KR20200056771A - 참당귀 및 미나리의 혼합 추출물을 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents
참당귀 및 미나리의 혼합 추출물을 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
참당귀와 미나리의 혼합 추출물의 허혈성 뇌질환 예방 및/또는 치료 및/또는 개선 용도, 신경세포 보호 용도, 및/또는 신경세포 생성 용도가 제공된다.
Description
참당귀(Angelica gigas Nakai) 및 미나리의 혼합 추출물을 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물, 및 건강기능성 식품이 제공된다.
대표적인 허혈성 뇌질환 중 하나인 뇌졸중(stroke)은 혈류의 차단으로 인하여 뇌의 광범위한 부위에서 신경세포 손상을 유발하여 심각한 기능 장애를 일으키는 질환이다. 뇌졸중은 크게 혈관이 막혀서 발생하는 뇌경색(cerebral ischemia)과 혈관이 터져서 생기는 뇌출혈(cerebral hemorrhage)로 분류된다.
뇌졸중은 크게 뇌혈관이 막히는 허혈성 뇌졸중(뇌경색)과 뇌혈관이 터지는 출혈성 뇌졸중(뇌출혈)으로 구분 할 수 있으며, 허혈성 뇌졸중의 경우에서는 동맥경화나 혈전 등에 의해 유발되는 것으로 알려져 있으며, 뇌출혈 의 경우는 고혈압에 의한 원발성 뇌출혈과 동정맥 기형이나 동맥류에 의한 지주막하 출혈이 중요한 원인이라고 할 수 있다.
현재, 뇌졸중 등의 허혈성 뇌질환에 치료효과를 갖는 다양한 약물이 개발되고 있으나, 많은 부작용들이 보고되고 있어서, 효과적이면서도 안전한 치료제의 개발이 요구되고 있다.
일 예는 참당귀(Angelica gigas Nakai) 및 미나리의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물, 신경세포 보호용 약학 조성물, 및/또는 신경세포 재생 (또는 생성)용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 참당귀 및 미나리의 혼합 추출물을 허혈성 뇌질환 예방 및/또는 치료, 신경세포 보호, 및/또는 신경세포 재생 (또는 생성)을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 허혈성 뇌질환의 예방 및/또는 치료 방법, 신경세포 보호 방법, 및/또는 신경세포 재생 (또는 생성) 방법을 제공한다.
상기 참당귀 및 미나리의 혼합 추출물은 참당귀 추출물 및 미나리 추출물의 혼합물, 참당귀 및 미나리의 혼합물의 추출물, 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 허혈성 뇌질환은 허혈성 뇌혈관질환 및 허혈성 뇌신경질환 (퇴행성 신경질환)들 중에서 선택될 수 있으며, 예컨대, 뇌졸중 (예컨대, 뇌경색 또는 뇌출혈), 고혈압, 치매 (예컨대, 혈관성 치매 등), 파키슨병, 헌팅턴병, 루게릭병 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 신경 세포는 뇌 (예컨대, 해마 (e.g., CA1 영역 등))의 신경 세포일 수 있으며, 예컨대, 뉴런, 신경아교세포 (예컨대, 별아교세포(astrocyte), 미세아교세포(microglia), 희돌기아교세포 (oligodendrocyte) 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
다른 예는 참당귀 및 미나리의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환 개선용, 신경세포 보호용, 및/또는 신경세포 재생 (또는 생성)용 건강기능성식품을 제공한다. 상기 참당귀 및 미나리의 혼합 추출물은 참당귀 추출물 및 미나리 추출물의 혼합물, 참당귀 및 미나리의 혼합물의 추출물, 또는 이들의 조합일 수 있다.
다른 예는 참당귀 및 미나리의 혼합 추출물을 제조하는 단계를 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방, 치료 및/또는 개선 효과를 갖는 조성물의 제조 방법을 제공한다.
다른 예는 참당귀 추출물 및 미나리 추출물을 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 및/또는 치료, 신경세포 보호, 및/또는 신경세포 재생 (또는 생성)을 위한 병용 투여용 약학 조성물 또는 병용투여용 키트를 제공한다. 상기 병용 투여용 약학 조성물은 참당귀 추출물 및 미나리 추출물을 하나의 제형 내에 포함하거나, 각각 서로 다른 제형 내에 포함하는 투여 단위(dosage unit)를 포함할 수 있다. 다른 예는 참당귀 추출물을 허혈성 뇌질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계 및 미나리 추출물을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 신경질환의 예방 및/또는 치료 방법, 신경세포 보호 방법, 및/또는 신경세포 재생 (또는 생성) 방법을 제공한다. 상기 참당귀 추출물의 투여 단계와 미나리 추출물의 투여 단계는 동시 또는 순서에 무관하게 이시적으로 수행될 수 있다.
본 명세서에서는 참당귀(Angelica gigas Nakai) 및 미나리의 혼합 추출물의 허혈성 뇌질환 예방 및/또는 치료 용도, 및 신경세포 보호 및/또는 재생 용도가 제공된다.
당귀는 산형과에 속하는 다년생 초본식물로서, 주로 한국, 일본, 중국 등지에서 약용을 목적으로 재배되고 있다. 당귀는 그 산지에 따라 한국에서 생산되는 참당귀(Angelica gigas Nakai), 일본에서 생산되는 일당귀(Angelica acutiloba Kitagawa), 그리고 중국에서 생산되는 중국당귀(Angelica sinensis Diels)로 구분되고, 그 성분과 약리적 효과는 상이한 것으로 알려져 있다. 본 명세서에서 사용되는 참당귀 추출물은 참당귀의 뿌리 (예컨대, 참당귀 뿌리의 건조 및 파쇄물)를 사용하여 얻어진 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 미나리는 돌미나리(Water dropwort, Oenanthe javanica)일 수 있다. 돌미나리는 미나리과(Umbelliferae)에 속하는 다년생 초본으로 쌍떡잎식물이다. 돌미나리는 습지 또는 물가에서 야생하는 것으로, 물미나리에 비하여 잎사귀가 많으며 줄기가 짧고 줄기 아래가 약간 붉은 색을 띤다. 또한, 독특한 향미가 있어서 식용으로 사용되기도 하고, 해열, 진정, 변비예방 등의 효과가 있고, 항균 작용이 있는 것으로 알려져 있다. 본 명세서에서 사용되는 미나리 추출물은 돌미나리의 식물체 전체(전초) 또는 그 일부를 사용하여 얻어진 것일 수 있으며, 상기 돌미나리의 일부는 돌미나리의 지상부, 구체적으로 꽃, 줄기, 및 잎으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 부위일 수 있다.
본 명세서에서, '치료'는 증상의 경감 또는 개선, 질환의 범위의 감소, 질환 진행의 지연 또는 완화, 질환 상태 또는 증상의 개선, 경감 또는 안정화, 부분적 또는 완전한 회복, 생존의 연장, 기타 다른 이로운 치료 결과 등을 모두 포함하는 의미로 사용된다. '예방'은 특정 질병을 갖지 않는 대상에게 작용하여 상기 특정 질병이 발병하지 않도록 하거나, 그 발병 시기를 늦추는 모든 기작 및/또는 효과를 포함하는 의미로 사용된다.
본 명세서에서, 참당귀 및 미나리의 혼합 추출물이 뇌허혈에 의한 뇌세포 손상에 대한 보호/신경세포 재생 효과를 나타냄을 확인하여, 참당귀 및 미나리의 혼합 추출물의 신경세포 보호 효과 및/또는 신경세포 재생 (또는 생성) 효과, 및 허혈성 뇌질환에 대한 치료 및/또는 예방 및/또는 개선 효과를 제안한다.
이에, 일 예는 참당귀(Angelica gigas Nakai) 및 미나리의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물, 신경세포 보호용 약학 조성물, 및/또는 신경세포 재생 (또는 생성)용 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 참당귀 및 미나리의 혼합 추출물을 허혈성 뇌질환 예방 및/또는 치료, 신경세포 보호, 및/또는 신경세포 재생 (또는 생성)을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 허혈성 뇌질환의 예방 및/또는 치료 방법, 신경세포 보호 방법, 및/또는 신경세포 재생 (또는 생성) 방법을 제공한다. 상기 참당귀 및 미나리의 혼합 추출물은 참당귀 추출물 및 미나리 추출물의 혼합물, 참당귀 및 미나리의 혼합물의 추출물, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 신경 세포는 뇌 (예컨대, 해마 (e.g., CA1 영역 등))의 신경 세포일 수 있으며, 예컨대, 뉴런, 신경아교세포 (예컨대, 별아교세포(astrocyte), 미세아교세포(microglia), 희돌기아교세포 (oligodendrocyte) 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예는 참당귀 추출물과 미나리 추출물을 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 및/또는 치료, 신경세포 보호, 및/또는 신경세포 재생 (또는 생성)을 위한 병용투여용 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 참당귀 추출물과 미나리 추출물을 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 및/또는 치료, 신경세포 보호, 및/또는 신경세포 재생 (또는 생성)을 위한 병용투여용 키트를 제공한다. 상기 병용투여용 약학 조성물 또는 키트에 포함된 참당귀 추출물과 미나리 추출물은 함께 제형화된 형태(예컨대 혼합물 형태)이거나, 각각 제형화되어 하나의 투여 단위(dosage unit)에 포함된 형태일 수 있다. 다른 예는 참당귀 추출물을 허혈성 뇌질환의 예방 및/또는 치료, 신경세포 보호, 및/또는 신경세포 재생 (또는 생성)을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계 및 미나리 추출물을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 허혈성 뇌질환의 예방 및/또는 치료 방법, 신경세포 보호 방법, 및/또는 신경세포 재생 (또는 생성) 방법을 제공한다. 상기 참당귀 추출물의 투여 단계와 미나리 추출물의 투여 단계는 동시 또는 순서에 무관하게 이시적으로 수행될 수 있다.
