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KR20190141120A - 비-표지된 가역성 종료자 또는 자연 뉴클레오티드에 의한 단계적 시퀀싱 - Google Patents

비-표지된 가역성 종료자 또는 자연 뉴클레오티드에 의한 단계적 시퀀싱 Download PDF

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KR20190141120A
KR20190141120A KR1020197022620A KR20197022620A KR20190141120A KR 20190141120 A KR20190141120 A KR 20190141120A KR 1020197022620 A KR1020197022620 A KR 1020197022620A KR 20197022620 A KR20197022620 A KR 20197022620A KR 20190141120 A KR20190141120 A KR 20190141120A
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라도제 드르마낙
스네자나 드르마낙
한동 리
쑨 쑤
매튜 제이. 칼로우
레온 에크하르트
나이보 양
콴 딩
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컴플리트 제노믹스 인코포레이티드
비지아이 션전
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Abstract

본 발명은 핵산을 시퀀싱하기 위한 조성물 및 방법 및 다른 응용을 제공한다. 합성에 의한 시퀀싱에서, 표지되지 않은 가역성 종료자는 각각의 주기에서 중합효소에 의해 혼입된 후, 가역성 종료자로의 직접적 또는 간접적으로 표지된 항체 또는 다른 친화성 시약의 결합에 의한 혼입 후에 표지된다.

Description

비-표지된 가역성 종료자 또는 자연 뉴클레오티드에 의한 단계적 시퀀싱
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2017년 1월 4일에 출원된 미국 가출원 번호 62/442,263호 및 2017년 4월 26일에 출원된 미국 가출원 번호 62/490,511호에 대한 우선권을 주장한다. 이들 출원의 전체 내용은 모든 목적상 참조로서 본원에 포함된다.
핵산 시퀀싱 및 재시퀀싱을 위한 저비용의 고-처리량 방법의 필요성으로 인해 "대량 병렬 시퀀싱(MPS)" 기술이 개발되었다. DNA를 시퀀싱하기 위한 하나의 일반적으로 사용되는 방법은, 예를 들어, 문헌[Ronaghi et al., Science, 281:363-365, 1998; Li et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 100:414-419, 2003; Metzker, Nat Rev Genet. 11:31-46, 2010; Ju et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 103:19635-19640, 2006; Bentley et al., Nature 456:53-59, 2008]; 및 미국 특허 번호 6,210,891호, 6,828,100호, 6,833,246호, 및 6,911,345호, 및 미국 특허 공보 N2016/0130647호에 개시된 바와 같은 "합성에 의한 시퀀싱(SBS)"으로 언급된다.
SBS는 시퀀싱될 올리고뉴클레오티드 반대의 정확한 상보성 뉴클레오티드의 조절된(즉, 한번에 하나씩) 혼입을 필요로 한다. 이는 각각의 뉴클레오티드 잔기가 한번에 하나씩 시퀀싱되어 이에 따라 조절되지 않는 일련의 혼입이 발생하는 것을 방지함에 따라 다수의 주기로 뉴클레오티드를 첨가함으로써 정확한 시퀀싱을 가능하게 한다. 일 접근법에서, 가역성 종료자 뉴클레오티드(RT)가 DNA 주형의 서열을 결정하는데 사용된다. 대부분의 일반적으로 이용되는 SBS 접근법에서, 각각의 RT는 (1) 성장하는 DNA 카피 가닥의 3' 말단으로의 DNA 중합효소 효소에 의해 단지 하나의 염기가 첨가될 수 있는 것을 보장하는 차단 기, 및 (2) 카메라에 의해 검출될 수 있는 형광 표지를 포함하는 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 가장 일반적인 SBS 방법에서, 주형 및 시퀀싱 프라이머가 고체 지지체에 고정되고, 지지체가 절단 가능한 링커에 의해 질소성 염기에 부착된 상이한 형광단, 및 데옥시리보스의 3'-OH 위치에 3'-O-아지도메틸 기, 및 DNA 중합효소를 각각 포함하는 4개의 DNA 뉴클레오티드 유사체 각각에 노출된다. 정확한 상보성 염기만이 표적에 어닐링되고, 이후 프라이머의 3' 말단에 혼입된다. 혼입되지 않은 뉴클레오티드는 세척되고, 고체 지지체가 이미지화된다. TCEP(트리스(2-카르복시에틸)포스핀)가 도입되어 링커를 절단하고, 형광단을 방출시키고, 3'-O-아지도메틸 기를 제거하여 3'-OH가 재생된다. 이후, 주기가 반복될 수 있다(Bentley et al., Nature 456, 53-59, 2008). 4개 염기 각각에 대해 상이한 형광 색 표지가 사용되므로, 시퀀싱의 각각의 주기에서, 혼입되는 RT의 정체가 이의 색에 의해 확인될 수 있다.
SBS의 널리 보급된 사용에도 불구하고, 개선이 여전히 필요하다. 예를 들어, 현재의 SBS 방법은 a) 표지 절단 후에 혼입된 염기에 남은 화학적 흉터, b) 보다 덜 효율적인 혼입, c) 켄칭, d) 여기된 염료 유도에 의한 연장의 종결, 및 각각의 시퀀싱 주기에서의 신호 감소를 발생시키는 절단 가능한 링커와 연결된 염기 상에 표지(예를 들어, 염료)를 갖는 고비용의 가역적으로 종결된 dNTP(RT)를 필요로 한다.
본 발명은 핵산 분석 및 시퀀싱을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 마지막으로 혼입된 뉴클레오티드에서 염기, 당, 절단 가능한 차단 기 또는 이들 성분의 조합물을 인지하는 친화성 시약(예를 들어, 항체, 앱타머, 아피머(affimer), 크노틴(knottin) 등)의 결합에 의해 마지막으로 혼입된 뉴클레오티드 염기가 확인되는 SBS 시퀀싱 방법이 본원에 개시된다. 상기 결합은 검출 가능한 신호의 생성과 직접적 또는 간접적으로 관련된다.
일 구현예에 따르면, 본 발명은 비-표지된 가역성 종료자(NLRT) 뉴클레오티드를 이용하는 시퀀싱 방법을 제공한다. 가역성 종료자(RT) 뉴클레오티드는 단지 하나의 염기가 DNA 중합효소 효소에 의해 성장하는 DNA 카피 가닥의 3' 말단에 첨가될 수 있는 것을 보장하는 제거 가능한 차단 기를 함유하는 변형된 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP) 또는 dNTP 유사체이다. 널리 공지된 바와 같이, DNA 합성 동안 성장하는 가닥의 3' 말단으로의 dNTP(2'-데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트)의 혼입은 피로포스페이트의 방출을 포함하며, dNTP가 DNA 가닥으로 혼입되는 경우, 혼입된 부분은 뉴클레오티드 모노포스페이트(또는 더욱 정확하게는, 1개 또는 2개의 인접한 뉴클레오티드 단량체에 포스포디에스테르 결합(들)에 의해 연결된 뉴클레오티드 단량체)이다. 가역성 종료자(RT) 뉴클레오티드는 단지 하나의 염기가 DNA 중합효소 효소에 의해 성장하는 DNA 카피 가닥의 3' 말단에 첨가될 수 있는 것을 보장하는 제거 가능한 차단 기를 함유하는 변형된 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP) 또는 dNTP 유사체이다. 비-표지된 RT 뉴클레오티드는 검출 가능한 표지를 함유하지 않는다. 시퀀싱의 각각의 주기에서, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체는 중합효소에 의해 혼입되어, DNA 카피 가닥의 3' 말단을 1개의 염기만큼 연장시키고, 혼입되지 않은 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체는 세척된다. 새로이 혼입된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체의 에피토프(들)를 특이적으로 인지하고 이에 결합하는 친화성 시약이 도입된다. 이미지를 찍은 후, 차단 기 및 표지된 친화성 시약이 DNA로부터 제거되어, 다음 주기의 시퀀싱이 시작되는 것을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 친화성 시약에 의해 인지되는 에피토프는 혼입된 뉴클레오티드 자체(즉, 염기 및 당) 또는 뉴클레오시드 및 3' 차단 기에 의해 형성된다. 일부 구현예에서, 친화성 시약에 의해 인지되는 에피토프는 가역성 종료자 자체, 데옥시리보스와 조합된 가역성 종료자, 또는 핵염기 또는 핵염기 및 데옥시리보스와 조합된 가역성 종료자에 의해 형성된다.
하나의 상기 구현예에 따르면, 본 발명은 (a) 프라이머가 연장되어 표지되지 않은 RT를 핵산 주형에 상보적인 서열에 혼입시킴으로써 혼입된 RT를 포함하는 표지되지 않은 연장 생성물을 생성시키는 조건하에서 핵산을 포함하는 핵산 주형, 상기 주형의 일부에 상보적인 핵산 프라이머, 중합효소, 및 하기 화학식 I의 표지되지 않은 RT를 접촉시키는 단계:
Figure pct00001
화학식 I
(상기 식에서, R1은 3'-O 가역성 차단 기이고; R2는 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T), 및 이들의 유사체로부터 선택되는 핵염기이고; R3는 하나 이상의 포스페이트를 포함하거나 이로 구성됨); (b) 친화성 시약이 혼입된 RT에 특이적으로 결합하여 RT를 포함하는 표지된 연장 생성물을 생성하는 조건하에서 표지되지 않은 연장 생성물과 친화성 시약을 접촉시키는 단계; (c) 친화성 시약의 결합을 검출하는 단계, 및 (d) 표지된 연장 생성물에 혼입된 뉴클레오티드를 확인하여 상기 연장 생성물, 및 이에 따른 주형 핵산의 서열의 적어도 일부를 확인하는 단계를 포함하는 핵산을 시퀀싱하기 위한 방법을 제공한다.
합성에 의한 시퀀싱에 일반적으로 사용되는 dNTP 유사체에서, 핵염기는 형광단과 같은 검출 가능한 표지에 염기를 연결시키는 절단 가능한 링커에 컨쥬게이션된다. 예를 들어, 미국 특허 공보 2002/0227131호를 참조한다. 대조적으로, 본 발명의 dNTP 유사체에서, 일반적으로 R2는 링커에 의해 염료 또는 다른 검출 가능한 표지에 컨쥬게이션된 핵염기가 아니다.
또 다른 구현예에 따르면, 상기 방법은 (d) RT로부터 가역성 차단 기를 제거하여 3'-OH를 생성시키는 단계; 및 (e) RT로부터 친화성 시약을 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 방법의 단계를 1회 이상 반복하는 단계, 즉, 시퀀싱의 다수의 주기를 수행하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 상기 핵산 주형의 서열의 적어도 일부가 결정된다.
또 다른 구현예에 따르면, 상기 방법은 동일 반응에서 가역성 차단 기 및 친화성 시약을 제거하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에 따르면, 상기 방법은 가역성 차단기(들)를 제거하지 않고 친화성 시약(들)을 제거하고, 상이한 친화성 시약으로 재프로빙하는 단계를 포함한다.
상기 방법에서, 친화성 시약은 항체(항체의 결합 단편, 단일쇄 항체, 이특이적 항체 등을 포함함), 앱타머, 크노틴, 아피머, 또는 적합한 특이성 및 친화성으로 혼입된 NLRT에 결합하는 임의의 다른 공지된 제제를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 친화성 시약은 항체이다. 또 다른 구현예에서, 친화성 시약은 형광 표지인 검출 가능한 표지를 포함하는 항체이다.
일 구현예에 따르면, R1은 알릴, 아지도메틸, 아미노알콕실, 2-시아노에틸, 치환된 알킬, 비치환된 알킬, 치환된 알케닐, 비치환된 알케닐, 치환된 알키닐, 비치환된 알키닐, 치환된 헤테로알킬, 비치환된 헤테로알킬, 치환된 헤테로알케닐, 비치환된 헤테로알케닐, 치환된 헤테로알키닐, 비치환된 헤테로알키닐, 알레닐, 시스-시아노에테닐, 트랜스-시아노에테닐, 시스-시아노플루오로에테닐, 트랜스-시아노플루오로에테닐, 시스-트리플루오로메틸에테닐, 트랜스-트리플루오로메틸에테닐, 비스시아노에테닐, 비스플루오로에테닐, 시스-프로페닐, 트랜스-프로페닐, 니트로에테닐, 아세토에테닐, 메틸카르보노에테닐, 아미도에테닐, 메틸설포노에테닐, 메틸설포노에틸, 포름이미데이트, 포름하이드록시메이트, 비닐로에테닐, 에틸레노에테닐, 시아노에틸레닐, 니트로에틸레닐, 아미도에틸레닐, 아미노, 시아노에테닐, 시아노에틸, 알콕시, 아실, 메톡시메틸, 아미녹실, 카르보닐, 니트로벤질, 쿠마리닐, 및 니트로나프탈레닐로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에 따르면, R2는 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 및 티민(T)로부터 선택되는 핵염기이다.
또 다른 구현예에 따르면, R3는 하나 이상의 포스페이트로 구성되거나 이를 포함한다.
용어 비-표지된 가역성 종료자(NLRT)는 뉴클레오티드 유사체의 트리포스페이트 형태를 나타낼 수 있거나, 혼입된 NLRT를 나타낼 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, (a) (i) 복수의 주형 DNA 분자를 포함하는 DNA 어레이를 제공하는 단계로서, 각각의 주형 DNA 분자가 핵산의 단편을 포함하고, 상기 복수의 주형 DNA 분자 각각이 어레이의 한 위치에 부착되는, 단계, (b) 프라이머가 연장되어 표지되지 않은 RT를 상기 복수의 상기 주형 DNA 분자 중 적어도 일부에 상보적인 서열에 혼입시킴으로써 RT를 포함하는 표지되지 않은 연장 생성물을 생성시키는 조건하에서 DNA 어레이와 상기 주형 DNA 분자 각각의 일부에 상보적인 핵산 프라이머, 중합효소, 및 하기 화학식 I의 표지되지 않은 RT를 접촉시키는 단계:
Figure pct00002
화학식 I
(상기 식에서, R1은 3'-O 가역성 차단 기이고; R2는 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T), 및 이들의 유사체로부터 선택되는 핵염기이고; R3는 하나 이상의 포스페이트로 구성되거나 이를 포함함); (c) 친화성 시약이 RT에 특이적으로 결합하여 RT를 포함하는 표지된 연장 생성물을 생성하는 조건하에서 표지되지 않은 연장 생성물과 검출 가능한 표지를 포함하는 친화성 시약을 접촉시키는 단계; 및 (d) 표지된 연장 생성물에서 RT를 확인하여 상기 핵산의 서열의 적어도 일부를 확인하는 단계를 포함하는 핵산을 시퀀싱하기 위한 방법이 제공된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 (b) 프라이머가 연장되어 상기 복수의 상기 주형 DNA 분자의 적어도 일부에 상보적인 서열로 표지되지 않은 RT를 혼입시킴으로써 RT를 포함하는 표지되지 않은 연장 생성물을 생성시키는 조건하에서 DNA 어레이와 상기 주형 DNA 분자의 각각의 일부에 상보적인 핵산 프라이머, 중합효소, 및 제1 RT(여기서, R2는 A임), 제2 RT(여기서, R2는 T임), 제3 RT(여기서, R2는 C임), 및 제4 RT(여기서, R2는 G임)를 포함하는 화학식 I의 표지되지 않은 RT의 한 세트를 접촉시키는 단계; (c) 한 세트의 친화성 시약이 혼입된 RT에 특이적으로 결합하여 RT를 포함하는 표지된 연장 생성물을 생성시키는 조건하에서 표지되지 않은 연장 생성물과 상기 세트의 친화성 시약을 접촉시키는 단계로서, (i) 상기 세트의 친화성 시약이 제1 RT에 특이적으로 결합하는 제1 친화성 시약, 제2 RT에 특이적으로 결합하는 제2 친화성 시약, 제3 RT에 특이적으로 결합하는 제3 친화성 시약, 및 선택적으로, 제4 RT에 특이적으로 결합하는 제4 친화성 시약을 포함하고, (ii) 상기 제1, 제2, 및 제3 친화성 시약 각각이 검출 가능한 표지를 포함하는, 단계; 및 (d) 어레이 상의 각각의 위치에서 RT에 결합된 친화성 시약의 표지를 확인함으로써 표지된 연장 생성물 내의 RT를 확인하여 상기 핵산의 서열의 적어도 일부(예를 들어, 주기 당 하나의 염기)를 확인하는 단계를 포함한다. 관련 구현예에 따르면, 상기 제1, 제2, 제3 및 제4 친화성 시약 각각은 검출 가능한 표지를 포함한다. 또 다른 관련 구현예에 따르면, 상기 제1, 제2, 및 제3 친화성 시약 각각은 상이한 검출 가능한 표지를 포함한다. 또 다른 관련 구현예에 따르면, 제1, 제2, 및 제3 친화성 시약 각각은 상이한 양의 동일 표지(예를 들어, 동일 형광단(들))를 포함하여 상이한 강도의 신호를 발생시킨다. 또 다른 구현예에 따르면, 혼입된 RT에 결합된 친화성 시약은 직접적으로 표지되지 않지만, 이차 친화성 시약을 이용하여 간접적으로 표지된다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, DNA 어레이가 제공된다. 상기 어레이는 복수의 주형 DNA 분자로서, 각각의 DNA 분자가 어레이의 한 위치에 부착된, 복수의 주형 DNA 분자, 복수의 위치에서 주형 DNA 분자의 일부와 염기쌍을 형성하는 상보성 DNA 서열로서, 상보성 DNA 서열이 이의 3' 말단에 혼입된 RT를 포함하는, 상보성 DNA 서열, 및 RT의 적어도 일부에 특이적으로 부착되는 친화성 시약으로서, 친화성 시약이 부착되는 RT를 확인하는 검출 가능한 표지를 포함하는, 친화성 시약을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, (a) 하기 화학식 I의 표지되지 않은 RT:
Figure pct00003
화학식 I
(상기 식에서, R1은 3'-O 가역성 차단 기이고; R2는 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T), 및 이들의 유사체로부터 선택되는 핵염기이고; R3는 하나 이상의 포스페이트로 구성되거나 이를 포함함); (b) RT 중 하나에 특이적으로 결합하는 표지된 친화성 시약; 및 (c) RT 및 친화성 시약에 대한 패키징을 포함하는 키트가 제공된다. 또 다른 구현예에 따르면, 상기 키트는 복수의 RT(여기서, 각각의 RT는 상이한 핵염기를 포함함), 및 복수의 친화성 시약(여기서, 각각의 친화성 시약은 RT 중 하나에 특이적으로 결합함)을 포함한다.
도 1은 본 발명의 시퀀싱 방법의 예를 예시하는 흐름도이다.
도 2는 도 1에 제시된 항체 염색 공정의 예를 예시하는 흐름도이다.
도 3은 NLRT 구조의 예를 제시한다: 도 3a 3'-O-아지도메틸-2'-데옥시구아닌; 도 3b 3'-O-아미노-2'-데옥시구아닌; 도 3c 3'-O-시아노에틸렌-2'-데옥시구아닌; 도 3d 3'-O-포스포; 도 3e: 3'-에틸디설파이드-메틸렌-2'-데옥시티민.
도 4는 본 발명의 실시에서 사용될 수 있는 다양한 차단 기를 예시한다. 도 4에서, "
Figure pct00004
"는 구조의 나머지에 대한 분자의 부착점을 나타낸다.
도 5는 3'-O-아지도메틸-2'-데옥시구아닌의 활성 에스테르(G4)의 합성을 예시한다.
도 6은 3'-O-아지도메틸-2'-의 활성 에스테르(C8)의 합성을 예시한다.
도 7은 3'-O-아지도메틸-2'-데옥시아데닌의 활성 에스테르(A12)의 합성을 예시한다.
도 8은 3'-O-아지도메틸-2'-데옥시티민의 활성 에스테르(T16)의 합성을 예시한다.
도 9는 면역원, 역가 모니터, 및 친화성 정제를 위한 기질로 사용하기 위한 BSA, KHL 및 아가로스 수지에 대한 3'-O-아지도메틸-dC-NHS 에스테르의 컨쥬게이션(3'-O-아지도메틸-2'-데옥시시토신을 이용함)을 예시한다.
도 10a 및 10b는 3개의 표지된 RT 및 하나의 NLRT를 이용한 5 및 10 주기의 시퀀싱에 대한 Rho를 제시한다.
도 10c 및 10d는 3개의 표지된 RT 및 하나의 NLRT를 이용한 5 및 10 주기의 시퀀싱에 대한 신호-노이즈-비(SNR)를 제시한다.
도 11a 및 11b는 합성에 의한 시퀀싱 50주기 동안 항-3'-아지도메틸-dG 토끼 일차 항체 및 항-토끼 AF647 단편 이차 항체에 의해 검출되는 비-표지된 3'-아지도메틸-dGTP와 함께 BGISEQ-1000 DNA 시퀀서를 이용하여 획득된 시퀀싱 데이터 메트릭스(metrics)를 예시한다.
도 12a 및 12b는 형광 직접 표지 항-아지도메틸-염기 항체를 이용하는 BGISEQ-500 기기에서의 E. 콜리 유전체 DNA의 25 시퀀싱 주기로부터의 결과를 예시한다.
1. 개요
특정 양태에서, 본 발명은 표지되지 않은 가역성 종료자 뉴클레오티드를 이용하는 핵산의 합성에 의한 시퀀싱(SBS) 또는 조합 프로브 앵커 시퀀싱(cPAS)을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 일 접근법에서, SBS는 어레이 상의 위치에 고정된 단일 가닥 주형 DNA를 생성시킴으로써 수행된다. 대부분의 접근법에서, 각각의 고정된 단일 가닥 주형 DNA는 유사한 서열의 많은 수의 카피(예를 들어, 앰플리콘)를 갖는 위치에 존재한다. 예를 들어, 브릿지 PCR은 어레이(Illumina) 상의 한 위치에서 주형 서열의 클러스터를 생성시키는데 사용될 수 있거나, 롤링 서클 복제(rolling circle replication)는 많은 카피의 주형 서열을 갖는 단일 가닥 콘카테머(concatemer), 또는 DNA 나노볼(DNB)을 생성시키는데 사용될 수 있다(Complete Genomics, Inc.). SBS는 프라이머 또는 프라이머들을 주형 DNA에 하이브리드화시키고, 프라이머를 연장시켜 연장된 프라이머, 또는 성장하는 DNA 가닥(GDS)을 생성시킴으로써 수행된다. 프라이머 연장은 주형에 하이브리드화되는 동안 프라이머 DNA 가닥의 3' 말단에서의 뉴클레오티드의 첨가("혼입" 또는 "혼입하는")를 나타낸다. 3' 말단에 혼입된 뉴클레오티드는 프라이머의 상응하는 뉴클레오티드에 상보적이므로 각각의 시퀀싱 주기에서 혼입된 뉴클레오티드의 정체를 결정함으로써 주형의 뉴클레오티드 서열이 결정될 수 있다.
하나의 선행 기술 접근법에서, 표지된 뉴클레오티드 유사체는 GDS에 혼입된다. 일반적으로, 표지된 뉴클레오티드 유사체는 단계 당 단지 하나의 뉴클레오티드가 혼입될 수 있고, 염료(전형적으로, 형광 염료)가 절단 가능한 링커를 통해 뉴클레오티드에 부착되는 것을 보장하는 차단 기를 포함한다. 시퀀싱의 각각의 주기는 GDS의 말단에 표지된 뉴클레오티드 유사체를 혼입시키고, 혼입된 표지된 뉴클레오티드 유사체 표지를 검출하고, 혼입된 뉴클레오티드 유사체로부터 표지를 제거하고, 혼입된 뉴클레오티드 유사체로부터 차단 기를 제거하여 새로운 표지된 뉴클레오티드 유사체의 혼입을 가능하게 하는 것을 포함한다. 대조적으로, 본 발명은 절단 가능한 링커를 통해 염기 또는 당에 부착된 염료를 포함하는 표지된 뉴클레오티드 유사체를 필요로 하지 않는다.
참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 공보 US2017/0240961호에 기재된 대안적 접근법에서, 혼입되는 경우 뉴클레오티드 유사체는 링커를 통해 뉴클레오티드에 부착된 친화성 태그를 포함한다. 친화성 태그는 특정 결합쌍(SBP)의 한 구성원이다. 일 접근법에서, 친화성 태그는 비오틴이다. 혼입 후, 혼입된 뉴클레오티드는 SBP의 제2 구성원(예를 들어, 스트렙타비딘) 및 검출 가능한 표지를 포함하는 친화성 시약에 노출된다. 검출 가능한 표지는 혼입된 뉴클레오티드를 확인하기 위해 검출된다. 검출 후, 혼입된 뉴클레오티드 유사체-친화성 시약 복합체는 링커를 절단하고, 검출 가능한 표지를 방출시키기 위해 처리된다. 일 접근법에서, 친화성 태그는 항원이고, 친화성 시약은 항원에 특이적으로 결합하는 형광 표지된 항체이다. 대조적으로, 본 발명은 친화성 태그를 필요로 하지 않으며, 일부 양태에서 친화성 태그가 아닌 핵염기, 당 모이어티, 절단 가능한 차단 기 또는 이들의 조합물에 결합하는 친화성 시약을 이용한다.
본원에 개시된 방법의 일 양태에 따르면, 비-표지된 가역성 종료자, 즉, 가역성 종료자 또는 차단 기를 포함하는 뉴클레오티드 유사체(Non-Labeled Reversible Terminator, 또는 NLRT)가 GDS의 3' 말단에 혼입된 후, 혼입된 NLRT에 특이적으로 결합하는 친화성 시약(예를 들어, 항체)에 노출된다("결합 사건"). 결합 사건의 검출 후, 친화성 시약이 제거된다. 일 접근법에서, 가역성 차단기를 포함하는 뉴클레오티드 유사체가 GDS의 3' 말단에 혼입되고, 결합 사건의 검출 후, 가역성 차단 기 및 친화성 시약이 선택적으로 동일 단계에서 제거된다. 이러한 접근법에서, 시퀀싱의 각각의 주기는 (i) DNA 중합효소에 의한 차단 기를 포함하는 NLRT의 혼입 후 혼입되지 않은 NLRT(들)의 세척; (ii) 혼입된 뉴클레오티드 유사체와 혼입된 NLRT를 인지하고 이에 특이적으로 결합하는 표지된 친화성 시약의 접촉; (iii) 친화성 시약의 결합 검출; (iv) 추가 뉴클레오티드 유사체의 혼입을 가능하게 하는 방식의 차단 기의 제거(예를 들어, 데옥시리보스 모이어티의 3' 위치에서 하이드록실기를 생성함), 및 (v) 친화성 시약의 제거를 포함한다. 이러한 단계 후에 새로운 뉴클레오티드 유사체가 혼입되고 검출되는 새로운 주기 또는 주기들이 후속될 수 있다. 친화성 시약(예를 들어, 항체)은 직접 표지(예를 들어, 형광 표지된 항체)될 수 있거나, 간접적으로 검출(예를 들어, 표지된 항-친화성 시약 이차 친화성 시약의 결합에 의함)될 수 있다. 따라서, "표지된 친화성 시약"은, 예를 들어, 형광단으로의 컨쥬게이션에 의해 직접 표지될 수 있거나, 간접적으로 표지될 수 있음이 인지될 것이다.
또 다른 접근법에서, 가역성 차단 기를 포함하는 뉴클레오티드 유사체가 GDS의 3' 말단에 혼입되고, 결합 사건의 검출 후, 가역성 차단 기 및 친화성 시약이 제거된다. 이러한 접근법에서, 시퀀싱의 각각의 주기는 (i) DNA 중합효소에 의한 차단 기를 포함하는 NLRT의 혼입 후, 선택적인 혼입되지 않은 NLRT(들)의 세척; (ii) 데옥시리보뉴클레오티드의 3' 위치에서 하이드록실(OH) 기를 재생시키는 방식의 차단 기의 제거; (iii) 혼입된 뉴클레오티드 유사체와 혼입된 NLRT를 인지하고 이에 특이적으로 결합하는 표지된 친화성 시약을 접촉시킴에 의한 추가 뉴클레오티드 유사체의 혼입(예를 들어, 데옥시리보스 모이어티의 3' 위치에서 하이드록실 기를 생성시킴)을 가능하게 하는 차단 기의 제거; (iv) 친화성 시약의 결합의 검출; 및 (v) 친화성 시약의 제거를 포함한다. 이러한 단계 후에 새로운 뉴클레오티드 유사체가 혼입되고 검출되는 새로운 주기 또는 주기들이 후속될 수 있다. 친화성 시약(예를 들어, 항체)은 직접 표지(예를 들어, 형광 표지된 항체)될 수 있거나, 간접적으로 검출(예를 들어, 표지된 항-친화성 시약 이차 친화성 시약의 결합에 의함)될 수 있다. 따라서, "표지된 친화성 시약"은, 예를 들어, 형광단으로의 컨쥬게이션에 의해 직접 표지될 수 있거나, 간접적으로 표지될 수 있음이 인지될 것이다.
SBS는 연장된 프라이머의 3' 말단에서 뉴클레오티드가 혼입되는 2회 이상의 주기의 프라이머 연장을 포함한다. 본 발명은 (i) 연장된 프라이머의 3' 말단에 혼입된 뉴클레오티드("3' 말단 뉴클레오티드")를 검출하고, (ii) 상기 3' 말단 뉴클레오티드의 핵염기를 확인하고, 하나의 핵염기를 또 다른 핵염기와 구별(예를 들어, A를 G와 구별)하기 위해 항체와 같은 친화성 시약을 사용한다. 특정 메커니즘으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 이는 각각의 친화성 시약이 3' 말단 뉴클레오티드 및 내부 뉴클레오티드가 동일 핵염기를 포함하는 경우에도 3' 말단 뉴클레오티드를 연장된 프라이머의 다른 "내부" 뉴클레오티드와 구별하도록 설계되므로 가능하다. 각각의 친화성 시약(또는 일부 경우에, 친화성 시약의 조합)은 또한 3' 말단 뉴클레오티드와 관련된 핵염기를 확인하는 3' 말단 뉴클레오티드의 특성을 검출하도록 설계된다. 이들 및 다른 단계를 수행하기 위한 많은 전략, 방법, 및 물질이 제공된다. 본 섹션은 많은 변형이 생략된 개요를 제공하며, 어떤 식으로든 제한하는 것으로 간주해서는 안된다.
일부 접근법에서, 본 발명의 SBS 반응은 3' 가역성 종료자 모이어티를 갖는 뉴클레오티드를 이용하여 수행된다. 이들 접근법에서, 혼입된 3' 말단 뉴클레오티드는 가역성 종료자 모이어티의 존재를 기초로 하여 내부 뉴클레오티드와 상이하다. 따라서, 연장된 프라이머에서 가역성 종료자 모이어티에 결합하는 친화성 시약은 3' 말단 뉴클레오티드에 결합(및 이에 의해 이를 검출)하여 이를 내부 뉴클레오티드와 구별한다. 상이한 접근법에서, 혼입된 3' 말단 뉴클레오티드는 내부 뉴클레오티드에 존재하지 않는 자유 3'-OH(하이드록실) 기의 존재를 기초로 하여 내부 뉴클레오티드와 상이하다. 따라서, 연장된 프라이머에서 자유 3'-OH 기에 결합하는 친화성 시약은 3' 말단 뉴클레오티드에 결합(및 이에 의해 이를 검출)하여 이를 내부 뉴클레오티드와 구별한다. 일부 접근법에서, 자유 3'-OH 기는 혼입된 뉴클레오티드 유사체에서 가역적 종료자의 절단에 의해 생성된다. 또 다른 접근법에서, 자유 3'-OH 기는 자연 발생 뉴클레오티드와 같은 가역성 종료자 모이어티를 포함하지 않는 뉴클레오티드의 혼입으로부터 발생한다. 상기 기재된 2개의 접근법 중 하나와 조합 가능한 추가 접근법에서, 혼입된 3' 말단 뉴클레오티드는 내부 뉴클레오티드의 데옥시리보스에 비한 3' 말단 뉴클레오티드의 데옥시리보스 당에 대한 친화성 시약의 더 큰 접근성, 내부 뉴클레오티드의 데옥시리보스에 비한 친화성 시약에 대한 3' 말단 뉴클레오티드의 핵염기에 대한 친화성 시약의 더 큰 접근성, 및 3' 말단 뉴클레오티드와 내부 뉴클레오시드 사이의 다른 분자 및 입체형태 차이를 포함하나 이에 제한되지는 않는 3' 말단 뉴클레오티드에 특징적인 다른 구조적 차이를 기초로 하여 내부 뉴클레오티드와 상이하다.
따라서, 본 발명의 일 양태에서, 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 연장된 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드와 다른 뉴클레오티드 사이의 이들 구조적 차이를 검출하기 위해 친화성 시약이 사용된다.
또한, 3' 말단 뉴클레오티드의 핵염기를 확인하는 3' 말단 뉴클레오티드의 특성을 검출하기 위한 다수의 전략, 방법, 및 물질이 제공된다. 일 접근법에서, 자연 발생 뉴클레오티드, 또는 자연 발생 핵염기(예를 들어, A, T, C 및 G)를 포함하는 뉴클레오티드 유사체가 시퀀싱 반응에 사용되어 프라이머 연장 생성물에 혼입된다. 하나의 핵염기(예를 들어, A)에 특이적으로 결합하고, 상기 핵염기를 결합하지 않은 다른 핵염기(예를 들어, T, C 및 G)와 구별하는 친화성 시약이 3' 말단 뉴클레오티드의 핵염기를 확인하기 위해 사용된다. 또 다른 접근법에서, 변형된(즉, 자연 발생이 아닌) 핵염기를 포함하는 뉴클레오티드 유사체가 시퀀싱 반응에서 사용되어 프라이머 연장 생성물에 혼입된다. 하나의 변형된 핵염기(예를 들어, 변형된 A)에 특이적으로 결합하고, 상기 변형된 핵염기를 다른 변형된 핵염기 또는 자연 핵염기와 구별하는 친화성 시약. 변형된 핵염기에 특이적으로 결합하는 친화성 시약은 일반적으로 변형된 핵염기에 대한 결합이 변형이 없는 자연 발생 핵염기에 대한 결합과 상이하도록 변형을 인식한다. 예를 들어, 위치 7의 질소(N7)가 메틸화된 탄소에 의해 대체된 아데노신 유사체(하기 구조 XV 참조)에 결합하는 친화성 시약은 자연 발생(변형되지 않은) 아데노신 핵염기에 결합하지 않거나, 덜 활발하게 결합할 수 있다. 특정 메커니즘으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 변형된 모이어티(이 경우, 변형된 핵염기)를 특이적으로 인지하는 친화성 시약이 변형된 특징부(이 경우, 메틸화된 탄소를 포함하는 변형된 아데노신의 일부)에 결합함으로써 그렇게 작용하는 것으로 생각된다. 달리 말하면, 친화성 시약은 메틸화된 탄소를 포함하는 에피토프에 결합한다. 친화성 시약은 혼입된 뉴클레오티드의 다른 부분에 또한 결합하는 것이 이해될 것이다.
또 다른 접근법에서, 3' 가역성 차단 기를 갖는 뉴클레오티드(가역성 종료자 뉴클레오티드)는 프라이머 연장 생성물에 혼입된다. 차단 기는 각각의 시퀀싱 주기에서 제거되어 프라이머 연장 생성물의 마지막으로 혼입된 뉴클레오티드만이 차단 기를 포함한다. 이러한 접근법에서, 차단 기에 결합하는 친화성 시약이 사용된다. 이러한 접근법에서, 시퀀싱 반응에서 사용되는 적어도 2개의 뉴클레오티드 유사체(즉, 상이한 핵염기를 가짐)는 상이한 차단 기를 포함한다. 예시를 위해, 아데닌 또는 아데닌 유사체를 포함하는 뉴클레오티드에 대해 제1 차단 기(예를 들어, 3'-O-아지도메틸), 구아닌 또는 구아닌 유사체를 포함하는 뉴클레오티드에 대해 제2의 상이한 차단 기(예를 들어, 3'-O-시아노에틸렌) 등을 이용함으로써, 친화성 시약의 특이성은 관련 핵염기를 확인할 것이다. 예를 들어, 상기 예시에 연장하여, 3' 말단 뉴클레오티드가 3'-O-시아노에틸렌에 특이적인 친화성 시약에 의해 인지되는 경우, 이는 관련 핵염기가 구아닌 또는 구아닌 유사체이고, 이러한 위치에서의 주형 염기가 시토신임을 나타낸다. 이러한 접근법의 변형에서, 단지 작은 특징만이 상이한 차단 기가 사용될 수 있고, 친화성 시약은 구별되는 작은 특징을 포함하는 에피토프에 결합한다.
본원의 하기에 기재되는 바와 같이, 본 발명의 일 양태에서, 구조적 특징의 조합을 기초로 하여 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 인지하고 이에 특이적으로 결합하는 친화성 시약(예를 들어, 특정 차단 기 및 특정 변형을 갖는 특정 핵염기를 인지하는 친화성 시약)이 사용된다. 이러한 양태에서, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체는 특정 친화성 시약에 의해 인지되는 특성에 대해 설계되고/되거나 선택된다. 일부 경우에, 다수의 구조적 특징부에 결합하는 친화성 시약은 보다 강력하고 보다 특이적인 친화성 시약 결합의 이점을 갖는다. 하기 표 A는 상이한 핵염기를 갖는 뉴클레오티드를 구별하기 위한 친화성 시약에 의해 인지될 수 있는 구조적 차이의 예(두번째 열) 및 충분한 결합 효율을 제공하는 친화성 시약에 의해 결합될 수 있고/있거나 상기 특징부를 기초로 하여 내부 뉴클레오티드로부터 마지막으로 혼입된 뉴클레오티드를 구별하는 마지막으로 혼입된 뉴클레오티드 내의 모이어티(세번째 열)의 총망라된 것은 아닌 수집물이다.
