KR20190045912A - 면역자극제 - Google Patents
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Abstract
변성 응고에 의해 고체화된 혈장 유래 단백 또는 혈청 유래 단백을 포함하는 담체, 및 그 담체에 담지된 페록시다아제 유사 활성을 갖는 단백을 포함하고, 항원제시세포를 강하게 자극할 수 있는 높은 유효성을 가지며, 또한 생체에 대한 독성이 경감된 안전성이 높은 면역자극제로서 이용 가능한 복합체.
Description
본 발명은 면역자극제에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 변성 응고함으로써 고체화된 혈장 유래 단백 또는 혈청 유래 단백을 담체로서 포함하는 면역자극제에 관한 것이다.
면역에는 크게 구별하여 자연면역과 획득면역의 2종류가 있는 것이 알려져 있다. 생체에 염증반응을 일으키는 물질은 주로 자연면역을 자극하여 수분 내지 수일 사이에 염증반응을 야기한다. 이후는 획득면역이 유도되어 항원이 되는 물질에 특이적인 반응이 일어난다. 그 반응에는 주로 B 세포에 의한 액성 면역반응(항체 생산)과 T 세포에 의한 세포성 면역반응(이상세포의 침해 제거)이 있다. 백신은 항원을 생체에 투여하고, 면역을 자극해서 감염증 등의 질병을 예방(경우에 따라서는 치료)하기 위해 사용된다. 또한, 면역반응을 야기하는 것이 기대되고 있는 항원의 면역자극 능력이 약한(항원성이 낮은) 경우, 면역 어쥬번트를 면역자극 보조를 위해 첨가하여 항원에 대한 면역반응을 증강시킬 수 있다.
면역 어쥬번트는 항원을 흡착·덮음·가둠·항원과 공유결합시키는 등, 어떠한 형태로 항원과 일체화되어 있어, 항원이 용이하게 체내에서 확산·소실되는 일이 없도록 고안되어 있다. 이들 고안은 항원이 액성 면역반응 또는 세포성 면역반응 중 어느 쪽을 야기시킨다고 하더라도, 항원이 일단 항원제시세포(수상세포, 마크로파지, 단핵구, B 세포가 알려져 있음)에 흡수되어 세포내에서 처리되어야만 하는 것에 대응하고 있다. 처리된 항원은 주요 조직 적합 유전자 복합체(major-histocompatibility complex, 「MHC」로 약칭함, 이하 동일) 상에 탑재되어 항원제시세포 표면에 제시되고, 그것이 헬퍼 T 세포에 인식되어, 액성 면역반응 또는 세포성 면역반응의 유도로 이어져 간다. 따라서, 면역 어쥬번트는 항원에 대한 면역반응의 유도를 기대하기 위해, 일반적으로는 항원과 함께 체외로부터 투여되거나, 또는 체내의 항원이 있는 국소에 투여된다. 항원을 수반하지 않고(따라서 그 항원 특이적 면역반응을 야기하는 것은 반드시 기대되는 것은 아니고) 일반적인 면역반응계의 자극작용을 기대하는 물질군은, 통상 「생물반응 수식물질(biological response modifier, BRM)」로서 분류되어 있으며, 저명한 것으로 크레스틴, 렌티난, 마루야마 백신이 있다.
항원제시세포에 흡수되어 처리된 항원은 MHC 중 class II 분자 상에 제시된 것은 주로 Th2형 헬퍼 T 세포의 활성화를 거쳐 성숙 B 세포에 의한 항원 특이적인 항체 생산을 유도한다. 항체가 액성 면역반응의 주역이다. 또한, MHC 중 class I 분자 상에 제시된 것은 주로 Th1형 헬퍼 T 세포의 활성화를 거쳐 항원 특이적인 세포상해성 T 세포(CTL)를 증식 활성화시킨다. Th1형 헬퍼 T 세포와 CTL이 세포성 면역반응의 주역이다. 액성 면역반응, 세포성 면역반응 모두, 백신 중의 면역 어쥬번트는 일반적으로 자연면역을 매개로 획득면역을 증강시키는 것으로 이해되고 있다(비특허문헌 1). 또한, 이 명세서 중에 인용한 특허문헌 및 비특허문헌 중의 기재 전부를 참조로써 이 명세서의 개시로서 포함시킨다.
외래 생물에 의한 감염증 대책으로서 뿐 아니라, 동일 개체의 체내에 발생한 종양(암종을 포함함)도, 체내 면역계의 활성화에 의해 치료하고자 하는 개념(Coley, 1891)의 등장부터 이미 100년을 넘기고 있다. 그러나, 감염증 백신과 동일한 방식(즉, 항원과 면역 어쥬번트의 조합)에 의한 종양 백신의 경우, 오늘날에도 종양 치료에 있어서 충분한 성공을 거두고 있다고는 말하기 어렵다.
또한, 면역반응계에는 림프구의 활성화를 정지시키는 면역 체크포인트가 있어, 이 벽을 극복하여 면역반응을 강화하는 방법의 개발이 과제로 되어 있다. 종양의 면역요법으로서는, 2014년 7월에 세계에 앞서서 일본에서 승인된 항PD-1항체 니볼루맙이 알려져 있다. 이 항체 의약은 면역 체크포인트를 저해하는 작용에 의해 면역반응을 활성화하는 작용을 가지고 있어, 흑색종, 폐암, 신장암 등에 있어서 높은 유효성을 발휘하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 유효한 암의 종류는 일부 암에 한정되어 있어, 대략 30% 정도의 증례에 있어서 성공하는 것에 그치고 있다. 또한, 예를 들면 뇌종양 중 교아종과 같이 종래형의 수술·방사선치료·화학요법 모두를 조합시킨 치료를 행하더라도, 수술 후 재발 예방조차 매우 곤란한 난치성 종양이 있기 때문에, 면역 체크포인트 저해제뿐 아니라, 다른 효과적인 면역반응의 증강에 의한 종양 치료법의 개발에 기대하는 사회적 요구는 매우 크다.
면역 어쥬번트의 후보로서는, 자연면역을 야기하는 패턴 인지 수용체(pattern-recognition receptors)에 결합하는 물질군이 있다. 이들에는 병원균 연관 분자 패턴(pathogen-associated molecular patterns)으로서 알려지는 외인성 톨 유사 수용체 아고니스트, NOD 유사 수용체 아고니스트, RIG 유사 수용체 아고니스트, 내인성 알라민을 들 수 있다. 그 밖에, 최종 당산화물 수용체(receptor of advanced glycation endproduct)에 결합하는 물질군이나, 사이토카인, 케모카인 등도 있어, 그 종류는 방대하다(비특허문헌 2).
이들 면역자극 물질군 중 면역 어쥬번트로서는, 세균 유래의 리포단백, 리포펩티드, 리포테이코산, 미코박테리아 유래의 리포글리칸, 미코플라스마 유래의 리포단백, 효모 유래의 자이모산, 포린, 바이러스 이중 가닥 RNA, 그람 음성 간균의 리포폴리사카라이드, 리피드 A, 모노포스포릴리피드 A, 리포다당체, 열충격 단백, 플라젤린, 바이러스 단일 가닥 RNA, 이미다조퀴놀린, 세균 DNA, CpG DNA, 헤모조인, 요로병원성 세균, 프로필린, 원충의 프로필린 유사 단백 등, 그 밖에 사포닌, 세균 톡신 등이 비교적 자주 사용된다(비특허문헌 1). 작용에 강약은 있으나 이들은 모두 염증 유도인자로, 사이토카인의 생산으로 이어지는 세포내 시그널을 야기한다.
염증 유도인자군의 딜리버리 시스템으로서는, 알루미늄염, 유지-물 에멀션(유화제로서 계면활성제를 포함함), 리포솜, 비로솜(virosome), 생물학적으로 분해 가능한 인조 폴리머 소구, ISCOM(Immune stimulating complex), 스쿠알렌, 알파토코페롤, 점막 딜리버리 시스템이 알려져 있다(비특허문헌 1). 이들 외에, 인산칼슘(특허문헌 1), 실리카(비특허문헌 3 및 4)도 알려져 있다. 또한, 사이토카인 중에서 면역반응 자극능이 높은 것으로서 과립구 마크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF)가 알려져 있고(비특허문헌 5), 그 밖에도 인터류킨-12 등(비특허문헌 6)이 있다.
가장 강력한 면역 어쥬번트로서 알려져 있는 것은 프로인트 완전 어쥬번트(FCA)(유동파라핀, 계면활성제, 결핵사균의 혼합물)이다(비특허문헌 3). 그러나, 강렬한 염증 유도에 의한 독성이 강하기 때문에 오늘날에는 실험 목적으로만 사용되고 있다. 종양 치료 분야에서는, 결핵사균을 포함하지 않는 프로인트 불완전 어쥬번트(IFA)(예를 들면 Montanide ISA-51)가 암 펩티드 백신의 면역 어쥬번트로서 임상적으로는 사용이 시도되고 있으나(비특허문헌 7 및 8), IFA에서도 강한 염증 반응을 유도하여, 피하주사한 경우에 수개월 이상, 때로는 약 1년에 걸친 장기간, 주사 국소의 발적과 부기가 남는 것이 알려져 있다.
현재, 감염증 대책용 백신의 조성물로서 가장 임상적으로 보급되어 있는 면역 어쥬번트는 알루미늄염 또는 수산화알루미늄이다. 그러나, 액성 면역반응 증강은 우수하지만 세포성 면역반응의 유도능이 낮다는 문제가 있다(비특허문헌 4 및 6).
종양의 치료나 재발 예방에 있어서는, 자연면역뿐 아니라 획득면역을 자극할 수 있었다고 하더라도 액성 면역반응 유도만으로는 불충분하여, 세포성 면역반응 유도에 의한 헬퍼 T 세포(특히 Th1형 헬퍼 T 세포) 및 CTL의 활성화와, CTL에 의한 종양세포 살해작용이 중요한 것이 널리 알려져 있다. 이 때문에 알루미늄염 또는 수산화알루미늄과는 다른 특징을 가져, 세포성 면역반응을 특이적으로 활성화할 수 있는 면역 어쥬번트나 면역자극제가 요구되고 있다. 그러나, 전술한 FCA나 IFA와 같이, 각종 공지의 면역 어쥬번트 중 세포성 면역반응 유도능이 높은 것은 염증 유도에 의한 독성도 강한 경향이 있어, 임상적인 응용이 곤란하다는 문제가 있다. 세포성 면역반응 증강이 우수하고, 또한 독성이 낮아 안전성이 높은 유용한 면역 어쥬번트는 충분히 개발되어 있다고는 할 수 없다.
본 발명자는 세포성 면역반응 유도를 위해 알부민-헤파린 코아세르베이트의 침전물에 GM-CSF, 인터류킨-2(IL-2) 및/또는 정제 투베르쿨린을 결합시킨 것을 면역 어쥬번트로 하고, 수술 후 적출 포르말린 고정 자가 간암 조직 단편을 항원으로 한 자가 암 백신을 제작하였다. 이 백신은 안전성이 높아, 간암 환자 18 예에 사용한 경우에, National Cancer Institute - Common Toxicity Criteria v2.0, 1999에 따른 grade 1~2의 자연치유되는 레벨의 이상사례만이 나타나고, grade 3~4의 심각한 이상사례를 나타낸 증례는 1 예도 없었다. 또한, 간암의 수술 후 재발 예방 효과가 관찰되고 있어 유효성도 확인되고 있다(비특허문헌 9 및 특허문헌 2).
또한, 수술 후 적출 포르말린 고정 간암 조직 단편을 항원으로 하고, 면역 어쥬번트로서 BCG균 추출물(BCGext)을 흡착시킨 것, 및 알부민-헤파린 코아세르베이트 침전에 정제 투베르쿨린을 포함시켜 가교반응에 의해 고정한 것에, 추가로 용해되어 있는 정제 투베르쿨린을 첨가하여 자가 간암 백신으로서 사용할 수 있는데, 이 백신에 의해 간암 특이적인 항원 분자 글리피칸(glypican) 3에 대한 CTL의 유도가 이루어진 것이 간암 증례에서 관찰되고 있다(비특허문헌 10).
포르말린 고정 자가 교아종 조직 단편을 항원으로 하고, 면역 어쥬번트로서 BCGext를 함유시킨 것(특허문헌 3), 및 알부민-헤파린 코아세르베이트 침전에 정제 투베르쿨린을 가교반응에 의해 고정한 것에(특허문헌 4), 추가로 용해되어 있는 정제 투베르쿨린도 첨가 혼합하여 자가 뇌종양 백신으로서 사용할 수 있다. 이 백신에 의해 교아종 환자에 있어서는 문헌 상의 과거 데이터에서 추출한 역사 대조군에 비해 수술 후 전체 생존기간의 연장이 관찰되고 있다(비특허문헌 11, 12, 13). 이들 임상시험에서도 높은 안전성이 나타내어져 있고, grade 3~4의 심각한 이상사례를 나타낸 증례는 역시 1 예도 없다.
전술한 자가 뇌종양 백신의 경우, 포르말린 고정 자가 뇌종양조직이 면역자극 물질의 담체로서 이용되고 있었으나, 종양 환자에 따라서는 충분량의 적출 종양조직을 이용할 수 없는 경우도 많다. 이에, 포르말린 고정 종양조직의 대용이 되는 것이 필요하여 예의 탐색되어 왔다. 그 개발 과정에 있어서 알부민을 무기 고형물인 인산칼슘 침전에 담지시킨 것이나(특허문헌 1), 알부민-헤파린 코아세르베이트 침전의 형태로 한 것(특허문헌 4, 5) 등, 기반이 되는 불용성 물질에 담지시킨 형태로 용해성 혈청 단백을 고정화한 형태가 제안되어 있다. 이들 형태의 경우, 알부민 분자 자체는 변성되지 않고 본래의 분자 형태를 유지하고 있는 상태로 되어 있다. 전자의 경우는 인산칼슘 침전 중에 알부민 분자가 들어가 있고, 후자의 경우는 코아세르베이트 상태 그대로 단백 분자간 가교제에 의해 가교되어 있다. 그러나, 알부민 분자 자체를 사전에 변성 응고시킨 후에 단백 분자간 가교제에 의해 가교되어 고체화된 것이, 항원이나 면역자극 물질의 효과적인 담체로서 작용하는 것은 종래 알려져 있지 않다.
또한, 인간을 포함하는 동물의 조직, 세포 및 이들 성분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 고체화된 재료로부터 조제된 불용성 미립자를 이용할 수 있는데(특허문헌 6), 조직세포 밖으로 분비되어 혈장 중에 용해되어 있는 단백을 조직, 세포 및 이들 성분으로서 이용할 수 있는 것에 대해서는 상기 특허문헌 6에 개시되어 있지 않고, 이러한 기술적 사상에 대해서도 시사 내지 교시가 없다. 혈장(또는 혈청) 중에 용해되어 있는 단백 그 자체를 사전에 분자 레벨로 변성 응고시키고, 단백 가교제 처리에 의해 불용성 고체로 한 것이 면역자극 물질의 주요한 담체 또는 조성물로서(염증 유도인자군의 딜리버리 시스템으로서) 사용하는 것을 시사 내지 교시하는 간행물은 눈에 띄지 않는다.
