 (Penicillium) sp., 휴미콜라 인솔레스 (Humicola insolens), 에이치. 라누기노스 (H. lanuginose), 에이치. 그리세아 (H. grisea), 크리소스포리움 (Chrysosporium) sp., 씨. 루크누웬스 (C. lucknowense), 글리오클라디움 (Gliocladium) sp., 아스퍼질러스 (Aspergillus) sp. (예컨대 에이. 오리자 (A. oryzae), 에이. 니거 (A. niger), 에이 소자 (A. sojae), 에이. 자포니커스 (A. japonicus), 에이. 니둘란스 (A. nidulans), 또는 에이. 아와모리 (A. awamori)), 푸사리움 (Fusarium) sp. (예컨대 에프. 로세움 (F. roseum), 에프. 그라미넘 (F. graminum), 에프. 세레알리스 (F. cerealis), 에프, 옥시스포루임 (F. oxysporuim), 또는 에프. 베네나텀 (F. venenatum)), 뉴로스포라 (Neurospora) sp. (예컨대 엔. 크라싸 (N. crassa) 또는 히포크레아 (Hypocrea) sp.), 무코르 (Mucor) sp. (예컨대 엠. 미에헤이 (M. miehei)), 리조퍼스 (Rhizopus) sp., 및 에메리셀라 (Emericella) sp. 세포를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 기술된 바와 같이 조작되는 진균 세포는 에이. 니둘란스, 에이. 아와모리, 에이. 오리자, 에이. 아쿨레아터스, 에이. 니거, 에이. 자포티커스, 티. 레에세이 (T. reesei), 티. 비리데, 에프. 옥시스포럼 (F. oxysporum), 또는 에프. 솔라니 (F. solani)이다. 이러한 숙주에서 사용을 위한 예시적인 플라스미드 또는 플라스미드 성분은 미국 공개 특허 출원 제2011/0045563호에 기술된 것을 포함한다.
효모가 또한 본 명세서에 기술된 방법에서 미생물 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예로는 사카로마이세스 (Saccharomyces) sp., 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces) sp., 피키아 (Pichia) sp., 한세눌라 폴리모르파 (Hansenula polymorpha), 피키아 스티피테스 (Pichia stipites), 글루이베로마이세스 마르시아너스 (Kluyveromyces marxianus), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) spp., 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 및 칸디다 (Candida) sp.가 포함된다. 일부 실시형태에서, 사카로마이세스 sp. 는 에스. 세레비지아이다 ([Romanos et al., Yeast, (1992), 8(6):423-488] 참조). 이러한 숙주와 사용을 위한 예시적인 플라스미드 또는 플라스미드 성분은 미국 특허 제7,659,097호 및 미국 공개 특허 출원 제2011/0045563호에 기술된 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 숙주 세포는 예를 들어, 녹조류, 홍조류, 회조류, 클로라라크니오피트 (chlorarachniophyte), 유글레니드 (euglenid), 크로미스타 (chromista), 또는 와편모충류 (dinoflagellate)로부터 유래된 조류 세포일 수 있다 (예를 들어, [Saunders & Warmbrodt, "Gene Expression in Algae and Fungi, Including Yeast," (1993), National Agricultural Library, Beltsville, Md.] 참조). 조류 세포에서 사용을 위한 예시적인 플라스미드 또는 플라스미드 성분은 미국 공개 특허 출원 제2011/0045563호에 기술된 것을 포함한다.
다른 실시형태에서, 숙주 세포는 시아노박테리움 (cyanobacterium), 예컨대 형태학을 기반으로 다음의 그룹 중 어느 하나로 분류되는 시아노박테리움이다: 클로로코칼레스 (Chlorococcales), 플레우로카프살레스 (Pleurocapsales), 오실라토리알레스 (Oscillatoriales), 노스토칼레스 (Nostocales), 시네코시스틱 (Synechosystic) 또는 스티고네마탈레스 (Stigonematales) (예를 들어, [Lindberg et al., Metab. Eng., (2010) 12(1):70-79] 참조). 시아노박테리아 세포에서 사용을 위한 예시적인 플라스미드 또는 플라스미드 성분은 미국 공개 특허 출원 제2010/0297749호 및 제2009/0282545호, 및 국제 공개 특허 출원 번호 WO 2011/034863에 기술된 것을 포함한다.
유전자 조작 방법
미생물 세포는 당업자에게 속하는 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학 및 생화학의 통상적인 기술을 사용하여 발효적 (6E)-8-히드록시제라니올 생산을 위해 조작될 수 있다. 이러한 기술은 문헌에 완전히 설명되어 있고, 예를 들어, 다음의 문헌들을 참조한다: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," fourth edition (Sambrook et al., 2012); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications" (R. I. Freshney, ed., 6th Edition, 2010); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates); "PCR: The Polymerase Chain Reaction," (Mullis et al., eds., 1994); Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994).
벡터는 유전 물질을 세포에 도입시키는데 사용되는 폴리뉴클레오티드 비히클이다. 본 명세서에 기술된 방법에서 유용한 벡터는 선형일 수 있거나 또는 원형일 수 있다. 벡터는 숙주 세포의 표적 게놈으로 통합될 수 있거나 또는 숙주 세포에서 독립적으로 복제될 수 있다. 많은 적용분야의 경우에, 안정한 형질전환체를 생산하는 통합 벡터가 바람직하다. 벡터는 예를 들어 복제 기원, 다중 클로닝 부위 (MCS), 및/또는 선별 마커를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 전형적으로 특정 숙주 세포에서 폴리뉴클레오티드 서열 (종종 코딩 서열)의 발현을 촉진하는 조절 구성요소를 함유하는 발현 카세트를 포함한다. 벡터는 제한없이 통합 벡터, 원형생물 플라스미드, 에피솜, 바이러스 벡터, 코스미드, 및 인공 염색체를 포함한다.
발현 카세트에서 사용될 수 있는 예시적인 조절 구성요소는 프로모터, 인핸서, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 및 다른 발현 제어 구성요소 (예를 들어, 전사 종결 신호, 예컨대 폴리아데닐화 신호 및 폴리-U 서열)를 포함한다. 이러한 조절 구성요소는 예를 들어 [Goeddel, Gene Expression Technology: Methods In Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)]에 기술되어 있다.
일부 실시형태에서, 벡터는 게놈 편집, 예컨대 CRISPR 시스템을 수행할 수 있는 시스템을 도입시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 2014년 3월 6일 공개된 미국 공개 특허 출원 제2014/0068797호를 참조하고, 또한 [Jinek M., et al., "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity," Science 337:816-21, 2012]를 참조한다. II형 CRISPR-Cas9 시스템에서, Cas9는 부위 지정 엔도뉴클레아제, 즉 2개의 별개 엔도뉴클레아제 도메인 (HNH 및 RuvC/RNase H-유사 도메인)을 사용하여 특정한 표적 서열에서 폴리뉴클레오티드를 절단하도록 유도하거나, 또는 유도할 수 있는 효소이다. Cas9는 Cas9가 RNA에 의한 이의 절단 부위로 유도되기 때문에 임의의 바람직한 부위에서 DNA를 절단하도록 조작될 수 있다. 그러므로 Cas9는 또한 "RNA-가이드된 뉴클레아제"로서 기술된다. 보다 특히, Cas9는 표적 폴리뉴클레오티드 내 특이적 서열과 RNA 분자(들)의 적어도 일부분의 하이브리드화를 기반으로 특이적 폴리뉴클레오티드 표적으로 Cas9를 가이드하는, 하나 이상의 RNA 분자와 회합된다. Ran, F.A. 등 ("In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9," Nature 520(7546):186-91, 2015, Apr 9], 모든 확장 데이터 포함)은 8종의 II형 CRISPR-Cas9 시스템의 crRNA/tracrRNA 서열 및 2차 구조를 제시한다. Cas9-유사 합성 단백질이 또한 당분야에 공지되어 있다 (2014년 10월 23일 공개된, 미국 공개 특허 출원 제2014-0315985호 참조).
실시예 1은 폴리뉴클레오티드 및 다른 유전적 변경을 에스. 세레비지아 세포의 게놈으로 도입시키기 위한 예시적인 통합 접근법을 기술한다.
벡터 또는 다른 폴리뉴클레오티드는 임의의 다양한 표준 방법, 예컨대 형질전환, 접합, 전기천공, 핵 미세주입, 형질도입, 형질감염 (예를 들어, 리포펙션 매개 또는 DEAE-덱스트린 매개 형질감염 또는 재조합 파지 바이러스 사용 형질감염), 칼슘 포스페이트 DNA 침전물과의 인큐베이션, DNA-코팅 미세투사기를 사용한 고속 충돌법, 및 원형질 융합법을 통해 미생물 세포에 도입될 수 있다. 형질전환체는 당분야에 공지된 임의 방법으로 선별될 수 있다. 형질전환체를 선별하기 위한 적합한 방법은 미국 공개 특허 출원 제2009/0203102호, 제2010/0048964호, 및 제2010/0003716호, 및 국제 공개 특허 출원 번호 WO 2009/076676, WO 2010/003007, 및 WO 2009/132220에 기술되어 있다.
조작된 미생물 세포
상기 기술된 방법은 (6E)-8-히드록시제라니올을 생산하고 일정 실시형태에서, 과생산하는 조작된 미생물 세포를 생성시키는데 사용된다. 조작된 미생물 세포는 천연 미생물 세포, 예컨대 본 명세서에 기술된 임의의 미생물 숙주 세포와 비교하여, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 이상의 유전자 변경, 예컨대 30-40개의 변경을 가질 수 있다. 하기 실시예에 기술된 조작된 미생물 세포는 1개, 2개 또는 3개의 유전자 변경을 가지지만, 당업자는 본 명세서에 기재된 지침에 따라서, 추가의 변경을 갖는 미생물 세포를 디자인할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조작된 미생물 세포는 천연 미생물 세포와 비교하여, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 또는 4개 이하의 유전자 변경을 갖는다. 다양한 실시형태에서, (6E)-8-히드록시제라니올 생산을 위해 조작된 미생물 세포는 임의의 하기 예시적인 범위 내에 속하는 많은 유전자 변경을 가질 수 있다: 1-10, 1-9, 1-8, 2-7, 2-6, 2-5, 2-4, 2-3, 3-7, 3-6, 3-5, 3-4 등.
일부 실시형태에서, 예컨대 (6E)-8-히드록시제라니올을 천연적으로 생산하지 않는 미생물 숙주 세포의 경우에, 조작된 미생물 세포는 적어도 하나의 이종성 제라닐 디포스페이트 디포스파타제 (제라니올 신타제)를 발현한다. 다양한 실시형태에서, 미생물 세포는 예를 들어, 다음을 포함하고 발현시킬 수 있다: (1) 단일 이종성 제라니올 신타제 유전자, (2) 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있는 둘 이상의 이종성 제라니올 신타제 (달리 말해서, 동일 이종성 제라니올 신타제 유전자의 다수 카피가 도입될 수 있거나 또는 다수의 상이한 이종성 제라니올 신타제 유전자가 도입될 수 있음), (3) 세포에 천연적이지 않은 단일 이종성 제라니올 신타제 유전자, 및 천연 제라니올 신타제 유전자의 하나 이상의 추가 카피, 또는 (4) 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있는 둘 이상의 비천연 제라니올 신타제 유전자, 및 천연 제라니올 신타제 유전자의 하나 이상의 추가 카피.
일부 실시형태에서, 예컨대 제라니올-8-히드록실라제 효소를 갖지 않는 미생물 숙주 세포의 경우에, 조작된 미생물 세포는 적어도 하나의 이종성 제라니올 신타제 이외에도, 적어도 하나의 이종성 제라니올-8-히드록실라제를 발현한다. 다양한 실시형태에서, 미생물 세포는 예를 들어, 다음을 포함하고 발현시킬 수 있다: (1) 단일 이종성 제라니올-8-히드록실라제 유전자, (2) 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있는 둘 이상의 이종성 제라니올-8-히드록실라제 유전자 (달리 말해서, 동일한 이종성 제라니올-8-히드록실라제 유전자의 다수 카피가 도입될 수 있거나, 또는 다수의 상이한 이종성 제라니올-8-히드록실라제 유전자가 도입될 수 있음), (3) 세포에 천연적이지 않은 단일 이종성 제라니올-8-히드록실라제 및 천연 제라니올-8-히드록실라제 유전자의 하나 이상의 추가 카피, 또는 (4) 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있는 둘 이상의 비천연 제라니올-8-히드록실라제, 및 천연 제라니올-8-히드록실라제의 하나 이상의 추가 카피.
