KR20190085141A

KR20190085141A - 펩티드 삼중 glp1/글루카곤/gip 수용체 효능제로서의 신규 화합물

Info

Publication number: KR20190085141A
Application number: KR1020197018943A
Authority: KR
Inventors: 마르틴 보싸르트; 안드레아스 에버스; 토르슈텐 하크; 디터 카데라이트; 카트린 로렌츠; 미하엘 바그너; 슈테파니아 파이퍼-마렉; 마르틴 로렌츠
Original assignee: 사노피
Priority date: 2016-12-02
Filing date: 2017-12-01
Publication date: 2019-07-17
Also published as: JP2019536796A; EP3548508A1; ECSP19046893A; WO2018100134A1; MX2019006429A; CL2019001465A1; AU2017367173A1; TW201833132A; EA201991345A1; EP3548508B1; IL266984A; CN110023329A; KR102576872B1; US20180155406A1; JP7100033B2; CA3045377A1; PH12019501216A1; CN110023329B; AR110300A1; AU2017367173B2

Abstract

본 발명은 삼중 GLP-1/글루카곤/GIP 수용체 효능제 및 예를 들어, 당뇨병 및 비만을 포함하는 대사 증후군 장애의 치료에서 뿐만 아니라 과도한 음식 섭취의 감소를 위한 이의 의학적 용도에 관한 것이다.

Description

펩티드 삼중 GLP1/글루카곤/GIP 수용체 효능제로서의 신규 화합물

본 발명은 삼중 GLP-1/글루카곤/GIP 수용체 효능제인 신규 화합물 및 예를 들어, 당뇨병 및 비만을 포함하는 대사 증후군 장애의 치료에서 뿐만 아니라 과도한 음식 섭취의 감소를 위한 이의 의학적 용도에 관한 것이다. 본 발명의 화합물은 엑센딘-4로부터 구조적으로 유도되고, m-크레졸 또는 페놀과 같은 항균 방부제의 존재하에 산성 조건 하에서 높은 용해도 및 안정성을 나타내어 다른 항당뇨병 화합물과의 병용에 특히 적합하게 한다.

Bhat 등(Diabetologia 2013, 56, 1417-1424), Bhat 등(Biochem Pharmacol. 2013, 85, 1655-62), Gault 등(J Biol Chem. 2013, 288, 35581-91) 뿐만 아니라 Finan 등(Nat Med. 2015, 21, 27-36)은 특히 GIP 수용체 매개된 증가된 인슐린 분비 뿐만 아니라 글루카곤-수용체 매개된 증가된 포만감 및 에너지 소비로 인해 예를 들면, GLP-1, 글루카곤 및 GIP의 작용을 하나의 분자에 결합시킴으로써, 항-당뇨병 작용 및 순수한 GLP-1 작용제보다 우수한 중량 감소 효과를 나타내는 치료 원리를 유도하는, 글루카곤-유사 펩티드-1(GLP-1), 글루카곤 및 글루코스-의존성 인슐린분비성 폴리펩티드(GIP) 수용체의 삼중 효능제를 기술한다.

GLP-1(7-36)-아미드의 아미노산 서열은 서열 번호 1로 제시된다:

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH₂

리라글루티드(Liraglutide)는 여러 변형 중에서도 특히, 지방산이 위치 20의 리신에 연결되어 연장된 작용 지속을 발생시키는 시판되는 화학적으로 변형된 GLP-1 유사체이다(Drucker 등, Nat. Rev. Drug Disc. 2010, 9, 267-268; Buse 등, Lancet 2009, 374, 39-47).

리라글루티드의 아미노산 서열은 서열 번호 2로 제시된다:

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK((S)-4-카르복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴) EFIAWLVRGRG-OH

글루카곤은 순환 글루코스가 낮을 때, 혈류 내로 방출되는 29-아미노산 펩티드이다. 글루카곤의 아미노산 서열은 서열 번호 3으로 표시된다.

HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT-OH

저혈당 동안, 혈당 수준이 정상 아래로 떨어지는 경우, 글루카곤은 간에 신호를 보내 글리코겐을 분해하고, 글루코스를 방출시켜, 혈당 수준을 증가시켜 정상 수준에 도달시킨다. 최근 문헌에서는 글루카곤이 체지방 질량의 감소, 음식 섭취 감소 및 에너지 소비의 증가에 추가적인 이로운 효과를 가짐을 제시한다(Heppner 등, Physiology & Behavior 2010, 100, 545-548).

GIP(글루코스-의존성 인슐린자극 폴리펩티드)는 음식 섭취 후 장 K-세포로부터 방출되는 42개의 아미노산 펩티드이다. GIP 및 GLP-1은 인크레틴 효과를 담당하는 2개의 장 내분비 세포-유래 호르몬이며, 이들은 경구 글루코스 유발접종에 대한 인슐린 반응의 70% 초과를 차지한다(Baggio 등 Gastroenterology 2007, 132, 2131-2157).

GIP의 아미노산 서열은 서열 번호 5로 제시된다:

YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQ-OH

GLP-1 또는 글루카곤의 구조에 기초하고 GLP-1, 글루카곤 및 GIP 수용체를 결합 및 활성화시키는 펩티드는 국제 특허 출원 WO 2010/011439, WO 2010/148089, WO 2012/088116, WO 2013/192129, WO 2013/192130, WO 2014/049610, 및 WO 2015/067716에 기재되어 있다. 엑센딘-4에 기반을 둔 추가의 삼중특이적 효능제는 WO 2014/096145, WO 2015/086731, WO 2015/086732, WO 2015/086733, WO 2015/155141 및 PCT/EP2016/063332에 기재되어 있다. 본 명세서에 기재된 화합물은 개선된 혈당 조절, 가능한 섬 및 베타-세포(islet and beta-cell) 보존 및 향상된 체중 감소를 유도하는 것으로 나타났다.

엑센딘-4의 유사체로서 설계되고 지방산 측쇄로 치환된 GIP 및 GLP-1 수용체에 결합하고 활성화시키는 펩티드는 특허 출원 WO 2014/096145 A1, WO 2014/096150 A1, WO 2014/096149 A1, 및 WO 2014/096148 A1에 기재되어 있다.

엑센딘-4는 힐라 몬스터 (Gila monster) (헬로더마 서스펙텀 (Heloderma suspectum))의 타액선에 의해 생산되는 39개 아미노산 펩티드이다. 엑센딘-4는 GLP-1 수용체의 활성제인 반면, 이는 GIP 수용체의 낮은 활성화를 나타내고, 글루카곤 수용체를 활성화하지 않는다(표 1 참조).

[표 1]

엑센딘-4의 아미노산 서열은 하기 서열 번호 4로 제시된다:

HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2

엑센딘-4는 GLP-1에 의해 관찰된 많은 글루코스 조절 작용을 공유한다. 임상 및 비 임상 연구에서 엑센딘-4는 인슐린 합성 및 분비의 글루코스 의존성 증진, 글루카곤 분비의 글루코스 의존성 억제, 위 배출 감소, 식이 섭취량 및 체중 감소 및 베타 세포의 질량 및 베타 세포 기능의 표지자 증가를 포함하는 여러 가지 유익한 항당뇨병 성질을 갖는 것으로 나타났다.

이들 효과는 당뇨 뿐만 아니라 비만으로 고통받는 환자에게도 이로울 수 있다. 비만인 환자는 당뇨병, 고혈압, 고지질혈증, 심혈관 및 근골격 질병에 걸릴 위험이 더 높다.

GLP-1와 비교하여, 엑센딘-4는 디펩티딜 펩티다제-4(DPP4)에 의한 분해에 내성이어서 반감기 및 생체내 작용 기간이 더 길어진다(Eng J., Diabetes, 1996 45(Suppl 2):152A(abstract 554)).

엑센딘-4는 또한 GLP-1, 글루카곤 또는 옥신토모듈린(oxyntomodulin)과 비교하는 경우 중성 엔도펩티다제(NEP)에 의한 분해에 훨씬 더 안정적인 것으로 밝혀졌다(Druce 등, Endocrinology, 2009 150(4), 1712-1722). 그럼에도 불구하고, 엑센딘-4는 위치 14에서의 메티오닌 산화(Hargrove 등, Regul. Pept., 2007, 141, 113-119) 뿐만 아니라 위치 28에서의 아스파라긴의 탈아미드화 및 이성화(WO 2004/035623)로 인해 화학적으로 불안정하다.

Bloom 등 (WO 2006/134340호)에는 글루카곤 및 GLP-1 수용체 둘 모두에 결합하고 이들을 활성화하는 펩티드가 글루카곤 및 엑센딘-4로부터의 하이브리드 분자로서 작제될 수 있고, N-말단 부분(예를 들어, 잔기 1 내지 14 또는 1 내지 24)은 글루카곤으로부터 유래되고, C-말단 부분(예를 들어, 잔기 15 내지 39 또는 25 내지 39)은 엑센딘-4로부터 유래되는 것이 개시되어 있다. 상기 펩티드는 위치 10 내지 13에 글루카곤의 아미노산 모티프 YSKY를 포함한다. Krstenansky 등(Biochemistry, 1986, 25, 3833-3839)은 글루카곤의 상기 잔기 10 내지 13이 수용체 상호 작용 및 아데닐레이트 사이클라아제의 활성화에 있어서 중요함을 보여준다.

GLP-1, 글루카곤 및 옥신토모듈린에 비해, 엑센딘-4는 이로운 물리화학적 특성, 예컨대 용액 중 용해도 및 안정성을 가지며, 생리학적 조건(효소, 예컨대 DPP4 또는 NEP에 의한 분해에 대한 효소적 안정성 포함) 하에 생체내에서 더 긴 작용 기간을 얻는다.

그럼에도 불구하고, 또한 엑센딘-4는 위치 28에서의 아스파라긴의 탈아미드화 및 이성화 뿐만 아니라 위치 14에서의 메티오닌 산화로 인해 화학적으로 불안정한 것으로 나타났다. 안정성은 위치 14에서의 메티오닌의 치환 및 아스파르트이미드 형성, 특히 위치 28 및 29에서의 Asp-Gly 또는 Asn-Gly를 통한 분해를 일으키기 쉬운 것으로 공지된 서열의 회피에 의해 더욱 개선되었다.

본 발명의 화합물에서, 기저 잔기 중 몇개는 WO 2006/134340에 기술된 펩티드 및 글루카곤과 상이하다. 특히, 글루카곤의 섬유화에 기여하는 것으로 알려진 잔기 Tyr10 및 Tyr13(JS Pedersen 등, Biochemistry, 2006, 45, 14503-14512)은 Leu로 치환된다. 이러한 치환은 특히 위치 23의 이소류신 및 위치 24의 글루타메이트와의 조합에서 용액에서의 용해도 또는 응집 거동으로서 잠재적으로 개선된 생물물리학적 특성을 갖는 엑센딘-4 유도체를 유도한다. 엑센딘-4 유사체의 위치 13에서의 방향족 아미노산의 지방족 아미노산에 의한 치환은 GLP-1 수용체에 대한 이의 활성을 유지하면서, 글루카곤 및 GIP 수용체 둘다에 대해 높은 활성을 갖는 펩티드를 유도한다.

천연 엑센딘-4는 글루카곤 수용체에 대해 활성을 갖지 않고 GIP 수용체에 대해 낮은 활성을 갖는 순수한 GLP-1 수용체 효능제이다. 본 발명의 화합물은 천연 엑센딘-4의 구조를 기초로 하지만, 서열 번호 4와 비교하여 14개 이상의 위치에서 상이하며, 상기 차이는 글루카곤 수용체 및 GIP 수용체에서 효능제 활성의 증진에 기여한다. 여러 치환 중에서 특히 - 위치 14에서의 메티오닌은 측쇄에 -NH₂ 그룹을 갖는 아미노산으로 대체되고, 이는 친지성 잔기(예를 들어, 링커(linker)와 조합된 지방산)로 추가 치환된다. 위치 13, 19, 20, 32, 34, 35 및 39의 엑센딘-4 아미노산을 위치 13의 Leu, 위치 19의 Gln, 위치 20의 Aib 또는 Lys 아미노산, 위치 34의 Aib, 위치 32의 Pro, 위치 35 및 39의 Lys로 치환하면, GLP-1 수용체에 대한 높은 활성을 유지하면서 GIP 수용체 뿐만 아니라 글루카곤 모두에서 높은 활성을 유도한다. 이들 펩티드는 또한 pH4.5와 같은 산성 pH 값에서 높은 화학적 안정성, 용해도 및 물리적 안정성을 나타낸다.

본 발명의 화합물은 화학식 I 또는 이의 염 또는 용매화물을 갖는다:

화학식 I

H₂N-His-Aib-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Leu-X14-Glu-Glu-Gln-Arg-Gln-X20-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Ala-X29-Gly-X31-Pro-Ser-Aib-Lys-Pro-Pro-Pro-Lys-R¹

상기 화학식 I에서,

X14는 Lys, Orn, Dab 또는 Dap로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 관능화된 -NH₂ 측쇄 그룹을 갖는 아미노산 잔기를 나타내고, 상기 -NH₂ 측쇄 그룹은 -Z-C(O)-R⁵에 의해 관능화되고,

Z는 모든 입체이성질체 형태의 링커를 나타내고,

R⁵는 최대 50개 탄소 원자 그리고 N 및 O로부터 선택된 헤테로원자를 포함하는 모이어티(moiety)이고,

X20은 Aib 및 Lys로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고,

X29는 D-Ala 및 Gly로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고,

X31은 His 및 Pro로부터 선택되는 아미노산 잔기를 나타내고,

R¹은 NH₂ 또는 OH이다.

본 발명의 화합물은 이들이 방법에 기재된 검정 시스템에서 세포내 cAMP 형성을 자극할 수 있다는 관찰에 의해 결정되는 GLP-1, 글루카곤 및 GIP 수용체 효능제이다.

또다른 실시형태에 따르면, 특히 위치 14에 리신을 가지며, 친지성 잔기로 추가 치환되는 본 발명의 화합물은 GLP-1 수용체에서 GLP-1(7-36)아미드에서에 비해 적어도 0.1%(즉, EC₅₀ 700 pM 미만), 보다 바람직하게는 1%(즉, EC₅₀ 70 pM 미만), 더욱 바람직하게는 3.5%(즉, EC₅₀ 20 pM 미만), 더욱 더 바람직하게는 7%(즉, EC₅₀ 10 pM 미만)의 상대 활성(relative activity)을 나타낸다. 또한, 본 발명의 화합물은 글루카곤 수용체에서 천연 글루카곤에서에 비해 적어도 0.1%(즉, EC₅₀ 500 pM 미만), 보다 바람직하게는 0.5%(즉, EC₅₀ 100 pM 미만), 더욱 바람직하게는 1% (50 pM 미만), 더욱 더 바람직하게는 5%(즉, EC₅₀ 10 pM 미만)의 상대 활성을 나타낸다. 또한, 본 발명의 화합물은 GIP 수용체에서 천연 GIP에서에 비해 적어도 0.1%(즉, EC₅₀ 400 pM 미만), 보다 바람직하게는 0.4%(즉, EC₅₀ 100 pM 미만), 더욱 바람직하게는 1%(40 pM 미만), 더욱 더 바람직하게는 4%(즉, EC₅₀ 10 pM 미만)의 상대 활성을 나타낸다.

본원에서 사용되는 용어 "활성"은 바람직하게는 인간 GLP-1 수용체, 인간 글루카곤 수용체 및 인간 GIP 수용체를 활성화시키는 화합물의 능력을 나타낸다. 보다 바람직하게는 본원에서 사용되는 용어 "활성"은 세포내 cAMP 형성을 자극하는 화합물의 능력을 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "상대 활성"은 또다른 수용체 효능제에 비해 또는 또다른 수용체에 비해 일정 비로 수용체를 활성화하는 화합물의 능력을 나타내는 것으로 이해된다. 효능제에 의한 수용체의 활성화(예를 들어, cAMP 수준을 측정함에 의함)는 본원에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 실시예에 기재된 바와 같이 결정된다.

본 발명의 화합물은 바람직하게는 450 pM 또는 그 미만, 바람직하게는 200 pM 또는 그 미만, 더욱 바람직하게는 100 pM 또는 그 미만, 더욱 바람직하게는 50 pM 또는 그 미만, 더욱 바람직하게는 25 pM 또는 그 미만, 더욱 바람직하게는 10 pM 또는 그 미만, 더욱 바람직하게는 8 pM 또는 그 미만, 더욱 바람직하게는 5　pM 또는 그 미만의 hGLP-1 수용체에 대한 EC₅₀, 및 450 pM 또는 그 미만, 바람직하게는 200 pM 또는 그 미만, 더욱 바람직하게는 100 pM 또는 그 미만, 더욱 바람직하게는 50 pM 또는 그 미만, 더욱 바람직하게는 25 pM 또는 그 미만, 더욱 바람직하게는 10 pM 또는 그 미만, 더욱 바람직하게는 8 pM 또는 그 미만, 더욱 바람직하게는 5　pM 또는 그 미만의 h글루카곤 수용체에 대한 EC₅₀, 및 450 pM 또는 그 미만, 바람직하게는 200 pM 또는 그 미만, 더욱 바람직하게는 100 pM 또는 그 미만, 더욱 바람직하게는 50 pM 또는 그 미만, 더욱 바람직하게는 25 pM 또는 그 미만, 더욱 바람직하게는 10 pM 또는 그 미만, 더욱 바람직하게는 8 pM 또는 그 미만, 더욱 바람직하게는 5　pM 또는 그 미만의 hGIP 수용체에 대한 EC₅₀을 갖는다. hGLP-1 수용체, h글루카곤 수용체 및 hGIP 수용체에 대한 EC₅₀은 본원의 방법에 기재되고 실시예에 기재된 결과를 발생시키도록 이용된 바와 같이 결정될 수 있다.

특히 위치 14에 리신을 가지며, 친지성 잔기로 추가 치환되는 화학식 I의 화합물이 위치 14에 원래 메티오닌(엑센딘-4 유래) 또는 류신을 갖는 유도체에 비해 증가된 글루카곤 수용체 활성화를 나타내었다(WO2014/056872 참조). 또한, 메티오닌의 산화(시험관내 또는 생체내)는 더 이상 가능하지 않다.

화학식 I의 화합물은 GIP 수용체 뿐만 아니라 글루카곤 수용체에서도 높은 활성을 나타낸다. GIP 수용체에 대한 추가의 높은 활성은 순수한 GLP-1 수용체 작용제와 비교하여 혈당 조절에 대한 효능 증진 및 GLP-1 부분의 기여가 감소될 수 있음에 따른 위장 장애와 같은 GLP-1 관련 부작용의 가능성을 감소시키기 위한 것이다. 부가적인 GIPR 활성은 또한 글루카곤 수용체 활성화에 의한 잠재적인 글루코스 증가를 상쇄하여 화학식 1의 화합물에서 관찰된 바와 같이 보다 높은 글루카곤 수용체 활성을 가능하게 하기 위한 것이다(Finan 등 Nat Med. 2015, 21, 27-36).

하나의 실시형태에서, 본 발명의 화합물은 페놀 또는 m-크레졸과 같은 항균 방부제의 존재하에, 예를 들어 pH 4 내지 5, 특히 pH 4.5의 산도 범위에서, 및/또는 pH 6 내지 8, 특히 pH 7.4에서, 25℃ 또는 40℃의 보다 생리학적 범위에서, 또다른 실시형태에서 적어도 1 mg/ml 및 특정 실시형태에서 적어도 5 mg/ml의, 산성 및/또는 생리학적 pH 값에서 높은 용해도를 갖는다.

또한, 본 발명의 화합물은 바람직하게는 페놀 또는 m-크레졸과 같은 항균 방부제의 존재하에 용액 중에 저장될 때 높은 안정성을 갖는다. 안정성을 결정하기 위한 바람직한 검정 조건은 pH 4 내지 5, 특히 pH 4.5의 산도 범위에서 용액 중 25℃ 또는 40℃에서 28일 동안 저장하는 것이다. 펩티드의 안정성은 방법에 기술된 바와 같은 크로마토그래피 분석에 의해 결정된다. 바람직하게는, pH 4.5의 용액 중 40℃에서 28일 후, 순도 손실은 20% 이하, 보다 바람직하게는 15% 이하, 더욱더 바람직하게는 12% 이하이다.

하나의 실시형태에서, 본 발명의 화합물은 방법에 기재된 바와 같은 동적 광산란법에 의해 분석된 바와 같이, 페놀 또는 m-크레졸과 같은 항균 방부제의 존재하에, 예를 들어 pH 4 내지 5에서 25℃에서, 특히 pH 4.5에서 25℃에서의 산도 범위에서 1 mg/ml 이상의 농도에서 5 nm 이하의 유체역학 반경 R_h를 나타낸다.

하나의 실시형태에서, 본 발명의 화합물은 페놀 또는 m-크레졸과 같은 항균 방부제의 존재하에 3 mg/ml의 농도에서 형광 프로브로서의 티오플라빈 T를 사용하여, 예를 들어 방법에 기재된 ThT 분석에 의해 분석된 바와 같이 pH 4 내지 5, 특히 pH 4.5의 산도 범위에서, 37℃에서 5시간 이상, 더욱 바람직하게는 10시간 이상, 더욱 바람직하게는 20시간 이상, 더욱 바람직하게는 30시간 이상, 더욱 바람직하게는 40시간 이상 및 더욱 더 바람직하게는 45시간 이상 동안 형광 강도 증가를 나타내지 않는다.

하나의 실시형태에서, 본 발명의 화합물은 천연 GLP-1 및 글루카곤과 비교하는 경우, 중성 엔도펩티다제(NEP) 및 디펩티딜 펩티다제-4(DPP4)에 의한 분해에 더욱 내성이 있어서 생체내 더 긴 반감기와 작용 기간을 얻는다.

하나의 실시형태에서, 본 발명의 화합물은 39개의 아미노 카복실산, 특히 펩티드, 즉, 카복사미드 결합에 의해 연결된 α-아미노 카복실산의 선형 서열인 펩티드 모이어티를 포함한다.

하나의 실시형태에서, R¹는 NH₂이다.

-Z-C(O)-R⁵ 그룹에 대한 특정 바람직한 예는 하기의 표 2에 나열되어 있으며, 이는

(S)-4-카르복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴-, (S)-4-카르복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴-, (S)-4-카르복시-4-((S)-4-카르복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노)-부티릴, (4S)-카르복시-[2-(2-{2-[(4R)-5-카르복시-4-헥사데카노일아미노-펜타노일아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸아미노]-부티릴, (4S)-카르복시- [2-(2-{2-[(4R)-5-카르복시-4-헥사데카노일아미노-펜타노일아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸아미노]-부티릴, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-카르복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-카르복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸, [2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-옥타데카노일아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸-

로부터 선택된다.