주지와 같이, 동물의 조직, 세포 및 이들 성분으로 이루어지는 재료를 이종 동물(xenogenic animal)에 투여한 경우 거부반응이 발생한다. 이 재료가 가공되어 고체화된 경우에도 거부반응은 발생할 것으로 추정되어 왔기 때문에, 이 재료가 용이하게 입수 가능하더라도 항원성이 매우 낮은 콜라겐 등의 일부 재료를 제외하고, 인간 임상에서 널리 응용되는 경우는 없었다. 인간 유래로, 애초부터 용해되어 있는 혈장 유래 단백은 비교적 대량으로 입수 가능하나, 이들 단백 분자를 변성시켜 가공한 경우, 동종인 인간에게 투여했을 때 거부반응을 야기하는지 여부에 대해서는 지금까지 상세하게 검토되어 있지 않다. 이러한 배경으로부터, 혈장 유래 단백을 불용성이 되도록 가공하여 항원이나 면역자극 물질의 담체로서 이용하고자 하는 기술적인 사상에 대해서 시사 내지 교시한 문헌은 없어, 이와 같이 하여 조제된 담체가 인간에게 투여되더라도 거부반응을 거의 야기하지 않고 항원에 대한 획득면역의 증강을 위해 공헌할 수 있다는 시사 내지 교시를 한 문헌도 전혀 존재하지 않는다. 더 나아가서는 항원을 동시에 같은 곳에 투여하지 않고, 분자 레벨로 변성 응고시켜 불용성 고체로 한 혈장(또는 혈청) 유래 단백을 주요한 담체로서 면역자극 물질을 담지하는 면역자극제만으로, 즉 BRM으로서 생체를 자극하여 일반적인 면역반응을 강화하고자 하는 시도도 종래 이루어져 있지 않다.
한편, IV형 알레르기 반응(지연형 알레르기, 세포성 면역, 투베르쿨린형으로도 불리고 있음)을 유도하는 대표적 물질인 투베르쿨린은 인간에게 반복 투여하더라도 매우 안전한 것이 알려져 있다(비특허문헌 14). IV형 알레르기 반응의 경우, 세포성 면역반응이 유도되고 있고, 게다가 액성 면역반응의 주역인 항체나 보체는 관여하지 않는다(비특허문헌 15). 단 정제한 투베르쿨린은 수용성으로, 그대로 체내에 투여해도 신속하게 확산 소실되어 버린다는 문제가 있다. 또한, 정제 투베르쿨린은 종양 항원이 아니기 때문에, 이를 단독으로 사용한 것만으로는 종양의 재발 예방·치료 효과는 기대할 수 없다고 생각되고 있다.
정제 투베르쿨린은 유리 용기에 흡착되기 쉬운데, 그 흡착은 혈청 알부민으로 방지할 수 있기 때문에, 정제 투베르쿨린은 혈청 알부민에 강하게 흡착되는 것으로 이해되고 있다(비특허문헌 16 및 17). 그러나, 분자 레벨로 혈청 알부민을 변성 응고시켜 단백 가교제 처리함으로써 알부민을 불용성 고체로 한 경우에도, 정제 투베르쿨린에 대해 충분한 흡착능을 갖는지 여부는 종래 알려져 있지 않다. 또한, 이러한 알부민의 불용성 고체에 흡착시킨 정제 투베르쿨린에 의한 항원제시세포의 자극성 변화에 대해서도 종래 전혀 검토되어 있지 않고, 마찬가지로 알부민 등의 혈장(또는 혈청) 유래 단백을 불용성 고체로 하고, 그것에 정제 투베르쿨린 이외의 면역자극성 물질을 담지시킨 경우에 대해서도 면역담당세포의 자극성에 변화를 초래하는지 여부는 종래 검토되어 있지 않다.
또한 헤모글로빈은 통상 혈장 중에 용해되어 있지 않아, 용혈 반응을 일으킨 경우에 적혈구 외로 나와 혈장 중에 나타나는데, 이 헤모글로빈에 페록시다아제 유사 활성이 있는 것이 널리 알려져 있다. 그러나, 헤모글로빈의 페록시다아제 유사 활성을 이용한 면역자극제는 종래 알려져 있지 않다. 헤모글로빈 유사 헴 단백인 미오글로빈, 시토크롬 및 카탈라아제도 페록시다아제 유사 활성을 갖는데, 이들 헴 단백의 페록시다아제 유사 활성을 이용한 면역자극제도 종래는 알려져 있지 않다.
사카이 하루미, 임상과 바이러스, 41(5):1-9, 2013.
블로그：EARL의 의학 노트, http://drmagician.exblog.jp/16073684
Stills HF, Jr. Adjuvants and antibody production: Dispelling the myths associated with Freund's complete and other adjuvants. ILAR Journal, 46:280-293, 2005.
Kuroda E, Coban C, Ishii KJ. Particulate adjuvant and innate immunity: Past achievements, present findings, and future prospects. Intern. Rev. Immunol., 32:209-220, 2013.
Disis ML, et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: an effective adjuvant for protein and peptide-based vaccines. Blood, 88:202-210, 1996.
이시이 켄, 어쥬번트 개발연구의 신전개, 제9회 후생과학심의회 예방접종·백신분과회 연구개발 및 생산·유통부회 자료1, 2015년 1월 30일.
Yutani S, et al. Phase II study of personalized peptide vaccination with both a hepatitis C virus-derived peptide and peptides from tumor-associated antigens for the treatment of HCV-positive advanced hepatocellular carcinoma patients. J. Immunol. Res., Article ID 473909, 2015. http://www.hindawi.com/journals/jir/2015/473909/
Hashimoto N, et al. Wilms tumor 1 peptide vaccination combined with temozolomide against newly diagnosed glioblastoma: safety and impact on immunological response. Cancer Immunol. Immunother., 64:707-16, 2015.
Kuang M, et al. Phase II randomized trial of autologous formalin-fixed tumor Vaccine for Postsurgical recurrence of Hepatocellular Carcinoma. Clin. Cancer Res., 10:1574-1579, 2004.
Kawashima I, et al. Suppression of postsurgical recurrence of hepatocellular carcinoma treated with autologous formalin-fixed tumor vaccine, with special reference to glypican-3. Clinical Case Reports, 3: 444-447, 2015.
Ishikawa E, et al. A clinical trial of autologous formalin-fixed tumor vaccine for glioblastoma multiforme patients. Cancer Sci., 98:1226-1233, 2007.
Muragaki Y, et al. Phase I / IIa Trial of Autologous Formalin-fixed Tumor Vaccine Concomitant with Fractionated Radiotherapy for Initially-Diagnosed Glioblastoma. J. Neurosurg., 115:248-255, 2011.
Ishikawa E, et al. Phase I/IIa trial of fractionated radiotherapy, temozolomide, and autologous formalin-fixed tumor vaccine for newly diagnosed glioblastoma. J. Neurosurg., 121:543-553, 2014.
Kunins HV, et al. Validity of a self-reported history of a positive tuberculin skin test - A prospective study of drug users. J. Gen. Intern. Med., 19:1039-1044, 2004.
후생노동성 홈페이지, 알레르기 총론 제1장. http://www.mhlw.go.jp/new-info/kobetu/kenkou/ryumachi/dl/jouhou01-17.pdf
Guld J. Standardization and stability of purified tuberculin, American Review of Respiratory Disease, 80(2), pp. 255-256, 1959.
Landi S, Held HR, Tseng MC. Evaluation of various substances to prevent adsorption of tuberculin purified protein derivative (PPD) to glass surfaces. Bull. Org. mond. Sant. ull. Wld. Hlth. Org., 43:91-106, 1970.
Kurosaka K, Watanabe N, Kobayashi Y. Production of proinflammatory cytokines by phorbol myristate acetate-treated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages after phagocytosis of apoptotic CTLL-2 cells. J. Immunol., 161:6245-6249, 1998.
Hu PQ, et al. Escherichia coli expressing recombinant antigen and listeriolysin O stimulate class I-restricted CD8＋ T cells following uptake by human APC. J. Immunol., 172:1595-1601, 2004.
Brett SJ, Rhodes J, Liew FY, Tite JP. Comparison of antigen presentation of influenza A nucleoprotein expressed in attenuated AroA- Salmonella typhimurium with that of live virus. J. Immunol., 150:2869-2884, 1993.
Oliveira MM, Charlab R, Pessolani MC. Mycobacterium bovis BCG but not Mycobacterium leprae induces TNF-alpha secretion in human monocytic THP-1 cells. Mem. Inst. Oswaldo. Cruz., 96(7):973-978, 2001.
Gordon S. The macrophage: past, present and future. Eur. J. Immunol., 37: Suppl 1:S9-17, 2007.
Chang ZL. Recent development of the mononuclear phagocyte system: in memory of Metchnikoff and Ehrlich on the 100th Anniversary of the 1908 Nobel Prize in Physiology or Medicine. Biol. Cell., 101(12):709-721, 2009.
Cho YS, et al. Deciphering the proteome of the in vivo diagnostic reagent "purified protein derivative" from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics, 12(7): 979-991, 2012. doi:10.1002/pmic.201100544.
Najjam S, et al. Further characterization of the binding of human recombinant interleukin 2 to heparin and identification of putative binding sites. Glycobiology, 8:509-516, 1998.
DAKO Educational IHC Guidebook, Immunohistochemical Staining Methods, Sixth Edition, Chapter 15, ed. Tayor CR and Rudbeck L, 2013. http://www.dako.com
본 발명의 과제는 항원제시세포를 강하게 자극할 수 있는 높은 유효성을 가지며, 또한 생체에 대한 독성이 경감된 안전성이 높은 면역자극제를 제공하는 것에 있다.
본 발명자는 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 행한 결과, 알부민 등의 혈장 유래 단백 등을 변성 응고시켜서 고체화한 재료를 생체에 투여해도 거부반응을 야기하지 않는 것을 확인하였으나, 한편으로 이와 같이 변성 응고에 의해 고체화된 알부민 등을 포함하는 담체에 헤모글로빈 등의 페록시다아제 유사 활성을 갖는 단백을 담지시킨 복합체가 높은 면역자극능을 갖는 것을 발견하였다. 또한, 상기 담체가 정제 투베르쿨린 등의 면역자극 물질에 대한 높은 흡착성을 유지하고 있는 것도 발견하고, 상기 복합체에 정제 투베르쿨린 등의 면역자극 물질을 담지시킴으로써 더욱 강력한 면역자극능을 달성할 수 있는 것을 발견하였다. 본 발명은 이러한 지견을 토대로 하여 완성된 것이다.
즉, 본 발명자에 의해 아래의 발명이 제공된다.
[1] 변성 응고에 의해 고체화된 혈장 유래 단백 또는 혈청 유래 단백을 포함하는 담체, 및 그 담체에 담지된 페록시다아제 유사 활성을 갖는 단백을 포함하는 복합체.
[2] 페록시다아제 유사 활성을 갖는 단백이 실질적으로 미변성의 상태 또는 변성된 상태로 담지되어 있는 상기 [1]에 기재된 복합체.
[3] 페록시다아제 유사 활성을 갖는 단백이 혈장 유래 단백 또는 혈청 유래 단백과 함께 변성 응고에 의해 고체화된 상태로 담지되어 있는 상기 [1]에 기재된 복합체.
[4] 페록시다아제 유사 활성을 갖는 단백이 헤모글로빈 또는 미오글로빈인 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 한 항에 기재된 복합체.
[5] 추가로 1종 또는 2종 이상의 면역자극 물질을 담지시킨 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 한 항에 기재된 복합체.
[6] 면역자극 물질이 정제 투베르쿨린, BCG균 추출물, 사이토카인, 톨 유사 수용체 리간드, NOD 유사 수용체 아고니스트, RIG 유사 수용체 아고니스트, C 타입 렉틴 수용체 아고니스트, 환상 GMP-AMP 신타아제에 결합하는 외인성 DNA, 알라민, 항원 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 내지 2 이상의 물질인 상기 [5]에 기재된 복합체.
[7] 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 한 항에 기재된 복합체를 포함하는 면역자극제.
[8] 상기 [7]에 기재된 면역자극제와 알부민-헤파린 코아세르베이트 침전을 포함하는 면역 자극성 조성물.
[9] 알부민-헤파린 코아세르베이트 침전이 사이토카인을 흡착시킨 헤파린-알부민 코아세르베이트 침전인 상기 [8]에 기재된 면역 자극성 조성물.
[10] 사이토카인이 과립구 마크로파지 콜로니 자극인자, 인터류킨-2 및 인터페론 감마로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 물질인 상기 [9]에 기재된 면역 자극성 조성물.
[11] 상기 [7]에 기재된 면역자극제 또는 상기 [8]에 기재된 면역 자극성 조성물과 면역반응 억제작용 저해물질과의 조합을 포함하는, 질병의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 의약.
[12] 악성종양의 치료 및/또는 재발 또는 전이의 예방에 사용하기 위한 상기 [11]에 기재된 의약.
[13] 면역반응 억제작용 저해물질이 면역 체크포인트 저해제인 상기 [11] 또는 [12]에 기재된 의약.
[14] 면역 체크포인트 저해제가 항PD-1 항체, 항PD-L1 항체, 항PD-L2 항체, 항CTLA-4 항체, 항CD40 항체, 항CD137 항체, 항OX40 항체, 항TGF-β 항체, 항LAG3 항체, 항B7-H3 항체, 항B7-H4 항체, 항TIM3 항체, 항CD96 항체 및 항TIGIT 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 항체인, 상기 [13]에 기재된 의약.
[15] 상기 [7]에 기재된 면역자극제 또는 상기 [8]에 기재된 면역 자극성 조성물과 항원과의 조합을 포함하는, 질병의 예방을 위해 사용하는 백신.
[16] 항원이 종양 항원인 상기 [15]에 기재된 백신.
[17] 악성종양의 재발 또는 전이의 예방에 사용하기 위한 상기 [16]에 기재된 백신.
[18] 인간을 포함하는 포유류동물에 있어서 면역을 활성화하는 방법으로서, 상기 [7]에 기재된 면역자극제 또는 상기 [8]에 기재된 면역 자극성 조성물의 유효량을 인간을 포함하는 포유류동물에 투여하는 공정을 포함하는 방법.
[19] 인간을 포함하는 포유류동물에 있어서 질병, 바람직하게는 악성종양을 치료 및/또는 예방하는 방법으로서, 상기 [7]에 기재된 면역자극제 또는 상기 [8]에 기재된 면역 자극성 조성물과 면역반응 억제작용 저해물질과의 조합의 유효량을 인간을 포함하는 포유류동물에 투여하는 공정을 포함하는 방법.
[20] 인간을 포함하는 포유류동물에 있어서 악성종양의 재발 또는 전이를 예방하는 방법으로서, 상기 [7]에 기재된 면역자극제 또는 상기 [8]에 기재된 면역 자극성 조성물과 항원과의 조합의 유효량을 인간을 포함하는 포유류동물에 투여하는 공정을 포함하는 방법.
변성 응고에 의해 고체화된 혈장 유래 단백 또는 혈청 유래 단백을 포함하는 담체, 및 그 담체에 담지된 페록시다아제 유사 활성을 갖는 단백을 포함하는 본 발명의 복합체, 바람직하게는 페록시다아제 유사 활성을 갖는 헤모글로빈 등의 단백이 알부민 등의 혈장 유래 단백 또는 혈청 유래 단백과 함께 변성 응고에 의해 고체화된 상태로 담지되어 있는 상기 복합체는 면역자극작용을 가지고 있어 항원제시세포를 효과적으로 자극할 수 있는 것으로부터, 종양 등의 질병에 대한 치료 외에 악성종양의 수술 후 재발이나 전이 예방을 위한 면역자극제로서 유용하다. 더욱 바람직한 태양에서는 정제 투베르쿨린 등의 면역자극 물질을 담지시킴으로써 강력한 면역자극제로서 이용할 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 면역자극제는 안전하여 인간 임상에서 사용되는 CTCAE(Common Terminology Criteria for Adverse Events) version 4.0(일본 임상 종양연구 그룹으로부터 일본어역 JCOG판이 발표되어 있음)에서 말하는 grade 3 이상의 문제가 되는 이상사례(adverse event)를 야기하지 않아 임상적으로 안전하게 사용할 수 있다.
