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KR20200018526A - 면역글로불린 단편을 이용한 인슐린 약물 결합체 - Google Patents

면역글로불린 단편을 이용한 인슐린 약물 결합체 Download PDF

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KR20200018526A
KR20200018526A KR1020200014368A KR20200014368A KR20200018526A KR 20200018526 A KR20200018526 A KR 20200018526A KR 1020200014368 A KR1020200014368 A KR 1020200014368A KR 20200014368 A KR20200014368 A KR 20200014368A KR 20200018526 A KR20200018526 A KR 20200018526A
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KR
South Korea
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insulin
immunoglobulin
region
conjugate
polymer
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KR1020200014368A
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송대해
신재희
박영진
임대성
배성민
권세창
Original Assignee
한미사이언스 주식회사
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Filing date
Publication date
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Abstract

본 발명은 인슐린, 비펩티드성 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역이 상호 공유결합에 의해 연결되어 있어 생체 내 지속성 및 안정성이 향상된 인슐린 결합체, 이를 포함하는 지속성 제제, 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 인슐린 결합체는 펩티드의 생체 내 활성이 비교적 높게 유지되고, 혈중 반감기가 현저히 증가되어 인슐린 치료시 복약순응도를 월등히 개선할 수 있다.

Description

면역글로불린 단편을 이용한 인슐린 약물 결합체{An insulin conjugate using an immunoglobulin fragment}
본 발명은 인슐린, 비펩티드성 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역이 상호 공유결합에 의해 연결되어 있어 생체 내 지속성 및 안정성이 향상된 인슐린 결합체, 이를 포함하는 지속성 제제, 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 인슐린 결합체는 펩티드의 생체 내 활성이 비교적 높게 유지되고, 혈중 반감기가 현저히 증가되어 인슐린 치료시 복약순응도를 월등히 개선할 수 있다.
인슐린은 사람의 췌장의 베타세포에서 분비되는 펩티드로서 체내의 혈당을 조절하는데 매우 중요한 역할을 담당하는 물질이다. 이러한 인슐린이 제대로 분비되지 않거나 분비된 인슐린이 체내에서 제대로 작용하지 못하는 경우 체내의 혈당이 조절되지 못하고 상승하며 이러한 상태를 당뇨병이라고 한다. 앞에서 언급한 경우를 제2형 당뇨병이라고 하며, 췌장에서 인슐린을 분비하지 못하여 혈당이 상승하는 경우를 제1형 당뇨병이라고 한다.
제2형 당뇨병의 경우, 화학물질을 주성분으로 하는 경구용 혈당 강하제를 이용하여 치료를 하며 일부 환자에는 인슐린을 사용하여 치료하기도 한다. 반면, 제1형 당뇨병의 경우에는 인슐린의 투여가 필수적으로 요구된다.
현재 많이 사용되고 있는 인슐린 치료법은 식사 전, 후에 주사를 통하여 인슐린을 투여하는 방법이다. 하지만, 이러한 인슐린 치료법은 하루에 3번씩 지속적으로 사용되어야 하기 때문에 환자들에게 많은 고통과 불편을 야기한다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여 다양한 시도가 있어왔으며, 그 중 하나로 펩티드의 약물의 생체막 투과도를 증가시켜 구강 또는 비강을 통한 흡입으로 펩티드의 약물을 체내로 전달하는 시도가 있었다. 그러나 이러한 방법은 주사제에 비해 펩티드의 체내 전달 효율이 현저히 낮으며, 따라서 펩티드 약물의 체내 활성을 요구되는 조건으로 유지하는데 아직까지는 어려움이 많다.
한편, 과량의 약물을 피하에 투여한 후 흡수가 지연되도록 하는 방법이 있었으며 이를 통하여 1일 1회 투여로 지속적인 혈중농도를 유지하는 방법이 있었다. 그중 일부는 의약품(Lantus®, Sanofi-aventis)으로 허가를 받아 현재 환자에게 투여되고 있다. 또 인슐린에 지방산을 수식하여 인슐린 중합체의 결합을 강하게 하며 투여부위 및 혈중의 알부민과 결합하여 지속시간을 늘리는 연구가 진행되었으며 의약품(Levemir, NovoNordisk)으로 허가를 받았다. 하지만, 이러한 방법은 투여부위에서 통증이 나타나는 부작용이 있으며, 아직도 하루 한번 주사를 통한 투여간격으로 여전히 환자에게 큰 부담이 아닐 수 없다.
