KR20190090827A

KR20190090827A - 키메라 응고 인자를 사용해 혈우병성 관절증을 치료하는 방법

Info

Publication number: KR20190090827A
Application number: KR1020197018602A
Authority: KR
Inventors: 제니퍼 듀몬트; 니샤 자인; 데시루 글라체브룩
Original assignee: 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크.
Priority date: 2016-12-02
Filing date: 2017-12-01
Publication date: 2019-08-02
Also published as: IL266972B2; BR112019011115A2; IL266972A; JP2020500874A; MX2019006444A; MA46967A; JP2023027301A; WO2018102743A1; CA3045660A1; EP3548066A1; IL266972B1; NZ754971A; US12161696B2; TWI777994B; AU2017366709A1; AU2024278509A1; CN110520150A; TW201827072A; IL308416A; US20190381149A1

Abstract

본 개시는 혈우병에 걸린 인간에서 관절의 가역적 혈우병성 관절증을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 키메라 단백질 또는 조성물의 유효량을 인간에게 투여하는 단계를 포함한다.

Description

키메라 응고 인자를 사용해 혈우병성 관절증을 치료하는 방법

관련 출원에 관한 상호 참조

본 출원은 2016년 12월 2일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/429,509호, 2017년 7월 7일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/529,896호, 2017년 8월 25일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/550,488호, 및 2017년 9월 14일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/558,793호의 이익을 주장하며, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.

본 개시는 일반적으로 혈액응고 장애의 치료법에 관한 것이다.

X-연관 출혈 장애인 혈우병은 응고 단백질을 암호화하는 유전자의 돌연변이 및/또는 결실에 의해 야기되는데, 구체적으로는 인자 VIII(FVIII) 유전자의 돌연변이 및/또는 결실에 의해 FVIII 활성이 결핍되거나(A형 혈우병), 인자 IX 유전자의 돌연변이 및/또는 결실에 의해 FIX 활성이 결핍된다(B형 혈우병) (예를 들어, Peyvandi, F. 등의 Haemophilia 12:82-89 (2006) 참조). 이러한 장애는 자발적 출혈(spontaneous hemorrhage) 및 외상 후 과다 출혈을 특징으로 한다. 혈우병의 치료는 FVIII 및/또는 FIX 활성의 복구를 표적으로 하는 치환 요법에 의해 자발적 출혈을 예방하는 것이다(예를 들어, Mannucci, P.M., 등의 N. Engl. J. Med. 344:1773-1779(2001) 참조).

유아기에 시작되기도 하는 근육 및 관절 내로의 반복성 출혈은 혈우병성 관절증 및 관절 손상을 초래한다. 혈우병성 관절증(hemophilic arthropathy)은 혈우병과 관련이 있는 흔하고 심각한 합병증으로서 종종 고통, 기형, 및 장애를 유발한다. 혈우병성 관절증으로 고통받는 가장 흔한 환자는 3세에서 15세 사이의 젊은 남성이다. 혈우병성 관절증에 걸릴 가능성이 가장 높은 관절은 무릎이지만, 팔꿈치, 손목, 어깨, 및 척추에도 존재할 수 있다. 혈우병성 관절증은 비가역적인 것으로 알려져 있다. 따라서, 혈우병성 관절증에 대한 현재 이용 가능한 치료법이 한정되어 있다.

이에 따라, 혈우병성 관절증의 새로운 치료 방식을 개발할 필요가 있다.

본 개시의 일 양태는 혈우병에 걸린 인간에서 관절의 가역적 혈우병성 관절증을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 키메라 단백질 또는 키메라 단백질을 포함하는 조성물의 유효량을 인간에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 가역적 혈우병성 관절증은 활액막염(synovitis)을 포함한다. 특정 구현예에서, 가역적 혈우병성 관절증은 미세출혈(microbleed) 또는 무증상 출혈(sub-clinical bleed)을 포함한다.

본 개시의 또 다른 양태는 혈우병에 걸린 인간에서 활액막염을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 키메라 단백질 또는 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 조성물의 유효량을 인간에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 활액막염은 혈우병성 관절증과 관련이 있다.

본 개시의 또 다른 양태는 혈우병에 걸린 인간에서 관절 내 혈관 변형의 발생을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 키메라 단백질의 유효량을 인간에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시의 또 다른 양태는 혈우병에 걸린 인간의 혈관 변형에 대한 예방적 치료를 제공하며, 상기 방법은 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 키메라 단백질 또는 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 조성물의 유효량을 인간에게 투여하는 단계를 포함한다.

본 개시의 또 다른 양태는 혈우병에 걸린 인간의 관절 주변 연조직을 개선하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 키메라 단백질 또는 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 조성물의 유효량을 인간에게 투여하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 투여는 인간에서 관절 건강 점수(HJHS)를 개선한다. 일부 구현예에서, 투여는 인간에서 관절 동통(joint pain)을 감소시킨다.

특정 구현예에서, Fc 영역은 저 친화도 면역글로불린 감마 Fc 영역 수용체 II-b(FcγRIIB)에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 수지상 세포-특이적 세포간 접착 분자-3-그래빙 넌-인테그린(dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin, DC-SIGN)에 특이적으로 결합한다.

일부 양태에서, 상기 방법은 치료를 요하는 인간을 식별하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 식별하는 단계는 영상 시스템(imaging system)을 사용하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 영상 시스템은 방사선 촬영, 자기 공명 영상, 초음파영상, 파워 도플러 초음파영상, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간은 관절 염증과 관련된 하나 이상의 바이오마커를 발현한다.

일부 양태에서, 응고 인자는 인자 VII (FVII), 인자 VIIa (FVIIa), 인자 VIII (FVIII), 인자 IX (FIX), 인자 X (FX), 폰 빌레브란트 인자 (VWF), FIX 및 FX에 특이적으로 결합하는 이들의 항원 결합 부분, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 키메라 단백질은 FVIII-Fc를 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 단백질은 FIX-Fc를 포함한다. 일 구현예에서, 키메라 단백질은 인자 VIII 부분 및 VWF 부분을 포함하되, FVIII 부분은 FVIII 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하고, VWF 부분은 VWF 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하고, FVIII 부분은 제1 Fc 영역에 연결되고, VWF 부분은 제2 Fc 영역에 연결되며, 제1 Fc 영역과 제2 Fc 영역은 서로 결합된다.

일부 구현예에서, 키메라 단백질은 반감기 연장 모이어티를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 반감기 연장 모이어티는 알부민 또는 이의 단편, 알부민 결합 모이어티, PAS 서열, HAP 서열, 트랜스페린 또는 이의 단편, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리시알산, 히드록시에틸 전분(HES), 이들의 유도체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

일부 양태에서, FVIII 및 Fc 영역을 포함하는 조성물, 예를 들어, 키메라 단백질의 유효량은 약 20 IU/kg 내지 약 300 IU/kg이다. 일부 구현예에서, FVII-Fc를 포함하는 키메라 단백질은 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일, 약 16일, 약 17일, 약 18일, 약 19일, 약 20일, 약 21일, 약 22일, 약 23일, 또는 약 24일의 투여 간격으로 투여된다.

다른 양태에서, FIX-Fc를 포함하는 키메라 단백질의 유효량은 약 20 IU/kg 내지 약 100 IU/kg이다. 일부 구현예에서, FIX-Fc를 포함하는 키메라 단백질은 약 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 또는 28일의 투여 간격으로 투여된다.

하나의 특정한 구현예에서, 키메라 단백질은 FVIII 부분, VWF 부분, 제1 Fc 영역, 및 제2 Fc 영역을 포함하되; FVIII 부분은 FVIII 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하고; VWF 부분은 VWF 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하고; FVIII 부분은 제1 Fc 영역에 연결되고; VWF 부분은 제2 Fc 영역에 연결되며; 제1 Fc 영역과 제2 Fc 영역은 서로 결합된다.

구현예

E1. 혈우병에 걸린 인간에서 관절의 가역적 혈우병성 관절증을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 키메라 단백질의 유효량을 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.

E2. E1에 있어서, 가역적 혈우병성 관절증은 활액막염을 포함하는, 방법.

E3. E1 또는 E2에 있어서, 가역적 혈우병성 관절증은 미세출혈을 포함하는, 방법.

E4. 혈우병에 걸린 인간에서 활액막염을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 키메라 단백질의 유효량을 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.

E5. E4에 있어서, 활액막염은 혈우병성 관절증과 관련이 있는, 방법.

E6. 혈우병에 걸린 인간에서 관절 내 혈관 변형의 발생을 예방하거나 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 키메라 단백질의 유효량을 인간에게 투여하는 단계를 포함한다.

E7. 혈우병에 걸린 인간에서 관절의 주변 연조직을 개선하는 방법으로서, 상기 방법은 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 키메라 단백질의 유효량을 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.

E8. E1 내지 E7 중 어느 하나에 있어서, 투여는 인간에서 관절 건강 점수(HJHS)를 개선하는, 방법.

E9. E8에 있어서, 관절 건강 점수는 관절 총 점수(joint totals)와 전체 보행 점수(global gait score)를 합한 것인, 방법.

E10. E9에 있어서, 관절 총 점수는 부기(swelling), 부기 지속기간, 근위축(muscle atrophy), 활동 시 염발음(crepitus on motion), 굴곡 상실(flexion loss), 신전 상실(extension loss), 관절 동통(joint pain), 및 지구력(strength)에 기초하여 측정되는, 방법.

E11. E9에 있어서, 전체 보행 점수는 걷기(walking), 계단 오르기(stairs), 달리기(running), 또는 한 발로 뛰기(hopping on one leg)에 기초하여 측정되는, 방법.

E12. E1 내지 E11 중 어느 하나에 있어서, 투여는 인간에서 관절 동통을 감소시키는, 방법.

E13. E1 내지 E12 중 어느 하나에 있어서, 관절은 한쪽 또는 양쪽 팔꿈치, 한쪽 또는 양쪽 무릎, 한쪽 또는 양쪽 발목, 한쪽 또는 양쪽 어깨, 한쪽 또는 양쪽 고관절, 한쪽 또는 양쪽 손목, 하나 이상의 손 관절, 하나 이상의 발 관절, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.

E14. E1 내지 E13 중 어느 하나에 있어서, 관절은 팔꿈치인, 방법.

E15. E1 내지 E13 중 어느 하나에 있어서, 관절은 무릎인, 방법.

E16. E1 내지 E13 중 어느 하나에 있어서, 관절은 발목인, 방법.

E17. E1 내지 E16 중 어느 하나에 있어서, Fc 영역은 저 친화도 면역글로불린 감마 Fc 영역 수용체 II-b(FcγRIIB)에 특이적으로 결합하는, 방법.

E18. E1 내지 E17 중 어느 하나에 있어서, Fc 영역은 수지상 세포-특이적 세포간 접착 분자-3-그래빙 넌-인테그린(DC-SIGN)에 특이적으로 결합하는, 방법.

E19. E1 내지 E18 중 어느 하나에 있어서, 치료를 요하는 인간을 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.

E20. E19에 있어서, 식별하는 단계는 영상 시스템을 이용하는 것을 포함하는, 방법.

E21. E20에 있어서, 영상 시스템은 방사선 촬영, 자기 공명 영상, 초음파영상, 파워 도플러 초음파영상, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.

E22. E21에 있어서, 인간은 관절 염증과 관련된 하나 이상의 바이오마커를 발현하는, 방법.

E23. E1 내지 E22 중 어느 하나에 있어서, 응고 인자는 인자 VII (FVII), 인자 VIIa (FVIIa), 인자 VIII (FVIII), 인자 IX (FIX), 인자 X (FX), 폰 빌레브란트 인자 (VWF), FIX 및 FX에 특이적으로 결합하는 이들의 항원 결합 부분, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.

E24. E1 내지 E23 중 어느 하나에 있어서, 키메라 단백질은 FVIII-Fc를 포함하는, 방법.

E25. E1 내지 E23 중 어느 하나에 있어서, 키메라 단백질은 FIX-Fc를 포함하는, 방법.

E26. E1 내지 E24 중 어느 하나에 있어서, 키메라 단백질은 인자 VIII 부분 및 VWF 부분을 포함하되, FVIII 부분은 FVIII 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하고, VWF 부분은 VWF 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하고, FVIII 부분은 제1 Fc 영역에 연결되고, VWF 부분은 제2 Fc 영역에 연결되며, 제1 Fc 영역과 제2 Fc 영역은 서로 결합되는, 방법.

E27. E23, E24, 및 E26 중 어느 하나에 있어서, FVIII 폴리펩티드는 전장 성숙 FVIII를 포함하는, 방법.

E28. E23, E24 및 E26 중 어느 하나에 있어서, FVIII 폴리펩티드는 B 도메인이 결실된 FVIII를 포함하는, 방법.

E29. E28에 있어서, B 도메인이 결실된 FVIII는 FVIII의 B 도메인의 전부 또는 일부의 결실을 포함하는, 방법.

E30. E28 또는 E29에 있어서, B 도메인이 결실된 FVIII는 성숙 FVIII의 아미노산 잔기 746 내지 1648의 결실을 포함하는, 방법.

E31. E23, E24, 및 E25 내지 E30 중 어느 하나에 있어서, VWF 폴리펩티드는 VWF의 D’ 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편을 추가로 포함하는, 방법.

E32. E1 내지 E31 중 어느 하나에 있어서, 키메라 단백질은 반감기 연장 모이어티를 포함하는, 방법.

E33. E32에 있어서, 반감기 연장 모이어티는 알부민 또는 이의 단편, 알부민 결합 모이어티, PAS 서열, HAP 서열, 트랜스페린 또는 이의 단편, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리시알산, 히드록시에틸 전분(HES), 이들의 유도체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.

E34. E32 또는 E33에 있어서, 반감기 연장 모이어티는 응고 인자 내에 삽입되는, 방법.

E35. E32 또는 E33에 있어서, 반감기 연장 모이어티는 응고 인자와 Fc 영역 사이에 삽입되는, 방법.

E36. E24, 및 E26 내지 E35 중 어느 하나에 있어서, FVIII 및 Fc 영역을 포함하는 키메라 단백질의 유효량은 약 20 IU/kg 내지 약 300 IU/kg인, 방법.

E37. E36에 있어서, FVIII-Fc를 포함하는 키메라 단백질의 유효량은 약 20 IU/kg 내지 약 275 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 250 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 200 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 175 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 150 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 125 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 90 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 80 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 70 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 60 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 50 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 40 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 30 IU/kg, 약 30 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 40 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 50 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 60 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 70 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 80 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 90 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 100 IU/kg 내지 약 200 IU/kg, 약 150 IU/kg 내지 약 200 IU/kg, 약 200 IU/kg 내지 약 300 IU/kg, 약 225 IU/kg 내지 약 300 IU/kg, 약 250 IU/kg 내지 약 300 IU/kg, 약 275 IU/kg 내지 약 300 IU/kg, 또는 약 25 IU/kg 내지 약 75 IU/kg인, 방법.

E38. E36 또는 E37에 있어서, FVIII-Fc를 포함하는 키메라 단백질의 유효량은 약 25 IU/kg 내지 약 65 IU/kg인, 방법.

E39. E24, 및 E26 내지 E38 중 어느 하나에 있어서, FVIII-Fc를 포함하는 키메라 단백질은 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일, 약 16일, 약 17일, 약 18일, 약 19일, 약 20일, 약 21일, 약 22일, 약 23일, 또는 약 24일의 투여 간격으로 투여되는, 방법.

E40. E24, 및 E26 내지 E38 중 어느 하나에 있어서, FVIII-Fc를 포함하는 키메라 단백질은 약 1 내지 약 14일, 약 1 내지 약 13일, 약 1 내지 약 12일, 약 1 내지 약 11일, 약 1 내지 약 10일, 약 1 내지 약 9일, 약 1 내지 약 8일, 약 1 내지 약 7일, 약 1 내지 약 6일, 약 1 내지 약 5일, 약 1 내지 약 4일, 약 1 내지 약 3일, 약 1 내지 약 2일, 약 2 내지 약 14일, 약 3 내지 약 14일, 약 4 내지 약 14일, 약 5 내지 약 14일, 약 6 내지 약 14일, 약 7 내지 약 14일, 약 8 내지 약 14일, 약 9 내지 약 14일, 약 10 내지 약 14일, 약 11 내지 약 14일, 약 12 내지 약 14일, 약 13 내지 약 14일, 또는 약 5 내지 약 10일의 투여 간격으로 투여되는, 방법.

E41. E24, 및 E26 내지 E40 중 어느 하나에 있어서, FVIII-Fc를 포함하는 키메라 단백질은 약 3일 내지 약 5일의 투여 간격으로 투여되는, 방법.

E42. E25에 있어서, FIX-Fc를 포함하는 키메라 단백질의 유효량은 약 20 IU/kg 내지 약 100 IU/kg인, 방법.

E43. E25 또는 E42에 있어서, FIXI-Fc를 포함하는 키메라 단백질의 유효량은 약 20 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 30 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 40 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 50 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 60 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 70 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 80 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 90 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 90 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 80 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 70 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 60 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 50 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 40 IU/kg, 또는 약 20 IU/kg 내지 약 30 IU/kg인, 방법.

E44. E25, 및 E42 내지 E44 중 어느 하나에 있어서, FIX-Fc를 포함하는 키메라 단백질의 유효량은 약 50 IU/kg 내지 E100 IU/kg인, 방법.

E45. E25, 및 E42 내지 E44 중 어느 하나에 있어서, FIX-Fc를 포함하는 키메라 단백질은 약 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 또는 E28 일의 투여 간격으로 투여되는, 방법.

E46. E25, 및 E42 내지 E45 중 어느 하나에 있어서, FIX-Fc를 포함하는 키메라 단백질은 약 1 내지 약 21일, 약 1 내지 약 20일, 약 1 내지 약 19일, 약 1 내지 약 18일, 약 1 내지 약 17일, 약 1 내지 약 16일, 약 1 내지 약 15일, 약 1 내지 약 14일, 약 1 내지 약 13일, 약 1 내지 약 12일, 약 1 내지 약 11일, 약 1 내지 약 10일, 약 1 내지 약 9일, 약 1 내지 약 8일, 약 1 내지 약 7일, 약 1 내지 약 6일, 약 1 내지 약 5일, 약 1 내지 약 4일, 약 1 내지 약 3일, 약 1 내지 약 2일, 약 2 내지 약 21일, 약 3 내지 약 21일, 약 4 내지 약 21일, 약 5 내지 약 21일, 약 6 내지 약 21일, 약 7 내지 약 21일, 약 8 내지 약 21일, 약 9 내지 약 21일, 약 10 내지 약 21일, 약 11 내지 약 21일, 약 12 내지 약 21일, 약 13 내지 약 21일, 약 14 내지 약 21일, 약 15 내지 약 21일, 약 16 내지 약 21일, 약 17 내지 약 21일, 약 18 내지 약 21일, 약 19 내지 약 21일, 약 20 내지 약 21일, 약 5 내지 약 10일, 약 10 내지 약 15일, 약 15 내지 약 20일의 투여 간격으로 투여되는, 방법.

E47. E25, 및 E42 내지 E46 중 어느 하나에 있어서, FIX-Fc를 포함하는 키메라 단백질은 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 또는 약 14일의 투여 간격으로 투여되는, 방법.

E48. E1 내지 E32 중 어느 하나에 있어서, 키메라 단백질은 FVIII 부분, VWF 부분, 제1 Fc 영역, 및 제2 Fc 영역을 포함하되, FVIII 부분은 FVIII 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하고; VWF 부분은 VWF 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하고; FVIII 부분은 제1 Fc 영역에 연결되고; VWF 부분은 제2 Fc 영역에 연결되며; 제1 Fc 영역과 제2 Fc 영역은 서로 결합되는, 방법.

E49. E1 내지 E47 중 어느 하나에 있어서, 키메라 단백질의 Fc 영역은 관절에 대한 키메라 단백질의 국소화를 촉진하는, 방법.

E50. E1 내지 E49 중 어느 하나에 있어서, 인간은 6세 미만인, 방법.

E51. E1 내지 E49 중 어느 하나에 있어서, 인간은 6세 이상 12세 미만인, 방법.

E52. E1 내지 E49 중 어느 하나에 있어서, 인간은 12세 이상인, 방법.

E53. E1 내지 E52 중 어느 하나에 있어서, 응고 인자는 혈장 구획 내부 조직뿐만 아니라 혈장 구획 외부 조직에도 분포되는, 방법.

도 1a~1f는 FVIII-Fc 연구(도1a 및 1b) 및 베이스라인에서 표적 관절을 가진 아동에 대한 FVIII-Fc 연구(도 1c~1f)의 대상체를 대상으로, 사전 연구(도 1a, 1c 및 1e) 및 연구 도중(도 1b, 1d 및 1f)의 중앙 값(IQR) 연간 환산 출혈율(ABR)을 도시한다. 도 1c~1d는 아동을 대상으로 한 FVIII-Fc 연구의 결합 데이터를 도시하는 반면, 도 1e~1f는 동일한 데이터를 대상체의 연령에 기초하여 (6세 미만 및 6세 이상 12세 미만으로) 계층화하여 도시한 것이다.
도 2a~2b는 FVIII-Fc 연구 베이스라인으로부터 연장 연구 2년차(도 2a; x축) 및 연장 연구 3년차(도 2b; x축)까지 총 변형 혈우병 관절 건강 점수(mHJHS; y축)의 평균 편화(mean change)를 도시한다. 도 2b에는 베이스라인에서의 표적 관절 있는 경우(삼각형)와 없는 경우(원형)가 구분되어 있다.
EH 3a~3c는 사전 연구 예방 치료를 받은 대상체 및 사전 연구 사례별(요구성) 치료를 받은 대상체를 대상으로 한, FVIII-Fc 연구 베이스라인에서 연장 연구 2년차(도 3a; x축) 및 연장 연구 3년차(도 3b)까지, 및 아동의 경우 FVIII-FC 연구의 연장 연구 2년차(도 3c; x축)까지 총 mHJHS(y축)의 평균 변화를 도시한다.
도 4는 FVIII-Fc 연구 베이스라인에서 표적 관절을 가진 대상체(사각형) 및 FVIII-Fc 연구 베이스라인에서 표적 관절을 가지지 않은 대상체(마름모형)를 대상으로 한, FVIII-Fc 베이스라인에서 2년차(x축)까지 총 mHJHS(y축)의 평균 변화를 도시한다.
도 5는 FVIII-Fc 연구 베이스라인에서의 mHJHS 장애가 가장 낮은 사분위(Q1; > 1~10)에 속하는 대상체(마름모형); FVIII-Fc 연구 베이스라인에서의 mHJHS 장애가 두 번째로 낮은 사분위(Q2; >10~22)에 속하는 대상체(사각형); FVIII-Fc 연구 베이스라인에서의 mHJHS 장애가 두 번째로 높은 사분위(Q3; > 22~34)에 속하는 대상체(삼각형); 및 FVIII-Fc 연구 베이스라인에서의 mHJHS 장애가 가장 높은 사분위(Q4; > 34~37)에 속하는 대상체(마름모형)를 대상으로 한, FVIII-Fc 연구 베이스라인에서 2년차(x축)까지 mHJHS(y축)의 평균 변화를 도시한다.
도 6은 FVIII-Fc 연구 베이스라인에서 표적 관절을 가진 대상체를 대상으로 한, FVIII-Fc 베이스라인에서 2년차(x축)까지 총 mHJHS(y축)의 평균 변화를 도시한다.
도 7은 체중 부하 관절(마름모형) 및 비 체중 부하 표적 관절(사각형)을 대상으로 한, FVIII-Fc 연구 베이스라인에서 2년차(x축)까지 총 mHJHS(y축)의 평균 변화를 도시한다.
도 8은 부기(마름모형), 가동 범위(range of motion; 사각형), 및 지구력(삼각형)을 대상으로 한, FVIII-Fc 연구 베이스라인에서 2년차(x축)까지 mHJHS의 평균 변화를 도시한다.
도 9는 관절 불안정성(진회색 사각형), 부기(검은색 삼각형), 근위축(연회색 사각형), 관절 동통(연회색 마름모형), 염발음(검은색 사각형), 및 지구력(연회색 원형)을 대상으로 한, FVIII-Fc 연구 환자의 mHJHS(y축)의 평균(SEM) 변화를 도시한다. 각 mHJHS 측정에 대한 총 베이스라인(BL) 점수가 도시되어 있다.
도 10a~10b는 rFIXFc 연구의 대상체를 대상으로 한, 사전 연구(10a) 및 연구 도중(10b) 중앙 값(IQR) 연간 환산 출혈율(ABR)을 도시한다. 도 10b는 전반적인 연구 도중 ABR(검은색 원), 전반적인 표적 관절 ABR(회색 마름모형), 및 표적 관절 자발적 ABR(회색 삼각형)을 추가로 도시한 것이다. WP = 주단위 예방 치료; IP = 개별화된 간격의 예방 치료; 및 MP = 변형된 예방 치료(도 10a~10b).
도 11은 적어도 12개월의 추적 검사 시간을 가지고, 추적 검사를 시작한 시점부터 적어도 12개월 이내에 관절 수술을 받지 않은 대상체(n=37)에서 평가할 수 있는 해결된 표적 관절(발목, 무릎, 팔꿈치, 고관절, 손목, 및 어깨) 및 미해결 표적 관절의 수를 도시하는 그래프이다. 각각의 표적 관절의 수(n)는 관련된 데이터 위에 첨가되어 있으며, 평가된 표적 관절은 총 93개이다. 해결된 표적 관절(100%) 및 미결 표적 관절(0%)의 백분율은 x축 아래에 도시되어 있다.
도 12a~12c는 ¹²⁵I-SIB-표지된 FIX (도 12a), ¹²⁵I-SIB-표지된 FIXFc (도 12b), 또는 ¹²⁵I-SIB-표지된 글리코PEG화-FIX (도 12c)가 투여된 마우스의 단일 광자 방출 단층촬영(Single Photon Emission Tomography, SPECT) 영상이다. 도 12d~12g는 다양한 시점에 ¹²⁵I-SIB-표지된 FIX, ¹²⁵I-SIB-표지된 FIXFc, 또는 ¹²⁵I-SIB-표지된 글리코PEG화-FIX가 투여된 마우스를 직접 비교한 것을 도시한다. 열지도(heat map)는 각각의 마우스에서 ¹²⁵I-SIB 표지의 상대 농도(%ID/g)를 나타낸다(도 12a~12g).
도 13a~13b는 시간 경과에 따라 ¹²⁵I-SIB-표지된 FIX, ¹²⁵I-SIB-표지된 FIXFc, 또는 ¹²⁵I-SIB-표지된 글리코PEG화-FIX를 무릎(도 13a) 및 어깨(도 13b)에 투여하고, 이어서 도 12a~12g에 도시된 마우스에서 ¹²⁵I-SIB 표지 국소화의 강도를 도시한 그래프이다. 좌우 무릎과 좌우 어깨 모두에 대한 데이터를 수집하고, 이를 결합하여 도시된 데이터를 생성하였다(각각, 도 13a 및 13b).
도 14a는 비표지된 FIX 및 FIXFc와 비교하여, 발색성 분석 또는 일단계 분석에서 측정된 바와 같은 표지된 FIX 및 표지된 FIXFc의 상대 활성을 도시한 그래프이다. 도 14b는 HemB 마우스에서 표지된 FIX 분자 및 비표지된 FIX 분자의 약동학을 도시한 그래프이다.
도 15a~15f는 팔꿈치 관절(굴곡: 도 15a, 및 신전: 도 15b), 무릎 관절(굴곡: 도 15c, 및 신전: 도 15d), 및 발목 관절(발바닥쪽 굴곡: 도 15e, 및 발등쪽 굴곡: 도 15f)을 대상으로 한 가동역을 도시한 도면으로, 변형된 혈우병 관절 건강 점수(HJHS) 및 굴곡/신전의 각도를 도면 상에 함께 표시하였다.
도 16은 FcγR 결합, 내재화, 신호 전달 및 사이토카인 생산, 및 유전자 발현 변화에 대한 rFVIIIFc의 효과뿐만 아니라, 후속 상호 작용 및 시험관 내의 T 세포에 대한 효과를 조사하기 위해 사용된 방법을 개략적으로 나타내는 흐름도이다.
도 17a~17c는 서양고추냉이(horseradish) 퍼록시다아제 면역 복합체((HRP-IC; 양성 대조군), IgG1, 재조합 FVIII(rFVIII), 또는 rFVIII Fc 융합 단백질(rFVIIIFc)로 처리한 후 Fcγ 수용체 CD16(도 17a), CD32(도 17b), 및 CD64(도 17c)의 상대적인 대식세포 표면 발현 수준 및 수지상 세포 표면 발현 수준을 나타낸 그래프이다. 별표(*)는 유의성의 정도를 나타낸다(n=3; * = P≤0.05, ** = P≤0.01, *** = P≤0.005, 다른 치료와 비교한 HRP-IC에 대한 유의성은 도시되지 않음).
도 18a~18c는 rFVIII 또는 rFVIIIFc로 처리한 후의 상대 신호 전달을 나타내는 그래프이다. 도 18a는 HRP-IC, IgG1, rFVIII 또는 rFVIIIFc로 15분 동안 치료한 THP-1 단핵구 세포주(“THP-1”), 단핵구, 말초 혈액 단핵구 유래의 대식세포(“대식세포”), 및 말초 혈액 단핵구 유래의 수지상 세포에서, Syk 인산화에 의해 측정된 신호 전달을 도시한다. 도 18b는 rFVIIIFc(“야생형”), 신생아 Fc 수용체에 결합할 수 없는 돌연변이 rFVIIIFc(“FcRn 돌연변이”), 또는 FcγR에 결합할 수 없는 돌연변이 rFVIIIFc(“FcgR 돌연변이”)로 치료한 대식세포에서의 상대적인 Syk 인산화를 도시한다. 도 18c는 HRP-IC, IgG1, rFVIII 또는 rFVIIIFc로 처리한 후 24시간차의 대식세포에서의 전염증성 사이토카인 인터류킨 1b(IL-1b), IL-6, IL-8, IL-10, 및 종양 괴사 인자 알파(TNFa)의 상대적인 생산을 도시한다.
도 19는 rFVIII 또는 rFVIIIFc로 처리한지 1분, 5분, 및 30분 후의, Src 상동성 영역 2 도메인 함유 포스파타아제-1(SHP1), pSHP2, 포스파티딜이노시톨-3,4,5-트리스인산 5-포스파타아제 1(SHIP1), 및 pSHIP2의 상대적인 인산화 상태를 도시한다. 별표(*)는 유의성의 정도를 나타낸다(n=3; **P≤0.01, ***P≤0.005).
도 20a~20m은 rFVIII 또는 rFVIIIFc로 처리한 후 내성 유발 대식세포의 유전자 발현 패턴을 나타내는 그래프이다. 도 20a~20b는 IgG1, rFVIII, 또는 rFVIIIFc로 6시간 동안 치료한 단핵구 유래 대식세포에서 유의하게 하향 조절된 유전자의 분포(도 20a) 및 유의하게 상향 조절된 유전자의 분포(도 20b)를 도시한 벤다이어그램이다(n=3). 도 20c~20g는 rFVIII 또는 rFVIIIFc로 처리한 후 정량적 PCR에 의해 측정한 다양한 NRF2 유전자 및 지질 대사 경로 유전자, 예컨대, 헴 옥시게나아제 1(Hmox1; 도 20c), 퍼록시좀 증식제 활성 수용체 감마(PPARγ; 도 20d), 지질 단백질 리파아제(LPL; 도 20e), 조기 성장 반응 2(EGR2; 도 20f), 및 용질 담체 유기 음이온 수송체 패밀리 멤버 4A1(SLCO4A1; 도 20g)의 상대 발현; 치료 후 6시간차(도 20i) 및 12시간차(도 20j)의 CD206의 상대 발현; 및 아르기나아제 1(ARG1; 도 20l)의 상대 발현을 보여주는 그래프이다. 별표(*)는 유의성의 정도를 나타낸다(n=8; *P≤0.05, **P≤0.01, ***P≤0.005; 도 20c~20g). 도 20k 및 20m은 유세포 계측법으로 수집한 CD206 발현하는 세포의 수를 보여주는 그래프이다. 또한, rFVIIIFc-면역 대식세포는 특유의 M2-유사 표현형을 나타내는 것으로 밝혀졌다(도 20i~20m). 특히, rFVIIIFc로 처리된 대식세포는 rFVIII로 처리된 세포에 비해 6시간차(도 20i) 및 24시간차(도 20j)의 CD206(마노스 수용체 C-1형으로도 알려짐; MRC1)의 발현이 상대적으로 더 높았으며, rFVIIIFc로 처리된 대식세포는 rFVIII로 처리된 세포에 비해 24시간차(도 20m)의 ARG1의 발현이 상대적으로 더 높았다.
도 21a는 rFVIIIFc 치료가 T-세포 분화에 미치는 효과를 결정하는 데 사용된 방법을 도식화한 흐름도이다. 도 21b는 대식세포 또는 수지상 세포를 IgG1(대조군), rFVIII, 또는 rFVIIIFc로 24시간 동안 처리한 다음 미처리 CD4 양성 T 세포와 함께 공동 배양한 후 6일 차에 조절 T 세포의 백분율을 나타내는 그래프이다. 도 21c는 IgG1, rFVIII, 또는 rFVIIIFc로 전처리된 대식세포 또는 수지상 세포의 컨디셔닝된 배지에서 미처리 CD4 양성 T 세포의 배양 후 조절 T 세포의 백분율을 나타내는 그래프이다.
도 22는 rFVIIIFc 조절 T-세포 분화의 제안 메커니즘을 도시한 것이다.
도 23은 rFIXFc가 대식세포에 미치는 제안된 효과를 도시한 것이다.

