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KR20200057749A - 생체이용성 디티오카르바메이트-금속 복합체 입자, 이의 제조 방법 및 용도 - Google Patents

생체이용성 디티오카르바메이트-금속 복합체 입자, 이의 제조 방법 및 용도 Download PDF

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KR20200057749A
KR20200057749A KR1020207011708A KR20207011708A KR20200057749A KR 20200057749 A KR20200057749 A KR 20200057749A KR 1020207011708 A KR1020207011708 A KR 1020207011708A KR 20207011708 A KR20207011708 A KR 20207011708A KR 20200057749 A KR20200057749 A KR 20200057749A
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KR
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blood
particulate form
dithiocarbamate
protein
nanoparticles
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KR1020207011708A
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English (en)
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KR102456683B1 (ko
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즈데네크 스크로트
마르틴 미스트릭
마리안 하이두흐
페트르 드주바크
지리 바르텍
라데크 즈보릴
Original Assignee
팔라츠키 유니버시티 올로모우츠
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Publication date
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Abstract

본 발명은 디티오카르바메이트-금속 복합체 및 적어도 하나의 혈액 단백질의 미립자 형태를 제공한다. 이러한 미립자 형태는 개별적인 구성성분의 순차적인 첨가 또는 동시적인 첨가에 의해 이들의 자가-조립을 초래하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된다. 미립자 형태의 수성 분산액은 비경구, 경구 및 국소 투여와 암의 치료법 및 시각화에 적합하다.

Description

생체이용성 디티오카르바메이트-금속 복합체 입자, 이의 제조 방법 및 용도
본 발명은 암 치료 및 진단을 포함하여 의료 적용에 적합한 R1,R2-디티오카르바메이트-금속 복합체 및 혈액 혈청 단백질 또는 혈액 혈청 단백질들의 혼합물의 입자, 뿐만 아니라 이러한 입자의 제조 방법에 관한 것이다.
R1,R2-디티오카르바메이트(DTC)는 문헌에 알려진 강한 금속 이온 킬레이터이다. 일단 DTC와 금속 사이에서 복합체가 형성되면, 이들 복합체 중 일부는 다양한 암세포 모델을 이용하는 세포 시스템에서 항암 활성을 나타낸다. 그러나, 제안된 항종양 활성을 갖는 복합체는 수용성이 아니어서, 이러한 복합체를 환자에게 투여하는 것을 특히 어렵게 만들며; 또한 상기 복합체는 암세포에 대해 낮은 우선적(preferential) 독성, 따라서 거의 좁은 치료 지수를 나타낸다. 이들 두 제한 모두는 본 발명에 의해 극복될 수 있다.
특히 다양한 2가 금속과의 복합체에서의 디티오카르바메이트(DTC)는 다양한 전임상 모델에서 유망한 항암 활성을 나타낸다. DTC의 금속 킬레이트화 특성뿐만 아니라 이들의 항종양 활성은 오랫동안 알려져 있다. 몇몇 특허 문헌은 다양한 악성물에 대한 치료 전략으로서 중금속, 특히 구리, 아연, 금 또는 은과의 디티오카르바메이트 복합체의 용도를 망라하였다(예를 들어 US20030229064, US20050096304 참조). 그러나, 이들 특허 문헌 중 어느 것도 현재까지 인간에서의 실용적인 용도로 옮겨진 적이 없었다. 분명하게는, 임상 루틴에서 디티오카르바메이트-금속 복합체의 용도에 대한 주요 장애는 바람직하지 못한 약리학적 특성, 즉, 안정성 및 수계(water based) 제제화 능력이다. 예를 들어, 비스(디에틸디티오카르바메이트)구리(II)(또는 구리 비스(디에틸디티오카르바메이트))인 가장 유망한 항암 복합체에 대해, 수중에서의 용해도 상수는 1 리터 당 나노그램 범위로만 존재하고, 이는 환자에서 치료적 용량을 전달하는 데 불충분하다.
본 발명의 주 목적은 항암 약물로서 또는 진단제로서 직접적으로 사용 가능한 입자의 생체이용성 분산액 형태의 디티오카르바메이트-금속 복합체의 신규 미립자 형태 및 이의 제조, 예컨대 인-시추(in-situ) 제조 방법이다.
미립자 형태는 디티오카르바메이트-금속 복합체 및 적어도 하나의 혈액 단백질, 바람직하게는 적어도 하나의 혈액 혈청 단백질을 포함하거나 이로 구성된다. 디티오카르바메이트-금속 복합체 및 혈액 단백질은 바람직하게는 분자 조립체(molecular assembly) 형태이며 및/또는 2-900 nm 범위의 크기를 가진다. 미립자 형태는 바람직하게는 유기 용매가 실질적으로 없다.
용어 "분자 조립체"는 디티오카르바메이트-금속 복합체 및 적어도 하나의 혈액 단백질을 포함하는 분자 복합체를 지칭한다. 분자 조립체의 구성성분은 전형적으로, 비-공유 상호작용에 의해 함께 결합되어, 분자 복합체를 형성한다.
분자 조립체의 구조는, 상기 분자 조립체가 화학양론적 비에서 비-공유 결합 상호작용에 의해 함께 결합된 구성성분의 분자를 함유한다는 점에서, 예를 들어 코어-쉘 입자, 응집물, 혼합물 등과 상이하다.
입자의 평균 크기는 동적 광 산란(DLS)에 의해 측정된 바와 같이 Z-평균 크기를 지칭한다. Z-평균은 누적률(cumulant) 기법을 사용한 분석에 의해 DLS 데이터로부터 수득된다. DLS 데이터로부터 Z-평균 크기를 결정하는 방법은 당업자에게 알려져 있다. Z-평균 크기는 유체역학적 크기(hydrodynamic size)를 지칭한다.
바람직하게는, 미립자 형태는 디티오카르바메이트-구리 복합체 및 적어도 하나의 혈액 단백질, 바람직하게는 적어도 하나의 혈액 혈청 단백질을 포함하거나 이로 구성된다. 디티오카르바메이트-금속 복합체 및 혈액 단백질은 바람직하게는 분자 조립체 형태이며 및/또는 2-900 nm 범위의 크기를 가진다. 상기 미립자 형태는 바람직하게는 유기 용매가 실질적으로 없다.
본 발명에 따르면, 미립자 형태(본원에서 또한 입자, 바람직하게는 나노입자로 지칭됨)는, 수성 용매에서 디티오카르바메이트 및 금속염으로부터 선택되는 제1 구성성분을 적어도 하나의 혈액 단백질과 조합하고, 동시에 또는 후속적으로 디티오카르바메이트 및 금속염으로부터 선택되는 제2 구성성분을 첨가함으로써 제조되는 반면, 제1 구성성분이 디티오카르바메이트인 경우, 제1 구성성분은 금속염이고; 제1 구성성분이 금속염인 경우, 제2 구성성분은 디티오카르바메이트이다.
본 발명의 프레임워크 내에서, 시약의 동시적인 또는 순차적인 첨가가 본원에 기재된 바와 같이 수행되는 경우, 제2 구성성분의 첨가 후, 혈액 단백질은 용액에서 신속하게 형성되는 디티오카르바메이트-금속 복합체에 결합하는 상당한 능력을 갖고 있고 바람직하게는 2-900 nm 범위 내에서 평균 크기를 갖는 입자로 자발적으로 조립하여, 입자의 주사 가능한 생체이용성 분산액을 형성하는 것으로 발견되었다. 이러한 미립자 형태에서, 디티오카르바메이트-금속 복합체, 예컨대 디티오카바메이트-구리 복합체의 분자는 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 균일하게 분포되며, 이들의 원래의 화학적 특성을 유지하고, 실질적으로 개선된 생물학적 활성을 나타내어, 암 치료 및 종양 시각화에서의 용도를 포함하여 수-불용성 화합물의 예상치 못한 약제학적 용도를 가능하게 한다.
입자 제조 방법은 심지어 환자의 침상에서 유기 (비-극성) 용매의 필요성 없이 단일 반응 용기 내에서 매우 짧은 시간(1분 미만) 내에 수행될 수 있고, 이는 즉각적인 또는 지속된 비경구 투여를 가능하게 한다.
나아가, 본 발명은 디티오카르바메이트, 금속염, 멸균 수성 용매, 및 상기 디티오카르바메이트, 상기 금속염 및 적어도 하나의 혈액 단백질을 멸균 조건 하에 상기 수성 용매에서 조합하기 위한 용기를 포함하는 부품 키트를 포함하며, 상기 수성 용매는 바람직하게는 물 또는 수계 완충제이다. 상기 부품 키트는 적어도 하나의 혈액 단백질, 바람직하게는 실질적으로 순수한 혈액 단백질을 추가로 함유할 수 있다. 상기 키트의 구성성분은 상기 키트 내에서 별도의 용기에 제공될 수 있다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명에서, "금속"은 주기율표의 IIIA 족 및 IVA 족의 전이 금속(또는 d-금속) 및 금속으로부터 선택되는 금속을 의미한다. 바람직하게는, 금속은 전이 금속이다. 보다 바람직하게는, 금속은 구리, 아연, 카드뮴, 수은으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 금속은 구리이다. 본 발명의 모든 이점은 구리에 대해 가장 강하게 확연하다.
금속은 단일 동위원소 또는 동위원소 혼합물 형태일 수 있다. 동위원소는 방사성 동위원소 또는 비-방사성 동위원소일 수 있다. 구리의 경우, 비-방사성 동위원소는 63Cu 및 65Cu이고, 방사성 동위원소는 바직하게는 64Cu 또는 67Cu이다. 64Cu는 분자 방사선치료법 및 양전자 방출 단층촬영을 위한 적용과 함께 구리의 양전자 방출 동위원소이다.
"금속염"은 양이온과 음이온의 형태의 금속염을 의미한다. 입자 분산액의 의도된 약제학적 용도에 관하여, 당업자는, 음이온이 약제학적으로 허용 가능한 음이온이고 바람직하게는 수용성이어야 함을 이해할 것이다. 음이온은 예를 들어, 무기산 음이온, 예컨대 할로게나이드(특히 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드), 설페이트, 설파이트, 설파이드, 포스페이트, 니트레이트, 카르보네이트; 카르복실산 음이온, 디카르복실산 음이온, 트리카르복실산 음이온, 설폰산 음이온, 아미노산 음이온, 예컨대 포르메이트, 아세테이트, 프로피오네이트, 옥살레이트, 숙시네이트, 말레이네이트, 푸마레이트, 말레에이트, 시트레이트, 트리플레이트, 글루코네이트, 비스-글리시네이트로부터 선택될 수 있다.
"디티오카르바메이트"는 화학식 (R1)(R2)N-CS2 -를 갖는 모이어티(본 맥락에서 R1,R2-디티오카르바메이트로도 지칭됨)를 의미하며, 상기 화학식에서, R1 및 R2는 동일하거나 상이하고, 독립적으로 C1-C8 알킬, C2-C8 알케닐, C3-C10 사이클로알킬, C6-C14 아릴, O, S, N으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하는 C4-C14 헤테로아릴, O, S, N으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하는 C3-C10 헤테로사이클릴로부터 선택되거나; 또는 R1과 R2는 이들이 결합되는 질소 원자와 함께 헤테로사이클을 형성하며, 여기서, -R1-R2-는 C2-C6 알킬렌 또는 C2-C6 알케닐렌이고, 선택적으로 1 내지 2개의 탄소 원자는 O, S, NH로부터 선택되는 헤테로원자에 의해 대체될 수 있다. R1 및 R2를 형성하는 모이어티는 비치환되거나 또는 C1-C4 알킬, 하이드록시, 머캅토, C1-C4 알콕시, C1-C4 알킬티오, 할로겐, 페닐, 벤질, 케토기, 카르복실기, C1-C4 알킬옥시카르보닐로부터 선택되는 적어도 하나의 치환기에 의해 추가로 치환될 수 있다.
보다 바람직하게는, R1 및 R2는 독립적으로 C1-C6(또는 C1-C4) 알킬, C2-C6(또는 C2-C4) 알케닐, C3-C6 사이클로알킬, 페닐로부터 선택되거나; 또는 R1과 R2는 이들이 결합되는 질소 원자와 함께 헤테로사이클을 형성하고, -R1-R2-는 C2-C6 알킬렌 또는 C2-C6 알케닐렌이다.
가장 바람직하게는, 디티오카르바메이트는 디에틸디티오카르바메이트(R1 및 R2는 에틸임)이다.
디티오카르바메이트는 음으로 하전된 음이온, 전형적으로 디티오카르바메이트-금속 복합체의 형태로 존재할 수 있다. 본 발명의 방법에서 출발 화합물로서, 이는 중성 화합물 (R1)(R2)N-C(S)SH 형태 또는 바람직하게는 염 [(R1)(R2)N-CS2]m-Catm+ 형태, 예컨대 알칼리 금속염(Cat+는 알칼리 금속 양이온이고, m=1임), 암모늄염(Cat+는 암모늄 양이온이고, m=1임) 또는 알칼리 토금속염(Cat+는 알칼리 토금속 양이온이고, m=2임) 형태로 사용될 수 있다. 당업자는, 용어 "디티오카르바메이트"가 사용되는 맥락에 따라 어떤 형태가 의미되는지 또는 어떤 형태가 필요한지 이해한다.