한편, 펩티드 약물이 체내로 흡수된 이후, 펩티드 약물의 혈중 안정성을 증가시키고 혈중 약물 농도를 오랫동안 높게 지속시켜 약효를 극대화하려는 노력이 계속되어 왔는데, 이러한 펩티드 약물의 지속형 제제는 펩티드 약물의 안정성을 높이는 동시에 약물 자체의 역가가 충분히 높게 유지되어야 하고 환자에게 면역반응을 유발하지 않아야 한다. 이러한 펩티드 약물의 지속형 제제로는 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 같은 용해도가 높은 고분자 물질을 펩티드 표면에 화학적으로 부가시키는 방법이 사용되어왔다.
PEG는 목적 펩티드의 특정 부위 또는 다양한 부위에 비특이적으로 결합하여 펩티드의 분자량을 증가시켜 신장에 의한 소실을 억제하고 가수분해를 방지하는데 효과가 있으며 특별한 부작용도 일으키지 않는다. 예를 들어, WO2006/076471은 NPR-A에 결합하여 cGMP의 생산을 활성화하여 동맥 내 혈압을 감소시키며, 따라서 울혈성 심부전증(Congestive heart failure) 치료제로 사용되는 B형 나트륨 배설 증가 펩티드(B-type natriuretic peptide, BNP)에 PEG를 결합하여 생리 활성을 지속시키는 것에 대해 기술하고 있으며, US 6,924,264에서는 엑센딘-4의 라이신 잔기에 PEG를 결합시켜 생체 내 지속 시간을 증가시키는 방법을 기술하고 있다. 그러나 이러한 방법은 PEG 분자량을 증가시켜 펩티드 약물의 생체 내 지속시간을 연장할 수 있는 반면, 분자량이 증가할수록 펩티드 약물의 역가가 현저히 낮아지고, 또한 펩티드와의 반응성이 낮아져 수율이 감소하는 문제가 있다.
WO 02/46227는 재조합 유전자 기술을 이용한 GLP-1 및 엑센딘-4 또는 그 유사체와 인간 혈청 알부민 또는 면역 글로불린 단편(Fc) 과의 융합 단백질에 대해 기술하고 있으며, US 6,756,480는 부갑상선 호르몬(PTH) 및 그 유사체와 Fc 융합 단백질에 대해 기술하고 있다. 이러한 방법은 낮은 페길화(pegylation) 수율 문제와 비특이성을 극복할 수 있는 반면에, 혈중 반감기 증가효과가 예상보다 획기적이지 못하고 경우에 따라서는 역가가 낮은 문제점을 지니고 있다. 혈중 반감기 증가효과를 극대화하기 위하여 다양한 종류의 펩티드 링커가 사용되기도 하지만 면역 반응을 유발할 수 있는 가능성이 있다. 또한, BNP와 같이 디설파이드 결합(disulfide bond)을 가지고 있는 펩티드를 이용할 경우 미스폴딩(misfolding)의 확률이 높아 적용이 어렵다는 문제점과 천연에 존재하지 않는 아미노산 잔기가 있는 경우 유전자 재조합의 형태로 생산이 불가능하다는 문제점이 있다.
이에, 본 발명자들은 인슐린의 혈중 반감기 증가 및 생체 내 활성유지를 동시에 극대화할 수 있는 방법으로 면역글로불린 Fc 영역, 비펩티드성 중합체 및 인슐린을 공유 결합에 의해 부위 선택적으로 상호 연결시키는 제조방법을 사용하였고, 그 결과 펩티드 결합체의 혈중 반감기를 획기적으로 증가시키고 공지의 인프레임 퓨전(inframe fusion) 방법보다 월등히 개선된 혈중 반감기 증가효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 인슐린의 생체 내 활성을 유지하면서 혈중 반감기를 연장시켜 월등히 우수한 인슐린 결합체, 이를 포함하는 지속형 제제, 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 인슐린 및 면역글로불린 Fc 영역이 비펩티드성 중합체를 통해 연결되고, 상기 인슐린의 베타 체인의 아미노 말단에 상기 비펩티드성 중합체가 결합된 것을 특징으로 하는 인슐린 결합체을 제공한다.
