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KR20180105634A - Igf-1r을 발현하는 암의 치료를 위한 조성물 - Google Patents

Igf-1r을 발현하는 암의 치료를 위한 조성물 Download PDF

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KR20180105634A
KR20180105634A KR1020187013246A KR20187013246A KR20180105634A KR 20180105634 A KR20180105634 A KR 20180105634A KR 1020187013246 A KR1020187013246 A KR 1020187013246A KR 20187013246 A KR20187013246 A KR 20187013246A KR 20180105634 A KR20180105634 A KR 20180105634A
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릴리앙 고뜨쉬
마뛰 브루싸
샤르로뜨 보-라르보르
띠엘리 쌍삐오
알레 로베르
쟝-프랑쓰와 아외
이앙 리라뜨
미셀 쁘레
Original Assignee
피에르 파브르 메디카먼트
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Abstract

본 발명은 IGF-1R을 발현하는 암들의 치료 방법뿐만 아니라 상기 치료를 위한 조성물들 및 키트에 관한 것이다. 일 관점으로부터 본 발명은 암의 IGF-1R 상태의 결정을 위한 첫 번째 항체 및 상기 암의 치료에 ADC로서 사용되는 두 번째 항체의 조합된 용도에 관한 것이다.

Description

IGF-1R을 발현하는 암의 치료를 위한 조성물
본 발명은 IGF-1R을 발현하는 암들의 치료 방법뿐만 아니라 상기 치료를 위한 조성물 및 키트에 관한 것이다. 일 관점으로부터 본 발명은 암의 IGF-1R 상태의 결정을 위한 첫 번째 항체 및 상기 암의 치료에 ADC로서 사용되는 두 번째 항체의 조합된 용도에 관한 것이다.
IGF-1R라고 불리는 (IGF1R 또는 IGF-IR라고도 역시 불림) 인슐린-유사 성장인자 I 수용체는 인슐린 수용체 IR과 70% 상동성을 가지는, 타이로신 키나제 활성을 가진 수용체이다. IGF-1R은 분자량 대략 350,000의 당단백질이다. 이것은 디설파이드 결합들에 의해 연결된 각각의 절반이 세포외 α-소단위체 및 막통과 β-소단위체로 구성된 헤테로-사량체 수용체이다. IGF-1R은 매우 높은 친화성 (Kd #1 nM)으로 IGF1 및 IGF2와 결합하지만, 100 내지 1,000배 더 낮은 친화성으로 인슐린과 동일하게 결합할 수 있다. 역으로, IR은 IGF들이 100배 더 낮은 친화성으로만 인슐린 수용체와 결합하더라도, 매우 높은 친화성으로 인슐린과 결합한다. IGF-1R 및 IR의 타이로신 키나제 도메인들은 상동성이 약한 영역들이 각각 α-소단위체 및 β-소단위체의 C-말단 부분 위에 위치하는 시스테인-강화 부위와 관련되긴 하더라도 매우 높은 서열 상동성을 가진다. α-소단위체에서 관찰되는 서열 차이들은 리간드들의 결합 영역에 위치하고, 따라서 IGF들 및 인슐린 각각에 대한 IGF-1R 및 IR의 상대적 친화성들의 기원이 된다. β-소단위체의 C-말단 부분에서 차이들은 두 가지 수용체들의 신호전달 경로들에서 다양성 (divergence)의 결과를 가져오고; IGF-1R은 분열생성, 분화 및 항-세포사멸 효과들을 매개하는 반면, IR의 활성화는 대사적 경로들 수준의 효과들에 관여한다.