이러한 조작된 숙주 세포는 제라닐-PP ((6E)-8-히드록시제라니올의 중간 전구체)의 생산으로 이어지는 경로를 통해서 유동성을 증가시키는 적어도 하나의 추가적 유전자 변경을 포함할 수 있다. 경로에서 이들 "상류" 효소는 그들 효소 활성을 갖는 임의의 이소폼, 파라로그 또는 오솔로그 (당업자가 쉽게 이해하게 되는 바와 같이 상이한 명칭으로 공지될 수 있음)를 포함하여, ATP-시트레이트 신타제, 아세틸-CoA 신써타제, 티올라제, 히드록시메틸글루타릴 조효소 A 신타제 (HMG-CoA 신타제), 히드록시메틸글루타릴 조효소 A 리덕타제 (HMG-CoA 리덕타제), 메발로네이트 키나제, 포스포메발로네이트 키나제, 디포스포메발로네이트 디카복실라제, 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이소머라제, 및 제라닐 디포스페이트 신타제를 포함한다. 적어도 하나의 추가적인 변경은 임의의 이용가능한 수단, 예를 들어 (1) 천연 효소(들)의 발현 또는 활성의 조절, (2) 천연 효소에 대한 유전자의 하나 이상의 추가 카피의 발현, 또는 (3) 하나 이상의 비천연 효소에 대한 유전자의 하나 이상의 카피의 발현을 통해서, 상류 경로 효소(들)의 활성을 증가시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 경로를 통해 증가된 유동성은 상기 기술된 바와 같이, 피드백-탈조절 효소를 코딩하는 하나 이상의 유전자를 발현시켜 획득될 수 있다. 예를 들어, 조작된 숙주 세포는 하나 이상의 피드백-탈조절 HMG-CoA 리덕타제 유전자를 포함하고 발현시킬 수 있다.
조작된 미생물 세포는 천연 뉴클레오티드 서열을 갖거나 또는 천연의 것과 상이한 도입된 유전자를 함유할 수 있다. 예를 들어, 천연 뉴클레오티드 서열은 특정 숙주 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 임의의 이들 도입된 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열은 천연일 수 있거나 또는 천연의 것과 상이할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 아미노산 서열은 천연 아미노산 서열과 적어도 0%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
일부 실시형태에서, (6E)-8-히드록시제라니올에 대한 전구체의 증가된 이용률은 하나 이상의 부-경로 효소, 예컨대 이기능성 (2E,6E)-파르네실 디포스페이트 신타제/디메틸알릴트랜스트랜스퍼라제, 제라닐제라닐 파이로포스페이트 신타제, 및아세틸 Co-A를 소모하는 임의의 부-경로 효소의 발현 또는 활성을 감소시켜서 획득될 수 있다. 예를 들어, 조작된 숙주 세포는 임의의 이들 효소의 발현을 하향조절시키도록 하나 이상의 프로모터 교환을 포함할 수 있고/있거나 그들 발현을 전체로 제거하기 위해 그들 유전자가 결실될 수 있다.
본 명세서에 기술된 접근법은 진균 세포, 즉 효모 에스. 세레비지아 (진핵생물), 및 박테리아 세포, 즉 씨. 글루타미컴 (원핵생물)에서 수행되었다 (실시예 1 참조).
예시적인 조작된 진균 세포
일정 실시형태에서, 조작된 효모 (예를 들어, 에스. 세레비지아) 세포는 페릴라 세토이엔시스의 제라니올 신타제 (예를 들어, SEQ ID NO:5)와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 이종성 제라니올 신타제를 발현한다. 특정 실시형태에서, 페릴라 세토이엔시스 제라니올 신타제는 SEQ ID NO:5를 포함한다.
조작된 효모 (예를 들어, 에스. 세레비지아) 세포는 또한 일정 실시형태에서, 파세올러스 안굴라리스 유래 제라니올-8-히드록실라제 (예를 들어, SEQ ID NO:11)와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 이종성 제라니올-8-히드록실라제를 발현한다. 특정 실시형태, 파세올러스 안굴라리스 제라니올-8-히드록실라제는 SEQ ID NO:11을 포함할 수 있다.
이들은 조작된 효모 세포의 유일한 유전자 변경일 수 있거나, 또는 효모 세포는 보다 일반적으로 상기 기술된 바와 같이 하나 이상의 추가적인 유전자 변경을 포함할 수 있다.
하나 이상의 추가적인 유전자 변경을 갖는 예시적인 효모 (예를 들어, 에스. 세레비지아) 세포는 대조군 세포에 비해서, 예를 들어 천연 에스. 세레비지아 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이소머라제 (SEQ ID NO:25) 유전자의 추가적인 카피를 세포에 도입시키거나 또는 천연 에스. 세레비지아 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이소머라제와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이소머라제를 코딩하는 유전자를 도입시켜 생산된, 상류 경로 효소, 예컨대 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이소머라제의 증가된 활성을 가질 수 있다.
특정 실시형태에서, 조작된 효모 (예를 들어, 에스. 세레비지아) 세포는 전형적으로 천연 에스. 세레비지아 HMG-CoA 리덕타제와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 에스. 세레비지아 HMG-CoA 리덕타제의 변이체, 또는 아미노산 잔기 1-529가 결실된 에스. 세레비지아 HMG-CoA 리덕타제의 절단형 변이체를 추가로 발현한다. 특정 실시형태에서, 에스. 세레비지아 HMG-CoA 리덕타제 변이체는 SEQ ID NO:27을 포함할 수 있다.
조작된 미생물 세포의 배양
본 명세서에 기술된 임의의 미생물 세포는 예를 들어, 유지, 성장, 및/또는 (6E)-8-히드록시제라니올 생산을 위해 배양될 수 있다.
일부 실시형태에서, 배양물은 10-500의 600 nm에서의 광학 밀도, 예컨대 50-150의 광학 밀도까지 성장된다.
다양한 실시형태에서, 배양물은 생산된 (6E)-8-히드록시제라니올을 적어도 10, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 또는 900 ㎍/L, 또는 적어도 1, 10, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 또는 900 mg/L 또는 적어도 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 또는 10 gm/L의 역가로 포함한다. 다양한 실시형태에서, 역가는 10 ㎍/L 내지 10 gm/L, 25 ㎍/L 내지 10 gm/L, 100 ㎍/L 내지 10 gm/L, 200 ㎍/L 내지 5 gm/L, 500 ㎍/L 내지 4 gm/L, 1 mg/L 내지 3 gm/L, 500 mg/L 내지 2 gm/L 범위 또는 상기 열거된 임의 값으로 경계된 임의 범위이다.
배양 배지
미생물 세포 제한없이 최소 배지, 즉 세포 성장을 위해 가능한 최소 영양소를 함유하는 것을 포함한, 임의의 적합한 배지에서 배양될 수 있다. 전형적으로 최소 배지는 (1) 미생물 성장을 위한 탄소원; (2) 특정 미생물 세포 및 성장 조건에 의존적일 수 있는 염; 및 (3) 물을 포함한다. 적합한 배지는 또는 하기의 임의 조합을 포함할 수 있다: 성장 및 생성물 형성을 위한 질소원, 성장을 위한 황원, 성장을 위한 포스페이트원, 성장을 위한 금속염, 성장을 위한 비타민, 및 성장을 위한 다른 보조인자.
임의의 적합한 탄소원은 숙주 세포를 배양시키는데 사용될 수 있다. 용어 "탄소원"은 미생물 세포에 의해 물질대사될 수 있는 하나 이상의 탄소-함유 화합물을 의미한다. 다양한 실시형태에서, 탄소원은 탄수화물 (예컨대 단당류, 이당류, 올리고당류, 또는 다당류), 또는 전화당 (예를 들어, 효소 처리 수크로스 시럽)이다. 예시적인 단당류는 글루코스 (덱스트로스), 프룩토스 (레불로스), 및 갈락토스를 포함하고; 예시적인 올리고당은 덱스트란 또는 글루칸을 포함하며, 예시적인 다당류는 전분 및 셀룰로스를 포함한다. 적합한 당류는 C6 당류 (예를 들어, 프룩토스, 만노스, 갈락토스, 또는 글루코스) 및 C5 당류 (예를 들어, 자일로스 또는 아라비노스)를 포함한다. 다른 덜 비싼 탄소원에는 사탕수수 주스, 비트 주스, 수수 주스 등이 포함되며, 임의의 이들은 그럴 필요는 없지만, 완전히 또는 부분적으로 탈이온화될 수 있다.
배양 배지 중 염은 세포가 단백질 및 핵산을 합성할 수 있도록, 일반적으로 필수 원소, 예컨대 마그네슘, 질소, 인, 및 황을 제공한다.
최소 배지는 하나 이상의 선별제, 예컨대 항생제가 보충될 수 있다.
(6E)-8-히드록시제라니올을 생산하기 위해서, 배양 배지는 글루코스 및/또는 질소원 예컨대 우레아, 암모늄 염, 암모니아, 또는 이의 임의 조합을 포함할 수 있고/있거나, 배양 동안 보충된다.
배양 조건
미생물 세포의 유지 및 성장을 위해 적합한 재료 및 방법은 당분야에서 충분히 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 제2009/0203102호, 제2010/0003716호, 및 제2010/0048964호, 및 국제 공개 특허 출원 번호 WO 2004/033646, WO 2009/076676, WO 2009/132220, 및 WO 2010/003007, [Manual of Methods for General Bacteriology Gerhardt et al., eds), American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1994)] 또는 [Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Mass]을 참조한다.
일반적으로, 세포는 적절한 온도, 가스 혼합물, 및 pH (예컨대 약 20℃ 내지 약 37℃, 약 6% 내지 약 84% CO2, 및 약 5 내지 약 9의 pH)에서 성장 및 유지된다. 일부 양태에서, 세포는 35℃에서 성장된다. 일정 실시형태에서, 예컨대 호열성 박테리아가 숙주 세포로서 사용되는 경우에, 더 높은 온도 (예를 들어, 50℃-75℃)가 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 발효를 위한 pH 범위는 약 pH 5.0 내지 약 pH 9.0 (예컨대 약 pH 6.0 내지 약 pH 8.0 또는 약 6.5 내지 약 7.0)이다. 세포는 특정 세포의 요건을 기반으로 호기성, 무산소, 또는 혐기성 조건 하에서 성장될 수 있다.
사용될 수 있는 표준 배양 조건 및 발효 방식, 예컨대 회분식, 유가식, 또는 연속 발효는 미국 공개 특허 출원 제2009/0203102호, 제2010/0003716호, 및 제2010/0048964호, 및 국제 공개 특허 출원 번호 WO 2009/076676, WO 2009/132220, 및 WO 2010/003007에 기술되어 있다. 회분식 및 유가식 발효는 일반적으로 충분히 당분야에 공지되어 있고, 예는 [Brock, Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc]에서 확인할 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 제한된 당류 (예를 들어, 글루코스) 조건 하에서 배양된다. 다양한 실시형태에서, 부가되는 당류의 양은 세포가 소모할 수 있는 당류 양의 약 105% 또는 그 미만 (예컨대 약 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 또는 10%)이다. 특정 실시형태에서, 배양 배지에 부가되는 당류의 양은 특정 시기 동안 세포에 의해 소모되는 당류의 양과 대략 동일하다. 일부 실시형태에서, 세포 성장 속도는 세포가 세포 배지 중 당류의 양에 의해 지원될 수 있는 속도로 성장되도록 부가되는 당류의 양을 제한하여 제어된다. 일부 실시형태에서, 당류는 세포가 배양되는 시간 동안 축적되지 않는다. 다양한 실시형태에서, 세포는 약 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60 또는 70시간 이상의 시간 동안 또는 심지어 최대 약 5-10일 동안 제한된 당 조건 하에서 배양된다. 다양한 실시형태에서, 세포는 세포가 배양되는 총 시간 길이의 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 또는 100% 이상 동안 제한된 당 조건 하에서 배양된다. 임의의 특정 이론에 국한하려는 의도는 아니지만, 제한된 당 조건은 세포의 보다 호의적인 조절을 허용할 수 있다고 여겨진다.
