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KR20190065191A - 프로테오좀 억제제를 사용하여 눈에서 바이러스 매개 유전자 전달을 향상시키는 방법 - Google Patents

프로테오좀 억제제를 사용하여 눈에서 바이러스 매개 유전자 전달을 향상시키는 방법 Download PDF

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KR20190065191A
KR20190065191A KR1020187035013A KR20187035013A KR20190065191A KR 20190065191 A KR20190065191 A KR 20190065191A KR 1020187035013 A KR1020187035013 A KR 1020187035013A KR 20187035013 A KR20187035013 A KR 20187035013A KR 20190065191 A KR20190065191 A KR 20190065191A
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KR
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KR1020187035013A
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English (en)
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주오-후아 판
셩지에 퀴
게리 아브람스
Original Assignee
웨인 스테이트 유니버시티
셩지에 퀴
게리 아브람스
주오-후아 판
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Publication date
Application filed by 웨인 스테이트 유니버시티, 셩지에 퀴, 게리 아브람스, 주오-후아 판 filed Critical 웨인 스테이트 유니버시티
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Abstract

본 발명은 피험체의 눈에 프로테아좀 억제제, 또는 및 관심 유전자를 코딩하는 바이러스 벡터를 투여함으로써 피험체의 눈으로의 바이러스 벡터의 전달을 향상시키는 방법을 제공한다.

Description

프로테오좀 억제제를 사용하여 눈에서 바이러스 매개 유전자 전달을 향상시키는 방법
관련 출원
본 출원은 2016년 5월 3일 출원된 미국 가출원 번호 62/331,281에 대한 우선권 및 그의 이익을 주장하며, 상기 가출원의 내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
서열 목록의 참조에 의한 포함
2017년 5월 3일 작성되고, 그 크기가 56 KB인 텍스트 파일명 "RTRO-706-001WO_ST25"의 내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
정부 지원
본 발명은 미국 국립 보건원(National Institutes of Health) 승인 EY017130하에 미국 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 세포의 바이러스 형질도입과 같은 유전자 전달의 효능을 개선하는 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 세포, 예컨대, 망막 세포에 바이러스 및/또는 바이러스 벡터를 도입하는 방법의 효율을 안전하고, 신뢰가능한 방식으로 개선하는 데 유용한 방법 및 물질을 제공한다.
눈은 광을 감지하고, 광을 전기 신호 세트로 전환시키고, 상기 신호를 뇌로 전달하여 궁극적으로 우리 세상을 표현해 내는 복잡한 광학계이다. 안질환 및 안장애는 시력 감소, 광 감수성 감소 및 실명을 유발할 수 있다.
낮은 형질도입 효율은 망막 뉴런에서 바이러스 매개 유전자 요법을 위한 주된 도전 과제가 된다. 따라서, 바이러스 벡터의 눈으로의 전달을 향상시키는 방법이 오랫동안 요구되어 왔다.
본 발명은 눈으로의 치료적 유전자 전달을 향상 또는 개선하는 방법에 대하여 오랫동안 요구되어 왔던 사항에 대한 해결안을 제공한다.
본 발명은 피험체의 눈에 프로테아좀 억제제, 및 관심 유전자를 코딩하는 바이러스 벡터를 투여함으로써 피험체의 눈으로의 관심 유전자의 전달을 향상시키는 방법을 특징으로 한다.
프로테아좀 억제제는 독소루비신, 아클라루비신, 보르테조밉, 락타시스틴, 디술피람 에피갈로카테킨-3-갈레이트 마리조밉(살리노스포라미드 A), 오프로조밉(ONX-0912), 델란조밉(CEP-18770) 에폭소미신, MG132, 베타-하이드록시 베타-메틸부티레이트 또는 카르필조밉이다.
바람직하게는, 프로테아좀 억제제는 독소루비신, 아클라루비신 또는 MG132이다.
관심 유전자는 옵신이다. 옵신 유전자의 예로는 채널로돕신(즉, 채널로돕신-1, 채널로돕신-2, 볼복스 카르테리(Volvox carteri) 채널로돕신 1 또는 2), 멜라놉신, 송과체 옵신, 포톱신, 할로로돕신, 박테리오로돕신, 프로테오로돕신, 또는 그의 임의의 기능적 변이체 또는 단편을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
옵신은 채널로돕신, 할로로돕신 또는 이들의 기능적 변이체 또는 단편이다.
바이러스 벡터는 관심 유전자(즉, 트랜스진)를 코딩하는 AAV 바이러스 벡터(즉, 재조합 AAV 또는 rAAV)이다.
예를 들어, AAV 바이러스 벡터는 AAV2, AAV3, 또는 AAV8이다. 본 개시내용의 방법의 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 AAV2이다.
바람직하게는, 관심 유전자는 세포 특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 세포 특이적 프로모터는 mGluR6, NK-3, 및 Pcp2(L7)이다. 일부 실시양태에서, 세포 특이적 프로모터는 mGluR6이다.
바이러스 벡터는 나노입자, 폴리머, 또는 리포솜에 캡슐화될 수 있다.
한 측면에서, 프로테아좀 억제제 및 바이러스 벡터는 동시에 또는 순차적으로 전달된다.
본 발명은 바이러스 벡터를 망막 세포로 전달하는 방법을 제공한다. 망막 세포는 망막 신경절 세포, 망막 수평 세포, 망막 양극 세포, 아마크린 세포, 광수용체 세포, 뮐러 신경교 세포, 또는 망막 색소 상피 세포이다.
한 측면에서, 프로테아좀 억제제 및 바이러스 벡터는 눈의 유리체에 투여된다.
다른 측면에서, 프로테아좀 억제제 및 바이러스 벡터는 투여가 주사 또는 주입에 의해 이루어지는 경로에 의해 투여된다.
추가 측면에서, 프로테아좀 억제제 및 바이러스 벡터는 망막하 경로가 아닌 경로에 의해 투여된다.
본 발명은 추가로 눈의 유리체에 프로테아좀 억제제 및 옵신을 코딩하는 바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 피험체의 광 감수성을 증가시키거나 회복시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 눈의 유리체에 프로테아좀 억제제 및 옵신을 코딩하는 바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 피험체의 시력을 개선하거나 회복시키는 방법을 제공한다.
본원에서는 피험체에서 안질환 또는 안장애를 치료하기 위한, 프로테아좀 억제제를 포함하는 조성물의 용도 또한 제공한다.
피험체는 안질환 또는 안장애를 앓고 있는 피험체이다. 안질환은 망막아세포종, 안구 흑색종, 당뇨병성 망막병증, 고혈압성 망막병증, 안조직의 임의의 염증이다. 바람직하게는, 안질환 또는 안장애는 광수용체 변성과 연관된 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련가가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 비록 본원에 기술된 것과 유사하거나, 또는 그와 등가인 방법 및 물질이 본 발명의 실시에서 사용될 수는 있지만, 적합한 방법 및 물질은 하기에 기술된다. 본원에서 언급된 모든 공개문헌, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 그 전문이 명백하게 본원에서 참조로 포함된다. 상충하는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 조정할 것이다.
추가로, 본원에 기술된 물질, 방법, 및 예는 단지 예시적인 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 자명해질 것이며, 그에 포함된다.
도 1a-b는 바이러스 주사 후 1개월 경과하였을 때의, 프로테아좀이 망막 양극 세포의 트랜스진(mCherry)의 AAV 매개 발현에 미치는 효과를 도시한 일련의 사진 및 그래프이다. 도 1a: 바이러스 형질도입된 망막 양극 세포의 대표 이미지. 망막 양극 세포에서의 mCherry의 표적화된 발현은 mGluR6 프로모터를 보유하는 rAAV2 벡터에 의해 달성하였다. 프로테아좀 억제제를 함유하거나, 또는 그를 함유하지 않는, 5 x 1012 vg(바이러스 게놈 접촉 입자)/ml 역가의 바이러스 벡터(1 ㎕)를 약 1개월된 C57BL/6J 마우스의 눈에 유리체내로 주사하였다. mCherry 발현을 사정하기 위하여, 바이러스 주사 후 1개월 경과하였을 때, 동물을 안락사시켰다. DOX: 독소루비신; Ada: 아클라루비신; MG: MG132. 도 1b. 바이러스 주사 후 1개월 경과하였을 때의 양극 세포에서의 mCherry의 형광 강도를 평가한 통계적 데이터. 양극 세포에서의 mCherry의 발현은 ≥300 μM 농도의 DOX와 공동 주사하였을 때, 유의적으로 증가하였다.
도 2a-b는 바이러스 주사 후 3개월 경과하였을 때의, DOX가 망막 양극 세포의 트랜스진(mCherry)의 AAV 매개 발현에 미치는 효과를 도시한 일련의 사진 및 그래프이다. 도 2a: 바이러스 주사 후 3개월 경과하였을 때의, 바이러스 형질도입된 망막 양극 세포의 대표 이미지. 바이러스 벡터를 상이한 농도의 DOX와 함께 공동 주사하였다. 도 2b. 바이러스 주사 후 3개월 경과하였을 때의 양극 세포에서의 mCherry의 형광 강도를 평가한 통계적 데이터. 양극 세포에서의 mCherry의 발현은 ≥200 μM 농도의 DOX와 공동 주사하였을 때, 유의적으로 증가하였다.
도 3a-b는 DOX가 바이러스 형질도입된 망막의 형태적 특성에 미치는 효과를 도시한 일련의 사진, 및 한 쌍의 그래프이다. 도 3a. 상이한 농도의 DOX와 함께 수행된 바이러스 공동 주사 후 3개월 경과하였을 때의 망막의 수직 단면을 나타낸 대표 이미지. DOX가 고농도일 때, 양극 세포층은 박막화되는 것으로 보인다. 적색: mCherry가 형질도입된 양극 세포. 녹색: PKC 항체 표지된 간상 양극 세포. 청색: DAPI 염색된 핵. 도 3b. 광수용체 세포체 층 및 양극 세포층 두께 비교에 관한 통계적 데이터. 바이러스 주사 후 3개월 경과하였을 때, 동물을 안락사시켰다. 300 또는 500 μM 농도의 DOX를 공동 주사하였을 때, 양극 세포층은 대조군 두께보다 통계적으로 더 얇은 박막이었다.
도 4a-b는 DOX가 망막 신경절 세포에 미치는 효과를 도시한 일련의 사진 및 그래프이다. 도 4a. 상이한 농도의 DOX와 함께 및 그의 부재하에서 수행된 양극 세포에서의 바이러스 형질도입 후, DAPI 염색을 이용하여 망막 신경절 세포의 밀도를 평가하기 위한 대표 이미지. 바이러스 주사 후 1개월 및 3개월 경과하였을 때, 동물을 안락사시켰다. 도 4b. 독소루비신(DOX)과 함께 및 그의 부재하에서의 바이러스 주사 후 1개월 및 3개월 경과하였을 때의 망막 신경절 세포의 밀도를 평가하기 위한 통계적 데이터. 300 μM 및 500 μM의 DOX 존재하에 바이러스 주사 후 3개월 경과하였을 때의 망막 신경절 세포 밀도가 대조군과 비교하였을 때 통계적으로 더 낮았다.
본 발명은 일반적으로 질환을 치료, 예방, 또는 호전시키기 위한 개선된 유전자 요법 조성물, 및 상기 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다. 유전자 요법을 위한 한가지 중요한 도전 과제는 피험체에게로 전달되는 치료적 유전자를 포함하는 세포의 형질도입 효율을 증가시키는 것이다.
본 발명은 부분적으로는, 프로테아좀 억제제가 바이러스 매개 형질도입 효율을 향상시킨 것으로 나타났다는 예상 밖의 발견을 기반으로 한다. 따라서, 본 발명은 질환 치료에서 유전자 요법의 효율을 개선하기 위한 충족되지 않은 임상적 요구에 대해 다룬다.
본 발명은 프로테아좀 억제제 및 치료제를 투여함으로써 바이러스 매개 유전자 전달 효율을 향상시키는 방법을 제공한다. 치료제는 관심 유전자를 코딩하는 바이러스 벡터이다. 바람직하게는, 프로테아좀 억제제 및 치료제는 눈으로 전달된다.
일부 실시양태에서, 프로테아좀 억제제 및 치료제는 망막 및 망막 세포로의 전달을 향상시키기 위해 유리체로 전달될 수 있다. 망막 세포는 예를 들어, 광수용체 세포(예컨대, 간상체, 추상체, 및 감광성 망막 신경절 세포), 수평 세포, 망막 양극 세포, 아마크린 세포, 망막 신경절 세포, 뮐러 신경교 세포, 및 망막 색소 상피 세포를 포함한다. 다른 실시양태에서, 프로테아좀 억제제 및 치료제는 예를 들어, 후안부, 전안부, 공막, 맥락막, 결막, 홍채, 수정체, 또는 각막으로 전달될 수 있다.
망막은 간상체 및 추상체로 불리는 분화된 광수용체 세포를 함유하는 눈의 뒤쪽에 있는 복합 조직이다. 광수용체는 시각 정보의 국소 처리를 위해 신경 세포 망에 연결된다. 상기 정보는 시각적 이미지의 디코딩을 위해 뇌로 전송된다. 망막은 황반 변성, 연령 관련 황반 변성(AMD: age-related macular degeneration), 당뇨병성 망막병증(DR: diabetic retinopathy), 망막 색소변성증(RP: retinitis pigmentosa), 녹내장, 및 다른 유전성 망막 변성, 포도막염, 망막 박리, 및 안암(안구 흑색종 및 망막아세포종)을 비롯한, 다양한 질환에 걸리기 쉽다. 각각의 상기 질환들은 시력 상실 또는 완전 실명에 이르게 할 수 있다.
눈의 구조가 복잡하기 때문에, 치료적 화합물을 망막으로 전달하는 것이 도전 과제가 된다. 치료적 화합물을 망막으로 전달하는 데 유리체내 주사 및 유리체 전달 장치가 빈번하게 사용되고는 있지만, 전달 효율은 망막 세포의 내부 경계막(ILM: inner limiting membrane) 및 다중 층에 의해 손상된다.
프로테아좀 억제제 및 치료제는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 눈으로 전달될 수 있다. 투여 경로로는 유리체내, 전방내, 결막하, 테논낭하, 안구후, 후방 공막옆, 또는 국부 경로를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 전달 방법은 예를 들어, 시린지 및 약물 전달 장치, 예컨대, 이식형 유리체 전달 장치(즉, VITRASERT®)에 의한 주사를 포함한다.
바람직하게는, 프로테아좀 억제제 및 치료제는 망막으로의 전달을 위해 유리체내 주사에 의해 유리체에 투여된다.
한 실시양태에서, 프로테아좀 억제제는 치료제와 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 동시 투여인 경우, 프로테아좀 억제제는 당업계에 공지된 방법에 의해 예를 들어, 주사와 같은 전달에 적합한 단일 조성물로 치료제와 함께 제제화될 수 있다. 대안적으로, 프로테아좀 억제제는 별개의 조성물로 동시에 또는 순차적으로 주사될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 프로테아좀 억제제는 치료제 투여 전에 투여될 수 있다.
상기 제제는 약학적으로 및/또는 생리적으로 허용되는 비히클, 희석제, 담체 또는 부형제, 예컨대, 완충처리된 식염수 또는 생리적 pH 유지를 위한 다른 완충제, 예컨대, HEPES를 포함한다. 상기 성분 및 그의 제제화에 관한 논의에 대해서는 일반적으로 문헌 [Gennaro, AE., Remington : The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins Publishers; 2003 또는 최신판]을 참조한다. 또한, WO00/15822도 참조한다. 제제를 장기간 보관하고자 하는 경우, 이는 예를 들어, 글리세롤 존재하에 냉동될 수 있다.
