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KR20190060881A - 레베르 선천성 흑내장-1(lca1)의 치료를 위한 재조합 아데노-관련된 바이러스-구아닐레이트 사이클라제 조성물 및 방법 - Google Patents

레베르 선천성 흑내장-1(lca1)의 치료를 위한 재조합 아데노-관련된 바이러스-구아닐레이트 사이클라제 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20190060881A
KR20190060881A KR1020197014973A KR20197014973A KR20190060881A KR 20190060881 A KR20190060881 A KR 20190060881A KR 1020197014973 A KR1020197014973 A KR 1020197014973A KR 20197014973 A KR20197014973 A KR 20197014973A KR 20190060881 A KR20190060881 A KR 20190060881A
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KR
South Korea
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leu
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Application number
KR1020197014973A
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English (en)
Inventor
섀넌 엘리자베스 보예
윌리암 더블유 호스워스
샌포드 레온 보예
Original Assignee
유니버시티 오브 플로리다 리서치 파운데이션, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

하나 이상의 생물학적으로 활성인 포유동물 구아닐레이트 사이클라제 단백질을 발현하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 벡터 조성물을 개시한다. 또한 적어도 부분적으로 생체 내 구아닐레이트 사이클라제 결핍으로부터 생성되는 질병, 질환, 이상 상태 또는 기능장애의 하나 이상의 증상을 예방, 치료 및/또는 개선함에 있어서 그의 사용 방법을 개시한다. 특정 실시태양에서, 레베르 선천성 흑내장의 증상뿐만 아니라 작용성 망막-특이성 구아닐레이트 사이클라제 1(retGC1)의 발현의 부재 또는 감소에 의해 야기되는 다른 병을 치료 또는 개선하기 위한 재조합 아데노-관련된 바이러스(rAAV) 벡터의 용도를 개시한다.

Description

레베르 선천성 흑내장-1(LCA1)의 치료를 위한 재조합 아데노-관련된 바이러스-구아닐레이트 사이클라제 조성물 및 방법{RAAV-GUANYLATE CYCLASE COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LEBER'S CONGENITAL AMAUROSIS-1 (LCA1)}
본 발명은 일반적으로 분자 생물학 및 바이러스학의 분야, 및 특히 적어도 제 1 치료 유전자 산물, 및 특히 포유동물 눈의 질병, 질환, 외상, 손상, 또는 기능장애의 하나 이상의 증상의 예방, 치료 또는 개선에 유용한 산물을 암호화하는 적어도 제 1 핵산 분절을 발현하는 재조합 아데노-관련된 바이러스(rAAV) 조성물의 사용 방법에 관한 것이다. 특정 실시태양에서, 본 발명은 예를 들어 포유동물 눈의 하나 이상의 질환 또는 질병의 치료를 포함하여, 특히 인간의 망막 이영양증, 예를 들어 레베르 선천성 흑내장 유형 1(LCA1)을 포함한 선천적인 망막 실명의 치료를 위한 하나 이상의 연구, 진단 및/또는 치료 섭생에 사용하기 위한, 생물학적으로-작용성인 구아닐레이트 사이클라제 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 발현하는 rAAV 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 또한 인간의 구아닐레이트 사이클라제 결핍의 하나 이상의 증상을 치료 또는 개선하기 위한, 예를 들어 rAAV-LCA1 벡터를 포함한 바이러스 벡터-기재 유전자 요법에 사용하기 위한 rAAV 벡터-기재 구아닐레이트 사이클라제 약제의 제조 방법을 제공한다.
관련 분야에 대한 상호 참조
본 출원은 현재 계류중인, 2010년 4월 23일자로 출원된 미국 가 특허 출원 제 61/327,521 호에 대한 우선권을 청구하며, 상기 가 출원의 전체 내용은 그 전체가 본 발명에 참고로 구체적으로 인용된다.
정부 지원 연구 또는 개발에 관한 진술
미국 정부는 미국 국립 보건원(NIH)으로부터 허여 번호 EY13729, EY11123 및 EY08571에 준하여 본 발명에 일정한 권리를 갖는다.
공동 연구 동의에 대한 관계자의 이름
적용 안 됨
관련 분야의 설명
레베르 선천성 흑내장(LCA)(이전에는 "레베르의 선천적인 흑내장")은 1869년에 독일의 안과의사인 테오도르 레베르(Theodor Leber) 박사에 의해 선천적인 유형의 망막색소 변성증(RP)으로서 처음으로 개시되었으며, 유전적인 망막병증 중 가장 초기이고 가장 중증인 형태로, 모든 유전적인 망막 이형성증의 약 6%를 차지한다. LCA는 망막 변성 질병의 한 그룹이며, 아동의 선천적인 실명의 가장 흔한 원인이다. 이러한 상염색체 열성 질환은 대개 태어날 때 또는 유아기의 삶에서 처음 몇개월 동안 인지되며 이때 완전히 실명하거나 또는 크게 손상된 시력, 정상 안저 및 소멸된 망막전도(ERG)를 갖는다(예를 들어 문헌[Perrault et al., 1996]을 참조하시오). 이러한 기능 결손에도 불구하고, LCA1 환자는 수년간 그의 황반 및 망막 주변 중에 일부 간상체 및 추상체 광수용체를 유지한다. 상기 질병의 증상은 망막 기능장애, 흔들리는 안구 움직임(눈 떨림), 손상된 시력, 느린 동공 반응, 및 최종적으로 실명을 포함한다.
유전자 분석을 통해, 상기 LCA1 유전자좌로 지정된 구아닐레이트 사이클라제-1의 돌연변이(Gucy2d)가 LCA의 모든 보고된 사례의 20%를 차지하는 것으로 나타났다(예를 들어 문헌[Milam et al., 2003]; [Perrault et al., 1996]; [Perrault et al., 2000]을 참조하시오). LCA1에 걸린 환자의 수는 상기 질병의 망막 색소 상피-특이성 65-kDa 단백질(RPE65) 버전의 결함(LCA2)(최근 수년간 유전자 요법 단체에서 많은 관심이 집중되었다)에 걸린 환자의 수의 대략 2 배이다.
200,000 명의 미국인이 1형 레베르에 걸린 것으로 추정된다. Gucy2d는, 광수용체 외부 분절 막에서 발현되고(예를 들어 문헌[Dizhoor et al., 1994]; [Liu et al., 1994]을 참조하시오) 광전환의 회복 단계에 한 역할을 하는 구아닐레이트 사이클라제(retGC1)를 암호화한다. 상기 효소의 활성을 감소시키거나 없애는 돌연변이는 간상체 및 추상체 광수용체에서 생화학적 당량의 만성적인 광 노출을 생성시키는 것으로 생각된다. LCA는 대개 광수용체의 손상된 발달이거나 또는 정상적으로 발달된 세포의 매우 이른 퇴화의 결과로서 간주된다. 상기 LCA1 유전자좌(GUCY2D)는 동형접합성 지도작성에 의해 인간 염색체 17p13.1(LCA1)에 위치하였다.
현재 인간의 LCA1을 예방하거나 치료하기 위해 이용할 수 있는 유효한 예방법이나 치료법이 존재하지 않는다.
본 발명은 생물학적으로 활성인 구아닐레이트 사이클라제 폴리펩타이드 활성의 결손 또는 결핍으로부터 생성되거나 또는 이에 의해 악화되는 하나 이상의 포유동물 질병, 질환 또는 기능장애, 또는 그의 하나 이상의 증상의 예방, 치료 및/또는 개선을 위해 하나 이상의 치료학적 포유동물 폴리펩타이드, 및 특히 구아닐레이트 사이클라제 패밀리의 단백질, 펩타이드, 폴리펩타이드를 암호화하는 신규의, 뻔하지 않은, 유용한 rAAV-기재 유전자 구조물을 제공함으로써 종래 기술에 내재하는 한계를 극복한다. 특히, 본 발명은 LCA1과 같은 병, 및 구아닐레이트 사이클라제 폴리펩타이드의 생리학적-정상 수준의 결핍 또는 부재로부터 나타나는 추상체-간상체 이영양증의 열성 및 우성 형태와 같은 안구의 다른 병들의 치료에 사용하기 위한, 하나 이상의 포유동물 망막-특이성 구아닐레이트 사이클라제(retGC1) 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자 구조물을 제공한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 적어도 제 1 포유동물 구아닐레이트 사이클라제 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 제 1 핵산 분절에 작동적으로 결합된 프로모터를 포함하는 적어도 제 1 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 아데노-관련된 바이러스(rAAV) 벡터를 제공한다. 바람직하게는, 상기 프로모터는 광수용체-특이성 프로모터(예를 들어 인간 로돕신 키나제 프로모터), 또는 편재하는 프로모터(예를 들어 절두된 키메릭 CMV-치킨 β-액틴 프로모터)이다. 바람직하게는 상기 제 1 핵산 분절은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11로 나타낸 포유동물 구아닐레이트 사이클라제 단백질들 중 임의의 하나 이상에 나타낸 바와 같은 서열의 적어도 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 또는 약 100 개 이상의 연속적인 아미노산의 적어도 제 1 서열 영역과 적어도 약 80%, 약 85% 또는 약 90% 이상 일치하는 적어도 제 1의 연속적인 아미노산 서열 영역을 포함하거나, 상기 영역으로 필수적으로 이루어지거나, 또는 한편으로 상기 영역으로 이루어진 적어도 제 1 포유동물 구아닐레이트 사이클라제 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화한다.
*몇몇 실시태양에서, 상기 적어도 제 1 핵산 분절은 바람직하게는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 인용된 포유동물 구아닐레이트 사이클라제 단백질 서열 중 임의의 하나 이상에 나타낸 바와 같은 서열의 적어도 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 또는 약 150 개 이상의 연속적인 아미노산의 적어도 제 1 서열 영역과 1차 아미노산 서열이 적어도 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 또는 약 95% 이상 일치하는 적어도 제 1의 연속적인 아미노산 서열 영역을 포함하는 적어도 제 1 포유동물 구아닐레이트 사이클라제 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화한다.
바람직하게는, 상기 적어도 제 1 핵산 분절은 바람직하게는 각각, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11 중 하나 이상에 나타낸 바와 같은 적어도 제 1 구아닐레이트 사이클라제 단백질 중의 적어도 약 90, 약 110, 약 130, 약 150, 또는 약 170 개 이상의 연속적인 아미노산을 포함하는 적어도 제 1 서열 영역과 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 일치하는 적어도 제 1의 연속적인 1차 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나 이상의 포유동물 구아닐레이트 사이클라제 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화할 것이다.
*바람직하게는 본 발명의 rAAV 벡터는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11 중 임의의 하나 이상의 아미노산 서열, 또는 엄격한 내지 고도로 엄격한 하이브리드화 조건 하에서 하나 이상의 상기와 같은 서열에 상보성이거나 또는 특이적으로 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 상기 서열로 필수적으로 이루어지거나, 또는 한편으로 상기 서열로 이루어지는 적어도 제 1 포유동물 구아닐레이트 사이클라제 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 제 1 핵산 분절을 포함한다. 바람직하게는, 상기 제 1 포유동물 구아닐레이트 사이클라제 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 형질전환된 포유동물 세포에서, 및 바람직하게는 형질전환된 인간 숙주 세포에서 시험관 내 및 생체 내 구아닐레이트 사이클라제 활성을 가질 것이다. 특정한 태양에서, 상기 구아닐레이트 사이클라제 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는, 상기 펩타이드, 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분절이 포유동물 및 바람직하게는 인간 숙주 세포에서 상기 서열을 발현할 수 있는 적어도 제 1 프로모터에 작동적으로 결합하는 경우, 형질전환된 포유동물 세포, 및 바람직하게는 형질전환된 인간 숙주 세포에서 중대한 생물학적으로 활성인 시험관 내 및 생체 내 구아닐레이트 사이클라제 활성을 가질 것이다.
본 발명의 rAAV 벡터는 특정한 혈청형으로 반드시 제한되는 것은 아니지만, 몇몇 실시태양에서, 발명자들은 하기의 공지된 혈청형 중 하나 이상인 rAAV 벡터를 사용함으로써 이로운 결과가 성취될 수 있음을 예측한다: 재조합 아데노-관련된 바이러스 혈청형 1(rAAV1), 재조합 아데노-관련된 바이러스 혈청형 2(rAAV2), 재조합 아데노-관련된 바이러스 혈청형 3(rAAV3), 재조합 아데노-관련된 바이러스 혈청형 4(rAAV4), 재조합 아데노-관련된 바이러스 혈청형 5(rAAV5), 재조합 아데노-관련된 바이러스 혈청형 6(rAAV6), 재조합 아데노-관련된 바이러스 혈청형 7(rAAV7), 재조합 아데노-관련된 바이러스 혈청형 8(rAAV8), 또는 재조합 아데노-관련된 바이러스 혈청형 9(rAAV9) 벡터. 몇몇 용도에서, 본 발명의 rAAV 벡터는 자기-상보성 rAAV(scAAV) 벡터일 수도 있다.
광수용체-특이성 프로모터를 목적으로 하는 실시태양에서, 본 발명에 개시된 rAAV 벡터는 적어도 제 1 광수용체-특이성 로돕신 키나제 프로모터를 포함할 수 있다. 예시적인 상기와 같은 프로모터는 인간 로돕신 키나제 프로모터를 포함하며, 이는 서열번호 12에 예시되어 있다. 본 발명의 몇몇 태양에서, 서열번호 12로부터의 약 20 개 이상, 약 25 개 이상, 약 30 개 이상, 약 35 개 이상, 약 40 개 이상, 약 45 개 이상, 또는 약 50 개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하는 프로모터 서열의 사용이, 상기 치료학적 구조물의 조직-특이성(및 특히 광수용체-특이성) 발현을 필요로 하는 경우 특히 바람직하다.
유사하게, 편재하는 프로모터를 목적으로 하는 실시태양에서, 본 발명에 개시된 rAAV 벡터는 적어도 제 1의 절두된 키메릭 CMV-치킨 β-액틴 프로모터를 포함할 수 있다. 예시적인 상기와 같은 프로모터는 절두된 키메릭 CMV-치킨 β-액틴 프로모터를 포함하며, 이는 서열번호 13에 예시되어 있다. 본 발명의 몇몇 태양에서, 서열번호 13으로부터의 약 20 개 이상, 약 25 개 이상, 약 30 개 이상, 약 35 개 이상, 약 40 개 이상, 약 45 개 이상, 또는 약 50 개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하는 프로모터 서열의 사용이, 상기 치료학적 유전자의 비-조직 특이성 발현을 필요로 하는 경우 특히 바람직하다.
일부 실시태양에서, 상기 개시된 치료학적 유전자 구조물에 사용된 프로모터 서열은 서열번호 12 또는 서열번호 13에 열거된 프로모터 서열들로부터 적어도 55 개, 약 60 개, 약 65 개, 약 70 개, 약 75 개, 약 80 개, 약 85 개, 약 90 개, 약 95 개, 약 100 개, 약 105 개, 약 110 개, 약 115 개, 또는 약 120 개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 서열을 포함하거나, 상기 서열로 필수적으로 이루어지거나, 또는 한편으로 상기 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명에 개시된 유전자 요법 벡터는 또한 추가로 하나 이상의 "상향" 또는 "하향" 조절 서열, 예를 들어 상기 적어도 제 1 핵산 분절에 작동적으로 결합된 제 1 인헨서, 또는 전사 조절 영역, 예를 들어 우드척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소를 임의로 포함할 수 있다. 본 발명의 구조물은 또한 추가로 상기 치료제를 암호화하는 상기 적어도 제 1 핵산 분절에 작동적으로 결합된 하나 이상의 인트론 서열을 임의로 포함할 수 있다.
본 발명의 포유동물 구아닐레이트 사이클라제 단백질, 펩타이드 및 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분절은 천연, 반-합성 또는 완전 합성 서열로부터 유래될 수 있으나, 바람직하게는 포유동물 기원의 것일 것이다. 예시적인 포유동물 공급원은 비제한적으로 인간, 비-인간 영장류, 쥐, 고양이, 개, 돼지, 양, 소, 말, 에핀(epine), 염소, 이리 등을 포함한다.
본 발명에 개시된 rAAV 벡터는 감염성 아데노-관련된 바이러스 입자, 비리온 내에, 또는 다수의 감염성 AAV 입자 중 하나 이상 내에 임의로 포함될 수도 있다. 그 자체로서, 본 발명은 비리온, 바이러스 입자뿐만 아니라 개시된 rAAV 유전자 구조물 중 하나 이상을 함유하는 단리된 재조합 숙주 세포를 추가로 포함한다. 본 발명의 실시에 특히 바람직한 숙주 세포는 비제한적으로 rAAV 벡터, AAV 비리온, 또는 다수의 감염성 바이러스 입자 중 하나 이상을 포함하는 단리된 포유동물 숙주 세포를 포함한다.
다른 태양에서, 본 발명은 (a) rAAV 벡터, rAAV 비리온, rAAV 감염성 바이러스 입자, 다수의 상기와 같은 비리온 또는 감염성 입자, 또는 상기 벡터, 상기 비리온, 상기 감염성 입자, 또는 이들 중 다수를 포함하는 단리된 포유동물 숙주 세포 중 하나 이상을 포함하는 신규의 유용한 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기와 같은 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 완충제, 담체, 비히클, 희석제 등을 추가로 임의로 포함할 것이며, 하나 이상의 지질, 리포솜, 지질 복합체, 에토솜, 니오솜, 나노입자, 미세입자, 지질구, 나노캡슐, 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 임의로 포함할 수도 있다. 바람직하게는 상기와 같은 조성물을 바람직하게는 인간 눈에 투여하기 위해 제형화하며, 치료 또는 예방, 및 특히 인간 망막 이영양증, 질병 또는 질환(예를 들어 LCA1)의 치료 또는 예방에 사용할 수도 있다.
하기에 나타내는 바와 같이, 본 발명은 또한 본 발명에 개시된 rAAV 벡터 구조물 중 하나 이상을 포함하는 진단, 치료 및 예방 키트를 포함한다. 상기와 같은 키트는 인간의 망막 이영양증, 질병, 질환 또는 이상 상태의 하나 이상의 증상의 진단, 예방, 치료 또는 개선에 상기 성분을 사용하기 위한 하나 이상의 프로토콜, 투여 섭생, 또는 설명서를 추가로 임의로 포함할 수도 있다. 몇몇 태양에서, 레베르 선천성 흑내장-1(LCA-1)로 진단된 인간 환자의 치료를 위한 치료 키트가 특히 고려된다.
본 발명은 또한 포유동물 질병 또는 질환의 치료 또는 예방에 있어서 상기 개시된 rAAV-기재 조성물들 중 하나 이상의 용도를 포함한다. 마찬가지로, 본 발명은 포유동물 눈의 질병, 질환, 기능장애, 또는 이상 상태의 하나 이상의 증상의 진단, 예방, 치료 또는 개선을 위한, 및 특히 인간의 레베르 선천성 흑내장-1(LCA-1)의 하나 이상의 증상의 치료 또는 개선을 위한 약제의 제조에 있어서 상기 개시된 조성물의 용도를 포함한다.
본 발명은 또한 포유동물의 질병, 기능장애, 질환, 결핍 또는 이상 상태의 하나 이상의 증상의 예방, 치료 또는 개선 방법을 제공한다. 상기와 같은 방법은 일반적으로 상기와 같은 예방, 치료 또는 개선이 필요한 포유동물에게 상기 포유동물의 상기 질병, 기능장애, 질환, 결핍 또는 이상 상태의 하나 이상의 증상을 예방, 치료 및/또는 개선하기에 충분한 시간 동안 유효량의 본 발명에 개시된 rAAV 조성물을 투여함을 포함한다. 상기와 같은 포유동물은 바람직하게는 예를 들어 레베르 선천성 흑내장-1(LCA-1)을 포함한 적어도 제 1 망막 질환, 질병 또는 이영양증이 있거나, 이들 질병에 걸린 것으로 의심이 가거나, 이들 질병이 발병할 위험이 있거나, 또는 이들 질병으로 진단되었거나, 또는 상기 포유동물은 생물학적으로 활성인 작용성 구아닐레이트 사이클라제 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 하나 이상의 결핍, 결함 또는 부재가 발생할 위험이 있거나 또는 이들 결핍, 결함 또는 부재가 있는 것으로 진단되었다. 상기 포유동물은 어떠한 연령일 수도 있으나, 보다 바람직하게는 선천성 망막 이영양증, 예를 들어 레베르 선천성 흑내장-1(LCA-1)이 발병할 위험이 있거나 또는 상기 질병으로 진단된 신생아, 갓난아기, 유아, 또는 아동일 것이다.
본 발명은 또한 치료 유효량의 생물학적으로 활성인 포유동물 구아닐레이트 사이클라제 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 이들이 필요한 포유동물에게 제공하는 방법을 추가로 포함한다. 상기와 같은 방법은 일반적으로 본 발명에 개시된 rAAV 벡터가 도입된 포유동물의 세포의 적어도 제 1 집단 또는 포유동물의 적어도 제 1 조직 중에 상기 벡터로부터 생물학적으로 활성인 구아닐레이트 사이클라제 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 생성시키기에 충분한 시간 동안 치료 유효량의 상기 rAAV 벡터 중 하나 이상을 상기 벡터가 필요한 포유동물의 적합한 세포 내로 도입시키는 단계를 적어도 수반한다. 상기 방법의 실시에서, 상기 벡터가 필요한 포유동물은 바람직하게는, 정상적인 포유동물 중의 생물학적으로 활성인 retGC1 단백질의 수준에 비해, 상기 포유동물의 신체 내 또는 부근의 하나 이상의 조직 중에 작용성의 생물학적으로 활성인 retGC1 단백질의 하나 이상의 결함, 결핍, 또는 실질적인 부재 또는 완전한 부재가 있을 것이다. 상기 방법의 몇몇 용도에서, 상기 포유동물로부터의 다수의 세포에 상기 rAAV 벡터를 생체 외 또는 시험관 내로 제공하며, 이때 상기 방법은 다수의 상기 제공된 세포를 후속적으로 상기 포유동물의 신체 내 또는 부근의 적어도 제 1 조직 부위 내로 도입시키는 추가의 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어 상기 수득된 다수의 세포를, 예를 들어 망막 내, 망막 하 공간 내로, 또는 상기 망막 주변의 하나 이상의 조직, 또는 전체 눈, 또는 상기 눈 주변의 조직에 직접 주사함을 포함하여, 상기 포유동물의 한쪽 또는 양쪽 눈 내의 적어도 제 1 부위 내로 도입시킬 수 있다.
특정 태양에서, 상기 세포 내로의 rAAV-벡터화된 구아닐레이트 사이클라제 유전자 구조물의 도입, 및 그의 후속 발현은 작용성 구아닐레이트 사이클라제 펩타이드, 단백질 또는 폴리펩타이드의 번역을 허용하며, 그 결과 추상체 광수용체가 보존되고, 추상체-매개된 기능이 복원된다. 중요하게는, 상기와 같은 방법은 상기 포유동물의 눈에서 정상적인 시각 반응의 복귀, 및 바람직하게는 시각의 복귀를 제공한다.
본 발명의 rAAV 벡터의 투여는 일회성 요법의 일부이거나, 또는 치료되는 환자의 생애 중 2 회 이상 반복되는 진행중인 치료 섭생의 일부일 수 있다. 몇몇 태양에서, 상기 rAAV 구조물의 단일 투여는 지속하는 구아닐레이트 사이클라제 단백질 형성을 생성하며, 이때 투여 후 1 개월 이상, 2 개월 이상, 3 개월 이상 또는 더 오랜 기간에 걸쳐 상기 추상체 광수용체가 보존되고 추상체-매개된 기능 및 시각 양상이 복원된다. 보다 바람직하게는, 장기간 요법 또는 예방은 수 개월 내지 수년의 기간 동안 상기 포유동물 눈에 상기 치료 구조물의 1회 이상의 후속 투여를 사용하여 성취된다. 바람직하게는, 투여 후 4 개월 이상, 5 개월 이상, 6 개월 이상 또는 더 오랜 기간에 걸쳐 상기 포유동물에서 상기 추상체 광수용체가 보존되고 추상체-매개된 기능 및 시각 양상이 복원된다. 몇몇 태양에서, 광수용체의 보존, 추상체-매개된 기능, 및 시각 양상이 상기 포유동물에서 본 발명에 개시된 조성물을 포함하는 치료 섭생의 완료에 이어서 1 년 이상, 2 년 이상, 3 년 이상 또는 4 년 이상 또는 더 오랜 기간 동안 복원된다. 본 발명은 LCA1에 걸렸거나, 걸린 것으로 의심이 가거나, 걸린 것으로 진단되거나, 또는 발병할 위험이 있는 포유동물의 하나 이상의 망막 세포 중에 상기 생물학적으로 활성인 retGC1 단백질의 수준을 증가시키는 방법을 추가로 제공한다. 상기와 같은 방법은 일반적으로 상기 개시된 rAAV-구아닐레이트 사이클라제 바이러스 벡터 구조물 중 하나 이상의 도입이 필요한 포유동물의 망막 세포의 적어도 제 1 집단 내로, 상기 포유동물의 하나 이상의 망막 세포 중에 생물학적으로 활성인 retGC1 단백질의 수준을 증가시키기에 유효한 시간 및 양으로 도입시킴을 포함한다. 상기와 같은 방법은 특히 포유동물에 있어서 망막 이영양증의 하나 이상의 증상을 예방하거나, 치료하거나 개선하기 위해 고려되며, 바람직하게는 상기 포유동물의 망막, 망막 하 공간, 또는 눈에 상기 개시된 치료 구조물 중 하나 이상을, 상기 포유동물의 상기 망막 이영양증의 하나 이상의 증상을 치료하거나 개선하기에 충분한 시간 및 양으로 직접적으로 또는 간접적으로 투여함을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 포유동물의 구아닐레이트 사이클라제 단백질 결핍의 증상을 예방, 치료 또는 개선하기 위한, 및 특히 생물학적으로 활성인 구아닐레이트 사이클라제 폴리펩타이드의 결핍과 관련된 질환 중 하나 이상을 나타내는 인간에게서 상기 결핍의 정도 또는 중증도를 치료하거나 감소시키기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일반적인 의미로, 상기 방법은 상기와 같은 질환, 또는 그의 하나 이상의 증상을 앓고 있는 것으로 의심이 가는 동물에게서 상기 결핍을 치료하거나 개선하기에 충분한 시간 및 양으로 상기 동물에게 약학적으로 허용 가능한 비히클 중의 하나 이상의 구아닐레이트 사이클라제 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질을 암호화하는 적어도 제 1 rAAV-기재 유전자 구조물을 투여함을 포함한다. 본 발명의 실시에 유용한 예시적인 구아닐레이트 사이클라제 폴리펩타이드는 비제한적으로, 구아닐레이트 사이클라제 활성을 가지며 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11에 개시된 서열들 중 임의의 하나와 1차 아미노산 서열이 실질적으로 동일한 펩타이드, 폴리펩타이 및 단백질, 및 그의 생물학적으로 활성인 등가물 또는 유도체를 포함한다. 본 발명의 실시에 유용한 추가의 예시적인 구아닐레이트 사이클라제 펩타이드, 단백질 및 폴리펩타이드는 비제한적으로, 포유동물 구아닐레이트 사이클라제를 암호화하는 아미노산 서열, 및 특히 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11에 개시된 바와 같은 서열, 및 그의 생물학적으로 작용성인 등가물, 또는 유도체를 포함하거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어진 것들을 포함한다.
rAAV-구아닐레이트 사이클라제 벡터 조성물
첫 번째 실시태양에서, 본 발명은 구아닐레이트 사이클라제 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 제 1 핵산 분절을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 rAAV 벡터, 및 특히 상기와 같은 벡터로 형질전환된 적합한 숙주 세포에서 상기 핵산 분절을 발현할 수 있는 적어도 제 1 프로모터에 작동적으로 결합된 포유동물 구아닐레이트 사이클라제 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드(또는 그의 생물학적으로 활성인 단편 또는 유도체)를 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 핵산 분절은 포유동물, 및 특히 인간 구아닐레이트 사이클라제 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질, 및 특히 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11에 개시된 아미노산 서열 중 하나 이상으로부터의 적어도 제 1의 30 개의 연속적인 아미노산 서열과 90% 이상 일치하는 적어도 제 1의 연속적인 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질, 또는 그의 생물학적으로 활성인 단편 또는 변체(variant)를 암호화한다.
바람직하게는, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1로부터의 30 개 이상, 40 개 이상, 50 개 이상, 60 개 이상, 70 개 이상, 또는 80 개 이상의 연속적인 아미노산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 또는 98% 이상 일치하는 적어도 제 1의 연속적인 아미노산 서열을 포함하고, 보다 바람직하게는 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1로부터의 90 개 이상의 연속적인 아미노산 서열과 99% 이상 일치하는 적어도 제 1의 연속적인 아미노산 서열을 포함한다.
한편으로, 본 발명의 치료 구조물은 임의의 포유동물 기원의 구아닐레이트 사이클라제 폴리펩타이드, 예를 들어 쥐, 영장류, 양, 돼지, 소, 말, 에핀, 염소, 개, 고양이 및/또는 이리 기원의 핵산, 펩타이드, 및 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분절을 포함하거나, 또는 처음에 하나 이상의 포유동물 종으로부터 수득되고 구아닐레이트 사이클라제 활성이 유지되도록 인간 세포에서 발현되도록 유전자 변형시킨, 변형되거나 부위-특이적으로 돌연변이된 핵산 분절을 포함할 수 있다.
다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 실시에 사용하기에 바람직한 핵산 분절은 포유동물, 및 특히 인간 구아닐레이트 사이클라제 폴리펩타이드 또는 그의 생물학적으로 활성인 단편 또는 변체를 암호화한다.
본 발명의 벡터 및 바이러스 입자에 포함된 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 본 발명에 개시된 바와 같은 구아닐레이트 사이클라제-암호화 핵산 분절에 작동적으로 결합된 적어도 제 1의 구성 또는 유도 프로모터를 포함한다. 상기와 같은 프로모터는 동종 또는 이종 프로모터일 수 있으며, 상기 프로모터를 상기 구아닐레이트 사이클라제 암호화 분절의 발현이 상기 프로모터의 조절하에 있도록 상기 구아닐레이트 사이클라제 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분절의 상류에 작동적으로 위치시킬 수 있다. 상기 구조물은 단일 프로모터를 포함하거나, 또는 한편으로 2 개 이상의 프로모터를 사용하여 상기 구아닐레이트 사이클라제 암호화 DNA 서열의 발현을 촉진시킬 수도 있다.
본 발명의 실시에 유용한 예시적인 프로모터는 비제한적으로 포유동물, 및 특히 인간 숙주 세포, 조직 및 기관에서 작동 가능한 프로모터 서열들, 예를 들어 편재하는 프로모터, 예를 들어 CMV 프로모터, 프로모터, β-액틴 프로모터, 하이브리드 CMV 프로모터, 하이브리드 CMV-β-액틴 프로모터, 절두된 CMV 프로모터, 절두된 β-액틴 프로모터, 절두된 하이브리드 CMV-β-액틴 프로모터, EF1 프로모터, U1a 프로모터, 또는 U1b 프로모터; 또는 하나 이상의 세포- 또는 조직-특이성 프로모터(예를 들어 광수용체-특이성 프로모터, 예를 들어 로돕신 키나제 프로모터[hGRK1] 포함), 또는 유도 프로모터, 예를 들어 Tet-유도 프로모터 또는 VP16-LexA 프로모터를 포함한다.
예시적인 실시태양에서, 치료학적 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 편재하는 절두된 하이브리드 치킨 β-액틴(CBA) 프로모터의 조절 하에, 또는 광수용체 세포-특이성 hGRK1 프로모터의 조절 하에 두었으며, 적합한 숙주 세포를 상기 유전자 구조물로 형질전환시키고 상기 구아닐레이트 사이클라제 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 상기와 같은 세포에서 발현시킬 때 상기 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 상기 암호화된 구아닐레이트 사이클라제 폴리펩타이드의 치료학적으로 유효한 수준을 생성시켰다. 적합한 hGRK1 프로모터의 예를 서열번호 12에 나타내는 반면, 적합한 편재하는 프로모터, 예를 들어 절두된 하이브리드 치킨 β-액틴(CBA) 프로모터를 서열번호 13에 나타낸다.
본 발명의 벡터 및 바이러스 입자에 포함된 폴리뉴클레오타이드는 또한 하나 이상의 고유, 합성, 동종, 이종, 또는 하이브리드 인헨서 또는 5' 조절 요소, 예를 들어 천연 인헨서, 예를 들어 CMV 인헨서, 또는 한편으로 합성 인헨서를 추가로 임의로 포함할 수도 있다. 세포- 또는 조직-특이성 인헨서, 예를 들어 작동적으로 결합된 유전자 서열의 발현을 증가시키는 것들이 또한 본 발명의 실시에 특히 유용한 것으로 고려된다. 상기와 같은 인헨서는 비제한적으로 망막-특이성 인헨서, 간상체-특이성 인헨서, 추상체-특이성 인헨서 등을 포함할 수도 있다.
본 발명의 벡터 및 바이러스 입자 내에 포함된 폴리뉴클레오타이드 및 핵산 분절은 또한 하나 이상의 인트론 서열을 추가로 임의로 포함할 수 있다. 상기와 같은 경우에, 상기 인트론 서열(들)은 바람직하게는 포유동물 기원, 및 보다 바람직하게는 인간 기원의 것일 것이다.
본 발명의 벡터, 비리온, 바이러스 입자, 숙주 세포, 또는 조성물 내에 포함된 DNA 서열, 핵산 분절, 및 폴리뉴클레오타이드는 또한 상기 암호화된 폴리펩타이드의 더 큰 발현, 더 큰 안정성 및/또는 증대된 번역을 제공하도록 본 발명에 개시된 구아닐레이트 사이클라제-암호화 핵산 분절에 대해 작동적으로 위치한 하나 이상의 고유, 합성, 동종, 이종 또는 하이브리드 전사 후 또는 3' 조절 요소를 추가로 임의로 포함할 수 있다. 하나의 상기와 같은 예는 상기 구아닐레이트 사이클라제 유전자의 하류에 작동적으로 위치한 우드척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소(WPRE)이다. 상기와 같은 상황에서 이들과 같은 요소의 사용은 분자 생물학 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다.
예시적인 실시태양에서, 본 발명은 하기에 개시된 폴리펩타이드 및 펩타이드, 및 특히 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11 중 어느 하나에 인용된 바와 같은 폴리펩타이드로부터의 약 10 개 이상, 약 15 개 이상, 약 20 개 이상, 약 25 개 이상, 약 30 개 이상, 약 35 개 이상, 약 40 개 이상, 약 45 개 이상, 약 50 개 이상, 약 55 개 이상, 약 60 개 이상, 약 65 개 이상, 약 70 개 이상, 약 75 개 이상, 약 80 개 이상, 약 85 개 이상, 약 90 개 이상, 약 95 개 이상, 또는 약 100 개 이상의 연속적인 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 생물학적으로 활성인 구아닐레이트 사이클라제 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 투여에 관한 것이다.
마찬가지로, 추가의 예시적인 실시태양에서, 본 발명은 하기에 개시된 핵산 분절, 및 특히 예를 들어 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11에 인용된 것들을 포함하여 임의의 하나 이상의 포유동물 구아닐레이트 사이클라제 단백질을 암호화하는 DNA 서열들로부터의 약 10 개 이상, 약 20 개 이상, 약 30 개 이상, 약 40 개 이상, 약 50 개 이상, 약 60 개 이상, 약 70 개 이상, 약 80 개 이상, 약 90 개 이상, 약 100 개 이상, 약 110 개 이상, 약 120 개 이상, 약 130 개 이상, 약 140 개 이상, 약 150 개 이상, 약 160 개 이상, 약 170 개 이상, 약 180 개 이상, 약 190 개 이상, 또는 적어도 약 200 개, 약 250 개, 약 300 개, 약 350 개, 약 400 개, 약 450 개, 약 500 개, 약 550 개, 약 600 개, 약 650 개, 약 700 개, 약 750 개, 또는 심지어 약 800 개 이상의 연속적인 핵산 잔기를 포함하거나, 상기 잔기로 필수적으로 이루어지거나, 또는 상기 잔기로 이루어지는 핵산 분절에 의해 암호화되는 하나 이상의 생물학적으로 활성인 구아닐레이트 사이클라제 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 투여에 관한 것이다.
본 발명의 예시적인 아데노-관련된 바이러스 벡터 구조물 및 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11의 서열과 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상 일치하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 제 1 핵산 분절을 포함하거나, 상기 분절로 필수적으로 이루어지거나, 또는 상기 분절로 이루어진 것들을 포함하며, 여기에서 상기 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 선택된 포유동물 세포 및/또는 조직에서 발현 시 구아닐레이트 사이클라제 활성을 갖는다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명의 바이러스 벡터 구조물 및 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11에 개시된 서열들 중 하나 이상과 약 82% 이상, 약 84% 이상, 약 86% 이상, 약 88% 이상, 약 92% 이상, 또는 약 94% 이상 일치하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 제 1 핵산 분절을 포함하거나, 상기 분절로 필수적으로 이루어지거나, 또는 상기 분절로 이루어진 벡터 및 폴리뉴클레오타이드를 포함할 것이다. 상기와 같은 구조물은 바람직하게는 포유동물 세포 및/또는 조직 및 특히 인간 세포 및/또는 조직에서 발현 시 구아닐레이트 사이클라제 활성을 갖는 하나 이상의 생물학적으로 활성인 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화할 것이다.
본 발명의 예시적인 폴리뉴클레오타이드는 또한 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 서열과 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 일치하는 적어도 제 1 핵산 분절을 포함하거나, 상기 분절로 필수적으로 이루어지거나, 또는 상기 분절로 이루어진 서열들을 포함하며, 여기에서 상기 핵산 분절에 의해 암호화된 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 선택된 포유동물 세포 및/또는 조직에서 발현 시 구아닐레이트 사이클라제 활성을 갖는다.
rAAV 바이러스 입자 및 비리온, 및 이들을 포함하는 숙주 세포
본 발명의 다른 태양은 본 발명의 rAAV-구아닐레이트 사이클라제 벡터를 포함하는 rAAV 입자 및 비리온, 다수의 상기와 같은 입자 및 비리온뿐만 아니라 본 발명에 개시된 rAAV-구아닐레이트 사이클라제 벡터 중 하나 이상을 포함하는 약학 조성물 및 숙주 세포, 적합한 수단을 통해 포유동물에게, 예를 들어 근육 내, 정맥 내 또는 직접 주사에 의해 상기 포유동물의 선택된 세포, 조직 또는 기관에, 예를 들어 상기 선택된 포유동물의 눈의 하나 이상의 영역에 투여하고자 하는 상기 rAAV-구아닐레이트 사이클라제 벡터 또는 비리온의 약학 제형에 관한 것이다. 전형적으로, 상기와 같은 조성물을 하기에 개시하는 바와 같이, 약학적으로 허용 가능한 부형제, 완충제, 희석제, 보조제, 또는 담체와 함께 제형화할 것이며, 상기 조성물은 치료를 요하는 선택된 기관, 조직 및 세포에 대한 투여를 촉진하기 위해서 하나 이상의 리포솜, 지질, 지질 복합체, 미소구, 미세입자, 나노구, 또는 나노입자 제형을 추가로 포함할 수도 있다.
본 발명의 추가의 태양은 본 발명에 개시된 바와 같은 rAAV 벡터, 비리온, 및 감염성 바이러스 입자 중 하나 이상을 포함하는 포유동물 숙주 세포, 및 이들 중 다수를 포함한다. 특히 바람직한 세포는 인간 숙주 세포, 및 특히 예를 들어 망막 세포를 포함한 인간 눈 조직이다.