본 개시는 혈우병에 걸린 인간에서 관절의 가역적 혈우병성 관절증을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 키메라 단백질 또는 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 조성물의 유효량을 인간에게 투여하는 단계를 포함한다. 본원에 개시된 키메라 단백질은 혈우병에 걸린 인간의 관절에서 활액막염(synovitis), 미세 출혈(microbleed), 하나 이상의 관절의 염증, 혈관 변형, 또는 이들의 임의의 조합을 치료하는 데 사용될 수도 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 혈우병에 걸린 인간의 관절 주변 연조직을 개선한다.

I. 정의

용어 “하나(a 또는 an)”의 엔티티는 하나 이상의 이러한 엔티티를 지칭하며, 예를 들어 “핵산 서열(a nucleotide sequence)”은 하나 이상의 핵산 서열을 나타내는 것으로 이해됨을 주목해야 한다. 마찬가지로, 용어 “하나(a 또는 an)”, “하나 이상(one or more), 및 “적어도 하나(at least one)”는 본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다.

또한, 본원에서 사용된 “및/또는(and/or)”은 두 가지 명시된 특징 또는 구성 요소의 각각을 다른 한 가지와 함께 또는 다른 한 가지 없이 구체적으로 개시하는 것으로서 간주되어야 한다. 따라서, “A 및/또는 B”와 같은 문구에 사용된 용어 “및/또는”은 “A 및 B”, “A 또는 B”, “A”만, “B”만을 포함하도록 의도된다. 마찬가지로, “A, B 및/또는 C”와 같은 문구에서 사용된 용어 “및/또는”은 다음의 양태 각각을 포함하도록 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).

본원에서 양태가 “포함하는(comprising)”이라는 말로 기술되는 곳이라면, 달리 “이루어진(consisting of)” 및/또는 “본질적으로 이루어진(consisting essentially of)”이라는 용어로 기술되는 유사한 양태도 제공되는 것으로 이해된다.

달리 정의되지 않는 한, 본 설명에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 관련된 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2판, 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3판, 1999, Academic Press; 및 Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, 개정판, 2000, Oxford University Press는 본 개시에 사용된 많은 용어들에 대한 일반적인 사전을 당업자에게 제공한다.

단위, 접두어, 및 기호는 국제단위계(Systeme International de Unites; SI) 허용 형식으로 표시된다. 숫자 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 아미노산-카르복시 배향에 있어서 아미노산 서열은 왼쪽에서 오른쪽으로 쓰여진다. 본원에 제공된 표제는 본 명세서를 전체로서 참조함으로써 가질 수 있는 본 개시의 다양한 양태를 한정하는 것이 아니다. 따라서, 바로 아래에 정의된 용어들은 본 명세서를 그 전체로서 참조함으로써 보다 완전하게 정의된다.

용어 “약(about)”은 대략적으로, 대강, 가량, 또는 ~한 정도를 의미한다. 용어 “약”이 숫자 범위와 함께 사용되는 경우, 이는 명시된 수치의 위와 아래로 경계를 확장함으로써 해당 범위를 수정한다. 따라서, “약 10~20”은 “약 10에서 약 20까지”를 의미한다. 일반적으로, 용어 “약”은 표시 값의 위와 아래의 수치를 예를 들어 10%의 편차만큼 위 또는 아래로(높게 또는 낮게) 수정할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, “투여(administering)”는 키메라 단백질과 같은, 본원에 기술된 약제학적으로 허용 가능한 조성물을 약제학적으로 허용 가능한 경로를 통해 대상체에게 전달하는 것을 의미한다. 투여 경로는 정맥 내 주사 및 정맥 내 주입과 같은 정맥 내(intravenous)일 수 있다. 추가의 투여 경로는, 예를 들어, 피하, 근육 내, 경구, 비강, 및 폐 투여를 포함한다. 적어도 하나의 부형제를 포함하는 약제학적 조성물의 일부로서 키메라 단백질(chimeric protein) 및 혼성 단백질(hybrid protein)이 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 키메라 단백질과 같은 조성물은 유전자 요법을 통해 인간에게 투여되는데, 예를 들어, 응고 인자 및/또는 Fc 영역을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 인간에게 투여되고, 응고 인자 및/또는 Fc 영역은 인간에서 발현된다.

본원에서 사용된 바와 같이, “치료(treat, treatment 또는 treating)”는, 예를 들어, 질환 또는 병태의 중증도를 감소시키는 것; 병태 과정의 지속 기간을 단축시키는 것; 질환 또는 병태와 연관된 하나 이상의 증상을 개선 또는 제거하는 것; 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체에게, 질환 또는 병태의 본질적인 치유를 요하지 않고 유익한 효과를 제공하는 것을 지칭하되, 혈우병성 관절증 또는 이의 증상을 예방 또는 방지하는 것을 포함하지 않는다. 일 구현예에서, 용어 “치료(treating 또는 treatment)”는 대상체에 대한 혈우병 관절 건강 점수(HJHS) 또는 변형된 HJHS(mHJHS)를 개선하는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 전체 HJHS 또는 mHJHS가 개선된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 표적 관절에 대한 개별 점수가 개선된다. 일부 구현예에서, 용어 “치료(treating 또는 treatment)”는 대상체에 대한 삶의 질(quality of life, QoL) 점수를 개선하는 것을 의미한다. 특정 구현예에서, QoL 점수는 운동과 여가, 육체적 건강, 혈우병을 대하는 자세, 가족 계획, (혈우병에 대한) 느낌, 미래, 교제 및 성생활, 치료, (스스로의) 가치관, 직업 및 학교, 또는 이들의 임의의 조합과 관련된 대상체의 성향(disposition)을 분석한 것이다. 다른 구현예에서, 용어 “치료(treating 또는 treatment)”는 하나 이상의 미세출혈의 영향 및/또는 중증도를 감소시키는 것을 의미한다. 또 다른 구현예에서, 용어 “치료(treating 또는 treatment)”는 하나 이상의 표적 관절에서 부기 및/또는 염증 및/또는 동통을 감소시키는 것을 의미한다. 또 다른 구현예에서, 용어 “치료(treating 또는 treatment)”는 하나 이상의 표적 관절에서 혈관 변형을 감소시키는 것을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, “예방(prevent 또는 preventing)”은 특정 결과가 발생하는 것 또는 이의 중증도를 낮추거나 감소시키는 것을 지칭한다. 일부 구현예에서, 결과를 예방하는 것은 예방적 치료(prophylactic treatment)를 통해 달성된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “비슷한(comparable)”은, 예를 들어, 키메라 폴리펩티드를 사용해 생성된 비교 속도 또는 수준이 기준 속도 또는 수준과 동등하거나, 실질적으로 동등하거나, 유사한 것을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “유사한(similar)”은 비교 속도 또는 수준이 기준 속도 또는 수준(예를 들어, 2개의 Fc 부분 및 가공된 FVIII로 이루어지거나 본질적으로 이로 이루어진 키메라 폴리펩티드에 의한 FXa 생성 속도이며, 여기서 상기 가공된 FVIII는 2개의 Fc 부분 중 하나의 Fc에 융합됨)과 10% 이하 또는 15% 이하의 차이를 갖는 것을 의미한다. 용어 “실질적으로 동등한(substantially equal)”은 비교 속도 또는 수준이 기준 속도 또는 수준과 0.01% 이하, 0.5% 이하 또는 1% 이하의 차이를 갖는 것을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 혈액응고 장애(hemostatic disorder)는 유전적으로 물려받은 병태 또는 후천적인 병태로서, 피브린 응고물질(fibrin clot)을 형성할 수 없거나 형성 능력의 손상으로 인한 자발적 또는 외상성 출혈 경향을 특징으로 한다. 이러한 장애의 예는 혈우병(hemophilias)을 포함한다. 3가지 주된 형태는 A형 혈우병(인자 VIII 결핍증), B형 혈우병(인자 IX 결핍증 또는 “크리스마스병”) 및 C형 혈우병(인자 XI 결핍증, 경미한 출혈 경향)이다. 다른 혈액응고 장애는, 예를 들어, 폰 빌레브란트병, 인자 XI 결핍증(PTA 결핍증), 인자 XII 결핍증, 피브로겐, 프로트롬빈, 인자 V, 인자 VII, 인자 X 또는 인자 XIII의 결핍 또는 구조적 이상, GPIb의 결함 또는 결핍인 베르나르-술리에 증후군을 포함한다. VWF에 대한 수용체인 GPIb가 결핍될 수 있고, 이는 일차 응고물질 형성(일차 혈액응고)의 결여 및 출혈 경향의 증가, 및 글란즈만 및 네겔리의 혈소판 무력증(글란즈만 혈소판무력증)으로 이어질 수 있다. 간부전(급성 및 만성 형태)인 경우에는, 간이 충분한 응고 인자를 생산하지 않으므로, 출혈 위험이 증가할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, “혈장 농도 대 시간 곡선의 아래 영역(AUC)”은 약리학에서의 당업계 용어와 동일하며, 투여 후 FVIII의 흡수 속도 및 정도에 기초한다. AUC는 12, 18, 24, 36, 48 또는 72시간과 같이 지정된 기간에 걸쳐 결정되거나, 곡선의 기울기에 기초한 외삽법(extrapolation)을 사용해 무한대로 결정된다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, AUC는 무한대로 결정된다. AUC의 결정은 하나의 대상체에서 수행되거나, 평균이 산출되는 대상체 개체군에서 수행될 수 있다.

용어 “응혈원 활성(procoagulant activity)”은 천연 FVIII 또는 FIX와 같은 천연 응고 인자를 대체하여, FVIII 또는 FIX 부분과 같은 본 발명의 응고 인자가 혈액 내 응고 연쇄반응(clotting cascade)에 참여할 수 있는 능력을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 FIX 부분은, 예를 들어, 발색성 분석(chromogenic assay)에서 시험한 바와 같이, 인자 VIII(FVIII)의 존재 하에 인자 X(FX)를 활성화된 인자 X(FXa)로 전환할 수 있을 때 응혈원 활성을 갖는다. 또 다른 구현예에서, FIX 활성은 테나아제 복합체(tenase complex)를 생성하는 능력이다. 다른 구현예에서, FIX 활성은 트롬빈(또는 응고물)을 생성하는 능력이다.

면연글로불린 또는 면역글로불린 단편의 아미노산 넘버링에 대해 이루어진 참조는 모두 Kabat 등의 문헌 Sequences of Proteins of Immunological Interest(1991, 미국 공중 보건부, 메릴랜드주 베데스다 소재)에 기초한 것이며, 동 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. (FcRn 수용체는 인간을 포함하는 여러 가지 포유동물 종으로부터 단리된 것이다. 인간 FcRn, 랫트 FcRn, 및 마우스 FcRn의 서열은 알려져 있다(그 전체가 참조로서 본원에 통합된 Story 등의, J. Exp. Med. 180: 2377 (1994) 참조). Fc는 면역 글로불린의 힌지 영역 유무와 상관없이 면역 글로불린의 CH2 및 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 Fc 변이체는 WO 2004/101740 및 WO 2006/074199에 제공되어 있으며, 이들 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.

본원에서 사용된 바와 같이, “혼성(hybrid)” 폴리펩티드 및 단백질은 키메라 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드와의 조합물을 의미한다. 혼성화물 내의 키메라 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 전하-전하 상호작용 또는 소수성 상호작용과 같은 단백질-단백질 상호작용을 통해 서로 결합될 수 있다. 혼성화물 내의 키메라 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 이황화 결합 또는 다른 공유 결합을 통해 서로 결합될 수 있다. 혼성화물은 WO 2004/101740 및 WO 2006/074199에 기술되어 있으며, 이들 문헌 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 또한, 미국 특허 제7,404,956호 및 미국 특허 제7,348,004호를 참조하며, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 제2 폴리펩티드는 동일한 키메라 폴리펩티드의 제2 사본일 수 있거나, 동일하지 않은 키메라 폴리펩티드일 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 단백질 서열에서의 “상응 아미노산(amino acid corresponding to)” 또는 “상응 부위(site corresponding to)” 또는 “동등한 아미노산(equivalent amino acid)”은 FVIII 또는 FIX 서열과 같은 제1 단백질 서열, 및 제2 FVIII 또는 제2 FIX 서열과 같은 제2 단백질 서열 간의 상동성 또는 유사성을 극대화하기 위한 정렬에 의해 동정된다. 제2 단백질 서열 중에서 동등한 아미노산을 동정하는 데 사용된 번호는 제1 단백질 서열에서 상응 아미노산을 동정하는 데 사용된 번호에 기초한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “삽입 부위(insertion site)”는 폴리펩티드(일반적으로 성숙 폴리펩티드; 예를 들어, 성숙 FVIII 폴리펩티드 또는 성숙 FIX 폴리펩티드), 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체에서의 아미노산 잔기 번호를 지칭하며, 이종 모이어티가 삽입될 수 있는 위치의 바로 상류에 있다. “삽입 부위”는 삽입 부위에 상응하는 아미노산 특정 단백질 서열의 번호인 번호로서 특정되며, 삽입 위치에 대한 바로 N-말단이다. 예를 들어, 구문 “EGF2 도메인은 주어진 아미노산 서열의 아미노산 105에 상응하는 삽입 부위에서 이종 모이어티를 포함한다”는, 이종 모이어티가 서열 중 아미노산 105 및 아미노산 106에 상응하는 2개의 아미노산 사이에 위치함을 나타낸다. 그러나, 당업자는 표시된 단백질의 임의의 변이체에서 상응하는 위치를 쉽게 식별할 수 있을 것이며, 본 개시는 본원에 구체적으로 개시된 변이체에서만 이루어진 삽입에 한정되지 않는다. 오히려, 본원에 개시된 삽입은, 본원에 개시된 변이체의 위치에 상응하는 위치에서 활성을 가지는 임의의 관련 변이체 또는 이의 단편에서 이루어질 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 구문 “아미노산의 바로 하류(immediately downstream of an amino acid)”는 아미노산의 말단 카르복실기 바로 다음의 위치를 지칭한다. 유사하게, 구문 “아미노산의 바로 상류(immediately upstream of an amino acid)”는 아미노산의 말단 아민기 바로 다음의 위치를 지칭한다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, 구문 “삽입 부위의 2개의 아미노산 사이(between two amino acids of an insertion site)”는 2개의 인접 아미노산 사이에서 이종 모이어티(예를 들어, 반감기 연장 모이어티)가 삽입되는 위치를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “삽입된(inserted)”, “삽입되어 있는(is inserted)”, “내에 삽입된(inserted into)” 또는 이와 문법적으로 관련된 용어는 특정 단백질(예: FVIII 또는 FIX 단백질) 내의 유사 위치에 대한 융합 폴리펩티드 내의 이종 모이어티(예: 반감기 연장 모이어티)의 위치를 지칭한다. 당업자는 다른 FVIII 및 FIX변이체와 같은 다른 폴리펩티드 서열과 관련된 상응하는 삽입 위치를 식별하는 법을 이해할 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 이들 용어는 본원에 개시된 재조합 폴리펩티드의 특성을 지칭하며, 융합 폴리펩티드가 만들어지는 임의의 방법 또는 단계를 나타내거나, 암시하거나, 추론하지 않는다. 예를 들어, 본원에서 제공된 융합 폴리펩티드를 참조하면, “이종 모이어티가 FIX 폴리펩티드의 잔기 105의 바로 하류에서 EGF2 도메인에 삽입된다”는 구문은 융합 폴리펩티드가 특정 FIX 변이체 내의 아미노산 105에 상응하는 아미노산의 바로 하류에 있는, 예를 들어, FIX 변이체의 아미노산 105 및 106에 상응하는 아미노산이 경계를 이루는 이종 모이어티를 포함한다는 것을 의미한다.

“융합(fusion)” 또는 “키메라(chimeric)” 단백질은 제2 아미노산 서열에 연결된 제1 아미노산 서열을 포함하며, 제1 아미노산 서열은 자연에서는 제2 아미노산 서열에 자연적으로 연결되지 않는다. 정상적으로는 별개의 단백질 내에 존재하는 아미노산 서열들이 융합 단백질에서 서로 합쳐질 수 있거나, 정상적으로는 동일한 단백질 내에 존재하는 아미노산 서열들이 융합 폴리펩티드에서 새로운 배열로, 예를 들어 본 발명의 FVIII 또는 FIX 도메인과 Ig Fc 도메인의 융합체로서 배치될 수 있다. 융합 단백질은, 예를 들어, 화학적 합성에 의해 생성되거나, 펩티드 영역이 원하는 관계로 암호화되는 폴리뉴클레오티드를 생성하고 번역함으로써 생성된다. 융합 단백질은, 공유 결합, 비-펩티드 결합, 또는 비-공유 결합에 의해 제1 아미노산 서열과 결합된 제2 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.

용어 “이종(heterologous)” 및 “이종 모이어티(heterologous moiety)”는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 또는 다른 모이어티가 이들이 비교되는 엔티티와 별개인 엔티티로부터 유래됨을 의미한다. 예를 들어, 이종 폴리펩티드는 합성이거나, 상이한 종, 일 개체의 상이한 세포 유형, 또는 별개인 개체의 동일하거나 상이한 세포 유형으로부터 유래될 수 있다. 일 양태에서, 이종 모이어티는 또 다른 폴리펩티드에 융합되어 융합 폴리펩티드 또는 단백질을 생성하는 폴리펩티드이다. 또 다른 양태에서, 이종 모이어티는 폴리펩티드 또는 단백질에 접합된 PEG와 같은 비-폴리펩티드이다.

본원에서 사용된 바와 같은, 용어 “연결된(linked)” 또는 “융합된(fused)”은 제1 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열이 각각 제2 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열에 공유 또는 비-공유 연결된 것을 지칭한다. 제1 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열은 제2 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에 직접 연결되거나 이와 병치될 수 있거나, 대안적으로는 개재 서열(intervening sequence)이 제1 서열을 제2 서열에 공유 연결시킬 수 있다. 용어 “연결된(linked)”은 C-말단 또는 N-말단에서 제1 아미노산 서열이 제2 아미노산 서열에 융합되는 것을 의미할 뿐만 아니라, 전체 제1 아미노산 서열(또는 제2 아미노산 서열)이 제2 아미노산 서열(또는 제1 아미노산 서열, 각각)의 임의의 2개의 아미노산 내에 삽입되는 것도 포함한다. 일 구현예에서, 제1 아미노산 서열은 펩티드 결합 또는 링커에 의해 제2 아미노산에 연결된다. 제1 뉴클레오티드 서열은 인산디에스테르 결합 또는 링커에 의해 제2 뉴클레오티드 서열에 연결될 수 있다. 링커는 펩티드이거나 폴리펩티드(폴리펩티드 사슬의 경우)이거나 뉴클레오티드이거나 뉴클레오티드 사슬(뉴클레오티드 사슬의 경우)이거나 임의의 화학적 모이어티(폴리펩티드 사슬 및 폴리뉴클레오티드 사슬 둘 다의 경우)일 수 있다. 용어 “연결된(linked)”은 하이픈(-)으로도 표시된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “결합된(associated with)”은 제1 아미노산 사슬 및 제2 아미노산 사슬 사이에 형성된 공유 결합 또는 비-공유 결합을 지칭한다. 일 구현예에서, 용어 “결합된”은 공유 결합, 비-펩티드 결합 또는 비-공유 결합을 의미한다. 결합(association)은 콜론(:)으로 표시될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 이는 펩티드 결합을 제외한 공유 결합을 의미한다. 예를 들어, 아미노산 시스테인은 제2 시스테인 잔기 상의 티올기(thiol group)와 이황화 결합 또는 이황화 브리지를 형성할 수 있는 티올기를 포함한다. 가장 자연 발생적인 IgG 분자의 경우, CH1 및 CL 영역은 이황화 결합에 의해 결합되고, 2개의 중쇄는 Kabat 넘버링 시스템을 사용하여 239 및 242(EU 넘버링 시스템의 경우 위치 226 또는 229)에 상응하는 위치에서 2개의 이황화 결합에 의해 결합된다. 공유 결합의 예는, 펩티드 결합(peptide bond), 금속 결합(metal bond), 수소 결합(hydrogen bond), 이황화 결합(disulfide bond), 시그마 결합(sigma bond), 파이 결합(pi bond), 델타 결합(delta bond), 글리코시드 결합(glycosidic bond), 아그노스트 결합(agnostic bond), 굽은 결합(bent bond), 배위 결합(dipolar bond), 파이 역결합(Pi backbond), 이중 결합(double bond), 삼중 결합(triple bond), 사중 결합(quadruple bond), 오중 결합(quintuple bond), 육중 결합(sextuple bond), 공액(conjugation), 초 공액(hyperconjugation), 방향족성(aromaticity), 햅티시티(hapticity), 또는 반결합(antibonding)을 포함하되, 이들로 한정되지 않는다. 비-공유 결합의 비-한정적 예는 이온 결합(예를 들어, 양이온-파이 결합 또는 염 결합), 금속 결합, 수소 결합(예를 들어, 이수소 결합, 이수소 복합체, 저 장벽 수소 결합, 또는 대칭성 수소 결합), 반 데르 발스 힘(van der Walls force), 런던 분산력(London dispersion force), 기계적 결합, 할로겐 결합, 친금성(aurophilicity), 인터칼레이션(intercalation), 스택킹(stacking), 엔트로피 힘(entropic force), 또는 화학적 극성(chemical polarity)을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “절단 부위(cleavage site)” 또는 “효소 절단 부위(enzymatic cleavage site)”는 효소에 의해 인식되는 부위를 지칭한다. 특정 효소 절단 부위는 세포 내 가공 부위를 포함한다. 일 구현예에서, 폴리펩티드는 응고 연쇄반응 중에 활성화되는 효소에 의해 절단되는 효소 절단 부위를 가지므로, 이러한 부위의 절단은 응고물질 형성 부위에서 발생한다. 예시적인 이러한 부위는, 예를 들어, 트롬빈, 인자 XIa 또는 인자 Xa에 의해 인식되는 부위를 포함한다. 다른 효소 절단 부위는 당업계에 공지되어 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “가공 부위(processing site)” 또는 “세포 내 가공 부위(intracellular processing site)”는 폴리펩티드의 번역 후에 기능하는 효소의 표적인 폴리펩티드 내의 효소 절단 부위의 일 유형을 지칭한다. 일 구현예에서, 이러한 효소는 골지 내강(Golgi lumen)에서 트랜스-골지 구획(trans-Golgi compartment)까지 수송되는 동안 작용한다. 세포 내 가공 효소는 단백질이 세포로부터 분비되기 전에 폴리펩티드를 절단한다. 이러한 가공 부위의 예는, 예를 들어, 엔도펩티다아제의 PACE/퓨린 군에 의해 표적화되는 것들을 포함한다(PACE는 Paired basic Amino acid Cleaving Enzyme(쌍을 이룬 염기 아미노산 절단 효소)의 머리글자임). 이들 효소는 골지 막에 국소화되어 서열 모티프 Arg-[임의의 잔기]-(Lys 또는 Arg)-Arg의 카르복시 말단 측의 단백질을 절단한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 효소의 “퓨린” 군은, 예를 들어, PCSK1 (PC1/Pc3로도 알려짐), PCSK2 (Pc2로도 알려짐), PCSK3 (퓨린 또는 PACE로도 알려짐), PCSK4 (Pc4로도 알려짐), PCSK5 (PC5 또는 Pc6으로도 알려짐), PCSK6 (PACE4로도 알려짐), 또는 PCSK7 (PC7/LPC, PC8, 또는 SPC7로도 알려짐)을 포함한다. 다른 가공 부위는 당업계에 공지되어 있다.

둘 이상의 가공 또는 절단 부위를 포함하는 작제물의 경우, 이러한 부위들이 동일하거나 상이할 수 있음을 이해할 것이다.

본원에서 사용된 바와 같이, “가공성 링커(processable linker)”는 적어도 하나의 세포 내 가공 부위를 포함하는 링커를 지칭하며, 본원의 다른 부분에서 기술된다.

본원에서 사용된 바와 같이, “베이스라인(baseline)”은 투여량의 투여 이전에 대상체에서 주어진 분석물, 예를 들어, 응고 인자(예: FVIII 또는 FIX)에 대해 측정된 가장 낮은 혈장 수준이다. 혈장 수준은 투여 이전의 두 시점, 즉 검진 방문 시 및 투여 직전에 측정될 수 있다. 대안적으로, (a) 검출 가능한 응고 인자 항원이 없었고, 넌센스 유전자형을 가지며, 전처리 응고 인자 활성이 <1%인 대상체에서의 베이스라인은 0%로 정의될 수 있고, (b) 전처리 응고 인자 활성이 <1%이며, 검출 가능한 응고 인자 항원을 가진 대상체에 대한 베이스라인은 0.5%로 설정될 수 있고, (c) 전처리 응고 인자 활성이 1~2%인 대상체에 대한 베이스라인은 C_min(PK 연구 전반에 걸쳐 최저 활성임)이며, (d) 전처리 응고 인자 활성이 ≥2%인 대상체에 대한 베이스라인은 2%로 설정될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, “동등 투여량(equivalent dose)”은 국제 단위로 표현되는 동일한 투여량의 응고 인자 활성, 예를 들어 FVIII 활성 또는 FIX 활성을 의미하며, 이는 논의되는 폴리펩티드의 분자량과는 무관하다. 예를 들어, FVIII 활성의 1 국제 단위(IU)는 1 mL의 정상 인간 혈장 중 FVIII의 양에 대략 상응한다. 유럽 약전의 발색 기질 분석법(European Pharmacopoeia chromogenic substrate assay) 및 일단계 혈액응고 분석법(one stage clotting assay)을 포함하여, 응고 인자 활성을 측정하기 위한 여러 가지 분석법이 이용 가능하다.

본원에서 사용된 바와 같이, “투여 간격(dosing interval)”은 대상체에게 투여되는 다중 투여 간에 경과하는 투여의 시간을 의미한다. 투여 간격의 비교는 하나의 대상체 또는 대상체의 개체군에서 수행될 수 있고, 개체군에서 얻은 평균을 산출할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, “대상체(subject)”는 인간 개체를 의미한다. 대상체는 현재 출혈 장애를 앓고 있거나, 이러한 치료가 필요할 것으로 예상되는 환자일 수 있다. 일부 구현예에서, 환자는 이전에 응고 인자로 치료받은 적이 없다(즉, 대상체는 이전에 치료되지 않은 대상체이거나 이전에 치료되지 않은 환자임). 일부 구현예에서, 대상체는 태아이고, 본 방법은 조성물, 예를 들어, 키메라 폴리펩티드를 태아의 모체에게 투여하는 단계를 포함하되, 대상체에 대한 투여는 모체로부터 태반을 통해 이루어진다. 일부 구현예에서, 대상체는 아동이거나 성인이다. 일부 구현예에서, 대상체는 1살 미만, 2살 미만, 3살 미만, 4살 미만, 5살 미만, 6살 미만, 7살 미만, 8살 미만, 9살 미만, 10살 미만, 11살 미만, 또는 12살 미만의 아동이다. 일부 구현예에서, 아동는 1살 미만이다. 특정 구현예에서, 대상체는 6살 미만이다. 다른 구현예에서, 대상체는 6살 이상 12살 미만이다. 다른 구현예에서, 대상체는 12살 이상이다. 일부 구현예에서, 아동 또는 성인 대상체는 출혈 장애를 일으키고, 출혈 장애의 증상은 1살 이후에 발병한다. 일부 구현예에서, 조성물, 예를 들어, 키메라 폴리펩티드를 대상체에게 투여하는 것은 응고 인자에 대한 체액성 면역 반응, 세포 매개 면역 반응, 또는 체액성 면역 반응 및 세포 매개 면역 반응 둘 다로부터 선택된 면역 반응을 예방하거나, 억제하거나 감소시키기에 충분하다.

본원에서 (상호 교환적으로) 사용된 바와 같이, “치료 투여량(therapeutic dose)”, “투여량(dose)”, “유효 투여량(effective dose)”, 또는 “투약량(dosing amount)”은 본원에 기술된 바와 같은 치료 목표를 달성하는 투여량을 의미한다. 일부 구현예에서, “치료 투여량(therapeutic dose)”은 치료 이전의 HJHS, mHJHS, 또는 QoL 점수와 비교해 HJHS, mHJHS, 또는 QoL 점수를 개선하는 투여량을 의미한다. 일부 구현예에서, “치료 투여량”은 치료 이전의 관절에서의 부기, 염증, 및/또는 동통과 비교해 대상체의 하나 이상의 관절에서 부기, 염증, 및/또는 동통을 감소시키는 투여량을 의미한다. 일부 구현예에서, “치료 투여량”은 치료 이전의 미세출혈의 영향 및/또는 중증도와 비교해 하나 이상의 미세출혈의 영향 및/또는 중증도를 감소시키는 투여량을 의미한다. 또 다른 구현예에서, “치료 투여량”은 치료 이전의 혈관 변형과 비교해 하나 이상의 표적 관절에서 혈관 변형을 감소시키는 투여량을 의미한다.

본 발명은 폴리펩티드의 단편 또는 변이체, 및 이들의 임의의 조합을 또한 포함한다. 본 개시의 방법에 사용된 폴리펩티드를 지칭할 때의 용어 “단편(fragment)” 또는 “변이체(variant)”는 기준 폴리펩티드의 특성 중 적어도 일부(예를 들어, FVIII 또는 FIX에 Fc 변이체 또는 대한 응고 활성)를 보유하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드의 단편은, 본원의 다른 곳에서 논의된 특이적 항체 단편에 추가하여 단백질 가수 분해 단편을 비롯하여 결실 단편도 포함하지만, 자연 발생 전장 폴리펩티드(또는 성숙 폴리펩티드)는 포함하지 않는다. 본 개시의 방법에 사용된 폴리펩티드 결합 도메인 또는 결합 분자의 변이체는 전술한 단편을 포함하며, 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입에 의해 아미노산 서열이 변경된 폴리펩티드도 포함한다. 변이체는 자연 발생적이거나 비-자연 발생적일 수 있다. 비-자연 발생적 변이체는 당업계에 공지된 돌연변이 유발 기술을 사용해 생성될 수 있다. 변이체 폴리펩티드는 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 하나의 특정한 FIX 변이체는 R338L FIX(파두아) 변이체이다. 예를 들어, Simioni, P. 등의 "X-Linked Thrombophilia with a Mutant Factor IX (Factor IX Padua)," NEJM 361:1671-75 (October 2009)를 참조하며, 동 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.

“보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)”은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환된 것이다. 염기성 측쇄를 가진 아미노산(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 가진 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄를 가진 아미노산(예를 들어, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 가진 아미노산(예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄를 가진 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신), 및 방향족 측쇄를 가진 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판)을 포함하여 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 군이 당업계에 정의되었다. 따라서, 폴리펩티드 내의 아미노산이 동일한 측쇄 군 유래의 또 다른 아미노산과 치환되는 경우, 이 치환은 보존적인 것으로 간주된다. 또 다른 구현예에서, 아미노산의 스트링은 측쇄 군 구성원의 순서 및/또는 조성이 상이하되 구조적으로는 유사한 스트링과 보존적으로 치환될 수 있다.

두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 간의 “서열 동일성 백분율(percent sequence identity)”이라는 용어는 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 하는 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 고려하여, 비교 창 위에서 서열에 의해 공유되는 동일한 정합 위치(matched positions)의 수를 지칭한다. 정합 위치는 표적 서열 및 기준 서열 모두에서 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산이 제시되는 임의의 위치이다. 갭(gaps)은 뉴클레오티드 또는 아미노산이 아니므로, 표적 서열에서 제시된 갭은 계수하지 않는다. 마찬가지로, 기준 서열의 뉴클레오티드 또는 아미노산이 아니라 표적 서열 뉴클레오티드 또는 아미노산이 계수되므로, 기준 서열에서 제시된 갭은 계수하지 않는다.

서열 동일성의 백분율은, 동일한 아미노산 잔기 또는 핵산 염기가 두 서열 모두에서 나타나는 위치의 수를 결정하여 정합 위치의 수를 산출하고, 정합 위치의 수를 비교 창 내 위치의 총 수로 나눈 뒤, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다. 서열의 비교 및 두 서열 간의 서열 동일성 백분율의 결정은 온라인 사용 및 다운로드 둘 다를 통해 쉽게 이용할 수 있는 소프트웨어를 사용해 달성될 수 있다. 다양한 공급원으로부터의 적절한 소프트웨어 프로그램을 이용할 수 있고, 단백질 및 뉴클레오티드 서열 모두의 정렬에 사용할 수 있다. 서열 동일성 백분율을 결정하기에 적절한 하나의 프로그램은 bl2seq이며, 미국 정부의 국립 생물공학 정보 센터 BLAST 웹사이트(blast.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 이용할 수 있는 프로그램인 BLAST 패키지(BLAST suite)의 일부이다. Bl2seq는 BLASTIN 또는 BLASTP 알고리즘 중 하나를 사용해 두 서열 간 비교를 수행한다. BLASTIN은 핵산 서열을 비교하는 데 사용되는 반면, BLASTP는 아미노산 서열을 비교하는 데 사용된다. 다른 적절한 프로그램은, 예를 들어, Needle, Stretcher, Water, 또는 Matcher인데, 이들은 생물공학 프로그램인 EMBOSS 패키지(EMBOSS suite)의 일부로서 www.ebi.ac.uk/Tools/psa를 통해 유럽 생물정보학 연구소(European Bioinformatics Institute; EBI)로부터 이용할 수도 있다.

폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 기준 서열과 정렬되는 단일 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 표적 서열 내의 상이한 영역은 각각 자신의 고유한 서열 동일성 백분율을 가질 수 있다. 서열 동일성 백분율 값은 가장 가까운 소수점 첫 번째 자리까지 반올림된다는 것은 주목할 사항이다. 예를 들어, 80.11, 80.12, 80.13, 및 80.14는 80.1로 절사되지만, 80.15, 80.16, 80.17, 80.18, 및 80.19는 80.2로 반올림된다. 길이 값은 언제나 정수가 된다는 것도 주목할 사항이다.

당업자는 서열 상동성 백분율을 계산하기 위한 서열 정렬의 생성이 일차 서열 데이터에 의해 배타적으로 수행되는 이진 서열-서열 비교로 한정되지 않는다는 것을 이해할 것이다. 서열 정렬은 다중 서열 정렬로부터 유도될 수 있다. 다중 서열 정렬을 생성하기에 적절한 하나의 프로그램은 ClustalW2이며, www.clustal.org로부터 이용할 수 있다. 또 다른 적절한 프로그램은 MUSCLE이며, www.drive5.com/muscle/로부터 이용할 수 있다. ClustalW2 및 MUSCLE은, 예를 들어, EBI로부터 대안적으로 이용할 수 있다.

서열 정렬은 서열 데이터를 구조적 데이터(예를 들어, 결정학적 단백질 구조), 기능적 데이터(예를 들어, 돌연변이 위치), 또는 계통발생 데이터와 같은 외래 공급원으로부터의 데이터와 통합함으로써 생성될 수 있다. 외래 데이터를 통합하여 다중 서열을 생성하는 적절한 프로그램은 T-Coffee이며, www.tcoffee.org에서 이용할 수 있고, 대안적으로는 예를 들어 EBI로부터 이용할 수 있다. 서열 동일성 백분율의 계산에 사용된 최종 정렬이 자동적으로 또는 수동적으로 선별될 수 있다는 것도 이해할 것이다.

폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩 영역, 비-코딩 영역, 또는 코딩 영역과 비-코딩 영역 모두에서 변경을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는, 침묵 치환, 첨가, 또는 결실을 생성하되 암호화된 폴리펩티드의 특성이나 활성을 변경시키지 않는 변경을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 뉴클레오티드 변이체는 유전 암호의 축퇴(degeneracy)로 인한 침묵 치환에 의해 생성된다. 다른 구현예에서, 5~10, 1~5, 또는 1~2개 아미노산이 임의의 조합으로 치환, 결실, 또는 첨가되는 변이체가 생성된다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 다양한 이유로, 예를 들어, 특정 숙주에 대한 코돈 발현을 최적화하기 위해 (인간 mRNA에서 코돈을 다른 것들, 예를 들어, 대장균과 같은 박테리아 숙주에 대해 변화시키도록) 생성될 수 있다.

자연 발생 변이체는 “대립유전자 변이체(allelic variants)”로 불리며, 유기체의 염색체 상의 주어진 유전자좌를 점유하는 유전자의 몇 가지 대안적 형태 중 하나를 지칭한다(Genes II, Lewin, B., 편집, John Wiley & Sons, New York (1985) 참조). 이들 대립유전자 변이체는 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드 수준이 변할 수 있고, 본 개시에 포함된다. 대안적으로, 비-자연 발생 변이체가 돌연변이 유발 기술에 의하거나 직접 합성에 의해 생성될 수 있다.

단백질 공학 및 재조합 DNA 기술의 알려진 방법을 사용하여, 폴리펩티드의 특성을 개선하거나 변경시키기 위한 변이체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산이 생물학적 기능의 실질적인 손실없이 분비된 단백질의 N-말단 또는 C-말단으로부터 결실될 수 있다. 본원에 그 전체가 참조로서 통합된 Ron 등의, J. Biol. Chem. 268: 2984-2988 (1993)에 따르면, 변이체 KGF 단백질은 3, 8, 또는 27개의 아미노 말단 아미노산 잔기의 결실 후에도 헤파린 결합 활성을 가지는 것으로 보고되었다. 유사하게, 인터페론 감마는 이러한 단백질의 카르복시 말단으로부터 8~10개의 아미노산이 결실된 후에 10배 더 높은 활성을 나타냈다. (Dobeli 등의, J. Biotechnology 7:199-216 (1988)을 참조하며, 본 문헌은 그 전체가 본원에 참조로서 통합됨.)

또한, 변이체가 종종 자연 발생 단백질과 유사한 생물학적 활성을 보유한다는 것을 입증하는 충분한 증거가 있다. 예를 들어, 게일(Gayle)과 동료들은 인간 사이토카인 IL-1a에 대한 광범위한 돌연변이 분석을 수행하였다(J. Biolyle. Chem 268: 22105-22111 (1993)을 참조하며, 본 문헌은 그 전체가 본원에 참조로서 통합됨). 이들은 무작위 돌연변이 유발을 사용해 3,500개가 넘는 개별 IL/1a 돌연변이체를 생성하였는데, 분자의 전장에 걸쳐 변이체당 평균 2.5개의 아미노산이 변화하였다. 가능한 모든 아미노산 위치에서 다중 돌연변이를 조사하였다. 조사자들은 “대부분의 분자가 (결합 활성이나 생물학적 활성)에 거의 영향을 미치지 않고 변경될 수 있음”을 발견하였다. (요약서 참조.) 실제로, 3,500개가 넘는 조사된 뉴클레오티드 서열 중 단 23개의 독특한 아미노산 서열만이 야생형과 활성이 상당히 다른 단백질을 생산하였다.

전술한 바와 같이, 폴리펩티드 변이체는, 예를 들어, 변형된 폴리펩티드를 포함한다. 변형은, 예를 들어, 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 부착, 헴 모이어티의 공유 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스파티딜이노시톨의 공유 부착, 가교 결합, 고리화, 이황화 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교 결합의 형성, 시스테인의 형성, 피로글루탐산의 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, PEG화(Mei 등의, Blood 116:270-79 (2010)를 참조하며, 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 단백질 가수분해 처리, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황화, 전사-RNA 매개에 의한 단백질에 대한 아미노산의 첨가(예: 아르기닐화), 및 유비퀴틴화를 포함한다. 일부 구현예에서, FVIII는 임의의 편리한 위치에서 변형(예를 들어, PEG화)된다. 일부 구현예에서, FVIII는 FVIII의 표면 노출된 아미노산에서, 예를 들어 조작된 시스테인일 수 있는, 표면 노출된 시스테인에서 PEG화된다. 동일 문헌 참조. 일부 구현예에서, 변형된 FVIII, 예를 들어 PEG화된 FVIII는 키메라 또는 융합 FVIII이다.

용어 “하류(downstream)”는 기준 뉴클레오티드 서열에 대해 3’에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. “하류”는 기준 펩티드 서열에 대해 C-말단에 위치하는 펩티드 서열을 지칭할 수도 있다.

용어 “상류(upstream)”는 기준 뉴클레오티드 서열에 대해 5’에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. “상류”는 기준 펩티드 서열에 대해 N-말단에 위치하는 펩티드 서열을 지칭할 수도 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “조절 영역(regulatory region)”은 코딩 영역의 상류(5’ 비-코딩 서열)에, 내에, 또는 하류(3’ 비-코딩 서열)에 위치하고, 결합된 코딩 영역의 전사, RNA 처리, 안정성, 또는 번역에 영향을 미치는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 조절 영역은 프로모터, 번역 선도 서열(translation leader sequence), 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 처리 부위, 작동자 결합 부위 및 스템-루프 구조(stem-loop structure)를 포함할 수 있다. 코딩 영역의 의도가 진핵 세포에서의 발현을 위한 것이라면, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열은 일반적으로 코딩 서열의 3’에 위치하게 된다.

폴리펩티드와 같은 유전자 산물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 코딩 영역과 작동 가능하게 결합된 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 조절 요소를 포함할 수 있다. 프로모터 외의 다른 전사 조절 요소, 예를 들어, 인핸서, 오퍼레이터, 리프레서, 및 전사 종결 신호도 유전자 산물의 발현을 유도하도록 코딩 영역과 작동 가능하게 결합될 수 있다.

다양한 전사 조절 영역이 당업자에게 공지되어 있다. 이들은, 사이토메갈로바이러스(인트론-A와 함께, 최초기 프로모터), 시미안 바이러스 40(초기 프로모터), 및 (라우스 육종 바이러스와 같은) 레트로바이러스 유래의 프로모터 및 인핸서 분절과 같은(이들로 한정되지는 않음), 척추동물 세포 내에서 기능하는 전사 조절 영역을 제한없이 포함한다. 다른 전사 조절 영역은 액틴, 열충격 단백질, 태아 성장 호르몬 및 토끼 β-글로빈과 같은 척추동물 유전자 유래의 것을 비롯하여 진핵 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 다른 서열도 포함한다. 추가의 적절한 전사 조절 영역은 조직-특이적 프로모터 및 인핸서를 비롯하여 림포카인-유도성 프로모터(예: 인터페론이나 인터류킨에 의해 유도 가능한 프로모터)도 포함한다.

유사하게, 다양한 전사 조절 요소가 당업자에게 공지되어 있다. 이들은, 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종결 코돈, 및 피코나바이러스에서 유래된 요소(특히, CITE 서열로도 지칭되는 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosome entry site, 또는 IRES))를 포함하되, 이들로 한정되지 않는다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “발현(expression)”은 폴리뉴클레오티드가 유전자 산물, 예를 들어, RNA 또는 폴리펩티드를 생산하는 과정을 지칭한다.

“벡터(vector)”는 핵산을 숙주 세포 내로 클로닝하고/하거나 전달하기 위한 임의의 비히클(vehicle)을 지칭한다. 벡터는 부착된 분절의 복제물이 생성되도록 또 다른 핵산 분절이 부착될 수 있는 레플리콘(replicon)일 수 있다. “레플리콘(replicon)”은 생체 내에서 자발적 복제 단위로서 기능하는, 즉 스스로의 조절하에 복제할 수 있는 임의의 유전 요소(예: 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 지칭한다. 용어 “벡터”는 시험관 내에서, 생체 외에서, 또는 생체 내에서 핵산을 세포 내로 도입하기 위한 바이러스성 및 비-바이러스성 비히클 모두를 포함한다. 예를 들어, 플라스미드, 변형된 진핵 생물 바이러스, 또는 변형된 박테리아 바이러스를 포함하는 다수의 벡터가 당업계에 공지되어 사용된다. 적절한 벡터 내에 폴리뉴클레오티드를 삽입하는 것은 상보성 결합 말단(complementary cohesive termini)을 갖는 선택된 벡터 내에 적절한 폴리뉴클레오티드 단편을 결합시킴으로써 달성될 수 있다.

용어 “플라스미드(plasmid)”는 종종 세포의 중추적 대사(central metabolism)의 일부가 아닌 유전자를 운반하며, 일반적으로 원형 이중 가닥 DNA 분자의 형태인 염색체 이외의 요소를 지칭한다. 이러한 요소는 임의의 공급원으로부터 유래된 선형, 원형, 또는 초나선형 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA의 자율적 복제 서열, 게놈 통합 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열로서, 선택된 유전자 산물에 대한 프로모터 단편 및 DNA 서열을 적절한 3’ 미번역 서열과 함께 세포 내로 도입할 수 있는 독특한 구조로 다수의 뉴클레오티드 서열이 결합되거나 재조합된 것일 수 있다.

사용될 수 있는 진핵 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 및 수두 바이러스 벡터, 예컨대 우두 바이러스 벡터, 배큘로바이러스 벡터, 또는 헤르페스바이러스 벡터를 포함하되, 이들로 한정되지 않는다. 비-바이러스성 벡터는 플라스미드, 리포솜, 전기적으로 하전된 지질(시토펙틴), DNA-단백질 복합체, 및 바이폴리머(bipolymer)를 포함한다.

“클로닝 벡터(cloning vector)”는, 순차적으로 복제되는 단위 길이의 핵산으로서, 플라스미드, 파지 또는 코스미드와 같은 복제 기원을 포함하고, 부착된 분절의 복제물이 생성되도록 또 다른 핵산 분절이 부착될 수 있는 “레플리콘”을 지칭한다. 특정 클로닝 벡터는 박테리아와 같은 하나의 세포 유형에서 복제될 수 있고, 진핵 세포와 같은 또 다른 세포에서 발현될 수 있다. 클로닝 벡터는 일반적으로 관심 핵산 서열의 삽입을 위한 벡터 및/또는 하나 이상의 다중 클로닝 부위를 포함하는 세포의 선택에 사용될 수 있는 하나 이상의 서열을 포함한다.

용어 “발현 벡터(expression vector)”는 숙주 세포 내에 삽입된 후 삽입된 핵산 서열의 발현을 가능하게 하도록 설계된 비히클을 지칭한다. 삽입된 핵산 서열은 전술한 바와 같이 조절 영역과 작동 가능하게 결합된다.

벡터는 당업계에 잘 알려진 방법, 예를 들어, 형질감염, 전기천공, 미세주입, 형질도입, 세포 융합, DEAE 덱스트란(dextran), 인산칼슘 침전, 리포펙션(리소좀 융합), 유전자 검의 사용, 또는 DNA 벡터 수송체에 의해 숙주 세포 내에 도입된다.

“단리된(isolated)” 폴리펩티드 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체는 그의 자연 환경에는 존재하지 않는 폴리펩티드를 지칭한다. 특정 수준의 정제가 필요하지는 않다. 예를 들어, 단리된 폴리펩티드를 그의 고유 환경 또는 자연 환경으로부터 단순히 떼어낼 수 있다. 재조합에 의해 생성된 폴리펩티드 및 숙주 세포에서 발현되는 단백질은 임의의 적절한 기술에 의해 분리되었거나, 분획화되었거나, 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 고유한 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드이므로, 이들은 본 발명의 목적에 맞게 단리된 것으로 간주된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “숙주 세포(host cell)”는 재조합 핵산을 보유하고 있거나 보유할 수 있는 세포 또는 세포 개체군을 지칭한다. 숙주 세포는 원핵 세포(예: 대장균)일 수 있거나, 대안적으로, 숙주 세포는 진균류 세포(예: 사카로미세스 세레비시아, 피치아 파스토리스, 또는 스키조사카로미세스 폼베)와 같은 진핵 세포, 및 곤충 세포(예: Sf-9) 또는 포유동물 세포(예: HEK293F, CHO, COS-7, NIH-3T3)와 같은 다양한 동물 세포일 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, “정태 분포 용적(Volume of distribution at steady state; Vss)”은 약물이 분포되는 겉보기 공간(용적)으로서, 약리학에서 사용되는 용어와 동일한 의미를 지닌다. Vss = 신체 내 약물의 양 / 정태 혈장 농도.

II. 본 발명의 방법

본 개시는 Fc 영역에 융합된 응고 인자가 혈우병성 관절증을 역전시키는 데 사용될 수 있다는 발견에 기초한다. 혈우병성 관절증은, 연조직의 변화가 MRI에 의해서만 가시화될 수 있었으므로, 발병한 후에는 비가역적인 것으로 이전에 알려졌다. 혈우병성 관절증을 앓고 있는 개인을 대상으로 현재 알려진 치료 방법은 비후해진 활액막을 제거하기 위한 수술이나 경화제(sclerosing agent)를 포함한다. 방사선 물질이거나 화학 물질인 경화제는 연골과 뼈의 추가적인 퇴행을 지연시킬 수 있지만; 혈우병성 관절증을 역전시킬 수는 없다. 활액막 비후를 조절하기 위한 다른 노력이 실패하는 경우에는 무릎과 고관절의 관절성형이 동통과 운동 상실을 줄이는 데 성공적이었다. Hilgartner M.의 Current Opinion in Pediatrics: February 2002, V14, Issue 1, 46~49쪽 참조.

따라서, 본 개시는 혈우병에 걸린 인간에서 관절의 혈우병성 관절증을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 조성물(예: 키메라 단백질) 또는 키메라 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 유효량을 인간에게 투여하는 단계를 포함한다. 혈우병성 관절증의 치료는 혈우병성 관절증(예: 혈우병성 관절증의 하나 이상의 증상)을 부분적으로 또는 완전히 역전시킬 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 본 개시는 혈우병에 걸린 인간으로서, 활액막염과 같은 혈우병성 관절증이 이미 발병한 인간을 치료하는 방법을 제공한다.

일반적으로, 혈우병성 관절증은 혈우병을 앓고 있는 인간 대상체에서, 대상체의 장기적 또는 반복적 관절 내 출혈의 결과로서 발생하는 관절 질환을 지칭한다. 하나 이상의 관절 내 자발적 출혈은 혈우병 환자에서는 흔하다. 6개월의 기간 내에 여러 번의 연속 출혈이 발생한 관절은 종종 “표적 관절(target joints)”로서 지칭되며, 이들 관절은 종종 혈우병성 관절증으로 진행된다.

혈우병성 관절증은 활액막 비후(synovial hyperlacia), 만성 염증(chronic inflammation)(활액막염 포함), 섬유증(fibrosis), 혈철증(haemosiderosis), 관절하 낭포 형성(subarticular cyst formation), 동통(pain), 가동역 감소(reduced range of motion), 근위축(muscle atrophy), 관절강직(ankylosis), 골다공증(osteoporosis), 관절 공간 붕괴를 동반한 연골 퇴행(cartilage degeneration with collapse of the joint space), 및 이들의 임의의 조합을 포함하되, 이들로 한정되지 않는 다양한 증상을 나타낼 수 있다. 혈우병성 관절증은 다음과 같은 다양한 병기를 포함한다: (i) 연조직 부기를 포함하되, 골격 이상은 없는 1기; (ii) 골단(epiphysis)의 과성장 및 골다공증을 포함하되, 관절의 온전성이 유지되는 2기. 골 낭포(bone cysts)가 없으며 관절 연골 공간(articular cartilage space)의 협착도 없음. 방사선 2기 치료가 아급성 혈우병성 관절증의 임상 단계와 병행됨; (iii) 연골하 낭포를 동반하는 경증 내지 중등도 관절 공간 협착을 포함하는 3기. 무릎의 과간 절흔(intercondylar notch)과 척골(ulna)의 활차 절흔(trochlear notch)이 확장됨. 무릎에서는 슬개골 경직(squaring of patella)이 있을 수 있다. 관절 연골은 여전히 유지되고, 혈우병성 관절증은 아직 가역적임; (iv) 관절 공간의 심한 협착을 동반하는 관절 연골의 파괴를 포함하는 4기. 3기에서 발견된 다른 골격 변화가 더 확연해짐; 및 (v) 관절의 섬유상 강직(fibrous ankylosis)을 동반하는 관절 공간의 완전한 상실을 포함하는 5기. 골단의 심한 불규칙 비후를 동반하는 관절 구조의 뚜렷한 부조화가 나타남.

본 개시는 가역적 혈우병성 관절증의 증상을 감소시킬 수 있고/있거나 완화시킬 수 있는, 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 조성물(예: 키메라 단백질)을 사용하는 치료를 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물(예: 키메라 단백질)은 혈우병성 관절증의 하나 이상의 병기, 예를 들어, 1기, 2기 및/또는 3기를 치료할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, “가역적(reversible)” 혈우병성 관절증은 치료 이후 부분적으로 또는 완전히 원래의 건강한 상태로 역전될 수 있는 혈우병성 관절증의 징후(manifestation)이다. 대조적으로, “비가역적(irreversibly)” 혈우병성 관절증은 영구적이고 치료 이후에도 개선되지 않을 혈우병성 관절증의 징후이다. 따라서, 본 방법은 하나 이상의 혈우병성 관절증의 증상, 예컨대, 활액막 비후, 만성 염증(활액막염을 포함함), 혈철증, 아관절 낭포 형성, 동통, 가동역의 감소, 부기, 혈관 변형, 또는 이들의 임의의 조합을 개선, 감소, 또는 완화(또는 부분적으로 또는 완전히 역전)시킬 수 있다.

본 개시의 방법을 사용해 치료된 (가역적) 혈우병성 관절증은 신체 내 임의의 관절에 영향을 미칠 수 있다. 일부 구현예에서, 관절은 체중 부하 관절(load bearing joint), 예를 들어, 한쪽 또는 양쪽 무릎, 한쪽 또는 양쪽 발목, 한쪽 또는 양쪽 고관절, 하나 이상의 발관절, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 관절이다. 또 다른 구현예에서, 관절은 비-체중 부하 관절(non-load bearing joint), 예를 들어, 한쪽 또는 양쪽 팔꿈치, 한쪽 또는 양쪽 어깨, 한쪽 또는 양쪽 손목, 하나 이상의 손관절, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 관절이다. 또 다른 구현예에서, 관절은 무릎이다.

일부 구현예에서, 가역적 혈우병성 관절증은 활액막염(synovitis)을 포함한다. 활액막염은 관절을 둘러싼 활액막(synovial membrane)의 염증을 지칭한다. 일부 구현예에서, 활액막염은 신체의 임의의 관절에서 발생한 것이다. 일부 구현예에서, 활액막염은 관절의 부기(swelling)로서 나타나며, 본 개시의 방법은 관절의 부기를 감소시킨다. 일부 구현예에서, 활액막염은 관절의 동통(pain)으로서 나타나며, 본 개시의 방법은 관절의 동통을 감소시킨다. 다른 구현예에서, 활액막염은 관절의 가동역(range of motion) 감소로서 나타나며, 본 개시의 방법은 관절의 가동역을 증가시킨다.

다른 구현예에서, 가역적 혈우병성 관절증은 관절 내 미세출혈(microbleed)을 포함한다. 일부 구현예에서, 가역적 혈우병성 관절증은 미세출혈의 결과이다. 미세출혈은 하나 이상의 관절에서의 미량 출혈을 지칭하며, 이의 반복적인 발생은 혈우병성 관절증으로 이어질 수 있다. 일부 구현예에서, 가역적 혈우병성 관절증은 급성 관절 출혈(acute joint bleed)을 포함한다. 일부 구현예에서, 가역적 혈우병성 관절증은 급성 관절 출혈의 결과이다. 급성 관절 출혈은 하나 이상의 관절에서의 보다 실질적인 출혈을 지칭한다.

특정 구현예에서, 가역적 혈우병성 관절증은 하나 이상의 관절의 염증을 포함한다. 일부 구현예에서, 염증은 신체의 임의의 관절에서 발생한 것이다. 일부 구현예에서, 염증은 관절의 부기로서 나타나며, 본 개시의 방법은 관절의 부기를 감소시킨다. 일부 구현예에서, 염증은 관절의 동통으로서 나타나며, 본 개시의 방법은 관절의 동통을 감소시킨다. 다른 구현예에서, 염증은 관절의 가동역 감소로서 나타나며, 본 개시의 방법은 관절의 가동역을 증가시킨다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질의 유효량을 투여하기 전에, 하나 이상의 관절에서 염증을 측정하는 단계를 추가로 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질의 유효량을 투여한 후에, 하나 이상의 관절에서 염증을 측정하는 단계를 추가로 제공한다.

다른 구현예에서, 혈우병성 관절증은 관절 염증 및/또는 관절 손상과 연관된 하나 이상의 바이오마커의 발현에 의해 입증된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 바이오마커는 인간에서 상향 조절되어 관절 염증 및/또는 관절 손상이 증가하였음을 나타낸다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 바이오마커는 인간에서 하향 조절되어 관절 염증 및/또는 관절 손상이 증가하였음을 나타낸다. 일부 구현예에서, 치료를 요하는 인간은 본 개시의 방법을 사용하는 치료에 대한 반응성의 증가와 관련되는 하나 이상의 바이오마커의 발현에 기초하여 식별된다.

일부 구현예에서, 본 방법은 하나 이상의 표적 관절에 대한 응고 인자의 국소화를 증가시킨다. 특정 구현예에서, 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질은, 응고 인자가 단독으로 투여된 것보다 더 많이 투여된 후 국소화된다. 특정 구현예에서, 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질은, 응고 인자가 단독으로 투여된 것보다 더 오랜 기간 동안 투여된 후 국소화된 상태를 유지한다.

또 다른 구현예에서, 본 방법은 가역적 혈우병성 관절증에 대한 하나 이상의 마커를 나타내는 대상체를 식별하고, 이어서 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질을 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 혈우병에 걸린 인간에서 혈관 변형의 발생을 방지하거나 감소시킨다. 혈우병성 관절증과 관련된 공통 요소는 관절, 특히 표적 관절을 둘러싸는 맥관 구조(vasculature)의 변형이다. 혈관 변형(vascular remodeling)은 혈관신생(angiogenesis)의 증가 및 관절 내 미세출혈 발생의 증가를 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 혈우병에 걸린 인간에서 관절 내 혈관 변형의 발생을 예방적으로 치료하거나 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질의 유효량을 인간에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 개시는 혈우병에 걸린 인간의 관절에서 혈우병성 관절증과 관련된 기존의 혈관 변형을 역전시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질의 유효량을 인간에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 혈관 변형은 신체의 임의의 관절에서 발생한 것이다. 특정 구현예에서, 혈관 변형은 표적 관절에서 발생한 것이다. 다른 구현예에서, 혈관 변형은 표적 관절 이외의 관절에서 발생한 것이다. 특정 구현예에서, 혈관 변형은 체중 부하 관절, 예를 들어, 한쪽 또는 양쪽 무릎, 한쪽 또는 양쪽 발목, 한쪽 또는 양쪽 고관절, 하나 이상의 발관절, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 관절에서 발생한 것이다. 또 다른 구현예에서, 혈관 변형은 비-체중 부하 관절, 예를 들어, 한쪽 또는 양쪽 팔꿈치, 한쪽 또는 양쪽 어깨, 한쪽 또는 양쪽 손목, 하나 이상의 손관절, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 관절에서 발생한 것이다. 또 다른 구현예에서, 혈관 변형은 무릎에서 발생한 것이다. 일부 구현예에서, 혈관 변형은 근육에서 발생한 것이다. 일부 구현예에서, 혈관 변형은 비장 및/또는 간에서 발생한 것이다.

특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 혈우병에 걸린 인간의 관절 주변 연조직을 개선한다. 혈우병성 관절증에 대한 흔한 또 다른 병리학적 해결책은 관절의 연조직을 과다증식(hyperproliferation)시키는 것이다. 일부 구현예에서, 본 개시의 방법에 의해 개선된 연조직은 신체 내 임의의 관절 내에 있는 것이다. 일부 구현예에서, 본 개시의 방법에 의해 개선된 연조직은 표적 관절 내에 있는 것이다. 다른 구현예에서, 본 개시의 방법에 의해 개선된 연조직은 표적 관절 이외의 관절 내에 있는 것이다.

일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 관절 연조직의 과다증식과 관련된 하나 이상의 증상의 중증도를 감소시킨다. 일부 구현예에서, 관절 연조직의 과다증식은 관절의 부기로서 나타나며, 본 개시의 방법은 관절의 부기를 감소시킨다. 일부 구현예에서, 관절 연조직의 과다증식은 관절의 동통으로서 나타나며, 본 개시의 방법은 관절의 동통을 감소시킨다. 다른 구현예에서, 관절 연조직의 과다증식은 관절의 가동역 감소로서 나타나며, 본 발명의 방법은 관절의 가동역을 증가시킨다.

본원에 기술된 방법은, 치료를 받아서 혈우병성 관절증이 감소된 대상체에 대해 실행되어 하나 이상의 관절의 혈우병성 관절증이 추가로 발생하는 것을 방지할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 방법은 대상체에게 적용되어 하나 이상의 관절의 기존 혈우병성 관절증을 치료하고, 동일하거나 상이한 관절에 대한 추가적인 혈우병성 관절증의 발병을 방지한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 방법은 응고 인자가 혈장 구획 내를 비롯하여 혈장 구획 외부에도 분포될 수 있게 한다.

본 개시의 방법은 혈우병에 걸린 인간에서 하나 이상의 관절의 관절 건강을 개선한다. 관절 건강은 당업계에 알려진 임의의 척도를 사용해 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 관절 건강은 혈우병 관절 건강 점수(HJHS) 시스템을 사용해 측정된다 (http://www.wfh.org/en/page.aspx?pid=885(마지막 접속일 2016년 11월 18일)를 통해서 이용할 수 있는, Feldman 등의 "Hemophilia Joint Health Score (HJHS) 2.1"을 참조하고, 그 전체는 참조로서 본원에 통합됨). HJHS는 신체 구조의 영역에서의 관절 건강, 및 혈우병에서의 출혈에 의해 가장 흔하게 영향을 받는 관절인 무릎, 발목, 및 팔꿈치의 기능(즉, 장애)을 측정하는 것이다. HJHS는 주로 혈우병에 걸린 4~18세의 (예를 들어, 예방 치료를 받은) 경증 관절 장애를 가진 아동을 대상으로 설계되었지만, HJHS는 임의의 개체군에 적용될 수 있다. 일부 구현예에서, HJHS는 혈우병에 걸린 인간의 좌우 팔꿈치, 좌우 무릎, 및 좌우 발목의 각각을 대상으로 부기, (부기의) 지속 기간, 근위축, 활동 시 염발음, 굴곡 상실, 신전 상실, 관절 동통, 및 지구력을 측정하는 것이다. 일부 구현예에서, 각각의 파라미터에 점수(numerical score)가 할당된다. 하나의 특정한 구현예에서, 표준 HJHS, 버전 2.1이 관절 건강을 측정하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 부기는 0에서 3까지 점수가 매겨지는데, 부기가 없으면 0이고, 중증 부기는 3이다. 일부 구현예에서, 부기의 지속 기간은 0에서 1까지 점수가 매겨지는데, 부기가 없거나 지속 기간이 6개월 미만이면 0이고, 6개월 이상 부기가 지속되면 1이다. 일부 구현예에서, 근위축은 0에서 2까지 점수가 매겨지는데, 위축이 없으면 0이고, 중증 위축은 2이다. 일부 구현예에서, 활동 시 염발음은 0에서 2까지 점수가 매겨지는데, 활동 시 염발음이 없으면 0이고, 활동 시 중증 염발음은 2이다. 일부 구현예에서, 굴곡 상실은 0에서 3까지 점수가 매겨지는데, 굴곡 상실이 5° 미만이면 0이고, 굴곡 상실이 20°보다 크면 3이다. 일부 구현예에서, 신전 상실은 0에서 3까지 점수가 매겨지는데, 신전 상실이 5° 미만이면 0이고, 신전 상실이 20°보다 크면 3이다. 일부 구현예에서, 관절 동통은 0에서 2까지 점수가 매겨지는데, 전체 활성 가동역에서 동통이 없으면 0이고, 전체 활성 가동역에서 동통이 있으면 2이다. 일부 구현예에서, 전체 보행 점수가 매겨지는데, 0은 모든 동작(skill)이 정상 한계 내에 있음을 반영하는 것이고; 1,2 및 3은 각각 1, 2 및 3가지 동작이 정상 한계 내에 있지 않음을 반영하는 것이며; 4는 모든 동작이 정상 한계 내에 있지 않음을 반영하는 것이다. 특정 구현예에서, 전체 보행은 걷기(walking), 계단 오르기(stairs), 달리기(running), 및/또는 한 발로 뛰기(hopping on one leg)에 기초하여 점수가 매겨진다. 일부 구현예에서, 점수들을 취합하여 총 점수를 생성한다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 관절에 대한 개별 점수가 하나 이상의 관절에 대한 건강의 지표로서 평가된다.

다른 구현예에서, 변형된 HJHS 시스템이 관절 건강을 측정하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, mHJHS는 관절 동통 및 보행에 대한 반응 옵션이 더 적은 범주로 압축되었고, 불안정성에 대한 평가가 추가되었으며, 표준 HJHS(범위, 0~124)와 비교해 총점이 더 낮다는(범위, 0~116; 0은 정상 관절 기능을 나타내고, 116은 중증 질환을 나타냄) 점에서 표준 HJHS, 버전 2.1과 상이하다. 2주 이내의 출혈에 대한 점수는 제외되었다. 외과 수술적 중재를 겪은 관절에 대한 점수는 마지막으로 관찰된 점수를 이월시켜 사용하는 것으로 간주하였다. 매년 변화를 평가하기 위해, 4개 시점(rFVIIIFc 중추적 3상 시험 베이스라인, rFVIIIFc 연장 연구 베이스라인, rFVIIIFc 연장 연구 1년차, 및 rFVIIIFc 연장 연구 2년차)에서 mHJHS 데이터를 가진 대상체를 본 사전 분석에 포함시켰다. rFVIIIFc 중추적 3상 시험 베이스라인에서 rFVIIIFc 연장 연구 2년차까지의 mHJHS에서의 변화(음의 값은 개선을 나타냄)는 기술 통계학(descriptive statistics)을 사용해 요약하였다. rFVIIIFc 중추적 3상 시험 베이스라인에서 추적 검사 방문(follow-up visits)까지의 mHJHS에서의 변화를: (1) 총 점수(범위, 0~116; 사전 연구 처방별(예방치료 대 사례별 치료); 초기 mJHJS에 기초한 기능적 장애의 중증도별; 및 베이스라인에서 표적 관절의 존재별); (2) 표적 관절(범위, 0~19: 단일 표적 관절에 대한 모든 의문의 합); (3) 체중 부하(예: 발목 및 무릎) 및 비-체중 부하(예: 팔꿈치) 관절(범위, 0~38: 단일 부위의 좌우 관절의 합); 및 (4) 개별 구성 요소(가동역(범위, 0~36: 모든 관절의 “신전 상실[발목의 발등쪽 굴곡]” 및 “굴곡 상실[발목의 발바닥쪽 굴곡]에 대한 질문의 조합); 부기(범위, 0~24: 모든 관절의 “부기” 및 “부기 지속 기간”에 대한 질문의 조합); 및 지구력(범위, 0~6: 모든 관절의 합))에 대해 요약하였다.