도 1은 예 1의 샘플 2(변성 응고 고체화 혈장 담체), 샘플 3(변성 응고 고체화 혈장 담체에 미변성 헤모글로빈을 흡착시킨 것), 샘플 4(변성 응고 고체화 혈장 담체에 미변성 미오글로빈을 흡착시킨 것)에 항원제시세포 자극작용이 있는 것을 나타낸 도면이다.
도 2는 예 2의 샘플 2~5(알부민과 헤모글로빈을 혼합하여 변성 응고 고체화한 담체：변성 응고 고체화 헤모글로빈/알부민 미립자(HAMP))의 항원제시세포의 자극활성을 나타낸 도면이다.
도 3은 예 3에 있어서 HAMP의 헤모글로빈에 유래하는 페록시다아제 유사 활성이 항원제시세포 자극작용에 관여하고 있는 것을 나타낸 도면이다.
도 4는 HAMP의 정제 투베르쿨린(PPD)에 대한 흡착능을 나타낸 도면이다.
도 5는 PPD 또는 hGM-CSF 등의 면역자극 물질을 흡착시킨 HAMP에 의한 항원제시세포의 자극작용을 나타낸 도면이다.
도 6은 BCG균 추출물(BCGext)을 흡착시킨 HAMP에 의한 항원제시세포의 자극 효과를 나타낸 도면이다.
도 7은 BCG균 추출물(BCGext)을 흡착시킨 HAMP로 자극한 항원제시세포로부터 TNFα(도면 중에서는 TNF로 표시)와 함께 GM-CSF가 동시에 생산되고 있는 것을 나타낸 도면이다.
도 8은 HAMP의 항체에 대한 흡착능을 나타낸 도면이다.
도 9는 HAMP의 항체에 대한 흡착능을 나타낸 도면이다.
도 10은 PPD를 담지시킨 HAMP의 안전성(마우스 체중 변화)을 나타낸 도면이다.
도 11은 PPD를 담지시킨 HAMP의 안전성(장기 중량 변화)을 나타낸 도면이다. NS(not significant)는 유의차가 인정되지 않은 것을 나타낸다.
도 12는 암 항원과 면역자극제를 혼합한 암 백신에 의한 항종양 효과를 나타낸 도면이다.
도 13은 암 항원과 면역자극제를 혼합한 암 백신에 의한 항종양 효과를 나타낸 도면이다.
도 2는 예 2의 샘플 2~5(알부민과 헤모글로빈을 혼합하여 변성 응고 고체화한 담체：변성 응고 고체화 헤모글로빈/알부민 미립자(HAMP))의 항원제시세포의 자극활성을 나타낸 도면이다.
도 3은 예 3에 있어서 HAMP의 헤모글로빈에 유래하는 페록시다아제 유사 활성이 항원제시세포 자극작용에 관여하고 있는 것을 나타낸 도면이다.
도 4는 HAMP의 정제 투베르쿨린(PPD)에 대한 흡착능을 나타낸 도면이다.
도 5는 PPD 또는 hGM-CSF 등의 면역자극 물질을 흡착시킨 HAMP에 의한 항원제시세포의 자극작용을 나타낸 도면이다.
도 6은 BCG균 추출물(BCGext)을 흡착시킨 HAMP에 의한 항원제시세포의 자극 효과를 나타낸 도면이다.
도 7은 BCG균 추출물(BCGext)을 흡착시킨 HAMP로 자극한 항원제시세포로부터 TNFα(도면 중에서는 TNF로 표시)와 함께 GM-CSF가 동시에 생산되고 있는 것을 나타낸 도면이다.
도 8은 HAMP의 항체에 대한 흡착능을 나타낸 도면이다.
도 9는 HAMP의 항체에 대한 흡착능을 나타낸 도면이다.
도 10은 PPD를 담지시킨 HAMP의 안전성(마우스 체중 변화)을 나타낸 도면이다.
도 11은 PPD를 담지시킨 HAMP의 안전성(장기 중량 변화)을 나타낸 도면이다. NS(not significant)는 유의차가 인정되지 않은 것을 나타낸다.
도 12는 암 항원과 면역자극제를 혼합한 암 백신에 의한 항종양 효과를 나타낸 도면이다.
도 13은 암 항원과 면역자극제를 혼합한 암 백신에 의한 항종양 효과를 나타낸 도면이다.
본 발명의 면역자극제는 혈장 유래 단백 또는 혈청 유래 단백을 변성 응고하여 고체화한 담체, 바람직하게는 가교제 처리에 의해 안정한 고체 상태로 한 고체화한 담체에 대해, 페록시다아제 유사 활성을 갖는 단백을 담지시킨 복합체의 형태를 가지고 있어, 또한 면역자극 물질을 담지시킨 형태로도 사용할 수 있다. 본 발명의 면역자극제는 그대로 체내에 투여하는 BRM으로서 사용할 수 있는데, 항원과 함께 생체에 투여하기 위한 면역 어쥬번트로서 사용하는 것도 가능하다.
본 명세서에 있어서 「면역자극제」 및 그의 유의어(예를 들면 「면역자극작용」 등)는, 특정 항원에 대한 특이적인 면역반응의 직접적인 자극작용을 갖는 것 외에, 항원 유무에 상관없이 항원 비특이적인 면역반응에 대해서도 간접적인 자극작용을 나타내는 것을 포함시켜, 가장 넓은 의미로 해석해야만 한다.
「면역자극제」에는 (a)항원과 함께 사용되어 그 항원에 대한 특이적 면역반응의 강화를 기대하는 「면역 어쥬번트」, 및 (b)항원을 수반하지 않고 사용되어 면역능의 일반적인 부활을 위해 사용되는 BRM 등이 포함된다. 또한, (b)에는 (b-1)면역반응경로를 일부라도 직접적으로 자극하는 「면역반응 촉진제」, 및 (b-2)면역반응경로의 저해에 의한 면역반응 억제작용을 반대로 저해하는 작용에 의해 간접적으로 면역자극을 하는 「면역반응 억제작용 저해제」가 포함된다. 본 발명의 면역자극제는 (a) 및 (b-1)로서 사용할 수 있을 뿐 아니라, 「면역반응 억제작용 저해제」를 담지시킨 형태의 경우는 (b-2)로서 사용할 수 있다.
본 발명자는 혈장 또는 혈청 중에 용해되어 있는 알부민 등의 단백(혈장 유래 단백 또는 혈청 유래 단백 변성)을 분자 레벨로 변성 응고시켜서 고체화하여 불용성 담체를 조제하고, 이 담체에 페록시다아제 유사 활성을 갖는 헤모글로빈이나 미오글로빈 등의 단백을 담지시킴으로써 얻어지는 복합체가 면역자극제로서 유용한 것, 및 추가로 이 복합체에 정제 투베르쿨린 등의 면역자극성 물질을 담지시킴으로써, 면역반응의 기점이 되는 항원제시세포에 의한 사이토카인(tumor necrosis factor alpha：TNFα) 등의 생산을 보다 강하게 촉진한다고 하는 효과를 갖는 것을 발견하였다.
본 발명에 의해 제공되는 변성 응고에 의해 고체화된 혈장 유래 단백 또는 혈청 유래 단백을 포함하는 담체는, 알부민 등의 혈장 유래 또는 혈청 유래 단백을 변성 응고시켜서 고체화함으로써 얻어지고, 일반적으로는 70 ㎛ 이하의 입경을 갖는 수불용성 미립자의 형태로 제공된다.
본래 수용해성인 혈장 유래 단백 또는 혈청 유래 단백을 분자적으로 변성 응고시켜서 고체화하고, 바람직하게는 미립자상 형태의 담체로 하는 방법은 특별히 한정되지 않고, 당업자에게 알려져 있는 방법이라면 어떠한 방법을 사용해도 된다. 변성 응고를 위한 수단으로서는, 예를 들면 열변성, 산처리, 유기용매 처리, 또는 계면활성제 처리 등이 당업자에게는 주지되어 있어, 이들 처리를 단독으로 또는 2종 이상의 처리를 조합해서 사용할 수 있다. 예를 들면 가열에 의해 단백 분자를 변성시켜서 응고시키는 방법을 채용하는 경우에는, 예를 들면 100℃ 이상에서의 가열처리를 채용할 수 있는데, 이 온도 범위로 한정되는 것은 아니다. 또한, 미립자 형태의 담체를 조제하는 방법도 특별히 한정되지 않고, 당업자가 이용 가능한 방법이라면 어떠한 방법을 사용해도 된다. 예를 들면 변성 응고에 의해 얻어진 고체를 기계적으로 마쇄하고 적절한 구멍 지름을 갖는 메시나 필터 등을 통과시켜, 목적하는 입자경을 갖는 미립자상의 담체를 조제하는 것이 바람직하나, 이것에 한정되는 것은 아니다.
이 미립자 형태의 고체를 면역자극제의 담체로서 사용하는 형태에서는, 일반적으로는 고체화된 미립자 형태의 담체가 수성 용매 중에서 가용화되는 것은 바람직하지 않기 때문에, 얻어진 미립자상 고체로부터 가용성 부분을 제거하여 불용성 고체로서 잔류하는 것을 담체로서 사용할 수 있다. 이러한 목적에서, 필요에 따라 고체화된 담체를 물 외에 에탄올이나 아세톤 등의 친수성 용매로 세정해도 된다.
다른 태양에서는, 고체화된 담체를 단백 분자간 가교제로 처리하여 보다 안정화된 불용성 고체로서 담체를 조제하는 것도 가능하다. 단백 분자간 가교제의 종류는 특별히 한정되지 않고, 당업자에게 주지인 것을 주지의 방법으로 사용할 수 있다. 예를 들면 포름알데히드, 포르말린, 파라포름알데히드, 글루타르알데히드, 또는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 등을 사용할 수 있다. 예를 들면 10% 중성 포르말린액에 실온에서 3일 이상에 걸쳐 침지시키는 방법 등이 바람직하다. 또한, 예를 들면 EDC를 수용액으로 하여, 최종농도 0.8~1.5 ㎎/㎖가 되도록 볼텍스 믹서로 혼합하면서 첨가한 후 실온에서 15분간 정치함으로써, 고체화된 담체 중의 단백 분자간에 충분히 안정한 가교가 형성된다. 그러나, 가교 형성 수단은 상기 특정 조건 또는 특정 단백 분자간 가교제에 한정되는 것은 아니다. 상기와 같이 하여 얻어지는 면역자극제, 바람직하게는 충분히 가교 처리된 면역자극제는 물로 세정해도 용해되는 경우는 없어, 본 발명의 면역자극제에 있어서의 담체로서 적합하게 사용할 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 변성 응고에 의해 고체화된 혈장 유래 단백 또는 혈청 유래 단백을 포함하는 담체에는, 페록시다아제 유사 활성을 갖는 단백을 담지시킬 수 있다. 이 단백은 실질적으로 미변성의 상태로 담체에 담지되어 있어도 되나, 변성된 상태로 담체에 담지되어 있어도 된다. 페록시다아제 유사 활성을 갖는 단백으로서는, 예를 들면 헴 단백을 사용할 수 있고, 보다 구체적으로는 헤모글로빈 외에, 미오글로빈, 시토크롬, 카탈라아제 등을 사용할 수 있다.
이 담체에 페록시다아제 유사 활성을 갖는 단백을 담지시키는 방법은 특별히 한정되지 않고, 이 담체에 대해 페록시다아제 유사 활성을 갖는 단백이 충분한 강도로 담지되어 양자가 일체화된 상태를 달성할 수 있는 것이라면, 임의의 방법을 채용할 수 있다. 예를 들면 담지시키기 위한 수단으로서 흡착반응을 사용해도 된다. 흡착이라는 용어는 어떠한 의미에 있어서도 한정적으로 해석해서는 안 되고, 가장 넓은 의미로 해석해야만 한다. 상기 담체에 대해 페록시다아제 유사 활성을 갖는 단백을 흡착시킴으로써, 이 단백을 실질적으로 미변성의 상태로 담체에 담지시킨 상태의 복합체를 조제할 수 있다. 또한, 담지시키기 위한 다른 수단으로서 가교제 등의 화학적 수단을 사용한 처리에 의해, 페록시다아제 유사 활성을 갖는 단백이 실질적으로 변성되지 않는 상태로 유지하면서, 이 담체에 대해 공유 결합에 의해 고정화하는 것도 가능하다.
또한, 변성된 상태에서도 헤모글로빈 등의 헴 단백은 페록시다아제 유사 활성을 갖는 경우가 있는 것으로부터, 상기 담체에는 페록시다아제 유사 활성을 갖는 단백을 변성된 상태로 담지시켜도 된다. 예를 들면 알부민 등의 혈장 유래 또는 혈청 유래 단백을 변성 응고에 의해 고체화함에 있어서, 이 단백과 페록시다아제 유사 활성을 갖는 헤모글로빈 등의 단백을 혼합 등의 수단에 의해 공존시켜 두어, 함께 변성된 상태의 혈장 유래 또는 혈청 유래 단백과 페록시다아제 유사 활성을 갖는 단백을 포함하는 고체를 조제하는 것도 가능하다. 본 명세서에 있어서 「담지」라는 용어는, 상기와 같이 페록시다아제 유사 활성을 갖는 단백이 담체를 형성하는 알부민 등의 단백과 함께 변성되어, 양자가 일체화되어 고체화되어 있는 상태를 포함하고 있어, 어떠한 의미에 있어서도 한정적으로 해석해서는 안 되며, 가장 넓은 의미로 해석해야만 한다.
혈장 유래 또는 혈청 유래 단백으로서 알부민을 사용하고, 페록시다아제 유사 활성을 갖는 단백으로서 헤모글로빈을 사용하여, 이들 단백을 혼합한 상태로 변성시킴으로써 얻어지는 고체상의 복합체는 본 발명의 바람직한 태양으로, 헤모글로빈을 혈청 알부민에 혼합하고, 열변성 응고시켜 포르말린 고정처리한 후에 미립자화한 것(HAMP:hemoglobin-albumin-microparticle)은 본 발명의 특히 바람직한 태양이다. 이 미립자의 입경은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면 200~0.01 ㎛의 범위이다. 바람직하게는 통상 70 ㎛ 구멍 지름의 메시 또는 필터를 통과할 수 있는 입자경이 바람직하나, 특정 사이즈에 한정되는 것은 아니다. 또한, 단백 분자간 가교제가 충분량 존재하는 수성 용매 중에서는 어떠한 생물도 생존할 수 없는 것이 당업자에게는 널리 알려져 있어, 가령 미지의 유해한 생물이 원료인 혈장 유래 또는 혈청 유래 단백 중에 포함되어 있었다고 하더라도, 단백 분자간 가교제 처리(대표예로서는 10% 중성 포르말린액에 침지할 뿐인 처리)에 의해 무생물화가 가능한 것으로부터, 상기 처리에 의해 본 발명의 면역자극제의 안전성을 높일 수 있다.