치료 키트 및 약학 조성물
포유동물의 구아닐레이트 사이클라제 결핍으로부터 생성되는 병의 증상을 치료 또는 개선하기 위한 치료 키트가 또한 본 발명의 부분이다. 예시적인 키트는 바람직하게는 본 발명에 개시된 AAV-구아닐레이트 사이클라제 벡터 구조물, 비리온 및 약학 조성물 중 하나 이상, 및 상기 키트의 사용 설명서를 포함하는 것이다. 구아닐레이트 사이클라제 결핍, 및 특히 망막-특이성 구아닐레이트 사이클라제-1의 치료 방법에서 상기와 같은 키트의 사용은 retGC1 결함 또는 결핍의 치료 및 병든 포유동물의 LCA-1과 같은 망막 이영양증의 치료에 바람직하다.
본 발명의 또 다른 중요한 태양은 포유동물, 및 특히 인간의 구아닐레이트 사이클라제 결핍의 증상을 치료 또는 개선하기 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명에 개시된 벡터, 비리온, 조성물 및 숙주 세포의 용도에 관한 것이다. 신경학적 및/또는 중추 신경계 결함, 예를 들어 망막 GC1의 결핍 또는 결함으로부터 생성되는 병, 예를 들어 LCA-1과 같은 망막 이영양증의 치료를 위한 약제의 제조 및 치료 방법에 있어서 상기와 같은 조성물의 용도는 일반적으로 상기 치료가 필요한 포유동물, 및 특히 인간에게 상기 병든 포유동물의 상기와 같은 결핍의 증상을 치료하거나 개선하기에 충분한 시간 및 양으로 상기 개시된 바이러스 벡터, 비리온, 숙주 세포, 및 이들 중 하나 이상을 포함하는 조성물 중 하나 이상을 투여함을 포함한다. 상기 방법은 또한 상기와 같은 병이 있는 것으로 의심이 가는 동물의 예방학적 치료, 또는 진단 후 또는 증상의 개시 전에 상기와 같은 병이 발병할 위험이 있는 동물들에게 상기와 같은 조성물의 투여를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양은 본 발명에 개시된 바와 같은 아데노-관련된 바이러스 벡터, 비리온, 바이러스 입자, 및 숙주 세포 중 하나 이상을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기와 같은 것들을 포함하는 약학 조성물이 치료, 및 병든 포유동물 및 특히 인간의 치료를 위한 약제의 제조에 유용한 것으로 특별히 고려된다.
치료 방법
본 발명은 또한 치료가 필요한 포유동물에게 치료 유효량의 구아닐레이트 사이클라제 폴리펩타이드를 전달하는 방법을 제공한다. 상기와 같은 방법은 일반적으로 상기와 같은 포유동물에게 본 발명에 개시된 구아닐레이트 사이클라제 조성물들 중 하나 이상을 제공하거나 투여하는 단계를 적어도 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 상기와 같은 포유동물에게, 본 발명에 개시된 바와 같은 rAAV 벡터, 비리온, 바이러스 입자, 숙주 세포, 및 약학 조성물 중 하나 이상을 제공함을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기와 같은 제공 또는 상기와 같은 투여는 상기 포유동물의 선택된 세포, 조직 또는 기관에 치료 유효량의, 및 특히 상기 포유동물 눈의 세포에 치료학적으로 유효한 수준의 본 발명에 개시된 구아닐레이트 사이클라제 폴리펩타이드들 중 하나 이상을 제공하기에 유효한 시간 및 양으로 수행될 것이다. 상기와 같은 방법은 상기 치료제의 전신 주사(들)를 포함하거나, 또는 심지어 상기 치료 조성물의 상기 동물의 특정 세포, 조직 또는 기관에의 직접적인 또는 간접적인 투여, 주사 또는 도입을 포함할 수도 있다.
예를 들어, 상기 치료 조성물을 직접 주사에 의해 포유동물 눈의 조직 또는 망막에, 또는 망막 하 공간에, 또는 상기 눈 안의 하나 이상의 특정한 세포 유형에 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 동물의 구아닐레이트 사이클라제 결핍의 증상을 치료, 개선하고 상기 결핍의 중증도를 감소시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 일반적으로 상기 치료가 필요한 동물에게 본 발명에 개시된 rAAV 구아닐레이트 사이클라제 벡터 조성물들 중 하나 이상을, retGC1 폴리펩타이드 결함 또는 결핍을 치료하거나, 또는 상기와 같은 축적으로부터 생성되거나, 또는 LCA1 등과 같은 망막 이영양증을 포함하는, 상기 동물의 충분한 생물학적으로 활성인 구아닐레이트 사이클라제 폴리펩타이드의 불충분한 발현 또는 부재로부터 발생하는 기능장애를 치료하기에 유효한 시간 및 양으로 제공하는 단계를 적어도 포함한다. 상술한 바와 같이, 상기와 같은 방법은 상기 치료제의 전신 주사(들)를 포함하거나, 또는 심지어 상기 치료 조성물의 상기 포유동물의 특정 세포, 조직 또는 기관에의 직접적인 또는 간접적인 투여, 주사 또는 도입을 포함할 수도 있다.
본 발명은 또한 포유동물의 구아닐레이트 사이클라제 결함 또는 결핍, 망막 이영양증, 또는 LCA1 또는 다른 GC1-관련된 눈 질병, 질환, 또는 기능장애를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명에 개시된 아데노-관련된 바이러스 벡터, 비리온, 바이러스 입자, 숙주 세포 및/또는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다. 상기 용도는 상기 포유동물의 하나 이상의 세포, 조직 또는 기관에 대한 전신 또는 국소화된 주사, 감염, 또는 투여를 포함할 수 있다. 상기와 같은 용도는 하나 이상의 망막 이영양증, 예를 들어 LCA-1이 있거나, 있는 것으로 의심이 가거나, 또는 상기 질병이 발병할 위험이 있는 인간에게서 특히 고려된다.
하기의 도면들은 본 명세서의 일부를 형성하며 본 발명의 몇몇 태양을 추가로 설명하기 위해 포함된다. 본 발명은 첨부된 도면과 함께 취한 하기의 설명을 참고로 보다 잘 이해될 수 있으며, 도면에서 같은 도면 번호는 같은 요소를 나타낸다:
도 1a 및 도 1b는 +/+(상부 파형), 처리되지 않은 GC1KO(중간 파형) 및 AAV-mGC1-처리된(기부 파형) 마우스로부터의 전형적인 추상체-(왼쪽 컬럼) 및 간상체-(오른쪽 컬럼) 매개된 ERG를 나타낸다. 검은색 자취는 hGRK1-mGC1이 주사된 눈(기부 파형) 및 그의 주사되지 않은 대측성 눈(중간 파형)에 해당한다. 붉은색 자취는 smCBA-mGC1이 주사된 눈(기부 파형) 및 주사되지 않은 대측성 눈(중간 파형)에 해당한다. AAV-mGC1 처리된 눈에서 추상체 반응은 정상의 대략 45%까지 복원된다.
도 2a 및 도 2b는 시간에 따른 GC1KO, 동질유전자 +/+ 대조군, smCBA-mGC1-처리된(도 2a) 및 hGRK1-mGC1-처리된(도 2b) GC1KO 마우스에서 평균 명소시(photopic) b-파 최대 진폭을 나타낸다. smCBA-mGC1 및 hGRK1-mGC1-처리된 마우스 모두의 추상체 반응은 주사 후 3 개월 이상 동안 정상의 대략 45%이다.
도 3a, 도 3b 및 도 3c는 눈 운동 분석에 의해, 시각적으로 유도된 양상이 smCBA-mGC1 또는 hGRK1-mGC1으로 처리된 GC1KO 마우스에서 복원되었음을 예시한다. M1 내지 M9는 시험에 사용된 9 마리 마우스에 해당한다. +/+ 대조용 마우스(M1, M2), 고유의 GC1KO(M3, M4), smCBA-mGC1(M5, M6, M7) 및 hGRK1-mGC1-처리된(M8, M9) 마우스의 명소시력 및 콘트라스트 감도는 처리된 마우스가 정상적으로 보이는 마우스와 같이 행동함을 나타낸다(도 3b 및 도 3c). 모든 +/+ 눈(n=4), GC1KO 눈(n=9) 및 AAV-mGC1-처리된 눈(n=5)의 평균을 나타낸다(도 3c). 각각의 마우스(M1 내지 M9)로부터의 추상체-매개된 ERG 반응을 전기생리학적 비교를 위해 나타낸다(도 3a).
도 4a, 도 4b, 도 4c, 도 4d, 도 4e, 및 도 4f는 AAV5-hGRK1-mGC1이 GC1KO 마우스의 광수용체 외부 분절에서 GC1의 발현을 구동함을 나타낸다(도 4a). GC1 발현은 처리되지 않은 대측성 대조용 눈에서 보이지 않는다(도 4b). AAV5-smCBA-mGC1은 광수용체 외부 분절에서(도 4c) 및 때때로 광수용체 세포 체에서(도 4f에서 흰색 화살표) GC1의 발현을 구동한다. 상기와 같은 GC1 발현은 처리되지 않은 대측성 대조용 눈에서 보이지 않는다(도 4d). AAV5-mGC1-처리된 눈에서 치료학적 트랜스유전자 발현의 수준은 동질유전자 +/+ 대조용 눈에서 나타난 것과 유사하다(도 4e). 모든 망막을 처리 후 3 개월째의 마우스 또는 나이-합치된 처리되지 않은 대조군으로부터 취하였다. 도 4a에서 스케일 바는 100 ㎛이고; 도 4f에서는 25 ㎛이다. OS = 외부 분절, IS = 내부 분절, 핵 층.
도 5a, 도 5b, 도 5c 및 도 5d는 +/+, GC1KO, AAV5-smCBA-mGC1-처리된 및 AAV5-hGRK1-mGC1-처리된 마우스의 추상체 광수용체에서의 추상체 어레스틴 발현을 나타낸다. 처리되지 않은 GC1KO 망막은 특징적인 무질서한, 탈착된 추상체 외부 분절을 함유하는 반면(도 5b), 추상체 외부 분절은 처리된 GC1KO(도 5c 및 도 5d) 및 +/+(도 5a) 망막 섹션에서 완전하였으며 추상체 어레스틴 분포는 정상인 것으로 보였다. 모든 망막을 처리 후 3 개월째의 마우스 또는 나이 합치된 처리되지 않은 대조군으로부터 취하였다. 도 5d에서 스케일 바는 100 ㎛이다. OS = 외부 분절, IS = 내부 분절, S = 시냅스 말단.
도 6a, 도 6b, 도 6c 및 도 6d는 AAV-mGC1 처리가 처리 후 3 개월 이상 동안 처리된 눈에서 추상체 광수용체의 보존이 일어나게 함을 나타낸다. hGRK1-mGC1 연구(도 6a) 및 smCBA-mGC1 연구(도 6b, 도 6d), 및 추상체 어레스틴이 염색된 대측성의 주사되지 않은 눈으로부터의 전형적인 망막 온(whole) 조직표본은 추상체 광수용체가 처리 후 3 개월 이상 동안 AAV-mGC1으로 처리된 GC1KO 마우스에서 보존됨을 나타낸다. 추상체 세포 밀도를 처리 및 처리되지 않은 마우스의 중앙 및 하부 망막에서 계수하였다. 상기 중 어느 한 바이러스 벡터로 처리 후 상기 두 영역 중에서 유의수준 차이가 밝혀졌다.
도 7은 척추동물 광전환 캐스케이드를 예시한다. 광 자극 시, 로돕신(R)의 형태적 변화는 전환(T) 및 cGMP 포스포다이에스테라제(PDE)의 활성화를 포함한 사건들의 캐스케이드를 자극하여 결국 cGMP의 가수분해를 생성시킨다. 이러한 세포 내 cGMP의 저하는 광수용체 외부 분절 막 중의 환상 뉴클레오타이드-관문 채널(CNG)의 폐쇄를 야기한다. 이러한 채널의 폐쇄는 상기 세포의 과분극을 일으키고 따라서 세포 내 칼슘의 극적인 강하를 일으킨다. 칼슘 수준이 떨어지면, 결합되지 않은 구아닐레이트 사이클라제 활성화 단백질(GCAP)은 구아닐레이트 사이클라제(GC)를 자유롭게 자극한다. GC는 그의 목적이 cGMP를 생산하는 것이라는 점에서 광전환의 회복 단계에 한 역할을 한다. cGMP의 수준이 GC에 의해 충분히 증가하면, cGMP-관문 채널이 다시 개방되어 상기 세포의 탈분극 및 암순응된 상태로의 복귀를 일으킨다.
도 8은 retGC1의 예견된 구조 및 위상이 단일의 막관통 영역, 세포 내 및 세포 외 도메인을 갖는 다른 구아닐레이트 사이클라제에 대해 상동성을 나타냄을 보인다. 상기 세포 내 도메인은 "키나제-유사" 영역 및 촉매 도메인으로 추가로 분할된다. retGC1의 칼슘 및 GCAP1-의존성 조절은 세포 내 도메인(KHD)을 통해 조절된다. 상기 광수용체 세포 중의 칼슘 농도가 높은 경우(어둠/탈분극된 상태에서), 칼슘-결합된 GCAP1은 retGC1의 활성화를 방지한다. 광 자극 시, 칼슘 수준은 감소한다. 칼슘은 GCAP1으로부터 결합되지 않으며, 이에 의해 GCAP1이 retGC1을 활성화되게 한다. retGC1의 역할은 cGMP를 생산하는 것이다.
도 9a 및 도 9b는 정상(WT) 대 GC1KO 마우스 중의 추상체 광수용체를 나타낸다. WT 추상체에서, GC1은 정상적으로 작용하여 cGMP를 생산하며 상기 cGMP는 CNG 관문 채널을 유효하게 재개방하고 상기 세포를 그의 암순응된/탈분극된 상태로 복귀시킬 수 있다. 상기 GC1KO 마우스의 추상체 광수용체에서, GC1은 cGMP를 생산하지 못한다. 이러한 실패는 CNG-관문 채널의 재개방을 방지한다. 이들 세포는 본질적으로, 만성적으로 과분극된다(광-순응된다). 상기 세포는 시각을 위해 빛을 전환하지 못하고(ERG의 결여에 의해 입증되는 바와 같이) 결국 퇴화될 것이다.
도 10a 및 도 10b는 공통 서열이 포함된 소 GC1(bov GC1) 및 마우스 GC1(mGC1)의 아미노산 서열 정렬을 나타낸다. N-말단 구역 중에 위치한 가변 영역을 붉은색 직사각형으로 강조한다.
도 11a 및 도 11b는 2 개의 예시적인 벡터의 지도를 나타낸다. 하나는 편재하는 프로모터 smCBA를 함유하는 반면, 다른 것은 광수용체-특이성 프로모터, hGRK1을 사용한다.
도 12는 GC1(붉은색) 및 PNA 렉틴(녹색)을 염색한 AAV5-smCBA-mGC1이 주사된 GC1KO 눈으로부터의 전형적인 망막 섹션이 추상체 외부 분절(노란색 겹침)뿐만 아니라 간상체 외부 분절(붉은색 단독)에서의 GC1 발현을 드러냄을 나타낸다. hGRK1-mGC1 주사된 눈은 동일한 패턴을 나타내었다.
도 13a, 도 13b 및 도 13c는 GC1KO 마우스에서 망막 기능의 AAV-매개된 복원을 나타낸다. 도 13a는 AAV5-hGRK1-mGC1(붉은색), AAV5-smCBA-mGC1(녹색) 또는 AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 또는 나이-합치된, 동질유전자 GC1+/+ 대조군으로 약 P14에서 처리된 GC1KO 마우스의 눈으로부터 기록된 전형적인 명소시(추상체-매개된) 자취를 나타낸다. 자취는 주사 후 4 개월(왼쪽), 7 개월(중간) 및 9 개월(오른쪽)째에 발생되었다. 도 13b는 처리된 GC1KO 마우스, 처리되지 않은 GC1KO 및 나이-합치된 동질유전자 GC1+/+ 대조용 마우스에서 12 cds/m2 자극으로 매달 발생시킨 평균 추상체 b-파 진폭을 나타낸다. 도 13c는 시간에 따른 처리 및 처리되지 않은 GC1KO 마우스에서 암소시(간상체-매개된) 반응을 나타낸다. 값들은 처리 대 처리되지 않은 눈에서 5 cds/m2에서 발생된 간상체 b-파 진폭의 비를 나타낸다. 3 개의 벡터는 모두 GC1KO 마우스에게 안정한 장기적인 요법을 부여하며, 이때 AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1이 가장 효율적이다.
도 14는 AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1으로 처리된 GC1KO 마우스를 주사 후 7개월째에 죽였음을 나타낸다. AAV5-smCBA-mGC1 및 AAV5-hGRK1-mGC1-처리된 마우스를 주사 후 9개월째에 죽였다. 이들의 눈뿐만 아니라 약 11개월 된 GC1+/+ 마우스의 눈을 절제하고 망막을 GC1(녹색, 윗줄) 및 추상체 어레스틴(붉은색, 아랫줄)에 대해 발생한 항체로 염색하였다. 3 개의 치료 벡터는 모두 GC1KO 마우스의 광수용체에서 GC1 발현을 독점적으로 구동하였다. 일부 망막 희박화가 AAV5-hGRK1-mGC1 처리된 마우스에서 관찰되었으며, 이는 상기 벡터의 높은 역가에 기인한 듯한 결과이다. AAV8(Y733F)- 및 AAV5-smCBA-처리된 마우스에서 GC1 발현 및 추상체 밀도/형태는 나이-합치된 GC1+/+ 대조군에서 나타난 것을 닮았다. 대조적으로, 나이-합치된 GC1KO 마우스의 망막은 GC1 발현의 부재 및 추상체 세포 밀도의 현저한 감소를 나타내었다.
도 15는 AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1을 주사 후 7.5 개월째에, 한 마리의 GC1KO 마우스를 죽였고 그의 망막을 웨스턴 블럿에 사용하였음을 나타낸다. GC1에 대한 항체는 처리된 GC1KO 눈에서의 AAV-매개된 GC1 발현의 수준이 상기 나이-합치된, 동질 유전자 GC1+/+ 대조용 눈에서 나타난 것과 유사함을 나타낸다. 구아닐레이트 사이클라제 활성화 단백질-1(GCAP1) 발현(구아닐레이트 사이클라제의 생화학적 상대)의 수준을 또한 처리 및 처리되지 않은 GC1KO뿐만 아니라 GC1+/+ 대조용 눈에서 평가하였다. 선행 보고서들과 일관되게, GCAP1 단백질이 상기 처리되지 않은 GC1KO 눈에서 하향조절되었다. AAV-매개된 GC1 발현은 증가된 GCAP1 발현을 생성시키며, 이는 상기 동질유전자 GC1+/+ 대조군에서 나타난 수준과 유사하다.
도 16a 및 도 16b는 AAV5-smCBA-mGC1을 주사 후 11 개월째의 결과를 나타내며, 한 마리의 GC1KO 마우스를 죽였고, 그의 망막 전체를 표본으로 하였으며 추상체 어레스틴에 대해 발생한 항체로 염색하였다. 상기 면역염색은 추상체가, 상부 망막을 제외하고 처리되지 않은 GC1KO 눈에서 존재하지 않음을 밝혀냈다(도 16a). AAV-매개된 GC1 발현은 11 개월(연구된 최근의 시점) 이상 동안 상기 처리된 눈의 망막 전체를 통해 추상체 광수용체를 보존한다(도 16b).
도 17은 AAV8(733)-hGRK1-mGC1을 주사한 GC1KO 마우스를 주사 후 4 개월 및 7 개월째에 죽인 데이터를 예시한다. AAV5-smCBA-mGC1 및 AAV5-hGRK1-mGC1을 주사한 GC1KO 마우스를 주사 후 7 개월 및 10 개월째에 죽였다. 나이 합치된, 원래의 GC1KO 마우스를 대조군으로서 사용하였다. 처리 및 처리되지 않은 눈으로부터의 시신경, 및 시각 경로를 함유하는 좌우측 뇌의 일부를 단리하고 벡터 게놈의 회수에 사용하였다. AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1을 GC1KO 마우스의 왼쪽 눈에 주사한 반면 2 개의 AAV5 벡터 모두를 GC1KO 마우스의 오른쪽 눈에 주사하였다. 벡터 게놈은 모든 경우에 처리된 눈의 시신경으로부터만 회수되었다. AAV5 벡터의 주사 후 10 개월까지, 벡터 게놈은 뇌로부터 회수되지 않았다. 가장 많은 수의 벡터 게놈은 강한, 빠르게 작용하는 AAV8(733) 벡터를 주사한 GC1KO 마우스로부터 회수되었다.
도 18a 및 도 18b는 AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 주사 후 2 개월째에 GCdko 마우스로부터의 OCT 및 간상체/추상체 EGR의 데이터를 예시한다.
도 19a 및 도 19b는 AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 주사 후 1 개월째에 GCdko 마우스로부터의 전형적인 간상체 및 추상체 ERG의 데이터를 예시한다.
도 20a 및 도 20b는 실시간 RT-PCR 표준을 나타낸다. 형광(Y-축의 log 단위)을 주기 한계 Cτ 값(X-축)에 대해 플롯팅한다. 각각의 패널은 야생형, GC1+/+ 마우스(a) 또는 AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1로 처리한 GC1KO 마우스로부터의 망막 cDNA를 사용한 GC1 및 Gapdh 전사물에 대한 표준 곡선(일련의 전체 망막 cDNA의 희석에 의해 생성된)을 나타낸다. GC1 및 Gapdh 프라이머 세트에 의해 생성된 표준 곡선은 어느 한 주형을 사용하여도 평행하였으며 이는 유사한 증폭 동역학을 가리킨다. Cτ 주기 값은 감소하는 주형의 양에 따라 증가한다.
도 21a 및 도 21b는 처리 및 처리되지 않은 GC1KO 마우스 및 GC1+/+ 대조군의 망막에서 GC1 및 추상체 어레스틴 발현을 나타낸다. 도 21a는 동결된 망막 횡단면의 면역조직화학을 사용하여 AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1(주사 후 7 개월째), AAV5-smCBA-mGC1(주사 후 10 개월째) 또는 AAV5-hGRK1-mGC1(주사 후 10 개월째) 벡터로 처리된 GC1KO 마우스뿐만 아니라 8 개월 된 처리되지 않은 GC1KO 및 GC1+/+ 대조용 마우스로부터의 망막에서의 GC1(녹색, 윗줄) 및 추상체 어레스틴(붉은색, 아랫줄)의 발현을 국소화하였다. 핵을 DAPI(청색)로 염색하였다. 모든 섹션을 20X 배율로 영상화하고 동일한 설정으로 노출시켰다. 도 21b는 추상체 어레스틴에 대한 항체로, AAV5-smCBA-mGC1(단지 하나의 눈만) 처리 후 11 개월째에 하나의 GC1KO 마우스로부터의 망막 온 조직표본을 면역염색하여, 처리되지 않은 대측성 대조용 눈(아래 왼쪽)에 비해 처리된 눈(아래 오른쪽)에서의 추상체 광수용체의 현저한 보존을 밝혀냈다. 망막 온 조직표본들을, 그들의 일시적인 부분들을 12 시 위치에 놓고, 유사하게 배향시켰다. 온 조직표본의 부분들을 10X 배율로 영상화하고 최종 표시를 위해 함께 합체시켰다. OS = 외부 분절; 핵 층; INL = 내부 핵 층.
도 22a 및 도 22b는 처리 및 처리되지 않은 GC1KO 및 처리되지 않은 GC1 +/+ 대조용 눈의 추상체-매개된 망막전도(ERG)를 나타낸다. 도 22a는 AAV5-hGRK1-mGC1(붉은색 선), AAV5-smCBA-mGC1(녹색 선) 또는 AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1(검은색 선)으로 처리된 GC1KO 눈 또는 처리되지 않은 나이-합치된 GC1+/+ 대조용 눈으로부터 12 cds/㎡ 광 자극에 의해 유도된 전형적인 추상체-매개된 자취를 나타낸다. 처리 후 4 개월 및 1년 사이에 발생한 전형적인 자취를 나타낸다(상부 패널). 척도: y 축 = 50 μV, x-축 = 20 ms. 도 22b는 최대 추상체 b-파 진폭(12 cds/㎡에서 발생한 것들)을 각각의 마우스로부터 계산하고 각각의 처리 그룹뿐만 아니라 나이-합치된, 처리되지 않은 GC1KO 및 GC1 +/+ 대조군에서 매달 평균하였다. n>3의 동물 그룹들 간에 비교를 수행하였다. 모든 AAV 처리 그룹을 처리 후 6 개월 동안 통계학적으로 비교하였다. AAV5 벡터 처리된 눈을, 처리 후 9 개월 동안 통계학적으로 비교하였다.
도 23a 및 도 23b는 처리 및 처리되지 않은 GC1KO 및 GC1+/+ 대조용 눈의 간상체-매개된 망막전도(ERG)를 예시한다. 도 23a는 암소시 조건 하에서 1 cds/㎡ 자극에 의해 유도된 간상체 b-파 진폭(상부 왼쪽) 및 a-파 진폭(상부 오른쪽)을 AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1(검은색 원), AAV5-hGRK1-mGC1(붉은색 원) 또는 AAV5-smCBA-mGC1(녹색 삼각형) 벡터로 처리한 GC1KO 마우스의 처리 및 처리되지 않은 눈에서 측정하였다. 처리 및 처리되지 않은 눈의 마우스 내 비를, 처리된 눈의 최대 a- 또는 b-파 진폭을 처리되지 않은 눈의 최대 진폭으로 나누어 생성시켰다. 상기 비를 모든 처리 그룹들에서 매달 평균하였다. 비교를 n>3의 동물 그룹들 간에 수행하였다. 모든 AAV 처리 그룹을 6 개월 동안 통계학적으로 비교하였다. AAV5 벡터를 또한 9 개월 동안 통계학적으로 비교하였다. 벡터-매개된 개선은 평균비 >0.8에 의해 정의되었다. 도 23b는 하나의 GC1KO 마우스로부터의 전형적인 간상체-매개된 ERG 자취가, AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1-처리된 눈(검은색 선)으로부터의 간상체 반응이 처리되지 않은 대측성 대조용 눈(녹색 선)으로부터 기록된 것들보다 더 높음을 밝힘을 나타낸다. 상기 처리된 간상체 반응은 정상 GC1+/+ 간상체 반응(붉은색 선)의 약 50%까지 복원되었다.
도 24a 및 도 24b는 처리 및 처리되지 않은 GC1KO 마우스 및 GC1+/+ 대조군에서 단백질 및 전사물 수준을 나타낸다. 도 24a는 AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1으로 처리 후 10 개월째에, 항-GC1 및 항-GCAP1 항체로 탐침된 하나의 GC1KO 마우스 눈으로부터의 망막 용해물의 면역블럿을 나타낸다. 항-β-액틴 항체를 내부 로딩 대조군으로서 사용하였다. 도 24b는 AAV5-smCBA-mGC1으로 처리된 하나의 GC1KO 망막, AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 벡터로 처리된 하나의 GC1KO 망막, 및 개별적인 처리되지 않은 GC1KO 또는 GC1+/+ 대조용 망막에서 여러 전사물(GC1, GCAP1, GNAT2 및 PDE6α)의 반정량적인 실시간 RT-PCR을 나타낸다. 샘플들을 표준으로서 Gapdh-특이성 프라이머를 사용하여 삼중으로 수행하였다. 데이터를 GC1+/+ 대조군에 대한 mRNA 수준의 변화 배수로서 제공한다.
본 발명의 예시적인 실시태양을 하기에 개시한다. 명확성을 위해서, 실제 실행의 모든 특징들을 본 명세서에 개시하지는 않는다. 물론, 임의의 상기와 같은 실제 실시태양의 개발에 있어서 다수의 실행-특이적인 결정들, 예를 들어 하나의 실행에서부터 또 다른 실행에 이르기까지 다양한 시스템-관련 및 사업-관련된 제약에 대한 순응을 개발자의 특정한 목적을 성취하기 위해 수행해야 함을 알 것이다. 더욱이, 상기와 같은 개발 노력은 복잡하고 시간 소모적일 수도 있으나, 그럼에도 불구하고 이러한 노력은 본 명세의 이점을 갖는 분야의 통상적인 숙련가들의 통상적인 의무일 수 있음을 알 것이다.
아데노-관련된 바이러스
아데노-관련된 바이러스-2(AAV)는 용균 바이러스 및 프로바이러스 모두로서 전파될 수 있는 인간 파르보바이러스이다(문헌[Cukor et al., 1984]; [Hoggan et al., 1972]). 상기 바이러스 게놈은 145 염기의 거꾸로 된 말단 반복부(문헌[Lusby et al., 1982])가 측면에 인접한, 4679 염기 길이(문헌[Srivastava et al., 1983])의 선형 단일-가닥 DNA(문헌[Rose et al., 1969])로 이루어진다. 용균 생육을 위해서, AAV는 헬퍼 바이러스에 의한 동시 감염을 요한다. 아데노바이러스(문헌[Atchinson et al., 1965]; [Hoggan, 1965]; [Parks et al., 1967])든 헤르페스 단순포진 바이러스(문헌[Buller et al., 1981])든 헬퍼 기능을 공급할 수 있다. 헬퍼 부재 하에서, AAV-특이성 복제 또는 유전자 발현의 증거는 존재하지 않는다(문헌[Rose and Koczot, 1972]; [Carter et al., 1983]). 헬퍼를 입수할 수 없는 경우, AAV는 통합된 프로바이러스로서 존속될 수 있다(문헌[Hoggan, 1965]; [Berns et al., 1975]; [Handa et al., 1977]; [Cheung et al., 1980]; [Berns et al., 1982]).
통합은 AAV 말단과 숙주 서열 간의 재조합을 명백히 수반하며 상기 AAV 서열의 대부분은 상기 프로바이러스 중에서 완전하게 남아있는다. 숙주 DNA 내로 통합하는 AAV의 능력은 명백히 헬퍼 바이러스의 부재 하에서 AAV 서열의 생존을 보장하기 위한 고유의 전략이다. AAV 프로바이러스를 지니는 세포를 헬퍼로 후속적으로 초감염시키는 경우, 상기 통합된 AAV 게놈이 구제되고 생산적인 용균 주기가 발생한다(문헌[Hoggan, 1965]).
원핵생물 플라스미드 내로 클로닝된 AAV 서열은 감염성이다(문헌[Samulski et al., 1982]). 예를 들어, 야생형 AAV/pBR322 플라스미드, pSM620을 아데노바이러스의 존재 하에서 인간 세포 내로 형질감염시키는 경우, 상기 AAV 서열은 상기 플라스미드로부터 구제되고 정상적인 AAV 용균 주기가 계속해서 일어난다(문헌[Samulski et al., 1982]). 이는 상기 AAV 서열을 상기 재조합 플라스미드 중에서 변형되게 할 수 있으며, 이어서 상기 플라스미드를 인간 세포 내로 형질감염시킴으로써 상기 돌연변이체의 바이러스 모액을 증식되게 할 수 있다(문헌[Samulski et al., 1983]; [Hermonat et al., 1984]). AAV는 3 개 이상의 표현형이 독특한 영역을 함유한다(문헌[Hermonat et al., 1984]). 상기 rep 영역은 DNA 복제 및 상기 재조합 플라스미드로부터의 구제에 필요한 하나 이상의 단백질을 암호화하는 반면, 뚜껑 및 입술 영역은 AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 것으로 보이며 이들 영역 내의 돌연변이체는 DNA 복제가 가능하다(문헌[Hermonat et al., 1984]). 상기 AAV 말단은 DNA 복제에 필요한 것으로 나타났다(문헌[Samulski et al., 1983]).
문헌[Laughlin et al.(1983])은 2 개의 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 하이브리드 플라스미드의 구조를 개시하였으며, 이들 구조는 각각 AAV의 전체 DNA 게놈, 및 상기 AAV 게놈의 성공적인 구제 및 복제를 위한 헬퍼 아데노바이러스의 존재 하에서의 인간 세포 주 내로의 재조합 DNA의 형질감염을 함유한다(또한 문헌[Tratschin et al., 1984a; 1984b]을 참조하시오).
아데노-관련된 바이러스(AAV)는 어떠한 병원성 반응도 유도하지 않고 숙주 세포 염색체 내로 통합될 수 있기 때문에 유전자 운반에 특히 매력적이다(문헌[Kotin et al., 1990]). 상기 AAV 말단 반복부(TR)는 염색체 통합에 유일한 필수 시스-성분이다(문헌[Muzyczka and McLaughlin, 1988]). 이러한 TR은 프로모터 활성을 갖는 것으로 보고되었다(문헌[Flotte et al., 1993]). 상기 TR은 세포질로부터 핵으로의 효율적인 유전자 운반을 촉진하거나 플라스미드 DNA의 안정성을 증가시키고 보다 오래 지속하는 유전자 발현을 가능하게 할 수 있다(문헌[Barlett and Samulski, 1998]). AAV TR을 함유하는 재조합 플라스미드 DNA를 사용하는 연구가 상당한 관심을 끌고 있다. AAV-기재 플라스미드는 대부분의 세포 유형에서 AAV의 TR이 없는 동일한 플라스미드보다 더 크고 더 긴 트랜스유전자 발현을 구동하는 것으로 나타났다(문헌[Philip et al., 1994]; [Shafron et al., 1998]; [Wang et al., 1998]).
연구자들이 rAAV의 발현 벡터로서의 사용 가능성을 연구하도록 촉구하는 여러 인자가 존재한다. 하나는 유전자를 숙주 염색체 내로 통합시키기 위해 전달하기 위한 필요조건이 놀랍게도 거의 없다는 것이다. AAV 게놈의 단지 6%인 145-pb ITR이 필요하다. 이는 4.5-kb DNA 삽입물을 조립하기 위한 공간을 상기 벡터 중에 남긴다. 이러한 운반 능력은 상기 AAV가 큰 유전자를 전달하지 못하게 할 수도 있지만, 본 발명의 안티센스 구조물을 전달하기에 충분히 적합하다.
AAV는 또한 그의 안전성으로 인해 전달 비히클로서 양호한 선택이다. 비교적 복잡한 구제 기전이 존재한다, 즉 야생형 아데노바이러스뿐만 아니라 AAV 유전자가 rAAV의 이동에 필요하다. 마찬가지로, AAV는 병원성이 아니며 어떠한 질병과도 관련이 없다. 바이러스 암호화 서열의 제거는 바이러스 유전자 발현에 대한 면역 반응을 최소화하며, 따라서 rAAV는 염증 반응을 불러 일으키지 않는다. 따라서 AAV는 본 발명의 구아닐레이트 사이클라제-암호화 폴리뉴클레오타이드의 전달에 이상적인 후보를 나타낸다.
rAAV 벡터의 제조
rAAV 벡터의 제조를 위한 전통적인 프로토콜은 일반적으로 3-성분 시스템을 기본으로 하였다. 상기 시스템의 하나의 성분은 rAAV로서 패키징되는 재조합 DNA를 암호화하는 프로바이러스 플라스미드이다. 상기 재조합 DNA는 상기 벡터의 복제 및 패키징을 지시하는 최소 시스 작용 AAV-2 서열인 145 염기쌍(bp) AAV-2 역전 말단 반복부(ITR) 사이에 위치한다. 상기 시스템의 두 번째 성분은 AAV-2 유전자, rep 및 cap를 암호화하는 플라스미드이다. 상기 AAV-2 rep 유전자는 상기 rAAV 게놈을 복제하고 복제 중간체를 분해하고, 이어서 단일-가닥 rAAV 게놈을 패키징하기 위해 트랜스로 작용하는 4 개의 Rep 단백질(Rep 78, 68, 52 및 40)을 암호화한다. 상기 AAV-2 cap 유전자는 바이러스 캡시드를 포함하는 3 개의 구조 단백질(VP1, VP2 및 VP3)을 암호화한다. AAV-2는 자신이 능숙하게 복제하지 못하므로, rAAV 패키징 시스템의 세 번째 성분은 또 다른 DNA 바이러스로부터의 일련의 헬퍼 작용이다. 이들 헬퍼 작용은, rAAV 복제 및 패키징이 효율적으로 발생할 수 있는 세포 환경을 생성시킨다. 아데노바이러스 (Ad)에 의해 제공된 헬퍼 작용은 rAAV의 생산에 거의 독점적으로 사용되었으며 유전자 E1a, E1b, E2a, E4orf6 및 VA RNA에 의해 암호화된다. 상기 시스템의 처음 2 개 성분은 일반적으로 세포 내로 도입되고 여기에서 복제 및 패키징이 형질감염에 의해 발생하는 반면, ad 헬퍼 작용은 야생형 Ad 바이러스에 의한 초감염에 의해 도입된다.
전통적인 rAAV 생산 기법은 형질감염의 본래의 비효율성으로 인해 다수의 벡터를 생산하는 능력이 제한된다. 형질감염의 규모를 증가시키는 경우 심각한 어려움에 또한 부닥친다. 야생형 Ad의 요구는, Ad가, 바이러스 복제에는 필요하지만 단지 제한량으로만 존재하는 세포 및 바이러스 기질과 경쟁할 수 있기 때문에, 생산된 rAAV의 양을 또한 감소시킬 수도 있다. 전통적인 생산 프로토콜에서 부닥치는 또 다른 문제점은 Ad에 의한 초감염이 상기 생산된 rAAV로부터의 Ad의 정제에 유효한 과정의 개발을 필요로 한다는 것이다. 이러한 정제 과정은 rAAV 제제의 Ad 오염을 제거하는데 일반적으로 성공적이지만, 상기 과정은 rAAV 역가를 또한 감소시킨다. rAAV의 Ad 오염에 대한 엄격한 분석이 또한 필요하다.
rAAV를 생산하기 위해서, 이중 동시-형질감염 과정을 사용하여 상기 AAV rep 및 cap 유전자뿐만 아니라 rAAV 복제 및 패키징에 필요한 Ad 헬퍼 유전자를 1:1 몰 비로 지니는 pDG(문헌[Grimm et al., 1998]) AAV 헬퍼 플라스미드와 함께 rAAV 운반 벡터 플라스미드를 도입시킨다. 상기 형질감염에 사용된 플라스미드 DNA를 통상적인 알칼리 용해/CsCl 구배 프로토콜에 의해 정제한다. 상기 형질감염을 하기와 같이 수행한다: 형질감염 시 상기 세포 융합률이 약 75 내지 80%이도록 293 세포를 실험 전날 1:2로 분할한다. 10 개의 15-㎝ 플레이트를 하나의 배치로서 형질감염시킨다. CaPO4 침전물을 제조하기 위해서 0.7 ㎎의 pDG를 180 ㎍의 rAAV 운반 벡터 플라스미드와 12.5 ㎖의 0.25 M CaCl2의 총 부피로 혼합한다. 오래된 배지를 상기 세포로부터 제거하고 37 ℃로 예온시킨 2X HBS(pH 7.05) 12.5 ㎖을 DNA-CaCl2 용액에 가하여 상기 CaPO4-침전물의 형성을 개시시킨다. 상기 DNA를 1 분간 배양하고; 상기 혼합물을 200 ㎖의 예온된 DMEM-10% FBS로 운반하고 이어서 상기 침전물의 형성이 중단된다. 22 ㎖의 상기 배지를 각각의 플레이트에 즉시 분배하고 세포를 37 ℃에서 48 시간 동안 배양한다. 상기 CaPO4-침전물을 세포 생육력의 손상 없이 전체 배양 기간 동안 상기 세포 상에 머무르게 할 수 있다. 48 시간 형질 감염 후 세포를 10 분 동안 1,140 x g에서 원심분리에 의해 수확한다. 이어서 세포를 드라이 아이스-에탄올 및 37 ℃ 욕에서 3 회의 동결/해동 주기에 의해 15 ㎖의 0.15 M MgCl, 50 mM 트리스-HCl(pH 8.5) 중에 용해시킨다. 벤조나제(나이코메드 파마(Nycomed Pharma) A/S, 순수 등급)를 상기 혼합물에 가하고(50 U/㎖ 최종 농도) 용해물을 37 ℃에서 30 분간 배양한다. 상기 용해물을 3,700 x g에서 20 분 동안 원심분리에 의해 등명화하고 바이러스-함유 상등액을 불연속적인 밀도 구배를 사용하여 추가로 정제한다.
