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KR20200095483A - 핵산, 이를 포함하는 조성물과 컨쥬게이트, 및 그의 제조 방법과 용도 - Google Patents

핵산, 이를 포함하는 조성물과 컨쥬게이트, 및 그의 제조 방법과 용도 Download PDF

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KR20200095483A
KR20200095483A KR1020207015745A KR20207015745A KR20200095483A KR 20200095483 A KR20200095483 A KR 20200095483A KR 1020207015745 A KR1020207015745 A KR 1020207015745A KR 20207015745 A KR20207015745 A KR 20207015745A KR 20200095483 A KR20200095483 A KR 20200095483A
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KR
South Korea
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nucleotide
sirna
nucleotide sequence
seq
nucleotides
Prior art date
Application number
KR1020207015745A
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English (en)
Inventor
홍얀 장
샨 가오
다이위 캉
Original Assignee
쑤저우 리보 라이프 사이언스 컴퍼니, 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 쑤저우 리보 라이프 사이언스 컴퍼니, 리미티드 filed Critical 쑤저우 리보 라이프 사이언스 컴퍼니, 리미티드
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Abstract

B형 간염 바이러스 유전자의 발현을 억제하기 위한 siRNA, 및 siRNA를 함유하는 약학 조성물 및 컨쥬게이트가 제공된다. siRNA에서 각 뉴클레오티드는 독립적으로 변성 뉴클레오티드이다. siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다. siRNA의 센스 가닥은 서열 번호 155에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 동일한 길이 및 3개 이하의 상이한 뉴클레오티드를 갖는 뉴클레오티드 서열 1을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호 156에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 동일한 길이 및 3개 이하의 상이한 뉴클레오티드를 갖는 뉴클레오티드 서열 2를 포함한다.

