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KR20200086292A - 바이러스 벡터를 제조하기 위한 수단 및 방법 및 그의 용도 - Google Patents

바이러스 벡터를 제조하기 위한 수단 및 방법 및 그의 용도 Download PDF

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KR20200086292A
KR20200086292A KR1020207014865A KR20207014865A KR20200086292A KR 20200086292 A KR20200086292 A KR 20200086292A KR 1020207014865 A KR1020207014865 A KR 1020207014865A KR 20207014865 A KR20207014865 A KR 20207014865A KR 20200086292 A KR20200086292 A KR 20200086292A
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KR
South Korea
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aav
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cells
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Application number
KR1020207014865A
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English (en)
Inventor
브라이언 케이. 카스파
제임스 마이클 하트필드
조세프 밸리디어
앨런 알만 캐스퍼
로버트 에밀 호지
Original Assignee
아벡시스, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아벡시스, 인크. filed Critical 아벡시스, 인크.
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Abstract

바이러스 입자를 제조하고, 정제하기 위한 방법 및 이를 포함하는 조성물 및 용도가 제공된다.

Description

바이러스 벡터를 제조하기 위한 수단 및 방법 및 그의 용도
서열목록
본 출원은 EFS-웹을 통해 ASCII 형식으로 제출되고, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 서열목록을 포함한다. 2018년 10월 31일에 작성된 상기 ASCII 사본의 파일명은 AVEX-003001WO_ST25.txt이며, 크기는 14,639바이트이다.
관련 출원
본 출원은 2017년 11월 8일자로 출원되고, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 가출원 제 62/583,035호에 대한 우선권으로 주장한다.
개시 분야
본 개시는 바이러스 입자의 제조 및 정제 방법 및 이를 포함하는 조성물 및 용도에 관한 것이다.
아데노 연관 바이러스(AAV)는 파르보바이러스과의 구성원이다. AAV 게놈은, 대략 4.7 킬로베이스(kb)를 포함하고 비-구조적 Rep(복제) 및 구조적 Cap(캡시드) 단백질을 인코딩하는 2개의 주 오픈 리딩 프레임(open reading frame)으로 구성되는 선형 단일 가닥 DNA 분자로 이루어져 있다. DNA 복제의 개시 동안 프라이머로서 기능하는 헤어핀 구조 내로 접힐 수 있는 중단된 회문 서열을 갖는 대략 145개의 뉴클레오타이드 길이의 2개의 cis-작용 역위 말단 반복(ITR) 서열이 AAV 코딩 영역에 측접되어 있다. DNA 복제에서의 이들의 역할에 더하여, ITR 서열은 바이러스 혼입, 숙주 게놈으로부터의 구조, 및 성숙 비리온으로의 바이러스 핵산의 포획화에 필요한 것으로 나타났다(문헌[Muzyczka, (1992) Curr. Top. Micro. Immunol) 158:97-129]).
다수의 AAV의 혈청형이 존재하고, 다양한 조직 향성을 제공한다. 공지된 혈청형은 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 및 AAV11을 포함한다. AAV9는 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제 7,198,951호 및 문헌[Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)]에 기재되어 있다. AAV6 및 AAV8의 전달에서의 진보는 단순한 전신 정맥내 또는 복강내 주사 후 골격 및 심장 근육의 이들 혈청형에 의한 형질도입을 가능하게 하였다. 문헌[Pacak et al., Circ. Res., 99(4): 3-9(2006) 및 Wang et al., Nature Biotech. 23(3): 321-8(2005)]을 참조한다. 그러나 중추신경계 내에서 세포 유형을 표적화하는 AAV를 사용하기 위해서는 실질내 주사가 필요하다. 문헌[Kaplitt et al., "Safety and tolerability of gene therapy with an adeno-associated virus (AAV) borne GAD gene for Parkinson's disease: an open label, phase I trial". Lancet, 369:2097-2105]; 문헌[Marks et al., "Gene delivery of AAV2-neurturin for Parkinson's disease: a double-blind, randomized, controlled trial". Lancet Neurol 9:1164-1172]; 및 문헌[Worgall et al., "Treatment of late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis by CNS administration of a serotype 2 adeno-associated virus expressing CLN2 cDNA". Hum Gene Ther, 19(5):463-74]을 참조한다.
AAV 혈청형 2(AAV2) 게놈의 뉴클레오타이드 서열은 문헌[Srivastava et al., J Virol, 45: 555-564(1983)]에 제시되어 있으며, 이는 문헌[Ruffing et al., J Gen Virol, 75: 3385-3392(1994)]에 의해 수정된 바 있다. 바이러스 DNA 복제(rep), 포획화/패키징 및 숙주 세포 염색체 혼입을 유도하는 cis-작용 서열이 ITR 내에 포함된다. 3개의 AAV 프로모터(그 상대 맵(map) 위치는 p5, p19 및 p40으로 명명됨)는 rep 및 cap 유전자를 인코딩하는 2개의 AAV 내부 오픈 리딩 프레임의 발현을 유도한다. 2개의 rep 프로모터(p5 및 p19)는 단일 AAV 인트론(뉴클레오타이드 2107 및 2227)의 차등 스플라이싱(splicing)과 결합하여, rep 유전자로부터 4개의 rep 단백질(rep 78, rep 68, rep 52 및 rep 40)을 생성한다. rep 단백질은 결과적으로 바이러스 게놈 복제에 관여하는 다수의 효소 특성을 보유한다. cap 유전자는 p40 프로모터로부터 발현되고, 이는 3개의 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3을 인코딩한다. 대안적 스플라이싱 및 비-공통 번역 개시 부위는 3개의 관련 캡시드 단백질의 생성에 관여한다. 단일 공통 폴리아데닐화 부위는 AAV 게놈의 맵 위치 95에 위치한다. AAV의 수명 주기 및 유전학은 문헌[Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992)]에서 검토된다.
AAV로부터 유래된 벡터는 (i) 근육 섬유 및 뉴런을 포함하는 다양한 비 분열 및 분열 세포 유형을 감염(형질도입)시킬 수 있고; (ii) 이들은 바이러스 구조 유전자가 부재하여, 바이러스 감염에 대한 천연 숙주 세포 반응, 예를 들어 인터페론(interferon)-매개 반응을 제거하고; (iii) 야생형 바이러스는 인간의 임의의 병리와 관련된 바가 없고; (iv) 숙주 세포 게놈으로 혼입될 수 있는 야생형 AAV와 달리, 복제-결핍 AAV 벡터는 일반적으로 에피솜(episome)으로서 지속되어, 삽입 돌연변이 유발 또는 발암 유전자의 활성화의 위험을 제한하고; (v) 다른 벡터 시스템과 달리, AAV 벡터는 유의한 면역 반응을 유발하지 않음으로써(ii 참조), 치료적 전이유전자의 장기 발현을 가능하게 하므로(이들의 유전자 산물이 거부되지 않는 경우), 유전 물질 전달을 위해 특히 중요하다.
자기 상보성 아데노-연관 벡터(scAAV)는 유전자 요법에 사용하기 위해 천연 발생 아데노-연관 바이러스(AAV)로부터 조작된 바이러스 벡터이다. 코딩 영역이 분자 내 이중 가닥 DNA 주형을 형성하도록 설계되었기 때문에 ScAAV는 "자기 상보성"으로 지칭된다. 통상적인 AAV 게놈이 단일 가닥 DNA 주형이기 때문에 표준 AAV 게놈 수명 주기에 대한 속도 제한 단계는 제2 가닥 합성을 포함한다. 그러나 이는 scAAV 게놈의 경우에는 해당되지 않는다. 감염 시, 제2 가닥의 세포 매개 합성을 기다리는 대신에, scAAV의 2개의 상보성인 절반은 결합하여 1개의 이중 가닥 DNA(dsDNA) 단위를 형성하며, 이는 즉시 복제 및 전사가 이루어질 수 있는 상태이다.
높은 효능을 유지하면서, 예를 들어, 빈 캡시드가 적고, 숙주 세포 단백질이 적고 및/또는 오염 DNA가 적은 AAV 약제학적 산물을 제조하고 정제하기 위한 규모 확장 가능 방법의 개발이 여전히 요구되고 있다.
본 개시는 AAV 입자 제조물을 포함하는 정제된 바이러스 입자 제조물을 제조하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 (a) 1 내지 8 x 1013 AAV9 바이러스 벡터 게놈/mL(vg/mL), (b) 약 7% 미만의 빈 바이러스 캡시드, (c) 1 x 1013 vg/mL당 약 100 ng/mL 미만의 숙주 세포 단백질, 및 (d) 1 x 1013 vg/mL당 약 5 x 106 pg/mL 미만의 잔여 숙주 세포 DNA를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하고, 적어도 약 80%의 1 내지 8 x 1013 AAV9 바이러스 벡터 게놈/mL는 기능성이다.
일 구현예에서, AAV9 바이러스 벡터는 생존 운동 뉴런(SMN) 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일 구현예에서, AAV9 바이러스 벡터는 메틸-CpG-결합 단백질 2(MECP2) 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일 구현예에서, AAV9 바이러스 벡터는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1(SOD1)을 표적화하는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일 구현예에서, AAV9 바이러스 벡터는 변형된 AAV2 ITR, 닭 베타-액틴(CB) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시/초기 인핸서, 변형된 SV40 후기 16s 인트론, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호, 및 비변형된 AAV2 ITR을 포함한다.
본 개시는 약제학적 제형을 제공한다. 일부 구현예에서, 수성 약제학적 제형은 (a) 생존 운동 뉴런(SMN) 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터, (b) Tris 완충액, (c) 염화마그네슘, (d) 염화나트륨, 및 (e) 폴록사머(예를 들어, 폴록사머 188)를 포함하고, 약제학적 조성물은 보존제를 포함하지 않는다. 제형의 일 구현예에서, AAV9 바이러스 벡터는 변형된 AAV2 ITR, 닭 베타-액틴(CB) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시/초기 인핸서, 변형된 SV40 후기 16s 인트론, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호, 및 비변형된 AAV2 ITR을 추가로 포함한다. 제형의 일 구현예에서, Tris 완충액 농도는 약 10 nM 내지 30 nM, 예를 들어, 약 20 mM이다. 일 구현예에서, 제형의 pH는 약 7.7 내지 약 8.3, 예를 들어, 약 pH 8.0(예를 들어, USP <791>(그 전문이 참조로 포함됨)에 의해 측정된 바와 같음)이다. 제형의 일 구현예에서, 염화마그네슘 농도는 약 0.5 mM 내지 1.5 mM, 예를 들어, 약 1 mM이다. 제형의 일 구현예에서, 염화나트륨 농도는 약 100 mM 내지 300 mM, 예를 들어, 약 200 mM이다. 일 구현예에서, 제형은 약 0.005% w/v 폴록사머 188을 포함한다.
본 개시의 또 다른 양태는 I형 척수성 근위축(SMA)의 치료가 필요한 환자에서 이를 치료하는 방법으로서, SMN 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터(예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 조성물 또는 제형)을 환자에 척수내 또는 정맥내 경로에 의해 투여하는 단계를 포함하고, 환자는 (a) 생후 9개월 이하이고, (b) 체중이 적어도 약 2.6 kg이고, (c) 이중 대립유전자 SMN1 눌 돌연변이 또는 결실을 갖고, (d) SMN2의 적어도 하나의 기능성 카피를 갖는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, AAV9 바이러스 벡터는 변형된 AAV2 ITR, 닭 베타-액틴(CB) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시/초기 인핸서, 변형된 SV40 후기 16s 인트론, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호, 및 비변형된 AAV2 ITR을 포함한다. 일 구현예에서, 환자는 체중이 약 8.5 kg 이하이다. 일 구현예에서, 환자는 SMN2 유전자의 적어도 하나의 카피의 엑손 7에 c.859G>C 치환을 갖지 않는다. 일 구현예에서, 치료는 생후 6개월 전에 환자에 투여된다. 일 구현예에서, 치료는 저긴장, 운동 능력의 지연, 불량한 머리 제어, 굽은 어깨 자세 및 관절의 과운동성으로부터 선택되는 하나 이상의 SMA 증상의 발병 전에 환자에 투여된다. 일 구현예에서, 환자는 투여 전에 ELISA 결합 면역분석에 의해 결정되는 바와 같이 1:100 이하의 항-AAV9 항체 역가를 나타낸다.
또한 질병 발병의 존재 또는 부재 하의 척수성 근위축(SMA) I형 소아 환자를 치료하는 방법으로서, 본원에 개시된 바와 같은 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 포함하는 조성물 또는 제형을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 개시된다.
본 개시는 또한 레트 증후군의 치료가 필요한 환자에서 이를 치료하는 방법으로서, 메틸-CpG-결합 단백질 2(MECP2) 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터 환자에 척수내 또는 정맥내 경로에 의해 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 개시는 또한 근위축성 측색 경화증(ALS)의 치료가 필요한 환자에서 이를 치료하는 방법으로서, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1(SOD1)을 표적화하는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터 환자에 척수내 또는 정맥내 경로에 의해 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 개시의 또 다른 양태는 I형 SMA를 앓고 있는 환자를 치료하는 방법으로서, (a) 환자의 중량을 결정하는 단계, (b) AAV9 바이러스 벡터 약제학적 조성물의 바이알을 포함하는 키트를 획득하는 단계, 및 (c) 바이알로부터의 AAV9 바이러스 벡터를 환자에 투여하는 단계를 포함하고, 각 바이알 중 바이러스 벡터 농도는 약 2.0 x 1013 vg/mL이고, AAV9 바이러스 벡터는 SMN 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고; 키트는 다음 수의 바이알을 포함하는 방법에 관한 것이다:
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일 구현예에서, 키트는 돌연변이된 AAV2 ITR, 닭 베타-액틴(CB) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시/초기 인핸서, 변형된 SV40 후기 16s 인트론, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호, 및 AAV2 ITR을 포함하는 AAV9 바이러스 벡터를 포함한다. 일 구현예에서, AAV 바이러스 벡터는 약 1.0x1014 vg/kg 내지 2.5x1014 vg/kg의 투여량으로 주입에 의해 투여된다.
본 개시의 또 다른 양태는 I형 척수성 근위축(SMA)을 앓고 있는 환자를 치료하기 위한 키트로서, 조성물을 포함하는 바이알을 포함하는 키트에 관한 것이며, AAV9 바이러스 벡터는 생존 운동 뉴런(SMN) 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 (a) 생존 운동 뉴런(SMN) 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터, (b) Tris 완충액, (c) 염화마그네슘, (d) 염화나트륨, 및 (e) 폴록사머(예를 들어, 폴록사머 188)를 포함하는 제형을 포함한다.
본 개시의 또 다른 양태는 약 5.5 mL 또는 약 8.3 mL의 생존 운동 뉴런(SMN) 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터를 포함하고, pH 7.7 내지 8.3, 예를 들어, 약 8.0의 20 mM Tris, 1 mM MgCl2, 200 mM NaCl, 0.005% w/v 폴록사머 188 중 약 2.0 x 1013 vg/mL의 농도로 제형화된 바이알을 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 개시의 또 다른 양태는 I형 SMA를 치료하는 방법으로서, 조성물의 부피를 필요한 환자에 정맥내 주입에 의해 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이며, 조성물 AAV9 바이러스 벡터는 생존 운동 뉴런(SMN) 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 (a) 생존 운동 뉴런(SMN) 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터, (b) Tris 완충액, (c) 염화마그네슘, (d) 염화나트륨, 및 (e) 폴록사머(예를 들어, 폴록사머 188)를 포함하는 제형을 포함한다.
본 개시의 또 다른 양태는 AAV 바이러스 벡터의 제조 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, AAV 바이러스 벡터의 제조 방법은 (a) 부착 세포를 배양하는 단계, (b) AAV 바이러스 벡터의 생성을 가능하게 하는 플라스미드(들)로 부착 세포를 형질감염시키는 단계, (c) 부착 세포를 용해시켜, AAV 바이러스 벡터를 단리하는 단계, (d)(c)의 세포 용해물을 산성화하여, 정화하는 단계, (e) 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)를 사용하여 (d)의 산물을 정제하는 단계, (f) 접선 유동 여과(TFF)를 사용하여 (e)의 산물을 여과하는 단계, (g) 염화세슘(CsCl) 완충액 중(f)의 산물을 초원심분리하는 단계; 및 (h)(g)의 산물로부터 AAV 바이러스 벡터를 수집하는 단계를 포함한다.
본 개시의 또 다른 양태는 세포 배양 용해물로부터 AAV 바이러스 벡터를 정제하는 방법으로서, (a) 세포 용해물을 산성화하여, 정화하는 단계, (b) 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)를 사용하여 (a)의 산물을 정제하는 단계, (c) 접선 유동 여과(TFF)를 사용하여 (b)의 산물을 여과하는 단계, (d) 2 M 내지 4 M 염화세슘(CsCl) 완충액을 사용하여 (c)의 산물을 초원심분리하는 단계, (e)(d)의 산물로부터 AAV 바이러스 벡터를 수집하는 단계, (f) 접선 유동 여과를 통해 (e)의 산물을 여과하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 본 방법은 산업적 규모로 수행된다. 일 구현예에서, 본 방법은 제조 배치당 5 x 1015 vg 초과, 또는 8 x 1015 vg 초과 또는 1 x 1016 vg 초과의 수율을 생성한다.
본 개시의 또 다른 양태는 본원에 개시된 임의의 방법에 따라 제조되는 바와 같은 SMN 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터를 투여함으로써, SMA I형 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 개시의 또 다른 양태는 본원의 임의의 방법에 따라 제조되는 바와 같은 MECP2 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터를 투여함으로써, 레트 증후군 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 개시의 또 다른 양태는 본원의 임의의 방법에 따라 제조되는 바와 같은 SOD1을 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터를 투여함으로써, ALS 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 개시의 또 다른 양태는 본원의 임의의 방법에 따라 제조되는 SMN 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터에 관한 것이다.
본 개시의 또 다른 양태는 본원의 임의의 방법에 따라 제조되는 SMN 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 개시의 또 다른 양태는 SMN 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터, Tris 완충액, 염화마그네슘 용액, 및 염화나트륨 용액을 포함하는 수성 약제학적 조성물에 관한 것이며, 약제학적 조성물은 보존제를 포함하지 않고, 조성물은 본원의 임의의 방법에 따라 제조된다.
본 개시의 또 다른 양태는 본원의 임의의 방법에 따라 제조되는 MECP2 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터에 관한 것이다.
본 개시의 또 다른 양태는 본원의 임의의 방법에 따라 제조되는 MECP2 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 개시의 또 다른 양태는 본원의 임의의 방법에 따라 제조되는 SOD1을 표적화하는 shRNA를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
본 개시의 또 다른 양태는 변형된 AAV2 ITR, 닭 베타-액틴(CB) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시/초기 인핸서, 변형된 SV40 후기 16s 인트론, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호, 및 비변형된 AAV2 ITR을 포함하는 자기 상보성 AAV9 바이러스 벡터, (b) pH 8.0의 20 mM Tris, (c) 1 mM MgCl2, (d) 200 mM NaCl, 및 (e) 0.005% 폴록사머 188을 포함하는 약제학적 조성물을 정맥내 투여함으로써, I형 SMA의 치료가 필요한 환자에서 이를 치료하는 방법에 관한 것이며, 환자는 체중이 2.6 kg 내지 8.5 kg이다. 일 구현예에서, 조성물은 보존제를 포함하지 않는다.
일 구현예에서, 환자는 (a) 생후 9개월 이하이고, (b) 체중이 적어도 약 2.6 kg이고, (c) 이중 대립유전자 SMN1 눌 돌연변이 또는 결실을 가지며, (d) SMN2의 적어도 하나의 기능성 카피를 갖는다.
본 개시의 또 다른 양태는 (a) 변형된 AAV2 ITR, 닭 베타-액틴(CB) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시/초기 인핸서, 변형된 SV40 후기 16s 인트론, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호, 및 비변형된 AAV2 ITR을 포함하는 자기 상보성 AAV9 바이러스 벡터, (b) pH 8.0의 20 mM Tris, (c) 1 mM MgCl2, (d)200 mM NaCl, 및 (e) 0.005% 폴록사머 188을 포함하는 약제학적 조성물의 정맥내 투여에 적합하거나, 이를 위해 제조된 조성물에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 조성물 또는 제형이 본원에 개시되고, 조성물 또는 제형은 다음 중 적어도 하나를 포함한다: (a) 1.0x1013 vg당 약 0.09 ng 미만의 벤조나제(benzonase), (b) 약 30 μg/g(ppm) 미만의 세슘, (c) 약 20 ppm 내지 80 ppm의 폴록사머 188, (d) 1.0x1013 vg당 약 0.22 ng 미만의 BSA, (e) 1.0x1013 vg당 약 6.8x105 pg 미만의 잔여 플라스미드 DNA, (f) 1.0x1013 vg당 약 1.1x105 pg 미만의 잔여 hcDNA, 및 (g) 1.0x1013 vg 당 약 4 ng 미만의 rHCP,
일부 구현예에서, 본 개시는 작업 세포 은행으로부터 유래된 중간체(예를 들어, 동결 중간체)를 생성하기 위한 상류 공정을 제공하고, 상류 공정은 (a) 세포를 배양하는 단계, (b) 배양된 세포를 플라스미드(예를 들어, 3개의 플라스미드)로 형질감염시키는 단계, (c) 배양 기간 후 세포로부터 확장된 바이러스 입자를 수집하는 단계, (d) 임의의 완전한 세포 또는 세포 잔해를 제거하기 위해 여과를 통해 바이러스 입자를 정제하는 단계, (e) 단계 (d)로부터의 용리액을 접선 유동 여과에 적용하는 단계, 및 (g) 선택적으로 정제된 바이러스 입자의 생성된 중간체 제조물을 동결시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상류 공정은 최종 약제학적 산물을 생성하기 위해, 추가의 처리 단계, 특히, 예를 들어, 추가의 정제 및 제형화 단계와 조합된다.
일 구현예에서, 작업 세포 은행은 HEK293 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 당업계에서 사용 가능하거나, 본원에 개시된 방법에 사용하기에 적합한 또 다른 세포 유형 또는 유도체가 사용된다.
일 구현예에서, 형질감염 단계는 폴리에틸렌이민을 사용한다. 일 구현예에서, 형질감염 단계는 전이유전자 플라스미드, 예를 들어, pSMN, pAAV 플라스미드 및 pHELP 플라스미드를 사용한 3중 벡터 형질감염을 포함한다.
일 구현예에서, 공정은 형질감염된 세포를 용해 완충액 및 계면활성제로 용해시키는 단계를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 수집 단계는 잔여 숙주 세포 DNA를 감소시키기 위해, 예를 들어, 50 U/ml 내지 200 U/ml의 농도, 예를 들어, 75 U/ml 내지 150 U/ml의 농도의 벤조나제와 같은 엔도뉴클레아제로 산물을 처리하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 정제 단계는 대형 분자 오염물 및 세포 잔해를 제거하나, 벡터 게놈은 이를 통해 통과할 수 있는 필터, 예를 들어 0.45 마이크론 필터를 통한 심층 여과 및 후속 여과를 포함한다. 임의의 적합한 심층 필터가 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 접선 유동 여과("TFF")는 단계(d)의 용리액의 5 X 내지 15 X, 예를 들어, 6 X 내지 10 X 농도 및 적어도 4 투석부피, 예를 들어, 6 투석부피 투석여과 또는 10 투석부피, 또는 12 투석부피, 또는 15 투석부피 투석여과를 획득한다. 임의의 적합한 TFF 필터가 사용될 수 있다. 일 구현예에서, TFF 막은 셀룰로스 막이다. 일 구현예에서 TFF 막은 300 kDa 컷오프를 나타낸다.
둘째로, 본 개시는 중간체(예를 들어, 동결 중간체)를 여과된 약물 물질에 처리하는 하류 공정을 제공한다. 하류 공정 단계는 산성화 및 정화 단계(여과 사용), 후 양이온 교환 크로마토그래피, 접선 유동 여과, CsCl 초원심분리 및 여과된 AAV 입자가 약제학적으로 허용 가능한 담체에 현탁되는 여과된 약물 물질을 생성하기 위한 추가의 접선 유동 여과 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 산성화 및 정화 단계는 대형 분자 오염물 및 세포 잔해를 제거하는 필터, 예를 들어 0.45 마이크론 필터를 통한 심층 여과 및 후속 여과를 포함한다. 일부 구현예에서, pH 조정이 제어된다. 이 단계의 일부로서, 일 구현예에서, 세정제, 예를 들어 Tween이 첨가한다. 일부 구현예에서, Tween 첨가의 속도 및 Tween의 농도 범위가 제어된다.
일 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피는 0.2 마이크론 기공 크기를 갖는 복합 술포닐 수지를 사용한 막-기반 크로마토그래피 수지를 포함한다.
일 구현예에서, 염화세슘(CsCl) 초원심분리 단계는 2 M 내지 4 M CsCl, 예를 들어, 약 3 M CsCl을 사용한다.
또 다른 구현예에서, CsCl 초원심분리 단계는 약 20시간 내지 25시간 동안 약 40 kRPM 내지 50 kRPM에서 수행된다. 또 다른 구현예에서, CsCl 초원심분리 단계는 약 22시간 동안 약 45 kRPM에서 수행된다.
일 구현예에서, 접선 유동 여과("TFF")는 단계(d)의 용리액의 5 X 내지 15 X, 예를 들어, 6 X 내지 10 X 농도 및 적어도 4 투석부피, 예를 들어, 6 투석부피 투석여과 또는 10 투석부피, 또는 12 투석부피, 또는 15 투석부피 투석여과를 획득한다. 일 구현예에서, TFF 막은 300 kDa 컷오프를 나타낸다.
일 구현예에서, 용리액은 세슘(Cs)의 검출 수준 미만이다. 또 다른 구현예에서, Cs의 검출 수준은 50/백만(ppm) 미만이다. 또 다른 구현예에서, Cs의 검출 수준은 약 50 ppm 내지 70 ppm이다. 또 다른 구현예에서, Cs의 검출 수준은 약 70 내지 90 백만분율(ppm)이다. 또 다른 구현예에서, Cs의 검출 수준은 약 90 내지 110 백만분율(ppm)이다. 또 다른 구현예에서, Cs의 검출 수준은 약 110 내지 130 백만분율(ppm)이다. 또 다른 구현예에서, Cs의 검출 수준은 약 130 내지 150 백만분율(ppm)이다. 또 다른 구현예에서, Cs의 검출 수준은 150 백만분율(ppm) 미만이다.
1X1013 벡터 게놈("vg")/ml당 5X106 pg/ml 미만의 잔여 숙주 세포 DNA(hcDNA), 예를 들어, 1X1013 vg/mL당 1.2 X106 pg/mL 미만의 hcDNA를 포함하는 AAV 제조물(예를 들어, AAV9-SMN)을 포함하는 고수율 바이러스 제조물을 제조하기 위해, 이들 정제 방법이 사용될 수 있다. 따라서, 7.5X1015 vg가 제공된 5 kg 환자는 5kg 투여량당 최대 1.2X106 pg/mL*7.5X1015 vg /(1X1013vg/mL) = 8.4X107 pg hcDNA = 84,000 ng hcDNA 이하를 획득한다. 일 구현예에서, 제조물은 1.0x1013 vg당 5.0x105 pg 미만의 잔여 숙주 세포 DNA, 1.0x1013 vg당 2.0x105 pg 미만의 잔여 숙주 세포 DNA, 1.0x1013 vg당 1.1x105 pg 미만의 잔여 숙주 세포 DNA, 1.0x1013 vg당 1.0x105 pg 미만의 잔여 숙주 세포 DNA, 1.0x1013 vg당 0.9x105 pg 미만의 잔여 숙주 세포 DNA, 1.0x1013 vg당 0.8x105 pg 미만의 잔여 숙주 세포 DNA, 또는 그 사이의 임의의 농도를 포함한다.
일 구현예에서, AAV는 AAV2-유래 ITR을 갖는 복제 불능 AAV9, 예를 들어, scAAV9이다. 또 다른 구현예에서, AAV 벡터는 SMN 전이유전자를 보유한다. 일 구현예에서, SMN-코딩 DNA는 GenBank 수탁번호 NM_000344.2로 제공되어 있다. SMN DNA의 보존적 뉴클레오타이드 치환이 또한 고려된다(예를 들어, GenBank 수탁번호 NM_000344.2에 제시된 바와 같이, 위치 625에서의 구아닌에서 아데닌으로의 변화)
본 개시의 또 다른 양태는 (a) 정맥내("IV") 주사 또는 (b) 척수내("IT") 투여에 적합한 제형 중 AAV 입자를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 10% 미만의 빈 캡시드, 8% 미만의 빈 캡시드, 7% 미만의 빈 캡시드, 5% 미만의 빈 캡시드, 3% 미만의 빈 캡시드, 또는 1% 미만의 빈 캡시드를 갖는다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 5% 미만의 빈 캡시드를 갖는다. 일 구현예에서, 빈 캡시드의 수는 검출 한계 미만이다. 일부 구현예에서, 소량의 빈 캡시드를 갖는 약제학적 조성물이 유리하며, 이는 빈 캡시드가 치료 이득 없이, 유해한 반응(예를 들어, 면역 반응, 염증 반응, 간 반응 및/또는 심장 반응)을 생성할 수 있기 때문이다.
또 다른 구현예에서, 상기 약제학적 조성물 중의 잔여 숙주 세포 단백질("rHCP")은 1 X 1013 vg/ml당 100 ng/ml 이하의 rHCP, 예를 들어, 1 X 1013 vg/ml당 40 ng/ml 이하의 rHCP 또는 1 X 1013 vg/ml당 1 내지 50 ng/ml rHCP이다. 일 구현예에서, 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물은 1.0x1013 vg당 10 ng 미만의 rHCP, 또는 1.0x1013 vg당 5 ng 미만의 rHCP, 1.0x1013 vg당 4 ng 미만의 rHCP, 또는 1.0x1013 vg당 3 ng 미만의 rHCP, 또는 그 사이의 임의의 농도를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 약제학적 조성물 중 잔여 숙주 세포 DNA("hcDNA")는 1 X 1013 vg/ml당 5 X 106 pg/ml 이하의 hcDNA, 1 X 1013 vg/ml당 1.2 X 106 pg/ml 이하의 rHDNA/, 또는 1 X 1013 vg/ml당 1 X 105 pg/ml rHDNA 내지 1 X 1013 vg/ml당 1.2 X 106 pg/ml이다. 일 구현예에서, 상기 약제학적 조성물 중 잔여 숙주 세포 DNA는 1.0x1013 vg당 5.0x105 pg 미만, 1.0x1013 vg당 2.0x105 pg 미만, 1.0x1013 vg당1.1x105 pg 미만, 1.0x1013 vg당 1.0x105 pg 미만의 hcDNA, 1.0x1013 vg당 0.9x105 pg 미만의 hcDNA, 1.0x1013 vg당 0.8x105 pg 미만의 hcDNA, 또는 그 사이의 임의의 농도이다.
일 구현예에서, 상기 약제학적 조성물 중 잔여 플라스미드 DNA는 1 X 1013 vg/ml당 1.7 X 106 pg/ml 이하, 또는 1 X 1013 vg/ml당 1 X 105 pg/ml 내지 1 X 1013 vg/ml당 1.7 X 106 pg/ml이다. 일 구현예에서, 상기 약제학적 조성물 중 잔여 플라스미드 DNA는 1.0x1013 vg당 10.0x105 pg 미만, 1.0x1013 vg당 8.0x105 pg 미만, 또는 1.0x1013 vg당 6.8x105 pg 미만이다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 약제학적 조성물은 1.0x1013 vg당 0.5 ng 미만, 1.0x1013 vg당 0.3 ng 미만, 1.0x1013 vg당 0.22 ng 미만, 또는 1.0x1013 vg당 0.2 ng 미만, 또는 그 사이의 임의의 농도의 소 혈청 알부민(BSA)을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 약제학적 조성물 중 벤조나제는 1.0x1013 vg당 0.2 ng 미만, 1.0x1013 vg당 0.1 ng 미만, 1.0x1013 vg당 0.09 ng 미만, 1.0x1013 vg당 0.08 ng 미만 또는 그 사이의 임의의 농도이다. 일 구현예에서, 상기 약제학적 조성물 중 폴록사머 188은 약 10 ppm 내지 150 ppm, 약 15 ppm 내지 100 ppm, 또는 약 20 ppm 내지 80 ppm이다. 일 구현예에서, 상기 약제학적 조성물 중 세슘은 50 μg/g(ppm) 미만, 30 μg/g(ppm) 미만 또는 20 μg/g(ppm) 미만, 또는 그 사이의 임의의 농도이다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 약제학적 조성물은, 예를 들어, SDS-PAGE에 의해 결정되는 바와 같이, 10% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 또는 그 사이의 임의의 백분율의 총 불순도를 포함한다. 일 구현예에서, 총 순도는, 예를 들어, SDS-PAGE에 의해 결정되는 바와 같이, 90% 초과, 92% 초과, 93% 초과, 94% 초과, 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 또는 그 사이의 임의의 백분율이다. 약제학적 조성물의 일 구현예에서, 불명의 비 단일 관련 불순도는, 예를 들어, SDS-PAGE에 의해 측정되는 바와 같이, 5% 초과, 4% 초과, 3% 초과 또는 2% 초과, 또는 그 사이의 임의의 백분율이다. 일 구현예에서, 약제학적 조성물은 85% 초과, 86% 초과, 87% 초과, 88% 초과, 89% 초과, 90% 초과, 91% 초과, 91.9% 초과, 92% 초과, 93% 초과, 또는 그 사이의 임의의 백분율의 총 캡시드 대비 충전 캡시드의 백분율(예를 들어, 분석 초원심분리에 의해 측정되는 바와 같이, 피크 1+피크 2)을 포함한다. 약제학적 조성물의 일 구현예에서, 분석 초원심분리에 의해 피크 1에서 측정된 충전 캡시드의 백분율은 20% 내지 80%, 25% 내지 75%, 30% 내지 75%, 35% 내지 75%, 또는 37.4% 내지 70.3%이다. 약제학적 조성물의 일 구현예에서, 분석 초원심분리에 의해 피크 2에서 측정된 충전 캡시드의 백분율은 20% 내지 80%, 20% 내지 70%, 22% 내지 65%, 24% 내지 62%, 또는 24.9% 내지 60.1%이다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 약제학적 조성물은 1.0 내지 5.0 x 1013 vg/mL, 1.2 내지 3.0 x 1013 vg/mL 또는 1.7 내지 2.3 x 1013 vg/mL의 게놈 역가를 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 약제학적 조성물은 5 CFU/mL 미만, 4 CFU/mL 미만, 3 CFU/mL 미만, 2 CFU/mL 미만, 또는 1 CFU/mL 미만, 또는 그 사이의 임의의 농도의 바이오버든(bioburden)을 나타낸다. 일 구현예에서, USP, 예를 들어 USP <85>(그 전문이 참조로 포함됨)에 따른 내독소의 양은 1.0 EU/mL 미만, 0.8 EU/mL 미만 또는 0.75 EU/mL 미만이다.
일 구현예에서, USP, 예를 들어 USP <785>(그 전문이 참조로 포함됨)에 따른 본원에 개시된 약제학적 조성물의 삼투몰농도는 350 mOsm/kg 내지 450 mOsm/kg, 370 mOsm/kg 내지 440 mOsm/kg 또는 390 mOsm/kg 내지 430 mOsm/kg이다. 일 구현예에서, 약제학적 조성물은 용기당 25 μm 초과의 1200개 미만의 입자, 용기당 25 μm 초과의 1000개 미만의 입자, 용기당 25 μm 초과의 600개 미만의 입자, 용기당 25 μm 초과의 500개 미만의 입자, 또는 그 사이의 임의의 값을 포함한다. 일 구현예에서, 약제학적 조성물은 용기당 10 μm 초과의 10000개 미만의 입자, 용기당 10 μm 초과의 8000개 미만의 입자, 또는 용기당 10 μm 초과의 6000개 미만의 입자를 포함한다.
일 구현예에서, 약제학적 조성물은 0.5 내지 5.0x1013 vg/mL, 1.0 내지 4.0x1013 vg/mL, 1.5 내지 3.0x1013 vg/mL 또는 1.7 내지 2.3x1013 vg/mL의 게놈 역가를 갖는다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 약제학적 조성물은 다음 중 하나 이상을 포함한다: 1.0x1013 vg당 약 0.09 ng 미만의 벤조나제, 약 30 μg/g(ppm) 미만의 세슘, 약 20 ppm 내지 80 ppm의 폴록사머 188, 1.0x1013 vg당 약 0.22 ng 미만의 BSA, 1.0x1013 vg당 약 6.8x105 pg 미만의 잔여 플라스미드 DNA, 1.0x1013 vg당 약 1.1x105 pg 미만의 잔여 hcDNA, 1.0x1013 vg당 약 4 ng 미만의 rHCP, pH 7.7 내지 8.3, 약 390 mOsm/kg 내지 430 mOsm/kg, 용기당 25 μm 이상의 크기의 약 600개 미만의 입자, 용기당 10 μm 이상의 크기의 약 6000개 미만의 입자, 약 1.7 x 1013 내지 2.3 x 1013 vg/mL 게놈 역가, 1.0 x 1013 vg당 약 3.9 x 108 내지 8.4 x 1010 IU의 감염 역가, 1.0 x 1013 vg당 약 100 μg 내지 300 μg의 총 단백질, 약 7.5 x 1013 vg/kg 투여량의 바이러스 벡터에 의한 △7SMA 마우스의 24일 이상의 중앙값 생존율, 시험관내 세포-기반 분석을 기반으로 한 약 70% 내지 130%의 상대 효능, 및/또는 약 5% 미만의 빈 캡시드.
다양한 구현예에서, 임의의 본원에 논의되는 바이러스 입자(예를 들어, AAV SMN, AAV MECP2, 또는 AAV SOD1 바이러스 입자)를 포함하는 본원에 개시된 약제학적 조성물은 기준 표준의 ± 20%, ± 15%, ± 10%, 또는 ± 5%의 효능을 보유한다. 일부 구현예에서, 효능은 적합한 시험관내 세포 분석 또는 생체내 동물 모델을 사용하여 측정된다. 예를 들어, 효능 또는 기능성 AAV SMN 바이러스 입자%는 SMA, 예를 들어 SMAΔ7 마우스의 동물 모델, 또는 적합한 세포주, 예를 들어 SMAΔ7 마우스의 피질로부터 단리된 1차 신경 전구체 세포(NPC)를 사용한 정량적 세포-기반 분석을 사용하여 결정될 수 있다. 일 구현예에서, 효능은 문헌[Foust et al., Nat. Biotechnol., 28(3), pp. 271-274(2010)]의 방법을 사용하여 기준 표준에 대비하여 평가한다. 임의의 적절한 기준 표준이 사용될 수 있다. 효능 또는 기능성 AAV MeCP2%는 적합한 시험관내 세포 분석 또는 생체내 동물 모델, 예를 들어, 문헌[Guy et al., "Reversal of neurological defects in a mouse model of Rett syndrome". Science, 315(5815):1143-7]에서와 같은 Mecp2 녹아웃 마우스를 사용하여 분석될 수 있다. 효능 또는 기능성 AAV SOD1%는 적합한 시험관내 세포 분석 또는 생체내 동물 모델, 예를 들어 문헌[Gurney et al., "Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation". Science, 264(5166):1772-5]에서와 같은 SOD1 돌연변이체 마우스를 사용하여 분석될 수 있다. 일 구현예에서, 약제학적 조성물은 7.5x1013 vg/kg 투여량이 제공된 SMAΔ7 마우스에서 중앙값 생존율에 의해 결정된 바와 같이 15일 초과, 20일 초과, 22일 초과 또는 24일 초과의 생체내 효능을 갖는다. 일 구현예에서, 약제학적 조성물은 기준 표준 및/또는 적합한 대조군과 비교하여, 세포-기반 분석에 의해 시험된 바와 같이 50% 내지 l50%, 60% 내지 140% 또는 70% 내지 130%의 생체내 상대 효능을 갖는다.
일 구현예에서, 정맥내("IV") 제형은 pH 7.5 및 8.5, 약 1 내지 8 x 1013 바이러스 벡터 게놈/mL(vg/mL), 또는 2 X 1013 vg/ml 내지 6 X 1013 vg/ml의 게놈 역가, 및 선택적으로 384 mOsm/kg 내지 448 mOsm/kg의 삼투몰농도를 갖는다. 일 구현예에서, IV 제형은 pH 8.0의 Tris 완충액 중 MgCl2, NaCl, pluronic F68을 포함한다.
일 구현예에서, IV 투여의 경우, SMN 전이유전자를 보유하는 AAV-9 벡터는 적절한 환경(예를 들어, 개입 세트, 수술실, 전용 절차실)에서 멸균 조건 하에 말초 사지 정맥(팔 또는 다리) 내에 삽입된 정맥내 카테터를 통해 소정의 투여량으로 1회 투여되며, 약 30분 내지 60분 동안 서서히 주입된다.
또 다른 구현예에서, 본원의 개시는 폴리뉴클레오타이드를 필요한 환자의 중추신경계에 전달하는 조성물 및 방법을 제공하고, 이는 환자에 rAAV9 및 비이온성, 저 삼투압 조영제를 척수내("IT") 전달하는 단계를 포함하며, rAAV9는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 자기 상보성 게놈을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어 뇌, 척수, 신경교 세포, 성상세포 및/또는 하부 운동 뉴런으로 전달된다. 비이온성, 저 삼투압 조영제는 예를 들어 이오비트리돌(iobitridol), 이오헥솔(iohexol), 이오메프롤(iomeprol), 이오파미돌(iopamidol), 이오펜톨(iopentol), 이오프로마이드(iopromide), 이오버솔(ioversol) 또는 이옥실란(ioxilan)이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 생존 운동 뉴런(SMN) 폴리뉴클레오타이드이다. 일 구현예에서, 조영제는 이오헥솔, 예를 들어, 이오헥솔 180(Omnipaque 180으로 판매, mL당 180mg의 유기 요오드에 해당하는 388 mg 이오헥솔 포함)이다.
일 구현예에서, IT 투여의 경우, SMN 전이유전자를 보유하는 scAAV9 벡터를 정상 식염수로 희석하고, 요추강내 주사를 통한 주사의 방사선학적 모니터링을 위해 소아용으로 승인되고, 표지된 적절한 고압성 조영제(예컨대 Omnipaque 180)와 미리 혼합한다. SMN 전이유전자를 보유하는 AAV-9 벡터 플러스 조영제 및/또는 식염수를 포함하는 수성 조성물의 총 부피는 5 mL를 초과하지 않을 것이다. 조영제 및 SMN 전이유전자를 보유하는 scAAV-9 벡터는 공동 제형화되고, 공동 패키징되거나 패키징되어, 환자 중추로 별도로 전달될 수 있다.
PICU 환자실 또는 다른 적절한 환경(예를 들어, 개입 세트, 수술실, 전용 절차실)에서 멸균 조건 하에서 척수내 주사를 통해 SMN 전이유전자를 보유하는 scAAV-9 벡터를 환자에 제공하고, 환자를 즉시 급성 중환자 관리에 배치한다. 부위에는 경막 섬유에 비스듬하게 평행으로 삽입된 비외상성 바늘이 사용될 수 있으며; 이는 소아의 경우를 포함하여, 경막 손상을 상당히 감소시키고, 결과적으로 요추 천자 후 뇌척수액 누출 위험을 감소시키는 것으로 나타났다(문헌[Ebinger et al., "Headache and Backache After Lumbar Puncture in Children and Adolescents: A Prospective Study". Pediatrics, 113(6):1588-1592; Kiechl-Kohlendorfer et al., "Cerebrospinal Fluid Leakage After Lumbar Puncture in Neonates: Incidence and Sonographic Appearance". American Journal of Roentgenology, 181(1):231-234]).
IT 주사가 제공된 모든 환자에게 진정제 투여/마취가 권장된다. 방법 및 약제는 국소 마취 전문의의 재량에 따르지만, 절차 및 절차 후 트렌델렌부르크 자세(Trendelenburg position) 배치를 위한 진통 및 움직임 부재를 보장하기에 충분한 정도의 진정제 또는 불안완화제를 포함해야 한다. 경추 및 뇌 영역으로의 분포를 향상시키기 위해 IT 요법 투여 후 15분 동안 환자를 트렌델렌부르크 자세에 배치하고, 머리를 30° 아래로 기울어지도록 할 것이다.
환자를 모로 누운 자세에 배치하고, 소침이 구비된 카테터를 요추 천자에 의해 L3-L4 또는 L4-L5 극간 공간으로 지주막하 공간으로 삽입한다. 지주막하 캐뉼라 삽입은 카테터로부터 투명한 뇌척수액(CSF)의 유체로 확인된다. 기관 지침에 따라 CSF를 제거하고, 처리한다. 사전 혼합된 조영제 용액 중 SMN 전이유전자를 보유하는 ScAAV-9 벡터가 지주막하 공간으로 직접 주입된다.
일 구현예에서, 본 개시는 신경계 질병의 치료가 필요한 환자에서 이를 치료하는 방법을 제공하고, 이는 본원에 개시된 약제학적 조성물을 정맥내 또는 척수내 전달하는 단계를 포함하고, 파르보바이러스는 자기 상보성 rAAV9 게놈을 포함하고, 조작된 전이유전자는 SMN 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 질병은 SMA이다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 신경계 질병의 치료를 필요로 하는 환자에서 이를 치료하는 방법을 제공하고, 이는 조영제와 함께 본원에 개시된 약제학적 조성물을 척수내 전달하는 단계를 포함하고, 파르보바이러스는 자기 상보성 rAAV9 게놈을 포함하고, 조작된 전이유전자는 SMN 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 질병은 SMA이고, 조영제는 omnipaque 180이다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 II형, III형, 또는 IV형 SMA의 치료를 필요로 하는 환자에서 이를 치료하는 방법을 제공하고, 이는 본원에 개시된 약제학적 조성물을 조형제와 함께 경막내로 전달하는 단계를 포함하고, 파르보바이러스는 자기 상보성 rAAV9 게놈을 포함하고, 조작된 전이유전자는 SMN 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 조영제는 omnipaque 180이다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 I형 SMA의 치료를 필요로 하는 환자에서 이를 치료하는 방법으로서, 본원에 개시된 약제학적 조성물을 정맥내 전달하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 파르보바이러스는 자기 상보성 rAAV9 게놈를 포함하고, 조작된 전이유전자는 SMN 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 생후 0개월 내지 9개월이다. 일부 구현예에서, 환자는 생후 0개월 내지 6개월이다. 다른 구현예에서, 소아 환자의 중량은 최대 약 8 kg이다. 일부 구현예에서, 소아 환자는 약 8.5 kg 이하이다. 일부 구현예에서, 소아 환자는 약 2.6 kg 이상이다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 I형 SMA의 치료를 필요로 하는 환자에서 이를 치료하기 위한 키트로서, 바이알 내에 포함된 본원에 개시된 약제학적 조성물의 정맥내 투여를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 환자의 중량을 측정하고, 투여량을 환자의 중량을 기반으로 하여 계산한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시가 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 단수 형태의 단어는 또한, 문맥상 명백하게 다르게 지시하지 않는 한, 복수 형태의 단어를 포함하고; 예로서, 용어 단수형("a", "an" 및 "the")은 단수 또는 복수인 것으로 이해되고, 용어 "또는"은 용어는 포괄적인 것으로 이해된다. 예로서, "요소"는 하나 이상의 요소를 의미한다.
명세서 전체에 걸쳐, 단어 "~를 포함하는" 또는 "~를 포함하다"와 같은 변용예는 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 포함하지만, 다른 요소, 정수 또는 단계 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 배제하지 않음을 함축하는 것으로 이해될 것이다. 명세서 전체에서, 단어 "~로 이루어진" 또는 "~로 이루어지다"와 같은 변용예는 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 포함하지만, 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 배제하지 않음을 함축하는 것으로 이해될 것이다. 명세서 전체에서, "~로 필수적으로 이루어진" 또는 "~로 필수적으로 이루어지다"와 같은 변용예는 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹 및 본 개시 및/또는 청구범위의 기본 및 신규한 특성에 실질적으로 영향을 주지 않는 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 포함함을 함축하는 것으로 이해될 것이다.
약(about)은 언급된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 또는 0.01% 이내로 이해될 수 있다. 백분율 값과 관련하여 사용되는 경우, "약"은 ± 1% 이내(예를 들어, "약 5%"는 4% 내지 6% 이내로 이해될 수 있음) 또는 ± 0.5%(예를 들어, "약 5%"는 4.5% 내지 5.5% 이내로 이해될 수 있음)로 이해될 수 있다. 문맥상 달리 명확하지 않는 한, 본원에 제공된 모든 수치는 용어 "약"에 의해 수정된다.
본원에 기재된 것과 유사하거나 균등한 방법 및 재료가 본 개시의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 아래에 기재된다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참조문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 본원에 인용된 참조문헌은 청구된 개시에 대한 선행 기술인 것으로 인정되지 않는다. 모순되는 경우, 정의를 포함하는 본원이 우선할 것이다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것이며 제한하는 의도가 아니다. 본 개시의 다른 특징 및 장점은 다음의 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
본 개시의 다양한 목적 및 장점 및 더욱 완전한 이해는 첨부된 도면과 관련하여 취합하는 경우, 다음의 상세한 설명 및 첨부된 청구범위를 참조함으로써 명백하고 더욱 용이하게 이해된다:
도 1. pSMN, pHELP 및 pAAV의 플라스미드 맵.
도 1a는 pSMN의 플라스미드 맵을 보여준다. pSMN은 즉시/초기 사이토메갈로 바이러스(CMV) 인핸서 요소를 갖는 닭-베타-액틴 혼성체 프로모터의 제어 하에 인간 생존 운동 뉴런(SMN) cDNA를 발현하는 재조합 자기 상보성 AAV DNA 게놈에 대한 정보를 인코딩하는 플라스미드이다. SMN cDNA는 전장의 기능성 단백질을 인코딩한다. 발현 카세트는 시미안 바이러스 40(SV40)으로부터 유래된 변형된 인트론 서열 및 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 발현 카세트(CMV-CB-SV40-SMN-BGHpA)는 AAV2 유래 역위 말단 반복(ITR)에 측접한다. 좌측 ITR은 자기 상보성 AAV 게놈을 우선적으로 패키징하도록 변형된다. 종합하면, ITR 사이 및 이를 포함하는 영역은 약물 확인 산물의 제조 동안 재조합 AAV9 캡시드 내로 패키징된다. 재조합 AAV 게놈으로 패키징하기 위한 것이 아닌 주요 pSMN 성분은 카나마이신(KanR)에 대한 내성을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임 및 pUC로부터 유래된 복제 기점(ori)을 포함한다. ori 및 KanR 영역은 플라스미드 제조에 유용하다.
도 1b는 pHELP 플라스미드의 플라스미드 맵을 보여준다. pHELP 플라스미드는 재조합 아데노 연관 바이러스 생성에 필요한 trans-작용 아데노바이러스 성분을 포함한다. pHELP 플라스미드는 AAV 복제에 중요한 인자, 즉 E2A, E4 및 VA RNA를 제공하는 아데노바이러스 게놈의 영역을 포함한다. rAVV 복제에 관여하는 아데노바이러스 E1 기능은 형질감염 숙주 293 세포에 의해 제공된다. 그러나, pHELP 플라스미드는 다른 아데노바이러스 복제 또는 구조 유전자를 포함하지 않는다. 이 플라스미드에 존재하는 아데노바이러스 서열은 단지 아데노바이러스 게놈의 약 28%(9,280/35,938)를 나타내며, 역위 말단 반복과 같은 복제에 중요한 cis 요소를 포함하지 않는다. 따라서, 이러한 생성 시스템으로부터 감염성 아데노바이러스가 생성될 것으로 예상되지 않는다.
