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KR20200006526A - 종양 미세 환경에서 면역 반응을 향상시키기 위한 치료제 및 방법 - Google Patents

종양 미세 환경에서 면역 반응을 향상시키기 위한 치료제 및 방법 Download PDF

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KR20200006526A
KR20200006526A KR1020197031630A KR20197031630A KR20200006526A KR 20200006526 A KR20200006526 A KR 20200006526A KR 1020197031630 A KR1020197031630 A KR 1020197031630A KR 20197031630 A KR20197031630 A KR 20197031630A KR 20200006526 A KR20200006526 A KR 20200006526A
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Inventor
지에이 왕
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리브젠 바이오파마 홀딩스 리미티드
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Abstract

힌지 도메인에 돌연변이를 갖고, Fcγ 수용체, 예컨대, FcγRIIB(CD32B)에 대한 변경된 결합 활성을 나타내는, 인간 IgG1, IgG2 및 IgG4 돌연변이체. 본원은 또한 면역 세포 표면 수용체 및 FcγRIIB 둘 다를 표적으로 할 수 있는 치료제를 사용하여 대상체에서의 면역 반응을 선택적으로 활성화시킬 수 있는 방법을 제공한다.

Description

종양 미세 환경에서 면역 반응을 향상시키기 위한 치료제 및 방법
관련 출원
이 출원은 2017년 3월 28일에 출원된 미국 가출원번호 62/477,661의 35 U.S.C.§119(e)에 따른 이익을 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참고로 원용된다.
Fc 수용체(FcR)는 항체의 Fc 부분에 결합할 수 있는 면역 세포 표면 단백질의 패밀리(family)이다. Fcγ 수용체, Fcα 수용체, Fcε 수용체 및 신생아 Fc 수용체(FcRn)를 포함하는 몇몇 상이한 유형의 Fc 수용체가 있으며, 이들은 각각 IgG, IgA, IgE 및 IgG 항체에 대한 상이한 결합 활성을 갖는다. Fcγ 수용체 서브패밀리(subfamily)는 FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32a), FcγRIIB(CD32b), FcγRIIB(CD32c), FcγRIIIA(CD16a) 및 FcγRIIIB(CD16b)를 포함한다. FcγRI은 IgG1 및 IgG3 항체에 대해 높은 결합 친화도를 갖는 반면에, 다른 FcγR은 IgG 항체에 대해 낮은 결합 친화도를 갖는다.
상이한 유형의 Fc 수용체는 면역계에서 상이한 역할을 한다. 예를 들어, NK 세포 및 대식세포에서 발현된 FcγRIII 수용체는, 감염된 세포 또는 침입 병원체에 부착되는 항체에 결합하고, 면역 세포의 항체 매개 식세포작용(ADCP) 또는 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)을 유발하여, 감염된 세포 또는 침입 병원체의 제거를 야기한다. 반면, B 세포 및 수지상 세포에서 발현된 FcγRII 수용체는 IgG 항체에 결합하는 경우 면역 세포의 활성을 하향 조절(down regulation)할 수 있다.
활성화된 면역 세포를 포함하는 요법은 질환이 있는 세포, 예컨대, 암 세포를 제거하기 위한 유망한 접근법이다. 그러나, 이러한 치료적 접근법은 종종 안전성 문제를 제기한다. 예를 들어, 과도하게 활성화된 면역 세포는 원하지 않은 세포독성을 유발하여 조직 손상을 야기할 수 있다. 그러므로, 효과적이고 안전한 새로운 면역 요법을 개발하는 것이 큰 관심사이다.
본 개시 내용은 적어도 부분적으로, 원하는 Fc 수용체 결합 활성 및/또는 선택성을 나타내는 IgG1, IgG2 또는 IgG4 분자의 다양한 Fc 영역 변이체의 개발을 기반으로 한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 함유 단백질, 예컨대, 면역 반응을 선택적으로 조정할 수 있는 항체를 구축하는데 사용될 수 있다.
따라서, 본 개시 내용의 일 양태는 야생형 모(parent) Fc 영역과 비교하여 위치 218 내지 329(예컨대, 218 내지 328) 중 어느 하나에서의 돌연변이(예컨대, 아미노산 잔기 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합)를 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 단백질(예컨대, 항체)을 제공한다. 본원에 사용된 Fc 넘버링(numbering) 시스템은 당업계에 공지된 바와 같은 EU 지수에 따른다.
일부 실시양태에서, 돌연변이가 다음 중 하나 이상을 포함한다: (a) 위치 219 내지 225 중 하나 이상에서의 돌연변이; (b) 위치 218과 위치 219 사이, 또는 위치 236에서의 삽입; (c) 233 내지 235의 하나 이상의 위치에서의 아미노산 잔기 치환; (d) 위치 220 내지 223 중 어느 하나에서의 삽입; (e) 위치 236 내지 238 중 하나 이상에서의 결실; 및 (f) 위치 267, 273, 328 및 329 중 하나 이상에서의 아미노산 치환(예컨대, S267E, V273E, L328F, P329G 또는 이들의 조합). 일부 경우에, 돌연변이는 삽입 및 임의로 결실을 포함한다. 예를 들어, 변이체 Fc 영역에서의 돌연변이가 (i) 위치 234 내지 238 중 하나 이상에서의 돌연변이 및 임의로 (ii) 위치 267, 273, 328 및 329 중 하나 이상에서의 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, (i)의 돌연변이가 결실, 예를 들어, 위치 234 내지 238(예컨대, 236 내지 238) 중 하나 이상의 결실일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, (ii)의 돌연변이는 아미노산 잔기 치환, 예를 들어, 아미노산 잔기 치환 S267E, V273E, L328F, P329G 또는 이들의 조합일 수 있다.
일부 실시양태에서, 야생형 모 Fc 영역은 IgG1 분자의 Fc 영역이다. IgG1 분자(예컨대, 인간 IgG1 분자)로부터 유래된 Fc 변이체를 포함하는 단백질은 다음 중 하나 이상을 포함하는 돌연변이를 포함할 수 있다: (a) 위치 228과 위치 229 사이의 삽입; (b) 위치 220 내지 225 중 하나 이상에서의 돌연변이; (c) 위치 234 및 235에서의 아미노산 치환; (d) 위치 236 내지 238 중 하나 이상에서의 결실; 및 (e) 하나 이상의 위치 267, 273, 328 및 329에서의 아미노산 치환(예컨대, S267E, V273E, L328F 및/또는 P329G). 일 실시예에서, 돌연변이는 (i) 위치 236 내지 238 중 하나 이상(예컨대, 236, 237, 238 또는 이들의 조합)에서의 결실 및 임의로 (ii) 위치 267, 273 및 328 중 하나 이상에서의 아미노산 잔기 치환을 포함한다. 예를 들어, 돌연변이는 위치 236의 결실 또는 위치 236 내지 238의 결실을 포함할 수 있다. 임의로, 돌연변이는 위치 267, 273 및 268 중 하나 이상에서의 아미노산 잔기 치환을 추가로 포함할 수 있으며, 이는 S267E, V273E, L328F 또는 이들의 조합일 수 있다. 일 실시예에서, 돌연변이는 위치 236 내지 238 중 하나 이상에서의 결실 및 S267E의 아미노산 치환을 포함한다. 인간 IgG1로부터 유래된 예시적인 변이체 Fc 영역은 G1m1, G1m2, G1m-2, G1m-4, G1m5, G1m7, G1m8, G1m9, G1m15, G1m17, G1m18, G1m19, G1m25, G1m27, G1m28, G1m29, G1mAA 및 G1mAG 중 하나일 수 있다.
다른 실시양태에서, 야생형 모 Fc 영역은 IgG2 분자(예컨대, 인간 IgG2 분자)의 Fc 영역이다. IgG2 분자(예컨대, 인간 IgG2 분자)로부터 유래된 Fc 변이체를 포함하는 단백질은 다음 중 하나 이상을 포함하는 돌연변이를 포함할 수 있다: (a) 219 내지 225의 하나 이상의 위치에서의 돌연변이; (b) 위치 233 내지 235 중 하나 이상에서의 아미노산 치환; (c) 위치 218과 219 사이 또는 위치 236에서의 삽입; (d) 위치 237 및 238 중 하나 이상에서의 결실; 및 (e) 위치 267, 273 및 328 중 하나 이상에서의 아미노산 잔기 치환(예컨대, S267E, V273E, L328F 또는 이들의 조합). 일부 실시예에서, 돌연변이는 위치 233 내지 238, 267, 273 및 328 중 하나 이상에 존재한다. 예를 들어, 돌연변이는 (i) 위치 236, 237 및 238 중 하나 이상 (예컨대, 237 및/또는 238)에서의 결실 및 임의로 (ii) 위치 267, 273 및 328 중 하나 이상에서의 아미노산 잔기 치환(예컨대, S267E, L328F 또는 이들의 조합)을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 돌연변이는 위치 236에서의 첨가를 포함한다. 다른 실시예에서, 돌연변이는 위치 233 내지 238 중 하나 이상에서의 아미노산 잔기 치환, 예컨대, P233E, V234F 또는 V234V, A235L, A235S 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 돌연변이는 하나 이상의 위치 267, 273 및 328에서의 아미노산 잔기 치환을 추가로 포함하며, 이는 S267E, V273E 및/또는 L328F일 수 있다. 일부 특정 실시예에서, IgG2로부터 유래된 변이체 Fc 영역은 G2m1, G2m-1, G2m2, G2m-4, G2m5, G2m7, G2m8, G2m9, G2m10, G2m15, G2m17, G2m18, G2m19, G2m20, G2m27, G2m27 및 G2m28 중 하나일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 야생형 모 Fc는 IgG4 분자(예컨대, 인간 IgG4 분자)의 Fc이다. IgG4 분자 (예컨대, 인간 IgG4)로부터 유래된 Fc 변이체는 S228P 치환을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, IgG4 분자, 예컨대, 인간 IgG4 분자로부터 유래된 Fc 변이체는 다음 중 하나 이상을 포함하는 돌연변이를 가질 수 있다: (a) 위치 219 내지 225 중 하나 이상에서의 돌연변이; (b) 하나 이상의 위치 234 및 235에서의 아미노산 잔기 치환; (c) 위치 236 내지 238 중 하나 이상에서의 결실; 및 (d) 위치 267, 273 및 328 중 하나 이상에서의 아미노산 잔기 치환(S267E, V273F, L328F 또는 이들의 조합). 일부 실시예에서, IgG4의 Fc 변이체는 S228P 아미노산 잔기 치환 및 위치 236 내지 238 중 하나 이상에서의 결실을 포함할 수 있다. 이러한 Fc 변이체는 위치 267, 273 및 328 중 하나 이상에서의 아미노산 치환(예컨대, L328F)을 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, Fc 변이체는 S228P 치환 및 하나 이상의 위치 234 내지 238, 267, 273 및 328에서의 추가 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 위치 235 내지 237 중 하나 이상에서의 결실을 포함하거나, 위치 235, 236 또는 둘 다에서의 아미노산 잔기 치환(예컨대, F234V, K235S 또는 이들의 조합)을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 돌연변이는 하나 이상의 위치 267, 273 및 328에서의 아미노산 잔기 치환을 추가로 포함한다. 실시예는 S267E, V273E, L328F 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 특정 실시예에서, 변이체 Fc 영역은 G4m1, G4m-1, G4m2, G4m-2, G4m3, G4m4, G4m5, G4m7, G4m8, G4m9, G4m10, G4m17, G4m18, G4m19, G4m20, G4m25, G4m27, G4m28, G4m29, G4m30 및 G4mPE 중 하나이다.
본원에 기술된 임의의 변이체 Fc 영역은 모 야생형 Fc 영역과 비교하여 FcγRIIB에 대해 향상된 결합 활성 및/또는 향상된 선택성을 나타낼 수 있다. 대안적으로, 본원에 기술된 변이체 Fc 영역은 임의의 FcγR 수용체에 대한 결합 활성이 낮거나 없을 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 변이체 Fc 영역은 FcRn과 결합한다.
본원은 또한 IgG2 또는 IgG4 분자(예컨대, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 분자)의 변이체 Fc 영역을 포함하는 단백질을 기술한다. 이러한 변이체 Fc 영역은 야생형 모 IgG2 또는 IgG4 Fc 영역과 비교하여 위치 267, 위치 273, 위치 328 또는 이들의 조합에서의 돌연변이를 포함할 수 있다. 넘버링은 EU 지수에 따른다.
다른 양태에서, 본원은, 본원에 기술된 바와 같은 임의의 변이체 Fc 영역을 함유하는 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 이러한 약학 조성물은 대상체의 면역 반응을 선택적으로 활성화시키는 데 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 대상체의 면역 반응을 선택적으로 활성화시키는 방법으로서, 유효량의 치료제를, 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하되, 치료제는 면역 세포 수용체에 결합하는 제1 모이어티(moiety) 및 FcγRIIB에 결합하는 제2 모이어티을 포함하는, 방법을 제공한다. 일부 실시예에서, 면역 세포 수용체는 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리(TNFRSF) 구성원(member)이다. 실시예는 FAS, TNFRSF12A, 4-1BB/CD137, TNFRSF13B, TNFRSF13C, CD27/TNFRSF7, CD30/TNFRSF8, CD40/TNFRSF5, DR3/TNFRSF25, DR4/TNFRSF10A, DR5/TNFRSF10B, DR6/TNFRSF21, GITR/TNFRSF18, HVEM/TNFRSF14, LTβR, OX40/TNFRSF4, TROY/TNFRSF19, RELT/TNFRSF19L, TNFRSF12A, TNFRSF13B, TL1A/TNFSF15, TNFRSF17, TNFRSF1A, TNFRSF11B, RANK/TNFRSF11A, TNFRSF11B, NGFR, EDA2R 및 TNFRSF1B를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 치료제는 항체(예컨대, 작용제 항체(agonist antibody))일 수 있으며, 이는 IgG1, IgG2 또는 IgG4 분자(예컨대, 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 분자)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료제는 FcγRIIB와 선택적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 치료제는 FcγRIIB에 대한 선택적 결합 친화도를 갖는 변이체 Fc 영역 (예컨대, 임의의 본원에 기술된 변이체 Fc 영역)을 함유할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 변이체 Fc 영역은 야생형 모 Fc 영역과 비교하여 FcγRIIB에 대해 향상된 결합 활성을 가질 수 있다.
다른 실시양태에서, 치료제가 면역 세포 수용체에 특이적인 제1 항원-결합 단편인 제1 모이어티 및 FcγRIIB에 특이적인 제2 항원-결합 단편인 제2 모이어티를 포함하는 이중특이적 항체일 수 있다.