상기 참당귀 추출물은 참당귀(예컨대, 뿌리)를 물 및 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 추출용매로 추출하여 얻어진 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 참당귀 추출물은 참당귀 (예컨대, 뿌리)의 40 내지 100%(v/v), 50 내지 100%(v/v), 60 내지 100%(v/v), 70 내지 100%(v/v), 80 내지 100%(v/v), 90 내지 100%(v/v), 92 내지 100%(v/v), 95 내지 100%(v/v), 96 내지 100%(v/v), 97 내지 100%(v/v), 또는 98 내지 100%(v/v) 에탄올 수용액 (예컨대, 98%(v/v) 에탄올 수용액(주정)) 추출물일 수 있다. 또한, 상기 참당귀 추출물은 10 내지 80℃, 10 내지 70℃, 10 내지 60℃, 10 내지 50℃, 20 내지 80℃, 20 내지 70℃, 20 내지 60℃, 20 내지 50℃, 30 내지 80℃, 30 내지 70℃, 30 내지 60℃, 30 내지 50℃, 40 내지 80℃, 40 내지 70℃, 40 내지 60℃, 또는 40 내지 50℃에서 추출된 것일 수 있다.
상기 미나리 추출물은 미나리, 예컨대, 꽃, 줄기, 잎, 전초 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 부위를 물 및 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 추출용매로 추출하여 얻어진 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 미나리 추출물은 미나리 (예컨대, 꽃, 줄기, 잎, 및/또는 전초 등)의 10 내지 80%(v/v), 10 내지 70%(v/v), 10 내지 65%(v/v), 10 내지 60%(v/v), 10 내지 55%(v/v), 10 내지 52%(v/v), 10 내지 50%(v/v), 10 내지 49%(v/v), 10 내지 48%(v/v), 10 내지 47%(v/v), 10 내지 46%(v/v), 10 내지 45%(v/v), 20 내지 80%(v/v), 20 내지 70%(v/v), 20 내지 65%(v/v), 20 내지 60%(v/v), 20 내지 55%(v/v), 20 내지 52%(v/v), 20 내지 50%(v/v), 20 내지 49%(v/v), 20 내지 48%(v/v), 20 내지 47%(v/v), 20 내지 46%(v/v), 20 내지 45%(v/v), 30 내지 80%(v/v), 30 내지 70%(v/v), 30 내지 65%(v/v), 30 내지 60%(v/v), 30 내지 55%(v/v), 30 내지 52%(v/v), 30 내지 50%(v/v), 30 내지 49%(v/v), 30 내지 48%(v/v), 30 내지 47%(v/v), 30 내지 46%(v/v), 또는 30 내지 45%(v/v)의 에탄올 추출물일 수 있다. 또한, 상기 미나리 추출물은, 유효성분 함량추출에 유리하도록, 추출시의 pH를 예컨대, 8 내지 10, 8.5 내지 10, 8.8 내지 10, 8 내지 9.5, 8.5 내지 9.5, 8.8 내지 9.5, 8 내지 9.2, 8.5 내지 9.2, 또는 8.8 내지 9.2로 조절하여 얻어진 것일 수 있다. 미나리를 상기 pH 범위에서 추출함으로써, 추출물 내의 유효성분 함량이 높은 추출물을 얻을 수 있다. 상기 추출 pH는 미나리에 추출용매와 함께 pH 조절제를 첨가하여 조절할 수 있다. 일 예에서, 상기 pH 조절제는 수산화나트륨, 수산화칼슘, 수산화칼륨 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, pH를 상기한 범위로 조절할 수 있는 모든 물질들 중에서 선택될 수 있다. 또한, 상기 미나리 추출물은 30 내지 100℃, 30 내지 98℃, 30 내지 95℃, 30 내지 94℃, 30 내지 93℃, 30 내지 92℃, 30 내지 91℃, 30 내지 90℃, 50 내지 100℃, 50 내지 98℃, 50 내지 95℃, 50 내지 94℃, 50 내지 93℃, 50 내지 92℃, 50 내지 91℃, 50 내지 90℃, 70 내지 100℃, 70 내지 98℃, 70 내지 95℃, 70 내지 94℃, 70 내지 93℃, 70 내지 92℃, 70 내지 91℃, 70 내지 90℃, 75 내지 100℃, 75 내지 98℃, 75 내지 95℃, 75 내지 94℃, 75 내지 93℃, 75 내지 92℃, 75 내지 91℃, 75 내지 90℃, 80 내지 100℃, 80 내지 98℃, 80 내지 95℃, 80 내지 94℃, 80 내지 93℃, 80 내지 92℃, 80 내지 91℃, 80 내지 90℃, 85 내지 100℃, 85 내지 98℃, 85 내지 95℃, 85 내지 94℃, 85 내지 93℃, 85 내지 92℃, 85 내지 91℃, 85 내지 90℃, 90 내지 100℃, 90 내지 98℃ 또는 90 내지 95℃에서 추출된 것일 수 있다.
상기 참당귀 및 미나리 혼합물의 추출물은 참당귀(뿌리)와 미나리 (꽃, 줄기, 잎, 전초 등)의 혼합물을 물 및 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 추출용매로 추출하여 얻어진 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 참당귀 및 미나리의 혼합 추출물은,
(1) (i) 참당귀 (뿌리)의 40 내지 100%(v/v), 50 내지 100%(v/v), 60 내지 100%(v/v), 70 내지 100%(v/v), 80 내지 100%(v/v), 90 내지 100%(v/v), 92 내지 100%(v/v), 95 내지 100%(v/v), 96 내지 100%(v/v), 97 내지 100%(v/v), 또는 98 내지 100%(v/v) 에탄올 수용액 (예컨대, 98%(v/v) 에탄올 수용액(주정)) 추출물과 (ii) 미나리 (예컨대, 꽃, 줄기, 잎, 전초 등)의 10 내지 80%(v/v), 10 내지 70%(v/v), 10 내지 65%(v/v), 10 내지 60%(v/v), 10 내지 55%(v/v), 10 내지 52%(v/v), 10 내지 50%(v/v), 10 내지 49%(v/v), 10 내지 48%(v/v), 10 내지 47%(v/v), 10 내지 46%(v/v), 10 내지 45%(v/v), 20 내지 80%(v/v), 20 내지 70%(v/v), 20 내지 65%(v/v), 20 내지 60%(v/v), 20 내지 55%(v/v), 20 내지 52%(v/v), 20 내지 50%(v/v), 20 내지 49%(v/v), 20 내지 48%(v/v), 20 내지 47%(v/v), 20 내지 46%(v/v), 20 내지 45%(v/v), 30 내지 80%(v/v), 30 내지 70%(v/v), 30 내지 65%(v/v), 30 내지 60%(v/v), 30 내지 55%(v/v), 30 내지 52%(v/v), 30 내지 50%(v/v), 30 내지 49%(v/v), 30 내지 48%(v/v), 30 내지 47%(v/v), 30 내지 46%(v/v), 또는 30 내지 45%(v/v)의 에탄올 수용액 (예컨대, 50%(v/v) 에탄올 수용액) 추출물(임의로, pH 8 내지 10, 8.5 내지 10, 8.8 내지 10, 8 내지 9.5, 8.5 내지 9.5, 8.8 내지 9.5, 8 내지 9.2, 8.5 내지 9.2, 또는 8.8 내지 9.2 조건에서 추출된 추출물)의 혼합물, 또는
(2) 참당귀 (뿌리) 및 미나리 (예컨대, 종자, 새싹, 꽃, 전초 등)의 혼합물의 40 내지 100%(v/v), 45 내지 100%(v/v), 48 내지 100%(v/v), 50 내지 100%(v/v), 60 내지 100%(v/v), 70 내지 100%(v/v), 80 내지 100%(v/v), 90 내지 100%(v/v), 92 내지 100%(v/v), 96 내지 100%(v/v), 또는 98 내지 100%(v/v) 에탄올 수용액 추출물
(3) 또는 이들의 조합
일 수 있다.
상기 참당귀 추출물과 미나리 추출물의 혼합물 중의 참당귀 추출물은 10 내지 80℃, 10 내지 70℃, 10 내지 60℃, 10 내지 50℃, 20 내지 80℃, 20 내지 70℃, 20 내지 60℃, 20 내지 50℃, 30 내지 80℃, 30 내지 70℃, 30 내지 60℃, 30 내지 50℃, 40 내지 80℃, 40 내지 70℃, 40 내지 60℃, 또는 40 내지 50℃에서 추출된 것일 수 있고; 및/또는 미나리 추출물은 30 내지 100℃, 30 내지 98℃, 30 내지 95℃, 30 내지 94℃, 30 내지 93℃, 30 내지 92℃, 30 내지 91℃, 30 내지 90℃, 50 내지 100℃, 50 내지 98℃, 50 내지 95℃, 50 내지 94℃, 50 내지 93℃, 50 내지 92℃, 50 내지 91℃, 50 내지 90℃, 70 내지 100℃, 70 내지 98℃, 70 내지 95℃, 70 내지 94℃, 70 내지 93℃, 70 내지 92℃, 70 내지 91℃, 70 내지 90℃, 75 내지 100℃, 75 내지 98℃, 75 내지 95℃, 75 내지 94℃, 75 내지 93℃, 75 내지 92℃, 75 내지 91℃, 75 내지 90℃, 80 내지 100℃, 80 내지 98℃, 80 내지 95℃, 80 내지 94℃, 80 내지 93℃, 80 내지 92℃, 80 내지 91℃, 80 내지 90℃, 85 내지 100℃, 85 내지 98℃, 85 내지 95℃, 85 내지 94℃, 85 내지 93℃, 85 내지 92℃, 85 내지 91℃, 85 내지 90℃, 90 내지 100℃, 90 내지 98℃ 또는 90 내지 95℃에서 추출된 것일 수 있다. 또한, 상기 참당귀 및 미나리의 혼합물의 추출물은 10 내지 80℃, 10 내지 70℃, 10 내지 60℃, 10 내지 50℃, 20 내지 80℃, 20 내지 70℃, 20 내지 60℃, 20 내지 50℃, 30 내지 80℃, 30 내지 70℃, 30 내지 60℃, 30 내지 50℃, 40 내지 80℃, 40 내지 70℃, 40 내지 60℃, 또는 40 내지 50℃에서 추출된 것일 수 있다.
