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KR20200019630A - 양이온 교환 크로마토그래피 세척 완충액 - Google Patents

양이온 교환 크로마토그래피 세척 완충액 Download PDF

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KR20200019630A
KR20200019630A KR1020197037762A KR20197037762A KR20200019630A KR 20200019630 A KR20200019630 A KR 20200019630A KR 1020197037762 A KR1020197037762 A KR 1020197037762A KR 20197037762 A KR20197037762 A KR 20197037762A KR 20200019630 A KR20200019630 A KR 20200019630A
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세파론, 인코포레이티드
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Abstract

관심 단백질을 단백질 응집체로부터 정제하고 바이러스를 제거 및/또는 불활성화하기 위한 친화성 및 양이온 교환 크로마토그래피에서 사용하기 위한 계면활성제를 포함하는 세척 완충액. 항체와 같은 관심 단백질의 정제를 위한 친화성 또는 양이온 교환 크로마토그래피 동안 사용되는 경우, 세척 완충액은 제제로부터 바이러스 클리어런스를 현저하게 개선하면서, 숙주 세포 단백질 및 단백질 응집체의 수준을 감소시킨다. 세척 완충액을 사용한 친화성 또는 양이온 교환 크로마토그래피 이후, 관심 단백질은 다른 크로마토그래피 및 여과 조작을 사용하여 추가로 정제될 수 있다.

Description

양이온 교환 크로마토그래피 세척 완충액
본 발명은 일반적으로 단백질 생화학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 단백질 응집체로부터 표적 단백질, 예를 들어, 항체를 정제하고 바이러스를 제거 및/또는 불활성화시키기 위해 양이온 교환 크로마토그래피에서 사용되는 세척 완충액에 관한 것이다. 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 완충액으로 양이온 교환 크로마토그래피 지지체를 세척하는 것은 단백질 제제로부터의 바이러스 클리어런스(viral clearance)를 실질적으로 개선하는 것으로 밝혀졌다.
재조합 단백질은 숙주 세포에서 발현되고 전형적으로 일련의 크로마토그래피 및 여과 단계에 의해 정제된다. 전통적으로, 단일클론 항체(mAb) 정제 공정 흐름은 세 가지 크로마토그래피 컬럼으로 구성된다. 각 크로마토그래피 컬럼의 주요 기능은 아래에 열거된다:
· 생성물 회수 및 숙주 세포 단백질(host cell protein, HCP) 제거를 위한 단백질 A(Protein A, ProA);
· DNA, HCP 및 응집체 제거를 위한 양이온 교환(Cation exchange, CEX); 및
· 추가의 DNA와 HCP 제거 및 바이러스 클리어런스를 위한 음이온 교환(Anion exchange, AEX).
다운스트림 캐스케이드로도 알려진 전형적인 정제 체계는 친화성 크로마토그래피에 이어 양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 이어 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)를 사용한다. CEX 크로마토그래피 및 AEX는 일반적으로 폴리싱(polishing) 단계로 간주된다 (예를 들어, GE Healthcare. (2006). Process-scale purification of monoclonal antibodies- polishing using Capto™ Q.www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/ Related%20Content/Files/1314750913712/litdoc28903716_20130507212449.PDF를 참조하라). 또한, 전형적인 다운스트림 정제 체계는 적절한 바이러스 클리어런스를 보장하기 위해 바이러스 불활성화 단계 및 바이러스 여과 단계를 또한 포함한다.
불행하게도, 각각의 추가적인 크로마토그래피 단계는 전형적으로 전체 단백질 수율을 감소시킨다. 게다가, 추가적인 크로마토그래피 단계의 사용은 공정의 비용 및 작업 복잡성을 증가시킨다.
양이온 교환 크로마토그래피 단계의 성능을 개선하여 폴리싱 크로마토그래피 단계를 줄이거나 없애는 것은 개발 노력 및 제조 비용을 현저하게 감소시키고, 표적 생성물 회수를 개선할 뿐만 아니라 제조 작업을 단순화할 수 있다. 그러나, 유일한 폴리싱 단계로서 CEX를 이용하는 것의 주요 우려 중 하나는 이것이 강력한 바이러스 클리어런스 단계로 간주되지 않는다는 것이다 (여러 연구의 메타데이터 분석에서 나타나는 바와 같이; Miesegaes et al. Biotechnol. Bioeng. 2010; 106:238-246).
적절한 공정 성능, 특히 효과적인 바이러스 클리어런스를 달성하기 위한 CEX 단계에 있어서, 공정 파라미터 측면에서 작업 설계 공간이 상당히 제한된다 (Miesegaes, G.R. et al. Biotechnol. Bioeng. 2012; 109:2048-2058 2 및 Connell-Crowley, L. et al. Biotechnol. Bioeng. 2012;109: 157-165.)
본 발명은 양이온 교환 단계에서 적용되는 세척 절차를 제공하여 이 단계의 크로마토그래피 성능, 특히 바이러스 클리어런스 능력을 개선한다. 세척 절차의 적용 및 그와 관련된 강력한 바이러스 클리어런스 능력은 AEX와 같은 특정한 다른 폴리싱 크로마토그래피 단계의 제거를 가능하게 하여 필요한 크로마토그래피 단계의 수를 감소시킬 수 있다.
본원에 기재된 세척 절차의 적용은 또한 바이러스 불활성화 단계의 제거를 가능하게 할 수 있고, 이는 전형적인 바이러스 불활성화 조건(예를 들어 낮은 pH)에서 안정하지 않은 분자에 대해, 또는 바이러스 불활성화를 시행하기 어려울 수 있는 공정(예를 들어 연속 처리)에서 특히 유용하면서도, 크로마토그래피 단계 및 여과 단계로부터의 다운스트림 단위 조작으로부터 적절한 바이러스 클리어런스를 달성한다.
발명의 요약
CEX 지지체상의 바이러스 클리어런스 능력을 증가시킴으로써, AEX 크로마토그래피 단계가 제거되어 전체 단백질, 예를 들어 항체 제조 공정을 단순화할 수 있음이 밝혀졌다. CEX에서 세척 완충액에 계면활성제를 첨가하는 것은 불순물 클리어런스 능력을 손상시키지 않으면서 바이러스 클리어런스 효율을 증가시킨다. 이러한 CEX 컬럼의 바이러스 클리어런스 능력 개선은 CEX가 폴리싱 단계로서 (즉 1차 생성물 회수 또는 예를 들어 ProA에서의 포획 단계 후), 또는 1차 회수 단계 그 자체로서 이용되는지에 관계 없이 관찰된다.
세척 용액은 위에 기재한 바와 같은 다단계 단백질 정제 방법과 같은 단백질 정제 방법에서 사용될 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 개시는 재조합 발현 또는 하이브리도마 발현에 의한 것을 포함하여 세포로부터 발현된 관심 단백질을 정제하는 방법을 특징으로 한다. 일반적으로, 상기 방법은 관심 단백질 및 하나 이상의 오염 바이러스의 혼합물을 CEX 크로마토그래피 지지체에 로딩하는 단계, 계면활성제를 포함하는 수성 세척 용액으로 지지체를 세척하는 단계, 이후 관심 단백질을 지지체로부터 용출시켜 정제된 관심 단백질의 용출액을 형성하는 단계를 포함하고, 여기서 정제된 용출액은 오염 바이러스를 포함하지 않는다 (또는 CEX 크로마토그래피 지지체에 로딩된 혼합물과 비교하여 감소된 수의 오염 바이러스를 포함한다). 임의로 상기 방법은, 계면활성제 세척 단계 후 및 용출 단계 전에, 계면활성제를 포함하지 않는 중간 세척 완충액으로 지지체를 세척하는 단계를 포함한다. 중간 세척 완충액은 용출 단계 이전에 지지체로부터 선행 세척으로부터의 임의의 잔류 계면활성제를 제거한다.
관심 단백질의 혼합물은 이전 크로마토그래피 단계의 용출액, 예컨대 친화성 크로마토그래피 컬럼, 임의로 단백질 A 크로마토그래피 컬럼의 용출액일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 관심 단백질의 혼합물은 수확 세포 배양액(harvest cell culture fluid, HCCF)이다. 이 구체예에서, 단백질 정제 방법은 친화성 크로마토그래피 단계를 포함하지 않을 수 있다 (즉 본원에 기재된 CEX 크로마토그래피 단계가 친화성 크로마토그래피, 예를 들어 단백질 A 단계를 대체할 수 있다). 수성 세척 용액은 하기 섹션에 기재된 세척 용액을 포함하여 본원에 기재되거나 예시된 임의의 그러한 용액일 수 있다. 중간 세척 완충액은 계면활성제를 포함하지 않는 한, CEX 평형 완충액과 같은 임의의 수성 CEX 세척 완충액 또는 본원에 기재된 임의의 CEX 세척 용액일 수 있다. 일 구체예에서, 중간 세척 완충액은 계면활성제가 없이, 본원에 기재된 CEX 세척 용액 중 어느 하나와 동일한 조성이다.
상기 방법은 용출액 중의 임의의 잔여 바이러스를 불활성화시키기 위해 관심 단백질을 포함하는 정제된 용출액을 산성화(예를 들어, pH 저하)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. pH 저하는 용출액 중의 바이러스를 불활성화시키기에 충분한 시간 동안 수행되고, 이후 pH는 더 중성인 pH까지 상승된다. 상기 방법은 불활성화 바이러스를 포함하여 바이러스를 제거하기 위해 정제된 관심 단백질의 용출액을 여과하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 정제된 관심 단백질의 용출액을 정용여과, 한외여과, 또는 정용여과와 한외여과 모두로써 처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 정제된 관심 단백질의 용출액을 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물로서 제형화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 추가 정제된 관심 단백질의 용출액을 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물로서 제형화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 단백질 정제 방법은 음이온 교환 (컬럼 또는 멤브레인) 크로마토그래피 단계를 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 단백질 정제 방법은 또 다른 폴리싱 크로마토그래피 단계를 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 단백질 정제 방법은 바이러스 불활성화 단계를 포함하지 않는다.
일부 양태에서, 양이온 교환(CEX) 크로마토그래피 지지체에 결합된 관심 단백질을 정제하는 방법은 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 세척 용액을 CEX 크로마토그래피 지지체에 적용하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 관심 단백질을 지지체로부터 용출시켜 관심 단백질을 포함하는 정제된 용출액을 형성하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 관심 단백질을 정제하는 방법은 관심 단백질 및 하나 이상의 오염물 단백질, 응집체 및/또는 바이러스를 포함하는 혼합물을 CEX 크로마토그래피 지지체에 로딩하는 단계, 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 세척 용액으로 지지체를 세척하는 단계, 이후 관심 단백질을 지지체로부터 용출시켜 정제된 관심 단백질의 용출액을 형성하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 관심 단백질을 정제하는 방법은 관심 단백질 및 하나 이상의 오염물 단백질, 응집체 및/또는 바이러스를 포함하는 혼합물을 CEX 크로마토그래피 지지체에 로딩하는 단계, 하나 이상의 오염물 단백질, 응집체 및/또는 바이러스를 지지체로부터 용출시키기 위해 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 수성 세척 용액으로 지지체를 세척하는 단계, 이후 관심 단백질을 지지체로부터 용출시켜 정제된 관심 단백질의 용출액을 형성하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 하나 이상의 계면활성제는 트리톤 100, 노닐 페녹시폴리에톡실에탄올(NP40), 설포베타인-12(SB-12), 설포베타인-14(SB-14), 라우릴디메틸아민 N-옥사이드(LDAO), 폴리소르베이트 20(PS 20), 폴리소르베이트 80(PS 80) 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 계면활성제는 양쪽이온성 계면활성제를 포함한다. 일부 양태에서, 양쪽이온성 계면활성제는 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(CHAPS) 또는 코카미도프로필 하이드록시설타인(CAHS), 또는 이들의 조합이다. 일부 양태에서, 하나 이상의 계면활성제는 4차 암모늄 염을 포함한다. 일부 양태에서, 4차 암모늄 염은 세트리모늄 브로마이드(CTAB) 또는 디옥타데실디메틸암모늄 브로마이드(DODAB)이다. 일부 양태에서, 하나 이상의 계면활성제는 알킬페놀 에톡실레이트를 포함한다. 일부 양태에서, 알킬페놀 에톡실레이트는 노녹시놀, 임의로 노나에틸렌 글리콜이다. 일부 양태에서, 하나 이상의 계면활성제는 에톡실레이트를 포함한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 계면활성제는 알킬 폴리글루코사이드, 임의로 데실 글루코사이드를 포함한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 계면활성제는 아미노 옥사이드를 포함한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 계면활성제는 포스핀 옥사이드를 포함한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 계면활성제는 비이온성 계면활성제를 포함한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 계면활성제는 음이온성 계면활성제를 포함하고, 임의로 음이온성 계면활성제는 소듐 도데실 설페이트(SDS)이다.
일부 양태에서, 세척 용액은 약 0.01% 내지 약 1% w/v의 하나 이상의 계면활성제를 포함한다. 일부 양태에서, 세척 용액은 약 0.05% 내지 약 0.5% w/v의 하나 이상의 계면활성제를 포함한다. 일부 양태에서, 세척 용액은 약 0.1% w/v의 하나 이상의 계면활성제를 포함한다. 일부 양태에서, 세척 용액은 약 0.2% w/v의 하나 이상의 계면활성제를 포함한다. 일부 양태에서, 세척 용액은 약 0.5% w/v의 하나 이상의 계면활성제를 포함한다.
일부 양태에서, CEX 크로마토그래피 지지체는 세파로스 매트릭스 수지이다. 일부 양태에서, CEX 크로마토그래피 지지체는 합성 중합체 매트릭스 수지이다. 일부 양태에서, CEX 크로마토그래피 지지체는 소수성 수지가 아니다. 일부 양태에서, CEX 크로마토그래피 지지체는 Capto S, Fractogel EMD SO3-, Fractogel EMD TMAE, Fractogel EMD, Eshnumo S, Eshmuno HCX, Tosoh Toyopearl CM, Tosoh Toyopearl SP 및 Nuvia cPrime로 이루어진 군에서 선택된다.
일부 양태에서, 상기 방법은 관심 단백질을 지지체로부터 용출시키기 전에 후속 세척 용액을 CEX 크로마토그래피 지지체에 적용하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 후속 세척 용액은 계면활성제를 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 후속 세척 용액은 지지체로부터 계면활성제를 제거한다. 일부 양태에서, 후속 세척 용액을 적용하는 것은 후속 용액을 적용하지 않는 것과 비교하여 숙주 세포 단백질(HCP) 제거를 증가시킨다.
일부 양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 세척 용액을 지지체에 적용하기 전에 수확 세포 배양액(HCCF)을 지지체에 로딩하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 관심 단백질 및 하나 이상의 오염물 단백질, 응집체 및/또는 바이러스를 포함하는 혼합물은 HCCF이다.
일부 양태에서, 상기 방법은 단백질 A 정제를 포함하지 않는다.
일부 양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 세척 용액을 지지체에 적용하기 전에 크로마토그래피 단계의 용출액을 지지체에 로딩하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 관심 단백질 및 하나 이상의 오염물 단백질, 응집체 및/또는 바이러스를 포함하는 혼합물은 크로마토그래피 단계의 용출액이다. 일부 양태에서, 크로마토그래피 단계의 용출액은 친화성 크로마토그래피 단계의 용출액이다. 일부 양태에서, 친화성 크로마토그래피 단계는 단백질 A 정제이다. 일부 양태에서, 단백질 A 정제는 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 세척 용액으로 단백질 A 지지체를 세척하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 단백질 A 정제는 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 세척 용액으로 단백질 A 지지체를 세척하는 것을 포함하지 않는다.
일부 양태에서, 세척 용액은 LRV에 의해 측정된 바와 같이 바이러스를 제거한다.
일부 양태에서, 단백질 정제 방법은 a) 관심 단백질 및 하나 이상의 오염물, 응집체 및/또는 바이러스를 포함하는 혼합물을 단백질 A 크로마토그래피 지지체에 로딩하는 단계, b) 하나 이상의 오염물 단백질, 응집체 및/또는 바이러스를 단백질 A 크로마토그래피 지지체로부터 제거하기 위해 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액으로 지지체를 세척하는 단계, c) 관심 단백질을 단백질 A 크로마토그래피 지지체로부터 용출시키는 단계, d) 관심 단백질을 포함하는 용출액을 양이온 교환(CEX) 크로마토그래피 지지체에 로딩하는 단계, e) 하나 이상의 오염물 단백질, 응집체 및/또는 바이러스을 지지체로부터 제거하기 위해 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 CEX 크로마토그래피 세척 용액으로 CEX 크로마토그래피 지지체를 세척하는 단계, 및 f) CEX 크로마토그래피 지지체로부터 관심 단백질을 용출시켜 정제된 관심 단백질의 용출액을 형성하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 오염물 단백질은 숙주 세포 단백질이다. 일부 양태에서, 숙주 세포 단백질은 중국 햄스터 난소 세포로부터 유래한다.
일부 양태에서, 단백질 A 세척 용액은 로그 감소 값(log reduction value, LRV)에 의해 측정된 바와 같이 바이러스를 제거한다. 일부 양태에서, CEX 세척 용액은 LRV에 의해 측정된 바와 같이 바이러스를 제거한다.
일부 양태에서, LRV는 약 1.0 내지 약 10.0 log10이다. 일부 양태에서, LRV는 약 1.0 내지 약 5.0 log10이다. 일부 양태에서, LRV는 약 4.0 내지 약 8.0 log10이다. 일부 양태에서, LRV는 약 3.0 log10이다. 일부 양태에서, LRV는 약 4.0 log10이다. 일부 양태에서, LRV는 약 5.0 log10이다. 일부 양태에서, LRV는 약 6.0 log10이다.
일부 양태에서, LRV는 정량적 PCR에 의해 측정된다. 일부 양태에서, LRV는 감염력 분석을 이용하여 측정된다.
일부 양태에서, LRV는 1 컬럼 부피(column volume, CV)의 세척을 적용하여 달성된다. 일부 양태에서, LRV는 2 CV의 세척을 적용하여 달성된다. 일부 양태에서, LRV는 3 CV의 세척을 적용하여 달성된다. 일부 양태에서, LRV는 4 CV의 세척을 적용하여 달성된다. 일부 양태에서, LRV는 5 CV의 세척을 적용하여 달성된다.
일부 양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 세척 용액을 지지체에 적용하기 전에 계면활성제를 포함하지 않는 세척 용액을 지지체에 적용하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 정제된 관심 단백질의 용출액을 정용여과, 한외여과, 또는 정용여과와 한외여과 모두로써 처리하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 정제된 관심 단백질의 용출액을 멤브레인 크로마토그래피 지지체에 로딩하는 단계 및 추가 정제된 용출액을 포함하는 흐름을 멤브레인 크로마토그래피 지지체로부터 수집하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함하지 않는다.