Description

핵산, 이를 포함하는 조성물과 컨쥬게이트, 및 그의 제조 방법과 용도
본 발명은 핵산, 이를 포함하는 조성물과 컨쥬게이트, 및 그의 제조 방법과 용도에 관한 것이다.
(B형 간염 또는 B-형 간염이라고도 공지된) 바이러스성 B형 간염은 전세계적으로, 특히 중국에서 심각한 위협이 되는 전염병의 일종이다. 현재, 인터페론 및 뉴클레오시드 유사체는 B형 간염의 예방/치료를 위해 세계적으로 인정되는 2종의 주요 약물이다. 그러나, 이러한 약물은 여러 가지 단점을 갖는다 (가령, 사용후 약물 내성을 발달하기 쉽거나 제한된 유용성을 지닌다). 예를 들어, 인터페론은 부작용을 일으키기 쉬우며; 뉴클레오시드 유사체는 약물 제거후 약물에 내성이 생기거나 및 질병이 재발하는 문제를 갖는다. 그러므로, 바이러스의 유전자 발현을 유전자 수준에서 침묵시켜 HBV의 생성 및 복제를 차단함으로써, 바이러스 대사 및 간 세포에 대한 감염을 근본적으로 감소시킨다면, 의심할 여지없이 B형 간염 치료용으로 가장 이상적인 수단이 될 것이다. 작은 간섭 RNA (small interfering RNA, siRNA)는 RNA 간섭 메커니즘 (RNAi)에 기반하여 서열-특이적인 방식으로 관심있는 임의의 표적 유전자, 가령 암과 같은 질병을 유발하는 유전자의 발현을 억제하거나 차단함으로써, 질병 치료의 목적을 달성할 수 있다.
siRNA의 안정화된 변형 및 그의 전달 시스템은 작은 RNA 약물의 개발에 있어서 2가지 핵심 기술이다.
본 발명에서는 B형 간염 바이러스 유전자의 발현을 억제하기 위한 siRNA, 및 siRNA를 함유하는 약학 조성물 및 컨쥬게이트가 제공된다.
일부 구현예에서, 본원은 화학식 (1)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 siRNA 컨쥬게이트를 제공한다:
Figure pct00001
상기, n1은 1 내지 3의 정수이고, n3은 0 내지 4의 정수이며;
각각의 m1, m2 및 m3은 독립적으로 2 내지 10의 정수이고;
각각의 R10, R11, R12, R13, R14 및 R15는 독립적으로 H이거나 C1-C10 알킬, C1-C10 할로알킬 및 C1-C10 알콕시로 이루어진 군에서 선택되고;
R3은 화학식 A59로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 기이다:
Figure pct00002
상기 E1은 OH, SH 또는 BH2이고;
Nu는 siRNA이다.
siRNA의 각 뉴클레오티드는 독립적으로 변형 또는 비변형의 뉴클레오티드이다. siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 1을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 2를 포함하며; 뉴클레오티드 서열 1 및 뉴클레오티드 서열 2는 이중 가닥 영역을 형성하기 위해 적어도 부분적으로 상보적이며; 뉴클레오티드 서열 1은 서열 번호 155에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 동일한 길이 및 3개 이하의 상이한 뉴클레오티드를 가지며; 뉴클레오티드 서열 2는 서열 번호 156에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 동일한 길이 및 3개 이하의 상이한 뉴클레오티드를 갖는다:
5'-CCUUGAGGCAUACUUCAAZ -3' (서열 번호: 155);
5'-Z'UUGAAGUAUGCCUCAAGG -3' (서열 번호: 156);
상기, Z는 A이고; Z'는 U이며;
뉴클레오티드 서열 1은 Z에 상응하는 부위에 뉴클레오티드 ZA를 포함하고;
뉴클레오티드 서열 2는 Z'에 상응하는 부위에 뉴클레오티드 Z'B를 포함하고; 뉴클레오티드 Z'B는 안티센스 가닥의 5' 말단에서부터 제 1 뉴클레오티드이며;
R2는 1 내지 20개의 탄소원자 길이를 갖는 선형 알킬렌이고, 하나 이상의 탄소원자는 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 알케닐렌, C2-C10 알키닐렌, C6-C10 아릴렌, C3-C18 헤테로사이클릴렌, 및 C5-C10 헤테로아릴렌으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 임의로 치환되고, 상기 R2는 C1-C10 알킬, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C1-C10 할로알킬, -OC1-C10 알킬, -OC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-OH, -OC1-C10 할로알킬, -SC1-C10 알킬, -SC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-SH, -SC1-C10 할로알킬, 할로, -OH, -SH, NH2, -C1-C10 알킬-NH2, -N(C1-C10 알킬) (C1-C10 알킬), -NH(C1-C10 알킬), 시아노, 니트로, -CO2H, -C(O)OC1-C10 알킬, -CON(C1-C10 알킬) (C1-C10 알킬), -CONH(C1-C10 알킬), -CONH2, -NHC(O) (C1-C10 알킬), -NHC(O) (페닐), -N(C1-C10 알킬)C(O)(C1-C10 알킬), -N(C1-C10 알킬)C(O)(페닐), -C(O)C1-C10 알킬, -C(O)C1-C10 알킬페닐, -C(O)C1-C10 할로알킬, -OC(O)C1-C10 알킬, -SO2 (C1-C10 알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1-C10 할로알킬), -SO2NH2, -SO2NH(C1-C10 알킬), -SO2NH (페닐), -NHSO2 (C1-C10 알킬), -NHSO2 (페닐) 및 -NHSO2(C1-C10 할로알킬)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 임의로 치환되며;
각 L1은 독립적으로 1 내지 70개의 탄소원자 길이를 갖는 선형 알킬렌이고, 하나 이상의 탄소원자는 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 알케닐렌, C2-C10 알키닐렌, C6-C10 아릴렌, C3-C18 헤테로사이클릴렌 및 C5-C10 헤테로아릴렌으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 임의로 치환되고, 상기 L1은 C1-C10 알킬, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C1-C10 할로알킬, -OC1-C10 알킬, -OC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-OH, -OC1-C10 할로알킬, -SC1-C10 알킬, -SC1-C10 알킬페닐 -C1-C10 알킬-SH, -SC1-C10 할로알킬, 할로, -OH, -SH, -NH2, -C1-C10 알킬-NH2, -N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -NH(C1-C10 알킬), 시아노, 니트로, -CO2H, -C(O)OC1-C10 알킬, -CON(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -CONH(C1-C10 알킬), -CONH2, -NHC(O)(C1-C10 알킬), -NHC(O)(페닐), -N(C1-C10 알킬)C(O)(C1-C10 알킬), -N(C1-C10 알킬)C(O) (페닐), -C(O)C1-C10 알킬, -C(O)C1-C10 알킬페닐, -C(O)C1-C10 할로알킬, -OC(O)C1-C10 알킬, -SO2 (C1-C10 알킬), -SO2 (페닐), -SO2 (C1-C10 할로알킬), -SO2NH2, SO2NH(C1-C10 알킬), -SO2NH (페닐), -NHSO2 (C1-C10 알킬), -NHSO2 (페닐), 및 -NHSO2(C1-C10 할로알킬)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 임의로 치환되며;
물결선(
Figure pct00003
)은 나머지 분자에 대한 기의 부착 부위를 나타내고;
M1은 표적화 기를 나타낸다.
일부 구현예에서, 본원은 컨쥬게이트의 제조 방법을 제공하며, 이 방법은 포스포라미다이트 고상 합성 조건하에 각각 siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 유형 및 서열에 따라 3' 내지 5' 방향으로 뉴클레오시드 단량체를 연속해서 연결하는 단계로, 상기 각 뉴클레오시드 단량체의 연결은 탈보호, 결합, 캡핑 및 산화 또는 황화의 4 단계 반응을 포함하는 단계; siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 분리하는 단계; 및 어닐링 단계를 포함하며; 상기 siRNA의 각 뉴클레오티드는 독립적으로 변형 또는 비변형의 뉴클레오티드이고; siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 상기 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 1을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 2를 포함하며; 뉴클레오티드 서열 1 및 뉴클레오티드 서열 2는 이중 가닥 영역을 형성하기 위해 적어도 부분적으로 상보적이며; 뉴클레오티드 서열 1은 서열 번호155에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 동일한 길이 및 3개 이하의 상이한 뉴클레오티드를 가지며; 뉴클레오티드 서열 2는 서열 번호156에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 동일한 길이 및 3개 이하의 상이한 뉴클레오티드를 갖는다:
5'-CCUUGAGGCAUACUUCAAZ -3' (서열 번호: 155);
5'-Z'UUGAAGUAUGCCUCAAGG -3' (서열 번호: 156);
상기, Z는 A이고; Z'는 U이며;
뉴클레오티드 서열 1은 Z에 상응하는 부위에 뉴클레오티드 ZA를 포함하고;
뉴클레오티드 서열 2는 Z'에 상응하는 부위에 뉴클레오티드 Z'B를 포함하고; 뉴클레오티드 Z'B는 안티센스 가닥의 5' 말단에서부터 제 1 뉴클레오티드이다.
또한, 상기 방법은 결합 반응 조건하 및 결합 시약의 존재하에 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 뉴클레오시드 단량체 또는 고상 지지체에 연결된 뉴클레오티드 서열과 접촉시킴으로써, 결합 반응에 의해 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 뉴클레오티드 서열에 연결하는 단계를 더 포함한다. 이하, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 접합 분자(conjugating molecule)라고도 지칭한다.
Figure pct00004
상기, R4는 Nu로 나타낸 siRNA에 결합할 수 있는 부분이고; 일부 구현예에서, R4는 공유 결합을 통해 Nu로 나타낸 siRNA에 결합할 수 있는 부분이고; 일부 구현예에서, R4는 반응에 의한 포스포디에스테르 결합을 통해 Nu로 나타낸 siRNA에 접합될 수 있는 임의의 작용기를 포함하는 부분이며;
각 S1은 독립적으로 모든 활성 하이드록실을 화학식 YCOO-로 표시되는 기로 치환함으로써 형성된 M1의 기이며, 상기 각 Y는 독립적으로 메틸, 트리플루오로메틸, 디플루오로메틸, 모노플루오로메틸, 트리클로로메틸, 디클로로메틸, 모노클로로메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 페닐, 할로페닐 및 알킬페닐로 이루어진 군에서 선택되며,
n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14, R15, L1 및 M1의 정의 및 선택은 각각 전술한 바와 같다.
일부 구현예에서, 본원은 B형 간염 바이러스 (hepatitis B virus, HBV) 유전자의 발현을 억제할 수 있는 siRNA를 제공하며, siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 둘 모두는 플루오로 변성 뉴클레오티드 및 비-플루오로 변성 뉴클레오티드를 포함하고; 상기 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 I의 세그먼트를 포함하고; 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 II의 세그먼트를 포함하며; 뉴클레오티드 서열 I 및 뉴클레오티드 서열 II는 이중 가닥 영역을 형성하기 위해 적어도 부분적으로 상보적이며; 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호155에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 동일한 길이 및 3개 이하의 상이한 뉴클레오티드를 갖는 뉴클레오티드 서열 A를 포함하고; 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호156에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 동일한 길이 및 3개 이하의 상이한 뉴클레오티드를 갖는 뉴클레오티드 서열 B를 포함한다:
5'-CCUUGAGGCAUACUUCAAZ -3' (서열 번호: 155);
5'-Z'UUGAAGUAUGCCUCAAGG -3' (서열 번호: 156);
상기, Z는 A이고; Z'는 U이며;
뉴클레오티드 서열 A는 Z에 상응하는 부위에 뉴클레오티드 ZA를 포함하고;
뉴클레오티드 서열 B는 Z'에 상응하는 부위에 뉴클레오티드 Z'B를 포함하고; 뉴클레오티드 Z'B는 안티센스 가닥의 5' 말단에서부터 제 1 뉴클레오티드이며;
플루오로 변성 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열 A 및 B에 위치되고;
5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오티드 서열 1의 위치 7, 8 및 9에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오티드 서열 2의 위치 2, 6, 14 및 16에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 본원은 본원에 개시된 siRNA 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 본원은 본원에 개시된 siRNA 및 siRNA에 접합 연결된 접합 기를 포함하는 siRNA 컨쥬게이트를 제공하고; siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 둘 모두는 플루오로 변성 뉴클레오티드 및 비-플루오로 변성 뉴클레오티드를 포함하고; 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 I의 세그먼트를 포함하고; 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 II의 세그먼트를 포함하며; 뉴클레오티드 서열 I 및 뉴클레오티드 서열 II는 이중 가닥 영역을 형성하기 위해 적어도 부분적으로 상보적이며; 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호155에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 동일한 길이 및 3개 이하의 상이한 뉴클레오티드를 갖는 뉴클레오티드 서열 A를 포함하고; 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호156에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 동일한 길이 및 3개 이하의 상이한 뉴클레오티드를 갖는 뉴클레오티드 서열 B를 포함한다:
5'-CCUUGAGGCAUACUUCAAZ -3' (서열 번호: 155);
5'-Z'UUGAAGUAUGCCUCAAGG -3' (서열 번호: 156);
상기, Z는 A이고; Z'는 U이며;
뉴클레오티드 서열 A는 Z에 상응하는 부위에 뉴클레오티드 ZA를 포함하고;
뉴클레오티드 서열 B는 Z'에 상응하는 부위에 뉴클레오티드 Z'B를 포함하고; 뉴클레오티드 Z'B는 안티센스 가닥의 5' 말단에서부터 제 1 뉴클레오티드이며;
플루오로 변성 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열 A 및 B 내에 위치되고;
5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오티드 서열 1의 위치 7, 8 및 9에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오티드 서열 2의 위치 2, 6, 14 및 16에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 본원은 B형 간염 바이러스(HBV)의 감염에 의해 야기된 병리학적 상태 또는 질병을 치료 및/또는 예방하기 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명의 siRNA 및/또는 약학 조성물 및/또는 siRNA 컨쥬게이트의 용도를 제공한다.
일부 구현예에서, 본원은 본 발명에 개시된 siRNA, 및/또는 약학 조성물 및/또는 siRNA 컨쥬게이트를 유효량으로, 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, B형 간염 바이러스 (HBV)의 감염에 의해 야기된 병리학적 상태 또는 질병을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본원은 본 발명에 개시된 변성 siRNA, 및/또는 약학 조성물 및/또는 siRNA 컨쥬게이트를 유효량으로, HBV로 감염된 간염 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, HBV 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본원은 본 발명의 siRNA, 및/또는 약학 조성물 및/또는 siRNA 컨쥬게이트를 포함하는 키트를 제공한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 siRNA, siRNA 조성물 또는 siRNA 컨쥬게이트는 생체내에서 더 높은 안정성, 더 낮은 독성 및/또는 더 높은 활성을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 siRNA 컨쥬게이트는 보다 낮은 동물 수준의 독성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 siRNA 컨쥬게이트는 간에서 특이적으로 유의하게 농축될 수 있고, 안정적으로 유지될 수 있어, 높은 정도의 표적화를 보인다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 siRNA 컨쥬게이트는 다양한 동물 모델에서 혈청 HBsAg에 대한 지속적이고 효율적인 억제 효율을 나타내어, 규칙적인 용량 의존성을 보인다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 siRNA 컨쥬게이트는 더 높은 시험관내 활성을 가질뿐만 아니라, 낮은 표적외 효과를 보인다.
도 1은 시험관내 트리토좀에서 시험한 siRNA 컨쥬게이트의 안정성 시험의 반정량적 결과를 나타낸다.
도 2는 시험관내 트리토좀에서 시험한 siRNA 컨쥬게이트의 안정성 시험의 반정량적 결과를 나타낸다.
도 3은 시험관내 인간 혈장에서 시험한 siRNA 컨쥬게이트의 안정성 시험의 반정량적 결과를 나타낸다.
도 4는 시험관내 원숭이 혈장에서 시험한 siRNA 컨쥬게이트의 안정성 시험의 반정량적 결과를 나타낸다.
도 5는 쥐의 간 트리토좀에서 시험한 siRNA 컨쥬게이트의 안정성 결과를 나타낸다.
도 6은 인간의 간 리소좀에서 시험한 siRNA 컨쥬게이트의 안정성 결과를 나타낸다.
도 7은 쥐의 혈장에서 10 mg/kg의 투여량으로 컨쥬게이트 1에 대한 PK/TK 혈장 농도를 나타내는 시간에 따른 대사 곡선이다.
도 8은 쥐의 간 및 신장에서 10 mg/kg의 투여량으로 컨쥬게이트 1에 대한 PK/TK 조직 농도를 나타내는 시간에 따른 대사 곡선이다.
도 9는 쥐의 혈장에서 50 mg/kg의 투여량으로 컨쥬게이트 1에 대한 PK/TK 혈장 농도를 나타내는 시간에 따른 대사 곡선이다.
도 10은 쥐의 간 및 신장에서 50 mg/kg의 투여량으로 컨쥬게이트 1에 대한 PK/TK 조직 농도를 나타내는 시간에 따른 대사 곡선이다.
도 11은 쥐의 혈장에서 10 mg/kg의 투여량으로 컨쥬게이트 6에 대한 PK/TK 혈장 농도를 나타내는 시간에 따른 대사 곡선이다.
도 12는 쥐의 간 및 신장에서 10 mg/kg의 투여량으로 컨쥬게이트 6에 대한 PK/TK 조직 농도를 나타내는 시간에 따른 대사 곡선이다.
도 13은 쥐의 혈장에서 50 mg/kg의 투여량으로 컨쥬게이트 6에 대한 PK/TK 혈장 농도를 나타내는 시간에 따른 대사 곡선이다.
도 14는 쥐의 간 및 신장에서 50 mg/kg의 투여량으로 컨쥬게이트 6에 대한 PK/TK 조직 농도를 나타내는 시간에 따른 대사 곡선이다.
도 15는 44Bri 모델 생쥐에서 HBV mRNA 발현에 대한 컨쥬게이트 5 및 7의 억제 효율을 나타낸다.
도 16은 44Bri 모델 생쥐에서 HBV mRNA 발현에 대한 컨쥬게이트 1 및 6의 억제 효율을 나타낸다.
도 17은 44Bri 모델 생쥐에서 HBV mRNA 발현에 대한 컨쥬게이트 5 및 6의 억제 효율을 나타낸다.
도 18은 44Bri 모델 생쥐에서 HBV mRNA 발현에 대한 컨쥬게이트 5, 6, 9 및 10의 억제 효율을 나타낸다.
도 19는 44Bri 모델 생쥐에서 HBV mRNA 발현에 대한 컨쥬게이트 1, 2, 3 및 4의 억제 효율을 나타낸다.
도 20은 44Bri 모델 생쥐에서 HBV mRNA 발현에 대한 컨쥬게이트 1의 억제 효율을 나타낸다.
도 21은 AAV-HBV 모델 생쥐에서 혈청 HBsAg 발현에 대한 siRNA 컨쥬게이트 1 및 6에서 siRNA의 억제 효율에 관한 시간-의존적 시험을 나타낸다.
도 22는 AAV-HBV 모델 생쥐에서 HBV DNA에 대한 siRNA 컨쥬게이트 1 및 6에서 siRNA의 억제 효율에 관한 시간-의존적 시험을 나타낸다.
도 23은 저농도 AAV-HBV 생쥐 모델에서 혈청 HBsAg 발현에 대한 컨쥬게이트 6의 억제 효율에 관한 시간-의존적 시험을 나타낸다.
도 24는 M-Tg 모델에서 혈청 HBsAg 발현에 대한 컨쥬게이트 5 및 6의 억제 효율에 관한 시간-의존적 시험을 나타낸다.
도 25는 M-Tg 모델에서 혈청 HBsAg 발현에 대한 컨쥬게이트 6 및 11의 억제 효율에 관한 시간-의존적 시험을 나타낸다.
도 26은 1.28 카피 모델에서 혈청 HBsAg 발현에 대한 컨쥬게이트 1의 억제 효율에 관한 시간-의존적 시험을 나타낸다.
도 27은 1.28 카피 모델에서 HBV DNA에 대한 컨쥬게이트 1의 억제 효율에 관한 시간-의존적 시험을 나타낸다.
도 28A 내지 28D는 GSCM, GSSM, PSCM 및 PSSM의 표적화 시에 컨쥬게이트 1의 IC50 값을 각각 나타낸다.
참조를 위한 인용
본 명세서에서 언급한 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 공보, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조로서 인용된 것으로 표시되는 것과 동일한 정도로 본원에서 참조로 인용한다.
이하, 본 발명의 구체적인 구현예를 상세하게 설명한다. 본원에서 설명한 특정 구현예는 본 발명의 예시 및 설명을 위한 목적일 뿐, 임의의 관점에서 본 발명을 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다.
정의
본 발명의 맥락에서, HBV 유전자는 유전자은행 수탁 번호 NC_003977.1에 나타낸 바와 같은 DNA 서열을 갖는 유전자를 지칭한다.
본 발명의 맥락에서, 달리 명시하지 않는 한, C, G, U, A 및 T는 뉴클레오티드의 염기 조성을 나타내고; d는 문자 d의 우측에 있는 하나의 뉴클레오티드가 디옥시리보뉴클레오티드임을 나타내고; 문자 m은 문자 m의 좌측에 인접한 뉴클레오티드가 메톡시 변성 뉴클레오티드임을 나타내고; f는 문자 f의 좌측에 인접한 뉴클레오티드가 플루오로 변성 뉴클레오티드임을 나타내고; s는 문자 s의 양쪽에 인접한 2개의 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 연결에 의해 연결된 것을 나타내고; P1은 P1의 우측에 인접한 뉴클레오티드가 5'-포스페이트 뉴클레오티드 또는 5'-포스페이트 유사 변성 뉴클레오티드, 특히 비닐 포스페이트 변성 뉴클레오티드 (하기 구현예에서 VP로 표시됨), 5'-포스페이트 뉴클레오티드 (하기 구현예에서 P로 표시됨) 또는 5'-티오포스페이트 변성 뉴클레오티드 (아래 구현예에서 Ps로 표시됨) 임을 나타낸다.
본 발명의 문맥에서, "플루오로 변성 뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 리보오스 기의 2'-하이드록시를 플루오로로 치환함으로써 형성된 뉴클레오티드를 지칭한다. "비-플루오로 변성 뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 리보오스 기의 2'-하이드록시를 비-플루오로 기로 치환함으로써 형성된 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 유사체를 지칭한다. "뉴클레오티드 유사체"는 핵산에서 뉴클레오티드를 대체할 수 있는 기를 지칭하지만, 아데닌 리보뉴클레오티드, 구아닌 리보뉴클레오티드, 시토신 리보뉴클레오티드, 우라실 리보뉴클레오티드 또는 티민 디옥시리보뉴클레오티드와 구조적으로 상이하며, 예컨대 이소뉴클레오티드, 가교된 핵산(BNA) 뉴클레오티드 또는 비환식 뉴클레오티드이다. 메톡시 변성 뉴클레오티드는 리보오스 기의 2'-하이드록시를 메톡시 기로 치환함으로써 형성된 뉴클레오티드를 지칭한다.
본 발명의 맥락에서, "상보적인" 및 "역 상보적인"이란 표현은 호환적으로 사용할 수 있고, 당업계에 공지된 의미를 가지며, 다시 말해, 한 가닥의 염기가 이중 가닥 핵산 분자의 다른 가닥의 염기와 상보적으로 쌍을 이루는 것을 말한다. DNA에서, 퓨린 염기 아데닌 (A)은 항상 피리미딘 염기 티민 (T) (또는 RNA에서 우라실 (U))과 쌍을 이루고; 퓨린 염기 구아닌 (G)은 항상 피리미딘 염기 시토신 (C)과 쌍을 이룬다. 각 염기쌍은 퓨린 및 피리미딘을 포함한다. 한 가닥의 아데닌은 항상 다른 가닥의 티민 (또는 우라실)과 짝을 이루고, 구아닌은 항상 시토신과 짝을 이루며, 이들 두 가닥은 서로 상보적인 것으로 간주되고; 어느 한 가닥의 서열은 그의 상보적인 가닥의 서열에서 추론할 수 있다. 상응하게, "염기쌍오류(mispairing)"은 이중 가닥 핵산에서, 상응하는 부위의 염기가 상보적으로 쌍을 이루는 방식으로 제공되지 않는 것을 의미한다.
본 발명의 맥락에서, 달리 명시하지 않는 한, "기본적으로 역 상보적"은 2개의 뉴클레오티드 서열 사이에 3개 이하의 염기의 염기쌍오류가 있는 것을 의미한다. "실질적으로 역 상보적"은 2개의 뉴클레오티드 서열 사이에 1개 이하의 염기의 염기쌍오류가 존재하는 것을 의미한다. "완전히 상보적"은 2개의 뉴클레오티드 서열 사이에 염기의 염기쌍오류가 없는 것을 의미한다.
본 발명의 맥락에서, 뉴클레오티드 서열이 또 다른 뉴클레오티드 서열과 "뉴클레오티드 차이"를 갖는 경우, 그들 사이의 동일한 위치에 있는 뉴클레오티드의 염기가 변한다. 예를 들어, 제 2 서열내 뉴클레오티드 염기가 A이고 제 1 서열내 동일한 위치의 뉴클레오티드 염기가 U, C, G 또는 T이면, 이들 2개의 뉴클레오티드 서열은 이 위치에서 뉴클레오티드 차이를 갖는 것으로 간주한다. 일부 구현예에서, 어느 위치의 뉴클레오티드가 염기성 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 유사체로 치환되면, 그 위치에서 뉴클레오티드 차이가 있는 것으로 간주한다.
본 발명의 맥락에서, 특히 본 발명의 접합 분자 또는 siRNA 컨쥬게이트를 제조하는 방법의 설명에서, 달리 명시하지 않는 한, "뉴클레오시드 단량체"는 제조될 siRNA 또는 siRNA 컨쥬게이트내 뉴클레오시드의 종류 및 서열에 따라, "고상 포스포라미다이트 합성에 사용되는 비변형 또는 변형 RNA 포스포라미다이트" (RNA 포스포라미다이트는 다른 부분에서 뉴클레오시드 포스포라미다이트라고도 부른다)를 지칭한다. 고상 포스포라미다이트의 합성은 당업자에게 공지된 방법의 RNA 합성이다. 본 발명에서 사용한 뉴클레오시드 단량체는 모두 상업적으로 이용 가능할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 달리 언급하지 않는 한, "접합"은 특정 기능이 공유 결합을 통해 서로 연결되는 2개 이상의 화학적 부분을 지칭한다. 상응하게, "컨쥬게이트"는 개별 화학적 부분의 공유 결합에 의해 형성된 화합물을 지칭한다. 또한, "siRNA 컨쥬게이트"는 siRNA와 특정 작용기를 갖는 하나 이상의 각 화학적 잔기를 공유 부착함으로써 형성된 화합물을 나타낸다. 이러한 맥랙에서, 본원에 개시된 siRNA 컨쥬게이트는 때때로 "컨쥬게이트"라고도 약칭한다. siRNA 컨쥬게이트는 문맥에 따라 siRNA 컨쥬게이트, 제 1 siRNA 컨쥬게이트 또는 제 2 siRNA 컨쥬게이트를 총칭하는 것으로 이해해야 한다. 본 발명의 맥락에서, "접합 분자"는 반응을 통해 siRNA에 접합될 수 있고, 따라서 최종적으로 본 발명의 siRNA 컨쥬게이트를 형성할 수 있는 특정 화합물로 이해되어야 한다.
본원에서 사용한 바와 같이, 두 글자 또는 기호 사이에 위치하지 않은 대시 ("-")는 치환기의 부착 위치를 나타내기 위해 사용된다. 예를 들어, ­C1-C10 알킬 ­NH2는 C1-C10 알킬을 통해 부착된다.
본원에서 사용한 바와 같이, "임의적" 또는 "임의로"란 이후에 설명하는 사건 또는 상태가 발생하거나 발생하지 않을 수 있고, 설명은 사건 또는 상태가 발생하거나 발생하지 않을 수 있는 경우를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, "임의로 치환된 알킬"은 아래에서 정의한 바와 같이, "알킬" 및 "치환된 알킬" 모두를 포함한다. 당업자는 하나 이상의 치환기를 포함하는 임의의 기와 관련하여, 이러한 기가 입체적으로 비현실적이고, 합성적으로 불가능하고/하거나 본질적으로 불안정한 임의의 치환 또는 치환 패턴을 도입하도록 의도하지 않음을 이해할 것이다.
본원에서 사용한 바와 같이, "알킬"은 지시된 수의 탄소원자, 일반적으로 1 내지 20개의 탄소원자, 예를 들어 1 내지 10개의 탄소원자, 예컨대 1 내지 8개 또는 1 내지 6개의 탄소원자를 갖는 직쇄 및 분지쇄를 지칭한다. 예를 들어, C1-C6 알킬은 1 내지 6개의 탄소원자를 갖는 직쇄 및 분지쇄 알킬 모두를 포함한다. 특정 수의 탄소원자를 갖는 알킬 잔기를 명명하는 경우, 그 수의 탄소원자를 갖는 모든 분지쇄 및 직쇄 형태를 포함하도록 의도되고; 따라서, 예를 들어, "부틸"은 n-부틸, sec-부틸, 이소부틸 및 t-부틸을 포함하고; "프로필"은 n-프로필 및 이소프로필을 포함한다. 알킬렌은 알킬과 동일한 잔기를 지칭하지만, 2개의 부착 위치를 갖는 알킬의 서브세트이다.
본원에서 사용한 바와 같이, "알케닐"은 모 알킬의 2개의 인접한 탄소원자로부터 1개의 수소 분자를 각각 제거함으로써 얻어진 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 불포화 분지쇄 또는 직쇄 알킬 기를 지칭한다. 이러한 기는 이중 결합의 어느 하나의 시스나 트랜스 배열 일 수 있다. 전형적인 알케닐 기는, 제한되지 않으나, 에테닐; 프로프-1-엔-1-일, 프로프-1-엔-2-일, 프로프-2-엔-1-일 (알릴), 프로프-2-엔-2-일 등의 프로페닐; 부트-1-엔-1-일, 부트-1-엔-2-일, 2-메틸-프로프-1-엔-1-일, 부트-2-엔-1-일, 부트-2-엔-2-일, 부트-1,3-디엔-1-일, 부트-1,3-디엔-2-일 등의 부테닐을 포함한다. 특정 구현예에서, 알케닐 기는 2 내지 20개의 탄소원자, 및 다른 구현예에서, 2 내지 10개, 2 내지 8개, 또는 2 내지 6개의 탄소원자를 갖는다. 알케닐렌은 알케닐과 동일한 잔기를 지칭하지만, 2개의 부착 위치를 갖는 알케닐의 서브세트이다.
본원에서 사용한 바와 같이, "알키닐"은 모 알킬의 2개의 인접한 탄소원자로부터 2개의 수소 분자를 각각 제거함으로써 얻어진 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 불포화 분지쇄 또는 직쇄 알킬 기를 지칭한다. 전형적인 알키닐 기는, 제한되지 않으나, 에티닐; 프로프-1-인-1-일, 프로프-2-인-1-일 같은 프로피닐; 부트-1-인-1-일, 부트-1-인-3-일, 부트-3-인-1-일 같은 부티닐 등을 포함한다. 특정 구현예에서, 알키닐 기는 2 내지 20개의 탄소원자, 및 다른 구현예에서, 2 내지 10개, 2 내지 8개, 또는 2 내지 6개의 탄소원자를 갖는다. 알키닐렌은 알키닐과 동일한 잔기를 지칭하지만, 2개의 부착 위치를 갖는 알키닐의 서브세트이다.
본원에서 사용한 바와 같이, "알콕시"는, 예를 들어 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시, 펜틸옥시, 2-펜틸옥시, 이소펜틸옥시, 네오펜틸옥시, 헥실옥시, 2-헥실옥시, 3-헥실옥시, 3-메틸펜틸옥시 등의 산소 브릿지를 통해 부착된 지시된 수의 탄소원자의 알킬 기를 지칭한다. 알콕시 기는 일반적으로 산소 브릿지를 통해 부착된 1 내지 10개, 1 내지 8개, 1 내지 6개, 또는 1 내지 4개의 탄소원자를 갖게 된다.
본원에서 사용한 바와 같이, "아릴"은 고리 탄소원자로부터 수소원자를 제거함으로써, 방향족 단환 또는 다환 탄화수소 고리 시스템에서 유래된 라디칼을 지칭한다. 방향족 단환 또는 다환 탄화수소 고리 시스템은 6 내지 18개의 탄소원자를 포함하여 수소 및 탄소만을 함유하며, 상기 고리 시스템에서 하나 이상의 고리는 완전히 불포화되고, 즉 이는 휘켈 이론에 따른 고리형 탈편재화(delocalized) (4n+2) 전자 시스템을 포함하는다. 아릴 기는 페닐, 플루오레닐, 나프틸 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 아릴렌은 아릴과 동일한 잔기를 지칭하지만, 2개의 부착 위치를 갖는 아릴의 서브세트이다.
본원에서 사용한 바와 같이, "사이클로알킬"은 비-방향족 탄소 고리를 지칭하며, 일반적으로 3 내지 7개의 고리 탄소원자를 갖는다. 고리는 포화되거나, 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 가질 수 있다. 시클로알킬 기의 예로는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로펜테닐, 시클로헥실 및 시클로헥세닐뿐만 아니라, 노르보르난 등의 가교되거나 닫힌(caged) 고리 기를 포함한다.
본원에서 사용한 바와 같이, "할로 치환기" 또는 "할로"는 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오드(iodo)를 지칭하고, "할로겐"이란 용어는 불소, 염소, 브롬 및 요오드(iodine)를 포함한다.
본원에서 사용한 바와 같이, "할로알킬"은 하나 이상의 할로겐 원자나 최대 허용 가능한 수의 할로겐 원자로 치환된 특정 수의 탄소원자 갖는 상기 정의한 바와 같은 알킬을 지칭한다. 할로알킬의 예로는 트리플루오로메틸, 디플루오로메틸, 2-플루오로에틸 및 펜타-플루오로에틸을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"헤테로사이클릴"은 질소, 산소 및 황에서 선택된 2 내지 12개의 탄소원자 및 1 내지 6개의 헤테로 원자를 포함하는 안정한 3 내지 18-원자 비-방향족 고리 라디칼을 지칭한다. 본 명세서에서 달리 언급하지 않는 한, 헤테로사이클릴은 단환식, 이환식, 삼환식 또는 사환식 고리 시스템이며, 이는 융합 또는 가교된 고리 시스템을 포함할 수 있다. 헤테로사이클릴 라디칼의 헤테로 원자는 임의로 산화될 수 있다. 하나 이상의 질소 원자가 존재하는 경우에는 임의로 4급화된다. 헤테로사이클릴은 부분적으로 또는 완전히 포화된다. 헤테로사이클릴은 고리의 임의 원자를 통해 분자의 나머지에 연결될 수 있다. 이러한 헤테로사이클릴의 예는, 제한되지 않으나, 디옥사닐, 티에닐[1,3]디술포닐, 데카하이드로이소퀴놀릴, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 옥타하이드로인돌릴, 옥타하이드로이소인돌릴, 2-옥사피페라지닐, 2-옥사피페리디닐, 2-옥사피리미디닐, 옥사졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 4-피페리도닐, 피롤리디닐, 피라졸리디닐, 퀴누클리디닐, 티아졸리디닐, 테트라하이드로푸릴, 트리티아닐, 테트라하이드로피라닐, 트리술포닐, 테트라하이드로피라닐, 티오모르폴리닐, 티아모르폴리닐, 1-옥사-티오모르폴리닐, 및 1,1-디옥사-티오모르폴리닐을 포함한다.
"헤테로아릴"은 질소, 산소 및 황에서 선택된 2 내지 17개의 탄소원자 및 1 내지 6개의 헤테로 원자를 포함하는 3 내지 18원 방향족 고리 라디칼에서 유래된 라디칼을 지칭한다. 본원에서 사용한 바와 같이, 헤테로아릴은 단환식, 이환식, 삼환식 또는 사환식 고리 시스템일 수 있으며, 고리 시스템에서 하나 이상의 고리는 완전히 불포화되고, 즉 이는 휘켈 이론을 따르는 고리형 탈편재화 (4n+2) 전자 시스템을 포함한다. 헤테로아릴은 융합 또는 가교된 고리 시스템을 포함한다. 헤테로아릴 라디칼내 헤테로 원자는 임의로 산화된다. 존재하는 경우, 하나 이상의 질소 원자는 임의로 4급화된다. 헤테로아릴은 고리의 임의의 원자를 통해 나머지 분자에 연결된다. 이러한 헤테로아릴의 예로는, 제한되지 않으나, 아제피닐, 아크리디닐, 벤즈이미다졸릴, 벤진돌릴, 1,3-벤조디옥사졸릴, 벤조푸라닐, 벤조옥사졸릴, 벤조[d]티아졸릴, 벤조티아디아졸일, 벤조[b][1,4]디옥사졸릴, 벤조[b][1,4] 옥사졸릴, 1,4-벤조디옥사졸릴, 벤조나프토푸라닐, 벤조디아졸릴, 벤조디옥사페닐, 벤조피라닐, 벤조피라노닐, 벤조푸라닐, 벤조푸라노닐, 벤조티에닐, 벤조티에노[3,2-d]피리미디닐, 벤조트리아졸릴, 벤조[4,6]이미다조[1,2-a]피리디닐, 카르바졸릴, 신놀리닐, 시클로펜타[d]피리미디닐, 6,7-디하이드로-5H-시클로펜타[4,5]티에노 [2,3-d]피리미디닐, 5,6-디하이드로벤조[h]퀴나졸리닐, 5,6-디하이드로벤조[h]신놀리닐, 6,7-디하이드로-5H-벤조[6,7]사이클로헵타[1,2-c]피리다지닐, 디벤조푸라닐, 디벤조티에닐, 푸라닐, 푸라노닐, 푸로[3,2-c]피리디닐, 5,6,7,8,9,10-헥사하이드로시클로헵타[d]피리미디닐, 5,6,7,8,9,10-헥사하이드로시클로옥타[d]피리다지닐, 5,6,7,8,9,10-헥사하이드로시클로옥타[d]피리디닐, 이소티아졸릴, 인다졸릴, 이미다졸릴, 인돌릴, 이소인돌릴, 인돌리닐, 이소인돌리닐, 이소퀴놀릴, 인돌리지닐, 이속사졸릴, 5,8-메타노-5,6,7,8-테트라하이드로퀴나졸리닐, 나프티리디노닐, 1,6-나프티리디노닐, 옥사디아졸릴, 2-옥소아제피닐, 옥사졸릴, 옥살릴, 5,6,6a,7,8,9,10a-옥타하이드로벤조[h]퀴나졸리닐, 1-페닐-1H-피롤릴, 페나지닐, 페노티아지닐, 페녹사지닐, 프탈릴, 프테리디닐, 퓨리닐, 피롤릴, 피라졸릴, 피라졸로[3,4-d]피리미디닐, 피리디닐, 피리도[3,2-d]피리미디닐, 피리도[3,4-d]피리미디닐, 피라지닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 피롤릴, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 5,6,7,8-테트라하이드로퀴나졸리닐, 5,6,7,8-테트라하이드로벤조[4,5]티에노[2,3-d]피리미디닐, 6,7,8,9-테트라하이드로-5H-시클로헵타[4,5]-티에노[2,3-d]피리미디닐, 5,6,7,8-테트라하이드로피리도[4,5-c]피리다지닐, 티아졸릴, 티아디아졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 트리아지닐, 티에노[2,3-d]피리미디닐, 티에노[3,2-d]피리미디닐, 티에노[2,3-c]프리디닐 및 티에닐을 포함한다.
다양한 하이드록실 보호기를 본 발명에서 사용할 수 있다. 일반적으로, 보호기는 화학적 작용기가 특정 반응 조건에 대해 불활성이 되도록 하며, 분자의 나머지를 실질적으로 손상시키지 않고 분자내 이러한 작용기에 부착되거나 그로부터 제거될 수 있다. 대표적인 하이드록실 보호기는 Beaucage 등의 Tetrahedron　1992, 48, 2223-2311, 및 Greene and Wuts,　Protective Groups in Organic Synthesis,　Chapter 2, 2d ed, John Wiley & Sons, New York, 1991에도 개시되어 있으며,이들 각각은 그 전문이 참조를 위해 본원에 인용된다. 일부 구현예에서, 보호기는 염기성 조건하에 안정되지만, 산성 조건하에 제거될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에서 사용한 하이드록실 보호기의 비-배타적인 예로는 디메톡시트리틸 (dimethoxytrityl, DMT), 모노메톡시트리틸, 9-페닐크산텐-9-일 (Pixyl) 및 9-(p-메톡시페닐)크산텐-9-일 (Mox)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에서 사용한 하이드록실 보호기의 비-배타적 예로는 Tr (트리틸), MMTr (4-메톡시트리틸), DMTr (4,4'-디메톡시트리틸) 및 TMTr (4,4',4"-트리메톡시트리틸)을 포함한다.
본원에서 사용한 바와 같이, 용어 "대상자"는 임의의 동물, 가령 포유동물 또는 유대목동물을 지칭한다. 본 발명의 대상자는 인간, 비인간 영장류 (가령, 붉은 털 원숭이 또는 다른 종류의 짧은 꼬리 원숭이), 생쥐, 돼지, 말, 당나귀, 소, 양, 쥐 및 임의 종류의 가금류를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용한 바와 같이, "치료"나 "치료하는" 또는 "완화"나 "개선"은 본원에서 호환적으로 사용된다. 이들 용어는 제한되지 않으나, 치료적 이점을 포함하는 유리한 또는 원하는 결과를 얻는 방법을 지칭한다. "치료적 이점"은 치료할 잠재적 장애의 근절 또는 개선을 의미한다. 또한, 환자가 여전히 잠재적인 장애를 겪을 수 있음에도 불구하고, 환자에게서 관찰되는 개선과 같이 잠재적 장애와 관련된 한가지 이상의 생리학적 증상을 근절하거나 개선함으로써 치료적 이점이 달성된다.
본원에서 사용한 바와 같이, "예방" 및 "예방하는"은 호환적으로 사용된다. 이들 용어는 제한되지 않으나, 예방적 이점을 포함하는 유리한 또는 원하는 결과를 얻는 방법을 지칭한다. "예방적 이점"을 얻기 위해서, 이러한 질환의 진단이 이루어지지 않았더라도, 특정 질환이 발병할 위험이 있는 환자 또는 질병의 한가지 이상의 병리학적 증상이 보고된 환자에게 컨쥬게이트 또는 조성물을 투여할 수 있다.
변성 siRNA
본 발명의 siRNA는 염기성 구조 단위로서 뉴클레오티드를 포함한다. 당업자에게는 뉴클레오티드가 포스페이트 기, 리보오스 기 및 염기를 포함하는 것이 주지되어 있다. 상기는 이러한 기에 관한 상세한 설명은 생략한다.
CN102140458B는 HBV 유전자를 특이적으로 억제하는 siRNA를 개시하며, siRNA의 다양한 화학적 변형 전략을 연구하였다. 이 연구는 상이한 변형 전략이 안정성, 생물학적 활성 및 세포 독성 같은 siRNA의 파라미터에 완전히 상이한 영향을 주는 것을 발견하였다. 이 연구에서는 7가지의 효과적인 변형 방식이 입증되었다. 비변형의 siRNA와 비교하여, 7가지의 변형 방식 중 하나에 의해 얻어진 siRNA는 비변형의 siRNA와 실질적으로 동일한 억제 활성을 유지하면서, 혈액에서 증가된 안정성을 보였다.
본원은 HBV 유전자의 발현을 억제할 수 있는 변성 siRNA를 제공하며, 이는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, siRNA의 각 뉴클레오티드는 변성 뉴클레오티드이고, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 모두 플루오로 변성 뉴클레오티드 및 비-플루오로 변성 뉴클레오티드를 포함하며; 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 I을 포함하고; 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오티드 서열 I 및 뉴클레오티드 서열 II는 이중 가닥 영역을 형성하기 위해 적어도 부분적으로 상보적이며; 상기 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 155에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 동일한 길이 및 3개 이하의 상이한 뉴클레오티드를 갖는 뉴클레오티드 서열 A를 포함하고; 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 156에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 동일한 길이 및 3개 이하의 상이한 뉴클레오티드를 갖는 뉴클레오티드 서열 B를 포함한다 :
5'-CCUUGAGGCAUACUUCAAZ -3' (서열 번호: 155);
5'-Z'UUGAAGUAUGCCUCAAGG -3' (서열 번호: 156);
상기, Z는 A이고; Z'는 U이며;
뉴클레오티드 서열 A는 Z에 상응하는 부위에 뉴클레오티드 ZA를 포함하고;
뉴클레오티드 서열 B는 Z'에 상응하는 부위에 뉴클레오티드 Z'B를 포함하고; 뉴클레오티드 Z'B는 안티센스 가닥의 5' 말단에서부터 제 1 뉴클레오티드이며;
플루오로 변성 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열 A 및 B에 위치되고;
5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오티드 서열 A의 위치 7, 8 및 9에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오티드 서열 B의 위치 2, 6, 14 및 16에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 5개 이하의 플루오로 변성 뉴클레오티드가 뉴클레오티드 서열 A에 존재하고; 뉴클레오티드 서열 B에는 7개 이하의 플루오로 변성 뉴클레오티드가 존재한다.
이러한 맥락에서, 용어 "상응하는 부위"는 뉴클레오티드 서열의 동일한 말단으로부터 계수함으로써 뉴클레오티드 서열의 동일한 부위에 있는 것을 의미한다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열 A의 3' 말단에서 제 1 뉴클레오티드는 서열 번호 155의 3' 말단에서 제 1 뉴클레오티드에 상응하는 부위의 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오티드 배타적으로 서열 I로만 구성되고, 안티센스 가닥은 배타적으로 뉴클레오티드 서열 II로만 구성된다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 A는 서열 번호 155에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 상이한 1개 이하의 뉴클레오티드를 갖고; 및/또는 뉴클레오티드 서열 B는 서열 번호 156에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 상이한 1개 이하의 뉴클레오티드를 갖는다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 B와 서열 번호 156에 나타낸 뉴클레오티드 서열 사이의 뉴클레오티드 차이는 Z'B 부위에서의 차이를 포함하며, 상기 Z'B는 A, C 또는 G에서 선택된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 차이는 Z'B가 A, C 또는 G에서 선택되는 Z'B 부위에서의 차이이다. 일부 구현예에서, ZA는 Z'B와 상보적인 뉴클레오티드이다. 이들 뉴클레오티드 차이는 siRNA가 표적 유전자를 억제하는 능력을 현저하게 감소시키지 않게 되며, 뉴클레오티드 차이를 포함하는 그러한 siRNA도 본 발명의 범위 내에 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 A는 뉴클레오티드 서열 B와 기본적으로 역 상보적, 실질적으로 역 상보적, 또는 완전히 역 상보적이다. "기본적으로 역 상보적"은 2개의 뉴클레오티드 서열에서 3개 이하의 염기쌍오류를 의미한다. "실질적으로 역 상보적"은 2개의 뉴클레오티드 서열에서 1개 이하의 염기쌍오류를 의미한다. "완전히 역 상보적"은 2개의 뉴클레오티드 서열에서 염기쌍오류가 없는 것을 의미한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 A는 서열 번호 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열이며; 뉴클레오티드 서열 B는 서열 번호 2에 나타낸 뉴클레오티드 서열이다:
5'-CCUUGAGGCAUACUUCAAZA-3' (서열 번호: 1);
5'-Z'BUUGAAGUAUGCCUCAAGG-3' (서열 번호: 2);
상기, Z'B는 안티센스 가닥의 5' 말단에서부터 제 1 뉴클레오티드이며; ZA는 A, U, G 또는 C에서 선택되고; Z'B는 ZA와 상보적인 뉴클레오티드이고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오티드 서열 A의 위치 7, 8 및 9에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오티드 서열 B의 위치 2, 6, 14 및 16에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고; 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 I의 세그먼트를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 II의 세그먼트를 포함하며; 뉴클레오티드 서열 I 및 뉴클레오티드 서열 II는 이중 가닥 영역을 형성하기 위해 역 상보적이고; 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 2에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
5'-CCUUGAGGCAUACUUCAAZA-3' (서열 번호: 1);
5'-Z'BUUGAAGUAUGCCUCAAGG -3' (서열 번호: 2);
상기 Z'B는 안티센스 가닥의 5' 말단에서부터 제 1 뉴클레오티드이며; ZA는 A, U, G 또는 C에서 선택되고; Z'B는 ZA와 상보적인 뉴클레오티드이고; 일부 구현예에서, ZA는 A이고; Z'B는 U이며;
5' 말단에서 3' 말단 방향으로, siRNA의 센스 가닥에서 서열 번호 1의 위치 7, 8 및 9에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고, siRNA의 센스 가닥 내 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 비-플루오로 변성 뉴클레오티드이고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, siRNA의 안티센스 가닥에서 서열 2의 위치 2, 6, 14 및 16에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고, siRNA의 안티센스 가닥내 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 비-플루오로 변성 뉴클레오티드이다.
센스 가닥 및 안티센스 가닥은 길이가 동일하거나 상이하다. 센스 가닥은 19 내지 23개의 뉴클레오티드 길이를 갖고, 안티센스 가닥은 20 내지 26개의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 이와 같이, 본 발명의 siRNA에서 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 19/20, 19/21, 19/22, 19/23, 19/24, 19/25, 19/26, 20/20, 20/21, 20/22, 20/23, 20/24, 20/25, 20/26, 21/20, 21/21, 21/22, 21/23, 21/24, 21/25, 21/26, 22/20, 22/21, 22/22, 22/23, 22/24, 22/25, 22/26, 23/20, 23/21, 23/22, 23/23, 23/24, 23/25 또는 23/26일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 siRNA에서 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 19/21, 21/23 또는 23/25이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 동일한 길이를 갖는다. 뉴클레오티드 서열 I은 뉴클레오티드 서열 III을 더 포함하고; 뉴클레오티드 서열 II는 뉴클레오티드 서열 IV를 더 포함한다. 뉴클레오티드 서열 III 및 뉴클레오티드 서열 IV는 각각 독립적으로 1 내지 4개의 뉴클레오티드 길이를 갖고; 뉴클레오티드 서열 III은 뉴클레오티드 서열 A의 5' 말단에 연결되고; 뉴클레오티드 서열 IV는 뉴클레오티드 서열 B의 3' 말단에 연결되고; 뉴클레오티드 서열 III 및 뉴클레오티드 서열 IV는 동일한 길이를 갖는다.
뉴클레오티드 서열 III은 뉴클레오티드 서열 IV와 상보적이거나 상보적이지 않을 수 있다. siRNA의 안정성을 향상시키기 위해, 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 III은 뉴클레오티드 서열 IV에 적어도 부분적으로 상보적이며; 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 III은 뉴클레오티드 서열 IV에 염기의 80% 또는 90% 이상 상보적이며; 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 III은 뉴클레오티드 서열 IV와 실질적으로 역 상보적이거나 완전히 역 상보적이며; "실질적으로 역 상보적"이란 2개의 뉴클레오티드 서열에서 1개 이하의 염기쌍오류을 지칭하고; "완전히 역 상보적"이란 2개의 뉴클레오티드 서열에서 염기쌍오류이 없는 것을 의미하며; 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 III은 뉴클레오티드 서열 IV에 완전히 역 상보적이다. 이와 같이, siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 동일한 길이를 가지며, 그의 길이 비는 20/20, 21/21, 22/22 또는 23/23이다. 일부 구현예에서, siRNA에서 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21 또는 23/23이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 III 및 뉴클레오티드 서열 IV는 모두 1개의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 뉴클레오티드 서열 III의 염기는 A이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 염기는 U이며; 이 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 20/20이고; 대안적으로, 뉴클레오티드 서열 III 및 뉴클레오티드 서열 IV는 모두 2개의 뉴클레오티드 길이를 갖고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오티드 서열 III의 염기 조성은 GA이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 염기 조성은 UC이며; 이 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이고; 대안적으로, 뉴클레오티드 서열 III 및 뉴클레오티드 서열 IV는 모두 3개의 뉴클레오티드 길이를 갖고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오티드 서열 III의 염기 조성은 CGA이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 염기 조성은 UCG이며; 이 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 22/22이고; 대안적으로, 뉴클레오티드 서열 III 및 뉴클레오티드 서열 IV는 모두 4개의 뉴클레오티드 길이를 갖고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오티드 서열 III의 염기 조성은 CCGA이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 염기 조성은 UCGG이며; 이 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 23/23이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 III 및 뉴클레오티드 서열 IV는 모두 2개의 뉴클레오티드 길이를 갖고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오티드 서열 III의 염기 조성은 GA이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 염기 조성은 UC이며; 이 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 III은 동일한 길이를 가지며 뉴클레오티드 서열 IV에 대해 완전히 역 상보적이다. 따라서, 뉴클레오티드 서열 III의 염기가 제공되면, 뉴클레오티드 서열 IV의 염기도 결정된다.
일부 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 상이한 길이를 갖는다. 뉴클레오티드 서열 II는 1 내지 3개의 뉴클레오티드 길이를 갖고 안티센스 가닥의 3' 말단에 연결된 뉴클레오티드 서열 V를 더 포함함으로써, 안티센스 가닥의 3' 돌출부를 구성한다. 이와 같이, 본 발명의 siRNA에서 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 19/20, 19/21, 19/22, 20/21, 20/22, 20/23, 21/22, 21/23, 21/24, 22/23, 22/24, 22/25, 23/24, 23/25, 또는 23/26일 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 V는 2개의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 이와 같이, 본 발명의 siRNA에서 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 19/21, 21/23 또는 23/25일 수 있다.
뉴클레오티드 서열 V의 각 뉴클레오티드는 임의의 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 V는 2개의 연속 티미딘 디옥시리보뉴클레오티드 (thymidine deoxyribonucleotides, TT) 또는 2개의 연속 우리딘 리보뉴클레오티드 (uridine ribonucleotides, UU)이고; 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 V는 표적 mRNA의 상응하는 부위에서 뉴클레오티드와 상보적이다.
일부 구현예에서, siRNA의 센스 가닥은 서열 번호 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호 3에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
5'-CCUUGAGGCAUACUUCAAZA-3' (서열 번호: 1);
5'-Z'B UUGAAGUAUGCCUCAAGGUU-3' (서열 번호: 3);
대안적으로, siRNA의 센스 가닥은 서열 번호 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호 4에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
5'-CCUUGAGGCAUACUUCAAZA-3' (서열 번호: 1);
5'-Z'B UUGAAGUAUGCCUCAAGGUC-3' (서열 번호: 4);
상기, 뉴클레오티드 Z'B는 안티센스 가닥의 5' 말단에서부터 제 1 뉴클레오티드이며; ZA는 A, U, G 또는 C에서 선택되고; Z'B는 ZA와 상보적인 뉴클레오티드이다.
본 명세서의 일부 구현예에 따르면, 본 명세서에 개시된 siRNA는 siHBa1 또는 siHBa2이다:
siHBa1
센스 가닥: 5'-CCUUGAGGCAUACUUCAAA-3' (서열 번호: 5),
안티센스 가닥: 5'-UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU-3' (서열 번호: 6),
siHBa2
센스 가닥: 5'-GACCUUGAGGCAUACUUCAAA-3' (서열 번호: 7),
안티센스 가닥: 5'-UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUCGG -3' (서열 번호: 8).
상술한 바와 같이, 본 발명의 siRNA의 모든 뉴클레오티드는 변성 뉴클레오티드이다. 뉴클레오티드 상의 이러한 변형은 HBV 유전자의 발현을 억제하기 위해 본 발명의 siRNA 컨쥬게이트의 기능의 현저한 감소 또는 손실을 유발하지 않게 된다. 예를 들어, 변성 뉴클레오티드는 J.K. Watts, G. F. Deleavey 및 M. J.Damha, 화학적으로 변성 siRNA: 도구 및 어플리케이션에 개시되었다. Drug Discov Today, 2008.13 (19-20): p.842-55를 선택할 수 있다.
일부 구현예에서, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 센스 가닥내 뉴클레오티드 서열 A의 위치 7, 8 및 9 또는 5, 7, 8 및 9에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고, 센스 가닥의 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 비-플루오로 변성 뉴클레오티드이며; 안티센스 가닥내 뉴클레오티드 서열 B의 위치 2, 6, 14 및 16 또는 2, 6, 8, 9, 14 및 16에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고, 안티센스 가닥의 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 비-플루오로 변성 뉴클레오티드이다.
본 발명의 맥락에서, 플루오로 변성 뉴클레오티드는 그의 리보오스 기의 2'-하이드록시를 플루오로 기로 치환함으로써 형성된 뉴클레오티드를 지칭하고, 이는 화학식 (107)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는다. 비-플루오로 변성 뉴클레오티드는 리보오스 기의 2'-하이드록시를 비-플루오로 기로 치환함으로써 형성된 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 유사체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 각 비-플루오로 변성 뉴클레오티드는 독립적으로 그의 리보오스 기의 2'-하이드록시를 비-플루오로 기로 치환함으로써 형성된 뉴클레오티드, 및 뉴클레오티드 유사체로 이루어진 군에서 선택된다.
리보오스 기의 2'-하이드록시를 비-플루오로 기로 치환하여 형성된 뉴클레오티드는 당업자에게 주지되어 있으며, 2'-알콕시 변성 뉴클레오티드, 2'-치환 알콕시 변성 뉴클레오티드, 2'-알킬 변성 뉴클레오티드, 2'-치환 알킬 변성 뉴클레오티드, 2'-아미노 변성 뉴클레오티드, 2'-치환 아미노 변성 뉴클레오티드 및 2'-데옥시 뉴클레오티드 중 하나에서 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 2'-알콕시 변성 뉴클레오티드는 화학식 (108)로 나타낸 바와 같은 메톡시 변성 뉴클레오티드 (2'-OMe)이다. 일부 구현예에서, 2'-치환 알콕시 변성 뉴클레오티드는, 예를 들어 화학식 (109)로 나타낸 바와 같은 2'-O-메톡시에톡시 변성 뉴클레오티드 (2'-MOE)이다. 일부 구현예에서, 2'-아미노 변성 뉴클레오티드 (2'-NH2)는 화학식 (110)으로 나타낸 바와 같다. 일부 구현예에서, 2'-데옥시 뉴클레오티드 (DNA)는 화학식 (111)으로 나타낸 바와 같다.
Figure pct00005
"뉴클레오티드 유사체"는 핵산에서 뉴클레오티드를 대체할 수 있는 기를 지칭하지만, 아데닌 리보뉴클레오티드, 구아닌 리보뉴클레오티드, 시토신 리보뉴클레오티드, 우라실 리보뉴클레오티드 또는 티민 디옥시리보뉴클레오티드와는 구조적으로 상이하다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 유사체는 이소뉴클레오티드, 가교된 핵산 (bridged nucleic acid, BNA) 뉴클레오티드 또는 비환식 뉴클레오티드일 수 있다.
BNA는 제한적이거나 접근할 수 없는 뉴클레오티드이다. BNA는 "고정된" C3'-엔도 슈가 퍼커링을 갖는 5-, 6-원 또는 심지어 7-원 고리 브릿지 구조를 포함할 수 있다. 브릿지는 전형적으로 리보오스의 2'- 및 4'-위치에 통합되어 2', 4'-BNA 뉴클레오티드를 제공한다. 일부 구현예에서, BNA는 LNA, ENA 및 cET BNA일 수 있으며, 이들은 각각 화학식 (112), (113) 및 (114)으로 나타낸 바와 같다.
Figure pct00006
비환식 뉴클레오티드는 리보오스 고리가 개방된 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 비환식 뉴클레오티드는 각각 화학식 (115) 및 (116)으로 나타낸 바와 같이, 잠금 해제된 핵산 (unlocked nucleic acid, UNA) 뉴클레오티드 및 글리세롤 핵산 (glycerol nucleic acid, GNA) 뉴클레오티드일 수 있다.
Figure pct00007
상기 R은 H, OH 또는 알콕시 (O-알킬)이다.
이소뉴클레오티드는 리보오스 고리 상에서 염기의 위치가 변경되는 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 이소뉴클레오티드는 각각 화학식 (117) 또는 (118)으로 나타낸 바와 같이, 리보오스 고리 상의 염기가 위치-1'에서 위치-2' 또는 -3'로 이동되는 화합물일 수 있다.
Figure pct00008
상기 "염기"는 A, U, G, C 또는 T 등의 염기를 나타내고; R은 H, OH, F 또는 전술한 비-플루오로 기이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 유사체는 이소뉴클레오티드, LNA, ENA, cET, UNA 및 GNA로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구현예에서, 각 비-플루오로 변성 뉴클레오티드는 메톡시 변성 뉴클레오티드이다. 본 발명의 맥락에서, 메톡시 변성 뉴클레오티드는 리보오스 기의 2'-하이드록시를 메톡시 기로 치환함으로써 형성된 뉴클레오티드를 지칭한다.
본 발명의 맥락에서, "플루오로 변성 뉴클레오티드", "2'-플루오로 변성 뉴클레오티드", "리보오스 기의 2'-하이드록시가 플루오로로 치환된 뉴클레오티드" 및 "2'-플루오로리보실'은 리보오스 기의 2'-하이드록시를 플루오로로 치환함으로써 형성된 뉴클레오티드를 지칭하는 동일한 의미를 가지며, 화학식 (107)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는다. "메톡시 변성 뉴클레오티드", "2-메톡시 변성 뉴클레오티드", "리보오스 기의 2'-하이드록시가 메톡시로 치환된 뉴클레오티드" 및 "2'-메톡시리보실"은, 뉴클레오티드에서 리보오스 기의 2'-하이드록시가 화학식 (108)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 메톡시로 치환된 뉴클레오티드를 지칭하는, 동일한 의미를 갖는다.
일부 구현예에서, 플루오로 변성 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열 A 및 B에 위치되고; 뉴클레오티드 서열 A에는 5개 이하의 플루오로 변성 뉴클레오티드가 존재하고, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오티드 서열 A의 위치 7, 8 및 9에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고; 뉴클레오티드 서열 B에는 7개 이하의 플루오로 변성 뉴클레오티드가 존재하고, 뉴클레오티드 서열 B의 위치 2, 6, 14 및 16에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 센스 가닥내 뉴클레오티드 서열 A의 위치 7, 8 및 9 또는 5, 7, 8 및 9에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고, 센스 가닥의 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 비-플루오로 변성 뉴클레오티드이며; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 안티센스 가닥내 뉴클레오티드 서열 B의 위치 2, 6, 14 및 16 또는 2, 6, 8, 9, 14 및 16에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고, 안티센스 가닥의 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 비-플루오로 변성 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 siRNA는 다음과 같은 변형을 갖는 siRNA이다: 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, siRNA의 센스 가닥내 뉴클레오티드 서열 A의 위치 7, 8 및 9 또는 5, 7, 8 및 9에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고, siRNA의 센스 가닥내 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 메톡시 변성 뉴클레오티드이고; 안티센스 가닥내 뉴클레오티드 서열 B의 위치 2, 6, 14 및 16 또는 2, 6, 8, 9, 14 및 16에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고, siRNA의 안티센스 가닥내 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 메톡시 변성 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 siRNA는 다음과 같은 변형을 갖는 siRNA이다: 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, siRNA의 센스 가닥내 뉴클레오티드 서열 A의 위치 5, 7, 8 및 9에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고, siRNA의 센스 가닥내 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 메톡시 변성 뉴클레오티드이고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, siRNA의 안티센스 가닥내 뉴클레오티드 서열 B의 위치 2, 6, 8, 9, 14 및 16에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고, siRNA의 안티센스 가닥내 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 메톡시 변성 뉴클레오티드이며;