상기 참당귀 추출물과 미나리 혼합 추출물 내의 참당귀 추출물과 미나리 추출물의 혼합비 또는 참당귀와 미나리 혼합물 내의 참당귀와 미나리의 혼합비는 1:0.1 내지 10, 1:0.1 내지 5, 1:0.1 내지 4, 1:0.1 내지 3, 1:0.1 내지 2, 1:0.1 내지 1.5, 1:0.1 내지 1.2, 1:0.5 내지 10, 1:0.5 내지 5, 1:0.5 내지 4, 1:0.5 내지 3, 1:0.5 내지 2, 1:0.5 내지 1.5, 1:0.5 내지 1.2, 1:0.8 내지 10, 1:0.8 내지 5, 1:0.8 내지 4, 1:0.8 내지 3, 1:0.8 내지 2, 1:0.8 내지 1.5, 1:0.8 내지 1.2, 또는 1:0.9 내지 1.1 (이상, 참당귀 중량 또는 참당귀 추출물의 고형분 중량:미나리 중량 또는 미나리 추출물의 고형분 중량)일 수 있다. 상기 고형분 중량은 추출물의 용매 성분을 제거하고 남은 고형물의 중량을 의미한다. 이는 상기 혼합물이 참당귀 추출물과 미나리 추출물의 혼합물인 경우, 상기 혼합비가 추출물의 성상 및/또는 농도에 영향을 받지 않도록 추출용매를 제거한 유효성분 중량 간 비율을 의미함을 나타내기 위하여 사용된 용어이다.
상기 약학 조성물 내의 유효성분으로서 포함된 참당귀와 미나리의 혼합 추출물은 건조물, 농축물, 또는 농축 건조물 형태일 수 있다.
상기 약학 조성물 내의 유효성분으로서 포함된 참당귀와 미나리의 혼합 추출물의 함량은 사용 형태 및 목적, 환자 상태, 증상의 종류 및 경중 등에 의하여 적절하게 조절할 수 있으며, 고형분 중량 기준으로 0.001 내지 99.9 중량%, 0.01 내지 99.9 중량%, 0.1 내지 99.9 중량%, 1 내지 99.9 중량%, 10 내지 99.9 중량%, 30 내지 99.9 중량%, 40 내지 99.9 중량%, 50 내지 99.9 중량%, 0.001 내지 90 중량%, 0.01 내지 90 중량%, 0.1 내지 90 중량%, 1 내지 90 중량%, 10 내지 90 중량%, 30 내지 90 중량%, 40 내지 90 중량%, 50 내지 90 중량%, 0.001 내지 70 중량%, 0.01 내지 70 중량%, 0.1 내지 70 중량%, 1 내지 70 중량%, 10 내지 70 중량%, 30 내지 70 중량%, 40 내지 70 중량%, 50 내지 70 중량%, 0.001 내지 50 중량%, 0.01 내지 50 중량%, 0.1 내지 50 중량%, 1 내지 50 중량%, 10 내지 50 중량%, 30 내지 50 중량%, 또는 40 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 고형분 중량이라 함은 앞서 설명한 바와 같이 추출물에서 용매 성분을 제거한 고형물의 중량을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바로서, 허혈성 뇌질환은 뇌혈관이 막혀서 발생하는 뇌혈류 차단, 이로 인한 뇌손상 (예컨대, 신경세포의 사멸, 감소, 기능 저하 또는 기능 소실 등에 의한 손상 등)에 의하여 발생하는 질병으로, 막힌 뇌혈관 위치 또는 손상된 뇌 부위에 따라서, 운동조절능력 상실 (전신 또는 국부 마비), 언어장애, 시야장애, 어지러움증, 의실 소실 등의 증상을 보이는 모든 질병들 중에서 선택된 것일 수 있다. 상기 허혈성 뇌질환은 허혈성 뇌혈관질환 및 허혈성 뇌신경질환 (퇴행성 신경질환)들 중에서 선택될 수 있으며, 예컨대, 뇌졸중 (예컨대, 뇌경색 또는 뇌출혈), 고혈압, 치매 (예컨대, 혈관성 치매 등), 파키슨병, 헌팅턴병, 루게릭병 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한, 본 명세서 사용된 바로서, 신경세포 보호, 및/또는 신경세포 재생 (또는 생성)은 뇌허혈에 의한 신경 세포 손상으로부터의 신경 세포 보호 및/또는 손상된 신경 세포의 재생을 의미하는 것일 수 있다. 상기 신경 세포는 뇌 (예컨대, 해마 (e.g., CA1 영역 등))의 신경 세포일 수 있으며, 예컨대, 뉴런, 신경아교세포 (예컨대, 별아교세포(astrocyte), 미세아교세포(microglia), 희돌기아교세포 (oligodendrocyte) 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 인간, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 염소, 토끼, 마우스, 래트 등을 포함하는 포유동물 또는 이로부터 분리된 세포, 조직, 또는 이의 배양물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예컨대, 경구 투여, 또는 정맥 투여, 근육 투여, 피하 투여, 복막내 투여, 병변 부위 (예컨대, 뇌, 척수 등) 국소 투여와 같은 비경구 투여일 수 있다. 상기 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 경피제, 좌제, 멸균 주사용액의 형태의 비경구 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 상기 추출물 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제, 및/또는 희석제 등의 보조제를 추가로 함유하는 것일 수 있다. 상기 담체, 부형제, 또는 희석제의 예로서 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 시럽제, 분말제, 현탁제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제, 경피제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 상기 약학적 조성물의 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 투여 용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다. 예컨대, 약학 조성물의 1회 또는 1일 투여량은 유효성분 (참당귀와 미나리의 혼합 추출물)의 고형분 중량 기준으로 0.0001 내지 10000㎎/kg, 구체적으로, 0.001 내지 1000㎎/kg, 0.001 내지 500㎎/kg, 0.001 내지 300㎎/kg, 0.001 내지 250㎎/kg, 0.01 내지 1000㎎/kg, 0.01 내지 500㎎/kg, 0.01 내지 300㎎/kg, 0.01 내지 250㎎/kg, 0.1 내지 1000㎎/kg, 0.1 내지 500㎎/kg, 0.1 내지 300㎎/kg, 0.1 내지 250㎎/kg, 1 내지 1000㎎/kg, 1 내지 500㎎/kg, 1 내지 300㎎/kg, 1 내지 250㎎/kg, 10 내지 1000㎎/kg, 10 내지 500㎎/kg, 10 내지 300㎎/kg, 또는 10 내지 250㎎/kg 범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1회 또는 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 상기한 투여량은 평균적인 경우를 예시한 것으로서 개인적인 차이에 따라 그 투여량이 높거나 낮을 수 있다.
다른 예는 참당귀 및 미나리의 혼합 추출물을 제조하는 단계를 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방, 치료 및/또는 개선 효과를 갖는 조성물의 제조 방법을 제공한다.
참당귀 및 미나리의 혼합 추출물을 제조하는 단계는 1) 참당귀 추출물과 미나리 추출물을 혼합하는 단계, 또는 2) 참당귀와 미나리를 혼합한 혼합물을 추출 용매로 추출하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 추출하는 단계에 사용된 추출 용매 및 추출 온도는 앞서 참당귀 및 미나리 혼합 추출물에 대한 설명을 참조할 수 있다.
예컨대, 상기 1) 참당귀 추출물과 미나리 추출물을 혼합하는 단계는
i) 참당귀 (예컨대, 뿌리)를, 10 내지 80℃, 10 내지 70℃, 10 내지 60℃, 10 내지 50℃, 20 내지 80℃, 20 내지 70℃, 20 내지 60℃, 20 내지 50℃, 30 내지 80℃, 30 내지 70℃, 30 내지 60℃, 30 내지 50℃, 40 내지 80℃, 40 내지 70℃, 40 내지 60℃, 또는 40 내지 50℃에서, 1 내지 10 부피배, 2 내지 8 부피배, 또는 4 내지 6 부피배의 물 및 탄소수 1-4의 직쇄 또는 분지형 알코올 (예컨대, 에탄올)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 예컨대, 40 내지 100%(v/v), 50 내지 100%(v/v), 60 내지 100%(v/v), 70 내지 100%(v/v), 80 내지 100%(v/v), 90 내지 100%(v/v), 92 내지 100%(v/v), 95 내지 100%(v/v), 96 내지 100%(v/v), 97 내지 100%(v/v), 또는 98 내지 100%(v/v) 에탄올 수용액 (예컨대, 98%(v/v) 에탄올 수용액(주정))으로 추출하는 단계,
ii) 미나리 (예컨대, 꽃, 줄기, 잎, 전초 등)를, 10 내지 80℃, 10 내지 70℃, 10 내지 60℃, 10 내지 50℃, 20 내지 80℃, 20 내지 70℃, 20 내지 60℃, 20 내지 50℃, 30 내지 80℃, 30 내지 70℃, 30 내지 60℃, 30 내지 50℃, 30 내지 45℃, 35 내지 60℃, 35 내지 50℃, 35 내지 45℃, 35 내지 60℃, 35 내지 50℃, 또는 35 내지 45℃에서, 1 내지 10 부피배, 2 내지 8 부피배, 또는 4 내지 6 부피배의 물 및 탄소수 1-4의 직쇄 또는 분지형 알코올 (예컨대, 에탄올)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 예컨대, 10 내지 80%(v/v), 10 내지 70%(v/v), 10 내지 65%(v/v), 10 내지 60%(v/v), 10 내지 55%(v/v), 10 내지 52%(v/v), 10 내지 50%(v/v), 10 내지 49%(v/v), 10 내지 48%(v/v), 10 내지 47%(v/v), 10 내지 46%(v/v), 10 내지 45%(v/v), 20 내지 80%(v/v), 20 내지 70%(v/v), 20 내지 65%(v/v), 20 내지 60%(v/v), 20 내지 55%(v/v), 20 내지 52%(v/v), 20 내지 50%(v/v), 20 내지 49%(v/v), 20 내지 48%(v/v), 20 내지 47%(v/v), 20 내지 46%(v/v), 20 내지 45%(v/v), 30 내지 80%(v/v), 30 내지 70%(v/v), 30 내지 65%(v/v), 30 내지 60%(v/v), 30 내지 55%(v/v), 30 내지 52%(v/v), 30 내지 50%(v/v), 30 내지 49%(v/v), 30 내지 48%(v/v), 30 내지 47%(v/v), 30 내지 46%(v/v), 또는 30 내지 45%(v/v)의 에탄올 수용액 (예컨대, 50%(v/v) 에탄올 수용액)으로 추출하는 단계, 및
iii) 상기 단계 i)에서 추출된 참당귀 추출물과 단계 ii)에서 추출된 미나리 추출물을 혼합하는 단계
를 포함할 수 있다.
