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KR20200066347A - 세포 - Google Patents

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KR20200066347A
KR20200066347A KR1020207013595A KR20207013595A KR20200066347A KR 20200066347 A KR20200066347 A KR 20200066347A KR 1020207013595 A KR1020207013595 A KR 1020207013595A KR 20207013595 A KR20207013595 A KR 20207013595A KR 20200066347 A KR20200066347 A KR 20200066347A
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ser
leu
ala
cell
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KR1020207013595A
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마틴 풀레
제임스 실리본
루카스 스탠크주크
Original Assignee
오토러스 리미티드
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Publication date
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Abstract

본 발명은 (i) 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 트랜스제닉 T 세포 수용체(TCR); 및 (ii) 세포 내에서 세포내 시그널링 도메인과 MHC 클래스 I 분자의 베타-2 마이크로글로불린 성분을 공국재화할 수 있는 폴리펩티드를 포함하는 세포를 제공한다.

Description

세포
본 발명은 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 세포에 관한 것이고, 특히 수용자에서 이러한 세포의 면역 거부반응을 제어하는 접근법에 관한 것이다.
주입 후, CAR T 세포는 수용자 내에서 생착하고 표적 보유 세포를 만나게 되면 증식한다. 그 후, CAR T 세포는 잔존하다가 그 집단은 시간이 지남에 따라 천천히 축소된다. CAR T 세포 잔존성은 혈액 샘플 중의 이식유전자(transgene)에 대한 실시간 PCR에 의해 또는 혈액 샘플 중의 CAR에 대한 유세포 분석법에 의해 임상 연구에서 확인될 수 있으며, 임상 연구자들은 잔존성과 지속된 반응 사이의 상관관계를 발견하였다. 이 상관관계는 특히 B-급성 림프아구성 백혈병(ALL)의 CD19 CAR 요법에서 현저하다. 종종 이러한 환경에서, CAR T 세포 생착의 소실은 백혈병의 재발을 예고한다.
CAR T 세포는, CAR T 세포의 거부반응을 유발할 수 있는 세포 매개성 면역 반응의 활성화를 유도할 수 있다. 이것은, 수용체를 제조하는 데 사용되는 비자기 단백질과 다른 엔지니어링 성분들 사이의 접합부로부터 형성되는 비자기 서열을 통해 또는 비자기 단백질을 통해 세포 내로 조작 도입된 성분들의 면역원성에 기인한다.
CAR은 전형적으로 표적화 도메인, 스페이서 도메인, 막관통 도메인 및 시그널링 도메인으로 이루어진 인공 단백질이다. 표적화 도메인은 전형적으로 뮤린(murine)일 수 있는 scFv로부터 유래된다. 이 scFv는 인간 또는 인간화될 수 있고, 다른 성분들은 개별적으로 자기 단백질로부터 유래되지만, 이들 사이의 접합부는 여전히 면역원성일 수 있다. 예를 들어, scFv 내에는 중쇄와 링커 및 링커와 경쇄 사이에 접합부가 존재한다. 그리고, scFv와 스페이서 도메인 사이에 접합부가 존재한다. 막관통 도메인이 스페이서와 연속적이지 않다면, 추가의 접합부가 존재한다. 유사하게, 막관통 도메인이 엔도도메인의 아미노 말단 부분과 연속적이지 않다면, 추가의 접합부가 존재한다. 마지막으로, 대부분의 엔도도메인은 2개 이상의 성분, 때로는 더 많은 성분을 가지며, 이어서 각 성분 사이에 접합부가 존재한다.
또한, CAR T 세포는 종종 추가 성분들을 갖도록 조작된다. 이들 성분은 자살 유전자(예를 들어, HSV-TK 효소)를 포함한다. 이 효소는 고도로 면역원성인 것으로 밝혀졌고, 반일치(haploidentical) 조혈모세포 이식의 심각한 면역억제 상황 외에는 CAR T 세포의 세포성 면역 고갈을 야기하였다. 다른 면역원성이 적은 자살 유전자는 여전히 약간의 면역원성을 제공할 수 있는데, 이는 두 단백질 사이의 융합 또는 이종 단백질의 사용을 수반하는 거의 모든 유형의 조작된 성분이 면역원성일 수 있기 때문이다.
많은 상황에서, CAR T 세포는 자가 T 세포로부터 생성된다. 이 상황에서는, 동종면역 반응이 발생하지 않는다. 어떤 상황에서는, 동종이계 공여자로부터의 T 세포가 사용된다. 이것은, 예를 들어 환자가 동종이계 조혈모세포 이식편을 받은 경우에 발생할 수 있다. 이 경우, 회수된 T 세포는 동종이계일 것이다. 그렇지 않으면, 환자는 화학요법에 의해 유발된 림프구 감소증으로 인해 CAR T 세포 생성물을 생성하기에 불충분한 T 세포를 가질 수 있다.
동종이계 세포의 거부반응은 경미한 불일치 또는 큰 불일치로 인한 것일 수 있다. 동종이계 T 세포가 수용자와 인간 백혈구 항원(HLA)이 일치하는 상황에서 경미한 불일치가 발생한다. 이 경우에, 거부반응은, HLA 상에 비자기(공여자) 에피토프/면역원성 펩티드의 제시를 초래하는 개체들 간의 비HLA 차이인 경미한 조직적합성 항원으로 인해 발생한다. 공여자와 수용자가 일치하지 않거나 부분적으로만 일치하는 경우, 수용자의 내인성 T 세포 상의 T 세포 수용체(TCR)는 불일치 HLA와 비특이적 방식으로 상호작용하여 결과적으로 거부반응을 유발할 수 있다. 동종이계 거부반응의 경미한 형태와 주요 형태 둘 다 TCR과 상호작용하는 HLA에 의해 유발된다.
세포성 면역 반응에 의한 거부를 방지하는 한 가지 방법은 조작된 징크 핑거 뉴클레아제, TALEN, CrispR/Casp9, MegaTAL 및 메가뉴클레아제와 같은 게놈 편집 도구에 의한 것이다. 이러한 도구를 이용하면, 펩티드/HLA 제시의 엘리먼트가 파괴될 수 있다. 이것을 하기 위한 가장 직접적인 방법은 HLA 제시의 파괴에 의한 것이다. 이것은 HLA 유전자좌의 파괴 또는 대안적으로 베타-2 마이크로글로불린(B2M) 유전자좌의 파괴(그 후 MHC 클래스 I 발현을 중단)에 의해 달성될 수 있다. 다른 접근법은 펩티드 제시 성분의 파괴를 포함한다.
세포 매개성 면역 거부반응을 예방하는 또 다른 방법은 HLA 발현을 방해하는 단백질 기반의 접근법에 의존한다. 예를 들어, B2M을 인식하고 카복시 말단에 골지/ER 유지 신호를 갖는 항체 단일쇄 가변 단편이, B2M이 ER/골지 복합체 내에 유지되기 때문에, HLA의 하향 조절을 초래할 수 있다. 다른 접근법은 HLA 발현 및 기능을 방해하도록 진화된 바이러스성 단백질을 이용하는 것을 포함한다.
이러한 모든 접근법의 주된 한계는 이들이 클래스 I의 표면 하향 조절에 의존하거나 그것을 초래하여, 그로 인해 NK 세포에 의한 거부반응이 유발된다는 점이다. 따라서, 이러한 접근법은 알파/베타 T 세포 매개성 세포 거부반응의 한 가지 문제를 해결하지만, 다른 유형의 세포 면역 거부반응, 즉 NK 세포에 의한 거부반응을 유발한다.
추가적인 한 방법 - 조작된 T 세포가 강력한 면역억제제에 내성을 갖도록 하고, 조작된 T 세포의 투여 후, 상기 면역 억제제를 투여하는 방법이 개시되었다. 이 접근법은, 모든 정상적인 T 세포가, 단지 조작된 세포 생성물을 거부할 수 있는 것보다 억제되므로, 수용자에게 심각한 면역억제를 유발하기 때문에 제한적이다.
따라서, 조작된 세포, 특히 CAR 또는 조작된 TCR을 발현하는 조작된 면역 세포의 세포 매개성 면역 거부반응을 감소시키기 위한 대안적인 접근법이 필요하다.
본 발명자들은, 제1 세포 상의 MHC 클래스 I의 결합을, 제2 세포 상의 TCR에 연결하여, 제1 세포에서 - 직접적으로 또는 간접적으로 - 신호전달을 유도하는 것이 가능하다는 것을 발견하였다. 특히, 본 MHC 클래스 I 신호전달 시스템은 상응하는 내인성 MHC 클래스 I 분자와 동일한 범위의 펩티드를 제시할 수 있다. 이와 같이, MHC 클래스 I에 의해 자연적으로 제시되는 임의의 펩티드가 본 발명의 MHC 클래스 I에 의해 제시된다. 이것은 면역원성일 수 있는 임의의 이종 또는 접합성 펩티드를 포함한다. 동종이계 환경에서, 이것은 또한 부조직적합성 항원을 포함할 수 있다. 따라서, 본원에 정의된 MHC 클래스 I은 펩티드/MHC 복합체의 인식을 통해 본 발명의 조작된 세포의 수용자에 존재하는 임의의 내인성, 반응성 T 세포와 상호작용할 것이다. 따라서, 반응성 T 세포는 본 발명의 세포에 의한 세포독성 매개 세포 사멸의 활성화에 의해 고갈될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 세포에 대한 세포성 면역 반응이 감소될 수 있다.
따라서, 제1 측면에서 본 발명은
(i) 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 트랜스제닉 T 세포 수용체(TCR); 및
(ii) 세포 내에서 세포내 시그널링 도메인과 MHC 클래스 I 분자의 베타-2 마이크로글로불린 성분을 공국재화할 수 있는 폴리펩티드
를 포함하는 세포를 제공한다.
세포내 시그널링 도메인과 MHC 클래스 I 분자의 베타-2 마이크로글로불린 성분을 공국재화할 수 있는 폴리펩티드는 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 엔도도메인을 추가로 포함하는 조작된 베타-2 마이크로글로불린일 수 있다.
조작된 베타-2 마이크로글로불린은 베타-2 마이크로글로불린과 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 엔도도메인 사이의 막관통 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
세포내 시그널링 도메인과 MHC 클래스 I 분자의 베타-2 마이크로글로불린 성분을 공국재화할 수 있는 폴리펩티드는 TCR 복합체의 성분에 연결된 베타-2 마이크로글로불린 폴리펩티드일 수 있고, 적합하게는 베타-2 마이크로글로불린 폴리펩티드는 CD3 복합체의 성분에 연결될 수 있다.
CD3 복합체의 성분은 CD3-제타, CD3-엡실론, CD3-감마 또는 CD3-델타로부터 선택될 수 있다. 베타-2 마이크로글로불린 폴리펩티드는 링커 펩티드에 의해 CD3 복합체의 성분에 융합될 수 있다. 베타-2 마이크로글로불린 폴리펩티드는 CD3 복합체 성분의 엑토도메인에 연결될 수 있다.
세포내 시그널링 도메인과 MHC 클래스 I 분자의 베타-2 마이크로글로불린 성분을 공국재화할 수 있는 폴리펩티드는 (i) 베타-2 마이크로글로불린 폴리펩티드에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인 및 (ii) 세포내 시그널링 도메인 또는 CD3 복합체의 성분을 포함하는 폴리펩티드에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 폴리펩티드일 수 있다.
이중특이적 분자는 막에 테더링된 것일 수 있다.
세포내 시그널링 도메인은 면역 수용체 티로신 기반 활성화(ITAM) 모티프를 포함할 수 있다.
세포내 시그널링 도메인은 다음 중 하나 이상을 포함하는 세포내 T 세포 시그널링 도메인일 수 있다: CD3 제타 엔도도메인, CD28 엔도도메인, OX40 엔도도메인, 4-1BB 엔도도메인, CD2 엔도도메인, CD27 엔도도메인, ICOS 엔도도메인, CD40 엔도도메인.
세포내 T 세포 시그널링 도메인은 CD3 제타 엔도도메인을 포함할 수 있다.
세포는 알파-베타 T 세포, NK 세포, 감마-델타 T 세포 또는 사이토카인 유도 살해 세포일 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은
(i) 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 트랜스제닉 TCR을 코딩하는 제1 핵산 서열; 및
(ii) 본 발명에 따른 세포내 시그널링 도메인과 MHC 클래스 I 분자의 베타-2 마이크로글로불린 성분을 공국재화할 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산 서열
을 포함하는 핵산 구성체를 제공한다.
제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열은 공발현 부위에 의해 분리될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은
(i) 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 트랜스제닉 TCR을 코딩하는 제1 핵산 서열; 및
(ii) 본 발명에 따른 세포내 시그널링 도메인과 MHC 클래스 I 분자의 베타-2 마이크로글로불린 성분을 공국재화할 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산 서열
을 포함하는 핵산 서열의 키트를 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 구성체를 포함하는 벡터를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은
(i) 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 트랜스제닉 TCR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 벡터; 및
(ii) 본 발명에 따른 세포내 시그널링 도메인과 MHC 클래스 I 분자의 베타-2 마이크로글로불린 성분을 공국재화할 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터
를 포함하는 벡터의 키트를 제공한다.