세포질 타이로신 키나제 단백질들은 수용체의 세포외 도메인과 리간드의 결합에 의해 활성화된다. 키나제의 활성화는 교대로 IRS-1, IRS-2, Shc 및 Grb 10를 포함하는, 서로 다른 세포내 기질들의 자극에 관여한다. IGF-1R의 두 가지 주요한 기질들은 IRS 및 Shc이고, 이들은 수많은 하부 효과기들의 활성화에 의해 IGF들의 이러한 수용체와 부착과 연관된 성장 및 분화 효과들의 대부분을 매개한다. 기질들의 유용성은 결론적으로 IGF-1R의 활성화와 연관된 최종 생물학적 효과를 설명할 수 있다. IRS-1이 우세할 때, 세포들은 증식하고 형질전환되는 경향이 있다. Shc가 우세할 때는, 세포들이 분화되는 경향이 있다. 세포사멸에 대항한 보호작용의 효과들에 기본적으로 관여하는 경로는 포스파디딜-이노시톨 3-키나제들 (PI 3-키나제들) 경로인 것으로 여겨진다.
발암기전에서 IGF 시스템의 역할은 지난 10년간 활발한 연구의 주제가 되어왔다. 이러한 관심은 그의 분열생성 및 항세포사멸 성질들에 추가하여, IGF-1R이 형질전환된 표현형의 확립 및 유지를 위해 요구되는 것으로 여겨지는 사실의 발견으로 이어졌다. 사실상, IGF-1R의 과다발현 또는 전신적 활성화가 다양한 많은 세포들에서 우태아 혈청이 결여된 배지의 사용과는 독립적인 세포들의 성장 그리고 누드 마우스에서 종양들의 형성을 유발하는 점은 잘 확립되어 왔다. 이것은 과다발현된 유전자들의 매우 다양한 산물들이 많은 성장인자들의 수용체들을 포함하여, 세포들을 형질전환할 수 있기 때문에 그 자체로 독특한 성질이 아니다. 그러나, 형질전환에서 IGF-1R가 담당하는 주요한 역할을 명백하게 보여주었던 결정적인 발견으로, IGF-1R을 코딩하는 유전자가 불활성된 IGF-1R- 세포들이 보통 세포들을 형질전환할 수 있는 소의 파필로마 바이러스의 E5, EGFR 또는 PDGFR의 과다발현, SV 40의 T 항원, 활성화된 ras 또는 이들 마지막 인자들 둘의 조합과 같은 서로 다른 제제들에 의한 형질전환과는 완벽하게 구별되는 점이 되었다.
IGF-1R은 매우 다양한 종양들 및 종양 계열들에서 발현되고, IGF들은 그들의 IGF-1R과의 부착을 통해 종양 성장을 증폭시킨다. 발암기전에서 IGF-1R의 역할을 찬성하는 다른 주장들은 수용체들에게로 유도되는 마우스 단일클론 항체들을 사용하거나, IGF-1R의 음성 우성체들을 사용하는 연구들로부터 나온다. 실제로, IGF-1R에게로 유도되는 마우스 단일클론 항체들은 배양에서 수많은 세포주들의 증식 및 생체내에서 종양 세포들의 성장을 억제하고 있다. 마찬가지로 이것은 IGF-1R의 음성 우성체들이 종양 증식을 억제할 수 있는 점을 보여주었다.
매우 많은 프로젝트들이 암들의 치료를 위한 IGF-1R 항체들을 개발하도록 시작되었으며, 70개 이상의 임상시험들이 다양한 적응증들에서 수행되어 왔다. 그럼에도 불구하고, 지금까지 이들 프로젝트들은 전혀 성공하지 못하였으며, 항-IGF-1R 항체들도 전혀 시판되지 못하였다.
더구나, EGFR 및 IGF-1R 둘 다를 표적하기 위하여 항-EGFR 항체들과 조합된 항-IGF-1R 항체들을 포함하는 일련의 임상시험들은 이들 항체들이 전혀 KRAS 돌연변이 환자들을 치료할 수 없었기 때문에 실패로 끝났다.