상기 복합체는 그 자체로 면역자극작용을 갖는 것으로부터 면역자극제로서 사용하는 것이 가능한데, 예를 들면 정제 투베르쿨린 등의 면역자극 물질의 1종 또는 2종 이상을 추가로 담지시킨 상태로 면역자극제로서 사용하는 것도 가능하다. 예를 들면 정제 투베르쿨린으로서는, 예를 들면 정제 투베르쿨린의 전체 단백을 사용할 수 있을 뿐 아니라, 당업자에게 주지의 방법으로 투베르쿨린으로부터 조제한 가용성 단백의 전부 또는 그 일부를 사용할 수 있다. 상기 복합체에 대해 담지시키는 면역자극 물질의 비율은 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 상기 복합체에 대해 흡착시킬 수 있는 범위 내의 양으로, 적절한 비율을 선택하는 것이 가능하다. 면역자극 물질로서는, 정제 투베르쿨린 외에, 예를 들면 BCG균 추출물, 사이토카인, 톨 유사 수용체 리간드, NOD 유사 수용체 아고니스트, RIG 유사 수용체 아고니스트, C 타입 렉틴 수용체 아고니스트, 환상 GMP-AMP 신타아제에 결합하는 외인성 DNA, 알라민, 항원 및 항체 등을 사용하는 것도 가능하다.
흡착 이외의 담지방법으로서, 예를 들면 알부민 등의 혈장 유래 또는 혈청 유래 단백, 페록시다아제 유사 활성을 갖는 헤모글로빈 등의 단백, 및 추가로 면역 어쥬번트 활성이 있는 면역자극 물질로서 예를 들면 정제 투베르쿨린 등의 가용성 단백을 사전에 혼합해 두고, 이 혼합물로부터 상기와 동일하게 변성 응고하여 고체화된 복합체를 얻음으로써, 페록시다아제 유사 활성을 갖는 단백과 어쥬번트 활성이 있는 정제 투베르쿨린 가용성 단백 등의 면역자극 물질이 혈장 유래 또는 혈청 유래 단백에 담지된 면역자극제를 제조할 수 있다.
또한, 페록시다아제 유사 활성을 갖는 단백과 어쥬번트 활성이 있는 정제 투베르쿨린 가용성 단백 등의 면역자극 물질을 포함하는 상기 면역자극제에 대해, 불용성 단백을 추가로 담지시킨 면역자극제로 해도 된다. 불용성 단백으로서는, 예를 들면 생분해성 불용성 단백을 사용할 수 있고, 보다 구체적으로는 콜라겐 등을 사용할 수 있는데, 반드시 이것에 한정되는 것은 아니다. 이 태양에 있어서는 생체 내에서 분해되는 불용성 단백이라면 어떠한 것도 사용할 수 있다.
본 발명의 면역자극제는 알부민-헤파린 코아세르베이트 침전과 조합시킨 면역 자극성 조성물로서 사용하는 것도 가능하다. 알부민-헤파린 코아세르베이트 침전으로서는, 예를 들면 사이토카인을 흡착시킨 헤파린-알부민 코아세르베이트 침전을 사용할 수 있고, 사이토카인으로서는, 예를 들면 과립구 마크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF), 인터류킨-2(IL-2), 및 인터페론 감마(IFNγ, 본 명세서 중에서 「IFNg」로 표시하는 경우가 있음)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 물질을 사용할 수 있는데, 이들에 한정되지는 않는다.
본 발명의 면역자극제를 질병의 치료 및/또는 예방을 위해 사용하는 경우에는, 약리학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 첨가물 등과 혼합하여 제제화하여, 의약 조성물로서 인간을 포함하는 포유류동물에 투여할 수 있다. 본 발명의 면역자극제가 정제 투베르쿨린 등의 면역자극 물질을 담지하고 있지 않은 경우에는, 별도로 제제화된 정제 투베르쿨린 등의 면역자극 물질을 사용 시에 혼합하여 동시에 투여할 수 있다. 또는 양자를 각각 동일 개소에 투여하여 생체 내의 동일 국소에 있어서 공존하도록 처치를 행하여도 된다. 또한, 본 발명의 면역자극제가 1종 또는 2종 이상의 면역자극 물질을 담지하는 경우에는, 담지되어 있는 면역자극 물질과는 다른 종류의 면역자극 물질을 사용 시에 혼합하여 동시에 투여할 수 있다. 또는 양자를 각각 동일 개소에 투여하여 생체 내에서 공존하도록 처치를 행하여도 된다.
본 발명의 면역자극제는 일반적인 면역 어쥬번트로서 사용할 수 있다. 단순히 항원과 혼합하여 인간을 포함하는 포유류동물의 체내에 투여함으로써 그 항원에 대한 전신성 면역반응을 유도할 수 있다. 그 항원이 종양조직, 종양세포, 종양세포 성분 및/또는 종양 항원 펩티드인 경우는, 종양 백신으로서 이용할 수 있다. 예를 들면 환자로부터 분리한 암세포 용해물(lysate)과 본 발명의 면역자극제를 혼합하여 환자에게 주사하면, 환자의 체내에 있어서 그 특정 암세포에 대한 항종양 면역반응을 유도할 수 있다. 또한 마찬가지로, 그 항원이 감염증을 야기하는 미생물 유래인 경우는, 통상의 감염증 예방백신으로서 사용할 수 있다. 그러나, 본 발명의 면역자극제의 사용방법은 상기의 것에 한정되지 않으며, 면역 어쥬번트를 사용하는 통상의 형태 중 어느 방법을 사용해도 된다.
또한, 환자의 생체 내에 있어서 종양조직을 물리적 수단에 의해 변성시킨 후, 그 변성 조직 내에 본 발명의 면역자극제를 투여함으로써, 변성 종양조직 내에 있는 종양 항원과 본 발명의 면역자극제가 그 국소에서 공존하는 상태가 되어, 환자의 생체 내에 죽지 않고 살아 있는 종양세포에 대한 항종양 면역반응을 유도하는 원위치 백신화(in situ vaccination)가 가능해진다. 종양조직 변성을 위한 물리적 수단은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면 마이크로파 조사, 고주파 응고법(radiofrequency coagulation method), 동결 응고법, 전기절개도(electrotome) 가열, 열수 주입, 알코올 주입, 색전법, 방사선 조사, 레이저광 조사, 또는 초음파 파괴 등의 수단을 단독으로 또는 2종 이상을 적절히 조합해서 채용할 수 있다. 그러나, 이들에 한정되는 것은 아니며, 종양조직 내에 있는 종양세포의 세포사를 유도할 수 있는 수단이라면 어떠한 것을 사용해도 된다.
예를 들면 종양조직을 마이크로파 조사에 의해 가열 응고하고, 그 응고 조직 내에 본 발명의 면역자극제를 투여하면, 당해 종양조직 내부나 그 주변에 죽지 않고 살아 있는 종양세포에 대한 항종양 면역반응을 유도할 수 있다. 본 발명의 면역자극제를 투여할 때, 추가로 정제 투베르쿨린 용액이나 면역반응을 자극하는 사이토카인, 또는 사이토카인 서방제제를 동시에 투여하는 것도 바람직하다. 그러나, 본 발명의 면역자극제의 투여방법은 상기 태양에 한정되는 것은 아니며, 당해 변성 종양조직에 모여드는 항원제시세포에 본 발명의 면역자극제가 변성 종양조직에 포함되는 종양 항원과 함께 흡수되거나, 또는 본 발명의 면역자극제가 항원제시세포를 직접 자극할 수 있는 환경을 부여하는 것이라면 어떠한 방법을 채용해도 된다.
또한, 사전에 본 발명의 면역자극제와 면역담당세포를 체외에서 혼합한 후에 환자의 체내에 투여하여 생체 내에 있어서의 면역반응을 자극하는 것도 가능하다. 면역담당세포로서는, 예를 들면 수상세포, 마크로파지, 단핵구(monocyte), B 림프구, T 림프구, 또는 NK 세포(natural killer cell) 등을 바람직하게 사용할 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기 수법에 있어서 2종 이상의 면역담당세포를 조합해서 사용해도 된다.
다른 관점에서는, 본 발명의 면역자극제를 면역 어쥬번트로서 포함하는 백신이 제공된다. 백신은 질병 요인 물질인 항원, 바람직하게는 병원 미생물 등 외래 생물 유래의 항원이나 바이러스 항원, 또는 종양 항원과 함께 투여할 수 있는데, 추가로 면역담당세포를 동시에 혼합해도 된다. 항원으로서는 환자 본인 유래의 것이 바람직하나, 타가 유래의 동일 종류의 항원을 사용하는 것도 가능하다. 예를 들면 다른 환자로부터 채취한 종양조직 및/또는 종양세포를 혼합해서 사용하는 것도 가능하고, 이와 같이 하여 얻은 백신을 종양 환자에게 투여함으로써 악성종양 등의 종양을 치료할 수 있다. 또한, 상기 백신에 의해 종양의 치료에 있어서 필요해지는 세포성 면역반응을 효과적으로 자극할 수 있기 때문에, 예를 들면 악성종양의 전이나 수술 후 재발을 예방하는 것이 가능해진다.
바람직한 태양에서는, 본 발명의 면역자극제에 면역 체크포인트 저해 항체 등의 면역반응 억제작용 물질을 담지시키는 것도 가능하여, 이러한 태양에 있어서는 더욱 효과적으로 악성종양의 치료 외에, 악성종양의 예방이나 전이 예방 등을 목적으로 면역자극제 또는 종양 백신으로서 사용할 수 있다. 면역 체크포인트 저해 항체로서는, 예를 들면 항PD-1 항체, 항PD-L1 항체, 항PD-L2 항체, 항CTLA-4 항체, 항CD40 항체, 항CD137 항체, 항OX40 항체, 항TGF-β 항체, 항LAG3 항체, 항B7-H3 항체, 항B7-H4 항체, 항TIM3 항체, 항CD96 항체, 및 항TIGIT 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 항체를 사용할 수 있는데, 이들에 한정되지는 않는다.
일반적으로, 생체 내에 자연 발생하는 종양세포에 포함되는 종양 항원은 항원성이 낮아, 생체 내에서 항종양 면역반응을 야기하지 못하는 경우가 많기 때문에 종양이 증식하는 것이 당업자에게는 널리 알려져 있다. 본 발명의 면역자극제를 면역 어쥬번트로서 이용함으로써, 상기와 같이 항원성이 낮은 종양 항원에 대해 유효한 항종양 면역반응을 유도할 수 있다. 마찬가지로, 생체 유래로 항원성이 낮은 다른 질병 요인 물질이더라도, 본 발명의 면역자극제를 면역 어쥬번트로서 이용함으로써, 이러한 항원성이 낮은 질병 요인 물질에 대해서도 면역반응을 유도할 수 있다.
또한, 본 발명의 면역자극제를 사용하면 항원제시세포를 자극하여, 항원제시세포의 생존 유지·증식에 필요해지는 GM-CSF를 항원제시세포 자신으로부터 방출시킬 수 있다. 따라서, GM-CSF가 오토크린(autocrine) 세포성장인자로서 작용하는 이 항원제시세포 자신, 및 파라크린(paracrine) 세포성장인자로서 작용하는 근린의 항원제시세포군의 활성화와 그 활성화 상태의 유지가 가능하다. 이는 생체의 면역능력을 향상시키는 BRM 성질 중 하나인 것으로부터, 본 발명의 면역자극제는 BRM으로서 유용하다.
실시예
아래에 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하는데, 본 발명의 범위는 아래의 실시예에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서의 용어나 개념은, 당해 분야에 있어서 관용적으로 사용되는 용어의 의미에 기초하는 것으로, 본 발명을 실시하기 위해 사용하는 기술은 특별히 그 출전(出典)을 명시한 기술을 제외하고는, 공지의 문헌 등에 기초하여 당업자라면 용이하고 확실하게 실시 가능하다. 또한, 각종 분석 등은 사용한 분석기기 또는 시약, 키트의 취급 설명서, 카탈로그 등에 기재된 방법을 사용해서 행하고 있다.
예 1：변성 응고 고체화 혈장을 포함하는 담체의 조제, 및 미변성 헤모글로빈 흡착 복합체 또는 미변성 미오글로빈 흡착 복합체에 의한 항원제시세포의 자극 효과
인간 마크로파지 유사 세포주 THP-1은 배양하에서 PMA(Phorbol 12-Myristate 13-Acetate)를 작용시켜서 분화 유도하면 탐식능을 나타낼 뿐 아니라(비특허문헌 18), 항원제시능도 획득하여 항원제시세포가 되는 것이 알려져 있다(비특허문헌 19). 또한, 이 세포를 사이토카인인 인간 인터페론 감마(IFNg)로 전처리하면, T 세포로의 항원제시능이 증강된다(비특허문헌 20). 분화되어 탐식능을 나타내는 THP-1 세포는 TNFα를 생산한다(비특허문헌 21). TNFα의 생산은 마크로파지(내지 항원제시세포)가 활성화된 것을 나타내고 있어, 체내에 있어서의 마크로파지(내지 항원제시세포)의 활성화는 그것에 계속되는 염증반응 및 면역반응의 기점이 되고 있는 것이 알려져 있다(비특허문헌 22, 23).
따라서, THP-1 세포를 항원제시세포로 분화 유도한 후에 어떠한 고형물을 탐식시켜 생산되는 TNFα량을 측정하면, 그 고형물의 체내에 있어서의 염증반응 및 면역반응의 자극작용을 체외에 있어서의 세포배양계에 있어서 측정할 수 있다.
(1) 바이오어세이용 샘플의 조제방법
성인 자원봉사자로부터 통상의 방법으로 헤파린 첨가 혈액으로서 채혈하고, 통상의 방법의 원심법에 의해 혈장을 얻었다. 이 2.25 mL를 110℃, 5분간 열처리하여 응고시킨 후, 스패츌러로 대충 파쇄하였다. 여기에 시판의 10% 중성 완충 포르말린액을 20 mL 첨가하여, 3일간 실온에서 방치하여 포르말린 고정하였다. 고정 파쇄물을 생리식염액으로 세정 후, 마이크로튜브를 세팅할 수 있는 범용의 조직 파쇄기(Tissue Lyser II, Qiagen사 제조)로 10분간 파쇄 처리하였다. 미립자화된 단편을 70 ㎛ 구멍 지름의 메시를 통과시켜, 충분량의 생리식염액으로 원심 세정하고, 추가로 에탄올에 침지하여 살균, 재차 충분량의 생리식염액으로 원심 세정하였다. 탁상 원심기로 3,000 rpm(최대 가속도 1,580 G)에서 15분간 원심 침전시킨 단편의 용량 비율이 25 v/v%가 되도록 생리식염액을 적량 첨가하여 현탁해서, 바이오어세이용 샘플 2 「변성 응고 고체화 혈장 담체 현탁액」으로 하였다.
또한, 인간 헤모글로빈(SIGMA사 제조, H7379-5G) 또는 말 미오글로빈(SIGMA사 제조, M0630)을 정제수로 4 w/v%가 되도록 현탁하고, 실온에서 2시간 교반하여 용해, 3,000 rpm에서 15분간 원심하여 불용 성분을 제거하고, 추가로 상청을 0.22 μ 구멍 지름의 멤브레인 필터로 여과 멸균하였다. 이 용액 36 μL와 변성 응고 고체화 혈장 담체 현탁액 264 μL를 혼합하여 실온에서 2시간 교반 후, 냉각 미량 고속원심기로 4℃, 12,000 rpm(최대 가속도 11,000 G)에서 5분간 원심하여 침전을 얻었다. 이를 충분량의 생리식염액으로 원심 세정 후, 침전에 대해 198 μL의 생리식염액을 첨가하여 현탁해서, 바이오어세이용 샘플 3 「미변성 헤모글로빈 흡착 변성 응고 고체화 혈장 담체 현탁액」 또는 바이오어세이용 샘플 4 「미변성 미오글로빈 흡착 변성 응고 고체화 혈장 담체 현탁액」으로 하였다.