"디티오카르바메이트-금속 복합체"는 적어도 하나의 디티오카르바메이트 모이어티 및 적어도 하나의 금속, 바람직하게는 하나의 금속을 포함하는 복합체이다. 예를 들어, 디티오카르바메이트-금속 복합체는 화학식 (I)에 상응할 수 있으며:
Figure pct00001
상기 화학식 (I)에서,
M은 금속, 바람직하게는 구리이며,
An은 약제학적으로 허용 가능한 음이온이고, 바람직하게는 본원 상기에 정의된 바와 같으며,
n은 d-금속의 원자가이고, 전형적으로 n은 1, 2 또는 3이고,
R1 및 R2는 본원 상기에 정의된 바와 같다.
금속 : 디티오카르바메이트의 비는 예를 들어 1:5 내지 5:1의 범위, 또는 1:2 내지 5:1의 범위일 수 있다. 금속 : 디티오카르바메이트의 비는 복합체에서 이들의 화학양론적 비, 이들의 화학양론적 비 ± 20%, 또는 이들의 화학양론적 비 ± 50%에 최적으로 상응할 수 있다. 예를 들어, 구리에 대해, 화학양론적 비는 2:1이다.
"혈액 단백질"은 인간을 포함한 동물의 혈액에 천연적으로 존재하는 단백질을 의미한다. 혈액 단백질은 바람직하게는, "혈액 혈청 단백질"이며, 이는 인간을 포함한 동물의 혈액 혈청에 천연적으로 존재하는 단백질을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명은 인간 혈액 단백질 또는 인간 혈액 혈청 단백질을 사용할 뿐만 아니라 다른 동물, 바람직하게는 포유류의 혈액 단백질 또는 혈액 혈청 단백질, 예컨대 개, 고양이, 말, 마우스, 래트, 토끼, 염소, 양, 소 혈액 단백질 또는 혈액 혈청 단백질이 사용될 수 있다. 혈액 단백질 또는 혈액 혈청 단백질은 각각 혈액 또는 혈액 혈청으로부터 단리될 수 있거나, 재조합 기원일 수 있다.
혈액 단백질, 보다 특히 혈액 혈청 단백질은 실질적으로 순수한 단백질의 형태 또는 단백질들의 혼합물 형태로 존재할 수 있다.
혈액 혈청 단백질은 바람직하게는 알부민, 트랜스페린, 면역글로불린, 세룰로플라스민(ceruloplasmin), 이들 단백질들을 포함하는 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 혈액 혈청 단백질은 알부민이다. 일부 바람직한 구현예에서, 혈액 혈청 단백질은 면역글로불린이다.
"적어도 하나의 혈액 단백질"은 하나의 또는 복수의 혈액 단백질을 의미한다. 따라서, 본 발명의 방법에서 반응 혼합물 및/또는 본 발명의 입자는 하나의 혈액 단백질 또는 혈액 단백질들의 혼합물을 포함할 수 있다. 혈액 단백질들의 혼합물은 예를 들어 전혈, 혈액 혈장 또는 혈액 혈청, 또는 적어도 2개의 혈액 단백질들의 인공적으로 제조된 혼합물일 수 있다.
"적어도 하나의 혈액 혈청 단백질"은 하나의 또는 복수의 혈액 혈청 단백질을 의미한다. 따라서, 본 발명의 방법에서 반응 혼합물 및/또는 본 발명의 입자는 하나의 혈액 혈청 단백질 또는 혈액 혈청 단백질들의 혼합물을 포함할 수 있다. 혈액 혈청 단백질들의 혼합물은 예를 들어 전혈, 혈액 혈장 또는 혈액 혈청, 또는 적어도 2개의 혈액 단백질들의 인공적으로 제조된 혼합물일 수 있다.
미립자 분자 조립체는 일부 구현예에서 수성 용매 중 현탁액 또는 분산액 형태로 존재한다. 일부 구현예에서, 이들은 동결건조된 형태 또는 건조된 형태로 제공된다.
"수성 용매"는 물 또는 수계 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 아세테이트, Tris, HEPES, 식염수 또는 다른 보편적인 완충제이다. 바람직하게는, 수성 용매는 멸균된다.
자가-조립된 입자(즉, 분자 조립체)의 크기는 2-900 nm이다. 바람직하게는, 적어도 90%의 입자는 2-500 nm 범위 내에서 크기를 가진다. 일부 구현예에서, 적어도 50%, 적어도 70% 또는 적어도 90%의 입자는 2-100 nm 범위, 10-100 nm 범위, 2 내지 90 nm 범위, 2 내지 80 nm 범위, 2-220 nm 범위, 2-200 nm 범위, 또는 10-200 nm 범위 내에서 크기를 가진다. 입자 크기 및 이들의 분포는 동적 광 산란(DLS) 방법에 의해 측정되었고, 본 맥락 전체에 걸쳐 사용되는 용어 "크기" 또는 "평균 크기"는 DLS에 의해 결정된 바와 같이 평균 크기를 지칭한다.
본 발명의 미립자 분자 조립체는 바람직하게는 음성(negative) 제타-전위를 가진다. 보다 바람직하게는, 이들은 -15 mV보다 낮은 제타-전위를 가진다(= -15 mV보다 더 음성임). 보다 더 바람직하게는, 이들은 -20 mV보다 낮거나 -30 mV보다 낮은 제타-전위를 가진다.
디티오카르바메이트-금속 복합체 및 적어도 하나의 혈액 단백질로 구성되거나 이를 포함하는 미립자 형태는 바람직하게는 0.22 마이크로미터 필터를 사용하여 필터 멸균(멸균 여과)될 수 있다.
디티오카르바메이트-금속 복합체 및 적어도 하나의 혈액 단백질로 구성되거나 이를 포함하는 미립자 형태는 주사액 또는 주입액(용액, 분산액 또는 현탁액), 점적액, 스프레이, 점적주입물, 좌제, 캡슐, 정제, 연고, 로션 또는 크림 형태로 제공될 수 있다. 약제학적 제제는 완충제, 계면활성제, 킬레이트제, 등장성 조정제, pH 조정제, 보존제, 안정화제, 항산화제, 환원제, 가용화제, 금속 이온, 결합제, 활택제(glidant), 윤활제, 희석제, 붕해제(disintegrant), 감미제, 풍미제, 코팅 중합체, 에멀젼 구성성분s, 연고 베이스(base) 또는 크림 베이스로부터 선택되는 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 성분을 추가로 포함한다.
디티오카르바메이트-금속 복합체 및 적어도 하나의 혈액 단백질로 구성되거나 이를 포함하는 미립자 형태는 건조 형태, 특히 동결건조된 형태 또는 분무-건조된 형태로 제공될 수 있다. 동결건조된 제제는 전형적으로, 동결보호제, 완충제, 계면활성제, 킬레이트제, 등장성 조정제, pH 조정제, 보존제, 안정화제, 항산화제, 환원제, 가용화제, 금속 이온으로부터 선택되는 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함한다. 분무-건조된 제제는 완충제, 계면활성제, 킬레이트제, 등장성 조정제, pH 조정제, 보존제, 안정화제, 항산화제, 환원제, 가용화제, 금속 이온으로부터 선택되는 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 특히, 동결건조는 안정성을 추가로 개선하므로, 저장 및 물류 관리(logistics)를 용이하게 한다. 동결건조된 미립자 형태는 특히 분말, 캡슐, 정제, 연고, 로션 또는 크림으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 재현탁에 의한 주사액, 주입액 및 다른 액체 약제학적 형태의 제조에 사용될 수 있다.
완충제는 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 트리에탄올아민, 아르기닌, 포스페이트 완충제를 포함할 수 있다.
계면활성제는 예를 들어 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴록사머 188, 폴록사머 407일 수 있다.
킬레이트제는 소듐 에데테이트, 글루탐산, 아스파르트산을 포함할 수 있다.
등장성 조정제는 예를 들어 만니톨, 소듐 또는 포타슘 클로라이드, 소르비톨, 덱스트로스로부터 선택될 수 있다.
pH 조정제는 예를 들어 아세트산, 염산일 수 있다.
안정화제는 아르기닌, 메티오닌, 글루탐산, 글리신, 류신, 아스파르트산, 지방산, 포스파티? 콜린, 에탄올아민, 아세틸트립토파네이트, PEG, PVP(10, 24, 40), 소르비톨, 글루코스, 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다.
항산화제는 글리세린, 아스코르브산, 시스테인 HCl, 티오글리세롤, 티오글리콜산, 티오소르비톨, 글루타티온, 알파 토코페롤, 소듐 디설파이드를 포함할 수 있다.
환원제는 예를 들어 티올이다.
가용화제는 예를 들어 알라닌일 수 있다.
금속 이온은 Ca2+, Ni2+, Mg2+, Mn2+를 포함할 수 있다.
보존제는 페놀, 벤질 알코올, 클로로부탄올, 메타크레졸 및 파라벤을 포함할 수 있다.
동결보호제(또는 동결보호제(lyoprotectant))는 동결보호 특성을 갖는 단당류, 이당류, 아미노산, 다당류 중합체 및 다른 성분 및 이들의 유도체를 포함할 수 있으며, 특히 만니톨, 트레할로스, 사카로스, 알부민, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 글루코스, 말토스, 이노시톨, 라피노스, 이눌린, 말토덱스트린, 다당류, 헤파린, 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린, 글리세롤, 이노시톨, 소르비톨, 머캅탄, 폴리에틸렌 글리콜, 아도니톨, 아미노산, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르(예를 들어 Tween 80), 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체(예를 들어 Pluronic), 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르(예를 들어 Brij), 소듐 도데실 설페이트, 아스코르브산, 폴리비닐피롤리돈(PVP K15), 덱스트란으로부터 선택될 수 있다.
결합제는 미세결정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 예비젤라틴화된 전분, 락토스, 프룩토스, 만니톨, 소르비톨, 칼슘 설페이트, 칼슘 하이드로겐포스페이트를 포함할 수 있다.
활택제는 마그네슘 스테아레이트, 콜로이드 실리콘 디옥사이드, 전분, 활석을 포함할 수 있다.
윤활제는 칼슘 실리케이트, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리옥실 스테아레이트, 폴리소르베이트, 소듐 지방산 설페이트, 소르비탄 지방산 에스테르, 활석을 포함할 수 있다.
희석제는 락토스, 미세결정질 셀룰로스, 만니톨, 소듐 하이드로겐카르보네이트를 포함할 수 있다.
붕해제는 가교된 폴리비닐피롤리돈, 크로스카멜로스 소듐, 변형된 전분 소듐 전분 글리콜레이트를 포함할 수 있다.
코팅 중합체는 셀룰로스 에테르 예컨대 메틸셀룰로스, 하이드록시메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 프탈레이트; 아크릴 중합체 예컨대 메타크릴산 공중합체, 메타크릴레이트 아미노에스테르 공중합체 및 다른 메타크릴레이트 에스테르 공중합체; 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트, 셸락(shellac), 셀룰로스 아세테이트 트리멜리테이트를 포함한다.
선택적으로 약제학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 나노미립자 형태는 치료가 필요한 대상체에게 임의의 적합한 방식으로, 특히 비경구, 경구 또는 국소로 투여될 수 있다.
다르게 나타내지 않는 한, 퍼센트는 w/v%이다.
본 발명은 디티오카르바메이트-구리 복합체 및 적어도 하나의 혈액 단백질을 나노입자 내로 인-시추 자가-조립하는 방법을 기재한다. 상기 방법은:
(a) 적어도 하나의 혈액 단백질을 수성 용매(예를 들어 물 또는 수계 완충제)에서 0.01% (w/v) 내지 포화된 용액, 바람직하게는 0.1% (w/v) 내지 10% (w/v) 범위의 농도까지 용해시키거나, 환자의 전혈, 혈액 혈장 또는 혈액 혈청을 제공하는 단계;
(b) 수성 용매(예를 들어 물 또는 수계 완충제)에 용해된 적어도 하나의 디티오카르바메이트를 1 uM 내지 100 mM, 바람직하게는 1 내지 10 mM의 범위의 농도로 첨가하는 단계;
(c) 금속염 용액을 수성 용매(예를 들어 물 또는 수계 완충제)에 첨가하여 1 uM 내지 100 M, 바람직하게는 1 내지 10 mM 범위의 금속염 농도를 갖는 단계
를 포함하는 방법에 의해 달성되고,
상기 단계들은 순서 (a), (b), (c)로 또는 순서 (a), (c), (b)로 수행되거나, 또는 단계 (b) 및 (c)는 동시에 수행된다.
