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KR20190056387A - 점막부착성 미생물 - Google Patents

점막부착성 미생물 Download PDF

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KR20190056387A
KR20190056387A KR1020197009765A KR20197009765A KR20190056387A KR 20190056387 A KR20190056387 A KR 20190056387A KR 1020197009765 A KR1020197009765 A KR 1020197009765A KR 20197009765 A KR20197009765 A KR 20197009765A KR 20190056387 A KR20190056387 A KR 20190056387A
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bacterium
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cmba
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로타 스테이들러
클라스 반덴부르크
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인트랙슨 액토바이오틱스 엔.브이.
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Abstract

본 발명은 향상된 뮤신-결합 및/또는 세포-부착 특성을 갖는 유전적으로 변형된 미생물 (예를 들어, 박테리아 또는 효모)을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 Caco-2 세포로의 증가된 시험관내 결합 및 뮤신으로의 증가된 시험관내 결합을 나타내는 박테리아를 제공한다. 이러한 미생물 (예를 들어, 박테리아)은, 예를 들어, 생활성 폴리펩티드의 포유류 대상체의 위장관으로의 전달에 사용될 수 있다. 전술한 방식으로의 미생물 변형은 미생물 (예를 들어, 박테리움)의 위장관 체류 및 통과 시간의 조절을 가능하게 한다. 예시적인 미생물 (예를 들어, 락트산 박테리아, 예컨대, 락토코커스 락티스)은 세포-부착 폴리펩티드, 예컨대, CmbA 및 뮤신-결합 폴리펩티드, 예컨대, 트레포일 인자 (TFF), 예를 들어, 인간 TFF3를 함유하는 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산을 함유한다. 본 발명은 기재된 미생물 (예를 들어, 박테리아)을 제조 및 사용하기 위한 방법을 추가로 제공한다.

Description

점막부착성 미생물
본 출원은 2016년 9월 13일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/394,024호의 출원일의 이익을 주장한다.
서열 목록에 관한 참조
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 본 명세서에서 그의 전체가 참고로 포함된다. 2017년 9월 11일에 만들어진 상기 ASCII 사본의 명칭은 205350-0031-00-WO_SL.txt이며, 이의 크기는 122,643 바이트이다.
배경 기술
유전적으로 변형된 미생물 (예를 들어, 박테리아)을 사용하여 점막 조직으로 치료 분자를 전달하였다. 참조 [Steidler, L., et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7): 785-789; Robert S. and Steidler L., Microb. Cell Fact. 2014, 13 Suppl. 1: S11; Braat et al., Clin. Gastroenterol. Hepatol. 2006, 4(6):754-759; and Steidler et al., Science 2000, 289(5483):1352-1355].
개선된 약동학 및 약역학적 특성을 지닌 미생물 (예를 들어, 박테리아) 균주에 대한 당업계의 필요성, 및 이러한 유전적으로 변형된 박테리아로 치료가능한 다양한 질환의 치료를 위한 효능있고 표적화되며 조절된 치료 방법에 대한 당업계의 필요성이 존재한다. 본 발명은 이러한 요구를 해결한다.
본 발명은 향상된 세포-부착 (cell-adhesion) 및/또는 뮤신-결합 (mucin-binding) 특성을 갖는 미생물 (예를 들어, 박테리아 또는 효모)을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 Caco-2 세포로의 증가된 시험관내 결합 및 뮤신으로의 증가된 시험관내 결합을 나타내는 박테리아를 제공한다. 이러한 미생물 (예를 들어, 박테리아)은, 예를 들어, 생활성 폴리펩티드 (bioactive polypeptide)의 포유류 대상체의 위장관 (gastrointestinal tract)으로의 전달에 사용될 수 있으며, 전술한 유전적 변형은 미생물 (예를 들어, 박테리움)의 위장 체류 (retention) 및 통과 시간 (transit time)의 조절을 가능하게 한다. 전술한 기술은 미생물 (예를 들어, 박테리움)에 의해 발현되는 생활성 폴리펩티드의 약동학적 및 약역학적 특성의 조절을 가능하게 한다. 예를 들어, 트레포일 인자 (trefoil factor: TFF) 및 세포-부착 폴리펩티드, 예컨대, 락트산 박테리움 (lactic acid bacterium: LAB), 예컨대, 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis)의 세포 벽 내의 CmbA (참조: 예를 들어, Jensen et al., Microbiology 2014, 160(4):671-681) (예를 들어, TFF3-CmbA)를 함유하는 융합 단백질의 발현, 분비 및 고정 (anchoring)은 박테리움의 장 상피 세포로의 부착 (adherence)을 가능하게 하며, 추가로 박테리움의 뮤신으로의 결합을 가능하게 한다.
조성물
일부 양태에서, 본 발명은 세포-부착 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 미생물 (예를 들어, 박테리아 또는 효모)를 제공한다. 일부 예에서, 본 발명은 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 미생물 (예를 들어, 박테리움 또는 효모)을 제공하며, 여기서, 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산은 세포-부착 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 함유한다. 일부 예에서, 세포-부착 폴리펩티드는, 세포 및 점액-결합 단백질 A (mucus-binding protein: CmbA)(참조: 예를 들어, Jensen et al., Microbiology 2014, 160(4):671-681), 점액 결합 단백질 또는 mub 도메인 단백질 (Mub)(참조: 예를 들어, Boekhorst et al., Microbiology 2006, 152(1):273-280), 점액 부착 촉진 단백질 (mucus adhesion promoting protein: MapA) (참조: 예를 들어, Miyoshi et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 2006, 70(7):1622-8), 락토코컬 뮤신 결합 단백질 (lactococcal mucin binding protein: MbpL) (참조: 예를 들어, Lukic et al., Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78(22):7993-8000)로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 세포-벽 고정 펩티드, 예컨대, 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 단백질 A 고정 단편 (anchor fragment) (SpaX)이 첨가될 수 있다 (참조: 예를 들어, Steidler et al., Appl. Environ. Microbiol. 1998, 64(1):342-5). 일부 예에서, 본 발명은 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 미생물 (예를 들어, 박테리움 또는 효모)을 제공하며, 여기서, 융합 단백질은 CmbA 폴리펩티드를 포함한다. 일부 예에서, CmbA 폴리펩티드는 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri)로부터의 CmbA 이다. 참조 [예컨대, ATCC PTA6474, 예를 들어, 상기 Jensen et al. 에 기재됨]. 상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, 세포-부착 폴리펩티드는 서열번호 1과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산을 갖는 CmbA 폴리펩티드이다. 상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 다른 예에서, 세포-부착 폴리펩티드는 서열번호 2와 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 외인성 핵산 서열에 의해 암호화된 CmbA 폴리펩티드이다.
상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 다른 예에서, 융합 단백질은 뮤신-결합 폴리펩티드, 예컨대, 트레포일 인자 (TFF) 폴리펩티드 (예를 들어, TFF1, TFF2 또는 TFF3) 또는 MucBP 폴리펩티드 (참조: 예를 들어, Lukic et al, Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78(22):7993-8000)를 포함한다. 따라서, 일부 예에서, 본 발명은 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 미생물 (예를 들어, 박테리움 또는 효모)을 제공하며, 여기서, 융합 단백질은 세포-부착 폴리펩티드 (예를 들어, CmbA 폴리펩티드) 및 뮤신-결합 폴리펩티드 (예를 들어, TFF 폴리펩티드)를 함유한다. 일부 예에서, TFF 폴리펩티드는 인간 TFF 폴리펩티드 (예를 들어, hTFF1, hTFF2 또는 hTFF3)이다. 상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, 뮤신-결합 폴리펩티드는 서열번호 3과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 인간 TFF3 폴리펩티드이다. 상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 다른 예에서, 뮤신-결합 폴리펩티드는 서열번호 4와 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 외인성 핵산 서열에 의해 암호화되는 인간 TFF3 폴리펩티드이다. 일부 예에서, TFF 폴리펩티드는 포유류 TFF 폴리펩티드, 예컨대, 소, 돼지, 양, 개, 고양이 또는 말 TFF이다. 추가의 예에서, TFF는 양서류 TFF이다. 예시적인 TFF 폴리펩티드는, 예를 들어, 문헌 [Conlon et al., Peptides 2015, 72:44-49]에 기재되며, 이들 문헌의 각각이 그 전체가 참고 문헌으로 본원에 포함된다. 다른 예에서, TFF 폴리펩티드는 트레포일-유사 도메인이다. 이러한 실시형태에 따른 예시적인 폴리펩티드는 문헌 [Fujita et al., Mol. Reprod. Dev. 2006, 75(7):1217-1228]에 기재되며, 이의 개시 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, 본 발명은, (1) TFF 폴리펩티드 (예를 들어, 인간 TFF1, 인간 TFF2 또는 인간 TFF3) 및 MucBP 폴리펩티드 중에서 선택된 뮤신-결합 폴리펩티드; 및 (2) CmbA 폴리펩티드, Mub 폴리펩티드, MapA 폴리펩티드, MbpL 폴리펩티드 및 SpaX 폴리펩티드 중에서 선택된 세포-부착 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 박테리움 (예를 들어, 락트산 박테리움, 예컨대, 락토코커스 락티스)를 제공한다. 이러한 실시형태에 따른 일부 예에서, 융합 단백질은 CmbA 폴리펩티드 (예를 들어, 락토바실러스 루테리 CmbA) 및 TFF 폴리펩티드 (예를 들어, 인간 TFF1, 인간 TFF2 또는 인간 TFF3)를 함유한다.
상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산은 미생물의 염색체, 예를 들어, 박테리움의 염색체 내로 통합된다. 일부 예에서, 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산은 미생물 (예를 들어, 박테리움) 내에서 구성적으로 발현된다 (constitutively expressed). 다른 예에서, 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산은 플라스미드 상에 위치한다.
상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, 융합 단백질은 미생물 (예를 들어, 박테리움)에 의해 발현된다. 다른 예에서, 융합 단백질은 미생물 (예를 들어, 박테리움)의 세포 벽에 고정된다. 예를 들어, 융합 단백질은 미생물 (예를 들어, 박테리움)의 표면 (즉, 외부 막)에 제시된다.
상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산은 분비 신호 펩티드 (secretion signal peptide)를 암호화하는 분비 선도 서열 (leader sequence)을 추가로 포함한다. 일부 예에서, 분비 선도 서열은 미규명된 분비된 45-kDa 단백질 (Usp45)의 분비 선도를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 이러한 분비 선도 서열 또는 펩티드는 본원에 SSusp45로 지칭된다. 일부 예에서, SSusp45는 서열번호 5와 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 다른 예에서, SSusp45는 서열번호 6 또는 서열번호 7과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 핵산 서열에 의해 암호화된다. 그람-양성 박테리움에서 유래된 임의의 분비 선도 서열, 예를 들어, 락토코커스 락티스에서 유래된 임의의 분비 선도 서열은 상기 실시형태의 맥락에서 유용하다. 상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 추가의 예에서, 분비 신호 펩티드 (예를 들어, SSusp45)는 뮤신-결합 폴리펩티드, 예컨대, TFF 폴리펩티드에 결합된다. 이러한 실시형태에 따른 일부 예에서, SSusp45는 인간 TFF 폴리펩티드에 결합된다. 예를 들어, 융합 단백질은 서열번호 8과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 융합 단백질은 서열번호 9와 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 함유하는 외인성 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다.
다른 예에서, 미생물 (예를 들어, 박테리움)은 TFF 폴리펩티드 및 CmbA 폴리펩티드를 함유하는 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산을 포함하며, 여기서, 분비 신호 펩티드는 TFF 폴리펩티드 (예를 들어, SSusp45)에 결합된다. 예를 들어, 융합 단백질은 서열번호 10과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 (또는 이로 이루어질) 수 있다. 다른 예에서, 융합 단백질은 서열번호 11과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 함유하는 (또는 이로 이루어진) 외인성 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다.
일부 예에서, 분비 신호 펩티드는 링커 펩티드를 포함한다. 일부 예에서, 분비 신호 펩티드는, 예를 들어, 융합 단백질이 미생물 (예를 들어, 박테리움)의 세포 벽에 고정되는 경우, 융합 단백질로부터 절단된다.
일부 예에서, 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산은 미생물 (예를 들어, 박테리움)에 대해 내인성인 프로모터에 의해 전사적으로 조절 (예를 들어, 이의 통제하에 놓임)된다. 다른 예에서, 융합 단백질의 발현은 외인성 프로모터에 의해 제어된다. 일부 예에서, 프로모터는 thyA 프로모터 (PthyA), hlla 프로모터 (PhllA) 및 gapB 프로모터 중에서 선택된다. 일부 예에서, 융합 단백질을 암호화하는 핵산은 PthyA 프로모터에 의해 전사적으로 조절된다. 다른 예에서, 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산은 PhllA 프로모터에 의해 전사적으로 조절된다. 다른 프로모터는 이러한 선행 유전자 (preceding gene) holA, soda, enoA, tufa, fbaA, acpA, ps431, malG, ptsH, dpsA, pgk, ahpC, pdhD, pts_II, pfk, trePP, ptnD, pgiA, usp45를 포함한다. 다른 적절한 프로모터는, 예를 들어, 미국 특허 출원 공보 2014/0105863에 기재되며, 이의 개시 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 융합 단백질 (예를 들어, 미생물, 예컨대, 박테리움의 세포-벽에 고정된)을 포함하는 미생물 (예를 들어, 박테리움)을 추가로 제공하며, 여기서, 융합 단백질은 TFF 폴리펩티드 및 CmbA 폴리펩티드를 포함한다. 일부 예에서, 미생물 (예를 들어, 박테리움)은 분비 선도 서열, TFF 폴리펩티드를 암호화하는 서열 및 CmbA 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 외인성 핵산을 포함한다. 일부 예에서, 분비 선도 서열은 분비 신호 펩티드를 암호화하며, 이는, 예를 들어, 융합 단백질이 미생물 (예를 들어, 박테리움)의 세포질 막 (예를 들어, 세포 벽에 고정된)을 통과하는 경우, 융합 단백질로부터 절단된다.
상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, 미생물은 박테리움이다. 상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 다른 예에서, 이러한 박테리움은 그람-양성 박테리움, 예를 들어, 비-병원성 박테리움이다. 상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 다른 예에서, 박테리움은 락트산 박테리움 (LAB)이다. 예시적인 락트산 박테리아 (lactic acid bacteria)가 본원에 기재되며, 이들 각각은 이러한 실시형태의 맥락에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, LAB은 락토코커스 종 (sp.) 박테리움, 락토바실러스 종 박테리움, 비피도박테리움 (Bifidobacterium) 종 박테리움, 스트렙토코커스 (Streptococcus) 종 박테리움 및 엔테로코커스 (Enterococcus) 종 박테리움으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 일부 예에서, LAB는 락토코커스 락티스이다. 다른 예에서, LAB는 락토코커스 락티스 아종 크레모리스 (Lactococcus lactis subsp. cremoris), 락토코커스 락티스 아종 호르드니아에 (Lactococcus lactis subsp. hordniae) 및 락토코커스 락티스 아종 락티스 (Lactococcus lactis subs. lactis) 중에서 선택된다. 일부 예에서, 락토코커스 락티스는 락토코커스 락티스 아종 크레모리스, 예컨대, 락토코커스 락티스 균주 (strain) MG1363 이다.
상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, 미생물 (예를 들어, 박테리움)은 TFF 폴리펩티드 및 세포-부착 폴리펩티드 (예를 들어, CmbA)를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 외인성 핵산을 포함한다. 이러한 실시형태에 따른 일부 예에서, TFF 폴리펩티드는 TFF1, TFF2 및 TFF3 중에서 선택된다. 이러한 실시형태에 따른 다른 예에서, TFF 폴리펩티드는 인간 TFF, 마우스 TFF, 돼지 TFF, 개 TFF, 고양이 TFF, 소 TFF 및 양 TFF 중에서 선택된다. 일부 예에서, TFF 폴리펩티드는 인간 TFF 이다. 다른 예에서, TFF 폴리펩티드는 인간 TFF1, 인간 TFF2 및 인간 TFF3 중에서 선택된다. 또 다른 예에서, TFF 폴리펩티드는 인간 TFF3 이다. 일부 예에서, TFF 폴리펩티드는 서열번호 3과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 다른 예에서, TFF 폴리펩티드는 TFF 변이 폴리펩티드, 예를 들어, 상응하는 야생형 TFF 폴리펩티드와 비교한 경우 향상된 뮤신-결합 능력을 갖는 TFF 변이 폴리펩티드이다. 다른 예에서, TFF 폴리펩티드는 양서류 또는 어류 TFF 폴리펩티드이다.
상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, 미생물 (예를 들어, 박테리움)은 적어도 하나의 치료 폴리펩티드를 암호화하는 외인성 핵산을 추가로 함유한다. 일부 예에서, 치료 폴리펩티드는 시토카인, 예컨대, 인터류킨 (IL)이다. 시토카인의 선택은 어떠한 숙주 반응이 활성화 또는 억제될 것인지에 기반하여 이루어진다. 일부 예에서, 시토카인은 IL-2, IL-10 또는 IL-22이다. 다른 예에서, 치료 폴리펩티드는 항원이다. 다른 예에서, 치료 폴리펩티드는 항원 및 인터류킨, 예컨대, IL-2, IL-10 또는 IL-22이다. 이러한 실시형태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, 항원은 자가항원, 예를 들어, T1D-특이적 항원이다. 예시적인 T1D-특이적 항원은 프로인슐린 (proinsulin: PINS), 글루탐산 데카르복실라아제 (GAD65), 인슐린종-관련 단백질 2 (insulinoma-associated protein 2: IA-2), 섬-특이적 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 소단위-관련 단백질 (islet-specific glucose-6-phosphatase catalytic subunit-related protein: IGRP), 아연 수송체 8 (zinc transporter 8: ZnT8), 크로모그라닌 A (chromogranin A), (프레프로) 섬 아밀로이드 폴리펩티드 ((prepro) islet amyloid polypeptide: ppIAPP), 페리페린 (peripherin), 시트룰린화된 글루코오스-조절된 단백질 (citrullinated glucose-regulated protein: GRP) 및 이의 조합을 포함한다. 상기 TID-특이적 항원에 대한 예시적인 아미노산 서열 및 핵산 서열이, 예를 들어, 국제 특허 출원 공보 WO2017/122180에 기재되며, 이의 개시 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 다른 예에서, 항원은 알레르겐, 예컨대, 나무 화분 (tree pollen) 알레르겐, 잡초 화분 (weed pollen) 알레르겐, 풀 화분 (grass pollen) 알레르겐, 식품 알레르겐, 먼지-진드기 알레르겐, 곰팡이 알레르겐 (mold allergen), 동물 비듬 알레르겐 또는 이의 조합이다. 일부 예에서, 알레르겐은 잡초 화분 알레르겐, 예를 들어, 돼지풀 (ragweed) 화분 알레르겐이다. 다른 예에서, 알레르겐은 나무 화분 알레르겐, 예컨대, 자작나무 (birch) 화분 알레르겐 또는 삼나무 (Japanese cedar) 화분 알레르겐이다. 또 다른 예에서, 알레르겐은 식품 알레르겐, 예컨대, 땅콩 알레르겐, 우유 알레르겐, 달걀 알레르겐, 글루텐 알레르겐 (글리아딘 에피토프) 또는 이의 조합이다.
추가의 예에서, 치료 폴리펩티드는 항체 또는 이의 단편이다. 예를 들어, 항체는 단일-도메인 항체 (예를 들어, 낙타과 또는 상어 항체) 또는 나노바디 (nanobody)이다. 예시적인 항체는 시토카인 중화 항체 (cytokine neutralizing antibody), 예컨대, IL-4에 대한 항체, IL-5에 대한 항체, IL-7에 대한 항체, IL-13에 대한 항체, IL-15에 대한 항체뿐만 아니라 면역글로불린 E (IgE)에 대한 항 TNFα 항체, 및 이의 단편을 포함한다. 일부 예에서, 치료 폴리펩티드는 융합 단백질이다. 예를 들어, 치료 폴리펩티드는 가용성 수용체, 예컨대, TNF 수용체 (예를 들어, 가용성 TNF 수용체 2) 및 항체 또는 항체 단편, 예컨대, 항체의 Fc 영역을 포함한다. 이러한 실시형태에 따른 일부 예에서, 치료 폴리펩티드는 인간 면역글로불린의 Fc 영역 (예를 들어, 인간 IgG1 Fc)을 함유한다. 일부 예에서, 치료 폴리펩티드는 인간 IgG1 Fc에 융합된 가용성 TNF 수용체 2를 포함한다. 일부 예에서, 치료 폴리펩티드는 에타네르셉트 (etanercept)이다.
또 다른 예에서, 치료 폴리펩티드는 효소 또는 이의 단편 (예를 들어, 기능적 단편), 예를 들어, 페닐알라닌 암모니아 리아제 (phenylalanine ammonia lyase: PAL), 아미노산 데카르복실라아제 (amino acid decarboxylase), 또는 이의 조합이다. 하나의 예에서, 치료 폴리펩티드는 PAL 또는 이의 기능적 단편이다.
추가의 예에서, 치료 폴리펩티드는 글루카곤-유사 펩티드 1 (GLP-1), 글루카곤-유사 펩티드 2 (GLP-2), 글루카곤, 엑센딘-4 (exendin-4) 또는 이의 조합이다. 다른 예에서, 치료 폴리펩티드는 성장 인자, 예컨대, 표피 성장 인자 (EGF), 예를 들어, 인간 EGF 또는 포사인 (porcine) EGF이다. 또 다른 예에서, 치료 폴리펩티드는 TFF, 예컨대, TFF1, TFF2, TFF3 또는 이의 조합이다.
치료 폴리펩티드는 상기 열거된 치료 폴리펩티드 중 임의의 것의 조합일 수 있다.
상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, 적어도 하나의 치료 폴리펩티드를 암호화하는 외인성 핵산은 gapB 프로모터 (PgapB), thyA 프로모터 (PthyA) 및 hlla 프로모터 (PhllA) 중에서 선택된 프로모터에 의해 전사적으로 조절된다. 일부 예에서, 적어도 하나의 치료 폴리펩티드를 암호화하는 외인성 핵산은 gapB 프로모터에 의해 전사적으로 조절 (예를 들어, 이의 통제하에 놓임)된다. 다른 프로모터는 이러한 선행 유전자 holA, soda, enoA, tufa, fbaA, acpA, ps431, malG, ptsH, dpsA, pgk, ahpC, pdhD, pts_II, pfk, trePP, ptnD, pgiA, usp45를 포함한다. 다른 적절한 프로모터는, 예를 들어, 미국 특허 출원 공보 2014/0105863에 기재되며, 이의 개시 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, 미생물 (예를 들어, LAB)은 돌연변이 및 삽입의 조합을 추가로 포함하여 트레할로오스 (trehalose) 축적을 촉진시키고, 이는 담즙산염 및 건조에 대한 LAB 생존가능성을 향상시킨다. 예를 들어, 이는 다음의 것 일 수 있다:
(i) 트레할로오스의 흡수를 위한, 염색체적으로-통합된 트레할로오스 수송체, 예컨대, PhllA>>수송체 1>> 유전자간 영역 (intergenic region)>>수송체 2, 예컨대, llmg_0453 및/또는 llmg_0454;
(ii) 트레할로오스-6-포스페이트의 트레할로오스로의 전환을 촉진하기 위하여 usp45 (Gene ID: 4797218)의 하류에 위치한 염색체적으로-통합된 트레할로오스-6-포스페이트 포스파타아제 유전자 (otsB; Gene ID: 1036914);
(iii) 불활성화된 (예를 들어, 유전자 결손으로) 트레할로오스-6-포스페이트 포르포릴라아제 유전자 (trePP; Gene ID: 4797140); 및
(iv) 불활성화된 셀로비오스-특이적 PTS 시스템 IIC 성분 (Gene ID: 4796893), ptcC, (예를 들어, 코돈 위치 446 중 30에서의 tga; tga30).
예를 들어, 트레할로오스-6-포스페이트 포스파타아제, 예를 들어, otsB, 예컨대, 에스케리키아 콜라이 otsB (Escherichia coli otsB)를 암호화하는 외인성 핵산. 이러한 실시형태에 따른 일부 예에서, 트레할로오스-6-포스페이트 포스파타아제를 암호화하는 외인성 핵산은 염색체적으로 통합된다. 일부 예에서, 트레할로오스-6-포스페이트 포스파타아제를 암호화하는 외인성 핵산은 미규명된 분비된 45-kDa 단백질 유전자 (usp45)의 3'에 염색체적으로 통합된다. 이러한 실시형태에 따른 일부 예에서, LAB는, usp45 프로모터, usp45 유전자 (예를 들어, 프로모터의 3') 및 트레할로오스-6-포스페이트 포스파타아제 (예를 들어, usp45 유전자의 3')를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트 (polycistronic expression cassette)를 포함한다. 일부 예에서, 제2 폴리시스트론성 발현 카세트는 usp45 유전자와 트레할로오스-6-포스페이트 포스파타아제를 암호화하는 외인성 핵산 사이의 유전자간 영역을 추가로 포함한다. 일부 예에서, 제2 폴리시스트론성 발현 카세트는 Pusp45>>usp45>>유전자간 영역>>otsB 로 예시된다. 이러한 실시형태에 따른 일부 예에서, 유전자간 영역은 상기에 본원에 기재된 바와 같은 rpmD (예를 들어, 서열번호 8 또는 서열번호 9를 가짐)이다. 이어서, 제2 폴리시스트론성 발현 카세트는 Pusp45>>usp45>>rpmD>>otsB 로 예시된다.
상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, 트레할로오스-6-포스페이트 포스포릴라아제 유전자 (trePP)는 미생물 (예를 들어, LAB) 내에서 분열되거나 또는 불활성화된다. 예를 들어, trePP는 trePP 유전자 또는 이의 단편을 제거함으로써 불활성화되거나, 또는 trePP는 정지 코돈을 삽입함으로써 분열되었다. 따라서, 이러한 실시형태에 따른 일부 예에서, 미생물 (예를 들어, LAB)은 trePP 활성이 부족하다.
상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 다른 예에서, 셀로비오스-특이적 PTS 시스템 IIC 성분 유전자 (ptcC)는 미생물 (예를 들어, LAB) 내에서 분열되거나 또는 불활성화되었다. 예를 들어, ptcC는 정지 코돈을 삽입함으로써 분열되거나, 또는 ptcC는 ptcC 또는 이의 단편을 제거함으로써 불활성화되었다. 따라서, 이러한 실시형태에 따른 일부 예에서, 미생물 (예를 들어, LAB)은 ptcC 활성이 부족하다.
상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 다른 예에서, LAB는 하나 이상의 트레할로오스 수송체를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 추가로 포함한다. 일부 예에서, 하나 이상의 트레할로오스 수송체를 암호화하는 하나 이상의 유전자는 LAB에 대해 내인성이다. 일부 예에서, LAB는 하나 이상의 트레할로오스 수송체를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 과발현한다. 이러한 실시형태에 따른 일부 예에서, 하나 이상의 트레할로오스 수송체를 암호화하는 하나 이상의 유전자는 외인성 프로모터, 예를 들어, hllA 프로모터 (PhllA)의 3'에 위치된다. 예를 들어, 하나 이상의 트레할로오스 수송체를 암호화하는 하나 이상의 유전자는 PhllA에 의해 전사적으로 조절된다. 이러한 실시형태에 따른 일부 예에서, 하나 이상의 트레할로오스 수송체를 암호화하는 하나 이상의 유전자는 llmg_0453, llmg_0454 및 이의 임의의 조합 중에서 선택된다. 일부 예에서, llmg_0453 및 llmg_0454는 PhllA에 의해 전사적으로 조절된다.
상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, 하나 이상의 트레할로오스 수송체를 암호화하는 하나 이상의 유전자는 2개 이상의 트레할로오스 수송체를 암호화하는 2개 유전자를 포함하며, 여기서, 유전자간 영역은 2개 유전자 사이에 위치된다. 일부 예에서, 유전자간 영역은, 예를 들어, 서열번호 8 또는 서열번호 9를 갖는 rpmD이다. 일부 예에서, 미생물 (예를 들어, LAB)은, 2개의 상이한 트레할로오스 수송체 (수송체 1 및 수송체 2 서열)를 암호화하는 2개의 핵산 서열 (예를 들어, 유전자)과 2개의 상이한 트레할로오스 수송체를 암호화하는 2개의 핵산 사이의 유전자간 영역을 포함하는, 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함한다. 이러한 발현 카세트는 PhllA>>수송체 1>>유전자간 영역>>수송체 2로 예시될 수 있다. 이러한 실시형태에 따른 일부 예에서, 유전자간 영역은 상기 본원에 기재된 바와 같은 rpmD (예를 들어, 서열번호 8 또는 서열번호 9를 가짐)이다. 이어서, 폴리시스트론성 발현 카세트는 PhllA>>수송체 1>> rpmD >>수송체 2로 예시될 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, 단일 균주 내에서 LAB는 여러개의 유용한 특징을 포함한다. 하나의 실시형태에서, LAB는 다음을 포함하는 락토코커스 락티스이다:
(A) 전사적으로 통합된 프로모터>>분비 신호>>뮤신 및 세포 부착 융합 단백질;
(B) 하나 이상의 염색체적으로-통합된 프로모터 >> 분비 신호>>치료 단백질;
(C) 담즙산염 및 건조에 대한 LAB 생존가능성을 향상시키는, 트레할로오스 축적을 촉진하기 위한 돌연변이 및 삽입의 조합. 돌연변이는 하기 중에서 선택된다:
(i) 트레할로오스의 흡수를 위한, 염색체적으로-통합된 트레할로오스 수송체, 예컨대, PhllA>>수송체 1>> 유전자간 영역>>수송체 2, 예컨대, llmg_0453 및/또는 llmg_0454;
(ii) 트레할로오스-6-포스페이트의 트레할로오스로의 전환을 촉진하기 위하여 usp45 (Gene ID: 4797218)의 하류에 위치한 염색체적으로-통합된 트레할로오스-6-포스페이트 포스파타아제 유전자 (otsB; Gene ID: 1036914);
(iii) 불활성화된 (예를 들어, 유전자 결손으로) 트레할로오스-6-포스페이트 포르포릴라아제 유전자 (trePP; Gene ID: 4797140); 및
(iv) 불활성화된 셀로비오스-특이적 PTS 시스템 IIC 성분 (Gene ID: 4796893), ptcC, (예를 들어, 코돈 위치 446 중 30에서의 tga; tga30).
또한, LAB는 생물학적 봉쇄 (biological containment)를 위한 영양요구성 돌연변이 (auxotrophic mutant), 예컨대, thyA를 함유할 수 있다. 하나 이상의 이러한 기능 (즉, 뮤신 및 세포 부착, 치료 단백질, 트레할로오스 축적)은 폴리시스트론성 오페론 내의 것일 수 있으며, 여기서, 각각의 유전자는 유전자간 영역으로 분리될 수 있다.
하나의 실시형태에서, LAB는 다음을 지닌 락토코커스 락티스이다:
(A) 생물학적 봉쇄를 위한, thyA 돌연변이;
(B) 세포 벽, 점액 및 세포 결합 융합 단백질로 배출하고 이에 연결하기 위한 염색체적으로 통합된 PthyA>>SSusp45-hTFF3-cmbA;
(C) LAB로부터 성숙한 PAL을 분비시키기 위한, 염색체적으로-통합된 PgapB>>gapB>>유전자간 영역 (such as rpmD)>>SSusp45>>pal;
(D) 트레할로오스의 흡수를 위한, 염색체적으로-통합된 트레할로오스 수송체, 예컨대, PhllA>>수송체 1>> 유전자간 영역>>수송체 2, 예컨대, llmg_0453 및/또는 llmg_0454;
(E) 불활성화된 (예를 들어, 유전자 결손으로) 트레할로오스-6-포스페이트 포르포릴라아제 유전자 (trePP; Gene ID: 4797140);
(F) 트레할로오스-6-포스페이트의 트레할로오스로의 전환을 촉진하기 위하여 usp45 (Gene ID: 4797218)의 하류에 위치한 염색체적으로-통합된 트레할로오스-6-포스페이트 포스파타아제 유전자 (otsB; Gene ID: 1036914); 및
(G) 불활성화된 셀로비오스-특이적 PTS 시스템 IIC 성분 (Gene ID: 4796893), ptcC, (예를 들어, 코돈 위치 446 중 30에서의 tga; tga30).
상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, 미생물 (예를 들어, 박테리움)은, 기재된 유전적 변형을 포함하지 않는, 즉, 융합 단백질을 암호화하는 상기 외인성 핵산을 포함하지 않거나 또는 상기 융합 단백질을 포함하지 않는 상응하는 미생물 (예를 들어, 박테리움)과 비교할 경우, 증가된 위장 (GI) 통과 시간을 갖는다. 일부 예에서, GI 통과 시간은 적어도 약 10 %, 적어도 약 30 %, 적어도 약 50 %, 적어도 약 80 % 또는 적어도 약 100 % (약 2Х로) 만큼 증가된다. 다른 예에서, GI 통과 시간은 적어도 약 10 % 내지 약 500 %, 적어도 약 20% 내지 약 400%, 적어도 약 20% 내지 약 300%, 적어도 약 20% 내지 약 300% 또는 적어도 약 30% 내지 약 300% 만큼 증가된다.
상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, 미생물 (예를 들어, 박테리움)은, 본원에 기재된 바와 같이 유전적으로 변형되지 않는, 즉, 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산을 포함하지 않거나 또는 융합 단백질을 포함하지 않는 상응하는 미생물 (예를 들어, 박테리움)과 비교할 경우, 증가된 시험관내 뮤신-결합 능력을 나타낸다. 일부 예에서, 시험관내 뮤신-결합 능력은 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50 %, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80 %, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 100 % (약 2Х로) 만큼 증가된다. 다른 예에서, 뮤신-결합 능력은 적어도 약 10% 내지 약 500%, 적어도 약 10% 내지 약 400%, 적어도 약 10% 내지 약 300%, 적어도 약 10% 내지 약 200%, 적어도 약 20 % 내지 약 200 %, 적어도 약 20% 내지 약 300 % 또는 적어도 약 20% 내지 약 500 % 만큼 증가된다.
뮤신-결합 능력은 당업계-인식된 방법, 예를 들어, 본원에 기재된 방법에 따라 측정될 수 있다. 일부 예에서, 시험관내 뮤신-결합 능력은 미생물 (예를 들어, 박테리움)을 고정된 뮤신 (예를 들어, 포사인 위로부터의 뮤신)에 접촉하고 이에 결합시킴, 및 뮤신에 결합된 미생물 균체 (microbial cell)(예를 들어, 박테리아 세포 (bacterial cell))의 수를 측정함, 예를 들어, 적절한 파장, 예컨대, 405 nm (OD405)에서 광 흡수도를 검출함; 또는 염료 (예를 들어, 크리스탈 바이올렛)으로 결합된 미생물 균체 (예를 들어, 결합된 박테리아 세포)를 염색함 및 이어서 사용된 염료에 적절한 파장에서 광 흡수도를 검출함으로써 측정된다. 예를 들어, 크리스탈 바이올렛이 뮤신에 결합된 박테리아 세포를 염색하는데 사용되는 경우, 광 흡수도는 595 nm (OD595)에서 측정될 수 있다.
상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, 미생물 (예를 들어, 박테리움)은, 기재된 유전적 변형이 없는, 즉, 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산을 포함하지 않거나 또는 융합 단백질을 포함하지 않는 상응하는 미생물 (예를 들어, 박테리움)과 비교할 경우, 증가된 시험관내 Caco-2 세포-결합 능력을 나타낸다. 일부 예에서, 시험관내 Caco-2 결합 능력은 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 80%, 적어도 약 100% (약 2Х로), 적어도 약 200%, 적어도 약 300% 또는 적어도 약 400% (약 5) 만큼 증가된다. 다른 예에서, 시험관내 Caco-2 결합 능력은 적어도 약 10 % 내지 약 200%, 적어도 약 10% 내지 약 300%, 적어도 약 10% 내지 약 400% 또는 적어도 약 10% 내지 약 500% 만큼 증가된다. Caco-2 세포 결합 능력은 임의의 당업계-인식된 방법, 예컨대, 본원에 기재된 방법에 따라 측정될 수 있다. 예를 들어, Caco-2 결합 능력은 다음에 의해 측정된다: (i) 미생물 (예를 들어, 박테리움), 예를 들어, 미생물 (예를 들어, 박테리움)의 배양물을 Caco-2 세포와 접촉시킴; (ii) Caco-2 세포를 세척하여 비결합된 미생물 (예를 들어, 박테리아 세포)을 제거함; (iii) Caco-2 세포에 결합된 미생물 균체 (예를 들어, 박테리아 세포)를 분리함; 및 (iv) 본원에 기재된 바와 같이 분리된 박테리아 세포의 수를 결정함 (즉, 분리된 세포를 적정함).
상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, 미생물 (예를 들어, 박테리움)은, 기재된 유전적 변형을 포함하지 않는, 즉, 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산을 포함하지 않거나 또는 융합 단백질을 포함하지 않는 상응하는 미생물 (예를 들어, 박테리움)과 비교할 경우, 장 점막 (intestinal mucosa)으로의 증가된 부착성을 나타낸다. 일부 예에서, 장 점막으로의 미생물 (예를 들어, 박테리움)의 부착성은 적어도 약 10% 내지 약 100% (약 2Х로), 적어도 약 10% 내지 약 200%, 적어도 약 10% 내지 약 400% 또는 적어도 약 10% 내지 약 500% 만큼 증가된다.
본 발명은 본 발명의 미생물 (예를 들어, 박테리움), 예를 들어, 상기 실시형태 중 임의의 것에 기재된 바와 같은 미생물 (예를 들어, 박테리움)을 포함하는 조성물을 추가로 개시한다. 예를 들어, 본 발명은 융합 단백질 (예를 들어, 미생물, 예컨대, 박테리움의 세포-벽에 고정된)을 포함하는 미생물 (예를 들어, 박테리움)을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서, 융합 단백질은 TFF 폴리펩티드 및 CmbA 폴리펩티드를 포함한다. 일부 예에서, 미생물 (예를 들어, 박테리움)은 분비 선도 서열 (예를 들어, SSusp45), TFF 폴리펩티드를 암호화하는 서열 및 CmbA 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 외인성 핵산을 포함한다. 일부 예에서, 분비 선도 서열은 분비 신호 펩티드를 암호화하며, 이는, 예를 들여, 융합 단백질이 박테리움의 세포질 막을 통과하는 경우, 융합 단백질로부터 절단된다.
본 발명은 본 발명의 미생물 (예를 들어, 박테리움) 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 추가로 제공한다. 예를 들어, 약학적 조성물은 상기 실시형태 중 임의의 것에 기재된 미생물 (예를 들어, 박테리움)을 함유한다.
본 발명은 질환의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 미생물 (예를 들어, 박테리움), 또는 본 발명의 조성물 (예를 들어, 약학적 조성물)을 추가로 제공한다. 본 발명은 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제 (medicament)의 제조에 사용하기 위한 미생물 (예를 들어, 박테리움) 또는 조성물 (예를 들어, 약학적 조성물)을 추가로 제공한다. 이러한 실시형태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, 질환은 자가면역 질환, 알레르기, 영양성 또는 대사성 질환 (metabolic disease), 위장 질환 및 유전적 장애 중에서 선택된다. 본 발명의 미생물 (예를 들어, 박테리아) 및 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 추가의 질환이 본원에 기재된다.