도 1c는 AAV 플라스미드의 플라스미드 맵을 보여준다. 야생형 AAV 게놈은 rep 및 cap 오픈 리딩 프레임에 측접한 역위 말단 반복이라고하는 2개의 비 코딩 구조 요소를 포함한다. Rep 및 cap은 각각 바이러스 복제 및 캡시드 단백질을 인코딩한다. 재조합 아데노-연관 바이러스 벡터의 생성에서; 바이러스 ITR은 cis에서 사용되는 유일한 요소이나, 바이러스 오픈 리딩 프레임은 trans로 제공된다. AAV를 제조하기 위해 부착 HEK293 세포의 일시적 형질감염 방법을 사용하여 상이한 유전자 요소를 별도의 플라스미드로 나눔으로써, 그에 대한 cis/trans 역할을 처리한다. pAAV2/9 플라스미드는 AAV2 rep 유전자 및 AAV9 cap 유전자에 대한 오픈 리딩 프레임을 포함한다.
도 2는 예외적 부착 및 사전-마스터 세포 은행(MCB) 기탁을 위한 HEK293 세포의 선택에 대한 처리 흐름도를 보여준다.
도 3은 예외적 부착 및 사전-마스터 세포 은행(MCB) 기탁을 위한 HEK293 세포의 선택에 대한 세포 처리 세부사항의 요약을 보여준다.
도 4는 약물 물질 상류 공정 흐름도를 기재한다.
도 5는 약물 물질 하류 공정 흐름도를 기재한다.
도 6은 최대 120분째에 첨가된 Tween 20에 의한 XMuLV의 불활성화를 보여준다.
도 7은 최대 120분째에 첨가된 Tween 20에 의한 PRV의 불활성화를 보여준다.
도 8은 세포 시딩 밀도 실험 동안 HEK 293 세포 확장 공정 흐름을 기재한다.
도 9a 내지 도 9e는 성장 및 대사산물 프로파일을 보여준다. HEK 293 세포를 생물반응기(pH 7.23, 37.0℃, 55% 용존 산소(DO))에 12,000 및 8,000 세포/cm2로 이중 반복실험으로 시딩하였다. 시딩 후 제4일(12,000 세포/cm2) 및 제5일(8,000 세포/cm2)에 세포를 DNA 플라스미드/PEI로 형질감염시켰다. 시딩 후 제8일(12,000 세포/cm2) 및 제9일(8,000 세포/cm2)에 생물반응기를 수확하였다. Nova BioFlex에서 매일 pH 및 대사산물 판독 값을 확인하였다.
도 10은 세포 시딩 밀도(8000 또는 12000 세포/cm2) 및 4개의 상이한 길이의 형질감염 시간(20분, 1시간 또는 2시간)의 함수로서 바이러스 게놈 생성을 보여준다.
도 11은 제조 공정 전반에 걸쳐 상이한 여과 단계에서 샘플링된 중간체로부터의 바이러스 역가를 보여준다.
도 12a 내지 도 12b는 TFF1 단계에서 바이러스 벡터 및 숙주 세포 단백질(HCP) 배출률의 회복을 보여준다.
도 13은 세포 시딩 밀도 실험 동안 HEK 293 세포 확장 공정 흐름을 기재한다.
도 14a 내지 도 14e는 HEK 293 세포가 생물반응기(pH 7.23, 37.0℃, 55% DO)에서 8,000 세포/cm2, 9,350 세포/cm2, 10,700 세포/cm2, 12,050 세포/cm2에서 이중 반복실험으로 시딩된 것을 보여준다. 시딩 후 제5일에 세포를 DNA 플라스미드/PEI(1:1 m/m)로 형질감염시켰다. NOVA BioProfile 400을 사용하여 pH 및 대사산물 분석을 수행하였다.
도 15a 내지 도 15b는 생물반응기에서 4개의 출발 시딩 밀도로부터 약물 물질 생성을 보여준다. 단위 표면적당 수확된 바이러스 역가 및 벡터 게놈의 비교.
도 16은 단계 1(공정 A) 및 단계 3 시험(공정 B) 제조 공정을 보여준다.
도 17a 내지 도 17b는 공정 A(단계 1) 및 공정 B(단계 3) 산물의 비교 및 제조 일관성 결과를 보여주는 표를 제공한다. 공정 B 산물은 공정 A와 비교하여 추가 이점이 있는 것으로 나타난다.
도 18은 공정 A(단계 1 항목번호 NCHAAV9SMN0613)와 공정 B(단계 3 항목번호 600156)의 이원 방식 비교를 사용한 공정 A와 공정 B의 비교를 도시한다. 공정 B 산물은 공정 A와 비교하여 추가 이점이 있는 것으로 나타난다.
도 19는 공정 B(단계 3) 항목번호 600156 및 600307의 이원 방식 비교에 의한 제조 일관성 평가를 도시한다.
도 20은 12개월에 걸쳐 -60℃ 이하의 실시간 저장 조건에서 저장된 NCH 항목번호 NCHAAV9SMN0613의 안정성 프로파일을 보여준다.
도 21은 단계 1 물질(NCHAAV9SMN0613)의 침강 계수(초 x 10-13)를 도시하고, 이는 빈 캡시드(7%)는 약 60 x 10-13초의 침강 계수를 갖고, 충전 캡시드는 약 80 내지 150 x 10-13초의 침강 계수 범위를 가짐을 보여준다.
도 22는 단계 3 물질(600156)의 침강 계수(초 x 10-13)를 도시하고, 이는 빈 캡시드(2%)는 약 60 x 10-13초의 침강 계수를 갖고, 충전 캡시드는 약 80 내지 150 x 10-13초의 침강 계수 범위를 가짐을 보여준다.
도 23은 단계 3 물질(600307)의 침강 계수(초 x 10-13)를 도시하고, 이는 빈 캡시드(4%)는 약 60 x 10-13초의 침강 계수를 갖고, 충전 캡시드는 약 80 내지 150 x 10-13초의 침강 계수 범위를 가짐을 보여준다.
동물 모델 이후 임상 연구 및/또는 치료 용도로 AAV 유전자 요법의 개발을 진행시키기 위해, 인간 용도에 적합한 바이러스 물질을 생성할 수 있는 규모 확장 가능한 공정이 개발되었다.
일부 구현예에서, "벡터"는 적절한 제어 요소와 결합되는 경우, 복제될 수 있고, 세포간에 유전자 서열을 전달할 수 있는 플라스미드, 파지, 트랜스포손, 코스미드, 염색체, 바이러스, 비리온 등과 같은 임의의 유전자 요소를 의미한다. 따라서, 이 용어는 바이러스 벡터뿐만 아니라, 클로닝 및 발현 비히클을 포함한다.
일부 구현예에서, "AAV 벡터"는 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8 및 AAV-9를 포함하지만 이에 제한되지 않는 아데노 연관 바이러스 혈청형으로부터 유래된 벡터를 의미한다. AAV 벡터는 전체 또는 일부, 예를 들어, rep 및/또는 cap 유전자에 결실된 하나 이상의 AAV 야생형 유전자를 가질 수 있지만, 기능성 측접 ITR 서열을 보유한다. 기능성 ITR 서열은 AAV 비리온의 구조, 복제 및 패키징에 필요하다. 따라서, AAV 벡터는 본원에서 cis에서 바이러스의 복제 및 패키징을 제공하는 최소한의 이러한 서열(예를 들어, 기능성 ITR)을 포함하는 것으로 규정된다. ITR은 야생형 뉴클레오타이드 서열일 필요는 없으며, 서열이 기능성 구조, 복제 및 패키징을 제공하는 한, 예를 들어 뉴클레오타이드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변이될 수 있다. 일 구현예에서, 벡터는 AAV-2 유래 ITR을 갖는 AAV-9 벡터이다. 또한 "AAV 벡터"는 표적 세포의 핵으로 벡터 핵산을 전달하기 위한 효율적인 비히클을 제공하는 단백질 외피 또는 캡시드를 의미한다.
일부 구현예에서, "scAAV"는 자기 상보성 아데노 연관 바이러스(scAAV)를 의미하며, 이는 유전자 요법에 사용하기 위해 천연 발생 아데노 연관 바이러스(AAV)로부터 조작된 바이러스 벡터이다. 코딩 영역이 분자 내 이중 가닥 DNA 주형을 형성하도록 설계되었기 때문에 scAAV는 "자기 상보성"으로 지칭된다.
일부 구현예에서, 용어 "벡터 관련 불순도"는 진성 재조합 AAV 입자 이외의 모든 유형의 AAV 입자를 지칭한다. 벡터 관련 불순도는 빈 AAV 캡시드(또한 "빈" 또는 "빈 입자"로 지칭됨) 및 의도한 벡터 게놈 이외의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 AAV 입자(또한 "AAV-포획된 핵산 불순도" 또는 " AAV-포획된 DNA 불순도")를 포함한다.
일부 구현예에서, "재조합 바이러스"는 예를 들어 입자에 이종성 핵산 작제물의 첨가 또는 삽입에 의해 유전자 변형된 바이러스를 의미한다. "재조합"은 "r"로 약칭될 수 있으며, 예를 들어, rAAV는 재조합 AAV를 지칭할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "AAV"는 "재조합 AAV" 또는 "rAAV"를 포함하는 것으로 의도된다.
일부 구현예에서, "AAV 비리온"은 야생형(wt) AAV 바이러스 입자(AAV 캡시드 단백질 코트와 결합된 선형 단일 가닥 AAV 핵산 게놈 포함)와 같은 완전한 바이러스 입자를 의미한다. 이와 관련하여, 상보성 센스, 예를 들어 "센스" 또는 "안티센스" 가닥의 단일 가닥 AAV 핵산 분자는 하나의 임의의 AAV 비리온으로 패키징될 수 있고, 두 가닥 모두 동일하게 감염성이다.
일부 구현예에서, 용어 "재조합 AAV 비리온", "rAAV 비리온", "AAV 벡터 입자", "충전 캡시드" 및 "충전 입자"는 본원에서 양쪽에 AAV ITR이 측접한 대상 이종 뉴클레오타이드 서열을 포획화하고, AAV 단백질 외피를 포함하는 감염성 복제 결함 바이러스로 규정된다. rAAV 비리온은 AAV 벡터, AAV 헬퍼 기능성 및 그에 도입된 부속 기능을 특정하는 서열을 갖는 적합한 숙주 세포에서 생성된다. 이러한 방식으로, 숙주 세포는 후속 유전자 전달을 위해 감염성 재조합 비리온 입자로의 AAV 벡터(대상 재조합 뉴클레오타이드 서열 포함)의 패키징을 제공하는 AAV 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있게 된다.
일부 구현예에서, 용어 "빈 캡시드"및 "빈 입자"는 AAV 단백질 외피를 포함하지만, 양쪽에 AAV ITR이 측접한 대상 이종성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 작제물 전체 또는 일부가 부재하는 AAV 비리온을 지칭한다.
용어 "숙주 세포"는 예를 들어, AAV 헬퍼 작제물, AAV 벡터 플라스미드, 부속 기능성 벡터 또는 다른 전달 DNA의 수용체로서 사용될 수 있거나 사용된 미생물, 효모 세포, 곤충 세포 및 포유류 세포를 나타낸다. 이 용어는 형질감염된 원래 세포의 자손을 포함한다. 따라서, 본원에 사용되는 바와 같이, "숙주 세포"는 일반적으로 외인성 DNA 서열로 형질감염된 세포를 지칭한다. 단일 모체 세포의 자손은 자연적, 우발적, 또는 의도적인 돌연변이로 인해 원래의 모체로서 형태 또는 게놈 또는 총 DNA 보체에 반드시 완전히 동일할 필요는 없을 수 있다.
다른 구현예에서, 용어 "AAV 헬퍼 기능"은 발현되어, 결과적으로 생성 AAV 복제를 위해 trans에서 기능하는 AAV 유전자 산물을 제공하는 AAV-유래 코딩 서열을 지칭한다. 따라서, AAV 헬퍼 기능은 AAV 오픈 리딩 프레임(ORF), rep 및 cap 둘 모두를 포함한다. Rep 발현 산물은 특히, AAV DNA 복제 기점의 인식, 결합 및 닉킹(nicking); DNA 헬리카제(helicase) 활성; 및 AAV(또는 다른 이종) 프로모터로부터 전사의 조절을 포함하여 많은 기능을 보유하는 것으로 나타났다. cap 발현 산물은 필요한 패키징 기능을 제공한다. AAV 헬퍼 기능은 본원에서 AAV 벡터로부터 누락된 trans에서 AAV 기능을 보완하는 것으로 사용된다.
일 구현예에서, 용어 "AAV 헬퍼 작제물"은 일반적으로 대상 뉴클레오타이드 서열의 전달을 위해 형질도입 벡터를 생성하기 위해 사용되는 AAV 벡터로부터 결실된 AAV 기능을 제공하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 지칭한다. AAV 헬퍼 작제물은 AAV 복제에 필요한 누락된 AAV 기능을 보완하기 위해 AAV rep 및/또는 cap 유전자의 일시적인 발현을 제공하기 위해 일반적으로 사용되나; 헬퍼 작제물은 AAV ITR이 부재하며, 스스로 복제하거나 패키징할 수 없다. AAV 헬퍼 작제물은 플라스미드, 파지, 트랜스포손, 코스미드, 바이러스 또는 비리온의 형태일 수 있다. Rep 및 Cap 발현 산물 둘 모두를 인코딩하는 일반적으로 사용되는 플라스미드 pAAV/Ad 및 plM29+45와 같은 다수의 AAV 헬퍼 작제물이 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌[Samulski et al.(1989) J. Virol. 63:3822-3828; 및 McCarty et al.(1991) J. Virol. 65:2936-2945]을 참조한다. Rep 및/또는 Cap 발현 산물을 인코딩하는 다수의 다른 벡터가 기재되었다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,139,941호 및 제 6,376,237호를 참조한다.
또 다른 구현예에서, 용어 "형질감염"은 세포에 의한 외래 DNA의 흡수를 지칭하기 위해 사용되며, 외인성 DNA가 세포막 내부에 도입되는 경우, 세포는 "형질감염"되었다. 다수의 형질감염 기법이 당업계에 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Graham et al. (1973) Virology, 52:456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, and Chu et al. (1981) Gene 13:197]을 참조한다. 이러한 기법은 하나 이상의 외인성 DNA 모이어티를 적합한 숙주 세포 내로 도입하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "세포주"는 시험관내에서 연속 또는 연장된 성장 및 분열이 가능한 세포 집합을 지칭한다. 이러한 클론 집합의 저장 또는 전달 동안 핵형에서 자발적 또는 유도된 변화가 발생할 수 있다는 것이 당업계에 추가로 공지되어 있다. 따라서, 지칭된 세포주로부터 유래된 세포는 조상 세포 또는 배양물과 정확하게 동일하지 않을 수 있으며, 지칭된 세포주는 이러한 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 용어 "HEK293 세포", "293 세포" 또는 그의 문법적 균등물은 본원에서 상호 혼용되며, 본원에 개시된 방법에 사용된 숙주/패키징 세포주를 지칭한다.
일부 구현예에서, 용어 "용리액"은 문맥상 물질을 용리시키기 위해 사용되는 완충액을 지칭하는 것으로 이해될 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "용리액"은 예를 들어, 분석 또는 추가 정제를 위한 이전 정제 단계로부터의 용리된 물질, 예를 들어, 목적 산물 또는 물질을 의미하는 것으로 이해될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 우수한 제조 관행(GMP)을 사용하여 산업 규모로 수행된다. GMP는 의약품 품질을 보장하기 위한, 예를 들어, 미국 식품의약국(FDA)에 의해 시행되는 규제 관행이다. GMP 규정은 제조 공정에 대한 제어를 설정한다. 현재 GMP 규정의 예는 FDA에 의해 발표되었다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 산업 규모의 AAV 바이러스 벡터를 생성하기 위한 GMP 절차를 사용한다. 현재까지, 유전자 요법을 위한 AAV 바이러스 벡터의 산업적 규모의 생성은 규모 확장성 문제로 인해 과제로 남아 있었다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 AAV 바이러스 벡터를, 예를 들어 부착 세포에서 산업 규모 및 인간에 투여하기에 충분한 순도 수준으로 생성함으로써 이점을 제공하였다. 용어 "산업 규모"는 실험 규모보다 더 큰, 예를 들어, 수율이 제조 배치당 5 x 1015 vg 초과, 또는 8 x 1015 vg 초과 또는 1 x 1016 vg 초과인, 예를 들어 상업적 규모로 세포에서 바이러스 벡터를 생성하는 방법을 지칭한다.
상류 공정
일부 구현예에서, 작업 세포 은행으로부터 유래된 중간체를 생성하기 위해 상류 공정이 사용되며, 상류 공정은 (a) 세포, 예를 들어, 부착 세포를 배양하는 단계, (b) 배양된 세포, 예를 들어, 부착 세포를 3개의 플라스미드로 형질감염시키는 단계, (c) 예를 들어 총 세포 용해에 의해 배양 기간 후 세포로부터 확장된 바이러스 입자를 수집하는 단계, (d) 임의의 완전한 세포 또는 세포 잔해를 제거하기 위해 여과를 통해 바이러스 입자를 정제하는 단계, (e) 단계(d)로부터의 용리액을 접선 유동 여과에 적용하는 단계, 및 (f) 선택적으로 정제된 바이러스 입자의 생성된 중간체 제조물을 동결시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 중간체 제조물은 동결될 수 있다. 다른 구현예에서, 중간체 제조물은 하류 공정 전에 동결되지 않아야 한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 상류 공정에 의해 제조되는 AAV는 본원에 기재되는 바와 같이, SOD1을 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 AAV, MECP2를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV, 또는 SMN을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV이다. 일부 구현예에서, 상류 공정은 GMP 하에 산업적 규모로 수행된다.
1. 세포주 형질감염 및 배양
일 양태에서, rAAV 게놈이 본원에 개시된다. rAAV 게놈은 폴리펩타이드(SMN 폴리펩타이드를 포함하지만 이에 제한되지 않음)를 인코딩하거나, 돌연변이 단백질에 유도되는 siRNA, shRNA, 안티센스 및/또는 miRNA 또는 이러한 유전자의 제어 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 측접하는 하나 이상의 AAV ITR을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 전사 제어 DNA, 구체적으로 프로모터 DNA, 인핸서 DNA 및 폴리아데닐화 신호 서열 DNA에 작동 가능하게 연결되어, 표적 세포에서 기능하여 유전자 카세트를 형성한다. 유전자 카세트는 또한 포유류 세포에서 발현되는 경우, RNA 전사체의 가공을 용이하게 하기 위해 인트론 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, rAAV(예를 들어, rAAV9) 게놈은 척수 및 뇌 외상/손상, 뇌졸중 및 뇌암을 포함하는 신경계 손상과 함께 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병을 포함하지만 이에 제한되지 않는 신경퇴행성 장애의 치료를 위한 영양 또는 보호 인자를 인코딩한다. 공지된 신경계 성장 인자의 비-제한적 예는 신경 성장 인자(NGF), 뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF), 뉴로트로핀(neurotrophin)-3(NT-3), 뉴로트로핀-4/5(NT-4/5), 뉴로트로핀-6(NT-6), 섬모 신경 영양 인자(CNTF), 신경교 세포주 유래 신경 영양 인자(GDNF), 섬유아세포 성장 인자 패밀리(예를 들어, FGF 1-15), 백혈병 억제 인자(LIF), 인슐린-유사 성장 인자 패밀리의 특정 구성원(예를 들어, IGF-1), 뉴르투린(neurturin), 페르세핀(persephin), 골 형성 단백질(BMP), 이뮤노필린(immunophilin), 성장 인자의 형질전환 성장 인자(TGF) 패밀리, 뉴레굴린(neuregulin), 표피 성장 인자(EGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 혈관 내피 성장 인자 패밀리(예를 들어, VEGF 165), 폴리스타틴(follistatin), Hif1 및 기타를 포함한다. 또한 일반적으로 본원에서 고려되는 각 영양 또는 보호 인자를 조절하는 아연 핑거 전사 인자가 고려된다. 추가의 구현예에서, 신경-면역 기능을 조절하는 방법은, 예를 들어 siRNA, shRNA, 안티센스, 또는 miRNA에 의한 신경 보호를 위한 NFkB 또는 NFkB 억제(NFkB의 이중 작용 및 상이한 세포 유형에서의 관련된 경로)를 통한 미세아교세포 및 성상세포 활성화의 억제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 것으로 고려된다. 또 다른 구현예에서, rAAV(예를 들어, rAAV9) 게놈은 아폽토시스(apoptosis) 억제제(예를 들어, bcl2, bclxL)를 인코딩한다. 축삭 성장 억제제의 저해제(예를 들어, Nogo의 저해제, 문헌[Oertle et al., The Journal of Neuroscience, 23(13):5393-5406(2003)]) 또는 영양 인자 또는 척수 손상 조절 단백질을 인코딩하는 rAAV(예를 들어, rAAV9)의 사용이 또한 척수 손상 치료를 위해 고려된다.
파킨슨병과 같은 신경퇴행성 장애의 치료를 위해, rAAV(예를 들어, rAAV9) 게놈은 다양한 구현예에서 방향족 산 도파 데카복실라제(AADC), 티로신 하이드록실라제, GTP-사이클로하이드롤라제 1(gtpch1), 아폽토시스 억제제(예를 들어, bcl2, bclxL), 신경교 세포주 유래 신경 영양 인자(GDNF), 억제성 신경 전달물질-아미노 부티르산(GABA), 또는 도파민 생합성에 관여하는 효소를 인코딩한다. 추가의 구현예에서, rAAV(예를 들어, rAAV9) 게놈은 예를 들어 파킨(Parkin) 및/또는 시누클레인(synuclein)의 변형제를 인코딩할 수 있다.
알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 장애의 치료를 위해, 일부 구현예에서, 아세틸콜린 생성을 증가시키는 방법이 고려된다. 일부 구현예에서, 콜린 아세틸트랜스퍼라제(ChAT)의 수준을 증가시키거나, 아세틸콜린 에스테라제(AchE)의 활성을 억제하는 방법이 고려된다.
rAAV(예를 들어, rAAV9) 게놈은 일부 구현예에서, 헌팅턴병과 같은 신경퇴행성 장애를 치료하기 위한 돌연변이 헌팅턴 단백질(htt) 발현을 감소시키는 방법에 사용하기 위한 siRNA, shRNA, 안티센스 및/또는 miRNA를 인코딩한다.
rAAV(예를 들어, rAAV9) 게놈은 다양한 구현예에서 ALS와 같은 신경퇴행성 장애의 치료에 사용하기 위한 siRNA, shRNA, 안티센스 및/또는 miRNA를 인코딩한다. 치료는 TNF-α 산화 질소, 퍼옥시니트라이트(peroxynitrite) 및/또는 산화 질소 합성효소(NOS)와 같은 질병의 분자 마커의 발현을 감소시킨다.
일부 구현예에서, 벡터는 ALS 또는 파킨슨병에 대한 GDNF 또는 IGF1과 같은 신경 영양 인자 또는 ALS를 위한 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase)(SOD, 예를 들어, SOD-1)와 같은 돌연변이된 단백질에 관한 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 인코딩한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 물질은 ALS의 치료에 사용될 수 있다. ALS는 뇌 및 척수에서 운동 뉴런이 점진적으로 손실되는 신경퇴행성 질병으로, 증상에는 말하고, 먹고, 움직이고, 결과적으로 호흡하는 능력의 상실이 포함된다. 이 질병은 일반적으로 진단 후 3년 내지 5년 이내에 사망한다. ALS 원인의 90% 내지 95%의 원인은 공지되어 있지 않지만, ALS의 하위세트는 돌연변이가 독성 우성 기능성 획득을 유발하는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD1) 유전자의 유전적 돌연변이에 의해 유발된다. 마우스 연구에 따르면 SOD1 녹아웃은 질병을 유발하지 않는 것으로 나타나므로, 돌연변이 SOD1 수준을 녹다운시키는 요법은 질병 증상을 완화시키는 것으로 여겨진다.
일부 구현예에서, AAV 벡터는 ALS에 대한 SOD1을 표적화하는 shRNA를 인코딩한다. SOD1에 대한 shRNA를 인코딩하는 예시적인 AAV, 예를 들어 scAAV9 작제물은 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 제 WO2015031392호 및 제 US2016272976호에 제공되어 있다. 일부 구현예에서, SOD1에 대한 shRNA를 인코딩하는 AAV 작제물은 본원에 개시된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 AAV 작제물은 ALS를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, SOD1 AAV는 10% 미만, 예를 들어, 7%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만의 빈 캡시드를 나타낸다. 일부 구현예에서, SOD1 AAV는 소량의 잔여 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 DNA, 플라스미드 DNA, 및/또는 내독소, 예를 들어 AAV 벡터의 제조 및 정제를 위해 본원에 논의된 수준을 나타낸다.
본원에 사용되는 바와 같이, "AVXS-301"은 scAAV9 벡터의 비-제한적인 예이며, 즉 항-인간 SOD1 shRNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, pSOD1sh), 변형된 AAV2 ITR, 인간 H1 프로모터 및 비변형된 AAV2 ITR을 포함한다. 변형 및 비변형 ITR은 항-인간 SOD1 shRNA 발현 카세트에 대해 임의의 방향(즉, 5' 또는 3')일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "pSOD1sh" 벡터 플라스미드는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1(SOD1) 유전자의 발현을 표적화하는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 즉, 항-SOD1 shRNA 카세트를 포함하고, 카세트는 아데노-연관 바이러스 역위 말단 반복(ITR) 서열에 측접하며, 예를 들어 pSOD1sh를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 "좌측" 및 "우측"에 존재한다. 일부 구현예에서, pSOD1sh를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 인간 SOD1 mRNA를 특이적으로 표적화하는 짧은 헤어핀 RNA로 전사된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 ITR 서열은 천연, 변이체 또는 변형된 AAV2 ITR 서열이다. 일부 구현예에서, ITR은 pSOD1sh를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 측접한다. 일부 구현예에서, 2개의 ITR 서열은 천연, 변이체 또는 변형된 AAV2 ITR 서열 둘 모두이다. 일부 구현예에서, "좌측" ITR은 자기 상보성 게놈의 생성을 가능하게 하는 변형된 AAV2 ITR 서열이고, "우측" ITR은 천연 AAV2 ITR 서열이다. 일부 구현예에서, "우측" ITR은 자기 상보성 게놈의 생성을 가능하게 하는 변형된 AAV2 ITR 서열이고, "좌측" ITR은 천연 AAV2 ITR 서열이다. 일부 구현예에서, pSOD1sh 벡터는, 예를 들어 Myslinksi(문헌[Myslinkski et al. "An unusually compact external promoter for RNA polymerase III transcription of the human H1RNA gene". Nucleic Acids Research, 29(12):2502-2509])에 의해 기재된 바와 같이 인간 H1 RNA 프로모터의 절편을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, pSOD1sh 벡터는 발현 카세트의 크기를 증가시키기 위해 랜덤 플라스미드 골격의 절편으로부터 제조된 고유한 선전 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, pSOD1sh 벡터는 항-인간 SOD1 shRNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 변형된 AAV2 ITR, 인간 H1 프로모터, 및 비변형된 AAV2 ITR을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 물질은 레트 증후군과 같은 신경 발달 장애의 치료에 사용될 수 있다. 레트 증후군은 90% 내지 95%의 경우 X 염색체에서 MECP2 유전자의 돌연변이로 인해 유아기에서 처음 인식되는 드문 신경계 장애이다. 문헌[Ruthie et al., "Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2". Nature Genetics, 23:185-188]. X 염색체의 카피를 하나만 갖는 남성은 일반적으로 출생 직후 사망하나, 2개의 X 염색체 카피를 갖는 여성은 일반적으로 하나의 기능성 유전자 카피를 갖는다. 이들은 6개월 내지 18개월 사이에 증상이 나타나기 시작하며, 손 비틀림 또는 오그라듬, 박수치기, 문지르기, 씻기 또는 손을 입으로 가져가는 행동과 같은 특징적인 증상이 나타난다. 이 질병은 자폐증과 유사한 행동, 호흡 불규칙성, 음식 섭취 및 연하 곤란, 성장 지연 및 발작을 포함할 수 있는 상당한 장애로 진행된다. MECP2 유전자의 200개의 돌연변이가 공지되어 있으며, X 불활성화 및 투여량 보상 수준에 따라, 질병의 중증도는 환자마다 크게 상이하다. 마우스 연구에 따르면 MECP2 돌연변이는 뉴런의 사멸을 초래하지 않으며, 이는 신경퇴행성 질병이 아님을 시사한다. 문헌[Guy et al, "Reversal of Neurological Defects in a Mouse Model of Rett Syndrome". Science, 315(5815)"1143-1147].
레트 증후군과 관련된 구현예에서, rAAV(예를 들어, rAAV9) 게놈은 예를 들어 메틸 시토신 결합 단백질 2(MeCP2)를 인코딩할 수 있다. MeCP2를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 예시적인 AAV, 예를 들어 scAAV9 작제물은 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제 9,415,121호에 제공되어 있다. 일부 구현예에서, MeCP2를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV 작제물은 본원에 개시된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 이들 AAV 작제물은 레트 증후군을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, MeCP2 AAV는 10% 미만, 예를 들어, 7%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만의 빈 캡시드를 나타낸다. 일부 구현예에서, MeCP2 AAV는 소량의 잔여 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 DNA, 플라스미드 DNA, 및/또는 내독소, 예를 들어 AAV 벡터의 제조 및 정제를 위해 본원에 논의된 수준을 나타낸다.
본원에 사용되는 바와 같이, "AVXS-201"은 scAAV9 벡터의 비-제한적인 예이며, 즉 MECP2 cDNA 발현 카세트, 변형된 AAV2 ITR, 쥣과동물 Mecp2 프로모터, 변형된 SV40 인트로, 최소 폴리아데닐화 신호, 및 비변형된 AAV2 ITR을 포함한다. 변형 및 비변형 ITR은 MECP2 cDNA 발현 카세트에 대해 임의의 방향(즉, 5' 또는 3')일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "pMECP2" 벡터 플라스미드는 MECP2 단백질, 변형된 AAV2 ITR, 쥣과동물 Mecp2 프로모터, 변형된 SV40 인트로, 최소 폴리아데닐화 신호, 및 비변형된 AAV2 ITR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, pMECP2는 MECP2 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 즉 MECP2 cDNA 발현 카세트를 포함하는 벡터 작제물이고, 카세트는 아데노-연관 바이러스 역위 말단 반복(ITR) 서열, 예를 들어, MECP2 유전자를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 "좌측" 및 "우측"에 측접한다. 일부 구현예에서, MECP2를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 인간 MECP2 서열, 예를 들어, 천연 발생 인간 MECP2 서열 또는 그의 이소폼, 변이체 또는 돌연변이체이다. 일부 구현예에서, ITR 서열은 천연, 변이체, 또는 변형된 AAV ITR 서열이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 ITR 서열은 천연, 변이체 또는 변형된 AAV2 ITR 서열이다. 일부 구현예에서, 2개의 ITR 서열은 천연, 변이체 또는 변형된 AAV2 ITR 서열 둘 모두이다. 일부 구현예에서, "좌측" ITR은 자기 상보성 게놈의 생성을 가능하게 하는 변형된 AAV2 ITR 서열이고, "우측" ITR은 천연 AAV2 ITR 서열이다. 일부 구현예에서, "우측" ITR은 자기 상보성 게놈의 생성을 가능하게 하는 변형된 AAV2 ITR 서열이고, "좌측" ITR은 천연 AAV2 ITR 서열이다. 일부 구현예에서, pMECP2 벡터는 마우스 Mecp2 프로모터의 절편을 추가로 포함하지만, 전체를 포함하는 것은 아니다. 일부 구현예에서, pMECP2 벡터는 시미안 바이러스 40(SV40) 인트론을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, pMECP2 벡터는, 예를 들어, 문헌[Levitt et al., "Definition of an efficient synthetic poly(A) site". Genes & Development, 3:1019-1025]에 규정된 바와 같은 최소 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 rAAV 게놈은 AAV rep 및 cap DNA가 부재한다. rAAV 게놈의 AAV DNA(예를 들어, ITR)는 AAV 혈청형 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10 및 AAV-11을 포함하지만 이에 제한되지 않고, 재조합 바이러스가 유래할 수 있는 임의의 AAV 혈청형으로부터 유래할 수 있다. AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오타이드 서열은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, AAV-1의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_002077에 제공되고; AAV-2의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC 001401 및 문헌[Srivastava et al., Virol., 45: 555-564 {1983)]에 제공되고: AAV-3의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_1829에 제공되고; AAV-4의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_001829에 제공되고; AAV-5 게놈은 GenBank 수탁 번호 AF085716에 제공되고; AAV-6의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_00 1862에 제공되고; AAV-7 및 AAV-8 게놈의 적어도 일부분은 각각 GenBank 수탁 번호 AX753246 및 AX753249에 제공되고; AAV-9 게놈은 문헌[Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388(2004)]에 제공되고; AAV-10 게놈은 문헌[Mol. Ther., 13(1): 67-76(2006)]에 제공되고; AAV-11 게놈은 문헌[Virology, 330(2): 375-383(2004)]에 제공된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "pSMN" 벡터 플라스미드는 SMN 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 즉, SMN cDNA 발현 카세트를 포함하고, 카세트는 아데노-연관 바이러스 역위 말단 반복(ITR) 서열, 예를 들어, SMN 유전자를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 "좌측" 및 "우측"에 측접한다. 일부 구현예에서, SMN을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 인간 SMN 서열, 예를 들어, 천연 발생 인간 SMN 서열 또는 그의 이소폼, 변이체 또는 돌연변이체이다. 일부 구현예에서, ITR 서열은 천연, 변이체, 또는 변형된 AAV ITR 서열이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 ITR 서열은 천연, 변이체, 또는 변형된 AAV2 ITR 서열이다. 일부 구현예에서, 2개의 ITR 서열은 천연, 변이체, 또는 변형된 AAV2 ITR 서열 둘 모두이다. 일부 구현예에서, "좌측" ITR은 자기 상보성 게놈의 생성을 가능하게 하는 변형된 AAV2 ITR 서열이고, "우측" ITR은 천연 AAV2 ITR 서열이다. 일부 구현예에서, "우측" ITR은 자기 상보성 게놈의 생성을 가능하게 하는 변형된 AAV2 ITR 서열이고, "좌측" ITR은 천연 AAV2 ITR 서열이다. 일부 구현예에서, pSMN 플라스미드는 CMV 인핸서/닭 베타-액틴("CB") 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, pSMN 플라스미드는 시미안 바이러스 40(SV40) 인트론을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, pSMN 플라스미드는 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화(폴리A) 종결 신호를 추가로 포함한다. 상기 논의된 하나 이상의 성분에 사용될 수 있는 예시적인 서열은 하기 표 1에 제시되어 있다. 일부 구현예에서, 하기 표 1에 제시된 모든 서열이 사용된다. 일부 구현예에서, "AVXS-101"은 표 1의 모든 서열을 사용하고, 용어 pSMN의 범위 내에 속하는 벡터 작제물의 비-제한적 예이다.
일부 구현예에서, pSMN 벡터는 SMN cDNA 발현 카세트, 변형된 AAV2 ITR, 닭 베타-액틴(CB) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시/초기 인핸서, 변형된 SV40 후기 16s 인트론, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호, 및 비변형된 AAV2 ITR을 포함할 수 있다. 변형 및 비변형 ITR은 SMN cDNA 발현 카세트에 대해 임의의 방향(즉, 5' 또는 3')일 수 있다.
일부 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 제조 공정 동안 벡터 작제물 서열은 예를 들어 AAV9 비리온으로 포획된다. 이들 구현예에서, 포획은 안정한 기능성 전이유전자, 예를 들어 완전한 기능성 인간 SMN 전이유전자, MECP2 전이유전자, 또는 항-SOD1 shRNA를 전달할 수 있는 비 복제 재조합 AAV9 캡시드 내에서 이루어진다. 일부 구현예에서, 캡시드는 예를 들어 VP2 및 VP3이 모두 공통 C 말단 서열을 갖는 VP1의 2개의 절단된 형태가 되도록 하는 교대 스플라이싱에 의해 생성된 1:1:10의 비율의 60개의 바이러스 단백질(VP1, VP2, VP3)로 구성된다. 일부 구현예에서, 제조 방법의 산물, 예를 들어 약물 산물은 안정한 완전 기능성 인간 SMN 전이유전자, MECP2 전이유전자, 또는 항-SOD1 shRNA를 전달하기 위해 비 복제 재조합 AAV9 캡시드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 캡시드는 VP2 및 VP3이 모두 공통 C 말단 서열을 갖는 VP1의 2개의 절단된 형태가 되도록 하는 교대 스플라이싱에 의해 생성된 1:1:10의 비율의 60개의 바이러스 단백질(VP1, VP2, VP3)로 구성된다.
일부 구현예에서, 기능성 바이러스 벡터의 양은 적합한 시험관내 세포 분석 또는 생체내 동물 모델을 사용하여 측정되는 바와 같은 기능성 vg/mL의 %에 의해 결정된다. 예를 들어, 기능성 AAV SMN의 %는 SMA, 예를 들어 SMAΔ7 마우스의 동물 모델을 사용하는 상대 효능 또는 적절한 세포주, 예를 들어 SMAΔ7 마우스의 피질로부터 단리된 1차 신경 전구체 세포(NPC)를 사용한 정량적 세포-기반 분석에 의해 분석될 수 있다. 기능성 AAV MeCP2의 %는 적합한 시험관내 세포 분석 또는 생체내 동물 모델, 예를 들어 Mecp2 녹아웃 마우스를 사용하여 분석될 수 있다. 기능성 AAV SOD1의 %는 적합한 시험관내 세포 분석 또는 생체내 동물 모델, 예를 들어 SOD1 돌연변이 마우스를 사용하여 분석될 수 있다.
예시적인 벡터 작제물, 예를 들어, AVXS-101의 DNA 서열은 표 1에 기재되어 있다.
Figure pct00002
또 다른 양태에서, AVXS-101 벡터 작제물의 DNA 서열은 SEQ ID NO: 1에 제공된다:
Figure pct00003
일부 구현예에서, pSMN 플라스미드에 의해 인코딩되는 SMN 단백질의 아미노산 서열은 다음을 포함한다:
Figure pct00004
일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질 VP1, VP2, VP3은 동일한 전사체로부터 유래된다. 이들은 대안적 개시 부위가 존재하지만, 카복시 말단을 공유한다. 아래에서, VP1 특이적 아미노산 서열은 흑색 불드체로 표시되어 있다. VP1 및 VP2에 공통적인 아미노산 서열은 밑줄친 이탤릭체로 표시되어 있다. 3개의 캡시드 단백질 모두에 공통적인 아미노산은 볼드체의 이탤릭체로 표시되어 있다.
Figure pct00005
일 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 3에 제시된 아미노산 서열을 인코딩하는 전사체로부터 유래된다.
또 다른 양태에서, rAAV 게놈을 포함하는 DNA 플라스미드가 본원에 개시된다. DNA 플라스미드는 rAAV 게놈을 AAV9 캡시드 단백질을 갖는 감염성 바이러스 입자로 어셈블리하기 위해 AAV의 헬퍼 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, E1-결실된 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스)로의 감염이 가능한 세포로 전달된다. 패키징될 AAV 게놈, rep 및 cap 유전자, 및 헬퍼 바이러스 기능이 세포에 제공되는 rAAV 입자를 생성하는 기법은 당업계의 표준이다. 일부 구현예에서, rAAV의 생성은 단일 세포 내에 존재하는 다음의 성분(본원에서 패키징 세포로 표시됨)을 포함한다: rAAV 게놈, rAAV 게놈과 별개의(즉, 그 내부에 존재하지 않는) AAV rep 및 cap 유전자, 및 헬퍼 바이러스 기능. 위형 rAAV의 생성은, 예를 들어 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 제 WO 01/83692호에 개시되어 있다. 다양한 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 재조합 벡터의 전달을 향상시키기 위해 변형될 수 있다. 캡시드 단백질에 대한 변형은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 그 개시 전문이 본원에 참조로 포함되는 제 US 2005/0053922호 및 제 US 2009/0202490호를 참조한다.
rAAV 생성의 일반적인 원리는 예를 들어, 문헌[Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539; and Muzyczka, 1992, CUM Topics in Microbial. and Immunol., 158:97-129). Various approaches are described in Ratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984); Hennonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963 (1988); and Lebkowski et al., 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). Samulski et al. (1989, J. Virol., 63:3822-3828)]; 미국 특허 제 5,173,414호; 제 WO 95/13365호 및 해당 미국 특허 제 5,658,776호; 제 WO 95/13392호; 제 WO 96/17947호; 제 PCT/US98/18600호; 제 WO 97/09441호 (제 PCT/US96/14423호); 제 WO 97/08298호 (제 PCT/US96/13872호); 제 WO 97/21825호 (제 PCT/US96/20777호); 제 WO 97/06243호 (제 PCT/FR96/01064호); 제 WO 99/11764호; 문헌[Perrin et al. (1995) Vaccine 13:1244-1250; Paul et al. (1993) Human Gene Therapy 4:609-615; Clark et al. (1996) Gene Therapy 3:1124-1132]; 미국 특허 제 5,786,211호; 미국 특허 제 5,871,982호; 및 미국 특허 제 6,258,595호에서 검토한다. 전술된 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함되며, rAAV 생성과 관련된 문헌의 이들 섹션이 특히 강조된다.
패키징 세포를 생성하는 예시적인 방법은 AAV 입자 생성에 필요한 모든 성분을 안정적으로 발현하는 세포주를 생성하는 것이다. 예를 들어, AAV rep 및 cap 유전자가 부재하는 rAAV 게놈, rAAV 게놈과는 별개의 AAV rep 및 cap 유전자, 및 네오마이신 저항성 유전자와 같은 선택 마커를 포함하는 플라스미드(또는 다중 플라스미드)를 세포의 게놈 내로 혼입시킨다. GC 꼬리 생성(문헌[Samulski et al., 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081]), 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 포함하는 합성 링커의 첨가(문헌[Laughlin et al., 1983, Gene, 23:65-73])와 같은 절차 또는 직접 평활 말단 결찰(문헌[Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666])에 의해 박테리아 플라스미드에 AAV 게놈을 도입시켰다. 이어서 패키징 세포주를 아데노바이러스와 같은 헬퍼 바이러스에 감염시킨다. 이 방법의 장점은 세포를 선택할 수 있고, rAAV의 대규모 생성에 적합하다는 것이다. 적합한 방법의 다른 예는 플라스미드 이외의 아데노바이러스 또는 바큘로바이러스를 사용하여, rAAV 게놈 및/또는 rep 및 cap 유전자를 패키징 세포에 도입하는 것이다.
따라서, 본원의 개시는 다양한 구현예에서 감염성 rAAV를 생성하는 패키징 세포를 제공한다. 패키징 세포는 현탁액에서 배양된 비 부착 세포 또는 부착 세포일 수 있다. 일 구현예에서, HeLa 세포, HEK 293 세포 및 PerC.6 세포(동족 293 세포주)와 같은 임의의 적합한 패키징 세포주가 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 세포주는 HEK 293 세포이다.
바이러스 벡터 생성 수율을 증가시키기 위해, 배양 플라스크에 대한 부착성을 향상시키기 위해 부착 세포를 배양하고, 선택할 수 있다. 일부 구현예에서, 후속 생물반응기 시딩 단계 동안 형질감염 효율 및 세포 수를 향상시킨다. 계대배양 동안, 당업계에 공지된 방법에 의해 세포를 세포 배양 표면으로부터 분리시킬 수 있다. 예를 들어, 긁어내거나, 프로테아제를 포함하는 용액에서 인큐베이션함으로써 세포를 부유시킬 수 있다. 예시적인 구현예에서, HEK293 세포를 PBS로 세척하고, 실온에서 약 2분 동안 트립신으로 분리시킬 수 있다. 혈청을 포함하는 성장 배지를 첨가함으로써 분리를 중지시킬 수 있고, 현탁액의 반복 피펫팅(pipetting)에 의해 세포 덩어리를 분리시킬 수 있다. 이어서 세포 현탁액을 펠릿화할 수 있고, 단리된 펠릿을 적합한 완전 성장 배지에 재현탁시킬 수 있다. 이어서 세포를 새로운 세포 배양 챔버에 시딩하여 부착시킬 수 있다. 세포 배양 배지를 성장 배지로 완전히 교체하기 전에, 일정 시간 후 표면에 부착되지 않은 세포를 세포 배양 배지로 가벼운 흡인에 의해 제거할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포가 부착되는 기간은 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간 또는 약 7시간일 수 있다. 세포가 확장되면, 배양 플라스크에 강하게 부착된 세포의 분율을 증가시키기 위해 공정을 반복할 수 있다. 일부 구현예에서, 공정을 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 5회 또는 임의의 적합한 횟수로 반복한다. 예시적인 구현예에서, HEK293 세포를 75 cm2 플라스크에 시딩하고, 37℃ 인큐베이터에서 4시간 동안 부착시킨 후, 약하게 부착된 세포를 흡인 및 세포 배양 배지를 교체함으로써 제거한다. 예시적 구현예에서, 강하게 부착된 세포를 선택하는 공정을 3회의 세포 배양 계대배양에 대해 반복한다.
다른 구현예에서, rAAV9(즉, 감염성 포획 rAAV9 입자)는 본원에 개시된 rAAV 게놈을 포함한다. 일 양태에서, rAAV 게놈은 자기 상보성 게놈이다.
또 다른 양태에서, "rAAV SMN"으로 명명된 rAAV9와 같은 rAAV가 제공된다. 일부 구현예에서, rAAV SMN 게놈은 제1 AAV2 ITR, 사이토메갈로바이러스 인핸서를 갖는 닭-β 액틴 프로모터, SV40 인트론, SMN을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 소 성장 호르몬으로부터의 폴리아데닐화 신호 서열, 및 제2 AAV2 ITR을 서열 내에 갖는다. 일부 구현예에서, SMN을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어 GenBank 수탁번호 MN_000344.2, Genbank 수탁번호 NM_017411 또는 임의의 다른 적합한 인간 SMN 이소형에 제시되거나 그로부터 유래된 인간 SMN 유전자이다. 예시적 SMN 서열은 다음의 서열을 포함한다:
Figure pct00006
SMN DNA의 보존적 뉴클레오타이드 치환이 또한 고려된다(예를 들어, GenBank 수탁번호 NM_000344.2의 위치 625에서 구아닌에서 아데닌으로의 변화). 일부 구현예에서, 게놈에는 AAV rep 및 cap DNA가 부재하며, 즉 게놈의 ITR 사이에 AAV rep 또는 cap DNA가 존재하지 않는다. 고려되는 SMN 폴리펩타이드는 NCBI 단백질 데이터베이스 번호 NP_000335.1에 제시된 인간 SMN1 폴리펩타이드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 구현예에서, SMN DNA는 인간 SMN 폴리펩타이드(예를 들어, Uniprot 수탁번호 Q16637, 이소형 1(Q16637-1)에 의해 확인되는 인간 SMN 단백질)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 또한, SMN1-변형제 폴리펩타이드 plastin-3(PLS3)(문헌[Oprea et al., Science 320(5875): 524-527(2008)])이 고려된다. 다른 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열로 SMN DNA를 치환할 수 있다.
형질감염 전, 세포를 적합한 배양 배지, 플라스크 또는 적합한 생물반응기, 또는 둘 모두에서 확장시킨다. 일부 구현예에서, 세포를 세포 배양 배지의 연속 순환을 제공하는 생물반응기에서 확장시킬 수 있다. 일 구현예에서, 세포를 200 m2, 333 m2, 또는 500 m2 iCELLis 생물반응기에서 확장시킨다. 하나의 배양 배지는 5% 내지 10% FBS, 4.5 g/L 글루코스, 4 mM L-글루타민을 포함하는 DMEM이다. 일부 구현예에서, 재순환 배지 백에서 부착 세포를 배지에 첨가하고, 생물반응기를 통해 순환시킨다. 일부 구현예에서, 세포 배양 배지 또는 임의의 다른 배지를 연동 펌프를 사용하여 생물반응기를 통해 연속적으로 재순환시킨다. 세포를 배양 및 형질감염을 위해 플라스크 또는 생물반응기에 적합한 밀도로 시딩할 수 있다. 시딩 밀도는 세포 유형 및 형질감염까지의 시간의 폭에 따라 달라질 수 있다. 일부 구현예에서, 세포를 약 8000 내지 16000 세포/cm2로 시딩한다. 일 구현예에서, HEK293 세포를 8000 내지 12,000 세포/cm2로 시딩한다.
형질도입된 세포의 대상체로의 형질도입 및 재도입에 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일 구현예에서, 예를 들어 적절한 배지 중에서 세포를 rAAV와 조합하고, 선택 마커를 사용하거나, 서던 블롯 및/또는 PCR과 같은 통상적인 기법을 사용하여 대상 DNA를 보유하는 세포를 스크리닝함으로써 세포를 시험관내에서 형질도입시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 패키징 세포주를 3개의 플라스미드로 형질감염시킨다: AAV 벡터 내에 패키징될 벡터 서열(예를 들어, pSMN, pMECP2 전이유전자 또는 pSOD1sh), pHELP 및 pAAV2/9를 인코딩하거나 포함하는 플라스미드. 전기천공, 예컨대 리포펙타민(lipofectamine), 양이온성 중합체 및 양이온성 지질에 의한 리포펙션(lipofection)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 기법을 사용하여 형질감염을 수행할 수 있다. 임의의 적합한 형질감염 배지를 사용할 수 있다. 형질감염 공정의 일 구현예에서, 부착 인간 배아 신장(HEK293) 세포를 삼중 DNA 플라스미드 폴리에틸렌이민(PEI) 공침전으로 형질감염시킨다. 일 구현예에서, 대규모 부착 세포 생물반응기에서 PEI 공침전을 사용하여 부착 HEK293 세포에 의한 삼중 DNA 플라스미드 형질감염을 사용하여 scAAV9.CB.SMN 벡터(CB 프로모터 및 SMN을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 자기 상보성 AAV9 벡터)를 생성한다. 일 구현예에서, 세포 확장에 사용되는 DMEM 성장 배지를 변형된 DMEM 형질감염 배지로 교체한다. 이 배지는 칼슘과 L-글루타민의 부재 하에 제형화된 것이다. 일 구현예에서, 형질감염 배지는 FBS, 칼슘, L 글루타민 및 4.5 g/L 글루코스가 부재하는 DMEM이다. 일부 구현예에서, 무혈청 (예를 들어, FBS가 부재하는) 형질감염 배지는 형질감염 효능을 향상시킨다. 일 구현예에서, 형질감염 배지는 OptiMEM(Invitrogen/Thermo Fisher)이다. 일 구현예에서, 3개의 플라스미드(pSMN, pHELP 및 pAAV2/9)를 형질감염 배지 중 PEI와 함께 혼합하여, 반응시킨다. 일부 구현예에서, 3개의 플라스미드를 약 1:1:1 몰비로 함께 혼합한다. 일부 구현예에서, 플라스미드 및 PEI를 DNA:PEI의 1:1 중량비로 혼합한다. 일부 구현예에서, 플라스미드 및 PEI를 DNA:PEI의 1:1 중량비로 혼합한다. 일 구현예에서, pSMN, pHELP 및 pAAV2/9를 OptiMEM 배지에서 1:1:1 몰비로 혼합한다. 이러한 구현예에서, DNA:PEI가 1:1 중량이 되도록 PEI를 첨가한다. 일부 구현예에서, 0분 내지 60분, 또는 10분 내지 45분, 또는 20분 내지 30분 동안 반응이 이루어지도록 한다. 일 구현예에서, 15분 내지 30분 동안 반응이 이루어지도록 한다.
일 구현예에서, 본 개시는 AAV 기반 바이러스 벡터를 제조하기 위한 방법을 제공하고, 이는 (i) 산업 규모 생물반응기에서 부착 HEK293 세포를 배양하는 단계, (2) 60분 미만 동안 플라스미드로 부착 세포를 형질감염시켜, AAV 벡터를 생성시키고, 선택적으로 추가적 처리, 정제, 제형화 및 충전 단계를 적용하여, 약제학적 산물을 생성하는 단계를 포함한다. 이 공정의 일 구현예에서, scAAV9.CB.SMN 벡터를 폴리에틸렌이민("PEI") 공침전을 사용한 삼중 DNA 플라스미드 형질감염을 사용하여 생성한다. 일 구현예에서, 이 형질감염에 사용된 3개의 플라스미드는 pSMN, pAAV2/9 및 pHELP이다.
