KR20200002732A

KR20200002732A - 불안정한 세포유리 dna 검출 방법 및 이를 이용한 장치

Info

Publication number: KR20200002732A
Application number: KR1020190170688A
Authority: KR
Inventors: 조영남
Original assignee: 주식회사 제놉시
Priority date: 2018-06-01
Filing date: 2019-12-19
Publication date: 2020-01-08
Also published as: US20210215681A1; KR20190137706A; JP7569110B2; JP2021526029A; EP3812471A1; KR102072735B1; EP3812471A4; TW202014522A; JP2023062100A; CN112236529A; TWI736898B; EP3812471B1; AU2019279371B2; CA3101178A1; AU2019279371A1; KR102381444B1; EP3812471C0; WO2019231259A1

Abstract

본 발명의 일 구체예는 소변, 뇌척수액, 혈장, 혈액, 흉수, 또는 체액 등의 액체 시료로부터 작은 크기의 cfDNA를 초고감도로 검출해, 이를 농축하고 분리한 후, PCR 없이 유전자 변이를 분석하는 기술에 관한 것이다. 특히, 양이온을 띠는 나노구조체를 이용할 경우 cfDNA 회수율 및 검출율을 높일 수 있다. 본 발명의 일 실시예 따른 검출 방법은 PCR 증폭 반응이 필요 없어 결과를 수득하는데 걸리는 시간이 크게 단축되었다. 또한, 특정 장비의 필요 없이 현장에서 바로 분석할 수 있으므로, 빠른 시간 내에 다수의 유전자를 동시에 검색할 수 있는 현장 진단용 검사(Point-Of-Care Testing, POCT)로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

불안정한 세포유리 DNA 검출 방법 및 이를 이용한 장치{METHOD FOR DETECTING UNSTABLE CELL FREE DNA AND DETECTING APPARATUS THEREOF}

본 발명은 유전자를 증폭하는 과정 없이 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 세포유리 DNA를 검출하는 방법 및 장치에 관한 것이다.

최근 전 세계적으로 암 질환의 조기 진단 중요성이 크게 부각되고 있다. 따라서 암 조기 진단 방법에 관한 연구가 증가하고 있다. 그러나 현재까지 암 진단 방법은 조직 샘플의 채취 및 내시경 검사와 같은 침습적인 방법으로 이루어지고 있다. 특히, 조직검사는 질병이 의심되는 부위의 일부를 적출해 현미경으로 관찰하는 방식으로 이루어지고 있다. 따라서, 조직 샘플을 채취하기 위해 침이나 펀치, 내시경 또는 복강경을 이용하기 위해서는, 인체를 절개하여야 하므로, 환자가 느끼는 불편함이 적지 않을 뿐 아니라 흉터가 남고 회복하는데 오랜 시간이 걸린다.

침습적인 진단 및 검사 방법의 대안으로 액체 생체 검사를 이용한 분자진단법이 주목 받고 있다. 액체 생체 검사는 비침습적인(non-invasive) 방법을 사용하기 때문에, 검사 결과를 신속하게 확인할 수 있다. 그뿐 아니라, 질병의 일부분만 분석할 수 있었던 조직 샘플과 달리, 액체 생체 검사는 질병에 대해 다각도로 분석을 수행할 수 있다. 특히, 액체 생체 검사는 암의 진단에 탁월한 효용성을 발휘할 것으로 전망된다. 특히, 혈액, 소변 등의 체액 검사만으로 신체 부위별 혈액 내에 존재하는 암세포 유래 DNA를 분석하여 암 발생 및 전이 등에 대한 상세한 관찰이 가능할 것으로 예측된다.

분자진단법은 체외진단의 대표적인 기술로서, 혈액, 소변 등의 유전자 정보가 들어 있는 시료로부터, DNA 또는 RNA 변화를 수치 또는 영상을 통해 검출해 진단하는 기법이다. 이는 정확도가 높으며 조직검사를 하지 않아도 된다는 장점이 있기 때문에, 유전체 분석기술의 급속한 발전과 함께 비용 절감의 장점을 바탕으로 암 진단 기술에 적용하려는 시도가 이루어지고 있다.

한편, 세포유리 DNA(cell-free DNA, 이하 cfDNA라 함)는 혈장에 존재하는 세포에서 유래한 DNA를 의미한다. 상기 cfDNA는 통상 이중나선구조를 가질 뿐 아니라, 코일드코일 구조를 가지는 경우가 많다. 상기 cfDNA는 종양 세포에서 유래된 것일 수 있다. 또한, 암 환자로부터 수득된 혈액, 혈장 또는 소변 등의 생물학적 시료에서는 종양 세포에서 유래된 cfDNA를 발견할 수 있다.

암 환자에서 발견되는 cfDNA는 괴사된 세포, 정상세포 및/또는 암세포에서 유래된 것일 수 있다. 이러한, cfDNA는 다양한 과정을 통해 소변, 혈액 등으로 방출된다. 따라서, 혈액, 혈장 또는 소변 등의 생물학적 시료 내의 cfDNA를 분리하고 검출하는 기술이 발전한다면, 액체 생체 검사가 암 위험군 환자를 모니터링 하는데 보다 효과적이고 신뢰할 수 있는 도구가 될 수 있다. 특히, 소변, 혈장, 혈액 또는 체액은 쉽게 얻을 수 있는 시료이므로, 비침습적인 방법으로 대량의 검체 수집이 가능하다.

그러나 혈액, 소변 등 액체 시료 내 cfDNA를 분석하고 유전자에 존재하는 변이를 발견하여 암을 조기에 진단하는 방법은 현재의 기술 수준상 많은 어려움이 있다. 따라서, 용이하게 cfDNA를 검출하는 방법의 개발 뿐 아니라, 검출 민감도의 향상 및 정확한 암 조기 진단을 위한 기술이 요구되고 있는 실정이다.

한편, 한국등록특허 제10-1751962호에는 cfDNA를 검출하기 위하여 프라이머를 이용하여 연쇄중합반응(PCR)을 하여 cfDNA를 정량화할 수 있는 기술이 개시되어 있다. 그러나 연쇄중합반응을 하기 위하여는 별도의 중합효소 및 실험기자재가 필요하다는 문제점이 여전히 존재하며, 증폭을 위해 정확한 프라이머 제작이 필요할 뿐 아니라, 현장 진단이 용이하지 않다는 문제점이 있다.

또한, 한국등록특허 제10-1701618호에서는 cfDNA를 효과적으로 분리하기 위하여 전기장 변화를 통해 표면의 성질이 변할 수 있는 나노구조체를 개시하고 있다. 상기 나노구조체는 전기변화를 통해, cfDNA를 결합시키거나 해리시킬 수 있어 시료로부터 용이하게 cfDNA를 분리할 수 있다. 그러나, 어떠한 cfDNA가 존재하는지를 확인하기 위하여는 여전히 연쇄중합반응을 이용하여야 하는 한계가 있다.

연쇄중합반응을 수행하여 cfDNA를 증폭하기 위해서는 여러 종류의 프라이머 세트가 필요할 뿐 아니라, 복잡한 단계를 수행해야 하므로 많은 시간이 소요된다. 따라서, PCR을 수행해야만 하는 한계를 극복하고, cfDNA를 높은 정확도로 분석하기 위한 방법을 개발하기 위한 연구가 지속적으로 이루어지고 있다.

KR

10-1751962

B

KR

10-1701618

B

종래에 cfDNA를 검출하기 위하여는 cfDNA를 변성시키고, cfDNA와 상보적인 프라이머를 이용하여 cfDNA를 증폭하는 과정이 필수적이었다. 그러나 본 발명자는 혈액 내에 불안정한 cfDNA와 존재한다는 점을 확인하였다. 또한, 불안정한 cfDNA는 안정한 cfDNA가 달리, 단일 가닥 프로브와 상이한 반응을 보인다는 점을 확인하였다. 특히, 이러한 불안정한 cfDNA가 암 또는 감염성 질환에 걸린 개체의 세포에서 유래한 것이라는 점을 확인하였고, 이러한 점을 기반으로 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 불안정한 cfDNA의 존재 여부를 확인하는 방법을 제공하며, 이러한 불안정한 cfDNA를 확인함으로써, 암 또는 여러 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 시료로부터, 증폭없이, 불안정한 cfDNA를 검출하기 위한 방법을 제공한다. 또한, 시료로부터, 증폭없이, 불안정한 cfDNA를 검출함으로써, 암 및 감염성 질환을 진단 또는 예측하기 위한 정보를 제공하기 위한 방법을 제공한다. 또한, 시료로부터, 증폭없이, 불안정한 cfDNA를 검출하기 위한 장치를 제공한다.