일부 구현예에서, 관절 점수는 6가지 관절(왼 발목-LA, 오늘 발목-RA, 왼 팔꿈치-LE, 오른 팔꿈치-RE, 왼 무릎-LK, 오른 무릎-RK)을 대상으로 별도로 매겨진다. 일부 구현예에서, 부기는 다음에 따라 점수가 매겨진다: 0 = 없음; 1 = 경증; 2 = 중등도; 3 = 중증. 일부 구현예에서, 부기의 지속 기간은 다음에 따라 점수가 매겨진다: 0 = 부기가 없거나 지속 기간 6개월 이하; 1 = 지속 기간 6개월 초과. 일 구현예에서, 근위축은 다음에 따라 점수가 매겨진다: 0 = 없음; 1 = 경증; 2 = 중증. 일부 구현예에서, 활동 시 염발음은 다음에 따라 점수가 매겨진다: 0 = 없음; 1 = 있음. 일부 구현예에서, 발목의 발등쪽 굴곡을 포함하는 굴곡 상실은 다음에 따라 점수가 매겨진다: 0 = 없음; 1 = 경증; 2 = 중등도; 3 = 중증. 일부 구현예에서, 발목의 발바닥쪽 굴곡을 포함하는 신전 상실은 다음에 따라 점수가 매겨진다: 0 = 없음; 1 = 경증; 2 = 중등도; 3 = 중증. 일부 구현예에서, 불안정성은 다음에 따라 점수가 매겨진다: 0 = 없음; 1 = 유의한 병적 관절 이완. 일부 구현예에서, 관절 동통은 다음에 따라 점수가 매겨진다: 0 = 가동역 전체 또는 가동역 끝에서 동통 없음; 1 = 있음. 일부 구현예에서, 지구력은 다음에 따라 점수가 매겨진다: 0 = 정상(중력 및 최대 저항에 대해 위치 유지함); 1 = 최소 감소(중력 및 최대 저항이 아닌 중등도 저항에 대해 위치 유지함); 2 = 경미한 감소(중력 또는 최소 저항에 대해 위치 유지함); 3 = 중등도 감소(중력이 없으면 움직일 수 있음); 4 = 중증 감소(따라 움직이거나 근수축 없음). 특정 구현예에서, 무릎과 팔꿈치에서 굴곡 상실과 신전 상실에 점수를 매기는 경우, 다음이 적용된다: 없음 = 대략 0~5도; 경미함 = 대략 5~10도; 중등도 = 대략 11~20도; 및 중증 = 대략 20도 초과.

일부 구현예에서, 보행은 한 번 점수가 매겨지며(범위는 0~2임), 여기서 0 = 걷거나 계단을 오르내리는 데 어려움 없음; 1 = 걷는데 어려움은 없으나, 계단은 오르내리기 어려움; 및 2 = 걷는 것 및 계단 오르내리기 어려움.

특정 구현예에서, 관절 점수는 다음의 범주 및 등급(범위는 각 관절에 대해 0~19이며, 6가지 관절 모두에 대해서는 0~114임)에 따라 6가지 관절(왼 발목-LA, 오른 발목-RA, 왼 팔꿈치-LE, 오른 팔꿈치-RE, 왼 무릎-LK, 오른 무릎-RK)에 대해 매겨진다: 부기(0 = 없음; 1 = 경증; 2 = 중동도; 3 = 중증); 부기의 지속 기간(0 = 부기가 없거나 지속 기간이 6개월 이하; 1 = 지속 기간이 6개월 초과); 근위축(0 = 없음; 1 = 경증; 2 = 중증); 활동 시 염발음(0 = 없음; 1 = 있음); 발목의 발바닥쪽 굴곡을 포함하는 굴곡 상실(0 = 없음; 1 = 경증; 2 = 중등도; 3 = 중증); 발목의 발등쪽 굴곡을 포함하는 신전 상실(0 = 없음; 1 = 경증; 2 = 중등도; 3 = 중증); 불안정성(0 = 없음; 1 = 유의한 병적 관절 이환); 관절 동통(0 = 가동역 전체 또는 가동역 끝에서, 동통 없음; 1 = 있음); 지구력(0 = 정상(중력 및 최대 저항에 대해 위치 유지함); 1 = 최소 감소(중력 및 최대 저항이 아닌 중등도 저항에 대해 위치 유지함); 2 = 경미한 감소(중력 또는 최소 저항에 대해 위치 유지함); 3 = 중등도 감소(중력이 없으면 움직일 수 있음); 4 = 중증 감소(따라 움직이거나 근수축 없음); 여기서, 무릎과 팔꿈치에서 굴곡 상실과 신전 상실에 점수를 매기는 경우, 다음이 적용됨: 없음 = 대략 0~5도; 경미함 = 대략 5~10도; 중등도 = 대략 11~20도; 및 중증 = 대략 20도 초과.

일부 구현예에서, 본 개시는 혈우병에 걸린 인간에서 관절의 가역적 혈우병성 관절증을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질의 유효량을 인간에게 투여하는 단계를 포함하되, 투여는 투여 이전의 HJHS 점수에 비해 인간의 HJHS 점수를 개선한다. 일부 구현예에서, HJHS 점수는 총 HJHS 점수이며, 측정된 모든 관절 점수의 합에 전체 보행 점수를 더한 것을 포함한다. 일부 구현예에서, HJHS 점수는 총 HJHS 점수이며, 측정된 모든 관절 점수의 합을 포함하되 전체 보행 점수는 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, HJHS 점수는 한쪽 또는 양쪽 팔꿈치, 한쪽 또는 양쪽 무릎, 한쪽 또는 양쪽 발목, 또는 이들의 임의의 조합을 대상으로 한다. 하나의 특정한 구현예에서, HJHS 점수는 팔꿈치에 대한 것이다. 또 다른 구현예에서, HJHS 점수는 무릎에 대한 것이다. 또 다른 구현예에서, HJHS 점수는 발목에 대한 것이다. 또 다른 구현예에서, HJHS 점수는 전체 보행을 반영한 것이다.

일부 구현예에서, 본 개시는 혈우병에 걸린 인간에서 관절의 가역적 혈우병성 관절증을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질의 유효량을 인간에게 투여하는 단계를 포함하되, 투여는 인간에서 관절 동통을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 관절 동통은 투여 이전의 관절 동통에 비해 감소된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질의 유효량을 투여하기 전에, 하나 이상의 관절에서 관절 동통을 측정하는 단계를 추가로 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질의 유효량을 투여한 후에, 하나 이상의 관절에서 관절 동통을 측정하는 단계를 추가로 제공한다.

특정 구현예에서, 본 방법의 효과는 인간의 하나 이상의 관절에서 관찰된다. 일부 구현예에서, 본 방법의 효과는 적어도 하나의 관절에서 관찰된다. 일부 구현예에서, 본 방법의 효과는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7게, 적어도 8개, 적어도 9개, 또는 적어도 10개의 관절에서 관찰된다.

일부 구현예에서, 본 개시의 방법은 치료를 요하는 인간을 식별하는 단계, 예를 들어, 혈우병성 관절증에 걸린 대상체를 식별하는 단계를 추가로 포함한다. 혈우병성 관절증는 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용해 검출 및/또는 모니터링될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체에서 혈우병성 관절증의 검출 및/또는 모니터링 하는 데 영상 시스템이 사용된다. 일부 구현예에서, 영상 시스템은 관절을 특성화하는 데 사용되는 당업계에 알려진 임의의 영상 시스템을 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 영상 시스템은 방사선 촬영, 자기 공명 영상, 초음파영상, 파워 도플러 초음파영상, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

일부 구현예에서, 대상체는 Fc 부분에 융합되지 않은 응고 인자로 이전에 치료받은 적이 있다. 응고 인자는 전장 응고 인자 또는 성숙 응고 인자일 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 응고 인자는 ADVATE®, RECOMBINATE®, KOGENATE FS®, HELIXATE FS®, XYNTHA®/REFACTO AB®, HEMOFIL-M®, MONARC-M®, MONOCLATE-P®, HUMATE-P®, ALPHANATE®, KOATE-DVI®, AFSTYLA®, 및 HYATE:C®, IDELVION®일 수 있다.

II.A. 키메라 단백질

본원에 개시된 가역적 혈우병성 관절증을 치료하는 방법은 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질에 일반적으로 적용될 수 있으며, 여기서 응고 인자는 임의의 알려진 응고 인자, 이의 단편, 또는 이의 변이체일 수 있고, Fc 영역은 임의의 알려진 Fc 영역, 이의 단편, 또는 이의 변이체일 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 키메라 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 응고 인자는 인자 VII (FVII), 인자 VIIa (FVIIa), 인자 VIII (FVIII), 인자 IX (FIX), 인자 X (FX), 폰 빌레브란트 인자 (VWF), 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 따라서, FVIIIFc 및 FIXFc 키메라 폴리펩티드 및 이의 용도에 관한 본 개시는 응고 인자 부분 및 Fc 부분을 포함하는 다른 키메라 폴리펩티드에 균등하게 적용될 수 있다. 임의의 응고 인자 또는 이의 단편이나 변이체가 본 개시의 방법에 사용될 수 있다.

임의의 이론에 구애됨이 없이, 응고 인자에 융합된 Fc 영역은 가역적 혈우병성 관절증을 치료하는 데 유용한 것으로 여겨진다. 혈우병에서의 염증은 관절 내 출혈 도중에 발생한다. 혈우병성 관절증에 관여하는 염증성 사이토카인인 TNF-α은 NF-κB 신호 전달을 유도하여 인간 단핵구에서 FcRn 발현을 상향 조절하는 것으로 나타났다(Liu 등의 J Immunol, 2007. 179(5): p. 2999-3011 참조). 이에 따라 FcRn은 염증 부위에서 상향 조절되어, 염증 과정 조절의 일환으로 Fc-함유 단백질이 수용체 Fc 수용체에 결합하여 염증 부위에 국소화되도록 할 수 있다. 응고 인자에 융합된 Fc 영역도, 면역 제어와 염증 경로를 하향 조절시킬 수 있는 억제 Fc 수용체와 상호작용할 수 있다. 예를 들어, rFVIIIFc는 Fc 신생아 수용체(FcRn)를 차단하고 Fcγ 수용체(FcγR)를 활성화시켜, 전염증 분자 및 항염증 분자의 수준을 변경시킬 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 키메라 단백질의 Fc 영역은 관절, 예를 들어 염증 부위 및/또는 부상 부위 및/또는 손상 부위에 대해 키메라 단백질의 국소화를 촉진한다.

다른 구현예에서, 응고 인자는 응고 인자 모방체(mimic)일 수 있다. 응고 인자 모방체는 하나 이상의 응고 인자 활성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 항체 결합 부분은 인자 IX 및 인자 X 모두에 결합함으로써 FVIII처럼 작용할 수 있다. 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 Fc 영역을 포함하는 경우, 이러한 항체 또는 항원 결합 부분이 본 방법에 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 FVIII 활성을 가진 펩티드이다.

이와 관련하여, 본 개시는 가역적 혈우병성 관절증의 치료를 요하는 대상체에서 이를 치료하는 방법을 일반적으로 제공하며, 상기 방법은 응고 인자 부분 및 Fc 부분을 포함하는 키메라 폴리펩티드를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

II.A.1. 인자 VIII

본원에서 사용된 바와 같이, 본원 전반에 걸쳐 “FVIII”로서 약칭되는 “인자 VIII(factor VIII)”는 달리 명시되지 않는 한, 응고에 있어서 정상적인 역할을 하는 기능적 FVIII 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, 용어 FVIII는 기능적인 변이체 폴리펩티드를 포함한다. “FVIII 단백질”은 FVIII 폴리펩티드(또는 단백질) 또는 FVIII와 상호 교환적으로 사용된다. FVIII의 기능에 대한 예는, 응고를 활성화하는 능력, 인자 IX에 대한 공동인자(cofactor)로서 작용하는 능력, 또는 Ca²⁺ 및 인지질의 존재 하에 인자 IX와 테나아제(tenase) 복합체를 형성하고, 이어서 인자 X를 활성화 형태인 Xa로 전환시키는 능력을 포함하되, 이들로 한정되지 않는다. FVIII 단백질은 인간, 돼지, 개, 랫트, 또는 쥣과 FVIII 단백질일 수 있다. 또한, 인간과 다른 종의 FVIII를 비교하여 기능에 필요할 것으로 보이는 보존된 잔기를 동정하였다(Cameron 등의, Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998); 미국 특허 제6,251,632호 참조). 전장 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 서열은 많은 기능적 단편, 돌연변이체 및 변형된 형태로서 알려져 있다. 다양한 FVIII 아미노산 및 뉴클레오티드 서열이, 예를 들어, 미국 공개 제2015/0158929 A1호, 제2014/0308280 A1호, 및 제2014/0370035 A1호, 및 국제 공개 제WO 2015/106052 A1호에 개시되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 통합된다. FVIII 폴리펩티드는, 예를 들어, 전장 FVIII, N-말단에서 Met가 결실된 전장 FVIII, 성숙 FVIII(신호 서열이 결실됨), N-말단에서 추가 Met를 갖는 성숙 FVIII, 및/또는 B 도메인이 전체적으로 또는 부분적으로 결실된 FVIII를 포함한다. FVIII 변이체는 B 도메인의 부분적 또는 전체적 결실을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 키메라 단백질 또는 조성물의 FVIII는 B 도메인이 결실된 FVIII를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, FVIII의 “B 도메인”은, 내부 아미노산의 서열 동일성 및 트롬빈에 의한 단백질 가수 분해 절단 부위, 예를 들어, 성숙 인간 FVIII의 잔기 Ser741/Arg1648에 의해 정의되는 당업계에 알려진 B 도메인과 동일하다. 다른 인간 FVIII 도메인은 다음의 아미노산 잔기에 의해 성숙 인간 FVIII에 대해 상대적으로 정의된다: A1, 성숙 FVIII의 잔기 Ala1-Arg372; A2, 성숙 FVIII의 잔기 Ser373-Arg740; A3, 성숙 FVIII의 잔기 Ser1690-Ile2032; C1, 성숙 FVIII의 잔기 Arg2033-Asn2172; C2, 성숙 FVIII의 잔기 Ser2173-Tyr2332. 달리 명시되지 않는 한, 임의의 서열번호를 지칭하지 않고 본원에서 사용된 서열 잔기 번호는 신호 펩티드 서열(19 아미노산)이 없는 FVIII 서열에 상응한다. FVIII 중쇄로도 알려진 A3-C1-C2 서열은 잔기 Ser1690/Tyr2332를 포함한다. 잔여 서열인 잔기 Glu1649/Arg1689는 일반적으로 FVIII 경쇄 활성화 펩티드로서 지칭된다. 돼지, 마우스, 및 개 FVIII에 대한 B 도메인을 포함하여, 모든 도메인에 대한 경계의 위치도 당업계에 알려져 있다. 일 구현예에서, FVIII의 B 도메인이 결실된다(“B-도메인-결실 FVIII” 또는 “BDD FVIII”). BDD FVIII의 일 예는 REFACTO^® (재조합 BDD FVIII)이다. 하나의 특정한 구현예에서, B 도메인이 결실된 FVIII 변이체는 성숙 FVIII의 아미노산 잔기 746 내지 1648의 결실을 포함한다.

"B-도메인-결실 FVIII"는 미국 특허 제6,316,226호, 제6,346,513호, 제7,041,635호, 제5,789,203호, 제6,060,447호, 제5,595,886호, 제6,228,620호, 제5,972,885호, 제6,048,720호, 제5,543,502호, 제5,610,278호, 제5,171,844호, 제5,112,950호, 제4,868,112호, 및 제6,458,563호 및 국제 공개 제WO 2015106052 A1호 (PCT/US2015/010738)에 개시된 전체 결실 또는 부분 결실을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 방법에 사용된 B-도메인-결실 FVIII 서열은 미국 특허 제6,316,226호의 4란 4행 내지 5란 28행, 및 실시예 1~5에 개시된(미국 특허 제6,346,513호에도 개시됨) 결실 중 어느 하나를 포함한다. 또 다른 구현예에서, B-도메인 결실 인자 VIII는 S743/Q1638 B-도메인 결실 인자 VIII(SQ BBB FVIII)(예를 들어, 아미노산 744에서 아미노산 1637까지 결실된 인자 VIII, 예를 들어, 성숙 FVIII의 아미노산 1~743 및 아미노산 1638~2332를 갖는 인자 VIII)이다. 일부 구현예에서, 본 개시의 방법에 사용된 B-도메인-결실 FVIII는 미국 특허 제5,789,203호의 2란 26 내지 51행 및 실시예 5 내지 8에 개시된(미국 특허 제6,060,447호, 제5,595,886호, 및 제6,228,620호에도 개시됨) 결실을 갖는다. 일부 구현예에서, B-도메인-결실 인자 VIII는 미국 특허 제5,972,885호의 1란 25행 내지 2란 40행; 미국 특허 제6,048,720호의 6란 1~22행, 및 실시예 1; 미국 특허 제5,543,502호의 2란 17~46행; 미국 특허 제5,171,844호의 4란 22행 내지 5란 36행; 미국 특허 제5,112,950호의 2란 55~68행, 도 2, 및 실시예 1; 미국 특허 제4,868,112호의 2란 2행 내지 19란 21행 및 표 2; 미국 특허 제7,041,635호의 2란 1행 내지 3란 19행, 3란 40행 내지 4란 67행, 7란 43행 내지 8란 26행, 및 11란 5행 내지 13란 39행; 또는 미국 특허 제6,458,563호의 4란 25~53행에 기술된 결실을 갖는다. 일부 구현예에서, B-도메인-결실 FVIII는 WO 91/09122에 개시된 바와 같이 대부분의 B 도메인의 결실을 갖지만, 일차 번역 산물을 2개의 폴리펩티드 사슬로 생체 내에서 단백질 가수 분해 처리하는 데 필수적인 B 도메인의 아미노-말단 서열을 여전히 포함한다. 일부 구현예에서, B-도메인-결실 FVIII는 아미노산 747~1638이 결실되어, 즉 B 도메인이 사실상 완전한 결실되어 작제된다. Hoeben R.C., 등의. J. Biol. Chem. 265 (13): 7318-7323 (1990) 참조. B-도메인-결실 인자 VIII는 아미노산 771~1666 또는 아미노산 868~1562의 결실을 포함할 수도 있다. Meulien P., 등의 Protein Eng. 2(4): 301-6 (1988) 참조. 본 발명의 일부분인, 추가적인 B 도메인 결실은: 아미노산 982 내지 1562 또는 760 내지 1639의 결실(Toole 등의, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1986) 83, 5939-5942) 참조), 797 내지 1562의 결실(Eaton, 등의 Biochemistry (1986) 25:8343-8347) 참조), 741 내지 1646의 결실(Kaufman (PCT 공개 출원 제WO 87/04187호) 참조), 747 내지 1560의 결실(Sarver, 등의 DNA (1987) 6:553-564) 참조), 741 내지 1648(Pasek (PCT 출원 제88/00831호) 참조), 또는 816 내지 1598 또는 741 내지 1648의 결실(Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) No 82:16-25, EP 295597) 참조)을 포함한다. 하나의 특정한 구현예에서, B-도메인-결실 FVIII는 성숙 FVIII의 아미노산 잔기 746 내지 1648의 결실을 포함한다. 또 다른 구현예에서, B-도메인-결실 FVIII는 성숙 FVIII의 아미노산 잔기 745 내지 1648의 결실을 포함한다.

다른 구현예에서, BDD FVIII는 전장 FVIII 서열의 아미노산 서열에 상응하는 하나 이상의 N-연결된 글리코실화 부위, 예를 들어, 잔기 757, 784, 828, 900, 963, 또는 선택적으로는 943을 보유한 B-도메인의 단편을 함유하는 FVIII 폴리펩티드를 포함한다. B-도메인 단편의 예는 Miao, H.Z., 등의 Blood 103(a): 3412-3419 (2004), Kasuda, A, 등의 J. Thromb. Haemost. 6: 1352-1359 (2008), 및 Pipe, S.W., 등의 J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011)에 개시된 B-도메인의 226개 아미노산 또는 163개 아미노산을 포함한다(즉, B 도메인의 첫 226개의 아미노산 또는 163개의 아미노산을 보유한다). 여전히 다른 구현예에서, BDD FVIII는 BDD FVIII 단백질의 발현을 개선하기 위한 (Phe에서 Ser로의) 점 돌연변이를 잔기 309에서 추가로 포함한다. Miao, H.Z., 등의 Blood 103(a): 3412-3419 (2004) 참조. 여전히 다른 구현예에서, BDD FVIII는, B-도메인의 일부를 함유하되 하나 이상의 퓨린 절단 부위(예: Arg 1313 및 Arg 1648)는 함유하지 않는 FVIII 폴리펩티드를 포함한다. Pipe, S.W., 등의 J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011) 참조. 일부 구현예에서, BDD FVIII는 성숙 전장 FVIII에 상응하는 아미노산 765 내지 1652의 결실을 함유하는 단쇄 FVIII(rVIII-SingleChain 및 AFSTYLA®로도 알려짐)를 포함한다. 미국 특허 제7,041,635호 참조. 전술한 결실의 각각은 임의의 FVIII 서열에서 이루어질 수 있다.

위와 아래에서 논의되는 바와 같이, 상당히 많은 기능적 FVIII 변이체가 알려져 있다. 또한, 수 백 가지의 FVIII에서의 비 기능적 돌연변이가 혈우병 환자에서 동정되었는데, 돌연변이가 FVIII의 기능에 미치는 효과는 치환의 성질에 기인하기 보다는 이들이 FVIII의 3-차원 구조 내에 존재하는 것에 더 기인하는 것으로 밝혀졌다(그 전체가 참조로서 본원에 통합된 Cutler 등의 Hum. Mutat. 19:274-8 (2002) 참조). 또한, 인간과 다른 종의 FVIII를 비교하여 기능에 필요할 것으로 보이는 보존된 잔기를 동정하였다(그 전체가 참조로서 본원에 통합된 Cameron 등의, Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998); 미국 특허 제6,251,632호 참조).

일부 구현예에서, FVIII 및 Fc 영역을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질의 유효량은 Fc 영역이 없는 FVIII의 유효량과 동등하다. 특정 구현예에서, 유효량은 약 10 IU/Kg 내지 약 300 IU/Kg이다. 일부 구현예에서, 유효량은 약 20 IU/kg 내지 약 300 IU/kg이다. 일부 구현예에서, 유효량은 약 20 IU/kg 내지 약 250 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 200 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 190 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 180 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 170 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 160 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 150 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 140 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 130 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 120 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 110 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 90 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 80 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 70 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 60 IU/kg, 약 25 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 25 IU/kg 내지 약 90 IU/kg, 약 25 IU/kg 내지 약 80 IU/kg, 약 25 IU/kg 내지 약 70 IU/kg, 약 25 IU/kg 내지 약 65 IU/kg이다. 일 구현예에서, 유효량은 약 20 IU/kg 내지 약 100 IU/kg이다. 또 다른 구현예에서, 유효량은 약 25 IU/Kg 내지 약 65 IU/Kg이다. 또 다른 구현예에서, 유효량은 약 20 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 30 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 40 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 50 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 60 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 70 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 80 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 90 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 90 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 80 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 70 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 60 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 50 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 40 IU/kg, 또는 약 20 IU/kg 내지 약 30 IU/kg이다.

일부 구현예에서, 유효량은 약 10 IU/kg, 약 15 IU/kg, 약 20 IU/kg, 약 25 IU/kg, 약 30 IU/kg, 약 35 IU/kg, 약 40 IU/kg, 약 45 IU/kg, 약 50 IU/kg, 약 55 IU/kg, 약 60 IU/kg, 약 65 IU/kg, 약 70 IU/kg, 약 75 IU/kg, 약 80 IU/kg, 약 85 IU/kg, 약 90 IU/kg, 약 95 IU/kg, 약 100 IU/kg, 약 105 IU/kg, 약 110 IU/kg, 약 115 IU/kg, 약 120 IU/kg, 약 125 IU/kg, 약 130 IU/kg, 약 135 IU/kg, 약 140 IU/kg, 약 145 IU/kg, 약 150 IU/kg, 약 155 IU/kg, 약 160 IU/kg, 약 165 IU/kg, 약 170 IU/kg, 약 175 IU/kg, 약 180 IU/kg, 약 185 IU/kg, 약 190 IU/kg, 약 195 IU/kg, 약 200 IU/kg, 약 225 IU/kg, 약 250 IU/kg, 약 275 IU/kg, 또는 약 300 IU/kg이다. 일 구현예에서, 유효량은 약 50 IU/kg이다. 또 다른 구현예에서, 유효량은 약 100 IU/Kg이다. 또 다른 구현예에서, 유효량은 약 200 IU/Kg이다.

FVIII 및 Fc 영역 또는 이들의 단편을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질을 투여할 때의 투여 간격은 Fc 도메인이 없는 상기 응고 인자의 동등한 투여량에 대해 필요한 투여 간격보다 적어도 약 1.5배 더 길 수 있다. 투여 간격은 Fc 도메인이 없는 상기 FVIII의 동등한 투여량에 대해 필요한 투여 간격보다 적어도 약 1.5 내지 6배 더 길거나, 1.5 내지 5배 더 길거나, 1.5 내지 4배 더 길거나, 1.5 내지 3배 더 길거나, 1.5 내지 2배 더 길 수 있다.

일부 구현예에서, FVII 및 Fc 영역을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질의 유효 투여량은 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일, 약 16일, 약 17일, 약 18일, 약 19일, 약 20일, 약 21일, 약 22일, 약 23일, 또는 약 24일의 투여 간격으로 인간에게 투여된다. 일부 구현예에서, FVIII 및 Fc 영역을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질의 유효 투여량은 약 25일, 약 26일, 약 27일, 약 28일, 약 29일, 약 30일, 약 45일, 또는 약 60일의 투여 간격으로 인간에게 투여된다.

일부 구현예에서, FVIII 및 Fc 영역을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질은 약 1 내지 약 14일, 약 1 내지 약 13일, 약 1 내지 약 12일, 약 1 내지 약 11일, 약 1 내지 약 10일, 약 1 내지 약 9일, 약 1 내지 약 8일, 약 1 내지 약 7일, 약 1 내지 약 6일, 약 1 내지 약 5일, 약 1 내지 약 4일, 약 1 내지 약 3일, 약 1 내지 약 2일, 약 2 내지 약 14일, 약 3 내지 약 14일, 약 4 내지 약 14일, 약 5 내지 약 14일, 약 6 내지 약 14일, 약 7 내지 약 14일, 약 8 내지 약 14일, 약 9 내지 약 14일, 약 10 내지 약 14일, 약 11 내지 약 14일, 약 12 내지 약 14일, 약 13 내지 약 14일, 또는 약 5 내지 약 10일의 투여 간격으로 투여된다. 다른 구현예에서, FVIII 및 Fc 영역을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질은 약 1 내지 약 21일, 약 1 내지 약 20일, 약 1 내지 약 19일, 약 1 내지 약 18일, 약 1 내지 약 17일, 약 1 내지 약 16일, 약 1 내지 약 15일, 약 1 내지 약 14일, 약 1 내지 약 13일, 약 1 내지 약 12일, 약 1 내지 약 11일, 약 1 내지 약 10일, 약 1 내지 약 9일, 약 1 내지 약 8일, 약 1 내지 약 7일, 약 1 내지 약 6일, 약 1 내지 약 5일, 약 1 내지 약 4일, 약 1 내지 약 3일, 약 1 내지 약 2일, 약 2 내지 약 21일, 약 3 내지 약 21일, 약 4 내지 약 21일, 약 5 내지 약 21일, 약 6 내지 약 21일, 약 7 내지 약 21일, 약 8 내지 약 21일, 약 9 내지 약 21일, 약 10 내지 약 21일, 약 11 내지 약 21일, 약 12 내지 약 21일, 약 13 내지 약 21일, 약 14 내지 약 21일, 약 15 내지 약 21일, 약 16 내지 약 21일, 약 17 내지 약 21일, 약 18 내지 약 21일, 약 19 내지 약 21일, 약 20 내지 약 21일, 약 5 내지 약 10일, 약 10 내지 약 15일, 약 15 내지 약 20일의 투여 간격으로 투여된다. 특정 구현예에서, FVIII 및 Fc 영역을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질은 약 2 내지 약 6일의 투여 간격으로 투여된다. 또 다른 구현예에서, FVIII 및 Fc 영역을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질은 약 3 내지 약 5일의 투여 간격으로 투여된다.

일 구현예에서, 유효 투여량은 25~65 IU/kg(25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 62, 64, 또는 65 IU/kg)이고 투여 간격은 3~5, 3~6, 3~7, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8일, 또는 그 이상마다 1회, 주 3회, 또는 주 3회 이하이다. 또 다른 구현예에서, 유효 투여량은 65 IU/kg이며 투여 간격은 주 1회, 또는 6~7일마다 1회이다. 투여량은 필요한 만큼 (예를 들어, 적어도 10, 20, 28, 30, 40, 50, 52 또는 57주, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10년 동안) 반복적으로 투여될 수 있다. 하나의 특정한 구현예에서, 유효 투여량은 약 25~65 IU/kg이며 투여 간격은 3~5일마다 1회이다.

FVIII 및 Fc 영역을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질은, 예를 들어, 국소(예: 경피 또는 안구), 경구, 구강, 비강, 질, 직장 또는 비경구 투여를 포함하는 임의의 적절한 투여 방식에 맞게 제형될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “비경구(parenteral)”는 피하, 피내, 혈관 내(예를 들어, 정맥 내), 근육 내, 척추, 두개 내, 척수강 내, 안구 내, 안구 주위, 안와 내, 활막 내 및 복막 내 주사뿐만 아니라 유사한 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 조성물은 예를 들어, 현탁액, 유화액, 서방성 제형(sustained release formulation), 크림, 젤 또는 분말일 수도 있다. 조성물은 전통적인 결합제 및 트리글리세리드와 같은 담체와 함께 좌약(suppository)으로서 제형될 수 있다.

하나의 실시예에서, 약제학적 제형은 액체 제형, 예를 들어, 완충액, 등장액, 수용액이다. 또 다른 실시예에서, 약제학적 조성물은 생리적 pH 또는 이에 근접한 pH를 갖는다. 다른 실시예에서, 수성 제형은 생리적 삼투도(osmolarity) 및 염도(salinity) 또는 이에 근접한 삼투도 및 염도를 갖는다. 수성 제형은 염화나트륨 및/또는 아세트산나트륨을 함유할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용된 FVIII 및 Fc 영역을 포함하는 키메라 단백질은: (a) 키메라 폴리펩티드; (b) 수크로오스(sucrose), 트레할로스(trehalose), 라피노오스(raffinose), 아르기닌, 또는 이들의 혼합물로부터 선택된 하나 이상의 안정화제; (c) 염화나트륨(NaCl); (d) L-히스티딘; (e) 염화칼슘; 및 (f) 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함하는 약제학적 조성물로 제형된다. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은: (a) 50 IU/ml 내지 2500 IU/ml의 키메라 폴리펩티드; (b) 10 mg/ml 내지 25 mg/ml의 수크로오스; (c) 8.8 mg/ml 내지 14.6 mg/ml의 염화나트륨(NaCl); (d) 0.75 mg/ml 내지 2.25 mg/ml의 L-히스티딘; (e) 0.75 mg/ml 내지 1.5 mg/ml의 염화칼슘 이수화물; 및 (f) 0.08 mg/ml 내지 0.25 mg/ml의 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 방법에 사용된 약제학적 조성물은 동결 건조된다.

일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 면역 세포를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 세포를 포함하지 않는다.

I I.A.2. 인자 IX

인간 인자 IX(FIX)는 혈액 응고 연쇄반응의 내재 경로의 중요 성분인 세린 프로테아제이다. 본원에서 사용된 바와 같이, “인자 IX” 또는 “FIX”는 응고 인자 단백질 및 이의 종 및 서열 변이체를 지칭하며, 인간 FIX 전구체 폴리펩티드(“prepro”)의 461 단쇄 아미노산 서열, 성숙 인간 FIX의 415 단쇄 아미노산 서열, 및 R338 FIX(파두아) 변이체를 포함하되, 이들로 한정되지 않는다. FIX는 혈액 응고 FIX의 전형적인 특징을 갖는 임의 유형의 FIX 분자를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, “인자 IX” 및 “FIX”는 Gla(γ-카복시글루탐산 잔기를 함유하는 영역), EGF1 및 EGF2(인간 상피 성장 인자에 대해 상동인 서열을 함유하는 영역) 도메인, 활성화 펩티드(성숙 FIX의 잔기 R136~R180에 의해 형성된 “AP”), 및 C-말단 프로테아제 도메인("Pro"), 또는 당업계에 알려진 이들 도메인의 동의어를 포함하는 폴리펩티드를 포함하도록 의도되거나, 천연 단백질의 생물학적 활성 중 적어도 일부를 보유한 절단된 단편 또는 서열 변이체일 수 있다.