결론적으로, IGF-1R은 현재 주요 표적으로서 고려되지 않고, 잠재적인 치료제 항체들의 연구에서 IGF-1R은 더 이상 특별히 흥미로운 것으로서 고려되지 않는다.
적절한 진단 또는 예후 판단 도구로서 사용될 수 있는 소중한 항체를 개발하려는 이전의 시도들이 보고되어 왔지만, 이들 모두는 전혀 만족스럽지 못하다.
다음의 실시예들로부터 자명해질 바와 같이, 본 발명자들은 요즘에 IGF-1R을 발현하는 종양들의 점수를 매기는 데 보편적으로 사용되는 시판 항체들이 위양성 및/또는 위음성을 나타내기 때문에 적절하지 않을 수 있는 점을 확인하고 놀랐다. 이러한 문제는 아마도 부적절한 환자들의 선택으로 인해 IGF-1R 항체들로의 임상 시험들이 실패하도록 부분적으로 기여하였다.
더구나, 시판 항체들을 사용하여 수행된 첫 번째 연구들은 IGF-1R 점수 매기기 및 표적화 ADC 치료법의 항-종양 활성 간의 모순을 보여주었다.
그럼에도 불구하고, IGF-1R 항체들을 생산하려는 노력들이 또한 미가공 (naked) 항체들, 예로 그들의 본질적 성질들에 의해 유용한 항체들에 중점을 두었던 점도 주목되어야 한다. 이러한 의미에서, IGF-1R은 혈관들을 포함하는 정상 세포들에 의해 역시 널리 발현되는 표적으로서 기술되어 있기 때문에, IGF-1R이 항체-약물 컨쥬게이트 ("ADC"라고도 약칭됨)와 같은 면역컨쥬게이트의 생산에는 부적합한 표적으로서 고려된다. 이러한 의미에서, 가장 최신의 IGF-1R 항체 예로 AVE1642가 약물이 장착되지 않은 미가공 항체로서 개발된 점을 주목할 수 있다. 이것은 현재 개발 중인 다른 IGF-1R 항체들 및 임상시험들에서 실패한 다른 모든 것들의 경우에서도 동일하다.
본 발명은 진단적 항체로서 첫 번째 IGF-1R 항체 및 치료적 항체로서 바람직하게 ADC로서 두 번째 IGF-1R 항체의 사용을 기초로 하여, IGF-1R을 발현하는 암들의 새로운 치료 방법을 제공하여 이러한 문제를 교정하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 암의 치료 방법으로서, 개체가 IGF-1R(+) 상태를 제시하는 경우라면 이를 필요로 하는 개체를 IGF-1R 표적화 요법으로 치료하는 단계를 포함하고,
개체의 IGF-1R 상태는 첫 번째 IGF-1R 항체를 사용하여 개체의 생물학적 시료로부터 결정되었고,
첫 번째 IGF-1R 항체는 (i) 서열번호 1의 CDR-H1, 서열번호 2의 CDR-H2 및 서열번호 3의 CDR-H3을 가진 중쇄; 및 서열번호 4의 CDR-L1, 서열번호 5의 CDR-L2, 서열번호 6의 CDR-L3를 가진 경쇄를 포함하는, 항체 또는 그의 임의의 항원 결합 단편; 또는 (ii) 서열번호 11의 CDR-H1, 서열번호 12의 CDR-H2 및 서열번호 13의 CDR-H3을 가진 중쇄; 및 서열번호 14의 CDR-L1, 서열번호 15의 CDR-L2, 서열번호 16의 CDR-L3를 가진 경쇄를 포함하는, 항체 또는 그의 임의의 항원 결합 단편:이고,
치료는 다음의 화학식 (I)
Figure pct00001
(I)
또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 항체-약물 컨쥬게이트로 실현되고,
여기에서
Ab는 인간 IGF-1R와 결합하고, 그의 IGF-1R과 결합 이후에 내재화되는, 두 번째 IGF-1R 항체 또는 그의 항원 결합 단편이고;
L은 링커이고;
D는 약물 분체이고;
n은 1부터 12까지 범위:인,
치료 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 개체에서 IGF-1R(+) 암을 다음의 화학식 (I)