대안적으로, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, siRNA의 센스 가닥내 뉴클레오티드 서열 A의 위치 5, 7, 8 및 9에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고, siRNA의 센스 가닥내 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 메톡시 변성 뉴클레오티드이고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, siRNA의 안티센스 가닥내 뉴클레오티드 서열 B의 위치 2, 6, 14 및 16에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고, siRNA의 안티센스 가닥내 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 메톡시 변성 뉴클레오티드이며;
대안적으로, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, siRNA의 센스 가닥내 뉴클레오티드 서열 A의 위치 7, 8 및 9에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고, siRNA의 센스 가닥내 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 메톡시 변성 뉴클레오티드이고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, siRNA의 안티센스 가닥내 뉴클레오티드 서열 B의 위치 2, 6, 14 및 16에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고, siRNA의 안티센스 가닥내 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 메톡시 변성 뉴클레오티드이다.
다시 말해, siRNA의 인산-리보오스 골격의 리보오스 기는 각각 다음과 같은 변형 기를 갖는다: 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, siRNA의 센스 가닥내 뉴클레오티드 서열 A의 위치 5, 7, 8 및 9에서 뉴클레오티드의 리보오스 기는 2'-플루오로리보실이고, siRNA의 센스 가닥내 나머지 위치에서 뉴클레오티드의 리보오스 기는 2'-메톡시리보실이고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, siRNA의 안티센스 가닥내 뉴클레오티드 서열 B의 위치 2, 6, 8, 9, 14 및 16에서 뉴클레오티드의 리보오스 기는 2'-플루오로리보실이며, siRNA의 안티센스 가닥내 나머지 위치에서 뉴클레오티드의 리보오스 기는 2'-메톡시리보실이다;
대안적으로, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, siRNA의 센스 가닥내 뉴클레오티드 서열 A의 위치 5, 7, 8 및 9에서 뉴클레오티드의 리보오스 기는 2'-플루오로리보실이고, siRNA의 센스 가닥내 나머지 위치에서 뉴클레오티드의 리보오스기는 2'-메톡시리보실이고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, siRNA의 안티센스 가닥내 뉴클레오티드 서열 B의 위치 2, 6, 14 및 16에서 뉴클레오티드의 리보오스 기는 2'-플루오로리보실이고, siRNA의 안티센스 가닥내 나머지 위치에서 뉴클레오티드의 리보오스 기는 2'-메톡시리보실이며;
대안적으로, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, siRNA의 센스 가닥내 뉴클레오티드 서열 A의 위치 7, 8 및 9에서 뉴클레오티드의 리보오스 기는 2'-플루오로리보실이고, siRNA의 센스 가닥내 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 2'-메톡시리보실이고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, siRNA의 안티센스 가닥내 뉴클레오티드 서열 B의 위치 2, 6, 14 및 16에서 뉴클레오티드의 리보오스 기는 2'-플루오로리보실이며, siRNA의 안티센스 가닥내 나머지 위치에서 뉴클레오티드의 리보오스기는 2'-메톡시리보실이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 siRNA는 siHBa1M1, siHBa1M2, siHBa2M1 또는 siHBa2M2이다:
siHBa1M1
센스 가닥: 5'-CmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 9),
안티센스 가닥: 5'-UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm -3' (서열 번호: 10),
siHBa1M2
센스 가닥: 5'-CmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 11),
안티센스 가닥: 5'-UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm -3' (서열 번호: 12),
siHBa2M1
센스 가닥: 5'-GmAmCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 13),
안티센스 가닥: 5'-UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm -3' (서열 번호: 14),
siHBa2M2
센스 가닥: 5'-GmAmCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 15),
안티센스 가닥: 5'-UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm -3' (서열 번호: 16),
상기, C, G, U 및 A는 뉴클레오티드의 염기 조성을 나타내고; m은 문자 m의 좌측에 인접한 뉴클레오티드가 2'-메톡시 변성 뉴클레오티드임을 나타내고; f는 문자 f의 좌측에 인접한 뉴클레오티드가 2'-플루오로 변성 뉴클레오티드임을 나타낸다. 상기 변형을 갖는 siRNA는 보다 낮은 비용으로 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 혈액에서의 리보뉴클레아제가 핵산의 절단을 어렵게 하여 핵산의 안정성을 증가시키고 뉴클레아제 가수분해에 대해 핵산이 보다 강한 내성을 가질 수 있게 한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥에서 하나 이상의 단일 가닥의 포스페이트-리보오스 골격내 포스페이트 기의 적어도 일부는 변형된 기를 갖는 포스페이트 기이다. 일부 구현예에서, 변형된 기를 갖는 포스페이트 기는 포스페이트 기의 포스포디에스테르 결합에서 하나 이상의 산소원자를 황원자로 치환함으로써 형성된 포스포로티오에이트 기이며; 일부 구현예에서 변형된 기를 갖는 포스페이트 기는 화학식 (101)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 포스포로티오에이트 기이다:
Figure pct00009
이 변형은 siRNA의 이중 가닥 구조를 안정화시켜 염기쌍에 대한 높은 특이성 및 높은 친화성을 유지한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 siRNA에서, 포스포로티오에이트 연결은 다음의 하나 이상의 다음 위치에 존재한다: 센스 또는 안티센스 가닥의 한쪽 말단에서 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 사이의 위치, 센스 또는 안티센스 가닥의 한쪽 말단에서 제 2 및 제 3 뉴클레오티드 사이의 위치, 또는 이들의 임의의 조합에 존재한다. 일부 구현예에서, 포스포로티오에이트 연결은 센스 가닥의 5' 말단을 제외한 상기 모든 위치에 존재한다. 일부 구현예에서, 포스포로티오에이트 연결은 센스 가닥의 3' 말단을 제외한 상기 모든 위치에 존재한다. 일부 구현예에서, 포스포로티오에이트 연결은 다음의 위치 중 적어도 하나에 존재한다:
센스 가닥의 5' 말단에서 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 사이의 위치;
센스 가닥의 5' 말단에서 제 2 및 제 3 뉴클레오티드 사이의 위치;
센스 가닥의 3' 말단에서 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 사이의 위치;
센스 가닥의 3' 말단에서 제 2 및 제 3 뉴클레오티드 사이의 위치;
안티센스 가닥의 5' 말단에서 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 사이의 위치;
안티센스 가닥의 5' 말단에서 제 2 및 제 3 뉴클레오티드 사이의 위치;
안티센스 가닥의 3' 말단에서 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 사이의 위치;
안티센스 가닥의 3' 말단에서 제 2 및 제 3 뉴클레오티드 사이의 위치.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 siRNA는 siHBa1M1S, siHBa1M2S, siHBa2M1S 또는 siHBa2M2S이다:
siHBa1M1S
센스 가닥: 5'-CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 17),
안티센스 가닥: 5'-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm -3' (서열 번호: 18),
siHBa1M2S
센스 가닥: 5'-CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 19),
안티센스 가닥: 5'-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm -3' (서열 번호: 20),
siHBa2M1S
센스 가닥: 5'-GmsAmsCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 21),
안티센스 가닥: 5'-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm -3' (서열 번호: 22),
siHBa2M2S
센스 가닥: 5'-GmsAmsCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 23),
안티센스 가닥: 5'-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm -3' (서열 번호: 24),
상기, C, G, U 및 A는 뉴클레오티드의 염기 조성을 나타내고; m은 문자 m의 좌측에 인접한 뉴클레오티드가 메톡시 변성 뉴클레오티드임을 나타내고; f는 문자 f의 좌측에 인접한 뉴클레오티드가 플루오로 변성 뉴클레오티드임을 나타내고; s는 이 문자의 양쪽에 인접한 두 뉴클레오티드 사이의 포스포로티오에이트 연결을 나타낸다.
일부 구현예에서, siRNA의 안티센스 가닥에서 5'-말단 뉴클레오티드는 5'-포스페이트 뉴클레오티드 또는 5'-포스페이트 유사체 변성 뉴클레오티드이다.
통상적인 유형의 5'-포스페이트 뉴클레오티드 또는 5'-포스페이트 유사체 변성 뉴클레오티드는 당업자에게 주지되어 있다. 예를 들어, 5'-포스페이트 뉴클레오티드는 다음의 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00010
또 다른 예에 대해, Anastasia Khvorova 및 Jonathan K. Watts에 개시된 바와 같이, 임상적 유용성의 올리고뉴클레오티드 치료법의 화학적 진화(The chemical evolution of oligonucleotide therapies of clinical utility). Nature Biotechnology, 2017, 35 (3): 238-48, 다음 4개의 5'-포스페이트 유사체 변성 뉴클레오티드:
Figure pct00011
상기,
R은 H, OH, 메톡시 및 F로 이루어진 군에서 선택된 기를 나타내고;
"염기"는 A, U, C, G 또는 T에서 선택된 염기를 나타낸다.
일부 구현예에서, 5'-포스페이트 뉴클레오티드는 화학식 (102)로 나타낸 바와 같은 5'-포스페이트 변형을 갖는 뉴클레오티드이고; 5'-포스페이트 유사체 변성 뉴클레오티드는 화학식 (103)으로 나타낸 바와 같은 5'-(E)-비닐포스포네이트 (E-VP) 변형을 갖는 뉴클레오티드 또는 화학식 (105)로 나타낸 바와 같은 포스포로티오에이트 변성 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 siRNA는 siHBa1M1P1, siHBa1M2P1, siHBa2M1P1, siHBa2M2P1, siHBa1M1SP1, siHBa1M2SP1, si HBa2M1SP1 및 siHBa2M2SP1로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이다:
siHBa1M1P1
센스 가닥: 5'-CmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 25),
안티센스 가닥: 5'-P1-UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm -3' (서열 번호: 26),
siHBa1M2P1
센스 가닥: 5'-CmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 27),
안티센스 가닥: 5'-P1-UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm -3' (서열 번호: 28),
siHBa2M1P1
센스 가닥: 5'-GmAmCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 29),
안티센스 가닥: 5'-P1-UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm -3' (서열 번호: 30),
siHBa2M2P1
센스 가닥: 5'-GmAmCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 31),
안티센스 가닥: 5'-P1-UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm -3' (서열 번호: 32),
siHBa1M1SP1
센스 가닥: 5'-CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 33),
안티센스 가닥: 5'-P1-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm -3' (서열 번호: 34),
siHBa1M2SP1
센스 가닥: 5'-CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 35),
안티센스 가닥: 5'-P1-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm -3' (서열 번호: 36),
siHBa2M1SP1
센스 가닥: 5'-GmsAmsCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 37),
안티센스 가닥: 5'-P1-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm-3' (서열 번호: 38),
siHBa2M2SP1
센스 가닥: 5'-GmsAmsCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 39),
안티센스 가닥: 5'-P1-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm -3' (서열 번호: 40),
상기, C, G, U 및 A는 뉴클레오티드의 염기 조성을 나타내고; m은 문자 m의 좌측에 인접한 뉴클레오티드가 2'-메톡시 변성 뉴클레오티드임을 나타내고; f는 문자 f의 좌측에 인접한 뉴클레오티드가 2'-플루오로 변성 뉴클레오티드임을 나타내고; s는 문자 s의 양쪽에 인접한 2개의 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 연결에 의해 연결된 것을 나타내고; P1은 P1의 우측에 인접한 뉴클레오티드가 5'-포스페이트 뉴클레오티드 또는 5'-포스페이트 유사체 변성 뉴클레오티드임을 나타낸다.
본 발명의 발명자들은 놀랍게도 본원에 제공된 siRNA가 더 높은 유전자 억제 활성을 유지하면서, 크게 향상된 혈장 및 리소좀 안정성과, 감소된 표적외 효과(off-target effect)를 갖는 것을 발견하였다.
본원에 제공된 siRNA는 당업계에서 siRNA를 제조하는 통상적인 방법, 예를 들어 고상 합성 및 액상 합성 방법에 의해 얻어질 수 있다. 상기, 상업적인 커스터마이즈 서비스는 이미 고상 합성에 이용 가능하다. 변성 뉴클레오티드는 상응하는 변형을 갖는 뉴클레오티드 단량체를 사용함으로써 본 발명의 siRNA에 도입될 수 있으며, 상기 상응하는 변형을 갖는 뉴클레오티드 단량체를 제조하는 방법 및 변성 뉴클레오티드를 siRNA에 도입하는 방법 역시 당업자에게 주지되어 있다.
약학 조성물
본원은 전술한 siRNA를 활성 성분으로 포함하는 약학 조성물 및 약학적으로 허용되는 담체를 제공한다.
약학적으로 허용되는 담체는 siRNA 투여 분야에서 통상적으로 사용되는 담체일 수 있으며, 예를 들어 제한되지 않으나, 1종 이상의 자성 나노입자 (예컨대 Fe3O4 및 Fe2O3- 나노입자에 기반), 탄소 나노튜브, 메조포러스 실리콘, 인산 칼슘 나노입자, 폴리에틸렌이민 (PEI), 폴리아미도아민 (PAMAM) 덴드리머, 폴리(L-리신) (PLL), 키토산, 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DOTAP), 폴리(D&L-락트산/글리콜산) 공중합체 (PLGA), 폴리(2-아미노에틸 에틸렌 포스페이트) (PPEEA), 폴리(2-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트) (PDMAEMA) 및 이들의 유도체일 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 약학 조성물에서, siRNA 및 약학적으로 허용되는 담체의 함량에 대한 특별한 요구조건은 없다. 일부 구현예에서, siRNA 대 약학적으로 허용되는 담체의 중량비는 1:(1-500), 일부 구현예에서 1:(1-50)이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물은 다른 약학적으로 허용되는 부형제를 함유할 수도 있으며, 이는 당해 분야의 다양한 통상적인 제형 또는 화합물 중 하나 이상일 수 있다. 예를 들어, 상기 다른 약학적으로 허용되는 부형제는 pH 완충제, 보호제 및 삼투압 조절제 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
pH 완충제는 pH 7.5 내지 8.5의 트리스(하이드록시메틸) 아미노메탄 하이드로클로라이드 완충용액 및/또는 pH 5.5 내지 8.5의 인산염 완충용액, 바람직하게는 pH 5.5 내지 8.5의 인산염 완충용액일 수 있다.
보호제는 이노시톨, 소르비톨, 수크로오스, 트레할로스, 만노스, 말토오스, 락토오스 및 글루코스 중 하나 이상일 수 있다. 보호제의 함량은 약학 조성물의 총 중량을 기준으로 0.01 중량% 내지 30 중량%일 수 있다.
삼투압 조절제는 염화나트륨 및/또는 염화칼륨일 수 있다. 삼투압 조절제의 함량은 약학 조성물의 삼투압이 200 내지 700 milliosmol/kg이 될 수 있게 한다. 원하는 삼투압에 따라, 당업자는 삼투압 조절제의 함량을 쉽게 결정할 수 있다.
일부 구현예에서, 약학 조성물은 액체 제형, 예를 들어 주사 용액; 또는 주사용 동결 건조 분말일 수 있고, 이는 투여시 액체 부형제와 혼합되어 액체 제형을 형성한다. 액체 제형은, 제한되지 않으나, 피하, 근육내 또는 정맥내 주사 경로에 의해 투여될 수 있고, 분무에 의한 폐, 또는 분무에 의한 폐를 통한 다른 기관 (예컨대, 간)에 투여될 수도 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 정맥 주사에 의해 투여된다.
일부 구현예에서, 약학 조성물은 리포좀 제형의 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 리포좀 제형에 사용되는 약학적으로 허용되는 담체는 아민-함유 형질주입 화합물 (이하, 유기 아민으로도 지칭함), 보조 지질(helper lipid) 및/또는 페길화된 지질을 포함한다. 상기, 유기 아민, 보조 지질 및 페길화된 지질은 CN103380113A (그 전문을 참고로 본원에서 인용함)에 기재된 바와 같은 아민-함유 형질주입 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 유도체, 보조 지질 및 페길화된 지질 중 하나 이상에서 각각 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 유기 아민은 CN103380113A에 기재된 화학식 (201)로 나타낸 바와 같은 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염일 수 있다:
Figure pct00012
상기:
X101 및 X102는 서로 독립적으로 O, S, N-A 및 C-A에서 선택되고, A는 수소 또는 C1-C20 탄화수소 쇄이며;
Y 및 Z는 서로 독립적으로 C=O, C=S, S=O, CH-OH 및 SO2에서 선택되고;
R101, R102, R103, R104, R105, R106 및 R107은 서로 독립적으로 수소; 환식 또는 비환식, 치환 또는 비치환, 분지형 또는 선형 지방족 기; 환식 또는 비환식, 치환 또는 비치환, 분지형 또는 선형 헤테로 지방족 기; 치환 또는 비치환, 분지형 또는 선형 아실 기; 치환 또는 비치환, 분지형 또는 선형 아릴 기, 또는 치환 또는 비치환, 분지형 또는 선형 헤테로아릴 기에서 선택되고;
x는 1 내지 10의 정수이며;
n은 1 내지 3의 정수이고, m은 0 내지 20의 정수이며, p는 0 또는 1이며; 상기 m 및 p가 모두 0인 경우, R102는 수소이고,
n 또는 m 중 하나 이상이 2인 경우, 화학식 (201)에서 R103 및 질소는 화학식 (202) 또는 (203)으로 나타낸 바와 같은 구조를 형성한다:
Figure pct00013
상기, g, e 및 f는 서로 독립적으로 1 내지 6의 정수이고, "HCC"는 탄화수소 쇄를 나타내고, 각 *N은 화학식 (201)에 나타낸 질소 원자를 나타낸다.
일부 구현예에서, R103은 폴리아민이다. 다른 구현예에서, R103은 케탈이다. 일부 구현예에서, 화학식 (201)에서의 R101 및 R102는 서로 독립적으로 3 내지 20개의 탄소원자 (예컨대 8 내지 18개의 탄소원자) 및 0 내지 4개의 이중 결합 (예컨대 0 내지 2개의 이중 결합)을 갖는 치환 또는 비치환, 분지쇄 또는 선형 알킬 또는 알케닐기 중 어느 하나이다.
일부 구현예에서, n 및 m이 서로 독립적으로 1 내지 3인 경우, R103은 하기 화학식 (204) 내지 (213) 중 임의의 하나를 나타낸다.
Figure pct00014
Figure pct00015
상기, 각각의 g, e 및 f는 독립적으로 1 내지 6의 정수이며; 각 "HCC"는 탄화수소 쇄를 나타내고, 각 *는 화학식 (201)에서 질소 원자에 대한 R103의 잠재적 부착점을 나타내고, 임의의 *위치에서 각 H는 화학식 (201)에서 질소 원자에 대한 부착을 실현하기 위해 치환될 수 있다.
화학식 (201)로 나타낸 바와 같은 화합물은 CN103380113A에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.
일부 구현예에서, 유기 아민은 화학식 (214)로 나타낸 바와 같은 유기 아민 및/또는 화학식 (215)로 나타낸 바와 같은 유기 아민일 수 있다:
Figure pct00016
보조 지질은 콜레스테롤, 콜레스테롤 유사체 및/또는 콜레스테롤 유도체이다.
페길화된 지질은 1,2-디팔미토일-슨-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)]-2000이다.
일부 구현예에서, 약학 조성물 내 유기 아민, 보조 지질 및 페길화된 지질 간의 몰비는 (19.7-80): (19.7-80): (0.3-50)이고; 예를 들어, 몰비는 (50-70): (20-40): (3-20)일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 siRNA 및 상기 아민-함유 형질주입제에 의해 형성된 약학 조성물은 약 30 nm 내지 약 200 nm, 전형적으로 약 40 nm 내지 약 135 nm의 평균 직경을 가지며, 보다 전형적으로, 리포좀 입자의 평균 직경은 약 50 nm 내지 약 120 nm, 약 50 nm 내지 약 100 nm, 약 60 nm 내지 약 90 nm, 또는 약 70 nm 내지 약 90 nm이고, 예를 들어 리포좀 입자의 평균 직경은 약 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 또는 160 nm이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 siRNA 및 상기 아민-함유 형질주입제에 의해 형성된 약학 조성물에서, siRNA 대 총 지질, 가령 유기 아민, 보조 지질 및/또는 페길화된 지질의 비 (중량/중량비)는 약 1:1 내지 약 1:50, 약 1:1 내지 약 1:30, 약 1:3 내지 약 1:20, 약 1:4 내지 약 1:18, 약 1:5 내지 약 1:17, 약 1:5 내지 약 1:15, 약 1:5 내지 약 1:12, 약 1:6 내지 약 1:12 또는 약 1:6 내지 약 1:10의 범위이다. 예를 들어, 본 발명의 siRNA 대 총 지질의 중량비는 약 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17 또는 1:18이다.
일부 구현예에서, 약학 조성물은 각 성분이 분리된 상태로 시판할 수 있고, 액체 제형의 형태로 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 siRNA 및 상기 약학적으로 허용되는 담체에 의해 형성된 약학 조성물은 기존의 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 본 발명의 siRNA로 치환하는 것을 제외하고, 여러 공지된 공정에 의해 제조할 수 있다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 다음의 공정에 따라 제조할 수 있다.
유기 아민, 보조 지질 및 페길화된 지질을 전술한 바와 같은 몰 비로 알콜에 현탁시키고 균질하게 혼합하여 지질 용액을 얻고; 알콜은 생성된 지질 용액이 2 내지 25 mg/mL (가령, 8 내지 18 mg/mL)의 총 질량 농도에서 존재하는 양으로 사용된다. 알콜은 약 실온에서 액체 형태인 알콜 같은 약학적으로 허용되는 알콜, 예를 들어 에탄올, 프로필렌 글리콜, 벤질 알콜, 글리세롤, PEG 200, PEG 300, PEG 400중 하나 이상이고, 바람직하게는 에탄올이다.
본 발명의 siRNA는 완충 염 용액에 용해되어 siRNA의 수용액을 생성한다. 완충 염 용액의 농도는 0.05 내지 0.5 M, 예컨대 0.1 내지 0.2 M이다. 완충 염 용액의 pH는 4.0 내지 5.5, 예컨대 5.0 내지 5.2로 조절된다. 완충 염 용액은 siRNA가 0.6 mg/ml 미만, 예컨대 0.2 내지 0.4 mg/mL의 농도로 존재하는 양으로 사용된다. 완충 염은 가용성 아세테이트 및 가용성 시트레이트, 예컨대 나트륨 아세테이트 및/또는 칼륨 아세테이트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
지질 용액과 siRNA의 수용액이 혼합된다. 혼합 후 얻어진 생산물을 40 내지 60℃의 온도에서 2 분 이상 (가령, 5 내지 30 분) 동안 배양하여 배양된 지질 제형을 생성한다. 지질 용액 대 siRNA의 수용액의 부피비는 1:(2-5), 예컨대 1:4이다.
배양된 지질 제형을 농축 또는 희석시키고, 정제하여 불순물을 제거한 후, 멸균하여 본 발명의 약학 조성물을 얻으며, 이는 다음과 같은 물리화학적 파라미터를 갖는다: pH 6.5 내지 8, 80% 이상의 캡슐화 백분율, 40 내지 200 nm의 입자 크기, 0.30 미만의 다분산 지수 및 250 내지 400 mOsm/kg의 삼투압; 예를 들어, 물리화학적 파라미터는 pH 7.2 내지 7.6, 90% 이상의 캡슐화 백분율, 60 내지 100 nm의 입자 크기, 0.20 미만의 다분산 지수 및 300 내지 400 mOsm/kg의 삼투압일 수 있다.
여기서, 농축 또는 희석 단계는 불순물 제거 단계 전, 후 또는 동시에 수행할 수 있다. 불순물을 제거하는 방법은 다양한 기존 방법, 예를 들어 100 kDa 중공 섬유 컬럼을 사용하는 한외여과, 한외여과 교환 용액으로서 pH 7.4의 PBS 및 접선 유동 시스템 중 어느 하나일 수 있다. 멸균 방법은 0.22 μm 필터에서 여과 멸균 등의 다양한 기존 방법 중 임의의 한 가지일 수 있다.
제 1 siRNA 컨쥬게이트
일 측면에서, 본원은 전술한 siRNA 및 이에 부착된 접합 기를 포함하는 제 1 siRNA 컨쥬게이트를 제공한다.
접합 기는 전형적으로 하나 이상의 약학적으로 허용되는 표적화 기 및 임의의 링커를 포함한다. 또한, siRNA, 링커 및 표적화 기는 연속해서 연결된다. 일부 구현예에서, 1 내지 6개의 표적화 기가 존재한다. 일부 구현예에서, 2 내지 4개의 표적화 기가 존재한다. siRNA 분자는 접합 기에 비공유적으로 또는 공유적으로 접합될 수 있으며, 예를 들어 siRNA 분자는 접합 기에 공유적으로 접합된다. siRNA와 접합 기 사이의 접합 부위는 siRNA의 센스 가닥의 3'-말단 또는 5'-말단, 또는 siRNA의 안티센스 가닥의 5'-말단, 또는 내부 서열 내에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, siRNA와 접합 기 사이의 접합 부위는 siRNA의 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일부 구현예에서, 접합 기는 뉴클레오티드의 인산 기, 2'-하이드록시 기 또는 염기에 연결된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드가 2'-5'-포스포디에스테르 결합을 통해 연결되는 경우, 접합 기는 3'-하이드록시 기에 연결될 수 있다. 접합 기가 siRNA의 말단에 연결되는 경우, 접합 기는 전형적으로 뉴클레오티드의 인산 기에 연결되고; 접합 기가 siRNA의 내부 서열에 연결되는 경우, 접합 기는 전형적으로 리보오스 고리 또는 염기에 연결된다. 특정 연결 모드에 대해서는 Muthiah Manoharan 등을 참조할 수 있다. 뉴클레오시드를 통해 연결된 차례대로 조립된 3가 N-아세틸갈락토사민을 운반하는 siRNA 컨쥬게이트는 간세포에서 생체내 강력한 유전자 침묵을 유발한다. ACS Chemical biology, 2015, 10(5):1181-7.
일부 구현예에서, siRNA 및 접합 기는 산-불안정성 또는 환원성 화학 결합에 의해 연결될 수 있으며, 이들 화학 결합은 세포 엔도좀의 산성 환경하에서 분해됨으로써, siRNA는 자유 상태가 될 수 있다. 비-분해성 접합 모드의 경우, 접합 기는 siRNA의 센스 가닥에 연결됨으로써, 이중 가닥 올리고 뉴클레오티드의 활성에 대한 접합의 영향을 최소화할 수 있다.
일부 구현예에서, 약학적으로 허용되는 표적화 기는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 투여 분야에서 통상적인 리간드, 예를 들어 WO2009082607A2 (그 전체를 참고로 본원에서 인용함)에 기재된 바와 같은 다양한 리간드일 수 있다.
일부 구현예에서, 약학적으로 허용되는 표적화 기는 다음의 표적화 분자 또는 그의 유도체에 의해 형성된 하나 이상의 리간드에서 선택될 수 있다: 친유성 분자, 예컨대 콜레스테롤, 담즙산, 비타민 (예컨대 비타민 E), 상이한 쇄 길이의 지질 분자; 폴리에틸렌 글리콜 등의 중합체; 세포-침투 펩티드 등의 폴리펩티드; 앱 타머; 항체; 양자점; 당류, 예컨대 락토스, 폴리락토스, 만노스, 갈락토스, N-아세틸갈락토사민 (GalNAc); 엽산; 또는 간의 실질 세포에서 발현되는 수용체 리간드, 예컨대 아시알로당단백질, 아시알로-당 잔기, 지질 단백질 (예컨대 고밀도 지단백질, 저밀도 지단백질), 글루카곤, 신경전달물질 (예컨대 아드레날린), 성장 인자, 트랜스페린 등이다.
일부 구현예에서, 각 리간드는 독립적으로 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 리간드는 간세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 리간드는 포유동물 간세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 리간드는 인간 간세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 리간드는 간 표면의 아시알로당단백질 수용체 (asialoglycoprotein receptor, ASGP-R)에 결합할 수 있는 리간드이다. 이들 리간드의 유형은 당업자에게 주지되어 있으며, 이들은 전형적으로 표적 세포의 표면에서 특정 수용체에 결합하는 기능을 제공함으로써, 리간드에 연결된 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 표적 세포 내로의 전달을 매개한다.
일부 구현예에서, 약학적으로 허용되는 표적화 기는 포유동물 간세포 표면 상의 아시알로당단백질 수용체 (ASGP-R)에 결합하는 임의의 리간드일 수 있다. 일 구현예에서, 각 리간드는 독립적으로 아시알로오르소뮤코이드 (asialoorosomucoid, ASOR) 또는 아시알로페투인 (asialofetuin, ASF) 등의 아시알로당단백질에서 선택된다. 일부 구현예에서, 리간드는 당류 또는 그의 유도체이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 리간드는 당`류이다. 일부 구현예에서, 각 리간드는 당류이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 리간드는 단당류, 다당류, 변형된 단당류, 변형된 다당류 또는 그의 유도체이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 리간드는 단당류, 이당류 또는 삼당류일 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 리간드는 변형된 당류이다. 일부 구현예에서, 각 리간드는 변형된 당류이다. 일부 구현예에서, 각 리간드는 독립적으로 다당류, 변형된 다당류, 단당류, 변형된 단당류, 다당류 유도체 및 단당류 유도체로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구현예에서, 각 리간드 또는 하나 이상의 리간드는 독립적으로 글루코스 및 그의 유도체, 만노스 및 그의 유도체, 갈락토스 및 그의 유도체, 자일로스 및 그의 유도체, 리보오스 및 그의 유도체, 푸코스 및 그의 유도체, 락토스 및 그의 유도체, 말토스 및 그의 유도체, 아라비노스 및 그의 유도체, 프럭토스 및 그의 유도체, 및 시알산으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 각 리간드는 독립적으로 D-만노피라노스, L-만노피라노스, D-아라비노스, D-자일로푸라노스, L-자일로푸라노스, D-글루코스, L-글루코스, D-갈락토스, L-갈락토스 α-D-만노푸라노스, β-D-만노푸라노스, α-D-만노피라노스, β-D-만노피라노스, α-D-글루코피라노스, β-D-글루코피라노스, α-D-글루코푸라노스, β-D-글루코푸라노스, α-D-프럭토푸라노스, α-D-프럭토피라노스, α-D-갈락토피라노스, β-D-갈락토피라노스, α-D-갈락토푸라노스, β-D-갈락토푸라노스, 글루코사민, 시알산, 갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, N-트리플루오로아세틸갈락토사민 N-프로피오닐갈락토사민, N-n-부티릴갈락토사민, N-이소부티릴갈락토사민, 2-아미노-3-O-[(R)-1-카르복시에틸]-2-데옥시-β-D-글루코피라노스, 2-데옥시-2-메틸아미노-L-글루코피라노스, 4,6-디데옥시-4-포름아미도-2,3-디-O-메틸-D-만노피라노스, 2-데옥시-2-술포아미노-D-글루코피라노스, N-글리콜릴-α-뉴라민산, 5-티오-β-D-글루코피라노스, 메틸 2,3,4-트리스-O-아세틸-1-티오-6-O-트리틸-α-D-글루코피라노시드, 4-티오-β-D-갈락토피라노오스, 에틸 3,4,6,7-테트라-O-아세틸-2-데옥시-1,5-디티오-α-D-글루코헵토피라노시드, 2,5-안하이드로-D-알로노니트릴, 리보오스, D-리보오스, D-4-티오리보오스, L-리보오스, 및 L-4-티오리보오스로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 예를 들어 CN105378082A (그 전체를 참고로 본원에서 인용함)의 개시에서 다른 리간드의 선택사항을 찾아 볼 수 있다.
일부 구현예에서, 제 1 siRNA 컨쥬게이트에서 약학적으로 허용되는 표적화 기는 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토사민일 수 있으며, 상기 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토사민 분자는 1가, 2가, 3가 또는 4가일 수 있다. 본원에 기재된 용어 1가, 2가, 3가 또는 4가는 각각 올리고뉴클레오티드 컨쥬게이트에서 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 분자 대 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토사민 분자의 몰비가 1:1, 1:2, 1:3 또는 1:4임을 의미하는 것으로 이해해야 한다. 상기, 올리고뉴클레오티드 컨쥬게이트는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 분자 및 표적화 기로서 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토사민 분자를 포함하는 접합 기로 형성된다. 일부 구현예에서, 약학적으로 허용되는 표적화 기는 N-아세틸갈락토사민이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중 가닥 올리고뉴클레오티드가 N-아세틸갈락토사민을 포함하는 접합 기에 접합되는 경우, N-아세틸갈락토사민 분자는 3가 또는 4가이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중 가닥 올리고뉴클레오티드가 N-아세틸갈락토사민을 포함하는 접합 기에 접합되는 경우, N-아세틸갈락토사민 분자는 3가이다.
표적화 기는 적절한 링커를 통해 siRNA 분자에 연결될 수 있고, 적절한 링커는 표적화 기의 특정 유형에 따라 당업자가 선택할 수 있다. 이들 링커 및 표적화 기의 유형 및 siRNA와의 연결 모드는 WO2015006740A2 (그 전체를 참고로 본원에서 인용함)의 개시에서 찾을 수 있다.
일부 구현예에서, 표적화 기가 N-아세틸갈락토사민인 경우, 적절한 링커는 화학식 (301)로 나타낸 바와 같은 다음의 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00017
상기,
k는 1 내지 3의 정수이며;
LA는 화학식 (302)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 쇄 부분을 포함하는 아미드 결합이며, 각 LA는 그의 2개의 말단에서 에테르 결합을 통해 표적화 기 및 LC 부분에 각각 연결된다:
Figure pct00018
LB는 화학식 (303)으로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 N-아실피롤리딘을 포함하는 쇄 부분이고, 이 쇄 부분은 하나의 말단에 카보닐기를 가지며, 아미드 결합을 통해 LC 부분에 연결되고, 다른 말단에는 옥시기를 가지며, 포스포에스테르 결합을 통해 siRNA에 연결되고:
Figure pct00019
LC는 하이드록시메틸 아미노메탄, 디하이드록시메틸 아미노메탄 또는 트리하이드록시메틸 아미노메탄에 기반한 2가 내지 4가 연결기이며, LC는 산소원자를 통한 에테르 결합을 통해 각각의 LA 부분에 연결되고, 질소 원자를 통한 아미드 결합을 통해 LB 부분에 연결된다.
일부 구현예에서, n=3이고 LC가 트리하이드록시메틸 아미노메탄에 기반한 4가 연결 기인 경우, 링커로서-(LA)3-트리하이드록시메틸 아미노메탄-LB-를 통해 N-아세틸갈락토사민 분자를 siRNA 분자와 연결함으로써 형성되는 제 1 siRNA 컨쥬게이트는 화학식 (304)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00020
상기 이중 나선 구조는 siRNA를 나타낸다.
마찬가지로, siRNA와 접합 기 사이의 접합 부위는 siRNA의 센스 가닥의 3'-말단 또는 5'-말단, 또는 안티센스 가닥의 5'-말단, 또는 siRNA의 내부 서열에 있을 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 siRNA의 센스 가닥의 3'-말단은 링커-(LA)3-트리하이드록시메틸 아미노메탄-LB-를 통해 3개의 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc) 분자에 공유적으로 접합되어 siRNA 분자 대 GaINAc 분자의 몰비가 1:3 (이하, (GaINAc)3-siRNA로 지칭함)인 제 1 siRNA 컨쥬게이트를 얻고, 이 컨쥬게이트는 화학식 (305)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00021
상기, 이중 나선 구조는 siRNA를 나타내고; 링커는 siRNA의 센스 가닥의 3'-말단에 연결된다.
일부 구현예에서, 표적화 기가 N-아세틸갈락토사민인 경우, 적절한 링커는 화학식 (306)으로 나타낸 바와 같은 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00022
상기,
l은 0 내지 3의 정수이며;
*는 링커 상에서 에테르 결합을 통해 표적화 기에 연결된 부위를 나타내고;
#은 링커 상에서 포스포에스테르 결합을 통해 siRNA에 연결된 부위를 나타낸다.
일부 특정 구현예에서, l=2인 경우, siRNA 컨쥬게이트는 화학식 (307)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00023
상기, 이중 나선 구조는 siRNA를 나타내고; 링커는 siRNA의 센스 가닥의 3'-말단에 연결된다.
상기 컨쥬게이트는 종래 기술에 상세히 기재된 방법에 따라 합성할 수 있다. 예를 들어, WO2015006740 A2에는 다양한 컨쥬게이트의 제조에 대해 상세하게 기재되어 있다. 본 발명의 제 1 siRNA 컨쥬게이트는 당업자에게 주지된 방법에 의해 얻을 수 있다. 다른 예로서, WO2014025805A1에는 화학식 (305)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 컨쥬게이트의 제조 방법이 기재되어 있다. 추가의 예로서, Rajeev등의 ChemBioChem 2015, 16, 903-908에는 화학식 (307)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 컨쥬게이트의 제조 방법이 기재되어 있다.
제 2 siRNA 컨쥬게이트
일부 구현예에서, 본원은 화학식 (1)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 제 2 siRNA 컨쥬게이트를 제공한다:
Figure pct00024
상기, n1은 1 내지 3의 정수이고, n3은 0 내지 4의 정수이며;
각각의 m1, m2 및 m3은 독립적으로 2 내지 10의 정수이고;
각각의 R10, R11, R12, R13, R14 및 R15는 독립적으로 H이거나, C1-C10 알킬, C1-C10 할로알킬 및 C1-C10 알콕시로 이루어진 군에서 선택되고;
R3은 화학식 (A59)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 기이다:
Figure pct00025
상기, E1은 OH, SH 또는 BH2이고;
Nu는 siRNA이며;
Nu로 나타낸 siRNA의 각 뉴클레오티드는 독립적으로 변형 또는 비변형의 뉴클레오티드이다. Nu로 나타낸 siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 상기 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 1을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 2를 포함하며; 뉴클레오티드 서열 1 및 뉴클레오티드 서열 2는 이중 가닥 영역을 형성하기 위해 적어도 부분적으로 상보적이며; 뉴클레오티드 서열 1은 서열 번호 155에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 동일한 길이 및 3개 이하의 상이한 뉴클레오티드를 가지며; 뉴클레오티드 서열 2는 서열 번호 156에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 동일한 길이 및 3개 이하의 상이한 뉴클레오티드를 갖는다:
5'-CCUUGAGGCAUACUUCAAZ -3' (서열 번호: 155);
5'-Z'UUGAAGUAUGCCUCAAGG -3' (서열 번호: 156);
상기,
Z는 A이고; Z'는 U이며;
뉴클레오티드 서열 1은 Z에 상응하는 부위에 뉴클레오티드 ZA를 포함하고;
뉴클레오티드 서열 2는 Z'에 상응하는 부위에 뉴클레오티드 Z'B를 포함하고; 뉴클레오티드 Z'B는 안티센스 가닥의 5' 말단에서부터 제 1 뉴클레오티드이며;
R2는 1 내지 20개의 탄소원자 길이를 갖는 선형 알킬렌이고, 상기 하나 이상의 탄소원자는 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 알케닐렌, C2-C10 알키닐렌, C6-C10 아릴렌, C3-C18 헤테로사이클릴렌, 및 C5-C10 헤테로아릴렌으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 임의로 치환되고, 상기 R2는 C1-C10 알킬, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C1-C10 할로알킬, -OC1-C10 알킬, -OC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-OH, -OC1-C10 할로알킬, -SC1-C10 알킬, -SC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-SH, -SC1-C10 할로알킬, 할로, -OH, -SH, NH2, -C1-C10 알킬-NH2, -N(C1-C10 알킬) (C1-C10 알킬), -NH(C1-C10 알킬), 시아노, 니트로, -CO2H, -C(O)OC1-C10 알킬, -CON(C1-C10 알킬) (C1-C10 알킬), -CONH(C1-C10 알킬), -CONH2, -NHC(O)(C1-C10 알킬), -NHC(O)(페닐), -N(C1-C10 알킬)C(O)(C1-C10 알킬), -N(C1-C10 알킬)C(O)(페닐), -C(O)C1-C10 알킬, -C(O)C1-C10 알킬페닐, -C(O)C1-C10 할로알킬, -OC(O)C1-C10 알킬, -SO2(C1-C10 알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1-C10 할로알킬), -SO2NH2, -SO2NH(C1-C10 알킬), -SO2NH (페닐), -NHSO2 (C1-C10 알킬), -NHSO2 (페닐) 및 -NHSO2(C1-C10 할로알킬)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 치환기를 가지며;
각 L1은 독립적으로 1 내지 70개의 탄소원자 길이를 갖는 선형 알킬렌이고, 하나 이상의 탄소원자는 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 알케닐렌, C2-C10 알키닐렌, C6-C10 아릴렌, C3-C18 헤테로사이클릴렌 및 C5-C10 헤테로아릴렌으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 기로 임의로 치환되고, 상기 L1은 C1-C10 알킬, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C1-C10 할로알킬, -OC1-C10 알킬, -OC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-OH, -OC1-C10 할로알킬, -SC1-C10 알킬, -SC1-C10 알킬페닐 -C1-C10 알킬-SH, -SC1-C10 할로알킬, 할로, -OH, -SH, -NH2, -C1-C10 알킬-NH2, -N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -NH(C1-C10 알킬), 시아노, 니트로, -CO2H, -C(O)OC1-C10 알킬, -CON(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -CONH(C1-C10 알킬), -CONH2, -NHC(O)(C1-C10 알킬), -NHC(O)(페닐), -N(C1-C10 알킬)C(O)(C1-C10 알킬), -N(C1-C10 알킬)C(O)(페닐), -C(O)C1-C10 알킬, -C(O)C1-C10 알킬페닐, -C(O)C1-C10 할로알킬, -OC(O)C1-C10 알킬, -SO2 (C1-C10 알킬), -SO2 (페닐), -SO2 (C1-C10 할로알킬), -SO2NH2, SO2NH(C1-C10 알킬), -SO2NH (페닐), -NHSO2 (C1-C10 알킬), -NHSO2 (페닐), 및 -NHSO2(C1-C10 할로알킬) 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 치환기를 가지며;
일부 구현예에서, L1은 A1 내지 A26의 기 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 A1 내지 A26의 구조 및 정의는 다음과 같다:
Figure pct00026
Figure pct00027
상기, 각 j1은 독립적으로 1 내지 20의 정수이고;
각 j2는 독립적으로 1 내지 20의 정수이며;
R'는 C1-C10 알킬이고;
Ra는 A27 내지 A45 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택되며:
Figure pct00028
Figure pct00029
Rb는 C1-C10 알킬이고;
물결선(
Figure pct00030
)은 나머지 분자에 대한 작용기의 연결 부위를 나타낸다.
당업자는 비록 L1이 편의상 선형 알킬로 정의되지만, 선형 기가 아니거나 상기 대체 및/또는 치환에 의해 생성된 아민 또는 알케닐과 같이 다르게 명명될 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명의 목적을 위해, L1의 길이는 2개의 부착점을 연결하는 쇄의 원자 수이다. 이를 위해, 헤테로사이클릴렌 또는 헤테로아릴렌 같은 선형 알킬렌의 탄소원자를 치환하여 얻은 고리는 하나의 원자로 계수된다.
M1은 표적화 기를 나타내며 정의 및 선택은 전술한 바와 동일하다. 일부 구현예에서, 각 M1은 독립적으로 포유동물 간세포 표면 상의 아시알로당단백질 수용체에 친화성을 갖는 리간드 중 하나에서 선택된다.
M1이 포유동물 간세포 표면 상의 아시알로당단백질 수용체 (ASGP-R)에 친화성을 갖는 리간드인 경우, 일부 구현예에서, n1은 1 내지 3의 정수일 수 있고, 컨쥬게이트에서 M1 리간드의 수가 2 이상일 수 있게 보장하도록 n3은 0 내지 4의 정수일 수 있다. 일부 구현예에서, n1+n3≥2이므로, 컨쥬게이트에서 M1 리간드의 수가 3 이상이 될 수 있고, 따라서 M1 리간드가 간세포 표면 상의 아시알로당단백질 보다 수용체에 편리하게 결합하며, 이는 세포 내로의 컨쥬게이트의 세포내 도입을 용이하게 할 수 있다. 실험은 M1 리간드의 수가 3보다 큰 경우, 간세포 표면 상의 아시알로당단백질 수용체에 대한 M1 리간드의 결합 용이성은 유의하게 증가되지 않는 것을 보였다. 따라서, 합성 편의성, 구조/프로세스 비용 및 전달 효율 같은 다양한 측면을 고려하여, 일부 구현예에서, n1은 1 내지 2의 정수이고, n3은 0 내지 1의 정수이며, n1+n3=2~3이다.
일부 구현예에서, m1, m2 및 m3이 서로 독립적으로 2 내지 10의 정수에서 선택되는 경우, 많은 M1 리간드들의 공간적 상호 위치는 M1 리간드를 간세포 표면의 아시알로당단백질 수용체에 결합시키기에 적합할 수 있다. 본 발명의 컨쥬게이트가보다 간단한 구조, 보다 용이한 합성 및/또는 비용을 갖도록 하기 위해, 일부 구현예에서, m1, m2 및 m3은 서로 독립적으로 2 내지 5의 정수이고, 일부 구현예에서, m1=m2=m3이다.
당업자는 R10, R11, R12, R13, R14 및 R15가 서로 독립적으로 H, C1-C10 알킬, C1-C10 할로알킬 및 C1-C10 알콕시 중 하나인 경우, 본 발명의 컨쥬게이트의 특성을 변화시키지 않으며, 본 발명의 목적을 모두 달성할 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, R10, R11, R12, R13, R14 및 R15는 서로 독립적으로 H, 메틸 및 에틸에서 선택된다. 일부 구현예에서, R10, R11, R12, R13, R14 및 R15는 H이다.
R3은 화학식 A59로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 기이며, 상기 E1은 OH, SH 또는 BH2이고, 출발 물질의 이용 가능성을 고려하여, 일부 구현예에서, E1은 OH 또는 SH이다.
일부 구현예에서, R2는 화학식 (A59)로 나타낸 바와 같은 기와 질소계 골격 상의 N 원자 사이의 연결을 달성하도록 선택된다. 본 발명의 맥락에서, "질소계 골격"은 R10, R11, R12, R13, R14 및 R15에 부착된 탄소원자 및 N 원자가 서로 연결된 쇄 구조를 지칭한다. 일부 구현예에서, R2는 화학식 A59로 나타낸 바와 같은 기를 적절한 수단에 의해 질소계 골격 상의 N 원자에 부착시킬 수 있는 임의의 연결 기일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 siRNA 컨쥬게이트가 고상 합성 공정에 의해 제조되는 경우, R2 기는 질소계 골격 상의 N 원자에 연결된 부위 및 R3에서 P 원자에 연결된 부위 모두를 가질 필요가 있다. 일부 구현예에 있어서, R2에서 질소계 골격 상의 N 원자에 연결된 부위는 N 원자와 아미드 결합을 형성하고, R3에서 P 원자에 연결된 부위는 P 원자와 포스포에스테르 결합을 형성한다. 일부 구현예에서, R2는 B5, B6, B5' 또는 B6'이다:
Figure pct00031
상기, 물결선(
Figure pct00032
)은 작용기가 공유 결합된 부위를 나타내고;
q2는 1 내지 10의 정수이며; 일부 구현예에서, q2는 1 내지 5의 정수다.
L1은 M1 리간드를 질소계 골격 상의 N 원자에 연결함으로써, 본 발명의 제 2 siRNA 컨쥬게이트에 대한 간 표적화 기능을 제공하는데 사용된다. 일부 구현예에서, L1은 화학식 A1 내지 A26 중 하나 이상의 연결 조합에서 선택된다. 일부 구현예에서, L1은 화학식 A1, A4, A5, A6, A8, A10, A11 및 A13 중 하나 이상의 연결 조합에서 선택된다. 일부 구현예에서, L1은 화학식 A1, A4, A8, A10 및 A11 중 2개 이상의 연결 조합에서 선택된다. 일부 구현예에서, L1은 화학식 A1, A8 및 A10 중 2개 이상의 연결 조합에서 선택된다.
일부 구현예에서, L1의 길이는 3 내지 25개, 3 내지 20개, 4 내지 15개 또는 5 내지 12개의 원자일 수 있다. 일부 구현예에서, L1은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60개의 원자 길이이다.
일부 구현예에서, j1은 2 내지 10의 정수이고, 일부 구현예에서, 3 내지 5의 정수이다. j2는 2 내지 10의 정수이고, 일부 구현예에서, 3 내지 5의 정수이다. R'는 C1-C4 알킬이고, 일부 구현예에서, 메틸, 에틸 및 이소프로필 중 하나이다. Ra는 A27, A28, A29, A30 및 A31 중 하나이고, 일부 구현예에서, A27 또는 A28이다. Rb는 C1-C5 알킬이고, 일부 구현예에서, 메틸, 에틸, 이소프로필 및 부틸 중 하나이다. 일부 구현예에서, 화학식 A1 내지 A26의 j1, j2, R', Ra 및 Rb는 각각 질소계 골격 상의 M1 리간드와 N 원자 사이의 연결을 달성하고, M1 리간드를 간세포 표면의 아시알로당단백질 수용체에 결합시키기에 보다 적절한 M1 리간드들 사이에 공간적 상호 위치를 만들기 위해 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 제 2 siRNA 컨쥬게이트는 화학식 (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (12), (13), (14), (15), (16), (17), (18), (19), (20), (21) 또는 (22) 으로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
일부 구현예에 있어서, 화학식 A59에서 P 원자는 siRNA (상기 화학식에서 Nu로 나타냄) 서열에서 임의의 가능한 위치에 연결될 수 있고, 예를 들어 화학식 A59에서 P 원자는 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥에서 임의의 뉴클레오티드에 연결될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 화학식 A59에서 P 원자는 siRNA의 센스 가닥에서 임의의 뉴클레오티드에 연결된다. 일부 구현예에 있어서, 화학식 A59에서 P 원자는 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥의 말단에 연결될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 화학식 A59에서 P 원자는 siRNA의 센스 가닥의 말단에 연결된다. 상기 말단은 센스 또는 안티센스 가닥의 한쪽 말단부터 계수한 처음 4개의 뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 구현예에 있어서, 화학식 A59에서 P 원자는 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥의 어느 한쪽 말단에 연결된다. 일부 구현예에 있어서, 화학식 A59에서 P 원자는 siRNA의 센스 가닥의 3' 말단에 연결된다. 화학식 A59에서 P 원자는 siRNA의 센스 가닥내 상기 위치에 연결되는 경우, 세포로 진입한 후, 본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트는 풀리는 동안 siRNA의 별도의 안티센스 가닥을 방출함으로써, HBV mRNA의 단백질로의 번역을 차단하고 B형 간염 바이러스 (HBV) 유전자의 발현을 억제할 수 있다.
화학식 A59에서 P 원자는 Nu로 나타낸 siRNA에서 뉴클레오티드의 임의의 가능한 위치, 예를 들어 위치 5', 2' 또는 3'에, 또는 뉴클레오티드의 염기에 연결될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 화학식 A59에서 P 원자는 포스포디에스테르 결합을 형성함으로써 siRNA에서 뉴클레오티드의 위치 2', 3' 또는 5'에 연결될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 화학식 A59에서 P 원자는 siRNA에서 센스 가닥의 3' 말단에서 뉴클레오티드의 3'-하이드록시의 탈양자화에 의해 형성된 산소원자에 연결되거나, 화학식 A59에서 P 원자는 siRNA에서 센스 가닥의 뉴클레오티드의 2'-하이드록시내 수소원자를 치환함으로써 뉴클레오티드에 연결되거나, 화학식 A59에서 P 원자는 siRNA에서 센스 가닥의 5' 말단에서 뉴클레오티드의 5'-하이드록시내 수소원자를 치환함으로써 뉴클레오티드에 연결된다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 1은 서열 번호 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 상이한 1개 이하의 뉴클레오티드를 갖고; 및/또는 뉴클레오티드 서열 2는 서열 번호 2에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 상이한 1개 이하의 뉴클레오티드를 갖는다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 2와 서열 번호 2에 나타낸 뉴클레오티드 서열 사이의 뉴클레오티드 차이는 뉴클레오티드 Z'B의 부위에서의 차이를 포함하고, Z'B는 A, C 또는 G에서 선택되고; 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 차이는 뉴클레오티드 Z'B의 부위에서의 차이이고, Z'B는 A, C 또는 G에서 선택되고; 일부 구현예에서, ZA는 Z'B와 상보적인 뉴클레오티드이다. 이러한 특별한 뉴클레오티드 차이는 표적 유전자를 억제하는 제 2 siRNA 컨쥬게이트의 능력을 현저하게 감소시키지 않으며, 따라서 특정 뉴클레오티드 차이를 포함하는 제 2 siRNA 컨쥬게이트도 본 발명의 범위 내에 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 1은 뉴클레오티드 서열 2와 기본적으로 역 상보적, 실질적으로 역 상보적, 또는 완전히 역 상보적이다. "기본적으로 역 상보적"이란 2개의 뉴클레오티드 서열에서 3개 이하의 염기쌍오류을 의미한다. "실질적으로 역 상보적"이란 2개의 뉴클레오티드 서열에서 1개 이하의 염기쌍오류을 지칭한다. "완전히 역 상보적"이란 2개의 뉴클레오티드 서열에서 염기쌍오류이 없는 것을 의미한다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 또한 뉴클레오티드 서열 3도 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 4를 더 포함한다. 뉴클레오티드 서열 3 및 4는 각각 독립적으로 1 내지 4개의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 뉴클레오티드 서열 3의 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열 4의 상응하는 부위의 뉴클레오티드에 상응한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 4는 표적 mRNA의 상응하는 부위의 뉴클레오티드에 적어도 부분적으로 상보적이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 4는 표적 mRNA의 상응하는 부위에서 뉴클레오티드와 완전히 상보적이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 3은 뉴클레오티드 서열 1의 5' 말단에 연결되고, 뉴클레오티드 서열 4는 뉴클레오티드 서열 2의 3' 말단에 연결된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 3은 동일한 길이를 갖고 뉴클레오티드 서열 4와 역 상보적이다. 따라서, 일부 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 19 내지 23개의 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 3 및 뉴클레오티드 서열 4는 모두 1개의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 뉴클레오티드 서열 3의 염기는 A이며; 이 경우에, 이중 가닥 영역은 20개의 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있는데, 다시 말해 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비율은 20/20이며; 대안적으로
뉴클레오티드 서열 3 및 뉴클레오티드 서열 4는 모두 2개의 뉴클레오티드 길이를 갖고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오티드 서열 3의 염기는 연속해서 G 및 A이며; 이 경우에, 이중 가닥 영역은 21개의 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있는데, 다시 말해 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비율은 21/21이고; 대안적으로
뉴클레오티드 서열 3 및 뉴클레오티드 서열 4는 모두 3개의 뉴클레오티드 길이를 갖고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오티드 서열 3의 염기는 연속해서 C, G 및 A이며; 이 경우, 이중 가닥 영역은 22개의 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있는데, 다시 말해 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비율은 22/22이고; 대안적으로
뉴클레오티드 서열 3 및 뉴클레오티드 서열 4는 모두 4개의 뉴클레오티드 길이를 갖고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오티드 서열 3의 염기는 연속해서 C, C, G 및 A이며; 이 경우, 이중 가닥 영역은 23개의 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있는데, 다시 말해 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비율은 23/23이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 3은 2개의 뉴클레오티드 길이를 갖고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오티드 서열 3의 염기는 연속해서 G 및 G이다.
뉴클레오티드 서열 3 및 뉴클레오티드 서열 4는 동일한 길이를 가지며 서로 상보적임을 이해해야 한다. 따라서, 뉴클레오티드 서열 3의 염기가 제공되면, 뉴클레오티드 서열 4의 염기도 결정된다.
일부 구현예에서, 화학식 (1)에서 Nu로 나타낸 siRNA는 1 내지 3개의 뉴클레오티드 길이를 갖고 안티센스 가닥의 3' 말단에 연결된 뉴클레오티드 서열 5를 더 포함함으로써, 안티센스 가닥의 3'돌출부를 구성한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 5는 1 또는 2개의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 따라서, Nu로 나타낸 siRNA에서 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 19/20, 19/21, 20/21, 20/22, 21/22, 21/23, 22/23, 22/24, 23/24 또는 23/25일 수 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 5는 2개의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 또한, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오티드 서열 5는 2개의 연속 티미딘 디옥시리보뉴클레오티드, 2개의 연속 우리딘 리보뉴클레오티드 또는 표적 mRNA와 상보적인 2개의 뉴클레오티드이다. 따라서, 일부 구현예에서, Nu로 나타낸 siRNA에서 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 19/21 또는 21/23이다. 상기, siRNA를 포함하는 컨쥬게이트는 APOC3 mRNA에 대해 더 우수한 침묵화 활성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 서열 번호 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 안티센스 가닥은 서열 번호 3 또는 서열 번호4에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
5'-CCUUGAGGCAUACUUCAAZA-3' (서열 번호: 1),
5'-Z'BUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU-3' (서열 번호: 3),
5'-Z'BUUGAAGUAUGCCUCAAGGUC-3' (서열 번호: 4),
상기, 뉴클레오티드 Z'B는 안티센스 가닥의 5' 말단에서부터 제 1 뉴클레오티드이며; ZA는 A, U, G 또는 C에서 선택되고; Z'B는 ZA와 상보적인 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, Nu로 나타낸 siRNA는 siHBa1 또는 siHBa2이다:
siHBa1
센스 가닥: 5'-CCUUGAGGCAUACUUCAAA -3' (서열 번호: 5),
안티센스 가닥: 5'-UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU -3' (서열 번호: 6),
siHBa2
센스 가닥: 5'-GACCUUGAGGCAUACUUCAAA -3' (서열 번호: 7),
안티센스 가닥: 5'-UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUCGG -3' (서열 번호: 8).