전형적인 불연속적인 단계 구배는, 덜 농후한 세포 용해물을 하층에 놓고, 옵티프렙(OptiPrep)(나이코메드)의 60%(중량/부피) 멸균 용액을 사용하여 제조한, 요오딕사놀(Iodixanol), 5,5"[(2-하이드록시-1-3-프로판다이일)-비스(아세틸아미노)] 비스[N,N'바이,(2,3다이하이드록시프로필-2-4,6-트라이요오도-1,3-엔젠카복스아미드]로 치환함으로써 형성시킨다. 구체적으로, 15 ㎖의 상기 등명화된 용해물을 1/27 x 89 ㎜ 척추 바늘이 장착된 주사기를 사용하여 퀵-씰 울트라-클리어(Quick-Seal Ultra-Clear) 25 x 89-㎜ 원심분리기 튜브(벡크만(Beckman))로 옮긴다. 상기 튜브의 후속 충전 및 밀봉을 방해할 수도 있는 기포가 발생하지 않도록 조심한다. 가변 속도의 연동식 정밀 정량 펌프, 모델 EP-1(바이오-래드(Bio-Rad))을 사용하여 하기의 순서로 하층에 놓는다: 페놀 레드를 함유하는 PBS-MK 완충제 중의 15% 요오딕사놀 및 1M NaCl 9 ㎖(상기 요오딕사놀 용액 ㎖당 2.5 ㎕의 0.5% 모액); PBS-MK 완충제 중의 40% 요오딕사놀 5 ㎖, 및 최종적으로, 페놀 레드를 함유하는 PBS-MK 완충제 중의 60% 요오딕사놀 5 ㎖(0.1 ㎕/L). 튜브를 밀봉하고 18 ℃에서 350,000 x g에서 1 시간 동안 타입 70 Ti 로터(벡크만)에서 원심분리한다. 4 ㎖의 등명한 40% 단계를, 상기 튜브를 측면에서 최고 경사를 갖는 18-게이지 바늘이 장착된 주사기로 천공한 후에 흡출한다. 상기 요오딕사놀 분획을 통상적인 헤파린 아가로스 친화성 크로마토그래피를 사용하여 추가로 정제한다.
크로마토그래피를 위해서, 전형적으로는 예비-충전된 2.5 ㎖ 헤파린 아가로스 유형 I 컬럼(시그마(Sigma))을 중력 하에서 20 ㎖의 PBS-MK로 평형화한다. 이어서 상기 rAAV 요오딕사놀 분획을 상기 예비-평형화된 컬럼에 적용하고, 상기 컬럼을 10 ㎖의 PBS-MK로 세척한다. rAAV를 1M NaCl을 함유하는 동일한 완충제로 용출시킨다. 상기 용출 완충제를 적용한 후에, 상기 용출제의 처음 2 ㎖은 버리고, 바이러스를 후속의 3.5 ㎖의 용출 완충제 중에서 수거한다.
이어서 바이러스를 제조자의 설명에 따라 바이오맥스(BIOMAX)(등록상표) 100 K 필터(밀리포어(Millipore), 미국 매사추세츠주 베드포드 소재)를 통해 원심분리에 의해 농축시키고 탈염시킨다. 상기 고염 완충제를, 상기 농축된 바이러스를 락테이트화된 링거액으로 반복해서 희석하고 게놈 함유 입자 및 감염성 rAAV 입자 모두의 적정을 반복함으로써 바꾼다. 통상적인 도트-블럿 분석, 정량적인 경쟁적인 PCR(QC PCR) 분석, 또는 보다 최근의 정량적인 실시간 PCR(aRT-PCR)을 사용하여 물리적인 입자 역가를 측정한다(문헌[Zolotukhin et al., 2002]; [Jacobson et al., 2006]). 감염 역가를 감염 중심 분석(ICA) 및 형광 세포 분석(FCA)에 의해 측정하며, 이들 분석은 GFP의 발현을 기록한다(문헌[Zolotukhin et al., 2002]).
QC PCR 방법은 반응 튜브 상에서 특정한 표적 서열을 기지 농도의 내부 표준 플라스미드와 함께 경쟁적으로 증폭시키는 것을 기본으로 한다. 상기 방법은 바이러스 입자의 정확하고 빠른 정량분석을 제공한다. 상기 내부 표준은 상기 특정한 주형과 프라이머 인식 부위를 공유해야 한다. 상기 특정한 주형과 내부 표준을 모두 동일한 효율성으로 PCR-증폭시켜야 하며 상기 PCR-증폭된 산물을 별도로 분석하는 것이 가능할 것임에 틀림없다. 상기 주형과 내부 표준을 구별하는 가장 쉬운 방법은 상기 두 산물의 크기 차이를 통합하는 것이다. 이를 예를 들어 상기 특정한 표적과 동일한 서열을 갖지만 결실을 함유하는 표준을 제작함으로써 성취할 수 있다. 이어서 상기 특정한 주형의 PCR 신호를 기지 농도의 경쟁자(내부 표준)에 의해 획득한 PCR 신호와 비교함으로써 수행한다. 정량적인 실시간 PCR(qRT-PCR)은 실시간 PCR 산물 형성과 공지된 DNA 표준과의 비교에 의해 미지 샘플의 DNA 농도를 평가하는 표준 방법이다.
상기 정제된 바이러스 모액을 먼저 DNAseI으로 처리하여 패키징되지 않은 임의의 오염 DNA를 절단한다. 10 ㎕의 정제된 바이러스 모액을 37 ℃에서 1 시간 동안 50 mM 트리스-HCl(pH 7.5), 10 mM MgCl2를 함유하는 100 ㎕ 반응 혼합물 중에서 10 U의 DNAseI(베링거(Boehringer), 독일 잉겔하임 암 라인 소재)와 함께 배양한다. 상기 반응의 끝에서, 10 ㎕의 10X 프로테이나제 K 완충제(10 mM 트리스-HCl[pH 8.0], 10 mM EDTA, 1% SDS 최종 농도)를 가한 다음 1 ㎕의 프로테이나제 K(18.6 ㎎/㎖, 베링거)를 가하였다. 상기 혼합물을 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 바이러스 DNA를 페놀/클로로폼 추출(2 회)에 이어서 클로로폼 추출, 및 담체로서 10 ㎍의 글리코겐을 사용하는 에탄올 침전에 의해 정제하였다. 상기 DNA 펠릿을 100 ㎕의 물에 용해시켰다. QC PCR 반응 혼합물은 각각 1 ㎕의 희석된 바이러스 DNA 및 2 배의 일련의 내부 표준 플라스미드 DNA, 예를 들어 pdl-GFP 희석물을 함유하였다. 상기 표준 DNA의 가장 신뢰할만한 범위는 1 내지 100 pg인 것으로 밝혀졌다. 이어서 각 반응의 분액을, 2 개의 PCR 산물이 분석될 때까지 2% 아가로스 젤 전기영동에 의해 분석하였다. 에티디움 브로마이드 염색된 젤의 아날로그 영상을 이미지스토어(ImageStore) 7500 시스템(UVP; 미국 캘리포니아주 업랜드 소재)을 사용하여 디지털화하였다. 각 레인의 표적 및 경쟁자 밴드의 밀도를 제로-디스캔(ZERO-Dscan) 상 분석 시스템, 버전 1.0(스캐널리틱스(Scanalytics), 미국 매릴랜드주 록빌 소재)을 사용하여 측정하고 이들의 비를 표준 DNA 농도의 함수로서 플롯팅하였다. 바이러스 DNA 분자의 수가 경쟁자 DNA 분자의 수와 동등한 1.0의 비를 사용하여 상기 바이러스 모액의 DNA 농도를 측정하였다.
앞서 공개된 프로토콜(문헌[McLaughlin et al., 1988])의 변형을 사용하여, C12 세포를 감염시키고, 패키징을 해제하고, 복제하는 상기 바이러스의 능력을 측정하였다. 간단히, 통합된 wtAAV rep 및 cap 유전자를 함유하는 C2 세포(문헌[Clark et al., 1995])를 약 75% 융합률로 96-웰 접시에 도말하고, 이어서 Ad5로 20의 M.O.I로 감염시켰다. 1 ㎕의 일련의 희석된 rAAV-sCNTF를 형광 현미경을 사용하여 육안으로 기록하였다. 고감도 크로마(CHROMA) 필터 #41012 하이Q FITC LP(크로마 테크놀로지(Chroma Technology), 미국 버지니아주 빌로우스 폴 소재)를 사용하여 상기 형광성을 모니터하였다. 하이브리드화에 의해 역가를 계산하기 위해서, 세포를 필수적으로 앞서 개시한 바와 같이 수확하고 처리하였다(문헌[McLaughlin et al., 1988]).
약학 조성물
몇몇 실시태양에서, 본 발명은 세포 또는 동물에게 단독으로 또는 하나 이상의 다른 양상의 요법과 함께 투여하기에 약학적으로 허용 가능한 용액 중의 본 발명에 개시된 rAAV-구아닐레이트 사이클라제 조성물들 중 하나 이상의 제형에 관한 것이다.
또한, 경우에 따라, 본 발명에 개시된 바와 같은 치료 유전자 산물을 발현하는 핵산 분절, RNA, DNA 또는 PNA 조성물을 다른 작용제들, 예를 들어 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 다양한 약학적으로 활성인 작용제, 예를 들어 구아닐레이트 사이클라제 폴리펩타이드의 하나 이상의 전신 또는 국소 투여와 함께 투여할 수도 있음을 알 것이다. 실제로, 상기 추가의 작용제들이 상기 표적 세포 또는 숙주 조직과 접촉 시 현저한 부작용을 유발하지 않는 한, 또한 포함시킬 수 있는 다른 성분들에 대한 제한은 실질적으로 없다. 따라서 상기 rAAV-벡터화된 구아닐레이트 사이클라제 조성물을 특정한 상황에서 필요에 따라 다양한 다른 작용제들과 함께 전달할 수도 있다. 상기와 같은 조성물을 숙주 세포 또는 다른 생물학적 공급원으로부터 정제하거나, 또는 한편으로 본 발명에 개시된 바와 같이 화학적으로 합성할 수도 있다. 마찬가지로, 상기와 같은 조성물은 치환되거나 유도체화된 RNA, DNA 또는 PNA 조성물을 추가로 포함할 수도 있다.
약학적으로 허용 가능한 부형제 및 담체 용액의 제형은, 예를 들어 눈, 망막, 및 망막 하 주사 등을 포함하여, 동물 내 하나 이상의 세포 또는 조직 유형에 대한 경구, 비 경구, 정맥 내, 비 내, 근육 내 및 직접 투여를 포함한 다양한 치료 섭생으로 본 발명에 개시된 특정 조성물을 사용하기에 적합한 투여 및 치료 섭생의 개발에 따라, 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다.
전형적으로, 상기 제형은 약 0.1% 이상의 활성 화합물 또는 그 이상을 함유할 수 있지만, 상기 활성 성분(들)의 백분율은 변할 수 있으며 편의상 전체 제형의 중량 또는 부피의 약 1 또는 2% 내지 약 60% 또는 70% 이상일 수 있다. 물론, 각각의 치료학적으로 유용한 조성물 중의 활성 성분(들)의 양을, 적합한 투여량이 임의의 주어진 상기 화합물의 단위 용량으로 획득되도록 하는 방식으로 제조할 수도 있다. 용해도, 생물학적 이용효능, 생물학적 반감기, 투여 경로, 제품 저장 수명과 같은 인자들뿐만 아니라 다른 약물학적 고려사항들이 상기와 같은 약학 제형의 제조 분야의 통상적인 숙련가에 의해 고려될 것이며, 그 자체로서, 다양한 투여량 및 치료 섭생이 바람직할 수 있다.
몇몇 상황에서 본 발명에 개시된 약학 조성물을 개시된 바와 같이 비경구, 정맥 내, 근육 내, 또는 심지어 복강 내로 전달하는 것이 바람직할 것이다(예를 들어 미국 특허 제 5,543,158 호; 미국 특허 제 5,641,515 호 및 미국 특허 제 5,399,363 호를 참조하시오, 이들 특허는 각각 내용 전체가 참고로 본 발명에 구체적으로 인용된다). 유리 염기로서 또는 약물학적으로 허용 가능한 염으로서 상기 활성 화합물의 용액을 하이드록시프로필셀룰로스와 같은 계면활성제와 적합하게 혼합된 수 중에서 제조할 수 있다. 분산액을 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물, 및 오일 중에서 제조할 수 있다. 통상적인 보관 및 사용 조건 하에서, 이들 제제는 미생물의 생육을 방지하기 위해서 보존제를 함유한다.
주사용으로 적합한 약제 형태는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다(예를 들어 내용 전체가 참고로 본 발명에 구체적으로 인용된 미국 특허 제 5,466,468 호를 참조하시오). 모든 경우에 상기 형태는 멸균성이고 용이하게 주사할 수 있는 정도로 유동성이어야 한다. 상기 형태는 제조 및 보관 조건 하에서 안정성이어야 하며 미생물, 예를 들어 세균 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적합한 유동성을 예를 들어 코팅제, 예를 들어 레시틴의 사용에 의해서, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해서, 및 계면활성제의 사용에 의해서 유지시킬 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 발휘될 수 있다. 많은 경우에, 등장성 작용제, 예를 들어 당 또는 염화 나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 상기 조성물 중에 흡수를 지연하는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용함으로써 발휘될 수 있다.
수용액 중의 비경구 투여를 위해서, 예를 들어 상기 용액을 필요에 따라 적합하게 완충시켜야 하며 액체 희석제를 먼저 충분한 염수 또는 글루코스로 등장성으로 만들어야 한다. 이들 특정 수용액은 정맥 내, 근육 내, 피하 및 복강 내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 명세에 비추어 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있을 것이다. 예를 들어, 하나의 투여량을 1 ㎖의 등장성 NaCl 용액에 용해시키고 1000 ㎖의 피하 주입액에 가하거나 또는 제안된 주입 부위에 주사할 수도 있다(예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 15th Ed., pages 1035-1038 and 1570-1580]을 참조하시오). 일부 투여량의 변화가 치료되는 환자의 상태에 따라 반드시 발생할 것이다. 투여를 맡고 있는 사람은 어쨌든 상기 개별적인 환자에 적합한 용량을 결정할 것이다. 더욱이, 인간 투여의 경우, 제제는 멸균성, 발열원성, 및 미국 식품 의약품 안전청(FDA) 생물 표준국에 의해 요구되는 바와 같은 일반적인 안전성 및 순도 표준을 충족해야 한다.
멸균 주사용 용액은 상기 활성 화합물을 본 발명에 열거한 바와 같은 다양한 다른 성분들과 함께 적합한 용매 중에 필요한 양으로 혼입시킨 다음, 경우에 따라 여과 멸균하여 제조한다. 일반적으로, 분산액은 상기 다양한 멸균된 활성 성분을, 상기 열거한 것들로부터 기본 분산 매질 및 필요한 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴으로써 제조한다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분의 분말 + 앞서 멸균-여과된 그의 용액으로부터의 임의의 추가적인 목적하는 성분을 제공하는 진공-건조 및 동결-건조 기법이다.
본 발명에 개시된 조성물을 중성 또는 염 형태로 제형화할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염은 산 부가염(단백질의 유리 아미노 기와 형성된)을 포함하며 무기산, 예를 들어 염산 또는 인산, 또는 아세트산, 옥살산, 타타르산, 만델산 등과 같은 유기산과 형성된 것들을 포함한다. 유리 카복실 기와 형성된 염은 또한 무기 염기, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 또는 수산화 제2철, 및 아이소프로필아민, 트라이메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다. 제형화 시, 용액을 상기 투여 제형과 적합한 방식으로 및 치료학적으로 유효한 양으로 투여할 것이다. 상기 제형을 다양한 투여형, 예를 들어 주사용 용액, 약물-방출 캡슐 등으로 쉽게 투여한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "담체"는 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅제, 희석제, 항균 및 항진균제, 등장성 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 약학적으로 활성인 물질에 대한 상기와 같은 매질 및 작용제의 용도는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 상기 활성 성분과 상용성이지 않은 한을 제외하고, 상기 치료 조성물에서 그의 사용을 고려한다. 보충적인 활성 성분을 또한 상기 조성물에 혼입시킬 수 있다.
"약학적으로 허용 가능한"이란 어구는 인간에게 투여 시 알러지 또는 유사한 성가신 반응을 생성시키지 않는 분자 존재 및 조성물을 지칭한다. 활성 성분으로서 단백질을 함유하는 수성 조성물의 제조는 당해 분야에 널리 이해되어 있다. 전형적으로, 상기와 같은 조성물을 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사용으로서 제조하며; 주사 용액 또는 현탁액, 주사 전 액체에 적합한 고체 형태를 또한 제조할 수 있다. 상기 제제를 또한 유화시킬 수 있다.
서열 비교, 확인 및 상동성
서열 비교 및 상동성 측정을 위해서, 전형적으로는 하나의 서열이 시험 서열과 비교되는 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 연산을 사용하는 경우, 시험 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요에 따라 부분수열 좌표를 표시하고, 서열 연산 프로그램 매개변수를 표시한다. 이어서 상기 서열 비교 연산을 사용하여 상기 표시된 프로그램 매개변수를 근거로, 상기 기준 서열에 대한 시험 서열(들)의 서열 일치 퍼센트를 계산할 수 있다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬을, 예를 들어 국소 상동성 연산(예를 들어 문헌[Smith and Waterman, 1981]을 참조하시오)에 의해, 상동성 정렬 연산(예를 들어 문헌[Needleman and Wunsch, 1970]을 참조하시오)에 의해, 탐색 유사성 비교 방법(예를 들어 문헌[Pearson and Lipman, 1988]을 참조하시오)에 의해, 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package)(제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 미국 와이오밍주 매디슨 소재)에서 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA와 같은 연산들의 컴퓨터화된 실행에 의해, 또는 가시적인 검사에 의해 수행할 수 있다. 서열 일치 퍼센트 및 서열 유사성을 측정하기에 적합한 연산의 일례는 BLAST 연산(문헌[Altschul et al., 1990]) 및 BLOSUM62 득점 행렬(예를 들어 문헌[Henikoff and Henikoff, 1989]을 참조하시오)이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어를 국립 생물공학 정보 센터(www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 공개적으로 입수할 수 있다.
서열 일치 퍼센트를 계산하는 것 이외에, 상기 BLAST 연산은 또한 2 개 서열 간의 유사성에 대한 통계학적 분석을 수행한다(예를 들어 문헌[Karlin and Altschul, 1993]을 참조하시오). 유용한 서열 정렬 연산의 또 다른 예는 PILEUP 프로그램이며, 이는 점진적인 쌍별 비교(progressive, pairwise alignment)를 사용하는 일단의 관련 서열들로부터의 다중 서열 정렬을 생성시킨다. 상기 연산은 또한 상기 정렬을 생성시키기 위해 사용된 집단화 관계를 나타내는 나무를 플롯팅할 수 있다. PILEUP는 상기 점진적인 정렬 비교 방법의 단순화(예를 들어 문헌[Feng and Doolittle, 1987]을 참조하시오)를 사용하며, 문헌[Higgins and Sharp(1989)]에 개시된 바와 유사한 일반적인 정렬 행렬을 사용한다.
치료 및 진단 키트
본 발명은 본 발명에 개시된 바와 같은 구아닐레이트 사이클라제-결핍 질병들 중 하나 이상, 예를 들어 LCA1과 같은 망막 이영양증에 대한 특정한 rAAV-구아닐레이트 사이클라제 제형의 제형화, 및 포유동물, 및 특히 인간에게 투여하기 위한 치료제의 제조에 사용될 수 있는 바와 같이, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체, 희석제, 보조제, 및/또는 다른 성분들과 함께 하나 이상의 조성물을 추가로 포함한다. 특히, 상기와 같은 키트는 하나 이상의 rAAV-벡터화된 구아닐레이트 사이클라제 조성물을, 포유동물에게서 상기와 같은 질환의 치료에 상기 바이러스 벡터를 사용하기 위한 설명서와 함께 포함할 수 있으며, 전형적으로는 편리한 상업적인 패키징을 위해 제조된 용기를 추가로 포함할 수도 있다.
그 자체로서, 본 발명에 개시된 약학 조성물의 투여에 바람직한 동물은 포유동물, 및 특히 인간을 포함한다. 다른 바람직한 동물은 비-인간 영장류, 쥐, 에핀, 소, 양, 말, 염소, 이리, 토끼, 여우, 돼지, 개, 고양이 등을 포함한다. 상기 조성물은 부분적으로 또는 상당히 정제된 rAAV-구아닐레이트 사이클라제 조성물을 단독으로 또는 하나 이상의 추가적인 활성 성분들과 함께 포함할 수 있으며, 상기 활성 성분은 천연 또는 재조합 공급원으로부터 수득되거나 또는 천연으로 수득되거나 또는 화학적으로 합성되거나, 또는 한편으로 상기와 같은 추가적인 활성 성분을 암호화하는 DNA 분절을 발현하는 재조합 숙주 세포로부터 시험관 내에서 생산될 수 있다.
본 발명에 개시된 조성물들 중 하나 이상 및 치료제로서 상기 조성물을 사용하기 위한 설명서를 포함하는 치료 키트를 또한 제조할 수 있다. 상기와 같은 키트용 용기 수단은 전형적으로는 상기 개시된 rAAV 조성물(들)이 놓일 수 있고 바람직하게는 적합하게 분액될 수 있는 하나 이상의 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 주사기, 또는 다른 용기 수단을 포함할 수 있다. 제 2 구아닐레이트 사이클라제 조성물이 또한 제공되는 경우, 상기 키트는 상기 제 2 조성물이 놓일 수 있는 제 2의 별도의 용기 수단을 또한 함유할 수 있다. 한편으로, 상기 다수의 구아닐레이트 사이클라제 조성물을 단일 약학 조성물로 제조할 수 있으며, 단일 용기 수단, 예를 들어 바이알, 플라스크, 주사기, 병, 또는 다른 적합한 단일 용기 수단에 패키징할 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 전형적으로 상업적인 판매를 위해 밀폐된 제한으로 상기 바이알(들)을 함유하는 수단, 예를 들어 목적하는 바이알(들)이 유지되는 사출 또는 취입-성형된 플라스틱 용기를 포함할 것이다.
동물 세포에서의 발현
발명자들은 본 발명의 치료학적 구아닐레이트 사이클라제 폴리펩타이드를 암호화하는 연속적인 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 사용하여, 형질전환된 숙주 세포에서의 하나 이상의 세포 결함을 치료할 수 있음을 고려한다. 상기와 같은 세포는 바람직하게는 동물 세포, 예를 들어 인간 또는 비-인간 영장류, 또는 비제한적으로 쥐, 개, 소, 말, 에핀, 고양이, 양, 염소, 이리, 여우, 돼지 등을 포함한 하나 이상의 포유동물 종으로부터 수득된 것들과 같은 포유동물 세포이다. LCA1과 같은 망막 이형성증, 또는 관련된 망막 또는 눈 질병, 질환, 병, 또는 기능장애를 앓고 있는 것으로 의심이 가거나 또는 상기와 같은 병이 발병할 위험이 있는 인간 환자에게서 상기와 같은 병의 하나 이상의 증상의 치료 및/또는 개선을 위한 상기와 같은 구조물의 용도가 본 발명의 발명자들에 의해 특별히 고려된다.
상기 세포를, 상기 동물의 숙주 세포 내로 도입되고 상기 세포 내에서 발현되는 유전자 구조물이 상기 유독한 상태 또는 질병 상태(들) 또는 그의 하나 이상의 증상을 생체 외에서, 시험관 내에서, 원위치 외에서, 원위치 내에서 및/또는 생체 내에서 변경시키거나, 감소시키거나, 개선하거나 또는 예방하기에 충분하도록, 관심의 하나 이상의 치료학적 구아닐레이트 사이클라제 유전자를 포함하는 하나 이상의 rAAV 벡터로 형질전환시킬 수 있다.
구아닐레이트 사이클라제
구아닐레이트 사이클라제(GC)(EC 4.6.1.2)는 구아노신 트라이포스페이트(GTP)의 3',5'-사이클릭 구아노신 모노포스페이트(cGMP) 및 피로포스페이트로의 전환을 촉매화하는 라이아제이다. 한편으로 문헌에서 "구아닐 사이클라제" 또는 "구아닐일 사이클라제"로서 언급하는 경우 GC의 막-결합된(유형 1) 및 용해성(유형 2) 형태 모두가 존재한다.
레베르 선천성 흑내장
레베르 선천성 흑내장(LCA)은 모든 유전된 망막 이영양증의 가장 초기이면서 가장 중증의 형태를 나타내는 상염색체 열성 그룹이다. 이러한 유전적으로 및 임상적으로 이종인 질병의 발병에 연루되고 따라서 상기 LCA1 유전자 좌로 지정된 첫 번째 유전자는 망막-특이성 구아닐레이트 사이클라제-1(Gucy2d)이다(문헌[Perrault et al., 1996]). Gucy2d는 광수용체 외부 분절 막에서 우세하게 발현되고 상기 세포 내에서 cGMP 및 Ca2+ 수준의 조절에 한 역할을 하는 망막 특이성 단백질 구아닐레이트 사이클라제(retGC1)를 암호화한다. 광 자극에 이어서, 광수용체 외부 분절 내의 cGMP의 수준은 cGMP 포스포다이에스테라제(PDE)에 의한 가수분해로 인해 급속히 감소한다. cGMP의 이러한 감소는 cGMP-관문 채널의 폐쇄, 감소된 Ca2+ 유입 및 상기 세포의 과분극에 이르게 한다. 세포 내 Ca2+의 이러한 감소는, GC의 활성을 조절하는 칼슘 결합 단백질의 패밀리인 구아닐레이트 사이클라제 활성화 단백질(GCAP)과의 상호작용을 통해 광-자극된 광수용체의 암 상태로의 회복을 자극한다. 암 순응된 광수용체에서, Ca2+-결합된 GCAP는 GC의 활성을 억제한다. 그러나, 광 자극 시, Ca2+부재 GCAP는 GC 활성을 자극하여 cGMP 수준의 증가, 상기 cGMP-관문 채널의 재개방 및 상기 세포의 탈분극된 상태로의 복귀를 생성시킨다. LCA1에서의 경우와 같이, 세포 내 cGMP를 재충전하고 cGMP-관문 양이온 채널을 재개방하는 GC의 능력을 감소시키거나 없애는 돌연변이는 간상체 및 추상체 광수용체에서 생화학적으로 등가의 만성적인 광 노출을 생성시키는 것으로 생각된다.
Gucy2d의 돌연변이는 LCA의 모든 경우의 약 15%를 차지하며 이는 상기 돌연변이를 상기 질병의 주요 원인으로 만든다. LCA1에 걸린 환자의 수는 상기 질병의 널리 공지된 RPE65 버전(LCA2)(성공적인 AAV-매개된 유전자 요법 시도가 최근에 세계적인 주목을 모으고 있는 형태)에 걸린 경우의 대략 2 배이다. LCA1의 진단은 전형적으로는 유아에게서 생애 처음 수 개월 내에 이루어지며, 이때 완전히 실명되거나 시력이 심하게 손상되고, 소멸된 망막 전도(ERG) 및 진자 안진을 갖는다(문헌[Perrault et al., 1999]; [Chung and Traboulsi, 2009]). 이러한 기능 결함에도 불구하고, LCA1 환자는 정상적인 안저를 나타내며(문헌[Perrault et al., 1999]) 수년간 황반 및 망막 주변 모두에 일부 간상체 및 추상체 광수용체를 유지한다(문헌[Milam et al., 2003]; [Simonelli et al., 2007]; [Pasadhika et al., 2009]). 최근의 연구는, 스펙트럼-영역 빛 간섭 단층 촬영(SDOCT)을 사용하여 중심 황반 및 중심와 주변 구역을 스캐닝하여, LCA1 환자(연령 범위, 20 내지 53 세)가 가시적인 광수용체 내부/외부 분절 접합으로 모두 6 개의 망막 층을 유지함을 밝혀냈다. LCA1에서 망막 구조의 유지는 연령에 따라 일반적으로 악화되는 현저한 망막 희박화를 나타내는 상기 질병의 다른 형태와 다르다(문헌[Pasadhika et al., 2009]). 망막 구조의 보존이 LCA1 환자에 있어서 더 양호한 시력을 필적시키지는 않지만, 상기 보존은 차후의 치료 전략에 더 양호하게 적합함을 암시한다.
동물 모델
retGC1 유전자의 삭제 돌연변이를 수반하는 2 마리의 동물 모델, 즉 천연 GUCY1*B 치킨 및 구아닐레이트-사이클라제 1(GC1) 녹아웃 마우스를 사용하여 유전자 대체 요법을 평가하였다(예를 들어 문헌[Williams et al., 2006]; [Haire et al., 2006]을 참조하시오). 상기 GUCY1*B 치킨은 부화 시 눈이 멀었으며, 소멸한 암소시(간상체-매개된) 및 명소시(추상체-매개된) ERG 및 망막 변성을 나타낸다(예를 들어 문헌[Ulshafer et al., 1984]; [Huang et al., 1998]; [Semple-Rowland et al., 1998]을 참조하시오). Gucy2d의 GUCY1*B 망막으로의 렌티바이러스-매개된 운반은 행동 시험 및 ERG에 의해 증명된 바와 같이 상기 동물에게 시각을 복원시켰다(예를 들어 문헌[Williams et al., 2006]을 참조하시오). 단기간의 치료 성공에도 불구하고, 상기 요법은 장기간 동안 망막 구조 또는 기능의 보존에 미치지 못하였다. 종란 내(in ovo) 전달된 통합 바이러스 벡터를 갖는 비-포유동물 종에서 획득된, 상기 결과의 일시적인 성질은 임상 적용의 개발에 대한 보다 적합한 번역 연구의 필요성을 시사하였다.
LCA1의 포유동물 모델, GC1KO 마우스는 추상체 광수용체 변성을 나타낸다(예를 들어 문헌[Yang et al., 1999]; [Coleman et al., 2004]). LCA1 환자들처럼, 상기 마우스 모델에서 추상체 기능의 상실은 추상체 변성에 선행한다(문헌[Yang et al., 1999]). 또한, 추상체 어레스틴의 광-유발된 전좌가 붕괴된다. 상기 모델에서 간상체 광수용체는, 상기 세포 중의 GC1의 가까운 관계물인 GC2의 존재로 인한듯한 결과(예를 들어 문헌[Lowe et al., 1995]; [Yang et al., 1995]; [Yang and Garbers, 1997]; [Karan et al., 2010])로, 변성하지 않고 계속해서 빛에 대해 전기 반응을 발생시킨다(문헌[Yang et al., 1999]). Gucy2d의 출생 후 GC1KO 망막으로의 AAV-매개된 운반은 형질도입된 세포에서 추상체 어레스틴의 빛-구동된 전좌를 복원시켰지만, 추상체 ERG 반응을 복원시키거나 또는 추상체 변성을 방지하는 데는 실패하였다(문헌[Haire et al., 2006]). 동일한 연구자에 의해 수행된 상기 치킨 및 마우스 연구 모두에서, 치료학적 cDNA는 GC1 작용성을 평가하는 생화학 분석에 역사적으로 사용된 단백질 종인 소 기원의 것이었다(문헌[Otto-Bruc et al., 1997]; [Williams et al., 2006]).
예시적인 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 발명에 사용된 모든 기술 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 통상적인 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에 개시된 바와 유사하거나 동일한 임의의 방법 및 조성물을 본 발명의 실시 또는 시험에 사용할 수 있지만, 바람직한 방법 및 조성물을 본 발명에 개시한다. 본 발명의 목적을 위해서, 하기의 용어들을 하기에 정의한다:
오래 존속되어 온 특허법 규약에 따라, 단수형 용어는, 특허청구범위를 포함하여 본 출원에 사용 시 "하나 이상"을 나타낸다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "약"이란 용어는 일반적으로 숫자 범위에서 양쪽 숫자 모두를 지칭하는 것으로 이해해야 한다. 예를 들어, "약 1 내지 10"은 "약 1 내지 약 10"으로서 이해해야 한다. 더욱이, 본 발명의 모든 숫자 범위는 상기 범위 내의 각각의 정수뿐만 아니라 각각의 1/10을 포함하는 것으로 이해해야 한다. 본 발명에 사용된 바와 같이 "약"이란 용어는 일반적으로 "대략"을 의미하는 것으로 이해해야 하며, 전형적으로는 숫자 범위 내의 인용된 주어진 숫자에 대략 동등한 숫자를 지칭한다. 더욱이, 본 발명의 모든 숫자 범위는 상기 범위 내의 각각의 정수를 포함하는 것으로 이해해야 한다.
본 발명에 따라, 폴리뉴클레오타이드, 핵산 분절, 핵산 서열 등은 비제한적으로, 천연 공급원으로부터 수득되거나, 화학적으로 합성되거나, 변형되거나 또는 달리 제조된 또는 전적으로 또는 부분적으로 인간의 손에 의해 합성된, DNA(비제한적으로 게놈 또는 게놈 외 DNA를 포함한다), 유전자, 펩타이드 핵산(PNA) RNA(비제한적으로 rRNA, mRNA 및 tRNA를 포함한다), 뉴클레오사이드, 및 적합한 핵산 분절을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "핵산"이란 용어는 하기 중 하나 이상의 유형을 포함한다: 폴리데옥시리보뉴클레오타이드(2-데옥시-D-리보스 함유), 폴리리보뉴클레오타이드(D-리보스 함유), 및 퓨린 또는 피리미딘 염기, 또는 변형된 퓨린 또는 피리미딘 염기(염기 부위 포함)의 N-글리코사이드인 폴리뉴클레오타이드의 임의의 다른 유형. 본 발명에 사용된 바와 같은 "핵산"이란 용어는 또한 전형적으로 서브유닛들 간에 포스포다이에스터 결합에 의해, 일부의 경우 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 등에 의해 공유 결합된 리보뉴클레오사이드 또는 데옥시리보뉴클레오사이드의 중합체를 포함한다. "핵산"은 단일- 및 이중-가닥 DNA뿐만 아니라 단일- 및 이중-가닥 RNA를 포함한다. 예시적인 핵산은 비제한적으로 gDNA; hnRNA; mRNA; rRNA, tRNA, 마이크로 RNA(miRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 작은 핵소체 RNA(snORAN), 작은 핵 RNA(snRNA), 및 작은 일시 RNA(stRNA) 등, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "DNA 분절"이란 용어는 특정 종의 전체 게놈 DNA 없이 단리된 DNA 분자를 지칭한다. 따라서, 본 발명에 개시된 조성물들 중 하나를 사용하여 생물학적 샘플로부터 수득된 DNA 분절은 상기 분절이 수득된 특정 종의 전체 게놈 DNA로부터 떨어져서 단리되거나 또는 상기 DNA 없이 정제된 하나 이상의 DNA 분절을 지칭한다. "DNA 분절"이란 용어 내에는 DNA 분절 및 상기와 같은 분절의 보다 작은 단편뿐만 아니라 재조합 벡터, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 파지, 바이러스 등이 포함된다.
유사하게, "RNA 분절"이란 용어는 특정 종의 전체 세포 RNA 없이 단리된 RNA 분자를 지칭한다. 따라서, RNA 분절은 다른 RNA로부터 떨어져서 단리되거나, 또는 상기 RNA 없이 정제된 하나 이상의 RNA 분절(천연 또는 합성 기원의 것)을 지칭할 수 있다. "RNA 분절"이란 용어 내에는 RNA 분절 및 상기와 같은 분절의 보다 작은 단편이 포함된다.
본 발명과 관련하여 "발현"이란 용어는 암호화된 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 합성하는 구조 유전자와 같은 폴리뉴클레오타이드에 의해 수행된 전사 및 번역을 포함하여, 세포 내 과정들의 조합을 포함함을 의미한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "예를 들어"란 용어는 의도된 제한 없이 단지 예로서 사용되며, 명세서에 명백하게 열거된 항목들만을 지칭하는 것으로서 해석해서는 안 된다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "프로모터"란 용어는 전사를 조절하는 핵산 서열의 영역 또는 영역들을 일반적으로 개시하고자 한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "조절 요소"란 용어는 전사를 조절하는 핵산 서열의 영역 또는 영역들을 일반적으로 개시하고자 한다. 예시적인 조절 요소는 비제한적으로 인헨서, 전사-후 요소, 전사 조절 서열 등을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "구조 유전자"란 용어는 암호화된 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 리보자임, 촉매적 RNA 분자, 또는 안티센스 분자를 생산하도록 발현되는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 유전자를 일반적으로 개시하고자 한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "형질전환"이란 용어는 외부 폴리뉴클레오타이드 서열(예를 들어 바이러스 벡터, 플라스미드, 또는 재조합 DNA 또는 RNA 분자)을 숙주 세포 또는 원형질체(여기에서 상기 외부 폴리뉴클레오타이드는 적어도 제 1 염색체 내로 도입되거나 또는 형질전환된 숙주 세포 내에서 자율적으로 복제될 수 있다) 내로 도입시키는 과정을 일반적으로 개시하고자 한다. 형질감염, 일렉트로포레이션, 및 "네이키드" 핵산 흡수는 모두 숙주 세포를 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드로 형질전환시키는데 사용되는 기법의 예를 나타낸다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "형질전환된 세포"란 용어는 헥산 보체가 상기 세포 내로 하나 이상의 외부 폴리뉴클레오타이드의 도입에 의해 변경된 숙주 세포를 의미하고자 한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "트랜스제닉 세포"란 용어는 일반적으로, 형질전환된 세포로부터 유래하거나 또는 재생되거나 또는 또 다른 트랜스제닉 세포로부터, 또는 상기와 같은 형질전환된 또는 트랜스제닉 숙주 세포의 임의의 세대의 자손 또는 후예로부터 유래하는 임의의 세포를 의미하고자 한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "벡터"란 용어는 일반적으로 숙주 세포에서 복제가 가능한 핵산 분자(전형적으로는 DNA로 구성됨) 및/또는 결합된 분절의 복제를 일으키기 위해서 또 다른 핵산 분절이 작동적으로 결합될 수 있는 핵산 분자를 의미하고자 한다. 플라스미드, 코스미드, 또는 바이러스가 예시적인 벡터이다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "실질적으로 상응하는", "실질적으로 상동성인" 또는 "실질적으로 일치하는"이란 용어들은 선택된 핵산 또는 아미노산 서열이 선택된 기준 핵산 또는 아미노산 서열에 비해 약 70 또는 약 75% 이상의 서열 일치성을 갖는 핵산 또는 아미노산 서열의 특징을 나타낸다. 보다 전형적으로, 상기 선택된 서열 및 기준 서열은 약 76, 약 77, 약 78, 약 79, 약 80, 약 81, 약 82, 약 83, 약 84, 또는 심지어 약 85% 이상의 서열 일치성, 및 보다 바람직하게는 약 86% 이상의 서열 일치성, 약 87% 이상의 서열 일치성, 약 88% 이상의 서열 일치성, 약 89% 이상의 서열 일치성, 약 90% 이상의 서열 일치성, 약 91% 이상의 서열 일치성, 약 92% 이상의 서열 일치성, 약 93% 이상의 서열 일치성, 약 94% 이상의 서열 일치성, 또는 약 95% 이상의 서열 일치성을 가질 것이다. 보다 바람직하게는, 더욱 고도로 상동성인 서열은 종종 상기 선택된 서열과, 상기 서열과 비교되는 기준 서열 간에 약 96% 이상의 서열 일치성, 약 97% 이상의 서열 일치성, 약 98% 이상의 서열 일치성, 또는 약 99% 이상의 서열 일치성을 공유한다. 상기 서열 일치성의 백분율을 상기 비교되는 서열들의 전체 길이에 대해 계산하거나, 또는 상기 선택된 기준 서열의 총 약 25% 미만 정도의 작은 결실 또는 첨가는 제외함으로써 계산할 수 있다. 상기 기준 서열은 보다 큰 서열의 부분집합, 예를 들어 유전자 또는 인접 서열의 일부, 또는 염색체의 반복 부분일 수도 있다.