일 실시예의 불안정한 cfDNA를 검출하는 방법을 이용할 경우, 불안정한 cfDNA를 증폭하는 과정이 불필요할 뿐 아니라, cfDNA 분석 시간을 단축할 수 있다. 특히, 유전자 변이 부분을 포함하여 불안정한 이중가닥 cfDNA를 효과적으로 검출할 수 있어, 유전자 변이와 관련된 암이나 질병을 효과적으로 진단 또는 예측할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 방법을 이용할 경우 소량의 소변, 뇌척수액, 흉수, 복수, 혈장, 혈액, 또는 체액 등의 생물학적 시료로부터, 불안정한 이중나선구조를 가지는 cfDNA의 존재 유무를 빠르고 정확하게 확인할 수 있다. 또한, 상기 검출된 불안정한 cfDNA가 각종 암이나 질환에 관련되어 있다는 점을 확인하였으므로, 본 발명의 일 실시예에 따른 방법은 암의 진단 또는 치료 후 예후 확인에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 양전하를 띠는 나노와이어(PEI/Ppy NW)의 주사전자현미경(SEM) 이미지를 나타낸 것이다.
도 2는 양전하를 띠는 나노와이어(PEI/Ppy NW)의 투과전자현미경(TEM) 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은 양이온성 고분자인 폴리라이신(polylysine, PLL)이 표면에 결합된 나노구조체(PLL/Ppy NW)의 표면을 주사전자현미경 이미지로 나타낸 것이다.
도 4는 HRP/스트렙타비딘이 결합된 나노입자의 주사전자현미경 이미지를 나타낸 것이다.
도 5는 직경이 50 nm인 PEI가 결합된 나노입자(PEI/Ppy NP)의 주사전자현미경(SEM) 이미지를 나타낸 것이다.
도 6은 폴리에틸렌이민(PEI)이 표면에 결합된 나노와이어(PEI/Ppy NW)를 이용하여 환자의 체액으로부터 cfDNA를 수득한 후 프로브 및 HRP/스트렙타비딘-나노입자(HRP/st-tagged NP)와의 반응을 통하여 유전자 변이를 60분 이내에 분석하는 방법에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 7은 나노와이어, 프로브 및 HRP/스트렙타비딘 나노입자를 이용하여 불안정한 cfDNA를 검출하는 방법을 도식화한 것이다.
도 8은 혈액, 뇌척수액 또는 흉수와 같은 시료에서 불안정한 cfDNA를 검출하기 위한 방법을 시계열적 흐름으로 나타난 것이다.
도 9는 소변과 같은 시료에서 불안정한 cfDNA를 검출하기 위한 방법을 시계열적 흐름으로 나타난 것이다.
도 10은 혈액에서 취득한 cfDNA의 상태에 따른 변성 조건의 차이를 도식화한 것이다.
도 11은 소변, 타액 및 객담에서 취득한 cfDNA의 상태에 따른 변성 조건의 차이를 도식화한 것이다.
도 12는 자궁경부암 환자 소변시료와 정상인 소변시료에서 cfDNA를 수득한 후, HPV 18 또는 HPV 16 프로브를 사용하여 cfDNA의 유전자 변이 여부를 검출한 결과이다.
도 13은 HPV 양성 자궁경부암 환자(HPV16(+) 및 HPV18(+)) 및 HPV 음성 건강 대조군(HPV-)의 소변에 존재하는 cfDNA와 HPV 18 또는 HPV 16에 특이적인 프로브의 결합 여부를 흡광도를 통하여 확인한 것이다.
도 14는 자궁경부암 환자의 소변에서 분리한 cfDNA에 HPV 16, EGFR19 deletion, HPV 18, 및 EGFR 21 L858R에 특이적인 프로브를 순차적으로 반응시킨 후, cfDNA와 각 프로브의 결합여부를 확인한 것이다.
도 15는 정상인의 혈장에 짧은 크기(10 bp 내지 100 bp), 중간 크기(100 bp 내지 2 kb), 긴 크기(3.5 kb 내지 21 kb)의 DNA ladder를 추가한 후, PEI/Ppy NW를 이용하여 DNA ladder를 회수할 때, 회수 효율을 평가한 결과이다.
도 16은 A549 세포주(레인 1 및 2), HCC2279 세포주(레인 3 및 4) 및 H1975 세포주(레인 5 및 6)를 초음파 처리(sonication)하지 않고 분해하여 얻은 세포주 게놈 DNA(genomic DNA, 이하 gDNA라 함)와 상기 세포주를 초음파 처리하여 세포주의 gDNA를 단편으로 만든 DNA(fragmented DNA, 이하 fDNA라 함)의 크기를 확인한 것이다.
도 17은 A549 세포주, HCC2279 세포주 및 H1975 세포주를 초음파 처리하지 않고 수득한 세포주의 gDNA와 세포주를 초음파 처리하여 수득한 세포주의 fDNA를 PEI/Ppy NW를 이용하여 회수한 후, 회수 효율을 평가한 결과이다.
도 18 및 도 19는 A549 세포주, HCC2279 세포주 및 H1975 세포주를 초음파 처리하지 않고 수득한 세포주의 gDNA와 세포주를 초음파 처리하여 수득한 세포주의 fDNA를 PEI/Ppy NW를 이용하여 회수한 후, EGFR 19(19Del), EGFR 20(T790M) 및 EGFR 21(L858R)에 특이적인 프로브를 첨가하여 색깔 변화 및 UV-Vis 스펙트럼의 변화를 확인한 결과이다. fDNA만이 타겟 프로브와 선택적으로 결합함을 확인하였다.
도 20은 H1975 세포주, HCC2279 세포주, 및 A549 세포주의 fDNA를 PEI/Ppy NW를 이용하여 수득한 다음, 형광 염료가 결합된 DNA 프로브를 사용하여 유전자 변이를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 HCC2279(EGFR exon 19 deletion 유전자 변이) 세포의 fDNA와 EGFR exon 19 deletion에 특이적인 프로브를 이용하여, fDNA 농도에 따른 프로브와의 결합 여부를 UV 흡광도를 이용하여 분석한 것이다. 이를 통해 검출 가능한 cfDNA 농도를 확인하였다.
도 22는 H1975(EGFR exon 20 T790M 및 exon 21 L858R 유전자 변이)의 fDNA와 EGFR exon 20 T790M에 특이적인 프로브를 이용하여, fDNA 농도에 따른 프로브와의 결합 여부를 UV 흡광도를 이용하여 분석한 것이다. 이를 통해 검출 가능한 cfDNA 농도를 확인하였다.
도 23은 PEI/Ppy NW를 사용하여 폐암 환자의 혈장 200 μL에서 수득된 cfDNA를 Bioanalyzer를 이용하여 분석한 것이다. 문헌에 따르면, 암관련 cfDNA의 크기가 평균 166 bp라고 알려져 있다. Bioanalyzer 데이터에서 증명된 것과 같이 PEI/Ppy NW를 사용하여 폐암 환자의 혈장에서 수득한 cfDNA는 169 bp에서 peak이 보이는 것을 확인하였다.
도 24는 EGFR 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장으로부터 분리한 cfDNA와 EGFR exon 19 deletion(Del) 또는 EGFR exon 21 L858R에 특이적으로 결합하는 프로브를 반응시키면, 조직의 유전형과 동일하게 색깔변화 및 UV 흡광도가 나타남을 확인한 결과이다.
도 25는 EGFR exon 19 deletion(Del), EGFR exon 20 T790M, 및 EGFR exon 21 L858R 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장으로부터 분리한 cfDNA를 EGFR exon 19Del, EGFR exon 20 T790M, 또는 EGFR exon 21 L858R에 특이적인 프로브와 반응시키면 조직의 유전형과 동일하게 색깔변화 및 UV 흡광도가 나타남을 확인한 결과이다.
도 26 및 도 27은 PEI/Ppy NW를 이용하여 KRAS exon 2 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장으로부터 분리된 cfDNA를 KRAS exon 2에 특이적인 프로브와 반응시키면, 조직의 유전형과 동일하게 색깔변화 및 UV 흡광도가 나타남을 확인한 결과이다.
도 28은 ALK-EML4 융합 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장으로부터 분리한 cfDNA를 ALK-EML4에 특이적으로 결합하는 프로브와 반응시키면, 조직의 유전형과 동일하게 색깔변화 및 UV 흡광도가 나타남을 확인한 결과이다.
도 29는 EGFR exon 19 deletion 및 EGFR exon 20 T790M 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장으로부터 분리한 cfDNA를, EGFR exon 19 deletion 또는 EGFR exon 20 T790M에 특이적으로 결합하는 다양한 프로브에 반응하여 조직과 일치하는 색깔변화 및 UV 흡광도를 보였다. 그러나 EGFR 21 L858R 변이에서는 사용된 세 종류의 프로브에 상관없이 색변화를 보이지 않는 것을 확인한 결과이다. 이러한 결과 유전자와 프로브의 반응은 특정 프로브에 한정되는 것이 아니라, 변이를 가지는 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브라면 모두 결합이 가능하다는 것을 알 수 있다.
도 30은 EGFR 유전자 변이가 없는 폐암 환자(Wildtype, WT)의 혈장으로부터 분리한 cfDNA를 95℃에서 1분 및 10분간 변성시킨 후에, EGFR exon 19 deletion, EGFR exon 20 T790M, 또는 EGFR exon 21 L858R 프로브와 반응시킨 결과이다. EGFR WT 환자의 혈장에서 추출된 cfDNA는 95℃ 1분 변성에는 어떠한 프로브와도 반응을 보이지 않는 반면, 95℃ 10분 변성 후에는 모든 프로브와 비특이적으로 반응하는 것을 확인하였다.
도 31, 도 32 및 도 33은 EGFR exon 19 deletion과 EGFR exon 20 T790M 유전자 변이가 있는 폐암 환자 및 정상인의 혈장에서 나노와이어를 통하여 cfDNA를 포획한 후, 95℃에서 0분(도 31), 1분(도 32) 및 10분(도 33)간 변성을 시킨 후, EGFR 19 deletion, 20 T790M, 또는 21 L858R 프로브와의 반응을 확인한 결과이다.
도 34는 151명의 폐암 환자들의 혈장으로부터 수득한 cfDNA를 이용하여 폐암 환자의 유전자 변이를 분석한 표이다.
도 35는 EGFR 변이가 없는 환자(Wild type), EGFR exon19 deletion이 있는 환자 및 EGFR exon 21 L858R을 가진 폐암 환자의 혈장으로부터 cfDNA를 수득한 후, EGFR exon19 Del에 특이적인 프로브를 혼합한 후, UV 스펙트럼의 흡광도(ΔOD, 500 nm 내지 650 nm) 값의 분석을 통하여 폐암 환자의 유전자 변이를 확인한 것이다.
도 36은 EGFR exon19 deletion이 있는 폐암 환자의 혈장으로부터 cfDNA를 수득한 후, EGFR exon19 Del에 특이적인 프로브를 혼합한 후, 유전자 변이의 특이도와 민감도를 분석한 것이다.
도 37은 EGFR 변이가 없는 환자(Wild type), EGFR exon19 deletion이 있는 환자 및 EGFR exon 21 L858R을 가진 폐암 환자의 혈장으로부터 cfDNA를 수득한 후, EGFR exon21 L858R에 특이적인 프로브를 첨가한 후, UV 스펙트럼의 흡광도(ΔOD, 500 nm 내지 650 nm) 값의 분석을 통하여 환자의 유전자 변이를 확인한 것이다.
도 38은 EGFR exon 21 L858R이 있는 폐암 환자의 혈장으로부터 cfDNA를 수득한 후, EGFR exon 21 L858R에 특이적인 프로브를 추가한 후, 환자의 유전자 변이의 특이도와 민감도를 분석한 것이다.
도 39는 PEI/Ppy NP를 이용하여 EGFR exon 19 deletion 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장으로부터 분리된 cfDNA를 EGFR exon 19Del(E19), EGFR exon 20 T790M(E20) 또는 EGFR exon 21 L858R(E21)에 특이적인 프로브와 반응시킨 결과, 조직과 일치하는 UV 흡광도를 보이는 것을 확인한 것이다.
도 40은 EGFR exon 20 T790M 및 EGFR exon 21 L858R 유전자 변이를 가진 H1975 세포주의 fDNA를 폴리라이신으로 개질된 PLL/Ppy NW를 이용하여 수득한 다음 EGFR exon 19Del, EGFR exon 20 T790M 또는 EGFR exon 21 L858R에 특이적인 프로브와 반응시킨 후 유전자 변이를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 41은 EGFR exon 19 deletion의 CP 및 DP의 서열을 나타낸 것이다. 본 연구에서는 CP_1 및 DP를 사용하여 폐암 환자의 cfDNA 유전자 변이를 분석하였다. 이때, CP는 변이가 있는 부분을 포함하거나 인접한 서열에 특이적으로 결합하도록 디자인한 프로브이며, DP는 변이 서열에서 이격된 부분에 특이적으로 결합하도록 디자인된 프로브를 의미한다.
도 42는 EGFR exon 20 T790M의 CP 및 DP의 서열을 나타낸 것이다. 본 연구에서는 CP2 및 DP를 사용하여 폐암 환자의 cfDNA 유전자 변이를 분석하였다.
도 43은 EGFR exon 21 L858R의 CP 및 DP의 서열을 나타낸 것이다. 본 연구에서는 CP2 및 DP를 사용하여 폐암 환자의 cfDNA 유전자 변이를 분석하였다.
도 44는 EGFR exon19 deletion 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장에서 cfDNA를 수득한 후, DP 없이, 도 41 내지 도 43의 EGFR exon19 CP_1, exon20 CP2, exon21 CP2를 이용하여 유전자 변이를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 45는 EGFR exon19 deletion이 있는 폐암 환자의 혈장을 RNase 및 DNase를 이용하여 처리한 후, PEI/Ppy 나노와이어를 통하여 cfDNA를 수득하고, EGFR exon 19 deletion에 특이적인 프로브를 이용하여 불안정한 cfDNA를 검출한 것이다.
도 46은 EGFR exon20 T790M 이 있는 폐암 환자의 혈장을 RNase 및 DNase를 이용하여 처리한 후, PEI/Ppy 나노와이어를 통하여 cfDNA를 수득하고, EGFR exon20 T790M에 특이적인 프로브를 이용하여 불안정한 cfDNA를 검출한 것이다.
도 47은 EGFR exon 19 deletion 및 EGFR exon 20 T790M 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장으로부터 수득된 cfDNA를 EGFR exon 19 deletion(Del19), EGFR exon 20 T790M 및 EGFR exon 21 L858R에 특이적인 프로브를 이용하여 반응시킨 후 HRP/스트렙타비딘 나노입자(다량의 HRP를 포함)를 첨가하여 cfDNA의 검출여부를 색깔 변화 및 UV 흡광도로 확인한 것이다.
도 48은 도 47과 동일한 EGFR exon 19 deletion 및 EGFR exon 20 T790M 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장으로부터 수득된 cfDNA를 EGFR exon 19 deletion(Del19), EGFR exon 20 T790M 및 EGFR exon 21 L858R에 특이적인 프로브를 이용하여 반응시킨 후 HRP/스트렙타비딘 복합체(HRP와 스트렙타비딘이 1:1로 결합된 복합체)를 첨가하여 cfDNA의 검출여부를 색깔 변화 및 UV 흡광도로 확인한 것이다. HRP/스트렙타비딘 나노입자에 비해 HRP/스트렙타비딘 복합체의 경우 노이즈가 생성됨을 확인한 것이다.
도 49는 5명의 EGFR exon19 deletion 및 exon20 T790M 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장에서 cfDNA를 추출한 후 EGFR exon 19 Del, EGFR exon 20 T790M, EGFR exon 21 L858R에 특이적인 프로브 및 HRP/스트렙타비딘 나노입자(HRP/st-tagged NP)와 반응시킨 결과와 EGFR exon19 Del, EGFR exon 20 T790M, EGFR exon 21 L858R에 특이적인 프로브와 HRP/스트렙타비딘 복합체(HRP와 스트렙타비딘이 1:1로 결합)를 반응시킨 결과의 분석을 통하여 암조직과 유전형과의 일치성을 확인 및 비교한 것이다.
도 50은 EGFR exon 20 T790M 및 21 L858R 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 흉수로부터 수득된 cfDNA를 HRP/st-tagged NP이 이미 결합된 EGFR exon 19 deletion(19 Del), EGFR exon 20 T790M 및 EGFR exon 21 L858R 프로브를 이용하여 반응시킨 후 유전자 변이 검출여부를 UV 흡광도로 확인한 것이다.
도 51은 EGFR exon 20 T790M 및 EGFR exon 21 L861Q 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장으로부터 수득된 cfDNA의 유전자 변이 검출을 위해 EGFR exon 19 deletion(19 Del), EGFR exon 20 T790M, EGFR exon 21 L858R 및 EGFR exon L861Q에 특이적인 프로브 및 HRP/st-tagged NP을 한꺼번에 혼합한 결과 암조직과 동일하게 EGFR exon 20 T790M 및 EGFR exon 21 L861Q 에서만 유전자변이가 관찰됨을 UV 흡광도로 확인한 것이다.
도 52는 ALK-EML4 fusion 및 ALK point mutation(I1171N/T) 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장으로부터 수득된 cfDNA의 유전자 변이 검출을 위해 ALK-EML4 fusion 및 ALK point mutation(T1151, L1152P, L1152R, C1156Y, I1171N/T)에 특이적인 프로브 및 HRP/st-tagged NP을 한꺼번에 혼합한 결과 암조직과 동일하게 ALK-EML4 fusion 및 ALK point mutation(I1171N/T) 유전형이 검출되는 것을 확인하였다.
도 53은 BRAF V600E 유전자 변이를 가진 갑상선암 환자의 혈장으로부터 수득된 cfDNA의 유전자 변이 검출을 위해 BRAF V600E에 특이적인 프로브 및 HRP/st-tagged NP을 한꺼번에 혼합하였다. 그 결과 BRAF V600E 유전자 변이가 환자의 유전형과 동일하게 검출되는 것을 확인하였다.
도 54는 정상인의 혈액에서 채취한 시료를 여러가지 온도 조건으로 변성 시킨 후, 처리조건에 따라 불안정한 cfDNA의 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 55는 환자의 혈액에서 채취한 시료를 여러가지 온도 조건으로 변성 시킨 후, 처리조건에 따라 불안정한 cfDNA의 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 56은 돌연변이 세포주에서 얻은 fDNA를 여러가지 온도 조건으로 변성 시킨 후, 처리조건에 따라 불안정한 cfDNA의 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 57은 돌연변이 세포주에서 얻은 fDNA를 DNase로 37℃, 30분간 처리 후, 처리조건에 따라 불안정한 cfDNA의 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 58은 돌연변이 세포주에서 얻은 fDNA를 DNase로 37℃, 60분간 처리 후, 처리조건에 따라 불안정한 cfDNA의 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 59는 돌연변이 세포주에서 얻은 fDNA를 DNase로 37℃, 120분간 처리 후, 처리조건에 따라 불안정한 cfDNA의 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 60은 DNase의 활성에 따른 불안정한 cfDNA와 안정한 cfDNA의 차이점을 확인하기 위하여, DNase 1 ㎕ 또는 2 ㎕를 24℃ 120분간 처리한 결과를 나타낸 것이다.
도 61은 DNase의 활성에 따른 불안정한 cfDNA와 안정한 cfDNA의 차이점을 확인하기 위하여, DNase 1 ㎕ 또는 2 ㎕를 3℃ 120분간 처리한 결과를 나타낸 것이다.

<용어의 정의>

본 명세서에서 사용된 용어, "세포유리(cell-free) DNA"는 cfDNA로도 불린다. 또한, cfDNA는 종양 세포에서 기인하여 암 환자로부터 유래된 소변, 뇌척수액, 혈장, 혈액, 또는 체액 등의 생물학적 시료에서 발견될 수 있는 암세포 유래 DNA인 순환 종양 DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)일 수도 있다. 또한, 소변, 뇌척수액, 흉수, 복수, 혈장, 혈액, 타액, 객담, 또는 체액 등의 생물학적 시료 내에 cfDNA가 존재할 수 있다. 이때, cfDNA는 80 bp 내지 10 kbp, 100 bp 내지 1 kbp, 120 bp 내지 500 bp의 크기를 가질 수 있다. 또한, cfDNA는 150 bp 내지 200 bp의 크기를 가질 수 있으며, 통상, 165 bp 내지 170 bp의 크기를 가질 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "불안정한 cfDNA"는 "안정한 cfDNA"에 비해 열역학적으로 불안정한 cfDNA를 의미한다. 즉, 안정한 cfDNA가 변성이 되는 조건보다 덜 가혹한 조건에서 불안정한 cfDNA는 변성이 될 수 있다. 상기 불안정한 cfDNA가 생성되는 이유는 불안정한 cfDNA는 불안정한 이중 나선 구조를 가지기 때문이다.