일부 양태에서, 상기 방법은 용출액이 바이러스 불활성화 단계를 거치는 것을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 바이러스 불활성화는 낮은 pH 바이러스 불활성화에 의해 달성되어 바이러스 불활성화 제제가 형성된다. 일부 양태에서, pH는 약 2.5 내지 약 5로 낮아진다. 일부 양태에서, 상기 방법은 바이러스를 불활성화시키기에 충분한 시간 동안 정제된 관심 단백질의 용출액의 pH를 낮추는 단계를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 바이러스를 제거하기 위해 정제된 관심 단백질의 용출액을 여과하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 정제된 관심 단백질의 용출액을 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물로서 제형화하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 적어도 약 250 리터의 용량을 갖는 생물반응기에서 관심 단백질 및 하나 이상의 오염물 단백질을 발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 생물반응기는 적어도 약 500 리터, 적어도 약 2000 리터, 또는 적어도 약 5000 리터의 용량을 갖는다.
일부 양태에서, 관심 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이의 융합 단백질 작제물을 포함한다. 일부 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a) TNF-유사 리간드 1A(TNF-like ligand 1A, TL1a)에 특이적으로 결합하고, 임의로 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고 (b) 칼시토닌 유전자-관련 펩타이드(calcitonin gene-related peptide, CGRP)에 특이적으로 결합하고, 임의로 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고 또는 (c) CD38에 특이적으로 결합하고, 임의로 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 양태에서, CEX 지지체에 결합된 관심 단백질을 정제하기 위한 양이온 교환(CEX) 크로마토그래피 동안 세척 용액의 사용이 본원에 제공되고, 여기서 세척 용액은 하나 이상의 계면활성제를 포함한다.
일부 양태에서, 계면활성제를 포함하는, CEX 지지체에 결합된 관심 단백질을 정제하기 위한 양이온 교환(CEX) 크로마토그래피 세척 용액이 본원에 제공된다.
본원에 제공된 용도, 방법, 또는 세척의 일부 양태에서, 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 약 0.1% 내지 약 0.6% w/v의 계면활성제를 포함한다. 일부 양태에서, 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 약 0.2 % 내지 약 0.5% w/v의 계면활성제를 포함한다. 일부 양태에서, 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 약 0.2% w/v의 계면활성제를 포함한다. 일부 양태에서, 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 약 0.3% w/v의 계면활성제를 포함한다. 일부 양태에서, 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 약 0.5% w/v의 계면활성제를 포함한다. 일부 양태에서, 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 약 0.6% w/v의 계면활성제를 포함한다.
본원에 제공된 용도, 방법, 또는 세척의 일부 양태에서, 계면활성제는 비이온성 계면활성제이다. 일부 양태에서, 계면활성제는 TRITON® X-100이다. 일부 양태에서, 세척은 약 0.2% TRITON® X-100을 포함한다. 일부 양태에서, 세척은 약 0.5% TRITON® X-100을 포함한다. 일부 양태에서, 계면활성제는 PS 80이다. 일부 양태에서, 세척은 약 0.3% PS 80을 포함한다. 일부 양태에서, 세척은 약 0.6% PS 80을 포함한다.
본원에 제공된 용도, 방법, 또는 세척의 일부 양태에서, 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 아르기닌을 추가로 포함하고, 임의로 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 약 25 mM 아르기닌을 포함한다. 일부 양태에서, 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 히스티딘을 추가로 포함하고, 임의로 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 약 5 mM 히스티딘을 포함한다. 일부 양태에서, 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 소듐 클로라이드를 추가로 포함하고, 임의로 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 약 5 mM 내지 약 15 mM 소듐 클로라이드를 포함한다. 일부 양태에서, 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 약 10 mM 소듐 클로라이드 또는 약 11 mM 소듐 클로라이드를 포함한다. 일부 양태에서, 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 소듐 포스페이트를 추가로 포함하고, 임의로 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 약 10 mM 소듐 포스페이트를 포함한다. 일부 양태에서, 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 소듐 아세테이트를 추가로 포함하고, 임의로 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 약 20 mM 내지 약 50 mM 소듐 아세테이트를 포함한다. 일부 양태에서, 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 약 25 mM 소듐 아세테이트 또는 약 50 mM 소듐 아세테이트를 포함한다.
본원에 제공된 용도, 방법, 또는 세척의 일부 양태에서, 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 (a) 약 10 mM 소듐 포스페이트 및 약 0.2 % TRITON® X-100, (b)약 10 mM 소듐 포스페이트 및 약 0.5% TRITON® X-100, (c) 약 10 mM 소듐 포스페이트 및 약 0.3% PS 80, 또는 (d) 약 10 mM 소듐 포스페이트 및 약 0.6% PS 80을 포함한다. 일부 양태에서, 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 (a) 약 50 mM 소듐 아세테이트, 약 25 mM 아르기닌, 약 5 mM 히스티딘, 약 11 mM 소듐 클로라이드 및 약 0.3% PS 80, (b) 약 50 mM 소듐 아세테이트, 약 25 mM 아르기닌, 약 5 mM 히스티딘, 약 11 mM 소듐 클로라이드 및 약 0.6% PS 80, (c) 약 50 mM 소듐 아세테이트, 약 25 mM 아르기닌, 약 5 mM 히스티딘, 약 11 mM 소듐 클로라이드 및 약 0.2% TRITON® X-100, (d) 약 50 mM 소듐 아세테이트, 약 25 mM 아르기닌, 약 5 mM 히스티딘, 약 11 mM 소듐 클로라이드 및 약 0.5% TRITON® X-100, (e) 약 25 mM 소듐 아세테이트, 약 10 mM 소듐 클로라이드 및 약 0.3% PS 80, (f) 약 25 mM 소듐 아세테이트, 약 10 mM 소듐 클로라이드 및 약 0.6% PS 80, (g) 약 25 mM 소듐 아세테이트, 약 10 mM 소듐 클로라이드 및 약 0.2% TRITON® X-100, 또는 (h) 약 25 mM 소듐 아세테이트, 약 10 mM 소듐 클로라이드 및 약 0.5% TRITON® X-100을 포함한다.
본원에 제공된 용도, 방법, 또는 세척의 일부 양태에서, 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 약 5.0 내지 7.0의 pH를 포함한다. 일부 양태에서, 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 약 5.5 또는 약 6.3의 pH를 포함한다.
일부 양태에서, 본원에 제공된 임의의 방법에 의해 생성된 관심 단백질의 제제가 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 본원에 제공된 임의의 방법에 의해 생성된 관심 단백질의 바이러스-불활성화 제제가 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 관심 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a) TNF-유사 리간드 1A(TL1a)에 특이적으로 결합하고, 임의로 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL를 포함하고 (b) 칼시토닌 유전자-관련 펩타이드(CGRP)에 특이적으로 결합하고, 임의로 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고 또는 (c) CD38에 특이적으로 결합하고, 임의로 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 양태에서, 본원에 제공된 임의의 방법에 의해 생성된 관심 단백질의 제제 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 본원에 제공된 임의의 방법에 의해 생성된, 관심 단백질의 바이러스-불활성화 제제 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.
일부 양태에서, 수성 캐리어 및 재조합적으로-발현된 또는 하이브리도마-발현된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물이 본원에 제공되고, 여기서 조성물에는 바이러스 입자가 실질적으로 없으며, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (a) TNF-유사 리간드 1A(TL1a)에 특이적으로 결합하고 서열 번호: 5 또는 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 하나 이상의 상보성 결정 영역(complementary determining region, CDR) 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 하나 이상의 CDR을 포함하고 (b) 칼시토닌 유전자-관련 펩타이드(CGRP)에 특이적으로 결합하고 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 하나 이상의 CDR 및 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 하나 이상의 CDR을 포함하고, 또는 (c) CD38에 특이적으로 결합하고, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 하나 이상의 CDR 및 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 하나 이상의 CDR을 포함한다. 일부 양태에서, 조성물에는 바이러스 입자가 없다. 일부 양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (a) 서열 번호: 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고, (b) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고, 또는 (c) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 양태에서, a) 항체 및 하나 이상의 오염물, 응집체 및/또는 바이러스를 포함하는 혼합물을 단백질 A 크로마토그래피 지지체에 로딩하는 단계, b) 하나 이상의 오염물 단백질, 응집체 및/또는 바이러스를 단백질 A 크로마토그래피 지지체로부터 제거하기 위해 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액으로 지지체를 세척하는 단계, c) 항체를 단백질 A 크로마토그래피 지지체로부터 용출시키는 단계, d) 단계 c)로부터의 용출액을 양이온 교환(CEX) 크로마토그래피 지지체에 로딩하는 단계, e) 하나 이상의 오염물 단백질, 응집체 및/또는 바이러스를 지지체로부터 제거하기 위해 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 CEX 크로마토그래피 세척 용액으로 CEX 크로마토그래피 지지체를 세척하는 단계, 및 f) 항체를 CEX 크로마토그래피 지지체로부터 용출시켜, 정제된 항체의 용출액을 형성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 재조합적으로-발현된 또는 하이브리도마-발현된 항체 및 수성 캐리어를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (a) TNF-유사 리간드 1A(TL1a)에 특이적으로 결합하고 서열 번호: 5 또는 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 하나 이상의 CDR을 포함하고 (b) 칼시토닌 유전자-관련 펩타이드(CGRP)에 특이적으로 결합하고 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 하나 이상의 CDR 및 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 하나 이상의 CDR을 포함하고, 또는 (c) CD38에 특이적으로 결합하고, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 하나 이상의 CDR 및 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 하나 이상의 CDR을 포함한다. 일부 양태에서, 조성물에는 바이러스 입자가 실질적으로 없다. 일부 양태에서, 조성물은 CEX 크로마토그래피 이전에 음이온 교환 크로마토그래피를 거치지 않는다. 일부 양태에서, 조성물은 CEX 크로마토그래피 이전에 임의의 이온 교환 크로마토그래피를 거치지 않는다.
도 1은 본원에 제공된 방법을 이용하는 예시적인 단백질 정제 공정의 개략도이다. 실시예에서 입증된 바와 같이, "계면활성제 세척"은 바이러스 입자를 실질적으로 제거할 수 있고 또한 계면활성제를 포함하지 않는 세척을 이용하는 것과 비교하여 수율을 증가시킬 수 있다. 중간 세척 단계인 "세척 3"은 계면활성제를 제거할 수 있고, 이에 의해 계면활성제를 제거하기 위한 세척 단계를 포함하지 않고 대신 계면활성제를 포함하는 초기 용출 분획 폐기를 필요로 하는 공정과 비교하여 수율이 증가한다. 이 도식에 나타난 방법은 단백질 A 정제 단계 없이 또는 (예를 들어, 다운스트림의) 단백질 정제 A 정제 단계와 조합으로 사용될 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 개시에 따라 CEX 세척 용액 중 계면활성제의 포함이 CEX 크로마토그래피 정제 동안 단백질 제제로부터의 바이러스 클리어런스를 실질적으로 향상시키는 것으로 관찰되었다. 이는 단백질 정제 방법에서 AEX 크로마토그래피 단계의 생략을 가능하게 하기 때문에 유리하다. 놀랍게도, 계면활성제는 관심 단백질에 해로운 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀졌다. 게다가, CEX 세척 용액은 단백질 제제로부터의 숙주 세포 단백질 제거를 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 계면활성제-포함 세척 후, 그러나 CEX 크로마토그래피 지지체로부터의 단백질 용출 전에 중간 세척의 사용은, CEX 크로마토그래피 지지체로부터 임의의 잔류 계면활성제 제거 이외에도, 용출액 중 관심 단백질의 수율을 놀랍게 개선하고 HCP 클리어런스를 개선함이 또한 밝혀졌다.
HCP 제거 및 바이러스 클리어런스의 수준은 음이온 교환(AEX) 크로마토그래피를 사용한 후속 정제 단계가 단백질 정제 체계로부터 제거될 수 있을 정도로 실질적인 것으로 관찰되었다. 따라서, 일 구체예에서, 본원에 기재된 단백질 정제 방법은 AEX 단계를 포함하지 않는다. 그러한 단백질 정제 방법은 친화성 크로마토그래피 단계, 이어서 본원에 기재된 바와 같은 CEX 크로마토그래피 단계를 포함할 수 있다.
본 개시는 친화성 및 CEX 크로마토그래피 세척 조성물, 그러한 조성물을 사용하는 단백질 정제 체계 및 예를 들어 그러한 조성물 또는 정제 체계를 사용하여 정제된 바와 같은, 고순도를 갖는 단백질 제제를 특징으로 한다. 조성물 및 정제 체계는 하이브리도마- 또는 재조합적으로-발현된 단일클론 항체에 특히 적합하지만, CEX 크로마토그래피에 의해 정제된 임의의 재조합적으로 발현된 단백질의 제조에 사용될 수도 있다.
따라서, 친화성 및 양이온 교환 크로마토그래피 세척 조성물, 그러한 조성물을 사용하는 폴리펩타이드 정제 체계 및 예를 들어 그러한 조성물 또는 정제 체계를 사용하여 정제된 바와 같은, 고순도를 갖는 폴리펩타이드 제제가 본원에 제공된다.
I. 정의
본 발명의 양태에 관한 다양한 용어가 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐 사용된다. 달리 명시되지 않는 한, 그러한 용어는 당해 분야에서 통상적인 의미를 부여받는다. 다른 구체적으로 정의된 용어는 본원에 제공된 정의와 일치하는 방식으로 해석되어야 한다.
본원에서 사용된 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 달리 명시적으로 언급되지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다.
용어 "물을 포함하는 용액"은 용어 "수성 용액"과 상호 교환적으로 사용된다.
용어 "숙주 세포 단백질", "HCP", "숙주 세포 단백질 오염물" 및 "숙주 세포 단백질 불순물"은 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드", "관심 폴리펩타이드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하도록 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비아미노산에 의해 차단될 수 있다. 상기 용어는 자연적으로 또는 개입; 예를 들어, 디설파이드 결합 형성, 글라이코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화에 의해 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지화 성분과의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 또한 포함한다. 또한 예를 들어 아미노산의 하나 이상의 유사체(예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함)를 포함하는 폴리펩타이드뿐만 아니라 당해 분야에 공지인 다른 변형물이 상기 정의에 포함된다. 본 개시의 폴리펩타이드는 항체에 기반하기 때문에, 특정 구체예에서, 폴리펩타이드가 단일 사슬 또는 연합된 사슬로서 존재할 수 있음이 이해된다. 바람직하게는, 관심 단백질은 폴리펩타이드, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항체 작제물이다.
용어 "항-TNF-유사 리간드 1A(TL1a)"는 TL1a에 결합할 수 있는 임의의 단백질을 지칭한다. 항-TL1a 단백질은, 예를 들어 항-TL1a 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 항체는 본원에 참조로 포함된 미국 공개 번호 제2014/0255302호에 기재된 임의의 항체일 수 있다. 항체는 미국 가출원 번호 제62/220,442호에 기재된 임의의 항체일 수 있다.
용어 "항-칼시토닌 유전자-관련 펩타이드(CGRP)"는 CGRP에 결합할 수 있는 임의의 단백질을 지칭한다. 항-GCRP 단백질은, 예를 들어 항-CGRP 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 항체는 미국 공개 번호 제2009/0220489호 또는 PCT 공개 번호 제WO 2007/054809호에 기재된 임의의 항체일 수 있다.
용어 "항-CD38"은 CD38에 결합할 수 있는 임의의 단백질을 지칭한다. 항-CD38 단백질은, 예를 들어 항-CD38 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 항체는 각각 본원에 참조로 포함된 미국 공개 번호 제2016/0068612호 또는 미국 공개 번호 제2015/0313965호에 기재된 임의의 항체일 수 있고, 이들 공보에 기재된 바와 같은 약독화 인터페론 분자에 추가로 융합된 항체를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "항체" 및 "항체들"은 당해 분야의 용어이고 본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있으며 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 갖는 분자를 지칭한다.
용어 "항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역 내의 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통하여 표적, 예컨대 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, 지질, 또는 이들의 조합을 인식하고 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 의미한다. 본원에서 사용된 용어 "항체"는 온전한 다중클론 항체, 온전한 단일클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체를 포함하는 융합 단백질, 및 항체가 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포함한다. 항체는 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 지칭되는 이들의 중쇄 불변 도메인의 정체성이 기초하여 면역글로불린의 임의의 다섯 가지의 주요 클래스: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 또는 이의 서브클래스(아이소타입)(예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)에 속할 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린은 상이하고 잘 알려진 서브유닛 구조 및 3-차원 배열을 갖는다. 항체는 노출되거나 독소, 방사성 동위원소 등과 같은 다른 분자와 접합될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "항체"는 이중특이적 및 다중특이적 항체를 포함한다.
용어 "항체 단편"은 온전한 항체의 일부를 지칭한다. "항원-결합 단편"은 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 지칭한다. 항원-결합 단편은 온전한 항체의 항원 결정 가변 영역을 포함할 수 있다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 선형 항체, 및 단일 사슬 항체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. "항원-결합 단편"은 이중특이적 또는 다중특이적 항원-결합 단편일 수 있다.
용어 "단일클론" 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단일 항원 결정인자 또는 에피토프(epitope)의 고도로 특이적인 인식 및 결합에 관여하는 균질 항체 또는 항원-결합 단편 집단을 지칭한다. 이는 여러 상이한 항원 결정인자에 대해 지시된 여러 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다중클론 항체와 대조적이다. 용어 "단일클론" 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 온전하면서 전장(full-length)인 단일클론 항체뿐만 아니라 항체 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 사슬 (scFv) 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포함한다. 더욱이, "단일클론" 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현 및 형질전환 동물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 방식으로 제조된 그러한 항체 및 이의 항원-결합 단편을 지칭한다.
용어 "인간화" 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 특이적 면역글로불린 사슬, 키메라 면역글로불린 또는 최소한의 비인간(예를 들어, 쥐과) 서열을 포함하는 이의 단편인 비인간(예를 들어 쥐과) 항체 또는 항원-결합 단편의 형태를 지칭한다. 전형적으로, 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상보성 결정 영역(CDR)으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비인간 종(예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 햄스터)의 CDR로부터의 잔기로 대체되는 인간 면역글로불린이다 ("CDR 이식됨") (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)). 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비인간 종으로부터의 항체 또는 단편 중의 상응하는 잔기로 대체된다. 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Fv 프레임워크 영역에서 및/또는 대체된 비인간 잔기 내에서 추가적인 잔기의 치환에 의해 추가로 변형되어 항체 또는 이의 항원-결합 단편 특이성, 친화성 및/또는 능력을 개선하고 최적화할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 비인간 면역글로불린에 상응하는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역을 포함하는 적어도 하나, 전형적으로 둘 또는 셋의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이지만, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 일치 서열의 영역이다. 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 전형적으로 인간 면역글로불린의 것인 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인(Fc)의 적어도 일부를 또한 포함할 수 있다. 인간화 항체 생성에 사용된 방법의 예는 미국 특허 제5,225,539호; Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91(3):969-973 (1994) 및 Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895-904 (1996)에 기재된다. 일부 구체예에서, "인간화 항체"는 리서페이싱된(resurfaced) 항체이다.