본 발명은, 본 발명의 복수의 세포; 핵산 구성체; 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열; 제1 벡터 및 제2 벡터를 포함하는 약학 조성물을 추가로 제공한다.
본 발명은 또한 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 세포, 핵산 구성체; 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열; 벡터; 제1 및 제2 벡터; 또는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 추가로 본 발명의 약학 조성물을 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 질환의 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다.
상기 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:
(i) 세포 함유 샘플의 단리 단계;
(ii) 본 발명의 핵산 구성체, 벡터 또는 제1 및 제2 벡터에 의한 세포의 형질도입 또는 형질감염 단계; 및
(iii) (ii)로부터의 세포를 대상체에게 투여하는 단계.
상기 방법의 부분 (i)에서 단리된 세포는 자가 유래일 수 있다. 상기 방법의 부분 (i)에서 단리된 세포는 동종이계일 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 의약의 제조에 있어서의 본 발명의 약학 조성물의 용도를 제공한다.
질환은 (i) 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 트랜스제닉 TCR; 및 (ii) 세포내 시그널링 도메인과 MHC 클래스 I 분자의 베타-2 마이크로글로불린 성분을 공국재화할 수 있는 폴리펩티드를 포함하는 세포의 면역 거부반응일 수 있다.
본 발명은 본 발명의 제1 측면에 따른 세포를 제조하는 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 핵산 구성체, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열; 벡터 또는 제1 및 제2 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다.
상기 세포는 대상체로부터 단리된 샘플로부터 유래된 것일 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 CD3 복합체의 성분에 연결된 MHC 클래스 I 분자의 베타-2 마이크로글로불린 성분을 포함하는 조작된 폴리펩티드를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, (i) 베타-2 마이크로글로불린 폴리펩티드에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인; 및 (ii) 세포내 시그널링 도메인 또는 CD3 복합체의 성분을 포함하는 폴리펩티드에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 폴리펩티드를 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면에 따른 세포의 MHC 클래스 I 분자에 의해 제시되는 펩티드를 인식하는 생체내 T 세포를 결실 또는 제거하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 이러한 펩티드/MHC를 인식하는 대상체의 T 세포가 음성 선택에 의해 결실되도록 본 발명의 제1 측면에 따른 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
상기 방법은 본 발명의 세포에 의해 발현된 외인성 단백질로부터 유래된 펩티드를 인식하는 T 세포를 결실시킬 수 있다. "외인성" 단백질은, 세포가, 예를 들어 재조합 수단에 의해 발현하도록 조작된 단백질이다. 이것은 정상적으로는 세포에 의해 발현되지 않는 단백질이다.
상기 방법은 키메라 항원 수용체(CAR), 트랜스제닉 T 세포 수용체(TCR), 자살 유전자, 키메라 사이토카인 수용체 또는 본 발명의 세포에 의해 발현되는 신호 전달 조절 단백질로부터 유래된 펩티드를 인식하는 T 세포를 결실시킬 수 있다.
상기 방법은 본 발명의 세포에 의해 발현된 키메라 항원 수용체(CAR)로부터 유래된 펩티드를 인식하는 T 세포를 결실시킬 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명의 제1 측면의 세포의 면역 거부반응을 예방하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기에 기재된 방법에 의해 세포의 MHC 클래스 I 분자에 의해 제시되는 펩티드를 인식하는 생체내 T 세포를 결실시키는 단계를 포함한다.
도 1 - (a) MHC 및 B2M으로 이루어진 MHC 클래스 I 분자 복합체; (b) CD3 엘리먼트로 둘러싸인 TCR 알파/베타 사슬로 이루어진 TCR 복합체.
도 2 - (a) B2M-Z 구성체: B2M 구성체는 막관통 도메인 및 CD3-제타 엔도도메인에 인프레임으로 융합됨; (b) B2M-TCR 이중특이적 구성체: B2M을 인식하는 scFv가 CD3/TCR 복합체를 인식하는 제2 scFv에 링커에 의해 융합된다. 그 후 이것은 막관통 도메인을 통해 막에 고정된다; (c) B2M과 CD3/TCR의 융합: 예로서, CD3 엡실론에 대한 플렉시블 링커를 통한 B2M의 융합이 도시되어 있다.
도 3 - a) 전형적인 CAR을 예시하는 개략도. (b) 내지 (d): CAR 엔도도메인의 다양한 세대 및 치환; (b) 초기 디자인은 FcεR1-γ 또는 CD3ζ 엔도도메인을 통해 ITAM 신호를 단독으로 전달하는 반면, 이후의 디자인은 추가적인 (c) 하나 또는 (d) 두 개의 공동 자극 신호를 동일한 복합 엔도도메인에서 전달한다.
도 4 - MHC 클래스 I CAR을 예시하는 개략도.
주조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I CAR은 2개의 비공유적으로 연결된 폴리펩티드 사슬, α 및 β2-마이크로글로불린(β2m)으로 이루어진 이종이량체이다. α1 및 α2 서브유닛은 로딩된 펩티드와 함께 T 세포의 표면에서 발현되는 T 세포 수용체(TCR)에 결합한다. β2-마이크로글로불린은 세포막에 분자를 고정시키는 막관통 도메인에 연결되고, 세포내 신호를 세포로 전달하는 작용을 하는 엔도도메인에 추가로 연결된다. 엔도도메인은 하나 이상의 시그널링 도메인으로 이루어질 수 있다.
도 5 - 3 가지의 가능한 β2m 기반 CAR 디자인을 예시하는 개략도
첫 번째 CAR(A)에서 β2-마이크로글로불린은 브릿지를 통해 CD3ζ 막관통 도메인에 연결되고, 이어서 CD3ζ 엔도도메인에 연결된다. 2개의 다른 CAR 디자인(B 및 C)은 공동 자극 도메인, 각각 41BB 또는 CD28을 부가하였다.
도 6 - MHC I CAR-T 세포는 MHC I/TCR 상호작용을 통해 표적 T 세포를 사멸시킬 수 있다.
3개의 β2m 구성체(β2m-CD3z, β2m-41BBz 및 β2m-CD28z)를 사용하여 HLA-A02 하플로타입의 2명의 건강한 공여자 유래의 PBMC를 형질도입시켰다. HLA-A02에 자연적으로 결합하는 재조합 HA1H 펩티드를 사용하여, CAR-T 세포를 다양한 농도 범위(상위 농도 = 10 μM)로 펄싱하였다. 펄싱된 CAR-T 세포를 2:1 이펙터 대 표적 비로 항-HA1H TCR을 발현하는 SupT1 세포와 공동 배양하였다. 48 시간 인큐베이션 후, 생존 가능한 SupT1 표적 세포의 수를 유세포 분석에 의해 평가하고, 형질도입되지 않은(NT) 대조군에 대해 정규화하였다. 3개의 β2m 구성체 모두 표적 세포를 사멸시키는 데 효과적이었다. HA1H 펩티드에 대한 EC50은 ~0.5 μM(β2m-CD3z) 내지 ~0.1 μM(β2m-41BBz) 범위였다.
도 7 - MHC I CAR-T 세포와 표적 세포와의 계합은 사이토카인의 생성을 유도한다. 2:1의 이펙터 대 표적 비에서, MHC I CAR-T 세포(β2m-CD3z n=1; β2m-41BBz 및 β2m-CD28z n=2)와 SupT1.HA1H-TCR 표적 세포의 48 시간 공동 배양으로부터 얻은 배지 중의 상대적 사이토카인 농도. CAR-T 세포는 표적을 시딩하기 전에 다양한 농도의 재조합 HA1H 펩티드로 펄싱되었다. 사이토카인 농도를 정규화하기 위해 NT 대조군을 사용하였다. 적색 선은 NT 대조군에 의해 생성된 사이토카인의 수준을 나타낸다.
B2M과 세포내 시그널링 도메인의 공국재화
본 발명은 (i) 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 트랜스제닉 T 세포 수용체(TCR); 및 (ii) 세포 내에서 세포내 시그널링 도메인과 MHC 클래스 I 분자의 베타-2 마이크로글로불린 성분을 공국재화할 수 있는 폴리펩티드를 포함하는 세포를 제공한다.
네오에피토프 또는 동종항원은 MHC 클래스 I 분자 상에 제시된다. MHC 클래스 I은 펩티드가 로딩된 MHC 클래스 I 단백질과 베타-2-마이크로글로불린(B2M)의 조립에 의해 형성된다. MHC 클래스 I 단백질은 고도로 다형성이지만, B2M은 보존되어 있다.
MHC 클래스 I 분자는 4개의 면역글로불린 유사 루프로 이루어진다. MHC 단백질은 3개의 루프(α1, α2 및 α3)를 제공한다. 별개의 단백질 B2M은 제4 루프를 제공한다(도 1(a) 참조). B2M은 세포 표면 상의 MHC 클래스 I의 α3 사슬 옆에 위치한다. α3과는 달리, 내인성 B2M은 막관통 영역이 없다. B2M 바로 위에(즉, 세포로부터 더 떨어져서) α1 사슬이 위치하며, 그 자체는 α2 옆에 위치한다.
예시적인 B2M 아미노산 서열은 서열 번호 1로서 제시된다:
Figure pct00001
본 발명에 사용하기 위한 B2M 폴리펩티드 서열은 서열 번호 1로서 나타낸 서열 또는 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 변이체는 MHC 클래스 I 단백질과 조립할 수 있는 능력을 유지하고 MHC 클래스 I 복합체에 의한 생산적인 펩티드 제시를 용이하게 한다.
서열 번호 1의 변이체는, 변이체 서열이 MHC 클래스 I 단백질과 조립할 수 있는 능력을 유지하고, MHC 클래스 I 복합체에 의한 생산적인 펩티드 제시를 용이하게 한다면, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다.
두 폴리펩티드 서열 사이의 동일성 백분율은 BLAST와 같은 프로그램에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 이는 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov에서 자유롭게 이용 가능하다. 적합하게는, 동일성 백분율은 참조 및/또는 질의 서열 전체에 걸쳐 결정된다.
본원에서 사용될 때, "세포 내에서 세포내 시그널링 도메인과 MHC 클래스 I 분자의 B2M 성분을 공국재화할 수 있는"은, 반응성 T 세포 상의 TCR이 본 발명의 세포 상의 펩티드/MHC 복합체에 결합할 경우, 폴리펩티드가, 세포내 시그널링 도메인이 본 발명의 세포에서 활성화 신호를 전달하도록, B2M 성분을 세포내 시그널링 도메인과 공국재화하는 것을 의미한다.
적합하게는, 유도되는 활성화 신호는 본 발명의 세포를 자극하여 펩티드/MHC 복합체를 인식하는 반응성 T 세포를 고갈시킨다. 이러한 고갈은 전형적으로 세포 매개성, 세포독성 사멸 메커니즘에 의해 달성된다.
세포에서 세포독성 사멸 메커니즘의 활성화를 측정하기 위한 적합한 방법은 크롬 방출 어세이, 유세포 분석 기반 사멸 어세이, 이펙터 및 표적이 접촉한 후 사이토카인 방출을 측정하는 방법(예를 들어. ELISA 또는 사이토카인 비드 어레이), 유세포 분석에 의한 이펙터-표적 세포의 접촉 후 이펙터 세포에서의 탈과립화 또는 활성화의 입증을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.
조작된 B2M
일부 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자의 B2M 성분을 세포내 시그널링 도메인과 공국재화할 수 있는 폴리펩티드는 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 엔도도메인을 추가로 포함하는 조작된 B2M이다.
이러한 조작된 B2M 성분은 B2M 폴리펩티드를 포함하고 MHC 클래스 I 단백질과 조립하여 MHC 클래스 I 복합체에 의한 생산적인 펩티드 제시를 용이하게 할 수 있다. 또한, 조작된 B2M은 조작된 B2M을 포함하는 펩티드/MHC 복합체에 TCR의 결합 후 활성화 신호를 전달할 수 있는 세포내 시그널링 도메인을 추가로 포함한다. 세포내 시그널링 도메인은 본원에 기재된 세포내 시그널링 도메인일 수 있다.
조작된 B2M 폴리펩티드는 문헌[Margalit et al. (Int. Immunol. 15, 1379-1387(2003))]에 기재되어 있다. 이들 조작된 MHC/B2M 폴리펩티드는 조작된 B2M에 연결된 펩티드를 포함하여 MHC 클래스 I이 상기 연결된 펩티드를 독점적으로 제시하게 한다. 이러한 구성체를 발현하는 T 세포는 선택된 펩티드/MHC 복합체를 인식하는 임의의 반응성 T 세포를 선택적으로 고갈시킬 것이다. 이러한 방식으로, 공지된 항원에 대한 선택적 면역억제는 동족 T 세포의 고갈에 의해 실행될 수 있다.
대조적으로, MHC 클래스 I에 의해 자연적으로 제시되는 임의의 펩티드가 본 MHC 클래스 I 복합체에 의해 제시될 것이다. 이는 유리하게는 본 MHC 클래스 I 복합체를 발현하는 세포가 본 발명의 세포에 의해 제시되는 임의의 펩티드/MHC 복합체를 인식하는 내인성 반응성 T 세포를 고갈시킬 수 있게 한다.