전술한 바와 같이, 화학식 (1)에서 Nu로 나타낸 siRNA내 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 변형 또는 비변형의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, Nu로 나타낸 siRNA내 뉴클레오티드는 비변형의 뉴클레오티드이고; 일부 구현예에서, Nu로 나타낸 siRNA내 일부 또는 모든 뉴클레오티드는 변성 뉴클레오티드이다. 뉴클레오티드 상의 이러한 변형은 HBV 유전자의 발현을 억제하기 위해 본 발명의 제 2 siRNA 컨쥬게이트 기능의 현저한 감소 또는 손실을 유발하지 않게 된다.
일부 구현예에서, 컨쥬게이트의 siRNA는 하나 이상의 변성 뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 본원에서 사용한 바와 같이, 용어 "변성 뉴클레오티드"는 리보오스 기의 2'-하이드록시를 다른 기로 치환함으로써 형성된 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 또는 변형된 염기를 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다. 이러한 변성 뉴클레오티드는 siRNA 컨쥬게이트의 기능의 현저한 감소 또는 손실을 유발하여 유전자의 발현을 억제하지 않게 된다. 예를 들어, 변성 뉴클레오티드는 J.K. Watts, G. F. Deleavey 및 M. J.Damha, 화학적으로 변성 siRNA: 도구 및 어플리케이션에 개시되어 있다. Drug Discov Today, 2008.13 (19-20): p.842-55를 선택할 수 있다.
일부 구현예에서, 센스 또는 안티센스 가닥에서 하나 이상의 뉴클레오티드는 변성 뉴클레오티드이고, 및/또는 하나 이상의 포스페이트는 변형된 기를 갖는 포스페이트 기이다. 다시 말해서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥에서 하나 이상의 단일 가닥의 포스페이트-리보오스 골격내 포스페이트 및/또는 리보오스 기의 적어도 일부는 변형된 기를 갖는 포스페이트 및/또는 리보오스 기이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오티드는 변성 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각 뉴클레오티드는 독립적으로 플루오로 변성 뉴클레오티드 또는 비-플루오로 변성 뉴클레오티드이다.
본 발명의 발명자들은 놀랍게도 본원에 개시된 제 2 siRNA 컨쥬게이트가 동물 실험에서 혈청에서의 안정성과 유전자 침묵 효율 사이에서 높은 수준의 균형을 달성하는 것을 발견하였다.
일부 구현예에서, 플루오로 변성 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열 1 및 2에 위치되고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오티드 서열 1의 위치 7, 8 및 9에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오티드 서열 2의 위치 2, 6, 14 및 16에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 5개 이하의 플루오로 변성 뉴클레오티드가 뉴클레오티드 서열 1에 존재하고; 일부 구현예에서, 7개 이하의 플루오로 변성 뉴클레오티드가 뉴클레오티드 서열 2에 존재한다.
일부 구현예에서, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 센스 가닥내 뉴클레오티드 서열 1의 위치 7, 8 및 9 또는 5, 7, 8 및 9의 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고, 센스 가닥의 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 비-플루오로 변성 뉴클레오티드이며; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 안티센스 가닥내 뉴클레오티드 서열 2의 위치 2, 6, 14 및 16 또는 2, 6, 8, 9, 14 및 16에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고, 안티센스 가닥의 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 비-플루오로 변성 뉴클레오티드이다.
플루오로 변성 뉴클레오티드 및 비-플루오로 변성 뉴클레오티드의 정의 및 선택은 각각 전술한 바와 같다.
일부 구현예에서, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, Nu로 나타낸 siRNA의 센스 가닥내 뉴클레오티드 서열 1의 위치 5, 7, 8 및 9에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고, siRNA의 센스 가닥내 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 메톡시 변성 뉴클레오티드이고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, Nu로 나타낸 siRNA의 안티센스 가닥내 뉴클레오티드 서열 2의 위치 2, 6, 8, 9, 14 및 16에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고; siRNA의 안티센스 가닥내 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 메톡시 변성 뉴클레오티드이며;
대안적으로, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, Nu로 나타낸 siRNA의 센스 가닥내 뉴클레오티드 서열 1의 위치 7, 8 및 9에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고, siRNA의 센스 가닥내 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 메톡시 변성 뉴클레오티드이고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, Nu로 나타낸 siRNA의 안티센스 가닥내 뉴클레오티드 서열 2의 위치 2, 6, 14 및 16에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고, siRNA의 안티센스 가닥내 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 메톡시 변성 뉴클레오티드이며;
대안적으로, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, Nu로 나타낸 siRNA의 센스 가닥내 뉴클레오티드 서열 1의 위치 5, 7, 8 및 9에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고, siRNA의 센스 가닥내 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 메톡시 변성 뉴클레오티드이고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, Nu로 나타낸 siRNA의 안티센스 가닥내 뉴클레오티드 서열 2의 위치 2, 6, 14 및 16에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고, siRNA의 안티센스 가닥내 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 메톡시 변성 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드는 포스페이트기 상에 변형을 갖는다. 일부 구현예에서, 포스페이트기 상의 변형은 하기 화학식 (101)로 나타낸 바와 같은 포스포로티오에이트 변형이며, 다시 말해 포스포디에스테르 결합에서 비-가교 산소원자를 황원자로 치환하여 포스포디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 디에스테르 결합으로 변화되도록 한다. 이 변형은 염기쌍에 대한 높은 특이성 및 높은 친화력을 유지하면서, siRNA의 구조를 안정화시킨다.
Figure pct00036
일부 구현예에서, Nu로 나타낸 siRNA에서, 포스포로티오에이트 연결은 다음의 위치 중 적어도 하나, 즉: 센스 또는 안티센스 가닥의 한쪽 말단부터 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 사이, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 한쪽 말단부터 제 2 및 제 3 뉴클레오티드 사이, 또는 이들의 임의의 조합에 존재한다. 일부 구현예에서, 포스포로티오에이트 연결은 센스 가닥의 5' 말단을 제외한 상기 모든 위치에 존재한다. 일부 구현예에서, 포스포로티오에이트 연결은 센스 가닥의 3' 말단을 제외한 상기 모든 위치에 존재한다. 일부 구현예에서, 포스포로티오에이트 연결은 다음의 위치 중 적어도 하나에 존재한다:
센스 가닥의 5' 말단부터 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 사이;
센스 가닥의 5' 말단부터 제 2 및 제 3 뉴클레오티드 사이;
센스 가닥의 3' 말단부터 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 사이;
센스 가닥의 3' 말단부터 제 2 및 제 3 뉴클레오티드 사이;
안티센스 가닥의 5' 말단부터 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 사이;
안티센스 가닥의 5' 말단부터 제 2 및 제 3 뉴클레오티드 사이;
안티센스 가닥의 3' 말단부터 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 사이; 및
안티센스 가닥의 3' 말단부터 제 2 및 제 3 뉴클레오티드 사이.
일부 구현예에서, Nu로 나타낸 siRNA 분자의 안티센스 가닥 서열에서 5'-말단 뉴클레오티드는 5'-포스페이트 뉴클레오티드 또는 5'-포스페이트 유사체 변성 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 5'-포스페이트 뉴클레오티드 또는 5'-포스페이트 유사체 변성 뉴클레오티드는 화학식 (102)로 나타낸 바와 같은 5'-포스페이트 변성 뉴클레오티드, 화학식 (103) 나타낸 바와 같은 E-비닐포스포네이트 (E-vinylphosphonate, E-VP) 변형을 포함하는 뉴클레오티드, 또는 화학식 (105)로 나타낸 바와 같은 5'-포스포로티오에이트 변성 뉴클레오티드이다.
본 발명의 발명자들은 놀랍게도 본 발명의 제 2 siRNA 컨쥬게이트가 HBV mRNA에 대한 침묵화 활성을 크게 손상시키지 않으면서 혈청에서 현저하게 개선된 안정성 및 낮은 표적외 효과를 나타내고, 혈액 지질에 대한 높은 억제 효과를 추가로 보이는 것을 발견하였다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 제 2 siRNA 컨쥬게이트에서 Nu로 나타낸 siRNA는 표 1에 나타낸 siRNA일 수 있다.
본 발명의 컨쥬게이트에서의 siRNA 서열
siRNA 번호. 서열 번호: 서열 방향 5'-3'
siHBa1 5 CCUUGAGGCAUACUUCAAA
6 UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU
siHBa2 7 GACCUUGAGGCAUACUUCAAA
8 UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUCGG
siHBa1M1 9 CmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm
10 UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm
siHBa1M2 11 CmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm
12 UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm
siHBa2M1 13 GmAmCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm
14 UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm
siHBa2M2 15 GmAmCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm
16 UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm
siHBa1M1S 17 CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm
18 UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm
siHBa1M2S 19 CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm
20 UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm
siHBa2M1S 21 GmsAmsCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm
22 UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm
siHBa2M2S 23 GmsAmsCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm
24 UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm
siHBa1M1P1 25 CmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm
26 P1- UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm
siHBa1M2P1 27 CmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm
28 P1- UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm
siHBa2M1P1 29 GmAmCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm
30 P1-UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm
siHBa2M2P1 31 GmAmCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm
32 P1-UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm
siHBa1M1SP1 33 CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm
34 P1-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm
siHBa1M2SP1 35 CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm
36 P1-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm
siHBa2M1SP1 37 GmsAmsCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm
38 P1-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm
siHBa2M2SP1 39 GmsAmsCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm
40 P1-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm
본 발명의 siRNA 또는 siRNA 컨쥬게이트에서, 인접한 뉴클레오티드의 각 쌍은 포스포디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 디에스테르 결합을 통해 연결된다. 포스포디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 디에스테르 결합에서 비-가교 산소 또는 황원자는 음전하를 띠며, 하이드록시 또는 설프히드릴 형태로 존재할 수 있다. 또한, 하이드록시 또는 설프히드릴 중의 수소 이온은 양이온으로 부분적으로 또는 완전히 치환될 수 있다. 양이온은 금속 양이온, 암모늄 양이온 NH4+ 또는 유기 암모늄 양이온 같은 임의의 양이온일 수 있다. 용해도를 증가시키기 위해, 일부 구현예에서, 양이온은 알칼리 금속 양이온, 3차 아민에 의해 형성된 암모늄 양이온 및 4차 암모늄 양이온 중 하나 이상에서 선택된다. 알칼리 금속 이온은 K+ 및/또는 Na+일 수 있고, 3차 아민에 의해 형성된 양이온은 트리에틸아민에 의해 형성된 암모늄 양이온 및/또는 N,N-디이소프로필에틸아민에 의해 형성된 암모늄 양이온일 수 있다. 따라서, 본 발명의 siRNA 또는 siRNA 컨쥬게이트는 염의 형태로 적어도 부분적으로 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 포스포디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 디에스테르 결합에서 비-가교 산소원자 또는 황원자는 적어도 부분적으로 나트륨 이온에 결합하며, 따라서 본 발명의 siRNA 또는 siRNA 컨쥬게이트는 나트륨 염의 형태로 존재하거나 부분적으로 존재한다.
당업자는 변성 뉴클레오티드가 상응하는 변형을 갖는 뉴클레오시드 단량체에 의해 본 발명의 siRNA에 도입될 수 있음을 분명히 알고 있다. 상응하는 변형을 갖는 뉴클레오시드 단량체의 제조 방법 및 변성 뉴클레오티드를 siRNA에 도입하는 방법 역시 당업자에게 주지되어 있다. 모든 변형된 뉴클레오시드 단량체는 상업적으로 이용 가능하거나 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다.
제 2 siRNA 컨쥬게이트의 제조
전술한 바와 같은 제 2 siRNA 컨쥬게이트는 임의의 적절한 합성 경로에 의해 제조할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 제 2 siRNA 컨쥬게이트는 다음의 방법에 의해 제조할 수 있으며, 이 방법은: 포스포라미다이트 고상 합성 조건하에 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 유형 및 서열에 따라 3' 내지 5' 방향으로 뉴클레오시드 단량체를 연속해서 연결시키는 단계로, 각 뉴클레오시드 단량체를 연결하는 단계는 탈보호, 결합, 캡핑 및 산화 또는 황화의 4 단계 반응을 포함하는, 단계; siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 분리하는 단계; 및 어닐링하는 단계를 포함하고, 상기 siRNA내의 각 뉴클레오티드는 독립적으로 변형 또는 비변형의 뉴클레오티드이다. Nu로 나타낸 siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 상기 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 1을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 2를 포함하며; 뉴클레오티드 서열 1 및 뉴클레오티드 서열 2는 이중 가닥 영역을 형성하기 위해 적어도 부분적으로 상보적이며; 뉴클레오티드 서열 1은 서열 번호155에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 동일한 길이 및 3개 이하의 상이한 뉴클레오티드를 가지며; 뉴클레오티드 서열 2는 서열 번호156에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 동일한 길이 및 3개 이하의 상이한 뉴클레오티드를 갖는다:
5'-CCUUGAGGCAUACUUCAAZ-3' (서열 번호: 155);
5'-Z'UUGAAGUAUGCCUCAAGG-3' (서열 번호: 156);
상기, Z는 A이고; Z'는 U이며;
뉴클레오티드 서열 1은 Z에 상응하는 부위에 뉴클레오티드 ZA를 포함하고;
뉴클레오티드 서열 2는 Z'에 상응하는 부위에 뉴클레오티드 Z'B를 포함하고; 뉴클레오티드 Z'B는 안티센스 가닥의 5' 말단에서부터 제 1 뉴클레오티드이다.
또한, 상기 방법은 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 결합 반응 조건하 및 결합제의 존재하에 고상 지지체에 연결된 뉴클레오시드 단량체 또는 뉴클레오티드 서열과 접촉시켜, 결합 반응을 통해 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 뉴클레오티드 서열에 연결하는 단계를 더 포함한다. 이하, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 접합 분자라고도 부른다.
Figure pct00037
상기, R4는 Nu로 나타낸 siRNA에 결합할 수 있는 부분이다. 일부 구현예에서, R4는 공유 결합을 통해 Nu로 나타낸 siRNA에 결합할 수 있는 부분이고; 일부 구현예에서, R4는 반응에 의한 포스포디에스테르 결합을 통해 siRNA에 접합될 수 있는 임의의 작용기를 포함하는 부분이며;
각 S1은 독립적으로 M1이고, 이는 모든 활성 하이드록실을 YCOO-기로 치환함으로써 형성된 기이며, 상기 각 Y는 독립적으로 메틸, 트리플루오로메틸, 디플루오로메틸, 모노플루오로메틸, 트리클로로메틸, 디클로로메틸, 모노클로로메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 페닐, 할로페닐 및 알킬페닐로 이루어진 군에서 선택된다.
n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14, R15, L1, M1의 정의 및 선택은 각각 전술한 바와 같다.
R4는 질소계 골격 상에서 N 원자에 대한 연결을 달성하고 화학식 (1)로 나타낸 바와 같은 siRNA 컨쥬게이트를 합성하기에 적절한 반응 부위를 제공하도록 선택된다. 일부 구현예에서, R4는 R2 연결기 또는 보호된 R2 연결기를 포함하고, 반응을 통해 siRNA와 함께 화학식 (A59)로 나타낸 바와 같은 작용기를 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, R4는 siRNA 또는 뉴클레오시드 단량체 상의 기와 반응하여 포스파이트 에스테르를 형성할 수 있는 제 1 작용기, 및 하이드록시 기 또는 아미노 기와 공유 결합을 형성할 수 있는 제 2 작용기를 포함하거나, 공유 결합을 통해 연결된 고상 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 작용기는 포스포라미다이트, 하이드록시 또는 보호된 하이드록시이다. 일부 구현예에서, 제 2 작용기는 포스포라미다이트, 카복실 또는 카복실레이트 염이다. 일부 구현예에서, 제 2 작용기는 하이드록시 기 또는 아미노기에 의해 형성된 공유 결합을 통해 나머지 분자에 연결된 고상 지지체이다. 일부 구현예에서, 고상 지지체는 포스포에스테르 결합, 카복실 에스테르 결합 또는 아미드 결합을 통해 연결된다. 일부 구현예에서, 고상 지지체는 수지이다.
일부 구현예에서, 제 1 작용기는 하이드록시, -ORk 또는 화학식 (C3)으로 나타낸 바와 같은 기를 포함하고; 제 2 작용기는 화학식 (C1), (C2), (C3), (C1') 또는 (C3')으로 나타낸 바와 같은 기를 포함한다:
Figure pct00038
Figure pct00039
상기, q1은 1 내지 4의 정수이고, X는 O 또는 NH이고, M+는 양이온이고, Rk는 하이드록시 보호기이고, SPS는 고상 지지체를 나타내며, 물결선(
Figure pct00040
)은 작용기가 공유 결합된 부위를 나타낸다.
일부 구현예에서, 제 1 작용기는 포스포라미다이트 작용기, 예컨대 화학식 (C3)으로 나타낸 바와 같은 기를 포함한다. 포스포라미다이트 기는 결합 반응에 의해 뉴클레오티드 상의 임의의 위치 (가령 2'- 또는 3'-하이드록시)에 하이드록시를 갖는 포스파이트 에스테르를 형성할 수 있고, 포스파이트 에스테르는 산화 또는 황화를 통해 화학식 (A59)로 나타낸 바와 같은 포스포디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 에스테르 결합을 형성함으로써, 접합 분자를 siRNA에 접합시킬 수 있다. 상기, 제 2 작용기가 존재하지 않아도, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물은 화학식 (1)로 나타낸 바와 같은 siRNA 컨쥬게이트의 획득에 영향을 주지 않으면서 여전히 뉴클레오티드에 접합될 수 있다. 이러한 상황하에, 포스포라미다이트 고상 합성 같은 방법에 의해 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥을 얻은 후, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물은 뉴클레오티드 서열의 말단 뉴클레오티드 상의 하이드록시와 반응하고, 생성된 포스파이트 에스테르는 후속 산화 또는 황화에 의해 포스포디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 결합을 형성함으로써, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 siRNA에 접합시킨다.
일부 구현예에서, 제 1 작용기는 보호된 하이드록시 기를 포함한다. 일부 구현예에서, 제 2 작용기는 고상 지지체와 반응하여 고상 지지체를 포함하는 접합 분자를 제공할 수 있는 기를 포함한다. 일부 구현예에서, 화학식 (C1), (C2) 또는 (C3)으로 나타낸 바와 같은 작용기 같은 제 2 작용기는 카복실, 카복실레이트 또는 포스포라미다이트를 포함한다. 제 2 작용기가 카복실 또는 카복실레이트를 포함하는 경우, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물은 에스테르화 또는 아미드화 반응을 통해 수지 같은 고상 지지체 상의 하이드록시 또는 아미노기와 반응하여, 카복실레이트 에스테르 결합 또는 아미드 결합을 통해 연결된 고상 지지체를 포함하는 접합 분자를 형성한다. 제 2 작용기가 포스포라미다이트 작용기를 포함하는 경우, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물은 수지 같은 범용 고상 지지체 상의 하이드록시 기와 결합되어, 산화에 의해, 포스포디에스테르 결합을 통해 연결된 고상 지지체를 포함하는 접합 분자를 형성할 수 있다. 이어서, 고상 지지체에 연결된 상기 산물에서 출발하여, 뉴클레오시드 단량체는 포스포라미다이트 고상 합성방법에 의해 차례대로 연결됨으로써, 접합 기에 연결되는 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥을 얻는다. 고상 포스포라미다이트의 합성 동안, 제 1 작용기는 탈보호된 후 결합 반응 조건하에 뉴클레오시드 단량체 상의 포스포라미다이트기와 결합된다.
일부 구현예에서, 제 1 작용기는 하이드록시 또는 보호된 하이드록시 기를 포함하고, 제 2 작용기는 화학식 (C1') 또는 (C3')으로 나타낸 바와 같은 카복실레이트 에스테르 결합, 아미드 결합 또는 포스포에스테르 결합을 통해 연결된 고상 지지체를 포함한다. 이러한 상황하에, 고상 지지체 대신에 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물에서 출발하여, 뉴클레오시드 단량체는 포스포라미다이트 고상 합성방법에 의해 차례대로 연결됨으로써, 접합 기에 연결되는 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥이 얻어진다. 일부 구현예에서, 카복실레이트는 -COO-M+로 나타낼 수 있으며, 상기 M+는 금속 양이온, 암모늄 양이온 NH4 +및 유기 암모늄 양이온 중 하나와 같은 양이온이다. 일 구현예에서, 금속 양이온은 K+ 또는 Na+ 같은 알칼리 금속 양이온일 수 있다. 용해도를 증가시키고 반응을 촉진시키기 위해, 일부 구현예에서, 유기 암모늄 양이온은 3차 아민에 의해 형성된 암모늄 양이온, 또는 4차 암모늄 양이온, 예컨대 트리에틸아민 또는 N,N-디이소프로필에틸아민에 의해 형성된 암모늄 양이온이다. 일부 구현예에서, 카복실레이트는 트리에틸아민 카복실레이트 또는 N,N-디이소프로필에틸아민 카복실레이트이다.
일부 구현예에서, R4는 화학식 (B9), (B10), (B9'), (B10'), (B11), (B12), (B11') 또는 (B12')으로 나타낸 바와 같은 구조를 포함한다:
Figure pct00041
상기 q1은 1 내지 4의 정수이고, q2는 1 내지 10의 정수이고, X는 O 또는 NH이고, M+는 양이온이고, Rk는 하이드록시 보호기이고, SPS는 고상 지지체를 나타내며, 물결선(
Figure pct00042
)은 작용기가 공유 결합된 부위를 나타낸다. 일부 구현예에서, q1은 1 또는 2이다. 일부 구현예에서, q2는 1 내지 5의 정수이다. 일부 구현예에서, R4는 화학식 (B9) 또는 (B10)으로 나타낸 바와 같은 구조를 포함한다. 일부 구현예에서, R4는 화학식 (B11) 또는 (B12)로 나타낸 바와 같은 구조를 포함한다.
일부 구현예에서, Rk는 Tr (트리틸), MMTr (4-메톡시트리틸), DMTr (4,4'-디메톡시트리틸) 및 TMTr (4,4',4"-트리메톡시트리틸) 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, Rk는 DMTr, 즉 4,4'-디메톡시트리틸일 수 있다.
L1의 정의는 전술한 바와 같다.
일부 구현예에서, L1은 M1 리간드를 질소계 골격 상의 N 원자에 연결함으로써, 올리고뉴클레오티드 컨쥬게이트에 대한 간 표적화 기능을 제공하는데 사용된다. 일부 구현예에서, L1은 화학식 A1 내지 A26 중 임의의 하나 또는 이들의 조합을 포함한다.
전술한 구현예에 따르면, 당업자는 당해 분야에 공지된 포스포라미다이트 고상 합성방법과 비교하여, 접합 분자가 뉴클레오티드 서열의 임의의 가능한 위치에 연결되는 siRNA 컨쥬게이트를 상기 제 1 작용기 및 임의의 제 2 작용기를 통해 얻을 수 있는 것을 쉽게 이해할 것이다. 예를 들어, 접합 분자는 뉴클레오티드 서열의 말단 또는 뉴클레오티드 서열의 한쪽 말단에 연결된다. 대응적으로, 달리 명시하지 않는 한, 컨쥬게이트 제조에 관한 다음의 설명에서, "탈보호", "결합", "캡핑", "산화", "황화" 같은 반응을 언급할 때, 당업계에 주지된 포스포라미다이트 고상 합성방법에 관여하는 반응 조건 및 제제 역시도 이들 반응에 적용하게 된다. 예시적인 반응 조건 및 제제는 이하에서 상세하게 설명한다.
일부 구현예에서, 각 S1은 독립적으로 M1이다. 일부 구현예에서, 각 S1은 독립적으로 M1 중에서 하나 이상의 활성 하이드록실을 하이드록실 보호기로 보호함으로써 형성된 기이다. 일부 구현예에서, S1은 독립적으로 M1의 모든 활성 하이드록실을 하이드록실 보호기로 보호함으로써 형성된 기이다. 일부 구현예에서, 당업자에게 공지된 임의의 하이드록실 보호기를 사용하여 M1 상의 활성 하이드록실을 보호할 수 있다. 일부 구현예에서, 보호된 하이드록시는 화학식 YCOO-와 같이 표현되며, 상기 각 Y는 독립적으로 C1-C10 알킬 및 C6-C10 아릴로 이루어진 군에서 선택되며, 이는 할로 및 C1-C6 알킬로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된다. 일부 구현예에서, 각 Y는 독립적으로 메틸, 트리플루오로메틸, 디플루오로메틸, 모노플루오로메틸, 트리클로로메틸, 디클로로메틸, 모노클로로메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 페닐, 할로페닐 및 C1-C6 알킬페닐로 이루어진 군에서 선택된다.
일부 구현예에서, 각 S1은 독립적으로 화학식 A46 내지 A54로 이루어진 군에서 선택된다:
Figure pct00043
일부 구현예에서, S1은 화학식 A49 또는 A50이다.
일부 구현예에서, 각 Y는 독립적으로 메틸, 트리플루오로메틸, 디플루오로메틸, 모노플루오로메틸, 트리클로로메틸, 디클로로메틸, 모노클로로메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 페닐, 할로페닐 및 알킬페닐 중 하나에서 선택된다. 본 발명의 접합 분자를 단순화하기 위해, 일부 구현예에서, Y는 메틸이다.
전술한 바와 같이, 제 2 siRNA 컨쥬게이트를 제조하는 방법은 다음의 단계, 즉: siRNA의 다른 가닥을 합성하는 단계 (예를 들어, 접합 분자에 연결되는 siRNA의 센스 가닥이 상기 단계에서 합성되는 경우, 상기 방법은 고상 합성방법에 의해 siRNA의 안티센스 가닥을 합성하는 단계, 및 그 역의 단계를 더 포함한다); 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 분리하는 단계; 및 어닐링 단계를 더 포함한다. 특히, 분리 단계에서, 뉴클레오티드 서열 및/또는 접합 분자에 연결된 고상 지지체가 절단됨과 동시에, 필요한 보호기가 제거됨으로써 (이 경우, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물의 각 S1 기는 상응하는 M1 리간드로 전환된다), 접합 분자 및 상응하는 안티센스 가닥 (또는 센스 가닥)에 연결되는 siRNA의 센스 가닥 (또는 안티센스 가닥)을 제공한다. 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 어닐링되어 이중 가닥 RNA 구조를 형성함으로써, 화학식 (1)로 나타낸 바와 같은 siRNA 컨쥬게이트를 제공한다.
일부 구현예에서, 제 2 siRNA 컨쥬게이트를 제조하는 방법은 다음의 단계, 즉: 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 결합 반응 조건 하 및 결합제의 존재 하에 센스 또는 안티센스 가닥의 3' 말단에서 제 1 뉴클레오시드 단량체와 접촉시킴으로써, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 서열의 제 1 뉴클레오티드에 연결시키는 단계; 3' 내지 5' 방향으로 뉴클레오시드 단량체를 연속해서 연결하여 포스포라미다이트 고상 합성 조건하에, 원하는 뉴클레오티드 유형 및 센스 또는 안티센스 가닥의 서열에 따라 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥을 합성하는 단계로, 상기 화학식 (321)의 화합물은 R4가 보호된 하이드록시를 포함하는 제 1 작용기 및 화학식 (C1') 또는 (C3')으로 나타낸 바와 같은 기를 포함하는 제 2 작용기를 포함하는 화합물이고, 화학식 (321)의 화합물은 제 1 뉴클레오시드 단량체에 연결되기 전에 탈보호되고; 각 뉴클레오시드 단량체의 연결은 탈보호, 결합, 캡핑 및 산화 또는 황화의 4 단계 반응을 포함하고; 따라서 접합 분자에 연결된 핵산의 센스 또는 안티센스 가닥을 얻는 단계; 3' 내지 5' 방향으로 뉴클레오시드 단량체를 연속해서 연결하여 포스포라미다이트 고상 합성 조건하에 뉴클레오티드 유형 및 센스 또는 안티센스 가닥의 서열에 따라 핵산의 센스 또는 안티센스 가닥을 합성하는 단계로, 상기 각 뉴클레오시드 단량체의 연결은 탈보호, 결합, 캡핑 및 산화 또는 황화의 4 단계 반응을 포함하는 단계; 보호기를 제거하고 고상 지지체를 절단하는 단계; 핵산의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 분리 및 정제하는 단계; 및 어닐링 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, siRNA 컨쥬게이트를 제조하는 방법은 다음의 단계, 즉: 3' 내지 5' 방향으로 뉴클레오시드 단량체를 연속해서 연결하여 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드 유형 및 센스 또는 안티센스 가닥의 서열에 따라 센스 가닥 또는 안티센스 가닥을 합성하는 단계로, 상기 각 뉴클레오시드 단량체의 연결은 탈보호, 결합, 캡핑 및 산화 또는 황화의 4 단계 반응을 포함함으로써, 고상 지지체에 연결된 센스 가닥 및 고상 지지체에 연결된 안티센스 가닥을 얻는, 단계; 결합 반응 조건하 및 결합제의 존재하에 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 고상 지지체에 연결된 센스 가닥 또는 고상 지지체에 연결된 안티센스 가닥과 접촉시킴으로써, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 센스 가닥 또는 안티센스 가닥에 연결하는 단계로, 상기 화학식 (321)의 화합물은 R4가 제 1 작용기로서 포스포라미다이트기를 포함하는 화합물인, 단계; 보호기를 제거하고 고상 지지체를 절단하는 단계; siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥을 각각 분리 및 정제하는 단계; 및 어닐링 하는 단계를 포함하고, siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥은 접합 분자에 연결된다.
일부 구현예에 있어서, 화학식 A59에서 P 원자는 siRNA의 센스 가닥의 3' 말단에 연결되고, 본 발명의 siRNA 컨쥬게이트를 제조하는 방법은:
(1) 화학식 (321)의 화합물에서 하이드록실 보호기 Rk를 제거하는 단계 (상기, 화학식 (321)의 화합물은 R4가 제 1 작용기 및 제 2 작용기를 포함하는 화합물이고, 제 1 작용기는 보호된 하이드록시 ORk를 포함하고, 제 2 작용기는 화학식 (C1') 또는 (C3')으로 나타낸 바와 같은 구조를 가짐); 탈보호된 산물을 뉴클레오시드 단량체와 접촉시켜, 결합 반응 조건하 및 결합제의 존재하에 접합 분자를 통해 고상 지지체에 연결된 뉴클레오시드 단량체를 얻는 단계;
(2) 접합 분자를 통해 고상 지지체에 연결된 뉴클레오시드 단량체에서 출발하여, 포스포라미다이트 고상 합성방법에 의해 siRNA의 센스 가닥의 센스 가닥을 3' 내지 5' 방향으로 합성하는 단계;
(3) 포스포라미다이트 고상 합성방법에 의해 siRNA의 안티센스 가닥을 합성하는 단계; 및
(4) siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 분리하고 이를 어닐링하여 본 발명의 siRNA 컨쥬게이트를 얻는 단계를 포함하고,
상기 단계 (1)에서, 화학식 (321)의 화합물에서 보호기 Rk를 제거하는 방법은 탈보호 조건하에 화학식 (321)의 화합물을 탈보호제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 탈보호 조건은 0 내지 50℃, 일부 구현예에서 15 내지 35℃의 온도, 및 30 내지 300 초, 일부 구현예에서는 50 내지 150 초의 반응시간을 포함한다. 탈보호제는 트리플루오로 아세트산, 트리클로로 아세트산, 디클로로 아세트산 및 모노클로로 아세트산 중 하나 이상에서 선택될 수 있으며, 일부 구현예에서, 탈보호제는 디클로로 아세트산이다. 탈보호제 대 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰비는 10:1 내지 1000:1, 일부 구현예에서는 50:1 내지 500:1일 수 있다.
결합 반응 조건 및 결합제는 상기 결합 반응에 적절한 임의의 조건 및 작용제일 수 있다. 일부 구현예에서는, 고상 합성방법에서의 결합 반응의 조건과 동일한 조건 및 제제를 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 결합 반응 조건은 0 내지 50℃, 일부 구현예에서 15 내지 35℃의 반응온도를 포함한다. 뉴클레오시드 단량체에 대한 화학식 (321)의 화합물의 몰비는 1:1 내지 1:50, 일부 구현예에서는 1:2 내지 1:5일 수 있다. 화학식 (321)의 화합물 대 결합제의 몰비는 1:1 내지 1:50일 수 있고, 일부 구현예에서는 1:3 내지 1:10일 수 있다. 반응시간은 200 내지 3000 초, 일부 구현예에서, 500 내지 1500 초일 수 있다. 결합제는 1H-테트라졸, 5-에틸티오-1H-테트라졸 및 5-벤질티오-1H-테트라졸 중 하나 이상에서 선택될 수 있으며, 일부 구현예에서 5-에틸티오-1H-테트라졸이다. 결합 반응은 유기 용매에서 수행될 수 있다. 유기 용매는 무수 아세토니트릴, 무수 DMF 및 무수 디클로로메탄 중 하나 이상에서 선택될 수 있으며, 일부 구현예에서 무수 아세토니트릴이다. 유기 용매의 양은 3 내지 50 L/mol, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물에 관하여 일부 구현예에서는 5 내지 20 L/mol일 수 있다.
단계 (2)에서, siRNA 컨쥬게이트의 센스 가닥 S는 상기 단계에서 제조된 접합 분자를 통해 고상 지지체에 연결된 뉴클레오시드 단량체에서 출발하여, 포스포라미다이트 고상 합성방법에 의해 3' 내지 5' 방향으로 합성된다. 이 경우에, 접합 분자는 생성된 센스 가닥의 3' 말단에 연결된다.
뉴클레오시드 단량체에 대한 탈보호 조건, 탈보호제의 유형 및 양, 결합 반응 조건, 결합제의 유형 및 양, 캡핑 반응 조건, 캡핑제의 유형 및 양, 산화 반응 조건, 산화제의 유형 및 양, 황화 반응 조건, 및 황화제의 유형 및 양을 포함하여, 단계 (2) 및 (3)에서 고상 합성을 위한 다른 조건은 당업계의 다양한 통상적인 제제, 양 및 조건을 채용한다.
일부 구현예에서, 예를 들어 단계 (2) 및 (3)의 고상 합성은 다음의 조건을 이용할 수 있다:
뉴클레오시드 단량체에 대한 탈보호 조건은 0 내지 50℃, 일부 구현예에서는 15 내지 35℃의 반응온도, 및 30 내지 300 초, 일부 구현예에서는 50 내지 150 초의 반응시간을 포함한다. 탈보호제는 트리플루오로 아세트산, 트리클로로 아세트산, 디클로로 아세트산 및 모노클로로 아세트산 중 하나 이상에서 선택될 수 있으며, 일부 구현예에서, 디클로로 아세트산이다. 탈보호제 대 고상 지지체 상의 보호기 4,4'-디메톡시트리틸의 몰비는 2:1 내지 100:1이고, 일부 구현예에서, 3:1 내지 50:1이다.
결합 반응 조건은 0 내지 50℃, 일부 구현예에서는 15 내지 35℃의 반응온도를 포함한다. 고상 지지체에 연결된 핵산 서열 대 뉴클레오시드 단량체의 몰비는 1:1 내지 1:50이고, 일부 구현예에서는 1:5 내지 1:15이다. 고상 지지체에 연결된 핵산 서열 대 결합제의 몰비는 1:1 내지 1:100이고, 일부 구현예에서, 1:50 내지 1:80이다. 반응시간 및 결합제의 선택은 상기와 동일할 수 있다.
캡핑 반응 조건은 0 내지 50℃, 일부 구현예에서는 15 내지 35℃의 반응온도, 및 5 내지 500 초, 일부 구현예에서는 10 내지 100 초의 반응시간을 포함한다. 캡핑제의 선택은 상기와 동일할 수 있다. 캡핑제의 총량 대 고상 지지체에 연결된 핵산 서열의 몰비는 1:100 내지 100:1일 수 있고, 일부 구현예에서, 1:10 내지 10:1이다. 캡핑제가 등몰의 아세트산 무수물 및 N-메틸이미다졸을 사용하는 경우, 무수 아세트산 대 N-메틸이미다졸 대 고상 지지체에 연결된 핵산 서열의 몰비는 1:1:10 내지 10:10:1일 수 있고, 일부 구현예에서 1:1:2 내지 2:2:1이다.
산화 반응 조건은 0 내지 50℃, 일부 구현예에서는 15 내지 35℃의 반응온도, 및 1 내지 100 초, 일부 구현예에서는 5 내지 50 초의 반응시간을 포함한다. 일부 구현예에서, 산화제는 요오드 (일부 구현예에서 요오드 수로서 제공됨)이다. 결합 단계에서 산화제 대 고상 지지체에 연결된 핵산 서열의 몰비는 1:1 내지 100:1일 수 있고, 일부 구현예에서 5:1 내지 50:1이다. 일부 구현예에서, 산화 반응은 테트라하이드로푸란: 물: 피리딘의 비율이 3:1:1 내지 1:1:3인 혼합 용매에서 수행된다. 황화 반응 조건은 0 내지 50℃, 일부 구현예에서는 15 내지 35℃의 반응온도, 및 50 내지 2000 초, 일부 구현예에서는 100 내지 1000 초의 반응시간를 포함한다. 일부 구현예에서, 황화제는 크산탄 하이드라이드다. 결합 단계에서 황화제 대 고상 지지체에 연결된 핵산 서열의 몰비는 10:1 내지 1000:1이고, 일부 구현예에서는 10:1 내지 500:1이다. 일부 구현예에서, 황화 반응은 아세토니트릴: 피리딘의 비율이 1:3 내지 3:1인 혼합 용매에서 수행된다.
상기 방법은 모든 뉴클레오시드 단량체를 연결한 후 및 어닐링 전에 siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 분리하는 단계를 더 포함한다. 분리 방법은 당업자에게 주지되어 있으며 일반적으로 고상 지지체로부터 합성된 뉴클레오티드 서열을 절단하고, 염기, 포스페이트 기 및 리간드 상의 보호기를 제거하고, 정제 및 탈염하는 단계를 포함한다.
siRNA의 합성에서 통상적인 절단 및 탈보호 방법을 이용하여 고상 지지체로부터 합성된 뉴클레오티드 서열을 절단하고 염기, 포스페이트 기 및 리간드의 보호기를 제거할 수 있다. 예를 들어, 고상 지지체에 연결된 생성 뉴클레오티드 서열을 농축된 수성 암모니아와 접촉시키는 단계를 통해; 탈보호 동안, 작용기 A46-A54의 보호기 YCOO-는 하이드록실 기로 변환되고, 따라서 S1 기는 상응하는 M1 기로 변환되어 화학식 (1)로 나타낸 바와 같은 컨쥬게이트를 제공하고; 농축된 수성 암모니아는 25 내지 30 중량% 농도의 수성 암모니아일 수 있다. 농축된 수성 암모니아의 양은 표적 siRNA에 대해 0.2 ml/μmol 내지 0.8 ml/μmol일 수 있다.
합성된 뉴클레오티드 서열에 적어도 일부 2'-TBDMS 보호가 있는 경우, 상기 방법은 고상 지지체로부터 제거된 뉴클레오티드 서열을 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드와 접촉시켜 2'-TBDMS 보호를 제거하는 단계를 더 포함한다. 상기, 생성된 표적 siRNA 서열은 유리 2'-하이드록시를 갖는 상응하는 뉴클레오시드를 포함한다. 순수한 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드의 양은 표적 siRNA 서열에 대해 0.4 ml/μmol 내지 1.0 ml/μmol이다. 이와 같이 해서, 화학식 (1)로 나타낸 바와 같은 siRNA 컨쥬게이트를 얻을 수 있다.
정제 및 탈염 방법은 당업자에게 주지되어 있다. 예를 들어, 핵산 정제는 NaBr 또는 NaCl의 구배 용리를 갖는 제조용 이온 크로마토그래피 정제 칼럼을 사용하여 수행할 수 있고; 산물의 수집 및 조합 후, 탈염은 역상 크로마토그래피 정제 컬럼을 사용하여 수행할 수 있다.
생성된 siRNA 컨쥬게이트의 뉴클레오티드들 간의 포스포디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 디에스테르 결합의 비-가교 산소 또는 황원자는 실질적으로 나트륨 이온에 결합한 뒤, siRNA 컨쥬게이트는 실질적으로 나트륨 염의 형태로 존재한다. 나트륨 이온이 수소 이온 및/또는 다른 양이온으로 치환됨으로써, 다른 형태의 siRNA 컨쥬게이트를 제공할 수 있는 공지된 이온 교환 방법을 이용할 수 있다. 양이온은 전술한 바와 같다.
합성 동안, 합성 품질을 보다 잘 제어하기 위해, 핵산 서열의 순도 및 분자량은 언제든지 측정할 수 있다. 이러한 결정 방법은 당업자에게 주지되어 있다. 예를 들어, 핵산의 순도는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 측정할 수 있고, 분자량은 액체 크로마토그래피-질량 분석 (LC-MS)에 의해 측정할 수 있다.
어닐링하는 방법 역시 당업자에게 주지되어 있다. 예를 들어, 합성된 센스 가닥 (S 가닥) 및 안티센스 가닥 (AS 가닥)을 등 몰비로 주입하기 위해 물에 간단히 혼합한 뒤, 70 내지 95℃로 가열한 다음, 실온에서 냉각하여 수소 결합을 통해 이중 가닥 구조를 형성한다. 따라서, 본 발명의 제 2 siRNA 컨쥬게이트가 얻어질 수 있다.
컨쥬게이트를 얻은 후, 일부 구현예에서, 이렇게 합성된 제 2 siRNA 컨쥬게이트 역시 LC-MS 등의 방법을 이용하여 분자량 검출 등에 의해서 특징화하여, 합성된 siRNA 컨쥬게이트가 설계된 관심 있는 제 2 siRNA 컨쥬게이트인지, 그리고 합성된 siRNA의 서열이 원하는 합성하고자 하는 siRNA 서열인지, 예를 들어 상기 표 1에 열거한 서열 중 하나인지를 확인할 수 있다.
화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물은 염기 및 에스테르화 촉매의 존재 및 에스테르화 반응 조건하에 유기 용매에서 화학식 (313)으로 나타낸 바와 같은 화합물을 환식 무수물과 접촉시키는 단계를 포함하는 다음의 방법, 즉 이온 교환에 의해 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 분리하는 단계에 의해 제조될 수 있다:
Figure pct00044
화학식 (313)
상기 n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14, R15, L1, S1의 정의 및 선택은 각각 전술한 바와 같고;
R6은 화학식 (321)의 R4를 제공하는 기이다. 일부 구현예에서, 예를 들어, R6은 화학식 (A61)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00045
상기, R1은 질소계 골격 상의 N 원자에 연결되어 RkO에 연결되고 유리 하이드록시 기에 연결될 수 있는 임의의 기이고; Rk는 하이드록시 보호기이다. 이 경우, R4가 하이드록시 보호기로서 제 1 작용기 및 화학식 (C1) 또는 (C2)로 나타낸 바와 같은 기를 포함하는 제 2 작용기를 포함하는 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물이 얻어진다.
에스테르화 반응 조건은 0 내지 100℃의 반응온도 및 8 내지 48 시간의 반응시간을 포함한다. 일부 구현예에서, 에스테르화 반응 조건은 10 내지 40℃의 반응온도 및 20 내지 30 시간의 반응시간을 포함한다.
일부 구현예에서, 유기 용매는 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸 설폭사이드, N,N-디메틸포름아미드 및 N,N-디이소프로필에틸아민 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 에폭시 용매는 디옥산 및/또는 테트라하이드로푸란이다. 일부 구현예에서, 에테르 용매는 디에틸 에테르 및/또는 메틸 3차-부틸 에테르이다. 일부 구현예에서, 할로알칸 용매는 디클로로메탄, 트리클로로메탄 및 1,2-디클로로에탄 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 디클로로메탄이다. 유기 용매의 양은 화학식 (313)으로 나타낸 바와 같은 화합물과 비교해 3 내지 50 L/mol, 일부 구현예에서는 5 내지 20 L/mol이다.
일부 구현예에서, 환식 무수물은 숙신산 무수물, 글루타르산 무수물, 아디프산 무수물 또는 피멜산 무수물 중 하나이고, 일부 구현예에서 환식 무수물은 숙신산 무수물이다. 환식 무수물 대 화학식 (313)으로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰비는 1:1 내지 10:1, 일부 구현예에서는 2:1 내지 5:1이다.
에스테르화 촉매는 4-디메틸아미노피리딘 같은 에스테르화를 촉진할 수 있는 임의의 촉매일 수 있다. 촉매 대 화학식 (313)으로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰비는 1:1 내지 10:1이고, 일부 구현예에서, 2:1 내지 5:1이다.
일부 구현예에서, 염기는 임의의 무기 염기, 유기 염기 또는 이들의 조합일 수 있다. 용해도 및 산물 안정성을 고려하면, 염기는 3차 아민의 유기 염기이다. 일부 구현예에서, 3차 아민의 유기 염기는 트리에틸아민 또는 N,N-디이소프로필에틸아민이다. 3차 아민의 유기 염기 대 화학식 (313)으로 표시되는 화합물의 몰비는 1:1 내지 20:1이고, 일부 구현예에서 3:1 내지 10:1이다.
이온 교환은 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 원하는 형태의 카복실산 또는 카복실산 염으로 전환시키는 기능을 하며, 이온 교환 방법은 당업자에게 주지되어 있다. 양이온이 M+인 상기 접합 분자는 본원에서 상세하게 설명하지 않은 적절한 이온 교환 용액 및 이온 교환 조건을 이용하여 얻을 수 있다. 일부 구현예에서, 트리에틸아민 포스페이트 용액이 이온 교환 반응에 사용된다. 일부 구현예에서, 트리에틸아민 포스페이트 용액의 농도는 0.2 내지 0.8 M이다. 일부 구현예에서, 트리에틸아민 포스페이트 용액의 농도는 0.4 내지 0.6 M이다. 일부 구현예에서, 트리에틸아민 포스페이트 용액의 양은 화학식 (313)으로 나타낸 바와 같은 화합물과 비교해 3 내지 6 L/mol, 및 추가 구현예에서, 4 내지 5 L/mol이다.
화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물은 임의의 적절한 분리 방법을 이용하여 반응 혼합물로부터 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물은 증발을 통해 용매를 제거한 후, 예를 들어 분리를 위해 다음의 크로마토그래피 조건을 이용하여 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다: (1) 정상상(normal phase) 정제: 200 내지 300 메쉬 실리카 겔 충전제, 1 중량‰의 트리에틸아민을 포함한 디클로로메탄: 메탄올=100:18 내지 100:20의 구배 용리; 또는 (2) 역상 정제: C18 및 C8 역상 충전제, 메탄올: 아세토니트릴=0.1:1 내지 1:0.1의 구배 용리. 일부 구현예에서, 용매는 직접 제거되어 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물의 조(crude) 산물을 얻을 수 있으며, 이는 후속 반응에서 그대로 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물의 제조 방법은 상기 이온 교환 반응에서 얻어진 산물을 축합 반응 조건하 및 축합제와 3차 아민의 유기 염기의 존재하에 유기 용매에서 아미노 또는 하이드록시 기를 갖는 고상 지지체와 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 이 경우, 상기 R4가 하이드록시 보호기를 포함하는 제 1 작용기와 화학식 (C1')으로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 제 2 작용기를 포함하는 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물이 얻어진다.
고상 지지체는 siRNA의 고상 합성에 사용되는 지지체 중 하나이며, 이들 중 일부는 당업자에게 주지되어 있다. 예를 들어, 고상 지지체는 활성 하이드록시 또는 아미노 작용기를 포함하는 고상 지지체에서 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 고상 지지체는 아미노 또는 하이드록시 수지이다. 핵산의 후속 고상 합성을 용이하게 하기 위해, 아미노 또는 하이드록시 수지는 일부 구현예에서 100 내지 400 메쉬의 입자 크기, 및 0.2 내지 0.5 mmol/g의 표면 아미노 또는 하이드록시 로딩 파라미터를 갖는다. 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물 대 고상 지지체의 비는 고상 지지체 그램당 화합물로 10 μmol (μmol/g) 내지 400 μmol/g이다. 일부 구현예에서, 화학식 (321)의 화합물 대 고상 지지체의 비는 50 μmol/g 내지 200 μmol/g이다.
유기 용매는 당업자에게 공지된 임의의 적절한 용매 또는 혼합 용매일 수 있다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴, 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸 설폭사이드, N,N-디메틸포름아미드 및 N,N-디이소프로필에틸아민 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 에폭시 용매는 디옥산 및/또는 테트라하이드로푸란이고; 에테르 용매는 디에틸 에테르 및/또는 메틸 3차-부틸 에테르이고; 할로알칸 용매는 디클로로메탄, 트리클로로메탄 및 1,2-디클로로에탄 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴이다. 유기 용매의 양은 20 내지 200 L/mol 이고, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물에 관해서 일부 구현예에서 50 내지 100 L/mol이다.
축합제는 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트, 3-디에톡시포스포릴-1,2,3-벤조트리진-4(3H)-온 및/또는 O-벤조트리아졸-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트일 수 있다. 일부 구현예에서, 축합제는 O-벤조트리아졸-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트이다. 축합제 대 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰비는 1:1 내지 20:1, 일부 구현예에서는 1:1 내지 5:1이다.
일부 구현예에서, 3차 아민의 유기 염기는 트리에틸아민 및/또는 N,N-디이소프로필에틸아민이고, 일부 구현예에서, N,N-디이소프로필에틸아민이다. 3차 아민의 유기 염기 대 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰비는 1:1 내지 20:1, 일부 구현예에서는 1:1 내지 5:1이다.
일부 구현예에서, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물의 제조 방법은, 생성된 축합 산물을 캡핑 반응 조건하에 유기 용매에서 캡핑제 및 아실화 촉매와 접촉시키는 단계와, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 분리하는 단계를 더 포함한다. 후속 반응에서 불필요한 부산물이 생성되는 것을 피하기 위해, 캡핑 반응을 이용하여 완전히 반응하지 않는 임의의 활성 작용기를 제거한다. 캡핑 반응 조건은 0 내지 50℃, 일부 구현예에서 15 내지 35℃의 반응온도, 및 1 내지 10 시간, 일부 구현예에서 3 내지 6 시간의 반응시간을 포함한다. 캡핑제는 당업자에게 주지된 siRNA의 고상 합성에 사용되는 캡핑제일 수 있다.
일부 구현예에서, 캡핑제는 캡핑제 A (capA) 및 캡핑제 B (capB)로 구성된다. capA는 N-메틸이미다졸이고, 일부 구현예에서, 피리딘/아세토니트릴내 N-메틸이미다졸의 혼합 용액으로서 제공되며, 상기 피리딘 대 아세토니트릴의 부피비는 1:10 내지 1:1, 일부 구현예에서, 1:3 대 1:1이다. 일부 구현예에서, 피리딘 및 아세토니트릴의 총 부피 대 N-메틸이미다졸 부피의 비는 1:1 내지 10:1, 일부 구현예에서 3:1 내지 7:1이다. 캡핑 시약 B는 아세트산 무수물이다. 일부 구현예에서, capB는 아세토니트릴내 아세트산 무수물의 용액으로서 제공되며, 아세트산 무수물 대 아세토니트릴의 부피비는 1:1 내지 1:10, 일부 구현예에서는 1:2 내지 1:6이다.
일부 구현예에서, 피리딘/아세토니트릴 내 N-메틸이미다졸 혼합 용액의 부피 대 화학식 (321)의 화합물의 질량 비는 5 ml/g 내지 50 ml/g, 및 일부 구현예에서 15 ml/g 내지 30 ml/g이다. 아세토니트릴내 아세트산 무수물 용액의 부피 대 화학식 (321)의 화합물의 질량의 비는 0.5 ml/g 내지 10 ml/g, 일부 구현예에서 1 ml/g 내지 5 ml/g이다.
일부 구현예에서, 캡핑제는 등몰의 아세트산 무수물 및 N-메틸이미다졸을 포함한다. 유기 용매는 아세토니트릴, 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸 설폭사이드, N,N-디메틸포름아미드 및 N,N-디이소프로필에틸아민 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴이다. 유기 용매의 양은 10 내지 50 L/mol이고, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물에 관하여 일부 구현예에서는 5 내지 30 L/mol이다.
아실화 촉매는 알칼리 헤테로환식 화합물 같은 에스테르화 축합 또는 아미드화 축합에 사용될 수 있는 임의의 촉매에서 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 아실화 촉매는 4-디메틸아미노피리딘이다. 촉매 대 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물의 질량비는 0.001:1 내지 1:1, 일부 구현예에서는 0.01:1 내지 0.1:1일 수 있다.
화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물은 임의의 적절한 방법에 의해 반응 혼합물로부터 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 (321)의 화합물은 유기 용매로 완전히 세척하고 여과하여 미반응의 반응물, 과잉 캡핑제 및 다른 불순물을 제거함으로써 얻어질 수 있으며, 유기 용매는 아세토니트릴, 디클로로메탄 또는 메탄올에서 선택된다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴이다.
일부 구현예에서, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 접합 분자의 제조는 결합 반응 조건하 및 결합제의 존재하에 화학식 (313)으로 나타낸 바와 같은 화합물을 유기 용매에서 포스포로디아미다이트와 접촉시키는 단계, 및 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 분리시키는 단계를 포함한다. 이 경우, R4가 하이드록시 보호기를 포함하는 제 1 작용기와 화학식 (C3)으로 나타낸 구조를 갖는 제 2 작용기를 포함하는 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물이 얻어진다.
일부 구현예에서, 결합 반응 조건은 0 내지 50℃, 예컨대 15 내지 35℃의 반응온도를 포함한다. 화학식 (313)의 화합물 대 포스포로디아미다이트의 몰비는 1:1 내지 1:50, 예컨대 1:5 내지 1:15일 수 있다. 화학식 (313)의 화합물 대 결합제의 몰비는 1:1 내지 1:100, 예컨대 1:50 내지 1:80일 수 있다. 반응시간은 200-3000 초, 예컨대 500-1500 초일 수 있다. 포스포로디아미다이트는, 예를 들어 비스(디이소프로필아미노)(2-시아노에톡시)포스핀일 수 있으며, 이는 상업적으로 이용 가능하거나 당업계에 공지된 방법에 따라 합성할 수 있다. 결합제는 1H-테트라졸, 5-에틸티오-1H-테트라졸 및 5-벤질티오-1H-테트라졸, 예컨대 5-에틸티오-1H-테트라졸 중 하나 이상에서 선택된다. 결합 반응은 유기 용매에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 무수 아세토니트릴, 무수 DMF 및 무수 디클로로메탄 중 하나 이상에서 선택되고 예컨대 무수 아세토니트릴이다. 유기 용매의 양은 화학식 (313)으로 나타낸 바와 같은 화합물과 비교해 3 내지 50 L/mol, 예컨대 5 내지 20 L/mol일 수 있다. 결합 반응을 수행함으로써, 화합물 (313) 중의 하이드록시 기는 포스포로디아미다이트와 반응하여 포스포라미다이트기를 형성한다. 일부 구현예에서, 용매는 직접 제거되어 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물의 조 산물을 얻을 수 있으며, 이는 후속 반응에서 그대로 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물의 제조 방법은 결합 반응 조건하 및 결합제의 존재하에 유기 용매에서 분리된 산물을 고상 지지체 및 하이드록시 기와 접촉시킨 다음, 캡핑, 산화 및 분리하여 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 얻는 단게를 더 포함하고, 상기 R4는 하이드록시 보호기를 포함하는 제 1 작용기 및 화학식 (C3')으로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 제 2 작용기를 포함한다.
일부 구현예에서, 고상 지지체는 핵산의 고상 합성을 위해 당업계에 공지된 지지체, 예컨대 화학식 (B80)으로 나타낸 바와 같이, NittoPhase®HL UnyLinkerTM 300 Oligonucleotide Synthesis Support, Kinovate Life Sciences 같은 탈보호된 상업적으로 이용 가능한 범용 고상 지지체이다.
Figure pct00046
탈보호 반응은 당업계에 주지되어 있다. 일부 구현예에서, 탈보호 조건은 0 내지 50℃, 예컨대 15 내지 35℃의 온도, 및 30 내지 300 초, 예컨대 50 내지 150 초의 반응시간을 포함한다. 탈보호제는 트리플루오로 아세트산, 트리클로로 아세트산, 디클로로 아세트산 및 모노클로로 아세트산 중 하나 이상에서 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 탈보호제는 디클로로 아세트산이다. 탈보호제 대 고상 지지체 상의 보호기-DMTr (4,4'-디메톡시트리틸)의 몰비는 2:1 내지 100:1, 예컨대 3:1 내지 50:1일 수 있다. 이러한 탈보호에 의해, 후속 결합 반응을 용이하게 하기 위해, 고상 지지체의 표면에 반응성 유리 하이드록시 기가 얻어진다.
결합 반응 조건 및 결합제는 상기와 같이 선택될 수 있다. 이러한 결합 반응에 의해, 탈보호 반응에서 형성된 유리 하이드록시 기는 포스포라미다이트 기와 반응하여 포스파이트 에스테르 연결을 형성한다.
일부 구현예에서, 캡핑 반응 조건은 0 내지 50℃, 예를 들어 15 내지 35℃의 온도, 및 5 내지 500 초, 예컨대 10 내지 100 초의 반응시간을 포함한다. 캡핑 반응은 캡핑제의 존재하에 수행된다. 캡핑제의 선택 및 양은 상기와 같다.
산화 반응 조건은 0 내지 50℃, 예컨대 15 내지 35℃의 온도, 및 1 내지 100 초, 예컨대 5 내지 50 초의 반응시간을 포함할 수 있다. 산화제는, 예를 들어 요오드일 수 있다 (일부 구현예에서, 요오드 수로서 제공됨). 일부 구현예에서, 산화제 대 포스파이트 에스테르 기의 몰비는 1:1 내지 100:1, 바람직하게는 5:1 내지 50:1이다. 일부 구현예에서, 산화 반응은 테트라하이드로푸란: 물: 피리딘의 비율이 3:1:1 내지 1:1:3인 혼합 용매에서 수행된다.
일부 구현예에서, R6은 화학식 B7 또는 B8으로 나타낸 기이다:
Figure pct00047
상기 q2는 위에서 정의한 바와 같다.
　이 경우, 상기 화학식 (313)으로 나타낸 바와 같은 화합물은 아미드화 반응 조건하 및 아미드화 축합제 및 3차 아민의 유기 염기의 존재하에 유기 용매에서 상기 화학식 (314)로 나타낸 바와 같은 화합물을 상기 화학식 (A-1) 또는 (A-2)로 나타낸 바와 같은 화합물과 접촉시키고, 분리하는 단계를 포함하는 다음의 제조 방법에 의해 제조될 수 있다:
Figure pct00048
상기 n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14, R15, L1, S1, q2 및 Rk의 정의 및 선택은 각각 전술한 바와 같다.
아미드화 반응 조건은 0 내지 100℃의 반응온도 및 1 내지 48 시간의 반응시간을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아미드화 반응 조건은 10 내지 40℃의 반응온도 및 2 내지 16 시간의 반응시간을 포함한다.
일부 구현예에서, 유기 용매는 알콜 용매, 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸 설폭사이드, N,N-디메틸포름아미드 및 N,N-디이소프로필에틸아민 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 알콜 용매는 메탄올, 에탄올 및 프로판올 중 하나 이상이고, 추가 구현예에서 에탄올이다. 일부 구현예에서, 에폭시 용매는 디옥산 및/또는 테트라하이드로푸란이다. 일부 구현예에서, 에테르 용매는 디에틸 에테르 및/또는 메틸 3차-부틸 에테르이다. 일부 구현예에서, 할로알칸 용매는 디클로로메탄, 트리클로로메탄 및 1,2-디클로로에탄 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 디클로로메탄이다. 유기 용매의 양은 화학식 (314)로 나타낸 바와 같은 화합물과 비교해 3 내지 50 L/mol, 일부 구현예에서는 3 내지 20 L/mol이다.
일부 구현예에서, 아미드화 축합제는 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트, 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리진-4(3H)-온, 4-(4,6-디메톡시트리아진-2-일)-4-메틸모르폴린 하이드로클로라이드, 2-에톡시-1-에톡시카보닐-1,2-디하이드로퀴놀린 (EEDQ) 또는 O-벤조트리아졸-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트, 및 추가 구현예에서, 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리진-4(3H)-온이다. 아미드화 축합제 대 화학식 (314)로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰비는 1:1 내지 10:1이고, 일부 구현예에서는 2.5:1 내지 5:1일 수 있다.
일부 구현예에서, 3차 아민의 유기 염기는 트리에틸아민 또는 N,N-디이소프로필에틸아민, 일부 구현예에서, N,N-디이소프로필에틸아민이다. 3차 아민 대 화학식 (314)로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰비는 3:1 내지 20:1, 일부 구현예에서는 5:1 내지 10:1일 수 있다.
화학식 (A-1) 및 (A-2)의 화합물은 임의의 적절한 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, Rk가 DMTr 기인 경우, 화학식 (A-1)의 화합물은 칼슘 글리세레이트를 DMTrCl과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 유사하게, 화학식 (A-2)의 화합물은 3-아미노-1,2-프로판디올을 환식 무수물과 접촉시킨 후, DMTrCl과 반응시켜 제조할 수 있으며, 상기 환식 무수물은 4 내지 13개, 일부 구현예에서, 4 내지 8개의 탄소원자의 탄소원자를 가질 수 있다. 당업자는 상이한 환식 무수물의 선택이 화학식 (A-2)의 화합물에서 q2에 대한 상이한 값에 상응한다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 예를 들어, 환식 무수물이 숙신산 무수물인 경우, q2=1; 환식 무수물이 글루타르산 무수물인 경우, q2=2 등이다.