일부 양태에서, 세포는 회분식 배양으로 성장된다. 세포는 또한 유가 배양 또는 연속 배양으로 성장될 수 있다. 추가로, 세포는 제한없이 상기 기술된 임의의 최소 배지를 포함한, 최소 배지에서 배양될 수 있다. 최소 배지는 1.0% (w/v) 이하의 글루코스 (또는 임의의 다른 6탄당)가 더 보충될 수 있다. 특히, 최소 배지는 1% (w/v), 0.9% (w/v), 0.8% (w/v), 0.7% (w/v), 0.6% (w/v), 0.5% (w/v), 0.4% (w/v), 0.3% (w/v), 0.2% (w/v), 또는 0.1% (w/v)의 글루코스가 보충될 수 있다. 일부 배양에서, 당 (예를 들어, 글루코스)의 유의하게 더 높은 수준, 예를 들어 적어도 10% (w/v), 20% (w/v), 30% (w/v), 40% (w/v), 50% (w/v), 60% (w/v), 70% (w/v), 또는 배지 중 당의 용해 한도까지 사용된다. 일부 실시형태에서, 당 수준은 상기 값 중 어느 2개의 범위 내, 예를 들어 0.1-10% (w/v), 1.0-20% (w/v), 10-70% (w/v), 20-60 % (w/v), 또는 30-50% (w/v)이다. 뿐만 아니라, 상이한 당 수준이 상이한 배양 시기에 대해 사용될 수 있다. 유가 배양 (예를 들어, 에스. 세레비지아 또는 씨. 글루타미컴 경우)에서, 당의 수준은 회분식 시기에는 약 100-200 g/L (10-20% (w/v))일 수 있고 그 다음으로 최대 약 500-700 g/L (공급 시 50-70%)일 수 있다.
추가로, 최소 배지는 0.1% (w/v) 이하의 효모 추출물이 보충될 수 있다. 특히 최소 배지는 0.1% (w/v), 0.09% (w/v), 0.08% (w/v), 0.07% (w/v), 0.06% (w/v), 0.05% (w/v), 0.04% (w/v), 0.03% (w/v), 0.02% (w/v), 또는 0.01% (w/v)의 효모 추출물이 보충될 수 있다. 대안적으로, 최소 배지는 1% (w/v), 0.9% (w/v), 0.8% (w/v), 0.7% (w/v), 0.6% (w/v), 0.5% (w/v), 0.4% (w/v), 0.3% (w/v), 0.2% (w/v), 또는 0.1% (w/v)의 글루코스, 및 0.1% (w/v), 0.09% (w/v), 0.08% (w/v), 0.07% (w/v), 0.06% (w/v), 0.05% (w/v), 0.04% (w/v), 0.03% (w/v), 또는 0.02% (w/v)의 효모 추출물이 보충될 수 있다. 일부 배양에서, 효모 추출물의 유의하게 더 높은 수준, 예를 들어 적어도 1.5% (w/v), 2.0% (w/v), 2.5% (w/v), 또는 3% (w/v)가 사용될 수 있다. 일부 배양 (예를 들어, 에스. 세레비지아 또는 씨. 글루타미컴의 경우)에서, 효모 추출물 수준은 상기 값 중 어느 2개의 범위 내, 예를 들어 0.5-3.0% (w/v), 1.0-2.5% (w/v), 또는 1.5-2.0% (w/v)이다.
본 명세서에 기술된 조작된 미생물 세포의 유지 및 성장에 적합한 예시적인 재료 및 방법은 하기 실시예 1에서 확인할 수 있다.
(6E)-8-히드록시제라니올 생산 및 회수
본 명세서에 기술된 임의의 방법은 (6E)-8-히드록시제라니올을 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 소위 수확 스트림에 함유되는 생산된 (6E)-8-히드록시제라니올은 생산 용기로부터 회수/수확된다. 수확 스트림은 생산 용기 내 휴지기 세포에 의한 생산 기질의 전환으로 인한 결과로서 (6E)-8-히드록시제라니올을 함유하는, 생산 용기로부터 비롯된, 예를 들어 세포-무함유 또는 세포-함유 수용액을 포함할 수 있다. 수확 스트림에 여전히 존재하는 세포는 당분야에 공지된 임의의 작업, 예컨대 예를 들어 여과, 원심분리, 경사법, 막 직교류 한외여과 또는 미세여과, 접선 유동 한외여과 또는 미세여과 또는 전량 여과를 통해 (6E)-8-히드록시제라니올로부터 분리될 수 있다. 이러한 세포 분리 작업 후에, 수확 스트림은 본질적으로 세포가 없다.
수확 스트림에 함유된 다른 성분으로부터 생산된 (6E)-8-히드록시제라니올의 분리 및/또는 정제의 추가 단계, 즉, 소위 하류 처리 단계가 임의로는 수행될 수 있다. 이들 단계는 당업자에게 공지된 임의 수단, 예컨대, 예를 들어 농축, 추출, 결정화, 침전, 흡착, 이온 교환 및/또는 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 임의의 이들 과정은 (6E)-8-히드록시제라니올을 정제하기 위해서 조합하여 또는 단독으로 사용될 수 있다. 추가 정제 단계는 예를 들어, 농축, 결정화, 침전, 세척 및 건조, 활성탄 처리, 이온 교환, 나노여과 및/또는 재결정화 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 적합한 정제 프로토콜의 디자인은 세포, 배양 배지, 배양의 크기, 생산 용기 등에 의존적일 수 있고, 당업자의 수준 내에 속한다.
하기 실시예는 본 개시의 다양한 실시형태를 예시하려는 목적으로 제공되며 임의 방식으로 본 개시를 제한하려는 것을 의미하지 않는다. 청구항의 범주로 정의된, 본 개시의 의도에 포괄되는 이의 변화 및 다른 용도는 당업자가 확인할 수 있을 것이다.
실시예 1 - (6E)-8-히드록시제라니올을 생산하도록 조작된 사카로마이세스 세레비지아 균주의 제작 및 선별
플라스미드/DNA 디자인
이러한 작업에서 시험된 모든 균주들은 사유 소프트웨어를 사용하여 디자인된 플라스미드 DNA로 형질전환되었다. 플라스미드 디자인은 이 작업에서 조작된 2종의 숙주 유기체 중 하나에 특이적이었다. 플라스미드 DNA는 표준 DNA 조립 방법에 의해 물리적으로 제작하였다. 이어서, 이 플라스미드 DNA를 사용하여 각각 하기에 기술된 2종의 숙주-특이적 방법 중 하나를 통해 물질대사 경로를 통합시켰다.
에스. 세레비지아 경로 통합
"분할-마커, 이중-교차" 게놈 통합 전력이 에스. 세레비지아 균주를 조작하기 위해 개발되었다. 도 2는 에스. 세레비지아에서 상보성, 분할-마커 플라스미드의 게놈 통합 및 콜로니 PCR을 통한 올바른 게놈 통합의 검증을 예시한다. 상보성 5' 및 3' 상동성 부분 및 URA3 선별 마커의 중복된 절반을 갖는 2종의 플라스미드 (직접 반복부는 해시된 막대로 표시됨)를 메가뉴클레아제로 분해하였고 선형 단편으로서 형질전환시켰다. 삼중-교차 사건은 바람직한 이종성 유전자를 표적화된 유전자좌에 통합시켰고 전체 URA3 유전자를 재구성시켰다. 이러한 통합 사건으로부터 유래된 콜로니는 5' 및 3' 접합부 둘 모두를 확인하기 위해 2개 3-프라이머 반응을 사용하여 어세이하였다 (UF/IF/wt-R 및 DR/IF/wt-F). 추가의 조작이 바람직한 균주의 경우에, 균주는 본래 직접 반복부의 소형 단일 카피가 남겨진, URA3의 제거에 대해 선별하기 위한 5-FOA 평판 상에 플레이팅하였다. 이러한 게놈 통합 전략은 동일한 작업 흐름으로 유전자 녹-아웃, 유전자 녹-인, 및 프로모터 적정에 사용될 수 있다.
세포 배양
에스. 세레비지아에 대해 확립된 작업 흐름은 평판 전체에서 균주를 임의 추출하는 자동화 작업흐름을 사용해 성공적으로 구축된 균주를 강화시키는 적중-선발 (hit-picking) 단계를 포함한다. 성공적으로 구축된 각 균주의 경우에, 콜로니 대 콜로니 변이 및 다른 과정 변이를 시험하기 위해서 별개 콜로니로부터 최대 4개 복제물을 시험하였다. 4개보다 적게 콜로니가 수득되었다면, 존재하는 콜로니를 복제하여 각각의 바람직한 유전자형에 대해 적어도 4개 웰을 시험하였다.
콜로니는 선별 배지 (에스. 세레비지아의 경우 SD-ura)가 존재하는 96웰 평판에서 강화시켰고 포화까지 2일 동안 배양시킨 후에 16.6% 글리세롤과 함께 저장을 위해 -80℃에서 냉동시켰다. 냉동된 글리세롤 스톡은 이후에 냉동으로부터의 회복 및 성장을 돕기 위해 낮은 수준의 아미노산이 존재하는 최소 배지에서 씨드 단계를 접종하는데 사용되었다. 씨드 평판은 30℃에서 1-2일 동안 성장시켰다. 그 다음으로 씨드 평판은 최소 배지가 존재하는 주배양 평판을 접종시키는데 사용되었고 48-88시간 동안 성장시켰다. 평판은 바람직한 시점에 제거하였고 세포 밀도 (OD600), 생존능, 및 글루코스에 대해 시험하였고, 상청액 샘플은 관심 생성물에 대한 LC-MS 분석을 위해 저장하였다.
세포 밀도
세포 밀도는 600 nm에서 각 웰의 흡광도를 검출하는 분광광도 어세이를 사용해 측정하였다. 로봇공학을 사용하여 각 배양 평판에서 어세이 평판으로 고정량의 배양물을 전달한 후에, 175 mM 소듐 포스페이트 (pH 7.0)를 혼합하여 10배 희석물을 생성시켰다. 어세이 평판은 Tecan M1000 분광광도계를 사용해 측정되었고 어세이 데이터는 LIMS 데이터베이스에 업로드하였다. 비접종 대조군을 사용하여 배경 흡광도를 차감하였다. 세포 성장은 각 단계에서 다수 평판을 접종하여 모니터링하였고, 그 이후 각 시점에 온전한 평판을 희생시켰다.
(측정 동안 비대표적 샘플을 야기시킬 수 있는) 대량의 평판을 취급하면서 세포 침강을 최소화시키기 위해서, 각 평판은 각각의 판독 전에 10-15초 동안 진탕시켰다. 평판 내 세포 밀도의 폭넓은 편차가 또한 선형 검출 범위 밖에서 흡광도 측정을 초래하여, 더 높은 OD 배양물의 과소추산을 야기시킬 수 있다. 일반적으로, 지금까지 시험된 균주들은 이것이 우려될 정도로 유의하게 충분히 가변적이지 않았다.
액체-고체 분리
LC-MS를 통한 분석을 위해 세포외 샘플을 수확하기 위해서, 액체상 및 고체상을 원심분리를 통해 분리하였다. 배양 평판을 2000 rpm으로 4분 동안 원심분리하였고, 상청액을 로봇공학을 사용해 목적 평판으로 전달하였다. 75 ㎕의 상청액을 각 평판에 전달하였고, 하나는 4℃에 저장하였고, 두번째는 장기간 저장을 위해 80℃에 저장하였다.