본 발명의 MHC 클래스 I 복합체는 세포에 의해 발현된 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 트랜스제닉 T 세포 수용체(TCR)로부터 유래된 펩티드를 제시할 수 있다. 대안적으로, 이는 자살 유전자, 키메라 사이토카인 수용체 또는 신호 전달 조절 단백질과 같이 세포가 발현하도록 조작된 다른 비내인성 단백질로부터 유래된 펩티드를 제시할 수 있다.
자살 유전자는, 수용할 수 없는 독성에 직면하여 입양 전달된 T 세포의 선택적 파괴를 허용하는 유전적으로 코딩되는 메커니즘이다. 임상 연구에서 2종의 자살 유전자가 테스트되었다: 허피스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제(HSV-TK) 및 유도성 카스파제 9(iCasp9). 본 발명의 세포는, 예를 들어, 이들 자살 유전자 중 하나 또는 WO2013/153391, WO2016/135470 또는 WO2016/166521에 기재된 것 중 하나와 같은 대안적인 시스템을 발현할 수 있다.
키메라 사이토카인 수용체는 세포에 사이토카인 신호를 제공한다. 이들은 항상적으로 활성이 있거나, 종양 분비 인자, 세포막 단백질 또는 케모카인과 같은 분자에 의해 유도될 수 있다. 두 유형의 키메라 사이토카인 수용체는 WO2017/029512에 보다 상세하게 기술되어 있다.
신호 전달 조절 단백질은, 예를 들어, 두 SH2 도메인 또는 둘 중 어느 하나를 포함하지만 포스파타제 도메인이 없는 절단된 SHP-1 또는 SHP-2 분자일 수 있다. 이러한 우성 음성 SHP-1 및 SHP-2 분자는 PD1과 같은 억제성 면역 수용체 분자 상의 pITIM에 결합하기 위해 내인성 SHP-1 및/또는 SHP-2와 경쟁한다. 이는 SHP-1/SHP-2에 의한 ITAM 도메인의 탈인산화를 감소시켜, 이들 분자에 의해 매개되는 면역 활성화의 억제를 차단 또는 감소시킨다. 이들 및 다른 신호 전달 조절 단백질은 WO2016/193696 및 WO2018/096361에 기재되어 있다.
내인성 B2M 폴리펩티드는 막관통 도메인을 포함하지 않는다. 적합하게는, 본 발명의 조작된 B2M은 B2M 폴리펩티드와 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 엔도도메인 사이에 위치한 막관통 도메인을 추가로 포함한다.
막관통 도메인은 세포막 내로 삽입되어 걸쳐 놓일 수 있는 임의의 펩티드 도메인일 수 있다. 막관통 도메인은 막 내에서 열역학적으로 안정한 임의의 단백질 구조일 수 있다. 이것은 전형적으로 몇몇 소수성 잔기로 구성된 알파 나선이다. 임의의 막관통 단백질의 막관통 도메인은 본 발명의 막관통 부분을 제공하는 데 사용될 수 있다. 단백질의 막관통 도메인의 존재 및 범위는 TMHMM 알고리즘(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)을 이용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 또한, 단백질의 막관통 도메인이 비교적 간단한 구조, 즉 막을 가로지르기에 충분한 길이의 소수성 알파 나선을 형성할 것으로 예측되는 폴리펩티드 서열 인 경우, 인공적으로 설계된 TM 도메인도 사용될 수 있다(US 7052906 B1은 합성 막관통 성분을 기술함). 예를 들어, 막관통 도메인은 소수성 알파 나선을 포함할 수 있다. 막관통 도메인은 CD8알파 또는 CD28로부터 유래될 수 있다.
예로서, CD8알파 및 CD28의 막관통 도메인은 각각 서열 번호 28 및 서열 번호 2로서 제시된다.
Figure pct00002
Figure pct00003
본 발명에 사용하기 위한 예시적인 조작된 B2M은 서열 번호 3으로 제시된다.이 폴리펩티드 서열은 B2M 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 CD3-ζ 엔도도메인을 포함한다.
Figure pct00004
본 발명에 사용하기 위한 조작된 B2M 폴리펩티드 서열은 서열 번호 3으로서 제시된 서열 또는 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 변이체는 MHC 클래스 I 단백질과 조립하는 능력을 유지하고, MHC 클래스 I 복합체에 의한 생산적인 펩티드 제시를 용이하게 하고, 조작된 B2M을 포함하는 펩티드/MHC 복합체에 TCR이 결합한 후 활성화 신호를 전달한다.
서열 번호 3의 변이체는, 변이체 서열이 MHC 클래스 I 단백질과 조립하는 능력을 보유하고, MHC 클래스 I 복합체에 의한 생산적인 펩티드 제시를 촉진하며, 조작된 B2M을 포함하는 펩티드/MHC 복합체에 TCR이 결합한 후 활성화 신호를 전달한다면, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다.
B2M/CD3 연결된 폴리펩티드
본 발명의 다른 실시양태에서, 세포내 시그널링 도메인과 MHC 클래스 I 분자의 B2M 성분을 공국재화할 수 있는 폴리펩티드는 TCR 복합체의 성분에 연결된 B2M 폴리펩티드이다.
CD3은 세포독성 T 세포 및 T 헬퍼 세포 둘 모두의 활성화에 관여하는 T 세포 공동 수용체이다. 이것은 4개의 별개의 사슬로 이루어진 단백질 복합체로 형성된다. 본원에서 사용된 용어 "CD3 복합체"는 또한 CD3ζ 사슬을 포함한다. 포유동물에서, 복합체는 CD3γ 사슬, CD3δ 사슬 및 2개의 CD3ε 사슬을 포함한다. 이들 사슬은 TCR과 회합하여, T 림프구에서 활성화 신호를 생성할 수 있는 TCR 복합체를 생성한다.
CD3ζ, CD3γ, CD3δ 및 CD3ε 사슬은 단일 세포외 면역글로불린 도메인을 포함하는 면역글로불린 수퍼패밀리의 고도로 관련된 세포 표면 단백질이다. CD3 사슬의 막관통 영역은 음으로 하전된 다수의 아스파테이트 잔기를 포함하며, 이것은 이들 사슬이 양으로 하전된 TCR 사슬과 회합되도록 하는 특성이다. CD3 분자의 세포내 테일은, TCR 신호전달에 관여하는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM)로 알려진 단일의 보존된 모티프를 포함한다.
TCR 복합체의 성분에 연결된 B2M 폴리펩티드는 MHC 클래스 I 복합체와 조립할 수 있고 MHC 클래스 I 복합체에 의한 생산적인 펩티드 제시를 촉진할 수 있다. 또한, TCR/CD3 성분은 TCR/CD3 복합체와 함께 조립할 수 있다. 따라서, TCR 복합체의 성분에 연결된 B2M을 포함하는 펩티드/MHC 복합체에 대한 TCR의 결합은 B2M에 연결된 CD3 성분을 포함하는 CD3/TCR 복합체를 통한 신호전달을 유발할 것이다(도 2(c) 참조).
B2M 폴리펩티드는 TCR 또는 CD3 복합체의 성분에 연결될 수 있다. 적합하게는, B2M 폴리펩티드는 가변 도메인이 결여된 조작된 TCR 폴리펩티드에 연결될 수 있다. 예로서, B2M 폴리펩티드는 조작된 프리-T-알파 사슬에 연결될 수 있다. 프리-T-알파 사슬은 흉선 선택 시에 발생되는 T 세포에서 발현되며, 가변 도메인이 결여되어 있다.
조작된 프리-T-알파 사슬의 예시적인 서열은 서열 번호 30으로서 제시된다.
Figure pct00005
프리-T-알파 사슬은 서열 번호 30에 나타낸 바와 같은 신호 서열이 결여될 수 있다.
프리-T-알파 사슬의 네이티브 TM 도메인은 유지되거나 또는 비신호전달 극성 앵커의 도메인, CD3-Z의 엔도도메인 및/또는 공동 자극 신호, 예컨대 CD28 및/또는 41BB로 대체될 수 있다. 적합한 신호전달 엔도도메인 및 이들의 조합이 본원에 기재되어 있다.
본 발명에 사용하기에 적합한 TCR 사슬에 연결된 예시적인 B2M 폴리펩티드는 서열 번호 31 및 32로 제시된다. 이들 폴리펩티드 서열은 프리-T-알파 사슬의 N-말단에 연결된 B2M 도메인을 포함하고, 네이티브 프리-T-알파 막관통 도메인 또는 41BB-CD3제타 신호전달 엔도도메인을 각각 포함한다.
Figure pct00006
Figure pct00007
TCR 복합체의 성분에 연결되고 본 발명에 사용하기에 적합한 B2M 폴리펩티드는 서열 번호 31 또는 32로 나타낸 서열, 또는 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 변이체는 MHC 클래스 I 단백질과 조립하는 능력을 유지하고 MHC 클래스 I 복합체에 의한 생산적인 펩티드 제시를 용이하게 한다. 또한, 이것은 조작된 B2M을 포함하는 펩티드/MHC 복합체에 TCR의 결합 후에 활성화 신호가 전달될 수 있게 한다.
서열 번호 31 또는 서열 번호 32의 변이체 서열은, 변이체 서열이 MHC 클래스 I 단백질과 조립할 수 있는 능력을 보유하고, MHC 클래스 I 복합체에 의한 생산적인 펩티드 제시를 용이하게 하고, 조작된 B2M을 포함하는 펩티드/MHC 복합체에 TCR의 결합 후 활성화 신호를 전달한다면, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가질 수 있다.
적합하게는, B2M 폴리펩티드는 CD3 복합체의 성분에 연결된다. B2M 폴리펩티드가 연결된 CD3 복합체의 성분은 CD3-제타, CD3-엡실론, CD3-감마 및 CD3-델타로부터 선택될 수 있다.
적합하게는, B2M 폴리펩티드가 연결된 CD3 복합체의 성분은 CD3-제타이다.
적합하게는, B2M 폴리펩티드가 연결된 CD3 복합체의 성분은 CD3-엡실론이다.
적합하게는, B2M 폴리펩티드가 연결된 CD3 복합체의 성분은 CD3-감마이다.
적합하게는, B2M 폴리펩티드가 연결된 CD3 복합체의 성분은 CD3-델타이다.
인간 CD3ζ, CD3γ, CD3δ 및 CD3ε 아미노산 서열의 예는 각각 서열 번호 4 내지 7로서 제시된다. 본 발명에 사용하기 위한 CD3 폴리펩티드 서열은 서열 번호 4 내지 7 중 하나로 제시된 서열 또는 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 변이체는 서열 번호 4 내지 7 중 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다.
Figure pct00008
Figure pct00009
B2M 폴리펩티드는 임의의 적합한 수단에 의해 CD3 성분에 연결될 수 있다. 예를 들어, B2M 폴리펩티드는 링커 펩티드에 의해 CD3 복합체의 성분에 융합될 수 있다.
적합한 링커 펩티드는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 다양한 적합한 링커 펩티드가 문헌[Chen et al. (Adv Drug Deliv Rev. 2013년 10월 15일; 65(10): 1357-1369 - 특히 표 3 참조)]에 기재되어 있다.
적합한 링커는 서열 번호 29의 하나 이상의 카피를 포함하는 (SGGGG)n(서열 번호 29)이다. 예를 들어, 적합한 링커 펩티드는 서열 번호 8로 나타낸다.
서열 번호 8 - SGGGGSGGGGSGGGGS
적합하게는, B2M 폴리펩티드는 CD3 복합체 성분의 엑토도메인에 연결된다. 적합하게는, B2M 폴리펩티드는 CD3 복합체 성분의 N-말단에 연결된다.
본 발명에 사용하기에 적합한 CD3 복합체의 성분에 연결된 예시적인 B2M 폴리펩티드는 서열 번호 9 및 10으로 나타낸다. 이들 폴리펩티드 서열은 각각 CD3ε 폴리펩티드 또는 CD3ζ 폴리펩티드의 N-말단에 연결된 B2M 도메인을 포함한다.
Figure pct00010
Figure pct00011
CD3 복합체의 성분에 연결되고 본 발명에 사용하기에 적합한 B2M 폴리펩티드는 서열 번호 9 또는 10으로서 제시된 서열, 또는 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 변이체는 MHC 클래스 I 단백질과 조립하는 능력을 유지하고 MHC 클래스 I 복합체에 의한 생산적인 펩티드 제시를 용이하게 한다. 또한, 이것은 조작된 B2M을 포함하는 펩티드/MHC 복합체에 TCR의 결합 후에 활성화 신호가 전달될 수 있게 한다.
서열 번호 9 또는 서열 번호 10의 변이체 서열은, 변이체 서열이 MHC 클래스 I 단백질과 조립할 수 있는 능력을 보유하고, MHC 클래스 I 복합체에 의한 생산적인 펩티드 제시를 용이하게 하고, 조작된 B2M을 포함하는 펩티드/MHC 복합체에 TCR의 결합 후 활성화 신호를 전달한다면, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가질 수 있다.