(2) 항원제시세포에 의한 바이오어세이방법
통상의 방법에 따라 유지 배양하고 있는 인간 마크로파지 유사 세포주 THP-1을 배양액에서 50 만개/mL로 조제하였다. 배양액은 통상의 방법에 의한 가열처리된 소 태아 혈청을 3% 포함하는 RPMI1640 배양액이다(이하, 「3% medium」이라 한다). 이것에 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)용액(SIGMA사 제조 PMA를 디메틸설폭시드에 1.62 mM가 되도록 용해한 것)을 최종농도 0.16 μM가 되도록 첨가하고, 24웰 플레이트에 1웰당 0.5 mL 파종하고 ４일간 배양하여, THP-1 세포를 항원제시세포로 분화 유도하였다. 이후의 실시예에서도 항원제시세포로 기재되어 있는 것은 이 방법으로 분화 유도한 세포이다.
분화 유도 배양 후, 어세이용 배양액(PMA 0.016 μM, 및 인간 인터페론 감마(hIFNg) 0.5 ng/mL를 포함하는 3% medium)으로 교환하여 하룻밤 배양하였다. 그 후, 새로운 어세이용 배양액으로 교환하고, 1웰당 0.5 mL의 어세이용 배양액에 아래의 바이오어세이용 샘플액을 첨가하여 22시간 배양(이하, 「어세이 배양」이라 함)하였다.
샘플 1. 생리식염액, 32 μL(이 샘플의 TNFα 생산량을 블랭크값으로 하였다)
샘플 2. 변성 응고 고체화 혈장 담체 현탁액, 32 μL
샘플 3. 미변성 헤모글로빈 흡착 변성 응고 고체화 혈장 담체 현탁액, 32 μL
샘플 4. 미변성 미오글로빈 흡착 변성 응고 고체화 혈장 담체 현탁액, 32 μL
어세이 배양 후의 배양액을 냉각 미량 고속원심기로 4℃, 12,000 rpm(최대 가속도 11,000 G)에서 5분간 원심하고 상청을 회수하여, 그 중의 TNFα(Tumor necrosis factor alpha) 농도를 측정하였다. 하나의 샘플에 대해서 2 또는 3웰을 사용하여 평균값을 데이터로 하였다.
(3) TNFα의 측정방법
시판의 ELISA법에 의한 TNFα 측정용 키트(BD Biosciences사 제조 OptEIA Set Human TNF, Cat. No. 555212)를 사용하였다. ELISA의 상세방법은 이 키트 첨부의 취급 설명서에 따랐다. 이 조작과정에서는 계면활성제 Tween 20을 포함하는 대과잉의 세정액을 ELISA용 각 웰에 첨가하여 세정하는 공정이 반복되는데, 이 ELISA에서는 포착용 1차 항체로 코팅되어 있는 ELISA용 웰에 회수 배양액 원심 상청을 첨가 후에서는 5회, 검출용 2차 항체에 추가 첨가하는 스트렙트아비딘-홀스래디쉬 페록시다아제(streptavidin-horseradish peroxidase)(이 키트에 포함되어 있는 SAv-HRP로 생략함) 또는 스트렙트아비딘-알칼리포스파타아제(streptavidin-alkalinephosphatase)(Promega사 제조, Cat. No. V5591, SAv-ALP로 생략함) 첨가 후에서는 7회, 합계 12회의 세정공정을 반복하였다. 이 때문에, 회수 배양액 원심 상청 중에 가령 변성 응고 고체화 혈장 담체의 미립자가 혼입되어 있었다고 하더라도 충분히 세정 제거된다. 실제, 회수 배양액 원심 상청 중의 TNFα 측정 시, SAv-HRP를 굳이 첨가하지 않고 이 TNFα 측정용 키트에 의한 ELISA를 실행하면, TNFα 측정값이 블랭크 레벨이 되어 버리는 것으로부터, 회수 배양액 원심 상청은 충분히 세정 제거되어 있는 것을 확인하였다.
이 키트 첨부의 표준 TNF의 농도와 최종적인 발색반응의 직선성은 매우 좋기 때문에, 플레이트 리더(Biotrak II, Amersham Biosciences사)에 의해 얻어진 최종 데이터는, 샘플 1.의 블랭크값을 제한 흡광도 그대로 도면에 나타내었다. SAv-HRP를 사용한 경우(샘플 1, 2, 3에 적용)는 범용되고 있는 시판의 TMB 기질액 및 2N H2SO4 반응 정지액을 사용했을 때의 A450값으로서 나타내었다. A450＝1.0은 이 키트 첨부의 표준 TNF 60 pg/mL에 상당한다. 또한, SAv-ALP를 사용한 경우(별도 시험으로서 샘플 1, 2, 4에 적용)는 알칼리포스파타아제의 활성 측정용으로 시판되고 있는 p-니트로페닐 포스페이트(p-nitrophenyl phosphate)를 2 ㎎/mL에 용해한 기질액 및 0.5N NaOH 반응 정지액을 사용했을 때의 A405값으로서 나타내었다. 이 방법도 당업자에게 있어서는 통상의 방법 중 하나로 되어 있다. 이때의 측정에서는, 이 키트 첨부의 표준 TNF로 240 pg/mL가 A405＝0.3이 되도록 조건을 설정하였다. TNFα 생산량의 결과를 도 1에 나타낸다. 블랭크값(샘플 1)은 제하였다. 도 1의 좌측 2개의 칼럼은 샘플 2와 샘플 3에 대해 SAv-HRP를 사용한 경우를, 우측 2개의 칼럼은 별도 시험에서 샘플 2와 샘플 4에 대해 SAv-ALP를 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
이 결과로부터, 샘플 2의 변성 응고 고체화 혈장 담체에는 항원제시세포 자극작용이 있는 것, 또한 이것에 미변성 헤모글로빈을 흡착시킨 샘플 3에는 보다 강한 항원제시세포 자극작용이 있는 것을 알 수 있다. 또한 미변성 미오글로빈을 흡착시킨 샘플 4에도 강한 항원제시세포 자극작용이 있는 것을 알 수 있다.
예 2：변성 응고 고체화 알부민/헤모글로빈 복합체에 의한 항원제시세포의 자극효과
예 1에서는, 미변성 헤모글로빈을 변성 응고 고체화 혈장 담체에 흡착시킨 것에 항원제시세포의 자극 효과가 있는 것을 나타내었는데, 혈청 단백의 대표예인 알부민과, 적혈구 유래의 헤모글로빈을 사전에 혼합하여, 그 혼합물을 변성 응고 고체화한 경우의 항원제시세포의 자극 활성을 조사하였다.
(1) 바이오어세이용 샘플의 조제방법
시판의 생물학적 제제 기준 사람 혈청 알부민(가가쿠오요비 켓세이료호 켄큐쇼 제조, 켄케츠 알부민 25 "가케츠켄", 이후 「25%HSA」라 함)에 대해, 아래에 나타내는 비율로 인간 헤모글로빈(SIGMA사 제조, H7379-5G, 생리식염액에 용해·현탁)을 혼합한 액을 제작하여, 110℃에서 5분간 열처리하여 응고시킨 후, 스패츌러로 대충 파쇄하였다. 여기에 10% 중성 완충 포르말린액을 20 mL 첨가하고, 3일간 실온에서 방치하여 포르말린 고정하였다. 고정 파쇄물을 생리식염액으로 세정 후, 마이크로튜브를 세팅할 수 있는 범용의 조직 파쇄기(Tissue Lyser II, Qiagen사 제조)로 10분간 파쇄 처리하였다. 파쇄 단편을 70 ㎛ 구멍 지름의 메시를 통과시켜, 충분량의 생리식염액으로 원심 세정하고, 추가로 에탄올에 침지하여 살균하고, 재차 충분량의 생리식염액으로 원심 세정하였다. 탁상 원심기로 3,000 rpm, 15분간 원심 침전시킨 단편의 용량 비율이 25 v/v%가 되도록 생리식염액을 적량 첨가하여 현탁해서, 바이오어세이용 샘플 「변성 응고 고체화 헤모글로빈·알부민 미립자 현탁액」으로 하였다. 이 샘플에는 헤모글로빈의 비율을 변경한 아래의 종류가 있다.
샘플 1. 25%HSA 3.0 mL
샘플 2. 25%HSA 2.4 mL＋100 ㎎/mL Hemoglobin 0.6 mL
샘플 3. 25%HSA 1.84 mL＋220 ㎎/mL Hemoglobin 0.909 mL＋생리식염액 0.251 mL
샘플 4. 25%HSA 1.04 mL＋220 ㎎/mL Hemoglobin 1.818 mL＋생리식염액 0.141 mL
샘플 5. 220 ㎎/mL Hemoglobin 3.0 mL
샘플 6. 생리식염액 3.0 mL(이 샘플의 TNFα 생산량을 블랭크값으로 하였다)
이들 샘플은 어세이 배양 시에는, 0.5 mL의 3% medium을 포함하는 웰에 모두 1웰당 32 μL 첨가하였다. 1 샘플에 대해서 3웰을 사용하여 평균값을 데이터로 하였다.
(2) 항원제시세포에 의한 바이오어세이방법 및 TNFα의 측정방법은 예 1의 SAv-HRP를 사용한 경우와 동일하게 하여 행하였다. TNFα 생산량의 결과를 도 2에 나타낸다. 블랭크값(샘플 6)은 제하였다. 이 결과는, 변성 응고 고체화 알부민 미립자 단독(샘플 1)의 경우는, 본래의 블랭크값보다도 TNFα의 생산량이 억제되는 것, 알부민과 함께 헤모글로빈을 변성 응고시켜서 고체화한 미립자 샘플 2~5의 경우는, 헤모글로빈의 함유 비율이 증가함에 따라 항원제시세포의 자극 효과가 강해지는 것을 나타내고 있다.
(3) 샘플 중의 엔도톡신 함유량의 측정과 결과
전술한 예 1 및 상기 바이오어세이용 샘플에 엔도톡신이 혼입되어 있으면 결과에 영향을 미칠 가능성이 있다. 이에 엔도톡신 함유량을 측정하였다. 측정에는 Kinect-QCL 192 Test Kit(Lonza사 제조), 및 표준 엔도톡신으로서 E. coli O55:B5를 사용하고, 측정방법은 이 키트의 사용 설명서에 따랐다. 그 결과, 전술한 예 1의 바이오어세이용 샘플, 금번 바이오어세이용 샘플의 경우는, 모두에 대해서 엔도톡신 함량은 검출한계 이하(＜0.500 EU/mL)였다. 이 결과로부터, 도 1 및 도 2에 있어서의 엔도톡신의 영향은 없다고 판단하였다.
또한, 이후의 실시예에서는 변성 응고 고체화 헤모글로빈·알부민 미립자(HAMP로 생략함) 중, 전술한 「샘플 2」에 상당하는 HSA와 Hemoglobin의 비율을 포함하는 것을 HAMP의 대표예로 하고, 탁상 원심기로 3,000 rpm(최대 가속도 1,580 G), 15분간 실온에서 원심, 침전시킴으로써 농축하여 농도를 조정해서 사용하고 있다. 농축 후의 HAMP 농도는 침전 중량 비율로 w/v%, 또는 침전 용량 비율로 v/v%로 나타내고 있다.
예 3：변성 응고 고체화 단백 미립자 중의 페록시다아제 유사 활성의 역할
헤모글로빈이나 미오글로빈과 같은 단백에는 페록시다아제 유사의 강한 활성이 있는 것은 널리 알려져 있다. 이 활성은 포르말린 고정하여 파라핀 포매 처리하여 제작한 병리조직 절편에서도 발휘되기 때문에, 병리조직 절편 중에 예를 들면 대량의 헤모글로빈이 함유되어 있으면, 페록시다아제 표지 항체에 의한 면역 염색에서는 바람직하지 않은 염색상이 생기는 경우가 있다. 이 활성을 소거할 수 있는 것이 과산화수소수 처리이다(비특허문헌 26). 상기 HAMP의 페록시다아제 유사 활성도 매우 강하다고 생각된다.
(1) 샘플 2의 페록시다아제 활성：정성적 시험
예 2 (1)의 바이오어세이용 샘플 중에서 헤모글로빈의 비율이 가장 적은 샘플 2를 HAMP의 대표예로 하였다. 이것을 원심하고 침전의 중량을 측정하여, 침전 함량을 생리식염액으로 40 w/v%로 조정한 현탁액으로 하였다. 이 20 μL를 페록시다아제에 의한 발색반응에 범용되고 있는 시판의 TMB 기질액 200 μL에 첨가한 바, 무색의 TMB 기질액이 몇초 안에 짙은 파랑으로 변화되었다. 이로써, HAMP의 페록시다아제 유사 활성도 매우 강한 것을 확인하였다.
샘플 2의 헤모글로빈 대신에 말 미오글로빈을 사용하고, 샘플 2와 완전히 동일하게 하여 조제한 미오글로빈-알부민 미세입자(myoglobin-albumin microparticle)의 현탁액 20 μL를 TMB 기질액 200 μL에 첨가한 바, 무색의 TMB 기질액이 1분 이내에 짙은 파랑으로 변화되었다. 따라서, 변성 응고 고체화 후에도 페록시다아제 유사 활성이 있는 단백이라면 HAMP와 동일하게 취급할 수 있다.
(2) 샘플 5의 과산화수소수에 의한 페록시다아제 유사 활성 불활성화 처리 후의 항원제시세포 자극 효과：정량적 시험
포르말린 고정·파라핀 포매 후에 제작된 병리조직 절편 중의 페록시다아제 유사 활성은 과산화수소수 처리에 의해 소실되는 것이 널리 알려져 있다. 예 2에 있어서의 바이오어세이용 샘플 2에 과잉의 과산화수소수를 첨가하여 하룻밤 방치 후, 생리식염액으로 반복해서 원심 세정하면, 샘플 2에 의한 시판의 TMB 기질액의 착색반응은 관찰되지 않았다. 한편, 예 2 (1)의 바이오어세이용 샘플 중에서 헤모글로빈의 비율이 가장 많은 샘플 5의 페록시다아제 유사 활성은 가장 강한 것으로부터, 샘플 5의 150 μL에 대해 1)정제수 또는 2)3% 과산화수소수를 900 μL 첨가하여 하룻밤 실온에서 교반하였다. 냉각 미량 고속원심기로 4℃, 12,000 rpm(최대 가속도 11,000 G)의 조건하에서 5분간 원심하여 침전을 얻고, 이것을 충분량의 생리식염액으로 원심 세정 후, 침전에 대해 112.5 μＬ의 생리식염액을 첨가하여 현탁해서, 바이오어세이용 샘플을 각각 1. Hemoglobin-MP, 2. H2O2-Hemoglobin-MP로 하였다. 항원제시세포에 의한 바이오어세이방법 및 TNFα의 측정방법은 예 1과 동일하다.
TNFα 생산량의 결과를 도 3에 나타낸다. 블랭크값(생리식염액을 바이오어세이용 샘플로 하고 있음)은 제하였다. 이 결과는 과산화수소수 처리에 의해 페록시다아제 유사 활성을 소실시키면 명백하게 TNFα 생산이 억제되는 것, 즉 변성 응고 고체화 헤모글로빈 단편 중의 페록시다아제 유사 활성이 항원제시세포에 대한 자극 효과에 공헌하고 있는 것을 나타내고 있다.