투여하고자 하는 그의 프로테아좀 억제제의 투여량은 당업계의 숙련가에 의해 최적화될 수 있다. 특정 표적 안조직으로의 전달을 위해서는 표적 조직의 위치, 개재 안구 구조, 및 작용제가 표적 조직을 투과할 수 있는 능력에 의존하여, 더 낮은 저용량의 프로테아좀 억제제, 또는 더 높은 고용량의 프로테아좀 억제제가 요구될 수 있다. 바람직하게는, 프로테아좀 억제제의 투여 용량은 눈 한쪽당 약 50 내지 2,000 μM, 바람직하게 100 내지 1,000 μM이다. 더욱 바람직하게는, 눈 한쪽당 200 내지 800 μM이다. 예를 들어, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1,000 μM의 프로테아좀 억제제가 눈으로 전달된다.
프로테아좀 억제제는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 프로테아좀 억제제는 독소루비신, 아클라루비신, 보르테조밉, 락타시스틴, 디술피람 에피갈로카테킨-3-갈레이트 마리조밉(살리노스포라미드 A), 오프로조밉(ONX-0912), 델란조밉(CEP-18770) 에폭소미신, MG132, 베타-하이드록시 베타-메틸부티레이트 또는 카르필조밉이다. 바람직한 실시양태에서, 프로테아좀 억제제는 독소루비신, 아클라루비신 또는 MG132이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 전달 향상 방법이 치료제의 효능을 증가시킬 수 있다. 치료제의 효능 증가는 치료제의 치료 효과를 측정함으로써 측정될 수 있다. 치료가 피험체에서 임상적 이익을 유도하였다면, 예컨대, 증상을 경감시켰다면, 치료는 효능이 있는 것이다. 예를 들어, 변성 망막 질환, 예컨대, 망막 색소변성증에서, 광 감수성 또는 시력의 또 다른 측면이 개선되거나, 또는 회복되었다면, 치료는 효능이 있는 것이다. 치료가 예방적으로 적용되었을 때, "효능이 있다는 것"은 치료가 안질환 또는 안장애를 지연 또는 예방하거나, 또는 안질환 또는 안장애의 임상적 증상의 증상을 예방 또는 경감시키는 것을 의미한다. 유효성은 특정 안질환 또는 안장애를 진단 또는 치료하는 임의의 공지된 방법과 연관하여 측정된다.
본원에 기술된 방법에 의해 전달하고자 하는 관심 유전자는 질환의 치료, 경감, 감소, 또는 예방을 위한 것으로 당업계에 공지된 임의의 관심 유전자(즉, 치료적 트랜스진)이다. 바람직하게는, 안질환, 안장애, 또는 안병태 증상의 치료, 경감, 감소, 또는 예방을 위한 관심 유전자(즉, 치료적 트랜스진)가 당업계에 공지되어 있다.
본원에 기술된 방법에서 사용하기에 적합한 핵산의 예로는 치료적 트랜스진(즉, 채널옵신, 또는 할로로돕신)을 코딩하는 바이러스 벡터, RNA 간섭 분자(즉, 짧은 헤어핀, siRNA, 또는 마이크로RNA)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특히 바람직한 실시양태에서, 치료제는 유전자 요법을 위한 트랜스진을 코딩하는 바이러스 벡터이다. 특히 바람직한 바이러스 벡터는 광 감수성을 회복시키기 위하여 망막에서의 발현을 위한 로돕신, 예컨대, 채널옵신 또는 할로로돕신을 코딩하는 rAAV이다.
본원에 기술된 방법에서 사용하기에 적합한 항체의 예로는 라니비주맙(Lucentis®), VEGF 항체(Eylea®), 베바시주맙(Avastin®), 인플릭시맙, 에타너셉트, 및 아달리무맙을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 기술된 작용제들 중 임의의 것은 임의적으로 캐리어, 예컨대, 나노입자, 폴리머, 또는 리포솜에 캡슐화될 수 있다. 상기 캐리어 작용제는 치료제의 눈으로의 전달을 추가로 향상시키는 역할을 할 수 있다. 일부 측면에서, 캐리어 작용제는 예컨대, 안정성(반감기)을 증가시키거나, 또는 지효성 특성을 치료제에 제공하는 것과 같이, 치료제의 특성을 변경시킬 수 있다. 대안적으로, 캐리어는 그가 전달을 위해 동일한 조성물로 제제화된 경우에는 플라스민의 단백질분해 활성으로부터 치료제를 보호할 수 있다.
다수의 안질환 및 안장애는 다양한 안조직에서의 비정상적인 유전자 발현으로부터 발생하는 바, 유전자 요법은 효과적인 요법으로서 점점 더 증가하고 있는 잠재성을 가지고 있다. 그러나, 유전자 요법의 눈에서의 효능은 임의의 안조직 전역으로의 치료적 바이러스 벡터의 효과적인 전달 및 형질도입에 관한 도전 과제로 인해 제한되어 왔다.
따라서, 본 발명은 안질환 또는 안장애 치료를 위한, 또는 시력 회복 또는 개선을 위한, 트랜스진의 눈으로의 전달 효율을 증가시키는 방법을 제공한다. 감광성 또는 시력 회복을 위한 것으로서 특히 관심의 대상이 되는 트랜스진으로는 감광성 단백질, 예컨대, 옵신 유전자 또는 로돕신 유전자를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "트랜스진"이란, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 여기서, 폴리뉴클레오티드는 유전자 요법에 적합한 핵산 발현 벡터(예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, AAV)에 존재하는 것인, 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
선행 연구에서는 트랜스진, 예컨대, 채널옵신-2를 코딩하는 재조합 아데노 연관 바이러스 벡터 주사 결과, 벡터의 전달은 불량하고, 내부 망막 세포, 특히, 양극 세포에서의 Chop2의 발현은 낮은 것으로 나타났다. 비인간 영장류에서, AAV 매개 유전자 형질감염이 망막 주변에서, 중심와에서, 및 혈관을 따라 더욱 효과적인 것으로 나타났으며, 이는 망막과 유리체 공간 사이의 경계인 내부 경계막(ILM)이 주요 장벽이라는 것을 제안한다(문헌 [Ivanova et al., 2010]).
본 발명은 프로테아좀 의존적 바이러스 분해를 억제 또는 감소시키기 위해 프로테아좀 억제제를 사용함으로써 상기 문제점에 대한 해결안을 제공한다. 따라서, 치료제는 망막, 구체적으로, 내부 망막의 세포, 예컨대, 망막 양극 세포, 망막 신경절 세포, 뮐러 신경교 세포, 및 망막 색소 상피 세포로의 더욱 큰 접근성을 가질 것이다. 본원에 기술된 방법은 치료적 바이러스 벡터의 전달을 향상시킨다. 바이러스 벡터의 전달 향상은 형질도입 효율 증가, 치료적 트랜스진(즉, Chop2)의 발현 증가, 및 치료적 화합물의 효능 증가(즉, 광 감수성 증가 또는 시력 회복)에 의해 입증된다.
유전자 요법에 사용하기에 적합한 핵산 발현 벡터는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 핵산 발현 벡터는 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 연관 벡터(AAV: adeno-associated vector), 또는 렌티바이러스 벡터, 또는 당업계에 공지된 임의의 조작된 또는 재조합 바이러스 벡터일 수 있다. 특히 바람직한 바이러스 벡터는 아데노 연관 벡터, 예를 들어, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, 또는 당업계에 공지된 임의의 조작된 또는 재조합 AAV이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 벡터는 재조합 AAV-2(rAAV2: recombinant AAV-2)이다.
일부 실시양태에서, 재조합 아데노 연관 바이러스(rAAV: recombinant adeno-associated viral) 벡터는, 벡터가 표적 세포, 예컨대, 망막 양극 세포(예컨대, 온(ON) 또는 오프(OFF) 망막 양극 세포; 간상 및 추상 양극 세포)의 개선된 형질도입 효율을 가질 수 있게 할 수 있는 티로신 잔기가 돌연변이화된 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 경우에서, rAAV는 표적 세포에서 관심 단백질의 발현을 유도할 수 있는 프로모터(예컨대, mGluR6, 또는 그의 단편)를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, AAV 1-12 또는 하이브리드 AAV의 캡시드 단백질의 티로신 잔기 중 하나 이상의 것에서 돌연변이화될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 상기 잔기는 표면에 노출된 티로신 잔기이다. 관련된 실시양태에서, 티로신 잔기는 VP1, VP2, 또는 V133 캡시드 단백질의 일부이다. 예시적인 실시양태에서, AAV-VP3 캡시드 단백질의 하기 아미노산 잔기 중 하나 이상의 것에서 돌연변이화될 수 있다: Tyr252, Tyr272, Tyr444, Tyr500, Tyr700, Tyr704; Tyr730; Tyr275, Tyr281; Tyr508, Tyr576, Tyr612, Tyr673 또는 Tyr720. 예시적인 돌연변이는 Y252F, Y272F, Y444F, Y500F, Y700F, Y704F, Y730F, Y275F, Y281F, Y508F, Y576F, Y612G, Y673F 및 Y720F를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 티로신에서 페닐알라닌으로의 돌연변이이다. 구체적인 실시양태에서, 이들 돌연변이는 AAV2 혈청형에서 이루어진다. 일부 경우에서, AAV2 혈청형은 Y444F 돌연변이를 포함하고/거나, AAV8 혈청형은 Y733F 돌연변이를 포함하고, 여기서, 444 및 733은 바이러스 캡시드의 티로신 점 돌연변이의 위치를 나타낸다. 추가의 실시양태에서, 상기 돌연변이화된 AAV2 및 AAV8 혈청형은 광 감수성 단백질을 코딩하고, 이는 또한 상기 광 감수성 단백질의 발현을 유도하기 위해 변형된 mGluR6 프로모터도 포함한다. 상기 AAV 벡터는 예를 들어, 문헌 [Petrs-Silva et al., Mol Ther., 2011 19:293-301)]에 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, 치료적 트랜스진의 발현은 구성적 프로모터, 즉, CAG 프로모터, CMV 프로모터, LTR에 의해 유도된다. 다른 실시양태에서, 프로모터는 유도성 또는 세포 특이적 프로모터이다. 세포의 특정 하위집단, 즉, 망막 뉴런 세포 또는 변성 세포에서 트랜스진 발현을 가능하게 하는 세포 유형 특이적 프로모터가 바람직할 수 있다. 이들 세포는 망막 신경절 세포, 광수용체 세포, 양극 세포, 간상 양극 세포, 온 타입 추상 양극 세포, 망막 신경절 세포, 감광성 망막 신경절 세포, 수평 세포, 아마크린 세포, AII 아마크린 세포, 또는 망막 색소 상피 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 세포 유형 특이적 프로모터는 당업계에 널리 공지되어 있다. 특히 바람직한 세포 유형 특이적 프로모터로는 mGluR6, NK-3, 및 Pcp2(L7)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 발현율 및 선택적 표적화를 증가시키기 위해 당업계에 공지된 재조합 DNA 기술을 사용하여 변형된 세포 유형 특이적 프로모터 또한 본 발명에 포함된다. 예를 들어, 변형된 mGluR6 프로모터는 미국 공개 번호 US 2017-0021038 A1(상기는 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술된 바와 같이, mGluR6 유전자로부터의 조절 요소의 조합을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 관심 유전자(즉, 치료적 트랜스진)는 임의의 광 감수성 옵신일 수 있다. 유전자인 옵신 계열은 척추동물(동물) 및 무척추동물 옵신을 포함한다. 동물 옵신은 이온 채널의 활성을 조절하는 7-막횡단 나선을 포함하는 G 단백질 커플링된 수용체(GPCR: G-protein coupled receptor)이다. 무척추동물 로돕신은 일반적으로 GPCR이 아니고, 광 감수성 또는 광 활성화 이온 펌프 또는 이온 채널이다. 변형된 mGluR6 유전자 프로모터
Figure pct00001
본원에서 언급될 때, 옵신 유전자 또는 광 감수성 단백질은 채널로돕신, 또는 채널옵신, (즉, ChR1, ChR2, 볼복스 카르테리로부터의 vChR1, vChR2, 및 임의의 척추동물, 무척추동물, 또는 미생물로부터 확인된 다른 변이체), 할로로돕신(NpHR), 멜라놉신, 송과체 옵신, 포톱신, 박테리오로돕신, 프로테오로돕신 및 이들의 기능적 변이체 또는 키메라를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 광 감수성 단백질은 식물, 동물, 원시세균, 조류, 또는 박테리아 세포에서 자연적으로 발생될 수 있거나, 또는 대안적으로, 실험실 기술을 통해 생성될 수 있다. 옵신 유전자의 예는 하기에서 추가로 상세하게 논의된다.
본 발명의 트랜스진으로서 채널로돕신, 또는 채널옵신의 예로는 채널로돕신 Chop1(ChR1로도 공지됨)(진뱅크(GenBank) 수탁 번호 AB058890(서열 번호: 3)/AF385748(서열 번호: 4)) 및 Chop2(ChR2로도 공지됨)(진뱅크 수탁 번호 AB058891(서열 번호: 5)/AF461397(서열 번호: 6))를 포함하며, 이 두 로돕신은 녹조류인 클라미도모나스 레인하르드티이(Chlamydomonas reinhardtii)로부터의 것이다(문헌 [Nagel, 2002; Nagel, 2003]).
본 개시내용의 예시적인 Chop1을 코딩하는 핵산 서열은 하기 진뱅크 수탁 번호 AB058890을 포함하거나, 또는 그로 구성된다:
Figure pct00002
Figure pct00003
본 개시내용의 예시적인 Chop1을 코딩하는 상응하는 아미노산 서열은 하기 진뱅크 수탁 번호 BAB68566을 포함하거나, 또는 그로 구성된다:
Figure pct00004
본 개시내용의 예시적인 Chop1을 코딩하는 핵산 서열은 하기 진뱅크 수탁 번호 AF385748을 포함하거나, 또는 그로 구성된다:
Figure pct00005
본 개시내용의 예시적인 Chop1을 코딩하는 상응하는 아미노산 서열은 하기 진뱅크 수탁 번호 AAL08946을 포함하거나, 또는 그로 구성된다:
Figure pct00006
본 개시내용의 예시적인 Chop1을 코딩하는 핵산 서열은 하기 진뱅크 수탁 번호 AB058891을 포함하거나, 또는 그로 구성된다:
Figure pct00007
본 개시내용의 예시적인 Chop1을 코딩하는 상응하는 아미노산 서열은 하기 진뱅크 수탁 번호 BAB68567.1을 포함하거나, 또는 그로 구성된다:
Figure pct00008
본 개시내용의 예시적인 Chop1을 코딩하는 핵산 서열은 하기 진뱅크 수탁 번호 AF461397을 포함하거나, 또는 그로 구성된다:
Figure pct00009
본 개시내용의 예시적인 Chop1을 코딩하는 상응하는 아미노산 서열은 하기 진뱅크 수탁 번호 AAM15777을 포함하거나, 또는 그로 구성된다:
Figure pct00010
채널옵신은 발색단인 전 트랜스-레티날(all-trans-retinal)에 결합하였을 때, 광전환성(광 감수성)이 되는 7 막횡단 도메인 단백질이다. 채널옵신은 쉬프(Schiff) 염기 연결을 통해 레티날 분자에 연결되었을 때, 채널로돕신으로 명명되는, 광 개폐형의 비특이적인 내향 정류 양이온 채널을 형성한다. 이러한 광 감수성 채널은 신경 조직에서 발현되고, 활성화된 경우, 광 자극을 받았을 때에는 세포가 탈분극화될 수 있게 허용한다(문헌 [Boyden, 2005]). Chop2 단편(315개의 아미노산)(서열 번호: 7)은 광수용체 변성인 마우스 모델에서 감광성 및 시력을 효율적으로 증가시키는 것으로 밝혀졌다(문헌 [Bi et al., Neuron, 2006], 및 미국 특허 8,470,790; 상기 두 문헌 모두 본원에서 참조로 포함된다).
315개의 아미노산을 포함하는, Chop2 단백질의 합성 단편
Figure pct00011
(본원에서 참조로 포함된) PCT 공개 WO 2013/134295에 기술된 바와 같은 Chop2 돌연변이체 및 변이체 또한 본원에 기술된 프로모터를 사용하여 발현될 수 있다. 본 발명은 또한 볼복스 카르테리 채널로돕신(즉, vChR1 및 vChR2)의 용도를 제공한다.