본원에 기술된 임의의 방법에서, 대상체가 암을 앓고 있거나 앓는 것으로 의심되는 인간 환자일 수 있다. 예시적인 암은 폐암, 위암, 간암, 유방암, 피부암, 췌장암, 뇌암, 전립선암, 방광암, 결장 직장암, 육종, 골암, 림프종 및 혈액암을 포함한다.
또한, 본 개시 내용의 범위는 본원에 기술된 바와 같은 임의의 변이체 Fc 영역을 함유하는 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 면역 반응을 향상시키는 데 사용하기 위한 약학 조성물, 및 의도된 치료적 목적, 예를 들어, 암 치료를 달성하는데 사용하기 위한 약제를 제조하기 위한 이러한 단백질의 용도 내에 있다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태의 세부 사항은 아래 설명에 기재되어 있다. 본 발명의 다른 특징 또는 장점은 몇몇 실시양태의 다음의 도면 및 상세한 설명, 및 첨부된 청구 범위로부터 명백해질 것이다.
도 1a-1w는 지시된 바와 같이 다양한 농도에서 CHO-K1 세포 상에 발현된 상이한 유형의 Fcγ 수용체에 대한 지시된 바와 같은 다양한 IgG 변이체의 결합 활성을 나타내는 차트이다. 도 1a-1c, 1e-j, 1l-1m, 1p-1r 및 1t-1v에서 각각의 IgG 변이체의 농도는, 왼쪽에서 오른쪽으로 0μg/ml, 0.3μg/ml, 1μg/ml, 3μg/ml 및 10μg/ml이다. 도 1d, 1k, 1o, 1s 및 1w 막대는 왼쪽에서 오른쪽으로 다음의 IgG 변이체 농도에 해당한다: 0.3μg/ml, 1μg/ml, 3μg/ml 및 10μg/ml.
도 2a-2c는 IFN-γ 분비에 의해 지시된 바와 같이, 다수의 IgG 변이체에 의한 모 또는 FcγR 발현 세포와의 공동 배양에서 인간 CD8+ T 세포의 자극을 나타내는 차트이다. 도 2a에서 그룹은 왼쪽에서 오른쪽으로 OKT 없음, 0.01μg/ml, 0.03μg/ml, 0.1μg/ml 및 0.3μg/ml에 해당한다. 도 2b 및 2c에서, 그룹은 왼쪽에서 오른쪽으로 0.01μg/ml, 0.03μg/ml 및 0.1μg/ml에 해당한다.
도 3은 항-CD3 및/또는 항-4-1BB 항체의 존재 하에서 다수의 IgG 분자에 의한 뮤린 T 세포 활성화를 나타내는 차트이다.
도 4a-4b는 상이한 IgG 아이소폼(isoform)의 항-뮤린 CD137 항체에 의한 생체 내 항-종양 효과 및 혈청 ALT 수준의 유도를 나타내는 차트이다.
도 5a-5h는 1-3mg/kg의 단일 정맥 주사 후 혈장에서 IgG 변이체의 항체 농도를 나타내는 차트이다. 수컷 C57BL/6 마우스를 사용하였고, 시점 당 4마리 마우스를 분석하였다. 도 5a의 차트는 3mg/kg의 IV 용량 후 G1m27의 혈장 농도(상단 그래프) 및 1.45mg/kg의 IV 용량 후 G4m10의 혈장 농도(하단 그래프)를 나타낸다. 도 5b의 차트는 3mg/kg의 IV 용량 후 G1m2의 혈장 농도(상단 그래프) 및 3mg/kg의 IV 용량 후 G4m2의 혈장 농도(하단 그래프)를 나타낸다. 도 5c의 차트는 3mg/kg의 IV 용량 후 G1m29의 혈장 농도(상단 그래프) 및 3mg/kg의 IV 용량 후 G4m7의 혈장 농도(하단 그래프)를 나타낸다. 도 5d의 차트는 3mg/kg의 IV 용량 후 G1m28의 혈장 농도(상단 그래프) 및 3mg/kg의 IV 용량 후 G4의 혈장 농도를 나타낸다. 도 5e의 차트는 1.45mg/kg의 IV 용량 후 G4m28의 혈장 농도(상단 그래프) 및 1.5mg/kg의 IV 용량 후 G4m29의 혈장 농도(하단 그래프)를 나타낸다. 도 5f의 차트는 3mg/kg의 IV 용량 후 G4m1의 혈장 농도(상단 그래프) 및 1.45mg/kg의 IV 용량 후 G4m27의 혈장 농도(하단 그래프)를 나타낸다. 도 5g는 3mg/kg의 IV 용량 후 G2m19의 혈장 농도(상단 그래프) 및 3mg/kg의 IV 용량 후 G2m1의 혈장 농도(하단 그래프)를 나타낸다. 도 5h는 3mg/kg의 IV 용량 후 G2(야생형)의 혈장 농도(상단 그래프) 및 3mg/kg의 IV 용량 후 G1Maa의 혈장 농도(하단 그래프)를 나타낸다.
FcγRIIB(CD32B)에 결합할 수 있는 작용성(agonistic) 항-TNFR 항체는 마우스 모델에서 향상된 활성을 나타내며, 마우스 IgG1 아이소폼은 가장 높은 항-종양 효능을 나타냈다. 이러한 결과는 FcγRIIB(CD32B)에 대한 선택적 결합 활성을 갖는 작용성 항체가 면역 반응 자극에서 우수한 작용성 활성을 가질 것으로 예상됨을 나타낸다. 또한, 특정 항-종양 작용제 항체는 차등한 간 독성을 보임이 관찰되었으며, 이는 향상된 치료적 지수를 갖는 치료적 작용제 항체(예컨대, 높은 치료 효능 및 낮은 독성)를 고안하기 위한 신규한 접근법을 제시한다.
따라서, 본원은 다른 Fc 수용체, 예컨대, FcγRIII(CD16)에 비해 FcγRIIB(CD32B)에 대한 선택적 결합 활성을 갖는 Fc 변이체를 함유하는 IgG 분자(예컨대, IgG1, IgG2 및 IgG4 분자, 예컨대, 인간 IgG1, 인간 IgG2 및 인간 IgG4 분자)를 고안하기 위한 접근법, 및 면역 세포 수용체, 예컨대, 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리(TNFRSF)의 수용체 및 FcγRIIB를 가교(cross-linking)시킬 수 있는 치료제의 사용을 포함하는, 암 치료 방법을 기술한다.
1. Fc 변이체
본원은 야생형 대응물에 비해 FcγRIIB에 대한 향상된 선택성을 갖는 Fc 변이체를 기술한다. FcγRIIB에 대한 선택성을 갖고, FcγRIIB에 선택적으로 결합하거나, 또는 FcγRIIB에 특이적으로 결합하는 Fc 단편은 당업계에서 널리 이해되는 용어이다. 분자는, 분자가 대안적인 표적(예컨대, FcγRIII 수용체)보다 특정 표적 항원(예컨대, FcγRIIB 수용체)과 더 긴 지속 시간 및/또는 더 큰 친화력으로 더 빈번하게, 더 빠르게 반응하는 경우, "선택적 결합" 또는 "특이적 결합"을 나타낸다고 한다. Fc 단편은, Fc 단편이 다른 Fc 수용체에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합활성(avidity), 더 용이하게 및/또는 더 긴 지속 시간으로 결합하는 경우, Fc 수용체에 "특이적으로 결합"한다. 예를 들어, FcγRIIB에 특이적으로 (또는 우선적으로) 결합하는 Fc 단편은 다른 Fc 수용체에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합활성, 더 용이하게 및/또는 더 긴 지속 시간으로 이 Fc 수용체에 결합하는 Fc 단편이다. 또한, 이러한 정의에 의해, 예를 들어, 제1 Fc 수용체에 선택적으로 또는 특이적으로 결합하는 Fc 단편은 제2 Fc 수용체에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있거나할 수 없는 것으로 이해된다. 이와 같이, "선택적 결합", "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"은 (비록 독점적 결합을 포함할 수 있으나,) 반드시 독점적 결합을 요구하지는 않는다. 일부 실시예에서, 표적 Fc 수용체(예컨대, FcγRIIB)에 "선택적으로 결합" 또는 "특이적으로 결합"하는 Fc 단편은 다른 Fc 수용체에 결합하지 않을 수 있다 (즉, 일상적인 방법으로는 검출 가능하지 않는 결합). 상이한 Fc 수용체에 대한 IgG1, IgG2 및 IgG4의 상대적 결합 친화도는 하기 표 1에 제공된다.
표 1. Fc 수용체에 대한 인간 및 마우스 면역 글로불린의 상대적 결합 친화도
Figure pct00001
본원에 기술된 Fc 변이체는 이의 야생형 대응물(Fc 변이체를 생성하기 위해 돌연변이가 도입되는 야생형 모체 Fc 영역)에 비해 FcγRIIB에 대한 향상된 선택성을 가질 수 있다. 이러한 Fc 변이체의 FcγRIIB 대비 다른 Fc 수용체(예컨대, FcγRIII)에 대한 상대적 결합 활성은 야생형 대응물의 FcγRIIB 대비 다른 Fc 수용체(예컨대, FcγRIII)에 대한 상대적 결합 활성보다 높다. Fc 변이체는 FcγRIIB에 대한 향상된 결합 활성을 갖고/갖거나 다른 Fc 수용체, 예컨대, FcγRIII에 대한 감소된 결합 활성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 Fc 변이체는 FcγRIIB 및 다른 Fc 수용체(예컨대, FcγRIII) 둘 다에 대한 감소된 결합 활성을 갖으나; 다른 Fc 수용체(예컨대, FcγRIII)에 대한 감소된 결합 활성 수준은 FcγRIIB에 대한 감소된 결합 활성 수준보다 더 크다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 Fc 변이체는, 예컨대, Fc 변이체가 유래된 야생형 모체 Fc와 비교하여 향상된 FcγRIIB에 대한 적합한 결합 친화도를 갖는다. 본원에 사용된 "결합 친화도"는 겉보기 회합 상수(association constant) 또는 KA를 지칭한다. KA는 해리 상수(KD)의 역수이다. 본원에 기술된 Fc 변이체는 FcγRIIB에 대해 적어도 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 또는 10-10 M 이하의 결합 친화도(KD)를 가질 수 있다. 증가된 결합 친화도는 감소된 KD에 상응한다. 제2 Fc 수용체에 비해 제1 Fc 수용체에 대한 Fc 단편의 높은 친화도 결합은, 제2 Fc 수용체를 결합시키기 위한 KA (또는 수치값 KD)보다 제1 Fc 수용체를 결합시키기 위해 더 높은 KA (또는 더 작은 수치값 KD)로 표시될 수 있다. 이러한 경우에, Fc 변이체는 제2 Fc 수용체에 비해 제1 Fc 수용체에 대한 특이성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 Fc 변이체는 FcγRIII (FcγRIIIA 또는 FcγRIIIB) 대한 결합 친화도와 비교하여 FcγRIIB에 대한 더 높은 결합 친화도 (더 높은 KA 또는 더 작은 KD)를 갖는다. (예컨대, 특이성 또는 다른 비교의 경우) 결합 친화도의 차이는 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 37.5, 50, 70, 80, 91, 100, 500, 1000, 10,000 또는 105배일 수 있다.
결합 친화도 (또는 결합 특이성)는 평형 투석, 평형 결합, 겔 여과, ELISA, 표면 플라즈몬 공명 또는 분광법 (예컨대, 형광 분석법 사용)을 포함한 다양한 방법에 의해 측정될 수 있다. 아래의 실시예를 참조할 수 있다. 결합 친화도를 평가하기 위한 예시적인 조건은 HBS-P 완충액 (10mM HEPES pH 7.4, 150mM NaCl, 0.005% (v/v) 계면활성제 P20)에 있다. 이 기술은 표적 단백질 농도의 함수로서 결합된 결합 단백질의 농도를 측정하는데 사용될 수 있다. 결합된 결합 단백질의 농도 ([결합된(Bound)])는 일반적으로 다음 방정식에 의해 유리 표적 단백질의 농도 ([유리(Free)])와 관련이 있다:
[결합된] = [유리]/(Kd+[유리])
KA의 정확한 측정이 항상 필요한 것은 아니며, 때때로, 이는, 예컨대, ELISA 또는 FACS 분석과 같은 방법을 사용하여 측정된 친화도의 정량적 측정을 얻는 것으로 충분하고, KA에 비례하기 때문에, 더 높은 친화도가 친화도의 정성적 측정을 얻기기 위한 것인지, 또는, 예컨대, 기능상 검정(생체 외 또는 생체 내 검정)에서의 활성에 의한 추정의 친화도를 얻기 위한 것인지 여부를 확인하는 것과 같은 비교에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 Fc 변이체는 상응하는 마우스 IgG, 예컨대, 마우스 IgG1의 아미노산 잔기에 비추어 야생형 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4 Fc 단편에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 돌연변이시킴으로써 고안될 수 있다. 인간 및 마우스 IgG의 서열 비교는 하기에 제공된다(서열번호 67-69, 64 및 65는 각각 위에서 아래로, 각가은 상응하는 Fc 영역의 단편 211-245, 260-278 및 320-332의 조합을 나타냄):
Figure pct00002
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 Fc 변이체는 Fc 단편의 힌지 도메인에 하나 이상의 돌연변이(예컨대, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가)를 포함하는 인간 IgG1, G2 또는 G4 Fc 변이체이다. 인간 IgG는 힌지 도메인 (EU 지수에 따른 위치 226-229)에서 CPPC 또는 CPSC의 핵심 모티프를 함유한다. 위치 (216 내지 225)는 힌지 도메인의 상부로 간주되고 위치 230-238은 힌지 도메인의 하부로 간주된다. 명시적으로 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 넘버링 시스템은 EU 지수에 따른다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 돌연변이는 힌지 도메인의 상부에 위치될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 하나 이상의 돌연변이는 힌지 도메인의 하부에 위치될 수 있다.
인간 IgG Fc에 대한 돌연변이는 마우스 IgG1의 힌지 도메인에서의 상응하는 아미노산 잔기에 따라 이루어질 수 있다. 예를 들어, 마우스 IgG1은 위치 236-238에 GGP 모티프를 함유하지 않는다. 따라서,이 GGP 모티프에서의 하나 이상의 잔기가 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4 Fc 단편으로부터 결실되어 본원에 기술된 Fc 변이체를 생성할 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 인간 Fc 변이체는 힌지 도메인의 상부, 하부 또는 둘 다에 하나 이상의 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 예를 들어, Fc 변이체는 위치 233, 234, 235 및/또는 236 중 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 본원에 언급된 하나 이상의 GGP 모티프 (236 내지 238)의 결실과 조합될 수 있다. 이들 돌연변이는 본원에 기술된 Fc 변이체를 생성하기 위해 인간 IgG2 또는 IgG4 Fc 단편으로 도입될 수 있다. 일부 실시예에서, 본원에 기술된 Fc 변이체는 하나 이상의 위치 236 내지 238 (예컨대, 236, 237, 238 또는 이들의 임의의 조합)에서의 결실을 함유한다.