본 발명은 융합 단백질을 암호화하는 단리된 핵산을 추가로 제공하며, 상기 핵산은 다음을 포함한다: (i) 뮤신-결합 폴리펩티드, 예컨대, TFF 폴리펩티드 (예를 들어, TFF1, TFF2 또는 TFF3) 또는 MucBP 폴리펩티드를 암호화하는 서열; 및 (ii) 세포-부착 폴리펩티드, 예컨대, CmbA 폴리펩티드, Mub 폴리펩티드, MapA 폴리펩티드 또는 MbpL 폴리펩티드를 암호화하는 서열. 이러한 실시형태에 따른 일부 예에서, 세포-부착 폴리펩티드는 CmbA 폴리펩티드이다. 따라서, 본 발명은 융합 단백질을 암호화하는 단리된 핵산을 제공하며, 여기서, 핵산은 (i) TFF 폴리펩티드, 예컨대, TFF1 (예를 들어, 인간 TFF1), TFF2 (예를 들어, 인간 TFF2), 또는 TFF3 (예를 들어, 인간 TFF3)을 암호화하는 서열, 및 (ii) CmbA 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 함유한다.
본 발명은 본 발명의 단리된 핵산, 예를 들어, 상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 단리된 핵산을 포함하는 플라스미드를 추가로 제공한다.
본 발명은 본 발명의 단리된 핵산 또는 본 발명의 플라스미드를 포함하는 미생물 (예를 들어, 박테리아) 숙주 세포를 추가로 제공한다.
본 발명은 (1) 본 발명의 미생물 (예를 들어, 박테리움), 조성물, 약학적 조성물 또는 단위 투여형 (unit dosage form); 및 (2) 포유동물, 예컨대, 동물 또는 인간 대상체 또는 환자에게 미생물 (예를 들어, 박테리움), 조성물, 약학적 조성물 또는 단위 투여형을 투여하기 위한 지침을 포함하는 키트 (kit)를 추가로 제공한다.
방법
본 발명은 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 위한 방법을 추가로 제공한다. 예시적인 방법은 본 발명의 치료학적 유효량의 미생물 (예를 들어, 박테리움), 조성물 또는 약학적 조성물을 대상체에게 투여함을 포함한다. 이러한 실시형태에 따른 일부 예에서, 미생물 (예를 들어, 박테리움)은 본원에 기재된 치료 폴리펩티드를 암호화하는 외인성 핵산을 포함한다. 본 발명의 이러한 미생물 (예를 들어, 박테리아) 및 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 예시적인 질환이 본원에 기재된다. 일부 예에서, 질환은 자가면역 질환, 알레르기, 영양성 또는 대사성 질환, 위장 질환, 유전적 장애 또는 이의 임의의 조합이다. 상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, 질환은 자가면역 질환, 예컨대, 제1형 당뇨병 (type-1 diabetes: T1D)이다. 다른 예에서, 질환은 대사성 질환, 예컨대, 페닐케톤뇨증 (phenylketonuria: PKU)이다. 다른 예에서, 질환은 위장 질환, 예컨대, 복강 질환 (celiac disease) 또는 염증성 장 질환 (inflammatory bowel disease: IBD), 예를 들어, 크론병 또는 궤양성 대장염 (ulcerative colitis)이다. 추가의 예에서, 질환은 성장 지연 (growth retardation)이다.
일부 실시형태에서, 질환은 페닐케톤뇨증 (PKU)이다. 이러한 실시형태에 따른 일부 예에서, 미생물 (예를 들어, 박테리움)은 폴리펩티드를 암호화하는 외인성 핵산, 예를 들어, 미생물이 투여되는 대상체에 의한 Phe 흡수 전에, 예를 들어, GI 관에서 페닐알라닌 (Phe)의 분해가 가능한 효소를 포함한다. 이러한 실시형태에 따른 일부 예에서, 미생물 (예를 들어, 박테리움)은 페닐알라닌 암모니아 리아제 (PAL)를 암호화하는 외인성 핵산, Phe를 신남산으로 전환시키는 효소를 포함한다. 따라서, 본 발명은 PKU의 치료가 필요한 대상체에서 이를 위한 치료 방법을 제공한다. 예시적인 방법은 대상체에게 본 발명의 치료학적 유효량의 미생물 (예를 들어, 박테리움), 조성물 또는 약학적 조성물을 투여함을 포함하며, 여기서, 미생물 (예를 들어, 박테리움)은 PAL을 암호화하는 외인성 핵산을 포함한다. Phe 흡수 억제 및 PKU의 치료는 마우스 PKU 모델을 사용하여, 예를 들어, (enu2/2) 마우스 [참조: 예를 들어, Sarkissian, C. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96: 2339-2344]를 활용하거나, 또는 래트 모델 [참조: 예를 들어, Chang et al., Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 1995, 23(1):1-21]를 사용하여 분석될 수 있다.
본 발명은 유전적으로 변형된 미생물 (예를 들어, 박테리움)을 제조하기 위한 방법을 추가로 제공한다. 예시적은 방법은, 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산을 미생물 (예를 들어, 박테리움)과 접촉시킴을 포함하며, 여기서, 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산은 세포-부착 폴리펩티드, 예컨대, CmbA 폴리펩티드, Mub 폴리펩티드, MapA 폴리펩티드 또는 MbpL 폴리펩티드를 포함한다. 일부 예에서, 세포-부착 폴리펩티드는 CmbA, 예를 들어, 락토바실러스 루테리 CmbA이다. 일부 예에서, 상기 방법 (즉, 미생물을 외인성 핵산과 접촉시킴)을 수행함은 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산을 함유하는 미생물 (예를 들어, 박테리움)을 발생시킨다. 다른 예에서, 미생물 (예를 들어, 박테리움)을 외인성 핵산과 접촉시킴은, 미생물 (예를 들어, 박테리움)이 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산을 함유하고, 이에 따라, 외인성 핵산에 의해 암호화되는 융합 단백질을 발현하게끔 한다. 일부 예에서, 방법은 미생물 (예를 들어, 박테리움)을 배양함 및 미생물 (예를 들어, 박테리움) 중에 융합 단백질을 발현시킴을 추가로 포함한다. 일부 예에서, 접촉시킴은 상기 박테리움에 충분한 조건 하에서 외인성 핵산의 내재화를 일으킨다. 이러한 실시형태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, 외인성 핵산은 플라스미드 상에 위치한다. 이러한 실시형태에 따른 일부 예에서, 외인성 핵산은 박테리움의 염색체 내로 통합된다.
상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산은 뮤신-결합 폴리펩티드, 예컨대, 트레포일 인자 (TFF) 폴리펩티드 또는 MucBP 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 예에서, 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산은 CmbA를 암호화하는 서열 및 TFF 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명은, 다음을 포함하는, 유전적으로 변형된 미생물 (예를 들어, 박테리움)을 제조하기 위한 방법을 제공한다: 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산을 미생물 (예를 들어, 박테리움)과 접촉시킴, 여기서, 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산은 (i) TFF 폴리펩티드 (예를 들어, TFF1, TFF2 또는 TFF3)를 암호화하는 서열 및 (ii) CmbA를 암호화하는 서열을 포함한다. 이러한 실시형태 중 임의의 것에 따른 일부 예는, 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산은, 예를 들어, 상동 재조합을 사용하여 염색체적으로 통합된다 (예를 들어, 박테리움의 염색체 내로 통합됨). 이러한 실시형태에 따라, 상기 방법은 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 플라스미드 (즉, 통합 플라스미드)를 형성함을 추가로 포함할 수 있다.
상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 하나의 예에서, 상기 방법은, 예를 들어, 미생물 (예를 들어, 박테리움)을 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산과 접촉하기 이전 또는 이후에, 미생물 (예를 들어, 박테리움)을 치료 폴리펩티드를 암호화하는 외인성 핵산과 접촉시킴을 추가로 포함한다.
상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, 상기 방법으로 제조된 유전적으로 변형된 미생물 (예를 들어, 박테리움)은, 즉각적인 방법에 따라 변형되지 않는, 즉, 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산을 포함하지 않는 상응하는 미생물 (예를 들어, 박테리움)과 비교한 경우, 본원에 기재된 바와 같은 증가된 점막- 및/또는 세포-부착 특성을 나타낸다.
관련 실시형태에서, 점액 및/또는 세포로의 부착은 점액 및/또는 세포의 유형에 특이적이다. 특이적 세포 또는 점액에서 발견된 특이적 수용체에 대한 우선적 결합의 결과로서, 박테리움은 특이적 부위에 국한될 수 있다. 이러한 방식으로, 특이적 분자가 가장 효과적인 부위로의 박테리움의 국소화 (localization)를 확증하는 것이 가능하다. 일부 실시형태에서, 위치는 점막 (장, 구강, 눈, 귀, 비뇨생식기) 일 수 있다. 일부 실시형태에서, 위치는 소장일 수 있고, 일부 실시형태에서, 위치는 상부 소장일 수 있다.
일부 예에서, 상기 방법은 유전적으로 변형된 박테리움의 배양물을 적어도 하나의 저온보존제와 배합하여 박테리아의 혼합물을 형성함을 추가로 포함한다. 상기 방법은 박테리아의 혼합물을 건조시켜 (예를 들어, 동결-건조 또는 분무 건조) 건조된 (예를 들어, 동결-건조된) 조성물을 형성함을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 유전적으로 변형된 박테리움 또는 건조된 조성물 (예를 들어, 동결-건조된 조성물)을 약학적으로 허용가능한 담체와 배합하여 약학적 조성물을 형성함을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 유전적으로 변형된 박테리움, 건조된 (예를 들어, 동결-건조된) 조성물 또는 약학적 조성물을 약학적 단위 투여형, 예컨대, 정제, 캡슐 또는 과립으로 제형화함을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 미생물 (예를 들어, 박테리움), 조성물 또는 약학적 조성물을 포함하는 단위 투여형을 추가로 제공한다. 일부 예에서, 이러한 단위 투여형은 경구 투여형이다. 이러한 실시형태에 따른 다른 예에서, 단위 투여형은 캡슐 (예를 들어, 분말 또는 미세-펠릿 또는 미세-과립을 함유하는 캡슐), 정제, 과립, 사셰 (sachet) 또는 포장된 액체, 예를 들어, 현탁액이다. 다른 실시형태에서, 단위 투여형은 계랑된 에어로졸 투여량 또는 좌제이다.
일부 실시형태에서, 투여형에 함유된 미생물 (예를 들어, 비-병원성 그람-양성 박테리움)은 건조-분말 형태 또는 이의 압축된 버전이다.
본 발명은 본 발명의 미생물, 예를 들어, 비-병원성 미생물 (예를 들어, 비-병원성 그람-양성 박테리움)의 약 1 Х 104 내지 약 1 Х 1012 콜로니-형성 단위 (cfu)를 포함하는 단위 투여형을 추가로 제공한다. 일부 실시형태에서, 단위 투여형은 미생물 (예를 들어, 비-병원성 그람-양성 박테리움)의 1 Х 106 내지 약 1 Х 1012 콜로니-형성 단위 (cfu)를 포함한다. 다른 실시형태에서, 단위 투여형은 미생물 (예를 들어, 비-병원성 그람-양성 박테리움)의 약 1 Х 109 내지 약 1 Х 1012 콜로니-형성 단위 (cfu)를 포함한다.
상기 방법 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 미생물 (예를 들어, 박테리움)은 대상체에게 경구로 투여된다. 예를 들어, 미생물 (예를 들어, 박테리움)은 대상체에게 미생물 (예를 들어, 박테리움) 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 경구 투여용 약학 조성물의 형태 (예를 들어, 캡슐, 정제, 과립, 현탁액 또는 액체)로 투여된다. 다른 예에서, 미생물 (예를 들어, 박테리움)은 식료품의 형태로 투여되거나 또는 식품 (예를 들어, 음료)에 첨가된다. 다른 예에서, 미생물 (예를 들어, 박테리움)은 대상체에게 식이 보충물의 형태로 투여된다. 또 다른 예에서, 미생물 (예를 들어, 박테리움)은 대상체에게 좌제 상품의 형태로 투여된다. 일부 예에서, 본 발명의 조성물은 폴리펩티드의 점막 전달에 적응되며, 이는 미생물 (예를 들어, 박테리움)로 발현된다. 예를 들어, 조성물은 대상체의 장관 내 치료 폴리펩티드의 효율적인 방출을 위하여 제형화될 수 있다.
본 발명은, 상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 방법으로 제조된, 유전적으로 변형된 박테리움, 조성물, 약학적 조성물 또는 단위 투여형을 추가로 제공한다.
본 발명은 포유동물의 성장을 향상시키기 위한 방법을 추가로 제공한다. 예시적인 방법은 본 발명의 유효량의 미생물 (예를 들어, 박테리움), 조성물, 약학적 조성물 또는 단위 투여형을 포유동물에게 투여함을 포함한다. 일부 예에서, 포유동물은 인간, 가축 (예를 들어, 돼지, 소, 염소 또는 양), 개, 고양이 또는 다른 가정용 동물이다. 일부 예에서, 미생물 (예를 들어, 박테리움), 조성물, 약학적 조성물 또는 단위 투여형은 포유동물로의 투여를 위하여, 예를 들어, 경구 투여를 위하여 제형화된다. 일부 예에서, 이러한 방법에 사용된 미생물 (예를 들어, 박테리움)은 성장 인자 또는 성장 호르몬을 암호화하는 외인성 핵산을 함유한다. 이러한 실시형태에 따른 일부 예에서, 성장 인자 또는 성장 호르몬은 미생물 (예를 들어, 박테리움) 내에서 구성적으로 발현된다. 일부 예에서, 성장 인자는 EGF이다. 다른 예에서, 포유동물은 돼지이고, EGF는 포사인 EGF이다.
본 발명은 미생물 (예를 들어, 박테리움)의 장 점막으로의 결합 (예를 들어, 뮤신 제제로의 시험관내 결합으로 측정되는 바와 같음)을 증가시키기 위한 방법을 추가로 제공한다. 예시적인 방법은 미생물 (예를 들어, 박테리움)을 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산과 접촉시킴; 및 미생물 (예를 들어, 박테리움)에서 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산을 발현시킴을 포함하며, 여기서, 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산은 CmbA 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 예에서, 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산은 뮤신-결합 폴리펩티드, 예컨대, TFF 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 예에서, 미생물 (예를 들어, 박테리움)에 의한 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산의 발현은 TFF 폴리펩티드 및 CmbA 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 생산한다.
상기 기재된 조성물 및 방법 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, 미생물은 비-병원성 미생물, 예를 들어, 포유류 대상체에 의한 소비에 안전한 임의의 미생물이다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물 및 방법에서 미생물은 효모이다. 효모는 사카로마이세스 (Saccharomyces) 종, 한세뉼라 (Hansenula) 종, 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 종, 쉬조사카로마이세스 (Schizzosaccharomyces) 종, 자이고사카로마이세스 (Zygosaccharomyces) 종, 피키아 (Pichia) 종, 모나스쿠스 (Monascus) 종, 제오트쿰 (Geothchum) 종 및 야로위아 (Yarrowia) 종 중에서 선택될 수 있다. 일부 예에서, 효모는 사카로마이세스 세레비시아에 (Saccharomyces cerevisiae)이다.
상기 조성물 및 방법의 다른 실시형태에서, 비-병원성 미생물은 비-병원성 박테리움이다. 이러한 실시형태에 따른 일부 예에서, 비-병원성 박테리움은 그람-양성 박테리움이다. 다른 예에서, 그람-양성 박테리움은 락트산 발효 박테리움 (LAB)이며, 이는, 예를 들어, 락토코커스 종 (예를 들어, 락토코커스 락티스), 락토바실러스 종 (Lactobacillus species) 및 비피도박테리움 종 중에서 선택된다. 다른 예에서, 비-병원성 박테리움은 스트렙토코커스 종 또는 엔테로코커스 종이다. 추가적인 박테리아의 종이 본원에 기재된다.
도 1은 PthyA>>SSusp45-htff3-CmbA 발현/thyA 통합 벡터 (integration vector) pAGX2005의 플라스미드 맵이다. 약어: thyA5', MG1363의 티미딘 신타아제 A (thyA) 유전자의 5' 측면 영역; PthyA, MG1363의 thyA 프로모터; SSups45, MG1363 단백질 usp45의 분비 신호를 암호화하는 유전자; hTFF3, 엘. 락티스 (L. lactis)에 관한 최적화된 코돈 사용빈도 (codon usage)를 갖는 인간 트레포일 인자 3을 암호화하는 유전자; CmbA, 락토바실러스 루테리 ATCC PTA6474 세포 및 점액-결합 단백질 A을 암호화하는 유전자; thyA3', MG1363의 thyA 유전자의 3' 측면 영역; ORI, 플라스미드 pORI19의 복제 기점; Em, 에리트로마이신 저항성 마커 (resistance marker).
도 2A-B는 박테리아 (락토코커스 락티스) 세포의 뮤신으로의 향상된 결합을 입증하는 그래프이며, 여기서, 뮤신 결합은 OD405 (도 2A) 또는 크리스탈 바이올렛 염색 (도 2B)을 사용하여 측정된다. pAGX1417: 빈 플라스미드를 보유하는 엘. 락티스 균주 LL108; pAGX1894: 박테리아의 표면상에 hTFF1-SpaX 발현을 위한 플라스미드를 보유하는 엘. 락티스 균주 LL108; pAGX2005: 박테리아의 표면상에 hTFF3-CmbA 발현을 위한 플라스미드를 보유하는 엘. 락티스 균주 LL108. 뮤신 제II형 = ~1%, 시알산 결합된, 포사인 위로부터의 뮤신; 뮤신 제III형 = 시알산 결합된, 포사인 위로부터의 뮤신 (0.5-1.5%).
도 3은 박테리아 (락토코커스 락티스) 세포의 Caco-2 세포로의 향상된 부착성을 입증한다. pAGX1417: 빈 플라스미드를 보유하는 엘. 락티스 균주 LL108; pAGX1893: 박테리아의 표면상에 CmbA를 발현하기 위한 플라스미드를 보유하는 엘. 락티스 균주 LL108; pAGX1894: 박테리아의 표면상에 hTFF1-spaX를 발현하기 위한 플라스미드를 보유하는 엘. 락티스 균주 LL108; pAGX2005: 박테리아의 표면상에 hTFF3-CmbA를 발현하기 위한 플라스미드를 보유하는 엘. 락티스 균주 LL108.
도 4는 예시적인 SSusp45-htff3 작제물 (construct)(아미노산 및 핵산 서열; 각각 서열번호 8 및 서열번호 9)을 예시한다.
도 5A-D는 예시적인 SSusp45-hTFF3-CmbA 작제물 (아미노산 및 핵산 서열: 각각 서열번호 10 및 서열번호 11)의 전체적인 삽화이다.
도 6은 박테리아 (락토코커스 락티스) 세포의 Caco-2 세포로의 향상된 부착성을 예시하는 그래프이며, 여기서, 상기 세포는 예시적인 세포 부착 폴리펩티드 (CmbA) 또는 예시적인 융합 단백질 (hTFF3-CmbA)을 에피솜으로 또는 구성적으로 발현한다. 회수(%) = 콜로니 형성 단위 계수에 의해 측정되는 바와 같은, 전체 적용된 엘. 락티스 세포와 비교하여, 세척 후 뮤신 코팅된 웰로부터 회수되었던 엘. 락티스 세포 (%). pAGX1893: 박테리아의 표면상에 CmbA를 발현하기 위한 플라스미드를 보유하는 엘. 락티스 균주 LL108; pAGX2005: 박테리아의 표면상에 hTFF3-CmbA를 발현하기 위한 플라스미드를 보유하는 엘. 락티스 균주 LL108; sAGX0618: 예시적인 치료 폴리펩티드 PAL (PgapB>>pal)을 구성적으로 발현하고 박테리아의 표면상에 CmbA를 구성적으로 발현하는 (thyA -; PthyA>>cmbA), 엘. 락티스 균주 MG1363; sAGX644: 예시적인 치료 폴리펩티드 PAL (PgapB>>pal)을 구성적으로 발현하고 박테리아의 표면상에 융합 단백질 hTFF3-CmbA를 구성적으로 발현하는 엘. 락티스 균주 MG1363, 여기서, 상기 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산은 thyA 유전자좌에서 내인성 thyA 프로모터에의해 전사적으로 조절됨 (thyA -; PthyA>>SSusp45-htff3-mbA); sAGX660: 예시적인 치료 폴리펩티드 PAL (PgapB>>pal)을 구성적으로 발현하고 박테리아의 표면상에 융합 단백질 hTFF3-CmbA를 구성적으로 발현하는 엘. 락티스 균주 MG1363, 여기서, 상기 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산은 thyA 유전자좌에서 hllA 프로모터에 의해 전사적으로 조절됨 (thyA -; PhllA>>SSusp45-htff3-cmbA).
도 7은 박테리아 (락토코커스 락티스) 세포의 뮤신으로의 향상된 결합을 예시하는 그래프이며, 여기서, 상기 세포는 예시적인 세포 부착 폴리펩티드 (CmbA) 또는 예시적인 융합 단백질 (hTFF3-CmbA)을 에피솜으로 또는 구성적으로 발현하고, 여기서, 뮤신 결합은 본원에, 예를 들어, 실시예 6에 기재된 바와 같이, OD405 (도 7A) 또는 크리스탈 바이올렛 염색 (도 7B)을 사용하여 측정된다. pAGX1893: 박테리아의 표면상에 hTFF3-CmbA를 발현하기 위한 플라스미드를 보유하는 엘. 락티스 균주 LL108; pAGX2005: 박테리아의 표면상에 hTFF3-CmbA를 발현하기 위한 플라스미드를 보유하는 엘. 락티스 균주 LL108; sAGX0618: 예시적인 치료 폴리펩티드 PAL (PgapB>>pal)을 구성적으로 발현하고 박테리아의 표면상에 CmbA를 구성적으로 발현하는 (thyA -; PthyA>>cmbA), 엘. 락티스 균주 MG1363; sAGX644: 예시적인 치료 폴리펩티드 PAL (PgapB>>pal)을 구성적으로 발현하고 박테리아의 표면상에 융합 단백질 hTFF3-CmbA를 구성적으로 발현하는, 엘. 락티스 균주 MG1363, 여기서, 상기 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산은 thyA 유전자좌에서 내인성 thyA 프로모터에의해 전사적으로 조절됨 (thyA -; PthyA>>SSusp45-htff3-cmbA); sAGX660: 예시적인 치료 폴리펩티드 PAL (PgapB>>pal)을 구성적으로 발현하고 박테리아의 표면상에 융합 단백질 htff3-CmbA를 구성적으로 발현하는, 엘. 락티스 균주 MG1363, 여기서, 상기 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산은 thyA 유전자좌에서 hllA 프로모터에 의해 전사적으로 조절됨 (thyA -; PhllA>>SSusp45-htff3-cmbA).
도 8은 점막부착성 폴리펩티드 (mucoadhesive polypeptide)(sAGX0599)를 발현하지 않거나, 박테리아의 표면상에 예시적인 세포 부착 폴리펩티드 CmbA (sAGX0618)를 발현하거나, 또는 박테리아의 표면상에 예시적인 융합 단백질 hTFF3-CmbA를 발현하는 (sAGX0644 (thyA -; PthyA>>SSusp45-htff3-cmbA) 및 sAGX0660 (thyA -; PhllA>>SSusp45-htff3-cmbA)), 박테리아 세포에 의한 예시적인 치료 폴리펩티드 (PAL)의 생산을 예시하는 그래프이다. 109 세포 당 PAL 생산 (μg)은 PAL 생산 균주 간에 필적하는 것으로 밝혀졌다.
도 9A-D는 PAL을 발현하는 엘. 락티스의 경구 투여가 페닐알라닌의 혈액 농도를 낮춘다는 것을 도시한다. 음성 CTR = 락티스 없음, 볼러스 (bolus) 단독; 양성 CTR = 엘. 락티스 균주 NZ9000[pAGX1886], 니신 유도된 PAL (AGX No 3151); 엘. 락티스-PAL = sAGX0599 (AGX No 2947), PAL 분비; 엘. 락티스-PAL + TFF3-CmbA= sAGX0645 점막부착 균주 (AGX No 3290), PAL 분비 및 표면 TFF3-CmbA 포함, 이는 세포 및 점막 부착성임. 도 9A-B는 방사선표지된 Phe의 볼러스 투여 후의 시간 동안 측정된 Phe 및 Tyr의 혈액 수준을 도시하며, 도 9C-D는 상응하는 AUC를 도시한다. 신규 작제물은 혈액 Phe의 더 낮은 수준과 관련된다. Phe의 최종 수준은 PAL 및 TFF3-CmbA 융합 단백질을 발현하는 엘. 락티스 투여된 마우스에서 가장 낮다.
본 발명은, 뮤신으로의 향상된 시험관내 결합 및 세포로의 향상된 시험관내 결합, 예를 들어, Caco-2 세포로의 부착성을 나타내는 미생물 (예를 들어, 락트산 박테리아, 예컨대, 락토코커스 락티스)를 제공한다. 일부 실시형태에서, 이러한 미생물은 증가된 GI 통과 시간을 갖는다. 예를 들어, 이러한 미생물은 치료 폴리펩티드를 추가적으로 발현할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 박테리아의 포유류 대상체로의 경구 투여시, GI-관의 상이한 부분에서의 박테리아의 체류 시간이 증가되며, 대상체는 장기간 동안 GI 관에서 치료 폴리펩티드에 노출된다. 예를 들어, 박테리아가 예컨대 십이지장에서 보호 코팅된 캡슐로부터 방출되면, 공장 및 회장에서 박테리아의 체류 시간은, 장 점막에 결합하거나 또는 이와 상호작용하는 점막 및 세포-부착성 단백질의 표면 표시/발현에 의해 연장된다. 결과적으로, 박테리아의 투여량은 감소될 수 있으며, 더 낮은 발현 프로파일을 갖는 미생물은 치료학적 유효량의 투여에 허용가능해지고, 더 작은 단위 투여형이 개발되어, 덜 빈번한 투여를 갖는 요법이 사용될 수 있다 (예를 들어, 환자 순응도 증가).
예를 들어, 본 발명은 락토코커스 락티스의 표면에 락토바실러스 루테리의 세포 및 점액 결합 단백질 A (CmbA)를 갖는 인간 트레포일 인자 3 (hTFF3)의 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산을 함유하는 미생물을 제공한다. 예시적인 융합 단백질은 hTFF3 (참조: 예를 들어, Tomasetto et al., Gastroenterology 2000, 118(1):70-80) 및 락토바실러스 루테리 CmbA (예를 들어, 이의 분비 신호 없음)에 융합된, 락토코커스 락티스 단백질 usp45 (참조: 예를 들어, Van Asseldonk et al., Mol. Gen. Genet. 1993, 240:428-434)의 분비 신호로 구성된다. SSusp45-hTFF3-CmbA 융합 단백질은 usp45 분비 신호를 통해 분비되며, 분비 신호 펩티드는 hTFF3-CmbA 융합 단백질이 락토코커스 락티스 세포질 막을 통과하는 경우 절단된다. CmbA의 바깥 부분은 장 상피 세포에 결합할 수 있다. CmbA 단백질의 hTFF3로의 융합으로써, 추가적인 점액 결합 단위가 추가된다. hTFF3-CmbA의 발현 및 표면 제시는 장 점막으로의 증가된 부착을 가능하게 하고, 변형된 락토코커스 락티스 세포의 더 느린 GI- 통과 시간을 야기하였다.
정의
명세서 및 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수형 "하나" 및 "하나의"는 문맥상 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수의 언급을 포함한다. 예를 들어, 용어 "세포"는 이의 혼합물을 비롯한 다수의 세포를 포함한다. 유사하게는, 본원에 지개된 치료 또는 약제의 제조를 위한 "화합물"의 용도는 문맥상 달리 명확하게 지시하지 않는 한 이러한 치료 또는 제조를 위한 본 발명의 하나 이상의 화합물을 사용함을 고려한다.
본원에 사용된 기준 수치값 및 이의 문법적 등가물과 관련한 용어 "약"은, 기준 수치값 자체 및 기준 수치값에서 -10% 또는 +10%의 범위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 용어 "약 10"은 10 및 9 내지 11을 비롯한 임의의 양을 포함한다. 일부 경우, 기준 수치값과 관련한 용어 "약"은 기준 수치값에서 + 또는 - 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%의 범위를 또한 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 특정 방법으로 측정된 수 또는 범위와 관련한 "약"은 주어진 수치값이 이러한 방법의 가변성으로 측정된 값을 포함한다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는"은 나열된 요소를 포함하나 다른 요소를 배제하지 않는 조성물 및 방법을 의미하는 것으로 의도된다. 조성물 및 방법을 정의하는데 사용되는 경우 "~으로 필수적으로 이루어진"은 조합에 관한 임의의 본직적인 의미의 다른 요소를 제외한다. 따라서, 본원에 정의된 바와 같이 요소로 필수적으로 이루어진 조성물은 단리 및 정제 방법 및 약학적으로 허용가능한 담체, 예컨대, 인산염 완충 식염수, 보존제 등으로부터의 미량 오염물질을 배제하지 않을 것이다. "~으로 이루어진"은 본 발명의 조성물을 투여하기 위한 다른 성분 및 실질적인 방법 단계보다 더 많은 미량 원소를 제외하는 것을 의미한다. 이러한 전환 용어 각각으로 정의된 실시형태는 이러한 발명의 범주 내에 있다.
폴리펩티드 서열의 동일성 백분율은 기준 서열 (reference sequence)과 문의 서열 (query sequence)을 비교하는 상업적으로 이용가능한 알고리즘을 사용하여 계산될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 디폴드 파라미터를 사용하여 (예를 들어, BLASTP 또는 CLUSTAL, 또는 다른 정렬 소프트웨어로 측정됨) 기준 폴리펩티드 또는 이의 단편과 70%, 적어도 70%, 75%, 적어도 75%, 80%, 적어도 80%, 85%, 적어도 85%, 90%, 적어도 90%, 92%, 적어도 92%, 95%, 적어도 95%, 97%, 적어도 97%, 98%, 적어도 98%, 99% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일하다. 유사하게는, 핵산은 또한 (예를 들어, BLASTN 또는 CLUSTAL, 또는 디폴트 파라미터를 사용하는 다른 정렬 소프트웨를 사용하여 측정됨) 출발 핵산 (starting nucleic acid)에 대한 기준으로 기재될 수 있으며, 예를 들어, 기준 핵산 또는 이의 단편과 50%, 적어도 50%, 60%, 적어도 60%, 70%, 적어도 70%, 75%, 적어도 75%, 80%, 적어도 80%, 85%, 적어도 85%, 90%, 적어도 90%, 95%, 적어도 95%, 97%, 적어도 97%, 98%, 적어도 98%, 99%, 적어도 99% 또는 100% 동일할 수 있다. 하나의 분자가 더 큰 분자와 특정 백분율의 서열 동일성을 갖는 것으로 일컫는 경우, 두 분자가 최적으로 정렬 될 때, 더 작은 분자에서 잔기의 백분율은 2개의 분자가 최적으로 정렬되는 순서에 따라 큰 분자에서 일치하는 잔기가 발견된다는 것을 의미하며, 동일성 "%"(퍼센트) 더 작은 분자의 길이에 따라 계산된다.
박테리움에서 외래 단백질의 발현은 전형적으로 변형을 필요로 하는 것으로 이해되어야 한다. 이는 박테리아로 인식되지 않는 인트론 및 다른 진핵생물 핵산 모티프를 제거하고, 숙주에 대한 코돈 사용빈도를 최적화하기 위한 핵산의 변형을 포함한다.
마찬가지로, 단백질은 자연 숙주에서의 적절한 처리에 필요하나, 박테리아의 숙주에 의해 인식되지는 않는 모티프, 예를 들어, 진핵생물 또는 다른 종의 박테리아로부터의 분비 신호를 제거하기 위하여 변형된다. 따라서, 박테리아에서 발현되는 외래 단백질에 관한 기준이 생기는 경우, 당업자는 성숙한 형태를 언급하는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 인간 IL-10은 세포에서 분비된 성숙 IL-10에 존재하지 않는 분비 선도 서열을 갖는 인간 세포로 번역된다. 진핵생물의 분비 선도 서열은 박테리아에서 비기능적이다. 따라서, 엘. 락티스는 "IL-10"을 발현하는 핵산을 추가로 포함하며, 이는 성숙 IL-10 단백질을 함유한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 유전자 또는 폴리펩티드를 "발현하는" 또는 폴리펩티드 (예를 들어, PAL 또는 IL-2 폴리펩티드 또는 T1D-특이적 항원 폴리펩티드)를 "생산하는"은, 각각 "발현이 가능한" 및 "생산이 가능한" 것을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 외인성 핵산을 함유하는 미생물은 충분한 조건 (예를 들어, 충분한 수화작용 및/또는 영양분의 존재하에)하에서 외인성 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 그러나, 미생물은 암호화된 폴리펩티드를 항상 활성적으로 생산하지 않을 수 있다. 미생물 (예를 들어, 박테리움)은 건조 (예를 들어, 동결-건조)될 수 있으며, 이 상태에서는 잠복 (dormant)하는 것으로 간주될 수 있다 (즉, 폴리펩티드를 활성적으로 생산하지 않음). 그러나, 일단 미생물이 충분한 조건에 처하는 경우, 예를 들어, 대상체로 투여되고 방출되는 경우 (예를 들어, 대상체의 위장관 내에), 이는 폴리펩티드 생산을 시작할 수 있다. 따라서, 본 발명의 유전자 또는 폴리펩티드를 "발현하거나" 또는 폴리펩티드를 "생산하는" 것은 이의 "잠복" 상태에서의 미생물을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 프로모터의 맥락에서 (또는 더 나아가 유전자 발현 또는 폴리펩티드의 분비와 관련하여), 용어 "구성적인 (constitutive)"은 이의 관련 유전자의 지속적인 전사를 허용하는 프로모터를 지칭한다.
용어 "염색체적으로 통합된" 또는 "염색체 내로 통합된" 또는 이의 임의의 변형은, 핵산 서열 (예를 들어, 유전자; 오픈 리딩 프레임 (open reading frame); 폴리펩티드를 암호화하는 외인성 핵산; 프로모터; 발현 카세트 등등)이 미생물 (예를 들어, 박테리아)의 염색체 상에 위치함, 즉, 에피좀 벡터, 예컨대, 플라스미드 상에 위치하지 않는다는 것을 의미한다. 핵산 서열이 염색체적으로 통합되는 일부 실시형태에서, 이러한 염색체적으로 통합된 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드는 구성적으로 발현된다.
용어 "분비 선도 서열", "분비 선도 (secretion leader)" 및 "분비 신호 서열"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어들은 이들의 당업계에 인식된 의미에 따라 사용되며, 일반적으로, 미생물에 의해 발현되고 미생물에 의해 분비될 신호 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 유발함, 즉, 세포내 공간을 떠나는 폴리펩티드를 유발함, 예를 들어, 주변 매질 내로 분비되거나 또는 세포 벽에 고정되어, 폴리펩티드의 적어도 일부가 주변 매질, 예컨대, 미생물의 표면상에 노출되는 "신호 펩티드" 또는 "분비 신호 펩티드"를 암호화하는, 핵산 서열을 지칭한다.
치료 폴리펩티드
용어 "치료 폴리펩티드"는 치료, 예방 또는 다른 생물학적 활성 (예를 들어, 포유류 대상체에서)을 갖거나, 또는 생물학적 활성을 이끌어 내는 잠재력을 갖는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 예로는 공지된 (승인된 및 임상시험중인) 생물 제제 (biologics), 및 임의의 신호 폴리펩티드, 예컨대, 호르몬 및 시토카인 및 이의 수용체, 작용제 및 길항제를 포함한다. "치료 폴리펩티드"는 상응하는 야생형 폴리펩티드로부터 변형될 수 있다. 일부 예에서, 치료 폴리펩티드는 시토카인, 예를 들어, 인터류킨 (IL), 예컨대, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21 또는 IL-22이다.
다른 예에서, 치료 폴리펩티드는 항원이다. 이러한 실시형태에 따른 일부 예에서, 항원은 "자가-항원 (auto-antigen)" 또는 "자기-항원 (self-antigen)"이다. 용어 "자기-항원" 또는 "자가-항원"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 본원에서 자기-항원 또는 자가-항원의 당업계에 인식된 의미에 따라 사용되며, 일반적으로, 대상체 본인의 신체로부터 유래된 (대상체 본인의 신체에 의해 생산된) 폴리펩티드/단백질을 지칭하며, 여기서, 항원은 대상체 본인의 면역계에 의해 인식되고, 전형적으로 이러한 항원에 대한 항체를 생산한다. 자가면역 질환은 일반적으로 특정한 질환-특이적 자가-항원과 연관된다. 예를 들어, TID에서 대상체의 면역계는 베타-세포의 파괴 과정과 관련된 적어도 하나의 항원에 대한 항체를 생산할 수 있다. 일부 예에서, 자가-항원은 TID-특이적 항원이다. 예시적인 TID-특이적 항원은 프로인슐린 (PINS), 글루탐산 데카르복실라아제 (GAD65), 인슐린종-관련 단백질 2 (IA-2), 섬-특이적 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 소단위-관련 단백질 (IGRP), 아연 수송체 8 (ZnT8) 및 이의 임의의 조합을 포함한다. 임상적 TID는 베타-세포, 예컨대, 크로모그라닌 A, (프레프로) 섬 아밀로이드 폴리펩티드 (ppIAPP), 페리페린 및 시트룰린화된 글루코오스-조절된 단백질 (GRP) 및 이의 임의의 조합에 의해 발현되는 추가적인 후보 표적 분자와 추가로 관련될 수 있다. 상기 TID-특이적 항원에 대한 예시적인 아미노산 서열 및 핵산 서열은, 예를 들어, 가특허 출원 62/350,472 (2016년 6월 15일 출원됨)에 기재되며, 이의 개시 내용은 이의 전문이 본원에서 참고로 포함된다. 일부 예에서, T1D-특이적 항원은 PINS, 예컨대, 야생형 인간 PINS이다. 예를 들어, 수탁 번호 NM_000207.2에 함유된 CDS, 또는 이러한 야생형 인간 PINS와 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성인 서열 참조. 추가의 예시적인 PINS 뉴클레오티드 서열은 NCBI 수탁 번호 AY899304 (완전 CDS, 대안적으로 스플라이싱됨); NM_000207 (전사 변이체 1); NM_001185097 (전사 변이체 2); NM_001185098 (전사 변이체 3); NM_001291897 (전사 변이체 4) 및 이의 부분적 서열의 코딩 서열 (coding sequence)로 표시된다. 예시적인 PINS 아미노산 서열은 상기 PINS 핵산 서열 중 임의의 것으로 암호화된 것들을 포함한다.
다른 예에서, 항원은 알레르겐, 예컨대, 나무 화분 알레르겐, 잡초 화분 알레르겐, 풀 화분 알레르겐, 식품 알레르겐, 먼지-진드기 알레르겐, 곰팡이 알레르겐, 동물 비듬 알레르겐 또는 이의 조합이다. 일부 예에서, 알레르겐은 잡초 화분 알레르겐, 예를 들어, 돼지풀 화분 알레르겐이다. 다른 예에서, 알레르겐은 나무 화분 알레르겐, 예컨대, 자작나무 화분 알레르겐 또는 삼나무 화분 알레르겐이다. 또 다른 예에서, 알레르겐은 식품 알레르겐, 예컨대, 땅콩 알레르겐, 우유 알레르겐, 달걀 알레르겐, 글루텐 알레르겐 (글리아딘 에피토프) 또는 이의 조합이다. 다른 예에서, 치료 폴리펩티드는 항원 및 인터류킨, 예컨대, IL-2, IL-10 또는 IL-22이다.