NpHR(할로로돕신) (진뱅크 수탁 번호 EF474018) 및 (진뱅크 수탁 번호 AB064387)은 호염알칼리성 고세균 나트로노모나스 파라오니스(Natronomonas pharaonis)로부터의 것이다. 특정 실시양태에서, NpHR의 변이체가 생성될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, NpHR 단백질에 대한 단일 또는 다중 점 돌연변이를 통해 NpHR 변이체가 생성될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 포유동물의 코돈 최적화된 버전의 NpHR이 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, NpHR 변이체가 사용된다. 한 구체적인 실시양태에서, eNpHR(향상된 NpHR: enhanced NpHR)이 사용된다. NpHR N 말단에의 니코틴성 아세틸콜린 수용체의 β 서브유니트로부터의 신호 펩티드와 함께, 아미노산 FCYENEV의 NpHR C 말단에의 부가를 통해 eNpHR이 구성된다.
본 개시내용의 예시적인 NpHR(할로로돕신)을 코딩하는 핵산 서열은 하기 진뱅크 수탁 번호 EF474018을 포함하거나, 또는 그로 구성된다:
Figure pct00012
본 개시내용의 예시적인 NpHR(할로로돕신)을 코딩하는 상응하는 아미노산 서열은 하기 진뱅크 수탁 번호 AB064387을 포함하거나, 또는 그로 구성된다:
Figure pct00013
멜라놉신 (진뱅크 수탁 번호 6693702) 및 (진뱅크 수탁 번호 AF147789_1)은 일주기 리듬, 동공 광 반사, 및 광에 대한 다른 비시각적 반응의 조절에 관여하는 망막의 분화된 감광성 신경절 세포에서 발견되는 광색소이다. 구조상, 멜라놉신은 G 단백질 커플링된 수용체의 레티닐리덴 단백질 변종인 옵신이다. 멜라놉신은 그의 아미노산 서열 및 하류 신호전달 캐스케이드를 비롯한 많은 측면에서 무척추동물의 옵신과 유사하다. 무척추동물의 옵신과 같이, 멜라놉신은 내재성 포토이소머라제 활성을 가진, 쌍안정성 광색소인 것으로 보인다. 특정 실시양태에서, 멜라놉신의 변이체가 생성될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 멜라놉신 단백질에 대한 단일 또는 다중 점 돌연변이를 통해 멜라놉신 변이체가 생성될 수 있다.
본 개시내용의 예시적인 멜라놉신을 코딩하는 핵산 서열은 하기 진뱅크 수탁 번호 6693702를 포함하거나, 또는 그로 구성된다:
Figure pct00014
본 개시내용의 예시적인 멜라놉신을 코딩하는 상응하는 아미노산 서열은 하기 진뱅크 수탁 번호 AF1477891을 포함하거나, 또는 그로 구성된다:
Figure pct00015
광 감수성 단백질은 또한 본원에 기술된 광 감수성 단백질(즉, ChR1, ChR2, yChR1, vChR2, NpHR 및 멜라놉신) 중 임의의 것과 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 동일한 단백질을 포함할 수 있다. 본 발명의 광 감수성 단백질은 또한 적어도 하나의 돌연변이를 가지는 단백질을 포함할 수 있다. 돌연변이는 점 돌연변이일 수 있다.
일부 실시양태에서, 광 감수성 단백질은 신경 회로 내에서의 신호전달을 조정할 수 있고, 단일 뉴런 수준에서 이온 전도도의 거동을 양방향으로 제어할 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴런은 망막 뉴런, 망막 양극 세포(예컨대, 온 또는 오프 망막 양극 세포; 간상 및 추상 양극 세포), 망막 신경절 세포, 광수용체 세포, 또는 망막 아마크린 세포이다.
일부 실시양태에서, 폴리A 테일은 본 발명의 발현 카세트 또는 핵산 발현 벡터에서 트랜스진의 하류에 삽입될 수 있다. 적합한 폴리A 테일은 당업계에 공지되어 있고, 이는 예를 들어, 인간 성장 호르몬 폴리A 테일(hGHpA: human growth hormone poly A tail), 소 성장 호르몬 폴리A 테일(bGHpA: bovine growth hormone polyA tail), 소 폴리A, SV40 폴리A, 및 AV40pA를 포함한다.
바람직한 선량의 광 방사선에 의한 조사 시, 로돕신 단백질은 채널의 공극을 개방하고, 이를 통해 H+, Na+, ICE, 및/또는 Ca2 + 이온이 세포외 공간으로부터 세포 내로 유동한다. 로돕신 채널의 활성화는 전형적으로 채널을 발현하는 세포의 탈분극화를 유발한다. 탈분극화된 세포는 차등 전위 및/또는 활동 전위를 생성하여 로돕신 발현 세포로부터 망막 또는 뇌의 다른 세포로 정보를 전달함으로써 광 감수성을 증가시키거나, 또는 시력을 회복시킨다. 채널옵신(또는 그의 변이체)를 코딩하는 벡터의 투여에 의해 시력 또는 광 감수성을 개선하는 방법은 PCT/US2007/068263(상기의 내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다.
따라서, 이중 로돕신 시스템은 시각적 처리 및 시력에 필수적인 온 및 오프 경로를 반복하는 데 사용될 수 있다. 간략하면, 본 발명의 Chop2 단백질은 온 타입 망막 뉴런 (즉, 온 타입 신경절 세포 및/또는 온 타입 양극 세포)에 특이적으로 표적화될 수 있는 반면, 저분극 광 센서(즉, 할로로돕신 또는 당업계에 공지된 다른 클로라이드 펌프)는 온 및 오프 경로를 생성하기 위해 오프 타입 망막 뉴런(즉, 오프 타입 신경절 세포 및/또는 오프 타입 양극 세포)에 표적화될 수 있다. 바람직한 세포 하위집단에의 특이적인 표적화는 상이한 세포 유형 특이적 프로모터의 사용으로 달성될 수 있다. 예를 들어, Chop2 발현은 온 타입 망막 뉴런(즉, 온 타입 신경절 세포 및/또는 온 타입 양극 세포)에서의 표적화된 발현을 위해 mGluR6 프로모터에 의해 유도될 수 있는 반면, 저분극 채널, 예컨대, 할로로돕신 발현은 오프 타입 망막 뉴런(즉, 오프 타입 신경절 세포 및/또는 오프 타입 양극 세포)에서의 표적화된 발현을 위해 NK-3 프로모터에 의해 유도된다.
망막에서 온 및 오프 경로를 회복시키기 위한 대안적 접근법은 탈분극화 광 센서, 예컨대, ChR2를 간상 양극 세포 또는 AII 아마크린 세포로 발현시킴으로써 달성된다. 이러한 접근법에서, 간상 양극 세포 또는 AII 아마크린 세포의 탈분극화는 추상 양극 세포 및 하류의 망막 신경절 세포의 수준에서 온 및 오프 반응으로 이어질 수 있다. 따라서, 망막에서 고유한 온 및 오프 경로는 유지된다.
최상의 프로모터, 바람직하게는, 구성적 CMV 프로모터 또는 세포 특이적 프로모터, 예컨대, mGluR6의 제어하에서 로돕신 DNA를 코딩하는 핵산 서열을 운반하는 rAAV 비리온의 유효량은 바람직하게는, 주사당 약 25 내지 약 800 ㎕ 부피 중 약 1010 내지 약 1013 rAAV 감염 단위 범위이다. rAAV 감염 단위는 문헌 [McLaughlin, SK et al., 1988, J Virol 62:1963]에 따라 측정될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 유효량은 약 1010 내지 약 1012 rAAV 감염 단위이고, 주사 부피는 바람직하게 약 50 내지 약 150 ㎕이다. 바람직하게는 상기 범위 내에 있지만, 가능하게는 그 범위 밖에도 있을 수도 있는 다른 투여량 및 부피는 치료되는 피험체(바람직하게는, 인간)의 연령, 체중, 일반적 건강 및 특정 안장애의 성질 및 중증도를 비롯한, 신체적 상태를 고려하여 치료 전문가에 의해 선택될 수 있다.
또한 본 핵산(들) 또는 rAAV 조성물의 추가적인 용량("부스터")를 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 안구 표적 세포 내에서의 트랜스진 발현의 지속 기간에 따라, 제2 치료가 6개월 후 또는 매년 투여될 수 있고, 유사하게 반복될 수 있다. AAV에 대한 중화 항체는 사용되는 경로 및 용량에 비추어 생성될 것으로 예상되지는 않으며, 이에, 반복 치료 라운드가 허용된다.
상기 추가 용량에 대한 필요성은, 예를 들어, 널리 공지된 전기생리적 및 다른 망막 및 시각 기능 시험 및 시각 거동 시험을 사용하여 치료 전문가에 의해 모니터링될 수 있다. 치료 전문가는 당업계의 통상의 기술을 적용하면서 적절한 시험을 선택할 수 있을 것이다. 관련 결과 파라미터를 추가로 개선하기 위해 단일 또는 다중 용량의 더욱 큰 부피의 조성물을 주사하는 것이 바람직할 수 있다.
안장애
본 발명의 방법이 시력에 대한 하나 이상의 파라미터를 개선하는 데 의도되어 사용될 수 있는 안장애로는 눈의 전안부 및 후안부, 둘 모두에 영향을 미치는 발달 이상을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 전안부 장애로는 녹내장, 백내장, 각막 이영양증, 원추각막을 포함한다. 후안부 장애로는 광수용체 기능부전에 의해 유발되는 실명유발 장애 및/또는 망막 이영양증 및 변성에 의해 유발되는 사망을 포함한다. 망막 장애로는 선천성 비진행성 야맹증, 연령 관련 황반 변성, 선천성 추상체 이영양증 및 광범위한 군의 망막 색소변성증(RP) 관련 장애를 포함한다. 이들 장애는 망막내 광수용체 세포, 간상체 및 추상체의 유전학적 성향의 사멸을 포함하며, 다양한 연령에서 발생한다. 그 중에는 중증 망막병증, 예컨대, 연령에 따라 진행되고, 소아기 및 성인 초기에 실명을 유발하는 RP 그 자체의 하위유형, 및 RP 연관 질환, 예컨대, 빈번하게는 생후 1년째만큼 조기에 소아기 동안 시력 상실을 초래하는 LCA의 유전적 하위유형이 있다. 후자의 장애는 일반적으로 광수용체 세포, 간상체 및 추상체의 심한 감소 및 종종 완전한 상실을 특징으로 한다. 본원에 기술된 방법이 도움이 될 수 있는 다른 안질환으로는 망막아세포종, 안구 흑색종, 당뇨병성 망막병증, 고혈압성 망막병증, 안조직의 임의의 염증(즉, 맥락망막 염증, 공막염, 각막염, 포도막염 등), 또는 감염(즉, 박테리아성 또는 바이러스성 감염)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
특히, 본 발명의 방법을 사용하여 수행되는 로돕신의 바이러스 매개 전달은, 기능 상실에도 불구하고 안조직 구조의 장기 보존 및 기능 상실과 피험체의 안구 세포내 정상 유전자의 결손 또는 부재와의 연관성을 특징으로 하는 것인, 예컨대, RPE 연관 망막병증과 같은 안장애에 기인하여 시력을 상실한 피험체의 치료 및/또는 상기 피험체에 대한 적어도 부분적인 시력의 회복에 유용하다. 상기와 같은 다양한 안장애, 예컨대, 소아기 발병 실명유발 질환, 망막 색소변성증, 황반 변성, 및 당뇨병성 망막병증뿐만 아니라, 당업계에 공지된 안구 실명유발 질환이 공지되어 있다. 이들 다른 장애뿐만 아니라, 후에 상기 기술된 것과 동일한 사항을 특징으로 하는 현재 원인불명의 실명유발 장애 또한 본원에 기술된 방법에 의해 성공적으로 치료될 수 있다고 기대된다. 따라서, 본 발명에 의해 치료되는 특정 안장애는 상기 언급된 장애 및 아직은 아니지만, 상기 특징을 가질 수많은 질환을 포함할 수 있다.
광 감수성 회복
본원에 기술된 본 방법은 정상 시력 및/또는 시력 장애를 가지는 피험체에서 사용될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 치료적 화합물의 전달 향상은 시력을 보존하거나, 개선하거나, 또는 회복시킬 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "시력"이라는 용어는 분화 또는 작용을 위한 자극으로서 광을 유용하게 감지하기 위한 유기체의 능력으로 정의된다. 시력은 하기를 포함하도록 의도된다:
1. 광 감지 또는 지각 - 광이 존재하는지 여부를 식별할 수 있는 능력;
2. 광 투사 식별능 - 광 자극이 오고 있는 방향을 식별할 수 있는 능력;
3. 분해능 - 격자 또는 문자 표적에서 상이한 휘도 수준(즉, 대비)을 감지할 수 있는 능력; 및
4. 인식 - 표적 내의 상이한 대비 수준을 참조로 하여 시각적 표적의 형상을 인식할 수 있는 능력.
따라서, "시력"은 광의 존재를 간단히 감지할 수 있는 능력을 포함한다. 본 발명의 방법은 시력을 개선하거나, 또는 회복시키는 데 사용될 수 있으며, 여기서, 시력 개선 또는 회복은, 예를 들어, 광 감지 또는 지각 증가, 광 자극에 반응하는 광 감수성 또는 감광성 증가, 광 자극이 오고 있는 방향을 식별할 수 있는 능력 증가, 상이한 휘도 수준을 감지할 수 있는 능력 증가, 시각적 표적의 형상을 인식할 수 있는 능력 증가, 및 망막으로부터 피질로의 시각적 유발 전위 또는 전달 증가를 포함한다. 따라서, 시력의 개선 또는 회복은 시력의 완전한 회복을 포함하거나, 포함하지 않을 수 있으며, 즉, 여기서, 본 발명으로 치료받는 환자의 시력은 비이환 개체의 시력 정도로 회복된다. 하기 기술되는 동물 연구에서 설명되는 시력 회복은, 인간의 관점에서, 완전한 시력 회복 없이, 시력의 한 측면(즉, 광 감수성 또는 시각적 유발 전위)을 증가시킴으로써 사람이 로우 엔드의 시각 기능을 가지게 할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 상기 개체는 이동 및 잠재적으로는 하위 분해능 과제에 관하여 훈련을 받을 수 있고, 이는 전체 실명과 비교하여 그들에게 매우 개선된 수준의 시각적 독립을 제공하기 때문에, 상기와 같은 수준의 기능을 가지게 하는 것도 상당한 도움이 될 것이다. 특정 일일 과제를 수행하고, 일상적인 이동, 능력 및 삶의 질을 개선하기 위해, 심지어 기본적 광 지각이 본 조성물 및 방법을 사용하여 시력이 개선되는 시력 장애를 앓는 개체에 의해 사용될 수 있다.
