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KR20190017900A - 면역 조절을 위한 미생물총의 선택적 변화 - Google Patents

면역 조절을 위한 미생물총의 선택적 변화 Download PDF

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KR20190017900A
KR20190017900A KR1020197000551A KR20197000551A KR20190017900A KR 20190017900 A KR20190017900 A KR 20190017900A KR 1020197000551 A KR1020197000551 A KR 1020197000551A KR 20197000551 A KR20197000551 A KR 20197000551A KR 20190017900 A KR20190017900 A KR 20190017900A
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재스퍼 클러브
모튼 소머
크리스티안 그론달
루벤 바스케스-우리베
데르 헬름 에릭 반
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스니프르 테크놀로지스 리미티드
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Abstract

본 발명은 환자의 미생물총을 변화시킴에 의해 환자에서 면역 세포를 조절하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 대상체의 미생물총을 변화시킴에 의해 대상체 유기체에서 치료 또는 치료요법을 조절하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 세포 집단, 시스템, 어레이, 세포, RNA, 키트 및 이를 수행하기 위한 다른 수단에 관한 것이다. 하나의 예에서, 가이드된 핵산 변형을 사용한 인간 장 내 미생물총에서 특정 종의 이로운 선택적 표적화는 상기 변화를 실행하기 위해 수행된다.

Description

면역 조절을 위한 미생물총의 선택적 변화
본 발명은 환자의 미생물총을 변화시킴에 의해 환자 내의 면역 세포 (환자의 내인성 세포 및/또는 예를 들어, 적응성 세포 치료요법을 통해 투여된 세포)를 조절하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 대상체의 미생물총을 변화시킴에 의해 대상체 유기체에서 치료 또는 치료요법을 조절하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이를 수행하기 위한 세포 집단, 시스템, 키트 및 다른 수단에 관한 것이다. 하나의 예에서, 가이드된 핵산 변형을 사용하여 인간의 장 내 미생물총에서 특정 종의 이로운 선택적 표적화는 상기 변화를 실행하기 위해 수행된다.
면역치료요법에 대한 하나의 접근법은 환자 자신 (또는 공여자)의 면역 세포를 가공하여 종양을 인지하고 이를 공격하는 세포-표면 항원 수용체 (cell-surface antigen receptors, CARs)를 발현시킴을 포함한다. 적응성 세포 전달 (adoptive cell transfer, ACT)로 불리우는 상기 접근법이 지금까지는 소규모 임상 시험으로 제한되었지만, 이들 가공된 면역 세포를 사용한 치료는 진행된 암을 갖는 환자에서 일부 현저한 반응을 생성하였다.
키메라 항원 수용체 (Chimeric Antigen Receptor, CAR)는 T-세포에 의해 발현되는 경우, 상기 CAR의 표적화 도메인에 의해 결정된 항원 특이성을 T-세포에게 부여하는 T-세포 신호전달 도메인과 융합된 항체-유래된 표적화 도메인으로 이루어진다. CAR은 항체-기반 표적화 도메인이 가용하는 한, 세포 표면 상에 발현된 임의의 단백질 및 비-단백질 표적으로 T-세포의 이펙터 기능을 잠재적으로 재지시할 수 있다. 이로써 상기 전략은 표적 세포에 의한 항원 프로세싱 및 제공을 필요로 하지 않고 탄수화물과 같이 비-전형적 T-세포 표적에 적용될 수 있다. 이러한 HLA-제한(HLA-restriction)의 우회는, CAR T-세포 접근법이 적응성 T-세포 치료요법의 응용성의 잠재력을 광범위하게 하는 포괄적 도구로서 사용될 수 있음을 의미한다. 문헌 (예를 들어, Methods Mol Biol. 2012;907:645-66. doi: 10.1007/978-1-61779-974-7_36, "Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy", Cheadle EJ et al.)을 참조한다.
첫번째 CAR-T 작제물(construct)은 PNAS에서 면역치료요법의 개척자 젤리그 에스하르 (Zelig Eshhar)에 의한 1989년 논문에서 기재되었다. CAR의 구조는 현재 다양한 세포 단백질로부터 기원하는 다양한 도메인들의 키메라인 막관통(transmembrane) 폴리펩타이드 체인을 포함한다. 예를 들어, CAR은 수용체가 면역 세포, 정상적으로 T-세포의 막에 매립된 CAR의 막관통 부분과 함께 세포내 부분에 연결된 (흔히 링커 및/또는 힌지 영역에 의해) 세포외 부분을 갖는다. 세포외 모이어티(moiety)는 통상적으로 암 세포의 표면 상의 종양 관련 항원 (tumour associated antigen, TAA)인 표적 항원을 인지하는 항체 결합 부위 (일반적으로 쥐 mAb로부터 유래된 것과 같은 scFv의 형태로)를 포함한다. 상기 방식의 항원 인지는 MHC-제한된 항원 제공을 요구하고 결합 친화성이 상대적으로 낮을 수 있는 TCR에 의존할 필요성을 제거한다. CAR의 세포내 모이어티는 전형적으로 항원이 세포외 결합 부위에 결합되는 경우 세포내 신호전달을 위한 CD3-제타 (CD3ζ) 도메인을 포함한다. 이후 세대의 CAR은 또한 흔히 T-세포 매개된 반응을 증진시키는 흔히 4-1BB (CD137) 또는 CD28 세포내 도메인인 추가의 도메인을 포함한다. CAR 결합 부위에 대한 동족체 항원 리간드를 접하게 되면, CAR은 세포내 신호전달을 활성화시킬 수 있고 따라서 CAR T-세포의 활성화는 종양 세포 사멸을 증진시킬 수 있다.
대부분의 CAR-T는 생체내 확장하고 따라서 통상적인 의미에서 용량 적정은 어려우며, 많은 경우에, 가공된 T-세포는 "영원히" 활성인 것으로 나타나고 - 즉, 계속되는 B-세포 무형성증의 관찰은 지금까지 C19 CAR-T 임상적 연구의 대부분에서 나타난다. 이것은 CAR T-세포 접근법에 대해 심각한 문제점을 제기한다. 일부 관찰된 위험은 문헌 (참조: Discov Med. 2014 Nov;18(100):265-71, "Challenges to chimeric antigen receptor (CAR)-T cell therapy for cancer", Magee MS & Snook AE)의 논의되고, 이것은 CAR-T 세포 치료 후 첫번째 심각한 부작용이 폐 및 간으로의 전이성인 결장직장암을 갖는 환자에서 일어남을 설명한다 (참조: Morgan et al., 2010). 상기 환자는 상피 성장 인자 수용체 2 (ERBB2, HER2)를 표적화하는 3세대 CAR을 발현하는 T 세포로 처리하였다. CAR은 HER2-양성 유방암의 치료를 위해 FDA 승인된 4D5 항체 (트라스투주맙(trastuzumab))으로부터 유래된 scFv를 함유하였다 (참조: Zhao et al., 2009). 상기 환자는 1010 CAR-T 세포 단일 용량을 투여받은지 15분 이내 호흡 곤란에 이어서 5일 동안 다수의 심정지가 발병하여 결국 사망하게 된다. 처리한지 4시간 후 혈청 분석은 사이토킨 IFNγ, GM-CSF, TNFα, IL-6, 및 IL-10에서 현저한 증가를 나타냈다. CAR-T 세포는 폐 및 복부 및 종격동 림프절에서 발견되었지만 종양 전이에서는 발견되지 않았다. 연구자들은 독성이 폐 독성 및 다중-기관 부전증을 유발하는 사이토킨 방출 증후군 (cytokine release syndrome, CRS)을 생성하는 염증 사이토킨 방출을 유도하는 폐 상피에서 HER2의 인지에 기인함을 밝혔다 (참조: Morgan et al., 2010). 보존적 용량-상승 전략 후 상이한 항체 (FRP5)로부터 유래된 2세대 HER2-표적화된 CAR을 사용한 시험은 현재 다른 연구자들 (clinicaltrials.gov identifiers NCT01109095, NCT00889954, and NCT00902044)에 의해 다양한 HER2+ 악성종양에 대해 진행 중이다.
CAR T-세포 테마에 대한 변화는 항체-커플링된 T-세포 수용체 (antibody-coupled T-cell receptor, ACTR) 치료전략이고, 이는 종양-특이적 IgG의 Fc 영역에 결합시키기 위해 CD16A(FCγRIIIA)를 사용한다 (참조: 예를 들어, WO2015/058018, US2015139943). 상기 목적은 환자에게 투여된 IgG를 적정함에 의해 생체내에서 CAR T-세포 활성을 보다 조절할 수 있게 하는 것이다. CAR-T-세포의 CD16 결합 부위는 그러나 또한 환자의 내인성 IgG에 결합하기 위해 유리될 수 있고 이것은 상기 접근법의 매력을 감소시킨다. 상기 접근법은 또한 신체에서 IgG의 고유하게 긴 반감기 (인간에서 IgG에 대해 약 20일)를 고려할 필요가 있고, 이는 CAR-세포 활성의 조절을 제한할 수 있다. 계속되는 연구는 이의 위험을 평가할 수 있다.
CAR-T-세포 접근법 및 다른 세포-기반 접근법과 같은 면역 세포-기반 치료요법 (하향조절 또는 상향조절)을 조절하기 위해 대안적인 방법을 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 또한 자가면역, 염증 및 감염성 질환 및 병태와 같은, 내인성 면역 세포에 의해 매개되는 질환 및 병태를 해결하기 위한 방식을 제공하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명은 본원의 청구항에 청구된 바와 같은, 가이드된 뉴클레아제, 숙주 세포 변형 (HM)-CRISPR/Cas 시스템, gRNA, HM-어레이, HM-crRNA, HM-Cas, HM-TALENs, HM-메가뉴클레아제, HM-아연 핑거 및 방법을 제공한다.
의료 행위는 흔히 환자에게 항생제의 투여를 포함한다. 상기 치료는 전형적으로 광범위 스펙트럼 항생제 또는 구분 없이 많은 그람-양성 세균 종(gram-positive bacterial species) 또는 많은 그람-음성 종(gram-negative species)을 표적화하는 항생제의 투여를 포함할 수 있다. 유사하게, 농사 및 농업에서 광범위한-스펙트럼 항생제의 사용은 예를 들어, 건강에 해롭고 미생물 내성 발생에 기여할 수 있는 상기 항생제의 인간 및 동물 먹이 사슬로의 진입을 포함하여 환경 문제를 제기한다. 오히려, 본 발명은 제1 미생물총 종 또는 균주의 선택적 표적화를 포함한다. 본원의 실시예에서 보여준 바와 같이, 특정 세균 종의 선택적 표적화는 선택된 종의 게놈의 가이드된 뉴클레아제를 표적화하면서 동시에 계통발생적으로 관련된 종 및 균주는 그대로 유지하는 표적화를 사용하여 성취되었다. 추가로, 본 발명은 차기에 추가로 논의된 바와 같이, 미생물총 세균 및 고세균이 인간 및 동물에서 면역 기능을 형성하는 작용을 하는 역할을 실현한다.
따라서, 본 발명은 환자의 미생물총을 변화시킴에 의해 환자에서 면역 세포 (환자의 내인성 세포 및/또는 예를 들어, 적응성 세포 치료요법을 통해 투여된 세포)를 조절하는 방법에 관한 것이다. 하나의 예에서, 미생물총 (예를 들어, 장 내 미생물 총)에서 특정 종의 이로운 선택적 표적화는 상기 변화를 실행하기 위해 수행된다. 선택적 표적화는 예를 들어, 동일한 문(phylum)의 종과 같은 또는 동일한 종의 상이한 균주와 같은, 관련된 종 또는 균주의 표적화를 회피할 수 있다.
예를 들어, 본 발명은 환자 및 대상체에서 미생물총을 변화시킴에 의해 질환 및 병태의 조절 면역 세포-기반 치료요법 또는 다른 치료요법, 및 이를 실행하기 위한 시스템, 키트 및 다른 수단을 제공한다.
예를 들어, 본 발명은 미생물총을 변화시킴에 의해 환자에서 질환 및 병태를 치료하거나 감소시키는 것을 제공하고 여기서, 상기 질환 및 병태는 면역 세포 (예를 들어, T-세포)에 의해 매개되거나 환자에서 면역 세포 활성 또는 집단을 변화시킴에 의해 해결되는 것들이다. 구현예는 암, 자가면역 질환 또는 병태, 염증 질환 또는 병태, 바이러스 감염 (예를 들어, 인간 환자의 HIV 감염), 또는 바이러스 감염에 의해 매개되거나 유발되는 질환 또는 병태이다.
본 발명은 또한 대상체의 미생물총을 변화시킴에 의해 대상 유기체(예를 들어, 식물, 효모, 인간 또는 동물 환자)에서 치료 또는 치료요법을 조절하는 방법에 관한 것이다. 치료요법의 예는 예를 들어, 환자에서 질환 또는 병태의 치료 또는 예방을 위한 적응성 세포 치료요법, 항체 치료요법(예를 들어, 면역 체크포인트 억제), 방사선 치료요법, 화학치료요법이다.
제1 구성에서, 본 발명은 환자에서 질환 또는 병태의 치료요법을 조절하는 방법을 제공하고, 상기 방법은
a. 상기 환자에서 상기 치료요법을 수행하고;
b. 상기 환자에서 장 내 세균 미생물총 장 내 불균형을 유발하고, 상기 장 내 불균형이 상기 환자에서 면역 세포를 조절함에 의해 환자에서 치료요법을 조절함을 포함한다.
또 다른 양상의 제1 구성에서, 본 발명은 인간 또는 동물 환자에서 질환 또는 병태의 치료요법을 조절하는 방법을 제공하고, 상기 방법은
a. 상기 환자에서 상기 치료요법을 수행하고;
b. 상기 환자에서 세균 (예를 들어, 장 내 세균) 미생물총 장 내 불균형을 유발하고, 상기 장 내 불균형이 상기 환자에서 면역 세포를 조절함에 의해 환자에서 치료요법을 조절함을 포함하고;
여기서, 상기 치료요법은 적응성 면역 세포 치료요법 (예를 들어, 적응성 T-세포 치료요법, 예를 들어, 환자로의 CAR-T 세포 투여)을 포함한다.
또 다른 양상의 제1 구성에서, 본 발명은 인간 또는 동물 환자에서 질환 또는 병태의 치료요법을 조절하는 방법을 제공하고, 상기 방법은
a. 상기 환자에서 상기 치료요법을 수행하고;
b. 상기 환자에서 세균 (예를 들어, 장 내 세균) 미생물총 장 내 불균형을 유발함으로써 상기 장 내 불균형이 상기 환자에서 치료요법을 조절함을 포함하고;
여기서, 상기 치료요법은 면역 체크포인트 억제제 (예를 들어, 항-PD-L1, 항-PD-1, 항-CTLA4 또는 항-TIM3 억제제, 예를 들어, 항체)를 상기 환자에게 투여함을 포함한다.
또 다른 양상의 제1 구성에서, 본 발명은 인간 또는 동물 환자에서 질환 또는 병태의 치료요법을 조절하는 방법을 제공하고, 상기 방법은
a. 상기 환자에서 상기 치료요법을 수행하고;
b. 상기 환자에서 세균 (예를 들어, 장 내 세균) 미생물총 장 내 불균형을 유발함으로써, 상기 장 내 불균형이 상기 환자에서 치료요법을 조절함을 포함하고;
여기서, 상기 치료요법은 항체 (예를 들어, 항-PD-L1, 항-PD-1, 항-CTLA4 또는 항-TIM3 항체; 또는 항-TNFa 슈퍼패밀리 구성원 항체, 예를 들어, 항-TNFa, TNFR1 또는 BAFF 항체; 또는, 항-IL6R 또는 항-IL-4Ra 항체; 또는 항-PCSK9 항체)의 환자로의 투여를 포함한다.
또 다른 양상의 제1 구성에서, 본 발명은 대상체에서 치료를 조절하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 ,
a. 상기 대상체에서 상기 치료를 수행하고;
b. 상기 대상체에서 미생물총 장 내 불균형을 유발함으로써 상기 장 내 불균형이 상기 대상체에서 치료를 조절함을 포함한다.
하나의 예에서, 대상체 또는 환자는 인간이다. 하나의 예에서, 대상체 또는 환자는 비-인간 동물이다. 하나의 예에서, 상기 대상체는 식물이고 임의로 상기 치료는 식물 성장-촉진 치료, 성장-억제 치료, 살충제 치료, 질소 고정 촉진 치료, 제초제 치료 또는 비료 치료이다. 하나의 예에서, 상기 대상체는 효모이고 임의로 상치 치료는 효모 성장-촉진 치료 또는 성장-억제 치료이다.
하나의 예에서, 상기 조절은 상기 대상체 또는 환자의 치료 또는 치료요법을 증강시키거나, 상향조절하거나, 하향조절하거나, 억제하거나 증진시키거나 강화시킨다. 하나의 예에서, 상기 치료 또는 치료요법은 상기 대상체 또는 환자에서 효과적이고, 상기 치료 또는 치료요법은 효과적이지 않거나 대상체, 환자 또는 대조군 대상체, 또는 조절에 적용되지 않는 환자에서 감소되거나 증가된 효능을 갖는다. 상기 대조군은 대상체 또는 환자와 동일한 종, 및 임의로 동일한 나이 및/또는 성별로부터 기원한다. 하나의 예에서, 세균 또는 고세균 숙주 세포는 사멸되거나 이의 성장은 본 발명의 방법을 사용하여 대상체 또는 환자에서 억제되고, 여기서, 상기 대조군은 동일한 세균 또는 고세균 종의 세포를 포함하고 상기 세포는 본 발명의 방법에 의해 사멸되거나 성장 억제되지 않는다.
하나의 예에서, 단계 (a) 및 (b)는 동시에 수행된다. 하나의 예에서, 단계 (a)는 단계 (b) 전에 수행된다. 하나의 예에서, 단계 (b)는 단계 (a) 전에 수행되고 임의로 단계 (b)는 단계 (a) 후 다시 수행한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 식물 또는 효모에서 치료를 조절하는 방법을 제공하고, 상기 방법은
a. 상기 식물 또는 효모에서 상기 치료를 수행하고;
b. 상기 식물 또는 효모에서 세균 미생물총 장 내 불균형을 유발함으로써 상기 장 내 불균형이 상기 대상체에서 치료를 조절함을 포함하고;
여기서, 상기 치료는 성장-촉진 치료, 성장-억제 치료, 살충제 치료, 질소 고정 촉진 치료, 제초제 치료 또는 비료 치료이다.
대상체, 환자, 식물 또는 효모에서 미생물 장 내 불균형을 유발하는 것은 하나의 예에서 대상체, 환자, 식물 또는 효모의 표면 상에서, 예를 들어, 잎 표면 (상기 대상체가 식물인 경우) 상에서 또는 피부, 폐, 눈 또는 점막 표면 (상기 대상체 또는 환자가 인간 또는 동물인 경우) 상에서 미생물 장 내 불균형을 유발함을 포함한다.
세균 장 내 불균형 대신 또는 이에 추가로, 본 발명은 단계 (b)에서 상기 대상체, 환자, 식물 또는 효모에서 고세균 미생물총 장 내 불균형(archaeal microbiota dysbiosis)을 유발함을 포함한다.
예를 들어, 상기 질환 또는 병태는 자가면역 질환 또는 병태 (예를 들어, SLE)이며 치료요법은 이를 위한 치료, 예를 들어, 종양 괴사 인자 리간드 슈퍼패밀리 구성원 길항제(tumor necrosis factor ligand superfamily member antagonist), 예를 들어, 항-B-세포 활성화 인자 (anti-B-cell activating factor, BAFF) 항체, 예를 들어 BENLYSTATM 또는 이의 포괄적 버전의 투여이다. 예를 들어, 상기 질환 또는 병태는 염증 질환 또는 병태 (예를 들어, 류마티스 관절염, IBD, 크론 질환, 대상염 또는 건선)이고 상기 치료요법은 이를 위한 치료이고, 예를 들어, 사릴루맙(sarilumab), 두필루맙(dupilumab), 종양 괴사 인자 리간드 슈퍼패밀리 구성원 길항제, 예를 들어, 항-TNF 알파 항체 또는 트랩, 예를 들어, HUMIRATM, REMICADETM, SYMPONITM 또는 ENBRELTM 또는 이의 포괄적 버전의 투여이다. 예를 들어, 상기 질환 또는 병태는 바이러스 감염, 또는 바이러스 감염 (예를 들어, HIV 감염)에 의해 매개되고 상기 치료요법은 이를 위한 치료이고, 예를 들어, 항-레트로바이러스 의약 또는 항-HIV 백신의 투여이다. 예를 들어, 상기 질환 또는 병태는 암 (예를 들어, 흑색종, NSCLC, 유방암 또는 전립선암)이고 상기 치료요법은 이를 위한 치료이고, 예를 들어, 화학치료학적 제제(chemotherapeutic agent), 예를 들어, 체크포인트 억제제(checkpoint inhibitor) 또는 효능제 항체(agonist antibody), 예를 들어, 항-CTLA4, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG3, OX40, CD28, BTLA, CD137, CD27, HVEM, KIR, TIM-3, VISTA, ICOS, GITR, TIGIT 또는 SIRPa 항체의 투여이다. 하나의 예에서, 항체는 CTLA4, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG3, OX40, CD28, BTLA, CD137, CD27, HVEM, KIR, TIM-3, VISTA, ICOS, GITR, TIGIT 및 SIRPa로부터 선택되는 제1 및 제2 표적에 특이적으로 결합하는 이특이적 항체이고, 예를 들어, 상기 제1 표적은 CTLA4이고 상기 제2 표적은 LAG3 또는 PD-1이다. 선택적으로, 상기 항체는 인간 감마-1 항체이고/이거나 ADCC 또는 CDC에 대해 증진될 수 있다. 예를 들어, 상기 치료요법은 백신 치료요법, 예를 들어, 암 백신 치료요법 또는 감염 또는 감염성 질환, 예를 들어, 말라리아, HIV 감염, 결핵 감염, 콜레라, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 감염, 씨 디피실(C dificile) 감염, 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis) 감염 또는 클라미디아(chlamydia) 감염을 치료하거나 예방하기 위한 백신 치료 요법이다.
제1 구성의 구현예는 환자에서 질환 또는 병태의 세포 치료요법을 조절하는 방법을 제공하고, 상기 방법은
a. 상기 환자에게 세포 집단을 투여함을 포함하는, 상기 환자에서 세포 치료요법을 수행하고, 여기서, 상기 세포의 투여는 상기 환자에서 질환 또는 병태를 치료할 수 있고;
b. 상기 환자에서 장 내 세균 미생물총 장 내 불균형을 유발하여, 상기 장 내 불균형이 상기 환자에서 치료요법을 조절함을 포함한다.
하나의 예에서, 상기 세포 치료요법은 암의 치료를 위한 적응성 면역 세포 치료요법, 예를 들어, CAR-T 또는 TIL 치료요법이다.
제2의 구성에서, 본 발명은 환자에서 질환 또는 병태를 치료하거나 이의 위험을 감소시키는 방법을 제공하고, 여기서, 상기 질환 또는 병태는 환자에서 면역 세포 (예를 들어, T-세포)에 의해 매개되고, 상기 방법은 환자에서 장 내 세균 미생물총 장 내 불균형을 유발함으로써 상기 장 내 불균형은 면역 세포 (예를 들어, TH17 세포)를 조절하여 환자에서 상기 질환 또는 장애를 치료하거나 이의 위험을 감소시킴을 포함한다.
예를 들어, 상기 질환 또는 병태는 자가면역 질환 또는 병태 (예를 들어, SLE), 염증 질환 또는 병태 (예를 들어, 류마티스 관절염, IBD, 크론 질환, 장염 또는 건선), 또는 바이러스 감염 (예를 들어, HIV 감염)에 의해 매개되는 바이러스 감염이다.
하나의 예에서, 미생물총 장 내 불균형은 상기 미생물총에서 하나 이상의 표적 세균 종을 사멸시키거나 상기 미생물총에서 상기 세균 집단의 성장을 억제함에 의해 실행된다. 하나의 예에서, 미생물총 장 내 불균형은 상기 미생물총에서 하나 이상의 표적 고세균 종을 사멸시키거나 상기 미생물총에서 상기 고세균 집단의 성장을 억제함에 의해 실행된다.
제3의 구성에서, 본 발명은 환자에서 질환 또는 병태의 적응성 면역 세포 치료요법을 조절하는 방법을 제공하고, 상기 방법은
a. 상기 환자에게 면역 세포의 집단을 투여함을 포함하는, 상기 환자에서 적응성 면역 세포 치료요법을 수행하고, 여기서, 상기 면역 세포의 투여는 상기 환자에서 질환 또는 병태를 치료할 수 있고;
b. 상기 환자의 미생물총 (예를 들어, 장 내 미생물총)에서 제1 세균 종 또는 균주, 또는 고세균 종 또는 균주의 세포의 서브-집단의 상대적 비율을 변화시킴으로써 상기 환자에서 상기 면역 세포 치료요법을 조절하는 변화된 미생물총을 생성함을 포함한다.
또 다른 양상의 제3 구성에서, 본 발명은 인간 또는 동물 환자에서 질환 또는 병태의 치료요법을 조절하는 방법을 제공하고, 상기 방법은
a. 상기 환자에서 상기 치료요법을 수행하고;
b. 상기 환자의 미생물총 (예를 들어, 장 내 미생물총)에서 제1 세균 종 또는 균주, 또는 고세균 종 또는 균주의 세포의 서브 집단의 상대적 비율을 변화시킴으로써 상기 환자에서 치료요법을 조절하는 변화된 미생물총을 생성함을 포함하고;
여기서, 상기 치료요법은 환자에게 면역 체크포인트 억제제 (예를 들어, 항-PD-L1, 항-PD-1, 항-CTLA4 또는 항-TIM3 억제제, 예를 들어, 항체)를 투여함을 포함한다.
또 다른 양상의 제3 구성에서, 본 발명은 인간 또는 동물 환자에서 질환 또는 병태의 치료요법을 조절하는 방법을 제공하고, 상기 방법은
a. 상기 환자에서 상기 치료요법을 수행하고;
b. 상기 환자의 미생물총 (예를 들어, 장 내 미생물총)에서 제1 세균 종 또는 균주, 또는 고세균 종 또는 균주의 서브-집단의 상대적 비율을 변화시켜 상기 환자에서 상기 치료요법을 조절하는 변화된 미생물총을 생성시킴을 포함하고;
여기서, 상기 치료요법은 항체 (예를 들어, 항-PD-L1, 항-PD-1, 항-CTLA4 또는 항-TIM3 항체; 또는 항-TNFa 슈퍼패밀리 구성원 항체, 예를 들어, 항-TNFa, TNFR1 또는 BAFF 항체; 또는, 항-IL6R 또는 항-IL-4Ra 항체; 또는 항-PCSK9 항체)의 환자로의 투여를 포함한다.
또 다른 양상의 제3 구성에서, 본 발명은 대상체에서 치료를 조절하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은
a. 상기 대상체에서 상기 치료를 수행하고;
b. 상기 대상체의 미생물총에서 제1 세균 종 또는 균주, 또는 고세균 종 또는 균주의 세포의 서브-집단의 상대적 비율을 변화시킴으로써 상기 장 내 불균형이 상기 대상체에서 상기 치료를 조절함을 포함한다.
하나의 예에서, 대상체 또는 환자는 인간이다. 하나의 예에서, 대상체 또는 환자는 비-인간 동물이다. 하나의 예에서, 상기 대상체는 식물이고 임의로 상기 치료는 식물 성장-촉진 치료, 성장-억제 치료, 살충제 치료, 질소 고정 촉진 치료, 제초제 치료 또는 비료 치료이다. 하나의 예에서, 상기 대상체는 효모이고 임의로 상기 치료는 효모 성장-촉진 치료 또는 성장-억제 치료이다.
하나의 예에서, 상기 조절은 상기 대상체 또는 환자의 치료 또는 치료요법을 증강시키거나, 상향조절하거나, 하향조절하거나, 억제하거나 증진시키거나 강화시킨다. 하나의 예에서, 상기 치료 또는 치료요법은 상기 대상체 또는 환자에서 효과적이고, 상기 치료 또는 치료요법은 효과적이지 않거나 대상체, 환자 또는 대조군 대상체 또는 조절에 적용되지 않는 환자에서 감소되거나 증가된 효능을 갖는다. 상기 대조군은 대상체 또는 환자와 동일한 종, 및 임의로 동일한 나이 및/또는 성별로부터 기원한다. 하나의 예에서, 세균 또는 고세균 숙주 세포는 사멸되거나 이의 성장은 본 발명의 방법을 사용하여 대상체 또는 환자에서 억제되고, 여기서, 상기 대조군은 동일한 세균 또는 고세균 종의 세포를 포함하고 상기 세포는 본 발명의 방법에 의해 사멸되거나 성장 억제되지 않는다.
하나의 예에서, 단계 (a) 및 (b)는 동시에 수행된다. 하나의 예에서, 단계 (a)는 단계 (b) 전에 수행된다. 하나의 예에서, 단계 (b)는 단계 (a) 전에 수행되고 임의로 단계 (b)는 단계 (a) 후 다시 수행한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 식물 또는 효모에서 치료를 조절하는 방법을 제공하고, 상기 방법은
a. 상기 식물 또는 효모에서 상기 치료를 수행하고;
b. 상기 식물 또는 효모의 미생물총에서 제1 세균 종 또는 균주, 또는 고세균 종 또는 균주의 세포의 서브-집단의 상대적 비율을 변화시킴으로써 상기 장 내 불균형이 상기 식물 또는 효모에서 상기 치료를 조절함을 포함하고,
여기서, 상기 치료는 성장-촉진 치료, 성장-억제 치료, 살충제 치료, 질소 고정 촉진 치료, 제초제 치료 또는 비료 치료이다.
대상체, 환자, 식물 또는 효모에서 세포의 서브-집단의 상대적 비율의 상기 변화는 하나의 예에서 대상체, 환자, 식물 또는 효모의 표면 상에서, 예를 들어, 잎 표면 (상기 대상체가 식물인 경우) 상에서 또는 피부, 폐, 눈 또는 점막 표면 (상기 대상체 또는 환자가 인간 또는 동물인 경우) 상에서 미생물 장 내 불균형을 유발함을 포함한다.
제1 세균 또는 고세균 서브-집단의 비율을 증가되거나 감소된다. 하나의 예에서, 제1 및 제2 세균 종 또는 균주의 상대적 비율은 변화되거나 (예를 들어, 증가되거나 감소됨); 제1 및 제2 고세균 종 또는 균주의 상대적 비율은 변화된다 (예를 들어, 증가되거나 감소됨).
하나의 예에서, 상기 적응성 면역 세포 치료요법은 암의 치료를 위한 CAR-T 치료요법이다. 하나의 예에서, 상기 적응성 면역 세포 치료요법은 암의 치료를 위한 TIL 치료요법이다.
제1 또는 제3 구성의 하나의 예에서, 단계 (a)의 세포는 CD4+ T-세포, CD8+ T-세포, TH1 새포 또는 TH17 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제1 유형의 것이고 단계 (b)는 환자에서 상기 유형의 세포를 상향조절한다. 이것은 세포 기반 치료요법을 증진시키기 위해 유용하다. 또 다른 예에서, 단계 (a)의 세포는 CD4+ T-세포, CD8+ T-세포, TH1 새포 또는 TH17 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제1 유형의 것이고 단계 (b)는 환자에서 상기 유형의 세포를 하향조절한다. 이것은 세포 기반 치료요법 또는 이의 부작용 (예를 들어, CRS)을 약화시키기 위해 유용하다.
하나의 구현예에서, 장 내 불균형 또는 단계 (b)는 미생물총 (예를 들어, 장 내 미생물총) 세균 및/또는 고세균의 CRISPR/Cas 표적화를 사용하는 세균 또는 고세균 미생물총 서브-집단의 선택적 표적화를 사용하여 수행된다. 하나의 예에서, 상기 방법은 숙주 세포에서 각각의 표적 서열의 가이드된 뉴클레아제 (예를 들어, RNA-가이드된 뉴클레아제) 절단을 사용하여 상기 표적 서열을 변형시킴을 포함하여, 이로써 숙주 세포는 사멸되거나 숙주 세포 집단 성장은 감소되어 미생물총에서 상기 서브-집단의 비율을 감소시킨다. 상기 가이드된 뉴클레아제 절단을 위해 적합한 시스템은 예를 들어, 가공된 CRISPR/Cas 시스템, TALEN, 메가뉴클레아제 및 아연 핑거 시스템이다.
이를 위해, 본원 발명자들은 이들이 처음으로 하기의 특성들 중 하나 이상과 함께 장 내 미생물총에서 함께 자연 발생하는 세균의 혼합 컨소시엄에서 특이적 세균 균주의 집단 성장의 억제를 입증한 것으로 사료된다:-
ㆍ 하기에 의해 가공된 CRISPR/Cas 시스템을 사용한 집단 성장 억제;
ㆍ 야생형 세포 표적화
ㆍ 야생형 내인성 Cas 뉴클레아제 활성의 이용;
ㆍ 필수 및 항생제 내성 유전자의 표적화;
ㆍ 여기서, 상기 표적은 야생형 서열이다.
본원 발명자들은 하기의 특성들과 함께 인간 장 내 미생물총 세균의 혼합 진단에서 이를 입증하였다:-
· 인간 장 내 미생물총 종의 혼합 집단에서 세균 성장 억제를 표적화하고;
· 여기서, 상기 집단은 3개의 상이한 종을 포함함;
· 상기 종들 중 하나의 선택적 사멸을 포함하고 다른 종의 세포를 그대로 유지하고;
· 상기 억제를 받지 않은 계통 발생적으로 밀접한 다른 인간 장 내 미생물총 종의 존재하에 세포 성장 억제를 표적화하고;
· 표적 피르미쿠테스(Firmicutes) 종 및 비-피르미쿠테스 종을 포함하는 인간 장 내 미생물총 세균의 혼합 집단에서 세포 성장 억제를 표적화하고;
· 인간 장 내 미생물총 세균의 혼합 집단에서 상이한 피르미쿠테스 종을 유지하면서 특이적 피르미쿠테스 종의 세포 성장 억제를 표적화하고;
· 인간 장 내 미생물총 세균의 혼합 집단에서 상이한 그람 양성 세균 종을 유지하면서 특이적 그람 양성 세균 균주의 세포 성장 억제를 표적화하고;
· 통상적인 인간 장 내 세균 종을 유지하면서 인간 장 내 미생물총 세균 종을 표적화하고;
· 프리오바이오틱 인간 장 내 세균 종을 유지하면서 인간 장 내 미생물총 세균 종을 표적화하고;
· 표면 상에 인간 장 내 미생물총 세균의 혼합 집단에서 세포 성장 억제를 표적화하고;
· 인간 장 내 미생물총 세균의 컨소시엄에서 단독으로 또는 다수의 다른 세균 종과 혼합된 경우 특이적 세균 종의 적어도 10배 성장 억제를 성취하고;
· 특이적 인간 장 내 미생물총 세균 종의 2개의 상이한 균주의 적어도 10배 성장 억제를 성취한다.
본 발명은 다음을 제공한다:
상기 환자에서 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하기 위한 환자의 적응성 세포 치료요법의 방법에 사용하기 위한 면역 세포의 생체외 집단으로서, 상기 방법은 다음을 포함한다:
a. 상기 환자에게 상기 집단을 투여함을 포함하는, 상기 환자에서 적응성 면역 세포 치료요법을 수행하고, 여기서, 상기 면역 세포의 투여는 상기 환자에서 질환 또는 병태를 치료할 수 있고;
b. 상기 환자에서 장 내 세균 미생물총 장 내 불균형을 유발하여, 상기 장 내 불균형이 상기 환자에서 면역 세포 치료요법을 조절하고 상기 질환 또는 병태가 치료되거나 예방된다.　
본 발명은 상기 환자에서 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하기 위한 환자의 적응성 세포 치료요법의 방법에 사용하기 위한 면역 세포의 생체외 집단을 제공하고, 상기 방법은:
a. 상기 환자에게 상기 집단을 투여함을 포함하는, 상기 환자에서 적응성 면역 세포 치료요법을 수행하고, 여기서, 상기 면역 세포의 투여는 상기 환자에서 질환 또는 병태를 치료할 수 있고;
b. 환자의 장 내 미생물총에서 제1 세균 종 또는 균주, 또는 고세균 종 또는 균주의 세포의 서브-집단의 상대적 비율을 변화시킴으로써, 환자에서 면역 세포 치료요법을 조절하는 변화된 장 내 미생물총을 생성시킴을 포함한다.본 발명은 또한 본 발명의 방법을 수행하기 위한 CRISPR/Cas 시스템, 어레이, cRNA 및 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 시스템, 키트 및 상기 방법을 수행하기 위한 다른 수단에 관한 것이다.
본원에서 하나의 구성 상에 임의의 특성은 하나의 예에서 본원에 하나 이상의 청구항에서 상기 조합의 가능한 내포를 위해 본 발명의 다양한 구성과 조합된다.
도 1은 크실로스 유도가능한 시스템(Xylose inducible system)을 보여준다.
도 2는 ST1-CRISPR 어레이를 보여준다.
도 3은 본 연구에 사용되는 균주의 TH-한천 상에서 스팟 검정(spot assay)을 보여준다. 모든 균주는 20시간 동안 37℃에서 TH-한천 상에서 성장시켰다. 밤새 배양물의 연속 희석은 개별 콜로니를 계수하기 위해 이. 콜라이(E.coli), 엘 락티스(L Lactis) 및 에스. 뮤탄스(S.mutans)에 대해 2회 그리고 에스. 써모필러스(S. thermophilus)의 균주 둘 다에 대해 3회 수행하였다.
도 4는 다양한 배양 조건하에서 에스. 써모필러스(S. thermophilus), 에스. 뮤탄스(S. mutans), 엘. 락티스(L. lactis) 및 이. 콜라이(E. coli)의 선택적 성장을 보여준다. 테트라사이클린(Tetracycline)은 에스. 써모필러스 LMD-9를 선택적으로 성장시키기 위해 사용될 수 없다. 그러나, 3g l-1의 PEA는 이. 콜라이의 성장을 제한하면서, 에스. 써모필러스 LMD-9를 선택적으로 성장시키는 것으로 입증되었다.
도 5는 2개의 크실로스 유도 카세트(xylose induction cassettes)의 구성을 도시한다.
도 6은 플라스미드 pBAV1KT5-XylR-mCherry-Pldha를 갖는 스트렙토코커스 써모필러스(Streptoccocus thermophilus) LMD-9에서 크실로스 유도성 카세트의 특징을 입증하였다. 형광성에서 명백한 반응은 크실로스의 증가하는 양과 함께 관찰될 수 있다.
도 7은 pBAV1KT5-XylR-mCherry-Pldha+XylA에서 CRISPR 어레이의 디자인을 도시한다. 상기 어레이는 유도성 크실로스 프로모터 하에 에스. 써모필러스 유전자들 및 강한 항상성 프로모터 P3A하에 tracrRNA를 표적화하는 2개의 스페이서 서열을 함유한다.
도 8은 플라스미드 pBAV1KT5-XylR-CRISPR-P ldh+XylA 와 pBAV1KT5-XylR-CRISPR-P XylA 를 사용한 스트렙토코커스 써모필러스 LMD-9의 형질전환 효율을 보여준다.
도 9는 크실로스-유도성 CRISPR 장치의 도식을 보여준다. 크실로스의 유도시, 에스. 써모필 LMD-9 게놈 상에 polIII 및 tetA 둘 다를 표적화하는 CRISPR 어레이가 발현된다. 항상성으로 발현된 tracrRNA와 함께, 복합체는 Cas9와 함께 형성된다. 상기 복합체는 에스. 써모필러스 LMD-9 게놈 내 tetA 및 polIII 유전자에서 이중 나선 틈을 도입하여 제한된 세포 생존능을 유도한다.
도 10은 플라스미드 pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PXylA 또는 pBAV1KT5-XylR-CRISPR-Pldha+XylA를 사용한 스트렙토코커스 써모필러스 DSM 20167(T)의 성장 억제가 유도되지 않고 유도되는지를 보여준다. 63H 항온처리 후 촬영한 사진. 하부 좌측 코너 (상부 열: >1000, >1000, 하부 열: 336, 113)에서 콜로니 계수.
도 11은 에스. 써모필러스, 엘. 락티스 및 이.콜라이로부터의 16S 서열의 최대 가능성 계통 발생 트리(tree)를 보여준다.
도 12는 pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA 또는 pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA+XylA 플라스미드를 함유하는 이-콜라이, 엘. 락티스 및 에스. 써모필의 공동-배양물 중에서 선택적 에스 써모필러스 성장 억제를 보여준다. 어떠한 성장 차이도 pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA 또는 pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA+XylA 플라스미드를 함유하는 이. 콜라이 간에 관찰되지 않았다. 그러나, 에스. 써모필 (2.5 gl-1 PEA가 보충된 TH 한천 상에서 선택적으로 성장한)은 본원 발명자가 예상된 바와 같이 pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA (강한) 또는 pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA +XylA (약한) 플라스미드 사이의 형질전환 효율의 감소를 보여준다. 따라서 본원 발명자는 세포의 혼합 집단에서 표적 에스. 써모필러스 서브-집단의 선택적 성장 억제를 입증하였다. 하부 좌측 코너 (상부 열: >1000, >1000, 68, 하부 열: >1000, >1000, 32)에서 콜로니 계수.
도 13은 spCas9의 발현을 조절하는 조절제 및 리보솜 RNA 서브유니트 16s를 표적화하는 자가 표적화 sgRNA를 보여준다.
도 14는 외인성 CRISPR-Cas 시스템(exogenous CRISPR-Cas system)에 의한 이. 콜라이 균주의 특이적 표적화를 보여준다. 상기 sgRNA는 이. 콜라이 TOP 10과 같이 K-12 유래된 이. 콜라이 균주의 게놈을 표적화하고 다른 시험된 균주는 영향받지 않는다.
도 15는 본 연구에 사용된 개별 세균 종의 연속 희석을 사용한 스팟 검정 및 CRISPR-Cas9 시스템의 유도 없이 TH 한천에서의 혼합 배양을 보여준다.