추가의 독립적 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 CD3 복합체의 성분에 연결된 조작된 B2M 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 CD3 복합체의 성분에 연결된 조작된 B2M 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다. 본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
추가로, 본 발명은 CD3 복합체의 성분에 연결된 조작된 B2M 폴리펩티드 또는 상기 조작된 B2M 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
이중특이적 B2M/TCR 결합 분자
본 발명의 추가적인 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자의 B2M 성분을 세포내 시그널링 도메인과 공국재화할 수 있는 폴리펩티드는 (i) B2M 폴리펩티드에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인 및 (ii) 세포내 시그널링 도메인 또는 CD3 복합체의 성분을 포함하는 폴리펩티드에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 폴리펩티드일 수 있다.
세포 표면 상에서 발현될 경우, 본 발명의 이중특이적 분자는 MHC 클래스 I과 TCR을 공국재화하고, 다른 T 세포 상의 TCR이 본 발명의 이중특이적 분자에 의해 결합된 펩티드/MHC 복합체에 결합한 후에 본 발명의 세포에서 TCR 시그널링을 촉진시킨다.
이중특이적 분자는 다수의 상이한 포맷으로 개발되었다. 가장 일반적인 것 중 하나는 상이한 항체의 2개의 단일쇄 가변 단편(scFvs)으로 구성되는 융합체이다.
본 발명의 이중특이적 분자의 제1 및/또는 제2 결합 도메인은 항체 또는 면역글로불린 기반 결합 도메인일 수 있다.
본원에서 사용될 때, "항체"는 하나 이상의 상보성 결정 영역 CDR을 포함하는 항원 결합 부위를 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 항체는 3개의 CDR을 포함할 수 있고 도메인 항체(dAb)의 것과 동등한 항원 결합 부위를 가질 수 있다. 항체는 6개의 CDR을 포함할 수 있고 전형적인 항체 분자의 항원 결합 부위와 동등한 항원 결합 부위를 가질 수 있다. 폴리펩티드의 나머지는 항원 결합 부위에 적합한 스캐폴드를 제공하고 항원에 결합하기에 적절한 방식으로 이를 나타내는 임의의 서열일 수 있다. 항체는 전체 면역글로불린 분자 또는 그의 일부, 예컨대 Fab, F(ab)'2, Fv, 단일쇄 Fv(ScFv) 단편, 나노바디 또는 단일쇄 가변 도메인(VH 또는 VL 사슬일 수 있음, 3개의 CDR을 가짐)일 수 있다. 항체는 이작용성 항체일 수 있다. 항체는 비인간, 키메라, 인간화 또는 완전 인간 항체일 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 이중특이적 분자의 제1 및/또는 제2 결합 도메인은 면역글로불린에서 유래되거나 면역글로불린에 기초하지 않는 도메인을 포함할 수 있다. 비항체 폴리펩티드의 결합 능력을 이용하기 위해 다수의 "항체 모방체" 설계 반복 단백질(DRP)이 개발되었다. 이러한 분자는 안키린 또는 류신 풍부 반복 단백질, 예를 들어 다핀(DARPins)(Designed Ankyrin Repeat Proteins), 안티칼린(Anticalins), 아비머(Avimers) 및 베르사바디(Versabodies)를 포함한다.
본 발명의 이중특이적 분자의 제1 결합 도메인은 B2M 폴리펩티드에 결합할 수 있다.
특히, 제1 결합 도메인은 B2Mb에 결합할 수 있다. 적합한 B2Mb 결합 도메인은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 서열 번호 11로 나타낸 폴리펩티드 서열을 포함한다.
Figure pct00012
이 B2Mb 결합 도메인은, 문헌[Brodsky et al. (Eur. J. Immunol; 9; 536-545; 1979)] 및 문헌[Parham et al. (J. Biol. Chem.; 258; 6179-6186; 1983)]에 기재된 BBM1 하이브리도마로부터 생성될 수 있다.
제1 결합 도메인은 서열 번호 11로 나타낸 scFv 서열로부터의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함할 수 있다.
제1 도메인은 서열 번호 11로 나타낸 것과 같은 scFv 서열을 포함할 수 있다. 제2 도메인은 서열 번호 11과 80% 이상의 서열 동일성을 갖고 B2M, 특히 B2Mb에 결합하는 서열의 변이체를 포함할 수 있다.
제1 결합 도메인은 서열 번호 11로 나타낸 서열로부터의 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 제2 결합 도메인은 서열 번호 11의 중쇄로부터의 CDR3 및/또는 서열 번호 11의 경쇄로부터의 CDR3을 포함할 수 있다. 제2 결합 도메인은 서열 번호 11로부터의 6개의 CDR 모두를 포함할 수 있다. 서열 번호 11로부터의 CDR의 서열은하기에 제시되어 있다.
Figure pct00013
Figure pct00014
제1 결합 도메인은 서열 번호 11로부터의 CDR 서열(서열 번호 33 내지 38에 제시됨)을 포함하는 scFv를 포함할 수 있다.
단지 예로서, B2M에 대한 항체를 제공하는 추가의 하이브리도마가 문헌[Mhashilkar et al. (Gene Ther .; 995); 207-319; 2002)]에 기재되어 있다. Mhashilkar 등에 의해 기술된 BB7.7 하이브리도마는 가변 중쇄 서열 및 2개의 가능한 가변 경쇄 서열 상에서 발현되는 것으로 밝혀졌다. 제1 결합 도메인은 BB7.7로부터 생성된 scFV(서열 번호 39 내지 40으로 나타냄)를 포함할 수 있다.
Figure pct00015
Figure pct00016
제1 결합 도메인은 서열 번호 11, 39 또는 40으로서 제시된 scFv 서열 또는 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 그의 변이체를 포함할 수 있으며, 이 변이체는 B2M에 결합하는 능력을 보유한다.
서열 번호 11, 39 또는 40 유래의 변이체 서열은 서열 번호 11, 39 또는 40으로서 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가질 수 있고, 그와 동등하거나 개선된 B2M 결합 능력을 가질 수 있다.
본 발명의 이중특이적 분자의 제2 도메인은 세포내 시그널링 도메인 또는 CD3 복합체의 성분을 포함하는 폴리펩티드에 결합할 수 있다. 특히, 제2 도메인은 T 세포 표면 상의 CD3에 결합할 수 있다. 이와 관련하여, 제2 도메인은 CD3 또는 TCR 특이적 항체 또는 이의 일부를 포함할 수 있다.
제2 도메인은 서열 번호 12로 나타낸 scFv 서열로부터의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함할 수 있다.
제2 도메인은 서열 번호 12로 나타낸 것과 같은 scFv 서열을 포함할 수 있다. 제2 도메인은 80% 이상의 서열 동일성을 가지고 CD3에 결합하는 그러한 서열의 변이체를 포함할 수 있다.
제2 도메인은 CD3에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 일부, 예컨대 OKT3, WT32, 항-leu-4, UCHT-1, SPV-3TA, TR66, SPV-T3B 또는 이들의 친화성 조정 변이체를 포함할 수 있다.
본 발명의 이중특이적 분자의 제2 도메인은 단클론 항체 OKT3의 전부 또는 일부를 포함할 수 있으며, 이는 FDA에 의해 승인된 최초의 단클론 항체이다. OKT3은 ATCC CRL 8001로부터 입수 가능하다. 항체 서열은 US 7,381,803에 공개되어 있다.
제2 도메인은 OKT3으로부터의 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 제2 결합 도메인은 OKT3의 중쇄로부터의 CDR3 및/또는 OKT3의 경쇄로부터의 CDR3을 포함할 수 있다. 제2 결합 도메인은 하기에 나타낸 바와 같이 OKT3으로부터의 6개의 CDR 모두를 포함할 수 있다.
Figure pct00017
Figure pct00018
제2 결합 도메인은 OKT3로부터의 CDR 서열을 포함하는 scFv를 포함할 수 있다. 제2 결합 도메인은, CD3에 결합하는 능력을 유지하는, 서열 번호 12 또는 41로서 하기에 나타낸 scFv 서열 또는 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
Figure pct00019
Figure pct00020
서열 번호 12 및 41은 본 발명에서 사용하기에 적합한 scFV의 대안적인 구조를 제공한다. 서열 번호 12는 VL-VH 배열로서 제공된다. 서열 번호 41은 VH-VL 배열로서 제공된다.
서열 번호 12 또는 41로부터의 변이체 서열은 서열 번호 12 또는 41로 나타낸 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가질 수 있고, 동일하거나 개선된 CD3 결합 능력을 가질 수 있다.
본 발명의 이중특이적 분자는 제1 도메인을 제2 도메인과 연결하고 2개의 도메인을 공간적으로 분리하기 위해 스페이서 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 제1 및 제2 결합 도메인은 짧은 5 잔기 펩티드 링커(GGGGS)를 통해 연결될 수 있다.
스페이서 서열은, 예를 들어, IgG1 힌지 또는 CD8 스톡(stalk)을 포함할 수 있다. 링커는 대안적으로 IgG1 힌지 또는 CD8 스톡과 유사한 길이 및/또는 도메인 간격 특성을 갖는 대안적인 링커 서열을 포함할 수 있다.
스페이서는 짧은 스페이서, 예를 들어 100개 미만, 80개 미만, 60개 미만 또는 45개 미만의 아미노산을 포함하는 스페이서일 수 있다. 스페이서는 IgG1 힌지 또는 CD8 스톡 또는 이의 변형된 버전이거나 이를 포함할 수 있다.
이들 링커의 아미노산 서열의 예는 다음과 같다:
Figure pct00021
Figure pct00022
CD8 스톡은 이것이 동종이량체의 형성을 유도할 수 있도록 하는 서열을 갖는다. 이것이 바람직하지 않은 경우, 하나 이상의 시스테인 잔기가 CD8 스톡 서열로부터 치환되거나 제거될 수 있다. 본 발명의 이중특이적 분자는, 서열 번호 20으로서 제시된 서열, 또는 변이체 서열이 제1 도메인 및 제2 도메인의 대략 동등한 간격을 발생시키는 분자 및/또는 변이체 서열이 이중특이적 분자의 동종이량체화를 유발하는 분자라면, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 스페이서를 포함할 수 있다.
본 발명의 이중특이적 분자는 하기 일반식을 가질 수 있다:
제1 도메인 - 스페이서 - 제2 도메인.
스페이서는 또한 사슬 파괴를 도입하기 위해 하나 이상의 링커 모티프를 포함할 수 있다. 사슬 파괴는 2개의 별개의 도메인을 분리하지만 다른 각도의 배향을 허용한다. 이러한 서열은 서열 SDP 및 서열 SGGGSDP(서열 번호 21)를 포함한다.
링커는 SGGGGS(서열 번호 22)와 같은 세린-글리신 링커를 포함할 수 있다.
스페이서는, 이중특이적 분자가 동종이량체를 형성하게 할 수 있으며, 예를 들어, 스페이서 내의 하나 이상의 시스테인 잔기의 존재로 인해, 이는 동일한 스페이서를 포함하는 다른 분자와 디설파이드 결합을 형성할 수 있다.
이중특이적 분자는 막에 테더링된 것일 수 있다. 다시 말해서, 이중특이적 분자는 본 발명의 세포에서 발현된 후 세포막에 국재화되도록 막관통 도메인을 포함할 수 있다.
예로서, 막관통 도메인은 본원에 기재된 막관통 도메인일 수 있다. 예를 들어, 막관통 도메인은 소수성 알파 나선을 포함할 수 있다. 막관통 도메인은 CD8알파 또는 CD28로부터 유래될 수 있다.
예를 들어, CD8알파 또는 CD28의 막관통 도메인은 본원에서 각각 서열 번호 28 및 서열 번호 2로 제시된다.
본 발명의 이중특이적 분자는 하기 일반식을 가질 수 있다:
제1 도메인 - 스페이서 - 제2 도메인 - 막관통 도메인; 또는
막관통 도메인 - 제1 도메인 - 스페이서 - 제2 도메인.
본 발명에 사용하기에 적합한 예시적인 이중특이적 분자는 서열 번호 23으로서 나타낸다. 이 폴리펩티드 서열은 CD3 결합 및 막관통 도메인에 연결된 B2M 결합 도메인을 포함한다.
Figure pct00023
본 발명에 사용하기에 적합한 이중특이적 분자는 서열 번호 23으로서 제시된 서열, 또는 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 변이체는 B2M 및 세포내 시그널링 도메인 또는 CD3 복합체의 성분에 결합하는 능력을 유지한다. 본 발명의 이중특이적 분자는 또한 이중특이적 분자에 의해 결합된 B2M을 포함하는 펩티드/MHC 복합체에 TCR의 결합 후 활성화 신호가 전달될 수 있게 한다.
서열 번호 23의 변이체 서열은, 변이체 서열이 B2M 및 세포내 시그널링 도메인 또는 CD3 복합체의 성분에 결합하는 능력을 유지하고, 이중특이적 분자에 의해 결합된 B2M을 포함하는 펩티드/MHC 복합체에 TCR의 결합 후 활성화 신호가 전달될 수 있게 한다면, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다.