표 A
Figure pct00005
Figure pct00006
하기에 상세히 논의되는 바와 같이, 표지된 친화성 시약이 결합하는 혼입된 뉴클레오티드 유사체의 일부는, 비제한적인 예로, 핵염기 및 차단 기, 또는 뉴클레오티드 유사체의 당 모이어티와 조합된 핵염기 및/또는 차단 기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 하기 표 A를 참조한다. 표지된 친화성 시약의 결합은 표적 뉴클레오티드의 위치에 좌우될 수 있으며, 예를 들어, GDS의 3' 말단에 차단 기를 갖는 뉴클레오티드 유사체와 GDS 내 또는 내부에 위치되는 유사한 뉴클레오티드 유사체(차단 기가 결여됨)를 구별할 수 있다. 표지된 친화성 시약의 결합은 또한 핵염기 자체에 의존하므로, 친화성 시약은 어레이의 한 위치에서 GDS의 말단에 혼입된 하나의 표적 NLRT(예를 들어, NLRT-A)에 결합하나, 어레이의 상이한 위치에서 GDS의 말단에 혼입된 다른 NLRT(예를 들어, NLRT-C, -T, 또는 -G)에는 결합하지 않는다.
본 발명은 다른 SBS 방법에 비해 장점을 갖는다. 표지된 친화성 시약의 제거는 링커의 절단 후 dNTP에 부착된 채로 남아 있는 기로부터 발생하는 화학적 "흉터(scar)"를 남기지 않는다. 이는 상기 "흉터"가 중합효소에 의한 dNTP 혼입의 효율을 감소시킬 수 있으므로 유리하다. 또한, 이러한 접근법에서, 친화성 시약은 다수의 형광 모이어티를 포함할 수 있으며, 일반적으로 이용되는 방법에 따라 dNTP에 부착된 단일 형광 염료보다 강한 신호를 제공할 수 있다. 이러한 접근법은 또한 낮은 여기 전력 또는 더 짧은 노출 시간이 이용될 수 있으므로 광 손상을 덜 일으킬 수 있다. 본원에 개시된 접근법은 더 긴 판독(예를 들어, 500개 염기보다 길거나, 1000개 염기보다 긴 판독) 및/또는 50, 100 또는 200개 염기보다 긴 더 정확한 판독(예를 들어, 2000개 염기에서 하나 또는 5000개 염기에서 하나보다 적은 오류를 가짐)을 가능하게 하는 것으로 예상된다. 본 발명의 조성물 및 방법은 또한 SBS에 일반적으로 이용되는 표지된 가역성 종료자(RT) 방법보다 더 경제적일 수 있다. 비-표지된 RT는 표지된 RT보다 비용이 적게 든다. 표지된 RT를 이용하는 표준 SBS에서, RT의 혼입을 완료시키기 위해 고농도의 표지된 RT가 사용되고, 표지된 RT의 대부분(70-99% 이상)은 중합효소에 의해 혼입되지 않고 세척된다. 따라서, 저비용의 표지되지 않은 RT를 이용하는 것은 상기 비용을 감소시킨다. 또한, 표지된 친화성 시약이 사용되는 본 발명의 표지화 단계에서, 특히 친화성 시약이 표적 dNTP에 효율적으로 결합하고, 다수의 표지 분자를 포함하는 경우 영상화를 위한 충분한 신호를 획득하기 위해 단지 적은 백분율의 표적 주형이 다수를 갖는 친화성 시약에 의해 결합되는 것이 충분할 수 있고, 표지화되는 다수의 분자의 표지 대 표지화되는 하나의 분자의 결합제를 갖는 효율적으로 표지되는 결합제를 이용하여 심지어 30%(예를 들어, 약 5%, 또는 약 10%, 또는 약 15% 미만, 약 20% 미만, 약 25% 미만, 또는 약 30% 미만)가 충분할 수 있다. 친화성 시약이 단지 하나의 표지 분자를 갖는 경우 더 높은 수준의 결합이 바람직할 수 있다(예를 들어, 70 퍼센트 이상).
2. 정의 및 용어
본원에서 사용되는 바와 같은, 뉴클레오티드 유사체의 상황에서의 용어 "표지되지 않은" 및 "비-표지된"은 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 문맥에서 달리 명백하지 않는 한, "비-표지된 가역성 종료자 [뉴클레오티드]", "NLRT", "가역성 종료자 뉴클레오티드", "가역성 종료자", "RT" 등은 모두 핵염기 또는 유사체, 데옥시리보스 또는 유사체, 및 절단 가능한 차단 기를 포함하는 시퀀싱 시약을 나타내기 위해 사용된다. 비-표지된 가역성 종료자 뉴클레오티드는 초기에 3' 말단에 그리고 존재시 추가 혼입 주기 후 프라이머 연장 생성물의 "내부" 부분 내의 프라이머 연장 생성물로 혼입된 dNTP(즉, 중합효소에 대한 기질) 또는 가역성 종료자 뉴클레오티드를 나타낼 수 있다.
본원에서 사용되는 "dNTP"는 자연 발생 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 및 3'-O 절단 가능 차단 기를 갖는 유사체를 포함하는 이의 유사체 둘 모두를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 뉴클레오티드 유사체의 절단 가능 차단 기의 상황에서, 3'-O-"라는 명칭은 때때로 명시적이기보다는 함축되어 있다. 예를 들어, 용어 "아지도메틸", "3'-O-아지도메틸"은 문맥에서 명백한 바와 같이 상호교환적이다.
"앰플리콘"은 폴리뉴클레오티드 증폭 반응의 생성물, 즉, 하나 이상의 시작 서열로부터 복제되는 폴리뉴클레오티드의 집단을 의미한다. 앰플리콘은 중합효소 연쇄 반응(PCR), 선형 중합효소 반응, 핵산 서열-기반 증폭, 롤링 서클 증폭 및 유사 반응을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 증폭 반응에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 4,683,195호; 4,965,188호; 4,683,202호; 4,800,159호; 5,210,015호; 6,174,670호; 5,399,491호; 6,287,824호 및 5,854,033호; 및 미국 공보 번호 2006/0024711호 참조).
본원에서 사용되는 "항원"은 항체에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 화합물을 의미한다. 일부 항원은 면역원이다(문헌[Janeway, et al., Immunobiology, 5th Edition, 2001, Garland Publishing] 참조). 일부 항원은 항체에 의해 인지되지만, 단백질에 컨쥬게이션되지 않는 경우 면역 반응을 유도하지 않는 합텐이다. 예시적 항원은 NLRT, 가역성 종료자 차단 기, dNTP, 폴리펩티드, 소분자, 지질, 또는 핵산을 포함한다.
"어레이" 또는 "마이크로어레이"는 수집물의 각각의 부위가 공간적으로 정의되고, 어레이의 다른 부위와 중첩되지 않도록, 즉, 부위가 공간적으로 분리되어 있도록 핵산을 포함하는 부위의 수집물을 갖는 표면, 바람직하나 배타적이지 않은 평면 또는 실질적으로 평면 표면을 갖는 고체 지지체(또는 비드와 같은 고체 지지체의 수집물)를 의미한다. 어레이 또는 마이크로어레이는 또한 비드 또는 웰과 같은 표면을 갖는 비-평면의 질의 가능한 구조를 포함할 수 있다. 어레이의 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 고체 지지체에 공유적으로 결합될 수 있거나, 이는 비공유적으로 결합될 수 있다. 통상적인 마이크로어레이 기술은, 예를 들어, 문헌[Schena, Ed. (2000), Microarrays: A Practical Approach (IRL Press, Oxford)]에 개관되어 있다. 본원에서 사용되는 "무작위 어레이" 또는 "무작위 마이크로어레이"는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 정체가 적어도 초기에는 이들의 위치로부터 식별 가능하지 않지만, 어레이 상의 특정 생화학 검출 기술에 의해 결정될 수 있는 마이크로어레이를 나타낸다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,396,995호; 6,544,732호; 6,401,267호; 및 7,070,927호; PCT 공보 WO 2006/073504호 및 2005/082098호; 및 미국 특허 공보 번호 2007/0207482호 및 2007/0087362호를 참조한다.
차단 기와 관련하여 용어 "가역성", "제거 가능" 및 "절단 가능"은 동일한 의미를 갖는다.
가역성 종료자 뉴클레오티드의 용어 "가역성 차단 기"는 또한 "제거 가능한 차단 기", "절단 가능한 링커", "차단 모이어티", "차단 기", "가역성 종료자 차단 기" 등으로 언급될 수 있다. 가역성 차단 기는 일반적으로 당 모이어티의 3'-O 위치에서 뉴클레오티드 당(예를 들어, 데옥시리보스)에 부착된 화학적 모이어티이며, 이는 상기 위치에서의 중합효소에 의한 뉴클레오티드의 첨가를 방지한다. 가역성 차단 기는 중합효소에 의한 뉴클레오티드의 첨가가 발생할 수 있도록 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드의 3'-위치에서 하이드록실기를 제공하기 위해 효소(예를 들어, 포스파타제 또는 에스테라제), 화학적 반응, 열, 빛 등에 의해 절단될 수 있다.
"유도체" 또는 "유사체"는 코어 구조가 모 화합물의 것과 동일하거나 매우 유사하지만, 유도체 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드가 또 다른 분자에 연결되는 것을 가능하게 하는 상이하거나 추가의 측면 기, 또는 2' 및/또는 3' 차단 기와 같은 화학적 또는 물리적 변형을 갖는 화합물 또는 분자를 의미한다. 예를 들어, 염기는 데아자퓨린일 수 있다. 유도체는 왓슨-크릭 쌍형성을 겪을 수 있어야 한다. "유도체" 및 "유사체"는 또한 변형된 염기 모이어티 및/또는 변형된 당 모이어티를 갖는 합성 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 유도체를 의미한다. 상기 유도체 및 유사체는, 예를 들어, 문헌[Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley & Son, 1980) 및 Uhlman et al., Chemical Reviews 90:543-584, 1990]에 논의되어 있다. 뉴클레오티드 유사체는 또한 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 알킬-포스포네이트, 포스포르아닐리데이트 및 포스포르아미데이트 결합을 포함하는 변형된 포스포디에스테르 결합을 포함할 수 있다. 유사체는 왓슨-크릭 염기쌍 형성을 겪을 수 있어야 한다. 예를 들어, 데옥시아데노신 유사체는 디다노신(didanosine)(ddI) 및 비다라빈(vidarabine)을 포함하고, 아데노신 유사체는 BCX4430을 포함하고; 데옥시시티딘 유사체는 시타라빈(cytarabine), 젬시타빈(gemcitabine), 엠트리시타빈(emtricitabine)(FTC), 라미부딘(lamivudine)(3TC), 및 잘시타빈(zalcitabine)(ddC)을 포함하고; 구아노신 및 데옥시구아노신 유사체는 아바카버(abacavir), 아시클로버(aciclovir), 및 엔테타버(entecavir)를 포함하고; 티미딘 및 데옥시티미딘 유사체는 스타부딘(stavudine)(d4T), 텔비부딘(telbivudine), 및 지도부딘(zidovudine)(아지도티미딘(azidothymidine), 또는 AZT)을 포함하고; 데옥시우리딘 유사체는 이독스우리딘(idoxuridine) 및 트리플루리딘(trifluridine)을 포함한다. 본원에서 사용되는 "유도체", "유사체" 및 "변형된"은 상호교환적으로 사용될 수 있고, 본원에 정의된 용어 "뉴클레오티드" 및 "뉴클레오시드"에 의해 포함된다.
"혼입하다"는 핵산 분자의 일부가 되는 것을 의미한다. SBS에서, RT의 혼입은 중합효소가 하나의 뉴클레오티드의 펜토스의 3' 위치, 즉, DNA 가닥 상의 3' 뉴클레오티드와 인접한 뉴클레오티 상의 펜토스의 5' 위치, 즉, DNA 가닥에 첨가되는 RT 사이의 포스포디에스테르 또는 변형된 포스포디에스테르 결합의 형성을 통해 성장하는 DNA 가닥에 RT를 첨가하는 경우에 발생한다.
표지된 친화성 시약의 상황에서 "표지"는 검출 가능하고/하거나 정량 가능한 신호를 제공하기 위해 사용될 수 있는 임의의 원자 또는 분자를 의미한다. 적합한 표지는 방사성 동위원소, 형광단, 발색단, 질량 표지, 전자 밀집 입자, 자성 입자, 스핀 라벨, 화학발광을 방출하는 분자, 전기화학적 활성 분자, 효소, 보조인자, 및 효소 기질을 포함한다. 일부 구현예에서, 검출 표지는 하전된 기(예를 들어, 양이온 기를 함유하는 분자 또는 음이온 기를 함유하는 분자), 형광 분자(예를 들어, 형광 염료), 형광원성 분자, 또는 금속을 함유하는 분자이다. 선택적으로, 검출 표지는 형광원성 표지이다. 형광원성 표지는 켄칭되지 않은 형태인 경우(예를 들어, 또 다른 제제에 의해 켄칭되지 않은 경우) 빛을 방출할 수 있는 임의의 표지일 수 있다. 형광 모이어티는 적절한 여기 파장에 의해 여기되는 경우 특정 방출 파장에서 빛 에너지(즉, 형광)를 방출한다. 형광 모이어티 및 켄처 모이어티가 근접하여 있는 경우, 형광 모이어티에 의해 방출된 빛 에너지는 켄처 모이어티에 의해 흡수된다. 일부 구현예에서, 형광원성 염료는 플루오레세인(fluorescein), 로다민(rhodamine), 페녹사진(phenoxazine), 아크리딘(acridine), 쿠마린(coumarin), 또는 이들의 유도체이다. 일부 구현예에서, 형광원성 염료는 카르복시플루오레세인이다. 적합한 형광원성 염료의 추가 예는 Alexa Fluor® 제품 라인(Life Technologies, Carlsbad, CA)으로 상업적으로 이용 가능한 형광원성 염료를 포함한다. 대안적으로, 산화환원 표지, 환원 태그, 티오 또는 티올 함유 분자, 치환되거나 비치환된 알킬, 형광 단백질, 비-형광 염료, 및 발광 단백질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 비-형광원성 표지가 사용될 수 있다.
"핵염기"는 주형 핵산의 상보적 질소성 염기와 염기쌍을 형성할 수 있는 질소성 염기를 의미한다. 예시적 핵염기는 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T), 우라실(U), 이노신(I) 및 이들의 유도체를 포함한다. 본원에서 티민에 대한 언급은 문맥에서 달리 명백하지 않는 한 우라실을 동등하게 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용되는 용어 "핵염기", "질소성 염기" 및 "염기"는 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 "자연 발생 핵염기"는 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T), 또는 우라실(U)을 의미한다. 일부 경우에, 자연 발생 핵염기는 A, C, G 및 T(DNA에서 발견되는 자연 발생 염기)를 나타낸다.
"뉴클레오티드"는 핵염기, 당, 및 하나 이상의 포스페이트 기로 구성된다. 이들은 핵산 서열의 단량체 단위이다. RNA에서, 당은 리보스이고, DNA에서는 데옥시리보스, 즉, 리보스에 존재하는 하이드록실기가 결여된 당이다. 질소성 염기는 퓨린 또는 피리미딘의 유도체이다. 퓨린은 아데닌(A) 및 구아닌(G)이고, 피리미딘은 시토신(C) 및 티민(T)(또는 RNA의 상황에서, 우라실(U))이다. 데옥시리보스의 C-1 원자는 피리미딘의 N-1 또는 퓨린의 N-9에 결합된다. 뉴클레오티드는 또한 당의 C-5에 부착된 하이드록실 기 상에서 발생하는 에스테르화를 갖는 포스페이트 에스테르 또는 뉴클레오시드이다. 뉴클레오티드는 일반적으로 모노, 디- 또는 트리포스페이트이다. "뉴클레오시드"는 뉴클레오티드와 구조적으로 유사하지만, 포스페이트 모이어티를 포함하지 않는다. 일반적인 약어는 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트에 대한 "dNTP"를 포함한다.
"핵산"은 뉴클레오티드 단량체의 중합체를 의미한다. 본원에서 사용되는 상기 용어는 단일-가닥 또는 이중-가닥 형태를 나타낼 수 있다. 핵산 및 올리고뉴클레오티드를 구성하는 단량체는 단량체 대 단량체 상호작용의 규칙적 패턴, 예를 들어, 왓슨-크릭 유형의 염기쌍 형성, 염기 스태킹(stacking), 후그스틴(Hoogsteen) 또는 역 후그스틴 유형의 염기쌍 형성 등에 의해 자연 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하여 듀플렉스 또는 트리플렉스 형태를 형성할 수 있다. 상기 단량체 및 이의 뉴클레오시드간 결합은 자연 발생일 수 있거나, 이의 유사체, 예를 들어, 자연 발생 또는 비-자연 발생 유사체일 수 있다. 비-자연 발생 유사체는 펩티드 핵산, 잠금 핵산, 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합, 형광단과 같은 표지의 부착을 가능하게 하는 연결 기 함유 염기, 또는 합텐 등을 포함할 수 있다. 핵산은 전형적으로 이들이 "올리고뉴클레오티드"로 일반적으로 언급되는 경우, 예를 들어, 5 내지 40과 같은 소수의 단량체 단위로부터 수십만 개 이상의 단량체 단위의 크기 범위이다. 핵산 또는 올리고뉴클레오티드가 "ATGCCTG"와 같은 일련의 문자(대문자 또는 소문자)로 표시될 때마다, 문맥으로부터 달리 표시되거나 명백하지 않는 한 뉴클레오티드는 좌측에서 우측으로 5' 에서 3' 순서이고, "A"는 데옥시아데노신을 나타내고, "C"는 데옥시시티딘을 나타내고, "G"는 데옥시구아노신을 나타내고, "T"는 티미딘을 나타내고, "I"는 데옥시이노신을 나타내고, "U"는 우리딘을 나타내는 것이 이해될 것이다. 달리 명시하지 않는 한, 용어 및 원자 넘버링 규칙은 문헌[Strachan and Read, Human Molecular Genetics 2 (Wiley-Liss, New York, 1999)]에 개시된 것을 따를 것이다. 일반적으로, 핵산은 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 자연 뉴클레오시드(예를 들어, DNA에 대해 데옥시아데노신, 데옥시시티딘, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘 또는 RNA에 대해 이들의 리보스 대응물)를 포함하나; 이들은 또한 비-자연 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어, 변형된 염기, 당, 또는 뉴클레오시드간 결합을 포함할 수 있다. 당업자에게 있어서, 효소가 활성에 대한 특정한 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 기질 요구조건, 예를 들어, 단일-가닥 DNA, RNA/DNA 듀플렉스 등을 갖는 경우, 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 기질에 대한 적절한 조성물의 선택은, 특히 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989)], 및 유사 참고문헌과 같은 논문으로부터의 지침에 따라 충분히 당업자의 지식 내이다.
"프라이머"는 폴리뉴클레오티드 주형과 듀플렉스 형성시 핵산 합성의 개시 지점으로 작용할 수 있고, 주형을 따라 이의 3' 말단으로부터 연장되어 연장된 듀플렉스가 형성될 수 있는 자연 또는 합성의 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 연장 과정 동안 첨가되는 뉴클레오티드의 서열은 주형 폴리뉴클레오티드의 서열에 의해 결정된다. 일반적으로, 프라이머는 DNA 중합효소에 의해 연장된다. 프라이머는 일반적으로 9 내지 40개의 뉴클레오티드, 또는 일부 구현예에서 14 내지 36개의 뉴클레오티드 범위의 길이를 갖는다.
"폴리뉴클레오티드"는 DNA, RNA, 및 하이브리드 및 합성 핵산을 의미하기 위해 용어 "핵산"과 상호교환적으로 사용되며, 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있다. "올리고뉴클레오티드"는 길이가 약 6 내지 약 300개의 뉴클레오티드인 짧은 폴리뉴클레오티드이다. "상보적 폴리뉴클레오티드"는 표적 핵산에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 나타낸다.
"고체 지지체" 및 "지지체"는 상호교환적으로 사용되며, 강성 또는 반-강성 표면 또는 표면들을 갖는 물질 또는 물질의 그룹을 나타낸다. 마이크로어레이는 일반적으로 적어도 하나의 평면 고체상 지지체, 예를 들어, 유리 현미경 슬라이드를 포함한다.
본원 및 첨부된 청구항에서 사용되는 바와 같은 단수 형태는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "중합효소"에 대한 언급은 하나의 제제 또는 상기 제제의 혼합물을 나타내며, "방법"에 대한 언급은 당업자에게 공지된 동등한 단계 및/또는 방법에 대한 언급을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 언급된 모든 간행물은 간행물에 기재되고, 이전에 기재된 발명과 관련하여 사용될 수 있는 장치, 조성물, 제형 및 방법을 기술하고 개시하기 위한 목적으로 본원에 참조로서 포함된다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥이 달리 명백히 지시하지 않는 한, 상기 범위의 상한과 하한 사이의 하한 단위의 1/10까지의 각각의 사이에 존재하는 값 및 상기 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급되거나 사이에 존재하는 값이 본 발명에 포함되는 것이 이해된다. 언급된 범위 내의 임의의 특별히 배제되는 한계를 조건으로 하여, 더 작은 범위에 독립적으로 포함될 수 있는 상기 작은 범위의 상한 및 하한이 본 발명에 또한 포함된다. 언급된 범위가 하나 또는 둘 모두의 한계를 포함하는 경우, 포함된 한계 둘 모두 중 어느 하나를 배제한 범위가 또한 본 발명에 포함된다.
하기 설명에서, 본 발명의 더욱 충분한 이해를 제공하기 위해 다수의 특정 세부사항이 기재된다. 그러나, 본 발명은 이들 특정 세부사항 중 하나 이상 없이 실시될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 다른 예에서, 본 발명을 불명료하게 하는 것을 피하기 위해 널리 공지된 특징 및 당업자에게 널리 공지된 절차는 기재되지 않았다.
본 발명은 주로 특정 구현예를 참조로 하여 기재되었으나, 본 발명의 개시를 읽는 경우 다른 구현예가 당업자에게 명백해질 것으로 또한 예견되고, 상기 구현예는 본 발명의 방법 내에 함유되는 것으로 의도된다.
본 발명의 실시는 달리 명시하지 않는 한 유기 화학, 중합체 기술, 분자 생물학(재조합 기술 포함), 세포 생물학, 생화학, 및 면역학의 통상적인 기술 및 설명을 이용할 수 있으며, 이는 당 분야의 기술 범위 내이다. 상기 통상적인 기술은 중합체 어레이 합성, 하이브리드화, 라이게이션, 및 표지를 이용한 하이브리드화의 검출을 포함한다. 적합한 기술의 특정 예시는 본원의 하기의 예를 참조할 수 있다. 그러나, 다른 동등한 통상적인 절차가 물론 또한 이용될 수 있다. 상기 통상적인 기술 및 설명은 문헌[Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV), Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cells: A Laboratory Manual, PCR Primer: A Laboratory Manual, and Molecular Cloning: A Laboratory Manual (all from Cold Spring Harbor Laboratory Press), Stryer, L. (1995) Biochemistry (4th Ed.) Freeman, N.Y., Gait, "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" 1984, IRL Press, London, Nelson and Cox (2000), Lehninger, Principles of Biochemistry 3rd Ed., W. H. Freeman Pub., New York, N.Y. and Berg et al. (2002) Biochemistry, 5th Ed., W. H. Freeman Pub., New York, N.Y.]과 같은 표준 실험실 매뉴얼에서 발견될 수 있으며, 상기 문헌 모두는 모든 목적상 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.
3. 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체
다양한 구현예에서, 본 발명에 따른 SBS는 비-표지된 가역성 종료자("NLRT")(예를 들어, 차단 기를 갖는 뉴클레오티드 유사체), 비-표지된 자연 발생 뉴클레오티드(예를 들어, dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP), 또는 차단 기를 포함하지 않는 비-표지된 뉴클레오티드 유사체를 이용할 수 있다.
3.1 비-표지된 가역성 종료자(NLRT)
본 발명의 비-표지된 가역성 종료자("NLRT")는 데옥시리보스의 3'-OH 위치에 제거 가능한 차단 기를 포함하는 뉴클레오티드 유사체이다. 다수의 가역성 종료자가 기재되었고, 가역성 종료자가 SBS에서 널리 사용되지만, 본 발명에 따라 사용되는 비-표지된 가역성 종료자는 상업적 용도의 것과 상이한데, 이는 이들이 비-표지되고, 이들이 본원의 하기에 기재되는 친화성 시약과 함께 사용되기 때문이다. 일 양태에서, 본 발명의 NLRT는 비-표지된다. 일 구현예에서, 비-표지된은 NLRT가 형광 염료를 포함하지 않는 것을 의미한다. 일 구현예에서, 비-표지된은 NLRT가 화학발광 염료를 포함하지 않는 것을 의미한다. 일 구현예에서, 비-표지된은 NLRT가 발광 모이어티를 포함하지 않는 것을 의미한다.
일부 구현예에서, 예시적 NLRT는 DNA 가닥으로의 NLRT의 혼입 전에 하기 구조 I을 갖는다.
Figure pct00007
구조 I
상기 식에서, R1은 3'-O 가역성 차단 기이고, R2는 핵염기이거나 이를 포함하고; R3는 적어도 하나의 포스페이트 기 또는 이의 유사체를 포함한다.
가역성 차단 기 R1은 DNA 가닥으로의 NLRT의 혼입 후에 제거될 수 있다. DNA 가닥의 3' 말단에서의 유사체의 혼입 후, 차단 기의 제거는 3'-OH를 발생시킨다. 임의의 가역성 차단 기가 사용될 수 있다. 예시적 가역성 차단 기가 하기에 기재된다.
핵염기 R2는, 예를 들어, 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T), 우라실(U), 또는 이노신(I) 또는 이들의 유사체일 수 있다. NLRT는 핵염기에 따라 언급될 수 있으며; 예를 들어, A 핵염기를 갖는 NLRT는 NLRT-A로 언급된다. 따라서, 상응하는 NLRT는 본원에서 "NLRT-A", "NLRT-C", "NLRT-G", "NLRT-T", "NLRT-U", 및 "NLRT-I"로 각각 언급된다. NLRT-T 및 NLRT-C는 NLRT-피리미딘으로 언급될 수 있다. NLRT-G 및 NLRT-A는 NLRT-퓨린으로 언급될 수 있다.
핵염기 R2는 임의의 핵염기 또는 핵염기 유사체(예를 들어, 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민, 우라실, 또는 이노신의 유사체)일 수 있다. 예를 들어, 자연 발생 핵염기에 대한 변형은 항체를 발생시키는 경우에 유사체에 대한 면역 반응을 증가시키거나, 특정 핵염기에 대한 항체(들)의 특이성을 증가시키기 위해 이루어질 수 있다.
R3은 1 내지 10개의 포스페이트 또는 포스페이트 유사체 기일 수 있다. 포스페이트 유사체는 포스포로티오에이트 결합이 DNA의 포스페이트 백본, 또는 당 분야에 공지된 임의의 다른 적합한 포스페이트 유사체에서 비-브릿징 산소를 황 원자로 대체한 포스포로티오에이트(PS)를 포함한다. 일부 경우에, R3는 1 내지 10개의 포스페이트 기일 수 있다. 일부 경우에, R3는 3 내지 12개의 포스페이트 기일 수 있다. 일부 경우에, 뉴클레오티드 유사체는 뉴클레오시드 트리포스페이트이다.
특정 구현예에서, 화학식 I의 R1은 184 미만, 종종 174 미만, 종종 164 미만, 종종 154 미만, 종종 144 미만, 종종 134 미만, 종종 124 미만, 종종 114 미만, 종종 104 미만, 종종 94 미만, 및 때때로 84 미만의 MW를 갖는다. R1은 합텐으로 작용할 수 있고, KLH와 같은 더 큰 담체 분자에 컨쥬게이션되는 경우 면역 반응을 유도할 수 있다.
혼입되지 않은 NLRT 뉴클레오티드 유사체는 DNA 중합효소 활성을 갖는 효소에 대한 기질로서 적합하며, 3' 말단에서 DNA 가닥에 혼입될 수 있음이 인지될 것이다. 예를 들어, 가역성 차단 기는 NLRT가 적어도 일부 DNA 중합효소에 대한 기질이 되도록 하는 크기 및 구조를 가져야 한다. NLRT의 혼입은 말단 트랜스페라제, 중합효소 또는 역전사효소를 통해 달성될 수 있다. 예를 들어, 이중 돌연변이체 Y409V 및 A485L을 포함하는 A485L을 포함하는 9° N 또는 이의 돌연변이체와 같은 써모코쿠스 종(Thermococcus sp.)으로부터의 DNA 중합효소를 포함하는 시퀀싱에서 사용되는 임의의 DNA 중합효소가 사용될 수 있다. 당 분야에 공지된 바와 같이, 중합효소는 3' 차단 기의 특성과 관련하여 매우 구별력이 있다. 결과로서, 중합효소 단백질에 대한 돌연변이가 효율적인 혼입을 유도하기 위해 종종 필요하다. 본 발명에서 사용될 수 있는 예시적인 DNA 중합효소 및 방법은 문헌[Chen, C., 2014, "DNA Polymerases Drive DNA Sequencing-By-Synthesis Technologies: Both Past and Present" Frontiers in Microbiology, Vol. 5, Article 305, Pinheiro, V. et al. 2012 "Polymerase Engineering: From PCR and Sequencing to Synthetic Biology" Protein Engineering Handbook: Volume 3:279-302], 국제 특허 공보 WO2005/024010호 및 WO2006/120433호에 기재된 것을 포함하며, 상기 문헌 및 특허 공보 각각은 모든 목적상 참조로서 포함된다. 일부 경우에, 중합효소는 이중 돌연변이체 Y409V 및 A485L을 포함하는 A485L을 포함하는 9° N 또는 이의 돌연변이체와 같은 써모코쿠스 종으로부터의 DNA 중합효소이다. 다른 예로는 E. 콜리 DNA 중합효소 I, DNA 중합효소 I의 클레노우(Klenow) 단편, T7 또는 T5 박테리오파지 DNA 중합효소, HIV 역전사효소; Phi29 중합효소, 및 Bst DNA 중합효소를 포함한다.
차단 기에 대한 변형은 가역성 종료자 기능을 방해하지 않아야 하는 것이 이해될 것이다. 즉, 이들은 3'-OH 데옥시리보뉴클레오티드를 생성하기 위해 절단 가능해야 한다.
일 구현예에서, RT는 DNA 가닥으로의 RT의 혼입 전에 하기 구조 II를 갖는다.
구조 II
Figure pct00008
상기 식에서, R1은 3'-O 가역성 차단 기이고, R4는 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T), 및 우라실(U)로부터 선택되는 핵염기이고; R3는 적어도 하나(예를 들어, 1 내지 10개)의 포스페이트를 포함한다. 일부 경우에, R3는 트리포스페이트이다.
일 구현예에서, RT는 DNA 가닥으로의 RT의 혼입 후에 하기 구조 III를 갖는다.
구조 III
Figure pct00009
상기 식에서, R1은 3'-O 가역성 차단 기이고, R2는 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T), 우라실(U) 또는 이노신(I), 또는 이들의 유사체와 같은 핵염기이고, X는 포스페이트-당 결합(예를 들어, 하나의 뉴클레오시드 당 분자의 3' 탄소 원자와 또 다른 뉴클레오시드 당 분자의 5' 탄소 원자를 연결시키는 포스포디에스테르 결합)에 의해 연결된 10 내지 1000개의 뉴클레오시드를 포함하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, GDS)이다.
또 다른 구현예에서, RT는 가역성 차단 기의 혼입 및 제거 후에 구조 IV를 갖는다.
구조 IV
Figure pct00010
R6는 H이고, R7은 상기 정의된 바와 같은 포스페이트-당 결합에 의해 연결된 10 내지 1000개의 뉴클레오시드를 포함하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, GDS)이거나, 상기 정의된 바와 같은 R3이다.
구조 I, III 및 IV의 특정 구현예에서, R2는 염기의 결합 특이성을 변화시키지 않는 변형(즉, A 유사체는 T에 결합하고, T 유사체는 A에 결합하고 기타도 마찬가지)을 갖지만, (ii) 유사체가 자연 발생 염기보다 더욱 면역원성이 되도록 할 수 있는 핵염기 유사체(예를 들어, A, T, G, C, U의 유사체)이다. 일부 구현예에서, 변형은 3개 이하의 탄소를 포함하는 기의 첨가를 포함할 수 있다. 첨가된 기는 이들이 GDS로 혼입되어 GDS가 변형을 포함하는 복수의 뉴클레오티드를 포함함에 따라 뉴클레오시드로부터 제거되지 않는다. 상기 구현예에서, 친화성 시약은 변형을 포함하는 말단 뉴클레오티드 유사체에 결합하나, 변형을 갖는 내부 뉴클레오티드는 훨씬 낮은 친화성으로 결합한다.
제공된 말단(예를 들어, 3' 말단)에 하나 초과의 말단 뉴클레오티드가 존재하는 적용에서, 예를 들어, 상이한 차단 기에 의하거나, 지지체에 "오염" 말단을 부착시킴으로써 관심 대상이 아닌 말단을 차단하기 위해 다양한 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, DNB 시퀀싱의 경우, 시퀀싱에 사용되는 3' 말단에 더하여 3' 말단이 존재할 수 있다. 브릿지 PCR에 의해 생성되는 PCR 클러스터에서, 시퀀싱 주형은 5' 말단에 의해 부착되고, 이에 따라 주형의 3' 말단은 RT로 연장될 수 없거나, 본원에 기재된 분자 결합제와의 결합을 방지하도록 변형된다.
3.2 가역성 종료자 차단 기
본 발명에서 사용되는 NLRT는 임의의 적합한 차단 기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 차단 기는 3'-OH 기를 생성시키기 위해 화학적 또는 효소적 처리에 의해 제거될 수 있는 것이다. 화학적 처리는 주형 또는 프라이머 연장 가닥을 유의하게 분해시키지 않아야 한다. 다양한 분자 모이어티가 3'-O-알릴 기(Ju et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 103: 19635-19640, 2006), 3'-O-아지도메틸-dNTP(Guo et al., Proc . Natl Acad . Sci . USA 105, 9145-9150, 2008), 아미노알콕실 기(Hutter et al., Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 29:879-895, 2010) 및 3'-O-(2-시아노에틸) 기(Knapp et al., Chem . Eur . J., 17, 2903 - 2915, 2011)와 같은 가역성 종료자의 3' 차단 기에 대해 기재되었다. 예시적 RT 차단 기는 -O-아지도메틸 및 -O-시아노에테닐을 포함한다. 제한이 아닌 예시를 위한 다른 예시적 RT 차단 기는 도 3 및 4에 제시된다.
다른 구현예에서, 화학식 I(상기)의 R1은 치환되거나 비치환된 알킬, 치환되거나 비치환된 알케닐, 치환되거나 비치환된 알키닐, 치환되거나 비치환된 헤테로알킬, 치환되거나 비치환된 헤테로알케닐, 또는 치환되거나 비치환된 헤테로알키닐이다. 일부 예에서, R1은 알레닐, 시스-시아노에테닐, 트랜스-시아노에테닐, 시스-시아노플루오로에테닐, 트랜스-시아노플루오로에테닐, 시스-트리플루오로메틸에테닐, 트랜스-트리플루오로메틸에테닐, 비스시아노에테닐, 비스플루오로에테닐, 시스-프로페닐, 트랜스-프로페닐, 니트로에테닐, 아세토에테닐, 메틸카르보노에테닐, 아미도에테닐, 메틸설포노에테닐, 메틸설포노에틸, 포름이미데이트, 포름하이드록시메이트, 비닐로에테닐, 에틸레노에테닐, 시아노에틸레닐, 니트로에틸레닐, 아미도에틸레닐, 3-옥소부트-1-이닐, 및 3-메톡시-3-옥소프로프-1-이닐로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 실시에서 다양한 3'-O 가역성 차단 기(화학식 I에서 R1)가 사용될 수 있다. 본 발명의 방법의 일 구현예에 따르면, R1은 알릴, 아지도메틸, 아미노알콕실, 2-시아노에틸, 치환된 알킬, 비치환된 알킬, 치환된 알케닐, 비치환된 알케닐, 치환된 알키닐, 비치환된 알키닐, 치환된 헤테로알킬, 비치환된 헤테로알킬, 치환된 헤테로알케닐, 비치환된 헤테로알케닐, 치환된 헤테로알키닐, 비치환된 헤테로알키닐, 알레닐, 시스-시아노에테닐, 트랜스-시아노에테닐, 시스-시아노플루오로에테닐, 트랜스-시아노플루오로에테닐, 시스-트리플루오로메틸에테닐, 트랜스-트리플루오로메틸에테닐, 비스시아노에테닐, 비스플루오로에테닐, 시스-프로페닐, 트랜스-프로페닐, 니트로에테닐, 아세토에테닐, 메틸카르보노에테닐, 아미도에테닐, 메틸설포노에테닐, 메틸설포노에틸, 포름이미데이트, 포름하이드록시메이트, 비닐로에테닐, 에틸레노에테닐, 시아노에틸레닐, 니트로에틸레닐, 아미도에틸레닐, 아미노, 시아노에테닐, 시아노에틸, 알콕시, 아실, 메톡시메틸, 아미녹실, 카르보닐, 니트로벤질, 쿠마리닐, 및 니트로나프탈레닐로 구성된 군으로부터 선택된다.
본원에서 사용되는 용어 "알킬", "알케닐" 및 "알키닐"은 직쇄 및 분지쇄 1가 치환기를 포함한다. 예로는 메틸, 에틸, 이소부틸, 3-부티닐 등을 포함한다. 본원에 기재된 화합물 및 방법에 유용한 이들 기의 범위는 C1-C10 알킬, C2-C10 알케닐, 및 C2-C10 알키닐을 포함한다. 본원에 기재된 화합물 방법에 유용한 이들 기의 추가 범위는 C1-C8 알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 알키닐, C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C1-C4 알킬, C2-C4 알케닐, 및 C2-C4 알키닐을 포함한다.