FIX 또는 서열 변이체는 미국 특허 제4,770,999호 및 제7,700,734호에 기술된 바와 같이 클로닝된 것이고, 인간 인자 IX에 대한 cDNA 코딩은 발현 벡터 내로 단리되고, 특성화되고, 클로닝된 것이다(예를 들어, Choo 등의 Nature 299:178-180 (1982); Fair 등의 Blood 64:194-204 (1984); 및 Kurachi 등의 Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 79:6461-6464 (1982) 참조). Simioni 등(2009)에 의해 특성화된, FIX 중 하나의 특정 변이체인 R338L FIX(파두아) 변이체는 천연 FIX에 비해 파두아 변이체의 활성을 거의 8배 증가시키는 것과 상관되는 기능획득 돌연변이(gain-of-function mutation)를 포함한다. FIX 변이체는 FIX 폴리펩티드의 FIX 활성에 영향을 미치지 않는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 FIX 폴리펩티드를 포함할 수도 있다.

일부 구현예에서, FIX는 응고 인자 IX(재조합)인 알부민 융합 단백질(rIX-FP 및 IDELVION®으로도 알려짐)을 포함한다.

FIX 폴리펩티드 55 kDa이며, 다음의 3가지 영역으로 이루어진 전구체폴리펩티드(prepropolypetide) 사슬로서 합성된다: 28개의 아미노산(아미노산 1 내지 28)으로 이루어진 신호 펩티드; 글루탐산 잔기의 감마-카르복실화에 필요한 18개의 아미노산(아미노산 29 내지 46)으로 이루어진 프로펩티드(propetide); 및 415개의 아미노산으로 이루어진 성숙 인자 IX. 프로펩티드는 감마-카르복시글루탐산염 도메인에 대해 N-말단에 있는 18-아미노산 잔기 서열이다. 프로펩티드는 비타민 K-의존성 감마 카르복실라아제에 결합한 다음, 내인성 프로테아제에 의해, 거의 대부분은 PACE(쌍을 이룬 염기성 아미노산 절단 효소(paired basic amino acid cleaving enzyme); 퓨린 또는 PCSK3로도 알려져 있음)에 의해 FIX의 전구체 폴리펩티드로부터 절단된다. 감마 카르복실화가 없으면, Gla 도메인은 음으로 하전된 인지질에 단백질을 고정시키는 데 필요한 정확한 구조를 취하기 위해 칼슘에 결합할 수가 없으므로, 인자 IX를 비 기능적으로 만든다. 비록 카르복실화된다고 하더라도, 보유된 프로펩티드가 칼슘과 인지질에 대한 최적 결합에 필요한 Gla 도메인의 구조 변화를 방해하므로, Gla 도메인은 또한 적절한 기능을 위해 프로펩티드의 절단에 의존한다. 인간의 경우, 생성된 성숙 인자 IX는, 415개의 아미노산 잔기로 이루어지고 약 17 중량%의 탄수화물을 함유하는 단쇄 단백질인 비활성 치모겐(zymogen)으로서 간 세포에 의해 혈류 내로 분비된다(Schmidt, A. E. 등의 (2003) Trends Cardiovasc Med, 13: 39 참조).

성숙 FIX는 N-말단에서 C-말단으로의 구성에 있어서의 여러 개의 도메인, 즉 GLA 도메인, EGR1 도메인, EFG2 도메인, 활성화 펩티드(AP) 도메인, 및 프로테아제(또는 촉매) 도메인으로 이루어진다. 짧은 링커(short linker)는 EGF2 도메인을 AP 도메인과 연결시킨다. FIX는 R145-A146 및 R180-V181에 의해 각각 형성된 2개의 활성화 펩티드를 포함한다. 활성화에 이어서, 단쇄 FIX는 2개의 사슬이 이황화 결합에 의해 연결된 2-사슬 분자가 된다. 응고 인자는 이들의 활성화 펩티드를 치환하여 활성화 특이성을 변경함으로써 조작될 수 있다. 포유동물의 경우, 인자 IXa를 생성하기 위해서는 성숙 FIX가 활성화된 인자 XI에 활성화되어야만 한다. FIX가 활성화되어 FIXa가 되면, 프로테아제 도메인은 FIX의 촉매 활성을 제공한다. 활성화된 인자 VIII(FVIIIa)는 FIXa 활성의 완전 발현을 위한 특이적 공동 인자이다.

다른 구현예에서, FIX 폴리펩티드는 혈장 유래 인자 IX의 Thr148 대립유전자 형태를 포함하고, 내인성 인자 IX와 유사한 구조적 및 기능적 특징을 갖는다.

대단히 많은 기능적 FIX 변이체가 알려져 있다. 국제 공개 제WO 02/040544 A3호의 4쪽 9~30행 및 15쪽 6~31행에는 헤파린에 의한 억제에 대해 내성 증가를 나타내는 돌연변이체들이 개시되어 있다. 국제 공개 제WO 03/020764 A2호의 표 2와 3(14~24쪽), 및 12쪽 1~17행에는 T 세포 면역원성이 감소된 FIX 돌연변이체들이 개시되어 있다. 국제 공개 제WO 2007/149406 A2호의 4쪽 1행 내지 19쪽 11행에는 단백질 활성 증가, 생체 내 및 시험관 내 반감기 증가, 및 프로테아제에 대한 내성 증가를 나타내는 기능적 돌연변이 FIX 분자들이 개시되어 있다. 제WO 2007/149406 A2호의 19쪽 12행 내지 20쪽 9행에도 키메라 및 다른 변이체 FIX 분자가 개시되어 있다. 국제 공개 제WO 08/118507 A3호의 5쪽 14행 및 6쪽 5행에는 내성 증가를 나타내는 FIX 돌연변이체들이 개시되어 있다. 국제 공개 제WO 09/051717 A2호의 9쪽 11행 내지 20쪽 2행에는 N-연결 및/또는 O-연결 글리코실화 부위의 수가 증가된 FIX 돌연변이체들이 개시되어 있다. 국제 공개 제WO 09/137254 A2호의 2쪽 [006]단락 내지 5쪽 [011] 단락 및 16쪽 [044] 단락 내지 24쪽 [057] 단락에도 글리코실화 부위의 수가 증가된 인자 IX 돌연변이체들이 기술되어 있다. 국제 공개 제WO 09/130198 A6호의 4쪽 26행 내지 12쪽 6행에는 글리코실화 부위의 수가 증가하여 반감기가 증가된 기능적 돌연변이 FIX 분자들이 개시되어 있다. 국제 공개 제WO 09/140015 A2호의 11쪽 [0043] 단락 내지 13쪽 [0053] 단락에는 중합체(예: PEG) 접합에 사용될 수 있는 Cys 잔기의 수가 증가된 기능적 FIX 돌연변이체들이 개시되어 있다. 2011년 7월 11에 출원되었고, 2012년 1월 12일에는 WO 2012/006624로 공개된 국제 공제 제PCT/US2011/043569호에 기술된 FIX 폴리펩티드도 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.

또한, FIX 내의 수 백 개의 비-기능적 돌연변이체가 혈우병 대상체에서 식별되었으며, 이 중 많은 부분이 국제 공개 제WO 09/137254 A2호의 11~14쪽에 있는 표 5에 개시되어 있다. 이러한 비-기능적 돌연변이체들은 본 발명에 포함되어 있지 않지만, 어떤 돌연변이체가 기능적인 FIX 폴리펩티드를 생성할 다소의 가능성이 있는지에 대한 추가적인 지침을 제공한다.

인자 IX의 응고 활성은 국제 단위(IU)로서 표현된다. FIX 활성의 1 IU는 1 mL의 정상 인간 혈장 중 FIX의 양에 대략 상응한다. 일단계 응고 분석(활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간; PTT), 트롬빈 생성 시간(TGA) 및 회전식 트롬보 탄성측정(ROTEM®)을 포함하는 여러 가지 분석법이 인자 IX 활성의 측정에 사용될 수 있다. 본 발명에서는, FIX 서열에 대해 상동성을 갖는 서열; 인간, 비인간 영장류, 포유동물(가축을 포함함) 유래의 것과 같은 천연 서열 단편; 및 FIX의 생물학적 활성 또는 생물학적 기능의 적어도 일부를 보유하고/하거나 응고 인자 관련 질환, 결핍, 장애 또는 병태(예: 응고 인자의 결핍으로 인한, 외상이나 수술과 관련된 출혈 사례)의 예방(preventing), 치료(treating), 조정(mediating), 또는 개선(ameliorating)에 유용한 비-천연 서열 변이체가 고려된다. 인간 FIX에 대해 상동성인 서열은 NCBI BLAST와 같은 표준 상동성 검색 기술에 의해 발견될 수 있다.

일부 구현예에서, FIX 및 Fc 영역을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질의 유효량은 Fc 영역이 없는 FIX의 유효량과 동등하다. 특정 구현예에서, 유효량은 약 0.1 IU/kg 내지 약 500 IU/kg이다. 일부 구현예에서, 유효량은 약 10 IU/kg 내지 약 400 IU/kg이다. 일부 구현예에서, 유효량은 약 20 IU/kg 내지 약 300 IU/kg이다. 일부 구현예에서, 유효량은 약 20 IU/kg 내지 약 275 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 250 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 225 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 200 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 175 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 150 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 90 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 80 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 70 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 60 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 50 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 40 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 30 IU/kg, 약 30 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 40 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 50 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 60 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 70 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 80 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 90 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 100 IU/kg 내지 약 200 IU/kg, 약 150 IU/kg 내지 약 200 IU/kg, 또는 약 25 IU/kg 내지 약 75 IU/kg이다. 일 구현예에서, 유효량은 약 20 IU/kg 내지 약 100 IU/kg이다.

일부 구현예에서, 유효량은 약 10 IU/kg, 약 15 IU/kg, 약 20 IU/kg, 약 25 IU/kg, 약 30 IU/kg, 약 35 IU/kg, 약 40 IU/kg, 약 45 IU/kg, 약 50 IU/kg, 약 55 IU/kg, 약 60 IU/kg, 약 65 IU/kg, 약 70 IU/kg, 약 75 IU/kg, 약 80 IU/kg, 약 85 IU/kg, 약 90 IU/kg, 약 95 IU/kg, 약 100 IU/kg, 약 105 IU/kg, 약 110 IU/kg, 약 115 IU/kg, 약 120 IU/kg, 약 125 IU/kg, 약 130 IU/kg, 약 135 IU/kg, 약 140 IU/kg, 약 145 IU/kg, 약 150 IU/kg, 약 155 IU/kg, 약 160 IU/kg, 약 165 IU/kg, 약 170 IU/kg, 약 175 IU/kg, 약 180 IU/kg, 약 185 IU/kg, 약 190 IU/kg, 약 195 IU/kg, 또는 약 200 IU/kg이다. 일 구현예에서, 유효량은 약 50 IU/kg이다. 또 다른 구현예에서, 유효량은 약 100 IU/Kg이다.

FIX 및 Fc 영역 또는 이들의 단편을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질을 투여할 때의 투여 간격은 Fc 도메인이 없는 상기 FIX의 동등한 투여량에 대해 필요한 투여 간격보다 적어도 약 1.5배 더 길 수 있다. 투여 간격은 Fc 도메인이 없는 상기 FIX의 동등한 투여량에 대해 필요한 투여 간격보다 적어도 약 1.5 내지 6배 더 길거나, 1.5 내지 5배 더 길거나, 1.5 내지 4배 더 길거나, 1.5 내지 3배 더 길거나, 1.5 내지 2배 더 길 수 있다. 일부 구현예에서, 투여 간격은 Fc 도메인이 없는 상기 FIX의 동등한 투여량에 대해 필요한 투여 간격보다 적어도 약 1.5배, 2.5배, 3.5배, 4.5배, 5.5배 또는 6배 더 길 수 있다. 투여 간격은 약 매 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 또는 14일 또는 그 이상일 수 있다. 투여 간격은 적어도 약 1.5 내지 5일, 1.5일, 2일, 3일, 4일, 또는 5일 또는 그 이상일 수 있다. 요구성 치료의 경우, 상기 키메라 폴리펩티드 또는 혼성화물의 투여 간격은 매 24~36, 24~48, 24~72, 24~96, 24~120, 24~144, 24~168, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 또는 72시간 또는 그 이상마다 약 1회이다.

일부 구현예에서, FIX 및 Fc 영역을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질의 유효 투여량은 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일, 약 16일, 약 17일, 약 18일, 약 19일, 약 20일, 약 21일, 약 22일, 약 23일, 또는 약 24일의 투여 간격으로 인간에게 투여된다. 일부 구현예에서, FVIII 및 Fc 영역을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질의 유효 투여량은 약 25일, 약 26일, 약 27일, 약 28일, 약 29일, 약 30일, 약 45일, 또는 약 60일의 투여 간격으로 인간에게 투여된다. 특정 구현예에서, FVIII 및 Fc 영역을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질의 유효 투여량은 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 또는 약 14일의 투여 간격으로 인간에게 투여된다. 하나의 특정한 구현예에서, FVIII 및 Fc 영역을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질의 유효량은 약 2일(예: 약 48시간)의 투여 간격으로 인간에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, FVIII 및 Fc 영역을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질의 유효량은 약 7일의 투여 간격으로 인간에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, FVIII 및 Fc 영역을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질의 유효량은 약 10일의 투여 간격으로 인간에게 투여된다. 일부 구현예에서, FVIII 및 Fc 영역을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질의 유효량은 매 6~10시간의 투여 간격으로 인간에게 투여된다. 특정 구현예에서, FVIII 및 Fc 영역을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질의 유효량은 매일 투여된다.

일부 구현예에서, FVIII 및 Fc 영역을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질은 약 1 내지 약 21일, 약 1 내지 약 20일, 약 1 내지 약 19일, 약 1 내지 약 18일, 약 1 내지 약 17일, 약 1 내지 약 16일, 약 1 내지 약 15일, 약 1 내지 약 14일, 약 1 내지 약 13일, 약 1 내지 약 12일, 약 1 내지 약 11일, 약 1 내지 약 10일, 약 1 내지 약 9일, 약 1 내지 약 8일, 약 1 내지 약 7일, 약 1 내지 약 6일, 약 1 내지 약 5일, 약 1 내지 약 4일, 약 1 내지 약 3일, 약 1 내지 약 2일, 약 2 내지 약 21일, 약 3 내지 약 21일, 약 4 내지 약 21일, 약 5 내지 약 21일, 약 6 내지 약 21일, 약 7 내지 약 21일, 약 8 내지 약 21일, 약 9 내지 약 21일, 약 10 내지 약 21일, 약 11 내지 약 21일, 약 12 내지 약 21일, 약 13 내지 약 21일, 약 14 내지 약 21일, 약 15 내지 약 21일, 약 16 내지 약 21일, 약 17 내지 약 21일, 약 18 내지 약 21일, 약 19 내지 약 21일, 약 20 내지 약 21일, 약 5 내지 약 10일, 약 10 내지 약 15일, 약 15 내지 약 20일의 투여 간격으로 투여된다.

일 구현예에서, 유효 투여량은 1~50 IU/dL(예를 들어, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 IU/dL)의 순환하는 FIX를 유지시킬 수 있는 투여량이다. 또 다른 구현예에서, 유효 투여량은 50 IU/kg이며 투여 간격은 주 1회이다. 또 다른 구현예에서, 유효 투여량은 100 IU/kg이며 투여 간격은 매 10일마다 1회이다. 투여량은 필요한 만큼 (예를 들어, 적어도 10, 20, 28, 30, 40, 50, 52 또는 57주, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10년 동안) 반복적으로 투여될 수 있다.

FIX 및 Fc 영역을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질은, 예를 들어, 국소(예: 경피 또는 안구), 경구, 구강, 비강, 질, 직장 또는 비경구 투여를 포함하는 임의의 적절한 투여 방식에 맞게 제형될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용된 FIX 및 Fc 영역을 포함하는 키메라 단백질은: (a) 키메라 폴리펩티드; (b) 수크로오스(sucrose) 및 만니톨(mannitol)을 포함하는 탄수화물; (c) 염화나트륨(NaCl); (d) L-히스티딘; 및 (e) 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함하는 약제학적 조성물로 제형된다. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은: (a) 약 25 IU/ml 내지 약 700 IU/ml의 인자 IX 폴리펩티드; (b) 약 10 mg/ml 내지 약 20 mg/ml의 수크로오스; (c) 약 20 mg/ml 내지 약 40 mg/ml의 만니톨; (d) 약 3 mg/ml 내지 약 4 mg/ml의 NaCl; (e) 약 3 mg/ml 내지 약 6 mg/ml의 L-히스티딘; (f) 약 0.08 mg/ml 내지 약 0.2 mg/ml의 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80; 또는 (g) 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 방법에 사용된 약제학적 조성물은 동결 건조된다.

II.A.3 Fc

본 개시의 조성물 또는 키메라 단백질은 FcRn, FcγRIIB 및/또는 DC-SIGN에 결합하는 Fc 도메인 또는 이의 일부분을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은, 예를 들어, 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 키메라 단백질의 일부로서 응고 인자에 융합된다. 다른 구현예에서, Fc 도메인은 응고 인자가 아닌 폴리펩티드에 융합되며, 여기서 조성물은 (1) 응고 인자 및 (2) Fc 도메인과 추가 폴리펩티드를 포함하는 키메라 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 응고 인자와 함께 공동 투여된다. Fc 도메인 또는 이의 일부는 키메라 단백질의 약동학적 또는 약역학적 특성을 개선할 수 있다. 특정 구현예에서, Fc 도메인 또는 이의 일부는 Fc 도메인 또는 이의 일부에 융합된 분자의 반감기를 연장시킨다. 일부 구현예에서, 키메라 단백질의 Fc 영역은 관절에 대해 키메라 단백질의 국소화를 촉진한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “Fc 도메인(Fc domain)” 또는 “Fc 영역(Fc region)”은 본원에서 사용된 바와 같이 천연 Ig의 Fc 도메인에 상응하는, 즉 천연 Ig의 두 중쇄의 Fc 도메인 각각의 이량체 결합에 의해 형성된 바와 같은, 폴리펩티드의 기능성 부분을 의미한다. 천연 Fc 도메인은 또 다른 Fc 도메인과 동종이량체(homodimer)를 형성한다. 이와 대조적으로, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “유전적으로 융합된 Fc 영역(genetically-fused Fc region)” 또는 “단쇄 Fc 영역(single-chain Fc region; scFc 영역)”은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 유전적으로 연결된 (즉, 하나의 연속 유전자 서열로 암호화된) Fc 영역을 포함하는 합성 이량체 Fc 영역을 지칭한다.

일 구현예에서, "Fc 영역"은 파파인 절단 부위(즉, IgG 내의 잔기 216, 중쇄 불변 영역의 첫 번째 잔기는 114로 간주함)의 바로 상류의 힌지 영역에서 시작하여 항체의 C-말단에서 종료되는 단일 Ig 중쇄의 일부를 지칭한다. 따라서, 완전한 Fc 도메인은 적어도 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함한다.

Ig 불변 영역의 Fc 영역은 Ig 이소형에 따라 CH2, CH3, 및 CH4 도메인뿐만 아니라 힌지 영역까지 포함할 수 있다. Ig의 Fc 영역을 포함하는 키메라 단백질은 안정성, 혈청 반감기의 증가(Capon 등의, 1989, Nature 337:525 참조)뿐만 아니라 신생아 Fc 수용체(FcRn)과 같은 Fc 수용체에 대한 결합(미국 특허 제6,086,875호, 제6,485,726호, 제6,030,613호; WO 03/077834; US2003-0235536A1 참조. 이들 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨)을 포함하는 여러 가지 바람직한 특성을 키메라 단백질에 부여한다.

일부 구현예에서, Fc 영역은 FcRn에 특이적으로 결합한다. FcRn 수용체는 인간을 포함하는 여러 가지 포유동물 종으로부터 단리된 것이다. 인간 FcRn, 원숭이 FcRn, 랫트 FcRn, 및 마우스 FcRn의 서열은 알려져 있다(Story 등의 1994, J. Exp. Med. 180:2377 참조). FcRn 수용체는 비교적 낮은 pH에서 IgG에 결합하고(IgA, IgM, IgD, 및 IgE와 같은 다른 Ig 클래스에는 결합하지 않음), 루미널(luminal)에서 장막(serosal) 방향으로 세포를 관통하여 능동적으로 IgG를 수송한 다음, 간질액(interstitial fluids)에서 발견되는 비교적 높은 pH에서 IgG를 방출한다. 이는 폐 및 장 상피(Israel 등의 1997, Immunology 92:69 참조), 신장 근위 관형 상피(Kobayashi 등의 2002, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F358 참조)를 비롯하여 코 상피, 질 표면, 및 담도계 표면(biliary tree surfaces)을 포함하는 성인 상피 조직에서 발현된다(미국 특허 제6,485,726호, 제6,030,613호, 제6,086,875호; WO 03/077834; US2003-0235536A1 참조).

본 발명에 유용한 Fc 영역은 FcRn, FcγRIIB, 및/또는 DC-SIGN에 특이적으로 결합할 수 있는 분자를 포함하며, 이에는 FcRn 수용체의 완전한 결합 영역을 포함하는 전체 IgG, IgG의 Fc 단편, 및 다른 단편이 포함된다. FcRn, FcγRIIB, 및/또는 DC-SIGN에 결합하는 IgG의 Fc 부분의 영역이 기술되었다.

하나의 특정한 구현예에서, Fc 영역은 저 친화도 면역글로불린 감마 Fc 영역 수용체 II-b(FcγRIIB)에 특이적으로 결합한다. FcγRIIB는 염증 반응의 양태를 조절하는 억제성 Fc 수용체이다. 특히, FcγRIIB의 활성화는 염증을 유발하는 활성화 신호를 억제한다. 따라서, 사실상, FcγRIIB의 활성화가 염증을 억제한다.

또 다른 구현예에서, Fc 영역은 수지상 세포-특이적 세포간 접착 분자-3-그래빙 넌-인테그린(dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin, DC-SIGN)에 특이적으로 결합한다. CD209로도 알려져 있는 DC-SIGN은 특정 단핵구, 수지상 세포, 및 대식세포를 포함하는 대부분의 골수 유래 세포에 의해 발현되는 C-형 렉틴 수용체(C-type lectin receptor)이다. DC-SIGN의 활성화가 염증을 억제할 수 있다는 것이 마우스 연구를 통해 밝혀졌다. Nimerjahn의 Chapter 5, Molecular and Cellular Pathways Involved in the Anti-inflammatory Activity of IgG, Molecular Mechanisms of Antibody Activity, New York, NY 2013: 113-138 참조.

특이적으로 결합된(specifically bound)이란 2개의 분자가 생리학적 조건 하에서 비교적 안정한 복합체를 형성하는 것을 지칭한다. 일반적으로 낮은 친화도 및 중간 내지 높은 용량을 갖는 비특이적 결합과 구별되는 바와 같이, 특이적 결합(specific binding)은 높은 친화도 및 중간 내지 낮은 용량을 특징으로 한다. 일반적으로, 결합(binding)은 친화도 상수 KA가 10⁶ M^-1보다 높거나 10⁸ M^-1보다 높은 경우 특이적인 것으로 간주된다. 필요한 경우, 결합 조건을 변화시킴으로써 특이적 결합에 실질적으로 영향을 미치지 않고도 비-특이적 결합을 감소시킬 수 있다. 분자 농도, 용액의 이온 강도, 온도, 결합 허용 시간, 차단제(예: 혈청, 알부민, 밀크 카세인)의 농도 등과 같은 적절한 결합 조건은 당업자가 일상적인 기술을 사용해 최적화할 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 하나 이상의 절단된 Fc 영역을 포함하는데, 이들 영역은 절단되었음에도 불구하고 Fc 영역에 FcRn, FcγRIIB, 및/또는 DC-SIGN 결합 특성을 부여하기에 충분하다. 예를 들어, FcRn, FcγRIIB, 및/또는 DC-SIGN에 결합하는 Fc 영역의 일부(즉, FcRn, FcγRIIB, 및/또는 DC-SIGN 결합 부분)은 EU 넘버링으로, IgG1의 약 아미노산 282~438를 포함한다(주요 접촉 부위는 CH2 도메인의 아미노산 248, 250~257, 272, 285, 288, 290~291, 308~311, 및 314이고 CH3 도메인의 아미노산 잔기 385~387, 428, 및 433~436임). 따라서, 본 발명의 Fc 영역은 FcRn, FcγRIIB, 및/또는 DC-SIGN 결합 부분을 포함하거나 이로 이루어진다. FcRn, FcγRIIB, 및/또는 DC-SIGN 결합 부분은 IgGl, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 이소형의 중쇄로부터 유래될 수 있다. 일 구현예에서, 인간 이소형 IgG1의 항체 유래의 FcRn, FcγRIIB, 및/또는 DC-SIGN 결합 부분이 사용된다. 또 다른 구현예에서, 인간 이소형 IgG4의 항체 유래의 FcRn, FcγRIIB, 및/또는 DC-SIGN 결합 부분이 사용된다.

또 다른 구현예에서, “Fc 영역”은 Fc 도메인의 아미노산 서열 또는 Fc 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, Fc 영역은: 힌지(예를 들어, 상부, 중간 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인(EU 넘버링에 따르는, 항체 Fc 영역의 약 아미노산 216~230); CH2 도메인(EU 넘버링에 따르는, 항체 Fc 영역의 아미노산 231~340); CH3 도메인(EU 넘버링에 따르는, 항체 Fc 영역의 약 아미노산 341~438); CH4 도메인; 또는 이들의 변이체, 일부, 또는 단편 중 적어도 하나를 포함한다. 다른 구현예에서, Fc 영역은 완전한 Fc 도메인(즉, 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인)을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 CH3 도메인(또는 이의 일부)에 융합된 힌지 도메인(또는 이의 일부), CH2 도메인(또는 이의 일부)에 융합된 힌지 도메인(또는 이의 일부), CH3 도메인(또는 이의 일부)에 융합된 CH2 도메인(또는 이의 일부), 힌지 도메인(또는 이의 일부) 및 CH3 도메인(또는 이의 일부) 모두에 융합된 CH2 도메인(또는 이의 일부)을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 여전히 다른 구현예에서, Fc 영역은 CH2 도메인의 적어도 일부(예를 들어, CH2 도메인의 전부 또는 일부)가 결여된다. 특정한 구현예에서, Fc 영역은 EU 넘버 221 내지 447에 상응하는 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진다.

본원에서 F, F1 또는 F2로서 표시된 Fc 영역은 다수의 상이한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 일 구현예에서, 폴리펩티드의 Fc 영역은 인간 Ig로부터 유래된다. 그러나, Fc 영역은 예를 들어 설치류(예: 마우스, 랫트, 토끼, 또는 기니 피그) 또는 비인간 영장류(예: 침팬지, 마카크) 종을 포함하는 또 다른 포유동물 종의 Ig로부터 유래될 수 있는 것으로 이해된다. 또한, 폴리펩티드의 Fc 도메인 또는 이의 일부는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함하는 임의의 Ig 클래스, 및 IgGl, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 Ig 이소형으로부터 유래될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 인간 이소형 IgG1이 사용된다.

특정 구현예에서, Fc 변이체는 야생형 Fc 도메인을 포함하는 Fc 영역에 의해 주어진 적어도 하나의 작동자 기능을 변화시킨다(예를 들어, Fc 영역이 Fc 수용체에 결합하는 능력을 개선 또는 감소시키거나(예를 들어, FcγRI 또는 FcγRIII에 대한 결합의 감소, 또는 FcRn 또는 FcγRIII에 대한 결합의 개선), 보체 단백질(예: C1q)이나 다른 Fc 결합 상대에 결합하는 능력을 개선 또는 감소시키거나(예를 들어, DC-SIGN에 대한 결합의 개선), 항체-의존성 세포독성(ADCC), 식균작용(phagocytosis), 또는 보체-의존성 세포독성(CDCC)을 유발하는 능력의 개선 또는 감소시킴). 다른 구현예에서, Fc 변이체는 조작된 시스테인 잔기를 제공한다.

본 발명의 Fc 영역은 작동자 기능 및/또는 FcR 결합에 변화(예를 들어, 강화 또는 감소)를 주는 것으로 알려진 당업계에서 인식되는 Fc 변이체를 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 결합 분자는 국제 PCT 공개 WO88/07089A1, WO96/14339A1, WO98/05787A1, WO98/23289A1, WO99/51642A1, WO99/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO00/42072A2, WO02/44215A2, WO02/060919A2, WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351A2, WO04/074455A2, WO04/099249A2, WO05/040217A2, WO04/044859, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2, 및 WO06/085967A2; 미국 특허 공개 제US2007/0231329호, 제US2007/0231329호, 제US2007/0237765호, 제US2007/0237766호, 제US2007/0237767호, 제US2007/0243188호, 제US20070248603호, 제US20070286859호, 제US20080057056호; 또는 미국 특허 제5,648,260호; 제5,739,277호; 제5,834,250호; 제5,869,046호; 제6,096,871호; 제6,121,022호; 제6,194,551호; 제6,242,195호; 제6,277,375호; 제6,528,624호; 제6,538,124호; 제6,737,056호; 제6,821,505호; 제6,998,253호; 제7,083,784호; 제7,404,956호, 및 제7,317,091호(각각은 본원에 참조로 통합됨)에 기술된 아미노산 위치 중 하나 이상에서, 예를 들어, 변화(예: 치환)를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 특이적 변화(예를 들어, 당업계에 개시된 하나 이상의 아미노산의 특이적 치환)는 개시된 하나 이상의 아미노산 위치에서 이루어질 수 있다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 개시된 아미노산 위치에서의 상이한 변화(예를 들어, 당업계에 개시된 하나 이상의 아미노산 위치에서의 상이한 치환)가 이루어질 수 있다.

Fc 영역은 부위 지향식 돌연변이 유발 등과 같은 잘 인식된 절차에 따라 변형되어, FcRn, FcγRIIB 및/또는 DC-SIGN이 결합될 변형된 Fc 단편 또는 이의 일부를 생성할 수 있다. 이러한 변형은 FcRn, FcγRIIB 및/또는 DC-SIGN 접촉 부위로부터 이격된 곳에서의 변형뿐만 아니라 FcRn, FcγRIIB 및/또는 DC-SIGN에 대한 결합을 유지시키거나 더 강화시키는 접촉 부위 내에서의 변형도 포함한다. 예를 들어, 다음의 인간 IgG1 Fc(Fc γ1)에서의 단일 아미노산 잔기는 FcRn, FcγRIIB 및/또는 DC-SIGN에 대한 Fc 결합 친화도의 상당한 손실 없이 치환될 수 있다: P238A, S239A, K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, P331A, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A, 및 K447A (여기서, 예를 들어, P238A는 위치 번호 238에서 알라닌으로 치환된 야생형 프롤린을 나타냄).

일 예로서, 특이적 구현예는 N297A 돌연변이를 통합하여, 고도로 보존된 N-글리코실화 부위를 제거한다. 알라닌에 추가하여 다른 아미노산이 위에 명시된 위치에서 야생형 아미노산으로 치환될 수 있다. 돌연변이가 Fc 내에 단독으로 도입되어 천연 Fc와 구별되는 100개가 넘는 Fc 영역을 생성시킬 수 있다. 추가적으로, 이들 개별 돌연변이 중 2개, 3개, 혹은 그 이상의 조합이 함께 도입되어 수 백개 더 많은 Fc 영역을 생성시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 작제물의 Fc 영역 중 하나가 돌연변이되고 작제물의 다른 하나의 Fc 영역은 전혀 돌연변이되지 않거나, 둘 다가 상이한 돌연변이로 돌연변이될 수 있다.

일 구현예에서, Fc 도메인 또는 이의 일부는, 미국 특허 제5,739,277호의 서열번호 3을 포함하고, 선택적으로 미국 특허 제5,739,277호의 서열번호 11, 1, 2, 및 31로부터 선택된 서열을 추가로 포함하는 폴리펩티드이다.

특정 구현예에서, Fc 도메인 또는 이의 일부는 반-클리코실화(hemi-glycosylated)된다. 예를 들어, 2개의 Fc 영역을 포함하는 키메라 단백질은 제1의 글리코실화(glycosylated) Fc 영역(예: 글리코실화된 CH2 영역) 및 제2의 비-글리코실화(aglycosylated) Fc 영역(예: 비-글리코실화된 CH2 영역)을 함유할 수 있다. 일 구현예에서, 링커(linker)는 글리코실화 Fc 영역과 비-글리코실화 Fc 영역 사이에 개재될 수 있다. 또 다른 구현예에서, Fc 영역은 완전히 글리코실화, 즉 모든 Fc 영역이 글리코실화된다. 다른 구현예에서, Fc 영역은 비-글리코실화, 즉 Fc 모이어티의 어떤 것도 글리코실화되지 않는다.

특정 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 Fc 도메인 또는 이의 일부(예: Fc 변이체)에 대한 아미노산 치환을 포함하는데, 이는 Fc 도메인의 항원-독립적 작동자 기능, 특히 단백질의 순환 반감기를 변경시킨다.