도 16은 다양한 선택적 배지 상에서 희석 103의 스팟 검정을 보여준다. 2.5 g l-1 PEA를 사용한 TH는 단독의 비. 서브틸리스(B.subtilis)에 대한 선택 배지이다. 말토스(maltose)가 보충된 맥콘키(MacConkey)는 그람-음성 및 장 바실리(enteric bacilli)를 선택적으로 단리하고 말토스 발효를 기준으로 이들을 구분하기 위해 디자인된 세균에 대한 선택적 및 차등적 배양 배지이다. 따라서 TOP10 △malK 돌연변이체는 플레이트 상에서 백색 콜로니를 생성하고 니슬(Nissle)은 분홍색 콜로니를 생성한다; A는 이 콜라이 △malK이고, B는 이 콜라이 니슬이고, C는 B 서브틸리스(subtilis)이고, D는 엘 락티스(L lactis)이고 E는 혼합 배양물이고; 맥콘키-/B 및 E에서의 이미지는 분홍색을 나타내고; 맥콘키+/B 및 E에서 이미지는 분홍색을 나타낸다.
도 17은 차등 배지 및 선택적 플레이트에 대해서 본 연구에 사용된 세균의 선택적 성장을 보여준다.
하기 수행된 실시예에서, 성장 억제는 인간 장 내 미생물총 세균 종의 혼합 집단에서 나타났다. 선택적으로 표적화된 종 (그람 양성의 피르미쿠테스 (Firmicutes) 집단)에서 >10-배 집단 성장 억제가 성취되었고 컨소시엄에서 비-표적화된 공색 세균은 온전하게 유지되었다. 본원 발명자들은 환자에서 동일계내 장 내 미생물총과 같은 미생물총을 변화시킴으로써 상기 변화된 미생물총에 응답하여 환자 내 면역 세포 조절을 가능하게 하기 위해 유용한 이의 적용을 실현하였다. 본원 발명자들은 또한 변화될 수 있는 미생물총을 포함하는 식물 및 효모와 같은 대상체에서 치료를 조절하는데 대한 적용을 실현하였다. 본 발명자들은 추가로 환자에서 면역 세포-기반 치료요법을 조절하기 위한 또는 환자에서 면역 세포-매개된 질환 또는 병태, 예를 들어, 자가면역 질환, 염증 질환 및 바이러스 감염 (예를 들어, 인간 HIV 감염)을 치료하거나 예방하기 위한 활용을 실현하였다. 본원 발명자들은 인간 또는 동물 대상체 또는 환자에서 상기 조절에 영향을 주기 위한 장 내, 피부, 질, 비강, 눈, 폐, GI 관, 직장, 음낭, 귀, 피부 또는 모발 미생물총의 장 내 불균형을 유발하는 활용을 실현하였다.
본원에 사용된 바와 같은 "장 내 불균형"은 미생물총, 예를 들어, 장 내 미생물총의 세균 및/또는 고세균 균형의 변화를 언급한다. 변화는 상기 방법을 수행하기 전 (예를 들어, 수행하기 직전 또는 하루 전)의 균형에 상대적이다. 상기 변화는 (i) 미생물총 (예를 들어, 장 내 미생물총)에서 제1 종 (세균 또는 고세균 종) 또는 균주 (예를 들어, 비 프라갈리스(B fragalis) 또는 테타이오타미크론(thetaiotamicron))의 비율에서의 증가; (ii) 제1 및 제2 종 (예를 들어, 비 프라갈리스(B fragalis) 대 씨 디피실(C dificile); 또는 에스 써모필러스 대 이 콜라이 또는 엘 락티스), 동일한 종의 제1 및 제2 균주, 또는 서로 간에 상이한 제1 및 제2 문(phyla) (예를 들어, 박테리오데테스(Bacteriodetes) 대 피르미쿠테스(Firmicutes))의 상대적 비율에서의 증가; (iii) 치료 방법 전에 미생물총에 의해 포함되지 않은 종 또는 균주의 첨가; (iv) 미생물총에서 제1 종 (세균 또는 고세균 종) 또는 균주 (예를 들어, 씨 디시필 또는 에스 써모필러스))의 비율에서 감소; (v) 제1 및 제2 종 (예를 들어, 비 프라갈리스 대 씨 디피실; 또는 에스 써모필러스 대 이 콜라이 또는 엘 락티스, 동일한 종의 제1 및 제2 균주, 또는 서로간에 상이한 제1 및 제2 문(phyla) (예를 들어, 박테리오데테스 대 피르미쿠테스)에서의 상대적 비율에서의 감소; 및 (vi) 치료 방법 전 미생물총에 의해 포함되지 않은 종 또는 균주의 제거 중 하나 이상일 수 있다. 장 내 불균형은 예를 들어, 미생물총, 예를 들어, 장 내 미생물총의 균형을 변화시키기 위해 환자 또는 대상체에 하나 이상의 세균 및/또는 고세균 이식물을 투여함에 의해 하나 이상의 선택적 항세균제 (예를 들어, 본원에 기재된 CRISPR-기반 또는 다른 가이드된 뉴클레아제)를 사용하여 실행될 수 있다.
미생물총 조성물에 대한 면역계의 영향은 질환에 걸리기 쉬운 방식으로 미생물 군집을 변화시키는 여러 면역 결핍에 의해 제안된다. 예를 들어, 가레트 등 (Garrett et al.)은 선천성 및 후천성 면역계 둘 다의 세포에서 염증 반응을 지배하는 전사 인자 T-bet (Tbx21에 의해 암호화된)가 부재인 쥐를 연구하였다 (참조: Cell. 2007 Oct 5;131(1):33-45, "Communicable ulcerative colitis induced by T-bet deficiency in the innate immune system", Garrett WS et al.). Tbx21-/-　쥐가 후천성 면역력이 부재인 Rag2-/- 쥐에 교배되는 경우, Tbx21-/-/Rag2-/-　후손은 미생물총-의존성 방식으로 궤양성 대장염을 발병했다. 현저하게, 상기 대장염 표현형은 Tbx21-/-/Rag2-/-미생물총의 적응성 전달에 의해 야생형 쥐에 전달될 수 있었다. 이것은 변화된 미생물총이 질환을 유도하기에 충분하였음을 입증하였다. 면역-구동된 장 내 불균형의 또 다른 예는 인플라마솜 성분 NLRP6의 상피 세포 발현이 결핍된 쥐에서 나타난다. 이들 쥐는 증가된 장 염증 세포 집결 및 화학적으로-유도된 대장염에 대한 민감성과 관련된 박테로이데테스 문의 구성원에 대한 증가된 풍부함과 함께 변화된 미생물총을 나타냈다.
개별적 공생의 종이 특유의 이펙터 기능을 갖는 라미나 프로프리아(lamina propria) T 림프구 서브세트의 구성에 영향을 준다는 것이 명백해졌다. 장 내 점막에서 항상성은 인터페론-γ를 생성하는 TH1세포, IL-17a, IL-17f, 및 IL-22를 생성하는 TH17 세포, TH2 및 TH17세포와 유사한 사이토킨 이펙터 특성을 갖는 다양한 선천성 림프구 세포, 및 항-염증 Foxp3+　조절 T 세포 (Tregs)를 포함하는, 잠재적으로 염증 촉진 세포 간의 체크 및 균형 시스템에 의해 유지된다.　
본 발명의 특정 응용은 환자에서 TH17 세포 집단의 형성에서 발견된다. 상기 세포는 자가면역 및 염증 장애에서 연관되어 있다. 이들 세포는 하기 문헌에 기재되어 있다: Harrington LE, Hatton RD, Mangan PR, et al., "Interleukin 17-producing CD41 effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages", Nat Immunol. 2005;6(11): 1123-1132; and Park H, Li Z, Yang XO, et al., "A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17", Nat Immunol. 2005; 6(11):1133-1141. 자가면역 장애의 경우에, TH17 세포 과활성화는 다발성 경화증, 류마티스 관절염 및 건선의 경우에서와 같이 부적당한 양의 염증을 유발할 수 있다. TH17 세포는 또한 점막 면역력을 유지하기 위해 필요한 것으로 나타났다. TH17세포는 Treg 세포에 비해 유전자 발현에서의 증가로 인해 후기 단계 천식 반응의 발병에 기여할 수 있다.
HIV에서, TH17 세포 집단의 상실은 만성 감염에 기여할 수 있다. 장 내에서 TH17 세포 집단의 고갈은 장 장벽을 붕괴시키고 미생물 위치 변경을 통한 장외로 세균의 이동 수준을 증가시키고, 만성 HIV 감염 및 AIDS로의 진행에 기여한다. 미생물 위치 변경은 세균이 장 루멘(gut lumen)으로부터 라미나 프로피아(lamina propia)로, 림프절(lymph nodes)로 및 이를 넘어서 비-림프구 조직으로 이동하게 한다. 이것은 HIV의 후기 단계에서 신체를 통해 나타나는 일정한 면역 활성화를 유발할 수 있다. 장에서 TH17 세포 집단의 증가는 효과적인 치료 및 가능하게 예방적 치료 둘 다인 것으로 나타났다. 장 내 모든 CD4+ T 세포가 HIV에 심하게 고갈되지만, 장 TH17 세포의 상실은 특히 만성, 병원성 HIV 및 SIV 감염의 증상과 연계되었다. 미생물 위치 변경은 HIV와 관련하여 만성 염증 및 면역 활성화에 기여하는 주요 인자이다. SIV의 비-병원성 경우에, 미생물 위치 변경은 관찰되지 않는다. TH17 세포는 장에서 HIV 감염 동안에 장 상피 장벽을 유지시킴에 의해 중증 HIV 감염을 예방한다. HIV에 대한 공동수용체인 CCR5의 고수준의 발현 때문에, 이들은 우선적으로 감염되고 고갈된다. 따라서, 이것은 미생물 위치 변경이 일어나는 TH17 세포 고갈을 통해서이다. 추가로, 장 내 TH17 세포의 상실은 염증 TH17 세포와 이들의 항-염증 대응물인 Treg 세포 간의 균형 상실을 유도한다. 이들의 면역억제 성질 때문에, 이들은 발병에 기여하는 HIV에 대한 항-바이러스 반응을 감소시키는 것으로 사료된다. TH17 활성과 비교하여 Treg 활성이 보다 높고, 바이러스에 대한 면역 반응은 덜 공격적이고 효과적이다. TH17 세포의 재활성화는 감소된 염증을 포함하는 만성 감염의 증상을 감소시키는 것으로 나타났고 고도의 활성 항-레트로바이러스 치료 (highly active anti-retroviral treatment, HAART)에 대해 개선된 반응을 초래한다. 이것은 미생물 위치 변경이 일반적으로 HAART에 비반응성을 초래한다는 중요한 발견이다. 환자들은 계속 증상을 나타내고 예상된 바와 같이 감소된 바이러스 부하량을 나타내지 않는다. SIV-레서스 원숭이 모델에서, TH17 분화 및 증식을 고무시키는 것으로 나타난 사이토킨인 IL-21의 투여가 TH17 세포 집단을 증가시킴에 의해 미생물 위치 변경을 감소시키는 것으로 나타났다.
상기 방법의 하나의 예에서, IL-21, IL-15 및/또는 IL-2는 상기 세포 집단과 함께 연속적으로 또는 동시에 환자에게 투여된다. 이것은 환자에서 면역 세포 집단을 추가로 조절하는데 유용하다.
양 등(Yang et al.)은 쥐에서 TH17 세포의 존재가 미생물총과 함께 쥐의 군체형성을 요구함을 관찰하였다. 분절된 필라멘트성 세균(Segmented filamentous bacteria, SFB)은 동물 모델에서 TH17 세포를 유도하고 TH17-의존성 자가면역 질환을 촉진시키기 위해 충분하였다 (참조: Nature, 2014 Jun 5;510(7503):152-6. doi: 10.1038/nature13279. Epub 2014 Apr 13, "Focused specificity of intestinal Th17 cells towards commensal bacterial antigens", Yang Y et al.). SFB는 말단 회장에서 장 상피 세포 상에 적층하는 점막층을 침투할 수 있는 것으로 나타나고 이들은 상피 세포와 밀접하게 상호작용하여, 추측컨대 TH17 편중 환경인 신호전달 이벤트인 상호작용 부위에서 숙주 세포 액틴 중합화(host cell actin polymerization)를 유도한다.
하나의 예에서, 제1 세균은 분절된 필라멘트성 세균의 16s rDNA 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 16s rDNA 서열을 포함하는 종 또는 균주 기원이다. 하나의 구현예에서, 상기 방법은 제1 세균의 비율을 증가시키고, 여기서, 환자 내 TH17 세포는 상향조절되고, 예를 들어, 여기서, 상기 질환은 암 또는 바이러스 감염 (예를 들어, HIV)이다. 하나의 구현예에서, 상기 방법은 제1 세균의 비율을 감소시키고, 여기서, 환자 내 TH17 세포는 하향조절되고, 예를 들어, 여기서, 상기 질환 또는 병태는 자가면역 또는 염증 질환 또는 병태이거나 ACT를 받은 암 환자에서 CRS의 위험을 감소시키기 위한 것이다.
하나의 예에서, 상기 방법은 알레르기 질환 또는 병태, 예를 들어, 천식을 치료하거나 예방한다. 하나의 예에서, 상기 방법은 IgE-매개된 질환 또는 병태, 예를 들어, 천식을 치료하거나 예방한다.
하나의 예에서, 상기 방법은 TH2 세포 사이토킨 방출에 의해 매개되는 환자에서 자가독성을 감소시킨다.
로페즈 등(Lopez et al.)은 감소된 피르미쿠테스/박테리오데테스 비율을 특징으로 하는 장 내 불균형이 전신 홍반성 낭창 (SLE) 환자에서 보고되었음을 관찰하였다. 이들의 연구에서, 시험관내 배양물은 SLE 환자 대변 샘플 (SLE-M)로부터 단리된 미생물총이 건강한 대조군 미생물총 보다 큰 정도로 순수 CD4+ 림프구로부터 림프구 활성화 및 TH17 분화를 촉진시킴을 밝혔다. Treg-유도 세균과 함께 SLE-M의 집적 (enrichment)은 2개의 클로스트리디아 균주의 혼합물이 TH17/TH1 균형을 상당히 감소시키는 반면, 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum) 보충은 CD4+ 림프구 과활성화를 차단시킴을 보여주었다. 환자 샘플의 생체외 분석은 비대해진 TH17 및 Foxp3* IL-17+ 집단을 보여주었고, 이는 가능한 Treg-TH17 트랜스-분화를 시사한다. 더욱이, 대변 미생물총의 분석은 건강한 대조군에서 IL-17+ 집단과 피르미쿠테스 간의 음성 상호관계를 밝힌 반면, SLE에서 이러한 문(phylum)은 환자에서 약하게 감소된 IFNγ, TH1 사이토킨의 혈청 수준과 직접적으로 상호관련이 있었다. (참조: Sci Rep. 2016 Apr 5;6:24072. doi: 10.1038/srep24072, "Th17 responses and natural IgM antibodies are related to gut microbiota composition in systemic lupus erythematosus patients", Lopez P et al.).
다른 세균은 Tregs의 분화를 지시하거나 IL-10 발현을 유도함에 의해 적응성 면역 시스템의 항-염증 분기를 증진시키는 것으로 나타났다. 예를 들어, 본래에 쥐 대변으로부터 단리되고 주로 클로스트리디움 속의 클러스터 IV 및 XIVa에 속하는 46마리 쥐 클로스트리디아 균주의 복잡한 칵테일과 함께 무균 (gnotobiotic) 쥐의 군체형성은 라미나 프로프리아 및 전신 Tregs의 확장을 유도한다.
박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis) 폴리사카라이드-A (PSA)는 전신 T 세포 반응의 발생에 영향을 준다. PSA-생성 비. 프라길리스에 의한 무균 (germ-free) 쥐의 군체형성은 PSA가 부재인 비. 프라길리스로 군체형성된 쥐와 비교하여 보다 큰 수의 순환 CD4+　T 세포를 유도한다. PSA-생성 비. 프라길리스는 또한 순환계에서 보다 높은 TH1 세포 빈도를 유발한다. 함께, 이들 발견은 공생 세균이 점막 조직을 훨씬 너머에 이르는 면역력에 일반적 영향을 가짐을 보여준다.
IBD 환자에서 발견되는 에프. 프라우스니치(F. prausnitzii)에서의 감소는 상기 세균이 부티레이트-생성이고 이의 경구 투여는 쥐에서 TNBS-유도된 대장염의 중증도를 감소시키기 때문에 관심 대상이다. 하나의 예에서, 제1 종은 부티레이트-생성 세균 종(예를 들어, 에프. 프라우스니치)이고 미생물총에서 제1 종의 비율이 감소되고, 여기서, 상기 방법은 환자에서 T-이펙터 및/또는 T-헬퍼 세포를 하향조절함으로써 상기 질환 또는 병태 (예를 들어, 자가면역 또는 염증 질환 또는 병태 또는 CRS)를 치료하거나 예방한다.
고세균은 통상적으로 5개의 문(phyla), 즉, 크레나카에오타(Crenarchaeota), 유리아카에오타(Euryarchaeota), 코라카에오타(Korarchaeota),　나노아카에오타(Nanoarchaeota) 및 타우마카에오타(Thaumarchaeota)로 나누어진다. 증가하는 다량의 전체 게놈 데이터 기준으로 (주로 환경 단리물로부터), 고세균 계통 발생은 최근에 재논의 되었고: 4개의 그룹 코라카에오타(Korarchaeota),　크레나카에오타(Crenarchaeota),　타우마카에오타(Thaumarchaeota) 및 새롭게 제안된 아이가카에오타(Aigarchaeota)는 하나의 상문(소위 TACK-상문)으로 포함되고 유리아카에오타(Euryarchaeota) 및 나노아카에오타(Nanoarchaeota)는 배제되었다. 본 발명의 방법에서 제1 종은 이 문단에서 언급된 임의의 고세균일 수 있다.
T 세포는 흉선에서 성숙화하고, TCR (T 세포 수용체)를 발현하고, 이들의 표면 상에 CD8 당단백질을 발현할 수 있고 소위 CD8+ T 세포 (세포독성) 또는 CD4 당단백질로 불리우고 이어서 CD4 세포 (헬퍼 T 세포)로 불리운다. CD4+ 세포는 상이한 서브세트로 분화한다: TH (T 헬퍼)1, TH2, TH9, TH17, TH22, Treg (조절 T 세포) 및 Tfh (소낭 헬퍼 T 세포)이고, 이들은 상이한 사이토킨 프로필을 특징으로 한다. 이들 상이한 CD4+ 서브세트는 T 세포의 면역 및 이펙터 반응 기능에서 중요한 역할을 수행한다. 모든 CD4+ TH 서브세트는 특정 사이토킨에 의해 순수 CD4+ T 세포로부터 분화된다: IL-12 및 IFN-γ (염증 촉진 사이토킨, TLR (톨형 수용체)의 증가, 사이토킨 분비 또는 대식세포 활성화의 유도와 같은 다중 역할을 갖는)에 의한 TH 1; IL-4에 의한 TH2; IL-2 및 TGF-베타에 의한 Treg. 각각의 TH 서브세트는 염증 촉진 또는 항-염증 기능, 생존 또는 보호 기능을 가질 수 있는 특이적 사이토킨을 방출한다. 예를 들어, TH1은 IFN-γ 및 TNF를 방출하고; TH2는 IL-4 (B-형 림프구를 위해 중요한 생존 인자), IL-5 및 IL-13을 방출하고; TH9는 IL-9를 생성하고; Treg는 IL-10 (다른 세포에 대한 Treg의 억제 기능을 위해 요구되는 FOXP3 전사 인자의 발현을 유지하면서 면역억제 기능을 갖는 사이토킨) 및 TGF-β를 분비하고; TH17은 IL-17 (세균 및 진균류에 대한 숙주 방어에서 중요한 역할을 수행하는 사이토킨)을 생성한다.
발명의 한 구현예는 CAR-T 및 다른 후천성 면역-세포 치료요법 (예를 들어, 적응성 TIL 치료요법)을 조절하기 위한 적용을 밝힌다. 여러 보고는 CD4+ 서브세트에 의해 방출되는 상이한 유형의 사이토킨의 차등적 역할을 입증하였고, CAR-T 및 다른 면역 세포-기반 치료요법을 평가하는 경우 중요한 고려 사항이다. TH1 및 TH 2 CD4+ T 세포 서브세트 사이토킨은 2세대 CD28-함유 CAR-T에 의해 생성된 상이한 유형의 세포독성을 구동시키는 것으로 나타났다. 단기 독성은 고수준의 TH1 사이토킨과 함께 관찰되었고, 반면 고용량의 TH 2형 사이토킨은 2세대 CD19-특이적 CAR-T를 투여받은 동물에서 만성 자가독성을 생성하였다. CAR-T 세포는 유도성 IL-12 조절된 종양 간질을 전달하여 암을 파괴하도록 가공하였다. 가공된 CAR-T 세포에 의한 IL-12 방출은 대식세포를 결집시킴에 의해 항-암 활성을 증가시켰다. CAR-T에 의해 방출된 IL-12는 또한 억제 세포의 재프로그래밍을 유도하여 이들의 억제 기능을 역전시켜 임상 시험에서 이의 평가를 시사한다.　 CAR-T 치료요법의 지속성은 주입된 제품에서 CD4+ 세포의 수 및 중추 기억 세포의 수에 의존하는 것으로 나타났다.　 CD8+ 이펙터 세포로부터가 아닌 중추 기억 T 세포로부터 단리된 CD8+ 클론은 비인간 영장류 모델에서 적응성 T 세포 전달 동안에 생체내 장기간 지속하였고 이는 효과적인 적응성 면역치료요법을 위한 특이적 T 세포 서브세트 기능의 중요성을 지적한다. 또한, CD8+ 서브세트와 CD4+ 서브세트의 조합이 T 세포 적응성 전달을 상당히 증진시켰다. CD4+ 세포는 CD8+ 기억 기능의 발생을 지지하는 것으로 나타났고, 이는 면역치료요법 시험에서 서브세트와 조합 둘 다의 중요성을 입증한다. 여러 임상전 모델은 효과적인 CAR-T 치료요법을 위해 상이한 T 세포 서브세트의 이점을 입증하였다: T-기억 줄기 세포 표현형 세포와 가장 가까운 CD8+ CD45RA+ CCR7+ CAR-T 세포는 CAR-T 세포의 보다 큰 항-종양 활성을 나타내었고; CD8+ 및 CD4+ 서브세트 둘 다는 상승작용 항-종양 CAR-T 활성을 나타내었다.
하나의 예에서, 투여된 세포 집단은 CD8+ CAR-T 서브세트와 CD4+ CAR-T 서브세트의 조합을 포함하는 CAR-T 세포의 집단이다.
발명의 하나의 예에서, 세포 치료요법은 적응성 T-세포 치료요법이고 임의로 CD4+ T-세포, CD8+ T-세포, TH1 세포 및 TH17 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포는 환자에게 투여된다. 하나의 예에서, 세포 치료요법은 본 발명의 방법에 의해 증진되고, 예를 들어, 암 세포의 면역 세포 세포독성은 환자에서 증진되거나 질환 또는 병태의 치료는 증진된다. 하나의 예에서, 세포 치료요법은 본 발명의 방법에 의해 감소되고, 예를 들어, 암 세포의 면역 세포 세포독성은 환자(예를 들어, 암 환자에서)에서 감소되거나 CRS의 위험은 감소된다. 따라서, 하나의 구현예에서 상기 방법은 환자에서 사이토킨 방출 증후군 (cytokine release syndrome, CRS)의 위험을 감소시키거나 상기 증후군 (CRS)을 예방한다. 하나의 구현예에서, 상기 방법은 세포 치료요법의 원치 않는 부작용 (예를 들어, CRS와 같은 인간 환자에서 CAR-T 치료요법 부작용)의 위험을 감소시키거나 상기 증후군을 예방한다.
하나의 예에서, 면역 세포 집단은 가공된 T-세포 수용체 (TCR) 및/또는 종양 침윤 림프구 (TIL, 예를 들어, 가공된 TIL)를 발현하는 CAR-T 세포 및/또는 T-세포를 포함한다. WO2013063361, US9113616, US20130109053, US20160081314 및 WO2016044745 (이의 기재내용은 본원에 참조로 인용된다)는 본 발명에 사용하기 위한 세포를 생성하는데 사용하기 위한 CAR 및 TCR을 생성하기 위해 적합한 유전자전이 생체내 플랫폼을 기재한다. 면역 세포 집단은 가공된 자가조직 또는 동종이계 면역 세포 (이식체), 예를 들어, T-세포, NK 세포 및/또는 TIL을 포함할 수 있고, 예를 들어, 상기 세포 및 환자는 인간이다. 자가조직 세포의 이득은 내인성 시스템의 조절이 세포 이식된 자가조직 세포의 조절과 유사하게 조정될 가능성이 있다는 것이다. 하나의 구현예에서, 상기 투여된 세포 및 환자는 동일한 종 또는 균주, 예를 들어, 인간 또는 설치류 (예를 들어, 쥐), 예를 들어, HLA 또는 MHC 매칭되는 공여자 이식체 및 수용자 환자이다.
하나의 예에서, 상기 T-세포는 CD4+ T-세포 또는 TH17 세포이다. 예를 들어, 투여된 CAR-T 세포는 ICOS 세포내 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 포함하고 임의로 세포는 TH17 세포이다. 하나의 구현예에서, 상기 투여된 T-세포는 CD8+ CD45RA+ CCR7+ CAR-T 세포이다.
쥐에서 적응성 전달 실험은 TH17 세포가 TH1 편향된 세포 보다 높은 생체내 생존 및 자기-재생 능력을 가짐을 지적한다. 하나의 예에서, 따라서, TH17 세포는 환자에서 조절되고, 예를 들어, 환자에서 상향조절되고, 예를 들어, 확장되거나 하향조절된다. 이들은 환자의 내인성 T-세포 및/또는 환자 또는 이의 후손에게 투여된 세포일 수 있다. 하나의 구현예에서, RORγt-발현 TH17 세포는 환자에서 상향조절되고, 예를 들어, 확장된다. 하나의 구현예에서, 하나 이상의 TH17-관련 유전자들, 예를 들어, Rorc , Il22 및 Il26 중 하나 이상의 발현은 증가된다. 하나의 구현예에서, 하나 이상의 TH1-관련 유전자들, 예를 들어, Ifng, Tnfa 및 Tbx21 (T-bet) 중 하나 이상의 발현은 증가된다. 하나의 구현예에서, 이 경우에, 상기 질환 또는 병태는 암이다.
하나의 예에서, Treg 세포는 환자에서 조절되고, 예를 들어, 환자에서 상향조절되고, 예를 들어, 확장되거나 하향조절된다. 이들은 환자의 내인성 T-세포 및/또는 환자 또는 이의 후손에게 투여된 세포일 수 있다. 하나의 구현예에서, 이 경우에, 상기 질환 또는 병태는 Treg 세포가 상향조절되는 경우 자가면역, 염증 또는 감염 질환 또는 병태이다.
하나의 예에서, CD4+ 세포는 환자에서 조절되고, 예를 들어, 환자에서 상향조절되고, 예를 들어, 확장되거나 하향조절된다. 이들은 환자의 내인성 세포 및/또는 환자 또는 이의 후손에게 투여된 세포일 수 있다.
하나의 예에서, CD8+ 세포는 환자에서 조절되고, 예를 들어, 환자에서 상향조절되고, 예를 들어, 확장되거나 하향조절된다. 이들은 환자의 내인성 세포 및/또는 환자 또는 이의 후손에게 투여된 세포일 수 있다.
하나의 예에서, 종양 침윤 림프구 (tumour infiltrating lymphocytes, TIL)는 환자에서 조절되고, 예를 들어, 환자에서 상향조절되고, 예를 들어, 확장되거나 하향조절된다. 이들은 환자의 내인성 세포 및/또는 환자 또는 이의 후손에게 투여된 세포일 수 있다.
하나의 예에서, 하나 이상의 중추 기억 T 세포 (TCM), 이펙터 기억 T 세포 (TEM), 줄기 세포 기억 세포 (TSCM) 및 이펙터 세포 (Teff)와 같은 기억 세포는 미생물총 또는 환자에서 상향조절되고, 임의로 여기서, 상기 세포는 환자에게 투여되는 면역 세포 집단 및/또는 후손에 포함된다. 하나의 구현예에서, 상기 기억 세포는 CD45RO+CD62L+ 또는 CD25+ CD45RA- CD45RO+ CD127+이다.
세포 집단의 상향조절은 예를 들어, 미생물총 또는 환자 또는 대상체에서 상기 유형 (예를 들어, 종 또는 균주)의 세포의 집단 크기 또는 비율에서의 증가 및/또는 미생물총 또는 환자 또는 대상체에서 상기 유형의 세포의 활성 (예를 들어, 세포독성, 이펙터 기능 또는 서프레서 기능)에서의 증가일 수 있다. 세포 집단의 하향조절은 예를 들어, 미생물총 또는 환자 또는 대상체에서 상기 유형 (예를 들어, 종 또는 균주)의 세포의 집단 크기 또는 비율에서의 감소 및/또는 미생물총 또는 환자 또는 대상체에서 상기 유형의 세포의 활성 (예를 들어, 세포독성, 이펙터 기능 또는 서프레서 기능)에서의 감소일 수 있다.
하나의 예에서, 세포 치료요법 집단은 CAR-T 세포 (즉, 키메라 항원 수용체 (CAR)를 표면 발현하도록 각각 가공된 T-세포)를 포함한다. 대안적으로, 상기 세포는 CAR-TIL 또는 CAR-NK 세포이다. CAR은 표적 항원 (예를 들어, 종양 세포 항원)에 결합하기 위한 세포외 수용체 도메인, 막관통 모이어티 및 면역 세포(예를 들어, T-세포)에서 신호전달하기 위한 하나 이상의 (예를 들어, 제1 및 제2) 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 모이어티를 포함한다. 적합한 세포내 도메인의 예는 널리 공지되어 있고, 예를 들어, CD3ζ 모메인 및 하나 이상의 ICOS, CD28, OX40 또는 4-1BB 신호전달 도메인의 조합, 예를 들어, ICOS 및 CD28의 조합; 또는 ICOS 및 41-BB; CD28 및 41-BB 신호전달 도메인이 있다.
임의로, 상기 세포 집단은 질환 (예를 들어, 암, 자가면역 질환, 이식 거부 또는 GvHD)을 치료하거나 예방하기 위해 환자에게 투여되는 이식체에 포함되거나 상기 세포 또는 이식체는 상기 용도를 위한 것이다.
하나의 예에서, 상기 환자는 인간, 예를 들어, 여성 또는 남성이다.
하나의 예에서, 환자 또는 인간은 면역 세포 (예를 들어, CAR-T 세포)의 투여 전에 림프구 고갈을 진행하였다.
CAR 및 CAR-T 세포를 생산하기 위한 기술은 공지되어 있고 당업계에서 통상적인 것이고 이들은 일반적으로 본 발명에 사용하기 위한 생산 세포에 적용될 수 있다 (예를 들어, 참조: WO2012079000A1; US8906682, US8911993, US8916381, US8975071, US9101584, US9102760, US9102761, US9328156, US9464140, US9481728, US9499629, US9518123, US9540445, US20130287748, US20130288368, US20130309258, US20140106449, US20140370017, US20150050729, US20150093822, US20150099299, US20150118202, US20160130355, US20160159907, US20160194404, US20160208012; J Immunother. 2009 Sep; 32(7): 689-702, doi; 10.1097/CJI.0b013e3181ac6138, "Construction and Pre-clinical Evaluation of an Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor", James N. Kochenderfer et al; 또한 본 발명에 적용될 수 있는 일반적인 방법에 대해 WO2014012001 및 US20150290244). 예를 들어, 당업자에게 공지된 바와 같이 전기천공, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터의 사용은 CAR의 요소들을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 T-세포, NK 세포, TIL 또는 다른 면역 세포에 도입하여 CAR-세포를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 환자 (자가조직 세포 샘플) 또는 동일한 종의 또 다른 공여자 (동종이계 샘플)로부터 단리된 세포를 사용하여 CAR-암호화 서열을 포함하도록 유전학적으로 가공된 선조 세포를 제공할 수 있다. 세포의 확장은 당업계에 공지된 바와 같이 상기 공정에 사용될 수 있다. 예를 들어, CAR-세포를 가공한 후, 세포 집단은 환자에게 투여되는 (예를 들어, 주입되는) 이식체를 생산하기 위한 통상의 기술을 사용하여 대량으로 확장될 수 있다. 상기 환자는 인간 또는 비-인간 동물일 수 있다. 하나 이상의 CAR 요소들에 대한 (예를 들어, 하나 이상의 이들의 신호전달 도메인에 대한) 뉴클레오타이드 서열은 환자로부터 또는 또 다른 공여자로부터 수득된 세포를 사용하여 클로닝될 수 있거나 서열 분석될 수 있다.
예를 들어, CAR은 인간 CD3ζ 도메인인 제1 세포내 신호전달 도메인을 포함하고 환자에게 투여되는 세포는 상기 인간 CD3ζ 도메인을 암호화하는 내인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인간 세포이다. 하나의 예에서, CD3 제타 신호전달 도메인은 WO2012079000A1에 기재된 바와 같은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 서열은 본 발명에 사용하기 위해 명백하게 도입되고 본원의 하나 이상의 청구항에 가능하게 포함된다. 하나의 예에서, CD3 제타 신호전달 도메인은 WO2012079000A1에 기재된 바와 같은 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화되어 있고, 상기 서열은 본 발명에 사용하기 위해 명백하게 도입되고 본원의 하나 이상의 청구항에 가능하게 포함된다.
예를 들어, 제1 신호전달 도메인은 인간 CD28 도메인이고 본 발명의 세포 집단은 상기 인간 CD28 도메인을 암호화하는 내인성 뉴클레오타이드 서열을 각각 포함하는 인간 세포 집단이다.
예를 들어, 제1 신호전달 도메인은 인간 4-1BB 도메인이고 본 발명의 세포 집단은 상기 인간 4-1BB 도메인을 암호화하는 내인성 뉴클레오타이드 서열을 각각 포함하는 인간 세포 집단이다.
예를 들어, 제1 신호전달 도메인은 인간 OX40 도메인이고 본 발명의 세포 집단은 상기 인간 OX40 도메인을 암호화하는 내인성 뉴클레오타이드 서열을 각각 포함하는 인간 세포 집단이다.
하나의 예에서, 제1 신호전달 도메인은 CD3ζ 도메인이고, 제1 및 제2 세포내 신호전달 도메인은 천연적으로 단일 세포 (예를 들어, 인간 야생형 세포 또는 상기 환자로부터 단리된 세포)에 함께 자연 발생하지 않고, 예를 들어 제2 도메인은 CD28, CD27, OX40 또는 4-1BB 도메인이다.
하나의 예에서, 상기 제1 세포내 도메인은 CD3ζ 도메인, CD28 도메인 또는 4-1BB 도메인이다.
하나의 예에서, CAR은 항원 결합 부위 (예를 들어, 인간 기원일 수 있는 항체 scFv); 임의의 힌지(예를 들어, 인간 CD8α 힌지); 막관통 도메인 (예를 들어, 인간 CD8α 또는 CD28 막관통 도메인); 및 인간 CD3ζ 도메인을 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 포함하는 가공된 단일 폴리펩타이드이다. 하나의 예에서, CAR은 상기 폴리펩타이드들의 2개 이상의 복합체이다. 임의로, CAR은 막관통과 CD3ζ 도메인 사이에 추가의 세포내 신호전달 도메인 (i)을 포함한다. 임의로, CAR은 추가의 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 여기서, 상기 CD3ζ 도메인은 추가의 신호전달 도메인과 막관통 도메인 사이에 있다. 하나의 예에서, 상기 추가의 신호전달 도메인은 인간 CD27 도메인, CD28 도메인, ICOS 도메인, OX40 도메인, CD40 도메인, 4-1BB 도메인, FcεRIγ 도메인, CD64 도메인 또는 CD16 도메인이다. 대안적으로, 단일 폴리펩타이드 대신, CAR은 상기 도메인을 포함하는 적어도 2개의 폴리펩타이드의 가공된 복합체를 포함한다.
면역 세포는 단독으로 투여되거나 희석제 및/또는 IL-2 또는 다른 사이토킨 또는 세포 집단과 같은 다른 성분들과 조합된 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다.
하나의 구현예에서, 면역 세포 (예를 들어, CAR 세포 또는 TCR을 함유하는 세포)는 TAA에 결합하는 세포 표면 결합 부위 (예를 들어, CAR 또는 TCR에 의해 제공되는)를 포함한다. 종양 항원 (Tumour antigens, TAA)은 면역 반응, 특히, T-세포 매개된 면역 반응을 유발하는 종양 세포에 의해 생성되는 단백질이다. 항원 결합 특이성의 선택은 치료될 암의 특정 유형에 의존한다. 종양 항원은 당업계에 널리 공지되어 있고 본 발명의 하나의 구현예와 관련하여, 예를 들어, 신경교종-관련 항원, 암배아 항원(carcinoembryonic antigen, CEA), β-인간 융모성 생식선 자극 호르몬, 알파페토단백질 (alphafetoprotein, AFP), 렉틴-반응성 AFP, 티로글로불린, RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1, RU2 (AS), 장 카복실 에스테라제, mut hsp70-2, M-CSF, 프로테아제, 전립선-특이적 항원(prostate-specific antigen, PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-la, p53, 단백질, PSMA, Her2/neu, 수르비빈 및 텔로머라제, 전립선-암종 종양 항원-1 (prostate-carcinoma tumour antigen-1, PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타제(neutrophil elastase), 에프린B2, CD22, 인슐린 성장 인자 (insulin growth factor, IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체 및 메소텔린을 포함한다.
하나의 구현예에서, 종양 항원은 악성 종양과 관련된 하나 이상의 항원성 암 에피토프(cancer epitopes)를 포함한다. 악성 종양은 면역 공격을 위한 표적 항원으로서 작용할 수 있는 다수의 단백질을 발현한다. 이들 분자는 조직-특이적 항원, 예를 들어 MART-1, 흑색종에서 티로시나제 및 GP 100 및 전립선 암에서 전립선 산 포스파타제 (PAP) 및 전립선-특이적 항원 (PSA)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 표적 분자는 발암유전자 HER-2/Neu ErbB-2와 같은 형질전환-관련 분자 그룹에 속한다. 여전히 또 다른 그룹의 표적 항원은 암배아 항원 (CEA)과 같은 종양-태아 항원이다. B-세포 림프종에서, 종양-특이적 이디오타이프 유전자형 면역글로불린은 개별 종양에 특유한 진정한 종양-특이적 면역글로불린 항원을 구성한다. CD19, CD20 및 CD37과 같은 B-세포 분화 항원은 B-세포 림프종에서 표적 항원에 대한 다른 후보물이다. 이들 항원 중 일부 (CEA, HER-2, CD19, CD20, 이디오타이프(idiotype))는 제한된 성공과 함께 모노클로날 항체(monoclonal antibodies)를 사용한 수동 면역치료요법에 대한 표적으로서 사용되어 왔다. 제1 항원 또는 제4 결합 모이어티는 임의의 이들 TAA일 수 있거나 임의의 이들 TAA에 의한 항원성 서열일 수 있다.
본 발명의 구현예에서 TAA 항원의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 분화 항원, 예를 들어, MART-l/MelanA (MART-1), g l OO (Pmel 17), 티로시나제, TRP-1, TRP-2 및 종양-특이적 다중 계통 항원, 예를 들어, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE- 1, GAGE-2, pi 5; 과발현된 배아 항원, 예를 들어, CEA; 과발현된 발암유전자 및 돌연변이된 종양-서프레서 유전자, 예를 들어, p53, Ras, HER-2/neu; 염색체 전좌로부터 비롯된 특유의 종양 항원; 예를 들어, BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, 1GH-IGK, MYL-RAR; 및 바이러스 항원, 예를 들어, 엡슈타인 바르 바이러스 항원(Epstein Barr virus antigens) EBVA 및 인간 파필로마바이러스 (HPV) 항원 E6 및 E7. 다른 대형, 단백질-기반 항원은 TSP- 180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, pl 85erbB2, p l 80erbB-3, c-met, nm-23H l, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 베타-카테닌, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4(791Tgp72} 알파-페토단백질, 베타-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3＼CA 27.29＼BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68＼I, CO-029, FGF-5, G250, Ga733VEpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV 18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS 1, SDCCAG16, TA-90＼Mac-2 결합 단백질 A 사이클로필린 C-관련 단백질, TAAL6, TAG72, TLP, 및 TPS를 포함한다.
하나의 구현예에서, CAR 또는 TCR은 인간 CD 19에 대한, 예를 들어, 항-CD 19 scFV에 의해 제공될 수 있는 CAR에 대한 결합 부위를 포함하고, 임의로 여기서 상기 항-CD19 scFv는 WO2012079000A1호에 기재된 서열번호 14에 의해 암호화되어 있다. 하나의 구현예에서, 항-CD 19 scFV는 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함한다. 이 문단에서 서열은 WO2012079000A1에 나타내고 본 발명에 사용하기 위해 그리고 본원의 하나 이상의 청구항에 포함될 수 있는 것으로 명시적으로 포함된다.
하나의 구현예에서, CAR 내 도메인들 중 하나와 천연적으로 관련된 막관통 도메인이 사용된다. 일부 경우에, 막관통 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인으로 상기 도메인의 결합을 회피하기 위해 선택될 수 있거나 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다.
막관통 도메인은 천연으로부터 또는 합성 공급원으로부터 유래할 수 있다. 공급원이 천연인 경우, 상기 도메인은 임의의 막-결합되거나 막관통 단백질로부터 유래할 수 있다. 본 발명에서 특정 용도의 막관통 영역은 T-세포 수용체, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 또는 CD154의 알파, 베타 또는 제타 쇄로부터 유래할 수 있다 (즉, 이의 적어도 막관통 영역(들)을 포함한다). 대안적으로, 막관통 도메인은 합성일 수 있고, 이 경우에, 이것은 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함한다. 임의로, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플렛은 합성 막관통 도메인의 각각의 말단에서 발견된다.
임의로, 바람직하게 2 내지 10개의 아미노산 길이의 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커는 막관통 도메인과, CAR과 같은 면역 세포 막관통 단백질의 세포내 부분 사이에 연결체를 형성한다. 글라이신-세린 더블렛은 특히 적합한 링커 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 (G4S)n 링커)를 제공한다.
임의로, 막관통 도메인은 서열번호 16의 핵산 서열에 의해 암호화된 CD8 막관통 도메인이다. 하나의 구현예에서, CD8 막관통 도메인은 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함한다. 이 문단에서 서열은 WO2012079000A1에 나타내고 본 발명에 사용하기 위해 그리고 본원의 하나 이상의 청구항에 포함될 수 있는 것으로 명시적으로 포함된다.