패키징 세포주를 DNA-PEI 공침전물과 접촉시킴으로써 형질감염을 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, 형질감염 배지 중 DNA-PEI 공침전물을 배지 재순환 백에 충전한다. 일부 구현예에서, 형질감염 배지 중 DNA-PEI 공침전물을 생물반응기 내로 순환시키고, 성장 배지를 완전히 교체한다. 일부 구현예에서, 형질감염 배지 중 DNA-PEI 공침전물을 생물반응기에서 부착 세포와 접촉시킨다. 일부 구현예에서, 형질감염 배지 중 DNA-PEI 공침전물을 생물반응기에서 부착 세포와 최대 2시간 동안 접촉시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 형질감염은 1시간 내지 2시간 동안 이루어진다. 일부 구현예에서, 형질감염은 1시간 미만, 예를 들어 10분, 20분, 30분, 40분 또는 50분 동안 이루어진다. 일부 구현예에서, 형질감염은 1시간 내지 2시간 동안 이루어진다. 일부 구현예에서, 생물반응기를 통해 완전 성장 배지를 재순환시키고 형질감염 배지를 완전히 교체시킴으로써 형질감염을 중지시킨다.
2. 확장된 바이러스 입자의 수확
형질감염 후 적합한 세포 확장 기간 후, 일부 구현예에서, 세포를 용해시키고, 바이러스 입자를 수확한다. 일부 구현예에서, 세포를 반응기로부터 분리시킨 후, 세포 용해 공정을 개시시킨다. 일부 구현예에서, 세포를 인시튜 용해시킨다. 선택적으로, 바이러스 입자를 용해 단계없이 수확한다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제를, 예를 들어 생물반응기 내로 최종 표적 농도로 첨가하여, 순환시킨다. 엔도뉴클레아제는 DNA 및 RNA 둘 모두를 분해하는 것일 수 있다. 일 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 Benzonase®(EMD Millipore)라는 상표명으로 판매되는 Serratia marcescens(문헌[Eaves, G. N. et al. J. Bact. 1963, 85, 273-278; Nestle, M. et al. J. Biol. Chem. 1969, 244, 5219-5225])로부터의 유전자 조작 엔도뉴클레아제이다. pNUC1 생성 플라스미드를 포함하는 균주 K12의 돌연변이체인 E. 콜라이(E. coli) 균주 W3110으로부터 효소를 생성하고, 정제한다(본원에 그 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 제 5,173,418호). 구조적으로, 단백질은 2개의 주요 이황화 결합을 갖는 동일한 245개의 아미노산의 약 30 kDa 하위단위의 이량체이다. Benzonase®는 모든 형태의 DNA 및 RNA(단일 가닥, 이중 가닥, 선형 및 원형)를 분해하고, 광범위한 작동 조건에서 핵산을 5'-모노포스페이트 종결 올리고뉴클레오타이드 2개 내지 5개의 염기 길이로 분해하는데 효과적이다. Benzonase®는 현재 우수 제조 관행(cGMP)에 따라 생성되므로, 단백질 및/또는 바이러스 입자의 정제를 위해 산업 규모 공정에 사용될 수 있다. cGMP 조건 하에서 생성된 다른 엔도뉴클레아제도 마찬가지로 본 출원에 개시된 정제 방법에 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 벤조나제를 생물반응기에 50 U/ml 내지 200 U/ml, 예를 들어, 75 U/ml 내지 150 U/ml, 예를 들어, 약 100 U/mL의 최종 농도로 첨가한다. 일부 구현예에서, 벤조나제의 첨가는 생물반응기에서 높은 vg 생성을 가능하게 하면서 숙주 세포 DNA를 상당히 감소시킨다.
일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제가 혼합되도록 한 후, 용해 완충액을 반응기에 첨가한다. 일부 구현예에서, 최대 1시간, 최대 2시간, 최대 3시간, 최대 4시간 또는 최대 5시간 동안 부착 세포와 세포 용해 용액이 혼합되도록 한다. 일부 구현예에서, 용해 완충액은 적합한 완충액 중에 염화마그네슘 및/또는 Tween-20을 포함할 수 있다. 예시적인 구현예에서, 용해 완충액은 pH 8.0의 500 mM HEPES, 10% Tween 20, 20 mM MgCl2이다. 벤조나제 반응을 퀀칭(quenching)시키는 염 수크로스 용액(SSS)을 첨가하여 용해 반응을 중지시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 세정 완충액을 포함하는 수확 백에 SSS를 첨가하고, 15분 동안 혼합시킨다. 일부 구현예에서, 생물반응기를 생물반응기 세정 완충액으로 세정하고, 이어서 퀀칭된 세포 용해 용액 및 용해된 세포 내용물과 함께 수확 수집 백에 세정물을 수집하고, 이들 모두는 함께 대량 수확물을 포함한다. 일부 구현예에서, 생물반응기 세정 완충액은 트리스, MgCl2, NaCl, Tween-20 및 수크로스를 포함할 수 있다. 예시적인 구현예에서, 생물반응기 세정 완충액은 pH 8.1의 20 mM Tris, 1 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 1% Tween-20 w/v 및 1% 수크로스 w/v를 포함한다.
3. 바이러스 입자의 정제
수확 후, 통상적으로 여과를 통해 대량 수확 바이러스 입자를 농축하고, 정제할 수 있다. 일 구현예에서, 바이러스 입자를 심층 여과에 의해 여과한 후, 대형 분자 오염물 및 세포 잔해를 제거하지만, 벡터 게놈이 통과할 수 있는 필터, 예를 들어 0.45 μm 필터를 통해 여과한다. 임의의 적합한 심층 필터를 사용할 수 있다.
당업계에서 이해되는 바와 같이, 심층 여과는, 이러한 조건 하에 빠르게 막히는 막 여과와 비교하여, 상당한 양의 대형 입자(예를 들어, 온전한 세포 또는 세포 잔해)를 포함하는 용액을 정화하는 다공성 필터 배지의 사용을 지칭한다. 다양한 기공 크기의 다양한 심층 여과 배지는 Millipore, Pall, General Electric, 및 Sartorious와 같은 다양한 제조업체에서 시판되고 있다.
심층 여과를 위한 표적 유속을 감소시켜, 필터 입구 압력을 사양 내로 유지할 수 있다. 모든 대량 수확물이 여과되면, 특정 구현예에서, 심층 필터를 후속의 제1 접선 유동 여과 단계("TFF1")에 사용되는 투석여과 완충액으로 처리할 수 있다. 심층 필터 풀을 혼합한다. 이어서 심층 필터 풀을 0.45 μm 필터를 통해 여과하여 대량 수확 물질을 추가로 정화할 수 있다. 그런 다음 0.45 μm 필터를 TFF1 완충액으로 처리한다.
4. 접선 유동 여과
다양한 구현예에서, 접선 유동 여과를 사용하여, 대량 수확물을 농축하고, 예를 들어 접선 유동 여과를 사용하여 염 및 단백질을 제거한다. 접선 유동 여과(TFF)(또한 교차 유동 여과 CFF로 지칭됨)는 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 광범위한 상황에서의 구현을 위한 장비 및 프로토콜은 Pall Corporation, Port Washington, NY 및 Spectrum Labs, Rancho Dominguez, CA를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 제조업체로부터 시판되고 있다. 일반적으로, TFF는 막 표면을 통한 보유물의 재순환을 포함할 수 있다. 이 가벼운 교차 유동 공급물은 특정 구현예에서 막 오염을 최소화하고, 높은 여과 속도를 유지하며, 높은 산물 회수율을 제공할 수 있다. 일 구현예에서, TFF 단계는 본원에 예시된 바와 같이 평 시트 시스템으로 구현될 수 있다. 시스템에 바이러스 입자에 대한 과도한 전단력을 방지하기 위한 수단(예를 들어, 개방 유동 채널)이 제공되는 평 시트 시스템을 대규모 생성에 사용할 수 있다. 대안적으로, TFF 단계는 본원에 예시된 바와 같이 중공 섬유 시스템으로 구현될 수 있다. 일 구현예에서, TFF 시스템의 분자량 컷오프(MWCO)는 200 kDa 내지 400 kDa, 예를 들어 약 300 kDa이다.
일 구현예에서, TFF1 단계는 300 kDa MW 컷오프 재생 셀룰로스 막 카세트를 사용하여 수행된다. 카세트를 NaOH 용액으로 플러싱(flushing)하고, 살균하고, TFF1 완충액으로 평형화시킨다. 일 구현예에서, TFF1 완충액은 pH 8.1의 20 mM Tris, 1 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 1% 수크로스를 포함한다.
일부 구현예에서, 정화된 수확물의 부피를 약 10x 감소시키기 위해 TFF1 단계의 농축 단계를 선택한다. 표적 보유물 부피에 도달하면, 투석여과 수행을 개시할 수 있다. 일부 구현예에서, 보유물을 약 6 투석부피의 TFF1 완충액으로 투석여과할 수 있다. 일부 구현예에서, 보유물을 약 5 내지 20, 또는 10 내지 15, 또는 12 투석부피의 TFF1 완충액으로 투석여과한다. 6 투석부피의 총 투과 유량이 달성되면, 보유물을 다시 농축시키고 수확할 수 있다. 막의 세정, 예를 들어, 2회 연속 세정을 수행하여, 중간체 약물 물질의 산물 회수를 증가시킬 수 있다.
5. 중간체 산물
일부 구현예에서, 중간체 약물 물질을 드라이아이스 또는 냉동고에서 동결시킨 후, -60℃ 이하의 저장고로 운반할 수 있다. 다른 구현예에서, 중간체 산물을 하류 공정 전에 동결시킬 필요가 없다.
일부 구현예에서, 추가의 처리(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 하류 공정에 의한 정제)를 위해 다수의 중간체 산물 물질 항목번호를 함께 풀링한다. 다수의 중간체 산물 물질 항목번호를 풀링한 후, 동결 및 저장할 수 있다. 다른 구현예에서, 동결 및 저장된 항목번호를 해동한 후, 다수의 중간체 산물 물질 항목번호를 풀링할 수 있다.
하류 공정
일부 구현예에서, 하류 공정을 사용하여, 중간체 산물(예를 들어, 풀링된 중간체 산물)을 여과된 약물 물질로 처리한다. 일부 구현예에서, 하류 공정 단계는 정제된 AAV 입자가 약제학적으로 허용 가능한 담체에 현탁된 여과 약물 물질을 생성하기 위해, (a) 산성화 및 정화(예를 들어, 여과 사용), (b) 양이온 교환 크로마토그래피, (c) 접선 유동 여과("TFF2"), (d) CsCl 초원심분리 (e) 바이러스 벡터의 수집 및 (f) 추가 접선 유동 여과("TFF3")를 포함한다. 일부 구현예에서, 하류 공정은 TFF1 중간체의 생성 후 후속 제조 단계를 포함한다: TFF1 중간체의 해동 및 풀링, 산성화 및 정화, 양이온 교환 크로마토그래피(CEX), 접선 유동 여과(TFF2), 충전/빈 캡시드 분리를 위한 CsCl 초원심분리, 농축/완충액 교환을 위한 접선 유동 여과(TFF3), 약물 물질을 생성하기 위한 TFF 3 풀 물질 여과, 약물 산물을 생성하기 위한 약물 물질의 희석 및 여과, 약물 산물의 저장 및 약물 산물의 바이알로의 충전.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 하류 공정을 사용하여, 본원에 기재된 바와 같이 AAV SMN, AAV MECP2, 또는 SOD1을 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 AAV를 포함하는 중간체를 처리할 수 있다.
1. 중간체의 산성화 및 정화
중간체가 동결된 구현예에서, TFF1 중간체 물질을 해동함으로써 하류 공정을 개시한다. 세제, 예를 들어 Tween 20을 사용하여, 산성 pH 하에서 대량의 숙주 세포 단백질 및 DNA의 응집을 촉진시킬 수 있다. 이어서 세제를 포함하는 TFF1 중간체의 pH를 감소시킬 수 있다. pH가 감소되는 경우, 심층 필터 및 대형 분자 오염물 및 세포 잔해를 제거하지만, 벡터 게놈이 통과할 수 있는 필터, 예를 들어 0.45 μm 필터를 통해 용액을 여과함으로써 형성된 응집물 및 침전물을 제거할 수 있다. 임의의 적절한 심층 필터를 사용할 수 있다.
일 구현예에서, 10% 내지 20% Tween 20의 최종 농도를 달성하기 위해 TFF1 중간체 용액에 Tween 20을 서서히 첨가한다. 일부 구현예에서, Tween 20을 첨가한 후의 표적 조성물은 pH 8.1의 20 mM Tris, 1 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 1% 수크로스 m/v 중 36% Tween 20 용액이다. 일부 구현예에서, Tween 20을 약 1시간 내지 6시간의 기간 동안 서서히 첨가한다. 일부 구현예에서, Tween 20을 3시간 내지 6시간 동안 서서히 첨가한다. 일부 구현예에서, Tween 20을 4시간 동안 서서히 첨가한다. 일부 구현예에서, Tween 20/TFF1 중간체 용액을 실온에서 밤새 인큐베이션한다. 일부 구현예에서, Tween 20/TFF1 중간체 용액을 실온에서 8시간 내지 20시간 동안 인큐베이션한다. 예시적인 구현예에서, Tween 20/TFF1 중간체 용액을 실온에서 12시간 내지 20시간 동안 인큐베이션한다.
인큐베이션 후, 임의의 적합한 산을 첨가함으로써 TFF1 중간체를 포함하는 Tween 20의 pH를 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 1 M 글리신 pH 2.5를 첨가하여, 3.5 ± 0.1의 표적 pH를 달성한다. 일부 구현예에서, 표적 pH는 pH 3.0 내지 4.0, 약 pH 3.3 내지 3.7, 약 pH 3.4 내지 3.6, 또는 약 pH 3.5이다. pH가 허용 가능한 범위 내에 있으면, 용액을 임의의 크기 필터에 통과시킬 수 있다. 예시적인 실시예에서, 0.45 μm 필터(예를 들어, Opticap XL10 Durapore 필터) 또는 0.8/0.45 μm PES 필터에 의한 일련의 심층 필터(예를 들어, Clarisolve POD)가 사용된다.
2. 양이온 교환 크로마토그래피
다양한 구현예에서, 양이온 교환(CEX) 포획 크로마토그래피 단계를 사용하여, 예를 들어 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 DNA, 숙주 세포 지질, Tween 20 및 다른 공정 관련 불순물로부터 바이러스 캡시드를 분리한다. 양이온 교환 크로마토그래피의 원리는 당업계에 잘 공지되어 있지만, 요약하면, 이 방법은 단리시킬 양으로 하전된 입자와 사용된 음으로 하전된 수지 사이의 전하-전하 상호작용에 의한다. 일반적으로, 우선, pH 및 전도도가 안정화될 때까지 소수의 투석부피의 완충액을 통과시킴으로써 컬럼을 평형화시킨다. 이어서 샘플을 로딩하고, 컬럼을 로딩 완충액으로 세척한다. 마지막으로, 용리 완충액을 사용하여 대상 샘플을 컬럼 밖으로 용리시키고, 샘플을 포함하는 분획을 수집한다. 용리액의 광학 흡광도 측정에 의해 대상 샘플의 존재를 검출할 수 있다.
일 구현예에서, CEX 단계는 CIMmultus S03-8000 고급 복합 컬럼(술포닐)(2 μm 기공) 크로마토그래피 컬럼을 사용한다. 일 구현예에서, OD280의 급격한 상승에서 시작하여, 용리 피크를 수집한다. 전도도가 80 mS/cm 내지 85 mS/cm 사이일 때 OD280이 상승하기 시작한다. CEX 용리액을 통상적인 절차에 따라 수집할 수 있고, 2개의 분획으로 수집할 수 있다. 일 구현예에서, 제1 분획은 OD280의 급격한 상승에서 시작하여, 1.5 수집 부피(CV)로 수집한다. 또 다른 구현예에서, 제2 분획은 제1 분획 직후에 시작하여 1.0 CV로 수집한다. 2개의 분획을 풀링한 후 pH 8.0 ± 0.30으로 중화시킨다. 일 구현예에서, 중화 완충액은 20℃에서 1.0 M Tris pH 9.1 ± 0.1을 포함한다.
3. 접선 유동 여과 2
일부 구현예에서, 접선 유동 여과 단계(TFF2)를 사용하여, 단백질 불순물을 농축시키고, 단백질 불순물을 제거하고, 후속 CsCl 초원심분리 단계를 위해 완충액을 적절한 완충액으로 교체한다. 임의의 적합한 TFF 막이 사용될 수 있다. 일 구현예에서, TFF2 단계는 300kD MWCO 재생 셀룰로스 막을 사용한다.
일부 구현예에서, 이 단계의 농축 단계는 CEX 용리액의 부피를 감소시키기 위해 설계된 것이다. 일 구현예에서, 보유물을 투석여과 완충액으로 2배로 희석시키고, 보유물을 초기 부피로 농축시킨다. 일 구현예에서, 투석여과 완충액은 20℃에서 pH 8.1 ± 0.1의 20 mM Tris, 2 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 0.2% 폴록사머 188, 1% 수크로스를 포함하는 TFF2 NaCl 투석여과 완충액이다. 이러한 구현예에서, 새로운 완충액에 의한 투석여과가 완료될 때까지 이 공정을 반복할 수 있다. 일 구현예에서, 보유물을 CsCl-포함 투석여과 완충액으로 2배 희석하고, 보유물을 초기 부피로 농축시킨다. 일 구현예에서, CsCl-포함 투석여과 완충액은 20℃에서 pH 8.1 ± 0.1의 20 mM Tris, 2 mM MgCl2, 3 M CsCl, 0.2% 폴록사머 188을 포함하는 TFF2 CsCl 투석여과 완충액이다. 이러한 구현예에서, 새로운 완충액에 의한 투석여과가 완료될 때까지 이 공정을 반복할 수 있다. CsCl 투석여과가 완료되면, 이어서 보유물을 시스템 보유 부피에 따라 소정의 부피로 농축시킬 수 있다. 일부 구현예에서, TFF2 시스템으로부터의 산물 회수를 최대화하기 위해 막의 세정, 예를 들어 2회 연속 세정을 수행한다.
4. CsCl 초원심분리
생체내 유전자 형질도입에 AAV가 사용되는 일부 구현예에서, rAAV의 최종 산물은 최소 불순물 및 빈 입자를 포함할 수 있다. AAV 벡터를 정제하기 위한 2가지 방법은 요오딕사놀 구배 또는 CsCl 구배를 사용하는 초원심분리이다. 2가지 방법을 비교한 한 연구에 따르면 요오딕사놀은 벡터 순도가 높은 AAV 벡터를 생성했지만, CsCl과 비교하여 빈 바이러스 캡시드가 더 많았다. 문헌[Strobel et al. "Comparative Analysis of Cesium Chloride- and Iodixanol-Based Purification of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors for Preclinical Applications". Human Gene Therapy Methods, 26(4):147-157]. CsCl을 사용하면 빈 바이러스 캡시드의 양이 감소하지만, CsCl은 세포에 유독하고, 잔여 CsCl을 제거하기 위해 다수의 정제 단계가 필요할 수 있으며, 요오딕사놀과 같은 더 단기간의 방법과 비교하여(약 1일), 처리 시간이 길어진다(약 3.5일). 다른 연구에 따르면 잔여 CsCl을 제거하기 위한 많은 단계가 종종 rAAV의 급격한 손실을 초래하여, 수율 및 회수율이 감소하여, 종종 이 방법의 다른 이점을 제거하는 것으로 나타났다. 문헌[Hermens et al. "Purification of Recombinant Adeno-Associated Virus by Iodixanol Gradient Ultracentrifugation Allows Rapid and Reproducible Preparation of Vector Stocks for Gene Transfer in the Nervous System". Human Gene Therapy, 10:1885-1891]. 또한, 이 2가지 방법은 전임상 샘플을 생성하기 위해 실험실에서 잘 수행되지만, 이는 규모를 확장할 수 없으므로, 상업적 산물의 대규모 생성에는 적합하지 않다. 예를 들어, 문헌[Tomono et al., "Ultracentrifugation-free chromatography-mediated large-scale purification of recombinant adeno-associated virus serotype 1 (rAAV1)". Molecular Therapy - Methods & Clinical Development, 3:15058 ("purification methods using cesium chloride (CsCl) or iodixanol density ultracentrifugation are not suitable for large-scale production")]을 참조한다.
일부 구현예에서, 초원심분리 단계를 사용하여, 예를 들어, 충전 캡시드로부터 빈 캡시드를 분리한다. 예상치 못하게, 본원에 개시된 CsCl 초원심분리 방법은 규모 확장 가능하고, 정제된 AAV 벡터의 대규모 생성에 적합하였다. 초원심분리는 분석 초원심분리에 의해 수행될 수 있고, 구배 완충액의 사용을 포함할 수 있다. 구배 완충액의 예는 CsCl, 수크로스, 요오딕사놀 및 당업계에 공지된 다른 것들을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 원심분리는 적절한 중력에 도달할 수 있는 임의의 원심분리기, 예를 들어 자동 Optima XPN 100 초원심분리 시스템 또는 50.2 Ti 로터 또는 균등한 로터가 장착된 균등한 시스템에서 수행할 수 있다. 초원심분리 후, 빈 캡시드 및 충전 캡시드는 튜브 내에서 상이한 밴드로 분리되고, 특정 밴드로부터 물질을 추출함으로써 추출될 수 있다. 일부 구현예에서, TFF2-정제 여과 물질을 241,600 g 내지 302,000 g(50.2 Ti 로터에서 약 40,000 rpm 내지 50,000 rpm)에서 원심분리한다. 일부 구현예에서, TFF2-정제 여과 물질을 밤새 원심분리한다. 일부 구현예에서, TFF2-정제 여과 물질을 16시간 내지 24시간 동안 원심분리한다. 일부 구현예에서, TFF2-정제 여과 물질은 20시간 내지 24시간 동안 원심분리한다. 일부 구현예에서, TFF2-정제 여과 물질을 15℃ 내지 25℃에서 원심분리한다. 일 구현예에서, TFF2-정제 여과 물질을 20℃에서 17시간 동안 302,000 g(50.2 Ti 로터에서 50,000 rpm)으로 원심분리한다. 일부 구현예에서, CsCl 원심분리를 위한 완충액은 다음 구성요소 중 하나 이상을 가질 수 있고, 이는 (a) CsCl을 포함하고, (b) MgCl2, (c) 폴록사머 188 및 (d) Tris 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, CsCl에 대한 완충액은 (a), (b), (c) 및 (d) 모두를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, CsCl에 대한 완충액은 pH 7.5 내지 8.5 또는 pH 7.9 내지 8.2이다. 일 구현예에서, CsCl 원심분리에 적합한 완충액은 pH 8.1 ± 0.10의 20 mM Tris, 2 mM MgCl2, 3 M CsCl, 0.2% 폴록사머 188이다. 원심분리 단계가 완료된 후, 튜브를 초원심분리기로부터 제거할 수 있다. 일부 구현예에서, 최상부 밴드, 밴드 A는 빈 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 다음 최상부 밴드, 밴드 B, C 및 D는 충전 캡시드 이중 밴드를 포함한다. 일부 구현예에서, 주사기를 사용하여 AAV 바이러스 벡터를 수집한다. 일 구현예에서, 밴드 B, C 및 D를 밴드 D 바로 아래에서 튜브의 중간까지 삽입된 30 mL 주사기에 부착된 18 G 바늘에 의해 제거한다. 다른 구현예에서, 당업계에 공지되고/되거나, 본원에 기재된 바와 같은 기법을 사용하여 충전 캡시드 또는 빈 캡시드의 존재에 대해 밴드를 분석할 수 있고, 충전 캡시드를 포함하는 밴드를 수집할 수 있다.
표준 실험 기법에 의해 비어있거나 비어있지 않은 바이러스 캡시드의 비율을 측정할 수 있다. 일부 구현예에서, 광학 흡광도 측정에 의해 측정을 수행한다. 일부 구현예에서, UV 흡광도 측정에 의해 측정을 수행한다. 일부 구현예에서, UV 흡광도 측정으로부터 캡시드 단백질의 총량 및 DNA의 총량을 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, 광학 굴절률 측정에 의해 측정을 수행한다. 일부 다른 구현예에서, 분석 초원심분리에 의해 측정을 수행한다.
일 구현예에서, 초원심분리 후에 수집된 AAV 바이러스 벡터는 8% 미만 빈 캡시드, 7% 미만 빈 캡시드, 5% 미만, 3% 미만, 또는 1% 미만을 갖는다. 일 구현예에서, 초원심분리 후에 수집된 AAV 바이러스 벡터는 1% 내지 10% 빈 캡시드를 갖는다. 일 구현예에서, 초원심분리 후에 수집된 AAV 바이러스 벡터는 2% 내지 8% 빈 캡시드를 갖는다. 일 구현예에서, 빈 캡시드의 수는 검출 한계 미만이다. 또 다른 구현예에서, 빈 캡시드의 백분율은 총 캡시드의 백분율로서 결정된다.
5. 여과된 약물 물질을 생성하기 위한 접선 유동 여과 3
일부 구현예에서, CsCl을 제거하고, 완전한 벡터 캡시드를 농축하기 위해, 접선 유동 여과 단계(TFF3)가 사용된다. 접선 유동 여과는 적합한 막을 사용하여 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 300 kDa MWCO 재생 셀룰로스 막이 사용된다. 벡터 캡시드는 막에 보유될 수 있다. TFF3 수행의 농축 단계는 잔여 CsCl의 농도 및 초원심분리 풀의 부피를 감소시키기 위해 설계될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 보유물 부피에 도달하면, 투석여과를 개시한다. 보유물을 최대 10 투석부피의 적합한 TFF3 완충액으로 투석여과한다. 일 구현예에서 적합한 TFF3 완충액은 (a) Tris, (b) MgCl2, (c) NaCl, 또는 (d) 폴록사머 188을 포함하는 성분 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 적합한 TFF3 완충액은 (a), (b), (c) 및 (d) 전체를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, TFF3 완충액은 pH 7.5 내지 8.5, pH 7.7 내지 8.3, 또는 pH 8.0이다. 일 구현예에서 적합한 TFF3 완충액은 20℃에서 pH 8.0 ± 0.1의 20 mM Tris, 1 mM MgCl2, 200 mM NaCl, 0.001% 폴록사머 188을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 적합한 TFF3 완충액은 20℃에서 pH 8.0 ± 0.1의 20 mM Tris, 1 mM MgCl2, 200 mM NaCl, 0.005% 폴록사머 188을 포함한다. 일 구현예에서, 0.2 μm Pall Supor® EKV 멸균 등급 필터(Mini Kleenpak) 필터를 사용하여 농축 보유물을 여과하여, 여과 약물 물질을 생성한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 제조 배치당 5 x 1015 vg, 또는 8 x 1015 vg 초과 또는 1 x 1016 vg 초과의 rAAV를 생성한다.
약제학적 조성물
본원에 개시된 방법에 따라 정제된 바이러스(예를 들어, AAV) 입자는 인간 대상체에 투여될 수 있는 충분한 순도로 고수율로 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 약 1 내지 8 x 1013 바이러스 벡터 게놈/mL(vg/mL), 또는 약 1.7 내지 2.3 x 1013 vg/mL의 농도로 제형화된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 약 1.9 내지 2.1 x 1013 vg/mL의 농도로 제형화된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 약 2.0 x 1013 vg/mL의 농도로 제형화된다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 생성 공정 동안, 핵산 물질을 포함하지 않는 빈 바이러스 캡시드가 생성될 수 있다. 소량의 빈 바이러스 캡시드를 포함하는 약제학적 조성물은 치료 효과없이 불필요하게 항원 물질(빈 캡시드, 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 DNA)에 미성숙 면역 시스템에 환자, 예를 들어 유아가 노출되는 것을 방지하므로, 유리할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 약제학적 조성물은 잠재적 주입 반응을 감소시키거나, 면역 반응의 범위를 증가시키고, 치료 효능을 개선시킬 수 있다. 게놈 물질을 갖는 충전 바이러스 캡시드와 비교하여, 빈 캡시드는 상이한 밀도를 가지므로, 2개의 종류가 구배 원심분리 또는 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 빈 캡시드는 초원심분리에 의해 분리된다. 일부 구현예에서, 빈 캡시드는 CsCl 구배 초원심분리에 의해 분리된다. 다른 구현예에서, 빈 캡시드는 요오딕사놀 구배 초원심분리에 의해 분리된다. 일부 구현예에서, 빈 캡시드는 수크로스 구배 초원심분리에 의해 분리된다.
비어있거나 비어있지 않은 바이러스 캡시드의 비율을 표준 실험 기법에 의해 측정할 수 있다. 일부 구현예에서, 이 비율을 광 흡광도 측정에 의해 측정한다. 일부 구현예에서, 이 비율을 UV 흡광도 측정에 의해 측정한다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질의 총량 및 DNA의 총량을 UV 흡광도 측정에 의해 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, 광학 굴절률 측정에 의해 측정을 결정한다. 일부 다른 구현예에서, 분석 초원심분리에 의해 측정을 결정한다.
높은 수준의 빈 캡시드는 바이러스 벡터 처리의 효능에 대한 과제를 제기할 수 있다. 일 구현예에서, 약제학적 조성물은 10% 미만 빈 캡시드, 8% 미만 빈 캡시드, 7% 미만, 약 5% 미만, 3% 미만, 1% 미만 빈 캡시드를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 1% 내지 10% 빈 캡시드를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 2% 내지 8% 빈 캡시드를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 6% 이하의 빈 캡시드, 5% 빈 캡시드, 4% 빈 캡시드, 3% 빈 캡시드, 2% 이하의 빈 캡시드를 갖는다. 일 구현예에서, 빈 캡시드의 수는 검출 한계 미만이다. 또 다른 구현예에서, 빈 캡시드의 백분율은, 예를 들어, AUC를 사용하여, 총 캡시드의 백분율로서 결정된다. 일부 구현예에서, 이러한 낮은 백분율의 빈 캡시드는, 예를 들어, 높은 백분율의 빈 캡시드를 갖는 조성물과 비교하여, 환자에 투여한 후 치료 효능을 개선시키고/시키거나, 부작용(예를 들어, 염증 반응, 간 손상)을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바이러스 벡터를 제조하는 방법은 선행 방법, 예를 들어 부착 세포를 사용하지 않는 방법 및/또는 본원에 기재된 정제 방법의 수준과 비교하여 이러한 개선된 백분율의 빈 캡시드를 제공한다.
바이러스 벡터의 생성 공정 동안, 바이러스 벡터를 생성하기 위해 사용되는 부착 세포(예를 들어, HEK293 세포)로부터의 잔여 단백질은 완전히 분리되지 않을 수 있다. 잔여 숙주 세포 단백질은 면역 반응을 유발할 가능성이 있다. 잔여 숙주 세포의 양은 바이러스 캡시드 단백질과 잔여 숙주 세포 단백질을 구별할 수 있는 임의의 표준 실험 기법에 의해 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 잔여 숙주 세포 단백질의 양은 크기 배제 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 측정은 모체 세포-특이적 항체에 의한 웨스턴 블롯에 의해 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 잔여 숙주 세포 단백질의 양은 효소 연결 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 잔여 숙주 세포 단백질의 양은 시판 ELISA 키트에 의해 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 잔여 숙주 세포 단백질의 양은 Cygnus Technologies HEK293 HCP ELISA 키트에 의해 측정될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 약제학적 조성물 중 잔여 숙주 세포 단백질은 1 X 1013 vg/ml당 5 X 106 pg/ml 이하, 1 X 1013 vg/mL당 1.2 X 106 pg/ml 이하 또는 1 X 1013 vg/ml당 1 X 105 pg/ml 내지 1 X 1013 vg/ml당 1.2 X 106 pg/ml 또는 1 X 1013 vg/ml당 40 ng/ml 이하이다. 일 구현예에서, 약제학적 조성물은 1.0 x 1013 vg당 5 이하, 4, 3, 2, 1 ng 이하의 잔여 숙주 세포 단백질을 포함한다. 일 구현예에서, 약제학적 조성물은 1.0 x 1013 vg당 4 ng 이하의 잔여 숙주 세포 단백질을 포함한다.
바이러스 벡터의 생성 과정 동안, 부착 세포(예를 들어, HEK293 세포)로부터의 잔여 숙주 세포 DNA 또는 바이러스 벡터를 생성하기 위해 형질감염된 잔여 플라스미드 DNA는 완전히 제거되지 않을 수 있다. 정제 공정(예를 들어, 산성화, 정화, 접선 유동 여과 등)은 잔여 숙주 세포 또는 플라스미드 DNA를 제거한다. 일 구현예에서, 잔여 숙주 세포 또는 플라스미드 DNA의 양의 측정은 PCR에 의해 수행된다. 또 다른 구현예에서, 잔여 숙주 세포 또는 플라스미드 DNA의 양의 측정은 숙주 세포 또는 플라스미드 서열에 특이적인 프라이머에 의한 정량적 PCR(qPCR)에 의해 수행된다. 또 다른 구현예에서, 잔여 숙주 세포 또는 플라스미드 DNA의 양의 측정은 디지털 액적 PCR(ddPCR)에 의해 수행된다. 일 구현예에서, 플라스미드 DNA의 양은 플라스미드의 카나마이신 저항성 유전자 영역에 특이적인 프라이머에 의한 qPCR 분석을 사용하여 결정된다. 또 다른 구현예에서, 잔여 숙주 세포 DNA의 양은 시판 qPCR 분석 키트, 예를 들어 ThermoFisher에 의한 resDNASEQⓒ 인간 잔여 DNA 정량화 키트, Biorad에 의한 잔여 DNA 정량화 슈퍼믹스, 또는 임의의 균등한 산물에 의해 결정된다. 잔여 숙주 세포 또는 플라스미드 DNA의 양을 감소시키면 치료 결과를 개선할 수 있고, 이러한 조성물을 본원에 개시된 치료에 사용하기 위해 정제하고/하거나, 선택할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 약제학적 조성물 중 잔여 숙주 세포 DNA는 1 X 1013 vg/ml당 1.7 X 106 pg/ml 이하, 1 X 1013 vg/ml당 1 X 105 pg/ml 내지 1 X 1013 vg/ml당 1.2 X 106 pg/ml이다. 일 구현예에서, 상기 약제학적 조성물 중 잔여 숙주 세포 DNA는 1.0 x 1013 vg당 3 x 105 이하, 2 x 105, 1.1 x 105, 1 x 105 pg 이하이다. 구현예에서, 상기 약제학적 조성물 중 잔여 숙주 세포 DNA는 1.0 x 1013 vg당 1.1 x 105 pg 이하이다.
또 다른 구현예에서, 상기 약제학적 조성물 중 잔여 플라스미드 DNA는 1 X 1013 vg/ml당 1.7 X 106 pg/ml 이하, 1 X 1013 vg/ml당 1 X 105 pg/ml 내지 1 X 1013 vg/ml당 1.7 X 106 pg/ml이다. 또 다른 구현예에서, 상기 약제학적 조성물 중 잔여 플라스미드 DNA는 1.0 x 1013 vg당 6.8 x 105 pg 이하이다.
일 구현예에서, 약제학적 조성물 중 잔여 숙주 세포 DNA는 1.0x1013 vg당 1.1x105 pg 이하이고 상기 약제학적 조성물 중 잔여 플라스미드 DNA는 1.0 x 1013 vg당 6.8 x 105 pg 이하이다.
일 구현예에서, 약제학적 조성물 중 잔여 숙주 세포 DNA는 1.0 x 1013 vg당 1.1 x 105 pg 이하이고, 상기 약제학적 조성물 중 잔여 플라스미드 DNA는 1.0 x 1013 vg당 6.8 x 105 pg 이하이며, 상기 약제학적 조성물 중 잔여 숙주 세포 단백질은 1.0 x 1013 vg당 4 ng 이하이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물 중 내독소의 양은 1.0x1013 vg/mL당 약 1 EU/mL 미만, 1.0x1013 vg/mL당 약 0.75 EU/mL 미만, 1.0x1013 vg/mL당 약 0.5 EU/mL 미만, 1.0x1013 vg/mL당 약 0.4 EU/mL 미만, 1.0x1013 vg/mL당 약 0.35 EU/mL 미만, 1.0x1013 vg/mL당 약 0.3 EU/mL 미만, 1.0x1013 vg/mL당 약 0.25 EU/mL 미만, 1.0x1013 vg/mL당 약 0.2 EU/mL 미만, 1.0x1013 vg/mL당 약 0.15 EU/mL 미만, 1.0x1013 vg/mL당 약 0.1 EU/mL 미만, 1.0x1013 vg/mL당 약 0.05 EU/mL 미만, 또는 1.0x1013 vg/mL당 약 0.02 EU/mL 미만이다. 내독소의 양을 결정하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 리물루스 아모에보사이트 용해물(limulus amoebocyte lysate)(LAL) 시험이 있다. 구현예에서, 내독소는 미국 약전("USP") 85(그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 따라 분석된다.
일 구현예에서, 약제학적 조성물 중 소 혈청 알부민(BSA)은 1.0 x 1013 vg당 0.5 ng 미만, 1.0 x 1013 vg당 0.3 ng 미만, 또는 1.0 x 1013 vg당 0.22 ng 미만이다. 일 구현예에서, 상기 약제학적 조성물 중 벤조나제는 1.0 x 1013 vg당 0.2 ng 미만, 1.0 x 1013 vg당 0.1 ng 미만, 또는 1.0 x 1013 vg당 0.09 ng 미만이다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 약제학적 조성물은 다음 중 하나 이상을 포함한다: 1.0x1013 vg당 약 0.09 ng 미만의 벤조나제, 약 30 μg/g(ppm) 미만의 세슘, 약 20 ppm 내지 80 ppm의 폴록사머 188, 1.0x1013 vg당 약 0.22 ng 미만의 BSA, 1.0x1013 vg당 잔여 플라스미드 DNA의 약 6.8x105 pg 미만, 1.0x1013 vg당 잔여 hcDNA의 약 1.1x105 pg 미만, 1.0x1013 vg당 약 4 ng 미만의 rHCP, pH 7.7 내지 8.3, 약 390 mOsm/kg 내지 430 mOsm/kg, 용기당 25 μm 이상의 크기의 약 600개 미만의 입자, 용기당 10 μm 이상의 크기의 약 6000개 미만의 입자, 약 1.7 x 1013 내지 2.3 x 1013 vg/mL 게놈 역가, 1.0 x 1013 vg당 약 3.9 x 108 내지 8.4 x 1010 IU의 감염 역가, 1.0 x 1013 vg당 약 100 μg 내지 300 μg의 총 단백질, 약 7.5 x 1013 vg/kg 투여량의 바이러스 벡터에 의한 △7SMA 마우스의 24일 이상의 중앙값 생존율, 시험관내 세포-기반 분석을 기반으로 한 약 70% 내지 130%의 상대 효능, 및/또는 약 5% 미만의 빈 캡시드.
일 구현예에서 본원에 개시된 약제학적 조성물은 다음 중 하나 이상, 예를 들어 전체를 포함한다: pH 7.7 내지 8.3(예를 들어, USP <791>에 의해 측정된 바와 같음), 약 390 mOsm/kg 내지 430 mOsm/kg(예를 들어, USP <785>에 의해 측정된 바와 같음), 용기당 25 μm 이상의 크기의 약 600개 미만의 입자(예를 들어, USP <787>에 의해 측정되는 바와 같음), 용기당 10 μm 이상의 크기의 약 6000개 미만의 입자(예를 들어, USP <787>에 의해 측정되는 바와 같음), 약 1.7 x 1013 내지 2.3 x 1013 vg/mL 게놈 역가, 1.0 x 1013 vg당 약 3.9 x 108 내지 8.4 x 1010 IU의 감염 역가, 1.0 x 1013 vg당 약 100 μg 내지 300 μg의 총 단백질, 약 7.5 x 1013 vg/kg 투여량의 바이러스 벡터에 의한 △7SMA 마우스의 24일 이상의 중앙값 생존율, 예를 들어, 생체내 기능성 시험에서, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이, 시험관내 세포-기반 분석을 기반으로 한 약 70% 내지 130%의 상대 효능, 및/또는 약 5% 미만의 빈 캡시드. 구현예에서, 본원에 개시된 약제학적 조성물은 95% 이상의 총 순도를 포함한다(예를 들어, SDS-PAGE에 의해 결정되는 바와 같음). 구현예에서, 본원에 개시된 약제학적 조성물은 2% 초과의 수준에서의 불명의 비 단일 관련 불순도를 포함한다(예를 들어, SDS-PAGE에 의해 결정되는 바와 같음). 구현예에서, 본원에 개시된 약제학적 조성물은 0.75 EU/mL 이하의 내독소 수준을 포함한다(예를 들어, USP <85>에 의해 측정되는 바와 같음). 구현예에서, 본원에 개시된 약제학적 조성물은 멸균성 시험에서, 예를 들어 USP <71>에 의해 측정되는 바와 같이 비 성장에 대해 시험된다.
높은 수준의 잔여 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 DNA, 플라스미드 DNA 및/또는 내독소는 바이러스 벡터 처리의 효능에 대한 과제를 제기할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 소량의 잔여 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 DNA, 플라스미드 DNA 및/또는 내독소는 예를 들어 더 많은 양을 갖는 조성물과 비교하여, 환자에 투여 후 치료 효능을 개선시키고/시키거나 부작용(예를 들어, 염증 반응, 간 손상)을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바이러스 벡터를 제조하는 방법은 선행 방법, 예를 들어 부착 세포를 사용하지 않는 방법 및/또는 본원에 기재된 정제 방법의 수준과 비교하여 이러한 개선된 수준을 제공한다. 일부 구현예에서, 본원의 방법은 또한 소량의 잔여 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 DNA, 플라스미드 DNA 및/또는 내독소 이외에 감소된 백분율의 빈 캡시드를 갖는 바이러스 벡터의 제조를 가능하게 한다.
일부 구현예에서, TFF, 예를 들어, 제2 TFF 후의 잔여 세슘의 양은 약 50 μg/g 미만이다. 일부 구현예에서, TFF, 예를 들어, 제2 TFF 후의 잔여 세슘의 양은 약 30 μg/g 미만이다. 일부 구현예에서, TFF, 예를 들어, 제2 TFF 후의 잔여 세슘의 양은 약 20 ug/g 미만이다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물 중 잔여 세šœ은 30 ug/g(ppm) 이하이다. 일부 구현예에서, 잔여 CsCl의 양은 질량 분광분석, 유도 결합 혈장 질량 분광분석(ICP-MS), 및/또는 또 다른 적합한 방법에 의해 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 TFF 후의 잔여 세슘의 양은, 예를 들어, ICP-MS를 사용한 경우, 정량화 한계 미만이다.
일부 구현예에서, 제2 TFF 후 수집된 AAV 바이러스 벡터의 농도는 약 5x1012 vg/ml 이상, 약 1x1013 vg/ml 이상, 또는 약 3x1013 vg/ml 이상이다.
일 구현예에서, 약제학적 조성물은 다음 중 하나 이상을 갖는다: 1.0x1013 vg당 0.09 ng 미만의 벤조나제, 30 μg/g(ppm) 미만의 세슘, 약 20 ppm 내지 80 ppm의 폴록사머 188, 1.0x1013 vg당 0.22 ng 미만의 BSA, 1.0x1013 vg당 6.8x105 pg 미만의 잔여 플라스미드 DNA, 1.0x1013 vg당 1.1x105 pg 미만의 잔여 hcDNA, 및 1.0x1013 vg당 4 ng 미만의 rHCP.
또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 기준 표준의 ± 20%, ± 15%, ± 10%, 또는 ± 5%의 효능을 보유한다. 일 구현예에서, 문헌[Foust et al., Nat. Biotechnol., 28(3), pp. 271-274 (2010)]의 방법을 사용하여, 기준 표준과 비교하여 효능을 평가한다. 임의의 적합한 기준 표준을 사용할 수 있다. 일 구현예에서, 약제학적 조성물은 SMAΔ7 마우스에 의해 시험된 바와 같이 생체내 효능을 갖는다. 일 구현예에서, 7.5x1013 vg/kg 투여량이 제공된 시험 마우스는 15일 초과, 20일 초과, 22일 초과 또는 24일 초과의 중앙값 생존율을 갖는다. 일 구현예에서, 약제학적 조성물은 세포-기반 분석에 의해 시험된 바와 같이, 기준 표준 및/또는 적합한 대조군과 비교하여 50% 내지 150%, 60% 내지 140% 또는 70% 내지 130%의 시험관내 상대 효능을 갖는다.
본 개시에 따라 정제된 바이러스 입자(예를 들어, 바이러스 입자)를 공지된 방법에 따라 제형화하여, 약제학적으로 유용한 조성물을 제조할 수 있다. 본 개시의 조성물은 당업계에 공지된 기법을 사용하여 포유류 대상체, 예를 들어 인간에 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 특히, 전달 시스템은 근육내, 피내, 점막, 피하, 정맥내, 척수내, 주사 가능한 데포형 장치(injectable depot type device) 또는 국소 투여용으로 제형화될 수 있다.
전달 시스템이 용액 또는 현탁액으로 제형화되는 경우, 전달 시스템은 허용 가능한 담체, 예를 들어 수성 담체 중에 존재한다. 물, 완충수, 0.8% 식염수, 0.3% 글리신, 히알루론산 등과 같은 다양한 수성 담체가 사용될 수 있다. 이들 조성물은 종래 널리 공지된 멸균 기법에 의해 멸균될 수 있거나, 멸균 여과될 수 있다. 생성된 수용액은 사용하기 위해 그대로 또는 동결건조하여 패키징될 수 있으며, 동결건조된 제조물을 투여 전에 멸균 용액과 조합한다.
조성물, 예를 들어, 약제학적 조성물은 생리학적 조건을 근사화하기 위한 약제학적으로 허용 가능한 보조제, 예컨대 pH 조정 및 완충제, 등장성 조정제, 습윤제 등, 예를 들어 아세트산나트륨, 락트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 등을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 보존제를 포함한다. 일부 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 보존제를 포함하지 않는다.
바이러스 벡터의 게놈 역가, 예를 들어 본원에 개시된 조성물 및 제형의 게놈 역가는 다수의 표준 방식으로 결정될 수 있다. 바이러스 벡터에 특이적인 프라이머에 의한 PCR은 상대 측정을 제공할 수 있지만, 정량적 PCR(qPCR)은 더 소량의 샘플 및 절대 측정에 사용될 수 있다. 액적 디지털 PCR(ddPCR)은 수-유 유제(water-oil emulsion) 액적 기술에 기반한 디지털 PCR을 수행하기 위한 방법이다. 샘플을 수만개의 액적으로 분별하고, 주형 분자의 PCR 증폭은 각 개별 액적에서 이루어진다. 표준 곡선을 작성하거나, 증폭 효율이 높은 프라이머에 의할 필요가 없으므로, ddPCR은 일반적으로 통상적인 PCR 기반 기법만큼 많은 샘플을 사용하지 않는다. 일 구현예에서, 바이러스 벡터의 게놈 역가는 PCR을 사용하여 결정된다. 또 다른 구현예에서, 바이러스 벡터의 게놈 역가는 qPCR을 사용하여 결정된다. 또 다른 구현예에서, 바이러스 벡터의 게놈 역가는 ddPC를 사용하여 결정된다. ddPCR을 사용하여 바이러스 게놈 역가를 결정하는 방법은 예를 들어 문헌[Lock et al., "Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR," Human Gene Therapy Methods, 25(2):115-125]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, PCR 기반 방법은 특이적으로 설계된 프라이머 및 SMN 유전자를 표적화하는 프로브를 사용하여 포획된 AAV9 바이러스 게놈을 검출하고, 정량화한다. 다른 구현예에서, PCR-기반 방법은 특이적으로 설계된 프라이머 및 닭 베타-액틴 프로모터를 표적화하는 프로브를 사용하여 포획된 AAV9 바이러스 게놈을 검출하고, 정량화한다. 다른 구현예에서, PCR-기반 방법은 특이적으로 설계된 프라이머 및 CMV 인핸서를 표적화하는 프로브를 사용하여 포획된 AAV9 바이러스 게놈을 검출하고, 정량화한다. 다른 구현예에서, PCR-기반 방법은 특이적으로 설계된 프라이머 및 ITR 서열을 표적화하는 프로브를 사용하여 포획된 AAV9 바이러스 게놈을 검출하고, 정량화한다. 다른 구현예에서, PCR-기반 방법은 특이적으로 설계된 프라이머 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호를 표적화하는 프로브를 사용하여 포획된 AAV9 바이러스 게놈을 검출하고, 정량화한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 pH 7.7 내지 pH 8.3이고, 390 mOsm/kg 내지 430 mOsm/kg의 삼투몰농도를 나타낸다. 일부 구현예에서, pH 측정기를 사용하여 pH를 측정한다. 일부 구현예에서, 미국 약전(USP), 예를 들어, <791>(그 전문이 참조로 포함됨)에 의해 설정된 표준에 따라 온도 보정된 미세 전극을 사용하여 전위차계로 pH를 측정한다. 일부 구현예에서, USP, 예를 들어, USP <785>(그 전문이 참조로 포함됨)에 따라 빙점 강하를 사용하여 삼투압을 측정한다. 일부 구현예에서, 증기압 억제 삼투압계를 사용하여 삼투압을 측정한다. 다른 구현예에서, 막 삼투압계를 사용하여 삼투압을 측정한다.
일 구현예에서, 정맥내 제형은 pH 7.5 내지 pH 8.5, 2 X 1013 vg/ml 내지 6 X 1013 vg/ml의 게놈 역가, 및 384 mOsm/kg 내지 448 mOsm/kg의 삼투몰농도를 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 정맥내 제형은 pH 7.5 내지 pH 8.5, 1.5 X 1013 vg/ml 내지 3.5 X 1013 vg/ml의 게놈 역가, 및 384 mOsm/kg 내지 448 mOsm/kg의 삼투몰농도를 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 정맥내 제형은 pH 7.5 내지 pH 8.5, 1.8 X 1013 vg/ml 내지 2.2 X 1013 vg/ml의 게놈 역가, 및 384 mOsm/kg 내지 448 mOsm/kg의 삼투몰농도를 나타낸다. 일 구현예에서, IV 제형은 약 0.1 mM 내지 2.0 mM MgCl2를 포함한다. 일 구현예에서, IV 제형은 약 100 mM 내지 300 mM NaCl을 포함한다. 일 구현예에서, IV 제형은 약 0.001% w/v 내지 0.01% w/v 폴록사머 188을 포함한다. 일 구현예에서, IV 제형은 예를 들어, pH 7.5 내지 pH 8.5의 10 mM 내지 30 mM Tris 완충액 중의 수성 제형이다.
일 구현예에서, IV 제형은 pH 8.0의 20 mM Tris 완충액 중 1 mM MgCl2, 200 mM NaCl, 0.005% w/v 폴록사머 188을 포함한다. 구현예에서, IV 제형은 약 1x1013 vg/mL 내지 3x1013 vg/mL 또는 1.7x1013 vg/mL 내지 2.3x1013 vg/mL의 게놈 역가를 포함한다.
약제학적 조성물의 용도
다른 구현예에서, 환자의 중추신경계에 폴리뉴클레오타이드를 전달하는 방법으로서, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 게놈을 갖는 rAAV9를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 전달은 환자의 중추신경계에의 폴리뉴클레오타이드의 척수내 전달로서, 이는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 게놈을 갖는 rAAV9를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 비이온성 저 삼투압 조영제가 또한 환자에 투여된다. 비이온성 저 삼투압 조영제는 환자의 중추신경계에서 표적 세포의 형질도입을 증가시킨다. 일부 구현예에서, rAAV9 게놈은 자기 상보성 게놈이다. 다른 구현예에서, rAAV9 게놈은 단일 가닥 게놈이다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 뇌 영역으로 전달된다. 전달을 위해 고려되는 뇌의 영역은 운동 피질 및 뇌간을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 척수로 전달된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 하부 운동 뉴런으로 전달된다. 본 개시의 구현예는 폴리뉴클레오타이드를 신경 및 신경교세포에 전달하기 위해 rAAV9를 사용한다. 일부 구현예에서, 신경교세포는 미세아교세포, 희소돌기신경교 또는 성상세포이다. 일부 구현예에서, rAAV9는 폴리뉴클레오타이드를 슈반 세포(Schwann cell)에 전달하기 위해 사용된다.