시력의 회복 정도는, 예를 들어, 치료적 트랜스진, 예컨대, Chop2 또는 할로로돕신, 또는 그 둘 모두를 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 투여하기 전 및 바람직하게는 그 이후의 시력 측정을 통해 측정될 수 있다. 시력은 다수의, 당업계에 널리 공지된 방법 또는 아직 확립되지 않은 방법들 중 임의의 것을 사용하여 측정될 수 있다. 본 발명에 의해 개선되거나 회복된 시력은 하기 시각적 반응 중 어느 하나에 의해 측정될 수 있다:
1. 광 자극에의 노출 이후의 피험체에 의한 광 감지 반응 - 여기서 증거로는 광이 켜질 때 피험체 개체가 광의 일반적 방향의 표시 또는 이동에 대해 신뢰가능한 방식으로 반응하는 것이 추구됨;
2. 광 자극에의 노출 이후의 피험체에 의한 광 투사 식별 반응 - 여기서 증거로는 광이 켜질 때 개체가 광의 특정 방향의 표시 또는 이동에 대해 신뢰가능한 방식으로 반응하는 것이 추구됨;
3. a. 입증할 수 있는 신뢰가능한 시운동으로 생성된 안진유사 눈 운동 및/또는 표적의 이동(상기 참조)을 입증하는 관련 머리 또는 신체 운동의 존재, 및/또는
b. 패턴형 시각적 자극을 식별하고, 언어 또는 비언어 수단에 의해, 예를 들어,가리키거나, 바 또는 버튼을 누름으로써 상기 식별을 표시할 수 있는 신뢰가능한 능력의 존재에 의해 입증된 바와 같은 명 대 암 패턴화 시각적 자극을 분석할 수 있는 피험체의 능력을 측정하는, 피험체에 의한 명 대 암 패턴화 시각적 자극의 광 분석; 또는
4. 섬광 자극 또는 패턴형 시각적 자극에 대한 시각 피질 반응의 전기 기록 - 이는 회복된 망막으로부터 시각 피질로의 전기적 전달의 종점이며, 또한 시각적 유발 전위(VEP: visual evoked potential)로도 지칭됨. 측정은 시각 피질 영역의 두피 표면 상, 피질 표면 상에서의 전기적 기록에 의해, 및/또는 시각 피질의 세포 내 기록에 의할 수 이루어질 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 시력 개선 또는 회복은 망막 세포에서 광 자극에 대한 반응으로 나타나는 광전류의 진폭 또는 동역학적 성질 또는 전기 반응의 증가, 망막 세포의 광 감수성 증가(즉, 광 자극에 대한 반응으로 나타나는 광전류 또는 전기 반응을 개시하는데 요구되는 임계치 광 강도를 낮춤으로써, 광전류를 유발하는 데 더 적은 또는 낮은 광이 요구된다), 광 유발 스파이킹 또는 스파이크 발화의 개수 또는 진폭 증가, 망막 또는 망막 세포로부터 시각 피질 또는 뇌로 전달된 시각적 유발 전위 증가를 포함하는, 시각 피질에 대한 광 반응 증가를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
실명유발 인간 안장애를 앓는 인식된 동물 모델을 비롯한, 본 발명의 다양한 파라미터를 사정하기 위한 시험관내 및 생체내 연구 둘 모두 사용될 수 있다. 인간 망막병증, 예컨대, 소아기 실명을 앓는 거대 동물 모델이 유용하다. 본원에 제공된 예를 통해 당업자는 이러한 방법이 다양한 망막 질환을 치료하는 데 유사하게 사용될 수 있다는 것을 용이하게 예상할 수 있다.
다른 발명자들에 의한 선행 연구를 통해 망막 변성이 유전자 요법 기술에 의해 지연될 수 있다고 입증되기는 하였지만, 본 발명은 거동 파라미터를 비롯한, 시력의 다양한 파라미터를 생성하거나 개선할 것으로 예상되는 기능의 명확한 생리적 회복을 입증한다.
거동 측정은 공지된 동물 모델 및 시험, 예를 들어, 수중 미로에서의 수행능을 사용하여 얻을 수 있으며, 여기서, 시력이 다양한 정도로 보존되거나 회복된 피험체는 광 방향으로 수영하게 될 것이다(문헌 [Hayes, JM et al., 1993, Behav Genet 23:395-403]).
성인 생애 동안 실명이 유도된 모델 또는 개체가 시력을 상실하기 전 시력을 경험하기에 충분할 정도로 천천히 선천성 실명이 발생된 모델에서, 다양한 시험 에서 피험체의 훈련을 수행할 수 있다. 이러한 방법으로, 이들 시험을 시력 상실 후 재실시하여 시력 회복 효과에 대한 본 조성물 및 방법의 효능을 시험하는 경우, 동물은 실명 상태인 동안 새롭게 과제를 학습해야 할 필요가 없다. 다른 거동 시험은 학습을 요구하지 않으며, 특정 거동의 본능에 의존한다. 한 예는 시운동성 안진 시험이다(문헌 [Balkema GW et al., 1984, Invest Ophthalmol Vis Sci. 25:795-800]; [Mitchiner JC et al., 1976, Vision Res. 16:1169-71).
본 발명은 또한 시력을 개선하거나, 또는 회복시키기 위해 당업계에 공지된 다른 형태의 시기능 요법, 예를 들어, 망막 임플란트, 피질 임플란트, 외측 슬상핵 임플란트 또는 시신경 임플란트를 포함하는 시각 보철 사용과 함께 조합되어 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법을 사용하여 망막 뉴런을 생존시키는 유전자 변형 외에도, 치료될 피험체는 분자 방법을 이용하기 전에, 그와 동시에 또는 그 이후에 시각 보철을 제공받을 수 있다. 시각 보철의 효과는 개체의 훈련에 의해 개선될 수 있으며, 이에 따라 본원에서 고려된 바와 같은 환자 세포의 Chop2 변환의 잠재적인 영향도 향상될 수 있다. 훈련 방법은, 예컨대 피험체가 (i) 다양한 수준의 광 및/또는 패턴 자극, 및/또는 (ii) 당업자가 이해할 수 있는 통상의 광원 또는 객체로부터의 환경적 자극을 인식하도록 피험체를 훈련시키는 것을 특징으로 하는 습관화 훈련; 및 피험체가 국부 객체를 시각적으로 감지하고, 훈련 없이 상기 대상들 사이를 이동하였을 때보다도 더 효과적으로 이동하도록 피험체를 훈련시키는 것을 특징으로 하는 방향성 및 이동 훈련이다. 실제로, 저시력 재활 분야에서 전형적으로 사용되는 임의의 시각적 자극 기술이 본원에서 적용가능하다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련가가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명의 목적을 위해 하기 용어가 하기에서 정의된다.
"벡터"라는 용어는 본원에서 또 다른 핵산 분자를 전달하거나, 또는 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하는 것으로 사용된다. 전달된 핵산은 일반적으로 벡터 핵산 분자에 연결되거나, 예컨대, 그 안으로 삽입된다. 벡터는 세포에서 자율 복제를 지시하는 서열을 포함할 수 있거나, 또는 숙주 세포 DNA 내로의 통합을 허용할 정도로 충분한 서열을 포함할 수 있다. 유용한 벡터로는 예를 들어, 플라스미드(예컨대, DNA 플라스미드 또는 RNA 플라스미드), 트랜스포존, 코스미드, 박테리아 인공 염색체, 및 바이러스 벡터를 포함한다. 유용한 바이러스 벡터로는 예컨대, 복제 결함 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 포함한다.
당업자에게 명백한 바와 같이, "바이러스 벡터"라는 용어는, 전형적으로 핵산 분자의 전달 또는 세포의 게놈 내로의 통합을 촉진시키는 바이러스 유래 핵산 요소를 포함하는 핵산 분자(예컨대, 전달 플라스미드), 또는 핵산 전달을 매개하는 바이러스 입자를 지칭하는 것으로 널리 사용된다. 바이러스 입자는 전형적으로 다양한 바이럿 성분을 포함할 것이며, 이는 종종 핵산(들) 이외에도 숙주 세포 성분 또한 포함할 것이다.
바이러스 벡터라는 용어는 핵산을 세포 내로 전달할 수 있는 바이러스 또는 바이러스 입자, 또는 전달되는 핵산 그 자체를 지칭할 수 있다. 바이러스 벡터 및 전달 플라스미드는 주로 바이러스로부터 유래된, 구조적 및/또는 기능성 유전적 요소를 함유한다. "아데노 연관 바이러스 벡터"라는 용어는 주로 아데노바이러스로부터 유래된, 구조적 및 기능성 유전적 요소, 또는 그의 일부를 함유하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드를 지칭한다. "레트로바이러스 벡터"라는 용어는 주로 레트로바이러스로부터 유래된, 구조적 및 기능성 유전적 요소, 또는 그의 일부를 함유하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드를 지칭한다. "렌티바이러스 벡터"라는 용어는 주로 렌티바이러스로부터 유래된, LTR을 비롯한, 구조적 및 기능성 유전적 요소, 또는 그의 일부를 함유하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드를 지칭한다. "하이브리드"라는 용어는 바이러스 및 비바이러스 바이러스 서열, 둘 모두를 함유하는 벡터, LTR 또는 다른 핵산을 지칭한다.
특정 측면에서, "바이러스 벡터," "바이러스 발현 벡터"라는 용어는 바이러스 전달 플라스미드 및/또는 감염성 바이러스 입자를 지칭하는 것으로 사용될 수 있다. 본원에서 요소, 예컨대, 클로닝 부위, 프로모터, 조절 요소, 이종성 핵산 등을 언급할 때, 이는 이들 요소의 서열이 본 발명의 바이러스 입자에서는 RNA 형태로 존재하고, 본 발명의 DNA 플라스미드에서는 DNA 형태로 존재한다는 것을 이해하여야 한다.
프로바이러스의 각 단부에는 "긴 말단 반복부" 또는 "LTR(long terminal repeat)"로 명명되는 구조가 존재한다. "긴 말단 반복부(LTR)"라는 용어는 그의 천연 서열 콘텍스트에서 일직선 반복부이고, U3, R, 및 U5 영역을 함유하는, 레트로바이러스 DNA 단부에 위치하는 염기쌍 도메인을 지칭한다. LTR은 일반적으로 바이러스 유전자의 발현(예컨대, 유전자 전사체의 촉진, 개시 및 폴리아데닐화)에, 및 바이러스 복제에 기본적인 기능을 제공한다. LTR은 전사 제어 요소, 폴리아데닐화 신호 및 바이러스 게놈의 복제 및 통합에 필요한 서열을 비롯한, 다수의 조절 신호를 함유한다. 바이러스 LTR은 U3, R, 및 U5로 명명되는 3개 영역으로 나뉜다. U3 영역은 인핸서 및 프로모터 요소를 함유한다. U5 영역은 프라이머 결합 부위 사이의 서열이고, R 영역은 폴리아데닐화 서열을 함유한다. R(반복부) 영역은 U3 및 U5 영역 측면에 위치한다. LTR은 U3, R 및 U5 영역으로 구성되고, 바이러스 게놈의 5' 및 3' 단부, 둘 모두에 출현한다. 게놈의 역전사에 필요한 서열(tRNA 프라이머 결합 부위), 및 바이러스 RNA의 입자 내로의 효율적인 패키징을 위한 서열(Psi 부위)이 5' LTR에 인접해 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "패키징 신호" 또는 "패키징 서열"이라는 용어는 바이러스 RNA의 바이러스 캡시드 또는 입자 내로의 삽입을 위해 요구되는, 바이러스 게놈 내에 위치하는 서열을 지칭하며, 예컨대, [Clever et al., 1995. J. of Virology, Vol. 69, No. 4; pp. 2101-2109]를 참조한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "패키징 서열," "패키징 신호," "psi"라는 용어 및 "PSI"라는 기호는 바이러스 입자 형성 동안 레트로바이러스 RNA 가닥의 캡시드화하는 데 요구되는 비코딩 서열과 관련하여 사용된다.
다양한 측면에서, 벡터는 변형된 5' LTR 및/또는 3' LTR을 포함한다. 3' LTR은 종종 바이러스를 복제 결함 상태로 만듦으로써 바이러스 시스템의 안전성을 개선하기 위해 변형된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "복제 결함"이라는 용어는 바이러스가 완전하고, 효과적인 복제를 할 수 없고, 이로써, 감염성 비리온이 생산되지 않는다는 것을 지칭한다(예컨대, 복제 결함 렌티바이러스 자손). "복제 가능"이라는 용어는 야생형 바이러스 또는 돌연변이체 바이러스가 복제 가능하고, 이로써, 바이러스의 바이러스 복제는 감염성 비리온을 생산할 수 있다는 것을 지칭한다(예컨대, 복제 가능 렌티바이러스 자손).
"자가 불활성화"(SIN: Self-inactivating) 벡터란, 바이러스 전사가 제1 라운드의 바이러스 복제를 초과하지 못하도록 U3 영역으로 공지된, 우측(3') LTR 인핸서-프로모터 영역이 (예컨대, 결실 및/또는 치환에 의해) 변형된 복제 결함 벡터를 지칭한다. 이는 우측(3') LTR U3 영역이 바이러스 복제 동안 좌측(5') LTR U3 영역에 대한 주형으로서 사용되고, 따라서, 바이러스 전사체는 U3 인핸서-프로모터 없이는 제조될 수 없기 때문이다. 본 발명의 추가 측면에서, 3' LTR은 U5 영역이 예를 들어, 이종성 또는 합성 폴리(A) 서열, 하나 이상의 절연 요소, 및/또는 유도성 프로모터로 대체되도록 변형된다. LTR에 대한 변형, 예컨대, 3' LTR, 5' LTR, 또는 3' 및 5' LTR, 둘 모두에 대한 변형 또한 본 발명에 포함된다는 것에 주의하여야 한다.
바이러스 입자 제조 동안 5' LTR의 U3 영역을 바이러스 게놈의 전사를 유도하는 이종성 프로모터로 대체함으로써 추가로 안전성을 향상시킬 수 있다. 사용될 수 있는 이종성 프로모터의 예로는 예를 들어, 바이러스 시미안 바이러스 40(SV40: simian virus 40)(예컨대, 조기 또는 후기 프로모터), 사이토메갈로바이러스(CMV)(예컨대, 즉각 조기 프로모터), 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV: Moloney murine leukemia virus), 라우스 육종 바이러스(RSV: Rous sarcoma virus), 및 단순 헤르페스 바이러스(HSV: herpes simplex virus)(티미딘 키나제) 프로모터를 포함한다. 전형적인 프로모터는 Tat 비의존적 방식으로 고수준의 전사를 유도할 수 있다. 바이러스 생산 시스템 중에 완전한 U3 서열이 존재하지 않기 때문에, 상기와 같은 대체는 재조합이 복제 가능 바이러스를 생성할 수 있는 가능성을 감소시킨다. 특정 측면에서, 이종성 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있고, 이로써, 바이러스 게놈 모두 또는 그 일부의 전사는 오직 하나 이상의 유도 인자가 존재할 때에만 일어날 것이다. 유도 인자로는 하나 이상의 화학 화합물 또는 숙주 세포가 배양되는 생리적 조건, 예컨대, 온도 또는 pH를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 측면에서, 바이러스 벡터는 TAR 요소를 포함한다. "TAR"이라는 용어는 렌티바이러스(예컨대, HIV) LTR의 R 영역에 위치하는 "전사활성화 반응(trans-activation response)" 유전적 요소를 지칭한다. 상기 요소는 바이러스 전사활성인자(tat) 유전적 요소와 상호작용하여 바이러스 복제를 향상시킨다. 그러나, 상기 요소는, 5' LTR의 U3 영역이 이종성 프로모터에 의해 대체된 상황에서는 요구되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "FLAP 요소"라는 용어는, 그의 서열이 레트로바이러스, 예컨대, HIV-1 또는 HIV-2의 중앙 폴리퓨린 트랙 및 중앙 종결 서열(cPPT(central polypurine tract) 및 CTS(central termination sequence))을 포함하는 것인 핵산을 지칭한다. 적합한 FLAP 요소는 미국 특허 번호 6,682,907 및 문헌 [Zennou, et al., 2000, Cell, 101:173]에 기술되어 있다. HIV-1 역전사 동안, 중앙 폴리퓨린 트랙(cPPT)에서 (+) 가닥 DNA의 중앙 개시 및 중앙 종결 서열(CTS)에서의 중앙 종결로 3 가닥 DNA 구조: HIV-1 중앙 DNA 플랩이 형성된다. 어떤 이론에 의해서도 제한하고자 하지 않으면서, DNA 플랩은 렌티바이러스 게놈 핵 내수송의 시스 활성 결정기로서 사용할 수 있고/거나, 바이러스 역가를 증가시킬 수 있다. 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터 백본은 벡터 중 관심의 대상이 되는 이종성 유전자의 상류 또는 하류에 하나 이상의 FLAP 요소를 포함한다. 예를 들어, 특정 측면에서, 전달 플라스미드는 FLAP 요소를 포함한다. 한 측면에서, 본 발명의 벡터는 HIV-1로부터 단리된 FLAP 요소를 포함한다.