추가로 바람직한 것은 상기 그룹 입체이성질체, 특히 S-거울상 이성질체 또는 R-거울상 이성질체인 거울상 이성질체이다. 표 2의 용어 "R"은 펩티드 주쇄, 예를 들어 Lys의 ε-아미노 그룹에서 -Z-C(O)-R⁵의 부착 부위를 의미하는 것으로 의도된다.

[표 2]

추가적인 실시형태는 화학식 I의 화합물에 관한 것으로, 여기서,

X14는 Lys이고, 상기 -NH₂ 측쇄 그룹은 그룹 -Z-C(O)R⁵로 관능화되고,

Z는 gGlu, gGlu-gGlu, gGlu-AEEAc-gAAA-, gGlu-gGlu-AEEAc, AEEAc-AEEAc-gGlu 및 AEEAc-AEEAc-AEEAc로부터 선택된 그룹을 나타내고;

R⁵는 펜타데카닐 또는 헵타데카닐로부터 선택된 그룹을 나타낸다.

Z는 gGlu, gGlu-gGlu, gGlu-AEEAc-gAAA- 및 gGlu-gGlu-AEEAc로부터 선택된 그룹을 나타내고;

추가적인 실시형태는 화학식 I의 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물에 관한 것으로, 여기서,

X14는 Lys를 나타내고, 상기 -NH₂ 측쇄 그룹은 (S)-4-카르복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴-, (S)-4-카르복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴-, (S)-4-카르복시-4-((S)-4-카르복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노)-부티릴-, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-카르복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-카르복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸, [2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-옥타데카노일아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸-로 관능화되고,

R¹은 NH₂를 나타낸다.

X14는 Lys를 나타내고, 상기 -NH₂ 측쇄 그룹은 (S)-4-카르복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴-, (S)-4-카르복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴-, (S)-4-카르복시-4-((S)-4-카르복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노)-부티릴-, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-카르복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-카르복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸로 관능화되고,

R¹은 NH₂를 나타낸다.

X14는 Lys를 나타내고, 상기 -NH₂ 측쇄 그룹은 (S)-4-카르복시-4-((S)-4-카르복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노)-부티릴-로 관능화되고,

X20은 Lys 또는 Aib를 나타내고,

X29는 D-Ala 및 Gly로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고,

X31은 His 및 Pro로부터 선택되는 아미노산 잔기를 나타내고,

R¹은 NH₂를 나타낸다.

X14는 Lys를 나타내고, 상기 -NH₂ 측쇄 그룹은 (S)-4-카르복시-4-((S)-4-카르복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노)-부티릴-, (S)-4-카르복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴-로 관능화되고,

X20은 Lys를 나타내고,

X29는 D-Ala 및 Gly로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고,

X31은 His 및 Pro로부터 선택되는 아미노산 잔기를 나타내고,

R¹은 NH₂를 나타낸다.

X20은 Lys를 나타내고,

X29는 D-Ala 및 Gly로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고,

X31은 His를 나타내고,

R¹은 NH₂를 나타낸다.

X20은 Lys를 나타내고,

X29는 Gly를 나타내고,

X31은 His 및 Pro로부터 선택되는 아미노산 잔기를 나타내고,

R¹은 NH₂를 나타낸다.

X20은 Aib를 나타내고,

X29는 D-Ala 및 Gly로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고,

X31은 His 및 Pro로부터 선택되는 아미노산 잔기를 나타내고,

R¹은 NH₂를 나타낸다.

X20은 Aib를 나타내고,

X29는 D-Ala 및 Gly로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고,

X31은 Pro을 나타내고,

R¹은 NH₂를 나타낸다.

X20은 Aib를 나타내고,

X29는 D-Ala를 나타내고,

X31은 His 및 Pro로부터 선택되는 아미노산 잔기를 나타내고,

R¹은 NH₂를 나타낸다.

화학식 I의 화합물의 특정 예는 서열 번호 6 내지 27의 화합물 뿐만 아니라 이들의 염 또는 용매화물이다.

화학식 I의 화합물의 특정 예는 서열 번호 6, 9 및 11의 화합물 뿐만 아니라 이들의 염 또는 용매화물이다.

화학식 I의 화합물의 특정 예는 서열 번호 6의 화합물 뿐만 아니라 이들의 염 또는 용매화물이다.

화학식 I의 화합물의 특정 예는 서열 번호 9의 화합물 뿐만 아니라 이들의 염 또는 용매화물이다.

화학식 I의 화합물의 특정 예는 서열 번호 11의 화합물 뿐만 아니라 이들의 염 또는 용매화물이다.

추가 양태에서, 본 발명은 담체와 혼합된 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 바람직한 실시형태에서, 조성물은 약제학적으로 허용되는 조성물이고, 담체는 약제학적으로 허용되는 담체이다. 본 발명의 화합물은 염, 예를 들어, 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물, 예를 들어, 수화물의 형태로 존재할 수 있다. 또다른 추가 양태에서, 본 발명은 의학적 치료 방법, 특히 인간 의학에서 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다.

화학식 I의 화합물은 추가의 치료학적으로 효과적인 제제 없이 인간 치료에 적합하다. 그러나, 다른 실시형태에서, 화합물은 "병용 요법(combination therapy)"에 기재된 바와 같이 적어도 하나의 추가의 치료학적 활성제와 함께 사용될 수 있다.

화학식 I의 화합물은 탄수화물 및/또는 지질 대사의 장애에 의해 야기되고/되거나, 이와 관련되고/되거나, 이에 수반되는 질환 또는 질병의 치료 또는 예방, 예를 들어, 고혈당증, 2형 당뇨병, 글루코스 내성 장애, 1형 당뇨병, 비만 및 대사 증후군의 치료 또는 예방에 특히 적합하다. 추가로, 본 발명의 화합물은 퇴행성 질환, 특히 신경퇴행성 질환의 치료 또는 예방에 적합할 수 있다.

기재된 화합물은 특히 체중 증가를 예방하거나 체중 감소를 촉진하는데 사용된다. "예방하는"은 치료의 부재와 비교하는 경우 억제하거나 감소시키는 것을 의미하며, 반드시 질병의 완전한 정지를 의미하지는 않는다.

본 발명의 화합물은 음식 섭취의 감소를 야기시키고/시키거나 에너지 소비를 증가시켜, 체중에 대해 관찰되는 효과를 얻을 수 있다.

체중에 대한 효과와 독립적으로, 본 발명의 화합물은 순환하는 콜레스테롤 수준에 대해 이로운 효과를 가질 수 있고, 지질 수준, 특히 LDL 뿐만 아니라 HDL 수준을 개선(예를 들어, HDL/LDL 비율 증가)시킬 수 있다.

따라서, 본 발명의 화합물은 과체중에 의해 야기되거나 과체중을 특징으로 하는 임의의 질환의 직접적 또는 간접적 요법, 예컨대, 비만, 병적 비만, 비만 관련 염증, 비만 관련 담낭 질병, 비만 유도 수면무호흡의 치료 및/또는 예방에 이용될 수 있다. 이들은 또한 대사 증후군, 당뇨병, 고혈압, 죽종형성 이상지질혈증, 죽상경화증, 동맥경화증, 관상동맥 심질환 또는 뇌졸중의 치료 및 예방에서 사용될 수 있다. 이들 질환에서의 이의 효과는 체중에 대한 이의 효과의 결과이거나 이와 관련될 수 있거나, 이와 독립적일 수 있다.

의료용으로는 2형 당뇨병의 진행 지연 또는 예방, 대사 증후군 치료, 비만 치료 또는 과체중 예방, 음식 섭취 감소, 에너지 소비 증가, 체중 감소, 내당능 장애(IGT)에서 2형 당뇨병으로의 진행 지연; 2형 당뇨병에서 인슐린-필요 당뇨병으로의 진행 지연을 포함한다.

정의

본 발명의 아미노산 서열은 천연 발생 아미노산에 대한 통상적인 1 문자 및 3 문자 코드 뿐만 아니라 다른 아미노산, 예컨대, Aib(α-아미노이소부티르산)에 대한 일반적으로 허용되는 3 문자 코드를 함유한다.

용어 "천연 엑센딘-4"는 서열 HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH₂(서열 번호 4)를 갖는 천연 엑센딘-4를 지칭한다.

본 발명은 화학식 I로 정의된 바와 같은 펩티드 화합물에 관한 것이다.

본 발명의 펩티드 화합물은 펩티드에 의해 연결된 아미노 카복실산의 선형 골격, 즉, 카복사미드 결합을 포함한다. 바람직하게는, 아미노 카복실산은 달리 표시되지 않는 한 α-아미노 카복실산, 더 바람직하게는 L-α-아미노 카복실산이다. 펩티드 화합물은 바람직하게는 39개 아미노 카복실산의 주쇄 서열을 포함한다.

펩티드 모이어티 (화학식 I) 내의 아미노산은 통상적인 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1에서 39까지 연속적으로 넘버링되는 것으로 간주될 수 있다. 펩티드 모이어티 I 내의 "위치"에 대한 언급은 이에 따라 구축되어야 하며, 이는 천연 엑센딘-4 및 다른 분자 내의 위치에 대한 언급이 그러해야 하는 것과 같고, 예를 들어, 엑센딘-4에서, His이 위치 1에 존재하고, Gly이 위치 2에 존재하고,..., Met이 위치 14에 존재하고,...Ser이 위치 39에 존재한다.

-NH₂ 측쇄 그룹을 갖는 아미노산 잔기, 예를 들어 Lys, Orn, Dab 또는 Dap는 -NH₂ 측쇄 그룹의 적어도 하나의 H 원자가 -Z-C(O)-R⁵로 치환되어 관능화되고, 상기 R⁵는 친지성 모이어티, 예로 아사이클릭 선형 또는 분지형 (C₈ 내지 C₃₀) 포화 또는 불포화 탄화수소 그룹을 포함하며, 이는, 예를 들어 할로겐(F, Cl, Br, J), -OH 및/또는 CO₂H로 치환되거나 치환되지 않으며, Z는 모든 입체이성질체 형태의 링커, 예로 γ-글루타메이트(gGlu), gAAA 및 AEEAc의 그룹으로부터 선택된 1개 이상, 예를 들어 1개 내지 5개, 바람직하게는 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 링커 그룹을 포함하는 링커를 포함한다. 바람직한 그룹 R⁵는 친지성 모이어티, 예로 아사이클릭 선형 또는 분지형 (C₁₂ 내지 C₂₀) 포화 또는 불포화 탄화수소 그룹, 예로 펜타데카닐, 헥사데카닐 또는 헵타데카닐을 포함하며, 이는 CO₂H, 보다 바람직하게는 펜타데카닐 또는 헵타데카닐로 치환되거나 치환되지 않는다. 하나의 실시형태에서, 아미노산 링커 그룹은 gGlu, gGlu-gGlu, gGlu-gGlu-AEEAc, gGlu-AEEAc-gAAA, AEEAc-AEEAc-gGlu 및 AEEAc-AEEAc-AEEAc로부터 선택된다. 또다른 실시형태에서, 아미노산 링커 그룹은 gGlu이다. 또다른 실시형태에서, 아미노산 링커 그룹은 gGlu-gGlu이다. 또다른 실시형태에서, 아미노산 링커 그룹은 gGlu-gGlu-AEEAc이다. 또다른 실시형태에서, 아미노산 링커 그룹은 gGlu-AEEAc-gAAA이다. 또다른 실시형태에서, 아미노산 링커 그룹은 AEEAc-AEEAc-gGlu이다. 또다른 실시형태에서, 아미노산 링커 그룹은 AEEAc-AEEAc-AEEAc이다.

추가의 양태에서, 본 발명은 담체와 혼합된 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 화합물, 또는 이들의 염 또는 용매화물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 의약으로 사용하기 위한, 특히 명세서에 기재되는 바와 같은 질환의 치료를 위한 본 발명의 화합물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 조성물이 약제학적으로 허용되는 조성물이고, 담체가 약제학적으로 허용되는 담체인 조성물에 관한 것이다.

펩티드 합성

당업자는 펩티드를 제조하는 다양한 상이한 방법을 알고 있다. 이들 방법은 합성 접근법 및 재조합 유전자 발현을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 펩티드를 제조하는 한 방식으로는 용액 중 또는 고체 지지체 상에서의 합성 및 후속적인 단리 및 정제가 있다. 펩티드를 제조하는 상이한 방식으로는 펩티드를 코딩하는 DNA 서열이 도입된 숙주 세포에서의 유전자 발현이 있다. 대안적으로, 유전자 발현은 세포 시스템을 이용하지 않고 달성될 수 있다. 상기에 기술된 방법은 또한 임의의 방식으로 조합될 수 있다.

본 발명의 화합물을 제조하는 바람직한 방식은 적합한 수지 상에서의 고체상 합성이다. 고체 상 펩티드 합성은 잘 확립된 방법이다(예를 들어, 문헌[Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., 1984]; 문헌[E. Atherton and R. C. Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis. A Practical Approach, Oxford-IRL Press, New York, 1989] 참조). 고체상 합성은 카르복시 말단을 갖는 N-말단 보호된 아미노산을 분해가능한 링커를 갖는 비활성 고체 지지체에 부착시킴으로써 개시된다. 이러한 고체 지지체는 수지에 대한 카르복시기(또는 Rink 수지에 대해서는 카복사미드)의 결합이 산에 민감(Fmoc 전략이 이용되는 경우)한, 최초 아미노산의 커플링을 가능케 하는 임의의 중합체, 예를 들어, 트리틸 수지, 클로로트리틸 수지, Wang 수지 또는 Rink 수지일 수 있다. 중합체 지지체는 펩티드 합성 동안 α-아미노 그룹을 탈보호시키는데 이용되는 조건 하에서 안정해야 한다.

N-말단 보호된 첫 번째 아미노산이 고체 지지체에 커플링된 후, 이 아미노산의 α-아미노 보호 그룹이 제거된다. 그 후, 나머지 보호된 아미노산은 적절한 아미드 커플링 시약, 예를 들어, BOP, HBTU, HATU 또는 DIC (N,N'-디이소프로필카르보디이미드)/HOBt(1-하이드록시벤조트리아졸)을 이용하여 펩티드 서열에 의해 표시된 순서로 번갈아 또는 사전형성된 디펩티드, 트리펩티드 또는 테트라펩티드와 함께 커플링되고, 상기 BOP, HBTU 및 HATU는 3차 아민 염기와 함께 사용된다. 대안적으로, 유리된 N-말단은 아미노산 이외의 그룹, 예를 들어 카복실산 등으로 관능화될 수 있다.

보통, 아미노산의 반응성 측쇄 그룹은 적합한 차단 그룹으로 보호된다. 이들 보호 그룹은 요망되는 펩티드가 어셈블리된 후에 제거된다. 이들은 동일 조건하에서 수지로부터의 요망되는 생성물의 분해와 동시에 제거된다. 보호 그룹 및 보호 그룹을 도입하기 위한 절차는 Protective Groups in Organic Synthesis, 3d ed., Greene, T.W.and Wuts, P.G.M., Wiley & Sons(New York:1999)에서 발견될 수 있다.

일부 경우에서, 다른 측쇄 보호 그룹이 온전하게 유지되면서 선택적으로 제거될 수 있는 측쇄 보호 그룹을 갖는 것이 요망될 수 있다. 이러한 경우에서, 유리된 작용기는 선택적으로 관능화될 수 있다. 예를 들어, 리신은 매우 친핵성인 염기, 예를 들어, DMF(디메틸 포름아미드) 중 4% 하이드라진에 불안정한 ivDde([1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소사이클로헥스-1-일리덴)-3-메틸부틸) 보호 그룹(S.R. Chhabra 등, Tetrahedron Lett. 39, (1998), 1603)으로 보호될 수 있다. 따라서, N-말단 아미노 그룹 및 모든 측쇄 작용기가 산 불안정 보호 그룹으로 보호되는 경우, ivDde 그룹은 DMF 중 4% 하이드라진을 이용하여 선택적으로 제거될 수 있고, 상응하는 자유 아미노 그룹은 이후, 예를 들어, 아실화에 의해 추가로 변형될 수 있다. 리신은 대안적으로 보호된 아미노산에 커플링될 수 있고, 이러한 아미노산의 아미노 그룹은 이후 탈보호되어 아실화되거나 추가 아미노산에 부착될 수 있는 또다른 자유 아미노 그룹을 발생시킬 수 있다. 대안적으로, 측쇄(표 2에 기재됨)는 미리 기능화된 빌딩 블록, 예를 들어 (2S)-6-[[(4S)-5-3급-부톡시-4-[[(4S)-5-3급-부톡시-4-(헥사데카노일아미노)-5-옥소-펜타노일]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)헥산 산을 커플링 파트너로 사용하여 펩티드 합성 동안 리신과 함께 도입될 수 있다.

최종적으로, 펩티드는 수지로부터 분해된다. 이는 킹 칵테일 (King's cocktail)을 이용하여 달성될 수 있다(문헌[D. S. King, C. G. Fields, G. B. Fields, Int. J. Peptide Protein Res. 36, 1990, 255-266]). 그 후, 원료 물질은 필요할 경우 크로마토그래피, 예를 들어, 분취용 RP-HPLC에 의해 정제될 수 있다.

효능

본원에서 사용되는 용어 "효능" 또는 "시험관내 효능"은 세포-기반 검정에서 GLP-1, 글루카곤 또는 GIP에 대한 수용체를 활성화시키는 화합물의 능력에 대한 척도이다. 수치상으로, 이는 용량-반응 실험에서 반응 (예를 들어, 세포내 cAMP의 형성)의 최대 증가의 절반을 유도하는 화합물의 유효 농도인 "EC50 값"으로 표현된다.

치료학적 용도

대사 증후군은 함께 발생하는 경우 2형 당뇨병 뿐만 아니라 죽상경화 혈관 질병, 예를 들어, 심장병 및 뇌졸중이 발생할 위험을 증가시키는 의학적 장애의 조합이다. 대사 증후군에 대해 의학적 매개변수를 규정하는 것은 당뇨병, 글루코스 내성 장애, 상승된 공복 혈당, 인슐린 내성, 소변 알부민 분비, 중심부 비만, 고혈압, 상승된 트라이글리세라이드, 상승된 LDL 콜레스테롤 및 감소된 HDL 콜레스테롤을 포함한다.

비만은 과도한 체지방이 건강 및 기대 여명에 유해한 효과를 미칠 수 있을 정도로 축적되고, 증가된 유병률로 인해 성인 및 아동에서 현대 사회에서의 주요한 예방가능한 사망 원인 중 하나가 되는 임상적 질환이다. 이는 심장병, 2형 당뇨병, 폐쇄수면무호흡, 특정 유형의 암 뿐만 아니라 골관절염을 포함하는 다양한 다른 질병의 가능성을 증가시키며, 이는 가장 흔히 과도한 음식 섭취, 감소된 에너지 소비 뿐만 아니라 유전적 감수성의 조합에 의해 야기된다.

당뇨로 종종 간단히 언급되는 진성 당뇨병은 신체가 충분한 인슐린을 생성하지 않거나, 세포가 생성되는 인슐린에 반응하지 않아서 사람이 높은 혈당 수준을 갖는 대사 질병의 그룹이다. 가장 흔한 유형의 당뇨병은: (1) 신체가 인슐린을 생성하지 못하는 1형 당뇨병, (2) 시간 경과에 따른 인슐린 결핍의 증가와 조합되는, 신체가 인슐린을 적절하게 사용하지 못하는 2형 당뇨병(T2DM) 및 (3) 여성이 임신으로 인해 당뇨가 발생하는 임신당뇨병이다. 당뇨병의 모든 형태는 통상적으로 수년 후에 발생하는 장기간 합병증의 위험을 증가시킨다. 대부분의 상기 장기간 합병증은 혈관에 대한 손상을 기초로 하며, 더 큰 혈관의 죽상경화증으로부터 발생하는 "대혈관" 질병 및 작은 혈관의 손상으로부터 발생하는 "미세혈관" 질병의 2개의 부류로 나뉘어질 수 있다. 대혈관 질병 상태의 예는 허혈심장병, 심근경색증, 뇌졸중 및 말초혈관병이다. 미세혈관 질병의 예는 당뇨망막병증, 당뇨병신장병증 뿐만 아니라 당뇨신경병증이다.

GLP-1 및 GIP 뿐만 아니라 글루카곤에 대한 수용체는 7-막횡단-스패닝(spanning), 이종삼합체 G-단백질 결합된 수용체의 패밀리의 일원이다. 이들은 서로 구조적으로 관련되고, 유의한 수준의 서열 동일성을 공유할 뿐만 아니라 리간드 인지 및 세포내 신호전달 경로의 유사한 메커니즘을 갖는다.

유사하게, 펩티드 GLP-1, GIP 및 글루카곤은 높은 서열 동일성/유사성의 영역을 공유한다. GLP-1 및 글루카곤은 일반적인 전구체인 프레프로글루카곤(preproglucagon)으로부터 생성되고, 이는 조직-특이적 방식으로 차별적으로 가공되어, 예를 들어, 장 내분비 세포에서 GLP-1 및 이자섬 알파 세포에서 글루카곤이 생성된다. GIP는 더 큰 proGIP 프로호르몬 전구체로부터 유래되고, 소장에 위치된 K-세포로부터 합성되고 방출된다.

펩티드 인크레틴 호르몬 GLP-1 및 GIP는 음식에 반응하여 장 내분비 세포에 의해 분비되고, 식사-자극 인슐린 분비의 70%까지 차지한다. 증거는 GLP-1 분비가 글루코스 내성 장애 또는 2형 당뇨병을 갖는 대상체에서 감소되는 반면, GLP-1에 대한 반응성은 상기 환자에서 여전히 보존되는 것을 암시한다. 따라서, 적합한 효능제를 이용한 GLP-1 수용체의 표적화는 당뇨병을 포함하는 대사 장애의 치료를 위한 매력적인 접근법을 제공한다. GLP-1에 대한 수용체는 널리 분포되어 있고, 이자섬, 뇌, 심장, 신장 및 위장관에서 주로 발견된다. 췌장에서, GLP-1은 베타 세포로부터의 인슐린의 분비를 증가시킴으로써 엄격히 글루코스-의존성 방식으로 작용한다. 이러한 글루코스-의존성은 GLP-1 수용체의 활성화가 저혈당을 야기시킬 가능성이 없는 것을 나타낸다. 또한, GIP에 대한 수용체는 이자섬, 지방 조직, 위, 소장, 심장, 뼈, 폐, 신장, 고환, 부신피질, 뇌하수체, 내피세포, 기관, 비장, 가슴샘, 갑상샘 및 뇌를 포함하는 말초 조직에서 광범위하게 발현된다. 인크레틴 호르몬으로서의 생물학적 기능과 일치하게, 췌장 β-세포는 인간에서 GIP에 대한 가장 높은 수준의 수용체를 발현한다.