본 발명의 인슐린은, 체내의 혈당이 높을 때 췌장에서 분비되어 간, 근육, 지방 조직에서 당을 흡수하여 글리코겐으로 저장하며, 지방을 분해하여 에너지원으로 사용되는 것을 억제하여 혈당을 조절하는 기능을 가지는 펩티드이다. 이러한 펩티드는, 인슐린 아고니스트(agonist), 전구물질(precursors), 유도체(derivatives), 단편(fragments), 변이체(variants) 등을 포함하며 바람직하게는 천연형 인슐린, 속효성 인슐린, 지속형 인슐린 등이다.
천연형 인슐린은 췌장에서 분비되는 호르몬으로서 일반적으로 세포 내 글루코스 흡수를 촉진하고 지방의 분해를 억제하여 체내의 혈당을 조절하는 역할을 한다. 인슐린은 혈당조절 기능이 없는 프로인슐린(Proinsulin) 전구체의 형태에서 프로세싱을 거쳐 혈당조절 기능을 가지는 인슐린이 된다. 인슐린 아미노산 서열은 아래와 같다:
알파 체인 :
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(서열번호: 1)
베타 체인:
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly- Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(서열번호: 2)
인슐린 아고니스트는 인슐린의 구조와 상관없이 인슐린의 생체내 수용체에 결합하여 인슐린과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 물질을 의미한다.
인슐린 유도체는 천연형 인슐린과 비교시 최소한 80% 이상 아미노산 서열에서 상동성을 보이며, 아미노산 잔기의 일부 그룹이 화학적으로 치환(예; alpha-mthylation, alpha-hydroxylation), 제거(예; deamination) 또는 수식(예; N-methylation)된 형태일 수 있고, 체내에서 혈당을 조절하는 기능을 보유한 펩티드를 의미한다.
인슐린 단편은 인슐린의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 하나 또는 그 이상 아미노산이 추가 또는 삭제된 형태를 의미하며 추가된 아미노산은 천연에 존재하지 않는 아미노산(예; D형 아미노산)도 가능할 수 있고, 이러한 인슐린 단편은 체내에서 혈당조절 기능을 보유한다.
인슐린 변이체는, 인슐린과 아미노산 서열이 하나 이상 다른 펩티드로서, 체내에서 혈당조절 기능을 보유한 펩티드를 의미한다.
인슐린 아고니스트, 유도체, 단편 및 변이체에서 각각 사용된 제조방법은 독립적으로 사용될 수 있고 조합도 가능하다. 예를 들어 아미노산 서열이 하나 이상 다르고, N-말단 아미노산 잔기에 탈아미노화(deamination)된 체내에서 혈당조절 기능을 보유한 펩티드도 포함된다.
구체적인 일 양태로서, 본 발명에서 사용한 인슐린은 재조합 방법을 통하여 생산될 수 있으며, 고체상(Solid phase) 합성법을 통하여 합성하는 방법으로도 생산 가능하다.
또한, 본 발명에서 사용된 인슐린은 베타 체인의 아미노 말단에 비펩티드성 중합체가 결합된 것을 특징으로 한다. 이와 같은 비펩티드성 중합체는 본 발명에서 링커로 이용된다. 인슐린의 경우 알파 체인 수식시 활성이 감소 및 안전성이 떨어지므로, 본 발명은 인슐린 베타 체인의 아미노 말단에 비펩티드성 중합체를 링커로 연결함으로서 인슐린의 활성을 유지시키면서, 안전성을 향상시켰다.
본 발명에서 용어, "활성"은 인슐린이 인슐린의 수용체에 결합하는 능력을 의미하며, 인슐린이 그의 수용체에 결합하여 인슐린의 작용을 하는 것을 의미한다.
본 발명의 인슐린 베타 체인의 아미노 말단에 비펩티드성 중합체가 결합하는 것은 pH 조절에 의해서 일어나며, 바람직한 pH 범위는 4.5 내지 7.5이다.
본 발명에서 용어, "N-말단"은 "N-말단 영역"과 혼용될 수 있다.
구체적인 일 실시예로서, 본 발명자는 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 PEG를 결합시키고 여기에 인슐린 베타 체인의 N-말단에 선택적으로 커플링하여 인슐린-PEG-면역글로불린 Fc 결합체를 제조하였다. 본 발명에서 제조한 인슐린-PEG-면역글로불린 Fc 결합체의 혈중 반감기는 약 18시간으로 획기적으로 증가하였고, 질환 모델 동물에서 혈당강화 효과를 보여 생체내 활성이 유지된 새로운 지속형 인슐린 제형을 제조할 수 있었다.