1차 라운드 유전자 조작 결과
유전자 조작 및 스크리닝의 1차 라운드는 숙주 세포로서 에스. 세레비지아를 사용하여 수행하였다. 라이브러리 접근법이 숙주 유기체에서 기능성 효소를 동정하는데 선택되었다. 제라니올 신타제 서열의 광범위 검색으로 총 13종의 오솔로그 서열이 확인되었다. 이종성 제라니올 신타제는 일부 경우에 이종성 제라니올-8-히드록실라제와 함께 숙주 세포에서 발현시켰다. 일부 경우에서, 제라니올 신타제 및/또는 제라니올-8-히드록실라제 뉴클레오티드 서열은 에스. 세레비지아에 대해 코돈-최적화되었다. 균주는 상기 기술된 바와 같이 생산하였고 배양하였으며, 배양 배지에서 (6E)-8-히드록시제라니올 역가는 LC-MS로 측정하였다. 균주 및 결과는 표 1 및 도 2에 표시되어 있다. 최고 성능 1차 라운드 균주는 파세올러스 안굴라리스 제라니올-8-히드록실라제와 함께, 페릴라 세토이엔시스 제라니올 신타제를 발현하는 에스. 세레비지아 균주로서, 37.5 ㎍/배양 배지 L의 (6E)-8-히드록시제라니올 역가를 제공하였다. 이러한 균주는 유전자 조작 및 스크리닝의 2차 라운드에 선택되었다.
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2차 라운드 유전자 조작 결과
최고 성능의 1차 라운드 균주가 조합 라이브러리 접근법을 사용한 유전자 조작의 2차 라운드를 위한 출발 숙주로 사용되었다. 이 라운드에서, 1-3개 상류 경로 유전자의 추가 카피가 강력한, 항상성 프로모터의 제어 하에, 별개 "딸" 균주에 도입되었다 (표 2). 상류 경로 유전자는 (6E)-8-히드록시제라니올로 이어지는 경로의 마지막 천연 대사산물로 핵심 전구체 (예를 들어, 아세틸-CoA)의 전환에 관여되는 모든 유전자를 의미한다. 조합 라이브러리 접근법으로 균주에서 시험하려고 선택된 효소는 메발로네이트 경로 다이아그램에 도시되어 있다 (도 1). 이 라운드의 최고 성능 균주는 에스. 세레비지아로부터 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이소머라제를 과발현시켜서, 123 ㎍/배양 배지 L의 (6E)-8-히드록시제라니올 역가를 제공하였다.
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3차 및 4차 라운드의 유전자 조작 결과
유전자 조작의 3차 라운드는 개선된 균주가 생산되지 않았는데, 아마도 균주 제작의 오류 때문인 듯하다. 4차 (개선) 라운드의 균주 디자인 및 결과는 표 3에 표시되어 있다.
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실시예 2 - (6E)-8-히드록시제라니올을 생산하도록 조작된 야로위아 리폴리티카 균주의 제작 및 선별
야로위아 리폴리티카는 에스. 세레비지아에 대해 상기 기술된 접근법을 사용해 조작하였다. 유전자 조작의 1차 라운드에서 제작된 균주 및 그들 (6E)-8-히드록시제라니알 역가는 표 4에 표시되어 있다.
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실시예 3 - (6E)-8-히드록시제라니올 생산을 위한 숙주 평가
최고 성능 효소는 다음 4종의 숙주에서 시험하였다: 야로위아 리폴리티카, 바실러스 서브틸리스, 코리네박테리아 글루타미컴, 사카로마이세스 세레비지아. 에스. 세레비지아에 대한 결과는 하기 표 5에 표시되어 있다.
와이. 리폴리티카의 최고 성능 균주는 310 마이크로그램/L의 역가를 생산하였다. 이 와이. 리폴리티카 균주는 페릴라 세토이엔시스 유래 제라니올 신타제 (UniProt ID C0KWV4), 파세올러스 안굴라리스 유래 제라니올 8-히드록실라제 (UniProt ID A0A0L9UT99) 및 에스. 세레비지아 유래 이소펜테닐-디포스페이트 델타3-델타2-이소머라제 (UniProt ID P15496)를 발현하였다. 차선 성능 와이. 리폴리티카 균주는 200 마이크로그램/L를 생산하였고, 이 균주는 아미노산 치환 S80F [4]를 보유하는 에스케리치아 콜라이 K12 유래 파르네실 디포스페이트 신타제 (UniProt ID P22939), 비티스 비니페라 유래 제라니올 신타제 (UniProt ID E5GAH8), 및 파세올러스 안굴라리스 유래 제라니올 8-히드록실라제 (UniProt ID A0A0L9UT99)를 발현하였다.
에스. 세레비지아에서 최고 성능 균주는 217 마이크로그램/L의 역가를 생산하였다. 이 에스. 세레비지아 균주는 페릴라 세토이엔시스 유래 제라니올 신타제 (UniProt ID C0KWV4), 파세올러스 안굴라리스 유래 제라니올 8-히드록실라제 (UniProt ID A0A0L9UT99) 및 에스. 세레비지아 유래 이소펜테닐-디포스페이트 델타3-델타2-이소머라제 (UniProt ID P15496)를 발현하였다.
비. 서브틸리스 또는 씨 글루타미컴 균주에 의해 생산된 역가는 없었다.
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참조문헌
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Ser Ile Ser Gln Lys Val Val Ile Gly Leu Asn Lys Ala Ala 1 5 10 15 Ala Asn Asn Cys Leu Gln Asn Leu Asp Arg Arg Gly Phe Lys Thr Arg 20 25 30 Arg Val Ser Ser Ser Glu Ala Ala Ser Cys Leu Arg Ala Ser Ser Ser 35 40 45 Leu Gln Leu Asp Val Lys Pro Val Glu Glu Gly Arg Arg Ser Gly Asn 50 55 60 Tyr Gln Pro Ser Ile Trp Asp Phe Asn Tyr Val Gln Ser Leu Asn Thr 65 70 75 80 Pro Tyr Lys Glu Glu Arg Tyr Leu Thr Arg His Ala Glu Leu Ile Val 85 90 95 Gln Val Lys Pro Leu Leu Glu Lys Lys Met Glu Ala Thr Gln Gln Leu 100 105 110 Glu Leu Ile Asp Asp Leu Asn Asn Leu Gly Leu Ser Tyr Phe Phe Gln 115 120 125 Asp Arg Ile Lys Gln Ile Leu Ser Phe Ile Tyr Asp Glu Asn Gln Cys 130 135 140 Phe His Ser Asn Ile Asn Asp Gln Ala Glu Lys Arg Asp Leu Tyr Phe 145 150 155 160 Thr Ala Leu Gly Phe Arg Leu Leu Arg Gln His Gly Phe Asn Val Ser 165 170 175 Gln Glu Val Phe Asp Cys Phe Lys Asn Asp Lys Gly Ser Asp Phe Lys 180 185 190 Ala Ser Leu Ser Gly Asn Thr Lys Gly Leu Leu Gln Leu Tyr Glu Ala 195 200 205 Ser Phe Leu Val Arg Glu Gly 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Trp Val Asp Leu Ala Glu Ser Phe Leu 420 425 430 Lys Glu Ala Asn Trp Tyr Tyr Ser Gly Tyr Thr Pro Ser Leu Glu Glu 435 440 445 Tyr Ile Asp Asn Gly Ser Ile Ser Ile Gly Ala Val Ala Val Leu Ser 450 455 460 Gln Val Tyr Phe Thr Leu Ala Asn Ser Ile Glu Lys Pro Lys Ile Glu 465 470 475 480 Ser Met Tyr Lys Tyr His His Ile Leu Arg Leu Ser Gly Leu Leu Val 485 490 495 Arg Leu His Asp Asp Leu Gly Thr Ser Leu Phe Glu Lys Lys Arg Gly 500 505 510 Asp Val Pro Lys Ala Val Glu Ile Cys Met Lys Glu Arg Asn Asp Thr 515 520 525 Glu Glu Glu Ala Glu Glu His Val Lys Tyr Leu Ile Arg Glu Ala Trp 530 535 540 Lys Glu Met Asn Thr Ala Thr Ala Ala Ala Gly Cys Pro Phe Met Asp 545 550 555 560 Glu Leu Asn Val Ala Ala Ala Asn Leu Gly Arg Ala Ala Gln Phe Val 565 570 575 Tyr Leu Asp Gly Asp Gly His Gly Val Gln His Ser Lys Ile His Gln 580 585 590 Gln Met Gly Gly Leu Met Phe Lys Pro Tyr Val 595 600 <210> 6 <211> 1809 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> mutated and/or codon-optimized sequence <400> 6 atgtgcagca tctctcaaaa ggtcgttatt ggattgaata aggcagcggc caataactgc 60 ctccaaaacc ttgatcgccg aggttttaaa acacgccgtg tttcatcctc cgaagcggct 120 tcttgcctcc gagcctcaag ctcgctgcag cttgatgtca agccggtgga ggaaggccga 180 cgttccggta actatcagcc atcaatctgg gattttaatt atgtccagtc cctcaacacc 240 ccctacaaag aggaacgtta ccttacccga cacgcggaac tcatcgttca ggtcaagccg 300 cttctcgaaa aaaagatgga ggctactcag cagttggagc tcatcgatga ccttaacaac 360 ctcggtctga gctacttttt ccaagaccgc atcaagcaga ttctctcatt catctatgat 420 gaaaatcagt gtttccactc caatatcaat gatcaagctg aaaagcgaga cctgtacttt 480 accgcccttg gatttcgtct ccttcgccag cacggcttta acgtgtctca ggaggtgttc 540 gattgcttca aaaacgataa aggctccgat tttaaagcgt ccctgtctgg aaacaccaag 600 ggcctcctcc agctctacga agcctccttc ttggtccgtg agggtgaaga caccctcgaa 660 ctggcccgtc agttcgcgac caagttcctg cgccgcaagc ttgacgaaat cgacgacaac 720 catctgctct cacgaattca ccactcactc gaaatcccgt tgcactggcg catccagcgt 780 ctggaggcgc gctggtttct ggacgcgtac gctacacgcc acgatatgaa tcccattatc 840 ttggagctcg caaaactgga ctttaatatt attcaagcaa cccaccaaga agagctcaag 900 gacgtgagcc gttggtggca gaatacgcgc ctggccgaaa agctcccgtt tgtgcgcgat 960 cgacttgtcg agtcatactt ttgggccatc gcactctttg agccacatca atatggatac 1020 cagcgccgtg ttgctgccaa gattatcacc ctcgcgacat ccatcgatga cgtgtacgac 1080 atctacggca ctctcgacga gctccaactt tttaccgata acttccgtcg ctgggacacg 1140 gaatccttgg gcggtcttcc ttactcgatg cagttgttct acatggtgat tcacaacttt 1200 gtctctgagt tggcctatga aatcctgaaa gaaaaaggtt ttatcgccat cccctacctc 1260 caacgctcct gggttgattt ggcagaatcc tttttgaaag aggcaaactg gtactactct 1320 ggttatacac cctccctcga agaatacatc gacaacggct ccatctcaat tggcgcagta 1380 gctgtgttgt cccaagttta tttcactttg gcaaattcta tcgaaaagcc aaagattgaa 1440 tctatgtaca agtaccacca tattttgcgt ctgtcgggtt tgttggtgcg cctgcacgat 1500 gacttgggaa cttccttgtt cgagaagaag cgcggcgatg ttcctaaggc ggtcgaaatt 1560 tgcatgaaag aacgcaacga tacggaggag gaagcagaag aacacgttaa gtacttgatt 1620 cgcgaagcct ggaaggagat gaacactgct acggcagctg caggatgtcc ttttatggat 1680 gagctcaacg tggctgctgc caatctgggt cgcgcagccc 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atcccaaacg caatccacgc ccatgaccaa tataagtata gcgtgatttg gctcccggtg 360 gcgtcccgat ggcgaggtct gcgtaaggcg ctcaactcca atatgttctc tggaaatcgc 420 ctggatgcaa atcagcactt gcgttcacga aaggtccagg aactgatcgc ctattgccgc 480 aagtcatctc aaactggcga tgctattgat gttggtcgcg cagcattccg cacttcattg 540 aacctgctta gcaacaccat gttcagcaag gaccttacag acccttattc tgactccgca 600 aaagaattta aggatctcgt ttggaacgtg atggtggagg caggcaaacc caatttggtt 660 gactacttcc ctctgttgga taaagttgac ccccaaggca ttcgaaagcg catgaccatt 720 catttcggta aaatcctcga attgtttggc ggacttatcg acgaacgatt gcagcaaaaa 780 aaagcaaagg gagtgaacga cgacgtgctg gacgtgctcc ttaccacttc agaggaaagc 840 ccggaggaaa tcgaccgtac ccatatccag cgcatgtgcc tggacttgtt cgtcgcgggc 900 acggacacta cgtcgtcgac gctcgaatgg gccatgtctg aaatgcttaa gaaccccgaa 960 aaaatgaagg cggcccaggc agaactggcc caggttattg gaaaaggcaa ggctgttgaa 1020 gaagcagact tggcgcgcct gccatacctg cgctgcgcta ttaaagagac ccttcgaatc 1080 catcctccgg ttccactgct gattcctcga cgcacggaac aagaggtcga ggtgtgcggt 1140 tatacggttc cgaagaactc acaggttttg gtgaacgttt gggccatctc tcgagacgat 1200 gcaatttgga aggatccact ctcctttaag cctgaacgtt ttctggagtc tgaattggag 1260 atgcgtggta aggatttcga gcttatccca ttcggtgcgg gccgacgcat ttgcccgggc 1320 cttcctctgg cggtgcgcat ggtcccagtg atgcttggat ctcttttgaa ctcattcgat 1380 tggaagctgg agggcggcat cgcgcctaag gacttggaca tggaagaaaa gttcggcatc 1440 acgctgcaga aagcccaccc tctccgcgct gtcgccactc cactgt 1486 <210> 9 <211> 505 <212> PRT <213> Populus trichocarpa (Western balsam