바람직하게는, 쉐이킹(shaking) 또는 보텍싱(vortexing)이 동반된 적어도 10초-지연이 개별 단계들 사이에 이루어진다.
이러한 단일-튜브 단일은 단백질-디티오카르바메이트-구리 나노미립자 형태의 신속한 자발적 자가-조립을 야기하여, 나노입자 분산액을 형성한다.
단계 (a)에서, 혈액 단백질, 바람직하게는 혈액 혈청 단백질 예컨대 알부민, 트랜스페린, 면역글로불린 또는 이들의 혼합물; 또는 혈액 혈청 또는 혈액 혈장 또는 전혈이 사용될 수 있다. 최종 생성물을 받아야 하는 환자로부터 채혈한 혈액 혈청 또는 혈액 혈장 또는 전혈을 사용하는 것이 유리할 수 있다.
단계 (a)는 바람직하게는 10℃ 내지 45℃, 바람직하게는 20℃ 내지 38℃ 범위의 온도, 및/또는 5 내지 8, 가장 바람직하게는 6.8의 pH에서 수행된다.
단계 (b)에서, 디티오카르바메이트는 바람직하게는 중성 화합물 또는 염의 형태이다.
바람직한 구현예에서, 금속 이온:디티오카르바메이트 이온의 몰비는 1:2이다.
수성 용매의 사용은 추가의 정제에 대한 필요성 없이 생물학적으로 융화 가능한 나노미립자 형태를 산출한다. 디티오카르바메이트를 용해시키는 데 바람직할 수 있을 유기 용매가 사용될 경우, 생성된 나노입자는 (분자 조립체 구조가 아닌) 코어-쉘 구조를 형성하며, 제거하기 어려운 잔류량의 유기 용매를 함유한다. 이는 나노입자의 생체적합성, 안전성 및 생체이용률을 저하시킨다. 부가적으로, 유기 용매의 사용은 혈액 단백질의 변성 및 변형을 야기하는 것으로 알려져 있고, 이는 변경된 단백질 구조, 증가된 면역원성을 초래하고, 변형, 변성 또는 부분 변성에 의해 유발되는 혈액 단백질 구조에서의 변화로 인해 강한 바람직하지 못한 면역계 반응을 야기할 수 있다. 따라서, 본 발명의 프레임워크 내에서, 놀랍게도, 제조 방법이 수성 용매에서 수행되는 경우, 분자 조립체 구조를 갖는 나노미립자 형태가 형성되지만, 디티오카르바메이트는 물에서 낮은 용해도를 갖는 것으로 밝혀졌다. 수성 용매의 사용은 유기 용매의 사용으로 인한 단점을 없앤다.
본 발명의 나노입자는 나노입자의 생체이용성 분산액을 형성하고, 이러한 치료가 필요한 환자에게 투여될 수 있다. 나노입자 분산액은 치료법, 특히 화학치료법, 방사선치료법, 면역치료법, 종양 치료 분야 치료법, 열치료법, 예컨대 흑색종, 비소세포폐암, 소세포폐암, 신장암, 결장직장암, 유방암, 췌장암, 위암, 방광암, 난소암, 자궁암, 림프종, 전립선암, 결장 및 결절(nodal)의 선암종 또는 간 전이, 고형암 및 혈액암의 뇌 전이, 다발성 골수종, 신경교아종을 포함한 고형 종양의 치료법을 포함한 암치료법에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 치료되는 암은 고형 종양의 뇌 전이, 다발성 골수종, 신경교아종 및 췌장암으로부터 선택된다. 나노입자 분산액은 또한, 예컨대 양전자 방출 단층촬영, 단일 광자 방출 단층촬영 등에 의한 진단, 예컨대 종양 시각화에 사용될 수 있다.
반응이 본 발명에 따라 수행되는 경우, 단백질-디티오카르바메이트-구리 나노입자의 생성된 분산액은 부가적인 화학적 또는 물리적 가공, 예컨대 추출, 분리, 생성물 세정, 농도 증강 등의 필요성 없이 치료되는 대상체(인간 또는 동물)에게 직접적인 비경구, 경구 또는 국소 적용을 가능하게 함을 주지하는 것이 중요하다.
본 발명에 따른 치료적 용도의 미립자 형태는 바람직하게는, 1시간의 주사 투여 후 혈액 중 CuET의 농도가 적어도 1 ng/l이거나 또는 주입 투여 동안 혈액 중 CuET의 농도가 적어도 5 ng/l가 되도록 치료받는 대상체에게 투여될 수 있다.
더욱이, 본 발명의 반응은 약제학적으로 허용 가능한 성분들의 조합을 사용하여 환자 침상에서 또는 병원 약국에서 직접적으로 수행될 수 있다. 예를 들어 인간 혈청 알부민 용액, 디에틸디티오카르바메이트 및 CuCl2는 보편적으로, 약제학적 등급에서 상업적으로 입수 가능하다. 이러한 절차는 비용이 많이 드는 화학적 반응기, 부가적인 장치에서의 가공을 필요로 하지 않고, 규제 승인을 간략화시킬 수 있다. 또한, 이는 나노입자 분산액의 저장과 관련된 일부 물류 관리 문제를 유의하게 제한하며 - 신선한(fresh) 약물은 높은 재현성으로 제조되고 즉각적으로 적용될 수 있다.
본 발명은 또한, 조립된 나노입자의 크기의 간략한 변형을 가능하게 한다. 디티오카르바메이트-금속 (특히 구리) 복합체와 단백질 사이의 비를 변화시킴으로써, 형성된 나노입자는, 더 높은 단백질 농도가 더 작은 입자를 야기한다는 규칙에 따라 상이한 크기를 갖는다. 나노입자 크기가 생체내에서 이의 거동, 특히 생물분포(예를 들어 혈액-뇌 장벽 침투) 및 동역학(kinetics)의 중요한 결정요인이므로, 최적의 반응 조건은 최적의 약리학적 특성을 갖는 나노입자를 제조하도록 결정될 수 있다. 생성된 나노입자의 크기는 또한, 반응에 들어가는 디티오카르바메이트의 치환기 R1, R2에 따라 다르다. 예를 들어, 알부민과 함께 디메틸디티오카르바메이트는, 알부민과 함께 피롤리딘디티오카르바메이트와 비교하여 2 가지 반응의 다른 조건들이 모두 동일하더라도, 더 큰 입자를 형성하며, 이는 더 긴 R1, R2 기를 갖는 더 작은 입자 형성을 시사한다.
생성된 나노입자 분산액은 상대적으로 안정하고, 유의한 분해 또는 침전 없이 4℃에서 수 개월 동안 저장될 수 있다. 형성된 단백질-디티오카르바메이트-금속 나노입자는 건조 또는 동결건조에 의해 추가로 가공되어, 안정성, 저장성 및 물류 관리를 추가로 개선할 수 있다. 건조된 나노입자는 반복적으로 멸균 수계 완충제에서 용해되고 치료법에 사용될 수 있다. 단백질-디티오카르바메이트-금속 나노입자 특성의 이러한 중요한 양태는 특히, 대규모 또는 소규모 산업적 생산, 저장 및 물류 관리 둘 모두에 중요하다.
면역글로불린 또는 면역글로불린-함유 혼합물이 나노입자의 제조에 사용될 수 있기 때문에, 생성된 나노입자는 특이적인 종야 또는 조직 항원에 대한 항체(또는 항체 단편)를 보유할 수 있다. 이러한 접근법은 나노입자를 종양/조직 내로 특이적으로 표적화하여, 보다 양호한 항암 효과 및 감소된 전신 독성을 산출할 수 있게 한다.
입자의 일반적인 적용성을 입증하기 위해, 하기 실시예는 생성된 나노입자 분산액의 일반적인 제제화 및 암 표적화 및 종양 시각화를 실증하기 위해 알부민, 트랜스페린 및 면역글로불린을 단독으로 또는 조합하여 포함하는 혈액 단백질과 함께 디티오카르바메이트-금속 복합체 나노입자의 제조 및 특징화를 보여준다. 실시예는 청구된 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
도 1은 실시예 1에서 제조된 나노입자의 동적 광 산란(DLS) 스펙트럼을 보여준다. 상기 나노입자는 다분산된 시스템을 형성한다: 대략 20 - 100 nm; 최장 분획: 30-40 nm.
도 2는 실시예 1에 따라 제조된 대략 20 내지 40 nm 범위의 수직 치수를 갖는 입자를 보여주는 대표적인 원자힘 현미경(AFM; atomic force microscopy) 이미지를 보여준다.
도 3은 나노입자(대략 30 nm)의 대표적인 투과 전자 현미경(TEM) 이미지를 보여주며; 실시예 1에 따라 제조된 분자 조립체(나노입자)의 결정 평면을 나타내지 않으며, 전자 회절을 나타내지 않고, 전반적인 특징을 나타낸다.
도 4는 cca 60 nm 분자 조립체의 HAADF/EDS 이미지를 보여주며; 주요 원소(Cu, N, S)는 실시예 1에 따라 제조된 나노-조립체에 분명하게 포매되어 있다.
도 5는 비스(디에틸디티오카르바메이트) 구리 복합체(CuET)의 X-밴드 전자 상자성 공명(EPR) 스펙트럼을 보여준다(a-b는 TOKYO CHEMICAL INDUSTRY CO.,LTD.로부터 수득된 순(neat) CuET 분말에 대한 공명이고; c-d는 실시예 1에 따라 제조된 CuET-알부민 나노입자에 대한 공명임). 2.044의 추정된 gavg-값 및 전반적인 공명 프로파일은 분명하게, 나노입자 형성 시 구리 산화-상태의 어떠한 변형도 발생하지 않고 Cu 팔면체-장(octahedral-field)의 어떠한 실질적인 변경도 발생하지 않음을 나타낸다.
도 6은 0.01% 알부민(실시예 2) 또는 5% 알부민(실시예 3)의 존재 하에 화학 반응 동안 형성되는 나노입자의 다분산된 시스템의 DLS 스펙트럼(상단 이미지) 및 대표적인 TEM 이미지(하단의 2개 이미지)를 보여준다. 분석은, 더 높은 알부민 농도가 화학 반응에 들어가는 경우 더 작은 입자를 향한 주된 변이(shift)를 보여준다.
도 7은 사용된 디티오카르바메이트 유형(디메틸디티오카르바메이트 - DMC 대 피롤리딘디티오카르바메이트 - PDT)에 따라 형성된 나노입자(실시예 4, 5)의 상이한 크기를 도시하는, 형성된 나노입자의 DLS 크기 분포(상단 이미지) 및 대표적인 TEM 이미지(하단의 2개 이미지)를 보여준다.
도 8은 실시예 7에서 제조된 나노입자의 동적 광 산란(DLS) 스펙트럼을 보여준다. 나노입자는 다분산된 시스템을 형성한다: ca 10 - 40 nm; 최장 분획: 15-30 nm.
도 9는 실시예 8에서 제조된 나노입자의 동적 광 산란(DLS) 스펙트럼을 보여준다. 나노입자는 다분산된 시스템을 형성한다: ca 15 - 100 nm; 최장 분획: 20-40 nm.
도 10은 실시예 9에서 제조된 나노입자의 동적 광 산란(DLS) 스펙트럼을 보여준다. 나노입자는 다분산된 시스템을 형성한다: ca 50 - 800 nm; 최장 분획: 60-200 nm.
도 11은 다양한 농도(125 nM 내지 10 μM)의 24시간 처리 후 실시예 1에 따라 제조된 CuET-알부민(CuET-HSA) 나노입자 독성의 2,3-비스-(2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐)-2H-테트라졸륨-5-카르복사닐라이드(XTT) - 기반 세포 생존능 분석을 보여준다. 암세포주(DU-145, MDA-MB-231)는 정상 세포(RPE-1, RWPE-1)와 비교하여 더 높은 민감도를 보여준다. CuET-HSA 나노입자는 암세포주에서 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해된 순 CuET 분말과 유사한 약효를 갖지만, 이는 정상 세포에 의해 더 많이 관용된다.
도 12는 마우스 실험에서 복강내로 적용되는 비-극성 화합물에 대한 표준 제제인 올리브 오일에 용해된 순 CuET 분말(TOKYO CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD.로부터 입수됨)로서 또는 실시예 1에 따른 알부민 나노입자로서 제제화된 5 mg/kg CuET의 단일 i.p. 적용 후 마우스 혈청에서 CuET 농도의 비행 시간 질량 분광법에 커플링된 고압 액체 크로마토그래피(HPLC-TOF/MS; high pressure liquid chromatography coupled to time-of-flight mass spectrometry) 분석을 보여준다. 측정된 농도는 나노입자 제제의 경우 CuET의 유의하게 더 높은 순환 농도를 보여준다.