면역글로불린 Fc 영역은 생체 내에서 대사되는 생분해성의 폴리펩티드이기 때문에, 약물의 캐리어로 사용하기에 안전하다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린 전체 분자에 비해 상대적으로 분자량이 적기 때문에 결합체의 제조, 정제 및 수율 면에서 유리할 뿐만 아니라 아미노산 서열이 항체마다 다르기 때문에 높은 비균질성을 나타내는 Fab 부분을 제거함으로써 물질의 동질성이 크게 증가되고 혈중 항원성의 유발 가능성도 낮아지게 되는 효과도 기대할 수 있다.
본 발명에서, "면역글로불린 Fc 영역"은, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 의미하며, 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함하기도 한다. 또한 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄 불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc 영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다. 즉, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 (1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, (2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, (3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, (4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, (5) 1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합, (6) 중쇄 불변영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 유도체(mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우, 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다. 또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체 결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York,197 9). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation), 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 영역과 동일한 생물학적 활성을 나타내나, Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 유도체다.
또한, 이러한 Fc 영역은 인간 및 소, 염소, 돼지, 마우스, 토끼, 햄스터, 랫트, 기니아 피그 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 얻을 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다.
바람직하게는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.
본 발명에서 "당쇄의 제거(Deglycosylation)"는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, "비당쇄화(Aglycosylation)"는 원핵동물, 바람직하게는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 영역을 의미한다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 바람직하게는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM 유래이며, 가장 바람직하게는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다.
한편, 본 발명에서 "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩티드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩티드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 Fc 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 Fc 단편에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지를 포함할 수 있다.
한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화도 가능하다. 바람직하게는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 가장 바람직하게는 보체 의존적 독성(CDC, Complement dependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역이다.
즉, 가장 바람직한 본 발명의 약물의 캐리어용 면역글로불린 Fc 영역은, 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역이다. 인간 유래의 Fc 영역은 인간 생체에서 항원으로 작용하여 이에 대한 새로운 항체를 생성하는 등의 바람직하지 않은 면역 반응을 일으킬 수 있는 비-인간 유래의 Fc 영역에 비하여 바람직하다.
본 발명에서 "비펩티드성 중합체"는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체 적합성 중합체를 의미하며, 상기 반복 단위들은 펩티드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다.
본 발명에 사용가능한 비펩티드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜이다. 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다.
기존 인프레임 퓨전(inframe fusion) 방법으로 제조된 융합 단백질에서 사용된 펩티드성 링커의 단점은 생체내에서 단백질 분해효소에 의해 쉽게 절단되어 캐리어에 의한 활성 약물의 혈중 반감기 증가 효과를 기대만큼 얻을 수 없다는 것이다. 그러나, 본 발명에서는 단백질 분해효소에 저항성이 있는 중합체를 사용하여 캐리어와 유사하게 펩티드의 혈중 반감기를 유지할 수 있다. 그러므로, 본 발명에서 사용될 수 있는 비펩티드성 중합체는 상기와 같은 역할, 즉 생체 내 단백질 분해효소에 저항성이 있는 중합체라면 제한 없이 사용될 수 있다. 비펩티드성 중합체는 분자량이 1 내지 100 kDa 범위, 바람직하게는 1 내지 20 kDa 범위인 것이 바람직하다. 또한, 상기 면역글로불린 Fc 영역과 결합되는 본 발명의 비펩티드성 중합체는 한 종류의 중합체뿐만 아니라 상이한 종류의 중합체들의 조합이 사용될 수도 있다.
본 발명에 사용되는 비펩티드성 중합체는 면역글로불린 Fc 영역 및 단백질 약물과 결합될 수 있는 반응기를 가진다.
상기 비펩티드성 중합체의 양말단 반응기는 반응 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 부틸 알데히드 그룹, 말레이미드(maleimide) 그룹 및 석시니미드(succinimide) 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 상기에서, 석시니미드 유도체로는 석시니미딜 프로피오네이트, 히드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트가 이용될 수 있다. 특히, 상기 비펩티드성 중합체가 양 말단에 반응 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 경우, 비특이적 반응을 최소화하고, 비펩티드성 중합체의 양 말단에서 생리활성 폴리펩티드 및 면역글로불린과 각각 결합하는데 효과적이다. 알데히드 결합에 의한 환원성 알킬화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다. 알데히드 반응기는 낮은 pH에서 아미노 말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH9.0 조건에서는 라이신 잔기와 공유결합을 형성할 수 있다.