본원에 기술된 힌지 도메인에서의 임의의 돌연변이는 Fc 수용체와의 상호 작용에 관여하는 하나 이상의 위치에서 돌연변이 (예컨대, 아미노산 치환)와 조합될 수 있다. 이러한 위치는 위치 267, 273, 328 및/또는 329를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이들 위치에서의 예시적인 아미노산 치환은 S261E, V271E, L328F 및 P329G를 포함한다. 위치 267, 273, 328 및/또는 329에서 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 IgG2 또는 IgG4 분자로부터 유래된 Fc 변이체 또한 본 개시 내용의 범위 내에 있다. 이러한 돌연변이는 이들 위치 중 하나 이상에서의 아미노산 치환, 예를 들어, S261E, V271E, L328F 및/또는 P329G를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 Fc 변이체는 이의 야생형 대응물의 것(예컨대, 본원에 기술된 야생형 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4의 Fc 단편)과 적어도 85% 동일한 (예컨대, 90%, 95%, 98%, 99% 이상) 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 두 아미노산 서열의 "동일성 백분율"은 문헌[Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993]에서와 같이 변형된, 문헌[Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990]의 알고리즘을 사용하여 측정된다. 이러한 알고리즘은 문헌[Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(버전 2.0)에 통합된다. BLAST 단백질은 검색은 XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 단어 길이 = 3으로 수행하여, 관심있는 단백질 분자와 상동성인 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 두 서열 사이에 갭이 존재하는 경우, Gapped BLAST는 문헌[Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997]에 기술된 바와 같이 이용될 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때, 각 프로그램의 기본 매개 변수 (예컨대, XBLAST 및 NBLAST)를 사용할 수 있다.
일 실시예에서, 본원에 기술된 Fc 변이체에서의 아미노산 잔기 치환은 보존적 아미노산 잔기 치환이다. 본원에 사용된 "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 치환이 이루어진 단백질의 상대 전하 또는 크기 특성을 변경시키지 않는 아미노산 치환을 지칭한다. 변이체는 당업자에게 공지된 폴리펩티드 서열을 변경시키는 방법, 예컨대, 이러한 방법을 엮은 참고 문헌, 예컨대, 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, or Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York]에서 발견되는 방법에 따라 제조될 수 있다. 아미노산의 보존적 치환은 하기 군(group) 내의 아미노산 사이에서 이루어진 치환을 포함한다: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; 및 (g) E, D.
본 개시 내용에 대한 다양한 Fc 변이체를 생성하기 위해 돌연변이가 hIgG1, hIgG2 및 IgG4에 도입될 수 있는 예시적인 위치를 보여주는 서열 정렬이 하기에 제공된다.
야생형 인간 IgG1에 대한 인간 IgG1 변이체의 서열 정렬 (위에서 아래로, 서열번호 70 내지 서열번호 88):
Figure pct00003
야생형 인간 IgG2에 대한 인간 IgG2 변이체의 서열 정렬 (위에서 아래로, 서열번호 89 내지 서열번호 105):
Figure pct00004
야생형 인간 IgG4에 대한 인간 IgG4 변이체의 서열 정렬 (위에서 아래로, 서열번호 106 내지 서열번호 117, 서열번호 66, 및 서열번호 118 내지 서열번호 127):
Figure pct00005
Figure pct00006
야생형 인간 IgG1, IgG2 및 IgG4 Fc 단편의 아미노산 서열, 및 다수의 예시적인 hIgG1, hIgG2 및 hIgG4 Fc 변이체가 하기에 제공된다:
야생형 인간 IgG1 Fc 단편의 아미노산 서열:
Figure pct00007
야생형 인간 IgG2 Fc 단편의 아미노산 서열:
Figure pct00008
야생형 인간 IgG4 Fc 단편의 아미노산 서열:
Figure pct00009
야생형 인간 IgG4 S228P Fc 단편의 아미노산 서열:
Figure pct00010
예시적인 인간 IgG1 Fc 단편의 아미노산 서열:
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
예시적인 인간 IgG2 Fc 단편의 아미노산 서열:
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
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Figure pct00036
Figure pct00037
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Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
예시적인 인간 IgG4 Fc 단편의 아미노산 서열:
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
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Figure pct00059
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Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
Figure pct00067
Figure pct00068
Figure pct00069
본원에 기술된 Fc 변이체는 야생형 대응 물과 비교하여 FcγRIIB에 대한 향상된 결합 활성을 나타낼 수 있다. 예로는 G2m2, G2m5, G2m7, G2m8, G2m9, G1m7, G1m9 및 G4m7을 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, Fc 변이체, 예컨대, G1m15, G1m17, G1m18, G1m19, G1m27, G1m28, G1m29, G4m1, G4m2, G4m7, G4m8, G4m9, G4m25, G4m27 및 G4m28은 이들의 야생형 대응물과 비교하여 FcγRIIB에 대한 향상된 선택성을 가질 수 있다. 이들 Fc 변이체는 면역 수용체 및 FcγRIIB 수용체를 가교시킬 수 있는 본원에 기술된 치료제를 구축하는데 사용될 수 있다.
대안적으로, 본원에 기술된 특정 Fc 변이체는 임의의 FcγR에 대한 결합 활성이 낮거나 없을 수 있다. 예로는 G1m2, G1m25, G4m5, G4m18, G4m19 및 G4m20을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 FcRn에 대한 결합 활성을 보유할 수 있다. 이러한 Fc 변이체를 함유하는 치료제(예컨대, 항체)는 Fcγ 수용체를 활성화시키는 활성이 낮거나 없고, 이들의 야생형 대응물에 비해 저하된 독성을 갖는다.
야생형 대응물과 비교하여 예시적인 Fc 변이체의 결합 친화도/특이성의 변화는 하기 표 2-4에 제공된다. "N/A"는 이용 가능한 데이터가 없음을 나타낸다. Fc 변이체의 결합 활성이 야생형 대응 물과 비교하여 "변화 없음"인 것으로 밝혀지면, 이는, 동일한 실험 조건 하에서 동일한 검정에 의해 나타난 바와 같이 Fc 변이체와 야생형 대응물 사이의 결합 활성의 유의한 변이가 없음을 의미한다. Fc 변이체의 결합 활성이 그의 야생형 대응물에 비해 "증가된" 또는 "감소된" 경우, Fc 변이체의 결합 활성이, 동일한 실험 조건 하에서 동일한 검정에 의해 측정된 바와 같이 야생형 대응물의 결합 활성보다 높거나 낮음을 의미하며, 변이는 당업자에게 공지된 바와 같이 유의하다(예컨대, 생물학적으로 중요하다). Fc 변이체의 결합 활성이 그의 야생형 대응물과 비교하여 "약간 증가된" 또는 "약간 감소된" 경우, Fc 변이체의 결합 활성이, 동일한 실험 조건 하에서 동일한 검정에 의해 측정된 바와 같이 야생형 대응물의 결합 활성보다 높거나 낮음을 의미하며, 변이는 통계적으로 유의하나, 제한된 수준 (예컨대, 최대 10%)이다.
표 2. 야생형 인간 IgG1과 비교하여 인간 IgG1 돌연변이체의 FcγR 결합 활성
Figure pct00070
표 3. 야생형 인간 IgG2와 비교하여 인간 IgG2 돌연변이체의 FcγR 결합 활성
Figure pct00071
표 4. 야생형 인간 IgG4와 비교하여 인간 IgG4 돌연변이체의 FcγR 결합 활성
Figure pct00072
본원에 기술된 바와 같은 Fc 변이체는 본원에 제공된 지시사항에 따라 고안될 수 있고 일상적인 재조합 기술을 통해 생성될 수 있다. 다양한 Fc 수용체에 대한 이의 결합 친화도 및 특이성은 일상적인 방법을 통해 측정될 수 있다. 아래의 실시예를 참조할 있다.
II. 면역 수용체 및 FcγRIIB를 가교시킬 수 있는 치료제
본원은 또한 면역 수용체 및 FcγRIIB 수용체를 가교시킬 수 있는 치료제를 제공한다. 이러한 치료제는 특정 미세 환경, 예컨대, 암 및 종양 배출 림프절에서 면역세포, 예컨대, T 세포 및 NK 세포를 활성화하기 위해 향상된 작용성 효과를 가져, 침입 병원체 또는 질환 세포에 대한 향상된 면역 반응을 유도하거나 향상시킬 것으로 예상된다.
(i) 결합 모이어티
본원에 기술된 치료제는 2개 이상의 결합 모이어티를 함유한다. 하나의 결합 모이어티는 세포 표면 상에 발현된 면역 세포 수용체, 예를 들어, TNF 수퍼패밀리의 수용체에 결합할 수 있다. 예로는 Fas 수용체/FAS, TWEAK 수용체/TNFRSF12A, 4-1BB/TNFRSF9/CD137, TACI/TNFRSF13B, BAFF R/TNFRSF13C, CD27/TNFRSF7, CD30/TNFRSF8, CD40/TNFRSF5, DR3/TNFRSF25, DR4/TNFRSF10A, DR5/TNFRSF10B, DR6/TNFRSF21, GITR/TNFRSF18, HVEM/TNFRSF14, Lymphotoxin-beta 수용체/LTβR, OX40/TNFRSF4, TROY/TNFRSF19, RELT/TNFRSF19L, TNFRSF12A, TACI/TNFRSF13B, TL1A/TNFSF15, TNFRSF17, TNFR1/TNFRSF1A, TNFRSF11B, RANK/TNFRSF11A, TR1/TNFRSF11B, NGFR, EDA2R 및 TNFRII/TNFRSF1B를 포함한다. 일부 경우에, 면역 세포 수용체에 대한 결합 모이어티는 항체-결합 단편(예컨대, Fab 단편 또는 단일-쇄 항체 단편)이다.
치료제에서 다른 결합 모이어티는 FcγRIIB에 결합할 수 있다. 일부 경우에,이 결합 모이어티는 다른 Fc 수용체에 비해 FcγRIIB에 대한 선택적 결합 활성을 갖는다. 이러한 결합 모이어티는 본원에 기술된 Fc 변이체 중 임의의 것일 수 있으며, 이는 FcγRIIB에 선택적으로 또는 특이적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, 면역 세포 수용체 및 FcγRIIB를 가교 결합시키는 치료제는 면역 세포 수용체에 특이적인 항체일 수 있고, FcγRIIB, 예컨대, 본원에 기술된 것에 대한 선택적 결합 활성을 갖는 Fc 단편을 포함한다. 예를 들어, 치료제는 당업계에 공지되거나 본원에 열거된 임의의 TNF 수퍼패밀리 구성원(예컨대, CD137)에 결합하고 본원에 기술된 바와 같은 hIgG1, hIgG2 또는 hIgG4 Fc 변이체를 갖는 항체일 수 있다. 일부 실시예에서, 항체는 작용성 항체이다.
일부 실시양태에서, 치료제는 본원에 기술된 바와 같은 면역 세포 수용체에 특이적인 하나의 항원-결합 모이어티 및 Fcγ 수용체, 예컨대, FcγRIIB에 특이적인 다른 항원-결합 모이어티를 포함하는 이중 특이적 항체이다.
(ii) 치료제의 제조
면역 세포 수용체, 예컨대 TNF 수퍼패밀리 구성원 및 본원에 기술된 바와 같은 FcγRIIB 둘 다에 결합할 수 있는 항체는 다음과 같이 만들어질 수 있다. 면역 세포 수용체에 결합하는 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어 문헌[Harlow and Lane, (1998) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York]를 참조할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 수용체 (예컨대, CD137)에 특이적인 항체 또는 이의 세포 외 도메인은 통상적인 하이브리도마(hybridoma) 기술에 의해 만들어질 수 있다. 임의로 담체 단백질, 예컨대, KLH와 커플링(coupling)된 전장 표적 수용체 또는 이의 단편을 사용하여 항원에 결합하는 항체를 생성하기 위해 숙주 동물을 면역화할 수 있다. 숙주 동물의 면역 경로 및 스케줄은 일반적으로 본원에 추가로 기술된 바와 같이 항체 자극 및 생산을 위한 확립되고 통상적인 기술에 따른다. 마우스, 인간화 및 인간 항체의 생산을 위한 일반적인 기술은 당업계에 공지되어 있고 본원에 기술되어 있다. 인간을 포함한 임의의 포유 동물 대상체 또는 이로부터의 항체 생산 세포는 인간 하이브리도마 세포주를 포함하여 포유 동물의 생산에 대한 기초로서 작용하도록 조작될 수 있는 것으로 고려된다. 전형적으로, 숙주 동물은 본원에 기술된 바와 같은 것을 포함하는 면역원의 양을 복강 내, 근육 내, 경구, 피하, 족저 내(intraplantar), 및/또는 피부 내로 접종한다.
하이브리도마는 문헌[Kohler, B. and Milstein, C. (1975) Nature 256:495-497] 또는 문헌[Buck, D. W., et al., In Vitro, 18:377-381 (1982)]에 의해 변형된 바와 같은 일반적인 체세포 혼성화 기술을 사용하여 림프구 및 불멸화된 골수종 세포로부터 제조될 수 있다. X63-Ag8.653 및 미국 캘리포니아주 샌디에고의 살크 연구소(Salk Institute)의 세포 분배 센터로부터의 것을 비제한적으로 포함하는 이용 가능한 골수종 주(line)가 혼성화에 사용될 수 있다. 일반적으로, 기술은 융합유도물질(fusogen), 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜을 사용하거나 당업자에게 널리 알려진 전기 수단에 의해 골수종 세포 및 림프구 세포를 융합하는 것을 포함한다. 융합 후, 세포를 융합 배지로부터 분리하고 선택적 성장 배지, 예컨대, 하이포크산틴-아미노프테린-티미딘(HAT) 배지에서 성장시켜, 비혼성화된 모 세포를 제거한다. 혈청이 보충되거나 보충되지 않은 본원에 기술된 임의의 배지가 단일 클론 항체(monoclonal antibody)를 분비하는 하이브리도마 배양에 사용될 수 있다. 세포 융합 기술의 다른 대안으로서, EBV 불멸화 B 세포는 본원에 기술된 항 면역 세포 수용체 단일 클론 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 원하는 경우, 하이브리도마를 확장 및 서브 클로닝하고, 상청액은 통상적인 면역검정 절차 (예컨대, 방사선면역검정, 효소 면역검정 또는 형광 면역검정)에 의해 항 면역원 활성에 대해 검정된다.