poplar) (Populus balsamifera subsp. trichocarpa) <400> 9 Met Asn Phe Phe Ile Ser Val Leu Leu Tyr Phe Leu Leu Thr Phe Ala 1 5 10 15 Val Ile Gln Ser Leu Asp Tyr Ile Leu Arg Arg Ser Lys Arg Lys Ser 20 25 30 Gly Lys Leu Pro Pro Gly Pro Ser Arg Leu Pro Ile Val Gly Asn Leu 35 40 45 Leu Asp Leu Gly Asp Lys Pro His Lys Ser Leu Ala Lys Leu Ala Lys 50 55 60 Thr His Gly Gln Leu Met Ser Leu Lys Leu Gly Gln Val Thr Thr Ile 65 70 75 80 Val Val Ser Ser Ala Thr Met Ala Lys Glu Val Leu Gln Lys His Asp 85 90 95 Leu Thr Phe Cys Asn Arg Thr Val 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tgctggacac tttgctcacg 840 atctcagaag tcaacaacga agagatggac gctacacgta tcaagcactt ttttttggat 900 ttgttcggcg caggcaccga tacgacttca tcgactcttg agtgggccat ggcagagctc 960 ttgcactcgc cgaaaaccct cctcaaagcc cgcgctgaac tggaacgcac catcggcgag 1020 ggcaatcttt tggaggaatc cgacatcacc cgtctcccct acctgcaggc tgtcatcaag 1080 gagactctcc gactccatcc agccgtgccc ttcctccttc cacacaaggc aggcgctgat 1140 gctgaaatcg gcggttttac tgtgccaaaa aacgcgcagg tcttggtgaa tgtctgggcg 1200 attggccgtg atccctcaat gtgggaagac cccaattcct tcgtccctga acgcttcttg 1260 gaatcaggta tcgatcaccg aggacaaaac tttgaattta tccctttcgg cagcggacgt 1320 cgaatttgcc caggtcttcc gctggcgatg cgtatgctcc ctctcatgct cggttctctc 1380 atcttgtcct tcgactggaa gttggcagat ggtgtgacgc cagaaaactt gaacatggac 1440 gataagttcg gtttgactct cctgaaagct cagccccttc gtgcgatccc catcacccga 1500 gaattgaaac acggt 1515 <210> 11 <211> 501 <212> PRT <213> Phaseolus angularis (Azuki bean) (Vigna angularis) <400> 11 Met Glu Thr Asn Ser Thr Leu Phe Phe Thr Phe Thr Val Leu Leu Ile 1 5 10 15 Thr 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cagctcgctg aagggcgagc ccgtgaacat cggtcgtctg 540 gcttttaaaa cgaccatcaa ccaactttct aacaccatct actcggaaga cttcttgcaa 600 tccgccgaga aagcgggcga aatgaaggaa ctcgttacca atattatgaa ggaggttggc 660 cgcccgaacc ttgccgactg cttccccgtt ctgaaaatga tcgaccccca cggcatccgc 720 cgtcgaaccg gctcttactt cagcaagctg cttaatatct tcaaatccct gatccacaag 780 cgtctggaac ttcgtaaaga tgctgcgggc tactgtacta aaaaggatat gcttgacgcg 840 atgctgaacg acgcccaaca caaaatggac atcgttaaga tccagcgtct ctctcttgat 900 ttgttcgttg caggaacgga taccgtcacc tccactgtcg agtgggctat ggctgaactg 960 cttcacaacc cccacgttat gtcaaaggct aaagaggaac tcgaacgcat tatcggtaag 1020 gataatctgg tggaggagtc agacatcgcc aagttgcctt acttgcaggc tatcgtgaag 1080 gagaccttcc gtctccaccc agcagtcccc cttttgctgc cacgcaaagc cgaggttgaa 1140 tttgaaatgc acggttacac aatccccaaa ggcgcccagg tcctgatcaa tgtctgggcc 1200 attggtcgcg acccgaactt gtgggaaaag ccacgcctgt tttggcccga gcgatttctt 1260 gaatccgaga tcgacttcaa gggccgatcg ttcgagctca ccccgttcgg cggcggccgt 1320 cgcatctgcc ctggactccc attggcgatc 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gtactacatt 420 aacatccact ccgtgcgcga gggtgactgg atcctcttta cccacgaggg cggtgtcgat 480 gtcggcgatg tcgacgccaa agcagagaag ctgttgatcc cggtgaatct caagaactac 540 ccctccaacg aggagatcgc atctgcattg ttgtccaagg tccctaaggg aatccataac 600 gtccttgtgg actttatctc ccgtctgtac gcggtctatg ttgattgtca atttacgtac 660 ctcgaaatca acccattggt cgtgattccc aacgcggacg caacttccgc tgatgttcat 720 tttcttgatc tcgctgcgaa gctggatcag acagccgaat tcgaatgcgg taccaagtgg 780 gccgtcgctc gttctcccgc caacttgggc ctcgcagcct tgcctacgag cgataaggtg 840 aacattgacg cgggacctcc gatggaattt cctgccccct ttggtcgcga gctgtcaaaa 900 gaagaaaaat ttatttccga catggatgct aagaccggag cgagccttaa gctcaccgtc 960 cttaatccga acggccgcgt gtggaccctc gtcgccggcg gaggtgcctc tgtggtatac 1020 gcagacgcga ttgcttctgc aggcttcgtg tccgaattgg ctaactacgg tgagtactcg 1080 ggcgcaccga ccgaaaccca aaccttcaac tacgcccgca ccatcttgga tctgatgctg 1140 cgctccccaa ttcacccgga cggtaaggtg cttttcattg gcggtggaat tgccaacttc 1200 acaaacgttg cgagcacctt caaaggagtg atccgtgctc tgcgtgaagt ggcaccagtt 1260 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cgagcccatg tacttcatgt 120 catttaagtc cgtcctcaag cagcaaacca ttgctgggat cccatgacta ttctttgcta 180 aaatccttga cgttgtctcc tcacgcagtt aactcagagg cagattcatc tacaaggaga 240 atgaaagaag tgaaagaaag aacttgggaa gcgttctaca gagcatggga ttcaagggca 300 gcaatggaaa tggtcgatac ggtggaaaga ttaggcttgt cataccattt tgaagacgaa 360 ataaatgctt tgcttcaaag gttctgtgac tggaatgcat ctgaggatct ttttacgacc 420 gcactaagat ttagactgtt gagacagaac ggcttcccaa cgcatagcga tgtgtttggt 480 aagttcatgg ataagaatgg gaaatttaag gagtccttaa ccgaagacat ctggggaatg 540 ttatccttgc atgaagcttc ccaccttggt gccaaaaacg aggaagtctt ggccgaagct 600 aaagaattca ccagaattca cctaatacaa tccatgcccc atatggaacc acatttctcc 660 tctcatgtgg ggagagcctt agagttgccg agacacttaa ggatggttag actagaagct 720 aggaactata tcggggaata ttcaagagaa agtaatccga atttggcgtt tttggagctt 780 gctaagttgg attttgatat ggttcaatcc ctgcaccaaa aagaactagc cgaaatagtt 840 aggtggtgga agcaattagg tctggttgat aaactggact ttgctagaga tagaccaatg 900 gagtgctttc tttggacggt aggtatcttc cctgacccaa ggcacagctc 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gccaagctgg atttcgacat ggtccagtcg ctgcaccaga aggagctcgc cgagattgtc 840 cgatggtgga agcaactcgg ccttgtcgac aaactggatt tcgctcgaga tcgacccatg 900 gagtgcttcc tgtggaccgt tggtattttc cccgaccccc gtcactcttc ctgccgaatc 960 gagctgacca aggccatcgc cattctgctc gttattgatg acatttacga ctcctacgga 1020 agccttgacg agctcgcact cttcaccgac gccgtgaagc gatgggatct gggtgccatg 1080 gatcaactgc ccgagtacat gaagatctgc tacatggccc tttacaacac aaccaacgac 1140 atcgcttacc gaatccttaa ggagcacgga tggtctgtta ttgaggacct caagcgaacg 1200 tggatggata tcttcggagc ctttctggct gaggcctact gtttcaaggg aggccatgtc 1260 ccttcgctcg aagagtatct gaccaacgct gtcaccaccg gtggtactta catggctctg 1320 gtccacgcat tcttcctgat gggtcaagga gtcacaagag agaatatggc tatgcttaag 1380 ccctatccca acattttttc ttgctctgga aagattctcc ggctctggga tgacctcggc 1440 actgctcgag aggagcagga gcgaggcgat aacgcttcct cgattgagtg ctacaagcga 1500 gagcgagaga tggataccgt ccttgaggac gaggcttgcc gtaagcatat tcgtcaaatg 1560 attcagtcgc tctgggttga gctgaacgga gaactggttg catcgtccgc cctccctctg 1620 tcgatcatca aagccgcttt caacctctcg agaactgctc aggtgattta ccagcacgga 1680 gatgacaaca agaccagctc tgtcgaagac cacgtccagg ctctgctttt cagacctgtg 1740 tcctcgaacg gtcacgctca aattaccatg cac 1773 <210> 102 <211> 501 <212> PRT <213> Phaseolus angularis (Azuki bean) (Vigna angularis) <400> 102 Met Glu Thr Asn Ser Thr Leu Phe Phe Thr Phe Thr Val Leu Leu Ile 1 5 10 15 Thr Ile Ile Thr Phe Leu Lys Ala Leu Lys Ser Leu Phe Thr Pro Asn 20 25 30 Lys Ser Lys Ser Asn Leu Pro Pro Gly Pro Lys Gly Leu Pro Leu Val 35 40 45 Gly Asn Leu Leu Gln Leu Gly Ala Lys Pro His Gln Thr Leu Ala Thr 50 55 60 Leu Ala Asn Ile His Gly Ser Ile Met Ser Leu Lys Leu Gly Gln Glu 65 70 75 80 Thr Thr Ile Val Met Ser Ser Ala Glu Ala Ala Lys Gly Val Leu Gln 85 90 95 Ile His Asp His Phe Leu Ser Asn Arg Lys Ile Pro Asp Ala Met Arg 100 105 110 Gly Ser Ser His Asp His Phe Ser Leu Pro Phe Met Pro Val Ser Gln 115 120 125 Gln Trp Arg Glu Leu Arg Lys Leu Cys Asn Glu Leu Leu Phe Ser Asn 130 135 140 Lys Asn Leu Asp Ala Thr Gln Gly Leu Arg Ser Lys 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agacatcgcc aagttgcctt acttgcaggc tatcgtgaag 1080 gagaccttcc gtctccaccc agcagtcccc cttttgctgc cacgcaaagc cgaggttgaa 1140 tttgaaatgc acggttacac aatccccaaa ggcgcccagg tcctgatcaa tgtctgggcc 1200 attggtcgcg acccgaactt gtgggaaaag ccacgcctgt tttggcccga gcgatttctt 1260 gaatccgaga tcgacttcaa gggccgatcg ttcgagctca ccccgttcgg cggcggccgt 1320 cgcatctgcc ctggactccc attggcgatc cgacttgttt ttctgatgct cggcctgttt 1380 attaactctt tcgattggga acttcaggac attcagccgg aagacatgaa tatggacgaa 1440 aacttcggtc tgactcttga aaaggcccag ccagttctcg caattccaat cattccaaaa 1500 cac 1503 <210> 104 <211> 1503 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> mutated and/or codon-optimized sequence <400> 104 atggaaacca acagtacttt attctttaca tttacagtcc ttcttatcac tatcataaca 60 tttctcaagg cgctcaaaag tttattcacg ccgaataaat caaaatcaaa tcttccgcct 120 ggaccaaaag gactcccgct ggttggaaat cttttgcaac tcggggcaaa acctcatcag 180 acattagcta cgcttgctaa cattcacgga agcattatgt ctctgaagtt aggtcaagaa 240 acaacaattg tcatgtcttc ggcggaggcg gctaaaggcg ttttgcagat ccacgatcat 300 tttctgagca accggaaaat tcctgacgcc atgcgtggta gctcacatga tcatttctca 360 ttaccgttca tgccagtaag ccaacaatgg cgcgagctga gaaaactgtg taatgagtta 420 ttattttcaa ataaaaactt ggatgcaacg caggggctga gaagcaaaaa agttcgtgaa 480 ctgtattcag atatacatcg ctcgtctctt