한 측면에서, 바이러스 전달 벡터는 하나 이상의 외수송 요소를 포함한다. "외수송 요소"이라는 용어는 RNA 전사체의 세포의 핵으로부터 세포질로의 수송을 조절하는 시스 작용성 전사 후 조절 요소를 지칭한다. RNA 외수송 요소의 예로는 인간 면역결핍 바이러스(HIV: human immunodeficiency virus) rev 반응 요소(RRE: rev response element)(예컨대, 문헌 [Cullen et al., 1991. J. Virol. 65: 1053]; 및 [Cullen et al., 1991. Cell 58: 423] 참조), 및 B형 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(HPRE: hepatitis B virus post-transcriptional regulatory element)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, RNA 외수송 요소는 유전자의 3' UTR 내에 배치되고, 하나의 카피 또는 다중 카피로서 삽입될 수 있다.
특정 측면에서, 바이러스 벡터 중의 이종성 서열의 발현은 전사 후 조절 요소, 유효한 폴리아데닐화 부위, 및 임의적으로 전사 종결 신호를 벡터 내로 도입함으로써 증가된다. 다양한 전사 후 조절 요소, 예컨대, 우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(WPRE: woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element; 문헌 [Zufferey et al., 1999, J. Virol., 73:2886]); B형 간염 바이러스에 존재하는 전사 후 조절 요소(HPRE)(문헌 [Huang et al., Mol. Cell. Biol., 5:3864]) 및 기타(문헌 [Liu et al., 1995, Genes Dev., 9:1766])가 단백질로의 이종성 핵산의 발현을 증가시킬 수 있다. 특정 측면에서, 본 발명의 벡터에는 전사 후 조절 요소, 예컨대, WPRE 또는 HPRE가 없거나, 또는 그를 포함하지 않으며, 이는 일부 경우에서, 상기 요소가 세포 형질전환의 위험을 증가시키고/거나, 실질적으로 또는 유의적으로 mRNA 전사체의 양을 증가시키지 않거나, mRNA 안정성을 증가시키지 않기 때문이다. 그러므로, 일부 측면에서, 본 발명의 벡터에는 부가되는 안전 조치로서 WPRE 또는 HPRE가 없거나, 또는 그를 포함하지 않는다.
이종성 핵산 전사체의 효율적인 종결 및 폴리아데닐화를 지시하는 요소가 이종성 유전자 발현을 증가시킨다. 전사 종결 신호는 일반적으로 폴리아데닐화 신호 하류에서 발견된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "폴리A 부위" 또는 "폴리A 서열"이라는 용어는 RNA 폴리머라제 II에 의한 초기 RNA 전사체의 종결 및 폴리아데닐화, 둘 모두를 지시하는 DNA 서열을 의미한다. 폴리A 테일이 없는 전사체는 불안정적이고, 빠르게 분해되기 때문에, 재조합 전사체의 효율적인 폴리아데닐화가 바람직하다. 본 발명의 벡터에서 사용될 수 있는 폴리A 신호의 예시적인 예로는 이상적인 폴리A 서열(예컨대, AATAAA, ATTAAA AGTAAA), 소 성장 호르몬 폴리A 서열(BGHpA: bovine growth hormone polyA sequence), 토끼 .베타.-글로빈 폴리A 서열(r.베타.gpA: rabbit .beta.-globin polyA sequence), 또는 당업계에 공지되어 있는 또 다른 적합한 이종성 또는 내인성 폴리A 서열을 포함한다.
특정 측면에서, 바이러스 벡터는 하나 이상의 절연 요소를 추가로 포함한다. 절연 요소는 게놈 DNA에 존재하는 시스 작용성 요소에 의해 매개될 수 있고, 전달된 서열의 탈조절된 발현을 유도할 수 있는 통합 부위 효과(즉, 위치 효과; 예컨대, 문헌 [Burgess-Beusse et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 99:16433]; 및 [Zhan et al., 2001, Hum. Genet., 109:471] 참조)로부터 렌티바이러스 발현 서열, 예컨대, 치료적 폴리펩티드를 보호하는 데 기여할 수 있다. 일부 측면에서, 전달 벡터는 3' LTR에 하나 이상의 절연 요소를 포함하고, 프로바이러스의 숙주 게놈 내로의 통합시, 프로바이러스는 3' LTR을 복제하기 때문에 5' LTR 또는 3' LTR 둘 모두에 하나 이상의 절연 요소를 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 절연 요소로는 닭 .베타.-글로빈 절연 요소(예컨대, 문헌 [Chung et al., 1993. Cell 74:505]; [Chung et al., 1997. PNAS 94:575]; 및 [Bell et al., 1999. Cell 98:387](상기 문헌들은 본원에서 참조로 포함된다) 참조)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 절연 요소의 예로는 예컨대, 닭 HS4와 같은, 베타.-글로빈 유전자좌로부터의 절연 요소를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "형질도입 효율을 증가시키는 데 충분한 시간"이라는 용어는, 프로테아좀 억제제 부재하에서 유사 유전자 전달 비히클과 접촉된 유사 세포 집단과 비교하여, 세포 집단이 유전자 전달 비히클, 예컨대, 아데노바이러스와 접촉할 때, 세포에 유전자 전달 비히클이 더 높은 형질도입 효율(유전자 전달 비히클로 형질도입된 세포의 비율(%)로 정의)로 형질도입되는, 세포 집단이 프로테아좀 억제제와 함께 배양될 수 있는 기간을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "형질도입 효율"이라는 용어는, 프로스타글란딘 신호전달을 증가시키는 화합물 부재하에서 유사 유전자 전달 비히클과 접촉된 유사 세포 집단 대비, 프로스타글란딘 신호전달을 증가시키는 화합물과 함께 배양된, 유전자 전달 비히클이 형질도입된 세포의 비율(%)을 지칭한다.
"소분자," "소형 유기 분자," 또는 "소분자 화합물"이란, 분자량이 약 5 kD 미만, 약 4 kD 미만, 약 3 kD 미만, 약 2 kD 미만, 약 1 kD 미만, 또는 약 0.5 kD 미만인 저분자량 화합물을 지칭한다. 특정 측면에서, 소분자로는 핵산, 펩티드, 펩티도미메틱, 펩토이드, 다른 소형 유기 화합물 또는 약물 등을 포함할 수 있다. 예컨대, 진균, 박테리아, 또는 조류 추출물과 같은, 화학적 및/또는 생물학적 혼합물의 라이브러리가 당업계에 공지되어 있고, 이는 본 발명의 검정법 중 임의의 것으로 스크리닝될 수 있다. 분자 라이브러리 합성 방법의 예는 문헌 ([Carell et al., 1994a]; [Carell et al., 1994b]; [Cho et al., 1993]; [DeWitt et al., 1993]; [Gallop et al., 1994]; [Zuckermann et al., 1994])에서 살펴볼 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"이라는 용어는 메신저 RNA(mRNA: messenger RNA), RNA, 게놈 RNA(gRNA: genomic RNA), (+) 가닥 RNA(RNA(+)), (-) 가닥 RNA(RNA(-)), 게놈 DNA(gDNA: genomic DNA), 상보적 DNA(cDNA: complementary DNA) 또는 DNA를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 단일 및 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 참조 서열(예컨대, 서열 목록 참조) 중 임의의 것과 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드 또는 변이체를 포함하며, 여기서, 전형적으로 변이체는 참조 서열의 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지하는 것이다. 다양한 예시적인 측면에서, 본 발명은 부분적으로는 바이러스 벡터 및 전달 플라스미드 폴리뉴클레오티드 서열, 및 상기를 포함하는 조성물을 고려한다. 특정 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 치료적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 다른 관심 유전자를 제공한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "폴리뉴클레오티드 변이체" 및 "변이체"라는 용어 등은 참조 폴리뉴클레오티드 서열과 실질적인 서열 동일성을 보이거나, 또는 이하 정의되는 엄격한 조건하에서 참조 서열과 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 상기 용어는 참조 폴리뉴클레오티드와 비교하여 하나 이상의 뉴클레오티드가 부가 또는 결실되거나, 또는 상이한 뉴클레오티드로 대체된 것인 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이와 관련하여, 변경된 폴리뉴클레오티드가 참조 폴리뉴클레오티드의 생물학적 기능 또는 활성을 유지하는 방식으로, 돌연변이, 부가, 결실 및 치환을 포함하는 특정 변경이 참조 폴리뉴클레오티드에 대해 이루어질 수 있다는 것이 당업계에서는 잘 이해되고 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "단리된"이라는 용어는 물질, 예컨대, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 세포에는 실질적으로 또는 본질적으로, 보통은 그의 천연 상태에서 그를 동반하는 성분이 없다는 것을 의미한다. 특정 측면에서, "수득된" 또는 "유래된"이라는 용어는 단리된이라는 것과 동의어로 사용된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 예를 들어, "단리된 폴리뉴클레오티드"는 자연적으로 발생된 상태에서 그 측면에 위치하는 서열로부터 정제된 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 보통은 해당 DNA 단편에 인접해 있는 서열로부터 제거된 DNA 단편을 지칭한다.
폴리뉴클레오티드의 방향을 기술하는 용어로는 5'(보통 유리 포스페이트 기를 가지는 폴리뉴클레오티드 단부), 및 3'(보통 유리 하이드록실(OH) 기를 가지는 폴리뉴클레오티드 단부)을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 서열은 5'에서 3' 방향으로, 또는 3'에서 5' 방향으로 주석이 표시될 수 있다.
"상보적" 및 "상보성"이라는 용어는 염기쌍 형성 법칙에 의해 결부된 폴리뉴클레오티드(즉, 뉴클레오티드 서열)를 지칭한다. 예를 들어, DNA 서열 5' A G T C A T G 3'의 상보적 가닥은 3' T C A G T A C5'이다. 후자 서열은 대개 좌측에 5' 단부 및 우측에 3' 단부를 가지는 역 상보체, 5' CAT GAC T 3'로서 기재된다. 그의 역 상보체와 동일한 서열은 회문 서열로 지칭된다. 핵산의 염기 중 단지 일부만이 염기쌍 형성 법칙에 따라 매칭될 때, 상보성은 "부분적"인 것일 수 있다. 또는, 핵산 사이에 "완전한" 또는 "전체적인" 상보성인 존재할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "핵산 카세트"라는 용어는 RNA를 발현하고, 이어서, 폴리펩티드를 발현할 수 있는 벡터 내의 유전자 서열을 지칭한다. 한 측면에서, 핵산 카세트는 관심 유전자(들), 예컨대, 관심 폴리뉴클레오티드(들)를 함유한다. 또 다른 측면에서, 핵산 카세트는 하나 이상의 발현 제어 서열 및 관심 유전자(들), 예컨대, 관심 폴리뉴클레오티드(들)를 함유한다. 벡터는 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 핵산 카세트를 포함할 수 있다. 핵산 카세트는 카세트 중 핵산이 RNA로 전사될 수 있고, 필요할 경우, 단백질 또는 폴리펩티드로 번역되고, 형질전환된 세포에서의 활성을 위해 요구되는 적절한 번역 후 변형이 이루어지고, 적절한 세포내 구획으로의 표적화에 의해, 또는 세포외 구획 내로의 분비에 의해 생물학적 활성을 위해 적절한 구획으로 이동될 수 있도록 위치별로 및 순차적으로 벡터 내에서 일정 방향으로 배열된다. 바람직하게는, 카세트는 벡터 내로의 삽입이 준비된 상태로 적합화된 그의 3' 및 5' 단부를 가지며, 예컨대, 카세트는 그의 각 단부에 제한 엔도뉴클레아제 부위를 갖는다. 본 발명이 바람직한 측면에서, 핵산 카세트는 유전적 장애, 예컨대, 안장애를 치료, 예방, 또는 호전시키는 데 사용되는 치료적 유전자의 서열을 함유한다. 카세트는 단일 단위로서 플라스미드 또는 바이러스 벡터 내로 제거 및 삽입될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 관심 폴리뉴클레오티드(들)를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "관심 폴리뉴클레오티드(들)"이라는 용어는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 발현 벡터 내로 삽입되는, 폴리펩티드(즉, 관심 폴리펩티드)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
"발현 제어 서열"이라는 용어는, 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오티드의 전사 또는 발현을 지시, 증가, 조절 또는 제어할 수 있는, 하나 이상의 프로모터, 인핸서, 또는 다른 전사 제어 요소 또는 그의 조합을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 특정 측면에서, 본 발명의 벡터는 특정 세포, 세포 유형, 또는 세포 계통, 예컨대, 표적 세포에 특이적인 하나 이상의 발현 제어 서열을 포함하고; 즉, 특정 세포, 세포 유형, 또는 세포 계통에 특이적인 발현 제어 서열에 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오티드의 발현은 표적 세포에서는 발현되지만, 다른 비표적 세포에서는 발현되지 않는다. 벡터 중의, 세포 특이적인 하나 이상의 발현 제어 서열들은 각자 원하는 요법에 따라 동일한 또는 상이한 세포 유형에서 발현될 수 있다. 바람직한 측면에서, 벡터는 조혈 세포, 예컨대, 조혈 줄기 또는 전구 세포에 특이적인 하나 이상의 발현 제어 서열을 포함한다. 다른 바람직한 측면에서, 벡터는 적혈구계 세포에 특이적인 하나 이상의 발현 제어 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "프로모터"라는 용어는 RNA 폴리머라제의 결합 대상이 되는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)의 인식 부위를 지칭한다. "인핸서"라는 용어는 전사를 향상시킬 수 있는 서열을 함유하고, 일부 경우에서는, 또 다른 제어 서열과 비교하여 그의 배향과는 독립적으로 작용할 수 있는 DNA의 세그먼트를 지칭한다. 인핸서는 프로모터 및/또는 다른 인핸서 요소와 협동적으로 또는 상가적으로 작용할 수 있다. "프로모터/인핸서"라는 용어는 프로모터 및 인핸서 기능 둘 모두를 제공할 수 있는 서열을 함유하는 DNA의 세그먼트를 지칭한다.
특정 측면에서, 본 발명의 벡터는 외인성, 내인성 또는 이종성 제어 서열, 예컨대, 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. "내인성" 제어 서열은 게놈 내에서 주어진 유전자에 자연적으로 연결된 것이다. "외인성" 제어 서열은 해당 유전자의 전사가 연결된 인핸서/프로모터에 의해 지시를 받도록 유전자 조작(즉, 분자 생물학 기술)에 의해 유전자에 병렬로 배치된 것이다. "이종성" 제어 서열은 유전적으로 조작된 세포와 상이한 종으로부터 유래하는 외인성 서열이다. "합성" 제어 서열은 1개 초과의 내인성 및/또는 외인성 서열, 및/또는 시험관내에서 또는 인실리코 결정된, 특정 유전자 요법을 위해 최적의 프로모터 및/또는 인핸서 활성을 제공하는 서열의 요소를 포함할 수 있다.