항체의 "가변 영역"은 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 단독으로 또는 조합으로 지칭한다. 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 영역은 초가변 영역으로도 알려진 세 개의 상보성 결정 영역(CDR)에 의해 연결된 네 개의 프레임워크 영역(FR)으로 구성된다. 각 쇄의 CDR은 FR에 의해 아주 근접하게 엮이고, 다른 쇄로부터의 CDR과 함께, 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다. CDR을 결정하기 위한 적어도 두 가지 기술이 있다: (1) 종간 서열 가변성에 기초한 접근법 (즉, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)); 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구에 기초한 접근법 (Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). 또한, 이들 두 접근법의 조합이 당해 분야에서 CDR을 결정하기 위하여 때때로 사용된다.
용어 "인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체 또는 당해 분야에서 공지인 임의의 기술을 사용하여 제조된 인간에 의해 생성된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 의미한다. 인간 항체의 이러한 정의는 온전한 또는 전장 항체, 이의 단편 및/또는 예를 들어 쥐과 경쇄 및 인간 중쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체와 같은, 적어도 하나의 인간 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 포함한다.
용어 "하이브리도마-발현된"은 면역학적 기원의 불멸 세포주와 항체 생산 세포의 융합에 의해 생성된 하이브리드 세포주에서 발현된 관심 단백질을 지칭한다. 용어 "하이브리도마"는 헤테로하이브리드 골수종 융합체의 자손을 포함하는데, 이는 인간 세포와 쥐과 골수종 세포주가 융합하고 후속하여 형질 세포와 융합한 결과이며, 트리오마(trioma) 세포주로 알려져 있다. 더욱이, 용어 "하이브리도마"는 예를 들어, 쿼드로마(quadroma)와 같이 항체를 생성하는 임의의 불멸화 하이브리드 세포주를 포함함을 의미한다 (예를 들어 Milstein et al., 1983, Nature, 537:3053 참조). 하이브리드 세포주는 인간 및 마우스를 포함하여 임의의 종의 것일 수 있다.
용어 "재조합적으로-발현된"은 재조합 플라스미드 또는 벡터와 같은 외인성 폴리뉴클레오타이드의 도입에 의해 유전적으로 변형되었거나 유전적으로 변형될 수 있는 "재조합 숙주 세포"에서 발현된 관심 단백질을 지칭한다. 그러한 용어는 특정 대상 세포뿐만 아니라 그러한 세포의 자손을 지칭하도록 의도됨을 이해해야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인한 특정한 변형이 후속 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 그러한 자손은 실제로 모세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에서 사용된 용어 "재조합 숙주 세포"의 범위 내에 여전히 포함된다.
용어 "아미노산"은 임의의 천연 발생 및/또는 비천연 아미노산 잔기를 지칭한다. 용어 "천연 발생 아미노산"은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 및 Val을 지칭한다. 용어 "염기성 아미노산"은 아르기닌, 리신, 글라이신 및 히스티딘을 지칭한다. 아미노산은 천연 및 비천연 아미노산의 D-형을 또한 포함한다. "D-"는 천연 발생 ("L-") 아미노산의 배열과 대조적으로 "D" (우회전성) 배열을 갖는 아미노산을 나타낸다. 천연 및 비천연 아미노산은 상업적으로 구입하거나 (Sigma Chemical Co., Advanced Chemtech) 당해 분야에 공지인 방법을 사용하여 합성될 수 있다.
용어 "바이러스 클리어런스"는 용어 "바이러스 제거" 및 "바이러스의 제거"와 상호 교환적으로 사용된다. 용어 "바이러스 불활성화"는 혼합물에 포함된 바이러스가 기능하지 않게 함을 지칭한다. 바이러스는 항체 생산원, 다운스트림 처리 단계 또는 제조 조건에서 유래할 수 있다. 바이러스를 비기능성으로 만들거나 바이러스를 제거하는 방법은 열 활성화, pH 불활성화, 화학적 불활성화제 등을 포함한다. 용어 "pH 바이러스 불활성화"는 바이러스가 바이러스를 비기능성으로 만들기에 충분한 pH, 예를 들어 약 2.5 내지 5.0의 pH를 거치는 것을 포함한다.
용어 "log10 감소 계수(log10 reduction factor, LRF)", "log10 감소 값(log10 reduction value, LRV)" 및 "로그 클리어런스"는 상호 교환적이고 출발 물질 중 및 관련 생성물 분획 중 바이러스 역가의 계산된 비율을 지칭한다. 감소 계수는 바이러스를 제거하거나 불활성화하는 공정 단계의 잠재성 또는 능력을 설명하기에 적합한 파라미터이다. 임의의 공정 단계의 LRV는 생성물을 오염시킬 수 있는 바이러스와 유사한 임의의 공지된 모델 바이러스, 예를 들어 쥐과 백혈병 바이러스(murine leukemia virus, MuLV) 및 마우스의 미세 바이러스(minute virus of mice, MVM)를 사용하여 측정될 수 있다. LRV는 또한 레트로바이러스 유사 입자(RVLP)에 의해 측정될 수 있다. LRV는 정량적 PCR(qPCR)에 의해 또는 감염력 분석(예를 들어, TCID50 측정)을 이용하여 계산될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 임의의 방법을 사용하여 바이러스 클리어런스 연구에 의해 측정 시 바이러스 입자가 "실질적으로 없는" 관심 단백질을 포함하는 정제된 용출액 및 조성물을 제공한다. 본원에서 사용된 용어 "바이러스 입자가 실질적으로 없는"은 관심 단백질이 바이러스 입자로부터 분리된, 관심 단백질을 포함하는 정제된 용출액 또는 조성물을 지칭한다. 용어 "실질적으로 없는"은 약 0.0005% 미만 내지 약 0.001% 바이러스 입자를 갖는 관심 단백질을 포함하는 용액 또는 조성물을 지칭한다. 바람직하게는, 조성물이 약 0.0005% 미만 바이러스 입자를 가질 경우 조성물에 "실질적으로 없다".
본 발명은 본 발명의 임의의 방법을 사용하여 바이러스 클리어런스 연구에 의해 측정 시 바이러스 입자가 "없는" 관심 단백질을 포함하는 정제된 용출액 및 조성물을 제공한다. 본원에서 사용된 용어 "바이러스 입자가 없는"은 약 0.0001% 미만을 갖는 조성물을 지칭한다. 바이러스 입자가 최대 감도의 조건 하에 바이러스 클리어런스 연구에 의해 검출될 수 없을 경우 조성물에 바이러스 입자가 없다.
용어 "컬럼", "지지체", "리간드" 및 "수지"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
용어 "조성물" 및 "정제된 조성물"은 상호 교환적이고 캐리어 및 관심 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 지칭한다. 캐리어는 바람직하게는 수성이고, 약학적으로 허용되는 캐리어일 수 있다. 캐리어는 완충액을 포함할 수 있고, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다. 조성물은 약제학적 조성물로 지칭될 수 있다.
용어 "친화성 크로마토그래피" 또는 "친화성 정제"는 고체 지지체에 고정되거나 연결된 리간드와 이의 결합 파트너 사이의 특이적 결합 상호작용에 기초한 분리 방법을 지칭한다. 복합 혼합물이 컬럼을 통과하면, 리간드에 대해 특이적 결합 친화성을 갖는 분자가 결합된다. 다른 샘플 성분이 세척된 후, 결합된 분자가 지지체로부터 스트리핑되어, 원래 혼합물로부터 정제된다. 각각의 특이적 친화성 시스템은 당업자에게 공지인 자체적인 조건 세트를 필요로 한다.
용어 "친화성 리간드"는 금속 (예를 들어, Cd+2, Co+2, Cu+2, Ga+3, Fe+3, Ni+2 및 Zn+2), 염료 (예를 들어, 시바크론 블루 및 이의 변형), 글루타치온, 서브틸리신, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G, 단백질 L, 보로네이트, 아비딘, 스트렙타비딘, 바이오틴, 항-c-Myc, 항-HA, 뉴클레오타이드, 조효소, 항체, 헤파린, 항원 (특히 공지된 특이성을 갖는 항체에 대하여) 및 다른 공지된 친화성 리간드를 지칭한다.
II. 정제를 위한 관심 단백질 및 이의 제제를 포함하는 조성물
본원에 입증된 바와 같이, 단백질 정제 방법은 계면활성제-포함 세척(예를 들어, CEX 크로마토그래피 컬럼 세척)의 사용을 통해 개선될 수 있다. 상기 방법은 재조합적으로 발현된 단백질을, 예를 들어 수확 세포 배양액(HCCF)으로부터 직접 포획하고 정제하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법은 또한, 재조합적으로 발현된 단백질, 예를 들어 HCCF로부터 (예를 들어, 단백질 A 정제를 통해) 이미 부분적으로 정제된 단백질을 추가로 정제(폴리싱)하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 관심 단백질은 바람직하게는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 관심 단백질은 TNF-유사 리간드 1A(TL1a)에 특이적으로 결합하는 항체이다. TL1a에 특이적으로 결합하는 항체는 서열 번호: 5 또는 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) (또는 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열) 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) (또는 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열)을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 관심 단백질은 칼시토닌 유전자-관련 펩타이드(CGRP)에 특이적으로 결합하는 항체이다. CGRP에 특이적으로 결합하는 항체는 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH (또는 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열) 및 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 VL (또는 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열)을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 관심 단백질은 CD38에 특이적으로 결합하는 항체이다. CD38에 특이적으로 결합하는 항체는 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH (또는 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열) 및 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL (또는 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열)을 포함할 수 있다. CD38에 특이적으로 결합하는 항체는 인터페론 알파 분자를 포함하고 약독화 인터페론 알파 분자를 포함하는 인터페론 분자에 대한 융합을 추가로 포함할 수 있다.
관심 단백질의 발현은 단백질을 인코딩하는 유전자로써 형질전환될 수 있는 임의의 적합한 숙주 세포에서 수행될 수 있다. 숙주 세포는 진핵 세포 또는 원핵 세포일 수 있고, 제한 없이 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포 및 포유류 세포를 포함한다. 포유류 세포가 바람직하다. 적합한 포유류 세포의 비제한적 예는 항체-발현 하이브리도마 세포뿐만 아니라, 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포, 인간 배아 신장 293(human embryonic kidney 293, HEK 293) 세포 및 쥐과 하이브리도마 NS0 세포와 같은 발현 숙주를 포함한다. 발현된 폴리펩타이드는 세포로부터 세포 배양 배지로 분비될 수 있거나, 세포 내에 있을 수 있다. 세포 배양물은 생물반응기 안에 있을 수 있다 (예를 들어, 발효). 전형적인 생물반응기 세포 배양은 기초 배지로써 개시되고, 배양 개시 후 배양 완료까지 영양분이 주기적으로 주입된다. 이러한 주입은 일반적으로 피드 배지(feed medium)의 주입이며, 단백질 발현 단계 동안 세포 배양을 지속시킨다. 대부분의 경우, 피드 배지 주입은 일시 주입을 통해 수행되며, 농축된 피드 배지가 설정된 시점에, 보통 하루에 한 번 세포 배양물에 빠르게 첨가된다. 일시 공급의 대안으로, 생물반응기 세포 배양은 연장된 또는 연속의 공급을 사용하여 주입될 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 피드 배지가 생물반응기 영양분 주입에 적합하다.
생물반응기는 적어도 약 250 리터의 용량을 가질 수 있다. 일부 양태에서, 생물반응기는 적어도 약 500 리터의 용량을 갖는다. 일부 양태에서, 생물반응기는 적어도 약 2000 리터의 용량을 갖는다. 일부 양태에서, 생물반응기는 적어도 약 5000 리터, 또는 10,000 리터 또는 15,000 리터의 용량을 갖는다.
발현 이후, 폴리펩타이드를 포함하는 배지(예를 들어, 세포 배양 배지)는, 예를 들어 숙주 세포 및 미립자 파편을 제거하기 위해 정화될 수 있다. 정화는 여과, 원심분리 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 규조토 및 셀룰로스 섬유를 통한 심층 여과가 사용될 수 있다. 임의의 상업적으로 이용 가능한 멤브레인 필터를 사용하는, 예를 들어 0.2 μm 필터를 통한 멤브레인 여과가 임의의 미생물 오염물을 제거하기 위하여 사용될 수 있다.
발현 이후, 정화가 사용되는 경우, 관심 폴리펩타이드는 오염 숙주 세포 단백질(HCP)을 제거하기 위해 친화성 크로마토그래피를 통해 정화될 수 있다. 친화성 크로마토그래피는 관심 폴리펩타이드의 정제에 적합한 임의의 친화성 리간드를 포함할 수 있다. 친화성 크로마토그래피 리간드의 비제한적 예는 금속 (예를 들어, Cd+2, Co+2, Cu+2, Ga+3, Fe+3, Ni+2 및 Zn+2), 염료 (예를 들어, 시바크론 블루 및 이의 변형), 글루타치온, 서브틸리신, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G, 단백질 L, 보로네이트, 아비딘, 스트렙타비딘, 바이오틴, 항-c-Myc, 항-HA, 뉴클레오타이드, 조효소, 항체, 헤파린, (특히 공지된 특이성을 갖는 항체에 대한) 항체 및 다른 공지된 친화성 리간드를 포함한다. 친화성 리간드는 일반적으로 고체 지지체에 고정되며, 이를 위한 다수의 공지되고 일반적인 지지체가 존재한다. 본 발명의 일 구체예에서, 본원에 기재된 세척 용액을 사용한 CEX 크로마토그래피가 친화성 크로마토그래피의 단계를 대체할 수 있다. 이 구체예에서, 발현 이후, 정화가 사용되는 경우, 사전의 친화성 크로마토그래피 없이 관심 폴리펩타이드를 포함하는 수용액이 CEX 지지체에 로딩될 수 있다.
III. CEX 정제
친화성 크로마토그래피 이후 (사용되는 경우) 단백질 제제가 CEX 지지체에 로딩되고, 이에 의해 관심 단백질이 지지체에 결합한다. 지지체는 바람직하게는 고 단백질-결합 능력을 갖는다. 지지체는 바람직하게는 폴리펩타이드 제제로써 로딩되기 전에 평형화된다. 평형은 바람직하게는 완충 용액을 사용한다.
일부 구체예에서, CEX 지지체는 세파로스 매트릭스 수지이다. 일부 구체예에서, CEX 지지체는 합성 중합체 매트릭스 수지이다. 예시적인 CEX 지지체는 GE Capto S, Millipore Fractogel EMD SO3-, Fractogel EMD TMAE, Fractogel EMD, Eshnumo S, Eshmuno HCX, Tosoh Toyopearl CM, Tosoh Toyopearl SP 및 Biorad Nuvia cPrime를 포함한다.
일부 구체예에서, CEX 지지체는 세파로스-기초 설포프로필 강 양이온 교환이다. CEX 지지체는 예를 들어 SPFF 수지일 수 있다.
일부 구체예에서, CEX 지지체는 설포프로필 리간드를 갖는 가교된 폴리 (스타이렌디비닐벤젠) 중합체 매트릭스를 포함한다. CEX 지지체는 예를 들어 Poros XS 수지일 수 있다.
일부 구체예에서, CEX 지지체는 중합체 이온-교환 크로마토그래피 수지(Poros™ XS, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA)이다.
일부 구체예에서, CEX 지지체는 4차 암모늄 (Q) 강 음이온 교환 그룹으로써 가교된 6% 아가로스 비드(Q Sepharose® Fast Flow, GE-Healthcare, Pittsburgh, PA)이다.
폴리펩타이드 제제를 CEX 크로마토그래피 지지체에 로딩하는 것은 관심 폴리펩타이드를 지지체에 흡착시키기에 적합한 온도, 부피에서 적합한 시간 동안 수행된다. 지지체에 결합하지 않는 바람직하지 않은 HCP 및 바이러스는 크로마토그래피 동안 지지체를 통해 흐른다. 본원에 기재되고 예시된 세척 용액은 바이러스, 응집체 및 HCP를 포함하는 오염물의 제거를 위한 CEX 크로마토그래피 지지체 세척에 사용된다. 중간 세척 완충액을 사용한 세척 이후, 관심 단백질은 CEX 지지체로부터 용출된다. 용출 완충액은 일반적으로 CEX 지지체 및 관심 폴리펩타이드의 유형에 맞추어지고, 따라서 다양할 수 있다. 용출은 관심 단백질의 최대 용출 수율에 적합한 온도, 부피에서 적합한 시간 동안 수행될 수 있다. 단백질의 용출은 단백질을 포함하는 CEX 크로마토그래피 용출액을 생성한다. 항체 또는 항체 작제물의 용출은 항체 또는 항체 작제물을 포함하는 CEX 용출액을 생성한다.
본 발명의 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 HCP 및 응집체 함량을 감소시킬 뿐만 아니라, 관심 단백질을 포함하는 조성물에서 바이러스의 수준을 감소시키거나 바이러스를 불활성화하기 위해 사용될 수 있다. 전형적인 종래 기술 정제 공정은 단백질 (예를 들어 항체) 정제 방법 동안 바이러스의 수준을 감소시키거나 바이러스를 불활성화하기 위해 음이온 교환에 이어서 추가의 산성화 처리를 사용한다. 놀랍게도, 본 발명자들은 본 발명의 CEX 크로마토그래피 세척 용액의 사용이 음이온 교환 크로마토그래피의 단계 또는 바이러스 불활성화 단계를 생략하기에 충분하게 바이러스의 수준을 감소시킴을 발견했다.
IV. 계면활성제 세척 및 기타 방법을 사용한 바이러스 클리어런스
단백질을 CEX 크로마토그래피 지지체에 로딩하기 전에, (예를 들어, 폴리펩타이드를 포함하는 또는 항체 또는 항체 작제물을 포함하는) 단백질 용액이 용출액에 존재하는 임의의 잔류 바이러스를 불활성화하는 처리로써 추가로 처리될 수 있다. 바이러스 불활성화는 용출액에 존재하는 임의의 바이러스를 불활성화하기에 충분한 온도에서 충분한 시간 동안 용출액을 산성화하는 것을 포함할 수 있다. 산성화는 원하는 pH가 달성될 때까지 예를 들어 아세트산, 시트르산, 염산, 포름산, 인산, 카프릴산, 다른 적합한 산 또는 이들의 조합을 용출액에 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 저 pH 바이러스 불활성화 후, 용출액은 (공정 요구에 따라) pH 3.0 내지 7.5까지 중화될 수 있다. 일부 구체예에서 용출액은 약 3.0 내지 약 3.5의 pH, 약 3.0 내지 약 4.0의 pH, 약 3.5 내지 약 4.5의 pH, 약 4.0 내지 약 5.5의 pH, 약 4.5 내지 5.5의 pH, 6.0 내지 약 7.0의 pH, 또는 약 6.0 내지 약 7.5의 pH까지 중화된다. 일부 구체예에서 용출액은 약 3.0의 pH, 약 3.5의 pH, 약 4.0의 pH, 약 4.5의 pH, 약 5.0의 pH, 약 5.5의 pH, 약 6.0의 pH, 약 6.5의 pH, 약 7.0의 pH 또는 약 7.5의 pH까지 중화된다. 중화 단계 동안, 불순물 (또는 생성물)의 침전으로 인해 생성물 풀에 혼탁이 나타날 수 있다. 심층 여과는 혼탁 및 불순물을 제거하기 위해 pH-조정된 제제 여과에 사용될 수 있다.