추가의 예에서, 치료 폴리펩티드는 항체 또는 이의 단편이다. 예를 들어, 항체는 단일-도메인 항체 또는 나노바디이다. 예시적인 항체는 시토카인 중화 항체, 예컨대, IL-4에 대한 항체, IL-5에 대한 항체, IL-7에 대한 항체, IL-13에 대한 항체, IL-15에 대한 항체뿐만 아니라 항-TNFα 항체, 면역글로불린 E (IgE)에 대한 항체, 항-P40 및 이의 임의의 단편을 포함한다.
또 다른 예에서, 치료 폴리펩티드는 효소 또는 이의 단편 (예를 들어, 기능적 단편), 예를 들어, 페닐알라닌 암모니아 리아제 (PAL), 아미노산 데카르복실라아제 또는 이의 조합이다. 하나의 예에서, 치료 폴리펩티드는 PAL 또는 이의 기능적 단편이다. 예시적인 PAL 서열은, 예를 들어, 국제 특허 출원 공보 WO 2014/066945에 기재되며, 이의 개시 내용은 이의 전문에 본원에 참조로 포함된다. PAL은 페닐알라닌을 대사시켜, 창자 (gut)로부터 혈액으로 흡수된 Phe의 수준을 감소시킬 수 있으며, 따라서, 페닐케톤뇨증을 치료하는데 사용될 수 있다. 또한, 다른 효소는 Phe, 예컨대, 방향족 아미노산 데카르복실라아제, 예컨대, 페닐알라닌 데카르복실라아제를 분해하는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 PAL 및 제2 페닐알라닌 분해 효소를 발현하고 이를 분비하는 박테리아가 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 PAL을 발현하고 이를 분비하는 박테리아, 및 제2 페닐알라닌 분해 효소를 발현하고 이를 분비하는 또 다른 박테리아가 투여된다.
추가의 예에서, 박테리아는 Phg 흡수 및 세포내 활용을 향상시키도록 조작된다. 이러한 박테리아의 투여는 환자에 의해 흡수된 Phe의 양을 추가로 감소시킬 수 있다.
추가의 예에서, 치료 폴리펩티드는 글루카곤-유사 펩티드 1 (GLP-1), 글루카곤-유사 펩티드 2 (GLP-2), 글루카곤, 엑센딘-4 또는 이의 조합이다. 다른 예에서, 치료 폴리펩티드는 성장 인자, 예컨대, 표피 성장 인자 (EGF), 예를 들어, 인간 EGF 또는 포사인 EGF이다. 또 다른 예에서, 치료 폴리펩티드는 TFF, 예컨대, TFF1, TFF2, TFF3 또는 이의 조합이다.
일부 예에서, 치료 폴리펩티드는 면역-조절 화합물이다. 용어 "면역-조절 화합물" 또는 "면역 조절자"는 당업계에-인식된 의미에 따라 본원에서 사용된다. 면역-조절 화합물은 당업자에게 공지된 임의의 면역-조절 화합물일 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역-조절 화합물은 내성 유도 화합물 (tolerance inducing compound)이다. 내성 유도는, 예를 들어, 조절 T-세포를 유도함으로써, 또는 간접적으로, 예를 들어, 수지상 세포의 내성화 및/또는 성숙 수지상 세포에 대한 "공동-자극" 인자의 발현을 유도하는 Th2 면역 반응의 억제에 대한 미성숙 수지상 세포를 활성화함으로써, 수득될 수 있다. 면역-조절 및 면역-억제 화합물은 당업자에게 공지되며, 제한 없이, 박테리아의 대사산물, 예컨대, 스퍼구알린 (spergualin), 진균 및 스트렙토마이칼 대사산물, 예컨대, 타크롤리무스 또는 시클로스포린, 면역-억제성 시토카인, 예컨대, IL-4, IL-10, IFNα, TGFβ (조절 T-세포에 대한 선택적 애쥬번트로서) Flt3L, TSLP 및 Rank-L (선택적 면역허용성 DC 유도인자로서), 항체 및/또는 길항제 (예를 들어, 항체), 예컨대, 항-CD40L, 항-CD25, 항-CD20, 항-IgE, 항-CD3 및 단백질, 펩티드 또는 융합 단백질, 예컨대, CTL-41 g 또는 CTLA-4 작용 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역-조절 화합물은 면역-억제 화합물이다. 다른 실시형태에서, 면역-억제 화합물은 면역-억제 시토카인 또는 항체이다. 또 다른 실시형태에서, 면역-억제 시토카인은 내성-향상 시토카인 또는 항체이다. 당업자에 의하여 또한 용어 "면역-조절 화합물"은 이의 기능적 동족체를 포함한다는 것이 이해될 것이다. 기능적 동족체는 의도된 목적을 위하여 필수적으로 동일한 또는 유사한 기능을 가지나, 구조적으로 상이할 수 있는 분자이다. 일부 예에서, 면역-조절 화합물은 항-CD3 항체 또는 이의 기능적 동족체이다.
본 발명의 미생물은 하나 초과의 또는 적어도 하나의 치료 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 치료 폴리펩티드는 상기 열거된 치료 폴리펩티드 중 임의의 것의 조합일 수 있다.
질환
본 발명의 미생물 (예를 들어, 박테리아), 조성물 및 방법은, 예를 들어, 점막 부위, 예컨대, 위장 점막의 부위에서 활성적인 생활성 폴리펩티드로 치료될 수 있는 임의의 질환을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하여 치료 또는 예방될 수 있는 예시적인 질환은 자가면역 질환, 알레르기, 영양성 또는 대사성 질환, 위장 질환 및 유전적 장애 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
용어 "영양성 질환 (nutritional disease)"은 음식 또는 영양소 처리의 기능부족과 관련된 임의의 질환이며, 예를 들어, 영양실조 (malnutrition), 체중 저하 또는 다른 2차 병증 (예컨대, 부음 (bloating))을 일으킬 수 있다. "영양성 질환"은 음식 또는 음식 성분, 예컨대, 지질 및 탄수화물을 처리하는 특정 효소 (예컨대, 리파아제, 프로테아제 또는 당 분해 효소)의 불충분한 생성과 관련될 수 있다. 용어 "영양성 질환"은 정의된 병증 또는 질환이 존재하지 않는다고 하더라도 향상될 수 있는 ("대사 향상 (metabolic enhancement)") 유기체, 예를 들어, 빠르게 성장하도록 치료되거나 또는 더 높은 무게를 축적할 수 있는 특정 가축, 예컨대, 돼지, 소, 새 또는 양에서의 임의의 대사 과정을 포함한다. 일부 예에서, "영양성 질환"은 불충분한 음식 또는 음식 성분 또는 이의 비정상적 대사에 기반한 특정한 음식 또는 음식 성분에 대한 불내성 (intolerance), 예컨대, 락토오스 불내성이다. 용어 "영양성 질환"은 본원에 상호교환적으로 사용되는 "대사성 질환" 또는 "대사성 장애"에 관한 것이다. 용어 "대사성 질환"은 당업계-인식된 의미에 따라 본원에 사용되며, 일반적으로 체내의 비정상적 화학 반응이 정상적인 대사 과정을 변경하는 임의의 병증을 지칭한다. 일부 예에서, 대사성 질환은 유전적 결함으로 유발되며 유전될 수 있다. 대사성 장애의 예는 산-염기 불균형, 대사성 뇌 질환, 칼슘 대사 장애, DNA 복구-결핍 장애, 글루코오스 대사 장애, 과젖산혈증 (hyperlactatemia), 이온 대사 장애 및 지질 대사 장애를 포함한다.
영양성 또는 대사성 질환의 다른 예는, 글루코오스 및/또는 갈락토오스 흡수장애, 레슈-니한 증후군 (Lesch-Nyhan syndrome), 멩케 증후군 (Menkes syndrome), 비만, 췌장암, 프레더-윌리 증후군 (Prader-Willi syndrome), 포르피린증, 레프숨병 (Refsum disease), 탄지에르병, 윌슨병, 후를러 증후군 (Hurler syndrome) (예를 들어, 비정상적 골 구조 및 발달 지연을 특징으로 함), 니만-픽병 (Niemann-Pick disease) (예를 들어, 영아에서 간 확대, 섭식 곤란 및 신경 손상이 발생함), 테이-삭스병 (Tay-Sachs disease)(예를 들어, 유아에서의 진행성 허약에 의해 심각한 신경 손상으로 이어지는 것을 특징으로함), 고셰병 (예를 들어, 골 통증, 확대된 간 및 낮은 혈소판수를 특징으로 함); 파브리병 (예를 들어, 아동기에서 팔다리 통증 및 성인에서 신장 및 심장 질환 및 뇌졸중을 특징으로함), 크라베병 (Krabbe disease) (예를 들어, 어린이에서 진행성 신경 손상, 발달 지연을 특징으로 함); 갈락토오스혈증 (예를 들어, 당 갈락토오스의 손상된 파괴가 신생아에 의한 유방 또는 유동식 섭식 후의 황달, 구토 및 간 확대로 이어질 수 있음을 특징으로 함); 단풍시럽뇨질환 (maple syrup urine disease) (예를 들어, 체내 아미노산 조립을 유발하는 효소 BCKD의 결핍을 특징으로 함); 페닐케톤뇨증 (PKU), 글리코겐 저장 질환 (glycogen storage diseases) (예를 들어, 낮은 혈당 수준, 근육 통증 및 허약을 특징으로 함); 미토콘드리아 질환, 프리드리히 운동실조 (Friedreich ataxia) (예를 들어, 단백질 프라탁신 (frataxin)과 관련한 문제를 특징으로 하며, 이는 신경 손상, 심장 문제, 보행 불가를 유발할 수 있음) 및 퍼옥시좀 장애 (peroxisomal disorder) (예를 들어, 퍼옥시좀 내 저조한 효소 기능을 특징으로 하며, 이는 독성 대사물질의 조립으로 이어질 수 있음)를 포함한다. 퍼옥시좀 장애의 예는, 예를 들어, 젤웨거 증후군 (Zellweger syndrome)(예를 들어, 신생아에서 비정상적 안면 특징, 확대된 간 및 신경 손상을 특징으로 함) 및 부신백질이영양증 (adrenoleukodystrophy)(예를 들어, 아동기 또는 성인 초기에 신경 손상 증상을 특징으로 함)을 포함한다. 다른 영양성 또는 대사성 장애는 금속 대사 장애 (예를 들어, 체내 단백질 기능장애 및 금속 독성의 축적을 특징으로 함)을 포함한다. 예를 들어, 윌슨병 (예를 들어, 간, 뇌 및 다른 장기에서 독성 구리 수준의 축적을 특징으로 함) 및 혈색소증 (예를 들어, 유전적 혈색소증)(예를 들어, 장이 과도한 철을 흡수하여 간, 췌장, 관절 및 심장에 쌓여 손상됨)을 예로 포함한다. 영양성 또는 대사성 장애의 추가의 예는 유기적 산혈증 (organic acidemias)(예컨대, 메틸말론산증 및 프로피온산증 (propionic academia), 요소 회로 장애 (예컨대, 오르니틴 트랜스카르바밀라아제 결핍 (ornithine transcarbamylase deficiency) 및 시트룰린혈증)을 포함한다. 일부 예에서, 영양성 또는 대사성 질환은 페닐케톤뇨증 (PKU)이다. 다른 예에서, 영양성 또는 대사성 질환은 에너지 조절장애 (예를 들어, 비알콜성 지방간염 (nonalcoholic steatohepatitis))와 관련된 대사성 장애이다.
일부 예에서, 질환은 자가면역 질환이다. 예시적인 자가면역 질환은, 심근염, 심근경색후증후군, 심낭막절개술후증후군, 아급성 세균 심내막염 (subacute bacterial endocarditis: SBE), 항-사구체 기저막 신장염 (anti-glomerular basement membrane nephritis), 간질성 방광염, 루푸스 신장염, 자가면역 간염, 원발성 담증성 간경변 (PBC), 원발성 경화성 담관염, 항합성효소항체 증후군 (antisynthetase syndrome), 원형 탈모, 자가면역 혈관부종, 자가면역 프로게스테론 피부염 (autoimmune progesterone dermatitis), 자가면역 두드러기 (autoimmune urticarial), 수포성유사천포창, 흉터유사천포창, 헤르페스모양피부염, 원반모양홍반루푸스, 후천성표피수포증, 결절성 홍반, 임신성유사천포창 (gestational pemphigoid), 화농성 한선염, 편평태선, 경화태선, 선상 면역글로불린 A 질환 (LAD), 국소피부경화증, 보통천포창, 급성태선모양잔비늘증 (pityriasis lichenoides et varioliformis acuta), 무샤-하버만병 (Mucha-Habermann disease), 건선, 전신 피부경화증, 백반증, 애디슨병, 제1형 자가면역성 다선 증후군 (autoimmune polyendocrine syndrome (APS) type 1), 제2형 자가면역성 다선 증후군, 제3형 자가면역성 다선 증후군, 자가면역 췌장염 (AIP), 제1형 당뇨병, 자가면역 갑상샘염, 오즈 갑상샘염 (Ord's thyroiditis), 그레이브스 병, 자가면역 난소염, 자궁내막증, 자가면역 고환염, 쇼그렌 증후군, 자가면역 창자병증 (autoimmune enteropathy), 복강 질환, 크론병, 미세 대장염 (microscopic colitis), 궤양성 대장염, 항인지질 증후군 (APS, APLS), 재생불량 빈혈, 자가면역 용혈빈혈, 자가면역 림프세포증식 증후군, 자가면역 호중구감소증, 자가면역 혈소판감소자색반, 저온응집병, 본태성 혼합 한랭글로불린혈증, 에반스 증후군, 발작성야간혈색소뇨증, 악성 빈혈, 진성 적혈구계 무형성증, 저혈소판증, 통증 지방증, 성인 발병성 스틸병 (adult-onset Still's disease), 강직성 척추염, CREST 증후군, 약물-유발된 루푸스, 부착부염-관련 관절염 (enthesitis-related arthritis), 호산구성 근막염, 펠티 증후군 (Felty syndrome), IgG4-관련 질환, 연소성 관절염, 라임 병 (만성), 혼합 결합 조직병 (MCTD), 재발 류마티스, 안면편측 위축증 (Parry Romberg syndrome), 페르소네지-터너 증후군 (Parsonage-Turner syndrome), 건선 관절염, 반응 관절염, 재발성 다발연골염, 후복막 섬유증, 류마티스 열, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 슈니츨러 증후군 (Schnitzler syndrome), 전신 홍반 루푸스 (SLE), 미분화된 결합 조직 질환 (undifferentiated connective tissue disease: UCTD), 피부근염, 섬유근육통, 봉입체 근육염, 근육염, 중증 근무력증, 신경근육긴장증 (neuromyotonia), 방종양성 소뇌 약화 (paraneoplastic cerebellar degeneration), 다발근육염, 급성 파종성 뇌척수염 (ADEM), 급성 운동 축색돌기 신경병증 (acute motor axonal neuropathy), 항-N-메틸-D-아스파르테이트 (항-NMDA) 수용체 뇌염, 발로 동심성 경화증 (balo concentric sclerosis), 비커스테프 뇌염 (Bickerstaff's encephalitis), 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증, 길랑-바레 증후군 (Guillain-Barre syndrome), 하시모토 뇌병증 (Hashimoto's encephalopathy), 특발성 염증성 탈수초 질환 (idiopathic inflammatory demyelinating diseases), 람베르트-이튼 근무력 증후군 (Lambert-Eaton myasthenic syndrome), 다발경화증 (MS), 패턴 (pattern) II, 오슈토란 증후군 (Oshtoran Syndrome), 스트렙토코커스 관련 소아 자가면역 신경정신성 장애 (pediatric autoimmune neuropsychiatric disorder associated with streptococcus: PANDAS), 진행 염증성 신경병증 (progressive inflammatory neuropathy), 하지 불안 증후군, 강직 인간 증후군 (stiff person syndrome), 시드남 무도병 (Sydenham chorea), 횡단 척수염, 자가면역 망막병증, 자가면역 포도막염, 코간 증후군 (Cogan syndrome), 그레이브스 눈병증, 중간 포도막염 (intermediate uveitis), 목질 결막염, 무렌각막궤양 (Mooren's ulcer), 시신경 척수염, 안구간대경련-근간대경련 증후군 (opsoclonus myoclonus syndrome), 시신경염, 공막염, 수삭 증후군 (Susac's syndrome), 교감성 안염, 톨로사-헌트 증후군 (Tolosa-Hunt syndrome), 자가면역 내이 질환 (AIED), 메니에르 병, 베체트 병, 다발혈관염을 동반한 호산구 육아종증 (eosinophilic granulomatosis with polyangiitis: EGPA), 거대세포 동맥염, 다발혈관염을 동반한 육아종증 (granulomatosis with polyangiitis: GPA), IgA 혈관염 (IgAV), 가와사키 병, 백혈구파괴 혈관염, 루푸스 혈관염, 류마티스 혈관염, 현미경적 다발혈관염 (MPA), 결절 다발동맥염 (PAN), 류마티스성 다발성근육통, 두드러기 혈관염, 혈관염 및 원발성 면역결핍을 포함한다. 일부 예에서, 자가면역 질환은 제1형 당뇨병 (T1D)이다.
다른 예에서, 질환은 위장 질환, 예컨대, 작은 창자 증후군, 복강 질환 또는 염증성 장 질환 (IBD), 예를 들어, 크론병 또는 궤양성 대장염이다.
일부 예에서, 질환은 염증성 질환 (예를 들어, Th2 및/또는 IgE 유발된 염증)이다. 예시적인 염증성 질환은, 보통 여드름 (acne vulgaris), 천식, 자가-염증성 질환, 만성 전립선염, 사구체신염, 과민증, 염증성 장 질환 (IBD), 골반 염증성 질환, 재관류 손상, 류마티스 열, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 이식 거부, 이식편대 숙주병, 혈관염, 화농성 한선염, 게실염, 간질성 방광염을 포함한다. 자가염증성 질환의 예는, 가족성 지중해열 (FMF), 재발열을 동반한 고면역글로불린혈증 D (hyperimmunoglobulinemia D with recurrent fever: HIDS), 메발론산뇨증, 메발로네이트 키나아제 결핍증 (mevalonate kinase deficiency), TNF 수용체 관련 주기성 증후군 (TRAPS), 머클-웰스 증후군 (Muckle-Wells syndrome)(두드러기 청각장애 아밀로이드증 (urticaria deafness amyloidosis)), 가족성 한랭 두드러기 (familial cold urticarial), 신생아 발병 다발적전신 염증성 질환 (neonatal onset multisystem inflammatory disease: NOMID), 주기성 열, 아프타 구내염, 인두염 및 선염 (PFAPA 증후군), 블라우 증후군 (Blau syndrome), 화농성 무균 관절염 (pyogenic sterile arthritis), 괴저성 농피증, 여드름 (PAPA), 인터류킨-1-수용체 길항제의 결핍증 (DIRA)를 포함한다.
추가의 예에서, 질환은 성장 지연이다. 다른 예에서, 질환은 제2형 당뇨병 (T2D), 비만 또는 통증 (예를 들어, 신경성 통증)이다.
다른 예에서, 질환은 알레르기, 예를 들어, 나무 화분 알레르겐, 잡초 화분 알레르겐, 풀 화분 알레르겐, 식품 알레르겐, 먼지-진드기 알레르겐, 곰팡이 알레르겐, 동물 비듬 알레르겐 또는 이의 조합 중에서 선택된 알레르겐에 대한 알레르기이다. 일부 예에서, 질환은 잡초 화분 알레르겐, 예를 들어, 돼지풀 화분 알레르겐에 대한 알레르기이다. 다른 예에서, 질환은 나무 화분 알레르겐, 예컨대, 자작나무 화분 알레르겐 또는 삼나무 화분 알레르겐에 대한 알레르기이다. 또 다른 예에서, 질환은 식품 알레르겐, 예컨대, 땅콩 알레르겐, 우유 알레르겐, 달걀 알레르겐, 글루텐 알레르겐 (글리아딘 에피토프) 또는 이의 조합에 대한 알레르기이다.
페닐케톤뇨증
일부 예에서, 본 발명은 페닐케톤뇨증 (PKU)의 치료를 위한 방법을 제공한다. 용어 "페닐케톤뇨증"은 당업계-인식된 의미에 따라 본원에 사용된다. 페닐케톤뇨증 (PKU)은 아미노산 대사의 가장 만연한 장애 중 하나이다. 유전적 결함 (효소 PAH의 결핍)은 높은 수준의 혈중 페닐알라닌 (Phe)이 인지되지 않아 조기에 치료되지 않는 경우, 심각한 정신 지체로 이어질 수 있다. 식사규정을 준수하더라도, PKU 환자는 청년기 이후부터 인지기능 장애를 겪을 위험이 있다.
프로모터
"프로모터"는 일반적으로 RNA 폴리머라아제가 결합하고 전사를 개시하는 핵산 분자, 예를 들어, DNA 분자 상의 영역을 의미한다. 프로모터는, 예를 들어, 상류, 즉, 이를 제어하는 전사 서열의 5'에 위치된다. 당업자는 프로모터가 추가적인 원래의 조절 서열 또는 영역, 예컨대, 오퍼레이터와 관련될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 발현에 필요한 조절 영역의 정확한 특성은 유기체마다 다를 수 있으나, 일반적으로 원핵생물에서 (RNA 전사의 개시를 지시하는) 프로모터뿐만 아니라 RNA로 전사된 경우에 단백질 합성의 개시를 신호전달 할 DNA 모두를 함유하는 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 이러한 영역은 보통 전사 및 번역의 개시와 관련된 이러한 5'-비-코딩 서열, 예컨대, 프립노우-박스 (Pribnow-box)(cf. TATA-박스)를 포함할 것이다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 기재된 성분이 이의 의도된 방식으로 기능하도록 하는 관계에 있는, 근접부위 (juxtaposition)를 지칭한다. 코딩 서열에 대해 "작동 가능하게 연결된" 조절 서열은 코딩 서열의 발현이 조절 서열과 양립할 수 있는 조건 하에 달성되는 방식으로 결찰된다. 예를 들어, 프로모터는, 결합 (linkage) 또는 연결이 상기 유전자의 전사를 허용하거나 이에 영향을 미치는 경우, 유전자, 오픈 리딩 프레임 또는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되어 있다고 한다. 추가의 예에서, 5' 및 3' 유전자, 시스트론, 오픈 리딩 프레임 또는 코딩 서열은, 결합 또는 연결이 적어도 3' 유전자의 번역을 허용하거나 이에 영향을 끼치는 경우, 폴리시스트론성 발현 단위에 작동 가능하게 연결되어 있다고 한다. 예를 들어, DNA 서열, 예컨대, 프로모터 및 오픈 리딩 프레임은, 서열 간의 결합 특성이 (1) 프레임-시프트 돌연변이를 도입하지 않거나, (2) 오픈 리딩 프레임의 전사를 지시하는 프로모터의 능력을 방해하지 않거나, 또는 (3) 프로모터 영역 서열에 의해 전사되는 오픈 리딩 프레임의 능력을 방해하지 않는 경우, 작동 가능하게 연결되어 있다고 한다.
발현 카세트
용어 "발현 카세트" 또는 "발현 단위 (expression unit)"는 당업계에 일반적으로 허용되는 의미에 따라 사용되며, 하나 이상의 유전자의 발현을 조절하는 하나 이상의 유전자 및 서열을 함유하는 핵산을 지칭한다. 예시적인 발현 카세트는 적어도 하나의 프로모터 서열 및 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임을 함유한다.
폴리시스트론성 발현 카세트
용어 "폴리시스트론성 발현 카세트," "폴리시스트론성 발현 단위" 또는 "폴리시스트론성 발현 시스템"은 상호교환적으로 본원에 사용되며, 당업계에 일반적으로 허용되는 의미에 따라 사용된다. 이들은, 2개 이상의 유전자의 발현이 일반적인 조절 메커니즘, 예컨대, 프로모터, 오퍼레이터 등에 의해 조절되는, 핵산 서열을 지칭한다. 본원에 사용되는 용어 폴리시스트론성 발현 단위는 멀티시스트론성 (multicistronic) 발현 단위와 의미가 같다. 폴리시스트론성 발현 단위의 예는, 제한 없이, 비시스트론성 (bicistronic), 트리시스트론성, 테트라시스트론성 발현 단위이다. 개별적인 발현 산물, 예컨대, 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드를 암호화하는 2개 이상, 예컨대, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 오픈 리딩 프레임 또는 코딩 영역을 포함하는 임의의 mRNA는 용어 폴리시스트론성 내에 포함된다. 폴리시스트론성 발현 카세트는 적어도 하나의 프로모터, 및 프로모터에 의해 조절되는 적어도 2개의 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 여기서, 유전자간 영역은 2개 오픈 리딩 프레임 사이에 임의로 배치된다.
일부 예에서, "폴리시스트론성 발현 카세트"는 하나 이상의 내인성 유전자 및 미생물 (예를 들어, LAB)에 대해 내인성인 프로모터에 의해 전사적으로 조절되는 하나 이상의 외인성 유전자를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 폴리시스트론성 발현 단위 또는 시스템은 미생물 (예를 들어, LAB)에 대해 외인성인 프로모터에 의해 전사적으로 조절된다. 추가의 실시형태에서, 본원에 기재된 번역적으로 또는 전사적으로 커플링된 하나 이상의 내인성 유전자 및 하나 이상의 외인성 유전자는, 상기 하나 이상의 (하나의) 내인성 유전자의 원래의 (native) 프로모터에 의해 전사적으로 조절된다. 또 다른 실시형태에서, 폴리시스트론성 발현 단위는 상기 폴리시스트론성 발현 단위에 포함된 상기 하나 이상의 (하나의) 내인성 유전자의 원래의 프로모터에 의해 전사적으로 조절된다. 또 다른 실시형태에서, 폴리시스트론성 발현 단위는 그람-양성 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 예시적인 실시형태에서, 프로모터는 상류, 즉, 작동 가능하게 연결된 오픈 리딩 프레임의 5'에 위치될 수 있다. 추가의 실시형태에서, 프로모터는 폴리시스트론성 발현 단위에서 가장 5', 즉, 가장 상류의 내인성 유전자의 원래의 프로모터이다. 따라서, 일부 예에서, 폴리시스트론성 발현 단위는 내인성 유전자, 및 상기 하나 이상의 내인성 유전자의 3' 말단, 예를 들어, 상기 하나 이상의 외인성 유전자가 폴리시스트론성 발현 단위의 가장 3' 유전자인, 3' 말단에 전사적으로 커플링된 하나 이상의 외인성 유전자를 함유한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "번역적으로 커플링된 (translationally coupled)"은 "번역적으로 결합된" 또는 "번역적으로 연결된"과 의미가 같다. 이러한 용어는 본질적으로 폴리시스트론성 발현 카세트 또는 단위와 관련된다. 2개 이상의 유전자, 오픈 리딩 프레임 또는 코딩 서열은, 일반적인 조절 요소, 예컨대, 특히 일반적인 프로모터가 상기 2개 이상의 유전자, 오픈 리딩 프레임 또는 코딩 서열을 암호화하는 하나의 mRNA와 같이 2개의 유전자의 전자에 영향을 미쳐, 결과적으로 2개 이상의 개별적인 폴리펩티드 서열로 번역될 수 있는 경우, 번역적으로 커플링된다고 한다. 당업자는 박테리아의 오페론이 2개 이상의 유전자가 번역적으로 또는 전사적으로 커플링되는 자연 발생 폴리시스트론성 발현 시스템 또는 단위라는 것을 이해할 것이다.
유전자간 영역
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자간 영역"은 "유전자간 링커" 또는 "유전자간 스페이서"와 의미가 같다. 유전자간 영역은 인접한 (즉, 동일한 다중핵산 서열에 위치된) 유전자, 오픈 리딩 프레임, 시스트론 또는 코딩 서열 간의 다중핵산 서열로 정의된다. 나아가, 유전자간 영역은 상기 유전자간 영역에 연결된 5' 유전자의 정지 코돈 및/또는 3' 유전자의 개시 코돈을 포함할 수 있다. 본원에 정의된 바와 같이, 용어 유전자간 영역은 구체적으로 폴리시스트론성 발현 단위의 인접 유전자 간의 유전자간 영역에 관한 것이다. 예를 들어, 본원에 정의된 유전자간 영역은 오페론의 인접한 유전자 사이에서 발현될 수 있다. 따라서, 하나의 실시형태에서, 본원에 정의된 유전자간 영역은 오페론 유전자간 영역이다.
일부 예에서, 유전자간 영역, 링커 또는 스페이서는 그람-양성 박테리움의 rplW, rpl P, rpmD, rplB, rpsG, rpsE 또는 rplN에 대해 5' 선행하는, 보다 특히 5' 직전에 선행하는 유전자간 영역 중에서 선택된다. 일부 실시형태에서, 그람-양성 박테리움은 락트산 박테리움, 예를 들어, 락토코커스 종, 예를 들어, 락토코커스 락티스 및 임의의 아종 또는 이의 균주이다. 하나의 실시형태에서, 상기 유전자간 영역은 rplW, rpl P, rpmD, rplB, rpsG, rpsE 또는 rplN의 개시 코돈 및/또는 정지 코돈에 선행하는 유전자, 즉, 5'를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 그람-양성 박테리움 또는 재조합 핵산에 관한 것이며, 여기서, 내인성 유전자 및 하나 이상의 외인성 유전자는 그람-양성 박테리움의 활성인 유전자간 영역 또는 영역에 의해 전사적으로 커플링되고, 예를 들어, 유전자간 영역 또는 영역은 상기 그람-양성 박테리움에 대해 내인성이고, 예를 들어, 여기서, 내인성 유전자간 영역은 유전자간 영역 선행하는 rplW, rpl P, rpmD, rplB, rpsG, rpsE or rplN rplM, rplE, 및 rplF 중에서 선택된다.
당업자는 유전자간 영역이 5' 정지 코돈 및/또는 3' 개시 코돈을 포함하는 경우, 일부 경우에서 이러한 각각의 코돈은, 정확한 번역 개시 및/또는 종료에 영향을 미칠 수 있는 이중 개시 및/또는 정지 코돈을 피하기 위하여, 상기 유전자간 영역에 의해 연결되는 유전자에 존재하지 않는다. 유전자간 영역을 확인하기 위한 방법은 당업계에 공지된다. 추가의 지침에 따라, 유전자간 영역은, 예를 들어, 오페론의 예측, 및 관련 프로모터 및 오픈 리딩 프레임에 기반하여 확인될 수 있으며, 이를 위한 소프트웨어가 공지되며 당업계에서 이용가능하다. 예시적인 유전자간 영역은 국제 특허 출원 공보 WO2012/164083에 기재되며, 이의 개시 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
대상체
"대상체"는 예를 들어, 본 발명의 방법에 따른 본 개시 내용의 조성물이 투여됨으로 이익을 얻을 수 있는 유기체이다. 대상체는 포유동물 ("포유류 대상체")일 수 있다. 예시적인 포유류 대상체는 인간, 가축 (예컨대, 소, 돼지, 말, 양, 염소), 애완동물 (예컨대, 개, 고양이 및 토끼) 및 다른 동물, 예컨대, 마우스, 래트 및 영장류를 포함한다. 일부 예에서, 포유류 대상체는 인간 환자이다.
점막
용어 "점막 (mucosa)" 또는 "점액성 막 (mucous membrane)"은 당업계 인식된 의미에 따라 본원에 사용된다. "점막"은 체내, 예컨대, 구강 점막, 직장 점막, 위 점막, 장 점막, 요도 점막, 질 점막, 안구 점막, 볼 점막 (buccal mucosa), 기관지 또는 폐 점막, 및 코 또는 후각 점막 (olfactory mucosa)에서 발견된 임의의 점막 일 수 있다. 또한 점막은 표면 점막, 예를 들어, 어류 및 양서류에서 발견된 점막을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "점막 전달"은, 예를 들어, 점막으로의 전달, 예를 들어, 본 발명의 조성물과 점막을 점촉시킴과 같이 이의 당업계 인식된 의미에 따라 사용된다. 구강 점막 전달은 볼, 설하 및 잇몸의 전달 경로를 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에서, "점막 전달"은 위 전달, 장 전달, 직장 전달, 볼 전달, 폐 전달, 안구 전달, 코 전달, 질 전달 및 구강 전달을 포함한다. 당업자는 구강 전달이 위장관의 윈부로의 전달에 영향을 미칠 수 있다.
용어 "점막 내성"은 대상체가 점막 경로를 통해 항원에 노출된 후, 포유류 대상체 (예를 들어, 인간 환자)에서 항원에 대한 특이적인 면역 반응성의 억제를 지칭한다. 일부 경우, 점막 내성은 전신 내성이다. 저용량 경구 내성 (oral tolerance)은 저용량 항원으로 유도된 경구 내성이며, 나이브한 (naive) 숙주에 대한 내성을 전달할 수 있는 사이클로포스파미드 감수성 조절 T-세포로 매개되는, 활성 면역 억제를 특징으로 한다. 고용량 내성은 고용량 항원으로 유도된 경구 내성이며, 사이클로포스파미드 처리에 비감수성이고, 항원 특이적 T-세포의 무반응 (anergy) 및/또는 결손에 의한 T 세포 저-반응성 (hyporesponsiveness)을 유도한다. 사이클로포스파미드에 대한 감수성의 차이는 저용량 및 고용량 내성 간의 차이를 만드는데 사용될 수 있다 (Strobel et al., 1983). 일부 경우에서, 경구 내성은 문헌[Mayer and Shao (2004)]에 기재된 저용량 경구 내성이다.
뮤신
용어 "뮤신"은 당업계-인식된 의미에 따라 본원에 사용된다. 인간 및 동물에서의 상피 조직으로 생성되는 고 분자량의 글리코실화된 단백질 (당포합체 (glycoconjugate))의 패밀리이다. 뮤신은 젤을 형성하는 능력을 가지며, 젤-유사 분비의 핵심 성분이다. 일부 뮤신은 소수성 막-신장 도메인 (membrane-spanning domain)의 존재로 인하여 막-결합된다. 대부분의 뮤신은 점막에 따른 점액의 주요 성분이거나 또는 타액의 성분이 되도록 분비된다. 뮤신 유전자는 MUC1, MUC2, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7, MUC8, MUC12, MUC13, MUC15, MUC16, MUC17, MUC19, MUC20 및 MUC21을 포함한다. MUC2는 주로 장내에서 분비되나, 기도에서도 분비된다. 성숙한 뮤신은 2개의 독특한 영역으로 구성된다: 아미노- 및 카르복시-말단 영역은 일부 글리코실화되나 시스테인이 풍부하다. 시스테인 잔기는 뮤신 단량체 내의 및 이들 사이의 디설파이드 연결에 참여한다. 아미노산의 절반에 미치는 10 내지 80개 잔기의 다수의 직열 반복 (tandem repeat)으로 형성된 큰 중심 영역은 세린 또는 트레오닌이다. 이러한 부위는 대개 O-연결된 올리고당으로 포화된다. 뮤신 단백질 (예를 들어, MUC1)의 과발현은 다양한 종류의 암과 관련된다. 이러한 개시의 맥락에서, "뮤신"은 또한 "뮤신 제제" 또는 "뮤신을 함유하는 점액 또는 다른 제제"를 의미할 수 있다.
치료
본원에 사용되는 용어 "치료" 및 "치료하는" 등은 질환 또는 병증, 예를 들어, PKU 또는 TID의 특징적인 증상 또는 소견을 개선 또는 완화하는 것을 의미한다. 예를 들어, TID의 치료는 대상체에서 항원-특이적 면역 내성의 회복 또는 유도를 야기할 수 있다. 다른 에에서, 치료는 자가-면역 당뇨를 저지하거나 또는 자가면역 당뇨를 역전시키는 것을 의미한다. 본원에 사용된 이러한 용어는 또한 상기 질환 또는 병증으로 인한 고통 이전에 이와 관련된 질환 또는 병증 또는 증상의 중증도를 감소시키는 것을 비롯한, 질환 또는 병증 또는 질환 또는 병증과 관련된 증상의 발병을 예방 또는 지연시키는 것을 포함한다. 이러한 고통 이전의 예방 또는 감소는 본 발명의 미생물 (예를 들어, 박테리움) 또는 조성물의 투여하지 않을 시 상기 질환 또는 병증을 않는 환자로의 투여를 지칭한다. "예방"은 또한, 예를 들어, 개선 기간 이후의 질환 또는 병증 또는 이와 관련된 증상의 재발을 예방하거나 또는 재발-방지하는 것을 포함한다.
"이를 필요로 하는" 대상체의 치료는 대상체가 질환 또는 병증을 가지며, 본 발명의 치료 방법이 구체적인 질환 또는 병증의 의도적인 목적으로 수행된다는 것을 의미한다.
치료학적 유효량
본원에 사용된 용어 "치료학적 유효량"은 목적하는 치료 요법에 따라 투여할 경우 목적하는 치료적 효과 또는 반응을 이끌어 낼 본 발명의 비-병원성 미생물 또는 조성물의 양을 지칭한다. 일부 예에서, 화합물 또는 조성물은, 1회 또는 1일 수회 투여되는 경우 치료학적 유효량과 동등한 활성 성분의 양을 함유하는, 단위 투여형, 예를 들어, 정제 또는 캡슐로 제공된다.
당업자는, 목적하는 치료 효과 (예를 들어, TID의 효과적인 치료)를 달성하는 것으로 요구되는 재조합 미생물의 치료학적 유효량이, 예를 들어, 미생물에 의해 발현되는 폴리펩티드의 성질, 투여 경로 및 수령자의 연령, 체중 및 다른 특성에 따라 다를 것 이라는 것을 이해할 것이다.
분비된 폴리펩티드의 양은 최첨단 방법, 예컨대, Q-PCR 또는 ELISA를 사용하여 측정되는 cfu에 기반하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 특정 미생물은 109 cfu 당 활성 폴리펩티드의 적어도 약 1 ng 내지 약 1 μg를 분비할 수 있다. 이에 기반하여, 당업자는 다른 cfu 용량으로 분비된 항원 폴리펩티드의 범주를 계산할 수 있다.
치료학적 유효량은 본원에 기재된 임의의 투여 요법과 관련하여 투여될 수 있다. 활성 폴리펩티드의 1일 투여량은 일일 내내 1, 2, 3, 4, 5 또는 6회 분량으로 투여될 수 있다. 더욱이, 1일 투여량은 투여 기간 사이에 임의의 수의 휴식 기간과 함께, 임의의 수의 일수 동안 투여될 수 있다. 예를 들어, 약 0.01 내지 약 3.0 M IU/일/대상체의 활성제 (예를 들어, 인터류킨)의 투여량은 총 6주 동안 매 격일로 투여될 수 있다. 다른 예에서, PAL은 각 식사마다 일당 0.1 내지 1000 mg, 예컨대, 1 내지 100 mg의 투여량으로 투여된다.