"헤테로알킬", "헤테로알케닐" 및 "헤테로알키닐"은 알킬, 알케닐 및 알키닐과 유사하게 정의되나, 백본 내에 O, S, 또는 N 헤테로원자 또는 이들의 조합을 함유할 수 있다. 본원에 기재된 화합물 및 방법에 유용한 이들 기의 범위는 C1-C10 헤테로알킬, C2-C10 헤테로알케닐, 및 C2-C10 헤테로알키닐을 포함한다. 본원에 기재된 화합물 및 방법에 유용한 이들 기의 추가 범위는 C1-C8 헤테로알킬, C2-C8 헤테로알케닐, C2-C8 헤테로알키닐, C1-C6 헤테로알킬, C2-C6 헤테로알케닐, C2-C6 헤테로알키닐, C1-C4 헤테로알킬, C2-C4 헤테로알케닐, 및 C2-C4 헤테로알키닐을 포함한다.
본원에서 사용되는 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 또는 헤테로알키닐 분자는 치환되거나 비치환될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 치환된은 알콕시, 아릴옥시, 아미노, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 헤테로알키닐, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 또는 헤테로사이클로알킬의 주요 사슬에 부착된 위치로의 알콕시, 아릴옥시, 아미노, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 헤테로알키닐, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 또는 헤테로사이클로알킬 기의 첨가, 예를 들어, 이들 분자 중 하나에 의한 수소의 대체를 포함한다. 치환 기의 예는 하이드록시, 할로겐(예를 들어, F, Br, Cl, 또는 I), 및 카르복실 기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 반대로, 본원에서 사용되는 용어 비치환된은 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 또는 헤테로알키닐이 수소의 완전한 보완을 갖고, 즉, 예를 들어, 선형 부탄 (-(CH2)3-CH3)과 같이 치환을 갖지 않는 이의 포화 수준에 상응하는 것을 나타낸다.
다른 구현예에서, 가역성 차단 기는 아미노-함유 차단 기(예를 들어, NH2-)이다. 예시적인 아미노-함유 가역성 차단 기를 기재하는 참조로서 본원에 포함하는 문헌[Hutter et al., 2010, Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 29(11)]을 참조한다. 일부 구현예에서, 가역성 차단 기는 알릴-함유 차단기(예를 들어, CH2=CHCH2-)이다. 일부 구현예에서, 가역성 차단기는 시아노 기(예를 들어, 시아노에테닐 또는 시아노에틸 기)를 포함한다. 일부 구현예에서, 가역성 차단 기는 아지도-함유 차단 기(예를 들어, N3-)이다. 일부 구현예에서, 가역성 차단 기는 아지도메틸(N3CH2-)이다. 일부 구현예에서, 가역성 차단 기는 알콕시-함유 차단 기(예를 들어, CH3CH2O-)이다. 일부 구현예에서, 가역성 차단 기는 하나 이상의 에틸렌 글리콜 단위를 갖는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티를 함유한다. 일부 구현예에서, 가역성 차단 기는 치환되거나 비치환된 알킬(즉, 치환되거나 비치환된 탄화수소)이다. 일부 구현예에서, 가역성 차단 기는 아실이다. 예를 들어, 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 6,232,465호를 참조한다. 일부 구현예에서, 가역성 차단 기는 메톡시메틸이거나 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 가역성 차단 기는 아미녹실(H2NO-)이거나 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 가역성 차단 기는 카르보닐(O=CH-)이거나 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 가역성 차단 기는 에스테르 또는 포스페이트 기를 포함한다.
일부 구현예에서, 가역성 차단 기는 니트로벤질(C6H4(NO2)-CH2-)이다. 일부 구현예에서, 가역성 차단 기는 쿠마리닐(즉, 쿠마린 모이어티 또는 이의 유도체를 함유함)이며, 여기서, 예를 들어, 쿠마리닐 가역성 차단 기의 CH 탄소 중 어느 하나는 뉴클레오티드 유사체의 3'-O에 공유적으로 부착된다.
일부 구현예에서, 가역성 차단 기는 니트로나프탈레닐(즉, 니트로나프탈렌 모이어티 또는 이의 유도체를 함유함)이며, 여기서, 예를 들어, 니트로나프탈레닐 가역성 차단 기의 CH 탄소 중 어느 하나는 뉴클레오시드 유사체의 3'-O에 공유적으로 부착된다.
일부 구현예에서, 가역성 차단 기는 하기 군으로부터 선택된다:
Figure pct00011
구조 VI-XIII
상기 식에서, R3 및 R4는 H 또는 알킬이고, R5는 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 및 벤질이다. 특정 구현예에서, R3-R5의 결정은 본원에 기재된 MW 제한에 의해 구속된다(예를 들어, 섹션 3.2.1 참조).
본 발명에서 사용하기에 적합한 다른 가역성 차단 기는 표지된 가역성 종료자의 차단 기로서 문헌에 기재되어 있다. 일반적으로, 합성에 의한 시퀀싱에서 사용되는 임의의 적합한 가역성 차단 기가 본 발명의 실시에서 사용될 수 있다.
3.2.1 가역성 종료자 차단 기 및 이를 함유하는 뉴클레오티드의 특성
바람직하게는, 시퀀싱 적용을 위해, RT의 차단 기는 시퀀싱되는 DNA의 온전성을 간섭하지 않는 반응 조건하에서 제거 가능하다. 이상적인 차단 기는 장기간의 안정성을 나타내고, 중합효소 효소에 의해 효율적으로 혼입되고, 이차 또는 추가 혼입의 전체 차단을 야기시키고, 바람직하게는 수성 조건하에서 폴리뉴클레오티드 구조에 대한 손상을 야기시키지 않는 온건한 조건하에서 제거되는 능력을 가질 것이다.
본 발명의 특정 구현예에서, 차단 기(데옥시리보스 3' 산소 원자를 포함함)는 200 미만, 종종 190 미만, 종종 180 미만, 종종 170 미만, 종종 160 미만, 종종 150 미만, 종종 140 미만, 종종 130 미만, 종종 120 미만, 종종 110 미만, 및 때때로 100 미만의 분자량(MW)을 갖는다. 달리 말하면, 특정 구현예에서, 화학식 I의 R3는 184 미만, 종종 174 미만, 종종 164 미만, 종종 154 미만, 종종 144 미만, 종종 134 미만, 종종 124 미만, 종종 114 미만, 종종 104 미만, 종종 94 미만, 및 때때로 84 미만의 MW를 갖는다.
데옥시리보뉴클레오티드 모노포스페이트의 분자량은 약 307 내지 322의 범위(dAMP 331.2, dCMP 307.2, dGMP 347.2 및 dTMP 322.2)이다. 특정 구현예에서, GDS로 혼입되는 경우(즉, dNTP의 피로포스페이트를 포함하지 않는) NLRT 모이어티는 550 미만, 종종 540 미만, 종종 530 미만, 종종 520 미만, 종종 510 미만, 종종 500 미만, 종종 490 미만, 종종 480 미만, 종종 470 미만, 및 때때로 460 미만의 분자량을 갖는다.
3.3 포스페이트 함유 모이어티
일부 구현예에서, R3 모이어티는 하나 이상의 포스페이트 및/또는 포스페이트 유사체 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, R3 모이어티는 하기 구조(구조 V)를 가질 수 있으며, 여기서 n은 0 내지 12(일반적으로, 0, 1, 3, 4, 5 또는 6)이고, X는 H 또는 프라이머 연장 반응에서 중합효소에 의한 혼입과 양립 가능한 임의의 구조이다. 예를 들어, X는 알킬 또는 당 분야에 기재된 임의의 다양한 링커일 수 있다. 예를 들어, 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 9,702,001호를 참조한다. 가역성 종료자를 GDS에 혼입시키는 과정에서, X가 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드에 존재하지 않도록 모이어티 X는 뉴클레오티드로부터 제거(알파 포스페이트를 제외한 모두와 함께)되는 것이 인지될 것이다. 특정 구현예에서, X는 검출 가능한 표지 또는 친화성 태그일 수 있으나, 단, 본 발명의 친화성 시약은 모이어티 X에 결합하지 않고, 모이어티 X의 존재, 부재 또는 구조를 기초로 하여 가역성 종료자 사이를 구별하며, X는 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드에 존재하지 않는다.
Figure pct00012
구조 XIV
3.4 NLRT 세트
일부 접근법에서, 본 발명에 따른 SBS 시퀀싱은 시퀀싱 어레이와 다수의 NLRT(예를 들어, NLRT-A, NLRT-T, NLRT-C 및 NLRT-G)를 접촉시키는 것을 포함한다. 접촉은 한번에 하나의 NLRT로 순차적으로 수행될 수 있다. 대안적으로, 4개의 NLRT는 한번에, 가장 흔하게는 4개의 NLRT의 혼합물로서 시퀀싱 어레이와 접촉될 수 있다. 함께, 4개의 NLRT는 "NLRT 세트"를 구성한다. NLRT 세트의 NLRT는 혼합물로 패키징되거나, 별도의 용기에 각각의 상이한 NLRT를 포함하는 키트로 패키징될 수 있다. 4개의 NLRT의 혼합물은 동등한 비율로 각각의 염기를 포함할 수 있거나, 동등하지 않은 양을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, NLRT 세트의 각각의 NLRT는 동일한 차단 기(예를 들어, 아지도메틸)를 포함한다. 일 구현예에서, NLRT 세트의 NLRT는 상이한 차단 기를 포함한다(예를 들어, NLRT-A는 아지도메틸을 포함하고, NLRT-T는 시아노에테닐을 포함하거나; NLRT-A 및 NLRT-G는 아지도메틸을 포함하고, NLRT-C 및 NLRT-T는 시아노에테닐을 포함한다). 상이한 차단 기가 사용되는 경우, 상기 차단 기는 상이한 차단 기가 동일 처리에 의해 제거될 수 있도록 선택적으로 선택된다. 대안적으로, 차단 기는 선택적으로 상이한 시간에 상이한 처리에 의해 제거되도록 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 한 세트의 하나 이상의 NLRT는 변형된(비자연 발생) 핵염기를 포함한다.
본원에 기재된 NLRT는 혼합물의 형태로 제공되거나 사용될 수 있다. 예를 들어, 혼합물은 2, 3, 또는 4개(또는 그 초과)의 구조적으로 상이한 NLRT를 함유할 수 있다. 구조적으로 상이한 NLRT는 이들의 각각의 핵염기가 상이할 수 있다. 예를 들어, 혼합물은 4개의 자연 DNA 핵염기(즉, 아데닌, 시토신, 구아닌, 및 티민) 중 하나, 또는 이의 유도체를 각각 포함하는 4개의 구조적으로 상이한 NLRT를 함유할 수 있다.
시퀀싱 목적을 위해, NLRT 세트 내의 상이한 NLRT는 개별적으로 패키징된 후, 시퀀서 자체 상에서 혼합(예를 들어, 플로우 셀로의 전달 전)되거나, 함께 패키징(즉, 예비혼합)될 수 있다. NLRT 세트를 포함하는 키트(별도의 용기에 패키징되거나 동일 용기에 혼합물로서의 상이한 NLRT를 가짐)가 제공될 수 있다.
3.5 친화성 시약 결합을 개선시키는 기를 갖는 핵염기 유사체
일 구현예에서, 핵염기는 성장하는 DNA 가닥의 3' 말단에 존재하는 경우(즉, 마지막 혼입된 염기로서) 핵염기에 대한 친화성 시약의 특이성 또는 친화성을 증가시키나, 프라이머 연장 생성물 내부의 뉴클레오티 내의 친화성 시약에 의해 인지되지 않거나 이에 접근 가능하지 않은 제거 가능하지 않은 화학 기를 포함한다. 일 접근법에서, 변형은 친화성 시약에 의해 인지되거나 결합되지만, 3' 말단 뉴클레오티드 내의 동일 변형에 비해 낮은 친화성 또는 낮은 효율을 갖는다.
제한이 아닌 예시를 위해, 상기 변형된 핵염기의 예는 하기를 포함한다:
Figure pct00013
구조 XV-XVIII
R6, R7, R8, 및 R9은 동일하거나 상이할 수 있고, 각각은 H, I, Br, F, 구조 XIX-XXVIII, 또는 염기 쌍형성을 간섭하지 않는 임의의 기로부터 선택된다. R9이 티미딘에서 메틸 구조 XVIII인 경우를 주목한다. 일부 경우에, 변형은 뉴클레오티드의 항원성을 증가시키는 추가 이점을 갖는다.
Figure pct00014
구조 XIX-XXVIII
자연 발생 핵염기의 분자량은 아데닌 135, 구아닌 151, 티민 126 및 시토신 111이다. 일부 구현예에서, 핵염기 유사체는 자연 염기의 분자량을 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 Da 초과만큼 초과하지 않는 분자량을 갖는다.
3.6 차단되지 않은 dNTP
일 구현예에서, 자연 dNTP(예를 들어, dATP, dGTP, dCTP 또는 dTTP) 또는 3'-O- 차단 기가 없는 dNTP 유사체가 시퀀싱에 사용된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드는 피로시퀀싱(pyrosequencing)에서와 같이 시퀀싱 공정에서 한번에 하나씩 혼입되거나, 하나의 염기 혼입 후에 정지되는 중합효소에 의해 혼입된다. 예시적인 방법은 문헌(예를 들어, 문헌[Ju et al., 2006, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 103:19635-40, 2006; Guo, Proc . Natl Acad . Sci . USA 105, 9145-50, 2008, 및 Ronaghi et al., Science, 281:363-365, 1998] 참조)에 기재되어 있고, 이는 표지 및/또는 표지를 RT에 연결시키는 링커의 제거에 의해 본 발명에서 사용하기 위해 변형될 수 있다. 일부 접근법에서, 상이한 핵염기를 갖는 dNTP가 첨가되고, 순차적으로 혼입된다(예를 들어, A, 이후, G 등). 일반적으로, 핵염기는 다음 dNTP의 첨가 전에 별도로 이미지화된다.
3.7 데옥시리보스 유사체
본 발명의 일부 구현예에서, 당(데옥시리보스) 모이어티는 변형된다. 예를 들어, 핵염기 아데닌, 차단 기 아지도메틸, 및 당 데옥시리보스를 갖는 NLRT는 차단 기 및 당 모이어티를 인지하도록 하는 친화성 시약을 이용하여 핵염기 시토신, 차단 기 아지도메틸, 및 당 변형-데옥시리보스를 갖는 NLRT와 구별될 수 있다.
3.8 3 '-O 가역성 종료자가 없는 뉴클레오티드
여러 적용에서 유용한 상이한 양태에서, 제거 가능하지 않는(즉, 절단 가능하지 않은) 3' 차단 기를 갖는 뉴클레오티드가 NLRT 대신 사용된다. 일 접근법에서, 친화성 시약을 이용한 검출 후, 마지막에 혼입된 염기가 제거되고, 이의 위치는 유사하지만 절단 가능한 차단 기를 갖는 뉴클레오티드로 파일링된다(Koziolkiewicz et al., FEBS Lett. 434:77-82, 1998).
상기 제공된 예는 데옥시리보스 당 모이어티의 3'-O를 통해 뉴클레오티드에 부착된 가역성 차단 기를 포함한다. 본 발명은 또한 데옥시리보스 당의 2'-O-에 부착된 가역성 및 비-가역성 차단 기를 갖는 NLRT를 포함한다. 이들 구현예는 단일 염기 검출(단일 또는 소수 염기 프라이머 연장), DNA 및 다른 검출 방법에서의 갭(gap) 및 닉(nick) 모니터링에 사용될 수 있다. 따라서, 당업자는 본원의 방법 및 정보를 3' 차단 기가 아니라 2' 차단 기를 갖는 NLRT에 적용할 수 있을 것이다.
4. 친화성 시약
본 발명은, 예를 들어, SBS 동안 성장하는 DNA 사슬의 말단으로의 중합효소에 의한 혼입 후에 GDS의 3' 말단에서 NLRT에 특이적으로 결합하는 친화성 시약을 이용한다. 일 구현예에서, 친화성 시약은 구조 III의 NLRT에 결합한다. 일 구현예에서, 친화성 시약은 구조 IV의 NLRT에 결합한다.
4.1 일반적인 친화성 시약
일 양태에서, 본 발명은 핵산의 3' 말단에 혼입된 NLRT의 존재 또는 부재를 검출하는데 사용되는 친화성 시약에 관한 것이다. 친화성 시약은 혼입된 NLRT의 구조적 특징을 기초로 하여 NLRT에 특이적으로 결합하는 분자 또는 거대분자이다. 예를 들어, 친화성 시약은, 예를 들어, 특정 염기 및/또는 특정 가역성 차단 기를 갖는 NLRT에 특이적으로 결합할 수 있다. 예시를 위해, 친화성 시약의 한 예는 NLRT가 핵염기 아데노신 및 아지도메틸 가역성 차단 기를 포함하는 경우에 DNA 가닥의 3' 말단에서 혼입된 NLRT에 높은 친화성으로 결합하나, NLRT가 핵염기 아데노신을 포함하나 아지도메틸 가역성 차단제가 아닌 3' 하이드록실 기를 갖는 경우에 DNA 가닥의 3' 말단에서 혼입된 NLRT에 높은 친화성으로 결합하지 않고, 각각이 아지도메틸 가역성 차단 기를 갖거나 갖지 않는 핵염기 시토신, 구아닌, 또는 티민을 포함하는 DNA 가닥의 3' 말단에서 혼입된 NLRT에 높은 친화성으로 결합하지 않는 모노클로날 항체(mAB)이다. 친화성 시약은 직접 또는 간접적으로 표지될 수 있다.
"특이성"은, 예를 들어, 분자에 대한 친화성 시약의 상대 결합 친화성에 의해 측정되는 바와 같은 상이한 분자(예를 들어, NLRT) 사이를 구별하는 친화성 시약에 대한 정도이다. 본 발명의 친화성 시약과 관련하여, 친화성 시약은 다른 NLRT에 대해서보다 하나의 NLRT(이의 표적 RT)에 대해 실질적으로 더 높은 친화성을 가져야 한다(예를 들어, 친화성 시약은 C 뉴클레오시드 유사체에 결합하나, A, T 또는 G에는 결합하지 않는다). 또한, 친화성 시약은 성장하는 DNA 사슬의 3' 말단에서 중합효소에 의해 혼입되는 경우 폴리뉴클레오티드의 말단에서 이의 표적 뉴클레오시드 유사체에 결합하나, DNA 사슬 상의 다른 곳의 뉴클레오티드 염기에는 결합하지 않는다. 친화성 시약은 GDS의 3'-말단이 NLRT-A, NLRT-T, NLRT-C, NLRT-G를 포함(예를 들어, 어레이 내)하는 복수(예를 들어, 어레이)의 주형 폴리뉴클레오티드의 존재하에서 친화성 시약이 SBS 시퀀싱에서 사용되는 반응 조건하에서 NLRT-A에 우선적으로 결합하는 경우 NLRT-A와 같은 특정 NLRT에 특이적이다. 본원에서 사용되는 바와 같은 제2 구조에 비한 제1 구조에 대한 친화성 제제의 "우선적 결합"은 친화성 제제가 제1 구조에 결합하지만, 제2 구조에 결합하지 않거나, 덜 강하거나(즉, 더 낮은 친화성을 가짐) 덜 효율적으로 제2 구조에 결합하는 것을 의미한다.
혼입된 NLRT에 대한 친화성 시약의 결합의 상황에서, 용어 "특이적 결합", "특이적으로 결합하는" 등은 상이한 핵염기(NLRT-T, -C, 또는 -G), 상이한 차단 기를 갖거나 차단 기를 갖지 않는(예를 들어, 3'-OH를 갖는 데옥시아데노신) NLRT와 비교하여 특정 NLRT를 갖는(예를 들어, 3'-O 아지도 기를 갖는 NLRT-A) 친화성 시약의 우선적 회합을 나타낸다. 친화성 시약과 NLRT 사이의 특이적 결합은 때때로 적어도 10-6 M-1의 친화성(즉, 해리 상수 Kd에 의해 측정시 10-6 M-1보다 낮은 수치 값을 갖는 친화성)을 의미한다. 10-8 M-1보다 큰 친화성이 바람직하다. 특이적 결합은 웨스턴 블롯, 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), 흐름세포측정법, 면역조직화학, 및 시퀀싱 반응에서 표적 NLRT에 결합된 형광 표지된 친화성 시약의 검출을 포함하는 당 분야에 공지된 결합(예를 들어, 항체 결합)에 대한 검정을 이용하여 결정될 수 있다. 본원의 하기에 논의되는 바와 같이, 결합의 특이성은 양성 및 음성 결합 검정에 의해 결정될 수 있다.
항체와 같은 친화성 시약과 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드 사이의 특정 결합 상호작용은 특이성을 담당하는 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드의 일부, 또는 모이어티와의 관련을 포함하여 다양한 방식으로 기재될 수 있다. 여기서는 비유가 유용하다: 도메인 1 및 도메인 2의 2개의 도메인을 갖는 단백질을 상상한다. 2개의 상이한 항체는 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다. 그러나, 이들은 상이한 에피토프를 인지할 수 있다. 예를 들어, 하나의 항체는 도메인 1의 에피토프에 결합할 수 있고, 제2 항체는 도메인 2의 에피토프에 결합할 수 있다. 이러한 가설에서, 도메인 1에서 변형이 이루어지는 경우, 이는 제2 항체에 의한 결합을 변화시키지 않고 제1 항체에 의한 단백질의 결합에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 경우, 제1 항체에 의한 단백질의 결합은 도메인 1에 "의존"하는 것으로 언급될 수 있는데, 이는 도메인 1에서의 변화(예를 들어, 아미노산 서열에서의 변화)가 항체 1의 결합 특성을 변화(예를 들어, 결합을 파괴하고, 결합 친화성을 증가시키고, 결합 친화성을 감소시키고, 기타 작용)시킬 것을 의미한다. 동등하게, 도메인 1은 항체 1에 의한 결합을 "담당"하는 것으로 언급될 수 있다. 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드의 경우에서, 결합의 특이성은 하나의 모이어티(예를 들어, 차단 기)의 구조적 특징으로 인한 것일 수 있고, 다른 모이어티에 의한 다른 모이어티(예를 들어, 핵염기)의 구조에 의해 영향을 받지 않을 수 있다. 대안적으로, 결합의 특이성은 다수의 모이어티(예를 들어, 핵염기 및 차단 기 둘 모두)의 구조적 특징 등으로 인한 것일 수 있다. 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드에 대한 친화성 시약의 결합이 모이어티의 특정 구조적 특징의 존재를 필요로 하는 경우, 친화성 시약에 의한 결합은 상기 구조적 특징을 갖는 모이어티의 존재 또는 부재에 "특이적"이거나 이를 "기초로 할" 수 있다. 동등하게, 상기 구조적 특징을 갖는 모이어티는 친화성 시약에 의한 결합을 "담당"할 수 있거나, 친화성 시약의 결합은 상기 구조적 특징을 갖는 모이어티의 존재에 "의존"할 수 있다.
"특이성"은 환경에 외존될 수 있음이 또한 인지되어야 한다. 예를 들어, A 및 A' 둘 모두에는 결합하나, B, C 또는 D에는 결합하지 않는 친화성 시약을 상상한다. A, A', B 및 C를 함유하는 반응 또는 샘플에서, 친화성 시약은 A 및 A' 둘 모두에 결합할 수 있고, 따라서 A에 "특이적으로 결합"하는 것으로 간주되지 않을 수 있다. 그러나, A, B, C 및 D를 함유하는 반응 또는 샘플에서, 친화성 시약은 A에만 결합하고, 상기 환경에서는 A에 특이적으로 결합하는 것으로 언급된다. 또 다른 예에서, A, A', B 및 C를 함유하는 샘플에서, 친화성 시약은 상이한 친화성 또는 효율로 A 및 A'에 결합할 수 있어, A에 대한 결합 및 A'에 대한 결합이 이들 염기에 대해 구별될 수 있다.
또 다른 관련 용어는 "식별하다"(또는 때때로 "구별하다")이다. 특정 차단 기(예를 들어, 아지도메틸)가 존재하는 경우에만 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드에 결합하나, 어떠한 핵염기가 존재하는지에 관계 없이 아지도메틸 차단 기를 갖는 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드에 결합하는 친화성 시약은 아지도메틸 차단 기를 갖거나 이를 갖지 않는 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드 사이를 "식별하는" 것으로 언급될 수 있거나, 더욱 광범위하게는, "차단 기를 기초로 하여 식별하는" 것으로 언급될 수 있다.
친화성 시약의 특이성은 친화성 시약을 제조하는데 사용되는 공정의 결과이다. 예를 들어, 아지도메틸 차단 모이어티를 인지하는 시약은 양성 및 음성 결합 검정으로 경험적으로 시험될 수 있다. 예시를 위해, 일 접근법에서, 시약은 O-아지도메틸 차단 모이어티의 존재에 기초하여 NLRT에 결합하는 항체이다. 일 접근법에서, 항체는 키홀 림펫 헤모시아닌에 컨쥬게이션된 아지도메틸을 이용하여 합텐 O-아지도메틸에 대해 생성된다. 원하는 항체는 3'-O-아지도메틸-2'-데옥시구아닌에 대한 결합에 대해 선택될 수 있으나, 3'-O-2-(시아노에톡시)메틸-2'-데옥시구아닌; 3'-O-(2-니트로벤질)-2'-데옥시구아닌; 및 3'-O-알릴-2'-데옥시구아닌과 같이 다른 데옥시구아닌 뉴클레오티드에 대한 결합에 대해; 그리고 3'-O-아지도메틸-2'-데옥시아데노신; 3'-O-아지도메틸-2'-데옥시시토신; 및 3'-O-아지도메틸-2'-데옥시티민과 같이 다른 아지도메틸 NLRT에 대한 결합에 대해 선택될 수 있다.
항체-합텐 상호작용의 특성은 또한 문헌[Al Qaraghuli, 2015, "Defining the complementarities between antibodies and haptens to refine our understanding and aid the prediction of a successful binding interaction" BMC Biotechnology, 15(1)p.1; Britta et al., 2005, "Generation of hapten-specific recombinant antibodies: Antibody phage display technology: A review" Vet Med. 50:231-52; Charlton et al., 2002. "Isolation of anti-hapten specific antibody fragments from combinatorial libraries" Methods Mol Biol. 178:159-71; 및 Hongtao et al., 2014, "Molecular Modeling Application on Hapten Epitope Prediction: An Enantioselective Immunoassay for Ofloxacin Optical Isomers" J. Agric. Food Chem. 62 (31) pp 7804-7812]에 기재된 것과 같은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 특정 모이어티(예를 들어, 핵염기 및 당 모이어티)에 결합하는 것으로 친화성 시약을 기재하는 것은 혼입된 뉴클레오티드의 다른 부분에 대한 결합을 배제하지 않는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 핵염기 및 당 모이어티에 결합하는 친화성 시약은 또한 차단 기에 결합할 수 있다.
유용한 친화성 시약의 예는 항체(항체의 결합 단편, 단일쇄 항체, 이특이적 항체 등을 포함함), 앱타머, 크노틴, 아피머, 1-염기 삼중 헬릭스를 형성하는 표지된 dNTP, 구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질(G-단백질), 또는 적합한 특이성 및 친화성으로 혼입된 NLRT에 결합하는 임의의 다른 공지된 제제를 포함한다.
친화성 시약은 표적 NLRT에서 핵염기, 당(예를 들어, 데옥시리보스), 차단 기, 또는 임의의 다른 모이어티 또는 이들의 조합을 특이적으로 인지할 수 있다. 일 접근법에서, 친화성 시약은 차단 기를 포함하는 에피토프를 인지한다. 또 다른 접근법에서, 친화성 시약은 핵염기를 포함하는 에피토프를 인지한다. 또 다른 접근법에서, 친화성 시약은 핵염기 및 차단 기를 포함하는 에피토프를 인지한다. 친화성 시약이 모이어티와 접촉하지 않더라도, 모이어티는 다른 모이어티의 위치를 지시할 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 핵염기 및 3' 차단 기를 기초로 하여 NLRT를 식별하는 친화성 시약의 경우, 데옥시리보스 모이어티는 인지를 위해 핵염기 및 3' 차단 기를 위치시키는데 요구된다.
항체인 친화성 시약의 경우, 특이적 결합은 웨스턴 블롯, 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), 흐름세포측정법, 또는 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 당 분야에 공지된 항체 결합에 대한 임의의 검정을 이용하여 결정될 수 있다. 일 접근법에서, 특이적 결합은 ELISA 유형 검정을 이용하여 입증된다. 예를 들어, 3'-아지도메틸-dC에 대해 발생된 혈청 항체는 3'-O-아지도메틸-dC(양성 특이성 검정) 및 3'-O-아지도메틸-dG 또는 -dA 또는 3'-OH-dC와 같은 뉴클레오티드(들)(음성 특이성 검정)에 대해 연속적으로 적정될 수 있다.
일부 구현예에서, 표적 뉴클레오시드에 대한 친화성 시약의 염기-특이적 결합은 다른 뉴클레오시드 또는 유사체에 대한 결합보다 2-100배 더 높다. 일부 구현예에서, 표적 뉴클레오시드에 대한 친화성 시약의 염기-특이적 결합은 다른 뉴클레오시드에 대한 결합보다 적어도 10배 더 높거나, 적어도 30배 더 높거나, 적어도 100배 더 높다.
특정 염기에 대한 바람직한 항체 결합 효율은 100 pM 미만, 또는 1 nM 미만, 또는 10 nM 미만, 또는 1 μM 미만의 농도이다.
원하는 특이성을 갖는 친화성 시약은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 항체와 같은 친화성 시약은 양성 선택(즉, 표적 분자에 결합) 및 음성 선택(즉, 표적 분자가 아닌 분자에 결합하지 않음)의 라운드에 의해 확인되거나, 선택되거나, 정제될 수 있다.
친화성 시약은 용액 중의 dNTP 및 프라이머 연장 생성물의 3' 말단에 혼입된 상응하는 뉴클레오티드 둘 모두에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 친화성 시약은 혼입되지 않은 NLRT(예를 들어, 용액 중의 NLRT)에 결합하지 않거나, 유의하게 낮은 특이성으로 결합한다. 그러나, 일반적으로, 친화성 시약에 의한 혼입되지 않은 NLRT의 결합은 시퀀싱 과정에서 발생하지 않는데, 이는 혼입되지 않은 NLRT가 친화성 시약의 도입 전에 제거(세척)되기 때문이다. 대안적으로, NLRT에 결합된 친화성 시약에 의해 형성된 복합체는 영상화 전에 제거(세척)된다.
일 접근법에서, 친화성 시약은 핵염기에 특이적으로 결합하고, 부분적으로 3'-OH 기의 존재 또는 부재를 기초로 하여 상이한 염기(예를 들어, A, T, G, C) 사이를 구별한다. 이러한 접근법에서, 친화성 시약은 GDS의 3' 말단의 뉴클레오티드와 GDS 내부의 혼입된 뉴클레오티드로부터의 3'-OH(3' 말단에 있지 않음)를 구별한다. 일부 경우에, 특이적 핵염기를 인지하는 친화성 시약은 또한 3'-OH 기의 존재 또는 부재 사이를 구별함으로써 혼입된 NLRT를 특정 핵염기를 갖는 3' 말단 뉴클레오티드로서 인지한다.
일 접근법에서, 친화성 시약은 차단 기를 포함하나, 염기 사이를 구별하지 않는 에피토프를 인지한다. 예를 들어, 4개의 RT 차단 기[A. 아지도메틸, B. 2-(시아노에톡시)메틸, C. 3'-O-(2-니트로벤질), 및 D. 3'-O-알릴]가 제공되는 경우, 4개의 치단 기를 구별하는 친화성 시약이 생성될 수 있다. 예시를 위해, 하기 A 내지 D로 표지된 데옥시구아닌 유사체가 제공되는 경우, 단지 하나의 NLRT만 인지하고 다른 3개는 인지하지 않는 친화성 시약이 선택될 수 있다.
A. 3'-O-아지도메틸-2'-데옥시구아닌
B. 3'-O-2-(시아노에톡시)메틸-2'-데옥시구아닌
C. 3'-O-(2-니트로벤질)-2'-데옥시구아닌
D. 3'-O-알릴-2'-데옥시구아닌
일부 구현예에서, 선택된 친화성 시약은 이들이 동일한 차단 기를 공유한다면 상이한 핵염기를 갖는 뉴클레오티드를 구별하지 않는다. 예를 들어, 상기 B(3'-O-2-(시아노에톡시)메틸-2'-데옥시구아닌)를 인지하는 친화성 시약은 또한 3'-O-2-(시아노에톡시)메틸-2'-데옥시아데닌; 3'-O-2-(시아노에톡시)메틸-2'-데옥시티민; 및 3'-O-2-(시아노에톡시)메틸-2'-데옥시시토신을 인지할 수 있다.
RT 차단 기를 차별적으로 인지하는 친화성 시약(예를 들어, 모노클로날 항체)을 생성시키는 것은 본 발명의 개시에 의해 안내되는 당업자의 기술 범위 내에 있다. 일 접근법에서, 항체는 합텐 O-아지도메틸(예를 들어, -O-아지도메틸 또는 키홀 림펫 헤모시아닌에 컨쥬게이션된 아지도메틸)에 대해 생성되고, GDS TP의 3' 말단에서 3'-O-아지도메틸-2'-dNM 뉴클레오티드(여기서, N은 A, T, G 또는 C 각각임)에 대한 결합 및 3'-O-X-2'-dNM(여기서, O-X는 시퀀싱 반응에 존재하는 상이한 차단 기임)에 대한 비결합에 대해 양성적 및 음성적으로 스크리닝된다. 다른 구현예에서, 합텐은 선택 과정이 원하는 특이성을 갖는 친화성 시약을 확인하는 한 3'-O 차단 기를 갖는 데옥시리보스, 뉴클레오티드(예를 들어, 3'-O 차단 기를 갖는 모노포스페이트 또는 트리포스페이트) 등일 수 있음이 인지될 것이다.
상기 예는 4개의 뉴클레오티드가 매우 명백한 차이를 갖는 상이한 차단 기(예를 들어, 아지도메틸 대 2-(시아노에톡시)메틸)를 갖는 구현예를 기재하였으나, 본 발명의 일부 구현예에서, 별개의 친화성 시약에 의해 결합된 차단 기 사이에는 단지 작은 차이가 존재한다. 예를 들어, 차단 기에서, 수소 원자는 플루오르 원자 또는 메틸 기로 대체되어 한 세트의 친화성 시약에 의해 구별될 수 있는 3개의 관련된 차단 기[차단 기, F 치환 차단 기, 메틸 치환된 차단 기]를 생성할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 시퀀싱은 2개 이상, 대안적으로 3개 이상, 대안적으로 4개 모두의 차단 기가 (1) 이들이 동일한 수의 원자를 갖거나 원자의 수가 단지 적은 수(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개) 이하만큼 상이하고; (2) 차단 기 모이어티의 분자식이 1 내지 10개의 원자(예를 들어, CH3에 의해 대체된 단일한 H; F에 의해 대체된 H, S에 의해 대체된 O는 3개의 차이임), 예를 들어, 1개의 원자, 2개의 원자, 3개의 원자, 4개의 원자, 6개의 원자, 7개의 원자, 8개의 원자, 9개의 원자 또는 10개의 원자만큼 상이하다는 의미에에서 구조적으로 유사한 3'-O-차단 기를 각각 갖는 4개의 NLRT를 이용하여 수행된다. 이들 및 다른 구현예에서, 차단 기 모이어티는 "가역성 종료자 차단 기 및 이를 함유하는 뉴클레오티드의 특성"의 표제의 섹션에서 상기 기재된 특성 중 임의의 특성을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 친화성 시약은 NLRT(예를 들어, 3'-O-아지도메틸-2'-데옥시구아닌)에 결합하나, 상응하는 차단되지 않은 뉴클레오티드(예를 들어, 3'-OH-2'-데옥시구아닌)에 결합하지 않는다.
일 구현예에서, 친화성 시약은 NLRT(예를 들어, 3'-O-아지도메틸-2'-데옥시구아닌)에 결합하나, 차단 기를 제거하기 위한 처리 후(예를 들어, TCEP(트리스(2-카르복시에틸)포스핀)을 이용한 처리 후)에 뉴클레오티드 유사체로부터 분리된다.
NLRT-A를 특이적으로 인지하는 친화성 시약은 항A로 언급된다. NLRT-T를 특이적으로 인지하는 친화성 시약은 항T로 언급된다. NLRT-G를 특이적으로 인지하는 친화성 시약은 항G로 언급된다. NLRT-C를 특이적으로 인지하는 친화성 시약은 항C로 언급된다. NLRT-U를 특이적으로 인지하는 친화성 시약은 항U로 언급된다. 이러한 명명법은 면역글로불린 특이성을 기재하기 위해 사용되는 것과 유사하나, 본 발명에서의 이러한 용어의 사용은 친화성 시약이 반드시 항체임을 나타내고자 하는 것이 아니다. 언급한 바와 같이, 친화성 시약은 직접 표지될 수 있다. 대안적으로, 친화성 시약은 표지된 이차 친화성 시약을 이용하여 검출 가능한 표지되지 않은 일차 친화성 시약일 수 있다. 예를 들어, NLRT에 특이적으로 결합하는 표지되지 않은 일차 친화성 시약은 일차 친화성 시약에 결합하는 표지된 이차 친화성 시약(예를 들어, 일차 친화성 시약에 결합하는 표지된 항체)으로 검출될 수 있다. 하기 섹션 4.5를 참조한다.
4.2 예시적 친화성 시약
일부 구현예에서, 친화성 시약은 항체이다. 당 분야에 공지된 항체 생성을 위한 임의의 방법이 이용될 수 있다.