본 명세서에서 사용된 용어, "불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA"는 안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA에 비해 낮은 Tm 값을 갖거나, 안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA가 변성되지 않는 조건에서 변성이 되는 것을 특징으로 한다. 상기 Tm은 녹는 온도(melting temperature)를 뜻하며, 이중 가닥 DNA의 50%가 단일 가닥 DNA로 바뀌는 온도를 의미한다. Tm 값은 DNA의 길이에 비례하고, 뉴크레오티드 서열에 따라 상이할 수 있다. 다만, 게놈 DNA는 많은 수의 뉴클레오티드가 수소 결합을 하고 있으므로, 92℃ 내지 95℃로 5분 이상 가열하거나, 98℃에서 2분 이상 가열해야 한다. 또한, 90℃보다 낮은 온도에서는 게놈 DNA는 변성(denaturation)이 용이하게 일어나지 않는다. 이때, 안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA는 평균 170 bp의 뉴클레오티드를 가지므로, 게놈 DNA와 유사한 Tm 값을 가질 수 있다.

그러나, 상기 "불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA"는 안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA 보다 낮은 Tm 값을 가진다. 따라서, 안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA를 i) 상온에서 1분 내지 120분 방치하는 조건; ii) 90℃ 내지 95℃에서 1초 내지 3분간 가열하는 조건; iii) 75℃ 내지 90℃에서 1초 내지 5분간 가열하는 조건; iv) 60℃ 내지 75℃에서 30초 내지 60분간 가열하는 조건; v) 25℃ 내지 40℃에서 10분 내지 120분 가열하는 조건; vi) 프로테아제로 10초 내지 30분 처리하는 조건; 및 vii) DNase로 10초 내지 30분 처리하는 조건으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 조건으로 변성을 시킨 후에 15머 내지 30머 프로브와 결합 반응을 수행하였을 때, 안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA는 상기 프로브와 결합을 하지 않는다. 이때, "상온"은 실온을 의미하며, 18℃ 내지 25℃일 수 있다. 또한, 상기 조건 외에도 40℃ 내지 65℃에서 5분 내지 80분간 가열하는 조건을 더 포함할 수 있다.

그러나, 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA는 상술한 i) 내지 vii) 중 어느 하나의 조건으로 처리한 후, 15머 내지 30머 프로브와 결합 반응을 수행하였을 때, 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA는 상기 프로브와 결합을 하는 것을 확인하였다. 이때, 상기 프로브는 15머 내지 30머 또는 20머 내지 25머일 수 있으며, 21머, 22머, 23머, 24머의 프로브일 수 있다.

이때, 상기 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA는 순환 종양 DNA(circulating tumor DNA, 이하 ctDNA)일 수 있다. 또한, 상기 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA란 정상 세포에는 존재하지 않는 손상된 핵산 서열에서 유래한 cfDNA일 수 있다. 이때, 상기 정상 세포에는 존재하지 않는 손상된 핵산 서열은 유전자의 일부가 결실(deletion), 복제(duplication), 역위(inversion) 또는 전좌(translocation)된 구조적 이상을 포함할 수 있다. 또한, 핵산의 일부가 미스매치(mis-match)된 구조적 이상을 포함할 수 있으며, 핵산의 일부 서열에 변이가 생긴 SNV(single nucleotide variation)일 수 있다. 상기 손상된 핵산 서열은 EGFR, KRAS, BRAF, TP53, PIK3CA, ROS1, RET, c-Met, PTEN, RB1, AR, BRCA, KIT, FGFR, BRCA, IDH, ESR1, HER2, ALK-EML4 및 TMPRSS2-ERG으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자가 변이된 서열을 가지는 것일 수 있다.

구체적으로, 정상 세포에는 존재하지 않는 손상된 핵산 서열은 1) 단일가닥의 절단, 2) 이중가닥의 절단, 3) DNA 복제중 멈춤(stalled replication fork), 4) 미스매치된 핵산, 5) 염색체 이상(chromosomal aberration), 6) 가닥내의 크로스링크(intra-strand crosslink), 7) 가닥간 크로스링크(inter-strand crosslink), 8) 외부 유전자의 삽입, 9) 유전자 일부의 결실, 10) 일부 핵산의 치환, 11) 핵산의 역위(inversion), 12) 티미딘 다이머 형성, 13) 디아미네이션, 14) 유전자 중복(duplication), 15) 염색체 전좌(translocation) 또는 16) 염기 결핍(AP site) 중 어느 하나 일 수 있다. 특히, 종양 세포의 경우 이중가닥 DNA(dsDNA)가 손상되는 경우가 많으며, 상기 손상된 dsDNA는 종양 세포에서 발견되는 특이적인 구조를 포함할 수 있다. 특히, 핵산의 미스매치에 의해 워블 염기쌍(wobble base pair)을 가지는 것일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "프로브(probe)"는 타겟 cfDNA를 검출하기 위한 DNA 또는 RNA를 의미한다. 프로브는 불안정한 cfDNA에 상보적인 결합을 할 수 있도록 디자인된 서열을 가질 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어, "cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브"는 혈장에 존재하는 검출하기를 원하는 목적 이중 나선 구조의 cfDNA에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 서열을 갖는 프로브를 의미한다.

이때, 프로브는 두가지 방식으로 제작될 수 있다. 하나는 유전자에 손상이 일어난 부분에 결합할 수 있도록 디자인된 제1 프로브(이하 CP라 함)이며, 다른 하나는 손상된 부분의 주변에 결합할 수 있도록 디자인된 제2 프로브(이하 DP라 함) 일 수 있다. DP는 표적이 되는 DNA 서열 또는 손상이 일어난 영역으로부터 10 bp 내지 100 bp, 20 bp 내지 50 bp 떨어진 위치의 서열에 특이적으로 결합하도록 디자인 될 수 있다.

본 명세서에서는 제1 프로브 및 제2 프로브를 동시에 사용하거나, 제1 프로브 또는 제2 프로브를 각각 사용하여도 손상된 cfDNA를 효과적으로 검출할 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 프로브는 표지자와 결합하기 위하여 바이오틴과 같은 물질이 결합된 형태일 수 있다. 또는 상기 프로브는 표지자가 직접 결합되거나, 링커를 통해 결합된 것일 수 있다. 이때, 표지자는 나노입자, 형광염료, 형광단백질 또는 효소 일 수 있다. 또한, 상기 프로브는 표지자와 동시에 첨가될 수 있으며, 순차적으로 첨가될 수 있다.

본 발명의 일 구체예로 타겟 cfDNA에 상보적인 결합을 할 수 있는 프로브는 하기 암세포에 특이적인 서열을 포함하는 영역에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 난소암 또는 유방암에 특이적인 서열의 경우 BRCA1 exon 7, BRCA1 exon 10, BRCA1 exon 11, BRCA1 exon 15에 존재하는 SNP일 수 있다. 또한, 위암에 특이적으로 서열의 경우에는 TP53, 대장암은 MSH2에 존재하는 SNP일 수 있다. 폐암에 특이적으로 서열의 경우 EGFR에 존재하는 SNP일 수 있다. 또한, 간암에 특이적으로 서열의 경우에는 FGFR3에 존재하는 SNP에서 선택될 수 있다.

유전자	암 종류	정상세포	암세포
BRCA1 Exon 7	난소암/ 유방암	608:CAAAGTATGGGCTACAGAAACCGTGCCAAAAG (서열번호 33)	608:CAAAGTATGGGCTTCAGAAACCGTGCCAAAAG (서열번호 34)
BRCA1 Exon 10		1615:TGGGAAAACCTATCGGAAGAAGGCAAGCCTCC (서열번호 35)	1615:TGGGAAAACCTATCGGTAGAAGGCAAGCCTCC (서열번호 36)
BRCA1 Exon 11		3845:GGGGCCAAGAAA-TTAGAGTCCTCAGAAGAG (서열번호 37)	3845:GGGGCCAAGAAAATTAGAGTCCTCAGAAGAG (서열번호 38)
BRCA1 Exon 15		7466:ATATACAGGATATGCGAATTAAGAAGAAACAAA (서열번호 39)	7466:ATATACAGGATATGTGAATTAAGAAGAAACAAA (서열번호 40)
TP53	위암	125:TAGGAGGCCGAGCTCTGTTGCTTCGAACTCCA (서열번호 41)	125:TAGGAGGCCGAGCTCT-TTGCTTCGAACTCCA (서열번호 42)
MSH2	대장암	126:TGAGGAGGTTTCGACATGGCGGTGCAGCCGA (서열번호 43)	126:TGAGGAGGTTTCGACCTGGCGGTGCAGCCGA (서열번호 44)
EGFR	폐암	2137:AAAAAGATCAAAGTGCTGGGCTCCGGTGCGTT (서열번호 45)	2137:AAAAAGATCAAAGTGCTGAGCTCCGGTGCGTT (서열번호 46)
FGFR3	간암	1771:ATCCTCTCTCTGAAATCACTGAGCAGGAGAAAG (서열번호 47)	1771:ATCCTCTCTCTGAAATCACTGCGCAGGAGAAAG (서열번호 48)

본 명세서에서 사용된 용어, "분리된 생물학적 시료"는 인체로부터 분리된 소변, 타액, 뇌척수액, 흉수, 복수, 혈장, 혈액, 객담 또는 체액 시료를 의미한다. 상기 분리된 생물학적 시료는 인체에서 분리된 액상 시료일 수 있다. 이때, 혈장은 혈액에서 수득될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "양전하를 띠는 물질"은 나노입자, 나노와이어, 망구조 또는 필터의 형태로 이용할 수 있으나, 그 형상에 제한되는 것은 아니다. 상기 "양전하를 띠는 물질"의 일 구체예로는 양전하를 띠는 나노와이어 또는 양전하를 띠는 멤브레인일 수 있다. 상기 나노와이어는 전도성 고분자를 이용하여 제조할 수 있다. 상기 전도성 고분자는 폴리아세틸렌(poly(acetylene)), 폴리피롤(poly(pyrrole)), 폴리티오펜(poly(thiophene)), 폴리파라페닐렌(poly(para-phenylene)), 폴리(3,4,-에틸렌디옥시테오펜(poly(3,4-ethylenedioxythiophene)), 폴리페닐렌설파이드(poly(phenylene sulfide)), 폴리(파라-페닐렌비닐렌)(poly(para-phenylene vinylene)) 및 폴리아닐린(polyaniline)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다. 제작 방법에 따라 길이 및 직경이 적절히 조절될 수 있으나, 일 실시예로는 직경은 200 nm을 가지며, 길이는 18 ㎛를 가지는 나노와이어일 수 있다. 또한, 상기 나노와이어는 제작시 바이오틴을 포함할 수 있다.

상기 나노와이어의 표면은 양이온 고분자에 의해 개질될 수 있다. 상기 양이온성 고분자는 그 종류에 제한이 없다. 양이온성 고분자의 일 구체예로는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI) 또는 폴리라이신(polylysine, PLL)일 수 있다. 또한, 양이온성 가지형 고분자 폴리에틸렌이민(cationic branched polymer polyethyleneimene)일 수 있다. 이러한 양이온성 고분자로 개질된 나노와이어는 표면이 양전하를 띨 수 있다.

일 구체예로 양전하를 띠는 나노와이어는 낮은 농도에서도 효율적으로 cfDNA를 성공적으로 포집할 수 있다. 특히, DNA 등의 표적 분자와의 결합을 위한 넓은 표면적, DNA와의 상호 작용 촉진을 위한 향상된 이동성과 같은 나노와이어의 특징으로 인해, 효과적으로 cfDNA를 포집할 수 있다.

본 명세서 사용된 용어, "표지자"는 불안정한 이중 나선 구조를 가진 cfDNA를 효과적으로 검출하기 위한 물질로서, 구체적으로, 양자점, 특정 기질을 분해하여 발색 반응을 나타내게 하는 물질, 특정 파장을 조사했을 때 발광을 나타내게 하는 물질 등일 수 있다. 구체적으로, 형광 단백질로 GFP(Green Fluorescent Protein). YFP(Yellow Fluorescent Protein), RFP(Red Fluorescent Protein) 또는 CFP(Cyan Fluorescent Protein)일 수 있다. 또는 HRP(Horseradish peroxidase)와 같이 ABTS, OPD, AmplexRed, DAB, AEC, TMB, Homovanillic acid 및 Luminol로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 기질을 색이 있는 물질로 전환시킬 수 있는 물질일 수 있다.

상기 표지자는 프로브에 결합할 수 있는 물질을 추가적으로 포함할 수 있다. 구체적으로, 프로브에 바이오틴이 결합되어 있는 경우, 상기 표지자는 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin) 또는 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 더 포함할 수 있다. 이러한 표지자의 일 구체예로는 전도성 고분자 및 히알루론산으로 구성된 나노입자에 스트렙타비딘 및 HRP를 결합시킨 나노입자의 형태로 이용될 수 있다. 이때, 상기 전도성 고분자는 상술한 바와 같으며, 바람직하게는 폴리피롤일 수 있다. 또 다른 구체예로는 전도성 고분자 및 히알루론산으로 구성된 나노입자에 스트렙타비딘 및 형광단백질이 결합된 나노입자의 형태로 이용될 수 있다.

<불안정한 cfDNA 검출 방법>

본 발명의 일 측면으로, 시료로부터, 증폭없이, 불안정한 세포유리 DNA를 표지자가 결합된 프로브와 혼합하는 단계를 포함하는 불안정한 cfDNA를 검출하기 위한 방법을 제공한다.

이러한 불안정한 cfDNA는 종양에서 유래한 순환 종양 DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)일 수 있다. 이때, 상기 ctDNA는 상술한 바와 같이 손상된 유전자 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 ctDNA는 발현이 매우 활발히 일어나는 유전자로부터 분리된 것일 수 있다. 이때, 상기 시료는 생물학적 시료일 수 있으며, 인체로부터 분리된 시료일 수 있다. 구체적으로, 상기 시료는 소변, 뇌척수액, 혈장, 혈액, 흉수, 복수, 타액, 객담, 또는 체액 일 수 있다.

따라서, 상기 불안정한 cfDNA는 시료를 다음과 같은 조건으로 처리하는 단계를 통해 프로브와의 반응성 면에서, 안정한 cfDNA와 차별화 될 수 있다. 구체적으로, i) 상온에서 1분 내지 120분 방치하는 조건; ii) 90℃ 내지 95℃에서 1초 내지 3분간 가열하는 조건; iii) 75℃ 내지 90℃에서 1초 내지 5분간 가열하는 조건; iv) 60℃ 내지 75℃에서 30초 내지 30분간 가열하는 조건; v) 25℃ 내지 40℃에서 10분 내지 120분 가열하는 조건; vi) 프로테아제로 1분 내지 30분 처리하는 조건; 및 vii) DNase로 1분 내지 30분 처리하는 조건에서 선택되는 어느 하나의 조건 일 수 있다. 상기 프로브는 15머 내지 30머, 20머 내지 25머의 뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 이때, 상기 프로브는 불안정한 cfDNA의 유전자 서열과 상보적인 결합을 할 수 있도록 디자인 될 수 있다.