도 13은 중증 복합형 면역결핍증(SCID; severe combined immunodeficiency) 마우스에서 컴퓨터 단층촬영과 조합된 양전자 방출 단층촬영(PET/CT) 영상의 조합에 의해 시각화된, 종양에서의 64Cu 방사성동위원소(화살표로 표시됨)의 존재를 보여준다. PET 신호는 각각 실시예 10 및 11에 따라 제조된 MSA-디에틸-디티오카르바메이트-구리64 나노입자(좌측)의 나노입자의 분산액 및 인간 트랜스페린-디에틸-디티오카르바메이트-구리64 나노입자(우측)의 나노입자의 분산액의 안와후방(retro-orbital) 주사 후 22시간째에 수합되었다. PET 신호는, 복합체에 포매된 64Cu가 MDA-MB-231 피하 종양 덩어리(mass) 내에 축적됨을 보여준다. GIT 양성은, 화합물이 장관에 의해 배출됨을 나타낸다.
도 14는 마우스 실험에서 복강내로 적용되는 비-극성 화합물에 대한 표준 제제인 올리브 오일에 용해된 순 CuET 분말(TOKYO CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD.로부터 입수됨)로서 또는 실시예 1에 따른 알부민 나노입자로서 제제화된 CuET(1 mg/ml)의 치료 후 SCID 내로 피하 이종이식된 MDA-MB-231 유방암 종양의 성장을 보여준다. 측정된 농도는 나노입자 제제의 경우 CuET의 유의하게 더 높은 순환 농도를 보여준다. CuET-알부민 나노입자만 종양 성장에 대해 유의한 효과를 보여준다.
도 15는 실시예 1에 따른 알부민 나노입자로서 제제화된 CuET (1 mg/ml)로 치료받은 SCID 마우스 내로 피하 이종이식된 AMO-1 종양의 성장을 보여준다. 나노입자 치료는 종양 성장을 유의하게 감소시키고(상단 이미지, 캘리퍼스(callipers)), 치료받은 동물은 알부민 단독에 의해 치료된 대조군 마우스와 비교하여 연장된 생존율(하단 이미지, 카플란-마이어 생존율 플롯)을 보여준다. 동물은 5일의 치료 + 2일의 휴식의 요법으로 1일 1회 복강내 적용에 의해 치료받았다. 이들 실험은 또한, 동물이 100회 초과 주사받았기 때문에 CuET-알부민 나노입자의 매우 양호한 관용성을 나타낸다.
실시예
재료 및 방법
제조된 나노입자의 평균 크기 및 크기 분포를 결정할 수 있게 하는 동적 광 산란(DLS) 분석을 Zetasizer Nano ZS 장비(Malvern, U.K.)에 의해 하기 매개변수 설정으로 수행하였다:V = 400 uL, T = 25℃, 진행 횟수: 10, 진행 기간: 1s, 측정 횟수: 3, 측정 각도: 173° Backscatter(NIBS 디폴트), 세포 유형: ZEN0040.
투과 전자 현미경(TEM) 이미지를 100 kV에서 작동하는 LaB6 유형 방출 건(gun)과 함께 TEM JEOL 2010 장비에서 수득하였다. 나노입자의 결정 구조/비정질도(amorphicity)의 분석은 선별 영역 전자 회절(SAED; Selected Area Electron Diffraction) 분석으로 가능하다. 나노입자의 원소 조성물의 EDS(에너지 분산 X-선 분광법) 맵핑을 위한 STEM/HAADF(주사 투과 전자 현미경/광각 환형 암시야(High-Angle Annular Dark-Field)) 분석은 80 kV에서 작동하는 FEI Titan G2 HRTEM 현미경으로 수행하였다. STEM 측정을 위해, 4개의 실리콘 드리프트 검출기를 갖는 Super-X 시스템(Bruker)을 사용하였다. 이들 모든 현미경 분석을 위해, 나노입자를 함유하는 분산액의 점적액을 탄소-코팅된 구리 그리드 상에 침착시키고, 실온에서 서서히 건조하였다.
원자힘 현미경(AFM) 이미지를 세미 - 접촉 AFM 모드에서 주사 터널링 현미경(scanning tunnelling microscope) Ntegra(Nt-MDT 회사)에 의해 얻었다. 시료를 Ha-NC 칩으로 스캐닝하였다. 시료 제조를 위해, 나노입자를 함유하는 분산액 1 방울을 운모(mica) 지지체 상에 놓고 실온에서 건조하였다.
나노입자의 동결된 분산액의 전자 상자성 공명(EPR) 스펙트럼을 가변적인 온도 제어 ES 13060DVT5 장치가 장착된 X-밴드 주파수(9.17 GHz)에서 작동하는 JEOL JES-X-320 장비 상에서 140 K에서 기록하였다. 고순도 석영 튜브를 이용하였다(Suprasil, Wilmad, ≤ 0.5 D). 다른 실험 매개변수는 하기와 같았다: 100 KHz 변조 주파수, 0.1 mW 마이크로파 파워, 0.03 s 시간 상수, 8 가우스 변조 폭.
세포주
세포주를 10% 태아 소 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 적절한 배지에서 배양하고; 보습된, 5% CO2 분위기에서 37℃에서 유지시켰다. DMEM 배지에서 배양된 세포주는 하기와 같았다: HCT116(American Type Culture Collection, ATCC에서 입수됨), DU145(European Collection of Authenticated Cell Cultures, ECACC에서 입수됨), MDA-MB-231(ATCC), U-2-OS(ECACC), HeLa(ATCC), CAPAN-1(ATCC), A253(ATCC), FaDu(ATCC), h-TERT-RPE1(ATCC). RPMI1640 배지에서 배양된 세포주는 하기와 같았다: AMO-1(ATCC), MM-1S(ATCC), OVCAR-3 (NCI60), CCRF-CEM(ATCC), K562(ATCC), 786-0 (NCI60). EMEM 배지에서 배양된 세포주는 하기와 같았다: U87-MG(ATCC), SiHA(ATCC). 세포주 A549(ATCC)를 F12K 배지에서 배양하고, HT29(ATCC)를 McCoy's 배지에서 배양하였다. RWPE-1(ATCC) 세포를 소 뇌하수체 추출물 및 인간 재조합 표피 성장 인자(Thermo Scientific)가 보충된 케라티노사이트 혈청-무함유 배지에서 배양하였다.
세포 생존능 시험
세포 생존능을 XTT 시험에 의해 측정하였다. 10000개 세포를 96-웰 플레이트에 접종하였다. 다음날, 세포를 나타낸 바와 같이 처리하였다. 24시간 후, XTT 검정법을 제조업체의 설명서(Applichem)에 따라 수행하였다. XTT 용액을 배지에 첨가하고 30-60분 동안 인큐베이션한 다음, 염료 세기를 분광광도계(TECAN, Infinite M200PRO)를 사용하여 475 nm 파장에서 측정하였다. 결과를 3 가지의 독립적인 실험으로부터 평균값 및 표준 편차로서 나타내고, 각각의 실험은 3벌 중복으로 수행된다. 확장(Extended) 데이터 2d에 열거된 세포주 패널에 걸친 LD50(치사 용량) 분석에서, 세포주를 다양한 용량(적어도 5 가지 용량)으로 48시간 동안 처리하였다. Ld50을 적어도 2 가지의 독립적인 실험으로부터의 생존율 곡선을 기반으로 Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 계산한다.
CuET 약물동력학 및/또는 조직 분포의 HPLC/MS 분석을 위한 시료 제조
액체 질소-동결된 생물학적 시료(뇌 조직)를 메스에 의해 작은 조각으로 절단하였다. 시료(30-100 mg)를 100% 아세톤에서 1:10 시료 대 아세톤(혈장 또는 혈청의 경우 상기 비는 1:4였음)의 비로 균질화함으로써 즉각적으로 가공하였다. 균질화를 2개의 유리 볼(5 mm)과 함께 2 ml 에펜도르프(Eppendorf) 튜브에서 냉장실(4℃)에 놓인 테이블 균질화기(Retsch MM301)에서 30 Hz, 1분 동안 수행하였다. 다음, 튜브를 4℃, 20,000 G에서, 2분 동안 즉각적으로 원심분리하였다. 상층액을 새로운 1.5 ml 에펜도르프 튜브에 디캔팅하고, -80℃ 냉동고 내부에 놓인 소형 테이블 원심분리기(BioSan FVL-2400N)를 사용하여 30분 동안 즉각적으로 원심분리하였다. 상층액을 유리 HPLC 바이얼에 신속하게 디캔팅하고, -80℃에서 6시간 이하 동안 유지시켰다. HPLC 분석 직전에, 바이얼을 예비-냉각된(4℃) LC-시료 랙(rack)에 놓고, 즉각적으로 분석하였다. 약물동력학적 분석으로부터의 혈청 시료를 유사하게 가공하였으나, 균질화하지 않았다. 분석된 CuET의 정량화를 할 수 있기 위해, 보정 곡선을 제조하였다. 그 후에, 표준을 상기 기재된 시료와 유사하게 가공하였다.
구리-디에틸디티오카르바메이트 복합체의 HPLC-MS 검출
구리-디에틸디티오카르바메이트 분석을, HPLC 크로마토그래프 Thermo UltiMate 3000과 AB Sciex TripleTOF 5600+ 질량 분광광도계로 구성된 HPLC-ESI-QTOF 시스템 상에서 DuoSpray ESI를 사용하여 수행하였다. 데이터를 CuET의 분석을 위한 2개의 부모 질량 358.9 및 360.9와 함께 생성물 이온 모드에서 획득하였다. 크로마토그래피 분리를, C18 흡착제(IntellMed, cat.no.IM_301)로 충전된 강한 금속 킬레이터의 분석용으로 특수 설계된 PTFE 컬럼에 의해 수행하였다. 분석을 실온 및 유속 1500 μL/min에서 등용매 크로마토그래피로 수행하였다. 이동상은 HPLC 등급 아세톤(Lachner) 99.9%, HPLC 물(Merck Millipore) 0.1% 및 0.03% HPLC 포름산(Sigma)으로 구성된다. 획득된 질량 스펙트럼을 소프트웨어 PeakView 1.2에서 평가하였으며, 이때 0.1 질량 관용(mass tolerance)과 함께 전이 88.0 및 116.0(두 부모 질량 모두에 대해 공통임)의 추출된 이온 크로마토그램을 2 포인트의 폭으로 가우시안 평탄화(Gaussian smoothen)시켰다.
PET 이미징
종양에서 64Cu 방사성동위원소의 존재를, MDA-MB-231 이종이식물을 갖고 있는 중증 복합형 면역결핍증 (SCID) 마우스에서 컴퓨터 단층촬영과 조합된 양전자 방출 단층촬영(PET/CT) 이미징 조합에 의해 시각화하였다. PET 신호를, 각각 활성 33 MBq 및 29 MBq에 상응하는 MSA-디에틸-디티오카르바메이트-구리64 나노입자의 나노입자의 분산액 및 인간 트랜스페린-디에틸-디티오카르바메이트-구리64 나노입자의 나노입자의 분산액의 안와후방 주사 후 22시간째에 수합하였다. 신호를 Albira PET/SPECT/CT 이미징 시스템(Bruker Biospin Corporation, Woodbridge, CT, USA)을 사용하여 기록하였다.
마우스 생체내 실험
CuET-알부민 나노입자의 효과를 직접적으로 시험하기 위해, 본 발명자들은 MDA-MB-231 및 AMO1 모델을 사용하였다. MDA-MB-231을 주사하여(5*106개 세포를 s.c. 이식하였음), SCID 마우스(Anlab, CZ)에서 종양을 성장시켰다. 유사하게는, AMO-1 이종이식물을 SCID 마우스에서 확장시켰다. 각각의 그룹은 10 마리의 동물로 구성되었고, 각각은 2개의 종양을 갖고 있었다. CuET를, 마우스 실험에서 최종 농도 1 mg/ml까지 복강내 적용된 비-극성 화합물에 대한 표준 제제인 올리브 오일에 용해된 순 CuET 분말(TOKYO CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD.로부터 입수됨)로서 또는 실시예 12에 따라 마우스 혈청 알부민 중 나노미립자 시스템으로서 제제화하였다. 올리브 오일 단독 및 마우스 혈청 알부민 용액을 비히클 대조군으로서 사용하였다. 모든 용액을 5일의 온(ON) 및 2일의 오프(OFF)의 스케쥴로 복강내 적용하였고, CuET를 체중 1 kg 당 최종 용량 1 mg으로 적용하였다. 동물 연구의 모든 양태는 실험실 동물의 관리 및 실험 용도에 대한 허용된 기준을 충족시켰다.