4.2.1 항체
본원에서 사용되는 "항체"는 면역글로불린 분자 또는 조성물(예를 들어, 모노클로날 및 폴리클로날 항체), 뿐만 아니라 유전적으로 조작된 형태, 예를 들어, 키메라, 인간화 및 인간 항체, 헤테로컨쥬게이트 항체(예를 들어, 이특이적 항체), 및 항체 단편을 의미한다. 항체는 재조합 공급원으로부터 유래되고/되거나, 트랜스제닉 동물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 동물에서 생성될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dsFv, ds-scFv, 이량체, 미니바디(minibodies), 나노바디(nanobodies), 디아바디(diabodies), 및 이들의 다량체 및 이특이적 항체 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 "항체 단편"을 포함한다. 항체는 통상적인 기술을 이용하여 단편화될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 단편은 항체를 펩신으로 처리함으로써 생성될 수 있다. 생성된 F(ab')2 단편은 디설파이드 브릿지를 감소시키기 위해 처리되어 Fab' 단편을 생성시킬 수 있다. 파파인 소화는 Fab 단편의 형성을 유도할 수 있다. Fab, Fab' 및 F(ab')2, scFv, dsFv, ds-scFv, 이량체, 미니바디, 디아바디, 이특이적 항체 단편 및 다른 단편이 또한 재조합 기술에 의해 합성될 수 있다. 항체는 IgM 및 IgG, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 유용한 아이소형일 수 있다. 일부 구현예에서, 친화성 시약은 미니바디이다. 미니바디는 힌지 영역 및 면역글로불린 분자의 CH3 도메인에 융합된 자연 항체의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 도메인으로 구성된 조작된 항체 작제물이다. 따라서, 미니바디는 항원 결합 영역, 2가 분자로의 어셈블리를 허용하는 CH3 도메인 및 디설파이드 결합에 의한 이량체화를 수용하기 위한 항체 힌지를 보유하는 단일 단백질 사슬로 인코딩되는 전체 항체의 작은 형태이다. 단일 도메인 항체(sdAb)가 또한 사용될 수 있다. 단일 도메인 항체, 또는 나노바디(Ablynx)는 단일 단량체 가변 항체 도메인을 갖는 대략적인 항체 단편이다. 단일 도메인 항체는 특정 항원에 선택적으로 결합하며, 통상적인 항체보다 작다(MW 12-15 kDa).
4.2.1.1 항체의 생성
폴리클로날 항체를 생성시키기 위한 방법은 공지되어 있으며, NLRT-특이적 항체를 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 일 접근법을 위해, 하기 실시예 2를 참조한다. 특정 NLRT, 예를 들어, NLRT-A에 특이적인 폴리클로날 항체를 생성시키기 위한 한 방법에 따르면, 토끼에 NLRT-A(면역원에 컨쥬게이션됨)가 주사되어 항체를 생성시키고, 항체는 차단 기가 결여된 동일 구조(예를 들어, 3'-OH를 가짐), 및 다른 NLRT(NLRT-T, NLRT-G, 및 NLRT-C)에 결합하지 않도록 선택된다. 따라서, 생성된 폴리클로날 항체는 시퀀싱 어레이 상의 특정 위치에서 성장하는 DNA 사슬의 3' 말단에 혼입되는 특정 NLRT를 인지하나, 성장하는 사슬의 다른 내부 위치의 동일 뉴클레오시드 또는 어레이 상의 다른 곳에 혼입될 수 있는 다른 NLRT를 인지하지 않는다. 폴리클로날 항체는 또한 혼입되지 않은 NLRT-A를 인지할 수 있으나, 혼입되지 않은 NLRT는 혼입된 NLRT가 표지된 친화성 시약을 이용하여 프로빙되기 전에 세척된다.
연구자의 필요에 따라, 항상 전체 NLRT에 대한 항체를 발생시킬 필요는 없는 것이 인지될 것이다. 예를 들어, 차단 기에 특이적인 항체가 필요한 경우, 합텐은 3'-O-차단 기(즉, 핵염기가 없음) 또는 3'-O-차단 기 단독을 갖는 데옥시리보스일 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 3' 말단에 관심 NLRT를 갖는 폴리뉴클레오티드에 대해 생성된다. 일부 구현예에서, 항체는 주형 분자에 어닐링된 폴리뉴클레오티드에 대해 생성된다.
모노클로날 항체를 생성시키기 위해, NLRT를 포함하는 면역원으로 면역화된 동물로부터 항체 생성 세포(림프구)가 수거될 수 있고, 표준 체세포 융합 절차에 의해 골수종 세포와 융합되어, 이들 세포를 무한증식화시키고, 하이브리도마 세포를 생성시킬 수 있다. 이러한 기술(예를 들어, 문헌[Kohler and Milstein (Kohler and Milstein Nature 256:495-497, 1975)]에 의해 본래 개발된 하이브리도마 기술) 뿐만 아니라 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Kozbor et al., 1983, Immunol . Today 4:72), 인간 모노클로날 항체를 생성시키기 위한 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., 1986, Methods Enzymol, 121:140-67), 및 조합 항체 라이브러리의 스크리닝(Huse et al., 1989, Science 246:1275)과 같은 다른 기술이 당 분야에 널리 공지되어 있다. 하이브리도마 세포는 특정 RT와 특이적으로 반응성인 항체의 생성을 위해 면역화학적으로 스크리닝될 수 있고, 모노클로날 항체가 분리될 수 있다.
특정 항원 또는 분자에 대해 반응성인 특정 항체 또는 항체 단편은 또한 세포 표면 성분을 갖는 박테리아에서 발현된 면역글로불린 유전자 또는 이의 일부를 인코딩하는 발현 라이브러리를 스크리닝함으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, 완전한 Fab 단편, VH 영역 및 FV 영역은 파지 발현 라이브러리를 이용하여 박테리아에서 발현될 수 있다(예를 들어, 문헌[Ward et al., Nature 341:544-546, 1989; Huse et al. Science 246:1275, 1989; 및 McCafferty et al. Nature 348:552-554, 1990] 참조).
또한, 표적 NLRT에 특이적인 항체는 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝함으로써 용이하게 분리된다. 예를 들어, 항체 파지 라이브러리는 표적 NLRT에 특이적인 항체 단편을 확인하기 위해 사용함으로써 선택적으로 스크리닝된다. 항체 파지 라이브러리를 스크리닝하기 위한 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다.
항-NLRT 항체는 또한 세포-비함유 시스템에서 생성될 수 있다. 비제한적인 예시적인 세포-비함유 시스템은, 예를 들어, 문헌[Sitaraman et al., Methods Mol. Biol. 498: 229-44, 2009; Spirin, Trends Biotechnol. 22: 538-45, 2004; 및 Endo et al., Biotechnol. Adv. 21: 695-713, 2003]에 기재되어 있다.
4.2.1.2 항체 정제
항-NLRT 항체는 임의의 적합한 방법에 의해 정제될 수 있다. 상기 방법은 친화성 매트릭스 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피의 사용을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 소수성 상호작용 크로마토그래피, 예를 들어, 부틸 또는 페닐 컬럼이 또한 일부 폴리펩티드를 정제하는데 적합할 수 있다. 하기 섹션 8.4를 참조한다. 폴리펩티드를 정제하는 많은 방법이 당 분야에 공지되어 있다. 폴리클로날 항혈청으로부터의 항-NLRT 항체의 친화성 정제는 하기 실시예 2에 기재되어 있다.
4.2.1.3 항체 표지화
항체는 당 분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 표지될 수 있다. 항체 또는 다른 친화성 시약을 리포터 분자, 예를 들어, 효소 및 형광/발광 단백질을 포함하는 신호-발생 단백질에 연결시키기 위한 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다(Wild, The Immunoassay Handbook, 4th ed.; Elsevier: Amsterdam, the Netherlands, 2013; Kobayashi and Oyama, Analyst 136:642-651, 2011).
4.2.2 앱타머
앱타머는 특정 표적 분자에 결합하는 올리고뉴클레오티드 또는 펩티드 분자이다. 앱타머는 (a) 올리고뉴클레오티드의 (보통 짧은) 가닥으로 구성되는 DNA 또는 RNA 또는 XNA 앱타머; 및 (b) 단백질 스캐폴드에 양 말단에서 부착된 하나(또는 그 초과)의 짧은 가변 펩티드 도메인으로 구성되는 펩티드 앱타머로 분류될 수 있다.
핵산 앱타머는 다양한 분자 표적, 예를 들어, NLRT에 결합시키기 위해 반복된 라운드의 시험관 내 선택 또는 동등하게는 SELEX(지수적 농축에 의한 리간드의 체계적 진화)를 통해 조작된 핵산 종이다. 예를 들어, 표적 NLRT에 대한 친화성을 갖는 앱타머는 비-결합 앱타머가 폐기되고, 제안된 표적에 결합하는 앱타머가 확장되는 반복 과정인 SELEX를 통해 큰 올리고뉴클레오티드 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 초기 양성 선택 라운드 이후에 때때로 음성 선택이 후속된다. 이는 발생된 앱타머 후보의 선택성을 개선시킨다. 이러한 과정에서, 표적 NLRT는 친화성 컬럼에 고정된다. 앱타머 라이브러리가 적용되고, 결합이 허용된다. 약한 결합제는 세척되고, 결합된 앱타머는 용리되고, PCR을 이용하여 증폭된다. 이후, 증폭된 앱타머의 푸울이 표적에 재적용된다. 원하는 선택성 및 친화성의 앱타머가 획득될 때까지 상기 과정이 엄격성을 증가시키면서 다수의 횟수로 반복된다. 예를 들어, 문헌[Jayasena, et al., Clinical Chemistry 45:1628-1650, 1999]을 참조한다. 펩티드 앱타머 선택은 효모 2-하이브리드 시스템을 포함하여 상이한 시스템을 이용하여 이루어질 수 있다. 펩티드 앱타머는 또한 파지 디스플레이 및 다른 표면 디스플레이 기술, 예를 들어, mRNA 디스플레이, 리보솜 디스플레이, 박테리아 디스플레이 및 효모 디스플레이에 의해 구성된 조합 펩티드 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 이들 실험 절차는 바이오패닝(biopanning)으로도 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Reverdatto et al., 2015, Curr. Top. Med. Chem. 15:1082-1101]을 참조한다.
4.2.3 아피머
아피머는 항체와 유사한 특이성 및 친화성으로 이의 표적 분자에 결합하는 작은(12-14 kDa) 고도로 안정적인 단백질이다. 이들 단백질은 역평행 베타-시트 위에 놓인 알파-헬릭스의 공통 3차 구조를 공유한다. 아피머 단백질은 모노클로날 항체와 유사한 방식으로 높은 친화성 및 특이성으로 원하는 표적 단백질에 결합하도록 모두 무작위화될 수 있는 2개의 펩티드 루프 및 N-말단 서열을 나타낸다. 단백질 스캐폴드에 의한 2개의 펩티드의 안정화는 펩티드가 취할 수 있는 가능한 입체형태를 제한하여, 자유 펩티드의 라이브러리에 비해 결합 친화성 및 특이성을 증가시킨다.
NLRT에 특이적인 아피머는 표적 NLRT에 대한 높은 특이성 결합 및 높은 결합 친화성(예를 들어, nM 범위 내)을 갖는 아피머 단백질을 확인하기 위해 스크리닝되는 파지 디스플레이 라이브러리의 사용에 의해 선택될 수 있다. 다양한 적용에서 사용하기 위해 많은 상이한 표지, 태그 및 융합 단백질, 예를 들어, 형광단이 아피머 단백질에 컨쥬게이션되었다. 예를 들어, 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 8,481,491호, US 8,063,019호, 및 WO 2009/136182호를 참조한다. 또한, 문헌[Crawford et al., Brief Funct . Genomic Proteomic, 2:72-79, 2003]을 참조한다.
4.2.4 크노틴
"크노틴" 또는 "억제제 시스틴 매듭(inhibitor cystine knot; ICK)"은 3개의 디설파이드 브릿지를 함유하는 단백질 구조 모티프이다. 사이의 폴리펩티드의 섹션과 함께, 2개의 디설파이드는 세번째 디설파이드 결합(서열에서 세번째 및 여섯번째 시스테인을 연결시킴)을 통과하여 매듭을 형성하는 루프를 형성한다. 새로운 결합 에피토프는 단백질 공학을 이용하여 자연 크노틴에 도입될 수 있으며, 크노틴은 광범위한 표적을 표적화하도록 조작되었다. NLRT에 특이적인 크노틴의 생성을 위한 일 접근법은 효모 표면 디스플레이 및 형광-활성화 세포 분류를 이용하여 크노틴 라이브러리를 생성시키고 스크리닝하는 것이다. 표적 NLRT에 대한 선택성 및 높은 친화성을 갖는 크노틴의 생성 및 본 발명과 함께 사용하기 위한 상기 크노틴의 표지화에 관한 정보는, 예를 들어, 문헌[Kintzing and Cochran, Curr . Opin . Chem . Biol. 34:143-150, 2016; Moore et al., Drug Discovery Today: Technologies 9(1):e3-e11, 2012; 및 Moore and Cochran, Meth . Enzymol. 503:223-51, 2012]을 참조한다.
4.3 표지된 친화성 시약
표지된 친화성 시약은 다양한 방법에 의해 주형 핵산을 시퀀싱하는데 사용될 수 있다. 이들은 또한 당업자에게 명백한 바와 같이 시퀀싱 이외의 다양한 적용에서 사용될 수 있다. 본 발명의 항체 및 다른 친화성 시약을 표지화하는 임의의 방법이 이용될 수 있다.
4.3.1 형광 검출 가능 표지
본원에 기재된 항체, 앱타머, 아피머, 크노틴 및 다른 친화성 시약을 포함하는 본 발명의 실시에서 사용되는 친화성 시약은 검출 가능하게 표지될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 친화성 시약은 형광 염료 또는 형광단으로 검출 가능하게 표지될 수 있다. "형광 염료"는 형광단(특정 파장의 빛 에너지를 흡수하고, 더 긴 파장에서 빛을 재방출하는 화학적 화합물)을 의미한다. 형광 염료는 젼형적으로 약 300 ㎚ 내지 약 1,000 ㎚ 또는 적어도 약 5,000, 더욱 바람직하게는 적어도 약 10,000, 가장 바람직하게는 적어도 약 50,000 cm-1 M-1의 파장에서 최대 몰 흡광 계수, 및 적어도 약 0.05, 바람직하게는 적어도 약 0.1, 더욱 바람직하게는 적어도 약 0.5, 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 약 1의 양자 효율을 갖는다.
참고문헌[Grimm et al., Prog . Mol . Biol . Transl . Sci. 113:1-34, 2013; Oushiki et al., Anal. Chem. 84:4404-4410, 2012; Medintz & Hildebrandt, editors, 2013, "FRET - F
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rster Resonance Energy Transfer: from theory to applications," (John Wiley & Sons)] 등에 예시된 바와 같이 친화성 시약에 대한 부착을 위한 적절한 검출 가능한 표지를 선택하기 위한 문헌에서 이용 가능한 많은 실질적인 지침이 있다. 문헌은 또한, 예를 들어, 문헌[Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 2005)] 등과 같은 형광단 또는 리포터-켄처 쌍을 선택하기 위한 형광 분자의 목록 및 이의 관련 광학 특성을 제공하는 문헌을 포함한다. 또한, 문헌[Ullman et al., U.S. Pat. No. 3,996,345; Khanna et al., U.S. Pat. No. 4,351,760] 등에 예시된 바와 같이 RT 또는 이의 일부에 첨가될 수 있는 공통 반응성 기를 통한 공유 부착을 위한 리포터 분자 유도체화에 대해 문헌에 광범위한 지침이 존재한다. 상기 언급된 간행물 각각은 모든 목적상 이의 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.
예시적 형광 염료는 비제한적으로 아크리딘 염료, 시아닌 염료, 플루오론 염료, 옥사진 염료, 페난트리딘 염료, 및 로다민 염료를 포함한다. 예시적 형광 염료는 비제한적으로 플루오레세인, FITC, Texas Red, ROX, Cy3, Alexa Fluor 염료(예를 들어, Alexa Fluor 647 또는 488), ATTO 염료(예를 들어, ATTO 532 또는 655), 및 Cy5를 포함한다. 예시적 형광 염료는 2- 또는 4-채널 SBS 화학 및 워크플로우에서 사용되거나 이와 상용 가능한 염료를 추가로 포함할 수 있다.
예시적 표지 분자는 플루오레세인, 및 로다민 염료를 포함하는 잔텐 염료로부터 선택될 수 있다. 친화성 시약에 연결시키기 위한 부위로서 사용될 수 있는 페닐 모이어티 상에 치환기를 갖는 이들 화합물의 많은 적합한 형태가 상업적으로 널리 이용 가능하다. 형광 화합물의 또 다른 군은 알파 또는 베타 위치에 아미노 기를 갖는 나프틸아민이다. 상기 나프틸아미노 화합물 중에서 포함되는 것은 1-디메틸아미노나프틸-5-설포네이트, 1-아닐리노-8-나프탈렌 설포네이트, 및 2-p-톨루이디닐-6-나프탈렌 설포네이트이다. 다른 표지는 3-페닐-7-이소시아네이토쿠마린; 아크리딘, 예를 들어, 9-이소티오시아네이토아크리딘 및 아크리딘 오렌지; N-(p-(2-벤족사졸릴)페닐)말레이미드; 벤족사디아졸; 스틸벤; 피렌 등을 포함한다.
일부 구현예에서, 표지는 플루오레세인 및 로다민 염료로부터 선택된다. 이들 염료 및 적절한 연결 방법은, 예를 들어, 문헌[Khanna et al. (상기 인용됨); Marshall, Histochemical J., 7:299-303 (1975); Menchen et al., U.S. Pat. No. 5,188,934; Menchen et al., European Pat. App. No. 87310256.0; 및 Bergot et al., International Application PCT/US90/05565]과 같은 많은 참고문헌에 기재되어 있다. 친화성 시약 또는 뉴클레오시드 유사체에 대한 검출 가능한 표지로 사용될 수 있는 형광단은 로다민, 시아닌 3(Cy 3), 시아닌 5(Cy 5), 플루오레세인, Vic™, Liz™, Tamra™, 5-Fam™, 6-Fam™, 6-HEX, CAL Fluor Green 520, CAL Fluor Gold 540, CAL Fluor Orange 560, CAL Fluor Red 590, CAL Fluor Red 610, CAL Fluor Red 615, CAL Fluor Red 635, 및 Texas Red(Molecular Probes)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
표지의 현명한 선택에 의해, 상이한 표지가 단일 반응에서 상이한 파장에서 여기되고/되거나 검출되는 분석이 수행될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Fluorescence Spectroscopy (Pesce et al., Eds.) Marcel Dekker, New York, (1971); White et al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach, Marcel Dekker, New York, (1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd ed., Academic Press, New York, (1971); Griffiths, Colour and Constitution of Organic Molecules, Academic Press, New York, (1976); Indicators (Bishop, Ed.). Pergamon Press, Oxford, 1972; 및 Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Eugene (2005)]을 참조한다.
4.3.2 효소적으로 표지된 친화성 시약
일 접근법에서, 친화성 시약(예를 들어, 항체 또는 아피머)은 효소적으로 표지되고, 기질의 존재하에서, 프라이머 연장 생성물에 결합된 친화성 시약과 회합된 효소는 검출 가능한 신호를 발생시킨다. 예를 들어, 비제한적으로, 효소는 퍼옥시다제, 포스파타제, 루시페라제 등을 포함한다. 일 접근법에서, 효소는 퍼옥시다제이다. 일 접근법에서, 친화성 시약(예를 들어, 항체 또는 아피머)은 효소적으로 직접 표지된다. 일 접근법에서, 예를 들어, 항체 또는 다른 친화성 시약은 퍼옥시다제, 예를 들어, 호스라디쉬 퍼옥시다제(HRP) 또는 포스파타제, 예를 들어, 알칼리성 포스파타제(Beyzavi et al., Annals Clin Biochem 24:145-152, 1987)를 이용하여 표지된다. 일 접근법에서, 친화성 시약은 루시페라제 또는 화학발광 신호를 생성하는데 사용될 수 있는 다른 단백질에 커플링된다(또는 이와의 융합 단백질의 일부이다). 또 다른 접근법에서, 친화성 시약은 비-광학 신호, 예를 들어, pH에서의 변화를 생성시키기 위해 선택되는 효소 시스템에 커플링/융합될 수 있으며, 여기서 양성자는, 예를 들어, 이온 반도체 시퀀싱(예를 들어, Ion Torrent 시퀀서; Life Technologies Corporation, Grand Island, NY)에 의해 검출될 수 있다. 효소 표지된 친화성 시약의 사용은 신호 증폭으로부터 발생하는 높은 민감도 및 다양한 기계에 시퀀싱 방법을 맞춤화하는 능력을 포함하는 특정 장점을 갖는다. 효소 리포터 시스템은 문헌[Rashidian et al., Bioconjugate Chem. 24:1277-1294, 2013]에 개관되어 있다.
4.3.3 항체 융합 친화성 시약
또한, 재조합 항체 단편, 예를 들어, 단일-사슬 Fv 단편(scFv)과 리포터 단백질을 직접 연결시키는 융합체(Skerra and Pl
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kthun, Science 240:1038-1041, 1988; Bird et al., Science 242:423-426, 1988; Huston et al., Methods Enzymol 203:46-88, 1991; Ahmad et al., Clin. Dev. Immunol. 2012:1, 2012)가 사용될 수 있다. 예를 들어, 생물발광 특성을 갖는 발광단백질, 예를 들어, 루시페라제 및 애큐오린이, 예를 들어, 항체 단편, 에피토프 펩티드 및 스트렙타비딘과의 융합 단백질에서 리포터 단백질로 사용될 수 있다(Oyama et al., Anal Chem 87:12387-12395, 2015; Wang et al., Anal Chim Acta 435:255-263, 2001; Desai et al., Anal Biochem 294:132-140, 2001; Inouye et al., Biosci Biotechnol Biochem 75:568-571, 2011).
4.4 간접 및 직접 검출 방법
친화성 시약은 직접 표지(예를 들어, 공유 결합을 통한 형광단으로의 표지의 컨쥬게이션에 의함)되거나, 예를 들어, 3' NLRT를 갖는 연장된 프라이머에 직접 결합된 일차 친화성 시약에 결합하는 표지된 이차 친화성 시약의 결합에 의해 간접적으로 표지될 수 있다. 표지되지 않은 일차 친화성 시약은 표적 뉴클레오티드에 결합하고, 표지된 이차 친화성 시약(예를 들어, 항체, 앱타머, 아피머 또는 크노틴)은 일차 친화성 시약에 결합한다. 일부 접근법에서, 일차 및/또는 이차 친화성 시약은 항체이다. 예를 들어, 일 접근법에서, 친화성 시약은 "일차" 항체(예를 들어, 토끼 항-NLRT-C 항체)이고, 이차 결합제는 표지된 항-일차 항체(예를 들어, 염료-표지된 염소 항-토끼 항체)이다. 일부 접근법에서, 이차 항체 시약의 사용은 이로운 신호 증폭을 제공한다.
간접 검출의 경우에서, 검정은 2개의 별개의 부분을 포함하며, 첫째로, 항체가 항원에 결합하는 동안(물론, 항원이 존재하는 것으로 추정함) 표지되지 않은 일차 항체와의 인큐베이션 기간(일반적으로, 1시간)이 존재한다. 이후, 과량의 결합되지 않은 항체가 세척되고, 표지된 이차 항체가 첨가된다. 인큐베이션 기간(다시, 1시간) 후, 과량의 이차 시약이 세척되고, 일차 항체와 회합된 표지의 양(즉, 이차 시약을 통해 간접적으로)이 정량된다. 항원이 존재하는 경우 표지는 일반적으로 착색된 물질의 생성 또는 특정 파장에서 방출되는 빛의 양의 증가를 발생시킨다. 항원의 부재하에서, 일차 항체의 결합 및 이차 시약의 결합이 존재하지 않고, 따라서 신호가 없다. 직접 검출의 경우, 일차 항체에 대한 표지의 사전 공유 부착은 간접 검출을 이용한 2 라운드의 인큐베이션 및 세척 단계와 대조적으로 항원과의 단지 단일 인큐베이션 단계가 필요하고, 단지 1 라운드의 세척 단계가 필요한 것을 의미한다.
4.4.1 이차 항체 특이성
일차 및 이차 항체는 다수의 항원을 구별(예를 들어, RT-A, RT-C, RT-G 및 RT-T를 서로 구별)하도록 선택될 수 있다. 표지되지 않은 일차 항체(전형적으로, 모노클로날 또는 조작된 항체)는 상이한 아이소형을 가질 수 있고/있거나, 상이한 종(예를 들어, 상이한 동물에서 발생된 폴리클로날 항체 또는 상응하는 모노클로날 항체 또는 다른 친화성 시약)을 특징으로 하는 서열을 가질 수 있다. 상기 경우에, 각각의 항원에 대한 표지된 이차(즉, 항-일차) 항체는 적절한 아이소형 또는 종 서열에 특이적이다. 예를 들어, 아이소형 IgG1, IgG2a, IgG2b, 및 IgG3의 일차 항체가 아이소형-특이적 이차 항체와 함께 사용될 수 있다.
4.4.2 재조합 일차 및 이차 항체
일차 및 이차 항체 또는 다른 제제가 시퀀싱 어레이에 순차적으로, 동시에 첨가될 수 있으며, 이차 항체(들)가 일차 항체에 결합하고, 복합체로서 어레이에 첨가되는 조건하에서 미리조합될 수 있다. 도 2 및 실시예 7을 참조한다.
4.5 1 -, 2-, 3-, 또는 4-색 시퀀싱
본 발명의 방법을 이용한 시퀀싱은 2-, 3-, 또는 4-색 시퀀싱일 수 있다. 일 접근법(4-색 시퀀싱)에서, 각각의 친화성 시약은 독특한 신호를 생성하는 상이한 검출 가능한 표지(예를 들어, 형광 염료) 또는 표지의 조합물로 직접적 또는 간접적으로 표지된다. 단일 항원이 2개 이상의 염료(또는 다른 표지)로 인지되는 경우, 염료 또는 다른 표지 둘 모두(또는 전부)로 단일 친화성 시약 분자를 표지하는 것이 가능하나, 반드시 필요한 것은 아님이 인지될 것이다. 오히려, 단일 항원에 특이적인 친화성 시약 분자의 일부(예를 들어, 50%)는 하나의 염료로 표지될 수 있고, 단일 항원에 특이적인 친화성 시약 분자의 또 다른 일부(예를 들어, 50%)는 다른 염료로 표지될 수 있다.
일 상기 방법에 따르면, 표면 상의 위치에 배치된 단일-가닥 핵산 주형을 포함하는 어레이가 제공된다. 연장, 또는 SBS에 의한 시퀀싱은 (i) 검출 위치에서 뉴클레오티드에 표지되지 않은 상보성 뉴클레오티드(NLRT)를 결합(또는 혼입)시키고, (ii) 상기 NLRT에 특이적으로 결합하는 직접적 또는 간접적으로 표지된 친화성 시약에 결합시킴으로써 NLRT를 표지화하고; (iii) 검출 위치에서 상보성 NLRT와 관련된 신호(들)의 존재 또는 부재를 검출하고, 상기 신호는 표지(예를 들어, 형광 신호)로부터 발생하고(여기서, (1) 검출 위치에서 제1 신호를 검출하고, 제2 신호를 검출하지 않는 것은 상보성 NLRT를 NLRT-A, NLRT-T, NLRT-G 및 NLRT-C로부터 선택되는 것으로 확인하고; (2) 검출 위치에서 제2 신호를 검출하고, 제1 신호를 검출하지 않는 것은 상보성 NLRT를 (1)에서 선택된 NLRT와 상이한 NLRT-A, NLRT-T, NLRT-G 또는 NLRT-C로부터 선택되는 NLRT로 확인하고; (3) 검출 위치에서 제1 신호 및 제2 신호 둘 모두를 검출하는 것은 상보성 NLRT를 (1) 및 (2)에서 선택된 뉴클레오티드와 상이한 NLRT-A, NLRT-T, NLRT-G 및 NLRT-C로부터 선택된 NLRT로 확인하고; (4) 상기 위치에서 제1 신호 또는 제2 신호 둘 모두를 검출하지 않는 것은 상보성 NLRT를 (1), (2) 및 (3)에서 선택된 뉴클레오티드와 상이한 NLRT-A, NLRT-T, NLRT-G 및 NLRT-C로부터 선택되는 NLRT로 확인함); (iv) 상보성 NLRT의 정체를 기초로 하여 핵산 주형 내의 검출 위치에서 뉴클레오티드의 정체를 추론함으로써 다수의 시퀀싱 주기에서 핵산 주형 내의 검출 위치의 뉴클레오티드의 정제를 결정하기 위해 수행된다.
또 다른 상기 방법은 프라이머 결합 부위 및 프라이머 결합 부위에 인접한 표적 핵산 서열을 각각 포함하는 복수의 핵산 주형을 제공하고; 프라이머 결합 부위에 프라이머를 하이브리드화시키고, 한 세트의 NLRT 및 상응하는 세트의 친화성 시약, 예를 들어, (i) 제1 NLRT 및 제1 NLRT에 특이적으로 결합하고, 제1 표지를 포함하는 제1 친화성 시약; (ii) 제2 NLRT 및 제2 NLRT에 특이적으로 결합하고, 제2 표지를 포함하는 제2 친화성 시약; (iii) 제3 NLRT 및 제3 NLRT에 특이적으로 결합하고, 제1 표지 및 제2 표지 둘 모두를 포함하는 제3 친화성 시약; 및 (iv) 제4 NLRT 및 제4 NLRT에 특이적으로 결합하고, 제1 표지 또는 제2 표지를 포함하지 않는 제4 친화성 시약(여기서, 제1 표지 및 제2 표지는 서로 구별 가능함)을 이용하여 합성에 의한 시퀀싱의 하나 이상의 주기로 주기 당 하나의 뉴클레오티드만큼 개별 프라이머를 연장시킴으로써 복수의 상이한 핵산 주형에 대한 시퀀싱 반응을 수행하고; 합성에 의한 시퀀싱의 각각의 주기에서, 제1 표지의 존재 또는 부재 및 제2 표지의 존재 또는 부재를 검출함으로써 검출 위치에서 NLRT의 정체를 결정하여 표적 핵산 서열을 결정하는 것을 포함한다. 상기 방법에 대한 대안은 제3 NLRT에 특이적으로 결합하는 제3 친화성 시약의 혼합물을 이용하는 것이며, 이 중 일부는 제1 표지를 포함하고, 일부는 제2 표지를 포함(예를 들어, 동등한 혼합물)한다.
1-색 시퀀싱 방법에서, 친화성 시약은 구별 가능한 강도로 존재하는 검출 가능한 표지를 포함한다. 예를 들어, 일 상기 구현예에 따르면, 상기 방법은 프라이머 결합 부위 및 프라이머 결합 부위에 인접한 표적 핵산 서열을 각각 포함하는 복수의 핵산 주형을 제공하고; 프라이머 결합 부위에 프라이머를 하이브리드화시키고, 한 세트의 NLRT 및 상응하는 세트의 친화성 시약, 예를 들어, (i) 제1 NLRT 및 제1 NLRT에 특이적으로 결합하고, 제1 강도의 표지를 포함하는 제1 친화성 시약; (ii) 제2 NLRT 및 제2 NLRT에 특이적으로 결합하고, 제2 강도의 표지를 포함하는 제2 친화성 시약; (iii) 제3 NLRT 및 제3 NLRT에 특이적으로 결합하고, 제3 강도의 표지를 포함하는 제3 친화성 시약; 및 (iv) 제4 NLRT 및 제4 NLRT에 특이적으로 결합하고, 표지되지 않은 제4 친화성 시약(또는, 대안적으로, 친화성 시약 세트는 단지 제1, 제2 및 제3 친화성 시약만 포함하고, 제4 NLRT에 결합하는 제4 친화성 시약을 포함하지 않음)을 이용하여 합성에 의한 시퀀싱의 하나 이상의 주기로 주기 당 하나의 뉴클레오티드만큼 개별 프라이머를 연장시킴으로써 복수의 상이한 핵산 주형에 대한 시퀀싱 반응을 수행하고; 합성에 의한 시퀀싱의 각각의 주기에서, 표지의 존재 및 강도(또는 부재)를 검출함으로써 검출 위치에서 NLRT의 정체를 결정하여 표적 핵산 서열을 결정하는 것을 포함한다.
또 다른 접근법에서, 하나 또는 동일한 수의 단일 염료의 분자로 표지되나, 상이한 결합 효율(즉, 어레이 상의 단일 스폿에 결합되는 친화성 시약의 평균 수, 예를 들어, NLRT-A에 대해 표적 DNA 분자의 모든 카피의 10%, NLRT-T에 대해 30%, 및 NLRT-C에 대해 60% 및 NLRT-G에 대해 0 퍼센트 또는 거의 검출 가능하지 않은 결합)의 결과로서 4개의 NLRT 사이를 구별하는 친화성 시약이 사용된다. 일 접근법에서, 표적은 동일한 차단 기를 가지며, 표적에 대해 상이한 친화성을 갖는 친화성 시약이 선택된다. 또 다른 일 접근법에서, 차단 기는 동일한 친화성 시약의 결합 효율을 조정하기 위해 작은 화학적 변화로 변형되어, 이에 따라 신호의 염기 특이적 수준을 발생시킬 수 있다. 예를 들어, 변형되지 않은 차단 기는 가장 높은 신호(신호의 100%)를 생성하고, 변형 1을 갖는 차단 기는 신호의 낮은 수준(예를 들어, 50%)을 생성하고, 변형 2를 갖는 차단 기는 보다 적은 더 낮은 신호(25%) 등을 생성할 수 있다.
관련 접근법에서, 2개의 상이한 차단 기(아지도메틸 및 시아노에톡시메틸) 및 각각의 하나의 화학 변이체 (아지도메틸-프라임 및 시아노에톡시메틸-프라임) 및 2개의 항체가 2-색 시퀀싱(2-색 x 2-강도)에 사용될 수 있다. 예시를 위해,
아지도메틸-dA 친화성 제제 1, 색 1, 낮은 강도(0-40%)
아지도메틸-프라임-dC 친화성 제제 1, 색 1, 높은 강도(60-100%)
시아노에톡시메틸-dG 친화성 제제 2, 색 2, 낮은 강도(0-40%)
시아노에톡시메틸-프라임-dT 친화성 제제 2, 색 2, 높은 강도(60-100%)
일 구현예에서, 친화성 제제 1, 색 1, 낮은 강도는 0에 가까운 신호 강도를 가지며, 친화성 제제 2, 색 2, 낮은 강도는 더 높은 신호 강도(25-40%)를 갖는다.
관련 접근법의 구현예에서, 단일 종의 뉴클레오티드가 일부가 하나의 차단 기로 표지되고, 나머지가 다른 차단 기로 표지되는 뉴클레오티드의 혼합물로 사용되는 2-색 시퀀싱이 수행될 수 있다. 예시를 위해,
아지도메틸-dA 차단 기 1
시아노에톡시메틸-dG 차단 기 2
아지도메틸-프라임-dC 차단 기 1을 갖는 뉴클레오티드 70% 및 차단기 2를 갖는 뉴클레오티드 30%를 갖는 혼합물
시아노에톡시메틸-프라임-dT 차단 기 1을 갖는 뉴클레오티드 30% 및 차단기 2를 갖는 뉴클레오티드 70%를 갖는 혼합물
또 다른 접근법에서, 단지 하나의 친화성 시약이 사용된다. 친화성 시약에 의해 인지되는 상이한 비율의 차단 기를 갖는 뉴클레오티드 혼합물은 구별 가능한 수준의 신호를 생성시키는데 사용된다. 혼합물 내의 뉴클레오티드의 균형은 상응하는 친화성 시약이 없는 차단 기를 갖는다. 예시를 위해,
dA 0% 차단 기 1, 100% 차단 기 2
dG 25% 차단 기 1, 75% 차단 기 2
dC 50% 차단 기 1, 50% 차단 기 2
dT 100% 차단 기 1, 0% 차단 기 2
또 다른 구현예에서, 항체는 2개의 염기(뉴클레오티드 이량체)를 인지할 수 있으며, 여기서 하류 염기는 절단 가능하거나 절단 가능하지 않은 기의 첨가로 변형된다.
또 다른 구현예에서, 마지막에 혼입된 염기는 조합된 2개의 친화성 시약의 결합에 의해 확인되며, 하나의 친화성 시약은 핵염기를 특이적으로 인지하고 이에 결합하고, 제2 친화성 시약은 차단 기를 특이적으로 인지하고 이에 결합한다. 둘 모두의 친화성 시약이 결합하고/하거나 공간적으로 근접한 경우에만, 2개의 친화성 시약이 각각의 "표지"로서 FRET 공여체-수용체 쌍을 포함하는 경우와 같이 말단 염기의 정체의 결정이 이루어질 수 있다. 대안적으로, 친화성 시약 중 하나의 결합은 제2 친화성 시약의 결합을 가능하게 하거나 향상시키는 입체형태적 변화를 유도할 수 있다.
본원에 기재된 뉴클레오시드 유사체는 다양한 시퀀싱 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 유사체는 1 표지(때대로, "비-표지"로 언급됨), 2-표지, 3-표지, 또는 4-표지 시퀀싱 방법에서 사용될 수 있으며, 여기서 표지되지 않은 유사체는 1-, 2-, 3- 또는 4-표지 방식에 따라 직접적 또는 간접적으로 표지된 친화성 시약과 쌍을 이룬다.
예시적 1-표지 시퀀싱 방법은 상이한 핵염기(예를 들어, A, C, G, T)를 갖는 뉴클레오시드 유사체가 연속적으로 전달되고, 혼입이 각각의 상이한 핵염기에 대한 동일 신호 또는 표지의 존재 또는 부재를 검출함으로써 검출되는 방법을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 1-표지 방법은 때때로 1-색 방법으로 공지되어 있는데, 이는 각각의 뉴클레오시드 유사체에 대한 강도에 있어서 상이(또는 부재)할 수 있을지라도 검출 신호 및/또는 표지가 모든 핵염기에 대해 동일하기 때문이다. 예를 들어, DNA 중합효소 매개 주형 특이적 중합에 의한 프라이머로의 뉴클레오시드의 혼입은 뉴클레오시드 피로포스페이트로부터 절단된 피로포스페이트를 검출함으로써 검출될 수 있다. 피로포스페이트는 ATP 설푸릴라제(sulfurylase)가 아데노신 5' 포스포설페이트의 존재하에서 피로포스페이트를 ATP로 전환시키고, 이는 차례로 루시페린의 옥시루시페린으로의 루시페라제-매개 전환을 위한 기질로 작용하여, ATP 생성에 비례하는 양의 가시 광선을 발생시키는 커플링된 검정을 이용하여 검출될 수 있다.