관심 단백질을 포함하는 유체에 존재하는 바이러스 불활성화의 단위 조작은 약 2.5 내지 5.0, 약 3.5 내지 약 4.5, 약 3.5 내지 약 4.25, 약 3.5 내지 약 4.0, 약 3.5 내지 약 3.8 또는 약 3.75의 pH에서 적어도 25 분, 약 30 분 내지 1.5 시간, 약 30 분 내지 1.25 시간, 약 0.75 시간 내지 1.25 시간 또는 약 1 시간의 기간 동안 재조합 치료용 단백질을 포함하는 유체를 배양할 수 있는 홀딩 탱크에서 수행될 수 있다.
대안의 구체예에서, 바이러스 불활성화 단계는 당해 분야에 공지인 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 불활성화 단계는, 다양한 구체예에서, 산, 세제, 화학물질, 핵산 가교제, 자외선, 감마선, 열을 이용한 처리 또는 이 목적에 유용한 것으로 당해 분야에 공지인 임의의 다른 공정을 포함할 수 있다.
바이러스는 여과에 의해 제거될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 여과는 심층 필터를 통한 재조합 단백질 유동 단계 전 및/또는 후에 수행될 수 있다. 바이러스는 미국 특허 제6,365,395호에 기재된 바와 같이 법선 흐름 필터(normal flow filter, NFF) 또는 접선 흐름 여과(tangential flow filtration, TFF) 필터에 의해 재조합 단백질을 포함하는 용액으로부터 제거될 수 있다. TFF 모드 또는 NFF 모드에서, 여과는 멤브레인을 통한 재조합 단백질의 통과를 허용하면서 멤브레인 표면에서 일반적으로 20 내지 100 나노미터(nm) 직경을 갖는 바이러스를 보유하는 조건 하에서 수행된다.
바이러스 클리어런스 연구의 목적은 바이러스 불활성화/제거에 효과적인 것으로 간주될 수 있는 공정 단계(들)를 평가하고 공정 단계(들)에 의해 획득된 바이러스 감소의 전체 수준을 정량적으로 추정하는 것이다. 바이러스 감소 수준은 상당한 양의 바이러스를 관심 단백질을 포함하는 혼합물에 첨가("스파이킹")하여, 다양한 공정 단계 후에, 후속 단계 동안 바이러스의 제거 또는 불활성화를 입증하여 획득할 수 있다. 바이러스 감염력 감소는 바이러스 입자의 제거 또는 바이러스 감염력의 불활성화에 의해 달성될 수 있다. 바이러스 클리어런스 연구는 혼합물에 존재하는 것으로 알려진 바이러스의 클리어런스를 입증하기 위해 수행된다. 감소 계수는 일반적으로 로그 스케일(log10)로 표현된다. 클리어런스 평가 연구를 위한 모델 바이러스는 관심 단백질을 포함하는 혼합물을 오염시키는 바이러스와 유사하게 선택된다. 이종친화 쥐과 백혈병 바이러스(xenotropic murine leukemia virus, X-MulV) 및 마우스의 미세 바이러스(MVM)와 같은 모델 바이러스가 세포주-유래의 관심 단백질의 바이러스 클리어런스 확인에 흔히 사용된다.
일부 구체예에서, CEX 세척 용액 또는 ProA 세척 용액은 바이러스 클리어런스를 증가시키거나 관심 단백질을 포함하는 혼합물로부터 바이러스를 불활성화한다. 일부 구체예에서, 세척 용액은 단백질 A 크로마토그래피 단계 동안 바이러스 클리어런스를 증가시킨다. 일부 구체예에서, 세척 용액은 CEX 크로마토그래피 단계 동안 바이러스 클리어런스를 증가시킨다. 바이러스 클리어런스는 log10 감소 값(LRV)으로 측정될 수 있다. 일부 구체예에서, 세척 용액은 바이러스 클리어런스를 증가시키고 여기서 LRV는 약 1.0 내지 약 10.0 log10이다. 일부 구체예에서, 세척 용액은 바이러스 클리어런스를 증가시키고 여기서 LRV는 약 1.0 내지 약 5.0 log10, LRV는 약 1.0 내지 약 3.0 log10, LRV는 약 2.0 내지 약 4.0 log10, LRV는 약 3.0 내지 약 5.0 log10 또는 LRV는 약 5.0 log10 내지 6.0 log10이다. 일부 구체예에서, LRV는 약 1.0 log10, LRV는 약 2.0 log10, LRV는 약 3.0 log10, LRV는 약 4.0 log10, LRV는 약 5.0 log10, LRV는 약 6.0 log10, LRV는 약 7.0 log10, LRV는 약 8.0 log10, LRV는 약 9.0 log10 또는 LRV는 약 10.0 log10이다. LRV는 1 컬럼 부피(CV)의 세척, 2 CV의 세척, 3 CV의 세척, 4 CV의 세척 또는 5 CV의 세척을 적용하여 달성될 수 있다.
V. 계면활성제-포함 세척을 사용하여 정제된 단백질의 추가 처리 및 이로부터 제조된 조성물
바이러스 불활성화 이후, 또는 바이러스 불활성화가 포함되지 않은 경우 CEX 크로마토그래피로부터의 용출 이후, 관심 단백질은, 예를 들어, 비인간 동물 또는 인간에게 치료적으로 투여하기에 적합한 형태로 추가로 처리될 수 있다. 그러한 추가 처리는 정제된 관심 단백질 제제의 한외여과, 나노여과, 농축 및 정용여과의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
한외여과는 관심 단백질 제제를 농축시키기 위한 방법이다. 단백질은 멤브레인 세공 크기 및 분획분자량에 기초하여 용액 중의 다른 분자로부터 여과된다. 정용여과는 관심 단백질을 원하는 완충액으로 (예를 들어, 용출 완충액으로부터 안정한 포뮬레이션 완충액으로) 교환하기 위해 사용된다. 한외여과 및 정용여과는 전형적으로 접선 흐름 여과를 사용한다.
본 발명의 CEX 크로마토그래피 세척 완충액의 사용을 포함하는 정제 체계 이후, 관심 단백질은 바람직하게는 조성물에 존재한다. 조성물은 바람직하게는 캐리어 및 관심 단백질을 포함한다. 캐리어는 바람직하게는 수성이고, 약학적으로 허용되는 캐리어일 수 있다. 캐리어는 완충액을 포함할 수 있고, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다. 조성물은 약제학적 조성물로 지칭될 수 있다. 용어 "조성물" 및 "정제된 조성물"은 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
일부 구체예에서 본원에 기재되거나 예시된 방법에 따라 정제된 단백질인 정제된 관심 단백질을 포함하는 조성물이 제공된다. 그러한 조성물은 관심 단백질 및 최소량의 레트로-바이러스 유사 입자(RVLP)를 포함하고, 후자는 관심 단백질과 공발현되지만 본원에 기재된 세척 용액을 사용하는 CEX 크로마토그래피를 통해 관심 단백질로부터 대부분 분리된다.
일부 양태에서, 조성물 중의 관심 폴리펩타이드는 항체 또는 항체 작제물이다. 항체 또는 항체 작제물은 형질전환된 숙주 세포(예를 들어, 항체 또는 항체 작제물을 인코딩하는 유전자를 포함하는 숙주 세포)에 의해 재조합적으로 발현될 수 있거나, 하이브리도마 세포를 통해 발현될 수 있다. 항체 또는 항체 작제물은 인간 TNF-유사 리간드 1A(TL1a)상의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 항체 또는 항체 작제물은 인간 칼시토닌 유전자-관련 펩타이드(CGRP)상의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 항체 또는 항체 작제물은 인간 CD38상의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다.
일부 양태에서, 조성물은 CGRP에 특이적으로 결합하고 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 정제된 항체 또는 항체 작제물을 포함한다. 중쇄 가변 영역(VH)은 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 경쇄 가변 영역(VL)은 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 조성물은 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 항체 또는 항체 작제물을 포함할 수 있고, 상기 항체 또는 항체 작제물은 CGRP에 특이적으로 결합한다. 조성물은 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 VH를 포함하는 항체 또는 항체 작제물을 포함할 수 있고, 상기 항체 또는 항체 작제물은 CGRP에 특이적으로 결합한다. 조성물은 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체 또는 항체 작제물을 포함할 수 있고, 상기 항체 또는 항체 작제물은 CGRP에 특이적으로 결합한다. 항체는 미국 공개 번호 제2009/0220489호 또는 PCT 공개 번호 제WO 2007/054809호에 기재된 임의의 항체일 수 있다.
일부 양태에서, 조성물은 TL1a에 특이적으로 결합하고 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 정제된 항체 또는 항체 작제물을 포함한다. 항체는 본원에 참조로 포함된 미국 공개 번호 제2014/0255302호에 기재된 임의의 항체일 수 있다. 항체는 미국 가출원 번호 제62/220,442호에 기재된 임의의 항체일 수 있다.
일부 양태에서, 조성물은 CD38에 특이적으로 결합하고 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 정제된 항체 또는 항체 작제물을 포함한다. 항-CD38 항체는 두 번째 폴리펩타이드 분자에 추가로 융합될 수 있고, 예를 들어, 폴리펩타이드 독소에 융합되거나, 인터페론 알파와 같은 인터페론 폴리펩타이드에 융합된다. 중쇄 가변 영역(VH)은 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 경쇄 가변 영역(VL)은 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 조성물은 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 항체 또는 항체 작제물을 포함할 수 있고, 상기 항체 또는 항체 작제물은 CD38에 특이적으로 결합한다. 조성물은 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 VH를 포함하는 항체 또는 항체 작제물을 포함할 수 있고, 상기 항체 또는 항체 작제물은 CD38에 특이적으로 결합한다. 조성물은 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체 또는 항체 작제물을 포함할 수 있고, 상기 항체 또는 항체 작제물은 CD38에 특이적으로 결합한다. 항체는 각각 본원에 참조로 포함된 미국 공개 번호 제2016/0068612호 또는 미국 공개 번호 제2015/0313965호에 기재된 임의의 항체일 수 있고, 이들 공보에 기재된 약독화 인터페론 분자에 추가로 융합된 항체를 포함한다.
일부 양태에서, 조성물은 TL1a에 특이적으로 결합하고 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 정제된 항체 또는 항체 작제물을 포함한다. VH는 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. VH는 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. VL은 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 따라서, VH는 서열 번호: 5를 포함할 수 있고 VL은 서열 번호: 7을 포함할 수 있고, 또는 VH는 서열 번호: 6를 포함할 수 있고 VL은 서열 번호: 7을 포함할 수 있다. 조성물은 서열 번호: 5 또는 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 항체 또는 항체 작제물을 포함할 수 있고, 상기 항체 또는 항체 작제물은 TL1a에 특이적으로 결합한다. 조성물은 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 VH를 포함하는 항체 또는 항체 작제물을 포함할 수 있고, 상기 항체 또는 항체 작제물은 TL1a에 특이적으로 결합한다. 조성물은 서열 번호: 5 또는 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 아미노산 서열 서열 번호: 7을 포함하는 VL을 포함하는 항체 또는 항체 작제물을 포함할 수 있고, 상기 항체 또는 항체 작제물은 TL1a에 특이적으로 결합한다. 항체는 본원에 각각 참조로 포함된 미국 출원 번호 제15/267,213호 또는 미국 공개 번호 제2014/0255302호에 기재된 임의의 항체일 수 있다.
일부 바람직한 양태에서, 항체(예를 들어, 항-TL1a, 항-CGRP 및 항-CD38)는 인간 IgG 불변 영역을 포함한다. 인간 IgG 불변 영역은 인간 IgG1 또는 인간 IgG4 불변 영역일 수 있다. 항체(예를 들어, 항-TL1a, 항-CGRP 및 항-CD38)는 인간화 항체 또는 완전 인간 항체일 수 있다.
VI. 세척 용액
본원에 제공된 바와 같이, 계면활성제를 포함하는 세척 용액은 단백질 정제 방법에서 사용될 수 있다. 계면활성제-포함 세척 용액은 바이러스 제거에 놀랍게도 효과적이다. 그러한 세척은, 예를 들어, 단백질 A 크로마토그래피 단계가 선행하거나 선행하지 않을 수 있는 양이온 교환 크로마토그래피에서 사용될 수 있다. 단백질 A 크로마토그래피 단계는 또한 계면활성제-포함 세척 용액을 사용할 수 있거나 계면활성제를 포함하지 않는 세척으로써 수행될 수 있다.
세척 용액 중의 계면활성제는 예를 들어 비이온성 계면활성제일 수 있다. 세척 용액 중의 계면활성제는, 예를 들어, CHAPS (3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트), CAHS(코카미도프로필 하이드록시설타인) 또는 SB-12 N-도데실-N,N-디메틸암모니오-3-프로판 설포네이트와 같은 양쪽이온성 계면활성제; CTAB(세트리모늄 브로마이드) 또는 DODAB(디옥타데실디메틸암모늄 브로마이드)와 같은 4차 암모늄 염; 노녹시놀(예를 들어, 노나에틸렌 글리콜)와 같은 알킬페놀 에톡실레이트; 에톡실레이트; 데실 글루코사이드와 같은 알킬 폴리글루코사이드, 아민 또는 포스핀 옥사이드; 및/또는 SDS(소듐 도데실 설페이트)와 같은 음이온성 계면활성제일 수 있다.
세척 용액 중의 계면활성제는 예를 들어 트리톤 100, 노닐 페녹시폴리에톡실에탄올(NP40), 설포베타인-12(SB-12), 설포베타인-14(SB-14), 라우릴디메틸아민 N-옥사이드(LDAO), 폴리소르베이트 20(PS 20), 폴리소르베이트 80(PS 80), 또는 이들의 조합일 수 있다.
세척 용액 중의 계면활성제는 예를 들어 트리톤 100, NP 40, LDAO, SB-12 및/또는 SB-14일 수 있다.
특정 예에서, 세척 용액은 특정 농도의 계면활성제를 포함한다. 세척 용액 중 계면활성제의 농도는 예를 들어 약 0.01% 내지 약 1 % w/v일 수 있다. 세척 용액 중 계면활성제의 농도는 예를 들어 약 0.05% 내지 약 1 % w/v일 수 있다. 세척 용액 중 계면활성제의 농도는 예를 들어 약 0.1% 내지 약 1 % w/v일 수 있다. 세척 용액 중 계면활성제의 농도는 예를 들어 약 0.2% 내지 약 1 % w/v일 수 있다. 세척 용액 중 계면활성제의 농도는 예를 들어 약 0.5% 내지 약 1 % w/v일 수 있다.
세척 용액 중 계면활성제의 농도는 예를 들어 약 0.01% 내지 약 0.5 % w/v일 수 있다. 세척 용액 중 계면활성제의 농도는 예를 들어 약 0.05% 내지 약 0.5 % w/v일 수 있다. 세척 용액 중 계면활성제의 농도는 예를 들어 약 0.1% 내지 약 0.5 % w/v일 수 있다. 세척 용액 중 계면활성제의 농도는 예를 들어 약 0.2% 내지 약 0.5 % w/v일 수 있다.
세척 용액 중 계면활성제의 농도는 예를 들어 약 0.01 % w/v일 수 있다. 세척 용액 중 계면활성제의 농도는 예를 들어 약 0.05 % w/v일 수 있다. 세척 용액 중 계면활성제의 농도는 예를 들어 약 0.1 % w/v일 수 있다. 세척 용액 중 계면활성제의 농도는 예를 들어 약 0.2 % w/v일 수 있다. 세척 용액 중 계면활성제의 농도는 예를 들어 약 0.5 % w/v일 수 있다. 세척 용액 중 계면활성제의 농도는 예를 들어 약 1 % w/v일 수 있다.
계면활성제 이외에, 세척 용액은 예를 들어 (예를 들어 25 mM의 농도의) 소듐 아세테이트 및/또는 (예를 들어 10 mM의 농도의) 소듐 클로라이드를 포함할 수 있다. 그러한 세척 용액은 예를 들어 약 5.5의 pH를 갖는다.
계면활성제 이외에, 세척 용액은 예를 들어 (예를 들어 10 mM의 농도의) 소듐 포스페이트를 포함할 수 있다. 그러한 세척 용액은 예를 들어 약 6.3의 pH를 갖는다.
일 구체예에서, 세척 용액은 10 mM 소듐 포스페이트 및 0.2% TRITON® X-100을 포함한다.
일 구체예에서, 세척 용액은 10 mM 소듐 포스페이트 및 0.5% TRITON® X-100을 포함한다.
일 구체예에서, 세척 용액은 10 mM 소듐 포스페이트 및 0.3% PS 80을 포함한다.
일 구체예에서, 세척 용액은 10 mM 소듐 포스페이트 및 0.6% PS 80을 포함한다.
일 구체예에서, 세척 용액은 10 mM 소듐 포스페이트 및 0.2% TRITON® X-100을 포함한다.
일 구체예에서, 세척 용액은 10 mM 소듐 포스페이트 및 0.5% TRITON® X-100을 포함한다.
일 구체예에서, 세척 용액은 10 mM 소듐 포스페이트 및 0.3% PS 80을 포함한다.
일 구체예에서, 세척 용액은 10 mM 소듐 포스페이트 및 0.6% PS 80을 포함한다.
일 구체예에서, 세척 용액은 50 mM 소듐 아세테이트, 25 mM 아르기닌, 5 mM 히스티딘, 11 mM 소듐 클로라이드 및 0.3% PS 80을 포함한다.
일 구체예에서, 세척 용액은 50 mM 소듐 아세테이트, 25 mM 아르기닌, 5 mM 히스티딘, 11 mM 소듐 클로라이드 및 0.6% PS 80을 포함한다.
일 구체예에서, 세척 용액은 50 mM 소듐 아세테이트, 25 mM 아르기닌, 5 mM 히스티딘, 11 mM 소듐 클로라이드 및 0.2% TRITON® X-100을 포함한다.
일 구체예에서, 세척 용액은 50 mM 소듐 아세테이트, 25 mM 아르기닌, 5 mM 히스티딘, 11 mM 소듐 클로라이드 및 0.5% TRITON® X-100을 포함한다.
일 구체예에서, 세척 용액은 25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM 소듐 클로라이드 및 0.3% PS 80을 포함한다.
일 구체예에서, 세척 용액은 25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM 소듐 클로라이드 및 0.6% PS 80을 포함한다.
일 구체예에서, 세척 용액은 25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM 소듐 클로라이드 및 0.2% TRITON® X-100을 포함한다.
일 구체예에서, 세척 용액은 25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM 소듐 클로라이드 및 0.5% TRITON® X-100을 포함한다.