aaaggcgaac cggtcaacat cgggagactt 540 gcttttaaaa caacaattaa ccaattgagc aatacgatct actcggagga cttccttcaa 600 agcgcggaaa aagcaggtga aatgaaggaa ctggtcacaa acatcatgaa ggaagtggga 660 cgtccgaatc tggctgactg ttttccggtg ctgaaaatga ttgatcctca cggaattcgc 720 cgccggacag gttcatattt ctcaaaactt ctgaatatat tcaaaagctt aattcataaa 780 cgcttagagt tgcgcaaaga tgctgcaggc tattgcacga agaaagatat gctggatgcg 840 atgctgaacg atgctcaaca taaaatggat atcgtgaaaa tccagcggct ctcactcgac 900 ttatttgttg ctggcacaga taccgtcacc tcgaccgtcg agtgggccat ggcagagttg 960 ctgcataatc cacacgtaat gtccaaagct aaagaagaac tggaaagaat cattggcaag 1020 gataacctcg ttgaagaaag cgacatcgcg aaacttcctt acttacaggc gattgtaaag 1080 gagacgttta gactgcatcc agcagtacct ctgcttcttc cgcgcaaagc tgaagtagaa 1140 tttgaaatgc atggatatac gatcccgaaa ggggcacagg tactcatcaa tgtgtgggcg 1200 attggcagag atccaaattt gtgggaaaaa cctcgtttgt tttggcctga aagattcctg 1260 gagtcagaaa ttgacttcaa gggcagatcc ttcgaactca cgccgtttgg cgggggccgg 1320 cgtatttgcc ctggcctgcc gttagccatt agattggttt tcttgatgtt aggcttattc 1380 atcaatagct tcgattggga gctccaggat attcaaccgg aagacatgaa tatggacgaa 1440 aactttggct taacactgga gaaagcacag ccggtactgg ccattccgat catcccgaaa 1500 cat 1503 <210> 105 <211> 1503 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> mutated and/or codon-optimized sequence <400> 105 atggaaacta acagcacttt attttttaca ttcacagtct tacttattac gataattacg 60 ttcctgaaag ctctgaaatc actatttact ccaaataaaa gtaagtctaa cttgccccct 120 ggcccaaagg gtttgccact tgttggaaat ctattgcaat taggtgcaaa acctcatcaa 180 acactggcta ctttggctaa tatacatggg tccattatga gcctaaagtt gggccaagag 240 acaactatag tgatgtcttc tgctgaagca gccaagggtg tcttgcaaat acatgatcat 300 ttcctgagca atagaaagat tcctgacgct atgaggggat caagccacga tcatttctca 360 ttgccattca tgcctgtatc ccagcaatgg agagaattaa gaaaattatg taatgaactg 420 ttattttcta acaagaatct ggatgcaaca cagggcttaa gatcaaagaa agttagggaa 480 ttatattcag atatccatcg tagttcttta aaaggcgaac cagtcaacat cggcagactg 540 gcatttaaaa ccaccattaa ccagttgtct aataccattt atagcgaaga tttcttacaa 600 tctgccgaaa aagctggcga gatgaaagaa ttggttacta atatcatgaa ggaagttggt 660 aggccgaacc ttgcagactg ctttcctgtc ttgaagatga tagatccaca tggcattaga 720 agaagaacgg gttcttattt ttctaagttg cttaatattt tcaaatcatt gatccacaag 780 aggttggagt tgagaaaaga tgcggcagga tattgtacga aaaaagacat gctggatgca 840 atgcttaacg atgctcagca taagatggat atagttaaga tccaaagatt atctttggat 900 ttgttcgtcg ccggtactga tactgttacc tccactgtag aatgggccat ggcagaattg 960 cttcataacc cgcatgtcat gtcaaaagct aaagaagaat tggaaagaat tattggcaag 1020 gataatctgg tagaggaaag tgacatagct aaacttccat acttgcaagc cattgttaag 1080 gagactttta gattgcatcc agcagtgcct cttcttttgc caagaaaggc tgaagtggaa 1140 tttgaaatgc acggctacac aattccaaaa ggagctcaag tgttgatcaa tgtatgggcc 1200 attggtcgtg acccaaatct atgggaaaaa ccacgtttat tctggccaga gagatttttg 1260 gaatcagaaa ttgacttcaa gggcaggtca ttcgagttga ccccattcgg cggtggtaga 1320 aggatatgtc ctggcttacc acttgccatc cgtttagtat ttttgatgct tgggctattc 1380 attaactctt ttgactggga gcttcaagat attcagcccg aggatatgaa catggatgag 1440 aatttcgggc tgacacttga aaaagcgcaa cctgtattag ctattccgat aattccaaaa 1500 cat 1503 <210> 106 <211> 1503 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> mutated and/or codon-optimized sequence <400> 106 atggagacca actcgactct gttctttact tttactgttc tcctgatcac cattatcacc 60 ttcctcaagg cactgaagtc gctgttcacc cccaataagt cgaagagcaa cctccccccc 120 ggtcctaagg gcctccctct ggtgggaaac ctcctccagc tcggcgccaa acctcatcag 180 actctggcta ccctggccaa cattcacggc agcatcatgt cgctcaagct tggtcaggag 240 actactatcg tcatgtcgtc ggccgaggct gctaagggcg tccttcagat ccacgatcac 300 ttcctgtcta accgaaagat ccccgacgct atgagaggat cttctcacga ccatttctct 360 ctccctttca tgccagtctc gcagcagtgg cgagagcttc gaaagctctg taacgagctt 420 ctcttctcta ataagaacct tgatgctact cagggtctca gatctaagaa ggttcgagag 480 ctgtattcgg acattcatcg atcttctctg aagggtgagc ccgtcaacat tggtagactg 540 gctttcaaga caacaattaa tcagctctct aacacaattt acagcgagga cttcctccag 600 tcggctgaga aggccggtga aatgaaggaa ctcgtcacca acatcatgaa ggaagtgggc 660 cggcccaacc ttgctgattg cttccccgtt ctcaagatga ttgaccccca tggaatccgg 720 cgacggaccg gctcctattt ttccaagctc ctgaacattt tcaagtccct catccacaag 780 cgactcgaac tccgaaaaga cgccgccggt tactgtacca aaaaagacat gcttgacgct 840 atgctcaacg acgcacagca caagatggat attgtcaaga ttcagcgact gtccctcgac 900 ctgttcgtgg ctggaaccga caccgttaca tctacagtcg aatgggctat ggccgaactg 960 ctgcataacc ctcacgtgat gagcaaggct aaggaggagc ttgagcgaat catcggaaag 1020 gacaacctcg tggaggagtc ggacatcgcc aagctgcctt accttcaagc cattgttaag 1080 gagacctttc gactgcaccc agctgttcca ctgctgctcc caagaaaagc tgaggtcgag 1140 ttcgaaatgc acggatatac aatccccaag ggagctcagg ttcttatcaa cgtctgggct 1200 attggacgag accccaacct ctgggagaag cctcgactct tttggcctga gcgattcctc 1260 gagagcgaga ttgactttaa gggtagatct ttcgaactga ccccctttgg tggcggacga 1320 cggatctgcc ccggtctgcc cctcgctatt cgactggttt tcctcatgct tggcctcttc 1380 atcaatagct ttgactggga gcttcaagac attcagcctg aagacatgaa catggacgag 1440 aacttcggcc tgaccctgga gaaggcccag cccgtcctgg caatccccat catccccaag 1500 cac 1503 <210> 107 <211> 495 <212> PRT <213> Swertia mussotii (Felwort) <400> 107 Met Asp Phe Asp Phe Leu Thr Ile Ala Ile Gly Phe Leu Phe Thr Ile 1 5 10 15 Thr Leu Tyr Gln Ala Leu Asn Phe Phe Ser Arg Lys Ser Lys Asn Leu 20 25 30 Pro Pro Gly Pro Ser Pro Leu Pro Leu Ile Gly Asn Leu His Leu Leu 35 40 45 Gly Asp Gln Pro His Lys Ser Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys His Gly 50 55 60 Pro Ile Met Gly Leu Gln Leu Gly Gln Val Thr Thr Ile Val Val Thr 65 70 75 80 Ser Ser Gly Met Ala Lys Glu Val Leu Gln Lys Gln Asp Leu Ala Phe 85 90 95 Ser Ser Arg Ser Ile Pro Asn Ala Ile His Ala His Asp Gln Tyr Lys 100 105 110 Tyr Ser Val Ile Trp Leu Pro Val Ala Ser Arg Trp Arg Gly Leu Arg 115 120 125 Lys Ala Leu Asn Ser Asn Met Phe Ser Gly Asn Arg Leu Asp Ala Asn 130 135 140 Gln His Leu Arg Ser Arg Lys Val Gln Glu Leu Ile Ala Tyr Cys Arg 145 150 155 160 Lys Ser Ser Gln Thr Gly Asp Ala Ile Asp Val Gly Arg Ala Ala Phe 165 170 175 Arg Thr Ser Leu Asn Leu Leu Ser Asn Thr Met Phe Ser Lys Asp Leu 180 185 190 Thr Asp Pro Tyr Ser Asp Ser Ala Lys Glu Phe Lys Asp Leu Val Trp 195 200 205 Asn Val Met Val Glu Ala Gly Lys Pro Asn Leu Val Asp Tyr Phe Pro 210 215 220 Leu Leu Asp Lys Val Asp Pro Gln Gly Ile Arg Lys Arg Met Thr Ile 225 230 235 240 His Phe Gly Lys Ile Leu Glu Leu Phe Gly Gly Leu Ile Asp Glu Arg 245 250 255 Leu Gln Gln Lys Lys Ala Lys Gly Val Asn Asp Asp Val Leu Asp Val 260 265 270 Leu Leu Thr Thr Ser Glu Glu Ser Pro Glu Glu Ile Asp Arg Thr His 275 280 285 Ile Gln Arg Met Cys Leu Asp Leu Phe Val Ala Gly Thr Asp Thr Thr 290 295 300 Ser Ser Thr Leu Glu Trp Ala Met Ser Glu Met Leu Lys Asn Pro Glu 305 310 315 320 Lys Met Lys Ala Ala Gln Ala Glu Leu Ala Gln Val Ile Gly Lys Gly 325 330 335 Lys Ala Val Glu Glu Ala Asp Leu Ala Arg Leu Pro Tyr Leu Arg Cys 340 345 350 Ala Ile Lys Glu Thr Leu Arg Ile His Pro Pro Val Pro Leu Leu Ile 355 360 365 Pro Arg Arg Thr Glu Gln Glu Val Glu Val Cys Gly Tyr Thr Val Pro 370 375 380 Lys Asn Ser Gln Val Leu Val Asn Val Trp Ala Ile Ser Arg Asp Asp 385 390 395 400 Ala Ile Trp Lys Asp Pro Leu Ser Phe Lys Pro Glu Arg Phe Leu Glu 405 410 415 Ser Glu Leu Glu Met Arg Gly Lys Asp Phe Glu Leu Ile Pro Phe Gly 420 425 430 Ala Gly Arg Arg Ile Cys Pro Gly Leu Pro Leu Ala Val Arg Met Val 435 440 445 Pro Val Met Leu Gly Ser Leu Leu Asn Ser Phe Asp Trp Lys Leu Glu 450 455 460 Gly Gly Ile Ala Pro Lys Asp Leu Asp Met Glu Glu Lys Phe Gly Ile 465 470 475 480 Thr Leu Gln Lys Ala His Pro Leu Arg Ala Val Ala Thr Pro Leu 485 490 495 <210> 108 <211> 1485 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> mutated and/or codon-optimized sequence <400> 108 atggatttcg atttccttac gattgccatt ggatttcttt ttacaattac cttgtatcag 60 gctctgaatt ttttcagtcg taaatcgaaa aaccttccgc caggaccatc accgctgcct 120 ttgataggga atcttcattt gttaggtgac cagcctcata aatcgttggc caagcttgcg 180 aagaaacatg gtcctattat gggcttacaa ttgggccaag tgacgactat tgttgttacg 240 tctagcggca tggccaagga agttcttcaa aagcaggatt tagctttttc atcccgttct 300 attccaaatg cgatacatgc acatgatcag tacaagtact cagtgatttg gcttcctgtg 360 gcatcacggt ggcgtgggct gcgcaaagct ttgaattcca acatgttttc cggaaacaga 420 ctggatgcga accaacatct gcggtctcgc aaagtgcagg aattaattgc ctattgcaga 