용도에는, 예를 들어, 폼페병, 리소좀 저장 장애, 다형성 교모세포종 및 파킨슨병뿐만 아니라, SMA 및 ALS와 같은 하부 운동 뉴런 질병의 치료가 포함된다. 리소좀 저장 장애는 활성화제 결핍/GM2 강글리오사이드증(gangliosidosis), 알파-만노사이드축적증, 아스파틸글루코사미뇨증, 콜레스테롤 에스테르 저장 질병, 만성 헥소사미니다제 A 결핍증, 시스틴증(Cystinosis), 다논병(Danon disease), 파브리병(Fabry disease), 파버병(Farber disease), 푸코사이드축적증(Fucosidosis), 갈락토시알리도시스(GalactoSialidosis), 고쉐병(Gaucher Disease)(I형, II형, III형), GM1 강글리오사이드증(유아, 후기 유아/청소년, 성인/만성), I-세포 질병/뮤코지질증 II(Mucolipidosis II), 유아 유리 시알산 저장 질병/ISSD, 청소년 헥소사미니다제 A 결핍증, 크랩베병(Krabbe disease)(유아 발병, 후기 발병), 이염성 백질디스트로피, 뮤코다당증 장애(가성후를러다발성이영양증(Pseudo-Hurler polydystrophy)/뮤코지질증 IIIA, MPSI 후를러 증후군(Hurler Syndrome), MPSI 샤이에 증후군(Scheie Syndrome), MPS I 후를러 샤이에 증후군, MPS II 헌터 증후군(Hunter syndrome), 산필리포 증후군(Sanfilippo syndrome) A 형, 산필리포 증후군 유형 A/MPS III A, 산필리포 증후군 유형 B/MPS III B, 산필리포 증후군 유형 C/MPS III C, 산필리포 증후군 유형 D/MPS III D, 모르키오(Morquio) 유형 A/MPS WA, 모르키오 유형 B/MPS IVB, MPS IX 히알루로니다제 결핍증(Hyaluronidase Deficiency), MPS VI 마로토-라미(Maroteaux-Lamy), MPS VII 슬라이 증후군(Sly Syndrome), 뮤코지질증 I/시알산증(Sialidosis), 뮤코지질증 IIIC, 뮤코지질증 유형 IV), 다발성 술파타제 결핍증(Multiple sulfatase deficiency), 니만-피크병(Niemann-Pick Disease)(유형 A, 유형 B, 유형 C), 신경 세로이드 리포푸스신증(Ceroid Lipofuscinoses)(CLN6 질병(이례적인 후기 유아, 후기 발병 변종, 조기 청소년), 바튼-스필마이어-보그트(Batten-Spielmeyer-Vogt)/청소년 NCL/CLN3 질병, 핀란드 변종 후기 유아 CLN5(Finnish Variant Late infantile CLN5), 빌쇼스키-얀스키병(Jansky-Bielschowsky disease)/후기 유아 CLN2/TPP1 질병, Kufs/성인 발병 NCL/CLN4 질병, 북부 뇌전증(Northern Epilepsy)/변종 후기 유아 CLN8, 산타부리-할티아(Santavuori-Haltia)/유아 CLN1/PPT 질병, 베타-만노사이드축적증, 폼페병/글리코겐 저장 질병 유형 II, 피크노디소토시스(Pycnodysostosis), 샌드호프병(Sandhoff Disease)/성인 발병/GM2 강글리오사이드증, 샌드호프병/GM2 강글리오사이드증--유아, 샌드호프병/GM2 강글리오사이드증--청소년, 쉰들러병(Schindler disease), 살라병(Salla disease)/시알산 저장 질병(Sialic Acid Storage Disease), Tay-Sachs/GM2 강글리오사이드증, 월만병(Wolman disease)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
추가의 구현예에서, 본 방법 및 물질의 사용은 레트 증후군, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병과 같은 신경계 질병의 치료, 또는 척수 및 뇌 외상/손상, 뇌졸중, 뇌암을 포함하는 신경계 손상의 치료를 위해 의도된다. 일 구현예에서, 본 방법 및 물질의 사용은 척수성 근위축(SMA)의 치료를 위해 의도된다.
SMA에는 4가지 유형이 있으며, 이는 일반적으로 발병 연령 및 달성된 최고 운동 기능에 의해 분류된다. SMA의 모든 형태는 상 염색체 열성 유전이며, 생존 운동 뉴런 1(SMN1) 유전자의 돌연변이에 의해 유발된다. 인간은 또한 SMN2라는 SMN 유전자의 거의 동일한 제2 카피를 보유한다. 문헌[Lefebvre et al. "Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene". Cell, 80(1):155-65. Monani et al. "Spinal muscular atrophy: a deficiency in a ubiquitous protein; a motor-neuron specific disease". Neuron, 48(6):885-896]. SMN1 및 SMN2 유전자는 둘 모두 SMN 단백질을 발현하지만, SMN2는 엑손 7에 번역 침묵 돌연변이를 포함하며, 이는 SMN2 전사체에 엑손 7이 비효율적으로 포함되도록 한다. 따라서, SMN2는 전장 SMN 단백질 및 엑손 7이 부재하는 SMN의 절단된 버전 둘 모두를 생성하며, 절단된 버전은 우성 형태이다. 결과적으로, SMN2에 의해 생성된 기능성 전장 단백질의 양은 SMN1에 의해 생성된 것보다 훨씬 적다(70% 내지 90%). 문헌[Lorson et al. "A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy". PNAS, 96(11) 6307-6311. Monani et al, "A single nucleotide difference that alters splicing patterns distinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2". Hum Mol Genet 8(7):1177-1183]. SMN2가 SMN1 유전자의 손실을 완전히 보정할 수는 없지만, 더 가벼운 형태의 SMA를 갖는 환자는 일반적으로 더 높은 SMN2 카피 수를 갖는다. 문헌[Lefebvre et al., "Correlation between severity and SMN protein level in spinal muscular atrophy". Nat Genet 16(3):265-269. Park et al., "Spinal muscular atrophy: new and emerging insights from model mice". Curr Neurol Neurosci Rep 10(2):108-117]. 주의할 점은 SMN2 카피 수가 유일한 표현형 변형인자가 아니라는 것이다. 특히, SMN2 유전자의 엑손 7의 c.859G> C 변이체는 양성 질병 변형인자로서 보고되었다. 이 특정 돌연변이를 가진 환자는 질병 표현형의 중증도가 낮다. 문헌[Prior et al., "A positive modified of spinal muscular atrophy in the SMN2 gene". Am J Hum Genet 85(3):408-413].
I형 SMA(또한 유아 발병 또는 베르니그-호프만병(Werdnig-Hoffmann disease)으로 지칭됨)는 SMA 증상이 출생시 또는 생후 6개월에 존재하는 경우이다. 이 유형에서 유아는 일반적으로 근긴장이 낮고(저긴장), 울음 소리가 약하며, 호흡 곤란이 있다. 이들은 종종 연하 및 흡인 곤란을 겪고, 보조 없이 앉기가 가능한 발달 이정표에 도달하지 못한다. 이들은 종종 저긴장, 운동 능력의 지연, 불량한 머리 제어, 굽은 어깨 자세 및 관절의 과운동성으로부터 선택되는 하나 이상의 SMA 증상이 나타난다. 일반적으로, 이들 유아는 각각의 염색체 5에 하나씩, 2개의 SMN2 유전자 카피를 갖는다. 모든 새로운 SMA 사례의 절반 이상이 SMA I형이다.
II형 또는 중간체 SMA는 SMA가 생후 7개월 내지 18개월 사이에 소아가 독립적으로 서거나 걸을 수 있기 전에 발병한다. 2형 SMA를 가진 소아는 일반적으로 적어도 3개의 SMN2 유전자를 갖는다. 후기 발병 SMA(또한 III형 및 IV형 SMA, 경증 SMA, 성인 발병 SMA 및 쿠겔베르그-웰란더병(Kugelberg-Welander disease)으로 공지됨)은 다양한 수준의 약화를 야기한다. III형 SMA는 18개월 후에 발병하며, 소아는 도움이 필요할 수 있지만 독립적으로 서서 걸을 수 있다. IV형 SMA는 성인기에 발병하여, 이들은 성년 기간 동안 걸을 수 있다. III형 또는 IV형 SMA를 가진 이들은 일반적으로 4개 내지 8개의 SMN2 유전자를 가지며, 이로부터 상당한 양의 전장 SMN 단백질이 생성될 수 있다.
일 구현예에서, 용어 "치료"는 본원에 개시된 바와 같은 rAAV를 포함하는 조성물의 유효 투여량 또는 유효 다중 투여량을 정맥내 또는 척수내 경로를 통해 필요한 동물(인간 포함)에 투여하는 단계를 포함한다. 투여량이 장애/질병이 발병하기 전에 투여되는 경우, 투여는 예방적이다. 투여량이 장애/질병 발병 후 투여되는 경우, 투여는 치료적이다. 구현예에서, 유효 투여량은 치료되는 장애/질병 상태와 관련된 적어도 하나의 증상을 완화(제거 또는 감소)시키고, 장애/질병 상태로의 진행을 지연시키거나 방지하고, 장애/질병 상태의 진행을 지연시키거나 방지하고, 질병의 정도를 감소시키고, 질병의 (부분적 또는 전체적) 경감을 야기하고/하거나 생존을 연장시키는 투여량이다. 치료를 위해 고려되는 질병 상태의 예가 본원에 제시되어 있다.
일 구현예에서, 본 개시의 rAAV를 포함하는 조성물은 SMA I형을 갖는 필요한 환자에 정맥내 투여된다. 또 다른 구현예에서, 본 개시의 rAAV를 포함하는 조성물은 SMA II형, III형, 또는 IV형을 갖는 필요한 환자에 척수내 투여된다.
척수내 또는 정맥내 경로를 통해 AAV9 바이러스 벡터를 투여함으로써, I형 SMA의 치료를 필요로 하는 환자에서 이를 치료하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 환자는 생후 0개월 내지 9개월이다. 일부 다른 구현예에서, 환자는 생후 0개월 내지 6개월이다. 바이러스 벡터가 환자의 I형 SMA를 치료하기 위해 사용되는 일부 구현예에서, 환자의 중량을 측정한다. 일부 구현예에서, 환자는 체중이 8.5 kg 미만이다. 일부 구현예에서, 환자는 체중이 2.6 kg 초과이다. 일부 구현예에서, 환자는 체중이 2.6 kg 내지 8.5 kg이다.
일부 구현예에서, 환자는 SMN1 유전자의 하나의 카피에 돌연변이, 예를 들어 눌 돌연변이(예를 들어, 인코딩된 SMN1을 비 기능성이 되도록 하는 임의의 돌연변이 포함)를 갖는다. 일부 구현예에서, 환자는 SMN1 유전자의 2개의 카피에 돌연변이, 예를 들어, 눌 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, 환자는 SMN1 유전자의 모든 카피에 돌연변이, 예를 들어, 눌 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, 환자는 SMN1 유전자의 1개의 카피에 결실을 갖는다. 일부 구현예에서, 환자는 SMN1 유전자의 2개의 카피에 결실을 갖는다. 일부 구현예에서, 환자는 염색체의 두 대립유전자 모두에 이중대립유전자 SMN1 돌연변이, 즉, SMN1의 결실 또는 치환을 갖는다. 일부 구현예에서, 환자는 SMN2 유전자의 적어도 하나의 기능성 카피를 갖는다. 일부 구현예에서, 환자는 SMN2 유전자의 적어도 2개의 기능성 카피를 갖는다. 일부 구현예에서, 환자는 SMN2 유전자의 적어도 2개의 기능성 카피를 갖는다. 일부 구현예에서, 환자는 SMN2 유전자의 적어도 3개의 기능성 카피를 갖는다. 일부 구현예에서, 환자는 SMN2 유전자의 적어도 4개의 기능성 카피를 갖는다. 일부 구현예에서, 환자는 SMN2 유전자의 적어도 5개의 기능성 카피를 갖는다. 일부 구현예에서, 환자는 SMN2 유전자의 적어도 하나의 카피의 엑손 7에 c.859G>C 치환을 갖지 않는다. 일부 구현예에서, SMN1 또는 SMN2 유전자의 유전자 서열은 전체 게놈 시퀀싱에 의해 결정될 수 있다. 다른 구현예에서, SMN1 또는 SMN2 유전자의 유전자 서열 및 카피 수는 고성능 시퀀싱에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, SMN1 또는 SMN2 유전자의 유전자 서열 및 카피 수는 마이크로 어레이에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, SMN1 또는 SMN2 유전자의 유전자 서열 및 카피 수는 Sanger 시퀀싱에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, SMN1 또는 SMN2 유전자의 카피 수는 형광 인시튜 혼성화(FISH)에 의해 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 환자는 하나 이상의 SMA 증상을 나타낸다. SMA 증상은 저긴장, 운동 능력의 지연, 불량한 머리 제어, 굽은 어깨 자세 및 관절의 과운동성을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 환자의 어깨(전면 및 후면)를 보조하면서 고리 형태로 앉기 자세를 시킴으로써 불량한 머리 제어를 결정한다. 환자가 머리를 똑바로 세울 수 있는 능력에 의해 머리 제어를 평가한다. 일부 구현예에서, 환자가 바로 누운 자세인 경우, 자발적인 움직임을 관찰하고, 환자가 팔꿈치, 무릎, 손 및 발을 표면으로부터 들어 올리는 능력에 의해 운동 능력을 평가한다. 일부 구현예에서, 환자의 손바닥에 손가락을 놓고 어깨가 표면에서 떨어질 때까지 환자를 들어 올림으로써 환자의 악력을 측정한다. 환자가 얼마나 빨리/길게 잡기를 유지하는지에 의해 저긴장 및 악력을 측정한다. 일부 구현예에서, 환자의 머리를 가능한 최대 회전 위치에 두고, 환자가 머리를 중간 선으로 돌리는 능력을 측정함으로써 머리 제어를 평가한다. 일부 구현예에서, 머리 및 몸통 지지대에 환자를 앉히고, 환자가 팔꿈치 또는 어깨를 구부려 팔 길이에서 어깨 높이에 있는 자극에 도달하는지 관찰함으로써 어깨 자세를 평가할 수 있다. 일부 구현예에서, 또한 환자를 모로 누운 자세가 되도록 하고, 환자가 팔꿈치 또는 어깨를 구부려 팔 길이에서 어깨 높이에 있는 자극에 도달하는지 관찰함으로써 어깨 자세를 평가할 수 있다. 일부 구현예에서, 환자의 발을 가격하거나, 간지럼을 태우거나, 꼬집은 경우, 환자가 엉덩이 또는 무릎을 구부리는지 관찰함으로써 운동 능력을 평가한다. 일부 구현예에서, 어깨 굴곡, 팔꿈치 굴곡, 고관절 내전, 목 굴곡, 머리 연장, 목 연장 및/또는 척추 만곡을 공지된 임상 측정, 예를 들어 CHOP INTEND에 의해 평가할 수 있다. 다른 SMA 증상을 공지된 임상 측정, 예를 들어, CHOP INTEND에 따라 평가할 수 있다.
일부 구현예에서, 환자는 본원에 기재된 시험 중 하나를 사용하여 결정되는 바와 같이 I형 SMA의 증상(예를 들어, 하나 이상의 증상)을 나타낸 후에 치료된다. 일부 구현예에서, 환자는 I형 SMA의 증상이 나타나기 전에 치료된다. 일부 구현예에서, 환자는 증상이 나타나기 전에 유전자 검사를 기반으로 하여 I형 SMA로 진단된다.
조합 요법이 또한 본원에서 고려된다. 본원에 사용되는 바와 같은 조합은 동시 치료 또는 순차적 치료를 포함한다. 방법의 조합은 신규 요법과의 조합과 같이 특정 표준 의학적 치료(예를 들어, ALS의 릴루졸(riluzole))의 첨가를 포함할 수 있다. 예를 들어, SMA에 대한 다른 요법은 pre-mRNA에 대한 결합을 변이시키고, 그의 스플라이싱 패턴을 변이시키는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO)를 포함한다. 문헌[Singh. et al., "A multi-exon-skipping detection assay reveals surprising diversity of splice isoforms of spinal muscular atrophy genes". Plos One, 7(11):e49595]. 일 구현예에서, 누시너센(nusinersen)(본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제 8,361,977호 및 제 US 8,980,853호)이 사용될 수 있다. 누시너센은 SMN2 pre-mRNA의 인트론 6, 엑손 7 또는 인트론 7을 표적화하여, 전장 SMN 단백질을 보다 효율적으로 생성하도록 SMN2의 스플라이싱을 조절하는 승인된 ASO이다. 일부 구현예에서, AAV9 바이러스 벡터를 포함하는 치료 방법은 근육증강제와 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, AAV9 바이러스 벡터를 포함하는 치료 방법은 신경보호제와 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, AAV9 바이러스 벡터를 포함하는 치료 방법은 SMN을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드-기반 약물과 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, AAV9 바이러스 벡터를 포함하는 치료 방법은 누시너센과 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, AAV9 바이러스 벡터를 포함하는 치료 방법은 미오스타틴(myostatin)-억제 약물과 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, AAV9 바이러스 벡터를 포함하는 치료 방법은 스타물루맙(stamulumab)과 조합하여 투여된다.
출생 후 필요한 개체에게의 전달이 고려되지만, 태아로의 자궁내 전달이 또한 고려된다.
바이러스 벡터를 포함하는 약제학적 조성물을 사용하여 I형 SMA 환자를 치료하는 방법이 고려된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 약 1 내지 8 x 1013 AAV9 바이러스 벡터 게놈/mL(vg/mL)의 농도로 제형화된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 약 1.7 내지 2.3 x 1013 vg/mL의 농도로 제형화된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 약 1.9 내지 2.1 x 1013 vg/mL의 농도로 제형화된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 약 2.0 x 1013 vg/mL의 농도로 제형화된다.
바이러스 벡터가 환자의 I형 SMA를 치료하기 위해 사용되는 일부 구현예에서, AAV 바이러스 벡터(예를 들어, AAV SMN)는 환자에 약 1.0 내지 2.5 x 1014 vg/kg의 투여량으로 투여된다. 바이러스 벡터가 환자의 I형 SMA를 치료하기 위해 사용되는 일부 구현예에서, AAV 바이러스 벡터는 환자에 약 1.1 x 1014 vg/kg의 투여량으로 투여된다. 바이러스 벡터가 환자의 I형 SMA를 치료하기 위해 사용되는 일부 구현예에서, AAV 바이러스 벡터는 환자 내에 약 45분 내지 70분 동안 주입된다. 바이러스 벡터가 환자의 I형 SMA를 치료하기 위해 사용되는 일부 구현예에서, AAV 바이러스 벡터는 환자 내에 약 60분 동안 주입된다. 바이러스 벡터가 환자의 I형 SMA를 치료하기 위해 사용되는 일부 구현예에서, AAV 바이러스 벡터는 환자 내에 주입 펌프, 연동 펌프 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 장치를 사용하여 주입된다. 바이러스 벡터가 환자의 I형 SMA를 치료하기 위해 사용되는 일부 구현예에서, AAV 바이러스 벡터는 환자 내에 주사기 펌프를 사용하여 주입된다.
투여될 rAAV 바이러스 벡터의 역가는 예를 들어 특정 rAAV, 투여 방식, 치료 표적, 개체 및 표적화되는 세포 유형(들)에 따라 상이할 것이고, 당업계의 표준 방법에 의해 결정될 수 있다. rAAV의 역가는 약 1 X 106, 약 1 X 107, 약 1 X 108, 약 1 X 109, 약 1 X 1010, 약 1 X 1011, 약 1 X 1012, 약 1 X 1013, 약 1 X 1014개 이상의 DNase 저항성 입자(DRP)/ml의 범위일 수 있다. 투여량은 또한 벡터 게놈(vg)의 단위로 표시될 수 있다. 게놈 역가는 본 출원, 문헌[Lock et al.]에 기재된 바와 같은 ddPCR 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
투여량은 인간 투여 일정에 따라 상이할 수 있다. rAAV의 이들 투여량은 성인의 킬로그램 체중당 약 1 X 1011 vg/kg, 약 1 X 1012 vg/kg, 약 1 X 1013 vg/kg, 약 1 X 1014 vg/kg, 약 1 X 1015 vg/kg, 약 1 X 1016 vg/kg 이상의 벡터 게놈의 범위일 수 있다. 신생아의 경우, rAAV의 투여량은 킬로그램 체중당 약 1 X 1011 vg/kg, 약 1 X 1012 vg/kg, 약 3 X 1012 vg/kg, 약 1 X 1013 vg/kg, 약 3 X 1013 vg/kg, 약 1 X 1014 vg/kg, 약 3 X 1014 vg/kg, 약 1 X 1015 vg/kg, 약 3 X 1015 vg/kg, 약 1 X 1016 vg/kg, 약 3 X 1016 vg/kg 이상의 벡터 게놈의 범위일 수 있다.
투여량은 인간 투여 일정에 따라 상이할 수 있다. rAAV의 이들 투여량은 성인의 킬로그램 체중당 약 1 X 1011 vg/kg/주, 약 1 X 1012 vg/kg/주, 약 1 X 1013 vg/kg/주, 약 1 X 1014 vg/kg/주, 약 1 X 1015 vg/kg/주, 약 1 X 1016 vg/kg/주 이상의 벡터 게놈의 범위일 수 있다. 신생아의 경우, rAAV의 투여량은 주당 킬로그램 체중당 약 1 X 1011 vg/kg/주, 약 1 X 1012 vg/kg/주, 약 3 X 1012 vg/kg/주, 약 1 X 1013 vg/kg/주, 약 3 X 1013 vg/kg/주, 약 1 X 1014 vg/kg/주, 약 3 X 1014 vg/kg/주, 약 1 X 1015 vg/kg/주, 약 3 X 1015 vg/kg/주, 약 1 X 1016 vg/kg/주, 약 3 X 1016 vg/kg/주 이상의 벡터 게놈의 범위일 수 있다. rAAV의 투여량은 1 X 1011 vg/1.5 kg/주, 약 1 X 1012 vg/1.5 kg/주, 약 1 X 1013 vg/1.5 kg/주, 약 1 X 1014 vg/1.5 kg/주, 약 1 X 1015 vg/1.5 kg/주, 약 1 X 1016 vg/1.5 kg/주 이상의 벡터 게놈/성인의 킬로그램 체중이다. 신생아의 경우, rAAV의 투여량은 주당 1.5 킬로그램 체중당 약 1 X 1011 vg/1.5 kg/주, 약 1 X 1012 vg/1.5 kg/주, 약 3 X 1012 vg/kg/주, 약 1 X 1013 vg/1.5 kg/주, 약 3 X 1013 vg/1.5 kg/주, 약 1 X 1014 vg/1.5 kg/주, 약 3 X 1014 vg/1.5 kg/주, 약 1 X 1015 vg/1.5 kg/주, 약 3 X 1015 vg/1.5 kg/주, 약 1 X 1016 vg/1.5 kg/주, 약 3 X 1016 vg/1.5 kg/주 이상의 벡터 게놈의 범위일 수 있다.
일 구현예에서, 투여량은 환자 체중의 kg(vg/kg)당 약 1.1 X 1014 벡터 게놈이다. 일 구현예에서, 5 kg 환자에는 0.5 X 1014 내지 5.0 X 1014 벡터 게놈의 총 투여량이 제공된다. 일 구현예에서, 바이러스 벡터는 Tris-완충 식염수 중에서 투여된다. 일 구현예에서, 바이러스 벡터는 약 5 mL/kg 내지 20 mL/kg, 약 10 mL/kg 내지 20 mL/kg, 또는 약 5.5 mL/kg 내지 6.5 mL/kg의 Tris-완충 식염수 중에서 투여된다.
투여량은 다수의 표준 방식으로 결정될 수 있다. 바이러스 벡터에 특이적인 프라이머에 의한 PCR은 상대 측정을 제공할 수 있지만, qPCR은 더 소형 샘플 및 절대 측정에 사용될 수 있다. ddPCR은 수-유 유제 액적 기술에 기반한 디지털 PCR을 수행하기 위한 방법이다. 문헌[Baker et al., "Digital PCR hits its stride". Nature Methods, 9(6):541-544. Sykes et al., "Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution". Biotechniques, 13(3)444-449]. 샘플을 수만개의 액적으로 분별하고, 주형 분자의 PCR 증폭은 각 개별 액적에서 이루어진다. 표준 곡선을 작성할 필요가 없거나, 증폭 효율이 높은 프라이머가 필요하지 않으므로, ddPCR은 일반적으로 통상적인 PCR 기반 기법만큼 많은 샘플을 사용하지 않는다. 시판되는 ddPCR 장치의 예는 BioRad QX100 ddPCR 및 RainDance Raindrop Digital PCR을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일 구현예에서, 투여량은 PCR을 사용하여 결정된다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 qPCR을 사용하여 결정된다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 디지털 액적 PCR(ddPCR)을 사용하여 결정된다. 일부 구현예에서, PCR 기반 방법은 특이적으로 설계된 프라이머 및 SMN 유전자를 표적화하는 프로브를 사용하여 포획된 AAV9 바이러스 게놈을 검출하고, 정량화한다. 다른 구현예에서, PCR-기반 방법은 특이적으로 설계된 프라이머 및 닭 베타-액틴 프로모터를 표적화하는 프로브를 사용하여 포획된 AAV9 바이러스 게놈을 검출하고, 정량화한다. 다른 구현예에서, PCR-기반 방법은 특이적으로 설계된 프라이머 및 CMV 인핸서를 표적화하는 프로브를 사용하여 포획된 AAV9 바이러스 게놈을 검출하고, 정량화한다. 다른 구현예에서, PCR-기반 방법은 특이적으로 설계된 프라이머 및 ITR 서열을 표적화하는 프로브를 사용하여 포획된 AAV9 바이러스 게놈을 검출하고, 정량화한다. 다른 구현예에서, PCR-기반 방법은 특이적으로 설계된 프라이머 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호를 표적화하는 프로브를 사용하여 포획된 AAV9 바이러스 게놈을 검출하고, 정량화한다.
일 양태에서, 투여량은 약물 산물의 표적 농도로서 2.0 X 1013 vg/ml를 사용하여 하기 표에 따라 투여된다.
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일부 구현예에서 AAV 바이러스 벡터를 포함하는 약제학적 조성물은 환자 내에 약 20분 내지 70분, 예를 들어 약 45분 내지 70분 동안 주입된다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스 벡터를 포함하는 약제학적 조성물은 환자 내에 약 60분 동안 주입된다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스 벡터를 포함하는 약제학적 조성물은 환자 내에 주입 펌프, 연동 펌프 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 장치를 사용하여 주입된다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스 벡터를 포함하는 약제학적 조성물은 환자 내에 주사기 펌프를 사용하여 주입된다.
치료할 수 있는 환자의 사전 스크리닝뿐만 아니라, 본원에 개시된 기준에 따라 확인된 환자에의 치료의 투여가 또한 고려된다. AAV는 세포성 및 체액성 면역 반응을 유발할 수 있다. 결과적으로, AAV-기반 유전자 요법에 대한 잠재적 환자의 일부는 AAV에 대한 기존의 항체를 보유한다. 문헌[Jeune et al., "Pre-existing anti-Adeno-Associated Virus antibodies as a challenge in AAV gene therapy". Hum Gene Ther Methods, 24(2):59-67. Boutin et al., "Prevalence of serum IgG and neutralizing factors against adeno-associated virus (AAV) types 1, 2, 5, 6, 8, and 9 in the healthy population: implications for gene therapy using AAV vectors". Hum Gene Ther, 21:704-712]. 매우 낮은 수준의 항체 조차도 성공적인 형질도입을 방지할 수 있기 때문에, 선행 항-AAV 항체는 AAV 유전자 요법의 보편적인 적용에 심각한 장애를 유발한다. 일부 구현예에서, 환자의 항-AAV9 항체 역가 수준은 AAV 바이러스 벡터의 투여 전에 결정된다. 일부 구현예에서, 환자의 항-AAV9 항체 역가 수준은 ELISA 결합 면역분석에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 환자는 치료 투여 전에 ELISA 결합 면역분석에 의해 결정되는 바와 같이 1:100 이하의 항-AAV9 항체 역가를 나타낸다. 일부 구현예에서, 환자는 치료 투여 전에 ELISA 결합 면역분석에 의해 결정되는 바와 같이 1:50 이하의 항-AAV9 항체 역가를 나타낸다. 일부 구현예에서, 환자는 치료 후 ELISA 결합 면역분석에 의해 결정되는 바와 같이, 1:100 초과의 항-AAV9 항체 역가를 나타내고, 1주 내지 8주 동안 또는 역가가 1:100 미만으로 저하될 때까지 모니터링된다. 일부 구현예에서, 환자는 치료 후 ELISA 결합 면역분석에 의해 결정되는 바와 같이, 1:100 초과의 항-AAV9 항체 역가를 나타내고, 1주 내지 8주 동안 또는 역가가 1:50 미만으로 저하될 때까지 모니터링된다.
높은 항-AAV 항체 역가를 극복하기 위한 한 가지 접근법은 면역저해 약물을 사용하는 것이다. 사이클로스포린 A(cyclosporine A)와 조합된 단일클론 항-CD20 항체 리툭시맙(rituximab)은 항-AAV 역가를 낮추는데 효과적인 것으로 나타났다. 문헌[Mingozzi et al., "Pharmacological modulation of humoral immunity in a nonhuman primate model of AAV gene transfer for hemophilia B". Mol Ther, 20:1410-1416]. 또 다른 접근법은 벡터 투여 전에 중화 항체를 고갈시키기 위한 혈장 반출법의 사용이다. 문헌[Monteilhet et al., "A 10 patient case report on the impact of plasmapheresis upon neutralizing factors against adeno-associated virus (AAV) types 1, 2, 6, and 8". Mol Ther, 19(11):2084-2091]. 혈장 반출법 동안, 환자로부터 혈액을 채혈하고, 혈장 및 혈액 세포를 원심분리 또는 중공 섬유 여과에 의해 분리한다. 이어서, 혈액 세포를 처리된 혈장 또는 대체 유체, 예컨대 식염수 중 4.5% 인간 알부민과 함께 환자에 돌려보낸다. 치료 성분채집술의 일반적인 용도는 부적절한 면역글로불린의 제거이지만, 이 경우 혈장 반출법은 항-AAV 항체를 고갈시키는 매력적인 접근법으로 나타난다. 일부 구현예에서, 환자는 치료 전 또는 후에 ELISA 결합 면역분석에 의해 결정되는 바와 같이 1:100 초과의 항-AAV9 항체 역가를 나타내고, 혈장 반출법으로 치료된다. 일부 구현예에서, 환자는 치료 전 또는 후에 ELISA 결합 면역분석에 의해 결정되는 바와 같이 1:50 초과의 항-AAV9 항체 역가를 나타내고, 혈장 반출법으로 치료된다.
AAV9에 대한 기존의 모체 항체는 모유 또는 자궁 태반 전달을 통해 유아 환자에게 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 환자는 치료 전 또는 후에 ELISA 결합 면역분석에 의해 결정되는 바와 같이, 1:100 초과의 항-AAV9 항체 역가를 나타내고, 제형 공급으로 전환된다. 일부 구현예에서, 환자는 치료 전 또는 후에 ELISA 결합 면역분석에 의해 결정되는 바와 같이, 1:50 초과의 항-AAV9 항체 역가를 나타내고, 제형 공급으로 전환된다.
치료의 투여 전 및 후에, 환자의 질병을 모니터링할 수 있다. AAV 기반 치료가 제공된 일부 환자는 혈소판 수가 적은 것을 특징으로 하는 질환인 혈소판 감소증이 나타났다. 혈소판 감소증은 혈구계에서 희석된 혈액 샘플을 사용하여 전체 혈액 수로 검출할 수 있다. 혈소판 감소증은 또한 현미경 하에서 환자의 혈액(얇은 혈액 막 또는 말초 도말)으로 제조된 슬라이드를 관찰함으로써, 검출할 수 있다. 정상 인간 혈소판 개수는 150,000 세포/ml 내지 약 450,000 세포/ml의 범위이다.
일부 구현예에서, 환자는 투여 전에 약 67,000 세포/ml 초과 또는 약 100,000 세포/ml 초과, 또는 약 150,000 세포/ml 초과의 혈소판 개수를 나타낸다. 일부 구현예에서, 환자는 투여 전에 약 150,000 세포/ml 미만 또는 약 100,000 세포/ml 미만, 또는 약 67,000 세포/ml 미만의 혈소판 개수를 나타내고, 1주 내지 8주 동안 또는 혈소판 개수가 약 67,000 세포/ml 초과, 또는 약 100,000 세포/ml 초과, 또는 약 150,000 세포/ml 초과로 증가할 때까지 모니터링된다. 바이러스 벡터의 투여 후에 혈소판 개수가 약 67,000 세포/ml 미만인 일부 구현예에서, 환자는 혈소판 수혈로 치료될 수 있다. 일부 구현예에서, 환자는 바이러스 벡터의 투여 전에 혈소판 감소증을 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, 환자는 바이러스 벡터의 투여 후에 혈소판 감소증을 나타내며, 약 1주 내지 8주 동안 또는 환자가 혈소판 감소증을 나타내지 않을 때까지 모니터링된다. 일부 구현예에서, 환자는 바이러스 벡터의 투여 후에 혈소판 감소증을 나타내며, 혈소판 수혈로 치료된다.
환자의 질환을 모니터링하는 단계는 또한 혈소판, 혈청 단백질 전기영동, 혈청 감마-글루타밀 트랜스퍼라제(GGT), 아스파테이트 트랜스아미나제(AST) 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 총 빌리루빈(bilirubin), 글루코스, 크레아틴 키나제(creatine kinase)(CK), 크레아티닌(creatinine), 혈액 우레아 질소(BUN), 전해질, 알칼리성 포스파타제 및 아밀라제의 수준을 측정하는 표준 혈액 시험을 포함할 수 있다. 트로포닌(troponin) I 수준은 심장 건강에 대한 일반적인 척도이며, 상승된 수준은 심장 손상 또는 심장 관련 질환을 나타낸다. 일부 구현예에서, 트로포닌-I 수준이 바이러스 벡터의 투여 후에 모니터링된다. 일부 구현예에서, 환자는 바이러스 벡터의 투여 전에 약 0.3, 0.2, 0.15, 또는 0.1 μg/ml 미만의 트로포닌-I 수준을 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 환자는 바이러스 벡터의 투여 전에 약 0.176 μg/ml 미만의 트로포닌-I 수준을 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 환자는 바이러스 벡터의 투여 후에 약 0.176 μg/ml 초과의 트로포닌-I 수준을 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 환자는 바이러스 벡터의 투여 후에 트로포닌-I 수준이 약 0.176 μg/ml 미만일 때까지 심장 모니터링이 제공된다.
아스파테이트 트랜스아미나제(AST) 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 및 총 빌리루빈은 간 기능의 일반적인 척도이며, 크레아티닌은 신장 기능을 규정한다. AST, ALT 또는 총 빌리루빈 상승된 수준은 간 기능 장애를 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 환자는 투여 바이러스 벡터의 투여 전에 정상 간 기능을 나타낸다. 일부 구현예에서, 환자는 바이러스 벡터의 투여 전에 약 8U/L 내지 40 U/L 미만의 간 트랜스아미나제 수준을 갖는다. 일부 구현예에서, 환자는 바이러스 벡터의 투여 전에 약 8 U/L 내지 40 U/L 미만의 AST 또는 ALT 수준을 나타낸다. 일부 구현예에서, 환자는 바이러스 벡터의 투여 전에 3.0 mg/dL 미만의 빌리루빈 수준을 나타낸다. 일부 구현예에서, 환자는 바이러스 벡터의 투여 전에 1.8 mg/dL 미만의 크레아티닌 수준을 나타낸다. 일부 구현예에서, 환자는 바이러스 벡터의 투여 전에 8 g/dL 내지 18 g/dL의 헤모글로빈(Hgb) 수준을 나타낸다. 일부 구현예에서, 환자는 바이러스 벡터의 투여 전에 mm3당 20000개 미만의 백혈구(WBC) 개수를 나타낸다.
치료 방법의 효능은 치료 전 및 후의 운동 능력에 대한 다양한 시험을 사용하여 결정될 수 있다. 특히, 필라델피아 소아 병원 신경 근육 장애 검사(CHOP INTEND)는 1형 SMA 환자의 운동 능력을 평가하기 위해 개발되었다. 문헌[Glanzman et al., "The Children's Hospital of Philadelphia Infant Test of Neuromuscular Disorders (CHOP INTEND): Test development and reliability". Neuromuscular Disorders, 20(3):155-161]. CHOP INTEND 시험은 유아 운동 능력 시험(TIMP) 및 SMA의 신규 고안 운동 평가인 SMA의 필라델피아 소아 병원 강도 시험(CHOP)을 통해 평균 생후 11.5개월(1.4개월 내지 37.9개월)의 I형 SMA를 가진 26명의 유아를 평가한 후에 개발되었다. 효능 치료의 시험은 CHOP INTEND 시험으로 제한되지 않지만, 또한, TIMP, CHOP TOSS, Peabody 발달 운동 척도, Brazelton 신생아 행동 평가 시험, 운동 이정표 발달 설문 조사, 상호 비디오 평가를 통해 포착된 능력(Ability Captured Through Interactive Video Evaluation)(ACTIVE), Bayley 유아 발달 척도 및 복합 운동 행동 가능성(CMAP) 측정을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 다른 운동 능력 시험을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 치료 전 기준선 시험은 CHOP INTEND 척도를 사용하여 수행된다. 일 구현예에서, 치료 효능은 후속 방문 동안 CHOP INTEND 척도를 사용하여 결정된다. 일부 구현예에서, CHOP INTEND는 머리 제어, 정위 반응, 보조 하에 앉기, 눕기 및 엎드린 자세에서의 몸통 운동의 측정을 포함한다. 일부 구현예에서, CHOP INTEND는 보조 하에 돌기, 복와위 지지 및 보조 하에 서기에서의 반 중력 운동의 측정을 포함한다.
AAV 벡터를 포함하는 많은 유전자 요법 연구에서, AAV 벡터에 대한 항원 특이적 T-세포 반응이 관찰되었으며, 이는 유전자 전달 후 2주 내지 4주 사이에 예상될 수 있다. 이러한 항원 특이적 T-세포 반응에 대한 하나의 가능한 결과는 형질도입된 세포의 배출 및 전이유전자 발현의 상실이다. AAV 기반 요법에 대한 숙주 면역 반응을 약화시키려 하는 경우, 환자에게 면역저해제가 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 환자에게 바이러스 벡터의 투여 전에 글루코코르티코이드가 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 환자에게 바이러스 벡터의 투여 전에 코르티코스테로이드가 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 환자에게 바이러스 벡터의 투여 전에 경구용 스테로이드가 제공될 수 있다. 경구용 스테로이드의 예는 프레드니손(prednisone), 프레드니솔론(prednisolone), 메틸프레드니솔론, 트리암시놀론(triamcinolone), 베타메타손(bethamethasone), 덱사메타손(dexamethasone) 및 하이드로코르티손(hydrocortisone)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 경구용 스테로이드는 프레드니솔론이거나, 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 바이러스 벡터 투여 적어도 24시간 전에 예방 스테로이드를 개시한다. 일부 구현예에서, 환자는 바이러스 벡터의 투여 후 적어도 30일 동안 경구용 스테로이드가 제공된다. 일부 구현예에서, 경구용 스테로이드는 1일 1회 투여된다. 일부 구현예에서, 경구용 스테로이드는 1일 2회 투여된다. 일부 구현예에서, 경구용 스테로이드는 약 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg, 예를 들어, 약 1 mg/kg의 투여량으로 제공된다. 일부 구현예에서, 경구용 스테로이드는 약 0.1 내지 10 mg/kg/일, 예를 들어, 약 1 mg/kg/일의 투여량으로 제공된다. 일부 구현예에서, AST 및 ALT의 수준이 바이러스 벡터의 투여 후에 모니터링된다. 이러한 구현예에서, 경구용 스테로이드 치료는 AST 및 ALT 수준이 예를 들어 당업계에 공지된 임상 표준 및 방법에 의해 결정되는 바와 같이, 정상 상한의 2배, 또는 약 120 IU/L을 초과하는 경우, 투여된다. 일부 구현예에서, AST 및 ALT 수준이, 예를 들어 당업계에 공지된 임상 표준 및 방법에 의해 결정된 바와 같이, 정상의 상한의 2배를 초과하거나, 약 120 IU/L를 초과하는 한, 경구용 스테로이드 치료는 30일 초과 동안 투여된다. 코르티코스테로이드로 지속적인 치료를 하는 동안 부신은 자연적으로 코티솔의 생성을 감소시킨다. 코르티코스테로이드 치료가 갑자기 중단되면, 신체에 코티솔 결핍이 발생할 수 있다. 경구용 스테로이드가 적어도 30일 동안 환자에게 제공되는 일부 구현예에서, 스테로이드 투여량을 일정에 따라 서서히 점감시킨다. 일부 구현예에서, AST 및 ALT 수준이 예를 들어 당업계에 공지된 임상 표준 및 방법에 의해 결정된 바와 같이 정상 상한의 2배, 또는 약 120 IU/L 미만으로 감소하는 경우, 경구용 스테로이드 투여량을 점감시킨다. 일부 구현예에서, 점감은 2주 동안 0.5 mg/kg/일 후, 추가의 2주 동안 0.25 mg/kg/일로 단계적으로 감소시키는 단계를 포함한다. 일부 다른 구현예에서, 경구용 스테로이드의 점감은 의사의 판단에 따라 이루어진다.
키트
본원의 개시는 또한 SMA의 치료를 필요로 하는 환자에서 이를 치료하기 위한 키트를 제공하며, 키트는 본원에 개시된 SMN 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바이러스 벡터의 유효량 또는 투여량을 포함하는 약제학적 조성물의 하나 이상의 투여량을 포함하며, SMA의 유형에 따라(본원에 추가로 개시된 바와 같음), 키트는 조영제(예를 들어, omnipaque 180), 및 약제학적 제조물 또는 조성물 및 조영제를 사용하는 방법에 대한 지침을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 바이러스 벡터 약제학적 조성물의 바이알을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터 약제학적 조성물은 약 1.7 내지 2.3 x 1013 vg/mL의 농도이다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터 약제학적 조성물은 약 1.9 내지 2.1 x 1013 vg/mL의 농도이다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터 약제학적 조성물은 약 2.0 x 1013 vg/mL의 농도이다. 일부 구현예에서, 바이알은 약 5.9 mL의 바이러스 벡터 약제학적 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이알은 약 8.7 mL의 바이러스 벡터 약제학적 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 5.9 mL 바이알을 포함하지 않거나, 적어도 하나의 5.9 mL 바이알, 적어도 2개의 5.9 mL 바이알 또는 적어도 3개의 5.9 mL 바이알을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 8.7 mL 바이알을 포함하지 않거나, 적어도 하나의 8.7 mL 바이알, 적어도 2개의 8.7 mL 바이알, 적어도 3개의 8.7 mL 바이알, 적어도 4개의 8.7 mL 바이알, 적어도 5개의 8.7 mL 바이알, 적어도 6개의 8.7 mL 바이알을 포함한다.
키트가 환자의 I형 SMA를 치료하기 위해 사용되는 일부 구현예에서, 환자의 중량을 결정한다 키트가 환자의 I형 SMA를 치료하기 위해 사용되는 일부 구현예에서, 환자의 중량은 적어도 약 2.6 kg이다. 키트가 환자의 I형 SMA를 치료하기 위해 사용되는 일부 구현예에서, 환자의 중량은 약 8.5 kg 이하이다. 키트가 환자의 I형 SMA를 치료하기 위해 사용되는 일부 구현예에서, 환자의 중량은 약 2.6 kg 내지 8.5 kg이다. 키트가 환자의 I형 SMA를 치료하기 위해 사용되는 일부 구현예에서, 키트 내 바이알로부터의 AAV 바이러스 벡터는 환자에 투여된다. 키트가 환자의 I형 SMA를 치료하기 위해 사용되는 일부 구현예에서, 키트 내 바이알로부터의 AAV 바이러스 벡터는 환자에 약 1.0 vg/kg 내지 2.5 x 1014 vg/kg의 투여량으로 투여된다. 키트가 환자의 I형 SMA를 치료하기 위해 사용되는 일부 구현예에서, 키트 내 바이알로부터의 AAV 바이러스 벡터는 환자에 약 1.1 x 1014 vg/kg의 투여량으로 투여된다. 키트가 환자의 I형 SMA를 치료하기 위해 사용되는 일부 구현예에서, 키트 내 바이알로부터의 AAV 바이러스 벡터는 환자 내에 약 45분 내지 70분 동안 주입된다. 키트가 환자의 I형 SMA를 치료하기 위해 사용되는 일부 구현예에서, 키트 내 바이알로부터의 AAV 바이러스 벡터는 환자 내에 약 60분 동안 주입된다. 키트가 환자의 I형 SMA를 치료하기 위해 사용되는 일부 구현예에서, 키트 내 바이알로부터의 AAV 바이러스 벡터는 환자 내에 주입 펌프, 연동 펌프 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 장치를 사용하여 주입된다. 키트가 환자의 I형 SMA를 치료하기 위해 사용되는 일부 구현예에서, 키트 내 바이알로부터의 AAV 바이러스 벡터는 환자 내에 주사기 펌프를 사용하여 주입된다.
일 구현예에서, 벡터는 정맥내 또는 척수내로 투여된다. 일 구현예에서, 벡터는 정맥내 투여된다. 일 구현예에서, 벡터는 omnipaque 180과 함께 정맥내 투여된다. 또 다른 구현예에서, 벡터는 omnipaque 180와 함께 척수내로 투여된다.
다른 양태에서, rAAV로 환자의 표적 세포(신경 또는 신경교 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않음)를 형질도입시키는 방법이 본원에서 고려된다.
본원에 개시된 rAAV에 의한 환자 세포의 형질도입은 rAAV에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드 또는 RNA의 지속적인 발현을 야기할 수 있다. 따라서, 본 개시는 rAAV(예를 들어, SMN 단백질을 인코딩함)를 동물 또는 인간 환자에게 투여/전달하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 하나 이상의 rAAV로 신경 및/또는 신경교 세포를 형질도입시키는 단계를 포함한다. 조직 특이적 제어 요소를 포함하는 유전자 카세트에 의해 형질도입을 수행할 수 있다. 예를 들어, 특이적으로 뉴런 내에서 또는 특이적으로 성상세포 내에서 발현을 가능하게 하는 프로모터. 예에는 뉴런 특이적 에놀라제(enolase) 및 신경교 섬유질 산성 단백질 프로모터가 포함된다. 복용한 약물의 제어 하의 유도성 프로모터가 또한 개발될 수 있다.
일부 양태에서, 조영제와 조합하여 사용되지 않는 경우, 본 개시의 벡터의 형질도입과 비교하여, 본 개시의 벡터가 본원에 기재된 바와 같이, 조영제와 조합하여 사용되는 경우, 세포의 형질도입이 증가하는 것으로 고려된다. 다양한 구현예에서, 조영제와 조합하여 사용되지 않는 경우, 본 개시의 벡터의 형질도입과 비교하여, 본 개시의 벡터가 본원에 기재된 바와 같이, 조영제와 조합하여 사용되는 경우, 세포의 형질도입은 적어도 약 1%, 또는 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 120%, 적어도 약 150%, 적어도 약 180%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 적어도 약 300%, 적어도 약 350%, 적어도 약 400%, 적어도 약 450%, 적어도 약 500% 이상만큼 증가한다. 추가의 구현예에서, 조영제와 조합하여 사용되지 않는 경우, 본 개시의 벡터의 형질도입과 비교하여, 본 개시의 벡터가 본원에 기재된 바와 같이, 조영제와 조합하여 사용되는 경우, 세포의 형질도입은 약 10% 내지 약 50%, 또는 약 10% 내지 약 100%, 또는 약 5% 내지 약 10%, 또는 약 5% 내지 약 50%, 또는 약 1% 내지 약 500%, 또는 약 10% 내지 약 200%, 또는 약 10% 내지 약 300%, 또는 약 10% 내지 약 400%, 또는 약 100% 내지 약 500%, 또는 약 150% 내지 약 300%, 또는 약 200% 내지 약 500%만큼 증가한다.
본 개시는 또한 본 개시의 벡터 및 조영제를 필요한 환자의 중추신경계로 척수내 투여하는 것으로 인해 조영제의 부재 하에 본 개시의 벡터가 투여되는 경우, 환자의 생존율과 비교하여, 환자의 생존율이 증가된다. 다양한 구현예에서, 본 개시의 벡터 및 조영제는 필요한 환자의 중추신경계에 개별적으로 척수내로 투여된다. 다른 구현예에서, 벡터 및 조영제는 공동 제형화되어, 필요한 환자 또는 중추신경계에 척수내로 투여된다. 다른 구현예에서, 벡터 및 조영제는 필요한 환자 또는 중추신경계에 척수내로 투여하기 위해 동일한 패키지로 제공된다. 다양한 구현예에서, 본 개시의 벡터 및 조영제를 필요한 환자의 중추신경계에 투여하는 경우, 조영제의 부재 하에 본 개시의 벡터가 투여되는 경우, 환자의 생존율과 비교하여, 환자의 생존율을 적어도 약 1%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200% 이상만큼 증가시킨다.
일부 양태에서, 본 개시의 벡터가 조영제와 조합하여 사용되는 경우 및 환자가 트렌델렌부르크 자세(머리를 아래로 기울인 자세)인 경우, 세포의 형질도입이 추가로 증가되는 것으로 고려된다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 척수내 벡터 주입 동안 또는 그 후에 환자의 머리를 약 1도 내지 약 30도, 약 15 내지 약 30도, 약 30 내지 약 60도, 약 60 내지 약 90도, 또는 약 90 최대 약 180도 아래로 기울어지게 한다. 다양한 구현예에서, 조영제 및 트렌델렌부르크 자세와 조합하여 사용되지 않는 경우, 본 개시의 벡터의 형질도입과 비교하여, 본 개시의 벡터가 본원에 기재된 바와 같이, 조영제 및 트렌델렌부르크 자세와 조합하여 사용되는 경우, 세포의 형질도입은 적어도 약 1%, 또는 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 120%, 적어도 약 150%, 적어도 약 180%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 적어도 약 300%, 적어도 약 350%, 적어도 약 400%, 적어도 약 450%, 적어도 약 500% 이상만큼 증가한다. 추가의 구현예에서, 조영제 및 트렌델렌부르크 자세와 조합하여 사용되지 않는 경우, 본 개시의 벡터의 형질도입과 비교하여, 본 개시의 벡터가 본원에 기재된 바와 같이, 조영제 및 트렌델렌부르크 자세와 조합하여 사용되는 경우, 세포의 형질도입은 약 10% 내지 약 50%, 또는 약 10% 내지 약 100%, 또는 약 5% 내지 약 10%, 또는 약 5% 내지 약 50%, 또는 약 1% 내지 약 500%, 또는 약 10% 내지 약 200%, 또는 약 10% 내지 약 300%, 또는 약 10% 내지 약 400%, 또는 약 100% 내지 약 500%, 또는 약 150% 내지 약 300%, 또는 약 200% 내지 약 500%만큼 증가한다.
본 개시는 또한 본 개시의 벡터 및 조영제를 트렌델렌부르크 자세의 필요한 환자의 중추신경계에 척수내 투여한 경우, 본 개시의 벡터가 조영제 및 트렌델렌부르크 자세의 부재 하에 투여된 경우, 환자의 생존율과 비교하여, 환자의 생존율을 추가로 증가시킨다. 다양한 구현예에서, 본 개시의 벡터 및 조영제를 트렌델렌부르크 자세의 필요한 환자의 중추신경계에 투여하는 경우, 조영제 및 트렌델렌부르크 자세의 부재 하에 본 개시의 벡터가 투여된 경우, 환자의 생존율과 비교하여, 환자의 생존율을 적어도 약 1%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200% 이상만큼 증가시킨다.