GIP-수용체 매개 신호전달이 T2DM을 갖는 환자에서 손상될 수 있으나, GIP-작용의 손상이 가역적이고 당뇨병 상태의 개선과 함께 회복될 수 있는 것으로 나타난 일부 임상적 증거가 존재한다. 요점은, 두개 모두의 인크레틴 호르몬 GIP 및 GLP-1에 의한 인슐린 분비의 자극은 엄격히 글루코스-의존성이어서, 저혈당증에 대한 낮은 위험과 관련된 오류 방지 메커니즘(fail-safe mechanism)을 보장한다.

베타 세포 수준에서, GLP-1 및 GIP는 글루코스 민감성, 네오제네시스(neogenesis), 증식, 프로인슐린의 전사 및 비대 뿐만 아니라 항아폽토시스를 촉진하는 것으로 밝혀졌다. GLP-1 및 GIP 수용체에 대한 이중 효능제 활성을 갖는 펩티드는 상가적 또는 상승작용적 항-당뇨병 이점을 갖는 것으로 예견될 수 있다. 췌장을 넘어서는 GLP-1의 다른 관련 효과는 지연된 위 배출, 증가된 포만, 감소된 음식 섭취, 체중의 감소 뿐만 아니라 신경보호 및 심장보호 효과를 포함한다. 2형 당뇨병을 갖는 환자에서, 상기 췌장외성 효과는 비만 및 심장혈관 질병과 같은 동반이환의 높은 비율을 고려하면 특히 중요할 수 있다. 췌장을 넘어서는 말초 조직에서의 추가 GIP 작용은 증가된 뼈 형성 및 감소된 뼈 재흡수 뿐만 아니라 골다공증 및 알츠하이머병과 같은 인지 장애의 치료에 이로울 수 있는 신경보호 효과를 포함한다.

글루카곤은 췌장 알파 세포에 의해 생성되고, 순환 글루코스가 낮은 경우 혈류로 방출되는 29개의 아미노산 펩티드 호르몬이다. 글루카곤의 중요한 생리학적 역할은 생체내에서 글루코스 항상성을 유지시키는데 있어서 인슐린에 대한 주요 역조절 메커니즘을 제공하는 과정인 간에서의 글루코스 배출을 자극하는 것이다.

그러나, 글루카곤 수용체는 또한 간외 조직, 예를 들어, 신장, 심장, 지방세포, 림프모세포, 뇌, 망막, 부신 및 위장관에서 발현되고, 이는 글루코스 항상성을 넘어서는 더 광범위한 생리학적 역할을 암시한다. 따라서, 최근의 연구는 글루카곤이 음식 섭취의 감소 및 체중 감소를 수반하는 에너지 소비 및 열발생의 자극을 포함하는 에너지 관리에 대한 치료학적으로 긍정적인 효과를 갖는 것을 보고하였다. 대체적으로, 글루카곤 수용체의 자극은 비만 및 대사 증후군의 치료에 유용할 수 있다.

옥신토모듈린은 C-말단 신장을 둘러싸는 8개의 아미노산을 갖는 글루카곤으로 구성된 펩티드 호르몬이다. GLP-1 및 글루카곤과 마찬가지로, 이는 프레프로글루카곤으로 미리 형성되고, 소장의 내분비 세포에 의해 조직-특이적 방식으로 분해되고 분비된다. 옥신토모듈린은 GLP-1 및 글루카곤에 대한 수용체 둘 모두를 자극하는 것으로 공지되어 있고, 따라서 이중 효능제의 원형(prototype)이다(Pocai, Molecular Metabolism 2013; 3:241-51 참조).

GLP-1 및 GIP가 이들의 항-당뇨병 효과에 대해 공지되어 있고, GLP-1 및 글루카곤 둘 모두가 이들의 음식 섭취-억제 효과에 대해 공지되어 있으며, 글루카곤이 또한 추가 에너지 소비의 매개체이므로, 하나의 분자에서의 3개의 호르몬의 활성의 조합이 대사 증후군 및 특히 이의 구성요소인 당뇨병 및 비만의 치료를 위한 강력한 약물을 수득할 수 있는 것을 생각할 수 있다.

따라서, 본 발명의 화합물은 글루코스 불내성, 인슐린 내성, 당뇨병전증, 증가된 공복 혈당(고혈당), 2형 당뇨병, 고혈압, 이상지질혈증, 죽상경화증, 관상동맥 심질환, 말초 혈관 질환, 뇌졸중 또는 이들 개별적 질병 구성요소의 임의의 조합의 치료에 사용될 수 있다.

또한, 이들은 식욕, 영양 및 칼로리 섭취의 조절, 에너지 소비의 증가, 체중 증가의 예방, 체중 감소의 촉진, 과체중의 감소 및 병적 비만을 포함하는 비만의 전체적 치료에 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물은 GLP-1, GIP 및 글루카곤에 대한 수용체를 위한 효능제(예를 들어, "삼중 효능제")이며, 당뇨병 및 비만의 동시 치료를 허용하여 대사 증후군을 표적화하는 임상적 필요성을 해결하는 치료학적 이로움을 제공할 수 있다.

본 발명의 화합물로 치료될 수 있는 추가 질병 상태 및 건강 질환은 비만-관련 염증, 비만-관련 담낭 질병 및 비만-유도 수면무호흡이다.

모든 상기 질환은 비만과 직접적 또는 간접적으로 관련될 수 있으나, 본 발명의 화합물의 효과는 체중에 대한 효과를 통해 전체적 또는 부분적으로 매개될 수 있거나, 이와 독립적일 수 있다.

추가로, 치료되는 질병은 신경퇴행성 질병, 예를 들어, 알츠하이머병 또는 파킨슨병 또는 상기 기재된 바와 같은 다른 퇴행성 질병일 수 있다.

하나의 실시형태에서, 화합물은 고혈당증, 2형 당뇨병 및/또는 비만의 치료 또는 예방에 유용하다.

본 발명의 화합물은 환자의 장 통과를 감소시키고/시키거나, 위 함량을 증가시키고/시키거나, 음식 섭취를 감소시키는 능력을 가질 수 있다. 본 발명의 화합물의 이러한 활성은 당업자에게 공지되고 또한 방법에서 본원에 기재된 동물 모델에서 평가될 수 있다.

본 발명의 화합물은 환자의 혈당 수준을 감소시키고/시키거나 HbA1c 수준을 감소시키는 능력을 갖는다. 본 발명의 화합물의 이러한 활성은 당업자에게 공지되고, 또한 방법 및 실시예에서 본원에 기재된 동물 모델에서 평가될 수 있다.

본 발명의 화합물은 환자의 체중을 감소시키는 능력을 가질 수 있다. 본 발명의 화합물의 이러한 활성은 당업자에게 공지되고 또한 방법 및 실시예에서 본원에 기재된 동물 모델에서 평가될 수 있다.

본 발명의 화합물은 지방간증, 바람직하게는 비-알콜성 간 질환(NAFLD) 및 비-알콜성 지방간염(NASH)의 치료 또는 예방에서 유용할 수 있다.

약제학적 조성물

"약제학적 조성물"이라는 용어는 혼합시 양립 가능하고 투여될 수 있는 성분을 함유하는 혼합물을 나타낸다. 약제학적 조성물은 하나 이상의 의학적 약물을 포함할 수 있다. 추가로, 약제학적 조성물은 고려되는 활성 성분이거나 비활성 성분이건 간에 담체, 완충제, 산화제, 알칼리화제, 용매, 애쥬번트, 긴장성 조절인자, 완화제, 증량제, 보존제, 물리적 및 화학적 안정화제, 예를 들어, 계면활성제, 항산화제 및 다른 성분을 포함할 수 있다. 약제학적 조성물을 제조하는 데 있어서 당업자에 대한 지침은, 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (20th ed.)ed.A.R.Gennaro A.R., 2000, Lippencott Williams & Wilkins 및 R.C.Rowe et al(Ed), Handbook of Pharmaceutical Excipients, PhP, May 2013 update]에서 찾아볼 수 있다.

본 발명의 엑센딘-4 펩티드 유도체 또는 이의 염은 약제학적 조성물의 일부로서 허용되는 약제학적 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 투여된다.

"약제학적으로 허용되는 담체"는 투여되는 물질의 치료학적 특성을 유지하면서 생리학적으로 허용(예를 들어, 생리학적으로 허용되는 pH)가능한 담체이다. 표준의 허용되는 약제학적 담체 및 이의 제형은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (20th ed.)ed.A.R.Gennaro A.R., 2000, Lippencott Williams & Wilkins 및 R.C.Rowe et al(Ed), Handbook of Pharmaceutical excipients, PhP, May 2013 update]에 기재되어 있다. 하나의 예시적인 약제학적으로 허용되는 담체는 생리식염수이다.

하나의 실시형태에서, 담체는 완충제(예를 들어, 시트레이트/시트르산, 아세테이트/아세트산), 산성화제(예를 들어, 염산), 알칼리화제(예를 들어, 나트륨 하이드록시드), 보존제(예를 들어, 페놀, m-크레졸), 공-용매(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 400), 긴장성 조절인자(예를 들어, 만니톨, 글리세롤), 안정화제(예를 들어, 계면활성제, 항산화제, 아미노산)의 그룹으로부터 선택된다.

사용되는 농도는 생리학적으로 허용되는 범위 내이다.

허용되는 제약적 담체 또는 희석제는 구강, 직장, 비강 또는 비경구 (피하, 근육내, 정맥내, 피내 및 경피) 투여에 적합한 제형에서 사용되는 것을 포함한다. 본 발명의 화합물은 전형적으로 비경구 투여될 것이다.

용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 포유동물에서 사용하기에 안전하고 효과적인 본 발명의 화합물의 염을 의미한다.

용어 "용매화물"은 본 발명의 화합물 또는 이의 염과 용매 분자, 예를 들어, 유기 용매 분자 및/또는 물의 복합체를 의미한다.

약제학적 조성물에서, 엑센딘-4 유도체는 단량체 또는 올리고머 형태일 수 있다.

용어, 화합물의 "치료학적 유효량"은 무독성이나, 요망되는 효과를 제공하는 화합물의 충분한 양을 지칭한다. 요망되는 생물학적 효과를 달성하는데 필요한 화학식 I의 화합물의 양은 다수의 요인, 예를 들어, 선택된 특정 화합물, 의도된 용도, 투여 방식 및 환자의 임상적 상태에 좌우된다. 임의의 각각의 사례에서 적절한 "유효한" 양은 일상적인 실험을 사용하여 해당 분야의 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 화학식 I의 화합물의 "치료학적 유효량"은 약 0.01 mg/용량 내지 50 mg/용량, 바람직하게는 0.02 mg/용량 내지 1 mg/용량이다.

본 발명의 약제학적 조성물은, 비록 가장 적합한 투여 방식은 각각의 개별 사례에서 치료되는 병태의 성질 및 중증도 및 각 사례에 사용되는 화학식 I의 화합물의 성질에 의존한다 하더라도, 비경구(예를 들어, 피하, 근육내, 피부내 또는 정맥내), 직장, 국소 및 경구(예를 들어, 설하) 투여에 적합한 것이다. 하나의 실시형태에서, 적용은 비경구적, 예를 들어 피하이다.

비경구 적용의 경우, 투여 중 미생물 및 박테리아의 증식을 억제하기 위해 상응하는 제형이 적어도 하나의 항균 방부제를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 바람직한 방부제는 벤질 알코올 또는 페놀 또는 m-크레졸과 같은 페놀 화합물이다. 이들 성분은 펩티드 및 단백질에 대한 응집을 유도하여 제형에서 낮은 용해도 및 안정성을 유도할 수 있다고 기술되어있다(R. L. Bis 등, Int. J. Pharm. 472, 356-361, 2014; T. J. Kamerzell, Adv. Drug Deliv. Rev., 63, 1118-1159, 2011 참고).

적합한 약제학적 조성물은 각각이 규정된 양의 화합물을 함유하는 독립된 단위, 예를 들어, 캡슐, 정제 및 바이얼 또는 앰풀 내의 분말의 형태; 분말 또는 과립; 수성 또는 비수성 액체 중 용액 또는 현탁액; 또는 수중유 또는 유중수 에멀젼으로 존재할 수 있다. 이는 단일 또는 다중 용량 주사 형태, 예를 들어, 펜의 형태로 제공될 수 있다. 본 조성물은, 이미 언급된 바와 같이, 활성 성분 및 담체(하나 이상의 부가적 성분으로 구성될 수 있음)를 접촉시키는 단계를 포함하는 임의의 적합한 약제학적 방법에 의해 제조될 수 있다.

특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 적용을 위한 장치, 예를 들어, 주사기, 주사 펜 또는 자동주사기와 함께 제공될 수 있다. 상기 장치는 약제학적 조성물과 독립적으로 제공될 수 있거나, 약제학적 조성물로 미리 충전될 수 있다.

투여 단위, 패키지, 펜 장치 및 투여

본 발명의 화합물(들)은 적합한 약제학적 조성물에 사용하기 위해 제조될 수 있다. 적합한 약제학적 조성물은 하나 이상의 투여 단위의 형태일 수 있다.

조성물은 본 발명의 화합물(들) 및 담체(하나 이상의 추가 성분으로 구성될 수 있음)를 접촉시키는 단계를 포함하는 임의의 적합한 약제학적 방법에 의해 제조될 수 있다.

투여 단위는 예를 들어, 캡슐, 정제, 당의정, 과립 샤세, 점적제, 용액, 현탁액, 동결건조제 및 분말일 수 있으며, 이들 각각은 정의된 양의 본 발명의 화합물(들)을 함유한다.

본 발명의 화합물(들) 또는 본 발명의 약제학적 조성물의 상기 언급된 각각의 투여 단위(투여 단위)는 운송 및 저장이 용이하도록 패키지로 제공될 수 있다. 투여 단위는 준비된 단위의 유형에 따라 표준 단일 또는 다중-용량 포장, 이의 형태, 재료 및 형태로 포장된다.

예를 들어 정제 및 기타 고형 투여 단위는 단일 단위로 포장될 수 있으며, 단일 포장 단위는 다중-포장 용기에 포장될 수 있다.

액체 제형은 단일 단위, 예컨대 예를 들어, 바이알, 카트리지, 주사기/예비 충전된 주사기, 주입 백, 접을 수 있는 플라스틱 백, 주입 병, 블로우-충전 밀봉(blow-filled seal) 병 또는 주입 튜빙 또는 단일 또는 다중 용량 주사가능 형태, 예를 들어 펜 장치, 펌프 또는 주사기 및 단일 포장 단위의 형태로 다중-포장 용기에 포장될 수 있다. 단일 포장재는 단지 하나 또는 복수의 투여 단위를 포함할 수 있다. 상기 포장재는 예를 들어 종이, 마분지, 판지, 플라스틱, 금속, 종이, 플라스틱 및 금속 중 하나 이상의 조합 또는 라미네이트, 또는 유리로 제조될 수 있다. 예시적인 실시형태는 골판지 상자 내에 차례로 제공될 수 있는 예를 들어 정제 또는 캡슐을 함유하는 블리스터 포장재, 예를 들어 분말을 함유하는 알루미늄 장벽 라미네이트 샤세, 예를 들어 정제 또는 용액을 함유하는 유리 병 또는 플라스틱 병, 또는 용액 또는 현탁액을 함유하는 바이알, 카트리지, 주사기, 주입 백, 주입 병, 주입 튜빙 또는 앰풀이다.

특정 실시형태에서, 투여 단위는 적용을 위한 장치, 예를 들어, 주사기, 주사 펜 또는 자동주사기와 함께 제공될 수 있다. 상기 장치는 약제학적 조성물과 독립적으로 제공될 수 있거나, 약제학적 조성물로 미리 충전될 수 있다.

흔히 "주사 펜"으로도 약칭되는 "펜형 주사 장치"는 전형적으로 필기용 만년필과 유사한 긴 형상을 갖는 주사 장치이다. 이러한 펜은 일반적으로 관형 단면을 가지지만, 이들은 삼각형, 직사각형 또는 정사각형과 같은 상이한 단면 또는 이러한 형상 주위의 임의의 변형을 쉽게 가질 수 있다. 일반적으로, 펜형 주사 장치는 흔히 하우징 또는 홀더에 내장되는 카트리지를 포함한 카트리지부; 카트리지부의 일 단부에 연결된 주사바늘 어셈블리; 및 카트리지부의 다른 단부에 연결된 투여부 등 세 주요 부재로 구성된다. 흔히 "앰플"로 지칭되는 카트리지는 통상적으로 약제로 채워지는 보관용기, 카트리지 보관용기의 일 단부에 위치하는 가동식 고무 유형의 마개(bung) 또는 스토퍼, 및 다른, 흔히, 넥다운 단부에 위치하는 관통가능 고무 씰을 가진 정상부(top)를 포함한다. 고무 씰을 제자리에 고정시키기 위해, 통상 권축가공된 환형 금속 밴드를 사용한다. 카트리지 하우징은 전형적으로 플라스틱으로 만들어질 수 있지만, 카트리지 저장조는 역사상 유리로 만들어져 왔다.

병용 요법

본 발명의 화합물인 GLP-1, GIP 및 글루카곤 수용체에 대한 삼중 효능제는 다른 약리학적으로 활성인 화합물, 예를 들어, [Rote Liste 2016]에 언급된 모든 약물, 예를 들어, [Rote Liste 2016, 챕터 1]에 언급된 모든 체중 감소제 또는 식욕 억제제, [Rote Liste 2016, 챕터 58]에 언급된 모든 지질-강하제, [Rote Liste 2016]에 언급된 모든 항고혈압제 및 신장보호제 또는 [Rote Liste 2016, 챕터 36]에 언급된 모든 이뇨제와 널리 조합될 수 있다.

활성 성분 조합은 특히 작용의 상승적 개선을 위해 사용될 수 있다. 이들은 환자에 활성 성분의 별개 투여에 의하거나, 복수의 활성 성분이 하나의 약제학적 제제에 존재하는 조합 제품의 형태로 적용될 수 있다. 활성 성분의 별개 투여에 의해 활성 성분이 투여될 때, 이것은 동시에 또는 연속적으로 수행될 수 있다.

상기 병용물에 적합한 다른 활성 물질은 특히, 예를 들어, 언급된 적응증 중 하나와 관련하여 1종 이상의 활성 물질의 치료 효과를 강화하고/강화하거나 1종 이상의 활성 물질의 용량이 감소되는 것을 가능하게 하는 것을 포함한다.

병용에 적합한 치료제는 예를 들어, 하기와 같은 항당뇨병제를 포함한다:

인슐린 및 인슐린 유도체, 예를 들어: 글라진(Glargine)/Lantus^®, 270 내지 330U/㎖의 인슐린 글라진(EP 2387989 A), 300U/㎖의 인슐린 글라진(EP 2387989 A), 글루리신(Glulisin)/Apidra^®, 데테미르(Detemir)/Levemir^®, 리스프로(Lispro)/Humalog^®/Liprolog^®, 데글루덱(Degludec)/데글루덱플러스(DegludecPlus), 아스파르트, 기본 인슐린 및 유사체(예를 들어, LY-2605541, LY2963016, NN1436), 페길화된(PEGylated) 인슐린 리스프로, Humulin^®, 린제타(Linjeta), SuliXen^®, NN1045, 인슐린 플러스 심린(Symlin), PE0139, 속성-작용 및 단기-작용 인슐린(예를 들어, 린제타(Linjeta), PH20, NN1218, HinsBet), (APC-002)하이드로젤, 구강, 흡입용, 경피 및 설하 인슐린(예를 들어, Exubera^®, Nasulin^®, 아프레자(Afrezza), 트레고필(Tregopil), TPM 02, 캡슐린(Capsulin), Oral-lyn^®, Cobalamin^® 구강 인슐린, ORMD-0801, NN1953, NN1954, NN1956, VIAtab, 오샤디(Oshadi) 구강 인슐린). 알부민 또는 다른 단백질과 이작용기 링커에 의해 결합된 인슐린 유도체도 추가로 포함된다.

GLP-1, GLP-1 유사체 및 GLP-1 수용체 효능제, 예를 들어: 릭시세나티드(Lixisenatide)/AVE0010/ZP10/릭수미아(Lyxumia), 엑세나티드(Exenatide)/엑센딘-4/비에타(Byetta)/비두레온(Bydureon)/ITCA 650/AC-2993, 리라글루티드(Liraglutide)/빅토자(Victoza), 세마글루티드(Semaglutide), 타스포글루티드(Taspoglutide), 신크리아(Syncria)/알비글루티드(Albiglutide), 둘라글루티드(Dulaglutide), r엑센딘-4, CJC-1134-PC, PB-1023, TTP-054, 에페글레나타이드(Efpeglenatide)/HM-11260C, CM-3, GLP-1 엘리젠(Eligen), ORMD-0901, NN-9924, NN-9926, NN-9927, 노덱센(Nodexen), 비아도르(Viador)-GLP-1, CVX-096, ZYOG-1, ZYD-1, GSK-2374697, DA-3091, MAR-701, MAR709, ZP-2929, ZP-3022, ZP-DI-70, TT-401, MK-8521, MEDI0382, BHM-034, HM12525A, MOD-6030, CAM-2036, DA-15864, ARI-2651, ARI-2255, LY3298176, NN1177, 엑세나티드(Exenatide)-XTEN 및 글루카곤-XTEN, NN9030.