상기 단계 ii)의 미나리 추출물 제조 단계는, 임의로, 미나리와 추출용매의 혼합물의 pH를 8 내지 10, 8.5 내지 10, 8.8 내지 10, 8 내지 9.5, 8.5 내지 9.5, 8.8 내지 9.5, 8 내지 9.2, 8.5 내지 9.2, 또는 8.8 내지 9.2로 조절하여 수행하는 것일 수 있으며, 상기 pH는 통상의 pH 조절제를 첨가하여 조절할 수 있으며, 상기 pH 조절제는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단계 i)의 참당귀 추출물 제조 단계와 단계 ii)의 미나리 추출물 제조 단계는 동시 또는 순서에 상관없이 이시적으로 진행될 수 있다.
상기 2) 참당귀와 미나리를 혼합한 혼합물을 추출 용매로 추출하는 단계는 i') 참당귀 (뿌리)와 미나리(예컨대, 종자, 새싹, 꽃, 전초 등)를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계, 및 ii') 상기 혼합물을, 10 내지 80℃, 10 내지 70℃, 10 내지 60℃, 10 내지 50℃, 20 내지 80℃, 20 내지 70℃, 20 내지 60℃, 20 내지 50℃, 30 내지 80℃, 30 내지 70℃, 30 내지 60℃, 30 내지 50℃, 40 내지 80℃, 40 내지 70℃, 40 내지 60℃, 또는 40 내지 50℃에서, 1 내지 10 부피배, 2 내지 8 부피배, 또는 4 내지 6 부피배의 물 및 탄소수 1-4의 직쇄 또는 분지형 알코올 (예컨대, 에탄올)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 예컨대, 40 내지 100%(v/v), 45 내지 100%(v/v), 48 내지 100%(v/v), 50 내지 100%(v/v), 60 내지 100%(v/v), 70 내지 100%(v/v), 80 내지 100%(v/v), 90 내지 100%(v/v), 92 내지 100%(v/v), 95 내지 100%(v/v), 96 내지 100%(v/v), 97 내지 100%(v/v), 또는 98 내지 100%(v/v) 에탄올 수용액으로 추출하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 참당귀 추출물과 미나리 추출물의 혼합비 또는 참당귀와 미나리의 혼합비는 앞서 설명한 바와 같다.
상기한 참당귀 및/또는 미나리의 추출 단계의 추출 시간은 추출이 충분히 이루어질 수 있는 시간이면 족하고, 1시간 이상, 2시간 이상, 3시간 이상, 또는 4시간 이상, 예컨대, 1 내지 24시간, 2 내지 24시간, 3 내지 24시간, 4 내지 24시간, 1 내지 12시간, 2 내지 12시간, 3 내지 12시간, 4 내지 12시간, 1 내지 6시간, 2 내지 6시간, 3 내지 6시간, 또는 4 내지 6시간 정도로 설정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 방법에 사용된 추출 과정은 통상적으로 사용되는 모든 추출 방법에 의하여 수생될 수 있으며, 예컨대, 열수 추출, 초음파 추출, 환류 추출법 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 방법은 상기 추출 과정 이후에, 임의로 추출물을 통상적인 방법으로 건조 및/또는 농축하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
다른 예는 참당귀 추출물, 또는 참당귀와 미나리의 혼합 추출물을 함유하는 허혈성 뇌질환 예방 및/또는 개선용, 신경세포 보호용, 및/또는 신경세포 재생 (또는 생성)용 건강 기능성 식품을 제공한다.
상기 건강 기능성 식품은 일상 식사에서 결핍되기 쉬운 영양소나 인체에 유용한 기능을 가진 원료나 성분(이하, '기능성 원료')을 사용하여 제조한 식품으로, 건강을 유지하거나 소정의 질병 또는 증상을 예방 및/또는 개선하는데 도움을 주는 모든 식품을 의미하며, 최종 제품 형태에는 특별한 제한이 없다. 예컨대, 상기 건강 기능성 식품은 각종 식품, 음료 조성물, 식품 첨가제 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 건강 기능성 식품에 함유된 참당귀 추출물 또는 참당귀와 미나리의 혼합 추출물의 함량은 식품의 형태, 소망하는 용도 등에 따라 적절하게 특별한 제한이 없으며, 예컨대, 전체 식품 중량의 0.001 내지 99 중량%, 0.01 내지 99 중량%, 0.01 내지 95 중량%, 0.01 내지 90 중량%, 0.01 내지 80 중량%, 0.01 내지 50 중량%, 0.1 내지 99 중량%, 0.1 내지 95 중량%, 0.1 내지 90 중량%, 0.1 내지 80 중량%, 0.1 내지 50 중량%, 0.1 내지 30 중량%, 0.1 내지 10 중량%, 1 내지 99 중량%, 1 내지 95 중량%, 1 내지 90 중량%, 1 내지 80 중량%, 1 내지 50 중량%, 1 내지 30 중량%, 1 내지 10 중량%, 10 내지 99 중량%, 10 내지 95 중량%, 10 내지 90 중량%, 10 내지 80 중량%, 10 내지 50 중량%, 10 내지 30 중량%, 25 내지 99 중량%, 25 내지 95 중량%, 25 내지 90 중량%, 25 내지 80 중량%, 25 내지 50 중량%, 25 내지 30 중량%, 40 내지 99 중량%, 40 내지 95 중량%, 40 내지 90 중량%, 40 내지 80 중량%, 40 내지 50 중량%, 50 내지 99 중량%, 50 내지 95 중량%, 50 내지 90 중량%, 50 내지 80 중량%, 60 내지 99 중량%, 60 내지 95 중량%, 60 내지 90 중량%, 또는 60 내지 80 중량%일 수 있다.
상기 건강 기능성 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 또는 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 또는 그의 염, 알긴산 또는 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 함유할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 전체 건강 기능성 식품 100 중량부 당 0.001 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
참당귀 및 미나리의 혼합 추출물의 뇌허혈에 의한 신경세포 손상으로부터의 보호 효과와 손상된 신경세포 재생 (또는 생성) 효과를 제안함으로써, 허혈성 뇌질환의 예방과 치료 모두에 있어서 우수한 효과를 갖는 새로운 치료법을 제안한다.
도 1은 일 실시예에 따른 미나리 추출물 200 mg/kg, 참당귀 추출물 200 mg/kg, 또는 혼합 추출물 200 mg/kg (참당귀 추출물 100 mg/kg + 미나리 추출물 100 mg/kg)의 허혈성 뇌질환 예방 효과를 알아보기 위하여, 이들 추출물을 투여한 후 뇌허혈을 유발하여 5일이 경과된 실험동물의 해마 조직과 해마 조직의 CA1 영역을 크레질 바이올렛(cresyl violet, CV)으로 염색하여 촬영한 사진이다.
도 2a는 일 실시예에 따른 미나리 추출물 200 mg/kg, 참당귀 추출물 200 mg/kg, 또는 혼합 추출물 200 mg/kg (참당귀 추출물 100 mg/kg + 미나리 추출물 100 mg/kg)의 허혈성 뇌질환 예방 효과를 알아보기 위하여, 이들 추출물을 투여한 후 뇌허혈을 유발하여 5일이 경과된 실험동물의 해마의 CA1 영역을 신경세포에 대한 표지자인 마우스 항-neuronal nuclei (NeuN)항체를 이용하여 면역조직화학(immunohistochemistry)으로 염색하여 촬영한 사진이고, 2b는 NeuN 항체에 면역반응성(immunoreactivity)이 있는 신경세포를 계수하여 나타낸 그래프이다.
도 3a는 일 실시예에 따른 미나리 추출물 200 mg/kg, 참당귀 추출물 200 mg/kg, 또는 혼합 추출물 200 mg/kg (참당귀 추출물 100 mg/kg + 미나리 추출물 100 mg/kg)의 허혈성 뇌질환 예방 효과를 알아보기 위하여, 이들 추출물을 투여한 후 뇌허혈을 유발하여 5일이 경과된 실험동물의 해마의 CA1 영역을 사멸 또는 사멸 과정 중에 있는 신경세포에 대한 표지자인 플루오르-제이드 B (fluoro-jade b, F-J B)로 염색하여 촬영한 사진이고, 3b는 F-J B에 양성 반응을 보이는 세포를 계수하여 나타낸 그래프이다.