본 개시 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 문맥상 명백하게 다르게 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 선택적 또는 선택적으로는 이후에 기재되는 사건 또는 상황이 발생할 수 있거나 발생할 수 없고, 본 설명은 사건 또는 상황이 발생하는 경우 및 그렇지 않은 경우를 포함함을 의미한다. 예를 들어, 조성물이 조합을 포함할 수 있는 어구 선택적으로는 조성물이 상이한 분자의 조합을 포함할 수 있거나, 조합을 포함하지 않을 수 있음으로써, 본 설명이 조합 및 조합의 부재(즉, 조합의 개별 구성원) 둘 모두를 포함함을 의미한다. 범위는 본원에서 약 하나의 특정 값에서 및/또는 약 또 다른 특정 값까지로 표시될 수 있다. 이러한 범위가 표시되는 경우, 또 다른 양태는 하나의 특정 값에서 및/또는 다른 특정 값까지를 포함한다. 유사하게, 값이 선행 수식어 약을 사용함으로써, 근사치로 표시되는 경우, 특정 값이 또 다른 양태를 형성하는 것으로 이해될 것이다. 다른 한계치와 관련된 경우, 및 다른 한계치와 무관한 경우 둘 모두 각각의 범위의 한계치가 유의하다는 것이 추가로 이해될 것이다.
본 개시는 하기 실시예에 의해 추가로 설명되며, 이는 제한적인 것으로 해석되어서는 안된다. 본 출원 전반에 인용된 모든 참조문헌, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용뿐만 아니라, 도면은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
실시예
하기 실시예는 예시적인 것으로 간주되어야 하고, 상기 기재된 개시의 범위를 제한하지 않는다.
실시예 1 - Pre-GMP 마스터 세포 은행의 생성
방법
해동: 단일 세포 바이알(1 x 106개의 세포)을 37℃ 수조에서 약 1분 동안 해동하고, 내용물을 예열된 완전 성장 배지 5 mL에 희석하였다. 세포를 T-25 cm2 플라스크로 옮기고, 37℃ 인큐베이터에서 4일 동안 성장시키고, 배양 배지를 매일 예열된 완전 성장 배지로 교체하였다.
증가된 부착성에 대한 선택: 세포를 다음 기법을 사용하여 배양하고, 강하게 부착된 세포를 선택하였다. 세포가 25 cm2 플라스크에서 95% 컨플루언스에 도달하면, 세포를 계대배양하였다. 세포를 5 mL의 PBS로 세척한 다음, 0.5 mL 내지 1 mL의 HyQTase로 약 2분 동안 실온에서 분리시켰다. 5 mL의 완전 성장 배지를 첨가하여 분리를 중지시키고, 반복적으로 피펫팅하여, 세포 덩어리를 분리시켰다. 이어서, 세포 현탁액을 200 x g에서 4분 동안 원심분리하였다. 상청액을 따라내고, 세포 펠릿을 10 mL의 완전 성장 배지에 재현탁시켰다. 세포를 75 cm2 플라스크로 옮겼다. 37℃ 인큐베이터에서 4시간 동안 인큐베이션한 후, 약하게 부착된 세포를 세포 배양 배지를 흡인시켜 세척하여, 약하게 부착된 세포 및 비 부착 세포를 제거하였다. 배양 배지를 10 mL의 예열된 완전 성장 배지로 교체하였다. 육안 관찰 결과, 이 공정은 세포 덩어리를 35%의 세포 수까지 감소시켰다. 세포를 추가 2일 동안 인큐베이션한 후, 다시 계대배양하였다. 시딩 후 4시간째의 배지 교체로 구성된 이 선택 공정을 3회 수행한 후, 선택된 세포 집합을 확장시켰다(도 2 및 도 3). 최종 선택 단계에서, 세포를 최종 부피 25 mL의 2x175 cm2 플라스크에 시딩하였다. 시딩 후 다음 4시간째의 배지 교체 후 세포 손실이 감소한 것으로 나타났다.
세포 확장: 세포가 2x175 cm2 플라스크에서 컨플루언스에 도달하면, 세포를 후속하여 확장시켰다. 세포를 15 mL PBS로 세척한 다음, 3 mL HyQTase로 분리하고, 실온에서 약 2분 동안 인큐베이션한다. 완전 성장 배지 10 mL를 첨가하여 분리를 중지시켰다. 이어서, 세포 현탁액을 원심분리하고, 상청액을 흡인하여, 2개의 세포 펠릿을 생성하였다. 각각의 펠릿을 8 mL의 완전 성장 배지에 재현탁시키고, 이 농축된 세포 현탁액 2 mL를 8x175 cm2 플라스크에 첨가하였다. 20 mL의 완전 성장 배지를 첨가하여 플라스크를 제조하여, 1:4의 분할 비율의 총 22 mL 세포 현탁액을 생성하였다. 다음 확장 단계는 동일한 절차를 사용하였으나, 다음과 같이 변경시켰다: 4x175 cm2 플라스크를 1:2의 분할 비율로 확장시키고, 4x175 cm2 플라스크를 1:3의 분할 비율로 확장시켰다. 이로써 총 20 x 175 cm2 플라스크가 생성되었다.
수확: 20 x 175 cm2 플라스크로부터 세포를 수확하였다. 세포를 15 mL의 PBS로 세척한 후, 전술한 바와 같이 3 mL HyQTase로 분리시켰다. 10 mL의 완전 성장 배지를 첨가하여 세포 분리를 중지시키고, 1 x 50 mL 튜브에 첨가된 4 x 175 cm2 플라스크로부터의 세포 현탁액으로 50 mL 튜브에 수집하였다. 이로써 각각 40 mL의 세포 현탁액이 포함된 5 x 50 mL 튜브가 생성되었다. 튜브를 원심분리하여 세포 펠릿을 생성하고, 상청액을 흡인하고, 세포를 10 mL의 완전 성장 배지로 재현탁시켜, 50 mL의 세포 현탁액을 생성하였다.
2 x 50 mL 튜브에 각각의 튜브에 총 25 mL의 세포 현탁액으로 부피를 분할하였다. 1:2로 희석된 샘플을 사용하여, 혈구계 및 톨루딘(트리판) 블루(Toludine(trypan) Blue)를 사용하여 튜브 세포당 생존 세포 수를 계산하였다. 튜브 1 샘플의 생존 세포 수는 1.99 x 106 세포/mL이고, 세포 농도는 3.98 x 106 세포/mL로 산출되었으며, 튜브 2 샘플의 생존 세포 수는 2.4 x 106 세포/mL(총 1 x 108개의 세포)이고, 세포 농도는 4.8x106 세포/mL(총 1.2 x 108개의 세포)로 산출되었다. 따라서, 총 2.2 x 108개의 세포가 수확되었다. 두 튜브를 다시 원심분리하고(6분, 200 x g), 펠릿을 10 mL(튜브 1) 및 12 mL(튜브 2)의 동결 배지에 각각 재현탁시켜, 세포 농도를 1x107 세포/mL로 조정하였다. 2개의 세포 현탁액을 풀링하고, 1 mL 분취량(각각 1x107개의 세포 포함)을 22개의 멸균 저온 바이알에 충전시켰다(표 3).
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그 후, 충전된 바이알을 제어된 동결 속도를 위해 -80℃ 냉동고에서 밤새 새로운 이소프로판올과 함께 동결 챔버로 옮겼다. 이어서 동결된 바이알을 액체 질소 탱크에서 기상 액체 질소로 옮겼다. 10개의 바이알을 드라이아이스로 옮기고 GMP 시설에 기탁하였다.
ATCC로부터의 HEK293 세포를 해동하고, 3회의 계대배양에서의 증가된 부착에 성공적으로 적용시킨 후, 확장시켜, 시드 은행에 성공적으로 기탁하였다. 종자 은행은 외래성 제제(미코플라스마(mycoplasma), 진균 및 박테리아)의 성장 및 존재에 대해 시험되었다. 시험 결과 종자 은행은 GMP 시설의 마스터 세포 기탁에 적합한 것으로 나타났다.
실시예 2 - 상류 공정
상류 공정(예를 들어, 도 4 참조)을 사용하여, 작업 세포 은행으로부터 유래된 중간체를 생성하였고, 상류 공정은 (a) 부착 세포를 배양하는 단계, (b) AAV 바이러스 벡터의 생성을 가능하게 하기 위해 도 1에 도시된 바와 같은 3개의 플라스미드(예를 들어, 본원에 기재된 AAV SMN 포함)로 배양 세포를 형질감염시키는 단계, (c) 부착 세포를 용해시켜, AAV 바이러스 벡터를 단리하는 단계, (d) 여과를 통해 바이러스 입자를 정제하여, 임의의 온전한 세포 또는 세포 잔해를 제거하는 단계, 및 (e) (d)의 정제된 산물을 접선 유동 여과에 적용하는 단계, (f) 정제된 바이러스 입자의 생성된 중간체 제조물을 동결시키는 단계를 포함한다. 대안적인 구현예에서, 본원에 개시된 상류 공정으로 제조된 AAV는 본원에 개시된 바와 같은 SOD1 또는 MECP2를 표적화하는 shRNA를 인코딩한다.
(a) 부착 세포를 배양하는 단계
HEK293 세포를 해동하고, CO2 인큐베이터를 사용하여 일회용 플라스크에서 7회의 계대배양을 통해 확장시켰다. 해동된 세포를 세포 확장 성장 배지로 세척하고, 원심분리하고, 새로운 세포 확장 성장 배지로 재현탁시켰다. 재현탁된 세포를 세포 확장 성장 배지를 포함하는 플라스크에 시딩하고, 인큐베이션하였다.
세포가 컨플루언스에 도달하는 경우, 이를 DPBS로 세척하고, TrypLE Select 효소 용액으로 플라스크로부터 제거하였다. 세포 확장 성장 배지를 첨가하여, 효소 용액을 중화시키고, 현탁된 세포를 분할하여, 세포 확장 성장 배지를 포함하는 새로운 플라스크로 다시 시딩하였다. 이 확장 공정을 7회 반복하였다. 마지막 반복에서, 현탁된 세포를 플라스크에 다시 시딩하지 않았지만, 대신에 세포 슬러리를 추가 확장을 위해 생물반응기에 접종하였다.
접종하기 전에 접종을 위해 iCELLis 500/200 m2 또는 iCELLis 500/333 m2 부착 세포 생물반응기를 제조하였다. 제조 작업에는 일회용 생물반응기의 패키징 해제, 물리적 검사, 누출 시험, 튜브 어셈블리 부착 및 프로브 평형화가 포함되었다. 생물반응기를 평형화하기 위해 세포 확장 성장 배지를 충전시켰다. pH(pH 6.9 내지 pH 7.5), 온도(35℃ 내지 39℃) 및 용존 산소(40% 내지 125%)가 소정의 범위 내에 있는 것으로 확인되면, 생물반응기를 4800 내지 7000 세포/cm2(200 m2 반응기) 또는 5000 내지 12000 세포/cm2(333 m2 반응기)의 표적 시딩 밀도로 시딩하였다. 이전 단계로부터의 세포 슬러리를 재순환 배지 백에서 배지에 첨가하고, 생물반응기를 통해 순환시켰다.
(b) 부착 세포의 형질감염
생물반응기 접종 시점으로부터 제4일, 제5일 또는 제6일에, 부착 HEK293 세포를 삼중 DNA 플라스미드 PEI 공침전으로 형질감염시켰다. 이 형질감염에 사용된 3개의 플라스미드는 pSMN, pAAV2/9 및 pHELP이다. 세포 확장에 사용된 DMEM 성장 배지를 생물반응기로부터 제거하고, 형질감염 배지로 교체한다. 대규모 부착 세포 생물반응기에서 폴리에틸렌이민("PEI") 공침전을 사용하여 부착 인간 배아 신장(HEK293) 세포에 삼중 DNA 플라스미드 형질감염을 사용하여 scAAV9.CB.SMN 벡터를 생성한다. 벡터 플라스미드 pSMN은 인간 생존 운동 뉴런 단백질(SMN)의 cDNA를 포함한다. 이 형질감염에 사용된 3개의 플라스미드는 pSMN(222 mg), pAAV2/9(333 mg), 및 pHELP(444 mg)이다. 플라스미드를 1:1:1 몰의 비율로 형질감염시킬 수 있다. 생물반응기 온도가 30℃를 초과할 때까지, 형질감염 배지를 생물반응기에서 평형화시킨 후, PEI-플라스미드 공침전을 첨가하였다. PEI-플라스미드 공침전 공정은 형질감염 배지에 플라스미드를 첨가하고, 반응 백에 0.2 μ 여과하는 단계를 포함한다. PEI를 형질감염 배지에 첨가한 후 반응 백에 첨가하였다. PEI-플라스미드 비율은 약 1:1 중량비이다. PEI-플라스미드 반응을 수동으로 혼합하여 균일한 현탁액을 형성하고, 15분 내지 30분 동안 반응이 이루어지도록 한다. 반응 시간의 종료 시, PEI-플라스미드 공침전을 반응 백으로부터 생물반응기로 옮겼다. PEI-플라스미드 공침전을 생물반응기에서 1시간 내지 2시간 동안 혼합(대체 기간은 실시예 7에 기재함)한 후, 교반을 재개하였다. 형질감염 배지를 다음 배지 교체 전에 18시간 내지 24시간 동안 생물반응기에서 재순환시켰다.
생물반응기에서의 제6일에 형질감염 18시간 내지 24시간 후, 생물반응기를 배수하고, 형질감염 배지 재순환 배지 백을 형질감염 후 배지로 교체하였다. 생물반응기를 형질감염 후 배지로 재충전하고, 생물반응기에서 재순환시켰다. 제7일에 제6일의 배지 교체 18시간 내지 24시간 후에, 재순환 백 내의 형질감염 후 배지를 새로운 형질감염 후 배지 백으로 교체하였다. 이 단계 동안 생물반응기를 배수시키지 않았다. 배지 재순환은 일반적으로 제9일 수확시까지 계속된다.
(c) 형질감염된 부착 세포의 용해
생물반응기에서 9일 후, 최종 수확 전 샘플을 반응기로부터 채취하고, 총 세포 용해 공정을 개시하였다. 벤조나제를 생물반응기에 최종 농도 100 U/mL로 첨가하였다. 벤조나제를 반응기에서 혼합하고, 용해 완충액을 반응기에 첨가하였다. 용해 완충액을 15℃ 내지 25℃에서 2시간 동안 반응기에서 혼합한 후, 생물반응기의 내용물을 수확 백으로 옮겼다. 벤조나제 반응을 퀀칭하는 염 수크로스 용액(SSS)을 수확 백에 첨가하고, 15분 동안 혼합하였다. 이어서, 생물반응기를 생물반응기 세정 완충액으로 15분 동안 세정하고, 이어서 세정물을 퀀칭된 세포 용해 용액과 함께 수확 수집 백에서 수집하였다. 세정물을 수집 백에 첨가하면, 내용물을 15분 동안 혼합하고, 대량 수확 샘플을 채취하였다.
(d) 여과 및 접선 유동 여과에 의한 바이러스 입자의 제조
혼합된 대량 수확물을 POD 심층 필터를 통해 수집 백 내로 여과하였다. 모든 대량 수확물이 여과되면, 심층 필터를 TFF1 완충액으로 처리하였다. 심층 필터 풀을 혼합하고, 샘플링하였다. 이어서 심층 필터 풀을 0.45 μm 필터를 통해 여과하고, 대량 수확 물질을 추가로 정화시켰다. 이후 0.45 μm 필터를 TFF1 완충액으로 처리하였다.
TFF1 단계의 경우, 300 kDa MW 컷오프 재생 셀룰로스 막 카세트 5.0 m2를 플러싱(flushing)하고, NaOH 용액으로 멸균하고, TFF1 완충액으로 평형화시켰다. 이 작업의 농축 단계는 정화된 수확물의 부피가 약 10x 감소되도록 설계되었다. 표적 보유 부피에 도달하면, 투석여과 작업을 개시한다. 보유물을 6 투석부피의 TFF1 완충액으로 투석여과시켰다. 대안적으로, 보유물을 6 초과의 투석부피의 TFF1 완충액, 예를 들어 10 투석부피, 12 투석부피 또는 15 투석부피로 투석여과할 수 있다. 6 투석부피의 총 투과물 유량이 달성되면, 보유물을 다시 농축시키고, 수집 백으로 수확하였다. 막의 2회 연속 세정을 수행하여, TFF 시스템으로부터 산물 회수를 최대화하여 중간체 약물 물질을 생성하였다.
(e) 중간체의 동결
TFF1 중간체를 LFH 후드에서 1리터 또는 2리터의 멸균 PETG 병에 분취한 후, 드라이아이스 또는 냉동고에서 동결시키고, -60℃ 저장기로 옮겼다.
Figure pct00009
실시예 3 - 하류 공정
하류 공정(예를 들어, 도 5 참조)을 사용하여 TFF1 중간체를 여과된 약물 물질로 가공하였다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 하류 공정을 사용하여, 본원에 기재된 바와 같이 AAV SMN, AAV MECP2, 또는 SOD1을 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 AAV를 포함하는 중간체를 처리할 수 있다. 하류 공정 단계는 (a) 중간체의 산성화 및 정화(여과 사용), (b) 양이온 교환 크로마토그래피를 사용한 정제, (c) 접선 유동 여과("TFF2")에 의한 여과, (d) 충전 및 빈 바이러스 캡시드를 분리하기 위한 CsCl 완충액을 사용한 초원심분리 (e) AAV 바이러스 벡터의 수집, 및 (d) 제2 접선 유동 여과("TFF3") 단계에 의한 수집된 AAV 바이러스 벡터의 여과를 포함한다.
(a) 산성화 및 정화
상류 공정으로부터의 TFF1 중간체 물질(이전에 동결된 경우 실온으로 해동함)을 혼합기를 사용하여 백으로 펌핑하였다. 풀링된 TFF1 중간체를 혼합하고, 역가를 결정하기 위해 샘플을 채취하였다. 풀링된 TFF1 중간체를 11% 내지 14%의 Tween 20을 첨가하여 즉시 처리하였다. Tween 20을 사용하여 산성 pH 조건 하에서 대량의 숙주 세포 단백질 및 DNA의 응집을 촉진시켰다. 혼합물을 12시간 내지 20시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서 산성화 완충액(1M 글리신)을 첨가함으로써 pH를 pH 3.3 내지 pH 3.7로 낮추었다. 이어서, pH를 낮춘 후 형성된 침전물을 1.1 m2 Clarisolve 및 2.2 m2 Millistak + C0HC 심층 필터 및 0.45μm 폴리싱 필터를 통해 용액을 여과함으로써 제거하였다. 이 공정에 의해 산성화 및 정화된 TFF 중간체를 생성하였다.
(b) 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제
양이온 교환(CEX) 크로마토그래피 단계를 사용하여 단백질로부터 바이러스 캡시드, DNA 및 다른 공정 불순물, 예를 들어 숙주 세포 지질, TWEEN 20을 분리하였다. 이 단계는 자동 공정 크로마토그래피 시스템을 사용하여 작동되는 CIMmultus S03-8000 Advanced Composite Column(술포닐)(0.2 μm 기공) 크로마토그래피 컬럼(8.0 L)을 사용하였다. 완충액 및 용액은 다음 표에 기재되어 있다:
Figure pct00010
산성화 및 정화된 TFF 중간체(즉, CEX 로딩)를 세척 및 평형화된 CEX 컬럼에 로딩하였다. 조건은 바이러스 벡터가 모놀리식 컬럼(monolithic column)에 결합하도록하는 것이었다. 결합되지 않은 물질을 CEX A 완충액으로 컬럼으로부터 세척하였다. CEX A 완충액 중 CEX B 완충액의 구배로 수지로부터 산물을 용리시켰다. 용리 구배의 개시시 소정의 부피 2.3 CV 내지 2.7 CV의 10 컬럼 부피(CV)에 대해 분획 1의 수집을 개시하였다. 각 배치 후에 크로마토그래피 컬럼을 폐기하였다(즉, 크로마토그래피 컬럼을 재사용하지 않음). 이어서, CEX 산물 용리액(분획 2)을 중화 완충액을 사용하여 pH 7.7 내지 pH 8.3으로 중화시켰다.
(c) 접선 유동 여과(TFF2)에 의한 여과
TFF2 단계에서 바이러스 벡터를 농축시키고, 단백질 불순물을 제거하고, CsCl 초원심분리 단계를 위해 적절한 완충액으로 완충액을 교체하였다. 중화된 CEX 용리액을 0.3 m2의 300 kDa MWCO 재생 셀룰로스 막이 장착된 TFF 시스템을 사용하여 처리하였다.
중화된 CEX 용리액의 부피를 표적 보유물 부피로 감소시켰다. 표적 보유물 부피에 도달하면, 불연속 TFF 모드(배치 모드)에서 투석여과를 개시시켰다. 보유물을 TFF2 NaCl 투석여과 완충액으로 2배 희석하고, 보유물을 초기 부피로 농축시켰다. TFF2 NaCl 투석여과 완충액에 의한 투석여과가 완료될 때까지 이를 반복하였다. 이어서, 보유물을 TFF2 CsCl 투석여과 완충액으로 2배 희석하고, 보유물을 초기 부피로 농축시켰다. TFF2 NaCl 투석여과 완충액에 의한 투석여과가 완료될 때까지 이를 반복하였다.
보유물을 중화된 CEX 용리액의 물리적 역가, 시스템 보유 부피, 시스템 플러싱(flushing) 부피 및 보유물 밀도를 기반으로 하여 최종 질량으로 추가로 농축시켜, 적절한 표적 벡터 농도를 달성하고, 수집 백으로 회수하였다. TFF2 CsCl 투석여과 완충액에 의한 시스템의 1회 플러싱 사이클에 이어서 산물 블로우 다운(blowdown)에 의해, TFF 시스템으로부터 산물 회수를 최대화하였다. 물리적 역가 측정을 위해 보유물 및 플러싱된 것을 포함하는 TFF2 보유물 샘플을 채취하였다. TFF2 막 카세트를 각각의 배치 후에 폐기하였다(즉, TFF 막은 재사용되지 않았음).
Figure pct00011
(d) CsCl 초원심분리
초원심분리 단계의 목적은 염화세슘 구배 초원심분리를 사용하여 충전 캡시드로부터 빈 캡시드를 제거하는 것이었다. TFF2 보유물을 초원심분리 튜브에 첨가하고, 튜브를 밀봉하였다. 튜브를 자동 Optima XPN 100 초원심분리 시스템 또는 유형 50.2 Ti 로터 또는 균등한 로터가 장착된 균등한 시스템과 같은 초원심분리기에 배치하였다. 충전된 튜브를 20℃에서 22시간 동안 45,000 rpm으로 원심분리하였다.
(e) AAV 바이러스 벡터의 수집
원심분리 단계가 완료된 후, 튜브를 초원심분리기로부터 제거하고, 생체안전 캐비닛에 배치하였다. 튜브를 포함하는 산물을 폐기물 용기 위의 링 스탠드에 장착하였다. 빈 캡시드 밴드(밴드 A, 최상부 밴드), 충전 캡시드 이중체 밴드(밴드 B 및 밴드 C, 이중체의 상단 및 하단 밴드) 및 이중체 아래의 최하 밴드(밴드D)를 시각화하기 위해 램프를 튜브 바로 아래에 배치하였다. 튜브를 통기하기 위해 주사기에 부착된 바늘로 튜브를 천공하고, 밴드 B, C 및 D를 바늘로 제거하였다. 수집된 물질을 수집 백으로 옮겼다. 수집된 초원심분리 풀(UC Pool)을 TFF2 완충액으로 희석하여 TFF2 로딩 물질에서 일정한 출발 CsCl 농도에 도달시켰다. 희석된 UC 풀을 TFF3 단계에서 처리한다. CsCl 초원심분리 단계의 완충액은 하기 표에 열거되어 있다.
Figure pct00012
(f) 접선 유동 여과(TFF3)에 의한 여과
TFF3 단계에서 CsCl을 제거하고, 최종 제형 완충액을 사용하여 전체 벡터를 농축시켰다. 접선 유동 여과 시스템을 50 cm2의 300 kDa MWCO 재생 셀룰로스 막과 함께 사용하였다. 바이러스 벡터는 막에 의해 보유되었다.
희석된 UC 풀의 부피를 표적 보유물 부피로 감소시켰다. 표적 부피에 도달하면, 일정한 보유물 부피의 연속 투석여과를 개시하였다. 보유물을 TFF3 완충액으로 투석여과시켰다. 투석여과된 보유물 샘플을 채취하였다. 물리적 역가 측정. 투과물 중량을 표적으로 하여 보유물을 추가로 농축시켰으며, 이를 1) 투석여과 종료 시 TFF 시스템 내의 보유물의 부피, 2) 희석된 UC 풀 물리적 역가, 3) 표적 약물 물질(DS) 농도, 4) 시스템 플러싱 및 필터 플러싱의 조합 부피, 5) TFF3 완충액의 밀도에 의해 계산하였다. TFF3 막 카세트를 각각의 배치 후에 폐기하였다(즉, 카세트를 재사용하지 않음).
Figure pct00013
TFF3 완충액에 의한 TFF 막의 2회 연속 20 mL 세정를 수행하여 TFF 시스템으로부터 벡터를 회수하였다. 세정물을 0.2 mm Pall Supor® EKV 멸균 등급 필터(Mini Kleenpak)를 통해 회수하였다. TFF3 완충액에 의해 필터 세정을 수행하여, 필터에 잔류하는 임의의 벡터를 회수하고, 여과된 TFF3 풀(즉, 약물 물질 DS)의 최종 부피를 조정하였다. DS를 125 또는 250 mL PETG 병에 분취하고, -60℃ 미만에서 동결시켰다.
실시예 4 - 제형화 및 충전
약물 산물(DP)은 2.0 x 1013 vg/ml의 표적 농도의 단일 투여량의 무보존제의 멸균된 투명 내지 약간 불투명하고, 무색 내지 희미한 백색의 정맥내 주입된 비 복제성 자기 상보성 AAV9 벡터이었다. DP는 20 mM Tris, 1 mM MgCl2, 200 mM NaCl, 0.005% w/v 폴록사머 188을 포함하였다. 용액의 pH 범위는 7.7 내지 8.3이었다.
Figure pct00014
DP를 즉시 사용 가능한 멸균 10 ml Crystal Zenith(CZ) 바이알에 충전하고, 즉시 사용 가능한 멸균 클로로부틸 탄성 마개에 의해 입구를 막고, 멸균 20 mm 플립-오프 알루미늄 씰(flip-off aluminum seal)로 밀봉하였다. 바이알을 5.5 mL 또는 8.3 mL의 공칭 충전 부피로 충전하였다. 표적 과충전은 0.4 mL이었고, 바이알을 5.9 ± 0.1 mL 또는 8.7 ± 0.1 mL로 충전하였다.
실시예 5 - 효능 분석
정량적 생체내 분석을 사용하여 약물 산물의 상대 효능을 측정하였다. 분석에는 SMA 질병의 확립된 마우스 모델이 사용되었다. SMAΔ7 마우스 균주의 번식 쌍(Jackson 연구소, #005025)은 표현형상 정상이지만, 그 자손의 약 25%는 표적화된 SMN 유전자 돌연변이에 대해 동형접합이며, SMA-유사 표현형을 나타낸다. 제5일에 이들은 근육 약화의 징후가 나타나며, 그 다음 주에는 비정상적인 걷기 및 넘어지는 경향이 나타난다. Jackson 연구소는 SMA 유사 표현형을 가진 동물의 중앙값 생존율이 약 15 ± 2일이라고 기록한다. 파일럿 연구에 의해 SMA-유사 표현형을 갖는 비처리 동물의 중앙값 생존율 시간이 16.3일인 것으로 나타났다(기하 평균; n = 3 연구; 연구당 10마리 마우스).
정맥내(IV) 주입에 의해 투여되는 생물학적 활성 약물 산물은 투여량(vg/kg)의 함수인 생존 시간의 증가를 산출한다. 기준 물질(벡터의 이전 배치)과 비교하여 약물 산물 효능을 측정하였다. 약물 산물의 역가 및 기준 물질(벡터 게놈/mL; vg/mL)을 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응(ddPCR)에 의해 결정하였다. SMA-유사 표현형을 갖는 마우스에 투여될 3개의 특정 투여량 수준 각각을 획득하기 위해 벡터를 식염수로 희석하였다.
분석이 적합성을 통과하면 분석 결과를 허용 가능한 것으로 고려한다. 분석 적합성은 다음으로 구성된다:
음성 대조군 샘플에 대한 허용 한계(15 ± 2일, 중앙값 생존율)
양성 대조군 샘플에 대한 허용 한계(40일 초과, 중앙값 생존율)
기준 표준 중앙값 생존율 투여량-반응 곡선에 대한 허용 한계
0.9% 식염수 용액을 사용한 0(제로) 투여량을 포함하는 5개의 상이한 투여량 수준의 약물 산물(이하, 샘플 배치)을 투여하는 경우(비처리 그룹), SMA△7 마우스의 중앙값 생존율(일) 사이의 선형 상관관계를 결정하기 위해 이 연구에서 벡터의 이전 배치(이하, 이전 배치)를 사용하였다. 표 10은 이전 배치 기준 배치를 사용한 보정 곡선을 보여준다.
Figure pct00015
이 연구로부터의 데이터에 의해 중앙값 생존율 투여량-반응 곡선의 선형 범위가 0 vg/kg 내지 7.4 vg/kg인 것으로 나타났다. 이전 배치 기준 표준의 선형 회귀 곡선을 약물 산물 샘플 배치 선형 회귀 곡선과 비교함으로써 약물 산물 샘플 배치의 상대 효능을 확립하였다. 각 선형 회귀선(즉, 기준 표준 및 시험 물품)의 y 절편과 기울기의 비율을 사용하여 이를 확립하였다. 상대 효능 백분율 계산은 아래 식(1)에 제시되어 있다.
RP %= [(시험 물품의 y 절편/기울기) ÷ (기준 표준의 y 절편/기울기)] X 100(1)
단계 1 임상 시험에 사용된 이전 배치를 기준 표준 배치로 사용하였고, 이에 100%의 효능을 배정하였다.
전술한 데이터에 의해, 중앙값 생존율 투여량-반응 곡선의 선형 부분을 사용하여 1차 분석 허용 기준을 확립하여, 다음과 같은 약물 산물 임상 배치의 상대 효능을 결정하였다:
Figure pct00016
5회 투여량(vg/kg) 수준을 사용하여 중앙값 생존율(일) 투여량-반응 곡선을 생성하였다.
Figure pct00017
선형 투여량 반응 모델을 실행하기 위해 투여량 0, 1.2E+13 및 7.4E+13을 선택하였다.
Figure pct00018
식염수(비처리 그룹)에 대한 적합성 한계는 13일 내지 17일의 중앙값 생존율이었다.
Figure pct00019
기준 표준 샘플에 대한 적합성 한계는 다음과 같이 설정되었다:
- 기울기: 2.0E-13 이상
- y-절편: 16.00(일) 이상
- y-절편/기울기 비율: 8.5E+13 이상
- R2: 0.7 이상
Δ7 마우스 모델을 사용하여 약물 산물을 포함하는 SMA 치료제의 효능을 입증하였다. 15일 ± 2일의 중앙값 생존율로, TFF3 완충 용액(비히클)-처리된 대조군 동물은 신뢰할 수 있는 기준선 대조군을 제공하며, 이로부터 중앙값 생존율의 증가로서 산물 효능을 측정할 수 있다. 약물 산물의 개발 작업에 의해, 투여된 투여량(vg/kg)을 log 값으로 변환하고, 처리된 SMAΔ7 신생 마우스의 중앙값 생존율(일)에 대해 그래프화하는 경우, 선형 상관관계를 갖는 마우스 모델의 생존율에 영향을 주는 것으로, 액적 디지털 PCR(ddPCR)을 사용하여 게놈 역가에 의해 결정된 세(3) 개의 투여량(비히클 처리 투여량 제외)을 확인하였다. 낮은, 중간 및 높은 역가 표준에 대해서는 표 11의 표준 역가(vg/mL)를 참조한다. 또한 TFF 완충액(비히클) 용액을 음성 대조군뿐만 아니라, 제로(0) 보정 곡선 포인트 둘 모두에 사용한다. 40일 이상의 생존율을 나타내는 투여량(중앙값 생존율의 배가를 나타내는 투여량을 초과함)이 또한 양성 대조군으로 포함되었다.
Figure pct00020
투여량 용액 제조(희석 방법 예에 대해서는 표 12 참조).
음성 대조군 -- 음성 대조군으로서 TFF3 완충 용액(약물 산물 최종 제형 완충액)을 사용한다
양성 대조군 -- 시험 물품 항목번호를 TFF3 완충 용액을 사용하여 1.10x1014 vg/kg에서 제조한다. 희석 방법 예는 표 12를 참조한다.
기준 표준 용액 -- 기준 표준 항목번호를 TFF3 완충 용액을 사용하여 표 11에 제시된 3개의 농도로 제조한다.
Figure pct00021
시험 물품 제조 -- 시험 물품을 TFF3 완충 용액을 사용하여 희석하였다. 희석액을 계산하여 최종 총 부피를 50 μl로 하여 마우스당 표 11에 제시된 시험 투여량(vg/kg)을 생성하였다. 처리된 마우스의 최소 수명을 40일 이상의 중앙값 생존율(일)로 증가시키는 것을 표적으로 하여, 양성 대조군으로서 하나의 추가 부피에 의해 해당 시점에 12마리의 마우스를 위해 희석액을 제조하였다.
대조군 샘플에 대한 허용 한계
음성 대조군(비처리 마우스) -- 음성 대조군 그룹에 대한 분석 허용 한계는 SMAΔ7 마우스가 15 ± 2일의 중앙값 생존율에 부합하는 것이었다. 추가로 10일 이하 내에 치사된 임의의 마우스는 분석에서 제외될 것이다.
양성 대조군(표적 임상 투여량으로 처리된 그룹) -- 양성 대조군 그룹에 대한 분석 허용 한계는 처리된 마우스의 최소 수명이 40일 이상의 중앙값 생존율이어야 한다는 것이었다. 추가로 10일 이하 내에 치사되는 임의의 마우스는 분석에서 제외될 것이다.
기준 표준 투여량 반응 곡선에 대한 허용 한계
투여된 투여량(vg/mL)에 대한 중앙값 생존율(일)을 그래프화한 기준 표준 선형 투여량 반응 곡선에 대해 분석 적합성 기준을 결정할 것이다. 분석 적합성 기준은 표 13을 참조한다.
Figure pct00022
Y-절편/기울기 비율 -- 기준 표준 및 시험 물품에 대한 중앙값 생존율(일) 대 투여된 투여량(vg/kg)의 선형 회귀 곡선을 결정한다. 각 선형 회귀에 대한 y 절편 대 기울기의 비율을 계산한다.
기록 결과
상대 효능 결과의 정성적 기록 -- 분석 적합성 기준을 각 분석에 대해 평가한 후, 양성 대조군 물질에 대해 40일 이상에서 판독된 단일 포인트 중앙값 생존율(일)을 결정한다. 양성 대조군 그룹의 중앙값 생존율이 40일 이상인 경우, 하기의 기준에 부합하면 시험 물품을 폐기할 수 있다.
상대 효능 결과의 정량적 기록 -- 분석 적합성 기준을 각 분석에 대해 평가한 후, 시험 물품에 대해 상대 효능의 정량적 결정을 수행한다. 양성 대조군이 40일 이상에 도달하고, 7.5x1013 vg/kg의 상위 표준 투여량을 나타내는 마우스 그룹에 대해 중앙값 생존율이 31±3일에 도달하면 시험 물품에 대한 상대 효능을 기록할 수 있다. 시험 물품에 대한 상대 효능 백분율(RP%)를 다음과 같이 중앙값 생존율(일) 투여량-반응의 선형 회귀의 y 절편 및 기울기를 사용하여 계산할 것이다:
RP%= 100% * [(시험 물품 y-절편/기울기) ÷(기준 표준 y-절편/기울기)]
실시예 6: 계면활성제 불활성화 연구
낮은 pH 및 Tween의 영향을 분리하기 위해, 계면활성제 불활성화 연구를 위해 pH 7.6 및 4% 내지 8% Tween-20을 갖는 약물 물질 TFF1 중간체의 샘플을 사용하였다. TFF1 중간체의 Tween-20 농도는 산성화 전에 Tween-20을 TFF1 중간체에 첨가하는 경우, 전체 공정에서보다 약 2.5배 더 낮다. 이렇게 더 낮은 Tween-20 농도를 약물 물질 공정에서 계면활성제 유도 불활성화에 대한 최저의 경우의 조건으로 고려하였다.
계면활성제 처리에 의한 바이러스 불활성화 단계에 대한 시험 물품은 4% 내지 8% Tween-20을 포함하는 TFF-1 중간체였다. 계면활성제 처리 단계에 의한 바이러스 불활성화 능력을 평가하기 위해, XMuLV 및 PRV를 각각 사용하여, 이중 반복실험에서 바이러스로 시험 물품을 스파이킹하였다. 플라크-형성 감염성 분석을 사용하여 바이러스를 정량하였다.
TFF1 제조 단계는 4% 내지 8% Tween-20의 계면활성제 농도 범위를 생성한다. TFF1 중간체를 풀링하고, 16℃ 내지 20℃의 수행 온도에서 TFF1 중간체에 12% 더 많은 Tween-20을 첨가하고, 12시간 내지 20시간 동안 혼합하였다. 바이러스 배출 공정을 4% 내지 8% Tween-20의 농도 및 16.0℃ ± 0.1℃의 제어된 온도에서 수행하였다. 불활성화 공정의 지속시간은 120분이었고, 통상적인 공정 시간은 16시간이었다.
불활성화 공정의 경우, 시험 물품의 부피를 측정하고, 표적 온도로 평형화한 후, 바이러스로 스파이킹함으로써, 불활성화 로딩을 제조하였다. 스파이킹된 불활성화 로딩의 샘플을 여섯(6)개의 시점에서 제거하여, 시간 경과에 따른 불활성화의 동역학을 입증하였다: 1분, 15분, 30분, 60분, 90분, 및 120분 미만. 수집 후, 각각의 샘플을 성장 배지에 희석시켜, 바이러스 불활성화를 중지시키고, 바이러스에 대해 분석하였다. 90분 및 120분째에 분석 감도를 증가시키기 위해, 또한 대량의 이들 시점 샘플을 바이러스에 대해서 분석하였다. 이 단계의 시험 물품에의 Tween-20의 존재로 인해, 스파이킹 바이러스의 역가 및 스파이킹 바이러스의 부피로부터 불활성화 로딩의 역가를 계산하였다.
계면활성제 처리(Tween-20)에 의한 바이러스 불활성화의 효과가 90분 시점에서 두 바이러스 모두에 대해 4 log10보다 큰 LRV 값에 의해 제시된 바와 같이 효과적인 것으로 나타났다. 계면활성제 처리에 의한 불활성화의 동역학은 Tween-20 계면활성제 처리 동안 120분에 걸친 바이러스 불활성화 속도의 그래프로서 도 6 및 도 7에 도시되어 있다.
실시예 7: 약물 물질의 생성에 대한 더 높은 시딩 밀도, 형질감염 및 수확 초기 및 DNA/PEI 혼합 시간의 효과
DS 생성에 대한 더 높은 시딩 밀도, 형질감염 및 수확 당일 초기 및 DNA/PEI 혼합 시간의 효과를 평가하였다. 각각의 조건은 1.6 m2 생물반응기에서 이중 반복실험으로 평가하였다.
재료 및 방법
세포 규모 확장
HEK 293 세포를 해동하고, 10% FBS가 보충된 DMEM에 재현탁시켰다. 세포를 실온에서 209 x g에서 5분 동안 원심분리한 후, 상청액을 제거하고, 새로운 DMEM+10% FBS를 첨가하였다. 세포를 생존 세포 밀도 및 생존율에 대해 계수하고, 2 x T175 cm2 플라스크에 시딩하고, 배양물이 약 90% 컨플루언스에 도달할 때까지 3일 동안 37.0℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 각각의 세포 계대배양에 대해, 소모된 배지를 제거하고, 플라스크를 0.08 mL/cm2에서 PBS(-CaCl2,-MgCl2)로 세척한 다음, 플라스크를 TrypLE Select(0.04 mL/cm2)로 처리하고, 37.0℃, 5% CO2에서 2분 내지 3분 동안 인큐베이션하였다. 트립신을 DMEM+10% FBS(0.04 mL/cm2)로 퀀칭하였다. 세포를 도 8의 다이어그램에 따라 확장하여, 시딩하였다.
세포 접종 및 모니터링
성장 배지(고 글루코스의 DMEM + 10% Australian Origin FBS + 1:100 페니실린 스트렙토마이신(Pen Strep))에서 8,000 세포/cm2 및 12,000 세포/cm2의 표적 밀도에서 HEK 293 세포에 의해 생물반응기를 이중 반복실험으로 접종하고 교반하였다. 공정 매개변수를 pH 7.23, 37.0℃, 55% 용존 산소(DO) 및 2 cm/s의 선형 속도로 설정하였다. 시딩 24시간 후, DMEM 성장 배지(0.188 mL/cm2)로의 재순환을 재순환 속도(12.5 mL/분)로 작동시켰다. 매일 채취한 샘플을 오프라인 pH, 대사산물 및 영양소에 대해 Nova BioFlex를 사용하여 판독하였다. 시딩 후 제4일(12,000 세포/cm2), 제5일(8,000 세포/cm2) 및 제9일에, 3개의 섬유를 제거하고, 1:1:1 v/v PBS, A100 및 B100 용액(ChemoMetec)으로 용해시키고, 총 핵에 대해 계수하여(NucleoCounter NC-200), 배양 성장을 모니터링하였다.
형질감염
세포 접종 후 제4일(12,000 세포/cm2) 및 제5일(8,000 세포/cm2)에, 재순환을 중지시키고, 각 생물반응기의 세포를 플라스미드 DNA 및 폴리에틸렌이민(PEI)으로 형질감염시켰다. DNA 및 PEI를 1:1 mg/mg 비율로 혼합하였다. 플라스미드 DNA를 pSMN 플라스미드와 1:1.5:2 질량비로 형질감염시키고, pAAV2/9 플라스미드 및 pHELP 플라스미드를 DMEM-/-배지; 고 글루코스, -CaCl2, -L-글루타민에 첨가하고, 0.2 μM 여과하고, 뒤집어서 혼합하였다. PEI를 DMEM-/-배지에 첨가하고, 뒤집어서 혼합하였다. 이어서 PEI를 DNA에 첨가하고, 뒤집어서 혼합하고, 8,000 세포/cm2(대조군) 및 12,000 세포/cm2에 대해 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. DNA/PEI를 다른 2개의 8,000 세포/cm2 조건에 대해 1시간 및 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이 DNA/PEI 복합체 혼합물을 사용하여, 4개의 조건 각각에 대해 2개의 생물반응기를 형질감염시켰다. DNA/PEI 복합체를 각각의 생물반응기에 첨가하고, 2시간 동안 공정 매개변수에서 인큐베이션하였다. 형질감염 2시간 후 재순환 루프를 다시 작동시켰다.
형질감염 후 배지 교체
형질감염 24시간 후, 생물반응기 및 재순환 루프 내의 모든 배지를 제거하고, OptiMEM + 1:100 Pen Strep(0.132 mL/cm2)으로 교체하고, 공정 매개변수에서 24시간 동안 재순환시켰다. 형질감염 48시간 후 모든 배지를 단지 재순환으로부터 제거하고, OptiMEM + 1:100 Pen Strep(12 mL/분)으로 교체하고, 공정 매개변수에서 재순환시켰다.
수확
세포 접종 후 제8일(12,000 세포/cm2) 및 제9일(8,000 세포/cm2)에, 벤조나제(100 U/mL)를 첨가하고, 용해 완충액(50 mM HEPES, 1% Tween 20)으로 처리하고, 공정 매개변수에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 생물반응기를 배수하고, 수크로스 염 용액(500mM NaCl, 1% w/v 수크로스)을 첨가하고, 이를 뒤집어서 혼합하였다. 생물반응기를 공정 매개변수에서 약 15분 동안 생물반응기 세정 완충액(500 mM NaCl, 1% w/v 수크로스, 20 mM Tris Base, 1% v/v Tween 20, 1 mM MgCl2.6H2O)으로 세척하였다. 생물반응기를 배수하고, 생물반응기 세정 완충액을 미정제 대량 수확물로 풀링하고, 뒤집어서 혼합하고, ddPCR 분석을 위해 샘플링하였다.
심층 여과 및 접선 유동 여과
제8일(12,000 세포/cm2) 및 제9일(대조군 8,000 세포/cm2)에, 세포 접종 후 생물반응기를 수확하고, 샘플링하고, 미정제 용해물을 각각의 조건에 대해 풀링하였다(n=2 생물반응기). 이어서 풀링된 용해물을 Millistak C0HC Pod, 270cm2 필터 및 Millipak 40, 0.45 μm, Durapore, 200 cm2 폴리싱 필터(EMD Millipore)를 통해 정화시켰다. C0HC+0.45 후 샘플을 채취하여 -80.0℃에서 동결시켰다. 이어서, 정화된 용해물을 접선 유동 Pellicon® 2 한외여과 모듈 PLCMK C 0.1m2 필터(EMD Millipore)를 통해 농축시켰다. 적어도 6 투석부피를 사용하여, 최종 산물을 투석여과하였다. TFF1 여과 후 샘플을 획득하고, -80.0℃에 동결시켰다. 모든 샘플을 AAV2/9 역가 및 숙주 세포 단백질에 대해 제출하였다.
플라스미드를 사용하여 생물반응기에서 DS를 생성시켰다. 데이터는 표 14에 제시된 이중 반복실험의 각각의 조건, 해당 생물반응기 번호 및 조건을 나타낸다.
Figure pct00023
세포 성장: 시딩 당일(0일)에 세포를 계수하고, 시딩 후 제4일(12,000 세포/cm2), 제5일(8,000 세포/cm2) 및 제9일에 핵을 계수하였다. 데이터는 모든 반응기의 세포가 제0일 내지 제5일에 급격하게 성장했음을 나타낸다. 형질감염 후, 제9일의 핵 계수는 생물반응기(221)이 제5일 내지 제9일에 총 핵이 2.0배 증가한 것을 시사한다. 다른 모든 반응기(222 내지 228)는 제5일 내지 제9일에 유의한 성장을 나타내지 않았다. 생물반응기(221)에서 성장의 증가는 총 핵 계수에 사용된 개별 섬유상의 세포의 불균일한 분포를 기반으로 한 부산물일 수 있다. 모든 생물반응기의 세포는 도 9a 내지 도 9e에 도시된 대사산물 데이터를 기반으로 하여 유사하게 성장할 수 있다.
pH, 영양소 및 대사산물: 글루코스 소모는 모든 생물반응기 배양에서 동일한 경향을 보였으며, 이는 생물반응기(221) 성장 곡선의 증가에도 불구하고, 세포가 유사한 속도로 글루코스를 소모함을 시사한다. 12,000 세포/cm2에서 시딩된 생물반응기의 pH는 평균 7.06이고, 8,000 세포/cm2의 경우에는 처음 3일 동안 평균 7.18이었다. 영양소 대사가 증가함에 따라 pH가 약간 감소하였고, 암모늄 이온 수준의 상승과 동시에 제9일까지 증가하였다. 락테이트는 제5일(생물반응기(221, 223, 224, 225, 227)) 및 제6일(생물반응기(222, 226, 228))까지 증가한 후, 생성 종료 시까지 균일하였으며, 이는 이 단계에서 락테이트가 에너지 공급원으로 활용됨을 시사한다.
생성 역가
수확 물질로부터의 바이러스 게놈을 디지털 액적(ddPCR)에 의해 측정하였다. 역가는 평균 역가 측정치가 4.33E+10 vg/mL(n=2)인 8,000 세포/cm2에서 시딩된 대조군 생물반응기와 비교하여, 평균 역가 측정치가 6.37E+10 vg/mL(n=2)인 12,000 세포/cm2에서 시딩된 생물반응기에서 약 1.5배 더 높았다. 역가 데이터는 더 높은 밀도의 시딩, 1일 빠른 형질감염 및 수확이 더 높은 DS 생성 수율을 지원함을 시사한다. DNA/PEI가 20분 동안 인큐베이션된 대조군(4.33E10 vg/mL n=2)과 비교하여, 1시간 동안 인큐베이션된 DNA/PEI에 대한 역가 수율은 측정된 평균 역가의 1.4배 감소(3.17E10 vg/mL n=2)를 나타내었고, 2시간 인큐베이션 평균 역가는 1.6배 감소(2.67E10 vg/mL n=2)하였다. 데이터에 따르면 인큐베이션 시간이 더 길어지면 역가가 감소하는 것으로 나타난다. 이는 HEK293 세포를 효율적으로 형질감염시킬 수 없는 대형 복합체를 형성하는 DNA 및 PEI 때문일 수 있다. 양성 대조군으로서 공지된 공정에서의 생성과 비교하여, mL 당 바이러스 생성 및 표면적 값이 도 10에 제공된다.
정화 및 농축 단계의 각 단계에서 측정된 바이러스 역가는 도 11에 도시되어 있다. TFF1 단계 동안 각 단계에서 잔여 숙주 세포 단백질은 도 12a 내지 도 12b에 도시되어 있다.
실시예 8: 약물 물질의 생성에 대한 시딩 밀도의 효과
DS의 생성에 대한 시딩 밀도의 효과를 평가하였다. 4개의 시딩 밀도를 평가하였고, 각 시딩 밀도는 생물반응기에서 2배였다.
세포 규모 확장
HEK 293 세포를 해동하고, 10% FBS가 보충된 DMEM에 재현탁시켰다. 세포를 실온에서 209 x g에서 5분 동안 원심분리한 후, 상청액을 제거하고, 새로운 DMEM+10% FBS를 첨가하였다. 세포를 생존 세포 밀도 및 생존율에 대해 계수하고, 2 x T175 cm2 플라스크에 시딩하고, 배양물이 약 90% 컨플루언스에 도달할 때까지 4일 동안 37.0℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 각각의 세포 계대배양에 대해, 소모된 배지를 제거하고, 플라스크를 0.08 mL/cm2에서 PBS(-CaCl2, -MgCl2)로 세척한 다음, 플라스크를 TrypLE Select(0.04 mL/cm2)로 처리하고, 37.0℃, 5% CO2에서 2분 내지 3분 동안 인큐베이션하였다. 트립신을 DMEM+10% FBS(0.04 mL/cm2)로 퀀칭하였다. 세포를 도 13의 다이어그램에 따라 확장하여, 시딩하였다.
세포 접종 및 모니터링
700 ml 성장 배지(고 글루코스의 DMEM + 10% Australian Origin FBS + 1:100 Pen Strep)에서 각각 이중 반복실험으로 4개의 표적 밀도: 8,000 세포/cm2, 9,350 세포/cm2, 10,700 세포/cm2 및 12,050 세포/cm2에서 HEK 293 세포에 의해 생물반응기를 접종하고 교반하였다. 공정 매개변수를 pH 7.23, 37.0℃, 55% 용존 산소(DO) 및 2 cm/s의 선형 속도로 설정하였다. 시딩 24시간 후, DMEM 성장 배지(현재 0.188 mL/cm2 총 부피)로의 재순환을 재순환 속도(12.5 mL/분)로 작동시켰다. 매일 채취한 샘플을 오프라인 pH, 대사산물 및 영양소에 대해 Nova BioFlex 400을 사용하여 판독하였다. 시딩 후 제5일 및 제9일에, 3개의 섬유를 제거하고, 1:1:1 v/v PBS, A100 및 B100 용액(ChemoMetec)으로 용해시키고, 총 핵에 대해 계수하여(NucleoCounter NC-200), 배양 성장을 모니터링하였다.