DPP-4 억제제, 예를 들어: 알로글립틴(Alogliptin)/네시나(Nesina), 트라젠타(Trajenta)/리나글립틴(Linagliptin)/BI-1356/온데로(Ondero)/트라젠타(Trajenta)/트라드젠타(Tradjenta)/트라옌타(Trayenta)/트라드젠타(Tradzenta), 삭사글립틴(Saxagliptin)/온글리자(Onglyza), 시타글립틴(Sitagliptin)/자누비아(Januvia)/젤레비아(Xelevia)/테사베(Tesave)/자누멧(Janumet)/벨메티아(Velmetia), 갈부스(Galvus)/빌다글립틴(Vildagliptin), 아나글립틴(Anagliptin), 제미글립틴(Gemigliptin), 테넬리글립틴(Teneligliptin), 멜로글립틴(Melogliptin), 트렐라글립틴(Trelagliptin), DA-1229, 오마리글립틴(Omarigliptin)/MK-3102, KM-223, 에보글립틴(Evogliptin), ARI-2243, PBL-1427, 피녹사신(Pinoxacin).

SGLT2 억제제, 예를 들어: 인보카나(Invokana)/카나글리포진(Canaglifozin), 포르지가(Forxiga)/다파글리플로진(Dapagliflozin), 레모글리포진(Remoglifozin), 세르글리플로진(Sergliflozin), 엠파글리플로진(Empagliflozin), 이프라글리플로진(Ipragliflozin), 토포글리플로진(Tofogliflozin), 루세오글리플로진(Luseogliflozin), 소타글리플로진(Sotagliflozin)(LX-4211), 에르투글리포진(Ertuglifozin)/PF-04971729, RO-4998452, 벡사글리플로진(Bexagliflozin) (EGT-0001442), KGA-3235/DSP-3235, LIK066, SBM-TFC-039, 헤나글리플로진(Henagliflozin)(SHR3824), 자나글리플로진(Janagliflozin), 티아나글리플로진(Tianagliflozin), AST1935, JRP493, HEC-44616

비구아니드(Biguanide)(예를 들어, 메트포르민(Metformin), 부포르민(Buformin), 펜포르민(Phenformin)), 티아졸리딘디온(예를 들어, 피오글리타존(Pioglitazone), 리보글리타존(Rivoglitazone), 로시글리타존(Rosiglitazone), 트로글리타존(Troglitazone)), 이중 PPAR 효능제(예를 들어, 알레글리타자르(Aleglitazar), 무라글리타자르(Muraglitazar), 테사글리타자르(Tesaglitazar)), 설포닐우레아(Sulfonylurea)(예를 들어, 톨부타미드(Tolbutamide), 글리벤클라미드(Glibenclamide), 글리메피리드(Glimepiride)/아마릴(Amaryl), 글리피지드(Glipizide)), 메글리티니드(Meglitinides)(예를 들어, 나테글리니드(Nateglinide), 레파글리니드(Repaglinide), 미티글리니드(Mitiglinide)), 알파-글루코시다제 억제제(예를 들어, 아카르보스(Acarbose), 미글리톨(Miglitol), 보글리보스(Voglibose)), 아밀린(Amylin) 및 아밀린 유사체(예를 들어, 프람린티드(Pramlintide), 심린(Symlin)).

GPR119 효능제(예를 들어, GSK-263A, PSN-821, MBX-2982, APD-597, ZYG-19, DS-8500), GPR40 효능제(예를 들어, 파시글리팜(Fasiglifam)/TAK-875, TUG-424, P-1736, JTT-851, GW9508).

기타 적합한 병용 파트너는: 사이클로셋(Cycloset), 11-베타-HSD의 억제제(예를 들어, LY2523199, BMS770767, RG-4929, BMS816336, AZD-8329, HSD-016, BI-135585), 글루코키나제의 활성화제(예를 들어, TTP-399, AMG-151, TAK-329, GKM-001), DGAT의 억제제(예를 들어, LCQ-908), 단백질 티로신포스파타제 1의 억제제(예를 들어, 트로두스퀘민(Trodusquemine)), 글루코스-6-포스파타제의 억제제, 프룩토스-1,6-비스포스파타제의 억제제, 글리코겐 포스포릴라제의 억제제, 포스포에놀 피루베이트 카르복시키나제의 억제제, 글리코겐 신타제(synthase) 키나제의 억제제, 피루베이트 데하이드로키나제의 억제제, 알파2-길항제, CCR-2 길항제, SGLT-1 억제제(예를 들어, LX-2761)이다.

예를 들어, 다음과 같은 1종 이상의 지질강하제가 또한 병용 파트너로서 적합하다: HMG-CoA-리덕타제 억제제(예를 들어, 심바스타틴(Simvastatin), 아토르바스타틴(Atorvastatin)), 피브레이트(fibrates)(예를 들어, 베자피브레이트(Bezafibrate), 페노피브레이트(Fenofibrate)), 니코틴산 및 이의 유도체(예를 들어, 니아신(Niacin)), PPAR-(알파, 감마 또는 알파/감마) 효능제 또는 조절제(예를 들어, 알레글리타자르(Aleglitazar)), PPAR-델타 효능제, ACAT 억제제(예를 들어, 아바시미베(Avasimibe)), 콜레스테롤 흡수 억제제(예를 들어 에제티미베(Ezetimibe)), 담즙산-결합 물질(예를 들어, 콜레스티라민(Cholestyramine)), 회장 담즙산 수송 억제제, MTP 억제제, 또는 PCSK9의 조절제.

HDL-상승 화합물, 예컨대: CETP 억제제(예를 들어, 토르세트라피브(Torcetrapib), 아나세트라피드(Anacetrapid), 달세트라피드(Dalcetrapid), 에바세트라피드(Evacetrapid), JTT-302, DRL-17822, TA-8995) 또는 ABC1 조절인자.

다른 적합한 병용 파트너는, 예를 들어, 다음과 같은 비만의 치료를 위한 1종 이상의 활성 물질이다: 시부트라민(Sibutramine), 테소펜신(Tesofensine), 오를리스타트(Orlistat), 카나비노이드-1 수용체의 길항제, MCH-1 수용체 길항제, MC4 수용체 효능제, NPY5 또는 NPY2 길항제(예를 들어, 벨네페리트(Velneperit)), 베타-3-효능제, 렙틴(leptin) 또는 렙틴 모방체, 5HT2c 수용체의 효능제(예를 들어, 로르카세린(Lorcaserin)) 또는 부프로피온(bupropione)/날트렉손(naltrexone), 부프로피온(bupropione)/조니사미드(zonisamide), 부프로피온(bupropione)/펜터민(phentermine) 또는 프람린티드(pramlintide)/메트렐렙틴(metreleptin)의 병용물.

기타 적합한 병용 파트너는:

추가 위장 펩티드(gastrointestinal peptides), 예를 들어, 펩티드 YY 3-36(PYY3-36) 또는 이의 유사체, 췌장 폴리펩티드(PP) 또는 이의 유사체.

글루카곤 수용체 효능제 또는 길항제, GIP 수용체 효능제 또는 길항제, 그렐린(ghrelin) 길항제 또는 역 효능제, 제닌(Xenin) 및 이의 유사체.

또한, 고혈압, 만성 심장부전 또는 죽상경화증에 영향을 미치는 약물과의 병용물, 예컨대 예를 들어: 안지오텐신 II 수용체 길항제(예를 들어, 텔미사르탄(telmisartan), 칸데사르탄(candesartan), 발사르탄(valsartan), 로사르탄(losartan), 에프로사르탄(eprosartan), 이르베사르탄(irbesartan), 올메사르탄(olmesartan), 타소사르탄(tasosartan), 아질사르탄(azilsartan)), ACE 억제제, ECE 억제제, 이뇨제, 베타-차단제, 칼슘 길항제, 중추 작용 고혈압제(centrally acting hypertensives), 알파-2-아드레날린 수용체의 길항제, 중성 엔도펩티다제의 억제제, 혈소판 응집 억제제 및 기타 약물 또는 이들의 병용물이 적합하다.

또다른 양태에서, 본 발명은 GLP-1 및 글루카곤에 대한 수용체에 결합하고, 이의 활성을 조절함으로써 영향을 받을 수 있는 질병 또는 질환의 치료 또는 예방에 적합한 약제를 제조하기 위한, 병용 파트너로서 상기 기재된 활성 물질 중 적어도 하나와 병용된 본 발명에 따른 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염의 용도에 관한 것이다. 이는 바람직하게는 대사 증후군, 특히 상기 나열된 질병 또는 질환 중 하나, 가장 특히 당뇨병 또는 비만 또는 이의 합병증의 상황의 질병이다.

하나 이상의 활성 물질들과 병용하는, 본 발명에 따른 화합물, 또는 이의 생리적으로 허용되는 염의 이용은 동시에, 개별적으로, 또는 순차적으로 일어날 수 있다.

다른 활성 물질과 병용하여, 본 발명에 따른 화합물, 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염의 사용은 동시에, 또는 시차를 두지만 특히 짧은 시간 내에 일어날 수 있다. 이들이 동시에 투여되는 경우, 2종의 활성 물질은 함께 환자에게 제공되고; 이들이 시차를 두고 사용되는 경우, 2종의 활성 물질은 12시간 이하, 그러나 특히 6시간 이하의 기간 내에 환자에게 제공된다.

결과적으로, 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 화합물 또는 이러한 화합물의 생리학적으로 허용되는 염 및 병용 파트너로서 상기 기재된 활성 물질 중 적어도 하나와 함께 선택적으로 하나 이상의 비활성 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약제에 관한 것이다.

본 발명에 따른 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염 또는 용매화물 및 이와 조합되는 추가 활성 물질은 둘 모두가 하나의 제형, 예를 들어, 정제 또는 캡슐에 함께 제공될 수 있거나, 예를 들어, 소위 부품 키트(kit-of-part)로서 2개의 동일하거나 상이한 제형에 독립적으로 제공될 수 있다.

도 1: 가역적인 자기-결합(인력적인 상호작용) 및 반발적인 비리알 상호작용을 나타내는 펩티드 제형에 대한 동적 디바이 플롯 비교
도 2. 서열 번호 6, 사료급여된 DIO 마우스에서 첫번째 처리 후 혈당 프로파일
도 3. 서열 번호 6, DIO 마우스의 체질량
도 4. 서열 번호 6, DIO 마우스의 체질량 변화
도 5. 서열 번호 6, DIO 마우스의 전체 체지방 질량 변화
도 6. 서열 번호 6, DIO 마우스의 사료 섭취량 추정
도 7. 서열 번호 6, DIO 마우스의 최종 간 질량
도 8. 서열 번호 6, 사료급여된 DIO 마우스의 최종 혈장 트리글리세리드
도 9. 서열 번호 6, 사료급여된 DIO 마우스의 혈장 LDL
도 10. 서열 번호 11, 사료급여된 DIO 마우스에서 첫번째 처리 후 혈당 프로파일
도 11. 서열 번호 11, DIO 마우스의 체질량
도 12. 서열 번호 11, DIO 마우스의 전체 체질량 변화
도 13. 서열 번호 11, DIO 마우스의 전체 체지방 질량 변화
도 14. 서열 번호 11, DIO 마우스의 사료 섭취량 추정
도 15. 서열 번호 11, DIO 마우스의 최종 간 질량
도 16. 서열 번호 11, 사료급여된 DIO 마우스의 최종 혈장 트리글리세리드
도 17. 서열 번호 11, 사료급여된 DIO 마우스의 혈장 LDL
도 18. 서열 번호 11, 사료급여된 DIO 마우스의 최종 혈장 인슐린
도 19. 서열 번호 11, 사료급여된 DIO 마우스의 최종 혈당
도 20. 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 사료급여된 db/db 마우스의 혈당 프로파일
도 21. 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 사료급여된 db/db 마우스의 곡선하 혈당 면적
도 22. 서열 번호 7, 사료급여된 db/db 마우스의 혈당 프로파일
도 23. 서열 번호 7, 사료급여된 db/db 마우스의 곡선하 혈당 면적
도 24. 서열 번호 11, 사료급여된 db/db 마우스의 혈당 프로파일
도 25. 서열 번호 11, 사료급여된 db/db 마우스의 곡선하 혈당 면적
도 26. 서열 번호 11, 사료급여된 db/db 마우스의 최종 혈청 트리아실글리세롤 농도
도 27. 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 16, 서열 번호 26, 사료급여된 db/db 마우스의 혈당 프로파일
도 28. 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 16, 서열 번호 26, 사료급여된 db/db 마우스의 곡선하 혈당 면적
도 29. 사료 섭취량 및 체중 모니터링 데이터(서열 번호 11, 서열 번호 6, 리라글루티드)
도 30. 대동맥판 면적 데이터(서열 번호 11, 서열 번호 6, 리라글루티드)
도 31. 혈청 총 콜레스테롤 및 LDL-콜레스테롤 데이터(서열 번호 11, 서열 번호 6, 리라글루티드)

방법

이용되는 약어는 하기와 같다:

AA 아미노산

AEEAc (2-(2-아미노에톡시)에톡시)아세틸

Aib 알파-아미노-이소부티르산

cAMP 환형 아데노신 모노포스페이트

Boc 3급-부틸옥시카르보닐

BOP (벤조트리아졸-1-일옥시)트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트

BSA 소 혈청 알부민

tBu 3차 부틸

dAla D-알라닌

DCM 디클로로메탄

Dde 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소사이클로헥실리덴)-에틸

ivDde 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소사이클로헥실리덴)-3-메틸-부틸

DIC N,N'-디이소프로필카르보디이미드

DIPEA N,N-디이소프로필에틸아민

DMEM 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)

DMF 디메틸 포름아미드

DMS 디메틸설파이드

EDT 에탄디티올

FA 포름산

FBS 소 태아 혈청

Fmoc 플루오레닐메틸옥시카르보닐

gAAA 감마-아미노 아디프산

gGlu 감마-글루타메이트(γE)

HATU O-(7-아자벤조트라이아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트

HBSS 행크스 균형화 염 용액

HBTU 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸-우로늄 헥사플루오로포스페이트

HEPES 2-[4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일]에탄설폰산

HOBt 1-하이드록시벤조트리아졸

HOSu N-하이드록시숙신이미드

HPLC 고성능 액체 크로마토그래피

HTRF 균질 시간 분해능 형광(Homogenous Time Resolved Fluorescence)

IBMX 3-이소부틸-1-메틸잔틴

LC-MS 액체 크로마토그래피/질량 분석기

Mmt 모노메톡시-트리틸

Palm 팔미토일

PBS 인산염 완충 식염수

PEG 폴리에틸렌 글리콜

PK 약물동역학

RP-HPLC 역상 고성능 액체 크로마토그래피

Stea 스테아릴

TFA 트리플루오로아세트 산

Trt 트리틸

UV 자외선

펩티드 화합물의 일반적 합성

재료

다양한 Rink-아미드 수지(4-(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc-아미노메틸)-페녹시아세트아미도-노르류실아미노메틸 수지, Merck Biosciences; 4-[(2,4-디메톡시페닐)(Fmoc-아미노)메틸]페녹시 아세트아미도 메틸 수지, Agilent Technologies)가 0.2 내지 0.7 m㏖/g 범위 내의 로딩으로 펩티드 아미드의 합성에 사용되었다.

Fmoc 보호된 천연 아미노산을 Protein Technologies Inc., Senn Chemicals, Merck Biosciences, Novabiochem, Iris Biotech, Bachem, Chem-Impex International 또는 MATRIX Innovation으로부터 구입하였다. 하기 표준 아미노산을 합성 전체에 사용하였다: Fmoc-L-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-L-Asn(Trt)-OH, Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-L-Cys(Trt)-OH, Fmoc-L-Gln(Trt)-OH, Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-L-His(Trt)-OH, Fmoc-L-Ile-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Lys(Boc)-OH, Fmoc-L-Met-OH, Fmoc-L-Phe-OH, Fmoc-L-Pro-OH, Fmoc-L-Ser(tBu)-OH, Fmoc-L-Thr(tBu)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-L-Val-OH.

게다가, 하기 특수 아미노산을 상기와 동일한 공급업체로부터 구매하였다: Fmoc-L-Lys(ivDde)-OH, Fmoc-L-Lys(Mmt)-OH, Fmoc-Aib-OH, Fmoc-D-Ser(tBu)-OH, Fmoc-D-Ala-OH, Boc-L-His(Boc)-OH(톨루엔 용매화물로서 이용가능함) 및 Boc-L-His(Trt)-OH.

또한, 빌딩 블록 (2S)-6-[[(4S)-5-3급-부톡시-4-[[(4S)-5-3급-부톡시-4-(헥사데카노일아미노)-5-옥소-펜타노일]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)헥산 산 및 Boc-L-His(Trt)-Aib-OH가 적용될 수 있다. 두 빌딩 블록들은 개별적으로 합성되었다.

고체상 펩티드 합성을, 예를 들어, 표준 Fmoc 화학 및 HBTU/DIPEA 활성화를 이용하여 프렐류드 펩티드 합성기(Prelude Peptide Synthesizer; Protein Technologies Inc) 또는 유사한 자동화 합성기에서 수행하였다. DMF를 용매로 사용하였다. 탈보호: 2 x 2.5분 동안 20% 피페리딘/DMF. 세척: 7 x DMF. 커플링: 20분 동안 DMF 2 x 중 2:5:10의 200 mM AA/500 mM HBTU/2 M DIPEA. 세척: 5 x DMF.

Lys-측쇄가 변형된 경우, Fmoc-L-Lys(ivDde)-OH 또는 Fmoc-L-Lys(Mmt)-OH를 상응하는 위치에서 사용하였다. 합성의 완료 후, ivDde 그룹을 DMF 중 4% 하이드라진 하이드레이트를 이용한 변형된 문헌의 절차에 따라 제거하였다(S.R. Chhabra 등, Tetrahedron Lett., 1998, 39, 1603). AcOH/TFE/DCM(1/2/7)을 사용하여 RT에서 15분간 반복 처리하여 Mmt 그룹을 제거한 후, 수지를 DCM, DCM 내 5% DIPEA 및 DCM/DMF 내 5% DIPEA로 반복 세척하였다.

수지를 요망되는 산의 N-하이드록시 숙신이미드 에스테르로 처리하거나, HBTU/DIPEA 또는 HOBt/DIC와 같은 커플링 시약을 이용함으로써 하기 아실화를 수행하였다.

합성된 모든 펩티드를 82.5% TFA, 5% 페놀, 5% 물, 5% 티오아니솔, 2.5% EDT로 구성된 King 분해 칵테일을 이용하여 수지로부터 분해하였다. 그 후, 미정질 펩티드를 디에틸 또는 디이소프로필 에테르에서 침전시키고, 원심분리하고, 동결건조하였다. 펩티드를 분석 HPLC에 의해 분석하고, ESI 질량분광법에 의해 확인하였다. 미정질 펩티드를 통상적인 분취용 RP-HPLC 정제 절차에 의해 정제하였다.

대안적으로, 펩티드를 수동 합성 절차에 의해 합성하였다:

0.3 g 건조된 Rink 아미드 MBHA 수지(0.66 mmol/g)를 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기에 넣었다. 수지를 1 h 동안 DCM(15 ml) 중에 그리고 1 h 동안 DMF(15 ml) 중에 팽윤시켰다. 수지 상의 Fmoc 그룹을 5분 및 15분 동안 20%(v/v) 피페리딘/DMF 용액으로 2회 처리하여 탈보호하였다. 수지를 DMF/DCM/DMF(각각 6:6:6회)로 세정하였다. 고체 지지체로부터 Fmoc의 제거 입체형태를 위해 Kaiser 시험(정량적 방법)을 이용하였다. 건조 DMF 중 C-말단 Fmoc-아미노산(수지 부하 대비 5 당량 과량)을 탈보호된 수지에 첨가하고, 5 당량 과량의 DMF 중 DIC 및 HOBT로 다음 Fmoc-아미노산의 커플링을 개시하였다. 반응 혼합물 중 각각의 반응물의 농도는 대략 0.4 M이었다. 혼합물을 2 h 동안 실온에서 회전자 상에서 회전시켰다. 수지를 여과하고 DMF/DCM/DMF로 세정하였다(각각 6:6:6회). 커플링 종료 시 펩티드 수지 분취액에 대한 Kaiser 시험은 음성이었다(수지에 색상 없음). 첫번째 아미노산 부착 후, 수지 내에, 존재하는 경우 미반응 아미노 그룹을 20분 동안 아세트산 무수물/피리딘/DCM(1:8:8)을 이용해서 캡핑하여 서열의 임의 결실을 배제하였다. 캡핑 후, 수지를 DCM/DMF/DCM/DMF로 세정하였다(각각 6/6/6/6회). 펩티딜 수지에 부착된 C-말단 아미노산 상의 Fmoc 그룹을 5분 및 15분 동안 20%(v/v) 피페리딘/DMF 용액으로 2회 처리하여 탈보호하였다. 수지를 DMF/DCM/DMF로 세정하였다(각각 6:6:6회). Fmoc-탈보호 종료 시 펩티드 수지 분취액에 대한 Kaiser 시험은 양성이었다.

Rink 아미드 MBHA 수지 상의 표적 서열에서 나머지 아미노산을 DMF 중 수지 부하 대비 5 당량 과량을 이용하여 Fmoc AA/DIC/HOBt 방법을 이용해서 순차적으로 커플링하였다. 반응 혼합물 중 각각의 반응물의 농도는 대략 0.4 M이었다. 혼합물을 2 h 동안 실온에서 회전자 상에서 회전시켰다. 수지를 여과하고 DMF/DCM/DMF로 세정하였다(각각 6:6:6회). 각각의 커플링 단계 및 Fmoc 탈보호 단계 후, Kaiser 시험을 수행하여 반응 종료를 확인하였다.

선형 서열의 종료 후, 분지점 또는 변형점으로 이용된 리신의 ε-아미노 그룹을 15분 동안 2회 DMF 중 2.5% 하이드라진 수화물을 이용해서 탈보호하고 DMF/DCM/DMF로 세정하였다(각각 6:6:6회). DMF 중에서 DIC/HOBt 방법으로(수지 부하 대비 5 당량 과량) Fmoc-Glu(OH)-OtBu을 이용하여 글루탐산의 γ-카복실 말단을 Lys의 ε-아미노 그룹으로 부착하였다. 혼합물을 2 h 동안 실온에서 회전자 상에서 회전시켰다. 수지를 여과하고 DMF/DCM/DMF로 세정하였다(각각 6x30 ml). 글루탐산 상의 Fmoc 그룹을 5분 및 15분 동안 20%(v/v) 피페리딘/DMF 용액으로 2회 처리하여 탈보호하였다(각각 25 ml). 수지를 DMF/DCM/DMF로 세정하였다(각각 6:6:6회). Fmoc-탈보호 종료 시 펩티드 수지 분취액에 대한 Kaiser 시험은 양성이었다.