일 구체예에서, 본 개시는 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 CEX 크로마토그래피 용액을 특징으로 한다. 일부 구체예에서, 본 개시는 염기성 아미노산, 염, 비이온성 계면활성제 또는 완충액 (예를 들어 유기 포스페이트) 및 계면활성제를 포함하는 CEX 크로마토그래피 세척 용액을 특징으로 한다. 일부 구체예에서, 완충액은 소듐 포스페이트이고 비이온성 계면활성제는 4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페닐-폴리에틸렌 글리콜(TRITON® X-100)이다. 일부 구체예에서, 완충액은 유기 포스페이트, 임의로 소듐 포스페이트이고, 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 80(PS 80)이다. 일부 구체예에서, 염기성 아미노산은 아르기닌이고, 염은 소듐 클로라이드이고, 비이온성 계면활성제는 TRITON® X-100이다. 일부 구체예에서, 비이온성 계면활성제는 TRITON® X-100이고 세척 용액은 또한 히스티딘을 포함한다. 일부 구체예에서, 비이온성 계면활성제는 TRITON® X-100이고 세척 용액은 또한 히스티딘 및 소듐 아세테이트를 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, 완충액은 소듐 아세테이트이고, 염은 소듐 클로라이드이고, 비이온성 계면활성제는 TRITON® X-100이다. 일부 바람직한 구체예에서, 완충액은 소듐 아세테이트이고, 염은 소듐 클로라이드이고, 비이온성 계면활성제는 PS 80이다. 일부 구체예에서, 세척 용액은 약 5.0 내지 약 7.0 범위의 pH를 갖는다. 일 구체예에서, 세척 용액은 약 5.0의 pH, 약 5.5의 pH, 약 6.0의 pH, 약 6.5의 pH, 또는 약 7.0의 pH를 갖는다. 일 구체예에서, 세척 용액은 약 6.3의 pH를 갖는다.
일부 구체예에서, CEX 세척 용액 또는 ProA 세척 용액은 0 mM 초과 약 75 mM 미만의 아르기닌, 0 mM 초과 약 30 mM 미만의 소듐 클로라이드 및 5 mM 초과 약 30 mM 미만의 음이온성 계면활성제를 포함한다. 세척 용액은 약 5 mM 내지 약 10 mM 아르기닌, 약 5 mM 내지 약 15 mM 아르기닌, 약 5 mM 내지 약 20 mM 아르기닌, 약 5 mM 내지 약 25 mM 아르기닌, 약 10 mM 내지 약 30 mM 아르기닌, 약 10 mM 내지 약 40 mM 아르기닌, 약 10 mM 내지 약 50 mM 아르기닌, 약 10 mM 내지 약 60 mM 아르기닌, 약 10 mM 내지 약 75 mM 아르기닌, 약 20 mM 내지 약 50 mM 아르기닌, 또는 약 20 mM 내지 약 75 mM 아르기닌을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 세척 용액은 약 5 mM 아르기닌, 약 10 mM 아르기닌, 약 15 mM 아르기닌, 약 20 mM 아르기닌, 약 25 mM 아르기닌, 약 30 mM 아르기닌, 약 40 mM 아르기닌, 약 50 mM 아르기닌, 약 60 mM 아르기닌, 또는 약 75 mM 아르기닌을 포함한다.일부 구체예에서, CEX 세척 용액 또는 ProA 세척 용액은 0 mM 초과 약 25 mM 미만 히스티딘, 약 5 mM 내지 약 25 mM 히스티딘, 약 5 mM 내지 약 20 mM 히스티딘, 약 10 mM 내지 약 25 mM 히스티딘, 약 10 mM 내지 약 20 mM 히스티딘을 포함한다. 일부 구체예에서, 세척 용액은 약 5 mM 히스티딘을 포함한다. 일부 구체예에서, 세척 용액은 약 10 mM 히스티딘, 약 15 mM 히스티딘, 20 mM 히스티딘, 또는 약 25 mM 히스티딘을 포함한다.
일부 구체예에서, CEX 세척 용액 또는 ProA 세척 용액은 0 mM 초과 내지 약 100 mM 소듐 클로라이드, 약 10 mM 내지 약 25 mM 소듐 클로라이드, 약 15 mM 내지 약 25 mM 소듐 클로라이드, 약 25 mM 내지 약 50 mM 소듐 클로라이드, 약 50 mM 내지 75 mM 소듐 클로라이드, 또는 약 75 mM 내지 약 100 mM 소듐 클로라이드를 포함한다. 일부 구체예에서, 세척 용액은 약 10 mM 소듐 클로라이드를 포함한다. 일부 구체예에서, 세척 용액은 약 11 mM 소듐 클로라이드를 포함한다. 일부 구체예에서, 세척 용액은 약 5 mM 소듐 클로라이드, 약 15 mM 소듐 클로라이드, 약 20 mM 소듐 클로라이드, 약 25 mM 소듐 클로라이드, 약 30 mM 소듐 클로라이드, 약 35 mM 소듐 클로라이드, 약 40 mM 소듐 클로라이드, 약 45 mM 소듐 클로라이드, 약 50 mM 소듐 클로라이드, 약 55 mM 소듐 클로라이드, 약 60 mM 소듐 클로라이드, 약 65 mM 소듐 클로라이드, 약 70 mM 소듐 클로라이드, 약 75 mM 소듐 클로라이드, 약 80 mM 소듐 클로라이드, 약 85 mM 소듐 클로라이드, 약 90 mM 소듐 클로라이드, 약 95 mM 소듐 클로라이드, 또는 약 100 mM 소듐 클로라이드를 포함한다.
일부 구체예에서, CEX 세척 용액 또는 ProA 세척 용액은 약 0.00% (w/v) 내지 약 1.0% (w/v)의 비이온성 계면활성제, 약 0.1% (w/v) 내지 약 0.2% (w/v)의 비이온성 계면활성제, 약 0.05% (w/v) 내지 약 0.15% (w/v)의 비이온성 계면활성제, 약 0.1% (w/v) 내지 약 0.15% (w/v)의 비이온성 계면활성제, 약 0.05% (w/v) 내지 약 0.1% (w/v)의 비이온성 계면활성제, 또는 약 0.1% (w/v) 내지 약 0.5% (w/v)의 비이온성 계면활성제, 또는 약 0.5% (w/v) 내지 약 1.0% (w/v)의 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 세척 용액은 약 0.01% (w/v)의 비이온성 계면활성제, 약 0.05% (w/v)의 비이온성 계면활성제, 약 0.1% (w/v)의 비이온성 계면활성제, 약 0.15% (w/v)의 비이온성 계면활성제, 약 0.2% (w/v)의 비이온성 계면활성제, 약 0.25% (w/v)의 비이온성 계면활성제, 약 0.3% (w/v)의 비이온성 계면활성제, 약 0.35% (w/v)의 비이온성 계면활성제, 약 0.4% (w/v)의 비이온성 계면활성제, 약 0.45% (w/v)의 비이온성 계면활성제, 약 5.0% (w/v)의 비이온성 계면활성제, 약 0.55% (w/v)의 비이온성 계면활성제, 약 0.6% (w/v)의 비이온성 계면활성제, 약 0.65% (w/v)의 비이온성 계면활성제, 약 0.7% (w/v)의 비이온성 계면활성제, 약 0.75% (w/v)의 비이온성 계면활성제, 약 0.8% (w/v)의 비이온성 계면활성제, 약 0.85% (w/v)의 비이온성 계면활성제, 약 0.9% (w/v)의 비이온성 계면활성제, 약 0.95% (w/v)의 비이온성 계면활성제, 또는 약 1.0% (w/v)의 비이온성 계면활성제를 포함한다. 일부 구체예에서, 비이온성 계면활성제는 TRITON® X-100을 포함한다. 일부 구체예에서, 비이온성 계면활성제는 PS 80을 포함한다. 일부 구체예에서, 비이온성 계면활성제는 라우릴디메틸아민 N-옥사이드(LDAO)이다.
일부 구체예에서, CEX 세척 용액 또는 ProA 세척 용액은 0 mM 초과 내지 약 100 mM 소듐 아세테이트, 약 5 mM 내지 약 20 mM 소듐 아세테이트, 약 5 mM 내지 약 30 mM 소듐 아세테이트, 약 5 mM 내지 약 40 mM 소듐 아세테이트, 약 5 mM 내지 약 50 mM 소듐 아세테이트, 약 10 mM 내지 약 25 mM 소듐 아세테이트, 또는 약 15 mM 내지 약 30 mM 소듐 아세테이트, 약 20 mM 내지 약 50 mM 소듐 아세테이트, 약 25 mM 내지 약 40 mM 소듐 아세테이트, 약 35 mM 내지 약 50 mM 소듐 아세테이트, 약 40 내지 약 65 mM 소듐 아세테이트, 약 45 mM 내지 약 70 mM 소듐 아세테이트, 약 65 mM 내지 약 80 mM 소듐 아세테이트, 약 75 mM 내지 약 100 mM 소듐 아세테이트를 포함한다. 일부 구체예에서, 세척 용액은 약 25 mM 소듐 아세테이트를 포함한다. 일부 구체예에서, 세척 용액은 약 5 mM 소듐 아세테이트, 약 10 mM 소듐 아세테이트, 약 15 mM 소듐 아세테이트, 약 20 mM 소듐 아세테이트, 약 30 mM 소듐 아세테이트, 약 35 mM 소듐 아세테이트, 약 40 mM 소듐 아세테이트, 약 45 mM 소듐 아세테이트, 약 50 mM 소듐 아세테이트, 약 55 mM 소듐 아세테이트, 약 60 mM 소듐 아세테이트., 약 65 mM 소듐 아세테이트, 약 70 mM 소듐 아세테이트, 약 75 mM 소듐 아세테이트, 약 80 mM 소듐 아세테이트, 약 85 mM 소듐 아세테이트, 약 90 mM 소듐 아세테이트, 약 95 mM 소듐 아세테이트, 또는 약 100 mM 소듐 아세테이트를 포함한다.
일부 구체예에서, CEX 세척 용액 또는 ProA 세척 용액은 약 0 mM 초과 내지 약 30 mM 소듐 포스페이트를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 세척 용액은 약 10 mM 소듐 포스페이트를 포함한다. 일부 구체예에서, 세척 용액은 약 5 mM 내지 약 10 mM 소듐 포스페이트, 약 5 mM 내지 약 15 mM 소듐 포스페이트, 약 5 mM 내지 20 mM 소듐 포스페이트, 약 10 mM 내지 25 mM 소듐 포스페이트, 또는 약 10 mM 내지 30 mM 소듐 포스페이트를 포함한다. 일부 구체예에서, 세척 용액은 약 5 mM 소듐 포스페이트, 약 10 mM 소듐 포스페이트, 약 15 mM 소듐 포스페이트, 약 20 mM 소듐 포스페이트, 약 25 mM 소듐 포스페이트 또는 약 30 mM 소듐 포스페이트를 포함한다.
일부 구체예에서 CEX 세척 용액 또는 ProA 세척 용액은 약 0 mM 초과 내지 약 100 mM 소듐 포스페이트 및 0.0% 초과 내지 약 1.0%의 비이온성 계면활성제를 포함한다. 일부 구체예에서, 세척 용액은 0 mM 초과 내지 약 100 mM 소듐 아세테이트, 0 mM 초과 내지 약 100 mM 소듐 클로라이드, 및 0.0% 초과 내지 약 0 mM 약 500 mM 미만의 아르기닌, 0 mM 초과 내지 약 100 mM 소듐 클로라이드, 0 mM 초과 약 25 mM 미만의 히스티딘, 0 mM 초과 내지 약 50 mM 소듐 아세테이트, 및 0.0% 초과 내지 약 1.0%의 비이온성 계면활성제를 포함한다.
본 발명의 임의의 세척 용액은 CEX 크로마토그래피 지지체를 사용하여 관심 단백질을 정제하기 위해 사용될 수 있다.
특정 양태에서, 1 내지 10 컬럼 부피(CV)의 세척 용액이 CEX 크로마토그래피 지지체에 적용된다. 특정 양태에서, 1 내지 9 CV의 세척 용액이 CEX 크로마토그래피 지지체에 적용된다. 특정 양태에서, 1 내지 8 CV의 세척 용액이 CEX 크로마토그래피 지지체에 적용된다. 특정 양태에서, 1 내지 7 CV의 세척 용액이 CEX 크로마토그래피 지지체에 적용된다. 특정 양태에서, 1 내지 6 CV의 세척 용액이 CEX 크로마토그래피 지지체에 적용된다. 특정 양태에서, 1 내지 5 CV의 세척 용액이 CEX 크로마토그래피 지지체에 적용된다. 특정 양태에서, 1 내지 4 CV의 세척 용액이 CEX 크로마토그래피 지지체에 적용된다. 특정 양태에서, 1 내지 3 CV의 세척 용액이 CEX 크로마토그래피 지지체에 적용된다. 특정 양태에서, 1 내지 2 CV의 세척 용액이 CEX 크로마토그래피 지지체에 적용된다.
특정 양태에서, CV의 세척 용액이 CEX 크로마토그래피 지지체에 적용된다. 특정 양태에서, 2 CV의 세척 용액이 CEX 크로마토그래피 지지체에 적용된다. 특정 양태에서, 3 CV의 세척 용액이 CEX 크로마토그래피 지지체에 적용된다. 특정 양태에서, 4 CV의 세척 용액이 CEX 크로마토그래피 지지체에 적용된다. 특정 양태에서, 5 CV의 세척 용액이 CEX 크로마토그래피 지지체에 적용된다.
본원에 제공된 방법의 특정 양태에서, 계면활성제를 포함하는 용액을 사용한 세척 후, 예를 들어 관심 단백질을 용출시키기 전에, 계면활성제를 포함하지 않는 용액을 사용한 세척이 이어질 수 있다. 계면활성제를 포함하지 않는 용액을 사용한 세척은 계면활성제를 제거할 수 있다. 용액을 사용한 세척으로써 계면활성제를 제거하는 것은, 예를 들어 계면활성제를 포함하기 때문에 용출의 첫 번째 분획을 폐기해야할 필요성을 제거함으로써 수율을 증가시킬 수 있고, 또한 CEX 크로마토그래피의 HCP 클리어런스 성능을 개선하는 것으로 나타났다.
특정 양태에서, 계면활성제를 포함하지 않는 1 내지 10 컬럼 부피(CV)의 세척 용액이 CEX 크로마토그래피 지지체에 적용된다. 특정 양태에서, 1 내지 9 CV의 계면활성제를 포함하지 않는 세척 용액이 CEX 크로마토그래피 지지체에 적용된다. 특정 양태에서, 1 내지 8 CV의 계면활성제를 포함하지 않는 세척 용액이 CEX 크로마토그래피 지지체에 적용된다. 특정 양태에서, 1 내지 7 CV의 계면활성제를 포함하지 않는 세척 용액이 CEX 크로마토그래피 지지체에 적용된다. 특정 양태에서, 1 내지 6 CV의 계면활성제를 포함하지 않는 세척 용액이 CEX 크로마토그래피 지지체에 적용된다. 특정 양태에서, 1 내지 5 CV의 계면활성제를 포함하지 않는 세척 용액이 CEX 크로마토그래피 지지체에 적용된다. 특정 양태에서, 1 내지 4 CV의 계면활성제를 포함하지 않는 세척 용액이 CEX 크로마토그래피 지지체에 적용된다. 특정 양태에서, 1 내지 3 CV의 계면활성제를 포함하지 않는 세척 용액이 CEX 크로마토그래피 지지체에 적용된다. 특정 양태에서, 1 내지 2 CV의 계면활성제를 포함하지 않는 세척 용액이 CEX 크로마토그래피 지지체에 적용된다.
특정 양태에서, CV의 계면활성제를 포함하지 않는 세척 용액이 CEX 크로마토그래피 지지체에 적용된다. 특정 양태에서, 2 CV의 계면활성제를 포함하지 않는 세척 용액이 CEX 크로마토그래피 지지체에 적용된다. 특정 양태에서, 3 CV의 계면활성제를 포함하지 않는 세척 용액이 CEX 크로마토그래피 지지체에 적용된다. 특정 양태에서, 4 CV의 계면활성제를 포함하지 않는 세척 용액이 CEX 크로마토그래피 지지체에 적용된다. 특정 양태에서, 5 CV의 계면활성제를 포함하지 않는 세척 용액이 CEX 크로마토그래피 지지체에 적용된다.
본원에 제공된 방법의 특정 양태에서, 계면활성제를 포함하는 용액을 사용한 세척 후, 용출 전에 계면활성제를 포함하지 않는 용액을 사용한 세척이 없는 관심 단백질의 용출이 후속하지 않는다. 그러한 양태에서, 계면활성제를 포함할 수 있는 용출의 첫 번째 분획은 폐기될 수 있다.
본 개시의 구체예는, 본 개시의 세척 용액의 제조 및 관심 단백질의 정제를 위해 본 개시의 세척 용액을 사용하는 방법을 상세하게 설명하는 다음의 비제한적 예를 참조하여, 추가로 한정될 수 있다. 재료 및 방법 양자에 대한 많은 변형이 본 개시의 범위를 벗어나지 않으면서 실시될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
실시예
본원에 기재된 실시예 및 구체예는 단지 예시적인 목적이며 이를 고려한 다양한 수정 또는 변경이 당업자에게 제안될 것이며 본 출원의 사상 및 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다.
실시예 1 - 바이러스 클리어런스를 위한 단백질 A 세척 용액
재료 및 방법
재료 및 장비. 이들 실시예에서 사용된 단일클론 항체는 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포를 사용하여 발현되었다. MABSELECT SURE® 단백질 A 수지는 GE Healthcare(Uppsala, Sweden)로부터 구입했다. 모든 완충 용액은 Millipore 정수 시스템으로부터 얻은 초순수를 사용하여 제조되었다. 완충액 및 용액 제조에 사용된 화학물질은 JT Baker(Philipsburg, NJ)로부터 입수했다. 모든 크로마토그래피 실험은 Akta Avant 액체 크로마토그래피 시스템(GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA)에서 수행되었다. 이 기기는 내장 UV- 및 전도도 모니터링 시스템을 갖는다. Unicorn 소프트웨어(GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA)가 시스템 제어 및 샘플 수집을 위해 사용되었다.
단백질 A 크로마토그래피. MABSELECT SURE® 크로마토그래피 컬럼을 5 CV(컬럼 부피)에 대해 1XPBS로써 평형화시켰다. 평형 후, 수확 세포 배양액(HCCF)을 수지 리터당 40 그램의 mAb의 로드 용량으로 컬럼에 로딩했다. 로드 적용 후, 컬럼을 3 CV 1X PBS 완충액으로써 1차 세척했고, 5 CV의 후보 세척 완충액을 사용한 2차 세척이 이어졌다. 컬럼을 5 CV 5 mM 석신산 pH 5.8 완충액을 사용하는 3차 세척으로 이어서 세척했다. mAb는 5CV 25 mM 글라이신, 10 mM 석신산, pH 3.7 완충액을 사용하여 컬럼으로부터 용출되었다. 제자리(in place) 세척이 생성 후 적용되었다.
정량적 ELISA―숙주 세포 단백질(HCP). 숙주 세포 단백질(HCP)은 제조사의 프로토콜에 따라 CHO 숙주 세포 단백질 3세대 키트(Immunoenzymetric Assay for the Measurement of CHO Host Cell Proteins, Catalog # F550, Cygnus Technologies, Southport, NC)에 의해 결정되었다. 450/650 nm에서의 흡광도 데이터가 SPECTRAMAX® Plus 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, Sunnyvale CA)에서 획득되고 SOFTMAX® Pro 6.4.2 소프트웨어(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)로 분석되었다. HCP 값은 CHO 숙주 세포 단백질 3세대 키트에 포함된 표준으로부터 생성된 표준 곡선의 네 개의 파라미터 로지스틱 적합으로부터 계산되었다.