Figure pct00002
(I)
의 항체-약물 컨쥬게이트 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염으로 치료하는 방법으로서,
여기에서
Ab는 인간 IGF-1R과 결합하고, 그의 IGF-1R과 결합 이후에 내재화되는, 두 번째 IGF-1R 항체 또는 그의 항원 결합 단편이고;
L은 링커이고;
D는 약물 분체이고;
n은 1부터 12까지 범위이고;
치료 이전에, 개체의 암은 첫 번째 IGF-1R 항체를 사용하는 방법에 의해 IGF-1R(+)인 것으로 결정되었고,
첫 번째 IGF-1R 항체는
(i) 서열번호 1의 CDR-H1, 서열번호 2의 CDR-H2 및 서열번호 3의 CDR-H3을 가진 중쇄; 및 서열번호 4의 CDR-L1, 서열번호 5의 CDR-L2, 서열번호 6의 CDR-L3를 가진 경쇄를 포함하는, 항체 또는 그의 임의의 항원 결합 단편; 또는
(ii) 서열번호 11의 CDR-H1, 서열번호 12의 CDR-H2 및 서열번호 13의 CDR-H3을 가진 중쇄; 및 서열번호 14의 CDR-L1, 서열번호 15의 CDR-L2, 서열번호 16의 CDR-L3를 가진 경쇄를 포함하는, 항체 또는 그의 임의의 항원 결합 단편:인,
방법에 관한 것이다.
또 다른 대안의 방식으로, 본 발명은 개체에서 암을 진단하고 치료하는 방법으로서,
(a) 개체의 암을 첫 번째 IGF-1R 항체를 사용하여 IGF-1R(+)인 것으로서 진단하고,
첫 번째 IGF-1R 항체는 (i) 서열번호 1의 CDR-H1, 서열번호 2의 CDR-H2 및 서열번호 3의 CDR-H3을 가진 중쇄; 및 서열번호 4의 CDR-L1, 서열번호 5의 CDR-L2, 서열번호 6의 CDR-L3를 가진 경쇄를 포함하는, 항체 또는 그의 임의의 항원 결합 단편; 또는 (ii) 서열번호 11의 CDR-H1, 서열번호 12의 CDR-H2 및 서열번호 13의 CDR-H3을 가진 중쇄; 및 서열번호 14의 CDR-L1, 서열번호 15의 CDR-L2, 서열번호 16의 CDR-L3를 가진 경쇄를 포함하는, 항체 또는 그의 임의의 항원 결합 단편:인, 단계;
(b) 단계 (a)에서 진단된 상기 개체를 다음의 화학식 (I)
Figure pct00003
(I)
의 항체-약물 컨쥬게이트 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염으로 치료하는 단계로서, 여기에서
Ab는 인간 IGF-1R과 결합하고, 그의 IGF-1R과 결합 이후에 내재화되는, 두 번째 IGF-1R 항체 또는 그의 항원 결합 단편이고;
L은 링커이고;
D는 약물 분체이고;
n은 1부터 12까지 범위인, 단계:
를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 IGF-1R(+) 상태를 가진 개체에서 암의 치료를 위한 또는 암의 치료에 사용하는 조성물로서, 다음의 화학식 (I)
Figure pct00004
(I)
의 항체-약물 컨쥬게이트 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하고, 여기에서
Ab는 인간 IGF-1R과 결합하고, 그의 IGF-1R과 결합 이후에 내재화되는, 두 번째 IGF-1R 항체 또는 그의 항원 결합 단편이고;
L은 링커이고;
D는 약물 분체이고;
n은 1부터 12까지 범위이고;
상기 개체의 IGF-1R(+) 상태는 첫 번째 IGF-1R 항체를 사용하여 개체의 생물학적 시료로부터 결정되었으며,