형질감염
세포 접종 후 제5일에, 재순환을 중지시키고, 각 생물반응기 챔버(재순환 병 아님) 내부의 배지를 600 ml DMEM-/-배지(고 글루코스, -CaCl2, -L글루타민)로 교체하였다. 각 반응기를 1:1 질량비의 플라스미드 DNA 및 폴리에틸렌이민(PEIpro)으로 형질감염시켰다. 플라스미드 DNA를 pSMN 플라스미드와 1:1.5:2 질량비(pSMN-3.56 mg, pAAV2/9-5.34 mg, 및 pHELP-7.1 mg)로 혼합하고, 300 mL DMEM-/-배지에 첨가하고; 0.2 μM 여과하고, 뒤집어서 혼합하였다. PEI(16 mL)를 300 mL DMEM-/-배지에 첨가하고, 뒤집어서 혼합하였다. 이어서 PEI 및 DNA 혼합물을 조합하고, 뒤집어서 혼합하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 각각 600 ml PEI/DNA 복합체 혼합물을 사용하여, 2개의 생물반응기를 형질감염시키고, 각각의 해당 시딩 밀도에서 이를 반복하였다. PEI/DNA 복합체를 각각의 생물반응기에 첨가하고, 2시간 동안 공정 매개변수에서 인큐베이션하였다. 재순환 루프를 형질감염 2시간 후 다시 작동시켰다(12.5 mL/분).
형질감염 후 배지 교체
형질감염 24시간 후, 생물반응기 및 재순환 루프 내의 모든 배지를 제거하고, OptiMEM(0.132 mL/cm2)으로 교체하고, 공정 매개변수에서 24시간 동안 재순환시켰다(12.5 mL/분). 형질감염 48시간 후 재순환 병 내의 배지를 새로운 OptiMEM으로 교체하고, 공정 매개변수에서 재순환시켰다(12 mL/분).
수확
세포 접종 후 제9일에, 벤조나제(100 U/mL)를 첨가하고, 용해 완충액(50 mM HEPES, 1% Tween 20)으로 처리하고, 공정 매개변수에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 생물반응기를 배수하고, 수크로스 염 용액(500 mM NaCl, 1% w/v 수크로스)을 첨가하고, 이를 뒤집어서 혼합하였다. 생물반응기를 공정 매개변수에서 약 15분 동안 생물반응기 세정 완충액(500 mM NaCl, 1% w/v 수크로스, 20 mM Tris Base, 1% v/v Tween 20, 1 mM MgCl2.6H2O)으로 세척하였다. 생물반응기를 배수하고, 생물반응기 세정 완충액을 미정제 대량 수확물로 풀링하고, 뒤집어서 혼합하고, ddPCR 분석을 위해 샘플링하였다.
플라스미드를 사용하여, 생물반응기에서 약물 물질을 생성하였다. 반응기를 다양한 밀도로 시딩하고, 동일한 일정(각각 시딩 후 제5일, 제9일)에 형질감염시키고, 수확하였다. 데이터는 하기 표 15에 제시된 바와 같이 각 시딩 밀도의 2배를 나타낸다:
Figure pct00024
세포 성장: 시딩 당일(0일)에 세포를 계수하고, 시딩 후 제5일 및 제9일에 핵을 계수하였다. 데이터는 모든 반응기의 세포가 제0일 내지 제5일에 급격하게 성장했음을 나타낸다. 출발 시딩 밀도의 차이에도 불구하고, 핵 계수는 제5일에 그룹들 사이에 세포 수의 큰 차이를 나타내지 않는다. 형질감염 후, 제9일의 핵 계수는 5개의 반응기(221, 224, 225, 226, 228)가 제5일 내지 제9일에 총 핵이 배가되었음을 시사한다. 2개의 반응기(222, 223)는 도 14a에 도시된 바와 같이, 총 핵이 1.4배 증가하였다. 반응기(227)는 제5일 내지 제9일에 총 핵이 3.8배 증가하였다. 이 차이는 계수에 사용된 개별 섬유 사이의 세포의 불균일한 분포를 기반으로 한 부산물일 수 있다. 모든 반응기의 세포는 도 14b 내지 도 14e에 도시된 대사산물 데이터를 기반으로 하여 유사하게 성장할 수 있다.
pH, 영양소 및 대사산물: 글루코스 소모(도 14b)는 모든 생물반응기 배양에서 동일한 경향을 보였으며, 이는 출발 시딩 밀도의 차이에도 불구하고, 글루코스가 배양에 유사한 속도로 소모되었음을 시사한다. 모든 배양에서 처음 3일 동안 오프라인 pH(도 14c)는 일정하게 유지되었고(pH 7.25), 영양소 대사 증가에 따라 감소하였고, 8일 후 암모늄 이온 수준의 상승과 동시에 증가하였다(도 14e). 락테이트(도 14d)는 제6일까지 증가한 다음, 생성 종료 시까지 균일하게 유지되며, 이는 이 단계에서 락테이트가 에너지 공급원으로 활용됨을 나타낸다. 상이한 출발 밀도에서 시딩된 반응기 사이에 대사산물 프로파일의 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 이는 출발 시딩 밀도의 차이가 최소 1.2배 미만만큼 차이가 나기 때문일 수 있다.
생성 역가
수확 물질로부터의 바이러스 게놈을 디지털 액적(ddPCR)에 의해 측정하였다. 역가는 각각 평균 3.99E+10 ± 2.1E+09 vg/mL(n=2) 및 3.70E+10 ± 7.4E+09 vg/mL(n=2)로서, 8,000 세포/cm2 및 10,070 세포/cm2의 출발 시딩 밀도 사이에 근사하였다. 불명의 이유로, 9,350 세포/cm2에서 시딩된 반응기는 평균 역가 측정치 5.02E+08 vg/mL(n=2)를 나타내었으며, 근사한 밀도에서 시딩된 반응기의 평균 역가보다 대략 2 log 더 낮았다. 이러한 차이는 이 시딩 밀도에서 생성성이 부족하기보다는 형질감염 또는 수확 중 미확인된 수행 오류의 결과일 수 있다. 12,050 세포/cm2에서 시딩된 이중 반복실험 반응기는 서로에 대해 2배의 차이를 나타내었고, 하나의 반응기는 더 낮은 시딩 밀도에 대해 관찰된 범위 내인 3.2E+10 vg/ ml였으며, 두 번째 반응기는 단지 1.4E+10 vg/ ml의 역가를 생성하였다. mL당 바이러스 생성 및 표면적 값은 도 15a에 제공된다.
시딩 밀도 및 DS의 생성을 도 15b에 도시된 바와 같이 평가하였다. 8E+03 내지 10E+03 세포/cm2의 범위에서 시딩된 HEK 293 세포는 일관된 성장 프로파일, pH, 글루코스 소모, 락테이트 및 암모니아 생성을 나타냈다. 추가로, 근사한 역가가 생성되었으며, 이는 약간 더 높은 시딩 밀도가 생성에 부정적인 영향을 미치지 않음을 시사한다. 이와 달리, 12x103 세포/cm2의 더 높은 밀도에서 시딩된 반응기는 다른 조건과 비교하여 더 낮은 평균 역가를 포함하여 이중 반복실험 사이에 더 많은 변동성을 나타내었고, 이는 본 실험에 사용된 접근법이 생성에 최적이 아닐 수 있음을 시사한다. 이들 결과는 생물반응기 실험에서 8x103 내지 1x104 세포/cm2 범위의 밀도에서의 시딩 세포를 뒷받침한다.
실시예 9: 비교 평가
단계 1 임상 연구에서 사용된 AVXS-101 약물 산물(공정 A)과 주 임상 연구에서 사용된 약물 산물(공정 B) 사이의 비교를 약물 산물 항목번호 600156 및 600307을 비교함으로써, 공정 B를 사용하여 제조 일관성을 평가하기 위한 2차 대상과 함께 1차 대상으로서 평가하였다. 도 16은 단계 1(공정 A) 및 단계 3 시험(공정 B) 제조 공정 흐름 및 이들의 차이점을 나타낸다.
미국 전국 어린이 병원(NCH)에서 제조된 단계 1 임상 약물 산물 항목번호 NCHAAV9SMN0613 및 AveXis에서 제조된 약물 산물 항목번호 600156을 사용하여 비교 평가를 수행하였다.
산물
하기 항목번호 물질을 표 16에 요약된 바와 같이 평가하였다. 평가는 공정 A를 사용하여 단계 1 임상 약물 산물 항목번호 NCHAAV9SMN0613 및 공정 B를 사용하여 AVXS-101 약물 산물 항목번호 600156으로부터의 품질 특성의 직접적인 비교를 포함하였다. 추가로, 항목번호 600156과 항목번호 600307의 방출 시험 결과를 규모 확장 공정 재현성 및 일관성에 대해 전체적으로 평가하였다.
Figure pct00025
제조 공정 개요
도 17a 내지 도 17b는 비교 결과의 요약을 제공한다.
비교 및 제조 일관성 평가
근사한 것으로 평가된 공정 A 및 공정 B 물질 및 공정 B 물질은 일관성이 있는 것으로 평가되었다. 공정 B 물질은 또한 예를 들어 산업 규모의 생성에 대해 추가 이점을 갖는 것으로 결정되었다.
시험 방법
pH
항목번호 NCHAAV9SMN0613(공정 A), 항목번호 600156(공정 B) 및 항목번호 600307(공정 B)에 대해 pH 분석을 수행하였다. 두 공정 모두의 결과는 7.9 내지 8.0의 범위였다. 이는 공정 A 및 공정 B 물질의 pH가 근사하고, 공정 B 물질이 일관성이 있음을 나타내었다.
외형
항목번호 NCHAAV9SMN0613(공정 A), 항목번호 600156(공정 B) 및 항목번호 600307(공정 B)에 대해 육안 관찰에 의한 외형을 수행하였다. 공정 A와 공정 B 사이의 외형 결과의 명백한 차이는 상이한 벡터 농도(게놈 역가) 때문이었다. 항목번호 NCH AAV9SMN0613은 공정 B 항목번호보다 벡터 농도가 더 낮았다. 결과적으로, 항목번호 NCH AAV9SMN0613은 더욱 희석되어 더욱 투명한 무색의 용액을 생성하였고, 공정 B 항목번호에 대한 무색 내지 백색의 약간 불투명한 관찰 결과는 mL당 용액 중 바이러스 입자의 약 4배 농도로부터 야기된다.
농도 차이를 고려하여, 공정 A 및 공정 B 물질의 외형은 근사한 것으로 평가되었고 공정 B 물질은 일관성이 있는 것으로 평가되었다.
삼투몰농도
항목번호 NCHAAV9SMN0613(공정 A), 항목번호 600156(공정 B) 및 항목번호 600307(공정 B)에 대해 어는점 내림에 의한 삼투몰농도를 수행하였다. 두 공정 모두의 결과는 410 mOSm/kg 내지 415 mOSm/kg 범위였다. 이는 공정 A 및 공정 B 물질의 삼투몰농도가 근슷하고, 공정 B 물질이 일관성이 있음을 나타내었다.
가시영역이하 입자
항목번호 NCHAAV9SMN0613(공정 A), 항목번호 600156(공정 B) 및 항목번호 600307(공정 B)에 대해 광 차단에 의한 가시영역이하 입자를 수행하였다. 두 공정 모두의 결과는 주사용 약물 산물에 대한 USP 모노그래프의 권장 한계보다 훨씬 낮았다. 이는 공정 A 및 공정 B 물질에 대한 가시영역이하 입자 계수가 근사하고, 공정 B 물질이 일관성이 있음을 나타내었다.
게놈 역가
항목번호 NCHAAV9SMN0613(공정 A), 항목번호 600156(공정 B) 및 항목번호 600307(공정 B)에 대해 ddPCR에 의한 게놈 역가를 수행하였다. AVXS-101 항목번호의 게놈 역가는 제조시 표적 농도에 따라 변동될 것으로 예상되었다. 공정 B에 의해 생성된 게놈 역가(3.7 x 1013 vg/mL 및 4.0 x 1013 vg/ml)는 공정 A보다 적어도 3배 더 높았으므로(1.1 x 1013 vg/mL), 공정 B는 AVXS-101의 대규모 제조에 더 적합한 방법이었다.
감염 역가
항목번호 NCHAAV9SMN0613(공정 A), 항목번호 600156(공정 B) 및 항목번호 600307(공정 B)에 대해 TCID50에 의한 감염 역가를 수행하였다. 공정 B(1.3 x 1010 IU/mL 및 6.7 x 109 IU/ml)는 공정 A(5.9 x 1010 IU/mL)보다 평균 66% 더 높은 감염 역가로 생성되며, 이는 rAAV, 예를 들어, AVXS-101의 대규모 제조에 유리할 수 있다.
총 단백질
항목번호 NCHAAV9SMN0613(공정 A), 항목번호 600156(공정 B) 및 항목번호 600307(공정 B)에 대해 마이크로 BCA에 의한 총 단백질을 수행하였다. 1.0 x 1013 vg/mL로 정규화된 두 공정 모두의 결과는 167 μg/mL 내지 179 μg/mL 범위였다. 정규화된 총 단백질 값은 공정 A 및 공정 B 물질이 근사하고, 공정 B 물질이 일관성이 있음을 나타내었다.
생체내 상대 효능
항목번호 NCHAAV9SMN0613을 분석을 위한 기준 물질로 사용하였다. 기준 표준 곡선을 기반으로 하여, 항목번호 600156 및 항목번호 600307에 대해 획득된 각각의 효능 결과는 각각 97% 및 96%였다. 이들 결과는 공정 A 및 공정 B 물질이 근사하고, 공정 B 물질이 일관성이 있음을 나타내었다.
웨스턴 블롯에 의한 확인
항목번호 NCHAAV9SMN0613(공정 A), 항목번호 600156(공정 B) 및 항목번호 600307(공정 B)에 대해 웨스턴 블롯에 의한 확인을 수행하였다. 주 밴드(VP1, VP2 및 VP3)에 대한 블롯 프로파일 및 겉보기 분자량 값은 공정 A 및 공정 B 물질에서 근사한 것으로 평가되었고, 또한 공정 B 물질이 일관성이 있는 것으로 평가되었다.
AUC에 의한 빈 캡시드 %
항목번호 NCHAAV9SMN0613(공정 A), 항목번호 600156(공정 B) 및 항목번호 600307(공정 B)에 대해 AUC에 의한 빈 캡시드 %를 수행하였다. 항목번호 NCHAAV9SMN0613(공정 A)의 결과는 7%이었다. 항목번호 600156 및 600307(공정 B)에 대한 결과는 각각 2% 및 4%였다. 공정 B(2% 및 4%)는 AUC에 의해 측정시 공정 A(7%)보다 약 2배 적은 빈 캡시드를 생성하였다. 따라서, 공정 B는 더 낮은 농도의 빈 캡시드를 포함하는 개선된 조성물을 생성할 수 있었다.
SDS-PAGE에 의한 확인 및 순도
항목번호 NCHAAV9SMN0613(공정 A), 항목번호 600156(공정 B) 및 항목번호 600307(공정 B)에 대해 SDS-PAGE에 의한 확인 및 순도를 수행하였다. 두 공정 모두로부터의 총 순도 %는 98% 이상이었고, 3개의 캡시드 단백질 각각에 대한 겉보기 분자량 및 밴드 패턴은 매우 일관되었다. 이들 결과는 공정 A 및 공정 B 물질이 근사하고, 공정 B 물질이 일관성이 있음을 나타내었다.
잔여 숙주 세포 단백질
항목번호 NCHAAV9SMN0613(공정 A), 항목번호 600156(공정 B) 및 항목번호 600307(공정 B)에 대해 ELISA에 의한 잔여 숙주 세포 단백질을 수행하였다. 시험된 모든 항목번호에 대한 결과는 분석에서 LOQ 미만(8 ng/mL)이었다. 이러한 결과는 공정 A 및 공정 B 물질이 근사하고, 공정 B 물질이 일관성이 있음을 나타내었다.
잔여 소 혈청 알부민(BSA)
항목번호 NCHAAV9SMN0613(공정 A), 항목번호 600156(공정 B) 및 항목번호 600307(공정 B)에 대해 잔여 BSA를 수행하였다. 시험된 모든 항목번호에 대한 결과는 분석에서 LOQ 미만(0.50 ng/mL)이었다. 이들 결과는 공정 A 및 공정 B 물질이 근사하고, 공정 B 물질이 일관성이 있음을 나타내었다.
잔여 벤조나제
항목번호 NCHAAV9SMN0613(공정 A), 항목번호 600156(공정 B) 및 항목번호 600307(공정 B)에 대해 ELISA에 의한 잔여 벤조나제를 수행하였다. 시험된 모든 항목번호에 대한 결과는 분석에서 LOQ 미만(0.20 ng/mL)이었다. 이들 결과는 공정 A 및 공정 B 물질이 근사하고, 공정 B 물질이 일관성이 있음을 나타내었다.
잔여 숙주 세포 DNA
항목번호 NCHAAV9SMN0613(공정 A), 항목번호 600156(공정 B) 및 항목번호 600307(공정 B)에 대해 qPCR에 의한 잔여 숙주 세포 DNA를 수행하였다. 1.0x1013 vg/mL로 정규화된 공정 A에 대한 결과는 3.7 x 105 pg/mL였고, 공정 B에 대한 결과는 각각 0.76 x 105pg/mL 및 0.68 x 105 pg/mL였다. 따라서, 공정 B는 잔여 hcDNA가 현저하게 더 낮은 바이러스 벡터를 생성하였으며, 이는 예를 들어, rAAV, 예를 들어, AVXS-101의 대규모 제조에 유리할 수 있다.
통계 분석
정량적 특질 특성에 대해 통계적 분석을 수행하였다. 아래에 열거된 바와 같이 공정 A 항목번호(NCHAAV9SMN0613)와 각 공정 B 항목번호(600156 및 600307) 사이의 비교를 이원 방식으로 수행하였다. 이들 결과는 도 18 및 도 19에 도시되어 있다.
이들 연구는 공정 B가 바이러스 벡터를 생성하는 우수한 방법임을 보여준다. 공정 B는 빈 캡시드가 더 적고 불순물이 적은 (더 적은 잔여 hcDNA) 대량의 바이러스 벡터(게놈 역가 및 감염 역가에 의해 측정된 바와 같음)를 일관되게 생성하였다.
차세대 시퀀싱
다음으로, 차세대 시퀀싱(NGS)을 수행하여 공정 B로부터의 AVXS-101 약물 산물 단계 3 물질의 확인을 확립하고(게놈 서열의 결정 및/또는 확인), 서열 변이(소집합)가 존재하는지를 확인하였다. 후원자 제공 기준 서열(pscSMN)에 대한 서열 데이터 세트의 정렬에 의해, 전장 게놈 범위의 완전한(100%) 폭 및 충분한 깊이를 밝혀, 변이체 검출을 할 수 있었다. 총 4개의 작은 변이체 위치가 확인되었지만, 이들은 실제 변이체가 아니라, 시퀀싱하기 어려운 영역(예를 들어, 높은 GC 함량 및 회문 서열로 인해 시퀀싱하기 매우 어려운 AAV의 역위 말단 반복(ITR)) 내의 시퀀싱 오류를 나타내는 것으로 보인다. 시퀀싱 결과는 표 17을 참조한다.
Figure pct00026
단계 1 항목번호 NCHAAV9SMN0613 안정성 프로파일
항목번호 NCHAAV9SMN0613을 12개월 동안 -60℃ 이하에서 저장하였다. 각 시점에서 항목번호를 분석하였다. 부적절한 경향은 나타나지 않는다. 도 20은 현재까지의 안정성 결과를 보여준다.
단계 1 임상 연구에 사용된 AVXS-101에 대한 근사성 연구가 완료되었다. 미국 전국 소아 병원에서 제조된 단계 1 임상 약물 산물 항목번호 NCHAAV9SMN0613 및 AveXis에서 제조된 AVXS-101 약물 산물 항목번호 600156을 사용하여 평가를 수행하였다. 추가로, 공정 B 항목번호 600156 및 600307을 사용하여 공정 일관성을 평가하였다. 근사성 평가(공정 A 대 공정 B) 및 제조 일관성(공정 B 항목번호 600156 vs 600307) 둘 모두에 대해, 본 연구는 새롭게 개선된 공정 및 분석 방법을 사용하는 AVXS-101 임상 시험 물질의 확인, 특질, 순도 및 효능을 평가하였으며, 이에 의해 근사성 및 제조 일관성을 명확하게 평가할 수 있다.
정량적 특질 특성에 대해 통계적 분석을 수행하였다. 공정 A 항목번호 NCHAAV9SMN0613과 공정 B 항목번호 600156 사이의 비교를 이원 방식으로 수행하였다. 공정 B는 공정 A보다 더 높은 순도로 더 많은 양의 바이러스 벡터를 생성하는 우수한 방법이었다. 예를 들어, 공정 A와 비교하여 공정 B에 의해 생성된 바이러스 벡터는 48% 더 높은 감염 역가, 8% 더 높은 게놈 역가, 92% 더 적은 10 μm 크기 초과의 가시영역이하 입자, 50% 더 적은 25 μm 크기 초과의 가시영역이하 입자, 100% 더 적은 빈 캡시드 및 11% 더 적은 잔여 hcDNA를 나타내었다. 모든 결과는 각 특질 특성에 대한 시험 한계와 관련하여 일관되었다.
추가로, 공정 B를 사용하여 제조 일관성을 확립하기 위해, 항목번호 600156 및 600307을 사용하여 이원 방식 비교를 수행하였다. 공정 B 항목번호 600156 및 600307 사이의 이러한 초기 이원 방식 비교의 결과는 제조 일관성을 나타낸다. 모든 결과는 또한 각 특질 특성에 대한 시험 한계와 관련하여 일관되었다.
결과 평가를 기반으로 하여, 공정 A를 사용한 단계 1 임상 약물 산물 항목번호 NCHAAV9SMN0613 및 공정 B를 사용한 AVXS-101 약물 산물 항목번호 600156으로부터의 결과 특질 특성은 더 많은 양의 바이러스 벡터 및 개선된 순도를 생성하고, 이는, 예를 들어 rAAV의 대규모 제조에 유리할 수 있음을 나타내었다. 추가로, 공정 B로부터 생성된 2개의 항목번호 물질(항목번호 600156 및 600307)은 재현 가능한 것으로 나타났으며, 이는 제조 일관성을 추가로 입증한다.
실시예 10: 분석 초원심분리(AUC) 분석
AUC 방법을 사용하여 단계 1(공정 A, 항목번호 NCHAAV9SMN0613) 및 단계 3(공정 B, 항목번호 600156 및 600307)으로부터의 물질을 분석하였다. NCHAAV9SMN0613, 600156 및 600307에 대한 AUC 프로파일(이중 반복실험 분석)은 각각 도 21, 도 22 및 도 23에 표시되어 있다.
각각의 물질의 AUC 분석은 빈 캡시드 및 충전 캡시드에 대해 유사한 침강 계수를 나타내며, 단계 1 물질(공정 A, 항목번호 NCHAAV9SMN0613)은 빈 캡시드 함량이 각각 2% 및 4%인 단계 3 물질(공정 B, 항목번호 600156 및 600307)과 비교하는 경우, 상승된 빈 캡시드 함량(7%)을 나타낸다. 이는 공정 A에서 사용되는 요오딕사놀 구배 초원심분리 제조 단계와 비교하여 공정 B에서 CsCl 구배 초원심분리 제조 단계가 빈 캡시드를 충전 캡시드로부터 더욱 효과적으로 분리할 수 있는 능력 때문이다.
임상 및 상업용 제품을 사용한 AVXS-101 생성 항목번호는 미국 전국 소아 병원에서 생성된 단계 1 임상 시험 물질(NCHAAV9SMN0613) 및 AveXis에 의한 각각의 후속 생성 항목번호 둘 모두에서, 초원심분리를 사용하여 CsCl 구배 정제 공정을 수행하는 경우, 캡시드의 3개의 육안 관찰 가능한 밴드를 일관되게 나타낸다. 공정 A를 사용한 단계 1 임상 약물 산물 항목번호 NCHAAV9SMN0613 및 공정 B를 사용한 AVXS-101 약물 산물 항목번호 600156에 대한 AUC 프로파일을 기반으로 하여, 이들 물질은 근사한 것으로 고려된다. 추가로, 공정 B로부터 생성된 2개의 항목번호 물질(항목번호 600156 및 600307)에 대한 AUC 프로파일이 일관된 것으로 평가되었다.
실시예 11 - 상류 공정
상류 공정을 사용하여, 작업 세포 은행으로부터 유래된 중간체를 생성하였고, 상류 공정은 (a) 세포를 배양하는 단계, (b) 도 1에 도시된 바와 같이 배양된 세포를 3개의 플라스미드로 형질감염시키는 단계 (c) 배양 기간 후에 세포로부터 확장된 바이러스 입자를 수확하는 단계, (d) 여과를 통해 바이러스 입자를 정제하여 임의의 온전한 세포 또는 세포 잔해를 제거하는 단계, (e) 단계(d)로부터의 용리액을 접선 유동 여과에 적용하는 단계; 및 (f) 정제된 바이러스 입자의 생성된 중간체 제조물을 동결시키는 단계를 포함한다.
형질감염 전, 세포를 적합한 배양 배지, 플라스크 또는 적합한 생물반응기 또는 둘 모두에서 확장시켰다. 하나의 배양 배지는 10% FBS, 4.5 g/L 글루코스, 4 mM L-글루타민의 DMEM이다. 일 구현예에서, 부착 세포를 초기에 플라스크에서 성장시킨 후 생물반응기 내에서 추가의 부착 세포 확장을 위해 iCELLis 생물반응기로 옮긴다.
세포 확장 후, 부착 HEK293 세포를 삼중 DNA 플라스미드 PEI 공침전으로 형질감염시켰다. 이 형질감염에 사용된 3개의 플라스미드는 다음과 같다; pSMN, pAAV2/9 및 pHELP. 세포 확장에 사용된 DMEM 성장 배지를 변형된 DMEM 형질감염 배지로 교체한다. DMEM 형질감염 배지는 무 FBS, 무칼슘, 무 L 글루타민 및 4.5 g/L 글루코스를 포함한다. 대규모 부착 세포 생물반응기에서 PEI 공침전을 사용하여 부착 HEK293 세포 내로의 삼중 DNA 플라스미드 형질감염을 사용하여 scAAV9.CB.SMN 벡터를 생성하였다. 벡터 플라스미드 pSMN은 인간 SMN에 대한 cDNA를 포함한다. 이 형질감염에 사용된 3개의 플라스미드는 다음과 같다; pSMN(222 mg), pAAV2/9(333 mg) 및 pHELP(444 mg). 생물반응기 온도가 30℃ 초과가 될 때까지 형질감염 배지를 생물반응기에서 평형화시킨 후, PEI-플라스미드 공침전을 첨가하였다. PEI-플라스미드 공침전 공정은 형질감염 배지에 플라스미드를 첨가하고, 반응 백에 0.2 μ 여과하는 단계를 포함하였다. PEI를 형질감염 배지에 첨가한 후 반응 백에 첨가하였다. PEI 플라스미드 반응을 수동으로 혼합하여 균일한 현탁액을 형성하고, 15분 내지 30분 동안 반응이 이루어지도록 한다. 반응 시간 종료 시, PEI-플라스미드 공침전을 생물반응기에 첨가하였다. 재순환을 재개하기 전에 1시간 내지 2시간 동안 생물반응기에서 PEI-플라스미드 공침전물을 혼합되도록하였다. DMEM 성장 배지를 다음 배지 교체 전에 18시간 내지 24시간 동안 생물반응기에서 재순환시켰다.
rAAV SMN 게놈(SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 980 내지 3336)은 AAV2 ITR, 사이토메갈로 바이러스 인핸서를 갖는 닭 β-액틴 프로모터, SV40 인트론, (GenBank 수탁번호 NM_000344.2)에 제시된 SMN 인코딩 DNA, 소 성장 호르몬으로부터의 폴리아데닐화 신호 서열 및 또 다른 AAV2 ITR을 서열 내에 포함한다. SMN DNA의 보존적 뉴클레오타이드 치환이 또한 고려된다(예를 들어, GenBank 수탁 번호 NM_000344.2의 위치 625에서 구아닌에서 아데닌으로의 변화). 게놈에는 AAV rep 및 cap DNA가 부재하며, 즉, 게놈의 ITR 사이에 AAV rep 또는 cap DNA가 부재한다. 고려되는 SMN 폴리펩타이드는 NCBI 단백질 데이터베이스 번호 NP_000335.1에 제시된 인간 SMN1 폴리펩타이드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. rAAV9 SMN 벡터는 문헌[Foust et al., Nature Biotechnology 28(3): 271-274 (2010)]에 기재되어 있으며, 벡터 게놈 삽입물의 서열은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 980 내지 3336으로 표시된다.
생물반응기에서의 제6일에 형질감염 18시간 내지 24시간 후, 생물반응기를 배수하고, DMEM 재순환 배지 백을 200 리터의 새로운 OptiMEM 형질감염 후 배지로 교체하였다. 생물반응기를 64 리터로 재충전하고, 생물반응기에서의 재순환을 재개하였다. 제7일에 제6일의 배지 교체 18시간 내지 24시간 후에, 재순환 백 내의 OptiMEM 형질감염 후 배지(약 135 리터)를 새로운 OptiMEM 배지 백으로 교체하였다. 이 단계 동안 생물반응기를 배수시키지 않았다. 배지 재순환은 제9일 수확시까지 계속하였다.
생물반응기에서 9일 후, 최종 수확 전 샘플을 반응기로부터 채취하고, 세포 용해 공정을 개시하였다. 벤조나제를 생물반응기에 최종 농도 100 U/mL로 첨가하였다. 벤조나제를 반응기에서 혼합한 후, 7.1 리터의 용해 완충액을 반응기에 첨가하였다. 용해 용액을 제1 수확 단계 전에 2시간 동안 반응기에서 혼합하였다. 2시간의 용해 종료 시, 생물반응기의 내용물을 수확 백으로 옮겼다. 8.9 리터의 염 수크로스 용액(SSS)을 수확 백에 첨가하고, 15분 동안 혼합하였다. SSS 용액을 수확 배지 중 벤조나제로 퀀칭시켰다. 이어서 생물반응기를 생물반응기 세정 완충액으로 세정하였다. 생물반응기 세정을 위해, 64 리터의 생물반응기 세정 완충액을 생물반응기에 첨가하고, 15분 동안 혼합하였다. 이어서 세정한 것을 일반적인 수확 수집 백으로 옮겼다. 세정한 것을 수집 백에 첨가하면, 내용물을 15분 동안 혼합하고, 대량 수확 샘플을 채취하였다.
혼합된 대량 수확물을 심층 필터를 통해 수집 백 내로 여과하였다. 모든 대량 수확물이 여과되면, 심층 필터를 50 리터의 TFF1 투석여과 완충액으로 처리하였다. 심층 필터 풀을 혼합하고, 샘플링하였다. 이어서 심층 필터 풀을 0.45 μm 필터를 통해 여과하여 대량 수확 물질을 추가로 정화시켰다. 그런 다음 0.45 μm 필터를 6 리터의 TFF1 완충액으로 처리한다.
TFF1 단계의 경우, 300 kDaMW 컷오프 재생 셀룰로스 막 카세트 5.0 m2를 플러싱하고, NaOH 용액으로 멸균하고, TFF1 완충액으로 평형화시켰다. 이 작업의 농축 단계는 정화된 수확물이 약 10배 감소되도록 설계되었다. 표적 보유물 부피에 도달하면, 투석여과 작업을 개시한다. 보유물을 6 투석부피의 TFF1 완충액으로 투석여과시켰다. 6 투석부피의 총 투과물 유량이 달성되면, 보유물을 다시 농축시키고 수집 백으로 수확하였다. 막의 2회 연속 세정을 수행하여, TFF 시스템으로부터 산물 회수를 최대화함으로써, 중간체 약물 물질을 생성하였다. TFF1 중간체를 LFH 후드에서 1리터 또는 2리터의 멸균 PETG 병에 분취한 다음, 드라이아이스 또는 냉동고에서 동결하고, -60℃ 저장기로 옮겼다.
Figure pct00027
실시예 12 - 하류 공정
하류 공정을 사용하여 중간체를 여과된 약물 물질로 가공하였다. 하류 공정 단계는 정제된 AAV 입자가 약제학적으로 허용 가능한 담체에 현탁된 여과된 약물 물질을 생성하기 위해, 산성화 및 정화 단계(여과 사용), 이어서 양이온 교환 크로마토그래피, 접선 유동 여과("TFF2"), CsCl 초원심분리 및 추가 접선 유동 여과 단계("TFF3")를 포함한다. 구체적으로, 하류 공정은 TFF1 중간체의 생성 후 다음의 제조 단계를 포함하였다: TFF1 중간체의 해동 및 풀링, 산성화 및 정화, 양이온 교환 크로마토그래피(CEX), 접선 유동 여과(TFF2), 충전/빈 캡시드 분리를 위한 CsCl 초원심분리, 농도/완충액 교체를 위한 접선 유동 여과(TFF3), 약물 물질을 생성하기 위한 TFF 3 풀 물질 여과, 약물 산물을 생성하기 위한 약물 물질의 희석 및 여과, 약물 산물의 저장 및 약물 산물의 바이알로의 충전.
TFF1 중간체 물질을 해동하고 부드럽게 혼합하였다. Tween 20을 사용하여 산성 pH 하에서 대량의 숙주 세포 단백질 및 DNA의 응집을 촉진시켰다. CEX 크로마토그래피(pH 3.5)를 위해 15% Tween 20을 포함하는 TFF1 중간체 풀의 pH를 감소시켰다. 용액을 심층 및 0.45 μm 필터를 통해 여과하여 pH를 감소시킨 후 형성된 침전물을 제거하였다.
Tween 20(20 mM Tris, 1 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 1% 수크로스 m/v 중 36% Tween 20 용액, pH 8.1)을 4시간 동안 TFF1 중간체 용액에 서서히 첨가하여 20% Tween 20의 최종 농도를 달성하였다. 실온(RT)에서 밤새 인큐베이션 후 TFF1 중간체/Tween 스파이킹 풀 kg당 약 4 g의 1 M 글리신 pH 2.5를 첨가하여 3.5 ± 0.1의 표적 pH를 달성함으로써 TFF1 중간체를 포함하는 Tween 20의 pH를 감소시켰다. pH가 허용 가능한 범위 내가 되면, 0.45 μm Opticap XL10 Durapore 필터 또는 0.8/0.45 μ PES 필터에 의한 일련의 Clarisolve POD 심층 필터를 통해 용액을 통과시킨 후, POD 필터의 보유 부피 플러스 CEX 완충액 A를 포함하는 폴리싱 필터의 하나의 보유 부피에 의해 필터를 2회 플러싱하였다.
양이온 교환(CEX) 포획 크로마토그래피 단계를 사용하여 바이러스 캡시드를 단백질, DNA 및 다른 공정 불순물로부터 분리하였다. 이 단계는 자동 공정 크로마토그래피 시스템을 사용하여 작동되는 CIMmultus S03-8000 고급 복합 컬럼(술포닐)(기공 2 μm) 크로마토그래피 컬럼(8.0 L)을 사용하였다. 완충액 및 용액은 다음 표에 기재되어 있다:
Figure pct00028
CEX 컬럼 로딩을 정화되고 산성화된 TFF1 중간체의 단백질 함량에 의해 결정하였다. CEX 컬럼의 단백질 로딩을 최대 컬럼 용량의 70%로 설정하였다.
OD280의 급격한 상승에서 시작하여 용리 피크를 수동으로 수집하였다. 전도도가 80 mS/cm 내지 85 mS/cm일 때 OD280이 상승한다. CEX 용리액(산물)의 대략적인 부피는 약 20 리터 또는 2.5 CV(컬럼 부피)였다. CEX 용리액을 2개의 분획으로 수집하였다. 제1 분획은 OD280의 급격한 상승에서 시작하여, 1.5 CV로 수집하였다. 제2 분획은 제1 분획 직후에 시작하여 1.0 CV로 수집하였다. 2개의 분획을 pH 9.0 중화 완충액을 사용하여 pH 8.0 ± 0.30으로 중화시켰다.
TFF2 단계를 농축하고, 단백질 불순물을 제거하고, CsCl 초원심분리 단계를 위해 적절한 완충액으로 완충액을 교체하였다. 접선 유동 여과 시스템을 0.4 m2(2 CEX 사이클) 또는 0.2 m2(1 CEX 사이클) 300 k MWCO 재생 셀룰로스 막과 함께 사용하였다.
이 작업의 농축 단계는 CEX 용리액의 부피를 감소시켰다. 표적 보유물 부피에 도달하면, 불연속 TFF 모드(배치 모드)에서 투석여과를 개시하였다. 보유물을 2X로 희석하고, 8 투석부피의 TFF2 NaCl 투석여과 완충액으로 투석여과한 후, 불연속적 TFF 모드에서 8 투석부피의 TFF2 CsCl 투석여과 완충액으로 투석여과하였다. CsCl 투석여과가 완료되면, 보유물을 시스템 보유 부피에 따라 소정의 부피로 농축시켰다. 막의 2회 연속 세정을 수행하여, TFF2 시스템으로부터 산물 회수를 최대화하였다.
보유물 공급 속도를 20%의 투과율 전환율(500 mL 보유물 공급율당 100 ml 투과물 유량)의 5 L/m2/분(0.1 m2 카세트당 500 mL/분)으로 설정하였다. 투과물 유량을 투과물 튜브 상의 클램프에 의해 제어하여, 보유물 공급 유량의 20%의 투과물 유량을 유지하였다.
Figure pct00029
염화세슘 구배 초원심분리를 사용함으로써 초원심분리를 사용하여 충전 캡시드로부터 빈 캡시드를 제거할 수 있다. CsCl 초원심분리 단계에는 자동 Optima XPN 100 초원심분리기 시스템 또는 유형 50.2 Ti 로터 또는 균등한 로터가 장착된 균등한 시스템이 사용되었다. 용액에 기포가 유입되지 않도록 하면서, TFF2 정제 여과 물질을 튜브 벽의 내부를 따라 초원심분리 튜브에 서서히 첨가하였다. 충전된 튜브를 휴대용 열 밀봉기로 밀봉하고, 20℃에서 17시간 동안 302,000 g(50.2 Ti 로터에서 50,000 rpm)으로 원심분리하였다. 원심분리 단계를 완료한 후, 튜브를 초원심분리기로부터 제거하고, 생체안전 캐비닛에 배치하였다. 튜브를 포함하는 산물을 폐기물 용기 상의 링 스탠드에 장착하였다. 램프를 튜브 아래에 디렉토리(directory)를 배치하고, 빈 캡시드 밴드(밴드 A가 최상부 밴드임), 충전 캡시드 이중체 밴드(이중체의 밴드 B 및 C 상부 및 하부 밴드) 및 이중체 아래의 최저 밴드를 튜브 상에 표시하였다. 밴드 D 바로 아래에서 튜브의 중간까지 삽입된 30 mL 주사기에 부착된 18 G 바늘에 의해 밴드 B, C 및 D를 제거하였다. 수집된 물질을 멸균 1 L PETG 병으로 옮겼다. 모든 원심분리 튜브로부터의 물질을 멸균 1 L PETG 병에 풀링하여, 초원심분리(UC) 풀을 생성하였다. CsCl 초원심분리 단계의 완충액이 아래 표에 열거되어 있다:
Figure pct00030
TFF3 단계에서 CsCl을 제거하고, 최종 제형화 완충액을 사용하여 전체 벡터를 농축시켰다. 접선 유동 여과 시스템을 2개의 50 cm2 300 k MWCO 재생 셀룰로스 막과 함께 사용하였다. TFF3 작업의 농축 단계는 잔여 CsCl의 농도 및 UC 풀의 부피가 감소하도록 설계되었다. 표적 보유물 부피에 도달하면, 투석여과를 개시하였다. 보유물을 10 투석부피의 TFF3 완충액으로 투석여과하였다. 투석여과가 완료되면, 농축된 보유물을 0.2 μm Pall Supor® EKV 멸균 등급 필터(Mini Kleenpak) 필터를 통해 2차 코니칼 튜브(conical tube)로 옮겼다.
TFF3 시스템으로부터 벡터를 회수하기 위해 막의 연속적인 세정을 수행하였다. 이전에 TFF3 보유물을 보유한 1차 코니칼 튜브에 TFF3 완충액을 첨가하였다. 이 물질을 셀룰로스 막을 통해 재순환시켰다. 재순환 후, 플러싱된 것을 0.2 μm Pall Supor® EKV 멸균 등급 필터(Mini Kleenpak) 필터를 통해 2차 코니칼 튜브로 옮겼다. TFF3 농축물 및 일부 풀을 혼합하여 4.5 x 1013 vg/mL 이상의 약물 물질(풀링된 TFF3 보유물 + 2회 세정물)의 최종 벡터 농도를 달성하였다.
막의 연속 세정을 수행하여, TFF3 시스템으로부터의 산물 회수를 최대화하였다. 이전에 TFF3 보유물 및 초기 플러싱 물질을 보유한 1차 코니칼 튜브에 TFF3 완충액을 첨가하였다. 이 물질을 셀룰로스 막을 통해 재순환시켰다. 2차 코니칼 튜브에서 소정의 중량이 획득될 때까지, 2차 플러싱된 것을 0.2 μm Pall Supor® EKV 멸균 등급 필터(Mini Kleenpak) 필터를 통해 2차 코니칼 튜브로 옮긴다. 최종 농축 용액을 약물 물질(DS)로 지칭한다.
Figure pct00031
멸균된 일회용 어셈블리를 사용하여 멸균된 1 L 유리 병에 Pall Supor® EKV 멸균 등급 필터(Mini Kleenpak)에 의해 DS를 여과하였다. TFF3 풀의 여과 전에, 연동 펌프를 사용하여 필터를 통해 TFF3 완충액을 통과시키고 폐기물 플러싱 백에 폐기함으로써 필터를 플러싱하였다. 이어서 약물 물질(DS)을 연동 펌프를 사용하여 플러싱된 필터를 통해 여과하고, 1 L 멸균 유리 병에 수집하였다. 5x1013 vg/mL의 DS의 표적 농도를 기반으로 하여, DS를 보유하는 2차 코니칼 튜브에 TFF3 완충액을 첨가하고, 필터를 통과시켜, 희석된 약물 산물("DP")을 3.5x1013 vg/mL의 표적 농도로 제조하였다.
DP를 제조하기 위해 필터 플러싱 및 DS 희석에 사용된 TFF3 완충액은 하기 제형으로 구성된다.
Figure pct00032
DP를 5 mL 즉시 사용 가능한 멸균 Crystal Zenith(CZ) 바이알에 충전하고, 즉시 사용 가능한 멸균 마개에 의해 입구를 막고, 즉시 사용 가능한 멸균 밀봉기로 밀봉하였다.
실시예 13 - 효능 분석
약물 산물의 상대 효능을 정량적 생체내 분석을 사용하여 측정하였다. 분석에는 SMA 질병의 확립된 마우스 모델이 사용되었다. SMAΔ7 마우스 균주의 증식 쌍(Jackson 연구소, #005025)은 표현형상 정상이지만, 그 자손의 약 25%는 표적화된 SMN 유전자 돌연변이에 대해 동형접합이며, SMA-유사 표현형을 나타낸다. 제5일에 이들은 근육 약화의 징후가 나타나며, 그 다음 주에는 비정상적인 걷기 및 넘어지는 경향이 나타난다. Jackson 연구소는 SMA 유사 표현형을 가진 동물의 평균 생존율이 약 15 ± 2일이라고 기록한다. 파일럿 연구에 의해 SMA-유사 표현형을 갖는 비처리 동물의 중앙값 생존율 시간이 16.3일인 것으로 나타났다(기하 평균; n=3 연구; 연구당 10마리 마우스).
정맥내(IV) 주입에 의해 투여되는 생물학적 활성 약물 산물은 투여량(vg/kg)의 함수인 생존 시간의 증가를 산출한다. 기준 물질(벡터의 이전 배치)과 비교하여 약물 산물 효능을 측정하였다. 약물 산물의 역가 및 기준 물질(벡터 게놈/mL; vg/mL)을 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응(ddPCR)에 의해 결정하였다. SMA-유사 표현형을 갖는 마우스에 투여될 3개의 특정 투여량 수준 각각을 획득하기 위해 벡터를 식염수로 희석하였다.
분석이 적합성을 통과하면 분석 결과를 허용 가능한 것으로 고려한다. 분석 적합성은 다음으로 구성된다:
4. 음성 대조군 샘플에 대한 허용 한계(15 ± 2 일, 중앙값 생존율)
5. 양성 대조군 샘플에 대한 허용 한계(40일 초과, 중앙값 생존율)
6. 기준 표준 중앙값 생존율 투여량-반응 곡선에 대한 허용 한계
0.9% 식염수 용액을 사용한 0(제로) 투여량을 포함하는 5개의 상이한 투여량 수준의 약물 산물을 투여하는 경우(비처리 그룹), SMA△7 마우스의 중앙값 생존율(일) 사이의 선형 상관관계를 결정하기 위해 이 연구에서 벡터의 이전 배치(이하, 이전 배치)를 사용하였다. 표 24는 이전 배치 기준 배치를 사용한 보정 곡선을 보여준다.
Figure pct00033
이 연구로부터의 데이터에 의해 중앙값 생존율 투여량-반응 곡선의 선형 범위가 0 vg/kg 내지 7.4 vg/kg인 것으로 나타났다. 이전 배치 기준 표준의 선형 회귀 곡선을 약물 산물 배치 816836 선형 회귀 곡선과 비교함으로써 약물 산물 배치 816836의 상대 효능을 확립하였다. 각 선형 회귀선(즉, 기준 표준 및 시험 물품)의 y 절편과 기울기의 비율을 사용하여 이를 확립하였다. 상대 효능 백분율 계산은 아래 식(1)에 제시되어 있다:
RP %= [(시험 물품의 y 절편/기울기) ÷(기준 표준의 y 절편/기울기)] X 100(1)
단계 1 임상 시험에 사용된 NCH0613 배치를 기준 표준 배치로 사용하였고, 이에 100%의 효능을 배정하였다.
전술한 데이터에 의해, 중앙값 생존율 투여량-반응 곡선의 선형 부분을 사용하여 1차 분석 허용 기준을 확립하여, 다음과 같은 약물 산물 임상 배치의 상대 효능을 결정하였다:
Figure pct00034
5회 투여량(vg/kg) 수준을 사용하여 중앙값 생존율(일) 투여량-반응 곡선을 생성하였다.
Figure pct00035
선형 투여량 반응 모델을 실행하기 위해 투여량 0, 1.2E+13 및 7.4E+13을 선택하였다.
Figure pct00036
식염수(비처리 그룹)에 대한 적합성 한계는 13일 내지 17일 중앙값 생존율이었다.
Figure pct00037
기준 표준 샘플에 대한 적합성 한계는 다음과 같이 설정되었다:
- 기울기: 2.0E-13 이상
- y-절편: 16.00(일) 이상
- y-절편/기울기 비율: 8.5E+13 이상
- R2: 0.7 이상
Δ7 마우스 모델을 사용하여 약물 산물을 포함하는 SMA 치료제의 효능을 입증하였다. 중앙값 생존율이 15일 ± 2일인 경우, 비처리 또는 식염수-처리된 대조군 동물은 신뢰할 수 있는 기준선 대조군을 제공하며, 이로부터 중앙값 생존율의 증가로서 산물 효능을 측정할 수 있다. 약물 산물의 개발 작업에 의해, 투여된 투여량(vg/kg)을 log 값으로 변환하고, 처리된 SMAΔ7 신생 마우스의 중앙값 생존율(일)에 대해 그래프화하는 경우, 선형 상관관계를 갖는 마우스 모델의 생존율에 영향을 주는 것으로, 액적 디지털 PCR(ddPCR)을 사용하여 게놈 역가에 의해 결정된 세(3) 개의 투여량(비히클 처리 투여량 제외)을 확인하였다. 낮은, 중간 및 높은 역가 표준에 대해서는 표 26의 표준 역가(vg/mL)를 참조한다. 또한 TFF 완충액(비히클) 용액을 음성 대조군뿐만 아니라, 제로(0) 보정 곡선 포인트 둘 모두에 사용한다. 40일 이상의 생존율을 나타내는 투여량(중앙값 생존율의 배가를 나타내는 투여량을 초과함)이 또한 양성 대조군으로 포함되었다.
Figure pct00038
투여량 용액 제조(희석 방법 예에 대해서는 표 26 참조).
음성 대조군 -- 음성 대조군으로서 0.9% 식염수 용액을 사용한다
양성 대조군 -- 시험 물품 항목번호를 식염수를 사용하여 1.5x1014 vg/kg에서 제조한다.
기준 표준 용액 -- 기준 표준 항목번호를 식염수 용액을 사용하여 표 25에 제시된 3개의 농도로 제조한다.
Figure pct00039
시험 물품 제조 -- 시험 물품을 식염수 용액을 사용하여 희석하였다. 희석액을 계산하여 최종 총 부피를 50 μl로 하여 마우스당 표 26에 제시된 시험 투여량(vg/kg)을 생성하였다. 처리된 마우스의 최소 수명을 40일 이상의 중앙값 생존율(일)로 증가시키는 것을 표적으로 하여, 양성 대조군으로서 하나의 추가 부피에 의해 해당 시점에 10마리의 마우스를 위해 희석액을 제조하였다.
대조군 샘플에 대한 허용 한계
음성 대조군(비처리 마우스) -- 음성 대조군 그룹에 대한 분석 허용 한계는 SMAΔ7 마우스가 15 ± 2일의 중앙값 생존율을 충족하는 것이었다. 추가로 10일 이하 내에 치사된 임의의 마우스는 분석에서 제외될 것이다. 그룹에 7마리 초과의 마우스가 사용되는 경우, 최대 2마리의 마우스가 10일 이하에 치사되어 제외될 수 있다.
양성 대조군(표적 임상 투여량으로 처리된 그룹) -- 양성 대조군 그룹에 대한 분석 허용 한계는 처리된 마우스의 최소 수명이 40일 이상의 중앙값 생존율이어야 한다는 것이었다. 추가로 10일 이하 내에 치사되는 임의의 마우스는 분석에서 제외될 것이다. 그룹에 7마리 초과의 마우스가 사용되는 경우, 최대 2마리의 마우스가 10일 이하에 치사되어 제외될 수 있다.
기준 표준 투여량 반응 곡선에 대한 허용 한계
투여된 투여량(vg/mL)에 대한 중앙값 생존율(일)을 그래프화한 기준 표준 선형 투여량 반응 곡선에 대해 분석 적합성 기준을 결정할 것이다. 분석 적합성 기준은 표 27을 참조한다.
Figure pct00040
Y-절편/기울기 비율 -- 기준 표준 및 시험 물품에 대한 중앙값 생존율(일) 대 투여된 투여량(vg/kg)의 선형 회귀 곡선을 결정한다. 각 선형 회귀에 대한 y 절편 대 기울기의 비율을 계산한다.
기록 결과
상대 효능 결과의 정성적 기록 -- 분석 적합성 기준을 각 분석에 대해 평가한 후, 양성 대조군 물질에 대해 40일 이상에서 판독된 단일 포인트 중앙값 생존율(일)을 결정한다. 양성 대조군 그룹의 중앙값 생존율이 40일 이상인 경우, 하기의 기준에 부합하면 시험 물품을 폐기할 수 있다.