상기 조건으로 cfDNA를 처리하여도 안정한 cfDNA는 변성이 일어나지 않고, 강한 이중 가닥을 형성하고 있어, 프로브와 상보적인 결합을 하지 않는다. 그러나, 불안정한 cfDNA는 상기 조건으로 처리시, 프로브와 결합할 수 있다. 이러한 불안정성은 cfDNA의 일부 뉴클레오티드가 상보적인 결합을 하지 못하여, 이중 나선 구조가 변화되었기 때문이다.

본 발명은 또 다른 측면으로, 시료로부터, 증폭없이, 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA를 검출하기 위한 방법을 제공한다. 이때, 상기 방법은 a) cfDNA가 포함된 시료 및 양전하를 띠는 물질을 혼합하는 단계; b) cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질을 분리하는 단계; c) 상기 혼합물에 프로브와 표지자를 혼합하는 단계; d) cfDNA에 결합하지 않은 프로브 및 표지자를 제거하는 단계; 및 e) 표지자를 검출하는 단계를 포함한다.

구체적으로, 상기 방법은 구체적으로, cfDNA가 포함된 시료 및 양전하를 띠는 물질을 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.

시료는 상술한 바와 같이 생물학적 시료일 수 있다. 구체예로 혈장이나 소변일 수 있다. 혈장이나 소변에는 정상 이중 나선 구조를 가진 cfDNA와 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA가 혼재되어 존재할 수 있다. 또한, 양전하를 띠는 물질은 구체적으로 양전하를 띠는 나노와이어일 수 있다. 양전하를 띠는 나노와이어는 상술한 바와 같다.

상기 단계는 구체적으로 다음과 같은 순서 및 조건으로 수행될 수 있다. 먼저, 환자의 혈장, 소변, 침 또는 가래 등을 받은 즉시, 4℃, 3000ⅹg, 10분간 원심분리한다. 그 후, 환자의 혈장, 소변, 침 또는 가래 등을 DPBS에 일정한 비율로 희석한다. 그 후, 혈장의 경우, 혈장 30 ㎕를 120 ㎕ DW(distilled water)에 섞어서 스핀 컬럼(spin column)(Type G 또는 Type Q)에 넣고, 폴리에틸렌 이민으로 표면 개질된 폴리피롤(PEI/Ppy) 나노와이어(20 μl)를 첨가하여 서모믹서(thermomixer)를 이용하여 실온에서 1,200 rpm의 속도로 20분간 혼합한다.

그 다음으로는, cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질을 분리하는 단계를 포함할 수 있다.

양전하를 띠는 물질을 분리하는 방법은 원심분리 또는 진공과 같은 음압을 주는 방식으로 수행할 수 있다. cfDNA가 양전하를 띠는 물질에 결합된다. 따라서, 양전하를 띠는 물질과 혼합된 시료를 스핀 컬럼 또는 배큠 컬럼(vacuum column)에 넣고, 원심분리 또는 음압을 줄 경우, 상기 나노와이어와 같은 양전하를 띠는 물질은 컬럼 내에 있는 필터를 통과하지 못하지만, 다른 생물학적 시료들은 통과하게 된다. 따라서, 원심분리나 진공과 같은 방법을 통하여 cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질을 분리할 수 있다. 또한, 이렇게 분리된 나노와이어에서 불순물을 제거하기 위하여 추가적으로 세척 단계를 1 내지 3회 수행할 수 있다. 상기 세척 방법은 종래의 방법을 적절히 이용할 수 있다.

상기 단계는 구체적으로 다음과 같은 순서 및 조건으로 수행될 수 있다. 스핀 컬럼(Spin column)을 진공(vacuum)을 주는 장치에 장착한 후 550 mBar에서 석션(suction)을 수행한다. 세척을 위해서 400 ㎕의 1xDPBS를 넣고 다시 석션을 수행한다. 같은 과정을 1회 더 반복할 수 있다.

일 구체예로, 온도 처리를 할 경우 95℃로 예열되어 있는 히트 블럭에 석션이 완료된 스핀 컬럼을 넣고, 95℃에서 1분간 인큐베이션을 수행한 후 바로 꺼낼 수 있다. 온도 변성 단계가 필요 없는 조건의 샘플들은 이 과정을 거치지 않을 수 있다.

그 다음으로는 상기 혼합물에 프로브와 표지자를 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.

프로브는 상술한 바와 같이 15머 내지 30머, 20머 내지 25의 뉴클레오티드로으로 구성된 프로브일 수 있다. 프로브의 서열은 검출하고자 하는 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA에 상보적으로 결합할 수 있도록 디자인 될 수 있다. 특히, 불안정한 이중 나선 구조의 cfDNA는 종양 유래의 ctDNA일 수 있다. 또한, 상기 불안정한 이중 나선 구조의 cfDNA는 암의 바이오마커로 알려진 유전자에 상보적으로 결합할 수 있도록 디자인 될 수 있다.

또한, 상기 표지자는 형광 단백질이나 HRP와 같은 특정 조건에서 검출할 수 있는 물질일 수 있다. 이때, 표지자는 프로브와 결합할 수 있는 물질을 포함할 수 있다. 구체적으로, 표지자에 바이오틴이 결합되어 있다면, 상기 표지자는 아비딘이나 스트렙타비딘이 결합되어 있을 수 있다. 일 구체예로, 검출 감도를 높이기 위해서, 표지자는 여러 개의 HRP와 여러 개의 스트렙타비딘이 응집된 나노입자 형태를 가질 수 있다.

상기 단계는 구체적으로 다음과 같은 순서 및 조건으로 수행될 수 있다. 실험에 맞는 프로브(200 μl) 및 HRP/STR 나노입자 용액(200 μl)를 스핀 컬럼에 각각 넣는다. 실온에서 850 rpm 내지 1,000 rpm의 속도로 30분간 혼합한다.

그 다음으로는, cfDNA에 결합하지 않은 프로브 및 표지자를 제거하는 단계를 포함할 수 있다.

이 단계는 cfDNA에 결합하지 않은 프로브를 제거하는 단계이다. 15머 내지 30머의 프로브도 음전하를 띠고 있어, 양전하를 띠는 나노와이어에 결합될 수 있다. 따라서, 혼합 반응을 마친 후에는 잔여 프로브 및 표지자를 반응액에서 제거하여야 한다. 이때, 프로브 및 표지자는 원심분리 또는 음압을 이용하여 제거할 수 있다. 이때, cfDNA는 짧은 가닥의 프로브에 비해 양전하를 띠는 물질, 구체적으로 양전하를 띠는 나노와이어에 강하게 결합되어 있어, 프로브 및 표지자를 제거하는 단계 수행시, cfDNA는 양전하를 띠는 물질에 결합되어 제거되지 않게 된다.

상기 단계의 일 실시예는 구체적으로 다음과 같은 순서로 수행될 수 있다. 상기 단계를 수행한 후, 스핀 컬럼에 음압을 주고, 석션을 수행한다. 그 후, 400 ㎕의 1x DPBS를 넣고 다시 석션을 수행하고, 같은 과정을 1회 더 반복할 수 있다.

마지막으로, 표지자를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

표지자를 검출하는 방법은 사용한 표지자에 따라 다르게 수행할 수 있다. 상기 표지자의 검출은 색깔 변화, UV 흡광도 변화, 형광반응 변화, 또는 전기화학적 변화에 의해 측정되는 것일 수 있다. 예를 들어, HRP를 표지자로 사용한 경우에는 발색반응을 관찰하여 표지자를 검출할 수 있다. 또한, 표지자가 GFP와 같은 형광단백질일 경우에는 특정 파장의 빛을 조사한 후 검출되는 빛을 관찰하여 표지자의 존재 여부를 검출할 수 있다.

상기 단계의 일 실시예는 구체적으로 다음과 같은 순서로 수행될 수 있다. 스핀 컬럼에 200 ㎕ 소디움 아세테이트 버퍼(sodium acetate buffer)(0.2 M, pH 7.0), 50 ㎕ TMB(10 mM), 50 ㎕ H₂O₂(0.1 M)을 순차적으로 스핀 컬럼에 첨가한 후 3분간 인큐베이션을 수행한다. 그 후, 3,500 rpm 내지 5,000 rpm 속도로 30초 동안 원심분리를 수행한다. 수거 튜브(Collection tube)에 모인 용액을 200 ㎕씩 96 well로 옮긴 후, UV/VIS 스펙트로포토미터(spectrophotometer)를 이용하여 500 nm 내지 850 nm 파장대의 흡광도를 측정한다.

또한, 추가적으로, 정상 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA와 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA가 프로브와의 반응성 차이를 크게 하기 위하여, 추가적인 과정을 더 포함할 수 있다. 추가적인 처리 과정은 시료를 수득한 다음에 수행하거나, cfDNA를 분리한 후 수행할 수 있다.

추가적으로, 상기 c) 단계 이전에 시료 또는 양전하를 띠는 물질에 결합된 cfDNA를 i) 상온에서 1분 내지 10분 방치하는 조건; ii) 90℃ 내지 95℃에서 1초 내지 1분간 가열하는 조건; iii) 75℃ 내지 90℃에서 10초 내지 3분간 가열하는 조건; iv) 60℃ 내지 75℃에서 1분 내지 30분간 가열하는 조건; v) 25℃ 내지 40℃에서 5분 내지 60분간 가열하는 조건; vi) 프로테아제로 1분 내지 10분 처리하는 조건; 및 vii) DNaseI로 1분 내지 10분 처리하는 조건으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 조건에서 변성시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 변성 과정은 안정한 cfDNA는 변성시키지 않으나, 불안정한 cfDNA는 더욱 불안정하게 변성시킴으로서, 프로부와의 결합을 더욱 용이하게 할 수 있다. 상기 변성 조건은 시료를 수득한 후 수행할 수 있다. 또한, 상기 변성은 양전하를 띠는 물질에 결합된 cfDNA를 수득한 후 수행할 수 있다. 또한, 온도, 프로테아제 및 DNase 처리 시간은 안정한 cfDNA를 변성시키지 않는 한 적절히 조정될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 별도의 변성 단계 없이도 타겟 프로브를 이용하여 검출하고자 하는 불안정한 이중나선구조 cfDNA를 검출할 수 있음을 확인하였다(도 31). 그러나 온도 처리 과정을 거칠 경우에도 여전히 동일한 프로브에 대하여, 안정한 이중 나선 구조 cfDNA와 불안정한 이중 나선 구조 cfDNA가 다른 결합 반응을 보임을 확인하였다(도 32 및 도 33).

<불안정한 cfDNA 검출을 통한 진단을 위한 정보 제공 방법>

본 발명의 또 다른 측면은, 시료로부터, 증폭없이, 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA를 검출함으로써, 암 및 감염성 질환을 진단 또는 예측하기 위한 정보를 제공하기 위한 방법을 제공한다. 이때, 상기 방법이 a) cfDNA가 포함된 시료 및 양전하를 띠는 물질을 혼합하는 단계; b) cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질을 분리하는 단계; c) 상기 혼합물에 프로브와 표지자를 혼합하는 단계; d) cfDNA에 결합하지 않은 프로브 및 표지자를 제거하는 단계; e) 표지자를 검출하는 단계; 및 f) 표지자가 검출되면 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA에 상응하는 유전자와 관련된 암 또는 감염성 질환이 있다고 결정하는 단계를 포함한다. 구체적으로, 불안정한 cfDNA를 검출하는 방법은 상술한 바와 같다.

본 명세서에서 사용된 암의 일 구체예는 방광암, 골암, 혈액암, 유방암, 흑색종양, 갑상선암, 부갑상선암, 골수암, 직장암, 인후암, 후두암, 폐암, 식도암, 췌장암, 대장암, 위암, 설암, 피부암, 뇌종양, 자궁암, 두부 또는 경부암, 담낭암, 구강암, 결장암, 항문 부근암, 중추신경계 종양, 간암 및 대장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 일 수 있다. 특히, 위암, 대장암, 간암, 폐암 또는 유방암 일 수 있다.

일 구체예로 상기 암세포에 특이적으로 존재하는 서열은 암세포에 존재하는 SNP일 수 있다. 상기 암에 존재하는 특이적으로 존재하는 서열의 일 구체예는 위암의 경우 종양 억제 유전자로 알려진 p53과 PTEN의 돌연변이 일 수 있다. 또한, 대장암의 경우 APC와 MSH2 유전자의 돌연변이 일 수 있다. 또한, 간암은 HBV, HCV 바이러스의 감염이 주요 원인이므로, HBV(Hepatitis B virus) 또는 HCV(Hepatitis C virus)의 핵산이 타겟이 될 수 있다. 또한, 폐암은 EGFR(Epidermal growth factor receptor) 유전자의 돌연변이가 타겟이 될 수 있으며, 유방암은 BRCA1/2 유전자의 변이가 주요 타겟일 수 있다. 또한, 자궁경부암의 경우에는 인유두종 바이러스 DNA(human papillomavirus DNA, HPV DNA) 유래의 cfDNA가 타겟이 될 수 있다.

상기 불안정한 dsDNA의 또 다른 구체예는 EGFR, KRAS, BRAF, TP53, PIK3CA, ROS1, RET, c-Met, PTEN, RB1, AR, BRCA, KIT, FGFR, BRCA, IDH, ESR1, HER2, ALK-EML4 및 TMPRSS2-ERG으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자 변이인 것일 수 있다.

<불안정한 cfDNA 검출 장치>

본 발명의 또 다른 측면은, a) cfDNA가 포함된 시료 및 양전하를 띠고 있는 나노와이어를 혼합시키는 혼합부; b) cfDNA가 결합된 나노와이어를 제외한 시료를 제거하기 위한 수득부; c) 상기 cfDNA가 결합된 나노와이어에 상기 cfDNA에 상보적으로 결합할 수 있는 바이오틴이 결합된 프로브; 및 스트렙타비딘 및 표지자를 포함하는 나노입자를 첨가시키는 반응부; d) 표지자를 검출하는 검출부; 및 e) 표지자의 검출여부에 따라 시료에 검출 프로브에 상보적인 서열을 가지며, 상온에서 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA가 존재한다고 결정하는 정보 처리부를 포함하는, 상온에서 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA를 검출하는 장치를 제공한다.

<불안정한 cfDNA 검출을 통한 진단 장치>

본 발명의 또 다른 측면은, 시료로부터, 증폭없이, 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 세포유리 DNA를 검출함으로써, 암 또는 감염성 질환을 진단 또는 예측하기 위한 정보를 제공하기 위한 장치를 제공한다. 이때, 상기 장치는 a) cfDNA가 포함된 시료 및 양전하를 띠고 있는 나노와이어를 혼합시키는 혼합부; b) cfDNA가 결합된 나노와이어를 제외한 시료를 제거하기 위한 수득부; c) 상기 cfDNA가 결합된 나노와이어에 상기 cfDNA에 상보적으로 결합할 수 있는 바이오틴이 결합된 프로브; 및 스트렙타비딘 및 표지자를 포함하는 나노입자를 첨가시키는 반응부; d) 표지자를 검출하는 검출부; 및 e) 표지자의 검출여부에 따라 시료에 검출 프로브에 상보적인 서열을 가지며, 상온에서 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA가 존재한다고 결정하는 정보 처리부를 포함한다.