"작동 가능하게 연결된"이라는 용어는 기술된 성분이 그가 그의 의도된 방식으로 작용할 수 있게 허용하는 관계로 존재하는 병렬관계를 지칭한다. 한 측면에서, 상기 용어는 핵산 발현 제어 서열(예컨대, 프로모터, 및/또는 인핸서 또는 다른 발현 제어 서열)과 제2 폴리뉴클레오티드 서열, 예컨대, 관심 폴리뉴클레오티드 사이의 기능적 연결을 지칭하며, 여기서 발현 제어 서열은 제2 서열에 상응하는 핵산의 전사를 지시한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "구성적 발현 제어 서열"이라는 용어는 작동 가능하게 연결된 서열이 계속해서 또는 연속적으로 전사될 수 있게 하는 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서를 지칭한다. 구성적 발현 제어 서열은 매우 다양한 세포 및 조직 유형에서 발현될 수 있게 하는 "편재성" 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서, 또는 제한된 종류의 세포 및 조직 유형에서 각각 발현될 수 있게 하는 "세포 특이적," "세포 유형 특이적," "세포 계통 특이적," 또는 "조직 특이적" 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서일 수 있다. 예시적인 편재성 발현 제어 서열로는 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉각 조기 프로모터, 바이러스 시미안 바이러스 40(SV40)(예컨대, 조기 또는 후기), 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV) LTR 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR, 단순 헤르페스 바이러스(HSV)(티미딘 키나제) 프로모터, 및 백시니아 바이러스로부터의 H5, P7.5, P11 프로모터, 신장 인자 1-알파(EF1a: elongation factor 1-alpha) 프로모터, 조기 성장 반응 1(EGR1: early growth response 1), 페리틴 H(FerH: ferritin H), 페리틴 L(FerL: ferritin L), 글리세르알데히드 3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH: Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase), 진핵성 번역 개시 인자 4A1(EIF4A1: eukaryotic translation initiation factor 4A1), 열 쇼크 70 kDa 단백질 5(HSPAS: heat shock 70 kDa protein 5), 열 쇼크 단백질 90 kDa 베타, 구성원 1(HSP90B1), 열 쇼크 단백질 70 kDa(HSP70), .베타.-키네신(베타-KIN), 인간 ROSA 26 유전자좌(문헌 [Irions et al., Nature Biotechnology 25, 1477-1482 (2007)]), 유비퀴틴 C 프로모터(UBC: Ubiquitin C promoter), 포스포글리세레이트 키나제-1(PGK: phosphoglycerate kinase-1) 프로모터, 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 .베타.-액틴(CAG) 프로모터, 및 .베타.-액틴 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "조건부 발현"은 유도성 발현; 억제성 발현; 특정한 생리적, 생물학적 또는 질환 상태 등을 가진 세포 또는 조직에서의 발현 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 임의 유형의 조건부 발현을 지칭할 수 있다. 이러한 정의는 세포 유형 또는 조직 특이적 발현을 배제하도록 의도되는 것은 아니다. 본 발명의 특정 측면은, 예컨대, 세포, 조직, 유기체 등을, 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 야기하거나, 관심 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가 또는 감소시키는 처리 또는 조건에 가함으로써 발현을 제어하는 것과 같은, 관심 폴리뉴클레오티드의 조건부 발현을 제공한다.
유도성 프로모터/인핸서의 예시적 예로는 스테로이드 유도성 프로모터, 예컨대, 글루코코르티코이드 또는 에스트로겐 수용체를 코딩하는 유전자에 대한 프로모터(상응하는 호르몬 처리에 의해 유도가능), 메탈로티오닌 프로모터(다양한 중금속 처리에 의해 유도가능), MX-1 프로모터(인터페론에 의해 유도가능), "진스위치(GeneSwitch)" 미페프리스톤 조절가능 시스템(문헌 [Sirin et al., 2003, Gene, 323:67]), 큐메이트 유도성 유전자 스위치(WO 2002/088346), 테트라사이클린 의존성 조절 시스템 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
조건부 발현은 또한 부위 특이적 DNA 리콤비나제를 이용함으로써 달성될 수 있다. 본 발명의 특정 측면에 따라, 벡터는 부위 특이적 리콤비나제에 의해 매개되는 재조합을 위해 적어도 하나의(전형적으로 2개의) 부위(들)를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "리콤비나제" 또는 "부위 특이적 리콤비나제"라는 용어는 야생형 단백질(문헌 [Landy, Current Opinion in Biotechnology 3:699-707 (1993)] 참조), 또는 그의 돌연변이체, 유도체(예컨대, 재조합 단백질 서열 또는 그의 단편을 함유하는 융합 단백질), 단편, 및 변이체일 수 있는, 하나 이상의 재조합 부위(예컨대, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 12, 15, 20, 30, 50개 등)를 포함하는 재조합 반응에 관여하는 절제성 또는 통합성 단백질, 효소, 보조인자 또는 회합된 단백질을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서 사용하기에 적합한 리콤비나제의 예시적인 예로는 Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, .PHI.C31, Cin, Tn3 리졸바제, TndX, XerC, XerD, TnpX, Hjc, Gin, SpCCE1, 및 ParA를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
벡터는 임의의 매우 다양한 부위 특이적 리콤비나제에 대한 하나 이상의 재조합 부위를 포함할 수 있다. 부위 특이적 리콤비나제에 대한 표적 부위는 벡터의 통합에 필요한 임의의 부위(들) 이외의 것이라는 것을 이해하여야 한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "재조합 서열," "재조합 부위," 또는 "부위 특이적 재조합 부위"라는 용어는 리콤비나제가 인식하고 결합하는 특정 핵산 서열을 지칭한다.
예를 들어, Cre 리콤비나제에 대한 한 재조합 부위는 8개 염기쌍 코어 서열이 측면에 인접해 있는 2개의 13개 염기쌍의 역전된 반복부(리콤비나제 결합 부위로서 작용)를 포함하는 34개 염기쌍 서열인 loxP이다(문헌 [Sauer, B., Current Opinion in Biotechnology 5:521-527 (1994)]의 도 1 참조). 다른 예시적인 loxP 부위로는 lox511(문헌 [Hoess et al., Nucleic Acids Res. 14: 2287-2300, 1996]; [Bethke and Sauer, Nucleic Acids Res; 25: 2828-2834, 1997]); lox5171(문헌 [Lee and Saito, Gene. 216: 55-65, 1998]); lox2272(문헌 [Lee and Saito, Gene. 216: 55-65, 1998]); m2(문헌 [Langer et al., Nucleic Acids Res. 30: 3067-3077, 2002]), lox71(문헌 [Albert et al., Plant J.; 7: 649-659, 1995]), 및 lox66(문헌 [Albert et al., Plant J.; 7: 649-659,1995])을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
FLP 리콤비나제에 적합한 인식 부위로는 FRT(문헌 [McLeod, et al., 1996]), F1, F2, F3(문헌 [Schlake and Bode, 1994]), F4, F5(문헌 [Schlake and Bode, 1994]), FRT(LE)(문헌 [Senecoff et al., 1988]) 및 FRT(RE)(문헌 [Senecoff et al., 1988])를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "내부 리보솜 진입 부위" 또는 "IRES(internal ribosome entry site)"는 시스트론(단백질 코딩 영역)의 개시 코돈, 예컨대, ATG로의 직접적인 내부 리보솜 진입을 촉진하여, 유전자의 캡-비의존적 번역을 유도하는 요소를 지칭한다. 예컨대, 문헌 [Jackson et al., 1990. Trends Biochem Sci 15(12):477-83] 및 [Jackson and Kaminski. 1995. RNA 1(10):985-1000]을 참조한다. 특정 측면에서, 본 발명에 의해 고려되는 벡터는 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 측면에서, 복수 개의 폴리펩티드 각각의 효율적인 번역을 달성하기 위해서, 폴리뉴클레오티드 서열은 자가 절단 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 하나 이상의 IRES 서열에 의해 이격될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "코작(Kozak) 서열"이라는 용어는 리보솜의 소형 서브유니트에의 mRNA의 초기 결합을 크게 촉진시키고, 번역을 증가시키는 짧은 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 공통 코작 서열은 (GCC)RCCATGG(서열 번호: 1)(여기서, R은 퓨린(A 또는 G)이다)이다(문헌 [Kozak, 1986. Cell. 44(2):283-92], 및 [Kozak, 1987. Nucleic Acids Res. 15(20):8125-48]). 특정 측면에서, 본 발명에 의해 고려되는 벡터는 공통 코작 서열을 가지고, 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
특정 측면에서, 벡터는 선별가능한 마커로도 명명되는 선별 유전자를 포함한다. 예컨대, 바실러스(Bacillus)에 대한 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자와 같은, 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예컨대, 암피실린, 네오마이신, 하이그로마이신, 메토트렉세이트, 제오신(Zeocin), 블라스토시딘(Blastocidin) 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용할 수 없는 중요한 영양소를 공급하는 단백질을 코딩한다. 임의 개수의 선별 시스템이 형질전환된 세포주를 회수하는 데 이용될 수 있다. 이는 각각 tk- 또는 aprt-세포에서 이용될 수 있는 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제(문헌 [Wigler et al., 1977. Cell 11:223-232]) 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(문헌 [Lowy et al., 1990. Cell 22:817-823]) 유전자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
다양한 측면에서, 본 발명의 벡터는 하나 이상의 폴리펩티드의 발현을 증가, 확립 및/또는 유지시키기 위해 사용된다. "폴리펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 아미노산 잔기의 폴리머 및 그의 변이체 및 합성 유사체를 지칭하는 데 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 따라서, 상기 용어는, 하나 이상의 아미노산 잔기가 자연적으로 발생된 아미노산 폴리머뿐만 아니라, 예컨대, 상응하는 자연적으로 발생된 아미노산의 화학적 유사체와 같은 합성 비자연적으로 발생된 아미노산에도 적용된다.
본 발명의 특정 측면은 또한 폴리펩티드 "변이체"를 포함한다. 설명되는 폴리펩티드 "변이체"는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 부가, 결실, 말단절단 및/또는 치환에 의해 참조 폴리펩티드와 구별되고, 생물학적 활성을 유지하는 폴리펩티드를 지칭한다. 특정 측면에서, 폴리펩티드 변이체는 당업계에 공지된 바와 같이, 보존적 또는 비보존적일 수 있는, 하나 이상의 치환에 의해 참조 폴리펩티드와 구별된다.
특정 측면에서, 변이체 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드의 상응하는 서열과 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성 또는 유사성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 측면에서, 아미노산 부가 또는 결실은 참조 폴리펩티드의 C 말단 단부 및/또는 N 말단 단부에서 발생한다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드는 아미노산 치환, 결실, 말단절단 및 삽입을 비롯한, 다양한 방식으로 변경될 수 있다. 상기 조작 방법은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 참조 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체는 DNA에서의 돌연변이에 의해 제조될 수 있다. 돌연변이유발 및 뉴클레오티드 서열 변경 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Kunkel (1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488-492)], [Kunkel et al., (1987, Methods in Enzymol, 154: 367-382)], 미국 특허 번호 4,873,192, [Watson, J. D. et al., (Molecular Biology of the Gene, Fourth Edition, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif , 1987)] 및 상기 문헌에서 인용된 참조문헌을 참조한다. 관심 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 적절한 아미노산 치환에 대한 가이던스는 문헌 [Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.)]의 모델에서 살펴볼 수 있다.
"숙주 세포"는 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 본 발명의 재조합 벡터 또는 폴리뉴클레오티드로 형질감염, 감염, 또는 형질도입된 세포를 포함한다. 숙주 세포는 패키징 세포, 생산자 세포, 및 바이러스 벡터로 감염된 세포를 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 본 발명의 바이러스 벡터로 감염된 숙주 세포는 요법을 필요로 하는 피험체에게 투여된다. 특정 측면에서, "표적 세포"라는 용어는 숙주 세포와 상호교환적으로 사용되고, 이는 원하는 세포 유형의 형질감염된, 감염된 또는 형질도입된 세포를 지칭한다.
대규모 바이러스 입자 제조는 종종 타당한 바이러스 역가를 달성하기 위해 필요하다. 바이러스 입자는 전달 벡터를, 바이러스 구조 및/또는 부속 유전자, 예컨대, gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu, vpx 또는 nef 유전자 또는 다른 레트로바이러스 유전자를 포함하는 패키징 세포주 내로 형질감염시킴으로써 제조된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "패키징 벡터"라는 용어는 패키징 신호가 결여되고, 1, 2, 3, 4개 이상의 바이러스 구조 및/또는 부속 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 또는 바이러스 벡터를 지칭한다. 전형적으로, 패키징 벡터는 패키징 세포에 포함되고, 형질감염, 형질도입 또는 감염을 통해 세포로 도입된다. 형질감염, 형질도입 또는 감염 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 본 발명의 레트로바이러스/렌티바이러스 전달 벡터는 생산자 세포 또는 세포주가 생성되도록, 형질감염, 형질도입 또는 감염을 통해 패키징 세포주로 도입될 수 있다. 본 발명의 패키징 벡터는 예컨대, 인산칼슘 형질감염, 리포펙션 또는 전기천공을 비롯한, 표준 방법에 의해 인간 세포 또는 세포주 내로 도입될 수 있다. 일부 측면에서, 패키징 벡터는 우성 선별가능한 마커, 예컨대, 네오마이신, 하이그로마이신, 퓨로마이신, 블라스토시딘, 제오신, 티미딘 키나제, DHFR, Gln 신타제 또는 ADA와 함께 세포 내로 도입된 후, 적절한 약물 존재하에서 선별되고, 클론 단리된다. 선별가능한 마커는 패키징 벡터에 의해, 예컨대, IRES 또는 자가 절단성 바이러스 펩티드에 의해 코딩되는 유전자에 물리적으로 연결될 수 있다.
바이러스 외피 단백질(env)은 세포주로부터 생성되는 재조합 레트로바이러스에 의해 궁극적으로 감염 및 형질전환될 수 있는 숙주 세포의 범위를 결정한다. 렌티바이러스, 예컨대, HIV-1, HIV-2, SIV, FIV 및 EIV의 경우, env 단백질은 gp41 및 gp120을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 패키징 세포에 의해 발현되는 바이러스 env 단백질은 앞서 기술된 바와 같이, 바이러스 gag 및 pol 유전자와 별개의 벡터 상에서 코딩된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "패키징 세포주"라는 용어는 패키징 신호를 함유하지 않지만, 바이러스 입자의 올바른 패키징에 필요한 바이러스의 구조 단백질 및 복제 단백질(예컨대, gag, pol 및 env)을 안정하게 또는 일시적으로 발현하는 세포주와 관련하여 사용된다. 임의의 적합한 세포주는 본 발명의 패키징 세포를 제조하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 세포는 포유동물 세포이다. 특정 측면에서, 패키징 세포주를 제조하는 데 사용되는 세포는 인간 세포이다. 사용될 수 있는 적합한 세포주로는 예를 들어, CHO 세포, BHK 세포, MDCK 세포, C3H 10T1/2 세포, FLY 세포, Psi-2 세포, BOSC 23 세포, PA317 세포, WEHI 세포, COS 세포, BSC 1 세포, BSC 40 세포, BMT 10 세포, VERO 세포, W138 세포, MRCS 세포, A549 세포, HT1080 세포, 293 세포, 293T 세포, B-50 세포, 3T3 세포, NIH3T3 세포, HepG2 세포, Saos-2 세포, Huh7 세포, HeLa 세포, W163 세포, 211 세포, 및 211A 세포를 포함한다. 바람직한 측면에서, 패키징 세포는 293 세포, 293T 세포, 또는 A549 세포이다. 또 다른 바람직한 측면에서, 세포는 A549 세포이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "생산자 세포주"라는 용어는 패키징 세포주 및 패키징 신호를 포함하는 전달 벡터 구성체를 포함하는, 재조합 레트로바이러스 입자를 생산할 수 있는 세포주를 지칭한다. 감염성 바이러스 입자 및 바이러스 스톡 용액의 제조는 통상의 기술을 사용해서 수행될 수 있다. 바이러스 스톡 용액 제조 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예컨대, 문헌 [Y. Soneoka et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23:628-633], 및 [N. R. Landau et al. (1992) J. Virol. 66:5110-5113]에 예시되어 있다. 감염성 바이러스 입자는 통상의 기술을 사용하여 패키징 세포로부터 수집될 수 있다. 예를 들어, 감염성 입자는 당업계에 공지된 바와 같이, 세포 용해에 의해, 또는 세포 배양물의 상청액의 수집에 의해 수집될 수 있다. 임의적으로, 수집된 바이러스 입자는 원하는 경우, 정제될 수 있다. 적합한 정제 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
"향상시키다," 또는 "촉진시키다," 또는 "증가시키다," 또는 "확장시키다"라는 것은 일반적으로, 비히클 또는 대조군 분자/조성물이 형질도입된 세포 개수와 비교하여, 형질도입된 세포의 개수가 더 높도록 유도하거나, 또는 유발하거나, 또는 더 높은 개수의 형질도입된 세포를 생성할 수 있는 본 발명의 조성물 및/또는 방법의 능력을 지칭한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법으로 형질도입된 조혈 줄기 세포는 현존 형질도입 조성물 및 방법과 비교하여, 형질도입된 세포 개수의 증가를 포함한다. 세포 형질도입 증가는 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 그 중에서도 리포터 검정법, RT-PCR, 및 세포 표면 단백질 발현을 사용하여 확인할 수 있다. 형질도입의 "증가된" 또는 "향상된" 양은 전형적으로 "통계적으로 유의적인" 양이며, 비히클, 대조군 조성물, 또는 다른 형질도입 방법에 의해 형질도입된 세포 개수의 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30배 이상(예컨대, 500, 1,000배)(그 사이 및 1 초과의 모든 정수 및 소수점, 예컨대, 1.5, 1.6, 1.7. 1.8 등 포함)인 증가를 포함할 수 있다.