또 다른 구현예에 따르면, 2-표지 또는 2-색 시퀀싱이 4개의 상이한 RT의 혼입을 검출하기 위해 조합 방식으로 2개의 구별 가능한 신호를 이용하여 본원에 기재된 RT 및 친화성 시약을 이용하여 수행될 수 있다. 예시적인 2-표지 시스템, 방법, 및 조성물은 모든 목적상, 특히 2-표지 시퀀싱에 관한 개시내용에 대해 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 8,617,811호에 기재된 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 간단히, 2-표지 시퀀싱에서, 제1 RT(예를 들어, RT-A)의 혼입은 제1 표지를 포함하는 제1 친화성 시약의 특이적 결합에 의해 새로이 혼입된 RT를 표지한 후, 제1 표지의 존재를 검출함으로써 검출된다. 제2 RT(예를 들어, RT-C)의 혼입은 제2 표지를 포함하는 제2 친화성 시약의 특이적 결합에 의해 제2 RT를 표지한 후, 제2 표지의 존재를 검출함으로써 검출된다. 제3 RT(예를 들어, RT-T)의 혼입은 제1 및 제2 표지 둘 모두를 포함하는 제3 친화성 시약의 특이적 결합에 의해 제3 RT를 표지한 후, 제1 및 제2 표지 둘 모두의 존재를 검출함으로써 검출되고; 제4 RT(예를 들어, RT-G)의 혼입은 표지되지 않은 제4 친화성 시약의 결합 또는 제4 친화성 시약이 사용되는 친화성 시약 세트에 포함되지 않는다는 사실로부터 발생하던지 아닌지 간에 제1 및 제2 표지의 부재를 검출함으로써 검출된다. 2-색 시퀀싱에서, 제1 표지는 제2 표지와 구별 가능하며, 제1 및 제2 표지의 조합은 단독으로 취해지는 제1 및 제2 표지와 구별될 수 있다.
또 다른 구현예에 따르면, 제1 표지를 포함하는 제1 친화성 시약의 특이적 결합에 의해 표지되는 제1 RT, 제2 표지를 포함하는 제2 친화성 시약의 특이적 결합에 의해 표지되는 제2 RT, 제3 표지를 포함하는 제3 친화성 시약의 특이적 결합에 의해 표지되는 제3 RT를 이용하여 3-표지 시퀀싱이 수행될 수 있다. 제4 RT의 경우, 상응하는 친화성 시약은 친화성 시약 세트로부터 생략되거나, 비-표지되거나, 제1, 제2 및 제3 표지 중 2개 이상의 조합(또는 표지 중 상이한 하나로 표지되고, 제4 RT에 특이적으로 결합하는 친화성 시약의 혼합물)을 포함한다. 제1, 제2 및 제3 표지는 서로 구별 가능하다.
유사하게, 4-표지 시퀀싱은 제1 표지를 포함하는 제1 친화성 시약의 특이적 결합에 의해 표지되는 제1 NLRT, 제2 표지를 포함하는 제2 친화성 시약의 특이적 결합에 의해 표지되는 제2 NLRT, 제3 표지를 포함하는 제3 친화성 시약의 특이적 결합에 의해 표지되는 제3 NLRT, 및 제4 표지를 포함하는 제4 친화성 시약의 특이적 결합에 의해 표지되는 제4 NLRT를 이용할 수 있다. 또한, 제1, 제2, 제3 및 제4 표지는 서로 구별 가능하다.
4.6 조합하여 사용되는 친화성 시약
단일 NLRT의 상이한 에피토프를 인지하는 친화성 시약은 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 혼입된 NLRT의 핵염기 부분을 인지하는 제1 친화성 시약은 차단 기를 인지하는 제2 친화성 시약과 함께 사용될 수 있다. 염색은 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있다. 순차적 염색에서, 제2 친화성 시약은 제1 친화성 시약이 NLRT에 결합된 채로 있는 동안 또는 재프로빙의 경우(하기 논의됨) 제1 친화성 시약의 제거 후에 적용될 수 있다.
4.7 친화성 시약 세트
"친화성 시약 세트"는 SBS에서 사용되는 RT를 표지하기 위해 사용된다. 예를 들어, 일 구현예에서, 4개의 RT(RT-A, RT-T, RT-C 및 RT-G)를 포함하는 RT 세트에 대해, 각각이 RT 중 하나를 특이적으로 인지하고 이에 결합하는 4개의 친화성 시약(항A, 항T, 항C 및 항G)의 상응하는 친화성 시약 세트가 존재할 수 있다. 친화성 시약 세트는 (i) 키트 형태로, 혼합물로서 또는 별도의 용기에 제공되고/되거나 (ii) 시퀀싱 어레이(예를 들어, 시퀀싱 플로우 셀 내)와 접촉되거나, 이와 조합될 수 있는 친화성 시약의 조합을 기재한다.
일 구현예에 따르면, 친화성 시약 세트의 각각의 구성원은 4-색 SBS에서와 같이 상이한 구별 가능한 검출 가능한 표지를 갖는다.
또 다른 구현예에 따르면, 친화성 시약 세트의 한 구성원은 표지되지 않는 반면, 다른 구성원은 표지된다. 대안적으로, 친화성 시약 세트는 표지되지 않은 친화성 시약을 간단히 배제하고, 표지된 친화성 시약만 포함할 수 있다.
예를 들어, 일 구현예에 따르면, 하나의 친화성 시약은 제1 표지(예를 들어, 항A)로 표지되고; 제2 친화성 시약은 제2 표지(예를 들어, 항T)로 표지되고; 제3 친화성 시약은 제3 표지(예를 들어, 항C)로 표지되고; 제4 친화성 시약은 표지되지 않거나, 친화성 시약 세트로부터 간단히 배제된다(예를 들어, 항G). 상기 친화성 시약 세트는 3-색 시퀀싱에 유용할 것이다.
또 다른 구현예에 따르면, 하나의 친화성 시약(예를 들어, 항A)은 제1 표지로 표지되고; 제2 친화성 시약(예를 들어, 항T)은 제2 표지로 표지되고; 제3 친화성 시약(예를 들어, 항C)는 제1 표지 및 제2 표지 둘 모두로 표지되고; 제4 친화성 시약(예를 들어, 항G)은 표지되지 않는다(또는 친화성 시약 세트로부터 배제된다). 대안적으로, 제3 친화성 시약은 친화성 시약 분자의 혼합물을 포함할 수 있으며, 이들 모두는 특정 염기에 특이적으로 결합하나(예를 들어, 모두가 항C임), 일부는 제1 표지를 포함하고, 일부는 제2 표지를 포함한다. 상기 친화성 시약 세트는 2-색 시퀀싱에 유용할 것이다.
또 다른 구현예에 따르면, 단지 단일한 검출 가능한 표지(또는 2개 이상의 표지의 단일 조합)가 사용되나, 이는 친화성 시약이 상이한 양의 표지(또는 2개 이상의 표지의 조합 중 적어도 하나의 표지)를 포함하는 경우와 같이 세트의 구성원들 사이에서 강도에 있어서 상이하다. 예를 들어, 일 구현예에서, 제1 친화성 시약(예를 들어, 항A)은 제1 강도의 표지로 표지되고; 제2 친화성 시약(예를 들어, 항T)은 동일 표지이나 제2의 강도로 표지되고; 제3 친화성 시약(예를 들어, 항C)은 동일 표지이나 제3의 강도로 표지되고; 제4 친화성 시약(예를 들어, 항G)은 표지되지 않는다(또는 제4 친화성 시약은 친화성 시약 세트로부터 배제된다). 또 다른 구현예에서, 제1 친화성 시약(예를 들어, 항A)은 제1 강도의 제1 표지 및 제2 표지로 표지되고; 제2 친화성 시약(예를 들어, 항T)은 동일한 제1 표지이나 제2 강도의 제1 표지 및 동일 제2 표지로 표지되고; 제3 친화성 시약(예를 들어, 항C)은 동일 제1 표지이나 제3 강도의 제1 표지 및 동일 제2 표지로 표지되고; 제4 친화성 시약(예를 들어, 항G)은 표지되지 않거나, 제2 표지로만 표지되거나, 친화성 시약 세트로부터 배제된다.
4.8 반응 혼합물
뉴클레오시드 유사체(예를 들어, NLRT) 및 상기 뉴클레오티드 유사체 또는 이의 반응 생성물을 함유하는 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드가 반응 혼합물의 성분으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 성분은 핵산 시퀀싱(예를 들어, SBS)을 위한 반응 혼합물에 사용될 수 있다. 예시적 반응 혼합물은 (a) 주형 핵산; (b) 중합효소; (c) 올리고뉴클레오티드 프라이머; (d) 3'-O 가역적으로 차단된 뉴클레오시드 유사체, 또는 구조적으로 상이한 핵염기를 갖는 3'-O 가역적으로 차단된 뉴클레오시드 유사체의 혼합물; 및 (e) 표지된 친화성 시약을 함유하는 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 예시적 시퀀싱 반응 혼합물은 어레이 상의 상이한 위치에 고정된 복수의 상이한 주형 핵산을 포함하는 어레이; (b) 중합효소; (c) 올리고뉴클레오티드 프라이머; 및 (d) NLRT 중 하나 또는 혼합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 예시적 시퀀싱 반응 혼합물은 어레이 상의 상이한 위치에 고정된 복수의 상이한 주형 핵산을 포함하는 어레이; (b) 성장하는 DNA 가닥(GDS)(3' NLRT를 포함할 수 있음); 및 (c) 하나 이상의 친화성 시약(예를 들어, 상기 기재된 바와 같은 친화성 시약 세트)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
5. 주형 핵산 및 핵산 어레이
다양한 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 DNA(예를 들어, cDNA, 유전체 DNA, 전사체 또는 마이크로바이옴(microbiome) DNA, 증폭 생성물 등) 또는 RNA이다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥이거나 단일 가닥이다.
일부 구현예에서, 주형 핵산은 고체 표면 상에 고정된다. 일부 구현예에서, 주형 핵산은 기판(예를 들어, 비드, 플로우 셀, 패드, 미세유체 장치 내의 채널 등)에 고정된다. 기판은 실리콘, 유리, 금, 중합체, PDMS 등을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 주형 핵산은 비말 내에 고정되거나 함유된다(선택적으로, 비말 내의 비드 또는 다른 기판에 고정된다).
일부 구현예에서, 주형 핵산은 표적 서열의 다수의 카피를 포함하는 고정된 DNA 콘카테머(concatemer)이다. 일부 구현예에서, 주형 핵산은 DNA 콘카테머, 예를 들어, 표적 서열의 다수의 카피 및 "어댑터 서열"을 포함하는 DNA 나노볼(DNB)로 표현된다. 모든 목적상 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 PCT 특허 공보 WO 2007/133831호를 참조한다. 일부 구현예에서, 주형은 단일 폴리뉴클레오티드 분자이다. 일부 구현예에서, 주형은 주형 분자의 클론 집단(예를 들어, 브릿지 증폭 또는 와일드파이어(Wildfire) 증폭에 의해 생성되는 클론 집단)으로 존재한다.
상기 방법은 특정 형태의 주형으로 제한되지 않으며, 주형은, 예를 들어, DNA 콘카테머, 덴드리머, 주형의 클론 집단(예를 들어, 브릿지 증폭 또는 와일드파이어 증폭에 의해 생성되는 것과 같음) 또는 단일 폴리뉴클레오티드 분자와 같은 임의의 주형일 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 본 명세서는 주형에 대한 각각의 언급이 대안적으로 콘카테머 주형, 덴드리머, 예를 들어, 짧은 선형 주형의 클론 집단, 단일 분자 주형(예를 들어, 제로-모드 도파관 내), 및 다른 형태의 주형을 나타내는 경우와 같이 읽어야 한다.
DNB, 클러스터, 폴로니(polony), 및 어레이 또는 이들의 군을 포함하는 적합한 주형 핵산은 모두 전체 내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 8,440,397호; 8,445,194호; 8,133,719호; 8,445,196호; 8,445,197호; 7,709,197호; 12/335,168호, 7,901,891호; 7,960,104호; 7,910,354호; 7,910,302호; 8,105,771호; 7,910,304호; 7,906,285호; 8,278,039호; 7,901,890호; 7,897,344호; 8,298,768호; 8,415,099호; 8,671,811호; 7,115,400호; 8,236,499호, 및 미국 특허 공보 번호 2015/0353926호; 2010/0311602호; 2014/0228223호; 및 2013/0338008호에 추가로 기재되어 있다.
일 양태에서, 본 발명은 복수의 주형 DNA 분자로서, 각각의 DNA 분자가 어레이의 한 위치에 부착된, 복수의 주형 DNA 분자, 복수의 위치에서 주형 DNA 분자의 일부와 염기 쌍을 형성한 상보적 DNA 서열로서, 상보적 DNA 서열이 이의 3' 말단에 혼입된 제1 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는, 상보적 DNA 서열, 및 제1 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드의 적어도 일부에 특이적으로 결합된 제1 친화성 시약을 포함하는 DNA 어레이를 제공한다. 일 접근법에서, DNA 어레이는 A, T, G 또는 C 핵염기 또는 이들의 유사체를 포함하는 3' 말단 뉴클레오티드를 갖는 프라이머 연장 생성물, 및 프라이머 연장 생성물에 결합된 친화성 시약을 포함한다.
6. 키트
본 발명을 실시하기 위한 키트가 제공될 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, NLRT 및 NLRT 세트가 키트 형태로 제공될 수 있다. 또한, 상기 기재된 바와 같이, 친화성 시약 및 친화성 시약 세트가 키트 형태로 제공될 수 있다. NLRT 및 NLRT 세트 및 친화성 시약 또는 친화성 시약 세트 둘 모두를 포함하는 키트가 또한 고려된다. 예를 들어, 본 발명은 (a) 가역성 종료자 뉴클레오티드(RT) 또는 1, 2, 3, 4개 이상의 상이한 개별적 RT를 포함하는 RT 세트; (b) 상응하는 친화성 시약 또는 각각이 RT 중 하나에 특이적인 1, 2, 3, 4개 이상의 친화성 시약을 포함하는 친화성 시약 세트; 및 (c) 패키징 물질 및/또는 사용 설명서를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 키트를 제공한다.
또 다른 구현예에 따르면, 상기 키트는 복수의 RT(여기서, 각각의 RT는 상이한 핵염기를 포함함), 및 복수의 친화성 시약(여기서, 각각의 친화성 시약은 RT 중 하나에 특이적으로 결합함)을 포함한다.
일 예에서, 본 발명은 (a) 프라이머 연장 생성물에 혼입될 수 있는 본원에 기재된 바와 같은 가역성 종료자 뉴클레오티드; (b) 프라이머 연장 생성물의 3' 말단에 혼입되는 경우 가역성 종료자 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제1 친화성 시약; 및 (c) (a) 및 (b)에 대한 패키징을 포함하는 키트를 제공한다. 일 접근법에서, 키트는 복수의 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드를 함유하며, 각각의 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드는 상이한 핵염기 및 복수의 제1 친화성 시약을 포함하고, 각각의 제1 친화성 시약은 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드 중 상이한 하나에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 제1 친화성 시약은 검출 가능하게 표지되고, 서로 구별될 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 이차 친화성 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 친화성 시약은 항체이다.
일 예에서, 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드는 하기 화학식 I의 구조를 갖는다:
Figure pct00017
화학식 I
상기 식에서, R1은 3'-O 가역성 차단 기이고; R2는 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T), 및 이들의 유사체로부터 선택되는 핵염기이고; R3는 하나 이상의 포스페이트를 포함한다.
7.적용
상기 기재된 SBS 적용에 더하여, 본원에 기재된 신규한 친화성 시약, NLRT, 키트 및 방법은 자연 또는 실험적으로 단편화된 DNA의 말단(또는 DNA 갭 내)에 있는 것을 검출하고; 특정 변형을 갖거나 특정 변형이 없는 특정 말단-염기(분자의 말단 또는 가닥의 갭 내의 말단)를 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포획하는 것과 같은 많은 다른 적용에서 사용될 수 있다. 5' 또는 3' 말단/갭 염기 모두가 검출될 수 있다. 친화성 시약은 라이게이션, 하이브리드화, 및 다른 검출에 사용될 수 있다.
본 발명의 방법이 또한 직접 RNA 시퀀싱에 사용될 수 있음이 인지될 것이다.
8. 방법
8.1 차단 기의 제거, 친화성 시약의 제거, 및 검출
차단 기 및 친화성 시약의 제거는 동시에 발생할 수 있다. 일 접근법에서, 어레이는 차단 기 및 친화성 시약이 동시에 제거되는 조건에 노출된다. 일 접근법에서, 어레이는 차단 기를 절단하는 제제와 조합된 일부가 친화성 시약의 제거를 발생시키는 제제(예를 들어, 고염, 소분자 경쟁자, 프로테아제 등)의 조합물을 갖는 용액과 접촉된다.
일부 경우에, 3' 차단 기의 제거는 친화성 시약의 제거를 발생시킨다. 특정 메커니즘으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 이들 경우에, 차단 모이어티의 제거가 항체 또는 다른 친화성 시약의 결합에 필요한 에피토프를 파괴하는 것으로 생각된다.
상이한 접근법에서, 친화성 시약 및 차단 기의 제거는 커플링되지 않아, 친화성 시약이 제거되나, 차단 기는 뉴클레오티드 당으로부터 절단되지 않는다. 이는 재프로빙이 요망되는 경우 유용하다. 하기 도 2, 섹션 9, 및 실시예 11을 참조한다.
친화성 시약 및/또는 차단 기의 제거를 위한 제거 조건에 대한 조건은 시퀀싱되는 DNA의 온전성을 보존하도록 선택될 것이 인지될 것이다.
8.1.1 차단 기의 제거
뉴클레오시드 유사체 또는 NLRT는 3'-O 가역적으로 차단된 것을 포함한다. 일부 양태에서, 차단 기는 프라이머의 3'-말단, 예를 들어, 이전 시퀀싱 주기에서 연장된 GDS에서 단일한 3'-O 가역적으로 차단된 NLRT의 조절된 혼입을 제공한다.
일반적으로, NLRT가 사용되는 각각의 시퀀싱 주기에서, 차단 기는 제거되고, 친화성 시약은 NLRT로부터 분리된다. 이들 단계는 동시에 수행될 수 있다. 예를 들어, 아지도메틸 차단 기는 포스핀을 이용한 처리(널리 사용되는 공정)에 의해 제거될 수 있고, 항체 친화성 시약은 낮은 pH(예를 들어, 100 mM 글리신 pH 2.8) 또는 높은 pH(예를 들어, 100 mM 글리신 pH 10), 고염, 또는 무질서유발 스트리핑 완충제를 이용한 처리에 의해 제거될 수 있다. 일 구현예에서, NLRT 및 친화성 시약 둘 모두를 제거하기 위해 단일 처리 또는 조건(예를 들어, 고염 완충제 중 포스핀)이 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 차단 기의 제거는, 예를 들어, 차단 기가 친화성 시약 결합에 필요한 경우 친화성 시약의 분리를 발생시킨다.
3'-O 가역성 차단 기는 효소적 절단 또는 화학적 절단(예를 들어, 가수분해)에 의해 제거될 수 있다. 제거를 위한 조건은 본원에 제공된 기재, 절단될 차단 기의 화학적 정체, 및 당 분야에 공지된 핵산 화학 원리를 기초로 하여 당업자에 의해 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 차단 기는 가역적으로 차단된 뉴클레오시드와 환원제, 예를 들어, 디티오트레이톨(DTT), 또는 포스핀 시약, 예를 들어, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP), 트리스(하이드록시메틸)포스핀(THP), 또는 트리스(하이드록시프로필) 포스핀을 접촉시킴으로써 제거된다. 일부 경우에, 차단 기는 포스핀 시약과 같은 환원제를 이용하여 혼입된 뉴클레오티드 유사체로부터 차단 기를 세척함으로써 제거된다. 일부 경우에, 차단 기는 광 불안정하고, 차단 기는, 예를 들어, UV 광의 적용에 의해 제거될 수 있다. 일부 경우에, 차단 기는 뉴클레오시드 유사체와, 예를 들어, 수성 팔라듐(Pd) 용액을 이용한 전이 금속 촉매 반응을 접촉시킴으로써 제거될 수 있다. 일부 경우에, 차단 기는 뉴클레오시드 유사체와 수성 니트라이트 용액을 접촉시킴으로써 제거될 수 있다. 또한, 또는 대안적으로, 차단 기는 혼입된 뉴클레오티드 유사체를 함유하는 용액 또는 혼합물의 pH를 변화시킴으로써 제거될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 차단 기는 뉴클레오시드 유사체와 산 또는 낮은 pH(예를 들어, 4 미만) 완충 수용액을 접촉시킴으로써 제거될 수 있다. 또 다른 예로서, 일부 경우에, 차단 기는 뉴클레오시드 유사체와 염기 또는 높은 pH(예를 들어, 10 초과) 완충 수용액을 접촉시킴으로써 제거될 수 있다.
포스핀과 같은 환원제에 의해 절단될 수 있는 3'-O 가역성 차단 기는 아지도메틸을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. UV 광에 의해 절단될 수 있는 3'-O 가역성 차단 기는 니트로벤질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 수성 Pd 용액과의 접촉에 의해 절단될 수 있는 3'-O 가역성 차단 기는 알릴을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 산으로 절단될 수 있는 3'-O 가역성 차단 기는 메톡시메틸을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 소듐 니트라이트의 수성 완충(pH 5.5) 용액과의 접촉에 의해 절단될 수 있는 3'-O 가역성 차단 기는 아미노알콕실을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
8.1.2 친화성 시약의 제거
항체-기반 친화성 시약은 낮은 pH, 높은 pH, 높거나 낮은 염, 또는 변성제, 예를 들어, 무질서 유발 스트리핑 완충제에 의해 제거될 수 있다. 친화성 시약의 다른 부류(예를 들어, 앱타머)는 당 분야에 공지된 임의의 수단에 의해 제거될 수 있다. 또한, 항체와 같은 친화성 시약은, 예를 들어, 하기 실시예 10에 예시된 바와 같이 친화성 시약 결합에 대해 결합된 에피토프와 경쟁하는 제제를 도입시킴으로써 제거될 수 있다.
또한, 친화성 시약은 또한 혼입된 NLRT를 결합시키는 제제의 능력을 파괴시킴으로써 제거될 수 있다. 전형적으로, 이는 3' 차단 기가 혼입된 뉴클레오티드 유사체로부터 절단되는 경우에 발생한다. 친화성 시약 결합이 차단 기의 존재에 의존하는 경우(예를 들어, 1° 항체에 의해 인지되는 에피토프가 차단 기 또는 이의 일부를 포함하는 경우), 차단 기의 제거는 친화성 시약의 방출을 또한 발생시킨다.
친화성 시약 및 차단 기의 동시 제거는 또한 동시에 발생할 수 있고, 차단 기 절단 성분(예를 들어, 포스핀 시약) 및 친화성 시약 방출 제제(예를 들어, 고염)를 포함하는 용액의 첨가에 의해 수행될 수 있다.
대안적으로, 친화성 시약은 3' 차단 기를 제거하지 않고 제거될 수 있다. 이러한 접근법은 재프로빙이 요망될 때 유용하다(하기 섹션 9에 기재됨).
8.1.3 검출
결합 사건을 검출하기 위한 방법은 사용되는 검출 가능한 표지(들)의 특성에 따라 가변적일 것이며, 당 분야에 널리 공지되어 있다. 검출(예를 들어, 형광 신호의 검출)은 일반적으로 차단 기의 제거 전에 수행된다. 그러나, 표지된 친화성 시약이 결합된 채로 있는 한 차단 기의 제거 전 또는 후에 검출이 수행될 수 있다.
8.2 항체 생성
예를 들어, 작은 화합물(약물 또는 펩티드)은 면역 반응을 유도하거나 특정 항체의 생성을 유도하는 방식으로 처리되기에 스스로가 충분히 복잡하지 않다. 항체 생성이 작은 항원으로 성공적이게 되려면, 이들은 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)과 같은 면역원성 담체 단백질과 화학적으로 컨쥬게이션되어야 한다. 애쥬번트는 면역 반응의 강도를 증가시키기 위해 면역원과 혼합되고 이와 함께 주사되어야 한다. 담체 단백질 컨쥬게이션, 애쥬번트의 사용 및 주사를 위한 샘플의 제조와 관련된 다른 문제가 항체 생성에 대해 본 섹션에 기재된다. 항원-특이적 프로브로 사용하기 위한 항체를 생성시키고, 정제하고, 변형시키기 위한 표준 절차가 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Harlow and Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual" (1988) 및 Harlow and Lane, "Using Antibodies: A Laboratory Manual" (1999)]을 참조한다.
합텐 : 항원으로 사용되는 소분자는 합텐으로 언급된다. 이들은 특정 항체의 생성을 위한 인지 부위로 작용할 수 있으나, 스스로가 필요한 면역 반응을 자극할 수는 없다. 합텐은 적합한 담체 분자에 이들을 커플링시킴으로써 면역원성이 될 수 있다.
에피토프 : 에피토프는 항체가 결합하는 항원 상의 특정 부위이다. 매우 작은 항원의 경우, 실제적으로 전체 화학 구조가 단일 에피토프로 작용할 수 있다. 이의 복잡성 및 크기에 따라, 항원은 다수의 에피토프에 특이적인 항체의 생성을 초래할 수 있다. 폴리클로날 항체는 혈청 면역글로불린의 혼합물이며, 집합적으로 항원 상의 다수의 에피토프에 결합할 가능성이 있다.
키홀 림펫 헤모시아닌( KLH ). 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)은 가장 널리 사용되는 담체 단백질이다.
소 혈청 알부민. 소 혈청 알부민(BSA; 67kDa)은 알부민으로 언급되는 혈청 단백질의 부류에 속한다.
8.3 면역화 프로토콜
면역화 프로토콜은 널리 공지되어 있으며, 단지 일반적으로 본원에 기재된다. 추가 설명에 대해서는 하기 실시예 2를 참조한다. 애쥬번트와 혼합되기 전에 면역원의 농도는 궁극적으로 주사 당 투여될 컨쥬게이트의 양을 결정할 것이다. 마우스에 대한 면역화 스케줄: 0일: 면역화 후 ELISA 스크리닝을 수행하는 경우에 면역전 혈청을 마우스로부터 수집하여 블랭크로 사용한다. 동결 저장한다. 마우스 당 50 내지 100 ㎍의 면역원(100 내지 200 ㎕의 항원-애쥬번트 혼합물과 동일함)을 주사한다. 전형적인 주사 경로는 복막내(i.p.) 또는 피하(s.c.)를 포함한다. 동물 당 1 또는 2회의 상기 주사가 이루어질 수 있다. 14일: 애쥬번트 중 동일량의 면역원으로 부스팅한다. 21일: 채혈 시험 및 ELISA에 의한 항체 반응 검정. (전형적으로, 마우스는 꼬리 정맥 또는 안와정맥총을 통해 마취 하에서 채혈된다). 28일: 필요시 다시 부스팅한다. 만족스러운 반응이 관찰될 때까지 부스트와 채혈 시험을 교대하면서 유사한 스케줄을 지속한다. 모노클로날 항체 생성을 위해, 염수(애쥬번트 없음)에 용해된 면역원과의 융합 4 내지 5일 전에 i.p. 또는 정맥내(i.v.) 주사한다.
토끼에 대한 면역화 스케줄: 0일: 면역화 후 ELISA를 수행하는 경우에 면역전 혈청을 토끼로부터 수집하여 블랭크로 사용한다. 동결 저장한다. 토끼 등 위의 8 내지 10개의 피하 부위 각각에 100 ㎍의 면역원(약 200 ㎕의 항원 애쥬번트 혼합물과 동일함)을 주사한다. 다른 주사 경로가 또한 이용될 수 있으나, 이는 토끼에 단연 가장 용이하다. 14일: 동일량의 애쥬번트로 부스팅한다. 21일: 채혈 시험 및 ELISA에 의한 항체 반응 검정. (전형적으로, 토끼는 마취 없이 귀 정맥을 통해 채혈된다). 혈액 5 내지 10 ㎖를 수집하는 것은 어렵지 않으며, 이는 항체 반응을 측정하기에 충분하다. 28일: 필요시 다시 부스팅한다. 만족스러운 반응이 관찰될 때까지 부스트와 채혈 시험을 교대하면서 유사한 스케줄을 지속한다.
면역글로불린의 일반 정제. 항체는 비교적 불변 도메인을 포함하여 예측 가능한 구조를 가지므로, 항원에 대한 항체의 특이성에 관계 없이 항체에 일반적으로 결합할 수 있는 특정 단백질 리간드를 확인할 수 있었다. 단백질 A, 단백질 G 및 단백질 L은 항체-결합 특성이 널리 특성규명된 3개의 박테리아 단백질이다. 이들 단백질은 재조합적으로 생성되었고, 다양한 종의 핵심 항체 유형의 친화성 정제에 일상적으로 사용되었다. 단백질 A/G로 언급되는 단백질 A 및 G의 유전적으로 조작된 재조합 형태가 또한 이용 가능하다. 이들 항체-결합 단백질은 비드화된 아가로스 수지에 이용 가능하게 고정된다.
8.4 항체의 친화성 정제:
미정제 세포 용해질 또는 다른 샘플에서 다른 단백질 및 성분으로부터 관심 단백질을 농축시키거나 정제하기 위해 다양한 방법이 이용된다. 이들 방법 중 가장 강력한 방법은 친화성 정제로도 언급되는 친화성 크로마토그래피이며, 이에 의해 관심 단백질이 고정된 리간드에 대한 특이적인 결합 특성에 의해 정제된다.
관심 단백질 및 다른 거대분자는 다양한 방법에 의해 미정제 추출물 또는 다른 복합 혼합물로부터 정제될 수 있다. 선택적 침전은 아마 거대분자의 한 유형을 또 다른 유형과 분리시키기 위한 가장 간단한 방법이다.
그러나, 대부분의 정제 방법은 정지 물질(고체상)과의 화학적 또는 물리적 상호작용에서의 차이를 기초로 하여 용액 상태의 분자(이동상)가 분리되는 크로마토그래피의 일부 형태를 수반한다. 젤 여과(크기-배제 크로마토그래피 또는 SEC로도 언급됨)는 크기를 기초로 하여 분자를 분리(즉, 물리적 배제)시키기 위해 다공성 수지 물질을 이용한다. 이온 교환 크로마토그래피에서, 분자는 고체상 물질과의 전체 이온 상호작용(즉, 비특이적 상호작용)의 강도에 따라 분리된다.
대조적으로, 친화성 크로마토그래피(친화성 정제로도 언급됨)는 분자 사이의 특이적 결합 상호작용을 이용한다. 특정 리간드는 고체 지지체에 화학적으로 고정되거나 "커플링"되어, 복잡한 혼합물이 컬럼 상을 통과하는 경우, 리간드에 대한 특이적 결합 친화성을 갖는 분자가 결합되게 된다. 다른 샘플 성분이 세척된 후, 결합된 분자는 지지체로부터 스트리핑되어, 본래의 샘플로부터 정제된다.
각각의 특이적 친화성 시스템은 자체적인 세트의 조건을 필요로 하며, 제공된 연구 목적에 대해 자체적인 고유한 난제를 제시한다. 다른 단백질 방법 항목에는 특정 정제 시스템과 관련된 요인 및 조건을 기재한다.
8.5 항체 표지화
항체 구조 및 변형 부위. 다른 단백질과 마찬가지로 항체는 특정 검정의 목적에 적합화시키기 위해 많은 방식으로 공유적으로 변형될 수 있다. 많은 면역학적 방법은 표지된 항체의 사용을 포함하며, 항체의 표지화를 가능하게 하기 위해 다양한 시약이 생성되었다. 효소, 비오틴, 형광단 및 방사성 동위원소는 모두 생물학적 검정에서 검출 신호를 제공하기 위해 일반적으로 사용된다. 항체에 이용 가능한 작용기를 이해하는 것은 표지화, 가교 또는 공유적 고정에 대한 것이든지 아니든지 간에 변형을 위한 최적의 방법을 선택하는 열쇠이다. 대부분의 항체 표지화 전략은 3개의 표적 중 하나를 이용한다: (1) 일차 아민(-NH2): 이들은 리신 잔기와 각각의 폴리펩티드 사슬의 N-말단 상에서 발생한다. 이들은 다수이며, 전체 항체 상에 분포되어 있다. (2) 설프히드릴 기(-SH): 이들은 시스테인 잔기에서 발생하며, 전체-분자 구조를 안정화시키는 디설파이드 결합으로 존재한다. 힌지-영역 디설파이드는 선택적으로 환원되어 자유 설프히드릴을 표적화된 표지화에 이용 가능하게 할 수 있다. (3) 탄수화물(당): 당화는 주로 항체(IgG)의 Fc 영역에서 발생한다. 시스-디올을 함유하는 이들 다당류 모이어티의 성분 당은 산화되어 커플링을 위한 활성 알데하이드(-CHO)를 생성시킬 수 있다.
항체 표지화 방법. 본 발명의 실시에서 항체를 표지화시키기 위한 임의의 공지된 방법이 이용될 수 있다. 모든 단백질과 같이 항체는 아미노산으로 구성되며, 일차 아민(-NH2)에서 종결되는 리신의 측쇄가 표지를 항체 분자에 공유적으로 연결시키기 위해 일반적으로 사용된다.
항체 표지화를 위한 4개의 주요 화학적 접근법은 하기와 같이 요약된다:
1. NHS 에스테르. 형광 염료 표지의 경우, 내장된 NHS 에스테르('숙신이미딜 에스테르'로도 언급됨)를 갖는 활성화된 형태의 표지를 구입하는 것이 일반적이다. 활성화된 염료는 적절한 조건하에서 항체(모두 다수의 리신 기를 가짐)와 반응될 수 있다. 과량의 반응성 염료는 표지된 항체가 면역검정에 사용될 수 있기 전에 여러 가능한 방법 중 하나(종종 컬럼 크로마토그래피)에 의해 제거된다.
2. 이종이기능성 시약. 표지가 단백질 분자(예를 들어, 호스라디쉬 퍼옥시다제[HRP], 알칼리성 포스파타제, 또는 피코에리트린)인 경우, 항체 표지화 절차는 항체 및 표지가 다수의 아민을 갖는 사실에 의해 복잡해진다. 이러한 상황에서, 하나의 분자(예를 들어, 항체) 상의 리신 중 일부를 변형시켜 새로운 반응성 기(X)를 생성시키고, 표지 상의 리신을 변형시켜 또 다른 반응성 기(Y)를 생성시키는 것이 일반적이다. '이종이기능성 시약'은 Y 기를 도입시키는데 사용되며, 이는 이후에 항체 및 표지가 혼합되는 경우에 X 기와 반응하고, 이에 따라 이종이량체 컨쥬게이트를 생성시킨다. 이러한 테마에는 많은 변형이 있으며, 표지된 항체 및 다른 표지된 생체분자를 생성시키기 위한 이종이기능성 시약의 사용에 대해 문헌에서 수백개의 예를 찾을 것이다.
3. 카르보디이미드. 이들 시약(EDC는 하나의 매우 일반적인 예임)은 아민-함유 분자와 카르복실-함유 분자 사이에 공유 결합을 생성시키는데 사용된다. 카르보디이미드는 카르복실 기를 활성화시키고, 활성화된 중간체는 이후 아민에 의해 공격받는다(예를 들어, 항체 상의 리신 잔기에 의해 제공됨). 카르보디이미드는 항체를 카르복실화된 입자(예를 들어, 라텍스 입자, 자기 비드), 및 다른 카르복실화된 표면, 예를 들어, 마이크로웰 플레이트 또는 칩 표면에 컨쥬게이션시키는데 일반적으로 사용된다. 카르보디이미드는 염료 또는 단백질 표지를 항체에 부착시키기 위해 거의 사용되지 않지만, 이들은 NHS-활성화된 염료의 생성에 중요하다(상기 참조).
4. 소듐 페리오데이트. 이러한 화학물질은 대다수의 표지와 함께 사용될 수 없으나, 가장 인기 있는 진단 효소인 HRP에 적용 가능하다는 점에서 매우 중요한 시약이다. 페리오데이트는 HRP 분자 상의 탄수화물 사슬을 활성화시켜 알데하이드 기를 생성시키며, 이는 항체 분자 상의 리신과 반응할 수 있다. HRP 자체는 매우 소수의 리신을 가지므로, 유의한 HRP 중합화 없이 항체-HRP 컨쥬게이트를 생성시키는 것이 비교적 용이하다.
임의의 특정한 항체 클론에서, 리신(일차 아민)이 항원 결합 부위 내에서 현저하게 발생할 수 있다. 따라서, 이러한 표지화 전략의 유일한 단점은 종종 항체의 항원-결합 활성을 유의하게 감소시킨다는 것이다. 모노클로날 항체로 작업하거나, 항체 분자 당 고밀도의 표지를 첨가하려고 시도하는 경우에 감소가 특히 현저할 수 있다.
9. 재프로빙
상기 섹션 8에 언급된 바와 같이, 친화성 시약(예를 들어, 항체) 및 3' 보호 기(들)의 제거를 분리하는 것이 본 발명에 따라 가능하다. 친화성 시약은 차단 모이어티를 제거하지 않고 제거될 수 있으므로, 염기 호출(calling)의 정확도를 증가시키거나, 칩의 온전성을 시험하거나, 다른 이유로 일부 또는 모든 염기 위치를 재프로빙할 수 있는 것이 유리하다. 하기 실시예 11 및 도 2를 참조한다. 임의의 제공된 염기 위치는 1회 프로빙되고, 0, 1, 2회 또는 2회 초과로 재프로빙될 수 있다. 일반적으로, 단일 라운드의 재프로빙이 충분한 것으로 고려된다. 단지, 편의상, 염기 위치가 2회 프로빙되는 경우, 프로빙의 첫번째 라운드는 첫번째-반주기로 언급될 수 있고, 프로빙의 두번째 라운드는 두번째-반주기로 언급될 수 있다.