그러나, 2 개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열의 서열 상동성의 경우에, 상기 기준 서열 및 표적 서열은 전형적으로는 약 18 내지 약 25 이상의 연속된 일치하는 뉴클레오타이드, 보다 전형적으로는 약 26 내지 약 35 이상의 연속된 일치하는 뉴클레오타이드, 및 훨씬 더 전형적으로는 적어도 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 또는 심지어 약 100 정도의 연속된 일치하는 뉴클레오타이드를 포함할 것이다. 바람직하게는, 고도로 상동성인 단편을 목적으로 하는 경우, 2 개의 주어진 서열 간의 전체 서열 일치 퍼센트의 정도는, 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 서열 비교 연산들 중 하나 이상, 예를 들어 문헌[Pearson and Lipman(1988)]에 개시된 FASTA 프로그램 분석에 의해 쉽게 측정되는 바와 같이, 약 80% 이상, 바람직하게는 약 85% 이상 일치할 것이고, 보다 바람직하게는 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 또는 심지어 약 95% 이상 일치할 것이다.
2 개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열과 관련하여 "일치하는" 또는 "일치" 퍼센트란 용어는, 하기 개시된 서열 비교 연산(또는 통상적인 숙련가들에게 이용 가능한 다른 연산)을 사용하여 또는 가시적인 검사에 의해 측정된 바와 같이, 최대 일치를 위해 비교 및 정렬 시, 동일하거나 또는 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 명시된 백분율을 갖는 2 개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다.
2 개의 핵산과 관련하여 "실질적으로 일치하는"이란 어구는 서열 비교 연산을 사용하여 또는 가시적인 검사에 의해 측정된 바와 같이, 최대 일치를 위해 비교 및 정렬 시, 적어도 약 90%, 바람직하게는 91%, 가장 바람직하게는 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 98.5%, 약 99%, 약 99.1%, 약 99.2%, 약 99.3%, 약 99.4%, 약 99.5%, 약 99.6%, 약 99.7%, 약 99.8%, 또는 약 99.9% 이상의 뉴클레오타이드 잔기 일치성을 갖는 2 개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 상기와 같은 "실질적으로 일치하는" 서열들을 전형적으로는 실제 계통의 참조 없이 "상동성"인 것으로 간주한다.
하나의 사물에 적용 시 본 발명에 사용된 바와 같은 "천연"이란 용어는 사물이 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 자연의 공급원으로부터 단리될 수 있고 실험실에서 인간의 손으로 의도적으로 변형시키지 않은 유기체(바이러스 포함) 중에 존재하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열이 천연이다. 본 발명에 사용된 바와 같이, 전통적인 유전학에 따라 선택적으로 번식된 설치류의 실험실 변종은 천연 동물인 것으로 간주한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "이종"은 소정의 참조한 유전자 서열과 관련하여 정의된다. 예를 들어, 구조 유전자 서열에 관하여, 이종 프로모터는 상기 참조한 구조 유전자에 인접하여 천연으로 발생하지 않지만 실험식 조작에 의해 배치되는 프로모터로서 정의된다. 마찬가지로, 이종 유전자 또는 핵산 분절은 상기 참조한 프로모터 및/또는 인헨서 요소에 인접하여 천연으로 발생하지 않는 유전자 또는 분절로서 정의된다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "상동성"이란 용어는 2 개 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열 간의 상보성 정도를 지칭한다. "일치성"이란 단어는 제 1 핵산 또는 아미노산 서열이 제 2 핵산 또는 아미노산 서열과 정확하게 동일한 1차 서열을 가질 때 "상동성"이란 단어를 대용할 수 있다. 서열 상동성 및 서열 일치성을 당해 분야에 공지된 연산 또는 컴퓨터 프로그램을 사용하여 2 개 이상의 서열을 분석함으로서 측정할 수 있다. 상기와 같은 방법을 사용하여 주어진 서열이 또 다른 선택된 서열과 동일하거나 상동성인지를 평가할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "상동성"은 폴리뉴클레오타이드를 언급하는 경우, 상이한 기원으로부터 발생함에도 불구하고, 동일한 필수적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 서열을 의미한다. 전형적으로, 상동성 핵산 서열은 하나 이상의 실질적으로 유사한 게놈 서열을 갖는 밀접하게 관련된 유전자 또는 유기체로부터 유래한다. 대조적으로, "유사한" 폴리뉴클레오타이드는, 상이한 종 또는 유기체로부터의 폴리뉴클레오타이드와 동일한 기능을 공유하지만 유사한 기능을 성취하거나 또는 유사한 생물 활성을 소유하는 하나 이상의 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 현저하게 상이한 1차 뉴클레오타이드 서열을 가질 수도 있는 것이다. 유사한 폴리뉴클레오타이드는 종종 밀접하게 관련되지 않은(예를 들어 유전적으로 또는 계통발생적으로) 2 개 이상의 유기체로부터 유래할 수도 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "폴리펩타이드"란 용어는 단일의 "폴리펩타이드"뿐만 아니라 복수의 "폴리펩타이드"를 포함함을 의미하며 2 개 이상의 아미노산의 임의의 쇄 또는 쇄들을 포함한다. 따라서, 본 발명에 사용된 바와 같이, 비제한적으로 "펩타이드", "다이펩타이드", "트라이펩타이드", "단백질", "효소", "아미노산 쇄" 및 "연속적인 아미노산 쇄"를 포함하는 용어들은 모두 "폴리펩타이드"의 정의 내에 포함되며, "폴리펩타이드"란 용어를 이들 용어 중 어느 하나 대신에, 또는 호환적으로 사용할 수 있다. 상기 용어는 하나 이상의 번역 후 변형(들), 예를 들어 비제한적으로 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 유도체화, 단백질 분해 절단, 번역-후 처리, 또는 하나 이상의 비-천연 아미노산의 포함에 의한 변형을 겪은 폴리펩타이드를 추가로 포함한다. 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 구조에 대한 통상적인 명명법이 당해 분야에 존재한다. 예를 들어, 1-문자 및 3-문자 약어가 아미노산을 기술하기 위해 널리 사용된다: 알라닌(A; Ala), 아르기닌(R; Arg), 아스파라진(N; Asn), 아스파트산(D; Asp), 시스테인(C; Cys), 글루타민(Q; Gln), 글루탐산(E; Glu), 글리신(G; Gly), 히스티딘(H; His), 아이소류신(I; Ile), 류신(L; Leu), 메티오닌(M; Met), 페닐알라닌(F; Phe), 프롤린(P; Pro), 세린(S; Ser), 쓰레오닌(T; Thr), 트립토판(W; Trp), 타이로신(Y; Tyr), 발린(V; Val), 및 리신(K; Lys). 본 발명에 개시된 아미노산 잔기는 "L" 이성체 형태로 존재하는 것이 바람직하다. 그러나, "D" 이성체 형태의 잔기를, 상기 폴리펩타이드의 목적하는 성질이 유지되는 한 임의의 L-아미노산 잔기 대신에 사용할 수도 있다.
"단백질"은 본 발명에서 "펩타이드" 및 "폴리펩타이드"와 호환적으로 사용되며, 합성적으로, 재조합에 의해, 또는 시험관 내에서 생산된 펩타이드 및 폴리펩타이드, 및 핵산 서열을 숙주 동물 또는 인간 환자에게 투여 후 생체 내에서 발현된 펩타이드 및 폴리펩타이드를 모두 포함한다. "폴리펩타이드"란 용어는 바람직하게는 약 2 내지 약 20 개 아미노산 잔기 길이의 짧은 펩타이드, 약 10 내지 약 100 개 아미노산 잔기 길이의 올리고펩타이드, 및 약 100 내지 약 5,000 개 이상 아미노산 잔기 길이의 폴리펩타이드를 포함한, 모든 아미노산 쇄 길이를 지칭하고자 한다. "서열"이란 용어는 아미노산에 대해 지칭 시, 주어진 아미노산 쇄, 예를 들어 폴리펩타이드 또는 단백질 내의 아미노산들의 선형 N-말단에서부터 C-말단 순서의 전부 또는 일부에 관한 것이며; "하위서열"은 서열 내 아미노산들의 임의의 연속적인 신장부, 예를 들어 주어진 단백질 또는 폴리펩타이드 서열 내 3 개 이상의 연속적인 아미노산을 의미한다. 뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드 쇄에 관하여, "서열" 및 "하위서열"은 뉴클레오타이드의 5'에서 3' 순서와 관련된 유사한 의미를 갖는다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "실질적으로 상동성"이란 용어는 1차 뉴클레오타이드 서열 수준에서 서로 현저하게 유사한 2 개 이상의 생물분자 서열을 포함한다. 예를 들어 2 개 이상의 핵산 서열과 관련하여, "실질적으로 상동성"은 약 75% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 및 보다 바람직하게는 약 85% 이상 또는 약 90% 이상의 일치성, 및 훨씬 더 바람직하게는 약 95% 이상, 보다 바람직하게는 약 97% 이상 일치성, 보다 바람직하게는 약 98% 이상 일치성, 보다 바람직하게는 약 99% 이상 일치성, 및 훨씬 더 바람직하게는 완전히 동일함(즉 100% 또는 "변함 없음")을 지칭할 수 있다.
마찬가지로, 본 발명에 사용된 바와 같이, "실질적으로 일치하는"이란 용어는 뉴클레오타이드 수준에서 서로 높은 정도의 일치성을 나타내는 2 개 이상의 생물분자 서열들(및 특히 폴리뉴클레오타이드 서열들)을 포함한다. 예를 들어, 2 개 이상의 핵산 서열에 관하여, "실질적으로 일치하는"은 약 80% 이상, 및 보다 바람직하게는 약 85% 이상 또는 약 90% 이상 서로 일치하는, 및 훨씬 더 바람직하게는 약 95% 이상, 보다 바람직하게는 약 97% 이상 일치하는, 보다 바람직하게는 약 98% 이상 일치하는, 보다 바람직하게는 약 99% 이상 일치하는, 및 훨씬 더 바람직하게는 완전히 일치하는(즉 100% 일치하는 또는 "변형 없는") 서열을 지칭할 수 있다.
"재조합"이란 용어는 물질(예를 들어 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드)이 인간 중재에 의해 인위적으로 또는 합성적으로(비-천연) 변경되었음을 가리킨다. 상기 변경을 상기 물질의 천연 환경 또는 상태 내에서 상기 물질 상에서 수행하거나 또는 상기 환경 또는 상태로부터 제거된 물질 상에서 수행할 수 있다. 구체적으로, 예를 들어 프로모터 서열은 상기 서열이 인간의 손에 의해 조작된 핵산 분절의 발현에 의해 생성될 때 "재조합형"이다. 예를 들어, "재조합 핵산"은 예를 들어 클로닝, DNA 셔플링 또는 다른 과정 중 핵산의 재조합에 의해서 또는 화학적 또는 다른 돌연변이에 의해 수행된 것이며; "재조합 폴리펩타이드" 또는 "재조합 단백질"은 재조합 핵산의 발현에 의해 생성된 폴리펩타이드 또는 단백질이고; "재조합 바이러스", 예를 들어 재조합 AAV 바이러스는 재조합 핵산의 발현에 의해 생성된다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "작동적으로 결합된"이란 용어는 2 개 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 2 개 이상의 핵산 서열의 작용성 관계의 결합을 지칭한다. 핵산은 또 다른 핵산 서열과 작용성 관계로 놓일 때 "작동적으로 결합된다". 예를 들어, 프로모터 또는 인헨서는 암호화 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 상기 암호화 서열에 작동적으로 결합된다. "작동적으로 결합된"은 결합되는 핵산 서열들이 전형적으로 연속적이거나 또는 실질적으로 연속적이고 2 개의 단백질 암호화 영역을 결합시키는 것이 필요한 경우, 연속적이고 판독 프레임 중에 있음을 의미한다. 인헨서는 일반적으로 수 킬로염기에 의해 프로모터로부터 분리된 경우 작용하고 인트론 서열은 가변 길이를 가질 수 있기 때문에; 일부 폴리뉴클레오타이드 요소들은 작동적으로 결합되지만 연속적이지 않을 수도 있다.
"전사 조절 요소"는 단독으로 또는 하나 이상의 다른 핵산 서열과 함께 전사를 활성화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 전사 조절 요소는 예를 들어 하나 이상의 프로모터, 하나 이상의 응답 요소, 하나 이상의 음의 조절 요소, 및/또는 하나 이상의 인헨서를 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "전사 인자 인식 부위" 및 "전사 인자 결합 부위"는, 흔히 직접적인 단백질-DNA 결합의 형태를 취하는 하나 이상의 전사 인자들의 서열-특이성 상호작용을 위한 부위인 것으로 확인된 폴리뉴클레오타이드 서열(들) 또는 서열 동기(들)를 지칭한다. 전형적으로, 전사 인자 결합 부위를 DNA 지문분석, 젤 이동성 변동 분석 등에 의해 확인할 수 있으며/있거나 공지된 공통서열 동기를 근거로, 또는 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 다른 방법들에 의해 예측할 수 있다.
"전사 단위"는 적어도 제 1 시스-작용 프로모터 서열에 작동적으로 결합되고 구조 유전자 서열의 효율적인 전사에 필요한 하나 이상의 다른 시스-작용 핵산 서열에 임의로 작동적으로 결합된 제 1 구조 유전자, 및 프로모터 및/또는 인헨서 요소의 조절 하에서 작동적으로 위치된 상기 구조 유전자 서열의 적합한 조직-특이성 및 발달중인 전사에 필요할 수도 있는 바와 같은 적어도 제 1 원위 조절 요소뿐만 아니라 효율적인 전사 및 번역에 필요한 임의의 추가적인 시스 서열(예를 들어 폴리아데닐화 부위(들), mRNA 안정성 조절 서열(들) 등)을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다.
"실질적으로 상보성"이란 용어는 아미노산 또는 핵산 서열을 정의하기 위해 사용되는 경우, 특정한 주제 서열, 예를 들어 올리고뉴클레오타이드 서열이 선택된 서열의 전부 또는 일부에 실질적으로 상보성이고 따라서 상기 선택된 서열을 암호화하는 mRNA의 일부에 특이적으로 결합할 것임을 의미한다. 그 자체로서, 전형적으로 상기 서열은 상기 mRNA "표적" 서열에 고도로 상보성일 것이며 상기 서열의 상보성 부분 전체를 통해 단지 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9 또는 약 10 정도의 염기 불합치를 가질 것이다. 다수의 경우에, 상기 서열들은 정확하게 합치되는 것, 즉 상기 올리고뉴클레오타이드가 특이적으로 결합하고 따라서 상기 상보성 신장부를 따라 불합치가 없는 서열에 완전히 상보성인 것이 바람직할 수 있다. 그 자체로서, 고도로 상보성인 서열은 전형적으로 상기 mRNA의 표적 서열 영역에 매우 특이적으로 결합할 것이며 따라서 상기 표적 mRNA 서열의 폴리펩타이드 산물로의 번역을 감소 및/또는 심지어 억제하기에 매우 효율적일 것이다.
실질적으로 상보성인 핵산 서열은 상기 핵산이 특이적으로 결합하는 상응하는 핵산 표적 서열에 약 80% 초과 상보성(또는 "정확한-합치%")일 것이며 보다 바람직하게는 상기 핵산이 특이적으로 결합하는 상응하는 핵산 표적 서열에 약 85% 초과 상보성일 것이다. 몇몇 태양에서, 상술한 바와 같이, 본 발명의 실시에 사용하기에 훨씬 더 실질적으로 상보성인 핵산 서열을 갖는 것이 바람직할 것이며, 상기와 같은 경우에, 상기 핵산 서열은 상기 핵산이 특이적으로 결합하는 상응하는 표적 서열에 약 90% 초과 상보성일 것이고, 몇몇 실시태양에서 상기 핵산이 특이적으로 결합하는 상응하는 핵산 표적 서열에 약 95% 초과 상보성일 수 있고, 심지어 상기 설계된 핵산이 특이적으로 결합하는 표적 서열의 전부 또는 일부에 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 및 심지어 약 100%까지 정확하게 합치하는 상보성일 수 있다.
상기 개시된 핵산 서열들 중 임의의 서열의 유사성 퍼센트 또는 상보성 퍼센트를 예를 들어 위스콘신 제네틱스 컴퓨터 그룹 대학(the University of Wisconsin Genetics Computer Group)(UWGCG)으로부터 입수할 수 있는 GAP 컴퓨터 프로그램, 버전 6.0을 사용하여 서열 정보를 비교함으로써 측정할 수 있다. 상기 GAP 프로그램은 니들맨과 분취(문헌[Needleman and Wunsch(1970)])의 정렬 방법을 사용한다. 간단히, 상기 GAP 프로그램은 2 개 서열 중 더 짧은 것의 기호의 총수로 나눈, 유사한 정렬된 기호(즉 뉴클레오타이드 또는 아미노산)의 수로서 유사성을 정의한다. 상기 GAP 프로그램에 바람직한 디폴트 매개변수는 (1) 뉴클레오타이드에 대한 1진법 비교 행렬(일치의 경우 1의 값 및 불-일치의 경우 0의 값을 함유한다), 및 그리브스코프와 버게스(문헌[Gribskov and Burgess(1986)])의 칭량된 비교 행렬, (2) 각각의 불연속(gap)에 대해 3.0의 벌점 및 각 불연속 중의 각 기호에 대해 추가로 0.10의 벌점; 및 (3) 최종 불연속의 경우 벌점 없음을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "단백질", "폴리펩타이드" 및 "펩타이드"란 용어는 호환적으로 사용되며, 2 개 이상의 아미노산 잔기들을 함께 결합시키는 하나 이상의 아미드 결합을 포함하는 분자들을 포함한다. 호환적으로 사용되지만, 일반적으로 펩타이드는 비교적 짧은 반면(예를 들어 2 내지 약 100 개 아미노산 잔기 길이), 단백질 또는 폴리펩타이드는 비교적 더 긴 중합체(예를 들어 100 개 이상 잔기 길이)이다. 그러나, 쇄 길에 의해 구체적으로 한정하지 않는 한, 펩타이드, 폴리펩타이드, 및 단백질이란 용어는 호환적으로 사용된다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "환자"(또한 "숙주" 또는 "피실험자"와 호환적으로 지칭된다)란 용어는 본 발명에 논의된 바와 같은 rAAV-기재 구아닐레이트 사이클라제 조성물 중 하나 이상에 대해 수용자로서 작용할 수 있는 임의의 숙주를 지칭한다. 몇몇 태양에서, 상기 수용자는 척추동물일 것이며, 상기 동물은 임의의 동물 종(및 바람직하게는, 인간과 같은 포유동물 종)을 나타냄을 의미한다. 몇몇 실시태양에서, "환자"는 임의의 동물 숙주, 예를 들어 비제한적으로 가축, 무리 또는 이주성 동물, 외래 또는 동물학적 시료뿐만 아니라 반려 동물, 애완 동물, 및 수의사의 보살핌 하에 있는 임의의 동물을 포함하여, 인간 및 비-인간 영장류, 소, 개, 염소, 캐빈(cavines), 까마귀, 에핀, 말, 고양이, 염소, 토끼, 이리, 쥐, 양, 돼지, 라신(racines), 여우 등을 포함한 임의의 동물 숙주를 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "담체"란 용어는 관련 동물에게 투여하기에 약학적으로 허용 가능하거나 또는 적용 가능한 경우, 진단 목적에 허용 가능한 임의의 용매(들), 분산 매질, 코팅제(들), 희석제(들), 완충제(들), 등장성 작용제(들), 용액(들), 현탁제(들), 콜로이드(들), 불활성 물질(들) 등 또는 이들의 조합을 포함하고자 한다. 유전자 요법 구조물, 바이러스 입자, 벡터 등에 대한 하나 이상의 전달 비히클의 용도가 약학 및 분자 분야의 통상적인 숙련가들에게 널리 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 성분과 상용성이지 않는 한을 제외하고, 예방 및/또는 치료 조성물에서의 상기 매질 또는 작용제의 사용이 고려된다. 하나 이상의 보충적인 활성 성분(들)을 또한 상기 개시된 조성물들 중 하나 이상에 혼입하거나 또는 이들과 함께 투여할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "유효량"은 수용 환자에게 치료, 예방 또는 달리 유익한 효과를 제공하는 것으로 당해 분야의 숙련가들에 의해 이해될 것이다.
"단리된" 또는 "생물학적으로 순수한"이란 어구는 물질을 고유한 상태로 발견되는 그대로 통상적으로 수반하는 성분이 실질적으로, 또는 필수적으로 없는 물질을 지칭한다. 따라서, 본 발명에 따라 단리된 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 천연에서 또는 원위치 환경에서 상기 폴리뉴클레오타이드와 통상적으로 회합된 물질을 함유하지 않는다.
"결합" 또는 "연결"은 하나 이상의 단백질, 펩타이드, 핵산, 또는 폴리뉴클레오타이드를 작용적으로 연결하기 위해 당해 분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 비제한적으로 재조합 융합, 공유 결합, 다이설파이드 결합, 이온 결합, 수소 결합, 정전기적 결합 등을 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "플라스미드" 또는 "벡터"란 용어는 유전 물질(즉 핵산)로 구성된 유전자 구조물을 지칭한다. 전형적으로, 플라스미드 또는 벡터는 세균 숙주 세포, 예를 들어 에스케리키아 콜라이에서 작용성인 복제 기원, 및 상기 플라스미드를 포함하는 세균 숙주 세포를 검출하기 위한 선택성 마커를 함유한다. 본 발명의 플라스미드 및 벡터는 삽입된 암호화 서열이 적합한 발현 세포에서 전사되고 번역될 수 있도록 배열된, 본 발명에 개시된 바와 같은 하나 이상의 유전 요소를 포함할 수 있다. 또한, 상기 플라스미드 또는 벡터는 하나 이상의 천연 및/또는 인공 공급원으로부터 수득되거나 유래하는 분절들을 포함한, 하나 이상의 핵산 분절, 유전자, 프로모터, 인헨서, 활성제, 다수의 클로닝 영역, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
"필수적으로 서열번호 X에 나타낸 바와 같은 서열"이란 용어는 상기 서열이 서열번호 X의 일부에 실질적으로 상응하며, 서열번호 X의 뉴클레오타이드(또는 아미노산)와 동일하지 않거나 또는 그의 생물학적으로 작용성인 등가물이 아닌 뉴클레오타이드(또는 폴리펩타이드 서열의 경우 아미노산)를 비교적 거의 갖지 않음을 의미한다. "생물학적으로 작용성인 등가물"이란 용어는 당해 분야에서 널리 이해되고 있으며 본 발명에 상세히 추가로 정의된다. 따라서, 본 발명에 제공된 뉴클레오타이드 서열 중 하나 이상과 동일하거나 작용상 등가인 뉴클레오타이드의 약 85% 내지 약 90%; 또는 보다 바람직하게는 약 91% 내지 약 95%; 또는 훨씬 더 바람직하게는 약 96% 내지 약 99%를 갖는 서열이 본 발명의 실시에 유용한 것으로 특별히 고려된다.
본 발명에 적합한 표준 하이브리드화 조건은 예를 들어 42 ℃에서 16 시간 동안 50% 폼아미드, 5x 덴하르트 용액, 5x SSC, 25 mM 나트륨 포스페이트, 0.1% SDS 및 100 ㎍/㎖의 변성된 연어 정자 DNA에서 하이브리드화에 이어서 60 ℃에서 0.1x SSC, 0.1% SDS 용액에 의해 1 시간 연속적으로 세척하여 목적하는 양의 배경 신호를 제거함을 포함한다. 본 발명의 더 낮은 엄격성 하이브리드화 조건은 예를 들어 42 ℃에서 16 시간 동안 35% 폼아미드, 5x 덴하르트 용액, 5x SSC, 25 mM 나트륨 포스페이트, 0.1% SDS 및 100 ㎍/㎖의 변성된 연어 정자 DNA 또는 에스케리키아 콜라이 DNA에서 하이브리드화에 이어서 55 ℃에서 0.8x SSC, 0.1% SDS 용액에 의한 연속 세척을 포함한다. 당해 분야의 숙련가들은 목적하는 엄격성 수준을 획득하기 위해 조건들을 쉽게 조절할 수 있음을 알 것이다.
물론, 본 발명은 본 발명에 구체적으로 나열된 특정한 뉴클레오타이드 서열 중 적어도 하나 이상에 상보성, 필수적으로 상보성 및/또는 실질적으로 상보성인 핵산 분절을 추가로 포함한다. "상보성"인 핵산 서열은 표준 와트슨-크리크 상보성 법칙에 따라 염기-짝 짓기가 가능한 것들이다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "상보성 서열"이란 용어는, 상기 나타낸 동일한 뉴클레오타이드 비교에 의해 평가될 수 있거나 또는 바로 위에 개시한 것들과 같은 비교적 엄격한 조건 하에서 본 발명에 개시된 특정 핵산 분절들 중 하나 이상에 하이브리드화 할 수 있는 것으로 정의된 바와 같이, 실질적으로 상보성인 핵산 서열을 의미한다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 탐침 및 프라이머는 임의의 길이를 가질 수 있다. 서열에 수치를 할당함으로써, 예를 들어 제 1 잔기는 1, 제 2 잔기는 2 등으로 할당함으로써, 주어진 서열 내에 함유된 모든 탐침 또는 프라이머를 정의하는 연산을 제안할 수 있다:
n 내지 n+y, 여기에서 n은 1 내지 서열의 마지막 수인 정수이고 y는 탐침 또는 프라이머-1의 길이이며, 이때 n+y는 상기 서열의 마지막 수를 초과하지 않는다. 따라서, 25-염기쌍 탐침 또는 프라이머(즉 "25-머")의 경우, 상기 탐침 또는 프라이머의 수집은 상기 서열의 전체 길이에 걸쳐 염기 1 내지 25, 염기 2 내지 26, 염기 3 내지 27, 염기 4 내지 28 등에 상응한다. 유사하게, 35-염기쌍 탐침 또는 프라이머(즉 "35-머")의 경우, 예시적인 프라이머 또는 탐침 서열은 비제한적으로 상기 서열의 전체 길이에 걸쳐 염기 1 내지 35, 염기 2 내지 36, 염기 3 내지 37, 염기 4 내지 38 등에 상응하는 서열을 포함한다. 마찬가지로, 40-머의 경우, 상기와 같은 탐침 또는 프라이머는 제 1 염기쌍에서부터 pb 40까지, 상기 서열의 제 2 bp로부터 bp 41까지, 제 3 bp로부터 bp 42까지의 뉴클레오타이드 등에 상응할 수 있는 반면, 50-머의 경우에 상기와 같은 탐침 또는 프라이머는 bp 1 내지 bp 50, bp 2 내지 bp 51, bp 3 내지 bp 52, bp 4 내지 bp 53 등까지 연장되는 뉴클레오타이드 서열에 상응할 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 하이브리드화 분석에서 주어진 표적 서열의 존재를 측정함에 있어서 표지된 폴리뉴클레오타이드 탐침을 사용하는 경우에서와 같이, 본 발명의 하나 이상의 핵산 분절을 적합한 검출 가능한 마커(즉 "표지")와 함께 사용하는 것이 유리할 것이다. 광범위하게 다양한 적합한 지표 화합물 및 조성물, 예를 들어 비제한적으로, 적합한 분석에서 검출될 수 있는 형광, 방사성, 효소 또는 다른 리간드, 예를 들어 아비딘/비오틴 등이 올리고뉴클레오타이드 탐침의 표지를 위해 당해 분야에 공지되어 있다. 특정 실시태양에서, 방사성 또는 다른 환경적으로 덜 바람직한 시약들 대신에, 하나 이상의 형광 표지 또는 효소 태그, 예를 들어 유레아제, 알칼리성 포스파타제 또는 퍼옥시다제를 또한 사용할 수도 있다. 효소 태그의 경우에, 하나 이상의 상보성 또는 실질적으로 상보성인 핵산 서열을 함유하는 샘플과의 특이적인 하이브리드화를 확인하기 위해서, 육안으로 또는 신티그래피, 형광측정, 분광광도측정 등과 같은 분석 방법에 의해 볼 수 있는 샘플을 검출하기 위한 방법을 제공하는데 사용될 수 있는 비색측정, 색원성 또는 형광 지표 기질이 공지되어 있다. 2 개 이상의 표지된 탐침을 동시에 또는 연속적으로 검출하는, 소위 "다중화" 분석의 경우에, 제 1 올리고뉴클레오타이드 탐침을 제 1 검출 성질 또는 매개변수(예를 들어 최대 방출 및/또는 여기 스펙트럼)를 갖는 제 1 표지로 표지하고, 또한 제 2 올리고뉴클레오타이드 탐침을 상기 제 1 표지와 상이한, 즉 분리된 또는 분별 가능한 제 2 검출 성질 또는 매개변수를 갖는 제 2 표지로 표지하는 것이 바람직할 수 있다. 특히 유전자 증폭/검출 프로토콜과 관련하여, 다중화 분석의 용도는 분자 유전학 분야의 통상적인 숙련가들에게 널리 공지되어 있다.
실시예
*하기의 실시예들을 본 발명의 바람직한 실시태양을 설명하기 위해서 포함한다. 당해 분야의 숙련가들은 하기의 실시예들에 개시된 기법이 본 발명의 실시에서 잘 작용하는 것으로 발명자들에 의해 발견된 기법을 나타내며 따라서 본 발명의 실시에 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주할 수 있음을 알아야 한다. 그러나, 당해 분야의 숙련가들은 본 명세에 비추어, 개시된 특정 실시태양들에서 다수의 변화들을 수행할 수 있고 본 발명의 진의 및 범위로부터 이탈됨 없이 유사한 결과를 여전히 수득할 수 있음을 알아야 한다.
실시예 1 - AAV-매개된 유전자 요법은 LCA1의 마우스 모델에 대해 시각 기능 및 반응을 회복한다
본 실시예에서, 발명자들은 retGC1의 종-특이성 버전(즉, 쥐)의, 출생 후 GC1KO 마우스의 추상체 세포로의 전달이 추상체 세포에 대해 기능을 회복할 수 있는지의 여부를 평가하였다. 혈청형 5 AAV 벡터를 사용하여 mGC1을 출생 후 14일째(P14) GC1KO 마우스의 광수용체로 전달하였다. 망막 전도(ERG) 및 반응 시험을 사용하여 시각 기능을 평가하였고 면역세포화학을 사용하여 처리 및 처리되지 않은 눈에서 치료학적 트랜스유전자 발현, 추상체 어레스틴 국소화 및 추상체 광수용체 밀도를 검사하였다.
본 실시예는 P14 GC1 KO 마우스의 한쪽 눈으로 망막 하 전달된 AAV 벡터가 야생형 retGC1의 발현, 시각 기능 및 반응의 복원, 및 추상체 광수용체의 보존을 촉진하였음을 입증한다. 주사 후 4주째에, 시각 기능(ERG)을 처리 및 처리되지 않은 눈에서 분석하였다. 그 후에 ERG를 주사 후 3개월까지(평가된 최종 시점) 매 2주마다 수행하였다. 양성 ERG 응답을 갖는 마우스뿐만 아니라 동질유전자 야생형 및 주사되지 않은 대조용 마우스를 시운동성 반사 시험을 사용하여 시각 반응의 복원에 대해 평가하였다. 주사 후 3 개월째에, 모든 동물을 죽이고 그들의 처리 및 처리되지 않은 망막을 GC1의 발현 및 추상체 어레스틴의 국소화에 대해 평가하였다.
결과는 또한 추상체-매개된 기능이 GC1KO 마우스의 처리된 눈에 대해서 복원되었음을 입증한다(ERG 진폭은 정상의 약 60%이었다). 더욱이, 상기 처리 효과는 투여 후 3 개월 이상 안정하였다. 반응 시험은 야생형 마우스의 경우와 유사하거나 동일한 처리된 마우스의 응답과 함께, 추상체-매개된 시각 반응의 확고한 개선을 밝혀냈다. 조직학은 처리된 마우스에서 광수용체의 AAV-매개된 GC1 발현 및 추상체 어레스틴 전좌의 복원을 밝혀냈다. 또한, 추상체 세포 밀도는 처리되지 않은 대측성 대조군보다 처리된 눈에서 더 높았다. 이러한 결과는 처리가 상기 처리 후 3 개월 이상 추상체 광수용체를 보존할 수 있음을 암시한다. 이는 출생 후 유전자 요법이 LCA1의 포유동물 모델에서 시각 기능 및 반응의 복원 및 망막 구조의 보존이 가능하다는 첫 번째 증거이다. 중요하게, 잘 특성화된, 임상적으로 적합한 AAV 벡터를 사용하여 결과를 획득하였으며, 상기와 같이 획득된 생체 내 동물 모델 데이터는 LCA1에 걸린 아동의 치료를 위한 AAV-기재 유전자 요법 벡터에 대한 토대를 제공한다.
물질 및 방법:
실험 동물:
GC1 +/- 이종접합체 태아를 더 잭슨 레보라토리(The Jackson Laboratory)(미국 메인주 바 하버 소재)의 저온보존된 모액으로부터 회수하였다. 이종접합체를 발명자의 시설에서 교배시켜 GC1 KO(-/-) 및 동질유전자 +/+ 대조용 자손을 생성시켰다. 모든 마우스를 12 시간/12 시간 명/암 주기 하에 발명자의 연구소의 집중설비에서 사육하고 유지시켰다. 먹이 및 물은 자유롭게 이용할 수 있었다. 모든 동물 연구는 지역 연구 동물 보호 및 사용 위원회에 의해 승인되고 안과 및 시각 연구에서의 동물 사용에 대한 ARVO 성명 및 NIH 규제에 따라 수행되었다.
AAV 벡터의 제작:
혈청형 5 아데노-관련된 바이러스(AAV5) 벡터를, 상기 벡터가 다른 AAV 혈청형보다 확고한 형질도입 효율 및 더 빠른 망막 광수용체에서의 발현 개시를 나타내는 것으로 입증되었기 때문에(문헌[Yang et al., 2002]), 쥐 GC1(mGC1)을 전달하는데 사용하였다. 세포-특이성 및 편재하는 프로모터 모두를 mGC1의 발현을 구동하도록 선택하였다. 상기 세포-특이성, G 단백질-결합된 수용체 키나제 1(GRK1)(또한 로돕신 키나제 프로모터로서 공지됨)을, AAV와 함께 사용 시 간상체 및 추상체 광수용체에서의 확고한 트랜스유전자 발현을 특이적으로 표적화하는 그의 능력 때문에 선택하였다(문헌[Khani et al., 2007]). 망막에서 완전-길이 CBA에 대해 유사한 발현 패턴을 나타내는 편재하는 smCBA 프로모터를, 신경 망막을 효율적으로 표적화하는 그의 능력 때문에 선택하였다(문헌[Haire et al., 2006]).
하기의 순방향 프라이머:
5'-AAAAGCGGCCGCATGAGCGCTTGGCTCCTGCCAGCC-3'(서열번호 14) 및
하기의 역방향 프라이머:
5'-AAAAGCGGCCGCTCACTTCCCAGTAAACTGGCCTGG-3'(서열번호 15)
를 사용하는 폴리머라제 쇄 반응을 사용하여 mGC1-eGFP 융합을 함유하는 플라스미드로부터 mGC1을 증폭시켰다(문헌[Bhowmick et al., 2009]). 생성 단편을 pCRblunt 플라스미드(인비트로젠(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재) 내로 클로닝하고 서열을 확인하였다. mGC1의 발현을 구동하는 smCBA를 함유하는 AAV 벡터 플라스미드(pTR-smCBA-mGC1)를, EcoRI 절단 및 후속 연결을 통해 플라스미드 pTR-CBSB-hRPE65(문헌[Jacobson et al., 2006])에서 전장 CBA를 smCBA로 치환함으로써 생성시켰다. 후속적으로, hRPE65를 NotI 절단 및 연결을 통해 mGC1으로 치환하여, pTR-smCBA-mGC1을 생성시켰다(도 11a 및 도 11b). mGC1의 발현을 구동하는 인간 GRK1 프로모터를 함유하는 AAV 벡터 플라스미드 pTR-GRK1-mGC1을, pTR-hGRK1-hGFP(문헌[Beltran et al., 2010])로부터 hGFP를 제거하고 이를 NotI 절단 및 연결을 통해 mGC1로 치환함으로써 생성시켰다(도 11a 및 도 11b). AAV 벡터를 앞서 공개된 방법(문헌[Haire et al., 2006])에 따라 패키징하였다. 바이러스 입자를 균형 염 용액(알콘(Alcon), 미국 텍사스주 포트 워쓰 소재)에 재현탁하고 정량적인 실시간 PCR에 의해 적정하였다(문헌[Jacobson et al., 2006]). 생성 역가는 AAV5-smCBA-mGC1 및 AAV5-hGRK1-mGC1에 대해 각각 4.69 x 1012 바이러스 게놈/㎖(vg/㎖) 및 4.12 x 1013 vg/㎖이었다.
망막 하 주사:
1 ㎕의 AAV5-GRK1-mGC1(4.12 x 1010 전달된 벡터 게놈) 또는 AAV5-smCBA-mGC1(4.69 x 109 전달된 벡터 게놈)을 출생 후 14(P14)일째에 각각의 GC1KO 마우스의 오른쪽 눈에 망막 하 전달하고, 왼쪽 눈은 대측성 대조군으로서 남겨두었다. 망막 하 주사를 앞서 개시된 바와 같이 수행하였다(문헌[Timmers et al., 2001]; [Pang et al., 2006]). 추가의 분석을, 필적할만한 성공적인 주사(>60% 망막 탈착 및 최소 합병증)를 제공받은 동물에 대해서만 수행하였다. 망막 탈착 구역이 바이러스 형질도입 구역에 상응함은 잘 확립되어 있다(문헌[Cideciyan et al., 2008]; [Timmers et al., 2001]).
망막 전기측정 분석:
처리된 GC1KO(n = 14) 및 동질유전자 +/+ 대조군(n = 2)의 망막 전도(ERG)를, 약간 변형된 앞서 개시된 방법(문헌[Haire et al., 2006])에 따라 PC-기재 조절 및 기록 유닛(테니스 멀티라이너 비젼(Toennies Multiliner Vision); 독일 훽베그크 재거/테니스 소재)을 사용하여 기록하였다. 초기 ERG 측정치를 주사-후 4주째에 기록하고 그 후에 주사-후 3 개월까지(상기 연구에서 평가된 최종 시점) 각각 2 주 연속해서 기록하였다. 나이 합치된 +/+ 동질유전자 대조군을 매 시점에서 처리된 동물들과 나란히 기록하였다. 마우스를 밤새(12 시간 초과하여) 암 순응시키고 100 ㎎/㎏의 케타민, 20 ㎎/㎏의 자일라진 및 염수 각각의 1:1:5 비의 혼합물로 마취시켰다. 동공을 1% 트로픽아미드 및 2.5% 페닐에프린 하이드로클로라이드로 확장시켰다. 가열식 순환 수욕을 사용하여 체온을 38 ℃에서 유지시켰다. 2.5% 하이드록시프로필 메틸셀룰로스를 각각의 눈에 적용시켜 각막 탈수를 방지하였다. 전체-시야 ERG를 통상적인, 금선 고리 각막 전극을 사용하여 기록하였다. 기준 및 접지 전극을 각각 눈 사이 및 꼬리에 피하로 놓았다. 암소시 간상체 기록을 7 개의 증가하는 강도(0.01 mcds/㎡ 내지 5 cds/㎡)의 일련의 백색 섬광으로 이끌어 내었다. 낮은 강도 자극에 대한 자극 간 간격은 1.1 초이었다. 3 개의 최고 강도(100 mcds/㎡, 1 cds/㎡ 및 5 cds/㎡)에서, 자극 간 간격은 각각 2.5, 5.0 및 20.0 초이었다. 10 개의 응답이 기록되었으며 각각의 강도에서 평균하였다. 이어서 마우스를 2 분 동안 100 cds/㎡ 백색 배경에 광 순응시켰다. 명소시 추상체 응답을 일련의 5 개의 증가하는 광 강도(100 mcds/㎡ 내지 12 cds/㎡)로 이끌어 내었다. 50 개의 응답을 기록하고 각각의 강도에서 평균하였다. 모든 자극을 100 cds/㎡ 배경의 존재 하에서 제공하였다. B-파 진폭은 각 파형의 양의 피크에 대한 a-파 골들 간의 차이로서 정의되었다.