일부 경우에, 막관통 도메인은 서열번호 15의 핵산 서열에 의해 암호화된 CD8 힌지 도메인을 포함한다. 하나의 구현예에서, CD8 막관통 도메인은 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함한다. 이 문단에서 서열은 WO2012079000A1에 나타내고 본 발명에 사용하기 위해 그리고 본원의 하나 이상의 청구항에 포함될 수 있는 것으로 명시적으로 포함된다.
환자에게 투여된 세포 집단의 세포에 의해 발현되는 막관통 단백질의 세포내 부분 또는 다르게는 세포내 신호전달 도메인(들)은, 막관통 단백질을 발현하는 면역 세포의 정상 이펙터 기능 (세포독성 (예를 들어, T-이펙터 세포에 대해) 또는 서프레션 (T-조절 세포에 대해)을 유도하는 것과 같은 T-세포 기능) 중 적어도 하나의 활성화에 관여한다. 용어 "이펙터 기능"은 세포의 특수화된 기능을 언급한다. T 세포의 이펙터 기능은 예를 들어, 사이토킨의 분비를 포함하는 세포 용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 따라서, 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 이펙터 기능 신호를 전달하고 세포가 특수화된 기능을 수행하도록 지시하는 단백질 부분을 언급한다. 일반적으로, 상기 전체 세포내 신호전달 도메인이 사용될 수 있고, 많은 경우에, 전체 쇄를 사용할 필요가 없다. 세포내 신호전달 도메인의 절단된 부분이 사용되는 정도로, 상기 절단된 부분은 이것이 이펙터 기능 신호를 전달하는 한 온전한 쇄를 대신하여 사용될 수 있다. 용어 "신호전달 도메인"은 따라서 상기 이펙터 기능 신호를 전달하기에 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 절단된 부분을 포함하는 것으로 의미된다. 투여되는 세포의 막관통 단백질에 사용하기 위한 세포내 신호전달 도메인의 예는 항원 수용체 개입 후 신호전달을 개시하기 위해 협력하여 작용하는 T 세포 수용체 (TCR) 및 공동-수용체의 세포질 서열, 및 동일한 기능 능력을 갖는 이들 서열 및 임의의 합성 서열의 임의의 유도체 또는 변이체를 포함한다.
단독의 TCR을 통해 생성되는 신호는 T 세포의 완전한 활성화를 위해 불충분하고 2차 또는 공동-자극 신호가 또한 요구되는 것으로 공지되어 있다. 따라서, T 세포 활성화는 세포질 신호전달 서열의 2개의 특유한 부류에 의해 매개되는 것으로 일컬어 질 수 있다: TCR을 통한 항원-의존성 1차 활성화를 개시하는 것들(1차 세포질 신호전달 도메인) 및 항원-독립적 방식으로 2차 또는 공동-자극 신호를 제공하는 작용을 하는 것들 (2차 세포질 신호전달 도메인). 1차 세포질 신호전달 서열은 자극 방식으로 또는 억제 방식으로 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 서열은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로서 공지된 신호전달 모티프를 함유할 수 있다.
하나의 예에서, 상기 제1 신호전달 도메인은 1차 세포질 신호전달 도메인(예를 들어, CD3ζ 도메인)이다. 하나의 예에서, 상기 제1 신호전달 도메인은 2차 세포질 신호전달 도메인 (예를 들어, CD28 도메인 또는 4-1BB 도메인)이다.
하나의 예에서, 제1 신호전달 도메인은 하나 이상의 ITAM을 포함한다.
본 발명에서 특정 용도를 갖는 1차 세포질 신호전달 도메인을 함유하는 적합한 ITAM의 예는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CDS, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터 유래된 것들을 포함한다. 본 발명의 막관통 단백질에서 세포질 신호전달 분자가 CD3 제타로부터 유래된 세포질 신호전달 서열을 포함하는 것이 특히 바람직하다.
세포내 부분은 임의로 (예를 들어, 제1 신호전달 도메인 또는 추가의 세포내 도메인으로서) 공동 자극 분자의 도메인을 포함한다. 공동자극 분자는 림프구 (예를 들어, T- 또는 NK 세포)의 항원으로의 효율적인 반응을 위해 요구되는 항원 수용체 또는 이들의 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 상기 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB (CD 137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다. 따라서, 이들 및 다른 공동 자극 요소들은 막관통 단백질의 세포내 부분에 사용하기 위한 본 발명의 범위내에 있다.
세포내 모이어티 도메인들은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 링커, 예를 들어, (G4S)n 링커에 의해 함께 연결될 수 있다.
하나의 구현예에서, 세포내 모이어티는 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 CD28의 신호전달 도메인을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 세포내 모이어티는 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함한다. 여전히 또 다른 구현예에서, 세포내 모이어티는 CD3-제타의 신호전달 도메인, 및 CD28 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함한다.
하나의 구현예에서, 세포내 모이어티는 4-1BB의 신호전달 도메인 및 CD3-제타의 신호전달 도메인을 포함하고, 여기서, 4-1BB의 신호전달 도메인은 서열번호 17에 제시된 핵산 서열에 의해 암호화되어 있고 CD3-제타의 신호전달 도메인은 서열번호 18에 제시된 핵산 서열에 의해 암호화되어 있다. 이 문단에서 서열은 WO2012079000A1에 나타내고 본 발명에 사용하기 위해 그리고 본원의 하나 이상의 청구항에 포함될 수 있는 것으로 명시적으로 포함된다.
하나의 구현예에서, 세포내 모이어티는 4-1BB의 신호전달 도메인 및 CD3-제타의 신호전달 도메인을 포함하고, 여기서, 4-1BB의 신호전달 도메인은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 CD3-제타의 신호전달 도메인은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함한다. 이 문단에서 서열은 WO2012079000A1에 나타내고 본 발명에 사용하기 위해 그리고 본원의 하나 이상의 청구항에 포함될 수 있는 것으로 명시적으로 포함된다.
하나의 구현예에서, 세포내 모이어티는 4-1BB의 신호전달 도메인 및 CD3-제타의 신호전달 도메인을 포함하고, 여기서, 4-1BB의 신호전달 도메인은 서열번호 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 CD3-제타의 신호전달 도메인은 서열번호 24에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 상기 문단에서 서열은 WO2012079000A1에 나타내고 본 발명에 사용하기 위해 그리고 본원의 하나 이상의 청구항에 포함될 수 있는 것으로 명시적으로 포함된다.
T-세포 및 다른 면역 세포의 공급원 및 이들을 생성하고, 활성화시키고 확장시키는 방법은 WO2012079000A1, US8906682, US8911993, US8916381, US8975071, US9101584, US9102760, US9102761, US9328156, US9464140, US9481728, US9499629, US9518123, US9540445, US20130287748, US20130288368, US20130309258, US20140106449, US20140370017, US20150050729, US20150093822, US20150099299, US20150118202, US20160130355, US20160159907, US20160194404, US20160208012에 기재되어 있다. 이들 개시내용은 본 발명을 실시할 때 가능한 사용을 위해 언급된다.
상기 방법에 의해 치료 또는 예방을 위한 암
치료될 수 있는 암은 혈관화된 종양 뿐만 아니라 혈관화되지 않거나 실질적으로 혈관화되지 않은 종양을 포함한다. 상기 암은 비-고형 종양 (예를 들어, 혈액학적 종양, 예를 들어, 백혈병 및 림프종)을 포함할 수 있거나 고형 종양을 포함할 수 있다. 본 발명을 사용하여 치료될 암의 유형은 암종, 아세포종, 및 육종, 및 특정 백혈병 또는 림프구 악성종양, 양성 및 악성 종양, 및 악성종양 예를 들어, 육종, 암종 및 흑색종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 성인 종양/암 및 소아 종양/암이 또한 포함된다.
혈액학적 암은 혈액 또는 골수의 암이다. 혈액학적 (또는 혈액발생) 암의 예는 백혈병을 포함하고, 이는 급성 백혈병 (예를 들어, 급성 림프구 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 및 골수아세포, 전골수구, 골수단핵구, 단핵구 및 적백혈병), 만성 백혈병 (예를 들어, 만성 골수구 (과립구) 백혈병, 만성 골수발생 백혈병, 및 만성 림프구 백혈병), 진성 다혈증, 림프종, 호지킨 질환, 비-호지킨 림프종 (무기력 및 고등급 형태), 다발성 골수종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 중쇄 질환, 골수이형성증후군, 모발 세포 백혈병 및 골수이형성증을 포함한다.
고형 종양은 낭포 또는 액체 영역을 일반적으로 함유하지 않는 비정상적 매쓰의 조직이다. 고형 종양은 양성 또는 악성일 수 있다. 상이한 유형의 고형 종양은 이들을 형성하는 세포 유형 (육종, 암종 및 림프종과 같은)을 따라 호칭된다. 육종 및 암종과 같은 고형 종양의 예는 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 및 다른 육종, 활막종, 중피종, 어윙 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 골수 악성 종양, 췌장암, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 간세포 암종, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 수질 갑상선 암종, 유두 갑상선 암종, 크롬친화성세포종 피지선 암종, 유두 암종, 유두 선암종, 수질 암종, 기관지성 암종, 신장 세포 암종, 간암종, 담즙관 암종, 융모암종, 빌름스 종양, 자궁암, 고환 종양, 정상피종, 방광 암종, 흑색종, 및 CNS 종양 (예를 들어, 신경교종(예를 들어, 뇌줄기 신경교종 및 혼합 신경교종), 교모세포종(또한 다형성 교모세포종으로서 공지됨), 성상세포종, CNS 림프종, 배아세포종, 수모세포종, 신경초종 두개인두종, 뇌실막세포종, 파인아이오마(pineaioma), 혈관모세포종, 청신경종양, 핍지교종, 혈관종, 신경모세포종, 망막모세포종 및 뇌 전이)을 포함한다.
하나의 구현예에서, 상기 투여된 세포는 특정 암을 치료하도록 디자인된 제1 항원 결합 부위 (예를 들어, CAR에 의해 포함됨)를 발현한다. 예를 들어, 이것은 CD19에 특이적으로 결합하여 암, 및 장애, 예를 들어, 전구-B ALL (소아 징후), 성인 ALL, 맨틀 세포 림프종, 확산 대형 B-세포 림프종을 치료하거나 또는 동종이계 골수 이식 후 구제를 위해 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 제1 모이어티 또는 제1 결합 부위는 CD22에 특이적으로 결합하여 확산 대형 B-세포 림프종을 치료한다.
하나의 구현예에서, 암 및 장애는 전구-B ALL (소아 징후), 성인 ALL, 맨틀 세포 림프종, 확산 대형 B-세포 림프종, 동종이계 골수 후 이식 후 구제 등을 포함하지만 이에 제한되지 않고 CD19, CD20, CD22, 및 ROR1 (예를 들어, CD19 및 다른 표적의 하나) 중 2개 또는 3개를 표적화하는 결합제 (또는 단일 제제에 의해 포함되는 모이어티 또는 부위를 결합하는)의 조합을 사용하여 치료될 수 있다.
하나의 구현예에서, 상기 세포는 다양한, 예를 들어, 이들의 표적 항원에 상이한 (및 임의로 다르게는 동일한) 제1 및 제2 막관통 단백질 (예를 들어, CARs 또는 CAR 및 T-세포에 의해 발현되는 가공된 TCR)을 포함한다. 유사하게, 본 발명은 예를 들어, 동일한 이식체에 의해 포함되는 면역 세포의 혼합물 (예를 들어, CAR-세포들의 혼합물)을 사용할 수 있고, 여기서, 상기 혼합물은 다양한, 예를 들어, 이들 표적 항원에서 상이한 (및 임의로 다르게는 동일한) 막관통 단백질 (예를 들어, CARs 또는 CAR 및 T-세포에 의해 발현되는 가공된 TCR)을 포함하는 세포를 포함한다. 이것은 암에 의한 치료에 대한 내성을 감소시키거나 보다 효과적으로 다수의 표적 항원을 표면 발현하는 암 세포와 같은 세포 집단을 표적화하기 위해 유용할 수 있다.
하나의 구현예에서, 상기 항원 결합 부위는 특이적으로 메소텔린에 결합하고 중피종, 췌장암 또는 난소암을 치료하거나 예방한다.
하나의 구현예에서, 상기 항원 결합 부위는 특이적으로 CD33/IL3Ra에 결합하고 급성 골수성 백혈병을 치료하거나 예방한다.
하나의 구현예에서, 상기 항원 결합 부위는 특이적으로 c-Met에 결합하고 3중 음성 유방암 또는 비-소세포 폐암을 치료하거나 예방한다.
하나의 구현예에서, 상기 항원 결합 부위는 특이적으로 PSMA에 결합하고 전립선암을 치료하거나 예방한다.
하나의 구현예에서, 상기 항원 결합 부위는 특이적으로 당지질 F77에 결합하고 전립선암을 치료하거나 예방한다.
하나의 구현예에서, 상기 항원 결합 부위는 특이적으로 EGFRvIII에 결합하고 교모세포종을 치료하거나 예방한다.
하나의 구현예에서, 상기 항원 결합 부위는 특이적으로 GD-2에 결합하고 신경모세포종 또는 흑색종을 치료하거나 예방한다.
하나의 구현예에서, 상기 항원 결합 부위는 특이적으로 NY-ESO-1 TCR에 결합하고 골수종, 육종 또는 흑색종을 치료한다.
하나의 구현예에서, 상기 항원 결합 부위는 특이적으로 MAGE A3 TCR에 결합하고 골수종, 육종 및 흑색종을 치료한다.
특정 항원 결합은 25℃ 또는 rtp에서 시험관내 표면 플라스몬 공명 (Surface Plasmon Resonance, SPR)에 의한 측정시 1 mM 이하(예를 들어, 1 mM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 100 pM 이하, 또는 10 pM 이하)의 KD로 결합한다.
하나의 예에서, 상기 방법을 사용한 상기 치료는 질환 또는 병태 또는 이의 증상의 진행을 감소시킨다. 하나의 예에서, 상기 방법을 사용한 상기 치료는 예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5년 동안 질환 또는 병태 또는 이의 증상의 발생율을 감소시킨다.
하나의 예에서, 상기 방법은 포유동물, 예를 들어, 인간, 남성 또는 여성, 또는 남아 또는 여아, 또는 인간 유아 (예를 들어, 1, 2, 3 또는 4세 연령 이하)에서 생체내 방법이다. 하나의 예에서, 환자는 성인 인간 또는 소아 인간 환자이다.
CAR 또는 TCR은 가공되고, 즉, 모이어티와 도메인의 비-천연적으로 존재하는 조합을 포함한다. 하나의 예에서, 세포 치료요법은 표적 세포를 표적화하고, 여기서, 상기 표적 세포는 암 세포, 예를 들어, 백혈병 세포, 림프종 세포, 선암종 세포 또는 암 줄기 세포이다. 임의로, 투여된 면역 세포의 CAR 또는 TCR은 인간 CD19 (및 임의로 표적 세포는 백혈병 또는 림프종 세포이다), EpCAM (및 임의로 표적 세포는 폐암 세포, 위장 암 세포, 선암종, 암 줄기 세포이다), CD20 (및 임의로 표적 세포는 백혈병 세포이다), MCSP (및 임의로 상기 표적 세포는 흑색종 세포이다), CEA, EGFR, EGFRvIII, 시알릴 Tn, CD133, CD33 (및 임의로 상기 표적 세포는 백혈병 세포, 예를 들어, AML 세포이다), PMSA, WT1, CD22, L1CAM, ROR-1, MUC-16, CD30, CD47, CD52, gpA33, TAG-72, mucin, CIX, GD2, GD3, GM2, CD123, VEGFR, 인테그린, cMET, Her1, Her2, Her3, MAGE1, MAGE A3 TCR, NY-ESO-1, IGF1R, EPHA3, CD66e, EphA2,TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, 안지오포이에틴, 메소텔린, 당지질 F77 또는 테나신에 특이적으로 결합한다.
임의로, CAR은 블리나투모맙 또는 항체 HD37의 CD19 결합 부위; 카투막소맙의 EpCAM 결합 부위; AFM11의 CD19 결합 부위; 림포문의 CD20 결합 부위; 에르투막소맙의 Her2 결합 부위; AGM211 (MEDI-565, MT111)의 CEA 결합 부위; 파소툭시주맙의 PSMA 결합 부위; 솔리토맙의 EpCAM 결합 부위; RG7221 또는 RG7716의 VEGF 또는 안지오포이에틴 2 결합 부위; RG7597의 Her1 또는 Her3 결합 부위; MM111의 Her2 또는 Her3 결합 부위; MM141의 IGF1R 또는 Her3 결합 부위; MGD006의 CD123 결합 부위; MGD007의 gpa33 결합 부위; TF2의 CEA 결합 부위; AFM13의 CD30 결합 부위; AFM11의 CD19 결합 부위; 및 LY3164530의 Her1 또는 cMet 결합 부위로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항체의 가변 도메인을 포함한다.
임의로, CAR은 ReoProTM; 아브식시맙; RituxanTM; 리툭시맙; ZenapaxTM; 다클리주맙; SimulectTM; 바실리식맙; SynagisTM; 팔리비주맙; RemicadeTM; 인플릭시밉; HerceptinTM; 트라스투주맙; MylotargTM; 겜투주맙; CampathTM; 알렘투주맙; ZevalinTM; 이브리투모맙; HumiraTM; 아달리무맙; XolairTM; 오말리주맙; BexxarTM; 토시투모맙; RaptivaTM; 에팔리주맙; ErbituxTM; 세툭시맙; AvastinTM; 베바시주맙; TysabriTM; 나탈리주맙; ActemraTM; 토실리주맙; VectibixTM; 파니투무맙; LucentisTM; 라니비주맙; SolirisTM; 에쿨리주맙; CimziaTM; 세르톨리주맙; SimponiTM; 골리무맙, IlarisTM; 카나키누맙; StelaraTM; 우?키누맙; ArzerraTM; 오파투무맙; ProliaTM; 데노수맙; NumaxTM; 모타비주맙; ABThraxTM; 락시바쿠맙; BenlystaTM; 벨리무맙; YervoyTM; 이필리무맙; AdcetrisTM; 브렌툭시맙; VedotinTM; PerjetaTM; 페르투주맙; KadcylaTM; 아도-트라스투주맙; GazyvaTM 및 오비누투주맙으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항체의 항원 결합 부위의 가변 도메인을 포함한다.
하나의 예에서, 표적 세포는 혈액 세포, 예를 들어, 인간 또는 동물의 줄기 세포 또는 골수 세포이다. 임의로, 표적 세포는 B- 또는 T-세포이다.
하나의 예에서, CAR 또는 TCR은 자가면역 질환 표적에 대한 항원 결합 부위를 포함하고 상기 신호전달은 면역 세포의 세포독성 활성 또는 증식을 하향조절한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "자가면역 질환"은 자가면역 반응으로부터 비롯되는 장애로서 정의된다. 자가면역 질환은 자가-항원에 대한 부적당하고 과도한 반응의 결과이다. 자가면역 질환의 예는 무엇보다 애디슨 질환, 원형탈모(alopecia greata), 강직성 척추염, 자가면역 간염, 자가면역 이하선염, 크론 질환, 당뇨병 (I형), 이영양성 수포성표피박리증, 부고환염, 사구체신염, 그레이브씨 질환, 길레인-바르 증후군, 하시모토 질환, 용혈성 빈혈, 전신 홍반성 낭창, 다발성 경화증, 중증근무력증, 심상성 천포창, 건선, 류마티스 열, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 피부 경화증, 쇼그렌 증후군, 척추관절병증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성 빈혈, 궤양성 대장염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
전체 기억 T 세포 집단 내에, 여러 구분된 서브집단이 기재되었고 케모킨 수용체 CCR7 및 L-셀렉틴 (CD62L)의 차등적 발현에 의해 인지될 수 있다. 순수 세포와 같은 줄기 기억 TSCM 세포는 CD45RO-, CCR7+, CD45RA+, CD62L+ (L-셀렉틴), CD27+, CD28+ 및 IL-7Rα+이지만, 이들은 또한 대량의 CD95, IL-2Rβ, CXCR3, 및 LFA-1을 발현하고, 기억 세포에 특유한 수많은 기능성 속성을 보여준다. 중추 기억 TCM 세포는 L-셀렉틴 및 CCR7을 발현하고, 이들은 IL-2를 분비하지만, IFNγ 또는 IL-4를 분비하지 않는다. 이펙터 기억 TEM 세포는 그러나 L-셀렉틴 또는 CCR7을 발현하지 않지만 IFNγ 및 IL-4와 같은 이펙터 사이토킨을 생성한다. 기억 T-세포, 예를 들어, TSCM은 특히 인간에서 가공된 면역 세포의 지속적 집단을 확립하기 위해 유용할 수 있다.
임의의 면역 세포, 표적 세포 또는 줄기 세포는 하나의 예에서 TSCM, TCM 또는 TEM 세포, 예를 들어, 인간 TSCM, TCM 또는 TEM 세포일 수 있다. 하나의 예에서, 상기 세포 치료요법의 면역 세포(예를 들어, CAR-T 세포) 각각은 자가면역 질환, 염증 질환, 바이러스 감염 또는 암을 앓는 인간 세포의 후손이고, 예를 들어, 여기서, 인간은 림프아구성 백혈병, ALL (예를 들어, T-ALL), CLL (예를 들어, B-세포 만성 림프구 백혈병) 또는 비-호지킨 림프종을 앓는다. 인간은 예를 들어, 환자 또는 이의 친척 (예를 들어, 형제 자매 또는 부모)일 수 있다.
하나의 예에서, 투여된 면역 세포는 증진된 신호전달을 위해 가공되었고, 여기서, 상기 신호전달은 CD28, 4-1BB, OX40, ICOS 및 CD40 신호전달로부터 선택된다.
임의로, 상기 표적 세포 (예를 들어, 종양 세포)는 사멸된다. 하나의 예에서, 각각의 표적 세포는 종양 세포이고 상기 방법은 인간에서 암을 치료하거나 이의 위험을 감소시키거나 암 진행을 치료하거나 이의 위험을 감소시킨다.
임의로, 인간은 암을 갖는다. 하나의 예에서, 상기 암은 혈액학적 암이다. 하나의 예에서, 상기 인간은 B-세포 기원의 암을 갖는다. 하나의 예에서, 상기 인간은 T-세포 기원의 암을 갖는다. 예를 들어, 상기 암은 폐암, 흑색종, 유방암, 전립선암, 결장암, 신장 세포 암종, 난소암, 신경모세포종, 횡문근육종, 백혈병 및 림프종이다. 본 발명과 함께 사용하기 위해 바람직한 암 표적은 B 세포 기원의 암이고, 특히 급성 림프아구성 백혈병, B-세포 만성 림프구 백혈병 또는 B-세포 비-호지킨 림프종을 포함한다. 하나의 예에서, 상기 암은 T-세포 또는 B-세포 기원의 암이고, 예를 들어, 림프아구성 백혈병, ALL (예를 들어, T-ALL), CLL (예를 들어, B-세포 만성 림프구 백혈병) 또는 비-호지킨 림프종이다.
임의로, 각각 투여된 면역 세포 (예를 들어, CAR-세포)는 상기 인간의 면역 세포의 후손이고, 예를 들어, 상기 인간은 림프아구성 백혈병, 확산 대형 B-세포 림프종 (DLBCL), ALL (예를 들어, T-ALL 또는 B-ALL), CLL (예를 들어, B-세포 만성 림프구 백혈병) 또는 비-호지킨 림프종을 앓는다. 임의로, 각각 투여된 면역 세포 (예를 들어, CAR-세포)는 상기 인간의 자가조직 세포 (예를 들어, T-세포)이거나 상기 자가조직 세포의 후손이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "자가조직"은 이후에 개체에 재도입될 동일한 개체로부터 유래된 임의의 물질을 언급하는 것으로 의미된다. "동종이계"는 동일한 종의 상이한 동물로부터 유래된 그래프트를 언급한다.
임의로, 각각 투여된 면역 세포 (예를 들어, CAR-세포)는 인간의 혈액 또는 종양 샘플로부터 유래하고 단계 (c) 전에 시험관내 활성화되고 확장된다. 본원에 사용된 바와 같은 "활성화"는 검출가능한 세포 증식을 유도하도록 충분히 자극된 T-세포 또는 다른 면역 세포 상태를 언급한다. 활성화는 또한 유도된 사이토킨 생성 및 검출가능한 이펙터 기능과 관련될 수 있다. 용어 "활성화된 T 세포"는 무엇 보다 세포 분열을 진행하는 T 세포를 언급한다.
하나의 구현예에서, 상기 인간은 자가면역 질환을 갖고, 여기서, 투여되는 상기 면역 세포 (예를 들어, CAR-세포)는 아네르기(anergic)이거나, 표적 세포에 결합되는 경우 증식 및/또는 세포독성 활성을 감소시킴으로써 상기 세포 이식 세포(및/또는 이의 후손)는 상기 자가면역 질환을 상향-조절하는 상기 인간의 내인성 면역 세포와 경쟁한다.
상기 방법에서 면역 세포의 환자의 혈액으로 세포 주입에 의한 것일 수 있다. 상기 면역 세포는 환자에게 투여된 확장된 면역 세포 집단을 생성하도록 확장될 수 있다. 상기 면역 세포는 환자에게 투여된 활성화된 면역 세포 집단을 생성하도록 활성화될 수 있다. 본원의 방법에서, 유효량의 면역 세포가 투여된다. 본원에 사용된 바와 같은 "유효량"은 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하기 위해 치료학적 또는 예방학적 이득을 제공하는 양을 의미한다.
본 발명의 방법의 하나의 구현예에서, 상기 방법은 환자 (예를 들어, 인간)에서 암을 치료하거나 암의 위험을 감소시키고, 여기서, 상기 환자는 면역 세포를 환자에게 투여하기 전에 림프구 고갈을 진행하였다.
하나의 구현예에서, 상기 인간은 적어도 하나의 화학치료학적 제제에 내성이다.
하나의 구현예에서, 만성 림프구 백혈병은 호흡기 CD 19+ 백혈병 및 림프종이다.
본 발명은 또한 암으로 진단된 인간에서 유전학적으로 가공된 T 세포의 지속적 집단을 생성하는 방법을 포함하고, 여기서, 투여된 세포는 T-세포를 포함하고 상기 지속적 집단은 이의 후손을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 방법은 인간에게 T-세포 집단 (예를 들어, CAR T-세포 집단)을 투여함을 포함하고, 여기서, 유전학적으로 가공된 T-세포의 지속적 집단은 투여 후 적어도 1개월 동안 인간에서 지속한다. 하나의 구현예에서, 유전학적으로 가공된 T-세포의 지속적 집단은 기억 T-세포를 포함한다. 하나의 구현예에서, 유전학적으로 가공된 T-세포의 지속적 집단은 투여 후 적어도 3개월 동안 인간에서 지속한다. 또 다른 구현예에서, 유전학적으로 가공된 T-세포의 지속적 집단은 투여 후 적어도 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 2년, 또는 3년 동안 인간에서 지속한다.
하나의 구현예에서, 만성 림프구성 백혈병은 치료된다. 본 발명은 또한 암으로 진단된 인간에서 가공된 T 세포 또는 NK 세포의 집단을 확장시키는 방법을 제공하고, 여기서, 상기 투여된 세포는 T-세포 및/또는 NK 세포를 포함하고 상기 확장된 집단은 이의 후손을 포함한다.
임의로, 자가조직 림프구 주입은 치료에 사용된다. 예를 들어, 자가조직 PBMC는 치료를 필요로 하는 환자로부터 수거하고 CAR-T-세포를 가공하여 CAR 막관통 단백질을 발현하고 당업계에 공지된 방법을 사용하여 활성화시키고 확장시키고 이어서 단계 (a)에서 환자에게 다시 주입한다.
하나의 예에서, 상기 투여된 세포는 만능성 또는 다능성이다.
상기 줄기 세포는 인간으로 발육할 수 없다. 하나의 구현예에서, 상기 줄기 세포는 인간 배아 또는 접합자로 발육할 수 없다.
하나의 예에서, 상기 투여된 세포 집단은 골수 줄기 세포, 예를 들어, 인간 자가조직 또는 동종이계 세포를 포함한다.
하나의 예에서, 상기 투여된 세포 집단은 조혈 줄기 세포, 예를 들어, 인간 자가조직 또는 동종이계 세포를 포함한다.
미생물총의 변형(MODIFYING MICROBIOTA )
의학적 수행은 흔히 환자에게 항생제의 투여를 포함한다. 상기 치료는 전형적으로 광범위 스펙트럼 항생제 또는 구분 없이 많은 그람-양성 세균 종 또는 많은 그람-음성 종을 표적화하는 항생제의 투여를 포함할 수 있다. 유사하게, 농사 및 농업에서 광범위-스펙트럼 항생제의 사용은 예를 들어, 건강에 해롭고 미생물 내성 발생에 기여할 수 있는 상기 항생제의 인간 및 동물 먹이 사슬로의 진입을 포함하여 환경 문제를 제기한다. 오히려, 하나의 예에서, 본 발명은 미생물총의 제1 미생물 (예를 들어, 세균 또는 고세균) 종 또는 균주의 선택적 표적화를 포함한다. 본원의 실시예에서 보여준 바와 같이, 특정 세균 종의 선택적 표적화는 선택된 종의 게놈의 가이드된 뉴클레아제 표적화를 사용하고 동시에 함께 거주하는 (실시예에서 인간 장 내 미생물총에서 함께 거주하는 종) 종 뿐만 아니라 관련된 종 및 균주는 그대로 유지하는 표적화를 사용하여 성취되었다. 따라서, 하나의 구현예에서, 장 내 불균형을 유발하는 단계 또는 단계 (b)는 미생물총 서브-집단에 의해 포함되는 제1 세포의 게놈을 표적화하는 가이드된 뉴클레아제 (예를 들어, RNA 가이드된 뉴클레아제)를 사용함에 의해 미생물총 서브-집단의 제1 세포를 사멸시키거나 상기 서브-집단의 성장을 억제함을 포함한다. 상기 가이드된 뉴클레아제 표적화를 수행하기 위해 적합한 시스템은 예를 들어, 가공된 CRISPR/Cas 시스템, TALEN, 메가뉴클레아제 및 아연 핑거 시스템이다. 예를 들어, 콘소시엄에서 선택된 인간 장 내 미생물총 세균 종의 CRISPR/Cas-매개된 가이드된 표적화는 본원의 실시예에서 입증된다. 상기 표적화는 표적 종 또는 균주 DNA의 뉴클레아제 절단을 생성하고, 예를 들어, 이는 미생물총에서 상기 종의 상대적 비율을 감소시키거나 상기 미생물총에서 상기 종의 서브-집단의 성장을 억제한다. 상기 방법에서 종의 선택적 표적화는 일반적으로 미생물총에서 세균 및/또는 고세균 종의 상대적 비율에서의 변화에 대해 보다 세밀한 제어를 할 수 있게 하여 유리하다. 이러한 방식으로, 본 발명은 TH1, TH17 및/또는 Treg 세포 (이들 세포는 상기 환자에게 내인성이고/이거나 상기 환자에게 투여되는 적응성 면역 세포 집단에 의해 포함된다)와 같은 특정 면역 세포 집단의 상향조절 또는 하향조절 또는 본원에 기재된 바와 같은 미생물총을 조절하는 다른 결과에 영향을 주는 목적과 함께, 미생물총을 변화시키는 능력을 제공한다.
하나의 예에서, 제1 세포 집단 성장은 상기 장 내 불균형 또는 단계 (b) 전의 성장과 비교하여 적어도 5배까지 감소한다. 상기 방법은 장 내 표면 상의 제1 세포 집단 성장을 억제함을 포함할 수 있다. 상기 방법은 식물 (예를 들어, 잎 및/또는 줄기) 표면 상의 제1 세포 집단 성장을 억제함을 포함할 수 있다.
대안적으로, 대상체에 적용되는 대신, 상기 치료는 환경 또는 토양에 적용되고 (예를 들어, 상기 치료제는 비료, 식물 성장 촉진 또는 억제제, 제초제 또는 살충 치료제이다), 여기서, 상기 치료는 본 발명에 의해 조절된다.
장 내 미생물총 또는 다른 미생물총에서 세균 및 고세균에서의 변화를 결정하는 방법은 당업자에게 용이하게 자명하다. 예를 들어, 이것은 상기 치료 전 및 후에 환자의 대변 샘플을 분석함에 의해 수행될 수 있다. 당업자는 각각의 샘플에서 다양한 종 또는 균주의 유형 및 종 또는 균주의 비율을 치료 전과 후에 결정할 수 있다. 16s 리보솜 RNA-암호화 DNA (16s rDNA)의 통상적인 분석을 사용하여, 예를 들어, 종을 동정할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 표준 생화학적 시험을 사용하여 균주 또는 종을 동정할 수 있고, 예를 들어, 또한 하기 중 하나 이상을 포함한다: 염색, 이동 시험, 혈청학적 시험, 파아지 유형 분류 및 동정 디스크 시험(예를 들어, Kirby Baur 디스크 확산 방법을 사용함). 생화학적 시험은 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (a) 카탈라제 시험, (b) 코귤라제 시험, (c) 옥시다제 시험, (d) 당 발효 시험, (e) 인돌 시험, (f) 시트레이트 시험, 및 (g) 우레아제 시험. 상대적 비율은 각각의 샘플 기원의 한천 플레이트 (본원의 실시예에서와 같이) 상에서 콜로니를 성장시키고 콜로니 수를 계수함에 의해 결정될 수 있다.
하나의 예에서, 장 내 불균형 또는 단계 (b)는 미생물총, 예를 들어, 장 내 미생물총에서 박테로이데스(Bacteroides) (예를 들어, 비 프라갈리스(B fragalis) 및/또는 비 테타이오타미크론(B thetaiotamicron))의 비율을 증가시킨다.
하나의 예에서, 장 내 불균형 또는 단계 (b)는 미생물총, 예를 들어, 장 내 미생물총에서 박테로이데스(Bacteroides) (예를 들어, 비 프라갈리스(B fragalis) 및/또는 비 테타이오타미크론(B thetaiotamicron))의 비율을 감소시킨다. 하나의 예에서, 장 내 불균형 또는 단계 (b)는 미생물총, 예를 들어, 장 내 미생물총에서 피르미쿠테스(Firmicutes)에 대한 박테로이데스(Bacteroides)의 비율을 증가시킨다. 하나의 예에서, 장 내 불균형 또는 단계 (b)는 미생물총, 예를 들어, 장 내 미생물총에서 피르미쿠테스(Firmicutes)에 대한 박테로이데스(Bacteroides)의 비율을 감소시킨다.
누적된 증거는 Treg 세포의 유도에서 클러스터 IV 및 XIVa에 속하는 비피도박테리움 및 클로스트리디움 종의 공생 균주의 역할을 지지한다. 예를 들어, 문헌 (Lopez et al.)을 참조한다. 하나의 예에서, 장 내 불균형 또는 단계 (b)는 장 내 미생물총에서 하나 이상의 클로스트리디움 종 또는 균주 (예를 들어, 하나의 예에서, 각각의 종은 클러스터 IV 또는 XIVa 클로스트리디움 종이다)의 비율을 감소시킨다. 하나의 예에서, 장 내 불균형 또는 단계 (b)는 장 내 미생물총에서 하나 이상의 클로스트리디움 종 또는 균주 (예를 들어, 하나의 예에서, 각각의 종은 클러스터 IV 또는 XIVa 클로스트리디움 종이다)의 비율을 증가시킨다.
하나의 예에서, 장 내 불균형 또는 단계 (b)는 장 내 미생물총에서 비피도박테리움 (예를 들어, 비 비피둠)의 비율을 감소시킨다. 하나의 예에서, 장 내 불균형 또는 단계 (b)는 장 내 미생물총에서 비피도박테리움 (예를 들어, 비 비피둠)의 비율을 증가시킨다.
예를 들어, 인간 장 내 미생물총을 선택적으로 변화시킴에 의해, 본 발명은 CAR-T 또는 다른 ACT 치료의 상향조절을 제공한다 (예를 들어, 여기서, 상기 변화된 미생물총은 CAR-T 또는 ACT 투여를 받은 환자에서 Treg 세포를 하향조절하고/하거나 환자에서 TH1 및/또는 TH17 세포를 상향조절한다 - 상기 세포는 예를 들어, CAR-T 또는 ACT 이식체에 의해 포함된다). Treg 세포의 하향조절은 환자에서 T-이펙터 및/또는 T-헬퍼의 억제를 감소시킴으로써 암 또는 다른 질환-매개 세포에 대하여 CAR-T 또는 ACT 세포독성 또는 다른 바람직할 수 있는 활성을 증진시킬 수 있다. TH1 및/또는 TH17 세포의 상향조절은 T-이펙터 활성을 증가시킴으로써 암 또는 다른 질환-매개 세포에 대한 CAR-T 또는 ACT 세포독성 또는 다른 바람직한 활성을 증진시킬 수 있다.
또 다른 예에서, 미생물총의 변화는 CAR-T 또는 다른 ACT 치료의 하향시키기 위한 스위치로서 사용될 수 있다 (예를 들어, 여기서, 변화된 미생물총은 CAR-T 또는 ACT 투여를 받은 환자에서 Treg 세포를 상향조절하고/하거나 환자에서 TH1 및/또는 TH17 세포를 하향조절한다 - 그러나 세포는 예를 들어, CAR-T 또는 ACT 이식체에 의해 포함된다). Treg 세포의 상향조절은 환자에서 T-이펙터 및/또는 T-헬퍼의 억제를 증가시킴으로써 사이토킨 방출 또는 다른 바람직하지 않는 활성을 촉진시키는 CAR-T 또는 ACT 능력을 감소시킬 수 있다. TH1 및/또는 TH17 세포의 하향조절은 T-이펙터 활성을 감소시킴으로써 사이토킨 방출 또는 다른 바람직할 수 없는 활성을 촉진시키는 CAR-T 또는 ACT 능력을 감소시킬 수 있다. 이것은 환자에서 사이토킨 방출 증후군 (CRS)의 위험을 제한하는데 유용할 수 있다. 본 발명의 방법을 사용한 환자의 장 내 미생물총의 후속적 추가의 변형은 직접 질환 또는 병태 (예를 들어, 암, 예를 들어, 혈액학적 암)를 해결하기 위해 이것을 한번 더 사용하는 것이 바람직한 경우 CAR-T 또는 ACT 치료를 상향조절하기 위해 수행될 수 있다. 이 경우에, 기억 T-세포 CAR-T 또는 ACT 집단은 조기 치료로부터 환자에 존재할 수 있고, 본 발명에 따른 미생물총 변화를 사용한 상향조절은 질환 또는 병태를 해결하기 위해 이펙터 및/또는 헬퍼 세포로 분화하도록 기억 T-세포를 상향조절할 수 있다. 따라서, 하나의 예에서, 본 발명의 세포 치료요법은 면역 기억 세포 (예를 들어, 기억 T-세포, 예를 들어, 중추 기억 T 세포 (TCM) 및/또는 줄기 세포 기억 세포 (TSCM)과 같은 기억 T-세포)를 포함하는 면역 세포 집단을 투여함을 포함하고/하거나 투여된 집단은 초기 미생물총 변화 후 상기 기억 세포를 산란(spawn)시키는 세포를 포함한다.
본 발명의 하나의 양상이 환자에서 세포-기반 치료요법을 조절하기 위한 용도를 인지하지만, 또 다른 양상은 환자에서 세포-매개된 질환 및 병태, 예를 들어, 환자의 T-세포 또는 다른 면역 세포에 의해 매개되는 자가면역 및 염증 질환 및 병태를 조절 (즉, 치료하거나 예방하는)하기 위한 용도를 인지한다. 추가의 양상에서, 본 발명은 질환 또는 병태의 또 다른 치료요법을 조절 (예를 들어, 증진)하기 위한; 예를 들어, 상기 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하기 위한 항체 또는 항-바이러스 의약을 사용한 치료요법을 증진시키거나 실행하기 위한 수단으로서의 용도를 인지한다. 예를 들어, 의약은 면역 체크포인트 길항제 또는 효능제 (예를 들어, 흑색종 또는 NSCLC와 같은 암을 치료하거나 예방하기 위한)일 수 있다. "실행 치료요법"이란, 환자가 의약에 응답하지 않거나 불량하게 응답하고 본 발명에 따른 미생물총 변화 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 세균 또는 고세균 종의 선택적 가이드된 뉴클레아제 표적화를 사용하여)가 환자에 의한 의약에 대한 반응 (또는 개선된 반응)을 유발하는 것으로 고려된다. 예를 들어, 본 발명의 상기 방법은 HIV 감염을 앓는 환자에서 TH17 세포를 상향조절한다. 하나의 양상에서, 이것은 환자의 항-레트로바이러스 치료요법 또는 HIV 백신 치료요법을 증진시킨다. 상기 TH17 세포는 환자의 내인성 세포 또는 환자의 ACT에 의해 제공되는 세포일 수 있다. 또 다른 예에서, 본 발명의 방법은 암 (예를 들어, 흑색종 또는 폐암, 예를 들어, NSCLC)을 앓는 환자에서 TH17 세포를 상향조절한다. 하나의 양상에서, 이것은 환자의 면역 체크포인트 길항작용 또는 효능작용 치료요법을 증진시킨다. 상기 TH17 세포는 환자의 내인성 세포 또는 환자의 ACT에 의해 제공되는 세포일 수 있다. 예를 들어, 상기 치료요법은 이필리무맙 (또는 YERVOYTM), 트레멜리무맙, 니볼루맙(또는 OPDIVOTM), 펨브롤리주맙 (또는 KEYTRUDATM), 피딜리주맙, BMS-936559, 두르발루맙 및 아테졸리주맙으로부터 선택된 항체를 사용한 항체 치료요법이다.
본 발명은 세균 또는 고세균 세포 집단 성장을 억제하거나, 인간의 장 내 미생물총에서 박테리오데테스(Bacteroidetes)(예를 들어, 박텔이데스(Bacteroides)), 피르미쿠테스(Firmicutes) 및/또는 그람 양성 또는 음성 세균의 비율의 변화를 위한 것과 같은, 식물, 효모, 환경, 토양, 인간 또는 동물 미생물총에서 세포의 하나 이상의 서브-집단의 상대적 비율을 변화시킴에 의해 제1 세포를 표적화하거나 장 내 불균형을 유발하기 위한 본 발명의 방법에 사용하기 위한 가이드된 뉴클레아제 시스템 (예를 들어, 가공된 CRISPR/Cas 시스템, TALEN, 메가뉴클레아제 및 아연 핑거 시스템), 어레이 (예를 들어, CRISPR 어레이), cRNA, gRNA 및 벡터 (예를 들어, 상기 시스템의 성분들을 포함하는 파아지)에 관한 것이다. 본 발명은, 예를 들어 숙주 세균 세포, 예를 들어, 박테로이데테스 세포 또는 피르미쿠테스 세포, 또는 숙주 고세균 세포의 하나 이상의 표적 게놈 또는 에피좀 뉴클레오타이드 서열을 변형시킴 (예를 들어, 절단하고/하거나 돌연변이시킴)을 포함한다. 하나의 예에서, 제1 세균은 병원성 장 내 세균이다.