본 발명은 안정한 cfDNA와 불안정한 cfDNA의 열역학적 안정성의 차이에 따른 프로브와의 반응성 차이점을 기반으로 한다. 이때, 양전하를 띠는 나노와이어는 게놈 DNA 및 cfDNA와 결합을 할 수 있으나, 결합력과 크기의 차이로 인해 세척시 게놈 DNA는 양전하를 띠는 나노와이어에서 분리된다. 또한, 일 구체예에서 나노와이어를 개질시킬 때, 바이오틴을 포함할 수 있다. 그러나, 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민으로 나노와이어의 표면을 개질시키는 과정에서, 나노와이어에 포함되고, 나노와이어 표면에 노출된 바이오틴은 양이온성 고분자와 결합을 하게 된다. 또한 양이온성 고분자로 나노와이어가 코딩이 되어, 스트렙타비딘을 포함하는 표지자가 나노와이어에 결합하지 않게 된다. 또한, 프로브도 음전하를 띠어 양이온을 띠는 나노와이어에 결합될 수 있으나, cfDNA에 비하여 결합력이 약하여 세척과정에서 프로브는 제거됨을 확인하였다.

또한, 안정한 cfDNA 및 불안정한 cfDNA에, 손상된 DNA 서열을 포함하는 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브(CP)와 손상된 DNA 서열을 포함하지 않는 주변 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브(DP)를 처리한 결과, 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA와 안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA가 프로브에 대한 결합 반응이 상이함을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통해, 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA는 손상된 DNA 서열에 특이적인 프로브 뿐 아니라, 주변 DNA 서열에 특이적으로 결합이 가능한 프로브와도 결합할 수 있음을 확인하였다. 뿐만 아니라, 상기 프로브 중 어느 하나의 프로브만으로도 불안정한 cfDNA를 검출할 수 있다는 점을 확인하였다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

I. 실험 방법, 나노와이어, 표지자 및 프로브 제조

실험방법 1. 불안정한 cfDNA를 검출하는 방법

1 단계 : 샘플 준비 및 나노와이어 추가

환자의 혈장, 소변, 침 또는 가래 등을 받은 즉시 3000ⅹg에서 4℃ 10분간 원심분리하였다. 환자의 혈장, 소변, 침 또는 가래 등을 DPBS에 일정한 비율로 희석하였다. 혈장의 경우, 혈장 30 ㎕를 120 ㎕ DW에 섞어서 스핀 컬럼(Spin column)(Type G 또는 Type Q) 에 넣고 PEI/Ppy 나노와이어(20 μl)를 첨가하여 thermomixer를 이용하여 실온에서 1,200 rpm의 속도로 20분간 혼합하였다.

2 단계 : Vacuum/Washing/온도변성

스핀 컬럼을 진공(vacuum) 흡입 장치에 장착한 후 550 mBar에서 석션을 수행하였다. 400 μl의 1x DPBS를 넣고 다시 석션을 하였다. 같은 과정을 1회 더 반복하였다. 2단계 스텝을 통하여 획득된 나노와이어-DNA 복합체만 스핀 컬럼에 걸렸다. 온도변성이 필요한 경우 95℃로 예열되어 있는 히트블럭(heating block)에 석션이 완료된 스핀 컬럼을 넣고, 95℃에서 1분간 인큐베이션한 후 바로 꺼냈다. 온도 변성 단계가 필요 없는 조건의 샘플들은 이 과정을 거치지 않는다.

3 단계 : 프로브 및 HRP/STR NPs 추가

실험에 맞는 프로브(200 μl 및 HRP/STR NPs solution(200 ㎕)를 스핀 컬럼에 각각 넣어주었다. 써모믹서(Thermomixer)를 이용하여 실온에서 850 rpm 내지 1,000 rpm의 속도로 30분간 혼합하였다. 스핀 컬럼을 진공 장치에 장착한 후 석션을 수행하였다. 400 ㎕의 1x DPBS를 넣고 다시 석션을 수행 하였다. 같은 과정을 1회 더 반복하였다.

4 단계 : 유전자변이 검출을 위한 TMB 반응

수거 튜브(collection tube)를 새 것으로 교체한 후, 스핀 컬럼에 200 ㎕ sodium acetate buffer(0.2 M, pH 7.0), 50 ㎕ H₂O₂(0.1 M)을 실린지 펌프(syringe pump)를 이용하여 차례대로 스핀 컬럼에 첨가한 후 3분간 인큐베이션을 수행하였다. 인큐베이션이 끝나면, 스핀 컬럼을 3,500 rpm 내지 5,000 rpm 속도로 30초동안 원심분리하였다. 수거 튜브(collection tube)에 모인 용액을 200 ㎕씩 96 well로 옮긴 후, UV/VIS 스펙트로포토미터(spectrophotometer)를 이용하여 500 nm 내지 850 nm 파장대의 흡광도를 측정하였다.

제조예 1. 양전하를 띠는 나노와이어 제조

도 1에 나타낸 바와 같이, 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI)이 표면에 접합된 나노와이어를 제조하였다. 양극산화 알루미늄(anodic aluminium oxide, AAO)의 한 면을 Q150T 모듈러 코팅 시스템(Quorum Technologies, UK)을 사용하여 5Х10^-3mbar 및 50 mA에서 600초 동안 금(Au) 층(약 150 ㎚ 두께)으로 코팅하였다. 모든 전기화학적 실험은 금(Au) 코팅된 AAO 주형에서 백금 와이어 상대 전극과 Ag/AgCl(3.0 M NaCl type) 비교 전극을 구비한 potentiostat/galvanostat(BioLogic SP-150)를 사용하여 측정하였다.

양이온성 고분자로 표면 처리된 나노와이어(PEI/Ppy NW)의 제조를 위해 AAO 주형의 기공에 0.01 M 폴리(4-스티렌설폰산)(poly(4-styrene sulfonic acid)) 및 1 ㎎/㎖ 의 바이오틴(biotin)을 함유하는 0.01 M 피롤용액과 함께 1.0 V(vs. Ag/AgCl)에서 7분 동안 크로노암페로메트리(chronoamperometry)를 적용하여 전기화학적 증착을 수행하였다.

생성된 AAO 주형을 증류수로 여러 번 세척하고, 2 M의 수산화나트륨(NaOH) 용액에 3시간 동안 담근 후, 초음파 처리를 위해(Bioruptor UCD-200, Diagenode)에 넣어 바이오틴 분자가 도핑된 프리-스탠딩 폴리피롤 나노와이어(free-standing Ppy NWs)를 얻었다. 그 후, 생성된 나노와이어에 30 mM N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride(EDC) 및 6 mM N-hydroxysuccinimide(NHS)를 첨가하여 카복실산(-COOH, carboxylic acid)기를 활성화하였다. 이후, PEI 용액을 첨가한 후 상온에서 1시간 동안 반응시키고, 물로 세척하였다. 폴리에틸렌이민이 표면에 접합된 나노구조체(PEI/Ppy NW)를 탈이온수에 분산시키고 사용할 때까지 실온에서 보관하였다.

이러한 제조방법으로 인해, AAO 주형이 선택적으로 용해된 후, 각각의 폴리피롤(Ppy) 나노와이어가 AAO 주형으로부터 방출되고, 나노와이어에 바이오틴-스트렙타비딘의 상호 작용을 통해 양이온성 분지형 폴리에틸렌이민(cationic branched PEI, 25 kDa)을 추가로 접합시켰다.

제조예 2. 양이온성 고분자로 표면처리된 나노입자(PEI/Ppy NP)의 제조

폴리에틸렌이민이 표면에 접합된 나노입자(PEI/Ppy NP)를 제조하기 위해, 폴리비닐피롤(polyvinylpyrrolidone, PVP) 0.2 g을 12.5 ㎖의 3차 증류수에 넣고 30분간 교반한 후, 65 ㎕의 피롤(pyrrole)을 넣고 10분간 더 교반하였다. 그 후, 0.75 g/㎖ 농도의 FeCl₃ 용액을 0.5 ㎖ 첨가하여 10분간 반응시켰다. 그 후, 히알루론산 수용액(400 mg/20 ㎖) 20 ㎖을 첨가하여 3시간 동안 교반시켰다.

MWCO: 50,000 pore-size의 멤브레인을 이용하여 3차 증류수에 2일간 투석한다. 큰 사이즈로 응집된 입자(particles aggregates)를 1,200 rpm으로 3분간 원심분리하여 제거한 후 동결건조시켰다. 200 ug의 Ppy-HA-NPs를 3차 증류수 1 ㎖에 넣은 후, 100 mM EDC/50 mM NHS 용액을 첨가하여 45분간 반응시켜 히알루론산의 카르복시 그룹을 활성화시켰다. 15,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하면서 세척을 2번씩 진행하였다.

이후, 100 mg의 1 ㎖의 PEI 용액(solvent : 0.2 M sodium bicarbonate)을 넣고 4℃에서 밤새도록 반응시켰다. 이후, 15,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액을 제거한 후 3차 증류수에 보관하였다. 폴리에틸렌이민이 표면에 접합된 나노입자(PEI/Ppy NP)의 형태는 주사전자현미경을 이용하여 관찰하였다. 도 6a에 나타낸 바와 같이, 주사전자현미경 이미지(스케일바 200 ㎛)로 평균 50 nm의 PEI가 접합된 나노입자(NP)의 형태를 확인하였다.

제조예 3. HRP 및 스트렙타비딘이 표지된 폴리피롤 나노입자 제조

HRP 및 스트렙타비딘을 포함하는 나노입자의 제조를 위해, 폴리비닐피롤(polyvinylpyrrolidone, PVP) 0.5 g을 12.5 ㎖의 3차 증류수에 넣고 30분간 교반한 후, 65 ㎕의 피롤(pyrrole)을 넣고 10분간 더 교반하였다. 그 후, 0.75 g/㎖ 농도의 FeCl₃ 용액을 0.5 ㎖ 첨가하여 3시간 반응시켰다. 그 후, 히알루론산 수용액(400 ㎎/20 ㎖) 20 ㎖을 첨가하여 3시간 동안 교반시켰다.

MWCO: 50,000 pore-size의 멤브레인을 이용하여 3차 증류수에 2일간 투석한다. 큰 사이즈로 응집된 입자(particles aggregates)를 1,200 rpm으로 3분간 원심분리하여 제거한 후 동결건조시켰다. 200 ㎍의 폴리피롤과 히알루론산을 포함한 나노입자(Ppy-HA-NPs)를 3차 증류수 1 ㎖에 넣은 후, 100 mM EDC/50 mM NHS 용액을 첨가하여 45분간 반응시켜 히알루론산의 카르복시 그룹을 활성화시켰다. 15,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하면서 세척을 2번씩 진행하였다. Ppy-HA-NPs에 1 ㎎의 HRP 및 1 ㎎의 스트렙타비딘을 첨가하여 4℃ 온도에서 혼합하였다. 이후, 15,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액을 제거한 후 3차 증류수에 보관하였다. HRP 및 스트렙타비딘이 표면에 접합된 나노입자(HRP/st-tagged NP)의 형태는 주사전자현미경을 이용하여 관찰하였다(도 4).

제조예 4. 프로브 제작

불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA를 검출하기 위하여 프로브를 제작하였다. 프로브 제작은 검출을 원하는 cfDNA에 따라 다르게 제작되었다. 이때, 상기 프로브는 바이오틴을 결합시켰다. 프로브는 불안정한 이중 나선 구조를 야기하는 손상된 DNA를 포함하는 영역에 상보적으로 결합하는 제1 프로브(이하, CP)와 손상된 DNA 주변 영역에 상보적으로 결합하는 제2 프로브(이하, DP) 두 종류로 제작하였다.

II. 두개의 프로브를 이용한 cfDNA 검출

실시예 1. 소변에 존재하는 HPV 유래 cfDNA 분석

소변시료에서 cell-free HPV DNA를 분리하기 위하여, 실시예 1에서 제조한 양이온성 고분자로 표면처리된 나노와이어(PEI/Ppy NW) 10 ㎍/㎖를 HPV 양성 환자의 소변 200 ㎕에 첨가하고 실온에서 30분 동안 혼합하였다. 분리된 cfDNA를 95℃에서 1분간 변성시켰다. 그 후, 1 pM의 말단에 바이오틴이 결합된 제1 프로브(CP)와 제2 프로브(DP)를 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시킨 다음, HRP(horseradish peroxidase) 및 스트렙타비딘이 표지된 폴리피롤 나노입자(polypyrrole nanoparticles)(이하, HRP/st-tagged NPs라고 함)를 시료에 넣고 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다.

이어서, HPV 유래 cfDNA에 10 mM 3,3′,5,5′-테트라메틸벤지딘(TMB)을 25 ㎕, 0.1 M H₂O₂을 25 ㎕, 및 0.2 M의 소디움 아세테이트 트리히드레이트 완충액(pH 5.0)을 200 ㎕를 첨가하였다. 어둠 속에서 DNA 샘플과 함께 실온에 3분간 반응시켰다. HPV DNA 농도와 흡광도 간의 상관관계를 확인하기 위하여, DU 730 UV-Vis 분광 광도계(Beckman Coulter, USA)를 사용하여 652 nm의 파장에서 UV-Vis 검출을 수행하였다.

그 결과, colorimetric signals를 육안으로 관찰할 수 있을 정도로 증폭시킨 결과를 확인할 수 있었다. HPV를 검출하기 위한 프로브 서열은 하기 표 2와 같다.

Probe label	Sequences	서열번호
HPV 16CP	5'-biotin-GAG GAG GAG GAT GAA ATA GAT GGT-3'	서열번호 1
HPV 16DP	5'-TTG GAA GAC CTG TTA ATG GGC-biotin-3'	서열번호 2
HPV 18CP	5'-biotin-CAC ATT GTG GCA CAA TCT TTT A-3'	서열번호 3
HPV 18DP	5'-GCC ATA TCG CTT TCA TCT GT-biotin-3'	서열번호 4
EGFR 19 deletion CP	5'-GGAATTAAGAGAAGCAACATCTCC-3'	서열번호 5
EGFR 19 deletion DP	5'-AACCTCAGGCCCACCTTTT-3'	서열번호 6
EGFR 21 L858R CP	5'-CCAGGAACGTACTGGTGAAAA-3'	서열번호 7
EGFR 21 L858R DP	5'-GGAAGAGAAAGAATACCATGCA-3'	서열번호 8

또한, PCR을 수반하지 않는 비색분석(PCR-free colorimetric assay)을 수행하여, HPV 양성 자궁경부암 환자(HPV16(+) 및 HPV18(+)), HPV 음성 건강대조군(HPV-)의 소변 표본을 평가하였다. 음성대조군으로는 PBS를 사용하였다. 그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 나노와이어를 사용하여 분리한 표적 HPV DNA에 CP 및 DP를 혼합하고, HRP/st-tagged NPs를 첨가한 후 색깔 변화를 관찰하였다. 분리된 cfDNA의 분석을 위하여 95℃에서 1분간 변성시켰다.