측쇄 분지가 또한 하나 이상의 γ-글루탐산을 함유하는 경우, DMF 중에서 DIC/HOBt 방법으로(수지 부하 대비 5 당량 과량) γ-글루탐산의 자유 아미노 그룹에 부착하기 위해 두번째 Fmoc-Glu(OH)-OtBu을 이용하였다. 혼합물을 2 h 동안 실온에서 회전자 상에서 회전시켰다. 수지를 여과하고 DMF/DCM/DMF로 세정하였다(각각 6x30 ml). γ-글루탐산 상의 Fmoc 그룹을 5분 및 15분 동안 20%(v/v) 피페리딘/DMF 용액(25 mL)으로 2회 처리하여 탈보호하였다. 수지를 DMF/DCM/DMF로 세정하였다(각각 6:6:6회). Fmoc-탈보호 종료 시 펩티드 수지 분취액에 대한 Kaiser 시험은 양성이었다.

글루탐산의 측쇄에 대한 팔미트산 및 스테아르산 부착:

γ-글루탐산의 자유 아미노 그룹에 DMF에 용해된 팔미트산 또는 스테아르산(5 당량)을 첨가하고, DMF 중 DIC(5 당량) 및 HOBt(5 당량)의 첨가에 의해 커플링을 개시하였다. 수지를 DMF/DCM/DMF로 세정하였다(각각 6:6:6회).

수지로부터 펩티드의 최종 분해:

수동 합성에 의해 합성된 펩티드 수지를 DCM(6x10 ml), MeOH(6x10 ml) 및 에테르(6x10 ml)로 세정하고, 밤새 진공 건조기에서 건조하였다. 펩티드-수지를 3 h 동안 실온에서 시약 칵테일(80.0% TFA/5% 티오아니솔/5% 페놀/2.5% EDT, 2.5% DMS 및 5% DCM)로 처리하여 고체 지지체로부터의 펩티드 분해를 달성하였다. 분해 혼합물을 여과로 수집하고, 수지를 TFA(2 ml) 및 DCM(2 x 5 ml)으로 세정하였다. 과량의 TFA 및 DCM을 질소 하에 작은 용적으로 농축하고 소량의 DCM(5 ml 내지 10 ml)을 잔류물에 첨가하고 질소 하에 증발시켰다. 공정을 3회 내지 4회 반복하여 대부분의 휘발성 불순물을 제거하였다. 잔류물을 0℃로 냉각하고, 무수 에테르를 첨가하여 펩티드를 침전시켰다. 침전된 펩티드를 원심분리하고 상층액 에테르를 제거하고, 신선 에테르를 펩티드에 첨가하여 재-원심분리하였다. 미정제 샘플을 분취용 HPLC로 정제하고 동결건조하였다. 펩티드의 정체를 LCMS로 확인하였다.

또한, 라이신 측쇄의 도입을 위한 다른 경로가 사용되고, 펩티드 합성시에 측쇄가 이미 라이신에 부착된 사전기능화된 빌딩 블록(예를 들어, (2S)-6-[[(4S)-5-3급-부톡시-4-[[(4S)-5-3급-부톡시-4-(헥사데카노일아미노)-5-옥소-펜타노일]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)헥산 산)이 커플링 파트너로 사용된다. 아미노 그룹을 갖는 펩티드 수지 0.67mmol이 디메틸포름아미드 20ml로 세척된다. (2S)-6-[[(4S)-5-3급-부톡시-4-[[(4S)-5-3급-부톡시-4-(헥사데카노일아미노)-5-옥소-펜타노일]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)헥산 산 2.93g이 하이드록시벤조트리아졸 하이드레이트 310 mg 및 0.32 ml의 디이소프로필카보디이미드와 함께 20 ml의 디메틸포름아미드에 용해된다. 5분 동안 교반한 후, 용액을 수지에 첨가한다. 수지를 20시간 동안 교반한 후, 각각 20 ml의 디메틸포름아미드로 3회 세정한다. 작은 수지 샘플을 취하여 Kaiser-테스트 및 클로라닐-테스트에 적용시킨다(E. Kaiser, R. L. Colescott, C. D. Bossinger, P. I. Cook, Anal. Biochem. 1970, 34, 595-598; 클로라닐-테스트: T. Vojkovsky, Peptide Research 1995, 8, 236-237). 이 과정은 매우 진전된 합성 중간체 상의 측쇄 빌딩 블록의 선택적 부착 뿐만 아니라 선택적인 탈보호 단계의 필요를 피한다.

분석적 HPLC/UPLC

방법 A: 210 내지 225 nm에서 검출

칼럼: 50℃에서 Waters ACQUITY UPLC® CSH™ C18 1.7 ㎛(150 x 2.1 mm)

용매: H₂O+0.05%TFA : ACN+0.035% TFA(유량 0.5 ㎖/분)

구배: 80:20(0분) → 80:20(3분) → 25:75(23분) → 2:98(23.5분) → 2:98(30.5분) → 80:20(31분) → 80:20(37분)

선택적으로 질량 분석기에 의해: LCT Premier, 전기분무 양이온 모드

방법 B: 214에서 검출

칼럼: 50℃에서 Waters ACQUITY UPLC® CSH™ C18 1.7 ㎛(150 x 2.1 mm)

용매: H₂O+0.05%TFA : ACN+0.035% TFA(유량 0.5 ㎖/분)

선택적으로 질량 분석기에 의해: Agilent 6230 Accurate-Mass TOF, Dual Agilent Jet Stream ESI

방법 C: 214 nm에서 검출

칼럼: 50℃에서 Waters ACQUITY UPLC® CSH™ C18 1.7 ㎛(150 x 2.1 mm)

용매: H₂O+0.1%TFA : ACN+0.1% TFA(유량 0.5 ㎖/분)

구배: 80:20(0분) → 80:20(3분) → 25:75(23분) → 2:98(23.5분) → 2:98(30.5분) → 80:20(31분) → 80:20(38분)

선택적으로 질량 분석기에 의해: Agilent 6230 Accurate-Mass TOF, Agilent Jet Stream ESI

방법 D: 220 nm에서 검출

칼럼: Waters ACQUITY BEH C18 (2.1x100 mm x 1.7 μm), 온도: 40℃

Aries peptide XB C18 (4.6x250 mm x 3.6 μm), 온도: 40℃

용매: H₂O+0.1% 포름산(완충액 A) : ACN+0.1% 포름산(유량 1 ml/분)(완충액 B)

구배: 2% 완충제 B로 컬럼 평형화 및 15분 동안 2% 내지 70% 완충제 B의 구배에 의한 용리

방법 E: 215 nm에서 검출

칼럼: 50℃에서 Waters ACQUITY UPLC® CSH™ C18 1.7 ㎛(150 x 2.1 mm)

용매: H₂O+0.05%TFA : ACN+0.035% TFA(유량 0.5 ㎖/분)

구배: 80:20(0분) → 80:20(3분) → 25:75(23분) → 5:95(23.5분) → 5:95(25.5 분) → 80:20(26분) → 80:20(30분)

일반 분취용 HPLC 정제 절차

미정제 펩티드를 Akta Purifier System, Jasco semiprep HPLC System 또는 Agilent 1100 HPLC 시스템에서 정제하였다. 상이한 크기 및 상이한 유량의 분취용 RP-C18-HPLC 컬럼을 정제되는 미정제 펩티드의 양에 따라 사용하였다. 아세토니트릴 + 0.1% TFA (B) 및 물 + 0.1% TFA (A)를 용출제로 이용하였다. 생성물-함유 분획을 수집하고, 동결건조시켜, 통상적으로 TFA 염으로서의 정제된 생성물을 수득하였다.

엑센딘-4 유도체의 용해도 평가

펩티드 배치의 용해도 측정 전에 UPLC/MS를 통해 그의 순도를 측정하였다.

용해도 시험을 위해, 표적 농도는 10 mg/ml의 순수한 화합물이었다. 따라서, 고체 샘플로부터의 용액을 이전에 결정된 순도%를 기초로 하여 10 mg/ml의 화합물의 농도로 완충제 시스템에서 제조하였다.

용해도 완충제 시스템 A) 아세테이트 완충액 pH 4.5, 100 mM 아세트산 나트륨 삼수화물, 2.7 mg/ml m-크레졸

용해도 완충제 시스템 B) 인산 완충액 pH 7.4, 100 mM 인산 수소 나트륨, 2.7 mg/ml m-크레졸

용해도 완충제 시스템 C) 시트르산 완충액 pH 6.0, 시트르산 100 mM, 2.7 mg/mL m-크레졸

UPLC-UV를 2500 RCF(상대 원심 가속)에서 15분의 원심분리에 의해 획득된 상층액으로부터의 1시간의 가벼운 진탕 후에 수행하였다.

용해도는 공지된 농도의 기준 펩티드의 표준 곡선과 1:10으로 희석된 완충된 샘플의 2 μL-주입의 UV 피크 면적의 비교에 의해 결정되었다. 샘플 및 기준 펩티드의 상이한 UV 흡광 계수는 상이한 아미노산 서열을 기초로 계산되었고, 농도 계산에서 고려되었다.

엑센딘 -4 유도체의 화학적 안정성 평가

펩티드 배치의 화학적 안정성 측정 전에 UPLC/MS를 통해 그의 순도를 측정하였다. 안정성 시험을 위해, 표적 농도는 1 mg/ml의 순수한 화합물이었다. 따라서, 고체 샘플로부터의 용액을 이전에 결정된 순도%를 기초로 하여 1 mg/ml의 화합물의 농도로 다양한 완충제 시스템에서 제조하였다:

화학적 안정성 완충제 시스템 A) 25 mM 아세테이트 완충액 pH 4.5, 3 mg/mL L-메티오닌, 2.7 mg/mL m-크레졸, 18 mg/mL 글리세롤 85%

화학적 안정성 완충제 시스템 B) 25 mM 인산 완충액 pH 6.0, 3 mg/mL L-메티오닌, 2.7 mg/mL m-크레졸, 18 mg/mL 글리세롤 85%

펩티드 용액을 0.22 μM 공극 크기로 여과하고, 무균 조건하에 분취액에 채웠다. 시작 시점에서, UPLC-UV는 희석되지 않은 샘플 2 μl를 주사하여 수행되었다.

화학적 안정성 시험을 위해, 분취액을 5℃ 및 40℃에서 28일 동안 저장하였다. 이 시간 경과 후 샘플을 2500 RCF에서 15분간 원심분리하였다. 이어서, 희석되지 않은 상층액 2 ㎕를 UPLC-UV로 분석하였다.

화학적 안정성은 하기 식에 의해 계산된 순도의 상대적 손실을 통해 평가되었다:

[(출발점 순도) - (X℃에서 28일 후의 순도)] / (출발점 순도)] *100%

X = 5 또는 40℃

순도는 하기와 같이 계산된다

[(피크 면적 펩티드) / (전체 피크 면적)] * 100%

물리적 안정성 평가를 위한 동적 광산란(DLS)

단색 및 간섭광선(레이저)이 액체 샘플을 조명하는데 사용한다. 동적 광산란(DLS)은 브라운 운동을 하는 입자(1 nm ≤ 반경 ≤ 1 μm)에서 산란된 빛을 측정한다. 이 운동은 열 에너지로 인해 움직이는 입자와 용매 분자 사이의 충돌에 의해 유도된다. 입자의 확산 운동은 산란광의 시간적 변동을 초래한다[Pecora, R. 동적 광산란: 광자상관 분광법의 적용, Plenum Press, 1985].

산란된 광 강도 변동이 기록되어, 자기상관 함수로 변환된다. 자기상관 곡선을 지수 함수에 맞추면, 용액내 입자의 확산 계수 D를 도출할 수 있다. 확산 계수는 구형 입자를 가정한 스톡스-아인슈타인(Stokes-Einstein) 식을 통해 유체역학 반경 R_h(또는 명백한 스톡스 반경)를 계산하는데 사용된다. 이 계산은 ISO 13321 및 ISO 22412에 정의되어 있다[국제 표준 ISO13321 입자 크기 분포 측정 방법 Part 8: 광자상관 분광법, 국제 표준화기구(ISO) 1996; 국제 표준 ISO22412 입자 크기 분석 - 동적 광산란, 국제 표준화기구(ISO) 2008].

다분산 샘플의 경우, 자기상관 함수는 각 종에 해당하는 지수 붕괴의 합이다. 산란광의 시간적 변동은 입자 분율 또는 계열의 크기 분포 프로파일을 결정하는데 사용될 수 있다. 1차 결과는 입자 크기의 함수로서 산란광의 강도 분포이다. 강도 분포는 각 입자 분율 또는 계열의 산란 강도에 따라 자연적으로 가중된다. 생물학적 물질 또는 중합체의 경우 입자 산란 강도는 분자량의 제곱에 비례한다. 따라서, 소량의 집합체/응집체 또는 존재 또는 더 큰 입자 종들이 강도 분포를 지배할 수 있다. 그러나, 이 분포는 샘플에 큰 물질이 존재할 때 민감한 검출기로 사용될 수 있다. 강도 분포는 특정 가정 하에서 Mie 이론을 사용하여 입자 크기의 용적 또는 질량 분포로 변환될 수 있다. 강도 분포와 달리, 질량 분포는 비교 목적으로 사용하는 것이 가장 좋으며, 절대로 절대적인 것으로 간주해서는 안된다(기본 가정 때문에).

DLS 기술은 고유한 피크 확장을 갖는 분포를 생성한다. 다분산 지수 %Pd는 입자 크기 분포 폭의 척도이며, ISO13321 및 ISO22412에 기재되어 있다[국제 표준 ISO13321 입자 크기 분포 측정 방법 Part 8: 광자상관 분광법, 국제 표준화기구(ISO) 1996; 국제 표준 ISO22412 입자 크기 분석 - 동적 광산란, 국제 표준화기구(ISO) 2008].

DLS 상호작용 매개변수(k _D )

DLS 상호작용 매개변수(k_D)는 입자가 접힌 단백질 또는 펩티드인 입자간 상호작용을 기술하는 척도이다[Sandeep Yadav 등 (2009) J Pharm Sc, Vol 99(3), pp 1152-1168; Brian D. Connolly 등 (2012) Biophysical Journal Volume 103, pp 69-78].

매개변수 k_D는 확산 계수 D의 농도 의존성으로부터 도출되고, 확산 계수 D는 농도 c의 파워의 확대에 의해 주어진다:

D(c) = D₀(1 + k_Dc + k_iDc² + k_jDc³ + ...)

더 높은 차수 항, 즉 k_iD= k_jD = ... = 0을 무시하면, 데이터는 선형적으로 적합될 수 있고, k_D는 곡선 D = D₀ (1+k_Dc) 및 D₀의 기울기로부터 얻어진다. D₀는 농도가 0일 때의 확산 계수이다. 매개변수 k_D는 단백질 또는 펩티드 분자 또는 올리고머의 용액 내에서의 자기 및 환경과의 상호작용을 기술하는데 사용될 수 있으며, 이론적으로는 예를 들어, Harding 및 Johnson에 의해 기술된 바와 같은 비리얼 계수 B₂₂와 이론적으로 관련되고, M은 몰 질량, k_s는 침강 속도의 1차 농도 계수이고, υ는 부분 비체적이다[Harding SE, Johnson P. (1985) Biochem J, 231, pp543-547].

k_D = 2B₂₂M - k_s - υ

양성 B₂₂ 값은 자기-연관보다 치유(salvation)를 선호하는 샘플을 나타내는 반면, 음성 B₂₂ 값은 자기-연관을 선호하는 샘플을 나타낸다. 실용적인 관점에서 볼 때, k_D는 B₂₂와 의미가 유사하며 분자 간의 순-힘에 대한 정보를 제공한다. 높은 값은 강한 그물-반발 상호작용을 나타내는 반면, 낮은 값은 순-인력을 나타낸다. 따라서, k_D는 상대적인 질적 비교에 사용될 수 있다(도 1 참고).

모든 펩티드 용액에 대해, 유체역학 반경 R_h 및 확산 상수 D(스톡스-아인슈타인 식을 통해 관련됨)이 평균 3배 이상 결정되었다. 두 매개변수는 동일한 완충제 시스템에서 상이한 펩티드 농도(예를 들어, R_h1 및 D₁: 1 mg/ml 및 R_h5 및 D₅: 5 mg/ml)에서 결정되었다. 낮은 펩티드 농도와 높은 펩티드 농도 사이의 이들 매개변수의 차이는 DLS 상호작용 매개변수 k_D에 대한 대용물이다. R_h5< R_h1 또는 D₅> D₁은 k_D > 0에 해당하므로 물리적(또는 콜로이드) 안정성이 향상되는 반발 입자 간 상호작용에 해당한다.

DLS 완충제 시스템 A) 25 mM 아세테이트 완충액 pH 4.5, 3 mg/mL L-메티오닌, 2.7 mg/mL m-크레졸, 18 mg/mL 글리세롤 85%

DLS 완충제 시스템 B) 25mM 인산 완충액 pH6.0, 3 mg/mL L-메티오닌, 2.7 mg/mL m-크레졸, 18 mg/mL 글리세롤 85%

DLS 방법 A: W130i 장치(Avid Nano Ltd, High Wycombe, 영국) 및 저용량 일회용 큐벳(UVette, Eppendorf AG, 독일 함부르크)을 사용하여 DLS 측정을 수행하였다. 데이터는 Avid Nano에서 제공한 i-Size 3.0으로 처리하였다. 입자 크기 분포의 매개변수는 DynaLS 알고리즘을 사용하는 비-음으로 제한된 최소 자승법(NNLS)으로 결정하였다. 측정은 660 nm 레이저 광원과 90° 각도로 25℃에서 수행하였다.

DLS 방법 B: Nanosizer ZS(Malvern Instruments, 영국 맬번) 상에서, 및 일회용 UV 큐벳(Brand macro, 2,5 mL 및 Brand semi-micro 1,5 mL, Brand GmbH + Co KG, 독일 베르타임)을 사용하여 DLS 측정을 수행하였다. Malvern Zetasizer 소프트웨어 버전 7.10 또는 7.01을 사용하여 데이터를 처리하였다. 입자 크기 분포의 매개변수는 비-음으로 제한된 최소 자승법(NNLS)으로 결정하였다. 측정은 NIBS(비침습성 역-산란기(Non-Invasive Back-Scatter)) 모드에서 633 nm 레이저 광원과 173° 각도로 25℃에서 수행하였다.

DLS 방법 C: DLS 측정은 DynaPro Plate Reader II(Wyatt Technology, Santa Barbara, CA, US)에서 하기 검정색, 저용적 및 비-처리판: 투명 바닥이 있는 폴리스티렌 384 검정 플레이트(Corning, MT, 미국), 투명 바닥이 있는 폴리스티렌 96 검정 플레이트(Corning, NY, 미국), 투명 바닥이 있는 사이클로 올레핀 중합체(COP) 384 검정 플레이트(Aurora, NY, US), 또는 투명 바닥이 있는 폴리스티렌 384 검정 플레이트(Greiner Bio-One, Germany) 중 하나를 사용하여 수행하였다. 데이터는 Wyatt Technology에서 제공한 Dynamics 소프트웨어를 사용하여 처리하였다. 입자 크기 분포의 매개변수는 DynaLS 알고리즘을 사용하는 비-음으로 제한된 최소 자승법(NNLS)으로 결정하였다. 측정은 830 nm 레이저 광원과 158° 각도로 25℃에서 수행하였다.

신체적 안정성 평가를 위한 ThT 분석

펩티드 용액의 물리적 안정성이 낮으면 아밀로이드 피브릴 형성이 일어날 수 있는데, 이는 샘플에서 잘-배열된 실-모양 거대분자 구조로 관찰되고 결국 겔 형성을 유발할 수 있다. 티오플라빈 T(Thioflavin T, ThT)는 잘못 접힌 단백질 응집체의 존재를 시각화하고 정량화하기 위해 널리 사용된다. [Biancalana 등 (2010) Biochimica et Biophysica Acta. 1804(7): 1405-1412.]. 그것이 아밀로이드 응집체와 같은 피브릴에 결합할 때 염료는 별개의 형광 특성을 나타낸다[Naiki 등 (1989) Anal. Biochem.177, 244-249; LeVine (1999) Methods. Enzymol. 309, 274-284]. 피브릴 형성을 위한 시간 과정은 종종 S자형 곡선의 특징적 형태를 따르며, 세 영역: 유도기, 신속성장기 및 고원기로 나뉜다.

전형적인 피브릴 형성 과정은 유도기부터 시작하여, 부분적으로 접힌 펩티드가 피브릴로 변하는 양은 검출되기에 충분하지 않다. 유도기는 핵의 임계 질량이 형성되는 시간과 상응한다. 그 후, 극적인 연신 단계가 일어나고 피브릴 농도가 급격히 증가한다.

Fluoroskan Ascent FL 내에서 37℃에서 진탕하여 스트레스 조건 하에서 피브릴 경향을 결정하기 위한 조사를 수행하였다.

Fluoroskan Ascent FL에서 시험하기 위해, 200 μL 샘플을 96 웰 미세적정기 플레이트 PS, 평평한 바닥, Greiner Fluotrac No. 655076에 넣었다. 플레이트를 스카치 테이프(Quiagen)로 밀봉하였다. 샘플을 960 rpm에서 10초간 진탕하고 37℃에서 50초의 휴식주기를 연속적으로 주기로 하여 강제하였다. 20분마다 형광 강도를 측정하여 반응 속도를 모니터링하였다.

펩티드를 완충제 시스템에서 3 mg/ml의 최종 농도로 희석시켰다. H2O 내 10.1 mM ThT 용액 20 ㎕를 2 ㎖의 펩티드 용액에 첨가하여 100 μM ThT의 최종 농도를 얻었다. 각 샘플에 대해 8개의 복제본을 테스트하였다.

Tht 완충제 시스템 A) m-크레졸을 포함하는 100 mM 아세테이트 pH 4.5(100 mM 나트륨 아세트산 트리하이드레이트, 2N CH3COOH를 사용하는 pH 조절, 2.7 mg/mL m-크레졸)

Tht 완충제 시스템 B) 100 mM 시트르산 완충액 pH 6.0

GLP-1, 글루카곤 및 GIP 수용체 유효성에 대한 시험관내 세포 검정

수용체에 대한 화합물의 작용을 인간 GLP-1, GIP 또는 글루카곤 수용체를 안정적으로 발현하는 HEK-293 세포주의 cAMP 반응을 측정하는 기능 검정에 의해 결정하였다.