모든 smCBA-mGC1-처리된(n = 6) 및 hGRK1-mGC1-처리된(n = 8) GC1KO(처리 및 처리되지 않은 눈 모두) 및 동질유전자 +/+ 대조용 마우스의 명소시 b-파 최대 진폭(12 cds/㎡에서 생성된 것)을 평균하고 이를 사용하여 표준 오차를 생성시켰다. 이러한 계산을 매 시점(주사-후 4 주째 내지 13 주째)에서 수행하였다. 상기 데이터를 최종 그래프 표시를 위해 시그마 플롯에 대입시켰다. 쌍별 비교(paired t-test)를 사용하여 각각의 프로모터 그룹(smCBA 또는 hGRK1) 내의 처리 및 처리되지 않은 눈 사이, 및 시간에 따른(주사-후 4 주째 대 주사-후 3 개월째) 각각의 프로모터 그룹들 사이의 P-값을 계산하였다. 표준 t-시험을 사용하여 smCBA-mGC1 대 hGRK1-mGC1 처리된 눈 간의 P-값을 계산하였다. 유의수준 차이는 P-값 < 0.05로서 정의되었다. 각각의 처리된 그룹들로부터의 마우스 중 일부를 반응 분석에 대한 연구로부터 일시적으로 제거하였으므로, 도 2a 및 도 2b에서 매 시점에서 평균하고 제공된 마우스의 총 수는 상이하다. 상기 smCBA-mGC1-처리된 그룹으로부터 3 마리의 마우스를 눈 운동 시험을 위해 보내고, 8, 10 및 12 주 측정 동안 ERG 분석에 사용된 3 마리 마우스의 "n"을 남겼다(도 2a). 상기 hGRK1-mGC1-처리된 그룹으로부터 2 마리의 마우스를 눈 운동 시험을 위해 보내고, 6, 8, 10 및 12 주 측정 동안 ERG 분석에 사용된 6의 "n"을 남겼다(도 2b). 반응 분석을 위해 보내진 모든 마우스를 반응 분석의 완료에 이어서 발명자의 실험실로 복귀 시 주사-후 13 주째에 측정하였다(smCBA-mGC1: n = 3, hGRK1-mGC1: n = 2).
눈 운동 시험:
처리 및 처리되지 않은 GC1KO 마우스 눈의 명소시 시력 및 콘트라스트 감도를 앞서 개시된 바와 같이 2-자 택일 범례를 사용하여 측정하였다(예를 들어 문헌[Umino et al., 2008]; [Alexander et al., 2007]을 참조하시오). 동일한 동물로부터 개별적인 눈의 감도를 시험하기 위해서 본 발명자들은 마우스 시각이 최소 양안 겹침(minimal binocular overlap)을 가지며 왼쪽 눈이 시계 방향 회전에 더 민감하고 오른쪽 눈은 반시계 방향 회전에 더 민감하다는 사실을 이용하였다(문헌[Douglas et al., 2005]). 따라서 본 발명자의 "무작위화-분리" 눈 운동 프로토콜에서, 각각의 눈의 시력 및 콘트라스트 감도 한계를 상기 시계 방향 및 반시계 방향 모두에 있어서 정확한 응답에 대한 단계식 기능을 통해 별도로 및 동시에 측정하였다. 시계 방향으로 회전하는 패턴에 대한 정확한 탐지는 주로 왼쪽 눈으로부터 기원하는 시각 신호에 의해 구동되고 반시계 방향의 정확한 응답은 오른쪽 눈으로부터 기원하는 시각 신호로부터 유래하였다. 시력은 한계 응답을 제공하는 최고 공간 도수(100% 콘트라스트)로 정의되었고, 콘트라스트 감도는 100을 한계 응답을 제공하는 최저 콘트라스트 퍼센트로 나눈 것으로서 정의되었다. 명소시 시력의 경우, 초기 자극은 고정된 100% 콘트라스트를 갖는 0.200 주기/도의 사인곡선 패턴이었다. 명소시 콘트라스트 감도 측정의 경우, 상기 초기 패턴은 100% 콘트라스트로서 제공되었고, 이때 고정된 공간 도수는 0.128 주기/도이었다. 명소시 시각을 70 cds/㎡의 평균 휘도에서 측정하였다. 시력 및 콘트라스트 감도를 1 주일의 기간에 걸쳐 각각의 마우스의 양쪽 눈에 대해 4 내지 6 회 측정하였다. 나이 합치된, 동질유전자 +/+ 대조용 동물(M1, M2) 및 고유의 GC1KO 마우스(M3, M4)를 도 3에서 smCBA-mGC1-처리된(M5, M6, M7) 및 hGRK1-mGC1-처리된 마우스(M8, M9)와 함께 제공하였다. 모든 마우스(M1 내지 M9)의 12 cds/㎡ 자극으로부터 발생한 추상체-매개된 ERG 진폭을 상기 반응 결과와 함께 제공하였다. 비-쌍별(unpaired) t-시험을 시력 및 콘트라스트 % 값에 대해 수행하여 결과의 유의수준을 측정하였다.
조직 준비:
주사-후 3 개월째에, P14-처리된 GC1KO 마우스 및 나이 합치된 동질유전자 +/+ 대조군을 2 시간 동안 암 순응시켰다. 암 순응에 이어서 바로, 마우스를 희미한 적색 광(>650 ㎚) 하에서 죽였다. 주사 및 주사하지 않은 눈의 윤부를 12:00 시 위치에서 뜨거운 바늘로 표시하여 배향을 용이하게 하였다. 희미한 적색 광 하에서 눈 적출을 수행하고 눈을 바로 4% 파라폼알데하이드에 넣었다. 동결절제를 위해 사용되는 눈을 앞서 개시된 방법(문헌[Haire et al., 2006])에 따라 준비하였다. 간단히, 각막을 각각의 눈으로부터 제거하여 남아있는 안배 내부에 수정체를 남겼다. 상기 탄 윤부에 인접한 공막 내에 작은 "V"자 형상의 절단을 수행하여 배향을 유지시켰다. 밤새 고정 후에, 상기 수정체 및 유리체를 제거하였다. 남아있는 망막/RPE-함유 안배를 4 ℃에서 1 시간 이상 PBS 중의 30% 슈크로스 중에 넣었다. 이어서 안배를 저온유지장치 화합물(티슈 텍(Tissue Tek) OCT 4583; 사쿠라 파인텍 인코포레이티드(Sakura Finetek, Inc.), 미국 캘리포니아주 토랜스 소재)에 넣고 드라이 아이스/에탄올의 욕에서 급속히 동결시켰다. 눈을 저온유지장치(마이크로톰(Microtome) HM550; 독일 발도르프 소재)로 10 ㎛로 연속 절제하였다. 온 조직표본 분석에 사용되는 눈을 앞서 개시된 방법(문헌[Pang et al., 2010])에 따라 준비하였다. 앞서 언급된 바와 같이 배향을 성취하였다. 밤새 고정 후에, 각막, 수정체, 유리체 및 망막 착색 상피를 상기 망막의 파괴 없이 각각의 눈으로부터 제거하였다. 탄 원래 윤부에 인접한 망막의 상부(등쪽) 부분을 절단하여 배향을 유지시켰다.
면역조직화학 및 현미경검사:
망막 동결절제 및 온 조직표본을 1X PBS 중에서 3 회 세척하였다. 상기 세척에 이어서, 샘플들을 실온에서 암실에서 1 시간 동안 0.5% 트리톤 X-100(등록상표) 중에서 배양하였다. 이어서, 샘플들을 실온에서 1 시간 동안 PBS 중의 1% 소 혈청 알부민(BSA) 용액 중에서 차단시켰다. 망막 절편을, 0.3% 트리톤 X-100(등록상표)/1% BSA 중에서 희석한 토끼 다클론 GC1 항체(1:200, sc-50512, 산타 크루즈 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Santa Cruz Biotechnology, Inc.), 미국 캘리포니아주 산타 크루즈 소재) 또는 토끼 다클론 추상체 어레스틴 항체("루미즈(Lumij)" 1:1000; 미국 캘리포니아주 로스 엔젤레스 서던 캘리포니아 대학, 셰릴 크래프트(Cheryl Craft) 박사에 의해 제공됨)와 함께 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 망막 온 조직표본을 0.3% 트리톤 X-100(등록상표)/1% BSA 중에서 1:1000 희석한, 상기 동일한 추상체 어레스틴 항체와 함께 실온에서 밤새 배양하였다. 1차 배양에 이어서, 망막 절편 및 온 조직표본을 1X PBS로 3X 세척하였다.
망막 절편을, 1X PBS로 1:500 희석한 알렉사(Alexa)-594 또는 알렉사-488 형광단(몰레큘라 프로브스(Molecular Probes), 미국 오레곤주 유진 소재)으로 표지한 IgG 2차 항체와 함께 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 2차 항체와의 배양에 이어서, 절편 및 온 조직표본을 1X PBS로 세척하였다. 망막 절편을 실온에서 5 분간 4',6'-다이아미노-2-페닐인돌(DAPI)로 대비염색하였다. 1X PBS 및 물로 최종 세정 후에, 절편들을 수성 배지(DAKO)에 올려놓고 커버-슬립을 놓았다. 망막 온 조직표본을, 망막의 상부(등쪽) 부분을 12:00 시 위치로 위치시켜 슬라이드 상에 배향시켰다. 샘플들을 DAKO에 올려놓고 커버-슬립을 놓았다.
망막 절편을 공초점 현미경 검사로 분석하였다(LCS 버전 2.61, 빌드(Build) 1537 소프트웨어가 구비된 레이카(Leica) TCS SP2 AOBS 스펙트럼 공초점 현미경(미국 일리노이주 바녹번 소재)). 모든 상들을 20x 또는 63x 배율로 동일한 노출 설정으로 촬영하였다. DAPI, GC1 및 추상체 어레스틴 염색에 사용된 여기 파장은 각각 405 ㎚, 488 ㎚, 및 594 ㎚이었다. 방출 스펙트럼은 각각 440 내지 470 ㎚, 500 내지 535 ㎚ 및 605 내지 660 ㎚이었다. 망막 온 조직표본을 큐이미징 레티가(QImaging Retiga) 4000R 카메라 및 큐이미징 큐캡쳐 프로(QCapture Pro) 소프트웨어(큐이미징 인코포레이티드, 캐나다 밴쿠버 써리 소재)가 구비된 넓은 시야 형광 현미경(액시오플랜(Axioplan) 2)(자이스(Zeiss), 미국 뉴욕주 쏜우드 소재)으로 분석하였다. 각각의 온 조직표본의 사분면들을 동일한 노출 설정 하에 5x 영상화하고 이어서 포토숍(Photoshop)(등록상표)(버전 7.0)(아도브(Adobe), 미국 캘리포니아주 산호세 소재)에서 함께 합하였다.
상 분석:
추상체 광수용체 밀도를, 이미지제이(ImageJ)(등록상표) 소프트웨어(국립 보건 연구소, 미국 메릴랜드주 베데스다 소재)를 사용하여 중심 및 하부 망막 중의 추상체 어레스틴 항체에 대한 2차 형광단으로 표지된 세포를 계수하여 망막 온 조직표본에서 분석하였다. 상기 값을, 도 6에 나타낸 5X TIFF 파일 상에 확대시켜 획득하였다. 5 개의 사각형(500 ㎛2)을 상기 처리 및 처리되지 않은 GC1KO 눈 모두의 중심 및 하부 망막 중의 동일한 구역 상에 놓았다. 중심 망막의 경우, 사각형들을 모든 눈에서 시신경 머리 둘레에 동일한 이심률로 놓았다(125 ㎛). 추상체 광수용체를 각각의 망막 구역에서 계수하고, 값들을 평균하고 표준 편차를 계산하였다. 표준 t-시험을 사용하여 목적하는 샘플들 간의 P-값을 계산하였다. 유의수준 차이를 P-값<0.05로서 정의하였다.
결과
광수용체 기능(ERG)이 AAV-처리된 GC1KO 마우스에서 복원되었다:
GC1KO 마우스에서 추상체 응답을 1 개월의 나이까지 거의 검출할 수 없음은 앞서 보고되었다. 여기에서 발명자들은 광수용체-특이성(hGRK1) 및 편재하는(smCBA) 프로모터 중 어느 하나의 조절 하에서 마우스 GC1 유전자를 수반하는 AAV 벡터에 의한 상기 마우스의 P14-처리가 ERG에 의해 측정된 바와 같이 추상체 광수용체 기능을 실질적으로 복원되게 함을 입증하였다. 전형적인 추상체 자취(도 1a 및 도 1b)(뿐만 아니라 hGRK1-mGC1-처리된, smCBA-mGC1-처리된, GC1KO 및 동질유전자 +/+ 대조군으로부터의 평균 명소시 b-파 진폭(도 2a 및 도 2b))는 처리된 눈의 추상체 기능이 주사-후 4주째에 정상의 대략 45%로 복원됨을 나타내었다. 선행 보고서들과 유사하게, 대측성의 처리되지 않은 눈의 추상체 응답은 이 시점까지 제거되었다. 주사-후 4주째에 smCBA-mGC1-처리된 눈의 평균 추상체-매개된 b-파 진폭(65.1 μV)은 처리되지 않은 눈에서의 경우(3.9 μV)보다 현저하게 더 높았다(P = 0.006). hGRK1-mGC1-처리된 눈의 평균 추상체 매개된 b-파 진폭(59.1 μV)은 처리되지 않은 눈에서의 경우(3.2 μV)보다 현저하게 더 높았다(P < 0.001). 상기 광수용체-특이성 hGRK1-mGC1 벡터의 전달-후 4 주째에 성취된 복원 수준은 편재하는 프로모터-함유 smCBA-mGC1 벡터에 의해 성취된 경우와 그다지 상이하지 않았다(P = 0.604). 주사-후 3 개월째에, smCBA-mGC1-처리된 눈의 평균 추상체-매개된 b-파 진폭(53.3 μV)은 처리되지 않은 눈에서의 경우(2.8 μV)보다 현저하게 더 높았다(P < 0.001). hGRK1-mGC1-처리된 눈의 평균 추상체 매개된 b-파 진폭(45.3 μV)은 처리되지 않은 눈에서의 경우(3.4 μV)보다 현저하게 더 높았다(P < 0.001). 상기 광수용체-특이성 GRK1-mGC1 벡터의 전달에 이어서 3 개월째에 성취된 복원 수준은 편재하는 프로모터-함유 smCBA-mGC1 벡터에 의해 성취된 경우와 그다지 상이하지 않았다(P = 0.331). 상기 두 프로모터는 모두 유사한 수준의 기능 복원을 단기간에 상기 GC1KO 마우스의 처리된 눈의 추상체에 부여하였다. 중요하게는, 추상체 광수용체 기능의 복원이 3 개월(본 연구에서 평가된 최후 시점) 동안 안정하게 유지되었다(도 1a, 도 1b, 도 2a 및 도 2b 참조). 처리 후 4 주째와 3 개월째(각각 P = 0.174 및 0.125)에 smCBA-mGC1-처리된 또는 hGRK1-mGC1-처리된 눈의 명소시 b-파 진폭의 유의수준 차이는 존재하지 않았다.
LCA의 다른 형태들을 포함하여 다양한 망막 질환의 진단에서 중요한 특징인 ERG 암묵 시간(문헌[Sun et al., 2010])을 또한 측정하였다. 상기와 같은 측정을 GC1KO 눈으로부터 획득할 수 없지만(상기 눈에서 ERG 응답이 존재하지 않는다), AAV-mGC1 처리된 및 동질유전자 +/+ 대조용 마우스에서 추상체 b-파 암묵 시간을 비교할 수 있었다. 주사 후 4 주째에, 처리 및 +/+ 대조용 눈에서 추상체 b-파 암묵 시간 간에 유의수준 차이는 없었고(P = 0.884); 이 시점에서 AAV-mGC1-처리된 및 +/+ 눈에서의 평균값은 각각 50.8 ms 및 50.4 ms이었다. 주사 후 3 개월째에, 상기 두 그룹들 간에 유의수준 차이는 없었고(P = 0.697); 처리된 및 +/+ 대조용 눈에서의 모든 추상체 b-파 암묵 시간의 평균은 각각 59.7 ms 및 58.3 ms이었다. 상기 처리된 GC1KO 망막 중의 추상체의 응답 동역학(암묵 시간 측정에 의해 측정된 바와 같은)은 단기간 동안 정상이고 안정한 것으로 보였다.
상기 GC1KO 마우스의 간상체 ERG는 1 개월의 나이까지 변경을 나타내며, 이때 간상체 a-파 및 b-파는 모두 현저하게 감소하는 것으로 앞서 보고되었다(문헌[Yang et al., 1999]). 이러한 감소는 5 개월의 나이에서 야생형(WT) 마우스의 경우의 대략 50 내지 70%의 응답으로 평탄역에 도달한다. AAV-mGC1-매개된 개선의 일부 예가 처리되지 않은 대조군에 대해 GC1KO 마우스의 처리된 눈에서 관찰되었지만(도 1a 및 도 1b에 나타낸 예), 상기 결과는 추상체-매개된 응답에서 나타난 경우만큼 일관되지 않았다.
AAV-처리된 GC1KO 마우스에서 시각 반응이 복원되었다:
눈 운동 분석은 smCBA-mGC1(M5, M6, M7) 또는 hGRK1-mGC1(M8, M9) 처리된 GC1KO 마우스의 눈이 모든 명소시, 추상체-매개된 조건 하에서 처리되지 않은 눈보다 현저하게 더 잘 응답함을 밝혀냈다. 처리되지 않은 GC1KO 눈은 0.163±0.040 주기/도(도 3b 및 도 3c, 막대, 평균±s.d., n = 9 눈)의 시력으로 불량하게 수행한다. 동질유전자 GC1+/+ 대조용 눈(M1, M2)은 현저하게 더 잘 응답하며, 이는 0.418±0.046 주기/도(n = 4 눈)의 평균 시력을 나타낸다. AAV-mGC1-처리된 눈(M5 내지 M9)은 0.392±0.077 주기/도(n = 5 눈)의 평균 시력을 가지며, 이는 대조용 +/+ 눈과 필수적으로 동일하고 처리되지 않은 GC1KO 눈보다 현저하게 더 양호한 수준이다(P < 0.0001). 명소시 콘트라스트 감도(도 3b 및 도 3c)는 상기 명소시 시력 결과에 필적하였으며, 이때 AAV-mGC1-처리된 눈(11.9±7.37, n = 5 눈)은 +/+ 마우스(11.94±3.03, n = 4 눈)와 거의 동일한 콘트라스트 한계를 나타낸다. 다시, AAV-mGC1으로 P14 처리된 GC1KO 눈은 처리되지 않은 눈보다 현저하게 더 양호하게 수행하였으며, 이는 1.27±0.31(n = 9, P < 0.0001)의 평균 콘트라스트 감도를 나타내었다. 모든 명소시 시험에서, 처리되지 않은 GC1KO 눈은 추상체-매개된 기능이 없는 것과 필수적으로 동등하게, 대단히 불량하게 수행한다. 이들 측정의 통계학적 비교를 표 1에 나타낸다. 반응 분석에 사용된 모든 GC1+/+ (M1, M2), GC1KO(M3, M4), smCBA-mGC1-처리된(M5, M5, M7) 및 hGRK1-mGC1-처리된(M8, M9) 마우스 모두의 추상체-매개된 ERG 자취를 망막 기능(전기생리학)에 대해 시각 기능(눈 운동 반응)을 관련시켜 도 3a에 나타낸다.
간상체 망막 기능(ERG)이 GC1KO 마우스에서 부분적으로 보존된다. 연구는 심지어 매우 작은 ERG 진폭조차 확고한 시각 반응으로 번역됨을 입증하였다(문헌[Williams et al., 2006]). 실제로, AAV-RPE65 요법을 받은 LCA2 환자는 ERG 응답의 완전한 결여에도 불구하고 반응 복원을 나타내는 것으로 밝혀졌다(문헌[Maguire et al., 2008]). 눈 운동 시험은 GC1KO 눈의 암소시, 간상체-매개된 시력 및 콘트라스트 감도가 +/+ 대조군과 매우 유사함을 밝혔다. 이러한 이유로 인해, 반응 수준에 대해 처리된 대 처리되지 않은 눈의 시각 복원을 비교하는 것은 불가능하였다. 이들 측정의 통계학적 비교를 표 1에 나타낸다.
눈 운동 반응에 의해 측정 시 WT, AAV-MGC1-처리된 및 처리되지 않은 GC1KO 눈의 명소시 기능의 통계학적 비교
명소시 시력 야생형(WT) 처리된 처리되지 않은
값의 수 4 5 9
평균 0.4183 0.3919 0.163
표준 편차 0.0456 0.07731 0.03954
P-값
WT 대 처리된 0.5671 유의수준 아님
WT 대 처리되지 않은 <0.0001 *
처리된 대 처리되지 않은 <0.0001 *
명소시 콘트라스트 감도 WT 처리된 처리되지 않은
값의 수 4 5 9
평균 11.94 11.16 1.27
표준 편차 3.03 7.37 0.31
P-값
WT 대 처리된 0.4186 유의수준 아님
WT 대 처리되지 않은 <0.0001 *
처리된 대 처리되지 않은 <0.0001 *
* = P < 0.0001
광수용체-특이성 및 편재하는 프로모터는 모두 GC1KO 마우스의 간상체 및 추상체에서 mGC1 트랜스유전자 발현을 구동한다:
GC1-결핍은 LCA1 환자에서 간상체 및 추상체 광수용체 모두에 영향을 미친다. 따라서 상기 광수용체-특이성 인간 RK 프로모터 및 편재하는 smCBA 프로모터는 상기 두 세포 유형 모두를 표적화하는 수단으로서 본 연구에 선택되었다. 인간 RK 프로모터는 그의 작은 크기, 및 특이적으로 광수용체 세포에서 트랜스유전자 발현을 효율적으로 구동하는 능력으로 인해 선택되었다. AAV-hGRK1-mGC1으로 처리-후 3 개월째에 GC1KO 망막의 면역염색은 상기 프로모터가 광수용체 외부 분절에서 확고한 GC1 발현을 구동함을 밝혀내었다. 상기 치료 벡터가 주사된 눈으로부터의 망막 횡단면에 대한 전형적인 상(도 4a)은 OS 층의 진한 GC1 염색을 나타내는 반면, 동일한 마우스의 대측성의 처리되지 않은 눈은 어떠한 GC1 발현도 없다(도 4b). 상기 smCBA 프로모터는 또한 광수용체 세포에서 GC1 발현을 효율적으로 구동하였다. 광수용체 OS는 상기 대측성의 처리되지 않은 눈에 비해(도 4d), 처리된 눈에서 확고한 smCBA-매개된 GC1 발현을 나타내었다(도 4c). hGRK1 및 smCBA-매개된 GC1 발현의 수준은 동질유전자, +/+ 대조용 눈에서 나타난 것에 접근하였다(도 4e). hGRK1-mGC1-처리된 눈의 GC1 발현은 OS로 제한되었다. smCBA-mGC1-처리된 눈에서, GC1 발현은 때때로 외부 핵 층의 광수용체 세포체에서 발견되었다(예를 들어 도 4f 화살표 참조). 그러나, 현저하게는, 어떠한 프로모터 구조물도 상기 광수용체 세포 밖에서 치료 GC1 발현을 구동하지 못했다. 이러한 표적-외 발현의 결여는 차후 임상 용도의 개발에 관련된다.
추상체 어레스틴 전좌는 AAV-mGC1-처리된 GC1KO 마우스에서 복원되었다:
AAV-mGC1 처리는 광-유발된 추상체 어레스틴 전좌를 상기 처리된 GC1KO 망막 중의 추상체 광수용체로 복원시켰다. 추상체 어레스틴에 대해 발생한 항체로 면역염색된 전형적인 처리된, 처리되지 않은 및 +/+ 망막 횡단면은 추상체 어레스틴이 +/+, smCBA-mGC1-처리된 및 hGRK1-mGC1-처리된 추상체 광수용체의 외부 분절, 내부 분절, 축색 돌기 및 시냅스 말단으로 국소화됨을 입증하였다(각각 도 5a, 도 5c, 및 도 5d). 대조적으로, 추상체 어레스틴은 처리되지 않은 GC1KO 망막에서 주로 추상체의 외부 분절로 국소화된 채로 남아있었다(도 5b). 이 결과는 상기 GC1KO 마우스 망막 중의 추상체가 만성적으로 과분극된다는 개념과 일치하였다. 암-순응된, 처리된 망막에서 추상체 어레스틴 국소화의 복원이 관찰되었을 뿐만 아니라 상기 단백질의 명백한 상향 조절이, 처리되지 않은 대조군에 비해 처리된 눈에서 나타났다. 현저하게는, 추상체 세포 밀도가 또한 처리되지 않은 대조군에 비해 처리된 눈에서 더 높게 나타났다(도 5a, 도 5b 및 도 5c를 참조하시오).
추상체 광수용체가 AAV-mGC1-처리된 GC1KO 마우스에서 보존되었다:
추상체 어레스틴에 대한 항체로 염색된 치료 벡터 주사-후 3 개월째에 smCBA-mGC1 및 hGRK-mGC1 처리된 및 주사하지 않은, 대측성 망막 온 조직표본에 대한 분석은 추상체 광수용체가 상기 치료 벡터에 의한 치료의 결과로서 보존됨을 밝혀내었다(도 6). 처리된 및 처리되지 않은 망막 온 조직표본 모두의 하부 및 중심 망막 중 추상체 광수용체의 수는 처리된 대 처리되지 않은 눈의 추상체 세포 밀도에 있어서 통계학적으로 의미 있는 차이가 존재함을 밝혀내었다. 이 결과는 확고한 전기생리학적 및 반응 복원이 분명히 확실하다는 관찰과 일치하였다. 어느 한 치료 구조물에 의한 GC1KO 마우스의 P14-처리는 3 개월 이상 동안 추상체 광수용체 구조를 보존할 수 있었다.
실시예 2 - GC1/GC2 이중 녹아웃을 함유하는 동물 모델
오직 추상체 광수용체만이 GC1KO 마우스에 영향을 미치는 반면(간상체는 단지 부분 기능을 상실할 뿐이며 변성되지 않는다), LCA1 환자는 간상체 기능 상실 및 간상체 변성을 나타냄에 주목하는 것이 중요하다. 이러한 차이에 대한 이유는 간상체 광수용체에서 발현되는 GC1의 가까운 관계물인 GC2에 대한 의존성에 있어서 종-특이적인 차이인 것으로 추측된다. 마우스 간상체는 추정 상 GC2가 활성을 재성립할 수 있기 때문에 GC1의 부재 하에서 작용할 수 있지만; 인간에서 이는 그 경우가 아니다. GC1은 간상체 기능에 필요하며, 따라서 상기 간상체 변성에 필요하다. GC1/GC2 이중 녹아웃 마우스 모델을 생성시켰으며 상기 모델은 간상체 기능 상실을 갖는 것으로 입증되었다(GC1 K/O에서 나타나는 바와 같은 추상체 기능 상실 이외에)(문헌[Baehr et al., 2007]). GC2가 GC1의 부재 하에서 간상체 기능을 제공하는 것임이 상기 모델을 사용한 생화학 연구를 통해 입증되었다. 그렇긴 해도, 인간 조건(병든 추상체 및 간상체 모두)을 보다 신뢰성 있게 모방하는 것은 GC1/GC2 이중 녹아웃 마우스이다(문헌[Karan et al., 2010]). GC1/GC2 이중 녹아웃 마우스에서 rAAV-smCBA-mGC1 및 rAAV-hGRK1-mGC1 벡터를 모두 시험하기 위해서, rAAV 벡터를 상기 언급한 GC1 녹아웃 연구에서와 정확하게 동일한 방식 및 시간(출생 후 14일째)으로 전달한다. 생리학적으로 및 반응적으로, 시각의 복원에 대한 분석을 또한 상기 GC1 녹아웃 연구에 대해 상술한 바와 동일한 방식으로 수행한다. GC1 벡터 구조물로 처리된 GC1/GC2 이중 녹아웃 마우스에서 간상체 기능의 측정 가능한 회복이 기대되므로, 암소시(즉 간상체) 응답이 특히 강조된다.
실시예 3 - LCA1의 '인간화된' 쥐 동물 모델
본 실시예는 LCA1의 "인간화된" 쥐 동물 모델의 생성을 개시한다. 하나의 실시태양에서, 상기 마우스 모델은 GC1/GC2/GCAP1 녹아웃을 함유한다. GCAP1은 GC1을 활성화하는 단백질이다. 인간에 사용하기 위해 고안된 임상 등급 rAAV 벡터로부터 발현된 인간 GC1을 기능에 대해 평가할 수 있는 생체 내 시스템을 생성시키기 위해서, GC1/GC2/GCAP1 삼중 녹아웃 hGCAP1 트랜스제닉 마우스를 사용한다. 이 마우스에서, 시각 기능은 오직 hGCAP1(즉 내생적인 쥐 GCAP1은 존재하지 않는다)과 상호작용하는 rAAV-매개된 hGC1에 의지한다. 이 연구로부터, 인간 GCAP1 단백질이 마우스 모델에서 인간 GC1 활성을 자극하는데 필요한지의 여부 및 2 개의 인간 폴리펩타이드를 재구성하고 상기 질병의 비-인간(즉, 쥐) 모델에서 발현시키는 경우 추상체 및 간상체에 대한 기능이 복원될 수 있는지의 여부를 결정할 수 있다. 상기 GC1/GC2/GCAP1 삼중 녹아웃 hGCAP1 트랜스제닉 마우스를 생성시키기 위해서 GC1/GC2 이중 녹아웃 마우스(문헌[Baehr et al., 2007])를 GCAP1 녹아웃 마우스와 교배시킨다(문헌[Mendez et al., 2001]). 이어서 인간 GCAP1을 동물 모델에서 트랜스제닉-발현시켜 GC1/GC2/GCAP1 삼중 녹아웃 hGCAP1 트랜스제닉 마우스를 생성시킨다. rAAV-벡터화된 hGC1을 상기 동물에 제공하는 연구를 상기 GC1 녹아웃 연구에 사용된 방법과 실질적으로 동일한 방식으로 수행한다. 이어서 생리학적으로 및 반응적으로, 시각의 복원에 대한 분석을 상기 GC1 녹아웃 연구에서 수행된 바와 동일한 방식으로 수행한다.
실시예 4 - 본 발명의 실시에 유용한 예시적인 벡터 구조물
2 개의 예시적인 벡터의 지도를 도 11a 및 도 11b에 나타낸다. 하나는 비특이성 프로모터 smCBA를 함유하고 다른 것은 간상체/추상체 제한된 프로모터 GRK1을 갖는다. 상기 둘 모두 혈청형 5 AAV 내에 패키징되었다. 지금까지 시험된 모든 벡터 용량이 상기 마우스 망막에 안전하다. 이어서 GC1 -/- 마우스의 코호트를 출생 후 14일째(P14)에 망막 하 주사하고, 이어서 주기적으로 ERG 및 명소시 눈 운동(추상체 매개된) 반응에 의해 분석하였다. 상기 GC1-/- 마우스는 간상체 매개된 ERG를 유지하기 때문에, 기능 구제의 모니터링은 주로 추상체 기능의 복원에 초점을 두었다. 상기 smCBA 벡터의 경우 ERG를 처리-후 4 주째 및 그 후에 처리-후 12 내지 13 주까지 매 2 주마다 평가하였다. 9 마리의 마우스에서 처리된 9 개의 눈은 모두 처리에 응답하였다. 하기에 나타낸 결과는 처리되지 않은 대조용 눈에서 본질적으로 기록될 수 없는 것으로부터 상대 벡터 처리된 눈에서 정상의 대략 50%까지 명소시 ERG 진폭의 현저한 복원을 입증한다.
이어서 4 마리의 GC1-/- 마우스를 처리된 대 처리되지 않은 상대 눈에 의해 매개된 차이에 대해 암소시 눈 운동 반응에 의해 분석하였다(하기에 나타냄). 모두 4 개의 처리된 눈(289, 290, 294, 295, 붉은색 막대)은 그들의 대조용 눈에 대해 시력의 현저한 개선을 나타내었으며 상기 4 마리 중 3 마리는 현저하게 개선된 콘트라스트 감도를 나타내었다. 마우스 297 및 298은 야생형 대조군이고, 마우스 299는 처리되지 않은 GC1-/- 마우스이었다. 결과는 상기 벡터가 LCA1의 동물 모델에서 추상체 매개된 시각의 기능 및 반응 복원을 성취하였음을 입증한다.
간상체 및 추상체에 대한 발현을 제한하는 GRK1 벡터의 경우에, ERG를 처리된 14 GC1-/- 마우스에서 처리-후 4 주째 및 그 후에 처리-후 12 내지 13 주까지 매 2 주마다 한쪽 눈에서 평가하였다. 12 마리의 동물에서 14 개의 처리된 눈 중 12 개가 응답하였다. 결과(하기에 나타냄)는 대조용의 처리되지 않은 눈에서 본질적으로 기록할 수 없음으로부터 상대 벡터 처리된 눈에서 정상의 대략 40%까지 명소시 ERG 진폭의 현저한 복원을 밝혀냈다.
이어서 한 마리의 GC1-/- 마우스(#293)를 처리된 대 처리되지 않은 상대 눈에서의 차이에 대해 암소시 눈 운동 반응에 의해 분석하였다(상기 나타냄). 상기 마우스는 상기 벡터 처리된 오른쪽 눈(붉은색 막대)에서 그의 대조용 왼쪽 눈(파란색 막대)에 비해 시력 및 콘트라스트 감도 모두에 있어서 현저한 개선을 보였다. 응답은 대조용 야생형 마우스(297 및 298)와 거의 동일하였으며 처리되지 않은 GC1-/- 마우스(299)에 비해 현저하게 개선되었다. 따라서 GRK1 벡터는 상기 LCA1 모델에서 추상체 매개된 시각의 기능 및 반응 복원을 또한 성취한다는 결론이 내려졌다.
실시예 5 - WTGC1의 특이적인 추상체 표적화는 구제를 개선한다
상기 제공된 데이터는 추상체 기능 및 추상체-매개된 반응이 상기 간상체/추상체 제한된 GRK1 프로모터에 의해 구제될 수 있음을 명백히 입증한다. 인간 LCA1은 간상체 및 추상체 결함을 모두 나타내기 때문에(주로 추상체 결함을 나타내는 상기 GC1-/- 마우스와 달리), 순수한 추상체 특이성을 얻기 위해 발현을 추가로 제한할 필요가 없다. 그러나, 연구에 중요한 마우스 모델에서 하나의 최종적인 추상체 표현형이 존재한다, 즉 암 순응 상태에서, 추상체 어레스틴은 야생형 망막에서와 같이 추상체 외부 분절로부터 내부 분절, 축색 돌기 및 시냅스 말단 내로 통상적으로 이동하지 않는다. 따라서 상기 세포 생물학적 표현형이 벡터-처리된 GC1-/- 눈에서 또한 교정되었는지의 여부를 평가하기 위한 연구를 수행하였다. 나타낸 결과에서, GC1-/- 마우스를 GRK1 벡터로 한쪽 눈을 처리하고, 이어서 주사-후 7 주째에 상기 마우스를 암 순응시켰다. 이어서 처리된(하부 패널) 및 대조용(상부 패널) 망막을 면역조직화학에 의해 추상체 어레스틴 국소화에 대해 분석하였다. 상기 처리된 GC1-/- 망막(상부 패널)에서, 추상체 어레스틴은 주로 추상체 외부 분절(OS) 및 시냅스 층(SL)에서 남아있었다. 대조적으로, 대측성 처리된 망막(하부 패널)에서 상당한 분획(약 50%)이 상기 내부 분절 및 시냅스 말단으로 전좌되었다. 따라서, 벡터 처리가 또한 추상체 어레스틴의 정확한 전좌를 복원시킨다는 결론이 내려졌다.
실시예 6 - RAAV-벡터화된 유전자 구조물을 사용하는 LCA1의 장기적인 치료
선행 실시예는 쥐 GC1 cDNA(광수용체-특이성 인간 로돕신 키나제[hGRK1] 또는 편재하는[smCBA] 프로모터에 의해 구동된)를 함유하는 rAAV 벡터의 망막 하 주사가 3 개월 이상 동안 상기 GC1KO 마우스에서 추상체-매개된 기능 및 시각 반응을 복원하고 추상체 광수용체를 보존할 수 있음을 입증하였다.
본 실시예에서, 발명자들은 장기적인 치료가 LCA1의 설치류 모델에서도 또한 성취될 수 있는 지의 여부를 평가하였다. 또한, 발명자들은 GC1의 상기 GC1/GC2 이중 녹아웃 마우스(GDdko)(간상체 및 추상체 모두의 구조 및 기능의 상실을 나타내고 인간 LCA1을 표현형으로 닮은 모델)의 광수용체로의 전달이 상기 세포에 치료를 부여하는지의 여부를 검사하였다.
방법
AAV5-hGRK1-mGC1, AAV5-smCBA-mGC1 또는 고도로 효율적인 캡시드 타이로신 돌연변이체 AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1의 망막 하 주사를 출생 후 14일(P14) 내지 P25 사이에 GC1KO 또는 GCdko 마우스의 한쪽 눈에서 수행하였다. 간상체 및 추상체 광수용체 기능을 망막전도검사에 의해 분석하였다. 치료학적 GC1 발현의 국소화 및 추상체 광수용체 보존의 정도를 면역조직화학에 의해 측정하였다. 생체분포 연구를 사용하여 처리된 동물의 시신경 및 뇌 중의 벡터 게놈의 존재를 평가하였다.
결과
추상체 광수용체 기능이 모든 벡터로 처리된 GC1KO 마우스에서 복원되었으며, 이때 AAV8(733)이 가장 효율적이었다. 처리-후 10 개월 이상 동안 응답이 안정하였다. 치료학적 GC1이 광수용체 외부 분절에서 발견되었다. 주사-후 10 개월까지, AAV5 및 AAV8(733) 벡터 게놈이 GC1KO 마우스의 처리된 눈의 시신경에서만 검출되었다. AAV8(733)-벡터화된 mGC1은 처리된 GCdko 마우스에서 간상체 및 추상체 모두에 대한 기능을 복원시켰다.
결론
GC1 결핍의 포유동물 모델인 GC1KO 마우스에서, 본 발명에 개시된 rAAV 벡터 구조물을 사용하여 장기적인 치료를 성취할 수 있다. 중요하게는, 상기 LCA1 간상체/추상체 표현형을 모방하는 GCdko 마우스에서 또한 치료를 성취할 수 있었다. 이러한 결과는 망막 이영양증, 및 특히 LCA1의 치료를 위한 rAAV-기재 유전자 요법 벡터의 용도에 대한 증거를 제공한다.