일부 변형에서, 화학식 (313)의 화합물은 또한 화학식 (314)으로 나타낸 화합물을 환식 무수물, 3-아미노-1,2-프로판디올 및 DMTrCl과 연속해서 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 당업자는 이들 변형이 화학식 (313)의 화합물의 구조 및 기능에 영향을 주지 않는 것을 쉽게 이해할 것이며, 당업자라면 상기 방법에 기반하여 이들 변형을 용이하게 달성할 수 있다.
유사하게, 화학식 (313)으로 나타낸 바와 같은 화합물은 임의의 적절한 분리 방법에 의해 반응 혼합물로부터 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 (313)으로 나타낸 바와 같은 화합물은 증발을 통해 용매를 제거한 후, 예를 들어 분리를 위해 다음의 2가지 크로마토그래피 조건 세트를 사용하여 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다: (1) 정상상 정제: 200-300 메쉬 실리카 겔 충전제, 석유 에테르: 에틸 아세테이트: 디클로로메탄: N,N-디메틸포름아미드=1:1:1:0.5 내지 1:1:1:0.6의 구배 용리; 및 (2) 역상 정제: C18 및 C8 역상 충전제, 메탄올: 아세토니트릴=0.1:1 내지 1:0.1의 구배 용리. 일부 구현예에서, 용매는 직접 제거되어 화학식 (313)으로 나타낸 바와 같은 화합물의 조 산물을 얻을 수 있으며, 이는 후속 반응에서 그대로 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 화학식 (314)로 나타낸 바와 같은 화합물은 탈보호 반응 조건하에 유기 용매에서 화학식 (315)로 나타낸 바와 같은 화합물을 할로 아세트산과 접촉시킨 후, 분리하는 단계를 포함하는 하기 제조 방법에 의해 제조될 수 있다:
Figure pct00049
상기 R7은 화학식 (330), (331), (332) 및 (333)으로 나타낸 바와 같은 군에서 선택되고, 일부 구현예에서, R7은 화학식 (330)으로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00050
상기 n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14, R15, L1 및 S1의 정의 및 선택은 각각 전술한 바와 같다.
할로 아세트산은 디클로로 아세트산, 트리클로로 아세트산, 모노클로로 아세트산 및 트리플루오로 아세트산 중 하나 이상, 및 일부 구현예에서 디클로로 아세트산에서 선택될 수 있다.
탈보호 반응 조건은 0 내지 100℃의 반응온도 및 0.1 내지 24 시간의 반응시간을 포함할 수 있고, 일부 구현예에서 10 내지 40℃의 반응온도 및 0.5 내지 16 시간의 반응시간을 포함한다.
일부 구현예에서, 유기 용매는 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸 설폭사이드, N,N-디메틸포름아미드 및 N,N-디이소프로필에틸아민 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 에폭시 용매는 디옥산 및/또는 테트라하이드로푸란이다. 일부 구현예에서, 에테르 용매는 디에틸 에테르 및/또는 메틸 3차-부틸 에테르이다. 일부 구현예에서, 할로알칸 용매는 디클로로메탄, 트리클로로메탄 및 1,2-디클로로에탄 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 디클로로메탄이다. 유기 용매의 양은 3 내지 50 L/mol이고, 화학식 (315)로 나타낸 바와 같은 화합물에 관하여 일부 구현예에서는 5 내지 20 L/mol이다.
할로 아세트산 대 화학식 (315)로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰비는 5:1 내지 100:1, 일부 구현예에서는 10:1 내지 50:1이다.
유사하게, 화학식 (314)로 나타낸 바와 같은 화합물은 임의의 적절한 분리 방법에 의해 반응 혼합물로부터 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 (314)로 나타낸 바와 같은 화합물은 증발을 통해 용매를 제거한 후, 예를 들어 분리를 위해 다음의 2가지 크로마토그래피 조건 세트를 사용하여 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다: (1) 정상상 정제: 200-300 메쉬 실리카 겔 충전제, 디클로로메탄: 메탄올=100:30 내지 100:40의 구배 용리; 및 (2) 역상 정제: C18 및 C8 역상 충전제, 메탄올: 아세토니트릴=0.1:1 내지 1:0.1의 구배 용리. 일부 구현예에서, 용매는 직접 제거되어 화학식 (314)로 나타낸 바와 같은 화합물의 조 산물을 얻을 수 있으며, 이는 후속 반응에서 그대로 사용할 수 있다.
화학식 (315)로 나타낸 바와 같은 화합물은 축합 반응 조건하 및 아미드화 축합제와 3차 아민의 유기 염기의 존재 하에 유기 용매에서 화학식 (317)로 나타낸 바와 같은 화합물과 화학식 (316)으로 나타낸 바와 같은 화합물을 접촉시키고, 분리하는 단계를 포함하는 다음의 방법에 의해 제조할 수 있다:
Figure pct00051
상기 n1, n3, m1, m2, m3, R7, R10, R11, R12, R13, R14, R15, L1 및 S1의 정의 및 선택은 각각 전술한 바와 같다.
화학식 (316)의 화합물은 예컨대 J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 16958-16961에 개시된 화합물일 수 있다. 대안적으로, 화학식 (316)의 화합물은 다양한 방법을 통해 당업자기 제조할 수 있다. 예를 들어, 일부 화학식 (316)의 화합물은 미국 특허 제 8,106,022 B2 (그 전체를 참고로 본원에서 인용함)의 구현예 1에 개시된 방법에 따라 제조할 수 있다.
일부 구현예에서, 축합 반응 조건은 0 내지 100℃의 반응온도 및 0.1 내지 24 시간의 반응시간을 포함한다. 일부 구현예에서, 축합 반응 조건은 반응온도가 10 내지 40℃이고 반응시간이 0.5 내지 16 시간인 것을 포함한다.
화학식 (316)으로 나타낸 바와 같은 화합물 대 화학식 (317)로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰비는 2:1 내지 10:1이고, 일부 구현예에서는 2.5:1 내지 5:1일 수 있다.
일부 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴, 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸 설폭사이드, N,N-디메틸포름아미드 및 N,N-디이소프로필에틸아민 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 에폭시 용매는 디옥산 및/또는 테트라하이드로푸란이다. 일부 구현예에서, 에테르 용매는 디에틸 에테르 및/또는 메틸 3차-부틸 에테르이다. 일부 구현예에서, 할로알칸 용매는 디클로로메탄, 트리클로로메탄 및 1,2-디클로로에탄 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴이다. 유기 용매의 양은 화학식 (317)로 나타낸 바와 같은 화합물과 비교해 3 내지 50 L/mol, 일부 구현예에서는 5 내지 20 L/mol일 수 있다.
아미드화 축합제는 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트, 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리진-4(3H)-온 (DEPBT), O-벤조트리아졸-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 또는 4-(4, 6-디메톡시트리아진-2-일)-4-메틸모르폴린 하이드로클로라이드이고, 일부 구현예에서, 4-(4,6-디메톡시트리아진-2-일)-4-메틸모르폴린 하이드로클로라이드이다. 아미드화 축합제 대 화학식 (317)로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰비는 2:1 내지 10:1이고, 일부 구현예에서 2.5:1 내지 5:1이다.
3차 아민의 유기 염기는 N-메틸모르폴린, 트리에틸아민 또는 N,N-디이소프로필에틸아민, 및 일부 구현예에서 N-메틸모르폴린이다. 3차 아민 대 화학식 (317)로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰비는 3:1 내지 20:1일 수 있고, 일부 구현예에서 5:1 내지 10:1이다.
유사하게, 화학식 (315)로 나타낸 바와 같은 화합물은 임의의 적절한 분리 방법에 의해 반응 혼합물로부터 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 (315)로 나타낸 바와 같은 화합물은 증발을 통해 용매를 제거한 후, 예를 들어 분리를 위해 다음의 2가지 크로마토그래피 조건 세트를 사용하여 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다: (1) 정상상 정제: 200-300 메쉬 실리카겔 충전제, 디클로로메탄: 메탄올=100:5 내지 100:7의 구배 용리; (2) 역상 정제: C18 및 C8 역상 충전제, 메탄올: 아세토니트릴=0.1:1 내지 1:0.1의 구배 용리. 일부 구현예에서, 용매는 직접 제거되어 화학식 (315)로 나타낸 바와 같은 화합물의 조 산물을 얻으며, 이는 후속 반응에서 그대로 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 화학식 (317)의 화합물은 하나의 배치(one batch)로 충분한 양의 화학식 (316) 중 하나의 화합물과 반응하여 원하는 화학식 (315)의 화합물을 얻으며, 상기 모든 S1-L1 부분은 동일하다. 일부 구현예에서, 화학식 (317)의 화합물은 필요에 따라 화학식 (316)의 상이한 화합물, 즉 상이한 L1 및/또는 S1을 갖는 화학식 (316)의 화합물과 반응하여 2가지 이상의 유형의 S1 및/또는 L1을 갖는 화학식 (315)의 화합물을 얻는다. 예를 들어, 1 당량의 화학식 (317)의 화합물을 2 당량의 화학식 (316)의 제 1 화합물과 먼저 접촉시킴으로써, 화학식 (317)의 화합물에서 2개의 말단 일차 아민기에 제 1 S1-L1 부분을 부착시키고, 이어서 화학식 (316)의 제 2 화합물의 (n3+n1-1) 당량과 접촉시킴으로써, 화학식 (317)의 화합물에서 (n3+n1-1) 이차 아민기에 제 2 S1-L1 부분을 부착시킬 수 있으며, 상기 n3 및 n1의 정의 및 범위는 전술한 바와 같다.
일부 구현예에서, 화학식 (317)로 나타낸 바와 같은 화합물은 유기 용매의 존재하에 탈보호 반응 조건하에 화학식 (318)로 나타낸 바와 같은 화합물을 메틸아민 수용액과 접촉시키고, 분리하는 단계를 포함하는 다음의 방법에 의해 제조할 수 있다:
Figure pct00052
상기 n1, n3, m1, m2, m3, R7, R10, R11, R12, R13, R14 및 R15의 정의 및 선택은 각각 전술한 바와 같다.
탈보호 반응 조건은 0 내지 150℃의 반응온도 및 5 내지 72 시간의 반응시간을 포함하고, 일부 구현예에서 20 내지 80℃의 반응온도 및 10 내지 30 시간의 반응시간을 포함한다.
유기 용매는 알콜에서 선택되며, 일부 구현예에서 메탄올, 에탄올 및 이소프로판올 중 하나이고, 일부 구현예에서 메탄올이다. 유기 용매의 양은 화학식 (318)로 나타낸 바와 같은 화합물과 비교해 1 내지 20 L/mol일 수 있고, 일부 구현예에서 1.5 내지 10 L/mol이다.
메틸아민 수용액의 농도는 30 내지 40 질량%일 수 있고, 메틸아민 대 화학식 (318)로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰비는 10:1 내지 500:1, 일부 구현예에서는 50:1 내지 200:1일 수 있다.
유사하게, 화학식 (317)로 나타낸 바와 같은 화합물은 임의의 적절한 분리 방법을 이용하여 반응 혼합물로부터 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 (317)로 나타낸 바와 같은 화합물은 증발을 통해 용매를 제거한 후, 예를 들어 분리를 위해 다음의 2가지 크로마토그래피 조건 세트를 사용하여 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다: (1) 정상상 정제: 200-300 메쉬 실리카 겔 충전제, 디클로로메탄: 메탄올: 수성 암모니아 (25 중량%)=1:1:0.05 내지 1:1:0.25의 구배 용리; 및 (2) 역상 정제: C18 및 C8 역상 충전제, 메탄올: 아세토니트릴=0.1:1 내지 1:0.1의 구배 용리. 일부 구현예에서, 용매는 직접 제거되어 화학식 (317)로 나타낸 바와 같은 화합물의 조 산물을 얻을 수 있으며, 이는 후속 반응에서 그대로 사용할 수 있다.
화학식 (318)로 나타낸 바와 같은 화합물은 화학식 (319)로 나타낸 바와 같은 화합물을 치환 반응의 조건하 및 유기 용매의 존재하에 트리페닐클로로메탄 (TrCl), 디페닐에틸페닐클로로메탄, 페닐디에틸페닐클로로메탄 또는 트리에틸페닐클로로메탄 (일부 구현예에서는 트리페닐클로로메탄 (TrCl))과 접촉시키고, 분리하는 단계를 포함하는 다음의 방법에 의해 제조될 수 있다.
Figure pct00053
상기 n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14 및 R15의 정의 및 선택은 각각 전술한 바와 같다.
치환 반응 조건은 0 내지 100℃의 반응온도 및 5 내지 72 시간의 반응시간을 포함할 수 있고, 일부 구현예에서 10 내지 40℃의 반응온도 및 10 내지 30 시간의 반응시간을 포함한다.
트리페닐클로로메탄 (TrCl), 디페닐에틸페닐클로로메탄, 페닐디에틸페닐클로로메탄 또는 트리에틸페닐클로로메탄은 상업적으로 이용 가능하다. 트리페닐클로로메탄 (TrCl), 디페닐에틸페닐클로로메탄, 페닐디에틸페닐클로로메탄 또는 트리에틸페닐클로로메탄 대 화학식 (319)로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰비는 1:1 내지 10:1, 일부 구현예에서는 1:1 내지 3:1일 수 있다.
유기 용매는 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸 설폭사이드, N,N-디메틸포름아미드 및 N,N-디이소프로필에틸아민 중 하나 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, 에폭시 용매는 디옥산 및/또는 테트라하이드로푸란이다. 일부 구현예에서, 에테르 용매는 디에틸 에테르 및/또는 메틸 3차-부틸 에테르이다. 일부 구현예에서, 할로알칸 용매는 디클로로메탄, 트리클로로메탄 및 1,2-디클로로에탄 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 디클로로메탄이다. 유기 용매의 양은 3 내지 50 L/mol이고, 화학식 (319)로 나타낸 바와 같은 화합물에 관하여 일부 구현예에서는 5 내지 20 L/mol일 수 있다.
유사하게, 화학식 (318)로 나타낸 바와 같은 화합물은 임의의 적절한 분리 방법에 의해 반응 혼합물로부터 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 (318)로 나타낸 바와 같은 화합물은 증발을 통해 용매를 제거한 후, 예를 들어 분리를 위해 다음의 2가지 크로마토그래피 조건 세트를 사용하여 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다: (1) 정상상 정제: 200-300 메쉬 실리카 겔 충전제, 메탄올: 디클로로메탄=0.01:1 내지 0.5:1의 구배 용리 또는 메탄올: 디클로로메탄: 에틸 아세테이트: 석유 에테르=0.1:1:1:1 내지 1:1:1:1의 구배 용리; 및 (2) 역상 정제: C18 및 C8 역상 충전제, 메탄올: 아세토니트릴=0.1:1 내지 1:0.1의 구배 용리. 일부 구현예에서, 용매는 직접 제거되어 화학식 (318)로 나타낸 바와 같은 화합물의 조 산물을 얻을 수 있으며, 이는 후속 반응에서 그대로 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 화학식 (319)로 나타낸 바와 같은 화합물은 치환 반응 조건하에 유기 용매에서 화학식 (320)으로 나타낸 바와 같은 화합물을 에틸 트리플루오로아세테이트와 접촉시키고, 분리하는 단계를 포함하는 다음의 방법에 의해 제조할 수 있다:
Figure pct00054
상기 n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14 및 R15의 정의 및 선택은 각각 전술한 바와 같다.
일부 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴, 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸 설폭사이드, N,N-디메틸포름아미드 및 N,N-디이소프로필에틸아민 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 에폭시 용매는 디옥산 및/또는 테트라하이드로푸란이다. 일부 구현예에서, 에테르 용매는 디에틸 에테르 및/또는 메틸 3차-부틸 에테르이다. 일부 구현예에서, 할로알칸 용매는 디클로로메탄, 트리클로로메탄 및 1,2-디클로로에탄 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴이다. 유기 용매의 양은 화학식 (320)으로 나타낸 바와 같은 화합물과 비교해 1 내지 50 L/mol, 일부 구현예에서는 1 내지 20 L/mol이다.
치환 반응 조건은 0 내지 100℃의 반응온도 및 5 내지 72 시간의 반응시간을 포함할 수 있고, 일부 구현예에서 10 내지 40℃의 반응온도 및 10 내지 30 시간의 반응시간을 포함한다.
화학식 (320)으로 나타낸 바와 같은 화합물은 상업적으로 이용할 수 있거나 공지된 방법을 통해 당업자에 의해 얻어질 수 있다. 예를 들어, m1=m2=m3=3, n1=1, n3=2이고 R10, R11, R12, R13, R14 및 R15가 모두 H인 경우, 화학식 (320)으로 나타낸 바와 같은 화합물은 Alfa Aesar Inc.에서 상업적으로 구입할 수 있다.
에틸 트리플루오로아세테이트 대 화학식 (320)으로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰비는 2:1 내지 10:1, 일부 구현예에서는 3:1 내지 5:1일 수 있다.
유사하게, 화학식 (319)로 나타낸 바와 같은 화합물은 임의의 적절한 분리 방법을 이용하여 반응 혼합물로부터 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 (319)로 나타낸 바와 같은 화합물은 증발을 통해 용매를 제거한 후, 예를 들어 분리를 위해 다음의 2가지 크로마토그래피 조건 세트를 사용하여 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다: (1) 정상상 정제: 200-300 메쉬 실리카 겔 충전제, 메탄올: 디클로로메탄=0.01:1 내지 0.5:1의 구배 용리 또는 메탄올: 디클로로메탄: 에틸 아세테이트: 석유 에테르=0.1:1:1:1 내지 1:1:1:1의 구배 용리; 및 (2) 역상 정제: C18 및 C8 역상 충전제, 메탄올: 아세토니트릴=0.1:1 내지 1:0.1의 구배 용리. 일부 구현예에서, 용매는 직접 제거되어 화학식 (319)로 나타낸 바와 같은 화합물의 조 산물을 얻을 수 있으며, 이는 후속 반응에서 그대로 사용할 수 있다.
본 발명의 제 1 또는 제 2 siRNA 컨쥬게이트는 다른 약학적으로 허용되는 부형제와 함께 사용할 수도 있으며, 이는 당업계의 다양한 통상적인 제형 또는 화합물 중 하나 이상일 수 있다. 자세한 내용은 본 발명의 약학 조성물의 상기 설명을 참조한다.
본 발명의 변성 siRNA, 약학 조성물, 제 1 siRNA 컨쥬게이트 및 제 2 siRNA 컨쥬게이트의 용도
일부 구현예에서, 본원은 B형 간염 바이러스 (HBV) 감염에 의해 야기된 병리학적 상태 또는 질병을 치료 및/또는 예방하기 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명의 siRNA, 약학 조성물, 제 1 siRNA 컨쥬게이트 및/또는 제 2 siRNA 컨쥬게이트의 용도를 제공한다.
일부 구현예에 따르면, 본원은 본 발명의 siRNA, 약학 조성물, 제 1 siRNA 컨쥬게이트 및/또는 제 2 siRNA 컨쥬게이트를 유효량으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, B형 간염 바이러스 (HBV) 감염에 의해 야기된 병리학적 상태 또는 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
다른 구현예에 따르면, 본원은 본 발명의 siRNA, 약학 조성물, 제 1 siRNA 컨쥬게이트 및/또는 제 2 siRNA 컨쥬게이트를 만성 HBV에 감염된 간염 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 만성 HBV로 감염된 간염 세포에서 HBV 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.
B형 간염 바이러스 (HBV) 감염으로 야기된 병리학적 상태 또는 질병은 만성 간 질환(chronic liver diseases), 염증(inflammation), 섬유성 질환(fibrotic diseases) 및 증식성 질환(proliferative diseases)에서 선택된다.
본 발명의 siRNA 및/또는 약학 조성물, 제 1 siRNA 컨쥬게이트 및/또는 제 2 siRNA 컨쥬게이트를 이를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 RNA 간섭 (RNA interference, RNAi)의 메커니즘에 기반하여 B형 간염 치료의 목적을 달성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 siRNA 및/또는 약학 조성물 및 siRNA 컨쥬게이트는 B형 간염을 예방 및/또는 치료하기 위해, 또는 B형 간염을 예방 및/또는 치료하기 위한 약제을 제조하는데 사용할 수 있다.
본원에서 사용한 바와 같이, 용어 "투여/투여하다"는 본 발명의 변성 siRNA, 약학 조성물, 제 1 siRNA 컨쥬게이트 및/또는 제 2 siRNA 컨쥬게이트를, 본 발명의 변성 siRNA, 약학 조성물, 제 1 siRNA 컨쥬게이트 및/또는 제 2 siRNA 컨쥬게이트를 원하는 부위에 적어도 부분적으로 위치시켜 원하는 효과를 생성하는 방법 또는 경로에 의해 대상자에게 전달하는 것을 지칭한다. 본 발명의 방법에 적절한 투여 경로는 국소 투여 및 전신 투여를 포함한다. 일반적으로, 국소 투여는 대상자의 전신과 비교하여 보다 변성 siRNA, 약학 조성물, 제 1 siRNA 컨쥬게이트 및/또는 제 2 siRNA 컨쥬게이트를 특정 부위에 전달하는 결과를 가져오는 반면; 전신 투여는 변성 siRNA, 약학 조성물, 제 1 siRNA 컨쥬게이트 및/또는 제 2 siRNA 컨쥬게이트를 실질적으로 대상자의 전신에 전달하는 결과를 가져온다. 본 발명은 이상 지질 혈증의 예방 및/또는 치료을 위한 수단을 제공하려는 점을 고려하여, 일부 구현예에서, 약물을 간으로 전달할 수 있는 투여 방식이 사용된다.
대상자에 대한 투여는 경구 또는 비경구 경로, 예컨대 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 경피 투여, 기관내 투여 (에어로졸), 폐 투여, 비강 투여, 직장 투여 및 국소 투여 (협측 투여 및 설하 투여 포함)를 포함한, 당업계에 공지된 임의의 적절한 경로에 의해 달성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 투여 빈도는 매일, 매주, 2주마다, 3주마다, 매월 또는 매년 1회 이상일 수 있다.
본 발명의 siRNA, 약학 조성물, 제 1 siRNA 컨쥬게이트 및/또는 제 2 siRNA 컨쥬게이트의 용량은 다양한 파라미터, 특히 대상자의 연령, 체중 및 성별에 따라 결정될 수 있는 당업계의 통상적인 용량일 수 있다. 독성 및 효능은 표준 약학 절차, 예를 들어 LD50 (50%의 개체군 사망을 초래하는 치사량) 및 ED50 (정량적 반응에서 최대 반응 강도의 50%를 유발할 수 있는 용량으로, 정성적 반응에서 실험 대상자의 50%가 긍정적인 반응을 갖도록 할 수 있는 용량)을 결정함으로써, 세포 배양 또는 실험 동물에서 측정될 수 있다. 인간의 용량 범위는 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻은 데이터에 기반하여 도출될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물 또는 siRNA 컨쥬게이트를 투여할 때, 예를 들어, 체중이 18 내지 25g인 6 내지 12 주령의 수컷 또는 암컷 C57BL/6J 또는 C3H/HeNCrIVr 생쥐에 투여할 때, 약학 조성물내 siRNA 또는 siRNA 컨쥬게이트의 양에 기반하여 계산하면: (i) 제 1 siRNA 컨쥬게이트 및/또는 제 2 siRNA 컨쥬게이트의 경우, 그 siRNA의 투여량은 0.001 내지 100 mg/kg 체중일 수 있고, 추가 구현예에서, 0.01 내지 50 mg/kg체중이고, 다른 추가 구현예에서 0.05 내지 20 mg/kg체중이고, 또 다른 구현예에서 0.1 내지 10 mg/kg체중이며; (ii) siRNA 및 약학적으로 허용되는 담체에 의해 형성된 약학 조성물의 경우, 그 siRNA의 투여량은 0.001 내지 50 mg/kg체중일 수 있고, 추가 구현예에서 0.01 내지 10 mg/kg체중이고, 다른 추가 구현예는 0.05 내지 5 mg/kg체중이고, 또 다른 구현예에서 0.1 내지 3 mg/kg체중이다.
또한, 본 발명의 siRNA 및/또는 약학 조성물 및/또는 siRNA 컨쥬게이트를 만성 HBV로 감염된 간염 세포에 도입함으로써, 만성 HBV로 감염된 간염 세포에서 HBV 유전자의 발현을 억제하려는 목적은 RNA 간섭의 메커니즘에 의해서 달성될 수도 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 세포는 HepG2.2.15 세포이다.
세포에서 HBV 유전자의 발현이 본 발명에 의해 제공된 방법을 이용하여 억제되는 경우, 제공되는 siRNA, 약학 조성물, 제 1 siRNA 컨쥬게이트 및/또는 제 2 siRNA 컨쥬게이트내 siRNA의 양은 전형적으로 표적 유전자의 발현을 감소시키고 표적 세포의 표면에서 1 pM 내지 1 μM, 또는 0.01 nM 내지 100 nM, 또는 0.05 nM 내지 50 nM 또는 0.05 nM 내지 약 5 nM의 세포외 농도를 가져오기에 충분한 양이다. 이 국소 농도를 달성하는데 필요한 양은 전달 방법, 전달 부위, 전달 부위와 표적 세포 또는 조직 사이의 세포층의 수, 전달 경로 (국소 또는 전신) 등을 포함한 다양한 요인에 따라 달라지게 된다. 전달 부위에서의 농도는 표적 세포 또는 조직의 표면에서의 농도보다 상당히 높을 수 있다.
키트
본원은 변성 siRNA, 약학 조성물, 제 1 siRNA 컨쥬게이트 및/또는 제 2 siRNA 컨쥬게이트 중 하나 이상을 유효량으로 포함하는 키트를 제공한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 키트는 변성 siRNA를 하나의 용기에 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 키트는 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 용기를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 키트는 안정화제 또는 보존제 같은 추가 성분을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 본 발명의 변성 siRNA를 포함하는 용기 이외의 다른 용기에 하나 이상의 추가 치료제를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 변성 siRNA를 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 보조제(adjuvant) 또는 (존재하는 경우) 다른 성분과 혼합하기 위한 설명서를 포함한다.
본 발명의 키트에서, 변성 siRNA 및 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 보조제뿐만 아니라, 변성 siRNA, 약학 조성물, 제 1 siRNA 컨쥬게이트 및/또는 제 2 siRNA 컨쥬게이트 및/또는 컨쥬게이트, 및/또는 약학적으로 허용되는 보조제는 임의의 형태, 예를 들어 액체 형태, 건조 형태 또는 동결건조 형태로 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 변성 siRNA 및 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 보조제뿐만 아니라 약학 조성물 및/또는 컨쥬게이트 및 임의의 약학적으로 허용되는 보조제는 실질적으로 순수하고/하거나 멸균성이다. 일부 구현예에서, 멸균수가 본 발명의 키트에 제공될 수 있다.
유리한 효과
일부 구현예에서, 본원에 제공된 siRNA, siRNA 조성물 또는 siRNA 컨쥬게이트는 생체내에서 더 높은 안정성, 더 낮은 독성 및/또는 더 높은 활성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 siRNA, siRNA 조성물 또는 siRNA 컨쥬게이트는 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 생체내 HBV 유전자 발현의 억제율(inhibition percentage)을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 발명의 siRNA, siRNA 조성물 또는 siRNA 컨쥬게이트는 간에서 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 생체내 HBV 유전자 발현의 억제율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 발명의 siRNA, siRNA 조성물 또는 siRNA 컨쥬게이트는 동물 모델의 간에서 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 생체내 HBV 유전자 발현의 억제율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 발명의 siRNA, siRNA 조성물 또는 siRNA 컨쥬게이트는 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 생체내 HBV 표면 항원 발현의 억제율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중 가닥 올리고뉴클레오티드, 조성물 또는 올리고뉴클레오티드 컨쥬게이트는 유의한 표적외 효과를 보이지 않는다. 표적외 효과는, 예를 들어 표적 유전자가 아닌 유전자의 정상 발현의 억제일 수 있다. 표적외 유전자 발현의 결합/억제가 표적 활성보다 50%, 40%, 30%, 20% 또는 10% 더 낮으면, 표적외 효과는 유의하지 않은 것으로 간주한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 siRNA 컨쥬게이트는 보다 낮은 동물 수준의 독성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 siRNA 컨쥬게이트는 인간 혈장에서 최대 72 시간 동안 분해되지 않은 채로 유지될 수 있어, 인간 혈장에서 우수한 안정성을 보인다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 siRNA 컨쥬게이트는 시노몰구스 원숭이 혈장에서 최대 72 시간 동안 분해되지 않은 채로 유지될 수 있어, 원숭이 혈장에서 우수한 안정성을 보인다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 siRNA 컨쥬게이트는 인간 및 쥐 유래 리소좀 용해물 각각에서 적어도 24 시간 동안 분해되지 않은 채로 유지될 수 있어, 우수한 안정성을 보인다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 siRNA 컨쥬게이트는 간에서 특이적으로 유의하게 농축될 수 있고, 안정적으로 유지될 수 있어, 높은 정도의 표적화를 보인다.
일부 구현예에서, 상이한 시험 시점을 갖는 여러 실험에서, 본원에 제공된 siRNA 컨쥬게이트는 생쥐에서 HBV mRNA의 발현에 대한 높은 생체내 억제 활성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 siRNA 컨쥬게이트는 다양한 동물 모델에서 혈청 HBsAg에 대한 지속적이고 효율적인 억제 효율을 나타내어, 규칙적인 용량 의존성을 보인다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 siRNA 컨쥬게이트는 더 높은 시험관내 활성을 가질뿐만 아니라, 낮은 표적외 효과를 보인다.
이하, 제조예 및 실험예에 의해 본 발명을 추가로 설명하지만, 임의의 점에서 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
이하, 실시예를 참조하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 달리 명시하지 않는 한, 다음의 실시예에서 사용한 작용제 및 배양 배지는 모두 상업적으로 이용 가능하고, 핵산 전기 영동 및 실시간 PCR 등의 사용한 절차는 모두 분자 클로닝 (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))에 기재된 방법에 따라 수행된다.
달리 명시하지 않는 한, 아래에 제공된 시약의 비율은 모두 부피 비율 (v/v)로 계산된다.
HBV 유전자이식 생쥐 C57BL/6J-Tg (Alb1HBV) 44Bri/J: 북경 대학교 보건 과학센터 실험실 동물 과학부에서 구입하였다. 실험 전에 S/COV>10인 생쥐를 선택했고; 이하 때때로 44Bri 모델 생쥐로도 지칭한다;
HBV 유전자이식 생쥐: M-Tg HBV라 명명되고 상하이 보건소 동물부에서 구입하였다. 유전자이식 생쥐를 만드는 방법은 문헌 Ren J. 등의 in J. Medical Virology. 2006, 78:551-560에 기재되어 있고; 이하, 때때로 M-Tg 모델이라고도 지칭한다;
AAV-HBV 유전자이식 생쥐: rAAV8-1.3HBV, D형 (ayw) 바이러스 (Beijing FivePlus Molecular Medicine Institute Co. Ltd., 1Х1012 바이러스 게놈 (v.g.)/mL, 로트 번호 2016123011에서 구입)를 사용하여 문헌 방법 (Xiaoyan Dong 등의 Chin J Biotech 2010, May 25; 26(5): 679-686)에 따라 제조하였다. rAAV8-1.3HBV를 멸균 PBS로 5x1011 v.g./mL로 희석시켰다. 200 μL의 희석된 rAAV8-1.3HBV를 각 생쥐, 즉 생쥐 당 1Х1011 v.g로 주사하였다. HBsAg 및 HBV DNA의 검출용 혈청을 수집하기 위해 바이러스 주사 후 28 일에 모든 생쥐로부터 안와부 혈액 (약 100 μL)을 채취했다; 이하 AAV-HBV 모델 생쥐라고도 지칭한다;
저농도 AAV-HBV 유전자이식 생쥐: 전술한 바와 실질적으로 동일한 모델링 방법을 이용하고, 차이는 바이러스를 실험 전에 멸균 PBS로 1Х1011 v.g./mL로 희석한 점이다. 100 μL 바이러스를 각 생쥐, 즉 생쥐 당 1Х1010 v.g로 주사했다; 이하 때때로 AAV-HBV 저농도 생쥐 모델이라고도 지칭한다;
HBV 유전자이식 생쥐: C57BL/6-HBV, 변종명: Beijing Vitalstar Biotechnology Co., Ltd.에서 구입한 B6-Tg HBV/Vst (1.28 카피, 유전자형 A). COI>104인 생쥐를 실험 전에 선택했고; 이하 때때로 1.28 카피 모델이라고도 지칭한다.
제조예 1: 컨쥬게이트 1 내지 11의 제조
이 제조예에서, 컨쥬게이트 1 (이하 L10-siHBa1M1SVP 컨쥬게이트라고도 지칭함), 컨쥬게이트 2 (이하 L10-siHBa1M1SP 컨쥬게이트라고도 지칭함), 컨쥬게이트 3 (이하 L10-siHBa1M1SPsT 컨쥬게이트라고도 지칭함), 컨쥬게이트 4 (이하, L10-siHBa1M1SPs 컨쥬게
이트라고도 지칭함), 컨쥬게이트 5 (이하 L10-siHBa1M2S라고도 지칭함), 컨쥬게이트 6 (이하 L10-siHBa1M2S라고도 지칭함), 컨쥬게이트 7 (이하 L10-siHBa2M1S라고도 지칭함), 컨쥬게이트 8 (이하, L10-siHBa1M1S라고도 지칭함), 컨쥬게이트 9 (이하 L10-siHBa1M2S라고도 지칭함), 컨쥬게이트 10 (이하 L10-siHBa2M2S라고도 지칭함) 및 컨쥬게이트 11 (이하 L10- siHBa2M1S이라고도 지칭함)을 합성하였다. 상기 컨쥬게이트는 L-9 접합 분자를 각각 L10-siHBa1M1SVP, L10-siHBa1M1SP, L10-siHBa1M1SPsT, L10-siHBa1M1SPs, L10-siHBa1M2S, L10-siHBa1M2S, L10-siHBa2M1S, L10-siHBa1M1S, L10-siHBa1M2S), L10-siHBa2M2S, 또는 L10-siHBa2M1S로 번호를 매긴 siRNA와 각각 접합시켜 형성한 것들이다. 컨쥬게이트에서 접합된 siRNA 서열을 표 3에 나타내었다.
(1-1) 화합물 L-10의 합성:
다음의 방법에 따라 화합물 L-10을 합성했다:
Figure pct00055
(1-1-1) GAL-5 (접합 분자의 말단 세그먼트)의 합성
Figure pct00056
(1-1-1a) GAL-2의 합성
100.0 g의 GAL-1 (N-아세틸-D-갈락토사민 하이드로클로라이드, CAS 번호: 1772-03-8, Ningbo Hongxiang Bio-Chem Co., Ltd.에서 구입, 463.8 mmol)을 1000 ml의 무수 피리딘에 용해시키고, 아세트산 무수물 540 ml (Enox Inc.에서 구입, 5565.6 mmol)를 빙수조에 첨가하여 실온에서 1.5 시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 생성된 반응액을 10 L의 빙수에 붓고 감압하에 흡인 여과하였다. 잔류물을 2 L의 빙수로 세척한 후, 완전히 용해될 때까지 아세토니트릴/톨루엔의 혼합 용매 (v/v 비=1:1)를 첨가하였다. 용매를 증발시켜 제거하여 130.0 g의 산물 GAL-2를 백색 고체로서 얻었다.
(1-1-1b) GAL-3의 합성
단계 (1-1-1a)에서 얻어진 GAL-2 (35.1 g, 90.0 mmol)를 213 ml의 무수 1,2-디클로로에탄에 용해시키고, 24.0 g의 TMSOTf (CAS 번호: 27607-77-8, Macklin Inc.에서 구입, 108.0 mmol)을 질소 대기하에 빙수조에 첨가하여 실온에서 밤새 반응시켰다.
반응액에 디클로로메탄 400 ml를 첨가하여 희석시키고, 규조토로 여과한 후, 1 L의 포화 중탄산 나트륨 수용액을 첨가하고 균일하게 교반하였다. 유기상을 분리하였다. 남아 있는 수성상을 각각 300 ml의 디클로로에탄으로 2회 추출하고, 모든 유기상을 합한 뒤 300 ml의 포화 중탄산 나트륨 수용액 및 300 ml의 포화 식염수로 각각 세척하였다. 세척된 유기상을 분리하고 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 담황색 점성 시럽으로서 26.9 g의 산물 GAL-3을 얻었다.
(1-1-1c) GAL-4의 합성
단계 (1-1-1b)에서 얻어진 GAL-3 (26.9 g, 81.7 mmol)을 무수 1,2-디클로로에탄 136 ml에 용해시키고, 30 g의 건조 4Å 분자체 분말 및 이어서 9.0 g의 5-헥센-1-올 (CAS 번호: 821-41-0, Adamas-beta Inc.에서 구입, 89.9 mmol)을 첨가한 후, 실온에서 30 분 동안 교반하였다. 9.08 ml의 TMSOTf (40.9 mmol)를 질소 대기하에 얼음조에 첨가하여 실온에서 교반하면서 밤새 반응시켰다. 4Å 분자체 분말을 여과에 의해 제거하였다. 여액에 300 ml의 디클로로에탄을 첨가하여 희석시키고, 규조토로 여과한 다음, 500 ml의 포화 중탄산 나트륨 수용액을 첨가하고 10 분 동안 교반하여 세척하였다. 유기상을 분리하였다. 수성상을 300 ml의 디클로로에탄으로 1회 추출하였다. 모든 유기상을 합한 뒤 300 ml의 포화 중탄산 나트륨 수용액 및 300 ml의 포화 식염수로 각각 세척하였다. 세척된 유기상을 분리하고 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 41.3 g의 산물 GAL-4를 황색 시럽으로서 얻었으며, 이를 정제없이 다음 산화 반응에 직접 사용하였다.
(1-1-1d) GAL-5의 합성
단계 (1-1-1c)에 기재된 방법에 따라 얻어진 GAL-4 (14.9 g, 34.7 mmol)를 77 ml의 디클로로메탄 및 77 ml의 아세토니트릴의 혼합 용매에 용해시키고, 103 ml의 탈이온수 및 29.7 g의 과요오드산 나트륨 (CAS 번호: 7790-28-5, Aladdin Inc.에서 구입, 138.8 mmol)을 각각 첨가한 후, 10 분 동안 얼음조에서 교반하였다. 루테늄 트리클로라이드 (CAS 번호: 14898-67-0, Energy Chemical에서 입수 가능함, 238 mg, 1.145 mmol)를 첨가하여 실온에서 밤새 반응시켰다. 300 ml의 물을 첨가하여 생성된 반응액을 교반하면서 희석시키고, 포화 중탄산 나트륨을 첨가하여 pH를 약 7.5로 조절하였다. 유기상을 분리해서 폐기하였다. 수성상을 각각 200 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하고, 추출된 유기상을 폐기하였다. 추출된 수성상을 시트르산 고체로 약 pH 3 으로 조절해서 각각 200 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하고, 생성된 유기상을 합한 뒤 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 6.5 g의 산물 GAL-5를 백색 발포성 고체로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.01 (br, 1H), 7.83 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 5.21 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 4.96 (dd, J = 11.2, 3.2 Hz, 1H), 4.49 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.07-3.95 (m, 3H), 3.92-3.85 (m, 1H), 3.74-3.67 (m, 1H), 3.48-3.39 (m, 1H), 2.20 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.11 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.90 (s, 3H), 1.77 (s, 3H), 1.55-1.45 (m, 4H).
(1-1-2) M-11-T3의 합성:
Figure pct00057
J-0 (1.883 g, 10 mmol, Alfa Aesar에서 구입)을 25 ml의 아세토니트릴에 용해시키고, 트리에틸아민 (4.048 g, 40 mmol)을 첨가한 후, 빙수조에서 0℃로 냉각시켰다. 에틸 트리플루오로아세테이트 (5.683 g, 40 mmol)를 첨가하여 실온에서 22 시간 동안 반응시켰다. 용매를 감압하에 증발시켜 제거하고, 잔류물을 진공 오일 펌프에서 18 시간 동안 발포 건조시켜 5.342 g의 조 고체 산물 M-11-T3을 얻었으며, 이를 추가 정제없이 후속 반응에 직접 사용하였다. C15H22F9N4O3, [M+H]+, 계산값: 477.35, 측정값: 477.65.
(1-1-3) M-11-T3-Tr의 합성:
Figure pct00058
조 산물 M-11-T3 (5.342 g, 10 mmol)을 50 ml의 디클로로메탄에 용해시켰다. 생성된 반응액에 TrCl (3.345 g, 12 mmol) 및 트리에틸아민 (1.518 g, 15 mmol)을 첨가하여 실온에서 20 시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응액을 20 ml의 포화 중탄산 나트륨으로 각각 2회, 20 ml의 포화 식염수로 1회 세척하였다. 생성된 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하였다. 유기 용매를 감압하에 증발시켜 제거하고, 잔류물을 진공 오일 펌프에서 밤새 발포 건조시켜 7.763 g의 조 고체 산물 M-11-T3-Tr을 얻었다. MS m/z: C34H36F9N4O3, [M+Na] +, 계산값: 741.25, 측정값: 741.53. 이어서 조 고체 산물 M-11-T3-Tr을 정제없이 다음 단계에서 M-18-Tr의 합성에 사용하였다.
(1-1-4) M-18-Tr의 합성:
Figure pct00059
단계 (1-1-3)에서 얻어진 조 산물 M-11-T3-Tr (7.763 g, 10 mmol)을 100 ml의 메탄올에 용해시키고, 메틸아민 수용액 (40 질량%) 100 ml를 첨가하였다. 50℃에서 23 시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 불용성 입자를 여과로 제거하였다. 용매를 감압하에 증발시키고, 잔류물에 부피비 1:1의 DCM: 메탄올의 혼합 용매 200 ml를 첨가하고, 50 ml의 포화 중탄산 나트륨으로 세척하였다. 수성상을 각각 50 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 모든 유기상을 합한 뒤 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하였다. 용매를 감압하에 증발시켜 제거하고, 잔류물을 진공 오일 펌프에서 밤새 발포 건조시킨 후, 정상상 실리카 겔 칼럼 (200-300 메쉬)을 사용하여 정제하였다. 칼럼을 석유 에테르로 채우고 실리카 겔의 산도를 중화시키기 위해 1 중량%의 트리에틸아민을 첨가하고, 디클로로메탄: 메탄올: 수성 암모니아 (25 중량%)=1:1:0.05 내지 1:1:0.25의 구배 용리로 용리시켰다. 용출액을 수집하고, 용매를 감압하에 증발시켜 제거한 후, 잔류물을 진공 오일 펌프에서 발포 건조시켜 2.887g의 순수한 산물 M-18-Tr을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ7.47-7.39 (m, 6H), 7.32-7.24 (m, 6H), 7.19-7.12 (m, 3H), 2.60-2.47 (m, 4H), 2.46-2.19 (m, 13H), 1.70-1.55 (m, 4H), 1.40 (p, J=6.8 Hz, 2H). MS m/z: C28H39N4, [M+H]+, 계산값: 431.65, 측정값: 432.61.
(1-1-5) L-5-Tr의 합성:
Figure pct00060
단계 (1-1-4)에서 얻은 M-18-Tr (2.02 g, 4.69 mmol) 및 단계 (1-1-1)에서 얻은 GAL-5 (6.93 g, 15.48 mmol)를 혼합해 47 ml의 아세토니트릴에 용해시킨 후, N-메틸모르폴린 (3.13 g, 30.96 mmol) 및 4-(4,6-디메톡시트리아진-2-일)-4-메틸모르폴린 하이드로클로라이드 (DMTMM, 4.28 g, 15.48 mmol)를 첨가하여 실온에서 교반하면서 2 시간 동안 반응시켰다. 생성된 반응액을 200 ml의 디클로로메탄으로 희석시켰다. 유기상을 100 ml의 포화 중탄산 나트륨 용액 및 100 ml의 포화 식염수로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켜 여과하였다. 이어서, 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 조 산물을 얻었다. 조 산물을 정상상 실리카 겔 칼럼 (200-300 메쉬)을 사용하여 정제하였다. 칼럼을 석유 에테르로 채운 뒤, 실리카 겔의 산도를 중화시키기 위해 1 중량%의 트리에틸아민을 첨가하고, 디클로로메탄: 메탄올=100:5 내지 100:7의 구배 용리로 용리시켰다. 용출액을 수집하고, 감압하에 증발 건조시켜 7.49 g의 순수한 산물 L-5-Tr을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ7.83-7.10 (m, 4H), 7.67-7.60 (m, 1H), 7.44-7.34 (m, 6H), 7.33-7.24 (m, 6H), 7.20-7.15 (m, 3H), 5.22 (s, 3H), 4.97 (d, J = 11.3 Hz, 3H), 4.49 (d, J = 8.4 Hz, 3H), 4.06-3.07 (m, 9H),3.95-3.83 (m, 3H), 3.77-3.64 (m, 3H), 3.45-3.35 (m, 3H), 3.12-2.87 (m, 8H), 2.30-2.15 (m, 3H), 2.11-1.98 (m, 22H), 1.95-1.84 (m, 11H), 1.81-1.61 (m, 14H), 1.54-1.36 (m, 14H).MS m/z: C85H119N7O30, [M+H]+, 계산값: 1718.81, 측정값: 1718.03.
(1-1-6) L-8의 합성:
Figure pct00061
단계 (1-1-5)에서 얻어진 L-5-Tr (5.94 g, 3.456 mmol)을 69 ml의 디클로로메탄에 용해시키고, 디클로로 아세트산 (13.367 g, 103.67 mmol)을 첨가하여 실온에서 2 시간 동안 반응시켰다. 100 ml의 디클로로메탄을 첨가하여 생성된 반응액을 희석시키고, 세척하여 포화 중탄산 나트륨 용액에 의해 pH 7-8로 조절하였다. 분리된 수성상을 각각 30 ml의 디클로로메탄으로 6회 추출하였다. 모든 유기상을 합한 뒤 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하였다. 이어서, 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 조 산물을 얻었다. 조 산물을 정상상 실리카 겔 칼럼 (200-300 메쉬)을 사용하여 정제하였다. 실리카 겔의 산도를 중화시키기 위해 컬럼에 10 중량%의 트리에틸아민을 첨가하고 1 중량‰의 트리에틸아민으로 평형화시킨 후, 디클로로메탄: 메탄올=100:30 내지 100:40의 구배 용리로 용리시켰다. 용출액을 수집하고, 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 4.26 g의 순수한 산물 L-8을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.84 (d, J = 9.0 Hz, 3H), 7.27-7.23 (m, 1H), 7.13-7.18 (m, 1H), 5.22 (d, J = 3.1 Hz, 3H), 4.97 (dd, J = 11.3, 3.1 Hz, 3H), 4.48 (d, J = 8.4 Hz, 3H), 4.09-3.98 (m, 9H), 3.88 (dd, J = 19.3, 9.3 Hz, 3H), 3.75-3.66 (m, 3H), 3.44-3.38 (m, 3H), 3.17-3.30 (m, 4H), 3.10-2.97 (m, 4H), 2.35-2.20 (m, 6H), 2.15-2.08 (m, 9H), 2.07-1.98 (m, 13H), 1.94-1.87 (m, 9H), 1.81-1.74 (m, 9H), 1.65-1.42 (m, 18H).MS m/z: C85H119N7O30, [M+H]+, 계산값: 1477.59, 측정값: 1477.23.
(1-1-7a) A-1의 합성
Figure pct00062
DMTrCl (4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드, 38.12 g, 112.5 mmol)을 450 ml의 무수 피리딘에 용해시키고, 칼슘 DL-글리세레이트 수화물 (12.88 g, 45.0 mmol)을 첨가하여 45℃에서 22 시간 동안 반응시켰다. 반응액을 여과하였다. 잔류물을 200 ml의 DCM으로 세정하고, 여액을 감압하에 농축하여 건조시켰다. 잔류물을 500 ml의 디클로로메탄에 재용해시키고 각각 200 ml의 0.5 M 트리에틸아민 포스페이트 (pH=7-8)로 2회 세척하였다. 분리된 수성상을 각각 200 ml의 디클로로메탄으로 2회 추출하였다. 모든 유기상을 합한 뒤 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하였다. 용매를 감압하에 증발시켜 제거하고, 잔류물을 석유 에테르: 에틸 아세테이트: 디클로로메탄: 메탄올=1:1:1:0.35 내지 1:1:1:0.55의 구배 용리로 용리하는 정상상 실리카 겔 칼럼 (200-300 메쉬)을 사용하여 정제하였다. 용출액을 수집하고, 용매를 감압하에 증발시켜 제거하였다. 잔류물을 500 ml의 디클로로메탄에 재용해시키고, 200 ml의 0.5 M 트리에틸아민 포스페이트로 1회 세척하였다. 분리된 수성상을 각각 200 ml의 디클로로메탄으로 2회 추출하였다. 모든 유기상을 합한 뒤 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하였다. 용매를 감압(진공 오일 펌프내 감압)하에 증발시켜 제거하고 밤새 건조시켜 20.7 g의 산물 A-1을 백색 고체로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.46 (ddd, J = 6.5, 2.3, 1.1 Hz, 1H), 7.40-7.28 (m, 7H), 6.89-6.81 (m, 4H), 4.84 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.36-4.24 (m, 1H), 4.29 (s, 6H), 3.92 (dd, J=12.4, 7.0 Hz, 1H), 3.67 (dd, J=12.3, 7.0 Hz, 1H), 2.52 (q, J=6.3 Hz, 6H), 1.03 (t, J=6.3 Hz, 9H). MS m/z: C24H23O6, [M-H]-, 계산값: 407.15, 측정값: 406.92.
(1-1-7b) L-7의 합성:
Figure pct00063
단계 (1-1-6)에서 얻어진 L-8 (2.262 g, 1.532 mmol) 및 단계 (1-1-7a)에서 얻은 A-1 (2.342 g, 4.596 mmol)을 혼합해 16 ml의 디클로로메탄에 용해시킨 후, 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리진-4(3H)-온 (DEPBT, 1.375 g, 4.596 mmol)을 첨가하고, 디이소프로필에틸아민 (1.188 g, 9.191 mmol)을 첨가하여 교반하면서 2 시간 동안 25℃에서 반응시켰다. 유기상을 10 ml의 포화 중탄산 나트륨으로 세척하였다. 분리된 수성상을 각각 10 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 모든 유기상을 합한 뒤 10 ml의 포화 식염수로 세척하고, 분리된 수성상을 각각 10 ml의 디클로로메탄으로 2회 추출하고, 얻어진 유기상을 합한 뒤 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하였다. 용매를 감압하에 증발시켜 제거하고, 잔류물을 진공 오일 펌프에서 밤새 발포 건조시켜 4.900 g의 조 산물을 얻었다. 조 산물에 컬럼 정제를 실시하였다. 컬럼에 120 g의 정상상 실리카 겔 (200-300 메쉬)을 채운 뒤, 실리카 겔의 산도를 중화시키기 위해 20 ml의 트리에틸아민을 첨가하고, 1 중량%의 트리에틸아민을 포함하는 석유 에테르로 평형화시킨 후, 석유 에테르: 에틸 아세테이트: 디클로로메탄: N,N-디메틸포름아미드=1:1:1:0.5 내지 1:1:1:0.6의 구배 용리로 용리시켰다. 용출액을 수집하고, 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 2.336 g의 순수한 산물 L-7을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ7.90-7.78 (m, 4H), 7.75-7.64 (m, 1H), 7.38-7.18 (m, 9H), 6.91 - 6.83 (m, 4H), 5.25-5.10 (m, 4H), 4.97 (dd, J=11.2, 3.2 Hz, 3H), 4.48-4.30 (m, 4H), 4.02 (s, 9H), 3.93-3.84 (m, 3H), 3.76-3.66 (m, 9H), 3.45-3.35 (m, 3H), 3.24-2.98 (m, 10H), 2.30-2.20 (m, 2H), 2.11-1.88 (m, 31H), 1.80-1.40 (m, 28H).MS m/z: C90H128N7O35, [M-DMTr]+, 계산값: 1564.65, 측정값: 1564.88.
(1-1-8) L-9 접합 분자의 합성:
Figure pct00064
단계 (1-1-7b)에서 얻어진 L-7 (2.300 g, 1.26 mmol), 숙신산 무수물 (0.378 g, 3.78 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP, 0.462 g, 3.78 mmol)을 혼합해 13 ml의 디클로로메탄에 용해시킨 후, DIPEA (0.814 g, 6.30 mmol)를 추가로 첨가하고, 25℃에서 24 시간 동안 교반하였다. 반응액을 5 ml의 0.5 M 트리에틸아민 포스페이트로 세척하였다. 수성상을 각각 5 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 모든 유기상을 합한 뒤, 용매를 감압하에 증발시켜 2.774 g의 조 산물을 얻었다. 조 산물에 컬럼 정제를 실시하였다. 칼럼에 60 g의 정상상 실리카 겔 (200-300 메쉬)을 채운 뒤, 실리카 겔의 산도를 중화시키기 위해 1 중량%의 트리에틸아민을 첨가하고, 디클로로메탄으로 평형화시킨 후, 1 중량‰의 트리에틸아민-함유 디클로로메탄: 메탄올=100:18 내지 100:20의 구배 용리로 용리시켰다. 용출액을 수집하고, 용매를 감압하에 증발시켜 1.874 g의 순수한 L-9 접합 분자 산물을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.58 (d, J=4.2 Hz, 1H), 7.94-7.82 (m, 3H), 7.41-7.29 (m, 5H), 7.22 (d, J = 8.1 Hz, 5H), 6.89 (d, J=8.3 Hz, 4H), 5.49-5.37 (m, 1H), 5.21 (d, J = 3.0 Hz, 3H), 4.97 (d, J=11.1 Hz, 3H), 4.49 (d, J=8.2 Hz, 3H), 4.02 (s, 9H), 3.88 (dd, J=19.4, 9.4 Hz, 3H), 3.77-3.65 (m, 9H), 3.50-3.39 (m, 6H), 3.11-2.90 (m, 5H), 2.61-2.54 (m, 4H), 2.47-2.41 (m, 2H), 2.26-2.17 (m, 2H), 2.15-1.95 (m, 22H), 1.92-1.84 (m, 9H), 1.80-1.70 (m, 10H), 1.65-1.35 (m, 17H), 1.31-1.19 (m, 4H), 0.96 (t, J=7.1 Hz, 9H). MS m/z: C94H132N7O38, [M-DMTr]+, 계산값: 1664.72, 측정값: 1665.03.
(1-1-9) 화합물 L-10의 합성:
Figure pct00065
이 단계에서, L-9 접합 분자를 고상 지지체에 연결하여 화합물 L-10을 제조하였다.
단계 (1-1-8)에서 얻어진 L-9 접합 분자 (0.233 g, 0.1126 mmol), O-벤조트리아졸-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU, 0.064 g, 0.1689 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (DIEA, 0.029 g, 0.2252 mmol)을 혼합해 19 ml의 아세토니트릴에 용해시킨 후, 실온에서 5 분 동안 교반하였다. 아미노메틸 수지 (0.901 g, 100-200 메쉬, 아미노 로딩: 400 μmol/g, Tianjin Nankai HECHENG S&T Co.에서 구입)를 반응액에 첨가하였다. 25℃에서 220 rpm/분으로 15 시간 동안 진탕기에서 반응을 수행한 후, 여과하였다. 잔류물을 각각 30 ml의 DCM으로 2회, 각각 30 ml의 아세토니트릴로 3회 및 30 ml의 에틸 에테르로 1회 세정하고, 진공 오일 펌프로 2 시간 동안 건조시켰다. 이어서, 표 2에 나타낸 충전비에 따라 출발 물질 (CapA, CapB, 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP) 및 아세토니트릴)을 첨가하여 캡핑 반응을 수행하였다. 25℃에서 200 rpm/분으로 5 시간 동안 진탕기에서 반응을 수행하였다. 반응액을 여과하였다. 잔류물을 각각 30 ml의 아세토니트릴로 3회 세정하고, 용매를 증발 건조시키고, 혼합물을 진공 오일 펌프로 감압하에 밤새 건조시켜 90.8 μmol/g의 로딩으로, 1.100 g의 화합물 L-10 (즉, 고상 지지체에 연결된 L-9 접합 분자)을 얻었다.
캡핑 반응의 충전비
출발 물질 양 수준 로트 번호 제조사
CapA 20 ml ―― ―― ――
CapB 2.3 ml ―― ―― ――
DMAP 0.01 g 분석적 순도 I1422139 Aladdin
아세토니트릴 2.3 ml 분광학적 순도 O15161001 CINC (Shanghai) Co., Ltd
상기 표에서, CapA 및 CapB는 캡핑제의 용액이다. CapA는 피리딘/아세토니트릴의 혼합물 내 20 부피%의 N-메틸이미다졸의 용액이고, 상기 피리딘 대 아세토니트릴의 부피비는 3: 5이다. CapB는 아세토니트릴내 20 부피%의 아세트산 무수물의 용액이다.
(1-2) 컨쥬게이트 1 내지 11의 센스 가닥의 합성
상기 단계에서 제조된 화합물 L-10에서 사이클을 시작하여, 포스포라미다이트 고상 합성방법에 의해 뉴클레오시드 단량체를 센스 가닥에서 뉴클레오티드의 배열 순서에 따라 3'에서 5' 방향으로 하나씩 연결하였다. 각 뉴클레오시드 단량체의 연결에는 탈보호, 결합, 캡핑 및 산화 또는 황화의 4 단계 반응이 포함되었다. 여기에, 2개의 뉴클레오티드가 포스포에스테르 연결을 통해 연결되는 경우, 탈보호, 결합, 캡핑 및 산화의 4 단계 반응은 이후 뉴클레오시드 단량체의 연결 동안 포함되었고; 2개의 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 연결을 통해 연결되는 경우, 탈보호, 결합, 캡핑 및 황화의 4 단계 반응은 이후 뉴클레오시드 단량체의 연결 동안 포함되었다. 합성 조건은 다음과 같이 주어졌다.
뉴클레오시드 단량체는 0.1 M 아세토니트릴 용액으로 제공된다. 각 단계에서 탈보호 반응의 조건은 동일하며, 다시 말해 온도 25℃, 반응시간 70 초, 탈보호제로서 디클로로메탄 내 디클로로 아세트산 용액(3% v/v), 및 디클로로 아세트산 대 4,4'-디메톡시트리틸의 고상 지지체상 보호기의 몰비는 5:1이다.
각 단계에서 결합 반응 조건은, 온도 25℃, 고상 지지체에 연결된 핵산 서열 대 뉴클레오시드 단량체의 몰비 1:10, 고상 지지체에 연결된 핵산 서열 대 결합제의 몰비 1:65, 반응시간 600 초, 및 결합제로서 5-에틸티오-1H-테트라졸의 0.5M 아세토니트릴 용액을 포함하여 동일하다.
각 단계에서 캡핑 반응의 조건은, 온도 25℃, 반응시간 15 초, 캡핑제로서 몰비 1:1의 CapA 및 CapB의 혼합 용액, 및 캡핑제 대 고상 지지체에 연결된 핵산 서열의 몰비 1:1:1 (무수물: N-메틸이미다졸: 고상 지지체에 연결된 핵산 서열)을 포함하여 동일하다.
각 단계에서 산화 반응의 조건은, 온도 25℃, 반응시간 15 초, 및 산화제로서 0.05M 요오드 수; 및 결합 단계에서 요오드 대 고상 지지체에 연결된 핵산 서열의 몰비 30:1을 포함하여 동일하다. 반응은 테트라하이드로푸란: 물: 피리딘의 비율이 3:1:1인 혼합 용매에서 수행된다.
각 단계에서 황화 반응의 조건은, 온도 25℃, 반응시간 300 초, 및 황화제로서 크산탄 수소화물; 및 결합 단계에서 황화제 대 고상 지지체에 연결된 핵산 서열의 몰비 120:1을 포함하여 동일하다. 반응은 아세토니트릴: 피리딘의 비율이 1:1인 혼합 용매에서 수행된다.
절단 및 탈보호 조건은 다음과 같다: 지지체에 연결된 합성 뉴클레오티드 서열을 25 중량% 암모니아수에 첨가하여 55℃에서 16 시간 동안 반응시키고, 이때 수성 암모니아는 0.5 ml/μmol의 양으로 존재한다. 액체를 제거하고, 잔류물을 진공에서 농축하여 건조시켰다.
정제 및 탈염: 핵산의 정제는 NaCl의 구배 용리를 통해, 제조용 이온 크로마토그래피 칼럼 (소스 15Q)을 사용하여 달성된다. 구체적으로, 용출액 A: 20 mM 인산 나트륨 (pH 8.1), 용매: 물/아세토니트릴=9:1 (v/v); 용출액 B:1.5 M 염화나트륨, 20 mM 인산 나트륨 (pH 8.1), 용매: 물/아세토니트릴=9:1 (v/v); 용리 구배: 용출액 A: 용출액 B=100:0 내지 50:50. 용출액은 역상 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 수집하고, 혼합 및 탈염된다. 구체적인 조건은 탈염을 위해 Sephadex 컬럼 (충전재: Sephadex-G25)을 사용하고 용리를 위해 탈이온수를 사용하는 것을 포함한다.
검출: 순도는 이온 교환 크로마토그래피 (IEX-HPLC)에 의해 측정했고; 분자량은 액체 크로마토그래피-질량 분석 (LC-MS)에 의해 분석하였다.
(1-3) 컨쥬게이트 1 내지 11의 안티센스 가닥의 합성
(1-3A) 컨쥬게이트 1, 6 및 11의 안티센스 가닥의 제조
고상 포스포라미다이트 합성에 따라 범용 고상 지지체 (UnyLinkerTM 로딩된 NittoPhase®HL 고체 지지체, Kinovate Life Sciences Inc.)를 사용하여 사이클을 시작함으로써, 컨쥬게이트 1 및 2의 안티센스 가닥 (AS)을 합성하였다. 고상 합성방법에서의 탈보호, 결합, 캡핑, 산화 또는 황화, 절단, 탈보호, 정제 및 탈염 반응은 센스 가닥의 합성과 동일한 조건하에 수행하였다.
상기, 비닐 포스페이트 및 2'-메톡시 변성 우리딘 단량체 (VP-Um)는 다음과 같은 방법으로 합성된다:
Figure pct00066
(1-3-1) VP-U-2의 합성
VP-U-2 분자를 다음의 방법에 따라 합성했다:
Figure pct00067
2'-메톡시 변성 우라실 뉴클레오시드 (2'-OMe-U, 51.30 g, 91.6 mmol), 3차-부틸 디페닐클로로실란 (TBDPSCl, 50.35 g, 183.2 mmol) 및 이미다졸 (12.47 g, 183.2 mmol)을 혼합해 450ml의 N,N-디메틸포름아미드 (DMF)에 용해시켜 실온에서 20 시간 동안 교반하면서 반응시켰다. DMF를 증발시켜 제거하고, 잔류물을 600 ml의 디클로로메탄에 용해시킨 후 300 ml의 포화 중탄산 나트륨으로 세척하였다. 분리된 수성상을 각각 300 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 모든 유기상을 합한 뒤, 수성상의 pH가 <5가 될 때까지 5% 옥살산으로 세척하였다. 용매를 증발 건조시켜 VP-U-1의 조 산물을 얻었으며, 이는 후속 VP-U-2의 합성에 직접 사용하였다.
조 산물 VP-U-1을 100 ml의 디클로로메탄에 용해시킨 후, 얼음조에서 10 분 동안 교반하였다. 4℃의 냉장고에서 예냉된 450 ml의 2% p-톨루엔술폰산 용액을 (부피비 3: 7의 메탄올 및 디클로로메탄의 혼합 용매와 함께) 첨가하고 10 분 동안 반응시켰다. 200 ml의 포화 중탄산 나트륨을 첨가하여 반응을 종결시켰다. pH=8로 포화 중탄산 나트륨 용액을 첨가하여 얻어진 유기상을 세척하였다. 수성상을 합한 뒤 각각 200 ml의 디클로로메탄으로 2회 추출하였다. 모든 유기상을 합한 뒤 200 ml의 포화 식염수로 1회 세척하였다. 용매를 증발시켜 제거하고, 잔류물을 정상상 실리카 겔 칼럼 (200-300 메쉬)을 사용하여 정제하였다. 칼럼을 석유 에테르로 채우고 석유 에테르: 에틸 아세테이트: 디클로로메탄: 메탄올=1:1:1:0.05 내지 1:1:1:0.25의 구배 용리로 용리시켰다. 용출액을 수집하고, 용매를 감압하에 증발시켜 제거한 후, 잔류물을 진공 오일 펌프에서 발포 건조시켜 총 40.00 g의 순수한 산물 VP-U-2를 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.96 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.64 (dtd, J=5.1, 4.0, 2.2 Hz, 4H), 7.41-7.30 (m, 6H), 6.79 (d, J=4.7 Hz, 1H), 5.73 (d, J=7.6 Hz, 1H), 4.94 (t, J=7.0 Hz, 1H), 4.12 (td, J=4.6, 3.9 Hz, 1H), 4.05 (dd, J=4.8, 4.0 Hz, 1H), 3.96 (t, J=4.7 Hz, 1H), 3.68 (ddd, J=11.8, 7.0, 4.6 Hz, 1H), 3.57-3.46 (m, 1H), 3.39 (s, 3H), 1.05 (s, 8H). MS m/z: C26H33N2O6Si, [M+H]+, 계산값: 497.21, 측정값: 497.45.
(1-3-2) VP-U-4의 합성:
Figure pct00068
VP-U-2 (19.84 g, 40.0 mmol), 디시클로헥실카르보디이미드 (DCC, 16.48 g, 80.0 mmol), 피리딘 (4.20 g, 53.2 mmol) 및 트리플루오로 아세트산 (6.61 g, 53.2 mmol)을 혼합해 200 ml의 디메틸 설폭사이드 (DMSO)에 용해시켜 실온에서 20 시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 별도로, 테트라에틸 메틸렌디포스페이트 (21.44 g, 74.4 mmol)를 120 ml의 THF에 용해시키고, 얼음조에서 냉각시킨 후, 얼음조의 온도에서 t-BuOK (11.36 g, 101.2 mmol)를 첨가하고 10 분 동안 반응시킨 뒤, 실온으로 가온하여 0.5 시간 동안 반응시키고 약 1 시간에 걸쳐 상기 반응액에 첨가하였다. 얼음조의 온도에서 1 시간 동안 반응을 수행한 다음, 실온으로 가온하여 18 시간 동안 반응시켰다. 물을 첨가하여 반응을 종결하였다. 분리된 수성상을 각각 200 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 모든 유기상을 합한 뒤 200 ml의 포화 식염수로 1회 세척하였다. 용매를 증발 건조시키고, 잔류물을 정상상 실리카 겔 칼럼 (200-300 메쉬)을 사용하여 정제하였다. 컬럼을 석유 에테르로 채우고 석유 에테르: 에틸 아세테이트=1:1 내지 1:4의 구배 용리로 용리시켰다. 용출액을 수집하고, 용매를 감압하에 증발시켜 제거한 후, 잔류물을 진공 오일 펌프에서 발포 건조시켜 총 14.00 g의 순수한 산물 VP-U-4를 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.96 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.64 (dtd, J = 5.1, 4.0, 2.2 Hz, 4H), 7.41 - 7.30 (m, 6H), 6.82 - 6.71 (m, 2H), 5.90 (ddd, J = 25.9, 15.0, 1.0 Hz, 1H), 5.73 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.36 - 4.21 (m, 3H), 4.18 (t, J = 4.9 Hz, 1H), 4.05 (ddq, J = 9.7, 8.5, 6.9 Hz, 2H), 3.87 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 3.39 (s, 3H), 1.32 (td, J = 6.9, 0.7 Hz, 6H), 1.05 (s, 8H). MS m/z: C31H42N2O8PSi, [M+H]+, 계산값: 629.24, 측정값: 629.51.