T1D-특이적 항원
일부 실시형태에서, 상기 조성물 및 방법 중 임의의 것에서, TID-특이적 항원은 TID에서 구현된 공지된 자가-항원 중에서 선택되며, 프로인슐린 (PINS); 인슐린 (INS); 글루탐산 데카르복실라아제 (GAD) (예를 들어, GAD65, GAD67 또는 GAD2); 인슐린종-관련 단백질 2 (섬 항원-2 (islet antigen-2); IA-2) (단백질 티로신 포스파타아제, 수용체 유형, N (PTPRN), 티로신 포스파타아제-유사 단백질 또는 ICA512로도 지칭), (참조: 예를 들어, Long et al., Diabetes 2013, 62 (6), 2067-2071); 섬-특이적 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 소단위-관련 단백질 (IGRP), 아연 수송체 8 (ZnT8), 크로모그라닌 A, (프레프로) 섬 아밀로이드 폴리펩티드 (ppIAPP), 페리페린, 시트룰린화된 글루코오스-조절된 단백질 (예를 들어, GRP78); 참조: 예를 들어, Rondas et al., Diabetes 2015; 64(2):573-586; and Ye et al., Diabetes 2010, 59(1):6-16), 및 이러한 항원의 2개 이상의 조합을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 조성물 및 방법에서, TID-특이적 항원은 PINS, GAD65 또는 IA-2이다. 다른 실시형태에서, 상기 조성물 및 방법에서, TID-특이적 항원은 PINS이다. 다양한 실시형태에서, TID-특이적 항원은 전장 (예를 들어, 야생형) 유전자보다 짧은 변이체 핵산 서열에 의해 암호화되며, 이러한 "다듬어진 (trimmed)" 버전은 종종 보다 효과적으로 발현되며/되거나 사용되는 미생물 (예를 들어, 락토코커스 락티스)에 의해 분비된다. 분비는 보다 효과적이나, 수많은 "다듬어진" 버전은 이들의 생물학적 활성의 모든 것 (또는 실질적인 부분)을 보유하고, 예를 들어, 충분한 Treg 자극 및/또는 내성-유도 능력을 보유한다.
미생물
본원에 제시된 실시형태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, 미생물은 비-병원성 미생물, 예를 들어, 비-병원성 및 비-침습성 박테리움이다. 다른 실시형태에서, 미생물은 비-병원성 및 비-침습성 효모이다.
일부 실시형태에서, 미생물은 사카로마이세스 종, 한세뉼라 종, 클루이베로마이세스 종, 쉬조사카로마이세스 종, 자이고사카로마이세스 종, 피키아 종, 모나스쿠스 종, 제오트쿰 (Geothchum) 종 및 야로위아 종으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 효모 균주이다. 일부 실시형태에서, 효모는 사카로마이세스 세레비시아에이다. 다른 실시형태에서, 에스. 세레비시아에는 아종 보울라디 (boulardii)이다. 본 발명의 하나의 실시형태에서, 재조합 효모 숙주-벡터 시스템은 생물학적으로 봉쇄된 시스템이다. 생물학적 봉쇄는 당업자에게 공지되며, 영양요구성 돌연변이, 예를 들어, 자살 (suicidal) 영양요구성 돌연변이, 예컨대, thyA 돌연변이 또는 이의 등가물의 도임으로 실현될 수 있다. 대안적으로, 생물학적 봉쇄는, 예를 들어, 불안정한 에피솜 작제물을 사용하여 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 운반하는 플라스미드의 수준으로 실현될 수 있으며, 이는 몇몇 세대 이후 상실된다. 여러 수준의 봉쇄, 예컨대, 플라스미드 불안정성 및 영양요구성은 조합되어, 원하는 경우, 높은 수준의 봉쇄를 확립할 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 미생물은 박테리움, 예컨대, 비-병원성 박테리움, 예를 들어, 식품 등급의 박테리아 균주이다. 일부 예에서, 비-병원성 박테리움은 그람-양성 박테리움, 예를 들어, 그람-양성 식품-등급의 박테리아 균주이다. 일부 실시형태에서, 그람-양성 식품-등급의 박테리아 균주는 락트산 발효 박테리아 균주 (즉, 락트산 박테리움 (LAB)) 또는 비피도박테리움이다.
일부 실시형태에서, 락트산 발효 박테리아 균주는 락토코커스, 락토바실러스 또는 비피도박테리움 종이다. 본원에 사용된 바와 같이, 락토코커스 또는 락토바실러스는 특정 종 또는 아종에 제한되지 않으나, 락토코커스 또는 락토바실러스 종 또는 아종 중 임의의 것을 포함하는 것을 의미한다. 예시적인 락토코커스 종은 락토코커스 가르비아에 (Lactococcus garvieae), 락토코커스 락티스, 락토코커스 피시움 (Lactococcus piscium), 락토코커스 플란타룸 (Lactococcus plantarum) 및 락토코커스 라피놀락티스 (Lactococcus raffinolactis)를 포함한다. 일부 예에서, 락토코커스 락티스는 락토코커스 락티스 아종 크레모리스, 락토코커스 락티스 아종 호르드니아에 또는 락토코커스 락티스 아종 락티스이다.
예시적인 락토바실러스 종은, 락토바실러스 아세토톨레란스 (Lactobacillus acetotolerans), 락토바실러스 아시도필루스 (Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 아길리스 (Lactobacillus agilis), 락토바실러스 알기두스 (Lactobacillus algidus), 락토바실러스 알리멘타리우스 (Lactobacillus alimentarius), 락토바실러스 아밀로일리티쿠스 (Lactobacillus amylolyticus), 락토바실러스 아밀로필루스 (Lactobacillus amylophilus), 락토바실러스 아밀로보루스 (Lactobacillus amylovorus), 락토바실러스 아니말리스 (Lactobacillus animalis), 락토바실러스 아비아리우스 (Lactobacillus aviarius), 락토바실러스 아비아리우스 아종 아라피노수스 (Lactobacillus aviarius subsp. araffinosus), 락토바실러스 아비아리우스 아종 아비아리우스 (Lactobacillus aviarius subsp. aviarius), 락토바실러스 바바리쿠스 (Lactobacillus bavaricus), 락토바실러스 비페르멘탄스 (Lactobacillus bifermentans), 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis), 락토바실러스 부크네리 (Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 불가리쿠스 (Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 카르니스 (Lactobacillus carnis), 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei), 락토바실러스 카세이 아종 알락토수스 (Lactobacillus casei subsp. alactosus), 락토바실러스 카세이 아종 카세이 (Lactobacillus casei subsp. casei), 락토바실러스 카세이 아종 슈도플란타룸 (Lactobacillus casei subsp. pseudoplantarum), 락토바실러스 카세이 아종 람노수스 (Lactobacillus casei subsp. rhamnosus), 락토바실러스 카세이 아종 톨레란스 (Lactobacillus casei subsp. tolerans), 락토바실러스 카테나포르미스 (Lactobacillus catenaformis), 락토바실러스 셀로비오수스 (Lactobacillus cellobiosus), 락토바실러스 콜리노이데스 (Lactobacillus collinoides), 락토바실러스 콘푸수스 (Lactobacillus confusus), 락토바실러스 코리니포르미스(Lactobacillus coryniformis), 락토바실러스 코리니포르미스 아종 코리니포르미스 (Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis), 락토바실러스 코리니포르미스 아종 토르쿠엔스 (Lactobacillus coryniformis subsp. torquens), 락토바실러스 크리스파투스 (Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 쿠르바투스 (Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 쿠르바투스 아종 쿠르바투스 (Lactobacillus curvatus subsp. curvatus), 락토바실러스 쿠르바투스 아종 멜리비오수스 (Lactobacillus curvatus subsp. melibiosus), 락토바실러스 델브루엑키 (Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 델브루엑키 아종 불가리쿠스 (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus), 락토바실러스 델브루엑키 아종 델브루엑키 (Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii), 락토바실러스 델브루엑키 아종 락티스 (Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis), 락토바실러스 디베르겐스 (Lactobacillus divergens), 락토바실러스 파르시미니스 (Lactobacillus farciminis), 락토바실러스 페르멘툼 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 포르니칼리스 (Lactobacillus fornicalis), 락토바실러스 프룩티보란스 (Lactobacillus fructivorans), 락토바실러스 프룩토수스 (Lactobacillus fructosus), 락토바실러스 갈리나룸 (Lactobacillus gallinarum), 락토바실러스 가세리 (Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 그라미니스 (Lactobacillus graminis), 락토바실러스 할로톨레란스 (Lactobacillus halotolerans), 락토바실러스 함스테리 (Lactobacillus hamsteri), 락토바실러스 헬베티쿠스 (Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 헤테로히오키이 (Lactobacillus heterohiochii), 락토바실러스 힐가르디이 (Lactobacillus hilgardii), 락토바실러스 호모히오치이 (Lactobacillus homohiochii), 락토바실러스 이네르스 (Lactobacillus iners), 락토바실러스 인테스티날리스 (Lactobacillus intestinalis), 락토바실러스 젠세니이 (Lactobacillus jensenii), 락토바실러스 존소니이 (Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 칸들레리 (Lactobacillus kandleri), 락토바실러스 케피리 (Lactobacillus kefiri), 락토바실러스 케피라노파시엔스 (Lactobacillus kefiranofaciens), 락토바실러스 케피르그라눔 (Lactobacillus kefirgranum), 락토바실러스 쿤케에이 (Lactobacillus kunkeei), 락토바실러스 락티스 (Lactobacillus lactis), 락토바실러스 레이크만니이 (Lactobacillus leichmannii), 락토바실러스 린드네리 (Lactobacillus lindneri), 락토바실러스 말레페르멘탄스 (Lactobacillus malefermentans), 락토바실러스 말리 (Lactobacillus mali), 락토바실러스 말타로미쿠스 (Lactobacillus maltaromicus), 락토바실러스 마니호티포란스 (Lactobacillus manihotivorans), 락토바실러스 미노르 (Lactobacillus minor), 락토바실러스 미누투스 (Lactobacillus minutus), 락토바실러스 뮤코사에 (Lactobacillus mucosae), 락토바실러스 무리누스 (Lactobacillus murinus), 락토바실러스 나겔리이 (Lactobacillus nagelii), 락토바실러스 오리스 (Lactobacillus oris), 락토바실러스 파니스 (Lactobacillus panis), 락토바실러스 파라부크네리 (Lactobacillus parabuchneri), 락토바실러스 파라카세이 (Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이 (Lactobacillus paracasei subsp. paracasei), 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스 (Lactobacillus paracasei subsp. tolerans), 락토바실러스 파라케피리 (Lactobacillus parakefiri), 락토바실러스 파랄리멘타리우스 (Lactobacillus paralimentarius), 락토바실러스 파라플란타룸 (Lactobacillus paraplantarum), 락토바실러스 펜토수스 (Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 페롤렌스 (Lactobacillus perolens), 락토바실러스 피시콜라 (Lactobacillus piscicola), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 폰티스 (Lactobacillus pontis), 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 리마에 (Lactobacillus rimae), 락토바실러스 로고사에 (Lactobacillus rogosae), 락토바실러스 루미니스 (Lactobacillus ruminis), 락토바실러스 사케이 (Lactobacillus sakei), 락토바실러스 사케이 아종 카모수스 (Lactobacillus sakei subsp. camosus), 락토바실러스 사케이 아종 사케이 (Lactobacillus sakei subsp. sakei), 락토바실러스 살리바리우스 (Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 살리바리우스 아종 살리시니우스 (Lactobacillus salivarius subsp. salicinius), 락토바실러스 살리바리우스 아종 살리바리우스 (Lactobacillus salivarius subsp. salivarius), 락토바실러스 산프란시스엔시스 (Lactobacillus sanfranciscensis), 락토바실러스 샤르페아에 (Lactobacillus sharpeae), 락토바실러스 수에비쿠스 (Lactobacillus suebicus), 락토바실러스 트리코데스 (Lactobacillus trichodes), 락토바실러스 울리 (Lactobacillus uli), 락토바실러스 박시노스테르쿠스 (Lactobacillus vaccinostercus), 락토바실러스 바지날리스 (Lactobacillus vaginalis), 락토바실러스 비리데센스 (Lactobacillus viridescens), 락토바실러스 비툴리누스 (Lactobacillus vitulinus), 락토바실러스 자일로수스 (Lactobacillus xylosus), 락토바실러스 야마나시엔시스 (Lactobacillus yamanashiensis), 락토바실러스 야마나시엔시스 아종 말리 (Lactobacillus yamanashiensis subsp. mali), 락토바실러스 야마나시엔시스 ㅇ 야아종 야먀나시엔시스 (Lactobacillus yamanashiensis subsp. Yamanashiensis), 락토바실러스 제아에 (Lactobacillus zeae), 비피도박테리움 아돌레센티스 (Bifidobacterium adolescentis), 비피도박테리움 안굴라툼 (Bifidobacterium angulatum), 비피도박테리움 비피둠 (Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 브레베 (Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 카테눌라툼 (Bifidobacterium catenulatum), 비피도박테리움 롱굼 (Bifidobacterium longum) 및 비피도박테리움 인판티스 (Bifidobacterium infantis)를 포함한다. 일부 예에서, LAB는 락토코커스 락티스 (LL)이다.
추가의 예에서, 박테리움은, 엔테로코커스 알세디니스 (Enterococcus alcedinis), 엔테로코커스 아퀴마리누스 (Enterococcus aquimarinus), 엔테로코커스 아시니 (Enterococcus asini), 엔테로코커스 아비움 (Enterococcus avium), 엔테로코커스 카카에 (Enterococcus caccae), 엔테로코커스 카멜리아에 (Enterococcus camelliae), 엔테로코커스 카닌테스티니 (Enterococcus canintestini), 엔테로코커스 카니스 (Enterococcus canis), 엔테로코커스 카셀리플라부스 (Enterococcus casseliflavus), 엔테로코커스 케코룸 (Enterococcus cecorum), 엔테로코커스 콜룸바에 (Enterococcus columbae), 엔테로코커스 데브리에세이 (Enterococcus devriesei), 엔테로코커스 디에스트람메나에 (Enterococcus diestrammenae), 엔테로코커스 디스파르 (Enterococcus dispar), 엔테로코커스 두란스 (Enterococcus durans), 엔테로코커스 에우레케니시스 (Enterococcus eurekensis), 엔테로코커스 파에칼리스 (Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 파에시움 (Enterococcus faecium), 엔테로코커스 갈리나룸 (Enterococcus gallinarum), 엔테로코커스 길부스 (Enterococcus gilvus), 엔테로코커스 하에모페록시두스 (Enterococcus haemoperoxidus), 엔테로코커스 헤르마니엔시스 (Enterococcus hermanniensis), 엔테로코커스 히라에 (Enterococcus hirae), 엔테로코커스 이탈리쿠스 (Enterococcus italicus), 엔테로코커스 락티스 (Enterococcus lactis), 엔테로코커스 레마니이 (Enterococcus lemanii), 엔테로코커스 말로도라투스 (Enterococcus malodoratus), 엔테로코커스 모라비엔시스 (Enterococcus moraviensis), 엔테로코커스 문드티이 (Enterococcus mundtii), 엔테로코커스 올리바에 (Enterococcus olivae), 엔테로코커스 팔렌스 (Enterococcus pallens), 엔테로코커스 포에니쿨리콜라 (Enterococcus phoeniculicola), 엔테로코커스 플란타룸 (Enterococcus plantarum), 엔테로코커스 슈도아비움 (Enterococcus pseudoavium), 엔테로코커스 쿠에베켄시스 (Enterococcus quebecensis), 엔테로코커스 라피노수스 (Enterococcus raffinosus), 엔테로코커스 랏티 (Enterococcus ratti), 엔테로코커스 리보룸 (Enterococcus rivorum), 엔테로코커스 로타이 (Enterococcus rotai), 엔테로코커스 사카롤리티쿠스 (Enterococcus saccharolyticus), 엔테로코커스 실레시아쿠스 (Enterococcus silesiacus), 엔테로코커스 솔리타리우스 (Enterococcus solitarius), 엔테로코커스 술푸레우스 (Enterococcus sulfureus), 엔테로코커스 테르미티스 (Enterococcus termitis), 엔테로코커스 타일란디쿠스 (Enterococcus thailandicus), 엔테로코커스 우레아시티쿠스 (Enterococcus ureasiticus), 엔테로코커스 우레일리티쿠스 (Enterococcus ureilyticus), 엔테로코커스 비익키엔시스 (Enterococcus viikkiensis), 엔테로코커스 빌로룸 (Enterococcus villorum) 및 엔테로코커스 시앙판젠시스 (Enterococcus xiangfangensis)로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
추가의 예에서, 박테리움은, 스트렙토코커스 아갈락티아에 (Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 안지노수스 (Streptococcus anginosus), 스트렙토코커스 보비스 (Streptococcus bovis), 스트렙토코커스 카니스 (Streptococcus canis), 스트렙토코커스 콘스텔라투스 (Streptococcus constellatus), 스트렙토코커스 다이스갈락티아에 (Streptococcus dysgalactiae), 스트렙토코커스 에퀴누스 (Streptococcus equinus), 스트렙토코커스 이니아에 (Streptococcus iniae), 스트렙토코커스 이테르메디우스 (Streptococcus intermedius), 스트렙토코커스 밀레리 (Streptococcus milleri), 스트렙토코커스 미티스 (Streptococcus mitis), 스트렙토코커스 무탄스 (Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 오랄리스 (Streptococcus oralis), 스트렙토코커스 파라산귀니스 (Streptococcus parasanguinis), 스트렙토코커스 페로리스 (Streptococcus peroris), 스트렙토코커스 프뉴모니아에 (Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 슈도프뉴모니아에 (Streptococcus pseudopneumoniae), 스트렙토코커스 파이로게네스 (Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 랏티 (Streptococcus ratti), 스트렙토코커스 살리바리우스 (Streptococcus salivarius), 스트렙토코커스 티구리누스 (Streptococcus tigurinus), 스트렙토코커스 테르모필루스 (Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 산귀니스 (Streptococcus sanguinis), 스트렙토코커스 소르비누스 (Streptococcus sobrinus), 스트렙토코커스 수이스 (Streptococcus suis), 스트렙토코커스 우베리스 (Streptococcus uberis), 스트렙토코커스 베스티불라리스 (Streptococcus vestibularis), 스트렙토코커스 비리단스 (Streptococcus viridans) 및 스트렙토코커스 주에피데미쿠스 (Streptococcus zooepidemicus)로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
본 발명의 특정 양태에서, 그람-양성 식품 등급의 박테리아 균주는 락토코커스 락티스, 또는 락토코커스 락티스 아종 크레모리스, 락토코커스 락티스 아종 호르드니아에, 및 락토코커스 락티스 아종 락티스를 비롯한, 이의 아종이다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 재조합체 그람-양성 박테리아 균주는 생물학적으로 봉쇄된 시스템, 예컨대, 우유에서 정상 성장 및 산 생성 능력을 상실한, 플라스미드가 없는 락토코커스 락티스 균주 MG1363 (Gasson, M.J. (1983) J. Bacteriol. 154:1-9); 또는 트레오닌- 및 피리미딘-영양요구성 유도체 엘. 락티스 균주 (Sorensen et al. (2000) Appl. Environ. Microbiol. 66:1253-1258; Glenting et al. (2002) 68:5051-5056) 이다.
상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, 박테리움은 이. 콜라이 (E. coli)가 아니다.
본 발명의 하나의 실시형태에서, 재조합 박테리아의 숙주-벡터 시스템은 생물학적으로 봉쇄된 시스템이다. 생물학적 봉쇄는 당업자에게 공지되며, 영양요구성 돌연변이, 예를 들어, 자살 영양요구성 돌연변이, 예컨대, thyA 돌연변이 또는 이의 등가물의 도입에 의해 실현될 수 있다. 대안적으로, 생물학적 봉쇄는, 예를 들어, 불안정한 에피솜 작제물을 사용하여 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 운반하는 플라스미드의 수준으로 실현될 수 있으며, 이는 몇몇 세대 이후 상실된다. 여러 수준의 봉쇄, 예컨대, 플라스미드 불안정성 및 영양요구성은 조합되어, 원하는 경우, 높은 수준의 봉쇄를 확립할 수 있다.
결합 및 부착 분자
용어 "결합" 및 "부착"은 본원에서 대체로 동일한 의미이다. 결합/부착은 포유류 세포 및/또는 생물학적 표면, 예컨대, 점액, 섬유결합소, 콜라겐 또는 무생물 (inanimate) 표면을 지닌 시험관내 모델로써; 및 생체내, 예를 들어, 콜로니화, 존속 또는 생물학적 효과로 암시된 것들의 측정으로써 평가될 수 있다.
이러한 결합/부착은 전형적으로 표적 분자, 세포 또는 부위에 특이적이다. 유기체는 다른 세포, 무생물체 및 세포 산물, 예컨대, 점액으로의 결합 및 부착을 촉진하는 매우 다양한 분자 (종종 폴리펩티드, 당단백질 및 탄수화물)을 생산할 수 있다. 결합 및 부착을 촉진시키는 이러한 분자는 표적 분자, 전형적으로 또 다른 단백질, 당단백질 또는 탄수화물로의 다양한 정도의 특이성을 갖는다. 상이한 결합 분자의 발현은 상이한 생물학적 표면으로의 우선적인 결합으로 이어진다. 예를 들어, GI 관의 상이한 세포는 상이한 표면 분자를 발현하며, 특이적 포면 분자의 빈도는 GI 관에 따라 상이할 수 있다. 따라서, 박테리아 세포는 특이적 숙주 세포 또는 GI 관의 특이적 영역에 우선적으로 결합할 수 있다. 결합은 증가된 콜로니화, 표적 부위에서 표적 단백질의 전달, 증가된 GI 통과 시간 등과 관련될 수 있다. 결과적으로, GI 관에서 어떠한 부위로의 결합은 또 다른 GI 부위로의 감소된 결합과 관련될 수 있다.
박테리아의 결합 단백질의 자연적 변이는 돌연변이 및 다른 유기체를 비롯한 다른 결합 분자로부터의 모티프를 발현하기 위한 재조합으로 보충될 수 있다. 이러한 재조합 결합 단백질은 단독으로, 또는 단일 분자에서 다중 결합 특이성을 제공하기 위한 융합 단백질로 발현될 수 있다.
생물학적 표면으로 박테리움을 결합시키는 단백질을 위하여, 결합 폴리펩티드는 전형적으로 세포질로부터 외수송되며, 박테리움의 표면에 고정된다. 그람 양성 박테리아, 예컨대, 락토코커스에서, 부착 분자는 전형적으로 (a) 세포질 막을 통한 분비를 지시하는 N-말단 분비 신호 및 (b) 세포 벽으로 폴리펩티드를 고정하는 C-말단 고정 도메인 (즉, "세포 벽 고정 도메인")과 함께 발현된다. 고정 도메인 없이, 폴리펩티드는 세포외 환경에 방출된다.
예를 들어, 트레포일 인자 (TFF)는 동물 세포에 의해 분비되며, 점액에 결합하고, 점막을 치유하는 것을 비롯한 다수의 생물학적 효과를 갖는다. 박테리움은 TFF로 박테리아의 분비 신호를 재조합적으로 가함으로써, TFF를 세포외 환경으로 분비하여 점막의 치유를 촉진시키도록 조작될 수 있다. 또한, 박테리움은 분비 및 TFF로의 고정 신호 모두를 가함으로써 점액 결합 특성을 가지도록 조작될 수 있다.
세포-부착 폴리펩티드
본 발명의 일부 실시형태에서, 미생물 (예를 들어, 박테리움)은 세포-부착 폴리펩티드를 함유하는 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산을 함유한다. 세포-부착 특성, 예를 들어, 장내 세포 또는 이의 세포주로의 결합 (예를 들어, Caco-2, IEC-18 또는 HT29-MTX 세포)을 나타내는 임의의 폴리펩티드는 본 발명의 맥락에 유용하다. 세포-부착 능력은 본원에 기재된 것과 같은 당업계-인식된 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 일부 예에서, 세포-부착 폴리펩티드는 세포 및 점액-결합 단백질 A (CmbA) (참조: 예를 들어, Jensen et al., Microbiology 2014, 160(4):671-681), 점액 결합 단백질 또는 mub 도메인 단백질 (Mub) (참조: 예를 들어, Boekhorst et al., Microbiology 2006, 152(1):273-280), 점액 부착 촉진 단백질 (MapA) (참조: 예를 들어, Miyoshi et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 2006, 70(7):1622-8), 락토코컬 뮤신 결합 단백질 (MpbL) (참조: 예를 들어, Lukic' et al., Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78(22):7993-8000) 중에서 선택된다. 일부 예에서, 융합 단백질은 세포-벽 고정 펩티드, 예컨대, 스타필로코커스 아우레우스 단백질 A 고정 단편 (SpaX) (참조: 예를 들어, Steidler et al., Appl. Environ. Microbiol. 1998, 64(1):342-5)을 포함할 수 있다. 상기 개시내용의 모두는 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다. 일부 예에서, 세포-부착 폴리펩티드는 CmbA 폴리펩티드, 예컨대, 락토바실러스 루테리로부터의 CmbA이다. 예를 들어, 상기 문헌[Jensen et al.,]에 기재된 것과 같은, ATCC PTA6474 참조.
상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, 세포-부착 폴리펩티드는 서열번호 1과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CmbA 폴리펩티드이다. 상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 다른 예에서, 세포-부착 폴리펩티드는 서열번호 2와 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 외인성 핵산에 의해 암호화된 CmbA 폴리펩티드이다.
뮤신-결합 폴리펩티드
본 발명의 일부 실시형태에서, 미생물 (예를 들어, 박테리움)는 뮤신-결합 폴리펩티드를 함유하는 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산을 함유한다. 뮤신-결합 특성, 예를 들어, 뮤신 제제에 대한 시험관내 결합을 나타내는 임의의 폴리펩티드는 본 발명의 맥락에 유용하다. 뮤신-결합 능력은 본원에 기재된 바와 같은 당업계-인식된 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 예시적인 뮤신-결합 폴리펩티드는 트레포일 인자 (TFF) 폴리펩티드 (예를 들어, TFF1, TFF2 또는 TFF3) (참조: 예를 들어, Caluwaerts, S. et al., Oral. Oncol. 2010, 46:564-570) 및 MucBP 폴리펩티드 (참조: 예를 들어, Lukic et al, Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78(22):7993-8000)를 포함한다. 일부 예에서, 본 발명은 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 미생물 (예를 들어, 박테리움)을 제공하며, 여기서, 융합 단백질은 세포-부착 폴리펩티드 (예를 들어, CmbA 폴리펩티드) 및 뮤신-결합 폴리펩티드 (예를 들어, TFF 폴리펩티드)를 함유한다. 일부 예에서, TFF 폴리펩티드는 인간 TFF 폴리펩티드 (예를 들어, hTFF1, hTFF2 또는 hTFF3)이다. 상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 다른 예에서, 뮤신-결합 폴리펩티드는 서열번호 3과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산을 갖는 인간 TFF3 폴리펩티드이다. 상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 다른 예에서, 뮤신-결합 폴리펩티드는 서열번호 4와 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 외인성 핵산 서열에 의해 암호화되는 인간 TFF3 폴리펩티드이다. 일부 예에서, 뮤신-결합 폴리펩티드는 어류 TFF 폴리펩티드 또는 양서류 TFF 폴리펩티드이다. 또 다른 예에서, 뮤신-결합 폴리펩티드는 문헌[Fujita et al., Mol. Reprod. Dev. 2006, 75(7):1217-1228]에 기재된 바와 같은 트레포일-유사 도메인을 포함한다 (또는 이로 이루어진다).
작제물
일부 실시형태에서, 미생물 (예를 들어, 박테리움, 예컨대, 락토코커스 락티스)은 융합 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터 및 임의로 치료 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 융합 단백질은 점막, 예를 들어, 위장관에 존재하는 조건하에 세표 표면 상에 노출된다. 미생물 (예를 들어, 박테리움)은, 융합 단백질이 목적하는 GI 체류를 제공하기에 충분한 정도로 세포 표면 상에 노출되도록, 융합 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터를 포함할 수 있다. 당업자는 대상체에게 제공된 미생물 (예를 들어, 박테리움)을 조정하여 목적하는 양의 치료 폴리펩티드를 전달할 수 있다.
보통, 발현 벡터는, 예를 들어, 숙주 미생물 내 서열의 발현을 지시할 수 있는 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 적어도 하나의 융합 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전적 작제물을 포함할 것이다. 적절하게는, 발현될 융합 단백질은 숙주의 바람직한 코돈 사용빈도에 적응된 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다. 작제물은, 당업자에게 공지된 바와 같이, 선택된 숙주에서 작동가능한 인핸서 (enhancer), 전사 개시 서열, 신호 서열, 리포터 유전자, 전사 종결 서열 등을 비롯한 다른 적절한 요소를 추가로 함유할 수 있다.
일부 예에서, 작제물은 숙주 및/또는 숙주에 안정적으로 유지될 수 있는 형태, 예컨대, 벡터, 플라스미드 또는 미니-염색체의 형질전환에 적합한 형태이다. 프로모터 서열, 종결자 단편, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 다른 적절한 서열을 비롯한 적절한 조절 서열을 함유하는, 미생물 (예를 들어, 박테리아)로의 도입을 위한 핵산을 포함하는 적절한 벡터가 선택되거나 또는 작제될 수 있다. 벡터는 적절한 플라스미드, 바이러스 (예를 들어, 파지 또는 파지미드)일 수 있다. 추가의 세부사항을 위하여, 예를 들어, 문헌[Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press]을 참고하며, 관련 개시내용은 본원에 전체가 참고로 포함된다.
예를 들어, 핵산 작제물의 제조에서 핵산의 조작, 돌연변이유발, 서열분석 (sequencing), 세포로의 DNA 도입 및 유전자 발현, 및 단백질 분석을 위한 수많은 공지된 기술 및 프로토콜이 문헌[Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, 1992]에 상세히 기재되며, 관련 개시내용은 본원에 전체가 참고로 포함된다. 하나의 실시형태에서, 융합 단백질을 위한 코딩 서열은 오페론, 즉, 폴리-시스트론성 발현을 위한 핵산 작제물에 함유된다. 오페론에서, 프로모터로부터의 전사는, 각각이 그 자체가 리보솜 결합 부위 상류에 적절히 위치된, 하나 초과의 코딩 서열을 포함하는 mRNA를 생성한다. 따라서, 하나 초과의 폴리펩티드는 단일 mRNA로부터 번역될 수 있다. 오페론의 사용은 융합 단백질 및 조정된 치료 폴리펩티드의 발현을 가능하게 한다. 박테리아의 숙주 세포에서의 폴리시스트론성 발현 시스템은, 예를 들어, Vanden-Broucke et al.,의 U.S. 특허 출원 제2014/0105863호에 기재되며, 이의 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 실시형태에서, 안정하게 형질주입된 미생물 (예를 들어, 박테리아)에 관한 것이다. 일부 예에서, 본 발명은 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산이 숙주 세포의 염색체 내로 통합되는 미생물 (예를 들어, 박테리아)을 제공한다. 형질주입된 미생물을 안정하게 확립하기 위한 기술이 당업계에 공지되어있다. 예를 들어, 융합 단백질을 암호화하는 핵산은 상동 재조합을 통해 숙주 염색체 내로 클로닝될 수 있다. 일부 예에서, 숙주의 필수적인 유전자는 상동 재조합 이벤트, 예컨대, 유전자 결손, 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 분열되어, 필수 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 불활성 형태, 또는 필수 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 절두된 생성하는 틀이동 돌연변이 (frameshift mutation)형태를 야기한다. 하나의 실시형태에서, 필수 유전자는 thyA 유전자이다. 예시적인 기술은, 예를 들어, WO 02/090551에 기재되며, 본원에 이의 전문이 참고로 포함된다. 플라스미드 형질전환은 분열된 필수 유전자, 예를 들어, thyA 유전자를 보완하지 못하는 한, 임의의 플라스미드일 수 있다. 플라스미드는 자기-복제될 수 있고, 하나 이상의 관심있는 유전자를 운반할 수 있으며, 하나 이상의 저항성 마커를 운반할 수 있다. 일부 예에서, 플라스미드는 통합적 플라스미드 (즉, 통합 플라스미드)이다. 이러한 통합적 플라스미드는 필수 유전자의 유전자좌, 예를 들어, thyA 부위에서 통합을 야기함으로써, 필수 유전자를 분열시키는데 사용될 수 있으며, 이는 필수 유전자, 예를 들어, thyA 유전자의 기능이 분열되기 때문이다. 일부 예에서, 필수 유전자, 예컨대, thyA 유전자는, 필수 유전자, 예컨대, thyA 표적 부위로의 삽입을 표적화하는 표적 서열에 의해 플랭킹되는 (flanked), 유전자 또는 관심있는 유전자를 포함하는 카세트에 의한 이중 상동 재조합으로 대체된다. 이러한 표적 서열은 충분히 길고, 표적 부위로의 관심있는 유전자의 통합을 가능하게 할 수 있도록 충분히 상동성이라는 것을 이해할 것이다.
융합 단백질을 암호화하는 유전적 작제물은 숙주 세포내에 여분의-염색체적으로, 예를 들어, 자신의 복제 기점을 사용하여 자율적으로 복제하여 존재하거나, 또는 미생물 유전체 DNA, 예를 들어, 박테리아 또는 효모 염색체, 예를 들어, 락토코커스 염색체 내로 통합될 수 있다. 후자의 경우, 핵산의 단일 사본 또는 다중 사본이 통합될 수 있으며; 통합은 염색체의 임의의 부위, 또는 상기 기재된 바와 같이, 락토코커스, 예를 들어, 락토코커스 락티스의 기결정된 부위, 예컨대, thyA 유전자좌에서 발생할 수 있다.
그러므로, 일부 실시형태에서, 융합 단백질을 암호화하는 유전적 작제물은 숙주 세포의 염색체로의 유전적 작제물의 삽입에 영향을 끼치도록 구성되는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 예에서, 유전적 작제물의 미생물 유전체, 예를 들어, 숙주 세포의 염색체 내의 특정 부위로의 삽입은 상동 재조합으로 촉진될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전적 작제물은 숙주 세포의 염색체 내로의 통합 부위에 대한 하나 이상의 상동성 영역을 포함할 수 있다. 염색체 부위에서 서열은 천연적, 즉, 자연 발생적일 수 있거나, 또는 이전의 유전 조작으로 도입된 외인성 서열일 수 있다.
일부 예에서, 상동성 영역은 적어도 50 염기쌍 (bp), 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1000 bp 이상일 수 있다.
하나의 예에서, 유전적 작제물에 존재하는 관련 발현 단위의 한 측면에 인접한 2개의 상동성 영역이 포함될 수 있다. 이러한 형상은 관련 서열을 숙주 세포 내로 유리하게 삽입할 수 있다. 특히 박테리아의 숙주에서 상동 재조합을 위한 방법, 및 재조합체의 선별을 위한 방법은 일반적으로 당업계에 공지된다.
미생물의 형질전환 방법, 예를 들어, 원형질체 형질전환 및 전기천공은 당업자에게 공지된다.
고도의 발현은 미생물, 예를 들어, 락토코커스 락티스에 존재하는 발현 벡터 상의 상동적 발현 및/또는 분비 신호를 사용함으로써 달성될 수 있다. 발현 신호는 당업자에게 자명할 것이다. 발현 벡터는 이것이 통합되는 미생물에 따라 발현을 위하여 최적화될 수 있다. 예를 들어, 락토코커스, 락토바실러스 락티스, 카세이 및 플란타룸에서의 충분한 발현 수준을 제공하는 특이적인 발현 벡터가 공지된다. 더욱이, 비-병원성, 비-콜로니성, 비-침습성 식품-등급의 박테리움 락토코커스 락티스에서 이종 항원의 발현을 위하여 개발된 시스템이 공지된다 (참조: UK 특허 GB2278358B, 본원에 참고로 포함됨). 일부 예에서, 본 발명의 작제물은 PCT/NL95/00135 (WO-A-96/32487)에 기재된 다중-사본 발현 벡터를 포함하며, 여기서, 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 포함된다. 이러한 작제물은 높은 발현 수준의 락트산 박테리움, 특히, 락토바실러스에서의 목적하는 폴리펩티드의 발현에 적합하며, 또한, 발현된 산물을 박테리아 세포의 표면으로 지시하는데 사용될 수 있다. 작제물 (예를 들어, PCT/NL95/00135에서의)은, 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열이, 리보솜 인식 및 RNA 안정화에 필요한 적어도 최소의 서열을 포함하는 5' 비-번역된 핵산 서열에 의해 선행된다는 것을 특징으로 할 수 있다. 이는, 락트산 박테리움의 유전자 또는 구조적 또는 기능적으로 동등한 단편의 비번역된 핵산 서열의 5' 종결 부분의 적어도 5개 코돈의 단편이 (바로) 뒤따를 수 있는, 번역 개시 코돈이 뒤이어 계속 될 수 있다. 단편은 또한 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 본원에 기재된 상이한 실시형태를 비롯한 PCT/NL95/00135의 내용 및 이러한 명세서에 언급된 모든 다른 문헌이 본원에 참고로 포함된다. 본 발명의 하나의 양태는 숙주 내 이종 유전자의 고수준의 조절된 발현 및 발현과 분비와의 커플링을 허용하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, T7 박테리오파지 RNA 폴리머라아제 및 이의 동족 프로모터는 본원에 참고로 포함되는 WO 93/17117에 따른 강력한 발현 시스템을 개발하는데 사용된다. 하나의 실시형태에서, 발현 플라스미드는 pT1 NX로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용되는 프로모터는 박테리움에서 구성적으로 발현된다. 구성적 프로모터의 사용은 유발인자를 공급할 필요성 또는 발현에 대해 발생하는 다른 조절 신호를 피한다. 예를 들어, 프로모터는, 성장이 유지되지 않더라도 박테리아의 숙주 세포가 생존한 채로 남을 수 있는, 즉, 일부의 대사 활성을 보유하는 수준으로 발현을 지시한다. 유리하게는, 이러한 발현은 낮은 수준일 수 있다. 예를 들어, 발현 산물이 세포내로 축적되는 경우, 발현 수준은 세포 단백질의 약 10% 미만의, 또는 약 5% 이하, 예를 들어, 약 1 내지 3%로 발현 산물의 축적을 초래할 수 있다. 프로모터는 사용된 박테리움, 즉, 자연에서 발견된 박테리움에 대해 상동성일 수 있다. 예를 들어, 락토코컬 프로모터는 락토코커스에 사용될 수 있다. 락토코커스 락티스 (또는 다른 락토코시 (Lactococci))에서 사용하기 위한 예시적인 프로모터는 락토코커스 락티스의 염색체로부터 유래된 "P1"이다 [참조: Waterfield, N R, Lepage, R W F, Wilson, P W, et al. (1995). "The isolation of lactococcal promoters and their use in investigating bacterial luciferase synthesis in Lactococcus lactis" Gene 165(1):9-15)]. 프로모터의 또 다른 예는 usp45 프로모터이다. 다른 유용한 프로모터가 Steidler et al.,의 U.S 특허 8,759,088 및 Vandenbroucke et al.,의 U.S 특허 출원 제2014/0105863호에 기재되며, 이의 개시내용은 본원에 전문이 참고로 포함된다.