실시예 7 - GC1KO 마우스에서 유전자 요법에 의한 추상체 광수용체의 장기간 보존 및 추상체 기능의 복원
선행 실시예에서, 광수용체-특이적인(hGRK1) 또는 편재하는(smCBA) 프로모터에 의해 구동되는 쥐 GC1 cDNA를 함유하는 망막 하 AAV5 벡터가 3 개월 동안 GC1KO 마우스에서 추상체-매개된 기능 및 시각 반응을 복원하고 추상체 광수용체를 보존할 수 있음이 입증되었다. 본 실시예에서, 동일한 쥐 모델을 사용하여 장기적인 치료를 평가한다. AAV5-hGRK1-mGC1, AAV5-smCBA-mGC1 또는 고도로 효율적인 캡시드 타이로신 돌연변이체 AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1을 출생 후 14일(P14) 내지 출생 후 25일(P25) 사이에 GC1KO 마우스에게 망막 하 전달하였다. 망막 기능을 망막전도(ERG)에 의해 분석하였다. AAV-매개된 GC1 발현의 국소화 및 추상체 생존을 면역조직화학에 의해 분석하고 상기 망막을 벗어난 벡터 게놈의 확산을 시신경 및 뇌 조직의 PCR에 의해 정량분석하였다. 추상체 기능은 시험된 모든 벡터에 의해 복원되었으며, 이때 AAV8(Y733F)이 가장 효율적이었다. GC1의 AAV-매개된 발현은 광수용체에서 독점적으로 발견되었다. 주사-후 10 개월까지, AAV 게놈이 처리된 눈의 시신경에서만 검출되었다. 이러한 결과는 장기적인 치료가 GC1 결핍의 포유동물 모델에서 성취될 수 있음을 최초로 입증한다.
GUCY2D에 의해 암호화된 망막 구아닐레이트 사이클라제-1(GC1)은 척추동물 광전환에서 핵심 기능으로 작용한다(문헌[Pugh et al., 1997]). 광 자극에 이어서, 제 2 전령 환상 GMP(cGMP)가 광수용체 세포 내에서 포스포다이에스테라제(PDE6)에 의해 급속히 가수분해되어 cGMP-관문 양이온 채널의 폐쇄 및 상기 세포의 과분극을 유도한다. 세포질 [Ca2+]가 50 nM 이하로 떨어질 때, GC1은 작은 Ca2+-결합 단백질, GCAP(구아닐레이트 사이클라제 활성화 단백질)에 의해 활성화된다. GC1은 cGMP-관문 채널과 결합하고 이를 재개방하는 cGMP를 합성하여, 상기 광수용체를 "어두운", 탈분극된 상태로 복귀시킨다(문헌[Pugh et al., 1997]; [Polans et al., 1996]; [Wensel, 2008]; [Lamb and Pugh, 2006]; [Arshavsky et al., 2002]). 따라서, GC1은 명-암 및 회복 주기에서, cGMP를 통해 세포 내 칼슘 수준과 광수용체의 분극 상태를 연계하는 피드백 고리를 고정시키는 절대적으로 중요한 역할을 한다.
GC1은 인간, 원숭이 및 마우스 망막의 간상체 및 추상체 광수용체의 외부 분절에서 발현된다(문헌[Dizhoor et al., 1994]; [Liu et al., 1994]; [Haire et al., 2006]). 다른 막 구아닐레이트 사이클라제처럼, 상기 GC1은 N'-말단 신호 서열, 세포외 도메인(ECD), 단일 막관통 도메인, 키나제-유사 동족체 도메인(KHD), 이량체화 도메인(DD) 및 C'-말단 촉매 도메인(CCD)을 함유하고, 준동형 이량체로서 존재하는 듯하다(문헌[Yang and Garbers, 1997]). GUCY2D의 돌연변이는 각각 추상체-간상체 이영양증의 우성 및 열성 형태, CORD6 및 CDRD뿐만 아니라 열성 레베르 선천성 흑내장-1(LCA1)과 관련된다(문헌[Perrault et al., 1996]; [Perrault et al., 2000]; [Kelsell et al., 1998]; [Perrault et al., 1998]; [Gregory-Evans et al., 2000]; [Weigell-Weber et al., 2000]; [Ugur et al., 2010]). LCA1은 광수용체 변성에 선행하는 소멸된 망막전도(ERG)를 특징으로 하는 중증의 초기 발병되는 상염색체 열성 실명 질환이다(문헌[Perrault et al., 1999]; [Chung and Traboulsi, 2009]). CORD6은 시력 및 색각의 조기 상실을 유발하는 추상체로 시작하는 광수용체의 진행성 변성에 이은 진행성 야맹증 및 주변 시야 상실을 유도하는 간상체 변성을 특징으로 하는 우성 질환이다(문헌[Kelsell et al., 1998]; [Perrault et al., 1998]). CORD6 돌연변이는 상기 이량체화 도메인(DD)으로 국한되며 일반적으로 GC1의 GCAP-매개된 활성화의 증가를 야기한다(문헌[Payne et al., 2001]; [Downes et al., 2001]; [Wilkie et al., 2000]). 최근에 발견된 열성 CORD-유발 돌연변이는 GC1의 촉매 도메인(CD)에 위치하고 전체적인 효소 기능을 감소시키는 것으로 생각된다(문헌[Ugur et al., 2010]). LCA1-유발 돌연변이는 GC1의 ECD, KHD, DD 및 CCD 도메인 전체를 통해 분포된다(문헌[Karan et al., 2010]). 이러한 돌연변이는 효소 구조 및 안정성을 변경시키고, 다른 표면 막 관련된 단백질의 역행하는 운반에 영향을 미칠 수 있으며 빈번히 효력이 없다.
상기 GC1KO 마우스는 GUCY2D의 쥐 상동체, Gucy2e의 삭제 돌연변이를 수반한다. LCA1 환자처럼, 상기 모델에서 추상체 기능의 상실은 추상체 변성에 선행한다(문헌[Timmers et al., 2001]). 간상체는 그의 기능의 30 내지 50%를 유지하며, 쥐 광수용체의 또 다른 작용성 구아닐레이트 사이클라제인 GC2의 존재로 인해 변성되지 않는다(문헌[Yang and Garbers, 1997]; [Jacobson et al., 2006]; [Timmers et al., 2001]; [Cideciyan et al., 2008]; [Song et al., 2002]). 선행 실시예들에서, 광수용체-특이성 인간 도롭신 키나제(hGRK1) 또는 편재하는(smCBA) 프로모터에 의해 구동되는 쥐 GC1 cDNA를 함유하는 혈청형 5 아데노-관련된 바이러스(AAV) 벡터의 망막 하 주사는 3 개월 동안 GC1KO 마우스에서 추상체-매개된 기능 및 시각 반응을 복원하고 추상체 광수용체를 보존할 수 있음을 입증하였다. 본 연구에서, AAV-매개된 유전자 치환 요법을 장기간에 걸쳐 상기 GC1KO 마우스에게 치료를 제공하는 그의 능력에 대해 평가하였다. AAV5-hGRK1-mGC1 및 AAV5-smCBA-mGC1 및 고도로 효율적인 캡시드 타이로신 돌연변이체 AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1을 출생 후 14일째(P14) 내지 출생 후 25일째(P25) 사이에 GC1KO 마우스에게 망막 하 전달하였다. 이러한 발견은 장기적인 요법이 GC1 결핍의 포유동물 모델에서 성취될 수 있음을 최초로 입증한다. 벡터 게놈 생체 분포를 또한 AAV5- 및 AAV8(733)-기재 벡터에 대해 평가하였다. 이러한 발견은 LCA1(및 가능하게는 추상체-간상체 이영양증)에 대한 AAV-기재 유전자 요법 임상 시험의 개발에 직접적인 영향을 주며, 광수용체-관련된 유전자의 결함에 의해 매개된 광범위한 열성 망막 변성의 표준화된 벡터 디자인 개발에 도움을 준다.
물질 및 방법
실험 동물:
잭슨 레보라토리(The Jackson Laboratory)(미국 메인주 바 하버 소재)에 의해 제공된 GC1 +/- 마우스의 이형접합 교배로부터 유래한 GC1KO 및 유사유전자 +/+ 대조군을 사육하고 12 시간/12 시간 명/암 주기 하에 발명자의 연구 동물 보호 설비에서 유지시켰다. 먹이 및 물은 자유롭게 이용할 수 있었다. 모든 연구를 안과 및 시각 연구에서 동물 사용에 대한 ARVO 성명 및 NIH 규제에 따라 수행하였다.
AAV 벡터의 제작:
쥐 GC1(mGC1) cDNA를 구동하는 편재하는(smCBA) 또는 광수용체-특이성 인간 로돕신 키나제(hGRK1) 프로모터를 함유하는 혈청형 5 아데노-관련된 바이러스(AAV5) 벡터 플라스미드를 앞서 개시된 방법(문헌[Boye et al., 2010])에 따라 생성시켰다. AAV2 캡시드 상의 표면-노출된 타이로신 잔기의 부위-특이적 돌연변이가 보고되었다(문헌[Zhong et al., 2008]). 유사한 방법들을 사용하여 본 발명에 개시된 AAV8(Y733F) 캡시드 돌연변이체를 생성시켰다. 앞서 개시된 방법들(문헌[Zolotukhin et al., 2002]; [Jacobson et al., 2006])에 따라 모든 벡터를 패키징하고, 정제하고 적정하였다. AAV5-smCBA-mGC1, AAV5-hGRK1-mGC1 및 AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1에 대해 생성된 역가는 각각 4.69 x 1012 벡터 게놈/㎖(vg/㎖), 4.12 x 1013 vg/㎖ 및 1.08 x 1013 vg/㎖이었다.
망막 하 주사:
1 ㎕의 AAV5-smCBA-mGC1(4.69 x 109 벡터 게놈), AAV5-hGRK1-mGC1(4.12 x 1010 벡터 게놈) 또는 AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1(1.08 x 1010 벡터 게놈)을 출생 후 14일(P14) 내지 출생 후 25일(P25) 사이에 GC1KO 마우스의 한쪽 눈에 망막 하 주사하였다. 대측성의 대조용 눈은 주사하지 않은 채로 두었다. 망막 하 주사를 앞서 개시한 바와 같이 수행하였다(문헌[Timmers et al., 2001]). 추가의 분석을 필적할만한, 성공적인 주사(최소의 합병증으로 >60% 망막 탈착)를 제공받은 동물에 대해서만 수행하였다. 모든 코호트의 대략 75%가 "성공적인" 주사를 제공받았다. 벡터 형질도입 구역이 적어도 망막 탈착의 구역에 상응함은 잘 확립되어 있다(문헌[Timmers et al., 2001]; [Cideciyan et al., 2008]).
망막전도검사 분석:
처리된 GC1KO 및 연령-합치된, 유사유전자(+/+) 대조용의 ERG를, 최소로 변형된, 앞서 개시된 방법(문헌[Haire et al., 2006]; [Boye et al., 2010])에 따라 PC-기본 조절 및 기록 유닛(테니스 멀티라이너 비젼; 독일 훼크베르크 재거/테니스 소재)을 사용하여 기록하였다. AAV5-smCBA-mGC1-처리된 GC1KO 마우스(n = 10), AAV5-hGRK1-mGC1-처리된 GC1KO 마우스(n = 6), AAV8(Y733F)-처리된 GC1KO 마우스(n = 6) 및 유사유전자(+/+) 대조군(n = 8)의 기록을 상이한 날짜에 개시하고, 따라서 마우스의 각각의 부분집합을 약간 상이한 시간의 길이로 모니터하였다. 처리된 GC1KO 마우스의 ERG를 주사-후 4 주째 및 그 후에 주사-후 1년(AAV5-처리된 마우스) 또는 주사-후 9 개월(AAV8[Y733F]-처리된 마우스)까지 매달 기록하였다. 나이-합치된, 유사유전자(+/+) 대조용 마우스를 8 개월 동안 추적하였다. 마우스를 다양한 사후 연구(생체분포 연구, 망막 면역조직화학 분석, 망막 조직의 실시간 RT-PCR) 또는 돌연한 병/사망 때문에 상기 실험 기간 전체를 통해 상이한 시점에서 상기 연구로부터 회수하였다. ERG 데이터를 오직 n>3의 동물 그룹에 대해서 나타내었다. 따라서, 본 연구는 AAV5-처리된 마우스에 대한 주사-후 9 개월째 및 AAV8(Y733F)-처리된 마우스에 대한 주사-후 6 개월째의 결과를 비교한다. 처리된 마우스는 계속해서 상기 시점 이상에서 ERG 응답을 나타내었지만, 샘플 크기가 통계학적 분석이 더 이상 실용적이지 않을 정도로 충분히 감소하였다. AAV5 벡터에 의한 처리-후 1년째 및 AAV8(Y733F)에 의한 처리-후 9 개월째의 개별적인 마우스로부터의 전형적인 추상체-매개된 자취를 상기 논쟁을 지지하기 위해 제공한다. 암소시(간상체-매개된) 및 명소시(추상체-매개된) 기록을 앞서 개시된 기록 매개변수들을 사용하여 유도해 내었다(문헌[Boye et al., 2010]). B-파 진폭은 각 파형의 a-파 골과 후속의 양의 피크 사이의 차이로서 정의되었다. 처리되지 않은 GC1KO 마우스에서 간상체-매개된 ERG 응답은 동물들에 따라 가변적이며(문헌[Yang et al., 1999]), 따라서 상이한 동물들로부터의 암소시 a- 및 b-파 진폭을 평균할 때 큰 표준 편차가 관찰되었다. 간상체 ERG 데이터를 비의 형태로 제공한다(내부-개별적인, 처리된 대 처리되지 않은 간상체 a- 및 b-파 진폭들의 평균). 그 자체로서, 1 이상의 임의의 값은 상기 간상체 응답에 의해 개선된 AAV-mGC1 처리를 가리킨다. 비를 1 cds/㎡ 자극으로 생성시킨 진폭을 사용하여 계산하였다. 12 cds/㎡에서 생성된 모든 처리된 GC1KO 마우스 및 유사유전자(+/+) 대조용 마우스의 주사된 및 주사하지 않은 눈의 명소시, 추상체-매개된 b-파 최대 진폭을 각 시점에서 평균하여 표준 오차를 생성시키는데 사용하였다. 모든 데이터를 최종적인 그래프 표현을 위해 시그마 플롯 내에 대입하였다. 표준 t-시험을 사용하여 데이터 세트들 간의 P-값을 계산하였다. 유의수준 차이는 P-값<0.05로서 정의되었다.
생체 분포:
상기 처리된 GC1KO 마우스의 조직 중 벡터 DNA의 확산을, 약간 변형시킨 앞서 개시된 방법(문헌[Jacobson et al., 2006])에 따라 희생 시 수거된 샘플에서 측정하였다. 벡터-처리된 마우스를 하기의 시점에서 죽였다: AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1-처리된 마우스(주사-후 4 개월째: n = 1; 주사-후 7 개월째: n = 1), AAV5-smCBA-mGC1(주사-후 7 개월째: n = 1; 주사-후 10 개월째: n = 5), AAV5-hGRK1-mGC1(주사-후 7 개월째: n = 1; 주사-후 10 개월째: n = 1). 주사-후 7 개월째 또는 주사-후 10 개월째에 나이-합치된 GC1KO 마우스로부터의 대조용 조직을 또한 실험 동물과 함께 평가하였다. 죽인 후, 다른 새로운 핀셋을 사용하여 처리된 및 처리되지 않은 눈을 적출하였으며 상기 눈은 대략 0.5 ㎝의 가까운 시신경을 유지하였다. 이어서 다른, 새로운 해부 가위를 사용하여 상기 시신경을 안구로부터 절단하고 그 후에 상기 안구를 액체 질소에 급속 동결시키고 -80 ℃로 옮기고 여기에서 상기 안구를 DNA 추출시까지 남겨두었다. 안구를 4% 파라폼알데하이드(PAF)에 담그고 면역조직화학을 위해 처리하였다(하기 참조).
뇌를 제거하고 스테인레스 강 마우스 관상 뇌 매트릭스(하버드 아파라투스(Harvard Apparatus), 미국 매사추세츠주 홀리스톤 소재)를 사용하여 시각-특이성 영역을 단리하였다. 오른쪽 및 왼쪽 외측 슬상핵을 처리 그룹당 한 마리의 마우스로부터 수거하고(최종 시점에서), 포르말린으로 고정하고, 벡터 게놈을 뇌로부터 회수하고 면역조직화학이 필요한 경우에 건졌다. 시각 경로를 함유하는 오른쪽 및 왼쪽 뇌의 분리된 부분들을 수거하고, 액체 질소에서 급속 동결시키고 -80 ℃로 옮기고 여기에서 상기 안구를 DNA 추출시까지 남겨두었다. 조직을 수확하는 동안 교차-오염을 피하도록 조심하였다. 게놈 DNA를 제조자의 프로토콜(퀴아겐(Qiagen) DNeasy 조직 키트)에 따라 조직으로부터 추출하였다. 생성되는 DNA 농도를 에펜도르프 바이오포토모터(Eppendorf Biophotomoter)(모델 6131; 에펜도르프, 독일 함부르크 소재)를 사용하여 측정하였다. 정량적인 PCR을, 약간 변형된 앞서 개시된 방법(문헌[Jacobson et al., 2006]; [Song et al., 2002]; [Poirier et al., 2004])에 따라 수행하였다.
프라이머 쌍을 각각의 벡터 게놈 중의 SV40 폴리-아데닐화 신호(SV40 폴리A) 영역에 대해 디자인하고 표준 곡선을 상기 동일한 SV40 폴리A 표적 서열을 함유하는 기지 농도의 플라스미드 DNA를 사용하여 확립하였다. DNA 샘플을 삼중으로 분석하였다. PCR의 억제로 인한 거짓 음성을 배제하기 위해서, 세 번째 복제물에 100 사본/㎍의 게놈 DNA의 비로 플라스미드 DNA 함유 표적(SV40 폴리A)을 '첨가'하였다. 상기 첨가된 DNA의 >40 사본이 검출된 경우, 상기 샘플을 벡터 게놈 사본 보고에 허용 가능한 것으로 간주하였다. 일부의 경우 '첨가'가 실패된 샘플을 PCR 반응에서 1 ㎍ 미만의 게놈 DNA를 사용하여 재분석하고, 이에 의해 PCR 억제제를 희석하고 상기 추출된 조직 중의 DNA와 함께 정제하였다. 첨가 사본 수를 상기 100 사본/㎍ DNA 비를 유지하도록 비례적으로 감소시켰다. 벡터 게놈 사본을 보고하는 기준은 앞서 개시된 방법(문헌[Jacobson et al., 2006])에 따라 확립되었다. 간단히, 100 게놈 사본/㎍ 초과는 양으로 간주하며 측정된 사본 수/㎍을 보고하였다. 100 사본/㎍ 미만은 음으로 간주하였다.
조직 제조, 면역조직화학 및 현미경검사:
희생 시, [AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1] 주사-후 7 개월째 및 (AAV5-smCBA-mGC1 및 AAV5-hGRK1-mGC1) 주사-후 10 개월째에 수행된 생체 분포와 동반하여, 처리된 GC1KO 마우스, 나이-합치된, 처리되지 않은 GC1KO 마우스뿐만 아니라 나이-합치된 유사유전자 GC1 +/+ 마우스의 각막윤을 12 시 위치에서 뜨거운 바늘로 표시하여 배향을 용이하게 하였다. 처리되지 않은 GC1KO 및 GC1+/+ 대조군을 상기 AAV8(Y733F)-처리된 마우스(희생 시 8 개월 된 것)에 나이-합치시켰다. 동결절제를 위해 지정된 눈을 처리하고 앞서 개시된 방법(문헌[Haire et al., 2006])에 따라 면역염색하였다. 간단히, 10 ㎛ 망막 절편을 GC1에 대한 항체(토끼 다클론 1:200, sc-50512 산타 크루즈 바이오테크놀로지, 미국 소재) 또는 마우스 추상체 어레스틴(토끼 다클론 "루미즈", 1:1000, 미국 캘리포니아주 로스 앤젤레스 소재, 서던 캘리포니아 대학의 셰릴 크래프트 박사에 의해 제공됨)과 배양하였다. 1차 배양에 이어서, 각각 IgG 2차 항체 알렉사-488 또는 알렉사-594를 실온에서 1 시간 동안 적용하였다(1X PBS 중에서 1:500). 절편을 실온에서 5 분간 4',6'-다이아미노-2-페닐-인돌(DAPI)로 대비 염색하였다. 주사-후 11 개월째에, 단지 한쪽 눈에만 AAV5-smCBA-mGC1으로 처리한 하나의 GC1KO 마우스를 죽이고 처리된 및 처리되지 않은 눈으로부터의 망막 온 조직표본을 앞서 개시된 방법(문헌[Pang et al., 2010])에 따라 처리하였다. 간단히, 온 조직표본을 루미즈로 염색한 다음(1:1000) IgG 2차 알렉사-594(1X PBS 중에서 1:500)로 염색하고 12 시로 배향된 망막의 상부(등쪽) 부분을 슬라이드 상에 위치시켰다. 망막 절편을 공초점 현미경 검사로 분석하였다(LCS 버전 2.61, 빌드 1537 소프트웨어가 구비된 레이카 TCS SP2 AOBS 스펙트럼 공초점 현미경). 상들을 20x 배율로 동일한 노출 설정으로 촬영하였다. 망막 온 조직표본을 큐이미징 레티가 4000R 카메라 및 큐이미징 큐캡쳐 프로 소프트웨어가 구비된 넓은 시야 형광 현미경(자이스 액시오플랜 2)으로 분석하였다. 각각의 온 조직표본의 사분면들을 동일한 노출 설정 하에 10x 영상화하고 이어서 아도브 포토숍에서 함께 합하였다.
면역블럿팅:
주사-후 7 개월째에, AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1을 주사한 한 마리의 마우스 및 나이-합치된, 유사유전자 GC1+/+(대조용) 마우스를 죽이고, 이들의 눈을 적출하고 1X PBS 중에 넣었다. 망막을 즉시 절제하고 하기와 같이 처리하였다. 개별적인 망막을 4 ℃에서 1 시간 동안 1% 트리톤 X-100 및 완전 프로테아제 억제제(로슈)와 함께 PBS(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4) 중에 용해시킨 다음 14000 rpm에서 원심분리시켰다. 상등액의 단백질 농도를 BCA(피어스(Pierce))에 의해 측정하고 각 샘플 15 ㎍을 12% 폴리아크릴아미드 젤(바이오-래드(Bio-Rad)) 상에서 분리시키고 15% 메탄올을 함유하는 운반 완충제(25 mM 트리스, 192 mM 글리신) 중에서 1 시간 동안 임모빌론(Immobilon)-FL 막 상으로 옮겼다. 블럿을 차단 완충제(Li-Cor)로 처리하고 GC1을 인식하는 마우스 단클론 항체(IS4, 1:3000, 미국 케이스 웨스턴 대학의 크리스 팔체스키 박사(Dr. Kris Palcweski)에 의해 제공됨) 및 GCAP1에 대해 발생한 토끼 다클론 항체(pAb UW14, 1:25,000, 유타 대학의 볼프강 바에르 박사(Dr. Wolfgang Baehr)에 의해 제공됨) 및 β-액틴(1:5000, 애브캠(Abcam))으로 1 시간 동안 표지하였다. 2차 항체(CW800에 접합된 염소 항-마우스 Ig 및 IR680과 함께 접합된 염소 항-토끼)를 1 시간 동안 적용하고 오디세이(Odyssey) 적외선 영상 시스템(리코(Licor), 미국 네브라스카주 링컨 소재)으로 블롯을 영상화하였다.
rtPCR, 망막 게놈 회수 및 시신경 IHC에 의한 mRNA 정량분석
시신경이 부착된 개별적인 처리된 눈을 AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 또는 AAV5-smCBA-mGC1 및 나이-합치된, 처리되지 않은 GC1 +/+ 마우스로 처리-후 1년째에 GC1KO 마우스로부터 수확하였다. 망막을 상기 눈으로부터 즉시 절제하고 액체 질소 중에 급속 동결시켰다. 시신경을 상기 눈으로부터 분리시키고, 4 ℃에서 밤새 4% 파라폼알데하이드 중에 고정시키고, 4 ℃에서 2 시간 동안 30% 슈크로스 중에 담그고, 이어서 드라이 아이스/에탄올의 욕에서 저온유지장치 화합물(티슈 텍(등록상표) OCT 4583; 사쿠라 파인텍 인코포레이티드, 미국 캘리포니아주 토랜스 소재)에 급속히 동결시켰다. 시신경을 앞서 개시된 방법(문헌[Boye et al., 2010])에 따라 10 ㎛로 절제하고 염색하였다. 망막을 45 초간 완충제 RLT(RNeasy(등록상표) 프로텍트 미니 키트, 퀴아겐 인코포레이티드(Qiagen, Inc.), 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재) + BME 350 ㎖ 중에서 균질화하였다. 샘플을 원심분리하고 용해물을 절반으로 분할하였다(절반은 게놈 회수용으로 지정하고 다른 절반은 RNA 추출용으로 지정하였다)(문헌[Traint and Whitehead, 2009]). 게놈 회수를 상술한 바와 같이 수행하였다. RNA 추출을 RNeasy(등록상표) 프로텍트 미니 키트(퀴아겐 인코포레이티드)로 수행하였다. RNA를 역전사하고(아이스크립트(iScript)(등록상표) cDNA 합성 키트, 바이오래드 레보라토리즈(Biorad Laboratories), 미국 캘리포니아주 헤르큘레스 소재) 실시간 PCR(iQ SYBR(등록상표) 그린 슈퍼믹스(Green Supermix) 및 아이사이클러(iCycler)(등록상표) 열 순환기와 이어져 있는 MyiQ 실시간 PCR 검출 시스템, 바이오래드 레보라토리즈(Biorad Laboratories))에 사용하여 하기의 망막 특이성 mRNA들을 측정하였다: 구아닐레이트 사이클라제-1(GC1), 구아닐레이트 사이클라제 활성화 단백질-1(GCAP1), 추상체 트랜스듀신 α(GNAT2), 간상체 cGMP-특이성 3',5' 사이클릭 포스포다이에스테라제 서브유닛 알파(PDE6α) 및 하우스키핑 유전자, 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH).
GCAP1, GNAT2, PDEα 및 GAPDH에 대한 프라이머 쌍들은 문헌[Baehr et al., 2007]에 사용된 것들과 동일하였다. 쥐 GC1용 프라이머(순방향 프라이머: 5'-GACCCTTCCTGCTGGTTCGATCCA-3' [서열번호 16], 역방향 프라이머: 5'-CTGCATGTGTAGCAGCCTGTGCCTC-3' [서열번호 17])를, 상기 GC1KO 마우스의 유전자 파괴 부위인 엑손 5에 인접하고(문헌[Yang et al., 1999]) 151 bp의 증폭절을 생성하도록 디자인하였다. PCR은 GC1 +/+ 및 AAV-mGC1-처리된 GC1KO 망막 샘플 중에 대략적인 크기의 증폭절들을 생성시켰으나, 예상된 바와 같이 처리되지 않은 GC1KO 망막에서는 생성시키지 않았다. 증폭절 정체를, 표적 서열 내에서 절단하여 56 bp 및 95 bp의 단편을 생성시키는 StuI(NEB)에 의한 제한 절단에 의해 입증하였다. 역전사된 DNA(GC1 +/+ 및 AAV-mGC1-처리된 GC1KO 망막 샘플 모두로부터)의 일련의 희석 시 GC1 및 GAPDH 프라이머를 사용한 rtPCR은 유사한 기울기를 생성시켰으며, 이는 내생적인 및 벡터 매개된 GC1 메시지 모두를 정량분석하기 위한 GC1 프라이머의 적합성을 가리킨다(도 20a 및 도 20b).
결과는 3 개의 반복 반응들의 평균이며 이를 구경 측정기로서 작용하는 GC1 +/+ 샘플 및 샘플들의 표준화에 사용된 GAPDH 신호와 함께 2-ΔΔCτ 방법(문헌[Livak and Schmittgen, 2001])을 사용하여 계산하였다. 표준 편차를 각각의 샘플에 대해 수행된 상기 3 개의 반복 반응들로부터 계산하였다. 데이터를 상기 GC1 +/+ 샘플에 대한 mRNA 수준의 변화 배수로서 제공한다.
결과
장기적인, 광수용체-특이성 GC1 발현:
GC1에 대한 항체에 의한 면역염색은, AAV-벡터화된 치료 단백질 발현이 처리된 GC1KO 마우스 수명의 상당 부분 동안 상기 동물의 광수용체에서 독점적으로 지속됨을 밝혀내었다; AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 7 개월 이상, AAV5-smCBA-mGC1 10 개월 이상, 및 AAV5-hGRK1-mGC1 10 개월 이상(도 21a 및 도 21b). GC1 발현은 AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 벡터로 처리된 간상체 및 추상체의 외부 분절로 제한된 반면 AAV5-smCBA-mGC1으로 처리된 눈의 외부 분절 및 보다 드물게는 광수용체 세포체 모두에서 발견되었으며, 이는 광수용체-특이성 hGRK1에 비해 상기 편재하는 프로모터의 강도와 일치하는 결과이다(문헌[Beltran et al., 2010]). 망막 희박화의 2 개의 예가 관찰되었다. 첫 번째는 AAV5-smCBA-mGC1(전달된 4.69 x 109 개의 총 벡터 게놈)로 처리된 GC1KO 망막이었다. 외부 핵 층(ONL)은 고유 GC1KO 또는 GC1 +/+ 대조용 망막(모두 8 개월의 나이)에서 나타난 것에 비해 약간 희박화되었다. 이는 상기 smCBA 프로모터에 의해 매개된 GC1의 과-발현의 결과일 수도 있다(문헌[Beltran et al., 2010]).
두 번째는 보다 농축된 AAV5-hGRK1-mGC1으로 처리된 GC1KO 망막을 수반하였으며 이전과 같이 광수용체-특이성 GC1 발현을 나타내었지만 외부 핵 층의 심한 희박화를 갖는다. 상기 벡터가 본 연구에서 평가된 3 개 중 가장 농축되었음은 물론이며(전달된 4.12 x 1010 벡터 게놈 대 AAV5-smCBA-mGC1 제제 및 AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 각각에 대해 4.69 x 109 및 1.08 x 1010), GC1의 과발현이 상기 관찰된 희박화의 원인일 수도 있음을 다시 강조한다. 최소한, 이러한 결과는 용량 제한 독성이 마우스에서 관찰될 수도 있음을 암시한다. GC1 발현은 상기 처리되지 않은 GC1KO 망막으로부터 존재하지 않았다(도 21a 및 도 21b).
장기적인 추상체 광수용체 생존이 AAV-벡터화된 GC1에 의해 성취된다
처리된 및 처리되지 않은 GC1KO 마우스뿐만 아니라 GC1 +/+ 대조군의 추상체 광수용체를 마우스 추상체 어레스틴 염색에 의해 확인하였다. 최종 생체분포 연구를 위해 죽인 마우스로부터의 망막 횡단면 및 AAV5-smCBA-mGC1(단지 오른쪽 눈만)으로 처리-후 11 개월째의 GC1KO 마우스로부터의 망막 온 조직표본을 분석하였다. 여기에서 추상체 광수용체 밀도가 처리되지 않은 GC1KO 망막에서 10 개월의 나이까지 현저하게 감소함이 입증되었으며 추상체가 상기 마우스 모델에서 지형상 특이적인 방식으로 상실된다는 선행 보고서들(문헌[Coleman et al., 2004])을 증명한다(도 21a 및 도 21b). 온 조직표본 분석은 11 개월 된, 처리되지 않은 망막이 빈약한 추상체 밀도를 나타내며, 이때 잔여 추상체는 상부 망막 영역에서 독점적으로 발견되는 반면, 망막 하 주사 중 벡터에 노출되지 않은 듯하고 따라서 트랜스유전자 산물을 함유하지 않는 일시적인 망막의 작은 패치를 제외하고, 상대인 P14-처리된 망막은 전체적으로 훨씬 더 높은 추상체 밀도를 유지하였음을 밝혀내었다. AAV5-처리된 망막에서 나타나는 경우에 비해, AAV8(Y733F)-처리된 마우스의 망막 횡단면 중의 추상체 밀도 및 구조는 정상적인 GC1 +/+ 망막에서 나타나는 경우와 정성적으로 가장 유사한 것으로 보였다(도 21a 및 도 21b). 이들의 밀도가 처리되지 않은 대조군에 비해 증가되었지만, AAV5-처리된 망막 중의 추상체는 약간 무질서한 것으로 나타났으며, 이는 상기 마우스에서 외부 핵 층의 약간의 전체적인 무질서/희박화에 기인하는 듯한 결과이다.
AAV-처리된 GC1KO 마우스에서 광수용체 기능(ERG)의 장기적인 복원
선행 실시예들에서, 추상체-매개된 기능은 AAV5-smCBA-mGC1 또는 AAV5-hGRK1-mGC1의 P14 전달에 이어서 3 개월 동안 GC1KO 마우스에 대해 복원될 수 있었다(문헌[Boye et al., 2010]). 처리된 마우스에서 평균 명소시 b-파 진폭은 주사-후 4 주째에 부분적으로 복원되었고 상기 연구기간 전체를 통해 안정하게 유지되었다. 본 실시예에서, 처리-후 9 개월째에 대한 추상체-매개된 응답들을 선행 연구에서 사용된 동일한 벡터로 P14 내지 P25 사이에 주사한 GC1KO 마우스에서 비교하였다. AAV5-mGC1 벡터로 처리된 모든 나머지 마우스는 처리-후 1년 이상 측정 가능한 추상체-매개된 기능을 계속해서 나타내었다. AAV5-hGRK1-mGC1으로 처리된 개별적인 마우스로부터 12 cds/㎡에서 유도된 전형적인 자취를 도 22a 및 도 22b에 나타낸다. 추상체 응답은 시간에 따라 안정하였으며 처리되지 않은, 대측성 대조군으로부터 생성된 응답보다 현저하게 더 높았고(p < 0.001), 이는 추상체 기능의 복원이 상기 동물의 수명 동안 가능함을 암시한다(도 22a). 선행 실시예와 일관되게, 상기 광수용체-특이성 프로모터(hGRK1)-함유 벡터의 전달에 따라 성취된 복원의 수준은 임의의 처리-후 시점에서 상기 편재하는 프로모터(smCBA)-함유 벡터로 성취된 경우와 크게 다르지 않았다. 전형적인 자취는 상기 복원된 추상체 ERG의 동역학이 상기 연구의 과정 전체를 통해 정상으로 나타났음을 밝힌다(도 22b). 또한, 본 실시예에서 추상체 광수용체 기능이 AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 주사에 이어 6 개월 이상 안정하게 복원됨을 입증한다.
상기 강한, 빠르게-작용하는 AAV8 타이로신 캡시드 돌연변이체를 주사한 GC1KO 마우스에서 추상체 b-파 진폭은 평가된 모든 시점에서 어느 한 AAV5 벡터를 주사한 GC1KO 마우스에서 나타난 것보다 더 높았다. 모든 벡터를 병행 비교할 수 있었던 최근의 시점인 처리-후 6 개월째에, AAV8(Y733)-hGRK1-mGC1 대 AAV5-hGRK1-mGC1-처리된 마우스(p = 0.033) 및 AAV(Y733F)-hGRK1-mGC1 대 AAV5-smCBA-mGC1-처리된 마우스(p = 0.025)에서 추상체 b-파 진폭들 사이에 유의수준 차이가 존재하였다. AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1(n = 1) 주사-후 9 개월째에 기록된 전형적인 자취는 주사-후 6 개월째에 기록된 경우보다 현저하게 더 적었다.
처리되지 않은 GC1KO 간상체 응답(5 개월의 나이까지 WT의 50 내지 70%)에서 마우스-간 변이성으로 인해(23), 처리된 대 처리되지 않은 눈의 평균 간상체 응답의 통계학적 비교는 문제가 된다. 그러나, 하나의 동물 내에서, 간상체 ERG 진폭은 상대 눈들 간에 거의 동일하며, 따라서 처리된 대 처리되지 않은 눈에 대한 평균 마우스-내 간상체 a- 및 b-파 진폭 비를 계산하고 이어서 상기 비를 시간에 대해 플롯팅하였다(도 23a 및 도 23b). 간상체 기능의 AAV-매개된 복원은 값 > 1.0의 비로 지시된다. 도 23a 및 도 23b는 하나의 시점(처리-후 4 개월째)을 제외하고, AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1-처리된 대 처리되지 않은 눈의 간상체 b-파 진폭의 평균비가 모두 > 1.0임을 나타낸다. AAV5-처리된 대 처리되지 않은 눈의 비는 단지 때때로 > 1.0이었다. 유사하게, 간상체 a-파 비는 AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1-처리된 마우스에서 일관되게 더 높은 반면, 상기 비는 어느 한 AAV5 벡터에 의한 처리에 이어서 종종 감소하였다(도 23b). 이러한 결과는 간상체에 대한 상기 치료 효과를 포착하기 힘들지만, AAV8(Y733F)이 상기 GC1KO 마우스에 대해 가장 확고한 간상체-매개된 기능 개선을 부여하였음을 암시한다(도 23b). 1 cds/㎡ 자극에 의해 유도된 전형적인 간상체-매개된 암소시 ERG 자취는 AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1-처리된 GC1KO 마우스(처리-후 6 개월째), 처리되지 않은 대측성 대조용 눈 및 나이-합치된 GC1 +/+ 대조군에서 입증되었다. 간상체 ERG 진폭의 AAV8(Y733F)-매개된 개선은 본 실시예에서 명백하며 이는, 야생형 이하-진폭은 차치하고, 처리된 눈 응답 동역학이 상기 GC1+/+ 대조군에서 나타난 것을 닮음을 가리킨다.
벡터 생체분포:
생체분포 연구를 각각의 벡터로 처리한 GC1KO 마우스에서 수행하여, AAV5 또는 AAV8(Y733F)-전달된 벡터 게놈이 수 개월의 기간 후 처리된 마우스의 시신경 및/또는 뇌에서 검출될 수 있는지의 여부를 확립하였다. AAV5 벡터를 주사한 마우스를 처리-후 7 개월(n = 2) 및 10 개월(n = 5)째에 평가하고 AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1을 주사한 마우스를 처리-후 4 개월(n = 1) 및 7 개월(n = 1)째에 평가하였다. 주사한 및 주사하지 않은 눈으로부터의 시신경들뿐만 아니라 시각 경로를 함유한 왼쪽 및 오른쪽 뇌의 일부를 검사하였다. AAV5 벡터를 GC1KO 마우스의 오른쪽 눈에 주사하였다. 따라서, 벡터 게놈이 주사-후 7 개월 및 10 개월째 모두에서 AAV5-처리한 마우스의 오른쪽 시신경에서 검출되었다. 주사-후 7 개월째에, 벡터 게놈이 AAV5-hGRK1-mGC1을 주사한 한 마리의 마우스의 왼쪽 뇌에서 또한 검출되었다. 상기 동물의 오른쪽 뇌에서는 어떠한 벡터 게놈도 검출되지 않았다. 오른쪽(주사한) 시신경 및 왼쪽 뇌가 양성이라는 관찰은, 왼쪽 반구가 오른쪽 눈에 우세하게 "묶이기" 때문에 해부학적으로 일치한다.
주사-후 10 개월까지, AAV5 전달된 벡터 게놈은 오른쪽(주사한) 시신경에서 여전히 검출되었지만 양쪽 뇌 반구에서는 존재하지 않았다. AAV8(Y733) 벡터를 GC1KO 마우스의 왼쪽 눈에 주사하였다. 따라서, AAV8(Y733F)-전달된 벡터 게놈이 주사-후 4 개월 및 7 개월째에 왼쪽 시신경에서 검출되었다. 상기 AAV8(733)-처리된 마우스의 어느 한 뇌 반구에서 어떠한 시점에서도 벡터 게놈은 검출되지 않았다. AAV5-smCBA-mGC1에 비해 AAV5-GRK1-mGC1을 주사한 눈의 시신경에서 보다 높은 평균 수의 벡터 게놈이 검출되었다. 이 결과는 후자(4.69 x 1012 vg/㎖)에 비해 전자(4.12 x 1013 vg/㎖)의 보다 높은 역가로 인한 듯하다.