추가의 독립적인 측면에서, 본 발명은 (i) B2M 폴리펩티드에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인 및 (ii) 본원에 기재된 세포내 시그널링 도메인 또는 CD3 복합체의 성분을 포함하는 폴리펩티드에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 분자를 제공한다.
본 발명은 추가로 (i) B2M 폴리펩티드에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인 및 (ii) 본원에 기재된 세포내 시그널링 도메인 또는 CD3 복합체의 성분을 포함하는 폴리펩티드에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
추가로, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 이중특이적 분자를 포함하는 세포; 또는 상기 조작된 B2M 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 제공한다.
세포내 시그널링 도메인
본 발명은 세포 내에서 세포내 시그널링 도메인과 MHC 클래스 I 분자의 베타-2 마이크로글로불린 성분을 공국재화할 수 있는 폴리펩티드를 제공하는 것을 포함한다.
본원에서 사용된 세포내 시그널링 도메인은 엔도도메인의 신호전달 부분을 지칭한다.
세포내 시그널링 도메인은, 반응성 T 세포 상에 존재하는 TCR이 본 발명의 세포의 조작된 B2M을 포함하는 MHC/펩티드 복합체에 결합한 후 본 발명의 세포 내에서 시그널링을 유도할 수 있다.
세포내 시그널링 도메인은, T 세포 시그널링 도메인이거나 이를 포함할 수 있다.
세포내 시그널링 도메인은 하나 이상의 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함할 수 있다. ITAM은 면역계의 특정 세포 표면 단백질의 세포질 테일에서 2회 반복되는 4개의 아미노산의 보존된 서열이다. 이 모티프는 임의의 다른 2개의 아미노산에 의해 루신 또는 이소루신으로부터 분리된 티로신을 포함하여, YxxL/I의 시그니처를 제공한다. 이들 시그니처 중 2개는 전형적으로 분자의 테일에서 6 내지 8개의 아미노산에 의해 분리된다(YxxL/Ix(6-8)YxxL/I).
ITAM은 면역 세포에서 신호 전달에 중요한다. 따라서, 이들은 T 세포 수용체 복합체의 CD3 및 ζ-사슬, B 세포 수용체 복합체의 CD79 알파 및 베타 사슬, 및 특정 Fc 수용체와 같은 중요한 세포 신호전달 분자의 테일에서 발견된다. 이들 모티프 내의 티로신 잔기는 수용체 분자와 그들의 리간드의 상호작용 후 인산화되어, 세포의 신호전달 경로에 관여하는 다른 단백질에 대한 도킹 부위를 형성한다.
바람직하게는, 세포내 시그널링 도메인 성분은 3개의 ITAM을 포함하는 CD3-ζ 엔도도메인을 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성되거나, 또는 이것으로 구성된다. 전형적으로, CD3-ζ 엔도도메인은 항원이 결합된 후 활성화 신호를 T 세포에 전달한다. 그러나, 본 발명의 맥락에서, 조작된 B2M을 포함하는 MHC/펩티드 복합체가 상이한 T 세포 상의 TCR에 결합한 후 CD3-ζ 엔도도메인은 T 세포에 활성화 신호를 전달한다.
세포내 시그널링 도메인은 추가의 공동 자극 시그널링을 포함할 수 있다. 예를 들어, 4-1BB(CD137도로 알려짐)를 CD3-ζ와 함께 사용하거나, CD28과 OX40을 CD3-ζ와 함께 사용하여 증식/생존 신호를 전달할 수 있다.
따라서, 세포내 시그널링 도메인은 CD3-ζ 엔도도메인 단독을 포함하고/하거나, CD3-ζ 엔도도메인을, 4-1BB, CD28 또는 OX40 엔도도메인으로부터 선택된 하나 이상의 공동 자극 도메인과 함께 포함하고/하거나, 4-1BB, CD28 또는 OX40의 일부 또는 전부의 조합을 포함할 수 있다.
엔도도메인은 ICOS 엔도도메인, CD2 엔도도메인, CD27 엔도도메인 또는 CD40 엔도도메인 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
엔도도메인은 서열 번호 24 내지 27로 나타낸 서열 또는 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 적어도 서열 동일성을 갖는 변이체는 서열 번호 24 내지 27 중 하나의 신호전달 기능을 유지한다.
서열 번호 24 내지 27로 나타낸 서열 중 하나의 변이체는, 변이체 서열이 활성화 신호를 세포에 전달하는 능력을 유지한다면, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다.
두 폴리펩티드 서열 사이의 동일성 백분율은 BLAST와 같은 프로그램에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 이는 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov에서 자유롭게 이용 가능하다. 적합하게는, 동일성 백분율은 참조 및/또는 질의 서열 전체에 걸쳐 결정된다.
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
신호 펩티드
세포 내에서 세포내 시그널링 도메인과 MHC 클래스 I 분자의 B2M 성분을 공국재화할 수 있는 본 발명의 폴리펩티드는 신호 펩티드를 포함할 수 있으며, 이로써 T 세포와 같은 세포에서 발현될 때 초기 단백질이 소포체로 향하고 나아가 세포 표면으로 향하여 거기에서 발현된다.
신호 펩티드의 코어는 단일 알파 나선을 형성하는 경향이 있는 소수성 아미노산의 긴 스트레치를 포함할 수 있다. 신호 펩티드는 짧은 양으로 하전된 아미노산 스트레치로 시작될 수 있으며, 이는 전위 동안 폴리펩티드의 적절한 토폴로지를 강화시키는 것을 돕는다. 신호 펩티드의 말단에는 전형적으로 신호 펩티다제에 의해 인식되고 절단되는 아미노산의 스트레치가 존재한다. 신호 펩티다제는 전위 동안 또는 전위의 완료 후에 절단되어 유리 신호 펩티드 및 성숙 단백질을 생성할 수 있다. 유리 신호 펩티드는 이후에 특정 프로테아제에 의해 소화된다.
세포
본 발명의 세포는 면역 이펙터 세포, 예컨대 T 세포, 자연 살해(NK) 세포 또는 사이토카인 유도 살해 세포일 수 있다.
T 세포는 알파-베타 T 세포 또는 감마-델타 T 세포일 수 있다.
세포는 환자 자신의 말초 혈액(제1 자), 또는 공여자 말초 혈액(제2 자)으로부터의 조혈모세포 이식물의 환경, 또는 관련이 없는 공여자(제3 자)로부터의 말초 혈액으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, T 또는 NK 세포는, 예를 들어, 항-CD3 단클론 항체로 처리함으로써, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자(들)로 형질도입되기 전에, 활성화 및/또는 증식시킬 수 있다.
대안적으로, 세포는 유도성 전구 세포 또는 배아 전구 세포의 T 세포로의 생체외 분화로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 용해 기능을 유지하는 불멸화된 T 세포주가 사용될 수 있다.
세포는 조혈모세포(HSC)일 수 있다. HSC는 이식을 위해 적절하게 일치하는 공여자의 골수로부터, 약리학적 용량의 사이토카인, 예컨대 G-CSF[말초 혈액 줄기 세포(PBSC)]의 투여에 의한 동원 후 말초 혈액의 백혈구성분채집술에 의해, 또는 분만 후 태반에서 채혈한 제대혈(UCB)로부터 얻을 수 있다. 골수, PBSC 또는 UCB는 가공 없이 이식될 수 있거나, 또는 HSC는 CD34 표면 항원에 대한 단클론 항체에 의한 면역 선택에 의해 농후화될 수 있다
키메라 항원 수용체
도 3에 개략적으로 나타낸 전형적인 CAR은 세포외 항원 인식 도메인(바인더)을 세포내 시그널링 도메인(엔도도메인)에 연결하는 키메라 I형 막관통 단백질이다. 바인더는 전형적으로 단클론 항체(mAb)로부터 유래된 단일쇄 가변 단편(scFv)이지만, 이는 항체 유사 항원 결합 부위를 포함하는 다른 포맷 또는 표적 항원에 대한 리간드를 기초로 할 수 있다. 바인더를 막으로부터 격리시키고 적절한 배향을 가능하게 하기 위해 스페이서 도메인이 필요할 수 있다. 사용되는 일반적인 스페이서 도메인은 IgG1의 Fc이다. 더 컴팩트한 스페이서도 충분할 수 있으며, 예를 들어, 항원에 따라, CD8α 유래의 스톡 및 심지어 IgG1 힌지만으로 충분하다. 막관통 도메인은 세포막에 단백질을 고정시키고 스페이서를 엔도도메인에 연결한다.
초기 CAR 설계는 CD3ζ 또는 FcεR1의 γ 사슬의 세포내 부분으로부터 유래된 엔도도메인을 가졌다. 결과적으로, 이들 제1 세대 수용체는 면역 신호 1을 전달하는데, 이는 동족 표적 세포의 T 세포 사멸을 유발하기에 충분하지만 T 세포를 완전히 활성화시켜 증식 및 생존하도록 하지는 못하였다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 화합물 엔도도메인이 구축되었다: T 세포 공동 자극 분자의 세포내 부분에 CD3ζ의 부분에 융합되면 항원 인식 후에 동시에 활성화 및 공동 자극 신호를 전달할 수 있는 제2 세대 수용체가 생성된다. 가장 일반적으로 사용되는 공동 자극 도메인은 CD28의 공동 자극 도메인이다. 이것은 가장 강력한 공동 자극 신호, 즉 T 세포 증식을 유발하는 면역 신호 2를 공급한다. 생존 신호를 전달하는 밀접하게 관련된 OX40 및 41BB와 같은 TNF 수용체 패밀리 엔도도메인을 포함하는 일부 수용체가 또한 기술되었다. 이제, 활성화, 증식 및 생존 신호를 전달할 수 있는 엔도도메인을 갖는 훨씬 더 강력한 제3 세대 CAR이 개시되었다.
CAR 코딩 핵산은, 예를 들어 레트로바이러스 벡터를 사용하여 T 세포로 전달될 수 있다. 이러한 방식으로, 입양 세포 전달을 위해 다수의 항원 특이적 T 세포가 생성될 수 있다. CAR이 표적 항원에 결합할 때, 이는 활성화 신호가 그것이 발현되는 T 세포로 전달되도록 한다. 따라서, CAR은 T 세포의 특이성 및 세포독성을 표적화된 항원을 발현하는 세포로 향하게 한다.
항원 결합 도메인
항원 결합 도메인은 전형적인 CAR의 항원을 인식하는 부분이다.
항체, 항체 모방체 및 T 세포 수용체의 항원 결합 부위에 기반한 것을 포함하여 다수의 항원 결합 도메인이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 항원 결합 도메인은 단클론 항체로부터 유래된 단일쇄 가변 단편(scFv); 표적 항원의 천연 리간드; 표적에 충분한 친화성을 갖는 펩티드; 카멜리드(camelid)와 같은 단일 도메인 바인더; 다핀(Darpin)과 같은 단일 인공 바인더; 또는 T 세포 수용체로부터 유래된 단일쇄를 포함할 수 있다.
하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 다양한 종양 관련 항원(TAA)이 공지되어 있다. 본 발명에 사용되는 항원 결합 도메인은, 여기에 제시된 바와 같은 TAA에 결합할 수 있는 도메인일 수 있다.
Figure pct00028
항원 결합 도메인은 B 세포 막 항원(BCMA)에 결합하는 증식 유도성 리간드(APRIL) 및 막관통 액티베이터 및 칼슘 모듈레이터 및 사이클로필린 리간드 인터랙터(TACI)를 포함할 수 있다. APRIL 기반 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR이 WO2015/052538에 기재되어 있다.
막관통 도메인
막관통 도메인은 전형적인 CAR의 막에 걸쳐 있는 서열이다. 이것은 소수성 알파 나선을 포함할 수 있다. 막관통 도메인은 CD28로부터 유래될 수 있으며, 이는 우수한 수용체 안정성을 제공한다.
신호 펩티드
CAR은 본원에 기재된 바와 같은 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있다.
스페이서 도메인
CAR은 항원 결합 도메인을 막관통 도메인과 연결하기 위한 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 플렉서블 스페이서는 결합이 용이해지도록 항원 결합 도메인이 상이한 방향으로 배향될 수 있게 한다.
스페이서 서열은, 예를 들어, IgG1 Fc 영역, IgG1 힌지 또는 인간 CD8 스톡 또는 마우스 CD8 스톡을 포함할 수 있다. 스페이서는 대안적으로 IgG1 Fc 영역, IgG1 힌지 또는 CD8 스톡과 유사한 길이 및/또는 도메인 간격 특성을 갖는 대안적인 링커 서열을 포함할 수 있다. 인간 IgG1 스페이서는 Fc 결합 모티프를 제거하도록 변경될 수 있다.
세포내 시그널링 도메인
세포내 시그널링 도메인은 전형적인 CAR의 신호 전달 부분이다.