HPLC-MS를 사용한 단백질 식별
아세톤 침전된 단백질을 분해 완충제(8 M 우레아, 0.5 암모늄 비카르보네이트, pH = 8)에서 1 - 5 ㎍/㎕의 단백질 농도까지 용해시켰다. 시료 중 단백질을 56℃에서 30분 동안 환원을 위해 디티오트레이톨로 처리하고, 뒤이어 실온, 암실에서 30분 동안 알킬화를 위해 요오도아세타미드로 처리하였다. 시료를 50 mM 암모늄 비카르보네이트 완충제와 함께 0.8 M 우레아로 희석시키고, 단백질을 트립신(1/60)으로 37℃에서 밤새 분해시켰다. TFA(pH = 2)를 첨가함으로써 분해를 중단시켰다. C18 컬럼을 사용함으로써 펩타이드를 정제하였다. EASY-분무 이온 공급원(Thermo Fisher Scientific)을 통해 Orbitrap Elite 질량 분광광도계(Thermo Fisher Scientific)에 커플링된 Dionex UltiMate 3000 RSLCnano 시스템(Thermo Fisher Scientific)으로 구성된 LC-MS를 사용하여 시료를 측정하였다. 정제된 펩타이드를 50 cm EASY-Spray 컬럼(75 ㎛ ID, PepMap C18, 2 ㎛ 입자, 100 Å 공극 크기; Thermo Fisher Scientific) 상에서 분리하였다. 각각의 LC-MS/MS 분석을 위해, 약 1 ㎍ 펩타이드를 165분 진행 동안 사용하였다. 처음 5분째에, 펩타이드를 완충제(98.9%/1%/0.1%, v/v/v, 물/아세토니트릴/포름산) 내 2 cm 트랩 컬럼(Acclaim PepMap 100, 100 ㎛ ID, C18, 5 ㎛ 입자, 100 Å 공극 크기; Thermo Fisher Scientific) 상에 6 ㎕/min의 유속으로 로딩하였다. 이후 밸브를 스위치하고, 펩타이드를 완충제 A(99.9%/0.1%, v/v, 물/포름산)에 로딩하고, 2%-35%의 완충제 B(99.9%/0.1%, v/v, 아세토니트릴/포름산)의 선형 120분 구배, 뒤이어 5분 90% B 세척으로 300 nl/min의 유속에서 EASY-Spray 컬럼으로부터 용출시켰다. EASY-Spray 컬럼 온도를 35℃에서 유지시켰다. 질량 분광법 데이터를 Top12 데이터-독립적 MS/MS 스캔 방법으로 획득하였다. 전체(full) 스캔 MS 스펙트럼에 대한 표적값은 300-1700 m/z 범위에서 1 x 106 차지(charge)였으며, 이때 최대 주사 시간은 35 ms이고 분해능(resolution)은 m/z 400에서 120,000이었다. 2 m/z 단리 창(window)을 MS/MS 스캔에 사용하였다. 35의 정규화된 충돌 에너지(collision energy)를 이용한 CID 해리에 의해 전구체 이온의 단편화를 수행하였다. MS/MS 스캔을 이온 트랩에서 수행하였으며, 이때 이온 표적값은 1 x 104이고 최대 주사 시간은 100 ms였다. 동역학적 배제(dynamic exclusion)를 70 s로 설정하여, 동일한 펩타이드의 반복된 시퀀싱을 피하였다.
단백질 데이터 분석
질량 분광법 원(raw) 파일을, MaxQuant 스프트웨어 환경(버전 1.5.6.5) 및 이의 빌트-인 Andromeda 검색 엔진을 사용하여 분석하였다. 단백질을, 보편적인 오염물 데이터베이스 및 UniProtKB(UP000005640, January 2017)로부터의 인간 프로테옴에 대한 MS 및 MS/MS 데이터를 검색함으로써 식별하였다. 시스테인의 카르바미도메틸화를 고정 변형으로서 설정하였다. 메티오닌의 N-말단 아세틸화 및 산화를 가변 변형으로서 설정하였다. 트립신을 프로테아제로서 설정하였고, 최대 2개의 결손된 절단을 데이터베이스 검색에서 허용하였다. 펩타이드 식별을, 7 ppm 이하의 허용된 초기 전구체 질량 편차(Orbitrap) 및 0.5 Da(충돌-유도 해리, 이온 트랩)의 허용된 단편 질량 편차로 수행하였다. "진행들 사이에서의 매칭" 옵션은 20 s의 정렬된 체류 시간의 시간창 내에서 시료에 걸친 식별을 매칭할 수 있게 하였다. 위발견율(false discovery rate)을 최소 길이가 7개 아미노인 단백질과 펩타이드 둘 모두에 대해 0.01로 설정하였다. LFQ를 2의 최소 비 카운트(minimum ratio count)로 수행하였다. 단백질 존재비(abundance)를, 독특한 "레이저(razor)" 펩타이드의 합계 펩타이드 세기를 기준으로 계산하였다. 변형된 펩타이드 단독으로 식별된 단백질 및 리버스(reverse) 데이터베이스에 대한 단백질 매칭을 필터링하였다.
실시예 1
0.2% 인간 혈청 알부민(HSA) 및 디에틸디티오카르바메이트 및 구리 클로라이드 염으로부터의 나노입자 분산액의 제조.
절차:
FDA 사양(pH=6.9±0.5)에 따른 주사 가능한 수성 20% (w/v) HSA 용액을 주사용 멸균수로 0.2% (w/v)까지 희석시킨다. 농도 280 mM의 물에 가용화된 디에틸디티오카르바메이트 소듐 염(DTC)의 멸균 용액을 0.2% HSA에 최종 농도 5.6 mM로 첨가하고, 뒤이어 간략히 교반한다. 5.6 mM DTC를 함유하는 0.2% HSA 용액에 멸균 구리 (ii) 클로라이드(수(water) 중 1 M 농도)를 최종 농도 2.8 mM까지 첨가하고, 뒤이어 간략히 교반한다.
결과
생성된 용액은 2.8 mM(1 mg/ml)의 디에틸디티오카르바메이트-구리-HSA 나노입자를 함유한다. 이 반응으로부터의 나노입자를, 이들의 기본적인 물리적 및 화학적 특성을 도시하는 DLS, AFM, TEM, EDS 및 EPR을 포함하는 다양한 진보된 분석 툴에 의해 추가로 분석하였다(도 1 내지 5 참조). 분석은, 나노입자가 다분산된 시스템을 형성함을 보여준다. 입자의 크기는 ca 20 - 100 nm 범위에 걸쳐 있엇고, 최장 분획은 DLS 분석에 의해 입증된 바와 같이 20-40 nm였다(도 1). AFM 이미지(도 2) 및 TEM 이미지(도 3)는 DLS 크기 분포의 결과를 확증한다. 더욱이, 나노입자의 투과 전자 현미경 이미지는 결정 평면의 어떠한 지표(indication)도 나타내지 않으며(그리고 비정질-유사 패턴을 갖는 어떠한 전자 회절도 나타내지 않음) - 사실은, 나노입자가 분자 조립체의 특징을 가짐을 확증시켜 준다. 단일 나노입자의 EDS 화학적 맵핑(mapping)(도 4)은, 구리 비스(디에틸디티오카르바메이트) 구조의 주요 원소(Cu, N, S)가 분자 조립체 내에서 균질하게 분포됨을 보여준다. X-밴드 EPR 분광법(도 5)에 의한 비교 분석은 순 비스(디에틸디티오카르바메이트) 구리 복합체(CuET)와 거의 동일한, 나노입자에 포매된 CuET 스펙트럼을 보여준다. 추정된 gavg-값 및 전반적인 공명 프로파일은 분명하게, 약물의 캡슐화 시, 구리 산화 및 스핀 상태(CuII, S=1/2)의 어떠한 변형도 발생하지 않고 Cu 팔면체-장의 어떠한 실질적인 변경도 발생하지 않음을 나타낸다. 생성된 입자는 또한, 전기화학적 임피던스 분광법에 의해 측정된 낮은 제타-전위(ζ) -35.6 mV를 보여주며, 이는 용액에서의 양호한 안정성을 나타낸다.
나노입자의 분산액을 또한, 형질세포종(AMO-1; LD50 = 63 nM), 췌장 선암종(Capan-1; LD50 = 64 nM), 다발성 골수종(MM1s; LD50 = 69 nM), 급성 림프아구성 백혈병(CCRF-CEM; LD50 = 70 nM), 난소 선암종(OVCAR3; LD50 = 83 nM), 폐 암종(A549; LD50 = 91 nM), 결장직장 암종(HCT116; LD50 = 117 nM), 침샘 암종(A253; LD50 = 214 nM), 신세포 선암종(786-O; LD50 = 235 nM), 골육종(U2OS; LD50 = 271 nM), 편평세포 암종(FADU; LD50 = 330 nM, SiHA; LD50 = 777 nM), 만성 골수성 백혈병(K562; LD50 = 318 nM), 유방 선암종(MDA-MB-231; LD50 = 517 nM), 신경교종(U87-MG; LD50 = 696 nM), 및 정상 망막 상피 세포(hTERT-PRE1; LD50 = > 1000 nM) 및 정상 전립선 상피 세포(RWPE; LD50 > 2000 nM)를 포함한 1차(정상) 세포를 포함하여 암으로부터 유래된 인간 세포주 패널 상에서의 세포독성 시험을 수반하는 생물학적 실험에서 시험하였다. 나노입자의 독성을 XTT - 기반 세포 생존능 검정법에서 시험하였다. 암세포주(DU-145, MDA-MB-231)는 정상 세포(RPE-1, RWPE-1)와 비교하여 더 높은 민감도를 보여준다. 중요하게는, CuET-HSA 나노입자는 암세포주에서 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해된 순 CuET 분말과 유사한 약효를 갖지만, 이는 정상 세포에 의해서는 더 관용되며, 종양 세포에 대한 일반적인 우선적 독성을 시사한다(도 11 참조).
나노입자 분산액을 또한, 4℃에서 장기간 저장 안정성 시험에서 검사하였다. 판독(readout)으로서, 세포 배양물에서의 활성을 선택하였다. 4℃에서 4주 동안 저장된 나노입자는 골육종주 U2OS를 사용하는 XTT 세포 생존능 시험에서 세포 독성의 측면에서, 새로 제조된 나노입자와 유사한 약효를 보여주었다(LD50은 271 nM와 비교하여 280 nM임).
나노입자 분산액을 또한, 건조 및 후속적인 재-가용화 확률에 대해 시험하였다. 나노입자를 실온에서 진공 하에 16시간 동안 건조하였다. 건조된 분말을 4℃에서 1주일 동안 저장한 다음, 멸균수와 혼합하고, 쉐이커 상에서 24시간 동안 유지시켜, 완전한 재-가용화를 달성하였다. 생성된 재-가용화된 나노입자를 DLS 및 전기화학적 임피던스 분광법에 의해 분석하였다. 측정된 가장 가능성 있는 평균 입자 크기 82 nm 및 제타 전위(ζ) - 40 mV는, 건조 및 재-가용화 공정 후 나노입자의 화학적/물리적 특성에서 최소의 변화를 나타낸다.
실시예 2
0.01% 인간 혈청 알부민(HSA) 및 디에틸디티오카르바메이트 및 구리 클로라이드 염으로부터 나노입자 분산액의 제조
절차:
FDA 사양(pH=6.9±0.5)에 따른 주사 가능한 수성 20% (w/v) HSA 용액을 주사용 멸균수로 0.01% (w/v)까지 희석시킨다. 농도 280 mM의 물에 가용화된 디에틸디티오카르바메이트 소듐 염(DTC)의 멸균 용액을 0.01% HSA에 최종 농도 5.6 mM로 첨가하고, 뒤이어 간략히 교반한다. 5.6 mM DTC를 함유하는 0.01% HSA 용액에 멸균 구리 (ii) 클로라이드(수 중 1 M 농도)를 최종 농도 2.8 mM까지 첨가하고, 뒤이어 간략히 교반한다.
결과
생성된 용액은 2.8 mM(1 mg/ml)의 디에틸디티오카르바메이트-구리-HSA 나노입자를 함유한다. 그 후에, 나노입자를 DLS 및 TEM에 의해 추가로 검사하여, 대부분의 나노입자가 대략 50-60 nm이고 유의한 분획은 더 큰 입자를 가졌으나 그 크기가 500 nm를 초과하지 않았음을 보여주었다(도 6 참조).
실시예 3
5% 인간 혈청 알부민(HSA) 및 디에틸디티오카르바메이트 및 구리 클로라이드 염으로부터 나노입자 분산액의 제조
절차:
FDA 사양(pH=6.9±0.5)에 따른 주사 가능한 수성 20% (w/v) HSA 용액을 주사용 멸균수로 5% (w/v)까지 희석시킨다. 농도 280 mM의 물에 가용화된 디에틸디티오카르바메이트 소듐 염(DTC)의 멸균 용액을 5% HSA에 최종 농도 5.6 mM로 첨가하고, 뒤이어 간략히 교반한다. 5.6 mM DTC를 함유하는 5% HSA 용액에 멸균 구리 (ii) 클로라이드(수 중 1 M 농도)를 최종 농도 2.8 mM까지 첨가하고, 뒤이어 간략히 교반한다.