480 aaatcaagcc aaactggtga cgcaattgac gtagggcgag ccgcctttcg aacatctctt 540 aacctcctgt ctaacacgat gttttctaaa gacctcactg atccttactc cgattccgcg 600 aaagaattca aggatttggt ctggaacgtg atggttgagg cgggaaaacc taacttggtg 660 gattattttc cgctccttga taaagtggac ccgcaaggaa ttcggaagcg catgacgatc 720 cattttggta aaattctcga gctttttggc ggattaattg atgaacgtct tcagcaaaaa 780 aaggcgaagg gagtgaacga cgacgttctt gacgtgcttc tgacgacctc tgaggaatcc 840 ccagaagaga ttgatcggac tcatattcag cgtatgtgcc tggatttgtt tgtggccggt 900 acggacacta cctcctccac gctcgaatgg gcaatgtcgg aaatgttaaa aaatcctgag 960 aaaatgaaag cggctcaagc agaactggcc caagtcatcg gcaaaggcaa agccgtagaa 1020 gaagccgatc ttgctcgctt gccgtattta cggtgcgcaa ttaaagaaac cctgagaatc 1080 catccgcctg tcccgctttt aatccctcga agaacagaac aagaggtcga agtctgtgga 1140 tataccgtgc ctaaaaattc acaagtgctc gtaaacgtct gggcgattag tcgtgacgac 1200 gcgatatgga aagacccgct tagttttaaa ccggaacggt tcctcgagag cgagttagaa 1260 atgcggggta aggatttcga gctgattcct ttcggggcgg gtagaagaat ctgccctggc 1320 ctgccgctgg cggtgcggat ggttccagtt atgcttggtt ctctgcttaa ttcattcgat 1380 tggaaactgg agggtggaat cgcgccgaag gacctggata tggaggagaa atttggaatt 1440 actttacaga aggcgcatcc tcttcgcgca gttgccacgc ctctc 1485 <210> 109 <211> 1485 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> mutated and/or codon-optimized sequence <400> 109 atggattttg attttttaac cattgcaatt ggttttttat tcaccattac gttgtatcaa 60 gcgttaaatt ttttttctag gaagtccaaa aaccttccgc caggtccttc tccactgcca 120 ctaatcggca acctacatct tttgggtgat cagcctcaca aatcattggc aaaattggcg 180 aagaaacacg gcccgattat gggtctacaa ctgggtcaag taacgaccat agttgtaaca 240 tctagtggca tggctaaaga agtacttcaa aagcaagatt tagctttttc ctcaagatct 300 ataccaaacg caatacatgc ccatgatcaa tacaagtaca gtgttatatg gctgccagtt 360 gcttccagat ggcgtgggct acgtaaagcg ctaaattcta acatgttctc tggcaataga 420 ttggacgcca accagcattt aagatctaga aaagtgcaag aattaattgc atactgtaga 480 aaatctagtc aaacagggga tgccatagat gtagggcgtg ctgcgtttag aaccagcttg 540 aatttattgt ctaacactat gttttcaaaa gacttgaccg atccctacag cgactccgca 600 aaggaattta aagatttagt ttggaacgtt atggtagagg ctggaaaacc gaatttggtg 660 gattattttc ccttgttgga taaggtcgac ccccagggta ttagaaagag aatgacaatt 720 cacttcggaa agatattgga actgtttggt ggattgatag acgaacgttt acaacaaaag 780 aaagccaaag gtgtgaatga tgatgtgctt gatgttttgc taactacaag cgaggaaagt 840 ccggaagaaa tagataggac ccatatccaa aggatgtgtt tggacttgtt tgttgccgga 900 actgatacca ctagttcaac attagaatgg gctatgtctg agatgttgaa aaatcctgag 960 aaaatgaaag ctgcacaggc agagttggcg caagtgatag gtaaaggtaa agctgtagag 1020 gaagcggatt tggctagatt accctatttg aggtgtgcta tcaaggaaac tcttaggatt 1080 catcctccag taccactatt aattccacgt agaaccgaac aggaagtgga agtgtgtgga 1140 tataccgtac cgaagaactc tcaagtgctg gtaaatgtgt gggccatttc tagagatgat 1200 gctatatgga aagacccatt atcttttaaa cccgagaggt ttctggaaag cgagttggaa 1260 atgagaggca aagactttga attgatccca tttggggcgg ggagaagaat ctgtcctgga 1320 ttgccgttgg cagtgagaat ggttccagtt atgctgggtt ctctgttgaa cagtttcgat 1380 tggaagttag agggagggat agcccctaaa gatctggaca tggaagaaaa gtttggcatt 1440 actcttcaaa aagcccatcc actaagggcc gtagctacac cgctg 1485 <210> 110 <211> 1485 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> mutated and/or codon-optimized sequence <400> 110 atggatttcg atttcctgac cattgcaatc ggctttcttt ttaccattac tctttaccag 60 gctcttaact tcttctctcg aaagtctaag aacctccctc ctggaccttc ccccctgccc 120 ctgatcggaa accttcacct cctcggcgac cagccccaca agtccctggc taagcttgct 180 aaaaagcacg gccccatcat gggtcttcag ctgggacagg ttacaactat tgttgttacc 240 agctccggaa tggctaagga ggtgctccag aaacaggacc ttgccttctc ctcgagatcc 300 atccccaacg ccatccatgc ccacgatcag tacaagtact ctgttatttg gctccctgtg 360 gcctctcgtt ggcgaggtct ccgaaaagct ctgaattcca acatgttcag cggtaaccgt 420 ctggacgcaa atcagcatct ccggtctaga aaggttcagg agctgattgc ttactgtcga 480 aagtcttcgc agacaggtga cgctatcgat gtgggtagag cagccttccg aacttcgctg 540 aacctcctct cgaataccat gttctctaag gatcttaccg atccatacag cgattctgcc 600 aaggagttta aggacctggt ttggaacgtc atggtcgagg caggtaagcc taacctggtt 660 gattactttc ccctgcttga taaagtggac cctcagggaa ttcgaaagag aatgaccatt 720 cattttggta agatcctcga gctgttcggt ggccttatcg acgagcgact ccagcagaaa 780 aaggccaagg gtgttaacga cgacgttctc gacgtgctgc tgacgacatc tgaggagtcc 840 cccgaggaaa ttgaccgaac ccatatccaa agaatgtgtc tggacctctt tgtcgctggt 900 actgacacca cttcctccac actggagtgg gcaatgtcgg aaatgctcaa gaaccctgag 960 aagatgaagg ctgcccaggc cgagcttgcc caggtcatcg gcaagggtaa ggccgtggaa 1020 gaggccgacc tcgctcgact gccctacctt cgatgtgcta tcaaggagac gctgagaatc 1080 cacccccctg tgcccctcct catcccccgt cgaaccgagc aggaagttga ggtctgtggc 1140 tacaccgtcc caaagaactc ccaggttctc gttaacgtgt gggctatttc cagagatgac 1200 gccatctgga aggaccctct gtcttttaag cctgagcgat tcctggagtc cgagctggag 1260 atgcggggaa aggactttga actgatcccc tttggagctg gacgacgaat ctgccccggt 1320 ctccccctgg ccgtccgaat ggtccccgtc atgcttggat cgctcctcaa ctcgtttgac 1380 tggaagcttg aaggcggaat tgctcccaag gaccttgata tggaagagaa gttcggtatc 1440 actctgcaga aagcacaccc cctccgggca gtcgccactc ctctg 1485 <210> 111 <211> 864 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> mutated and/or codon-optimized sequence <400> 111 atgacagcag ataacaattc catgcctcac ggtgctgtgt cttcatacgc gaaactggtg 60 cagaaccaaa cacctgagga tattctcgag gaattccccg aaatcatccc tctccagcag 120 cgcccgaaca cccgctcctc tgaaacctct aatgacgaat ccggcgagac atgtttctcc 180 ggccacgacg aagagcaaat taagctgatg aacgaaaatt gcatcgtgtt ggactgggat 240 gacaacgcca ttggagccgg taccaaaaag gtgtgccatc tgatggagaa cattgaaaag 300 ggactgctcc atcgagcttt ctcagtgttc attttcaatg aacagggtga gctcctgctg 360 caacagcgcg caacggaaaa gattaccttc cccgacctct ggactaacac ctgctgctca 420 cacccattgt gtatcgatga cgaacttggc ttgaagggca agcttgatga taagattaag 480 ggcgcaatca cggccgctgt tcgtaaactc gatcacgaac ttggaattcc tgaagacgaa 540 accaagactc gcggcaaatt tcacttcttg aatcgtatcc actatatggc gccttccaac 600 gagccttggg gcgagcacga gatcgactat attttgttct acaagatcaa tgcaaaggag 660 aacctgactg tgaacccgaa tgtgaatgaa gtgcgtgact tcaagtgggt ctcaccgaac 720 gatctgaaga ccatgtttgc cgatccatcc tacaaattca ccccgtggtt caaaattatc 780 tgtgaaaact atctgttcaa ttggtgggaa caactcgacg atttgtccga ggtcgagaac 840 gatcgtcaaa tccaccgtat gctt 864 <210> 112 <211> 1485 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> mutated and/or codon-optimized sequence <400> 112 atggattttg atttcttgac aatcgcaatt ggtttcctgt tcaccattac cttgtaccaa 60 gcgctcaact tctttagccg caaatccaag aacctcccac caggtccgag ccccctcccg 120 cttattggca acctgcactt gctgggagat cagccgcaca aatcattggc gaagctcgct 180 aagaagcacg gtccaattat gggtctgcag ttgggccaag ttacaactat cgtcgtgacc 240 tcgtccggaa tggcaaagga ggttttgcaa aaacaagatt tggctttctc gtcccgctcc 300 atccccaacg ctatccacgc acacgaccag tacaagtaca gcgtgatttg gctgcccgtt 360 gctagccgct ggcgcggatt gcgcaaggca ctgaattcca acatgttctc tggcaaccgc 420 ttggacgcca accaacacct tcgatcccgc aaagtgcaag aactgatcgc ttactgtcgc 480 aaaagctctc agaccggcga tgccattgac gtaggccgcg cggcatttcg aacctcgctc 540 aaccttctct cgaacacgat gttttcaaaa gaccttaccg acccatattc agattccgcc 600 aaggagttca aggaccttgt ttggaacgtg atggtcgaag ccggcaagcc gaatcttgtc 660 gattactttc cgttgctcga taaggtggat ccccagggaa tccgcaagcg tatgaccatc 720 cacttcggaa aaatcctgga gctgttcggt ggcctgatcg acgagcgcct tcaacagaag 780 aaggccaagg gagttaatga cgacgtgctg gatgtgcttc tcaccacctc tgaagagtcc 840 cctgaggaga tcgatcgtac acacatccag cgcatgtgtc ttgatttgtt cgtggctgga 900 acagatacca caagctcaac cttggagtgg gcaatgtcgg agatgcttaa gaacccggaa 960 aagatgaagg ctgcacaggc ggaactggcc caggtaatcg gcaagggtaa ggcagtagaa 1020 gaggctgacc tcgcacgact cccatatctc cgttgtgcta tcaaggagac cctgcgtatt 1080 cacccgccgg tccctcttct tattcctcgc cgcaccgagc aggaggttga agtgtgtggt 1140 tacactgtgc ccaaaaactc ccaagtgctg gtcaacgttt gggcgatctc gcgcgatgac 1200 gccatctgga aagacccttt gtccttcaag ccagagcgtt ttttggaatc cgagctggag 1260 atgcgtggaa aggattttga attgatcccg ttcggtgccg gtcgtcgcat ctgcccgggt 1320 cttccccttg cagtacgcat ggtcccggta atgctgggct cgctcctgaa ctcttttgat 1380 tggaaacttg agggcggtat cgctccaaag gacttggata tggaagaaaa gttcggaatt 1440 actttgcaaa aagcacaccc gttgcgcgca gtcgcaaccc ctctg 1485

Claims (44)

  1. 조작된 미생물 세포로서, 조작된 미생물 세포는
    (a) 비천연 제라닐 디포스페이트 디포스파타제 (제라니올 신타제); 및
    (b) 비천연 제라니올-8-히드록실라제
    를 발현하고; 조작된 미생물 세포는 (6E)-8-히드록시제라니올을 생산하는 것인 조작된 미생물 세포.