가장 일반적으로 사용되는 시그널링 도메인 성분은 3개의 ITAM을 포함하는 CD3-제타 엔도도메인의 성분이다. 이것은 항원이 결합된 후 활성화 신호를 T 세포에 전달한다. CD3-제타는 완전히 적격한 활성화 신호를 제공하지 못할 수 있으며, 추가적인 공동 자극 신호가 필요할 수 있다. 예를 들어, 키메라 CD28 및 OX40을 CD3-제타와 함께 사용하여 증식/생존 신호를 전달할 수 있거나, 3 가지 모두를 함께 이용할 수 있다(도 3b에 예시됨).
트랜스제닉 T 세포 수용체
T 세포 수용체(TCR)는 T 세포의 표면에서 발견되는 분자로서, 주조직적합성 복합체(MHC) 분자에 결합된 펩티드로서 항원의 단편을 인식하는 역할을 한다.
TCR은 2개의 상이한 단백질 사슬로 이루어진 이종이량체이다. 인간에 있어서, T 세포의 95%에서 TCR은 알파(α) 사슬 및 베타(β) 사슬(각각 TRA 및 TRB에 의해 코딩됨)로 구성되는 반면, T 세포의 5%에서 TCR은 감마 및 델타(γ/δ) 사슬(각각 TRG 및 TRD에 의해 코딩됨)로 구성된다.
TCR이 항원성 펩티드 및 MHC(펩티드/MHC)와 계합할 때, T 림프구는 신호 전달을 통해 활성화된다.
통상적인 항체 지향 표적 항원과 달리, TCR에 의해 인식된 항원은 잠재적인 세포내 단백질의 전체 어레이를 포함할 수 있으며, 이는 프로세싱되어 펩티드/MHC 복합체로서 세포 표면에 전달된다.
벡터를 사용하여 세포 내로 TRA 및 TRB 유전자 또는 TRG 및 TRD 유전자를 인위적으로 도입함으로써 이종성(즉, 비네이티브) TCR 분자를 발현하도록 세포를 조작하는 것이 가능하다. 예를 들어, 조작된 TCR의 유전자는 자가 유래의 T 세포로 재도입되고 T 세포 입양 요법을 위해 환자에게 다시 전달될 수 있다. 이러한 '이종성' TCR은 본 명세서에서 '트랜스제닉 TCR'로 지칭될 수도 있다.
핵산 구성체/핵산 서열의 키트
본 발명은 (i) 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 트랜스제닉 TCR을 코딩하는 제1 핵산 서열; 및 (ii) 본원에 정의된 바와 같은 세포내 시그널링 도메인과 MHC 클래스 I 분자의 베타-2 마이크로글로불린 성분을 공국재화할 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산 서열을 제공한다.
본 발명은 추가로 본 발명에 따른 핵산 서열을 포함하는 키트를 제공한다. 예를 들어, 키트는 (i) 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 트랜스제닉 TCR을 코딩하는 제1 핵산 서열; 및 (ii) 본원에 정의된 바와 같은 세포내 시그널링 도메인과 MHC 클래스 I 분자의 베타-2 마이크로글로불린 성분을 공국재화할 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산 서열을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드" 및 "핵산"은 서로 동의어인 것으로 의도된다.
다수의 상이한 폴리뉴클레오티드 및 핵산이 유전자 코드의 퇴화의 결과로서 동일한 폴리펩티드를 코딩할 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 또한, 숙련된 기술자는, 일상적인 기술을 이용하여, 폴리펩티드가 발현되는 임의의 특정 숙주 유기체의 코돈 이용법을 반영하기 위해 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열에 영향을 미치지 않는 뉴클레오티드 치환을 행할 수 있음을 이해해야 한다.
본 발명에 따른 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있다. 이들은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 이들은 또한 합성 또는 변형된 뉴클레오티드를 그 안에 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 올리고뉴클레오티드에 대한 다수의 상이한 유형의 변형이 당업계에 공지되어 있다. 이들은 메틸포스포네이트 및 포스포로티오에이트 골격, 분자의 3' 및/또는 5' 말단에의 아크리딘 또는 폴리리신 사슬의 부가를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 용도의 목적을 위해, 폴리뉴클레오티드는 당업계에서 이용 가능한 임의의 방법에 의해 변형될 수 있음을 이해해야 한다. 이러한 변형은 관심있는 폴리뉴클레오티드의 생체내 활성 또는 수명을 향상시키기 위해 수행될 수 있다.
뉴클레오티드 서열과 관련하여 용어 "변이체", "동족체" 또는 "유도체"는 서열로부터 또는 서열에 하나(또는 그보다 많은)의 핵산을 치환, 변경, 변형, 대체, 결실 또는 부가하는 것을 포함한다.
공발현 부위
공발현 부위는 본원에서 (i) CAR 또는 TCR; 및 (ii) 세포내에서 세포내 시그널링 도메인과 MHC 클래스 I 분자의 베타-2 마이크로글로불린 성분을 공국재화할 수 있는 폴리펩티드 둘 다의 공발현을 가능하게 하는 핵산 서열을 지칭하기 위해 사용된다. 공발현 부위는, 핵산 구성체가 절단 부위(들)에 의해 연결된 2개의 폴리펩티드를 포함하도록, 절단 부위를 코딩하는 서열일 수 있다. 절단 부위는 자가 절단성일 수 있어서, 폴리펩티드가 생성될 때 외부 절단 활성에 대한 필요 없이 개별 펩티드로 바로 절단된다.
절단 부위는 2개의 폴리펩티드가 분리될 수 있게 하는 임의의 서열일 수 있다.
용어 "절단(cleavage)"이 편의상 본원에서 사용되지만, 절단 부위는 펩티드가 전형적 절단 이외의 메커니즘에 의해 개별 개체로 분리되게 할 수 있다. 예를 들어, 구제역 바이러스(Foot-and-Mouth disease)(FMDV) 2A 자가 절단형 펩티드(하기 참조)의 경우, "절단" 활성을 설명하기 위해 다양한 모델이 제안되어 있다: 숙주 세포 단백질 분해 효소에 의한 단백질 분해, 자가 단백질 분해 또는 번역 효과(Donnelly et al(2001) J. Gen. Virol. 82: 1027-1041). 절단 부위가, 단백질을 코딩하는 핵산 서열 사이에 위치할 때, 단백질이 별개의 개체로 발현되도록 하는 한, 이러한 "절단"의 정확한 메커니즘은 본 발명의 목적에 중요하지 않다. 절단 부위는 푸린(furin) 절단 부위일 수 있다.
푸린은 서브틸리신 유사 전구단백질 전환효소 패밀리에 속하는 효소이다. 이 패밀리의 구성원은 잠재적 전구체 단백질을 그의 생물학적 활성 생성물로 프로세싱하는 전구단백질 전환효소이다. 푸린은 쌍을 이루는 염기성 아미노산 프로세싱 위치에서 전구체 단백질을 효율적으로 절단할 수 있는 칼슘 의존성 세린 엔도프로테아제이다. 푸린 기질의 예는 전구부갑상선 호르몬, 변환 성장 인자 베타 1 전구체, 프로알부민, 프로-베타-세크레타제, 막 유형-1 매트릭스 메탈로프로테이나제, 전구구 신경 성장 인자의 베타 서브 유닛 및 폰 빌레브란트 인자를 포함한다. 푸린은 염기성 아미노산 표적 서열(정규적으로, Arg-X-(Arg/Lys)-Arg')의 바로 하류에서 단백질을 절단하고, 골지체에서 풍부하다.
절단 부위는 담배 식각 바이러스(Tobacco Etch Virus; TEV) 절단 부위일 수 있다.
TEV 프로테아제는 키모트립신 유사 프로테아제인 고도로 서열 특이적인 시스테인 프로테아제이다. 이는 표적 절단 부위에 대해 매우 특이적이기 때문에, 시험관내 및 생체내 둘 다에서 융합 단백질의 제어된 절단에 종종 사용된다. 컨센서스 TEV 절단 부위는 ENLYFQ|S(여기서 '|'는 절단된 펩티드 결합을 나타냄)이다. 인간 세포와 같은 포유동물 세포는 TEV 프로테아제를 발현하지 않는다. 따라서, 본 발명의 핵산 구성체가 TEV 절단 부위를 포함하고 포유동물 세포에서 발현되는 실시양태에서, 외인성 TEV 프로테아제는 포유동물 세포에서도 발현되어야 한다.
절단 부위는 자가 절단형 펩티드를 코딩할 수 있다.
'자가 절단형 펩티드'는 단백질 및 자가 절단형 펩티드를 포함하는 폴리펩티드가 생성될 경우, 임의의 외부 절단 활성을 필요로 하지 않으면서 즉시 "절단"되거나 상이한 별개의 제1 및 제2 폴리펩티드로 분리되도록 기능하는 펩티드를 지칭한다.
자가 절단형 펩티드는 아프토바이러스 또는 카디오바이러스로부터의 2A 자가 절단형 펩티드일 수 있다. 아프토바이러스 및 카디오바이러스의 1차 2A/2B 절단은 그 자신의 C-말단에서 2A "절단"에 의해 매개된다. 구제역 바이러스(FMDV) 및 말 비염 A 바이러스와 같은 아프토바이러스에서, 2A 영역은 약 18개 아미노산의 짧은 부분이며, 이는 단백질 2B의 N-말단 잔기(보존된 프롤린 잔기)와 함께 자체 C-말단에서 "절단"을 매개할 수 있는 자율적 엘리먼트를 나타낸다(상기와 같은 Donelly et al. (2001)).
"2A 유사" 서열은 아프토바이러스 또는 카디오바이러스 이외의 피코나바이러스, "피코나바이러스 유사" 곤충 바이러스, C형 로타바이러스 및 트리파노소나 spp 내의 반복 서열 및 박테리아 서열에서 발견되었다(상기와 같은 Donnelly et al., 2001).
공발현 서열은 내부 리보솜 진입 서열(IRES)일 수 있다. 공발현 서열은 내부 프로모터일 수 있다.
벡터
본 발명은 또한 본 발명의 하나 이상의 핵산 서열(들) 또는 핵산 구성체(들)를 포함하는 벡터 또는 벡터의 키트를 제공한다. 이러한 벡터는 CAR 또는 CAR 성분 및 임의로 CAR 활성을 조절하는 작용제를 발현하도록 핵산 서열(들) 또는 구성체(들)를 숙주 세포 내로 도입하는 데 사용될 수 있다.
벡터는, 플라스미드, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터, 또는 트랜스포존 베이스의 벡터 또는 합성 mRNA일 수 있다.
벡터는 세포를 형질감염 또는 형질도입시킬 수 있다.
약학 조성물
본 발명은 또한 본 발명의 복수의 세포, 핵산 구성체, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열; 벡터 또는 제1 및 제2 벡터를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 본 발명에 따른 복수의 세포를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.
약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 약학 조성물은 임의로 1종 이상의 추가의 약학적 활성 폴리펩티드 및/또는 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 제제는, 예를 들어, 정맥내 주입에 적합한 형태일 수 있다.
치료 방법
본 발명은 본 발명의 세포를(예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 약학 조성물로) 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환의 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다.
질환을 치료하는 방법은 본 발명의 세포의 치료적 용도에 관한 것이다. 이와 관련하여, 세포는 질환과 관련된 적어도 하나의 증상을 저감, 감소 또는 개선시키기 위해 및/또는 질환의 진행을 늦추거나, 감소시키거나, 차단하기 위해, 기존 질환 또는 병태를 갖는 대상체에게 투여될 수 있다.
질환을 예방하는 방법은 본 발명의 세포의 예방적 용도에 관한 것이다. 이와 관련하여, 세포는, 질환의 원인을 예방 또는 손상시키기 위해 또는 질환과 관련된 하나 이상의 증상의 발병을 저감 또는 예방하기 위해, 질환에 아직 걸리지 않았고/거나 질환의 증상을 나타내지 않는 대상체에게 투여될 수 있다. 대상체는 질환의 소인이 있거나 질환의 발병 위험이 있다고 생각될 수 있다.
이 방법은 하기 단계를 포함한다:
(i) 세포 함유 샘플을 단리하는 단계;
(ii) 이러한 세포를 본 발명에 의해 제공되는 핵산 서열 또는 벡터로 형질도입 또는 형질감염시키는 단계;
(iii) (ii)로부터의 세포를 대상체에게 투여하는 단계.
본 발명은, 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 본 발명의 세포, 핵산 구성체, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열, 벡터, 또는 제1 및 제2 벡터를 제공한다. 특히, 본 발명은 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 질환의 치료 및/또는 예방용 의약의 제조에 있어서의 본 발명의 세포, 핵산 구성체, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열, 벡터, 또는 제1 및 제2 벡터의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 질환의 치료 및/또는 예방용 의약의 제조에 있어서의 세포의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 방법에 의해 치료 및/또는 예방되는 질환은 (i) 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 트랜스제닉 TCR; 및 (ii) 세포내 시그널링 도메인과 MHC 클래스 I 분자의 베타-2 마이크로글로불린 성분을 공국재화할 수 있는 폴리펩티드를 포함하는 세포의 면역 거부반응일 수 있다.