세포의 cAMP 함량을 HTRF (균일 시간 해상 형광 (Homogenous Time Resolved Fluorescence))를 기반으로 한 Cisbio Corp.제 키트(카탈로그 번호 62AM4PEJ)를 이용하여 결정하였다. 제조를 위해, 세포를 T175 배양 플라스크 내로 분주하고, 배지(DMEM/10% FBS)에서 거의 컨플루언스(confluence)까지 하룻밤 성장시켰다. 그 후, 배지를 제거하고, 세포를 칼슘 및 마그네슘이 결여된 PBS로 세정하고, 이어서 아큐타아제(accutase)(Sigma-Aldrich 카탈로그 번호 A6964)를 이용하여 프로테이나아제 처리를 하였다. 떼어낸 세포를 세척하고, 분석 완충제 (1 x HBSS; 20 mM HEPES, 0.1% BSA, 2 mM IBMX)에 재현탁시키고, 세포 밀도를 결정하였다. 그 후, 이것을 400000개 세포/㎖까지 희석시키고, 25 ㎕-분취물을 96-웰 플레이트의 웰 내로 분배하였다. 측정을 위하여, 분석 완충제 중 테스트 화합물 25 ㎕를 웰에 첨가하고, 이어서 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 용해 완충액에 희석시킨 HTRF 시약(키트 구성요소)을 첨가한 후, 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하고, 665/616 nm에서 형광 비율을 측정하였다. 효능제의 시험관 내 효력을 최대 반응의 50% 활성화를 야기한 농도 (EC50)의 결정에 의해 정량화하였다.

마우스 및 돼지에서의 엑센딘-4 유도체의 정량화를 위한 생분석 스크리닝 방법

마우스에 1 ㎎/kg을 피하(s.c.) 투약하였다. 마우스를 희생시키고, 혈액 샘플을 적용 후 0.25시간, 0.5시간, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 16시간 및 24시간 후에 채취하였다. 혈장 샘플을 액체 크로마토그래피 질량분광법(LC/MS)을 통한 단백질 침전 후에 분석하였다. PK 매개변수 및 반감기를 WinonLin Version 5.2.1(비-구획 모델)을 이용하여 계산하였다.

암컷 Goettinger 미니돼지에 0.05 mg/kg, 0.075 mg/kg 또는 0.1 ㎎/kg을 피하(s.c.) 투약하였다. 혈액 샘플을 적용 후 0.25시간, 0.5시간, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 24시간, 32시간, 48시간, 56시간 및 72시간 후에 채취하였다. 혈장 샘플을 액체 크로마토그래피 질량분광법(LC/MS)을 통한 단백질 침전 후에 분석하였다. PK 매개변수 및 반감기를 WinonLin Version 5.2.1(비-구획 모델)을 이용하여 계산하였다.

암컷 식이-유도 비만(DIO) C57BL/6 마우스의 혈당, 체질량, 총 체지방 함량 및 사료 섭취량에 대한 피하 처리 후 급성 및 만성 효과

암컷 C57BL/6NHsd 마우스는 Envigo RMS Inc.에서 수용된 그룹으로 주문되었으며, 그룹 수용하여 선적된 후 예비투약 단계의 38일까지 나무 칩 침구와 함께 신발상자 케이지에 상기 선적된 케이지 메이트와 그룹 수용하였다. 연구 시작시 마우스는 25 내지 26주령이었다.

마우스는 12시간의 명/암 사이클(명기 오전 04:00 내지 오후 4:00), 23 내지 26℃의 실내 온도 및 30 내지 70%의 상대 습도를 포함하는 사육장 조건하에 수용하였다. 약리학적 개입(투약 단계)이전에 모든 동물은 16주 동안 물과 고지방 식이요법(TD97366)에 자유롭게 접근할 수 있었다. 예비투약 단계의 38일까지 사료를 매주 신선한 사료로 대체하고 마지막 사료로 대체하였다. 후속적인 투약 단계 동안 남아있는 사료의 약 50%가 제거되고, 신선한 사료로 대체되었고, 펠릿을 주당 1회 균등하게 혼합하였다.

예비투약 38일에 비만 DIO 마우스를 모든 DIO 그룹 사이의 평균 체질량을 맞추기 위해 치료 그룹(n=8)에 할당하였다. 설치류 유지관리 식단(Teklad Global Diets Rodent 2014, 펠릿화됨)에 자유롭게 접근할 수 있는 연령-맞춤 그룹을 일반(lean) 대조군 그룹으로 연구에 포함시켰다. 32일부터 38일까지의 예비투약 단계에서, 모든 연구 동물을 비히클(인산 완충 식염수, PBS, Gibco, CaCl₂ 및 MgCl₂ 없음)로 1일 1회(피하 대략 0.2 mL/마우스) 처리하였다.

예비투약 단계의 37일에, 시험 제품을 PBS로 100 μg/mL의 농도로 희석하고, 이 저장 용액의 분취액을 약 -60℃ 이하에서 보관하였다. 스톡 분취액을 주간 사용을 위해 해동시킨 후 약 4℃의 냉장고에 보관하였다. 주입된 시험 제품 용액은 PBS로 원액을 희석하여 원하는 농도가 되도록 각 투약일에 한 번 신선한 상태로 준비되었다.

마우스는 28일 동안 PBS-비히클 또는 시험 제품의 피하 주사로 1일 2회 처리하였다. 아침 투약은 오전 6:00부터 7:30 사이에, 및 오후 투약은 2:00부터 오후 3:30 사이에 시작 및 완료되었다. 투약 단계 28일째에 아침 용량만을 투여하였다. 적용된 용적은 5 ml/kg이었고, 용량은 각 개인의 최근 체질량 기록으로 조정되었다.

1) 비-공복, 암컷 DIO 마우스에서의 혈당 프로파일에 대한 급성 효과

동물들은 실험 중에 물과 사료에 무제한으로 접근할 수 있었다. 투약 단계의 1일에, 비-마취 동물에서 PBS-비히클 또는 시험 제품을 첫번째 피하 투약하기전 0시간에, 및 투약 후 1, 2, 3, 4, 6 및 24시간에 꼬리 클립을 통해 약 5 ㎕의 혈액을 채취하였다. 24시간 혈액 채취를 2일째에 투약하기 전에 수행하였다. 6 내지 24시간 혈액 샘플 사이에 오후 용량을 투여하였다. 혈당 측정은 전혈에서 Aviva 글루코미터를 사용하여 2회 또는 3회 수행하였다.

2) 비-공복, 암컷 DIO 마우스에서의 체질량에 대한 만성 효과:

체질량은 예비투약 단계 32 내지 38일간 및 투약 단계 28일 내내 매일 약 오전 06:00 내지 07:30 사이에 측정하였다. 투약 단계 동안, 마우스를 PBS-비히클 또는 시험 제품의 피하 주사에 의해 1일 2회 처리하였다.

3) 비-공복, 암컷 DIO 마우스에서의 총 체지방 질량에 대한 만성 효과:

총 체지방 질량을 측정하기 위해, 예비투약 37일째 및 투약 단계 26일째에 정량적 핵자기공명(QNMR) 측정을 수행하였다. 투약 단계 동안, 마우스를 PBS-비히클 또는 시험 제품의 피하 주사에 의해 1일 2회 처리하였다.

4) 암컷 DIO 마우스에서 사료 섭취량에 대한 효과:

사료 섭취량은 오전 06:00 내지 07:30 사이에 각 케이지의 사료섭취 마우스의 체중을 매일 평가한 결과에 기초하였다. 각 케이지는 4마리의 마우스를 수용하고, 사료 섭취량을 투약 단계 28일 내내 계산하였다. 투약 단계 동안, 마우스를 PBS-비히클 또는 시험 제품의 피하 주사에 의해 1일 2회 처리하였다.

5) 비-공복 암컷 DIO 마우스의 최종 혈장 매개변수:

28일째에 혈장 인슐린 농도를 측정하기 위해 임의의 다른 생전 활동에 앞서 혈액을 채취하였다. 그런 다음, 아침 용량을 투여하고, 투약-후 4시간 후 부검을 수행하였다. 이 목적을 위해 동물을 이소플루란으로 마취시키고, 안와 출혈로 혈액을 채취하였다.

5) 비-공복 암컷 DIO 마우스의 최종 간 질량:

아침 투약 후 28일 및 4시간에, 상기한 바와 같이 이소플루란 마취 하에 마우스로부터 혈액을 채취하였다. 그런 다음 마우스를 사멸시키고, 간을 채취하고, 중량을 재었다.

6) 간 지질의 정량화:

간 분취액을 디클로로메탄:메탄올(2:1)과 함께 배양하였다. 친지성 및 소유성 단계는 dH₂O 첨가 및 후속 원심분리에 의해 분리하였다. 하부 친지성 상을 수집하고, 나머지 소유성 층 및 간 조직으로 절차를 반복하였다. 다음으로, 친지성 상을 조합하고 용매를 증발시켰다. 60℃에서 연속 진탕시에 샘플을 2-프로판올과 함께 인큐베이션하였다. 총 콜레스테롤, 트리아실글리세롤 및 인지질 농도를 제조사의 지시에 따라 상업적 키트를 사용하여 효소적으로 정량화하였다.

7) 통계적 분석:

통계적 분석은 Sigmaplot 12.5로 수행하였다. DIO-비히클 마우스(일반적으로 n=8) 그룹과 DIO-시험 제품 처리된 마우스(일반적으로 n=8)를 비교하기 위해 2-테일 T-테스트를 이용하였다. 두 그룹의 평균값의 차이가 0.05보다 큰 경우, 통계적으로 유의한 차이가 있다고 간주되었다. 일반(lean)-비히클 그룹 데이터는 도면에 도시되고, 비-비만 상태에 대한 참조 데이터 세트로 사용되었다.

비-공복 암컷, 당뇨병 db/db 마우스에서 혈당 농도에 대한 피하 치료후 급성 효과

암컷 건강한, 일반 BKS.Cg-(일반)/OlaHsd 및 당뇨병-경향이 있는 비만한 BKS.Cg-+Lepr^db/+Lepr^db/OlaHsd 마우스는 Envigo RMS Inc.에서 수용한 그룹으로 주문되었으며, 그룹 수용하여 선적된 후 나머지 그룹은 예비투약 단계의 15일까지 나무 칩 침구와 함께 신발상자 케이지에 수용하였다. 연구 시작시 마우스는 약 12주령이었다.

마우스는 12시간의 명/암 사이클(명기 오전 04:00 내지 오후 4:00), 23 내지 26℃의 실내 온도 및 30 내지 70%의 상대 습도를 포함하는 사육장 조건하에 수용하였다. 모든 동물은 물과 Purina Fomulab Diet 5008에 자유롭게 접근할 수 있었다.

예비투약 9일째에 HbA1c 뿐만 아니라 혈당 및 체질량(대략 오전 08:00 내지 10:00) 측정을 수행하였다. 예비투약 단계 15일째에, 동물을 처리 그룹(n=8) 및 새로운 케이지로 할당하여 모든 db/db 그룹 사이의 평균 HbA1c 및 체질량을 매칭시켰다. 연령-매칭된 일반 그룹을 건강한, 일반 참조군으로서 연구에 포함시켰다.

투약 단계의 1일 전에, 시험 제품을 1 mg/mL의 농도로 인산 완충 식염수(PBS, Gibco, CaCl₂ 및 MgCl₂ 없음)로 희석하고, 이 원액의 분취액을 약 -60℃ 이하에서 저장하였다. 투약 단계의 1일째에, 원액 분취액을 해동시키고, 주입된 시험 제품 용액을 원하는 농도를 달성하도록 PBS로 희석하여 신선하게 제조하였다.

투약 단계의 1일째에 db/db 마우스를 PBS-비히클 또는 30 μg/kg 시험 제품으로 피하 주사하여 1회 처리하였다. 일반 참조군을 PBS-비히클의 피하 주사에 의해 1회 처리하였다. 투약은 오전 08:00 내지 10:00 사이에 개시 및 완료하였다. 적용된 용적은 5 ml/kg이었고, 용량은 각 개인의 최근 체질량 기록으로 조정되었다.

1) 비-공복 동물에서의 혈당 프로파일에 대한 급성 효과:

동물들은 실험 중에 물과 사료에 무제한으로 접근할 수 있었다. 투약 단계의 1일째에 임의의 다른 생전 활동전 -30분 및 0분 전에 꼬리 클립을 통해 약 5 μL의 혈액을 채취하였다. 0분에 마우스는 PBS-비히클 또는 30 μg/kg 시험 제품의 피하 투약을 받았다. 투약 후 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 및 24시간 후에 추가로 혈액 샘플을 수거하였다. 혈당 측정은 전혈에서 AlphaTRAK 글루코미터를 사용하여 실시하였다. 두 측정의 혈당 농도가 20 mg/dL 초과 차이난다면, 제3 값을 기록하였다. 혈당에 대한 곡선하 면적(AUC)을 트래피조이드 방법을 통해 투약 후 24시간 지속하는 동안 계산하였다.

2) 통계적 분석:

도면에서, 데이터는 평균±SEM으로 도시한다. 통계적 분석은 Sigmaplot 12.5로 수행하였다. 당뇨병, 비만 db/db 비히클 마우스(n=8)를 각각의 당뇨병, 비만 db/db 시험 제품처리된 마우스(n=8)와 비교함으로써, 일원분산분석 및 다중 비교(던넷 방법(Dunnett's Method))를 수행하였다. 두 그룹의 평균값의 차이가 0.05보다 큰 경우, 통계적으로 유의한 차이가 있다고 간주되었다. 비-당뇨병, 일반-비히클 그룹 데이터는 도면에 도시되고, 비-비만, 비-당뇨병 상태에 대한 참조 데이터세트로 제공되었다.

실시예

본 발명을 하기 실시예에 의해 추가로 예시한다.

실시예1:

서열 번호 6의 합성

방법에서 설명한 바와 같은 고체상 합성을 노바바이오켐 링크-아미드 수지 (4-(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc-아미노메틸)-페녹시아세트아미도-노르류실아미노메틸 수지), 100 내지 200 메시, 0.43 mmol/g의 로딩에서 실시하였다. Fmoc-합성 전략을 HBTU/DIPEA-활성화와 함께 적용하였다. 위치 14에서 Fmoc-Lys(Mmt)-OH 및 위치 1에서 Boc-His(Trt)-OH를 고상 합성 프로토콜에서 사용하였다. 방법에 기재된 바와 같이, 수지 상 펩티드로부터 Mmt-그룹을 분열시켰다. 이후 Palm-gGlu-gGlu-OSu를 염기로서 DIPEA를 채용하는 방출된 아미노-그룹에 커플링하였다. 펩티드를 킹 칵테일을 이용하여 수지로부터 절단하였다(문헌[D. S. King, C. G. Fields, G. B. Fields, Int. J. Peptide Protein Res. 1990, 36, 255-266]). 조 생성물을 아세토니트릴/물 구배(이들 둘 다는 0,1% TFA를 포함하는 완충제임)를 사용하여 워터스 컬럼(RP18 XSelectCSH-5 μm 50x150 mm)에서의 분취용 HPLC를 통해 정제하였다. 정제된 펩티드를 LCMS에 의해 분석하였다(방법 B).

체류 시간 8.737분을 갖는 피크 아래에서 발견된 질량 신호의 디콘볼루션(Deconvolution)은 4932.67의 예상값과 일치하는 펩티드 질량 4932.68을 나타내었다.

실시예 2:

서열 번호 11의 합성

방법에서 설명한 바와 같은 고체상 합성을 노바바이오켐 링크-아미드 수지 (4-(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc-아미노메틸)-페녹시아세트아미도-노르류실아미노메틸 수지), 100 내지 200 메시, 0.43 mmol/g의 로딩에서 실시하였다. Fmoc-합성 전략을 HBTU/DIPEA-활성화와 함께 적용하였다. 위치 14에서 Fmoc-Lys(Mmt)-OH 및 위치 1에서 Boc-His(Trt)-OH를 고상 합성 프로토콜에서 사용하였다. 방법에 기재된 바와 같이, 수지 상 펩티드로부터 Mmt-기를 절단하였다. 이후 Palm-gGlu-gGlu-OSu를 염기로서 DIPEA를 채용하는 방출된 아미노-그룹에 커플링하였다. 펩티드를 킹 칵테일을 이용하여 수지로부터 절단하였다 (문헌[D. S. King, C. G. Fields, G. B. Fields, Int. J. Peptide Protein Res. 1990, 36, 255-266]). 조 생성물을 아세토니트릴/물 구배(이들 둘 다는 0,1% TFA를 포함하는 완충제임)를 사용하여 워터스 컬럼(Sunfire Prep C18 ODB 5 μm 30x250 mm))에서의 분취용 HPLC를 통해 정제하였다. 정제된 펩티드를 LCMS에 의해 분석하였다(방법 B).

체류 시간 9.995분을 갖는 피크 아래에서 발견된 질량 신호의 디콘볼루션은 4863.63의 예상값과 일치하는 펩티드 질량 4863.67을 나타내었다.

실시예 3:

서열 번호 20의 합성

방법에서 설명한 바와 같은 고체상 합성을 노바바이오켐 링크-아미드 수지 (4-(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc-아미노메틸)-페녹시아세트아미도-노르류실아미노메틸 수지), 100 내지 200 메시, 0.43 mmol/g의 로딩에서 실시하였다. Fmoc-합성 전략을 HBTU/DIPEA-활성화와 함께 적용하였다. 위치 14에서 Fmoc-Lys(Mmt)-OH 및 위치 1에서 Boc-His(Trt)-OH를 고상 합성 프로토콜에서 사용하였다. 방법에 기재된 바와 같이, 수지 상 펩티드로부터 Mmt-기를 절단하였다. 이후 Palm-gGlu(OSu)-OtBu(CAS 204521-63-1)를 염기로서 DIPEA를 채용하는 방출된 아미노-그룹에 커플링하였다. 펩티드를 킹 칵테일을 이용하여 수지로부터 절단하였다(문헌[D. S. King, C. G. Fields, G. B. Fields, Int. J. Peptide Protein Res. 1990, 36, 255-266]). 조 생성물을 아세토니트릴/물 구배(이들 둘 다는 0,1% TFA를 포함하는 완충제임)를 사용하여 워터스 컬럼(Sunfire Prep C18 ODB 5 μm 30x250 mm))에서의 분취용 HPLC를 통해 정제하였다. 정제된 펩티드를 LCMS에 의해 분석하였다(방법 B).

체류 시간 8.837분을 갖는 피크 아래에서 발견된 질량 신호의 디콘볼루션은 4763.617의 예상값과 일치하는 펩티드 질량 4763.670을 나타내었다.

유사한 방식으로, 표 3에 기재된 다른 펩티드를 합성하고 특성규명하였다.

[표 3]

실시예 4: 안정성

펩티드 샘플을 화학적 안정성 완충제 시스템 A에서 제조하고, 안정성을 방법에서 기재된 바와 같이 평가하였다. 결과는 표 4에 제공된다

[표 4]

실시예 5: 용해도

펩티드 샘플을 용해도 완충제 시스템 A에서 제조하고, 용해도를 방법에서 기재된 바와 같이 평가하였다. 결과는 표 5에 제공된다

[표 5]

실시예 6: DLS 상호작용 매개변수에 의해 평가되는 안정성

펩티드 샘플의 유체역학 반경 R_h는 DLS 상호작용 매개변수 k_D에 대한 대용물로서 방법에 기재된 바와 같이 DLS 방법 C를 사용하여 DLS 완충제 시스템 A에서 상이한 펩티드 농도(1 mg/ml 및 5 mg/ml)에서 측정하였다. 결과는 표 6에 제공된다.

[표 6]

실시예 7: ThT 검정에서 안정성을 평가하였다.

펩티드 샘플의 티오플라빈 T(ThT) 검정에서의 지체시간은 방법에 기술된 바와 같이 ThT 완충제 시스템 A에서 결정되었다. 결과는 표 7에 제공된다

[표 7]

실시예 8: GLP-1, 글루카곤 및 GIP 수용체에 대한 시험관내 데이터

인간 글루카곤 수용체(h글루카곤 R), 인간 GIP 수용체(hGIP-R) 또는 인간 GLP-1 수용체(hGLP-1 R)를 발현하는 세포를 증가하는 농도의 상기 나열된 화합물에 노출시키고, 형성된 cAMP를 방법에 기재된 바와 같이 측정함으로써 GLP-1, 글루카곤 및 GIP 수용체에서의 펩티드 화합물의 효능을 결정하였다.

결과는 표 8에 제시되어 있다:

[표 8]

실시예 9: 비교 테스트

(여러 아미노산 중에서 특히) 위치 1의 His, 위치 13의 Leu, 위치 15의 Glu, 위치 19의 Gln, 위치 34의 Aib 아미노산, 위치 32의 Pro 및 위치 35 및 39의 Lys를 포함하는 선택 엑센딘-4 유도체는 이들 위치에 천연 엑센딘-4 또는 다른 아미노산의 아미노산 잔기를 갖는 상응하는 화합물과 비교하여 시험하였다. 기준 쌍 화합물, 및 인간 GLP-1, 글루카곤 및 GIP 수용체에서의 상응하는 EC50 값 (pM로 표시됨)은 표 9에 제공되어 있다. 도시된 바와 같이, 본 발명의 엑센딘-4 유도체는 GLP-1 수용체 및 글루카곤 수용체 활성을 유지하면서, 천연 엑센딘-4 또는 다른 아미노산에서와 같은 아미노산을 갖는 상응하는 유도체와 비교되는 GIP 수용체 상의 개선된 활성을 나타낸다.

[표 9]

실시예 10: 사료급여된, 암컷 식이-유도 비만(DIO) C57BL/6 마우스의 혈당, 체질량, 총 체지방 함량, 사료 섭취량, 최종 간 중량 및 최종 혈장 매개변수에 대한 피하 처리 후 서열 번호 6의 급성 및 만성 효과

동물, 연구 설계(예비투약 단계, 투약 단계), 약리학적 개입:

1) 아침-급여된 동물들의 혈당 프로파일

동물들은 실험 중에 물과 사료에 무제한으로 접근할 수 있었다. 혈당 농도는 투약 단계의 1일째에 PBS-비히클 또는 30 μg/kg의 서열 번호 6을 첫번째 피하 주사하기 0시간 전에 및 투약 후 1, 2, 3, 4, 6 및 24시간 후에 측정하였다. 6 내지 24시간 혈액 샘플 사이에 오후 용량을 투여하였다.