(1-3-3) VP-U-5의 합성:
Figure pct00069
VP-U-4 (14.00 g, 22.29 mmol)를 100 ml의 테트라하이드로푸란에 용해시키고, 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드 (17.96 g, 111.45 mmol)를 첨가한 후, 실온에서 20 시간 동안 교반하여 완전히 반응시켰다. 용매를 직접 증발 건조시키고 잔류물을 디클로로메탄에 용해시켰다; 상기 증발 및 용해 단계를 각각 50 ml의 디클로로메탄으로 2회 추가로 반복하여 조 산물을 얻었다. 조 산물을 정상상 실리카 겔 칼럼 (200-300 메쉬)을 사용하여 정제하였다. 칼럼을 석유 에테르로 채우고 석유 에테르: 에틸 아세테이트: 디클로로메탄: 메탄올=1:1:1:0.05 내지 1:1:1:0.25의 구배 용리로 용리시켰다. 용출액을 수집하고, 용매를 감압하에 증발시켜 제거한 후, 잔류물을 진공 오일 펌프에서 발포 건조시켜 총 6.70 g의 순수한 산물 VP-U-5를 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.96 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 6.77 (dd, J = 15.0, 6.2 Hz, 1H), 5.99 - 5.82 (m, 2H), 5.73 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 5.27 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 5.10 (dd, J = 5.3, 4.7 Hz, 1H), 4.29 (ddq, J = 9.8, 8.6, 7.0 Hz, 2H), 4.17 (ddd, J = 6.2, 5.2, 1.0 Hz, 1H), 4.12 - 3.98 (m, 3H), 3.39 (s, 2H), 1.32 (td, J = 6.9, 0.6 Hz, 6H). MS m/z: C15H24N2O8P, [M+H]+, 계산값: 391.13, 측정값: 391.38.
(1-3-4) VP-U-6의 합성:
Figure pct00070
VP-U-5 (391 mg, 1.0 mmol), 피리딘 트리플루오로아세테이트 (0.232 g, 1.2 mmol), N-메틸이미다졸 (0.099 g, 1.2 mmol) 및 비스(디이소프로필아미노)(2-시아노에톡시)포스핀 (0.452 g, 1.5 mmol)를 아르곤 대기하에 10 ml의 무수 디클로로메탄에 첨가하고, 실온에서 5 시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 용매를 증발 건조시킨 후, 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (200-300 메쉬 정상상 실리카 겔, 디클로로메탄: 아세토니트릴 (0.5 중량%의 트리에틸아민 함유)=3:1 내지 1:3의 구배 용리를 지님)로 정제하였다. 용출액을 수집하고 농축한 뒤 용매를 제거하여 총 508 mg의 표적 산물 VP-U-6을 얻었다. 31P NMR (161 MHz, DMSO-d6) δ 150.34, 150.29, 17.07, 15.50. MS m/z: C24H41N4O9P2, [M+H]+, 계산값: 591.23, 측정값: 591.55. VP-U-6은 뉴클레오시드 단량체로서 RNA 가닥의 합성에 관여하는 표적 산물 VP-Um인 것으로 나타났다.
(1-3B) 컨쥬게이트 2 및 10의 안티센스 가닥의 제조
컨쥬게이트 2 및 10의 안티센스 가닥은 단지 첫번째 5'-말단의 뉴클레오티드 변성이 컨쥬게이트 1 및 11의 안티센스 가닥과 상이하다. 고상 포스포라미다이트 합성 방법에 따른 안티센스 가닥의 제조 동안, 연결될 마지막 뉴클레오시드 단량체로서 2'-메톡시 변성 우리딘 단량체의 연결 후, 화학식 (CPR-I)의 단량체 (Suzhou GenePharma Inc.에서 Cat#13-2601-XX로 구입)을 탈보호, 결합, 캡핑 및 산화의 4 단계 반응에 의해 안티센스 가닥의 5' 말단에 연결시켜, 5'-포스페이트 에스테르 변형을 형성하였다.
Figure pct00071
합성 동안, 사용되는 범용 고상 지지체, 탈보호, 결합, 캡핑, 산화 또는 황화 반응, 절단 및 탈보호, 정제 및 탈염의 조건은 센스 가닥의 합성에 사용된 조건과 동일하다.
(1-3C) 컨쥬게이트 3, 4 및 9의 안티센스 가닥의 제조
CPR-I 단량체의 연결에서 상기 산화 반응 조건을 황화 반응 조건으로 대체한 것을 제외하고, 컨쥬게이트 2 및 19의 안티센스 가닥의 합성을 위한 동일한 합성 절차를 채용함으로써, 5'-포스포로티오에이트 변형을 갖는 컨쥬게이트 3, 4 및 9의 안티센스 가닥을 얻었다.
(1-3D) 컨쥬게이트 5, 7 및 8의 안티센스 가닥의 제조
고상 포스포라미다이트 합성에 따라 범용 고상 지지체 (UnyLinkerTM 로딩된 NittoPhase®HL 고체 지지체, Kinovate Life Sciences Inc.)를 사용하여 사이클을 시작함으로써, 컨쥬게이트 5, 7 및 8의 안티센스 가닥 (antisense strand, AS)을 합성하였다. 고상 합성방법에서의 탈보호, 결합, 캡핑, 산화 또는 황화, 절단, 탈보호, 정제 및 탈염 반응은 센스 가닥의 합성과 동일한 조건하에 수행하였다.
(1-4) 컨쥬게이트 1 내지 11의 합성
컨쥬게이트 1의 경우, S 가닥 및 AS 가닥을 각각 주사용 증류수에 용해시켜 40 mg/m의 용액을 얻었다. 이들 용액은 등 몰비로 혼합되고, 50℃에서 15 분 동안 가열된 다음, 실온에서 냉각되어, 수소 결합을 통해 이중 가닥 구조를 형성할 수 있었다. 컨쥬게이트를 초순수 (Milli-Q 초순수 기기로 제조함, 18.2MΩ*cm (25℃)의 저항률을 지님)로 0.2 mg/mL의 농도로 희석시켰다. 분자량은 LC-MS 기기 (Waters Corp.에서 구입, 모델: LCT Premier)로 측정하였다. 측정된 값이 계산된 값과 일치하였기 때문에, 합성된 컨쥬게이트 1은 L-9 접합 분자를 갖는 관심 있는 설계된 이중 가닥 핵산 서열임을 확인하였다.
상기 합성된 컨쥬게이트 2-11의 센스 가닥 및 상응하는 안티센스 가닥을 동일한 방법에 따라 어닐링하여 이중 가닥 구조를 형성했고; 컨쥬게이트의 분자량은 다음과 같이 측정했다:
컨쥬게이트 2: 계산된 값 S: 7516.37, AS: 7065.58;
측정된 값: S: 7516.6, AS: 7064.5;
컨쥬게이트 3: 계산된 값 S: 7504.34, AS: 7139.68;
측정된 값: S: 7515.6, AS: 7138.9;
컨쥬게이트 4: 계산된 값 S: 7516.37, AS: 7081.64;
측정된 값: S: 7515.6, AS: 7080.9;
컨쥬게이트 5: 계산된 값 S: 7504.34, AS: 6961.52;
측정된 값: S: 7503.4, AS: 6960.9;
컨쥬게이트 6: 계산된 값 S: 7504.34, AS: 7037.51;
측정된 값: S: 7503.6, AS: 7036.9;
컨쥬게이트 7: 계산된 값 S: 8218.83, AS: 7703.05;
측정된 값: S: 8218, AS: 7702.5;
컨쥬게이트 8: 계산된 값 S: 7516.37, AS: 6985.58;
측정된 값: S: 7516.5, AS: 6984.9;
컨쥬게이트 9: 계산된 값 S: 7504.34, AS: 7041.52;
측정된 값: S: 7503.6, AS: 7040.8;
컨쥬게이트 10: 계산된 값 S: 7504.34, AS: 7057.58,
측정된 값: S: 7503.6, AS: 7057;
측정된 값은 계산된 값과 일치했고, 이는 합성된 컨쥬게이트가 표적 서열을 갖는 siRNA 컨쥬게이트임을 나타낸다.
컨쥬게이트 1 내지 11은 화학식 (3)으로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는다.
제조예 2: 컨쥬게이트 12 내지 26 및 비교 컨쥬게이트 1의 제조
본 컨쥬게이트는, 1) siRNA가 컨쥬게이트 12 내지 26 및 비교 컨쥬게이트 1에 각각 상응하는 표 1에 도시된 서열을 갖고; 2) 표적 서열이 비변형 뉴클레오티드를 포함하는 경우, 절단 및 탈보호 조건 중에서, 수성 암모니아로 처리한 후, 산물을 0.4 ml/μmol의 양으로 N-메틸피롤리돈에 용해시킨 후, 단일 가닥 핵산의 양에 대해 0.3 ml/μmol의 트리에틸아민 및 0.6 ml/μmol의 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드를 첨가함으로써, 리보오스 상의 2'-TBDMS 보호를 제거한 점을 제외하고, 제조예 1과 동일한 방법을 이용하여 얻어질 수 있을 것으로 예상하였다.
본 컨쥬게이트에서 접합된 siRNA 서열은 표 3에 나타나 있다. 상기, 비교 컨쥬게이트 1에 포함된 siRNA는 HBV 유전자에 대한 억제 효과를 보이지 않는 음성 대조군 siRNA (이하 NC라고도 지칭함)이다.
siRNA 컨쥬게이트
예 번호 서열 방향 5’-3’ 서열 번호
컨쥬게이트 1 L10-siHBa1M1SVP 센스 가닥 CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 41
안티센스 가닥 VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 42
컨쥬게이트 2 L10-siHBa1M1SP 센스 가닥 CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 43
안티센스 가닥 P-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 44
컨쥬게이트 3 L10-siHBa1M1SPsT 센스 가닥 CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 45
안티센스 가닥 Ps-TmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 46
컨쥬게이트 4 L10-siHBa1M1SPs 센스 가닥 CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 47
안티센스 가닥 Ps-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 48
컨쥬게이트 5 L10-siHBa1M2S 센스 가닥 CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 49
안티센스 가닥 UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 50
컨쥬게이트 6 L10-siHBa1M2SVP 센스 가닥 CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 51
안티센스 가닥 VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 52
컨쥬게이트 7 L10-siHBa2M1S 센스 가닥 GmsAmsCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 53
안티센스 가닥 UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm 54
컨쥬게이트 8 L10-siHBa1M1S 센스 가닥 CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 55
안티센스 가닥 UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 56
컨쥬게이트 9 L10-siHBa1M2SPs 센스 가닥 CmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 57
안티센스 가닥 Ps-UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm 58
컨쥬게이트 10 L10-siHBa2M2SP 센스 가닥 GmAmCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 59
안티센스 가닥 P-UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm 60
컨쥬게이트 11 L10-siHBa2M1SVP 센스 가닥 GmsAmsCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 61
안티센스 가닥 VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm 62
컨쥬게이트 12 L10-siHBa1 센스 가닥 CCUUGAGGCAUACUUCAAA 63
안티센스 가닥 UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU 64
컨쥬게이트 13 L10-siHBa2 센스 가닥 GACCUUGAGGCAUACUUCAAA 65
안티센스 가닥 UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUCGG 66
컨쥬게이트 14 L10-siHBa1M1 센스 가닥 CmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 67
안티센스 가닥 UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm 68
컨쥬게이트 15 L10-siHBa1M2 센스 가닥 CmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 69
안티센스 가닥 UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm 70
컨쥬게이트 16 L10-siHBa2M1 센스 가닥 GmAmCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 71
안티센스 가닥 UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm 72
컨쥬게이트 17 L10-siHBa2M2 센스 가닥 GmAmCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 73
안티센스 가닥 UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm 74
컨쥬게이트 18 L10-siHBa2M2S 센스 가닥 GmsAmsCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 75
안티센스 가닥 UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm 76
컨쥬게이트 19 L10-siHBa1M1VP 센스 가닥 CmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 77
안티센스 가닥 VP-UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm 78
컨쥬게이트 20 L10-siHBa1M2VP 센스 가닥 CmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 79
안티센스 가닥 VP-UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm 80
컨쥬게이트 21 L10-siHBa2M1VP 센스 가닥 GmAmCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 81
안티센스 가닥 VP-UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm 82
컨쥬게이트 22 L10-siHBa2M2VP 센스 가닥 GmAmCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 83
안티센스 가닥 VP-UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm 84
컨쥬게이트 23 L10-siHBa2M2SVP 센스 가닥 GmsAmsCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 85
안티센스 가닥 VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm 86
컨쥬게이트 24 L10-siHBa1M5SVP 센스 가닥 CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 87
안티센스 가닥 VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 88
컨쥬게이트 25 L10-siHBa1M3SVP 센스 가닥 CmsCmsUmUmGmAmGfGmCfAmUfAmCmUmUmCmAmAmAm 89
안티센스 가닥 VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 90
컨쥬게이트 26 L10-siHBa1M4SVP 센스 가닥 CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 91
안티센스 가닥 VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 92
컨쥬게이트 27 P10-siHBa1M1SVP 센스 가닥 CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 93
안티센스 가닥 VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 94
컨쥬게이트 28 R5-siHBa1M1SVP 센스 가닥 CmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 95
안티센스 가닥 VP-UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm 96
컨쥬게이트 29 LA5-siHBa1M1SVP 센스 가닥 CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 97
안티센스 가닥 VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 98
컨쥬게이트 30 LB5-siHBa1M1SVP 센스 가닥 CmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 99
안티센스 가닥 VP-UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm 100
컨쥬게이트 31 V8-siHBa1M1SVP 센스 가닥 CmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 101
안티센스 가닥 VP-UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm 102
컨쥬게이트 32 W8-siHBa1M1SVP 센스 가닥 CmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 103
안티센스 가닥 VP-UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm 104
컨쥬게이트 33 X8-siHBa1M1SVP 센스 가닥 CmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 105
안티센스 가닥 VP-UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm 106
컨쥬게이트 34 Z5-siHBa1M1SVP 센스 가닥 CmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 107
안티센스 가닥 VP-UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm 108
컨쥬게이트 35 FIN-siHBa2 센스 가닥 GACCUUGAGGCAUACUUCAAA 109
안티센스 가닥 UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUCGG 110
컨쥬게이트 36 FIN-siHBa2M5SVP 센스 가닥 GmsAmsCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 111
안티센스 가닥 VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm 112
컨쥬게이트 37 FIN-siHBa2M3SVP 센스 가닥 GmsAmsCmCmUmUmGfAmGfGmCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 113
안티센스 가닥 VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm 114
컨쥬게이트 38 FIN-siHBa2M4SVP 센스 가닥 GmsAmsCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 115
안티센스 가닥 VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm 116
컨쥬게이트 39 FIN-siHBa2M1SVP 센스 가닥 GmsAmsCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 117
안티센스 가닥 VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm 118
컨쥬게이트 40 FIN-siHBa2M2SVP 센스 가닥 GmsAmsCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 119
안티센스 가닥 VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm 120
컨쥬게이트 41 FIN-siHBa3M2SVP 센스 가닥 CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 121
안티센스 가닥 VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsCm 122
컨쥬게이트 42 FIN-siHBa3M2S 센스 가닥 CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 123
안티센스 가닥 UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsCm 124
컨쥬게이트 43 FIN-siHBa1 센스 가닥 CCUUGAGGCAUACUUCAAA 125
안티센스 가닥 UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU 126
컨쥬게이트 44 FIN-siHBa1M2SVP 센스 가닥 CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 127
안티센스 가닥 VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 128
컨쥬게이트 45 FIN-siHBa1M2S 센스 가닥 CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 129
안티센스 가닥 UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 130
컨쥬게이트 46 FIN-siHBa1M1SVP 센스 가닥 CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 131
안티센스 가닥 VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 132
컨쥬게이트 47 FIN-siHBa2M1S 센스 가닥 GmsAmsCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 133
안티센스 가닥 UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm 134
컨쥬게이트 48 FIN-siHBa1M1S 센스 가닥 CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 135
안티센스 가닥 UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 136
컨쥬게이트 49 FIN-X2M2 센스 가닥 CmCmUmUmGAGGCmAUmACmUmUmCmAAAdT-S-dT 137
안티센스 가닥 UfUmUfGAAGUfAUGCCUfCAAGGdT-S-dT 138
비교 컨쥬게이트 1 L10-NC 센스 가닥 UUCUCCGAACGUGUCACGU 139
안티센스 가닥 ACGUGACACGUUCGGAGAAUU 140
비교 컨쥬게이트 2 AD-66810 센스 가닥 GmsUmsGmUmGfCmAfCfUfUmCmGmCmUmUmCmAmCmAm 141
안티센스 가닥 UmsGfsUmGmAmAfGmCfGfAmAmGmUmGfCmAfCmAmCmsUmsUm 142
제조예 3: P10-siHBa1M1SVP (컨쥬게이트 27)의 제조
(3-1) P-10 화합물의 합성
P-10 화합물을 다음의 공정에 따라 합성했다:
Figure pct00072
(3-1-1) GAL5-C4-1의 합성
상기 단계 (1-1-1)에 기재된 방법에 따라 얻어진 GAL-5 (13.43 g, 30.0 mmol), t-부틸 4-아미노부티레이트 하이드로클로라이드 (5.87 g, 30.0 mmol), O-벤조트리아졸-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (13.65 g, 36.0 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (11.63 g, 90.0 mmol)을 40 ml의 N,N-디메틸포름아미드에 첨가하고, 균질하게 용해시킨 다음, 실온에서 교반하여 5 시간 동안 반응시켰다. 생성된 반응액에 300 ml의 포화 중탄산 나트륨 수용액을 첨가하고, 각각 200 ml의 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 모든 유기상을 합한 뒤 200 ml의 포화 식염수로 1회 세척하였다. 유기상을 분리하고 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 감압하에 증발 건조시켜 용매를 제거하여 30.3 g의 조 산물 GAL5-C4-1을 오일로서 얻었고, 이를 다음 반응에 직접 사용하였다.
(3-1-2) GAL5-C4-2의 합성
단계 (3-1-1)에서 얻어진 조 산물 GAL5-C4-1 (30.3 g, 30 mmol)을 180 ml의 포름산에 용해시키고 실온에서 교반하여 16 시간 동안 반응시켰다. 용매를 증발 건조시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (200-300 메쉬 정상상 실리카 겔, 디클로로메탄: 메탄올=100:18 내지 100:20의 구배 용리를 지님)로 정제하였다. 용출액을 수집하고 농축한 뒤 용매를 제거하여 총 14.84 g의 표적 산물 GAL5-C4-2를 얻었다.
(3-1-3) P-6의 합성:
단계 (1-1-4)에 기재된 방법에 따라 얻어진 M-18-Tr (2.02 g, 4.69 mmol) 및 단계 (3-1-2)에서 얻어진 GAL5-C4-2 (8.24 g, 15.48 mmol)를 혼합해 47 ml의 아세토니트릴에 용해시킨 후, N-메틸모르폴린 (3.13 g, 30.96 mmol)에 이어서 4-(4,6-디메톡시트리아진-2-일)-4-메틸모르폴린 하이드로클로라이드 (DMTMM, 4.28 g, 15.48 mmol)를 첨가하고 실온에서 2 시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 생성된 반응액을 20 ml의 디클로로메탄으로 희석시켰다. 생성된 유기상을 10 ml의 포화 중탄산 나트륨 용액 및 10 ml의 포화 식염수로 각각 세척하였다. 모든 유기상을 합한 뒤 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하였다. 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 조 산물을 얻었고, 이를 정상상 실리카 겔 컬럼 (200-300 메쉬)을 사용하여 정제하였다. 칼럼을 석유 에테르로 채운 뒤, 실리카 겔의 산도를 중화시키기 위해 1 중량%의 트리에틸아민을 첨가하고, 디클로로메탄: 메탄올=100:5 내지 100:7의 구배 용리로 용리시켰다. 용출액을 수집하고, 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 총 8.27 g의 순수한 산물 P-6을 얻었다.
(3-1-4) P-7의 합성:
상기 단계 (3-1-3)에서 얻은 P-6 (6.82 g, 3.456 mmol)을 69 ml의 디클로로메탄에 용해시키고, 디클로로 아세트산 (13.367 g, 103.67 mmol)을 첨가하여 실온에서 2 시간 동안 반응시켰다. 100 ml의 디클로로메탄을 첨가하여 생성된 반응액을 희석시키고, 세척하여 포화 중탄산 나트륨 용액에 의해 pH 7-8로 조절하였다. 분리된 수성상을 각각 30 ml의 디클로로메탄으로 6회 추출하였다. 모든 유기상을 합한 뒤 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하였다. 이어서, 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 조 산물을 얻었다. 조 산물을 정상상 실리카 겔 칼럼 (200-300 메쉬)을 사용하여 정제하였다. 실리카 겔의 산도를 중화시키기 위해 컬럼에 10 중량%의 트리에틸아민을 첨가하고, 1 중량‰의 트리에틸아민으로 평형화시킨 후, 디클로로메탄: 메탄올=100:30 내지 100:40의 구배 용리로 용리시켰다. 용출액을 수집하고, 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 총 4.82 g의 P-7을 얻었다. MS m/z: C78H127N10O33, [M+H]+, 계산값: 1732.91, 측정값: 1735.73.
(3-1-5) P-8의 합성:
Figure pct00073
P-7 (2.653 g, 1.532 mmol) 및 A-1 (2.342 g, 4.596 mmol)을 혼합해 16 ml의 디클로로메탄에 용해시키고, 3-디에톡시포스포릴-1,2,3-벤조트리진 4(3H)-온 (DEPBT) (1.375 g, 4.596 mmol)에 이어서 디이소프로필에틸아민 (1.188 g, 9.191 mmol)을 25℃에서 2 시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 유기상을 10 ml의 포화 중탄산 나트륨으로 세척하였다. 분리된 수성상을 각각 10 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 모든 유기상을 합한 뒤 10 ml의 포화 식염수로 세척하였다. 분리된 수성상을 각각 10 ml의 디클로로메탄으로 2회 추출하고, 얻어진 유기상을 합한 뒤, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하였다. 용매를 감압하에 증발시켜 제거하고, 진공 오일 펌프에서 밤새 발포 건조하여 조 산물을 얻었다. 조 산물에 컬럼 정제를 실시하였다. 컬럼에 120 g의 정상상 실리카 겔 (200-300 메쉬)을 채운 뒤, 실리카 겔의 산도를 중화시키기 위해 20 ml의 트리에틸아민을 첨가하고, 1 중량%의 트리에틸아민을 포함하는 석유 에테르로 평형화시킨 후, 석유 에테르: 에틸 아세테이트: 디클로로메탄: N,N-디메틸포름아미드=1:1:1:0.5 내지 1:1:1:0.6의 구배 용리로 용리시켰다. 용출액을 수집하고, 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 총 2.793 g의 순수한 산물 P-8을 얻었다.
(3-1-6) P-9의 합성:
P-8 (490 mg, 0.231 mmol), 숙신산 무수물 (69 mg, 0.693 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP, 68 mg, 0.554 mmol)을 혼합해 2.3 ml의 디클로로메탄에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민 (DIEA, 149 mg, 1.155 mmol)을 첨가하여 25℃에서 21 시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 생성된 반응액에 희석을 위해 50 ml 디클로로메탄을 첨가한 다음 100 ml의 0.5 M 트리에틸아민 포스페이트로 세척하였다. 분리된 수성상을 각각 10 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 모든 유기상을 합한 뒤, 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 조 산물을 얻었다. 조 산물에 컬럼 정제를 실시하였다. 컬럼에 80 g의 정상상 실리카 겔 (200-300 메쉬)을 채운 뒤, 실리카 겔의 산도를 중화시키기 위해 1 중량%의 트리에틸아민을 첨가하고, 디클로로메탄으로 평형화시킨 후, 1 중량‰의 트리에틸아민을 포함하는 디클로로메탄: 메탄올=100:18 내지 100:20의 구배 용리로 용출시켰다. 용출액을 수집하고, 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 총 200 mg의 순수한 산물 P-9 접합 분자를 얻었다 MS m/z: C106H153N10O41, [M-DMTr]+, 계산값: 1921.05, 측정값: 1920.97.
(3-1-7) P-10의 합성:
L-9 접합 분자 대신에 P-9 접합 분자를 사용하여 고상 지지대에 연결된 P-9 접합 분자를 얻은 것을 제외하고, 제조예 1의 단계 (1-1-9)에서와 동일한 방법을 이용하여 P-10을 제조하였다.
(3-2) P10-siHBa1M1SVP 컨쥬게이트의 합성
L-10 화합물 대신에 P-10 화합물을 사용하여 센스 가닥의 합성을 시작한 것을 제외하고, 제조예 1의 단계 (1-2), (1-3A) 및 (1-4)에서와 동일한 방법을 이용하여 컨쥬게이트 27을 제조하였다. 화학식 (4)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 P10-siHBa1M1SVP 컨쥬게이트가 얻어질 것으로 예상하였다.
제조예 4: R5-siHBa1M1SVP 컨쥬게이트 (컨쥬게이트 28)의 제조
(4-1) R-5 화합물의 합성
R-5 화합물을 다음의 방법으로 합성했다:
Figure pct00074
(4-1-1) GAL-C7-1의 합성
단계 (1-1-1b)에 기재된 방법에 따라 얻어진 GAL-3 (26.4 g, 80.2 mmol)을 134 ml의 무수 1,2-디클로로에탄에 용해시키고, 60 g의 4Å 분자체 분말에 이어서 7-옥텐-1-올 (11.3 g, 88.2 mmol)을 첨가하여 실온에서 10 분 동안 교반하면서 반응시켰다. 트리메틸실릴 트리플루오로메탄술포네이트 (8.9 g, 40.1 mmol)를 질소 대기하에 얼음조에 첨가하여 실온에서 24 시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 4Å 분자체 분말을 여과에 의해 제거하였다. 여액에 500 ml의 포화 중탄산 나트륨 수용액을 첨가하여 세척하였다. 유기상을 분리하였다. 수성상을 100 ml의 디클로로메탄으로 1회 추출하였다. 모든 유기상을 합한 뒤 250 ml의 포화 식염수로 1회 세척하였다. 유기상을 분리하고 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 감압하에 증발 건조시켜 용매를 제거하여 33.3 g의 산물 GAL-C7-1을 황색 시럽으로서 얻었으며, 이를 정제하지 않고 다음 산화 반응에 직접 사용하였다.
(4-1-2) GAL-C7-2의 합성
단계 (4-1-1)에서 얻어진 GAL-C7-1 (33.3 g, 72.8 mmol)을 160 ml의 디클로로메탄 및 160 ml의 아세토니트릴의 혼합 용매에 용해시키고, 216 ml의 물 및 고체 과요오드산 나트륨 (62.3 g, 291.2 mmol)을 각각 첨가한 후, 빙수조에서 10 분 동안 교반하고, 촉매 삼염화 루테늄 (498mg, 2.4 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 자연적으로 실온으로 가온하고 23 시간 동안 교반하였다. 물 200 ml를 첨가하여 생성된 반응액을 교반하면서 희석시키고, 포화 중탄산 나트륨을 첨가하여 pH 7.5로 조절하였다. 유기상을 분리해서 폐기하였다. 수성상을 각각 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 추출된 유기상을 폐기하였다. 추출된 수성상을 시트르산 고체로 약 pH 3으로 조절해서 각각 200 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하고, 생성된 유기상을 합한 뒤 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압하에 증발시켜 제거하고, 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (200-300 메쉬 정상상 실리카 겔, 디클로로메탄: 메탄올=100:18 내지 100:20의 구배 용리를 지님)로 정제하여 22.4g의 산물 GAL-C7-2를 백색 발포성 고체로서 얻었다. MS m/z: C21H32NO11, [M+H]+, 계산값: 476.50, 측정값: 475.94.
(4-1-3) R-1의 합성:
단계 (1-1-4)에 기재된 방법에 따라 얻어진 M-18-Tr (2.02 g, 4.69 mmol) 및 GAL-C7-2 (7.36 g, 15.48 mmol)를 혼합해 47 ml의 아세토니트릴에 용해시키고, N-메틸모르폴린 (3.13 g, 30.96 mmol)에 이어서 4-(4,6-디메톡시트리아진-2-일)-4-메틸모르폴린 하이드로클로라이드 (DMTMM, 4.28 g, 15.48 mmol)를 첨가하여 실온에서 2 시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 생성된 반응액을 200 ml의 디클로로메탄으로 희석시켰다. 유기상을 100 ml의 포화 중탄산 나트륨 용액 및 100 ml의 포화 식염수로 각각 세척하였다. 모든 유기상을 합한 뒤 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하였다. 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 조 산물을 얻었고, 이를 정상상 실리카 겔 컬럼 (200-300 메쉬)을 사용하여 정제하였다. 칼럼을 석유 에테르로 채운 뒤, 실리카 겔의 산도를 중화시키기 위해 1 중량%의 트리에틸아민을 첨가하고, 디클로로메탄: 메탄올=100:5 내지 100:7의 구배 용리로 용리시켰다. 용출액을 수집하고 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 7.82 g의 순수한 산물 R-1을 얻었다.
(4-1-4) R-2의 합성:
R-1 (6.23 g, 3.456 mmol)을 69 ml의 디클로로메탄에 용해시키고, 디클로로 아세트산 (13.367 g, 103.67 mmol)을 첨가하여 실온에서 2 시간 동안 반응시켰다. 100 ml의 디클로로메탄을 첨가하여 생성된 반응액을 희석시키고, 세척하여 포화 중탄산 나트륨 용액에 의해 pH 7-8로 조절하였다. 분리된 수성상을 각각 30 ml의 디클로로메탄으로 6회 추출하였다. 모든 유기상을 합한 뒤 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하였다. 이어서, 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 조 산물을 얻었다. 조 산물을 정상상 실리카 겔 칼럼 (200-300 메쉬)을 사용하여 정제하였다. 실리카 겔의 산도를 중화시키기 위해 컬럼에 10 중량%의 트리에틸아민을 첨가하고 1 중량‰의 트리에틸아민으로 평형화시킨 후, 디클로로메탄: 메탄올=100:30 내지 100:40의 구배 용리로 용리시켰다. 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 4.49 g의 순수한 산물 R-2를 얻었다.
(4-1-5) R-3의 합성:
R-2 (2.391 g, 1.532 mmol) 및 A-1 (2.342 g, 4.596 mmol)을 혼합해 16 ml의 디클로로메탄에 용해시키고, 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리진-4(3H)-온 (DEPBT, 1.375 g, 4.596 mmol)에 이어서 디이소프로필에틸아민 (1.188 g, 9.191 mmol)을 25℃에서 2 시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 유기상을 10 ml의 포화 중탄산 나트륨으로 세척하였다. 분리된 수성상을 각각 10 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 유기상을 10 ml의 포화 염수로 세척하였다. 분리된 수성상을 각각 10 ml의 디클로로메탄으로 2회 추출하고, 얻어진 유기상을 합한 뒤, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하였다. 용매를 감압하에 증발시켜 제거하고, 잔류물을 진공 오일 펌프에서 밤새 발포 건조시켜 조 산물을 얻었다. 조 산물에 컬럼 정제를 실시하였다. 컬럼에 120 g의 정상상 실리카 겔 (200-300 메쉬)을 채운 뒤, 실리카 겔의 산도를 중화시키기 위해 20 ml의 트리에틸아민을 첨가하고, 1 중량%의 트리에틸아민을 포함하는 석유 에테르로 평형화시킨 후, 석유 에테르: 에틸 아세테이트: 디클로로메탄: N,N-디메틸포름아미드=1:1:1:0.5 내지 1:1:1:0.6의 구배 용리로 용리시켰다. 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 2.642 g의 순수한 산물 R-3을 얻었다.
(4-1-6) R-4의 합성:
R-3 (795mg, 0.4074 mmol), 숙신산 무수물 (82 mg, 0.8148 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP, 100 mg, 0.8148 mmol)을 혼합해 4 ml의 디클로로메탄에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민 (DIEA, 100 mg, 0.8148 mmol)을 첨가하여 25℃에서 18 시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 생성된 반응액을 5 ml의 0.5 M 트리에틸아민 포스페이트로 세척하였다. 수성상을 각각 5 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 모든 유기상을 합한 뒤, 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 조 산물을 얻었다. 조 산물에 컬럼 정제를 실시하였다. 칼럼에 30 g의 정상상 실리카 겔 (200-300 메쉬)을 채운 뒤, 실리카 겔의 산도를 중화시키기 위해 1 중량%의 트리에틸아민을 첨가하고, 디클로로메탄으로 평형화시킨 후, 1 중량의 트리에틸아민을 포함하는 디클로로메탄: 메탄올=100:18 내지 100:20의 구배 용리로 용리시켰다. 용출액을 수집하고, 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 505 mg의 순수한 R-4 접합 분자 산물을 얻었다.
(4-1-7) R-5의 합성
L-9 접합 분자 대신에 R-4 접합 분자를 사용하여 고상 지지대에 연결된 R-4 접합 분자를 얻은 것을 제외하고, 제조예 1의 단계 (1-1-9)에서와 동일한 방법을 이용하여 R-5를 제조하였다.
(4-2) R5-siHBa1M1SVP 컨쥬게이트의 합성
L-10 화합물 대신에 R-5 화합물을 사용하여 센스 가닥의 합성을 시작한 것을 제외하고, 제조예 1의 단계 (1-2), (1-3A) 및 (1-4)에서와 동일한 방법을 이용하여 컨쥬게이트 28을 제조하였다. 화학식 (7)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 R5-siHBa1M1SVP 컨쥬게이트가 얻어질 것으로 예상하였다.
제조예 5: LA5-siHBa1M1SVP (컨쥬게이트 29)의 제조
LA-5 화합물을 다음의 공정 경로에 따라 합성할 수 있을 것으로 예상했다:
Figure pct00075
L-10 화합물 대신에 LA-5 화합물을 사용하여 센스 가닥의 합성을 시작한 것을 제외하고, 제조예 1의 단계 (1-2), (1-3A) 및 (1-4)에서와 동일한 방법을 이용하여 컨쥬게이트 29를 제조하였다. 화학식 (12)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 LA5-siHBa1M1SVP 컨쥬게이트가 얻어질 것으로 예상하였다.
제조예 6: LB5-siHBa1M1SVP 컨쥬게이트 (컨쥬게이트 30)의 제조
(6-1) LB-5 화합물의 합성
LB-5 화합물을 다음의 공정에 따라 합성했다:
Figure pct00076
(6-1-1) LB-1의 합성:
단계 (1-1-6)에 기재된 방법에 따라 얻어진 L-8 (5.0 g, 3.386 mmol), 아디프산 무수물 (870 mg, 6.772 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP, 827 mg, 6.772 mmol)을 혼합해 130 ml의 디클로로메탄에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민 (DIEA, 2.2 g, 16.931 mmol)을 첨가하여 25℃에서 4 시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 생성된 반응액에 70 ml 디클로로메탄을 첨가하여 희석한 다음 0.5 M 트리에틸아민 포스페이트로 세척하였다. 분리된 수성상을 각각 10 ml의 디클로로메탄으로 4회 추출하였다. 모든 유기상을 합한 뒤, 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 조 산물을 얻었다. 조 산물에 컬럼 정제를 실시하였다. 컬럼에 120 g의 정상상 실리카 겔 (200-300 메쉬)을 채운 뒤, 실리카 겔의 산도를 중화시키기 위해 1 중량%의 트리에틸아민을 첨가하고 디클로로메탄으로 평형화시킨 후, 석유 에테르: 에틸 아세테이트: 디클로로메탄: 메탄올=1:1:1:0.2 내지 1:1:1:1의 구배 용리로 용리시켰다. 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 4.267 g의 순수한 산물 LB-1을 얻었다.
(6-1-2) LB-2의 합성:
단계 (6-1-1)에 기재된 방법에 따라 얻어진 LB-1 (4.697 g, 2.753 mmol, 2 배치의 조합), 3-아미노-1,2-프로판디올 (313 mg, 3.442 mmol), 4-(4,6-디메톡시트리아진-2-일)-4-메틸모르폴린 하이드로클로라이드 (DMTMM, 953mg, 3.442 mmol) 및 N-메틸모르폴린 (700 mg, 6.884 mmol)을 30 ml의 아세토니트릴 및 3 ml의 메탄올 혼합물에 차례대로 첨가하여 실온에서 밤새 교반하면서 반응시켰다. 용매를 증발 건조시키고, 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (200-300 메쉬 정상상 실리카 겔, 디클로로메탄: 메탄올=1:0.07 내지 1:0.5의 구배 용리를 지님)로 정제하였다. 용출액을 수집하고 농축한 뒤 용매를 제거하여 3.27 g의 표적 산물 LB-2를 얻었다.
(6-1-3) LB-3의 합성:
LB-2 (2.27 g, 1.353 mmol)를 14 ml의 무수 피리딘에 용해시키고, 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드 (688 mg, 2.03 mmol)를 첨가하여 실온에서 교반하면서 밤새 반응시켰다. 150 ml의 메탄올을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 용매를 증발 건조시키고, 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (200-300 메쉬 정상상 실리카 겔, 디클로로메탄: 메탄올=1:0.05 내지 1:0.2의 구배 용리를 지님)로 정제하였다. 용출액을 수집하고 농축한 뒤 용매를 제거하여 1.647 g의 표적 산물 LB-3을 얻었다.
(6-1-4) LB-4의 합성:
LB-3 (822 mg, 0.415 mmol), 숙신산 무수물 (83 g, 0.83 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP, 102 mg, 0.83 mmol)을 혼합해 4 ml의 디클로로메탄에 용해시키고, DIEA (270 mg, 2.075 mmol)를 첨가한 후, 25℃에서 교반하여 밤새 반응시켰다. 생성된 반응액을 0.5 M 트리에틸아민 포스페이트로 3회 세척하였다. 분리된 수성상을 각각 2 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 모든 유기상을 합한 뒤, 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 조 산물을 얻었다. 조 산물에 컬럼 정제를 실시하였다. 칼럼을 정상상 실리카 겔 (200-300 메쉬)로 채운 뒤, 실리카 겔의 산도를 중화시키기 위해 5 중량%의 트리에틸아민을 첨가하고 석유 에테르로 평형화시킨 후, 1 중량‰의 트리에틸아민-함유 디클로로메탄: 메탄올=100:5 내지 100:20의 구배 용리로 용리시켰다. 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 787 mg의 순수한 산물 LB-4 접합 분자를 얻었다.
(6-1-5) LB-5의 합성
L-9 접합 분자 대신에 LB-4 접합 분자를 사용하여 고상 지지대에 연결된 LB-4 접합 분자를 얻은 것을 제외하고, 제조예 1의 단계 (1-1-9)에서와 동일한 방법을 이용하여 LB-5를 제조하였다.
(6-2) LB5-siHBa1M1SVP 컨쥬게이트의 합성
L-10 화합물 대신에 LB-5 화합물을 사용하여 센스 가닥의 합성을 시작한 것을 제외하고, 제조예 1의 단계 (1-2), (1-3A) 및 (1-4)에서와 동일한 방법을 이용하여 컨쥬게이트 30을 제조하였다. 화학식 (13)으로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 LB5-siHBa1M1SVP 컨쥬게이트가 얻어질 것으로 예상하였다.
제조예 7: V8-siHBa1M1SVP 컨쥬게이트 (컨쥬게이트 31)의 제조
V-8 화합물을 다음의 공정 경로에 따라 합성할 수 있을 것으로 예상했다:
Figure pct00077
L-10 화합물 대신에 V-8 화합물을 사용하여 센스 가닥의 합성을 시작한 것을 제외하고, 제조예 1의 단계 (1-2), (1-3A) 및 (1-4)에서와 동일한 방법을 이용하여 컨쥬게이트 31을 제조하였다. 화학식 (14)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 V8-siHBa1M1SVP 컨쥬게이트가 얻어질 것으로 예상하였다.
제조예 8: W8-siHBa1M1SVP 컨쥬게이트 (컨쥬게이트 32)의 제조
(8-1) W-8 화합물의 합성
W-8 화합물을 다음의 공정에 따라 합성했다:
Figure pct00078
(8-1-1) W-1의 합성:
W-0 (2.024 g, 10 mmol)을 25 ml의 아세토니트릴에 용해시키고, 트리에틸아민 (4.048 g, 40 mmol)을 첨가하고, 빙수조에서 약 0℃로 냉각시켰다. 에틸 트리플루오로아세테이트 (5.683 g, 40 mmol)를 첨가하여 실온에서 22 시간 동안 반응시켰다. 용매를 감압하에 증발시켜 제거하고, 잔류물을 진공 오일 펌프에서 18 시간 동안 발포 건조시켜 5.835 g의 조 산물 W-1을 얻었다.
(8-1-2) W-2의 합성:
조 산물 W-1 (5.835 g, 10 mmol)을 50 ml의 디클로로메탄에 용해시켰다. 생성된 반응액에 TrCl (3.345 g, 12 mmol) 및 트리에틸아민 (1.518 g, 15 mmol)을 첨가하여 실온에서 20 시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 생성된 반응액을 20 ml의 포화 중탄산 나트륨으로 각각 2회, 20 ml의 포화 식염수로 1회 세척하였다. 모든 유기상을 합한 뒤 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하였다. 유기 용매를 감압하에 증발시켜 제거하고, 잔류물을 진공 오일 펌프에서 밤새 발포 건조시켜 8.012 g의 조 산물 W-2를 얻었다. 조 고체 산물 W-2를 처리없이 다음 탈보호 반응에 사용하였다.
(8-1-3) W-3의 합성:
조 산물 W-2 (8.012 g, 10 mmol)를 100 ml의 메탄올에 용해시키고, 100 ml의 메틸아민 수용액 (40 중량%)을 첨가하여 50℃에서 23 시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 불용성 입자를 여과로 제거하였다. 용매를 감압하에 증발시켜 제거하였다. 잔류물에 부피비 1:1의 DCM: 메탄올의 혼합 용매 200 ml를 첨가하고, 생성된 유기상을 50 ml의 포화 중탄산 나트륨으로 세척하였다. 분리된 수성상을 각각 50 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 모든 유기상을 합한 뒤 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하였다. 용매를 감압하에 증발시켜 제거하고, 잔류물을 진공 오일 펌프에서 밤새 발포 건조시킨 후, 정상상 실리카 겔 칼럼 (200-300 메쉬)을 사용하여 정제하였다. 칼럼을 석유 에테르로 채운 뒤, 실리카 겔의 산도를 중화시키기 위해 1 중량%의 트리에틸아민을 첨가하고, 디클로로메탄: 메탄올: 수성 암모니아 (25 중량%)=1:1:0.05 내지 1:1: 0.25의 구배 용리로 용리시켰다. 용출액을 수집하였다. 용매를 감압하에 증발시켜 제거하고, 잔류물을 진공 오일 펌프에서 발포 건조시켜 3.062 g의 순수한 산물 W-3을 얻었다.
(8-1-4) W-4의 합성:
W-3 (0.675 g, 1.517 mmol) 및 GAL-C7-2 (2.60 g, 5.46 mmol)를 혼합해 47 ml의 아세토니트릴에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민 (1.57 g, 12.14 mmol)에 이어서 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리진-4(3H)-온 (DEPBT, 1.816 g, 6.04 mmol)을 첨가하여 실온에서 2.5 시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 생성된 반응액을 100 ml의 디클로로메탄으로 희석시켰다. 얻어진 유기상을 80 ml의 포화 중탄산 나트륨 용액 및 80 ml의 포화 식염수로 각각 세척하였다. 모든 유기상을 합한 뒤 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하였다. 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 조 산물을 얻었고, 이를 정상상 실리카 겔 컬럼 (200-300 메쉬)을 사용하여 정제하였다. 칼럼을 석유 에테르로 채운 뒤, 실리카 겔의 산도를 중화시키기 위해 1 중량%의 트리에틸아민을 첨가하고, 디클로로메탄: 메탄올=100:5 내지 100:7의 구배 용리로 용리시켰다. 용출액을 수집하고, 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 1.610 g의 순수한 산물 W-4를 얻었다.
(8-1-5) W-5의 합성:
W-4 (1.61 g, 0.886 mmol)를 125 ml의 디클로로메탄에 용해시키고, 디클로로 아세트산 (3.5 ml, 42.43 mmol)을 첨가하여 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 150 ml의 피리딘을 첨가하여 생성된 반응액을 중화시켰다. 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 조 산물을 얻었다. 조 산물을 정상상 실리카 겔 칼럼 (200-300 메쉬)을 사용하여 정제하였다. 실리카 겔의 산도를 중화시키기 위해 컬럼에 10 중량%의 트리에틸아민을 첨가하고, 1 중량‰의 트리에틸아민으로 평형화시킨 후, 디클로로메탄: 메탄올=100:30 내지 100:40의 구배 용리로 용리시켰다. 용출액을 수집하고, 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 1.26 g의 순수한 산물 W-5를 얻었다.
(8-1-6) W-6의 합성:
단계 (1-1-7a)에 기재된 방법에 따라 얻어진 W-5 (1.25 g, 0.793 mmol) 및 A-1 (1.21 g, 2.38 mmol)을 혼합해 12 ml의 디클로로메탄에 용해시키고, 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리진-4(3H)-온 (DEPBT, 0.712 g, 2.38 mmol)에 이어서 디이소프로필에틸아민 (0.615 g, 4.76 mmol)을 첨가하여 25℃에서 3 시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 유기상을 80 ml의 포화 중탄산 나트륨으로 세척하였다. 분리된 수성상을 각각 10 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 모든 유기상을 합한 뒤 10 ml의 포화 식염수로 세척하였다. 얻어진 유기상을 합한 뒤 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하였다. 용매를 감압하에 증발시켜 제거하고, 잔류물을 진공 오일 펌프에서 밤새 발포 건조시켜 조 산물을 얻었다. 조 산물에 컬럼 정제를 실시하였다. 컬럼에 185 g의 정상상 실리카 겔 (200-300 메쉬)을 채운 뒤, 실리카 겔의 산도를 중화시키기 위해 20 ml의 트리에틸아민을 첨가하고, 1 중량%의 트리에틸아민을 포함하는 석유 에테르로 평형화시킨 후, 석유 에테르: 에틸 아세테이트: 디클로로메탄: N,N-디메틸포름아미드=1:1:1:0.1 내지 1:1:1:0.7의 구배 용리로 용리시켰다. 용출액을 수집하고, 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 1.57 g의 순수한 산물 W-6을 얻었다.
(8-1-7) W-7의 합성:
W-6 (1.238 g, 0.63 mmol), 숙신산 무수물 (0.189 g, 1.89 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP, 0.231 g, 1.89 mmol)을 혼합해 7 ml의 디클로로메탄에 용해시키고, DIEA (0.407 g, 3.15 mmol)를 첨가하여 25℃에서 24 시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 생성된 반응액을 5 ml의 0.5 M 트리에틸아민 포스페이트로 세척하였다. 분리된 수성상을 각각 5 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 모든 유기상을 합한 뒤, 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 조 산물을 얻었다. 조 산물에 컬럼 정제를 실시하였다. 칼럼에 30 g의 정상상 실리카 겔 (200-300 메쉬)을 채운 뒤, 실리카 겔의 산도를 중화시키기 위해 1 중량%의 트리에틸아민을 첨가하고, 디클로로메탄으로 평형화시킨 후, 1 중량‰의 트리에틸아민-함유 디클로로메탄: 메탄올=100:18 내지 100:20의 구배 용리로 용리시켰다. 용출액을 수집하고, 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 1.033 g의 순수한 산물 W-7 접합 분자를 얻었다. MS m/z: C101H146N7O38, [M-DMTr]+, 계산값: 1763.92, 측정값: 1763.21.
(8-1-8) W-8의 합성
L-9 접합 분자 대신에 W-7 접합 분자를 사용하여 고상 지지대에 연결된 W-7 접합 분자를 얻는 것을 제외하고, 제조예 1의 단계 (1-1-9)에서와 동일한 방법을 이용하여 W-8을 제조하였다.
(8-2) W8-siHBa1M1SVP 컨쥬게이트의 합성
L-10 화합물 대신에 W-8 화합물을 사용하여 센스 가닥의 합성을 시작한 것을 제외하고, 제조예 1의 단계 (1-2), (1-3A) 및 (1-4)에서와 동일한 방법을 이용하여 컨쥬게이트 32를 제조하였다. 화학식 (15)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 W8-siHBa1M1SVP 컨쥬게이트가 얻어질 것으로 예상하였다.
제조예 9: X8-siHBa1M1SVP 컨쥬게이트 (컨쥬게이트 33)의 제조
X-8 화합물을 다음의 공정 경로에 따라 합성할 수 있을 것으로 예상했다:
Figure pct00079
L-10 화합물 대신에 X-8 화합물을 사용하여 센스 가닥의 합성을 시작한 것을 제외하고, 제조예 1의 단계 (1-2), (1-3A) 및 (1-4)에서와 동일한 방법을 이용하여 컨쥬게이트 33을 제조하였다. 화학식 (21)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 X8-siHBa1M1SVP 컨쥬게이트가 얻어질 것으로 예상하였다.
제조예 10: Z5-siHBa1M1SVP 컨쥬게이트 (컨쥬게이트 34)의 제조
(10-1) Z-5 화합물의 합성
Z-5 화합물을 다음의 공정에 따라 합성했다:
Figure pct00080
(10-1-1) Z-1의 합성:
단계 (8-1-3)에 기재된 방법에 따라 얻어진 W-3 (1.50 g, 3.37 mmol) 및 단계 (3-1-2)에 기재된 방법에 따라 얻어진 GAL5-C4-2 (7.18 g, 13.48 mmol)를 혼합해 34 ml의 디클로로메탄에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민 (3.48 g, 26.96 mmol)에 이어서 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리진-4(3H)-온 (DEPBT, 4.04 g, 13.48 mmol) 을 첨가하여 실온에서 4.5 시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 생성된 액체 용액을 100 ml의 디클로로메탄으로 희석시켰다. 유기상을 80 ml의 포화 중탄산 나트륨 용액 및 80 ml의 포화 식염수로 각각 세척하였다. 모든 유기상을 합한 뒤 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하였다. 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 조 산물을 얻었고, 이를 정상상 실리카 겔 컬럼 (200-300 메쉬)을 사용하여 정제하였다. 칼럼을 석유 에테르로 채운 뒤, 실리카 겔의 산도를 중화시키기 위해 1 중량%의 트리에틸아민을 첨가하고, 디클로로메탄의 구배 용리: 메탄올=30:1 내지 15:1로 용리시켰다. 용출액을 수집하고 감압하에 증발시켜 제거하여 3.97 g의 순수한 산물 Z-1을 얻었다. MS m/z: C98H143N10O33, [M+H]+, 계산값: 1987.98, 측정값: 1987.90.
(10-1-2) Z-2의 합성:
Z-1 (3.97 g, 2.00 mmol)을 250 ml의 디클로로메탄에 용해시키고, 디클로로 아세트산 (10.941 g, 84.85 mmol)을 첨가하여 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 피리딘을 첨가하여 생성된 반응액을 중성으로 중화시켰다. 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 조 산물을 얻었다. 컬럼에 220 g의 200-300 메쉬 정상상 실리카 겔을 로딩하고, 실리카 겔의 산도를 중화시키기 위해 10 중량% 피리딘을 첨가하고, 1 중량‰ 피리딘으로 평형화시킨 후, 디클로로메탄: 메탄올=10:1-2:1의 구배 용리로 용리시켰다. 용출액을 수집하고, 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 3.49 g의 순수한 산물 Z-2를 얻었다. MS m/z: C79H129N10O33, [M+H]+, 계산값: 1746.94, 측정값: 1746.90.
(10-1-3) Z-3의 합성:
단계 (1-1-7a)에 기재된 방법에 따라 얻어진 Z-2 (3.49 g, 2.0 mmol) 및 A-1 (3.06 g, 6.0 mmol)을 혼합해 30 ml의 디클로로메탄에 용해시키고, 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리진-4(3H)-온 (DEPBT, 1.80 g, 6.0 mmol)에 이어서 디이소프로필에틸아민 (1.55 g, 12.0 mmol)을 첨가하여 25℃에서 교반하면서 3 시간 동안 반응시켰다. 생성된 반응액에 100 ml 디클로로메탄을 첨가하여 희석시켰다. 유기상을 30 ml의 포화 중탄산 나트륨으로 2회 세척하였다. 수성상을 10 ml의 디클로로메탄으로 추출하였다. 모든 유기상을 합한 뒤 50 ml의 포화 식염수로 세척하였다. 얻어진 유기상을 합한 뒤 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하였다. 용매를 감압하에 증발시켜 제거하고, 잔류물을 진공 오일 펌프에서 밤새 발포 건조시켜 조 산물을 얻었다. 조 산물에 컬럼 정제를 실시하였다. 컬럼에 200 g의 정상상 실리카 겔 (200-300 메쉬)을 채운 뒤, 실리카 겔의 산도를 중화시키기 위해 20 ml의 트리에틸아민을 첨가하였다. 칼럼을 1 중량%의 트리에틸아민을 포함하는 석유 에테르로 평형화시킨 후, 디클로로메탄: 메탄올=25:1 내지 15:1의 구배 용리로 용리시켰다. 용출액을 수집하고, 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 2.2 g의 순수한 산물 Z-3을 얻었다. MS m/z: C103H151N10O38, [M+H]+, 계산값: 2136.02, 측정값: 2136.20.
(10-1-4) Z-4의 합성:
Z-3 (2.10 g, 0.983 mmol)을 14.8 ml의 DIEA (0.635 g, 4.915 mmol)를 포함하는 디클로로메탄에 용해시키고, 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP, 240 mg, 1.966 mmol)을 생성된 용액에 첨가하고 용액이 투명해질 때까지 교반하였다. 숙신산 무수물 (197 mg, 1.966 mmol)을 첨가하여 25℃에서 18 시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 생성된 반응액에 50 ml 디클로로메탄을 첨가하여 희석시키고, 80 ml의 0.5 M 트리에틸아민 포스페이트로 세척하였다. 수성상을 각각 50 ml의 디클로로메탄으로 2회 추출하였다. 모든 유기상을 합한 뒤, 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 조 산물을 얻었다. 조 산물에 컬럼 정제를 실시하였다. 칼럼에 188 g의 정상상 실리카 겔 (200-300 메쉬)을 채운 뒤, 실리카 겔의 산도를 중화시키기 위해 1 중량%의 트리에틸아민을 첨가하고, 디클로로메탄으로 평형화시킨 후, 1 중량‰의 트리에틸아민을 포함하는 디클로로메탄: 메탄올=10:1-3:1의 구배 용리로 용리시켰다. 용출액을 수집하고, 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 1.95 g의 순수한 산물 Z-4 접합 분자를 얻었다. MS m/z: C107H155N10O41, [M+H]+, 계산값: 1935.07, 측정값: 1935.29.
(10-1-5) Z-5의 합성
L-9 접합 분자 대신에 Z-4 접합 분자를 사용하여 고상 지지대에 연결된 Z-4 접합 분자를 얻은 것을 제외하고, 제조예 1의 단계 (1-1-9)에서와 동일한 방법을 이용하여 Z-5를 제조하였다.
(10-2) Z5-siHB1M1SVP 컨쥬게이트의 합성
L-10 화합물 대신에 Z-5 화합물을 사용하여 센스 가닥의 합성을 시작한 것을 제외하고, 제조예 1의 단계 (1-2), (1-3A) 및 (1-4)에서와 동일한 방법을 이용하여 컨쥬게이트 34를 제조하였다. 화학식 (22)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 Z5-siHB1M1SVP 컨쥬게이트가 얻어질 것으로 예상하였다.
제조예 11: 이 제조예는 컨쥬게이트 35 내지 49의 제조를 나타내 보이기 위해 사용했다
이 제조예에서, 컨쥬게이트 35 내지 49가 합성되었다. 컨쥬게이트에서 접합된 siRNA 서열이 표 3에 나타나 있다.
(11-1) FIN-2 접합 분자의 합성
다음의 공정 경로에 따라 Rajeev 등의 ChemBioChem 2015, 16, 903-908에 기재된 제조 방법을 참조하여 FIN-2 접합 분자를 합성했다:
(11-1-1) PRO-10의 합성
Figure pct00081
(11-1-1a) PRO-7의 합성
2.93 g의 PRO-6 (L-하이드록시프롤린, CAS 번호: 51-35-4, Energy Chemical에서 구입, 22.4 mmol)을 22.5 ml의 1,4-디옥산 (CAS 번호:123-91-1)에 용해시키고, 34 ml의 10% (w/w) 수성 Na2CO3 용액을 현탁액 형태로 첨가하였다. 6.95 g의 Fmoc-Cl (9-플루오레닐메틸 클로로포르메이트, CAS 번호: 28920-43-6, Energy Chemical에서 구입, 26.8 mmol)을 34 ml의 1,4-디옥산에 용해시키고, 얼음조내 상기 현탁액에 첨가한 다음, 밤새 반응시키기 위해 자연적으로 실온으로 가온하였다. 반응액을 빙수 150 ml에 붓고, 100 ml의 메틸 t-부틸 에테르로 각각 3회 추출한 뒤, 유기층을 폐기하였다. 남아 있는 수성상을 진한 염산에 의해 pH ≤5로 조절하고, 각각 100 ml의 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 얻어진 유기상을 합한 뒤 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 7.83 g의 산물 PRO-7을 백색 발포성 고체로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.91 (t, J 7.2 Hz, 2H), 7.67 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.48-7.39 (m, 2H), 7.38-7.27 (m, 2H), 5.17 (s, 1H), 4.27 (s, 2H), 4.23-4.11 (m, 2H), 3.55-3.41 (m, 3H), 2.31-2.10 (m, 1H), 2.08-1.88 (m, 1H). HRMS (ESI) m/z C20H19NO5 [M-H]- 에 대한 계산값 352.1190, 측정값: 352.1033.