재프로빙되는 경우, 동일한 친화성 시약, 예를 들어, 동일한 일차 항체로 각각의 위치를 2회 프로빙하는 것이 가능하다. 더 자주, 상이한 항체 제조물(예를 들어, 상이한 모노클로날 항체), 상이한 부류의 친화성 시약(예를 들어, 첫번째-반주기에서 항체 및 두번째-반주기에서 앱타머로 프로빙), 또는 상이한 특이성을 갖는 친화성 시약과 같은 상이한 친화성 시약이 사용된다. 예를 들어, 첫번째-반주기에서, 어레이는 항-A, 항-T, 항-C 및 항-G로 프로빙될 수 있고, 두번째-반주기에서 어레이는 사용되는 항-퓨린 및 항-피리미딘으로 프로빙될 수 있다.
일 접근법에서, 4개의 NLRT는, 예를 들어, 아지도메틸-T, 아지도메틸-G, 시아노에테닐-C 및 시아노에테닐-A와 같이 2개의 차단 기를 이용하여 차단되며, 어레이는 2개의 친화성 시약(하나는 3'-O-아지도메틸-2'-데옥시리보스에 특이적이고, 다른 하나는 3'-O-시아노에테닐-2'-데옥시리보스에 특이적임)으로 1회 프로빙되고, 상이한 쌍의 친화성 시약(하나는 퓨린에 특이적이고, 하나는 피리미딘에 특이적임)으로 두번째로 프로빙된다. 3'-O-아지도메틸-2'-데옥시리보스 및 퓨린에 특징적인 신호를 나타내는 어레이 상의 어드레스는 구아닌 염기를 갖는 것 등으로 확인될 것이다.
10. 시퀀싱 과정
도 1 및 2는 독자에게 추가 안내를 제공하나, 제한하는 것으로 해석되어선 안된다. 예를 들어, 연장 생성물의 말단 3'-OH를 검출하기 위해 친화성 시약을 이용하는 경우(상기 섹션 3.8 참조), 차단 기는 항체 염색(단계 5) 전에 제거(단계 8b)될 것이다.
상기 논의된 바와 같이, 일 양태에서, 본 발명은 표지되지 않은 가역성 종료자 뉴클레오티드를 이용한 합성에 의한 시퀀싱(SBS) 방법에 관한 것이다. 모든 목적상 각각이 참조로서 본원에 포함되는 본원에 인용된 참고문헌에 기재된 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 SBS 방법이 널리 공지되어 있다. 전형적으로, SBS는 표면 상의 한 위치에 고정된 단일 가닥 핵산 주형의 서열을 결정한다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 일반적으로 표면 상의 한 위치에 많은 카피의 주형이 존재한다. 비제한적인 예시를 위해, 주형 카피는 DNA 나노볼(DNB) 방법 또는 브릿지 PCR 방법을 이용하여 가장 흔히 생성된다. DNB 방법은 많은 카피의 주형(예를 들어, 유전체 DNA 서열 및 인접한 프라이머 결합 부위)을 갖는 단일 가닥 콘카테머를 발생시킨다. 브릿지 PCR 방법은 주형 분자의 클론성 클러스터(예를 들어, 프라이머 결합 부위로 작용할 수 있는 어댑터가 측접된 유전체 DNA 서열)를 발생시킨다. 브릿지 PCR에서, 주형 핵산의 둘 모두의 가닥은 별개의 단일 가닥으로 존재할 수 있다. "주형" 핵산(즉, 단수의 문법적 형태) 또는 동등한 용어에 대한 본원의 언급은 또한 기판 상의 제공된 위치에서 복수의 카피의 주형을 나타내는 것이 이해될 것이다. 본원에서 주형 핵산 또는 주형 핵산 서열의 서열(즉, 단수의 문법적 형태)을 결정하는 것으로 언급될 수 있으나, 본 발명의 방법이 하나 또는 복수의 주형 핵산 분자를 함유하는 복수(종종 수억개)의 위치를 포함하는 어레이를 이용하여 수행되는 것으로 고려되는 것이 또한 인지될 것이다.
이러한 상황에서 사용되는 "어레이"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 달리 명시되지 않는 한, 정렬된 어레이(주형 결합 영역이 정렬된, 전형적으로 직선, 패턴, 예를 들어, 격자, 나선형 또는 다른 패턴으로 배열되는 것을 의미함) 및 정렬되지 않은 어레이(주형 결합 영역이 무작위 위치에 있음을 의미함)를 포함한다. 일 접근법에서, 어레이 상의 임의의 특정 위치(또는 "어드레스")에서의 주형의 정체는 주형의 시퀀싱 전에 공지되어 있을 수 있다. 더욱 흔히, 어레이는 제공된 어드레스에서의 주형의 정체가 시퀀싱 전에 공지되어 있지 않은 "무작위 어레이"이다. 달리 명시되지 않는 한, 본 발명의 개시에서, "어레이"는 평면 표면 상에 위치로 제한되지 않으며, 비드 어레이, 비말 어레이 등을 포함할 수 있다.
다양한 SBS 방법이 본 발명의 뉴클레오시드 유사체 및 친화성 시약과 함께 사용될 수 있다. 일부 양태에서, SBS 방법은 미국 특허 번호 6,210,891호; 6,828,100호, 6,833,246호; 6,911,345호; 6,969,488호; 6,897,023호; 6,833,246호; 및 6,787,308호; 미국 특허 공보 번호 2003/0064398호; 2003/0022207호; 2016/0130647호; 및 PCT 특허 공보 WO 2016/133764호; 문헌[Margulies et al., 2005, Nature 437:376-380; Ronaghi et al., 1996, Anal. Biochem. 242:84-89; Constans, A, 2003, The Scientist 17(13):36; 및 Bentley et al., 2008, Nature 456(7218):53-59]에 기재된 것으로부터 선택될 수 있다. 합성에 의한 시퀀싱을 수행하는 DNA 시퀀서는, 예를 들어, MiniSeq, MiSeq, NextSeq, HiSeq, HiSeq X, 및 NovaSeq sequencing systems를 포함하여 Illumina Inc.(San Diego, CA)로부터 상업적으로 이용 가능하다. 본 발명의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 다른 DNA 시퀀싱 시스템은 BGISEQ-50, BGISEQ-500, BGISEQ-1000, MGI-200, 및 MGISEQ-2000(BGI, Shenzhen, People's Republic of China); 및 GeneReader 시퀀싱 플랫폼(QIAGEN, Manchester, United Kingdom)을 포함한다.
일부 SBS 구현예는 연장 생성물로의 뉴클레오티드의 혼입시 방출되는 양성자의 검출을 포함한다. 예를 들어, 방출된 양성자의 검출을 기초로 한 시퀀싱은 Ion Torrent(Guilford, Conn., a Life Technologies subsidiary)로부터 상업적으로 이용 가능한 전기 검출기 및 관련 기술 또는 미국 특허 출원 공보 번호 2009/0026082 A1호; 2009/0127589 A1호; 2010/0137143 A1호; 또는 2010/0282617 A1호에 기재된 시퀀싱 방법 및 시스템을 이용할 수 있다.
주기 반응을 이용하는 또 다른 시퀀싱 절차, 예를 들어, 피로시퀀싱이 본 발명의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있다. 피로시퀀싱은 특정 뉴클레오티드가 초기 핵산 가닥에 혼입됨에 따라 무기 피로포스페이트(PPi)의 방출을 검출한다(Ronaghi et al., Anal Biochem 242:84-89, 1996; Ronaghi, Genome Res. 11:3-11, 2001; Ronaghi et al., Science 281:363, 1998); 및 미국 특허 번호 6,210,891호; 6,258,568호 및 6,274,320호. 피로시퀀싱에서, 방출된 PPi는 ATP 설푸릴라제에 의해 아데노신 트리포스페이트(ATP)로 전환됨으로써 검출될 수 있고, 생성된 ATP는 루시페라제-생성된 광자를 통해 검출될 수 있다. 따라서, 시퀀싱 반응은 발광 검출 시스템을 통해 모니터링될 수 있다. 형광 기반 검출 시스템에 사용되는 여기 방사선원은 피로시퀀싱 절차에 필요하지 않다. 본 발명의 개시의 어레이에 대한 피로시퀀싱의 적용에 사용될 수 있는 유용한 유체 시스템, 검출기 및 절차는, 예를 들어, WIPO 특허 출원 일련 번호 PCT/US11/57111호, 미국 특허 출원 공보 번호 2005/0191698 A1호, 미국 특허 번호 7,595,883호, 및 미국 특허 번호 7,244,559호에 기재되어 있다.
일부 양태에서, 라이게이션에 의한 시퀀싱 방법은 PCT 특허 공보 WO 1999/019341호; WO 2005/082098호; WO 2006/073504호; 및 문헌[Shendure et al., 2005, Science, 309: 1728-1739]에 기재된 것으로부터 선택될 수 있다. SBS 방법은, 예를 들어, 미국 특허 공보 2010/0105052호, 2007/099208호, 및 US 2009/0264299호 및 PCT 특허 공보 WO 2007/120208호, WO 2006/073504호, 및 WO 2007/133831호에 기재된 정렬된 DNA 나노볼 어레이를 이용할 수 있다. 상기 본 단락에 나열된 특허 및 비-특허 간행물은 모든 목적상 이들의 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된다.
일 구현예에 따르면, 시퀀싱은 DNA 나노볼(DNB)의 정렬된 어레이 상에서 수행된다. DNB는 수용액에서 붕괴되어 밀집한 공-유사 구조를 형성하는 다수의 카피의 원형 작제물을 포함하는 선형의 단일-가닥 DNA 콘카테머를 발생시키는 유전체의 단편 또는 다른 관심 표적 핵산을 각각 함유하는 원형 라이브러리 작제물의 롤링 서클 복제에 의해 생성된다. DNB는 2차원 평면 기판의 표면에 배치되어 단일 분자의 무작위 어레이를 형성한다. DNB는 공유 부착 및 비-공유 부착을 포함하는 다양한 기술에 의해 표면에 직접적 또는 간접적으로 고정될 수 있다. 일부 구현예에서, 스폿의 2차원 어레이를 갖는 패턴화된 기판이 DNB 어레이를 생성시키는데 사용된다. 스폿은 DNB를 포획하고 유지시키기 위해 활성화되는 반면, DNB는 스폿 사이의 영역에 남아 있지 않는다. 일반적으로, 스폿 상의 DNB는 다른 DNB를 반발시켜, 스폿 당 하나의 DNB를 발생시킬 것이다. DNB는 3차원(즉, DNA의 짧은 선형 단편이 아님)이므로, 본 발명의 어레이는 통상적인 DNA 어레이보다 결합 표면의 제곱 나노미터 당 더 많은 DNA 카피를 발생시킨다. 이러한 3차원 특성은 필요한 시퀀싱 시약의 양을 추가로 감소시켜, 더 밝은 스폿 및 더 효율적인 영상화를 발생시킨다. DNB 어레이의 점유는 종종 90%를 초과하나, 50% 내지 100% 점유 범위일 수 있다. DNB는 표면 상에 배치되고, 이후 이들 구현예에서 활성화된 스폿에 달라 붙으므로, 고-밀도 DNB 어레이는 본질적으로 용액 중 DNB로부터 "자가-조립"된다.
상기 DNB 어레이가 합성에 의한 시퀀싱에서 사용되는 경우, DNB 어레이는 프라이머와 접촉되고, 프라이머는 시퀀싱의 각각의 주기에서 중합효소에 의해 하나의 상보적인 염기에 의해 연장된다. 어레이의 각각의 위치에서 중합효소에 의해 혼입된 RT의 정체는 상응하는 RT에 대한 특정 친화성 시약의 결합의 결과로서 드러난다. 예를 들어, 4색 시퀀싱에서, 결과는 DNB의 어레이이며, 이들 각각은 친화성 시약으로 표지되어, 어레이 상의 특정 위치에 혼입된 RT의 정체가 RT에 결합된 친화성 시약의 일부인 형광 표지(또는 다른 검출 가능한 표지)에 의해 확인될 수 있다.
가역성 종료자를 이용하는 SBS 방법에서, 주형 핵산은 표면 상에 고정되고, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 주형 상의 소정의 위치(즉, 프라이머 결합 부위)에 하이브리드화된다. 데옥시리보스 3'-OH가 제거 가능한 차단 기, 예를 들어, 3'-O-아지도메틸로 대체된 뉴클레오티드 유사체는 프라이머 연장 반응에서 프라이머의 3'-말단에서 혼입된다. 혼입된 뉴클레오티드 유사체는 주형 상의 상응하는 위치의 뉴클레오티드와 상보적이고, 이와 염기쌍을 형성한다. 통상적으로, 뉴클레오티드 유사체는 혼입된 뉴클레오티드 유사체의 핵염기를 확인하고, 이에 따라 주형 내의 상보성 뉴클레오티드의 염기를 또한 확인하는 검출 가능한 표지를 포함한다. 일반적으로 이용되는 SBS 방법에서, 뉴클레오티드 유사체는 절단 가능한 링커에 의해 핵염기에 부착된 형광 표지를 포함한다.
가역성 종료자를 이용하는 SBS 방법에서, 뉴클레오티드 유사체의 혼입이 검출된 후, 차단 기는 전형적으로 화학적 또는 효소적으로 제거되어 3'-OH 기를 갖는 혼입된 뉴클레오티드를 생성시킨다. 추가 프라이머 연장 반응에서 추가 라운드의 3' 차단 뉴클레오티드 유사체의 혼입, 검출, 및 탈-차단이 수행될 수 있다. 프라이머 연장의 각각의 라운드에서 뉴클레오티드가 첨가되지만, 상기 공정은 보다 엄밀히 말하자면 연장되는 이전 라운드의 연장 생성물(및 본래의 올리고뉴클레오티드 프라이머가 아님)일 수 있으나 프라이머의 연장으로 언급될 수 있다. 프라이머 연장 가닥은 "성장하는 DNA 가닥(GDS)", "프라이머 연장 생성물" 또는 "연장된 프라이머"를 포함하는 다양한 방식으로 언급될 수 있다.
dNTP(즉, 뉴클레오시드 트리포스페이트)가 프라이머의 3' 말단에 첨가되는 경우, 피로포스페이트는 뉴클레오시드 모노포스페이트(또는 뉴클레오티드)가 혼입되도록 제거되는 것이 인지될 것이다. 표지되지 않거나 비-표지된 가역성 종료자 뉴클레오티드는 달리 명시되지 않는 한 문맥으로부터 명백한 바와 같이 어느 형태(자유 뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 혼입된 뉴클레오티드 모노포스페이트)로도 언급될 수 있다. 표지되지 않거나 비-표지된 가역성 종료자 뉴클레오티드는 NLRT로 언급될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 혼입되는 dNTP 유사체(들)은 검출 가능하게 표지되지 않는다. 이러한 상황에서, "검출 가능하게 표지되지 않음"은 혼입된 dNTP가 검출 가능한(예를 들어, 형광) 신호를 발생시키는 염료 또는 기질의 존재하에서 검출 가능한(예를 들어, 화학발광) 신호를 발생시키는 효소에 컨쥬게이션되지 않는 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 "가역성 종료자 뉴클레오티드"는 자연 발생 뉴클레오티드, 또는 데옥시리보스 3'-OH가 제거 가능한 차단 모이어티, 예를 들어, 3'-O-아지도메틸로 대체된 뉴클레오티드 유사체를 나타낸다.
본 발명의 일 양태에서, 시퀀싱 반응에서, 혼입된 NLRT는 프라이머 연장 생성물의 3' 말단 뉴클레오티를 구별함으로써 주형의 3' 말단 뉴클레오티드의 핵염기를 확인하는 항체(들)와 같은 친화성 시약(들)에 의해 검출된다. 일 접근법에서, 친화성 시약은 시퀀싱 반응에서 존재하는 다른 염기 또는 다른 염기 유사체를 갖는 혼입된 NLRT에 결합하는 것보다 훨씬 큰 친화성으로 특정 염기(예를 들어, A, T, G, 또는 C), 또는 특정 염기의 유사체를 함유하는 혼입된 NLRT에 특이적으로 결합한다. 또 다른 접근법에서, 친화성 시약은 시퀀싱 반응에 존재하는 다른 염기, 또는 다른 염기 유사체에 결합하는 친화성 또는 효율과 상이한 특징적인 친화성 또는 효율로 특정 염기(예를 들어, A, T, G, 또는 C), 또는 특정 염기의 유사체를 함유하는 혼입된 NLRT에 결합한다.
본 발명에 따르면, 친화성 시약은 또한 프라이머 연장 생성물의 3' 말단에 혼입된 NLRT를 3' 말단이 아닌 이전에 혼입된 "내부" 뉴클레오티드와 구별할 수 있다. 일반적으로, 프라이머 연장 생성물의 3' 말단의 NLRT는 자유 3'-OH의 존재(내부 뉴클레오티드에서 포스포디에스테르 결합에 의해 대체됨) 또는 3' 차단 모이어티의 존재뿐만 아니라 당 및 핵염기의 차별적 접근성에 의해 이전에 혼입된 뉴클레오티드와 상이하다.
본 발명에 따르면, SBS 반응은 상이한 질소성 염기(예를 들어, A, T, G 및 C)를 갖는 4개의 NLRT를 이용하여 수행된다. SBS 반응에서, 상이한 친화성 시약(예를 들어, 2, 3 또는 4개의 상이한 친화성 시약)이 사용되며, 이들 각각은 특정 질소성 염기를 갖는 NLRT와 결합하고, 상이한 질소성 염기를 갖는 NLRT에는 결합하지 않거나, 일부 구현예에서, 상이한 질소성 염기 또는 동일하지 않은 차단 기를 갖는 NLRT와 결합하나, 상이한 수준의 효율로 결합한다.
친화성 시약은 질소성 염기, 당, 절단 가능한 차단 기 또는 이들 요소의 조합에서의 구조적 차이를 기초로 하여 하나의 혼입된 NLRT를 상이한 NLRT와 구별할 수 있다. 일부 경우에, 예를 들어, 질소성 염기에서의 유의한 구조적 차이(예를 들어, 아데노신 대 구아닌) 및/또는 차단 기에서의 유의한 구조적 차이(예를 들어, 아지도메틸 대 시아노에테닐)로 인해 상이한 NLRT가 구별된다.
또한, 친화성 시약은 바람직하게는 자연적 차이와 조합된 작은 구조적 차이(예를 들어, 일부 경우, 5개 원자 미만의 첨가 또는 치환)를 기초로 하여 하나의 혼입된 NLRT를 다른 NLRT와 구별할 수 있다. 이들 작은 구조적 변화는 질소성 염기, 당, 및/또는 차단 기에서 이루어질 수 있다. 상이한 NLRT 사이의 상기 작은 차이를 구별하는 항체와 같은 친화성 시약이 제조될 수 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 친화성 시약 각각은 시퀀싱 반응에 존재하는 다른 것(들)(예를 들어, 각각이 상이하게 표지되기 때문)과 구별될 수 있거나, 상이한 이차 결합제에 의해 결합된다.
본 발명에 따르면, 질소성 염기, 당, 및 절단 가능한 차단 기 각각의 구조에 제약이 존재한다.
예를 들어, 적합한 변형된 염기는 정상 왓슨-크릭 결합 특이성을 보유할 것이며, DNA 중합효소에 의한 혼입과 양립되어야 한다. 일부 구현예에서, 염기 유사체는 형광 특성을 갖지 않는다(Renatus et al., 2010, Chem Rev. 110(5): 2579-2619).
유사하게, NLRT의 당 부분은 변형될 수 있다. 상기 변형된 NLRT를 갖는 핵산은 주형 가닥에 어닐링하는 능력을 보유해야 하며, DNA 중합효소에 의한 혼입과 양립되어야 한다.
유사하게, 단지 약간 상이한 차단 기를 갖는 NLRT가 사용될 수 있다. 예를 들어, 2, 3 또는 4개의 상이한 상기 NLRT가 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, 차단 기(데옥시리보스 3' 산소 원자를 포함하지 않음)는 184 미만, 종종 174 미만, 종종 164 미만, 종종 154 미만, 종종 144 미만, 종종 134 미만, 종종 124 미만, 종종 114 미만, 종종 104 미만, 종종 94 미만, 및 때때로 84 미만의 분자량(MW)을 갖는다.
특정 구현예에서, 데옥시리보뉴클레오티드 모노포스페이트의 분자량은 약 300 내지 325의 범위(dAMP 331.2, dCMP 307.2, dGMP 347.2 및 dTMP 322.2)이다. 특정 구현예에서, 프라이머 연장 생성물로 혼입되는 경우(즉, 가역성 종료자 차단 기를 포함하나, dNTP의 피로포스페이트를 포함하지 않는) NLRT 모이어티는 700 미만, 600 미만, 550 미만, 종종 540 미만, 종종 530 미만, 종종 520 미만, 종종 510 미만, 종종 500 미만, 종종 490 미만, 종종 480 미만, 종종 470 미만, 및 때때로 460 미만의 분자량을 갖는다.
특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 1000개 뉴클레오티드 이상, 때때로 10-500개 뉴클레오티드, 때때로 10-250개, 때때로 25개 초과, 때때로 50개 뉴클레오티드 초과의 시퀀싱 판독을 발생시키는데 사용된다. 일부 경우에, 시퀀싱은 2000개 염기 당 하나 미만의 오류, 5000개 염기 당 하나의 오류로 수행된다.
11. 실시예
11.1 실시예 1. 컨쥬게이션된 3'-O- 아지도메틸 -2'- dG , -dC, -dA 및 -dT 항원의 제조.
3'-O- 아지도메틸 -2'- 데옥시구아닌의 활성 에스테르의 합성. 3'-O-아지도메틸-2'-데옥시구아닌의 아미노-반응성 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 에스테르의 합성이 도 5에 제시된다. 화합물 G1(416 ㎎, 0.708 m㏖), 무수 DMF(3 ㎖) 및 1,1'-카르보닐디이미다졸(CDI)(171 ㎎, 1.054 m㏖)을 50 ㎖ 플라스크에 첨가하였다. 반응 혼합물을 20시간 동안 실온에서 교반하였다. 에틸 4-아미노부티레이트 하이드로클로라이드(384 ㎎, 2.29 m㏖) 및 트리에틸아민(300 ㎕, 2.155 m㏖)을 첨가하였다. 혼합물을 10시간 동안 40℃에서 교반하였다. 대부분의 DMF를 진공하에 회전식 증발기(또는 회전증발기)상에서 제거하여 미정제 화합물 G2를 생성시켰다.
미정제 화합물 G2에 EtOH(5 ㎖) 및 1N NaOH/H2O(7 ㎖)를 첨가하였다. 혼합물을 3일 동안 실온에서 교반하였다. 1N HCl/H2O를 첨가하여 pH를 7.4로 조정하였다. 대부분의 EtOH를 회전증발기에서 제거한 후, 여과하였다. 여과액을 25 mM TEAB 완충액(트리에틸아민 바이카르보네이트, 실온에서 pH 8.0) 및 CH3CN을 이용하는 분취용 HPLC로 정제하여 백색 고체로서 화합물 G3(341 ㎎)를 생성시켰다. LCMS : 452.1 (MS+).
5 ㎖ 바이알에 화합물 G3(42 ㎎, 0.076 m㏖), 무수 디메틸-포름아미드(DMF)(0.6 ㎖) 및 O-(N-숙신이미딜)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TSTU)(19 ㎎, 0.063 m㏖)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반하고, 생물학적 컨쥬게이트를 제조하기 위해 원하는 활성화된 NHS 에스테르 G4를 획득하였다. LCMS: 548 (MS+).
3'-O- 아지도메틸 - dG와 소 혈청 알부민(BSA)의 컨쥬게이션 . 150 mM NaCl을 갖는 50 mM Na 바이카르보네이트 완충액(pH=9.0) 중 20 ㎎ BSA(10 ㎎/㎖)를 5 ㎎의 화합물 G4와 반응시켰다. 반응을 1시간 동안 실온에서 수행하고, 반응 혼합물을 포스페이트-완충 염수 중 탈염 컬럼(Bio-Gel® P 폴리아크릴아미드 비드 [P6DG 비드], Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)으로 정제하였다. 컨쥬게이트를 동결건조시켜 백색 분말을 획득하였다.
3'-O- 아지도메틸 - dG와 키홀 림펫 헤모시아닌( KLH )의 컨쥬게이션 . 150 mM NaCl을 갖는 50 mM 소듐 바이카르보네이트 완충액(pH=9.0) 중 20 ㎎ KLH(10 ㎎/㎖)를 7 ㎎의 화합물 G4와 반응시켰다. 반응을 1시간 동안 실온에서 수행하고, 반응 혼합물을 포스페이트-완충 염수 중 탈염 컬럼(P-6DG 비드)으로 정제하였다. 컨쥬게이트를 동결건조시켜 백색 분말을 획득하였다.
상이한 링커가 사용되는 도 5에 제시된 것과 약간 상이한 합성 방법을 이용하는 BSA, KLH 및 아가로스 수지에 대한 3'-O-아지도메틸-dC-NHS 에스테르의 컨쥬게이션이 도 9에 제시된다.
3'-O- 아지도메틸 - dG와 아민 -활성화된 아가로스 수지의 컨쥬게이션 . 20 ㎖ 습윤 아민-활성화 아가로스 수지(5 μmole의 활성화 기/㎖)를 30 ㎖의 50 mM 소듐 바이카르보네이트 완충액(pH=9.0), 및 150 mM NaCl로 세척하였다. 70 ㎎의 화합물 G4를 20 ㎖ 습윤 비드에 첨가하고, 반응물을 인큐베이션하고, 2시간 동안 실온(RT)에서 회전시켰다. 반응 후, 수지를 260 ㎚의 흡광도가 0.02보다 낮아질 때까지 50 ㎖ 포스페이트-완충 염수로 세척하여 원하는 정제 수지를 생성시켰다.
3'-O- 아지도메틸 -2'- 데옥시시토신의 아미노-반응성 NHS 에스테르(C8)의 합성. 3'-O-아지도메틸-2'-데옥시시토신의 아미노-반응성 NHS 에스테르(C8)의 합성이 도 6에 제시된다. 화합물 C5(410 ㎎, 1.061 m㏖), 무수 DMF(3 ㎖) 및 1,1'-카르보닐디이미다졸(CDI)(213 ㎎, 1.314 m㏖)을 50 ㎖ 플라스크에 첨가하였다. 반응 혼합물을 20시간 동안 실온에서 교반하였다. 에틸 4-아미노부티레이트 하이드로클로라이드(223 ㎎, 1.330 m㏖) 및 트리에틸아민(200 ㎕, 1.437 m㏖)을 첨가하였다. 혼합물을 6시간 동안 40℃에서 교반하였다. 대부분의 DMF를 진공하에 회전증발기 상에서 제거하여 미정제 화합물 C6를 생성시켰다.
미정제 화합물 C6에 EtOH(5 ㎖) 및 1N NaOH/H2O(5 ㎖)를 첨가하였다. 혼합물을 24시간 동안 실온에서 교반하였다. 1N HCl/H2O를 첨가하여 pH를 7.4로 조정하고, 대부분의 EtOH를 회전증발기 상에서 제거한 후, 혼합물을 여과하였다. 여과액을 25 mM TEAB 완충액 및 CH3CN을 이용하는 분취용 HPLC로 정제하여 백색 고체로서 화합물 C7(518 ㎎)을 생성시켰다. LCMS : 412.1 (MS+).
5 ㎖ 바이알에서, 화합물 C7(49 ㎎, 0.096 m㏖), 무수 DMF(0.8 ㎖) 및 TSTU(27 ㎎, 0.090 m㏖)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반하고, 생물학적 컨쥬게이트를 제조하기 위해 원하는 활성화된 NHS 에스테르 C8을 획득하였다. LCMS: 509.2 (MS+).
3'-O- 아지도메틸 -dC와 소 혈청 알부민(BSA)의 컨쥬게이션 . 150 mM NaCl을 갖는 50 mM Na 바이카르보네이트 완충액(pH=9.0) 중 20 ㎎ BSA(10 ㎎/㎖)를 5 ㎎의 화합물 C8과 반응시켰다. 반응을 1시간 동안 실온에서 수행하고, 반응 혼합물을 포스페이트-완충 염수 중 탈염 컬럼(P6DG 비드)으로 정제하였다. 컨쥬게이트를 동결건조시켜 백색 분말을 획득하였다.
3'-O- 아지도메틸 -dC와 키홀 림펫 헤모시아닌( KLH )의 컨쥬게이션 . 150 mM NaCl을 갖는 50 mM Na 바이카르보네이트 완충액(pH=9.0) 중 20 ㎎ KLH(10 ㎎/㎖)를 7 ㎎의 화합물 C8과 반응시켰다. 반응을 1시간 동안 실온에서 수행하고, 반응 혼합물을 포스페이트-완충 염수 중 탈염 컬럼(P-6DG 비드, Bio-Rad Laboratories, Inc.)으로 정제하였다. 컨쥬게이트를 동결건조시켜 백색 분말을 획득하였다.
3'-O- 아지도메틸 -dC와 아민 -활성화된 아가로스 수지의 컨쥬게이션 . 20 ㎖ 습윤 아민-활성화 아가로스 수지(5 μmole의 활성화 기/㎖)를 30 ㎖의 50 mM 소듐 바이카르보네이트 완충액(pH=9.0) 및 150 mM NaCl로 세척하였다. 70 ㎎의 화합물 C8을 20 ㎖ 습윤 비드에 첨가하고, 반응물을 인큐베이션하고, 2시간 동안 RT에서 회전시켰다. 반응 후, 수지를 260 ㎚의 흡광도가 0.02보다 낮아질 때까지 50 ㎖ 포스페이트-완충 염수로 세척하여 원하는 정제 수지를 생성시켰다.
3'-O- 아지도메틸 -2'- 데옥시아데닌의 아미노-반응성 NHS 에스테르(A12)의 합성. 3'-O-아지도메틸-2'-데옥시아데닌의 아미노-반응성 NHS 에스테르(A12)의 합성이 도 7에 제시된다. 화합물 A9(111 ㎎, 0.270 m㏖), 무수 DMF(1 ㎖) 및 1,1'-카르보닐디이미다졸(CDI)(70 ㎎, 0.431 m㏖)을 25 ㎖ 플라스크에 첨가하였다. 반응 혼합물을 24시간 동안 실온에서 교반하였다. 에틸 4-아미노부티레이트 하이드로클로라이드(78 ㎎, 0.465 m㏖) 및 트리에틸아민(75 ㎕, 0.539 m㏖)을 첨가하였다. 혼합물을 16시간 동안 40℃에서 교반하였다. 대부분의 DMF를 진공하에 회전증발기 상에서 제거하여 미정제 화합물 10을 생성시켰다.
미정제 화합물 A10에 EtOH(2 ㎖) 및 1N NaOH/H2O(4 ㎖)를 첨가하였다. 혼합물을 24시간 동안 40℃에서 교반하였다. 1N HCl/H2O를 첨가하여 pH를 8.5로 조정하고, 대부분의 EtOH를 회전증발기 상에서 제거한 후, 혼합물을 여과하였다. 여과액을 25 mM TEAB 완충액 및 CH3CN을 이용하는 분취용 HPLC로 정제하여 백색 고체로서 화합물 A11(107 ㎎)을 생성시켰다. LCMS : 435.9 (MS+).
5 ㎖ 바이알에서, 화합물 11(61 ㎎, 0.114 m㏖), 무수 DMF(1 ㎖) 및 TSTU(20 ㎎, 0.066 m㏖)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반하고, 생물학적 컨쥬게이트를 제조하기 위해 원하는 활성화된 NHS 에스테르 A12를 획득하였다. LCMS: 555.2 (MS+).
3'-O- 아지도메틸 -dA와 소 혈청 알부민(BSA)의 컨쥬게이션 . 150 mM NaCl을 갖는 50 mM Na 바이카르보네이트 완충액(pH=9.0) 중 20 ㎎ BSA(10 ㎎/㎖)를 5 ㎎의 화합물 A12와 반응시켰다. 반응을 1시간 동안 실온에서 수행하고, 반응 혼합물을 포스페이트-완충 염수 중 탈염 컬럼(P-6DG 비드)으로 정제하였다. 컨쥬게이트를 동결건조시켜 백색 분말을 획득하였다.
3'-O- 아지도메틸 -dA와 키홀 림펫 헤모시아닌( KLH )의 컨쥬게이션 . 150 mM NaCl을 갖는 50 mM Na 바이카르보네이트 완충액(pH=9.0) 중 20 ㎎ KLH(10 ㎎/㎖)를 7 ㎎의 화합물 A12과 반응시켰다. 반응을 1시간 동안 실온에서 수행하고, 반응 혼합물을 포스페이트-완충 염수 중 탈염 컬럼(P-6DG 비드)으로 정제하였다. 컨쥬게이트를 동결건조시켜 백색 분말을 획득하였다.
3'-O- 아지도메틸 -dC와 아민 -활성화된 아가로스 수지의 컨쥬게이션 . 20 ㎖ 습윤 아민-활성화 아가로스 수지(5 μmole의 활성화 기/㎖)를 30 ㎖의 50 mM 소듐 바이카르보네이트 완충액(pH=9.0), 및 150 mM NaCl로 세척하였다. 70 ㎎의 화합물 A12를 20 ㎖ 습윤 비드에 첨가하고, 반응물을 인큐베이션하고, 2시간 동안 실온에서 회전시켰다. 반응 후, 수지를 260 ㎚의 흡광도가 0.02보다 낮아질 때까지 50 ㎖ 포스페이트-완충 염수로 세척하여 원하는 정제 수지를 생성시켰다.
3'-O- 아지도메틸 -2'- 데옥시티민의 아미노-반응성 NHS 에스테르(T16)의 합성. 3'-O-아지도메틸-2'-데옥시티민의 아미노-반응성 NHS 에스테르(T16)의 합성이 도 8에 제시된다. 화합물 T13(108 ㎎, 0.363 m㏖), 무수 DMF(1 ㎖) 및 1,1'-카르보닐디이미다졸(CDI)(74 ㎎, 0.456 m㏖)을 25 ㎖ 플라스크에 첨가하였다. 반응 혼합물을 24시간 동안 실온에서 교반하였다. 에틸 4-아미노부티레이트 하이드로클로라이드(80 ㎎, 0.477 m㏖) 및 트리에틸아민(75 ㎕, 0.539 m㏖)을 첨가하였다. 혼합물을 6시간 동안 40℃에서 교반하였다. 대부분의 DMF를 진공하에 회전증발기 상에서 제거하여 미정제 화합물 T14를 생성시켰다.
미정제 화합물 T14에 EtOH(2 ㎖) 및 1N NaOH/H2O(2 ㎖)를 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 1N HCl/H2O를 첨가하여 pH를 7.5로 조정한 후, 대부분의 EtOH를 회전증발기 상에서 제거하고, 혼합물을 여과하였다. 여과액을 25 mM TEAB 완충액 및 CH3CN을 이용하는 분취용 HPLC로 정제하여 백색 고체로서 화합물 T15(286 ㎎)를 생성시켰다. LCMS : 426.5 (MS+).
5 ㎖ 바이알에서, 화합물 15(121 ㎎, 0.225 m㏖), 무수 DMF(1 ㎖) 및 TSTU(40 ㎎, 0.132 m㏖)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반하고, 생물학적 컨쥬게이트를 제조하기 위해 원하는 활성화된 NHS 에스테르 T16을 획득하였다. LCMS: 546.1 (MS+Na+).
3'-O- 아지도메틸 -dT와 소 혈청 알부민(BSA)의 컨쥬게이션 . 150 mM NaCl을 갖는 50 mM Na 바이카르보네이트 완충액(pH=9.0) 중 20 ㎎ BSA(10 ㎎/㎖)를 5 ㎎의 화합물 T16과 반응시켰다. 반응을 1시간 동안 실온에서 수행하고, 반응 혼합물을 포스페이트-완충 염수 중 탈염 컬럼(P-6DG 비드)으로 정제하였다. 컨쥬게이트를 동결건조시켜 백색 분말을 획득하였다.
3'-O- 아지도메틸 -dT와 키홀 림펫 헤모시아닌( KLH )의 컨쥬게이션 . 150 mM NaCl을 갖는 50 mM Na 바이카르보네이트 완충액(pH=9.0) 중 20 ㎎ KLH(10 ㎎/㎖)를 7 ㎎의 화합물 T16과 반응시켰다. 반응을 1시간 동안 실온에서 수행하고, 반응 혼합물을 포스페이트-완충 염수 중 탈염 컬럼(P-6DG 비드)으로 정제하였다. 컨쥬게이트를 동결건조시켜 백색 분말을 획득하였다.
3'-O- 아지도메틸 -dT와 아민 -활성화된 아가로스 수지의 컨쥬게이션 . 20 ㎖ 습윤 아민-활성화 아가로스 수지(5 μmole의 활성화 기/㎖)를 30 ㎖의 50 mM 소듐 바이카르보네이트 완충액(pH=9.0) 및 150 mM NaCl로 세척하였다. 70 ㎎의 화합물 T16을 20 ㎖ 습윤 비드에 첨가하고, 반응물을 인큐베이션하고, 2시간 동안 실온에서 회전시켰다. 반응 후, 수지를 260 ㎚의 흡광도가 0.02보다 낮아질 때까지 50 ㎖ 포스페이트-완충 염수로 세척하여 원하는 정제 수지를 생성시켰다.