서열 번호 6 처리된 동물은 24시간에 걸쳐 혈당 농도의 현저한 감소를 입증하였다. 대조적으로, DIO 대조군 마우스에서 혈당 농도의 변화는 관찰되지 않았다(도 2).

2) 체질량

30 μg/kg 서열 번호 6에 의한 DIO 동물의 1일-2회 만성 처리는 비히클 DIO 그룹에 비해 28일의 처리 기간에 걸쳐 체질량의 지속적 감소를 유발하였다(도 3). 서열 번호 6에 의한 만성 1일-2회 처리로 인해, 비히클로 처리한 DIO 동물과 비교하여 28 일의 투약 단계 이내에 통계적으로 보다 현저한 체질량 감소를 얻었다(도 4, 표 10).

3) 총 체지방 질량

총 체지방 질량 측정은 예비투약 37일째 및 투약 단계 26일째에 수행하였다.

현저한 체질량 감소와 병행하여, 30 μg/kg 서열 번호 6에 의한 DIO 동물의 1일-2회 만성 처리로 인해 DIO-비히클 동물과 비교하여, 28일의 투약 단계동안 통계적으로 유의하게 더 현저한 총 체지방 질량 감소를 얻었다(도 5, 표 10).

4) 사료 섭취량

각 케이지는 4마리의 마우스를 수용하고, 사료 섭취량을 투약 단계 28일 내내 추정하였다.

투약 시작 후, 30 μg/kg 서열 번호 6에 의한 1일 2회 만성 치료는 사료 섭취량을 억제하였지만, 마우스는 약 10일 이내에 약리학적 효과에 익숙해졌다. 그 후, 추정 사료 섭취량은 서열 번호 6과 DIO-비히클 그룹 사이에서 유사하였다(도 6).

5) 최종 간 질량

28일째에 아침 투약 후 4시간 후에 마우스를 안락사시키고, 간을 채취하였다.

30 μg/kg 서열 번호 6에 의한 DIO 동물의 1일-2회 만성 처리로 인해 비히클에 의해 처리된 DIO 동물에 비해 투약 단계 28일째에 간 질량의 통계적으로 유의한 감소를 얻었다(도 7, 표 10).

6) 최종 혈장 트리글리세리드 및 LDL

28일째에, 아침 투약 후 4시간 후에 마취된, 비-공복 마우스로부터 안와 출혈에 의해, 혈액을 채취하였다. 30 μg/kg 서열 번호 6에 의한 DIO 동물의 1일-2회 만성 처리로 인해 비히클에 의해 처리된 DIO 동물에 비해 비-공복 혈장 트리글리세리드(도 8, 표 10) 및 혈장 LDL 농도(도 9, 표 10)의 통계적으로 유의한 감소를 얻었다.

7) 통계적 분석

도면에서, 데이터는 평균±SEM으로 도시한다. 통계적 분석은 Sigmaplot 12.5로 수행하였다. DIO-비히클 마우스(n=8) 그룹과 DIO-시험 제품 처리된 마우스(n=8)를 비교하기 위해 2-테일 T-테스트를 이용하였다. 두 그룹의 평균값의 차이가 0.05보다 큰 경우, 통계적으로 유의한 차이가 있다고 간주되었다. 일반-비히클 그룹 데이터는 도면에 비-비만 상태에 대한 참조 데이터세트로 제공되었다.

[표 10]

실시예 11: 사료급여된 암컷 식이-유도 비만( DIO ) C57BL /6 마우스의 혈당, 체질량, 총 체지방 함량, 사료 섭취량, 최종 간 중량 및 최종 혈장 매개변수에 대한 피하 처리 후 서열 번호 11의 급성 및 만성 효과

마우스는 1일 및 28일째에 마우스가 단일 용량을 투여받은 것을 제외하고는, 28일동안 PBS-비히클 또는 30 μg/kg의 서열 번호 11의 1일 2회 피하 주사에 의해 처리하였다. 아침 투약은 오전 6:00부터 7:30 사이에, 및 오후 투약은 2:00부터 오후 3:30 사이에 시작 및 완료되었다. 투약 단계 1일 및 28일째에 아침 용량만을 투여하였다. 적용된 용적은 5 ml/kg이었고, 용량은 각 개인의 최근 체질량 기록으로 조정되었다.

1) 아침-급여된 동물들의 혈당 프로파일

동물들은 실험 중에 물과 사료에 무제한으로 접근할 수 있었다. 투약 단계의 1일에, 비-마취 동물에서 PBS-비히클 또는 30 μg/kg 서열 번호 11을 첫번째 피하 투약하기전 0시간에, 및 투약 후 1, 2, 3, 4, 6 및 24시간에 꼬리 클립을 통해 약 5 ㎕의 혈액을 수집하였다. 24시간 혈액 채취를 2일째에 투약하기 전에 수행하였다. 혈당 측정은 전혈에서, Aviva 글루코미터를 사용하여 2회 또는 3회 수행하였으며, 서열 번호 11 처리된 동물들은 24시간에 걸쳐 지속되는 혈당 농도의 확연한 감소를 입증하였다. 대조적으로, DIO 대조군 마우스에서 혈당 농도의 변화는 관찰되지 않았다(도 10).

2) 체질량

체질량은 예비투약 단계 32 내지 38일간 및 투약 단계 28일 내내 매일 약 오전 06:00 내지 07:30 사이에 측정하였다. 투약 단계 동안, 1일 및 28일째를 제외하고, 동물을 PBS-비히클 또는 30 μg/kg의 서열 번호 11의 피하 주사에 의해 1일 2회 처리하였다. 30 μg/kg 서열 번호 11에 의한 DIO 동물의 만성 처리는 비히클 DIO 그룹에 비해 28일의 처리 기간에 걸쳐 체질량의 지속적 감소를 유발하였다(도 11). 서열 번호 11에 의한 만성 1일-2회 처리로 인해, 비히클로 처리한 DIO 동물과 비교하여 28일의 투약 단계 이내에 통계적으로 보다 현저한 체질량 감소를 얻었다(T-시험, 2-테일 P<0.001, 도 12, 표 11).

3) 총 체지방 질량

총 체지방 질량을 측정하기 위해, 예비투약 37일째 및 투약 단계 26일째에 정량적 핵자기공명(QNMR) 측정을 수행하였다. 투약 단계 동안, 마우스를 PBS-비히클 또는 30 μg/kg의 서열 번호 11의 피하 주사에 의해 1일 2회 처리하였다.

현저한 체질량 감소와 병행하여, 30 μg/kg 서열 번호 11에 의한 DIO 동물의 1일-2회 만성 처리로 인해 비히클로 처리된 DIO 동물과 비교하여, 28일의 투약 단계동안 통계적으로 유의하게 더 현저한 총 체지방 질량 감소를 얻었다(T-시험, 2-테일 P<0.001, 도 13, 표 11).

4) 사료 섭취량

사료 섭취량은 오전 06:00 내지 07:30 사이에 사료섭취 마우스의 체중을 매일 평가한 결과에 기초하여 추정하였다. 각 케이지는 4마리의 마우스를 수용하고, 사료 섭취량을 투약 단계 28일 내내 측정하였다. 투약 단계 동안, 마우스를 PBS-비히클 또는 30 μg/kg의 서열 번호 11의 피하 주사에 의해 1일 2회 처리하였다.

투약 시작 후, 30 μg/kg 서열 번호 11에 의한 처리는 사료 섭취량을 억제하였지만, 마우스는 약 15일 이내에 약리학적 효과에 익숙해졌다. 투약 단계내 15일 후, 추정된 사료 섭취량은 서열 번호 11 및 비히클 처리된 DIO 마우스 사이에서 유사하였다(도 14).

5) 최종 간 질량

28일째에 혈액을 채취한 후, 아침 용량을 투여하고, 투약-후 4시간 후 부검을 수행하였다. 이 목적을 위해 동물은 이소플루란 마취로 안락사시켰으며, 안와 출혈후, 경추 탈골, 참수, 양측 개흉술, 방혈 또는 마지막 채혈 후 사망을 보장하는 중요한 장기 제거를 통해 혈액을 채취하였다. 그런 다음, 간을 채취하고, 간 질량을 기록하였다.

30 μg/kg 서열 번호 11에 의한 DIO 동물의 1일-2회 만성 처리로 인해 비히클에 의해 처리된 DIO 그룹에 비해 투약 단계 28일째에 간 질량의 통계적으로 유의한 감소를 얻었다(T-시험, 2-테일 P<0.001, 도 15, 표 11).

6) 최종 혈장 트리글리세리드, LDL, 인슐린 및 글루코스

28일째에 혈액을 채취한 후, 아침 용량을 투여하고, 투약-후 4시간 후 부검을 수행하였다. 이 목적을 위해 비-공복 동물을 이소플루란 마취로 안락사시키고, 혈장 매개변수 측정을 위해 안와 출혈에 의해 혈액을 채취하였다.

비히클로 처리된 DIO 동물과 비교하여 투약 단계의 28일째 날 마지막 투약 후 4시간 후에, 30 μg/kg의 서열 번호 11에 의한 DIO 동물의 만성 처리로 인해 비-공복 혈장 트리글리세리드(T-테스트, 2-테일 P<0.05, 도 16, 표 11), LDL(T-테스트, 2-테일 P<0.0001, 도 17, 표 11), 인슐린(T-테스트, 2-테일 P=0.001, 도 18, 표 11) 및 글루코스 농도(T-테스트, 2-테일 P<0.00001, 도 19, 표 11)가 통계적으로 유의하게 감소하였다.

7) 통계적 분석

도면에서, 데이터는 평균±SEM으로 도시한다. 통계적 분석은 Sigmaplot 12.5로 수행하였다. DIO-비히클 마우스(n=8) 그룹과 DIO-화합물 처리된 마우스(n=8) 그룹을 비교하기 위해 2-테일 T-테스트를 사용하였다. 두 그룹의 평균값의 차이가 0.05보다 큰 경우, 통계적으로 유의한 차이가 있다고 간주되었다. 일반-비히클 그룹 데이터는 도면에 도시되고, 비-비만 상태에 대한 참조 데이터 세트로 제공되었다.

[표 11]

실시예 12: 사료급여된 암컷 당뇨병 db/db 마우스의 혈당에 대한 피하 처리후 , 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 9의 급성 효과

암컷 건강한, 일반 BKS.Cg-(일반)/OlaHsd 및 당뇨병-경향이 있는 비만한 BKS.Cg-+Lepr^db/+Lepr^db/OlaHsd 마우스는 Envigo RMS Inc.에서 수용한 그룹으로 주문되었으며, 그룹 수용하여 선적된 후 나머지 그룹은 예비투약 단계의 15일까지 나무 칩 침구와 함께 일회용 신발상자 케이지에 수용하였다. 연구 시작시 마우스는 약 12주령이었다.

1) 아침-급여된 동물들의 혈당 프로파일

동물들은 실험 중에 물과 사료에 무제한으로 접근할 수 있었다. 투약 단계의 1일째에 임의의 다른 생전 활동전 -30분 및 0분에 꼬리 클립을 통해 약 5 μL의 혈액을 채취하였다. 0분에 마우스는 PBS-비히클 또는 30 μg/kg 서열 번호 6, 서열 번호 8, 또는 서열 번호 9의 피하 투약을 받았다. 투약 후 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 및 24시간 후에 추가로 혈액 샘플을 채취하였다. 혈당 측정은 전혈에서 AlphaTRAK 글루코미터를 사용하여 실시하였다. 두 측정의 혈당 농도가 20 mg/dL 초과 차이난다면, 제3 값을 기록하였다. 혈당에 대한 곡선하 면적(AUC)을 트래피조이드 방법을 통해 투약 후 24시간 지속하는 동안 계산하였다.

6시간 이내에 30 μg/kg 서열 번호 6, 서열 번호 8 또는 서열 번호 9에 의한 당뇨병, 비-공복 db/db 마우스의 단일 처리는 비-비만, 일반 참조 마우스에서 관찰된 비-공복 혈당 농도로 고혈당으로 표준화된다. 모든 처리된 동물의 투약 후 24시간 후 평균 혈당 농도는 기저선이거나, 그에 근접하였다(도 20). 30 μg/kg 서열 번호 6, 서열 번호 8, 또는 서열 번호 9에 의한 당뇨병 db/db 마우스의 단일 처리로 인해, 당뇨병-비히클 그룹과 비교하여 혈당 AUC가 통계적으로 유의하게 감소하였다(일원분산분석(One-way ANOVA), 던넷 방법, P<0.001 모든 처리그룹 대 당뇨병-비히클 그룹, 도 21, 표 12).

2) 통계적 분석

도면에서, 데이터는 평균±SEM으로 도시한다. 통계적 분석은 Sigmaplot 12.5로 수행하였다. 당뇨병, 비만 db/db 비히클 마우스(n=8) 그룹을 각각의 당뇨병, 비만 db/db 화합물 처리된 마우스(n=8)와 비교함으로써, 일원분산분석 및 다중 비교(던넷 방법)를 수행하였다. 두 그룹의 평균값의 차이가 0.05보다 큰 경우, 통계적으로 유의한 차이가 있다고 간주되었다. 비-당뇨병, 일반-비히클 그룹 데이터는 도면에 도시되고, 비-비만, 비-당뇨병 상태에 대한 참조 데이터세트로 제공되었다.

[표 12]

실시예 13: 사료급여된 암컷 당뇨병 db/db 마우스의 혈당에 대한 피하 처리후 , 서열 번호 7의 급성 효과

투약 단계의 1일째에 db/db 마우스를 PBS-비히클 또는 30 μg/kg 시험 제품으로 피하 주사하여 1회 처리하였다. 일반 참조군을 PBS-비히클의 피하 주사에 의해 1회 처리하였다. 투약은 오전 08:00 내지 10:00 사이에 개시 및 완료하였다. 적용된 용적은 5 ml/kg이었고 용량은 각 개인의 최근 체질량 기록으로 조정되었다.

1) 아침-급여된 동물들의 혈당 프로파일

동물들은 실험 중에 물과 사료에 무제한으로 접근할 수 있었다. 투약 단계의 1일째에 임의의 다른 생전 활동전 -30분 및 0분에 꼬리 클립을 통해 약 5 μL의 혈액을 채취하였다. 0분에 마우스는 PBS-비히클 또는 30 μg/kg 서열 번호 7의 피하 투약을 받았다. 투약 후 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 및 24시간 후에 추가로 혈액 샘플을 채취하였다. 혈당 측정은 전혈에서 AlphaTRAK 글루코미터를 사용하여 실시하였다. 두 측정의 혈당 농도가 20　mg/dL 초과 차이난다면, 제3 값을 기록하였다. 혈당에 대한 곡선하 면적(AUC)을 트래피조이드 방법을 통해 투약 후 24시간 지속하는 동안 계산하였다.

6시간 이내에 30 μg/kg 서열 번호 7에 의한 당뇨병, 비-공복 db/db 마우스의 단일 처리는 비-비만, 일반 참조 마우스에서 관찰된 비-공복 혈당 농도로 고혈당으로 표준화된다. 서열 번호 7 처리된 동물의 투약 후 24시간 후 평균 혈당 농도는 기저선이었다(도 22). 30 μg/kg 서열 번호 7에 의한 당뇨병 db/db 마우스의 단일 처리로 인해, 당뇨병-비히클 그룹과 비교하여 혈당 AUC가 통계적으로 유의하게 감소하였다(일원분산분석, 던넷 방법, P<0.001 서열 번호 7 대 당뇨병-비히클 그룹, 도 23, 표 13).

2) 통계적 분석

도면에서, 데이터는 평균±SEM으로 도시한다. 통계적 분석은 Sigmaplot 12.5로 수행하였다. 당뇨병, 비만 db/db 비히클 마우스(n=8)의 그룹을 당뇨병, 비만 db/db 화합물 처리된 마우스(n=8)와 비교함으로써, 일원분산분석 및 다중 비교(던넷 방법)를 수행하였다. 두 그룹의 평균값의 차이가 0.05보다 큰 경우, 통계적으로 유의한 차이가 있다고 간주되었다. 비-당뇨병, 일반-비히클 그룹 데이터는 도면에 도시되고, 비-비만, 비-당뇨병 상태에 대한 참조 데이터세트로 제공되었다.

[표 13]

실시예 14: 사료급여된 , 암컷 당뇨병 db/db 마우스의 혈당에 대한 피하 처리후 , 서열 번호 11의 급성 효과

예비투약 단계 15일째에, 동물을 처리 그룹(n=8) 및 새로운 케이지로 할당하여 모든 db/db 그룹 사이의 평균 HbA1c 및 체질량을 매칭시켰다. 연령-매칭된 일반 그룹을 건강한, 일반 참조군으로서 연구에 포함시켰다.

1) 아침-급여된 동물들의 혈당 프로파일

동물들은 실험 중에 물과 사료에 무제한으로 접근할 수 있었다. 투약 단계의 1일째에 임의의 다른 생전 활동전 -30분 및 0분에 꼬리 클립을 통해 약 5 μL의 혈액을 채취하였다. 0분에 마우스는 PBS-비히클 또는 30 μg/kg 서열 번호 11의 피하 투약을 받았다. 투약 후 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 및 24시간 후에 추가로 혈액 샘플을 수거하였다. 혈당 측정은 전혈에서 AlphaTRAK 글루코미터를 사용하여 실시하였다. 두 측정의 혈당 농도가 20 mg/dL 초과 차이난다면, 제3 값을 기록하였다. 혈당에 대한 곡선하 면적(AUC)을 트래피조이드 방법을 통해 투약 후 24시간 지속하는 동안 계산하였다.

6시간 이내에 30μg/kg 서열 번호 11에 의한 당뇨병, 비-공복 db/db 마우스의 단일 처리는 비-비만, 일반 참조 마우스에서 관찰된 비-공복 혈당 농도로 고혈당으로 표준화된다. 서열 번호 11-처리된 동물의 투약 후 24시간 후 평균 혈당 농도는 여전히 기저선 농도 아래였다(도 24). 30 μg/kg 서열 번호 11에 의한 당뇨병 db/db 마우스의 단일 처리로 인해, 당뇨병-비히클 그룹과 비교하여 혈당 AUC가 통계적으로 유의하게 감소하였다(일원분산분석, 던넷 방법, P<0.001 서열 번호 11 대 당뇨병-비히클 그룹, 도 25, 표 14).

2) 아침-급여된 동물의 최종 혈청 트리아실글리세롤 농도

동물들은 실험 동안 물과 사료에 무제한으로 접근할 수 있었다. 최종 연구 종점에서 동물을 이소플루란으로 깊게 마취시키고, 안와 혈액 샘플을 채취하고, 트리아실글리세롤 측정을 위해 혈청을 준비하였다. 서열 번호 11-처리된 동물의 투약 후 24시간 후, 평균 혈청 트리아실글리세롤 농도는 당뇨병-비히클 그룹의 동물에 의해 나타낸 농도 보다 통계적으로 유의하게 아래였다(일원분산분석, 던넷 방법, P=0.007 서열 번호 11 대 당뇨병-비히클 그룹, 도 26, 표 14).

3) 통계적 분석

도면에서, 데이터는 평균±SEM으로 도시한다. 통계적 분석은 Sigmaplot 12.5로 수행하였다. 당뇨병, 비만 db/db 비히클 마우스의 그룹(n=8, 트리아실글리세롤 분석의 경우 n=7)을 당뇨병, 비만 db/db 화합물 처리된 마우스(n=8)의 그룹과 비교함으로써, 일원분산분석 및 다중 비교(던넷 방법)를 수행하였다. 두 그룹의 평균값의 차이가 0.05보다 큰 경우, 통계적으로 유의한 차이가 있다고 간주되었다. 비-당뇨병, 일반-비히클 그룹 데이터는 도면에 도시되고, 비-비만, 비-당뇨병 상태에 대한 참조 데이터세트로 제공되었다.

[표 14]

실시예 15: 사료급여된 암컷 당뇨병 db/db 마우스의 혈당에 대한 피하 처리후 , 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 16, 서열 번호 26의 급성 효과

1) 아침-급여된 동물들의 혈당 프로파일

동물들은 실험 중에 물과 사료에 무제한으로 접근할 수 있었다. 투약 단계의 1일째에 임의의 다른 생전 활동전 -30분 및 0분에 꼬리 클립을 통해 약 5 μL의 혈액을 채취하였다. 0분에 마우스는 PBS-비히클 또는 30 μg/kg 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 16, 또는 서열 번호 26의 피하 투약을 받았다. 투약 후 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 및 24시간 후에 추가로 혈액 샘플을 채취하였다. 혈당 측정은 전혈에서, AlphaTRAK 글루코미터를 사용하여 실시하였다. 두 측정의 혈당 농도가 20　mg/dL 초과 차이난다면, 제3 값을 기록하였다. 혈당에 대한 곡선하 면적(AUC)을 트래피조이드 방법을 통해 투약 후 24시간 지속하는 동안 계산하였다.

6시간 이내에 30 μg/kg의 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 16, 또는 서열 번호 26에 의한 당뇨병, 비-공복 db/db 마우스의 단일 처리는 비-비만, 일반 참조 마우스에서 관찰된 비-공복 혈당 농도로 고혈당으로 표준화된다. 모든 처리된 동물의 투약 후 24시간 후 평균 혈당 농도는 기저선이거나, 그에 근접하였다(도 27). 30 μg/kg 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 16, 또는 서열 번호 26에 의한 당뇨병 db/db 마우스의 단일 처리로 인해, 당뇨병-비히클 그룹과 비교하여 혈당 AUC가 통계적으로 유의하게 감소하였다(일원분산분석, 던넷 방법, P<0.001 모든 처리그룹 대 당뇨병-비히클 그룹, 도 28, 표 15).

2) 통계적 분석

도면에서, 데이터는 평균±SEM으로 도시한다. 통계적 분석은 Everst@t 6.0.12로 수행하였다. 당뇨병, 비만 db/db 비히클 마우스(n=8)의 그룹을 각각의 당뇨병, 비만 db/db 화합물 처리된 마우스(n=8)와 비교함으로써, 일원분산분석 및 다중 비교(던넷 방법)를 수행하였다. 두 그룹의 평균값의 차이가 0.05보다 큰 경우, 통계적으로 유의한 차이가 있다고 간주되었다. 비-당뇨병, 일반-비히클 그룹 데이터는 도면에 도시되고, 비-비만, 비-당뇨병 상태에 대한 참조 데이터세트로 제공되었다.