첫 번째 IGF-1R 항체는 (i) 서열번호 1의 CDR-H1, 서열번호 2의 CDR-H2 및 서열번호 3의 CDR-H3을 가진 중쇄; 및 서열번호 4의 CDR-L1, 서열번호 5의 CDR-L2, 서열번호 6의 CDR-L3를 가진 경쇄를 포함하는, 항체 또는 그의 임의의 항원 결합 단편; 또는 (ii) 서열번호 11의 CDR-H1, 서열번호 12의 CDR-H2 및 서열번호 13의 CDR-H3을 가진 중쇄; 및 서열번호 14의 CDR-L1, 서열번호 15의 CDR-L2, 서열번호 16의 CDR-L3를 가진 경쇄를 포함하는, 항체 또는 그의 임의의 항원 결합 단편:인,
것을 특징으로 하는, 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 개체에서 IGF-1R을 발현하는 암의 치료에 사용하는 항체-약물 컨쥬게이트로서,
상기 치료는 (a) 상기 개체의 IGF-1R(+) 상태를 첫 번째 IGF-1R 항체를 사용하여 개체의 생물학적 시료로부터 결정하는 단계; (b) 개체가 IGF-1R(+) 상태를 제시하는 경우라면 상기 항체-약물 컨쥬게이트를 환자에게 투여하는 단계:
를 포함하고,
상기 첫 번째 IGF-1R 항체는 (i) 서열번호 1의 CDR-H1, 서열번호 2의 CDR-H2 및 서열번호 3의 CDR-H3을 가진 중쇄; 및 서열번호 4의 CDR-L1, 서열번호 5의 CDR-L2, 서열번호 6의 CDR-L3를 가진 경쇄를 포함하는, 항체 또는 그의 임의의 항원 결합 단편; 또는 (ii) 서열번호 11의 CDR-H1, 서열번호 12의 CDR-H2 및 서열번호 13의 CDR-H3을 가진 중쇄; 및 서열번호 14의 CDR-L1, 서열번호 15의 CDR-L2, 서열번호 16의 CDR-L3를 가진 경쇄를 포함하는, 항체 또는 그의 임의의 항원 결합 단편이고,
상기 항체-약물 컨쥬게이트는 다음의 화학식 (I)
Figure pct00005
(I)
또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 가지고, 여기에서
Ab는 인간 IGF-1R과 결합하고, 그의 IGF-1R과 결합 이후에 내재화되는, 두 번째 IGF-1R 항체 또는 그의 항원 결합 단편이고;
L은 링커이고;
D는 약물 분체이고;
n은 1부터 12까지 범위인:
항체-약물 컨쥬게이트에 관한 것이다.
본 명세서에서 기술된 방법, 조성물 또는 키트에 따르면, "항체 또는 그의 임의의 항원 결합 단편"에 의하여, 상세하게 IGF-1R 항체 또는 그의 임의의 IGF-1R 결합 단편을 지정하도록 의도된다.
본 명세서에서 기술된 방법, 조성물 또는 키트에 따르면, 첫 번째 및 두 번째 항체들은 동일한 IGF-1R 에피토프와 결합하지 않는다.
본 명세서에서 기술된 방법, 조성물 또는 키트에 따르면, 첫 번째 IGF-1R 항체는
(i) 서열번호 7의 서열 또는 서열번호 7의 서열과 적어도 90%의 상동성을 가진 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인; 및/또는 서열번호 8의 서열 또는 서열번호 8의 서열과 적어도 90%의 상동성을 가진 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 항체; 또는
(ii) 서열번호 17의 서열 또는 서열번호 17의 서열과 적어도 90%의 상동성을 가진 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인; 및/또는 서열번호 18의 서열 또는 서열번호 18의 서열과 적어도 90%의 상동성을 가진 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 항체:
이다.