(11-1-1b) PRO-8의 합성
7.83 g의 PRO-7 (22.2 mmol)을 80 ml의 THF (CAS 번호:109-99-9)에 용해시키고, 오일 조에서 65℃로 가열하고, 36.6 ml의 THF내 BH3-Me2S (CAS 번호: 13292-87-0, J & K Scientific Ltd.에서 구입, 73.2 mmol) 2 mol/L 용액을 환류하에 첨가하고, 계속 환류하면서 3 시간 동안 반응시켰다. 반응액을 따라내고, 남아 있는 고체를 메탄올에 용해시켰다. 생성된 반응액에, 기체가 방출되지 않을 때까지 교반하면서, 메탄올을 첨가하고, 30 분 동안 계속 교반하였다. 용매를 감압하에 증발시켜 제거한 후, 잔류물을 석유 에테르로 3회 정제하여 7.1 g의 산물 PRO-8을 백색 고체로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.91 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 7.67 (d, J=7.2 Hz, 2H), 7.49-7.39 (m, 2H), 7.38-7.26 (m, 2H), 5.18 (dd, J = 6.1, 3.8 Hz, 1H), 4.28 (s, 2H), 4.23-4.13 (m, 2H), 3.55-3.38 (m, 2H), 2.32-2.11 (m, 1H), 2.08-1.89 (m, 1H). HRMS (ESI) m/z C20H21NO4 [M+Na]+ 에 대한 계산값 362.1368, 측정값: 362.1012.
(11-1-1c) PRO-9의 합성
7.1 g의 PRO-8 (21 mmol)을 100 ml의 피리딘에 용해시키고, 14.2 g의 DMTr-Cl (4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드, 42 mmol)을 첨가하여 실온에서 5 시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 용매를 감압하에 증발시켜 제거하였다. 생성된 조 산물을 에틸 아세테이트에 용해시키고 여과하여 염 불순물을 제거하였다. 용매를 감압하에 증발시켜 제거한 후, 실리카겔 컬럼을 사용하여 잔사를 정제하였다. 정제를 위해, DCM에 용해된 조 산물을 컬럼을 알칼리화하기 위해 피리딘으로 전처리된 실리카 겔 컬럼에 로딩하였다. 1% (v/v) 피리딘을 포함하는 DCM으로 DMTr-Cl을 용리시킨 다음, 산물을 에틸 아세테이트로 용리시켰다. 용출액을 수집하고, 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 8.2 g의 산물 PRO-9를 백색 고체로서 얻었다.HRMS (ESI) m/z C41H39NO6 [M+Na]+ 에 대한 계산값 664.2675, 측정값: 664.2348; C18 RP-HPLC (로트 번호: JJS160324-1); 순도: 94.20%.
(11-1-1d) PRO-10의 합성
8.2 g의 PRO-9 (12.8 mmol)를 64 ml의 DMF에 용해시키고 40 ml의 피페리딘 (384 mmol)을 첨가하여 실온에서 30 분 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응액을 300 ml의 빙수에 붓고 각각 150 ml의 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 얻어진 유기상을 합한 뒤 200 ml의 포화 식염수로 세정하고, 세정한 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압하에 증발시켜 제거한 다음, 실리카겔 컬럼을 사용하여 잔사를 정제하였다. 정제를 위해, DCM에 용해된 조 산물을 컬럼을 알칼리화하기 위해 피리딘으로 전처리된 실리카 겔 컬럼에 로딩하였다. 1% (v/v) 피리딘을 포함하는 DCM으로 Fmoc를 용리시킨 다음, 산물을 에틸 아세테이트로 용리시켰다. 용출액을 수집하고, 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 4.65 g의 산물 PRO-10을 백색 고체로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.40 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.35 - 7.18 (m, 7H), 6.93 - 6.84 (m, 4H), 4.56 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 4.12 (s, 1H), 3.74 (s, 6H), 3.46 - 3.37 (m, 1H), 2.88 (ddd, J = 18.5, 10.0, 5.5 Hz, 2H), 2.75 (dd, J = 8.7, 5.8 Hz, 1H), 2.62 (dd, J = 11.0, 2.7 Hz, 1H), 1.74 - 1.65 (m, 1H), 1.40 (ddd, J = 12.9, 8.5, 5.9 Hz, 1H); HRMS (ESI) m/z C26H29NO4 [M+Na]+ 에 대한 계산값 442.1994, 측정값: 442.1999; C18 RP-HPLC (로트 번호: JJS160329-1), 순도: 97.07%.
(11-1-2) FIN-1의 합성
Figure pct00082
단계 (1-1-1)에 기재된 방법에 따라 얻어진 GAL-5 (4.5 g, 10 mmol)를 40 ml의 DMF에 용해시키고, 3.9 g의 DIEA (N,N-디이소프로필에틸아민, CAS 번호: 7087-68-5, Aladdin Inc.에서 구입, 30 mmol) 및 3.8 g의 HBTU (벤조트리아졸-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트, CAS 번호: 94790-37-2, Aladdin Inc.에서 구입, 11 mmol)를 차례대로 첨가하여 실온에서 10 분 동안 교반하였다. 단계 (11-1-1d)에서 얻어진 PRO-10 (4.2 g, 10 mmol)을 40 ml의 DMF에 용해시킨 후, 상기 반응액에 첨가하였다. 무수 황산나트륨을 첨가하여 생성된 반응액을 건조시키고 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응액을 120 ml의 빙수에 붓고 각각 60 ml의 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 생성된 유기상을 합한 뒤, 물 20 ml 및 20 ml의 포화 식염수로 각각 세척하였다. 세척으로 얻어진 유기상을 분리하고 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압하에 증발시켜 제거한 다음, 실리카겔 컬럼을 사용하여 잔사를 정제하였다. 정제를 위해, 샘플을 칼럼을 알칼리화하기 위해 피리딘으로 전처리된 실리카 겔 칼럼 상에 로딩시키고, 1% (v/v) 트리에틸아민 및 1% (v/v) 메탄올을 포함하는 디클로로메탄 (DCM) 용액으로 용리시켰다. 용출액을 수집하고, 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 6.5 g의 산물 FIN-1을 연황색 포말 고체로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.83 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.32 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 7.20 (td, J = 8.9, 3.5 Hz, 5H), 6.93 - 6.84 (m, 4H), 5.21 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 5.04 - 4.90 (m, 2H), 4.49 (s, 1H), 4.40 (d, J = 4.4 Hz, 0.8H), 4.31 (d, J = 5.0 Hz, 0.2H), 4.15 (s, 1H), 4.03 (s, 3H), 3.93 (s, 1H), 3.74 (s, 7H), 3.59 (dt, J = 12.0, 6.0 Hz, 1H), 3.50 - 3.40 (m, 1H), 3.39 - 3.25 (m, 3H), 3.13 (dd, J = 8.9, 5.2 Hz, 1H), 3.00 (dq, J = 9.3, 5.3, 4.3 Hz, 1H), 2.22 (s, 2H), 2.07 (s, 3H), 1.99 (s, 3H), 1.90 (s, 4H), 1.74 (s, 3H), 1.50 (s, 3H), 1.36 (s, 1H). C18 RP-HPLC (로트 번호: LJ160422), 순도: 95.45%.
(11-1-3) FIN-2의 합성
Figure pct00083
단계 (11-1-2)에서 얻어진 FIN-1 (3.0 g, 3.53 mmol) 및 아세토니트릴을 공비 탈수를 위해 가열하고, 감압하에 흡인 건조시킨 후, 10 ml의 DMF에 용해시키고 (분자체에 침지하여 건조시킴), 2.13 g의 PA (비스(디이소프로필아미노)(2-시아노에톡시)포스핀, Adamas Inc., 제품 번호 11356B, 7.06 mmol) 및 346 mg의 테트라졸 (CAS 번호: 288-94-8, Aladdin Inc.에서 구입, 4.94 mmol)를 질소 대기하에 첨가한 후, 교반하여 실온에서 반응시켰다. 반응물에 10 ml의 DMF를 보충하고 계속 교반하여 1 시간 동안 반응시켰다. 용매를 감압하에 증발시켜 제거한 다음, 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 정제를 위해, DCM에 용해된 조 산물을 컬럼을 알칼리화하기 위해 피리딘으로 전처리된 실리카 겔 컬럼 상에 로딩시키고, 에틸 아세테이트로 용리시켰다. 용출액을 수집하고, 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 4.5g의 조 산물을 무색 시럽으로서 얻었다. 조 산물을 50% (v/v) 아세토니트릴 수용액에 완전히 용해시키고 컬럼을 알칼리화하기 위해 아세토니트릴에서 1% (v/v) 피리딘 용액으로 전처리된 중압 컬럼 N(C-18, 330 g, 300 Å)을 사용하여 정제하였다. 산물 피크를 구배 용리에 의해 수집하고 용매를 감압하에 증발시켜 제거하여 2.2 g의 산물 FIN-2 접합 분자를 백색 분말로서 얻었다. 31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ 148.04, 147.94, 147.62, 147.19, 31P NMR의 순도: 92%; C18 RP-HPLC의 순도: 90.54%.
(11-2) FIN-2 접합 분자를 고상 지지체에 연결
3개의 반응 사이클을 통해 핵산 고상 합성방법을 이용하여, 단계 (11-1-3)에서 얻어진 FIN-2 접합 분자를 범용 고상 지지체 (UnyLinkerTM NittoPhase®HL Solid Supports로 로드)에 연결함으로써 RNA 센스 가닥의 3' 말단에 접합 기 (FIN_FIN_FIN)를 연결하였다.
접합 기 FIN_FIN_FIN의 연결은 Rajeev 등의 Chem Bio Chem 2015, 16, 903-908에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 구체적으로, 하이드록시 보호기는 전술한 범용 고상 지지체로부터 초기에 제거되었고, 이어서 고상 지지체는 결합 반응 조건하 및 결합제의 존재하에 FIN-2 접합 분자와 차례대로 접촉 및 결합되었으며, 캡핑 및 산화 반응 후에 고상 지지체에 연결된 FIN 접합 분자가 얻어졌다. 또한, 하이드록시 보호기 DMTr을 고상 지지체에 연결된 FIN 접합 분자로부터 제거하고, 고상 지지체를 추가로 또 다른 FIN-2 접합 분자와 접촉시키고 결합한 다음 캡핑 및 산화 반응을 수행하였다. 상기 탈보호 결합-캡핑-산화 단계를 반복함으로써, 제 3 FIN-2 접합 분자가 연결되었고, 따라서 고상 지지체에 연결된 접합 기(FIN_FIN_FIN)가 얻어졌다.
전술한 반응에서, 탈보호, 결합, 캡핑 및 산화의 반응 조건하 및 용매와 시약의 양은 상기 단계 (1-2)에서 설명한 핵산 고상 합성방법에서 사용된 것과 동일하다.
(11-3) 컨쥬게이트 35 내지 49의 합성
본 컨쥬게이트는 1) 단계 (11-2)에서 얻어진 화합물을 사용하여 센스 가닥의 합성을 시작했고; 2) 접합된 siRNA는 표 3에 나타낸 컨쥬게이트 35 내지 49에 상응하는 서열을 가진 것을 제외하고, 제조예 1의 단계 (1-2) 내지 (1-4)에서와 동일한 방법으로 제조되었다:
분자량은 LC-MS 기기 (Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, Waters Corp.에서 구입, Model: LCT Premier)로 측정하였다. 결과는 측정된 값이 계산된 값과 일치하는 것을 보였고, 따라서 합성된 컨쥬게이트는 화학식 (307)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 관심사의 설계된 화합물임을 확인하였다.
제조예 12: 비교 컨쥬게이트 2의 제조
이 제조예에서는, 비교 컨쥬게이트 2를 합성하였다. 이 컨쥬게이트에서 접합된 siRNA 서열은 표 3에 나타내었다. 이 컨쥬게이트는 미국 특허 출원 15/597,225에 기재된 화합물 AD-66810과 동일한 구조를 갖는다.
(12-1) (GalNAc)3 접합 분자의 합성
화합물 30, 즉, 전술한 링커 -(LA)3-트리하이드록시메틸 아미노메탄-LB- 및 표적 기 N-아세틸갈락토사민 분자 (상기 각 LA는 하나의 N-아세틸갈락토사민 분자에 연결될 수 있어, 하나의 링커가 3개의 N-아세틸갈락토사민 분자에 연결될 수 있음)를 포함하는 접합 분자는 WO2014025805A1에 기재된 제조 방법에 따라 합성되었다. 이 접합 분자는 (GaINAc)3 접합 분자라고도 지칭할 수 있으며, 화합물 30의 구조는 다음과 같이 나타내었다:
Figure pct00084
(12-2) (GalNAc)3 접합 분자를 고상 지지체에 연결
(GalNAc)3 접합 기는 제조예 1의 단계 (1-1-9)와 동일한 방법으로 고상 지지체에 연결됨으로써, 고상 지지체에 연결된 (GalNAc)3 접합 기가 얻어졌다.
(12-3) 비교 컨쥬게이트 2의 합성
비교 컨쥬게이트 2는, 1) 단계 (12-2)에서 얻어진 화합물을 센스 가닥의 합성을 시작하는데 사용했고; 2) 접합 siRNA는 표 1의 번호 AD-66810에 나타낸 서열을 가진 점을 제외하고, 제조예 1의 단계 (1-2), (1-3D) 및 (1-4)와 동일한 방법으로 제조하였다.
분자량은 액체 크로마토그래피-질량 분석 (LC-MS, Waters Corp.에서 구입, 모델: LCT Premier)에 의해 측정하였다. 결과는 측정된 값이 계산된 값과 일치하는 것을 보였고, 따라서 합성된 컨쥬게이트는 화학식 (305)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 표적 설계 화합물임을 확인하였다.
실험예 1: 본 발명의 siRNA 컨쥬게이트의 독성.
C57BL/6J 생쥐에서, 컨쥬게이트 1 (0.9 중량% NaCl 수용액, 투여부피 10 mL/kg, 농도 10 mg/mL 및 20 mg/mL, 상기 각 농도는 6 마리 생쥐에 사용됨: 3 마리의 수컷 및 3 마리의 암컷)을 100 mg/kg 또는 200 mg/kg (siRNA에 기반함)의 단일 용량으로 각 생쥐에 피하 투여하였다. 치료 기간 동안 계속해서 임상 관찰을 수행하였으며, 이는 동물 사망 및 약물 부작용과 관련된 임상 증상이 없음을 나타낸다. 투여 24 시간 후, 임상 병리학 시험을 위해 혈액 샘플을 채취하고 생쥐를 해부하였다. 결과는 임상 병리학 시험 및 육안 해부에서 이상이 발견되지 않았음을 보인다. 따라서, 상기 결과는 본 발명의 컨쥬게이트가 동물 수준의 비교적 낮은 독성을 갖는 것을 나타낸다.
실험예 2: 이 실험은 본 발명의 siRNA 컨쥬게이트의 안정성을 나타냈다.
(실험예 2-1) 시험관내 리소좀 용해물에서 본 발명의 siRNA 컨쥬게이트의 안정성.
리소좀 용해물로 처리된 시험 샘플의 제조: 비교 컨쥬게이트 2 및 컨쥬게이트 49, 36, 37, 38, 39, 43, 45 (각각 siRNA의 농도가 군별로 20 μM, 6 μl인 0.9 중량%의 NaCl 수용액 형태로 제공됨)를 27.2 μL의 시트르산 나트륨 수용액 (pH 5.0), 4.08 μL의 탈이온수 및 2.72 μL의 트리토좀 (Xenotech Inc.에서 구입, 카탈로그 번호 R0610 LT, 로트 번호 1610069)과 개별적으로 잘 혼합하고, 37℃의 항온에서 배양하였다. 0 시간, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 24 시간 및 48 시간의 각 시점에서 5 μL 샘플을 각각 채취하고, 변성을 위해 15 μL의 9 M 우레아에 첨가했으며, 4 μL의 6Х로딩 완충액 (Solarbio Inc.사에서 구입, 카탈로그 번호 20160830)을 첨가한 다음, 즉시 -80℃의 냉동고에서 동결 보존하여 반응을 종결시켰다. 0 시간은 시험할 샘플이 리소좀 용해물과 잘 혼합된 직후 샘플을 채취한 순간을 나타낸다.
리소좀 용해물로 처리되지 않은 대조군 샘플의 제조: 동일한 몰 (20 μM)로 1.5 μL의 상기 컨쥬게이트를 각각 7.5 μL의 시트르산 나트륨 수용액 (pH 5.0) 및 1 μL의 탈이온수와 잘 혼합하고, 변성을 위해 30 μL의 9 M 우레아 용액에 첨가했으며, 8 μL의 6Х 로딩 완충액을 첨가한 다음, 즉시 -80℃의 냉동고에서 동결 보존하여 반응을 종결시켰다. 각 컨쥬게이트에 대한 대조군 샘플은 전기 영동도에서 Con으로 표시되어 있다.
16 중량%의 비-변성 폴리아크릴아미드 겔을 제조하였다. 20 μL의 전술한 각각의 시험 샘플 및 대조군 샘플을 겔 상에 로딩하여 20 mA 정전류하에 10 분 동안, 이어서 40 mA 정전류하에 30 분 동안 전기 영동을 수행하였다. 전기 영동을 종료한 후, 겔을 진탕기에 넣고 10 분 동안 겔레드 염료(Gelred dye) (BioTium, 카탈로그 번호 13G1203)로 염색하였다. 겔을 영상화, 관찰 및 복사가 실시되었다. 결과는 도 1에 도시되어 있다.
도 1은 트리토좀에서 시험한 siRNA 컨쥬게이트의 시험관내 안정성의 반정량적 검출 결과를 나타낸다. 결과는 본 발명의 컨쥬게이트가 트리토좀에서 오랫동안 분해되지 않고 유지될 수 있으며, 이는 우수한 안정성을 보이는 것을 나타낸다.
도 1의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 특정 변형을 갖는 siRNA는 리소좀 용해물에서 만족스러운 안정성을 나타낸다.
(실험예 2-2) 시험관내 리소좀 용해물에서의 siRNA 컨쥬게이트의 안정성.
시험할 샘플이 컨쥬게이트 1 및 6, 서열 1 및 2, 및 NS 음성 대조군이고 트리토좀과의 배양 시간이 각각 0 시간, 5 분, 15 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간 및 8 시간인 것을 제외하고, 실험예 2-1에서와 동일한 방법을 이용하여 안정성을 측정하였다. 상기, 서열 1 및 2의 서열은 아래에 나타나 있으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 고상 합성방법에 의해 얻어질 수 있다:
서열 1:
센스 가닥: CCUUGAGGCAUACUUCAAA (서열 번호: 143)
안티센스 가닥: UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUC (서열 번호: 144)
서열 2:
센스 가닥: CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm (서열 번호: 145)
안티센스 가닥: VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsCm (서열 번호: 146)
비-변성 폴리아크릴아미드 겔의 전기 영동 결과는 도 2에 도시되어 있다.
도 2는 트리토좀에서 시험된 siRNA 컨쥬게이트의 시험관내 안정성의 반정량적 검출 결과를 나타낸다. 결과는 본 발명의 컨쥬게이트가 트리토좀에서 오랫동안 분해되지 않고 유지될 수 있으며, 이는 우수한 안정성을 보이는 것을 나타낸다.
(실험예 2-3) 인간 혈장에서의 안정성
컨쥬게이트 1 및 6, 서열 2 및 3, 및 NS 음성 대조군 (각각 siRNA의 농도가 군별로 20 μM, 12 μl인 0.9 중량% NaCl 수용액의 형태로 제공됨)을 개별적으로 108 μL의 90% 인간 혈장 (PBS에 희석됨)으로 잘 혼합하고, 37℃의 항온에서 배양하였다. 0 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 24 시간, 48 시간 및 72 시간의 각 시점에서 10 μL의 샘플을 각각 채취하고, 액체 질소에서 즉시 동결시켜 -80℃의 냉동고에서 동결 보존하였다. 각 시점에서 샘플링한 후, 동결 보존된 각 샘플을 1ХPBS (pH 7.4)로 5배 희석한 다음, 사용을 위해 10 μL의 부피로 채취하였다. 한편, 시험할 각각의 샘플을 동일한 몰 (2μM, 2μL)로 채취하여 8μL의 1ХPBS (pH 7.4)와 잘 혼합함으로써, 인간 혈장으로 처리되지 않은 10μL의 샘플 (Con으로 표시)을 얻었다. 20 중량%의 비-변성 폴리아크릴아미드 겔을 제조하였다. 상기 동결 보존된 각 샘플을 4 μL의 로딩 완충액 (20 mM EDTA의 수용액, 36 중량%의 글리세롤 및 0.06 중량%의 브로모페놀블루)과 혼합한 다음, 상기 겔에 로딩하여 80 mA 정전류에서 60 분 동안 전기 영동을 수행하였다. 전기 영동을 종료한 후, 겔을 1ХSybr Gold 염료 (Invitrogen, 카탈로그 번호 11494)로 15 분 동안 염색한 후 영상화하였다. 결과는 도 3에 도시되어 있다. 상기, 서열 3의 서열은 아래에 도시되어 있으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 고상 합성방법에 의해 얻어질 수 있다:
서열 3:
센스 가닥: CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm (서열 번호: 147)
안티센스 가닥: VPUmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm (서열 번호: 148)
도 3은 인간 혈장에서 시험한 컨쥬게이트의 시험관내 안정성의 반정량적 검출 결과를 나타낸다.
도 3의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 인간 혈장에서, 본 발명의 컨쥬게이트는 최대 72 시간까지 분해되지 않은 상태로 유지되어, 인간 혈장에서 우수한 안정성을 나타낸다.
(실험예 2-4) 원숭이 혈장에서의 컨쥬게이트의 안정성
컨쥬게이트 1 및 6, 및 서열 2 및 3 (각각 siRNA의 농도가 군별로 20 μM, 12 μl인 0.9 중량%의 NaCl 수용액 형태로 제공됨)을 108 μL의 90% 시노몰구스 원숭이 혈장 (원숭이 혈장, HONGQUAN Bio에서 구입, 카탈로그 번호 HQ70082, PBS로 희석함)과 개별적으로 잘 혼합하고 37℃의 항온에서 배양하였다. 0 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 24 시간, 48 시간 및 72 시간의 각 시점에서 10 μL의 샘플을 각각 채취하고, 액체 질소에서 즉시 동결시켜 -80℃의 냉동고에서 동결 보존하였다. 각 시점에서 샘플링한 후, 각 샘플을 1ХPBS (pH 7.4)로 5배 희석한 후 사용을 위해 10 μL의 부피로 채취하였다. 한편, 시험할 각 샘플을 동일한 몰 (2μM, 2μL)로 채취하여 8μL의 1ХPBS (pH 7.4)와 잘 혼합함으로써, 10μL의 원숭이 혈장으로 처리하지 않은 샘플 (Con로 표시)을 얻었다. 20 중량%의 비-변성 폴리아크릴아미드 겔을 제조하였다. 동결 보존된 각 샘플을 4 μL의 로딩 완충액 (20 mM EDTA의 수용액, 36 중량%의 글리세롤 및 0.06 중량%의 브로모페놀 블루)과 모두 혼합한 다음, 상기 겔에 로딩하여 80 mA 정전류에서 60 분 동안 전기 영동을 수행하였다. 전기 영동을 종료한 후, 겔을 1ХSybr Gold 염료 (Invitrogen, 카탈로그 번호 11494)로 15 분 동안 염색한 후 영상화하였다. 결과는 도 4에 도시되어 있다.
도 4는 원숭이 혈장에서 시험한 siRNA의 시험관내 안정성의 반정량적 검출 결과를 나타낸다.
도 4의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 시노몰구스 원숭이 혈장에서, 본 발명의 siRNA 컨쥬게이트는 최대 72 시간까지 분해되지 않은 상태로 유지되어 원숭이 혈장에서 우수한 안정성을 나타낸다.
(실험예 2-5) 이 실험은 시험관내 리소좀 용해물에서 본 발명의 siRNA 컨쥬게이트의 안정성을 나타냈다.
이 실험예에서 사용된 음성 대조군 X2M2의 서열은 다음과 같다:
센스 가닥: 5'-CmCmUmUmGAGGCmAUmACmUmUmCmAAAdT-S-dT-3' (서열 번호: 149)
안티센스 가닥: 5'-UfUmUfGAAGUfAUGCCUfCAAGGdT-S-dT-3' (서열 번호: 150).
이 siRNA는 고상 포스포라미다이트법에 의해 합성되었다. 음성 대조군 및 컨쥬게이트 2를 0.9 중량%의 NaCl 수용액으로 각각 20 μM (siRNA의 농도에 기반함) 농도의 수용액으로 제형화했고, 이는 X2M2 및 컨쥬게이트 2로 표시되었다.
1) 쥐 유래 리소좀 용해물에서의 안정성 검출
리소좀 용해물로 처리된 시험 샘플의 제조: 6 μl의 각각의 컨쥬게이트 2 및 X2M2 (20μM)에 대해 27.2 μL의 시트르산 나트륨 수용액 (pH 5.0), 4.08 μL의 탈이온수 및 2.72 μL의 쥐 리소좀 용해물 (Rat Liver Tritosomes, Xenotech Inc.에서 구입, 카탈로그 번호 R0610.LT, 로트 번호 1610069, 산성 포스파타아제의 최종 농도 0.2 mU/μL)과 개별적으로 잘 혼합하고, 37℃의 항온에서 배양하였다. 0 시간, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간 및 24 시간의 각 시점에서 5 μL 혼합 용액을 채취하고, 변성을 위해 15 μL의 9 M 우레아 용액에 첨가했으며, 4 μL의 첨가 6Х로딩 완충액 (Solarbio Inc.에서 구입, 카탈로그 번호 20160830)을 첨가한 다음, 즉시 -80℃의 냉동고에서 동결 보존하여 반응을 종결시켰다. 0 시간은 시험할 샘플이 리소좀 용해물과 잘 혼합된 직후 샘플을 채취한 순간을 나타낸다.
리소좀 용해물로 처리되지 않은 대조군 샘플의 제조: 동일한 몰로 1.5 μL의 각각의 컨쥬게이트 2 및 X2M2 (20 μM)에 대해 7.5 μL의 시트르산 나트륨 수용액 (pH 5.0) 및 1 μL의 탈이온수와 잘 혼합하고, 변성을 위해 30 μL의 9 M 우레아 용액을 첨가했으며, 8 μL의 6Х로딩 완충액을 첨가한 다음, 즉시 -80℃의 냉동고에서 동결 보존하여 반응을 종결시켰다. 각 전기 영동 이미지에 대해, 상응하는 대조군 샘플을 M으로 표시하였다. 16 중량%의 변성되지 않은 폴리아크릴아미드 겔을 제조하였다. 20 μL의 전술한 시험 샘플 및 대조군 샘플을 각각 겔 상에 로딩하여 20 mA 정전류하에 10 분 동안, 이어서 40 mA 정전류하에 30 분 동안 전기 영동을 수행하였다. 전기 영동을 종료한 후, 겔을 진탕기에 넣고 10 분 동안 겔레드 염료 (BioTium, 카탈로그 번호 13G1203)로 염색하였다. 겔을 영상화, 관찰 및 복사가 실시되었다. 결과는 도 5에 도시되어 있다.
2) 인간 리소좀 용해물에서의 안정성 검출
쥐 리소좀 용해물을 인간 리소좀 용해물(Human Liver Lysosomes, Xenotech Inc.에서 구입, 카탈로그 번호 R0610.L, 로트 번호 1610316)로 대체한 것을 제외하고, 인간 리소좀 용해물에서 X2M2 및 컨쥬게이트 2의 안정성을 1)과 동일한 방법을 이용하여 측정했다 . 결과는 도 6에 도시되어 있다.
도 5 및 6은 본 발명의 siRNA 컨쥬게이트가 인간 유래 리소좀 용해물 및 쥐 리소좀 용해물 모두에서 적어도 24 시간 동안 분해되지 않은 상태로 유지되어 만족스러운 안정성을 보이는 것을 나타낸다.
실험예 3: 생체내 쥐에서 컨쥬게이트 1과 6의 약동학적 연구 결과
이 실험예에서, 컨쥬게이트 1 및 6을 각각 10 mg/kg 및 50 mg/kg의 단일 용량으로 피하 주사에 의해 각 실험군 (각 군에는 5 마리의 수컷과 5 마리의 암컷, 총 10 마리의 쥐)의 쥐에 투여하였다. 이어서, 쥐의 혈장, 간 및 신장 조직에서의 약물 농도를 각 시점에 측정하였다.
이 실험예에서 사용된 SD 쥐는 Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.에서 제공하였다.
먼저, PRISTIMAdata 시스템 버전 7.2.0을 사용하여 SD 쥐를 체중 및 성별에 따라 무작위로 몇개의 군으로 나눈 다음, 각 컨쥬게이트 기를 설계된 투여량에 따라 각각 투여하였다. 모든 동물에 대한 약물 투여량은 체중에 따라 계산했다 (단일 투여 (피하), 1 mg/ml 및 5 mg/ml 컨쥬게이트를 포함하는 0.9% NaCl 수용액의 형태로 10 mg/kg 및 50 mg/kg의 투여량, 및 10 mL/kg의 투여부피). 쥐 전혈은 투여 전, 그리고 투여 후 5 분 (±30 초), 30 분 (±1 분), 1 시간 (±2 분), 2 시간 (±2 분), 6 시간 (±5분), 24 시간 (±10 분), 48 시간 (±20 분), 72 시간 (±20 분), 120 시간 (±30 분) 및 168 시간 (±30 분)에 경정맥에서 수집하였다. 이어서, 전혈 샘플을 2 내지 8℃에서 1800Хg으로 10 분 동안 원심 분리하여 혈장을 분리하였다. 약 70 μL 부피의 혈장 샘플을 하나의 튜브에 넣고서, 나머지 샘플은 또 다른 튜브에 넣은 후, 둘 모두는 검출을 위해 -70℃ 내지 -86℃에서 동결 보존하였다. 쥐의 체중 (60 mg/kg, 복강내 주사)에 따라 펜토바비탈 나트륨으로 쥐를 마취시키고, 복부 대동맥에서 혈액을 수집해서 쥐를 안락사시키고 육안 해부를 수행하는 것을 포함하는 방법에 의해 투여후 약 24, 48, 72, 120 및 168 시간에 쥐의 간 및 신장 조직을 수집하였다. 각 쥐의 간 및 신장을 샘플링하고 검출 및 분석할 때까지 -68℃ 아래에서 1mL의 냉동관에 저장하였다.
쥐의 혈장, 간 및 신장 조직에서 컨쥬게이트 24 및 25의 농도는 다음의 특정 단계에 따라 형광 검출을 이용한 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC-FLD)에 의해 정량적으로 측정했다:
(1) 조직의 질량이 80 mg 이하가 될 때까지 조직을 분쇄한 다음, 조직 및 세포 용해 용액 (공급자: Epicentre, 카탈로그 번호 MTC096H)을 첨가하여 66.7 mg/mL의 조직 균질물을 제조하는 단계;
(2) 조직 균질물을 초음파 처리 (150 W, 30 초)하여 세포를 파괴시키는 단계;
(3) 조직 샘플의 경우, 96-웰 PCR 플레이트에 75 μL의 조직 샘플을 첨가하고, 5 μL의 프로테이나제 K (공급자: Invitrogen, 카탈로그 번호 25530-015), 및 10 중량%의 아세토니트릴과 0.01 중량%의 트윈 20 (Tween 20)의 혼합 수용액 10 μL를 첨가하며; 혈장 샘플의 경우, 96-웰 PCR 플레이트에 20 μL의 혈장을 첨가하고, 45 μL의 조직 및 세포 용해 용액, 5 μL의 프로테이나제 K, 및 10 중량%의 아세토니트릴과 0.01 중량%의 트윈 20의 혼합 수용액 20 μL를 첨가하는 단계;
(4) 플레이트를 밀봉하고 이를 PCR기구 (공급자: Applied Biosystems, 모델: GeneAmp® PCR system 9700)에 넣은 후, 65℃에서 45 분 동안 배양하는 단계;
(5) 배양을 종료한 후, 10 μl의 3M KCl 수용액 (공급자: Sigma-aldrich, 카탈로그 번호 60135-250ML)을 첨가하고, 잘 흔든 후, 4℃에서 3200 rcf로 15 분 동안 원심 분리하는 단계;
(6) 조직 샘플의 경우, 120 μL의 혼성화 혼합물 용액(제조: 0.5 mL의 6 μM PNA 프로브 (공급자: TAHE-PNA), 1 mL의 200 mM Trizma/pH=8, 5 mL의 8 M 우레아 수용액, 3.5 mL의 H2O, 2 mL의 아세토니트릴)에 80 μL의 상청액을 첨가하는 단계 ;
혈장 샘플의 경우, 160 μL의 혼성화 혼합물 용액(제조: 0.5 mL의 6 μM PNA 프로브, 1 mL의 200 mM Trizma/pH=8, 5 mL의 8 M 우레아 수용액, 7.5 mL의 H2O, 2 mL의 아세토니트릴)에 40 μL의 상청액을 첨가하는 단계 ;
(7) 플레이트를 밀봉하고 이를 PCR기구에 넣고서, 95℃에서 15 분 동안 배양한 다음, 즉시 얼음 위에 5 분 동안 놓아 두는 단계;
(8) 샘플을 원뿔형 바닥을 지닌 새로운 96-웰 플레이트로 옮기고, 잘 흔든 후, 3200 rcf로 1 분 동안 원심 분리하는 단계; 및
(9) HPLC-FLD (액상 시스템 공급자: Thermo Fisher, 크로마토그래피 모델: ultimate 3000)를 사용하여 검출 및 정량 분석을 위해 샘플을 주입하는 단계.
분석한 결과는 도 7 내지 14에서 확인할 수 있으며, 상기 도 7 내지 10은 각각 10 mg/kg 또는 50 mg/kg의 투여량으로 컨쥬게이트 1에 대한 쥐 혈장의 PK/TK 혈장 농도와 쥐의 간 및 신장에서 PK/TK 조직 농도의 시간에 따른 대사 곡선을 나타내며; 도 11 내지 14는 각각 10 mg/kg 또는 50 mg/kg의 투여량으로 컨쥬게이트 6에 대한 쥐 혈장에서 PK/TK 혈장 농도와 쥐의 간 및 신장에서 PK/TK 조직 농도의 시간에 따른 대사 곡선을 나타낸다. 구체적으로,
도 7은 쥐의 혈장에서 10 mg/kg의 투여량으로 컨쥬게이트 1에 대한 PK/TK 혈장 농도를 나타내는 시간에 따른 대사 곡선이다.
도 8은 쥐의 간 및 신장에서 10 mg/kg의 투여량으로 컨쥬게이트 1에 대한 PK/TK 조직 농도를 나타내는 시간에 따른 대사 곡선이다.
도 9는 쥐의 혈장에서 50 mg/kg의 투여량으로 컨쥬게이트 1에 대한 PK/TK 혈장 농도를 나타내는 시간에 따른 대사 곡선이다.
도 10은 쥐의 간 및 신장에서 50 mg/kg의 투여량으로 컨쥬게이트 1에 대한 PK/TK 조직 농도를 나타내는 시간에 따른 대사 곡선이다.
도 11은 쥐의 혈장에서 10 mg/kg의 투여량으로 컨쥬게이트 6에 대한 PK/TK 혈장 농도를 나타내는 시간에 따른 대사 곡선이다.
도 12는 쥐의 간 및 신장에서 10 mg/kg의 투여량으로 컨쥬게이트 6에 대한 PK/TK 조직 농도를 나타내는 시간에 따른 대사 곡선이다.
도 13은 쥐의 혈장에서 50 mg/kg의 투여량으로 컨쥬게이트 6에 대한 PK/TK 혈장 농도를 나타내는 시간에 따른 대사 곡선이다.
도 14는 쥐의 간 및 신장에서 50 mg/kg의 투여량으로 컨쥬게이트 6에 대한 PK/TK 조직 농도를 나타내는 시간에 따른 대사 곡선이다.
도 7 내지 14의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 쥐의 혈장에서의 컨쥬게이트 1 및 6의 농도는 수 시간 내에 검출 한계 아래로 급격히 감소한 반면, 쥐의 간 조직의 농도는 낮은 투여량 (10 mg/kg) 또는 상대적으로 높은 투여량 (50 mg/kg)에서 각각 적어도 168 시간에 걸쳐 상대적으로 높고 안정적인 수준으로 유지되었다. 이는 본 발명의 siRNA 컨쥬게이트가 간에서 특이적으로 그리고 현저하게 농축될 수 있고 안정하게 유지되어 높은 수준의 표적화를 보이는 것을 나타낸다.
실험예 4: 이 실험은 생체내 HBV mRNA의 발현에 대한 본 발명의 siRNA 컨쥬게이트의 억제 효율을 나타낸다.
이 실험예에서, HBV 유전자이식 생쥐 C57BL/6J-Tg (Alb1HBV) 44Bri/J에서 HBV mRNA의 발현에 대한 컨쥬게이트 5 및 7의 억제 효율을 조사하였다.
생쥐 혈청내 HBsAg 함량은 B형 간염 바이러스 표면 항원 분석 키트 (효소 연결 면역흡착 분석(Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA) (Shanghai Kehua Bio-engineering Co., Ltd.)를 사용하여 측정하였다. S/COV>10을 갖는 생쥐를 선택하고 무작위로 군 (모든 암컷, 각 군에서 4 마리의 생쥐)으로 나눠서, 각각 컨쥬게이트 5 및 컨쥬게이트 7로 번호를 매긴 후, 대조군에는 생리 식염수 (normal saline, NS)를 첨가하였다. 모든 동물에 대한 약물 투여량은 체중에 따라 계산했다 (단일 투여 (피하), 0.2 mg/ml 및 0.02 mg/ml 컨쥬게이트를 포함하는 0.9% NaCl 수용액의 형태로 1 mg/kg 및 0.1 mg/kg의 투여량, 및 5 mL/kg의 투여량). 투여후 14 일째에 동물을 희생시켰다. 간은 나중에 RNA로 수집하여 보관하고 (Sigma Aldrich), 간 조직을 조직 균질화기로 균질화시켰다. 이어서, 총 RNA 추출을 위한 표준 절차에 따라 트리졸을 사용하여 총 RNA를 추출해서 얻었다.
간 조직에서 HBV mRNA의 발현 수준은 실시간 형광 qPCR에 의해 검출하였다. 구체적으로, 추출된 총 RNA를 지시에 따라 ImProm-IITM 역전사 키트 (Promega)를 사용하여 cDNA로 역전사한 다음, 형광 qPCR 키트 (Beijing Cowin Biosicences Co., Ltd)를 사용하여 간 조직에서 HBV mRNA의 발현에 대한 siRNA의 억제 효율을 검출하였다. 이 형광 qPCR 방법에서, β-액틴 유전자는 내부 제어 유전자로서 사용했고, HBV 및 β-액틴은 각각 HBV 및 β-액틴용 프라이머를 사용하여 검출하였다.
검출용 프라이머의 서열은 표 4에 나타나 있다.
검출용 프라이머의 서열
유전자 업스트림 프라이머 다운스트림 프라이머
HBV 5'-CCGTCTGTGCCTTCTCATCT-3'
(서열번호: 151)		 5'-TAATCTCCTCCCCCAACTCC-3'
(서열번호: 152)
β-액틴 5'-AGCTTCTTTGCAGCTCCTTCGTTG-3'
(서열번호: 153)		 5'- TTCTGACCCATTCCCACCATCACA-3'
(서열번호: 154)
이 형광 qPCR 방법에서, HBV mRNA의 발현은 HBV X 유전자의 잔여 발현으로서 표현했고 다음의 식에 의해 계산했다:
HBV X 유전자의 잔여 발현=(시험 군에서 HBV X 유전자의 카피 수/시험 군에서 β-액틴 유전자의 카피 수)/(대조군에서 HBV 유전자의 카피 수/대조군에서 β-액틴 유전자의 카피 수) Х 100%, 이는 도면에서 HBV X/β-액틴 mRNA 발현으로 표시된다.
이어서, mRNA에 대한 컨쥬게이트의 억제율을 하기 식에 따라 계산했다:
mRNA에 대한 컨쥬게이트의 억제율=(1-HBV X 유전자의 잔여 발현) Х 100%.
상기, 대조군은 이 실험에서 NS를 투여한 대조군 생쥐의 군이고 각 시험 군은 각각 상이한 siRNA 컨쥬게이트를 투여한 생쥐의 군이었다. 결과는 도 15에 도시되어 있다.
다른 실험에서, 다음의 조건에 따라 몇 가지 시험을 추가로 수행하였다.
투여할 siRNA 컨쥬게이트를 컨쥬게이트 1 및 6으로 대체하고, 14 일에 데이터를 수집한 것을 제외하고, 전술한 바와 동일한 방법을 이용하여 시험을 수행하였다. 결과는 도 16에 도시되어 있다;
투여할 siRNA 컨쥬게이트를 컨쥬게이트 5 및 6으로 대체하고 데이터를 7 일에 수집한 것을 제외하고, 전술한 바와 동일한 방법을 이용하여 시험을 수행하였다. 결과는 도 17에 도시되어 있다;
투여할 siRNA 컨쥬게이트를 컨쥬게이트 9, 10, 5 및 6으로 대체하고 데이터를 7 일에 수집한 것을 제외하고, 전술한 바와 동일한 방법을 이용하여 시험을 수행하였다. 결과는 도 18에 도시되어 있다;
투여할 siRNA 컨쥬게이트를 컨쥬게이트 1, 2, 3 및 4 (각 군에서 5 마리 생쥐)로 대체하고 28 일에 데이터를 수집한 것을 제외하고, 전술한 바와 동일한 방법을 이용하여 시험을 수행하였다. 각 컨쥬게이트는 1 mg/kg 및 0.3 mg/kg의 2가지 투여량으로 투여했다 (상기 투여부피는 동일하게 유지되는 반면, 컨쥬게이트 용액의 농도는 각각 조절되었다). 그 결과는 각각 도 19에 도시되어 있다.
투여할 siRNA 컨쥬게이트를 컨쥬게이트 1로 대체하고 데이터를 14 일에 수집한 것을 제외하고, 전술한 바와 동일한 방법을 이용하여 시험을 수행하였다. 각각의 컨쥬게이트는 1 mg/kg 및 0.1 mg/kg의 2가지 투여량으로 투여하였다. (상기 투여량은 동일하게 유지되는 반면, 컨쥬게이트 용액의 농도는 각각 조절되었다). 결과는 각각 도 20에 도시되어 있다.
상기 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 상이한 시험 시점을 갖는 여러 실험에서, 전술한 본 발명의 모든 컨쥬게이트는 생체내 생쥐에서 HBV mRNA의 발현에 대한 높은 억제 활성을 나타낸다.
실험예 5: 이 실험은 HBV 유전자이식 생쥐 혈청에서 HBsAg 및 HBV DNA에 대한 본 발명의 siRNA 컨쥬게이트의 억제 효율에 관한 시간-의존적 시험을 나타낸다.
AAV-HBV 모델 생쥐를 사용하였다. 동물 모델을 성공적으로 확립한 후, 이들 생쥐를 혈청내 HBsAg 함량 (각 군에서 5 마리 생쥐)에 기반하여 무작위로 몇개의 군으로 나누었다. 컨쥬게이트 1 및 6, 비교 컨쥬게이트 2 및 블랭크 대조군으로서 NS를 각 그룹에 투여하였다. 모든 동물에 대한 약물 투여량은 체중에 따라 계산되었다(단일 투여 (피하), 0.3 mg/ml 및 0.1 mg/ml 컨쥬게이트를 포함하는 0.9% NaCl 수용액의 형태로 3 mg/kg 및 1 mg/kg의 투여량, 및 5 mL/kg의 투여부피). 투여전 (D0으로 표시됨) 및 투여후 7, 14, 21, 28, 56, 84, 112, 140, 154, 168 및 182 일에 생쥐 눈확 정맥 신경총에서 혈액을 채취하고, 혈청내 HBsAg 수준을 각 시점마다 측정하였다. 실험 동안, 시험 결과에서 혈청내 HBsAg 함량이 원래 값에 근접하거나 그 이상이면 대상체의 검출이 종료된다.
매번 약 100 μl의 안와부 혈액을 채취했고, 원심 분리 후 혈청은 20 μl 이상이었다. 혈청내 HBsAg의 함량은 HBsAg CLIA 키트 (Autobio, CL0310)를 사용하여 측정하였다. HBV DNA의 발현 수준은 QIAamp 96 DNA 혈액 키트 및 이어서 qPCR의 지시를 참조하여 혈청에서 DNA를 추출함으로써 측정하였다.
정규화된 HBsAg 발현 수준=(투여후 HBsAg의 함량/투여전 HBsAg의 함량) Х 100%.
HBsAg에 대한 억제율=(1-투여후 HBsAg의 함량/투여전 HBsAg의 함량) Х 100%, 상기 HBsAg의 함량은 혈청 밀리리터 (ml) 당 HBsAg의 당량 (UI)으로 표현하였다.
정규화된 HBV DNA 발현 수준=(투여후 HBV DNA 함량/투여전 HBV DNA 함량) Х 100%.
HBV DNA에 대한 억제율=(1-투여후 HBV DNA의 함량/투여전 HBV DNA의 함량) Х 100%,
상기 HBV DNA의 함량은 혈청 밀리리터 (ml) 당 HBV DNA의 카피로 표현하였다.
결과는 도 21 및 22에 도시되어 있다.
도 21의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, NS 음성 대조군은 투여후 여러 시점에서 억제 효과를 보이지 않았다; 대조적으로, 각 siRNA 컨쥬게이트는 투여후 여러 시점에서 HBsAg에 대한 우수한 억제 효과를 보인다. 특히, 컨쥬게이트 1은 최대 140 일 동안 혈청에서 HBsAg에 대해 높은 억제율을 일관되게 보였고, 이는 더 긴 시간에 걸쳐 HBV 유전자의 발현에 대해 안정적이고 효과적인 억제를 나타낸다.
도 22의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 각각의 실시예의 siRNA 컨쥬게이트는 HBV DNA의 발현에 대한 효율적인 억제도 보였고, 최대 84 일의 기간에 걸쳐 높은 억제율을 유지하였다.
대조적으로, 비교 컨쥬게이트 2는 생체내 실험에서 개별 컨쥬게이트와 유사한 mRNA 억제 효과를 달성했지만, 도 21 및 22에 도시된 억제 효과의 지속 기간은 동일한 용량 수준으로 컨쥬게이트 1 및 6의 기간보다 현저히 짧았다.
전술한 바와 동일한 방법에 따라, 다음을 제외하고 혈청 HBsAg를 측정한 4 가지 이상의 시험을 추가로 수행하였다.
저농도 AAV-HBV 생쥐 모델에서, 3 mg/kg 및 1 mg/kg의 컨쥬게이트 6을 각각 투여했고; 시험은 140 일까지 계속되었으며; 결과는 도 23에 도시되어 있다.
M-Tg 모델에서, 각각 3 mg/kg (3mpk) 및 1 mg/kg (1mpk)의 컨쥬게이트 5 및 6 (대조군으로 PBS)을 투여했고; 시험은 70 일까지 계속되었다; 결과는 도 24에 도시되어 있다. 생쥐는 상하이 보건소 동물부에서 구입하였다. 유전자이식 생쥐의 제조 방법은 Ren J. 등의 J. Medical Virology. 2006, 78: 551-560에 기재되어 있다;
M-Tg 모델에서, 5 mg/kg, 1 mg/kg 및 0.2 mg/kg의 컨쥬게이트 11 및 6 (대조군으로 PBS), 및 5 mg/kg의 비교 컨쥬게이트 2를 각각 투여했고; 시험은 78 일까지 계속되었다; 결과는 도 25에 도시되어 있다.
1.28 카피 모델에서, 3 mg/kg 및 1 mg/kg의 컨쥬게이트 1을 각각 투여했고; 시험은 210 일까지 계속되었다; 결과는 도 26 및 27에 도시되어 있다.
전술한 다양한 투여량에 대해, 각 컨쥬게이트를 동일한 투여량으로 투여하는 반면, 용액의 농도는 상응하는 투여량으로 투여되도록 상응하게 조절하였다.
도 22 내지 27의 결과로부터, 본 발명의 siRNA 컨쥬게이트는 다양한 동물 모델에서 혈청 HBsAg에 관한 일관되고 효율적인 억제 효율 및 규칙적인 용량 의존성을 보이는 것을 알 수 있다.
실험예 6: 이 실험은 본 발명의 siRNA 컨쥬게이트가 시험관내에서 더 높은 활성을 가질뿐만 아니라, 낮은 표적외 효과를 보이는 것을 나타낸다.
(6-1) 이 실험예에서 사용된 HEK293A 세포는 북경 대학교 분자 의학 연구소의 핵산 기술 연구소에서 제공했으며, 20%의 소 태아 혈청 (FBS, Hyclone company), 0.2v%의 페니실린-스트렙토마이신 (Gibco, Invitrogen사)을 포함하는 DMEM 완전 배지 (Hyclone company)내에서 5% CO2/95% 공기를 포함하는 37℃의 인큐베이터에서 배양되었다.
이 실험예에서, 컨쥬게이트 1은 시험관내 psiCHECK 시스템에서 표적내 활성 및 표적외 효과에 대해 조사하였다. 구체적으로, 컨쥬게이트 1은 완전히 일치하는 (뉴클레오티드 서열이 컨쥬게이트 1의 센스/안티센스 가닥의 전체 길이의 뉴클레오티드 서열과 완전히 상보적인) 표적 서열, 또는 표적화 시드 영역이 일치하는 (뉴클레오티드 서열이 컨쥬게이트 1의 센스/안티센스 가닥의 위치 1 내지 8의 뉴클레오티드 서열과 상보적인) 표적 서열을 표적화한다.
Kumico Ui-Tei 등이 기재한 방법, 체계적인 DNA 치환에 의한 siRNA 서열의 기능적 해부에 따르면: DNA 시드 암(seed arm)을 갖는 변성 siRNA는 표적외 효과를 상당히 감소시킨 포유동물 유전자 침묵을 위한 강력한 도구이다. Nucleic Acids Research, 2008.36 (7), 2136-2151, 검출용 플라스미드를 구성한 후 검출될 siRNA 컨쥬게이트로 HEK293A 세포 내부에 동시-형질주입시키고; 이중 루시퍼라제 리포터 유전자의 발현 수준은 siRNA 컨쥬게이트의 표적내 활성 및 표적외 효과를 반영한다. 구체적인 단계는 다음과 같다.
[1] 검출용 플라스미드 구성
psiCHECKTM-2 (PromegaTM) 플라스미드를 사용하여 4개의 재조합 플라스미드를 구성하였다. GSCM은 표적내 플라스미드를 나타내며; PSCM, GSSM 및 PSSM은 표적외 플라스미드를 나타낸다.
(1) 표적 서열을 포함하는 GSCM으로, 상기 표적 서열은 컨쥬게이트 1에서 안티센스 가닥의 모든 21개의 뉴클레오티드 서열과 완전히 상보적이다.
(2) 표적 서열을 포함하는 PSCM으로, 상기 표적 서열은 컨쥬게이트 1에서 안티센스 가닥의 모든 21개의 뉴클레오티드 서열과 동일하다.
(3) 표적 서열을 포함하는 GSSM으로, 상기 표적 서열은 컨쥬게이트 1에서 안티센스 가닥의 5' 말단부터 위치 1 내지 8의 뉴클레오티드 서열과 완전히 상보적인 반면, 표적 서열의 나머지 부분은 컨쥬게이트 1에서 안티센스 가닥의 5' 말단부터 위치 9 내지 21의 뉴클레오티드 서열과 상응하지만 완전히 불일치한다. 즉, 컨쥬게이트 1에서 안티센스 가닥의 5' 말단부터 위치 9 내지 21의 임의 위치에 있는 뉴클레오티드가 G, C, A 또는 U인 경우, 표적 서열내 상응하는 위치에 있는 뉴클레오티드는 T, A, C 또는 G이다.
　(4) 표적 서열을 포함하는 PSSM으로, 상기 표적 서열은 컨쥬게이트 1에서 센스 가닥의 5' 말단부터 위치 1 내지 8의 뉴클레오티드 서열과 완전히 상보적인 반면, 표적 서열의 나머지 부분은 컨쥬게이트 1에서 센스 가닥의 5' 말단부터 위치 9 내지 19의 뉴클레오티드 서열과 상응하지만 완전히 불일치한다. 즉, 컨쥬게이트 1에서 센스 가닥의 5' 말단부터 위치 9 내지 19의 임의 위치에 있는 뉴클레오티드가 G, C, A 또는 U인 경우, 표적 서열에서 상응하는 위치에 있는 뉴클레오티드는 T, A, C 또는 G이다. GSSM에서 표적 서열과 동일한 길이를 갖기 위해, PSSM에서 표적 서열의 3' 말단에 2개의 CC를 추가하였다.
표적 서열을 psiCHECKTM-2 플라스미드의 Xho I/Not I 부위에 삽입하였다.
형질주입
96-웰 플레이트에서, siRNA 및 각각의 상기 플라스미드를 LipofectamineTM 2000 (Invitrogen)의 지시에 따라 동시-형질주입시켰으며, 각 플라스미드는 몇몇 특이적 농도의 컨쥬게이트 A1에 상응한다. 구체적으로, 웰 당 0.2 μl의 LipofectamineTM 2000을 사용하여 10 ng의 플라스미드를 웰마다 형질주입시키고; 컨쥬게이트 1의 최종 농도 (siRNA의 농도에 기반함)는 100 nM 내지 0.0001 nM (11 농도의 4배 연속 희석)이었으며, 그룹 당 3개의 복제 웰이 있다.
검출
동시-형질주입 24 시간 후, 지시에 따라 이중 루시퍼라제 리포터 유전자 분석 키트 (Promega, 카탈로그 번호 E2940)를 사용하여 HEK293A 세포를 용해시켜 이중 루시퍼라제 리포터 유전자의 발현 수준을 검출하였다. 각 특정 농도의 시험 군에 대해, 컨쥬게이트로 처리되지 않은 군들을 대조군 (con)으로 사용하였다. 레닐라 루시퍼라제 단백질 수준 (Ren)을 반딧불이 루시퍼라제 단백질 수준 (Fir)으로 정규화하였다.
상이한 siRNA 농도로 측정한 활성 결과에 의해 용량-반응 곡선을 그리고, 곡선을 그래프패드 5.0 소프트웨어의 기능 로그 (억제제) 대 반응-가변 기울기를 사용하여 맞추었다. 하기 화학식을 갖는 용량-반응 곡선에 기반하여 GSCM을 표적화하는 siRNA의 IC50을 계산했다:
Figure pct00085
상기:
Y는 잔류 mRNA의 발현 수준이고,
X는 형질주입된 siRNA의 농도의 로그이고,
Bot는 정상 단계의 하단에 있는 Y 값이고,
Top 는 정상 단계의 상단에 있는 Y 값이고,
LogIC50은 Y가 점근선의 하단과 상단 사이의 중앙값일 때 X 값이며, HillSlope는 곡선의 기울기이다.
GSCM을 표적화하는 컨쥬게이트 1의 IC50을 용량-효과 곡선에 기반하여 계산하였다. 결과는 도 28A-28D에 도시되어 있으며, 이는 GSCM에 상응하는 컨쥬게이트 1의 IC50 값이 0.0513 nM임을 나타낸다. PSCM, GSSM 또는 PSSM에 상응하는 컨쥬게이트 1은 각 siRNA 농도에서 유의한 억제 효과를 보이지 않으며, 이는 본 발명의 siRNA 컨쥬게이트가 시험관내에서 더 높은 활성을 가질뿐만 아니라, 낮은 표적외 효과를 보이는 것을 나타낸다.
상기 결과에 따르면, 컨쥬게이트 1은 낮은 IC50을 갖는 표적내 플라스미드에서 표적 mRNA의 발현에 대한 우수한 억제 효과를 보인 반면; 3개의 표적외 플라스미드의 발현에 대한 억제 효과는 보이지 않았다. 따라서, 컨쥬게이트 1은 표적 mRNA의 우수한 억제 효율을 가질뿐만 아니라, 낮은 표적외 효과를 나타낸다.
이상으로 본 발명의 구현예에 대해 상세하게 설명했지만, 본 발명은 전술한 구현예의 구체적인 세부 내용으로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 본 발명의 기술적 해결방안의 여러 간단한 변형이 이루어질 수 있으며, 이들 간단한 변형은 본 발명의 범위 내에 있다.
상기 구현예에서 설명한 각각의 특정한 기술적 특징은 모순이 발생하지 않는 한 임의의 적절한 방식으로 결합될 수 있음을 주목해야 한다. 불필요한 반복을 피하기 위해, 다양한 가능한 조합 방식을 본 발명에서는 더 이상 설명하지 않는다.
또한, 본 발명의 다양한 상이한 구현예는 본 발명의 사상을 위반하지 않는 한, 임의의 조합으로 수행될 수도 있으며, 이 역시 본 발명의 개시로서 간주해야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Suzhou Ribo Life Science Co.,Ltd <120> NUCLEIC ACID, COMPOSITION AND CONJUGATE CONTAINING SAME, AND PREPARATION METHOD AND USE <130> ESP1V192712ZX/CNSZRB-KR <150> CN201711249333.8 <151> 2017-12-01 <150> CN201711482970.X <151> 2018-12-29 <160> 156 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is A, U, G or C <400> 1 ccuugaggca uacuucaan 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is A, U, G or C <400> 2 nuugaaguau gccucaagg 19 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is A, U, G or C <400> 3 nuugaaguau gccucaaggu u 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is A, U, G or C <400> 4 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86 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for L10-siHBa2M2SVP <400> 86 uuugaaguau gccucaaggu cgg 23 <210> 87 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for L10-siHBa1M5SVP <400> 87 ccuugaggca uacuucaaa 19 <210> 88 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for L10-siHBa1M5SVP <400> 88 uuugaaguau gccucaaggu u 21 <210> 89 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for L10-siHBa1M3SVP <400> 89 ccuugaggca uacuucaaa 19 <210> 90 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for L10-siHBa1M3SVP <400> 90 uuugaaguau gccucaaggu u 21 <210> 91 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for L10-siHBa1M4SVP <400> 91 ccuugaggca uacuucaaa 19 <210> 92 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for L10-siHBa1M4SVP <400> 92 uuugaaguau gccucaaggu u 21 <210> 93 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for P10-siHBa1M1SVP <400> 93 ccuugaggca uacuucaaa 19 <210> 94 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for P10-siHBa1M1SVP <400> 94 uuugaaguau gccucaaggu u 21 <210> 95 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for R5-siHBa1M1SVP <400> 95 ccuugaggca uacuucaaa 19 <210> 96 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for R5-siHBa1M1SVP <400> 96 uuugaaguau gccucaaggu u 21 <210> 97 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for LA5-siHBa1M1SVP <400> 97 ccuugaggca uacuucaaa 19 <210> 98 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for LA5-siHBa1M1SVP <400> 98 uuugaaguau gccucaaggu u 21 <210> 99 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for LB5-siHBa1M1SVP <400> 99 ccuugaggca uacuucaaa 19 <210> 100 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for LB5-siHBa1M1SVP <400> 100 uuugaaguau gccucaaggu u 21 <210> 101 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for V8-siHBa1M1SVP <400> 101 ccuugaggca uacuucaaa 19 <210> 102 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for V8-siHBa1M1SVP <400> 102 uuugaaguau gccucaaggu u 21 <210> 103 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for W8-siHBa1M1SVP <400> 103 ccuugaggca uacuucaaa 19 <210> 104 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for W8-siHBa1M1SVP <400> 104 uuugaaguau gccucaaggu u 21 <210> 105 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for X8-siHBa1M1SVP <400> 105 ccuugaggca uacuucaaa 19 <210> 106 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for X8-siHBa1M1SVP <400> 106 uuugaaguau gccucaaggu u 21 <210> 107 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for Z5-siHBa1M1SVP <400> 107 ccuugaggca uacuucaaa 19 <210> 108 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for Z5-siHBa1M1SVP <400> 108 uuugaaguau gccucaaggu u 21 <210> 109 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for FIN-siHBa2 <400> 109 gaccuugagg cauacuucaa a 21 <210> 110 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for FIN-siHBa2 <400> 110 uuugaaguau gccucaaggu cgg 23 <210> 111 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for FIN-siHBa2M5SVP <400> 111 gaccuugagg cauacuucaa a 21 <210> 112 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for FIN-siHBa2M5SVP <400> 112 uuugaaguau gccucaaggu cgg 23 <210> 113 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for FIN-siHBa2M3SVP <400> 113 gaccuugagg cauacuucaa a 21 <210> 114 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for FIN-siHBa2M3SVP <400> 114 uuugaaguau gccucaaggu cgg 23 <210> 115 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for FIN-siHBa2M4SVP <400> 115 gaccuugagg cauacuucaa a 21 <210> 116 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for FIN-siHBa2M4SVP <400> 116 uuugaaguau gccucaaggu cgg 23 <210> 117 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for FIN-siHBa2M1SVP <400> 117 gaccuugagg cauacuucaa a 21 <210> 118 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for FIN-siHBa2M1SVP <400> 118 uuugaaguau gccucaaggu cgg 23 <210> 119 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for FIN-siHBa2M2SVP <400> 119 gaccuugagg cauacuucaa a 21 <210> 120 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for FIN-siHBa2M2SVP <400> 120 uuugaaguau gccucaaggu cgg 23 <210> 121 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for FIN-siHBa3M2SVP <400> 121 ccuugaggca uacuucaaa 19 <210> 122 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for FIN-siHBa3M2SVP <400> 122 uuugaaguau gccucaaggu c 21 <210> 123 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for FIN-siHBa3M2S <400> 123 ccuugaggca uacuucaaa 19 <210> 124 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for FIN-siHBa3M2S <400> 124 uuugaaguau gccucaaggu c 21 <210> 125 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for FIN-siHBa1 <400> 125 ccuugaggca uacuucaaa 19 <210> 126 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for FIN-siHBa1 <400> 126 uuugaaguau gccucaaggu u 21 <210> 127 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for FIN-siHBa1M2SVP <400> 127 ccuugaggca uacuucaaa 19 <210> 128 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for FIN-siHBa1M2SVP <400> 128 uuugaaguau gccucaaggu u 21 <210> 129 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for FIN-siHBa1M2S <400> 129 ccuugaggca uacuucaaa 19 <210> 130 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for FIN-siHBa1M2S <400> 130 uuugaaguau gccucaaggu u 21 <210> 131 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for FIN-siHBa1M1SVP <400> 131 ccuugaggca uacuucaaa 19 <210> 132 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for FIN-siHBa1M1SVP <400> 132 uuugaaguau gccucaaggu u 21 <210> 133 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for FIN-siHBa2M1S <400> 133 gaccuugagg cauacuucaa a 21 <210> 134 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for FIN-siHBa2M1S <400> 134 uuugaaguau gccucaaggu cgg 23 <210> 135 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for FIN-siHBa1M1S <400> 135 ccuugaggca uacuucaaa 19 <210> 136 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for FIN-siHBa1M1S <400> 136 uuugaaguau gccucaaggu u 21 <210> 137 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for FIN-X2M2 <400> 137 ccuugaggca uacuucaaat t 21 <210> 138 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for FIN-X2M2 <400> 138 uuugaaguau gccucaaggt t 21 <210> 139 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for L10-NC <400> 139 uucuccgaac gugucacgu 19 <210> 140 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for L10-NC <400> 140 acgugacacg uucggagaau u 21 <210> 141 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for AD-66810 <400> 141 gugugcacuu cgcuucaca 19 <210> 142 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for AD-66810 <400> 142 ugugaagcga agugcacacu u 21 <210> 143 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for Sequence 1 <400> 143 ccuugaggca uacuucaaa 19 <210> 144 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for Sequence 1 <400> 144 uuugaaguau gccucaaggu c 21 <210> 145 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for Sequence 2 <400> 145 ccuugaggca uacuucaaa 19 <210> 146 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for Sequence 2 <400> 146 uuugaaguau gccucaaggu c 21 <210> 147 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for Sequence 3 <400> 147 ccuugaggca uacuucaaa 19 <210> 148 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for Sequence 3 <400> 148 uuugaaguau gccucaaggu u 21 <210> 149 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence for X2M2 <400> 149 ccuugaggca uacuucaaat t 21 <210> 150 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence for X2M2 <400> 150 uuugaaguau gccucaaggt t 21 <210> 151 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> upstream primer for HBV <400> 151 ccgtctgtgc cttctcatct 20 <210> 152 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> downstream primer for HBV <400> 152 taatctcctc ccccaactcc 20 <210> 153 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> upstream primer for ┑-actin <400> 153 agcttctttg cagctccttc gttg 24 <210> 154 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> downstream primer for ┑-actin <400> 154 ttctgaccca ttcccaccat caca 24 <210> 155 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense strand for the sequence <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> nA <400> 155 ccuugaggca uacuucaan 19 <210> 156 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense strand for the sequece <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> nU <400> 156 nuugaaguau gccucaagg 19