질환은 본원에 기술된 바와 같은 자가 유래 세포의 면역 거부반응 또는 CAR 또는 트랜스제닉 TCR을 코딩하는 동종이계 세포의 면역 거부반응일 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 치료 및/또는 예방되는 질환은 바이러스 감염과 같은 감염일 수 있다.
본 발명의 방법은 또한, 예를 들어, 자가 면역 질환, 알레르기 및 이식편 대 숙주 거부 반응에서 병원성 면역 반응의 제어를 위한 것일 수 있다.
상기 방법은 방광암, 유방암, 결장암, 자궁내막암, 신장암(신세포), 백혈병, 폐암, 흑색종, 비호지킨 림프종, 췌장암, 전립선암 및 갑상선암과 같은 암성 질환의 치료를 위한 것일 수 있다.
본 발명의 CAR 세포는 암 세포와 같은 표적 세포를 사멸시킬 수 있다. 표적 세포는 TAA의 발현, 예를 들어 상기 표 1에 제공된 TAA의 발현에 의해 인식될 수 있다.
세포의 제조 방법
본 발명의 CAR 또는 트랜스제닉 TCR 발현 세포는, 바이러스 벡터에 의한 형질도입, DNA 또는 RNA에 의한 형질감염을 포함하는 많은 수단 중 하나에 의해 CAR 또는 TCR을 코딩하는 DNA 또는 RNA 및 세포 내에서 세포내 시그널링 도메인과 MHC 클래스 I 분자의 베타-2 마이크로글로불린 성분을 공국재화할 수 있는 폴리펩티드를 도입함으로써 생성될 수 있다.
본 발명의 세포는
(i) 대상체 또는 상기에 열거된 다른 공급원 중 하나로부터 세포 함유 샘플을 단리하는 단계; 및
(ii) 시험관내 또는 생체외에서 상기에 정의된 바와 같은 하나 이상의 핵산 서열(들) 또는 핵산 구성체로 세포를 형질도입 또는 형질감염시키는 단계
에 의해 제조될 수 있다.
그 후, 세포는 정제되고, 예를 들어 항원 결합 폴리펩티드의 항원 결합 도메인의 발현에 기초하여 선택될 수 있다.
본 개시는 여기에 개시된 예시적인 방법 및 재료에 의해 제한되지 않으며, 여기에 설명된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 개시의 실시양태의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. 달리 나타내지 않는다면, 임의의 핵산 서열은 5'에서 3' 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기록되고; 아미노산 서열은 각각 아미노에서 카복시 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기록된다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 그 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 개재된 값은 하한 단위의 10분의 1까지도 구체적으로 개시되는 것으로 이해된다. 언급된 범위 내의 임의의 명시된 값 또는 개재된 값과 상기 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급된 또는 개재된 값 사이의 각각의 더 작은 범위가 본 개시내용에 포함된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 범위에 포함되거나 배제될 수 있으며, 더 작은 범위에 상한 및 하한 중 어느 하나, 둘 다가 포함되거나 어느 것도 포함되지 않는 각각의 범위가 또한 본 발명에 포함되며, 언급된 범위의 임의의 구체적으로 배제된 한계를 조건으로 한다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 그러한 포함된 한계 중 어느 하나 또는 둘 다를 배제하는 범위도 본 개시에 포함된다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 지시되지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다.
본원에서 사용된 용어 "포함하는", "포함한다" 및 "포함하고"는 "포괄하는", "포괄한다" 또는 "함유하는", "함유한다"와 동의어이고, 포괄적이거나 개방적인 것이며, 추가의 언급되지 않은 구성원, 요소, 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. "포함하는", "포함한다" 및 "포함하고"는 또한 "이루어지는" 및 "구성되는"이라는 용어를 포함한다.
본 명세서에서 언급된 간행물은 본 출원의 출원일 이전의 그 공개만을 위해 제공된다. 본 명세서의 어떠한 것도 그러한 간행물이 여기에 첨부된 청구범위에 대한 선행 기술을 구성한다는 인정으로 해석되어서는 안 된다.
본 발명은 이하에서 실시예에 의해 추가로 설명될 것이며, 이는 본 발명을 수행하는 데 있어서 당업자에게 도움을 주기 위한 것으로, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
실시예
실시예 1 - 혼합 림프구 반응 어세이에서의 감소된 동종 반응성의 입증
혼합 림프구 반응(MLR) 어세이는 동종 반응성(allo-reactivity)을 측정하기 위해 이용되는 전형적인 어세이이다. 정상적인 공여자 T 세포를 B2M-CD3 제타 엔도도메인(B2M-Z) 구성체와 공발현된 CD19 CAR을 발현하는 레트로바이러스 벡터로 형질도입한다. 동일한 공여자 유래의 T 세포를 또한 단지 CD19 CAR을 발현한 레트로바이러스 벡터로 형질도입한다. 이들 CAR T 세포 또는 CAR/B2M-Z T 세포에 방사선을 조사하고 MHC 불일치의 다른 정상 공여자로부터의 T 세포와 반복적으로 공동 배양한다. 불일치 T 세포에는 삼중수소가 로딩되어, 동종 항원에 반응하여 카운팅이 가능하다. 공동 배양을 반복한 후, CAR T 세포는 CAR/B2M-Z T 세포와 비교하여 더 큰 동종 반응성을 가질 것이다.
실시예 2 - 면역적격성 동물 모델에서의 감소된 면역원성의 입증
OVA 단백질 또는 HSV-TK와 같은 면역원성 인자의 공발현에 의해 특히 면역원성인 CAR T 세포 카세트를 생성한다. 제2 CAR T 세포 카세트에서, 동일한 CAR과 면역원성 단백질을 B2M-Z와 함께 공발현한다. 뮤린 비장 세포를 상기 구성체로 형질도입한다. 동계 마우스를 저용량의 전신 조사로 컨디셔닝하고 형질도입된 비장 세포를 주입한다. CAR T 세포의 생착 및 잔존성을 유세포 분석에 의해 결정한다. 면역원성 인자에 대한 면역 반응은 ELISPOT에 의해 측정한다. B2M-Z 성분의 포함은 생착을 향상시키고 면역 반응을 감소시킬 것으로 예상된다.
실시예 3 - 반일치 전달 모델에서의 감소된 동종이계 반응의 입증
BALB/C BLACK6 마우스를 교배하여 F1 하이브리드를 만든다. F1 하이브리드 마우스 유래의 T 세포의 생착은 일반적으로 BalB/C MHC 분자의 인식으로 인해 BalB/C 마우스에 투여 후 거부 반응을 초래할 것이다. 항뮤린 CD19를 발현하는 F1 CAR T 세포 및 항뮤린 CD19 CAR뿐만 아니라 B2MZ를 둘 다 발현하는 F1 CAR T 세포를 저용량 전신 조사 후 BalB/C 마우스에 투여한다. 생착은 생물발광 영상화에 의해, 그리고 종결 후 유세포 측정법에 의해 연속적으로 조사한다.
실시예 4 - T 세포에서의 β2m 키메라 구성체의 발현은 MHC I을 기능적 CAR로 전환시킨다.
MHC 클래스 I 분자는 α 사슬 및 β2-마이크로글로불린으로 이루어지는 이종이량체이다. 내인성 MHC I 복합체에서, α 사슬만이 세포막에 고정되고, 한편 β2-마이크로글로불린은 그의 파트너에 비공유적으로 결합된다. α 사슬(α1 및 α2)의 막 원위 도메인은 T 세포 상의 펩티드 특이적 T 세포 수용체(TCR)에 의해 인식될 수 있는 짧은 펩티드에 결합하는 그로브를 형성한다. 내인성 분자와 대조적으로, MHC I CAR은, 막관통 도메인을 통해 세포막에 고정되고 신호전달 엔도도메인에 연결되는 β2-마이크로글로불린으로 이루어진다(도 4). β2m 키메라 구성체의 디자인에 따라 3종의 가능한 MHC I CAR 디자인이 가능하다(도 5). 이들 구성체는 CD3ζ 엔도도메인만을 포함할 수 있거나(제1 세대), 공동 자극 도메인, 41BB 또는 CD28을 추가로 포함할 수 있다(제2 세대).
3종의 β2m 키메라 구성체의 기능성을 테스트하기 위해, CAR, gag/pol 및 외피 단백질 RD114를 코딩하는 플라스미드로 293T 세포를 일시적으로 형질감염시켜 레트로바이러스를 만들었다. 3일 후, 상청액을 수거하고 레트로넥틴이 코팅된 플레이트를 사용하여 2명의 건강한 공여자 유래의 PBMC를 형질도입하는 데 사용하였다. 형질도입 후 5일이 지나, CAR 발현을 유세포 분석에 의해 확인하였다.
이용된 PBMC 공여자 둘 다, DNA 시퀀싱법에 의해 미리 HLA-A02+로서 하플로타이핑되었다. 이전에 공개된 바와 같이, HLA-A02+ 공여자는 HA1H 펩티드를 MHC I 복합체의 펩티드 결합 그로브에 결합시킬 수 있다. 따라서, 재조합 HA1H 펩티드와 함께 이들 공여자로부터 입수한 CAR-T 세포 또는 비형질도입 대조군 세포(NT)의 짧은 인큐베이션은 펩티드를 T 세포에 제시하는 결과를 가져온다. 다양한 HA1H 펩티드 농도(0.01∼10 μM)로 펄싱된 CAR-T를 HA1H 특이적 TCR을 발현하도록 조작된 SupT1 세포와 2:1 비로 공동 배양하였다. 표적 세포 사멸을 유세포 분석법에 의해 2일 후 분석하고, HA1H 펩티드 EC50을 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)을 이용하여 각 CART에 대해 계산하였다(도 6). 동시에, 상청액을 제거하고, 사이토카인 수치를 루미넥스 멀티플렉스(Luminex Multiplex) 어세이로 분석하였다(도 7).