본 명세서에서 기술된 방법, 조성물 또는 키트에 따르면, 첫 번째 IGF-1R 항체는
(i) 파리, 파스퇴르 연구소, CNCM에 2014년 9월 17일자로 수탁번호 제 I-4893호하에 기탁된 하이브리도마에 의해 분비된 항체 810D12; 또는
(ii) 파리, 파스퇴르 연구소, CNCM에 2014년 9월 17일자로 수탁번호 제 I-4894호 하에 기탁된 하이브리도마에 의해 분비된 항체 816C12:
이다.
본 명세서에서 기술된 방법, 조성물 또는 키트에 따르면, Ab는 IGF-1R 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, (i) 서열번호 21, 22 및 23 서열의 세 개 중쇄 CDR들 및 서열번호 24, 25 및 26 서열의 세 개 경쇄 CDR들을 포함하는 항체; (ii) (i)의 항체와 IGF-1R과 결합을 경쟁하는 항체; 또는 (iii) (i)의 항체와 동일한 IGF-1R 에피토프와 결합하는 항체로부터 선택되는, 항체이다.
본 명세서에서 기술된 방법, 조성물 또는 키트에 따르면, Ab는
(a) 서열번호 27, 22 및 23 서열의 세 개 중쇄 CDR들 및 서열번호 29, 25 및 31 서열의 세 개 경쇄 CDR들을 포함하는 항체;
(b) 서열번호 27, 22 및 23 서열의 세 개 중쇄 CDR들 및 서열번호 30, 25 및 31 서열의 세 개 경쇄 CDR들을 포함하는 항체;
(c) 서열번호 27, 22 및 23 서열의 세 개 중쇄 CDR들 및 서열번호 29, 25 및 32 서열의 세 개 경쇄 CDR들을 포함하는 항체; 또는
(d) 서열번호 28, 22 및 23 서열의 세 개 중쇄 CDR들 및 서열번호 29, 25 및 31 서열의 세 개 경쇄 CDR들을 포함하는 항체:
이다.
본 명세서에서 기술된 방법, 조성물 또는 키트에 따르면, Ab는
(a) 서열번호들 33, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 및 59로부터 선택된 서열 또는 서열번호들 33, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 또는 59와 적어도 80% 일치도를 가진 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인; 및 서열번호들 29, 25 및 31의 서열들의 세 개 경쇄 CDR들을 포함하는, 항체;
(b) 서열번호들 34, 37 및 60으로부터 선택된 서열 또는 서열번호들 34, 37 또는 60과 적어도 80% 일치도를 가진 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인; 및 서열번호들 27, 22 및 23 서열들의 세 개 중쇄 CDR들을 포함하는, 항체; 또는
(c) 서열번호들 33, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 및 59로부터 선택된 서열 또는 서열번호들 33, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 또는 59와 적어도 80% 일치도를 가진 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인; 및 서열번호들 34, 37 및 60으로부터 선택된 서열 또는 서열번호들 34, 37 또는 60과 적어도 80% 일치도를 가진 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 항체:
이다.
본 명세서에서 기술된 방법, 조성물 또는 키트에 따르면, Ab는
(a) 서열번호들 35, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 및 61로부터 선택된 서열 또는 서열번호들 35, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 또는 61과 적어도 80% 일치도를 가진 임의의 서열의 중쇄; 및
(b) 서열번호들 36, 38 및 62의 서열 또는 서열번호들 36, 38 또는 62과 적어도 80% 일치도를 가진 임의의 서열의 경쇄:
를 포함한다.
본 명세서에서 기술된 방법, 조성물 또는 키트에 따르면, Ab는 (i) 항체들 208F2, 212A11, 214F8, 219D6 및 213B10, (ii) (i)의 항체들과 IGF-1R과 결합을 경쟁하는 항체들, 또는 (iii) (i)의 항체들과 동일한 IGF-1R 에피토프와 결합하는 항체들이다.