핵산 작제물 또는 작제물들은 분비 신호 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 융합 단백질을 암호화하는 핵산은, 예를 들어, 신호 서열을 암호화하는 핵산 서열을 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열에 적절하게 커플링시킴으로써, 폴리펩티드의 분비를 제공할 수 있다. 항원을 분비하기 위한 핵산을 보유하는 박테리움의 능력은 유기체의 생존가능성을 유지하는 배양 조건에서 시험관내 시험될 수 있다. 예시적인 분비 신호 서열은 그람-양성 유기체, 예컨대, Bacillus, Clostridium 및 Lactobacillus에서 활성을 갖는 임의의 것을 포함한다. 이러한 서열은, 바실러스 아밀로이퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens)의 α-아밀라아제 분비 선도 서열 또는 스타필로코커스의 일부 균주에 의해 분비된 스타필로키나아제 (Staphylokinase) 효소의 분비 선도 서열 (이는 그람-양성 및 그람-음성 숙주에서 모두 기능하는 것으로 공지됨 (참조: "Gene Expression Using Bacillus," Rapoport (1990) Current Opinion in Biotechnology 1:21-27)), 또는 수많은 다른 바실러스 효소 또는 S-층 단백질로부터의 선도 서열 (참조: pp 341-344 of Harwood and Cutting, "Molecular Biological Methods for Bacillus," John Wiley & Co. 1990)을 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 상기 분비 신호는 usp45로부터 유래된다 (Van Asseldonk et al., Mol. Gen. Genet. 1993, 240:428-434). 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 구성적으로 분비된다.
제형 및 요법
본 발명의 방법에서, 다수의 치료 폴리펩티드는 동일하거나 상이한 미생물에 의해 발현될 수 있다. 예를 들어, (a) PAL 및 아미노산 데카르복실라아제; (b) TID 특이적 항원, 예컨대, PINS 및 Treg 활성화 시토카인, 예컨대, IL-2 또는 IL-10 (c) 글루텐 항원 및 IL-2 또는 IL-10 등. 별개의 유기체에서 발현되는 경우, 하나 또는 바람직하게는 2개의 박테리아는 뮤신 및/또는 세포-결합 인자를 발현할 것이다. 2개 폴리펩티드가 상이한 미생물에 의해 발현되는 경우, 이들은 대상체에게 동일한 (예를 들어, 배합된) 제형으로 투여되거나 또는 별개의 (예를 들어, 상이한) 제형으로 투여될 수 있다. 별개의 제형은 동일한 시간 또는 상이한 시점에 투여될 수 있다. 예를 들어, 이들 각각의 제형에서의 제1 및 제2 치료 폴리펩티드 생성 미생물의 사용은 대상체에게 동시에 투여되거나 또는, 예를 들어, 투여 사이에 휴식 기간을 두고 순차적으로 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 및 제2 치료 폴리펩티드 생성 미생물은 동시에 투여된다. 일부 예에서, 이러한 실시형태에 따라, 제1 치료 폴리펩티드 미생물 및 제2 치료 폴리펩티드 미생물은 동일한 약학적 제형 또는 동시에 취해진 하나 초과의 약학적 제형에 포함된다. 일부 실시형태에서, 2개의 생활성 폴리펩티드는 IL-2 및 TID-특이적 항원 모두를 생성하는 미생물을 사용하여 대상체에게 전달된다.
일부 실시형태에서, 미생물은 예를 들어 경구 제형을 사용하여 1일 1, 2, 3, 4, 5 또는 6회 투여될 것이다. 일부 실시형태에서, 미생물은 매일, 격일, 1주 1회, 1주 2회, 1주 3회 또는 1주 4회 투여된다. 다른 실시형태에서, 치료는 매 2주에 1회 일어난다. 다른 실시형태에서, 치료는 매 3주에 1회 일어난다. 다른 실시형태에서, 치료는 매달 1회 일어난다.
방법을 위한 치료 주기의 지속기간은, 예를 들어, 질환의 치료 또는 역전, 또는 재발을 방지하기 위하여 필요에 따라 7일 내지 대상체의 일생동안이다. 일부 실시형태에서, 치료 주기는 약 30일 내지 약 2년 지속된다. 다른 실시형태에서, 대상체는 30일 내지 1.5년 동안 지속되는 치료 주기를 가질 것이다. 다른 실시형태에서, 대상체는 30일 내지 1년 동안 지속하는 치료 주기를 가질 것이다. 다른 실시형태에서, 대상체는 30일 내지 11달 동안 지속하는 치료 주기를 가질 것이다. 다른 실시형태에서, 대상체는 30일 내지 10달 동안 지속하는 치료 주기를 가질 것이다. 다른 실시형태에서, 대상체는 30일 내지 9달 동안 지속하는 치료 주기를 가질 것이다. 다른 실시형태에서, 대상체는 30일 내지 8달 동안 지속하는 치료 주기를 가질 것이다. 다른 실시형태에서, 대상체는 30일 내지 7달 동안 지속하는 치료 주기를 가질 것이다. 다른 실시형태에서, 대상체는 30일 내지 6달 동안 지속하는 치료 주기를 가질 것이다. 다른 실시형태에서, 대상체는 30일 내지 5달 동안 지속하는 치료 주기를 가질 것이다. 다른 실시형태에서, 대상체는 30일 내지 4달 동안 지속하는 치료 주기를 가질 것이다. 다른 실시형태에서, 대상체는 30일 내지 3달 동안 지속하는 치료 주기를 가질 것이다. 다른 실시형태에서, 대상체는 30일 내지 2달 동안 지속하는 치료 주기를 가질 것이다.
1일 유지 용량 (daily maintenance dose)은 대상체에서 임상적으로 바람직한 기간, 예를 들어, 1일 내지 수년까지 (예를 들어, 대상체의 남은 생애 동안); 예를 들어, 약 2년, 3년 또는 5년, 1 또는 2주, 또는 1개월 이상 및/또는 예를 들어 약 5년, 1년, 6개월, 1개월, 1주 또는 3 또는 5일까지 동안 주어질 수 있다. 약 3 내지 5일 또는 약 1주 내지 약 1년 동안의 1일 유지 용량의 투여가 일반적이다. 단위 용량 (unit dose)은 치료 효과가 관찰될 때까지 1일 2회 내지 2주 1회 투여될 수 있다.
제1 및 제2 치료 폴리펩티드를 생성하는 미생물은 질환의 치료를 위하여 단일- 또는 병용 치료법으로 전달될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 추가의 치료학적 활성제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물 및 대상체의 치료는 다른 활성 성분을 수반하지 않으며, 예를 들어, 추가의 면역-조절 물질, 예컨대, 항체 (예를 들어, TID의 치료를 위한 항-CD3)를 수반하지 않는다. 따라서, 일부 예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 본원에 기재된 (치료적 IL-2 및 항원 폴리펩티드를 발현하는) 미생물, 및 약학적으로 허용가능한 담체로 필수적으로 이루어진다.
약학적 조성물 및 담체
미생물 (예를 들어, 본원에 기재된 박테리아 또는 효모)은 순수한 형태, 다른 활성 성분과 배합된 형태 및/또는 약학적으로 허용가능한 (즉, 비독성) 부형제 또는 담체와 함께 배합된 형태로 투여될 수 있다. 용어 "약학적으로 허용가능한"은 본원에 당업계-인식된 의미에 따라 사용되며, 약학적 조성물의 다른 성분과 호환되며 이의 수령자에게 해롭지 않은 담체를 지칭한다.
본 발명의 조성물은 미생물 (예를 들어, 박테리아)의 점막으로의 전신 전달을 제공하는데 사용하기 위한 임의의 공지된 또는 달리는 적절한 유효 용량 또는 생성물로 제조될 수 있으며, 이는 약학적 조성물 및 투여형뿐만 아니라 영양제품의 형태를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제형은 경구 제형 또는 약학적 조성물이다. 이러한 실시형태에 따른 일부 예에서, 제형 또는 약학적 조성물은 다른 건조 담체와 임의로 배합된, 건조-분말 형태 (예를 들어, 동결-건조된 형태) 또는 이의 압축된 형태의 비-병원성 미생물을 포함한다. 경구 제형은 일반적으로 불활성 희석제 담체 또는 식용 담체를 포함할 것이다.
일부 예에서, 경구 제형은 제형의 장관으로의 전달을 촉진하며/하거나 미생물을 장관 (예를 들어, 회장, 소장 또는 결장) 내에 방출하고 수화시키는, 코팅을 포함하거나 캡슐화 전략을 활용한다. 미생물이 제형으로부터 방출되고 충분히 수화되면, 생활성 폴리펩티드를 발현하기 시작하여, 이후에 주변으로 방출되거나 또는 미생물의 표면 상에 발현된다. 이러한 코딩 및 캡슐화 전략 (즉, 지연-방출 전략)은 당업자에게 공지된다. 예를 들어, 문헌[U.S. 5,972,685; WO 2000/18377; 및 WO 2000/22909]을 참고하며, 이의 개시내용은 본원에 전체가 참고로 포함된다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 임의로 다른 성분, 예컨대, 덱스트란, 글루탐산 나트륨 및 폴리올과 함께, 동결건조된 또는 냉동건조된 형태의 미생물 (예를 들어, 비-병원성 박테리아)을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 예시적인 냉동 건조된 조성물은, 예를 들어, Corveleyn et al.,의 U.S. 특허 출원 제2012/0039853호에 기재되며, 이의 개시내용은 본원에 전문이 참고로 포함된다. 예시적인 제형은 냉동-건조된 박테리아 (예를 들어, 치료학적 유효량의 박테리아) 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 냉동-건조된 박테리아는 캡슐, 정제, 과립 및 분말의 형태로 제조될 수 있으며, 이들 각각은 경구로 투여될 수 있다. 대안적으로, 냉동-건조된 박테리아는 적절한 매질 중 수성 또는 유성 현탁액으로 제조되거나, 또는 동결건조된 박테리아는, 예컨대, 사용 직전의 음료와 같은 적절한 매질 중에 현탁될 수 있다.
경구 투여를 위한 제형은 위-저항성 경구 투여형일 수 있다. 예를 들어, 경구 투여형 (예를 들어, 캡슐, 정제, 펠릿 및 미세-펠릿 등)은 장이 아닌 위에서의 용해 또는 분열을 견디는 얇은 층의 부형제 (보통 중합체, 셀룰로오스 유도체 및/또는 친유성 물질)로 코팅되어, 장에서의 분해, 용해 및 흡수에 유리하게 위를 통과할 수 있다. 일부 예에서, 경구 제형은 조절 방출 (controlled release), 지속 방출 (sustained release) 또는 연장 방출 (prolonged release)의 미생물을 제공하여, 이에 암호화된 목적하는 단백질의 조절된 방출을 제공하는, 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 투여형 (예를 들어, 정제 또는 캡슐)은 전형적으로 종래의 잘 알려진 부형제, 예컨대, 친유성, 중합체성, 셀룰로오스성, 불용성, 팽윤성 부형제를 함유한다. 조절된 방출 제형은 또한 장, 결장, 생체접착 (bioadhesion) 또는 설하 전달 (즉, 치아 점막 전달) 및 기관지 전달을 비롯한 임의의 다른 전달 부위에 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물이 직장 또는 질로 투여되어야 하는 경우, 약학적 제형은 좌제 및 크림을 포함할 수 있다. 이러한 경우, 숙주 세포는 지질을 비롯한 일반적인 부형체의 혼합물 중에 현탁된다. 상기 언급된 각각의 제형은 당업계에 잘 공지되며, 예를 들어, 다음 참조문헌에 기재된다 [Hansel et al. (1990, Pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems, 5th edition, William and Wilkins); Chien 1992, (Novel drug delivery system, 2nd edition, M. Dekker); Prescott et al. (1989, Novel drug delivery, J. Wiley & Sons); Gazzaniga et al., (1994, Oral delayed release system for colonic specific delivery, Int. J. Pharm. 108:77-83)].
일부 실시형태에서, 경구 제형은 미생물에 의해 발현되는 생활성 폴리펩티드의 점막 전달 및/또는 점막 흡수를 향상시킬 수 있는 화합물을 포함한다. 다른 예에서, 제형은 제형 내 미생물의 생존가능성을 향상시키는 화합물 및/또는 이전에 방출된 화합물을 포함한다.
본 발명의 박테리아는 치료될 질환을 앓는 인간 또는 동물로의 투여를 위한 약학적 제형 중에 현탁될 수 있다. 이러한 약학적 제형은 살아있는 그람-양성 박테리아 및 투여에 적합한 매질을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 박테리아는 일반적인 부형제, 예컨대, 락토오스, 다른 당, 알칼리 및/또는 알칼리 토 스테아레이트(alkali earth stearate), 카보네이트 및/또는 설페이트 (예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 카보네이트 및 나트륨 설페이트), 카올린, 실리카, 향미제(flavorant) 및 아로마의 존재 중에서 동결건조될 수 있다. 이렇게-동결건조된 박테리아는 캡슐, 정제, 과립 및 분말 (예를 들어, 구강 세정 분말)의 형태로 제조될 수 있으며, 이들 각각은 경구 경로에 의해 투여될 수 있다. 대안적으로, 일부 그람-양성 박테리아는 적절한 매질 중 수성 현탁액으로 제조될 수 있거나, 또는 동결건조된 박테리아는 사용 직전 적절한 매질 중에 현탁될 수 있으며, 이러한 매질은 본원에 지칭된 부형제 및 글루코오스, 글리신 및 사카린나트륨과 같은 다른 부형제를 포함한다.
일부 예에서, 미생물은 임의의 적절한 방법을 사용하여 대상체의 위장관으로 국소 전달된다. 예를 들어, 창자로의 전달을 향상시키는데 미세구 전달 시스템이 사용될 수 있다. 미세구 전달 시스템은 대상체의 위장관으로의 국한된 방출 (예를 들어, 조절 방출 제형, 예컨대, 장-코팅된 제형 및 결장 제형)을 제공하는 코팅을 갖는 미세입자를 포함한다.
경구 투여를 위하여, 위저항성 (gastroresistant) 경구 투여형이 제형화될 수 있으며, 상기 투여형은 또한 그람-양성 박테리아의 조절 방출을 제공하여 이에 암호화된 목적하는 단백질 (예를 들어, IL-2)의 조절 방출을 제공하는, 화합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 경구 투여형 (캡슐, 정제, 펠릿, 과립, 분말)은 장이 아닌 위에서의 용해 또는 분열을 견디는 얇은 층의 부형제 (예를 들어, 중합체, 셀룰로오스 유도체 및/또는 친유성 물질)로 코팅되어, 장에서의 분해, 용해 및 흡수에 유리하게 위를 통과할 수 있다.
경구 투여형은 그람-양성 박테리아, 및 예를 들어, 조절 방출, 지속 방출, 연장 방출, 지효성 정제 (sustained action tablet) 또는 캡슐로서 생성된 외인성 단백질의 점진적인 방출을 허용하도록 설계될 수 있다. 이러한 투여형은 보통 종래의 잘 알려진 부형제, 예컨대, 친유성, 중합체성, 셀룰로오스성, 불용성, 팽윤성 부형제를 함유한다. 이러한 제형은 당업계에 잘 공지되며, 예를 들어, 다음 참조문헌에 기재된다 [Hansel et al., Pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems, 5th edition, William and Wilkins, 1990; Chien 1992, Novel drug delivery system, 2nd edition, M. Dekker; Prescott et al., Novel drug delivery, J.Wiley & Sons, 1989; and Gazzaniga et al., Int. J. Pharm. 108:77-83 (1994)].
약학적 투여형 (예를 들어, 캡슐)은 pH-의존성 유드라짓 폴리머 (Eudragit polymer)로 코팅되어 위액 저항성, 및 pH 6.5에서 폴리머가 용해되는 말단 회장 및 결장에서의 의도된 전달을 수득할 수 있다. 다른 유드라짓 폴리머 또는 폴리머 간의 상이한 비율을 사용함으로써, 지연된 방출 프로파일이 조정되어, 예를 들어, 십이지장 또는 공장에서 박테리아를 방출할 수 있다.
약학적 조성물은 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체를 함유한다. 적절한 부형제, 희석제 및 담체의 비-제한적인 예는, 보존제, 무기 염류, 산, 염기, 완충제, 영양소, 비타민, 충전제 및 증량제, 예컨대, 전분, 당, 만니톨 및 규소성 유도체; 결합제, 예컨대, 카복시메틸 셀룰로오스 및 다른 셀루로오스 유도체, 알기네이트, 젤라틴, 및 폴리비닐 피롤리돈; 보습제, 예컨대, 글리세롤/ 붕해제, 예컨대, 탄산칼슘 및 중탄산나트륨; 용해 지연용 작용제, 예컨대, 파라핀; 재흡수 촉진제, 예컨대, 4급 암모늄 화합물; 계면활성제, 예컨대, 아세틸 알콜, 글리세롤 모노스테아레이트; 흡착성 담체, 예컨대, 카올린 및 벤토나이트; 담체, 예컨대, 프로필렌 글리콜 및 에틸 알콜, 및 윤활제, 예컨대, 탈크, 칼슘 및 마그네슘 스테아레이트, 및 고체 폴리에틸 글리콜을 포함한다.
약학적으로 호환되는 결착제 및/또는 보조 물질이 조성물의 일부로 포함될 수 있다. 정제, 알약, 캡슐 및 구내정 (troche) 등은 하기 성분 또는 유사한 성질의 화합물 중 임의의 것을 함유할 수 있다: 결합제, 예컨대, 미정질 셀룰로오스, 트라가칸트 검 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대, 전분 또는 락토오스, 분산제, 예컨대, 알긴산, 프리모겔 (Primogel) 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예컨대, 마그네슘 스테아레이트; 활강제 (glidant), 예컨대, 콜로이드성 이산화규소; 감미제, 예컨대, 수크로오스 또는 사카린; 또는 착향료, 예컨대, 페퍼민트, 살리실산메틸 또는 오렌지 향료. 투여 단위 형태가 캡슐인 경우, 이는 상기 형태의 물질 이외에, 지방유와 같은 액체 담체를 함유할 수 있다. 또한, 투여 단위 형태는 투여 단위의 물리적 형태를 변경하는 다양한 다른 물질, 예를 들어, 당, 셸락 또는 장용 작용제의 코팅을 함유할 수 있다. 추가로, 시럽은 활성 화합물 이외에, 감미제로서 수크로오스 및 보존제, 염료, 색소 및 향료를 함유할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체의 형태 및 특성은 배합될 활성 성분의 양, 투여 경로 및 다른 공지된 변수에 의해 좌우된다는 것을 이해할 것이다. 담체는 제형의 다른 성분과 호환된다는 의미로 "허용가능"하며, 이의 수령자에게 해롭지 않아야 한다.
투여를 위한 대안적인 제제는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 비-수성 용매의 예는 디메틸설폭사이드, 알콜, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예컨대, 올리브 오일 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대, 에틸 올레이트이다. 수성 담체는 알콜 및 물의 혼합물, 완충 배지 및 염수를 포함한다. 정맥내 비히클은 유동 및 영양 보충물, 전해질 보충물, 예컨대, 링거 덱스트로스 (Ringer's dextrose)등에 기반한 것들을 포함한다. 보존제 및 다른 첨가제는 또한, 예를 들어, 항균제, 항산화제, 킬레이트화제 및 불활성 기체 등에 존재할 수 있다. 다양한 액체 제형은 염수, 알콜, DMSO 및 물 기반 용액을 비롯한 이러한 전달 방법에 가능하다.
경구 수성 제형은 부형제, 예컨대, 약학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로오스 및/또는 마그네슘 카보네이트 등을 포함한다. 이러한 조성물은, 수성 담체, 예를 들어, 물, 알콜성/수성 용액, 식염수, 비경구 비히클, 예컨대, 나트륨 클, 링거 덱스트로스 등을 추가로 포함하는, 구강 청결제 및 구강 세정제와 같은 용액의 형태를 취한다.
수성 구강 청결제는 당업계예 잘-공지된다. 구강 청결제 및 구강 세정제와 관련된 제형은, 예를 들어, 다음의 문헌에 상세히 논의되며: U.S. 특허 6,387,352, U.S. 특허 6,348,187, U.S. 특허 6,171,611, U.S. 특허 6,165,494, U.S. 특허 6,117,417, U.S. 특허 5,993,785, U.S. 특허 5,695,746, U.S. 특허 5,470,561, U.S. 특허 4,919,918, U.S. 특허 출원 제2004/0076590호, U.S. 특허 출원 제2003/0152530호 및 U.S. 특허 출원 제2002/0044910호, 이들 각각은 본 명세서의 섹션 및 명세서의 다른 모든 섹션에 참고로 구체적으로 포함된다.
다른 첨가제가 본 발명의 제형, 예컨대, 향료, 감미제 또는 착색제 또는 보존제로 존재할 수 있다. 페퍼민트 또는 스피어민트, 시나몬, 유칼립투스, 시트러스, 계피, 아니스 및 멘톨로부터의 민트가 적합한 착향료의 예이다. 착향료는 액체 조성물의 경우, 0 내지 3%, 예를 들어, 최대 2%, 예컨대, 최대 0.5%, 예를 들어, 약 0.2%의 범위의 양의 경구 조성물 중에 존재할 수 있다.
감미료는 인공 또는 천연 감미제, 예컨대, 사카린나트륨, 수크로오스, 글루코오스, 사카린, 덱스트로오스, 과당, 락토오스, 만니톨, 소르비톨, 프럭토오스, 말토오스, 자일리톨, 타우마틴, 아스파르테임, D-트립토판, 디히드로칼콘, 아세설팜 및 이의 임의의 조합을 포함하며, 이는 경구 조성물의 약 0 내지 2%, 예를 들어, 최대 1% w/w, 예컨대, 0.05 내지 0.3% w/w의 범위의 양으로 존재할 수 있다.
착색제는 적절한 천연 또는 합성 안료, 예컨대, 이산화티탄 또는 CI 42090, 또는 이의 혼합물이다. 착색제는 액체 조성물의 경우 0 내지 3%; 예를 들어, 최대 0.1%, 예컨대 최대 0.05%, 예를 들어, 약 0.005 내지 0.0005%의 범위의 양으로 조성물 중에 존재할 수 있다. 일부 예에서, 완충제의 양이 달리 목적하는 pH에 도달하도록 조정되어야 할 필요가 있는 경우, 예를 들어, 조성물의 pH를 실질적으로 변경하기에 불충분한 농도로 벤조산 나트륨이 보존제로서 첨가된다.
다른 임의의 성분은 습윤제, 계면활성제 (비-이온성, 양이온성 또는 양쪽성), 증점제, 검 및 결착제를 포함한다. 습윤제는 제형에 주요부 (body)를 부가하고, 치약 (dentifrice) 조성물 중에 수분을 유지시킨다. 또한, 습윤제는 제형을 저장하는 동안 미생물 열화 (microbial deterioration)를 방지하는데 도움이 된다. 이는 또한 상 안정성을 유지하는 것을 보조하며, 투명 또는 반투명 치약을 제형화하는 방법을 제공한다.
적절한 습윤제는, 글리세린, 자일리톨, 글리세롤 및 글리콜, 예컨대, 프로필렌 글리콜을 포함하며, 이는 각각 최대 50% w/w의 양이나, 총 습윤제는 예를 들어 조성물의 약 60 내지 80% 보다 많지 않게 존재할 수 있다. 예를 들어, 액체 조성물은 최대 약 30%의 글리세린 및 최대 약 5% 또는 약 2% w/w 자일리톨을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 계면활성제는 음이온성이 아니며, 조성물의 최대 약 6% 또는 약 1.5 내지 3%의 양으로 폴리소르베이트 20 또는 코코아미도베타인 등을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 본 발명의 경구 조성물이 액체 형태인 경우, 필름-형성제가 경구 조성물의 최대 약 3% w/w, 예컨대, 경구 조성물의 0 내지 0.1%, 또는 약 0.001 내지 0.01%, 예컨대, 약 0.005% w/w의 범위로 첨가될 수 있다. 적절한 필름-형성제는 (히알루론산 나트륨 이외에) 상품명 Gantrez로 판매되는 것들을 포함한다.
경구 또는 장 투여를 위한 액체 영양 제형은 하나 이상의 영양소, 예컨대, 지방, 탄수화물, 단백질, 비타민 및 미네랄을 포함할 수 있다. 수많은 상이한 공급원 및 탄수화물, 지질, 단백질, 미네랄 및 비타민의 유형이 공지되며, 본 발명의 영양 액체 실시형태에 사용될 수 있으나, 단, 이러한 영양소는 선택된 제형에 첨가된 성분과 호환되며, 안전하고, 이들의 사용 목적에 효과적이며, 달리는 제품의 성능을 과도하게 손상시키지 않는 것이다.
이러한 영양 액체 (nutritional liquid)는 충분한 점도, 흐름 또는 다른 물리적 또는 화학적 특성으로 제형화되어, 영양 액체를 음용 또는 투여하는 동안 더욱 효과적이며 부드러운 점막의 코팅을 제공할 수 있다. 이러한 영양 실시형태는 또한 유일한, 주요한 또는 추가의 개별적인 영양 요구를 충족시키는데 적합한 균형잡힌 영양 공급원을 나타낼 수 있다.
적절한 영양 액체의 비-제한적인 예는 다음의 문헌에 기재되며 (U. S. Patent 5,700,782 (Hwang et al.); U. S. Patent 5,869,118 (Morris et al.); and U. S. Patent 5,223,285 (DeMichele et al.), 상기 설명은 본원에 참고로 포함된다.
본원에 사용하기에 적합한 영양 단백질은 가수분해되거나, 부분적으로 가수분해되거나 또는 비-가수분해될 수 있으며, 임의의 공지된 또는 달리는 적절한 공급원, 예컨대, 우유 (예를 들어, 카제인, 유장), 동물 (예를 들어, 육류, 어류), 곡물 (예를 들어, 쌀, 옥수수), 야채 (예를 들어, 콩) 또는 이의 조합으로부터 유래될 수 있다.
영양 액체에 사용하기에 적합한 지방 또는 지질은 코코넛 오일, 대두유, 옥수수 오일, 올리브 오일, 홍화유, 고-올레산 홍화유, MCT 오일 (중쇄 트리글리세리드), 해바라기 오일, 고-올레산 해바라기 오일, 구조화된 트리글리세리드, 야자 및 야자핵 오일, 야자 올레인, 카놀라 오일, 수산유지 (marine oil), 면실유 및 이의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 영양 액체에 사용하기에 적합한 탄수화물은 단순 또는 복합한, 락토오스- 함유 또는 락토오스-비함유, 또는 이의 조합일 수 있다. 적절한 탄수화물의 비-제한적 예는 가수분해된 옥수수 전분, 말토덱스트린, 글루코오스 중합체, 수크로오스, 옥수수 시럽, 옥수수 시럽 고체, 쌀-유래된 탄수화물, 글루코오스, 프럭토오스, 락토오스, 고 프럭토오스 옥수수 시럽 및 소화가 힘든 올리고당, 예컨대, 프럭토-올리고당 (FOS) 및 이의 조합을 포함한다.
영양 액체는 임의의 다양한 비타민을 추가로 포함할 수 있으며, 이들의 비-제한적인 예는 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 티아민, 리보플라빈, 피리독신, 비타민 B12, 니아신, 엽산, 판토텐산, 비오틴, 비타민 C, 콜린, 이노시톨, 염 및 이의 유도체, 및 이의 조합을 포함한다.
영양 액체는 공지된 달리는 TID를 앓을 위험이 있거나 이를 앓고 있는 환자에서 사용하기에 적절한 임의의 다양한 미네랄을 추가로 포함할 수 있으며, 이들의 비-제한적인 예는 칼슘, 인, 마그네슘 철, 셀레늄, 망간, 구리, 요오드, 나트륨, 칼륨, 클로라이드 및 이의 조합을 포함한다.
미생물 및 특히 본 발명의 효모 및 박테리아는 또한 종래의 경구 또는 직장 투여를 위한 엘릭시르 (elixir) 또는 용액으로, 또는 비경구 투여, 예컨대, 근육내, 피하 또는 정맥내 경로에 적합한 용액으로 제형화될 수 있다. 추가적으로, 뉴클레오시드 유도체는 또한, 예를 들어, 확장된 또는 연장된 기간 동안 장관으로만 또는 장관의 특정 부분으로 활성 성분을 방출하여 효능을 추가로 향상시키는 투여형을 비롯한, 지속 또는 연장된 투여형의 제형에 적합하다. 이러한 투여형의 코팅, 외피 및 보호 매트릭스가, 예를 들어, 약학적 분야에 잘 공지된 중합체성 물질 또는 왁스로부터 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적 투여형, 예컨대, 로젠지 (lozenge), 구내정 또는 향정 (pastille)을 포함한다. 이들은 전형적으로 적절하게 맛을 낸 베이스 (base) 중 활성 성분을 함유하는 원반-형상의 고체이다. 베이스는 단단한 달콤한 사탕, 글리세린화된 젤라틴 또는 이를 형성하기에 충분한 점질물 (mucilage)을 갖는 당의 조합일 수 있다. 구내정은 구강 내에 놓이며, 여기서 이들은 천천히 용해되고, 활성 성분을 점막과 직접적으로 접촉하게 한다.
예를 들어, 유연한 물질이 형성될 때까지 분말화된 활성, 분말화된 당 및 검의 혼합물에 물을 천천히 첨가하여, 본 발명의 구내정 실시형태가 제조될 수 있다. 7%의 아카시아 분말이 사용되어 물질에 충분한 점착성을 제공할 수 있다. 물질이 펼쳐지고 평평한 물질로부터 구내정 조각이 잘려지거나, 또는 실린더로 물질이 펼쳐져 나눠질 수 있다. 각각의 잘려진 또는 나눠진 조각이 형성되고 건조되어 구내정 투여형을 형성한다.
활성 성분이 열-불안정성인 경우, 압축하여 로젠지 제제로 제조될 수 있다. 예를 들어, 제조 중 과립 단계가 임의의 압출된 정제에 사용되는 방식과 유사한 방식으로 수행된다. 중압축 장비를 사용하고 로렌지를 제조하여, 일반적인 것보다 단단한 정제를 생산할 수 있으며, 이는 구강 내에서 천천히 용해시키거나 분해하기 위한 투여형에 바람직하다. 일부 예에서, 천천히-용해되는 특성을 촉진시키기 위한 성분이 선택된다.
본 발명의 특별한 제형에서, 미생물은 예비-젤라틴화된 전분 및 가교-결합된 폴리(아크릴산)을 함유하는 생체접착성 담체 (bioadhesive carrier)에 도입되어, 볼 적용 (buccal application)에 적합한 (즉, 연장된 생체접착 및 지연된 약물 전달을 지닌) 생체접착성 정제 및 생체접착성 겔을 형성할 것이다. 예를 들어, 본 발명에 따른 비-병원성 및 비-침습성 박테리움, 생체접착성 중합체 (분무 건조를 통해 공동처리된, 예비-젤라틴화된 전분 및 가교-결합된 폴리(아크릴산)), 나트륨 스테아릴 푸마레이트 (윤활제) 및 이산화규소 (활강제)의 분말 혼합물이 정제로 처리된다 (중량: 100 mg; 직경: 7 mm). 이러한 정제의 제조를 위한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 다양한 약물 (미코나졸, 테스토스테론, 플루오라이드, 시프로플록사신)을 함유하는 생체접착성 정제의 성공적인 개발에 대하여 이전에 기재된다 [Bruschi M. L. and de Freitas O., Drug Development and Industrial Pharmacy, 2005 31:293-310]. 모든 부형제 물질은 약학적 등급으로 시중에 판매된다.
제형을 최적화하기 위하여, 정제 중의 약물 부하 및 전분 및 폴리(아크릴산) 간의 비율은 달라질 것이다. 이전의 연구에 기반하여, 보조처리된 생체접착성 담체 중의 최대 약물 부하는 약 60% (w/w)이며, 전분/폴리(아크릴산) 비율은 75/25 및 95/5 (w/w) 사이로 달라질 수 있다. 최적화 연구 동안, 정제의 생체접착성 특성 및 정제로부터의 약물 방출이 주요 평가 파라미터이며, 제2 평가 기준으로는 표준 정제 특성 (경도, 파쇄성)이 있다.
박테리아는 예비-젤라틴화된 전분 및 가교-결합된 폴리(아크릴산)의 수성 분산물로 도입된다. 이러한 중합체 분산물은 고 전단 혼합기 (high shear mixer)를 사용하여 표준 공정을 통해 제조된다.
정제와 유사하게, 겔의 약물 부하 및 전분/폴리 (아크릴산) 비율은 식도 점막으로의 최적의 부착을 가지는 겔을 수득하기 위하여 최적화될 필요가 있다. 겔의 경우, 분산물 중 중합체의 농도는 겔의 점도, 따라서, 이의 점막-부착 특성을 결정하기 때문에 추가적인 변수이다.
중합체 분산물의 식도 점막으로의 생체접착성 특성을 스크리닝하기 위한 모델이 문헌[Batchelor et al. (Int. J. Pharm., 238:123- 132, 2002)]에 기재되었다.
투여의 다른 경로 및 형태는 살아있는 미생물을 함유하는 음식 제제를 포함한다. 일부 예에서, 생활성 폴리펩티드-발현 미생물은 유제품 내에 포함될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 임의의 공지된 방법 또는 달리는 선택된 투여형을 제형화 또는 제조하기 위한 효과적인 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 미생물은 일반적인, 예컨대, 경구 정제, 캡슐, 스프레이, 로젠지, 처리된 기질 (예를 들어, 경구 또는 국소 면봉, 패드 또는 본 발명의 조성물로 처리된 일회용의 비-소화성 기질); 경구 액체 (예를 들어, 현탁액, 용액, 에멀젼), 분말, 좌제 또는 임의의 다른 적절한 투여형으로 형성되는, 약학적으로 허용가능한 담체, 예컨대, 부형제 및 희석제와 함께, 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 약학적 조성물의 제조를 위한 방법을 제공한다. 예시적인 방법은 미생물 (예를 들어, 비-병원성 박테리움)과 약학적으로 허용가능한 담체를 접촉시켜 약학적 조성물을 형성함을 포함한다. 일부 예에서, 상기 방법은 미생물을 배지에서 성장시킴을 추가로 포함한다. 상기 방법은 미생물을 함유하는 액체를 건조 (예를 들어, 동결-건조)시킴을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서, 상기 액체는 임의로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
단위 투여형
본 발명은 임의로 식품-등급 또는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께, 일정량의 본 발명의 미생물 (예를 들어, 박테리움)을 포함하는 단위 투여형을 추가로 제공한다. 예시적인 단위 투여형은 비-병원성 미생물 (예를 들어, 비-병원성 그람-양성 박테리움)의 약 1 Х 103 내지 약 1 Х 1014 콜로니-형성 단위 (cfu)를 함유한다. 다른 예시적인 단위 투여형은 비-병원성 미생물 (예를 들어, 비-병원성 그람-양성 박테리움)의 약 1 Х 104 내지 약 1 Х 1013 콜로니-형성 단위 (cfu), 또는 비-병원성 미생물 (예를 들어, 비-병원성 그람-양성 박테리움)의 약 1 Х 104 내지 약 1 Х 1012 콜로니-형성 단위 (cfu)를 함유한다. 다른 실시형태에서, 단위 투여형은 비-병원성 미생물 (예를 들어, 비-병원성 그람-양성 박테리움)의 약 1 Х 105 내지 약 1 Х 1012 콜로니-형성 단위 (cfu), 또는 약 1 Х 106 내지 약 1 Х 1012 콜로니-형성 단위 (cfu)를 포함한다. 다른 실시형태에서, 단위 투여형은 비-병원성 미생물 (예를 들어, 비-병원성 그람-양성 박테리움)의 1 Х 108 내지 약 1 Х 1012 콜로니-형성 단위 (cfu), 또는 약 1 Х 109 내지 약 1 Х 1012 콜로니-형성 단위 (cfu)를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 단위 투여형은 비-병원성 미생물 (예를 들어, 비-병원성 그람-양성 박테리움)의 약 1 Х 109 내지 약 1 Х 1011 콜로니-형성 단위 (cfu), 또는 약 1 Х 109 내지 약 1 Х 1010 콜로니-형성 단위 (cfu)를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 단위 투여형은 비-병원성 미생물 (예를 들어, 비-병원성 그람-양성 박테리움)의 약 1 Х 107 내지 약 1 Х 1011 콜로니-형성 단위 (cfu), 또는 약 1 Х 108 내지 약 1 Х 1010 콜로니-형성 단위 (cfu)를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 단위 투여형은 비-병원성 미생물 (예를 들어, 비-병원성 그람-양성 박테리움)의 약 1 Х 109 내지 약 1 Х 1010 콜로니-형성 단위 (cfu), 또는 약 1 Х 109 내지 약 100 Х 109 콜로니-형성 단위 (cfu)를 포함한다.
단위 투여형은 임의의 물리적 형태 또는 모양을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 단위 투여형은 경구 투여에 적합하다. 이러한 실시형태에 따른 일부 예에서, 단위 투여형은 캡슐, 정제 또는 과립의 형태이다. 예시적인 캡슐은 미세-과립으로 충전된 캡슐이다. 일부 실시형태에서, 투여형에 함유된 비-병원성 미생물 (예를 들어, 비-병원성 그람-양성 박테리움)은 건조-분말 형태이다. 예를 들어, 미생물은 임의로 압축되고 코팅된 동결-건조된 분말 형태이다.
본 발명은 하기의 실시예를 참고로 더 잘 이해될 것이나, 당업자는 이들이 단지 이후의 청구 범위에서 보다 완전하게 기술된 본 발명의 예시일 뿐임을 이해할 것이다. 또한, 이러한 출원을 통해, 다양한 문헌이 인용된다. 이러한 공보의 개시내용은 본 발명이 속하는 기술 수준을 더욱 완전하게 설명하기 위해 본원에 전체가 참고문헌으로 포함된다.
실시예
실시예 1
박테리아의 표면 상에 CmbA를 발현하는 락토코커스 락티스 균주의 생성
(a) CmbA의 에피솜 발현
CmbA 암호화 유전자 (참조: 서열번호 2 및 서열번호 11의 CmbA에 대한 코딩 영역, 도 5A-D)의 코돈 사용빈도를 엘. 락티스 MG1363에 대해 최적화하였다. 생성된 DNA 서열을 합성하여 제조하였다. 오버레이 (overlay) PCR 어셈블리를 사용하여, PthyA>>SSusp45 (usp45 분비 신호) 및 cmbA를 융합하여 하나의 PCR 단편을 형성하였다. PCR에 의하여 PthyA>>SSusp45-cmbA 발현 단위를 엘. 락티스 균주 MG1363의 5'thyA 및 3'thyA 영역 사이에 위치시켰다. 생성된 PCR 단편: 5'thyA>>PthyA>>SSusp45-cmbA>>3'thyA를 플라스미드 pORI19 (참조: 예를 들어, Law et al., J. Bacteriol. 1995, 177(24):7011-7018) 내로 서브클로닝하여 플라스미드 pAGX1893을 생성하였다. 플라스미드 pAGX1893를 락토코커스 락티스 균주 LL108 내로 형질전환시켜 균주 LL108[pAGX1893]을 형성하였다.
(b) 염색체 통합 (CmbA의 구성적 발현)
통합 벡터 pAGX1893을 치료 폴리펩티드 PAL (gapB>>rpmD>>pal) (서열번호 24 및 25)를 암호화하는 이종 핵산 서열을 함유하는 비시스트론성 발현 카세트를 함유하는 2개의 상이한 엘. 락티스 균주내로 전기천공시켰다. 이러한 2개 균주는 sAGX0599 및 sAGX0585 (트레할로오스 축적 균주)였다. thyA 유전자좌에서 상동 재조합 (이중-교차)에 의한 SSusp45-cmbA의 삽입을 PCR 및 생어 (Sanger) DNA 서열분석으로 확인하였다. 생성된 균주를 각각 sAGX0618 및 sAGX0619로 칭하였다.