항체 공급원으로서 사용될 수 있는 하이브리도마는 표적 면역 세포 수용체의 활성을 조정할 수 있는 단일 클론 항체를 생성하는 모 하이브리도마의 자손 세포인, 모든 유도체를 포함한다. 이러한 항체를 생산하는 하이브리도마는 공지된 절차를 사용하여 생체 외에서 또는 생체 내에서 성장될 수 있다. 단일 클론 항체는 원하는 경우, 통상적인 면역 글로불린 정제 절차, 예컨대, 암모늄 설페이트 침전, 겔 전기 영동, 투석, 크로마토그래피 및 초미세여과에 의해 배양 배지 또는 체액으로부터 단리될 수 있다. 존재하는 경우 원하지 않은 활성은, 예를 들어, 고체 상에 부착된 면역원으로 이루어진 흡착제에 대한 준비를 실행하고 면역원으로부터 원하는 항체를 용리 또는 방출함으로써 제거될 수 있다. 이중작용기성제 또는 유도체화제, 예를 들어, 말레이미도벤조일 설포석신이미드 에스테르(시스테인 잔기를 통한 컨쥬게이션), N-하이드록시 석신이미드(리신 잔기를 통해), 글루타르알데하이드, 숙신산 무수물, SOCl 또는 R1N=C=NR (여기서, R 및 R1은 상이한 알킬 그룹임)를 사용하여, 표적 항원 또는 면역화될 종에서 면역원성인 단백질, 예컨대, 키홀-림펫 헤모사이아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 컨쥬게이트된(conjugated) 표적 아미노산 서열을 함유하는 단편으로 숙주세포의 면역화는, 항체(예컨대, 단일 클론 항체) 집단을 생성할 수 있다.
원하는 경우, 관심있는(예컨대, 하이브리도마에 의해 생성된) (단일클론 또는 다중클론) 항체가 서열화될 수 있고, 이후 폴리뉴클레오티드 서열이 발현 또는 증식을 위해 벡터로 클로닝될 수 있다. 관심 항체를 코딩하는 서열은 숙주 세포에서 벡터로 유지될 수 있고, 이후 숙주 세포는 추후 사용을 위해 확장 및 동결될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드 서열은 항체를 "인간화"하거나 항체의 친화도 (친화도 성숙) 또는 다른 특성을 개선시키기 위해 유전자 조작에 사용될 수 있다. 예를 들어, 불변 영역은 항체가 인간의 임상 시험 및 치료에 사용되는 경우 면역 반응을 피하기 위해 인간 불변 영역과 더 유사하도록 조작될 수 있다. 표적 항원에 대한 더 큰 친화도 및 면역 세포 수용체의 활성을 억제 또는 활성화시키는 데 더 큰 효능을 얻기 위해 항체 서열을 유전적으로 조작하는 것이 바람직할 수 있다. 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 변화가 항체에서 이루어질 수 있으며 표적 수용체에 대한 이의 결합 특이성을 여전히 유지할 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
다른 실시양태에서, 완전 인간 항체는 특이적 인간 면역 글로불린 단백질을 발현하도록 조작된 상업적으로 이용 가능한 마우스를 사용함으로써 얻을 수 있다. 더 바람직한 (예컨대, 완전한 인간 항체) 또는 더 강력한 면역 반응을 생성하도록 고안된 유잔자 이식(transgenic) 동물이 또한 인간화된 또는 인간 항체의 생성에 또한 사용될 수 있다. 이러한 기술의 예로는 암젠(캘리포니아주 프리몬트)로부터의 XenomouseRTM 및 메다렉스(뉴저지주 프린스턴)로부터의 HuMAb-MouseRTM 및 TC MouseTM이다. 다른 대안에서, 항체는 파지 디스플레이 또는 효모 기술에 의해 재조합적으로 만들어질 수 있다. 예를 들어, 문헌[U.S. Pat. Nos. 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; and 6,265,150; and Winter et al., (1994) Annu. Rev. Immunol. 12:433-455]를 참조할 수 있다.
대안적으로, 항체 라이브러리 기술, 예컨대, 파지 디스플레이 기술(McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-553), 효모 디스플레이 기술 또는 포유 동물 세포 디스플레이 기술은 단리된 항체, 예컨대, 표적 면역 수용체에 특이적인 단리된 항체, 예컨대, 인간 항체에 사용될 수 있다.
온전한 항체 (전장 항체)의 항원-결합 단편은 일상적인 방법을 통해 제조될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 단편은 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생성될 수 있고, Fab 단편은 F(ab')2 단편의 이황화 브릿지(disulfide bridge)를 저하시킴으로써 생성될 수 있다.
인간화 항체를 구축하는 방법은 또한 당업계에 널리 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033 (1989)]을 참조할 수 있다. 일 실시예에서, 모 비인간 항체의 VH 및 VL의 가변 영역은 당업계에 공지된 방법에 따라 3차원 분자 모델링 분석의 대상이 된다. 다음으로, 정확한 CDR 구조의 형성에 중요한 것으로 예상되는 프레임워크(framework) 아미노산 잔기는 동일한 분자 모델링 분석을 사용하여 확인된다. 이와 동시에, 모 비-인간 항체와 상동성인 아미노산 서열을 갖는 인간 VH 및 VL 쇄는, 검색 쿼리(query)로서 모 VH 및 VL 서열을 사용하여 임의의 항체 유전자 데이터베이스로부터 확인된다. 이후, 인간 VH 및 VL 수용체 유전자가 선택된다.
선택된 인간 수용체 유전자 내의 CDR 영역은 모 비-인간 항체 또는 이의 기능상 변이체로부터의 CDR 영역으로 대체될 수 있다. 필요한 경우, CDR 영역과 상호 작용하는 데 중요할 것으로 예상되는 모 쇄의 프레임워크 영역 내의 잔기(상기 설명 참조)는 인간 수용체 유전자에서 상응하는 잔기를 치환하기 위해 사용될 수 있다.
표적 면역 세포 수용체에 결합할 수 있는 항체가 수득되면, 이의 항원-결합 단편은 적합한 IgG 아이소폼의 적합한 Fc 단편에 컨쥬게이트될 수 있으며, 이는 FcgRIIB, 예를 들어, 일상적인 재조합 기술을 통해 본원에 기술된 임의의 Fc 변이체에 선택적으로 결합할 수 있다. 일부 경우에, 항체는 이가 결합하는 면역 세포 수용체를 활성화시키는 작용성 효과에 대해 먼저 조사된다. 이러한 작용성 항체는 작용성 효과를 향상시키기 위해 본원에 기술된 치료제를 만들하기 위해 선택될 수 있다.
생성된 항체 분자는 하기 예시된 바와 같이 일상적인 재조합 기술을 통해 생성될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산은 하나의 발현 벡터 내에 클로닝될 수 있으며, 각각의 뉴클레오티드 서열은 적합한 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있다. 일 실시예에서, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 각각의 뉴클레오티드 서열은 별개의 프롬프터에 작동 가능하게 연결되어 있다. 대안적으로, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 단일 프로모터와 작동 가능하게 연결되어, 중쇄 및 경쇄 둘 다가 동일한 프로모터로부터 발현될 수 있다. 필요한 경우, 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 중쇄 및 경쇄 코딩 서열 사이에 삽입할 수 있다.
일부 실시예에서, 항체의 2개의 쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 2개의 벡터 내에 클로닝되며, 이는 동일하거나 상이한 세포로 도입될 수 있다. 2개의 쇄가 상이한 세포에서 발현될 때, 이들을 각각은 발현하는 숙주 세포로부터 단리될 수 있고, 단리된 중쇄 및 경쇄는 항체의 형성을 허용하는 적합한 조건 하에서 혼합 및 항온처리될 수 있다.
일반적으로, 항체의 하나 또는 모든 쇄를 코딩하는 핵산 서열은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 적합한 프로모터와 작동 가능하게 연결하여 적합한 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 서열 및 벡터는, 적합한 조건 하에서 제한 효소와 접촉하여 서로 쌍을 이루고 리가아제(ligase)를 이용하여 함께 연결될 수 있는 각각의 분자 상에 상보적인 말단을 생성할 수 있다. 대안적으로, 합성 핵산 링커는 유전자의 말단에서 결찰(ligation)될 수 있다. 이들 합성 링커는 벡터의 특정 제한 부위에 상응하는 핵산 서열을 함유한다. 발현 벡터/프로모터의 선택은 항체 생산에 사용하기 위한 숙주 세포의 유형에 따라 달라질 것이다.
사이토메갈로바이러스(CMV) 중간 초기 프로모터, 바이러스성 LTR, 예컨대, Rous 육종 바이러스 LTR, HIV-LTR, HTLV-1 LTR, 시미안 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, E. coli lac UV5 프로모터 및 단순 헤르페스 tk 바이러스 프로모터를 비제한적으로 포함하는 다양한 프로모터가 본원에 기술된 항체의 발현에 사용될 수 있다.
조절가능한 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 이러한 조절가능한 프로모터는, lac 작동자(operator)-보유 포유 동물 세포 프로모터[Brown, M. et al., Cell, 49:603-612 (1987)]로부터의 전사를 조절하기 위한 전사 조절인자로서 E. coli 로부터의 lac 억제자를 사용하는 것, 테트라사이클린 억제자(repressor)(tetR)[Gossen, M., and Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551 (1992); Yao, F. et al., Human Gene Therapy, 9:1939-1950 (1998); Shockelt, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)]를 사용하는 것을 포함한다. 다른 시스템은 FK506 이량체, 아스트라디올을 사용한 VP16 또는 p65, RU486, 디페놀 무리슬레론(diphenol murislerone) 또는 라파마이신을 포함한다. 유도 시스템은 인비트로젠(Invitrogen), 클론테크(Clontech) 및 아리아드(Ariad)로부터 입수할 수 있다.
오페론을 갖는 억제자를 포함하는 조절 가능한 프로모터가 사용될 수 있다. 일 실시양태에서, E. coli 로부터의 lac 억제자는, tetR-포유 동물 세포 전사 활성화제 융합 단백질을 생성하기 위해 전사 활성화제(VP 16)를 포함한 테트라사이클린 억제자(tetR)인 tTa (tetR-VP 16) 및 포유 동물 세포에서 유전자 발현을 제어하기 위한 tetR-tet 작동자 시스템을 생성하기 위한 인간 사이토메갈로바이러스(hCMV) 주요 즉시(immediately)-초기 프로모터로부터 유래된 tetO-보유 최소 프로모터가 조합된, lac 작동자(operator)-보유 포유 동물 세포 프로모터[M. Brown et al., Cell, 49:603-612 (1987)]; Gossen and Bujard (1992); [M. Gossen et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)]로부터의 전사를 조절하기 위한 전사 조절인자로서 기능을 할 수 있다. 일 실시양태에서, 테트라사이클린 유도성 스위치가 사용된다. tetR-포유 동물 세포 전사 인자 융합 유도체가 아닌 테트라사이클린 억제자(tetR) 단독은, 테트라사이클린 작동자가 CMVIE 프로모터의 TATA 요소에 대해 하류에 위치할 때 포유 동물 세포에서 유전자 발현을 조절하는 강력한 트랜스-조절인자로서 기능을할 수 있다(Yao et al., Human Gene Therapy). 이 테트라 사이클린 유도성 스위치의 하나의 특정 이점은, 조절 가능한 효과를 달성하기 위해 테트라사이클린 억제제-포유 동물 세포 전이활성화제 또는 억제자 융합 단백질의 사용을 필요로하지 않으며, 일부 경우 세포에 유독할 수 있다는 점이다(Gossen et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992); Shockett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)).
추가로, 벡터는, 예를 들어, 다음 중 일부 또는 전부를 함유할 수 있다: 포유 동물 세포에서 선택 가능한 마커 유전자, 예컨대, 안정한 또는 일시적 형질주입체의 선택을 위한 네오 이신 유전자; 높은 수준의 전사를 위한 인간 CMV의 즉시 초기 유전자로부터의 인핸서/프로모터 서열; mRNA 안정성을 위한 SV40으로부터의 전사 종결 및 RNA 처리 신호; 적절한 에피솜 복제를위한 SV40 폴리오마 복제 기점 및 ColE1; 내부 리보솜 결합 부위(IRESes), 다양한(versatile) 다중 클로닝 부위; 및 센스 및 안티센스 RNA의 생체 외 전사를 위한 T7 및 SP6 RNA 프로모터. 트랜스진을 함유하는 벡터를 생성하기 위한 적합한 벡터 및 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고 이용 가능하다.
본원에 기술된 방법을 실시하는데 유용한 폴리아데닐화 신호의 예로는 인간 콜라겐 I 폴리아데닐화 신호, 인간 콜라겐 II 폴리아데닐화 신호 및 SV40 폴리아데닐화 신호를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
임의의 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예컨대, 발현 벡터)는 항체를 생성하기에 적합한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 숙주 세포는 항체 또는 이의 임의의 폴리펩티드 쇄의 발현에 적합한 조건 하에서 배양될 수 있다. 이러한 항체 또는 이의 폴리펩티드 쇄는 통상적인 방법, 예컨대, 친화도 정제를 통해 배양된 세포에 의해(예컨대, 세포 또는 배양 상청액으로부터) 회수될 수 있다. 필요한 경우, 항체의 폴리펩티드 쇄는 항체의 생산을 허용하는 적합한 시간 동안 적합한 조건 하에서 배양될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항체의 제조 방법은 본원에 기술된 바와 같은 항체의 중쇄 및 경쇄 둘 다를 코딩하는 재조합 발현 벡터를 포함한다. 재조합 발현 벡터는 통상적인 방법, 예컨대, 칼슘 포스페이트-매개 형질주입에 의해 적합한 숙주 세포 (예컨대, dhfr-CHO 세포) 내로 도입될 수 있다. 양성 형질전환체 숙주 세포는 항체를 형성하는 2개의 폴리펩티드 쇄의 발현을 허용하는 적합한 조건 하에서 선택되고 배양될 수 있으며, 이는 세포 또는 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 필요한 경우, 숙주 세포로부터 회수된 2개의 쇄는 항체의 형성을 허용하는 적합한 조건 하에서 항온처리될 수 있다.