본 명세서에서 기술된 방법, 조성물 또는 키트에 따르면, 약물 분체 D는 알킬화제들, 항-대사물들, 항-종양 항생제들, 세포분열 저해제들, 크로마틴 기능 저해제들, 항-혈관형성제들, 항-에스트로겐들, 항-안드로겐들, 킬레이팅제들, 철 흡수 자극제, 사이클로옥시게나제 저해제들, 포스포디에스테라제 저해제들, DNA 저해제들, DNA 합성 저해제들, 세포사멸 자극제들, 티미딜레이트 저해제들, T 세포 저해제들, 인터페론 작동제들, 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 환원효소 저해제들, 아로마타제 저해제들, 에스트로겐 수용체 길항제들, 타이로신 키나제 저해제들, 세포 주기 저해제들, 택산, 튜불린 저해제들, 혈관형성 저해제들, 대식구 자극제들, 뉴로키닌 수용체 길항제들, 카나비노이드 수용체 작동제들, 도파민 수용체 작동제들, 과립구 자극인자 작동제들, 에리트로포이에틴 수용체 작동제들, 소마토스타틴 수용체 작동제들, LHRH 작동제들, 칼슘 민감화제들, VEGF 수용체 길항제들, 인터루킨 수용체 길항제들, 파골세포 저해제들, 라디칼 형성 자극제들, 엔도텔린 수용체 길항제들, 빈카 알칼로이드, 항-호르몬 또는 면역조절인자들 또는 세포독성제 또는 독소의 활성 판정기준을 충족하는 임의의 다른 약물로부터 선택된다.
본 명세서에서 기술된 방법, 조성물 또는 키트에 따르면, 약물 분체 D는 아우리스타틴, 돌라스타틴 10 또는 그의 유도체이다.
본 명세서에서 기술된 방법, 조성물 또는 키트에 따르면, 약물 분체 D는 다음의 화학식 (Ⅱ)
Figure pct00006
(Ⅱ)
을 가지고,
여기에서
R2는 COOH, COOCH3 또는 티아졸릴이고;
R3는 H 또는 (C1-C6)알킬이고;
R9는 H 또는 (C1-C6)알킬이고;
m은 1 및 8 사이 범위에 포함된 정수이고;
물결선은 L과 부착점을 표시한다.
본 명세서에서 기술된 방법, 조성물 또는 키트에 따르면, L은 다음의 화학식 (Ⅲ)
Figure pct00007
(Ⅲ)
의 링커를 가지고,
여기에서
L2는 (C4-C10)고리알킬-카보닐, (C2-C6)알킬, (C2-C6)알킬-카보닐이고;
W는 아미노산 유닛이고; w는 0 및 5 사이 범위에 포함된 정수이고;
Y는 PAB가
Figure pct00008
인 PAB-카보닐이고; y는 0 또는 1이고;
별표는 D와 부착점을 표시하고;
물결선은 Ab와 부착점을 표시한다.
본 명세서에서 기술된 방법, 조성물 또는 키트에 따르면, 항체-약물 컨쥬게이트는 화학식
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
의 화합물 및 그의 약제학적으로 허용가능한 염이고,
여기에서 Ab는 (i) 항체들 208F2, 212A11, 214F8, 219D6 및 213B10, (ii) (i)의 항체들과 IGF-1R과 결합을 경쟁하는 항체들, 또는 (iii) (i)의 항체들과 동일한 IGF-1R 에피토프와 결합하는 항체들이다.