2개의 주요 장 문(phyla)인 박테로이데테스 및 피르미쿠테스 각각의 수준이 인간 및 무균 쥐 둘 다에서 비만과 연관되어 있음을 지적하는 다수의 연구들이 있었다. 연구의 저자들은 탄수화물 대사가 중요한 인자인 것으로 추론한다. 이들은 비만 개체의 미생물총에는 피르미쿠테스 문의 세균들이 보다 과중하게 풍부하고 박테로이데테스는 적음을 관찰하였고 이들은 상기 세균 혼합물은 마른 개체(이들은 반대의 비율을 갖는다)의 미생물총 보다 소정의 다이어트로부터 에너지를 추출하는데 보다 효율적일 수 있음을 추측한다. 일부 연구에서, 이들은 박테로이데테스의 상대적 풍부함이 비만 개체가 체중 감량함에 따라 증가하고 추가로 비만 쥐의 미생물총이 무균 쥐로 전달되는 경우, 이들 쥐는 마른 쥐로부터 미생물총을 투여받은 대조군 그룹 보다 더 지방을 획득함을 밝혔다. 문헌 (예를 들어, Turnbaugh, P. J., R. E. Ley, M. A. Mahowald, V. Magrini, E. R. Mardis, and J. I. Gordon 2006, "An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest", Nature 444:1027-1131)을 참조한다. 추가의 양상에서, 본 발명은 예를 들어, 미생물총 내 박테로이데테스 대 피르미쿠테스의 비율을 증가시킴에 의해 환자의 항-비반 치료요법을 증진시키기 위한 수단으로서의 용도를 인지한다.
임의로, 제1 세포는 상이한 균주 또는 종의 세포의 존재에 있고, 여기서, 상기 상이한 세포는 엔테로박테리아세아 또는 인간 (예를 들어, 인간 장에서)과 함께 프로바이오틱, 공생 또는 심바이오틱인 세균이다. 하나의 예에서, 각각의 제1 세포는 피르미쿠테스, 예를 들어, 스트렙토코커스(Streptococcus) 세포이다.
하나의 예에서, 본 발명은 미생물총에서 표적 미생물을 선택적으로 사멸시키거나 하향조절할 수 있고, 그럼에도 불구하고 계통발생적으로 관련된 (16s rDNA에 의해 지적된 바와 같이) 동일한 종 또는 상이한 종의 제2 관련 균주는 표적화하지 않는다. 예를 들어, 미생물총은 제2 세균 종 또는 균주, 또는 고세균 종 또는 균주의 세포를 포함하고, 여기서, 상기 제2 종 또는 균주는 제1 세포 종 또는 균주의 16s 리보솜 RNA-암호화 DNA 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 16s 리보솜 RNA-암호화 DNA 서열을 갖고, 여기서, 상기 미생물총에서 제2 세포의 성장은 상기 방법에 의해 억제되지 않는다. 하나의 구현예에서, 제2 균주 또는 종의 성장은 억제되지 않거나; 상기 제1 세포의 성장은 제2 세포의 적어도 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 50x, 100x 또는 1000x 성장 억제에 의해 억제된다.
상기 방법의 하나의 양상에서, 장 내 불균형을 유발하거나 단계 (b)는 환자의 미생물총, 예를 들어, 장 내 미생물총에서 제1 세포 (숙주 세포)의 서브-집단의 비율을 변화시킴으로써 환자내 면역 세포 치료요법을 조절하는 변화된 장 내 미생물총을 생성함을 포함하고, 여기서, 상기 서브-집단은 제1 종 또는 균주의 숙주 세포를 포함하고, 상기 방법은 숙주 세포에서 각각의 표적 서열의 가이드된 뉴클레아제 (예를 들어, RNA-가이드된 뉴클레아제) 절단을 사용하여 상기 표적 서열을 변형시킴을 포함하고, 이에 의해 숙주 세포는 사멸되거나 숙주 세포 집단 성장은 감소됨으로써 미생물총에서 상기 서브-집단의 비율을 감소시킨다. 상기 가이드된 뉴클레아제 절단을 위해 적합한 시스템은 예를 들어, 가공된 CRISPR/Cas 시스템, TALEN, 메가뉴클레아제 및 아연 핑거 시스템이다. 예를 들어, 콘소시엄에서 선택된 인간 장 내 미생물총 세균 종의 CRISPR/Cas-매개된 가이드된 절단은 본원의 실시예에서 입증된다.
하나의 예에서, 상기 표적 서열 변형은:
a. 상기 미생물총과 숙주 변형 (HM) crRNA를 암호화하는 가공된 핵산 서열의 다중 카피와 조합하는 단계, 및
b. 숙주 세포에서 HM-crRNA를 발현하는 단계에 의해 수행되고,
여기서, 각각의 가공된 핵산 서열은 각각의 숙주 세포에서 Cas 뉴클레아제와 함께 작동할 수 있어 HM-CRISPR/Cas 시스템을 형성하고 상기 가공된 서열은
(i) HM-crRNA를 암호화하는 스페이서 및 반복 서열을 포함하고;
(ii) 상기 HM-crRNA는 숙주 세포 내 Cas 뉴클레아제를 표적 서열로 가이드하기 위해 숙주 세포 표적 서열에 하이브리드화할 수 있는 서열을 포함하고;
임의로 상기 Hm-시스템은 tracrRNA 서열 또는 tracrRNA 서열을 발현하는 DNA 서열을 포함하고;
이로써, HM-crRNA는 숙주 세포에서 숙주 표적 서열의 Cas 변형을 가이드하고, 이로써 숙주 세포는 사멸되거나 숙주 세포 집단 성장은 감소됨으로써 미생물총 내 상기 서브-집단의 비율을 감소시킨다.
대안적으로, HM-crRNA 및 tracrRNA는 단일 가이드 RNA (gRNA)에 의해 포함된다. 하나의 예에서, 각각의 가공된 핵산 서열은 각각의 벡터에 의해 포함되고, 여기서, 각각의 벡터는 임의로 플라스미드 (예를 들어, 숙주 세포로 전달할 수 있는 접합체 플라스미드), 파아지, 파아지미드 또는 프로파아지이다. 상기 파아지는 상기 숙주 세포를 감염시킬 수 있다.
하나의 예에서, 숙주 세포의 내인성 Cas 뉴클레아제는 표적 뉴클레오타이드 서열의 변형을 위해 사용된다. 하나의 구현예에서, 따라서 각각의 벡터는 Cas (예를 들어, Cas9) 뉴클레아제-암호화 서열이 부재이다. 내인성 Cas 뉴클레아제를 이용함에 의해, 본 발명의 구현예는 내인성 Cas 뉴클레아제 활성 (즉, 뉴클레아제 활성을 활성화시키거나 증진시키기 위한 숙주 세포의 사전 유전학적 변형이 필요 없다)을 사용한다. 따라서, 하나의 예에서, Cas 뉴클레아제는 숙주 세포의 야생형 유전자에 의해 암호화된다. 하나의 예에서, 뉴클레아제는 숙주 세포 내 내인성 Cas 뉴클레아제 (또는 Cas 뉴클레아제 유전자) 레프레서의 억제 없이 세포 사멸 또는 성장 감소를 성취하기 위해 활성이다. 따라서, 본 발명은 효과적인 Cas-매개된 세포 사멸 또는 성장 감소를 유발하기 위한 사전 조작 필요 없이 야생형 세균 집단을 사용할 수 있다. 따라서, 상기 집단은, 상기 집단이 이의 야생형 환경 (예를 들어, 식물, 효모, 환경, 토양, 인간 또는 동물 미생물총에 의해 포함되는 것과 같은)에 있을 때 cRNA에 노출될 수 있다.
하나의 예에서, cRNA 또는 gRNA는 점막, 장 내, 경구, 비강, 직장 내 또는 협측 투여에 의해 인간 또는 비인간 동물 환자로의 투여 (또는 여기에 투여되는)를 위한 것이다.
임의로 상기 Cas 뉴클레아제는 각각의 제1 세포의 내인성 II형 CRISPR/Cas 시스템에 의해 제공된다. 임의로, tracrRNA 서열 또는 tracrRNA 서열을 발현하는 DNA 서열은 각각의 숙주 세포에 내인성이다. 임의로, 각각의 표적 서열은 각각의 숙주 세포의 항생제 내성 유전자, 독성 유전자 또는 필수 유전자에 의해 포함되고, 예를 들어, 상기 표적 서열은 숙주 세포 간에 동일하다. 임의로, 상기 가공된 핵산 서열은 항생제 조성물에 의해 포함되고, 여기서, 상기 서열은 항생제 (제1 항생제)와 조합되고, 하나의 예에서 상기 표적 서열은 항생제 내성 유전자에 의해 포함되고, 여기서, 상기 항생제는 상기 제1 항생제이다. 상기 항생제 조성물은 장 내 불균형 또는 단계 (b)를 실행하기 위해 환자 또는 대상체에게 투여된다.
임의로, 각각의 숙주 세포는 목적하는 Hm-서열을 암호화하는 유리된 말단을 갖는 데옥시 리보핵산 가닥 (HM-DNA)을 포함하고/하거나 여기서 상기 방법은 상기 HM-DNA를 암호화하는 서열을 숙주 세포에 포함시키고, 여기서, 상기 HM-DNA는 HM-DNA를 숙주 게놈으로 (예를 들어, 염색체 또는 에피좀 부위에) 삽입하기 위한 표적 서열 내 또는 이를 플랭킹하는 서열 또는 서열들에 각각 상동성인 서열 또는 서열들을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 치료 또는 예방 방법을 수행하기 위해 제1 세포 (숙주 세포)로 도입하기 위한 벡터를 제공하고, 여기서, 각각의 벡터는: 내인성 CRISPR/Cas 시스템을 포함하는 세균 또는 고세균 숙주 세포를 변형시키기 위해 가공된 핵산 벡터, 장 내 불균형을 유발하는데 사용하기 위해 또는 상기 방법의 단계 (b)에 사용하기 위한 다수의 상이한 crRNA (예를 들어, gRNA)를 발현하기 위한 핵산 서열을 포함하는 벡터; 및 임의로 Cas 뉴클레아제를 암호화하는 핵산이 부재인 벡터가 있고, 여기서, 제1의 상기 crRNA는 상기 숙주 세포에서 제1 핵산 서열과 하이브리드화할 수 있고; 제2의 상기 crRNA는 상기 숙주 세포에서 제2 핵산 서열과 하이브리드화할 수 있고, 여기서, 상기 제2 서열은 상기 제1 서열과는 상이하고;
a. 상기 제1 서열은 항생제 내성 유전자 (또는 이의 RNA)에 의해 포함되고 상기 제2 서열은 항생제 내성 유전자 (또는 이의 RNA)에 의해 포함되고; 임의로 여기서, 상기 유전자들은 상이하고;
b. 상기 제1 서열은 항생제 내성 유전자 (또는 이의 RNA)에 의해 포함되고 상기 제2 서열은 필수 또는 독성 유전자 (또는 이의 RNA)에 의해 포함되고;
c. 상기 제1 서열은 필수 유전자 (또는 이의 RNA)에 의해 포함되고 상기 제2 서열은 필수 또는 독성 유전자 (또는 이의 RNA)에 의해 포함되거나;
d. 상기 제1 서열은 독성 유전자 (또는 이의 RNA)에 의해 포함되고 상기 제2 서열은 필수 또는 독성 유전자 (또는 이의 RNA)에 의해 포함된다.
각각의 벡터는 상기된 바와 같을 수 있고, 예를 들어, 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 파아지 또는 숙주 세포로 도입될 수 있는 접합성 플라스미드가 있다. 하나의 예에서, 상기 벡터는 항생제 (예를 들어, 베타-락탐 항생제)와 조합된다.
각각의 제1 세포 (숙주 세포)는 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 살모넬라(Salmonella), 리스테리아(Listeria), 이. 콜라이(E coli), 데설포비브리오(Desulfovibrio) 또는 클로스트리디움(Clostridium) 숙주 세포일 수 있다. 하나의 예에서, 각각의 제1 세포 (숙주 세포)는 피르미쿠테스(Firmicutes) 세포, 예를 들어, 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 리스테리아(Listeria) 또는 클로스트리디움(Clostridium) 세포이다.
하나의 예에서, 각각의 가공된 핵산 서열은 숙주 세포에서 각각의 crRNA (예를 들어, 단일 가이드 RNA에 의해 포함되는)의 발현 및 생성을 위한 서열 R1-S1-R1'를 포함하고, (i) 여기서, R1은 제1 CRISPR 반복체이고, R1'은 제2 CRISPR 반복체이고, R1 또는 R1'은 임의의 것이고; (ii) S1은 상기 표적 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 제1 CRISPR 스페이서이다.
하나의 예에서, R1 및 R1'은 숙주 세포 종의 CRISPR 어레이의 제1 및 제2 반복 서열과 각각 적어도 95% 동일하다. 하나의 예에서, R1 및 R1'는 상기 종의, 예를 들어, 상기 종의 상기 숙주 세포의 CRISPR 어레이의 제1 (5'-최외곽) 및 제2 (제1 반복체의 3'에 바로 인접한 반복체) 반복체 서열과 각각 적어도 95% (예를 들어, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 동일하다. 하나의 예에서, R1 및 R1'은 상기 숙주 세포에서 표적을 변형시키기 위한 II형 Cas9 뉴클레아제 (예를 들어, 에스 써모필러스(S thermophilus), 에스 피로게네스(S pyogenes) 또는 에스 아우레우스(S aureus Cas 9) 또는 I형 Cas3과 함께 기능성이다.
하나의 양상에서, 상기 방법은 실험 실시예에 의해 입증된 바와 같이 하기의 용도를 포함한다:
상기 집단의 성장을 억제하기 위한 제1 세포 (숙주 세포) 집단의 야생형 내인성 Cas 뉴클레아제 활성의 용도 (여기서, 각각의 숙주 세포는 야생형 Cas 뉴클레아제 활성을 갖는 내인성 CRISPR/Cas 시스템을 갖는다), 상기 집단의 숙주 세포를 형질전환시킴을 포함하는 용도 (여기서, 각각의 형질전환된 숙주 세포는 숙주 세포에서 (HM) cRNA 또는 가이드 RNA (gRNA)를 변형시키는 숙주를 제공하기 위한 가공된 뉴클레오타이드 서열로 형질전환시키고, 상기 HM-cRNA 또는 gRNA는 내인성 Cas를 표적으로 가이드하기 위해 숙주 세포 표적 프로토스페이서 서열과 하이브리드화할 수 있는 서열을 포함하고, 여기서, cRNA 또는 gRNA는 야생형 뉴클레아제 활성을 갖는 숙주 세포의 내인성 Cas 뉴클레아제와 동족성이고 숙주 세포 형질전환 후 집단의 성장은 억제된다).
"동족성"이란 내인성 Cas가 숙주 세포에서 표적으로 가이드될 crRNA 또는 gRNA 서열과 작동할 수 있는 것으로 의도된다. 당업자는 상기 Cas 가이딩이 일반적으로 세균 및 고세균 세포에서 CRISPR/Cas 활성, 예를 들어, 내인성 활성 야생형 CRISPR/Cas 시스템을 갖는 세균 또는 고세균 세포에서 야생형 CRISPR/Cas 활성의 특성임을 이해할 것이다.
"야생형" Cas 활성이란 당업자에게 자명한 바와 같이 내인성 Cas가 가공된 Cas가 아니거나 상기 세포는 내인성 Cas 활성을 활성화시키기 위해 가공되지 않은 것으로 의도된다. 이것은 Cas 뉴클레아제 활성이 천연적으로 억제되는 특정 세균과 대조적이다 (즉, 본 발명을 위해 유용한 야생형 Cas 뉴클레아제 활성은 없거나 부재이고, 이것은 반대로 예를 들어 내인성 Cas 활성이 세포 집단 성장 억제를 실행하기 위해 사용될 수 있는 동일계 야생형 숙주 세포를 해결하기 위해 적용될 수 있다).
하기 실시예에서, 억제는 고체 표면 상의 세균 집단 (그람 양성 피르미쿠테스)에서 나타났다. 숙주 세포 집단 성장의 >10-배 억제가 성취되었다. 표적화는 항생제 내성 유전자 및 필수 유전자로 지시되었다. 표면 상의 숙주 세포 성장을 억제하는 본 발명의 능력의 입증은 본 발명이 인간 또는 동물 대상체에서 본원에 기재된 바와 같이 미생물총에 의해 매개되거나 유발되는 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하기 위한 것인 구현예에서 중요하고 바람직할 수 있다. 상기 미생물총은 전형적으로 대상체의 조직 (예를 들어, 장 내 조직)과 접촉한 상태로 있고 따라서 본원 발명자는 표면 상의 미생물총 세균 종 (스트렙토코커스에 의해 예시되는)의 성장을 억제하는 활성의 입증이 상기 용도를 지지하는 것으로 믿는다. 식물 표면 상에서 미생물총의 표적화는 또한 목적하는 적용이다.
하나의 예에서, 제1 세포 (숙주 세포) 집단의 억제는 상기 가공된 뉴클레오타이드 서열에 노출되지 않은 동일한 종 또는 균주의 세포의 성장과 비교하여 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10-배이다. 예를 들어, 성장 억제는 숙주 세포의 제1 샘플 (단독으로 또는 혼합 세균 집단, 예를 들어, 치료 후 환자의 미생물총 대변 샘플에서)의 보다 낮은 세균 콜로니 수에 의해 지적되고 숙주 세포의 제2 샘플 (단독으로 또는 혼합 세균 집단, 예를 들어, 치료 전 환자의 미생물총 또는 대변 샘플에서)의 콜로니 수와 비교하여 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10-배이고, 여기서, 상기 제1 세포는 상기 가공된 뉴클레오타이드 서열에 의해 형질전환되었지만 상기 제2 샘플은 상기 가공된 뉴클레오타이드 서열에 노출되지 않았다. 하나의 구현예에서, 콜로니 계수는 제1 샘플이 상기 가공된 서열에 노출된 후 12, 24, 36 또는 48시간째에 결정한다. 하나의 구현예에서, 상기 콜로니는 시험관내 고체 한천 상에서(예를 들어, 페트리 디쉬에서) 성장시킨다. 따라서, 제1 (숙주) 세포 또는 집단의 성장에서의 감소 (치료 부재와 비교하여 <100% 성장, 즉, 대조군 샘플 성장)에 의해 지적될 수 있거나 상기 성장의 완전한 배제일 수 있다. 하나의 예에서, 숙주 세포 집단의 성장은 즉, 소정의 기간 (예를 들어, 숙주 세포에서 cRNA 또는 gRNA, TALEN, 메가뉴클레아제, 아연 핑거 등과의 조합 후 24시간 또는 48시간) 동안 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 95%까지 감소하고, 즉, 숙주 세포 집단의 성장은 상기 cRNA 또는 gRNA 등에 노출되지 않았지만 다르게는 상기 소정의 지속 기간 동안 동일한 조건하에 유지되는 대조군 숙주 세포 집단의 성장 보다 적어도 낮은 %이다. 하나의 구현예에서, 성장의 % 감소는 상기 기간 말기에서 (예를 들어, 대조군 샘플의 중간-대수 증식 단계의 시점에서) 각각의 집단의 샘플 중 콜로니 수를 비교함에 의해 결정한다. 예를 들어, 제로 시점에서 상기 시험 집단을 crRNA 또는 gRNA 등에 노출시킨 후, 상기 시험 및 대조군 집단의 샘플을 취하고 각각의 샘플을 한천 플레이트 상에 도말하고 상기 소정의 기간 동안 동일한 조건하에서 항온처리한다. 기간 말기에, 각각의 샘플의 콜로니 수를 계수하고 % 차이를 구한다 (즉, 시험 콜로니 수를 대조군 콜로니 수로 나누고 이어서 100을 곱한 다음 상기 결과를 100으로부터 공제하여 % 성장 감소를 구한다). 상기 배수 차이는 상기 대조군 콜로니 수를 시험 콜로니 수로 나누어 계산한다.
집단 성장의 억제는 따라서 집단 중 제1 (숙주) 세포 수의 증식에서의 감소에 의해 지적될 수 있다. 이것은 표적 프로토스페이서 서열에 대한 뉴클레아제의 작용에 의해 뉴클레아제에 의한 및/또는 숙주 세포 증식 (분열 및/또는 세포 성장)의 하향조절에 의한 세포 사멸 때문일 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 치료 또는 예방의 구현예에서, 인간 또는 동물 대상체의 숙주 세포 부하량은 감소됨으로써 상기 질환 또는 병태는 치료되거나 (예를 들어, 감소되거나 제거된다), 예방되거나 (즉, 대상체가 상기 질환 또는 병태를 발병할 위험), 감소되거나, 제거된다.
하나의 예에서, 야생형 숙주 세포 내인성 Cas9 또는 cfp1 활성이 사용된다. 하나의 예에서, 야생형 숙주 세포 내인성 Cas3 및/또는 CASCADE 활성이 사용된다. 상기 가공된 뉴클레오타이드 서열은 외인성 Cas 뉴클레아제-암호화 서열과의 조합이 아닐 수 있다. 임의로, 상기 Cas 뉴클레아제는 닉카제이다.
하나의 예에서, 상기 숙주 세포의 세균 콜로니의 형성은 상기 장 내 불균형 또는 단계 (b) 후 억제된다. 하나의 예에서, 상기 숙주 세포의 증식은 상기 장 내 불균형 또는 단계 (b) 후 억제된다. 하나의 예에서, 상기 숙주 세포는 상기 장 내 불균형 또는 단계 (b) 후 사멸된다.
또 다른 양상에서, 상기 방법은 상기 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하기 위한 상기 장 내 불균형을 유발하는 단계 또는 단계 (b)를 위해 환자에게 투여하기 위한 생체외 약물을 생성함을 포함하고, 여기서, 상기 약물은 변형된 혼합 세균 집단 (예를 들어, 하나 이상의 인간 공여자 또는 상기 환자의 대변 또는 장 내 미생물총으로부터 수득됨)을 포함하고, 여기서, 상기 변형된 집단은 상기 환자에게 투여되어 상기 장 내 불균형을 유발하거나 단계 (b)에서 환자의 장 내 미생물총에서 종 또는 균주의 균형을 변화시킴으로써 상기 장 내 미생물총에서 제1 세포의 비율을 변화시킨다. 상기 변형된 혼합된 집단은 본원에 기재된 바와 같은 가이드된 뉴클레아제 약물 기술을 사용하여 생체외에서 제조될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 상기 방법은 혼합 집단에서 특이적 피르미쿠테스 서브-집단의 비율을 감소시키고 박테로이데테스를 그대로 유지하기 위해, 예를 들어, 본원에 기재된 대사적 또는 GI 병태 또는 질환을 치료하거나 예방하기 위한 약물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방식으로, 본 발명은 상기 용도를 위해 또는 인간 또는 동물에서 상기 치료 또는 예방을 위해 변형된 세균 이식체 (예를 들어, 변형된 대변 이식체) 약물을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 의학적 용도 (예를 들어, 대사적 병태 (비만 또는 당뇨병과 같은) 또는 GI관 병태 (예를 들어, 본원에서 언급된 임의의 병태) 또는 암 (예를 들어, GI관 암)의 치료 또는 예방)를 위해 인간 또는 동물에게 투여하기 위한 변형된 세균 수거물을 생산하기 위해 시험관내 하나 이상의 미생물총을 변형시키는데 사용될 수 있다. 하나의 예에서, 본원에 기재된 바와 같은 가공된 핵산 서열을 포함하는 파아지 또는 플라스미드 벡터를 사용한 세균 세포의 형질전환은 시험관내에서 수행되거나, 상기 가공된 뉴클레오타이드 서열은 숙주 세포로 전기천공된 핵산에 의해 포함된다. 하나의 예에서, 핵산은 RNA (예를 들어, gRNA 카피물)이다. 또 다른 예에서, 핵산은 숙주 세포에서 이의 발현을 위해 crRNA 또는 gRNA를 암호화하는 DNA이다.
따라서, 하나의 예에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 식물, 효모, 환경, 토양, 인간 또는 동물 대상체의 미생물총에 의해 포함된 야생형 세균 숙주 세포의 집단에서 (HM) cRNA 또는 가이드 RNA (gRNA)를 변형시키는 숙주 세포를 제공하기 위한 가공된 뉴클레오타이드 서열을 제공하고, 상기 cRNA 또는 gRNA는 Cas를 상기 표적에 가이드하기 위한 숙주 세포 표적 프로토스페이서 서열과 하이브리드화할 수 있는 서열을 포함하고, 여기서, 상기 cRNA 또는 gRNA는 야생형 뉴클레아제 활성을 갖는 내인성 숙주 세포 Cas 뉴클레아제와 동족성이고, 숙주 세포의 형질전환 후, 집단의 성장은 억제되고 상기 질환 또는 병태는 치료되거나 예방되거나 치료요법 또는 치료는 조절된다.
하나의 예에서, 상기 가공된 뉴클레오타이드 서열은 HM-CRISPR 어레이를 포함한다. 하나의 예에서, 상기 가공된 뉴클레오타이드 서열은 단일 가이드 RNA를 암호화한다. 하나의 예에서, 상기 가공된 뉴클레오타이드 서열은 가이드 RNA (예를 들어, 단일 가이드 RNA) 또는 crRNA이다. 하나의 예에서, 상기 가공된 서열은 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 박테리오파아지에 의해 포함되고, 여기서, 상기 형질전환은 박테리오파아지에 의한 숙주 세포의 형질도입을 포함한다. 박테리오파아지는 본원에 기재된 바와 같은 파아지일 수 있다. 하나의 예에서, 상기 가공된 뉴클레오타이드 서열은 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있는 플라스미드 (예를 들어, 접합성 플라스미드)에 의해 포함된다. 상기 플라스미드는 본원에 기재된 바와 같은 플라스미드일 수 있다. 하나의 예에서, 상기 가공된 뉴클레오타이드 서열은 숙주 세포로 전달될 수 있고/있거나 이들 세포 간에 전달될 수 있는 트랜스포존에 의해 포함된다. 상기 트랜스포존은 본원에 기재된 바와 같은 트랜스포존일 수 있다.
본 발명의 임의의 방법은 세포에서 cRNA 또는 gRNA를 생산하기 위해 숙주 세포를 핵산 벡터로 형질전환시킴을 포함할 수 있다. 예를 들어, 가공된 뉴클레오타이트 서열을 포함하는 벡터 또는 핵산은 경구로, 정맥내로, 국소적으로, 눈으로, 비강내로, 흡입에 의해, 직장 투여에 의해 또는 본원에 기재되거나 다른 임의의 투여 경로로 환자에게 투여되고, 여기서, 상기 투여는 제1 (숙주) 세포를 벡터 또는 핵산으로 형질전환시킨다.
하나의 예에서, 제1 세균은 환자 또는 대상체의 미생물총에서 제2 세균과 혼합된다. 임의로, 제2 세균 종은 하기 실시예 보여지는 바와 같이 이. 콜라이(E coli), 엘. 락티스(L lactis) 또는 에스. 써모필러스(S thermophilus)이고, 이것은 인간 및 동물 장 내 미생물총에서 공생하여 공존하는 균주들이다. 상기 예는 또한 혼합된 그람 양성 및 그람 음성 세균 집단에서 표적화를 다룬다. 추가로, 상기 예는 피르미쿠테스(Firmicutes)(에스. 써모필러스(S thermophilus))의 집단 및 엔테로박테리아세아(Enterobacteriaceae) (이. 콜라이)의 집단을 다루고, 이들 둘 다는 인간 미생물총에서 발견된다. 엔테로박테리아세아(Enterobacteriaceae)의 다른 예는 살모넬라(Salmonella), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 클레브시엘라(Klebsiella), 쉬겔라(Shigella), 프로테우스(Proteus), 엔테로박터(Enterobacter), 세라티아(Serratia), 및 시트로박터(Citrobacter)이다.
하나의 예에서, 병태 또는 질환은 대사적 또는 위장 질환 또는 병태, 예를 들어, 비만, IBD, IBS, 크론 질환 또는 궤양성 대장염이다. 하나의 예에서, 병태 또는 질환은 암, 예를 들어, 고형 종양 또는 GI 암(예를 들어, 위암), 간암 또는 췌장암이다. 하나의 예에서, 상기 병태는 항생제 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 항생제)에 대해 내성 또는 감소된 반응이다.
하나의 예에서, 각각의 제1 (숙주) 세포는 세포에서 상기 HM-crRNA의 제조에서 가공된 서열과 작동할 수 있는 내인성 Rnase III를 포함한다. 대안적으로, 하나 이상의 벡터는 숙주 세포에서 RNase III의 발현을 위해 상기 RNase III를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
하나의 예에서, 상기 필수 유전자 (표적을 포함하는)는 세포의 DNA 폴리머라제를 암호화한다. 이것은 하기에 예시된다.
하나의 예에서, cRNA 또는 gRNA는 NGG, NAG, NGA, NGC, NGGNG, NNGRRT 또는 NNAGAAW 프로토스페이서 모티프 (PAM), 예를 들어, AAAGAAA 또는 TAAGAAA PAM (이들 서열은 5'에서 3'로 기재된다)에 인접한 숙주 세포 표적 프로토스페이서 서열에 하이브리드화할 수 있는 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, PAM은 프로토스페이서 서열의 3' 말단에 바로 인접해 있다. 하나의 예에서, Cas는 에스. 아우레우스(S aureus), 에스. 써모필러스(S theromophilus) 또는 에스 피오게네스(S pyogenes) Cas이다. 하나의 예에서, Cas는 Cpf1이고/이거나 PAM은 TTN 또는 CTA이다.
하나의 예에서, 각각의 가공된 뉴클레오타이드 서열 또는 벡터는 상기 CRISPR 어레이, 또는 상기 crRNA 또는 gRNA를 암호화하는 서열을 포함하고 추가로 항생제 내성 유전자 (예를 들어, 가나마이신 내성)을 포함하고, 여기서, 상기 HM-crRNA 또는 gRNA는 상기 항생제 내성 유전자를 표적화하지 않는다. 하나의 예에서, 상기 표적 서열은 숙주 세포의 항생제 내성 유전자에 의해 포함되고, 여기서, 상기 항생제는 제1 항생제 (예를 들어, 가나마이신)와 상이하다. 상기 방식으로, 상기 가공된 서열 또는 벡터는 자체의 표적화 없이 숙주를 표적화할 수 있다. 상기 숙주 세포를 제1 항생제에 노출시킴에 의해 (예를 들어, 이를 환자에게 경구적으로 또는 정맥내 투여함에 의해), 양성 선택압에 의해 가공된 서열 또는 벡터의 보유를 촉진시킬 수 있는데, 그 이유는 제1 항생제 내성 유전자를 함유하는 세포가 제1 항생제의 존재하에 생존 이점을 가질 것이기 때문이다 (가공된 서열 또는 벡터에 의해 형질전환되지 않은 숙주 세포가 제1 항생제에 내성이 아닌 경우). 따라서, 하나의 예는 다음을 제공한다: 본 발명의 방법은 숙주 세포내 cRNA 또는 gRNA-암호화 서열의 유지를 촉진시키기 위해, 상기 제1 (숙주) 세포 집단을 상기 항생제 (예를 들어, 가나마이신) 및 상기 가공된 서열 또는 벡터(들)에 노출시킴을 포함하거나; 본 발명의 상기 가공된 서열, 어레이 또는 벡터는 상기 항생제와 조합된다.
하나의 예에서, cRNA 또는 gRNA를 암호화하는 서열은 숙주 세포 종에서 작동할 수 있는 항상성 프로모터 (예를 들어, 강한 프로모터) 또는 유도성 프로모터하에 있다.
하나의 예에서, 상기 또는 각각의 제1 (숙주) 세포는 그람 양성 세포이다. 또 다른 예에서, 상기 또는 각각의 제1 (숙주) 세포는 그람 양성 세포이다.
본 발명은 또한 다음을 제공한다: 상기 방법을 수행한 후 환자로부터 장 내 미생물총 샘플의 단리에 의해 또는 상기 방법을 수행한 후 환자의 대변 샘플의 단리에 의해 상기 방법에 의해 수득될 수 있는 미생물총 세균의 생체외 혼합 집단. 하나의 예에서, 상기 혼합된 집단은 의학적 또는 영양학적 사용을 위해 컨테이너에 있다. 예를 들어, 상기 컨테이너는 멸균 컨테이너, 예를 들어, 흡입기, 비강내 전달 장치 또는 시린지 또는 IV 니들로 연결된 장치이다. 하나의 예에서, 상기 혼합 집단은 질환 또는 병태 (예를 들어, 본원에 기재된 질환 또는 병태)를 치료하기 위해 이의 미생물총을 거주시키기 위해 인간 또는 동물에게 투여하기 위해 유용하다.
본원에서, 하나의 예에서 박테로이데스(Bacteroides)는 카카에(caccae), 카필로서스(capillosus) , 셀룰로실리티쿠스(cellulosilyticus), 코프로콜라(coprocola), 코프로필루스(coprophilus), 코프로수이스(coprosuis), 디스타소니스(distasonis), 도레이(dorei), 에게르티(eggerthii), 파에시스(faecis), 피네골디(finegoldii), 플럭서스(fluxus), 프라갈리스(fragalis), 인테스티날리스(intestinalis), 멜라니노게니쿠스(melaninogenicus), 노르디(nordii), 올레이시플레누스(oleiciplenus), 오랄리스(oralis), 오바투스(ovatus), 펙티노필러스(pectinophilus), 플레베이우스(plebeius), 스터코리스(stercoris), 테타이오타오미크론(thetaiotaomicron), 유니포르미스(uniformis), 불가투스(vulgatus) 및 크실라니솔벤스(xylanisolvens)로부터 선택된 종이다. 예를 들어, 상기 박테로이데스(Bacteroides)는 테타이오타오미크론(thetaiotaomicron)이다. 하나의 예에서, 제1 (숙주 세포) 집단 또는 제2 세균은 다수의 상이한 박테리오이데테스(Bacteroidetes) 종, 또는 다수의 박테로이데스 종 (예를 들어, 비. 테타이오타오미크론(B thetaiotaomicron) 및 비. 프라가리스(B fragalis)를 포함함), 또는 박테로이데스 및 프레보텔라 종을 포함한다. 본원에서, 하나의 예에서, 프레보텔라(Prevotella)는 버겐시스(bergensis), 비비아(bivia), 부카에(buccae), 부칼리스(buccalis), 코프리(copri), 멜라니노겐시아(melaninogenica), 오리스(oris), 루미니콜라(ruminicola), 타네라에(tannerae), 티모넨시스(timonensis) 및 베로랄리스(veroralis)로부터 선택되는 종이다. 대안적으로, 제1 (숙주) 세포 또는 제2 세균은 예를 들어, 언에어로트룬쿠스(Anaerotruncus), 아세트언에어로박테리움(Acetanaerobacterium), 아세티토마쿨럼(Acetitomaculum), 아세티비브리오(Acetivibrio), 언에어로코커스(Anaerococcus), 언에어로필럼(Anaerofilum), 언에어로시누스(Anaerosinus), 언에어로스티페스(Anaerostipes), 언에어로보락스(Anaerovorax), 부티리비브리오(Butyrivibrio), 클로스트리디움(Clostridium), 카프라코커스(Capracoccus), 데할로박터(Dehalobacter), 디알리스터(Dialister), 도레아(Dorea), 엔테로코커스(Enterococcus), 에탄올리게넨스(Ethanoligenens), 파에칼리박테리움(Faecalibacterium), 푸소박테리움(Fusobacterium), 그라실리박터(Gracilibacter), 구겐헤이멜라(Guggenheimella), 헤스펠리아(Hespellia), 라흐노박테리움(Lachnobacterium), 라흐노스피라(Lachnospira), 락토바실러스(Lactobacillus), 류코노스톡(Leuconostoc), 메가모나스(Megamonas), 모리엘라(Moryella), 미트수오켈라(Mitsuokella), 오리박테리움(Oribacterium), 옥소박터(Oxobacter), 파필리박터(Papillibacter), 프로프리오니스피라(Proprionispira), 슈도부티리비브리오(Pseudobutyrivibrio), 슈도라미박터(Pseudoramibacter), 로세부리아(Roseburia), 루미노코커스(Ruminococcus), 사니카(Sarcina), 세이노넬라(Seinonella), 셔틀오르티아(Shuttleworthia), 스포로박터(Sporobacter), 스포로박테리움(Sporobacterium), 스트렙토코커스(Streptococcus), 서브돌리그라눌럼(Subdoligranulum), 신트로포코커스(Syntrophococcus), 써모바실러스(Thermobacillus), 투리박터(Turibacter) 및 웨이셀라(Weisella)로부터 선택되는 하나 이상의 피르미쿠테스(Firmicutes)를 포함하거나 이들로 이루어진 피르미쿠테스(Firmicutes) 세포이다. 하나의 예에서, 제1 (숙주) 세포 또는 제2 세균은 클로스트리디움(Clostridium) (예를 들어, 디피실(dificile)) 세포를 포함하거나 이들로 이루어진다 (및 임의로 다른 서브-집단은 박테로이데스(Bacteroides) (예를 들어, 테타이오타오미크론)세포로 이루어진다). 하나의 예에서, 제1 (숙주) 세포 또는 제2 세균은 엔테로코커스 (Enterococcus) 세포를 포함하거나 이것으로 이루어진다 (및 임의로 다른 세포는 박테로이데스(Bacteroides) (예를 들어, 테타이오타오미크론) 세포로 이루어진다). 하나의 예에서, 제1 (숙주) 세포 또는 제2 세균은 루미노코커스(Ruminococcus) 세포를 포함하거나 이것으로 이루어진다 (및 임의로 다른 세포는 박테로이데스(Bacteroides) (예를 들어, 테타이오타오미크론) 세포로 이루어진다). 하나의 예에서, 제1 (숙주) 세포 또는 제2 세균은 스트렙토코커스 (Streptococcus) 세포를 포함하거나 이것으로 이루어진다 (및 임의로 다른 세포는 박테로이데스(Bacteroides) (예를 들어, 테타이오타오미크론)세포로 이루어진다). 하나의 예에서, 제1 (숙주) 세포 또는 제2 세균은 패칼리박테리움 (Faecalibacterium) 세포를 포함하거나 이것으로 이루어진다 (및 임의로 다른 세포는 박테로이데스(Bacteroides) (예를 들어, 테타이오타오미크론) 세포로 이루어진다). 예를 들어, 상기 패칼리박테리움(Faecalibacterium)은 패칼리박테리움 프라우스니트지(Faecalibacterium prausnitzii) (예를 들어, A2-165, L2-6, M21/2 또는 SL3/3)이다.
하나의 예에서, 제1 (숙주) 세포 또는 제2 세균은 스트렙토코토코커스(Streptococcus) 세포 (임의로 에스. 써모필러스(S thermophilus) 및/또는 피오게네스(pyogenes) 세포)로 이루어지고 상기 제2 세균은 박테로이데스(Bacteroides) (예를 들어, 테타이오타오미크론(thetaiotaomicron)) 및/또는 엔테로박테리아세아 (Enterobacteriaceae) (예를 들어, 이. 콜라이) 세포로 이루어진다.
하나의 예에서, 제1 (숙주) 세포는 인간, 동물 (예를 들어, 비-인간 동물) 또는 식물의 감염성 질환 병원체이다.
하나의 예에서, 제1 (숙주) 세포는 에스케리치아(Escherichia) (예를 들어, 이. 콜라이 O157:H7 또는 O104: H4), 쉬겔라(Shigella) (예를 들어, 디센테리아 (dysenteriae)), 살모넬라 (Salmonella) (예를 들어, 티피(typhi) 또는 엔테리카 (enterica), 예를 들어, 혈청형 티피무리움 (typhimurium), 예를 들어, DT 104), 에르위니아(Erwinia), 예르시니아(Yersinia) (예를 들어, 페스티스 (pestis)), 바실러스(Bacillus), 비브리오(Vibrio), 레지오넬라(Legionella) (예를 들어, 뉴모필리아(pneumophilia)), 슈도모나스(Pseudomonas) (예를 들어, 아에루기노사(aeruginosa)), 나이세리아(Neisseria) (예를 들어, 고노로에아(gonnorrhoea) 또는 메닌기티디스(meningitidis)), 보르데텔라(Bordetella) (예를 들어, 퍼투서스(pertussus)), 헬리코박터(Helicobacter) (예를 들어, 파이롤리(pylori)), 리스테리아(Listeria) (예를 들어, 모노사이토게네스(monocytogenes)), 아그로박테리움(Agrobacterium), 스타필로코커스(Staphylococcus) (예를 들어, 아우레우스, 예를 들어, MRSA), 스트렙토코커스(Streptococcus) (예를 들어, 피오게네스(pyogenes) 또는 써모필러스(thermophilus)), 엔테로코커스(Enterococcus), 클로스트리디움(Clostridium) (예를 들어, 디피실(dificile) 또는 보툴리눔( botulinum)), 코리네박테리움(Corynebacterium) (예를 들어, 아미콜라툼(amycolatum)), 마이코박테리움(Mycobacterium) (예를 들어, 튜버쿨로시스(tuberculosis)), 트레포네마(Treponema), 보렐리아(Borrelia) (예를 들어, 부르그도르페리(burgdorferi)), 프란시셀라(Francisella), 브루셀라(Brucella), 캄필로박터(Campylobacter) (예를 들어, 이에이우니(jejuni)), 클렙시엘라(Klebsiella) (예를 들어, 뉴모니아(pneumoniae)), 프란키아(Frankia), 바토넬라(Bartonella), 리케치아(Rickettsia), 슈와넬라(Shewanella), 세라티아(Serratia), 엔테로박터(Enterobacter), 프로테우스(Proteus), 프로비덴시아(Providencia), 브로코트릭스(Brochothrix), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 브레비박테리움 (Brevibacterium), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 락토코커스 (Lactococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 페디오코커스(Pediococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 비브리오(Vibrio) (예를 들어, 콜레라(cholera), 예를 들어, O139, 또는 불니피쿠스(vulnificus)), 해모필러스(Haemophilus) (예를 들어, 인플루엔자(influenzae)), 브루셀라(Brucella) (예를 들어, 아보르투스(abortus)), 프란시스셀라(Franciscella), 크산토모나스(Xanthomonas), 에를리키아(Erlichia) (예를 들어, 샤펜시스(chaffeensis)), 클라미디아 (Chlamydia) (예를 들어, 뉴모니아(pneumoniae)), 파라키아미디아(Parachlamydia), 엔테로코커스(Enterococcus) (예를 들어, 패칼리스(faecalis) 또는 파세임(faceim), 예를 들어, 리네졸리드-내성), 오에노코커스(Oenococcus) 및 악시네토에박터(Acinetoebacter) (예를 들어, 바우만니(baumannii), 예를 들어, 다중 약물 내성)의 종으로부터 선택된다.