상기 비펩티드성 중합체의 양말단 반응기는 서로 같거나 다를 수 있다. 예를 들어, 한쪽 말단에는 말레이미드 그룹을, 다른 쪽 말단에는 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 또는 부틸 알데히드 그룹을 가질 수 있다. 양쪽 말단에 히드록시 반응기를 갖는 폴리(에틸렌글리콜)을 비펩티드성 중합체로 이용하는 경우에는 공지의 화학반응에 의해 상기 히드록시기를 상기 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수 가능한 변형된 반응기를 갖는 폴리(에틸렌글리콜)을 이용하여 본 발명의 단백질 결합체를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명의 인슐린 결합체를 포함하는 인슐린 지속성 제제를 제공한다.
본 발명에서 "투여"는, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 결합체의 투여 경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비강내 투여, 폐내 투여, 직장 내 투여 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 펩티드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 지속성 제제는 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 결합체를 포함한 지속성 제제는 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구투여시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 지속성 제제의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 지속성 제제는 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다. 본 발명의 약제학적 조성물은 생체 내 지속성 및 역가가 우수하므로, 본 발명의 약제학적 제제의 투여 횟수 및 빈도를 현저하게 감소시킬 수 있다.
본 발명의 지속성 제제는 인슐린의 생체 내 지속성 및 안정성을 매우 높게 유지시키므로 인슐린에 의한 당뇨병 치료에 효과적이다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은
(1) 각 말단에 알데히드, 말레이미드, 또는 석시니미드 유도체 반응기를 갖는 비펩티드성 중합체를 사용하여 면역글로불린 Fc 영역의 아민 그룹 또는 티올 그룹에 공유결합으로 연결하는 단계;
(2) 상기 (1)의 반응 혼합물로부터 비펩티드성 중합체가 공유결합된 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및
(3) 분리된 연결체의 비펩티드성 중합체의 다른 쪽 말단에 인슐린을 공유결합으로 연결하여 비펩티드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 인슐린과 결합된 펩티드 결합체를 생성하는 단계를 포함하는 인슐린 결합체의 제조방법을 제공한다.
바람직하게는, 단계 (1)의 비펩티드성 중합체는 말단에 알데히드 유도체 반응기를 가지고 있으며, 더욱 바람직하게는 세 말단의 알데히드 반응기를 가지는 비펩티드성 중합체이다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은
(1) 각 말단에 알데히드 반응기를 갖는 비펩티드성 중합체를 사용하여 면역글로불린 Fc의 N-말단에 pH6.0에서 공유결합으로 연결하는 단계;
(2) 상기 (1)의 반응 혼합물로부터 N-말단에 비펩티드성 중합체가 공유결합된 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및
(3) 분리된 연결체의 비펩티드성 중합체의 다른 쪽 말단에 인슐린을 공유결합으로 연결하여 비펩티드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 인슐린과 결합된 펩티드 결합체를 생성하는 단계를 포함하는 인슐린 결합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은
(1) 각 말단에 알데히드, 말레이미드, 또는 석시니미드 유도체 반응기를 갖는 비펩티드성 중합체를 사용하여 인슐린의 아민 그룹 또는 티올 그룹에 공유결합으로 연결하는 단계;
(2) 상기 (1)의 반응 혼합물로부터 비펩티드성 중합체가 공유결합된 인슐린을 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및
(3) 분리된 연결체의 비펩티드성 중합체의 다른 쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하여 비펩티드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 인슐린과 결합된 펩티드 결합체를 생성하는 단계를 포함하는 인슐린 결합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은
(1) 각 말단에 알데히드 반응기를 갖는 비펩티드성 중합체를 사용하여 인슐린의 아민 그룹에 공유결합으로 연결하는 단계;
(2) 상기 (1)의 반응 혼합물로부터 비펩티드성 중합체가 공유결합된 인슐린을 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및
(3) 분리된 연결체의 비펩티드성 중합체의 다른 쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하여 비펩티드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 인슐린과 결합된 펩티드 결합체를 생성하는 단계를 포함하는 인슐린 결합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 인슐린 결합체를 포함하는 지속성 제제를 인슐린-결핍 질환을 가진 개체에 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 인슐린-결핍 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 바람직하게, 상기 인슐린-결핍 질환은 당뇨병일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개체"는 예를 들어, 인간, 비인간인 영장류, 말, 양, 고양이, 개, 소 또는 돼지인 포유동물일 수 있다.