바이러스 클리어런스 결과
일곱 가지의 선택된 세척 용액이 단백질 A 크로마토그래피 세척에서 RVLP 클리어런스에 대해 연구되었고, 결과는 표 1에 요약된다. TRITON® X-100이 시험관 내 RVLP 클리어런스에서 매우 효과적이었다.
표 1: 레트로바이러스-유사 입자 클리어런스
세척 조건 Log10
감소 값
(LRV)
0.1% TRITON® X-100 3.85
150 mM NaCl 1.73
250 mM 아르기닌 1.82
25 mM CA 1.57
0.1% TRITON® X-100, 250 mM 아르기닌 및 150 mM NaCl 4.43
25 mM CA, 250 mM 아르기닌 및 150 mM NaCl 2.04
100 mM 아르기닌, 150 mM 구아니딘, 150 mM NaCl 및 25 mM CA 1.21
더욱이, 선택된 세척 용액으로부터의 바이러스 클리어런스가 두 가지 모델 바이러스: 이종친화 쥐과 백혈병 바이러스(X-MulV) 및 마우스의 미세 바이러스(MVM)를 사용하여 스파이크-인(spike-in) 연구에 의해 평가되었다. 조성 및 결과가 표 2에 나타난다. 결과는, pH 5.8에서 5 mM 석신산의 대조군 세척 용액과 비교하여, X-MulV 클리어런스에서 1.7-log (아르기닌) 또는 0.8-log (아르기닌 + 구아니딘) 개선 및 MVM 클리어런스에서 아르기닌- 또는 아르기닌 + 구아니딘-포함 세척 용액으로써 1.3-log 개선이 있음을 나타낸다.
표 2: 스파이크-인 바이러스 클리어런스 연구
공정 단계 Log10 감소 값(LVR)
X-MuLV MVM
MabSelect SuRe 세척
250 mM 아르기닌, 0.1% TRITON® X-100, 150 mM NaCl, pH 7.5 5.86 3.08
4.78 3.03
5 mM 석신산, pH 5.8 대조군 3.07 1.77
100 아르기닌 + 150 구아니딘 + 25mM 소듐 카프릴레이트 +150 mM NaCl, pH 7.5 3.84 3.05
실시예 2 -양이온 교환 크로마토그래피를 위한 세척 용액
재료 및 방법
중합체 이온-교환 크로마토그래피 수지(Poros™ XS, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA) 및 4차 암모늄 (Q) 강 음이온 교환 그룹으로써 가교된 6% 아가로스 비드로 구성된 수지(Q Sepharose® Fast Flow, GE-Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA)가 CEX 크로마토그래피에 사용되었다. 이 연구에 사용된 모든 완충 용액은 정수 시스템(EMD Millipore, Billerica MA)으로부터 얻은 초순수를 사용하여 제조되었다. 완충액 및 용액 제조에 사용된 화학물질은 JT Baker(Philipsburg, NJ)로부터 입수했다. 모든 크로마토그래피 실험은 Akta Avant 크로마토그래피 시스템(GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA)에서 수행되었다.
양이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 5 CV(컬럼 부피)에 대해 pH 5.5, 저 전도도(<5mS/cm) 평형 완충액으로써 평형화시켰다. 평형 후, pH 조정된 단백질 A 정제 생성물 풀(pH 5.5)을 수지 리터당 50-80 그램의 mAb 로드 용량으로 컬럼에 로딩했다. 로드 적용 후, 컬럼을 3 CV의 EQ 완충액으로써 1차 세척했고, 5 CV의 후보 세척 완충액을 사용한 세척 2가 이어졌다. 컬럼을 5 CV의 10 mM 포스페이트, pH 6.0 완충액을 사용하여 세척 3 완충액으로써 이어서 세척했다. mAb는 5 CV의 20 mM 포스페이트 pH 7.0 완충액을 사용하여 컬럼으로부터 용출되었다. 제자리(in place) 세척이 생성 후 적용되었다.
정량적 ELISA―숙주 세포 단백질(HCP)
숙주 세포 단백질(HCP)은 제조사의 프로토콜에 따라 CHO 숙주 세포 단백질 3세대 키트(Immunoenzymetric Assay for the Measurement of CHO Host Cell Proteins, Catalog # F550, Cygnus Technologies, Southport, NC)에 의해 결정되었다. 450/650 nm에서의 흡광도 데이터가 SpectraMax Plus 마이크로플레이트 리더에서 획득되고 SoftMaxPro 6.4.2 소프트웨어(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)로 분석되었다. HCP 값은 CHO 숙주 세포 단백질 3세대 키트에 포함된 표준으로부터 생성된 표준 곡선의 4개의 파라미터 로지스틱 적합으로부터 계산되었다.
HPLC-SEC
생성물 샘플의 순도는 Waters HPLC 시스템(2695 분리 모듈 및 2996 Photodiode Array Detector)을 사용하여 TSK 겔 G3000SW 컬럼(7.5 mm ID × 30 cm, 10 μm 평균 입자 크기, Tosoh Bioscience, Japan)에서 HPLC-SEC 방법에 의해 분석되었다. PBS pH 6.8 완충액이 1 ml/min의 유량으로 이동상으로서 사용되었다. 주입량은 100-125 μg 단백질이었다.
결과 및 논의
연구에서 사용된 관심 단백질은 서열 번호:5 또는 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:7의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-TL1a-항체였다. 총 4 종의 세제-포함 세척 용액이 연구에서 조사되었다. 연구는 항-CGRP 항체(서열 번호:1의 VH, 서열 번호:2의 VL) 및 항-CD38 항체(서열 번호:3의 VH, 서열 번호:4의 VL)로써 본질적으로 반복되었다. 세척 2 완충액 레시피 및 결과가 표 3 내지 8에 나타난다.
표 3: 항-TL1a-항체에 대한 CEX 세척 2 완충액 레시피
성분 양 (g/l)
10 mM 소듐 포스페이트,
0.2% TRITON® X-100 (w/v) pH 6.3		 소듐 포스페이트, 일염기, 일수화물 1.09
소듐 포스페이트, 이염기 칠수화물 0.57
TRITON® X-100 2
10 mM 소듐 포스페이트,
0.5% TRITON® X-100 (w/v) pH 6.3		 소듐 포스페이트, 일염기, 일수화물 1.09
소듐 포스페이트, 이염기 칠수화물 0.57
TRITON® X-100 5
10 mM 소듐 포스페이트,
0.3% PS 80 (w/v) pH 6.3		 소듐 포스페이트, 일염기, 일수화물 1.09
소듐 포스페이트, 이염기 칠수화물 0.57
폴리소르베이트 80 3
10 mM 소듐 포스페이트,
0.6% PS 80 (w/v) pH 6.3		 소듐 포스페이트, 일염기, 일수화물 1.09
소듐 포스페이트, 이염기 칠수화물 0.57
폴리소르베이트 80 6
표 4: 생성물 품질 - 항-TL1a Ab
세척 조건 수율 % SEC-단량체 % HCP (ppm) 잔류 계면활성제
대조군 99 99.2 12 NT
0.2% TRITON® -X-100 96 99.2 7 NT
0.5% TRITON® -X-100 99 98.8 5 NT
0.3% PS-80 100 99.1 6 <LOQ
0.6% PS-80 98 99.0 7 <LOQ
대조군 조건은 세척 1이 없음
NT: 테스트되지 않음
표 5: 항-CGRP-항체에 대한 CEX 세척 2 완충액 레시피
완충액 성분 양 (g/l)
25 mM 소듐 아세테이트, 10mM NaCl, 0.2% TRITON® X-100 (w/v) pH 6.3 빙초산 0.17
소듐 아세테이트 트리하이드레이트 3.02
소듐 클로라이드 7.89
TRITON® X-100 2
25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM, NaCl 0.5% TRITON® X-100 (w/v) pH 6.3 빙초산 0.17
소듐 아세테이트 트리하이드레이트 3.02
소듐 클로라이드 7.89
TRITON® X-100 5
25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, 0.3% PS 80 (w/v) pH 6.3 빙초산 0.17
소듐 아세테이트 트리하이드레이트 3.02
소듐 클로라이드 7.89
폴리소르베이트 80 3
25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, 0.6% PS 80 (w/v) pH 6.3 빙초산 0.17
소듐 아세테이트 트리하이드레이트 3.02
소듐 클로라이드 7.89
폴리소르베이트 80 6
표 6: 생성물 품질
세척 조건 수율 % SEC-단량체 % HCP (ppm) 잔류 계면활성제
대조군
(세척1 없음) 		96 98.3 78 NT
0.2% TRITON® X-100 96 98.4 70 NT
0.5% TRITON® X-100 >99 98.2 71 NT
0.3% PS 80 >99 98.3 86 <LOQ
0.6% PS 80 >99 98.3 81 <LOQ
NT: 테스트되지 않음
표 7: 항-CD38-항체에 대한 세척 2 완충액 레시피
성분 양 (g/l)
50mM Na-아세테이트, 25mM 아르기닌, 5mM 히스티딘, 11mM Nacl, 0.3% (w/v) PS-80, pH 5.5 소듐 아세테이트 트리하이드레이트 5.44
빙초산 0.6
L-아르기닌 HCl 5.26
L-히스티딘 0.775
소듐 클로라이드 0.65
폴리소르베이트 80 3
50mM Na-아세테이트, 25mM 아르기닌, 5mM 히스티딘, 11mM Nacl, 0.6% (w/v) PS80, pH 5.5 소듐 아세테이트 트리하이드레이트 5.44
빙초산 0.6
L-아르기닌 HCl 5.26
L-히스티딘 0.775
소듐 클로라이드 0.65
폴리소르베이트 80 6
50mM Na-아세테이트, 25mM 아르기닌, 5mM 히스티딘, 11mM Nacl, 0.2% (w/v) TRITON® X-100, pH 5.5 소듐 아세테이트 트리하이드레이트 5.44
빙초산 0.6
L-아르기닌 HCl 5.26
L-히스티딘 0.775
소듐 클로라이드 0.65
TRITON® X-100 2
50mM Na-아세테이트, 25mM 아르기닌, 5mM 히스티딘, 11mM Nacl, 0.5% (w/v) TRITON® X-100, pH 5.5 소듐 아세테이트 트리하이드레이트 5.44
빙초산 0.6
L-아르기닌 HCl 5.26
L-히스티딘 0.775
소듐 클로라이드 0.65
TRITON® X-100 5
표 8: 생성물 품질
세척 조건 수율 % SEC-단량체 % HCP (ppm) 잔류 계면활성제
대조군
(세척 1 없음) 		95 99.0 110 NT
0.2% TX-100 97 99.1 106 NT
0.5% TX-100 98 99.2 120 NT
0.3% PS 80 94 98.9 125 <LOQ
0.6% PS 80 92 99.0 123 <LOQ
NT: 테스트되지 않음
계면활성제가 없는 대조군 조건과 비교하여, 네 가지의 모든 계면활성제-포함 세척이 항-TL1a, 항-CGRP 및 항-CD38 항체 분자에 대해 유사한 불순물 클리어런스를 달성했다. 용출 풀 중의 잔류 계면활성제가 관찰되지 않았다. 계면활성제 세척은 정제된 mAb 품질을 유지하면서 바이러스 클리어런스를 개선하기 위해 사용될 수 있다.
표 9: 바이러스 클리어런스 연구 계획
용액 MVM X-MulV 분자
25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, pH 5.5, 대조군 X X 항-CGRP
25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, 0.2% w/v TRITON® X-100 pH 5.5 X
25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, 0.5% w/v TRITON® X-100 pH 5.5 X X
25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, 0.3% w/v PS 80 pH 5.5 X
25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, 0.6% w/v PS 80 pH 5.5 X X
10 mM 소듐 포스페이트, pH 6.3 X X 항-TL1A
10 mM 소듐 포스페이트, 0.2% TRITON® X-100 (w/v) pH 6.3 X
10 mM 소듐 포스페이트, 0.5% TRITON® X-100 (w/v) pH 6.3 X X
10 mM 소듐 포스페이트, 0.3% PS 80 (w/v) pH 6.3 X
10 mM 소듐 포스페이트, 0.6% PS 80 (w/v) pH 6.3 X X
MVM: 감염력 분석X-Mulv: 감염력 분석 및 qPCR 분석
이 연구는 계면활성제 세척이 생성물 품질을 감소시키지 않음을 입증했다. 잔류 계면활성제 및 숙주 세포 단백질(HCP) 모두가 계면활성제 세척을 사용하여 생성물로부터 제거될 수 있다.
실시예 3 - 바이러스 클리어런스를 위한, 폴리싱 컬럼 및 포획 컬럼으로서의 양이온 교환
재료 및 방법
양이온 교환 크로마토그래피
크로마토그래피 컬럼을 먼저 평형화한 다음, 로드 물질을 컬럼에 40-100 mg/ml 수지의 로딩 용량으로 로딩했다. 컬럼을 세척한 후, 용출 완충액을 사용하여 단일클론 항체(mAb) 생성물을 컬럼으로부터 용출시켰다. 생성물 용출 후 제자리 세척(cleaning in place, CIP) 및 제자리 위생 처리(sanitization in place, SIP) 절차가 적용되었다.
HPLC-단백질 A 역가
2.1 mm x 30 mm 분석 친화성 컬럼(Poros A 친화성 컬럼, ABI. P/N: 2-1001-00) 및 적절한 표준을 사용하여 Waters Alliance HPLC 시스템에서 항체 역가를 정량화했다. 표준의 양은 10 μL의 주입 부피에서 1 내지 100 μg 범위였다. 표준 및 샘플을 10 μL로 주입했다. 이동상 A는 1 X PBS 완충액(ThermoFisher Scientific, Cat.#: 10010072)이었다. 이동상 B는 12 mM HCl이었다. 유량은 2.5 mg/mL였다. 항체는 컬럼으로부터 0-70% 이동상 B의 구배에서 2.5 분 후 용출되었다. 용출 피크를 적분했다. 용출 피크의 면적을 표준의 면적 및 양으로부터 유도된 선형 표준 곡선에 대해 플로팅하여 항체 역가를 결정했다.
Solo VPE 단백질 농도 측정
단백질 농도를 Solo VPE 시스템(C Technologies Inc.)에서 측정했다. 전형적으로 50 - 200 μL의 샘플을 A 280 값을 위해 작은 실리카 용기에 첨가했다. 분자 흡광 효율에 기초하여 Solo VPE 시스템에 의해 단백질 농도를 계산했다.
HPLC-크기 배제 크로마토그래피(SEC)
항체 순도 단량체 퍼센트(%)를 6.0 mm × 4.0 cm 가드 컬럼(TOSOH TSKgel Guard SWxl, P/N: 08543)에 이어서 7.8 mm × 30 cm 크기 배제 컬럼(TSKgel G3000SWxl, P/N: 08541)을 사용하는 Waters Alliance HPLC 시스템에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석했다. 전형적으로 샘플을 30 μL에서 5.0 mg/mL로 주입했다. 등용매 이동상은 100 mM 소듐 포스페이트, 250 mM 소듐 클로라이드 pH 6.5였다. 유량은 0.5 mg/mL였다. 고분자량 화학종, 이량체, 단량체 및 저분자량 화학종이 35 min 후 분리되었다. 각 화학종의 백분율은 피크의 면적을 모든 피크의 총 면적으로 나누어 결정되었다.
정량적 ELISA-숙주 세포 생산(HCP)
샘플 중 HCP 수준은 제조사의 프로토콜에 따라 Cygnus CHO HCP ELISA 키트(Cygnus technologies, Cat.#: F550)를 사용하여 ELISA 분석에 의해 결정되었다.
X-MuLV 스파이크-인 연구
이 실시예에서 위에 기재된 CEX 조건이 X-Mulv 바이러스-스파이킹된 로드 물질을 사용하여 수행되었다. 로드 및 용출 샘플 중 바이러스 함량을 세포 기반감염력 분석, TCID 50에 의해 분석했다. 각 실행의 LRV는 로드 샘플의 log10 총 PFU로부터 용출 샘플의 log10 총 PFU 를 빼서 계산되었다.
RVLP qPCR 분석
RVLP(레트로바이러스-유사 입자)는 qPCR에 의해 정량화되었다. 제조사의 프로토콜에 따라 MagMAX™ 바이러스 RNA 분리 키트(ThermoFisher, Cat# AM1939)를 사용하여 샘플로부터 전체 핵산을 분리했다. 먼저 전체 핵산을 (유전체 DNA 제거를 위해) esDNase로 처리한 다음, ezDNase™ 효소 키트(ThermoFisher, Cat# AM1939)와 함께 SuperScript™ IV VILO™ 마스터 믹스를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. cDNA 샘플은 RVLP 유전자의 3027 내지 3125 bp 영역(GeneBank 수탁#: U09104.1)을 표적화하는 Taqman-기반 qPCR을 거쳤다. qPCR에서 사용된 프라이머는 CCTGAGTCACCGGACTGCAT(서열 번호: 8) 및 ACCAGTCGCGAGCTGGAG(서열 번호: 9)였다. 이들은 Integrated DNA Technologies(Skokie, Illinois)로부터 구입되었다. qPCR에서 사용된 프로브는 ThermoFisher로부터 구입한 5-FAM-AGGGAGCTACAGGCGG-MGBNFQ-3(서열 번호: 10)이었다. qPCR을 위한 표준은 앰플리콘(amplicon) 영역을 포함하는 이중-가닥 DNA 단편이었다. qPCR 분석은 Taqman Fast Universal PCR 마스터 믹스(ThermoFisher, Cat#4352046)를 사용하여 7500FAST 시스템(ThermoFisher)에서 수행되었다.
잔류 트리톤-100
잔류 트리톤 X-100 농축물을 4.6 mm × 150 mm XDB-C18 컬럼(Agilent Technologies, P/N: 993967-902)을 사용하는 Waters Alliance HPLC 시스템에서 HPLC에 의해 정량화했다. 샘플을 동일한 부피의 100% 메탄올과 혼합하고 4°C, 25,000 X g에서 30분 동안 원심분리했다. 샘플의 상청액을 HPLC 주입을 위해 저장했다. HPLC 주입에 앞서 트리톤 X-100 표준을 50% 메탄올로 희석했다. 트리톤 X-100를 용출시키기 위해 78% 내지 100% 메탄올의 구배를 사용했다. 트리톤 X-100 피크를 적분했다. 표준의 피크 면적에 대해 상응하는 피크 면적을 플로팅하여 샘플 중 트리톤 X-100의 농도를 계산했다.
폴리싱 컬럼으로서의 CEX
폴리싱 컬럼으로서 CEX의 효능을 평가하기 위해, 계면활성제의 존재 또는 부재에서 상이한 항체, 수지, 평형 완충액 및 세척 조건을 사용하여 두 가지 분석을 수행했다.