하나의 예에서, 제1 (숙주) 세포는 예를 들어, 메티실린, 반코마이신-내성 및 테이코플라닌으로부터 선택되는 항생제에 내성인 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 세포이다.
하나의 예에서, 제1 (숙주) 세포는 예를 들어, 세팔로스포린 (예를 들어, 세프타지딤), 카바페넴(carbapenems) (예를 들어, 이미페넴 또는 메로페넴), 플루오로퀴놀론(fluoroquinolone), 아미노글리코사이드 (예를 들어, 겐타마이신 또는 토브라마이신) 및 콜리스틴으로부터 선택되는 항생제에 내성인 슈도모나스 아에우로기노사(Pseudomonas aeuroginosa) 세포이다.
하나의 예에서, 제1 (숙주) 세포는 예를 들어, 카바페넴에 내성인 클렙시엘라(Klebsiella) (예를 들어, 뉴모니아(pneumoniae)) 세포이다.
하나의 예에서, 제1 (숙주) 세포는 예를 들어, 에리트로마이신, 클린다마이신, 베타-락탐, 마크롤리드, 아목시실린, 아지트로마이신 및 페니실린으로부터 선택되는 항생제에 내성인 스트렙토코커스(Streptoccocus) (예를 들어, 뉴모니아(pneumoniae) 또는 피오게네스(pyogenes)) 세포이다.
하나의 예에서, 제1 (숙주) 세포는 예를 들어, 세프트리악손, 아지트로마이신 및 시프로플록사신으로부터 선택되는 항생제에 내성인 살모넬라 (Salmonella)(예를 들어, 혈청형 타이피(Typhi) 세포이다.
하나의 예에서, 제1 (숙주) 세포는 예를 들어, 시프로플록사신 및 아지트로마이신으로부터 선택되는 항생제에 내성인 쉬겔라(Shigella) 세포이다.
하나의 예에서, 제1 (숙주) 세포는 예를 들어, 이소니아지드 (INH), 리팜피신 (RMP), 플루오로퀴놀론, 아미카신, 가나마이신 및 카프레오마이신에 대한 내성으로부터 선택되는 항생제에 내성인, 마이코박테리움 튜버쿨로시스(mycobacterium tuberculosis) 세포이다.
하나의 예에서, 제1 (숙주) 세포는 예를 들어, 반코마이신에 내성인 엔테로코커스(Enterococcus) 세포이다.
제13항의 방법에서, 모든 상기 숙주 세포는 예를 들어, 세팔로스포린 및 카바페넴으로부터 선택되는 항생제에 내성인 엔테로박테리아세아(Enterobacteriaceae) 세포이다.
하나의 예에서, 제1 (숙주) 세포는 예를 들어, 트리메토프림, 이트로푸란토인, 세팔렉신 및 아목시실린으로부터 선택되는 항생제에 내성인 이. 콜라이 세포이다.
하나의 예에서, 제1 (숙주) 세포는 예를 들어, 플루오로퀴놀론 항생제 및 카바페넴으로부터 선택되는 항생제에 내성인 클로스트리디움(Clostridium) (예를 들어, 디피실(dificile)) 세포이다.
하나의 예에서, 제1 (숙주) 세포는 예를 들어, 세픽심(예를 들어, 경구 세팔로스포린), 세프트리악손(주사가능한 세팔로스포린), 아지트로마이신 및 테트라사이클린으로부터 선택되는 항생제에 내성인 나이세리아 고노로에아(Neisseria gonnorrhoea) 세포이다.
하나의 예에서, 제1 (숙주) 세포는 예를 들어, 베타-락탐, 메로페넴 및 카바페넴으로부터 선택되는 항생제에 내성인 아시네토에박터 바만니(Acinetoebacter baumannii) 세포이다.
하나의 예에서, 제1 (숙주) 세포는 예를 들어, 시프로플록사신 및 아지트로마이신으로부터 선택되는 항생제에 내성인 캄필로박터(Campylobacter) 세포이다.
하나의 예에서, 상기 제2 종 또는 균주는 인간 장 내 공생 종 또는 균주 및/또는 인간 장 내 프로바이오틱 종 또는 균주이다.
하나의 예에서, 제2 종 또는 균주는 박테로이이데테스(Bacteroidetes)(예를 들어, 박테로이데스(Bacteroides))이고 임의로 상기 숙주 세포는 그람 양성 세균 세포이다.
하나의 예에서, 제1 세포는 피르미쿠테스(Firmicutes) 세포이다.
하나의 예에서, 상기 장 내 불균형을 유발하는 단계 또는 단계 (b)는 상기 면역 세포 집단과 동시에 또는 후속적으로 항-세균 또는 항-고세균 제제를 투여함에 의해 제1 세포가 사멸되거나 서브-집단 성장이 감소되어 환자의 장 내 미생물총에서 상기 서브-집단의 비율을 감소시킴에 의해 수행된다.
하나의 예에서, 상기 방법은 상기 가이드된 뉴클레아제 (예를 들어, Cas) 변형을 받지 않은 숙주 세포의 대조군 집단의 성장에 비해 적어도 5, 10, 20, 50 또는 100-배까지 제1 (숙주) 세포 집단 성장을 감소시킨다.
하나의 예에서, 상기 방법은 장 내 표면 상의 숙주 세포 집단 성장을 억제한다.
하나의 예에서, 각각의 숙주 세포에 대해, 상기 시스템은 (i) 내지 (iv)에 따른 성분을 포함한다:-
(i) Cas 뉴클레아제를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열;
(ii) 스페이서 서열 및 HM-crRNA를 암호화하는 반복체를 포함하는 가공된 HM-CRISPR 어레이(상기 HM-crRNA는 상기 Cas를 숙주 세포에서 표적으로 가이드하여 상기 표적 서열을 변형시키기 위해 숙주 세포 표적 서열을 하이브리드화하는 서열을 포함한다);
(iii) 임의의 tracrRNA 서열 또는 tracrRNA 서열을 발현하는 DNA 서열;
(iv) 여기서, 상기 시스템의 상기 성분들은 숙주 세포와 숙주 세포를 형질전환시키는 적어도 하나의 핵산 벡터 간에 스플릿되어 있어, 상기 숙주 세포 내 숙주 표적 서열을 변형시키기 위해 Cas를 상기 표적으로 가이드하는 HM-crRNA를 포함하고,
여기서, 상기 표적 서열은 Cas에 의해 변형됨으로써 상기 숙주 세포가 사멸되거나 숙주 세포 성장이 감소되고,
상기 방법은 (iv)의 벡터를 숙주 세포로 도입하고 숙주 세포 내에서 상기 HM-crRNA를 발현하여, 숙주 세포 내에서 Cas를 표적으로 가이드하여 표적 서열을 변형시키기 위해 숙주 세포 표적 서열에 HM-cRNA가 하이브리드화되도록 하여, 이로써 숙주 세포는 사멸되거나 숙주 세포 성장은 감소되어 미생물총에서 상기 서브-집단의 비율을 변화시킴을 포함한다.
하나의 예에서, 성분 (i)는 각각의 숙주 세포에 내인성이다.
하나의 예에서, 각각의 벡터는 바이러스 또는 파아지이다.
하나의 예에서, 각각의 표적 서열은 NNAGAAW 또는 NGGNG 프로토스페이서 인접한 모티프 (PAM)에 인접해 있다.
하나의 예에서, 대안적으로 HM-crRNA 및 tracrRNA는 단일 가이드 RNA (gRNA)에 의해 포함되고, 상기 방법은 상기 gRNA를 숙주 세포로 도입하거나 숙주 세포에서 상기 gRNA를 발현시킴을 포함한다.
하나의 예에서, 미생물총은 제2 세균 또는 고세균 종을 포함하고, 여기서, 상기 제1 및 제2 종 각각은 동일한 문(phylum)의 각각의 종 (예를 들어, 둘 다 피르미쿠테스 종)이고 상기 제2 세균의 성장은 HM-시스템에 의해 억제되지 않거나; 여기서, 상기 미생물총은 제2 세균 또는 고세균 균주를 포함하고, 여기서, 상기 제1 및 제2 세균 또는 고세균 각각은 동일한 종의 각각의 균주이고 상기 제2 세균 또는 고세균의 성장은 HM-시스템에 의해 억제되지 않는다.
하나의 예에서, 상기 미생물총은 제2 세균 종을 포함하고, 여기서, 제1 및 제2 종 각각은 각각 그람-양성 종이고 상기 제2 세균의 성장은 HM-시스템에 의해 억제되지 않는다.
하나의 예에서, 각각의 표적 서열은 숙주 세포의 항생제 내성 유전자, 독성 유전자 또는 필수 유전자에 의해 포함된다.
하나의 예에서, 각각의 제1 세포는 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 살모넬라(Salmonella), 리스테리아(Listeria), 이. 콜라이(E coli), 데설포비브리오(Desulfovibrio), 비브리오(Vibrio) 또는 클로스트로디움(Clostridium) 세포이다.
하나의 예에서, 장 내 불균형 또는 단계 (b)는 장 내 박테로이데스(Bacteroides) (예를 들어, 비 테타이오타미크론(B thetaiotamicron))에 의해 환자의 파네트(Paneth) 세포를 자극시킴을 포함하고, 여기서, 장 내 불균형 또는 단계 (b)에 의해 생성된 변화된 미생물총이 장 내 불균형 또는 단계 (b) 전의 미생물총과 비교하여 제1 세균 박테로이데스의 증가된 비율을 포함함으로써 파네트 세포가 자극되고 세포 치료요법은 조절된다.
박테로이데스(Bacteroides)는 파네트 세포 단백질의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 소장 크립트(crypt)는 죽은 그리고 융모로부터 상실된 상피 세포를 일정하게 보충하는 작용을 하는 줄기 세포를 수용한다. 파네트 세포 (호중구와 유사한 면역계 세포)는 이들 줄기 세포에 인접하게 위치하고 있고 다수의 항미생물 분자 (데펜신)를 크립트의 루멘으로 분비함에 의해 미생물로부터 상기 줄기 세포를 보호하고 이들의 보호 효과는 심지어 융모상으로 이동한 성숙한 세포에까지 확장될 수 있다. 동물 모델에서,　비. 테타이오타오마이크론(B. Thetaiotaomicron)은 특정 병원성 유기체 (예를 들어, 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)를 사멸시킬 수 있는 항생제 파네트 세포 단백질 (Ang4)의 생성을 자극할 수 있다. 리스테리아 모노사이토케네스(Listeria monocytogenes)는 강한 TH1 세포 유도제이고 따라서 본 발명의 특정 양상에서 파네트 세포를 자극함에 의해 이것은 TH1로부터 다른 세포 유형, 예를 들어, TH17로 면역력을 이동시키기 위해 유용할 수 있다. 이것은 본 발명의 면역 세포 치료요법을 증가시키거나 증진시키기 위해 유용할 수 있다. 예를 들어, 이것은 본 발명이 TH17-기반 세포 치료요법 (예를 들어, CAR-TH17)을 환자에게 투여함을 포함하는 경우 유용할 수 있다.
하나의 예에서, 장 내 불균형 또는 단계 (b)는 장 내 박테로이데스(Bacteroides) (예를 들어, 비 테타이오타미크론(B thetaiotamicron))에 대한 환자 내 면역 반응을 생성시킴을 포함하고, 여기서, 장 내 불균형 또는 단계 (b)에 의해 생성된 변화된 미생물총은 장 내 불균형 또는 단계 (b) 전의 미생물총과 비교하여 박테로이데스 제1 세균의 증가된 비율을 포함함으로써 세포 치료요법은 조절된다.
하나의 예에서, 장 내 불균형 또는 단계 (b)는 환자의 장 내 미생물총 내에 제1 세포의 상기 서브-집단의 상대적 비율을 변화시킴으로써 환자 내 면역 세포 치료요법을 조절하는 변화된 장 내 미생물총을 생성함을 포함하고, 여기서, 상기 장 내 불균형 또는 단계 (b)는 서브-집단에 의해 포함되는 제1 세포의 게놈을 표적화하는 가이드된 뉴클레아제를 사용함에 의해 상기 서브-집단의 제1 세포를 사멸시키거나 상기 서브-집단의 성장을 억제함을 포함한다.
본 발명은 또한 다음을 제공한다: 본 발명의 방법을 사용하여 환자에서 질환 또는 병태의 치료요법을 위해 환자에게 투여하기 위한 세균 또는 고세균 이식체. 임의로, 상기 이식체는 상기 제1 종의 세포를 포함한다. 임의로 상기 이식체는 상기 제2 종의 세포를 포함한다(그리고 제1 종의 세포를 포함하지 않는다).
본 발명은 또한 다음을 제공한다: 본 발명의 방법을 사용하여 이의 치료를 조절하기 위한 대상체 (예를 들어, 식물 또는 효모) 또는 토양 또는 환경에게 투여하기 위한 세균 또는 고세균 이식체. 임의로, 상기 이식체는 상기 제1 종의 세포를 포함한다. 임의로 상기 이식체는 상기 제2 종의 세포를 포함한다(그리고 제1 종의 세포를 포함하지 않는다).
하나의 예에서, 상기 효모는 동일한 종 또는 균주의 효모 세포의 집단을 포함한다. 예를 들어, 상기 효모는 미생물총에 의해 포함되고, 예를 들어, 상기 효모는 미생물총의 세포의 서브-집단을 포함하고, 예를 들어, 여기서, 상기 표적 세포는 또한 미생물총에 의해 포함되는 세균 또는 고세균 세포이다. 하나의 예에서, 상기 방법은 표적화된 세포 (예를 들어, 세균)를 사멸시키거나 미생물총에 의해 포함되는 표적 세포 서브-집단의 성장을 감소시키고, 여기서, 미생물총에서 표적 세포에 의한 하나 이상의 화학물질 또는 메신저의 방출 (또는 이의 농도)이 감소한다. 예를 들어, 미생물총의 미생물 (예를 들어, 세균)에서 쿼럼 센싱을 매개하는 하나 이상의 화학물질 또는 메신저는 감소한다. 이것은 미생물총에서 표적 세포 및/또는 다른 미생물 세포 집단의 성장을 형성하기 위해 유용할 수 있다. 하나의 예에서, 하나 이상의 화학물질 또는 메신저는 효모의 성장을 억제하거나 효모를 사멸시키고, 따라서, 미생물총 내 화학물질 또는 메신저(들)의 방출 또는 농도를 감소시키는 것은 미생물총에서 효모의 성장 및/또는 유지를 촉진시키기 위해 유리하다. 이들 예의 구현예에서, 상기 치료는 성장 촉진제를 갖는 효모의 영양물 또는 효모의 처리물이다(예를 들어, 여기서, 상기 효모는 식품 또는 음료 생산을 위한 것이거나, 항체와 같은 생물공학 또는 의학적 제품을 위한 것이고, 예를 들어, 상기 효모는 사카로마이세스(Saccharaomyces)이다). 또 다른 예에서, 화학물질 또는 메신저(들)은 효모 성장을 촉진시키고, 여기서, 상기 효모 처리물은 효모 사멸제 (예를 들어, 살진균제)를 사용한 처리물이다. 이것은 효모가 바람직하지 않은 경우(예를 들어, 바람직하지 않은 곰팡이), 사멸 치료의 효능을 촉진시키기 위해 유용하다. 하나의 예에서, 대상체가 식물인 경우, 하나 이상의 화학물질 또는 메신저는 식물의 성장을 억제하거나 식물을 사멸시키고, 따라서, 미생물총 내 화학물질 또는 메신저(들)의 방출 또는 농도를 감소시키는 것은 식물의 성장을 촉진시키고/시키거나 식물의 사멸을 억제하기 위해 유리하다. 이들 예의 하나의 구현예에서, 상기 처리물은 비교 또는 질소 고정제와 함께 식물의 영양물 또는 효모의 처리물이다. 하나의 구현예에서, 상기 처리물은 식물의 살충제 처리물이고, 예를 들어, 표적화된 미생물총 세포의 존재하에 억제되거나 감소된 처리물이다.
하나의 예에서, 상기 식물은 농작물 (예를 들어, 밀, 보리, 곡물 또는 가축 사료 식물), 과일 식물 (예를 들어, 사과, 오렌지, 귤, 라임, 레몬, 산딸기, 딸기, 베리 또는 바나나 식물), 콩과 식물, 사탕 수수 식물, 스파이스 식물, 가든 식물, 야채 식물, 잔디, 나무 또는 개화 식물이다. 예를 들어, 상기 식물은 덩이줄기 식물, 예를 들어, 토마토 또는 고구마 (예를 들어, 및 제1 숙주 또는 표적화된 세균은 펙토박테리움 아트로세피쿰(Pectobacterium atrosepticum) 세포이고, 임의로 여기서, 상기 처리는 저장(예를 들어, 냉각 저장), 세척, 살충제 또는 제초제 처리, 이의 농작물 (예를 들어, 감자 농작물)의 수정 또는 수화이다) . 예를 들어, 상기 식물은 담배 식물 (예를 들어, 및 제1 숙주 또는 표적화된 세균은 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum) 세포이고, 임의로 여기서, 상기 처리는 저장(예를 들어, 냉각 저장), 세척, 살충제 또는 제초제 처리, 이의 농작물(예를 들어, 담배잎 농작물)의 수정 또는 수화이다).
하나의 예에서, 대상체는 원생동물이다. 하나의 예에서, 대상체 또는 환자는 어류이다. 하나의 예에서, 대상체 또는 환자는 조류이다. 하나의 예에서, 대상체 또는 환자는 파충류이다. 하나의 예에서, 대상체 또는 환자는 거미류이다. 하나의 예에서, 대상체는 효모 세포 (예를 들어, 사카로마이세스(Saccharomyces) 세포)이다. 하나의 예에서, 대상체 또는 환자는 동물 (예를 들어, 설치류, 쥐 또는 래트)이다. 하나의 예에서, 대상체 또는 환자는 인간 (예를 들어, 배아 또는 배아가 아닌)이다. 하나의 예에서, 대상체 또는 환자는 반려 애완 동물 (예를 들어, 조류, 말, 개, 고양이 또는 토끼)이다. 하나의 예에서, 대상체 또는 환자는 곤충 (이의 생활주기의 임의의 단계에 있는 곤충, 예를 들어, 알, 유충 또는 번데기, 예를 들어, 파리 또는 기는 곤충 또는 딱정벌레)이다. 하나의 예에서, 대상체 또는 환자는 두족류 동물 또는 선충이다. 하나의 예에서, 대상체 또는 환자는 식물 또는 동물 해충이다. 하나의 예에서, 동물 또는 인간의 치료는 영양 치료, 질환 또는 병태의 치료요법, 질환 또는 병태의 치료요법, 질환 또는 병태의 예방, 안구 치료, 살충제 치료, 치과 치료, 국소적 치료 또는 분해 치료일 수 있다. 하나의 예에서, 상기 방법은 병원체(예를 들어, 병원성 기생충, 원생동물, 바이러스 또는 세균)에 대한 대상체 또는 환자의 면역력을 증진시킨다. 하나의 예에서, 상기 치료 또는 치료요법은 인간 또는 동물에 대해 수행되는 조합 치료 또는 치료요법이고, 여기서, 상기 인간 또는 동물에게 제2 약물처리 또는 방사선과 조합된 제1 약물처리가 적용된다. 상기 제1 및/또는 제2 약물처리는 항체 치료요법 또는 면역 세포 이식체(예를 들어, CAR-T 또는 TIL 이식체) 치료요법일 수 있다(그리고 본 발명의 면역 조절 양상은 상기 치료요법을 조절하기 위해 유리할 수 있다). 하나의 예에서, 각각의 약물처리 또는 치료는 표 2로부터 선택된다.
하나의 예에서, 상기 질환 또는 병태는 당뇨병(예를 들어, I형 또는 II형 당뇨병, 인슐린-내성 당뇨병 (예를 들어, 인슐린-내성 II형 당뇨병), 당뇨병 또는 전-당뇨병 환자에서 인슐린 내성의 개시 또는 당뇨병 또는 전-당뇨병 환자에서 인슐린 반응에서의 감소이다. 임의로 상기 예에 추가로, 표적화된 제1 또는 숙주 세포는 프레보텔라 코프리(Prevotella copri) 또는 박테로이데스 불가투스(Bacteroides vulgatus) 세포이다. 하나의 구현예에서, 프레보텔라 코프리(Prevotella copri) 및 박테로이데스 불가투스(Bacteroides vulgatus) 세포는 상기 환자에서 표적화되고(즉, 본원에 기재된 바와 같은 이식체의 투여 후 사멸되고/되거나 집단 성장이 감소되거나 미생물총에서 감소됨), 여기서, 상기 질환 또는 병태는 치료되거나 예방된다.
본 발명은 또한 다음을 제공한다: 본 발명의 방법을 사용하여 환자에서 질환 또는 병태의 치료요법을 위해 환자에게 투여하기 위한 HM-CRISPR/Cas 시스템, HM-어레이 또는 HM-crRNA.
본 발명은 또한 다음을 제공한다: 환자의 적응성 세포 치료요법을 위해 면역 세포의 생체외 집단을 포함하는 키트 (여기서, 상기 키트는 이식체, 시스템, 어레이 또는 crRNA를 포함하고, 임의로 상기 면역 세포는 CAR-T 세포, 가공된 T-세포 수용체 (TCR)을 발현하는 T-세포, 종양 침윤 림프구 (TIL) 및 NK 세포를 추가로 포함한다).
이동 유전학적 요소(MOBILE GENETIC ELEMENTS, MGEs )
하나의 예에서, 각각의 벡터는 이동 유전학적 요소 (MGE)를 포함하거나 이들로 이루어진 핵산 벡터이고, 여기서, 상기 MGE는 전달 오리진 (oriT) 및 숙주 세포에서 숙주 세포의 게놈 또는 바이러스의 게놈 (예를 들어, 프로파아지)의 표적 서열을 변형시키기 위한 CRISPR 어레이를 포함한다. MGE의 예는 ICE, 트랜스포존, 플라스미드 및 박테리오파아지이다. 전달 오리진 (oriT)은 접합 동안에 세균 숙주로부터 이를 함유하는 DNA의 수용자로의 전달을 위해 필요한 짧은 서열 (예를 들어, 500 bp 까지)이다. oriT 는 시스-작용한다 ― 동일한 DNA 상에서 전달되고 DNA와 함께 전달되는 것으로 밝혀졌다. 전형적인 전달 오리진은 3개의 기능적으로 한정된 도메인을 포함한다: 닉킹(nicking) 도메인, 전달 도메인 및 종결 (termination) 도메인.
ICEberg 데이터베이스 (http://db-mml.sjtu.edu.cn/ICEberg/)를 참조하고, 이는 본 발명을 위해 적합한 ICE 및 적합한 oriT를 위한 공급원의 예를 제공한다. 하나의 예에서, ICE는 그룹 1 내지 28로부터 선택된 ICE를 포함하는 ICE 계열의 구성원이거나 oriT는 상기 계열의 구성원의 oriT이다: 1=SXT/R391; 2=Tn916; 3=Tn4371; 4=CTnDOT/ERL; 5=ICEclc; 6=ICEBs1; 7=ICEHin1056; 8=PAPI-1; 9=ICEMlSym(R7A); 10=ICESt1; 11=SPI-7; 12=ICE6013; 13=ICEKp1; 14=TnGBS1; 15=Tn5253; 16=ICESa2603; 17=ICEYe1; 18=10270-RD.2; 19=Tn1207.3; 20=Tn1806; 21=ICEA5632; 22=ICEF-I/II; 23=ICEAPG2; 24=ICEM; 25=10270-RD.1; 26=Tn5801; 27=PPI-1; 28=ICEF-III. 계열 기재는 ICEberg 데이터베이스에서 발견된다. 예를 들어, Tn916 계열은 로버트 등(Roberts et al (2009))등에 의해 한정되었다 (문헌참조: Trends Microbiol. 2009 Jun;17(6):251-8. doi: 10.1016/j.tim.2009.03.002. Epub 2009 May 20; "A modular master on the move: the Tn916 family of mobile genetic elements", Roberts A, Mullany P). Tn916 계열에 속하는 요소들은 하기의 기준에 의해 한정된다: 이들은 문헌 (Roberts et al)에서 보여지는 일반 구성을 가져야만 하고 이들은 DNA 수준에서 본래의 Tn916과 서열 및 구조에서 유사한 코어 영역 (접합 및 조절 모듈)을 가져야만 한다. 예외는 일부 접합성 트랜스포존, 예를 들어, 상기 계열에서 이전에 분류된 Tn1549 및 상응하는 문헌에 기재된 바와 같은 고도의 단백질 유사성을 갖는 것들이다. 임의로, ICE는 트랜스포존, 예를 들어 접합성 트랜스포존이다. 하나의 예에서, MGE는 기능성 헬퍼 요소의 존재하에 이동가능한, 이동가능한 트랜스포존이고, 임의로 여기서, 상기 트랜스포존은 상기 헬퍼 요소와 조합된다.
임의로 상기 벡터는 플라스미드이고, 임의로 여기서, 상기 MGE는 플라스미드에 의해 포함된 트랜스포존이다. 예를 들어, 상기 트랜스포존은 접합성 트랜스포존이다. 하나의 예에서, 상기 트랜스포존은 이동가능한 트랜스포존 (예를 들어, 플라스미드에 의해, 예를 들어, 상기 플라스미드의 트랜스포존 서열 외부의 유전자에 의해 암호화된 하나 이상의 인자들을 사용하여 이동가능함)이다. 임의로, 상기 트랜스포존은 I형 트랜스포존이다. 임의로, 상기 트랜스포존은 II형 트랜스포존이다. 임의로, 상기 벡터 oriT는 박테로이데테스(Bacteroidetes)(예를 들어, 박테로이달레스(Bacteroidales) 또는 박테로이데스(Bacteroides)) 또는 프레보텔라(Prevotella) 트랜스포존의 oriT이다. 이것은 제1 (숙주) 세포가 각각 박테로이데테스(Bacteroidetes)(예를 들어, 박테로이달레스(Bacteroidales) 또는 박테로이데스(Bacteroides)) 또는 프레보텔라(Prevotella)인 경우 유용하다. 임의로, 상기 벡터 oriT는 CTnDot, CTnERL SXT/R391, Tn916 또는 Tn4371 계열 트랜스포존 oriT이다.
임의로, 상기 방법은 환자의 미생물총을, 제2 세균에서 작동할 수 있지만 제1 (숙주) 세포에서 작동가능하지 않거나 감소된 작동을 갖는 항-독소 유전자를 포함하는 독소-항독소 모듈을 포함하는 벡터 또는 MGE (예를 들어, 상기된 것)에 노출시킴을 포함한다. 따라서, 제1 세포는 사멸되고 제2 세균은 그대로 남아 있으므로, 환자의 미생물총에서 제1 세포의 비율을 변화시킨다.
스플릿 CRISPR/CAS 시스템
하나의 양상에서, 제1 (숙주) 세포의 내인성 Cas가 이용되고, 숙주 세포로 도입된 벡터 (예를 들어, 파아지)에 의해 포함되는 가공된 서열과 함께 작동한다. 상기 양상은 벡터, 예를 들어, 외인성 서열을 수행하기 위해 제한된 능력을 갖는 바이러스 또는 파아지에서 공간을 늘리는 것이 유리하다. 공간을 늘림에 의해, 숙주 내성을 회피하기 위해 유용한, 보다 많은 표적화 스페이서 또는 어레이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 특히 sp 또는 saCas9와 같은 벌크 Cas 서열을 위해, 벡터에서 이를 암호화하기 보다는 내인성 Cas 엔도뉴클레아제를 이용하는 것이 유리하다. 추가로, 비-숙주 공급원 기원의 일부 외인성 Cas와 함께 나타날 수 있는 바와 같은 열성의 상용성을 가질 기회는 없다. 바이러스, 예를 들어, 파아지 게놈 크기를 감소시키는 능력은 또한 숙주 세포 취득 (숙주 세포 내 바이러스의 감염 및/또는 유지)을 촉진시키기 위해 이로울 수 있다. 일부 예에서, 이점은 벡터(예를 들어, 파아지)에 의한 숙주의 공격이, 숙주가 공격하는 핵산에 대항하도록 하는 시도에서 숙주 Cas 뉴클레아제의 증가된 발현을 포함하여, 숙주 CRISPR/Cas 활성을 상향조절할 수 있다는 것이다. 이것은 그러나 또한, 이들이 숙주 Cas에 의해 인지되는 cRNA 또는 gRNA를 사용하는 경우 본 발명과 함께 사용하기 위한 내인성 Cas를 제공하기 위해 유용하다. 본 발명이 숙주 CRISPR 어레이를 표적화하는 cRNA 또는 gRNA를 포함하는 경우에, 이것은 이어서 숙주 CRISPR 어레이 자체의 불활성화를 촉진시키고, 이것은 자신의 CRISPR 시스템을 불활성화시키기 위해 자신의 Cas 뉴클레아제를 사용하는 "자살" 숙주 세포와 유사하다.
따라서, 벡터는 Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)-암호화 서열이 부재일 수 있다.
임의로, 상기 내인성 제1 (숙주) 세포 시스템은 CRISPR/Cas9 시스템이다. 임의로, 상기 뉴클레아제는 I형 Cas 뉴클레아제이다. 임의로, 상기 뉴클레아제는 II형 Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)이다. 임의로, 상기 뉴클레아제는 III형 Cas 뉴클레아제이다.
심지어 보다 많은 공간을 구하기 위해, 임의로 tracrRNA 서열은 벡터에 의해 제공되지 않지만 내인성 숙주 세포 CRISPR/Cas 시스템의 tracrRNA 서열이고, 여기서, 상기 tracrRNA는 Cas를 숙주 세포 내 표적으로 가이드하기 위해 성숙한 crRNA로의 후속적 프로세싱을 위한 세포내 HM-crRNA와 하이브리드화할 수 있다.
유전학적으로 적용될 수 있는 특성
하기의 특성은 본 발명의 임의의 구성 (예를 들어, 임의의 양상, 구현예, 개념, 문단 또는 예 중 어느 하나에서)에 적용한다:-
하나의 예에서, 표적 서열은 염색체 서열, 내인성 숙주 세포 서열, 야생형 숙주 세포 서열, 비-바이러스 염색체 숙주 세포 서열 및/또는 비-파아지 서열 (즉, 이들의 1개 초과 또는 전부)이고, 예를 들어, 상기 서열은 숙주 세포 염색체에 의해 포함되는 항생제 내성 유전자 또는 필수 유전자 서열로서와 같은 야생형 숙주 염색체 세포 서열이다. 하나의 예에서, 상기 서열은 숙주 세포 플라스미드 서열, 예를 들어, 항생제 내성 유전자 서열이다.
하나의 예에서, 적어도 2개의 표적 서열은 Cas, 예를 들어, 항생제 내성 유전자 및 필수 유전자에 의해 변형된다. 상기 방식의 다중 표적화는 회피 돌연변이체 숙주 세포의 진화를 감소시키기 위해 유용할 수 있다.
하나의 예에서, Cas는 야생형 내인성 숙주 세포 Cas 뉴클레아제이다. 하나의 예에서, 각각의 숙주 세포는 항상성 Cas 뉴클레아제 활성, 예를 들어, 항상성 야생형 Cas 뉴클레아제 활성을 갖는다. 하나의 예에서, 상기 숙주 세포는 세균 세포이고; 또 다른 예에서, 숙주 세포는 고세균 세포이다. 내인성 Cas의 사용은 이것이 벡터 cRNA 또는 gRNA에서 공간이 자유로워질 수 있도록 하기 때문에 유리하다. 예를 들어, II형 Cas9 뉴클레오타이드 서열은 대형이고 대신 숙주 세포의 내인성 Cas의 사용은 상기 경우에 II형 CRISPR/Cas 시스템이 본 발명에서 숙주 세포 변형을 위해 사용되는 경우 유리하다. 대부분의 통상적으로 사용되는 Cas9는 4.2 킬로베이스 (kb)인 것으로 측정되고 에스 피오게네스(S pyogenes)로부터 유래한다. 이것은 효율적인 뉴클레아제이지만, 분자의 길이는 벡터가 얼마나 많은 유전학적 물질을 수용할 수 있는지의 한계를 부과하여 생존 동물의 조직 및 본원에 기재된 다른 세팅에서 CRISPR을 사용하는 것에 대한 장벽을 생성한다 (참조: F.A. Ran et al., "In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9," Nature, doi:10.1038/nature14299, 2015). 따라서, 하나의 구현예에서, 본 발명의 벡터는 AAV 벡터이거나 AAV 벡터 이하의 외인성 DNA 삽입 능력을 갖고 Cas는 숙주 세포의 내인성 Cas이며, 상기 세포는 세균 또는 고세균 세포이다. 에스 써모필러스(S thermophilus) Cas9 (UniProtKB - G3ECR1 (CAS9_STRTR)) 뉴클레오타이드 서열은 1.4 kb의 크기를 갖는다.
하나의 예에서, 상기 벡터는 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터는 외인성 DNA 삽입에 대해 특히 제한된 능력을 갖고 따라서 바이러스 팩키징 능력은 고려될 필요가 있다. 필수 바이러스 기능을 암호화하는, 예를 들어, 코트 단백질 및 폴리머라제를 발현하기 위한 서열에 대한 공간이 있을 필요가 있다. 하나의 예에서, 벡터는 파아지 벡터 또는 AAV 또는 렌티바이러스 벡터이다. 파아지 벡터는 숙주가 세균 세포인 경우 유용하다.
용어 "가공된"이란, 본 발명의 어레이, 서열, 벡터, cRNA, gRNA, MGE 또는 임의의 다른 구성, 개념, 양상, 구현예, 문단 또는 예시 등은 천연적으로 존재하지 않는 것으로 당업자에게 용이하게 자명할 것이다. 예를 들어, MGE, 벡터, 서열 또는 어레이는 MEG, 벡터, 서열 또는 어레이의 다른 서열 또는 성분들과 함께 천연적으로 발견되지 않는 하나 이상의 서열 또는 성분들을 포함한다. 예를 들어, 어레이 또는 서열은 재조합, 인공, 합성 또는 각각의 숙주 세포에 대해 외인성(즉, 비-내인성 또는 비 야생형)이다.
하나의 예에서, 본 발명의 어레이 또는 서열은 단리된, 예를 들어, 숙주 세포로부터 단리된 어레이 또는 서열의 가공된 버전이다. 하나의 예에서, 가공된 어레이 또는 서열은 세포에서 천연적으로 발견되는 Cas 엔도뉴클레아제-암호화 서열과 조합되지 않는다.
연구는 박테로이데스(Bacteroides)가 클로스트리디움 디시필(Clostridium difficile)에 의한 감염을 예방하는 역할을 함을 시사한다. 잠재적 병원체의 진입 및 증식을 제한하는 면역 반응의 생성은 비. 프라길리스(B fragilis)에 상당히 의존한다 또한, 파네트 세포 단백질은 비. 테타이오토마이크론(B thetaiotomicron)에 의한 자극에 응답하여 항세균 펩타이드를 생성할 수 있고, 이들 분자는 장 내에 병원체가 군집화하는 것을 예방할 수 있다. 추가로, 비. 테타이오토마이크론(B thetaiotomicron)은 그람-양성 유기체의 펩티도글리칸에 결합함에 의해 이의 항미생물 효과를 발휘하는 살균 렉틴, RegIII를 파네트 세포가 생성하도록 유도할 수 있다. 따라서, 환자의 미생물총에서 박테로이데스(Bacteroides)(예를 들어, 테타이오토마이크론(thetaiotomicron) 및/또는 프라갈리스(fragalis))의 생성을 증가시키기 위한 임의의 구성에 본 발명의 사용은 인간 또는 비-인간 동물의 내장에서 집단의 병원성 세균 군집화를 제한하기 위해 유용하다
후퍼 등(Hooper et al)은 비. 테타이오토마이크론(B thetaiotomicron)이 푸코스 억제 유전자 및 신호전달 시스템에 의해 매개되는 복잡한 상호작용에서 장 푸코실화를 변형시킬 수 있음을 입증하였다. 전사 분석을 사용하여, 비. 테타이오타오마이크론(B thetaiotaomicron)이 영양물 흡수, 점막 장벽 요새화 및 혈관형성 인자의 생성에 관여하는 것들을 포함하는 다양한 숙주 유전자의 발현을 조절할 수 있는 것으로 결정되었다.
임의로, 숙주 (또는 제1 및/또는 제2 세균)는 그람 음성 세균 (예를 들어, 스피릴라(spirilla) 또는 비브리오(vibrio))이다. 임의로, 숙주 (또는 제1 및/또는 제2 세균)는 그람 양성 세균이다. 임의로, 숙주 (또는 제1 및/또는 제2 세균)는 마이코플라스마(mycoplasma), 클라미디아(chlamydiae), 스피로케테(spirochete) 또는 마이코박테리움(mycobacterium)이다. 임의로, 숙주 (또는 제1 및/또는 제2 세균)는 스트렙토코커스(Streptococcus) (예를 들어, 피오게네스(pyogenes) 또는 서모필러스(thermophilus)) 숙주이다. 임의로, 숙주 (또는 제1 및/또는 제2 세균)는 스타필로코커스(Staphylococcus)(예를 들어, 아우레우스(aureus), 예를 들어, MRSA) 숙주이다. 임의로, 숙주 (또는 제1 및/또는 제2 세균)는 이. 콜라이(E. coli)(예를 들어, O157: H7) 숙주이고, 예를 들어, 여기서, 상기 Cas는 벡터에 의해 암호화되거나 내인성 숙주 Cas 뉴클레아제 활성은 탈억제된다. 임의로, 숙주 (또는 제1 및/또는 제2 세균)는 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들어, 아에루기노사(aeruginosa)) 숙주이다. 임의로, 숙주 (또는 제1 및/또는 제2 세균)는 비브로(Vibro) (예를 들어, 콜레라(cholerae)(예를 들어, O139) 또는 불니피쿠스(vulnificus) 숙주이다. 임의로, 숙주 (또는 제1 및/또는 제2 세균)는 나이세리아(Neisseria)(예를 들어, 고노로에아(gonnorrhoeae) 또는 메닌기티디스(meningitidis)) 숙주이다. 임의로, 숙주 (또는 제1 및/또는 제2 세균)는 보르데텔라(Bordetella)(예를 들어, 퍼투시스(pertussis)) 숙주이다. 임의로, 숙주 (또는 제1 및/또는 제2 세균)는 해모필러스(Haemophilus)(예를 들어, 인플루엔자(influenzae)) 숙주이다. 임의로, 숙주 (또는 제1 및/또는 제2 세균)는 쉬겔라(Shigella) (예를 들어, 디센테리아(dysenteriae)) 숙주이다. 임의로, 숙주 (또는 제1 및/또는 제2 세균)는 브루셀라(Brucella) (예를 들어, 아보르투스(abortus)) 숙주이다. 임의로, 숙주 (또는 제1 및/또는 제2 세균)는 프란시셀라(Francisella) 숙주이다. 임의로, 숙주 (또는 제1 및/또는 제2 세균)는 산토모나스(Xanthomonas) 숙주이다. 임의로, 숙주 (또는 제1 및/또는 제2 세균)는 아그로박테리움(Agrobacterium) 숙주이다. 임의로, 숙주 (또는 제1 및/또는 제2 세균)는 에르위니아(Erwinia) 숙주이다. 임의로, 숙주 (또는 제1 및/또는 제2 세균)는 레지오넬라(Legionella) (예를 들어, 뉴모필라(pneumophila)) 숙주이다. 임의로, 숙주 (또는 제1 및/또는 제2 세균)는 리스테리아(Listeria)(예를 들어, 모노사이토게네스(monocytogenes)) 숙주이다. 임의로, 숙주 (또는 제1 및/또는 제2 세균)는 캄필로박터(Campylobacter)(예를 들어, 제주니(jejuni)) 숙주이다. 임의로, 숙주 (또는 제1 및/또는 제2 세균)는 예르시니아(Yersinia)(예를 들어, 페스티스(pestis)) 숙주이다. 임의로, 숙주 (또는 제1 및/또는 제2 세균)는 보렐리아(Borelia) (예를 들어, 부르그도르페리(burgdorferi)) 숙주이다. 임의로, 숙주 (또는 제1 및/또는 제2 세균)는 헬리코박터(Helicobacter) (예를 들어, 파이롤리(pylori)) 숙주이다. 임의로, 숙주 (또는 제1 및/또는 제2 세균)는 클로스트리디움(Clostridium) (예를 들어, 디피실(dificile) 또는 보툴리눔(botulinum)) 숙주이다. 임의로, 숙주 (또는 제1 및/또는 제2 세균)는 에를리키아(Erlichia) (예를 들어, 샤펜시스(chaffeensis)) 숙주이다. 임의로, 숙주 (또는 제1 및/또는 제2 세균)는 살모넬라(Salmonella) (예를 들어, 타이피(typhi) 또는 엔테리카(enterica) 예를 들어, 혈청형 타이피무리움(typhimurium), 예를 들어, DT 104) 숙주이다. 임의로, 숙주 (또는 제1 및/또는 제2 세균)는 클라미디아(Chlamydia)(예를 들어, 뉴모니아(pneumoniae)) 숙주이다. 임의로, 숙주 (또는 제1 및/또는 제2 세균)는 파라키아미디아(Parachlamydia) 숙주이다. 임의로, 숙주 (또는 제1 및/또는 제2 세균)는 코리네박테리움(Corynebacterium)(예를 들어, 아마이코라툼(amycolatum)) 숙주이다. 임의로, 숙주 (또는 제1 및/또는 제2 세균)는 클레브시엘라(Klebsiella) (예를 들어, 뉴모니아(pneumoniae)) 숙주이다. 임의로, 숙주 (또는 제1 및/또는 제2 세균)는 엔테로코커스(Enterococcus) (예를 들어, 패칼리스(faecalis) 또는 파에심(faecim) 예를 들어, 라인졸리드-내성) 숙주이다. 임의로, 숙주 (또는 제1 및/또는 제2 세균)는 아시네토박터(Acinetobacter) (예를 들어, 바우마니(baumannii), 예를 들어, 다중 약물 내성) 숙주이다.
tracrRNA 서열은 예를 들어, tracrRNA를 사용하지 않는 유형의 Cas 시스템에 대해 본 발명의 어레이 또는 벡터로부터 생략될 수 있다.