실시예 2
박테리아의 표면 상에 MbpL를 발현하는 락토코커스 락티스 균주의 생성
(a) MbpL의 에피솜 발현 (원래의 신호 펩티드 사용)
[PthyA>>mbpL] thyA 통합/발현 벡터 pAGX1903의 작제물: MbpL 암호화 유전자 (신호 펩티드; SSmbpL 포함)의 코돈 사용빈도를 엘. 락티스 MG1363에 대해 최적화하였다. 생성된 DNA 서열을 합성하여 제조하였다. 오버레이 PCR 어셈블리를 사용하여, PthyA 및 mbpL을 융합하여 하나의 PCR 단편을 형성하였다. PCR에 의하여 PthyA>>SSmbpL>>mbpL 발현 단위 (서열번호 17)를 엘. 락티스 균주 MG1363의 5'thyA 및 3'thyA 영역 사이에 위치시켰다. 생성된 PCR 단편: 5'thyA>>PthyA>>SSmbpL>>mbpL>>3'thyA를 플라스미드 pORI19 내로 서브클로닝하여 플라스미드 pAGX1903을 생성하였고, 이를 엘. 락티스 균주 LL108 내로 형질전환시켜 균주 LL108[pAGX1903]을 형성하였다.
(b) MbpL의 에피솜 발현 (SSusp45 사용)
mbpL을 포함하는 또 다른 작제물은 MbpL 자신의 신호 펩티드 대신 분비 선도 서열 SSusp45를 포함할 수 있다. [PthyA>>SSusp45-mbpL] thyA 통합/발현 벡터를 실시예 1에 개략된 절차에 따라 제조할 수 있으며, 여기서, cmbA를 암호화하는 핵산 서열은 이의 자신의 신호 펩티드 없이 MbpL 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열로 대체할 수 있다. MbpL 암호화 유전자 (신호 펩티드 없음)를 엘. 락티스 MG1363에 대하여 최적화하였다. 생성된 DNA 서열을 합성하여 제조하였다. 오버레이 PCR 어셈블리를 사용하여, PthyA>>SSusp45 및 mbpL를 융합하여 하나의 PCR 단편을 형성하였다. PCR에 의하여 PthyA>>SSusp45-mbpL 발현 단위 (서열번호 15)를 엘. 락티스 균주 MG1363의 5'thyA 및 3'thyA 영역 사이에 위치시켰다. 생성된 PCR 단편: 5'thyA>>PthyA>>SSusp45-mbpL>>3'thyA를, 예를 들어, 플라스미드 pORI19 내로 서브클로닝하여, 또 다른 플라스미드를 생성하였으며, 이는 엘. 락티스, 예를 들어, 균주 LL108 내로 형질전환될 수 있다.
실시예 3
박테리아의 표면 상에 MapA를 발현하는 락토코커스 락티스 균주의 생성
(a) MapA의 에피솜 발현 (원래의 신호 펩티드 사용)
[PthyA>>mapA] thyA 통합/발현 벡터 pAGX1946의 작제물: mapA 암호화 유전자 (신호 펩티드 포함)를 엘. 락티스 MG1363에 대해 최적화하였다. 생성된 DNA 서열을 합성하여 제조하였다. 오버레이 PCR 어셈블리를 사용하여, PthyA 및 mapA를 융합하여 하나의 PCR 단편을 형성하였다. PCR에 의하여 PthyA>>SSmapA>>mapA 발현 단위 (서열번호 21)를 엘. 락티스 균주 MG1363의 5'thyA 및 3'thyA 영역 사이에 위치시켰다. 생성된 PCR 단편: 5'thyA>>PthyA>>SSmapA>>mapA>>3'thyA를 플라스미드 pORI19 내로 서브클로닝하여 플라스미드 pAGX1946을 생성하였고, 이를 엘. 락티스 균주 LL108 내로 형질전환시켜 균주 LL108[pAGX1946]을 형성하였다.
(b) MapA의 에피솜 발현 (SSusp45 사용)
mapA를 포함하는 또 다른 작제물은 MapA 자신의 신호 펩티드 대신 분비 선도 서열 SSusp45를 포함할 수 있다. [PthyA>>SSusp45>>mapA] thyA 통합/발현 벡터를 실시예 1에 개략된 절차에 따라 제조할 수 있으며, 여기서, cmbA를 암호화하는 핵산 서열은 이의 자신의 신호 펩티드 없이 MapA 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열로 대체할 수 있다. MbpL 암호화 유전자 (신호 펩티드 없음)를 엘. 락티스 MG1363에 대하여 최적화하였다. 생성된 DNA 서열은 합성하여 제조할 수 있다. 오버레이 PCR 어셈블리를 사용하여, PthyA>>SSusp45 및 mapA를 융합하여 (신호 펩티드 없음) 하나의 PCR 단편을 형성하였다. PCR에 의하여 PthyA>>SSusp45-mapA 발현 단위 (서열번호 19)를 엘. 락티스 균주 MG1363의 5'thyA 및 3'thyA 영역 사이에 위치시켰다. 생성된 PCR 단편: 5'thyA>>PthyA>>SSusp45-mapA>>3'thyA를, 예를 들어, 플라스미드 pORI19 내로 서브클로닝하여, 또 다른 플라스미드를 생성하였고, 이는 엘. 락티스, 예를 들어, 균주 LL108 내로 형질전환될 수 있다.
실시예 4
박테리아의 표면 상에 hTFF3-CmbA 융합 단백질을 발현하는 락토코커스 락티스 균주
(a) hTFF3의 발현
도 4는 C-말단 부착 폴리펩티드와 함께, 융합 단백질의 N-말단 부분으로 사용될 수 있는 예시적인 SSusp45-htff3 작제물 (아미노산 및 핵산 서열)을 예시한다. PCR 융합 또는 보다 전통적인 결찰로 C-말단 부착 폴리펩티드를 첨가할 수 있다.
(b) hTFF3-CmbA의 에피솜 발현
[PthyA>>SSusp45-hTFF3-cmbA] thyA 통합/발현 벡터를 작제하였다. hTFF3 및 CmbA를 암호화하는 (신호 펩티드 없음) 유전자의 코돈 사용빈도를 엘. 락티스 MG1363에 대하여 최적화하였다. 생성된 htff3 및 cmbA DNA 서열을 합성하여 제조하였다. 오버레이 PCR 어셈블리를 사용하여, PthyA>>SSusp45, hTFF3 및 cmbA를 융합하여 하나의 PCR 단편을 형성하였다. PCR에 의하여 PthyA>>SSusp45-hTFF3-cmbA 발현 단위 (참조: 서열번호 11 및 도 5A-D)를 엘. 락티스 균주 MG1363의 5'thyA 및 3'thyA 영역 사이에 위치시켰다. 생성된 PCR 단편: 5'thyA>>PthyA>>SSusp45-hTFF3-cmbA>>3'thyA를 플라스미드 pORI19 [Law et al., 1995 supra] 내로 서브클로닝하여 플리스미드 pAGX2005를 생성하였고 (도 1 참조), 이를 엘. 락티스 균주 LL108 내로 형질전환시켜 균주 LL108[pAGX2005]를 형성하였다.
(b) 염색체 통합 (hTFF3-cmbA; thyA 프로모터의 구성적 발현)
통합 벡터 pAGX2005 (상기 및 도 1 참조)를 치료 폴리펩티드 PAL (gapB>>rpmD>>pal)을 암호화하는 비시스트론성 발현 카세트를 함유하는 2개의 상이한 thyA-야생형 락토코커스 락티스 균주, 엘. 락티스 sAGX0599 및 sAGX0585 (트레할로오스 축적 균주)내로 전기천공시켰다. thyA 유전자좌에서 상동 재조합 (이중-교차)에 의한 SSusp45-hTFF3-CmbA (참조: 예를 들어, 서열번호 11 및 도 5A-D)의 삽입을 PCR 및 생어 DNA 서열분석으로 확인하였다. 생성된 균주를 각각 sAGX0644 및 sAGX0645로 칭하였다.
(c) 염색체 통합 (hTFF3-CmbA; PhllA 프로모터의 구성적 발현)
프로모터 대체 벡터 (replacement vector) pAGX2041 (PthyA->PhllA)를 치료 폴리펩티드 PAL (gapB>>rpmD>>pal) 및 PthyA>>SSusp45-hTFF3-cmbA를 암호화하는 비시스트론성 발현 카세트를 함유하는 엘. 락티스 균주 sAGX0644 (상기 참조) 내로 전기천공시켰다. 상동 재조합 (이중-교차)에 의한 PthyA에 의한 PhllA의 대체를 PCR 및 생어 DNA 서열분석으로 확인하였다. 생성된 균주를 sAGX0660으로 칭하였다.
실시예 5
박테리아의 표면 상에 hTFF1-SpaX를 발현하는 락토코커스 락티스 균주
(a) hTFF1-spaX의 에피솜 발현
[PthyA>>SSusp45-hTFF1-spaX](서열번호 22 및 23) thyA 통합/발현 벡터 pAGX1894의 작제물: hTFF1 암호화 유전자의 코돈 사용빈도를 엘. 락티스 MG1363에 대해 최적화하였다. 생성된 DNA 서열을 합성하여 제조하였다. 오버레이 PCR 어셈블리를 사용하여, PthyA>>SSusp45, hTFF1 및 스타필로코커스 아우레우스 (SpaX, Steidler et al., 1998)의 단백질 A의 세포벽 고정에 관하여 암호화하는 유전자를 융합하여 하나의 PCR 단편을 형성하였다. PCR에 의하여 PthyA>>SSusp45-hTFF1-spaX 발현 단위를 엘. 락티스 균주 MG1363의 5'thyA 및 3'thyA 영역 사이에 위치시켰다. 생성된 PCR 단편: 5'thyA>>PthyA>>SSusp45-hTFF1-spaX >>3'thyA를 플라스미드 pORI19 내로 서브클로닝하여 플라스미드 pAGX1894를 생성하였고, 이를 엘. 락티스 균주 LL108 내로 형질전환시켜 균주 LL108[pAGX1894]를 형성하였다.
실시예 6
뮤신-결합 및 세포-결합 폴리펩티드를 에피솜으로 발현하는 락토코커스 락티스 균주
하기의 플라스미드 및 락토코커스 락티스 균주를 본원에 기재된 바와 같이 제조하고, 이들의 뮤신- 및 세포-결합 (Caco-2, IEC-18, 및 HT29-MTX 세포) 능력에 대해 이를 시험하였다. 하기 표 1에 나열된 플라스미드를 엘. 락티스 균주 LL108 내로 전기천공시켰다.
뮤신-결합 및 세포-결합 폴리펩티드를 에피솜으로 발현하는 락토코커스 락티스 균주
플라스미드 균주 생체접착 작제물
(bioadhesion construct) 		뮤신
결합 		세포
결합
pAGX1417 LL108[pAGX1417] 없음 (대조군) - -
pAGX1893 LL108[pAGX1893] PthyA>>cmbA - +++
pAGX1903 LL108[pAGX1903] PthyA>>mbpL - +++
pAGX1946 LL108[pAGX1946] PthyA>>mapA - +
pAGX1894 LL108[pAGX1894] PthyA>>SSusp45-hTFF1-spaX +++ -
pAGX1986 LL108[pAGX1986] PthyA>>SSusp45-hTFF3-spaX N/A N/A
pAGX2005 LL108[pAGX2005] PthyA>>SSusp45-hTFF3-cmbA +++ +++
(+): ; (++): ; (+++): 0 내지 2 %의 세포 회수 (다양한 종류의 세포 (Caco-2, IEC-18, HT29-MTX) 및 기질 (뮤신 유형 II & III)을 사용한 다양한 실험에 기반한 상대적인 전체 성능을 나타냄).
(a) 락토코커스 락티스 LL108[pAGX2005]의 뮤신으로의 결합
실험 절차: 뮤신 (Sigma type II, cat#M2378-100G, 포사인 위로부터의 뮤신 및 Sigma type III, cat#M1778-10G, 부분적으로 정제된, 시알산 결합된 (0.5-1.5%), 포사인 위로부터의 뮤신)을 Nunc MaxiSorp® 플레이트에 50 mM 카보네이트 완충액 중 500 μg/ml로 코팅하였다. 플레이트를 PBS로 3회 세척하고, PBS + Tween20로 블로킹하고 (blocked), PBS로 3회 세척하였다. 밤새 포화된 엘. 락티스 배양물을 PBS 중에 OD600 = 1로 희석하였다. 배양물을 PBS+0.05% Tween20로 세척하고, 1 용적의 PBS+0.05% Tween20에 재현탁하였다. 100 μl의 박테리아의 현탁액을 각각의 웰에 적용하였다. 플레이트를 4 ℃에서 16시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 PBS+0.05% Tween20로 3회 세척하였다. 플레이트를 55 ℃에서 1시간 동안 건조시켰다. (A) OD를 405 nm에서 측정하였다. (B) 웰 당 100 μl의 크리스탈 바이올렛 (1 mg/ml)을 첨가하고, 실온에서 45분 동안 항온처리하였다. 이어서 OD를 595 nm에서 측정하였다.
결과:
도 2는, 스타필로코커스 아우레우스 단백질 A 고정 단편 SpaX를 사용하여 이들의 표면 상에 인간 트레포일 인자 1 (hTFF1)를 발현하는 균주 LL108[pAGX1894] (Steidler et al., 1998, supra), 및 이들의 표면 상에 hTFF3-CmbA를 발현하는 균주 LL108[pAGX2005]이, 2개 상이한 판독 방법을 사용하여 측정하는 경우 필적하는 강도 (Sigma type II & type III)를 갖는 뮤신에 결합한다는 것을 도시한다. 대조적으로, 빈 대조군 벡터를 함유하는 대조군 균주 LL108[pAGX1417]는 2개 판독 방법에서 뮤신으로의 어떤 결합도 나타내지 않았다.
(b) 락토코커스 락티스 LL108[pAGX2005]의 Caco-2 세포로의 부착
실험 절차: Caco-2 세포를 12-웰 플레이트에 5 Х 104 세포/cm²로 시딩 (seeding)하였다. 세포를 17일 동안 성장시켜 분화하였다. 밤새 포화된 엘. 락티스 배양물을 DMEM 중에서 1/1000 희석하고, DMEM으로 3회 세척하였다. 엘. 락티스 세포를 최종적으로 DMEM 중에 재현탁시켰다. 1 ml의 박테리아의 현탁액을 12-웰 플레이트의 세포에 적용하고 37 ℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 세포를 DMEM으로 3회 세척하였다. 세포를 Triton-X100을 사용하여 용해로 수확하였다 (PBS 중 1 ml의 0.1% Triton-X100을 세포에 적용하고, 세포의 총 분리 (detachment)까지 5 내지 10분 동안 항온처리함). 수확된 세포 현탁액을 적절히 희석하고, GM17E 플리에트 상에 플레이팅하였다. 30 ℃에서 항온처리 24시간 후, 플레이트 상의 박테리아의 계수를 측정하였다. 초기에 Caco-2 세포에 적용된 세포의 수로 나눠진 수확된 세포 현탁액의 플레이팅으로부터 회수된 엘. 락티스 세포로 회복률을 측정하였다.
도 3은 이들의 표면 상에 CmbA를 발현하는 균주 LL108[pAGX1893] 및 이들의 표면 상에 hTFF3-CmbA를 발현하는 균주 LL108[pAGX2005]가 Caco-2 세포로의 필적하는 부착력을 나타낸다는 것을 도시한다. 반대로, 대조군 균주 LL108[pAGX1417] (대조군) 및 이들의 표면 상에 hTFF1-SpaX를 발현하는 균주 LL108[pAGX1894]는 Caco-2 세포로의 향상된 부착력을 나타내지 않았다.
결론:
이들의 표면 상에 hTFF3-CmbA 융합 폴리펩티드를 발현하는 엘. 락티스 균주는 hTFF3-CmbA 융합 폴리펩티드를 발현하지 않는 상응하는 균주와 비교한 경우, 뮤신으로의 향상된 시험관내 결합 및 Caco-2 세포로의 향상된 부착력을 나타낸다.
실시예 7
비시스트론성 발현 단위를 함유하는 통합 플라스미드의 작제물
하기 표 2에 나열된 통합 플라스미드를 유전자간 영역 (예를 들어, 유전자간 영역 선행 rplN)을 포함하는 작제물을 사용하여 본원에 기재된 바와 같이 제조하고, 본원에 기재된 바와 같이 이들의 뮤신- 및 세포-결합 능력에 대해 시험하였다. 표 2에 나열된 플라스미드를 숙주 세포, 예컨대, 엘. 락티스 균주 LL108 내로 전기천공시켜 이러한 작제물에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 발현하는 (예를 들어, 구성적으로 발현하는) 박테리아를 생성하였다.
비시스트론성 발현 단위를 함유하는 통합 플라스미드
플라스미드 생체접착 작제물
(지시된 오페론에서)
pAGX1935 PhllA>>hllA>>rplN>>cmbA
pAGX1938 Pusp45>>usp45>>rplN>>cmbA
pAGX1997 PhllA>>hllA>>rplN>>SSusp45-hTFF1-spaX
pAGX1998 PhllA>>hllA>>rplN>>SSusp45-hTFF3-spaX
pAGX2016 PhllA>>hllA>>rplN>>SSusp45-hTFF3-cmbA
실시예 8
염색체적으로 통합된 발현 단위를 함유하는 락토코커스 락티스 균주
하기 플라스미드 및 락토코커스 락티스 균주를 본원에 기재된 바와 같이 제조하고, 실시예 6에 기재된 바와 같이 이들의 뮤신- 및 세포-결합 능력에 대해 시험하였다. 결과를 도 6 및 7에 예시한다. 하기 표 3에 나열된 플라스미드를 염색체적으로 통합된 PAL 발현 단위 (PgapB>>gapB>>rpmD>>pal)를 함유하는 엘. 락티스 숙주 균주 내로 통합시켰다. 숙주 균주의 일부는 세포내 트레할로오스 축적 (*)을 야기하는 유전적 변형을 추가로 포함하였다. 예시적인 트레할로오스 축적 균주는 (i) 기능적 트레할로오스-6-포스페이트 포스포릴라아제 (ΔtrePP)가 부족하며, 기능적 셀로비오스-특이적 PTS 시스템 IIC 성분 (ΔptcC) 유전자가 부족하고; (ii) 이. 콜라이 트레할로오스-6-포스페이트 포스파타아제 (E. coli otsB)를 발현하며, (iii) 트레할로오스 수송체 유전자 (PTS 유전자)를 발현하다. 참조 [예를 들어, U.S. 특허 9,200,249 및 U.S. 특허 출원 공보 2014/0234371], 이의 개시 내용은 본원에 전체가 참조로 포함됨.
또한, 선별된 균주를 PAL 발현에 대해 시험하였다. 결과 (도 8에 개략됨)은 세포 부착 및 점막부착성 폴리펩티드의 발현이 세포 당 발현된 PAL의 양 (μg/109 세포)에 실질적인 영향력 미치지 않는다는 것을 나타낸다.
뮤신-결합 및 세포-결합 폴리펩티드를 구성적으로 발현하는 락토코커스 락티스 균주
균주 트레할로오스 생체접착 작제물
(thyA 유전자좌)		 뮤신
결합 		세포
결합
sAGX0585 (*) 없음 (대조군) - -
sAGX0599 wt 없음 (대조군) - -
sAGX0618 wt PthyA>>cmbA - ++
sAGX0619 (*) PthyA>>cmbA - ++
sAGX0644 wt PthyA>>SSusp45-hTFF3-cmbA ++ ++
sAGX0645 (*) PthyA>>SSusp45-hTFF3-cmbA ++ ++
sAGX0660 wt PhllA>>SSusp45-hTFF3-cmbA +++ ++
(*) PhllA>>PTS; Δ trePP; Δ ptcC; usp45>>otsB.wt : 야생형 (트레할로오스 축적 없음)
(+): ; (++): ; (+++): 0 내지 2 %의 세포 회수 (다양한 종류의 세포 (Caco-2, IEC-18, HT29-MTX) 및 기질 (뮤신 유형 II & III)을 사용한 다양한 실험에 기반한 상대적인 전체 성능을 나타냄).
실시예 9
염색체적으로 통합된 발현 단위를 함유하는 락토코커스 락티스 균주의 작제물
하기 표 4에 나열된 락토코커스 락티스 균주를 적절한 작제물을 사용하여 본원에 기재된 바와 같이 제조할 수 있고, 이를 본원에 기재된 바와 같이 이들의 뮤신- 및 세포-결합 능력에 대해 시험할 수 있다.
이들의 표면 상에 뮤신-결합 및 세포-부착 폴리펩티드를 발현하는 이러한 각각의 박테리아 균주 (예를 들어, 이들의 표면 상에 hTFF3-CmbA 융합 단백질을 발현하는 락토코커스 락티스 균주)를 이들의 위장 (GI)-통과 시간에 대해 평가할 수 있고, 뮤신-결합 및 세포-부착 포릴펩티드를 발현하지 않는 상응하는 균주 (예를 들어, hTFF3-CmbA 융합 폴리펩티드를 발현하지 않는 상응하는 균주)와 비교할 수 있다.
예를 들어, hTFF3-CmbA를 발현하거나 또는 융합 단백질을 발현하지 않는, 박테리아 균주의 동등한 수의 박테리아 세포 (예를 들어, cfu 기반)를 개체 (인간 또는 동물)에 투여할 수 있다. 항생제 선별 마커 (예를 들어, pT1NX, 에리트로마이신 저항성 전달)로 비-에피솜 균주 +/- hTFF3-CmbA를 처리할 수 있다. 에피솜 균주를 이들의 Em 저항성에 기반하여 추가로 선별할 수 있다. GI 통과 시간을 하기의 방법 중 하나로 측정할 수 있다:
뮤신-결합 및 세포-결합 폴리펩티드를 구성적으로 발현하는 락토코커스 락티스 균주
균주 트레할로오스 생체접착 작제물
(thyA 유전자좌)
sAGX0620 wt PthyA>>SSmbpL>>mbpL
sAGX0621 (a) PthyA>> SSmbpL >> mbpL
sAGX0624 wt PthyA>>SSmapA>>mapA
sAGX0625 (a) PthyA>> SSmapA >> mapA
sAGX0661 (a) PhllA>>SSusp45-hTFF3-cmbA
(*) PhllA>>PTS; Δ trePP; ΔptcC; usp45>>otsB.
wt : 야생형 (트레할로오스 축적 없음)
(1) 일정한 간격 (예를 들어, 1h)을 두고, 총 분변을 수집하고, 예를 들어, Q-PCR 또는 에리트로마이신을 함유하는 고체 한천상에 희석 플레이팅으로 각각의 균주에 대해 회수된 cfu 수를 측정할 수 있다. 이는 모든 균주에 대해 회수된 cfu 수가 최대인 수집 시점을 나타낼 수 있는 회수 동력학을 산출할 것이다. 이러한 최대치를 넘긴 각 시험에서, 더 많은 cfu가 hTFF3-CmbA+ 균주에 대해 회수된다는 것이 관찰된다.
(2) 일정한 간격 (예를 들어, 1h)을 두고, 시험 동물 (예를 들어, 마우스)를 희생시키고, 이들 동물로부터 회수된 박테리아의 cfu의 수를 에리트로 마이신을 함유하는 고체 한천상에 희석 플레이팅으로 측정할 수 있다. 이는, 시간 경과시 더 많은 cfu가 hTFF3-CmbA+ 균주로부터 회수된다는 것을 나타낸다.
실시예 10
PKU의 처리 - 본 발명의 유전적으로 변형된 박테리아에 의해 발현되는 PAL을 사용한 페닐알라닌의 위장 분해
Phe를 신남산으로 전환시키고 보조-인자를 필요로 하지 않는 효소 페닐알라닌 암모니아 리아제 (PAL)를 사용하여 페닐케톤뇨증 (PKU)을 치료하였다. 참조 [예를 들어, Sarkissian, C. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2008, 105: 20894-20899]. PAL은 위장 (GI) 관에서 빠르게 분해되기 때문에, 경구 전달은 달성하기 어렵다. 개념 입증 연구 (proof-of-concept study)는 PKU (enu2/2) 마우스에서 유전적으로 조작된 이. 콜라이에 의해 발현되는 PAL의 경구 투여가 플라스마 Phe 수준의 유의한 감소로 이어진다는 것을 밝혔다. 참조 [예를 들어, Sarkissian, C. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:2339-2344]. 그러나, 이. 콜라이의 투여와 관련된 안정성 문제는 인간에서의 이러한 전략의 사용을 예방한다. PAL을 발현하는 락토코커스 락티스 균주를 생성하고, PKU 마우스 모델에서 이를 평가하였다. 재조합체 박테리아의 경구 투여는 중수소화된 Phe 흡수의 감소로 이어진다. 참조 [예를 들어, International Patent Application Publication WO 2014066945].
PAL을 발현하는 유전적으로 변형된 박테리아의 인간 PKU 환자로의 투여를 허용하기 위하여, 본 발명자들은 PAL 효소를 구성적으로 발현하고 증가된 GI 통과 시간, GI 조건하의 더 큰 안정성 및 자기-봉쇄를 나타내도록 추가로 변형되는, "임상적 등급"의 균주를 제조하였다. 에피솜 발현이 안정성 문제와 관련되기 때문에, 생활성 폴리펩티드의 염색체적 통합은 중요하다. 예를 들어, 에피솜은 위장 계통에서 다른 박테리아로 용이하게 전달될 수 있다. 추가로, 에피솜 유지 (episomal maintenance)는 제조에 장애물을 제공할 수 있다. 추가로, 공지된 PAL 생산 균주는 인접한 GI 관에서 쉽게 파괴된다. 또한, 공지된 PAL 생산 박테리아는 체외에서 생존하고 번식할 수 있다는 문제가 존재한다.
예를 들어, 실시예 8에 상기 기재된 바와 같은, 하기의 개선된 특징 중 하나 이상을 갖는 다양한 엘. 락티스 균주를 생성하였다: 1) 박테리아의 염색체 내로 통합되고, 개선된 안정성 및 제조 용이성을 위한 구성적 프로모터로 지시된, PAL 발현 카세트; 2) GI 관에서 엘. 락티스 생존을 향상시키는 트레할로오스 축적을 촉진시키는 변형 (참조: 예를 들어, Termont, S. et al., Appl. Environ. Microbiol. 2006, 72: 7694-7700); 3) 인체 외부에서의 생존을 예방하기 위한 티미딘에 대한 영양요구적 의존성의 포함 (참조: 예를 들어,Steidler, L. et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21: 785-789); 및 4) 근접한 GI 관에서의 체류를 개선하고 Phe 분해를 지속하도록 점막부착성 표면 단백질을 발현하기 위한 유전적 변형 (참조: 예를 들어, Caluwaerts, S. et al., Oral. Oncol. 2010, 46:564-570). 실시예 6 및 8에 기재된 바와 같이 PAL 발현 및 이들 각각의 세포 부착 및 점막부착성 특성에 대하여 균주를 평가하였다. 부착 단백질의 표면 발현은 Caco-2 단층 상의 박테리아의 체류를 약 8배 개선시켰다. 유형 II 및 유형 III 뮤신 모두에 대한 부착은 유사하게 향상되었다. 중요하게는, GI 관에서의 개선된 생존 및 부착 단백질의 발현을 위한 트레할로오스 변형은 박테리아에 의해 발현되는 PAL 수준을 변경하지 않았다.
선별된 박테리아 균주, 예를 들어, 락토코커스 락티스 균주 (예컨대, PAL을 구성적으로 발현하는 균주; 예를 들어, sAGX0599, sAGX0644, aAGX0585 및 sAGX0645)를 인간 임상 시험에 적절한 균주를 동정하기 위한 enu2/2 "PKU" 마우스에서의 이들의 효능에 대해 시험하였다.
제1 연구에서, 영양을 통해 109 cfu의 엘. 락티스와 동시에 중수소화된 Phe의 투여량을 수령한 PKU 마우스에서 sAGX0599 및 sAGX0645를 시험하였다. 1시간 동안 15분의 간격으로 혈액을 샘플링하고, 중수소화된 Phe에 대해 분석하였다. 양성 대조군 동물은, 예를 들어, 국제 특허 출원 공보 WO 2014066945)에 기재된 바와 같은 공지된 에피솜 재조합체 균주를 수령하였다. 음성 대조군 동물은 박테리아를 수령하지 않았다. 도 9에 도시된 바와 같이, 마우스에 의해 흡수된 총 Phe는 sAGX0599 (PAL 분비) 및 sAGX0645 (PAL 및 TFF3-CmbA) 공급된 마우스에서 가장 낮았으며, 양성 대조군보다 우수하였다. 흥미롭게도, Phe의 최종 수준은 sAGX0645 (PAL 및 TFF3-CmbA) 공급된 마우스에서 가장 낮았으나, Phe의 Cmax는 더 높았다. 이는, sAGX0645가 부착 융합 단백질이 없는 엘. 락티스와 비교하여 Phe 흡수의 특정 부위에 대해 소장에서 천천히 움직인다는 것을 반영할 수 있다. 더 낮은 Cmax 및 AUC가 공급 이전 Phe-분해 박테리아의 투여로 수득될 수 있다. 또한, 더 낮은 Cmax 및 AUC는, 식사 (meal)와 함께 박테리아의 정기적인 투여에 의하여 수득될 수 있어서, 1회 식사로부터 Phe를 감소시키는 원위 (distal) Phe-분해 박테리아가 이전의 식사로부터 이미 존재하도록 한다.
Phe 공급은 PKU의 인공 모델이라는 것을 주목해야 한다. 단일 아미노산은 매우 효과적으로 흡수된다. 일반적인 상황에서, 단백질은 장을 통과하여 분해되며, 흡수가 가능한 유리 아미노산은 상부 소장보다 더 먼 부분에서 주로 발생할 수 있다. 따라서, 장의 보다 번 부분에 위치된 PAL-분비 박테리움은, Phe를 직접 투여하는 실험에 의해 제안된 것보다 음식으로부터의 Phe 흡수를 더욱 잘 차단할 수 있다.
더욱이, 엘. 락티스는 상이한 세포 및 점액 부착 분자로 변형되어 장의 최적 부분으로 PAL의 전달을 국소화할 수 있다.
제2 연구는 선별된 박테리아 균주, 예컨대, 락토코커스 락티스 균주의 약역학을 평가할 수 있다. 박테리아는 중수소화된 Phe 이전 최대 6시간 투여될 수 있다. 상기 기재된 바와 같이 혈액을 평가하였다. 생성된 데이터는 후속 연구에 관한 스케줄을 알려 임상 적용과 관련한 정보를 제공할 수 있다. 예를 들어, 인간은 각각의 식사를 포함하는 박테리아를 함유하는 1개의 단위 투여형 (예를 들어, 캡슐)을 섭취할 수 있다.
제3 연구는 Phe 혈액 수준을 낮추는 박테리아의 장기간 효과를 평가할 수 있다. 선별된 박테리아 균주 (예를 들어, 락토코커스 락티스 균주), 예를 들어, 제1 연구로부터의 최적의 균주로 동물을 영양공급 (gavaged)할 수 있고, 이어서, 표준 식사 식단을 공급할 수 있다. 예를 들어, 매일 2개 엘. 락티스-관련 공급을 섭취하고, 제2 공급의 결과에 따라 각 공급량을 결정한다. 혈액 Phe 수준을 예를 들어 3주 동안 주 2회로 정기적으로 평가할 수 있다. 대조군은 제1 연구에 사용된 것일 수 있으며, 저 Phe 식단 코호트 (cohort)를 포함할 수 있다. 주의: 이러한 연구는 중수소화된 Phe를 사용하지 않을 수 있다. 긍정적인 결과는 Phe 혈액 수준에서의, 예를 들어, 임상 효능을 가져오기에 충분할만큼 통계학적으로 유의한 개선일 수 있다. 다른 연구는 박테리아의 치료법 (예를 들어, 엘. 락티스 치료법)과 식단 개입을 병용할 수 있다.
각각의 연구는 5마리 마우스의 코호트를 활용하여 통계적 연구에 충분한 효력을 제공할 수 있으며, 마우스는 씻긴 후 재사용할 수 있다. Phe를 이중 질량 분석법 (tandem mass spectrometry)으로 평가할 수 있으며, 이는 모두 민감하고 특이적이며, 최소 혈액량을 필요로 한다.
실시예 11
구강 점막염 (oral mucositis)의 치료
구강 점막염은 구강 점막의 붕괴를 말하며, 암 치료법, 특히 두경부암의 치료에 있어서, 일반적인 합병증이다. TFF1은 상부 GI 관에서 분비되고, 점막 표면의 보호 및 치유와 관련된다. TFF1은 구강 점막염를 위한 치료로서 가능성을 나타낸다. 구강 점막에서 TFF1의 전달을 증가시키기 위하여, 염색체 상에 hTFF1-CmbA 융합체와 함께 "유리" hTFF1을 모두 발현하도록 엘. 락티스를 조작한다. 이것이 단계적으로 진행되는 경우, htff1 유전자가 염색체 상의 또 다른 htff1 유전자와 재조합할 수 있다는 위험성이 존재할 것이다. 이러한 위험성을 최소화하기 위하여, hTFF1-cmbA 및 htff1을 폴리시스트론적으로 작제할 수 있으며, 따라서, 이들을 한 단계로 염색체 내로 형질전환시키고 통합시킬 수 있다. 또한, 각각의 코돈에서 제3 염기가 1개의 tff1 서열에서 변형되어 이의 뉴클레오티드 서열은 다른 tff1 서열과 상이하나, 번역된 hTFF1은 동일할 수 있다. 예를 들어, 하기의 빈도에 따른 6개 알라닌 코돈이 존재한다: UCU (18.6), UCC (4.0), UCA (20.6), UCG (3.9), AGU (16.7) 및 AGC (7.3). 따라서, UCC 및 UCG는 상호호환성 일 수 있다. UCU, UCA 및 보다 좁게는, AGU가 상호호환성 일 수 있다.
코돈 빈도를 변형한 후, PCR로 Ph11A>>SSusp45>>hTFF1>>rpmD>> SSusp45>>hTFF1-CmbA를 작제하고, pORI19로부터 유래된 조건부로 복제가능한 캐리어의 5' thyA 및 3' thyA 사이에 이를 클로닝한다. 본원에 다른 곳에서 설명된 바와 같이 엘. 락티스 내로의 형질전환 및 선별은 염색체 thyA 유전자좌 내로의 통합으로 이어진다.
생성된 균주는 TFF1를 분비하며, TFF1을 단독으로 발현하는 균주와 비교하여 구강 점액으로의 증가된 결합을 매개하는 TFF-CmbA 융합체를 발현하는 것으로 나타난다. 점막염의 모델에서 균주를 시험하고, 투여량 빈도가 감소될 수 있도록 TFF-CmbA의 존재는 구강에서 지속성이 증가하며, 치료 TFF1의 전달이 증가한다.
실시예 12
당뇨병의 치료
상기 기재된 바와 같은 hTFF3-CmbA를 분비하는 락토코커스 락티스 균주를 변형시켜 인간 프로인슐린 PINS 및 인간 IL10을 발현한다. 예를 들어, hPINS 발현을 위한 작제물은, 강력한 gapB 프로모터의 조절 하 및 gapB 유전자 및 rpmD 스페이서 후의, SSUsp45 분비 선도를 갖는, hPINS일 수 있다 (즉, PgapB >>gapB>> rpmD >> usp45>>PINS). hIL-10의 경우, 작제물은 PhllA>>SSusp45>>hil-10일 수 있다.
hTFF3-CmbA가 이미 thyA 유전자좌 내로 삽입되기 때문에, PINS 및 IL-10을 또 다른 게놈 부위, 예컨대, ptcC 또는 trePP 내로 삽입할 수 있다. PtcC 및 trePP 돌연변이는 트레할로오스 축적과 관련된다. 생성된 균주를 hIL-10, PINS 및 hTFF3-CmbA의 발현에 대해 시험한다. 이어서, 균주를, hTFF3-CmbA를 결핍하는 균주에 대하여(against), 제1형 당뇨병의 동물 모델인 NOD 마우스에서 시험한다. hTFF3-CmbA를 결핍하는 균주는 PINS에 반응하는 Treg를 생성하고, 췌장의 베타 세포에 대한 자가면역 반응을 역전시켜, 당뇨병을 치료하는 것으로 밝혀졌다. 상기 치료는 특히 최근에 발병한 질환에서 효과가 있다. hTFF-CmbA의 존재는 창자 콜로니화 및 지속성을 증가시켜 더욱 강력한 Treg 반응을 초래할 수 있다.
일부 실시형태가 본원에 도시되고 기재되나, 이러한 실시형태는 단지 예로서 제공된다. 본 발명을 벗어나지 않고, 당업자에게 다양한 변형, 변경 및 대체가 이루어질 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 실시형태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 이용될 것이라는 것을 이해해야 한다.
예시적 실시형태
1. 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 박테리움으로서, 상기 융합 단백질은 세포-부착 폴리펩티드를 포함하는, 박테리움.
2. 실시형태 1에 있어서, 상기 세포-부착 폴리펩티드는 세포 및 점액-결합 단백질 A (CmbA), 점액 결합 단백질 (Mub), 점액 부착 촉진 단백질 (MapA), 락토코컬 뮤신 결합 단백질 (MbpL) 및 이의 조합으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 박테리움.
3. 실시형태 2에 있어서, 상기 세포-부착 폴리펩티드는 CmbA인 것인, 박테리움.
4. 실시형태 3에 있어서, 상기 CmbA는 락토바실러스 루테리 CmbA인 것인, 박테리움.
5. 실시형태 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 융합 단백질은 뮤신-결합 폴리펩티드를 추가로 포함하는 것인, 박테리움.
6. 실시형태 5에 있어서, 상기 뮤신-결합 폴리펩티드는 트레포일 인자 (TFF) 폴리펩티드인 것인, 박테리움.
7. 실시형태 6에 있어서, 상기 융합 단백질은 CmbA 및 TFF를 포함하는 것인, 박테리움.
8. 실시형태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 융합 단백질을 암호화하는 상기 외인성 핵산은 상기 박테리움의 염색체 내로 통합되는 것인, 박테리움.
9. 실시형태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 융합 단백질을 암호화하는 상기 외인성 핵산은 플라스미드 상에 위치하는 것인, 박테리움.
10. 실시형태 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 융합 단백질은 상기 박테리움에 의해 발현되는 것인, 박테리움.
11. 실시형태 10에 있어서, 상기 융합 단백질은 상기 박테리움의 세포 벽에 고정되는 것인, 박테리움.
12. 실시형태 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 융합 단백질을 암호화하는 상기 외인성 핵산은 분비 신호 펩티드를 암호화하는 분비 선도 서열을 추가로 포함하는 것인, 박테리움.
13. 실시형태 12에 있어서, 상기 분비 선도 서열은 SSusp45인 것인, 박테리움.
14. 실시형태 13에 있어서, 상기 분비 선도 서열은 서열번호 5와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 분비 신호 펩티드를 암호화하는 것인, 박테리움.
15. 실시형태 12 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 분비 신호 펩티드는 상기 뮤신-결합 폴리펩티드에 결합되는 것인, 박테리움.
16. 실시형태 12 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 분비 신호 펩티드는 링커에 결합되는 것인, 박테리움.
17. 실시형태 12 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 분비 신호 펩티드가 상기 융합 단백질로부터 절단되는 것인, 박테리움.
18. 실시형태 17에 있어서, 상기 분비 신호 펩티드가 상기 융합 단백질로부터 절단되고, 상기 융합 단백질은 상기 박테리움의 세포 벽에 고정되는 것인, 박테리움.