도 4a는 일 실시예에 따른 미나리 추출물 200 mg/kg, 참당귀 추출물 200 mg/kg, 또는 혼합 추출물 200 mg/kg (참당귀 추출물 100 mg/kg + 미나리 추출물 100 mg/kg)의 허혈성 뇌질환 예방 효과를 알아보기 위하여, 이들 추출물의 투여한 후 뇌허혈을 유발하여 5일이 경과된 실험동물의 해마의 CA1 영역을 별아교세포(astrocyte)에 대한 표지자인 마우스 항-glial fibrillary acidic protein (GFAP)항체를 이용하여 면역조직화학으로 염색하여 촬영한 사진이고, 4b는 GFAP 항체에 염색된 세포들의 면역반응성을 정상군(vehicle-sham)에 대한 상대적 수치로 나타낸 그래프이다.
도 5a는 일 실시예에 따른 미나리 추출물 200 mg/kg, 참당귀 추출물 200 mg/kg, 또는 혼합 추출물 200 mg/kg (참당귀 추출물 100 mg/kg + 미나리 추출물 100 mg/kg)의 허혈성 뇌질환 예방 효과를 알아보기 위하여, 이들 추출물을 투여한 후 뇌허혈을 유발하여 5일이 경과된 실험동물의 해마의 CA1 영역을 미세아교세포(microglia)에 대한 표지자인 래빗 항-ionized calcium-binding adapter molecule 1 (Iba-1)항체를 이용하여 면역조직화학으로 염색하여 촬영한 사진이고, 5b는 Iba-1 항체에 염색된 세포들의 면역반응성을 정상군에 대한 상대적 수치로 나타낸 그래프이다.
도 2a는 일 실시예에 따른 미나리 추출물 200 mg/kg, 참당귀 추출물 200 mg/kg, 또는 혼합 추출물 200 mg/kg (참당귀 추출물 100 mg/kg + 미나리 추출물 100 mg/kg)의 허혈성 뇌질환 예방 효과를 알아보기 위하여, 이들 추출물을 투여한 후 뇌허혈을 유발하여 5일이 경과된 실험동물의 해마의 CA1 영역을 신경세포에 대한 표지자인 마우스 항-neuronal nuclei (NeuN)항체를 이용하여 면역조직화학(immunohistochemistry)으로 염색하여 촬영한 사진이고, 2b는 NeuN 항체에 면역반응성(immunoreactivity)이 있는 신경세포를 계수하여 나타낸 그래프이다.
도 3a는 일 실시예에 따른 미나리 추출물 200 mg/kg, 참당귀 추출물 200 mg/kg, 또는 혼합 추출물 200 mg/kg (참당귀 추출물 100 mg/kg + 미나리 추출물 100 mg/kg)의 허혈성 뇌질환 예방 효과를 알아보기 위하여, 이들 추출물을 투여한 후 뇌허혈을 유발하여 5일이 경과된 실험동물의 해마의 CA1 영역을 사멸 또는 사멸 과정 중에 있는 신경세포에 대한 표지자인 플루오르-제이드 B (fluoro-jade b, F-J B)로 염색하여 촬영한 사진이고, 3b는 F-J B에 양성 반응을 보이는 세포를 계수하여 나타낸 그래프이다.
도 4a는 일 실시예에 따른 미나리 추출물 200 mg/kg, 참당귀 추출물 200 mg/kg, 또는 혼합 추출물 200 mg/kg (참당귀 추출물 100 mg/kg + 미나리 추출물 100 mg/kg)의 허혈성 뇌질환 예방 효과를 알아보기 위하여, 이들 추출물의 투여한 후 뇌허혈을 유발하여 5일이 경과된 실험동물의 해마의 CA1 영역을 별아교세포(astrocyte)에 대한 표지자인 마우스 항-glial fibrillary acidic protein (GFAP)항체를 이용하여 면역조직화학으로 염색하여 촬영한 사진이고, 4b는 GFAP 항체에 염색된 세포들의 면역반응성을 정상군(vehicle-sham)에 대한 상대적 수치로 나타낸 그래프이다.
도 5a는 일 실시예에 따른 미나리 추출물 200 mg/kg, 참당귀 추출물 200 mg/kg, 또는 혼합 추출물 200 mg/kg (참당귀 추출물 100 mg/kg + 미나리 추출물 100 mg/kg)의 허혈성 뇌질환 예방 효과를 알아보기 위하여, 이들 추출물을 투여한 후 뇌허혈을 유발하여 5일이 경과된 실험동물의 해마의 CA1 영역을 미세아교세포(microglia)에 대한 표지자인 래빗 항-ionized calcium-binding adapter molecule 1 (Iba-1)항체를 이용하여 면역조직화학으로 염색하여 촬영한 사진이고, 5b는 Iba-1 항체에 염색된 세포들의 면역반응성을 정상군에 대한 상대적 수치로 나타낸 그래프이다.
이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당 업자들에게 있어 자명하다.
실시예
1: 추출물의 제조
1.1. 참당귀 추출물의 제조
참당귀(Angelica gigas Nakai) 뿌리를 깨끗한 물을 이용하여 세척한 후 충분히 건조하였다. 건조된 참당귀 뿌리를 파쇄하고 얻은 분말 100g에 5 부피배(500ml)의 에탄올 (98%(v/v) 에탄올(주정))을 첨가하고, 40~60℃ 에서 4 시간 이상 추출한 후, 1um(micrometer) 필터로 여과한 여액을 원래 중량의 10%(w/w)가 될 때까지 가온 농축하였다. 상기 얻어진 농축물에 결정셀룰로오스를 서서히 가하면서 계속 농축하여 완전히 건조시킨 후 분말화하여 참당귀 에탄올 추출물 분말을 준비하였다 (이하, AGE라고 명명함).
1.2. 미나리 추출물의 제조
강원도 춘천시에서 채취한 미나리(Oenanthe javanica) 700 g을 세절한 후 50% 또는 그 이하 농도의 에탄올 수용액 3.5 L에 묽은 NaOH를 가해 PH 9로 맞춘 용매를 환류냉각기를 부착한 추출기에서 90℃로 24시간씩 3회 반복추출 하였다. 이 추출물을 감압여과장치를 이용하여 Whatman No. 1(Whatman Ltd, Maidstone, Kent, UK)여과지를 이용하여 여과하였고, 여과액은 회전진공농축기 (EYELA, SN-1100, Tokyo, Japan)를 사용하여 50℃에서 감압농축 하였다. 농축된 추출물은 동결건조기(PVTFA 10AT, ILSIN, Korea)를 이용하여 -70℃에서 급속 동결 과정을 거쳐 분말 상태의 미나리 추출물을 준비하였다 (이하, OJE라고 명명함).
실시예
2: 참당귀와 미나리의 혼합 추출물의
뇌허혈시
신경세포 보호 효과 확인
상기 실시예 1에서 제조된 참당귀 추출물, 미나리 추출물, 또는 이들의 혼합물 (참당귀와 미나리의 혼합 추출물)의 신경세포 보호효능을 확인하기 위하여, 체중 65g 내지 75g인 수컷 몽골리안 저빌(Mongolian gerbil, Halan, USA)을 마취 시켜 온목동맥(common carotid artery)을 노출시킨 뒤 결찰하여, 뇌허혈을 유발시킨 몽골리안 저빌의 해마조직을 염색하여 관찰하였다. 몽골리안 저빌은 신경세포사와 관련하여 주로 사용되는 동물모델로서, 몽골리안 저빌의 양측 온목 동맥을 5분간 결찰시키면, 사람에서와 유사한 뇌허혈을 일으킬 수 있다. 몽골리안 저빌에 뇌허혈을 유발시키면 4일 뒤에 특징적으로 해마 CA1 영역에서 세포사가 일어나는 것을 관찰할 수 있는데, 상기 현상으로부터 지연성 신경세포사(delayed neuronal death)가 발생하였음이 확인된다.
실시예
2-1. 실험동물의 사육
체중 65g 내지 75g의 수컷 몽골리안 저빌(Mongolian gerbil, Meriones unguiculatus, Halan, USA) 56마리를 오전 7시부터 오후 7시까지 빛을 가하는 일정한 명암주기, 21℃ 내지 25℃의 온도 및 45% 내지 65%의 상대습도의 조건에서 사육하였다. 실험동물의 사료는 일반적인 펠렛건조 사료(대한실험동물, 대한민국)를 사용하였고, 사료와 물은 상시로 섭취할 수 있게 하였다.
실시예
2-2. 추출물 투여 후
뇌혀혈
유도된 뇌조직 절편 준비
상기 실시예 2-1에서 사육한 실험동물에게 상기 실시예 1에서 제조된 참당귀 추출물, 미나리 추출물, 또는 이들의 혼합물 (참당귀와 미나리의 혼합 추출물)을 각 실험동물의 체중 1 kg당 총 200 mg의 용량이 되도록 (혼합물의 경우, 참당귀 추출물 100 mg/kg + 미나리 추출물 100 mg/kg) (1일 투여량)생리식염수에 녹여 28일동안 존데(sonde)를 이용하여 경구투여 하였다.
상기 28일간 추출물을 투여한 후에, 질소와 산소가 7:3의 비율로 혼합된 가스에 3%(v/v) 이소플루란(isoflurane, Baxtor, USA)을 혼합한 가스를 이용하여 실험동물을 전신마취 하였다. 상기의 질소와 산소 혼합 가스에 2.5%(v/v) 이소플루란을 혼합한 가스를 이용하여 실험동물의 마취상태를 유지하면서 실험동물에 대한 수술을 수행하였다.