"감소시키다," "낮추다," "줄이다," 또는 "저감하다," "약화시키다"라는 것은 일반적으로 본 발명에 따른 조성물 및/또는 방법에 따라 형질도입된 세포와 비교하여 비교적 더 적은 개수의 형질도입된 세포를 가지도록 하는 조성물 또는 방법을 지칭한다. 형질도입된 세포의 "감소된" 또는 "저감된" 양은 전형적으로 "통계적으로 유의적인" 양이며, 본 발명에 따른 조성물 및/또는 방법에 의해 생성된 형질도입된 세포의 개수(참조 반응)의 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30배 이상(예컨대, 500, 1,000배)(그 사이 및 1 초과의 모든 정수 및 소수점, 예컨대, 1.5, 1.6, 1.7. 1.8 등 포함)인 감소를 포함할 수 있다.
"유지하다," 또는 "보존하다," 또는 "유지," 또는 변화 없음," 또는 "실질적인 변화 없음," 또는 "실질적인 감소 없음"이란, 일반적으로 생리적 반응이 비히클, 대조군 분자/조성물에 의해 유발된 반응, 또는 특정 세포 계통에서의 반응과 유사하다는 것을 지칭한다. 유사한 반응은 참조 반응과 유의적으로 상이하지 않거나, 또는 측정가능하게 상이하지 않은 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "피험체"란 개체를 의미한다. 따라서, "피험체"는 사육 동물(예컨대, 고양이, 개 등), 가축(예컨대, 소, 말, 돼지, 양, 염소 등), 실험실용 동물(예컨대, 마우스, 토끼, 래트, 기니 피그 등), 및 조류를 포함할 수 있다. "피험체"는 또한 포유동물, 예컨대, 영장류 또는 인간을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 피험체는 인간이다. "그를 필요로 하는 피험체"란, 안질환 또는 안장애를 앓거나, 안질환 또는 안장애가 발생할 위험 또는 그를 앓을 위험이 있는 피험체이다. 안질환 또는 안장애가 발생할 위험 또는 그를 앓을 위험이 있는 피험체는 당업계의 통상의 방법을 사용하여 의사 또는 안과 전문의에 의해 진단받을 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "치료" 또는 "치료하는"이라는 것은 질환 또는 병적 상태의 증상 또는 병상에 미치는 임의의 유익한 또는 바람직한 효과를 포함하고, 심지어는 치료되는 질환 또는 병태의 하나 이상의 측정 가능한 마커의 최소의 감소조차도 포함할 수 있다. 치료는 임의적으로 질환 또는 병태의 증상의 감소 또는 호전, 또는 질환 또는 병태의 진행 지연을 포함할 수 있다. "치료"가 반드시 질환 또는 병태, 또는 그의 연관된 증상의 완전한 근절 또는 치유를 의미할 필요는 없다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "예방하다," 및 예컨대, "예방된," "예방하는" 등과 같은 유사 단어는 질환 또는 병태의 발생 또는 재발 가능성을 막거나, 억제시키거나, 또는 감소시키는 접근법을 의미한다. 이는 또한 질환 또는 병태의 발생 또는 재발을 지연시키거나, 또는 질환 또는 병태의 증상의 발생 또는 재발을 지연시키는 것을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "예방" 및 유사 단어는 또한 질환 또는 병태가 발병 또는 재발되기 이전에 질환 또는 병태의 감소, 효과, 증상 및/또는 부담을 감소시키는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "양"이라는 용어는 바이러스 또는 형질도입된 치료적 세포의, 임상적 결과를 비롯한, 유익한 또는 원하는 예방적 또는 치료적 결과를 달성하는 데 "효과적인 양" 또는 그를 달성하기 위한 "유효량"을 지칭한다.
"예방적 유효량"이란, 원하는 예방적 결과를 달성하는 데 효과적인, 바이러스 또는 형질도입된 치료적 세포의 양을 지칭한다. 반드시 그러한 것은 아니지만, 전형적으로는, 질환의 조기 단계 이전 또는 조긴 단계에서는 피험체에서 예방 용량이 사용되기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 적다.
바이러스 또는 형질도입된 치료적 세포의 "치료적 유효량"은 예컨대, 질환 상태, 개체의 연령, 성별, 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 유도할 수 있는 줄기 및 전구 세포의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 치료적 유효량은 또한 치료적으로 유익한 효과가 바이러스 또는 형질도입된 치료적 세포의 임의의 독성 유해한 효과를 능가하는 양이다. "치료적 유효량"이라는 용어는 피험체(예컨대, 환자)를 "치료하는 데" 효과적인 양을 포함한다.
본원에서 사용되는 "하나"("a," "an") 및 "그"라는 관사는 상기 관사의 문법상 개체 하나, 또는 1개 초과(즉, 적어도 하나)를 지칭한다. 예로서, "한 요소"란, 하나의 요소, 또는 1개 초과의 요소를 의미한다.
대안적 표현(예컨대, "또는")의 사용은 대안 중 하나, 그 둘 모두, 또는 그의 임의 조합을 의미하는 것으로 이해하여야 한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "포함하다(include)" 및 "포함하다(comprise)"라는 용어는 동의어로 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "약" 또는 "대략"이라는 용어는 정량, 수준, 값, 개수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이가 참조 정량, 수준, 값, 개수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이 대비 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%만큼까지 변화한다는 것을 지칭한다. 한 측면에서, "약" 또는 "대략"이라는 용어는 정량, 수준, 값, 개수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이 범위가 참조 정량, 수준, 값, 개수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 .+-.15%, .+-.10%, .+-.9%, .+-.8%, .+-.7%, .+-.6%, .+-.5%, .+-.4%, .+-.3%, .+-.2%, 또는 .+-.1%라는 것을 지칭한다.
본 명세서 전역에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, "포함한다(comprise)", "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"이라는 단어는 언급된 단계 또는 요소, 또는 단계들 또는 요소들로 이루어진 군을 포함하지만, 어떤 다른 단계 또는 요소, 또는 단계들 또는 요소들로 이루어진 군을 배제하지는 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. "∼로 구성된"이라는 것은 "∼로 구성된"이라는 어구에 이어지는 것이 무엇이든지 포함하며, 이에 제한된다는 것을 의미한다. 따라서, "∼로 구성된"이라는 어구는 열거된 요소가 필요하거나 필수적인 것이고, 다른 요소는 존재할 수 없다는 것을 의미한다. "본질적으로 ∼로 구성된"이라는 것은 상기 어구 다음에 열거된 임의의 요소를 포함하고, 본 개시내용에서 언급된, 열거된 요소에 대한 활성 또는 작용을 방해하지 않거나, 또는 그에 기여하는 다른 요소들로 제한되는 것을 의미한다. 따라서, "본질적으로 ∼로 구성된"이라는 어구는 열거된 요소가 필요하거나 필수적이지만, 다른 요소는 임의적인 것이 아니며, 열거된 요소의 활성 또는 작용에 영향을 미치는지 여부에 따라 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예
실시예 1: 망막 양극 세포에서의 AAV 매개 형질도입 효율에 대한 프로테아좀 억제제의 평가
트랜스진, mCherry의 발현을 이용하여, MV 형질도입 효율을 평가하였다. 망막 양극 세포에서의 mCherry의 표적화된 발현은 mGiuR6 프로모터를 보유하는 rMV2 벡터에 의해 이루어졌다. 프로테아좀 억제제를 함유하거나 함유하지 않는, 5 x 1012 vg(바이러스 게놈 접촉 입자)/ml 농도의 rMV 벡터를 약 1월령의 C57BL/6J 마우스의 눈에 유리체내로 주사하였다. mCherry 발현을 측정하기 위해, 바이러스 주사 후 약 1개월 경과하였을 때, 동물을 안락사시켰다.
결과: 본 발명자들은 3종의 프로테아좀 억제제, MG132, 독소루비신, 및 아클라루비신이 망막 양극 세포에서의 rMV 매개 형질도입 효율에 미치는 효과를 시험하였다. 200 μM 내지 800 μM의 독소루비신으로 처리된 망막은 농도에 의존하는 방식으로 형질도입 효율의 증가를 보였다. 2,000 M 농도의 독소루비신은, 망막 박막화 및 mCherry 발현 양극 세포수 감소로 입증되는 바와 같이, 세포독성을 일으켰다. MV 형질도입 효율을 향상시키는 독소루비신의 최적 농도는 500 μM이었다. MG132(100 μM, 200 μM, 500 μM) 및 아클라루비신(50 μM, 100 μM)은 형질도입 효율을 향상시키지 않는 것으로 확인되었다(도 1-4).
다른 실시양태
본 발명이 그의 상세한 설명과 함께 기술되었지만, 상기 상세한 설명은 본 발명을 예시하고자 하는 것이고, 그의 범주를 제한하고자 하는 것이 아니며, 본 발명의 범주는 첨부된 특허청구범위의 범주에 의해서 정의된다. 다른 측면, 이점 및 변형은 하기 특허청구범위의 범주에 포함된다.
본원에서 언급된 특허 및 과학 문헌은 당업자에게 이용가능한 지식을 확립한다. 본원에서 인용된 모든 미국 특허 및 공개 또는 비공개된 미국 특허 출원은 참조로 포함된다. 본원에서 인용된 모든 공개된 외국 특허 및 특허 출원은 본원에서 참조로 포함된다. 본원에서 인용된 모든 다른 공개된 참고문헌, 문서, 원고 및 과학 문헌은 본원에서 참조로 포함된다.
본 발명은 특별히 본 발명의 바람직한 실시양태를 참조로 하여 제시되고, 기술되었지만, 당업자는 첨부된 특허청구범위에 포함되는 본 발명의 범주에서 벗어나지 않으면서 이에 대한 형태 및 세부사항을 다양하게 변화시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> WAYNE STATE UNIVERITY Pan, Zhuo-hua Cui, Shengjie Abrams, Gary <120> METHOD OF ENHANCING VIRAL-MEDIATED GENE DELIVERY <130> RTRO-706/001WO (322116-2054) <150> US 62/331,281 <151> 2016-05-03 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide, where R is a purine (A or G) <400> 1 gccrccatgg 10 <210> 2 <211> 1784 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 caagcaggag gctgctgtgt gctgggagct gtcaggctcg tcctgaacag ggaagggccc 60 atccacctcc caaacccagt ttatgcagtc cttcgcaatg tcaggctcag ggcctggcac 120 cagccaagct ccccaccctt cccactgtta aaatggatag gagcagggct aggcccagcc 180 tgttgactct gggcttccac caggagaagt ggttctggca gtagaaacta tcggggcctg 240 ggagaggcgg gggaagagag aaaggtggca tgtttcttgc ttgctccctc taccagcctt 300 gtccaaatcc ccgcagccac cctaatccag cctgtctaat ggagcccaag ccggctcagg 360 ccctcggacg aggagcctgc taatccctgt ggctaggagc tcaccacctg tctccaggac 420 gccctttgct ctcttggcat cagagagcca aatcctgggc ctcggatggg gggatgataa 480 aagcatcttt tggccaagcc ccctcacctt ggcctccacg atgagatggg gagttaggtg 540 cagagagcgt tggcacagtg agcaccgcag ctcgagtggc tgcctcagac ccagagcccg 600 aggagacttt atacggagcc agaacgaccc cgcggggttc catcctccca agcaataggc 660 gggagtggga gctgcgagga aagccggccc ctcccctccc tccatccaag gcagtgtggg 720 ctgtttgttt catgccattc tgggtgtgaa tcctgatgcc cacacatgcc agctgcatgc 780 acttgggcaa ctcaactcac tcctcgaggg ctgtttctcg actgcagggt gttgtaagtt 840 cgctaatact aaaggcttct ccctcctggc cccttcctgc ccctcgctct tcctcctctt 900 ccttaggccc tcccagctca ggcagcccct gccccctgca gggttctgca aggagaaagc 960 tggggaatac cttaggcaac tgcagtcagg agcactggtg gccaggacag agacagagag 1020 acagaaaagg ggtcagggac agagagagat aaccgcaggg agagacagga agggacagag 1080 acagaaaaga tttccaagaa gaggacagag gcagaaagcc agggacagag actgagaaac 1140 agagacctag aggcagaaga agactgagat agagatggac agagattgtg tcagacacag 1200 ccccagagac agccagacag tctgagtcag acgcaaacca aagacaagaa aacaggaaaa 1260 cagacccaga gattgggaga gggaggggaa ggagatgcgg ggagagccag caccgccacc 1320 ccccacactc aggaggggtc tccaccctcg gagcggtctc tcatccctcc ctagaatcct 1380 taaatcctct ctcgctcagg gcctcggccg catctgtcac agacttgtcc tgaaccgaca 1440 gcggctggcg caggtgactg gcttggggcg ggagcctggg tgtgcgctgg ggatggaccc 1500 cgaggaagag gggccaagct gtcgggaagc ggcagggctg gaggggtgga ggcagtggtc 1560 gggcgggacc ccgggcgaca gggttcggcg cttgtaagag cgagacggag gcccgggcag 1620 gccggctgag ctaactcccc agagccgaag tggaaggcgc gccccgagcg ccttctcccc 1680 aggaccccgg tgtccctccc cgcgccccga gcccgcgctc tccttccccc gccctcagag 1740 cgctccccgc ccctctgtct ccccgcagcc cgctagacga gccg 1784 <210> 3 <211> 3773 <212> DNA <213> Chlamydomonas reinhardtii <400> 3 cttgactacg cttcgctgta ataatagcag cgccacaagt agtgtcgcca gacaactctc 60 actttgagct tgagcacacc gctgagcccc gatgtcgcgg aggccatggc ttcttgccct 120 agcgctggca gtggcgctgg cggccggcag cgcaggagcc tcgactggca gtgacgcgac 180 ggtgccggtc gcgactcagg atggccccga ctacgttttc caccgtgccc acgagcgcat 240 gctcttccaa acctcataca ctcttgagaa caatggttct gttatttgca tcccgaacaa 300 cggccagtgc ttctgcttgg cttggcttaa atccaacgga acaaatgccg agaagttggc 360 tgccaacatt ctgcagtgga ttacttttgc gctttcagcg ctctgcctga tgttctacgg 420 ctaccagacc tggaagtcta cttgcggctg ggaggagatt tacgtggcca cgatcgagat 480 gatcaagttc atcatcgagt atttccatga gtttgacgaa cctgcggtga tctactcatc 540 caacggcaac aagaccgtgt ggcttcgtta cgcggagtgg ctgctgacct gccctgtcat 600 tcttatccat ctgagcaacc ttacgggtct ggcgaacgac tataacaagc gtaccatggg 660 tctgctggtg tcagatatcg gcacgatcgt gtggggcacc acggccgcgc tgtccaaggg 720 atacgtccgt gtcattttct tcctgatggg cctgtgctac ggcatctaca cattcttcaa 780 cgcagccaag gtctacattg aggcgtacca caccgtgccc aagggcattt gccgcgacct 840 ggtccgctac cttgcctggc tctacttctg ttcatgggct atgttcccgg tgctgttcct 900 gctgggcccc gagggctttg gccacatcaa ccaattcaac tctgccatcg cccacgccat 960 cctggacctt gcctccaaga acgcttggag tatgatgggt cactttctgc gtgtcaagat 1020 ccacgagcac atcctgctgt acggcgacat ccgcaagaag cagaaggtca acgtggctgg 1080 ccaggagatg gaggtggaga ccatggtgca cgaggaggac gacgagacgc agaaggtgcc 1140 cacggcaaag tacgccaacc gcgactcgtt catcatcatg cgcgaccgcc tcaaggagaa 1200 gggcttcgag acccgcgcct cgctggacgg cgacccgaac ggcgacgccg aggccaacgc 1260 tgcagccggc ggcaagcccg gaatggagat gggcaagatg accggcatgg gcatgggcat 1320 gggtgccggc atgggcatgg cgaccatcga ttcgggccgc gtcatcctcg ccgtgccgga 1380 catctccatg gtggactttt tccgcgagca gttcgcgcgg ctgcccgtgc cctacgaact 1440 ggtgcccgcg ctgggcgcgg agaacaccct ccagctggtg cagcaggcgc agtcactggg 1500 aggctgcgac ttcgtcctca tgcaccccga gttcctgcgc