  2. 제1항에 있어서, 조작된 미생물 세포는 하나 이상의 상류 (6E)-8-히드록시제라니올 경로 효소(들) 또는 상류 경로 활성의 조절인자의 증가된 활성을 포함하고, 상기 증가된 활성은 대조군 세포에 비해서 증가되는 것인 조작된 미생물 세포.
  3. 제2항에 있어서, 하나 이상의 상류 (6E)-8-히드록시제라니올 경로 효소(들)는 ATP-시트레이트 신타제, 아세틸-CoA 신써타제, 티올라제, 히드록시메틸글루타릴 조효소 A 신타제 (HMG-CoA 신타제), 히드록시메틸글루타릴 조효소 A 리덕타제 (HMG-CoA 리덕타제), 메발로네이트 키나제, 포스포메발로네이트 키나제, 디포스포메발로네이트 디카복실라제, 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이소머라제, 및 제라닐 디포스페이트 신타제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조작된 미생물 세포.
  4. 제3항에 있어서, 하나 이상의 상류 (6E)-8-히드록시제라니올 경로 효소(들)는 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이소머라제를 포함하는 것인 조작된 미생물 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 미생물 세포는 하나 이상의 (6E)-8-히드록시제라니올 경로 전구체를 소모하는 하나 이상의 효소(들)의 감소된 활성을 포함하고, 상기 감소된 활성은 대조군 세포에 비해서 감소되는 것인 조작된 미생물 세포.
  6. 제5항에 있어서, 하나 이상의 (6E)-8-히드록시제라니올 경로 전구체를 소모하는 하나 이상의 효소(들)는 이기능성 (2E,6E)-파르네실 디포스페이트 신타제/디메틸알릴트랜스트랜스퍼라제 및/또는 제라닐 파이로포스페이트 신타제를 포함하는 것인 조작된 미생물 세포.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 미생물 세포는 피드백-탈조절 HMG-CoA 리덕타제를 추가로 발현하는 것인 조작된 미생물 세포.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 미생물 세포는 대조군 세포에 비해서, 더 높은 속도의 아세틸-CoA 합성 및/또는 더 낮은 속도의 아세틸-CoA 분해에 기인하여 아세틸-CoA의 증가된 이용률을 포함하는 것인 조작된 미생물 세포.
  9. 조작된 미생물 세포로서, 조작된 미생물 세포는
    (a) 비천연 천연 제라닐 디포스페이트 디포스파타제 (제라니올 신타제)를 발현시키기 위한 수단; 및
    (b) 비천연 제라니올-8-히드록실라제를 발현시키기 위한 수단
    을 포함하고; 조작된 미생물 세포는 (6E)-8-히드록시제라니올을 생산하는 것인 조작된 미생물 세포.
  10. 제9항에 있어서, 조작된 미생물 세포는 하나 이상의 상류 (6E)-8-히드록시제라니올 경로 효소(들) 또는 상류 경로 활성의 조절인자의 활성을 증가시키기 위한 수단을 포함하는 것인 조작된 미생물 세포.
  11. 제10항에 있어서, 하나 이상의 상류 (6E)-8-히드록시제라니올 경로 효소(들)는 ATP-시트레이트 신타제, 아세틸-CoA 신써타제, 티올라제, 히드록시메틸글루타릴 조효소 A 신타제 (HMG-CoA 신타제), 히드록시메틸글루타릴 조효소 A 리덕타제 (HMG-CoA 리덕타제), 메발로네이트 키나제, 포스포메발로네이트 키나제, 디포스포메발로네이트 디카복실라제, 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이소머라제, 및 제라닐 디포스페이트 신타제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조작된 미생물 세포.
  12. 제11항에 있어서, 하나 이상의 상류 (6E)-8-히드록시제라니올 경로 효소(들)는 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이소머라제를 포함하는 것인 조작된 미생물 세포.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 미생물 세포는 하나 이상의 (6E)-8-히드록시제라니올 경로 전구체를 소모하는 하나 이상의 효소(들)의 활성을 감소시키기 위한 수단을 포함하고, 상기 감소된 활성은 대조군 세포에 비해서 감소되는 것인 조작된 미생물 세포.
  14. 제13항에 있어서, 하나 이상의 (6E)-8-히드록시제라니올 경로 전구체를 소모하는 하나 이상의 효소(들)는 이기능성 (2E,6E)-파르네실 디포스페이트 신타제/디메틸알릴트랜스트랜스퍼라제 및/또는 제라닐 파이로포스페이트 신타제를 포함하는 것인 조작된 미생물 세포.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 미생물 세포는 피드백-탈조절 HMG-CoA 리덕타제를 발현시키기 위한 수단을 추가로 포함하는 것인 조작된 미생물 세포.
  16. 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 미생물 세포는 대조군 세포에 비해서, 더 높은 속도의 아세틸-CoA 합성 및/또는 더 낮은 속도의 아세틸-CoA 분해에 기인하여 아세틸-CoA의 이용률을 증가시키기 위한 수단을 포함하는 것인 조작된 미생물 세포.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 미생물 세포는 진균 세포를 포함하는 것인 조작된 미생물 세포.
  18. 제17항에 있어서, 조작된 미생물 세포는 효모 세포를 포함하는 것인 조작된 미생물 세포.
  19. 제18항에 있어서, 효모 세포는 사카로마이세스 (Saccharomyces) 속의 세포인 조작된 미생물 세포.
  20. 제19항에 있어서, 효모 세포는 세레비지아 (cerevisiae) 종의 세포인 조작된 미생물 세포.
  21. 제18항에 있어서, 효모 세포는 야로위아 (Yarrowia) 속의 세포인 조작된 미생물 세포.
  22. 제21항에 있어서, 효모 세포는 리폴리티카 (lipolytica) 종의 세포인 조작된 미생물 세포.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 비천연 제라니올 신타제는 페릴라 세토이엔시스 (Perilla setoyensis) 유래 제라니올 신타제와 적어도 70% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제라니올 신타제를 포함하는 것인 조작된 미생물 세포.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 비천연 제라니올 신타제는 비티스 비니페라 (Vitis vinifera) 유래 제라니올 신타제와 적어도 70% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제라니올 신타제를 포함하는 것인 조작된 미생물 세포.
  25. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 비천연 제라니올-8-히드록실라제는 파세올러스 안굴라리스 (Phaseolus angularis) 유래 제라니올-8-히드록실라제와 적어도 70% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제라니올-8-히드록실라제를 포함하는 것인 조작된 미생물 세포.
  26. 제4항 또는 제12항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이소머라제의 증가된 활성은 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이소머라제를 이종으로 발현시켜서 획득되는 것인 조작된 미생물 세포.
  27. 제26항에 있어서, 이종성 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이소머라제는 사카로마이세스 세레비지아 (Saccharomyces cerevisiae) 유래 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이소머라제와 적어도 70% 아미노산 서열 동일성을 갖는 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이소머라제를 포함하는 것인 조작된 미생물 세포.
  28. 제6항, 또는 제14항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 (6E)-8-히드록시제라니올 경로 전구체를 소모하는 하나 이상의 효소(들)는 이기능성 (2E,6E)-파르네실 디포스페이트 신타제/디메틸알릴트랜스트랜스퍼라제를 포함하는 것인 조작된 미생물 세포.
  29. 제28항에 있어서, 이기능성 (2E,6E)-파르네실 디포스페이트 신타제/디메틸알릴트랜스트랜스퍼라제는 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli) 유래 이기능성 (2E,6E)-파르네실 디포스페이트 신타제/디메틸알릴트랜스트랜스퍼라제와 적어도 70% 아미노산 동일성을 가지고, 아미노산 치환 S80F를 포함하는 것인 조작된 미생물 세포.
  30. 제7항, 또는 제15항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, HMG-CoA 리덕타제는 에스. 세레비지아 HMG-CoA 리덕타제의 변이체인 조작된 미생물 세포.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 배양했을 때, 조작된 미생물 세포는 (6E)-8-히드록시제라니올을 100 ㎍/배양 배지 L 초과의 수준으로 생산하는 것인 조작된 미생물 세포.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 조작된 미생물 세포의 배양물.
  33. 제32항에 있어서, 기질은 우레아, 암모늄 염, 암모니아 및 이의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질소원, 및 탄소원을 포함하는 것인 배양물.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 조작된 미생물 세포는 배양물이 10-500의 600 nm에서의 광학 밀도를 갖게 하는 농도로 존재하는 것인 배양물.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 배양물은 (6E)-8-히드록시제라니올을 포함하는 것인 배양물.
  36. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 배양물은 (6E)-8-히드록시제라니올을 100 ㎍/배양 배지 L 초과의 수준으로 포함하는 것인 배양물.
  37. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 조작된 미생물 세포를 배양하는 방법으로서, 방법은 (6E)-8-히드록시제라니올 생산에 적합한 조건 하에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것인 배양 방법.
  38. 제37항에 있어서, 방법은 1-100 g/L 범위의 초기 글루코스 수준에 이어서, 제어된 당 공급이 후속되는 유가 배양을 포함하는 것인 배양 방법.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 발효 기질은 우레아, 암모늄 염, 암모니아, 및 이의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질소원, 및 글루코스를 포함하는 것인 배양 방법.
  40. 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 배양물은 배양 단계 동안 pH-제어되는 것인 배양 방법.
  41. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 배양물은 배양 단계 동안 통기되는 것인 배양 방법.
  42. 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 미생물 세포는 (6E)-8-히드록시제라니올을 100 ㎍/배양 배지 L 초과의 수준으로 생산하는 것인 배양 방법.
  43. 제37항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 배양물로부터 (6E)-8-히드록시제라니올을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 것인 배양 방법.
  44. (6E)-8-히드록시제라니올을 생산하도록 조작된 미생물 세포를 사용하여 (6E)-8-히드록시제라니올을 제조하기 위한 방법으로서, 방법은
    (a) 미생물 세포에서 비천연 제라닐 디포스페이트 디포스파타제 (제라니올 신타제)를 발현시키는 단계;
    (b) 미생물 세포에서 비천연 제라니올-8-히드록실라제를 발현시키는 단계;
    (c) 미생물 세포가 (6E)-8-히드록시제라니올을 생산할 수 있게 하는 조건 하의 적합한 배양 배지에서 미생물 세포를 배양시키는 단계로서, (6E)-8-히드록시제라니올이 배양 배지로 방출되는 것인 단계; 및
    (d) (6E)-8-히드록시제라니올을 배양 배지로부터 단리시키는 단계
    를 포함하는 것인 제조 방법.
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