예 4：HAMP로의 정제 투베르쿨린의 흡착
정제 투베르쿨린은 IV형 알레르기 반응(즉 세포성 면역반응)을 유도하는 대표적인 면역자극 물질이다. 정제 투베르쿨린 본체 그 자체는 안정한 물질이나, 용해 후에는 유리병 내벽에 흡착되어 외관상의 불활성화를 일으키기 쉽고, 또한 그 흡착은 인간 혈청 알부민으로 방지 가능한 것이 알려져 있다(비특허문헌 16). 이에 HAMP가 정제 투베르쿨린을 흡착하는지 여부를 검토하였다.
(1) 정제 투베르쿨린의 정량법
일반 진단용 정제 투베르쿨린(PPD)(1 ㎍/바이알, 일본 비씨지 제조 주식회사)에 포함되어 있는 미코박테리움 투베르큘로시스(Mycobacterium tuberculosis) 유래의 단백 중 하나, DnaK(비특허문헌 24)에 대한 HuCAL-Fab 항체(진 프론티어 주식회사, 치바현 가시와시)를 얻었다. 이것을 1차 항체로 하고, Jackson Immuno Research사의 항체 #109-035-097을 2차 항체로 하여, 정제 투베르쿨린의 ELISA 정량법을 책정하였다. 항원으로서의 정제 투베르쿨린(PPD), 1차 항체, 2차 항체 이외는 당업자에게 주지되어 있는 통상의 ELISA 정량법이다. 최종적인 발색반응에는 예 1 (3)에 나타낸 홀스래디쉬 페록시다아제(horseradish peroxidase)에 대한 범용의 TMB 기질액과 반응 정지액을 사용하고, 결과는 A450값으로 나타내었다. 이 법에서는 생리식염액을 블랭크로 하였다. 블랭크값을 제하였을 때, 상기 PPD의 농도가 1.25 ㎍/mL(ELISA 반응 시의 액량은 ELISA용 96웰 마이크로플레이트의 1웰당 200 μL)일 때의 A450값은 0.063으로, 정량 가능한 범위였다.
(2) HAMP로의 흡착반응
플라스틱제 마이크로튜브에 HAMP(탁상 원심기로 3,000 rpm(최대 가속도 1,580 G)에서 15분간 원심 침전시킨 미립자의 용량 비율이 40 v/v%가 되도록 생리식염액을 적량 첨가하여 현탁하였음)를 최종농도 20 v/v%가 되도록, 상기 PPD의 농도가 1.25 ㎍/mL가 되도록 첨가하고 실온에서 교반하였다. 교반시간은 30분~6시간이다. 교반 후, 미량 고속원심기로 4℃, 12,000 rpm(최대 가속도 11,000 G)에서 5분간 원심하여 상청을 얻었다. 이 상청 150 μL를 사용하여 상기 ELISA 정량법에 의해(생리식염액을 블랭크로 하여) 상청 중의 PPD량을 측정하였다.
(3) 결과
상청 중에 잔존하는 PPD량을 블랭크값을 제한 A450값으로서 도 4에 나타내었다. 이 결과는 실온에서 30분의 교반으로 92%의 PPD가 HAMP에 흡착되는 것을 나타내고 있다. 2시간 이상의 교반에서는(최소 A450값이 -0.004라는 약간의 측정 오차가 있으나) 거의 전량이 HAMP에 흡착되어 있는 것으로 생각된다. 또한, 이 결과는 항원이 될 수 있는 이종 유래 단백도 HAMP에 흡착될 수 있는 것을 나타내고 있다.
예 5：HAMP로의 흡착 PPD, 흡착 사이토카인에 의한 항원제시세포의 자극 효과
예 4에 나타낸 바와 같이, HAMP에는 PPD에 대한 강한 흡착력이 있다. 이에 흡착된 PPD의 항원제시세포의 자극 활성은 어떤지, 및 생체 내에서 중요한 작용을 하는 사이토카인을 흡착시킨 경우에 사이토카인 흡착 HAMP가 항원제시세포의 자극 활성을 나타내는지에 대해서 검토하였다.
(1) 흡착 조작
50-mL 원심 튜브에 생리식염액에 현탁한 HAMP 침전과 PPD의 농도가 각각 25 v/v%, 286 ng/mL가 되도록 첨가하고, 실온에서 2시간 교반하였다. 이를 PPD-HAMP 현탁액으로 하였다.
인간 과립구 마크로파지 콜로니 자극인자(hGM-CSF, Leukine(sargamostim), sanofi-aventis U.S. LLC사 제조)를 물로 용해하여 100 ㎍/mL로 하였다. 이 100 μL와 HAMP(25 w/v%, 변성 응고 고체화 헤모글로빈·알부민 미립자 침전의 중량을 토대로 조제하였음) 200 μL를 합하여 실온에서 2시간 교반하였다. 교반 후, 미량 고속원심기로 4℃, 12,000 rpm(최대 가속도 11,000 G)의 조건하에서 5분간 원심하여 침전을 얻었다. 이 침전을 750 μL의 생리식염액으로 현탁하고, 동일하게 원심하여 침전을 얻는 원심 세정을 합계 3회 반복하고, 최종적인 침전에 150 μL의 생리식염액을 첨가하여 hGM-CSF-HAMP 현탁액으로 하였다.
인간 인터류킨 2(hIL-2)의 경우는, 이무네이스 인젝션 35(1 바이알병에 테셀류킨(유전자 재조합, 실질적으로 hIL-2임) 35만 단위 함유, 시오노기 제약)의 바이알병에 625 μL의 생리식염액을 주입하여 용해하고, 그 용액으로부터 50 μL를 취해 HAMP 200 μL와 혼합하여 실온에서 2시간 교반하였다. 이하는 전술한 hGM-CSF의 경우와 동일한 조작을 더하여 hIL-2-HAMP 현탁액으로 하였다. 인간 인터페론 감마(hIFNg, 와코 순약 공업)의 경우는, 생리식염액 중에 50 ng/mL로 한 용액을 조제하고, HAMP 200 μL와 혼합하여 실온에서 2시간 교반하였다. 이하는 전술한 hGM-CSF의 경우와 동일한 조작을 더하여 hIFNg-HAMP 현탁액으로 하였다.
(2) 항원제시세포에 의한 바이오어세이방법 및 TNFα의 측정방법은 예 1과 동일하다. TNFα의 측정에서는 SAv-HRP를 사용하고 있다. 여기서는 바이오어세이용 샘플로서 1웰당 아래의 용액 또는 현탁액을 첨가하였다.
샘플 1. 생리식염액, 32 μL(이 샘플의 TNFα 생산량을 블랭크값으로 하였다)
샘플 2. 일반 진단용 정제 투베르쿨린(PPD) 1인용(0.25 ㎍/바이알, 일본 비씨지 주식회사)을 1.2 mL의 생리식염액으로 용해한 PPD 용액, 32 μL
샘플 3. HAMP 현탁액, 32 μL
샘플 4. PPD-HAMP(HAMP에 PPD를 흡착시킨 것) 현탁액, 32 μL
샘플 5. hGM-CSF-HAMP(HAMP에 hGM-CSF를 흡착시킨 것) 현탁액, 32 μL
샘플 6. hIL-2-HAMP(HAMP에 hIL-2를 흡착시킨 것) 현탁액, 32 μL
샘플 7. hIFNg-HAMP(HAMP에 hIFNg를 흡착시킨 것) 현탁액, 32 μL
1샘플에 대해서 3웰을 사용하였다. 22시간의 어세이 배양 후에 회수한 배양액은 신선한 3% medium로 1/2로 희석하여, TNFα의 ELISA에 의한 측정에 제공하였다.
(3) 결과
블랭크값을 제한 A450값에 대해서 3웰의 평균값을 도 5에 나타내었다. 단, 샘플 4의 경우, 샘플 2에 비해 2배량의 PPD가 첨가된 32 μL 중에 포함되어 있기 때문에, 실측 A450값은 0.374이지만 도면에서는 측정값의 절반 0.187로 되어 있다.
이 결과에서는, 용액 상태의 PPD(샘플 2)는 블랭크로 한 생리식염액(샘플 1)의 경우와 같은 레벨로(A450값은 0.004, 예 3의 경우와 동일하게 측정 오차 범위이다), 항원제시세포의 자극 효과는 확인되지 않았다. 또한, HAMP 단독(샘플 3)의 경우, 예 2의 경우와 마찬가지로 본래의 블랭크값보다 TNFα의 생산량이 억제되어 있었으나, HAMP에 PPD를 흡착시킨 PPD-HAMP(샘플 4)의 경우는 자극 효과가 관찰되었다. 따라서, 용해성 PPD를 고체화한 단편인 HAMP에 흡착 고정한 쪽이 항원제시세포를 보다 강하게 활성화 가능한 것이 판명되었다.
사이토카인을 흡착시킨 hGM-CSF-HAMP(샘플 5, A450값은 0.019) 및 hIFNg-HAMP(샘플 7, A450값은 0.025)의 경우는, 낮으면서도 명료한 TNFα의 생산이 관찰되었다. 그러나, hIL-2-HAMP(샘플 6)의 경우는, 블랭크로 한 생리식염액(샘플 1)의 경우를 초과한 효과가 보이지 않았다.
전술한 예 1 (2)항목에 기재한 바와 같이, THP-1 세포를 항원제시세포로 분화 유도한 경우, TNFα 생산에는 트리거로서 미량의 IFNg를 배양액에 첨가해 둘 필요가 있는데, HAM 단독의 경우는 이 배양액 중의 미량 IFNg를 흡착해 버리기 때문에, 예 2의 샘플 1, 2, 및 본 실시예의 샘플 3, 6에서는 A450값이 마이너스가 된 것으로 생각된다.
예 6：BCG균 추출물을 흡착시킨 HAMP에 의한 항원제시세포의 자극 효과
예 5의 결과로부터, HAMP에 용해성 PPD를 흡착시킨 쪽이 항원제시세포를 보다 강하게 활성화 가능한 것이 판명되었으나, 다른 면역자극 물질에서도 이러한 효과를 기대할 수 있는지 검토하였다. 여기서는 다양한 저분자가 혼합되어 있는 BCG균 추출물(BCGext)을 사용하였다.
(1) BCGext의 제작방법
건조 BCG 백신 앰플 1병(일본 비씨지 제조 주식회사, 12 ㎎ 들이)을 110℃에서 5분간 오토클레이브에 걸고, 에탄올 1 ㎖를 첨가하여 6시간 이상 교반한 후, 그의 현탁액을 채취하여 별도의 건조 BCG 제제 1병에 첨가하고, 재차 충분히 교반한 후, 미량 고속원심기로 12,000 rpm(최대 가속도 11,000 G)에서 5분간 원심하고, 그의 상청을 회수하여 BCGext로 하였다.
(2) HAMP로의 BCGext의 흡착
HAMP(40 w/v%)에 에탄올로 1/5로 희석한 BCGext를 등량 첨가하여 실온에서 하룻밤 교반하였다. 이것을 충분량의 생리식염액으로 원심 세정하여 원래의 HAMP(40 w/v%)가 되도록 현탁하였다. 3% medium으로 5.65배로 희석하여 샘플 HAMP-BCGext로 하였다.
(3) 항원제시세포에 의한 바이오어세이방법 및 TNFα의 측정방법은 예 1과 동일하며, TNFα의 측정에서는 SAv-HRP를 사용하고 있다.
여기서는 바이오어세이용 샘플로서 1웰당 아래의 것을 첨가하였다.
샘플 1. 생리식염액, 30 μL(이 샘플의 TNFα 생산량을 블랭크값으로 하였다)
샘플 2. HAMP(40 w/v%)를 생리식염액으로 5.65배로 희석한 것, 30 μL(어세이 배양 시의 최종농도 0.4 w/v%)
샘플 3. BCGext를 3% medium으로 28.3배로 희석한 것, 30 μL(어세이 배양 시의 최종농도 0.2 v/v%)
샘플 4. HAMP-BCGext, 30 μL(어세이 배양 시의 HAMP 최종농도 0.4 w/v%, 원래의 BCGext가 전부 HAMP에 흡착되었다고 가정할 때 최종농도 0.18 v/v%가 되는 것)
(4) 결과
결과를 도 6에 나타낸다. 이 결과는 BCGext를 그대로 첨가하는 것보다도, HAMP에 BCGext를 흡착시킨 쪽이 보다 강력하게 항원제시세포를 자극할 수 있는 것을 나타내고 있다. 즉, PPD에 한정되지 않고, 용해성 면역자극 물질을 HAMP에 흡착시킬 수 있으면 보다 강력한 면역자극제가 되는 것으로부터, HAMP는 면역자극 물질의 효과적인 담체인 것을 알 수 있다.
(5) 앞의 항목과 동일하게 하여 HAMP-BCGext를 제작하고(단, 3% medium으로 5.65배로 희석하지 않고, 원래의 HAMP(40 w/v%)가 되도록 3% medium에 현탁한 것을 1/1 농도로 하였음), 어세이용 배양액으로 1/50~1/800로 희석한 현탁액을 제작하여, 항원제시세포에 의한 바이오어세이에 제공하였다. 회수한 상청 중의 생산 TNFα량의 정량에 있어서는, ELISA법에 의한 측정용 키트(BD Biosciences사 제조 OptEIA Set Human TNF, Cat. No. 555212)에 첨부되어 있는 표준 TNF를 사용하여 TNF량으로 환산하였다. 또한, 회수한 상청 중의 생산 GM-CSF(THP-1 세포가 인간 유래이기 때문에 hGM-CSF임)량의 정량에 있어서는, ELISA법에 의한 측정용 키트(Thermo Scientific사 제조 GM-CSF ELISA kits, Cat. No. EHGMCSF)에 첨부되어 있는 표준 GM-CSF를 사용하여 GM-CSF량으로 환산하였다.
(6) 결과
결과를 도 7에 나타낸다. 이 결과로부터, TNFα에 비해 1/40량 정도의 hGM-CSF가 동시에 생산되고 있는 것이 판명되었다.
예 5의 샘플 5에서 보여진 바와 같이, hGM-CSF는 직접 HAMP에 흡착되고, 흡착 hGM-CSF는 항원제시세포를 자극하여 활성화 가능하다. 따라서, BCGext를 담지시킨 HAMP에 의한 자극을 계기로 항원제시세포로부터 hGM-CSF가 생산되고, 그것이 항원제시세포 자신에게도 작용하여 활성화한다고 하는 오토크린 메커니즘이 작동하는 것이 판명되었다. 생산된 hGM-CSF는 생산된 항원제시세포 자신에게 작용할 뿐 아니라, 별종의 항원분자에 대해서 제시를 행하는 항원제시세포이더라도, 근린에 있다면 hGM-CSF는 그것에도 작용하여 활성화 가능하다는 파라크린 작용도 있는 것은 당업자에게 있어서는 주지이다. 따라서, 본 발명의 면역자극제는 자극을 받은 항원제시세포로부터 분비되는 hGM-CSF가 근린의 항원제시세포에 대한 작용을 통해 일반적인 면역반응을 강화할 수 있기 때문에, 동시에 다른 특정 항원을 투여하지 않고도 BRM으로서도 사용할 수 있다.
예 7：HAMP로의 항체의 흡착-1
항체는 그 종류에 따라서는 면역자극작용이 있는 것이 알려져 있다. 전항의 실시예까지 HAMP는 각종 분자를 흡착하는 능력이 있다고 추정되었다. 이에 항체도 흡착하는지 검토하였다.