첫 번째 분석에서, 항-CGRP IgG2 항체를 정제하기 위해 표 10에 나열된 공정 조건이 SP Sepharose Fast Flow(SPFF) 수지에 적용되었다. 수지는 GE에 의해 제조된 세파로스-기초 설포프로필 강 양이온 교환 크로마토그래피이다. 유사한 수지는 Fractogel EMD SO3- 및 Capto S를 포함한다.
표 10: 분석 1 - 공정 조건
공정 단계 완충액 CV
EQ 25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, pH 5.5 ≥5
로드 50 g/L수지에서 단백질 A 정제된 mAb 로드
세척 1 25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, pH 5.5 ≥2
세척 2 연구할 변수 ≥5
세척 3 25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, pH 5.5 ≥5
용출 25 mM 소듐 아세테이트, 135 mM NaCl, pH 5.5 5
바이러스 스파이킹된 로드 물질이 사용되는 바이러스 스파이크-인 연구를 수행했다. 테스트된 세척 2 조건 및 결과가 표 11에 나타난다.
표 11: 분석 1 - 바이러스 스파이크-인 연구
세척 2 조건 수율 % X-MuLV의 LRV
25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, pH 5.5 96 3.7
25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, 0.5% 트리톤-100, pH 5.5 >99 >7.05a
a바이러스는 검출한계 이하까지 제거되었다.이들 결과는 세척 2에서 0.5% 트리톤의 첨가가 X-MuLV의 로그 클리어런스를 현저하게 개선함을 입증한다.
생성물 품질은 또한 표 12에 요약된 조건하에 로드로서 단백질 A-정제된 mAb를 사용하여 평가되었고, 결과는 또한 이 표에 기록된다.
표 12: 분석 1 - 생성물 품질
세척 조건 수율 % SEC-단량체 % HCP (ppm) 잔류 계면활성제 %
세척 2 및 3: 25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, pH 5.5 96 98.3 78 NA
세척 2: 25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, 0.5% 트리톤-100, pH 5.5세척 3: 25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, pH 5.5 >99 98.2 71 <DL
세척 2: 25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, 0.5% 트리톤-100, pH 5.5세척 3 없음 91 97.6 91 0.008
DL=0.002%표 12의 결과는 세척 2에서 0.5% 트리톤의 첨가가 단량체 % 또는 잔류 숙주 세포 단백질(HCP) 측면에서 생성물 품질을 감소시키지 않음을 입증한다. 이들 결과는 또한 세척 3이 잔류 계면활성제를 검출 불가능한 수준까지 제거할 수 있음을 입증한다.
두 번째 분석에서, 항-TL1a IgG1 항체를 정제하기 위해 표 13에 나열된 공정 조건이 Poros XS 수지(Thermo Scientific)에 적용되었다. 이 수지는 설포프로필 리간드를 갖는 가교된 폴리 (스타이렌디비닐벤젠) 중합체 매트릭스를 갖는다.
표 13: 분석 2 - 공정 조건
공정 단계 완충액 CV
EQ 25 mM 글라이신, 10 mM 석신산, pH 5.5 ≥5
로드 85 g/L수지에서 단백질 A 정제된 mAb 로드
세척 1 25 mM 글라이신, 10 mM 석신산, pH 5.5 ≥2
세척 2 연구할 변수 ≥5
세척 3 10 mM 소듐 포스페이트, pH 6.3 ≥5
용출 24 mM 소듐 포스페이트, pH 6.9 8
바이러스 스파이킹된 로드 물질이 사용되는 바이러스 스파이크-인 연구를 수행했다. 테스트된 세척 2 조건 및 결과가 표 14에 나타난다.
표 14: 분석 2 - 바이러스 스파이크-인 연구
세척 2 조건 수율 % X-MuLV의 LRV X-Mulv의 LRV
qPCR
10 mM 소듐 포스페이트, pH 6.3 >99 2.9 2.22
10 mM 소듐 포스페이트, 0.5% 트리톤-100, pH 6.3 >99 6.05 3.83
10 mM 소듐 포스페이트, 0.5% 트리톤-100, pH 6.3 세척 2의 종료 시 30 분 일시 중지 >99 6.25 4.01
이들 결과는, 분석 1에서와 같이, 세척 2에서 0.5% 트리톤의 첨가가 분석 2에서 X-MuLV의 로그 클리어런스를 현저하게 개선함을 입증한다. 또한, 6 초과의 로그 바이러스 클리어런스가 세척 2의 종료 시 30 분 일시 중지를 하거나 하지 않고 5 컬럼 부피(CV)의 세척에서 달성될 수 있다.
생성물 품질은 또한 표 15에 요약된 조건하에 로드로서 단백질 A-정제된 mAb를 사용하여 평가되었고, 결과는 또한 이 표에 기록된다.
표 15: 분석 2 - 생성물 품질
세척 조건 수율 % SEC-단량체 % HCP (ppm) 잔류 계면활성제 %
세척 2 및 3: 25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, pH 5.5 96 98.3 78 NA
세척 2: 25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, 0.5% 트리톤-100, pH 5.5세척 3: 25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, pH 5.5 >99 98.2 71 <DL
세척 2: 25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, 0.5% 트리톤-100, pH 5.5세척 3 없음 91 97.6 91 0.008
DL = 0.002%표 15의 결과는, 분석 1에서와 같이, 세척 2에서 0.5% 트리톤의 첨가가 분석 2에서 단량체 % 또는 잔류 숙주 세포 단백질(HCP) 측면에서 생성물 품질을 감소시키지 않음을 입증한다. 그러나, 아마도 Poros XS가 소수성 수지이기 때문에 잔류 계면활성제가 세척 3 없이 효과적으로 제거되지 않았다. 어떤 경우이든, 세척 3의 첨가는 계면활성제 수준을 검출 한계 이하로 감소시켰다.
포획 컬럼으로서의 CEX
포획 컬럼으로서 CEX에 대한 계면활성제의 효과의 효능을 평가하기 위해, 계면활성제의 존재 또는 부재에서 상이한 수지, 평형 완충액 및 세척 조건을 사용하여 두 가지 분석을 수행했다.
첫 번째 분석에서, 표 16에 나열된 공정 조건이 SPFF 수지에 적용되었다.
표 16: 분석 1 - 공정 조건
공정 단계 완충액 CV
EQ 25 mM 소듐 아세테이트, 45 mM NaCl, pH 5.5 ≥5
로드 pH 5.0로 조정된 HCCF, 전도도 7 mS/cm, 40 g/L수지에서 로드
세척 1 25 mM 소듐 아세테이트, 45 mM NaCl, pH 5.5 ≥2
세척 2 연구할 변수 연구할 변수
세척 3 25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, pH 5.5 ≥5
용출 25 mM 소듐 아세테이트, 250 mM NaCl, pH 5.5 5
로드 물질로서 HCCF 및 표 17에 나열된 조건을 사용하여 레트로바이러스-유사 입자(RVLP) 클리어런스를 평가했다.
표 17: 분석 1 - RVLP 클리어런스
세척 조건 수율 % SEC-단량체 % HCP (ppm) RVLP의 LRV
세척 2: 5 CV의 25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, pH 5.5
세척 3: 5 CV의 25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, pH 5.5		 96 97.0 40,744 1.6
세척 2: 5 CV의 25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, 0.5% 트리톤-100, pH 5.5
세척 3: 5 CV의 25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, pH 5.5		 97 98.7 18,873 >3.7a
세척 2: 1 CV의 25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, 0.5% 트리톤-100, pH 5.5세척 3: 5 CV의 25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, pH 5.5 96 98.7 23,490 >3.7 a
세척 2:1 CV의 25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, 0.5% 트리톤-100, pH 5.5
세척 3 없음 		97 95.6 27,086 >3.7a
aRVLP는 검출한계 이하까지 제거되었다.
이들 결과는 세척 2에서 0.5% 트리톤의 첨가가 RVLP 클리어런스를 2 로그만큼 개선하고 또한 HCP 클리어런스를 현저하게 증가시킴을 입증한다. 세척 2의 부피는 바이러스 클리어런스 효능에 영향을 미치지 않았고, 1 컬럼 부피(CV)는 세척 2에 충분했다. 그러나, 세척 2의 부피 증가는 HCP 클리어런스를 개선했다. 세척 3 포함이 또한 HCP 클리어런스를 개선했다.
표 18에 요약된 바와 같이 세척 2 조건을 변화시키며 추가적인 테스트를 수행했다. 이들 테스트에서, 5 컬럼 부피(CV)의 세척 2 및 5 CV의 3이 적용되었다. 결과가 또한 표 17에 보고된다.
표 18: 분석 1 - 세척 2 조건 연구 (Atoll 컬럼 결과)
세척 2 조건 수율 % SEC-단량체 % HCP (ppm) RVLP의 LRV
25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, pH 5.5 74 98.4 40,445 1.03
25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, 0.05% 트리톤, pH 5.5 87 98.4 34,844 2.39
25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl , 0.1% 트리톤-100, pH 5.5 82 98.5 40,251 > 2.46 a
25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, 0.5% PS 20, pH 5.5 74 98.6 38,847 1.18
25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, 0.2% PS 20, pH 5.5 81 98.4 38,040 1.33
25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, 0.5% PS 80, pH 5.5 81 98.4 44,535 1.27
25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, 0.5% NP 40, pH 5.5 82 98.4 39,684 > 2.46 a
25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, 0.1% LDAO, pH 5.5 81 97.2 9,132 >2.09 a
25 mM 소듐 아세테이트, 10 mM NaCl, 0.05% LDAO, pH 5.5 88 97.5 21,749 >2.09 a
25 mM 소듐 아세테이트 10 mM NaCl, 0.2% SB-12, pH 5.5 89 99.8 28,223 >3.53 a
25 mM 소듐 아세테이트 10 mM NaCl, 1.0% SB-12, pH 5.5 86 97.1 19,509 >3.53 a
25 mM 소듐 아세테이트 10 mM NaCl, 0.2% SB-14, pH 5.5 92 98.7 25,600 >3.53 a
25 mM 소듐 아세테이트 10 mM NaCl, 0.5 % SB-14, pH 5.5 93 97.6 19,819 >3.53a
LDAO = 라우릴디메틸아민 N-옥사이드; SB-12 = 설포베타인-12; 및 SB-14 = 설포베타인-14aRVLP는 검출한계 이하까지 제거되었다.
표 18의 결과는 0.05% 트리톤, >0.2 %의 SB-12, >0.2 %의 SB-14, >0.5%의 NP-40 및 >0.05% LDAO의 첨가가 모두 RVLP 클리어런스에 효과적임을 입증한다. 이들은 RVLP를 검출한계 이하까지 제거할 수 있었다. LDAO, SB-12 및 SB-14는 또한 HCP 클리어런스를 현저하게 개선할 수 있다.
두 번째 분석에서, 표 19에 나열된 공정 조건이 Poros XS 수지에 적용되었다.
표 19: 분석 2 - 공정 조건
공정 단계 완충액 CV
EQ 25 mM 글라이신, 60 mM 석신산, pH 5.5 ≥5
로드 pH 5.5로 조정된 HCCF, 전도도 7 mS/cm, 40 g/L수지에서 로드
세척 1 25 mM 글라이신, 60 mM 석신산, pH 5.5 ≥2
세척 2 연구할 변수 연구할 변수
세척 3 10 mM 소듐 포스페이트, pH 6.3 ≥5
용출 24 mM 소듐 포스페이트, pH 6.9 8
로드 물질로서 HCCF 및 표 20에 나열된 조건을 사용하여 레트로바이러스-유사 입자(RVLP) 클리어런스를 평가했다. 결과가 또한 이 표에 나타난다.
표 20: 분석 2 - RVLP 클리어런스
세척 조건 수율 % SEC-단량체 % HCP (ppm) RVLP의 LRV
세척 2: 1 CV의 10 mM 소듐 포스페이트, 0.5% 트리톤-100, pH 6.3
세척 3: 5 CV의 10 mM 소듐 포스페이트, pH 6.3		 96 99.0 8,325 4.3
세척 2: 1 CV의 10 mM 소듐 포스페이트, 0.5% 트리톤-100, pH 6.3
세척 3 없음 		94 98.6 17,145 4.3
이들 결과는 세척 3을 함으로써 하지 않는 것보다 HCP가 현저하게 더 낮음을 입증한다.
표 21에 요약된 바와 같이 세척 2 조건을 변화시키며 추가적인 테스트를 수행했다. 이들 테스트에서, 5 컬럼 부피(CV)의 세척 2 및 5 CV의 3이 적용되었다. 결과가 또한 표 21에 보고된다.
표 21: 분석 2 - 세척 2 조건 연구 (Atoll 컬럼 결과)
세척 2 조건 수율 % SEC-단량체 % HCP (ppm) RVLP의 LRV
10 mM 소듐 포스페이트, 0.05% 트리톤, pH 6.3 77 99.0 11,398 2.34
10 mM 소듐 포스페이트, 0.1% 트리톤-100, pH 6.3 67 98.9 12,356 3.10
10 mM 소듐 포스페이트, 0.5% 트리톤-100, pH 6.3 73 99.0 11,352 >3.82 a
10 mM 소듐 포스페이트, 0.5% PS 20, pH 6.3 71 98.9 10,423 2.78
10 mM 소듐 포스페이트, 0.2% PS 20, pH 6.3 73 99.0 44,481 2.73
10 mM 소듐 포스페이트, 0.5% PS 80, pH 6.3 72 98.9 12,207 2.58
10 mM 소듐 포스페이트, 0.5% NP 40, pH 6.3 75 98.9 10,026 2.65
10 mM 소듐 포스페이트, 10 mM NaCl, pH 6.3 72 99.0 9,877 2.09
aRVLP는 검출한계 이하까지 제거되었다.
표 21의 결과는 적어도 0.1% 트리톤 농도가 바이러스 클리어런스에 효과적임을 입증한다.
요약하면, 실시예 3에 기재된 결과는 CEX가 폴리싱 단계에서 사용되는지 포획 단계에서 사용되는지에 관계 없이 CEX 세척(세척 2)으로의 계면활성제의 첨가가 레트로바이러스의 클리어런스를 개선함을 입증한다. 계면활성제의 첨가는 HCP 또는 단량체 순도 (%) 측면에서 공정 수율 또는 생성물 품질에 부정적인 영향을 미치지 않는다. 이러한 계면활성제-기초의 바이러스 제거는 세파로스 매트릭스 수지 및 합성 중합체 매트릭스 수지에서 달성될 수 있고, 1 컬럼 부피가 효과적인 RVLP 클리어런스를 달성하기에 충분하다. 더욱이, 세척 3은 HCP 클리어런스를 개선하고, LDAO 및 0.5% 트리톤은 각각 세파로스-기초 수지에서 HCP 클리어런스를 개선한다
본 발명은 위에 기재되고 예시된 구체예로 제한되지 않고, 첨부된 청구범위의 범위 내에서 변형 및 수정될 수 있다.
특허, 특허 출원, 수탁 번호, 기술 논문 및 학술 논문을 포함하는 다양한 간행물이 명세서 전체에서 인용된다. 이들 인용된 간행물 각각은 그 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
항-CGRP VH (서열 번호: 1)
1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYWISWVRQA PGKGLEWVAE 50
51 IRSESDASAT HYAEAVKGRF TISRDNAKNS LYLQMNSLRA EDTAVYYCLA 100
101 YFDYGLAIQN YWGQGTLVTV SS
항-CGRP VL (서열 번호: 2)
1 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCKASKRVT TYVSWYQQKP GQAPRLLIYG 50
51 ASNRYLGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCSQ SYNYPYTFGQ 100
101 GTKLEIK
항-CD38 VH (서열 번호: 3)
1 EVQLVQSGAE VKKPGATVKI SCKVSGYTFT DSVMNWVQQA PGKGLEWMGW 50
51 IDPEYGRTDV AEKFQGRVTI TADTSTDTAY MELSSLRSED TAVYYCARTK 100
101 YNSGYGFPYW GQGTTVTVSS
항-CD38 VL (서열 번호: 4)
1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQNVD SDVDWYQQKP GKAPKLLIYK 50
51 ASNDYTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYYCMQ SNTHPRTFGG 100
101 GTKVEIKR
항-TL1a VH1 (서열 번호: 5)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQAPGQGLEWMGWLNPNSGNTGY
AQKFQGRVTMTADRSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREVPETAAFEYWGQGTLVTVSS
항-TL1a VH2 (서열 번호: 6)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQAPGQGLEWMGWLNPNSGYTGY
AQKFQGRVTMTADRSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREVPETAAFEYWGQGTLVTVSS
항-TL1a VL (서열 번호: 7)
QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTSSSSDIGAXXGVXWYQQLPGTAPKLLIEGYYNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLTITGLLPEDEGDYYCQSXDGTLSALFGGGTKLTVLG
Xaa 32는 G 또는 A
Xaa 33은 L 또는 S 또는 Q
Xaa 36은 H 또는 L
Xaa 93은 Y 또는 F 또는 W
SEQUENCE LISTING <110> Cephalon, Inc. WANG, LU KAO, ALBERT ZHANG, ZHAOQING JIN, Mi ZHOU, Tianyi <120> CATION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY WASH BUFFER <130> 2873.277PC01/TJS/CLD/BMB <150> 62/523,038 <151> 2017-06-21 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CGRP VH <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Ser Glu Ser Asp Ala Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ala Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Leu Ala Tyr Phe Asp Tyr Gly Leu Ala Ile Gln Asn Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CGRP VL <400> 2 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Lys Arg Val Thr Thr Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Leu Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 3 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD38 VH <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser 20 25 30 Val Met Asn Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Glu Tyr Gly Arg Thr Asp Val Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Lys Tyr Asn Ser Gly Tyr Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 4 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD38 VL <400> 4 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Ser Asp 20 25 30 Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Asn Asp Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser Asn Thr His Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 5 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-TL1a VH1 <400> 5 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Leu Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Val Pro Glu Thr Ala Ala Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 6 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-TL1a VH2 <400> 6 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Leu Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Val Pro Glu Thr Ala Ala Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 7 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-TL1a VL <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa 32 is G or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Xaa 33 is L or S or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> Xaa 36 is H or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (93)..(93) <223> Xaa 93 is Y or F or W <400> 7 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Ser Ser Ser Ser Asp Ile Gly Ala Xaa 20 25 30 Xaa Gly Val Xaa Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Glu Gly Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Leu Pro Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Xaa Asp Gly Thr 85 90 95 Leu Ser Ala Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 cctgagtcac cggactgcat 20 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 accagtcgcg agctggag 18 <210> 10 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 agggagctac aggcgg 16

Claims (113)

  1. 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 세척 용액을 CEX 크로마토그래피 지지체에 적용하는 단계를 포함하는, 양이온 교환(CEX) 크로마토그래피 지지체에 결합된 관심 단백질을 정제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 관심 단백질을 지지체로부터 용출시켜 관심 단백질을 포함하는 정제된 용출액을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 관심 단백질 및 하나 이상의 오염물 단백질, 응집체 및/또는 바이러스를 포함하는 혼합물을 CEX 크로마토그래피 지지체에 로딩하는 단계, 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 세척 용액으로 지지체를 세척하는 단계, 이후 관심 단백질을 지지체로부터 용출시켜 정제된 관심 단백질의 용출액을 형성하는 단계를 포함하는 관심 단백질을 정제하는 방법.