Claims (101)

  1. 하기 화학식 (1)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 siRNA 컨쥬게이트:
    Figure pct00086

    상기,
    n1은 1 내지 3의 정수이고, n3은 0 내지 4의 정수이며;
    각각의 m1, m2 및 m3은 독립적으로 2 내지 10의 정수이고;
    각각의 R10, R11, R12, R13, R14 및 R15는 독립적으로 H이거나 C1-C10 알킬, C1-C10 할로알킬 및 C1-C10 알콕시로 이루어진 군에서 선택되고;
    R3은 화학식 A59로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 기이다:
    Figure pct00087

    상기 E1은 OH, SH 또는 BH2이고; Nu는 siRNA이며;
    siRNA의 각 뉴클레오티드는 독립적으로 변형 또는 비변형의 뉴클레오티드이고; siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 상기 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 1을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 2를 포함하며; 상기 뉴클레오티드 서열 1 및 상기 뉴클레오티드 서열 2는 이중 가닥 영역을 형성하기 위해 적어도 부분적으로 상보적이며; 상기 뉴클레오티드 서열 1은 서열 번호155에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 동일한 길이 및 3개 이하의 상이한 뉴클레오티드를 가지며; 상기 뉴클레오티드 서열 2는 서열 번호156에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 동일한 길이 및 3개 이하의 상이한 뉴클레오티드를 갖는다:
    5'-CCUUGAGGCAUACUUCAAZ -3' (서열 번호: 155);
    5'-Z'UUGAAGUAUGCCUCAAGG -3' (서열 번호: 156);
    상기,
    Z는 A이고; Z'는 U이며;
    상기 뉴클레오티드 서열 1은 Z에 상응하는 부위에 뉴클레오티드 ZA를 포함하고;
    상기 뉴클레오티드 서열 2는 Z'에 상응하는 부위에 뉴클레오티드 Z'B를 포함하고; 상기 뉴클레오티드 Z'B는 안티센스 가닥의 5' 말단에서부터 제 1 뉴클레오티드이며;
    R2는 1 내지 20개의 탄소원자 길이를 갖는 선형 알킬렌이고, 하나 이상의 탄소원자는 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 알케닐렌, C2-C10 알키닐렌, C6-C10 아릴렌, C3-C18 헤테로사이클릴렌, 및 C5-C10 헤테로아릴렌으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 임의로 치환되고, 상기 R2는 C1-C10 알킬, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C1-C10 할로알킬, -OC1-C10 알킬, -OC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-OH, -OC1-C10 할로알킬, -SC1-C10 알킬, -SC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-SH, -SC1-C10 할로알킬, 할로, -OH, -SH, NH2, -C1-C10 알킬-NH2, -N(C1-C10 알킬) (C1-C10 알킬), -NH(C1-C10 알킬), 시아노, 니트로, -CO2H, -C(O)OC1-C10 알킬, -CON(C1-C10 알킬) (C1-C10 알킬), -CONH(C1-C10 알킬), -CONH2, -NHC(O)(C1-C10 알킬), -NHC(O)(페닐), -N(C1-C10 알킬)C(O)(C1-C10 알킬), -N(C1-C10 알킬)C(O)(페닐), -C(O)C1-C10 알킬, -C(O)C1-C10 알킬페닐, -C(O)C1-C10 할로알킬, -OC(O)C1-C10 알킬, -SO2 (C1-C10 알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1-C10 할로알킬), -SO2NH2, -SO2NH(C1-C10 알킬), -SO2NH (페닐), -NHSO2 (C1-C10 알킬), -NHSO2 (페닐) 및 -NHSO2(C1-C10 할로알킬)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 임의로 치환되며;
    각 L1은 독립적으로 1 내지 70개의 탄소원자 길이를 갖는 선형 알킬렌이고, 상기 하나 이상의 탄소원자는 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 알케닐렌, C2-C10 알키닐렌, C6-C10 아릴렌, C3-C18 헤테로사이클릴렌 및 C5-C10 헤테로아릴렌으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 임의로 치환되고, 상기 L1은 C1-C10 알킬, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C1-C10 할로알킬, -OC1-C10 알킬, -OC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-OH, -OC1-C10 할로알킬, -SC1-C10 알킬, -SC1-C10 알킬페닐 -C1-C10 알킬-SH, -SC1-C10 할로알킬, 할로, -OH, -SH, -NH2, -C1-C10 알킬-NH2, -N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -NH(C1-C10 알킬), 시아노, 니트로, -CO2H, -C(O)OC1-C10 알킬, -CON(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -CONH(C1-C10 알킬), -CONH2, -NHC(O)(C1-C10 알킬), -NHC(O)(페닐), -N(C1-C10 알킬)C(O)(C1-C10 알킬), -N(C1-C10 알킬)C(O) (페닐), -C(O)C1-C10 알킬, -C(O)C1-C10 알킬페닐, -C(O)C1-C10 할로알킬, -OC(O)C1-C10 알킬, -SO2 (C1-C10 알킬), -SO2 (페닐), -SO2 (C1-C10 할로알킬), -SO2NH2, SO2NH(C1-C10 알킬), -SO2NH (페닐), -NHSO2 (C1-C10 알킬), -NHSO2 (페닐), 및 -NHSO2(C1-C10 할로알킬)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 임의로 치환되며;
    물결선(
    Figure pct00088
    )은 분자의 나머지에 대한 작용기의 부착 부위를 나타내고;
    M1은 표적화 기를 나타낸다.
  2. 제 1 항에 있어서, 각 L1은 독립적으로 A1 내지 A26의 기 및 이들의 임의의 연결 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 siRNA 컨쥬게이트:
    Figure pct00089

    Figure pct00090

    상기, 각 j1은 독립적으로 1 내지 20의 정수이고;
    각 j2는 독립적으로 1 내지 20의 정수이며;
    각 R'는 독립적으로 C1-C10 알킬이고;
    각 Ra는 독립적으로 A27 내지 A45 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택되며:
    Figure pct00091

    Figure pct00092

    각 Rb는 독립적으로 C1-C10 알킬이다.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 L1은 A1, A4, A5, A6, A8, A10, A11, A13, 및 이들의 연결조합 중 하나 이상의 연결 조합, 및 이들의 연결 조합에서 선택되는 siRNA 컨쥬게이트.
  4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 L1은 A1, A4, A8, A10 및 A11 중 2개 이상의 연결 조합에서 선택되는 siRNA 컨쥬게이트.
  5. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L1은 A1, A8 및 A10 중 적어도 2개의 연결 조합에서 선택되는 siRNA 컨쥬게이트.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L1의 길이는 3 내지 25개의 원자인 siRNA 컨쥬게이트.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L1의 길이는 4 내지 15개의 원자인 siRNA 컨쥬게이트.
  8. 제 2 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 j1은 2 내지 10의 정수이고, j2는 2 내지 10의 정수이며, R'는 C1-C4 알킬이고, Ra는 A27, A28, A29, A30 및 A31로 이루어진 군에서 선택되며, Rb는 C1-C5 알킬인 siRNA 컨쥬게이트.
  9. 제 2 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 j1은 3 내지 5의 정수이고, j2는 3 내지 5의 정수이며, R'는 메틸, 에틸 또는 이소프로필이고, Ra는 A27 또는 A28이고, Rb는 메틸, 에틸, 이소프로필 또는 부틸인 siRNA 컨쥬게이트.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 n1은 1 내지 2의 정수이고, n3은 0 내지 1의 정수이며, n1+n3=2~3인 siRNA 컨쥬게이트.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각각의 m1, m2 및 m3은 독립적으로 2 내지 5의 정수인 siRNA 컨쥬게이트.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 m1=m2=m3인 siRNA 컨쥬게이트.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각 M1은 독립적으로 포유동물 간세포 표면 상의 아시알로당단백질 수용체 (asialoglycoprotein receptor, ASGP-R)에 결합하는 리간드인 siRNA 컨쥬게이트.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각 M1은 독립적으로 아시알로당단백질 또는 당류인 siRNA 컨쥬게이트.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각 M1은 독립적으로 D-만노피라노스, L-만노피라노스, D-아라비노스, D-자일로푸라노스, L-자일로푸라노스, D-글루코스, L-글루코스, D-갈락토스, L-갈락토스 α-D-만노푸라노스, β-D-만노푸라노스, α-D-만노피라노스, β-D-만노피라노스, α-D-글루코피라노스, β-D-글루코피라노스, α-D-글루코푸라노스, β-D-글루코푸라노스, α-D-프럭토푸라노스, α-D-프럭토피라노스, α-D-갈락토피라노스, β-D-갈락토피라노스, α-D-갈락토푸라노스, β-D-갈락토푸라노스, 글루코사민, 시알산, 갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, N-트리플루오로아세틸갈락토사민 N-프로피오닐갈락토사민, N-n-부티릴갈락토사민, N-이소부티릴갈락토사민, 2-아미노-3-O-[(R)-1-카르복시에틸]-2-데옥시-β-D-글루코피라노스, 2-데옥시-2-메틸아미노-L-글루코피라노스, 4,6-디데옥시-4-포름아미도-2,3-디-O-메틸-D-만노피라노스, 2-데옥시-2-술포아미노-D-글루코피라노스, N-글리콜릴-α-뉴라민산, 5-티오-β-D-글루코피라노스, 메틸 2,3,4-트리스-O-아세틸-1-티오-6-O-트리틸-α-D-글루코피라노시드, 4-티오-β-D-갈락토피라노오스, 에틸 3,4,6,7-테트라-O-아세틸-2-데옥시-1,5-디티오-α-D-글루코프토피라노시드, 2,5-안하이드로-D-알로노니트릴, 리보오스, D-리보오스, D-4-티오리보오스, L-리보오스, 및 L-4-티오리보오스로 이루어진 군에서 선택되는 siRNA 컨쥬게이트.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상 또는 각 M1은 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc)인 siRNA 컨쥬게이트.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각각의 R10, R11, R12, R13, R14 및 R15는 독립적으로 H, 메틸 또는 에틸인 siRNA 컨쥬게이트.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R2 기는 질소계 골격 상의 N 원자에 연결된 부위 및 R3에서 P 원자에 연결된 부위 모두를 갖는 siRNA 컨쥬게이트.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R2는 질소계 골격 상에서 N 원자와 아미드 결합을 형성하고, R3에서 P 원자에 연결된 부위는 P 원자와 포스포에스테르 결합을 형성하는 siRNA 컨쥬게이트.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R2는 B5, B6, B5' 또는 B6'에서 선택되는 siRNA 컨쥬게이트:
    Figure pct00093


    상기, 물결선(
    Figure pct00094
    )은 작용기가 공유 결합된 부위를 나타내고; q2는 1 내지 10의 정수이다.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 q2는 1 내지 5의 정수인 siRNA 컨쥬게이트.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨쥬게이트는 화학식 (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (12), (13), (14), (15), (16), (17), (18), (19), (20), (21) 또는 (22)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 siRNA 컨쥬게이트.
    Figure pct00095

    Figure pct00096

    Figure pct00097
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 A59에서 상기 P 원자는 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥의 말단 영역에 연결되고, 이는 센스 또는 안티센스 가닥의 어느 한쪽 말단에 가장 가까운 4개의 뉴클레오티드를 지칭하는 siRNA 컨쥬게이트.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 A59에서 상기 P 원자는 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥에 연결되는 siRNA 컨쥬게이트.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 A59에서 상기 P 원자는 siRNA의 상기 센스 가닥의 3' 말단에 연결되는 siRNA 컨쥬게이트.
  26. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 A59에서 상기 P 원자는 포스포디에스테르 결합을 형성함으로써 siRNA에서 뉴클레오티드의 위치 2', 3' 또는 5'에 연결되는 siRNA 컨쥬게이트.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열 1은 서열 155에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 상이한 1개 이하의 뉴클레오티드를 갖고; 및/또는 뉴클레오티드 서열 2는 서열 번호 156에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 상이한 1개 이하의 뉴클레오티드를 갖는 siRNA 컨쥬게이트.
  28. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열 2와 상기 서열 번호 156에 나타낸 뉴클레오티드 서열 사이의 상기 뉴클레오티드 차이는 Z'B 부위에서의 차이를 포함하고, Z'B는 A, C 또는 G 중에서 선택되는 siRNA 컨쥬게이트.
  29. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ZA는 Z'B와 상보적인 뉴클레오티드인 siRNA 컨쥬게이트.
  30. 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열 1은 상기 뉴클레오티드 서열 2와 기본적으로 역 상보적, 실질적으로 역 상보적, 또는 완전히 역 상보적인 siRNA 컨쥬게이트.
  31. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 3을 더 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 4를 더 포함하고; 상기 뉴클레오티드 서열 3 및 4는 각각 1 내지 4개의 뉴클레오티드 길이를 갖고; 상기 뉴클레오티드 서열 3은 뉴클레오티드 서열 1의 5' 말단에 연결되고, 상기 뉴클레오티드 서열 4는 뉴클레오티드 서열 2의 3' 말단에 연결되며; 뉴클레오티드 서열 3은 동일한 길이를 갖고 뉴클레오티드 서열 4와 실질적으로 역 상보적이거나 완전히 역 상보적인 siRNA 컨쥬게이트.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열 3 및 상기 뉴클레오티드 서열 4는 모두 1개의 뉴클레오티드 길이를 갖고; 뉴클레오티드 서열 3의 염기는 A이며;
    상기 뉴클레오티드 서열 3 및 상기 뉴클레오티드 서열 4는 모두 2개의 뉴클레오티드 길이를 갖고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오티드 서열 3의 염기는 연속해서 G 및 A이며;
    상기 뉴클레오티드 서열 3 및 상기 뉴클레오티드 서열 4는 모두 3개의 뉴클레오티드 길이를 갖고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오티드 서열 3의 염기는 연속해서 C, G 및 A이며; 또는
    상기 뉴클레오티드 서열 3 및 상기 뉴클레오티드 서열 4는 모두 4개의 뉴클레오티드 길이를 갖고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오티드 서열 3의 염기는 연속해서 C, C, G 및 A인 siRNA 컨쥬게이트.
  33. 제 1 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 siRNA는 1 내지 3개의 뉴클레오티드 길이를 갖고 안티센스 가닥의 3' 말단에 연결된 뉴클레오티드 서열 5를 더 포함함으로써, 안티센스 가닥의 3' 돌출부를 구성하는 siRNA 컨쥬게이트.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열 5는 2개의 뉴클레오티드 길이를 갖고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 상기 뉴클레오티드 서열 5는 2개의 연속 티미딘 디옥시리보뉴클레오티드, 2개의 연속 우리딘 리보뉴클레오티드, 또는 표적 mRNA와 상보적인 2개의 뉴클레오티드인 siRNA 컨쥬게이트.
  35. 제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥은 서열 번호 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 siRNA 컨쥬게이트:
    5'-CCUUGAGGCAUACUUCAAZA -3' (서열 번호: 1);
    5'-Z'B UUGAAGUAUGCCUCAAGGUU -3' (서열 번호: 3);
    5'-Z'B UUGAAGUAUGCCUCAAGGUC -3' (서열 번호: 4);
    상기, 뉴클레오티드 Z'B는 안티센스 가닥의 5' 말단에서부터 제 1 뉴클레오티드이며; ZA는 A, U, G 또는 C에서 선택되고; Z'B는 ZA와 상보적인 뉴클레오티드이다.
  36. 제 1 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA는 siHBa1 또는 siHBa2인 siRNA 컨쥬게이트:
    siHBa1
    센스 가닥: 5'-CCUUGAGGCAUACUUCAAA-3' (서열 번호: 5),
    안티센스 가닥: 5'-UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU-3' (서열 번호: 6),
    siHBa2
    센스 가닥: 5'-GACCUUGAGGCAUACUUCAAA-3' (서열 번호: 7),
    안티센스 가닥: 5'-UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUCGG-3' (서열 번호: 8).
  37. 제 1 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 또는 안티센스 가닥에서 상기 하나 이상의 뉴클레오티드는 변성 뉴클레오티드이고, 및/또는 하나 이상의 포스페이트 기는 변형을 갖는 포스페이트 기인 siRNA 컨쥬게이트.
  38. 제 1 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥에서 상기 각 뉴클레오티드는 독립적으로 플루오로 변성 뉴클레오티드 또는 비-플루오로 변성 뉴클레오티드이고; "플루오로 변성 뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 리보오스 기의 2'-하이드록시를 플루오로로 치환함으로써 형성된 뉴클레오티드를 지칭하고; "비-플루오로 변성 뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 리보오스 기의 2'-하이드록시를 플루오로 이외의 기로 치환함으로써 형성된 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 유사체를 지칭하는 siRNA 컨쥬게이트.
  39. 제 38 항에 있어서, 상기 플루오로 변성 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열 1 및 2에 위치되고;
    5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오티드 서열 1의 위치 7, 8 및 9에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오티드 서열 2의 위치 2, 6, 14 및 16에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드인 siRNA 컨쥬게이트.
  40. 제 1 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 상기 센스 가닥내 뉴클레오티드 서열 1의 위치 7, 8 및 9 또는 5, 7, 8 및 9의 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고, 센스 가닥의 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 비-플루오로 변성 뉴클레오티드이며; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 안티센스 가닥내 뉴클레오티드 서열 2의 위치 2, 6, 14 및 16 또는 2, 6, 8, 9, 14 및 16에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고, 안티센스 가닥의 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 비-플루오로 변성 뉴클레오티드인 siRNA 컨쥬게이트.
  41. 제 38 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각 비-플루오로 변성 뉴클레오티드는 독립적으로 그의 리보오스 기의 2'-하이드록시를 비-플루오로 기로 치환함으로써 형성된 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 유사체인 siRNA 컨쥬게이트.
  42. 제 41 항에 있어서, 상기 리보오스 기의 2'-하이드록시를 비-플루오로 기로 치환함으로써 형성된 뉴클레오티드는 2'-알콕시 변성 뉴클레오티드, 2'-치환 알콕시 변성 뉴클레오티드, 2'-알킬 변성 뉴클레오티드, 2'-치환 알킬 변성 뉴클레오티드, 2'-아미노 변성 뉴클레오티드, 2'-치환 아미노 변성 뉴클레오티드, 또는 2'-데옥시 뉴클레오티드에서 선택되고; 상기 뉴클레오티드 유사체는 이소뉴클레오티드, LNA, ENA, cET, UNA 또는 GNA에서 선택되는 siRNA 컨쥬게이트.
  43. 제 38 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각 비-플루오로 변성 뉴클레오티드는 메톡시 변성 뉴클레오티드이고, 이는 리보오스 기의 2'-하이드록시를 메톡시 기로 치환함으로써 형성된 뉴클레오티드를 지칭하는 siRNA 컨쥬게이트.
  44. 제 1 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로 상기 센스 가닥내 상기 뉴클레오티드 서열 1의 위치 7, 8 및 9에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고, 상기 센스 가닥의 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 메톡시 변성 뉴클레오티드이며; 상기 안티센스 가닥내 상기 뉴클레오티드 서열 2의 위치 2, 6, 14 및 16에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고, 상기 안티센스 가닥내 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 메톡시 변성 뉴클레오티드이며;
    5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 상기 센스 가닥의 상기 뉴클레오티드 서열 1의 위치 5, 7, 8 및 9에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고, 상기 센스 가닥의 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 메톡시 변성 뉴클레오티드이며; 상기 안티센스 가닥내 상기 뉴클레오티드 서열 2의 위치 2, 6, 8, 9, 14 및 16에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고, 상기 안티센스 가닥의 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 메톡시 변성 뉴클레오티드이며; 또는
    5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 상기 siRNA의 상기 센스 가닥내 상기 뉴클레오티드 서열 1의 위치 5, 7, 8 및 9에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고, 상기 센스 가닥내 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 메톡시 변성 뉴클레오티드이고; 상기 안티센스 가닥내 상기 뉴클레오티드 서열 2의 위치 2, 6, 14 및 16에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고, 상기 안티센스 가닥내 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 메톡시 변성 뉴클레오티드인 siRNA 컨쥬게이트.
  45. 제 1 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 siRNA는 siHBa1M1, siHBa1M2, siHBa2M1 또는 siHBa2M2인 siRNA 컨쥬게이트:
    siHBa1M1
    센스 가닥: 5'-CmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm-3' (서열 번호: 9),
    안티센스 가닥: 5'-UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm -3' (서열 번호: 10),
    siHBa1M2
    센스 가닥: 5'-CmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 11),
    안티센스 가닥: 5'-UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm -3' (서열 번호: 12),
    siHBa2M1
    센스 가닥: 5'-GmAmCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 13),
    안티센스 가닥: 5'-UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm -3' (서열 번호: 14),
    siHBa2M2
    센스 가닥: 5'-GmAmCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 15),
    안티센스 가닥: 5'-UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm -3' (서열 번호: 16),
    상기, C, G, U 및 A는 뉴클레오티드의 염기 조성을 나타내고; m은 문자 m의 좌측에 인접한 뉴클레오티드가 메톡시 변성 뉴클레오티드임을 나타내고; f는 문자 f의 좌측에 인접한 뉴클레오티드가 플루오로 변성 뉴클레오티드임을 나타낸다.
  46. 제 37 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형을 갖는 포스페이트 기는 화학식 (101)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 포스포로티오에이트 기인 siRNA 컨쥬게이트:
    Figure pct00098
  47. 제 46 항에 있어서, siRNA에서 상기 포스포로티오에이트 연결은 다음의 위치 중 하나 이상에 존재하는 siRNA 컨쥬게이트:
    센스 가닥의 5' 말단에서 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 사이의 위치;
    센스 가닥의 5' 말단에서 제 2 및 제 3 뉴클레오티드 사이의 위치;
    센스 가닥의 3' 말단에서 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 사이의 위치;
    센스 가닥의 3' 말단에서 제 2 및 제 3 뉴클레오티드 사이의 위치;
    안티센스 가닥의 5' 말단에서 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 사이의 위치;
    안티센스 가닥의 5' 말단에서 제 2 및 제 3 뉴클레오티드 사이의 위치;
    안티센스 가닥의 3' 말단에서 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 사이의 위치;
    안티센스 가닥의 3' 말단에서 제 2 및 제 3 뉴클레오티드 사이의 위치.
  48. 제 1 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 siRNA는 siHBa1M1S, siHBa1M2S, siHBa2M1S 또는 siHBa2M2S인 siRNA 컨쥬게이트:
    siHBa1M1S
    센스 가닥: 5'-CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 17),
    안티센스 가닥: 5'-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm -3' (서열 번호: 18),
    siHBa1M2S
    센스 가닥: 5'-CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 19),
    안티센스 가닥: 5'-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm -3' (서열 번호: 20),
    siHBa2M1S
    센스 가닥: 5'-GmsAmsCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 21),
    안티센스 가닥: 5'-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm -3' (서열 번호: 22),
    siHBa2M2S
    센스 가닥: 5'-GmsAmsCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 23),
    안티센스 가닥: 5'-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm -3' (서열 번호: 24),
    상기, C, G, U 및 A는 뉴클레오티드의 염기 조성을 나타내고; m은 문자 m의 좌측에 인접한 뉴클레오티드가 메톡시 변성 뉴클레오티드임을 나타내고; f는 문자 f의 좌측에 인접한 뉴클레오티드가 플루오로 변성 뉴클레오티드임을 나타내고; s는 문자 s의 양쪽에 인접한 2개의 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 연결에 의해 연결된 것을 나타낸다.
  49. 제 1 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 가닥에서 상기 5'-말단 뉴클레오티드는 5'-포스페이트 뉴클레오티드 또는 5'-포스페이트 유사체 변성 뉴클레오티드인 siRNA 컨쥬게이트.
  50. 제 1 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 siRNA는 siHBa1M1P1, siHBa1M2P1, siHBa2M1P1, siHBa2M2P1, siHBa1M1SP1, siHBa1M2SP1, siHBa2M1SP1 및 siHBa2M2SP1로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 siRNA 컨쥬게이트:
    siHBa1M1P1
    센스 가닥: 5'-CmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 25),
    안티센스 가닥: 5'-P1-UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm -3' (서열 번호: 26),
    siHBa1M2P1
    센스 가닥: 5'-CmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 27),
    안티센스 가닥: 5'-P1-UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm -3' (서열 번호: 28),
    siHBa2M1P1
    센스 가닥: 5'-GmAmCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 29),
    안티센스 가닥: 5'-P1-UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm -3' (서열 번호: 30),
    siHBa2M2P1
    센스 가닥: 5'-GmAmCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 31),
    안티센스 가닥: 5'-P1-UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm -3' (서열 번호: 32),
    siHBa1M1SP1
    센스 가닥: 5'-CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 33),
    안티센스 가닥: 5'-P1-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm -3' (서열 번호: 34),
    siHBa1M2SP1
    센스 가닥: 5'-CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 35),
    안티센스 가닥: 5'-P1-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm -3' (서열 번호: 36),
    siHBa2M1SP1
    센스 가닥: 5'-GmsAmsCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 37),
    안티센스 가닥: 5'-P1-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm-3' (서열 번호: 38),
    siHBa2M2SP1
    센스 가닥: 5'-GmsAmsCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 39),
    안티센스 가닥: 5'-P1-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm -3' (서열 번호: 40),
    상기, C, G, U 및 A는 뉴클레오티드의 염기 조성을 나타내고; m은 문자 m의 좌측에 인접한 뉴클레오티드가 메톡시 변성 뉴클레오티드임을 나타내고; f는 문자 f의 좌측에 인접한 뉴클레오티드가 플루오로 변성 뉴클레오티드임을 나타내고; s는 문자 s의 양쪽에 인접한 2개의 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 연결에 의해 연결된 것을 나타내고; P1은 P1의 우측에 인접한 뉴클레오티드가 5'-포스페이트 뉴클레오티드 또는 5'-포스페이트 유사체 변성 뉴클레오티드임을 나타낸다.
  51. 제 49 항 또는 제 50 항에 있어서, 상기 5'-포스페이트 뉴클레오티드 또는 5'-포스페이트 유사체 변성 뉴클레오티드는 다음의 화학식 중 하나로 표시되는 뉴클레오티드인 siRNA 컨쥬게이트:
    Figure pct00099

    상기,
    R은 H, OH, F 및 메톡시로 이루어진 군에서 선택된 기를 나타내고;
    "염기"는 A, U, C, G 또는 T에서 선택된 염기를 나타낸다.
  52. 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 HBV 유전자의 발현을 억제하는 siRNA에 있어서, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥 모두는 플루오로 변성 뉴클레오티드 및 비-플루오로 변성 뉴클레오티드를 포함하고; 상기 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 I의 세그먼트를 포함하고; 상기 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 II의 세그먼트를 포함하며; 상기 뉴클레오티드 서열 I 및 상기 뉴클레오티드 서열 II는 이중 가닥 영역을 형성하기 위해 적어도 부분적으로 상보적이며; 상기 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 155에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 동일한 길이 및 3개 이하의 상이한 뉴클레오티드를 갖는 뉴클레오티드 서열 A를 포함하고; 상기 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 156에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 동일한 길이 및 3개 이하의 상이한 뉴클레오티드를 갖는 뉴클레오티드 서열 B를 포함한다:
    5'-CCUUGAGGCAUACUUCAAZ -3' (서열 번호: 155);
    5'-Z'UUGAAGUAUGCCUCAAGG -3' (서열 번호: 156);
    상기,
    Z는 A이고; Z'는 U이며;
    상기 뉴클레오티드 서열 A는 Z에 상응하는 부위에 뉴클레오티드 ZA를 포함하고;
    상기 뉴클레오티드 서열 B는 Z'에 상응하는 부위에 뉴클레오티드 Z'B를 포함하고; 상기 뉴클레오티드 Z'B는 안티센스 가닥의 5' 말단에서부터 제 1 뉴클레오티드이며;
    상기 플루오로 변성 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열 A 및 B에 위치되고;
    5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 상기 뉴클레오티드 서열 1의 위치 7, 8 및 9에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 상기 뉴클레오티드 서열 2의 위치 2, 6, 14 및 16에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드인 siRNA.
  53. 제 52 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열 A는 서열 155에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 상이한 1개 이하의 뉴클레오티드를 갖고; 및/또는 상기 뉴클레오티드 서열 B는 서열 번호 156에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 상이한 1개 이하의 뉴클레오티드를 갖는 siRNA.
  54. 제 52 항 또는 제 53 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열 B와 상기 서열 번호 156에 나타낸 뉴클레오티드 서열 사이의 상기 뉴클레오티드 차이는 Z'B 부위에서의 차이를 포함하고, Z'B는 A, C 또는 G에서 선택되는 siRNA.
  55. 제 52 항 내지 제 54 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ZA는 Z'B와 상보적인 뉴클레오티드인 siRNA.
  56. 제 52 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열 A는 뉴클레오티드 서열 B와 기본적으로 역 상보적, 실질적으로 역 상보적, 또는 완전히 역 상보적이고; "기본적으로 역 상보적"이란 2개의 뉴클레오티드 서열에서 3개 이하의 염기쌍오류(mispairing)을 지칭하고; "실질적으로 역 상보적"이란 2개의 뉴클레오티드 서열에서 1개 이하의 염기쌍오류을 지칭하고; "완전히 역 상보적"이란 2개의 뉴클레오티드 서열에서 염기쌍오류이 없는 것을 의미하는 siRNA.
  57. 제 52 항 내지 제 56 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열 A는 서열 번호 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열이고; 뉴클레오티드 서열 B는 서열 번호 2에 나타낸 뉴클레오티드 서열인 siRNA:
    5'-CCUUGAGGCAUACUUCAAZA-3' (서열 번호: 1);
    5'-Z'BUUGAAGUAUGCCUCAAGG -3' (서열 번호: 2);
    상기, ZA는 A, U, G 또는 C에서 선택되고; Z'B는 ZA와 상보적인 뉴클레오티드이다.
  58. 제 57 항에 있어서, 상기 ZA는 A이고; Z'B는 U인 siRNA.
  59. 제 52 항 내지 제 58 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열 I은 뉴클레오티드 서열 III을 더 포함하고; 상기 뉴클레오티드 서열 II는 뉴클레오티드 서열 IV를 더 포함하고; 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 각각 독립적으로 1 내지 4개의 뉴클레오티드 길이를 갖고; 상기 뉴클레오티드 서열 III은 뉴클레오티드 서열 A의 5' 말단에 연결되고; 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 뉴클레오티드 서열 B의 3' 말단에 연결되고; 상기 뉴클레오티드 서열 III은 동일한 길이를 갖고 상기 뉴클레오티드 서열 IV와 실질적으로 역 상보적이거나 완전히 역 상보적이며; "실질적으로 역 상보적"이란 2개의 뉴클레오티드 서열에서 1개 이하의 염기쌍오류을 지칭하고; "완전히 역 상보적"이란 2개의 뉴클레오티드 서열에서 염기쌍오류이 없는 것을 의미하는 siRNA.
  60. 제 59 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 뉴클레오티드 서열 IV는 모두 1개의 뉴클레오티드 길이를 갖고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 염기는 A이며;
    상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 모두 2개의 뉴클레오티드 길이를 갖고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 염기는 연속해서 G 및 A이며;
    상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 모두 3개의 뉴클레오티드 길이를 갖고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 염기는 연속해서 C, G 및 A이며; 또는
    상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 모두 4개의 뉴클레오티드 길이를 갖고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오티드 서열 III의 염기는 연속해서 C, C, G 및 A인 siRNA.
  61. 제 52 항 내지 제 60 항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열 II는 1 내지 3개의 뉴클레오티드 길이를 갖고 안티센스 가닥의 3' 말단에 연결된 뉴클레오티드 서열 V를 더 포함함으로써, 안티센스 가닥의 3' 돌출부를 구성하는 siRNA.
  62. 제 61 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열 V는 2개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 siRNA.
  63. 제 61 항 또는 제 62 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열 V는 표적 mRNA와 상보적이거나, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 상기 뉴클레오티드 서열 V는 2개의 연속 티미딘 디옥시리보뉴클레오티드 또는 2개의 연속 우리딘 리보뉴클레오티드인 siRNA.
  64. 제 52 항 내지 제 63 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥은 서열 번호 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 siRNA:
    5'-CCUUGAGGCAUACUUCAAZA-3' (서열 번호: 1);
    5'-Z'B UUGAAGUAUGCCUCAAGGUU-3' (서열 번호: 3);
    5'-Z'B UUGAAGUAUGCCUCAAGGUC-3' (서열 번호: 4);
    상기, 뉴클레오티드 Z'B는 안티센스 가닥의 5' 말단에서부터 상기 제 1 뉴클레오티드이며; ZA는 A, U, G 또는 C에서 선택되고; Z'B는 ZA와 상보적인 뉴클레오티드이다.
  65. 제 52 항 내지 제 64 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 siRNA는 siHBa1 또는 siHBa2인 siRNA:
    siHBa1
    센스 가닥: 5'-CCUUGAGGCAUACUUCAAA-3' (서열 번호: 5),
    안티센스 가닥: 5'-UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU-3' (서열 번호: 6),
    siHBa2
    센스 가닥: 5'-GACCUUGAGGCAUACUUCAAA-3' (서열 번호: 7),
    안티센스 가닥: 5'-UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUCGG-3' (서열 번호: 8).
  66. 제 52 항 내지 제 65 항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 상기 센스 가닥내 상기 뉴클레오티드 서열 A의 위치 7, 8 및 9 또는 5, 7, 8 및 9에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고, 상기 센스 가닥의 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 비-플루오로 변성 뉴클레오티드이며; 상기 안티센스 가닥내 상기 뉴클레오티드 서열 B의 위치 2, 6, 14 및 16 또는 2, 6, 8, 9, 14 및 16에서 뉴클레오티드는 플루오로 변성 뉴클레오티드이고, 상기 안티센스 가닥의 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 비-플루오로 변성 뉴클레오티드인 siRNA.
  67. 제 52 항 내지 제 66 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각 비-플루오로 변성 뉴클레오티드는 독립적으로 그의 리보오스 기의 2'-하이드록시를 비-플루오로 기로 치환함으로써 형성된 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 유사체인 siRNA.
  68. 제 67 항에 있어서, 상기 리보오스 기의 2'-하이드록시를 비-플루오로 기로 치환함으로써 형성된 뉴클레오티드는 2'-알콕시 변성 뉴클레오티드, 2'-치환 알콕시 변성 뉴클레오티드, 2'-알킬 변성 뉴클레오티드, 2'-치환 알킬 변성 뉴클레오티드, 2'-아미노 변성 뉴클레오티드, 2'-치환 아미노 변성 뉴클레오티드, 또는 2'-데옥시 뉴클레오티드에서 선택되고; 상기 뉴클레오티드 유사체는 이소뉴클레오티드, LNA, ENA, cET, UNA 또는 GNA에서 선택되는 siRNA.
  69. 제 52 항 내지 제 68 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각 비-플루오로 변성 뉴클레오티드는 메톡시 변성 뉴클레오티드이고, 이는 리보오스 기의 2'-하이드록시를 메톡시 기로 치환함으로써 형성된 뉴클레오티드를 지칭하는 siRNA.
  70. 제 52 항 내지 제 69 항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA는 siHBa1M1, siHBa1M2, siHBa2M1 또는 siHBa2M2인 siRNA:
    siHBa1M1
    센스 가닥: 5'-CmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm-3' (서열 번호: 9),
    안티센스 가닥: 5'-UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm -3' (서열 번호: 10),
    siHBa1M2
    센스 가닥: 5'-CmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm-3' (서열 번호: 11),
    안티센스 가닥: 5'-UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm-3' (서열 번호: 12),
    siHBa2M1
    센스 가닥: 5'-GmAmCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm-3' (서열 번호: 13),
    안티센스 가닥: 5'-UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm-3' (서열 번호: 14),
    siHBa2M2
    센스 가닥: 5'-GmAmCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 15),
    안티센스 가닥: 5'-UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm -3' (서열 번호: 16),
    상기, C, G, U 및 A는 뉴클레오티드의 염기 조성을 나타내고; m은 문자 m의 좌측에 인접한 뉴클레오티드가 메톡시 변성 뉴클레오티드임을 나타내고; f는 문자 f의 좌측에 인접한 뉴클레오티드가 플루오로 변성 뉴클레오티드임을 나타낸다.
  71. 제 52 항 내지 제 70 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥 중 하나 이상의 단일 가닥의 포스페이트-리보오스 골격에서 상기 포스페이트 기 중 하나 이상은 변형된 기를 갖는 포스페이트 기인 siRNA.
  72. 제 71 항에 있어서, 상기 변형된 기를 갖는 포스페이트 기는 상기 포스페이트 기의 포스포디에스테르 결합에서 하나 이상의 산소원자를 황원자로 치환함으로써 형성된 포스포로티오에이트 기인 siRNA.
  73. 제 71 항 또는 제 72 항에 있어서, 상기 변형된 포스페이트 기는 화학식 (101)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 포스포로티오에이트 기인 siRNA:
    Figure pct00100
  74. 제 72 항 또는 제 73 항에 있어서, siRNA에서 상기 포스포로티오에이트 연결은 다음의 위치 중 하나 이상에 존재하는 siRNA:
    센스 가닥의 5' 말단에서 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 사이의 위치;
    센스 가닥의 5' 말단에서 제 2 및 제 3 뉴클레오티드 사이의 위치;
    센스 가닥의 3' 말단에서 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 사이의 위치;
    센스 가닥의 3' 말단에서 제 2 및 제 3 뉴클레오티드 사이의 위치;
    안티센스 가닥의 5' 말단에서 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 사이의 위치;
    안티센스 가닥의 5' 말단에서 제 2 및 제 3 뉴클레오티드 사이의 위치;
    안티센스 가닥의 3' 말단에서 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 사이의 위치;
    안티센스 가닥의 3' 말단에서 제 2 및 제 3 뉴클레오티드 사이의 위치.
  75. 제 52 항 내지 제 74 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 siRNA는 siHBa1M1S, siHBa1M2S, siHBa2M1S 또는 siHBa2M2S인 siRNA:
    siHBa1M1S
    센스 가닥: 5'-CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm-3' (서열 번호: 17),
    안티센스 가닥: 5'-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm -3' (서열 번호: 18),
    siHBa1M2S
    센스 가닥: 5'-CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 19),
    안티센스 가닥: 5'-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm -3' (서열 번호: 20),
    siHBa2M1S
    센스 가닥: 5'-GmsAmsCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 21),
    안티센스 가닥: 5'-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm -3' (서열 번호: 22),
    siHBa2M2S
    센스 가닥: 5'-GmsAmsCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 23),
    안티센스 가닥: 5'-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm -3' (서열 번호: 24),
    상기, C, G, U 및 A는 뉴클레오티드의 염기 조성을 나타내고; m은 문자 m의 좌측에 인접한 뉴클레오티드가 메톡시 변성 뉴클레오티드임을 나타내고; f는 문자 f의 좌측에 인접한 뉴클레오티드가 플루오로 변성 뉴클레오티드임을 나타내고; s는 문자 s의 양쪽에 인접한 2개의 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 연결에 의해 연결된 것을 나타낸다.
  76. 제 52 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 가닥 내의 상기 5'-말단 뉴클레오티드는 5'-포스페이트 뉴클레오티드 또는 5'-포스페이트 유사체 변성 뉴클레오티드인 siRNA.
  77. 제 76 항에 있어서, 상기 5'-포스페이트 뉴클레오티드는 화학식 (102)로 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드이고; 5'-포스페이트 유사체 변성 뉴클레오티드는 화학식 (103) 내지 (106) 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오티드인 siRNA:
    Figure pct00101

    상기,
    R은 H, OH, 메톡시 또는 F로 이루어진 군에서 선택된 기를 나타내고;
    "염기"는 A, U, C, G 또는 T에서 선택된 염기를 나타낸다.
  78. 제 52 항 내지 제 77 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 siRNA는 siHBa1M1P1, siHBa1M2P1, siHBa2M1P1, siHBa2M2P1, siHBa1M1SP1, siHBa1M2SP1, siHBa2M1SP1 및 siHBa2M2SP1로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 siRNA:
    siHBa1M1P1
    센스 가닥: 5'-CmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 25),
    안티센스 가닥: 5'-P1-UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm -3' (서열 번호: 26),
    siHBa1M2P1
    센스 가닥: 5'-CmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 27),
    안티센스 가닥: 5'-P1-UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm -3' (서열 번호: 28),
    siHBa2M1P1
    센스 가닥: 5'-GmAmCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 29),
    안티센스 가닥: 5'-P1-UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm -3' (서열 번호: 30),
    siHBa2M2P1
    센스 가닥: 5'-GmAmCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 31),
    안티센스 가닥: 5'-P1-UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm -3' (서열 번호: 32),
    siHBa1M1SP1
    센스 가닥: 5'-CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 33),
    안티센스 가닥: 5'-P1-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm -3' (서열 번호: 34),
    siHBa1M2SP1
    센스 가닥: 5'-CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 35),
    안티센스 가닥: 5'-P1-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm -3' (서열 번호: 36),
    siHBa2M1SP1
    센스 가닥: 5'-GmsAmsCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 37),
    안티센스 가닥: 5'-P1-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm-3' (서열 번호: 38),
    siHBa2M2SP1
    센스 가닥: 5'-GmsAmsCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm -3' (서열 번호: 39),
    안티센스 가닥: 5'-P1-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm -3' (서열 번호: 40),
    상기, C, G, U 및 A는 뉴클레오티드의 염기 조성을 나타내고; m은 문자 m의 좌측에 인접한 뉴클레오티드가 메톡시 변성 뉴클레오티드임을 나타내고; f는 문자 f의 좌측에 인접한 뉴클레오티드가 플루오로 변성 뉴클레오티드임을 나타내고; s는 문자 s의 양쪽에 인접한 2개의 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 연결에 의해 연결된 것을 나타내고; P1은 P1의 우측에 인접한 뉴클레오티드가 5'-포스페이트 뉴클레오티드 또는 5'-포스페이트 유사체 변성 뉴클레오티드임을 나타낸다.
  79. 약학 조성물로서, 제 52 항 내지 제 78 항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  80. 제 79 항에 있어서, 상기 siRNA 대 상기 약학적으로 허용되는 담체의 중량비는 1:(1-500)인 약학 조성물.
  81. 제 80 항에 있어서, 상기 siRNA 대 상기 약학적으로 허용되는 담체의 중량비는 1:(1-50)인 약학 조성물.
  82. 제 79 항 내지 제 81 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적으로 허용되는 담체는 유기 아민, 보조 지질(helper lipid) 및 페길화된 지질(pegylated lipid)을 포함하고; 상기 유기 아민은 화학식 (201)로 나타낸 바와 같은 화합물 및/또는 그의 약학적으로 허용되는 염인 약학 조성물:
    Figure pct00102
    화학식 (201)
    상기:
    각각의 X101 및 X102는 독립적으로 O, S, N-A 또는 C-A에서 선택되고, 상기 A는 수소 또는 C1-C20 탄화수소 쇄이며;
    각각의 Y 및 Z는 독립적으로 C=O, C=S, S=O, CH-OH 또는 SO2에서 선택되고;
    각각의 R101, R102, R103, R104, R105, R106 및 R107은 독립적으로 수소; 환식 또는 비환식, 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 지방족 기; 환식 또는 비환식, 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 헤테로 지방족 기; 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 아실 기; 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 아릴 기, 또는 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 헤테로아릴 기에서 선택되고;
    x는 1 내지 10의 정수이며;
    n은 1 내지 3의 정수이고, m은 0 내지 20의 정수이며, p는 0 또는 1의 정수이며, 상기 m과 p가 0이면, R102는 수소이고, n과 m중 적어도 하나가 2의 값을 가지면, 화학식 (201)에서 R103 및 질소는 화학식 (202) 또는 (203)으로 나타낸 바와 같은 구조를 형성하고;
    Figure pct00103

    상기, 각각의 g, e 및 f는 독립적으로 1 내지 6의 정수이고; "HCC"는 탄화수소 쇄를 나타내며; 각 *N은 화학식 (201)에서 질소 원자를 나타낸다.
  83. 제 82 항에 있어서, 상기 유기 아민은 화학식 (214)로 나타낸 바와 같은 유기 아민 및/또는 화학식 (215)로 나타낸 바와 같은 유기 아민인 약학 조성물:
    Figure pct00104

    상기 보조 지질은 콜레스테롤, 그의 유사체 및/또는 유도체이며; 페길화된 지질은 1,2-디팔미토일-슨-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)]-2000이다.
  84. 제 82 항 또는 제 83 항에 있어서, 상기 유기 아민, 상기 보조 지질 및 상기 페길화된 지질 간의 몰 비는 (19.7-80): (19.7-80): (0.3-50)인 약학 조성물.
  85. 제 84 항에 있어서, 상기 유기 아민, 상기 보조 지질 및 상기 페길화된 지질 간의 몰비는 (50-70): (20-400): (3-20)인 약학 조성물.
  86. 제 52 항 내지 제 78 항 중 어느 한 항에 따른 상기 siRNA, 및 상기 siRNA에 접합적으로 연결된 접합 기를 포함하는 siRNA 컨쥬게이트.
  87. 제 86 항에 있어서, 상기 접합 기는 약학적으로 허용되는 표적화 기 및 링커를 포함하고; 상기 siRNA, 상기 링커 및 상기 표적화 기는 연속해서 공유 연결되는 siRNA 컨쥬게이트.
  88. 제 86 항 또는 제 87 항에 있어서, 링커는 화학식 (301)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 siRNA 컨쥬게이트:
    Figure pct00105

    상기,
    k는 1 내지 3의 정수이며;
    LA는 화학식 (302)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 아미드 결합을 포함하는 쇄 부분이고, 그 2개의 말단은 각각 에테르 결합을 통해 표적화 기 및 LC 부분에 연결되고;
    Figure pct00106

    LB는 화학식 (303)으로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 N-아실피롤리딘을 포함하는 쇄 부분이고, 그 중 하나의 말단은 카르보닐기를 가지며 아미드 결합을 통해 LC 부분에 연결되고, 다른 말단은 옥시를 가지며 포스포에스테르 결합을 통해 siRNA에 연결되고;
    Figure pct00107

    LC는 하이드록시메틸 아미노메탄, 디하이드록시메틸 아미노메탄 또는 트리하이드록시메틸 아미노메탄을 기반으로 하는 2가 내지 4가의 연결기이며, 그 중 하나의 말단은 산소원자에 의한 에테르 결합을 통해 각각의 LA 부분에 연결될 수 있고, 다른 말단은 질소 원자에 의한 아미드 결합을 통해 LB 부분에 연결된다.
  89. 제 86 항 내지 제 88 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 siRNA 컨쥬게이트는 화학식 (305)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 siRNA 컨쥬게이트:
    Figure pct00108

    상기, 이중 나선 구조는 siRNA를 나타낸다.
  90. 제 87 항에 있어서, 상기 링커는 화학식 (306)으로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 siRNA 컨쥬게이트:
    Figure pct00109

    상기,
    l은 0 내지 5, 바람직하게는 0 내지 3의 정수이고;
    *는 에테르 결합을 통해 표적화 기에 연결된 링커의 부위를 나타내며;
    #은 포스포에스테르 결합을 통해 siRNA에 연결된 링커 상의 부위를 나타낸다.
  91. 제 86 항, 제 87 항 및 제 90 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 siRNA 컨쥬게이트는 화학식 (307)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 siRNA 컨쥬게이트:
    Figure pct00110

    상기, 이중 나선 구조는 siRNA를 나타낸다.
  92. 제 87 항 내지 제 91 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 siRNA의 상기 센스 가닥의 3'-말단에 연결되는 siRNA 컨쥬게이트.
  93. 제 87 항, 제 88 항, 제 90 항 및 제 92 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각각의 표적화 기는 독립적으로 포유동물 간세포 표면 상의 아시알로당단백질 수용체 (ASGP-R)에 결합하는 리간드인 siRNA 컨쥬게이트.
  94. 제 93 항에 있어서, 상기 각각의 표적화 기는 독립적으로 아시알로당단백질 또는 당류인 siRNA 컨쥬게이트.
  95. 제 94 항에 있어서, 각각의 표적화 기는 독립적으로 D-만노피라노스, L-만노피라노스, D-아라비노스, D-자일로푸라노스, L-자일로푸라노스, D-글루코스, L-글루코스, D-갈락토스, L-갈락토스 α-D-만노푸라노스, β-D-만노푸라노스, α-D-만노피라노스, β-D-만노피라노스, α-D-글루코피라노스, β-D-글루코피라노스, α-D-글루코푸라노스, β-D-글루코푸라노스, α-D-프럭토푸라노스, α-D-프럭토피라노스, α-D-갈락토피라노스, β-D-갈락토피라노스, α-D-갈락토푸라노스, β-D-갈락토푸라노스, 글루코사민, 시알산, 갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, N-트리플루오로아세틸갈락사갈로아민 N-프로피오닐갈락토사민, N-n-부티릴갈락토사민, N-이소부티릴갈락토사민, 2-아미노-3-O-[(R)-1-카르복시에틸]-2-데옥시-β-D-글루코피라노스, 2-데옥시-2-메틸아미노-L-글루코피라노스, 4,6-디데옥시-4-포름아미도-2,3-디-O-메틸-D-만노피라노스, 2-데옥시-2-술포아미노-D-글루코피라노스, N-글리콜릴-α-뉴라민산, 5-티오-β-D-글루코피라노스, 메틸 2,3,4-트리스-O-아세틸-1-티오-6-O-트리틸-α-D-글루코피라노시드, 4-티오-β-D-갈락토피라노오스, 에틸 3,4,6,7-테트라-O-아세틸-2-데옥시-1,5-디티오-α-D-글루코헵토피라노시드, 2,5-안하이드로-D-알로노니트릴, 리보오스, D-리보오스, D-4-티오리보오스, L-리보오스, 및 L-4-티오리보오스로 이루어진 군에서 선택되는 siRNA 컨쥬게이트.
  96. 제 95 항에 있어서, 상기 하나 이상 또는 각각의 표적화 기는 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc)인 siRNA 컨쥬게이트.
  97. B형 간염 바이러스 (HBV) 감염에 의해 야기된 병리학적 상태 또는 질병을 치료 및/또는 예방하기 위한 의약의 제조에 있어서 제 1 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 따른 상기 siRNA 컨쥬게이트, 제 52 항 내지 제 78 항 중 어느 한 항에 따른 상기 siRNA, 제 79 항 내지 제 85 중 어느 하나에 따른 상기 약학 조성물, 및/또는 제 86 항 내지 제 96 항 중 어느 한 항에 따른 상기 siRNA 컨쥬게이트의 용도.
  98. 제 97 항에 있어서, B형 간염 바이러스 (HBV) 감염에 의해 야기된 상기 병리학적 상태 또는 질병은 만성 간 질환, 간염, 간 섬유증 및 간 증식성 질환에서 선택되는 용도.
  99. 제 1 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 따른 상기 siRNA 컨쥬게이트, 제 52 항 내지 제 78 항 중 어느 한 항에 따른 상기 siRNA, 제 79 항 내지 제 85 중 어느 하나에 따른 상기 약학 조성물, 및/또는 제 86 항 내지 제 96 항 중 어느 한 항에 따른 상기 siRNA 컨쥬게이트의 유효량을, 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, B형 간염 바이러스 (HBV)의 감염에 의해 야기된 병리학적 상태 또는 질병을 치료 및/또는 예방하는 방법.
  100. 제 1 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 따른 상기 siRNA 컨쥬게이트, 제 52 항 내지 제 78 항 중 어느 한 항에 따른 상기 siRNA, 제 79 항 내지 제 85 중 어느 하나에 따른 상기 약학 조성물, 및/또는 제 86 항 내지 제 96 항 중 어느 한 항에 따른 상기 siRNA 컨쥬게이트의 유효량을, HBV로 감염된 간염 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, HBV 유전자의 발현을 억제하는 방법.
  101. 제 1 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 따른 상기 siRNA 컨쥬게이트, 제 52 항 내지 제 78 항 중 어느 한 항에 따른 상기 siRNA, 제 79 항 내지 제 85 중 어느 하나에 따른 상기 약학 조성물, 및/또는 제 86 항 내지 제 96 항 중 어느 한 항에 따른 상기 siRNA 컨쥬게이트를 포함하는 키트.
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