총 24개의 HPV 양성 및 HPV 음성 소변 샘플을 채취하여 시험한 결과, HPV 양성 자궁경부암 환자(HPV16(+) 및 HPV18(+)), HPV 음성 건강 대조군(HPV-), 및 소변에서 분리된 cfDNA가 서로 다른 흡광도 값을 갖는 것을 확인하였다(도 13). 이때, HPV16 또는 HPV18에 특이적으로 결합하는 프로브를 사용하였고, 분리된 cfDNA의 분석을 위하여 95℃에서 1분간 변성시켰다.

또한, EGFR 19 및 EGFR 21과 같은 non-HPV 프로브를 사용한 경우 반응은 관찰되지 않았으며, 표적 HPV와 그 상보적인 프로브 사이의 유형 특이적 결합 결과로서 색상 변화 및 UV 흡광도의 변화가 나타난다는 것을 알 수 있었다(도 14). 이때, 분리된 cfDNA의 분석을 위하여 95℃에서 1분간 변성시켰다.

실시예 2. 폐암 세포주의 DNA 분석을 통한 EGFR 유전자의 변이 확인

실시예 2.1. 나노와이어를 통해 수득 가능한 cfDNA 사이즈 확인

정상인의 혈장에 짧은 크기(10 bp 내지 100 bp), 중간 크기(100 bp 내지 2 kb), 긴 크기(3.5 kb 내지 21 kb)의 DNA ladder를 추가한 후 나노와이어(PEI/Ppy NW)를 이용한 회수 효율을 확인하였다. 나노구조체가 작은 크기의 DNA의 회수에 효율이 좋다는 점을 확인하였다(도 15).

나노와이어를 이용하여 H1975(EGFR exon 20 T790M, 21 L858R 유전자 변이를 갖는 세포주), HCC2279(EGFR exon 19 deletion 유전자 변이를 갖는 세포주), 및 A549 세포주(EGFR exon 유전자 변이가 없는 세포주)에서 유전자를 수득하였다. 그 후, 초음파 처리를 하지 않은 게놈 DNA(gDNA) 및 초음파 처리를 한 단편 DNA(fDNA)를 사용하여 나노구조체의 회수 효율을 비교한 결과, 나노구조체를 사용하면 gDNA 보다 fDNA의 회수 효율이 높음을 확인하였다(도 16 및 도 17).

실시예 2.2. 불안정한 cfDNA 분석을 통한 EGFR 변이 검출

PCR을 수반하지 않은 비색분석을 수행하여, EGFR exon 20, 21 양성 H1975 세포주 및 EGFR exon 19 양성의 HCC2279 세포주 및 EGFR 유전자 변이가 없는 A549 gDNA 및 fDNA를 나노구조체를 사용하여 분리하였다. 그 후, EGFR exon 19, 20, 및 21 프로브를 추가하여 혼합한 후, HRP/st-tagged NPs를 첨가하고 색깔 변화를 관찰하였다. 그 결과, 나노구조체는 작은 크기의 DNA, 즉 fDNA의 회수에 훨씬 효과적이었으며, gDNA와 비교하였을 때, 명확한 색깔 변화 및 UV-Vis 스펙트럼의 변화가 있음을 확인할 수 있었다(도 18 및 도 19).

실시예 2.3. 형광 염료를 이용한 cfFNA 검출

폐암 환자의 혈장 시료로부터 타겟 프로브를 이용하여 유전자 변이가 검출 가능한지 확인하기 위하여, 형광 염료를 이용하여 가능성을 확인하였다. H1975(EGFR exon 20 T790M, 21 L858R 유전자 변이를 갖는 세포주), HCC2279(EGFR exon 19 deletion 유전자 변이를 갖는 세포주), 및 A549 세포주(EGFR exon 유전자 변이가 없는 세포주)를 초음파 처리한 후 획득된 단편 DNA(fDNA)를 나노와이어를 통하여 회수하였다. 그 후, 95℃에서 1분간 변성을 시킨 후 EGFR19, 20, 및 21에 특이적인 프로브와 혼합시켰다. 프로브에 결합된 형광 염료(Alexa488)를 사용하여 세포주에 따른 유전자 변이를 확인하였다.

그 결과, A549 세포주에서는 EGFR 19 및 21 프로브를 반응시켰을 때 형광이 검출되지 않았다. 그러나, H1975 및 HCC2279에서는 상기 EGFR 19 및 20 프로브에 대한 형광이 검출됨을 확인할 수 있었다(도 20).

실시예 2.4. in vitro에서 cfDNA 분석을 통한 EGFR 유전자 변이 검출 가능 농도(Limit of detection, LOD) 확인

H1975(EGFR exon 20 T790M, 21 L858R 유전자 변이를 갖는 세포주) 및 HCC2279(EGFR exon 19 deletion 유전자 변이를 갖는 세포주)를 초음파 처리한 후 획득된 다양한 농도의 단편 DNA(fDNA; 1 ag ㎖^-1 to 100 ng ㎖^-1)를 건강한 사람의 혈장(200 ㎕)에 첨가한 후 나노와이어를 통하여 회수하였다. 그 후, 95℃에서 1분간 변성을 시킨 후 EGFR exon 19Del 및 EGFR exon 20 T790M에 특이적인 프로브와 HRP/st-tagged NPs를 사용하여 검출한계(LOD)를 확인한 결과, 3배의 신호잡음비(Signal to Noise ratio)를 적용할 경우, HCC2279 세포주의 fDNA 경우는 10 ag ㎖^-1, H1975 세포주 fDNA의 경우는 100 ag ㎖^-1 까지 검출이 가능함을 확인하였다(도 21 및 도 22).

실시예 3. 혈장 또는 뇌척수액 시료에 존재하는 cfDNA 분석을 통한 EGFR , KRAS, 및 ALK-EML4 유전자의 변이 확인 : 폐암 환자

실시예 3.1. 불안정한 cfDNA 분석을 통한 EGFR 유전자 변이 확인

일 구체예로, 암 환자의 체액 시료에서 나노구조체를 이용하여 cfDNA를 분리하고 프로브와 hybridization 및 HRP/st 나노입자와의 순차적인 결합을 통해 유전자 변이를 검출하는데 총 60분의 시간이 걸렸다(도 6).

혈장 또는 뇌척수액 시료에서 cfDNA를 분리하기 위하여, 200 ㎕의 EGFR 양성 환자의 혈장 및 PEI/Ppy NWs 5 μg/㎖를 실온에서 30분 동안 혼합하여 환자의 혈장에서 cfDNA를 추출한다. 200 ㎕의 폐암 환자의 혈장에서 PEI/Ppy NW를 사용하여 추출된 cfDNA의 크기를 Bioanalyzer를 통하여 분석하였다(도 23). 일반적으로, 암관련 cfDNA의 크기가 평균 166 bp라고 알려져 있는 것과 동일하게, 본 Bioanalyzer 실험에서 PEI/Ppy NW를 사용하여 폐암 환자의 혈장에서 cfDNA를 추출한 결과 169 bp에서 peak이 보이는 것을 확인하였다.

계속해서, 나노구조체에 포획된 DNA를 95℃에서 1분간 변성시켰고, 1 pM의 바이오틴이 결합된 CP 및 바이오틴이 결합된 DP를 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 그 후, HRP 및 스트렙타비딘 표지된 폴리피롤 나노입자(HRP/st-tagged NPs)를 시료에 넣고 37℃에서 30분간 반응시켰다.

그 후, 상기 반응액에 10 mM TMB를 25㎕, 0.1 M H₂O₂을 25 ㎕, 및 0.2 M 소디움 아세테이트 트리히드레이트 완충액(pH 5.0)을 200 ㎕를 첨가한 후 빛을 차단하고 실온에 3분간 반응시켰다. 그 후, DU 730 UV-Vis 분광 광도계(Beckman Coulter, USA)를 사용하여 652 nm의 파장에서 UV-Vis 검출을 수행하였다.

TMB의 산화반응을 통해 발생된 색의 차이를 육안으로 관찰하였다. EGFR exon 19 deletion, 20 T790M, 및 21 L858R의 변이된 cfDNA를 포획하고 검출하기 위한 프로브의 서열은 하기 표 3과 같다.

EGFR	프로브 sequences
EGFR exon 19 deletion-프로브1 (Target specific)	CP1: GGAATTAAGAGAAGCAACATCTCC(서열번호 9) DP: AACCTCAGGCCCACCTTTT(서열번호 10)
EGFR exon 19 deletion-프로브2 (Target non-specific)	CP2: AAAATTCCCGTCGCTATCAAG(서열번호 11) DP: AACCTCAGGCCCACCTTTT(서열번호 12)
EGFR exon 19 deletion-프로브3 (Target non-specific)	CP3: GGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAG(서열번호 13) DP: AACCTCAGGCCCACCTTTT(서열번호 14)
EGFR exon 20 T790M-프로브 1(Target non-specific)	CP1: CCATGAGTACGTATTTTGAAACTC(서열번호 15) DP: GCAAGAGTTTGCCATGGGGATATG(서열번호 16)
EGFR exon 20 T790M-프로브2 (Target specific)	CP2: CCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCA(서열번호 17) DP: GCAAGAGTTTGCCATGGGGATATG(서열번호 18)
EGFR exon 20 T790M-프로브3 (Target non-specific)	CP3: GAAGCCTACGTGATGGCCAGCGT(서열번호 19) DP: GCAAGAGTTTGCCATGGGGATATG(서열번호 20)
EGFR exon 21 L858R-프로브1 (Target non-specific)	CP1: CCAGGAACGTACTGGTGAAAA(서열번호 21) DP: GGAAGAGAAAGAATACCATGCA(서열번호 22)
EGFR exon 21 L858R-프로브2 (Target specific)	CP2: AAG ATC ACA GAT TTT GGG CGG G(서열번호 23) DP: GGAAGAGAAAGAATACCATGCA(서열번호 24)
EGFR exon 21 L858R-프로브3 (Target non-specific)	CP3: GGC ATG AAC TAC TTG GAG GAC CGT(서열번호 25) DP: GGAAGAGAAAGAATACCATGCA(서열번호 26)

본 실험에서는 특별히 언급하지 않으면, EGFR exon 19 deletion-프로브 1(target specific), EGFR exon 20 T790M-프로브 2(target specific) 및 EGFR exon 21 L858R-프로브 2(target specific)를 CP 및 DP로 사용하였다.그 결과, 분리된 EGFR 변이 cfDNA가 검출 프로브에 따라 특이적으로 검출됨을 확인하였다(도 24 및 도 25). EGFR exon 19 deletion, 20 T790M 또는 21 L858R의 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장에서 회수된 cfDNA와 EGFR exon 19 deletion, 20 T790M 또는 21 L858R 타겟 프로브 및 HRP/스트렙타비딘이 결합된 나노입자(NP)를 각각 반응시킬 경우, 환자의 조직의 유전자 변이와 동일한 타겟 프로브를 사용한 경우, 색깔 변화 및 UV-Vis 스펙트럼의 변화가 나타나는 것을 확인하였다(도 24).

또한, 다른 EGFR 변이를 가진 폐암 환자에게서 회수된 cfDNA에 동일한 EGFR 19, 20, 및 21번 타겟 프로브와 반응시킨 결과, 환자 조직의 유전자 변이와 동일한 타겟 프로브를 사용한 경우, 색깔 변화 및 UV-Vis 스펙트럼의 변화가 나타나는 것을 확인하였다(도 25).

실시예 3.2. cfDNA 분석을 통해 KRAS 및 ALK-EML4 유전자 변이 확인

나아가, EGFR과 유사하게, KRAS 및 ALK-EML4 유전자 변이를 분석하고자 혈장 또는 뇌척수액 시료에서 cfDNA를 분리한 후, 포획된 DNA를 95℃에서 1분간 변성시켰다. 1 pM의 바이오틴이 결합된 CP와 바이오틴이 결합된 DP를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응 후, HRP 및 스트렙타비딘 표지된 폴리피롤 나노입자를 시료에 넣고 37℃에서 30분간 반응시켰다.

그 결과, KRAS exon 2 유전자 변이 및 ALK-EML4 fusion 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장으로부터 분리된 cfDNA가 KRAS exon 2 프로브 및 ALK-EML4 프로브에 반응하여, 환자 조직과 일치하는 색깔변화 및 UV 흡광도를 보이는 것을 확인할 수 있었다(도 26 내지 도 28). KRAS exon 2 변이 cfDNA(도 26 및 도 27) 및 ALK-EML4 변이체 1 및 3(도 28)을 검출하기 위한 프로브(CP 및 DP)의 서열은 하기 표 4와 같다.

EGFR	Probe sequences
KRAS exon2-probe	CP1: AAATGACTGAATATAAACTTG (서열번호 27) DP: GAGTGCCTTGACGATACAGCT (서열번호 28)
ALK-EML4 variant 1-probe	CP2: TAGAGCCCACACCTGGGAAA (서열번호 29) DP: CGGAGCTTGCTCAGCTTGTA (서열번호 30)
ALK-EML4 variant 3-probe	CP3: GCATAAAGATGTCATCATCAACCAAG (서열번호 31) DP: CGGAGCTTGCTCAGCTTGTA (서열번호 32)

실시예 3.3. 온도 변성에 의한 비특이적 반응 확인

EGFR exon 19 deletion 및 20 T790M 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장에 상기 표 3의 각각 세 종류의 프로브들을(즉, target-specific 또는 target-nonspecific 프로브들을 포함) 넣어 혼합하였다. 그 결과, 95℃에서 1분의 DNA 변성 후에는 사용된 모든 프로브에서(즉, target-specific 또는 target-nonspecific에 상관 없음) 조직과 동일하게 EGFR exon 19 deletion 및 20 T790M 에서만 색깔 및 UV 흡광도 변화를 보임으로써 특정 유전자 변이를 확인할 수 있었다(도 29). 그러나 EGFR exon 21에서는 프로브의 종류에 관계없이 색깔 및 uv 흡광도 변화를 보이지 않았다. 이는 불안정한 cfDNA가 EGFR exon 19 및 EGFR exon 20의 돌연변이에 특이적인 프로브들이 반응함으로 유전자 변이 분석이 가능할 수 있음을 시사한다.

또한, EGFR 유전자 변이가 없는 폐암 환자의 혈장에서 cfDNA를 수득하였다. 95℃에서 1분 및 10분간 변성시킨 후, EGFR19, 20, 및 21의 돌연변이에 특이적인 프로브와 불안정한 cfDNA 간의 결합 여부를 확인하였다. 그 결과, 95℃에서 1분간 변성시키면 EGFR 유전자 변이가 없는 폐암 환자의 경우 색깔 변화 및 UV 흡광도 변화가 나타나지 않았으나, 95℃에서 10분간 변성을 시킬 경우 EGFR exon 19, 20 및 21 프로브 모두에게서 비특이적인 하이브리드를 통한 색깔 변화 및 UV 흡광도 변화를 관찰할 수 있었다(도 30).