19. 실시형태 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 융합 단백질을 암호화하는 상기 외인성 핵산은 thyA 프로모터 (PthyA), hlla 프로모터 (PhllA) 및 gapB 프로모터로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 프로모터에 의해 전사적으로 조절되는 것인, 박테리움.
20. 실시형태 19에 있어서, 융합 단백질을 암호화하는 상기 외인성 핵산은 PthyA에 의해 전사적으로 조절되는 것인, 박테리움.
21. 실시형태 19에 있어서, 융합 단백질을 암호화하는 상기 외인성 핵산은 PhllA에 의해 전사적으로 조절되는 것인, 박테리움.
22. 상기 박테리움의 세포-벽에 고정된 융합 단백질을 포함하는 박테리움으로서, 상기 융합 단백질은 TFF 폴리펩티드 및 CmbA 폴리펩티드를 포함하는 것인, 박테리움.
23. 실시형태 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 박테리움은 그람-양성 박테리움인 것인, 박테리움.
24. 실시형태 23에 있어서, 상기 그람-양성 박테리움은 비-병원성인 것인, 박테리움.
25. 실시형태 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 박테리움은 락트산 박테리움 (LAB)인 것인, 박테리움.
26. 실시형태 25에 있어서, 상기 LAB는 락토코커스 종 박테리움, 락토바실러스 종 박테리움, 비피도박테리움 종 박테리움, 스트렙토코커스 종 박테리움 및 엔테로코커스 종 박테리움으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 박테리움.
27. 실시형태 25에 있어서, 상기 LAB는, 락토코커스 가르비아에, 락토코커스 락티스, 락토코커스 피시움, 락토코커스 플란타룸, 락토코커스 라피놀락티스, 락토바실러스 아세토톨레란스, 락토바실러스 아시도필루스, 락토바실러스 아길리스, 락토바실러스 알기두스, 락토바실러스 알리멘타리우스, 락토바실러스 아밀로일리티쿠스, 락토바실러스 아밀로필루스, 락토바실러스 아밀로보루스, 락토바실러스 아니말리스, 락토바실러스 아비아리우스, 락토바실러스 아비아리우스 아종 아라피노수스, 락토바실러스 아비아리우스 아종 아비아리우스, 락토바실러스 바바리쿠스, 락토바실러스 비페르멘탄스, 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 부크네리, 락토바실러스 불가리쿠스, 락토바실러스 카르니스, 락토바실러스 카세이, 락토바실러스 카세이 아종 알락토수스, 락토바실러스 카세이 아종 카세이, 락토바실러스 카세이 아종 슈도플란타룸, 락토바실러스 카세이 아종 람노수스, 락토바실러스 카세이 아종 톨레란스, 락토바실러스 카테나포르미스, 락토바실러스 셀로비오수스, 락토바실러스 콜리노이데스, 락토바실러스 콘푸수스, 락토바실러스 코리니포르미스, 락토바실러스 코리니포르미스 아종 코리니포르미스, 락토바실러스 코리니포르미스 아종 토르쿠엔스, 락토바실러스 크리스파투스, 락토바실러스 쿠르바투스, 락토바실러스 쿠르바투스 아종 쿠르바투스, 락토바실러스 쿠르바투스 아종 멜리비오수스, 락토바실러스 델브루엑키, 락토바실러스 델브루엑키 아종 불가리쿠스, 락토바실러스 델브루엑키 아종 델브루엑키, 락토바실러스 델브루엑키 아종 락티스, 락토바실러스 디베르겐스, 락토바실러스 파르시미니스, 락토바실러스 페르멘툼, 락토바실러스 포르니칼리스, 락토바실러스 프룩티보란스, 락토바실러스 프룩토수스, 락토바실러스 갈리나룸, 락토바실러스 가세리, 락토바실러스 그라미니스, 락토바실러스 할로톨레란스, 락토바실러스 함스테리, 락토바실러스 헬베티쿠스, 락토바실러스 헤테로히오키이, 락토바실러스 힐가르디이, 락토바실러스 호모히오치이, 락토바실러스 이네르스, 락토바실러스 인테스티날리스, 락토바실러스 젠세니이, 락토바실러스 존소니이, 락토바실러스 칸들레리, 락토바실러스 케피리, 락토바실러스 케피라노파시엔스, 락토바실러스 케피르그라눔, 락토바실러스 쿤케에이, 락토바실러스 락티스, 락토바실러스 레이크만니이, 락토바실러스 린드네리, 락토바실러스 말레페르멘탄스, 락토바실러스 말리, 락토바실러스 말타로미쿠스, 락토바실러스 마니호티포란스, 락토바실러스 미노르, 락토바실러스 미누투스, 락토바실러스 뮤코사에, 락토바실러스 무리누스, 락토바실러스 나겔리이, 락토바실러스 오리스, 락토바실러스 파니스, 락토바실러스 파라부크네리, 락토바실러스 파라카세이, 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이, 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스, 락토바실러스 파라케피리, 락토바실러스 파랄리멘타리우스, 락토바실러스 파라플란타룸, 락토바실러스 펜토수스, 락토바실러스 페롤렌스, 락토바실러스 피시콜라, 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 폰티스, 락토바실러스 루테리, 락토바실러스 람노수스, 락토바실러스 리마에, 락토바실러스 로고사에, 락토바실러스 루미니스, 락토바실러스 사케이, 락토바실러스 사케이 아종 카모수스, 락토바실러스 사케이 아종 사케이, 락토바실러스 살리바리우스, 락토바실러스 살리바리우스 아종 살리시니우스, 락토바실러스 살리바리우스 아종 살리바리우스, 락토바실러스 산프란시스엔시스, 락토바실러스 샤르페아에, 락토바실러스 수에비쿠스, 락토바실러스 트리코데스, 락토바실러스 울리, 락토바실러스 박시노스테르쿠스, 락토바실러스 바지날리스, 락토바실러스 비리데센스, 락토바실러스 비툴리누스, 락토바실러스 자일로수스, 락토바실러스 야마나시엔시스, 락토바실러스 야마나시엔시스 아종 말리, 락토바실러스 야마나시엔시스 아종 야마나시엔시스, 락토바실러스 제아에, 비피도박테리움 아돌레센티스, 비피도박테리움 안굴라툼, 비피도박테리움 비피둠, 비피도박테리움 브레베, 비피도박테리움 카테눌라툼, 비피도박테리움 롱굼, 비피도박테리움 인판티스, 엔테로코커스 알세디니스, 엔테로코커스 아퀴마리누스, 엔테로코커스 아시니, 엔테로코커스 아비움, 엔테로코커스 카카에, 엔테로코커스 카멜리아에, 엔테로코커스 카닌테스티니, 엔테로코커스 카니스, 엔테로코커스 카셀리플라부스, 엔테로코커스 케코룸, 엔테로코커스 콜룸바에, 엔테로코커스 데브리에세이, 엔테로코커스 디에스트람메나에, 엔테로코커스 디스파르, 엔테로코커스 두란스, 엔테로코커스 에우레케니시스, 엔테로코커스 파에칼리스, 엔테로코커스 파에시움, 엔테로코커스 갈리나룸, 엔테로코커스 길부스, 엔테로코커스 하에모페록시두스, 엔테로코커스 헤르마니엔시스, 엔테로코커스 히라에, 엔테로코커스 이탈리쿠스, 엔테로코커스 lactis, 엔테로코커스 레마니이, 엔테로코커스 말로도라투스, 엔테로코커스 모라비엔시스, 엔테로코커스 문드티이, 엔테로코커스 올리바에, 엔테로코커스 팔렌스, 엔테로코커스 포에니쿨리콜라, 엔테로코커스 플란타룸, 엔테로코커스 슈도아비움, 엔테로코커스 쿠에베켄시스, 엔테로코커스 라피노수스, 엔테로코커스 랏티, 엔테로코커스 리보룸, 엔테로코커스 로타이, 엔테로코커스 사카롤리티쿠스, 엔테로코커스 실레시아쿠스, 엔테로코커스 솔리타리우스, 엔테로코커스 술푸레우스, 엔테로코커스 테르미티스, 엔테로코커스 타일란디쿠스, 엔테로코커스 우레아시티쿠스, 엔테로코커스 우레일리티쿠스, 엔테로코커스 비익키엔시스, 엔테로코커스 빌로룸, 엔테로코커스 시앙판젠시스, 스트렙토코커스 아갈락티아에, 스트렙토코커스 안지노수스, 스트렙토코커스 보비스, 스트렙토코커스 카니스, 스트렙토코커스 콘스텔라투스, 스트렙토코커스 다이스갈락티아에, 스트렙토코커스 에퀴누스, 스트렙토코커스 이니아에, 스트렙토코커스 이테르메디우스, 스트렙토코커스 밀레리, 스트렙토코커스 미티스, 스트렙토코커스 무탄스, 스트렙토코커스 오랄리스, 스트렙토코커스 파라산귀니스, 스트렙토코커스 페로리스, 스트렙토코커스 프뉴모니아에, 스트렙토코커스 슈도프뉴모니아에, 스트렙토코커스 파이로게네스, 스트렙토코커스 랏티, 스트렙토코커스 살리바리우스, 스트렙토코커스 티구리누스, 스트렙토코커스 테르모필루스, 스트렙토코커스 산귀니스, 스트렙토코커스 소르비누스, 스트렙토코커스 수이스, 스트렙토코커스 우베리스, 스트렙토코커스 베스티불라리스, 스트렙토코커스 비리단스 및 스트렙토코커스 주에피데미쿠스로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 박테리움.
28. 실시형태 27에 있어서, 상기 박테리움은 락토코커스 락티스인 것인, 박테리움.
29. 실시형태 28에 있어서, 상기 락토코커스 락티스는 락토코커스 락티스 ㅇ 아종 크레모리스, 락토코커스 락티스 아종 호르드니아에 및 락토코커스 락티스 ㅇ 아종 락티스로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 박테리움.
30. 실시형태 6 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 TFF 폴리펩티드는 TFF1, TFF2, 및 TFF3로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 박테리움.
31. 실시형태 6 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 TFF 폴리펩티드는 인간 TFF, 마우스 TFF, 돼지 TFF, 개 TFF, 고양이 TFF, 소 TFF, 양 TFF, 어류 TFF 및 양서류 TFF로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 박테리움.
32. 실시형태 31에 있어서, 상기 TFF 폴리펩티드는 인간 TFF인 것인, 박테리움.
33. 실시형태 32에 있어서, 상기 인간 TFF는 인간 TFF3인 것인, 박테리움.
34. 실시형태 6 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 TFF 폴리펩티드는 서열번호 3과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 것인, 박테리움.
35. 실시형태 6 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 TFF 폴리펩티드는 TFF 변이체 폴리펩티드인 것인, 박테리움.
36. 실시형태 35에 있어서, 상기 TFF 변이체 폴리펩티드는 상응하는 야생형 TFF 폴리펩티드와 비교한 경우 향상된 뮤신-결합 능력을 갖는 것인, 박테리움.
37. 실시형태 1 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 상기 CmbA 폴리펩티드는 서열번호 1과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 것인, 박테리움.
38. 실시형태 1 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 치료 폴리펩티드를 암호화하는 외인성 핵산을 추가로 포함하는, 박테리움.
39. 실시형태 38에 있어서, 상기 적어도 하나의 치료 폴리펩티드는 시토카인인 것인, 박테리움.
40. 실시형태 38 또는 39에 있어서, 상기 적어도 하나의 치료 폴리펩티드는 인터류킨 (IL)인 것인, 박테리움.
41. 실시형태 40에 있어서, 상기 인터류킨은 IL-2, IL-10, IL-18 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 박테리움.
42. 실시형태 38에 있어서, 상기 적어도 하나의 치료 폴리펩티드는 항원인 것인, 박테리움.
43. 실시형태 42에 있어서, 상기 적어도 하나의 치료 폴리펩티드는 항원 및 인터류킨인 것인, 박테리움.
44. 실시형태 43에 있어서, 상기 인터류킨은 IL-2 또는 IL-10인 것인, 박테리움.
45. 실시형태 42 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 상기 항원은 자가항원인 것인, 박테리움.
46. 실시형태 45에 있어서, 상기 자가항원은 제1형 당뇨병 (T1D)-특이적 항원인 것인, 박테리움.
47. 실시형태 46에 있어서, 상기 T1D-특이적 항원은 프로인슐린 (PINS), 글루탐산 데카르복실라아제 (GAD65), 인슐린종-관련 단백질 2 (IA-2), 섬-특이적 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 소단위-관련 단백질 (IGRP), 아연 수송체 8 (ZnT8), 크로모그라닌 A, (프레프로) 섬 아밀로이드 폴리펩티드 (ppIAPP), 페리페린, 시트룰린화된 글루코오스-조절된 단백질 (GRP) 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 박테리움.
48. 실시형태 38에 있어서, 상기 적어도 하나의 치료 폴리펩티드는 항체 또는 이의 단편인 것인, 박테리움.
49. 실시형태 48에 있어서, 상기 항체는 단일-도메인 항체 또는 나노바디인 것인, 박테리움.
50. 실시형태 48 또는 49에 있어서, 상기 항체는 항 TNFα 항체, IL-4에 대한 항체, IL-5에 대한 항체, IL-13에 대한 항체, IL-15에 대한 항체, 면역글로불린 E (IgE)에 대한 항체 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 박테리움.
51. 실시형태 48 또는 49에 있어서, 상기 항체는 가용성 TNF 수용체 및 항체의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질인 것인, 박테리움.
52. 실시형태 38에 있어서, 상기 적어도 하나의 치료 폴리펩티드는 효소 또는 이의 단편인 것인, 박테리움.
53. 실시형태 52에 있어서, 상기 효소 또는 이의 단편은 기능적인 것인, 박테리움.
54. 실시형태 52 또는 53에 있어서, 상기 효소 또는 이의 단편은 페닐알라닌 암모니아 리아제 (PAL), 아미노산 데카르복실라아제 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 박테리움.
55. 실시형태 54에 있어서, 상기 효소 또는 이의 단편은 PAL인 것인, 박테리움.
56. 실시형태 38에 있어서, 상기 적어도 하나의 치료 폴리펩티드는 글루카곤-유사 펩티드 1 (GLP-1), 글루카곤-유사 펩티드 2 (GLP-2), 글루카곤, 엑센딘-4 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 박테리움.
57. 실시형태 38에 있어서, 상기 적어도 하나의 치료 폴리펩티드는 성장 인자인 것인, 박테리움.
58. 실시형태 57에 있어서, 상기 성장 인자는 표피 성장 인자 (EGF)인 것인, 박테리움.
59. 실시형태 58에 있어서, 상기 EGF는 인간 EGF 또는 포사인 EGF인 것인, 박테리움.
60. 실시형태 38에 있어서, 상기 적어도 하나의 치료 폴리펩티드는 TFF인 것인, 박테리움.
61. 실시형태 60에 있어서, 상기 TFF는 TFF 1, TFF2, TFF3 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 박테리움.
62. 실시형태 38 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 상기 치료 폴리펩티드는 인간 폴리펩티드인 것인, 박테리움.
63. 실시형태 42 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 상기 항원은 알레르겐인 것인, 박테리움.
64. 실시형태 63에 있어서, 상기 알레르겐은 나무 화분 알레르겐, 잡초 화분 알레르겐, 풀 화분 알레르겐, 식품 알레르겐, 먼지-진드기 알레르겐, 곰팡이 알레르겐, 동물 비듬 알레르겐 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 박테리움.
65. 실시형태 64에 있어서, 상기 알레르겐은 잡초 화분 알레르겐인 것인, 박테리움.
66. 실시형태 65에 있어서, 상기 잡초 화분 알레르겐은 돼지풀 화분 알레르겐인 것인, 박테리움.
67. 실시형태 64에 있어서, 상기 알레르겐은 나무 화분 알레르겐인 것인, 박테리움.
68. 실시형태 67에 있어서, 상기 나무 화분 알레르겐은 자작나무 화분 알레르겐 또는 삼나무 화분 알레르겐인 것인, 박테리움.
69. 실시형태 64에 있어서, 상기 알레르겐은 식품 알레르겐인 것인, 박테리움.
70. 실시형태 69에 있어서, 상기 식품 알레르겐은 땅콩 알레르겐, 우유 알레르겐, 달걀 알레르겐, 글루텐 알레르겐 (글리아딘 에피토프) 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 박테리움.
71. 실시형태 38 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 치료 폴리펩티드를 암호화하는 상기 외인성 핵산은 gapB 프로모터에 의해 전사적으로 조절되는 것인, 박테리움.
72. 실시형태 1 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 상기 박테리움은, 상기 외인성 핵산을 포함하지 않거나 또는 상기 융합 단백질을 포함하지 않는 상응하는 박테리움과 비교할 경우, 증가된 위장 (GI) 통과 시간을 갖는 것인, 박테리움.
73. 실시형태 72에 있어서, 상기 GI 통과 시간은 적어도 약 10% 만큼 증가되는 것인, 박테리움.
74. 실시형태 73에 있어서, 상기 GI 통과 시간은 적어도 약 10% 내지 약 50%만큼 증가되는 것인, 박테리움.
75. 실시형태 72에 있어서, 상기 GI 통과 시간은 적어도 약 10% 내지 약 50%만큼 증가되는 것인, 박테리움.
76. 실시형태 1 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 상기 박테리움은, 상기 외인성 핵산을 포함하지 않거나 또는 상기 융합 단백질을 포함하지 않는 상응하는 박테리움과 비교할 경우, 증가된 시험관내 뮤신-결합 능력을 갖는 것인, 박테리움.
77. 실시형태 76에 있어서, 상기 시험관내 뮤신-결합 능력은 적어도 약 20%만큼 증가되는 것인, 박테리움.
78. 실시형태 77에 있어서, 상기 시험관내 뮤신-결합 능력은 적어도 약 50%만큼 증가되는 것인, 박테리움.
79. 실시형태 78에 있어서, 상기 시험관내 뮤신-결합 능력은 적어도 약 100 % (약 2Х) 만큼 증가되는 것인, 박테리움.
80. 실시형태 76에 있어서, 상기 시험관내 뮤신-결합 능력은 적어도 약 20% 내지 약 500% 증가되는 것인,
81. 실시형태 76 내지 80 중 어느 하나에 있어서, 상기 시험관내 뮤신-결합 능력은 하기에 따라 상기 박테리움의 포사인 위로부터의 뮤신으로의 결합으로 측정되는 것인, 박테리움:
(a) 405 nm (OD405)에서 광 흡수를 검출함; 또는
(b) 상기 박테리움을 크리스탈 바이올렛으로 염색하고 이어서 595 nm (OD595)에서 광 흡수를 검출함.
82. 실시형태 1 내지 81 중 어느 하나에 있어서, 상기 박테리움은, 상기 외인성 핵산을 포함하지 않거나 또는 상기 융합 단백질을 포함하지 않는 상응하는 박테리움과 비교할 경우, 증가된 시험관내 Caco-2 세포-결합 능력을 갖는 것인, 박테리움.
83. 실시형태 82에 있어서, 상기 시험관내 Caco-2 결합 능력은 적어도 약 10% 실시형태 23에 있어서, 증가되는 것인, 박테리움.
84. 실시형태 83에 있어서, 상기 시험관내 Caco-2 결합 능력은 적어도 약 100% (약 2X) 만큼 증가되는 것인, 박테리움.
85. 실시형태 84에 있어서, 상기 시험관내 Caco-2 결합 능력은 적어도 약 400% (약 5Х) 만큼 증가되는 것인, 박테리움.
86. 실시형태 82에 있어서, 상기 시험관내 Caco-2 결합 능력은 적어도 약 10 % 내지 약 500% 만큼 증가되는 것인, 박테리움.
87. 실시형태 82 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 상기 시험관내 Caco-2 결합 능력은 하기에 의해 측정되는 것인, 박테리움:
(a) 상기 박테리움의 배양물을 Caco-2 세포와 접촉시킴;
(b) 상기 Caco-2 세포를 세척하여 비결합된 박테리아 세포를 제거함;
(c) 상기 Caco-2 세포로 결합된 박테리아 세포를 분리하여, 분리된 박테리아 세포를 형성함; 및
(d) 상기 분리된 박테리아 세포를 적정함.
88. 실시형태 1 내지 87 중 어느 하나에 있어서, 상기 박테리움은, 상기 외인성 핵산을 포함하지 않거나 또는 상기 융합 단백질을 포함하지 않는 상응하는 박테리움과 비교할 경우, 장 점막으로의 증가된 부착성을 나타내는 것인, 박테리움.
89. 실시형태 88에 있어서, 장 점막으로의 상기 부착력은 적어도 약 10% 내지 약 500% 증가되는 것인, 박테리움.
90. 실시형태 1 내지 89 중 어느 하나에 따른 박테리움을 포함하는, 조성물.
91. 실시형태 1 내지 89 중 어느 하나에 따른 박테리움, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
92. 자가면역 질환, 알레르기, 대사성 질환 및 위장 질환으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 실시형태 1 내지 89 중 어느 하나에 따른 박테리움, 실시형태 90의 조성물 또는 실시형태 91의 약학적 조성물.
93. 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 사용하기 위한, 실시형태 1 내지 89 중 어느 하나에 따른 박테리움, 실시형태 90의 조성물 또는 실시형태 91의 약학적 조성물.
94. 실시형태 93에 있어서, 상기 질환은 자가면역 질환, 알레르기, 대사성 질환, 위장 질환 및 영양 결함 (nutritional defect)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 박테리움, 조성물 또는 약학적 조성물.
95. 대상체에게 실시형태 1 내지 89 중 어느 하나의 박테리움, 실시형태 90의 조성물 또는 실시형태 91의 약학적 조성물의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 질환의 치료 방법.
96. 실시형태 95에 있어서, 상기 질환은 자가면역 질환, 알레르기, 대사성 질환, 위장 질환 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 방법.
97. 실시형태 96에 있어서, 상기 질환은 자가면역 질환인 것인, 방법.
98. 실시형태 97에 있어서, 상기 자가면역 질환은 제1형 당뇨병 (T1D)인 것인, 방법.
99. 실시형태 96에 있어서, 상기 질환은 대사성 질환인 것인, 방법.
100. 실시형태 99에 있어서, 상기 대사성 질환은 페닐케톤뇨증 (PKU)인 것인, 방법.
101. 실시형태 96에 있어서, 상기 질환은 위장 질환인 것인, 방법.
102. 실시형태 101에 있어서, 상기 위장 질환은 복강 질환인 것인, 방법.
103. 실시형태 101에 있어서, 상기 위장 질환은 염증성 장 질환 (IBD)인 것인, 방법.
104. 실시형태 103에 있어서, 상기 IBD는 크론병 또는 궤양성 대장염인 것인, 방법.
105. 박테리움과 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산을 접촉시킴을 포함하는 유전적으로 변형된 박테리움을 제조하는 방법으로서, 융합 단백질을 암호화하는 상기 외인성 핵산은 세포-부착 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 것인, 방법.
106. 실시형태 105에 있어서, 상기 접촉은 상기 박테리움에 충분한 조건 하에서 외인성 핵산의 내재화를 일으키는 것인, 방법.
107. 실시형태 106 또는 107에 있어서, 상기 외인성 핵산은 플라스미드 상에 위치하는 것인, 방법.
108. 실시형태 106 또는 107에 있어서, 상기 외인성 핵산은 상기 박테리움의 염색체 내로 통합되는 것인, 방법.
109. 실시형태 105 내지 108 중 어느 하나에 있어서, 상기 박테리움을 배양함 및 상기 박테리움 중에 융합 단백질을 발현시킴을 추가로 포함하는, 방법.
110. 실시형태 105 내지 109 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포-부착 폴리펩티드는 세포 및 점액-결합 단백질 A (CmbA), Mub, MapA, MbpL 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 방법.
111. 실시형태 110에 있어서, 상기 세포-부착 폴리펩티드는 CmbA인 것인, 방법.
112. 실시형태 111에 있어서, 상기 CmbA는 락토바실러스 루테리 CmbA인 것인, 방법.
113. 실시형태 105 내지 112 중 어느 하나에 있어서, 융합 단백질을 암호화하는 상기 외인성 핵산은 뮤신-결합 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 추가로 포함하는 것인, 방법.
114. 실시형태 113에 있어서, 상기 뮤신-결합 폴리펩티드는 트레포일 인자 (TFF) 폴리펩티드인 것인, 방법.
115. 실시형태 114에 있어서, 융합 단백질을 암호화하는 상기 외인성 핵산은 CmbA를 암화화하는 서열 및 TFF 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 것인, 방법.
116. 실시형태 105 내지 115 중 어느 하나에 있어서, 융합 단백질을 암화화하는 상기 외인성 핵산은 상기 박테리움의 염색체 내로 통합되는 것인, 방법.
117. 실시형태 116에 있어서, 상기 외인성 핵산은 상동 재조합을 사용하여 염색체 내로 통합되는 것인, 방법.
118. 실시형태 105 내지 117 중 어느 하나에 있어서, 상기 박테리움을 치료 폴리펩티드를 암호화하는 외인성 핵산과 접촉시킴을 추가로 포함하는, 방법.
119. 실시형태 118에 있어서, 박테리움을 치료 폴리펩티드를 암호화하는 외인성 핵산과 접촉시킴은 상기 박테리움을 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산과 접촉시킴 이전에 발생하는 것인, 방법.
120. 실시형태 118에 있어서, 상기 박테리움을 치료 폴리펩티드를 암호화하는 외인성 핵산과 접촉시킴은 상기 박테리움을 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산과 접촉시킴 이후에 발생하는 것인, 방법.
121. 실시형태 105 내지 120 중 어느 하나에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 박테리움은, 융합 단백질을 암호화하는 상기 외인성 핵산을 포함하지 않는 상응하는 박테리움과 비교한 경우, 증가된 점막- 및 세포-부착 특성을 나타내는 것인, 방법.
122. 실시형태 105 내지 120 중 어느 하나에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 박테리움의 배양물과 적어도 하나의 저온보존제를 배합하여 박테리아의 혼합물을 형성함을 추가로 포함하는, 방법.
123. 실시형태 122에 있어서, 상기 박테리아의 혼합물을 동결-건조시켜 동결-건조된 조성물을 형성함을 추가로 포함하는, 방법.
124. 실시형태 105 내지 121 또는 실시형태 123에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 박테리움 또는 상기 동결-건조된 조성물을 약학적으로 허용되는 담체와 배합하여 약학적 조성물을 형성함을 추가로 포함하는, 방법.
125. 실시형태 123 또는 124에 있어서, 상기 동결-건조된 조성물 또는 상기 약학적 조성물을 약학적 투여형으로 제형화함을 추가로 포함하는, 방법.
126. 실시형태 105 내지 125 중 어느 하나의 방법으로 제조되는 유전적으로 변형된 박테리움.
127. 실시형태 1 내지 89 중 어느 하나의 박테리움, 실시형태 90의 조성물 또는 실시형태 91의 약학적 조성물을 포함하는, 단위 투여형.
128. 실시형태 127에 있어서, 상기 단위 투여형은 경구 투여형인 것인, 단위 투여형.
129. 실시형태 128에 있어서, 상기 경구 투여형은 정제, 캡슐, 사셰 및 포장된 액체로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 단위 투여형.
130. 포유동물에서 성장을 향상시키는 방법으로서, 상기 포유동물에게 실시형태 1 내지 89 중 어느 하나의 박테리움, 실시형태 90의 조성물, 실시형태 91의 약학적 조성물 또는 실시형태 127 내지 129 중 어느 하나의 단위 투여형의 유효량을 투여함을 포함하는, 방법.
131. 실시형태 130에 있어서, 상기 포유동물이 인간, 돼지, 소 및 양으로 이루어진 그룹 중에서 선택된느 것인, 방법.
132. 실시형태 130 또는 131에 있어서, 상기 박테리움, 상기 조성물, 상기 약학적 조성물 또는 상기 단위 투여형은 상기 포유동물로의 투여를 위하여 제형화되는 것인, 방법.
133. 실시형태 130 내지 132 중 어느 하나에 있어서, 상기 박테리움은 성장 인자를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 것인, 방법.
134. 실시형태 133에 있어서, 상기 성장 인자는 상기 박테리움 중에서 구성적으로 발현되는 것인, 방법.
135. 실시형태 133 또는 134에 있어서, 상기 성장 인자는 EGF인 것인, 방법.
136. 실시형태 135에 있어서, 상기 포유동물은 돼지이고, 상기 EGF는 포사인 EGF인 것인, 방법.
137. 하기를 포함하는, 박테리움의 장 점막으로의 결합을 증가시키는 방법:
(a) 상기 미생물을 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산과 접촉시킴 (상기 융합 단백질을 암호화하는 상기 외인성 핵산은 CmbA 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함함); 및
(b) 상기 박테리움 중에서 융합 단백질을 암호화하는 상기 외인성 핵산을 발현시킴.
138. 실시형태 137에 있어서, 융합 단백질을 암호화하는 상기 외인성 핵산은 TFF 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 추가로 포함하는 것인, 방법.
139. 실시형태 138에 있어서, 융합 단백질을 암호화하는 상기 외인성 핵산의 발현이 상기 TFF 및 상기 CmbA를 포함하는 융합 단백질을 생성하는 것인, 방법.
140. (1) 실시형태 1 내지 89 중 어느 하나의 박테리움, 실시형태 90의 조성물, 실시형태 91의 약학적 조성물 또는 실시형태 127 내지 129 중 어느 하나의 단위 투여형, 및 (2) 상기 박테리움, 상기 조성물, 상기 약학적 조성물 또는 상기 단위 투여형을 포유동물에게 투여하기 위한 지침을 포함하는, 키트.
141. 실시형태 140에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 것인, 키트.
142. 융합 단백질을 암호화하는 핵산으로서, 상기 핵산은 하기를 포함하는, 핵산:
(i) 세포 및 점액-결합 단백질 A (CmbA), Mub, MapA, MbpL 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 세포-부착 폴리펩티드를 암호화하는 서열; 및
(ii) TFF 폴리펩티드, MubBP 및 이의 임의의 조합 중에서 선택되는 뮤신-결합 폴리펩티드를 암호화하는 서열.
143. 실시형태 142에 있어서, 상기 뮤신-결합 폴리펩티드는 TFF 폴리펩티드인 것인, 핵산.
144. 실시형태 143에 있어서, 상기 TFF 폴리펩티드는 TFF3인 것인, 핵산.
145. 실시형태 142 내지 144 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포-부착 폴리펩티드는 CmbA인 것인, 핵산.
146. 실시형태 142 내지 145 중 어느 하나의 핵산을 포함하는 플라스미드.
147. 실시형태 146의 플라스미드를 포함하는 박테리아의 숙주 세포.