본 발명에 사용된 Fc 영역은 키메라 단백질의 클리코실화를 변경시키는, 당업계에서 인식된 아미노산 치환도 포함한다. 예를 들어, FVIII 단백질 또는 FIX 단백질에 연결된 키메라 단백질의 Fc 영역은 글리코실화의 감소(예: N- 또는 O-연결 글리코실화)를 유도하는 돌연변이를 갖는 Fc 영역을 포함하거나, 야생형 Fc 모이어티의 변경된 당형태(예: 푸코오스가 적거나 푸코오스가 없는 글리칸)를 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 미처리된 키메라 단백질은 본원에 기술된 Ig 불변 영역 또는 이의 일부로부터 독립적으로 선택된 둘 이상의 구성적 Ig 불변 영역 또는 이의 일부를 갖는, 유전적으로 융합된 Fc 영역(scFc 영역)을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 이량체 Fc 영역의 Fc 영역들은 동일하다. 또 다른 구현예에서, Fc 영역 중 적어도 2개는 상이하다. 예를 들어, 본 발명의 단백질의 Fc 영역들은 동일한 수의 아미노산 잔기를 포함하거나, 이들의 길이는 하나 이상의 아미노산 잔기만큼(예: 약 5개의 아미노산 잔기(예: 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 잔기)만큼, 약 10개의 잔기만큼, 약 15개의 잔기만큼, 약 20개의 잔기만큼, 약 30개의 잔기만큼, 약 40개의 잔기만큼, 또는 약 50개의 잔기만큼) 상이할 수 있다. 여전히 다른 구현예에서, 본 발명의 단백질의 Fc 영역은 하나 이상의 아미노산 위치에서의 서열이 상이할 수 있다. 예를 들어, Fc 영역 중 적어도 2개는 약 5개의 아미노산 위치(예: 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 위치), 약 10개의 아미노산 위치, 약 15개의 아미노산 위치, 약 20개의 아미노산 위치, 약 30개의 아미노산 위치, 약 40개의 아미노산 위치, 또는 약 50개의 아미노산 위치)에서 상이할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시의 방법에 사용된 키메라 단백질은 둘 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 단백질은 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 응고 인자 및 제1 Fc 영역을 포함하고, 제2 폴리펩티드 사슬은 제2 Fc 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 Fc 영역과 제2 Fc 영역은 공유 결합에 의해 결합된다. 일 구현예에서, 제1 Fc 영역과 제2 Fc 영역은 펩티드 결합에 의해 결합된다. 또 다른 구현예에서, 제1 Fc 영역과 제2 Fc 영역은 이황화 결합에 의해 결합된다.

하나의 특정한 구현예에서, 키메라 단백질은 FVIII 부분 및 폰 빌레브란트 인자(VWF) 부분을 포함하되, FVIII 부분은 FVIII 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하고, VWF 부분은 VWF 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하고, FVIII 부분은 제1 Fc 영역에 연결되고, VWF 부분은 제2 Fc 영역에 연결되며, 제1 Fc 영역과 제2 Fc 영역은 서로 결합된다. 특정 구현예에서, VWF 부분은 VWF의 D’ 및 D3 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 또는 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드 둘 다는 하나 이상의 반감기 연장 모이어티를 추가로 포함한다.

본 개시의 방법에 사용된 키메라 단백질을 생성하기 위한 Fc 영역 또는 이의 일부는 다수의 상이한 공급원으로부터 얻을 수 있다. 일부 구현예에서, Fc 영역 또는 이의 일부는 인간 Ig로부터 유래된다. 그러나, Fc 영역은 예를 들어 설치류(예: 마우스, 랫트, 토끼, 기니 피그) 또는 비인간 영장류(예: 침팬지, 마카크) 종을 포함하는 또 다른 포유동물 종의 Ig로부터 유래될 수 있는 것으로 이해된다. 또한, Fc 영역 또는 이의 일부는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함하는 임의의 Ig 클래스, 및 IgGl, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 Ig 이소형으로부터 유래될 수 있다. 일 구현예에서, 인간 이소형 IgG1이 사용된다.

다양한 Fc 영역 유전자 서열(예: 인간 Fc 유전자 서열)이 공개적으로 액세스할 수 있는 보관소(deposits)의 형태로 이용 가능하다. 특정 작동자 기능을 갖거나 (또는 특정 작동자 기능이 결여되거나), 면역원성을 감소시키기 위한 특정 변형을 갖는 Fc 서열이 선택될 수 있다. 항체 및 항체-암호화 유전자의 많은 서열이 공개되었으며, 적절한 Fc 영역 서열은 당업계에서 인식된 기술을 사용해 이들 서열로부터 유래될 수 있다. 전술한 임의의 방법을 사용해 수득된 유전 물질은, 이어서 본 발명의 방법에 사용된 키메라 단백질을 얻기 위해 변경되거나 합성될 수 있다. 본 발명의 범주가 불변 영역 DNA 서열의 대립 유전자, 변이체 및 돌연변이를 포함한다는 것을 더 이해할 수 있을 것이다.

Fc 또는 이의 일부의 서열은, 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응 및 관심 도메인을 증폭시키도록 선택되는 프라이머를 사용해 클로닝될 수 있다. 항체로부터 Fc 영역 또는 이의 일부의 서열을 클로닝하기 위해, mRNA는 하이브리도마(hybridoma), 비장, 또는 림프 세포로부터 단리될 수 있고, DNA로 역전사될 수 있으며, PCR에 의해 증폭된 항체 유전자일 수 있다. PCR 증폭 방법은 미국 특허 제4,683,195호; 제4,683,202호; 제4,800,159호; 제4,965,188호; 및, 예를 들어 Innis 등의(편집) "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications” Academic Press, San Diego, CA (1990); Ho 등의 1989. Gene 77:51; Horton 등의 1993. Methods Enzymol. 217:270에 상세하게 기술되어 있다. PCR은 공통 불변 영역 프라이머에 의하거나, 공개된 중쇄 및 경쇄 DNA 및 아미노산 서열에 기초한 보다 특이적인 프라이머에 의해 개시될 수 있다. 위에서 논의된 바와 같이, PCR은 항체 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA 클론을 단리하는 데 사용될 수도 있다. 이 경우, 라이러브리는 공통 프라이머 또는 상동 프로브, 예컨대, 마우스 불변 영역 프로브에 의해 스크리닝될 수 있다. 항체의 증폭에 적합한 다수의 프라이머가 당업계에 알려져 있다(예: 정제된 항체의 N-말단 서열에 기초한 5’ 프라이머(Benhar 및 Pastan. 1994. Protein Engineering 7:1509 참조); cDNA 말단의 급속 증폭(Ruberti, F. 등 1994. J. Immunol. Methods 173:33 참조); 항체 선도 서열(Larrick 등의 1989 Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250 참조)). 항체 서열의 클로닝은 1995년 1월 25일에 출원된 Newman 등의 미국 특허 제5,658,570호에 추가적으로 기술되어 있으며, 본 문헌은 참조로서 본원에 통합된다.

II.B. 반감기 연장 모이어티

일부 구현예에서, 본 개시의 방법에 사용된 키메라 단백질은 하나 이상의 반감기 연장 모이어티를 포함한다. 응고 인자의 반감기는 당업자에게 알려진 임의의 방법, 예를 들어, 혈장 FVIII 활성 수준을 검출하기 위한 FVIII 활성 분석(발색성 분석 또는 일단계 응고 aPTT 분석) 또는 혈장 FVIII/FIX 항원 수준을 검출하기 위한 FVIII/FIX ELISA에 의해 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, 응고 인자의 응고 활성 반감기는 일단계 응고 분석(one stage clotting assay)에 의해 결정된다. 보다 특정한 구현예에서, 응고 인자의 응고 활성 반감기는 마우스, HemA 마우스 또는 폰 빌레브란트 이중 녹아웃(DKO) 마우스에서 결정된다.

특정 양태에서, 본 발명의 응고 인자의 반감기를 증가시키는 이종 모이어티는, 알부민과 같은 이종 폴리펩티드, 면역 글로불린 Fc 영역, XTEN 서열, 인간 융모성 성선 자극 호르몬 β 서브유닛의 C-말단 펩티드(CTP), PAS 서열, HAP 서열, 트랜스페린(transferrin), 알부민-결합 모이어티, 이들 폴리펩티드의 임의의 단편, 유도체, 변이체, 또는 조합을 제한없이 포함한다. 관련된 다른 양태에서, 반감기 연장 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 히드록시에틸 전분(HES), 폴리시알산, 또는 이들 모이어티의 임의의 유도체, 변이체, 또는 조합과 같은 비-폴리펩티드 모이어티에 대한 부착 부위를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 반감기 연장 모이어티는 알부민 또는 이의 단편, 알부민 결합 모이어티, PAS 서열, HAP 서열, 트랜스페린 또는 이의 단편, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리시알산, 히드록시에틸 전분(HES), 이들의 유도체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 모이어티는 XTEN을 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 반감기 연장 모이어티는 XTEN을 포함한다.

다른 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 하나 이상의 중합체에 접합된다. 중합체는 수용성이거나 비-수용성일 수 있다. 중합체는 응고 인자, Fc, 또는 응고 인자나 Fc에 접합된 다른 모이어티에 공유 부착되거나 비-공유 부착될 수 있다. 중합체에 대한 비-한정적 예는 폴리(알킬렌 옥사이드), 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리옥사졸린, 또는 폴리(아크릴로일모폴린)일 수 있다. 예를 들어, 중합체-접합 FVIII의 추가 유형은, 그 전체가 참조로서 개시된 미국 특허 제7,199,223호에 개시되어 있다.

특정 양태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 1개, 2개, 또는 3개 이상의 반감기 연장 모이어티를 포함할 수 있으며, 이들은 각각 동일하거나 상이한 분자일 수 있다.

일부 구현예에서, 반감기 연장 모이어티는 키메라 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 모이어티는 응고 인자의 N-말단 또는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 모이어티는 Fc의 N-말단 또는 C-말단에 융합된다. 특정 구현예에서, 반감기 연장 모이어티는 키메라 단백질의 응고 인자 내에 삽입된다.

일부 구현예에서, 키메라 단백질은 FVIII 또는 이의 일부를 포함하고, 반감기 연장 모이어티는 미국 특허 공개 제2015-0158929 A1호 및/또는 국제 공개 제WO 2015106052 A1호(그 전체는 참조로서 본원에 통합됨)에 개시된 하나 이상의 위치에서 FVIII 내에 삽입된다. 하나의 특정한 구현예에서, 반감기 연장 모이어티는 FVIII의 B 도메인 (또는 이의 단편) 내에 삽입된다. 하나의 특정한 구현예에서, 반감기 연장 모이어티는 성숙 FVIII의 아미노산 잔기 745의 바로 하류에서 FVIII 내에 삽입된다.

다른 구현예에서, 키메라 단백질은 FIX 또는 이의 일부를 포함하고, 반감기 연장 모이어티는 국제 출원 제PCT/US16/045401호에 개시된 하나 이상의 위치에서 FIX 내에 삽입된다. 하나의 특정한 구현예에서, 반감기 연장 모이어티는 파두아 FIX의 아미노산 103, 아미노산 105, 아미노산 142, 아미노산 149, 아미노산 162, 아미노산 166, 아미노산 174, 아미노산 224, 아미노산 226, 아미노산 228, 아미노산 413로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기의 바로 하류의 삽입 부위에서 FIX 내에 삽입된다. 일 구현예에서, 키메라 단백질은 FIX 및 Fc 영역을 포함하되, FIX는 FIX의 활성화 펩티드(AP) 도메인 내에 삽입된 반감기 연장 모이어티를 포함한다. 일 구현예에서, 키메라 단백질은 FIX 및 Fc 영역을 포함하되, FIX는 성숙 파두아 FIX의 아미노산 잔기 166의 바로 하류에서 FIX 내에 삽입된 반감기 연장 모이어티를 포함한다.

II.B.1. 알부민

특정 양태에서, 본 개시의 방법에 사용된 키메라 단백질은 적어도 하나의 알부민 폴리펩티드 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함한다. 609개의 아미노산으로 이루어진 전장 형태의 단백질인 인간 혈청 알부민(HSA 또는 HA)은 혈청의 삼투압 중 상당한 부분을 담당하며, 내인성 및 외인성 리간드의 담체로서도 기능한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “알부민(albumin)”은 전장(full-length) 알부민, 또는 이의 기능적 단편, 변이체, 유도체, 또는 유사체를 포함한다. 알부민 또는 이의 단편 또는 변이체에 대한 예는 미국 특허 공개 제2008/0194481A1호, 제2008/0004206 A1호, 제2008/0161243 A1호, 제2008/0261877 A1호, 또는 제2008/0153751 A1호, 또는 PCT 출원 공개 제2008/033413 A2호, 제2009/058322 A1호, 또는 제2007/021494 A2호에 개시되어 있으며, 이들 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.

알부민-결합 폴리펩티드(ABP)는 세균성 알부민-결합 도메인, 알부민-결합 펩티드, 또는 알부민에 결합할 수 있는 알부민-결합 항체 단편을 제한없이 포함할 수 있다. Kraulis 등의 FEBS Lett. 378:190-194 (1996) 및 Linhult 등의 Protein Sci. 11:206-213 (2002)에 의해 개시된 바와 같은, 연쇄상 구균 단백질 G(streptococcal proteinis G) 유래의 도메인 3은 세균성 알부민-결합 도메인의 일 예이다. 알부민-결합 펩티드의 예는 Dennis 등의 J. Biol. Chem. 2002, 277: 35035-35043 (2002)에 개시되어 있다. 알부민-결합 항체 단편의 예는 Muller 및 Kontermann의 Curr. Opin. Mol. Ther. 9:319-326 (2007); Roovers 등의 Cancer Immunol. Immunother. 56:303-317 (2007), 및 Holt 등의 Prot. Eng. Design Sci., 21:283-288 (2008)에 개시되어 있으며, 이들 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.

특정 양태에서, 본 개시의 방법에 사용된 키메라 단백질은 알부민에 결합할 수 있는 비-폴리펩티드 소분자, 변이체, 또는 유도체에 대한 적어도 하나의 부착 부위를 포함한다. 예를 들어, 키메라 단백질은 하나 이상의 유기 알부민-결합 모이어티를 포함할 수 있다. 이러한 알부민-결합 모이어티에 대한 예는 Trussel 등의 Bioconjugate Chem. 20:2286-2292 (2009)에 기술된 바와 같은 2-(3-말레이미도프로판아미도)-6-(4-(4-요오드페닐)부탄아미도)헥사논산("Albu" 태그)이다.

II.B.2. XTEN

특정 양태에서, 본 개시의 방법에 사용된 키메라 단백질은 적어도 하나의 XTEN 폴리펩티드 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, “XTEN 서열”은 생리학적 조건 하에서 2차 또는 3차 구조를 조금 가지거나 가지지 않는 서열을 갖는 작은 친수성 아미노산으로 주로 구성된 비 자연발생적이고 실질적으로 비 반복적인 펩티드 서열을 갖는 연장 길이의 폴리펩티드를 지칭한다. 키메라 단백질의 상대로서, XTEN은, 예를 들어, 키메라 단백질의 응고 인자와 융합되거나 이에 삽입될 때, 특정 바람직한 약동학적, 생리화학적, 및 약제학적 특성을 부여하는 담체의 역할을 할 수 있다. 이러한 바람직한 특성은 강화된 약동학적 파라미터 및 용해 특성을 포함하되, 이들로 한정되지 않는다.

본 개시의 방법에 사용된 키메라 단백질의 응고 인자와 융합되거나 이에 삽입된 XTEN 서열은 다음의 유리한 특성 중 하나 이상을 키메라 단백질에 부여할 수 있다: 구조적 유연성; 강화된 수용해성; 고도의 프로테아제 저항성; 낮은 면역원성; 포유동물 수용체에 대한 낮은 결합도; 또는 유체역학적 (또는 스토크스(Stokes)) 반경의 증가. 특정 양태에서, XTEN 서열은 연장된 반감기(예: 생체 내 반감기) 또는 곡선 아래 영역(AUC)의 증가와 같은 약동학적 특성을 증가시킬 수 있어, 키메라 단백질은 XTEN이 없는 키메라 단백질과 비교해 더 오랜 기간 동안 생체 내에 머물고, 더 오랜 기간 동안 응혈원 활성(procoagulant activity)을 가진다.

본 발명의 재조합 FVIII 단백질에 삽입될 수 있는 XTEN 서열의 예는, 예를 들어, 미국 특허 공개 제2010/0239554 A1호, 제2010/0323956 A1호, 제2011/0046060 A1호, 제2011/0046061 A1호, 제2011/0077199 A1호, 또는 제2011/0172146 A1호, 또는 국제 특허 공개 제WO 2010091122 A1호, 제WO 2010144502 A2호, 제WO 2010144508 A1호, 제WO 2011028228 A1호, 제WO 2011028229 A1호, 제WO 2011028344 A2호, 또는 제WO 2015106052 A1호에 개시되어 있으며, 이들 문헌의 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.

II.B.3. VWF 또는 이의 단편

특정 양태에서, 본 개시의 방법에 사용된 키메라 단백질은 적어도 하나의 VWF 폴리펩티드 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함한다. VWF(F8VWF로도 알려짐)는 혈장에 존재하는 다량체 당단백질이며, (바이벨-파라디체; Weibel-Palade bodies에서의) 상피, 거핵구(혈소판의 α-과립), 및 상피 내 결합 조직에서 구성적으로 생성된다. 기본적인 VWF 단량체는 2813 아미노산 단백질이다. 각 단량체는 특이적 기능을 갖는 다수의 특이적 도메인, 즉 D'/D3 도메인(인자 FVIII에 결합됨), A1 도메인(혈소판 GPIb-수용체, 헤파린, 및/또는 가능하게는 콜라겐에 결합됨), A3 도메인(콜라겐에 결합됨), C1 도메인(활성화되는 경우, RGD 도메인이 혈소판 인테그린 αIIbβ3에 결함됨), 및 단백질의 C-말단 단부에 있는 "시스테인 매듭(cysteine knot)" 도메인(혈소판-유래 성장 인자(PDGF)와 함께 형질변환 생장 인자-β(TGFβ) 및 β-인간 융모성 성선 자극 호르몬(βHCG)을 공유함)을 함유한다.

일 구현예에서, VWF 폴리펩티드는 VWF 단편이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “VWF 단편”은 내인성 VWF가 FVIII에 결합하는 것을 억제할 수 있는 D’ 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 기능성 VWF 단편을 포함하되, 이에 한정되지 않는다. 일 구현예에서, 본 개시의 방법에 사용된 키메라 단백질은 응고 인자, Fc 영역, 및 VWF 단편을 포함하되, 응고 인자는 FVIII를 포함하며, VWF 단편은 FVIII 단백질에 결합한다. 또 다른 구현예에서, VWF 단편은 FVIII 단백질 상의 VWF 결합 부위를 차단하여 FVIII 단백질과 내인성 VWF의 상호 작용을 억제한다. VWF 단편은 VWF의 이러한 활성을 보유하는 유도체, 변이체, 돌연변이체, 또는 유사체를 포함한다. 특정 구현예에서, VWF 단편은 VWF의 D’ 도메인 및 D3 도메인을 포함한다.

인간 VWF에 대한 2813 단량체 아미노산 서열은 수탁 번호_NP_000543.2__로서 Genbank에 보고되어 있다. 인간 VWF를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 수탁 번호__NM_000552.3_으로서 Genbank에 보고되어 있다.

특정 구현예에서, 본원에서 유용한 VWF 단백질은 FVIII와의 상호 작용을 개선하기 위해, 예를 들어, FVIII에 대한 결합 친화도를 개선하기 위해 추가로 변형될 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명에 유용한 VWF 단백질은 다른 변형을 가질 수 있는데, 예를 들어, 이 단백질은 PEG화, 글리코실화, HES화, 또는 폴리시알산화될 수 있다. 본 개시의 방법에서 유용한 예시적인 VWF 서열은, 예를 들어, 미국 공개 제US 2015/0023959 Al호, 제US 2015/0266943 A1호, 및 제US 2015/0158929호에서 제공된다. 특정 구현예에서, VWF 단백질 또는 이의 단편은 FcRn 결합 상대에게 융합되거나 이와 함께 공동 투여된다. 일부 구현예에서, VWF 단백질 또는 이의 단편은 Fc에 융합되거나 Fc 또는 Fc를 포함하는 폴리펩티드와 함께 공동 투여된다. 일부 구현예에서, VWF 단백질 또는 이의 단편은 알부민에 융합되거나 알부민 또는 알부민을 포함하는 폴리펩티드와 함께 공동 투여된다.

II.B.4. CTP

특정 양태에서, 본 개시의 방법에 사용된 키메라 단백질은 인간 융모성 성선 자극 호르몬 β 서브유닛의 적어도 하나의 C-말단 펩티드(CTP) 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함한다. CTP 펩티드는 본 단백질의 반감기를 증가시키는 것으로 알려져 있다. 미국 특허 제5,712,122호를 참조하며, 본 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 비한정 예시적인 CTP 펩티드는 미국 특허 출원 공개 제2009/0087411 A1호에 개시되어 있으며, 동 문헌은 참조로서 본원에 통합된다.

II.B.5. PAS

특정 양태에서, 본 개시의 방법에 사용된 키메라 단백질은 적어도 하나의 PAS 펩티드 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, PAS 펩티드 또는 PAS 서열은 주로 알라닌 및 세린 잔기를 포함하거나, 주로 알라닌, 세린, 및 프롤린 잔기를 포함하는 아미노산 서열로서, 생리학적 조건 하에서 무작위 코일 구조를 형성하는 아미노산 서열을 의미한다. 따라서, PAS 서열은 키메라 단백질에서 이종 모이어티의 일부로서 사용될 수 있는 알라닌, 세린, 및 프롤린을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어지는 단위체(building block), 아미노산 중합체, 또는 서열 카세트이다. 부성분(minor constituent)으로서 알라닌, 세린, 및 프롤린 이외의 잔기가 PAS 서열에 첨가되면 아미노산 중합체도 무작위 코일 구조를 형성할 수 있다. “부성분(minor constituent)”이라는 용어는 알라닌, 세린, 및 프롤린 이외의 아미노산이 특정 정도로, 예를 들어, 12% 이하로, 즉 PAS 서열의 100개의 아미노산 중 약 12개, 아미노산의 약 10% 이하로, 약 9% 이하로, 약 8% 이하로, 약 6%, 약 5%, 약 3%(즉, 약 2% 또는 약 1%)로 PAS 서열에 첨가될 수 있다는 것을 의미한다. 알라닌, 세린, 및 프롤린과 상이한 아미노산은 Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Tyr, 및 Val로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 생리학적 조건하에서, PAS 펩티드는 무작위 코일 구조를 형성하여, 본 발명의 재조합 단백질에 대한 생체 내 및/또는 시험관 내 안정성 증가를 매개할 수 있으며, 응혈원 활성을 갖는다.

PAS 펩티드의 비한정적 예는, 예를 들어, 미국 특허 공개 제2010/0292130 A1호; PCT 출원 공개 제WO 2008/155134 A1호; 및 유럽 등록 특허 제EP2173890호에 개시되어 있다.

II.B.6. HAP

특정 양태에서, 본 개시의 방법에 사용된 키메라 단백질은 적어도 하나의 호모-아미노산 중합체(HAP) 펩티드 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함한다. HAP 펩티드는 적어도 50 아미노산, 100 아미노산, 120 아미노산, 140 아미노산, 160 아미노산, 180 아미노산, 200 아미노산, 250 아미노산, 300 아미노산, 350 아미노산, 400 아미노산, 450 아미노산, 또는 500 아미노산 길이를 갖는 글리신의 펩티드 서열을 포함한다. HAP 서열은 HAP 서열에 융합되거나 연결된 모이어티의 반감기를 연장할 수 있다. HAP 서열의 비한정적 예는 (Gly)_n, (Gly₄Ser)_n 또는 S(Gly₄Ser)_n을 포함하되, 이들로 한정되지 않는다(여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20임). 일 구현예에서, n은 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40이다. 또 다른 구현예에서, n은 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200이다. 예를 들어, Schlapschy M 등의 Protein Eng. Design Selection, 20: 273-284 (2007)를 참조.

II.B.7. 트랜스페린

특정 양태에서, 본 개시의 방법에 사용된 키메라 단백질은 적어도 하나의 트랜스페린 펩티드 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함한다. 임의의 트랜스페린이 본 개시의 방법에 사용된 키메라 단백질과 융합될 수 있다. 예를 들어, 야생형 인간 Tf(Tf)는 대략 75 kDa(글리코실화는 제외함)인 679개의 아미노산 단백질이며, 유전자 복제에서 기원된 것으로 보이는 2개의 주 도메인, 즉 N(약 330개의 아미노산) 및 C(약 340개의 아미노산)를 갖는다. GenBank 수탁 번호 NM001063, XM002793, M12530, XM039845, XM 039847 및 S95936 (www.ncbi.nlm.nih.gov)을 참조하며, 이들 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.

트랜스페린은 트랜스페린 수용체(TfR)-매개 세포 내 섭취(endocytosis)를 통해 철(iron)을 수송한다. 철이 엔도솜 구획 내로 방출되고 Tf-TfR 복합체가 세포 표면으로 재활용된 후, Tf는 다음 주기(cycle)의 철 수송을 위해 세포 외 공간으로 다시 방출된다. Tf는 14~17을 초과하는 긴 반감기를 보유한다(Li 등의 Trends Pharmacol. Sci. 23:206-209 (2002) 참조). 트랜스페린 융합 단백질은 프로인슐린의 반감기 연장, 암 치료를 위한 표적화 전달, 경구 전달 및 지속적인 활성화에 대해 연구되었다(Brandsma 등의, Biotechnol. Adv., 29: 230-238 (2011); Bai 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:7292-7296 (2005); Kim 등의 J. Pharmacol. Exp. Ther., 334:682-692 (2010); Wang 등의 J. Controlled Release 155:386-392 (2011) 참조).

II.B.8. PEG

특정 양태에서, 본 개시의 방법에 사용된 키메라 단백질은 비-폴리펩티드 이종 모이어티 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 위한 적어도 하나의 부착 부위를 포함한다. 예를 들어, 본 개시의 방법에 사용된 키메라 단백질은 응고 인자 및/또는 Fc 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기에 부착된 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티를 포함할 수 있다.

단백질의 PEG화는 단백질과 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자 사이에 형성된 접합물을 지칭하는 것일 수 있다. PEG는 매우 다양한 분자량 및 평균 분자량 범위에서 상업적으로 이용 가능하다. PEG 평균 분자량 범위의 전형적인 예는 약 200, 약 300, 약 400, 약 600, 약 1000, 약 1300~1600, 약 1450, 약 2000, 약 3000, 약 3000~3750, 약 3350, 약 3000~7000, 약 3500~4500, 약 5000~7000, 약 7000~9000, 약 8000, 약 10000, 약 8500~11500, 약 16000~24000, 약 35000, 약 40000, 약 60000, 및 약 80000 돌턴(Dalton)을 포함하되, 이들로 한정되지 않는다. 이들 평균 분자량은 단지 예시로서 제공되며 어떤 방식으로도 한정을 의미하지 않는다.

본 개시의 방법에 사용된 키메라 단백질은 모노- 또는 폴리-(예: 2~4) PEG 모이어티를 포함하도록 PEG화될 수 있다. PEG화는 당업계에 알려진 임의의 PEG화 반응에 의해 수행될 수 있다. PEG화된 단백질 산물을 제조하기 위한 방법은 일반적으로 (i) 본 발명의 펩티드가 하나 이상의 PEG기에 부착되게 되는 조건 하에서, 폴리펩티드를 (PEG의 반응 에스테르 또는 알데히드 유도체와 같은) 폴리에틸렌 글리콜과 반응시키는 단계; 및 (ii) 반응 산물(들)을 수득하는 단계를 포함하게 된다. 일반적으로, 반응을 위한 최적 반응 조건은 알려진 파라미터와 원하는 결과에 따라 사례별로 결정될 것이다.

Malik F 등의 Exp. Hematol. 20:1028-35 (1992); Francis의 Focus on Growth Factors 3(2):4-10 (1992); 유럽 특허 공개 제EP0401384호, 제EP0154316호, 및 제EP0401384호; 및 국제 특허 출원 공개 제WO92/16221호 및 제WO95/34326호와 같은 다수의 PEG 부착 방법을 당업자가 이용할 수 있다. 비 한정적 예로서, FVIII 변이체는 시스테인 치환을 함유할 수 있고, 시스테인은 PEG 중합체에 추가로 접합될 수 있다. Mei 등의 Blood 116:270-279 (2010) 및 미국 특허 제7,632,921호를 참조하며, 이들 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.

II.B.9. HES

특정 양태에서, 본 개시의 방법에 사용된 키메라 단백질은 적어도 하나의 히드록시에틸 전분(HES) 중합체를 포함한다. HES는 자연 발생 아밀로펙틴의 유도체이며, 체 내의 알파-아밀라아제에 의해 분해된다. HES는 유리한 생물학적 특성을 나타내며, 혈액량 대체제(blood volume replacement agent)로서 사용되고, 임상에서는 혈액희석 요법에 사용된다. 예를 들어, Sommermeyer 등의 Krankenhauspharmazie 8:271-278 (1987); 및 Weidler 등의 Arzneim.-Forschung/Drug Res. 41: 494-498 (1991)를 참조한다.

HES는 주로 분자량 분포 및 치환의 정도에 의해 특징지어진다. HES는 1 내지 300 kD, 2 내지 200 kD, 3 내지 100 kD, 또는 4 내지 70 kD의 평균 분자량(가중 평균)을 갖는다. 히드록시에틸 전분은 히드록시에틸기에 대해 0.1 내지 3, 0.1 내지 2, 0.1 내지 0.9, 또는 0.1 내지 0.8의 치환 몰도(molar degree of substitution), 및 2 내지 20 범위의 C2:C6 치환 사이의 비율을 더 나타낼 수 있다. 약 130 kD의 평균 분자량을 갖는 HES는 프레제니우스(Fresenius)의 Voluven^®이다. Voluven^®은, 예를 들어, 저혈량증(hypovolaemia)의 치료 및 예방을 위한 치료적 표시에 사용된 혈액량 대체(volume replacement)에 사용된 인공 콜로이드이다. 전술한 동일한 PEG 부착 방법과 같은 많은 HES 부착 방법을 당업자가 이용할 수 있다.

II.B.10. PSA

특정 양태에서, 본 개시의 방법에 사용된 키메라 단백질은 적어도 하나의 폴리시알산(PSA) 중합체를 포함한다. PSA는 특정 박테리아 균주에 의해서 및 포유동물의 특정 세포에서 생산되는 시알산의 자연 발생적 비 분지형 중합체이다. 예를 들어, Roth J. 등의 (1993) in Polysialic Acid: From Microbes to Man, (편집자) Roth J., Rutishauser U., Troy F. A. (BirkhauserVerlag, Basel, Switzerland), pp. 335-348을 참조한다. PSA는 제한된 산 분해에 의하거나, 뉴라미니다제를 사용한 소화에 의하거나, 중합체를 천연의 박테리아 유도 형태로 분획화하는 것에 의해 n=약 80 이상의 시알산 잔기에서 n=2까지 다양한 중합도(degree of polymerization)로 생성될 수 있다. 전술한 동일한 PEG 부착 방법과 같은 많은 PSA 부착 방법을 당업자가 이용할 수 있다. 특정 양태에서, 활성화된 PSA는, 예를 들어, FVIII 또는 FIX 상의 응고 인자 내에서 또는 Fc 영역 내에서 시스테인 아미노산 잔기에 부착될 수도 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5846951호를 참조한다.

II.B.11. 제거 수용체

특정 양태에서, 본 개시의 방법에 사용된 키메라 단백질의 반감기는, 키메라 단백질의 응고 인자가 FVIII 및 FVIII 제거 수용체의 적어도 하나의 단편이나 FVIII 제거 수용체의 FVIII-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하는 경우 연장될 수 있다. 저밀도 지질 단백질-관련 단백질 수용체인 LRP1, 또는 이의 단편과 같은 용해 가능한 형태의 제거 수용체의 삽입은 FVIII가 제거 수용체에 결합하는 것을 차단하여 이의 반감기, 예를 들어, 생체 내 반감기를 연장할 수 있다. LRP1은, FVIII를 포함하여 다양한 단백질의 수용체-매개 제거에 관여하는 600 kDa의 내재 막 단백질(integral membrane protein)이다. 예를 들어, Lenting 등의 Haemophilia 16:6-16 (2010)을 참조한다. 다른 적합한 FVIII 제거 수용체는, 예를 들어, LDLR (저밀도 지질 단백질 수용체), VLDLR (초저밀도 지질단백질 수용체), 및 메갈린(LRP-2), 또는 이들의 단편이다. 예를 들어, Bovenschen 등의 Blood 106:906-912 (2005); Bovenschen의 Blood 116:5439-5440 (2010); Martinelli 등의 Blood 116:5688-5697 (2010)을 참조한다.

III. 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및 숙주 세포

일부 양태에서, 본 개시는 혈우병에 걸린 인간에서 관절의 가역적 혈우병성 관절증을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 응고 인자 및/또는 Fc 영역을 암호화하는, 예를 들어, 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 키메라 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 세트의 유효량을 인간에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 세트는 발현 벡터 또는 발현 벡터 세트 내에 존재한다. 특정 구현예에서, 발현 벡터 또는 발현 벡터 세트는 하나 이상의 숙주 세포 내에 존재한다.

본 개시의 방법에 사용된, 응고 인자 및/또는 Fc 영역을 암호화하는, 예를 들어, 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 키메라 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 단일 뉴클레오티드 서열, 2개의 뉴클레오티드 서열, 또는 3개 이상의 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 일 구현예에서, 단일 뉴클레오티드 서열은 응고 인자(예: FVIII 또는 FIX 폴리펩티드) 및 Fc 영역을 포함하는 키메라 단백질을 암호화한다. 또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 2개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는데, 제1 뉴클레오티드 서열은 응고 인자(예: FVIII)를 암호화하고, 제2 뉴클레오티드 서열은 Fc 영역을 암호화한다. 또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 2개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는데, 제1 뉴클레오티드 서열은 응고 인자(예: FVIII 또는 FIX) 및 Fc 영역을 암호화하고, 제2 뉴클레오티드 서열은 제2 Fc 영역을 암호화한다. 특정 구현예에서, 암호화된 Fc 도메인은 발현 후에 공유 결합을 형성한다.