하나의 예에서, 표적으로 가이드된 Cas는 엑소뉴클레아제이다. 임의로 상기 언급된 바와 같은 닉카제는 이중 닉카제이다. 닉카제의 하나의 예는 Cas9 닉카제, 즉, 불활성화된 2개의 도메인 중 하나 - RuvC 및/또는 HNH 도메인을 갖는 Cas9이다.
본원에서 벡터 DNA를 사용하는 것에 대한 언급은 또한 대안적 구현예에서 뮤타티스 뮤타티스(mutatis mutandis)를 문맥이 허용하는 경우 벡터 RNA에 적용할 수 있다. 예를 들어, 여기서, 상기 벡터는 RNA 벡터이다. 본 발명의 모든 특성은 따라서 대안적으로 기재되고 문맥이 허용하는 경우 본원에서 벡터 DNA를 언급하는 경우 "DNA" 대신 "RNA"로서 판독된다. 하나의 예에서, 벡터 또는 각각의 벡터는 또한 역전사효소를 암호화한다.
하나의 예에서, 어레이 또는 가공된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 각각은 나노입자 벡터에 의해 또는 리포좀으로 제공된다.
하나의 예에서, Cas는, 절단을 표적을 활성화시키기 위해 전사 활성화 인자에 접합된 죽은 Cas(dCas)를 방해하기 위해 dCas를 절단시키는 Cas 뉴클레아제이다.
하나의 예에서, 어레이 또는 가공된 서열 또는 이의 각각은 숙주에서 crRNA 또는 gRNA의 전사를 위해 기능성인 외인성 프로모터를 포함한다.
하나의 구현예에서, 어레이 또는 가공된 서열은 바이로파아지(virophage) 벡터에 함유되고 상기 숙주는 대안적으로 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스이다. 예를 들어, 상기 숙주는 아메바 세포를 감염시킬 수 있는 대형 바이러스이다. 예를 들어, 숙주는 스퍼트닉(Sputnik) 바이러스, 피토바이러스(Pithovirus), 미미바이러스(mimivirus), 마마바이러스(mamavirus), 메가바이러스(Megavirus) 또는 판도라바이러스(Pandoravirus)이고, 예를 들어, 상기 숙주 바이러스는 물에 있다. 상기 구현예의 하나의 예에서, 본 발명은 물 또는 오물 처리 (예를 들어, 정제, 예를 들어, 수로, 강, 호수, 연못 또는 바다 처리)를 위한 것이다.
하나의 구현예에서, 벡터 또는 가공된 서열 또는 이의 각각은 φNM1 파아지이거나 이에 의해 포함되고, 예를 들어, 숙주 세포(들)은 에스. 아우레우스(S. aureus) (예를 들어, MRSA) 세포이다.
예를 들어, 상기 방법은 포유동물 대상체, 예를 들어, 인간, 설치류, 쥐 또는 래트에 대해 수행된다. 예를 들어, 상기 방법은 척추동물, 파충류. 조류 또는 어류에 대해 수행된다.
세포 집단은 하나 이상의 용량으로 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 상기 장 내 불균형을 유발하기 위해 항세균제를 투여하거나, 세균 이식체를 환자에게 투여하여 상기 장 내 불균형을 유발함을 포함한다.
여기서, 상기 방법은 세포 치료요법을 감소시키고, 상기 치료요법은 햐향조절하거나, 약화시키거나 중단하여 세포 치료요법의 원치 않는 부작용 (예를 들어, CRS와 같은 인간 환자에서 CAR-T 치료요법 부작용)을 감소시키거나 예방할 수 있다. 여기서, 상기 방법은 상기 세포 치료요법을 증가시키고, 상기 치료요법은 상향조절하거나, 증진시키거나 가동시켜 예를 들어, 하나의 표적 세포에 대한 세포독성을 증진시킬 수 있다.
상기 방법은 질환 또는 병태를 치료하거나 예방(즉, 이의 위험을 감소시키는)한다. 이것은 완전하거나 부분적 치료 또는 예방, 즉, 질환/병태 또는 이의 증상의 감소이지만 완전한 감소는 아니거나; 질환/병태 또는 이의 증상의 위험의 감소이지만 완전한 예방은 아닐 수 있다. 유사하게, 상기 방법은 질환 또는 병태의 목적하지 않는 증상 또는 치료요법 (예를 들어, CRS)을 치료하거나 예방한다(즉, 이의 위험을 감소시킨다).
개념:
1. 환자에서 질환 또는 병태의 적응성 면역 세포 치료요법을 조절하는 방법으로서, 상기 방법이
a. 상기 환자에게 면역 세포 집단을 투여함을 포함하는, 상기 환자에서 적응성 면역 세포 치료요법을 수행하고, 여기서, 상기 면역 세포의 투여는 상기 환자에서 질환 또는 병태를 치료할 수 있고;
b. 상기 환자에서 세균 미생물총(예를 들어, 장 내 미생물총) 장 내 불균형을 유발하여, 상기 장 내 불균형이 상기 환자에서 면역 치료요법을 조절함을 포함하는 방법.　
2. 환자에서 질환 또는 병태의 적응성 면역 세포 치료요법을 조절하는 방법으로서, 상기 방법이
a. 상기 환자에게 면역 세포 집단을 투여함을 포함하는, 상기 환자에서 적응성 면역 세포 치료요법을 수행하고, 여기서, 상기 면역 세포의 투여는 상기 환자에서 질환 또는 병태를 치료할 수 있고;
b. 환자의 미생물총 (예를 들어, 장 내 미생물총)에서 제1 세균 종 또는 균주, 또는 고세균 종 또는 균주의 세포의 서브-집단의 상대적 비율을 변화시킴으로써 상기 환자에서 상기 면역 세포 치료요법을 조절하는 변화된 미생물총을 생성함을 포함하는 방법.
3. 개념 2에 있어서, 단계 (b)가 상기 면역 세포 집단과 동시에 또는 이에 후속적으로 항-세균 또는 항-고세균 제제를 투여함에 의해 제1 세포의 서브-집단을 표적화함으로써 제1 세포가 사멸되거나 서브-집단 성장이 감소됨으로써 환자의 미생물총에서 상기 서브-집단의 비율을 감소시킴에 의해 수행되는, 방법.
4. 이전의 개념 중 하나에서, 상기 세포 치료요법이 적응성 T-세포 치료요법인, 방법.
5. 개념 4에 있어서, CD4+ T-세포, CD8+ T-세포, TH1 세포 및 TH17 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 세포가 단계 (a)에서 환자에게 투여되는, 방법.
6. 개념 4 또는 5에 있어서, TH17 세포가 환자에서 조절되는, 방법.
7. 개념 4, 5 또는 6에 있어서, Treg 세포가 환자에서 조절되는, 방법.
8. 임의의 이전의 개념에 있어서, 상기 세포 치료요법이 증진되는, 방법.
9. 임의의 이전의 개념에 있어서, TH17 세포가 환자에서 상향조절되고/되거나 Treg 세포가 환자에서 하향조절되는, 방법.
10. 임의의 이전의 개념에 있어서, CD4+ T-세포가 환자에서 상향조절되는, 방법.
11. 임의의 이전의 개념에 있어서, CD8+ T-세포가 환자에서 상향조절되는, 방법.
12. 임의의 이전의 개념에 있어서, 하나 이상의 중추 기억 T 세포 (TCM), 이펙터 기억 T 세포 (TEM), 줄기 세포 기억 세포 (TSCM) 및 이펙터 세포 (Teff)가 환자에서 상향조절되고, 여기서, 상기 세포가 단계 (a)에서 투여되는 면역 세포 집단 및/또는 이의 후손에 포함되는, 방법.
13. 개념 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 치료요법이 감소되는, 방법.
14. 개념 13에 있어서, 상기 방법이 환자에서 사이토킨 방출 증후군 (CRS)의 위험을 감소시키거나 상기 증후군을 예방하는, 방법.
15. 개념 1 내지 7, 13 및 14 중 어느 하나에 있어서, TH17 세포가 환자에서 하향조절되고/되거나 Treg 세포가 환자에서 상향조절되는, 방법.
16. 개념 1 내지 7 및 13 내지 15 중 어느 하나에 있어서, CD4+ T-세포가 환자에서 하향조절되는, 방법.
17. 개념 1 내지 7 및 13 내지 16 중 어느 하나에 있어서, CD8+ T-세포가 환자에서 하향조절되는, 방법.
18. 개념 1 내지 7 및 13 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 중추 기억 T 세포 (TCM), 이펙터 기억 T 세포 (TEM), 줄기 세포 기억 세포 (TSCM) 및 이펙터 세포 (Teff)가 환자에서 하향조절되고, 여기서, 상기 세포가 단계 (a)에서 투여되는 면역 세포 집단 및/또는 이의 후손에 포함되는, 방법.
19. 임의의 이전의 개념에 있어서, 상기 면역 세포 집단이 가공된 T-세포 수용체 (TCR) 및/또는 종양 침윤 림프구 (TIL)를 발현하는 CAR-T 세포 및/또는 T-세포를 포함하는, 방법.
20. 임의의 이전의 개념에 있어서, 상기 면역 세포 집단이 가공된 자가조직 또는 동종이계 면역 세포, 예를 들어, T-세포, NK 세포 및/또는 TIL을 포함하는, 방법.
21. 개념 19 또는 20에 있어서, 상기 T-세포가 CD4+ T-세포 또는 TH17 세포인, 방법.
22. 임의의 이전의 개념에 있어서, 단계 (b)가 미생물총에서 박테로이데스 (Bacteroides) (예를 들어, 비 프라갈리스(B fragalis) 및/또는 비 테타이오타미크론(B thetaiotamicron))의 비율을 증가시키는, 방법.
23. 개념 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 단계 (b)가 미생물총에서 박테로이데스(Bacteroides) (예를 들어, 비 프라갈리스(B fragalis) 및/또는 비 테타이오타미크론(B thetaiotamicron))의 비율을 감소시키는, 방법.
24. 임의의 이전의 개념에 있어서, 단계 (b)가 미생물총에서 피르미쿠테스(Firmicutes)에 대한 박테로이데스(Bacteroides)의 비율을 증가시키는, 방법.
25. 개념 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 단계 (b)가 미생물총에서 피르미쿠테스(Firmicutes)에 대한 박테로이데스(Bacteroides)의 비율을 감소시키는, 방법.
26. 임의의 이전의 개념에 있어서, 단계 (b)가 미생물총에서 하나 이상의 클로스트리디움 종 또는 균주 (예를 들어, 각각의 종은 클러스터 IV 또는 XIVa 클로스트리디움 종이다)의 비율을 감소시키는, 방법.
27. 개념 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 단계 (b)가 미생물총에서 하나 이상의 클로스트리디움 종 또는 균주 (예를 들어, 각각의 종은 클러스터 IV 또는 XIVa 클로스트리디움 종이다)의 비율을 증가시키는, 방법.
28. 임의의 이전의 개념에 있어서, 단계 (b)가 미생물총에서 비피도박테리움(Bifidobacterium)(예를 들어, 비. 비피둠(B bifidum))의 비율을 감소시키는, 방법.
29. 개념 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 단계 (b)가 미생물총에서 비피도박테리움(Bifidobacterium)(예를 들어, 비. 비피둠(B bifidum))의 비율을 증가시키는, 방법.
30. 임의의 이전의 개념에 있어서, 단계 (b)가 환자의 미생물총에서 제1 세포의 상기 서브-집단의 상대적 비율을 변화시켜 상기 환자에서 면역 세포 치료요법을 조절하는 변화된 미생물총을 생성함을 포함하고, 여기서, 상기 서브-집단이 상기 제1 종 또는 균주의 숙주 세포를 포함하고, 상기 방법이
a. 상기 미생물총과 숙주 변형 (HM) crRNA를 암호화하는 가공된 핵산 서열의 다중 카피와 조합하는 단계, 및
b. 숙주 세포에서 HM-crRNA를 발현하는 단계를 포함하고,
여기서, 각각의 가공된 핵산 서열은 각각의 숙주 세포에서 Cas 뉴클레아제와 함께 작동할 수 있어 HM-CRISPR/Cas 시스템을 형성하고 상기 가공된 서열은
(iii) HM-crRNA를 암호화하는 스페이서 및 반복 서열을 포함하고;
(iv) 상기 HM-crRNA는 숙주 세포 내 Cas 뉴클레아제를 표적 서열로 가이드하기 위해 숙주 세포 표적 서열에 하이브리드화할 수 있는 서열을 포함하고;
임의로 상기 HM-시스템은 tracrRNA 서열 또는 tracrRNA 서열을 발현하는 DNA 서열을 포함하고;
이로써, HM-crRNA는 숙주 세포에서 숙주 표적 서열의 Cas 변형을 가이드하고, 이로써 숙주 세포는 사멸되거나 숙주 세포 집단 성장은 감소됨으로써 미생물총 내 상기 서브-집단의 비율을 감소시키는, 방법.
31. 개념 30에 있어서, 표적 뉴클레오타이드 서열의 변형을 위해 숙주 세포의 내인성 Cas 뉴클레아제를 사용함을 포함하는, 방법.
32. 개념 30 또는 31에 있어서, 상기 Cas 변형을 받지 않은 숙주 세포의 대조군 집단의 성장과 비교하여 적어도 5배까지 숙주 세포 집단 성장을 감소시킴을 포함하는, 방법.
33. 개념 30 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 장 내 표면 상에 숙주 세포 집단 성장을 억제함을 포함하는, 방법.
34. 개념 30 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 상기 미생물총이 제2 세균 종 또는 균주, 또는 고세균 종 또는 균주의 세포를 포함하고, 상기 제2 종 또는 균주가 상기 숙주 세포 종 또는 균주의 16s 리보솜 RNA-암호화 DNA 서열과 적어도 80% 동일한 16s 리보솜 RNA-암호화 DNA 서열을 갖고, 상기 미생물총에서 상기 제2 세포의 성장이 상기 HM-시스템에 의해 억제되지 않는, 방법.
35. 개념 34에 있어서, 상기 제2 종 또는 균주가 인간 장 내 공생 종 또는 균주 및/또는 인간 장 내 프로바오이틱 종 또는 균주인, 방법.
36. 개념 34 또는 35에 있어서, 상기 제2 종 또는 균주가 박테로이데테스(Bacteroidetes)(예를 들어, 박테로이데스(Bacteroides))이고 임의로 상기 숙주 세포가 그람 양성 세균 세포인, 방법.
37. 개념 30 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 세포가 피르미쿠테스(Firmicutes) 세포인, 방법.
38. 개념 30 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 각각의 숙주 세포에 대해 상기 시스템이 (i) 내지 (iv)에 따른 성분들을 포함하는 방법으로서,
(i) Cas 뉴클레아제를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열;
(ii) 스페이서 서열 및 HM-crRNA를 암호화하는 반복체를 포함하는 가공된 HM-CRISPR 어레이(상기 HM-crRNA는 상기 Cas를 숙주 세포에서 표적으로 가이드하여 상기 표적 서열을 변형시키기 위해 숙주 세포 표적 서열을 하이브리드화하는 서열을 포함한다);
(iii) 임의의 tracrRNA 서열 또는 tracrRNA 서열을 발현하는 DNA 서열;
(iv) 여기서, 상기 시스템의 상기 성분들은 숙주 세포와 숙주 세포를 형질전환시키는 적어도 하나의 핵산 벡터 간에 스플릿되어 있어, 상기 숙주 세포 내 숙주 표적 서열을 변형시키기 위해 Cas를 상기 표적으로 가이드하는 HM-crRNA를 포함하고,
여기서, 상기 표적 서열은 Cas에 의해 변형됨으로써 상기 숙주 세포가 사멸되거나 숙주 세포 성장이 감소되고,
상기 방법은 (iv)의 벡터를 숙주 세포로 도입하고 숙주 세포 내에서 상기 HM-crRNA를 발현하여, 숙주 세포 내에서 Cas를 표적으로 가이드하여 표적 서열을 변형시키기 위해 숙주 세포 표적 서열에 HM-cRNA가 하이브리드화되도록 하여, 이로써 숙주 세포는 사멸되거나 숙주 세포 성장은 감소되어 미생물총에서 상기 서브-집단의 비율을 변화시킴을 포함하는, 방법.
39. 개념 38에 있어서, 성분 (i)가 각각의 숙주 세포에 내인성인, 방법.
40. 개념 38 또는 39에 있어서, 각각의 벡터가 바이러스 또는 파아지인, 방법.
41. 개념 30 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 각각의 표적 서열이 NNAGAAW 또는 NGGNG 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 인접해 있는, 방법.
42. 개념 30 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 대안적으로 HM-crRNA 및 tracrRNA가 단일 가이드 RNA (gRNA)에 의해 포함되고, 상기 gRNA를 숙주 세포에 도입하거나 숙주 세포에서 상기 gRNA를 발현시킴을 포함하는, 방법.
43. 개념 30 내지 35 및 37 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 미생물총이 제2 세균 또는 고세균 종을 포함하고, 상기 제1 및 제2 종의 각각이 동일한 문(phylum) (예를 들어, 둘 다 피르미쿠테스(Firmicutes) 종)의 각각의 종이고 제2 세균의 성장이 HM-시스템에 의해 억제되지 않거나; 상기 미생물총이 제2 세균 또는 고세균 균주를 포함하고, 상기 제1 및 제2 세균 또는 고세균 각각이 동일한 종의 각각의 균주이고 상기 제2 세균 또는 고세균의 성장이 HM-시스템에 의해 억제되지 않는, 방법.
44. 개념 30 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 상기 미생물총이 제2 세균 종을 포함하고, 상기 제1 및 제2 종 각각이 각각의 그람-양성 종이고 상기 제2 세균의 성장이 HM-시스템에 의해 억제되지 않는, 방법.
45. 개념 30 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 각각의 표적 서열이 숙주 세포의 항생제 내성 유전자, 독성 유전자 또는 필수 유전자에 의해 포함되는, 방법.
46. 임의의 이전의 개념에 있어서, 각각의 제1 세포가 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 살모넬라(Salmonella), 리스테리아(Listeria), 이. 콜라이(E coli), 데설포비브리오(Desulfovibrio), 비브리오(Vibrio) 또는 클로스트리디움(Clostridium) 세포인, 방법.
47. 임의의 이전의 개념에 있어서, 단계 (b)가 장 내 벡터로이데스(Bacteroides) (예를 들어, 비. 테타이오타마이신(B thetaiotamicron))에 의해 환자의 파네트 세포를 자극함을 포함하고, 단계 (b)에 의해 생성되는 상기 변화된 미생물총이 단계 (b) 전의 미생물총과 비교하여 박테로이데스 제1 세균의 증가된 비율을 포함하여 파네트 세포가 자극되고 상기 세포 치료요법이 조절되는, 방법.
48. 임의의 이전의 개념에 있어서, 단계 (b)가 장 내 벡터로이데스(Bacteroides) (예를 들어, 비. 테타이오타마이신(B thetaiotamicron))에 대한 환자 내 면역 반응을 생성함을 포함하고, 단계 (b)에 의해 생성되는 상기 변화된 미생물총이 단계 (b) 전의 미생물총과 비교하여 박테로이데스 제1 세균의 증가된 비율을 포함하여 상기 세포 치료요법이 조절되는, 방법.
49. 임의의 이전의 개념에 있어서, 단계 (b)가 환자의 미생물총에서 제1 세포의 상기 서브-집단의 상대적 비율을 변화시켜 상기 환자에서 면역 세포 치료요법을 조절하는 변화된 미생물총을 생성함을 포함하고, 여기서, 단계 (b)가 상기 서브-집단의 제1 세포를 사멸시키거나 상기 서브-집단에 의해 포함되는 제1 세포의 게놈을 표적화하는 가이드된 뉴클레아제를 사용함에 의해 상기 서브-집단의 성장을 억제함을 포함하는, 방법.
50. 임의의 이전의 개념의 방법을 사용하여 환자에서 질환 또는 병태의 치료를 위해 환자에게 투여하기 위한 세균 또는 고세균 이식체로서, 임의로 상기 이식체가 상기 제1 종의 세포를 포함하는, 세균 또는 고세균 이식체.
51. 개념 1 내지 49 중 어느 하나의 방법을 사용하여 환자에서 질환 또는 병태의 치료요법을 위해 환자에게 투여하기 위한 개념 30 내지 45 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 HM-CRISPR/Cas 시스템, HM-어레이 또는 HM-crRNA.
52. 환자의 적응성 세포 치료요법을 위해 면역 세포의 생체외 집단을 포함하는 키트로서, 상기 키트가 개념 50 또는 51의 이식체, 시스템, 어레이 또는 crRNA를 추가로 포함하고, 임의로 상기 면역 세포가 CAR-T 세포, 가공된 T-세포 수용체 (TCR)를 발현하는 T-세포, 종양 침윤 림프구 (TIL) 및 NK 세포로부터 선택되는, 키트.
양상:
1. 환자에서 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하기 위한 환자의 적응성 세포 치료요법의 방법에 사용하기 위한 면역 세포의 생체외 집단으로서, 상기 방법이
a. 상기 환자에게 상기 집단의 세포를 투여함을 포함하는, 상기 환자에서 적응성 면역 세포 치료요법을 수행하고, 여기서, 상기 면역 세포의 투여는 상기 환자에서 질환 또는 병태를 치료할 수 있고;
b. 상기 환자에서 장 내 세균 미생물총 장 내 불균형을 유발하여, 상기 장 내 불균형이 상기 환자에서 면역 세포 치료요법을 조절하고 상기 질환 또는 병태가 치료되거나 예방됨을 포함하는, 면역 세포의 생체외 집단.　
2. 환자에서 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하기 위한 환자의 적응성 세포 치료요법의 방법에 사용하기 위한 면역 세포의 생체외 집단으로서, 상기 방법이
a. 상기 환자에게 상기 집단의 세포를 투여함을 포함하는, 상기 환자에서 적응성 면역 세포 치료요법을 수행하고, 여기서, 상기 면역 세포의 투여는 상기 환자에서 질환 또는 병태를 치료할 수 있고;
b. 환자의 장 내 미생물총에서 제1 세균 종 또는 균주, 또는 고세균 종 또는 균주의 세포의 서브-집단의 상대적 비율을 변화시킴으로써 상기 환자에서 상기 면역 세포 치료요법을 조절하는 변화된 장 내 미생물총을 생성함을 포함하는, 면역 세포의 생체외 집단.
3. 양상 2에 있어서, 단계 (b)가 상기 면역 세포 집단과 동시에 또는 이에 후속적으로 항-세균 또는 항-고세균 제제 (예를 들어, 가이드된 뉴클레아제)를 투여함에 의해 제1 세포의 서브-집단을 표적화함으로써 제1 세포가 사멸되거나 서브-집단 성장이 감소되어 환자의 장 내 미생물총에서 상기 서브-집단의 비율을 감소시킴에 의해 수행되는, 면역 세포 집단.
4. 임의의 이전 양상에 있어서, 상기 세포 치료요법이 적응성 T-세포 치료요법인, 면역 세포 집단.
5. 양상 4에 있어서, CD4+ T-세포, CD8+ T-세포, TH1 세포 및 TH17 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 세포가 단계 (a)에서 환자에게 투여되는, 면역 세포 집단.
6. 양상 4 또는 5에 있어서, TH17 세포가 환자에서 조절되는, 면역 세포 집단.
7. 양상 4, 5 또는 6에 있어서, Treg 세포가 환자에서 조절되는, 면역 세포 집단.
8. 이전 양상에 있어서, 상기 세포 치료요법이 증진되는, 면역 세포 집단.
9. 임의의 이전 양상에 있어서, TH17 세포가 환자에서 상향조절되고/되거나 Treg 세포가 환자에서 하향조절되는, 면역 세포 집단.
10. 임의의 이전 양상에 있어서, CD4+ T-세포가 환자에서 상향조절되는, 면역 세포 집단.
11. 임의의 이전 양상에 있어서, CD8+ T-세포가 환자에서 상향조절되는, 면역 세포 집단.
12. 임의의 이전 양상에 있어서, 하나 이상의 중추 기억 T 세포 (TCM), 이펙터 기억 T 세포 (TEM), 줄기 세포 기억 세포 (TSCM) 및 이펙터 세포 (Teff)가 환자에서 상향조절되고, 여기서, 상기 세포가 단계 (a)에서 투여되는 면역 세포 집단 및/또는 이의 후손에 포함되는, 면역 세포 집단.
13. 양상 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 치료요법이 감소되는, 면역 세포 집단.
14. 양상 13에 있어서, 상기 방법이 환자에서 사이토킨 방출 증후군 (CRS)의 위험을 감소시키거나 상기 증후군을 예방하는, 면역 세포 집단.
15. 양상 1 내지 7, 13 및 14 중 어느 하나에 있어서, TH17 세포가 환자에서 하향조절되고/되거나 Treg 세포가 환자에서 상향조절된, 면역 세포 집단.
16. 양상 1 내지 7 및 13 내지 15 중 어느 하나에 있어서, CD4+ T-세포가 환자에서 하향조절된, 면역 세포 집단.
17. 양상 1 내지 7 및 13 내지 16 중 어느 하나에 있어서, CD8+ T-세포가 환자에서 하향조절된, 면역 세포 집단.
18. 양상 1 내지 7 및 13 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 중추 기억 T 세포 (TCM), 이펙터 기억 T 세포 (TEM), 줄기 세포 기억 세포 (TSCM) 및 이펙터 세포 (Teff)가 환자에서 하향조절되고, 여기서, 상기 세포가 단계 (a)에서 투여되는 면역 세포 집단 및/또는 이의 후손에 포함되는, 면역 세포 집단.
19. 임의의 이전 양상에 있어서, 상기 면역 세포 집단이 가공된 T-세포 수용체 (TCR) 및/또는 종양 침윤 림프구 (TIL)를 발현하는 CAR-T 세포 및/또는 T-세포를 포함하거나 이들로 이루어진, 면역 세포 집단.
20. 임의의 이전 양상에 있어서, 상기 면역 세포 집단이 가공된 자가조직 또는 동종이계 면역 세포, 예를 들어, T-세포, NK 세포 및/또는 TIL을 포함하거나 이들로 이루어진, 면역 세포 집단.
21. 양상 19 또는 20에 있어서, 상기 T-세포가 CD4+ T-세포 또는 TH17 세포인, 면역 세포 집단.
22. 임의의 이전 양상에 있어서, 단계 (b)가 장 내 미생물총에서 박테로이데스(Bacteroides) (예를 들어, 비 프라갈리스(B fragalis) 및/또는 비 테타이오타미크론(B thetaiotamicron))의 비율을 증가시키는, 면역 세포 집단.
23. 양상 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 단계 (b)가 장 내 미생물총에서 박테로이데스(Bacteroides) (예를 들어, 비 프라갈리스(B fragalis) 및/또는 비 테타이오타미크론(B thetaiotamicron))의 비율을 감소시키는, 면역 세포 집단.
24. 임의의 이전의 양상에 있어서, 단계 (b)가 장 내 미생물총에서 피르미쿠테스(Firmicutes)에 대한 박테로이데테스(Bacteroidetes)의 비율을 증가시키는 면역 세포 집단.
25. 양상 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 단계 (b)가 장 내 미생물총에서 피르미쿠테스(Firmicutes)에 대한 박테로이데테스(Bacteroidetes)의 비율을 감소시키는, 면역 세포 집단.
26. 임의의 이전 양상에 있어서, 단계 (b)가 장 내 미생물총에서 하나 이상의 클로스트리디움 종 또는 균주 (예를 들어, 각각의 종은 클러스터 IV 또는 XIVa 클로스트리디움 종이다)의 비율을 감소시키는, 면역 세포 집단.
27. 양상 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 단계 (b)가 장 내 미생물총에서 하나 이상의 클로스트리디움 종 또는 균주 (예를 들어, 각각의 종은 클러스터 IV 또는 XIVa 클로스트리디움 종이다)의 비율을 증가시키는, 면역 세포 집단.
28. 임의의 이전 양상에 있어서, 단계 (b)가 장 내 미생물총에서 비피도박테리움(Bifidobacterium)(예를 들어, 비. 비피둠(B bifidum))의 비율을 감소시키는, 면역 세포 집단.
29. 양상 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 단계 (b)가 장 내 미생물총에서 비피도박테리움(Bifidobacterium)(예를 들어, 비. 비피둠(B bifidum))의 비율을 증가시키는, 면역 세포 집단.
30. 임의의 이전 양상에 있어서, 단계 (b)가 환자의 장 내 미생물총에서 제1 세포의 상기 서브-집단의 상대적 비율을 변화시켜 상기 환자에서 면역 세포 치료요법을 조절하는 변화된 장 내 미생물총을 생성함을 포함하고, 여기서, 상기 서브-집단은 상기 제1 종 또는 균주의 숙주 세포를 포함하고, 상기 방법은
a. 상기 미생물총과 숙주 변형 (HM) crRNA를 암호화하는 가공된 핵산 서열의 다중 카피와 조합하는 단계, 및
b. 숙주 세포에서 HM-crRNA를 발현하는 단계를 포함하고,
여기서, 각각의 가공된 핵산 서열은 각각의 숙주 세포에서 Cas 뉴클레아제와 함께 작동할 수 있어 HM-CRISPR/Cas 시스템을 형성하고 상기 가공된 서열은
(i) HM-crRNA를 암호화하는 스페이서 및 반복 서열을 포함하고;
(ii) 상기 HM-crRNA는 숙주 세포 내 Cas 뉴클레아제를 표적 서열로 가이드하기 위해 숙주 세포 표적 서열에 하이브리드화할 수 있는 서열을 포함하고;
임의로 상기 HM-시스템은 tracrRNA 서열 또는 tracrRNA 서열을 발현하는 DNA 서열을 포함하고;
이로써, HM-crRNA는 숙주 세포에서 숙주 표적 서열의 Cas 변형을 가이드하고, 이로써 숙주 세포는 사멸되거나 숙주 세포 집단 성장은 감소됨으로써 미생물총 내 상기 서브-집단의 비율을 감소시키는, 방법.
31. 양상 30에 있어서, 표적 뉴클레오타이드 서열의 변형을 위해 숙주 세포의 내인성 Cas 뉴클레아제를 사용함을 포함하는, 면역 세포 집단.
32. 양상 30 또는 31에 있어서, 상기 Cas 변형을 받지 않은 숙주 세포의 대조군 집단의 성장과 비교하여 적어도 5배까지 숙주 세포 집단 성장을 감소시킴을 포함하는, 면역 세포 집단.
33. 양상 30 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 장 내 표면 상에 숙주 세포 집단 성장을 억제함을 포함하는, 면역 세포 집단.
34. 양상 30 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 상기 미생물총이 제2 세균 종 또는 균주 또는 고세균 종 또는 균주의 세포를 포함하고, 상기 제2 종 또는 균주가 상기 숙주 세포 종 또는 균주의 16s 리보솜 RNA-암호화 DNA 서열과 적어도 80% 동일한 16s 리보솜 RNA-암호화 DNA 서열을 갖고, 상기 미생물총에서 상기 제2 세포의 성장이 상기 HM-시스템에 의해 억제되지 않는, 면역 세포 집단.
35. 양상 34에 있어서, 상기 제2 종 또는 균주가 인간 장 내 공생 종 또는 균주 및/또는 인간 장 내 프로바오이틱 종 또는 균주인, 면역 세포 집단.
36. 양상 34 또는 35에 있어서, 상기 제2 종 또는 균주가 박테로이데테스(Bacteroidetes)(예를 들어, 박테로이데스(Bacteroides))이고 임의로 상기 숙주 세포가 그람 양성 세균 세포인, 면역 세포 집단.
37. 양상 30 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 세포가 피르미쿠테스(Firmicutes) 세포인, 면역 세포 집단.
38. 양상 30 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 각각의 숙주 세포에 대해 상기 시스템이 (i) 내지 (iv)에 따른 성분들을 포함하는 면역 세포 집단으로서,
(i) Cas 뉴클레아제를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열;
(ii) 스페이서 서열 및 HM-crRNA를 암호화하는 반복체를 포함하는 가공된 HM-CRISPR 어레이(상기 HM-crRNA는 상기 Cas를 숙주 세포에서 표적으로 가이드하여 상기 표적 서열을 변형시키기 위해 숙주 세포 표적 서열을 하이브리드화하는 서열을 포함한다);
(iii) 임의의 tracrRNA 서열 또는 tracrRNA 서열을 발현하는 DNA 서열;
(iv) 여기서, 상기 시스템의 상기 성분들은 숙주 세포와 숙주 세포를 형질전환시키는 적어도 하나의 핵산 벡터 간에 스플릿되어 있어, 상기 숙주 세포 내 숙주 표적 서열을 변형시키기 위해 Cas를 상기 표적으로 가이드하는 HM-crRNA를 포함하고,
여기서, 상기 표적 서열은 Cas에 의해 변형됨으로써 상기 숙주 세포가 사멸되거나 숙주 세포 성장이 감소되고,
상기 방법은 (iv)의 벡터를 숙주 세포로 도입하고 숙주 세포 내에서 상기 HM-crRNA를 발현하여, 숙주 세포 내에서 Cas를 표적으로 가이드하여 표적 서열을 변형시키기 위해 숙주 세포 표적 서열에 HM-cRNA가 하이브리드화되도록 하여, 이로써 숙주 세포는 사멸되거나 숙주 세포 성장은 감소되어 미생물총에서 상기 서브-집단의 비율을 변화시킴을 포함하는, 면역 세포 집단.
39. 양상 38에 있어서, 성분 (i)가 각각의 숙주 세포에 내인성인, 면역 세포 집단.
40. 양상 38 또는 39에 있어서, 각각의 벡터가 바이러스 또는 파아지인, 면역 세포 집단.
41. 양상 30 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 각각의 표적 서열이 NNAGAAW 또는 NGGNG 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 인접해 있는, 면역 세포 집단.
42. 양상 30 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 대안적으로 HM-crRNA 및 tracrRNA가 단일 가이드 RNA (gRNA)에 의해 포함되고, 상기 gRNA를 숙주 세포에 도입하거나 숙주 세포에서 상기 gRNA를 발현시킴을 포함하는, 면역 세포 집단.
43. 양상 30 내지 35 및 37 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 미생물총이 제2 세균 또는 고세균 종을 포함하고, 상기 제1 및 제2 종의 각각이 동일한 문(phylum) (예를 들어, 둘 다 피르미쿠테스 (Firmicutes) 종)의 각각의 종이고 제2 세균의 성장이 HM-시스템에 의해 억제되지 않거나; 상기 미생물총이 제2 세균 또는 고세균 균주를 포함하고, 상기 제1 및 제2 세균 또는 고세균 각각이 동일한 종의 각각의 균주이고 상기 제2 세균 또는 고세균의 성장이 HM-시스템에 의해 억제되지 않는, 면역 세포 집단.
44. 양상 30 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 상기 미생물총이 제2 세균 종을 포함하고, 상기 제1 및 제2 종 각각이 각각의 그람-양성 종이고 상기 제2 세균의 성장이 HM-시스템에 의해 억제되지 않는, 면역 세포 집단.
45. 양상 30 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 각각의 표적 서열이 숙주 세포의 항생제 내성 유전자, 독성 유전자 또는 필수 유전자에 의해 포함되는, 면역 세포 집단.
46. 임의의 이전 양상에 있어서, 각각의 제1 세포가 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 살모넬라(Salmonella), 리스테리아(Listeria), 이. 콜라이(E coli), 데설포비브리오(Desulfovibrio), 비브리오(Vibrio) 또는 클로스트리디움(Clostridium) 세포인, 방법.
47. 임의의 이전 양상에 있어서, 단계 (b)가 장 내 벡터로이데스(Bacteroides) (예를 들어, 비. 테타이오타마이신(B thetaiotamicron))에 의해 환자의 파네트 세포를 자극함을 포함하고, 단계 (b)에 의해 생성되는 상기 변화된 미생물총이 단계 (b) 전의 미생물총과 비교하여 박테로이데스 제1 세균의 증가된 비율을 포함하여 파네트 세포가 자극되고 상기 세포 치료요법이 조절되는, 면역 세포 집단.
48. 임의의 이전 양상에 있어서, 단계 (b)가 장 내 벡터로이데스(Bacteroides) (예를 들어, 비. 테타이오타마이신(B thetaiotamicron))에 대한 환자 내 면역 반응을 생성함을 포함하고, 단계 (b)에 의해 생성되는 상기 변화된 미생물총이 단계 (b) 전의 미생물총과 비교하여 박테로이데스 제1 세균의 증가된 비율을 포함하여 상기 세포 치료요법이 조절되는, 면역 세포 집단.
49. 임의의 이전 양상에 있어서, 단계 (b)가 환자의 장 내 미생물총에서 제1 세포의 상기 서브-집단의 상대적 비율을 변화시켜 상기 환자에서 면역 세포 치료요법을 조절하는 변화된 장 내 미생물총을 생성함을 포함하고, 여기서, 단계 (b)가 상기 서브-집단의 제1 세포를 사멸시키거나 상기 서브-집단에 의해 포함되는 제1 세포의 게놈을 표적화하는 가이드된 뉴클레아제를 사용함에 의해 상기 서브-집단의 성장을 억제함을 포함하는, 면역 세포 집단.
50. 임의의 이전의 양상에 기재된 방법을 사용하여 환자에서 질환 또는 병태의 치료요법을 위해 환자에게 투여하기 위한 세균 또는 고세균 이식체로서, 임의로 상기 이식체가 상기 제1 종의 세포를 포함하는, 세균 또는 고세균 이식체.
51. 양상 1 내지 49 중 어느 하나에 기재된 방법을 사용하여 환자에서 질환 또는 병태의 치료요법을 위해 환자에게 투여하기 위한 개념 30 내지 45 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 HM-CRISPR/Cas 시스템, HM-어레이 또는 HM-crRNA.
52. 상기 질환 또는 병태를 치료하기 위해 환자의 적응성 세포 치료요법을 위해 양상 1 내지 49 중 어느 하나에 따른 면역 세포의 생체외 집단을 포함하는 키트로서, 상기 키트가 양상 50 또는 51의 이식체, 시스템, 어레이 또는 crRNA를 추가로 포함하고, 임의로 상기 면역 세포가 CAR-T 세포, 가공된 T-세포 수용체 (TCR)를 발현하는 T-세포, 종양 침윤 림프구 (TIL) 및 NK 세포로부터 선택되는, 키트.
임의로, 숙주 세포(들), 제1 세포(들), 제2 세포(들) 또는 혼합 세균 집단이 인간 또는 비-인간 동물 대상체에 의해 포함되고, 예를 들어, 상기 집단이 장 내 미생물총, 피부 미생물총, 구강 미생물총, 목 미생물총, 모발 미생물총, 겨드랑이 미생물총, 질 미생물총, 직장 미생물총, 항문 미생물총, 눈 미생물총, 비강 미생물총, 혀 미생물총, 폐 미생물총, 간 미생물총, 신장 미생물총, 생식기 미생물총, 음경 미생물총, 음낭 미생물총, 유선 미생물총, 귀 미생물총, 요도 미생물총, 순음 미생물총, 기관 미생물총 또는 치음 미생물총에 의해 포함된다. 임의로, 혼합 세균 집단은 식물 (예를 들어, 담배, 농작 식물, 과일 식물, 야채 식물 또는 담배, 예를 들어, 식물의 표면 상에 또는 식물내 함유된)에 의해 또는 환경 (예를 들어, 토양 또는 물 또는 수로 또는 수성 액체)에 의해 포함된다.
임의로 인간 또는 동물 대상체 또는 환자의 질환 또는 병태는 하기로 부터 선택된다:
(a) 신경변성 질환 또는 병태;
(b) 뇌 질환 질환 또는 병태;
(c) CNS 질환 또는 병태;
(d) 기억 손실 또는 손상;
(e) 심장 또는 심혈관 질환 또는 병태, 예를 들어, 심장 마비, 뇌졸중 또는 심방 세동;
(f) 간 질환 또는 병태;
(g) 신장 질환 또는 병태, 예를 들어, 만성 신장 질환 (CKD);
(h) 췌장 질환 또는 병태;
(i) 폐 질환 또는 병태, 예를 들어, 낭성 섬유증 또는 COPD;
(j) 위장 질환 또는 병태;
(k) 목 또는 구강 질환 또는 병태;
(l) 눈 질환 또는 병태;
(m) 생식기 질환 또는 병태, 예를 들어, 질, 입술, 음경 또는 음낭 질환 또는 병태;
(n) 성적 전염성 질환 또는 병태, 예를 들어, 임질, HIV 감염, 매독 또는 클라미디아 감염;
(o) 귀 질환 또는 병태;
(p) 피부 질환 또는 병태;
(q) 심장 질환 또는 병태;
(r) 비강 질환 또는 병태
(s) 혈액학적 질환 또는 병태, 예를 들어, 빈혈, 예를 들어, 만성 질환 또는 암의 빈혈;
(t) 바이러스 감염;
(u) 병원성 세균 감염;
(v) 암;
(w) 자가면역 질환 또는 병태, 예를 들어, SLE;
(x) 자가면역 질환 또는 병태, 예를 들어, 류마티스 관절염, 건선, 습진, 천식, 궤양성 대장염, 대장염, 크론 질환 또는 IBD;
(y) 자폐증;
(z) ADHD;
(aa) 양극성 장애;
(bb) ALS [근위축성 측삭 경화증];
(cc) 골관절염;
(dd) 선천적 또는 발육 결함 또는 병태;
(ee) 유산;
(ff) 혈액 응고 병태;
(gg) 기관지염;
(hh) 건식 또는 습식 AMD;
(ii) 신혈관형성 (예를 들어, 종양의 또는 눈에서);
(jj) 일반 감기;
(kk) 간질;
(ll) 섬유증, 예를 들어, 간 또는 폐 섬유증;
(mm) 진균 질환 또는 병태, 예를 들어, 질염;
(nn) 대사 질환 또는 병태, 예를 들어, 비만, 식욕부진증, 당뇨병, I형 또는 II형 당뇨병.