또한, 다른 EGFR 19 deletion 및 20 T790M 유전자 변이가 있는 폐암 환자와 정상인의 혈장에서 나노와이어를 통하여 cfDNA를 포획한 후, 95℃에서 0분, 1분 및 10분의 변성을 통하여 EGFR19, 20, 및 21 프로브와의 하이브리드 반응성을 확인하였다. 그 결과, 도 31 내지 도 33에 나타낸 바와 같이, 95℃에서 0분(도 31) 및 1분(도 32)의 변성으로는 EGFR 유전자 변이가 없는 정상인의 경우 색깔 변화 및 UV 흡광도 변화가 나타나지 않았다. 그러나, 95℃에서 10분(도 33)의 변성을 통하여서는 EGFR exon 19, 20 및 21 프로브 모두에게서 비특이적인 하이브리드를 통한 색깔 변화 및 UV 흡광도 변화가 나타났다. 따라서, 변성을 하지 않아도 cfDNA의 유전자 변이를 분석할 수 있다는 점을 확인하였다.

실시예 4. 폐암 환자의 샘플 분석을 통해 불안정한 cfDNA 검출 방법의 정확도 확인

본 발명의 일 실시예로 확인한 결과, 151명의 폐암 환자의 혈장으로부터 수득된 cfDNA의 유전자 변이의 특이도와 민감도를 분석한 후 환자 암조직 유전자 변이 결과와 일치함을 확인하였다(도 34). EGFR 변이가 없는 환자(EGFR wild type), EGFR exon19 deletion(Del)이 있는 환자 및 EGFR exon 21 L858R를 가진 폐암 환자의 cfDNA에 EGFR exon19 Del에 특이적인 프로브를 추가하여 발생된 유전자 변이를 UV 스펙트럼의 흡광도(ΔOD, 500 nm 내지 650 nm) 값의 분석을 통하여 확인한 결과 환자의 암조직의 유전자 변이 결과와 98.4% 일치함을 확인하였다(도 35 및 도 36).

또한, EGFR 변이가 없는 환자, EGFR exon19 deletion(Del)이 있는 환자 및 EGFR exon 21 L858R 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 cfDNA에 EGFR exon21 L858R 프로브를 추가하여 발생된 유전자 변이를 UV 스펙트럼의 흡광도(ΔOD, 500 nm 내지 650 nm) 값의 분석을 통하여 환자의 암조직의 유전자 변이 결과와 98.0% 일치함을 확인하였다(도 37 및 도 38).

실시예 5. 양이온을 띠는 나노입자를 이용한 cfDNA 검출

상술한 EGFR 실험과 유사하게, EGFR 19 deletion(결실) 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장 시료에서 cfDNA를 분리하기 위해, 200 ㎕의 EGFR 양성 환자의 혈장에 제조예에서 제조한 PEI가 결합된 나노입자(PEI-Ppy NP, 5 μg/㎖)를 첨가하고 실온에서 30분 동안 혼합하였다. 그 후, 포획된 DNA를 변성시키지 않거나 95℃에서 1분간 변성 후에, 1 pM의 바이오틴이 결합된 CP와 DP를 첨가하여 37℃에서 30분 배양하였다. 그 후, HRP/st-tagged NPs를 시료에 넣고 37℃에서 15분간 반응시키고, TMB의 산화반응을 통해 EGFR 19에 특이적인 프로브에서만 UV-Vis 스펙트럼에서 흡광도 변화가 있음을 확인하였다(도 39).

실시예 6. 혈장에 존재하는 cfDNA 분석을 통한 EGFR 유전자 변이 확인

H1975(EGFR exon 20 T790M와 21 L858R 유전자 변이) 세포주를 사용하여 초음파 처리를 통해 fDNA를 만든 후, 제조예의 방법으로 제조된 폴리라이신이 표면에 접합된 나노구조체(PLL/Ppy NW)를 첨가한 후, PCR 과정 없이 비색분석을 수행하였다(도 40). EGFR exon 20, 21 양성 H1975 세포주 fDNA를 나노와이어를 사용하여 분리한 후, EGFR exon 19, 20, 및 21 프로브를 추가하여 반응시켰다. 그 후, HRP/st-tagged NPs를 첨가한 후 색변화를 관찰하였다. 도 40에 나타낸 바와 같이, EGFR 20, 21에서만 명확한 색깔 변화 및 UV-Vis 스펙트럼의 변화가 있음을 확인할 수 있었다.

III. 단일 프로브를 이용한 불안정한 cfDNA 검출

실시예 7. 손상된 부분에 결합 가능한 프로브만을 이용한 불안정한 cfDNA 검출

폐암 환자의 혈장 시료에서 cfDNA를 분리 한 후 유전자 변이를 검출하기 위하여 두 종류의 프로브, 즉 CP 및 DP를 혼합하여 사용하였다. 도 41 내지 도 43에 나타낸 바와 같이, EGFR exon19 deletion, exon20 T790M, 및 exon21 L858R 유전자 변이를 검출하기 위하여, 상기 영역을 포함한 cfDNA에 특이적인 프로브인 CP_1(EGFR exon19 deletion), CP2(EGFR exon20 T790M) 및 CP2(EGFR exon21 L858R)를 DP와 혼합하여 사용하였다.

그러나, 도 44에 나타낸 바와 같이 DP없이 CP만 추가한 경우에도, 환자의 암조직 결과(EGFR exon 19 deletion)과 동일한 EGFR exon19 deletion 유전자 변이 결과를 확인할 수 있었다.

IV. 시료 처리 방법에 따른 불안정한 cfDNA 검출 가능성 확인

실시예 8. DNase 또는 RNase 처리에 따른 불안정한 cfDNA 검출 가능성 확인

DNase 또는 RNase를 먼저 폐암 환자의 혈장 시료에 처리한 후 나노구조체를 이용하여 cfDNA를 분리하여 유전자 변이를 확인하였다. 도 45에 나타낸 바와 같이, EGFR exon19 deletion 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장을 RNase A를 사용하여 선처리한 후에, 나노와이어로 cfDNA를 수득한 후, EGFR exon19 del 프로브와 반응시켰다. 그 결과, 대조군(control cfDNAs)과 같이 환자의 암조직 결과와 동일한 EGFR exon19 deletion 유전자 변이 UV-vis peak가 확인되었으나, DNase I를 선처리한 후에는 cfDNA가 분해되었을 가능성이 있기 때문에 UV 흡광도가 보이지 않음을 확인할 수 있었다(도 45).

동일하게, 도 46에 나타낸 바와 같이, EGFR exon20 T790M 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장을 RNase A로 선처리한 후에, 나노와이어로 cfDNA를 수득한 후, EGFR exon20 T790M 프로브와 반응시켰다. 그 결과, 환자의 암조직 결과와 동일한 EGFR exon20 T790M 유전자 변이 UV 흡광도가 확인되었으나, DNase I를 처리한 후에는 UV 흡광도가 보이지 않음을 확인할 수 있었다(도 46). DNase I를 환자의 혈장에 추가함으로써 cfDNA가 분해되었을 가능성이 있기 때문이다.

V. 표지자에 따른 cfDNA 검출 가능성 확인

실시예 9. HRP/스트렙타비딘 복합체를 이용한 cfDNA 검출 가능성 확인

도 47에 나타낸 바와 같이, EGFR exon19 deletion 및 exon20 T790M 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장에서 cfDNA를 추출한 후 EGFR exon19 Del, 20 T790M, 21 L858R 프로브 및 HRP/st-tagged NP과 반응시킨 후 환자의 암조직 결과와 동일한 EGFR exon19 deletion 및 exon20 T790M 유전자 변이 결과를 UV 흡광도 및 색깔변화로 확인하였다.

그러나, 도 48과 같이 동일 환자의 혈장에서 cfDNA를 추출한 후 EGFR exon19 Del, 20 T790M, 21 L858R 프로브와 HRP/st-tagged NP 대신 HRP-streptavidin 복합체(HRP와 streptavidin이 1:1로 결합)를 반응시키면, 환자의 암조직 결과와는 전혀 다른 유전자 변이 결과를 보여주었다. HRP/스트렙타비딘 나노입자(NP) 대신 HRP/스트렙타비딘 복합체를 사용하면 비특이적인 결합을 증가시켜 유전자 변이 결과가 정확하지 않음을 알 수 있었다.

도 49와 같이 5명의 EGFR exon19 deletion 및 exon20 T790M 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장에서 cfDNA를 추출한 후 EGFR exon19 Del, 20 T790M, 21 L858R 프로브 및 HRP/st-tagged NP과 반응시킨 결과와 EGFR exon19 Del, 20 T790M, 21 L858R 프로브와 HRP/st-tagged NP 대신 HRP/스트렙타비딘 복합체(HRP와 스트렙타비딘이 1:1로 결합)를 반응시킨 결과를 분석하였다. 그 결과, 나노와이어를 통하여 cfDNA를 수득한 후, 프로브와 HRP/st-tagged NP의 결합이 반응 특이성을 높여 암조직과 일치하는 UV 흡광도를 나타냄을 확인하였다. 또한, 5명의 EGFR exon20 T790M 및 21 L858R 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장에서도 HRP/st-tagged NP이 유전자 변이를 결정하는데 중요한 역할을 하는 것을 확인하였다.

VI. 프로브와 표지자가 결합된 복합체를 이용한 cfDNA 검출

실시예 10. HRP /st-tagged NP가 결합된 프로브를 사용하여 유전자 변이 검출

도 50에 나타낸 바와 같이, 프로브와 HRP/st-tagged NP을 각각 순차적으로 cfDNA에 반응시키는 대신, EGFR exon19 Del, 20 T790M, 21 L858R에 특이적인 프로브에 HRP/st-tagged NP를 먼저 결합시켜 프로브-HRP 표지자 형태로 만든 결합체를 cfDNA에 반응시킨 결과, EGFR exon20 T790M 및 21 L858R 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 흉수에서도 암조직과 동일한 유전형이 검출되는 것을 확인하였다.

VII. 혼합 순서에 따른 cfDNA 검출

실시예 11. 프로브와 표지자를 동시 혼합을 통한 불안정한 cfDNA 검출 확인

도 51에 나타낸 바와 같이, CP 및 DP 프로브와 HRP/st-tagged NP을 각각 순차적으로 cfDNA에 반응시키는 대신, 한꺼번에 혼합하여 반응시킨 결과, EGFR exon20 T790M 및 21 L861Q 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장에서도 암조직과 동일한 유전형이 검출되는 것을 확인하였다. 또한, 도 52에서 나타낸 바와 같이, CP 및 DP 프로브와 HRP/st-tagged NP을 한꺼번에 혼합하여 반응시킨 결과, ALK-EML4 fusion 및 ALK point mutation(I1171N/T) 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장에서도 암조직과 동일한 유전형이 검출되는 것을 확인하였다.

VIII. 시료의 변성 조건에 따른 불안정한 cfDNA 검출

실시예 12. 온도 조건에 따른 시료 변성 후 cfDNA 검출

시료 변성 조건에 따라 불안정한 cfDNA와 안정한 cfDNA가 구분될 수 있는지를 확인하기 위하여 실험을 수행하였다. 구체적으로, EGFR 19 deletion을 검출할 수 있는 프로브를 이용하여, 정상인과 폐암환자(0208-343, 20190311_LC#1, Tissue 결과 : E19del)에서 채취한 혈장에 다양한 변성 조건을 준 후, 불안정한 cfDNA와 안정한 cfDNA가 구분 가능한지 확인하였다.

프로브는 EGFR 엑손 19, deletion을 검출할 수 있는 프로브인 ggaattaaga gaagcaacat ctcc(서열번호 9)를 이용하였다. 이때, 프로브는 바이오틴이 결합된 것을 이용하였다. PEI/Ppy 나노와이어를 이용하였고, HRP/스트렙타비딘이 응집된 나노입자를 표지자로 이용하였다.

구체적으로, 나노와이어로 cfDNA를 분리하기 전에 샘플 다음과 같이 다양한 조건으로 처리하였다. 시료를 30℃에서 15분 및 0분간 가열하였다. 또한, 60℃ 5분 및 0분간 가열하였다. 또한, 95℃ 1분 및 0분간 가열하였다. 다른 단계는 도 8에 도식화된 방법으로 수행하였다.

그 결과 EGFR 19 deletion 돌연변이가 없는 정상인에서는 어떠한 변성 조건에서 불안정한 cfDNA가 검출되지 않았다(도 54). 그러나, E19del 환자에서는 여러가지 변성 조건에서 모두 불안정한 cfDNA가 검출되었음을 확인하였다(도 55). 이러한 결과를 통해 불안정한 cfDNA의 존재 유무를 통해, 폐암환자가 E19del 변이가 있다는 정보를 제공할 수 있다.

실시예 13. 온도 조건에 따른 세포주 유래의 불안정한 cfDNA 검출

인체에서 수득한 시료 뿐 아니라, 세포주에 존재하는 변이 위치를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 구체적으로, HCC2279(Exon19Del), HCC827(Exon19Del), H1975(T790M, L858R) 및 A549(EGFR wildtype)에서 cfDNA와 유사한 크기를 가지는 fDNA를 수득하였다. 구체적으로, 실시예 2의 방법으로 fDNA를 수득하였다.

그 결과, 95℃ 1분 및 0분간 가열하는 변성조건에서, 불안정한 cfDNA만이 특이적으로 프로브와 결합하고, 표지자와 결합하여 검출되는 것을 확인하였다(도 56). 이러한 결과를 통해 세포주에서 수득한 시료에서도 불안정한 cfDNA의 존재 유무를 확인할 수 있음을 검증하였다.

실시예 14. DNase 처리에 따른 불안정한 cfDNA 검출

불안정한 cfDNA와 안정한 cfDNA가 온도 조건 뿐 아니라, DNA 분해 효소에 의해서도 차이가 나는지를 확인하기 위하여, 불안정한 cfDNA와 안정한 cfDNA에 DNase 처리 후 프로브와의 반응성을 확인하였다. 이때, 시료는 고온을 이용한 변성을 수행하지 않았다.

구체적으로, HCC2279(Exon19Del), HCC827(Exon19Del), H1975(T790M, L858R) 및 A549(EGFR wildtype)에서 PEI/Ppy 나노와이어를 이용하여 수득한 fDNA를 PBS에 현탁시킨 후, DNase 1 ㎕를 처리하였다. 37℃ 30분을 처리한 결과, 불안정한 cfDNA와 안정한 cfDNA는 프로브와 반성에서 차이가 남을 확인하였다(도 57). 또한, DNase 처리 시간을 37℃ 60분으로 처리하였음에도 동일한 효과가 나타남을 확인하였다(도 58). 이러한 결과를 바탕으로, 안정한 cfDNA는 DNase 효소에 의해서 분해가 쉽게 일어나지 않는다는 점을 확인할 수 있었다.