(1) 흡착 조작
시판의 염소 항마우스 IgG(H＋L) 항체(horseradish peroxidase 표지)(Cat. No. W4021, Promega사 제조)를 둘베코(Dulbecco)의 Ca＋Mg＋ 불포함 인산완충액(PBS(-))으로 1/25,000로 희석하고, 이를 20 μL 취하여, HAMP 60 μL 및 생리식염액 920 μL를 포함하는 현탁액에 첨가하고, 0~60분간 실온에서 교반하였다. 교반 후, 바로 냉각 미량 고속원심기로 4℃, 12,000 rpm(최대 가속도 11,000 G)에서 5분간 원심하여, 그의 상청 100 μL 중에 잔존하는 항체의 페록시다아제 활성을 측정하였다. 페록시다아제 활성은 예 1 (3)TNFα의 측정방법의 TNFα 측정용 키트에 부수되어 있는 TMB 기질액에 의한 발색반응을 이용하여 A450값으로 나타내었다.
(2) 결과
도 8에 나타내는 바와 같이, 상청 중의 페록시다아제 활성은 교반 시간과 함께 감소하였다. 염소 항마우스 IgG(H＋L) 항체에 HAMP를 첨가하지 않은 경우, 항체의 희석액은 1시간 정도 동안에는 활성에 변화가 없는 것이 알려져 있기 때문에, 이 감소는 항체가 HAMP 침전에 시간의 경과에 따라 흡착되어 가는 것을 나타내고 있다. 또한, 이 결과는 가령 염소 항체를 항원 단백으로서 이용하고자 하는 경우, 항체 용액으로서가 아니라 항체를 HAMP에 흡착시킨 고체화 항원으로서 이용할 수 있는 것을 나타내고 있다.
예 8：HAMP로의 항체의 흡착-2
항체 흡착이 별종의 항체에서도 동일하게 일어나는지를 검토하였다.
(1) 흡착 조작
시판의 토끼 항염소 IgG(전분자) 항체(alkaline phosphatase 표지)(A4187, Sigma-Aldrich사 제조)를 PBS(-)로 1,000배로 희석하여 1차 항체로 하였다. 이를 100 μL 취하여, HAMP 60 μL 및 생리식염액 840 μL를 포함하는 현탁액에 첨가하고, 0~60분간 실온에서 교반하였다. 교반 후, 바로 냉각 미량 고속원심기로 4℃, 12,000 rpm(최대 가속도 11,000 G)의 조건하에서 5분간 원심하고, 얻어진 침전을 충분량의 생리식염액으로 원심 세정하였다. 이 세정 후의 침전을 100 μL의 생리식염액에 현탁하고, 그 절반량에 알칼리성 포스파타아제용 완충액(TRACP & ALP Assay Kit, Code No. MK301, 다카라 바이오사 제조)과 이 키트의 반응 기질액을 설명서에 따라 190 μL 첨가하였다. 실온에서 10분간 교반하고, 반응 정지액(0.5 N NaOH) 30 μL를 첨가한 후, 냉각 미량 고속원심기로 4℃, 12,000 rpm(최대 가속도 11,000 G)의 조건하에서 5분간 원심하고, 상청 200 μL를 취하여 405 nm의 흡광도를 측정하였다.
(2) 결과
도 9에 나타내는 바와 같이, 침전 중의 알칼리성 포스파타아제 활성은 1차 항체와의 교반시간 길이에 따라 증가하였다. 즉, 토끼 항염소 IgG(전분자) 항체도 HAMP에 흡착하는 것을 나타내고 있다. 따라서, 항체를 흡착시킨 HAMP도 효과적인 면역자극제의 조성물이 될 수 있는 것이 예 7 및 8의 결과로부터 알 수 있다. 또한, 항체를 흡착시킨 HAMP를 면역자극제로서 사용하는 경우, 항체가 투여 국소에서 바로 용해 확산되어 버리는 경우는 없기 때문에, 투여 국소에 국한된 효과적인 항체 적용법으로 할 수 있는 것이 이 결과로부터 명확하다.
예 9：PPD-HAMP의 안전성
예 5에서는 HAMP에 흡착된 사이토카인에 의한 항원제시세포의 자극 효과가 hGM-CSF 및 hIFNg에서는 확인되었으나, hIL-2에서는 확인되지 않았다. 이들 사이토카인은 모두 헤파린에 결합하기 쉽고, 특히 hIL-2는 헤파린에 결합한 상태에서 활성을 나타내는 것이 알려져 있다(비특허문헌 25). 이에, HAMP와는 별종의 고체화 담체인 헤파린-알부민 코아세르베이트 침전(미립자상이 되어 있음)(특허문헌 4, 단, 이 문헌에서는 PPD를 포함하는 헤파린-알부민 코아세르베이트 침전에 대해서 기재되어 있는데, 본 실시예에서는 PPD를 포함하지 않는 헤파린-알부민 코아세르베이트 침전(nega-TuMP로 명명)을 사용하였음)에 hIL-2를 흡착시킨 미립자(hIL-2-MP)로 하고, 항원제시세포의 자극 효과가 있는지 여부를 검토하였다.
특허문헌 4 중의 예 1, A．재료 및 방법, 1．면역 어쥬번트의 제작 항목에 기재된 미립자화 투베르쿨린(PPD 함유의 nega-TuMP에 상당함)의 제작법에 있어서, 단순히 PPD를 첨가하지 않고 제작한 것을 nega-TuMP로 하고 있다. 미립자상이 되어 있는 nega-TuMP의 현탁액 1 mL 중에는 헤파린이 625 단위, 인간 혈청 알부민이 12.5 ㎎ 포함되어 있다. 또한, 이무네이스 인젝션 35(시오노기 제약)를 주사용수 625 μL에 용해하고, 이 50 μL(hIL-2로서는 28,000 단위)를 취하여 nega-TuMP 현탁액 100 μL와 혼합하여 하룻밤 실온에서 교반하면, hIL-2는 미립자상의 nega-TuMP에 흡착된다. 이것을 예 1에 따라 항원제시세포에 의한 바이오어세이용 샘플 hIL-2-MP로 하였다. 이때의 비교 대조는 동량의 nega-TuMP 단독이다. 또한, 이때의 항원제시세포에 의한 바이오어세이방법 및 TNFα의 측정방법은 예 1에서 SAv-HRP를 사용한 경우와 동일하다. 그 결과, 최종적으로 회수한 항원제시세포 배양액 중의 TNFα량에 비례하는 A450값은 nega-TuMP 단독의 경우는 -0.016, hIL-2-MP의 경우는 -0.006이 되었다.
즉, 이들 샘플은 양자 모두 항원제시세포의 자극성은 없고, 오히려 TNFα 생산을 다소 감소시켰다. nega-TuMP는 IFNg를 흡착하는 성질이 있기 때문에, hIL-2-MP의 경우도 포함하여, 배양액 중에 첨가되어 있는 트리거용 미량 IFNg의 농도 저하를 초래한 결과로 생각되는데, 적어도 nega-TuMP 자체는 항원제시세포를 직접 활성화하는 것은 아니다.
이상의 결과를 감안하여, PPD-HAMP에 nega-TuMP를 혼합한 것을 샘플로 하여, 독성 시험의 기본으로 되어 있는 성장기 마우스에 투여한 경우의 체중 변화·장기 중량 변화를 지표로 안전성을 검토하였다.
(1) 방법
5주령의 C3H/HeN(수컷) 마우스 14마리를 2군으로 나누고, 대조군에는 1마리당 50 μL의 생리식염액을, 처치군에는 1마리당 PPD-HAMP(3,000 rpm(최대 가속도 1,580 G)에서 15분간 원심했을 때의 침전량으로서 19.1 v/v%)와 nega-TuMP 현탁액(용량 비율로 8.7%)을 포함하는 현탁액 50 μL를, 각각 매주 1회, 합계 3회, 미근부 피내에 주사하였다. 또한, 다음주부터 각각 매주 1회, 합계 6회, 대퇴부 피하에 주사하고, 체중을 측정하였다. 또한 최종 주사 7일 후에 마우스의 비장, 신장, 간장의 중량을 측정하였다.
(2) 결과
도 10에 마우스의 체중 변화를, 도 11에 장기 중량을 나타낸다. 이들 결과는 PPD-HAMP에 nega-TuMP를 혼합한 현탁액에는 성장기 마우스에 체중 감소를 초래하는 강한 독성은 없어, 프로인트 완전 어쥬번트(FCA)를 투여한 경우에 보이는 당업자에게 주지되어 있는 안전성에 대한 커다란 문제가 없는 것을 나타내고 있다.
예 10：암 항원과 면역자극제를 혼합한 암 백신에 의한 항종양 효과-1
예 4에 나타낸 바와 같이, HAMP는 PPD를 신속하게 흡착하여 용해성 PPD를 불용성으로 할 수 있고, 또한 예 5에 나타낸 바와 같이 항원제시세포를 자극할 수 있다. 이 때문에, PPD-HAMP는 효과적인 면역 어쥬번트가 될 것으로 추정된다. 또한, HAMP는 예 5에 나타낸 바와 같이 사이토카인을 흡착할 수 있다. 한편으로, 사이토카인은 헤파린에 잘 흡착되는 것이 당업자에게는 주지되어 있어, 헤파린과 알부민의 코아세르베이션에 의해 생긴 nega-TuMP에도 사이토카인은 잘 흡착된다. 이에 nega-TuMP에 사이토카인을 혼합하여 흡착시켜, PPD-HAMP에 첨가했을 때의 면역 어쥬번트로서의 효과를 검토하였다.
(1) 방법
(1-1) 사이토카인 흡착 nega-TuMP의 제작
마우스 GM-CSF(Miltenyi Biotec사 제조, premium grade) 100 ㎍을 1 mL의 정제수에 용해하였다. 이 50 μL를 100 μL의 nega-TuMP 현탁액과 혼합하여 하룻밤 실온에서 교반하여 흡착시키고, 이것을 mGM-CSF-MP로 하였다. 또한, 이무네이스 인젝션 35(시오노기 제약)를 주사용수 625 μL에 용해하고, 이를 50 μL 취하여 100 μL의 nega-TuMP 현탁액과 혼합하여 하룻밤 실온에서 교반하고, 이것을 hIL-2-MP로 하였다.
(1-2) 항원과 면역 어쥬번트의 조성액
난백알부민(Calbiochem사 제조, 카탈로그 번호 32467, OVA로 약칭함) 1.12 ㎎을 1 mL의 생리식염액에 용해하였다. 이것을 항원 원액으로 하고, 아래 표와 같은 액량의 비율로 마우스의 G1~G4군에 맞추어, 사이토카인 흡착(또는 비흡착) nega-TuMP를 면역 어쥬번트로서 첨가한 조성액을 제작하였다.
(1-3) 마우스로의 투여 스케줄
6주령의 C57BL/6 마우스(암컷, 일본 클레아사로부터 구입)에 상기 표의 조성액을 1마리당 50 μL 피내주사하였다. 하나의 마우스의 군은 10마리이다. 주사 개시일을 day 0로 하였다. 이 day 0일 때의 50 μL 중에는 OVA 원액을 포함하고 있다. 이후, OVA를 포함하지 않는 상기 표의 조성액을 각각의 군에 1마리당 50 μL, day 4, 11, 18, 25, 32(합계 5회)에 추가 피내주사하였다.
(1-4) 마우스로의 E.G7-OVA 종양세포의 챌린지
OVA 단백 단편을 종양 항원으로서 발현하고 있는 마우스 림프종 세포주 E.G7-OVA를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션으로부터 입수, 통상의 방법에 따라 배양하였다. 이 세포를 무혈청의 MEM 배양액으로 세정하고, 추가로 무혈청 MEM 배양액에서 2시간 배양 후에, 한번 더 무혈청의 MEM 배양액으로 세정하였다. 이 세포 50만개를 0.1 mL의 생리식염액에 현탁하고, (1-3) 항목에서 기술한 마우스의 우측 하지 피하에 day 15에 주사하여 종양세포 챌린지로 하고, 이후 증식되는 종양의 용적을 통상의 방법에 따라 측정하였다. 종양 용적이 5,000 ㎣에 도달해도 생존해 있는 마우스는 측정을 중단하고 안락사시켰다.
(2) 결과
결과를 도 12에 나타낸다. 마우스의 생존기간 중앙값은 E.G7-OVA 종양세포 챌린지 후, G1(대조)군에서 21일(조성액 주사 개시일부터는 day 36이 됨), G2(PPD-HAMP-nega-TuMP)군에서 24일, G3(PPD-HAMP-mGM-CSF-MP)군에서 26일, G4(PPD-HAMP-mGM-CSF-MP-hIL-2-MP)군에서는 31일 이상이 되었다. 챌린지 후 31일째 종료 시점에서 생존해 있는 마우스의 비율은 G1군에서 1/10, G4군에서 5/10로, 이 2군 간의 모비율차 검정(카이제곱 검정)을 실시한 바, 양쪽 p=0.051이 되어, G4군에서 연명 효과가 있는 강한 경향이 관찰되었다. 다른 G2군, G3군에서는 G1군에 대한 통계학적 유의차는 없으나, 각각 생존기간 중앙값이 G1군보다도 연장되어 있는 것으로부터, 각각에서 연명 효과가 있는 경향이 확인되었다.
예 11：암 항원과 면역자극제를 혼합한 암 백신에 의한 항종양 효과-2
예 10에서 사용한 항원은 난백알부민으로, 면역학에 있어서는 전형적 모델 항원으로서 범용되고 있는데, 자연 발생한 종양세포에 포함되는 종양 항원은 아니다. 이에, 여기서는 마우스 폐암세포의 용해물을 종양 항원으로 하여 살아 있는 동일한 폐암세포를 챌린지했을 때, 첨가제로서 사이토카인 흡착 nega-TuMP를 첨가한 PPD-HAMP 현탁액의 면역 어쥬번트 효과를 검토하였다.
(1) 방법
(1-1) 항원과 면역 어쥬번트의 조성액
사이토카인 흡착 nega-TuMP 현탁액의 제작법은 예 10의 (1-1) 항목과 동일하다. 마우스 폐암인 LLC 세포(이화학 연구소·리켄 바이오리소스 센터로부터 입수, 세포번호 RCB0558)를 통상의 방법에 따라 증식배양 후, 2시간 무혈청 배양하여 PBS(-)로 충분히 세정하고, 통상의 방법의 EDTA 처리에 의해 세포를 박리하여 PBS(-) 중에서 현탁액으로 하였다. 세포 수를 2×107/mL로 조정하고, 동결 융해를 반복하여 용해물로 하였다. 용해물은 3% 트리판블루액으로 염색하여 살아 있는 LLC 세포가 없는 것을 확인하였다. 이것을 종양 항원으로 하고, 아래의 표와 같은 액량의 비율로 마우스의 각 군에 맞추어, 사이토카인 흡착 nega-TuMP(mGM-CSF-MP 및 hIL-2-MP)를 면역 어쥬번트로서 첨가한 조성액을 제작하였다. 여기서는 PPD-HAMP 현탁액에는 nega-TuMP는 첨가하지 않았다.
(1-2) 마우스로의 투여 스케줄
6주령의 C57BL/6 마우스(암컷, 일본 클레아사로부터 구입)에 상기 표의 조성액을 1마리당 0.1 mL, 등부 피하에 주사하였다. 하나의 마우스의 군은 10마리인데, mGM-CSF-hIL-2-PPD-HAMP 군은 8마리이다. 주사 개시일을 day 0로 하였다. 이때의 투여 0.1mL 중에는 LLC 세포 용해물을 포함하고 있다. 이후, LLC 세포 용해물을 포함하지 않는 상기 표의 조성액을 각각의 군에 1마리당 0.1 mL, day 4, 10, 18, 25, 32, 39, 46에 추가 피하주사하였다.