뇌허혈을 일으키기 위하여, 실험동물의 목 부위의 털을 깎고 소독한 다음 절개를 하여 양쪽 온목동맥을 노출시키고, 동맥류 클립(aneurysm clip, Staelting, USA)을 이용하여 5분 동안 결찰한 뒤, 클립을 제거하여 재관류 시켰다. 이 때, 각 실험군은 검안경(ophthalmoscope)을 이용하여 망막 중심동맥(central artery of retina)의 혈액 순환 여부를 관찰하여 완전한 온목동맥의 폐쇄를 관찰 하였다.
뇌허혈을 유발시키는 동안 직장 내 체온계를 삽입하여 체온을 측정하였으며, 실험동물의 체온에 따라 자동으로 조절되는 온열 패드를 사용하여 체온을 정상 체온인 36.8℃ 내지 37.2℃로 일정하게 유지시켰다.
뇌허혈 유발 5일 후에 티오펜탈 소듐(thiopental sodium, 유한양행, 대한민국)을 체중 1 kg 당 각각 30 mg의 용량으로 시험 동물 복강 내 주사하여 마취시킨 다음, 1,000 ㎖ 당 헤파린 1,000 IU를 함유한 4℃의 생리식염수를 좌심실로 주입하여 관류세척하였다. 상기 관류세척이 완료된 상기 동물에 대해 4℃의 4% 파라포름알데하이드(0.1 M 인산완충액(in 0.1 M phosphate buffer; PB), pH 7.4)를 이용하여 관류고정을 수행하였다.
뼈절단기를 이용하여, 관류 고정이 끝난 상기 실험동물의 머리뼈 공간을 개방하여 뇌를 적출하였다. 상기 적출된 실험동물의 뇌를 상온에서 교반기를 이용하여 4℃의 4% 파라포름알데하이드(0.1 M 인산완충액(in 0.1 M phosphate buffer; PB), pH 7.4)용액에서 4시간 동안 후고정하였다. 상기 후고정이 끝난 뇌는 30%(w/v) 수크로스 용액(in 0.1 M 인산 완충액(phosphate buffer))에 넣어 바닥에 가라앉을 때까지 침강시킨 후, 슬라이드 마이크로톰(sliding microtome, Reichert-Jung, Germany)으로 상기 뇌 조직을 30 ㎛ 두께로 잘라 조직 절편을 만들어, 하기 실시예에서 시험군으로 사용하였다. 상기 조직 절편을 보존액(storing solution)이 들어있는 6 well plate에 넣어 염색을 수행할 때까지 4℃에서 보관하였다.
대조군(vehicle)으로 상기 추출물을 녹이는데 이용된 생리식염수만을 경구투여 한 것을 제외하고는 상기와 동일한 과정을 수행하여 얻어진 조직 절편을 준비하고, 정상군(sham)으로 미나리 추출물 및/또는 참당귀 추출물을 포함한 어떠한 물질도 투여하지 않고 뇌허혈을 일으키기 위한 과정도 수행하지 않고 얻어진 조직 절편을 준비하였다.
실시예
2-3.
뇌허혈시
신경세포 보호 효능 측정 1 (
크레질
바이올렛 염색)
상기 실시예 2-2에서 준비된 조직 절편 중에서 해마형성체(hippocampal formation)가 잘 나와있는 조직을 선택하고, 조직 절편에 묻어있는 보존액을 없애기 위해 0.01M PBS (pH 7.4)로 10분씩 3회 세척하였다. 상기 세척된 조직 절편을 젤라틴이 코팅된 슬라이드 글라스에 도말하여 37℃에서 충분히 건조시켰다. 상기 조직절편을 증류수에 잠시 담가 둔 후, 2%(w/v) 크레질 바이올렛 아세테이트(cresyl violet acetate, Sigma, USA) 용액에 1분간 담가 조직 절편의 염색을 수행하였다. 이어 상기 염색한 조직 절편을 흐르는 물에 충분히 세척하여 슬라이드에 묻어 있는 과량의 염료를 제거하고, 증류수에 잠시 담근 후에 50%(v/v), 70%(v/v), 80%(v/v), 90%(v/v), 95%(v/v) 및 100%(v/v) 에탄올 용액으로 순차적으로 처리하여 탈수 및 과량의 크레질 바이올렛 세척을 수행하였다. 상기 조직 절편에서 니슬소체(Nissl body)가 보이는 것을 확인한 후, 자일렌(Junsey, 일본)에 담가 투명화한 다음 카나다 발삼(Canada balsam, Kanto, 일본)으로 봉입하였다.
정상군, 대조군, 및 실험군의 각 조직들은 디지털 카메라(Axiocam, Cal Zeiss, Germany)가 부착되어 있는 악시오M1 현미경(AxioM1 microscope, Carl Zeiss, 독일)으로 전체 해마 영역을 40배, CA1 영역을 20배로 각각 확대하여 각 조직절편들을 사진 촬영하고, 전체 해마영역을 촬영한 사진을 도 1의 A, B, C, D, E, F, G 및 H에, 해마의 CA1 영역을 촬영한 사진을 도 1의 a, b, c, d, e, f, g 및 h에 각각 나타내었다.
도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 모든 정상군(sham groups)들은 해마의 영역 전체에서 신경세포가 보라색으로 진하게 염색되었고(도 1의 A, C, E 및 G), 특히 CA1 영역에서는 피라미드층(stratum pyramidale, SP)에 신경세포가 밀집하여 있는 것을 관찰할 수 있었다 (도 1의 a, c, e 및 g). 그러나, 용매만을 투여하고 뇌허혈을 유발시킨 대조군(vehicle-ischemia)의 경우 뇌허혈에 의한 지연성 신경세포사멸로 인해 해마의 영역 중 CA1 영역에서 신경세포사멸이 일어남으로써 신경세포의 염색이 거의 관찰되지 않았고(도 1의 B), CA1 영역 중 피라미드층에 대부분의 신경세포가 소실되었음이 확인되었다(도 1의 b). 또한 200 mg/kg의 미나리 추출물 또는 200 mg/kg의 참당귀 추출물을 투여한 실험군(OJE-ischemia, AGE-ischemia)의 경우, 해마의 CA1 영역에서 대조군(vehicle-ischemia)에 비하여 크레질 바이올렛에 대한 염색성이 강하게 나타났지만, 정상군(sham) 과 비교하였을 때, 크레질 바이올렛에 대한 염색성이 다소 약하게 나타났다(도 1의 D, d, F 및 f). 반면, 100 mg/kg 의 미나리 추출물과 100 mg/kg의 참당귀 추출물을 혼합하여 투여한 실험군(OJE+AGE-ischemia)의 경우, 대조군 및 200 mg/kg의 미나리 추출물 또는 200 mg/kg의 참당귀 추출물을 투여한 실험군과 비교하였을 때 해마의 영역 전체에서 많은 수의 신경세포가 보라색으로 진하게 염색되었고(도 1의 H), CA1 영역의 피라미드층에서도 신경세포가 밀집하여 있는 것이 관찰되었다(도 1의 h). 이러한 결과는 미나리 추출물과 참당귀 추출물을 함께 투여한 경우, 동량의 미나리 추출물 또는 참당귀 추출물을 투여한 경우와 비교하여, 뇌허혈 유발에 따른 신경세포사멸을 보다 효과적으로 억제함을 보여준다.
실시예
2-4.
뇌허혈시
신경세포 보호 효능 측정 2 (면역조직화학 염색)
미나리와 참당귀 추출물의 신경세포 보호효과, 보다 구체적으로 뇌허혈에 의한 신경세포사멸을 억제하는 효과를 확인하기 위하여, 신경세포의 표지자인 NeuN에 대한 항체를 이용하여 면역조직화학염색을 수행하였다.
보다 구체적으로, 상기 실시예 2-2에서 준비된 조직 절편 중 해마형성체(hippocampal formation)가 잘 나타난 조직 절편을 선택하여 실험에 사용하였으며, 상기 선택된 조직 절편은 조직에 존재하는 보존액(storing solution)을 제거하기 위해 0.01M PBS(phosphate buffered saline)로 10분씩 3회 세척한 후 내인성 페록시다아제(endogenous peroxidase)를 제거하기 위하여 0.3% H2O2(in 0.01M PBS)에서 30분 동안 반응시켰다. 상기 반응이 끝난 조직 절편은 0.01M PBS로 10분씩 3회 세척하였다.
신경세포 염색을 위하여, 상기 과정을 거친 조직 절편을 5%의 정상 말 혈청(5% normal horse serum, in 0.01M PBS)으로 30분 동안 반응시킨 뒤, 1:800으로 희석한 1차 항체인 마우스 항-NeuN 항체(mouse anti-NeuN, Chemicon, USA)를 4℃에서 48시간 동안 반응시켰다. 상기 반응이 끝난 조직 절편은 각각 1:250으로 희석한 2차 항체인 항-마우스 IgG(anti-mouse IgG, Vector)로 상온에서 2시간 반응시킨 후, 1:200으로 희석한 3차 항체인 ABC용액(avidin-biotin complex, Vector)으로 상온에서 1시간 반응시켰으며, 3,3'-DAB(diaminobenzidine)를 기질로 발색하였다. 상기 항체와 반응시키는 과정의 각 단계를 수행함에 있어서, 각 단계 별로 상기 조직 절편을 0.01M PBS를 사용하여 10분씩 3회 세척하였다.
상기 발색이 끝난 조직 절편을 젤라틴이 코팅된 슬라이드 글라스(gelatin coating slide glass)에 도말한 후, 실온에서 12시간 동안 건조하였고, 상기 건조된 조직 절편은 통상적인 탈수투명화 과정을 거쳐 커버 글라스(cover glass)를 이용하여 봉입하였다. 상기 NeuN 항체와 반응을 수행한 후, 봉입한 조직 절편을 현미경을 이용하여 관찰하고, 그 결과를 촬영된 사진을 도 2a에 나타내었다. 또한, 상기 촬영 사진에 대하여 이미지 분석기(Optimas 6.5, USA)프로그램을 이용하여 면역 반응성을 나타낸 (즉, 항-NeuN 항체에 염색된) 조직 절편의 신경세포를 계수하여 얻어진 신경세포 개수를 도 2b에 나타내었으며, 각 실험군에 대한 유의성 검증을 위하여 일원분산분석 (one-way ANOVA test)을 수행하였다.