[표 15]

실시예 16

ApoE KO 마우스에서 삼중 GLP-1R/GCGR/GIPR 효능제의 항-죽상경화 활성

아포리포단백질 E(ApoE) 녹아웃(KO) 마우스 모델은 죽상경화증을 조사하기 위해 널리 사용된다. 이 마우스는 인간에서 관찰된 것과 형태학적으로 유사한 죽상경화 병변을 자발적으로 발병시킨다(Meir & Leitersdorf 2004, Arterioscler Thromb Vasc Biol 24: 1006-1014, Rosenfeld 등 2000, Arterioscler Thromb Vasc Biol 20: 2587-2592).

동물

수컷 ApoE KO 마우스(B.129P2-apoetm1Unc/J)를 대조군 또는 처리군(그룹당 N=15)에 무작위로 할당하고; 야생형 마우스(C57BL6/J)는 비히클 처리를 받았고, 건강한 두 번째 대조군으로 행동하였다.

연구 절차

ApoE KO 및 야생형 마우스는 비히클(멸균된 아세테이트 완충액, pH 4.5), 펩티드 서열 번호 6 및 서열 번호 11(150 μg/kg/일) 또는 리라글루티드(600 μg/kg/일)로 채운 피하 삼투 미니펌프(ALZET^TM)를 사용하여 지속적인 16주 주입을 받았다. 체중과 사료 섭취량은 연구 기간 동안 매주 모니터링하였다.

혈중 지질 매개변수

총 콜레스테롤, 저밀도 지단백(LDL) 콜레스테롤 및 고밀도 지단백(HDL) 콜레스테롤(도시되지 않음)을 분석하기 위해 혈액 지질 분석을 위한 혈액 샘플을 처리 전 및 7주 및 16주에 채취하였다.

죽상경화 플라크 형성의 정량화

대동맥을 절개하고, 대동맥 죽상경화 플라크 형성을 양적 및 자동화된 이미지 분석을 사용하여 절대 및 상대 플라크 면적(총 대동맥 표면적의 오일레드 착색 면적%)으로 측정하였다.

결과는 도면에 제시되어 있다:

도 29: 사료 섭취량 및 체중 모니터링 데이터

도 30: 대동맥 플라크 면적 데이터

도 31: 혈청 총 콜레스테롤 및 LDL-콜레스테롤 데이터

수컷 ApoE KO 마우스에서 150 μg/kg/일의 용량으로 펩티드 서열 번호 6 및 서열 번호 11로 만성 4개월 처리하면, 죽상경화 플라크를 비히클 대조군에 비해 63% 및 73%까지 상당히 감소시켰다. 항-죽상경화 효능은 LDL-콜레스테롤의 현저한 감소를 동반하였다.

대조적으로, 순수한 GLP-1 수용체 효능제 리라글루티드의 4배 높은 용량은 대동맥 플라크 형성을 현저히 감소시켰지만, 덜 뚜렷한 LDL-콜레스테롤 저하는 37%만 감소시켰다.

[표 8]

SEQUENCE LISTING <110> SANOFI <120> NEW COMPOUNDS AS PEPTIDIC TRIGONAL GLP1/GLUCAGON/GIP RECEPTOR AGONISTS <130> DE2016/076WOPCT <150> EP 16306604.6 <151> 2016-12-02 <160> 29 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 1 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> liraglutide <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys is derivatized at N6 with (S)-4-Carboxy-4-hexadecanoylamino-butyryl- <400> 2 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 3 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr 20 25 <210> 4 <211> 39 <212> PRT <213> Heloderma suspectum <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> AMIDATION <400> 4 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 5 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Tyr Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys 1 5 10 15 Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys Gly Lys 20 25 30 Lys Asn Asp Trp Lys His Asn Ile Thr Gln 35 40 <210> 6 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin-4 derivative <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is derivatized at N6 with (S)-4-Carboxy-4-((S)-4-carboxy-4-hexadecanoylamino-butyrylamino)- butyryl- <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> Xaa = Aib <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> AMIDATION <400> 6 His Xaa His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 Gln Arg Gln Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Gly Gly His Pro 20 25 30 Ser Xaa Lys Pro Pro Pro Lys 35 <210> 7 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin-4 derivative <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is derivatized at N6 with (S)-4-Carboxy-4-((S)-4-carboxy-4-hexadecanoylamino-butyrylamino)- butyryl- <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> Xaa = dAla <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> Xaa = Aib <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> AMIDATION <400> 7 His Xaa His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 Gln Arg Gln Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Xaa Gly His Pro 20 25 30 Ser Xaa Lys Pro Pro Pro Lys 35 <210> 8 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin-4 derivative <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is derivatized at N6 with (S)-4-Carboxy-4-((S)-4-carboxy-4-hexadecanoylamino-butyrylamino)- butyryl- <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> Xaa = Aib <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> AMIDATION <400> 8 His Xaa His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 Gln Arg Gln Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Gly Gly Pro Pro 20 25 30 Ser Xaa Lys Pro Pro Pro Lys 35 <210> 9 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin-4 derivative <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is derivatized at N6 with (S)-4-Carboxy-4-((S)-4-carboxy-4-hexadecanoylamino-butyrylamino)- butyryl- <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> Xaa = dAla <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> Xaa = Aib <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> AMIDATION <400> 9 His Xaa His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 Gln Arg Gln Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Xaa Gly Pro Pro 20 25 30 Ser Xaa Lys Pro Pro Pro Lys 35 <210> 10 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin-4 derivative <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is derivatized at N6 with (S)-4-Carboxy-4-((S)-4-carboxy-4-hexadecanoylamino-butyrylamino)- butyryl- <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Xaa = Aib <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> Xaa = Aib <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> AMIDATION <400> 10 His Xaa His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 Gln Arg Gln Xaa Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Gly Gly Pro Pro 20 25 30 Ser Xaa Lys Pro Pro Pro Lys 35 <210> 11 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin-4 derivative <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is derivatized at N6 with (S)-4-Carboxy-4-((S)-4-carboxy-4-hexadecanoylamino-butyrylamino)- butyryl- <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) 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Trp Leu Lys Ala Gly Gly Pro Pro 20 25 30 Ser Xaa Lys Pro Pro Pro Lys 35 <210> 19 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin-4 derivative <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is derivatized at N6 with (S)-4-Carboxy-4-octadecanoylamino-butyryl- <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Xaa = Aib <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> Xaa = Aib <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> AMIDATION <400> 19 His Xaa His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 Gln Arg Gln Xaa Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Gly Gly Pro Pro 20 25 30 Ser Xaa Lys Pro Pro Pro Lys 35 <210> 20 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin-4 derivative <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is derivatized at N6 with (S)-4-Carboxy-4-hexadecanoylamino-butyryl- <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> Xaa = Aib <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> AMIDATION <400> 20 His Xaa His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 Gln Arg Gln Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Gly Gly Pro Pro 20 25 30 Ser Xaa Lys Pro Pro Pro Lys 35 <210> 21 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin-4 derivative <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is derivatized at N6 with (S)-4-Carboxy-4-octadecanoylamino-butyryl- <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> Xaa = Aib <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> AMIDATION <400> 21 His Xaa His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 Gln Arg Gln Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Gly Gly Pro Pro 20 25 30 Ser Xaa Lys Pro Pro Pro Lys 35 <210> 22 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin-4 derivative <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is derivatized at N6 with (4S)-Carboxy- [2-(2-{2-[(4R)-5-carboxy-4-hexadecanoylamino-pentanoylamino]-etho xy}-ethoxy)-acetylamino]-butyryl <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> Xaa = Aib <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> AMIDATION <400> 22 His Xaa His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 Gln Arg Gln Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Gly Gly His Pro 20 25 30 Ser Xaa Lys Pro Pro Pro Lys 35 <210> 23 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin-4 derivative <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is derivatized at N6 with (4S)-Carboxy- [2-(2-{2-[(4R)-5-carboxy-4-hexadecanoylamino-pentanoylamino]-etho xy}-ethoxy)-acetylamino]-butyryl <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> Xaa = dAla <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> Xaa = Aib <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> AMIDATION <400> 23 His Xaa His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 Gln Arg Gln Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Xaa Gly His Pro 20 25 30 Ser Xaa Lys Pro Pro Pro Lys 35 <210> 24 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin-4 derivative <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is derivatized at N6 with [[(4S)-4-carboxy-4-[[(4S)-4-carboxy-4-[[2-[2-[2-(hexadecanoylamin o)ethoxy]ethoxy]acetyl]amino]butyrylamino]-butyryl- <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Xaa = Aib <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> Xaa = dAla <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> Xaa = Aib <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> AMIDATION <400> 24 His Xaa His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 Gln Arg Gln Xaa Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Xaa Gly Pro Pro 20 25 30 Ser Xaa Lys Pro Pro Pro Lys 35 <210> 25 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin-4 derivative <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is derivatized at N6 with (4S)-Carboxy- [2-(2-{2-[(4R)-5-carboxy-4-hexadecanoylamino-pentanoylamino]-etho xy}-ethoxy)-acetylamino]-butyryl <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Xaa = Aib <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> Xaa = dAla <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> Xaa = Aib <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> AMIDATION <400> 25 His Xaa His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 Gln Arg Gln Xaa Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Xaa Gly Pro Pro 20 25 30 Ser Xaa Lys Pro Pro Pro Lys 35 <210> 26 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin-4 derivative <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is derivatized at N6 with [[(4S)-4-carboxy-4-[[(4S)-4-carboxy-4-[[2-[2-[2-(hexadecanoylamin o)ethoxy]ethoxy]acetyl]amino]butyrylamino]-butyryl- <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Xaa = Aib <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> Xaa = Aib <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> AMIDATION <400> 26 His Xaa His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 Gln Arg Gln Xaa Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Gly Gly Pro Pro 20 25 30 Ser Xaa Lys Pro Pro Pro Lys 35 <210> 27 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin-4 derivative <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is derivatized at N6 with (4S)-Carboxy- [2-(2-{2-[(4R)-5-carboxy-4-hexadecanoylamino-pentanoylamino]-etho xy}-ethoxy)-acetylamino]-butyryl <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Xaa = Aib <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> Xaa = Aib <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> AMIDATION <400> 27 His Xaa His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 Gln Arg Gln Xaa Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Gly Gly Pro Pro 20 25 30 Ser Xaa Lys Pro Pro Pro Lys 35 <210> 28 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin-4 derivative <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is derivatized at N6 with (S)-4-Carboxy-4-octadecanoylamino-butyryl- <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> AMIDATION <400> 28 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Lys Asp Glu 1 5 10 15 Gln Arg Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 29 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin-4 derivative <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is derivatized at N6 with (S)-4-Carboxy-4-octadecanoylamino-butyryl- <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> AMIDATION <400> 29 Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Lys Asp Glu 1 5 10 15 Gln Arg Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ser Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35

Claims

화학식 I 또는 이의 염 또는 용매화물:
화학식 I
H₂N-His-Aib-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Leu-X14-Glu-Glu-Gln-Arg-Gln-X20-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Ala-X29-Gly-X31-Pro-Ser-Aib-Lys-Pro-Pro-Pro-Lys-R¹
상기 화학식 I에서,
X14는 Lys, Orn, Dab 또는 Dap로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 관능화된 -NH₂ 측쇄 그룹을 갖는 아미노산 잔기를 나타내고, 상기 -NH₂ 측쇄 그룹은 -Z-C(O)-R⁵에 의해 관능화되고,
Z는 모든 입체이성질체 형태의 링커(linker)를 나타내고,
R⁵는 최대 50개 탄소 원자 그리고 N 및 O로부터 선택된 헤테로원자를 포함하는 모이어티(moiety)이고,
X20은 Aib 및 Lys로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고,
X29는 D-Ala 및 Gly로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고,
X31은 His 및 Pro로부터 선택되는 아미노산 잔기를 나타내고,
R¹은 NH₂ 또는 OH이다.
제1항에 있어서,
R¹이 NH₂인,
화합물 또는 이의 염 또는 용매화물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 펩티드 화합물이 글루카곤 수용체에서 천연 글루카곤의 활성에 비해 적어도 5%의 상대 활성(relative activity)을 갖는, 화합물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 펩티드 화합물이 GLP-1 수용체에서 GLP-1(7-36)-아미드의 활성에 비해 적어도 7%의 상대 활성을 나타내는, 화합물.
제1항 또는 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 펩티드 화합물이 GIP 수용체에서 GIP의 활성에 비해 적어도 4%의 상대 활성을 나타내는, 화합물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
X14가 Lys를 나타내고, 상기 -NH₂ 측쇄 그룹은 그룹 -Z-C(O)R⁵로 관능화되고,
Z는 gGlu, gGlu-gGlu, gGlu-AEEAc-gAAA-, gGlu-gGlu-AEEAc, AEEAc-AEEAc-gGlu 및 AEEAc-AEEAc-AEEAc로부터 선택된 그룹을 나타내고;
R⁵는 펜타데카닐 또는 헵타데카닐로부터 선택된 그룹을 나타내는, 화합물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
X14가 Lys이고, 상기 -NH₂ 측쇄 그룹은 그룹 -Z-C(O)R⁵로 관능화되고,
Z는 gGlu, gGlu-gGlu, gGlu-AEEAc-gAAA- 및 gGlu-gGlu-AEEAc로부터 선택된 그룹을 나타내고;
R⁵는 펜타데카닐 또는 헵타데카닐로부터 선택된 그룹을 나타내는, 화합물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
X14가 Lys를 나타내고, 상기 -NH₂ 측쇄 그룹은 (S)-4-카르복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴-, (S)-4-카르복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴-, (S)-4-카르복시-4-((S)-4-카르복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노)-부티릴-, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-카르복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-카르복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸, [2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-옥타데카노일아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸-로 관능화되고,
R¹이 NH₂를 나타내는,
화합물 또는 이의 염 또는 용매화물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
X14가 Lys를 나타내고, 상기 -NH₂ 측쇄 그룹은 (S)-4-카르복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴-, (S)-4-카르복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴-, (S)-4-카르복시-4-((S)-4-카르복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노)-부티릴-, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-카르복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-카르복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸로 관능화되고,
R¹이 NH₂를 나타내는,
화합물 또는 이의 염 또는 용매화물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
X14가 Lys를 나타내고, 상기 -NH₂ 측쇄 그룹은 (S)-4-카르복시-4-((S)-4-카르복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노)-부티릴-로 관능화되고,
X20이 Lys 또는 Aib를 나타내고,
X29가 D-Ala 및 Gly로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고,
X31이 His 및 Pro로부터 선택되는 아미노산 잔기를 나타내고,
R¹이 NH₂를 나타내는,
화합물 또는 이의 염 또는 용매화물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
X14가 Lys를 나타내고, 상기 -NH₂ 측쇄 그룹은 (S)-4-카르복시-4-((S)-4-카르복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노)-부티릴-, (S)-4-카르복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴-로 관능화되고,
X20이 Lys를 나타내고,
X29가 D-Ala 및 Gly로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고,
X31이 His 및 Pro로부터 선택되는 아미노산 잔기를 나타내고,
R¹가 NH₂를 나타내는,
화합물 또는 이의 염 또는 용매화물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
X14가 Lys를 나타내고, 상기 -NH₂ 측쇄 그룹은 (S)-4-카르복시-4-((S)-4-카르복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노)-부티릴-, (S)-4-카르복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴-로 관능화되고,
X20이 Lys를 나타내고,
X29가 D-Ala 및 Gly로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고,
X31이 His를 나타내고,
R¹이 NH₂를 나타내는,
화합물 또는 이의 염 또는 용매화물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
X14가 Lys를 나타내고, 상기 -NH₂ 측쇄 그룹은 (S)-4-카르복시-4-((S)-4-카르복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노)-부티릴-, (S)-4-카르복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴-로 관능화되고,
X20이 Lys를 나타내고,
X29가 Gly를 나타내고,
X31이 His 및 Pro로부터 선택되는 아미노산 잔기를 나타내고,
R¹이 NH₂를 나타내는,
화합물 또는 이의 염 또는 용매화물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
X14가 Lys를 나타내고, 상기 -NH₂ 측쇄 그룹은 (S)-4-카르복시-4-((S)-4-카르복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노)-부티릴-, (S)-4-카르복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴-로 관능화되고,
X20이 Aib를 나타내고,
X29가 D-Ala 및 Gly로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고,
X31이 His 및 Pro로부터 선택되는 아미노산 잔기를 나타내고,
R¹이 NH₂를 나타내는,
화합물 또는 이의 염 또는 용매화물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
X14가 Lys를 나타내고, 상기 -NH₂ 측쇄 그룹은 (S)-4-카르복시-4-((S)-4-카르복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노)-부티릴-, (S)-4-카르복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴-로 관능화되고,
X20이 Aib를 나타내고,
X29가 D-Ala 및 Gly로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고,
X31이 Pro을 나타내고,
R¹이 NH₂를 나타내는,
화합물 또는 이의 염 또는 용매화물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
X14가 Lys를 나타내고, 상기 -NH₂ 측쇄 그룹은 (S)-4-카르복시-4-((S)-4-카르복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노)-부티릴-로 관능화되고,
X20이 Aib를 나타내고,
X29가 D-Ala를 나타내고,
X31이 His 및 Pro로부터 선택되는 아미노산 잔기를 나타내고,
R¹이 NH₂를 나타내는,
화합물 또는 이의 염 또는 용매화물.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
서열 번호 6 내지 27의 화합물 뿐만 아니라 이들의 염 및 용매화물로부터 선택되는 화합물.
제1항에 있어서,
상기 화합물이 서열 번호 6으로 표시되는, 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물.
제1항에 있어서,
상기 화합물이 서열 번호 9로 표시되는, 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물.
제1항에 있어서,
상기 화합물이 서열 번호 11로 표시되는, 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 의약에 사용하기 위한 화합물.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
약제로 사용하기 위한 화합물.
제21항 또는 제22항에 있어서, 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 약제학적 조성물 내에 활성제로서 존재하는, 상기 용도를 위한 화합물.
제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 추가 치료학적 활성제를 함께 갖는, 상기 용도를 위한 화합물.
제24항에 있어서,
상기 적어도 하나의 추가 치료학적 활성제가:
인슐린 및 인슐린 유도체; GLP-1, GLP-1 유사체 및 GLP-1 수용체 효능제; DPP-4 억제제; SGLT2 억제제; 이중 SGLT2/SGLT1 억제제; 비구아니드(Biguanides), 티아졸리딘디온(thiazolidinediones), 이중 PPAR 효능제, 설포닐우레아(Sulfonylurea), 메글리티니드(Meglitinides), 알파-글루코시다제 억제제, 아밀린(Amylin) 및 아밀린 유사체; GPR119 효능제, GPR40 효능제, GPR120 효능제, GPR142 효능제, 전신 또는 저-흡수 TGR5 효능제; 브로모크립틴 메실레이트(bromocriptine mesylate), 11-베타-HSD의 억제제, 글루코키나제의 활성화제, DGAT의 억제제, 단백질 티로신포스파타제 1의 억제제, 글루코스-6-포스파타제의 억제제, 프룩토스-1,6-비스포스파타제의 억제제, 글리코겐 포스포릴라제의 억제제, 포스포에놀 피루베이트 카르복시키나제의 억제제, 글리코겐 신타제(synthase) 키나제의 억제제, 피루베이트 데하이드로키나제의 억제제, 알파2-길항제, CCR-2 길항제, SGLT-1 억제제, 글루코스 수송체-4의 조절제, 소마토스타틴(somatostatin) 수용체 3 효능제; 지질강하제; 비만의 치료를 위한 활성 물질; 위장 펩티드(gastrointestinal peptides); 리파제 억제제, 혈관형성 억제제, H3 길항제, AgRP 억제제, 삼중 모노아민 흡수 억제제, MetAP2 억제제, 칼슘 채널 차단제 딜티아젬의 비강 제형, 섬유아세포 성장인자 수용체 4의 생성에 대한 안티센스 분자, 프로히비틴 표적화 펩티드-1; 및 고혈압, 만성 심부전 또는 죽상경화증에 영향을 미치는 약물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 상기 용도를 위한 화합물.
제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
글루코스 불내성, 인슐린 내성, 당뇨병전증, 증가된 공복 글루코스, 고혈당증, 2형 당뇨병, 고혈압, 이상지질혈증, 죽상경화증, 관상동맥 심질환, 말초 동맥 질환, 뇌졸중 또는 이들 개별적인 질환 요소의 임의의 조합의 치료를 위한, 상기 용도를 위한 화합물.
제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
식욕, 급식 및 칼로리 섭취의 제어, 에너지 소비의 증가, 체중 증가의 예방, 체중 감소의 촉진, 과체중의 감소 및 병적 비만을 포함하는 비만의 총괄적 치료를 위한, 상기 용도를 위한 화합물.
제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
지방간의 치료 또는 예방을 위한, 상기 용도를 위한 화합물.
제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
고혈당증, 2형 당뇨병, 및/또는 비만의 치료 또는 예방을 위한, 상기 용도를 위한 화합물.
제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
2형 당뇨병 및 비만의 동시 치료를 위한, 상기 용도를 위한 화합물.
제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
당뇨병의 치료를 위한, 상기 용도를 위한 화합물.
제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
비만의 치료를 위한, 상기 용도를 위한 화합물.
제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
죽상경화증의 치료를 위한, 상기 용도를 위한 화합물.
제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
환자의 장 통과를 감소시키고, 위 함량을 증가시키고/시키거나, 음식 섭취를 감소시키기 위한, 상기 용도를 위한 화합물.
제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
환자의 혈당 수준을 감소시키고/시키거나, HbA1c 수준을 감소시키기 위한, 상기 용도를 위한 화합물.
제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
환자의 체중을 감소시키기 위한, 상기 용도를 위한 화합물.
약제로 사용하기 위한, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 화합물 또는 이들 중 어느 것의 생리학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 포함하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 화합물 또는 이들 중 어느 것의 생리학적으로 허용되는 염 또는 용매화물 및 적어도 하나의 추가의 약제학적 활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물.
환자에서 고혈당증, 2형 당뇨병 또는 비만을 치료하는 방법으로서,
상기 방법이 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 화학식 I의 화합물의 유효량, 및 당뇨병, 비만, 이상지질혈증 또는 고혈압을 치료하는데 유용한 적어도 하나의 기타 화합물의 유효량을 상기 환자에게 투여함을 포함하는, 방법.
제39항에 있어서,
상기 적어도 하나의 화학식 I의 화합물 및 추가 활성 성분의 유효량이 상기 환자에게 동시에 투여되는, 방법.
제39항에 있어서,
상기 적어도 하나의 화학식 I의 화합물 및 추가 활성 성분의 유효량이 상기 환자에게 순차적으로 투여되는, 방법.