일 실시예에서, 하나는 항-면역 세포 수용체 항체의 중쇄를 코딩하고 다른 하나는 동일한 항체의 경쇄를 코딩하는 2개의 재조합 발현 벡터가 제공된다. 2개의 재조합 발현 벡터 둘 다는 통상적인 방법, 예컨대, 칼슘 포스페이트-매개 형질주입에 의해 적합한 숙주 세포(예컨대, dhfr- CHO 세포) 내로 도입될 수 있다. 대안적으로, 각각의 발현 벡터는 적합한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 양성 형질전환체는 항체의 폴리펩티드 쇄의 발현을 허용하는 적합한 조건 하에서 선택되고 배양될 수 있다. 2개의 발현 벡터가 동일한 숙주 세포 내로 도입될 때, 그 안에서 생산된 항체는 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 필요한 경우, 폴리펩티드 쇄는 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 회수된 후 항체의 형성을 허용하는 적합한 조건 하에서 배양될 수 있다. 2개의 발현 벡터가 상이한 숙주 세포 내로 도입될 때, 이들 각각은 상응하는 숙주 세포 또는 상응하는 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 이 후, 2개의 폴리펩티드 쇄는 항체의 형성을 위해 적합한 조건 하에서 배양될 수 있다.
표준 분자 생물학 기술은 재조합 발현 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 형질주입시키고, 형질전환체를 선택하고, 숙주 세포를 배양하고, 배양 배지로부터 항체를 회수하는데 사용된다. 예를 들어, 일부 항체는 단백질 A 또는 단백질 G 커플링된 매트릭스(matrix)를 갖는 친화도 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있다.
본원에 기술된 항체의 생체 활성은 당업계에 공지되거나 본원에 기술된 검정을 사용하여 확인될 수 있다.
(iii) 약학 조성물
본원에 기술된 항체는 표적 질환을 치료하는데 사용하기 위한 약학 조성물을 형성하기 위해 약학적으로 허용 가능한 담체(부형제)와 혼합될 수 있다. "허용 가능한"은 담체가 조성물의 활성 성분과 상용성 (및 바람직하게는 활성 성분을 안정화시킬 수 있음)이어야 하고, 치료될 대상체에 유해하지 않아야 함을 의미한다. 당업계에 널리 공지된 완충제를 포함하는 약학적으로 허용 가능한 부형제 (담체). 예컨대, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover]을 참조할 수 있다.
본 방법에 사용되는 약학 조성물은 동결 건조된 제형 또는 수용액 형태의 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함할 수 있다. (Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover). 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 버퍼, 예컨대, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 항산화제, 예컨대, 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제(예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저 분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역 글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리비닐피 롤리돈; 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물, 예컨대, 글루코스, 만노스 또는 덱스 트란; 킬레이트제, 예컨대, EDTA; 당, 예컨대, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대, 소듐; 금속 착물(예컨대, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대, TWEENTM, PLURONICSTM 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 본원에 기술된 약학 조성물은 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 문헌[Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)]; 및 미국특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호에 기술된 방법에 의해 제조될 수 있는 항체(또는 코딩 핵산)를 함유하는 리포좀을 포함한다. 향상된 순환 시간을 갖는 리포좀은 미국특허 제5,013,556호에 개시되어 있다. 특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 이용하여 역상 증발법에 의해 생성될 수 있다. 리포좀은 정의된 공극 크기의 필터를 통해 압출되어 원하는 직경을 갖는 리포좀을 생성한다.
항체, 또는 코딩 핵산(들)은 또한, 예를 들어, 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합체화에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노 입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼에서 각각 하이드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트) 마이크로캡슐에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대, Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)를 참고할 수 있다.
다른 실시예에서, 본원에 기술된 약학 조성물은 서방형(sustained-release) 포맷으로 제형화될 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예로는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이 매트릭스는 성형품(shaped article), 예컨대, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 서방형 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 하이드로겔 (예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(v 닐알콜)), 폴리락타이드(미국특허 제3,773,919호), L-글루탐산 및 7 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대, LUPRON DEPOTTM(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사 가능한 마이크로스피어), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다.
생체 내 투여에 사용되는 약학 조성물은 멸균되어야만 한다. 이는, 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다. 치료적 항체 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어, 피하 주사 바늘에 의해 관통 가능한 마개를 갖는 정맥 내 용액 백(bag) 또는 바이알(vial) 내에 배치된다.
본원에 기술된 약학 조성물은 경구, 비경구 또는 직장 투여, 또는 흡입(inhalation) 또는 공기주입(insufflation)에 의한 투여를 위한 정제, 환제, 캡슐, 분말, 과립제, 용액 또는 현탁액제 또는 좌제와 같은 유닛 투여 형태(unit dosage form)일 수 있다.
정제와 같은 고체 조성물을 제조하기 위해, 주요 활성 성분은 제약 담체, 예컨대, 통상적인 정제 성분, 예컨대, 옥수수 전분, 락토오스, 수크로스, 소르비톨, 활석, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 디칼슘 포스페이트 또는 검(gum) 및 다른 약학 희석제, 예컨대, 물과 혼합되어, 본 발명의 혼합물의 균질 혼합물 또는 이의 비독성 약학적으로 허용 가능한 염을 함유하는 고체 전제형(preformulation) 혼합물을 형성할 수 있다. 이들 전제형 조성물이 균질한 것으로 언급하는 경우, 활성 성분이 조성물 전체에 균등하게 분산되어 조성물이 정제, 환제 및 캡슐과 같은 동일한 효과적인 유닛 투여 형태로 용이하게 세분될 수 있음을 의미한다. 이 후, 이 고체 전제형 조성물을 0.1 내지 약 500mg의 본 발명의 활성 성분을 함유하는 상기 기술된 유형의 유닛 투여 형태로 세분화한다. 신규한 조성물의 정제 또는 환제는 코팅되거나 달리 배합되어 연장된 작용의 이점을 제공하는 투여 형태를 제공할 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 환제는 내부 투여량 및 외부 투여량 구성 요소를 포함할 수 있으며, 후자는 전자에 대한 외피 형태이다. 2개의 구성 요소는 위에서의 붕해에 저항하고 내부 구성 요소가 십이지장 내로 그대로 통과하거나 방출이 지연되는 것을 허락하는 장층에 의해 분리될 수 있다. 다수의 중합체산 및 중합체산과 쉘락, 세틸 알콜 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 물질의 혼합물을 포함하는 물질과 같은 다양한 물질이 이러한 장층 또는 코팅에 사용될 수 있다.
적합한 표면-활성제로는 특히 비이온제, 예컨대, 폴리옥시에틸렌소르비탄(예컨대, TweenTM 20, 40, 60, 80 또는 85) 및 다른 소르비탄(예컨대, SpanTM 20, 40, 60, 80 또는 85)를 포함한다. 계면활성제를 갖는 조성물은 편리하게는 0.05 내지 5%의 계면활성제를 포함할 것이며, 0.1 내지 2.5%일 수 있다. 필요하다면, 다른 성분, 예를 들어, 만니톨 또는 다른 약학적으로 허용 가능한 비히클이 첨가될 수 있음이 이해될 것이다.
적합한 에멀젼은 상업적으로 이용 가능한 지방 에멀젼, 예컨대, IntralipidTM, LiposynTM, InfonutrolTM, LipofundinTM 및 LipiphysanTM을 사용하여 제조될 수 있다. 활성 성분은 미리-혼합된 에멀젼 조성물에 용해될 수 있거나, 대안적으로는 오일(예컨대, 대두유, 홍화유, 면실유, 참기름, 옥수수유 또는 아몬드유), 및 인지질(예컨대, 난황 인지질(egg phospholipid), 대두 인지질 또는 대두 레시틴) 및 물을 혼합시 형성된 에멀젼에 용해될 수 있다. 에멀젼의 등장성을 조정하기 위해 다른 성분, 예를 들어, 글리세롤 또는 글루코스가 첨가될 수 있음이 이해될 것이다. 적합한 에멀젼는 전형적으로 최대 20%, 예를 들어, 5 내지 20%의 오일을 함유할 것이다. 지방 에멀젼은 0.1 내지 1.0μm, 특히, 0.1 내지 0.5μm의 지방 액적(droplet)을 포함할 수 있고, 5.5 내지 8.0 범위의 pH를 갖는다.
에멀젼 조성물은 항체를 IntralipidTM 또는 이의 구성 요소(대두유, 난황 인지질, 글리세롤 및 물)과 혼합함으로써 제조된 것일 수 있다.
흡입 또는 공기주입을 위한 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한, 수성 또는 유기 용매 또는 이들의 혼합물 중 용액 및 현탁액, 및 분말을 포함한다. 액체 또는 고체 조성물은 상기 제시된 바와 같은 적합한 약학적으로 허용가능한 부형제를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 국소 또는 전신 효과를 위해 경구 또는 비강 호흡 경로에 의해 투여된다.
바람직하게는 멸균의 약학적으로 허용 가능한 용매 중 조성물은 기체를 사용하여 분무될 수 있다. 분무된 용액은 분무 장치로부터 직접 호흡될 수 있거나, 분무 장치는 안면 마스크, 텐트 또는 간헐적인 양압 호흡 기계에 부착될 수 있다. 용액, 현탁액 또는 분말 조성물은 제형을 적절한 방식으로 전달하는 장치로부터 바람직하게는 경구 또는 비강으로 투여될 수 있다.
III. 치료 적용
본원에 기술된 면역 세포 수용체 및 FcγRIIB를 가교시킬 수 있는 임의의 치료제(예컨대, 항체)는 침입성 병원체 및/또는 암 세포와 같은 질환이 있는 세포에 대한 면역 반응을 향상시키는 데 유용하다.
본원에 개시된 방법을 실시하기 위해, 본원에 기술된 유효량의 약학 조성물은 적합한 경로, 예컨대, 정맥 내 투여, 예컨대, 볼루스, 또는 근육 내, 복강 내, 뇌척수 내, 피하, 관절 내, 활액 내, 척수강 내, 경구, 흡입 또는 국부 경로에 의한 일정 기간에 걸친 연속 주입에 의해 치료를 필요로 하는 대상체(예컨대, 인간)에 투여될 수 있다. 액체 제형용 상업적으로 이용 가능한 분무기, 예컨대, 제트 분무기 및 초음파 분무기가 투여에 유용하다. 액체 제형은 직접 분무될 수 있고, 동결 건조된 분말은 재구성 후에 분무될 수 있다. 대안적으로, 본원에 기술된 바와 같은 항체는 플루오로카본 제형 및 계량 용량 흡입기를 사용하여 에어로졸화되거나 동결 건조 및 분쇄된 분말로서 흡입될 수 있다.
본원에 기술된 방법에 의해 치료될 대상체는 포유 동물, 보다 바람직하게는 인간일 수 있다. 포유 동물은 농장 동물, 스포츠 동물, 애완 동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 마우스 및 래트를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에, 대상체는 폐암, 위암, 간암, 유방암, 피부암, 췌장암, 뇌암, 전립선 암, 방광암 또는 결장 직장암을 비제한적으로 포함하는 암과 같은 세포 매개 질환 또는 장애를 갖거나 또는 가질 위험이 있는 인간 환자이다.
본원에 사용된 "유효량"은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 활성제와 함께 병용(combination)으로 대상체에 치료적 효과를 부여하는데 필요한 각각의 활성제의 양을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 치료적 효과는 표적 면역 수용체를 조정 (예컨대, 활성화)하여 수용체에 의해 매개되는 면역 반응을 유발하거나 향상시킨다. 치료적 효과를 달성한 항체의 양의 결정은 당업자에게 명백할 것이다. 당업자에게 인식되는 바와 같이, 유효량은 치료될 특정 병태, 병태의 중증도, 개별 환자 파라미터, 예컨대, 연령, 신체 상태, 크기, 성별 및 체중, 치료 기간, (있는 경우) 병행 요법(concurrent therapy)의 특성, 특정 투여 경로 및 보건 전문가의 지식과 전문 지식 내의 유사 요인에 따라 달라질 것이다. 이들 인자는 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 일상적인 실험만으로 다뤄질 수 있다. 일반적으로, 개별 구성 요소 또는 이들의 조합의 최대 용량, 즉, 건전한 의학적 판단에 따라 가장 안전한 용량이 사용되는 것이 바람직하다.
반감기와 같은 경험적 고려 사항은 일반적으로 투여량의 결정에 기여할 것이다. 예를 들어, 인간 면역계, 예컨대, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체와 상용성인 항체는, 항체의 반감기를 연장시키고 항체가 숙주의 면역계에 의해 공격되는 것을 예방하는데 사용될 수 있다. 투여 빈도는 요법 과정에 걸쳐 결정 및 조정될 수 있으며, 일반적으로 치료 및/또는 억제 및/또는 개선 및/또는 표적 질환/장애의 지연에 기반할 필요는 없다. 대안적으로, 항체의 연속 서방형 제형이 적절할 수 있다. 서방형을 달성하기 위한 다양한 제형 및 장치가 당업계에 공지되어 있다.
일 실시예에서, 본원에 기술된 바와 같은 항체의 투여량은 항체의 하나 이상의 투여(들)가 주어진 개인에서 경험적으로 결정될 수 있다. 개인에게 길항제(antagonist)의 증분 투여량이 주어진다. 길항제의 효능을 평가하기 위해, 질환/장애의 지표를 따를 수 있다.
일반적으로, 본원에 기술된 항체와 같은 임의의 치료제의 투여를 위한, 초기 후보 투여량은 약 2mg/kg일 수 있다. 본 개시 내용의 목적을 위해, 전형적인 일일 투여량은 약 0.1μg/kg 내지 3μg/kg 내지 30μg/kg 내지 300μg/kg 내지 3mg/kg, 30mg/kg 내지 100mg/kg 이상의 범위일 수 있으며, 상기 언급된 인자에 따라 달라진다. 수일 또는 그 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 병태에 따라, 원하는 증상의 억제가 일어날 때까지 또는 표적 질환 또는 장애 또는 이의 증상을 완화시키기에 충분한 치료 수준이 달성될 때까지 치료가 지속된다. 예시적인 투여 양생법은 약 2mg/kg의 초기 용량, 이어서 약 1mg/kg의 항체의 1주 마다 유지량, 또는 격주 마다 약 1mg/kg의 유지량을 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 의사가 달성하고자 하는 약동학적 붕괴 패턴에 따라 다른 투여 양생법이 유용할 수 있다. 예를 들어, 일주일에 1-4회 투여가 고려된다. 일부 실시양태에서, 약 3μg/mg 내지 약 2mg/kg(예컨대, 약 3μg/mg, 약 10μg/mg, 약 30μg/mg, 약 100μg/mg, 약 300μg/mg, 약 1mg/kg 및 약 2mg/kg) 범위의 투여가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여 빈도는 매주 1회, 2주 마다, 4주 마다, 5주 마다, 6주 마다, 7주 마다, 8주 마다, 9주 마다 또는 10주 마다; 또는 매월 1회, 2개월 마다 또는 3개월 마다 또는 그 이상이다. 이 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 쉽게 모니터링된다. 투여 양생법 (사용된 항체 포함)은 시간에 따라 변할 수 있다.