상대 효능 결과의 정량적 기록 -- 분석 적합성 기준을 각 분석에 대해 평가한 후, 시험 물품에 대해 상대 효능의 정량적 결정을 수행한다. 양성 대조군이 40일 이상에 도달하고, 7.5x1013 vg/kg의 상위 표준 투여량을 나타내는 마우스 그룹에 대해 중앙값 생존율이 31±3일에 도달하면 시험 물품에 대한 상대 효능을 기록할 수 있다. 시험 물품에 대한 상대 효능 백분율(RP%)를 다음과 같이 중앙값 생존율(일) 투여량-반응의 선형 회귀의 y 절편 및 기울기를 사용하여 계산할 것이다:
RP%= 100% * [(시험 물품 y-절편/기울기) ÷(기준 표준 y-절편/기울기)]
실시예 14-척수성 근위축에 대한 단일-투여량 유전자 대체 요법: 투여량 연구
척수성 근위축(SMA)은 생존 운동 뉴런 1(SMN1)을 인코딩하는 유전자의 손실 또는 기능이상으로 인한 중증의 소아 단발성 질병이다. 이 질병의 발병률은 약 10,000명의 생존 출생 중 약 1명이며, 보균자 빈도는 54명 중 1명이다. SMA는 하부 운동 뉴런의 퇴행 및 손실을 특징으로 한다. 이 질병은 발병 연령 및 이정표 달성을 기준으로 4개의 하위유형(1 내지 4)으로 나뉜다. SMA 1형(SMA1)은 유아에게 가장 중증 형태이며 가장 흔한 사망 원인이다. SMN에는 2개의 형태가 있으며; SMN1은 SMN 단백질의 기능성 생성에 관여하는 주요 유전자이다. SMN2는 스플라이싱 동안 엑손 7을 우선적으로 배제하고, 결과적으로 SMN1과 비교하여 소 분량의 기능성 SMN 단백질만을 생성한다. 따라서, SMN2 카피 수는 질병 표현형을 변형시키고, SMN2의 2 카피의 존재는 SMA1과 관련이 있다. SMN1 이중대립유전자 결실 및 SMN2의 2개의 카피를 갖는 유아는 SMA1의 97% 위험을 갖는다.
SMA1(후향성 코호트)의 자연 후향성에 대한 최근의 연구에 따르면, 질병을 가진 유아의 증상 발생시의 중앙값 연령은 1.2개월(범위, 0개월 내지 4개월)이었고, 이 질병은 저긴장, 초기 유아기의 중증 약화 및 보조 없이 앉아 있지 못하는 것을 특징으로 하는 것으로 나타났다. SMN2의 2개의 카피를 갖는 SMA1을 가진 유아의 경우, 사망시 중앙값 연령 또는 적어도 연속 14일 동안 하루에 적어도 16시간 동안 비침습적 인공호흡(영구 인공호흡과 균등한 것으로 고려됨)이 필요한 중앙값 연령은 10.5개월이었다. 발병 소아의 하나의 코호트에서 13.6개월째에 영구 인공호흡 보조 장치 없이 25%만이 생존했으며, 20개월째까지 이러한 보조 장치가 없는 경우, 8%만이 생존하였다. SMN2의 2개 카피를 가진 환자가 포함된, 미국 국립 보건원(NeuroNEXT)이 후원하는 또 하나의 전향적인 다기관 후향성 연구는 8개월째의 기관절개술 부재 하에 중앙 생존율(95% 신뢰 구간, 6 내지 17)을 보여주었다. 모든 SMA1 환자는 출생 후 호흡기 및 연하 기능이 급격히 감소하며, 결과적으로 적절한 영양을 유지하고, 흡인과 관련된 호흡기 위험을 감소시키기 위해 (비위 또는 위관을 통한) 기계적 영양 지원이 필요하다. 생후 3개월째에 증상이 시작되는 SMA1 환자의 경우, 대부분의 환자는 생후 12개월째까지 영양 공급 지원이 필요하다.
SMA1 환자는 또한, 사지의 반 중력 운동과 같은 운동 기능의 경미한 변화를 감지하는 도구로서, 0 내지 64 범위이고, 점수가 더 높을수록 운동 기능이 더 우수한 것을 나타내는 CHOP INTEND(필라델피아 소아 병원 신경 근육 장애 유아 시험) 척도에서 측정된 바와 같이 운동 기능에서 주요 이정표를 달성하지 못하고, 기능이 저하된다. SMA1 환자 34명에 대한 후향성 분석에서, 환자 1명을 제외한 모든 환자는 생후 6개월 후 적어도 40점에 도달하지 못하였다. NeuroNEXT 코호트에서 CHOP INTEND 점수는 생후 6개월 내지 12개월째에 평균 10.7점만큼 감소하였다.
운동 뉴런에서 SMN 단백질의 수준을 증가시키기 위한 치료 전략은 SMN2의 효과의 향상에 집중되어 있다. 한 가지 접근법은 SMN2에서 엑손 7 스플라이싱을 억제하기 위해 개발된 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 누시너센(Ionis Pharmaceuticals/Biogen)의 중추신경계 전달이다. 이 약물은 중증 SMA의 쥣과동물 모델에서 약점을 개선하고, 발병 마우스의 중앙값 수명을 16일 내지 25일로 증가시키는 것으로 나타났다. 2016년 12월에, 누시너센은 미국 식품의약국에 의해 SMA 치료를 위해 승인되었다. 이 약물은 생후 첫 2개월 내에 4회 로딩 투여량 후 반복된 척수내 주사로 투여된다.
SMA1의 잠재적 대안 치료는 자기 상보성 아데노-연관 바이러스 혈청형 9(scAAV9)에서 SMN의 카피를 전달하는 1회 정맥내 투여로 제공되는 유전자 요법이다. (이 재조합 바이러스의 코딩 영역은 분자 내 이중 가닥 DNA [또는 자기-상보성] 주형을 형성함). 이 접근법은 운동 뉴런 및 말초 조직에서 SMN 발현을 유도하여, 쥣과동물 모델에서 SMA의 효과를 상쇄하고, 이 모델에서 평균 생존율을 저 투여량(킬로그램 체중당 6.7Х1013 vg)에 의해서는 15일에서 28.5일로, 더 높은 투여량의 벡터(킬로그램당 2.0Х1014 내지 3.3Х1014 vg)에 의해서는 250일 초과로 확장시킨다.
혈액-뇌 장벽을 통과하고, 척수의 모든 영역에서 중추신경계 뉴런을 표적화하는 것 외에도, SMN 단백질이 편재적으로 발현되고, SMA1이 다수의 세포 유형(예를 들어, 심장, 췌장 및 골격근)과 함께 다수의 시스템(예를 들어, 자율 신경 및 장 신경계, 심혈관계 및 췌장)에 발병하는 점을 고려할 때, AAV9-매개 유전자 요법의 전신 투여가 유리할 수 있다. 혼성체 사이토메갈로 바이러스 인핸서-닭 베타액틴 프로모터와 조합된 벡터의 자기 상보성 특징은 SMN의 신속하고, 지속적인 발현을 가능하게 한다. 2014년 4월에, 본 발명자들은 닭 베타-액틴 프로모터(scAAV9.CB.hSMN)(AVXS-101)의 제어하에 인간 생존 운동 뉴런 유전자(hSMN)의 전달과 함께 1회 투여량 scAAV9가 제공된 SMA1을 가진 유아를 포함하는 유전자 대체 요법에 대한 연구를 시작하였다.
방법
환자 및 연구 절차: 연구의 목적을 위해, 모든 환자는 SMA1의 유전자 확인된 진단, 동종접합 SMN1 엑손 7 결실 및 SMN2의 2개의 카피를 가졌다. SMN2의 엑손 7에서 c.859G → C 질병 변형인자가 존재하는 환자는 제외되었다. 선택 환자는 출생시로부터 최대 생후 6개월까지 운동 능력의 지연, 불량한 머리 제어, 굽은 어깨 자세 및 관절의 과운동성이 동반된 임상 평가에 의해 결정된 바와 같은 저긴장을 특징으로 하는 질병이 발병한 것으로 나타났다. 활성 바이러스 감염(B형 또는 C형 간염에 양성인 HIV 또는 혈청학 포함) 또는 유전자 전달에 대한 불필요한 위험을 야기하는 수반 질병을 가진 환자는 연구에서 제외되었다. 스크리닝 방문시 침습적 인공 호흡 보조장치(양압 기관절개술) 또는 맥박 산소 측정 95% 미만 포화도가 필요한 환자 역시 제외시켰다.
투여된 유전자 요법의 투여량에 따라 환자를 2개의 코호트에 등록시켰다. 코호트 1의 환자는 저 투여량(킬로그램당 6.7Х1013 vg)을 제공하고, 5개월 동안 등록하였고; 코호트 2의 환자는 고 투여량(킬로그램당 2.0Х1014 vg)을 제공하고, 1년 동안 등록되었다. 투여 후 제30일에, 코호트 1의 환자 1에 대한 IFN-γ ELISpot 분석은 T-세포 반응을 검출하였고, 106개의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)당 스팟 형성 세포(SFC)에서 갑작스러운 스파이킹이 나타났으며, 이는 AAV9 캡시드에 대해 50 초과가 유도된다(정상, 106 PBMC당 50 미만의 SFC). 프레드니솔론을 2 mg/kg에서 개시하여, T-세포 반응 및 혈청 트랜스아미나제가 감소될 때까지 35일 동안 유지시켰다. 결과적으로, 실험 프로토콜을 수정하고, 환자 2 내지 15에 유전자 벡터의 투여 24시간 전에 개시하여 대략 30일 동안 하루에 킬로그램당 1 mg의 투여량으로 경구 프레드니솔론을 제공하였다. AST 및 ALT 효소가 120 IU/L 수준 아래로 떨어지고, T-세포 반응이 106 PBMC당 100 미만 SFC로 떨어질 때까지 프레드니솔론을 유지한 상태로 치료를 계속하였고, 이 시점에서 프레드니솔론은 임상적 판단을 기반으로 하여 감쇠될 것이다.
대략 60분의 기간 동안 정맥내 주입된 정상 식염수(킬로그램당 대략 10 ml 내지 20 ml) 중의 벡터를 전달하였다. 등록 당시 일부 환자는 위 절개 또는 비위 튜브를 통한 장내 영양공급이 필요했으며, 부모 또는 주치의의 선호에 따라 선택하였다. 연구에 등록한 후 영양 지원이 필요한 모든 환자는 위 절개 튜브를 배치했으며, 연구 동안 튜브를 제거하지 않았다.
결과: 1차 결과는 3등급 이상의 임의의 치료 관련 부작용을 기반으로 하여 안전성을 결정하는 것이었다. 2차 결과는 사망까지의 시간 또는 영구적인 호흡 지원의 필요성이었다. 후자는 급성의 가역적 병태가 부재하는 경우 또는 수술 전 상태에서 적어도 14일 동안 연속적으로 하루에 적어도 16시간의 호흡 지원으로 규정되었다. 연구 결과에는 운동 이정표 달성(특히 보조 없이 앉기) 및 CHOP INTEND 점수가 포함되었다.
CHOP INTEND 척도의 적용에서 SMA에서 40점 초과의 점수 유지는 임상적으로 유의한 것으로 고려되었다. 보조 없이 앉기는 다음 기준에 따라 평가하여 분류하였다: 베일리 유아 및 아동 발달 척도(Bayley Scales of Infant and Toddler Development) 총 운동 부 검사의 항목 22("보조 없이 앉기")에 따라 적어도 5초 동안 보조 없이 앉기; 세계 보건기구(WHO) 기준("WHO 기준에 따라 보조 없이 앉기")에 따라 적어도 10초 동안 보조 없이 앉기; 및 상기 언급된 Bayley Scales의 항목 26("독립적인 기능적 앉기")에 따라, 적어도 30초 동안 보조 없이 앉기. 상호 비디오 평가를 통해 포착된 능력-미니(ACTIVE-mini)에 의해 독립적인 검토자에 의해 환자의 비디오 기록을 검사함으로써 주요 운동 이정표를 확인하였다. 화합물 근육 작용 전위(CMAP)를 기준선 및 주입 후 6개월마다 표면 전극으로부터 기록하였다. 근육의 병리학적 상태를 전기적 임피던스 근운동기록(EIM)에 의해 정량화하였다.
통계 분석: 또한 생존율에 대한 1차 분석(상기 규정된 바와 같은 프로토콜) 및 기준선에서 1개월 및 3개월까지의 CHOP INTEND 척도의 변화 분석에 포함된 모든 환자에서 안전성 분석을 수행하였다. 기준선에서 각 연구 방문시까지의 이러한 변화를 반복 측정을 위해 혼합 효과 모델을 사용하여 분석하였다. 혼합 모델에는 코호트 및 방문의 고정 효과 및 기준선 점수의 공변량이 포함되었다. 이정표 달성 및 영양 및 호흡 지원을 코호트 2에서 분석하였다. 통계 분석을 SAS 소프트웨어 버전 9.4를 사용하여 수행하였다. 후향성 코호트의 모든 비교는 전적으로 기술되었다.
결과
환자: 선택된 16명의 환자 중, 항-AAV9 항체 역가가 지속적으로 상승하여(1:50 초과) 1명이 제외되었다. 연구에 포함된 15명의 환자 중 3명이 저 투여량 코호트 1에 등록되었고, 12명이 고 투여량 코호트 2에 등록되었다. 치료 당시 환자의 평균 연령은 코호트 1의 경우 6.3개월(범위, 5.9 내지 7.2)이고, 코호트 2의 경우 3.4개월(범위, 0.9 내지 7.9)이었다(표 28).
Figure pct00041
생존 및 영구 인공호흡: 연구 종료 시점에, 모든 환자는 적어도 20개월의 연령에 도달하였고, 영구 기계 호흡이 필요하지 않았으며; 최종 폐 평가시 평균 연령은 코호트 1에서 30.8개월이고, 코호트 2에서 25.7개월이었다. 이와 달리, 후향성 코호트 환자의 8%만이 영구 기계 호흡이 필요하지 않았다. 생후 29개월에, 코호트 1의 한 환자는 타액분비항진으로 인해 영구 인공호흡이 필요하였다. 침샘 결찰 후, 비 침습적 호흡 사용에 대한 필요성은 하루에 25%에서 15시간으로 단축되었다.
운동 기능 평가: 코호트 1 및 2의 모든 환자는 CHOP INTEND 척도에 대한 기준선으로부터 점수가 증가하였고, 연구 동안 이러한 변화가 유지되었다. 코호트 2의 환자는 1개월째에 9.8점, 3개월째에 15.4점의 평균 증가를 나타냈고(두 비교 모두에 대해 P<0.001); 11명의 환자가 40점 초과의 점수를 획득하여, 유지하였다. 2017년 8월 7일의 연구 마감 시점에서 코호트 1의 환자는 기준선의 평균 16.3점으로부터 평균 7.7점의 증가를 나타내었으며, 코호트 2의 환자는 기준선의 평균 28.2점으로부터 평균 24.6점의 증가를 나타내었다.
코호트 2에서의 운동 이정표: 코호트 2의 총 12명의 환자 중 11명은 적어도 5초, 10명은 적어도 10초, 및 9명은 적어도 30초 동안 보조 없이 앉기가 가능하였다. 총 11명이 머리 제어를 수행하였고, 9명은 구르기가 가능하였으며, 2명은 기기, 잡고 서기, 독립적으로 서기 및 독립적으로 걷기가 가능하였다. 11명의 환자는 말하기 능력을 획득하였다. 후향성 코호트 환자는 이러한 운동 이정표 중 어느 것도 달성하지 못했으며, 말하기 능력을 거의 획득하지 못하였다.
Figure pct00042
코호트 2에서의 폐 및 영양 상태: 코호트 2의 12명의 환자 중 10명은 최종 추적 조사 방문시 호흡 보조 장치가 불필요한 7명과 비교하여, 기준선에서 비 침습적 호흡이 필요하지 않았다(표 29). 기준선에서, 7명의 환자는 이후에 가능하게는 척추 측만증 수술과 관련하여 유전자 대체 요법 후 위루술 튜브의 배치가 필요한 1명을 포함하여 장내 영양 공급이 필요하지 않았다. 유전자 대체 요법 전에 장내 영양 공급이 제공된 5명의 환자 중, 최종 추적 조사에서 12명의 환자 중 11명이 독립적 연하 능력을 획득하거나, 유지하였고, 4명이 경구 영양 공급이 가능하였다.
안전성: 연구 종료 시점에, 2개의 코호트에서 13명의 환자에서 총 56개의 중증 부작용이 관찰되었다. 이들 이벤트 중에서, 부작용에 대한 공통 용어 기준에 따르면, 연구자들은 2건의 이벤트를 실험 값을 기반으로 하여 치료 관련 등급 4 이벤트로 판단하였다(표 30). 코호트 1의 환자 1은 다른 간 기능 이상(즉, 총 및 간접 빌리루빈 및 알칼리성 포스파타제)의 부재 하 및 임상 증상의 부재 하에, 혈청 아미노트랜스퍼라제 수준의 상승(알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)의 경우 정상 범위의 상한의 31배, 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST)의 경우 상한의 14배)을 나타내었다. 전술한 바와 같이, 이들 상승은 후속하여 잔여 환자에 투여된 프레드니솔론 치료에 의해 경감되었다. 코호트 2의 한 환자는 상승된 혈청 ALT 및 AST 수준(ALT의 경우 정상 범위의 상한의 35배 및 AST의 경우 37배)을 경감시키기 위해 추가 프레드니솔론이 필요하였다. 241건의 비중증 부작용 중 3건은 치료와 관련된 것으로 고려되었고, 2명의 환자에서의 혈청 아미노트랜스퍼라제 수준의 무증상 상승(ALT 및 AST, 둘 모두 정상 범위의 상한의 10배 미만)으로 구성되었으며, 이는 추가적 프레드니솔론 치료 없이 해소되었다(표 0. 간 기능 검사에서 다른 이상이 존재하지 않았다. 15명의 환자 중 14명은 호흡기 병태를 앓고 있었으며, 이는 SMA1 소아에서 종종 사망을 야기하거나, 기관절개술이 필요하다.
Figure pct00043
Figure pct00044
SMA1 환자에서 SMN을 코딩하는 DNA를 포함하는 아데노-연관 바이러스 벡터의 단일 정맥내 주입은 이 질병의 후향성 코호트에서보다 더 긴 생존율을 야기하였다. 15명의 환자 모두, 2개의 SMN2 카피를 가진 SMA1 환자의 경우 10.5개월의 이전에 보고된, 영구 인공호흡기 부재 하의 중앙값 생존율 연령을 초과하였다. 모든 환자는 또한 20개월의 기준을 초과하였으며, 이 시점에서 통상적으로 이 질병 환자의 8%만이 영구 인공호흡기 부재 하에 생존한다. 코호트 2의 12명의 환자 중 4명에서, 모두는 아니지만 1명이 후향성 코호트에서 보고되지 않은 운동 기능 이정표를 달성하였다. 획득된 운동 기능은 먹기(손을 입으로 가져가기), 앉기 및 말하기로 반영되어 임상적으로 유의하였다. 등록시 보조 치료가 필요하지 않은 대부분의 환자는 최종 추적조사 방문시 영양 지원(7명의 환자 중 6명) 및 호흡 지원(10명의 환자 중 7명)이 부재하였다. 두 코호트에서, 환자는 기준선으로부터 CHOP INTEND 척도 점수가 증가하였다. 코호트 2의 처음 1개월 내에, NeuroNEXT 연구에서 후향성 코호트에서 6개월에서 12개월 사이에 평균 10점 초과의 감소와 달리, 평균 증가는 9.8점이었다.
SMNΔ7 마우스 모델에서 SMN 유전자 대체 요법의 전임상 연구는 아마도 운동 뉴런이 여전히 손상되지 않은 시점에 조기 치료로 생존율 및 운동 기능이 개선됨을 보여주었다. 본 발명자들의 조기 치료 연구에서 임상 결과는 전임상 연구에서의 방향을 반영하였다. 두 환자는 조기 치료 후 보조 없이 기기, 서기 및 말하기가 가능하였다. 이 두 환자 모두 SMA의 가족력이 있었으며, 아마도 조기 진단에 기여했을 것이다. 본 발명자들의 연구에서 두 코호트의 모든 환자가 운동 기능이 지속적으로 개선되었지만, 전임상 및 임상 데이터는 SMA에 대한 조기 치료 및 신생아 스크리닝에 대한 이점을 시사한다.
AAV 유전자 대체 요법에 의해 야기된 중증 부작용은 2명의 환자에서 치료 후 대략 3주 후에 다른 간 효소 이상의 부재 하에 상승된 혈청 아미노트랜스퍼라제 수준으로 제한되었고; 다른 2명의 환자는 중증 부작용의 정의에 대한 컷오프에 도달하지 않은 상승을 나타내었다(즉, 정상 범위의 10배 초과). 간 효소의 상승은 프레드니솔론 처리에 의해 경감되었다. 한 명의 환자는 항-AAV9 항체의 존재로 인해 스크리닝을 통과하지 못했는데, 이는 소아 및 청소년에서 낮은 항-AAV9 혈청 양성률 및 40세 초과의 개인에서 증가된 항-AAV9 혈청 양성률을 시사하는 집합 연구와 일치한다. 그러나, 바이러스에 대한 항체의 존재는 AAV 유전자 대체 요법의 한계일 수 있다.
이 연구는 질병의 자연 후향성이 잘 특성화되어 있고, 치명적인 경우의, 제한된 수의 선택 중 하나인, 후향성 집합을 대조군으로 가지는 단일 그룹 설계를 사용하였다. 공개된 후향성 연구에서와 유사한 동종 샘플을 등록하기 위해, 본 발명자들은 이중대립유전자 SMN1 돌연변이 및 2개의 SMN2 카피를 갖는 SMA1 유증상 환자만이 포함되도록 등록을 제한하였으며, c.859G → C 유전자 변형인자를 가진 환자의 경우, 이러한 유전자 변형인자에 의해 이 질병의 더 경미한 표현형이 예측되므로, 등록시키지 않았다. SMN2의 엑손 7에서, 이 유전자 변형 제는 질병의 더 가벼운 표현형을 예측하기 때문이다. 그러나, 이 유전자 대체 요법은 유증상 환자, 또는 특정 게놈 하위유형을 갖는 환자로 제한될 필요는 없다.
결론적으로, SMA1 환자에서 SMN을 코딩하는 DNA를 포함하는 고 투여량의 아데노-연관 바이러스 벡터의 1회 정맥내 주입으로 연장된 생존율, 개선된 운동 기능 및 이전에 이 질병에서 관찰되지 않은 수준으로의 CHOP INTEND 척도의 증가된 점수가 야기되었다. 이러한 개선으로 인해 후향성 연구보다 보조 치료가 필요한 환자의 백분율이 감소하였다. 최대 2년의 추적 조사에서 운동 기능 효과의 약화 또는 임상적 퇴행은 보고되지 않았다. 몇몇 환자는 아미노트랜스퍼라제 수준에서 일시적 무증상 상승을 나타내었다. SMA1 환자에서 유전자 대체 요법의 장기 안전성 및 지속성을 평가하기 위한 추가 연구가 필요하다.
실시예 15 - scAAV9.CB.h SMN 의 약동학
기존의 임상 약동학 연구는 유전자 대체 요법 산물에는 적용할 수 없다. 그러나 체액과 배설물을 통해 체내로부터 제거된 벡터의 양을 평가하는 scAAV9.CB.hSMN 벡터 배출 연구는 유전자 대체 요법을 위한 기존의 약동학 연구 대신 사용될 수 있는 측정이다.
scAAV9.CB.hSMN을 주입한 후 벡터 배출을 임상 연구 동안 다수 시점에 조사하였다. 타액, 소변 및 대변의 샘플을 매주 30일까지 수집한 다음, 12개월 동안 1개월마다 이후 3개월마다 수집하였다. 5명의 환자로부터의 샘플을 18개월 방문 동안 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응에 의한 scAAV9.CB.hSMN 벡터 배출 분석에 사용하였다. scAAV9.CB.hSMN 벡터 배출에 대해 분석한 5명의 환자 모두에게 1.1 x 1014 vg/kg의 치료 투여량을 투여하였다.
scAAV9.CB.hSMN은 주입 후 배출 샘플에서 검출 가능하였다. 주입 후 제1일에 소변 및 타액에서의 scAAV9.CB.hSMN 농도는 체내의 초기 농도의 0.1% 내지 0.01%였으며, 그 후 농도는 정량 한계 미만으로 떨어졌다. 대변에서, 주입 후 제1일에 체내의 초기 농도의 10% 내지 30% 수준이 검출 가능하였다. 하나의 환자는 주입 후 제14일에 대변에서 체내 초기 농도의 280%의 피크 농도를 나타냈다. 이와 달리, 데이터 정보가 존재하는 3명의 환자는 주입 후 제14일에 체내의 초기 농도의 1% 미만의 농도를 나타냈으며, 주입 후 30일 동안 농도가 약 4 log(10,000배) 감소하였다. 전반적으로, scAAV9.CB.hSMN은 주로 대변에서 체내로부터 배출되었으며, 주입 후 제60일까지 대변에서 정량 한계 미만이었다.
실시예 16 - 비 임상 독성 시험
동물 약리학: 질병의 델타 7 SMA 마우스 모델(SMN△7 마우스)에 scAAV9.CB.hSMN 벡터를 주입한 후, 체중이 증가하고, 정위 거동이 개선되었고, 생존율은 투여량 의존적 방식으로 유의하게 연장되었으며, SMA 관련 심장 결함은 비처리 SMN△7 마우스와 비교하여 정상으로 복원되었다.
동물 독성학: 마우스에 정맥내 주입 후, 벡터 및 전이유전자는 광범위하게 분포되고, 일반적으로 심장 및 간에서 최고 발현이 관찰되고, 뇌 및 척수에서는 상당한 발현이 관찰되었다. 주요 우수 실험실 관행(GLP) 준수 3개월 마우스 독성 연구에서 독성의 주요 표적 기관은 심장 및 간이었다. 심장의 심실에서 scAAV9.CB.hSMN 벡터 관련 결과는 투여량 관련 염증, 부종 및 섬유증, 및 심방, 염증 및 혈전증으로 구성되었다. 간 결과는 간세포 비대, 쿠퍼 세포 활성화 및 산재된 간세포 괴사에 포함되었다. 마우스에서 scAAV9.CB.hSMN 벡터 관련 심장 및 간 결과에 대해 무 부작용 수준(No AEL)이 확인되지 않았으며, 최대 허용 투여량은 1.5 Х 1014 vg/kg으로 규정되며, 이는 1.1 Х 1014 vg/kg의 권장 치료 투여량에 비해 약 1.4배의 안전성 한계를 제공한다. 권장 치료 투여량 1.1 x 1014 vg/kg 대비. 마우스에서 관찰된 결과를 영장류에 대해 적용할 수 있는지는 현재 공지되어 있지 않다.
실시예 17 - 소아 환자에서의 척수성 근위축
이 시험은 이중 대립유전자 SMN1 결실, 생존 운동 뉴런 2(SMN2)의 2개의 카피, 엑손 7의 c.859G>C 변형에 대한 음성 결과를 확인하기 위해 유전자 시험되고, 생후 6개월 전에 임상 증상이 발생한 SMA 1형 환자에서의 scAAV9.CB.hSMN 벡터의 안전성 및 효능을 평가하는 단계 1 연구이다. scAAV9.CB.hSMN 벡터를 생후 0.9개월 내지 7.9개월의 환자에게 단일 투여량 주입 동안 정맥내로 전달하였다. 두 코호트에 다음을 투여하였다: 코호트 1(n = 3)은 이 연구에 사용된 저 투여량이 제공되고, 코호트 2(n = 12)는 고 투여량(치료 투여량: 1.1 x 1014 vg/kg)이 제공되었다. 보고된 연구 결과는 코호트 2를 반영하고, scAAV9.CB.hSMN 벡터 주입 24개월 후까지의 모든 환자의 추적 조사를 포함한다.
치사율 및 무 이벤트 생존율
생존율 및 시간-대-이벤트 분석은 scAAV9.CB.hSMN 벡터의 효능을 뒷받침한다. 코호트 2에서, 12명의 환자 모두(100%)가 생후 24개월 초과였고, 무 이벤트였으며, 이와 달리, 자연 후향성 연구에서는 환자의 8%만이 위와 같았다. 이는 비치료 환자와 비교하는 경우, scAAV9.CB.hSMN 벡터가 주입된 환자의 전체 생존율에서 현저하고 임상적으로 유의한 증가를 나타낸다. 주입 2년 후, 환자 사망은 보고되지 않았다.
발달 운동 이정표
발달 운동 이정표를 조사하였고; 발달 운동 이정표의 달성을 확인할 수 있도록 15명의 환자 모두에 대한 평가를 비디오 기록하였다. 코호트 2의 환자는 주요 발달 운동 이정표를 지속적으로 달성하고, 유지하였다. 투여 후 24개월의 추적 조사에서, 11명의 환자(91.7%)가 3초 이상 동안 머리를 똑바로 세우기, 5초 이상 동안 보조 없이 앉기가 가능하였고, 10명의 환자(83.3%)는 10초 이상 동안 보조 없이 앉기가 가능하였고, 9명의 환자(75.0%)는 30초 이상 동안 보조 없이 앉기가 가능하였으며, 2명의 환자(16.7%)는 각각 혼자 서기, 보조 하에 걷기 및 혼자 걷기가 가능하였다. 현재 이 연구의 지속적인 관찰 장기 추적 조사에 등록되어 있는 코호트 2 환자는 발달 운동 이정표를 유지하였으며, 일부는 추가 운동 이정표를 달성하였다.
Figure pct00045
폐
기준선에서 비 침습적 인공호흡(NIV)을 사용하지 않는 코호트 2의 10명의 환자 중 7명은 24개월의 추적 조사에서 매일 NIV를 사용하지 않았다. SMA 1형 소아에서 일반적으로 기관절개 또는 사망으로 이어지는 일반적인 소아 호흡기 질병이 거의 모든 환자에서 진행되었다. 모든 환자는 기관절개술 또는 영구 인공호흡이 필요함이 없이 호흡기내과에 입원하여 생존하였다.
영양
영양 증가가 또한 관찰되었다. 코호트 2에서, 7명의 환자에 유전자 대체 요법 전에 장내 영양 공급을 제공하지 않았다. 이 7명의 환자 중 한(1) 명은 척추 측만증 수술 후 회복이 어려워 상처 치유를 돕는 영양 지원을 받았지만, 경구 영양 공급이 진행되었다. 유전자 대체 요법 전에 장내 영양 공급이 제공된 코호트 2의 5명의 환자 중 네(4)명은 연구 종료 시 경구 영양 공급이 가능하였고; 따라서, 코호트 2의 12명의 환자 중 총 11명은 경구 영양 공급이 가능하였으며, 6명은 배타적으로 경구 영양 공급되었다.
운동 기능(CHOP-INTEND)
치료 투여량이 제공된 환자는 1개월 및 3개월째까지 통계적으로 유의한 운동 기능 개선을 달성하였으며; 필라델피아 소아 병원의 신경 근육 장애 검사(CHOP INTEND)는 기준선으로부터의 증가가 각각 9.8점(n = 12, P < 0.001) 및 15.4점(n = 12, P < 0.001)임을 의미한다.
scAAV9.CB.hSMN 벡터가 주입된 환자에서 운동 기능성 개선이 시간 경과에 따라 지속되었다. 12명(91.7%)의 코호트 2 환자 중 11명은 24개월째에 50 이상의 CHOP-INTEND 점수를 획득하였다. 조기 개입 및 투여량은 반응에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 보인다. 일반적인 임상 실습에서, 생후 6개월 이상의 비치료 SMA 1형 소아는 CHOP-INTEND에서 40점을 초과하지 않는다. 추가로, 생후 6개월 내지 12개월에 평균 10.7점의 감소가 비치료 유아 중 보고되었으며, 이는 예상 자연 후향성의 일부에 부합한다.
실시예 18 - qPCR을 사용하여 AAV9 바이러스 벡터에서 잔여 숙주 세포 DNA의 측정
방법
이 방법은 AAV 약물 물질, 예를 들어 AVXS-101 및 qPCR에 의한 공정 중 샘플에서 잔여 hc DNA의 정량화를 위해 사용되었다. 플레이트당 최대 6개의 샘플을 시험하였다. TaqMan 프로브를 사용하여 qPCR 분석을 수행하였다. TaqMan 프로브는 5'-말단에 결합된 형광성 리포터 염료 및 3'-말단에 결합된 비 형광성 소광제를 갖는다. 프로브가 손상되지 않은 동안, 소광제와 리포터 염료의 근접성은 리포터 염료에 의해 방출되는 형광을 크게 감소시킨다. 프로브의 절단은 리포터 염료와 소광제를 분리하여 리포터 형광을 증가시킨다.
인간 게놈 내의 반복 서열에 결합하도록 설계된 측접 정방향 및 역방향 프라이머를 반응 혼합물에 첨가하고, 샘플 및 표준에 존재하는 표적 서열에 어닐링하였다. TaqMan 형광 프로브는 프라이머 부위 사이에서 어닐링되었다. 주형 변성, 프라이머 어닐링 및 산물 연장의 연속 사이클에 의해 표적 서열을 증폭시켰다. 증폭 사이클의 연장 단계 동안, Taq DNA 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성은 프로브로부터 리포터 염료를 방출하여, 소광제로부터 염료를 제거함으로써, 주형의 양에 비례하는 형광 방출을 야기하였다.
96-웰 플레이트의 각 웰의 형광을 qPCR 장치로 측정하였다. 추가적인 PCR 사이클을 통해, 표적 서열의 양이 증가하였고, 그 결과 더 많은 리포터 염료가 프로브로부터 방출되고, 각각의 연속적인 PCR 사이클에서 더 높은 형광이 발생하였다. 형광 신호가 소정의 임계값에 도달하기 위해 필요한 증폭 사이클의 횟수를 측정한다. 이 사이클을 임계 사이클 또는 CT 값으로 지칭한다. 샘플 또는 표준 웰에서 DNA의 출발 농도가 더 클수록 임계값 형광 수준에 도달하기 위해 필요한 PCR 사이클의 횟수가 더 적고 CT 값이 더 낮아진다. 표준 곡선은 각 표준 점에 대해 측정된 log10(DNA 농도) 대 CT 값을 그래프화하여 결정된다. 샘플에 대해 개별 CT 값을 사용하고, DNA 값에 대해 적용함으로써 샘플에 존재하는 DNA의 양을 결정하기 위해 CT 값을 사용한다.
먼저, Wako DNA 추출기 키트(Wako, 295-50201)를 사용하여 샘플을 제조하였다. 간단히 말하면, 시험용 샘플을 잘 혼합하고, 1000배 희석하였다. 희석된 샘플을 4개의 튜브(각각 500 μL)로 분할하고, 50 μL의 물을 2개의 튜브에 첨가하고(비스파이킹 이중 반복실험), 50 μL의 30,000 pg/mL DNA 표준을 다른 2개의 튜브에 첨가하였다(스파이킹 대조군). 20 μL의 소듐 N-라우로일 사르코시네이트 용액을 각 튜브에 첨가하고, 5초 동안 교반한 다음 간단히 원심분리하여 단백질 용해를 수행하였다. 글리코겐 및 Pellet Paint(Novagen, 70748)를 포함하는 NaI 용액을 NaI:글리코겐:Pellet Paint의 2000:5:4 비율이 되도록 제조하였다. 500 μL의 NaI 혼합물을 각 튜브에 첨가하고, 15분 동안 53℃ ± 1℃에서 인큐베이션하였다. 튜브를 열로부터 제거하고, 900 μL의 이소프로판올과 혼합하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 튜브를 10,000 g에서 18℃에서 15분 동안 원심분리하고, 상청액을 따라내었다. 남은 펠릿을 800 μL의 세척액 A로 세척하고, 교반하고, 2회 다시 펠릿팅하였다. 마지막으로, 펠릿을 글리코겐을 포함하는 1500 μL의 냉각된 이소프로판올 세척액으로 세척하고, 교반하고, 다시 펠릿팅하였다. 최종 펠릿팅된 것을 500 μL의 무뉴클레아제 물에 재현탁시켰다.
qPCR을 resDNA SEQ 인간 정량적 키트(Applied Biosystems, A26366)를 사용하여 수행하였다. 키트에 지시된 바와 같이 2x Environmental 마스터 믹스, 10x 인간 DNA 분석 믹스 및 음성 대조군을 조합하여 반응 믹스를 제조하였다. 20 μL 반응 혼합물을 10 μL의 제조 샘플과 혼합하고, PCR 플레이트 상의 각 웰에 첨가하였다. 각 샘플을 삼중 반복실험으로 플레이팅하였다. 플레이트를 광학 접착 필름으로 밀봉하였다. 열 순환 동안, 먼저 용융을 95℃에서 10분 동안 수행한 다음, 샘플을 95℃에서 15초 동안 및 60℃에서 1분 동안 40 사이클 동안 순환시켰다.
표준 곡선을 CT 값 대 DNA의 양(log([pg/mL]))을 그래프화하여 생성하였다. 이 데이터는 다음 식으로 주어진 직선에 적합하다:
CT 값 = m x log10(x) + b
여기서 x = 표준 농도(pg/mL), m은 기울기이고, b는 y 절편이다. 상기 식을 사용하여 웰의 CT 값으로부터 숙주 세포 DNA의 농도를 역 계산한 후, 희석 배수로 보정하였다.
결과
qPCR에 의해 측정된 잔여 숙주 세포 DNA는 벡터의 이전 배치의 경우 3.7x105 pg/mL이고, AVXS-101 항목번호 600156의 경우 0.76x105 pg/mL이고, AVXS1-101 항목번호 600307의 경우 0.68x105 pg/mL이며, AVXS-201 DS의 경우 1.3x105 pg/mL이었다.
실시예 19 - ELISA에 의한 AAV9 바이러스 벡터에서의 잔여 숙주 세포 단백질(HCP)의 측정
방법
AVXS-101 샘플에서 숙주 세포 단백질(HCP) 농도를 시판 효소 연결 면역흡착 분석(ELISA) 키트를 사용하여 측정하였다. Cygnus Technologies 인간 배아 신장 293 HCP ELISA 키트는 고상 2 부위 효소 면역분석법이다. 이는 2개의 다클론 항체가 HCP의 별도의 항원 결정기에 대해 유도되는 직접 샌드위치 기법을 기반으로 한다. 인큐베이션 동안, 샘플 중의 HCP는 마이크로플레이트 웰에 결합된 항-HCP 항체 및 용액 중의 퍼옥시다제-접합된 항-HCP 항체와 결합하였다.
인큐베이션 기간 후, 웰을 세척하여 결합되지 않은 효소-접합 항체를 제거하였다. 이어서, 3,3', 5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 기질 용액을 웰에 첨가하였다. 결합된 퍼옥시다제 접합체는 기질에서 색 변화 반응을 촉매하였다. 산을 첨가하여 반응을 중지시켰고, 이에 의해 450 nm에서 분광학적으로 판독될 수 있는 비색 종점이 제공되었다. 가수 분해된 기질의 양은 존재하는 HCP의 농도에 정비례하였다.
시험될 샘플을 본 방법의 범위인, 4 ng/mL 내지 200 ng/mL에 부합하게 희석하였다. 이어서, 각각의 샘플을 SDB(110 μL 샘플 및 110 μL SDB)에서 2배 희석하고, 혼합하였다. 일관성을 확인하기 위해 스파이킹 대조군을 또한 제조하였다. 스파이킹 대조군에서, 각각의 샘플 110 μL를 200 ng/mL HCP 표준의 27.5 μL 및 SDB 82.5 μL와 혼합하였다. 마지막으로, 50 μL의 각 표준, 대조군 또는 시험 샘플을 96웰 플레이트 상의 웰에 첨가하고, 100 μL의 항-HEK 293-HRP 접합체와 혼합하였다. 모든 조건을 삼중 반복실험으로 플레이팅하였다. 플레이트를 밀봉 테이프로 밀봉하고, 400 rpm 내지 600 rpm에서 2시간 동안 실온에서 진탕시켰다. 인큐베이션 후, 플레이트를 거꾸로 흔들고, 흡수성 타월로 블로팅하여, 웰의 용액을 제거하였다. 웰을 세척 병으로 세척하고, 빠르게 블로팅하고, 웰 내의 세척액을 흡수시키는 단계 없이 두드렸다. 세척을 4회 반복하고, 마지막 세척 후 배수되도록 약 20초 동안 거꾸로 방치하였다. 마지막으로, 100 μL의 TMB 기질을 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 교반 없이 실온에서 20분 내지 30분 동안 인큐베이션하였다. 각 웰에 100 μL의 정지 용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 정지 용액을 첨가한 후 45분 이내에 플레이트를 플레이트 판독기에 로딩하고, 450 nm 및 650 nm에서 플레이트를 판독하였다.
표준의 평균 흡광도를 다음 식을 기반으로 하여 4-매개변수 log(4PL) 적합 곡선을 생성하기 위해 표준의 이론적 HCP 농도에 대해 반-log 그래프로 그래프화하였다:
Y = [(A-D)/(1+(X/C)^B)] + D
여기서, A는 하부 점근선이고, B는 곡선 기울기이고, C는 두 점근선 사이의 중앙 흡광도 값에 해당하는 농도(ng/mL)이고, D는 상부 점근선이고, X는 샘플 농도(ng/mL)이고, Y는 흡광도이다. 그런 다음 표준 곡선을 사용하여 SoftMax Pro 소프트웨어를 사용하여 스파이킹된 샘플 대조군 및 스파이킹되지 않은 시험 샘플 중 HCP 농도를 결정하였다. 표준 곡선의 r2가 0.98 이상이고, 200 ng/mL 표준의 평균 보정 흡광도가 1.0 OD 이상이고, 0 ng/mL 표준의 평균 보정 흡광도가 0.2 OD 이하이며, 3웰 이중 반복실험에 대한 보정된 흡광도의 변동 계수가 15% 이하인 경우에만 시험이 인정되었다. 각 샘플의 HCP 최종 농도를 다음 식을 사용하여 계산하였다:
HCP 농도 샘플(ng/mL) = 희석 배수 x 측정된 평균 HCP 농도(ng/mL).
결과
ELISA에 의해 측정된 잔여 숙주 세포 단백질은 벡터의 이전 배치, AVXS-101 항목번호 600156, AVXS1-101 항목번호 600307 및 AVXS-201 DS에 대한 정량 한계 미만이었다(8 ng/mL).
실시예 20 - ELISA에 의한 AAV9 바이러스 벡터에서 잔여 벤조나제의 측정
방법
AAV 산물, 예를 들어, AVXS-101에서의 잔여 벤조나제 농도를 시판 효소-연결 면역흡착 분석(ELISA) 키트를 사용하여 측정하였다. Merck 벤조나제 엔도뉴클레아제 ELISA 키트 II는 고상 2 부위 효소 면역분석법이다. 이는 2개의 다클론 항체가 벤조나제의 별도의 항원 결정기에 대해 유도되는 직접 샌드위치 기법을 기반으로 한다. 인큐베이션 동안, 샘플 중의 벤조나제는 마이크로플레이트 웰에 결합된 항-벤조나제 항체 및 용액 중의 퍼옥시다제-접합된 항-벤조나제 항체와 결합하였다.
인큐베이션 기간 후, 웰을 세척하여 결합되지 않은 임의의 효소-접합 항체를 제거하였다. 이어서 3,3', 5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 기질 용액을 웰에 첨가하였다. 결합된 퍼옥시다제 접합체는 기질에서 색 변화 반응을 촉매하였다. 산을 첨가하여 반응을 중지시켰고, 이에 의해 450 nm에서 분광학적으로 판독될 수 있는 비색 종점이 제공되었다. 가수 분해된 기질의 양은 존재하는 벤조나제의 농도에 정비례하였다.
간략하게 말하면, 175 μL의 샘플과 175 μL의 PBST를 조합함으로써 샘플을 2배 희석하였다. 동시에, 벤조나제 스파이킹 샘플 대조군을 또한 35 μL의 10 ng/mL 벤조나제 표준 및 140 μL의 PBST와 175 μL의 샘플을 조합함으로써 제조하였다. 키트로부터 사전 코팅된 ELISA 스트립을 스트립 지지체에 장착하고, 각 시험 믹스 100 μL를 웰당 로딩하였다. 블랭크의 경우, 샘플 대신 100 μL의 PBST를 로딩하였다. 각 조건은 삼중 반복실험으로 로딩되었다. 플레이트를 밀봉하고, 플레이트 진탕기(450 rpm)에서 교반하면서 2시간 ± 5분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 내용물을 따라내고, 면역 세척기를 사용하여 약 350 μL의 PBST를 첨가하여 플레이트를 세척하고, 1분 동안 인큐베이션한 다음, 뒤집어서 흡수성 타월에 두드렸다. 총 3회의 세척을 수행한 후, 100 μL의 희석된 HRP-접합 항체를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 플레이트 진탕기(450 rpm)에서 교반하면서 1시간 ± 5분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 내용물을 따라내고, 면역 세척기를 사용하여 약 350 μL의 PBST를 첨가하여 플레이트를 세척하고, 1분 동안 인큐베이션한 다음, 뒤집어서 흡수성 타월에 두드렸다. 총 3회의 세척을 수행하고, 100 μL의 TMB 기질을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 내용물을 암소에서 교반 없이 실온에서 15분 내지 40분 동안 인큐베이션하였다. 100 μL의 0.2 N H2SO4 중지 용액을 각 웰에 첨가하여 반응을 중지시켰다. 플레이트의 흡광도를 중지 용액의 첨가 후 45분 내에 450 nm에서 분광광도계를 사용하여 측정하였다.
표준의 평균 흡광도를 다음 식을 기반으로 하여 4-매개변수 log(4PL) 적합 곡선을 생성하기 위해 표준의 이론적 벤조나제 농도에 대해 반-log 그래프로 그래프화하였다:
Y = [(A-D)/(1+(X/C)^B)] + D
여기서, A는 하부 점근선이고, B는 곡선 기울기이고, C는 두 점근선 사이의 중앙 흡광도 값에 해당하는 농도(ng/mL)이고, D는 상부 점근선이고, X는 샘플 농도(ng/mL)이고, Y는 흡광도이다. 그런 다음 표준 곡선을 사용하여 SoftMax Pro 소프트웨어를 사용하여 스파이킹된 샘플 대조군 및 스파이킹되지 않은 시험 샘플 중 HCP 농도를 결정하였다. 표준 곡선의 r2가 0.98 이상이고, 2.5 ng/mL 표준의 평균 보정 흡광도가 1.0 OD 이상이고, 0.10 ng/mL 표준의 평균 보정 흡광도가 PBST 블랭크의 평균 OD를 초과하고, 3웰 이중 반복실험에 대한 보정된 흡광도의 변동 계수가 15% 이하인 경우에만 시험이 인정되었다. 각 샘플의 HCP 최종 농도를 다음 식을 사용하여 계산하였다:
벤조나제 농도샘플(ng/mL) = 희석 배수 x 측정된 평균 벤조나제 농도(ng/mL).
결과
ELISA에 의해 측정된 잔여 벤조나제 농도는 벡터의 이전 배치, AVXS-101 항목번호 600156, AVXS1-101 항목번호 600307 및 AVXS-201 DS에 대한 정량 한계 미만이었다(0.2 ng/mL).
실시예 21-마이크로 BCA 분석에 의한 AAV9 바이러스 벡터에서의 단백질 농도 측정
방법
공정 중, 약물 물질 및 약물 산물 샘플, 예를 들어, AVXS-101 내의 단백질의 양을 2 mg/mL 소 혈청 알부민(Thermo Fisher Scientific, 23209) 기준 단백질 표준 및 마이크로 BCA 단백질 분석 키트(Thermo Fisher Scientific, 23235)를 사용하여 마이크로 BCA 플레이트 분석에 의해 측정하였다. 참조 단백질 표준 및 마이크로 BCA 단백질 분석 키트(Thermo Fisher Scientific, 23235). 분석은 총 단백질의 비색 검출 및 정량화를 위한 세제-적합성 비친코닌산(BCA) 제형을 기반으로 한다. BCA는 Cu2+가 알칼리성 환경에서 단백질에 의해 환원되는 경우, 형성되는 Cu1+를 검출한다. 자주색의 반응 산물은 2개의 BCA 분자와 하나의 구리 이온(Cu1+)의 킬레이트화에 의해 형성되며, 이는 562 nm에서 강한 흡광도를 나타내며, 단백질 농도가 증가함에 따라 선형이다.
간략하게 말하면, 희석제 중 2 mg/mL BSA의 연속 희석(pH 8.0의 제형 완충액, 200 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM MgCl2, 0.001% w/v Pluronic F-68의 20배 희석)을 수행하여 표준을 제조하였다. AVXS-101의 시험 샘플을 물로 20배 희석하고, 희석제로 연속 희석하였다. 표적 농도는 약 7.5 μg/mL이다. 키트로부터 25부의 마이크로 BCA 시약 A, 24부의 시약 B 및 1부의 시약 C를 혼합함으로써 작업 시약(WR)을 제조하였다. 150 μL의 각 표준 및 시험 샘플을 96웰 플레이트에 삼중 반복실험으로 로딩하고, 150 μL의 WR과 혼합하였다. 플레이트를 밀봉하고, 30초 동안 플레이트 진탕기에서 300 rpm으로 진탕시켰다. 이어서, 플레이트를 37℃ ± 2℃에서 2시간 동안 진탕 없이 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 1000 rpm에서 2분 동안 원심분리하여 응축물을 수집하고, 인큐베이션 후 플레이트를 15분 내지 60분 동안 냉각시켰다. 플레이트를 562 nm에서 플레이트 판독기에서 판독하고, 데이터를 SoftMax Pro로 분석하였다.
표준의 평균 흡광도 대 표준의 이론적 단백질 농도를 반 log 그래프로 그래프화하고, 2차 적합을 생성하였다. 2차 적합은 다음 식을 기반으로 한다:
Y = A + Bx + Cx2
여기서, A, B, C는 곡선 적합 매개변수이고, x는 샘플 농도(μg/mL)이고, Y는 흡광도(OD)이다. 표준 곡선의 r2가 0.98 이상이고, 블랭크의 평균 흡광도가 최저 표준(1 μg/mL)보다 낮고, 각 표준의 3웰 이중 반복실험에 대한 흡광도의 변동 계수가 10% 이하인 경우에만 시험이 인정되었다. 이어서 표준 곡선을 사용하여 시험 샘플 중 단백질 농도를 결정하였다. 최종 단백질 농도를 다음 식을 사용하여 계산하였다:
총 단백질 농도(μg/mL) = 희석 배수 x 측정된 평균 단백질 농도(μg/mL).
결과
마이크로 BCA에 의해 측정된 총 단백질 농도는 벡터의 이전 배치의 경우 1.0x1013 vg/mL당 167 μg/mL이고, AVXS-101 항목번호 600156의 경우 1.0x1013 vg/mL당 179 μg/mL이고, AVXS1-101 항목번호 600307의 경우 1.0x1013 vg/mL당 176 μg/mL이고, AVXS-201 DP의 경우 1.0x1013 vg/mL당 182 μg/mL이고, AVXS-301 DP의 경우 1.0x1013 vg/mL당 418 μg/mL이었다.
실시예 22 - AVXS-101, AVXS-201 및 AVXS-301의 순도 및 방출 규모
실시예 1 내지 4의 AVXS-101 약물 물질 및 AVXS-101 약물 산물의 순도를 시험하였다. 표 32 및 표 33은 이러한 산물의 규모 및 방출 기준을 보여준다.
Figure pct00046
Figure pct00047
AVXS-201 및 AVXS-301은 예를 들어 실시예 1 내지 4에 기재된 바와 같이 AVXS-101에 대해 기재된 것과 동일한 공정을 사용하여 제조하고 정제할 수 있다. 생물반응기에서 생성된 각 산물의 배치에 대한 규모 및 방출 기준은 표 34 내지 표 36에 제시되어 있다.
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
AVXS-201 및 AVXS-301에 대해 달성된 고순도는 본 출원에 기재된 바와 같은 AAV 바이러스 벡터를 생성하여 정제하는 방법이 상이한 함유물을 갖는 AAV 바이러스 벡터에 걸쳐 광범위하게 적용할 수 있음을 보여준다.
첨부 도면을 참조하여 구현예를 기재하였지만, 본 개시는 정확한 구현예로 제한되지 않으며, 첨부된 청구범위에 규정된 바와 같은 본 개시 및 구현예의 범위 또는 사상을 벗어남이 없이, 당업자에 의해 다양한 변경 및 변형이 이루어질 수 있음을 이해해야 한다.