  4. 관심 단백질 및 하나 이상의 오염물 단백질, 응집체 및/또는 바이러스를 포함하는 혼합물을 CEX 크로마토그래피 지지체에 로딩하는 단계, 하나 이상의 오염물 단백질, 응집체 및/또는 바이러스를 지지체로부터 용출시키기 위해 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 수성 세척 용액으로 지지체를 세척하는 단계, 이후 관심 단백질을 지지체로부터 용출시켜 정제된 관심 단백질의 용출액을 형성하는 단계를 포함하는 관심 단백질을 정제하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 계면활성제는 라우릴디메틸아민 N-옥사이드(LDAO), 트리톤 100, 노닐 페녹시폴리에톡실에탄올(NP40), 설포베타인-12(SB-12), 설포베타인-14(SB-14), 폴리소르베이트 20(PS 20), 폴리소르베이트 80(PS 80), 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 계면활성제는 양쪽이온성 계면활성제를 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 양쪽이온성 계면활성제는 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(CHAPS), 또는 코카미도프로필 하이드록시설타인(CAHS), 또는 이들의 조합인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 계면활성제는 4차 암모늄 염을 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 4차 암모늄 염은 세트리모늄 브로마이드(CTAB) 또는 디옥타데실디메틸암모늄 브로마이드(DODAB)인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 계면활성제는 알킬페놀 에톡실레이트를 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 알킬페놀 에톡실레이트는 노녹시놀, 임의로 노나에틸렌 글리콜인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 계면활성제는 에톡실레이트를 포함하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 계면활성제는 알킬 폴리글루코사이드, 임의로 데실 글루코사이드를 포함하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 계면활성제는 아미노 옥사이드를 포함하는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 계면활성제는 포스핀 옥사이드를 포함하는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 계면활성제는 비이온성 계면활성제를 포함하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 계면활성제는 음이온성 계면활성제를 포함하고, 임의로 음이온성 계면활성제는 소듐 도데실 설페이트(SDS)인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 세척 용액은 약 0.01% 내지 약 1% w/v의 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 세척 용액은 약 0.05% 내지 약 0.5% w/v의 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 방법.
  20. 제18항에 있어서, 세척 용액은 약 0.1% w/v의 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 방법.
  21. 제18항에 있어서, 세척 용액은 약 0.2% w/v의 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 방법.
  22. 제18항에 있어서, 세척 용액은 약 0.5% w/v의 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, CEX 크로마토그래피 지지체는 세파로스 매트릭스 수지인 방법.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, CEX 크로마토그래피 지지체는 합성 중합체 매트릭스 수지인 방법.
  25. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, CEX 크로마토그래피 지지체는 소수성 수지가 아닌 방법.
  26. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, CEX 크로마토그래피 지지체는 Capto S, Fractogel EMD SO3-, Fractogel EMD TMAE, Fractogel EMD, Eshnumo S, Eshmuno HCX, Tosoh Toyopearl CM, Tosoh Toyopearl SP, 및 Nuvia cPrime로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  27. 제2항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 단백질을 지지체로부터 용출시키기 전에 후속 세척 용액을 CEX 크로마토그래피 지지체에 적용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 후속 세척 용액은 계면활성제를 포함하지 않는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 후속 세척 용액은 지지체로부터 계면활성제를 제거하는 방법.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 후속 세척 용액을 적용하는 것은 후속 용액을 적용하지 않는 것과 비교하여 숙주 세포 단백질(HCP) 제거를 증가시키는 방법.
  31. 제1항, 제2항 및 제5항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 세척 용액을 지지체에 적용하기 전에 수확 세포 배양액(HCCF)을 지지체에 로딩하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  32. 제3항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 단백질 및 하나 이상의 오염물 단백질, 응집체 및/또는 바이러스를 포함하는 혼합물은 HCCF인 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 단백질 A 정제를 포함하지 않는 방법.
  34. 제1항, 제2항 및 제5항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 세척 용액을 지지체에 적용하기 전에 크로마토그래피 단계의 용출액을 지지체에 로딩하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  35. 제3항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 단백질 및 하나 이상의 오염물 단백질, 응집체 및/또는 바이러스를 포함하는 혼합물은 크로마토그래피 단계의 용출액인 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 크로마토그래피 단계의 용출액은 친화성 크로마토그래피 단계의 용출액인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 친화성 크로마토그래피 단계는 단백질 A 정제인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 단백질 A 정제는 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 세척 용액으로 단백질 A 지지체를 세척하는 것을 포함하는 방법.
  39. 제37항에 있어서, 단백질 A 정제는 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 세척 용액으로 단백질 A 지지체를 세척하는 것을 포함하지 않는 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 세척 용액은 LRV에 의해 측정된 바와 같이 바이러스를 제거하는 방법.
  41. 다음 단계를 포함하는 단백질 정제 방법:
    a) 관심 단백질 및 하나 이상의 오염물, 응집체 및/또는 바이러스를 포함하는 혼합물을 단백질 A 크로마토그래피 지지체에 로딩하는 단계,
    b) 하나 이상의 오염물 단백질, 응집체 및/또는 바이러스를 단백질 A 크로마토그래피 지지체로부터 제거하기 위해 지지체를 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액으로 세척하는 단계,
    c) 관심 단백질을 단백질 A 크로마토그래피 지지체로부터 용출시키는 단계,
    d) 관심 단백질을 포함하는 용출액을 양이온 교환(CEX) 크로마토그래피 지지체에 로딩하는 단계,
    e) 하나 이상의 오염물 단백질, 응집체 및/또는 바이러스를 지지체로부터 제거하기 위해 CEX 크로마토그래피 지지체를 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 CEX 크로마토그래피 세척 용액으로 세척하는 단계, 및
    f) 관심 단백질을 CEX 크로마토그래피 지지체로부터 용출시켜, 정제된 관심 단백질의 용출액을 형성하는 단계.
  42. 제3항 내지 제30항, 제32항, 제33항 및 제35항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 오염물 단백질은 숙주 세포 단백질인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 숙주 세포 단백질은 중국 햄스터 난소 세포로부터 유래하는 방법.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 A 세척 용액은 로그 감소 값(log reduction value, LRV)에 의해 측정된 바와 같이 바이러스를 제거하는 방법.
  45. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, CEX 세척 용액은 LRV에 의해 측정된 바와 같이 바이러스를 제거하는 방법.
  46. 제40항, 제44항 및 제45항 중 어느 한 항에 있어서, LRV는 약 1.0 및 약 10.0 log10인 방법.
  47. 제46항에 있어서, LRV는 약 1.0 및 약 5.0 log10인 방법.
  48. 제46항에 있어서, LRV는 약 4.0 및 약 8.0 log10인 방법.
  49. 제46항에 있어서, LRV는 약 3.0 log10인 방법.
  50. 제46항에 있어서, LRV는 약 4.0 log10인 방법.
  51. 제46항에 있어서, LRV는 약 5.0 log10인 방법.
  52. 제46항에 있어서, LRV는 약 6.0 log10인 방법.
  53. 제40항 및 제44항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, LRV는 정량적 PCR에 의해 측정되는 방법.
  54. 제40항 및 제44항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, LRV는 감염력 분석을 사용하여 측정되는 방법.
  55. 제40항 및 제44항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, LRV는 1 컬럼 부피(CV)의 세척을 적용하여 달성되는 방법.
  56. 제40항 및 제44항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, LRV는 2 CV의 세척을 적용하여 달성되는 방법.
  57. 제40항 및 제44항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, LRV는 3 CV의 세척을 적용하여 달성되는 방법.
  58. 제40항 및 제44항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, LRV는 4 CV의 세척을 적용하여 달성되는 방법.
  59. 제40항 및 제44항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, LRV는 5 CV의 세척을 적용하여 달성되는 방법.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 세척 용액을 지지체에 적용하기 전에 계면활성제를 포함하지 않는 세척 용액을 지지체에 적용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  61. 제2항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 관심 단백질의 용출액을 정용여과, 한외여과, 또는 정용여과와 한외여과 모두로써 처리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  62. 제2항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 관심 단백질의 용출액을 멤브레인 크로마토그래피 지지체에 로딩하는 단계 및 추가 정제된 용출액을 포함하는 흐름을 멤브레인 크로마토그래피 지지체로부터 수집하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함하지 않는 방법.
  64. 제2항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 용출액은 바이러스 불활성화 단계를 거치는 것을 추가로 포함하는 방법.
  65. 제64항에 있어서, 바이러스 불활성화는 낮은 pH 바이러스 불활성화에 의해 달성되어 바이러스 불활성화 제제가 형성되는 방법.
  66. 제65항에 있어서, pH는 약 2.5 내지 약 5로 낮아지는 방법.
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서, 바이러스를 불활성화시키기에 충분한 시간 동안 정제된 관심 단백질의 용출액의 pH를 낮추는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  68. 제2항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스를 제거하기 위한 정제된 관심 단백질의 용출액 여과를 추가로 포함하는 방법.
  69. 제2항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 관심 단백질의 용출액을 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물으로서 제형화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  70. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 약 250 리터의 용량을 갖는 생물반응기에서 관심 단백질 및 하나 이상의 오염물 단백질을 발현시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  71. 제70항에 있어서, 생물반응기는 적어도 약 500 리터, 적어도 약 2000 리터, 또는 적어도 약 5000 리터의 용량을 갖는 방법.
  72. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이의 융합 단백질 작제물을 포함하는 방법.
  73. 제72항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a) TNF-유사 리간드 1A(TL1a)에 특이적으로 결합하고, 임의로 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL를 포함하고 (b) 칼시토닌 유전자-관련 펩타이드(CGRP)에 특이적으로 결합하고, 임의로 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고 또는 (c) CD38에 특이적으로 결합하고, 임의로 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 방법.
  74. CEX 지지체에 결합된 관심 단백질을 정제하기 위한 양이온 교환(CEX) 크로마토그래피 동안의 세척 용액의 용도에 있어서, 세척 용액은 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 용도.
  75. 계면활성제를 포함하는, CEX 지지체에 결합된 관심 단백질을 정제하기 위한 양이온 교환(CEX) 크로마토그래피 세척 용액.
  76. 제46항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 약 0.1% 내지 약 0.6% w/v의 계면활성제를 포함하는 용도, 방법 또는 세척 용액.
  77. 제46항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 약 0.2% 내지 약 0.5% w/v의 계면활성제를 포함하는 용도, 방법 또는 세척 용액.
  78. 제46항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 약 0.2% w/v의 계면활성제를 포함하는 용도, 방법 또는 세척 용액.
  79. 제46항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 약 0.3% w/v의 계면활성제를 포함하는 용도, 방법 또는 세척 용액.
  80. 제46항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 약 0.5% w/v의 계면활성제를 포함하는 용도, 방법 또는 세척 용액.
  81. 제46항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 약 0.6% w/v의 계면활성제를 포함하는 용도, 방법 또는 세척 용액.
  82. 제46항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제는 비이온성 계면활성제인 용도, 방법 또는 세척 용액.
  83. 제46항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제는 TRITON® X-100인 용도, 방법 또는 세척 용액.
  84. 제83항에 있어서, 약 0.2% TRITON® X-100을 포함하는 용도, 방법 또는 세척 용액.
  85. 제83항에 있어서, 약 0.5% TRITON® X-100을 포함하는 용도, 방법 또는 세척 용액.
  86. 제46항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제는 PS 80인 용도, 방법 또는 세척 용액.
  87. 제86항에 있어서, 약 0.3% PS 80을 포함하는 용도, 방법 또는 세척 용액.
  88. 제86항에 있어서, 약 0.6% PS 80을 포함하는 용도, 방법 또는 세척 용액.
  89. 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 아르기닌을 추가로 포함하고, 임의로 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 약 25 mM 아르기닌을 포함하는 용도, 방법 또는 세척 용액.
  90. 제1항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 히스티딘을 추가로 포함하고, 임의로 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 약 5 mM 히스티딘을 포함하는 용도, 방법 또는 세척 용액.
  91. 제1항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 소듐 클로라이드를 추가로 포함하고, 임의로 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 약 5 mM 내지 약 15 mM 소듐 클로라이드를 포함하는 용도, 방법 또는 세척 용액.
  92. 제91항에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 약 10 mM 소듐 클로라이드 또는 약 11 mM 소듐 클로라이드를 포함하는 용도, 방법 또는 세척 용액.
  93. 제1항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 소듐 포스페이트를 추가로 포함하고, 임의로 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 약 10 mM 소듐 포스페이트를 포함하는 용도, 방법 또는 세척 용액.
  94. 제1항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 소듐 아세테이트를 추가로 포함하고, 임의로 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 약 20 mM 내지 약 50 mM 소듐 아세테이트를 포함하는 용도, 방법 또는 세척 용액.
  95. 제93항 또는 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 약 25 mM 소듐 아세테이트 또는 약 50 mM 소듐 아세테이트를 포함하는 용도, 방법 또는 세척 용액.
  96. 제1항 내지 제4항 및 제23항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 (a) 약 10 mM 소듐 포스페이트 및 약 0.2 % TRITON® X-100, (b) 약 10 mM 소듐 포스페이트 및 약 0.5% TRITON® X-100, (c) 약 10 mM 소듐 포스페이트 및 약 0.3% PS 80 또는 (d) 약 10 mM 소듐 포스페이트 및 약 0.6% PS 80을 포함하는 용도, 방법 또는 세척 용액.
  97. 제1항 내지 제4항 및 제23항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 (a) 약 50 mM 소듐 아세테이트, 약 25 mM 아르기닌, 약 5 mM 히스티딘, 약 11 mM 소듐 클로라이드 및 약 0.3% PS 80, (b) 약 50 mM 소듐 아세테이트, 약 25 mM 아르기닌, 약 5 mM 히스티딘, 약 11 mM 소듐 클로라이드 및 약 0.6% PS 80, (c) 약 50 mM 소듐 아세테이트, 약 25 mM 아르기닌, 약 5 mM 히스티딘, 약 11 mM 소듐 클로라이드 및 약 0.2% TRITON® X-100, (d) 약 50 mM 소듐 아세테이트, 약 25 mM 아르기닌, 약 5 mM 히스티딘, 약 11 mM 소듐 클로라이드 및 약 0.5% TRITON® X-100, (e) 약 25 mM 소듐 아세테이트, 약 10 mM 소듐 클로라이드 및 약 0.3% PS 80, (f) 약 25 mM 소듐 아세테이트, 약 10 mM 소듐 클로라이드 및 약 0.6% PS 80, (g) 약 25 mM 소듐 아세테이트, 약 10 mM 소듐 클로라이드 및 약 0.2% TRITON® X-100 또는 (h) 약 25 mM 소듐 아세테이트, 약 10 mM 소듐 클로라이드 및 약 0.5% TRITON® X-100을 포함하는 용도, 방법 또는 세척 용액.
  98. 제1항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 약 5.0 내지 7.0의 pH를 포함하는 용도, 방법 또는 세척 용액.
  99. 제98항에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액 또는 CEX 크로마토그래피 세척 용액은 약 5.5 또는 약 6.3의 pH를 포함하는 용도, 방법 또는 세척 용액.
  100. 제1항 내지 제73항 및 제76항 내지 제99항의 방법에 의해 생성된 관심 단백질의 제제.
  101. 제1항 내지 제73항 및 제76항 내지 제99항의 방법에 의해 생성된 관심 단백질의 바이러스-불활성화 제제.
  102. 제100항 또는 제101항에 있어서, 관심 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 제제.
  103. 제102항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a) TNF-유사 리간드 1A(TL1a)에 특이적으로 결합하고, 임의로 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL를 포함하고 (b) 칼시토닌 유전자-관련 펩타이드(CGRP)에 특이적으로 결합하고, 임의로 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고 또는 (c) CD38에 특이적으로 결합하고, 임의로 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 제제.
  104. 제1항 내지 제73항 및 제76항 내지 제100항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 관심 단백질의 제제 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물.
  105. 제1항 내지 제73항 및 제76항 내지 제100항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된, 관심 단백질의 바이러스-불활성화 제제 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물.
  106. 수성 캐리어 및 재조합적으로-발현된 또는 하이브리도마-발현된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물, 여기서 조성물에는 바이러스 입자가 실질적으로 없으며, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (a) TNF-유사 리간드 1A(TL1a)에 특이적으로 결합하고 서열 번호: 5 또는 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 하나 이상의 CDR을 포함하고 (b) 칼시토닌 유전자-관련 펩타이드(CGRP)에 특이적으로 결합하고 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 하나 이상의 CDR 및 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 하나 이상의 CDR을 포함하고, 또는 (c) CD38에 특이적으로 결합하고, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 하나 이상의 CDR 및 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 하나 이상의 CDR을 포함함.
  107. 제106항에 있어서, 조성물에는 바이러스 입자가 없는 조성물.
  108. 제106항 또는 제107항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (a) 서열 번호: 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고, (b) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고, 또는 (c) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 조성물.
  109. 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 재조합적으로-발현된 또는 하이브리도마-발현된 항체 및 수성 캐리어를 포함하는 조성물:
    a) 상기 항체 및 하나 이상의 오염물, 응집체 및/또는 바이러스를 포함하는 혼합물을 단백질 A 크로마토그래피 지지체에 로딩하는 단계,
    b) 하나 이상의 오염물 단백질, 응집체 및/또는 바이러스를 단백질 A 크로마토그래피 지지체로부터 제거하기 위해 지지체를 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 단백질 A 크로마토그래피 세척 용액으로 세척하는 단계,
    c) 항체를 단백질 A 크로마토그래피 지지체로부터 용출시키는 단계,
    d) 단계 c)로부터의 용출액을 양이온 교환(CEX) 크로마토그래피 지지체에 로딩하는 단계,
    e) 하나 이상의 오염물 단백질, 응집체 및/또는 바이러스를 지지체로부터 제거하기 위해 CEX 크로마토그래피 지지체를 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 CEX 크로마토그래피 세척 용액으로 세척하는 단계, 및
    f) 항체를 CEX 크로마토그래피 지지체로부터 용출시켜, 항체의 정제된 용출액을 형성하는 단계.
  110. 제109항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (a) TNF-유사 리간드 1A(TL1a)에 특이적으로 결합하고 서열 번호: 5 또는 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 하나 이상의 CDR을 포함하고 (b) 칼시토닌 유전자-관련 펩타이드(CGRP)에 특이적으로 결합하고 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 하나 이상의 CDR 및 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 하나 이상의 CDR을 포함하고, 또는 (c) CD38에 특이적으로 결합하고, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 하나 이상의 CDR 및 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 하나 이상의 CDR을 포함하는 조성물.
  111. 제109항 또는 제110항에 있어서, 상기 조성물에는 실질적으로 바이러스 입자가 없는 조성물.
  112. 제109항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 CEX 크로마토그래피 이전에 음이온 교환 크로마토그래피를 거치지 않는 조성물.
  113. 제109항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 CEX 크로마토그래피 이전에 어떠한 이온 교환 크로마토그래피도 거치지 않는 조성물.
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