일부 실시양태에서, 정상 체중의 성인 환자의 경우, 약 0.3 내지 5.00mg/kg 범위의 용량이 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 본원에 기술된 항체와 같은 치료제의 투여량은 10mg/kg일 수 있다. 특정 투여량 양생법, 즉 용량, 타이밍 및 반복은 특정 개인 및 그 개인의 병력 뿐만 아니라 개별 약제의 특성(예컨대, 약제의 반감기 및 널리 공지된 다른 고려 사항)에 따라 달라질 것이다.
본 개시 내용의 목적을 위해, 본원에 기술된 바와 같은 항체의 적절한 투여량은 이용된 특정 항체, 항체들 및/또는 비-항체 펩티드 (또는 이의 조성물), 질환/장애의 유형 및 중증도, 항체가 예방 또는 치료적 목적으로 투여되는지, 이전 요법, 환자의 임상 병력 및 길항제에 대한 반응, 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. 전형적으로 임상의는 원하는 결과를 달성하는 투여량에 도달할 때까지 항체를 투여할 것이다. 일부 실시양태에서, 원하는 결과는 혈전증의 감소이다. 투여량이 원하는 결과를 초래하는지 여부를 결정하는 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 하나 이상의 항체의 투여는, 예를 들어, 수용자의 생리학적 병태에 따라, 투여의 목적이 치료적 또는 예방적인지 여부, 및 숙련된 전문가에게 공지된 다른 요인에 따라 연속적이거나 간헐적일 수 있다. 항체의 투여는 미리 선택된 기간에 걸쳐 본질적으로 연속적일 수 있거나, 또는 예컨대, 표적 질환 또는 장애가 발생하기 전, 동안 또는 후에 일련의 이격된 용량(spaced dose)일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료하는"은, 장애, 질환의 증상, 또는 질환 또는 장애에 대한 소인을 치료, 치유, 완화, 경감, 변경, 교정(remedy), 개선(ameliorate), 향상(improve) 또는 영향을 미치기 위한 목적으로, 표적 질환 또는 장애, 질환/장애의 증상 또는 질환/장애에 대한 소인이 있는 대상체에 하나 이상의 활성제를 포함하는 조성물의 적용 또는 투여를 지칭한다.
표적 질환/장애를 완화시키는 것은 질환의 발생 또는 진행을 지연시키거나 질환 중증도를 감소시키는 것을 포함한다. 질환을 완화시키는 것은 반드시 치료 결과를 요구하지 않는다. 본원에 사용된, 표적 질환 또는 장애의 발생을 "지연시키는 것"은 질환의 진행을 미루고/거나, 방해하고/하거나, 둔화시키고/시키거나, 지체시키고/시키거나, 안정화시키고/시키거나 연기하는 것을 의미한다. 이러한 지연은 질환의 병력 및/또는 치료받는 개체에 따라 다양한 시간이될 수 있다. 질환의 발생을 "지연"시키거나 완화시키거나, 질환의 발병을 지연시키는 방법은, 방법을 사용하지 않는 것과 비교할 때, 주어진 기간 동안(given time frame) 질환의 하나 이상의 증상이 발생할 확률을 감소시키고/시키거나 주어진 기간 동안 증상의 정도를 감소시키는 방법이다. 이러한 비교는 전형적으로 통계적으로 유의한 결과를 제공하기에 충분한 다수의 대상체를 사용한 임상 연구에 기초한다.
질병의 "발생" 또는 "진행"은 질환의 초기 징후 및/또는 후속(ensuing) 진행을 의미한다. 질환의 발생은 당업계에 공지된 표준 임상 기술을 사용하여 검출 및 평가될 수 있다. 그러나 발생은 검출될 수 없는 진행도 또한 지칭한다. 본 개시 내용의 목적을 위해, 발생 또는 진행은 증상의 생물학적 과정을 지칭한다. "발생"으로는 존재(occurrence), 재발 및 발병을 포함한다. 본원에 사용된, 표적 질환 또는 장애의 "발병" 또는 "존재"는 초기 발병 및/또는 재발을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항체는 표적 수용체의 활성을 생체 내에서 20% 이상 (예컨대, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상)으로 활성화시키기에 충분한 양으로 치료를 필요로 하는 대상체에 투여된다.
의학 분야의 당업자에게 공지된 통상적인 방법은 치료될 질환의 유형 또는 질환 부위에 따라 대상체에 약학 조성물을 투여하기 위해 사용될 수 있다. 이 조성물은 또한 다른 통상적인 경로, 예컨대, 경구, 비경구, 흡입 스프레이, 국부, 직장, 비강, 협측, 질로 투여되는 경로, 또는 임플란트 저장소를 통해 투여될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥 내, 근육 내, 관절 내, 동맥 내, 활액 내, 흉골 내, 척수강 내, 병변 내 및 두개 내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 또한, 1개월, 3개월 또는 6개월의 주사 가능한 데포(depot) 또는 생분해성 물질 및 방법을 사용하는 것과 같은 주사 가능한 데포 투여 경로를 통해 대상체에 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 약학 조성물은 안구 내 또는 유리체 내(intravitreally)로 투여된다.
주사 가능한 조성물은 다양한 담체, 예컨대, 식물성 오일, 디메틸락타미드, 디메틸포름아미드, 에틸 락테이트, 에틸 카보네이트, 이소프로필 미리스테이트, 에탄올 및 폴리올(글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)을 함유할 수 있다. 정맥 주사의 경우, 수용성 항체는 드립(drip)법에 의해 투여될 수 있으며, 이에 의해 항체 및 생리학적으로 허용 가능한 부형제를 함유하는 약학 제형이 주입된다. 생리학적으로 허용 가능한 부형제는, 예를 들어, 5% 덱스트로스, 0.9% 식염수, 링거 용액 또는 다른 적합한 부형제를 포함할 수 있다. 근육 내 제제, 예컨대, 적합한 가용성 염 형태의 항체의 멸균 제형은 약학 부형제, 예컨대, 주사용수, 0.9% 식염수 또는 5% 글루코스 용액에 용해 및 투여될 수 있다.
본원에 기술된 방법에 사용되는 특정 투여량 양생법, 즉, 용량, 시기(timing) 및 반복은 특정 대상체 및 대상체의 병력에 따라 달라질 것이다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 항체, 또는 항체와 다른 적합한 치료제의 조합이 치료를 필요로 하는 대상체에 투여될 수 있다. 항체는 또한 약제의 효과를 향상시키고/시키거나 보완하는 역할을 하는 다른 약제와 컨쥬게이션(conjugation)되어 사용될 수 있다.
표적 질환/장애에 대한 치료 효능은 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 평가될 수 있다.
본원에 기술된 치료제는 암과 같은 표적 질환에 대한 다른 유형의 요법과 컨쥬게이션되어 이용될 수 있다. 추가적인 항암 요법으로는 화학요법, 수술, 방사선, 유전자 요법 등을 포함한다. 제2 치료제가 사용될 때, 이러한 약제는 면역 세포 수용체 및 FcγRIIB를 가교시키는 본원에 기술된 치료제와 동시에 또는 순차적으로 (임의의 순서로) 투여될 수 있다.
추가적인 치료제와 공동 투여될 때, 각각의 약제에 대한 적합한 치료적으로 유효한 투여량은 상가 작용(additive action) 또는 상승 작용(synergy)으로 인해 감소될 수 있다.
본 개시 내용의 치료는 다른 면역 조절 치료, 예컨대, 치료적 백신(GVAX, DC-기반 백신 등을 포함하나, 이에 제한되지 않음) 또는 체크포인트 억제제(CTLA4, PD1, LAG3, TIM3 등을 차단하는 약제를 포함하나, 이에 제한되지 않음)와 병용될 수 있다. 대안적으로, 본 개시 내용의 치료는 화학요법제, 예컨대, 피리미딘 유사체(5-플루오로우라실, 플록스우리딘, 카페시타빈, 젬시타빈 및 시타라빈), 퓨린 유사체, 엽산 길항제 및 관련 억제제(메르캅토퓨린, 티오구아닌, 펜토스타틴 및 2-클로로데옥시아데노신(클라드리빈)); 항증식제/유사분열억제제, 예컨대, 자연 생성물, 예컨대, 빈카 알칼로이드(빈블라스틴, 빈크리스틴 및 비노렐빈), 미세소관 교란물질, 예컨대, 탁산(파클리탁셀, 도세탁셀), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 노코다졸, 에포틸론 및 나벨빈, 에피디포도필로톡신(에토포시드, 테니포시드), DNA 손상제(액티노마이신, 암사크린, 안트라사이클린, 블레오마이신, 부설판, 캄프토테신, 카보플라틴, 클로람부실, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 사이톡산, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 헥사메티넬아미네옥살리프라틴(hexamethyhnelamineoxaliplatin), 이포스파미드, 멜팔란, 머클로레타민(merchlorehtamine), 미토마이신, 미톡산트론, 니트로소우레아, 플리카마이신, 프로카르바진, 탁솔, 탁소테레, 테니포시드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 에토포시드(VP16)); 항생제, 예컨대, 닥티노마이신(악티노마이신 D), 다우노루비신, 독소루비신(아드리아마이신), 이다루비신, 안트라사이클린, 미톡산트론, 블레오마이신, 플리카마이신(미트라마이신) 및 미토마이신; 효소(L-아스파라긴을 전신적으로 대사시키고, 자신이 아스파라긴을 합성하는 능력을 갖지 않는 세포를 박탈시키는 L-아스파라기나제); 항혈소판 작용제; 항증식/유사분열억제 알킬화제, 예컨대, 질소 머스타드(메클로르에타민, 사이클로포스파미드 및 유사체, 멜팔란, 클로람부실), 에틸렌이민 및 메틸멜라민(헥사메틸멜라민 및 티오테파), 알킬 설포네이트-부설판, 니트로소우레아(카르무스틴(BCNU) 및 유사체, 스트렙토조신), 트라젠-다카바지닌(DTIC); 항증식/유사분열억제 항대사산물, 예컨대, 폴산 유사체(메토트렉세이트); 백금 배위결합 착물(시스플라틴, 카보플라틴), 프로카바진, 하이드록시우레아, 미토탄, 아미노글루테티미드; 호르몬, 호르몬 유사체(에스트로겐, 타목시펜, 고세렐린, 비칼루타미드, 닐루타미드) 및 아로마타제 억제제(레트로졸, 아나스트로졸); 항응고제(헤파린, 합성 헤파린 염 및 트롬빈의 다른 억제제); 섬유소용해제(예컨대, 조직 플라스미노겐 활성화제, 스트렙토키나제 및 우로키나제), 아스피린, 디피리다몰, 티클로피딘, 클로피도그렐, 아브식시맙; 이동방지제(antimigratory agent); 항분비제(브레벨딘); 면역억제제(사이클로스포린, 타크롤리무스(FK-506), 시롤리무스(라파마이신), 아자티오프린, 미코페놀레이트 모페틸); 항-혈관신생 화합물(예컨대, TNP-470, 제니스테인, 베바시주맙) 및 성장 인자 억제제(예컨대, 섬유모세포 성장 인자(FGF) 억제제); 안지오텐신 수용체 차단제; 니트릭 옥사이드 공여체; 안티센스 올리고뉴클레오티드; 항체(트라스투주맙); 세포 주기 억제제 및 분화 유도인자(트레티노인); mTOR 억제제, 토포아이소머라아제 억제제(독소루비신(아드리아마이신), 암사크린, 캄프토테신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 에니포시드, 에피루비신, 에토포시드, 이다루비신 및 미톡산트론, 토포테칸, 이리노테칸), 코르티코스테로이드(코르티손, 덱사메타손, 하이드로코르티손, 메틸페드니솔론, 프레드니손 및 프레니솔론); 성장인자 신호전달 키나제 억제제; 미토콘드리아 기능이상 유도인자 및 카스파제 활성화제; 및 염색질 교란물질과 병용될 수 있다.
추가적인 유용한 약제의 예로는 또한 문헌[Physician's Desk Reference, 59.sup.th edition, (2005), Thomson P D R, Montvale N.J.; Gennaro et al., Eds. Remington's The Science and Practice of Pharmacy 20.sup.th edition, (2000), Lippincott Williams and Wilkins, Baltimore Md.; Braunwald et al., Eds. Harrison's Principles of Internal Medicine, 15.sup.th edition, (2001), McGraw Hill, NY; Berkow et al., Eds. The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, (1992), Merck Research Laboratories, Rahway N.J]을 참조할 수 있다.
IV. 키트
본 개시 내용은 또한 본원에 기술된 임의의 치료제, 예를 들어, FcγRIIB와 선택적으로 결합하는 본원에 기술된 Fc 변이체를 함유하는 항-TNF 항체를 사용하여 원하는 면역 반응을 향상시키는 데 사용하기 위한 키트를 제공한다.
일부 실시양태에서, 키트는 본원에 기술된 임의의 방법에 따라 사용하기 위한 지시사항을 포함할 수 있다. 포함된 지시사항은 본원에 기술된 것과 같은 표적 질환을 치료, 발병 지연 또는 완화시키기 위한 치료제의 투여에 대한 설명을 포함할 수 있다. 키트는 개체가 표적 질환을 갖는지의 여부를 식별하는 것에 기초하여 치료에 적합한 개체를 선택하는 설명을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 지시사항은 치료제, 예컨대, 항체를 표적 질환의 위험이 있는 개체에 투여하는 것에 대한 설명을 포함한다.
치료제의 사용에 관한 지시사항은 일반적으로 의도된 치료를 위한 투여량, 투여 스케줄 및 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 용기는 유닛 용량, 벌크 패키지(예컨대, 다중-용량 패키지) 또는 서브-유닛 용량일 수 있다. 본 발명의 키트에 제공된 지시사항은 전형적으로 라벨 또는 패키지 삽입물(예컨대, 키트에 포함된 종이 시트)에 대한 서면 지시사항이나, 기계 판독 가능한 지시사항(예컨대, 자기 또는 광학 저장 디스크 상에 운반되는 지시사항)는 또한 허용 가능하다.
라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 암과 같은 표적 질환 또는 장애를 치료하고/하거나, 발병을 지연시키고/시키거나, 완화시키기 위해 사용됨을 나타낸다. 본원에 기술된 임의의 방법을 실시하기 위한 지시사항이 제공될 수 있다.