도 2a에 나타낸 바와 같이, 모든 정상군(sham groups)에서는 해마의 CA1 영역에서 항-NeuN 항체에 대한 면역반응성을 보이는 신경세포가 잘 관찰되고(도 2a의 A, C, E 및 G), 용매만을 투여하고 뇌허혈을 유발시킨 대조군(vehicle)의 경우, 뇌허혈에 의한 지연성 신경세포사멸로 인해 해마의 영역 중 CA1 영역에서 신경세포사멸이 일어남으로써 항-NeuN 항체에 대한 면역반응성을 보이는 신경세포가 거의 관찰되지 않았고, CA1 영역 중 피라미드층에 대부분의 신경세포가 소실되었음이 확인되었다(도 2a의 B). 또한, 미나리 추출물 (200 mg/kg; OJE)과 참당귀 추출물 (200 mg/kg; AGE)을 각각 단독 투여한 뒤 뇌허혈을 유발시킨 실험군의 경우, 해마의 CA1 영역에서 항-NeuN 항체에 대한 면역반응성을 보이는 신경세포는 정상군에 비하여 유의하게 감소하였다(도 2a의 D, F 및 I). 반면, 미나리 추출물 (100 mg/kg)과 참당귀 추출물 (100 mg/kg)의 혼합물 (200 mg/kg)을 투여한 후 뇌허혈을 유발시킨 실험군 (OJE+AGE)의 경우 정상군과 유사한 정도로 CA1 영역에서 항-NeuN 항체에 대한 면역반응성을 보이는 신경세포가 밀집하여 있는 것이 관찰되었다(도 2a의 H 및 I). 이러한 결과는 도 2b의 그래프를 통하여 정량적으로 확인할 수 있다. 상기 결과들은 미나리 추출물과 참당귀 추출물을 함께 투여한 뒤 뇌허혈을 유발시킨 실험군에서 신경세포 보호효과가 미투여군 및 상기 추출물의 단독 투여군과 비교하여 현저히 우수함을 보여준다.
실시예
2-5.
뇌허혈시
신경세포 보호효능 측정 3 (조직 형광 염색)
미나리 추출물, 참당귀 추출물, 또는 미나리와 참당귀의 혼합 추출물의 신경세포 보호 효과를 확인하기 위하여, 사멸된 신경세포 또는 사멸 과정 중에 있는 신경세포에 대한 표지자인 Fluoro-Jade B(F-J B)를 이용하여 조직 형광염색을 수행하였다.
보다 구체적으로, 상기 실시예 2-2에서 준비된 조직절편 중 해마복합체가 잘 나타난 조직절편을 선택하여 실험에 사용하였으며, 퇴행신경세포의 표지자인 F-J B를 이용하여 조직 형광염색을 수행하였다. 상기 조직절편 0.01M PBS에 10분씩 3회 세척한 뒤, 젤라틴이 코팅된 슬라이드에 도말한 뒤 상온에서 12시간 동안 건조시켰다. 상기 조직 절편을 증류수로 5분간 3회 세척한 뒤, 0.06% 과망간산칼륨(potassium permanganate) 용액에 20분 동안 반응시켰다. 이 후, 증류수를 이용하여 2분간 세척한 후, 0.1% 초산(acetic acid)이 포함된 0.001% F-J B(Histochem, Jefferson, AR, USA) 용액에 40분 동안 형광 염색을 수행하였다. 상기 염색된 조직은 1분씩 3회 증류수로 세척하고, 50 ℃ slide warmer에서 20분간 건조한 후, 자일렌(xylene, Junsei, Japan)에 담근 다음, DPX(Sigma, USA)로 봉입하였다. 상기 봉입된 조직을 형광현미경(Ex: 385nmm Em: 425nm)을 이용하여 관찰하고, 그 결과를 촬영한 사진을 도 3a에 나타내었다. 또한, 상기 촬영한 사진에 대해 이미지 분석기(Optimas 6.5, USA)프로그램을 이용하여 염색된 신경세포를 계수하고, 상기 계수한 결과를 대조군(Vehicle 투여군)에 대한 상대적인 수치로 도 3b에 나타내었다.
상기 도 3a에 나타낸 바와 같이, 모든 정상군(sham groups)은 해마의 CA1 영역 전체가 사멸된 신경세포 또는 사멸 과정 중에 있는 신경세포에 대한 표지자인 F-J B에 의해 염색되지 않았다(도 3a의 A, C, E 및 G). 반면에, 용매만을 투여한 대조군(vehicle-ischemia)의 경우에는 해마의 CA1 영역에서 진하게 형광 염색되어, 다수의 신경세포가 사멸 또는 사멸 과정 중에 있는 것으로 확인되었다(도 3a의 B). 그러나, 미나리 추출물 (200 mg/kg; OJE)과 참당귀 추출물 (200 mg/kg; AGE)을 각각 단독 투여한 실험군의 경우, 해마의 CA1 영역에서 F-J B에 의해 염색된 신경세포가 일부 관찰되었다(도 3a의 D, F 및 I). 반면, 미나리 추출물 (100 mg/kg)과 참당귀 추출물 (100 mg/kg)의 혼합물 (200 mg/kg)을 투여한 뒤 뇌허혈을 일으킨 실험군(OJE+AGE)의 경우, 사멸되었거나 사멸 과정 중에 있는 신경세포 수가, 대조군(Vehicle)뿐 아니라 미나리 추출물과 참당귀 추출물의 단독 투여군 (OJE 및 AGE)에 비교하여, 현저히 줄어든 것으로 관찰되었다(도 3a의 H 및 I). 이러한 결과는 도 3b의 그래프를 통하여 정량적으로 확인할 수 있다.
실시예
2-6.
뇌허혈시
신경아교세포 활성변화 확인
미나리 추출물, 참당귀 추출물, 또는 미나리와 참당귀 추출 혼합물의 신경세포 보호효능, 보다 구체적으로 뇌허혈에 의한 신경세포의 사멸 방지 효과를 추가적으로 확인하기 위하여, 상기 실시예 2-2에서 준비된 조직 절편에 대하여 추가적으로, 별아교세포의 표지자인 GFAP(glial fibrillary acidic protein)와 미세아교세포의 표지자인 Iba-1(ionized calcium-binding adaptor molecule-1)에 대한 항체를 이용한 면역조직화학(immunohistochemistry) 염색을 통하여 별아교세포(astrocyte)와 미세아교세포(microglia)의 활성 변화를 확인하였다.
보다 구체적으로, 실시예 2-2에서 준비된 조직 절편 중 해마형성체(hippocampal formation)가 잘 나타난 조직 절편을 선택하여 실험에 사용하였으며, 상기 선택된 조직 절편은 조직에 존재하는 보존액(storing solution)을 제거하기 위해 0.01M PBS(phosphate buffered saline)로 10분씩 3회 세척한 후 내인성 페록시다아제(endogenous peroxidase)를 제거하기 위하여 0.3% H2O2(in 0.01M PBS)에서 30분 동안 반응시켰다. 상기 반응이 끝난 조직 절편은 0.01M PBS로 10분씩 3회 세척하였다.
별아교세포의 변화를 확인하기 위한 면역조직화학 염색과 관련해서는 상기 과정을 거친 조직 절편을 5%(v/v)의 정상 말 혈청(5% normal horse serum, in 0.01M PBS)에서 30분 동안 반응시켰고, 미세아교세포의 변화를 확인하기 위한 면역조직화학 염색과 관련해서는 상기 과정을 거친 조직 절편을 5%(v/v)의 정상 염소 혈청(5% normal goat serum, in 0.01M PBSS)으로 30분 동안 반응시켰다. 상기 반응이 끝난 조직 절편은 각각 1:800의 비율로 희석한 1차 항체인 마우스 항-GFAP 항체(mouse anti-GFAP, Chemicon, USA)와 래빗 항-Iba-1 항체(rabbit anti-Iba-1, Wako, Japan)로 4℃에서 48시간 반응시켰다. 상기 1차 항체와 반응한 조직절편은 각각 1:250으로 희석한 2차 항체인 항-마우스 IgG(anti-mouse IgG, Vector)와 항-래빗 IgG(anti-rabbit IgG, Vector)로 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 1:200으로 희석한 3차 항체인 ABC 용액(avidin-biotin complex, Vector)으로 상온에서 1시간 반응시키고, 3,3'-DAB(diaminobenzidine)를 기질로 발색시켰다. 상기 항체와 반응시키는 과정의 각 단계를 수행함에 있어서, 각 단계 별로 상기 조직 절편을 0.01M PBS를 사용하여 10분씩 3회 세척하였다.
상기 발색이 끝난 조직 절편을 젤라틴이 코팅된 슬라이드 글라스(gelatin coating slide glass)에 도말한 후, 실온에서 12시간 동안 건조하였고, 상기 건조된 조직 절편은 통상적인 탈수투명화 과정을 거쳐 커버 글라스(cover glass)를 이용하여 봉입하였다. 상기 GFAP 또는 Iba-1 항체와 반응을 수행한 후, 봉입한 조직절편을 현미경을 이용하여 관찰하였으며, 그 관찰결과를 촬영한 사진을 각각 도 4a (GFAP에 항체에 염색된 별아교세포) 및 도 5a (Iba-1 항체에 염색된 미세아교세포)에 나타내었다.
또한, 상기 촬영한 사진에 대해 이미지 분석기(Optimas 6.5, USA)프로그램을 이용하여 GFAP에 항체에 염색된 별아교세포와 Iba-1 항체에 염색된 미세아교세포의 면역반응성을 측정하였으며, 상기 면역반응성의 측정 결과를 각각 도 4b (별아교세포) 및 도 5b (미세아교세포)에 각각 함께 나타내었다.