또한, 상기 연구 과정에 걸쳐 뇌 조직에서 오직 AAV5-hGRK1-mGC1-전달된 게놈만이 검출되었으며, 이는 상기 벡터의 비교적 높은 역가로 인한 듯한 또 다른 관찰이다. 사용된 AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 벡터의 역가(1.08 x 1013 vg/㎖)가 AAV5-hGRK1-mGC1 벡터의 경우보다 작다는 사실에도 불구하고, 더 높은 평균 수의 벡터 게놈이 AAV8(Y733F)-처리된 눈의 시신경에서 검출되었다. AAV5는 상기 마우스 망막의 신경절 세포의 형질도입에 유효하지 않은 것으로 공지되어 있지만(문헌[Stieger et al., 2008]), AAV8은 상기 세포 유형을 형질도입하는 것으로 입증되었다(문헌[Jacobson et al., 2006]). 주사기가 망막 하 주사 중에 내부 망막을 횡단하고 주사 부피 대 전체 눈 크기의 비가 마우스에서 높기 때문에 망막 신경절 세포에 대한 벡터의 일부 노출이 예상된다. 따라서 AAV8(Y733F)-처리된 눈의 시신경에서 검출된 벡터 게놈의 더 많은 수는 망막 신경절 세포에 대한, AAV5에 비해 AAV8(Y733F)의 증가된 친화성에 기인할 수 있다. 예상된 바와 같이, 고유 GC1KO 대조용 마우스의 임의의 조직으로부터 어떠한 AAV 벡터 게놈도 회수되지 않았다.
AAV-mGC1 처리는 처리된 GC1KO 망막에 대한 GC1 및 GCAP1의 야생형 수준을 복원시킨다
AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 주사-후 7 개월째에, 한 마리의 GC1KO 마우스뿐만 아니라 한 마리의 나이-합치된 GC1+/+ 대조용 마우스로부터의 처리된 및 처리되지 않은 망막을 사용하여 GC1 및 GCAP1 단백질 발현의 수준을 분석하였다. 상기 실험의 목적은 처리 그룹들에 걸쳐 GC1 수준을 비교하는 것이 아니라 벡터-매개된 GC1 발현의 수준을 야생형 동물의 GC1의 수준과 비교하는 것이었다. 유사하게 본 발명자들은 GCAP1 발현에 대한 AAV-전달된 GC1의 효과를 평가하였다. 예상된 바와 같이, GC1 단백질은 상기 GC1KO 마우스의 처리되지 않은 눈으로부터 존재하지 않았다. 대조적으로, 상기 AAV8(Y733F)-처리된 눈의 GC1의 수준은 정상적인, GC1 +/+ 대조군에서 나타난 것에 접근하였다(도 4). GCAP1이 GC1KO 마우스에서 번역-후 하향조절된다는 선행 보고서와 일치하게, GCAP1이 GC1 +/+ 대조군에 비해 처리되지 않은 GC1KO 망막에서 하향조절되었음을 보인다(39). 그러나, GC1의 AAV8(Y733F)-매개된 전달은 처리된 GC1KO 마우스 망막에서 GCAP1 발현의 상향 조절을 유도한다. GCAP1 발현의 수준은 또한 GC1 +/+ 대조군에서 나타난 수준에 필적할만하였다.
처리된 GC1KO 마우스에서, GC1 mRNA가 존재하며 GNAT2 mRNA 수준이 처리되지 않은 GC1KO 마우스에 비해 증가한다. 상기 GC1KO마우스의 엑손 5 내에 위치한 네오마이신 유전자 파괴에 인접한 GC1 프라이머 쌍을 사용하여(문헌[Timmers et al., 2001]), GC1 +/+ 및 벡터-처리된 GC1KO 마우스 모두에서 GC1 mRNA를 측정할 수 있었다. 흥미롭게도 상기 유전자 파괴의 충분히 하부인 GC1의 엑손 18 및 19에 대해 표적화된 제 2 GC1 프라이머 쌍은 처리되지 않은 GC1KO 마우스 샘플에서 PCR 산물을 생성시켰으며 따라서 상기 프라이머를 사용하지 않았다. 처리-후 1 년째에, 처리된 망막 중의 GC1 mRNA의 수준은 상기 나이-합치된 GC1 +/+ 대조용 마우스에서 나타난 것보다 대략 7 배(AAV5-처리된) 및 14 배[AAV8(YY733F)-처리된] 더 높았다(도 24a 및 도 24b). 상기 샘플을 2 개의 똑같은 반쪽, 즉 RNA 추출용 하나와 DNA용 다른 하나로 균일하게 분할할 수 있게 한 핵산 회수 기법을 사용함으로써(문헌[Pang et al., 2011]), 동일한 샘플 내에서 mRNA 수준을 측정하고 벡터 게놈의 수를 측정할 수 있었다. 처리된 망막 중의 GC1 mRNA의 높은 수준은 다수의 벡터 게놈의 회수에 상응하는 것으로 밝혀졌다; AAV8(Y733F)의 경우 1.57 x 107 벡터 게놈/㎍의 DNA 및 AAV5의 경우 4.7 x 106 벡터 게놈/㎍. 처리된 망막 중의 높은 수준의 GC1 mRNA에도 불구하고, 처리된 눈의 시신경에서 GC1 발현은 검출되지 않았다. 이러한 결과는 본 연구에서 평가된 벡터들이 표적-외 트랜스유전자 발현을 생성시키지 않았다는 개념을 추가로 지지한다. GC1KO 마우스에서 GCAP1의 감소가 번역-후라는 선행 보고서와 일치하게(즉 mRNA 수준이 변하지 않는다), 본 발명자들은 샘플을 통해 GCAP1 mRNA의 수준의 실질적인 변화를 발견하지 못했다(도 24a 및 도 24b).
다른 추상체 특이성 RNA에 대한 처리의 초기 평가로서, 여러 개의 다른 전사물을 또한 상기 샘플에서 평가하였다. 추상체 트랜스듀신 α(GNAT2)의 수준에 대한 기준선을 확립하기 위해서, GNAT2 RNA를 처리되지 않은 GC1KO 샘플에서 평가하였으며 GC1 +/+ 대조군에 비해 감소되는 것으로 밝혀졌고, 이는 상기 망막 중 추상체 광수용체의 상실에 기인한 듯한 결과이다(도 24a 및 도 24b). 대조적으로, AAV5 또는 AAV8(Y733F) 벡터로 처리한 눈에서 GNAT2 mRNA 수준이 감지할 정도로 증가하였으며, 이는 추상체 광수용체가 AAV-mGC1-처리된 GC1KO 마우스에서 보존된다는 개념을 추가로 지지하는 결과이다. 간상체 PDE6α의 수준은, 간상체 광수용체가 GC1KO마우스에서 변성되지 않기 때문인 것처럼 샘플을 통해 비교적 변하지 않았다(도 24a 및 도 24b).
결론적으로, 상기 연구는 지속적인 AAV-매개된 GC1 발현이 GC1KO마우스에서 장기적인 망막 기능의 복원 및 추상체 광수용체의 보존을 가능하게 함을 입증한다. AAV5- 및 AAV8(Y733F)-처리된 GC1KO 마우스의 코호트를 각각 주사-후 9 개월 및 6 개월 동안 ERG 회수에 대해 평가하였다. 추상체 ERG 진폭의 통계학적 비교를 샘플 크기의 축소로 인해 상기 시점을 벗어나 계속하지는 못했지만, 모든 처리된 마우스는 계속해서 기능적인(ERG) 구제를 나타내었다. 이들 나머지 마우스의 부분집합들에 대해 수행된 다양한 분석들은 모두 계속되는 요법의 분명한 적응증들을 나타낸다. 이러한 치료 수명은 다수의 상이한 수준들, 즉 1) 처리-후 10 개월째에 처리된 눈 중의 GC1 단백질의 존재, 2) 처리-후 12 개월째에 ERG에 의해 측정된 바와 같은 추상체 기능의 복원, 3) 처리-후 11 개월째에 처리된 눈에서 증가된 추상체 생존 및 4) 처리-후 12 개월째에 망막 중의 벡터 게놈 및 GC1 mRNA의 회수에서 입증되었다. 개별적인, 별도의 분석들로서 관찰 시, 이들 분석에 사용된 샘플 크기는 종종 작았다. 그러나, 모두를 명백한 기능 구제의 신호를 나타내는 마우스에서 치료 효능의 상관관계로서 간주할 때, 상기 샘플 크기는 훨씬 더 큰 것이 유효하다. 따라서, 이러한 상황 하에서, 치료는 ERG 구제를 위해 통계학적으로 평가된 기간을 벗어나 지속되는 것으로 보인다. 이는 GC1 결핍의 동물 모델에서 장기적인 치료의 첫 번째 증거이다.
복원된 추상체 ERG를 AAV5 및 AAV8(Y733)-처리된 GC1KO 마우스에서 각각 처리-후 9 개월 및 6 개월 이상 관찰하였다. 응답은 상기 연구 과정 전체를 통해 안정하였으며 처리되지 않은 GC1KO 추상체 응답보다 현저하게 더 높았다. 회복은 AAV8(Y733F) 벡터로 처리된 마우스에서 가장 현저하였다. AAV8(Y733F)-처리된 마우스에서 평균 추상체 b-파 진폭은 표준 AAV5 벡터로 처리된 GC1KO 마우스로부터 기록된 것들보다 시종일관 약 20 μV 더 높았다(각각 약 55 μM 대 약 35 μM). 모든 벡터를 통계학적으로 비교한 최근의 시점인 처리-후 6 개월째에, 상기 차이는 유의수준으로 남아있었다. 이러한 결과는 AAV8(Y733F) 벡터가 망막 구조 및 기능을, 표준 AAV 벡터 처리에 대해 무반응성인 모델인 rd10 마우스에 대해 안정하게 복원하였음을 입증한다.
GC1KO 마우스에서 처리된 및 처리되지 않은 눈 간의 간상체 진폭의 차이를 정량분석하는 것은 상기 모델에서 간상체 기능이 구아닐레이트 사이클라제-2(GC2)에 의해 부분적으로 지원된다는 사실(문헌[Sun et al., 2010])에 의해 복잡하다. 따라서 간상체 ERG 응답은 동물에 따라 가변적이다(정상의 30 내지 50%). 따라서, 처리된 및 처리되지 않은 추상체 응답의 비교와 달리, 처리된 간상체 응답을 제로 기준선에 비교할 수 없다. 그럼에도 불구하고, 짝지어진 GC1KO 눈은 필적할만한 간상체 ERG 진폭을 가지며, 상대 눈, 즉 처리된 것과 처리되지 않은 다른 것의 간상체 ERG의 동물-내 비는 간상체 기능에 대한 처리 효과를 평가하기 위한 타당한 측정규준이다. AAV8(Y733F)-처리된 GC1KO 마우스에서 간상체-매개된 응답의 개선은 상기 처리된 및 처리되지 않은 눈으로부터의 간상체 a- 및 b-파 진폭의 개별-내 비를 비교함으로써 가리키는 바와 같이 AAV5-처리된 마우스로부터 기록된 것들보다 일관되게 더 큰 것으로 관찰되었다. 이는 상기 GC1KO 눈에서 GC1의 적극적인 발현이 쥐 간상체 기능에 대한 GC2의 부분적인 효과를 보충할 수 있음을 암시한다.
장기적인 추상체 광수용체 생존(주사-후 11 개월)은 추상체 어레스틴에 대한 항체로, AAV5-smCBA-mGC1 처리한 한 마리의 마우스로부터의 처리된 및 처리되지 않은 망막 온 조직표본을 면역염색함으로써 입증되었다. 추상체는 상기 처리된 GC1KO 망막 전체를 통해 확인되었다. AAV5-smCBA-mGC1-처리된 망막은 또한 처리되지 않은 눈(이는 선행 보고서와 일치하게, 상기 눈의 상부 반구 중의 추상체의 단지 작은 분획만을 유지하였다(문헌[Provost et al., 2005])보다 더 많은 추상체를 명백히 함유하였다. 처리된 GC1KO 망막 중에 보존된 추상체를 초미세 구조 수준(예를 들어 전자 현미경 검사)으로 검사하지는 않았지만, ERG 분석에 의해 추상체가 시간에 따라 작용성인 채로 남아있었다는 관찰은 상기 추상체의 구조가 완전하였음을 암시한다. 치료학적 AAV-GC1에 의해 매개된 추상체 광수용체의 장기적인 보존은, 황반 추상체를 보존하고 GC1 결핍된 환자에게 유용한 주간/색각을 복원하는 잠재성을 암시하므로 명백한 임상 관련성을 갖는다.
AAV-매개된 GC1 발현은 처리-후 10 개월(IHC에 의해 평가된 최근 시점) 이상 지속되었으며, 사용된 혈청형, 또는 광수용체-특이성(hGRK1) 또는 편재하는(smCBA) 프로모터가 그의 발현을 구동하는지의 여부에 관계없이 광수용체 중에 독점적으로 위치하였다. 트랜스유전자 발현은 표적 세포 유형에 국한되었지만, 상기 hGRK1 프로모터는 상기 표적 세포의 적합한 분절(광수용체 외부 분절) 내에 독점적으로 발현을 생성시킨다는 점에서 보다 특이적이었다. 이 결과는, 상기 프로모터를 사용하는 다른 성공적인 개념 증명 연구와 함께, 상기 hGRK1 프로모터가 광수용체를 표적화하는 임상 AAV 벡터의 디자인에 고려되어야 함을 암시한다.
AAV5-smcBA-mGC1으로 처리-후 10 개월째에 횡단하는 GC1KO 망막 절편의 면역염색은 야생형 및 처리되지 않은 GC1KO 대조군에 비해 ONL의 보통의 희박화를 밝혀냈다. 또한, 상기 망막에서 GC1은 때때로 광수용체의 세포체에서 발견되었다. 상기 강한, 편재하는 smCBA 프로모터가 일부 광수용체의 수송 기구를 압도하는 수준으로 GC1의 발현을 구동하고 광수용체 세포체 중의 트랜스유전자 산물의 축적이 상기 세포에서 스트레스-개시된 세포사멸을 구성하는 것이 가능하다. 보다 극적인 ONL 희박화가 AAV5-hGRK1-mGC1을 주사한 한 마리의 마우스에서 관찰되었다. 1의 n의 경우, 망막 희박화가 상기 벡터로 처리된 모든 마우스 중에 존재하였다는 명확한 결론을 내릴 수는 없다. 그럼에도 불구하고, 과발현 독성의 개념과 일관되게, 상기 AAV5-hGRK1-mGC1 벡터의 역가는 본 연구에서 평가된 3 개 벡터 중 최고였다. 그러나, 상기 높은 역가 AAV5-hGRK1-mGC1 벡터를 갖는 광수용체 체세포 중에 GC1의 축적이 없었음은 또한 물론이다.
AAV-매개된 GC1 발현의 광수용체-독점적인 성질에도 불구하고, 발명자들은 상기 망막 하 공간 외부 조직으로의 벡터 게놈의 확산을 평가하는데 관심을 가졌다. 중요하게, 상기 데이터를 '병든' 동물로부터 수집하였다. 이는 벡터 형질도입 패턴이 병든 대 건강한 망막에서 상이하다는 증거를 근거로 적절하다(문헌[Kolstad et al., 2010]). 이는 생체분포 패턴이 또한 상이할 수 있음을 암시할 것이다. 이러한 이유로 인해, 상기 구제된 동물 모델 자체 내(즉 명백한 ERG 회복을 나타낸 환자들 내)의 게놈의 확산을 평가하는 것이 중요하였다. 상기 샘플 크기가 제한되었지만, 시신경 및 뇌에서 AAV5- 및 AAV8(Y733F)-전달된 게놈의 분포에 대한 유용한 정보가 수집되었다.
이는 캡시드 표면 노출된 타이로신 돌연변이를 함유하는 AAV 벡터에 대한 생체분포의 첫 번째 평가이다. AAV5- 및 AAV8(Y733F)-전달된 벡터 게놈이, 평가된 모든 시점에서 주사된 눈의 시신경에서 검출되었다. 처리된 GC1KO 마우스의 뇌에서는 오직 하나의 시점(주사-후 7 개월째)에서만 AAV5 벡터 게놈이 검출되었다. 상기 주사된 눈의 반대 반구에서만 게놈이 회수되었다. 이러한 결과는, 망막 하-주사된 래트 및 개의 뇌에서 AAV5-전달된 서열의 결여를 보고한 문헌[Provost et al., 2005]에 의한 발견과 대조된다. 주사-후 10 개월까지, AAV5-처리된 GC1KO 마우스의 뇌로부터도, AAV8(Y733F)로 처리된 마우스의 뇌로부터도, 어떠한 시점에서도 벡터 게놈이 회수되지 않았다. 그러나, 분석된 마우스의 비교적 적은 수로 인해, 임의의 시점에서 AAV5-전달된 게놈이 주사-후 10 개월째에 뇌 중에 존재하거나 또는 AAV8(Y733F) 전달된 게놈이 처리된 GC1KO의 뇌에 결코 존재하지 않음을 명백하게 제외할 수는 없다.
처리된 눈의 시신경으로부터 벡터 게놈을 회수함에도 불구하고, 면역염색은 AAV5-smCBA-mGC1 또는 AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 벡터로 처리된 눈의 시신경에서 GC1 발현의 결여를 밝혀내었다. 스티거(Stieger) 등(2005)에 의한 선행 연구는 녹색 형광 단백질(GFP)을 함유하는 AAV8의 망막 하 주사-후 2 개월 및 4 개월째에 래트 및 개의 시신경 및 뇌에서 트랜스유전자 발현을 검출하였다. 상기 AAV8(Y733F) 벡터가 광수용체-특이성 hGRK1 프로모터를 함유하고 GC1 발현이 smCBA와 같은 편재하는 프로모터의 조절하에 있을 때조차 광수용체로 제한된다는 선행 발견을 고려할 때, 시신경에서 GC1 발현의 결여는 뜻밖이지 않다. 문헌[Stieger et al., (2005)]에서는 상기 강한, 편재하는 CMV 프로모터를 그의 벡터 내로 통합시켜, 바이러스 벡터를 통해 전달 시 광범위하게 다양한 조직에서 안정하게 발현될 수 있는 단백질인 GFP를 구동하였다.
AAV5 및 AAV8(Y733F) 벡터는 모두 GC1KO 마우스에게 장기적인 치료를 제공할 수 있지만, AAV8(Y733F)를 사용하는 것과 관련하여 명백한 이점이 존재한다. 다른 무엇보다도 더, 광수용체-특이성 프로모터를 갖는 AAV8(Y733F)은 처리된 마우스에게 어느 한 AAV5 벡터보다 현저하게 더 큰 추상체 ERG 응답을 부여하였다. 이에 대한 이유는 설치류 망막 중의 상기 주사 기포 밖 구역을 형질도입시키는 AAV8 벡터의 능력에 기인할 수 있는 반면, AAV5에 의해 형질도입된 망막의 구역은 주로 상기 기포에 국한된 채로 남아있는다(47). 따라서, AAV8(733F)은 AAV5 벡터에 비해 평균적으로 더 큰 망막 구역을 단순히 형질도입시킬 수 있으며 차례로 이는 각각의 형질도입된 추상체에서 증가된 전체 추상체 생존 및/또는 증가된 수준의 광 반응 중 어느 하나 또는 이들 둘 모두를 통해, 보다 많은 추상체 형질도입 및 확고한 전면적인 추상체 ERG 응답을 생성시킬 수 있다.
실시예 8 - 예시적인 포유동물 GC1 폴리펩타이드 서열
본 발명의 실시에 유용한 예시적인 아미노산 서열은 비제한적으로 생물학적으로-활성인 포유동물 구아닐레이트 사이클라제 단백질을 암호화하는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 상기와 같은 서열은 비제한적으로 인간, 비-인간 영장류, 쥐, 소, 및 개 기원의 것들, 예를 들어 하기 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 및 서열번호 11에 나타낸 구아닐레이트 사이클라제 단백질들을 포함한다:
호모 사피엔스(Homo sapiens)(인간; 진펩트(GenPept) 수납 번호: NP 000171)
Figure pat00001
(서열번호 1)
무스 무스쿨루스(Mus musculus)(마우스; 진펩트 수납 번호: NP 032218)
Figure pat00002
(서열번호 2)
라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus)(노르웨이 래트; 진펩트 수납 번호: NP 077356)
Figure pat00003
(서열번호 3)
보스 타우루스(Bos taurus) GC1(소; 진펩트 수납 번호: NP 776973)
Figure pat00004
(서열번호 4)
캐니스 루푸스 파밀리아리스(Canis lupus familiaris)(개; 진펩트 수납 번호: NP 001003207)
Figure pat00005
(서열번호 5)
마카카 뮬라타(Maccaca mulatta)(붉은 털 원숭이; XP 001111670으로부터 예견된 서열)
Figure pat00006
(서열번호 6)
퐁고 아벨리(Pongo abelii)(수마트라 오랑우탄; XP_002827037로부터 예견된 서열)
Figure pat00007
(서열번호 7)
칼리트릭스 자쿠스(Callithrix jacchus)(흰털-귀 마모셋 원숭이; XP_002747985로부터 예견된 서열)
Figure pat00008
(서열번호 8)
아일루로포다 멜라노레우카(Ailuropoda melanoleuca)(자이언트 판다; XP_002921218로부터 예견된 서열)
Figure pat00009
(서열번호 9)
모노델피스 도메스티카(Monodelphis domestica)(회색 짧은 꼬리 주머니쥐; XP_001369029로부터 예견된 서열)
Figure pat00010
(서열번호 10)
에쿠우스 카발루스(Equus caballus)(말; XP_001918412로부터 예견된 서열)
Figure pat00011
(서열번호 11)
실시예 9 - 공지된 포유동물 GC1 폴리펩타이드의 서열 분석
하기의 종들에 대한 아미노산 서열을 사용하여 생성된 모든 GC1 정렬 데이터: 보스 타우루스(소; 1110 잔기), 캐니스 루푸스 파밀리아리스(개; 1109 잔기), 무스 무스쿨루스(쥐; 1108 잔기), 및 호모 사피엔스(인간; 1103 잔기). 공통 서열 및 가변 영역의 위치들은 보스 타우루스에 상응하는 숫자의 잔기를 기본으로 하는데 그 이유는 상기 잔기가 가장 긴 GC1 단백질인 1110 잔기이고 상기 정렬에서 중단이 없기 때문이다.
보스 타우루스, 캐니스 루푸스 파밀리아리스, 무스 무스쿨루스, 및 호모 사피엔스로부터의 GC1 단백질의 정렬에 대한 유사성 그래프.
Figure pat00012
GC1 공통 영역:
아미노산 위치: 44-49, 55-90, 98-155, 164-321, 464-549, 561-604, 620-761, 813-1026, 1045-1054, 및 1060-1110.
가변 영역:
아미노산 위치: 4-43, 50-54, 91-97, 156-163, 322-463, 550-560, 605-619, 762-812, 1027-1044, 및 1055-1059.
상기 GC1 공통 정렬의 다른 주목할만한 영역은 하기를 포함한다:
(1) 키나제 상동성 도메인: 상기 공통 서열의 아미노산 위치 531 내지 541(광수용체에서의 활성에 필수적인 것으로 공지됨, 예를 들어 문헌[Bereta et al., 2010]을 참조하시오).
(2) 쥐 GC1 단백질의 키나제 상동성 도메인 내의 인산화된 세린 잔기(괄호 안에 공통/소 위치를 나타냄): 530(532), 532(534), 533(535) 및 538(540).
실시예 10 - smCBA 프로모터의 뉴클레오타이드 서열
상술한 연구들에 사용된 예시적인 인간 GRK1(hGRK1) 프로모터의 핵산 서열을 하기에 나타낸다:
Figure pat00013
(서열번호 12)
상술한 연구들에 사용된 예시적인 smCBA 프로모터의 핵산 서열을 하기에 나타낸다:
Figure pat00014
(서열번호 13)
참고문헌
하기의 참고문헌들을, 이들 참고문헌이 본 발명에 나타낸 내용에 보충적인 예시적인 과정 또는 다른 세부사항들을 제공하는 정도로, 본 발명에 참고로 구체적으로 인용한다.
미국 특허 제4,237,224호(등록일: 1980년 12월 2일).
미국 특허 제4,554,101호(등록일: 1985년 11월 19일).
미국 특허 제4,683,195호(등록일: 1987년 7월 28일).
미국 특허 제4,683,202호(등록일: 1987년 7월 28일).
미국 특허 제4,800,159호(등록일: 1989년 1월 24일).
미국 특허 제4,883,750호(등록일: 1989년 11월 28일).
미국 특허 제4,987,071호(등록일: 1991년 1월 22일).
미국 특허 제5,145,684호(등록일: 1992년 9월 8일).
미국 특허 제5,334,711호(등록일: 1994년 8월 2일).
미국 특허 제5,354,855호(등록일: 1994년 10월 11일).
미국 특허 제5,399,363호(등록일: 1995년 3월 21일).
*미국 특허 제5,466,468호(등록일: 1995년 11월 14일).
미국 특허 제5,543,158호(등록일: 1996년 4월 6일).
미국 특허 제5,552,157호(등록일: 1996년 9월 3일).
미국 특허 제5,565,213호(등록일: 1996년 10월 15일).
미국 특허 제5,567,434호(등록일: 1996년 10월 22일).
미국 특허 제5,602,306호(등록일: 1997년 2월 11일).
미국 특허 제5,631,359호(등록일: 1997년 5월 20일).
미국 특허 제5,639,940호(등록일: 1997년 6월 17일).
미국 특허 제5,641,515호(등록일: 1997년 6월 24일).
미국 특허 제5,656,016호(등록일: 1997년 8월 12일).
미국 특허 제5,697,899호(등록일: 1997년 12월 16일).
미국 특허 제5,720,936호(등록일: 1998년 2월 24일).
미국 특허 제5,738,868호(등록일: 1998년 4월 14일).
미국 특허 제5,741,516호(등록일: 1998년 4월 21일).
미국 특허 제5,770,219호(등록일: 1998년 6월 23일).
미국 특허 제5,779,708호(등록일: 1998년 7월 14일).
미국 특허 제5,783,208호(등록일: 1998년 7월 21일).
미국 특허 제5,789,655호(등록일: 1998년 8월 4일).
미국 특허 제5,795,587호(등록일: 1998년 8월 18일).
미국 특허 제5,797,898호(등록일: 1998년 8월 25일).
국제 특허 출원 제PCT US87/00880호.
국제 특허 출원 제PCT/US88/10315호.
국제 특허 출원 제PCT/US89/01025호.
국제 특허 출원 공개 제WO 89/06700호.
국제 특허 출원 공개 제WO 91/03162호.
국제 특허 출원 공개 제WO 92/07065호.
국제 특허 출원 공개 제WO 93/15187호.
국제 특허 출원 공개 제WO 93/23569호.
국제 특허 출원 공개 제WO 94/02595호.
국제 특허 출원 공개 제WO 94/13688호.
유럽 특허 출원 공개 제EP 0329822호.
유럽 특허 출원 공개 제EP 0360257호.
유럽 특허 출원 공개 제EP 92110298.4호.
유럽 특허 출원 공개 제320,308호.
영국 특허 출원 제2202328호.
Figure pat00015
Figure pat00016
Figure pat00017
Figure pat00018
Figure pat00019
Figure pat00020
Figure pat00021
Figure pat00022
Figure pat00023
본 발명에 개시되고 특허청구된 조성물 및 방법들을 모두 본 명세에 비추어 과도한 실험 없이 제조하고 실행할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법을 바람직한 실시태양에 의해 개시하였지만, 본 발명의 개념, 진의 및 범위로부터 이탈됨 없이 본 발명에 개시된 조성물 및 방법 및 단계들 또는 단계들의 순서에 변화를 적용할 수도 있음은 당해 분야의 통상적인 숙련가들에게 자명할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적으로 및 생리학적으로 모두 관련된 몇몇 작용제들을 본 발명에 개시된 작용제들 대신에 사용할 수 있는 반면 동일하거나 유사한 결과가 성취될 것임은 자명할 것이다. 당해 분야의 통상적인 숙련가들에게 자명한 모든 상기와 같은 유사한 대용 및 변경들은 첨부된 특허청구범위에 의해 한정되는 바와 같은 발명의 진의, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주한다.