gaccgcagtc ccacgggtct 1560 gctgccccgc ctcaagatgg gcgggcagcg cgccgcggcc ttcggctggg cggcaatcgg 1620 ccccatgcgg gacttgatcg agggttcggg cgttgacggc tggctggagg gccccagctt 1680 tggcgccggc atcaaccagc aggcgctggt ggcgctgatc aaccgcatgc agcaggccaa 1740 gaagatgggc atgatgggcg gtatgggtat gggcatgggc ggcggcatgg gtatgggcat 1800 gggtatgggc atgggcatgg cccccagcat gaacgccggc atgactggcg gcatgggcgg 1860 cgcctccatg ggcggtgccg tgatgggcat gggcatgggc atgcagccca tgcagcaggc 1920 tatgccggcc atgtcgccca tgatgactca gcagcccagc atgatgagtc agccctccgc 1980 catgagcgcc ggcggcgcca tgcaggccat gggtggcgtc atgcccagcc ccgcccccgg 2040 cggccgcgtg ggcaccaacc cgctgtttgg ctctgcgccc tctccgctga gctcgcagcc 2100 cggcatcagc cctggcatgg cgacgccgcc cgccgccacc gccgcacccg ccgctggcgg 2160 cagcgaggcc gagatgctgc agcagctgat gagcgagatc aaccgcctga agaacgagct 2220 gggcgagtaa actgctggcc cagccgtacg gacatatgcc tgctgaggca ccagcgccgc 2280 aacacacatc gccgcagctg tcgcggctgc catgttggat ttgcgcgtgg cggcgtggtg 2340 gtgtggtggt gtggtggcag gaacaagggc gaagctttaa cttacccggc gctcagcgct 2400 tcgttcatag gttcggcgct tgagccgtgg tagcggcaag tgtgccgcgg caacgcgggg 2460 caaagcgaag acgccgatga cttgacgcct ggtatgacac cttggtctat gaagtcgcgc 2520 tgcggtgctg ggatcaagaa acagcaactc gaggaaggta tcatcgagcg tcgttataca 2580 gcagacaagg tacgaaacgg tgtgcaggag ggcatgcaca gcagcttcaa atggcacgtg 2640 catggctctg ttgcgaacaa gctgctctga gacacggatt gagagccctt aatcggtggt 2700 cacaagaggt ggggttacgg tatcggggcg ctgcgatagt cctgcaagtg ctgcctgttg 2760 aacacaaggg ctcagaattt atggcaggga aggtcaaggc cgagaatggc cgcgtgcgtg 2820 atttattgtt tgagccaggg cttgttgata ctgtattaat catgcgtgtg tgtttgtgtg 2880 cgtgaacgtg acccgacgga ttccgtgagc cgctgcgcat gcaagatccg gccctgacct 2940 atgtcctagt acaagccgat cgtgcttggc ctgccttgat taatgcgtcg cctgaggatt 3000 cccgtttgtg gcttttaagg agcgcgaata cggcagttac gtgacctgct tgtcgggttg 3060 gggaaatccg tctggtgtgt acctggcctg gccggctgat cgggtctgct tccggcaagt 3120 aactgtgcgg gtgaaactac aaaaggcagc gccggttgtg ggcgtcgttt tggttggttt 3180 ggcggggttc ccattgcaat gtgtgtttcc ataaatcatg ggcgacactg gatggaacgg 3240 ctttggcttg cgcggaggct tctcaggtcg gtacctaata ttgccataac ctctctttca 3300 aacctgcgcc tcctgcaatc aatagatgca gggggctgcg catcaaccct ggggaccata 3360 caatgcttaa ttccgctctg caattattcg agtagtggcc tgtcgcggag aagctgcttc 3420 agggtgtcaa tgtggctgca ggacggcaca ataaaagaga gtgtgggagc accgtatcct 3480 gaacagcggt ggattctcag agcctgtggg cgcttgcccg gcgcaccggc cgctcgtggg 3540 gggtagcagc tgcggctggt gtgctgatct tcatttgttt ctgtttgggg gggcacccct 3600 tgctctcgtt ggtgtgagcg ccggtgcgca gttgtaataa gggaagggag cataacgcgg 3660 cgtggcttac actaagagag ttgatacttt gaatcgacgc cttggatgca tgtaaaacca 3720 gaatttgaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 3773 <210> 4 <211> 2236 <212> DNA <213> Chlamydomonas reinhardtii <400> 4 gcgttgcttg actacgcttc gctgtaataa tagcagcgcc acaagtagtg tcgccaaaca 60 actctcactt tgagcttgag cacaccgctg agccccgatg tcgcggaggc catggcttct 120 tgccctagcg ctggcagtgg cgctggcggc cggcagcgca ggagcctcga ctggcagtga 180 cgcgacggtg ccggtcgcga ctcaggatgg ccccgactac gttttccacc gtgcccacga 240 gcgcatgctc ttccaaacct catacactct tgagaacaat ggttctgtta tttgcatccc 300 gaacaacggc cagtgcttct gcttggcttg gcttaaatcc aacggaacaa atgccgagaa 360 gttggctgcc aacattctgc agtggattac ttttgcgctt tcagcgctct gcctgatgtt 420 ctacggctac cagacctgga agtctacttg cggctgggag gagatttacg tggccacgat 480 cgagatgatc aagttcatca tcgagtattt ccatgagttt gacgaacctg cggtgatcta 540 ctcatccaac ggcaacaaga ccgtgtggct tcgttacgcg gagtggctgc tgacctgccc 600 tgtcattctt atccatctga gcaaccttac gggtctggcg aacgactata acaagcgtac 660 catgggtctg ctggtgtcag atatcggcac gatcgtgtgg ggcaccacgg ccgcgctgtc 720 caagggatac gtccgtgtca ttttcttcct gatgggcctg tgctacggca tctacacatt 780 cttcaacgca gccaaggtct acattgaggc gtaccacacc gtgcccaagg gcatttgccg 840 cgacctggtc cgctaccttg cctggctcta cttctgttca tgggctatgt tcccggtgct 900 gttcctgctg ggccccgagg gctttggcca catcaaccaa ttcaactctg ccatcgccca 960 cgccatcctg gaccttgcct ccaagaacgc ttggagtatg atgggtcact ttctgcgtgt 1020 caagatccac gagcacatcc tgctgtacgg cgacatccgc aagaagcaga aggtcaacgt 1080 ggctggccag gagatggagg tggagaccat ggtgcacgag gaggacgacg agacgcagaa 1140 ggtgcccacg gcaaagtacg ccaaccgcga ctcgttcatc atcatgcgcg accgcctcaa 1200 ggagaagggc ttcgagaccc gcgcctcgct ggacggcgac ccgaacggcg acgccgaggc 1260 caacgctgca gccggcggca agcccggaat ggagatgggc aagatgaccg gcatgggcat 1320 gggcatgggt gccggcatgg gcatggcgac catcgattcg ggccgcgtca tcctcgccgt 1380 gccggacatc tccatggtgg actttttccg cgagcagttc gcgcggctgc ccgtgcccta 1440 cgaactggtg cccgcgctgg gcgcggagaa caccctccag ctggtgcagc aggcgcagtc 1500 actgggaggc tgcgacttcg tcctcatgca ccccgagttc ctgcgcgacc gcagtcccac 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ctgctttgtc ttcttcctcc ccctgctcat catcatcttc tgctacatct tcatcttcag 960 ggccatccga gagacaggcc gggcctgtga gggctgcggt gagtcccctc tgcggcagag 1020 gcggcagtgg cagcggctgc agagtgagtg gaagatggcc aaggtcgcac tgattgtcat 1080 tcttctcttc gtgctgtcct gggctcccta ctccactgtg gctctggtgg cctttgctgg 1140 atactcgcac atcctgacgc cctacatgag ctcggtgcca gccgtcatcg ccaaggcttc 1200 tgccatccac aatcccatta tctacgccat cactcacccc aagtacaggg tggccattgc 1260 ccagcacctg ccttgccttg gggtgcttct cggtgtatca ggccagcgca gccacccctc 1320 cctcagctac cgctctaccc accgctccac attgagcagc cagtcctcag acctcagctg 1380 gatctctgga cggaagcgtc aagagtccct gggttctgag agtgaagtgg gctggacaga 1440 cacagaaaca accgctgcat ggggagctgc ccagcaagca agtggacagt ccttctgcag 1500 tcagaaccta gaagatggag aactcaaggc ctcttccagc ccccaggtac agagatctaa 1560 gactcccaag gtgcctggac ccagtacctg ccgccctatg aaaggacagg gagccaggcc 1620 aagtagccta aggggtgacc agaaaggcag gcttgctgtg tgcacaggcc tctcagagtg 1680 tccccatccc catacatccc agtttcccct tgctttccta gaggatgatg tgactctcag 1740 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Arg 85 90 95 Asn Arg Gly Leu Arg Thr Pro Ala Asn Met Phe Ile Ile Asn Leu Ala 100 105 110 Val Ser Asp Phe Leu Met Ser Val Thr Gln Ala Pro Val Phe Phe Ala 115 120 125 Ser Ser Leu Tyr Lys Lys Trp Leu Phe Gly Glu Thr Gly Cys Glu Phe 130 135 140 Tyr Ala Phe Cys Gly Ala Val Phe Gly Ile Thr Ser Met Ile Thr Leu 145 150 155 160 Thr Ala Ile Ala Met Asp Arg Tyr Leu Val Ile Thr Arg Pro Leu Ala 165 170 175 Thr Ile Gly Arg Gly Ser Lys Arg Arg Thr Ala Leu Val Leu Leu Gly 180 185 190 Val Trp Leu Tyr Ala Leu Ala Trp Ser Leu Pro Pro Phe Phe Gly Trp 195 200 205 Ser Ala Tyr Val Pro Glu Gly Leu Leu Thr Ser Cys Ser Trp Asp Tyr 210 215 220 Met Thr Phe Thr Pro Gln Val Arg Ala Tyr Thr Met Leu Leu Phe Cys 225 230 235 240 Phe Val Phe Phe Leu Pro Leu Leu Ile Ile Ile Phe Cys Tyr Ile Phe 245 250 255 Ile Phe Arg Ala Ile Arg Glu Thr Gly Arg Ala Cys Glu Gly Cys Gly 260 265 270 Glu Ser Pro Leu Arg Gln Arg Arg Gln Trp Gln Arg Leu Gln Ser Glu 275 280 285 Trp Lys Met Ala Lys Val Ala Leu Ile Val Ile Leu Leu Phe Val Leu 290 295 300 Ser Trp Ala Pro Tyr Ser Thr Val Ala Leu Val Ala Phe Ala Gly Tyr 305 310 315 320 Ser His Ile Leu Thr Pro Tyr Met Ser Ser Val Pro Ala Val Ile Ala 325 330 335 Lys Ala Ser Ala Ile His Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Ile Thr His Pro 340 345 350 Lys Tyr Arg Val Ala Ile Ala Gln His Leu Pro Cys Leu Gly Val Leu 355 360 365 Leu Gly Val Ser Gly Gln Arg Ser His Pro Ser Leu Ser Tyr Arg Ser 370 375 380 Thr His Arg Ser Thr Leu Ser Ser Gln Ser Ser Asp Leu Ser Trp Ile 385 390 395 400 Ser Gly Arg Lys Arg Gln Glu Ser Leu Gly Ser Glu Ser Glu Val Gly 405 410 415 Trp Thr Asp Thr Glu Thr Thr Ala Ala Trp Gly Ala Ala Gln Gln Ala 420 425 430 Ser Gly Gln Ser Phe Cys Ser Gln Asn Leu Glu Asp Gly Glu Leu Lys 435 440 445 Ala Ser Ser Ser Pro Gln Val Gln Arg Ser Lys Thr Pro Lys Val Pro 450 455 460 Gly Pro Ser Thr Cys Arg Pro Met Lys Gly Gln Gly Ala Arg Pro Ser 465 470 475 480 Ser Leu Arg Gly Asp Gln Lys Gly Arg Leu Ala Val Cys Thr Gly Leu 485 490 495 Ser Glu Cys Pro His Pro His Thr Ser Gln Phe Pro Leu Ala Phe Leu 500 505 510 Glu Asp Asp Val Thr Leu Arg His Leu 515 520

Claims (18)

  1. 피험체의 눈으로의 관심 유전자의 전달을 향상시키는 방법으로서, 피험체의 눈에 프로테아좀 억제제, 및 관심 유전자를 코딩하는 바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프로테아좀 억제제가 독소루비신(DOX), 아클라루비신, 보르테조밉, 락타시스틴, 디술피람 에피갈로카테킨-3-갈레이트 마리조밉(살리노스포라미드 A), 오프로조밉(ONX-0912), 델란조밉(CEP-18770) 에폭소미신, MG132, 베타-하이드록시 베타-메틸부티레이트 또는 카르필조밉인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 관심 유전자가 옵신인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 옵신이 채널로돕신, 할로로돕신, 멜라놉신, 송과체 옵신, 박테리오로돕신, 및 프로테오로돕신, 또는 이들의 기능적 변이체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 관심 유전자가 세포 특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 나노입자, 폴리머, 또는 리포솜에 캡슐화되는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 피험체가 안질환 또는 안장애를 앓는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 안질환이 망막아세포종, 안구 흑색종, 당뇨병성 망막병증, 고혈압성 망막병증, 또는 안조직의 염증인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 프로테아좀 억제제와 상기 바이러스 벡터가 동시에 또는 순차적으로 전달되는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 망막 세포로 전달되는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 망막 세포가 망막 신경절 세포, 망막 양극 세포, 망막 수평 세포, 아마크린 세포, 광수용체 세포, 뮐러 신경교 세포, 또는 망막 색소 상피 세포인 방법.
  12. 제1항 또는 제9항에 있어서, 상기 프로테아좀 억제제 및 상기 바이러스 벡터가 눈의 유리체에 투여되는 것인 방법.
  13. 제1항 또는 제9항에 있어서, 상기 프로테아좀 억제제 및 상기 바이러스 벡터가 주사 또는 주입에 의한 투여 경로로 투여되는 것인 방법.
  14. 제1항 또는 제9항에 있어서, 상기 프로테아좀 억제제 및 상기 바이러스 벡터가 망막하로 투여되지 않는 것인 방법.
  15. 피험체의 광 감수성을 증가시키거나 시력을 개선 또는 회복시키는 방법으로서, 눈의 유리체에 프로테아좀 억제제, 및 옵신을 코딩하는 바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 옵신이 채널로돕신, 할로로돕신, 멜라놉신, 송과체 옵신, 박테리오로돕신, 및 프로테오로돕신, 또는 이들의 기능적 변이체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 피험체가 안질환 또는 안장애를 앓는 것인 방법.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안질환이 망막아세포종, 안구 흑색종, 당뇨병성 망막병증, 고혈압성 망막병증, 또는 안조직의 염증인 방법.
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