예시적 구현예의 목록
1. 약제학적 조성물로서,
(a) 1 내지 8 X 1013 벡터 게놈/ml 전이유전자 조작 파르보바이러스;
(b) 5.0% 미만의 빈 캡시드;
(c) 1 X 1013 vg/ml당 40 ng/ml 미만의 잔여 숙주 세포 단백질;
(d) 1 X 1013 vg/ml당 1.2 X 106 pg/ml 미만의 잔여 숙주 세포 DNA
를 포함하고;
(e) 적어도 80%의 1 내지 8 x 1013 벡터 게놈/ml가 기능성인 약제학적 조성물.
2. 구현예 1에 있어서, 잔여 플라스미드 DNA의 양은 1 X 1013 vg당 1.7 X 106 pg 미만을 포함하는, 조성물.
3. 구현예 1에 있어서, 벡터 게놈/ml 파르보바이러스의 양은 1.8 내지 2.2 X 1013 벡터 게놈/ml를 포함하는, 조성물.
4. 동결된 중간체 약물 물질을 형성하기 위한 포유류 숙주 세포 배양으로부터의 AAV 입자의 정제를 위한 방법으로서, 다음 단계를 포함하는 방법:
(a) 재조합 AAV 비리온으로 형질감염된 세포를 배양하는 단계;
(b) 배양 기간 후 세포로부터 확장된 바이러스 입자를 수확하는 단계;
(c) 임의의 완전한 세포 또는 세포 잔해를 제거하기 위해 여과를 통해 바이러스 입자를 정제하는 단계;
(d) 단계(c)로부터의 용리액을 접선 유동 여과에 적용하는 단계; 및,
(e) 정제된 바이러스 입자의 생성된 중간체 제조물을 동결시키는 단계.
5. 구현예 4에 있어서, 수호가 단계 동안 엔도뉴클레아제가 사용되는, 방법.
6. 구현예 5에 있어서, 엔도뉴클레아제는 벤조나제인, 방법.
7. 구현예 4에 있어서, 정제 단계는 심층 여과 후, 대형 분자 오염물 및 세포 잔해를 제거하는 필터를 통한 여과를 사용하는, 방법.
8. 구현예 4에 있어서, 접선 유동 여과 단계는 셀룰로스 막을 사용하는, 방법.
9. 약물 산물을 형성하기 위해 포유류 숙주 세포 배양으로부터 AAV 입자의 샘플을 정제하기 위한 방법으로서, 다음 단계를 포함하는 방법:
(a) 산성화 및 정화 단계;
(b) 양이온 교환 크로마토그래피 단계;
(c) 접선 유동 여과 단계;
(d) 빈 캡시드를 제거하기 위한 CsCl 초원심분리 단계; 및,
(e) 접선 유동 여과 단계.
10. 구현예 9에 있어서, 산성화 및 정화 단계는 샘플을 pH 3.5으로 조정하고, 숙주 세포 단백질 및 DNA를 세제에 의한 응집을 통해 제거하는 단계를 포함하는, 방법.
11. 구현예 9에 있어서, 양이온 교환 컬럼은 술포닐 수지를 포함하는, 방법.
12. 구현예 9에 있어서, 접선 유동 여과 단계(c)는 분자량 컷오프가 300 kDa MW인 셀룰로스 막을 사용하고, 양이온 교환 단계의 용리액 부피를 적어도 6배 감소시키는, 방법.
13. 구현예 9에 있어서, CsCl 초원심분리 단계는 샘플 중 적어도 80%의 빈 캡시드를 제거하고, 심층 여과 후, 0.45 마이크론 필터를 통한 여과를 사용하는, 방법.
14. 구현예 9에 있어서, 접선 유동 여과 단계(e)는 분자량 컷오프가 300 kDa MW인 셀룰로스 막을 사용하는, 방법.
15. 신경계 질병의 치료를 필요로 하는 환자에서 이를 치료하는 방법으로서, 구현예 1 내지 3 중 어느 한 구현예의 약제학적 조성물의 정맥내 또는 척수내 전달을 포함하고, 파르보바이러스는 자기 상보성 AAV9 게놈를 포함하고, 조작된 전이유전자는 SMN 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 질병은 SMA인 방법.
16. 신경계 질병의 치료를 필요로 하는 환자에서 이를 치료하는 방법으로서, 조영제와 구현예 1 내지 3 중 어느 한 구현예의 약제학적 조성물의 척수내 전달을 포함하고, 파르보바이러스는 자기 상보성 AAV9 게놈을 포함하고, 조작된 전이유전자는 SMN 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 질병은 SMA이고, 조영제는 omnipaque 180인, 방법.
17. 구현예 15 또는 16에 있어서, SMA는 II형, III형 또는 IV형 SMA인, 방법.
18. II형, III형, 또는 IV형 SMA의 치료를 필요로 하는 환자에서 이를 치료하는 방법으로서, 구현예 1 내지 3 중 어느 한 구현예의 약제학적 조성물의 척수내 전달을 포함하고, 파르보바이러스는 자기 상보성 AAV9 게놈을 포함하고, 조작된 전이유전자는 SMN 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 조영제는 omnipaque 180인, 방법.
19. I형 SMA의 치료를 필요로 하는 환자에서 이를 치료하는 방법으로서, 구현예 1 내지 3 중 어느 한 구현예의 약제학적 조성물의 정맥내 전달을 포함하고, 파르보바이러스는 자기 상보성 AAV9 게놈을 포함하고, 조작된 전이유전자는 SMN 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
20. 구현예 19에 있어서, 환자는 생후 0개월 내지 9개월인, 방법.
21. 구현예 20에 있어서, 환자는 생후 0개월 내지 6개월인, 방법.
22. 구현예 19에 있어서, 소아 환자의 체중은 최대 약 8 kg인, 방법.
SEQUENCE LISTING <110> AveXis Inc. <120> MEANS AND METHOD FOR PREPARING VIRAL VECTORS AND USES OF SAME <130> AVEX-003/001WO <150> 62/583,035 <151> 2017-11-08 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2359 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> vector construct <400> 1 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggaatt cacgcgtgga 120 tctgaattca attcacgcgt ggtacctctg gtcgttacat aacttacggt aaatggcccg 180 cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata 240 gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc 300 cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac 360 ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg 420 cagtacatct actcgaggcc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 480 ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 540 ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga 600 gaggtgcggc ggcagccaat 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caagagaatg aaaatgaaag ccaagtttca 1500 acagatgaaa gtgagaactc caggtctcct ggaaataaat cagataacat caagcccaaa 1560 tctgctccat ggaactcttt tctccctcca ccacccccca tgccagggcc aagactggga 1620 ccaggaaagc caggtctaaa attcaatggc ccaccaccgc caccgccacc accaccaccc 1680 cacttactat catgctggct gcctccattt ccttctggac caccaataat tcccccacca 1740 cctcccatat gtccagattc tcttgatgat gctgatgctt tgggaagtat gttaatttca 1800 tggtacatga gtggctatca tactggctat tatatgggtt ttagacaaaa tcaaaaagaa 1860 ggaaggtgct cacattcctt aaattaagga gaaatgctgg catagagcag cactaaatga 1920 caccactaaa gaaacgatca gacagatcta gaaagcttat cgataccgtc gactagagct 1980 cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc 2040 gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa 2100 attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac 2160 agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggagagatc gatctgagga 2220 acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg 2280 gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc 2340 gcgcagagag ggagtggcc 2359 <210> 2 <211> 294 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Met Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Val Pro Glu Gln Glu 1 5 10 15 Asp Ser Val Leu Phe Arg Arg Gly Thr Gly Gln Ser Asp Asp Ser Asp 20 25 30 Ile Trp Asp Asp Thr Ala Leu Ile Lys Ala Tyr Asp Lys Ala Val Ala 35 40 45 Ser Phe Lys His Ala Leu Lys Asn Gly Asp Ile Cys Glu Thr Ser Gly 50 55 60 Lys Pro Lys Thr Thr Pro Lys Arg Lys Pro Ala Lys Lys Asn Lys Ser 65 70 75 80 Gln Lys Lys Asn Thr Ala Ala Ser Leu Gln Gln Trp Lys Val Gly Asp 85 90 95 Lys Cys Ser Ala Ile Trp Ser Glu Asp Gly Cys Ile Tyr Pro Ala Thr 100 105 110 Ile Ala Ser Ile Asp Phe Lys Arg Glu Thr Cys Val Val Val Tyr Thr 115 120 125 Gly Tyr Gly Asn Arg Glu Glu Gln Asn Leu Ser Asp Leu Leu Ser Pro 130 135 140 Ile Cys Glu Val Ala Asn Asn Ile Glu Gln Asn Ala Gln Glu Asn Glu 145 150 155 160 Asn Glu Ser Gln Val Ser Thr Asp Glu Ser Glu Asn Ser Arg Ser Pro 165 170 175 Gly Asn Lys Ser Asp Asn Ile Lys Pro Lys Ser Ala Pro Trp Asn Ser 180 185 190 Phe Leu Pro Pro Pro Pro Pro Met Pro Gly Pro Arg Leu Gly Pro Gly 195 200 205 Lys Pro Gly Leu Lys Phe Asn Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro 210 215 220 Pro Pro His Leu Leu Ser Cys Trp Leu Pro Pro Phe Pro Ser Gly Pro 225 230 235 240 Pro Ile Ile Pro Pro Pro Pro Pro Ile Cys Pro Asp Ser Leu Asp Asp 245 250 255 Ala Asp Ala Leu Gly Ser Met Leu Ile Ser Trp Tyr Met Ser Gly Tyr 260 265 270 His Thr Gly Tyr Tyr Met Gly Phe Arg Gln Asn Gln Lys Glu Gly Arg 275 280 285 Cys Ser His Ser Leu Asn 290 <210> 3 <211> 736 <212> PRT <213> Adeno-associated virus 9 <400> 3 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 260 265 270 Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 340 345 350 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 370 375 380 Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 405 410 415 Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445 Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser 450 455 460 Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 465 470 475 480 Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 565 570 575 Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln 580 585 590 Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met 625 630 635 640 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 <210> 4 <211> 1621 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ccacaaatgt gggagggcga taaccactcg tagaaagcgt gagaagttac tacaagcggt 60 cctcccggcc accgtactgt tccgctccca gaagccccgg gcggcggaag tcgtcactct 120 taagaaggga cggggcccca cgctgcgcac ccgcgggttt gctatggcga tgagcagcgg 180 cggcagtggt ggcggcgtcc cggagcagga ggattccgtg ctgttccggc gcggcacagg 240 ccagagcgat gattctgaca tttgggatga tacagcactg ataaaagcat atgataaagc 300 tgtggcttca tttaagcatg ctctaaagaa tggtgacatt tgtgaaactt cgggtaaacc 360 aaaaaccaca cctaaaagaa aacctgctaa gaagaataaa agccaaaaga agaatactgc 420 agcttcctta caacagtgga aagttgggga caaatgttct gccatttggt cagaagacgg 480 ttgcatttac ccagctacca ttgcttcaat tgattttaag agagaaacct gtgttgtggt 540 ttacactgga tatggaaata gagaggagca aaatctgtcc gatctacttt ccccaatctg 600 tgaagtagct aataatatag aacagaatgc tcaagagaat gaaaatgaaa gccaagtttc 660 aacagatgaa agtgagaact ccaggtctcc tggaaataaa tcagataaca tcaagcccaa 720 atctgctcca tggaactctt ttctccctcc accacccccc atgccagggc caagactggg 780 accaggaaag ccaggtctaa aattcaatgg cccaccaccg ccaccgccac caccaccacc 840 ccacttacta tcatgctggc tgcctccatt tccttctgga ccaccaataa ttcccccacc 900 acctcccata tgtccagatt ctcttgatga tgctgatgct ttgggaagta tgttaatttc 960 atggtacatg agtggctatc atactggcta ttatatgggt ttcagacaaa atcaaaaaga 1020 aggaaggtgc tcacattcct taaattaagg agaaatgctg gcatagagca gcactaaatg 1080 acaccactaa agaaacgatc agacagatct ggaatgtgaa gcgttataga agataactgg 1140 cctcatttct tcaaaatatc aagtgttggg aaagaaaaaa ggaagtggaa tgggtaactc 1200 ttcttgatta aaagttatgt aataaccaaa tgcaatgtga aatattttac tggactcttt 1260 tgaaaaacca tctgtaaaag actggggtgg gggtgggagg ccagcacggt ggtgaggcag 1320 ttgagaaaat ttgaatgtgg attagatttt gaatgatatt ggataattat tggtaatttt 1380 atggcctgtg agaagggtgt tgtagtttat aaaagactgt cttaatttgc atacttaagc 1440 atttaggaat gaagtgttag agtgtcttaa aatgtttcaa atggtttaac aaaatgtatg 1500 tgaggcgtat gtggcaaaat gttacagaat ctaactggtg gacatggctg ttcattgtac 1560 tgtttttttc tatcttctat atgtttaaaa gtatataata aaaatattta attttttttt 1620 a 1621

Claims (221)

  1. 약제학적 조성물로서,
    a. 1 내지 8 x 1013 AAV9 바이러스 벡터 게놈/mL(vg/mL);
    b. 약 7% 미만의 빈 바이러스 캡시드;
    c. 1 x 1013 vg/mL당 약 100 ng/mL 미만의 숙주 세포 단백질;
    d. 1 x 1013 vg/mL당 약 5 x 106 pg/mL 미만의 잔여 숙주 세포 DNA
    를 포함하고;
    적어도 약 80%의 1 내지 8 x 1013 AAV9 바이러스 벡터 게놈/mL가 기능성인, 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, AAV9 바이러스 벡터는 생존 운동 뉴런(SMN) 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, AAV9 바이러스 벡터는 메틸-CpG-결합 단백질 2(MECP2) 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, AAV9 바이러스 벡터는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1(SOD1)을 표적화하는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  5. 제2항에 있어서, AAV9 바이러스 벡터는 변형된 AAV2 ITR, 닭 베타-액틴(CB) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시/초기 인핸서, 변형된 SV40 후기 16s 인트론, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호, 및 비변형된 AAV2 ITR을 포함하는, 조성물.
  6. 제2항 또는 제5항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 2의 SMN 단백질을 인코딩하는, 조성물.
  7. 제2항, 제5항, 또는 제6항 중 어느 한 항에 있어서, AAV9 바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 1을 포함하는, 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 1.7 내지 2.3 x 1013 AAV9 vg/mL를 포함하는, 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 1.9 내지 2.1 x 1013 AAV9 vg/mL를 포함하는, 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 약 2 x 1013 AAV9 vg/mL를 포함하는, 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 약 5% 미만의 빈 캡시드를 포함하는, 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 약 3% 미만의 빈 캡시드를 포함하는, 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1% 미만의 빈 캡시드를 포함하는, 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 1 내지 2 x 1014 vg의 AAV9 바이러스 벡터를 포함하거나, 이로 이루어진, 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 1.1 x 1014 vg의 AAV9 바이러스 벡터를 포함하거나, 이로 이루어진, 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 1.7 x 1014 vg의 AAV9 바이러스 벡터로 이루어진, 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 기능성 바이러스 벡터 게놈의 백분율은 시험관내 세포 분석 또는 생체내 동물 모델을 사용하여 측정되는, 조성물.
  18. 수성 약제학적 제형으로서, 생존 운동 뉴런(SMN) 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터, Tris 완충액, 염화마그네슘, 염화나트륨, 및 폴록사머(예를 들어, 폴록사머 188)를 포함하고, 약제학적 조성물은 보존제를 포함하지 않는, 수성 약제학적 제형.
  19. 제18항에 있어서, AAV9 바이러스 벡터는 변형된 AAV2 ITR, 닭 베타-액틴(CB) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시/초기 인핸서, 변형된 SV40 후기 16s 인트론, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호, 및 비변형된 AAV2 ITR을 추가로 포함하는, 제형.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 2의 SMN 단백질을 인코딩하는, 제형.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, AAV9 바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 1을 포함하는, 제형.
  22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, Tris 완충액 농도는 약 10 nM 내지 30 nM, 예를 들어, 약 20 mM인, 제형.
  23. 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 제형의 pH는 약 7.7 내지 약 8.3, 예를 들어, 약 pH 8.0(예를 들어, USP <791>에 의해 측정된 바와 같음)인, 제형.
  24. 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 염화마그네슘 농도는 약 0.5 mM 내지 1.5 mM, 예를 들어, 약 1 mM인, 제형.
  25. 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 염화나트륨 농도는 약 100 mM 내지 300 mM, 예를 들어, 약 200 mM인, 제형.
  26. 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 제형은 약 0.005% w/v 폴록사머 188을 포함하는, 제형.
  27. 제18항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제형은 390 mOsm/kg 내지 430 mOsm/kg의 삼투몰농도(예를 들어, USP <785>에 의해 측정된 바와 같음)를 나타내는, 제형.
  28. 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, AAV9 바이러스 벡터는 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 조성물 내에 존재하는, 제형.
  29. I형 척수성 근위축(SMA)의 치료를 필요로 하는 환자에서 이를 치료하는 방법으로서, 제18항 내지 제28항 중 어느 한 항의 제형 또는 제2항 또는 제5항 내지 제17항 중 어느 한 항의 조성물을 환자에 척수내 또는 정맥내 경로에 의해 투여하는 단계를 포함하고, 환자는
    a. 생후 9개월 이하이고;
    b. 체중이 적어도 약 2.6 kg이고;
    c. 이중 대립유전자 SMN1 눌 돌연변이 또는 결실을 갖고;
    d. SMN2의 적어도 하나의 기능성 카피를 갖는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, AAV9 바이러스 벡터는 변형된 AAV2 ITR, 닭 베타-액틴(CB) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시/초기 인핸서, 변형된 SV40 후기 16s 인트론, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호, 및 비변형된 AAV2 ITR을 포함하는, 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 2의 SMN 단백질을 인코딩하는, 방법.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, AAV9 바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 1을 포함하는, 방법.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1 내지 2.5 x 1014 vg/kg의 투여량의 바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  34. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1.1 x 1014 vg/kg의 투여량의 바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 바이러스 벡터 게놈의 양은 ddPCR을 사용하여 측정되는, 방법.
  36. 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 체중이 약 8.5 kg 이하인, 방법.
  37. 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 SMN2 유전자의 적어도 하나의 카피의 엑손 7에 c.859G>C 치환을 갖지 않는, 방법.
  38. 제29항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 치료는 생후 6개월 전에 환자에 투여되는, 방법.
  39. 제29항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 치료는 저긴장, 운동 능력의 지연, 불량한 머리 제어, 굽은 어깨 자세 및 관절의 과운동성으로부터 선택되는 하나 이상의 SMA 증상의 발병 전에 환자에 투여되는, 방법.
  40. 제29항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 투여 전에 ELISA 결합 면역분석에 의해 결정되는 바와 같이 1:100 이하의 항-AAV9 항체 역가를 나타내는, 방법.
  41. 제29항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 투여 전에 ELISA 결합 면역분석에 의해 결정되는 바와 같이 1:50 이하의 항-AAV9 항체 역가를 나타내는, 방법.
  42. 제29항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 투여 후에 ELISA 결합 면역분석에 의해 결정되는 바와 같이 1:100 초과의 항-AAV9 항체 역가를 나타내고, 약 1주 내지 8주 동안 또는 역가가 1:100 미만으로 저하될 때까지 모니터링되는, 방법.
  43. 제29항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 투여 후에 ELISA 결합 면역분석에 의해 결정되는 바와 같이 1:100 초과의 항-AAV9 항체 역가를 나타내고, 약 1주 내지 8주 동안 또는 역가가 1:50 미만으로 저하될 때까지 모니터링되는, 방법.
  44. 제29항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 투여 전 또는 후에 ELISA 결합 면역분석에 의해 결정되는 바와 같이 1:100 초과의 항-AAV9 항체 역가를 나타내고, 예를 들어 투여 전 또는 후에 제형 공급으로 전환되는, 방법.
  45. 제29항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 투여 전 또는 후에 ELISA 결합 면역분석에 의해 결정되는 바와 같이 1:50 초과의 항-AAV9 항체 역가를 나타내고, 예를 들어 투여 전 또는 후에 제형 공급으로 전환되는, 방법.
  46. 제29항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 투여 후에 ELISA 결합 면역분석에 의해 결정되는 바와 같이 1:100 초과의 항-AAV9 항체 역가를 나타내고, 혈장 반출법을 사용하여 치료되는, 방법.
  47. 제29항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 투여 후에 ELISA 결합 면역분석에 의해 결정되는 바와 같이 1:50 초과의 항-AAV9 항체 역가를 나타내고, 혈장 반출법을 사용하여 치료되는, 방법.
  48. 제29항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 투여 전에 혈소판 개수가 약 67,000 세포/ml 초과 또는 약 100,000 세포/ml 초과, 또는 약 150,000 세포/ml 초과인, 방법.
  49. 제29항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 투여 후에 혈소판 개수가 약 67,000 세포/ml 미만, 또는 약 100,000 세포/ml 미만, 또는 약 150,000, 세포/ml 미만이고, 약 1주 내지 8주 동안 또는 혈소판 개수가 약 67,000 세포/ml, 또는 약 100,000 세포/ml 초과, 또는 약 150,000 세포/ml 초과로 증가할 때까지 모니터링되는, 방법.
  50. 제29항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 투여 후에 혈소판 개수가 약 67,000 세포/ml 미만이고, 혈소판 수혈로 치료되는, 방법.
  51. 제29항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 투여 전에 혈소판 감소증을 나타내지 않은, 방법.
  52. 제29항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 투여 후에 혈소판 감소증을 나타내고, 약 1주 내지 8주 동안 또는 환자가 혈소판 감소증을 나타내지 않을 때까지 모니터링되는, 방법.
  53. 제29항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 투여 후에 혈소판 감소증을 나타내고, 혈소판 수혈로 치료되는, 방법.
  54. 제29항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 바이러스 벡터의 투여 전에 약 0.176 ug/ml 미만의 트로포닌(troponin)-I 수준을 나타내는, 방법.
  55. 제29항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 환자의 트로포닌-I의 수준은 바이러스 벡터의 투여 후에 모니터링되는, 방법.
  56. 제54항 또는 제55항에 있어서, 심장 모니터링은 투여 후에 환자에서의 트로포닌-I 수준이 약 0.176 ug/ml 미만일 때까지 수행되는, 방법.
  57. 제29항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 투여 전에 정상 간 기능을 나타내는, 방법.
  58. 제57항에 있어서, 환자는 투여 전에 약 8 U/L 내지 40 U/L 미만의 간 트랜스아미나제 수준을 나타내는, 방법.
  59. 제58항에 있어서, 간 트랜스아미나제는 알라닌 트랜스아미나제(AST), 아스파테이트 트랜스아미나제(ALT), 및 그의 조합으로부터 선택되는, 방법.
  60. 제29항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 투여 전에 3.0 mg/dL 미만의 빌리루빈(bilirubin) 수준, 1.8 mg/dL 미만의 크레아티닌(creatinine) 수준, 8 g/dL 내지 18 g/dL의 Hgb 수준, 및/또는 mm3당 약 20000 미만의 백혈구 세포 개수를 나타내는, 방법.
  61. 제29항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터는 Tris-완충 식염수에서 투여되는, 방법.
  62. 제29항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터는 약 5 mL/kg 내지 20 mL/kg, 약 10 mL/kg 내지 20 mL/kg, 또는 약 5.5 mL/kg 내지 6.5 mL/kg의 Tris-완충 식염수에서 투여되는, 방법.
  63. 제29항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터는 약 45분 내지 75분 동안 주입되는, 방법.
  64. 제29항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터는 약 60분 동안 주입되는, 방법.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서, 주입은 주사기 펌프를 포함하는, 방법.
  66. 제29항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터의 투여 전에 적어도 24시간 동안 환자에 경구용 스테로이드를 투여하는, 방법.
  67. 제29항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터의 투여 후에 적어도 30일 동안 환자에 경구용 스테로이드를 투여하는, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 경구용 스테로이드는 1일 1회 투여되는, 방법.
  69. 제67항에 있어서, 경구용 스테로이드는 1일 2회 투여되는, 방법.
  70. 제66항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 바이러스 벡터의 투여 후 ALT 및/또는 AST의 증가된 수준에 대해 모니터링되고, 경구용 스테로이드는 30일 후에 AST 및/또는 ALT 수준이 정상 상한의 2배 미만이거나, 약 120 IU/L 미만이 될 때까지 계속하여 투여되는, 방법.
  71. 제66항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, AST 및/또는 ALT 수준이 정상 상한의 2배 미만이거나, 약 120 IU/L 미만이 될 때까지 환자에 경구용 스테로이드가 투여되는, 방법.
  72. 제66항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 경구용 스테로이드는 약 1 mg/kg의 투여량으로 투여되는, 방법.
  73. 제66항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, AST 및/또는 ALT 수준이 정상 상한의 2배 미만이거나, 약 120 IU/L 미만이 될 때까지 경구용 스테로이드 투여를 점감시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  74. 제73항에 있어서, 점감은 2주 동안 0.5 mg/kg/일 후 추가의 2주 동안 0.25 mg/kg/일로 단계적으로 증가시키는 단계를 포함하는, 방법.
  75. 제66항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 30일 동안 약 1 mg/kg의 투여량의 경구용 스테로이드를 투여한 후, 2주 동안 0.5 mg/kg/일 후, 추가의 2주 동안 0.25 mg/kg/일로 점감시키는 단계를 포함하는, 방법.
  76. 제66항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 경구용 스테로이드는 프레드니솔론(prednisolone) 또는 균등물인, 방법.
  77. 제29항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 근육증강제 또는 신경보호제를 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  78. 제29항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, SMN을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  79. 제29항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 누시너센(nusinersen)을 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  80. 제29항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 스타물루맙(stamulumab)을 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  81. 제29항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, CHOP-INTEND 척도를 사용하여 효능을 결정하는, 방법.
  82. 질병 발병의 존재 또는 부재 하의 척수성 근위축(SMA) I형 소아 환자를 치료하는 방법으로서, 제2항 또는 제5항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 포함하는 조성물 또는 제형을 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  83. 레트 증후군의 치료를 필요로 하는 환자에서 이를 치료하는 방법으로서, 제3항 또는 제8항 내지 제17항 중 어느 한 항의 조성물을 환자에 척수내 또는 정맥내 경로에 의해 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  84. 근위축성 측색 경화증(ALS)의 치료를 필요로 하는 환자에서 이를 치료하는 방법으로서, 제4항 또는 제8항 내지 제17항 중 어느 한 항의 조성물을 환자에 척수내 또는 정맥내 경로에 의해 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  85. I형 SMA를 앓고 있는 환자를 치료하는 방법으로서,
    a. 환자의 중량을 결정하는 단계;
    b. AAV9 바이러스 벡터 약제학적 조성물의 바이알을 포함하는 키트를 획득하는 단계로서, 키트는 다음 개수의 바이알을 포함하고:
    Figure pct00051

    c. 각 바이알 중 바이러스 벡터 농도는 약 2.0 x 1013 vg/mL이고;
    d. AAV9 바이러스 벡터는 SMN 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고; 및
    e. 바이알로부터의 AAV9 바이러스 벡터를 환자에 투여하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  86. 제85항에 있어서, AAV9 바이러스 벡터는 돌연변이된 AAV2 ITR, 닭 베타-액틴(CB) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시/초기 인핸서, 변형된 SV40 후기 16s 인트론, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호, 및 AAV2 ITR을 포함하는, 방법.
  87. 제85항 또는 제86항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 2의 SMN 단백질을 인코딩하는, 방법.
  88. 제85항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, AAV9 바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 1을 포함하는, 방법.
  89. 제85항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 바이러스 벡터는 약 1.0x1014 내지 2.5x1014 vg/kg의 투여량으로 주입에 의해 투여되는, 방법.
  90. 제85항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 바이러스 벡터는 약 1.1 x1014 vg/kg의 투여량으로 주입에 의해 투여되는, 방법.
  91. 제89항 또는 제90항에 있어서, 바이러스 벡터는 약 45분 내지 70분 동안 주입되는, 방법.
  92. 제89항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터는 약 60분 동안 주입되는, 방법.
  93. 제89항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 주입은 주사기 펌프를 포함하는, 방법.
  94. 제85항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터 게놈의 양은 ddPCR을 사용하여 측정되는, 방법.
  95. 제85항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, AAV9 바이러스 벡터의 투여량 역가는 ddPCR에 의해 측정되는, 방법.
  96. 제85항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 다음 투여량 부피를 투여하는 단계를 포함하는, 방법:
    Figure pct00052
    .
  97. I형 척수성 근위축(SMA)을 앓고 있는 환자를 치료하기 위한 키트로서, 제2항 또는 제5항 내지 제17항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제18항 내지 제28항 중 어느 한 항의 제형을 포함하는 바이알을 포함하는, 키트.
  98. 생존 운동 뉴런(SMN) 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약 5.5 mL 또는 약 8.3 mL의 AAV9 바이러스 벡터를 포함하고, pH 7.7 내지 8.3, 예를 들어, 약 8.0의 20 mM Tris, 1 mM MgCl2, 200 mM NaCl, 0.005% w/v 폴록사머 188 중 약 2.0 x 1013 vg/mL의 농도로 제형화된 바이알을 포함하는, 키트.
  99. 제98항에 있어서, AAV9 바이러스 벡터는 돌연변이된 AAV2 ITR, 닭 베타-액틴(CB) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시/초기 인핸서, 변형된 SV40 후기 16s 인트론, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호, 및 AAV2 ITR을 포함하는, 키트.
  100. 제98항 또는 제99항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 2의 SMN 단백질을 인코딩하는, 키트.
  101. 제98항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, AAV9 바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 1을 포함하는, 키트.
  102. 제98항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터 게놈의 양은 ddPCR을 사용하여 측정되는, 키트.
  103. I형 SMA를 치료하는 방법으로서, 제2항 또는 제5항 내지 제17항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제18항 내지 제28항 중 어느 한 항의 제형의 일 부피를 필요한 환자에 정맥내 주입에 의해 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  104. 제103항에 있어서, 환자의 체중이 2.6 kg 내지 3.0 kg인 경우, 부피는 16.5 mL인, 방법.
  105. 제103항에 있어서, 환자의 체중이 3.1 kg 내지 3.5 kg인 경우, 부피는 19.3 mL인, 방법.
  106. 제103항에 있어서, 환자의 체중이 3.6 kg 내지 4.0 kg인 경우, 부피는 22.0 mL인, 방법.
  107. 제103항에 있어서, 환자의 체중이 4.1 kg 내지 4.5 kg인 경우, 부피는 24.8 mL인, 방법.
  108. 제103항에 있어서, 환자의 체중이 4.6 kg 내지 5.0 kg인 경우, 부피는 27.5 mL인, 방법.
  109. 제103항에 있어서, 환자의 체중이 5.1 kg 내지 5.5 kg인 경우, 부피는 30.3 mL인, 방법.
  110. 제103항에 있어서, 환자의 체중이 5.6 kg 내지 6.0 kg인 경우, 부피는 33.0 mL인, 방법.
  111. 제103항에 있어서, 환자의 체중이 6.1 kg 내지 6.5 kg인 경우, 부피는 35.8 mL인, 방법.
  112. 제103항에 있어서, 환자의 체중이 6.6 kg 내지 7.0 kg인 경우, 부피는 38.5 mL인, 방법.
  113. 제103항에 있어서, 환자의 체중이 7.1 kg 내지 7.5 kg인 경우, 부피는 41.3 mL인, 방법.
  114. 제103항에 있어서, 환자의 체중이 7.6 kg 내지 8.0 kg인 경우, 부피는 44.0 mL인, 방법.
  115. 제103항에 있어서, 환자의 체중이 8.1 kg 내지 8.5 kg인 경우, 부피는 46.8 mL인, 방법.
  116. AAV 바이러스 벡터를 제조하는 방법으로서,
    a. 부착 세포를 배양하는 단계;
    b. AAV 바이러스 벡터의 생성을 가능하게 하는 플라스미드(들)로 부착 세포를 형질감염시키는 단계;
    c. 부착 세포를 용해시켜, AAV 바이러스 벡터를 단리하는 단계;
    d. (c)의 세포 용해물을 산성화하여, 정화하는 단계;
    e. 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)를 사용하여 (d)의 산물을 정제하는 단계;
    f. 접선 유동 여과(TFF)를 사용하여 (e)의 산물을 여과하는 단계;
    g. 염화세슘(CsCl) 완충액 중(f)의 산물을 초원심분리하는 단계; 및
    h. (g)의 산물로부터 AAV 바이러스 벡터를 수집하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  117. 제116항에 있어서, AAV는 AAV9인, 방법.
  118. 제116항 또는 제117항에 있어서, AAV는 자기 상보성(scAAV)인, 방법.
  119. 제116항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 부착 세포는 HEK293 세포인, 방법.
  120. 제116항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 전에 부착 세포가 부착 여부에 대해 선택되는, 방법.
  121. 제116항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 선택은 부착 여부에 대해 선택하기 위해 부착 세포를 다회 계대배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  122. 제116항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 배양을 위해 생물반응기에서 부착 세포를 시딩(seeding)하는, 방법.
  123. 제122항에 있어서, 생물반응기는 세포 배양 배지의 지속적인 순환을 제공할 수 있는 대규모 생물반응기인, 방법.
  124. 제122항 또는 제123항에 있어서, 생물반응기는 200 m2 또는 333 m2 생물반응기인, 방법.
  125. 제122항 또는 제123항에 있어서, 생물반응기는 500 m2 생물반응기인, 방법.
  126. 제122항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 재순환 배지 백에서 부착 세포를 배지에 첨가하고, 예를 들어, 연동 펌프를 사용하여, 생물반응기를 통해 순환시키는, 방법.
  127. 제126항에 있어서, 배양을 위해 생물반응기에서 부착 세포를 시딩하는 동안 연동 펌핑이 지속되는, 방법.
  128. 제122항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 시딩 밀도는 약 8,000 내지 12,000 세포/cm2인, 방법.
  129. 제122항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염 단계는 재순환 배지 백에 형질감염 배지를 첨가하는 단계 및 예를 들어 연동 펌프를 사용하여 생물반응기를 통해 형질감염 배지를 순환시키는 단계를 포함하는, 방법.
  130. 제126항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 순환, 예를 들어, 연동 펌핑은 15℃ 내지 25℃에서 이루어지는, 방법.
  131. 제116항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염 단계는 부착 세포와 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드(pHELP)를 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  132. 제116항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염 단계는 부착 세포와 AAV rep 유전자를 인코딩하는 플라스미드를 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  133. 제116항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염 단계는 부착 세포와 AAV cap 유전자를 인코딩하는 플라스미드를 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  134. 제116항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염 단계는 부착 세포와 AAV rep 유전자 및 AAV cap 유전자를 동일한 플라스미드(pAAV) 상에서 인코딩하는 플라스미드를 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  135. 제132항 또는 제134항에 있어서, AAV rep 유전자는 rep2인, 방법.
  136. 제133항 또는 제134항에 있어서, AAV cap 유전자는 cap9인, 방법.
  137. 제116항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염 단계는 부착 세포와 형질감염제 폴리에틸렌이민(PEI)을 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  138. 제137항에 있어서, PEI 대 적어도 하나의 플라스미드의 중량 비율은 1:1 미만인, 방법.
  139. 제137항에 있어서, PEI 대 적어도 하나의 플라스미드의 중량 비율은 약 1:1인, 방법.
  140. 제116항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염 단계는 부착 세포와 혈청을 포함하지 않는 형질감염 배지를 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  141. 제116항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염 단계는 부착 세포와 칼슘을 포함하지 않는 형질감염 배지를 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  142. 제116항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염 단계는 부착 세포와 글루타민을 포함하지 않는 형질감염 배지를 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  143. 제116항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염 단계는 10분 내지 60분 동안 수행되는, 방법.
  144. 제116항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염 단계는 10분 내지 30분 동안 수행되는, 방법.
  145. 제116항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염 단계는 30분 미만 동안 수행되는, 방법.
  146. 제116항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염 단계는 20분 내지 30분 동안 수행되는, 방법.
  147. 제116항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염 단계는 15분 내지 30분 동안 수행되는, 방법.
  148. 제116항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 용해 단계는 총 세포 용해를 포함하는, 방법.
  149. 제116항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 용해 단계는 엔도뉴클레아제로 보충된 용해 완충액을 사용하는 단계를 포함하는, 방법.
  150. 제149항에 있어서, 엔도뉴클레아제는 벤조나제(benzonase)인, 방법.
  151. 제116항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 용해 단계는 TWEEN이 보충된 용해 완충액을 사용하는 단계를 포함하는, 방법.
  152. 제116항 내지 제151항 중 어느 한 항에 있어서, 용해 단계는 15℃ 내지 25℃에서 수행되는, 방법.
  153. 제116항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, (d)의 산성화 단계 전에 단계(c)의 세포 용해물을 동결시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  154. 세포 배양 용해물로부터 AAV 바이러스 벡터를 정제하는 방법으로서, 다음 단계를 포함하는 방법:
    a. 세포 용해물을 산성화하여, 정화하는 단계;
    b. 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)를 사용하여 (a)의 산물을 정제하는 단계;
    c. 접선 유동 여과(TFF)를 사용하여 (b)의 산물을 여과하는 단계;
    d. 2 M 내지 4 M 염화세슘(CsCl) 완충액을 사용하여 (c)의 산물을 초원심분리하는 단계;
    e. (d)의 산물로부터 AAV 바이러스 벡터를 수집하는 단계;
    f. 접선 유동 여과를 통해 (e)의 산물을 여과하는 단계.
  155. 제116항 내지 제154항 중 어느 한 항에 있어서, 산성화 단계는 세포 용해물을 약 pH 3.0 내지 pH 4.0으로 산성화시키는 단계를 포함하는, 방법.
  156. 제116항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 산성화 단계는 세포 용해물을 약 pH 3.3 내지 pH 3.7로 산성화시키는 단계를 포함하는, 방법.
  157. 제116항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, 산성화 단계는 세포 용해물을 약 pH 3.4 내지 pH 3.6으로 산성화시키는 단계를 포함하는, 방법.
  158. 제116항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, 산성화 단계는 세포 용해물을 약 pH 3.5로 산성화시키는 단계를 포함하는, 방법.
  159. 제116항 내지 제158항 중 어느 한 항에 있어서, 초원심분리는 40,000 rpm 내지 50,000 rpm에서 수행되는, 방법.
  160. 제116항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서, 초원심분리는 약 43,000 rpm 내지 46,000 rpm에서 수행되는, 방법.
  161. 제116항 내지 제160항 중 어느 한 항에 있어서, 초원심분리는 15℃ 내지 25℃에서 수행되는, 방법.
  162. 제116항 내지 제161항 중 어느 한 항에 있어서, 초원심분리는 16시간 내지 24시간 동안 수행되는, 방법.
  163. 제116항 내지 제162항 중 어느 한 항에 있어서, 초원심분리는 20시간 내지 24시간 동안 수행되는, 방법.
  164. 제116항 내지 제168항 중 어느 한 항에 있어서, CsCl은 약 3 M의 농도인, 방법.
  165. 제116항 내지 제164항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 용해물은 산성화 단계 전에 Tween과 함께 인큐베이션되는, 방법.
  166. 제116항 내지 제165항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 용해물은 산성화 단계 전에 약 8시간 내지 20시간 동안 Tween과 함께 인큐베이션되는, 방법.
  167. 제116항 내지 제166항 중 어느 한 항에 있어서, 정화 단계는 심층 필터를 통해 세포 용해물을 여과하는 단계를 포함하는, 방법.
  168. 제116항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 정화 단계는 0.45 마이크론 필터를 통해 세포 용해물을 여과하는 단계를 포함하는, 방법.
  169. 제116항 내지 제168항 중 어느 한 항에 있어서, CEX는 술포닐 수지를 포함하는, 방법.
  170. 제116항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 TFF 단계는 분자량 컷오프가 300 kDa MW인 셀룰로스 막을 사용하는 단계를 포함하고, 양이온 교환 단계의 용리액 부피를 적어도 6배만큼 감소시키는, 방법.
  171. 제116항 내지 제170항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 TFF 단계는 분자량 컷오프가 약 300 kDa MW인 셀룰로스 막을 사용하는 단계를 포함하는, 방법.
  172. 제116항 내지 제171항 중 어느 한 항에 있어서, CsCl 완충액은 약 3 M CsCl을 포함하는, 방법.
  173. 제116항 내지 제172항 중 어느 한 항에 있어서, CsCl 완충액은 Tris, MgCl2, 및 폴록사머 188을 포함하는, 방법.
  174. 제116항 내지 제173항 중 어느 한 항에 있어서, CsCl 완충액은 약 20 mM Tris를 포함하는, 방법.
  175. 제116항 내지 제174항 중 어느 한 항에 있어서, CsCl 완충액은 약 2 mM MgCl2을 포함하는, 방법.
  176. 제116항 내지 제175항 중 어느 한 항에 있어서, CsCl 완충액은 폴록사머 188, 선택적으로 약 약 0.2% w/v 폴록사머 188을 포함하는, 방법.
  177. 제116항 내지 제176항 중 어느 한 항에 있어서, CsCl 완충액은 약 pH 7.5 내지 pH 8.5인, 방법.
  178. 제116항 내지 제177항 중 어느 한 항에 있어서, CsCl 완충액은 약 pH 7.9 내지 pH 8.2인, 방법.
  179. 제116항 내지 제178항 중 어느 한 항에 있어서, 초원심분리된 세포 용해물로부터 AAV 바이러스 벡터를 수집한 후에 빈 바이러스 캡시드의 수는 총 바이러스 캡시드의 7% 미만인, 방법.
  180. 제116항 내지 제179항 중 어느 한 항에 있어서, 초원심분리된 세포 용해물로부터 AAV 바이러스 벡터를 수집한 후에 빈 바이러스 캡시드의 수는 총 바이러스 캡시드의 5% 미만인, 방법.
  181. 제116항 내지 제200항 중 어느 한 항에 있어서, 초원심분리된 세포 용해물로부터 AAV 바이러스 벡터를 수집한 후에 빈 바이러스 캡시드의 수는 총 바이러스 캡시드의 3% 미만인, 방법.
  182. 제116항 내지 제201항 중 어느 한 항에 있어서, 초원심분리된 세포 용해물로부터 AAV 바이러스 벡터를 수집한 후에 빈 바이러스 캡시드의 수는 총 바이러스 캡시드의 1% 미만인, 방법.
  183. 제179항 내지 제182항 중 어느 한 항에 있어서, 빈 바이러스 캡시드의 수는 AUC에 의해 측정되는, 방법.
  184. 제116항 내지 제183항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 바이러스 벡터는 주사기를 사용하여 초원심분리된 세포 용해물로부터 수집되는, 방법.
  185. 제116항 내지 제184항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 TFF 단계 후에 수집된 AAV 바이러스 벡터는 Tris, MgCl2, NaCl, 및 폴록사머 188을 포함하는 용액 중에 저장되는, 방법.
  186. 제185항에 있어서, 용액은 약 20 mM Tris를 포함하는, 방법.
  187. 제185항 또는 제186항에 있어서, 용액은 약 1 mM MgCl2을 포함하는, 방법.
  188. 제185항 내지 제187항 중 어느 한 항에 있어서, 용액은 약 200 mM NaCl을 포함하는, 방법.
  189. 제185항 내지 제188항 중 어느 한 항에 있어서, 용액은 약 0.005% w/v 폴록사머 188을 포함하는, 방법.
  190. 제185항 내지 제189항 중 어느 한 항에 있어서, 용액은 약 pH 7.5 내지 8.5인, 방법.
  191. 제185항 내지 제190항 중 어느 한 항에 있어서, 용액은 약 pH 7.7 내지 8.3인, 방법.
  192. 제116항 내지 제191항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 TFF 후에 수집된 AAV 바이러스 벡터는 약 30 μg/g 미만 또는 약 20 μg/g 미만의 CsCl을 포함하는, 방법.
  193. 제116항 내지 제192항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 TFF 후에 수집된 AAV 바이러스 벡터의 농도는 약 3x1013 vg/ml 이상인, 방법.
  194. 제116항 내지 제193항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포 단백질 및/또는 숙주 세포 DNA는 세정제에 의한 응집을 사용하여 세포 용해물로부터 제거되는, 방법.
  195. 제116항 내지 제194항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 바이러스 벡터는 생존 운동 뉴런(SMN) 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  196. 제116항 내지 제195항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 바이러스 벡터는 돌연변이된 AAV2 ITR, 닭 베타-액틴(CB) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시/초기 인핸서, 변형된 SV40 후기 16s 인트론, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호, 및 AAV2 ITR을 포함하는, 방법.
  197. 제195항 또는 제196항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 2의 SMN 단백질을 인코딩하는, 방법.
  198. 제195항 내지 제196항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 1을 포함하는, 방법.
  199. 제195항 내지 제198항 중 어느 한 항에 있어서, SMN 단백질을 인코딩하는 플라스미드, pAAV를 인코딩하는 플라스미드, 및 pHELP를 인코딩하는 플라스미드는 1:1:1의 비율로 형질감염되는, 방법.
  200. 제116항 내지 제194항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 바이러스 벡터는 MECP2 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  201. 제116항 내지 제194항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 바이러스 벡터는 SOD1을 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  202. 제116항 내지 제199항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 바와 같은 SMN 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터를 투여함으로써, SMA I형 환자를 치료하는 방법.
  203. 제116항 내지 제194항 또는 제200항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 바와 같은 MECP2 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터를 투여함으로써, 레트 증후군 환자를 치료하는 방법.
  204. 제116항 내지 제194항 또는 제201항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 바와 같은 SOD1을 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터를 투여함으로써, ALS 환자를 치료하는 방법.
  205. 제116항 내지 제199항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 SMN 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터.
  206. 제116항 내지 제199항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 SMN 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터를 포함하는 약제학적 조성물.
  207. 수성 약제학적 조성물로서, SMN 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터, Tris 완충액, 염화마그네슘 용액, 및 염화나트륨 용액을 포함하고, 약제학적 조성물은 보존제를 포함하지 않고, 조성물은 제116항 내지 제199항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조되는, 수성 약제학적 조성물.
  208. 제116항 내지 제194항 또는 제200항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 MECP2 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터.
  209. 제116항 내지 제194항 또는 제200항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 MECP2 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터를 포함하는 약제학적 조성물.
  210. 제116항 내지 제194항 또는 제201항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 SOD1을 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터.
  211. 제116항 내지 제194항 또는 제201항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 SOD1을 표적화하는 shRNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터를 포함하는 약제학적 조성물.
  212. a. 변형된 AAV2 ITR, 닭 베타-액틴(CB) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시/초기 인핸서, 변형된 SV40 후기 16s 인트론, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호, 및 비변형된 AAV2 ITR을 포함하는 자기 상보성 AAV9 바이러스 벡터;
    b. pH 8.0의 20 mM Tris;
    c. 1 mM MgCl2;
    d. 200 mM NaCl; 및
    e. 0.005% 폴록사머 188
    을 포함하는 약제학적 조성물을 정맥내 투여함으로써, I형 SMA의 치료를 필요로 하는 환자에서 이를 치료하는 방법으로서;
    환자의 체중이 2.6 kg 내지 8.5 kg인, 방법.
  213. 제212항에 있어서, 조성물은 보존제를 포함하지 않는, 방법.
  214. 제212항 또는 제213항에 있어서, 환자는:
    a. 생후 9개월 이하이고;
    b. 체중이 적어도 약 2.6 kg이고;
    c. 이중 대립유전자 SMN1 눌 돌연변이 또는 결실을 갖고;
    d. SMN2의 적어도 하나의 기능성 카피를 갖는, 방법.
  215. a. 변형된 AAV2 ITR, 닭 베타-액틴(CB) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시/초기 인핸서, 변형된 SV40 후기 16s 인트론, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호, 및 비변형된 AAV2 ITR을 포함하는 자기 상보성 AAV9 바이러스 벡터;
    b. pH 8.0의 20 mM Tris;
    c. 1 mM MgCl2;
    d. 200 mM NaCl; 및
    e. 0.005% 폴록사머 188
    을 포함하는 약제학적 조성물의 정맥내 투여에 적합하거나 그를 위해 제조된 조성물.
  216. 제215항에 있어서, 조성물은 보존제를 포함하지 않는, 조성물.
  217. 제116항 내지 제201항 중 어느 한 항에 있어서, 본 방법은 산업적 규모로 수행되는, 방법.
  218. 제116항 내지 제201항 또는 제217항 중 어느 한 항에 있어서, AAV의 생성 수율은 제조 배치당 5 x 1015 vg 초과, 또는 8 x 1015 vg 초과 또는 1 x 1016 vg 초과인, 방법.
  219. 제1항 내지 제17항, 제18항 내지 제28항, 제82항 내지 제84항, 또는 제205항 내지 제211항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 또는 제형은 다음 중 적어도 하나를 포함하는, 조성물 또는 제형:
    a. 1.0x1013 vg당 약 0.09 ng 미만의 벤조나제,
    b. 약 30 μg/g(ppm) 미만의 세슘,
    c. 약 20 ppm 내지 80 ppm의 폴록사머 188,
    d. 1.0x1013 vg당 약 0.22 ng 미만의 BSA,
    e. 1.0x1013 vg당 약 6.8x105 pg 미만의 잔여 플라스미드 DNA,
    f. 1.0x1013 vg당 약 1.1x105 pg 미만의 잔여 hcDNA,
    g. 1.0x1013 vg당 약 4 ng 미만의 rHCP,
    h. 약 pH 7.7 내지 pH 8.3,
    i. 약 390 mOsm/kg 내지 430 mOsm/kg,
    j. 용기당, 25 μm 이상의 크기의 약 600개 미만의 입자,
    k. 용기당, 10 μm 이상의 크기의 약 6000개 미만의 입자,
    l. 약 1.7 x 1013-2.3 x 1013 vg/mL 게놈 역가,
    m. 1.0 x 1013 vg당 약 3.9 x 108 IU 내지 8.4 x 1010 IU의 감염 역가,
    n. 1.0 x 1013 vg당 약 100 μg 내지 300 μg의 총 단백질,
    o. 약 70% 내지 130%의 상대 효능, 및
    p. 약 5% 미만의 빈 캡시드.
  220. 제1항 내지 제17항, 제18항 내지 제28항, 제82항 내지 제84항, 또는 제205항 내지 제211항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 또는 제형은 다음 중 적어도 하나를 포함하는, 조성물 또는 제형:
    a. 약 pH 7.7 내지 pH 8.3,
    b. 약 390 mOsm/kg 내지 430 mOsm/kg,
    c. 용기당, 25 μm 이상의 크기의 약 600개 미만의 입자,
    d. 용기당, 10 μm 이상의 크기의 약 6000개 미만의 입자,
    e. 약 1.7 x 1013 vg/mL 내지 2.3 x 1013 vg/mL 게놈 역가,
    f. 1.0 x 1013 vg당 약 3.9 x 108 IU 내지 8.4 x 1010 IU의 감염 역가,
    g. 1.0 x 1013 vg당 약 100 μg 내지 300 μg의 총 단백질,
    h. 약 20 ppm 내지 80 ppm의 Pluronic F-68 함량,
    i. 약 70% 내지 130%의 상대 효능,
    j. 투여량이 7.5 x 1013 vg/kg인 델타7SMN 마우스 모델에서 24일 이상의 중앙값 생존율,
    k. 약 5% 미만의 빈 캡시드,
    l. 및 약 95% 이상의 총 순도, 및
    m. 약 0.75 EU/mL 이하의 내독소.
  221. 제1항 내지 제17항, 제18항 내지 제28항, 제82항 내지 제84항, 또는 제205항 내지 제211항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 또는 제형은 다음 중 적어도 하나를 포함하는, 조성물 또는 제형:
    a. 1.0x1013 vg당 약 0.09 ng 미만의 벤조나제,
    b. 약 30 μg/g(ppm) 미만의 세슘,
    c. 약 20 ppm 내지 80 ppm의 폴록사머 188,
    d. 1.0x1013 vg당 약 0.22 ng 미만의 BSA,
    e. 1.0x1013 vg당 약 6.8x105 pg 미만의 잔여 플라스미드 DNA,
    f. 1.0x1013 vg당 약 1.1x105 pg 미만의 잔여 hcDNA, 및
    g. 1.0x1013 vg당 약 4 ng 미만의 rHCP.
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