SEQUENCE LISTING <110> University of Florida Research Foundation, Inc. <120> rAAV-Guanylate Cyclase Compositions and Methods for Treating Leber's Congenital Amaurosis-1 (LCA1) <130> 36689.309 <140> PCT/US2011/033669 <141> 2011-04-22 <150> US 61/327,521 <151> 2010-04-23 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1103 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Thr Ala Cys Ala Arg Arg Ala Gly Gly Leu Pro Asp Pro Gly Leu 1 5 10 15 Cys Gly Pro Ala Trp Trp Ala Pro Ser Leu Pro Arg Leu Pro Arg Ala 20 25 30 Leu Pro Arg Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Pro Pro 35 40 45 Ala Leu Ser Ala Val Phe Thr Val Gly Val Leu Gly Pro Trp Ala Cys 50 55 60 Asp Pro Ile Phe Ser Arg Ala Arg Pro Asp Leu Ala Ala Arg Leu Ala 65 70 75 80 Ala Ala Arg Leu Asn Arg Asp Pro Gly Leu Ala Gly Gly Pro Arg Phe 85 90 95 Glu Val Ala Leu Leu Pro Glu Pro Cys Arg Thr Pro Gly Ser Leu Gly 100 105 110 Ala Val Ser Ser Ala Leu Ala Arg Val Ser Gly Leu Val Gly Pro Val 115 120 125 Asn Pro Ala Ala Cys Arg Pro Ala Glu Leu Leu 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Gly Thr Ile Tyr Asp 340 345 350 Ala Val Phe Leu Leu Ala Arg Gly Val Ala Glu Ala Arg Ala Ala Ala 355 360 365 Gly Gly Arg Trp Val Ser Gly Ala Ala Val Ala Arg His Ile Arg Asp 370 375 380 Ala Gln Val Pro Gly Phe Cys Gly Asp Leu Gly Gly Asp Glu Glu Pro 385 390 395 400 Pro Phe Val Leu Leu Asp Thr Asp Ala Ala Gly Asp Arg Leu Phe Ala 405 410 415 Thr Tyr Met Leu Asp Pro Ala Arg Gly Ser Phe Leu Ser Ala Gly Thr 420 425 430 Arg Met His Phe Pro Arg Gly Gly Ser Ala Pro Gly Pro Asp Pro Ser 435 440 445 Cys Trp Phe Asp Pro Asn Asn Ile Cys Gly Gly Gly Leu Glu Pro Gly 450 455 460 Leu Val Phe Leu Gly Phe Leu Leu Val Val Gly Met Gly Leu Ala Gly 465 470 475 480 Ala Phe Leu Ala His Tyr Val Arg His Arg Leu Leu His Met Gln Met 485 490 495 Val Ser Gly Pro Asn Lys Ile Ile Leu Thr Val Asp Asp Ile Thr Phe 500 505 510 Leu His Pro His Gly Gly Thr Ser Arg Lys Val Ala Gln Gly Ser Arg 515 520 525 Ser Ser Leu Gly Ala Arg Ser Met Ser Asp Ile Arg Ser Gly Pro Ser 530 535 540 Gln His Leu Asp Ser Pro Asn Ile Gly Val Tyr Glu Gly Asp Arg Val 545 550 555 560 Trp Leu Lys Lys Phe Pro Gly Asp Gln His Ile Ala Ile Arg Pro Ala 565 570 575 Thr Lys Thr Ala Phe Ser Lys Leu Gln Glu Leu Arg His Glu Asn Val 580 585 590 Ala Leu Tyr Leu Gly Leu Phe Leu Ala Arg Gly Ala Glu Gly Pro Ala 595 600 605 Ala Leu Trp Glu Gly Asn Leu Ala Val Val Ser Glu His Cys Thr Arg 610 615 620 Gly Ser Leu Gln Asp Leu Leu Ala Gln Arg Glu Ile Lys Leu Asp Trp 625 630 635 640 Met Phe Lys Ser Ser Leu Leu Leu Asp Leu Ile Lys Gly Ile Arg Tyr 645 650 655 Leu His His Arg Gly Val Ala His Gly Arg Leu Lys Ser Arg Asn Cys 660 665 670 Ile Val Asp Gly Arg Phe Val Leu Lys Ile Thr Asp His Gly His Gly 675 680 685 Arg Leu Leu Glu Ala Gln Lys Val Leu Pro Glu Pro Pro Arg Ala Glu 690 695 700 Asp Gln Leu Trp Thr Ala Pro Glu Leu Leu Arg Asp Pro Ala Leu Glu 705 710 715 720 Arg Arg Gly Thr Leu Ala Gly Asp Val Phe Ser Leu Ala Ile Ile Met 725 730 735 Gln Glu Val Val Cys Arg Ser Ala Pro Tyr Ala Met Leu Glu Leu Thr 740 745 750 Pro Glu Glu Val Val Gln Arg Val Arg Ser Pro Pro Pro Leu Cys Arg 755 760 765 Pro Leu Val Ser Met Asp Gln Ala Pro Val Glu Cys Ile Leu Leu Met 770 775 780 Lys Gln Cys Trp Ala Glu Gln Pro Glu Leu Arg Pro Ser Met Asp His 785 790 795 800 Thr Phe Asp Leu Phe Lys Asn Ile Asn Lys Gly Arg Lys Thr Asn Ile 805 810 815 Ile Asp Ser Met Leu Arg Met Leu Glu Gln Tyr Ser Ser Asn Leu Glu 820 825 830 Asp Leu Ile Arg Glu Arg Thr Glu Glu Leu Glu Leu Glu Lys Gln Lys 835 840 845 Thr Asp Arg Leu Leu Thr Gln Met Leu Pro Pro Ser Val Ala Glu Ala 850 855 860 Leu Lys Thr Gly Thr Pro Val Glu Pro Glu Tyr Phe Glu Gln Val Thr 865 870 875 880 Leu Tyr Phe Ser Asp Ile Val Gly Phe Thr Thr Ile Ser Ala Met Ser 885 890 895 Glu Pro Ile Glu Val Val Asp Leu Leu Asn Asp Leu Tyr Thr Leu Phe 900 905 910 Asp Ala Ile Ile Gly Ser His Asp Val Tyr Lys Val Glu Thr Ile Gly 915 920 925 Asp Ala Tyr Met Val Ala Ser Gly Leu Pro Gln Arg Asn Gly Gln Arg 930 935 940 His Ala Ala Glu Ile Ala Asn Met Ser Leu Asp Ile Leu Ser Ala Val 945 950 955 960 Gly Thr Phe Arg Met Arg His Met Pro Glu Val Pro Val Arg Ile Arg 965 970 975 Ile Gly Leu His Ser Gly Pro Cys Val Ala Gly Val Val Gly Leu Thr 980 985 990 Met Pro Arg Tyr Cys Leu Phe Gly Asp Thr Val Asn Thr Ala Ser Arg 995 1000 1005 Met Glu Ser Thr Gly Leu Pro Tyr Arg Ile His Val Asn Leu Ser 1010 1015 1020 Thr Val Gly Ile Leu Arg Ala Leu Asp Ser Gly Tyr Gln Val Glu 1025 1030 1035 Leu Arg Gly Arg Thr Glu Leu Lys Gly Lys Gly Ala Glu Asp Thr 1040 1045 1050 Phe Trp Leu Val Gly Arg Arg Gly Phe Asn Lys Pro Ile Pro Lys 1055 1060 1065 Pro Pro Asp Leu Gln Pro Gly Ser Ser Asn His Gly Ile Ser Leu 1070 1075 1080 Gln Glu Ile Pro Pro Glu Arg Arg Arg Lys Leu Glu Lys Ala Arg 1085 1090 1095 Pro Gly Gln Phe Ser 1100 <210> 2 <211> 1108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Ser Ala Trp Leu Leu Pro Ala Gly Gly Leu Pro Gly Ala Gly Phe 1 5 10 15 Cys Val Pro Ala Arg Gln Ser Pro Ser Ser Phe Ser Arg Val Leu Arg 20 25 30 Trp Pro Arg Pro Gly Leu Pro Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro 35 40 45 Ser Pro Ser Ala Leu Ser Ala Val Phe Lys Val Gly Val Leu Gly Pro 50 55 60 Trp Ala Cys Asp Pro Ile Phe Ala Arg Ala Arg Pro Asp Leu Ala Ala 65 70 75 80 Arg Leu Ala Ala Asn Arg Leu Asn Arg Asp Phe Ala Leu Asp Gly Gly 85 90 95 Pro Arg Phe Glu Val Ala Leu Leu Pro Glu Pro Cys Leu Thr Pro Gly 100 105 110 Ser Leu Gly Ala Val Ser Ser Ala Leu Ser Arg Val Ser Gly Leu Val 115 120 125 Gly Pro Val Asn Pro Ala Ala Cys Arg Pro Ala Glu Leu Leu Ala Gln 130 135 140 Glu Ala Gly Val Ala Leu Val Pro Trp Gly Cys Pro Gly Thr Arg Ala 145 150 155 160 Ala Gly Thr Thr Ala Pro Ala Val Thr Pro Ala Ala Asp Ala Leu Tyr 165 170 175 Val Leu Leu Arg Ala Phe Arg Trp Ala Arg Val Ala Leu Ile Thr Ala 180 185 190 Pro Gln Asp Leu Trp Val Glu Ala Gly Arg Ala Leu Ser Thr Ala Leu 195 200 205 Arg Ala Arg Gly Leu Pro Val Ala Leu Val Thr Ser Met Glu Thr Ser 210 215 220 Asp Arg Ser Gly Ala Arg Glu Ala Leu Gly Arg Ile Arg Asp Gly Pro 225 230 235 240 Arg Val Arg Val Val Ile Met Val Met His Ser Val Leu Leu Gly Gly 245 250 255 Glu Glu Gln Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Ala Glu Glu Leu Ala Leu Thr 260 265 270 Asp Gly Ser Leu Val Phe Leu Pro Phe Asp Thr Leu His Tyr Ala Leu 275 280 285 Ser Pro Gly Pro Glu Ala Leu Ala Ala Phe Val Asn Ser Ser Gln Leu 290 295 300 Arg Arg Ala His Asp Ala Val Leu Thr Leu Thr Arg Arg Cys Pro Pro 305 310 315 320 Gly Gly Ser Val Gln Asp Ser Leu Arg Arg Ala Gln Glu His Gln Glu 325 330 335 Leu Pro Leu Asp Leu Asn Leu Lys Gln Val Ser Pro Leu Phe Gly Thr 340 345 350 Ile Tyr Asp Ala Val Phe Leu Leu Ala Gly Gly Val Lys Arg Ala Arg 355 360 365 Thr Ala Val Gly Gly Gly Trp Val Ser Gly Ala Ser Val Ala Arg Gln 370 375 380 Val Arg Glu Ala Gln Val Ser Gly Phe Cys Gly Val Leu Gly Arg Thr 385 390 395 400 Glu Glu Pro Ser Phe Val Leu Leu Asp Thr Asp Ala Ser Gly Glu Gln 405 410 415 Leu Phe Ala Thr His Leu Leu Asp Pro Val Leu Gly Ser Leu Arg Ser 420 425 430 Ala Gly Thr Pro Met His Phe Pro Arg Gly Gly Pro Ala Pro Gly Pro 435 440 445 Asp Pro Ser Cys Trp Phe Asp Pro Asp Val Ile Cys Asn Gly Gly Val 450 455 460 Glu Pro Gly Leu Val Phe Val Gly Phe Leu Leu Val Ile Gly Met Gly 465 470 475 480 Leu Thr Gly Ala Phe Leu Ala His Tyr Leu Arg His Arg Leu Leu His 485 490 495 Met Gln Met Ala Ser Gly Pro Asn Lys Ile Ile Leu Thr Leu Glu Asp 500 505 510 Val Thr Phe Leu His Pro Pro Gly Gly Ser Ser Arg Lys Val Val Gln 515 520 525 Gly Ser Arg Ser Ser Leu Ala Thr Arg Ser Ala Ser Asp Ile Arg Ser 530 535 540 Val Pro Ser Gln Pro Gln Glu Ser Thr Asn Val Gly Leu Tyr Glu Gly 545 550 555 560 Asp Trp Val Trp Leu Lys Lys Phe Pro Gly Glu His His Met Ala Ile 565 570 575 Arg Pro Ala Thr Lys Thr Ala Phe Ser Lys Leu Arg Glu Leu Arg His 580 585 590 Glu Asn Val Ala Leu Tyr Leu Gly Leu Phe Leu Ala Gly Thr Ala Asp 595 600 605 Ser Pro Ala Thr Pro Gly Glu Gly Ile Leu Ala Val Val Ser Glu His 610 615 620 Cys Ala Arg Gly Ser Leu His Asp Leu Leu Ala Gln Arg Glu Ile Lys 625 630 635 640 Leu Asp Trp Met Phe Lys Ser Ser Leu Leu Leu Asp Leu Ile Lys Gly 645 650 655 Met Arg Tyr Leu His His Arg Gly Val Ala His Gly Arg Leu Lys Ser 660 665 670 Arg Asn Cys Val Val Asp Gly Arg Phe Val Leu Lys Val Thr Asp His 675 680 685 Gly His Gly Arg Leu Leu Glu Ala Gln Arg Val Leu Pro Glu Pro Pro 690 695 700 Ser Ala Glu Asp Gln Leu Trp Thr Ala Pro Glu Leu Leu Arg Asp Pro 705 710 715 720 Ser Leu Glu Arg Arg Gly Thr Leu Ala Gly Asp Val Phe Ser Leu Ala 725 730 735 Ile Ile Met Gln Glu Val Val Cys Arg Ser Thr Pro Tyr Ala Met Leu 740 745 750 Glu Leu Thr Pro Glu Glu Val Ile Gln Arg Val Arg Ser Pro Pro Pro 755 760 765 Leu Cys Arg Pro Leu Val Ser Met Asp Gln Ala Pro Met Glu Cys Ile 770 775 780 Gln Leu Met Thr Gln Cys Trp Ala Glu His Pro Glu Leu Arg Pro Ser 785 790 795 800 Met Asp Leu Thr Phe Asp Leu Phe Lys Ser Ile Asn Lys Gly Arg Lys 805 810 815 Thr Asn Ile Ile Asp Ser Met Leu Arg Met Leu Glu Gln Tyr Ser Ser 820 825 830 Asn Leu Glu Asp Leu Ile Arg Glu Arg Thr Glu Glu Leu Glu Gln Glu 835 840 845 Lys Gln Lys Thr Asp Arg Leu Leu Thr Gln Met Leu Pro Pro Ser Val 850 855 860 Ala Glu Ala Leu Lys Met Gly Thr Ser Val Glu Pro Glu Tyr Phe Glu 865 870 875 880 Glu Val Thr Leu Tyr Phe Ser Asp Ile Val Gly Phe Thr Thr Ile Ser 885 890 895 Ala Met Ser Glu Pro Ile Glu Val Val Asp Leu Leu Asn Asp Leu Tyr 900 905 910 Thr Leu Phe Asp Ala Ile Ile Gly Ala His Asp Val Tyr Lys Val Glu 915 920 925 Thr Ile Gly Asp Ala Tyr Met Val Ala Ser Gly Leu Pro Gln Arg Asn 930 935 940 Gly Gln Arg His Ala Ala Glu Ile Ala Asn Met Ser Leu Asp Ile Leu 945 950 955 960 Ser Ala Val Gly Ser Phe Arg Met Arg His Met Pro Glu Val Pro Val 965 970 975 Arg Ile Arg Ile Gly Leu His Ser Gly Pro Cys Val Ala Gly Val Val 980 985 990 Gly Leu Thr Met Pro Arg Tyr Cys Leu Phe Gly Asp Thr Val Asn Thr 995 1000 1005 Ala Ser Arg Met Glu Ser Thr Gly Leu Pro Tyr Arg Ile His Val 1010 1015 1020 Asn Met Ser Thr Val Arg Ile Leu Arg Ala Leu Asp Gln Gly Phe 1025 1030 1035 Gln Met Glu Cys Arg Gly Arg Thr Glu Leu Lys Gly Lys Gly Ile 1040 1045 1050 Glu Asp Thr Tyr Trp Leu Val Gly Arg Leu Gly Phe Asn Lys Pro 1055 1060 1065 Ile Pro Lys Pro Pro Asp Leu Gln Pro Gly Ala Ser Asn His Gly 1070 1075 1080 Ile Ser Leu Gln Glu Ile Pro Pro Glu Arg Arg Lys Lys Leu Glu 1085 1090 1095 Lys Ala Arg Pro Gly Gln Phe Thr Gly Lys 1100 1105 <210> 3 <211> 1108 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 3 Met Ser Ala Trp Leu Leu Pro Ala Gly Gly Phe Pro Gly Ala Gly Phe 1 5 10 15 Cys Ile Pro Ala Trp Gln Ser Arg Ser Ser Leu Ser Arg Val Leu Arg 20 25 30 Trp Pro Gly Pro Gly Leu Pro Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro 35 40 45 Ser Pro Ser Ala Phe Ser Ala Val Phe Lys Val Gly Val Leu Gly Pro 50 55 60 Trp Ala Cys Asp Pro Ile Phe Ala Arg Ala Arg Pro Asp Leu Ala Ala 65 70 75 80 Arg Leu Ala Thr Asp Arg Leu Asn Arg Asp Leu Ala Leu Asp Gly Gly 85 90 95 Pro Trp Phe Glu Val Thr Leu Leu Pro Glu Pro Cys Leu Thr Pro Gly 100 105 110 Ser Leu Gly Ala Val Ser Ser Ala Leu Thr Arg Val Ser Gly Leu Val 115 120 125 Gly Pro Val Asn Pro Ala Ala Cys Arg Pro Ala Glu Leu Leu Ala Gln 130 135 140 Glu Ala Gly Val Ala Leu Val Pro Trp Gly Cys Pro Gly Thr Arg Ala 145 150 155 160 Ala Gly Thr Thr Ala Pro Ala Val Thr Pro Ala Ala Asp Ala Leu Tyr 165 170 175 Val Leu Leu Lys Ala Phe Arg Trp Ala Arg Val Ala Leu Ile Thr Ala 180 185 190 Pro 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750 Pro Met Cys Arg Pro Ser Val Ser Val Asp Gln Ala Pro Met Glu Cys 755 760 765 Ile Gln Leu Met Lys Gln Cys Trp Ala Glu Gln Pro Asp Leu Arg Pro 770 775 780 Asn Met Asp Thr Thr Phe Asp Leu Phe Lys Asn Ile Asn Lys Gly Arg 785 790 795 800 Lys Thr Asn Ile Ile Asp Ser Met Leu Arg Met Leu Glu Gln Tyr Ser 805 810 815 Ser Asn Leu Glu Asp Leu Ile Arg Glu Arg Thr Glu Glu Leu Glu Leu 820 825 830 Glu Lys Gln Lys Thr Asp Lys Leu Leu Thr Gln Met Leu Pro Pro Ser 835 840 845 Val Ala Glu Ala Leu Lys Leu Gly Ile Pro Val Glu Pro Glu Tyr Phe 850 855 860 Glu Glu Val Thr Leu Tyr Phe Ser Asp Ile Val Gly Phe Thr Thr Ile 865 870 875 880 Ser Ala Met Ser Glu Pro Ile Glu Val Val Asp Leu Leu Asn Asp Leu 885 890 895 Tyr Thr Leu Phe Asp Ala Ile Ile Gly Ser His Asp Val Tyr Lys Val 900 905 910 Glu Thr Ile Gly Asp Ala Tyr Met Val Ala Ser Gly Leu Pro Lys Arg 915 920 925 Asn Gly Gln Arg His Ala Ala Glu Ile Ala Asn Met Ser Leu Asp Ile 930 935 940 Leu Ser Ser Val Gly Ser Phe Arg Met Arg His Met Pro Glu Val Pro 945 950 955 960 Val Arg Ile Arg Ile Gly Leu His Ser Gly Pro Cys Val Ala Gly Val 965 970 975 Val Gly Leu Thr Met Pro Arg Tyr Cys Leu Phe Gly Asp Thr Val Asn 980 985 990 Thr Ala Ser Arg Met Glu Ser Thr Gly Leu Pro Tyr Arg Ile His Val 995 1000 1005 Asn Leu Ser Thr Val Lys Ile Leu Gln Gly Leu Asn Glu Gly Phe 1010 1015 1020 Gln Ile Glu Ile Arg Gly Arg Thr Glu Leu Lys Gly Lys Gly Val 1025 1030 1035 Glu Asp Thr Tyr Trp Leu Val Gly Arg Lys Gly Phe Asp Lys Pro 1040 1045 1050 Ile Pro Ile Pro Pro Asp Leu Leu Pro Gly Ala Ser Asn His Gly 1055 1060 1065 Ile Ser Leu Gln Glu Ile Pro Glu Asp Arg Arg Lys Lys Leu Glu 1070 1075 1080 Lys Ala Arg Pro Gly Gln Pro Leu Gly Lys 1085 1090 <210> 11 <211> 862 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 11 Met Val Met His Ser Val Leu Leu Gly Gly Glu Glu Gln Arg Cys Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Ala Glu Glu Leu Gly Leu Ala Asp Gly Ser Leu Val Phe 20 25 30 Leu Pro Phe Asp Thr Leu His Tyr Ala Leu Ser Pro Gly Pro Glu Ala 35 40 45 Leu Ala Val Leu Ala Asn Asn Ser Gln Leu Arg Arg Ala His Asp Ala 50 55 60 Val Leu Thr Leu Thr Arg His Cys Pro Leu Gly Gly Ser Val Leu Asp 65 70 75 80 Ser Leu Arg Arg Ala Gln Glu His Gln Glu Leu Pro Ser Asp Leu Asn 85 90 95 Leu Gln Gln Val Ser Pro Leu Phe Gly Thr Ile Tyr Asp Ala Val Tyr 100 105 110 Leu Leu Ala Gly Gly Val Ala Arg Ala Arg Ala Ala Ala Gly Gly Ser 115 120 125 Trp Val Ser Gly Ala Ala Val Ala His His Val Arg Asp Ala Gln Val 130 135 140 Pro Gly Phe Cys Gly Ala Leu Gly Gly Ala Glu Glu Pro Gln Phe Val 145 150 155 160 Leu Leu Asp Thr Asp Ala Ala Gly Asp Arg Leu Phe Ala Thr Tyr Met 165 170 175 Leu Asp Pro Thr Arg Gly Ser Leu Trp Ser Ala Gly Thr Pro Val His 180 185 190 Phe Pro Arg Gly Gly Arg Gly Pro Gly Pro Asp Pro Trp Cys Trp Phe 195 200 205 Asp Pro Asp Asp Ile Cys Asn Gly Gly Val Glu Pro Arg Leu Val Phe 210 215 220 Ile Gly Phe Leu Leu Ala Val Gly Met Gly Leu Ala Gly Val Phe Leu 225 230 235 240 Ala His Tyr Val Arg His Arg Leu Leu His Ile Gln Met Ala Ser Gly 245 250 255 Pro Asn Lys Ile Ile Leu Thr Leu Asp Asp Ile Thr Phe Leu His Pro 260 265 270 Gln Gly Gly Ser Ser Arg Lys Val Ile Gln Gly Ser Arg Ser Ser Leu 275 280 285 Ala Ala Arg Ser Val Ser Asp Ile Arg Ser Val Pro Ser Gln Pro Met 290 295 300 Asp Ser Ser Asn Ile Gly Leu Tyr Glu Gly Asp Trp Val Trp Leu Lys 305 310 315 320 Lys Phe Pro Gly Asp Gln His Ile Ala Ile Arg Pro Ala Thr Lys Thr 325 330 335 Ala Phe Ser Lys Leu Arg Glu Leu Arg His Glu Asn Val Ala Leu Tyr 340 345 350 Leu Gly Leu Phe Leu Ala Gly Gly Ser Ser Gly Ala Ala Ala Pro Arg 355 360 365 Glu Gly Met Leu Ala Val Val Ser Glu His Cys Ala Arg Gly Ser Leu 370 375 380 His Asp Leu Leu Ala Gln Arg Asp Ile Lys Leu Asp Trp Met Phe Lys 385 390 395 400 Ser Ser Leu Leu Leu Asp Leu Ile Lys Gly Met Arg Tyr Leu His His 405 410 415 Arg Gly Val Ala His Gly Arg Leu Lys Ser Arg Asn Cys Val Val Asp 420 425 430 Gly Arg Phe Val Leu Lys Val Thr Asp His Gly His Gly Arg Leu Leu 435 440 445 Glu Ala Gln Lys Val Leu Pro Glu Pro Pro Ser Ala Glu Asp Gln Leu 450 455 460 Trp Thr Ala Pro Glu Leu Leu Arg Asp Pro Ala Leu Glu Arg Gln Gly 465 470 475 480 Thr Leu Ala Gly Asp Val Phe Ser Leu Gly Ile Ile Ile Gln Glu Val 485 490 495 Val Cys Arg Ser Thr Pro Tyr Ala Met Leu Glu Leu Thr Pro Glu Glu 500 505 510 Val Val Gln Arg Leu Gln Ser Pro Pro Pro Leu Cys Arg Pro Ser Val 515 520 525 Ser Met Asp Gln Ala Pro Met Glu Cys Ile Gln Leu Met Lys Gln Cys 530 535 540 Trp Ala Glu Gln Pro Asp Leu Arg Pro Ser Met Asp Arg Thr Phe Asp 545 550 555 560 Leu Phe Lys Ser Ile Asn Lys Gly Arg Lys Thr Asn Ile Ile Asp Ser 565 570 575 Met Leu Arg Met Leu Glu Gln Tyr Ser Ser Asn Leu Glu Asp Leu Ile 580 585 590 Arg Glu Arg Thr Glu Glu Leu Glu Leu Glu Lys Gln Lys Thr Asp Arg 595 600 605 Leu Leu Thr Gln Met Leu Pro Pro Ser Val Ala Glu Ala Leu Lys Met 610 615 620 Gly Thr Pro Val Glu Pro Glu Tyr Phe Glu Glu Val Thr Leu Tyr Phe 625 630 635 640 Ser Asp Ile Val Gly Phe Thr Thr Ile Ser Ala Met Ser Glu Pro Ile 645 650 655 Glu Val Val Asp Leu Leu Asn Asp Leu Tyr Thr Leu Phe Asp Ala Ile 660 665 670 Ile Gly Ser His Asp Val Tyr Lys Val Glu Thr Ile Gly Asp Ala Tyr 675 680 685 Met Val Ala Ser Gly Leu Pro Gln Arg Asn Gly Gln Arg His Ala Ala 690 695 700 Glu Ile Ala Asn Met Ala Leu Asp Ile Leu Ser Ala Val Gly Ser Phe 705 710 715 720 Arg Met Arg His Met Pro Glu Val Pro Val Arg Ile Arg Ile Gly Leu 725 730 735 His Ser Gly Pro Cys Val Ala Gly Val Val Gly Leu Thr Met Pro Arg 740 745 750 Tyr Cys Leu Phe Gly Asp Thr Val Asn Thr Ala Ser Arg Met Glu Ser 755 760 765 Thr Gly Leu Pro Tyr Arg Ile His Val Asn Met Ser Thr Val Arg Ile 770 775 780 Leu Arg Ala Leu Asp Glu Gly Phe Gln Val Glu Val Arg Gly Arg Thr 785 790 795 800 Glu Leu Lys Gly Lys Gly Val Glu Asp Thr Tyr Trp Leu Val Gly Arg 805 810 815 Arg Gly Phe Asn Lys Pro Ile Pro Lys Pro Pro Asp Leu Gln Pro Gly 820 825 830 Ala Ser Asn His Gly Ile Ser Leu Gln Glu Ile Pro Pro Glu Arg Arg 835 840 845 Gln Lys Leu Glu Lys Ala Arg Pro Gly Gln Phe Ser Gly Lys 850 855 860 <210> 12 <211> 292 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 gggccccaga agcctggtgg ttgtttgtcc ttctcagggg aaaagtgagg cggccccttg 60 gaggaagggg ccgggcagaa tgatctaatc ggattccaag cagctcaggg gattgtcttt 120 ttctagcacc ttcttgccac tcctaagcgt cctccgtgac cccggctggg atttagcctg 180 gtgctgtgtc agccccggtc tcccaggggc ttcccagtgg tccccaggaa ccctcgacag 240 ggcccggtct ctctcgtcca gcaagggcag ggacgggcca caggccaagg gc 292 <210> 13 <211> 953 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hybrid CBA/CMV promoter <400> 13 aattcggtac cctagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata 60 tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga 120 cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt 180 ccattgacgt caatgggtgg actatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt 240 gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca 300 ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt 360 catcgctatt accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc 420 cccctcccca cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg 480 ggcggggggg gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg 540 ggcgaggcgg agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt 600 tatggcgagg cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgggagt 660 cgctgcgacg ctgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc 720 ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg 780 gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc 840 ttgaggggct ccgggagcta gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct 900 acagctcctg ggcaacgtgc tggttattgt gctgtctcat cattttggca aag 953 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 14 aaaagcggcc gcatgagcgc ttggctcctg ccagcc 36 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer <400> 15 aaaagcggcc gctcacttcc cagtaaactg gcctgg 36 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 16 gacccttcct gctggttcga tcca 24 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer <400> 17 ctgcatgtgt agcagcctgt gcctc 25 <210> 18 <211> 992 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus Sequence <400> 18 Met Ser Ala Ala Gly Gly Leu Gly Cys Pro Arg Ala Pro Ser Ile Pro 1 5 10 15 Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Ser Ala Val Phe Val Gly 20 25 30 Val Leu Gly Pro Trp Ala Cys Asp Pro Ile Phe Ala Arg Ala Arg Pro 35 40 45 Asp Ile Ala Ala Arg Leu Ala Ala Arg Leu Asn Ala Leu Asp Gly Gly 50 55 60 Pro Arg Phe Glu Val Ala Leu Leu Pro Glu Pro Cys Thr Pro Gly Ser 65 70 75 80 Leu Gly Ala Val Ser Ser Ala Ser Arg Val Ser Gly Leu Val Gly Pro 85 90 95 Val Asn Pro Ala Ala Cys Arg Pro Ala Glu Leu Leu Ala Gln Glu Ala 100 105 110 Gly Val Ala Leu Val Pro Trp Gly Val Pro Gly Thr Arg Ala Ala Gly 115 120 125 Thr Thr Ala Pro Val Thr Pro Ala Ala Asp Ala Leu Tyr Leu Leu Arg 130 135 140 Ala Phe Arg Trp Ala Val Ala Leu Ile Thr Ala Pro Gln Asp Leu Trp 145 150 155 160 Val Glu Ala Gly Ala Leu Ser Thr Ala Leu Arg Ala Arg Gly Leu Pro 165 170 175 Val Ala Leu Val Thr Ser Met Glu Val Arg Val Ile Met Val Met Gly 180 185 190 Ser Val Leu Leu Gly Gly Glu Glu Gln Arg Leu Leu Glu Ala Ala Glu 195 200 205 Glu Leu Ala Leu Asp Gly Ser Leu Val Phe Leu Pro Phe Asp Thr Leu 210 215 220 His Trp Ala Leu Ser Pro Gly Pro Asp Ala Ile Ala Asn Ser Ser Gln 225 230 235 240 Leu Arg Lys Ala His Asp Ala Val Leu Thr Leu Thr Arg Cys Pro Gly 245 250 255 Gly Ser Val Asp Ser Leu Arg Arg Ala Gln Glu His Glu Leu Pro Leu 260 265 270 Asp Leu Asn Leu Gln Val Ser Pro Leu Phe Gly Thr Ile Tyr Asp Ala 275 280 285 Val Phe Leu Leu Ala Gly Gly Thr Ala Thr Ala Gly Gly Gly Trp Val 290 295 300 Ser Gly Ala Ala Val Ala Arg Ile Arg Asp Ala Val Gly Phe Cys Gly 305 310 315 320 Leu Gly Glu Glu Pro Ser Phe Val Leu Ile Asp Thr Asp Ala Ser Gly 325 330 335 Asp Gln Leu Phe Ala Thr His Leu Leu Asp Pro Gly Ser Ala Gly Thr 340 345 350 Pro Met His Phe Pro Lys Gly Gly Ala Pro Gly Pro Asp Pro Ser Cys 355 360 365 Trp Phe Asp Pro Asp Ile Cys Asn Gly Gly Val Glu Pro Leu Val Phe 370 375 380 Ile Gly Phe Leu Leu Val Ile Gly Met Gly Leu Gly Ala Phe Leu Ala 385 390 395 400 Phe Leu Ala His Tyr Arg His Arg Leu Leu His Ile Gln Met Ser Gly 405 410 415 Pro Asn Lys Ile Ile Leu Thr Leu Asp Asp Ile Thr Phe Leu His Pro 420 425 430 Gly Gly Ser Arg Lys Val Gln Gly Ser Arg Ser Ser Leu Ala Arg Ser 435 440 445 Ser Asp Ile Arg Ser Ile Ser Gln Asp Thr Asn Ile Gly Leu Tyr Glu 450 455 460 Gly Asp Trp Val Trp Leu Lys Lys Phe Pro Gly Asp His Ile Ala Ile 465 470 475 480 Arg Pro Ala Thr Lys Ala Phe Ser Lys Ile Arg Glu Leu Arg His Glu 485 490 495 Asn Val Ala Leu Tyr Leu Gly Leu Phe Leu Ala Gly Ala Gly Ala Pro 500 505 510 Ala Pro Gly Glu Gly Ile Leu Ala Val Val Ser Glu His Cys Ala Arg 515 520 525 Gly Ser Leu Asp Leu Leu Ala Gln Arg Asp Ile Lys Leu Asp Trp Met 530 535 540 Phe Lys Ser Ser Leu Leu Leu Asp Leu Ile Lys Gly Ile Arg Tyr Leu 545 550 555 560 His His Arg Gly Val Ala His Gly Arg Leu Lys Ser Arg Asn Cys Val 565 570 575 Val Asp Gly Arg Phe Val Leu Lys Val Thr Asp His Gly His Gly Arg 580 585 590 Leu Leu Glu Ala Gln Arg Val Leu Pro Glu Pro Pro Ser Ala Glu Asp 595 600 605 Gln Leu Trp Thr Ala Pro Glu Leu Leu Arg Asp Pro Leu Glu Arg Arg 610 615 620 Arg Gly Thr Leu Ala Gly Asp Val Phe Ser Leu Ala Ile Ile Met Gln 625 630 635 640 Glu Val Val Cys Arg Ser Pro Tyr Ala Met Leu Glu Leu Thr Pro Glu 645 650 655 Glu Val Ile Arg Val Ser Pro Pro Pro Leu Cys Arg Pro Val Ser Ile 660 665 670 Asp Gln Ala Pro Met Glu Cys Ile Gln Leu Met Gln Val Trp Ala Glu 675 680 685 Pro Glu Leu Arg Pro Ser Met Asp Thr Phe Asp Leu Phe Lys Ser Ile 690 695 700 Asn Lys Gly Arg Lys Asn Ile Ile Asp Ser Met Leu Arg Met Leu Glu 705 710 715 720 Gln Tyr Ser Ser Asn Leu Glu Asp Leu Ile Arg Glu Arg Thr Glu Glu 725 730 735 Leu Glu Glu Glu Lys Gln Lys Thr Asp Arg Leu Leu Thr Gln Met Leu 740 745 750 Pro Pro Ser Val Ala Glu Ala Leu Lys Met Gly Thr Val Glu Pro Glu 755 760 765 Tyr Phe Glu Glu Val Thr Leu Tyr Phe Ser Asp Ile Val Gly Phe Thr 770 775 780 Thr Ile Ser Ala Met Ser Glu Pro Ile Glu Val Val Asp Leu Leu Asn 785 790 795 800 Asp Leu Tyr Thr Leu Phe Asp Ala Ile Ile Gly Ala His Asp Val Tyr 805 810 815 Lys Val Glu Thr Ile Gly Asp Ala Tyr Met Val Ala Ser Gly Leu Pro 820 825 830 Gln Arg Asn Gly Arg His Ala Ala Glu Ile Ala Asn Met Ala Leu Asp 835 840 845 Ile Leu Ser Ala Val Gly Ser Phe Arg Phe Arg Met Arg His Met Pro 850 855 860 Glu Val Pro Val Arg Ile Arg Ile Gly Leu His Ser Gly Pro Cys Val 865 870 875 880 Ala Gly Val Val Gly Leu Thr Met Pro Arg Tyr Cys Leu Phe Gly Asp 885 890 895 Thr Val Asn Thr Ala Ser Met Glu Ser Thr Gly Leu Pro Tyr Arg Ile 900 905 910 His Val Asn Ser Thr Val Ile Leu Ala Leu Gly Phe Glu Arg Gly Arg 915 920 925 Thr Glu Leu Lys Gly Lys Gly Glu Asp Thr Tyr Trp Leu Val Gly Arg 930 935 940 Gly Phe Asn Lys Pro Ile Pro Lys Pro Pro Asp Leu Gln Pro Gly Ala 945 950 955 960 Ser Asn His Gly Ile Ser Leu His Gly Ile Ser Leu Glu Ile Pro Pro 965 970 975 Asp Arg Arg Lys Leu Glu Lys Ala Arg Pro Gly Gln Phe Ser Gly Lys 980 985 990

Claims (56)

  1. 적어도 제 1 포유동물 구아닐레이트 사이클라제 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 제 1 핵산 분절에 작동적으로 결합된, 편재하는 절두된 키메릭 CMV-치킨 β-액틴 프로모터(ubiquitous truncated chimeric CMV-chicken β-actin promotor)를 포함하는 적어도 제 1 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 아데노-관련된 바이러스(rAAV) 벡터.
  2. 제 1 항에 있어서,
    적어도 제 1 핵산 분절이 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11에 나타낸 서열의 80 개 이상의 연속적인 아미노산의 적어도 제 1 서열 영역과 약 90% 이상 일치하는 적어도 제 1 연속적인 아미노산 서열 영역을 포함하는 적어도 제 1 포유동물 구아닐레이트 사이클라제 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는, rAAV 벡터.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    적어도 제 1 핵산 분절이 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11에 나타낸 서열의 100 개 이상의 연속적인 아미노산의 적어도 제 1 서열 영역과 약 92% 이상 일치하는 적어도 제 1 연속적인 아미노산 서열 영역을 포함하는 적어도 제 1 포유동물 구아닐레이트 사이클라제 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는, rAAV 벡터.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 제 1 포유동물 구아닐레이트 사이클라제 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11에 나타낸 서열의 120 개 이상의 연속적인 아미노산의 적어도 제 1 서열 영역과 약 95% 이상 일치하는 적어도 제 1 연속적인 아미노산 서열 영역을 포함하는, rAAV 벡터.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 제 1 포유동물 구아닐레이트 사이클라제 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11에 나타낸 서열의 140 개 이상의 연속적인 아미노산의 적어도 제 1 서열 영역과 약 98% 이상 일치하는 적어도 제 1 연속적인 아미노산 서열 영역을 포함하는, rAAV 벡터.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 제 1 포유동물 구아닐레이트 사이클라제 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11 중 어느 하나의 아미노산 서열과 약 98% 이상 일치하는 아미노산 서열을 적어도 포함하는, rAAV 벡터.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 제 1 포유동물 구아닐레이트 사이클라제 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 제 1 포유동물 구아닐레이트 사이클라제 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11의 서열과 98% 이상 일치하는 아미노산 서열로 필수적으로 이루어지는, rAAV 벡터.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 제 1 포유동물 구아닐레이트 사이클라제 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 생물학적으로 활성이고 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11로부터의 50 개 이상의 아미노산 연속 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 제 1 포유동물 구아닐레이트 사이클라제 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 생물학적으로 활성이고 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11로부터의 75 개 이상의 아미노산 연속 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 제 1 포유동물 구아닐레이트 사이클라제 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 생물학적으로 활성이고 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11로부터의 100 개 이상의 아미노산 연속 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 제 1 포유동물 구아닐레이트 사이클라제 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 생물학적으로 활성이고 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11로부터의 125 개 이상의 아미노산 연속 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    포유동물 구아닐레이트 사이클라제 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 생물학적으로 활성이고 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11 중 하나 이상으로부터의 1차 아미노산 서열과 95% 이상 일치하는 1차 아미노산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    포유동물 구아닐레이트 사이클라제 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 생물학적으로 활성이고 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11 중 하나 이상으로부터의 1차 아미노산 서열과 99% 이상 일치하는 1차 아미노산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합 아데노-관련된 바이러스 혈청형 1(rAAV1) 벡터, 재조합 아데노-관련된 바이러스 혈청형 2(rAAV2) 벡터, 재조합 아데노-관련된 바이러스 혈청형 3(rAAV3) 벡터, 재조합 아데노-관련된 바이러스 혈청형 4(rAAV4) 벡터, 재조합 아데노-관련된 바이러스 혈청형 5(rAAV5) 벡터, 재조합 아데노-관련된 바이러스 혈청형 6(rAAV6) 벡터, 재조합 아데노-관련된 바이러스 혈청형 7(rAAV7) 벡터, 재조합 아데노-관련된 바이러스 혈청형 8(rAAV8) 벡터, 또는 재조합 아데노-관련된 바이러스 혈청형 9(rAAV9) 벡터인 rAAV 벡터.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    자기-상보성 rAAV(scAAV)인 rAAV 벡터.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    절두된 키메릭 CMV-치킨 β-액틴 프로모터가 서열번호 13으로부터의 70 개 이상의 연속적인 염기쌍 서열로 필수적으로 이루어지는 핵산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    절두된 키메릭 CMV-치킨 β-액틴 프로모터가 서열번호 13으로부터의 90 개 이상의 연속적인 염기쌍 서열로 필수적으로 이루어지는 핵산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    절두된 키메릭 CMV-치킨 β-액틴 프로모터가 서열번호 13으로부터의 120 개 이상의 연속적인 염기쌍 서열로 필수적으로 이루어지는 핵산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    절두된 키메릭 CMV-치킨 β-액틴 프로모터가 서열번호 13의 핵산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 제 1 핵산 분절에 작동적으로 결합된 적어도 제 1 인헨서를 추가로 포함하는 rAAV 벡터.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 제 1 핵산 분절에 작동적으로 결합된 적어도 제 1 포유동물 인트론 서열을 추가로 포함하는 rAAV 벡터.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 제 1 포유동물 구아닐레이트 사이클라제 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 인간, 비-인간 영장류, 쥐, 고양이, 개, 돼지, 양, 소, 말, 에핀(epine), 염소 또는 이리 기원의 것인, rAAV 벡터.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 제 1 핵산 분절이 인간 기원의 생물학적으로 활성인 인간 구아닐레이트 사이클라제 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는, rAAV 벡터.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    절두된 키메릭 CMV-치킨 β-액틴 프로모터가 서열번호 12의 서열로 필수적으로 이루어진 핵산 서열을 포함하거나, 또는 적어도 제 1 핵산 분절이 서열번호 1로부터의 100 개 이상의 연속적인 아미노산 서열을 포함하는 포유동물 구아닐레이트 사이클라제 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는, rAAV 벡터.
  26. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    감염성 아데노-관련된 바이러스 입자, 비리온, 또는 다수의 감염성 AAV 입자 내에 포함된 rAAV 벡터.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 rAAV 벡터를 포함하는 비리온 또는 감염성 바이러스 입자.
  28. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 rAAV 벡터로부터 제조된 다수의 감염성 바이러스 입자.
  29. (a) 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 rAAV 벡터;
    (b) 제 27 항에 따른 비리온 또는 감염성 바이러스 입자; 또는
    (c) 제 28 항에 따른 다수의 감염성 바이러스 입자
    를 포함하는 단리된 포유동물 숙주 세포.
  30. 제 29 항에 있어서,
    인간 숙주 세포인 단리된 포유동물 숙주 세포.
  31. (1) (a) 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 rAAV 벡터;
    (b) 제 27 항에 따른 비리온 또는 감염성 바이러스 입자;
    (c) 제 28 항에 따른 다수의 감염성 바이러스 입자; 또는
    (d) 상기 벡터, 비리온, 또는 감염성 입자를 포함하는 단리된 포유동물 숙주 세포; 및
    (2) 약학적으로 허용 가능한 완충제, 담체, 비히클 또는 희석제
    를 포함하는 조성물.
  32. 제 31 항에 있어서,
    지질, 리포솜, 지질 복합체, 에토솜, 니오솜, 나노입자, 미세입자, 지질구, 나노캡슐, 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함하는 조성물.
  33. 제 31 항 또는 제 32 항에 있어서,
    인간 눈에 투여하기 위해 제형화된 조성물.
  34. 제 31 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료 또는 예방에 사용하기 위한 조성물.
  35. 제 31 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 망막 이영양증, 질병 또는 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 조성물.
  36. 제 31 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
    레베르 선천성 흑내장-1(LCA1)의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 조성물.
  37. (1) (a) 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 rAAV 벡터;
    (b) 제 27 항에 따른 비리온 또는 감염성 바이러스 입자;
    (c) 제 28 항에 따른 다수의 감염성 바이러스 입자;
    (d) 제 29 항 또는 제 30 항에 따른 단리된 포유동물 숙주 세포; 및
    (e) 제 31 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 따른 조성물
    로 이루어진 군에서 선택된 성분; 및
    (2) 인간의 망막 이영양증, 질병, 질환 또는 이상 상태의 하나 이상의 증상의 진단, 예방, 치료 또는 개선에 있어서 상기 성분을 사용하기 위한 설명서
    를 포함하는 키트.
  38. 제 37 항에 있어서,
    망막 이영양증이 레베르 선천성 흑내장-1(LCA-1)로서 진단된 키트.
  39. 포유동물 눈의 질병, 질환, 기능장애, 또는 이상 상태, 또는 그의 하나 이상의 증상을 진단, 예방, 치료 또는 개선하기 위한 약제의 제조에 있어서 제 31 항에 따른 조성물의 용도.
  40. 제 39 항에 있어서,
    인간의 레베르 선천성 흑내장-1(LCA-1)의 하나 이상의 증상을 치료 또는 개선하기 위한 약제의 제조에 있어서의 용도.
  41. 포유동물에게 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 rAAV 벡터를 포함하는 조성물을, 상기 포유동물의 질병, 기능장애, 질환, 결핍, 또는 이상 상태, 또는 그의 하나 이상의 증상을 예방, 치료 또는 개선하기에 충분한 양 및 시간으로 투여함을 포함하는, 상기 포유동물의 상기 질병, 기능장애, 질환, 결핍, 또는 이상 상태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 예방, 치료 또는 개선 방법.
  42. 제 41 항에 있어서,
    포유동물이 적어도 제 1 망막 질환, 질병 또는 이영양증에 걸렸거나, 상기 병에 걸린 것으로 의심이 되거나, 상기 병이 발병할 위험이 있거나, 또는 상기 병으로 진단된, 방법.
  43. 제 41 항 또는 제 42 항에 있어서,
    포유동물이 생물학적으로 활성인 망막 구아닐레이트 사이클라제 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 결핍이 발병할 위험이 있거나 또는 상기 결핍으로 진단된, 방법.
  44. 제 41 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서,
    포유동물이 레베르 선천성 흑내장-1(LCA-1)과 같은 선천성 망막 이영양증이 발병할 위험이 있거나 또는 상기 병으로 진단된 인간 신생아, 갓난아기, 유아, 또는 아동인, 방법.
  45. 치료 유효량의 생물학적으로 활성인 포유동물 구아닐레이트 사이클라제 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질이 필요한 포유동물의 적합한 세포 내로 유효량의 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 rAAV 벡터를, 상기 rAAV 벡터가 도입된 상기 포유동물의 세포의 적어도 제 1 집단 또는 상기 포유동물의 적어도 제 1 조직에서 상기 벡터로부터 생물학적으로 활성인 구아닐레이트 사이클라제 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 생성시키기에 충분한 시간 동안 도입시킴을 포함하는, 상기 포유동물에게 상기 치료 유효량의 상기 생물학적으로 활성인 포유동물 구아닐레이트 사이클라제 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 제공하는 방법.
  46. 제 45 항에 있어서,
    포유동물이, 정상 포유동물의 생물학적으로 활성인 retGC1 단백질 수준에 비해, 상기 포유동물의 적어도 제 1 조직 중에 생물학적으로 활성인 retGC1 단백질의 결함, 결핍 또는 실질적인 부재를 갖는, 방법.
  47. 제 45 항 또는 제 46 항에 있어서,
    포유동물로부터의 다수의 세포에 rAAV 벡터를 생체 외 또는 시험관 내로 제공하고, 다수의 상기 제공받은 세포를 상기 포유동물의 신체 내 또는 신체 주위의 적어도 제 1 조직 부위 내로 도입시킴을 추가로 포함하는, 방법.
  48. 제 45 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서,
    다수의 수득된 세포를 포유동물의 한쪽 또는 양쪽 눈 내의 적어도 제 1 부위 내로 도입시키는 방법.
  49. 제 45 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서,
    다수의 수득된 세포를 망막 또는 주변 조직 내로의 직접 주사에 의해 포유동물의 한쪽 또는 양쪽 눈 내의 적어도 제 1 부위 내로 도입시키는 방법.
  50. 제 45 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서,
    rAAV 벡터의 도입이 포유동물의 눈에서 추상체 광수용체를 보존하고, 추상체-매개된 기능 및 시각 반응을 복원하는, 방법.
  51. 제 45 항 내지 제 50 항 중 어느 한 항에 있어서,
    포유동물의 눈 내로의 rAAV 벡터의 단일 도입이 3 개월 이상의 기간 동안 포유동물에서 추상체 광수용체를 보존하고, 추상체-매개된 기능 및 시각 반응을 복원하는 방법.
  52. 제 45 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서,
    포유동물의 눈 내로의 rAAV 벡터의 단일 도입이 6개월 이상의 기간 동안 포유동물에서 추상체 광수용체를 보존하고, 추상체-매개된 기능 및 시각 반응을 복원하는, 방법.
  53. 제 45 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서,
    포유동물의 눈 내로의 rAAV 벡터의 단일 도입이 10개월 이상의 기간 동안 포유동물에서 추상체 광수용체를 보존하고, 추상체-매개된 기능 및 시각 반응을 복원하는, 방법.
  54. LCA1에 걸렸거나, LCA1에 걸린 것으로 의심이 되거나, 또는 LCA1로 진단되거나, 또는 LCA1이 발병할 위험이 있는 포유동물의 망막 세포의 적어도 제 1 집단 내로, 상기 포유동물의 하나 이상의 망막 세포 중에 생물학적으로 활성인 retGC1 단백질의 수준을 증가시키기에 유효한 양 및 시간으로 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 rAAV 벡터를 도입시킴을 포함하는, 상기 포유동물의 하나 이상의 망막 세포 중에 생물학적으로 활성인 retGC1 단백질의 수준을 증가시키는 방법.
  55. 포유동물의 망막 또는 망막 하 공간에 상기 포유동물의 망막 이영양증의 하나 이상의 증상을 치료하거나 개선하기에 충분한 양 및 시간으로 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 rAAV 벡터를 직접 투여함을 포함하는, 상기 포유동물의 망막 이영양증의 하나 이상의 증상의 치료 또는 개선 방법.
  56. 제 55 항에 있어서,
    포유동물이 레베르 선천성 흑내장-1(LCA-1)로 진단된 방법.
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