본 발명의 인슐린 결합체는 펩티드의 생체내 활성이 비교적 높게 유지되고, 혈중 반감기가 현저히 증가되어 인슐린 투여를 필요로 하는 환자들의 복약순응도를 높일 수 있는 인슐린의 지속형 제형 개발에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 인슐린-PEG-면역글로불린 Fc 결합체의 약물동태 확인 시험 결과이다.
도 2는 인슐린 유도체-PEG-면역글로불린 Fc 결합체들의 생체내 효력 비교시험 결과이다.
도 3은 인슐린-PEG-면역글로불린 Fc 결합체가 베타 체인의 1번 페닐알라닌(B1F)에 90% 이상 수식되었음을 확인하기 위하여 크기 배제 칼럼을 이용하여 분석한 결과이다.
도 4a 내지 4c는 인슐린-PEG-면역글로불린 Fc 결합체가 베타 체인에 특이적으로 결합하는 것을 나타낸 결과이다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 페길화된 면역글로불린 Fc 영역 정제
5K PropionALD(3) PEG(프로필알데히드기를 3개 가지고 있는 PEG, NOF, 일본)를 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 페길화시키기 위하여 면역글로불린 Fc 영역과 PEG의 몰비 1:2, 면역글로불린 Fc 농도를 10 mg/ml로 4℃에서 4.5시간 반응시켰다. 이때 반응은 100 mM 포타슘 포스페이트(Potasssium phosphate, pH 6.0)에서 이루어졌으며 환원제인 20 mM SCB(NaCNBH3)를 첨가하여 반응시켰다. 반응액은 Source 15Q(GE Healthcare) 정제 컬럼을 사용하여 모노-페길화된(Mono-PEGylated) 면역글로불린 Fc를 정제하였다.
실시예 2: 인슐린-PEG-면역글로불린 Fc 결합체 제조
인슐린의 베타 체인의 1번 페닐알라닌(B1F)에 90%이상 수식된 인슐린-PEG-면역글로불린 Fc 결합체를 제조하기 위하여, 실시예 1의 방법을 이용하여 얻은 모노-페길화된(mono-PEGylated) 면역글로불린 Fc와 인슐린을 몰비가 4 : 1이 되도록 하고 전체 단백질 농도를 20 mg/ml로 하여 4℃에서 20시간 반응시켰다. 반응액은 100 mM 포타슘 포스페이트 (pH 6.0)이며 환원제인 20 mM SCB를 첨가하였다. 반응이 종결된 후 반응액은 Source 15Q 정제 컬럼을 사용하여 1차 정제를 하였다. 이후 Source 15ISO 정제 컬럼으로 2차 정제를 진행하여 인슐린-PEG-면역글로불린 Fc 결합체를 얻었다. 이렇게 얻은 인슐린-PEG-면역글로불린 Fc 결합체가 B1F에 90% 이상 수식되었음을 확인하기 위하여 크기 배제 칼럼을 이용하여 분석한 결과를 도 3에 나타내었다.
실시예 3: 인슐린 리스프로 ( Humalog ® )-PEG-면역글로불린 Fc 결합체 제조
실시예 1의 방법을 이용하여 얻은 모노-페길화된 면역글로불린 Fc와 인슐린 리스프로를 몰비가 4 : 1이 되도록 하고 전체 단백질 농도를 20mg/ml로 하여 4℃에서 20시간 반응시켰다. 반응액은 100 mM 포타슘 포스페이트(pH 6.0)이며 환원제인 20 mM SCB를 첨가하였다. 반응이 종결된 후 정제과정은 실시예 2와 동일하다.
실시예 4: 인슐린 글라진 ( Lantus ® )-PEG-면역글로불린 Fc 결합체 제조
실시예 1의 방법을 이용하여 얻은 모노-페길화된 면역글로불린 Fc와 인슐린 글라진을 몰비가 4 : 1이 되도록 하고 전체 단백질 농도를 20 mg/ml로 하여 4℃에서 20시간 반응하였다. 반응액은 100 mM 포타슘 포스페이트(pH 6.0)이며 환원제인 20 mM SCB를 첨가하였다. 반응이 종결된 후 정제과정은 실시예 2와 동일하다.
실시예 5: 인슐린 디테미르 ( Levemir ® )-PEG-면역글로불린 Fc 결합체 제조
실시예 1의 방법을 이용하여 얻은 모노-페길화된 면역글로불린 Fc와 인슐린 디테미르를 몰비가 4 : 1이 되도록 하고 전체 단백질 농도를 20 mg/ml로 하여 4℃에서 20시간 반응시켰다. 반응액은 100 mM 포타슘 포스페이트 (pH 6.0)이며 환원제인 20 mM SCB를 첨가하였다. 반응이 종결된 후 정제과정은 실시예 2와 동일하다.