결과
생성된 용액은 2.8 mM(1 mg/ml)의 디에틸디티오카르바메이트-구리-HSA 나노입자를 함유한다. DLS 및 TEM에 의해 검사된 나노입자 내로의 이러한 반응 결과는 대부분의 입자가 대략 20-30 nm임을 보여주고; 일반적으로 크기 분포는 더 작은 입자로 유의하게 변이되며, 이때 HSA 농도는 증가한다(도 6 참조).
실시예 4
1% 인간 혈청 알부민(HSA) 및 디메틸디티오카르바메이트 및 구리 클로라이드 염으로부터 나노입자 분산액의 제조
절차:
FDA 사양(pH=6.9±0.5)에 따른 주사 가능한 수성 20% (w/v) HSA 용액을 주사용 멸균수로 1% (w/v)까지 희석시킨다. 농도 280 mM의 물에 가용화된 디에틸디티오카르바메이트 소듐 염(DTC)의 멸균 용액을 1% HSA에 최종 농도 5.6 mM로 첨가하고, 뒤이어 간략히 교반한다. 5.6 mM DTC를 함유하는 1% HSA 용액에 멸균 구리 (ii) 클로라이드(수 중 1 M 농도)를 최종 농도 2.8 mM까지 첨가하고, 뒤이어 간략히 교반한다.
결과
생성된 용액은 2.8 mM(1 mg/ml)의 디에틸디티오카르바메이트-구리-HSA 나노입자를 함유한다. DLS 및 TEM에 의해 검사된 나노입자 내로의 이러한 반응 결과는 대부분의 입자가 대략 60-70 nm임을 보여준다(도 7 참조).
실시예 5
1% 인간 혈청 알부민(HSA) 및 피롤리딘디티오카르바메이트 및 구리 클로라이드 염으로부터 나노입자 분산액의 제조
절차:
FDA 사양(pH=6.9±0.5)에 따른 주사 가능한 수성 20% (w/v) HSA 용액을 주사용 멸균수로 1% (w/v)까지 희석시킨다. 농도 280 mM의 물에 가용화된 피롤리딘디티오카르바메이트 암모늄 염(PDC)의 멸균 용액을 1% HSA에 최종 농도 5.6 mM로 첨가하고, 뒤이어 간략히 교반한다. 5.6 mM DTC를 함유하는 1% HSA 용액에 멸균 구리 (ii) 클로라이드(수 중 1 M 농도)를 최종 농도 2.8 mM까지 첨가하고, 뒤이어 간략히 교반한다.
결과
생성된 용액은 2.8 mM(1 mg/ml)의 피롤리딘디티오카르바메이트-구리-HSA 나노입자를 함유한다. DLS 및 TEM에 의해 검사된 나노입자 내로의 이러한 반응 결과는 대부분의 입자가 대략 15 nm임을 보여준다(도 7 참조). 명백하게는, 알부민과 함께 디메틸디티오카르바메이트는, 두 반응의 모든 다른 조건이 동일하더라도 알부민과 함께 피롤리딘디티오카르바메이트(PDT)와 비교하여 더 큰 입자를 형성한다. 이러한 사실은, 더 작은 입자가 더 긴 R1, R2 기로 형성됨을 반영한다.
실시예 6
1% 인간 혈청 트랜스페린 및 디에틸디티오카르바메이트 및 구리 클로라이드 염으로부터 나노입자 분산액의 제조
절차:
주사 가능한 수성 1% (w/v) 인간 혈청 트랜스페린 용액을 주사용 멸균수에서 제조한다. 농도 280 mM의 물에 가용화된 디에틸디티오카르바메이트 소듐 염(DTC)의 멸균 용액을 1% 트랜스페린에 최종 농도 5.6 mM로 첨가하고, 뒤이어 간략히 교반한다. 5.6 mM DTC를 함유하는 1% 트랜스페린 용액에 멸균 구리 (ii) 클로라이드(수 중 1 M 농도)를 최종 농도 2.8 mM까지 첨가하고, 뒤이어 간략히 교반한다.
결과
생성된 용액은 2.8 mM(1 mg/ml)의 디에틸디티오카르바메이트-구리-HSA 나노입자를 함유한다. DLS 및 TEM에 의해 검사된 나노입자 내로의 이러한 반응 결과는 가장 가능성 있는 평균 크기가 대략 60 nm임을 보여준다. 생성된 입자는 전기화학적 임피던스 분광법에 의해 측정 시 낮은 제타 전위(ζ) -21.5 mV를 보여주며, 이는 용액에서의 양호한 안정성을 나타낸다.
실시예 7
1% 인간 혈청 면역글로불린(IgG) 및 디에틸디티오카르바메이트 및 구리 클로라이드 염으로부터 나노입자 분산액의 제조
절차:
주사 가능한 수성 1% (w/v) 면역글로불린 용액(인간 감마-글로불린 분획)을 주사용 멸균수에서 제조한다. 농도 280 mM의 물에 가용화된 디에틸디티오카르바메이트 소듐 염(DTC)의 멸균 용액을 1% 트랜스페린에 최종 농도 5.6 mM로 첨가하고, 뒤이어 간략히 교반한다. 5.6 mM DTC를 함유하는 1% 면역글로불린 용액에 멸균 구리 (ii) 클로라이드(수 중 1 M 농도)를 최종 농도 2.8 mM까지 첨가하고, 뒤이어 간략히 교반한다.
결과
생성된 용액은 거의 2.8 mM(1 mg/ml)의 디에틸디티오카르바메이트-구리-면역글로불린 나노입자를 함유한다. DLS에 의해 검사된 나노입자 내로의 이러한 반응 결과는 가장 가능성 있는 평균 크기가 대략 20 nm임을 보여준다(도 8 참조). 생성된 입자는 전기화학적 임피던스 분광법에 의해 측정 시 낮은 제타 전위(ζ) -1.39 mV를 보여주며, 이는 용액에서의 상대적으로 불량한 안정성을 나타낸다.
실시예 8
1% 인간 혈청 트랜스페린 및 1% 인간 혈청 알부민과 디에틸디티오카르바메이트 및 구리 클로라이드 염의 혼합물로부터 나노입자 분산액의 제조
절차:
주사 가능한 수성 1% (w/v) 인간 혈청 트랜스페린 용액을 주사 가능한 수성 1% (w/v) HSA 용액과 혼합한다. 농도 280 mM의 물에 가용화된 디에틸디티오카르바메이트 소듐 염(DTC)의 멸균 용액을 단백질 혼합물에 최종 농도 5.6 mM로 첨가하고, 뒤이어 간략히 교반한다. 5.6 mM DTC를 함유하는 단백질 용액에 멸균 구리 (ii) 클로라이드(수 중 1 M 농도)를 최종 농도 2.8 mM까지 첨가하고, 뒤이어 간략히 교반한다.
결과
생성된 용액은 2.8 mM(1 mg/ml)의 디에틸디티오카르바메이트-구리-트랜스페린/HSA 나노입자를 함유한다. DLS에 의해 검사된 나노입자 내로의 이러한 반응 결과는 가장 가능성 있는 평균 크기가 대략 30 nm임을 보여준다(도 9 참조).
실시예 9
1% 인간 혈청 알부민 및 1% (w/v) 면역글로불린 용액과 디에틸디티오카르바메이트 및 구리 클로라이드 염의 혼합물로부터 나노입자 분산액의 제조
실험 설정
주사 가능한 수성 1% (w/v) 인간 혈청 알부민 용액을 주사 가능한 수성 1% (w/v) 면역글로불린 용액과 혼합한다. 농도 280 mM의 물에 가용화된 디에틸디티오카르바메이트 소듐 염(DTC)의 멸균 용액을 단백질 혼합물에 최종 농도 5.6 mM로 첨가하고, 뒤이어 간략히 교반한다. 5.6 mM DTC를 함유하는 단백질 용액에 멸균 구리 (ii) 클로라이드(수 중 1 M 농도)를 최종 농도 2.8 mM까지 첨가하고, 뒤이어 간략히 교반한다.
결과
생성된 용액은 2.8 mM(1 mg/ml)의 디에틸디티오카르바메이트-구리-알부민/면역글로불린 나노입자를 함유한다. DLS에 의해 검사된 나노입자 내로의 이러한 반응 결과는 가장 가능성 있는 평균 크기가 대략 120 nm임을 보여준다(도 10 참조).
실시예 10
종양 이미징 및 생물분포에 대한 0.2% 마우스 혈청 알부민(MSA) 및 디에틸디티오카르바메이트 및 방사성 구리(64Cu) 아세테이트 염으로부터 나노입자 분산액의 제조
실험 설정
농도 280 mM의 물에 가용화된 디에틸디티오카르바메이트 소듐 염(DTC)의 멸균 용액을 1% MSA에 최종 농도 5.6 mM로 첨가하고, 뒤이어 간략히 교반한다. 5.6 mM DTC를 함유하는 1% MSA 용액에 멸균 구리(64Cu) (ii) 아세테이트와 비-활성 구리 클로라이드의 혼합물(수 중 100 mM 농도)을 최종 농도 2.8 mM까지 첨가하고, 뒤이어 간략히 교반한다.
결과
생성된 용액은 2.8 mM(1 mg/ml)의 디에틸디티오카르바메이트-구리(64Cu)-MSA 나노입자를 함유한다. 이 반응으로부터의 나노입자를, 피하 MDA-MB-231 종양 이종이식물을 갖는 마우스 내로의 안와후방 주사(활성 33 MBq에 상응하는 용량 1 mg/kg)에 의해 생체내에서 추가로 적용하고, 적용 후 Albira PET/SPECT/CT 이미징 시스템(Bruker Biospin Corporation, Woodbridge, CT, USA)을 사용하여 다수의 시점에서 PET 분석하였다. 측정된 PET 신호는 종양 덩어리 내에서의 축적을 보여준다(도 13).
실시예 11
종양 이미징 및 생물분포에 대한 0.2% 인간 혈청 트랜스페린(HST) 및 디에틸디티오카르바메이트 및 방사성 구리(64Cu) 아세테이트 염으로부터 나노입자 분산액의 제조.
실험 설정
농도 280 mM의 물에 가용화된 디에틸디티오카르바메이트 소듐 염(DTC)의 멸균 용액을 1% HST에 최종 농도 5.6 mM로 첨가하고, 뒤이어 간략히 교반한다. 5.6 mM DTC를 함유하는 1% HST 용액에 멸균 구리(64Cu) (ii) 아세테이트와 비-활성 구리 클로라이드의 혼합물(수 중 100 mM 농도)을 최종 농도 2.8 mM까지 첨가하고, 뒤이어 간략히 교반한다.
결과
생성된 용액은 2.8 mM(1 mg/ml)의 디에틸디티오카르바메이트-구리(64Cu)-HST 나노입자를 함유한다. 이 반응으로부터의 나노입자를, 피하 MDA-MB-231 종양 이종이식물을 갖는 마우스 내로의 안와후방 주사(활성 29 MBq에 상응하는 용량 1 mg/kg)에 의해 생체내에서 추가로 적용하고, 적용 후 Albira PET/SPECT/CT 이미징 시스템(Bruker Biospin Corporation, Woodbridge, CT, USA)을 사용하여 다수의 시점에서 PET 분석하였다. 측정된 PET 신호는 종양 덩어리 내에서의 축적을 보여준다(도 13).
실시예 12
0.2% 마우스 혈청 알부민(MSA) 및 디에틸디티오카르바메이트 및 구리 클로라이드 염으로부터 나노입자 분산액의 제조
실험 설정
주사 가능한 수성 20% (w/v) MSA 용액(pH=6.9±0.5)을 주사용 멸균수로 0.2% (w/v)까지 희석시킨다. 농도 280 mM의 물에 가용화된 디에틸디티오카르바메이트 소듐 염(DTC)의 멸균 용액을 0.2% MSA에 최종 농도 5.6 mM로 첨가하고, 뒤이어 간략히 교반한다. 5.6 mM DTC를 함유하는 0.2% MSA 용액에 멸균 구리 (ii) 클로라이드(수 중 1 M 농도)를 최종 농도 2.8 mM까지 첨가하고, 뒤이어 간략히 교반한다.
결과
생성된 용액은 2.8 mM(1 mg/ml)의 디에틸디티오카르바메이트-구리-MSA 나노입자를 함유한다. 이 반응으로부터의 나노입자를 HPLC/MS에 의해 CuET의 혈청 약물동력학을 포함한 다양한 마우스 생체내 실험에 의해 추가로 분석하였다(도 12 참조). 동물을 5 mg/kg의 CuET에 상응하는 농도의 나노입자에 의해 복강내 치료하였다. 투여 후 1시간 및 3시간째에 혈청을 수합하였다. 대조군으로서, 올리브 오일에 분산된 5 mg/kg의 CuET를 사용하였다. 항종양 활성에 대해, 나노입자를 1 mg/kg의 CuET에 상응하는 농도로 투여하였다(도 14와 도 15 및 방법 참조). CuET 농도를 또한, 뇌 조직에서 HPLC/MS에 의해 분석하였다(방법 참조). 동물을 1 mg/kg의 CuET에 상응하는 농도의 나노입자에 의해 복강내 치료하였다. 복강내 투여 후 1시간째에, 뇌 CuET 수준은 혈액 수준과 유사하였고, 대략 3 ng/ml에 도달하였다. 이는 혈액-뇌 장벽을 통한 MSA 나노입자로서 제제화된 CuET의 매우 양호한 침투를 나타낸다.