상기 도 4a에 나타낸 바와 같이, 모든 정상군(sham groups)의 경우 항-GFAP 항체에 대한 면역반응성을 보이는 별아교세포는 휴면상태의 형태로 관찰되었다(도 4a의 A, C, E 및 G). 반면에, 용매만을 투여한 대조군(vehicle-ischemia)의 경우에는 항-GFAP 항체에 대한 면역반응성을 보이는 별아교세포는 정상군에 비하여 증가하였으며, 세포질이 비대해졌다(도 4a의 B 및 I). 또한, 미나리 추출물 (200 mg/kg; OJE)과 참당귀 추출물 (200 mg/kg; AGE)을 각각 단독 투여한 뒤 뇌허혈을 일으킨 실험군에서 항-GFAP 항체에 대한 면역반응성을 보이는 별아교세포는 대조군(vehicle-ischemia)과 비교하여 활성화 정도가 감소하였다(도 4a의 D, F 및 I). 반면에, 미나리 추출물 (100 mg/kg)과 참당귀 추출물 (100 mg/kg)의 혼합물 혼합물 (200 mg/kg)을 투여한 후 뇌허혈을 유발시킨 실험군의 경우 항-GFAP 항체에 대한 면역반응성을 보이는 별아교세포는 정상군과 같이 휴면상태의 형태로 관찰되었다(도 4a의 H 및 I).
상기 도 5a에 나타낸 바와 같이, 모든 정상군(sham groups)의 경우 항-Iba-1 항체에 대한 면역반응성을 보이는 미세아교세포는 휴면상태의 형태로 고르게 분포하는 것으로 관찰되었다(도 5a의 A, C, E 및 G). 용매만을 투여한 대조군(vehicle-ischemia)의 경우에는 항-Iba-1 항체에 대한 면역반응성을 보이는 미세아교세포는 활성화되어 있는 형태로 특히, 피라미드층에 모여 있는 형태로 관찰되었다(도 5a의 B). 또한, 미나리 추출물 (200 mg/kg; OJE)과 참당귀 추출물 (200 mg/kg; AGE)을 각각 단독 투여한 뒤 뇌허혈을 일으킨 실험군에서 항-Iba-1 항체에 대한 면역반응성을 보이는 미세아교세포는 대조군(vehicle-ischemia)과 비교하여 활성화 정도가 감소하였다 (도 5a의 D, F 및 I). 반면에, 미나리 추출물 (100 mg/kg)과 참당귀 추출물 (100 mg/kg)의 혼합물 (200 mg/kg)을 투여한 후 뇌허혈을 유발시킨 실험군의 경우, 정상군(Sham)과 유사한 휴면상태의 형태로 관찰되었다(도 5a의 H 및 I).
상기 결과로부터, 대조군 및 미나리 추출물과 참당귀 추출물을 각각 단독 투여한 경우와 비교하여, 미나리 추출물과 참당귀 추출물을 함께 투여 후 뇌허혈을 유발시킨 시험 동물에서의 신경세포 특히, 해마 영역을 크레질 바이올렛 염색 및 신경세포의 표지자인 항-NeuN 항체를 이용한 면역조직 화학 염색을 통하여 신경 조직 절편을 관찰한 결과, 해마의 전체 영역 구체적으로, 해마의 CA1 영역에서의 신경세포사멸이 억제된 것을 확인할 수 있었고, 사멸된 또는, 사멸 과정 중에 있는 신경세포에 대한 표지자인 F-J B를 통해 확인한 결과, 신경세포 사멸이 현저하게 억제됨이 확인되었으며, 별아교세포와 미세아교세포의 표지자인 항-GFAP와 항-Iba-1 항체를 통하여 확인한 결과, 신경아교세포의 비정상적인 활성화를 매우 탁월하게 억제할 수 있음이 확인되었다. 이러한 결과는 미나리 추출물과 참당귀 추출물이 혼합 투여되는 경우, 단독투여시와 비교하여, 신경세포보호 및 신경아교세포의 비정상인 활성화를 억제에 있어서 현저한 상승 효과를 보임을 입증한다.
Claims (17)
- 참당귀(Angelica gigas Nakai) 및 미나리의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하고,
상기 참당귀 및 미나리의 혼합 추출물은,
참당귀를 90 내지 100%(v/v) 에탄올 수용액으로 40 내지 80℃에서 추출한 참당귀 에탄올 추출물, 및 미나리를 10 내지 80%(v/v) 에탄올 수용액으로 30 내지 100℃에서 추출한 미나리 에탄올 추출물을 포함하거나,
참당귀 및 미나리의 혼합물을 40 내지 100%(v/v) 에탄올 수용액으로 30 내지 80℃에서 추출한 참당귀 및 미나리 혼합물의 추출물인,
허혈성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서, 상기 미나리는 돌미나리(Oenanthe javanica)인, 허혈성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 미나리 에탄올 추출물은 pH 8 내지 10 조건에서 추출된 것인, 허혈성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 혼합 추출물 내의 참당귀 또는 참당귀 추출물과 미나리 또는 미나리 추출물 간 혼합비는 중량 기준으로 1:0.1 내지 10 (참당귀 또는 참당귀 추출물의 중량:미나리 또는 미나리 추출물의 중량)인, 허혈성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 혼 혼합 추출물 내의 참당귀 또는 참당귀 추출물과 미나리 또는 미나리 추출물 간 혼합비는 중량 기준으로 1:0.2 내지 5 (참당귀 또는 참당귀 추출물의 중량:미나리 또는 미나리 추출물의 중량)인, 허혈성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 허혈성 뇌질환은 뇌졸중, 고혈압, 치매, 파킨슨병, 헌팅턴병, 또는 루게릭병인, 허혈성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 참당귀(Angelica gigas Nakai) 및 미나리의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하고,
상기 참당귀 및 미나리의 혼합 추출물은,
참당귀를 90 내지 100%(v/v) 에탄올 수용액으로 40 내지 80℃에서 추출한 참당귀 에탄올 추출물, 및 미나리를 10 내지 80%(v/v) 에탄올 수용액으로 30 내지 100℃에서 추출한 미나리 에탄올 추출물을 포함하거나,
참당귀 및 미나리의 혼합물을 40 내지 100%(v/v) 에탄올 수용액으로 30 내지 80℃에서 추출한 참당귀 및 미나리 혼합물의 추출물인,
신경세포 보호 또는 신경세포 재생용 약학 조성물. - 제7항에 있어서, 상기 미나리는 돌미나리(Oenanthe javanica)인, 신경세포 보호 또는 신경세포 재생용 약학 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 미나리 에탄올 추출물은 pH 8 내지 10 조건에서 추출된 것인, 신경세포 보호 또는 신경세포 재생용 약학 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 혼합 추출물 내의 참당귀 또는 참당귀 추출물과 미나리 또는 미나리 추출물 간 혼합비는 중량 기준으로 1:0.1 내지 10 (참당귀 또는 참당귀 추출물의 중량:미나리 또는 미나리 추출물의 중량)인, 신경세포 보호 또는 신경세포 재생용 약학 조성물.
- 제10항에 있어서, 상기 혼 혼합 추출물 내의 참당귀 또는 참당귀 추출물과 미나리 또는 미나리 추출물 간 혼합비는 중량 기준으로 1:0.2 내지 5 (참당귀 또는 참당귀 추출물의 중량:미나리 또는 미나리 추출물의 중량)인, 신경세포 보호 또는 신경세포 재생용 약학 조성물.
- 참당귀(Angelica gigas Nakai) 및 미나리의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하고,
상기 참당귀 및 미나리의 혼합 추출물은,
참당귀를 90 내지 100%(v/v) 에탄올 수용액으로 40 내지 80℃에서 추출한 참당귀 에탄올 추출물, 및 미나리를 10 내지 80%(v/v) 에탄올 수용액으로 30 내지 100℃에서 추출한 미나리 에탄올 추출물을 포함하거나,
참당귀 및 미나리의 혼합물을 40 내지 100%(v/v) 에탄올 수용액으로 30 내지 80℃에서 추출한 참당귀 및 미나리 혼합물의 추출물인,
허혈성 뇌질환 예방 또는 개선, 신경세포 보호, 또는 신경세포 재생을 위한 건강기능성 식품. - 제12항에 있어서, 상기 미나리는 돌미나리(Oenanthe javanica)인, 건강기능성 식품.
- 제12항에 있어서, 상기 미나리 에탄올 추출물은 pH 8 내지 10 조건에서 추출된 것인, 건강기능성 식품.
- 제12항에 있어서, 상기 혼합 추출물 내의 참당귀 또는 참당귀 추출물과 미나리 또는 미나리 추출물 간 혼합비는 중량 기준으로 1:0.1 내지 10 (참당귀 또는 참당귀 추출물의 중량:미나리 또는 미나리 추출물의 중량)인, 건강기능성 식품.
- 제15항에 있어서, 상기 혼 혼합 추출물 내의 참당귀 또는 참당귀 추출물과 미나리 또는 미나리 추출물 간 혼합비는 중량 기준으로 1:0.2 내지 5 (참당귀 또는 참당귀 추출물의 중량:미나리 또는 미나리 추출물의 중량)인, 건강기능성 식품.
- 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 허혈성 뇌질환은 뇌졸중, 고혈압, 치매, 파킨슨병, 헌팅턴병, 또는 루게릭병인, 건강기능성 식품.
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| KR20210065671A (ko) * | 2019-11-27 | 2021-06-04 | 강원대학교산학협력단 | 천연물 복합 추출물을 유효성분으로 함유하는 허혈성 뇌혈관 질환 예방용 조성물 |
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| KR102177309B1 (ko) | 2020-11-10 |
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