상기 명세서에서 언급된 모든 간행물은 본원에 참고로 포함된다. 기술된 본 발명의 방법 및 시스템의 다양한 수정 및 변형은 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않으면서 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명은 특정 바람직한 실시양태와 관련하여 설명되었지만, 청구된 본 발명은 이러한 특정 실시양태에 과도하게 제한되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다. 실제로, 분자 생물학 또는 관련 분야의 숙련자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 기술된 방식의 다양한 변형이 하기 청구범위의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Autolus Limited <120> CELL <130> P113238PCT <150> GB 1716728.9 <151> 2017-10-12 <160> 45 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M amino acid sequence <400> 1 Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser 1 5 10 15 Gly Leu Glu Ala Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg 20 25 30 His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser 35 40 45 Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu 50 55 60 Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp 65 70 75 80 Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp 85 90 95 Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile 100 105 110 Val Lys Trp Asp Arg Asp Met 115 <210> 2 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28 transmembrane domain <400> 2 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp 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Artificial Sequence <220> <223> spacer sequence, CD8 stalk <400> 20 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 35 40 45 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chain break sequence <400> 21 Ser Gly Gly Gly Ser Asp Pro 1 5 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> serine-glycine linker <400> 22 Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 23 <211> 575 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> bispecific molecule, comprises a B2M-binding domain linked to a CD3-binding and a transmembrane domain <400> 23 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val 20 25 30 Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Pro Ser Gly Phe Asn 35 40 45 Val Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Lys Gln Gly 50 55 60 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Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu 180 185 190 Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu 195 200 205 Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe 210 215 220 Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly 225 230 235 240 Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg 245 250 255 Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln 260 265 270 Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp 275 280 285 Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro 290 295 300 Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 305 310 315 320 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 325 330 335 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 340 345 350 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 355 360 365 <210> 26 <211> 152 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28 and CD3-zeta endodomains <400> 26 Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro 1 5 10 15 Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro 20 25 30 Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala 35 40 45 Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu 50 55 60 Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly 65 70 75 80 Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu 85 90 95 Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser 100 105 110 Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly 115 120 125 Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu 130 135 140 His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 145 150 <210> 27 <211> 188 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28, OX40 and CD3-zeta endodomains <400> 27 Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro 1 5 10 15 Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro 20 25 30 Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp 35 40 45 Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu 50 55 60 Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile Arg Val Lys Phe 65 70 75 80 Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu 85 90 95 Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp 100 105 110 Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys 115 120 125 Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala 130 135 140 Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys 145 150 155 160 Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr 165 170 175 Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 180 185 <210> 28 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8alpha transmembrane domain <400> 28 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr 20 <210> 29 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide sequence <400> 29 Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 30 <211> 281 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of an engineered pre-T-alpha chain <400> 30 Met Ala Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Cys Pro Ala 1 5 10 15 Leu Pro Thr Gly Val Gly Gly Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro 20 25 30 Ile Met Leu Leu Val Asp Gly Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu 35 40 45 Val Leu Asp Val Ala Pro Pro Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser 50 55 60 Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro 65 70 75 80 Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser 85 90 95 Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly 100 105 110 Ala Glu Gly His Ser Arg Ser Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu 115 120 125 Ala Ser Thr Ala Arg Thr Cys Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Thr Pro 130 135 140 Gly Gly Ala Leu Trp Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Leu Phe Lys Leu 145 150 155 160 Leu Leu Phe Asp Leu Leu Leu Thr Cys Ser Cys Leu Cys Asp Pro Ala 165 170 175 Gly Pro Leu Pro Ser Pro Ala Thr Thr Thr Arg Leu Arg Ala Leu Gly 180 185 190 Ser His Arg Leu His Pro Ala Thr Glu Thr Gly Gly Arg Glu Ala Thr 195 200 205 Ser Ser Pro Arg Pro Gln Pro Arg Asp Arg Arg Trp Gly Asp Thr Pro 210 215 220 Pro Gly Arg Lys Pro Gly Ser Pro Val Trp Gly Glu Gly Ser Tyr Leu 225 230 235 240 Ser Ser Tyr Pro Thr Cys Pro Ala Gln Ala Trp Cys Ser Arg Ser Ala 245 250 255 Leu Arg Ala Pro Ser Ser Ser Leu Gly Ala Phe Phe Ala Gly Asp Leu 260 265 270 Pro Pro Pro Leu Gln Ala Gly Ala Ala 275 280 <210> 31 <211> 393 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M-L-PreTalpha sequence <400> 31 Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser 1 5 10 15 Gly Leu Glu Ala Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg 20 25 30 His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser 35 40 45 Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu 50 55 60 Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp 65 70 75 80 Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp 85 90 95 Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile 100 105 110 Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro 130 135 140 Ile Met Leu Leu Val Asp Gly Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu 145 150 155 160 Val Leu Asp Val Ala Pro Pro Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser 165 170 175 Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro 180 185 190 Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser 195 200 205 Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly 210 215 220 Ala Glu Gly His Ser Arg Ser Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu 225 230 235 240 Ala Ser Thr Ala Arg Thr Cys Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Thr Pro 245 250 255 Gly Gly Ala Leu Trp Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Leu Phe Lys Leu 260 265 270 Leu Leu Phe Asp Leu Leu Leu Thr Cys Ser Cys Leu Cys Asp Pro Ala 275 280 285 Gly Pro Leu Pro Ser Pro Ala Thr Thr Thr Arg Leu Arg Ala Leu Gly 290 295 300 Ser His Arg Leu His Pro Ala Thr Glu Thr Gly Gly Arg Glu Ala Thr 305 310 315 320 Ser Ser Pro Arg Pro Gln Pro Arg Asp Arg Arg Trp Gly Asp Thr Pro 325 330 335 Pro Gly Arg Lys Pro Gly Ser Pro Val Trp Gly Glu Gly Ser Tyr Leu 340 345 350 Ser Ser Tyr Pro Thr Cys Pro Ala Gln Ala Trp Cys Ser Arg Ser Ala 355 360 365 Leu Arg Ala Pro Ser Ser Ser Leu Gly Ala Phe Phe Ala Gly Asp Leu 370 375 380 Pro Pro Pro Leu Gln Ala Gly Ala Ala 385 390 <210> 32 <211> 435 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M-L-PreTalpha-41BB-Z sequence <400> 32 Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser 1 5 10 15 Gly Leu Glu Ala Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg 20 25 30 His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser 35 40 45 Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu 50 55 60 Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp 65 70 75 80 Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp 85 90 95 Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile 100 105 110 Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro 130 135 140 Ile Met Leu Leu Val Asp Gly Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu 145 150 155 160 Val Leu Asp Val Ala Pro Pro Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser 165 170 175 Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro 180 185 190 Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser 195 200 205 Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly 210 215 220 Ala Glu Gly His Ser Arg Ser Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu 225 230 235 240 Ala Ser Thr Ala Arg Thr Cys Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Thr Pro 245 250 255 Gly Gly Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu 260 265 270 Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly 275 280 285 Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val 290 295 300 Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu 305 310 315 320 Glu Glu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln 325 330 335 Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu 340 345 350 Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly 355 360 365 Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu 370 375 380 Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys 385 390 395 400 Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu 405 410 415 Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu 420 425 430 Pro Pro Arg 435 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain complementarity determining region (CDR), CDR1 <400> 33 Gly Phe Asn Val Lys Asp Thr 1 5 <210> 34 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain CDR2 <400> 34 Asp Pro Ser Asp Gly Asp 1 5 <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain CDR3 <400> 35 Trp Phe Gly Asp Tyr Gly Ala Met Asn Tyr 1 5 10 <210> 36 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain CDR1 <400> 36 Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain CDR2 <400> 37 Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp 1 5 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain CDR3 <400> 38 Gln Gln Leu Tyr Ser Lys Pro Tyr Thr 1 5 <210> 39 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFV generated from the BB7.7 hybridoma (first binding domain) <400> 39 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His 20 25 30 Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu His Leu Ser Ser Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Glu Ile Thr Thr Val Val Pro Arg Gly Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Leu Thr Gln Thr 130 135 140 Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys 145 150 155 160 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys 165 170 175 Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Tyr 180 185 190 Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Tyr 195 200 205 Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe 210 215 220 Cys Gln Gln Gly Asn Val Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 225 230 235 240 Leu Glu Met Lys Arg 245 <210> 40 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFV generated from the BB7.7 hybridoma (first binding domain) <400> 40 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Thr Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His 20 25 30 Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu His Leu Ser Ser Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Glu Ile Thr Thr Val Val Pro Arg Gly Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser 130 135 140 Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys 145 150 155 160 His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys 165 170 175 Pro Gly Asn Ile Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His 180 185 190 Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Gly Phe 195 200 205 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Gly Thr Tyr Tyr 210 215 220 Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 225 230 235 240 Leu Glu Met Lys Arg 245 <210> 41 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFV comprising the CDR sequences from OKT3 <400> 41 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ser Ser Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln 115 120 125 Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys 130 135 140 Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His 145 150 155 160 Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile 165 170 175 Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys 180 185 190 Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu 195 200 205 Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr 210 215 220 Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 225 230 235 240 Thr Val Ser Ser <210> 42 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker <400> 42 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 43 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif) <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa may be Leu or Ile <400> 43 Tyr Xaa Xaa Xaa 1 <210> 44 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> basic amino acid furin target sequence <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa may be Arg or Lys <400> 44 Arg Xaa Xaa Arg 1 <210> 45 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus Tobacco Etch Virus (TEV) cleavage site <400> 45 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser 1 5

Claims (35)

  1. (i) 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 트랜스제닉 T 세포 수용체(TCR); 및
    (ii) 세포 내에서 세포내 시그널링 도메인과 MHC 클래스 I 분자의 베타-2 마이크로글로불린 성분을 공국재화할 수 있는 폴리펩티드
    를 포함하는 세포.
  2. 제1항에 있어서, 세포내 시그널링 도메인과 MHC 클래스 I 분자의 베타-2 마이크로글로불린 성분을 공국재화할 수 있는 폴리펩티드가, 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 엔도도메인을 추가로 포함하는 조작된 베타-2 마이크로글로불린인 세포.
  3. 제2항에 있어서, 조작된 베타-2 마이크로글로불린이, 베타-2 마이크로글로불린 폴리펩티드와 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 엔도도메인 사이의 막관통 도메인을 추가로 포함하는 것인 세포.
  4. 제1항에 있어서, 세포내 시그널링 도메인과 MHC 클래스 I 분자의 베타-2 마이크로글로불린 성분을 공국재화할 수 있는 폴리펩티드가, TCR 복합체의 성분에 연결된 베타-2 마이크로글로불린 폴리펩티드인 세포.
  5. 제4항에 있어서, TCR 복합체의 성분이 CD3-제타, CD3-엡실론, CD3-감마 또는 CD3-델타로부터 선택되는 CD3 복합체의 성분인 세포.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 베타-2 마이크로글로불린 폴리펩티드가 링커 펩티드에 의해 CD3 복합체의 성분에 융합되는 것인 세포.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 베타-2 마이크로글로불린 폴리펩티드가 CD3 복합체의 성분의 엑토도메인에 연결되는 것인 세포.
  8. 제1항에 있어서, 세포내 시그널링 도메인과 MHC 클래스 I 분자의 베타-2 마이크로글로불린 성분을 공국재화할 수 있는 폴리펩티드가, (i) 베타-2 마이크로글로불린 폴리펩티드에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인 및 (ii) 세포내 시그널링 도메인 또는 CD3 복합체의 성분을 포함하는 폴리펩티드에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 폴리펩티드인 세포.
  9. 제8항에 있어서, 이중특이적 분자가 막에 테더링되는 것인 세포.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 시그널링 도메인이 면역수용체 티로신 기반 활성화(ITAM) 모티프를 포함하는 것인 세포.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 시그널링 도메인이 CD3 제타 엔도도메인, CD28 엔도도메인, OX40 엔도도메인, 4-1BB 엔도도메인, CD2 엔도도메인, CD27 엔도도메인, ICOS 엔도도메인, CD40 엔도도메인 중 하나 이상을 포함하는 세포내 T 세포 시그널링 도메인인 세포.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 T 세포 시그널링 도메인이 CD3 제타 엔도도메인을 포함하는 것인 세포.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 알파-베타 T 세포, NK 세포, 감마-델타 T 세포, 또는 사이토카인 유도 살해 세포인 세포.
  14. (i) 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 트랜스제닉 TCR을 코딩하는 제1 핵산 서열; 및
    (ii) 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 정의된 세포내 시그널링 도메인과 MHC 클래스 I 분자의 베타-2 마이크로글로불린 성분을 공국재화할 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산 서열
    을 포함하는 핵산 구성체.
  15. 제14항에 있어서, 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열이 공발현 부위에 의해 분리되어 있는 것인 핵산 구성체.
  16. (i) 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 트랜스제닉 TCR을 코딩하는 제1 핵산 서열; 및
    (ii) 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 정의된 세포내 시그널링 도메인과MHC 클래스 I 분자의 베타-2 마이크로글로불린 성분을 공국재화할 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산 서열
    을 포함하는 핵산 서열의 키트.
  17. 제15항 또는 제16항에 따른 핵산 구성체를 포함하는 벡터.
  18. (i) 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 트랜스제닉 TCR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 벡터; 및
    (ii) 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 세포내 시그널링 도메인과MHC 클래스 I 분자의 베타-2 마이크로글로불린 성분을 공국재화할 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터
    를 포함하는 벡터의 키트.
  19. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 복수의 세포, 제14항 또는 제15항에 따른 핵산 구성체, 제16항에 정의된 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열; 제17항에 따른 벡터 또는 제18항에 정의된 제1 및 제2 벡터를 포함하는 약학 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 약학 조성물.
  21. 제19항에 따른 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환의 치료 및/또는 예방 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    (i) 세포 함유 샘플을 단리하는 단계;
    (ii) 제15항 또는 제16항에 정의된 핵산 구성체, 제17항에 따른 벡터 또는 제18항에 정의된 제1 및 제2 벡터로 세포를 형질도입 또는 형질감염시키는 단계; 및
    (iii) (ii)로부터 얻은 세포를 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 세포가 자가 유래인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 세포가 동종이계인 방법.
  25. 질환의 치료 및/또는 예방용 의약의 제조에 있어서의 제19항에 따른 약학 조성물의 용도.
  26. 제20항, 제21항 내지 제24항 및 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 (i) 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 트랜스제닉 TCR; 및 (ii) 세포내 시그널링 도메인과 MHC 클래스 I 분자의 베타-2 마이크로글로불린 성분을 공국재화할 수 있는 폴리펩티드를 포함하는 세포의 면역 거부반응인 약학 조성물, 방법, 또는 용도.
  27. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 세포의 제조 방법으로서, 제14항 또는 제15항에 따른 핵산 구성체, 제16항에 정의된 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열; 제17항에 따른 벡터 또는 제18항에 정의된 제1 및 제2 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 제조 방법.
  28. 제27항에 있어서, 세포가 대상체로부터 단리된 샘플 유래의 것인 제조 방법.
  29. CD3 복합체의 성분에 연결된 MHC 클래스 I 분자의 베타-2 마이크로글로불린 성분을 포함하는 조작된 폴리펩티드.
  30. (i) 베타-2 마이크로글로불린 폴리펩티드에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인; 및 (ii) 세포내 시그널링 도메인 또는 CD3 복합체의 성분을 포함하는 폴리펩티드에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 폴리펩티드.
  31. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 세포의 MHC 클래스 I 분자에 의해 제시되는 펩티드를 인식하는 생체내 T 세포를 결실시키는 방법으로서, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 세포를 대상체에게 투여하여, 그러한 펩티드/MHC를 인식하는 대상체의 T 세포가 음성 선택에 의해 결실되도록 하는 단계를 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 세포에 의해 발현되는 외인성 단백질로부터 유래된 펩티드를 인식하는 T 세포를 결실시키는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 세포에 의해 발현되는 키메라 항원 수용체(CAR), 트랜스제닉 T 세포 수용체(TCR), 자살 유전자, 키메라 사이토카인 수용체 또는 신호 전달 조절 단백질로부터 유래된 펩티드를 인식하는 T 세포를 결실시키는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 키메라 항원 수용체(CAR)로부터 유래된 펩티드를 인식하는 T 세포를 결실시키는 방법.
  35. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 세포의 면역 거부반응을 예방하는 방법으로서, 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해, 세포의 MHC 클래스 I 분자에 의해 제시되는 펩티드를 인식하는 생체내 T 세포를 결실시키는 단계를 포함하는 방법.
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