실시예 13
0.2% 인간 혈청 알부민(HSA) 및 구리 클로라이드 염 및 디에틸디티오카르바메이트으로부터 나노입자 분산액의 제조
실험 설정
주사 가능한 수성 20% (w/v) MSA 용액(pH=6.9±0.5)을 주사용 멸균수로 0.2% (w/v)까지 희석시킨다. 농도 1 M의 물에 가용화된 멸균 구리 (ii) 클로라이드의 멸균 용액을 0.2% HSA에 최종 농도 2.8 mM로 첨가하고, 뒤이어 간략히 교반한다. 2.8 mM 구리 (ii) 클로라이드를 함유하는 0.2% HSA 용액에 멸균 디에틸디티오카르바메이트 소듐 염(수 중 280 mM 농도)를 최종 농도 5.6 mM까지 첨가하고, 뒤이어 간략히 교반한다.
결과
생성된 용액은 2.8 mM(1 mg/ml)의 디에틸디티오카르바메이트-구리-HSA 나노입자를 함유한다.
실시예 14
구리 클로라이드 염 및 디에틸디티오카르바메이트와 함께 나노입자를 형성할 수 있는 혈장 단백질의 프로테오믹 식별
실험 설정
건강한 지원자로부터의 헤파린 혈장을 초원심분리(4℃, 200000 g에서 3시간 동안)에 의해 예비-세정하여, 혈장에서 천연 발생하는 모든 침전물 및 큰 복합체를 제거한다. 농도 280 mM의 물에 가용화된 디에틸디티오카르바메이트 소듐 염(DTC)의 멸균 용액을 예비-세정된 혈장에 최종 농도 5.6 mM로 첨가하고, 뒤이어 간략히 교반한다. 5.6 mM DTC를 함유하는 예비-세정된 혈장에 멸균 구리 (ii) 클로라이드(수 중 1 M 농도)를 최종 농도 2.8 mM까지 첨가하고, 뒤이어 간략히 교반한다. 나노입자 용액을 450 nm 공극 필터(Millipore)에 의해 여과하여, 모든 큰 입자를 제거한다. 여과된 용액을 초원심분리(4℃, 200000 g에서 3시간 동안)하여, 나노입자를 단리한다. 나노입자를 함유하는 펠렛을 세척하고, 생리 식염수에 재현탁시켜, 잠재적인 오염물을 제거하고 다시 초원심분리(4℃, 200000 g에서 3시간 동안)한다. 나노입자를 함유하는 펠렛을 80% 아세톤에서 가용화하여, 단백질을 침전시키고 단리한다. 단백질을 HPLC-MS 기반 프로테오믹 식별에 추가로 사용한다(식별된 단백질은, 많은 혈액 단백질이 본 발명의 나노미립자 형태를 형성할 수 있음을 보여줌).
결과
생성된 용액은 HPLC-MS 프로테오믹스에 의해 추가로 식별된 다양한 혈장 단백질과 함께 2.8 mM(1 mg/ml)의 디에틸디티오카르바메이트-구리 나노입자를 함유한다. 하기 단백질을 식별하였다: 피브리노겐 베타 사슬; 피브리노겐 감마 사슬; 알파-2-마크로글로불린; 피브리노겐 알파 사슬; Ig mu 사슬 C 영역; 아포리포단백질 A-I; 아포리포단백질 C-III; Ig mu 중쇄 질병 단백질; Ig 카파 사슬 C 영역; 혈청 알부민; CD5 항원-유사; 클러스터린(Clusterin); Ig 감마-1 사슬 C 영역; 아포리포단백질 B-100; 아포리포단백질 B-48; 아포리포단백질 A-IV; Ig 알파-1 사슬 C 영역; 피브로넥틴; 아나스텔린(Anastellin); Ugl-Y1;Ugl-Y2;Ugl-Y3; 면역글로불린 람다-유사 폴리펩타이드 5;Ig 람다-1 사슬 C 영역; C4b-결합 단백질 알파 사슬; 아포리포단백질 C-I;절단된(truncated) 아포리포단백질 C-I; 보체 C3;보체 C3 베타 사슬;C3-베타-c;보체 C3 알파 사슬;C3a 아나필라톡신(anaphylatoxin);아실화 자극 단백질;보체 C3b 알파 사슬;보체 C3c 알파 사슬 단편 1;보체 C3dg 단편;보체 C3g 단편;보체 C3d 단편;보체 C3f 단편;보체 C3c 알파 사슬 단편 2; 비특징화된 단백질 C1orf177;보체 C1r 하위구성성분;보체 C1r 하위구성성분 중쇄;보체 C1r 하위구성성분 경쇄; 보체 C1s 하위구성성분;보체 C1s 하위구성성분 중쇄;보체 C1s 하위구성성분 경쇄; 인터-알파-트립신 저해제 중쇄 H4;70 kDa 인터-알파-트립신 저해제 중쇄 H4;35 kDa 인터-알파-트립신 저해제 중쇄 H4; 비트로넥틴(Vitronectin);비트로넥틴 V65 하위단위;비트로넥틴 V10 하위단위;소마토메딘(Somatomedin)-B; 아포리포단백질 C-II;프로아포리포단백질 C-II; 보체 C1q 하위구성성분 하위단위 B; 면역글로불린 J 사슬; 보체 인자 H; 아포리포단백질 A-II;프로아포리포단백질 A-II;절단된 아포리포단백질 A-II; Ig 감마-3 사슬 C 영역; Ig 감마-4 사슬 C 영역; 보체 C1q 하위구성성분 하위단위 A; 합토글로빈-관련 단백질; 아포리포단백질 E; 합토글로빈;합토글로빈 알파 사슬;합토글로빈 베타 사슬; 보체 C4-A;보체 C4 베타 사슬;보체 C4-A 알파 사슬;C4a 아나필라톡신;C4b-A;C4d-A;보체 C4 감마 사슬;보체 C4-B;보체 C4 베타 사슬;보체 C4-B 알파 사슬;C4a 아나필라톡신;C4b-B;C4d-B;보체 C4 감마 사슬; 트랜스티레틴(Transthyretin); 헤모글로빈 하위단위 베타;LVV-헤모핀(hemorphin)-7; 스피노핀(Spinorphin); 갈렉틴(Ga렉틴)-3-결합 단백질; 피콜린(Ficolin)-3; Ig 감마-2 사슬 C 영역; 플라스미노겐;플라스민 중쇄 A;활성화 펩타이드;안지오스타틴;플라스민 중쇄 A, 짧은 형태;플라스민 경쇄 B; 보체 C1q 하위구성성분 하위단위 C; 히스티딘-풍부 당단백질; Ig 중쇄 V-III 영역 CAM;Ig 중쇄 V-III 영역 23; Ig 카파 사슬 V-IV 영역; Ig 중쇄 V-III 영역 BUT;Ig 중쇄 V-III 영역 KOL;Ig 중쇄 V-III 영역 WEA;Ig 중쇄 V-III 영역 TRO; Ig 알파-2 사슬 C 영역;Ig 람다-3 사슬 C 영역;Ig 람다-2 사슬 C 영역;Ig 람다-6 사슬 C 영역;Ig 람다-7 사슬 C 영역; Ig 카파 사슬 V-III 영역 VG; 아포리포단백질 D; 아포리포단백질(a); 겔솔린(Gelsolin); 인터-알파-트립신 저해제 중쇄 H1; 프로트롬빈;활성화 펩타이드 단편 1;활성화 펩타이드 단편 2;트롬빈 경쇄;트롬빈 중쇄; 세룰로플라스민;비타민 K-의존적 단백질 S; Ig 람다 사슬 V-I 영역 HA;Ig 람다 사슬 V-I 영역 VOR; 보체 C5;보체 C5 베타 사슬;보체 C5 알파 사슬;C5a 아나필라톡신;보체 C5 알파 사슬; Ig 카파 사슬 V-III 영역 POM; 세로트랜스페린(Sero이전rin); 베타-2-당단백질 1; 인터-알파-트립신 저해제 중쇄 H2; 일시적 수용체 잠재 양이온 채널 하위계통 M 구성원 6;보체 구성성분 C8 알파 사슬; 헤모글로빈 하위단위 알파; Ig 카파 사슬 V-III 영역 B6; 키니노겐(키닌ogen)-1;키니노겐-1 중쇄;T-키닌;Brady키닌;리실(Lysyl)-브래드키닌;키니노겐-1 경쇄;저분자량 성장-촉진 인자; Ig 카파 사슬 V-II 영역 FR;보체 구성성분 C8 베타 사슬; Ig 중쇄 V-II 영역 NEWM;Ig 중쇄 V-II 영역 ARH-77;Ig 중쇄 V-II 영역 WAH;C4b-결합 단백질 베타 사슬; 보체 인자 B;보체 인자 B Ba 단편;보체 인자 B Bb 단편; 알파-1-항트립신; AAT로부터의 짧은 펩타이드; 보체 인자 H-관련 단백질 1; 보체 인자 H-관련 단백질 2; 알파-2-HS-당단백질; 알파-2-HS-당단백질 사슬 A;알파-2-HS-당단백질 사슬 B; 아포리포단백질 M; 아포리포단백질 L1;Ig 람다 사슬 V-I 영역 NEWM; Ig 람다 사슬 V-III 영역 LOI; 응고 인자 V;응고 인자 V 중쇄;응고 인자 V 경쇄; IgGFc-결합 단백질; 만난-결합 렉틴 세린 프로테아제 1;만난-결합 렉틴 세린 프로테아제 1 중쇄;만난-결합 렉틴 세린 프로테아제 1 경쇄; N-아세틸뮤라모일-L-알라닌 아미다제; 혈장 칼리크레인(kallikrein);혈장 칼리크레인 중쇄;혈장 칼리크레인 경쇄; 혈청 파라옥소나제/아릴에스테라제 1; 단백질 AMBP;알파-1-미크로글로불린;인터-알파-트립신 저해제 경쇄;트립스타틴; Ig 람다 사슬 V 영역 4A; 헤모펙신(Hemopexin); 피콜린(Ficolin)-2; 알파-1-산 당단백질 2;알파-1-산 당단백질 1; 보체 구성성분 C8 감마 사슬; 피불린(Fibulin)-1; 세포외 기질 단백질 1; 응고 인자 XII;응고 인자 XIIa 중쇄;베타-인자 XIIa 파트 1;응고 인자 XIIa 경쇄; 칼리스타틴; 만난-결합 렉틴 세린 프로테아제 2;만난-결합 렉틴 세린 프로테아제 2 A 사슬;만난-결합 렉틴 세린 프로테아제 2 B 사슬; 폰 빌레브란트(von Willebrand) 인자;폰 빌레브란트 항원 2; 헤파린 보조인자 2; 콜레스테릴 에스테르 전달 단백질; SUN 도메인-함유 단백질 3; Ig 델타 사슬 C 영역; 보체 구성성분 C6; 포스파티?이노시톨-글리칸-특이적 포스포리파제 D; 아포리포단백질 F; 혈청 아밀로이드 A-2 단백질;혈청 아밀로이드 A-1 단백질;아밀로이드 단백질 A;혈청 아밀로이드 단백질 A(2-104);혈청 아밀로이드 단백질 A(3-104);혈청 아밀로이드 단백질 A(2-103);혈청 아밀로이드 단백질 A(2-102);혈청 아밀로이드 단백질 A(4-101); 2-하이드록시아실스핑고신 1-베타-갈락토실트랜스퍼라제; 비타민 D-결합 단백질; 안지오텐시노겐;안지오텐신-1;안지오텐신-2;안지오텐신-3;안지오텐신-4;안지오텐신 1-9;안지오텐신 1-7;안지오텐신 1-5;안지오텐신 1-4; 케라틴, 유형 I 세포골격 10; 혈청 아밀로이드 A-4 단백질; Ig 중쇄 V-II 영역 MCE; 케라틴, 유형 I 세포골격 9; Ig 중쇄 V-I 영역 HG3;Ig 중쇄 V-I 영역 EU; 폴리콤브(Polycomb) 단백질 SUZ12; 아파민(Afamin); 보체 구성성분 C9;보체 구성성분 C9a;보체 구성성분 C9b; 케라틴, 유형 II 세포골격 1; 보체 구성성분 C7; 응고 인자 XI;응고 인자 XIa 중쇄;응고 인자 XIa 경쇄; 알파-2-항플라스민; 항트롬빈-III; 매트릭스 Gla 단백질; 헤모글로빈 하위단위 델타; 작은 유비퀴틴-관련 변형제 2;작은 유비퀴틴-관련 변형제 3; 카르복시펩티다제 N 촉매 사슬; 추정상(Putative) 히스톤-라이신 N-메틸트랜스퍼라제 PRDM6; UBA-유사 도메인-함유 단백질 2; 액포 융합 단백질 MON1 상동체 A; Ig 카파 사슬 V-I 영역 HK102; 응고 인자 XIII A 사슬; 중합체성 면역글로불린 수용체;분비 구성성분; 액틴, 세포질 1;액틴, 세포질 1, N-말단 가공;액틴, 세포질 2;액틴, 세포질 2, N-말단 가공; Ig 중쇄 V-I 영역 V35; 인히빈(Inhibin) 베타 C 사슬; 아포리포단백질 C-IV; 만난-결합 렉틴 세린 프로테아제 1;만난-결합 렉틴 세린 프로테아제 1 중쇄;만난-결합 렉틴 세린 프로테아제 1 경쇄; 케라틴, 유형 II 세포골격 2 표피; 레티놀-결합 단백질 4;혈장 레티놀-결합 단백질(1-182);혈장 레티놀-결합 단백질(1-181);혈장 레티놀-결합 단백질(1-179);혈장 레티놀-결합 단백질(1-176); 혈장 프로테아제 C1 저해제; 루미칸(Lumican); WD 반복-함유 단백질 20; 시알산-결합 Ig-유사 렉틴 16; 알파-1B-당단백질; 빈쿨린(Vinculin); 크로모도메인(Chromodomain)-헬리카제-DNA-결합 단백질 7; 비특징화된 단백질 C17orf102; 전좌 단백질 SEC62; 성장 억제-특이적 단백질 6; 베타-2-미크로글로불린;베타-2-미크로글로불린 형태 pI 5.3; 트랜스겔린(Transgelin)-2; 테트라넥틴; 단백질 S100-A9; 아연 핑거 단백질 215; 아연 핑거 FYVE 도메인-함유 단백질 1; Ig 카파 사슬 V-II 영역 Cum; 조직 인자 경로 저해제; 섬유아세포 성장 인자 수용체 1; 임신 구역 단백질; 셀레노단백질 P; 인지질 전달 단백질; 미오트로핀(Myotrophin); 아연 핑거 MYND 도메인-함유 단백질 11; 시냅토타그민(Synaptotagmin)-13; 비특징화된 단백질 C19orf68; E3 유비퀴틴-단백질 리가제 RNF169; LIM 도메인 단독 단백질 7; 소팅 넥신(Sorting nexin)-27. 이들 단백질 또는 이들의 조합은 CuET 나노입자의 산업적 생산에 사용될 수 있다.