본 발명의 키트는 적합한 패키징 상태에 있다. 적합한 패키징은 바이알, 병, 자르(jar), 가요성 패키징(예컨대, 밀봉된 마일라(mylar) 또는 플라스틱 백) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특이적 장치, 예컨대, 흡입기, 코 투여 장치(예컨대, 분무기) 또는 주입 장치, 예컨대, 미니 펌프와 조합하여 사용되는 패키지가 또한 고려된다. 키트는 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예컨대, 용기는 정맥 내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 용기는 또한 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예컨대, 용기는 정맥 내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 조성물 중 하나 이상의 활성제는 본원에 기술된 것과 같은 치료제이다.
키트는 완충액 및 해석 정보와 같은 추가적인 구성 요소를 임의로 제공할 수 있다. 일반적으로, 키트는 용기 및 용기 상의 또는 용기와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물(들)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 상기 기술된 키트의 내용물을 포함하는 제조 물품을 제공한다.
일반적인 기술
달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 실시는 당업자에게 속하는 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 종래 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌, 예컨대, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)에 충분히 설명되어 있다.
추가의 설명없이, 당업자는 상기 설명에 기초하여 본 발명을 최대한 활용할 수 있다고 생각된다. 그러므로, 이하의 특정 실시양태는 단지 예시적인 것으로 해석되어야 하며, 어떠한 방식으로든 본 개시 내용의 나머지를 제한하지 않는다. 본원에 인용된 모든 공개물는 본원에 참조된 목적 또는 주제를 위해 참고로 원용된다.
실시예 1. 선택적 FcγR2B / CD32B 결합을 위한 인간 IgG1 , IgG2 및 IgG4 조작
FcγR2b/CD32B에 대한 결합 활성에 대한 인간 IgG1, IgG2 및 IgG4의 힌지 도메인에서의 돌연변이의 영향을 확인하기 위해, 본원에 개시된 인간 Fc 변이체 G1m1, G1m2, G2m1, G2m2, G2m10, G4m1, G4m2, G4m10 및 G4m20을 항-CD137 항체의 VH 단편 및 상응하는 IgG1, G2 및 G4 CH1 단편에 연결시켜, 전장 IgG 중쇄를 생성하였다. 이들 돌연변이 IgG 중쇄를 클로닝하고, 항-CD137 항체의 경쇄와 공동 발현하고, 표준 분자 생물학 및 항체 프로토콜을 사용하여 정제하였다. VH-CH1 단편(VH 도메인 이탤릭체화) 및 경쇄의 아미노산 서열은 하기에 제공된다:
Figure pct00073
Figure pct00074
Figure pct00075
Figure pct00076
이들 IgG 돌연변이체는 Octet Red96 시스템(ForteBio, Model# Red96)을 사용하여 FcRn을 포함하는 인간 Fc 수용체(FcR)의 패널에의 결합에 대해 테스트하였다. 인간 FcR 단백질은 상업적으로 구매되었다(FcRn, MednaBio, E1032; FcRI, MednaBio, E1031; FcRIIA, MednaBio, E1033; FcRIIB/C, MednaBio, E1034; FcRIIIA-F158, MednaBio, E1036; FcRIIIA-V158, MednaBio, E1035; FcRIIIB, MednaBio, E1037). 모든 Fcγ 수용체 검정은 pH 7.2에서 수행되었다; 모든 FcRn 검정은 pH 6에서 수행되었다. Fcγ 수용체를 20μg/mL의 농도로 항-펜타-HIS1K(ForteBio, Cat #18-5122) 바이오센서에 로딩하였다. 이 후, 로딩된 바이오센서를 300nM의 출발 농도에서 0.1% BSA, 0.02% 트윈-20(pH 7.2)을 포함하는 PBS 중 8-포인트 1:3 희석 일련의 테스트 IgG 분자 (본 명세서에 기재된 대조군 및 돌연변이체 포함)에 침지시켰다. 키네틱 분석은 1:1 결합 모델 및 전체적 적합(global fitting)을 사용하여 수행되었다. 결과는 하기 표 5 및 6에 제시되어 있다.
표 5. 다양한 Fc 수용체에 대한 IgG1 및 IgG2 돌연변이체의 FcgR 결합 활성
Figure pct00077
표 6. IgG4 돌연변이체의 FcγR 결합 활성
Figure pct00078
이 연구에서 테스트된 특정 IgG 돌연변이체, 예를 들어, G4m2는 FcγRIIB (CD32B)에 대한 선택적 결합 활성을 나타냈고, FcRn에 대한 결합 활성을 유지하였으며, 이는 생체 내에서 IgG 분자의 반감기에 중요하다. 다른 것들, 예컨대, G1m2, G2m1 또는 G4m20은 모든 FcγR에 대한 결합을 잃었다.
실시예 2. 추가적인 IgG1, IgG2 및 IgG4 돌연변이체 및 다양한 Fc 수용체에 대한 결합 활성
본원에 개시된 인간 Fc 변이체 G1m5, G1m7, G1m8, G1m9, G2m5, G2m7, G2m8, G2m9, G4m5, G4m7, G4m8 및 G4m9를 항-CD137 항체의 VH 단편 및 상응하는 IgG1, G2 및 G4 CH1 단편에 연결시켜, 전장 IgG 중쇄를 생성하였다. 상기 실시예 1을 참조할 수 있다. 이들 돌연변이 IgG 중쇄를 클로닝하고, 항-CD137 항체의 경쇄와 공동 발현하고 (상기 실시예 1 참조), 표준 분자 생물학 및 항체 프로토콜을 사용하여 정제하였다. 결과는 하기 표 7-9에 제시되어 있다.
표 7. IgG1 돌연변이체의 FcR 결합 활성
Figure pct00079
표 8. IgG2 돌연변이체의 FcR 결합 활성
Figure pct00080
표 9. IgG4 돌연변이체의 FcR 결합 활성
Figure pct00081
실시예 3. FcγRIIB(CD32B)에 대한 선택적 결합을 향상시키기 위해 결합된 돌연변이를 갖는 예시적인 IgG 돌연변이체
본원에 개시된 인간 Fc 변이체 G1m15, G1m17, G1m18, G1m19, G2m25, G2m27, G2m28, G4m15, G4m17, G4m18 및 G4m19, G4m25, G4m27, G4m28 및 G4m29를 항-CD137 항체의 VH 단편 및 상응하는 IgG1, G2 및 G4 CH1 단편에 연결시켜, 전장 IgG 중쇄를 생성하였다. 상기 실시예 1을 참조할 수 있다. 이들 Fc 변이체는 힌지 도메인에서 하나 이상의 돌연변이 및 CH2 및/또는 CH3 도메인에서 하나 이상의 돌연변이의 조합을 함유한다. 이들 돌연변이 IgG 중쇄를 클로닝하고, 항-CD137 항체의 경쇄와 공동 발현하고 (상기 실시예 1 참조), 표준 분자 생물학 및 항체 프로토콜을 사용하여 정제하였다. 결과는 하기 표 10-12에 제시되어 있다.
실시예 4. 세포성 FcγR에 대한 인간 IgG 돌연변이체 결합 활성의 측정
세포성 Fc 수용체에 대한 인간 IgG 돌연변이체의 결합 활성을 측정하기 위해, CHO 세포를, 당업계에 공지된 바와 같은 렌티바이러스 전달 시스템을 사용하여, 인간 FcγR (FcγRI, FcγRIIA(H131), FcγRIIA(R131), FcγRIIB, FcγRIIC 및 FcγRIII)을 발현하도록 유전적으로 조작하였다.
IgG Fc 돌연변이체, 예컨대, G1m-2, G1m-4, G1mAA, G1mAG, G2m-1 G2m-4, G2m15, G2m17, G2m17, G2m18, G2m19, G2m20, G2m27, G2m28, G4m-1, G4m-2, G430 및 G4PE(상기 제공된 아미노산 서열)를 본원의 개시 내용에 따라 고안하고 구축하였다. 이들 IgG 돌연변이체는 지시된 바와 같이 상부 힌지 도메인 또는 하부 힌지 도메인에 돌연변이를 함유한다.
상이한 FcγR에 대한 IgG 돌연변이체의 결합의 FACS 분석을 위해, 트립신 -EDTA를 사용하여 FcγR 과발현 CHO 세포를 수확하고 저온 염색 완충액 (PBS 중 3% BSA)에 현탁시켰다. 염색 완충액 중 희석된 테스트 IgG 돌연변이체를 세포 내에 첨가하였다. 혼합물을 2시간 동안 4℃에서 항온처리한 후, 저온 염색 완충액으로 2회 세척하고 PE-표지된 항-인간 IgG에 재현탁시킨 후 2시간 동안 4℃에서 항온처리하였다. 혼합물을 염색 완충제로 2회 세척하고 FACS를 위해 PBS 중 2% PFA에 재현탁시켰다.
표 10. 인간 IgG1 돌연변이체의 FcR 결합 활성
Figure pct00082
표 11. 인간 IgG2 돌연변이체의 FcR 결합 활성
Figure pct00083
표 12. 인간 IgG4 돌연변이체의 FcR 결합 활성
Figure pct00084
도 1a-1w에 도시된 바와 같이, 다수의 인간 IgG1, IgG2 및 IgG4 돌연변이체는 세포 표면에서 발현된 FcγR에 대한 결합 활성을 나타냈다. 야생형 대응물에 대한 돌연변이체의 Fcγ 결합 활성의 변화에 대한 정성적 요약은 상기 표 2-4에 제공되어 있다.
실시예 5. 세포성 FcγRIIB에 결합할 수 있는 인간 IgG 돌연변이체는 향상된 작용제 활성을 나타냈다
세포성 FcγR2B에 대한 결합이 IgG 돌연변이체의 작용제 활성을 향상시킬 것임을 확인하기 위해, 공동 배양 검정을 발생시켰으며, 이는 FcγR2B를 발현하는 CHO 세포 및 인간 CD8 양성 T 세포를 포함한다. CHO-FcγRIIB 세포를 96-웰 세포 배양 플레이트 중 2x104/웰에 플레이팅하고 밤새 항온처리하였다. 인간 CD8 양성 T 세포를 단리하기 위해, 건강한 공여자로부터의 신선한 혈액을 동일한 부피의 DPBS와 부드럽게 혼합하였다. 이 후, 혈액 샘플을 Ficoll 언더레이의 상부에 놓고 브레이크 없이 RT에서 1000g에서 30분 동안 원심분리하였다. PBMC를 함유한 버피 코트(buffy coat)를 새로운 튜브 내에 수확하고 DPBS로 세척하였다. CD8 양성 T 세포를, 키트 매뉴얼에 따라 EasySep™ 인간 CD8+ T 세포 단리 키트(Stemcell #17953)를 사용하여 PBMC로부터 단리하였다. RPMI 배지에 현탁된 단리된 CD8+ T 세포를 CHO-FcγRIIB 세포와 함께 플레이트에 첨가하였다. 항-인간 CD3 항체 OKT3을 0.1μg/ml의 최종 농도로 첨가한 후, 원하는 농도로 희석된 테스트 항체를 첨가하였다. 플레이트를 3일 동안 배양한 후, 인간 IFN-감마 ELISA Ready-SET-GO 키트 (EBIOSCIENCE, #88-7316-88)를 사용하여 ELISA에 의해 IFNg 농도를 측정하기 위해 배양 상청액을 수확하였다.
도 2a-2c에 도시된 바와 같이, 다수의 테스트된 IgG 돌연변이체는 IFN-γ의 분비에 의해 입증되는 바와 같이 CHO-FcγRIIB 세포의 존재 하에서 인간 CD8+ 세포를 자극하였다.
실시예 6. 마우스 모델에서 생체 외 및 생체 내에서 IgG 아이소타입의 효과
마우스 4-1BB(CD137)에 대한 2개의 상이한 항체, LOB12.3 및 3H3을 상세하게 조사하였다. 이들 2개의 항체를 클로닝하여 다양한 마우스 IgG 아이소타입, 예컨대, 뮤린 IgG1, (음성 대조군으로서) FcR과 결합하는 능력이 감소된 것으로 알려진 뮤린 IgG1 N297A 돌연변이체 및 뮤린 IgG2a를 발현시켰다.
뮤린 CD8 양성 T 세포는 용액 중의 항체에 의해 자극되었다. 뮤린 CD8 T 세포의 전형적인 생체 외 공동 자극 검정에서, 도 3에 도시된 바와 같이, 항체 LOB12.3은 인터페론 감마 분비에 의해 측정될 때 T 세포를 자극할 수 없었으나, 3H3 항체는 항체 아이소타입에 관계없이 작용성 활성을 나타냈다.
생체 내 항종양 활성 및 간 독성을 조사하였다. 이들 2개의 항체의 활성 프로파일 및 이들의 아이소타입은 크게 상이했다. 뮤린 동계(syngeneic) CT26 결장 직장암 모델에서, LOB12.3 및 3H3는 종양의 완전한 거부를 포함하는 강력한 항종양 활성을 나타내었지만, 각각의 항체에 대한 최적의 아이소타입은 별개이다. 도 4a-4b. LOB12.3은 생체 외에서 명백한 공동 자극 활성을 나타내지 않았으나, 뮤린 IgG1 아이소타입일 경우, 생체 내에서 효능이 있었으며, 이는 FcγR2B 매개된 가교 결합이 효율적인 작용성 활성을 초래할 수 있음을 나타낸다. 3H3는 본질적으로 작용성이며, 이의 활성은 Fc-매개 가교 결합에 의존하지 않았다. 실제로, Fc-널(null) 돌연변이체에서 3H3가 가장 효과적이었다.
예기치 않은 관찰은 이들 항체의 간 독성에 대한 차등 효과를 보였다. LOB12.3 및 3H3 둘 다는 종양 거부를 유도하는데 효과적이었으나, 3H3만이 처리된 동물의 혈청 샘플에서 증가된 간 효소 ALT에 의해 측정된 바와 같은 간 독성을 나타냈다(도 4b).
이러한 실험 데이터는 처음으로 공동 자극 작용제 항체의 증가된 치료적 지수를 위한 작용성 항체를 선택하고 조작하는 잠재적인 유용성을 제시하였다.
실시예 7. 키메라 항체의 약동학적 연구
선택된 키메라 항체의 약동학을 연구하기 위해 생체 내 연구를 수행하였다. PBS 중 제형화된 항체를 꼬리 정맥 주사를 통해 C57BL/6 마우스(6-7 주령, 19-20g, 수컷)에게 투여하였다. 용량은 1-3 mg/kg이었다 (그룹 당 n=4 마우스).