(1-3) 마우스로의 LLC 세포의 챌린지
전술한 용해물을 제작한 세포의 원주인 살아 있는 LLC 세포를 무혈청의 MEM 배양액 0.1 mL 중에 현탁하여 1×104개를 day 15에 대퇴부 피하에 주사하여 종양세포 챌린지로 하고, 이후, 촉진(palpation)에 의해 처음으로 종양 덩어리가 발생한 날을 기록하였다. 챌린지 후, 이 날까지가 무종양(tumor-free) 기간이다.
(2) 결과
LLC 세포의 챌린지 후, 53일까지 관찰한 결과, 양쪽 군에서 무종양(tumor-free)인 채로 남은 마우스는 도 13에 나타내는 바와 같았다. 대조(saline)군에서는 종양세포 챌린지 후 17일째부터 종양 덩어리의 발생이 관찰된 것에 대해, PPD-HAMP군에서는 종양 덩어리의 발생이 24일째부터로 늦어지고 있어 종양 덩어리의 발생에 억제 효과가 확인되었으나, 양쪽 군 모두 챌린지 후 50일 이후에서 무종양(tumor-free)인 채로 남는 마우스는 6/10(60%)으로 동일하였다. 그러나, mGM-CSF-hIL-2-PPD-HAMP 투여군에서는 전혀 종양 덩어리의 발생은 관찰되지 않고(8/8, 100%), 대조군과의 사이에서 2군 간의 모비율차 검정(카이제곱 검정)을 실시한 바, 양쪽 p＝0.0425가 되어, 통계학적으로 유의한 차가 있었다.
이 결과 및 예 10의 도 12의 결과를 합쳐서 생각하면, PPD-HAMP에는 (nega-TuMP의 첨가 여부에 상관없이) 종양의 악화를 억제할 수 있는 면역 어쥬번트 활성이 있고, 그것에 nega-TuMP에 흡착시킨 사이토카인 mGM-CSF 및 hIL-2를 추가한 경우는 보다 강하고 효과적인 면역 어쥬번트 활성이 발휘되는 것으로 확인된다.
또한 체내에 자연 발생하는 종양세포의 경우, 그것에 포함되는 종양 항원의 항원성은 일반적은 낮은 것으로서, 간단하게는 체내의 항종양 면역반응을 야기할 수 있는 것은 아닌 것이 당업자에게는 널리 알려져 있다(그렇기 때문에 종양이 발생하는 것이다). 따라서, 여기서 사용한 종양 항원(LLC 세포 용해물) 대신에 항원성이 높은 물질(예를 들면 바이러스 등의 외래생물 유래 항원)을 사용하면 그 바이러스 감염증에 대항할 수 있는 백신이 되는 것은, 면역반응의 메커니즘이 항원에 상관없이 기본적으로 동일한 것으로부터, 당업자에게 있어서는 자명하다. 또한 PPD-HAMP에 mGM-CSF-MP나 IL-2-MP를 추가한 면역자극제를 면역 어쥬번트로 하면, 상기와 같이 항원성이 낮은 종양 항원에조차 유효한 항종양 면역반응을 유도할 수 있는 것으로부터, 체내 유래로 항원성이 낮은 다른 질병 요인 물질이더라도, 그 물질을 항원으로 한 당해 질병의 치료용 백신이 되는 조성물을 만들어 내는 것이 가능한 것은 역시 당업자에게 있어서는 자명하다.
산업상 이용가능성
본 발명의 복합체는 면역자극작용을 가지고 있어 항원제시세포를 효과적으로 자극할 수 있는 것으로부터, 종양 등의 질병에 대한 치료 외에, 악성종양의 수술 후 재발이나 전이의 예방을 위한 면역자극제로서 유용하다.
Claims (17)
- 변성 응고에 의해 고체화된 혈장 유래 단백 또는 혈청 유래 단백을 포함하는 담체, 및 그 담체에 담지된 페록시다아제 유사 활성을 갖는 단백을 포함하는 복합체.
- 제1항에 있어서,
페록시다아제 유사 활성을 갖는 단백이 실질적으로 미변성의 상태 또는 변성된 상태로 담지되어 있는 복합체. - 제1항에 있어서,
페록시다아제 유사 활성을 갖는 단백이 혈장 유래 단백 또는 혈청 유래 단백과 함께 변성 응고에 의해 고체화된 상태로 담지되어 있는 복합체. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
페록시다아제 유사 활성을 갖는 단백이 헤모글로빈 또는 미오글로빈인 복합체. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
추가로 1종 또는 2종 이상의 면역자극 물질을 담지시킨 복합체. - 제5항에 있어서,
면역자극 물질이 정제 투베르쿨린, BCG균 추출물, 사이토카인, 톨 유사 수용체 리간드, NOD 유사 수용체 아고니스트, RIG 유사 수용체 아고니스트, C 타입 렉틴 수용체 아고니스트, 환상 GMP-AMP 신타아제에 결합하는 외인성 DNA, 알라민, 항원 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 내지 2 이상의 물질인 복합체. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 복합체를 포함하는 면역자극제.
- 제7항에 기재된 면역자극제와 알부민-헤파린 코아세르베이트 침전을 포함하는 면역 자극성 조성물.
- 제8항에 있어서,
알부민-헤파린 코아세르베이트 침전이 사이토카인을 흡착시킨 헤파린-알부민 코아세르베이트 침전인 면역 자극성 조성물. - 제9항에 있어서,
사이토카인이 과립구 마크로파지 콜로니 자극인자, 인터류킨-2 및 인터페론 감마로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 물질인 면역 자극성 조성물. - 제7항에 기재된 면역자극제 또는 제8항에 기재된 면역 자극성 조성물과 면역반응 억제작용 저해물질과의 조합을 포함하는, 질병의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 의약.
- 제11항에 있어서,
악성종양의 치료 및/또는 재발 또는 전이의 예방에 사용하기 위한 의약. - 제11항 또는 제12항에 있어서,
면역반응 억제작용 저해물질이 면역 체크포인트 저해제인 의약. - 제13항에 있어서,
면역 체크포인트 저해제가 항PD-1 항체, 항PD-L1 항체, 항PD-L2 항체, 항CTLA-4 항체, 항CD40 항체, 항CD137 항체, 항OX40 항체, 항TGF-β 항체, 항LAG3 항체, 항B7-H3 항체, 항B7-H4 항체, 항TIM3 항체, 항CD96 항체 및 항TIGIT 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 항체인 의약. - 제7항에 기재된 면역자극제 또는 제8항에 기재된 면역 자극성 조성물과 항원과의 조합을 포함하는, 질병의 예방을 위해 사용하는 백신.
- 제15항에 있어서,
항원이 종양 항원인 백신. - 제16항에 있어서,
악성종양의 치료 및/또는 재발 또는 전이의 예방에 사용하기 위한 백신.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190045912A (ko) * | 2016-09-06 | 2019-05-03 | 셀 메디신 가부시키가이샤 | 면역자극제 |
| FR3078887B1 (fr) * | 2018-03-14 | 2020-12-18 | Urodelia | Vaccins autologues contre le cancer |
| US20210000933A1 (en) | 2019-06-20 | 2021-01-07 | Cell- Medicine, Inc. | Tumor vaccine |
| CN112316148A (zh) * | 2019-08-01 | 2021-02-05 | 成都夸常奥普医疗科技有限公司 | 包含血浆的半流体的应用、包含该半流体和活性成分的药物组合物及其制备方法 |
| CN112023038B (zh) * | 2020-09-13 | 2023-05-26 | 天津市泌尿外科研究所 | 一种复合免疫增强剂 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS492671A (ko) | 1972-04-27 | 1974-01-10 | ||
| JPS5579586A (en) | 1978-12-13 | 1980-06-16 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | Still-picture receiver |
| JP4176021B2 (ja) | 2002-03-05 | 2008-11-05 | セルメディシン株式会社 | 固体化組織免疫アジュバント |
| JP4238279B2 (ja) | 2006-01-06 | 2009-03-18 | セルメディシン株式会社 | 免疫アジュバント |
| JP4569946B2 (ja) | 2003-10-21 | 2010-10-27 | セルメディシン株式会社 | リン酸カルシウム微粒子 |
| JP4688254B2 (ja) | 1999-02-09 | 2011-05-25 | 独立行政法人理化学研究所 | 腫瘍ワクチン |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1683517A1 (en) * | 1996-08-19 | 2006-07-26 | American Bioscience, Inc. | Methods for the production of protein particles useful for delivery of pharmacological agents |
| EP1159967B1 (en) | 1999-02-09 | 2008-09-10 | Riken | Tumor vaccines |
| JP2001058955A (ja) * | 1999-06-17 | 2001-03-06 | Inst Of Physical & Chemical Res | 生理活性ペプチド徐放性製剤 |
| JP3492671B2 (ja) * | 2002-04-18 | 2004-02-03 | 理化学研究所 | 免疫アジュバント |
| TWI617309B (zh) * | 2013-10-25 | 2018-03-11 | 製藥公司 | 使用布魯頓氏酪胺酸激酶抑制劑之治療及免疫療法 |
| EP2962681A1 (en) * | 2014-07-03 | 2016-01-06 | Swiss VX Venentherapie und Forschung GmbH | Devices and methods for injectable vascular sclerofoams using a carrier made of human blood and uses thereof |
| KR20190045912A (ko) * | 2016-09-06 | 2019-05-03 | 셀 메디신 가부시키가이샤 | 면역자극제 |
| MX2021000155A (es) * | 2018-07-03 | 2021-05-12 | Catalent Pharma Solutions Llc | Moleculas de proteina multifuncionales que comprenden decorina y su uso. |
-
2017
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Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS492671A (ko) | 1972-04-27 | 1974-01-10 | ||
| JPS5579586A (en) | 1978-12-13 | 1980-06-16 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | Still-picture receiver |
| JP4688254B2 (ja) | 1999-02-09 | 2011-05-25 | 独立行政法人理化学研究所 | 腫瘍ワクチン |
| JP4176021B2 (ja) | 2002-03-05 | 2008-11-05 | セルメディシン株式会社 | 固体化組織免疫アジュバント |
| JP4569946B2 (ja) | 2003-10-21 | 2010-10-27 | セルメディシン株式会社 | リン酸カルシウム微粒子 |
| JP4238279B2 (ja) | 2006-01-06 | 2009-03-18 | セルメディシン株式会社 | 免疫アジュバント |
Non-Patent Citations (26)
| Title |
|---|
| Brett SJ, Rhodes J, Liew FY, Tite JP. Comparison of antigen presentation of influenza A nucleoprotein expressed in attenuated AroA- Salmonella typhimurium with that of live virus. J. Immunol., 150:2869-2884, 1993. |
| Chang ZL. Recent development of the mononuclear phagocyte system: in memory of Metchnikoff and Ehrlich on the 100th Anniversary of the 1908 Nobel Prize in Physiology or Medicine. Biol. Cell., 101(12):709-721, 2009. |
| Cho YS, et al. Deciphering the proteome of the in vivo diagnostic reagent "purified protein derivative" from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics, 12(7): 979-991, 2012. doi:10.1002/pmic.201100544. |
| DAKO Educational IHC Guidebook, Immunohistochemical Staining Methods, Sixth Edition, Chapter 15, ed. Tayor CR and Rudbeck L, 2013. http://www.dako.com |
| Disis ML, et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: an effective adjuvant for protein and peptide-based vaccines. Blood, 88:202-210, 1996. |
| Gordon S. The macrophage: past, present and future. Eur. J. Immunol., 37: Suppl 1:S9-17, 2007. |
| Guld J. Standardization and stability of purified tuberculin, American Review of Respiratory Disease, 80(2), pp. 255-256, 1959. |
| Hashimoto N, et al. Wilms tumor 1 peptide vaccination combined with temozolomide against newly diagnosed glioblastoma: safety and impact on immunological response. Cancer Immunol. Immunother., 64:707-16, 2015. |
| Hu PQ, et al. Escherichia coli expressing recombinant antigen and listeriolysin O stimulate class I-restricted CD8＋ T cells following uptake by human APC. J. Immunol., 172:1595-1601, 2004. |
| Ishikawa E, et al. A clinical trial of autologous formalin-fixed tumor vaccine for glioblastoma multiforme patients. Cancer Sci., 98:1226-1233, 2007. |
| Ishikawa E, et al. Phase I/IIa trial of fractionated radiotherapy, temozolomide, and autologous formalin-fixed tumor vaccine for newly diagnosed glioblastoma. J. Neurosurg., 121:543-553, 2014. |
| Kawashima I, et al. Suppression of postsurgical recurrence of hepatocellular carcinoma treated with autologous formalin-fixed tumor vaccine, with special reference to glypican-3. Clinical Case Reports, 3: 444-447, 2015. |
| Kuang M, et al. Phase II randomized trial of autologous formalin-fixed tumor Vaccine for Postsurgical recurrence of Hepatocellular Carcinoma. Clin. Cancer Res., 10:1574-1579, 2004. |
| Kunins HV, et al. Validity of a self-reported history of a positive tuberculin skin test - A prospective study of drug users. J. Gen. Intern. Med., 19:1039-1044, 2004. |
| Kuroda E, Coban C, Ishii KJ. Particulate adjuvant and innate immunity: Past achievements, present findings, and future prospects. Intern. Rev. Immunol., 32:209-220, 2013. |
| Kurosaka K, Watanabe N, Kobayashi Y. Production of proinflammatory cytokines by phorbol myristate acetate-treated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages after phagocytosis of apoptotic CTLL-2 cells. J. Immunol., 161:6245-6249, 1998. |
| Landi S, Held HR, Tseng MC. Evaluation of various substances to prevent adsorption of tuberculin purified protein derivative (PPD) to glass surfaces. Bull. Org. mond. Sant. ull. Wld. Hlth. Org., 43:91-106, 1970. |
| Muragaki Y, et al. Phase I / IIa Trial of Autologous Formalin-fixed Tumor Vaccine Concomitant with Fractionated Radiotherapy for Initially-Diagnosed Glioblastoma. J. Neurosurg., 115:248-255, 2011. |
| Najjam S, et al. Further characterization of the binding of human recombinant interleukin 2 to heparin and identification of putative binding sites. Glycobiology, 8:509-516, 1998. |
| Oliveira MM, Charlab R, Pessolani MC. Mycobacterium bovis BCG but not Mycobacterium leprae induces TNF-alpha secretion in human monocytic THP-1 cells. Mem. Inst. Oswaldo. Cruz., 96(7):973-978, 2001. |
| Stills HF, Jr. Adjuvants and antibody production: Dispelling the myths associated with Freund's complete and other adjuvants. ILAR Journal, 46:280-293, 2005. |
| Yutani S, et al. Phase II study of personalized peptide vaccination with both a hepatitis C virus-derived peptide and peptides from tumor-associated antigens for the treatment of HCV-positive advanced hepatocellular carcinoma patients. J. Immunol. Res., Article ID 473909, 2015. http://www.hindawi.com/journals/jir/2015/473909/ |
| 블로그：EARL의 의학 노트, http://drmagician.exblog.jp/16073684 |
| 사카이 하루미, 임상과 바이러스, 41(5):1-9, 2013. |
| 이시이 켄, 어쥬번트 개발연구의 신전개, 제9회 후생과학심의회 예방접종·백신분과회 연구개발 및 생산·유통부회 자료1, 2015년 1월 30일. |
| 후생노동성 홈페이지, 알레르기 총론 제1장. http://www.mhlw.go.jp/new-info/kobetu/kenkou/ryumachi/dl/jouhou01-17.pdf |
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| US20210000933A1 (en) | Tumor vaccine |
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