Claims (36)

  1. 디티오카르바메이트-금속 복합체 및 적어도 하나의 혈액 단백질의 미립자 형태.
  2. 제1항에 있어서,
    유기 용매가 실질적으로 없는 미립자 형태.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    분자 조립체(molecular assembly) 형태의 미립자 형태.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    2 내지 900 nm 범위의 평균 입자 크기를 갖는 미립자 형태.
  5. 디티오카르바메이트-금속 복합체 및 실질적으로 순수한 혈액 단백질, 특히 실질적으로 순수한 혈액 혈청 단백질의 미립자 형태.
  6. 제5항에 있어서,
    유기 용매가 실질적으로 없으며 및/또는 분자 조립체 형태이며, 및/또는 2 내지 900 nm 범위의 평균 입자 크기를 갖는 미립자 형태.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 금속은 구리, 아연, 은 및 금으로부터 선택되고, 바람직하게는 상기 금속은 구리인, 미립자 형태.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 금속은 63Cu, 65Cu, 64Cu 및 이들의 혼합물로부터 선택되는, 미립자 형태.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 디티오카르바메이트는 화학식 (R1)(R2)N-CS2 -를 가지고, 상기 화학식에서, R1 및 R2는 동일하거나 상이하고, 독립적으로 C1-C8 알킬, C2-C8 알케닐, C3-C10 사이클로알킬, C6-C14 아릴, O, S, N으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하는 C4-C14 헤테로아릴, O, S, N으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하는 C3-C10 헤테로사이클릴로부터 선택되거나; 또는 R1과 R2는 이들이 결합되는 질소 원자와 함께 헤테로사이클을 형성하고, 여기서, -R1-R2-는 C2-C6 알킬렌 또는 C2-C6 알케닐렌이며, 선택적으로 1 내지 2개의 탄소 원자는 O, S, NH로부터 선택되는 헤테로원자에 의해 대체될 수 있고; R1 및 R2를 형성하는 모이어티는 비치환되거나 또는 C1-C4 알킬, 하이드록시, 머캅토, C1-C4 알콕시, C1-C4 알킬티오, 할로겐, 페닐, 벤질, 케토기, 카르복실기, C1-C4 알킬옥시카르보닐로부터 선택되는 적어도 하나의 치환기에 의해 추가로 치환될 수 있는, 미립자 형태.
  10. 제9항에 있어서,
    R1 및 R2는 독립적으로 C1-C6(또는 C1-C4) 알킬, C2-C6(또는 C1-C4) 알케닐, C3-C6 사이클로알킬, 페닐로부터 선택되거나; 또는 R1과 R2는 이들이 결합되는 질소 원자와 함께 헤테로사이클을 형성하며, 여기서, -R1-R2-는 C2-C6 알킬렌 또는 C2-C6 알케닐렌인, 미립자 형태.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 디티오카르바메이트는 디에틸디티오카르바메이트인, 미립자 형태.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혈액 단백질은 혈액 혈청 단백질이며, 바람직하게는 알부민, 실질적으로 순수한 알부민, 트랜스페린, 실질적으로 순수한 트랜스페린, 면역글로불린, 실질적으로 순수한 및/또는 모노클로날 면역글로불린을 포함하는 군으로부터 선택되는 혈액 혈청 단백질인, 미립자 형태.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 상기 혈액 단백질은 전혈, 혈액 혈장 또는 혈액 혈청을 포함하여 혈액 혈청 단백질을 포함하는 혼합물이고,
    상기 혈액 혈청 단백질은 바람직하게는 알부민, 트랜스페린, 면역글로불린을 포함하는, 미립자 형태.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    유기 용매가 실질적으로 없는 미립자 형태.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 50%, 적어도 70% 또는 적어도 90%의 입자는 2 내지 220 nm 범위 내에서, 2 내지 100 nm 범위 내에서, 2 내지 90 nm 범위 내에서, 또는 2 내지 80 nm 범위 내에서 크기를 갖는, 미립자 형태.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    음성(negative) 제타-전위(zeta-potential), 바람직하게는 -15 mV보다 낮은 제타-전위, 보다 바람직하게는 -30 mV보다 낮은 제타-전위를 갖는, 미립자 형태.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    실질적으로 건조 형태인, 바람직하게는 동결건조된(lyophilized) 형태 또는 분무-건조된 형태인, 미립자 형태.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미립자 형태는 동결건조된 형태이고, 상기 미립자 형태는 만니톨, 트레할로스, 사카로스, 알부민, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 글루코스, 말토스, 이노시톨, 라피노스, 이눌린, 말토덱스트린, 다당류, 헤파린, 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린, 글리세롤, 이노시톨, 소르비톨, 머캅탄, 폴리에틸렌 글리콜, 아도니톨, 아미노산, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 소듐 도데실 설페이트, 아스코르브산, 폴리비닐피롤리돈, 덱스트란으로부터 선택되는 적어도 하나의 동결보호제(cryoprotectant)를 추가로 포함하는, 미립자 형태.
  19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    주사액 또는 주입액, 점적액, 스프레이, 점적주입물(instillation), 좌제, 캡슐, 정제, 분말, 연고, 로션 또는 크림 형태인, 미립자 형태.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    멸균 여과되는, 미립자 형태.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 미립자 형태를 제조하는 방법으로서,
    상기 방법은:
    (a) 수성 용매에서 디티오카르바메이트 및 금속염으로부터 선택되는 제1 구성성분을 적어도 하나의 혈액 단백질과 조합하는 단계, 및
    (b) 디티오카르바메이트 및 금속염으로부터 선택되는 제2 구성성분을 동시에 또는 후속적으로 첨가하는 단계로서,
    상기 제1 구성성분이 디티오카르바메이트인 경우, 상기 제2 구성성분은 금속염이고; 상기 제1 구성성분이 금속염인 경우, 상기 제2 구성성분은 디티오카르바메이트인 단계, 및
    (c) 선택적으로, 생성된 용액을 동결건조하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 디티오카르바메이트는 디에틸디티오카르바메이트이며,
    상기 금속염은 Cu 염이고,
    선택적으로, 상기 혈액 단백질은 인간 혈청 알부민인, 방법.
  23. 제21항에 있어서,
    (a) 적어도 하나의 혈액 단백질을 수성 용매(예를 들어 물 또는 수계(water-based) 완충제)에서 0.01% (w/v) 내지 포화된 용액, 바람직하게는 0.1% (w/v) 내지 10% (w/v) 범위의 농도까지 용해시키거나, 환자의 전혈, 혈액 혈장 또는 혈액 혈청을 제공하는 단계;
    (b) 수성 용매에 용해된 적어도 하나의 디티오카르바메이트를 디티오카르바메이트에 1 uM 내지 100 mM, 바람직하게는 1 내지 10 mM의 범위로 첨가하는 단계;
    (c) 상기 단계 (b)와 동시에 또는 상기 단계 (b)에 후속적으로, 금속염 용액을 수성 용매에 첨가하여 1 uM 내지 100 M, 바람직하게는 1 내지 10 mM 범위의 금속염 농도를 갖는 단계
    를 포함하는, 방법.
  24. 제21항에 있어서,
    (a) 적어도 하나의 혈액 단백질을 수성 용매(예를 들어 물 또는 수계 완충제)에서 0.01% (w/v) 내지 포화된 용액, 바람직하게는 0.1% (w/v) 내지 10% (w/v) 범위의 농도까지 용해시키거나, 환자의 전혈, 혈액 혈장 또는 혈액 혈청을 제공하는 단계;
    (b) 상기 단계 (b)와 동시에 또는 상기 단계 (b)에 후속적으로, 금속염 용액을 수성 용매에 첨가하여 1 uM 내지 100 M, 바람직하게는 1 내지 10 mM 범위의 금속염 농도를 갖는 단계;
    (c) 상기 단계 (b)와 동시에 또는 상기 단계 (b)에 후속적으로, 수성 용매에 용해된 적어도 하나의 디티오카르바메이트를 디티오카르바메이트에 1 uM 내지 100 mM, 바람직하게는 1 내지 10 mM의 범위로 첨가하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 (a)에서, 알부민, 트랜스페린, 면역글로불린 또는 이들의 혼합물, 또는 전혈, 혈액 혈청 또는 혈액 혈장은 혈액 단백질로서 사용되는, 방법.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    금속 이온:디티오카르바메이트 이온의 몰비는 1:5 내지 5:1인, 방법.
  27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수성 용매는 물 또는 수계 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 아세테이트, Tris, HEPES, 식염수이고; 바람직하게는 상기 수성 용매는 멸균된 것인, 방법.
  28. 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득 가능한, 디티오카르바메이트-금속 복합체 및 적어도 하나의 혈액 단백질의 미립자 형태.
  29. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료제 및/또는 진단제로서 사용하기 위한, 미립자 형태.
  30. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    암의 화학치료법, 암의 방사선치료법, 종양 치료 분야, 열치료법 및/또는 종양의 시각화로부터 선택되는 치료법에 사용하기 위한, 미립자 형태.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서,
    상기 미립자 형태는 비경구, 경구 또는 국소 투여되는, 미립자 형태.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    1시간의 주사 투여 후 혈액 중 CuET의 농도는 적어도 1 ng/l이거나, 또는 주입 투여 동안 혈액 중 CuET의 농도는 적어도 5 ng/l인, 치료적 용도의 미립자 형태.
  33. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미립자 형태는 면역글로불린 또는 면역글로불린-함유 혈액 단백질 혼합물을 혈액 단백질로서 포함하고, 종양 항원에 대한 항체나 항체 단편 또는 세포 특이적 마커를 추가로 보유하는, 선택적으로 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한, 미립자 형태.
  34. 디티오카르바메이트, 금속염, 멸균 수성 용매, 및 상기 디티오카르바메이트, 상기 금속염 및 적어도 하나의 혈액 단백질을 상기 수성 용매 내에서 멸균 조건 하에 조합하기 위한 용기를 포함하는 부품 키트로서,
    상기 수성 용매는 바람직하게는 물 또는 수계 완충제인, 부품 키트.
  35. 제34항에 있어서,
    적어도 하나의 혈액 단백질, 바람직하게는 실질적으로 순수한 혈액 단백질을 추가로 함유하는, 부품 키트.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서,
    상기 디티오카르바메이트는 디에틸디티오카르바메이트이며,
    상기 금속염은 구리 염이고,
    선택적으로, 상기 혈액 단백질은 인간 혈청 알부민인, 부품 키트.
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