(oo) 궤양(들), 예를 들어, 위 궤양화 또는 피부 궤양화;
(pp) 건조 피부;
(qq) 쇼그렌 증후군;
(rr) 사이토킨 발작;
(ss) 귀먹음, 청력 상실 또는 손상;
(tt) 느리거나 신속한 대사 (즉, 대상체의 체중, 성별 및 연령에 대한 평균 보다 느리거나 신속함);
(uu) 임신 장애, 예를 들어, 불임 또는 저수태;
(vv) 황달;
(ww) 피부 발진;
(xx) 가와사키 질환;
(yy) 라임 질환;
(zz) 알레르기, 예를 들어, 견과, 잔디, 꽃가루, 먼지 진드기, 고양이 또는 개 털 또는 비듬 알레르기;
(aaa) 말라리아, 장티푸스, 결핵 또는 콜레라;
(bbb) 우울증;
(ccc) 정신 지체;
(ddd) 소두증;
(eee) 영양실조;
(fff) 결막염;
(ggg) 폐렴;
(hhh) 폐 색전증;
(iii) 폐 고혈압;
(jjj) 골 장애;
(kkk) 패혈증 또는 패혈성 쇼크;
(lll) 부비강염;
(mmm) 스트레스(예를 들어, 직장 스트레스);
(nnn) 지중해빈혈, 빈혈, 본 빌레브란트 질환, 또는 혈우병;
(ooo) 대상 포진 또는 입술의 잘진;
(ppp) 월경;
(qqq) 낮은 정자 계수.
상기 방법에 의해 치료 또는 예방을 위한 신경변성 또는 CNS 질환 또는 병태
하나의 예에서, 신경변성 또는 CNS 질환 또는 병태는 알츠하이머 질환, 노년기정신병, 다운 증후군, 파킨슨 질환, 크루츠펠트-자콥 질환, 당뇨성 신경병증, 파킨슨 증후군, 헌팅톤 질환, 마카도-조셉 질환, 근위축성측색경화증, 당뇨성 신경병증, 및 크루츠펠트 크로츠펠트-자콥 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 예를 들어, 상기 질환은 알츠하이머 질환이다. 예를 들어, 상기 질환은 파킨슨 증후군이다.
하나의 예에서, 본 발명의 방법이 CNS 또는 신경변성 질환 또는 병태를 치료하기 위해 인간 또는 동물 대상체에 대해 수행되는, 상기 방법은 대상체에서 Treg 세포의 하향조절을 유발함으로써 맥락총을 거쳐 대상체의 뇌로 전신 단핵구-유래된 대식세포 및/또는 Treg 세포의 진입을 촉진시킴으로써 상기 질환 또는 병태 (예를 들어, 알츠하이머 질환)는 치료되거나, 예방되거나 이의 진행이 감소된다. 하나의 구현예에서, 상기 방법은 대상체의 CNS 계에서 (예를 들어, 뇌 및/또는 CSF에서) IFN-감마의 증가를 유발한다. 하나의 예에서, 상기 방법은 신경 섬유를 복구하고/하거나 신경 섬유 손상의 진행을 감소시킨다. 하나의 예에서, 상기 방법은 신경 미엘린을 복구하고/하거나 신경 미엘린 손상의 진행을 감소시킨다. 하나의 예에서, 본 발명의 방법은 WO2015136541에 기재된 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하고/하거나 상기 방법은 WO2015136541에 기재된 임의의 방법과 함께 사용될 수 있다(상기 문헌의 개시내용은 이의 전문이 본원에 참조로 인용되고, 예를 들어, 이는 상기 방법, 질환, 병태의 기재내용을 제공하기 위한 것이고, CNS 및 신경변성 질환 및 병태의 치료 및/또는 예방을 수행하기 위해 대상체에게 투여될 수 있는 잠재적 치료학적 제제, 예를 들어, 제제, 예를 들어, 면역 체크포인트 억제제, 예를 들어, 본원에 기재된 항-PD-1, 항-PD-L1, 항-TIM3 또는 다른 항체).
상기 방법에 의한 암 치료 또는 예방
치료될 수 있는 암은 혈관화된 종양 뿐만 아니라 혈관화되지 않거나 실질적으로 혈관화되지 않은 종양을 포함한다. 상기 암은 비-고형 종양 (예를 들어, 혈액학적 종양, 예를 들어, 백혈병 및 림프종)을 포함할 수 있거나 고형 종양을 포함할 수 있다. 본 발명을 사용하여 치료될 암의 유형은 암종, 아세포종, 및 육종, 및 특정 백혈병 또는 림프구 악성종양, 양성 및 악성 종양, 및 악성종양 예를 들어, 육종, 암종 및 흑색종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 성인 종양/암 및 소아 종양/암이 또한 포함된다.
혈액학적 암은 혈액 또는 골수의 암이다. 혈액학적 (또는 혈액발생) 암의 예는 백혈병을 포함하고, 이는 급성 백혈병(예를 들어, 급성 림프구 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 및 골수아세포, 전골수구, 골수단핵구, 단핵구 및 적백혈병), 만성 백혈병 (예를 들어, 만성 골수구(과립구) 백혈병, 만성 골수발생 백혈병, 및 만성 림프구 백혈병, 진성 다혈증, 림프종, 호지킨 질환, 비-호지킨 림프종 (무기력 및 고등급 형태), 다발성 골수종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 중쇄 질환, 골수이형성증후군, 모발 세포 백혈병 및 골수이형성증을 포함한다.
고형 종양은 낭포 또는 액체 영역을 일반적으로 함유하지 않는 비정상적 매쓰의 조직이다. 고형 종양은 양성 또는 악성일 수 있다. 상이한 유형의 고형 종양은 이들을 형성하는 세포 유형 (육종, 암종 및 림프종과 같은)을 따라 호칭된다. 육종 및 암종과 같은 고형 종양의 예는 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 및 다른 육종, 활막종, 중피종, 어윙 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 골수 악성 종양, 췌장암, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 간세포 암종, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 수질 갑상선 암종, 유두 갑상선 암종, 크롬친화성세포종 피지선 암종, 유두 암종, 유두 선암종, 수질 암종, 기관지성 암종, 신장 세포 암종, 간암종, 담즙관 암종, 융모암종, 빌름스 종양, 자궁암, 고환 종양, 정상피종, 방광 암종, 흑색종, 및 CNS 종양 (예를 들어, 신경교종(예를 들어, 뇌줄기 신경교종 및 혼합 신경교종), 교모세포종 (또한 다형성 교모세포종으로서 공지된) 성상세포종, CNS 림프종, 배아세포종, 수모세포종, 신경초종 두개인두종, 뇌실막세포종, 파인아이오마(pineaioma), 혈관모세포종, 청신경종양, 핍지교종, 혈관종, 신경모세포종, 망막모세포종 및 뇌 전이)를 포함한다.
상기 방법에 의한 치료 또는 예방을 위한 자가면역 질환
ㆍ 급성 파종뇌척수염(Acute Disseminated Encephalomyelitis, ADEM)
ㆍ 급성 괴사 출혈성 백질뇌염
ㆍ 애디슨 질환(Addison’s disease)
ㆍ 무감마글로불린혈증
ㆍ 원형 탈모
ㆍ 아밀로이드증
ㆍ 강직성 척추염
ㆍ 항-GBM/항-TBM 신염
ㆍ 항인지질 증후군 (Antiphospholipid syndrome, APS)
ㆍ 자가면역 혈관부종
ㆍ 자가면역 재생불량 빈혈
ㆍ 자가면역 자율신경 장애
ㆍ 자가면역 간염
ㆍ 자가면역 고지혈증
ㆍ 자가면역 면역결핍
ㆍ 자가면역 내이 질환 (Autoimmune inner ear disease, AIED)
ㆍ 자가면역 심근염
ㆍ 자가면역 난소염
ㆍ 자가면역 췌장염
ㆍ 자가면역 신병증
ㆍ 자가면역 혈소판 감소성 자반병 (Autoimmune thrombocytopenic purpura, ATP)
ㆍ 자가면역 갑상선 질환
ㆍ 자가면역 두드러기
ㆍ 축색 및 뉴런 신경병증
ㆍ 발로 질환
ㆍ 베쳇 질환
ㆍ 수포성 유사 천포창
ㆍ 심근병증
ㆍ 캐슬만 질환
ㆍ 복강 질환
ㆍ 샤가스(Chagas) 질환
ㆍ 만성 피로 증후군
ㆍ 만성 염증 탈수초 말초신경병증 (Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy, CIDP)
ㆍ 만성 재발성 다초점 골근염 (Chronic recurrent multifocal ostomyelitis, CRMO)
ㆍ 척-스트라우스 (Churg-Strauss) 증후군
ㆍ 흉터유사 천포창/양성 점막유사 천포창
ㆍ 크론 질환
ㆍ 코간스 (Cogans) 증후군
ㆍ 한랭 응집소 질환
ㆍ 선천적 심장 차단
ㆍ 콕사키 (Coxsackie) 심근염
ㆍ CREST 질환
ㆍ 필수 혼합 저온글로불린혈증
ㆍ 탈수초 신경병증
ㆍ 포지낭 피부염
ㆍ 피부근염
ㆍ 데빅 질환 (시신경척수염)
ㆍ 원판성 루프스
ㆍ 드레슬러 증후군
ㆍ 자궁내막증
ㆍ 호산구 식도염
ㆍ 호산성 근막염
ㆍ 결절 홍반
ㆍ 실험 알레르기 뇌척수염
ㆍ 에반스 (Evans) 증후군
ㆍ 섬유 근육통
ㆍ 섬유성 폐포염
ㆍ 거대 세포 동맥염 (측두 동맥염)
ㆍ 거대 세포 심근염
ㆍ 사구체신염
ㆍ 굿파스쳐 증후군
ㆍ 다발성혈관염을 갖는 육아종성림프종 (Granulomatosis with Polyangiitis, GPA) (이전에는 베게너 육아종성 림프종으로 불리움)
ㆍ 그레이브 질환
ㆍ 길레인-바르(Guillain-Barre) 증후군
ㆍ 하시모토 뇌척수염
ㆍ 하시모토 갑상선염
ㆍ 용혈성 빈혈
ㆍ 헤노흐-쇼늘레인 자반증
ㆍ 임신포진
ㆍ 저감마글로불린혈증
ㆍ 특발성 혈소판 감소성 자반병 (Idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP)
ㆍ IgA 신장병증
ㆍ IgG4-관련 경화성 질환
ㆍ 면역조절 지단백질
ㆍ 봉입체 (Inclusion body) 근염
ㆍ 간질성 방광염
ㆍ 연소성 관절염
ㆍ 연소성 당뇨병 (1형 당뇨병)
ㆍ 연소성 근염
ㆍ 가와사키 증후군
ㆍ 람베르트-이튼 (Lambert-Eaton) 증후군
ㆍ 백혈구 혈관염
ㆍ 편평태선
ㆍ 경화태선 (Lichen sclerosus)
ㆍ 목질 (Ligneous) 결막염
ㆍ 선형 (Linear) IgA 질환 (Linear IgA disease, LAD)
ㆍ 루푸스 (SLE)
ㆍ 라임 질환, 만성
ㆍ 메니에르 질환
ㆍ 현미경적 다발혈관염
ㆍ 혼합 연결 조직 질환 (Mixed connective tissue disease, MCTD)
ㆍ 무렌 궤양
ㆍ 무하-하버맨 (Mucha-Habermann) 질환
ㆍ 다발성 경화증
ㆍ 중증근무력증
ㆍ 근염
ㆍ 기면증
ㆍ 시신경척수염 (데빅(Devic's))
ㆍ 백혈구 감소증
ㆍ 눈 흉터유사 천포창
ㆍ 시신경염
ㆍ 회귀성 류머티즘
ㆍ PANDAS (스트렙토코커스와 관련된 소아성 자가면역 신경 정신병학 장애(Pediatric Autoimmune Neuropsychiatric Disorders Associated with Streptococcus))
ㆍ 방종양성 소뇌 변성
ㆍ 발작성 야간 헤모글로불린혈증(Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, PNH)
ㆍ 파리 롬베르크 (Parry Romberg) 증후군
ㆍ 파르소니지-터너 증후군
ㆍ 평면부염 (Pars planitis) (말초 포도막염)
ㆍ 천포창
ㆍ 말초 신경병증
ㆍ 말초정맥 뇌척수염
ㆍ 치명적 빈혈
ㆍ POEMS 증후군
ㆍ 결절 다발동맥염
ㆍ I형, II형, 및 III형 자가면역 다선성 증후군
ㆍ 류마티스성 다발근통
ㆍ 다발성 근염
ㆍ 심근경색후증후군
ㆍ 심막절개후증후군
ㆍ 프로게스테론 피부염
ㆍ 1차 담즙성 간경변증
ㆍ 1차 경화성 담관염
ㆍ 건선
ㆍ 건선성 관절염
ㆍ 특발성 폐 섬유증
ㆍ 괴저성 농피증
ㆍ 순수 적혈구 세포 무형성증
ㆍ 레이노드 현상
ㆍ 반응성 관절염
ㆍ 반사성 교감신경성 이영양증
ㆍ 라이터 증후군
ㆍ 재발 다발 연골염
ㆍ 하지 불안 증후군
ㆍ 후복막 섬유증
ㆍ 류마티스 열
ㆍ 류마티스 관절염
ㆍ 사르코이드증
ㆍ 슈미트 증후군
ㆍ 공막염
ㆍ 피부 경화증
ㆍ 쇼그렌 증후군
ㆍ 정자 및 고환 자가면역
ㆍ 강직 인간 증후군
ㆍ 아급성 세균 심내막염 (Subacute bacterial endocarditis, SBE)
ㆍ 수삭 증후군
ㆍ 교감성 안염
ㆍ 다카야수 관절염
ㆍ 측두 관절염/거대 세포 관절염
ㆍ 혈소판 감소성 자반병 (Thrombocytopenic purpura, TTP)
ㆍ 톨로사-헌트 (Tolosa-Hunt) 증후군
ㆍ트랜스버스 (Transverse) 근염
ㆍ 1형 당뇨병
ㆍ 궤양성 대장염
ㆍ 비분화된 연결 조직 질환 (Undifferentiated connective tissue disease, UCTD)
ㆍ 포도막염
ㆍ 혈관염
ㆍ 대소수포성 피부증
ㆍ 백반
ㆍ베게너 육아종성 림프종 (현재 다발성혈관염을 갖는 육아종성 림프종(Granulomatosis with Polyangiitis, GPA)이라 함).
상기 방법에 의한 치료 또는 예방을 위한 염증성 질환
ㆍ 알츠하이머
ㆍ 강직성 척추염
ㆍ 관절염(골관절염, 류마티스 관절염 (RA), 건선 관절염)
ㆍ 천식
ㆍ 죽상동맥경화증
ㆍ 크론 질환
ㆍ 대장염
ㆍ피부염
ㆍ 게실염
ㆍ 섬유 근육통
ㆍ 간염
ㆍ 과민성 장 증후군 (irritable bowel syndrome, IBS)
ㆍ전신 홍반성 낭창 (systemic lupus erythematous, SLE)
ㆍ 신염
ㆍ파킨슨 질환
ㆍ 궤양성 대장염
하나의 예에서(예를 들어, 혼합 세균 집단을 포함하는 본 발명의 방법에서), 숙주 세포(또는 제1 세포 또는 제2 세포) 속 또는 종은 표 1에 열거된 속 또는 종으로부터 선택된다. 본 발명의 예에서, Cas (예를 들어, Cas 뉴클레아제, 예를 들어, I형, II형 또는 III형 Cas, 예를 들어, Cas3 또는 9)는 표 1에 열거된 속 또는 종으로부터 선택된 속 또는 종의 세균에 의해 포함되는 Cas이고, 임의로 상기 숙주 세포 (또는 제1 세포 또는 제2 세포)는 동일한 속 또는 종으로부터 기원한다. 이의 하나의 예에서, Cas는 본원의 구현예를 위해 유용한 상기 숙주 세포 (또는 제1 또는 제2 세포)에 내인성이고, 여기서, 내인성 Cas를 사용하여 표적 서열을 변형시킨다. 이 경우에, HM-어레이는 하나 이상의 반복 뉴클레오타이드 (예를 들어, DNA 또는 RNA) 서열을 포함할 수 있고, 상기 서열은 상기 세포, 속 또는 종의 반복체 서열과 적어도 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일함으로써(또는 100% 동일한) 상기 Cas는 세포에서 하나 이상의 표적 서열을 변형시키기 위해 HM-어레이에 의해 암호화된 cRNA를 사용하여 작동 가능하다. 하나의 예에서, 상기 Cas는 I형 Cas3이고 I형 CASCADE와 함께 사용되고, 여기서, Cas3 및 CASCAE 중 하나 또는 둘 다는 숙주 또는 제1 세포에 내인성이거나 벡터 함유 (즉, 숙주 또는 제1 세포에 외인성)이다.
하나의 예에서, 본 발명의 방법은 미생물총에서 제1 세포를 선택적으로 사멸시키고 제2 세포를 표적화하지 않으며, 예를 들어, 여기서, 상기 제2 세포는 (a) 제1 종의 균주와 관련된 균주의 세포 또는 (b) 제1 종과 상이하고 상기 제1종과 계통발생적으로 관련된 종의 세포이고, 여기서, 상기 제2 종 또는 균주는 제1 세포 종 또는 균주의 16s 리보솜 RNA-암호화 DNA 서열과 적어도 80% 동일한 16s 리보솜 RNA-암호화 DNA 서열을 갖는다. 하나의 구현예에서, 제1 세포는 표 1로부터 선택된 제1 종의 세포이고 제2 세포는 표 1로부터 선택된 상이한 종의 세포이다. 하나의 예에서, 종은 동일한 속 기원이거나 상이한 속의 기원이다.
본원에 기재된 특정 구현예가 예시로서 나타내지만 본 발명을 제한하지 않는 것으로서 이해된다. 본 발명의 기본 특성은 본 발명의 범위로부터 벗어나는 것 없이 다양한 구현예에서 사용될 수 있다. 당업자는 단지 통상의 실험, 본원에 기재된 특정 과정에 대한 많은 등가물을 사용하여 인지하거나 이를 사용하여 확인할 수 있다. 상기 등가물은 본 발명의 범위 이내에 있는 것으로 고려되고 청구항에 의해 보호된다. 명세서에 언급된 모든 공보 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 당업자의 기술 수준을 나타낸다. 모든 공보 및 특허 출원 및 모든 US 등가 모출원 및 특허는 본원에 각각의 개별 공보 또는 특허 출원이 특이적으로 및 개별적으로 참조로 인용된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 인용된다. 청구항 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는"과 연계하여 사용되는 경우 용어 "a" 또는 "an"의 사용은 "하나"를 의미할 수 있지만 이것은 또한 "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와 일관된다. 청구항에서 용어 "또는"의 사용은 단지 대안물을 언급하기 위해 달리 명시되지 않는 경우 "및/또는"을 의미하는 것이거나 대안물은 상호 배타적이지만 상기 개시내용은 단지 대안물 및 "및/또는"을 언급하는 정의를 지지한다. 본원의 전반에 걸쳐, 용어 "약"은 값이 장치에 대해 고유 오차 변화를 포함하는 것으로 나타내기 위해 사용되고, 상기 방법은 연구 대상체 중에 존재하는 값 또는 변화를 결정하기 위해 사용된다.
본원 명세서 및 청구항(들)에 사용된 바와 같은 용어 "포함하는" (및 "포함한다(comprise)" 및 "포함한다(comprises)"와 같은 포함하는의 임의의 형태), "갖는" (및 "갖는다(have)" 및 "갖는다 (has)"와 같은 갖는의 임의의 형태), "포함하는 (including)" (및 "포함한다(includes)" 및 "포함한다(include)"와 같은 포함하는의 임의의 형태) 또는 "함유하는(containing)" (및 "함유한다(contains)" 및 "함유한다(contrain)"와 같은 함유하는의 임의의 형태)는 포괄적이거나 말단 개방형이고 추가의, 인용되지 않은 요소들 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "또는 이의 조합" 또는 유사한 용어는 그 용어에 선행하는 열거된 목록들의 모든 순열 및 조합을 언급한다. 예를 들어, "A, B, C, 또는 이의 조합"은 A, B, C, AB, AC, BC, 또는 ABC 중 적어도 하나를 포함하고, 순서가 특정 문맥에서 중요한 경우, 또한 BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC, 또는 CAB를 포함하는 것으로 의도된다. 상기 예와 계속하여, 하나 이상의 품목 또는 용어의 반복체, 예를 들어, BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB, 등을 함유하는 조합이 명백히 포함된다. 당업자는 전형적으로 문맥으로부터 달리 명백하지 않는 경우 임의의 조합의 품목 또는 용어의 수에 어떠한 제한이 없음을 이해할 것이다.
본원의 임의의 개시내용은 문맥으로부터 달리 명백하지 않는 경우 상기 개시내용의 임의의 다른 일부와 조합하여 판독될 수 있다.
본원에 기재되고 청구된 조성물 및/또는 방법 모두가 만들어 질 수 있고 본원의 개시내용의 관점에서 과도한 실험 없이 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 구현예의 측면에서 기재되었지만, 변화가 본 발명의 개념, 취지 및 범위로부터 이탈하는 것 없이 본원에 기재된 조성물 및/또는 방법 및 본원에 기재된 방법의 단계 또는단계들의 순서에 적용될 수 있다는 것은 자명하다. 당업자에게 자명한 모든 상기 유사 치환체 및 변형은 첨부된 청구항에 의해 한정된 바와 같은 본 발명의 취지, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
본 발명은 하기의 비제한적인 실시예에서 보다 상세하게 기재된다.
실시예
실시예 1: 야생형 내인성 Cas를 사용함에 의해 특이적 미생물총 세균 집단 성장 억제
1. 재료 및 방법
1.1. 균주
하기의 균주는 본 실시예 및 실시예 2 및 3의 과정에서 사용하였다: 이. 콜라이(E. coli) MG1655, 이. 콜라이(E.coli) TOP10, 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) LMD-9 (ATCC BAA-491, Manassas, Virginia), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)　DSM 20617(T) (DSMZ, Braunschweig, Germany), 락토바실러스 락티스(Lactococcus lactis) MG1363 및 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) Clarke 1924 　DSM 20523 (DSMZ, Braunschweig, Germany).
배지 선택 과정 및 유전학적 작제물의 시험 과정 동안에, 상이한 스트렙토코시 균주를 사용하였다. 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) LMD-9(ATCC BAA-491) 및 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) TOP10은 이들의 유사한 성장 요건들 때문에 고려되었다. 　모든 균주는 달리 지적되지 않는 경우 호기 조건에서 및 37℃에서 토드-헤위트(Todd-Hewitt) 브로쓰 　(TH) (T1438 Sigma-Aldrich)에서 배양하였다. 상기 균주는 -80℃에서 25% 글리세롤 중에 저장하였다.
1.2. 차등 성장 배지(Differential growth media)
모든 균주는 20시간 동안 37℃에서 TH-배지 상에서 성장시켰다. 에스. 써모필러스에 대한 선택적 배지는 3 g l-1의 2-페닐에탄올 (PEA)이 보충된 TH 배지였다. 　PEA는 상기 배지에 첨가하고 15 psi에서 15분 동안 121℃에서 오토클레이빙하였다. 한천 플레이트는 1.5%　(wt/vol) 한천을 상응하는 배지에 첨가함에 의해 제조하였다. 선택 또는 플라스미드 유지를 위해 필요한 경우, 30 μg ml-1 의 가나마이신은 에스. 써모필러스(S. thermophilus) 균주 및 이. 콜라이(E.coli) 둘 다에 대해 사용하였고 에스. 뮤탄스(S. mutans)에 대해서는 500 μg ml-1을 사용하였다.
일부 경우에, 균주 및 플라스미드에 따라, 48시간 이하의 보다 긴 항온처리가 PEA가 보충된 배지에 대한 성장을 보기 위해 필요할 수 있다.　 사용되는 유기체의 생존능을 제어하기 위해, 제어 TH 한천은 평행하게 수행되어야만 한다.
1.3. 클로닝 (Cloning)
이. 콜라이(E. coli) (One Shot® ThermoFischer TOP10 Chemically Competent cells)는 모든 서브클로닝 과정에서 사용하였다. PCR은 푸젼 (Phusion) 폴리머라제를 사용하여 수행하였다. 모든 PCR 생성물은 제조업자의 프로토콜에 따른 맥커리-나겔(Macherey-Nagel)에 의한 뉴클레오스핀 겔 및 PCR 세정을 사용하여 정제하였다. 상기 정제된 단편은 총 34 μl의 용적으로, 1 μl 효소를 갖는 1X FD 완충액 중에서 제한 효소 DpnI로 분해하였다. 분해된 반응물은 제조업자의 프로토콜에 따른 맥커리-나겔(Macherey-Nagel)에 의한 뉴클레오스핀 겔 및 PCR 세정을 사용하여 다시 정제하였다. 깁슨(Gibson) 어셈블리는 제조업자의 프로토콜 (NewEngland Biolab)에 따라 10 μl의 반응물 중에서 수행하였다.
플라스미드 DNA는 제조업자의 지시에 따라 퀴아겐 (Qiagen) 키트를 사용하여 제조하였다. 그람-양성 균주에 대한 변형은 세포 용해를 촉진시키기 위해 0.5% 글라이신 및 리소자임이 보충된 배지에서 세균을 성장시킴을 포함하였다.
1.4. 형질전환
1.4.1 전기-컴피턴트(Electro-competent) 이. 콜라이 세포 및 형질전환
상업적 전기컴피턴트 세포는 클로닝 및 실험을 위해 사용하였다 (One Shot® ThermoFischer TOP10 화학적 컴피턴트 이. 콜라이(E. coli)). 전기천공은 표준 세팅을 사용하여 수행하였다: 전기 세포 조작기 (BTX Harvard Apparatus ECM630)를 사용한 1800 V, 25 μF 및 200 Ω. 펄스 후, 1 ml의 LB-SOC 배지를 첨가하고 세포는 1시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 형질전환된 세포는 50 μg ml-1의 가나마시인을 함유하는 LB-한천에 분주하였다.
1.4.2 전기-컴피턴트 에스. 써모필러스(S. thermophilus) 세포의 제조
상기 전기천공 프로토콜은 문헌 (Somkuti and Steinberg, 1988)으로부터 변형되었다. 40 mM DL-트레오닌(T8375 Sigma-Aldrich)이 보충된 TH 브로쓰에서 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)의 밤새 배양물은 5 ml의 동일한 배지에서 100배 희석시키고 0.3 내지 0.5 (항온처리 후 대략 2.5 시간)의 OD600이 될때까지 성장시켰다. 상기 세포는 4℃에서 10분 동안 10,000 x g에서 원심분리하여 수거하였고 5 ml의 빙냉 세척 완충액 (0.5 M 슈크로스 + 10% 글리세롤)으로 3회 세척하였다. 세포가 세척된 후, 이들은 전기천공 완충액 (0.5 M 슈크로스, 10% 글리세롤 및 1 mM MgCl2)에서 15 내지 30의 OD600이 될때까지 현탁시켰다. 전기천공 완충액 중의 세포는 사용때 까지 (1시간 이내) 4℃에서 유지시킬 수 있거나 이들을 액체 질소에 동결시키면서 에펜도르프 튜브 중 분취량 50 μl로 유지시킬 수 있고 이후 사용을 위해 -80℃에서 저장하였다.
1.4.3 에스. 써모필러스(S. thermophilus) 세포의 전기천공
1 μl의 정제된 플라스미드 DNA는 50 μl의 세포 현탁액에 첨가하고 전기천공은 미리 냉각된 2 mm-갭 전기천공 큐벳에서 수행하였다. 전기천공 세팅은 전기 세포 조작기(BTX Harvard Apparatus ECM630)를 사용한 2500 V, 25 μF 및 200 Ω이었다. 전기 펄스 직후, 1 ml의 TH 브로쓰는 세포에 첨가하였고 현탁액은 10분 동안 빙상에서 유지시키고, 후속적으로 상기 세포는 37℃에서 3시간 동안 항온처리하였다. 내성 유전자가 발현되도록 허용한 후, 상기 세포는 30 μg ml-1의 가나마이신을 함유하는 TH-한천 플레이트 상에 분주하였다. 작제물에 따라, 콜로니는 37℃에서 12 내지 48시간 항온처리에서 관찰되었다.
1.5. XylS 플라스미드의 작제
본 연구에 사용된 모든 플라스미드는 pBAV1K-T5를 기준으로 하고 있고, 이는 스트렙토코커스 크레모리스(Streptococcus cremoris) (Bryksin 　& Matsumura, 2010)로부터 유래된 크립틱 플라스미드 pWV01로부터 유래된 광범위 숙주 범위 발현 벡터이고, 골격은 깁슨 방법을 사용하여 다른 단편과의 어셈블리를 위해 오버행을 함유하는 것을 사용하여 증폭시켰다.
상기 크실로스 유도성 시스템은 XylR 리프레서 앞에 프로모터 gyrA를 클로닝함에 의해 작제하였다(도 1). XylR 리프레서는 깁슨 어셈블리에 대한 오버행을 포함하는 역배향 프라이머, 및 gyrA 프로모터 (참조: Xie et al., 2013) 및 pBAV1KT5 골격으로의 어셈블리를 위해 상응하는 오버행을 도입하기 위해 사용되는 울트라머인 정배향 프라이머를 사용하여 바실러스 서브틸리스(Bacillus Subtilis) 균주 SCK6 (Zhang et al. 2011)로부터 증폭시켰다. 상기 수득한 단편은 Pldha+PxylA 하이브리드 프로모터를 포함하는 울트라머를 사용하여 pCL002 (비공개된 연구)로부터 증폭된 mCherry로 플랭킹하였다(Xie et al. 2013). 　3개의 수득한 PCR 생성물은 제조업자의 지침에 따라 깁슨 마스터 Mix® 　(NewEngland Biolab)에 어셈블리하였다. 상기 생성물은 최종적으로 이. 콜라이 TOP10 전기컴피턴트 세포에 형질전환시켰다. 도 1을 참조한다.
1.6. CRISPR 어레이 플라스미드의 디자인 및 작제
스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)는 4개의 구분된 CRISPR 시스템을 갖고(문헌참조: Sapranauskas, et al. 2011), 본 연구를 위해 II형 CRISPR1 (ST1-CRISPR) 시스템을 선택하였다. 표적 서열의 디자인은 LMD-9의 가용한 게놈 서열 (GenBank: CP000419.1)을 기준으로 하였다. ST1-CRISPR 어레이는 크실로스 유도성 프로모터 하에 CRISPR 어레이 반복체 및 스페이서만을 함유하고(참조: Xie et al. 2013) 이어서 스트렙토코씨 종에 대한 강한 항상성 프로모터 하에 상응하는 tracrRNA 만을 함유하도록 (참조 Sorg et al. 2014) (도 2, 서열번호) 디자인하였다.
상기 tracrRNA는 crRNA의 성숙화에 역할을 수행하고 이것은 crRNA와 복합체를 형성하는 에스. 써모필러스 내인성 RNase III에 의해 프로세싱되었다. 상기 복합체는 엔도뉴클레아제 ST1-Cas9에 대한 가이드로서 작용한다(참조: Horvath & Barrangou, 2010). 크실로스 유도성 프로모터로부터 합성 어레이의 전사 후, 내인성 Cas9 및 RNAse는 이를 기능성 gRNA로 프로세싱한다. 상기 gRNA/Cas9 복합체는 표적 위치에서 이중 가닥 절단을 유발할 것이다.
어레이의 디자인은 GC 함량이 높은 2개의 특이적 표적 서열 및 tracrRNA의 감소된 부분 (즉, 완전하지 못한 tracrRNA 서열) (이것은 crRNA의 적당한 성숙화를 위해 필요하지 않은 것으로 제안되었다)을 사용하였다 (문헌참조: Horvath & Barrangou, 2010).
상기 2개의 표적은 필수 유전자 (DNA 폴리머라제 III 서브유니트 알파) 및 항생제 내성 유전자(tetA-형 유전자) (서열번호 )이었다.
프라이머를 사용하여 pBAV1KT5-XylR-PldhA 골격을 증폭시켰다. CRISPR 어레이 gBlock 및 오버행을 갖는 골격은 제조업자의 지침 (NewEngland Biolabs)에 따라 깁슨 마스터 (Gibson Master) Mix®에서 어셈블리하였다. 상기 생성물은 최종적으로 이. 콜라이 TOP10 전기컴피턴트 세포에 형질전환시켰다.
1.7. 스트렙토코커스 써모필러스 LMD-9에서 크실로스 유도성 시스템의 특징 분석
밤새 정체기 배양물은 상응하는 항생제와 함께 TH 브로쓰로 1:100으로 희석하였다. 중간-log 세포는 다양한 농도의 D-(+)-크실로스 (0, 0.001, 0.01, 0.1, 0.5 및 1 % wt/vol)로 유도하였고 세포 배양물은 세포 현탁액 또는 현탁액 완충액 (PBS 완충액)에 대한, 배지의 자가형광성의 정도를 평가하기 위해 배지에서 직접 측정하였다. 세포 배양물의 20 μl 샘플은 평저를 갖는 96-웰 플레이트 상에서, PBS 완충액에 대해 1/10으로 희석하였다. 세포 현탁액 또는 배지의 형광성은 플레이트 판독기 상에서 판독하였다. mCherry 형광성은 558nm의 여기 파장 및 612nm에서 방출을 사용하여 측정하였다. 재현탁된 세포의 흡광도는 OD 600 nm에서 측정하였다. 최소 3개의 독립적 생물학적 레플리케이트는 각각의 실험에 대해 수행하였다.
1.8. 에스. 써모필러스(S. thermophilus)에서 CRISPR 어레이의 활성화
에스. 써모필러스의 DNA 폴리머라제 III 및 tetA를 표적화하는 CRISPR 어레이를 함유하는 플라스미드를 갖는 에스. 써모필러스(S. thermophilus) LMD-9 및 이. 콜라이(E.coli) TOP10 둘 다는 플라스미드 유지를 위해 30 μg ml-1의 가나마이신이 보충된 3 ml의 배양물에서 밤새 성장시켰다. 다음 날에, 96 웰 깊은 웰 플레이트에 30 μg ml-1 가나마이신이 보충된, 새로운 TH 배지에서 1/100의 밤새 배양물 500 μl을 접종하였다. 중간-log 세포 배양물은 1% 크실로스로 유도하였다. 상기 사멸 효과는 에스. 써모필러스(S.thermophilus) 및 이. 콜라이(E.coli) 단독에 대해 시험하였다. 시험된 각각의 균주 및 조건에 대해, 음성 대조군은 크실로스 없이 유지시켰다. 세포는 ~OD 0.5까지 성장시키고 이어서 TH 배지에서 10배 연속 희석하였고 96-웰 레플리케이터(Mettler Toledo LiquidatorTM 96)를 사용하여 5 μL의 용적 적가물을 TH 한천, 및 g l-1 PEA 플레이트가 보충된 TH 한천 상에 스팟팅하였다. 상기 플레이트는 37℃에서 24H 동안 항온처리하고 콜로니 형성 유니트(CFU)는 3회 측정으로부터 계산하였다.
2. 결과
2.1 성장 조건 및 선택적 배지
본원 발명자는 먼저 본원 발명자가 동시-배양실험을 위해 사용하기로 계획했던 모든 균주에 대한 성장을 지지하는 세균 균주 및 배양 프로토콜을 확립하기로 하였다. 본원 발명자는 37℃에서 TH 브로쓰에서 이. 콜라이와 유사한 성장을 지지할 수 있는 에스. 써모필러스(S. thermophilus) 균주 LMD-9를 사용하였다(도 3).
혼합 배양물로부터 다양한 세균의 구분은 상이한 종의 세포 수를 결정하기 위해 중요하다. 맥콘키(MacConkey) 한천을 사용하여 이. 콜라이를 선택적으로 성장시킬 수 있지만 에스. 써모필러스의 선택적 성장을 위한 어떠한 특이적 배지가 없다. PEA 한천은 그람-음성 (이. 콜라이)로부터 그람-양성(에스. 써모필러스)의 단리를 위해 사용되는 선택적 배지이다. 추가로, 본원 발명자는 다양한 농도의 PEA는 부분적으로 다른 그람 양성의 성장을 억제하여 본 연구에 사용되는 다른 그람-양성 세균 간의 선택을 가능하게 함을 발견하였다(도 4). 3 g l-1의 PEA는 이. 콜라이의 성장을 제한하면서, 에스. 써모필러스 LMD-9를 선택적으로 성장시키는 것으로 입증되었다.
2.2 유도성 시스템의 디자인 및 확인
스트렙토코커스(Streptococcus) 종에 대한 유도 시스템은 이종성 크실로스 유도 카세트(Xyl-S)를 생성시킴에 의해 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 크실로스 오페론(도 5)을 기반으로 이전에 개발하였다. xylR 및 xylA 프로모터는 각각 에스. 뮤탄스(S. mutans') 항상성으로 발현된 gyrA 및 ldh 프로모터로 대체하였다. 스트렙토코커스 종에 대한 상기 발현 카세트는 다양한 종 간의 민감성 및 발현 수준에서의 차이를 보여주었지만 상기 시스템은 에스. 써모필러스(S. thermophilus)에서 시험되지 않았다(참조: Xie et al. 2013). 따라서, 본 발명자는 에스. 써모필러스에서 유도 카세트를 확인하기로 하였다.
상기 유도 카세트의 대안적 버전은 단지 xylR 프로모터를 에스. 뮤탄스(S. mutans') gyrA 프로모터로 대체하여 작제하였지만 내인성 비. 메가테리움(B. megaterium) xylA 프로모터는 온전하게 유지하였다. 크실로스 유도성 시스템의 디자인 동안에, 본 발명자는 유도성 프로모터 버전 둘 다, 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)에서 발견되는 천연 P XylA 프로모터, 및 P XylA 프로모터의 리프레서 결합 부위와 융합된 고도의 보존성 프로모터 P ldha 의 하이브리드 프로모터를 고려하였다(도 5). 단지 몇개의 스트렙토코커스 종은 크실로스를 대사하는 것으로 보고되었고 따라서 다른 스트렙토코커스 종에서 xylA 프로모터를 인지하기 위한 조절 기구는 가능하지 않다. 따라서, 본원 발명자는 크실로스 유도 시스템 둘 다를 작제하였지만 단지 Pldha+XylA 시스템을 사용한 mCherry의 유도성을 시험하였다.
크실로스에 의한 mCherry 유도성 발현을 결정하기 위해, 플라스미드(pBAV1KT5-XylR-mCherry-Pldha+XylA)를 갖는 세포의 중간-log 배양물은 다양한 농도의 크실로스로 유도하였다. 유도 후 6시간 째에 본 발명자는 배양물에서 mCherry 형광성을 측정하였고, 여기서, 본 발명자는 플라스미드를 갖는 세포에서 실질적으로 보다 높은 전체 발현 수준을 관찰하였다(도 6). 상기 시스템이 심지어 크실로스가 첨가되지 않은 배양물에서도 기본 발현의 실질적 수준을 보여주었다는 것은 주지할 가치가 있다. 이것은 상기 시스템이 '누설'이고 사멸-어레이와 관련하여, 이것은 시스템이 크실로스로 유도되기 전에도 세포사를 유도할 수 있음을 의미한다. 그러나, 상기 연구의 후속적 과정에서, 본 발명자는 플라스미드 버전 둘 다(pBAV1KT5-XylR-mCherry-Pldha+XylA 및 pBAV1KT5-XylR-mCherry-PxylA)를 사용하였다.
2.3 CRISPR/CAS9 어레이의 디자인
CRISPR 어레이에서 게놈 표적화 스페이서가 에스. 써모필러스(S.thermophilus) LMD-9에서 사멸을 유발할 수 있는지를 결정하기 위해, 본 발명자는 본 발명자가 이전에 작제된 2개의 크실로스 유도성 시스템 (pBAV1KT5-XylR-mCherry-Pldha+XylA 및 pBAV1KT5-XylR-mCherry-PxylA)으로 디자인했던 CRISPR 어레이를 삽입하였다. 이들 플라스미드에서, 본 발명자는 CRISPR 어레이를 함유하는 gBlock으로 mCherry를 대체하였다(도 7). P ldha+XylA 프로모터를 갖는 변이체는 P xylA 보다 더 강하고 높은 기본 활성을 갖는 것으로 예상되었다(참조: Xie et al. 2013).
2.4 내인성 Cas9를 사용한 세균 집단 성장의 억제
본 발명자가 이. 콜라이에서 플라스미드를 작제한 후, 본 발명자는 플라스미드로 에스. 써모필러스(S. thermophilus)를 형질전환시켰다. 이것은 본 발명자가 특이적 세균 종의 세포사를 유도할 수 있는지를 결정할 수 있게 한다. 흥미롭게도, 강한 P ldh + XylA 하이브리드 프로모터를 함유하는 플라스미드에 노출된 에스. 써모필러스에서 세균 숙주 집단 크기 (한천 플레이트 상에서 세균을 증식시키고 콜로니 수를 계수함에 의해 지적되는)는 약한, 정상의 P xylA 프로모터를 함유하는 플라스미드에 노출된 에스. 써모필러스(S. thermophilus)와 비교하는 경우 10배 미만이었고(도 8; 강한 어레이 발현을 갖는 52개 콜로니 대 약한 어레이 발현을 갖는 556개 콜로니, 10.7-배 차이), 상기 2개 균주는 전기컴피턴트 에스. 써모필러스 세포의 동일한 배치를 사용하여 병행하여 형질전환시켰다. 이것은 에스. 써모필러스(S. thermophilus) 유전자를 표적화하는 CRISPR 어레이를 갖는 플라스미드가 내인성 Cas 뉴클레아제 및 RNase III를 사용하여 세포를 사멸시킴으로써, 집단 성장을 10배까지 억제할 수 있음을 본 발명자에게 시사한다.
본 발명자는 P xylA 프로모터를 포함하는 플라스미드에 의해 형질전환된 숙주 세포에서의 약한 어레이 발현이 강한 프로모터 플라스미드 보다는 훨씬 못하지만 어느 정도의 세포 사멸을 유도한 것으로 예상한다. 본 발명자는 관찰된 10배 억제 보다 큰 집단 성장 억제가 강한 어레이 발현의 활성이 임의의 어레이-암호화 플라스미드에 노출되지 않은 에스. 써모필러스(장 내 미생물총으로부터 직접 단리된 세균과 같은)와 비교되었는지를 결정한 것으로 예상한다. 따라서, 본 발명자는 내인성 Cas 뉴클레아제를 사용하기 위한 숙주 세포에서 어레이 (또는 단일 가이드 RNA)가 본원에 언급된 환경적, 의학적 및 다른 세팅에서 표적 숙주 세포의 효과적인 성장 억제를 제공하기 위해 유용한 것으로 믿는다. 항생제의 동시 투여는 또한 특히, 하나 이상의 항생제 내성 유전자가 표적화되는 경우 성장 억제를 증진시키기 위해 유용할 수 있다.