일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 코돈-최적화된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 발현 벡터(expression vector)는 삽입된 코딩 서열의 전사와 번역에 필요한 요소를 함유하거나, RNA 바이러스 벡터의 경우, 적절한 숙주 세포 내에 도입될 때 복제와 번역에 필요한 요소를 함유하는 임의의 핵산 작제물을 지칭한다. 발현 벡터는 플라스미드, 파지미드, 바이러스, 및 이들의 유도체를 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 유전자 발현 조절 서열은 프로모터 서열 또는 프로모터-인핸서 조합과 같은 임의의 조절 뉴클레오티드 서열로서, 이들이 작동 가능하게 연결되는 코딩 핵산의 효율적인 전사 및 번역을 촉진한다. 유전자 발현 조절 서열은, 예를 들어, 구성적 또는 유도성 프로모터와 같은 포유동물 또는 바이러스 프로모터일 수 있다. 구성적 포유동물 프로모터는, 다음의 유전자를 위한 프로모터를 포함하되, 이들로 한정되지 않는다: 히포크산틴 포스포리보실 전달효소(hypoxanthine phosphoribosyl transferase; HPRT), 아데노신 디아미나아제(adenosine deaminase), 피루브산 키나아제(pyruvate kinase), 베타-액틴 프로모터(beta-actin promoter), 및 기타 구성적 프로모터. 진핵 세포에서 구성적으로 기능하는 예시적인 바이러스 프로모터는, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus; CMV), 시미안 바이러스(simian virus; 예: SV40), 유두종 바이러스(papilloma virus), 아데노바이러스(adenovirus), 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus; HIV), 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus), 몰로니 백혈병 바이러스(Moloney leukemia virus)의 긴 말단 반복체(long terminal repeats; LTR), 및 기타 레트로바이러스 유래의 프로모터, 및 단순 헤르페스 바이러스(herpes simplex virus)의 티미딘 키나아제 프로모터(thymidine kinase promoter)를 포함한다. 다른 구성적 프로모터가 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명의 유전자 발현 서열로서 유용한 프로모터는 유도성 프로모터도 포함한다. 유도성 프로모터는 유도제의 존재 하에 발현된다. 예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터는 특정 금속 이온의 존재 하에 전사와 번역을 촉진하도록 유도된다. 다른 유도성 프로모터가 당업자에게 공지되어 있다.

본 발명의 목적을 위해, 다양한 발현 벡터 시스템이 사용될 수 있다.　이들 발현 벡터는 일반적으로 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 필수적인 부분으로서 숙주 유기체에서 복제될 수 있다.　발현 벡터는 프로모터(예: 자연 결합된 프로모터 또는 이종 프로모터), 인핸서, 신호 서열, 스플라이스 신호, 인핸서 요소, 및 전사 종결 서열을 포함하되 이들로 한정되지 않는 발현 조절 서열을 포함할 수 있다.　바람직하게는, 발현 조절 서열은 진핵 숙주 세포를 형질변환시키거나 형질감염시킬 수 있는 벡터 내 진핵세포 프로모터 시스템이다.　발현 벡터는, 소 유두종 바이러스(bovine papilloma virus), 폴리오마 바이러스(polyoma virus), 아데노바이러스, 우두 바이러스, 배큘로바이러스(baculovirus), 레트로바이러스(RSV, MMTV 또는 MOMLV), 사이토메갈로바이러스(CMV), 또는 SV40 바이러스와 같은 동물 바이러스로부터 유래된 DNA 요소를 활용할 수도 있다.　다른 것들은 내부 리보솜 결합 부위를 갖는 폴리시스트론 시스템을 사용하는 것을 포함한다.　

흔히, 발현 벡터는 원하는 DNA 서열로 형질변환된 이들 세포의 검출을 가능하게 하는 선별 마커(예: 암피실린-저항, 히그로마이신-저항, 테트라시클린 저항, 또는 네오마이신 저항)를 포함한다(예를 들어, Itakura 등의 미국 특허 제4,704,362호 참조).　DNA가 염색체 내에 통합된 세포는 형질감염된 숙주 세포의 선별을 가능하게 하는 하나 이상의 마커를 도입함으로써 선별할 수 있다.　마커는 영양요구성 숙주를 자가 영양체화(protrophy)하거나, 살생물제(예: 항생제) 저항성이나 구리와 같은 중금속에 대한 저항성을 부여할 수 있다.　선별 마커 유전자는 발현될 DNA 서열에 직접 연결되거나, 공동형질변환에 의해 동일한 세포 내로 도입될 수 있다.　

본 개시의 방법에 사용된 키메라 단백질의 발현 최적화에 유용한 벡터의 예는 NEOSPLA에 개시되어 있다(미국 특허 제6,159,730호 참조).　이러한 벡터는 사이토메갈로바이러스 프로모터/인핸서, 마우스 베타 글로빈 주요 프로모터, SV40 복제 기원, 소 생장 호르몬 폴리아데닐화 서열, 네오마이신 포스포트란스페라아제 엑손 1 및 엑손 2, 디하이드로엽산 환원효소 유전자 및 선도 서열을 함유한다.　이러한 벡터는 가변 및 불변 영역 유전자의 통합, 세포 내 형질감염, 및 이어서 G418 함유 배지의 선별 및 메토트렉사트 증폭에 따라 매우 높은 수준으로 항체를 발현시키는 것으로 밝혀졌다.　벡터 시스템은 미국 특허 제5,736,137호 및 제5,658,570호에서도 교지되며, 이들 문헌의 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.　이러한 시스템은 고 수준의 발현, 예를 들어, > 30 pg/세포/일을 가능하게 한다.　다른 예시적은 벡터 시스템은 미국 특허 제6,413,777호에 개시되어 있다.

다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 폴리시스트론 작제물을 이용해 발현될 수 있다. 이러한 발현 시스템에서, 다량체 결합 단백질의 다중 폴리펩티드와 같은 다수의 관심 유전자 산물이 단일 폴리시스트론 작제물로부터 생성될 수 있다. 이러한 시스템은 진핵 숙주 세포 내에서 비교적 높은 수준의 폴리펩티드를 제공하기 위해 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosome entry site, IRES)를 유리하게 사용한다. 비슷한 IRES 서열은 미국 특허 제6,193,980호에 개시되어 있으며, 동 문헌도 본원에 통합된다.

보다 일반적으로, 폴리펩티드를 암호화하는 벡터 또는 DNA 서열이 일단 제조되었으면, 발현 벡터를 적절한 숙주 세포 내로 도입할 수 있다.　즉, 숙주 세포는 형질변환될 수 있다.　위에서 논의된 바와 같이, 플라스미드를 숙주 세포 내로 도입하는 것은 당업자에게 알려진 다양한 기술에 의해 달성될 수 있다.　형질변환된 세포를 키메라 단백질의 생성에 적절한 조건 하에 생장시키고, 키메라 단백질 합성에 대해 분석한다. 예시적인 분석 기술은 효소 결합 면역흡착 검정법(ELISA), 방사면역검정법(RIA), 또는 형광 활성화 세포 분류 분석법(FACS), 면역조직화학법 등을 포함한다.

지금까지 본 발명을 상세하게 기술하였는데, 단지 예시의 목적으로 본원에 포함되고 본 발명을 한정하도록 의도되지 않는 다음의 실시예를 참조함으로써 본 발명을 보다 명확하게 이해할 수 있을 것이다.

실시예 1

표적 관절 및 A형 혈우병에 걸린 소아, 청소년, 및 성인 대상체에서 rFVIIIFc 예방 치료의 장기 효능

혈우병에 환자의 경우, 동일한 관절(표적 관절) 내 빈번한 출혈은 혈우병성 관절증(만성 관절 질환)에 기여할 수 있다. 종래의 FVIII 산물과 비교해 인자 VIII(FVIII)의 반감기를 연장하기 위해 rFVIIFc를 개발하였다(Peters 등의 J. Thromb. Haemost. 11(1):132-41 (2013) 참조). 완성된 rFVIIIFc 중추적 3상 시험(ClinicalTrials.gov 식별자: NCT01181128; Mahlangu, 등의 Blood 123(3):317-25 (2014) 참조) 및 소아 rFVIIIFc 중추적 3상 시험(NCT01458106; Young 등의 J. Thromb. Haemost. 13(6):967-77 (2015) 참조) 연구를 통해 중증 A형 혈우병에 걸린 성인/청소년(12세 이상의 환자) 및 아동(12세 미만의 환자) 사이에서 rFVIIIFc의 안전성과 효능을 확립하였다. rFVIIIFc의 장기 안전성 및 효능은 진행 중인 rFVIIIFc 연장 연구(NCT01454739; Nolan 등의 Haemophilia 22(1):72-80(2016)참조)에서 평가되고 있다.

본 연구의 목적은 rFVIIIFc 중추적 3상 시험 및 소아 rFVIIIFc 중추적 3상 시험에 들어갈 때 표적 관절을 가진 대상체에서 3상 시험 rFVIIIFc의 지속 가능한 효능 및 QOL에 대한 누적 데이터를, 제2 rFVIIIFc 연장 연구의 잠정 데이터 중단 시점(2014년 12월 8일) 현재까지 보고하는 것이다.

방법

이용 가능한 사전 연구 데이터(전부모 연구) 및 연구 도중 데이터(표적 관절 특이적 및 전체 데이터)가 있는 대상체로서, 부모 연구(rFVIIIFc 중추적 3상 시험 또는 소아 rFVIIIFc 중추적 3상 시험)에 들어갈 때 하나 이상의 표적 관절을 가진(6개월 동안 주요 관절에서 3회 이상의 출혈 사례(세계 혈우병 연맹의 문헌, Guidelines for the Management of Hemophilia 2판, Blackwell Publishing: Montreal, Canada (2012) 참조)) 대상체를 평가하였다. 4개의 치료군이 rFVIIIFc 연장 연구에 포함된다(표 1).

rFVIIIFc 연장 연구 치료 처방

치료 처방	프로토콜별 투여량 지침
개별화된 예방 치료	rFVIIIFc 25~65 IU/kg 매 3~5일 또는 주 2회 (rFVIIIFc 20~65 IU/kg 1일차, 40~65 IU/kg 4일차); 소아 대상체의 경우 투여량과 빈도(매 2~5일)를 조정할 수 있도록 함
주별 예방 치료	rFVIIIFc 65 IU/kg 매 7일
변형된 예방 치료	개별화된 또는 주별 예방 치료로 최적의 예방을 달성할 수 없는 대상체의 경우, 조사자가 투여량을 개인 맞춤화할 수 있었음
사례별 치료	출혈 사례의 유형 및 중증도에 기초한 rFVIIIFc 투여

12세 이상의 대상체가 rFVIIIFc 연장 연구에서 임의의 치료 처방에 참여할 수 있었던 반면, 12세 미만의 대상체는 개별화된 예방 치료 및 변형된 예방 치료 처방에만 참여할 수 있었음.

2차 rFVIIIFc 연장 연구 잠정 데이터 중단까지의 부모 연구의 누적 기간에 걸쳐 표적 관절을 가진 대상체에 대한 결과를 사후 분석하였다. 결과에는 ABR, 표적 관절 출혈 사례의 수 및 해결 여부, 및 예방 투여량 및 투여 빈도를 포함시켰다. 연속 추적 검사 기간이 12개월 이상이고 추적 검사 기간의 시작 시점 이래로 표적 관절 부위에 대한 중요한 수술(교체 또는 제거 수술)을 받지 않은 대상체를 대상으로 표적 관절의 해결에 대한 분석을 수행하였다. 연속 12개월의 기간 동안 표적 관절에서 자발적 출혈 사례가 2회 이하인 경우, 표적 관절이 임상적으로 해결된 것으로 간주하였다(Blanchette 등의 J Thromb Haemost. 12(11):1935-39 (2014) 참조).

17세 이상이고, 연구 도중에 1곳 이상의 표적 관절이 해결되었고, rFVIIIFc 중추적 3상 시험 베이스라인과 rFVIIIFc 연장 연구 2년차 모두에서 Heam-A-QOL 점수를 받은 예방 치료 대상체에서 Heam-A-QOL에 의한 QOL 측정치를 평가하였다. 소아 rFVIIIFc 중추적 3상 시험의 대상체 가운데서, 캐나다 혈우병 결과-소아 인생 평가 도구(Canadian Hemophilia Outcomes-Kids Life Assessment Tool, CHO-KLAT)에 의해 QOL을 측정하였다.

결과

연구 모집단

베이스라인에서 표적 관절을 가진 rFVIIIFc 중추적 3상 시험의 대상체 113명 중, 사전 연구 예방 치료나 사례별 처방 데이터 및 연구 도중 데이터가 있는 111명의 대상체는 베이스라인에서 287개의 표적 관절을 가졌다(중앙 값 연령, 31.0세; 사분위수 범위(IQR), 24.0~44.0세; 표 2). 소아 rFVIIIFc 중추적 3상 시험의 13명의 대상체는 베이스라인에서 15개의 표적 관절을 가졌고, 사전 연구 데이터와 연구 도중 데이터가 있었다(중앙 값 연령, 6.0세; IQR, 5.0~8.0세; 표 2).

인구 통계학적 특정 및 기준 특성^a

	부모 연구
특성	rFVIIIFc 중추적 3상 시험 n = 111	소아 rFVIIIFc 중추적 3상 시험 n = 13
중앙 값(IQR) 나이, 세	31.0 (24.0~44.0)	6.0 (5.0~8.0)
사전 연구 처방
사례별 치료	65 (58.6)	3 (23.1)
예방 치료	46 (41.4)	10 (76.9)
표적 관절의 총 수, n	287	15
표적 관절의 총 수, n (%)^b
1	42 (37.8)	11 (84.6)
2	27 (24.3)	2 (15.4)
3	7 (6.3)	0
>3	35 (31.5)^c	0
표적 관절 위치, n (%)
팔꿈치	69 (62.2)	4 (30.8)
발목	65 (58.6)	9 (69.2)
무릎	48 (43.2)	1 (7.7)
어깨	14 (12.6)	0
손목	6 (5.4)	0
고관절	5 (4.5)	0

IQR - 사분위수 범위. ^a부모 연구에 들어갈 때 표적 관절이 1곳 이상이고 효능 지속 기간(efficiency period)을 가진 대상체를 포함함. 표적 관절은 반복적인 출혈이 발생한(연속 6개월의 기간 내에 동일한 관절 내 출혈 사례 빈도가 3회 이상) 주요 관절(예: 팔꿈치, 발목, 무릎, 어깨, 손목, 및 고관절)로서 정의된다. ^b반올림으로 인해 백분율은 100.0%가 아닐 수 있음. ^c대상체의 평균 연령은 39.9세였음.

출혈율

성인/청소년 및 12세 이하의 아동을 대상으로 한 rFVIIIFc 예방 치료를 받은 경우의 중앙 값(IQR) 연구 도중 ABR은 사전 연구 예방 치료를 받은 경우의 출혈율보다 낮았다(도 1a~1d). 소아 rFVIIIFc 중추적 3상 시험 데이터를 환자 연령별로 더 계층화하였으며, 중앙 값 사전 연구 및 연구 도중 ABR은 도 1e 및 1f에 도시되어 있다. 사전 연구에서, 6세 미만의 환자는 6세 이상 12세 미만인 환자보다 중앙 값(IQR) ABR이 더 낮았다(도 1e). 연구 도중에는, 6세 미만의 환자가 6세 이상 12세 미만인 환자보다 전체 연구 도중 ABR, 전체 표적 관절 ABR, 및 표적 관절 자발적 ABR이 더 높았다(도 1f).

rFVIIIFc 중추적 3상 시험에서, 개별화된 예방 치료 대상체의 46.3%, 주별 예방 치료 대상체의 40.7%, 및 변형된 예방 치료 대상체의 21.4%에서 표적 관절 출혈 사례가 없었던 반면, 소아 rFVIIIFc 중추적 3상 시험에서는, 개별화된 예방 치료 대상체의 53.8%에서 표적 관절 출혈 사례가 없었다.

표적 관절의 임상적 해결

베이스라인에서 표적 관절이 있었고, 12개월의 추적 검사를 받았으며, 예방 치료 중인 대상체 가운데서, rFVIIIFc 중추적 3상 시험 대상체의 100%(93/93) 및 소아 rFVIIIFc 중추적 3상 시험 대상체의 100%(7/7)에서 하나 이상의 표적 관절이 해결되었고(즉, 연속 12개월 동안 출혈 사례가 2회 이하였음); rFVIIIFc 중추적 3상 시험 및 소아 rFVIIIFc 중추적 3상 시험 대상체에서, (전체 출혈에 기초하여) 표적 관절의 98.3%(231/235) 및 100%(9/9)가 각각 해결되었다.

예방 치료 인자 소모량

베이스라인에서 표적 관절을 가진 rFVIIIFc 중추적 3상 시험 예방 치료 대상체(n = 105) 및 소아 rFVIIIFc 중추적 3상 시험 예방 치료 대상체(n = 13)에서의 중앙 값(IQR) 주별 예방 치료 인자 소모량은 각각 76.0 (68.0~90.9) IU/kg 및 83.5 (79.9~111.6) IU/kg이었다.

소모량은, 이용 가능한 사전 연구 데이터 및 연구 도중 투여량 데이터가 있는(rFVIIIFc 중추적 3상 시험, n = 79, 75.0 [70.0~113.8] IU/kg; 소아 rFVIIIFc 중추적 3상 시험, n = 54, 95.0 [75.0-113.0] IU/kg) 부모 연구의 대상체가 rFVIIIFc 중추적 3상 시험/소아 rFVIIIFc 중추적 3상 시험 모두가 진행되기 전에 예방 치료 중일 때의 소모량, 및 rFVIIIFc 중추적 3상 시험/소아 rFVIIIFc 중추적 3상 시험을 진행 중일 때의 소모량과 비슷하였다.

두 환자 개체군의 경우, 중앙 값(IQR) 투여 간격은, 베이스라인에서 표적 관절을 가진 예방 치료 대상체 간에도 비슷하였고(rFVIIIFc 중추적 3상 시험, n = 105, 3.8 [3.5~5.6]일; 소아 rFVIIIFc 중추적 3상 시험, n = 13, 3.5 [3.5-3.5]일), 이용 가능한 전임상 및 연구 도중 투여량 데이터가 있는 부모 연구에서의 예방 치료 대상체 간에도 비슷하였다(rFVIIIFc 중추적 3상 시험, n = 79, 3.5 [3.0~5.0]일; 소아 rFVIIIFc 중추적 3상 시험, n = 54, 3.5 [3.5~3.5]일).

소아 rFVIIIFc 중추적 3상 시험 데이터를 환자 연령별로 더 계층화하였다. 6세 미만의 환자에서 평균 주별 소모량은 투여 간격이 3.5 (3.5~3.5)일일 때 89.6 (75.3~97.5; n = 6) IU/kg이었다. 6세 이상 12세 미만의 환자의 경우, 평균 주별 소모량은 투여 간격이 3.5 (3.0~3.6)일일 때 82.2 (79.4~113.2) IU/kg이었다.

삶의 질

QOL은, rFVIIIFc 연장 연구 2년차에 rFVIIIFc 중추적 3상 시험 베이스라인과 비교해 성인/청소년(n = 48) 가운데서 18%만큼 개선되었다(표 3). 소아 rFVIIIFc 중추적 3상 시험 베이스라인 및 rFVIIIFc 연장 연구 1년차에 자가 보고(self-reported) CHO-KLAT 점수가 있는 소아 rFVIIIFc 중추적 3상 시험 대상체의 경우, 평균(표준 편차[SD]) 베이스라인 점수는 85.5(12.1)점이었고; rFVIIIFc 연장 연구 1년차에는 CHO-KLAT 점수가 28%만큼 개선되었다(24.1[15.3]의 평균[SD] 개선).

베이스라인에서 표적 관절을 가진 대상체에서의 Haem-A-QOL 분석

	rFVIIIFc 중추적 3상 시험 베이스라인에서의 평균(SD) 점수^a N= 30~48^c	rFVIIIFc 연장 연구 24개월차에서의 평균(SD) 점수^a N= 30~48^c	평균(SD) 변화	P 값^b
계	30.3 (15.7)	24.9 (15.7)	-5.4 (10.8)	0.001
운동과 여가	51.5 (26.9)	40.8 (27.6)	-10.7 (21.7)	0.008
육체적 건강	42.7 (21.7)	32.1 (27.8)	-10.6 (19.8)	0.0005
혈우병을 대하는 자세	17.0 (13.6)	15.3 (15.9)	-1.7 (17.5)	NS
가족 계획	15.5 (19.8)	11.5 (18.3)	-4.0 (16.3)	NS
(혈우병에 대한) 느낌	23.0 (21.8)	15.4 (19.2)	-7.7 (16.0)	0.002
미래	38.9 (20.9)	33.8 (23.1)	-5.1 (15.4)	0.03
교제 및 성생활	12.6 (20.2)	12.2 (21.4)	-0.4 (20.6)	NS
치료	28.3 (16.6)	23.3 (14.1)	-5.0 (15.7)	0.03
(스스로의) 가치관	34.2 (22.7)	32.1 (21.1)	-2.1 (16.8)	NS
직업 및 학교	19.6 (20.0)	13.7 (19.1)	-6.0 (12.1)	0.002

NS, 유의하지 않음

^a Haem-A-QOL 점수는 0에서 100까지이고, 세목 점수와 총점에 있어서 점수가 높을 수록 장애가 더 많음을 나타낸다.

^b 양측 분포 대응 표본 t 검정에 기초함.

^c 48명의 환자를 대상으로, 운동과 여가(n = 33), 가족 계획(n = 30), 교제 및 성생활(n = 45), 및 직업 및 학교(n = 44)를 제외한 모든 결과에 대해 평가할 수 있었다.

결론

3상 rFVIIIFc 중추적 3상 시험 및 소아 rFVIIIFc 중추적 3상 시험 연구 및 진행 중인 rFVIIIFc 연장 연구로부터의 효능 데이터는 중증 A형 혈우병에 걸린 소아, 청소년, 및 성인 대상체에서 장기 rFVIIIFc 예방 치료가 표적 관절의 연간 환산 출혈율(ABR)을 낮게 지속시켰고 표적 관절을 해결했음을 보여준다. 본 분석에서, 베이스라인에서 표적 관절을 가진 대상체의 주별 예방 치료 인자 소모량은 이전에 공개된 RFVIIIFc 중추적 3상 시험 및 소아 rFVIIIFc 중추적 3상 시험 연구의 전체 개체군에서의 소모량과 일치하였다. 예방 치료 인자 소모량이나 투여 간격을 바꾸지 않고 rFVIIIFc 예방 치료로 표적 관절을 해결한 대상체에서는 삶의 질(QOL)에 있어서 개선이 보였다.

실시예 2

중증 A형 혈우병에 걸린 대상체에서 재조합 인자 VIII Fc 융합 단백질(rFVIIIFc)로 예방 치료한 후의 종적 변형 혈우병 관절 건강 점수(mHJHS) 결과

혈우병성 관절증은 혈우병 관리에 있어서의 미결 과제이다(Knobe 등의 J Comorbidity. 2011;1(1):51-59; Simpson 등의 Expert Rev Hematol. 2012;5(4):459-68 참조). 혈우병 관절 건강 점수(HJHS)는 혈우병성 관절증의 발병을 검출하는 데 사용할 수 있는 제1 선 도구이다(Oymak 등의 J Pediatr Hematol Oncol. 2015;37(2):e80-5 참조). 근골격 결과의 개선은 A형 혈우병을 대상으로 한 예방적 치료의 유효성에 대한 중요한 척도이다(Blanchette 등의 Haemophilia. 2004;10 (Suppl. S4):97-104 참조). rFVIIIFc 중추적 3상 시험 연구(Mahlangu 등의 Blood. 2014;123(3):317-325 참조) 및 소아 rFVIIIFc 중추적 3상 시험 연구(Young 등의 J Thromb Haemost. 2015;13(6):967-977 참조)를 각각 완료한 성인/청소년 및 아동 사이에서 rFVIIIFc의 장기적 안전성 및 효능을 진행 중인 rFVIIIFc 연장 연구(Nolan 등의 Haemophilia. 2016;22(1):72-80 참조)로부터의 잠정 데이터를 사용해 입증하였다. rFVIIIFc가 근골격 결과에 미치는 장기적인 영향을 결정하는 데에는 추가적인 연구가 필요할 것이다.

본 연구의 목적은 변형 혈우병 관절 건강 점수(mHJHS)를 사용해 rFVIIIFc 중추적 3상 시험 및 rFVIIIFc 연장 연구의 종적 관절 건강 데이터를 보고하는 것이다.

연구 참가자 및 설계

분석 개체군에는 rFVIIIFc 중추적 3상 시험을 완료하고 rFVIIIFc 연장 연구 2년차에 등록한 성인/청소년(12세 이상)을 포함시켰다. 환자는 사전 연구 예방 치료 또는 사례별 치료 중에 있었을 수도 있다. rFVIIIFc 중추적 3상 시험 스크리닝(프로토콜 개정 후) 및 베이스라인에서 mHJHS를 사용해 관절 건강을 평가하였고, 그 이후로는 rFVIIIFc 연장 연구를 위해 연단위로 평가하였다.

mHJHS는, 관절 동통 및 보행에 대한 반응 옵션이 더 적은 범주로 압축되었고, 불안정성에 대한 평가가 추가되었으며, 표준 HJHS(범위, 0~124)와 비교해 총점이 더 낮다는(범위, 0~116; 0 0은 정상 관절 기능을 나타내고, 116은 중증 질환을 나타냄) 점에서 표준 HJHS, 버전 2.1과 상이하다(표 4 참조). 2주 이내의 출혈에 대한 점수는 제외되었다. 외과 수술적 중재를 겪은 관절에 대한 점수는 마지막으로 관찰된 점수를 이월시켜 사용하는 것으로 간주하였다. 매년 변화를 평가하기 위해, 4개 시점(rFVIIIFc 중추적 3상 시험 베이스라인, rFVIIIFc 연장 연구 베이스라인, rFVIIIFc 연장 연구 1년차, 및 rFVIIIFc 연장 연구 2년차)에서 mHJHS 데이터를 가진 대상체를 본 사전 분석에 포함시켰다. rFVIIIFc 중추적 3상 시험 베이스라인에서 rFVIIIFc 연장 연구 2년차까지의 mHJHS에서의 변화(음의 값은 개선을 나타냄)는 기술 통계학(descriptive statistics)을 사용해 요약하였다. rFVIIIFc 중추적 3상 시험 베이스라인에서 추적 검사 방문(follow-up visits)까지의 mHJHS에서의 변화를: (1) 총 점수(범위, 0~116; 사전 연구 처방별(예방치료 대 사례별 치료); 초기 mJHJS에 기초한 기능적 장애의 중증도별; 및 베이스라인에서 표적 관절의 존재별); (2) 표적 관절(범위, 0~19: 단일 표적 관절에 대한 모든 의문의 합); (3) 체중 부하(예: 발목 및 무릎) 및 비-체중 부하(예: 팔꿈치) 관절(범위, 0~38: 단일 부위의 좌우 관절의 합); 및 (4) 개별 구성 요소(가동역(범위, 0~36: 모든 관절의 “신전 상실[발목의 발등쪽 굴곡]” 및 “굴곡 상실[발목의 발바닥쪽 굴곡]에 대한 질문의 조합); 부기(범위, 0~24: 모든 관절의 “부기” 및 “부기 지속 기간”에 대한 질문의 조합); 및 지구력(범위, 0~6: 모든 관절의 합))에 대해 요약하였다.

HJHS와 mHJHS의 차이

HJHS	mHJHS
활동 시 염발음(0~2점)	활동 시 염발음(0 또는 1점)
관절 동통(0~2점)	관절 동통(0 또는 1점)
전체 보행(0~4점)	전체 보행(설명으로 점수 기록)
-	불안정성(0 또는 1점)
총 점수(0~124점)	총 점수(0~116점^a)

^a0 = 정상 관절 기능; 116 = 중증 질환

대응 표본 t-검정을 사용해 rFVIIIFc 중추적 3상 시험 베이스라인과 rFVIIIFc 연장 연구 2년차 간의 차이를 분석하였다. 본 분석은 임시적인 것이었기에, P 값은 통계적 유의성을 추정하는 데 사용하지 않았다. 하위 그룹 분석의 경우, 기술 통계만 제공된다.

결과

베이스라인 특성

베이스라인 특성은 본 분석에 포함된 완료자 개체군(n = 47)과 rFVIIIFc 중추적 3상 시험 베이스라인에서 mHJHS의 수집 대상이었고 rFVIIIFc 연장 연구에 등록한 환자 개체군(n = 74) 간에 유사하였다(표 5).

베이스라인 특성

	rFVIIIFc 중추적 3상 시험 베이스라인 및 rFVIIIFc 연장 연구 등록자 n=74 ^a	rFVIIIFc 중추적 3상 시험 및 rFVIIIFc 연장 연구 2년 완료자 n = 47 ^b
평균(SD) 나이, 세	31.6 (11.9)	32.3 (12.8)
부모 연구 시작 시점의 평균(SD) 체중, kg	72.7 (15.1)	73.5 (15.7)
평균(SD) BMI, kg/m²	23.8 (4.3)	24.0 (4.1)
평균(SD) 베이스라인 mHJHS 점수	22.1 (18.0)	23.4 (18.3)
표적 관절, %	55.4	51.1
사전 연구 치료, % 예방 치료 요구성 치료	68.9 31.1	63.8 36.2
평균(SD) 사전 연구 ABR	15.8 (20.0)	16.5 (18.4)

^a rFVIIIFc 예방 치료 중인 74명의 대상체가 rFVIIIFc 중추적 3상 시험에 등록하였고(mHJHS 점수를 가지고 있음), 후속하여 rFVIIIFc 연장 연구에 참가하였다. ^b예방 치료 중인 47명의 환자가 rFVIIIFc 연장 연구 중 2년차에 도달하여 rFVIIIFc 중추적 3상 시험 베이스라인, rFVIIIFc 연장 연구 베이스라인, 및 1년차 및 2년차에서의 데이터를 이용할 수 있다.

종적 관절 건강

rFVIIIFc 중추적 3상 시험 베이스라인에서부터 rFVIIIFc 연장 연구 2년차까지 mHJHS 점수에 있어서 지속적인 개선이 관찰되었으며, 총 점수는 평균적으로 23.4에서 19.4으로 감소하였다(도 2a). 74명의 대상체 중, 24명을 연장 연구 3년차에 평가하였고, mHJHS에서의 이러한 개선은 rFVIIIFc 중추적 3상 시험의 베이스라인에서 표적 관절이 존재 여부와 상관없이 연장 연구 3년차에서 나타났다(도 2b). 평균 추적 검사 기간은 2.8(2.5~3.3)년이었다. 환자의 사전 연구 치료(도 3) 또는 rFVIIIFc 중추적 3상 시험 베이스라인에서 표적 관절의 존재 여부(도 4)와 무관하게 지속적인 개선이 관찰되었다. 연장 연구 3년차에 평가된 이들 환자에서, 모든 시점에서의 데이터가 구비된 성인/청소년의 평균 mHJHS 총 점수는 베이스라인에서 25.0(평균 표준 오차[SEM], 2.9)이었다. 베이스라인으로부터의 평균(SEM) 변화는 연장 연구 베이스라인에서 -2.0(1.2), 연장 연구 1년차에 -3.8(1.5), 연장 연구 2년차에 4.5(1.6), 및 연장 연구 3년차에 5.1(1.5)이었다(도 3b). 베이스라인으로부터 연장 연구 3년차까지의 변화는 통계적으로 유의하였다(P<0.002). 소아 rFVIIIFc 중추적 3상 시험 분석 개체군(n = 24) 또한 베이스라인으로부터 연장 연구 2년차까지 유의한 평균(SEM) 개선을 나타냈다(-1.2 [0.56]; P<0.05) (도 3c). rFVIIIFc 중추적 3상 시험 베이스라인에서의 mHJHS에서 가장 높은 사분위의 장애를 가졌던 대상체는 베이스라인으로부터 rFVIIIFc 연장 연구 2년차까지의 mHJHS 총 점수에 있어서 가장 큰 개선을 나타냈다(도 5). rFVIIIFc 중추적 3상 시험 베이스라인으로부터 rFVIIIFc 연장 연구 2년차까지 mJHJS 표적 관절 점수에 있어서 지속적인 개선이 관찰되었으며, 베이스라인에서의 평균 7.0으로부터 rFVIIIFc 연장 연구 2년차에서의 평균 5.3까지 개선되었다(도 6). 체중 부하 관절에 대한 mHJHS 관절 점수는 평균 8.0에서 평균 6.8로 감소하였고, 비-체중 부하 관절의 경우, rFVIIIFc 중추적 3상 시험 베이스라인으로부터 rFVIIIFc 연장 연구 2년차까지 평균 6.7에서 평균 4.8로 감소하였다(도 7). 체중 부하(발목 및 무릎) 및 비-체중 부하 관절(팔꿈치) 점수의 계산을 위해, 먼저 점수를 한 쌍의 좌우 관절(발목, 무릎, 또는 팔꿈치)에 대한 관절당 점수의 합으로서 도출하였다. 그런 다음, 체중 부하 관절 점수는 발목과 무릎에 대한 점수의 평균으로서 산출하였으며, 비-체중 부하 관절 점수는 팔꿈치에 대한 점수와 동일하였다. 또한, rFVIIIFc 중추적 3상 시험으로부터 rFVIIIFc 연장 연구 2년차까지 부기, 가동역, 및 지구력에서의 특이적인 개선도 관찰되었는데, 이는 mHJHS 총 점수의 변화에 대한 가장 유의한 기여 요인으로 나타났다(도 8).

rFVIIIFc 중추적 3상 시험 베이스라인으로부터의 통계적으로 유의한 평균 개선은 3년차에 체중 부하 및 비-체중 부하 관절 모두에서 관찰되었다(각각, -1.1 [SEM, 0.5; P=0.036] 및 -3.0 [SEM, 0.8; P=0.001]). 베이스라인으로부터 3년차까지 20% 이상의 감소를 보인 mHJHS의 개별 구성 요소는 부기(-47%), 근위축(-26%), 염발음(-20%) (3가지 구성 요소 모두에 대한 P<0.05) 및 관절 불안정성(-89%), 관절 동통(-31%), 및 지구력(-26%)이었다(도 9).