11.2 실시예 2. 비-표지된 가역성 종료자(NLRT)에 대한 폴리클로날 항체 제조
본 실시예는 시퀀싱을 위한 시약을 생성하기 위한 면역화 및 항체 정제에 사용되는 프로토콜을 기재한다. 본 프로토콜은 3' 차단 기로서 아지도메틸을 갖는 NLRT-A, -T, -G, 및 -C에 특이적인 항체를 갖는 폴리클로날 항혈청을 제조하는데 사용되었다.
재료: 토끼를 면역화시키기 위해 다음 재료를 사용하였다: 3 ㎎의 KLH-항원(토끼 주사용), 3 ㎎의 BSA-항원(적정용), 및 2-3 ㎖의 세파로스-항원(정제용).
2마리의 토끼의 면역화: 토끼를 실시예 1에 기재된 KLH-항원으로 면역화시켰다.
일 접근법에서, 70일의 면역화 스케줄을 따랐다: 첫번째 면역화는 1일이었고; 두번째 면역화는 20일이었고; 세번째 면역화는 40일이었고; 네번째 면역화는 60일이었다. 5 ㎖의 면역 전 혈청을 첫번째 면역화 전에 수집하고, 5 ㎖ 시험 혈액을 품질 관리를 위해 세번째 면역화 후에 수집하였다. 최종적으로, 전체 100 ㎖의 항혈청을 네번째 면역화 10일 후에 2마리의 토끼로부터 수집하였다.
폴리클로날 항체 역가: 역가를 모니터링하기 위해 하기 프로토콜을 이용하였다:
a) 플레이트의 각각의 웰을 4℃에서 밤새 또는 37℃에서 2-3시간 동안 1 ㎍/웰(100 ㎕)의 농도로 3'-O-아지도메틸-2'-데옥시 구아닌-BSA로 코팅한다.
b) 면역화된 토끼로부터의 100 ㎕의 연속적으로 희석된 항혈청을 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한다.
c) 과량의 1 X PBS로 3회 세척한다.
d) 100 ㎕의 HRP-컨쥬게이션된 염소 항-토끼 IgG(1:4000)를 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한다.
e) 과량의 1 X PBS로 3회 세척한다.
f) 100 ㎕의 ABTS 기질 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 20분 동안 실온에서 인큐베이션한다.
g) A450㎚에서 플레이트를 판독한다.
동일한 프로토콜을 이용하여 3'-O-아지도메틸-2'-데옥시-시토신, -아데닌 및 -티민에 대한 항혈청을 생성시켰다.
정제: 혈청으로부터 항체를 정제하기 위해 하기 프로토콜을 이용하였다. 아미노카프로산 링커를 통한 세파로스 6B로의 3'-아지도메틸-2'-데옥시리보-핵염기의 컨쥬게이션에 의해 Affi-Gel(Bio-Rad)을 제조하고, 정제 컬럼을 Affi-Gel로 패킹하였다. 1 또는 2마리의 토끼로부터 회수된 항혈청(최대 100 ㎖)을 아지도-dG, 아지도-dC, 아지도-dA, 또는 아지도-dT가 고정된 세파로스 6G의 친화성 컬럼 상에 적용하였다. 3'-아지도메틸 NLRT 각각에 특이적인 높은 역가의 폴리클로날 항체가 획득되었다.
본 발명자는 또한 폴리클로날 항체를 발생시키기 위해 50일 및 90일 면역화 프로그램을 이용하였다. 예를 들어, 4마리의 토끼를 항원 KLH-3'-아지도-2'-데옥시구아노신 컨쥬게이트로 면역화시켰다. 면역화 스케줄은 다음과 같았다: 첫번째 면역화, 1일; 두번째 면역화, 14일; 세번째 면역화, 28일, 및 네번째 면역화, 42일. 5 ㎖의 면역 전 혈청을 첫번째 면역화 전에 수집하고, 5 ㎖ 시험 혈액을 품질 관리를 위해 세번째 면역화 후에 수집하였다. 최종적으로, 전체 100 ㎖의 항혈청을 네번째 면역화 10일 후에 2마리의 토끼로부터 수집하였다.
11.3 실시예 3. E. 콜리 DNA 라이브러리의 제조
E. 콜리 유전체 DNA 라이브러리의 DNA 나노볼(DNB) 어레이를 실시예에 기재된 시퀀싱 실험에 사용하였다. DNB 및 DNB 어레이는, 예를 들어, 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Drmanac et al., 2010, "Human genome sequencing using unchained base reads on self-assembling DNA nanoarrays," Science 327:78-81]에 기재되어 있다. 샘플 제조 동안, 원형 라이브러리 작제물을 E. 콜리 유전체 DNA의 단편으로부터 제조하였고, 라이브러리 작제물을 롤링 서클 증폭(RCA)로 증폭하여 인접한 프라이머 결합 부위를 갖는 유전체 DNA 삽입물을 포함하는 DNB를 생성시켰다. DNB를 DNA 시퀀싱 플로우-셀(예를 들어, BGISEQ-500 플로우-셀 또는 BGISEQ-1000 플로우-셀)에 배열시키고, 시퀀싱을 BGISEQ-500(BGI, Shenzhen, China; 문헌[Huang et al., 2017, "A reference human genome dataset of the BGISEQ-500 sequencer" Gigascience 6:1-9] 참조) 또는 BGISEQ-1000(BGI, Shenzhen, China)을 이용하여 수행하였다.
11.4 실시예 4. DNB 어레이에서 혼입된 NLRT를 검출하기 위한 dN - 아지도메틸 -특이적 토끼 폴리클로날 항체 및 표지된 염소 항 토끼 이차 항체 이용
실시예 2에 기재된 바와 같은 3'-아지도메틸-dA, 3'-아지도메틸-dC, 3'-아지도메틸-dG, 또는 3'-아지도메틸-dT의 KLH 컨쥬게이트에 대해 발생된 혈청-유래 항체를 본 실험에서 사용하였다. 항-NLRT 항체의 4개의 상이한 정제 제조물을 4개의 염기(즉, RT-A, RT-C, RT-G 및 RT-T) 각각에 대해 제조하여, A1-A4, C1-C4, G1-G4, 및 T1-T4로 표시된 16개의 항체 제조물을 발생시켰다. 실시예 4에 기재된 바와 같은 E. 콜리 유전체 DNA 삽입물을 함유하는 DNB 어레이를 프라이밍하고, 프라이머를 3' 변형 dNTP 및 3'-아지도메틸 차단 기를 갖는 4개의 비-표지된 가역성 종료자(예를 들어, 3'-아지도메틸-dATP, -dCTP, -dGTP 및 -dTTP)를 혼입시키도록 조작된 중합효소인 BG9 DNA 중합효소(BGI Shenzhen, China)를 이용하여 연장시켰다. 16개의 항체 제조물을 10 ㎍/㎖로 DNB 어레이 상의 개별 레인에 개별적으로 적용하고, 5분 동안 35℃에서 인큐베이션(16개의 별개의 인큐베이션)하였다. 인큐베이션 종료시, 어레이 상의 결합되지 않은 일차 항체를 35℃에서 항체 완충액(AbB)(트리스 완충 염수 pH 7.4 + 0.1%BSA 및 0.05% Tween-20)으로 세척하여 제거하였다. 이후, 어레이를 35℃에서 5분 동안 Jackson Immune Research(West Grove, PA, USA)로부터 획득된 AF488-표지된 염소 항-토끼 이차 항체(Fab 단편)와 함께 인큐베이션하였다. 어레이를 AbB로 세척하여 결합되지 않은 이차 항체를 제거하고, BGISEQ-1000 시퀀싱 시스템을 이용하여 이미지화하였다. 단일 일차 항체로 염색된 16개의 항체 제조물 각각은 DNA 부위의 약 25%에서 혼입된 NLRT에 결합할 것으로 예상되는 것이 인지될 것이다.
시퀀싱 어레이의 4개의 대조군 레인은 DNB를 프라이밍하고, 절단 가능한 링커를 통해 염기에 부착된 형광단에 의해 표지된 4개 모두의 3'-아지도메틸 dNTP를 이용하여 프라이머를 연장시킴으로써 생성시켰다. 본원에 제시된 대조군 신호 값은 C-AF488에 대한 것이다.
표 1은 대조군 어레이 및 항체 어레이를 이용하여 획득된 신호를 제시한다. 가장 높은 수준의 항체-매개 신호는 굵은 글씨로 제시된다. 신호 강도에서의 변화가 어레이 사이에서 관찰되었으나(사용된 토끼 폴리클로날 항체의 특정 제조물에 좌우됨), 결과는 이러한 간접 검출 기술을 이용하여 상대적으로 낮은 항체 농도에서 대조군 신호 강도를 충족시키거나 초과하는 것이 가능함을 제시한다.
표 1
Figure pct00018
11.5 실시예 5. 형광 표지된 RT-A, -C 및 -T 및 표지되지 않은 RT-G를 이용한 DNA 시퀀싱
DNA 나노볼 E. 콜리 유전체 DNA 라이브러리를 모두 3'-아지도메틸 차단 기를 갖는 형광 표지된 RT-A, -C 및 -T 및 표지되지 않은 RT-G를 이용하여 시퀀싱하였다. 시퀀싱을 BGISEQ-500 시퀀서(BGI, Shenzhen, China)를 이용하여 수행하였고, 데이터를 시퀀서와 함께 제공된 염기 호출 분석 보고서를 이용하여 분석하였다. 시퀀싱을 5 주기(도 10a 및 10c) 또는 10 주기(도 10b 및 10d) 동안 수행하였다. 도 10a 및 10c는 Rho 값을 제시한다. (Rho 값은 이미지 분석 후에 획득된 신호 강도로부터 백그라운드의 공제에 의해 계산된다. 크로스톡 보정(cross-talk correction)을 포함하여 신호의 표준화가 또한 적용된다). 도 10b 및 10d는 신호 대 노이즈 비(SNR)를 제시한다.
성공적인 염기 호출 보고서로부터의 강도의 Rho 및 SNS(신호 대 노이즈 비)를 포함하는 데이터는 시퀀싱이 표지되지 않은 RT 및 RT에 특이적으로 결합하는 표지된 친화성 시약으로 성공적으로 수행될 수 있음을 나타낸다.
11.6 실시예 6. 4개의 표지되지 않은 RT 및 표지되지 않은 항- NLRT 폴리클로날 항체를 이용한 DNA 시퀀싱
표 2는 8-레인 칩 어레이를 갖는 BGISEQ-1000 시퀀서(BGI, Shenzhen, China)를 이용하여 생성된 시퀀싱 데이터를 예시한다(문헌[Fehlmann et al., Clin . Epigenetics 8:123, 2016] 참조). 컬럼 5는 절단 가능한 차단 모이어티가 4개의 NLRT 각각에 대해 특이적인 3'-O-아지도메틸(NLRT-A, -T, -C 및 -G) 및 폴리클로날 항체("1° 항체")인 비-표지된 가역성 종료자를 이용한 결과를 제시한다. 항체 결합을 2° 항체(Jackson Immune Research로부터 획득된 AF488-표지된 염소 항-토끼 Fab 단편)를 이용하여 검출하였다. 신호를 FIT 채널에서 측정하였다. 비-대조군 레인(예를 들어, 표 2, 3-8열)에서, 각각의 일차 항체는 별개로 적용되고(즉, 별개의 채널에 적용되고), 검출된다. 미가공 신호 값이 제시된다.
표 2의 행은 가역성 차단 기로서 3' 절단 가능한 아지도메틸 기를 갖는 하나의 NLRT에 해당한다. 표 2의 각각의 행은 하나의 표적 dNTP와 관련이 있으며, 각각의 열은 표적에 대한 시험을 제시한다. 열은 다음과 같다:
열 1: 열 5(양성 대조군 2)에 사용된 1° 항체의 특이성 및 농도(㎍/㎖).
열 2 및 9: 연장을 4개의 형광 표지된("핫(hot)") 가역성 종료자 dNTP(절단 가능한 링커를 통해 염기에 부착된 형광 염료를 가짐)를 이용하여 수행하였다. (DNA 어레이에 대한 양성 대조군).
열 3: 연장을 BG9 DNA 중합효소를 이용하여 수행하였다. 100 ㎍/㎖의 농도의 4개 모두의 1° 항체(양성 대조군 1).
열 4: 일차 항체는 생략된다(음성 대조군; 이차 항체 백그라운드 단독).
열 5: 연장을 4개의 표지되지 않은 아지도메틸 NLRT를 이용하여 수행하였다. 열 1의 농도로 사용된 각각의 일차 항체에 의한 염색을 제시하는 결과.
열 6: 연장을 표적 NLRT를 생략하나, 3개의 비-표적 NLRT를 포함하여 수행하였다(항체 특이성 대조군 1);
열 7: GDS의 3' 말단의 표적 염기가 아지도메틸 차단 기보다는 3'-OH를 갖는 음성 대조군(항체 특이성 대조군 2).
열 8: 시퀀싱 프라이머가 사용되지 않는 음성 대조군(특이성 대조군 3).
표 2
8 라인 칩 어레이를 갖는 BGISeq-1000 상에서의 시퀀싱 데이터
Figure pct00019
11.7 실시예 7. 표지되지 않은 RT-G가 항-RT-G 토끼 일차 항체 및 표지된 염소 항-토끼 이차 항체를 이용하여 검출되는 50 주기의 시퀀싱
본 실시예는 BGISEQ-1000 DNA 시퀀서 및 E. 콜리 유전체 DNB 라이브러리를 이용하여 수행된 50주기의 합성에 의한 시퀀싱(SBS)의 결과를 제시한다. 유전체 DNA 삽입물에 측접한 서열에 상보적인 DNA 프라이머를 DNB 어레이 상에 하이브리드화시키고, 프라이머 연장을 각각 2 μM 농도의 3'-아지도메틸 가역성 종료자(RT-A, -C, -G, -T)를 이용하여 수행하였다. 3개의 가역성 종료자(아지도메틸-A, -C, -T)를 염기(50% 표지/50% 비-표지의 비율로 사용)에 부착된 절단 가능한 링커를 통해 형광 표지시키고, 하나의 가역성 종료자(3'-아지도메틸-dGTP)는 비-표지시켰다. 프라이머 연장을 BG9 DNA를 이용하여 2분 동안 35℃에서 수행하였다.
프라이머 연장의 한 주기 후, 어레이를 세척하여 혼입되지 않은 뉴클레오티드를 제거하였다. 혼입된 3'-아지도메틸-dG를 AF647-표지된 염소 항-토끼 형광 표지 Fab 단편과 미리 조합된 항-3'-아지도메틸-dG 토끼 일차 항체와 함께 인큐베이션하여 검출하였다. 일차 항체 및 이차 항체(Fab 단편)를 이들을 35℃에서 15분 동안 함께 인큐베이션하여 예비 조합시켰다. 이러한 예비조합된 복합체를 35℃에서 10분 동안 25 ㎍/㎖ 일차 및 50 ㎍/㎖ 이차 농도로 어레이 상에서 인큐베이션하고, 어레이를 3회 세척하여 임의의 결합되지 않은 항체를 제거하였다.
항체 인큐베이션 후, 3개의 표지된 RT(RT-A, -C, -T)를 이들의 독특한 형광 표지를 이용하여 검출하였고, 비-표지된 염기(RT-G)를 염소 항-토끼 단편 이차 항체에 컨쥬게이션된 형광 표지를 이용하여 검출하였다. 형광 파장 검출을 통해 DNB 염기 정체를 결정한 후, 표지(RT-A, -C, -T)에 대한 링커 및 3' 차단기(RT-G, -A, -C, -T)를 35℃에서 2분 동안 13 mM의 THPP를 이용한 환원에 의해 제거하여, 3'-OH 기의 재생 및 초기 DNA 가닥을 추가로 연장시키는 능력을 가능하게 하였다. 이러한 일련의 단계(연장, 항체 인큐베이션, 검출, 및 차단 해제)를 전체 50주기의 서열 확인 동안 반복하였다.
도 11a는 염기호출 정보 함량(BIC) 백분율을 제시한다. 이러한 그래프는 항-토끼 AF647 형광 표지 단편 이차 항체와 미리 조합된 항-3'-아지도메틸-dG 토끼 일차 항체를 통해 간접적으로 검출되는 경우 표지되지 않은 염기의 정체가 공지되지 않은 DNA 잔기(들)의 염기호출 분석 및 확인을 위한 충분한 정보를 제공하는 것을 제시한다.
도 11b는 독특한 형광 표지 각각에 대한 신호 강도 및 경향을 제시한다. 염기에 부착된 형광 표지된 절단 가능한 링커를 함유하는 3개의 뉴클레오티드(dATP, dCTP, dTTP)를 50% 표지/50% 비-표지의 비율로 사용하였고, 각각 Cy3, FITC 및 TxR에 상응한다. 비-표지된 3'-아지도메틸-dGTP를 항-토끼 AF647 형광 표지 단편 이차 항체와 미리 조합된 항-3'-아지도메틸-dG 토끼 일차 항체로 검출하였다. 이들 데이터는 비-표지된 3'-아지도메틸-dG 염기에 대한 신호 강도의 분해 속도가 절단 가능한 링커 표지된 뉴클레오티드의 것보다 적은 것을 제시한다. 신호 강도의 이러한 감소된 분해는 절단 가능한 링커를 사용하여 표지된 dNTP를 사용하는 통상적인 방법보다 상기 기술을 이용하여 가능할 수 있음을 나타낸다.
11.8 실시예 8. 염기호출 분석에 적합한 신호 대 노이즈 비( SNR ) 값을 발생시키기에 충분한 특이성으로 NLRT에 결합하는 항체
표 3, 4, 5 및 6의 데이터는 직접 표지된 항-아지도메틸-염기 항체를 이용하는 E. 콜리 유전체 DNA에 대한 비-표지된 가역성 종료자의 염색 및 표지된 아지도메틸-염기를 이용한 대조군 어레이에 대해 획득된 최고 신호, Rho(백그라운드 및 크로스톡 공제 신호), 백그라운드 신호("백") 및 신호 대 노이즈 비(SNR) 값을 제시한다. 실험을 E. 콜리 유전체 DNA 라이브러리를 갖는 BGISEQ-500 플로우-셀 어레이에서 수행하고, BGISEQ-500 DNA 시퀀서에서 스캐닝하였다.
대조군 값은 4개의 표지된 3'-아지도메틸 RT(절단 가능한 링커를 통해 염기에 연결된 표지)를 이용한 시퀀싱의 결과이다. 3'-아지도메틸 RT를 표 4, 5 및 6에서 60% 표지("핫"), 40% 비-표지("콜드(cold)")의 비율로 사용하였고, 표 3에서 25% 표지 및 75% 비-표지의 비율로 사용하였다.
염색 전 값은 1 라운드의 프라이머 연장 후이나 항체의 첨가 전에 스캐닝한다.
염색된 값은 표시된 농도의 적절한 항-아지도메틸-염기 항체와의 인큐베이션(35℃에서 2 X 2분) 후에 스캐닝함으로써 획득하였다. 항-아지도메틸-염기 항체를 제시된 형광단으로 직접 표지하였다. 항-아지도메틸-염기 결합에 해당하는 값은 굵은 글씨로 표시된다.
표 3은 3'-O-아지도메틸-2'-데옥시아데닌에 대한 폴리클로날 항체를 이용한 결과를 제시한다. 표 4는 3'-O-아지도메틸-2'-데옥시시토신에 대한 폴리클로날 항체를 이용한 결과를 제시한다. 표 5는 3'-O-아지도메틸-2'-데옥시구아닌에 대한 폴리클로날 항체를 이용한 결과를 제시한다. 표 6은 3'-O-아지도메틸-2'-데옥시티민에 대한 폴리클로날 항체를 이용한 결과를 제시한다.
표 3
Figure pct00020
표 4
Figure pct00021
표 5
Figure pct00022
표 6
Figure pct00023
11.9 실시예 9. 표지된 항 NLRT 폴리클로날 항체를 이용한 25 주기 동안의 시퀀싱
E. 콜리 유전체 DNA 라이브러리를 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조하였고, BGISEQ-500 플로우-셀 상에 배열하였다. 프라이머를 첨가하고, 합성에 의한 시퀀싱을 표지되지 않은 뉴클레오티드 3'-아지도메틸 가역성 종료자(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)를 이용한 프라이머 연장에 의해 수행하였다. 표지되지 않은 3'-차단 dNTP는 각각 1 μM의 농도로 존재하였고, 주기 당 1분 동안 55℃에서 BG9 DNA를 이용하여 혼입시켰다. 혼입 및 혼입되지 않은 뉴클레오티드를 제거하기 위한 세척 후, 4개의 3'-아지도메틸-염기 뉴클레오티드를 어레이와 표 11에 제시된 농도(10-100 ㎍/㎖ 범위) 내의 4개의 직접 표지된 항-3'-아지도메틸-염기 항체의 혼합물을 접촉시킴으로써 검출하였고, 주기 당 2 X 2분으로 35℃에서 어레이 상에서 인큐베이션하였다. "2 x 2"는 2분 동안 항체와의 인큐베이션 후, 추가 항체 첨가 후의 추가 2분 인큐베이션을 나타낸다. 어레이를 3회 세척하여 임의의 결합되지 않은 항체를 제거하였다. 표 7은 각각의 검출 항체에 직접 컨쥬게이션된 형광단의 정체를 제시한다.
표 7
Figure pct00024
DNB 어레이 상의 각각의 위치에서의 형광 신호를 형광단의 레이저 여기 동안 80 ms 동안 스캐냉함으로써 결정하였다. DNB 염기 정체를 결정한 후, 3' 차단 기를 35℃에서 2분 동안 THPP(13 mM)를 이용한 환원에 의해 제거하여, 3'-OH 기의 재생을 가능하게 하고, 초기 DNA 가닥의 추가 연장을 허용시켰다. 3' 차단 기의 제거는 또한 프라이머 연장 생성물로부터 항체의 분리를 발생시켰다.
이러한 일련의 단계(연장, 항체 인큐베이션, 검출, 및 차단 해제)를 전체 25주기의 DNA 서열 확인 동안 반복하였다.
도 12a 및 12b는 각각의 시퀀싱 주기에서 각각의 염기에 대한 Rho 및 신호 대 노이즈 비(SNR)를 제시한다. 표 8은 참조 E. 콜리 유전체와 비교하는 경우 DNB 판독의 수뿐만 아니라 맵핑 및 오류율을 제시한다.
성공적인 염기 호출 보고서로부터의 강도의 Rho 및 SNR을 포함하는 이들 데이터는 다수 주기의 DNA 시퀀싱이 표지되지 않은 가역성 종료자 및 차단 기 및 염기에 결합하는 항체를 이용하여 수행될 수 있음을 입증한다.
표 8
Figure pct00025
11.10 실시예 10: 동등한 결과를 제공하는 상이하게 표지된 항체 세트
표 9 및 10은 직접 표지된 항-아지도메틸-염기 항체를 이용하는 E. 콜리 유전체 DNA에 대한 비-표지된 가역성 종료자의 염색으로 획득된 (최고 신호), Rho(백그라운드 및 크로스톡 공제 신호), 백그라운드 신호 및 신호 대 노이즈 비(SNR) 값을 제시한다. 본 실험을 E. 콜리 유전체 DNA 라이브러리를 갖는 BGISEQ-500 플로우-셀 어레이에서 수행하고, BGISEQ-500 DNA 시퀀서에서 스캐닝하였다. 프라이머를 고정된 DNB에 하이브리드화시키고, BG9 중합효소를 이용하여 35℃에서 2분 동안 1 μM의 각각의 농도의 4개 모두의 비-표지된 뉴클레오티드 3'-아지도메틸 RT(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)의 존재하에서 연장시켰다. 혼입 및 혼입되지 않은 뉴클레오티드를 제거하기 위한 세척 후, 혼입된 3'-아지도메틸-염기 뉴클레오티드를 35℃에서 각각 2분의 2회의 순차적 인큐베이션을 위해 제시된 농도(예를 들어, "@30"은 30 ㎍/㎖를 의미함)로 4개 모두의 표지된 항-3'-아지도메틸-염기 항체(항체 세트 1)를 인큐베이션시킴으로써 동시에 검출하였다.
두번째 어레이는 항체 세트 2를 이용하여 프로빙하였다. 항체 세트 2는 동일한 항체 제조물을 포함하나, 항체는 상이하게 표지된다. 표 10은 항체 세트 2를 적용한 후의 신호를 제시한다. 데이터는 신호 및 SNR 값이 직접적으로 표지된 형광단의 정체와 관계 없이 염기호출 분석에 적합한 것을 입증한다.
표 9
Figure pct00026
표 10
Figure pct00027
11.11 실시예 11: 3 ' 차단 기를 제거하지 않은 항- NLRT 항체의 제거
본원의 다른 곳에 논의된 바와 같이, 항체 제거(프라이머 연장 생성물로부터의 분리)는 3' 차단 기의 절단 및 제거와 분리될 수 있으며, 표 11은 특정 경쟁에 의해 항체가 제거된 실험의 결과를 제시한다. 프라이머 연장을 4개의 비-표지된 3'-아지도메틸-염기 뉴클레오티드를 이용하여 E. 콜리 라이브러리를 포함하는 DNB 어레이에서 수행하였다. 색 세트 1 형광단으로 직접 표지된 4개 모두의 항-3'-아지도메틸-염기 항체를 인큐베이션하여 동시에 염색하였다(실시예 10 참조). 50% WB1, 50% Ab 완충액 중에서 2분 동안 57℃에서 20 μM 자유 항원(3'-O-아지도메틸-2'-데옥시구아닌, 데옥시아데닌, 데옥시시토신, 데옥시티민, 각각 트리포스페이트 형태임)의 존재하에서 인큐베이션함으로써 검출 친화성 시약을 제거하기 위해 특이적 경쟁을 이용하였다. Ab 제거 절차는 (1) WB1, 55℃; (2) 제거 용액; (3) WB1, 20℃; (4) WB2; (5) SRE였다. WB1: NaCl 0.75 M, 소듐 시트레이트 0.075M, Tween 20 0.05%, pH 7.0; WB2 NaCl 50 mM, Tris-HCl pH9 50 mM,Tween 20 0.05%, EDTA 1 mM. pH 9.0; SRE NaCl 400 mM, Tris HCl pH7 1000 mM, 소듐 L 아스코르베이트 100 mM, Tween 20 0.05%, pH 7.0.
데이터는 신호 및 SNR이 유의하게 감소되는 것을 제시하며, 이는 DNB 어레이로부터의 대부분의 친화성 검출 시약의 제거를 나타낸다.
표 11
제거된 표지된 항체
Figure pct00028
11.12 실시예 12: 항- NLRT 항체의 제거 및 다수 주기의 시퀀싱에서의 재프로빙
본 실시예는 (1) 첫번째 위치의 염기의 정체가 염기 및 3' 차단 기에 특이적인 제1 일차 항체에 의한 결합을 검출함으로써 결정되고; (2) 3' 차단 기를 제거하지 않고 제1 일차 항체를 제거하고; (3) 염기 및 3' 차단 기에 특이적인 제2 일차 항체를 이용하여 동일한 위치를 재프로빙하는 과정을 기재한다. 이들 실험의 결과는 표 12에 요약되어 있다.
표 12는 상이한 형광 색 조합(실시예 10에 기재된 바와 같음)으로부터의 2개의 독립적 판독이 전체 20 위치 판독 동안 초기 합성에 의한 시퀀싱 가닥의 각각의 위치에 대해 조합되는 경우 개선된 DNA 서열 정체 맵핑 비율을 예시한다. "Odd indep"는 각각의 시퀀싱 위치에 대한 "통상적인 색"에서의 초기 판독을 나타낸다. "Even indep"은 표 12에 요약된 절차를 이용한 특정 경쟁에 의한 제거 후 "대체 색"에서의 후속 판독을 나타낸다. "Combo"는 2개의 독립적 판독 각각을 비교하고 결과를 더 높은 강도에 가중치를 둔 결과 및 이에 따른 2개 판독의 더 높은 신뢰도 값을 나타낸다. 결과는 2개의 독립적 판독이 상기 기술을 이용하여 조합되는 경우 유의하게 더 높은 맵핑 비율 및 유의하게 더 낮은 미스매치 비율을 제시한다.
표 12
Figure pct00029
전술한 본 발명은 이해의 명료함을 위해 예시 및 실시예에 의해 일부 상세히 기재되었으나, 당업자는 첨부된 청구항의 범위 내에서 특정한 변화 및 변형이 실시될 수 있음을 인지할 것이다. 또한, 본원에 제공된 각각의 참고문헌은 각각의 참고문헌이 참조로서 개별적으로 포함되는 것과 동일한 정도로 전체내용이 참조로서 포함된다. 본 출원과 본원에 제공된 참고문헌 사이에 상충되는 부분이 있는 겅우, 본 출원이 우선한다.

Claims (76)

  1. 프라이머 연장 생성물의 3' 말단에서의 3'-O-가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드의 혼입을 검출하기 위한 방법으로서, 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드가 핵염기, 당 모이어티 및 절단 가능한 차단 기를 포함하고,
    상기 방법이,
    (a) (i) 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 연장 생성물 및 (ii) 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드에 결합하는 제1 친화성 시약을 조합하는 단계로서, 제1 친화성 시약이 핵염기, 절단 가능한 차단기 또는 둘 모두에 결합하는, 단계, 및
    (b) 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드에 대한 제1 친화성 시약의 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 제1 친화성 시약이 당 모이어티에 결합하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 제1 친화성 제제가 핵염기 및 절단 가능한 차단 기에 결합하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 제1 친화성 시약이 핵염기 및 당 모이어티에 결합하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 핵염기가 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T), 시토신(C), 및 우라실(U)로부터 선택되는 자연 핵염기인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 제1 친화성 시약이,
    a) 아데닌(A)을 포함하는 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드를 데옥시리보뉴클레오티드 구아닌(G), 티민(T) 또는 시토신(C)을 포함하는 혼입된 가역성 종료자와 구별하고;
    b) G를 포함하는 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드를 혼입된 가역성 종료자 T, C 또는 A와 구별하고;
    c) T를 포함하는 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드를 G, C 또는 A를 포함하는 혼입된 가역성 종료자와 구별하고;
    d) C를 포함하는 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드를 데옥시리보뉴클레오티드 구아닌 G, T 또는 A를 포함하는 혼입된 가역성 종료자와 구별하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 핵염기가 핵염기 유사체인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 핵염기가 아데닌 유사체(A'), 구아닌 유사체(G'), 티민 유사체(T') 또는 시토신 유사체(C')이고, 제1 친화성 제제가 상응하는 자연 핵염기를 포함하는 혼입된 뉴클레오티드에 대한 결합에 비해 유사체를 포함하는 혼입된 뉴클레오티드에 우선적으로 결합하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 제1 친화성 제제가 절단 가능한 차단 기에 결합하는 방법.
  10. 제1항 또는 제8항에 있어서, 단계 (d)에서, 프라이머 연장 생성물이 상이한 결합 특이성을 갖는 2 내지 4개의 친화성 시약과 조합되고, 하나의 친화성 시약이 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드에 결합하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 하나의 친화성 시약에 의한 결합이 핵염기를 확인하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 절단 가능한 차단 기를 제거하여 3'-OH 데옥시리보뉴클레오티드를 생성시키는 단계 (d)를 추가로 포함하는 방법.
  13. 프라이머 연장 생성물의 3' 말단에서의 3'-O-가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드의 혼입을 검출하기 위한 방법으로서, 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드가 핵염기, 당 모이어티 및 절단 가능한 차단 기를 포함하고,
    상기 방법이,
    (a) 3' 말단에 3'-O-가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 연장 생성물을 생성시키는 단계;
    (b) 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드의 절단 가능한 차단 기를 제거하여 3'-OH 모이어티를 포함하는 3'-OH 데옥시리보뉴클레오티드 연장 생성물을 생성시키는 단계;
    (c) (b)로부터의 연장 생성물과 3'-OH 데옥시리보뉴클레오티드 연장 생성물에 결합하는 제1 친화성 시약을 조합하는 단계로서, 제1 친화성 시약이 핵염기 및 3'-OH 모이어티에 결합하는, 단계, 및
    (d) 연장 생성물에 대한 제1 친화성 시약의 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 친화성 시약을 제거하는 단계 (c)를 추가로 포함하는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 절단 가능한 차단 기가 아지도메틸, 알레닐, 시스-시아노에테닐, 트랜스-시아노에테닐, 시스-시아노플루오로에테닐, 트랜스-시아노플루오로에테닐, 시스-트리플루오로메틸에테닐, 트랜스-트리플루오로메틸에테닐, 비스시아노에테닐, 비스플루오로에테닐, 시스-프로페닐, 트랜스-프로페닐, 니트로에테닐, 메틸카르보노에테닐, 아세토카르보노에테닐, 아미도에틸레닐, 메틸아미도에틸레닐, 디메틸아미도에틸레닐, 메틸설포노에테닐, 메틸설포노에틸, 포름이미데이트, 포름하이드록시메이트, 비닐로에테닐, 에틸레노에테닐, 시아노에틸레닐, 니트로에틸레닐, 아미도에틸레닐, 3-옥소부트-1-이닐, 및 3-메톡시-3-옥소프로프-1-이닐, 또는 상기 중 임의의 것의 유사체로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 친화성 시약이 항체인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 친화성 시약이 검출 가능한 표지에 컨쥬게이션되거나 결합되고, 단계 (b)에서 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드에 대한 친화성 시약의 결합을 검출하는 것이 검출 가능한 표지로부터 신호를 검출하는 것을 포함하는 방법.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 친화성 시약이 표지되지 않고, 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드에 대한 제1 친화성 시약의 결합을 검출하는 단계가 (i) 제1 친화성 시약에 하나 이상의 이차 친화성 시약을 결합(여기서, 이차 친화성 시약은 검출 가능한 표지를 포함함)시키는 것을 포함하고, (ii) 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드에 대한 제1 친화성 시약의 결합을 검출하는 것이 검출 가능한 표지로부터 신호를 검출하는 것을 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 제1 친화성 시약 및 제2 친화성 시약이 단계 (a) 전에 조합되는 방법.
  20. 제18항에 있어서, 제1 친화성 시약이 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드에 결합하는 일차 항체이고, 하나 이상의 이차 친화성 시약이 일차 항체에 결합하는 하나 이상의 이차 항체인 방법.
  21. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 가능한 표지가 형광 또는 화학발광 신호를 발생시키는 방법.
  22. 합성에 의한 시퀀싱 반응을 수행하기 위한 방법으로서, 상기 방법이,
    (a) 복수의 상이한 서열을 포함하는 복수의 고정된 주형 핵산을 제공하는 단계;
    (b) 올리고뉴클레오티드 프라이머를 주형 핵산에 어닐링시키는 단계로서, 올리고뉴클레오티드 프라이머가 주형 핵산 상의 소정의 위치에 하이브리드화되는, 단계;
    (c) 복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머가 단일한 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드의 혼입에 의해 연장되어 복수의 프라이머 연장 생성물(이 중 일부는 3' 말단에 혼입된 A 또는 A'을 포함하고, 이 중 일부는 3' 말단에 혼입된 T 또는 T'을 포함하고, 이 중 일부는 3' 말단에 혼입된 G 또는 G'을 포함하고, 이 중 일부는 3' 말단에 혼입된 C 또는 C'을 포함함)을 생성시키는 조건하에서 주형 핵산 및 이에 어닐링된 프라이머와 중합효소 및 4개의 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP)(각각의 데옥시리보뉴클레오티드는 핵염기(N), 당 모이어티, 및 절단 가능한 차단 기를 포함함)를 조합시키는 단계로서, N이 아데닌(A) 또는 이의 유사체(A'), 구아닌(G) 또는 이의 유사체(G'), 티민(T) 또는 이의 유사체(T'), 및 시토신(C) 또는 이의 유사체(C')이고, 상기 4개의 dNTP 중 적어도 하나가 표지되지 않는, 단계;
    (d) 하나 이상의 제1 친화성 시약 각각이 4개의 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드 중 단지 하나에 결합하는 조건하에서 복수의 프라이머 연장 생성물과 상기 하나 이상의 제1 친화성 시약을 접촉시키는 단계로서, 제1 친화성 시약이 상기 4개의 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드 중 하나의 핵염기, 당 모이어티, 절단 가능한 차단 기 또는 이들의 조합물에 결합하는, 단계; 및
    (e) 하나 이상의 제1 친화성 시약의 결합을 검출하는 단계로서, 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 연장 생성물에 대한 제1 친화성 시약의 결합이 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드의 핵염기에 상보적인 주형 뉴클레오티드의 핵염기에 상보적인 주형 내의 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드의 핵염기를 확인하는, 단계를 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 dNTP 모두가 표지되지 않는 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 단계 (d) 및 (e)에서, 2, 3 또는 4개의 제1 친화성 시약이 사용되는 방법.
  25. 제22항에 있어서, 제1 친화성 시약을 제거하는 단계 (f)를 추가로 포함하는 방법.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 절단 가능한 차단 기를 제거하여 3'-OH 데옥시리보뉴클레오티드를 생성시키는 단계 (g)를 추가로 포함하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 주형 내의 추가 뉴클레오티드를 확인하기 위해 원하는 수의 주기 동안 단계 (c) 내지 (g)를 반복하는 것을 포함하며, 단계 (c)의 프라이머가 이전 주기의 프라이머 연장 생성물인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 원하는 주기 수가 25회 이상인 방법.
  29. 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 친화성 시약이 항체인 방법.
  30. 제22항에 있어서, 4개의 dNTP가 표지되지 않고, 단계 (c)에서, 4개의 제1 친화성 시약이 사용되며, 이들 각각이 4개의 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드 중 하나에 특이적으로 결합하는 방법.
  31. 제22항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서, 제1 친화성 시약(들)이 검출 가능한 표지에 컨쥬게이션되거나 결합되고, 단계 (d)에서, 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드에 대한 제1 친화성 시약(들)의 결합을 검출하는 것이 검출 가능한 표지로부터 신호를 검출하는 것을 포함하는 방법.