3. 논의 및 관점
본 연구에서, 본 발명자는 내인성 Cas9 시스템을 사용하여 에스. 써모필서스(S. thermophilus)를 특이적으로 사멸시키기 위해 CRISPR-어레이를 디자인하기로 하였다. 사멸 신호에 대한 제어를 얻기 위해, 본 발명자는 에스. 써모필러스(S. thermophilus)에 적용될 수 있는 유도성 시스템을 적용하고자 하였다. 비. 메가테리움(B. megaterium)으로부터의 크실로스 유도성 XylR 시스템은 이전에 에스. 뮤탄스(S. mutans)(참조: Xie, 2013)에 적용되었지만 에스. 써모필러스(S. thermophilus)에 적용되지 않았다. 본 연구에서, 본 발명자는 에스. 써모필러스(S. thermophilus)에서 디자인된 XylR-mCherry-Pldha 서킷을 사용하여 xylR 유도 시스템의 기능성을 입증하였다. 본 발명자는 0.1 % wt/vol이 에스. 써모필러스(S. thermophilus)에서 xylR 시스템을 완전히 유도하기에 충분함을 발견하였다(도 6).
에스. 써모필러스 및 이. 콜라이를 동시 배양하는 경우의 풍부함을 관찰하기 위해, 본 발명자는 3 g l-1의 PEA를 갖는 배양 배지의 보충이 이. 콜라이의 성장을 제한하면서 에스. 써모필러스의 선택적 성장을 가능하게 함을 확립하였다(도 4).
에스. 써모필러스 LMD-9 게놈에서 DNA 폴리머라제 III 서브유니트 알파 및 tetA 유사 유전자를 표적화하는 ST1-CRISPR 어레이는 크실로스 유도성 프로모터 하에 위치시켰다(참조: Xie et al. 2013). 이들 영역의 표적화는 이중 가닥 절단을 유도함에 따라서 에스. 써모필러스 생존능을 제한해야만 한다(도 9). 가공된 어레이는 암호화된 CRISPR 어레이를 프로세싱하기 위한 내인성 CRISPR/Cas 기구를 사용하여 에스. 써모필러스 게놈을 표적화하도록 디자인되었기 때문에, 상기 어레이는 심지어 유사한 표적이 이의 게놈 상에서도 발견될 수 있지만, 이. 콜라이와 같은 관련 없는 균주의 성장에 대한 어떠한 영향을 갖지 않는 것으로 예상된다. 이것은 성공적으로 실시예 3에 논의된 바와 같이 혼합 세균 집단 (인간 미생물총의 시뮬레이션 양상)에서 시험하였다.
표면 상의 숙주 세포 성장을 억제하는 능력의 입증은 본 발명이 인간 또는 동물 대상체에서 본원에 기재된 바와 같은 미생물총에 의해 매개되거나 유발되는 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하기 위한 구현예에서 중요하고 바람직할 수 있다. 상기 미생물총은 전형적으로 대상체의 조직(예를 들어, 장 내 조직)과 접촉해 있고 따라서, 본 발명자는 표면 상의 미생물총 세균 종 (스트렙토코커스에 의해 예시된)의 성장을 억제하는 능력의 입증이 상기 용도를 지지함을 믿는다.
실시예 2: 다양한 균주에서 특이적 미생물총 세균 집단 성장 억제
실시예 1은 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) LMD-9의 특이적 성장 억제를 입증하였다. 여기서, 본 발명자는 성장 억제가 또한 제2 균주에서 수득될 수 있음을 입증한다: 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)　DSM 20617. 실시예 1에 기재된 방법은 따라서 후자 균주에 적용하였다(에스. 써모필러스(S.thermophilus) DSM 20617에 대한 선택 배지가 2.5g l-1의 2-페닐에탄올 (PEA)로 보충된 TH 배지임을 제외함).
CRISPR 어레이 플라스미드로 형질전환된 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)　DSM 20617은 가나마이신 내성의 발현을 가능하게 하는, 37℃에서 3시간의 기간 동안 액체 배지에서 회수를 위해 배양하였다. 회수 기간 후, 세포는 세포사를 유도하기 위해 1% 크실로스의 존재하에 및 대조군으로서 크실로스 없이 다양한 선택 배지에 분주하였다 (도 10). (1) 크실로스 유도에 의해, 에스. 써모필러스(S. thermophilus)의 성장이 억제될 수 있고 (대조군에 비해 "강한" 프로모터 플라스미드에 대해 약 10배), (2) '강한' 시스템(pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA)이 '약한' 시스템(pBAV1KT5- XylR-CRISPR-PxylA)보다 더 성장 감소를 유도한다는 것은 자명하다.
실시예 3: 다양한 미생물총 종의 혼합 컨소시엄에서 선택적 세균 집단 성장 억제
본 발명자는 이어서 3개의 종의 혼합 집단에서 특이적 세균 종의 선택적 성장 억제를 입증하였다. 본 발명자는 인간 및 동물의 장 내 미생물총에서 발견되는 종(에스. 써모필러스(S thermophilus) DSM 20617(T), 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis) 및 이. 콜라이(E coli))를 선택하였다. 본 발명자는 이것이 이전 종의 선택적 사멸을 위한 능력에 영향을 주는지를 알아보기 위해; 추가로 이것이 에스. 써모필러스과 계통발생적으로 관련된 종이기 때문에 (2개의 종 간에 높은 16s 리보솜 RNA 서열 동일성에 의해 지적된 바와 같이) 엘. 락티스가 선택되는 어려움을 증가시키기 위해 (및 미생물총 내 상황을 보다 밀접하게 시뮬레이션하기 위해) 2개의 그람-양성 종을 포함시켰다. 에스 써모필러스(S thermophilus) 및 엘. 락티스(L lactis)는 둘 다 피르미쿠테스(Firmicutes)이다. 추가로, 미생물총을 시뮬레이션하기 위해, 인간 공생 장 내 종(이. 콜라이)이 포함되었다.
1. 재료 및 방법
실시예 1에 설정된 바와 같은 방법을 사용하였다(선택적 배지가 2.5 g l-1의 2-페닐에탄올(PEA)이 보충된 TH 배지인 것임을 제외함).
1.1 전기-컴피턴트 엘. 락티스(L. lactis) 세포의 제조
0.5 M 슈크로스 및 1% 글라이신이 보충된 TH 배지에서 엘.락티스(L. lactis)의 밤새 배양물은 5 ml의 동일한 배지에서 100배 희석시키고 0.2 내지 0.7 (항온처리 후 대략 2시간)의 OD600이 될때까지 30℃에서 성장시켰다. 상기 세포는 4℃에서 5분 동안 7000 x g에서 수거하였고 5 ml의 빙냉 세척 완충액 (0.5 M 슈크로스 + 10% 글리세롤)으로 3회 세척하였다. 세포가 세척된 후, 이들은 전기천공 완충액 (0.5 M 슈크로스, 10% 글리세롤 및 1 mM MgCl2)에서 15 내지 30의 OD600이 될때까지 현탁시켰다. 전기천공 완충액 중의 세포는 사용때 까지 (1시간 이내) 4℃에서 유지시키거나 이들을 액체 질소에 동결시키면서 에펜도르프 튜브 중 분취량 50 μl로 유지시킬 수 있고 이후 사용을 위해 -80℃에서 저장하였다.
모든 종에 대한 전기천공 조건은 실시예 1에 기재된 바와 같다.
1.2 CRISPR 어레이의 활성화: 컨소시엄 실험.
에스. 써모필러스(S. thermophilus) DSM 20617, 엘. 락티스(L. lactis) MG1363 및 이. 콜라이(E.coli) TOP10은 에스. 써모필러스의 DNA 폴리머라제 III 및 tetA를 표적화하는 CRISPR 어레이를 함유하는 플라스미드로 유전학적으로 형질전환시켰다. 형질전환 후, 모든 세포는 단독으로 성장시키고 37℃에서 3시간 동안 동시 배양하여 회수를 위해 플라스미드에 암호화된 항생제 내성이 나타내도록 한다. 본 발명자는 CRISPR-암호화된 성장 억제의 판독치로서 형질전환 효율을 사용하기로 결정하였다. 따라서, 세포가 회수되도록 한 후, 배양물은 TH 배지에 분주하고, TH에 PEA를 보충하고 맥콘키 한천 모두에 가나마이신을 보충하고 1% 크실로스에 의해 유도하였다.
2. 결과
2.0 엘. 락티스(L. lactis), 이. 콜라이(E. coli) 및 에스. 써모필러스(S. thermophilus) 간의 계통발생적 거리
에스. 써모필러스(S. thermophilus) 및 엘. 락티스(L. lactis)의 16S rRNA-암호화 DNA 서열에서 계산된 서열 유사성은 83.3%인 것으로 결정하였다. 하기의 16S 서열을 사용하였다: 이. 콜라이(E. coli): AB030918.1, 에스. 써모필러스(S. thermophilus): AY188354.1, 엘. 락티스(L. lactis): AB030918. 상기 서열은 하기의 파리미터와 함께 니들로 정렬하였다 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html): -가포펜(gapopen) 10.0 -가펙스텐드(gapextend) 0.5 -엔도펜(endopen) 10.0 -엔덱스텐드(endextend) 0.5 -아포르매트3 쌍 -스뉴클레오타이드1 -스뉴클레오타이드2. 도 11은 에스. 써모필러스(S. thermophilus), 엘. 락티스 및 이.콜라이로부터의 16S 서열의 최대 가능성 계통 발생 트리(tree)를 보여준다.
2.1 성장 조건 및 선택적 배지
에스. 써모필러스(S. thermophilus) 및 엘. 락티스(L. lactis)는 통상적으로 많은 발효된 식품 및 요쿠르트에서 조합하여 사용한다. 본 발명자는 상기 균주들이 통상적으로 에스. 써모필러스(S. thermophilus) 및 엘. 락티스(L. lactis)의 16S 리보솜 RNA 영역의 숙주 및 이전의 특징 분석과 친밀한 연합을 형성하는 장 내 미생물인 것으로 공지되어 있기 때문에 이들 균주들을 선택하였고 이들 유기체들이 계통발생적으로 밀접하게 관련되어 있음을 보여주었다 (참조: Ludwig et al., 1995). 병행하여, 본 발명자는 또한 본원의 혼합된 집단 동시-배양 실험을 위해 이. 콜라이의 성장을 평가하였는데, 그 이유는 상기 유기체가 또한 장 내 미생물 공통체에서 통상적으로 발견되기 때문이다. 본원 발명자는 먼저 본원 발명자가 동시-배양실험을 위해 사용하기로 계획했던 모든 균주에 대한 성장을 지지하는 세균 균주 및 배양 프로토콜을 확립하기로 하였다. 본 발명자는 모든 균주가 37℃에서 TH 브로쓰에 성장을 지지할 수 있음을 발견하였다(도 3).
혼합 배양물로부터 상이한 세균의 구분은 상이한 종의 세포 수를 결정하기 위해 중요하다. 맥콘키(MacConkey) 한천을 사용하여 이. 콜라이를 선택적으로 성장시킬 수 있지만 에스. 써모필러스의 선택적 성장을 위한 어떠한 특이적 배지가 없다. PEA 한천은 그람-음성(이. 콜라이)로부터 그람-양성(에스. 써모필러스)의 단리를 위해 사용되는 선택적 배지이다. 추가로, 다양한 농도의 PEA는 부분적으로 상이한 그람 양성 종 및 균주의 성장을 억제하고, 이는 본 연구에 사용되는 다른 그람-양성 세균과 구분하여 선택되도록 한다. 2.5 g l-1의 PEA의 사용은 엘. 락티스 및 이. 콜라이의 성장을 제한하면서, 에스. 써모필러스를 선택적으로 성장시키는 것으로 입증되었다.
모든 균주는 가나마이신 선택 마커를 갖는 pBAV1KT5의 벡터 골격을 사용한 플라스미드로 형질전환시켰고; 본 발명자는 30 ug ml-1의 가나마이신이 보충된 배지의 사용은 플라스미드를 유지하면서 세포를 성장시키기 위해 충분함을 발견하였다.
2.3 혼합 집단에서 형질전환 및 선택 성장 억제
본 발명자는 에스. 써모필러스(S. thermophilus), 엘. 락티스(L. lactis) 및 이. 콜라이(E. coli)를, CRISPR 어레이를 함유하는 플라스미드로 형질전환시키고 이들을 균등한 부분으로 조합된 모든 세균 종의 컨소시엄 중에서 이들을 배양하여, 본원 발명자가 에스. 써모필러스(S.thermophilus) 중에서 특이적으로 세포사를 유발할 수 있는지를 결정하도록 한다. 본 발명자는 모든 종을 pBAV1KT5-XylR-CRISPR-P XylA 또는 pBAV1KT5-XylR-CRISPR-P ldha+XylA 플라스미드로 형질전환시켰다.
도 12는 pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA 또는 pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA+XylA 플라스미드를 함유하는 이. 콜라이, 엘. 락티스 및 에스. 써모필러스의 공동-배양물 중에서 선택적 에스 써모필러스 성장 억제를 보여준다. 어떠한 성장 차이도 pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA 또는 pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA+XylA 플라스미드를 함유하는 이. 콜라이 간에 관찰되지 않았다 (중앙 칼럼). 그러나, 에스. 써모필러스 (2.5 gl-1 PEA가 보충된 TH 한천 상에서 선택적으로 성장한, 마지막 칼럼)는 본 발명자가 예상된 바와 같이 pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA (강한) 또는 pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA +XylA (약한) 플라스미드 간의 형질전환 효율의 감소를 보여준다. 본원 발명자는 따라서 세포의 혼합 집단에서 표적 에스. 써모필러스 서브-집단의 선택적 성장 억제를 입증하였다.
참조문헌
Figure pct00001
Figure pct00002
실시예 4: 혼합 장 미생물총 집단에서 클로스트리디움 디피실 ( Clostridium dificile ) 비율의 변화
세균의 비율의 변화는 본 실시예에 따라 수행되고, 이는 혼합 장 내 미생물총 샘플 중에서 클로스트리디움 디피실(Clostridium dificile) 세균의 녹다운을 참조로 기재된다. 상기 샘플은 박테로이데스(Bacteroides) 및 메트로니다졸(MTZ)-내성 씨. 디피실(C dificile) 균주 630 서브-집단을 함유한다. 생체외 혼합 집단은 CRISPR 어레이를 함유하도록 가공된 캐리어 세균 (락토바실러스 액시도필러스(Lactobacillus acidophilus) La-14 및/또는 La-5)의 집단과 조합된다.
각각의 CRISPR 어레이는 캐리어 세균 및 씨. 디피실(C dificile) 세포와 상용성일 수 있는 플라스미드 상에 포함된다. 상기 어레이는 또한 oriT, intDOT 서열, tetQ-rteA-rteB 오페론, rteC 및 오페론 xis2c-xis2d-orf3-exc를 또한 포함하는 박테로이데스 테타이오타미크론(Bacteroides thetaiotamicron) CTnDot 트랜스포존에 의해 포함된다. 하나의 예에서, mob 및 tra 오페론은 배제된다(대신 캐리어 세균과 조합된 혼합물 중에서 트랜스포존이 전달되는 박테로이데스 세포에 의해 공급되는 것들에 의존한다). 또 다른 예에서, mob 및 tra 오페론은 트랜스포존 내에 포함된다.
세포질막에 걸친 단백질 전위는 모든 세균 중에서 필수 프로세스이다. 이의 코어에서 ATPase, SecA, 및 막 채널, SecYEG를 포함하는 Sec 시스템은 대다수의 상기 단백질 수송에 관여한다. 제2 병행 Sec 시스템은 다수의 그람-양성 종에서 보고되었다. 상기 악세서리 Sec 시스템은 에너지화 ATPase의 제2 카피, SecA2의 존재를 특징으로 하고; 이것이 연구된 경우 SecA2는 Sec 기질의 서브세트의 전위에 관여한다. 많은 병원성 그람-양성 종과 공통적으로, 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile)은 2개 카피의 SecA를 갖는다. S-층 단백질 (SLP) 및 추가의 세포벽 단백질 (CwpV)의 배출은 SecA2에 의존한다. SLP SlpA 및 다른 세포벽 단백질의 세포질 전구체의 축적은 우성-음성　secA1　또는　secA2　대립유전자를 발현하는 세포에서 관찰되고 이와 동시에 세포벽에서 성숙한 SLP의 수준은 감소한다. 추가로, 우성-음성 대립유전자 또는 SecA1 또는 SecA2의 안티센스 RNA 녹다운의 발현은 급격히 성장을 손상시키고, 이는 Sec 시스템 둘 다가 씨. 디피실(C. difficlile)에서 필수적임을 지적한다.
씨. 디피실(C. difficile)　균주 630 (전염 유형 X)은 4,290,252 bp (G+C 함량 = 29.06%)의 단일 환형 염색체 및 7,881 bp (G+C 함량 = 27.9%)의 환형 플라스미드를 갖는다. 전체 게놈은 서열 분석되었고 게놈의 11%가 접합성 트랜스포존과 같은 이동 유전자 요소들로 이루어진 것으로 밝혀졌다. 이들 요소들은 이의 항미생물 내성, 독성, 숙주 상호작용 및 표면 구조물의 생성에 관여하는 유전자들을 갖는　씨. 디피실(C. difficile)을 제공한다. 예를 들어,　씨. 디피실(C. difficile)의 cdeA 유전자는 다중약물 및 독성 화합물 분출 (MATE) 계열에서 공지된 유출 수송체와 상동성인 것으로 나타난 다중약물 유출 펌프를 생성한다. 상기 단백질은 세포로부터 약물의 에너지-의존성 및 나트륨-커플링된 유출을 촉진시킨다. 추가로, 씨. 디피실(C. difficile)에서 cme 유전자는 다른 세균에서 다중 약물 내성을 제공하는 것으로 나타났다.
상기 어레이는 씨. 디피실 세포의 필수 유전자 (SecA2)에서 서열을 표적화하기 위해 R1-S1-R1' CRISPR 유니트 (2개의 CRISPR 반복체에 의해 플랭킹된 스페이서)를 포함한다. 또 다른 실험에서, 표적화는 MTZ의 존재 및 임의로 하나 이상의 다른 항-씨. 디피실 항생제의 존재하에 cdeA 유전자에 대한 것이다. 각각의 스페이서(들)은 SecA 또는 cdeA 유전자의 20량체 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서, 상기 서열은 반복체 서열과 동족성인 씨. 디피실 균주 630 CRIPR/Cas 시스템의 PAM을 포함한다. 각각의 반복체는 씨. 디피실(C dificile) 균주 630 반복체와 동일하다.
상기 반복체는 혼합 집단에서 씨. 디피실(C dificile) 세포에 내인성인 Cas와 함께 기능한다. 세균의 상기 혼합 집단은 씨. 디피실(C dificile) 감염을 앓는 인간 환자의 대변 샘플로부터의 생체외 샘플로서 회수된다. 상기 혼합 집단은 시험관내에서 캐리어 세균과 혼합되고 혐기적 조건하에서 37℃에서 배양하여 테트라사이클린의 존재하에 장 내 조건을 자극한다. CRISPR 어레이를 함유하는 트랜스포존이 상기 혼합물에서 박테로이데스 및 씨. 디피실 세포로 전달될 것으로 예상된다. 추가로, 후자 세포에서 표적 부위가 Cas 뉴클레아제 작용에 의해 절단됨에 따라서 혼합 집단에서 씨. 디피실의 비율을 감소시키는(및 씨 디피실에 대한 박테로이데스의 비율을 증가시키는) 것으로 예상된다.
후속 실험에서, 캐리어 세균을 포함하는 음료를 제조하고 이것은 제산제의 존재 또는 부재하에 수일의 연속일 동안 1회 또는 2회 인간 환자에 의해 소비된다. 또한 치료 기간 동안에 환자에게 테트라사이클린을 투여한다. 이것은 대변 분석이 대변 샘플 중에 씨 디피실의 비율이 감소함 (및 씨 디피실에 대한 박테로이데스의 비율은 증가한다)을 밝힐 것으로 예상된다.
실시예 5: 혼합 세균 컨소시엄에서 선택적 종 및 균주 성장 억제를 위한 벡터-암호화된 시스템
실시예 3에서, 본 발명자는 놀랍게도 상이한 종의 혼합 컨소시엄에서 선택적 집단 성장 억제를 위해, 숙주 세균에서 내인성 Cas 뉴클레아제 활성을 사용할 가능할 가능성을 확립하였다. 본 발명자는 이어서 상이한 종의 혼합 컨소시엄에서 선택적 집단 성장 억제를 위한 벡터-암호화된 Cas 활성을 대신 사용할 가능성을 탐구하였다. 본 발명자는 3개의 상이한 종 및 표적 세균에 대한 균주 대안물을 추가로 포함하는 혼합 집단에서 특이적 세균 종의 선택적 성장 억제를 입증하였다. 본 발명자는 놀랍게도 소정의 표적 종의 단지 표적 균주의 선택적 성장 억제를 보여줄 수 있다. 추가로, 대안적 균주는 인간 또는 동물 장 내 미생물총 요소들을 모방하는 혼합 세균 컨소시엄에서 상기 벡터-함유 시스템의 미세한 특이성을 확립하기 위해 바람직할 수 있는, 벡터 암호화된 CRISPR/Cas 시스템에 의해 표적화되지 않았다.
본 발명자는 인간 및 동물의 장 내 미생물총에서 발견되는 종(바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis) 및 이. 콜라이(E.coli)를 선택하였다. 본 발명자는 인간 공생 장 내 종, 이. 콜라이(E. coli)의 2개의 균주를 포함하였다. 본 발명자는 이것이 본 발명자가 밀접하게 관련되었지만 그럼에도 불구하고 본 발명자가 하나의 균주에서 표적 사멸을 위해 사용할 수 있지만 다른 균주의 표적을 사멸시키지 않는 서열 차이를 갖는 균주들을 구분할 수 있는지를 알아보기 위해 관심 대상인 것으로 사료된다. 이것은 미생물총에서 이. 콜라이의 일부 균주가 바람직할 수 있기 때문에 관심 대상인 반면 다른 것들은 바람직하지 않을 수 있고 (예를 들어, 인간 또는 동물에 병원성인) 따라서 상기 균주를 녹다운시키기 위해 Cas 변형을 위한 표적이 될 수 있다.
1. 재료 및 방법
1.1. 플라스미드 및 균주
표 7 및 8을 참조한다. 모든 균주는 달리 지적되지 않는 경우 호기 조건에서 및 37℃에서 토드-헤위트(Todd-Hewitt) 브로쓰 　(TH) (T1438 Sigma-Aldrich)에서 배양하였다. 상기 균주는 -80℃에서 25% 글리세롤 중에 저장하였다.
자가-표적화 sgRNA-Cas9 복합체는 각각 테오필린 리보스위치 및 AraC/PBAD 발현 시스템에 의해 엄격하게 조절되었다. Cas9의 엄격한 조절은 이. 콜라이에서 안정하게 이동하도록 하기 위해 요구된다. 플라스미드는 이. 콜라이 K-12 균주를 표적화하는 단일 가이드 RNA (single guide RNA, sgRNA)와 함께 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)로부터 기원하는 외인성 Cas9를 함유하였다. 따라서 K-12 유래된 균주 TOP10은 이중 나선 자가-절단에 민감할 수 있고 결과적으로 시스템이 활성화되는 경우 사멸된다. 니슬(Nissle)과 같은 이. 콜라이 균주는 동일한 표적 서열을 갖지 않고 따라서 이들은 sgRNA-Cas9 활성에 의해 영향받지 않았다. 하기 표 9 내지 11을 참조하고, 이는 실시예 9에 사용된 서열을 보여준다. 본 발명자는 표적 세포에서 보존되고 다중 카피물(7개 카피물)로 존재하여 다수의 위치에서 숙주 세포 게놈을 절단할 기회를 증가시켜 단일 gRNA 디자인을 사용하여 사멸을 촉진시키는, 표적 서열 (리보솜 RNA-암호화 서열)을 선택하였다.
도 13은 spCas9의 발현을 조절하는 조절제 및 리보솜 RNA 서브유니트 16s를 표적화하는 자가 표적화 sgRNA를 보여준다.
1.2. 차등 성장 배지
모든 균주는 20시간 동안 37℃에서 TH-배지 상에서 성장시켰다. 비. 서브틸리스(B.subtilis)에 대한 선택적 배지는 2.5 g l-1의 2-페닐에탄올(PEA)이 보충된 TH 배지였다. 　PEA는 상기 배지에 첨가하고 15 psi에서 15분 동안 121℃에서 오토클레이빙하였다. 한천 플레이트는 1.5% (wt/vol) 한천을 상응하는 배지에 첨가함에 의해 제조하였다.
1.3. 클로닝
이. 콜라이(E. coli) (One Shot® ThermoFischer TOP10 Chemically Competent cells)는 서브클로닝 과정에서 사용하였다. PCR은 PhusionTM 폴리머라제를 사용하여 수행하였다. 모든 PCR 생성물은 제조업자의 프로토콜에 따른 Macherey-NagelTM에 의한 NucleospinTM 겔 및 PCR 세정으로 정제하였다. 상기 정제된 단편은 총 34 μl의 용적으로, 1μl 효소를 갖는 1X FD 완충액 중에서 제한 효소 Dpnl로 분해하였다. 분해된 반응물은 제조업자의 프로토콜에 따른 맥커리-나겔 (Macherey-Nagel)에 의한 뉴클레오스핀 겔 및 PCR 세정을 사용하여 다시 정제하였다. 깁슨 (Gibson) 어셈블리는 제조업자의 프로토콜 (NewEngland Biolab)에 따라 10 μl의 반응물 중에서 수행하였다.
플라스미드 DNA는 제조업자의 지시에 따라 퀴아겐 (Qiagen) 키트를 사용하여 제조하였다. 그람-양성 균주에 대한 변형은 세포 용해를 촉진시키기 위해 0.5% 글라이신 및 리소자임이 보충된 배지에서 세균을 성장시킴을 포함하였다.
1.4. 형질전환
1.4.1 전기-컴피턴트 이. 콜라이 세포 및 형질전환
상업적 전기컴피턴트 세포는 클로닝 및 실험을 위해 사용하였다 (One Shot® ThermoFischer TOP10 전기컴피턴트 이. 콜라이(E. coli)). 전기천공은 표준 세팅을 사용하여 수행하였다: 전기 세포 조작기 (BTX Harvard Apparatus ECM630)를 사용한 1800 V, 25 μF 및 200 Ω. 펄스 후, 1 ml의 LB-SOC 배지를 첨가하고 세포는 1시간동안 37℃에서 항온처리하였다. 형질전환된 세포는 상응하는 항생제를 함유하는 LB-한천에 분주하였다.
1.5. 이. 콜라이 및 컨소시엄 실험에서 sgRNA-Cas9 의 활성화.
K12 유래된 균주 및 다른 세균의 리보솜-RNA-암호화 서열을 표적화하는 sgRNA를 함유하는 플라스미드를 갖는 이. 콜라이(E.coli) TOP10 및 니슬 (Nissle) 둘 다는 3 ml의 TH 브로쓰에서 밤새 성장시켰다. 다음 날에 상기 세포는 ~OD 0.5까지 희석시키고 이어서 TH 배지에서 10배 연속 희석하였고 96-웰 레플리케이터(Mettler Toledo LiquidatorTM 96)를 사용하여 4μL의 용적 적가물을 TH 한천, 유도제 (1% 아라비노스 및 2mM 테오필린)를 갖는 TH 한천, 2.5 g l-1 PEA가 보충된 TH 한천, 및 1% 말토스가 보충된 맥콘키 (MacConkey) 한천 상에 스팟팅하였다. 상기 플레이트는 37℃에서 20h 동안 항온처리하고 콜로니 형성 유니트(CFU)는 3회 측정으로부터 계산하였다.
2. 결과
2.1 외인성 CRISPR- Cas9 시스템을 사용한 이. 콜라이 균주의 특이적 표적화.
본 발명자는 먼저 사멸 시스템을 이. 콜라이 TOP10 및 니슬 둘 다에 사멸 시스템을 도입함에 의해 상기 시스템이 2개의 이. 콜라이 균주를 구분할 수 있는지를 시험하였다.
2.1 혼합 배양물 중에 외인성 CRISPR-Cas9 시스템을 사용한 이. 콜라이의 표적화
밤새 배양물의 연속 희석을 이. 콜라이 균주, 비. 서브틸리스, 엘. 락티스에 대해 2회 및 혼합 배양물에 대해 3회 수행하였다. 모든 균주는 유도제의 존재 및 부재하의 선택적 플레이트 중에서 20시간 동안 37℃에서 성장시켰다. 상기 시스템의 유도는 K-12 유래된 균주를 표적화하는 sgRNA-Cas9를 활성화시키고 다른 세균은 온전한 상태로 유지시킨다.
혼합 배양물로부터 상이한 세균의 구분은 상이한 종의 세포 수를 결정하고 종의 특이적 제거를 결정하기 위해 중요하다. 맥콘키 (MacConkey) 한천은 그람-음성(이. 콜라이)로부터 그람-양성(에스. 서브틸리스)의 단리를 위해 사용되는 선택적 배지이다. 추가로, 본 발명자는 상이한 농도의 PEA가 다른 그람 양성의 성장을 부분적으로 억제함을 밝혔다. 2.5 g l-1의 PEA는 이. 콜라이 및 엘. 락티스의 성장을 제한하면서, 비. 서브틸리스를 선택적으로 성장시키는 것으로 입증되었다.
도 14는 유도성, 외인성, 벡터-함유-CRISPR-Cas 시스템에 의한 이. 콜라이 균주의 특이적 표적화를 보여준다. 상기 sgRNA는 K-12 유래된 이. 콜라이 균주 이. 콜라이 TOP 10의 게놈을 표적화하고 다른 시험된 이, 콜라이 균주는 영향받지 않는다.
도 15는 본 연구에 사용된 개별 세균 종의 연속 희석을 사용한 스팟 검정 및 CRISPR-Cas9 시스템의 유도 없이 TH 한천에서의 혼합 배양을 보여준다.
도 16은 다양한 선택적 배지 상에서 희석 103의 스팟 검정을 보여준다. 2.5 g l-1 PEA를 사용한 TH는 단독의 비. 서브틸리스(B.subtilis)에 대한 선택 배지이다. 말토스가 보충된 맥콘키는 그람-음성 및 장 바실리를 선택적으로 단리하고 말토스 발효를 기준으로 이들을 구분하기 위해 디자인된 세균에 대한 선택적 및 차등적 배양 배지이다. 따라서 TOP10 △malK 돌연변이체는 플레이트 상에서 백색 콜로니를 생성하고 니슬 (Nissle)은 분홍색 콜로니를 생성한다; A는 이 콜라이 △malK이고, B는 이 콜라이 니슬이고, C는 비 서브틸리스이고, D는 엘 락티스(L lactis)이고 E는 혼합 배양물이고; 맥콘키-/B 및 E에서의 이미지는 분홍색을 나타내고; 맥콘키+/B 및 E에서 이미지는 분홍색을 나타낸다. 도 17은 차등 배지 및 선택적 플레이트에 대해서 본 연구에 사용된 세균의 선택적 성장을 보여준다. 본 발명자는 혼합 집단에서 표적 이. 콜라이 균주 (도 17에서 x-축 상에 "이. 콜라이")를 명백하게 선택적으로 사멸시키는 반면 다른 관련 균주 ("이. 콜라이-니슬")는 유사하게 사멸시키지 않음을 알 수 있다. 혼합 집단에서 표적 균주의 사멸은 본 실험에서 1000-배 였다.
참조문헌
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Claims (21)

  1. 환자에서 질환(disease) 또는 병태(condition)를 치료하거나 감소시키는 방법에 사용하기 위한 가이드된 뉴클레아제 시스템(guided nuclease system)으로서,
    상기 방법은, 상기 시스템의 가이드된 뉴클레아제를 사용하여 환자의 미생물총을 변화시킴(altering)에 의해 환자에서 면역 세포를 조절함(modulating)을 포함하고,
    상기 질환 또는 병태가 면역 세포 (예를 들어, T-세포)에 의해 매개되거나 환자에서 면역 세포 활성 또는 집단을 변화시킴에 의해 치료되거나 예방되는, 가이드된 뉴클레아제 시스템.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 방법은, 상기 변화를 수행하기 위해, 상기 가이드된 뉴클레아제를 사용하여 미생물총에서 제1 종의 세포의 게놈의 선택적 표적화를 포함하는, 시스템.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 선택적 표적화는, (i) 상기 제1 종과 동일한 문(phylum)의 종 또는 (ii) 상기 제1 종의 상이한 균주(strain)의 표적화를 회피하는, 시스템.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은, 상기 미생물총에서 제1 세포를 선택적으로 사멸시키고 제2 세포를 표적화하지 않으며,
    상기 제2 세포는 (i) 상기 제1 종의 균주와 관련된 균주의 세포 또는 (ii) 상기 제1 종과 상이하고 상기 제1종과 계통발생적으로 관련된 종의 세포이고,
    상기 제2 종 또는 균주는 상기 제1 세포 종 또는 균주의 16s 리보솜 RNA-암호화 DNA 서열(16s ribosomal RNA-encoding DNA sequence)과 적어도 80% 동일한 16s 리보솜 RNA-암호화 DNA 서열을 갖고,
    상기 미생물총에서 상기 제2 세포의 성장은 상기 방법에 의해 억제되지 않거나 상기 제1 세포의 성장은 상기 제2 세포의 성장 억제의 적어도 5배까지 억제되는, 시스템.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 환자가 인간 환자이고;
    (b) 상기 미생물총이 장 내 미생물총이고;
    (c) 상기 방법이 변화를 수행하기 위해 상기 가이드된 뉴클레아제를 사용하여 상기 미생물총에서 제1 종의 게놈의 선택적 표적화를 포함하고;
    (d) 상기 방법이 상기 미생물총에서 제1 세포를 선택적으로 사멸시키고 제2 세포를 표적화하지 않으며, 상기 제2 세포가 (a) 상기 제1 종의 균주와 관련된 균주의 세포 또는 (b) 상기 제1 종과 상이하고 상기 제1종과 계통발생적으로 관련된 종의 세포이고, 상기 제2 종 또는 균주가 상기 제1 세포 종 또는 균주의 16s 리보솜 RNA-암호화 DNA 서열과 적어도 80% 동일한 16s 리보솜 RNA-암호화 DNA 서열을 갖는, 시스템.
  6. 환자에서 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하기 위한 환자의 적응성 세포 치료요법의 방법에 사용하기 위한 면역 세포의 생체외 집단(ex vivo population)으로서, 상기 방법은,
    (a) 상기 환자에게 상기 집단을 투여를 포함하여, 상기 환자에서 적응성 면역 세포 치료요법을 수행하고, 여기서, 상기 면역 세포의 투여는 상기 환자에서 질환 또는 병태를 치료할 수 있고;
    (b) 상기 환자의 장 내 미생물총에서 제1 세균 종 또는 균주, 또는 고세균 종 또는 균주의 세포의 서브-집단의 상대적 비율을 변화시킴으로써 상기 환자에서 상기 면역 세포 치료요법을 조절하는 변화된 장 내 미생물총을 생성함을 포함하고,
    상기 단계 (b)는 상기 면역 세포 집단과 동시에 또는 이에 후속적으로 항-세균(anti-bacterial) 또는 항-고세균(anti-archaeal) 가이드된 뉴클레아제 시스템을 투여함에 의해 제1 세포의 서브-집단을 표적화함으로써 제1 세포가 사멸되거나 상기 서브-집단 성장이 감소되어 환자의 장 내 미생물총에서 상기 서브-집단의 비율을 감소시킴에 의해 수행되는, 생체외 집단.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 세포는, 세균 또는 고세균 세포, 예를 들어, 피르미쿠테스(Firmicutes) 세포인, 시스템 또는 집단.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은, 상기 제1 종의 세포의 하나 이상의 표적 게놈 또는 에피좀 뉴클레오타이드 서열(target genomic or episomal nucleotide sequences)을 변형시킴(예를 들어, 절단하고/하거나 돌연변이시킴)을 포함하는, 시스템 또는 집단.
  9. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 세포는, 숙주 세포의 집단을 포함하고,
    상기 방법은, 상기 숙주 세포에서 표적 서열을 변형시킴을 포함하고,
    상기 표적 서열 변형은,
    a. 상기 미생물총과 숙주 변형(HM) crRNA를 암호화하는 가공된 핵산 서열의 다중 카피와 조합하는 단계, 및
    b. 숙주 세포에서 HM-crRNA를 발현하는 단계에 의해 수행되고,
    여기서, 각각의 가공된 핵산 서열은 각각의 숙주 세포에서 Cas 뉴클레아제로 작동가능하여 HM-CRISPR/Cas 시스템을 형성하고, 상기 가공된 서열은,
    (i) HM-crRNA를 암호화하는 스페이서 및 반복 서열을 포함하고;
    (ii) 상기 HM-crRNA는 숙주 세포 내 Cas 뉴클레아제를 표적 서열로 가이드하기 위해 숙주 세포 표적 서열에 하이브리드화할 수 있는 서열을 포함하고;
    임의로 상기 Hm-시스템이 tracrRNA 서열 또는 tracrRNA 서열을 발현하는 DNA 서열을 포함하고;
    이로써, HM-crRNA가 숙주 세포에서 숙주 표적 서열의 Cas 변형을 가이드하고, 이로써 숙주 세포가 사멸되거나 숙주 세포 집단 성장이 감소됨으로써 상기 미생물총 내 상기 제1 세포의 비율을 감소시키는, 시스템 또는 집단.
  10. 제1항 내지 제5항 및 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조절된 면역 세포는, 적응성 세포 치료(adoptive cell thrapy)를 통하는것과 같이, 환자의 내인성 세포(endogenous cell) 및/또는 투여된 세포를 포함하는, 시스템.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뉴클레아제는, RNA-가이드된 뉴클레아제인, 시스템 또는 집단.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시스템은, 가공된 CRlSPR/Cas 시스템, TALEN 시스템, 메가뉴클레아제 시스템 또는 아연 핑거(zinc finger) 시스템인, 시스템 또는 집단.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은, 환자 내의 (i) TH1, TH17 및/또는 Treg 세포 집단을 상향조절하거나; (ii) 환자에서 TH1, TH17 및/또는 Treg 세포 집단을 하향조절하는, 시스템 또는 집단.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은, 상기 환자의 질환 또는 병태의 치료요법을 조절하는 방법이고, 상기 방법은,
    (a) 상기 환자에서 상기 치료요법을 수행하고;
    (b) 상기 가이드된 뉴클레아제를 사용하여 상기 미생물총의 상기 변화를 수행함에 의해 상기 환자에서 장 내 세균 미생물총 장 내 불균형을 유발하여, 상기 장 내 불균형이 상기 환자의 면역 세포를 조절함에 의해 상기 환자의 치료요법을 조절함을 포함하는, 시스템 또는 집단.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은,
    (a) 상기 환자의 면역 체크포인트 길항작용 또는 효능작용 치료요법을 증진시키거나(임의로, 상기 치료요법은 이필리무맙(ipilimumab)(또는 YERVOYTM), 트레멜리무맙(tremelimumab), 니볼루맙(nivolumab)(또는 OPDIVOTM), 펨브롤리주맙(pembrolizumab) (또는 KEYTRUDATM), 피딜리주맙(pidilizumab), BMS-936559, 두르발루맙(durvalumab) 및 아테졸리주맙(atezolizumab)으로부터 선택된 항체를 사용한 항체 치료요법이다);
    (b) 상기 질환 또는 병태의 백신 치료요법을 조절하거나;
    (c) 임의로 세포 기반 치료요법 또는 이의 부작용 (예를 들어, 사이토킨 방출 증후군)을 약화시키기 위해, 상기 질환 또는 병태의 세포 치료요법 (예를 들어, 적응성 면역 세포 치료요법)을 조절하거나;
    (d) 환자에서 암의 치료를 위해 CAR-T 또는 TIL 치료요법을 조절하거나;
    (e) TH2 세포 사이토킨 방출에 의해 매개되는 환자에서 자가독성을 감소시키기 위한 것인, 시스템 또는 집단.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 질환 또는 병태는, 암, 자가면역 질환 또는 병태, 염증 질환 또는 병태, 바이러스 감염 (예를 들어, 인간 환자의 HIV 감염), 알레르기 질환 또는 병태, 또는 바이러스 감염에 의해 매개되거나 유발되는 질환 또는 병태인, 시스템 또는 집단.
  17. 제2항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 세포 집단 성장은 적어도 5배(5-fold)까지 감소되는, 시스템 또는 집단.
  18. 제2항 내지 제5항 및 제7항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미생물총은, 환자의 장 미생물총인, 시스템.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미생물총을 변화시킴으로써 환자에서 파네트(Paneth) 세포를 자극함에 의해 수행되어 이로써 면역 세포가 조절되고 상기 질환 또는 병태가 치료되거나 감소되는, 시스템 또는 집단.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 방법을 수행하기 위한 시스템에 사용하기 위한 가이드된 뉴클레아제;
    제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 방법을 이용하여 상기 환자의 질환 또는 병태의 치료를 위해 상기 환자에게 투여하기 위한 HM-CRlSPR/Cas 시스템, gRNA, HM-어레이 또는 HM-crRNA;
    제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 방법을 수행하기 위한 HM-CRlSPR/Cas 시스템에 사용하기 위한 gRNA, HM-어레이 또는 HM-crRNA;
    상기 시스템, HM-어레이, gRNA 또는 HM-crRNA를 포함하거나 이를 암호화하고, 제1 세포를 감염시키거나 형질감염시킬 수 있는 박테리오파아지, 접합 플라스미드 또는 트랜스포존(transposon)과 같은 벡터; 또는
    상기 시스템, HM-어레이, gRNA 또는 HM-crRNA를 포함하거나 암호화하는 약물로서, 선택적으로 상기 gRNA는 단일 가이드 RNA인 약물.
  21. 환자에서 질환 또는 병태를 치료하거나 감소시키는 방법으로서,
    상기 방법은, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 것인, 방법.

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