그러나, 37℃ 120분간 DNase 1 ㎕ 또는 2 ㎕를 처리한 결과, 안정한 cfDNA도 처리 시간이 길어지거나, DNase 양이 증가할 경우, 프로브와 반응을 한다는 점을 확인하였다(도 59). 이러한 실험 결과를 통해, 불안정한 cfDNA와 안정한 cfDNA의 안정성의 차이를 확인할 수 있었다.

또한, DNase의 활성에 따른 불안정한 cfDNA와 안정한 cfDNA의 차이점을 확인하기 위하여, 24℃ 120분간, DNase 1 ㎕ 또는 2 ㎕를 처리한 결과를 도 60에 나타내었다. 그 결과 24℃에서는 효소의 활성이 저하되었음에도, 프로브 반응성 측면에서 불안정한 cfDNA와 안정한 cfDNA이 차이가 남을 확인하였다(도 60).

또한, DNase의 활성에 따른 불안정한 cfDNA와 안정한 cfDNA의 차이점을 확인하기 위하여, 3℃ 120분간, DNase 1 ㎕ 또는 2 ㎕를 처리한 결과를 도 58에 나타내었다. 그 결과 3℃에서는 효소의 활성이 저하되었음에도, 프로브 반응성 측면에서 불안정한 cfDNA와 안정한 cfDNA이 차이가 남을 확인하였다(도 61).

<110> Genopsy Co., Ltd. <120> METHOD FOR DETECTING UNSTABLE CELL FREE DNA AND DETECTING APPARATUS THEREOF <130> FPD/201912-0036/c <150> KR 10-2018-0063258 <151> 2018-06-01 <160> 48 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16-CP <400> 1 gaggaggagg atgaaataga tggt 24 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16-DP <400> 2 ttggaagacc tgttaatggg c 21 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18-CP <400> 3 cacattgtgg cacaatcttt ta 22 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18-DP <400> 4 gccatatcgc tttcatctgt 20 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR 19-CP <400> 5 ggaattaaga gaagcaacat ctcc 24 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR 19-DP <400> 6 aacctcaggc ccacctttt 19 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR 21-CP <400> 7 ccaggaacgt actggtgaaa a 21 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR 21-DP <400> 8 ggaagagaaa gaataccatg ca 22 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR Exon 19-probe1 CP1 <400> 9 ggaattaaga gaagcaacat ctcc 24 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR Exon 19-probe1 DP <400> 10 aacctcaggc ccaccttt 18 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR Exon 19-probe2 CP2 <400> 11 aaaattcccg tcgctatcaa g 21 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR Exon 19-probe2 DP <400> 12 aacctcaggc ccacctttt 19 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR Exon 19-probe3 CP3 <400> 13 ggactctgga tcccagaagg tgag 24 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR Exon 19-probe3 DP <400> 14 aacctcaggc ccacctttt 19 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR Exon 20-probe1 CP1 <400> 15 ccatgagtac gtattttgaa actc 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR Exon 20-probe1 DP <400> 16 gcaagagttt gccatgggga tatg 24 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR Exon 20-probe2 CP2 <400> 17 ccaccgtgca gctcatcacg cagctca 27 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR Exon 20-probe2 DP <400> 18 gcaagagttt gccatgggga tatg 24 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR Exon 20-probe3 CP3 <400> 19 gaagcctacg tgatggccag cgt 23 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR Exon 20-probe3 DP <400> 20 gcaagagttt gccatgggga tatg 24 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR Exon 21-probe1 CP1 <400> 21 ccaggaacgt actggtgaaa a 21 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR Exon 21-probe1 DP <400> 22 ggaagagaaa gaataccatg ca 22 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR Exon 21-probe2 CP2 <400> 23 aagatcacag attttgggcg gg 22 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR Exon 21-probe2 DP <400> 24 ggaagagaaa gaataccatg ca 22 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR Exon 21-probe3 CP3 <400> 25 ggcatgaact acttggagga ccgt 24 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR Exon 21-probe3 DP <400> 26 ggaagagaaa gaataccatg ca 22 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS exon2-probe CP1 <400> 27 aaatgactga atataaactt g 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS exon2-probe DP <400> 28 gagtgccttg acgatacagc t 21 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK-EML4 variant 1-probe CP2 <400> 29 tagagcccac acctgggaaa 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK-EML4 variant 1-probe DP <400> 30 cggagcttgc tcagcttgta 20 <210> 31 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK-EML4 variant 3-probe CP3 <400> 31 gcataaagat gtcatcatca accaag 26 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK-EML4 variant 3-probe DP <400> 32 cggagcttgc tcagcttgta 20 <210> 33 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRCA1 Exon 7 of normal cell <400> 33 caaagtatgg gctacagaaa ccgtgccaaa ag 32 <210> 34 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRCA1 Exon 7 of cancer cell <400> 34 caaagtatgg gcttcagaaa ccgtgccaaa ag 32 <210> 35 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRCA1 Exon 10 of normal cell <400> 35 tgggaaaacc tatcggaaga aggcaagcct cc 32 <210> 36 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRCA1 Exon 10 of cancerl cell <400> 36 tgggaaaacc tatcggtaga aggcaagcct cc 32 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRCA1 Exon 11 of normal cell <400> 37 ggggccaaga aattagagtc ctcagaagag 30 <210> 38 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRCA1 Exon 11 of cancer cell <400> 38 ggggccaaga aaattagagt cctcagaaga g 31 <210> 39 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRCA1 Exon 15 of normal cell <400> 39 atatacagga tatgcgaatt aagaagaaac aaa 33 <210> 40 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRCA1 Exon 15 of cancer cell <400> 40 atatacagga tatgtgaatt aagaagaaac aaa 33 <210> 41 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TP53 of normal cell <400> 41 taggaggccg agctctgttg cttcgaactc ca 32 <210> 42 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TP53 of cancer cell <400> 42 taggaggccg agctctttgc ttcgaactcc a 31 <210> 43 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MSH2 of normal cell <400> 43 tgaggaggtt tcgacatggc ggtgcagccg a 31 <210> 44 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MSH2 of cancer cell <400> 44 tgaggaggtt tcgacctggc ggtgcagccg a 31 <210> 45 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR of normal cell <400> 45 aaaaagatca aagtgctggg ctccggtgcg tt 32 <210> 46 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR of cancer cell <400> 46 aaaaagatca aagtgctgag ctccggtgcg tt 32 <210> 47 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGFR3 of normal cell <400> 47 atcctctctc tgaaatcact gagcaggaga aag 33 <210> 48 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGFR3 of cancer cell <400> 48 atcctctctc tgaaatcact gcgcaggaga aag 33

Claims

시료로부터, 증폭없이, 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 세포유리 DNA(cell-free DNA, 이하 cfDNA)를 검출하기 위한 방법으로서, 상기 방법은
a) cfDNA가 포함된 시료 및 양전하를 띠는 물질을 혼합하는 단계;
b) cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질을 분리하는 단계;
c) 상기 혼합물에 프로브와 표지자를 혼합하는 단계;
d) cfDNA에 결합하지 않은 프로브 및 표지자를 제거하는 단계; 및
e) 표지자를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는,
불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA를 검출하기 위한 방법.
제1항에 있어서,
상기 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA는
i) 안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA에 비해 낮은 Tm 값을 갖거나,
ii) 안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA가 변성되지 않는 조건에서 변성이 되는 것을 특징으로 하는 것인, 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA를 검출하기 위한 방법.
제1항에 있어서,
상기 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA는 하기의 조건 중 어느 하나의 조건에서 cfDNA 상보적으로 결합 가능한 15머 내지 30머 프로브와 결합할 수 있는 것인, 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA를 검출하기 위한 방법:
i) 상온에서 1분 내지 120분 방치하는 조건;
ii) 90℃ 내지 95℃에서 1초 내지 3분간 가열하는 조건;
iii) 75℃ 내지 90℃에서 1초 내지 5분간 가열하는 조건;
iv) 60℃ 내지 75℃에서 30초 내지 30분간 가열하는 조건;
v) 25℃ 내지 40℃에서 10분 내지 120분간 가열하는 조건;
vi) 프로테아제로 1분 내지 30분 처리하는 조건; 및
vii) DNase로 1분 내지 30분 처리하는 조건.
제1항에 있어서,
상기 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA는 순환 종양 DNA(circulating tumor DNA)인 것인, 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA를 검출하기 위한 방법.
제1항에 있어서,
상기 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA란 정상 세포에는 존재하지 않는 손상된 핵산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는, 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA를 검출하기 위한 방법.
제5항에 있어서,
상기 정상 세포에는 존재하지 않는 손상된 핵산 서열은 결실(deletion), 복제(duplication), 역위(inversion), 전좌(translocation), 미스매치(mis-match) 및 SNV(single nucleotide variation)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 구조적 이상을 포함하는 것인, 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA를 검출하기 위한 방법.
제1항에 있어서,
상기 c) 단계 이전에 시료 또는 양전하를 띠는 물질에 결합된 cfDNA를 하기의 조건 중 어느 하나의 조건에서 변성시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA를 검출하기 위한 방법:
i) 상온에서 1분 내지 10분 방치하는 조건;
ii) 90℃ 내지 95℃에서 1초 내지 1분간 가열하는 조건;
iii) 75℃ 내지 90℃에서 10초 내지 3분간 가열하는 조건;
iv) 60℃ 내지 75℃에서 1분 내지 30분간 가열하는 조건;
v) 25℃ 내지 40℃에서 5분 내지 60분간 가열하는 조건;
vi) 프로테아제로 1분 내지 10분 처리하는 조건; 및
vii) DNase로 1분 내지 10분 처리하는 조건.
제1항에 있어서,
상기 프로브는 15머 내지 30머의 뉴클레오티드로 구성된 것인, 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA를 검출하기 위한 방법.
제8항에 있어서,
상기 프로브는 바이오틴(biotin)이 결합된 것인, 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA를 검출하기 위한 방법.
제1항에 있어서,
상기 표지자는 HRP(horse-radish peroxidase) 또는 형광단백질을 포함하는 것인, 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA를 검출하기 위한 방법.
제10항에 있어서,
상기 표지자는 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin) 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 더 포함하는 것인, 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA를 검출하기 위한 방법.
제1항에 있어서,
상기 표지자는 전도성 고분자; 히알루론산; 아비딘(avidin) 또는 스트렙타비딘(streptavidin); 및 HRP(horse-radish peroxidase) 또는 형광단백질;을 포함하는 나노입자인 것인, 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA를 검출하기 위한 방법.
제1항에 있어서,
상기 양전하를 띠는 물질은 양전하를 띠는 나노와이어인 것인, 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA를 검출하기 위한 방법.
제13항에 있어서,
상기 나노와이어는 전도성 고분자를 포함하는 것인, 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA를 검출하기 위한 방법.
제14항에 있어서,
상기 나노와이어는 추가적으로 바이오틴을 더 포함하는 것인, 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA를 검출하기 위한 방법.
제14항에 있어서,
상기 전도성 고분자는 폴리아세틸렌(poly(acetylene)), 폴리피롤(poly(pyrrole)), 폴리티오펜(poly(thiophene)), 폴리파라페닐렌(poly(para-phenylene)), 폴리(3,4,-에틸렌디옥시테오펜(poly(3,4-ethylenedioxythiophene)), 폴리페닐렌설파이드(poly(phenylene sulfide)), 폴리(파라-페닐렌비닐렌)(poly(para-phenylene vinylene)) 및 폴리아닐린(polyaniline)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA를 검출하기 위한 방법.
제1항에 있어서,
상기 시료는 소변, 뇌척수액, 혈장, 혈액, 흉수, 복수, 타액, 객담 및 체액으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA를 검출하기 위한 방법.
제5항에 있어서,
상기 손상된 핵산 서열은 EGFR, KRAS, BRAF, TP53, PIK3CA, ROS1, RET, c-Met, PTEN, RB1, AR, BRCA, KIT, FGFR, BRCA, IDH, ESR1, HER2, ALK-EML4 및 TMPRSS2-ERG으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 변이된 서열인 것인, 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA를 검출하기 위한 방법.
제1항에 있어서,
상기 e) 단계에서 상기 표지자는 색깔 변화, UV 흡광도 변화, 형광반응 변화, 또는 전기화학적 변화에 의해 검출되는 것인, 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA를 검출하기 위한 방법.
시료로부터, 증폭없이, 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA를 검출함으로써, 암 또는 감염성 질환을 진단 또는 예측하기 위한 정보를 제공하기 위한 방법으로서, 상기 방법은
a) cfDNA가 포함된 시료 및 양전하를 띠는 물질을 혼합하는 단계;
b) cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질을 분리하는 단계;
c) 상기 혼합물에 프로브와 표지자를 혼합하는 단계;
d) cfDNA에 결합하지 않은 프로브 및 표지자를 제거하는 단계;
e) 표지자를 검출하는 단계; 및
f) 표지자가 검출되면 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA에 상응하는 유전자와 관련된 암 또는 감염성 질환이 있다고 결정하는 단계를 포함하는,
암 또는 감염성 질환을 진단 또는 예측하기 위한 정보를 제공하기 위한 방법.
시료로부터, 증폭없이, 상온에서 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA의 존재여무를 검출하기 위한 장치로서,
a) cfDNA가 포함된 시료 및 양전하를 띠는 나노와이어를 혼합시키는 혼합부;
b) cfDNA가 결합된 나노와이어를 제외한 시료를 제거하기 위한 수득부;
c) 상기 cfDNA가 결합된 나노와이어에, 상기 cfDNA에 상보적으로 결합할 수 있는 바이오틴이 결합된 프로브; 및 스트렙타비딘 및 표지자를 포함하는 나노입자를 첨가시키는 반응부;
d) 표지자를 검출하는 검출부; 및
e) 표지자의 검출 여부에 따라 상기 시료에 프로브에 상보적인 서열을 가지며, 상온에서 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA가 존재한다고 결정하는 정보 처리부를 포함하는, 상온에서 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA의 존재 여부를 검출하는 장치.
시료로부터, 증폭없이, 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA를 검출함으로써, 암 또는 감염성 질환을 진단 또는 예측하기 위한 정보를 제공하기 위한 장치로서,
a) cfDNA가 포함된 시료 및 양전하를 띠고 있는 나노와이어를 혼합시키는 혼합부;
b) cfDNA가 결합된 나노와이어를 제외한 시료를 제거하기 위한 수득부;
c) 상기 cfDNA가 결합된 나노와이어에 상기 cfDNA에 상보적으로 결합할 수 있는 바이오틴이 결합된 프로브; 및 스트렙타비딘 및 표지자를 포함하는 나노입자를 첨가시키는 반응부;
d) 표지자를 검출하는 검출부; 및
e) 표지자의 검출여부에 따라 시료에 프로브에 상보적인 서열을 가지며, 상온에서 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA가 존재한다고 결정하는 정보 처리부를 포함하는, 암 또는 감염성 질환을 진단 또는 예측하기 위한 정보를 제공하기 위한 장치.