실시예 3

B형 혈우병에 걸린 성인 및 청소년에서 rFIXFc를 사용한 예방 치료의 표적 관절 결과

중증 B형 혈우병 환자에서, 관절 내 반복 출혈은 충분한 치료가 없는 경우 불구성(crippling) 만성 관절 질환, 동통, 및 삶의 질 저하로 이어질 수 있다(Djambas Khayat, J Blood Med. 7:275-82 (2016) 참조). 재조합 인자 IX Fc 융합 단백질(rFIXFc)를 사용하는 예방적 치료는 중증 B형 혈우병에 걸린 청소년과 성인에서 연간 환산 출혈율(ABR)를 감소시켰고 자발적/외상성 출혈 사례를 감소시켰다(Kavakli 등의 Haemophilia 22(3):381-88 (2016); Powell 등의 N Engl J Med. 369(24):2313-23 (2013); Powell 등의 Br J Haematol. 168(1):124-34 (2015); Powell 등의 Br J Haematol. 168(1):113-23 2015) 참조). 관절 손상을 방지하고 출혈 사례를 감소시키는 것에 추가하여, 종래의 rFIX 및 장기 작용성 rFIX 모두를 사용한 예방적 치료는 결근이나 결석 일수를 줄일 수 있고, 병원 입원일수를 줄일 수 있고, 모니터링 빈도를 줄일 수 있고, 삶의 질을 개선할 수 있다(Kavakli 등의 Haemophilia 22(3):381-88 (2016); Wyrwich 등의 Haemophilia 22(6):866-72 (2016) 참조). 예방적 치료를 어린 시절에 시작한 경우 출혈이 감소하고 관절 손상이 예방된다. 나이가 들어서, 관절 손상이 발행한 다음에 시작한 경우에도, 예방적 치료는 여전히, 관절 내 출혈을 포함하여, 출혈의 수를 상당히 감소시킬 수 있다(Fischer 등의 Haemophilia 20(Suppl 4):106-13 (2014) 참조). 중증 B형 혈우병에 걸린 성인/청소년으로서 rFIXFc 중추적 3상 시험(NCT01027364)을 완료한 대상체들이 rFIXFc의 안전성과 효능을 평가하는 장기 연장 연구에 등록할 수 있었다(NCT01425723; Pasi 등의 Thromb Haemost. 117(3):508-18 (2017) 참조). rFIXFc 중추적 3상 시험 시작 시점에 표적 관절을 가진 대상체에 대한 장기 연장 연구 전반에 걸친 종적 결과가 본원에 보고되어 있다.

본 연구의 목적은 연장 연구의 시작 시점에서부터 잠정 데이터 중단 시점까지(2015년 9월 11일) 표적 관절을 가진 대상체로부터 rFIXFc 중추적 3상 시험의 종적 데이터 결과를 제시하는 것이다.

방법

연구 설계 및 개체군

중증 B형 혈우병에 걸린 대상체(2 IU/dL 이하의 내인성 FIX)로서 rFIXFc 중추적 3상 시험을 완료한 대상체는, 연장 연구의 4개의 치료 그룹 중 1개에 등록하였다: (1) 주별 예방 치료(WP; 매 7일마다 20~100 IU/kg); (2) 개별화된 간격의 예방 치료(IP; 매 8~16일 마다 100 IU/kg); (3) 변형 예방 치료(MP; IP 또는 WP로 최적 투여량을 달성할 수 없는 대상체를 대상으로 조사자가 투여량을 개인 맞춤화할 수 있음); 및 (4) 사례별 치료(ET; 출혈 사례의 유형 또는 중증도에 기초한 요구성 투여). 대상체가 연장 연구에 들어가기 위한 등록 시점 및 연구 도중 임의의 시점에 각자의 치료 그룹을 바꿀 수 있도록 하였다. 해당 치료 처방에 소요된 기간 동안 각각의 치료 그룹에 대한 분석에 치료 그룹을 바꾼 대상체를 포함시켰으므로, 개별 대상체는 분석에 있어서 둘 이상의 치료 그룹으로 카운트될 수도 있었다. 중추적 3상 시험에서 1곳 이상의 표적 관절을 가진 대상체(3개월 동안 주요 관절에서 3회 이상의 출혈 사례 발생)를 평가하였다.

결과 측정치 및 통계적 분석

rFIXFc 중추적 3상 시험에서 제2 B-YONG 잠정 데이터 중단 시점(2015년 9월 11일)까지의 누적 기간에 걸쳐 결과를 분석하였다. 표적 관절의 해결에 대한 분석을 수행하였다. 표적 관절의 해결은 연속 12개월의 기간 동안 표적 관절에서 자발적 출혈 사례가 2회 이하인 경우로서 정의하였다(Blanchette 등의 J Thromb Haemost. 12(11):1935-39 (2014) 참조).

결과

표적 관절을 가진 대상체에 대한 베이스라인 특성은 표 6에 도시되어 있다. 연구 도중의 데이터가 있는 117명의 rFIXFc 중추적 3상 시험 대상체 중 60명은 베이스라인에서 총 166개의 표적 관절을 가졌다. 이들 대상체에게 3.4(1.4~4.2)년의 누적 중앙 값(사분위수 범위[IQR]) 기간 동안 rFIXFc를 투여하였다.

베이스라인 특성

특성	N = 60
사전 연구 처방
사례별 치료	44 (73.3)
예방 치료	16 (26.7)
표적 관절(들)의 총 수
1	20 (33.3)
2	13 (21.7)
3	7 (11.7)
>3	20 (33.3)
표적 관절 위치
무릎	42 (70.0)
발목	33 (55.0)
팔꿈치	28 (46.7)
고관절	6 (10.0)
어깨	3 (5.0)
손목	3 (5.0)

모든 데이터는 n (%)임. rFIXFc, 재조합 인자 IX Fc 융합 단백질. 효능 지속 기간(연구의 치료 처방에 따라 rFIXFc로 대상체를 치료한 시간 간격의 합으로써 정의되며, 수술로 인한 재활 기간은 제외함)이 동반된 B-LONG에 들어갈 때, 1곳 이상의 표적 관절을 가진 대상체를 포함함; bA 표적 관절은 반복 출혈이 발생한(연속 3개월 내 동일 관절 내 출혈 사례의 빈도가 3회 이상임) 주요 관절(예: 무릎, 발목, 팔꿈치, 고관절, 어깨, 및 손목)로서 정의됨.

예방적 투여

평균 주당 투여량 및 투여 간격이 표 7에 요약되어 있다.

평균 rFIXFc 예방 투여량 및 투여 간격 요약

치료 군	WP (n = 40)	IP (n = 12)	MP (n = 12)
평균 주당 투여량, IU/kg	45.2 (37.3~55.8)	64.7 (46.7~82.3)	59.7 (40.0~109.8)
투여 간격, d	6.98 (6.9~7.0)	10.25 (8.9~13.2)	6.57 (4.9~6.9)

모든 데이터는 중앙 값(IQR)임. IP, 개별화된 간격의 예방 치료; MP, 변형된 예방 치료; rFIXFc, 재조합 인자 IX Fc 융합 단백질; WP, 주별 예방 치료. 본 분석에는 이용 가능한 연구 도중 투여량 및 투여 간격 데이터를 가진 대상체만 포함시켰다. 대상체는 해당 처방에 대한 기간 동안 이들이 참여한 각각의 치료 처방에 포함되어 있으며, 따라서 둘 이상의 치료 그룹에서 보일 수 있다.

출혈율

사전 연구 및 연구 도중 출혈 데이터는 도 10a 및 10b에 각각 도시되어 있다. rFIXFc 예방 치료를 받는 대상체로서, 연구 도중 표적 관절 재출혈이 없는 대상체는 다음과 같다: WP: 40명 중 15명(37.5%); IP: 12명 중 1명(8.3%); MP: 12명 중 4명(33.3%): ET: 14명 중 0명(0%). 베이스라인에서 표적 관절을 가진 대상체의 경우, rFIXFc 예방 치료 후의 연구 도중 전체 ABR 및 표적 관절 ABR은 사전 연구 치료 후의 출혈율보다 낮았다(도 10a 및 10b).

표적 관절의 해결

전체적으로, 12개월 내에 2회 이하의 자발적 출혈로 표시된 바와 같이, (37명의 대상체에서) 표적 관절의 100%(93/93)가 해결되었다.

결론

중증 B형 혈우병에 걸린 성인/청소년의 경우, 장기적인 rFIXFc 예방 치료는 베이스라인에서 평가 가능한 표적 관절을 가진 대상체의 표적 관절을 100% 해결하였고 치료 그룹 전체에 걸쳐 표적 관절 ABR을 감소시켰다. 표적 관절을 가진 환자에 대해 유익하고 유의하게 개선된 장기적 결과가 rFIXFc로 달성되었음을 임상의들이 예방 치료 플랜을 설계할 때 고려해야할 것이다.

실시예 4

생체 내 단일 광자 방출 영상촬영(SPECT)에 의한 HemB 마우스 내 ¹²⁵ I-표지된 FIXFc, FIX, 및 글리코PEG화 FIX의 생분포(biodistribution)

투여 후 다중 시점에서 FIX 단백질의 생분포를 평가하기 위한 생체 내 마우스 연구를 단일 광자 방출 영상촬영(SPECT)에 의해 수행하였다. FIX 단백질은 ¹²⁵I-표지된 SIB 링커를 사용해 리신 잔기에서 표지하였다.7~12주령의 HemB 마우스에게 표지된 FIX 단백질을 치료적으로 관련된 단일 투여량만큼 투여하였다. ¹²⁵I-SIB-FIX는 1 mg/kg (n = 3)의 단일 투여량으로 투여하였고; ¹²⁵I-SIB-FIXFc는 2 mg/kg (n = 3)의 단일 투여량으로 투여하였으며, ¹²⁵I-SIB-FIX-PEG는 1 mg/kg (n = 3)의 단일 투여량으로 투여하였다.

표지된 FIX 단백질의 국소화를 0.5시간, 2.5시간, 20시간, 48시간, 92시간, 120시간, 168시간, 및/또는 216시간차에 촬영하였다(도 10a~10c). 관절 영역(예: 우/좌 무릎 및 우/좌 어깨), 심장(좌심실), 및 간에 대한 특이적 국소화를 관심 영역(ROI) 삽입에 의해 분석하였다. 좌심실과 간 ROI는 올바른 기관 내에 삽입된 고정 부피의 대상이었다. 무릎 관절 ROI는, 대퇴골의 대략 절반 정도 아래로부터 경골/비골의 절반 정도 아래까지 뼈 주위에 실린더를 삽입함으로써 정의하였다. 어깨 ROI는, 어깨 중심에 균일한 구를 삽입한 다음, 뼈에 대한 임계치를 해당 구 내로 한정하고, 이어서 ROI를 확장함으로써 정의하였다.

표지된 FIXFc는 투여 후 30분(도 12d) 및 2.5시간(도 12e)차에 관절 둘레에 분포하는 것으로 밝혀졌고, 투여 후 48~216시간 동안 지속되었는데(도 12f~12g), 이는 각각 반감기 및 반감기의 5배를 나타낸다. 무릎(도 13a) 및 어깨(도 13b)에 대한 FIXFc의 국소화는 동일한 관절에 대한 FIX 및 글리코PEG-FIX의 국소화보다 더 두드러졌다.

HemB 마우스에 대한 투여 이후, ¹²⁵I-SIB 표지화는 표지된 FIX 단백질의 FIX 활성에 영향을 미치지 않았으며(도 14a), FIX 단백질의 약동학적 특성에도 표지화는 영향을 미치지 않았다(도 14b).

실시예 5

베이스라인 관절 평가

베이스라인 관절 평가

6가지 관절(왼 발목-LA, 오른 발목-RA, 왼 팔꿈치-LE, 오른 팔꿈치-RE, 왼 무릎-LK, 오른 무릎-RK)은 다음의 기준에 따라 0~19의 스케일로 점수를 매기게 된다: 부기, 지속 기간, 근위축, 염발음, 굴곡 상실, 신전 상실, 불안정성, 관절 동통, 및 지구력. 보행은 걷기 및 계단 오르기에 기초하여 0~2의 스케일로 점수를 매기게 된다. 총 점수는, 6가지 관절에 대한 점수에 보행 점수를 더한 합계가 된다(0~116 범위이며, 0은 정상이고 116은 가장 중증 질환).

스크리닝 방문

스크리닝 시에는 신체의 각각의 측면에 있는 팔꿈치, 무릎 및 발목을 관절 질환에 대해 평가하게 된다. 관절 기능은 활발한 출혈 사례가 없을 때 평가해야만 한다. 관절 점수가 0이면 정상 상태임을 반영하는 것이다.

점수 세부 내역

1. 관절 점수는 이러한 범주 및 등급(범위는 각 관절에 대해 0~19이며, 6가지 관절 모두에 대해서는 0~114임)에 따라 6가지 관절(LA, RA, LE, RE, LK, RK)에 대해 매겨진다: 부기(0 = 없음; 1 = 경증; 2 = 중동도; 3 = 중증); 부기의 지속 기간(0 = 부기가 없거나 지속 기간이 6개월 이하; 1 = 지속 기간이 6개월 초과); 근위축(0 = 없음; 1 = 경증; 2 = 중증); 활동 시 염발음(0 = 없음; 1 = 있음); 발목의 발바닥쪽 굴곡을 포함하는 굴곡 상실(0 = 없음; 1 = 경증; 2 = 중등도; 3 = 중증); 발목의 발등쪽 굴곡을 포함하는 신전 상실(0 = 없음; 1 = 경증; 2 = 중등도; 3 = 중증); 불안정성(0 = 없음; 1 = 유의한 병적 관절 이환); 관절 동통(0 = 가동역 전체 또는 가동역 끝에서, 동통 없음; 1 = 있음); 지구력(0 = 정상(중력 및 최대 저항에 대해 위치 유지함); 1 = 최소 감소(중력 및 최대 저항이 아닌 중등도 저항에 대해 위치 유지함); 2 = 경미한 감소(중력 또는 최소 저항에 대해 위치 유지함); 3 = 중등도 감소(중력이 없으면 움직일 수 있음); 4 = 중증 감소(따라 움직이거나 근수축 없음). 무릎과 팔꿈치에서 굴곡 상실과 신전 상실에 점수를 매기는 경우, 다음이 적용된다: 없음 = 대략 0~5도; 경미함 = 대략 5~10도; 중등도 = 대략 11~20도; 및 중증 = 대략 20도 초과.

2. 보행은 한 번 점수가 매겨지게 되며(범위는 0~2임), 여기서 0 = 걷거나 계단을 오르내리는 데 어려움 없음; 1 = 걷는데 어려움은 없으나, 계단은 오르내리기 어려움; 및 2 = 걷는 것 및 계단 오르내리기 어려움.

이러한 변형 혈우병 관절 건강 점수(HJHS)는 혈우병에 걸린 소년에서 관절 신뢰성 점수 연구에 사용된 점수 시스템에 기초한다(Hilliard, Funk 등의 Haemophilia 12(5):518-525 (2006) 참조하고, 그 전체는 참조로서 본원에 통합됨). 이는 4~17세의 20명의 소년으로 이루어진 코호트에서 근골격 결과를 평가하는 도구로서 사용되었다(Saulyte Trakymiene, Ingerslev 등의 Haemophilia 16(3):479-486 (2010)을 참조하고, 그 전체는 참조로서 본원에 통합됨). 변형은 점수 시스템을 성인 혈우병 개체군에 적용하기 위해, 국제 혈우병 예방 치료 연구 그룹에 의한 최근 검증 연구에서의 의견에 따라 이루어졌다(Feldman, Funk 등의 Arthritis Care Res (Hoboken), 2010을 참조하고, 그 전체는 참조로서 본원에 통합됨).

실시예 6

A형 혈우병에서 인자를 사용하는 치환 요법의 주된 합병증은 중증 A형 혈우병 환자의 약 30%에서 억제제(중화 항인자 VIII 항체)가 형성되는 것이다. 억제제의 발생은 치료 효능뿐만 아니라 병에 걸린 개체의 삶의 질에도 영향을 미친다. 면역 시스템이 재조합 인자 III(rFVIII)에 어떻게 반응하는 지에 대한 더 깊이 이해하는 것이 억제제를 효과적으로 근절시키기 위한 혈우병 연구에 있어서의 지속적인 노력이다. 반감기가 연장된 rFVIII Fc 융합 단백질(rFVIIIFc)은 출혈 사례를 예방하고 조절하기 위한 효과적이고 내성이 좋은 요법이다. 이러한 분자의 Fc 영역은 rFVIII 반감기의 연장을 담당할 뿐만 아니라, 전임상 동물 모델에서 나타난 바와 같이(Krishnamoorthy S, 등의 Cell Immunol. 301:30-39 (2016) 참조), 및 면역 내성 유도 사례 보고서에서 제시된 바와 같이 항원 특이적 내성을 촉진할 수 있다(Groomes CL, 등의 Pediatr Blood Cancer 63(5):922-24 (2016); Malec LM, 등의 Haemophilia 22(6):e552-e554 (2016); Ragni MV, 등의 Haemophilia 22(5):e462-e464 (2016) 참조).

방법

말초 혈액 유래의 인간 APC 또는 THP-1 단핵구 세포를 사용해 FcγR 결합, 내재화, 신호 전달 및 사이토카인 생산, 및 유전자 발현 변화뿐만 아니라 후속 상호 작용에 대한 rFVIIIFc의 효과 및 T 세포에 대한 시험관 내 효과를 조사하였다(도 16).

결과

FcγR의 세포 표면 발현의 감소는 rFVIIIFc 치료에 의해 내재화되었음을 나타낸다(도 17a~17c). 서양고추냉이 퍼록시다아제 면역 복합체(HRP-IC)를 양성 대조군으로 사용하고, 인간 면역글로불린 G1(IgG1)을 음성 대조군으로 사용하고, 재조합 인자 VIII(rFVIII) 또는 rFVIII Fc 융합 단백질(rFVIIIFc)를 등몰 농도로(200 nM) 사용하여 단핵구 유래의 대식세포 및 수지상 세포를 24시간 동안 처리하였다. Fcγ 수용체(FcγR)인 CD16(도 17a), CD32(도 17b), 및 CD64(도 17c)의 세포 표면 발현을 유세포 계측법에 의해 측정하였다(n=3; **P≤0.01, ***P≤0.005, 다른 치료제에 대한 HRP-IC의 유의성은 도시되지 않음). rFVIII로 처리한 이후의 표면 발현과 비교하면, rFVIIIFc를 사용한 처리는 CD16(도 17a), CD32(도 17b), 및 CD64(도 17c)의 세포 표면 발현의 감소와 관련되어 있었다.

rFVIIIFc는 후속적인 전염증성 사이토카인의 생산 없이 FcγR에 결합하여 단핵구와 대식세포에서 신호 전달을 유도한다(도 18a~18c). THP-1 단핵구 세포주, 단핵구, 말초 혈액 단핵구 유래의 대식세포, 및 말초 혈액 단핵구 유래의 수지상 세포를 HRP-IC, IgG1, rFVIII 또는 rFVIIIFc로 15분 동안 처리하였다(도 18a). MSD 플랫폼을 사용하여 세포 용해물(cell lysates)에서 Syk 인산화를 측정하였다(n=3~7, *P≤0.05). rFVIIIFc(야생형), 신생아 Fc 수용체에 결합할 수 없는 돌연변이 rFVIIIFc(FcRn 돌연변이), 또는 FcγR에 결합할 수 없는 돌연변이 rFVIIIFc(FcγR 돌연변이)로 대식세포를 처리한 후 Syk 인산화를 측정하였다(n=4, *P≤0.05) (도 18b). MSD ELISA에 의해 24시간 동안 처리된 대식세포의 전염증성 사이토카인 생성을 측정하였다(n=4, 유의성 나타나지 않음) (도 18c).

rFVIIIFc는 활성화 및 전염증 사이토카인 생성에서 역할을 하는 분자보다는 면역조절의 일부를 담당하는 분자를 인산화시킨다(표 9 및 도 19). 15분 동안 rFVIIIFc로 처리된 단핵구 유래 대식세포의 용해물 중의 인산화된 단백질을 프로테옴 프로파일러(Proteome Profiler)의 포스포-키나아제 및 포스포-면역수용체 어레이를 사용해 조사하였다. 프로테옴 프로파일러(Proteome Profiler) 분석에 의해 동정된 rFVIIIFc-처리된 대식세포 중의 인산화된 분자의 목록은 표 9에 도시되어 있다. 억제성 신호 전달을 담당하는 포스파타아제의 인산화는 MSD 플랫폼을 사용해 측정하였다(n=3; **P≤0.01, ***P≤0.005) (도 19).

프로테옴 프로파일러(Proteome Profiler) 분석에 의해 동정된 rFVIIIFc-처리된 대식 세포 내의 인산화 분자.

인산화된 단백질
면역수용체	ILT6/CD85e	NKp46/NCR1	FcH5/IRTA2	키나아제	SRC	STAT5
	KIR2DL4	Siglec9	Siglec2/CD22		CREB	cJun
	SLAMF8	SLAMF4	CDCIR/CLEC4α		pRAS40	p53
	FcγRIIIA/B	FcγRIIA	DECTIN-1/CLEC7α		ERK1/2	WNK1
	PECAM/CD31	FcRH4/IRTA1	KNKp44/NCR2		HSP27	p70S6
	CLEC-2	SHP2	Siglec7		JNK1/2/3	FAK
	TREM2	ILT2/CD85j	SLAMF5		AMPKα2	GSK-3α/β
	SHP1	ILT3/CD85k	Siglec3/CD33		STAT2	RSK1/2/3
	TREML1/TLT-1	ILT4/CD85d	Siglec5		STAT6	p53

rFVIIIFc는 내성 유발 대식세포의 특징인 유전자 발현 패턴을 유도한다(도 20a~20g). 유의하게 하향 조절된 유전자(도 20a) 및 유의하게 상향 조절된 유전자(도 20b)에 대한 탐사적 RNA 시퀀싱을 IgG1, rFVIII, 또는 rFVIIIFc로 6시간 동안 처리된 단핵구 유래의 대식세포 상에서 수행하였고(n=3), rFVIIIFc-상향 조절된 유전자 상에서 경로 분석을 실행하여 rFVIII-처리된 세포와 비교하여 이들 세포에서 선택적으로 나타나는 분자 경로를 조사하였다(표 9). NRF2의 다양한 유전자 및 PPAR-감마 경로뿐만 아니라 다양한 다른 면역 조절기도 상향 조절되는 것으로 밝혀졌다(도 20h). NRF2의 선택된 유전자 및 지질 대사 경로를 Q-PCR에 의해 확인하였다(n=8; *P≤0.05, **P≤0.01, ***P≤0.005) (도 20c~20g). 또한, rFVIIIFc-면역 대식세포는 특유의 M2-유사 표현형을 나타내는 것으로 밝혀졌다(도 20i~20m). 특히, rFVIIIFc로 처리된 대식세포는 rFVIII로 처리된 세포에 비해 6시간차(도 20i) 및 24시간차(도 20j)의 CD206의 발현이 상대적으로 더 높았으며, rFVIIIFc로 처리된 대식세포는 rFVIII로 처리된 세포에 비해 24시간차(도 20m)의 ARG1의 발현이 상대적으로 더 높았다.

[표 9]

rFVIIIFc-처리된 항원 제시 세포는 APC-T 세포-세포 접촉을 필요로 하는 조절 T-세포 분화에 영향을 미친다(도 21a~21c). 말초 혈액 단핵구-유래의 대식세포를 IgG1, rFVIII, 또는 rFVIIIFc로 처리한 다음, 동일한 공여자의 말초 혈액으로부터 단리한 미처리 CD4 양성 T 세포와 공동 배양하였다. 6일간의 공동 배양 이후(도 21a), 유세포 계측법을 사용해 조절 T 세포(CD4+ CD25+ FoxP3+)의 백분율을 정량화하였다(n=4)(도 21b). 미처리 T 세포가 IgG1, rFVIII 또는 rFVIIIFc로 전처리된 APC의 컨디셔닝된 배지에서 배양될 때의 조절 T 세포의 백분율도 정량화하였다(n=4)(도 21c).

결론

rFVIIIFc는 APC 상의 Fcγ 수용체를 통해 결합하여 내재화 및 신호 전달을 유도하는 것으로 보인다. 신호 전달은 전염증성 사이토카인 생성을 번역하지 않고, APC를 활성화시키지 않는다(데이터 미도시). rFVIIIFc 처리 시에 면역조절 신호 전달 이벤트가 개시된다. 이러한 이벤트는 NRF2 및 PPARγ 경로의 상향 조절(도 20h)뿐만 아니라 CD206 및 아르기나아제 1 분자의 상향 조절을 특징으로 하는 M2-유사 표현형으로 대식세포의 분화를 유도하는 것으로 보인다. 다양한 다른 면역 조절기도 발현 증가를 나타낸 반면, rFVIIIFc 처리된 세포에서 적어도 구아닐산 고리화효소 1 가용성 서브유닛 베타(2GUCY1B2), 프로토포르피리노겐 옥시다아제(PPOX), 및 사이토카인 신호 전달 억제자 3(SOCS3)은 발현 감소를 나타냈다(도 20h). 대식세포는 조절 T-세포 분화, FVIII 내성화, 및 항FVIII 억제제 감소와 같은 이전에 보고된 유익한 면역학적 작용을 실행할 수 있다(도 22 및 23).

실시예 7

인자 IX(FIX)의 약동학적(PK) 프로파일은, 혈장 구획 바깥 공간(세포 외 공간)에 대해 FIX가 광범위하게 분포하는 2구획 모델과 일치한다. FIX가 혈장 구획 바깥 조직에 분포하는 반면, PEG 모이어티에 의해 부여된 변형으로 인해 글리코PEG화-rFIX는 대부분 혈장 구획에 남는다는 가설과 B형 혈우병 마우스에서의 rFIXFc 및 rFIX 생분포 프로파일이 일치한다는 것이 SPECT 영상촬영을 사용해 이전에 입증되었다. 본 연구에서, rFIX 및 rFIXFc의 분포를 비인간 영장류(NHP)에서 평가하였고, rFIXFc 및 rFIX는 124I-SIB(숙신이미딜 요오드벤조산염)를 사용해 리신 잔기에서 표지하였다.

시노몰구스 원숭이에게 124I-SIB-rFIXFc (2 mg/kg) 또는 124I-SIB-rFIX (1 mg/kg)의 추적 투여량인 ~2 mCi를 단일 IV 볼루스 주사로 투여하였다. 최대 강도 투사(MIP) 이미지를 생성하기 위해 재구성 전신 PET/CT 스캔을 사용하였고, 관심 영역(ROI) 분석을 위해 생체 내 생분포를 결정하였다.

NHP의 PET 영상 촬영에서는 혈액 웅덩이(blood pool), 심장, 간 및 신장에서 124I-SIB-rFIXFc 및 124I-SIB-rFIX의 초기 분포가 나타났다. 시간이 흐른 후, rFIXFc 및 rFIX 모두의 경우, 어깨 관절뿐만 아니라 다른 뼈 관절(손목, 발목 및 턱)에서도 분포하는 것으로 나타났는데, 이는 FIX 혈장 수준이 검출 수준 아래에 있는 경우의 시점에서조차 rFIXFc가 이들 영역에 대해 유의하게 높게 분포함을 나타내는 것이다. 생체 내 및 생체 외 데이터 모두는 rFIXFc 및 rFIX의 혈액 웅덩이 제거를 나타냈다. TCA 침전 데이터는 95%가 넘는 방사능(radioactivity)이 FIX와 연관되었음을 나타냈다.

NHP에서의 rFIXFc 및 rFIX의 생분포 프로파일은 B형 혈우병 마우스에서와 유사하며, FIX가 혈장 구획 바깥 조직에 분포할 수 있다는 가설과 일치한다. rFIX와 비교해 관절 영역에 rFIXFc가 유의하게 더 많이 분포하는 것은, Fc-매개 메커니즘 또는 PK의 개선에 의해 이들 조직에서 유지되는 것을 잠재적으로 반영하는 것일 수 있다. 출혈 예방 및 관절 건강의 전반적인 보호에 있어서 혈관 외 분포의 역할은 연구 영역으로 남아 있지만, 본 연구는 FIX 변이체에 대한 생분포 차이를 입증한 마우스에서의 관찰 결과와 일치하고, 이는 혈장 수준이 FIX 변이체에 걸쳐 비슷하거나, 동일한 의미를 가질 수 있음을 시사한다.

특정 구현예에 대한 전술한 기술은 당업계 내의 지식을 적용함으로써 다른 사람이 본 발명의 일반적인 개념을 벗어나지 않고도 과도한 실험없이 이러한 특정 구현예를 다양한 응용예에 맞도록 용이하게 수정 및/또는 개조할 수 있는 본 발명의 일반적인 속성을 완전히 밝힐 것이다. 따라서, 이러한 개조 및 수정은 본원에 제시된 교지 및 지침에 기초하여 개시된 구현예의 등가물의 의미 및 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 본원에서의 표현 또는 용어는 본 명세서의 용어 또는 표현이 본 발명의 교지 및 지침에 비추어 당업자에 의해 해석될 수 있도록 기술하기 위한 것이며 한정하기 위한 것이 아님을 이해해야 한다.

본 발명의 다른 실시 양태는 본 명세서의 고려 및 본원에 개시된 본 발명의 실시에 의해 당업자에게 명백해질 것이다. 본 명세서 및 실시예는 단지 예시적인 것으로서 간주되는 것으로 의도되며, 이때 본 발명의 실제 범주 및 사상은 하기 청구범위로 나타낸다.

본원에 개시된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 마치 각각의 개별적인 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조로서 통합되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 참조로서 본원에 통합된다.

Claims

혈우병에 걸린 인간에서 관절의 가역적 혈우병성 관절증을 치료하기 위한 방법에 있어서 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 키메라 단백질 또는 조성물의 용도.
제1항에 있어서, 가역적 혈우병성 관절증은 활액막염, 미세출혈, 또는 둘 다를 포함하는, 용도.
혈우병에 걸린 인간의 관절에서 혈관 변형의 발생을 감소시키거나 예방적으로 치료하기 위한 방법에 있어서 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 키메라 단백질 또는 조성물의 용도.
혈우병에 걸린 인간의 관절의 주변 연조직을 개선하기 위한 방법에 있어서 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 키메라 단백질 또는 조성물의 용도.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 투여는 인간에서 관절 건강 점수(HJHS)를 개선하는, 용도.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 투여는 인간에서 관절 동통을 감소시키는, 용도.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 관절은 한쪽 또는 양쪽 팔꿈치, 한쪽 또는 양쪽 무릎, 한쪽 또는 양쪽 발목, 한쪽 또는 양쪽 어깨, 한쪽 또는 양쪽 고관절, 한쪽 또는 양쪽 손목, 하나 이상의 손 관절, 하나 이상의 발 관절, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용도.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역은 저 친화도 면역글로불린 감마 Fc 영역 수용체 II-b(FcγRIIB)에 특이적으로 결합하는, 용도.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 방사선 촬영, 자기 공명 영상, 초음파영상, 파워 도플러 초음파영상, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 영상 시스템을 사용하는 치료를 필요로 하는 인간을 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 용도.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 응고 인자는 인자 VII (FVII), 인자 VIIa (FVIIa), 인자 VIII (FVIII), 인자 IX (FIX), 인자 X (FX), 폰 빌레브란트 인자 (VWF), FIX 및 FX에 특이적으로 결합하는 이들의 항원 결합 부분, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용도.
제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 단백질은 FVIII-Fc 또는 FIX-Fc를 포함하는, 용도.
제11항에 있어서, FVIII-Fc를 포함하는 키메라 단백질의 유효량은 약 20 IU/kg 내지 약 300 IU/kg인, 용도.
제11항 또는 제12항에 있어서, FVIII-Fc를 포함하는 키메라 단백질은 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일, 약 16일, 약 17일, 약 18일, 약 19일, 약 20일, 약 21일, 약 22일, 약 23일, 또는 약 24일의 투여 간격으로 투여되는, 용도.
제11항에 있어서, FIX-Fc를 포함하는 키메라 단백질의 유효량은 약 20 IU/kg 내지 약 100 IU/kg인, 용도.
제11항 또는 제14항에 있어서, FIX-Fc를 포함하는 키메라 단백질은 약 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 또는 약 28일의 투여 간격으로 투여되는, 용도.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 응고 인자는 혈장 구획 내부 조직뿐만 아니라 혈장 구획 외부 조직에도 분포되는, 용도.