SEQUENCE LISTING <110> Intrexon Actobiotics N.V. <120> MUCOADHESIVE MICROORGANISM <130> IPA190359-US <140> PCT/IB2017/055470 <141> 2017-09-11 <150> US 62/394,024 <151> 2016-09-13 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 838 <212> PRT <213> Lactobacillus reuteri <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(50) <223> Signal sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(838) <223> Mature protein <400> 1 Met Leu Ser Arg Lys Asn Tyr Lys Glu Thr Ile Arg Lys Gln Thr Pro 1 5 10 15 Thr Lys Gln Tyr Tyr Thr Ile Lys Lys Leu Thr Val Gly Val Thr Ser 20 25 30 Val Leu Ile Gly Leu Ser Phe Met Gly Glu Leu Glu Gly Asp Ser Val 35 40 45 His Ala Asp Thr Met Thr Ala Ser Ser Glu Ser Thr Ser Val Thr Ser 50 55 60 Thr Thr Ala Gln Asp Gly Leu Lys Lys Ser Pro Gln Leu Tyr Leu Gln 65 70 75 80 Val Thr Asp Thr Asn Asn Pro Ser Thr Pro Leu Ser Ala Ser Ser Thr 85 90 95 Gly Thr Ser Lys Asn Val Thr Ser Ser Ala Ala Val Gln Val Lys Ser 100 105 110 Ala Ser Asp Glu Glu Asp Ser Asp Ser Thr Leu Ala Lys Gly Glu Asn 115 120 125 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gactagtaag 300 aatgttacct catcagctgc ggtacaagtg aagtccgcta gtgatgaaga agatagtgat 360 tctacactag ctaagggaga aaataaattt gctcggtcag cagtaaaaga ttcagtcact 420 gatgggaaaa caagtacagc agaaattaat ccggcaaaat taagcagtcc tgctttaata 480 acgcaactca accaatcctt agctaagagc agtacgagtg atgcagcaaa agctaatgat 540 gagttagaaa ttaaagcaac agatccgact aattatccaa actgtggcga tgtgtatggg 600 ccattatttg aattggatgc tagcggacag cttgttaata aagatgaagt tatatctctt 660 aaagatatgt atattttcca aatattgaaa ttagtaaata caaaagatag tgactttcaa 720 tatgtaatat taacaatgaa tcgtaaagat actgcagata ggtctgtata tctttttgta 780 actggaagca attatagtaa tgctgttgtt gttaaagtaa agccaaatga tacttatgaa 840 ttaagtaaaa ctggatatag tgttacttat acagaaccaa caactataaa tggacattat 900 gttgatggaa ctttttatgt tacaggaagt acttacgatg atggttttat aatgccagat 960 tggcaactgc agcaccttca gattatatat agtttaggaa attatgatcc aagcaatact 1020 gacgcaacat cagtttgtga aataatgcca agttatgaaa aggtaccggt aattaaatat 1080 agtggagtac cttcaaatat tagccaacct aaggtttaca ttaccgggtt tacgggtcaa 1140 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gtc act agt tca gct cac gaa 1584 His Asn Trp Ile Ala Arg Asn Pro Tyr Val Thr Ser Ser Ala His Glu 515 520 525 gtc ata tta aag tat gct aag tta ggt tca gtt att cct gtt gat gaa 1632 Val Ile Leu Lys Tyr Ala Lys Leu Gly Ser Val Ile Pro Val Asp Glu 530 535 540 aac gga aat aaa ata aac gat gga tgg caa tat gtt aat gat cca gat 1680 Asn Gly Asn Lys Ile Asn Asp Gly Trp Gln Tyr Val Asn Asp Pro Asp 545 550 555 560 gat gct tcc aaa gcc act agc cca tat gaa aaa gcg cca gtt atc gat 1728 Asp Ala Ser Lys Ala Thr Ser Pro Tyr Glu Lys Ala Pro Val Ile Asp 565 570 575 ggt tat gta gct gta aat cca gat gaa acg atc gtt ctt cct cat aac 1776 Gly Tyr Val Ala Val Asn Pro Asp Glu Thr Ile Val Leu Pro His Asn 580 585 590 tta agt agt gac aca aag att tat tac cga aag agg att aaa gtt acc 1824 Leu Ser Ser Asp Thr Lys Ile Tyr Tyr Arg Lys Arg Ile Lys Val Thr 595 600 605 tat agt ggt agt gac agc aag acc tac gat ggt aac cca gct aac ttc 1872 Tyr Ser Gly Ser Asp Ser Lys Thr Tyr Asp Gly Asn Pro Ala Asn Phe 610 615 620 gag cca acg aca gtt cag tgg agt ggc ttg aaa gga ctg aac act tca 1920 Glu Pro Thr Thr Val Gln Trp Ser Gly Leu Lys Gly Leu Asn Thr Ser 625 630 635 640 acc tta acg tcc gct gac ttc acg tgg aat act gcg gat aag aag gca 1968 Thr Leu Thr Ser Ala Asp Phe Thr Trp Asn Thr Ala Asp Lys Lys Ala 645 650 655 cca acg gat gcc ggt aag tac aca ctt agt ttg aat acg acc gga gaa 2016 Pro Thr Asp Ala Gly Lys Tyr Thr Leu Ser Leu Asn Thr Thr Gly Glu 660 665 670 gca gcc tta cgt aag gct aac ccg aac tat gat ctc aag aca att agc 2064 Ala Ala Leu Arg Lys Ala Asn Pro Asn Tyr Asp Leu Lys Thr Ile Ser 675 680 685 ggt agt tac acc tac acg att aat cca cta ggg att gtg act gta aat 2112 Gly Ser Tyr Thr Tyr Thr Ile Asn Pro Leu Gly Ile Val Thr Val Asn 690 695 700 tac aag ggc tat gat aag aaa gtc tat gat ggt caa cct gga acg att 2160 Tyr Lys Gly Tyr Asp Lys Lys Val Tyr Asp Gly Gln Pro Gly Thr Ile 705 710 715 720 aat ccg ggt aaa tta acg tgg agt aag ttg cca gat ggt act tca ttg 2208 Asn Pro Gly Lys Leu Thr Trp Ser Lys Leu Pro Asp Gly Thr Ser Leu 725 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aaccatatcg aggtggtgtg gtataatgaa 180 gggaattaaa aaagatagga aaatttc atg gtg tca aag aat aac gtg cag ttt 234 Met Val Ser Lys Asn Asn Val Gln Phe 1 5 tac gac aag aaa aat gat aat caa cag cga tgg ggc ttg aga aaa act 282 Tyr Asp Lys Lys Asn Asp Asn Gln Gln Arg Trp Gly Leu Arg Lys Thr 10 15 20 25 tca ttt ggt tta gcg agc ctt ttg ctt ggc acg tct ttc gtt tta ttc 330 Ser Phe Gly Leu Ala Ser Leu Leu Leu Gly Thr Ser Phe Val Leu Phe 30 35 40 aat gga gcg gtc gtg cac gcg gat aca ccg agc aat gac aaa cct gtg 378 Asn Gly Ala Val Val His Ala Asp Thr Pro Ser Asn Asp Lys Pro Val 45 50 55 gtt gta aca acc att gcg tca aac tca tct gcc gtt gaa gct gag act 426 Val Val Thr Thr Ile Ala Ser Asn Ser Ser Ala Val Glu Ala Glu Thr 60 65 70 gcc agc agt tct tca tca agt gcc gta aaa gcg gaa acg acc agc gcc 474 Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Thr Ser Ala 75 80 85 tct tct tca agt gct gta aaa gct gag aca gcc tct agc agt tca agc 522 Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Ala Ser Ser Ser Ser Ser 90 95 100 105 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Ser Asn Gly Lys Pro Val Val Gly Ser Ser 430 435 440 gag aac agc aaa ttt tac ata gac aca gac agt aat gtc tat ctt aca 1578 Glu Asn Ser Lys Phe Tyr Ile Asp Thr Asp Ser Asn Val Tyr Leu Thr 445 450 455 aaa cag ggg ttt gat caa ctt ggt aac ttt ggt aaa ata atg gct cca 1626 Lys Gln Gly Phe Asp Gln Leu Gly Asn Phe Gly Lys Ile Met Ala Pro 460 465 470 ttc gtt tat acg agc gct tca aac gat ttg aag aag gtc gga ata gac 1674 Phe Val Tyr Thr Ser Ala Ser Asn Asp Leu Lys Lys Val Gly Ile Asp 475 480 485 aaa ttc tca gcc atg atg aac caa ggg ttg agt agc ata caa agc aag 1722 Lys Phe Ser Ala Met Met Asn Gln Gly Leu Ser Ser Ile Gln Ser Lys 490 495 500 505 tct ggg gca aac acc atc gta tca ggg aac ggc ggc cag att caa ttg 1770 Ser Gly Ala Asn Thr Ile Val Ser Gly Asn Gly Gly Gln Ile Gln Leu 510 515 520 agc ggt ttc aat aga gaa aca gac ttg gat gga gca ttc tca tct tca 1818 Ser Gly Phe Asn Arg Glu Thr Asp Leu Asp Gly Ala Phe Ser Ser Ser 525 530 535 ata agc gat cgt gag aac gat gca tta aag aat aca gat gtc aac ttc 1866 Ile 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gac tta aaa 2202 Gly Gly Ser Thr Tyr Ser Asn Asp Ser Tyr Thr Leu Asn Asp Leu Lys 650 655 660 665 gcc tta ttg acc agc gga aac atc act gtc cct aag ata gtt atc gct 2250 Ala Leu Leu Thr Ser Gly Asn Ile Thr Val Pro Lys Ile Val Ile Ala 670 675 680 tat acc tac tct gcg act gat tca aaa act gat aac atc ggt aag tta 2298 Tyr Thr Tyr Ser Ala Thr Asp Ser Lys Thr Asp Asn Ile Gly Lys Leu 685 690 695 ccg tct gaa att gac gac aac aca ggc gcg tac gcc gtt ccg ttc aca 2346 Pro Ser Glu Ile Asp Asp Asn Thr Gly Ala Tyr Ala Val Pro Phe Thr 700 705 710 cgt acg ttg acg aat gac att cca gat aaa aaa agt aac att acg gtc 2394 Arg Thr Leu Thr Asn Asp Ile Pro Asp Lys Lys Ser Asn Ile Thr Val 715 720 725 aag tat atc gat atc tct ggt aat acc ata tct gat aac ata gtt aaa 2442 Lys Tyr Ile Asp Ile Ser Gly Asn Thr Ile Ser Asp Asn Ile Val Lys 730 735 740 745 gcc ggt aat gtt ggc gat tca tat aca aca gaa caa aaa gca ata ccg 2490 Ala Gly Asn Val Gly Asp Ser Tyr Thr Thr Glu Gln Lys Ala Ile Pro 750 755 760 gga tac acc ttc aaa gcc gta 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ggt aac acg ata tca gac aac gtt gtg aag tca ggt aac att 2874 Glu Asn Gly Asn Thr Ile Ser Asp Asn Val Val Lys Ser Gly Asn Ile 875 880 885 ggg gat tct tac act act gag caa aag gca att cct gga tac act ttt 2922 Gly Asp Ser Tyr Thr Thr Glu Gln Lys Ala Ile Pro Gly Tyr Thr Phe 890 895 900 905 aaa gct gtt cag gga aac cca acg gga caa ttc acc agt gac gcc cag 2970 Lys Ala Val Gln Gly Asn Pro Thr Gly Gln Phe Thr Ser Asp Ala Gln 910 915 920 acg gtg acc tac ata tac act aaa gtg aaa aca tct ggt ggg agc gaa 3018 Thr Val Thr Tyr Ile Tyr Thr Lys Val Lys Thr Ser Gly Gly Ser Glu 925 930 935 acc cca acg ccg tca aaa acg att gca acc aag tca agt aca aac aca 3066 Thr Pro Thr Pro Ser Lys Thr Ile Ala Thr Lys Ser Ser Thr Asn Thr 940 945 950 atc tct agt tct aca ctt ccg aag acg ggc gat agt caa gtg tct act 3114 Ile Ser Ser Ser Thr Leu Pro Lys Thr Gly Asp Ser Gln Val Ser Thr 955 960 965 tta ttc ggc atg gtg gtg ggg ttc ttc ata ttt ggg gcg gga acc ttg 3162 Leu Phe Gly Met Val Val Gly Phe Phe Ile Phe Gly Ala Gly Thr Leu 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120 125 Leu Ile Val Pro Thr Asp Ser Asn Ile Lys Ser Leu Lys Asn Ile Lys 130 135 140 Gly Lys Lys Ile Ile Ala Gly Thr Gly Thr Asn Asn Ala Asn Val Val 145 150 155 160 Lys Lys Tyr Lys Gly Asn Leu Thr Pro Asn Gly Asp Phe Ala Ser Ser 165 170 175 Leu Asp Met Ile Lys Gln Gly Arg Ala Ala Gly Thr Ile Asn Ser Arg 180 185 190 Glu Ala Trp Tyr Ala Tyr Ser Lys Lys Asn Ser Thr Lys Gly Leu Lys 195 200 205 Met Ile Asp Val Ser Ser Glu Gln Asp Pro Ala Lys Ile Ser Ala Leu 210 215 220 Phe Asn Lys Lys Asp Thr Ala Ile Gln Ser Ser Tyr Asn Lys Ala Leu 225 230 235 240 Lys Glu Leu Gln Gln Asp Gly Thr Val Lys Lys Leu Ser Glu Lys Tyr 245 250 255 Phe Gly Ala Asp Ile Thr Glu 260 <210> 21 <211> 960 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS <222> (153)..(941) <400> 21 tggatatttt ttataaatct ggtttgaaca aattatattg acatctcttt ttctatcctg 60 ataattctga gaggttattt tgggaaatac tattgaacca tatcgaggtg gtgtggtata 120 atgaagggaa ttaaaaaaga taggaaaatt tc atg aaa ttt tgg aag aaa gca 173 Met Lys Phe Trp Lys Lys Ala 1 5 cta tta aca att gta gcc tta acg gtc ggt acc cct gca gga atc aca 221 Leu Leu Thr Ile Val Ala Leu Thr Val Gly Thr Pro Ala Gly Ile Thr 10 15 20 agt gtt tct gct gct tca tca gct gtt aat tca gaa tta gtt cat aag 269 Ser Val Ser Ala Ala Ser Ser Ala Val Asn Ser Glu Leu Val His Lys 25 30 35 gga gaa tta aca att ggt ctt gag gga acg tac tct ccg tac tct tat 317 Gly Glu Leu Thr Ile Gly Leu Glu Gly Thr Tyr Ser Pro Tyr Ser Tyr 40 45 50 55 cgt aaa aat aac aaa tta act ggc ttt gaa gta gat ctt ggt aaa gca 365 Arg Lys Asn Asn Lys Leu Thr Gly Phe Glu Val Asp Leu Gly Lys Ala 60 65 70 gtt gct aaa aag atg ggc tta aaa gct aac ttt gta cca act aaa tgg 413 Val Ala Lys Lys Met Gly Leu Lys Ala Asn Phe Val Pro Thr Lys Trp 75 80 85 gat tcg cta att gcc ggt ctt ggt tca ggt aag ttt gat gta gta atg 461 Asp Ser Leu Ile Ala Gly Leu Gly Ser Gly Lys Phe Asp Val Val Met 90 95 100 aac aac att aca cag aca cct gaa cgg gcc aag caa tat aat ttc tct 509 Asn Asn Ile Thr Gln Thr Pro Glu Arg Ala Lys Gln Tyr Asn Phe Ser 105 110 115 acc cca tat atc aag tcc cgg ttt gca tta att gtt cct act gat agt 557 Thr Pro Tyr Ile Lys Ser Arg Phe Ala Leu Ile Val Pro Thr Asp Ser 120 125 130 135 aac atc aaa agc ttg aag aat att aaa ggc aag aag att att gct ggt 605 Asn Ile Lys Ser Leu Lys Asn Ile Lys Gly Lys Lys Ile Ile Ala Gly 140 145 150 acg gga act aat aat gcg aat gtg gta aaa aaa tat aag ggt aac ctt 653 Thr Gly Thr Asn Asn Ala Asn Val Val Lys Lys Tyr Lys Gly Asn Leu 155 160 165 aca cca aat ggc gat ttt gct agt tcc tta gat atg atc aag caa ggt 701 Thr Pro Asn Gly Asp Phe Ala Ser Ser Leu Asp Met Ile Lys Gln Gly 170 175 180 cgg gct gcc ggg aca att aac tcc cgt gaa gct tgg tac gct tac agc 749 Arg Ala Ala Gly Thr Ile Asn Ser Arg Glu Ala Trp Tyr Ala Tyr Ser 185 190 195 aag aag aac agt act aag ggt ctc aag atg att gat gtt tct agt gaa 797 Lys Lys Asn Ser Thr Lys Gly Leu Lys Met Ile Asp Val Ser Ser Glu 200 205 210 215 caa gat cca gct aag att tca gca ctt ttt aac aag aaa gat act gct 845 Gln Asp Pro Ala Lys Ile Ser Ala Leu Phe Asn Lys Lys Asp Thr Ala 220 225 230 att caa tct tcc tac aac aag gca ctt aag gaa ctt caa caa gac gga 893 Ile Gln Ser Ser Tyr Asn Lys Ala Leu Lys Glu Leu Gln Gln Asp Gly 235 240 245 aca gtc aag aag cta tct gaa aag tac ttc ggt gca gat att act gaa 941 Thr Val Lys Lys Leu Ser Glu Lys Tyr Phe Gly Ala Asp Ile Thr Glu 250 255 260 taaattaatc tataagtta 960 <210> 22 <211> 271 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 22 Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu 1 5 10 15 Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Glu Ala Gln Thr Glu 20 25 30 Thr Cys Thr Val Ala Pro Arg Glu Arg Gln Asn Cys Gly Phe Pro Gly 35 40 45 Val Thr Pro Ser Gln Cys Ala Asn Lys Gly Cys Cys Phe Asp Asp Thr 50 55 60 Val Arg Gly Val Pro Trp Cys Phe Tyr Pro Asn Thr Ile Asp Val Pro 65 70 75 80 Pro Glu Glu Glu Cys Glu Phe Asp Pro Lys Glu Glu Asp Asn Asn Lys 85 90 95 Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys 100 105 110 Pro Gly Lys Glu Asp Asn Lys Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys 115 120 125 Pro Gly Lys Glu Asp Asn Lys Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys 130 135 140 Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys 145 150 155 160 Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Gly 165 170 175 Val His Val Val Lys Pro Gly Asp Thr Val Asn Asp Ile Ala Lys Ala 180 185 190 Asn Gly Thr Thr Ala Asp Lys Ile Ala Ala Asp Asn Lys Leu Ala Asp 195 200 205 Lys Asn Met Ile Lys Pro Gly Gln Glu Leu Val Val Asp Lys Lys Gln 210 215 220 Pro Ala Asn His Ala Asp Ala Asn Lys Ala Gln Ala Leu Pro Glu Thr 225 230 235 240 Gly Glu Glu Asn Pro Phe Ile Gly Thr Thr Val Phe Gly Gly Leu Ser 245 250 255 Leu Ala Leu Gly Ala Ala Leu Leu Ala Gly Arg Arg Arg Glu Leu 260 265 270 <210> 23 <211> 1020 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS <222> (153)..(965) <400> 23 tggatatttt ttataaatct ggtttgaaca aattatattg acatctcttt ttctatcctg 60 ataattctga gaggttattt tgggaaatac tattgaacca tatcgaggtg gtgtggtata 120 atgaagggaa ttaaaaaaga taggaaaatt tc atg aaa aaa aag att atc tca 173 Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser 1 5 gct att tta atg tct aca gtg ata ctt tct gct gca gcc ccg ttg tca 221 Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser 10 15 20 ggt gtt tac gcc gaa gct caa act gaa act tgt act gtt gct cca cgt 269 Gly Val Tyr Ala Glu Ala Gln Thr Glu Thr Cys Thr Val Ala Pro Arg 25 30 35 gaa cgt caa aac tgt ggt ttt cca ggt gtt act cca tca caa tgt gct 317 Glu Arg Gln Asn Cys Gly Phe Pro Gly Val Thr Pro Ser Gln Cys Ala 40 45 50 55 aac aaa ggt tgt tgt ttt gat gat act gtt cgt ggt gtt cca tgg tgt 365 Asn Lys Gly Cys Cys Phe Asp Asp Thr Val Arg Gly Val Pro Trp Cys 60 65 70 ttt tac cca aac act atc gat gtt cca cca gaa gaa gaa tgt gaa ttt 413 Phe Tyr Pro Asn Thr Ile Asp Val Pro Pro Glu Glu Glu Cys Glu Phe 75 80 85 gat cca aaa gag gaa gac aac aac aag cct ggt aaa gaa gac ggc aac 461 Asp Pro Lys Glu Glu Asp Asn Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn 90 95 100 aaa cct ggt aaa gaa gac ggc aac aaa cct ggt aaa gaa gac aac aaa 509 Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Asn Lys 105 110 115 aaa cct ggc aaa gaa gac ggc aac aaa cct ggt aaa gaa gac aac aaa 557 Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Asn Lys 120 125 130 135 aaa cct ggc aaa gaa gat ggc aac aaa cct ggt aaa gaa gac ggc aac 605 Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn 140 145 150 aag cct ggt aaa gaa gat ggc aac aag cct ggt aaa gaa gat ggc aac 653 Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn 155 160 165 aag cct ggt aaa gaa gac ggc aac gga gta cat gtc gtt aaa cct ggt 701 Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Gly Val His Val Val Lys Pro Gly 170 175 180 gat aca gta aat gac att gca aaa gca aac ggc act act gct gac aaa 749 Asp Thr Val Asn Asp Ile Ala Lys Ala Asn Gly Thr Thr Ala Asp Lys 185 190 195 att gct gca gat aac aaa tta gct gat aaa aac atg atc aaa cct ggt 797 Ile Ala Ala Asp Asn Lys Leu Ala Asp Lys Asn Met Ile Lys Pro Gly 200 205 210 215 caa gaa ctt gtt gtt gat aag aag caa cca gca aac cat gca gat gct 845 Gln Glu Leu Val Val Asp Lys Lys Gln Pro Ala Asn His Ala Asp Ala 220 225 230 aac aaa gct caa gca tta cca gaa act ggt gaa gaa aat cca ttc atc 893 Asn Lys Ala Gln Ala Leu Pro Glu Thr Gly Glu Glu Asn Pro Phe Ile 235 240 245 ggt aca act gta ttt ggt gga tta tca tta gcg tta ggt gca gcg tta 941 Gly Thr Thr Val Phe Gly Gly Leu Ser Leu Ala Leu Gly Ala Ala Leu 250 255 260 tta gct gga cgt cgt cgc gaa cta taaaattaat ctataagtta ctgacaaaac 995 Leu Ala Gly Arg Arg Arg Glu Leu 265 270 tgtcagtaac tttttttgtg ggaaa 1020 <210> 24 <211> 716 <212> PRT <213> Petroselinum crispum <400> 24 Met Glu Asn Gly Asn Gly Ala Thr Thr Asn Gly His Val Asn Gly Asn 1 5 10 15 Gly Met Asp Phe Cys Met Lys Thr Glu Asp Pro Leu Tyr Trp Gly Ile 20 25 30 Ala Ala Glu Ala Met Thr Gly Ser His Leu Asp Glu Val Lys Lys Met 35 40 45 Val Ala Glu Tyr Arg Lys Pro Val Val Lys Leu Gly Gly Glu Thr Leu 50 55 60 Thr Ile Ser Gln Val Ala Ala Ile Ser Ala Arg Asp Gly Ser Gly Val 65 70 75 80 Thr Val Glu Leu Ser Glu Ala Ala Arg Ala Gly Val Lys Ala Ser Ser 85 90 95 Asp Trp Val Met Asp Ser Met Asn Lys Gly Thr Asp Ser Tyr Gly Val 100 105 110 Thr Thr Gly Phe Gly Ala Thr Ser His Arg Arg Thr Lys Gln Gly Gly 115 120 125 Ala Leu Gln Lys Glu Leu Ile Arg Phe Leu Asn Ala Gly Ile Phe Gly 130 135 140 Asn Gly Ser Asp Asn Thr Leu Pro His Ser Ala Thr Arg Ala Ala Met 145 150 155 160 Leu Val Arg Ile Asn Thr Leu Leu Gln Gly Tyr Ser Gly Ile Arg Phe 165 170 175 Glu Ile Leu Glu Ala Ile Thr Lys Phe Leu Asn Gln Asn Ile Thr Pro 180 185 190 Cys Leu Pro Leu Arg Gly Thr Ile Thr Ala Ser Gly Asp Leu Val Pro 195 200 205 Leu Ser Tyr Ile Ala Gly Leu Leu Thr Gly Arg Pro Asn Ser Lys Ala 210 215 220 Val Gly Pro Thr Gly Val Ile Leu Ser Pro Glu Glu Ala Phe Lys Leu 225 230 235 240 Ala Gly Val Glu Gly Gly Phe Phe Glu Leu Gln Pro Lys Glu Gly Leu 245 250 255 Ala Leu Val Asn Gly Thr Ala Val Gly Ser Gly Met Ala Ser Met Val 260 265 270 Leu Phe Glu Ala Asn Ile Leu Ala Val Leu Ala Glu Val Met Ser Ala 275 280 285 Ile Phe Ala Glu Val Met Gln Gly Lys Pro Glu Phe Thr Asp His Leu 290 295 300 Thr His Lys Leu Lys His His Pro Gly Gln Ile Glu Ala Ala Ala Ile 305 310 315 320 Met Glu His Ile Leu Asp Gly Ser Ala Tyr Val Lys Ala Ala Gln Lys 325 330 335 Leu His Glu Met Asp Pro Leu Gln Lys Pro Lys Gln Asp Arg Tyr Ala 340 345 350 Leu Arg Thr Ser Pro Gln Trp Leu Gly Pro Gln Ile Glu Val Ile Arg 355 360 365 Ser Ser Thr Lys Met Ile Glu Arg Glu Ile Asn Ser Val Asn Asp Asn 370 375 380 Pro Leu Ile Asp Val Ser Arg Asn Lys Ala Ile His Gly Gly Asn Phe 385 390 395 400 Gln Gly Thr Pro Ile Gly Val Ser Met Asp Asn Thr Arg Leu Ala Ile 405 410 415 Ala Ala Ile Gly Lys Leu Met Phe Ala Gln Phe Ser Glu Leu Val Asn 420 425 430 Asp Phe Tyr Asn Asn Gly Leu Pro Ser Asn Leu Ser Gly Gly Arg Asn 435 440 445 Pro Ser Leu Asp Tyr Gly Phe Lys Gly Ala Glu Ile Ala Met Ala Ser 450 455 460 Tyr Cys Ser Glu Leu Gln Phe Leu Ala Asn Pro Val Thr Asn His Val 465 470 475 480 Gln Ser Ala Glu Gln His Asn Gln Asp Val Asn Ser Leu Gly Leu Ile 485 490 495 Ser Ser Arg Lys Thr Ser Glu Ala Val Glu Ile Leu Lys Leu Met Ser 500 505 510 Thr Thr Phe Leu Val Gly Leu Cys Gln Ala Ile Asp Leu Arg His Leu 515 520 525 Glu Glu Asn Leu Lys Ser Thr Val Lys Asn Thr Val Ser Ser Val Ala 530 535 540 Lys Arg Val Leu Thr Met Gly Val Asn Gly Glu Leu His Pro Ser Arg 545 550 555 560 Phe Cys Glu Lys Asp Leu Leu Arg Val Val Asp Arg Glu Tyr Ile Phe 565 570 575 Ala Tyr Ile Asp Asp Pro Cys Ser Ala Thr Tyr Pro Leu Met Gln Lys 580 585 590 Leu Arg Gln Thr Leu Val Glu His Ala Leu Lys Asn Gly Asp Asn Glu 595 600 605 Arg Asn Leu Ser Thr Ser Ile Phe Gln Lys Ile Ala Thr Phe Glu Asp 610 615 620 Glu Leu Lys Ala Leu Leu Pro Lys Glu Val Glu Ser Ala Arg Ala Ala 625 630 635 640 Leu Glu Ser Gly Asn Pro Ala Ile Pro Asn Arg Ile Glu Glu Cys Arg 645 650 655 Ser Tyr Pro Leu Tyr Lys Phe Val Arg Lys Glu Leu Gly Thr Glu Tyr 660 665 670 Leu Thr Gly Glu Lys Val Thr Ser Pro Gly Glu Glu Phe Glu Lys Val 675 680 685 Phe Ile Ala Met Ser Lys Gly Glu Ile Ile Asp Pro Leu Leu Glu Cys 690 695 700 Leu Glu Ser Trp Asn Gly Ala Pro Leu Pro Ile Cys 705 710 715 <210> 25 <211> 3300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS <222> (1091)..(3238) <220> <221> misc_feature <222> (1091)..(3241) <223> PAL <220> <221> misc_feature <222> (3239)..(3241) <223> Stop codon <400> 25 ttgttaactt agtcaattta aaaggtttgc cttttataaa atctaatccc tataaggagg 60 aaactactaa tggtagttaa agttggtatt aacggtttcg gtcgtatcgg tcgtcttgct 120 ttccgtcgta ttcaaaatgt tgaaggtgtt gaagttgttg caatcaacga cttgacagat 180 ccagcaatgc ttgctcactt gcttaaatac gatacaactc aaggtcgttt tgatggtaaa 240 gttgaagtta aagatggtgg ttttgaagtt aacggtaaat tcgttaaagt tactgctgaa 300 tctaacccag ctaacatcaa ctgggctgaa gttggtgcag aaatcgttct tgaagcaact 360 ggtttcttcg caactaaaga aaaagctgaa caacacttgc acgctaatgg tgctaagaaa 420 gttgttatca ctgcacctgg tggatcagat gttaaaacaa tcgttttcaa cactaaccac 480 gaagtacttg atggaactga aacagtaatt tcagctggtt catgtacaac caactgtctt 540 gctccaatgg ctgatacttt gaacaaacaa ttcggtatca aagttggtac aatgactaca 600 gttcacggtt acactggtga ccaaatgact cttgatggcc cacaccgtgg tggagatttc 660 cgtcgcgcac gtgctgcagc tgaaaacatc gtacctaact caacaggtgc tgctaaagcc 720 atcggtcttg tattgccaga acttcaaggt aaacttcaag gacatgctca acgtgtacca 780 gttccaactg gttcattgac tgaacttgtt actatccttg ataaagaagt tacagttgac 840 gaaatcaacg cagctatgaa agctgcttca aatgaatcat ttggttacaa cgaagaccaa 900 atcgtttcat ctgatatcgt tggtatctca aactcttcac tctttgatgc tactcaaact 960 gaagttactt cagctaacgg agctcaactt gttaaaactg tatcttggta cgataacgaa 1020 atgtcataca cttcaaacct tgttcgtaca cttgcatact tcgctaaaat cgctaaataa 1080 ggaggaaaaa atg gaa aat ggt aat ggt gca act acg aat ggg cat gtg 1129 Met Glu Asn Gly Asn Gly Ala Thr Thr Asn Gly His Val 1 5 10 aac ggg aat gga atg gac ttc tgt atg aag aca gaa gat cct ctt tat 1177 Asn Gly Asn Gly Met Asp Phe Cys Met Lys Thr Glu Asp Pro Leu Tyr 15 20 25 tgg ggt att gca gct gaa gcg atg act ggt tca cac ttg gat gaa gta 1225 Trp Gly Ile Ala Ala Glu Ala Met Thr Gly Ser His Leu Asp Glu Val 30 35 40 45 aaa aaa atg gtc gcc gag tac aga aaa cct gtc gtt aaa tta gga gga 1273 Lys Lys Met Val Ala Glu Tyr Arg Lys Pro Val Val Lys Leu Gly Gly 50 55 60 gag aca ctt aca att agt cag gtt gct gct att agt gcg cga gat gga 1321 Glu Thr Leu Thr Ile Ser Gln Val Ala Ala Ile Ser Ala Arg Asp Gly 65 70 75 agt ggt gta act gtg gaa ctt agt gag gca gca cgc gct gga gtt aaa 1369 Ser Gly Val Thr Val Glu Leu Ser Glu Ala Ala Arg Ala Gly Val Lys 80 85 90 gct tct tct gat tgg gta atg gac agt atg aat aaa gga act gat tca 1417 Ala Ser Ser Asp Trp Val Met Asp Ser Met Asn Lys Gly Thr Asp Ser 95 100 105 tac ggt gta aca act ggt ttc ggc gct act tct cat cgt cgt acg aaa 1465 Tyr Gly Val Thr Thr Gly Phe Gly Ala Thr Ser His Arg Arg Thr Lys 110 115 120 125 cag gga gga gct ctt caa aaa gaa ctt att aga ttt ctt aac gca gga 1513 Gln Gly Gly Ala Leu Gln Lys Glu Leu Ile Arg Phe Leu Asn Ala Gly 130 135 140 att ttc ggt aat ggc tca gat aat act ctt cca cat tct gca aca cga 1561 Ile Phe Gly Asn Gly Ser Asp Asn Thr Leu Pro His Ser Ala Thr Arg 145 150 155 gct gca atg ctt gtc aga att aat act tta ctt caa gga tac tca ggc 1609 Ala Ala Met Leu Val Arg Ile Asn Thr Leu Leu Gln Gly Tyr Ser Gly 160 165 170 att cgt ttt gaa ata ctt gaa gca att aca aaa ttt ttg aac caa aat 1657 Ile Arg Phe Glu Ile Leu Glu Ala Ile Thr Lys Phe Leu Asn Gln Asn 175 180 185 att act cct tgc tta cca ctt cgt gga aca att aca gct tca ggt gat 1705 Ile Thr Pro Cys Leu Pro Leu Arg Gly Thr Ile Thr Ala Ser Gly Asp 190 195 200 205 tta gtt cca tta tct tac att gct ggt ctt ctt act ggt cga cct aat 1753 Leu Val Pro Leu Ser Tyr Ile Ala Gly Leu Leu Thr Gly Arg Pro Asn 210 215 220 agt aaa gct gta ggt cct acg ggg gtt att tta tct cca gaa gag gca 1801 Ser Lys Ala Val Gly Pro Thr Gly Val Ile Leu Ser Pro Glu Glu Ala 225 230 235 ttc aag tta gct ggt gtt gaa ggt ggg ttt ttc gaa ttg caa cca aag 1849 Phe Lys Leu Ala Gly Val Glu Gly Gly Phe Phe Glu Leu Gln Pro Lys 240 245 250 gaa gga ctt gca ttg gtg aat ggc aca gct gtt ggc tct gga atg gct 1897 Glu Gly Leu Ala Leu Val Asn Gly Thr Ala Val Gly Ser Gly Met Ala 255 260 265 agt atg gtt tta ttt gaa gct aat att ctt gcg gta tta gct gaa gta 1945 Ser Met Val Leu Phe Glu Ala Asn Ile Leu Ala Val Leu Ala Glu Val 270 275 280 285 atg tct gca att ttt gcc gaa gtc atg caa gga aaa cca gaa ttt act 1993 Met Ser Ala Ile Phe Ala Glu Val Met Gln Gly Lys Pro Glu Phe Thr 290 295 300 gat cat tta act cac aaa ttg aaa cac cat cct gga caa atc gaa gca 2041 Asp His Leu Thr His Lys Leu Lys His His Pro Gly Gln Ile Glu Ala 305 310 315 gct gca att atg gaa cat ata tta gat ggg tca gct tat gtt aaa gct 2089 Ala Ala Ile Met Glu His Ile Leu Asp Gly Ser Ala Tyr Val Lys Ala 320 325 330 gct cag aaa ctt cac gaa atg gat cct tta caa aaa cct aag caa gat 2137 Ala Gln Lys Leu His Glu Met Asp Pro Leu Gln Lys Pro Lys Gln Asp 335 340 345 cgt tat gct ctt aga acg agt cca caa tgg ttg ggg cca caa att gag 2185 Arg Tyr Ala Leu Arg Thr Ser Pro Gln Trp Leu Gly Pro Gln Ile Glu 350 355 360 365 gtt att cgc tca tca act aaa atg att gaa aga gaa atc aat tca gtt 2233 Val Ile Arg Ser Ser Thr Lys Met Ile Glu Arg Glu Ile Asn Ser Val 370 375 380 aat gac aat cct tta att gat gtt tca cgt aat aaa gcg att cat ggt 2281 Asn Asp Asn Pro Leu Ile Asp Val Ser Arg Asn Lys Ala Ile His Gly 385 390 395 ggt aac ttc caa gga aca cca atc ggt gtt tca atg gat aat act aga 2329 Gly Asn Phe Gln Gly Thr Pro Ile Gly Val Ser Met Asp Asn Thr Arg 400 405 410 tta gct att gcg gct att gga aaa ctt atg ttt gca caa ttt tct gaa 2377 Leu Ala Ile Ala Ala Ile Gly Lys Leu Met Phe Ala Gln Phe Ser Glu 415 420 425 ctt gtt aac gat ttc tat aac aac gga tta cca tca aat tta agt ggc 2425 Leu Val Asn Asp Phe Tyr Asn Asn Gly Leu Pro Ser Asn Leu Ser Gly 430 435 440 445 ggg cgc aat cca agt ttg gat tat ggt ttt aaa ggt gct gaa att gcc 2473 Gly Arg Asn Pro Ser Leu Asp Tyr Gly Phe Lys Gly Ala Glu Ile Ala 450 455 460 atg gca tct tat tgt tca gaa ctt caa ttt tta gcc aat cca gtt aca 2521 Met Ala Ser Tyr Cys Ser Glu Leu Gln Phe Leu Ala Asn Pro Val Thr 465 470 475 aac cac gta caa agt gcg gaa caa cat aat caa gat gtc aac tct ttg 2569 Asn His Val Gln Ser Ala Glu Gln His Asn Gln Asp Val Asn Ser Leu 480 485 490 ggc ctt att tct tca cga aaa aca agt gag gcc gtc gag ata tta aaa 2617 Gly Leu Ile Ser Ser Arg Lys Thr Ser Glu Ala Val Glu Ile Leu Lys 495 500 505 tta atg tca aca aca ttt ctt gtc ggc ctt tgc caa gca att gat tta 2665 Leu Met Ser Thr Thr Phe Leu Val Gly Leu Cys Gln Ala Ile Asp Leu 510 515 520 525 cgt cat ctt gaa gaa aat tta aaa tca act gtt aaa aac aca gta tct 2713 Arg His Leu Glu Glu Asn Leu Lys Ser Thr Val Lys Asn Thr Val Ser 530 535 540 tct gtt gct aaa cga gtt tta acc atg gga gtt aat ggt gaa tta cat 2761 Ser Val Ala Lys Arg Val Leu Thr Met Gly Val Asn Gly Glu Leu His 545 550 555 cca tca cgc ttt tgt gaa aaa gat ctt tta cgc gtc gtc gat cgt gaa 2809 Pro Ser Arg Phe Cys Glu Lys Asp Leu Leu Arg Val Val Asp Arg Glu 560 565 570 tat att ttt gca tat att gat gac cca tgt agt gca aca tat cct tta 2857 Tyr Ile Phe Ala Tyr Ile Asp Asp Pro Cys Ser Ala Thr Tyr Pro Leu 575 580 585 atg cag aaa ctt aga caa aca tta gtt gag cat gcc ttg aag aat ggt 2905 Met Gln Lys Leu Arg Gln Thr Leu Val Glu His Ala Leu Lys Asn Gly 590 595 600 605 gat aat gag cgt aat ctt tct aca tca att ttt caa aaa att gca acc 2953 Asp Asn Glu Arg Asn Leu Ser Thr Ser Ile Phe Gln Lys Ile Ala Thr 610 615 620 ttc gag gac gaa ctt aaa gca tta tta cct aaa gaa gtg gaa tca gct 3001 Phe Glu Asp Glu Leu Lys Ala Leu Leu Pro Lys Glu Val Glu Ser Ala 625 630 635 aga gcc gct ttg gaa agt gga aac cca gcc att cca aat cga att gaa 3049 Arg Ala Ala Leu Glu Ser Gly Asn Pro Ala Ile Pro Asn Arg Ile Glu 640 645 650 gaa tgt cgt tca tat cct ctt tat aaa ttt gtt cga aaa gag ctt ggt 3097 Glu Cys Arg Ser Tyr Pro Leu Tyr Lys Phe Val Arg Lys Glu Leu Gly 655 660 665 acg gaa tat ctt act ggc gaa aag gta aca tca cct ggt gaa gag ttt 3145 Thr Glu Tyr Leu Thr Gly Glu Lys Val Thr Ser Pro Gly Glu Glu Phe 670 675 680 685 gaa aaa gtt ttt att gcc atg agt aaa ggt gaa att att gat cct tta 3193 Glu Lys Val Phe Ile Ala Met Ser Lys Gly Glu Ile Ile Asp Pro Leu 690 695 700 ctt gaa tgt ctt gag tca tgg aat gga gcc cct tta cct atc tgt 3238 Leu Glu Cys Leu Glu Ser Trp Asn Gly Ala Pro Leu Pro Ile Cys 705 710 715 taattttccg attttaacgg tataaaaacc agtcttcggg ctggtttttt tattttataa 3298 ag 3300

Claims (20)

  1. (A) N-말단 뮤신 결합 폴리펩티드 및 (B) 세포-벽 고정 도메인 (cell-wall anchoring domain)을 포함하는 C-말단 세포 부착 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는, 락트산 박테리움 (lactic acid bacterium: LAB).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 세포 부착 폴리펩티드는 세포 및 점액-결합 단백질 A (CmbA), 점액 결합 단백질 (Mub), 점액 부착 촉진 단백질 (mucus adhesion promoting protein: MapA), 락토코컬 뮤신 결합 단백질 (MbpL) 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 박테리움.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 세포 부착 폴리펩티드는 CmbA, 예컨대, 락토바실러스 루테리 CmbA (Lactobacillus reuteri CmbA)인 것인, 박테리움.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 CmbA 폴리펩티드는 서열번호 1과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 것인, 박테리움.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 뮤신-결합 폴리펩티드는 TFF1, TFF2 및 TFF3 중에서 선택된 트레포일 인자 (trefoil factor: TFF)인 것인, 박테리움.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 TFF 폴리펩티드는 서열번호 3과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 것인, 박테리움.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 CmbA 및 TFF를 포함하는 것인, 박테리움.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 분비 신호 펩티드 (secretion signal peptide), 예컨대, SSusp45를 추가로 포함하는 것인, 박테리움.
  9. 제1항에 있어서,
    융합 단백질을 암호화하는 상기 외인성 핵산은 thyA 프로모터 (PthyA), hlla 프로모터 (PhllA) 및 gapB 프로모터 (PgapB)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 프로모터에 의해 전사적으로 조절되는 것인, 박테리움.
  10. 제1항에 있어서,
    하기 중에서 선택되는 적어도 하나의 치료 폴리펩티드를 암호화하는 외인성 핵산을 추가로 포함하는, 박테리움:
    a. 시토카인;
    b. 인터류킨 (IL), 예컨대, IL-2, IL-10, IL-18;
    c. 항체 또는 이의 단편, 예컨대, 항 TNFα 항체, IL-4에 대한 항체, IL-5에 대한 항체, IL-13에 대한 항체, IL-15에 대한 항체, 면역글로불린 E (IgE)에 대한 항체;
    d. 항원, 예컨대, 프로인슐린 (PINS), 글루탐산 데카르복실라아제 (GAD65), 인슐린종-관련 단백질 2 (IA-2), 섬-특이적 글루코오스-6-포스파타아제 촉매 소단위-관련 단백질 (islet-specific glucose-6-phosphatase catalytic subunit-related protein: IGRP), 아연 수송체 8 (ZnT8), 크로모그라닌 A, (프레프로) 섬 아밀로이드 폴리펩티드 ((prepro) islet amyloid polypeptide: ppIAPP), 페리페린, 시트룰린화된 글루코오스-조절된 단백질 (GRP), 나무 화분 알레르겐 (자작나무 화분 알레르겐 또는 삼나무 화분 알레르겐 포함), 잡초 화분 알레르겐, 풀 화분 알레르겐, 식품 알레르겐 (땅콩 알레르겐, 우유 알레르겐, 달걀 알레르겐, 글루텐 알레르겐 (글리아딘 에피토프) 포함), 먼지-진드기 알레르겐, 곰팡이 알레르겐, 동물 비듬 알레르겐;
    e. 호르몬, 예컨대, 글루카곤-유사 펩티드 1 (GLP-1), 글루카곤-유사 펩티드 2 (GLP-2), 글루카곤, 엑센딘-4, 표피 성장 인자 및 성장 호르몬;
    f. TFF, 예컨대, TFF 1, TFF2 및 TFF3.
    g. 효소, 예컨대, 페닐알라닌 암모니아 리아제 (PAL), 아미노산 데카르복실라아제; 및
    h. 이의 임의의 조합.
  11. 제10항에 있어서,
    적어도 하나의 치료 폴리펩티드가 PAL인 것인, 박테리움.
  12. 제10항에 있어서,
    적어도 하나의 치료 폴리펩티드를 암호화하는 상기 외인성 핵산은 gapB 프로모터 (PgapB)에 의해 전사적으로 조절되는 것인, 박테리움.
  13. 제1항에 있어서,
    락토바실러스 종 (Lactobacillus species)(sp.) 박테리움, 비피도박테리움 (Bifidobacterium) 종 박테리움, 스트렙토코커스 (Streptococcus) 종 박테리움, 및 엔테로코커스 (Enterococcus) 종 박테리움 및 락토코커스 (Lactococcus) 종 박테리움, 예컨대, 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, LAB.
  14. 제1항에 있어서,
    융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 상기 박테리움은 하기를 갖는 것인, 박테리움:
    상기 융합 단백질을 암호화하는 상기 외인성 핵산을 포함하지 않는 상응하는 박테리움과 비교한 경우,
    a. 적어도 10%의 증가된 위장 (GI) 통과 시간; 및/또는
    b. 적어도 10%의 장 점막으로의 증가된 부착성; 및/또는
    c. 적어도 20%의 증가된 시험관내 뮤신-결합 능력; 및/또는
    d. 적어도 10%의 증가된 시험관내 Caco-2 세포-결합 능력.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    하기 중에서 선택된 트레할로오스 축적을 증가시키는 적어도 하나의 돌연변이 또는 삽입을 추가로 포함하는, 박테리움:
    a. 에스케리키아 콜라이 otsB (Escherichia coli otsB)의 삽입;
    b. usp45 프로모터, usp45, 및 트레할로오스-6-포스페이트 포스파타아제를 암호화하는 외인성 핵산 및 임의로 상기 usp45와 트레할로오스-6-포스페이트 포스파타아제를 암호화하는 상기 외인성 핵산 사이의 유전자간 영역, 예컨대, rpmD를 포함하는, 폴리시스트론성 발현 카세트의 삽입;
    c. hllA 프로모터 (PhllA)의 3'에 위치한, 트레할로오스 운반체 (transporter) lmg_0453 및 llmg_0454를 포함하는 폴리시스트론성 발현 카세트의 삽입;
    d. trePP의 불활성화;
    e. ptcC의 불활성화; 및
    f. (a) 내지 (e) 중 임의의 것의 조합.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 박테리움, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  17. 자가면역 질환, 알레르기, 대사성 질환 및 위장 질환으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 질환의 치료 또는 예방에서의, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 박테리움 또는 제16항의 약학적 조성물의 용도.
  18. 자가면역 질환, 알레르기, 대사성 질환, 위장 질환 및 영양 결함 (nutritional defect)으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조를 위한, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 박테리움 또는 제16항의 약학적 조성물의 용도.
  19. 대상체에게 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 박테리움 또는 제16항의 조성물의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서의 질환의 치료 방법으로서, 여기서, 상기 질환은 제1형 당뇨병 (T1D), 복강 질환, 염증성 장 질환 및 페닐케톤뇨증 (PKU) 중에서 선택되는 것인, 치료 방법.
  20. 융합 단백질을 암호화하는 핵산으로서, 하기를 포함하는 핵산:
    a. 세포 및 점액-결합 단백질 A (CmbA), Mub, MapA, MbpL 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 세포-부착 폴리펩티드를 암호화하는 서열; 및
    b. TFF 폴리펩티드, MubBP 및 이의 조합 중에서 선택된 뮤신-결합 폴리펩티드를 암호화하는 서열.
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