실시예 6: 지속형 인슐린 결합체의 생체내 소실 반감기 측정
지속형 인슐린 결합체의 생체 내 지속성을 확인하기 위해 정상 수컷 쥐(Normal SD rat)를 이용하여 약물 동태를 확인하였다. 정상 수컷 쥐에 인슐린과 지속형 인슐린 결합체를 100 μg/kg(인슐린 기준)을 단회 피하 투여한 후 인슐린 ELISA 키트를 이용하여 시간에 따른 혈중 농도 변화를 측정하였고, 측정된 값으로 WinNonlin 5.2를 이용하여 약물동태 파라미터(parameter)를 산출하였다. 지속형 인슐린 결합체의 생체내 소실 반감기는 17.67시간으로 0.58시간의 천연형 인슐린에 비해 30배 정도 긴 지속성을 나타내는 것으로 확인되었다(도 1).
실시예 7: 인슐린 유도체 결합체의 생체내 효력시험
인슐린 유도체 결합체들의 인 비보 효력을 비교하기 위하여 스트렙토조토신(Streptozotocin)으로 당뇨병이 유발된 쥐에서 혈당 강하 효력 비교 시험을 진행 하였다. 16시간 절식된 정상 쥐에 10 mM 시트르산 완충용액(pH4.5)에 용해시킨 스트렙토조토신을 60 mg/kg으로 복강 투여한 후 당뇨를 유발시킨다. 이후 혈당이 500 mg/dL 이상 높아진 쥐에 인슐린 결합체, 인슐린 디테미르 결합체, 인슐린 리스프로 결합체를 0.5 mg/kg의 용량으로 단회 피하 투여 후 혈당 강하 효력을 비교하였다. 그 결과, 인슐린 결합체와 인슐린 리스프로 결합체의 혈당 강하는 투여 후 약 4일간 지속되며 5일째 혈당이 상승하였다. 또한, 인슐린 디테미르 결합체 역시 혈당을 강하시키는 효력이 나타났으나, 동일 용량의 인슐린 결합체와 인슐린 리스프로 결합체보다 낮은 효력을 보였다(도 2).
실시예 8: 인슐린-5K PEG- 면역글로블린 Fc 결합체 결합 부위 확인
인슐린에 5K PEG-면역글로블린 Fc의 결합 부위를 확인하기 위하여 Glu-C 맵핑 방법을 사용하였다. 농도 1 mg/ml의 인슐린-5K PEG-면역글로블린 Fc 100 ㎍에 농도 1 mg/ml의 펩티드 내부 가수분해효소 Glu-C 20 ㎍을 첨가하였다. 반응액은 50 mM HEPES pH 7.5이며 25℃에서 8시간 반응하였다. 이후에 1 N HCL 10 ㎕를 첨가함으로써 반응을 종결하였다. 맵핑은 HPLC 역상 크로마토그래피를 사용하였다. 맵핑 결과, 인슐린 베타체인의 N 말단 피크가 이동함으로써 인슐린 베타체인 N-말단에 5K PEG-면역글로블린 Fc가 결합하였음을 확인할 수 있었다(도 4a 내지 4c).
칼럼:　Jupiter C18 4.6×250 mm, 5 ㎛（Phenomenex）
이동상 A: 20% 0.1 M NaSO4(pH 2.0), 10% ACN
이동상 B: 20% 0.1 M NaSO4(pH 2.0), 40% ACN
구배 0% B in 10분 > 0-10% B in 5분 > 10-70% B in 60분
<110> Hanmi Science Co., Ltd <120> An Insulin Conjugate Using an Immunoglobulin Fragment <130> PA110256-KR-D1D1D1 <150> KR10-2010-0030575 <151> 2010-04-02 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30

Claims (20)

  1. 인슐린 및 면역글로불린 Fc 영역이 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비펩티드성 중합체를 통해 연결되고, 상기 인슐린의 베타 체인의 아미노 말단에 상기 비펩티드성 중합체가 결합된 것을 특징으로 하는 인슐린 결합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인슐린은 천연형 인슐린, 천연형 인슐린에서 일부 아미노산이 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion) 및 수식(modification) 중에 어느 하나의 방법 또는 이들 방법의 조합을 통해 제조된 변이체, 유도체 또는 이들의 단편인 인슐린 결합체.