  32. 제22항에 있어서, 단계 (d)에서, 제1 친화성 시약(들)이 표지되지 않고, 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드(들)에 대한 제1 친화성 시약(들)의 결합을 검출하는 단계가 (i) 각각의 제1 친화성 시약에 하나 이상의 이차 친화성 시약을 결합(여기서, 각각의 이차 친화성 시약은 검출 가능한 표지를 포함함)시키는 것을 포함하고, (ii) 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드에 대한 제1 친화성 시약의 결합을 검출하는 것이 검출 가능한 표지로부터 신호를 검출하는 것을 포함하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 제1 및 제2 친화성 시약이 항체이고, 각각의 제1 친화성 시약이 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드에 결합하는 일차 항체이고, 각각의 이차 친화성 시약이 하나의 일차 항체에 결합하는 이차 항체인 방법.
  34. 제22항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 제1 친화성 시약의 상응하는 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드에 대한 결합이 구별 가능한 검출 가능한 신호를 발생시키는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 구별 가능한 검출 가능한 신호가 형광 또는 화학발광 신호인 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 구별 가능한 검출 가능한 신호가 색 또는 강도에서의 차이에 의해 구별되는 방법.
  37. 제22항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 친화성 시약이 당 모이어티에 결합하는 방법.
  38. 제22항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 친화성 제제가 핵염기 및 절단 가능한 차단 기에 결합하는 방법.
  39. 제22항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 친화성 시약이 핵염기 및 당 모이어티에 결합하는 방법.
  40. 제22항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 핵염기가 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T), 시토신(C), 및 우라실(U)로부터 선택되는 자연 핵염기인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 제1 친화성 시약이,
    a) 아데닌(A)을 포함하는 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드를 데옥시리보뉴클레오티드 구아닌(G), 티민(T) 또는 시토신(C)을 포함하는 혼입된 가역성 종료자와 구별하고;
    b) G를 포함하는 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드를 혼입된 가역성 종료자 T, C 또는 A와 구별하고;
    c) T를 포함하는 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드를 G, C 또는 A를 포함하는 혼입된 가역성 종료자와 구별하고;
    d) C를 포함하는 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드를 데옥시리보뉴클레오티드 구아닌 G, T 또는 A를 포함하는 혼입된 가역성 종료자와 구별하는, 방법.
  42. 제22항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 핵염기가 핵염기 유사체인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 핵염기가 아데닌 유사체(A'), 구아닌 유사체(G'), 티민 유사체(T') 또는 시토신 유사체(C')이고, 제1 친화성 제제가 상응하는 자연 핵염기를 포함하는 혼입된 뉴클레오티드에 대한 결합에 비해 유사체를 포함하는 혼입된 뉴클레오티드에 우선적으로 결합하는 방법.
  44. 제22항에 있어서, 제1 친화성 제제가 절단 가능한 차단 기에 결합하는 방법.
  45. 제22항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)에서, 프라이머 연장 생성물이 상이한 결합 특이성을 갖는 2 내지 4개의 친화성 시약과 조합되고, 하나의 친화성 시약이 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드에 결합하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 하나의 친화성 시약에 의한 결합이 핵염기를 확인하는 방법.
  47. 제22항에 있어서, 항체가 제1 핵염기를 포함하는 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드 및 제2 핵염기를 포함하는 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드를 서로 구별하고,
    a) 제1 핵염기가 아데닌(A)이고, 제2 핵염기가 T와 염기쌍을 형성하고 A와 상이한 A 유사체이거나;
    b) 제1 핵염기가 구아닌(G)이고, 제2 핵염기가 C와 염기쌍을 형성하고 G와 상이한 G 유사체이거나;
    c) 제1 핵염기가 티민(T)이고, 제2 핵염기가 A와 염기쌍을 형성하고 T와 상이한 T 유사체이거나;
    d) 제1 핵염기가 시토신(C)이고, 제2 핵염기가 G와 염기쌍을 형성하고 C와 상이한 C 유사체인,
    방법.
  48. 제22항에 있어서, 친화성 시약이 제1의 절단 가능한 차단 기와 하나 이상의 제2의 절단 가능한 차단 기 사이를 구별하고, 제1 및 제2의 절단 가능한 차단 기가 아지도메틸, 알레닐, 시스-시아노에테닐, 트랜스-시아노에테닐, 시스-시아노플루오로에테닐, 트랜스-시아노플루오로에테닐, 시스-트리플루오로메틸에테닐, 트랜스-트리플루오로메틸에테닐, 비스시아노에테닐, 비스플루오로에테닐, 시스-프로페닐, 트랜스-프로페닐, 니트로에테닐, 메틸카르보노에테닐, 아세토카르보노에테닐, 아미도에틸레닐, 메틸아미도에틸레닐, 디메틸아미도에틸레닐, 메틸설포노에테닐, 메틸설포노에틸, 포름이미데이트, 포름하이드록시메이트, 비닐로에테닐, 에틸레노에테닐, 시아노에틸레닐, 니트로에틸레닐, 및 아미도에틸레닐로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  49. 제22항에 있어서, 항체가,
    a) 아데닌(A)을 포함하는 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드를 데옥시리보뉴클레오티드 구아닌(G), 티민(T) 또는 시토신(C)을 포함하는 혼입된 가역성 종료자와 구별하고;
    b) G를 포함하는 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드를 혼입된 가역성 종료자 T, C 또는 A와 구별하고;
    c) T를 포함하는 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드를 G, C 또는 A를 포함하는 혼입된 가역성 종료자와 구별하고;
    d) C를 포함하는 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드를 데옥시리보뉴클레오티드 구아닌 G, T 또는 A를 포함하는 혼입된 가역성 종료자와 구별하는, 방법.
  50. 프라이머 연장 생성물의 3' 말단에서 데옥시리보뉴클레오티드의 합성에 의한 시퀀싱을 수행하기 위한 방법으로서, 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드가 핵염기, 당 모이어티 및 절단 가능한 차단 기를 포함하고,
    상기 방법이,
    (a) 3' 말단에 3'-O-가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 연장 생성물을 생성시키는 단계;
    (b) 혼입된 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드의 절단 가능한 차단 기를 제거하여 3'-OH 데옥시리보뉴클레오티드 연장 생성물을 생성시키는 단계;
    (c) (b)로부터의 연장 생성물과 3'-OH 데옥시리보뉴클레오티드 연장 생성물에 특이적으로 결합하는 제1 친화성 시약을 조합하는 단계로서, 제1 친화성 시약이 핵염기 및 3' OH 모이어티에 특이적으로 결합하는, 단계, 및
    (d) 연장 생성물에 대한 제1 친화성 시약의 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 제1 친화성 시약을 제거하는 단계 (e)를 추가로 포함하는 방법.
  52. (a) 프라이머가 연장되어 표지되지 않은 RT를 핵산 주형에 상보적인 서열에 혼입시킴으로써 RT를 포함하는 표지되지 않은 연장 생성물을 생성시키는 조건하에서 핵산을 포함하는 핵산 주형, 상기 주형의 일부에 상보적인 핵산 프라이머, 중합효소, 및 하기 화학식 I의 표지되지 않은 RT를 접촉시키는 단계:
    Figure pct00030

    화학식 I
    (상기 식에서,
    R1은 3'-O 가역성 차단 기이고;
    R2는 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T), 및 이들의 유사체로부터 선택되는 핵염기이고;
    R3는 하나 이상의 포스페이트로 구성됨);
    (b) 친화성 시약이 RT에 특이적으로 결합하여 RT를 포함하는 표지된 연장 생성물을 생성시키는 조건하에서 표지되지 않은 연장 생성물과 검출 가능한 표지를 포함하는 친화성 시약을 접촉시키는 단계; 및
    (c) 표지된 연장 생성물에서 RT를 확인하여 상기 핵산의 서열의 적어도 일부를 확인하는 단계를 포함하는,
    핵산을 시퀀싱하기 위한 방법.
  53. 제52항에 있어서,
    (d) RT로부터 제거 가능한 차단 기를 제거하여 3'-OH를 생성시키는 단계; 및
    (e) RT로부터 친화성 시약을 제거하는 단계를 추가로 포함하는,
    방법.
  54. 제53항에 있어서, 단계 (a) 내지 (c)를 1회 이상 반복하는 것을 추가로 포함하고, 상기 핵산 주형의 서열의 적어도 일부가 결정되는 방법.
  55. 제53항에 있어서, 동일 반응에서 제거 가능한 차단 기 및 친화성 시약을 제거하는 것을 포함하는 방법.
  56. 제52항에 있어서, 친화성 시약이 항체인 방법.
  57. 제52항에 있어서, 표지가 형광 표지인 방법.
  58. 제50항 또는 제52항에 있어서, R1이 알릴, 아지도메틸, 아미노알콕실, 2-시아노에틸, 치환된 알킬, 비치환된 알킬, 치환된 알케닐, 비치환된 알케닐, 치환된 알키닐, 비치환된 알키닐, 치환된 헤테로알킬, 비치환된 헤테로알킬, 치환된 헤테로알케닐, 비치환된 헤테로알케닐, 치환된 헤테로알키닐, 비치환된 헤테로알키닐, 알레닐, 시스-시아노에테닐, 트랜스-시아노에테닐, 시스-시아노플루오로에테닐, 트랜스-시아노플루오로에테닐, 시스-트리플루오로메틸에테닐, 트랜스-트리플루오로메틸에테닐, 비스시아노에테닐, 비스플루오로에테닐, 시스-프로페닐, 트랜스-프로페닐, 니트로에테닐, 아세토에테닐, 메틸카르보노에테닐, 아미도에테닐, 메틸설포노에테닐, 메틸설포노에틸, 포름이미데이트, 포름하이드록시메이트, 비닐로에테닐, 에틸레노에테닐, 시아노에틸레닐, 니트로에틸레닐, 아미도에틸레닐, 아미노, 시아노에테닐, 시아노에틸, 알콕시, 아실, 메톡시메틸, 아미녹실, 카르보닐, 니트로벤질, 쿠마리닐, 및 니트로나프탈레닐로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  59. 제1항에 있어서, R2가 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 및 티민(T)로부터 선택되는 핵염기인 방법.
  60. (a) (i) 복수의 주형 DNA 분자를 포함하는 DNA 어레이를 제공하는 단계로서, 각각의 주형 DNA 분자가 핵산의 단편을 포함하고, 상기 복수의 주형 DNA 분자 각각이 어레이의 한 위치에 부착되는, 단계,
    (b) 프라이머가 연장되어 표지되지 않은 RT를 상기 복수의 상기 주형 DNA 분자 중 적어도 일부에 상보적인 서열에 혼입시킴으로써 RT를 포함하는 표지되지 않은 연장 생성물을 생성시키는 조건하에서 DNA 어레이와 상기 주형 DNA 분자 각각의 일부에 상보적인 핵산 프라이머, 중합효소, 및 하기 화학식 I의 표지되지 않은 RT를 접촉시키는 단계:
    Figure pct00031

    화학식 I
    (상기 식에서,
    R1은 3'-O 가역성 차단 기이고;
    R2는 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T), 및 이들의 유사체로부터 선택되는 핵염기이고;
    R3는 하나 이상의 포스페이트로 구성됨);
    (c) 친화성 시약이 RT에 특이적으로 결합하여 RT를 포함하는 표지된 연장 생성물을 생성시키는 조건하에서 표지되지 않은 연장 생성물과 검출 가능한 표지를 포함하는 친화성 시약을 접촉시키는 단계; 및
    (d) 표지된 연장 생성물에서 RT를 확인하여 상기 핵산의 서열의 적어도 일부를 확인하는 단계를 포함하는,
    핵산을 시퀀싱하기 위한 방법.
  61. 제60항에 있어서,
    (a) 프라이머가 연장되어 표지되지 않은 RT를 상기 복수의 상기 주형 DNA 분자 중 적어도 일부에 상보적인 서열에 혼입시킴으로써 RT를 포함하는 표지되지 않은 연장 생성물을 생성시키는 조건하에서 DNA 어레이와 상기 주형 DNA 분자 각각의 일부에 상보적인 핵산 프라이머, 중합효소, 및 R2가 A인 제1 RT, R2가 T인 제2 RT, R2가 C인 제3 RT 및 R2가 G인 제4 RT를 포함하는 화학식 I의 표지되지 않은 RT의 한 세트를 접촉시키는 단계;
    (b) 한 세트의 친화성 시약이 RT에 특이적으로 결합하여 RT를 포함하는 표지된 연장 생성물을 생성시키는 조건하에서 표지되지 않은 연장 생성물과 상기 세트의 친화성 시약을 접촉시키는 단계로서, (i) 상기 세트의 친화성 시약이 제1 RT에 특이적으로 결합하는 제1 친화성 시약, 제2 RT에 특이적으로 결합하는 제2 친화성 시약, 제3 RT에 특이적으로 결합하는 제3 친화성 시약, 및 선택적으로, 제4 RT에 특이적으로 결합하는 제4 친화성 시약을 포함하고, (ii) 상기 제1, 제2, 및 제3 친화성 시약 각각이 검출 가능한 표지를 포함하는, 단계; 및
    (c) 어레이 상의 각각의 위치에서 RT에 결합된 친화성 시약의 표지를 확인함으로써 표지된 연장 생성물 내의 RT를 확인하여 상기 핵산의 서열의 적어도 일부를 확인하는 단계를 포함하는,
    방법.
  62. 복수의 주형 DNA 분자로서, 각각의 DNA 분자가 어레이의 한 위치에 부착된, 복수의 주형 DNA;
    복수의 위치에서 주형 DNA 분자의 일부와 염기쌍을 형성하는 상보성 DNA 서열로서, 상보성 DNA 서열이 이의 3' 말단에 혼입된 제1 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는, 상보성 DNA 서열; 및
    제1 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드 중 적어도 일부에 특이적으로 결합된 제1 친화성 시약을 포함하는,
    DNA 어레이.
  63. 제62항에 있어서, 어레이가 A, T, G 또는 C 핵염기 또는 이들의 유사체를 포함하는 3' 말단 뉴클레오티드를 갖는 프라이머 연장 생성물, 및 프라이머 연장 생성물에 결합된 친화성 시약을 포함하는 DNA 어레이.
  64. (a) 하기 화학식 I의 표지되지 않은 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드:
    Figure pct00032

    화학식 I
    (상기 식에서,
    R1은 3'-O 가역성 차단 기이고;
    R2는 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T), 및 이들의 유사체로부터 선택되는 핵염기이고;
    R3는 하나 이상의 포스페이트로 구성됨);
    (b) 프라이머 연장 생성물의 3' 말단에 혼입되는 경우에 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드에 특이적으로 결합되는 제1 친화성 시약; 및
    (c) (a) 및 (b)에 대한 패키징을 포함하는,
    키트.
  65. 제64항에 있어서,
    복수의 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드로서, 각각의 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드가 상이한 핵염기를 포함하는, 복수의 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드, 및
    복수의 제1 친화성 시약으로서, 각각의 제1 친화성 시약이 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드 중 상이한 하나에 특이적으로 결합하는, 복수의 제1 친화성 시약을 포함하는,
    키트.
  66. 제65항 또는 제66항에 있어서, 이차 친화성 시약을 추가로 포함하는 키트.
  67. 제64항 또는 제65항에 있어서, 제1 친화성 시약이 검출 가능하게 표지되고, 서로 구별될 수 있는 키트.
  68. 제64항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 친화성 시약(들)이 항체인 키트.
  69. (i) 제1 자연 발생 핵염기 또는 이의 유사체를 포함하는 제1 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드에 결합하는 제1 친화성 시약 및 (ii) 제2 자연 발생 핵염기 또는 이의 유사체를 포함하는 제2 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드에 결합하는 제1 친화성 시약을 포함하는 키트로서, 제1 및 제2 핵염기가 상이한, 키트.
  70. 제69항에 있어서, (iii) 제3 자연 발생 핵염기 또는 이의 유사체를 포함하는 제3 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드에 결합하는 제1 친화성 시약을 포함하고, 제1, 제2 및 제3 핵염기가 서로 상이한, 키트.
  71. 제70항에 있어서, (iv) 제4 자연 발생 핵염기 또는 이의 유사체를 포함하는 제4 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드에 결합하는 제1 친화성 시약을 포함하고, 제1, 제2, 제3 및 제4 핵염기가 서로 상이한, 키트.
  72. 제69항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 가역성 종료자 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 키트.
  73. 제61항에 있어서, 상기 제1, 제2, 제3 및 제4 친화성 시약 각각이 검출 가능한 표지를 포함하는 방법.
  74. 제61항에 있어서, 상기 제1, 제2 및 제3 친화성 시약 각각이 상이한 검출 가능한 표지를 포함하는 방법.
  75. 제61항에 있어서, 상기 제1, 제2 및 제3 친화성 시약 각각이 상이한 양 또는 강도로 동일 표지를 포함하는 방법.
  76. 제22항에 있어서,
    (i) 친화성 시약을 제거하는 단계;
    (ii) 상이한 세트의 친화성 시약을 이용하여 단계 (c) 내지 (e)를 반복하는 단계의 추가 단계를 포함하는,
    방법.
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Families Citing this family (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102349259B1 (ko) 2017-01-04 2022-01-07 엠쥐아이 테크 컴퍼니 엘티디. 친화성 시약을 이용한 핵산 시퀀싱
WO2019067635A1 (en) 2017-09-27 2019-04-04 Ultima Genomics, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING
CA3118607A1 (en) * 2018-11-07 2020-05-14 Egi Tech (Shen Zhen) Co, Limited Method for sequencing polynucleotides
CN113272448B (zh) * 2018-11-09 2025-02-07 深圳华大智造科技股份有限公司 使用未标记的核苷酸进行大规模平行测序
KR102618147B1 (ko) * 2018-12-05 2023-12-27 이지아이 테크 (센젠) 컴퍼니 리미티드 회전환 증폭 방법, 시퀀싱 라이브러리 제조 방법 및 제조된 dna 나노스피어
US11293061B2 (en) 2018-12-26 2022-04-05 Illumina Cambridge Limited Sequencing methods using nucleotides with 3′ AOM blocking group
EP3702474A1 (en) * 2019-02-26 2020-09-02 QIAGEN GmbH Sequencing method and kit
CA3139169A1 (en) * 2019-05-15 2020-11-19 Egi Tech (Shen Zhen) Co., Limited Single-channel sequencing method based on self-luminescence
WO2021023252A1 (en) 2019-08-07 2021-02-11 Bgi Shenzhen Co., Ltd. Acridinium ester-containing compounds and methods of using the same for chemiluminescence-based one-color sequencing
AU2020407967A1 (en) * 2019-12-16 2021-09-23 Illumina Cambridge Limited Kits and flow cells
KR20220111315A (ko) * 2019-12-18 2022-08-09 에프. 호프만-라 로슈 아게 연속 표지화 방식을 사용하는 합성에 의한 시퀀싱 방법
US20210189483A1 (en) 2019-12-23 2021-06-24 Mgi Tech Co. Ltd. Controlled strand-displacement for paired end sequencing
US12110548B2 (en) 2020-02-03 2024-10-08 10X Genomics, Inc. Bi-directional in situ analysis
CN115427586B (zh) 2020-03-18 2025-03-28 深圳华大智造科技股份有限公司 大规模平行测序中的恢复阶段
US11761040B2 (en) 2020-04-20 2023-09-19 Mgi Tech Co., Ltd. DNA protection agent in DNA imaging buffer
US20230235379A1 (en) 2020-04-30 2023-07-27 Dimensiongen Devices and methods for macromolecular manipulation
US11787831B2 (en) 2020-06-22 2023-10-17 Illumina Cambridge Limited Nucleosides and nucleotides with 3′ acetal blocking group
US11981964B2 (en) 2020-07-28 2024-05-14 Illumina Cambridge Limited Substituted coumarin dyes and uses as fluorescent labels
EP4225933A4 (en) * 2020-10-09 2024-11-27 BGI Shenzhen Co., Limited METHODS AND COMPOSITIONS FOR BIOLUMINESCENCE-BASED SEQUENCING
CN116438446A (zh) * 2020-10-12 2023-07-14 深圳华大智造科技股份有限公司 使用核苷标记进行蛋白质检测和追踪
GB2599729A (en) * 2020-10-12 2022-04-13 Sumitomo Chemical Co Method comprising light emitting marker
KR20230107259A (ko) 2020-10-21 2023-07-14 비지아이 션전 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드
US20220195196A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 Illumina Cambridge Limited Alkylpyridinium coumarin dyes and uses in sequencing applications
US20220195516A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 Illumina Cambridge Limited Methods, systems and compositions for nucleic acid sequencing
US20220195517A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 Illumina Cambridge Limited Long stokes shift chromenoquinoline dyes and uses in sequencing applications
US20220195518A1 (en) * 2020-12-22 2022-06-23 Illumina Cambridge Limited Methods and compositions for nucleic acid sequencing
WO2022197589A1 (en) 2021-03-15 2022-09-22 President And Fellows Of Harvard College Methods for in situ sequencing
EP4317168A1 (en) 2021-04-01 2024-02-07 BGI Shenzhen Nucleotide analogue for sequencing
EP4334327A1 (en) 2021-05-05 2024-03-13 Illumina Cambridge Limited Fluorescent dyes containing bis-boron fused heterocycles and uses in sequencing
CN113372402A (zh) * 2021-06-15 2021-09-10 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 3’-o-可逆封闭的核苷酸及其在无模板酶促核酸合成中的应用
CA3222829A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Gabriele CANZI Methods for metal directed cleavage of surface-bound polynucleotides
WO2023122499A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Illumina Cambridge Limited Periodate compositions and methods for chemical cleavage of surface-bound polynucleotides
WO2023122491A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Illumina Cambridge Limited Periodate compositions and methods for chemical cleavage of surface-bound polynucleotides
WO2023186819A1 (en) 2022-03-29 2023-10-05 Illumina Cambridge Limited Chromenoquinoline dyes and uses in sequencing
AU2023246691A1 (en) 2022-03-30 2024-01-18 Illumina, Inc. Methods for chemical cleavage of surface-bound polynucleotides
EP4499659A1 (en) * 2022-03-31 2025-02-05 Illumina, Inc. Nucleosides and nucleotides with 3' vinyl blocking group useful in sequencing by synthesis
EP4499870A1 (en) 2022-03-31 2025-02-05 Illumina, Inc. Compositions and methods for improving sequencing signals
CN119213143A (zh) 2022-05-11 2024-12-27 10X基因组学有限公司 用于原位测序的组合物和方法
US20230416279A1 (en) 2022-06-28 2023-12-28 Illumina Cambridge Limited Fluorescent dyes containing fused tetracyclic bis-boron heterocycle and uses in sequencing
AU2022477524A1 (en) 2022-09-09 2025-04-10 Bgi Shenzhen Use of heteroaromatic ring compounds in nucleic acid detection
WO2024067674A1 (zh) 2022-09-28 2024-04-04 深圳华大智造科技股份有限公司 测序方法
US20240140939A1 (en) 2022-09-30 2024-05-02 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for reducing photo damage during sequencing
US20240240217A1 (en) 2022-12-09 2024-07-18 Illumina, Inc. Nucleosides and nucleotides with 3' blocking groups and cleavable linkers
US20240229131A1 (en) 2022-12-22 2024-07-11 Illumina, Inc. Transition-metal catalyst compositions and methods for sequencing by synthesis
US20240247311A1 (en) 2022-12-22 2024-07-25 Illumina, Inc. Palladium catalyst compositions and methods for sequencing by synthesis
AU2023419253A1 (en) 2022-12-27 2024-10-03 Illumina, Inc. Methods of sequencing using 3´ allyl blocked nucleotides
WO2024206407A2 (en) 2023-03-29 2024-10-03 Illumina, Inc. Naphthalimide dyes and uses in nucleic acid sequencing
WO2024206394A1 (en) 2023-03-30 2024-10-03 Illumina, Inc. Compositions and methods for nucleic acid sequencing
WO2024216163A1 (en) * 2023-04-13 2024-10-17 Esbiolab Llc Methods and compositions for nucleic acid sequencing using predominantly unlabeled nucleotides
CN119061122A (zh) * 2023-05-30 2024-12-03 深圳市真迈生物科技有限公司 单分子测序方法
CN116536399A (zh) * 2023-07-07 2023-08-04 之江实验室 一种基于微珠测序的基因芯片编解码方法及基因芯片
WO2025090596A1 (en) 2023-10-26 2025-05-01 Illumina, Inc. 4,5-substituted naphthalimide dyes and uses in nucleic acid sequencing
US20250215493A1 (en) 2023-12-28 2025-07-03 Illumina, Inc. Nucleotides with enzymatically cleavable 3'-o-glycoside blocking groups for sequencing
WO2025144711A1 (en) 2023-12-29 2025-07-03 Illumina, Inc. Tricyclic polymethine dyes for nucleic acid sequencing
CN118496347B (zh) * 2024-05-30 2024-10-25 北京航空航天大学杭州创新研究院 一种用于抗体寡核苷酸偶联的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030124560A1 (en) * 2001-06-14 2003-07-03 Yoshihiko Makino Method for analyzing a target nucleic acid fragment and a kit for analyzing a target nucleic acid fragment
WO2004070005A2 (en) * 2003-01-29 2004-08-19 454 Corporation Double ended sequencing
WO2004074503A2 (en) * 2003-02-21 2004-09-02 Hoser Mark J Nucleic acid sequencing methods, kits and reagents

Family Cites Families (86)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2713102A (en) 1952-06-25 1955-07-12 Railroad Accessories Corp Test terminal
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4351760A (en) 1979-09-07 1982-09-28 Syva Company Novel alkyl substituted fluorescent compounds and polyamino acid conjugates
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
CA2020958C (en) 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
US5053336A (en) * 1989-07-17 1991-10-01 Regents Of The University Of California Monoclonal antibodies for the separate detection of halodeoxyuridines and method for their use
US5188934A (en) 1989-11-14 1993-02-23 Applied Biosystems, Inc. 4,7-dichlorofluorescein dyes as molecular probes
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US6401267B1 (en) 1993-09-27 2002-06-11 Radoje Drmanac Methods and compositions for efficient nucleic acid sequencing
US6232465B1 (en) 1994-09-02 2001-05-15 Andrew C. Hiatt Compositions for enzyme catalyzed template-independent creation of phosphodiester bonds using protected nucleotides
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
ES2326050T5 (es) 1996-06-04 2012-04-26 University Of Utah Research Foundation Monitorización de la hibridación durante la PCR
GB9620209D0 (en) 1996-09-27 1996-11-13 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
GB9626815D0 (en) 1996-12-23 1997-02-12 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
US6969488B2 (en) 1998-05-22 2005-11-29 Solexa, Inc. System and apparatus for sequential processing of analytes
AU737174B2 (en) 1997-10-10 2001-08-09 President & Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
US6743605B1 (en) 1998-06-24 2004-06-01 Enzo Life Sciences, Inc. Linear amplification of specific nucleic acid sequences
US20030022207A1 (en) 1998-10-16 2003-01-30 Solexa, Ltd. Arrayed polynucleotides and their use in genome analysis
US6787308B2 (en) 1998-07-30 2004-09-07 Solexa Ltd. Arrayed biomolecules and their use in sequencing
US6287824B1 (en) 1998-09-15 2001-09-11 Yale University Molecular cloning using rolling circle amplification
AR021833A1 (es) 1998-09-30 2002-08-07 Applied Research Systems Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico
GB9901475D0 (en) 1999-01-22 1999-03-17 Pyrosequencing Ab A method of DNA sequencing
US20050244870A1 (en) 1999-04-20 2005-11-03 Illumina, Inc. Nucleic acid sequencing using microsphere arrays
CA2374596A1 (en) 1999-05-20 2000-11-30 Illumina, Inc. Method and apparatus for retaining and presenting at least one microsphere array to solutions and/or to optical imaging systems
US6544732B1 (en) 1999-05-20 2003-04-08 Illumina, Inc. Encoding and decoding of array sensors utilizing nanocrystals
US6818395B1 (en) 1999-06-28 2004-11-16 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences
US7244559B2 (en) 1999-09-16 2007-07-17 454 Life Sciences Corporation Method of sequencing a nucleic acid
US6274320B1 (en) 1999-09-16 2001-08-14 Curagen Corporation Method of sequencing a nucleic acid
WO2001023610A2 (en) 1999-09-29 2001-04-05 Solexa Ltd. Polynucleotide sequencing
JP2001245698A (ja) * 1999-11-22 2001-09-11 Xiao Bing Wang 核酸検出法
GB0002389D0 (en) 2000-02-02 2000-03-22 Solexa Ltd Molecular arrays
JP3852555B2 (ja) 2000-09-01 2006-11-29 三菱電機株式会社 熱制御装置、宇宙機および熱制御方法
US6897023B2 (en) 2000-09-27 2005-05-24 The Molecular Sciences Institute, Inc. Method for determining relative abundance of nucleic acid sequences
DE20122767U1 (de) 2000-10-06 2007-08-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Massives Parallelverfahren zur Dekodierung von DNA und RNA
GB0105831D0 (en) * 2001-03-09 2001-04-25 Toumaz Technology Ltd Method for dna sequencing utilising enzyme linked field effect transistors
CN100379879C (zh) 2001-06-14 2008-04-09 卡维迪技术有限公司 用于测量dna聚合作用的方法及其应用
EP1412752B1 (en) 2001-06-29 2011-06-22 VERI-Q, Inc. Methods and compositions for determining the purity of and purifying chemically synthesized nucleic acids
FR2836995B1 (fr) * 2002-03-05 2006-09-22 Centre Nat Rech Scient Utilisation de derives de nucleosides comportant un groupement citrate pour la production d'anticorps ayant une affinite pour des nucleosides triphosphorylees et leurs applications
US7595883B1 (en) 2002-09-16 2009-09-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biological analysis arrangement and approach therefor
EP1601791B1 (en) 2003-02-26 2016-10-05 Complete Genomics Inc. Random array dna analysis by hybridization
GB0321306D0 (en) 2003-09-11 2003-10-15 Solexa Ltd Modified polymerases for improved incorporation of nucleotide analogues
CA2557841A1 (en) 2004-02-27 2005-09-09 President And Fellows Of Harvard College Polony fluorescent in situ sequencing beads
US20060024711A1 (en) 2004-07-02 2006-02-02 Helicos Biosciences Corporation Methods for nucleic acid amplification and sequence determination
WO2006073504A2 (en) 2004-08-04 2006-07-13 President And Fellows Of Harvard College Wobble sequencing
JP4990886B2 (ja) 2005-05-10 2012-08-01 ソレックサ リミテッド 改良ポリメラーゼ
EP1904529B1 (en) 2005-06-10 2010-08-11 Medical Research Council Use of stefin a as a scaffold protein
EP3257949A1 (en) 2005-06-15 2017-12-20 Complete Genomics Inc. Nucleic acid analysis by random mixtures of non-overlapping fragments
WO2007133831A2 (en) 2006-02-24 2007-11-22 Callida Genomics, Inc. High throughput genome sequencing on dna arrays
US7960104B2 (en) 2005-10-07 2011-06-14 Callida Genomics, Inc. Self-assembled single molecule arrays and uses thereof
WO2007120208A2 (en) 2005-11-14 2007-10-25 President And Fellows Of Harvard College Nanogrid rolling circle dna sequencing
SG10201405158QA (en) 2006-02-24 2014-10-30 Callida Genomics Inc High throughput genome sequencing on dna arrays
US20100311602A1 (en) 2006-10-13 2010-12-09 J. Craig Venter Institute, Inc. Sequencing method
WO2008070352A2 (en) 2006-10-27 2008-06-12 Complete Genomics, Inc. Efficient arrays of amplified polynucleotides
US8262900B2 (en) 2006-12-14 2012-09-11 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
GB2457851B (en) 2006-12-14 2011-01-05 Ion Torrent Systems Inc Methods and apparatus for measuring analytes using large scale fet arrays
US8349167B2 (en) 2006-12-14 2013-01-08 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for detecting molecular interactions using FET arrays
US7897344B2 (en) 2007-11-06 2011-03-01 Complete Genomics, Inc. Methods and oligonucleotide designs for insertion of multiple adaptors into library constructs
US8518640B2 (en) 2007-10-29 2013-08-27 Complete Genomics, Inc. Nucleic acid sequencing and process
US8415099B2 (en) 2007-11-05 2013-04-09 Complete Genomics, Inc. Efficient base determination in sequencing reactions
WO2009061840A1 (en) 2007-11-05 2009-05-14 Complete Genomics, Inc. Methods and oligonucleotide designs for insertion of multiple adaptors employing selective methylation
WO2009073629A2 (en) 2007-11-29 2009-06-11 Complete Genomics, Inc. Efficient shotgun sequencing methods
WO2009097368A2 (en) 2008-01-28 2009-08-06 Complete Genomics, Inc. Methods and compositions for efficient base calling in sequencing reactions
US8236499B2 (en) 2008-03-28 2012-08-07 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and compositions for nucleic acid sample preparation
GB0807065D0 (en) 2008-04-18 2008-05-21 Univ Leeds Novel scaffolds
WO2009140541A2 (en) * 2008-05-16 2009-11-19 Life Technologies Corporation Dual labeling methods for measuring cellular proliferation
US20100137143A1 (en) 2008-10-22 2010-06-03 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
WO2010075188A2 (en) 2008-12-23 2010-07-01 Illumina Inc. Multibase delivery for long reads in sequencing by synthesis protocols
US20140228223A1 (en) 2010-05-10 2014-08-14 Andreas Gnirke High throughput paired-end sequencing of large-insert clone libraries
US9005565B2 (en) 2010-06-24 2015-04-14 Hamid-Reza Jahangiri-Famenini Method and apparatus for forming graphene
WO2012027623A2 (en) 2010-08-25 2012-03-01 Pacific Biosciences Of California, Inc. Cyanine dyes
EP2768972B2 (en) * 2011-09-23 2020-07-22 Illumina, Inc. Methods and compositions for nucleic acid sequencing
US8671811B2 (en) 2011-09-30 2014-03-18 Robert Bosch Gmbh Pivoting saw system
GB201301178D0 (en) * 2013-01-23 2013-03-06 Dynamic Biosensors Gmbh Method for sequencing a template nucleic acid immobilized on a substrate
US9650406B2 (en) * 2013-02-28 2017-05-16 Centrillion Technology Holdings Corporation Reversible terminator molecules and methods of their use
US9944924B2 (en) 2014-01-16 2018-04-17 Illumina, Inc. Polynucleotide modification on solid support
CN107074904B (zh) 2014-10-23 2022-12-23 深圳华大智造科技股份有限公司 信号约束测序(scs)和用于信号约束测序的核苷酸类似物
CN104448001A (zh) 2014-11-14 2015-03-25 杭州博谱医药科技有限公司 抗5-甲基-胞嘧啶单克隆抗体及其应用
US10227647B2 (en) 2015-02-17 2019-03-12 Complete Genomics, Inc. DNA sequencing using controlled strand displacement
CN105001292A (zh) * 2015-07-14 2015-10-28 深圳市瀚海基因生物科技有限公司 一种光可断裂的荧光标记可逆终端化合物及其在dna或rna测序中的用途
US20170240961A1 (en) 2016-02-23 2017-08-24 Complete Genomics, Inc. Affinity tag labeled nucleosides and uses
CN109790196B (zh) 2016-04-22 2022-09-27 深圳华大智造科技股份有限公司 可逆封闭的核苷类似物及其用途
CA3033741A1 (en) 2016-08-15 2018-02-22 Omniome, Inc. Method and system for sequencing nucleic acids
KR102349259B1 (ko) 2017-01-04 2022-01-07 엠쥐아이 테크 컴퍼니 엘티디. 친화성 시약을 이용한 핵산 시퀀싱

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030124560A1 (en) * 2001-06-14 2003-07-03 Yoshihiko Makino Method for analyzing a target nucleic acid fragment and a kit for analyzing a target nucleic acid fragment
WO2004070005A2 (en) * 2003-01-29 2004-08-19 454 Corporation Double ended sequencing
EP2159285A2 (en) * 2003-01-29 2010-03-03 454 Life Sciences Corporation Methods of amplifying and sequencing nucleic acids
WO2004074503A2 (en) * 2003-02-21 2004-09-02 Hoser Mark J Nucleic acid sequencing methods, kits and reagents

Also Published As

Publication number Publication date
AU2023201547A1 (en) 2023-04-13
WO2018129214A1 (en) 2018-07-12
HUE059673T2 (hu) 2022-12-28
PT3565905T (pt) 2022-08-02
US10851410B2 (en) 2020-12-01
BR112019013715B1 (pt) 2021-08-24
EP3565905A1 (en) 2019-11-13
BR112019013715A2 (pt) 2020-03-03
JP2020508037A (ja) 2020-03-19
EP4112741A1 (en) 2023-01-04
AU2018205472B2 (en) 2022-12-15
FI4112741T3 (fi) 2025-05-15
RS66810B1 (sr) 2025-06-30
JP7025595B1 (ja) 2022-02-24
US11788138B2 (en) 2023-10-17
AU2018205472A1 (en) 2019-07-25
MX2024006412A (es) 2024-06-05
ES3026859T3 (en) 2025-06-12
PL3565905T3 (pl) 2022-09-26
ES2924223T3 (es) 2022-10-05
EP4112741B1 (en) 2025-02-26
CN110418847A (zh) 2019-11-05
EP3565905A4 (en) 2020-11-04
KR102349259B1 (ko) 2022-01-07
CN110418847B (zh) 2025-04-18
EP3565905B1 (en) 2022-05-25
IL267836B2 (en) 2023-09-01
EP4575499A3 (en) 2025-07-09
IL267836B1 (en) 2023-05-01
CA3048486A1 (en) 2018-07-12
RS63419B1 (sr) 2022-08-31
MX2019008016A (es) 2019-10-15
IL267836A (en) 2019-09-26
JP2022046677A (ja) 2022-03-23
US20240117425A1 (en) 2024-04-11
DK3565905T3 (da) 2022-07-25
US20210254150A1 (en) 2021-08-19
PT4112741T (pt) 2025-05-05
PL4112741T3 (pl) 2025-06-16
KR102349259B9 (ko) 2022-07-20
US20180223358A1 (en) 2018-08-09
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