항체의 투여 전, 및 투여 후 1h, 2h, 4h, 8h, 1d, 2d, 3d, 5d, 8d, 11d, 15d 및 21d에 혈액 샘플을 채취하였다. 시점 당 10μL 혈액을 추출하여 40μL의 PBS-BSA 용액에 첨가하였다. 이 후, 샘플을 잘 혼합하고 4℃에서 5분 동안 2000g에서 원심 분리하였다. 수집 직후 상청액을 드라이 아이스에 놓고 분석할 때까지 약 -70□에서 보관하였다. 혈액 샘플 중 항체 농도는 아래 간략하게 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 측정되었다.
CD137 단백질(인간 CD137-His 태그 단백질(Sino Biological Inc. Cat#10377-H08H-100) 또는 붉은 털 원숭이 CD137-His(Sino Biological Inc. Cat#90305-K08H-100))을 PBS 중에 1μg/ml로 희석하고 50μl/웰의 농도로 ELISA 플레이트(Corning, Cat#9018, 고 결합)를 코팅하는데 사용하였다. 플레이트를 4□에서 밤새 항온처리하였다. 이 후, 플레이트를 디켄트(decant)하고 PBS-T로 세척하고, 200μl/웰 검정 희석액(1xPBS/1% BSA/0.05% 트윈-20/0.05% 프롤린 300)을 첨가하였다. 실온에서 3시간 동안 항온처리한 후, 플레이트를 PBS-T로 3회 세척하였다. 이 후, 적절한 희석의 샘플은, 검정 희석액 중 0, 0.000003, 0.00003, 0.0003, 0.003, 0.03 및 0.3μg/ml (또는 대략 0, 0.00002, 0.0002, 0.002, 0.02, 0.2 및 2nM)로 희석된 공지된 농도의 항체 표준과 함께 플레이트(50μl/웰)에 첨가시켰다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 항온처리한 후, PBS-T로 3회 세척하였다. 1:10,000 희석에서 항-인간 IgG-HRP 컨쥬게이트(Bethyl Cat#A80-319P)를 플레이트(100μl/웰)에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 0.5시간 동안 항온처리한 후, PBS-T로 3회 세척하였다. TMB 기질 용액을 첨가하였다(100μl/웰). 100μl/웰 2N H2SO4로 중단하기 전에 8분 동안 발색시켰다. 450nm에서의 흡광도를 ELISA 판독기로 측정하고, 표준 곡선 용량 반응으로부터 항체 농도를 계산하였다.
도 5a-5g는 1-3mg/kg의 단일 정맥 주사 후 키메라 항체의 혈장 항체 농도를 나타낸다. 조사된 이들 항체의 약동학 파라미터는 하기 표 13에 열거되어 있으며, 이는 전부는 아니지만 대부분의 조사된 돌연변이가 정상적인 IgG PK 파라미터를 변경시키지 않았음을 나타낸다.
표 13. 마우스에서 조사된 IgG 변이체의 약동학 요약
Figure pct00085
Figure pct00086
다른 실시양태
본 명세서에 개시된 모든 특징들은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특징은 동일하거나 동등한 또는 유사한 목적을 제공하는 대안적인 특징으로 대체될 수 있다. 따라서, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 개시된 각각의 특징은 일반적인 일련의 동등하거나 유사한 특징의 예일 뿐이다.
상기 설명으로부터, 당업자는 본 발명의 본질적인 특성을 용이하게 확인할 수 있고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 본 발명의 다양한 변화 및 변형을 수행하여 다양한 용도 및 조건에 적응시킬 수 있다. 따라서, 다른 실시양태들도 청구 범위 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Lyvgen Biopharma Holdings Limited <120> THERAPEUTIC AGENTS AND METHODS FOR ENHANCING IMMUNE RESPONSES IN TUMOR MICROENVIRONMENT <130> L0839.70001WO00 <140> Not Yet Assigned <141> 2018-03-28 <150> US 62/477,661 <151> 2017-03-28 <160> 128 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 237 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 1 5 10 15 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 20 25 30 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 35 40 45 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 50 55 60 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 65 70 75 80 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 85 90 95 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 100 105 110 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 115 120 125 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 130 135 140 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 145 150 155 160 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 165 170 175 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 180 185 190 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 195 200 205 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 210 215 220 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 235 <210> 2 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 20 25 30 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 35 40 45 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 50 55 60 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 65 70 75 80 Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His 85 90 95 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 119 Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Phe Leu Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Thr Cys Val Val Val 20 25 30 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Lys Cys 35 40 45 Lys Val Ser Asn Lys Gly Phe Pro Ser Ser Ile 50 55 <210> 120 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 120 Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Phe Leu Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Thr Cys Val Val Val 20 25 30 Asp Val Glu Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Lys Cys 35 40 45 Lys Val Ser Asn Lys Gly Phe Pro Ser Ser Ile 50 55 <210> 121 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 121 Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Phe Leu Gly Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Thr Cys Val Val 20 25 30 Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 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Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Phe Leu Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Phe Pro Ser Ser Ile 50 55 60 <210> 125 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 125 Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Phe Leu Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Glu Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Phe Pro Ser Ser Ile 50 55 60 <210> 126 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 126 Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Phe Leu Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Thr Cys Val Val 20 25 30 Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Lys 35 40 45 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 50 55 60 <210> 127 <211> 62 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 127 Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 35 40 45 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 50 55 60 <210> 128 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 128 Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala Pro Glu Phe Leu Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 35 40 45 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Glu Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 50 55 60 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 65 70 75 80 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 85 90 95 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 100 105 110 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 115 120 125 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 130 135 140 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 145 150 155 160 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 165 170 175 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 180 185 190 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 195 200 205 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 225 230

Claims (48)

  1. 변이체 Fc 영역을 포함하는 단백질로서, 상기 변이체 Fc 영역은 야생형 모(parent) Fc 영역과 비교하여 위치 218 내지 329 중 어느 하나에서의 돌연변이를 포함하고, 상기 넘버링(numbering)은 EU 지수에 따르는, 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이가 위치 218 내지 328 중 어느 하나에 존재하는, 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 돌연변이가 아미노산 잔기 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합인, 단백질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이가 다음 중 하나 이상을 포함하는, 단백질:
    (a) 위치 219 내지 225 중 하나 이상에서의 돌연변이;
    (b) 위치 218과 위치 219 사이, 또는 위치 236에서의 삽입;
    (c) 위치 233 내지 235의 하나 이상에서의 아미노산 잔기 치환;
    (d) 위치 220 내지 223 중 어느 하나에서의 삽입;
    (e) 위치 236 내지 238 중 하나 이상에서의 결실; 및
    (f) 위치 267, 273, 328 및 329 중 하나 이상에서의 아미노산 치환.
  5. 제4항에 있어서, 상기 (a)의 돌연변이가 삽입, 결실, 아미노산 잔기 치환 또는 이들의 조합을 포함하는, 단백질.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이가 (i) 위치 234 내지 238 중 하나 이상에서의 돌연변이 및 (ii) 위치 267, 273, 328 및 329 중 하나 이상에서의 돌연변이를 포함하는, 단백질.
  7. 제4항에 있어서, (i)이 결실이고, (ii)가 아미노산 잔기 치환인, 단백질.
  8. 제7항에 있어서, (i)이 위치 236 내지 238 중 하나 이상의 결실을 포함하는, 단백질.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, (ii)가 아미노산 잔기 치환 S267E, V273E, L328F, P329G 또는 이들의 조합을 포함하는, 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모 Fc 영역이 IgG1 분자인, 단백질.
  11. 제10항에 있어서, 상기 돌연변이가 다음 중 하나 이상을 포함하는, 단백질:
    (a) 위치 228과 위치 229 사이의 삽입;
    (b) 위치 220 내지 225 중 하나 이상에서의 돌연변이;
    (c) 위치 234 및 235에서의 아미노산 치환;
    (d) 위치 236 내지 238 중 하나 이상에서의 결실; 및
    (e) 하나 이상의 위치 267, 273, 328 및 329에서의 아미노산 치환.
  12. 제11항에 있어서, 상기 돌연변이가 (i) 위치 236 내지 238 중 하나 이상에서의 결실을 포함하는, 단백질.
  13. 제12항에 있어서, 상기 돌연변이가 (ii) 위치 267, 273 및 328 중 하나 이상에서의 아미노산 잔기 치환을 추가로 포함하는, 단백질.
  14. 제13항에 있어서, 상기 아미노산 잔기 치환이 S267E인, 단백질.
  15. 제13항에 있어서, 상기 변이체 Fc 영역이 G1m1, G1m2, G1m-2, G1m-4, G1m5, G1m7, G1m8, G1m9, G1m15, G1m17, G1m18, G1m19, G1m25, G1m27, G1m28, G1m29, G1mAA 및 G1mAG로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단백질.
  16. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모 Fc 영역이 IgG2 분자인, 단백질.
  17. 제16항에 있어서, 상기 돌연변이가 다음 중 하나를 포함하는, 단백질:
    (a) 위치 219 내지 225의 하나 이상에서의 돌연변이;
    (b) 위치 233 내지 235 중 하나 이상에서의 아미노산 치환;
    (c) 위치 218과 219 사이 또는 위치 236에서의 삽입;
    (d) 위치 237 및 238 중 하나 이상에서의 결실; 및
    (e) 위치 267, 273 및 328 중 하나 이상에서의 아미노산 잔기 치환.
  18. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 돌연변이가 (i) 위치 237 및 238 중 하나 이상에서의 결실을 포함하는, 단백질.
  19. 제18항에 있어서, 상기 돌연변이가 (ii) 위치 267, 273 및 328 중 하나 이상에서의 아미노산 잔기 치환을 추가로 포함하는, 단백질.
  20. 제19항에 있어서, 상기 아미노산 잔기 치환이 S267E, L328F 또는 이들의 조합인, 단백질.
  21. 제19항에 있어서, 상기 변이체 Fc 영역이 G2m1, G2m-1, G2m2, G2m-4, G2m5, G2m7, G2m8, G2m9, G2m10, G2m15, G2m17, G2m18, G2m19, G2m20, G2m27, G2m27 및 G2m28로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단백질.
  22. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모 Fc가 IgG4 분자인, 단백질.
  23. 제22항에 있어서, 상기 돌연변이가 S228P 아미노산 잔기 치환 및 다음 중 하나 이상을 포함하는, 단백질:
    (a) 위치 219 내지 225 중 하나 이상에서의 돌연변이;
    (b) 위치 234 및 235 중 하나 이상에서의 아미노산 잔기 치환;
    (c) 위치 236 내지 238 중 하나 이상에서의 결실; 및
    (d) 위치 267, 273 및 328 중 하나 이상에서의 아미노산 잔기 치환.
  24. 제23항에 있어서, 상기 돌연변이가 (i) 상기 S228P 아미노산 잔기 치환 및 (ii) 위치 236 내지 238 중 하나 이상에서의 결실을 포함하는, 단백질.
  25. 제24항에 있어서, 상기 돌연변이가 (iii) 위치 267, 273 및 328 중 하나 이상에서의 아미노산 잔기 치환을 추가로 포함하는, 단백질.
  26. 제25항에 있어서, L328F의 아미노산 잔기 치환인, 단백질.
  27. 제24항에 있어서, 상기 변이체 Fc 영역이 G4m1, G4m-1, G4m2, G4m-2, G4m3, G4m4, G4m5, G4m7, G4m8, G4m9, G4m10, G4m17, G4m18, G4m19, G4m20, G4m25, G4m27, G4m28, G4m29, G4m30 및 G4mPE로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단백질.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체 Fc 영역이 상기 모 Fc 영역과 비교하여 FcγRIIB에 대해 향상된 결합 친화도를 나타내는, 단백질.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체 Fc 영역이 상기 모 Fc 영역과 비교하여 FcγRIIB에 대해 향상된 선택성을 나타내는, 단백질.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체 Fc 영역이 임의의 FcγR에 대한 결합 활성이 낮거나 존재하지 않는, 단백질.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체 Fc 영역이 FcRn에 결합하는, 단백질.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 항체인, 단백질.
  33. IgG2 또는 IgG4 분자의 변이체 Fc 영역을 포함하는 단백질로서, 상기 변이체 Fc 영역은 야생형 모 IgG2 또는 IgG4 Fc 영역과 비교하여 위치 267, 위치 273, 위치 328 또는 이들의 조합에서의 돌연변이를 포함하고, 상기 넘버링은 EU 지수를 따르는, 단백질.
  34. 제33항에 있어서, 상기 IgG2 또는 IgG4 분자가 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 분자인, 단백질.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  36. 대상체의 면역 반응을 선택적으로 활성화시키는 방법으로서, 유효량의 치료제를, 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하되, 상기 치료제는 면역 세포 수용체에 결합하는 제1 모이어티(moiety) 및 FcγRIIB에 결합하는 제2 모이어티를 포함하는, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 면역 세포 수용체가 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리(TNFRSF)의 구성원(member)인, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 TNFRSF의 구성원이 FAS, TNFRSF12A, 4-1BB/CD137, TNFRSF13B, TNFRSF13C, CD27/TNFRSF7, CD30/TNFRSF8, CD40/TNFRSF5, DR3/TNFRSF25, DR4/TNFRSF10A, DR5/TNFRSF10B, DR6/TNFRSF21, GITR/TNFRSF18, HVEM/TNFRSF14, LTβR, OX40/TNFRSF4, TROY/TNFRSF19, RELT/TNFRSF19L, TNFRSF12A, TNFRSF13B, TL1A/TNFSF15, TNFRSF17, TNFRSF1A, TNFRSF11B, RANK/TNFRSF11A, TNFRSF11B, NGFR, EDA2R 및 TNFRSF1B로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료제가 항체인, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 항체가 작용제 항체(agonist antibody)인, 방법.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 항체가 IgG1, IgG2 또는 IgG4 분자인, 방법.
  42. 제36항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료제가 FcγRIIB에 선택적으로 결합하는, 방법.
  43. 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료제가 야생형 대응물과 비교하여 FcγRIIB에 대해 향상된 결합 친화도 및/또는 향상된 결합 선택성을 갖는 변이체 Fc 영역을 함유하는, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 변이체 Fc 영역이 인간 FcγRIIB에 선택적으로 결합하는, 방법.
  45. 제36항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료제가 이중특이적 항체이며, 이는 면역 세포 수용체에 특이적인 제1 항원-결합 단편 및 FcγRIIB에 특이적인 제2 항원-결합 단편을 포함하는, 방법.
  46. 제36항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 암을 앓고 있거나 앓는 것으로 의심되는 인간 환자인, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 암이 폐암, 위암, 간암, 유방암, 피부암, 췌장암, 뇌암, 전립선암, 방광암, 결장 직장암, 육종, 골암, 림프종 및 혈액암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  48. 대상체의 면역 반응을 선택적으로 활성화시키는 방법으로서, 유효량의 제35항의 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
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