  3. 제1항에 있어서, 비펩티드성 중합체의 각 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역과 인슐린의 아민 그룹 또는 티올 그룹(Thiol group)에 결합된 인슐린 결합체.
  4. 제1항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 비당쇄화됨을 특징으로 하는 인슐린 결합체.
  5. 제1항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인으로 이루어진 군으로부터 1개 내지 4개 선택되는 도메인으로 이루어진 인슐린 결합체.
  6. 제5항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 힌지영역을 추가로 포함하는 인슐린 결합체.
  7. 제1항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM에서 유래된 Fc 영역인 인슐린 결합체.
  8. 제7항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역의 각각의 도메인이 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM로 이루어진 군에서 선택되는 면역글로불린에서 유래된 상이한 기원을 가진 도메인의 하이브리드인 인슐린 결합체.
  9. 제7항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 단쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체인 인슐린 결합체.
  10. 제7항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 IgG4 Fc 영역인 인슐린 결합체.
  11. 제10항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 인간 비당쇄화 IgG4 Fc 영역인 인슐린 결합체.
  12. 제1항에 있어서, 비펩티드성 중합체의 반응기가 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 부틸 알데히드 그룹, 말레이미드 그룹 및 석시니미드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 인슐린 결합체.
  13. 제12항에 있어서, 석시니미드 유도체가 석시니미딜 프로피오네이트, 석시니미딜 카르복시메틸, 히드록시 석시니미딜 또는 석시니미딜 카보네이트인 인슐린 결합체.
  14. 제12항에 있어서, 비펩티드성 중합체는 양 말단에 반응 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 인슐린 결합체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 인슐린 결합체를 포함하는 생체 내 지속성 및 안정성이 증가된 인슐린의 지속성 제제.
  16. 제15항에 있어서, 당뇨병 치료용인 지속성 제제.
  17. (1) 각 말단에 알데히드, 말레이미드, 또는 석시니미드 유도체 반응기를 갖는 비펩티드성 중합체의 일 말단을 면역글로불린 Fc 영역의 아민 그룹 또는 티올 그룹에 공유결합으로 연결하는 단계;
    (2) 상기 (1)의 반응 혼합물로부터 비펩티드성 중합체가 공유결합된 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및
    (3) 분리된 연결체의 비펩티드성 중합체의 다른 쪽 말단에 인슐린을 공유결합으로 연결하여 비펩티드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 인슐린과 결합된 펩티드 결합체를 생성하는 단계를 포함하는, 제1항의 인슐린 결합체의 제조방법.
  18. (1) 각 말단에 알데히드 반응기를 갖는 비펩티드성 중합체를 면역글로불린 Fc의 N-말단에 pH6.0에서 공유결합으로 연결하는 단계;
    (2) 상기 (1)의 반응 혼합물로부터 N-말단에 비펩티드성 중합체가 공유결합된 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및
    (3) 분리된 연결체의 비펩티드성 중합체의 다른 쪽 말단에 인슐린을 공유결합으로 연결하여 비펩티드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 인슐린과 결합된 펩티드 결합체를 생성하는 단계를 포함하는, 제1항의 인슐린 결합체의 제조방법.
  19. (1) 각 말단에 알데히드, 말레이미드, 또는 석시니미드 유도체 반응기를 갖는 비펩티드성 중합체를 인슐린의 아민 그룹 또는 티올 그룹에 공유결합으로 연결하는 단계;
    (2) 상기 (1)의 반응 혼합물로부터 비펩티드성 중합체가 공유결합된 인슐린을 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및
    (3) 분리된 연결체의 비펩티드성 중합체의 다른 쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하여 비펩티드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 인슐린과 결합된 펩티드 결합체를 생성하는 단계를 포함하는, 제1항의 인슐린 결합체의 제조방법.
  20. (1) 각 말단에 알데히드 반응기를 갖는 비펩티드성 중합체를 인슐린의 아민 그룹에 공유결합으로 연결하는 단계;
    (2) 상기 (1)의 반응 혼합물로부터 비펩티드성 중합체가 공유결합된 인슐린을 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및
    (3) 분리된 연결체의 비펩티드성 중합체의 다른 쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하여 비펩티드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 인슐린과 결합된 펩티드 결합체를 생성하는 단계를 포함하는, 제1항의 인슐린 결합체의 제조방법.
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