본 발명은 또한 IGF-1R을 발현하는 암의 치료에 사용하는 키트로서, 적어도
(a) 첫 번째 IGF-1R 항체로서, (i) 서열번호 1의 CDR-H1, 서열번호 2의 CDR-H2 및 서열번호 3의 CDR-H3을 가진 중쇄; 및 서열번호 4의 CDR-L1, 서열번호 5의 CDR-L2, 서열번호 6의 CDR-L3를 가진 경쇄를 포함하는, 항체 또는 그의 임의의 항원 결합 단편; 또는 (ii) 서열번호 11의 CDR-H1, 서열번호 12의 CDR-H2 및 서열번호 13의 CDR-H3을 가진 중쇄; 및 서열번호 14의 CDR-L1, 서열번호 15의 CDR-L2, 서열번호 16의 CDR-L3를 가진 경쇄를 포함하는, 항체 또는 그의 임의의 항원 결합 단편으로 구성되는, 항체: 및
(b) 다음의 화학식 (I)
Figure pct00013
(I)
의 항체-약물 컨쥬게이트 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염으로서,
여기에서 Ab는 (i) 서열번호 21, 22 및 23 서열의 세 개 중쇄 CDR들 및 서열번호 24, 25 및 26 서열의 세 개 경쇄 CDR들을 포함하는 항체; (ii) (i)의 항체와 IGF-1R과 결합을 경쟁하는 항체; 또는 (iii) (i)의 항체와 동일한 IGF-1R 에피토프와 결합하는 항체로부터 선택된, 인간 IGF-1R과 결합할 수 있는 두 번째 IGF-1R 항체 또는 그의 항원 결합 단편이고;
L은 링커이고;
D는 다음의 화학식 (Ⅱ)의 약물 분체이고;
Figure pct00014
(Ⅱ)
여기에서
R2는 COOH, COOCH3 또는 티아졸릴이고;
R3는 H 또는 (C1-C6)알킬이고;
R9는 H 또는 (C1-C6)알킬이고;
m은 1 및 8 사이 범위에 포함된 정수이고;
물결선은 L과 부착점을 표시하고;
n은 1부터 12까지 범위인, 항체-약물 컨쥬게이트:
를 포함하는, 키트에 관한 것이다.
본 발명은 암의 치료 방법으로서, 개체가 IGF-1R(+) 상태를 제시하는 경우라면 이를 필요로 하는 개체를 IGF-1R 표적화 요법으로 치료하는 단계를 포함하고,
개체의 IGF-1R 상태는 첫 번째 IGF-1R 항체를 사용하여 개체의 생물학적 시료로부터 결정되었고,
첫 번째 IGF-1R 항체는 (i) 서열번호 1의 CDR-H1, 서열번호 2의 CDR-H2 및 서열번호 3의 CDR-H3을 가진 중쇄; 및 서열번호 4의 CDR-L1, 서열번호 5의 CDR-L2, 서열번호 6의 CDR-L3를 가진 경쇄를 포함하는, 항체 또는 그의 임의의 항원 결합 단편; 또는 (ii) 서열번호 11의 CDR-H1, 서열번호 12의 CDR-H2 및 서열번호 13의 CDR-H3을 가진 중쇄; 및 서열번호 14의 CDR-L1, 서열번호 15의 CDR-L2, 서열번호 16의 CDR-L3를 가진 경쇄를 포함하는, 항체 또는 그의 임의의 항원 결합 단편:이고,
치료는 다음의 화학식 (I)
Figure pct00015
(I)
의 항체-약물 컨쥬게이트 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염으로 실현되고,
여기에서
Ab는 인간 IGF-1R와 결합하고, 그의 IGF-1R과 결합 이후에 내재화되는, 두 번째 IGF-1R 항체 또는 그의 항원 결합 단편이고;
L은 링커이고;
D는 약물 분체이고;
n은 1부터 12까지 범위인, 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 IGF-1R(+) 상태를 가진 개체에서 암의 치료를 위한 또는 암의 치료에 사용하는 조성물로서, 다음의 화학식 (I)
Figure pct00016
(I)
의 항체-약물 컨쥬게이트 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하고, 여기에서
Ab는 인간 IGF-1R과 결합하고, 그의 IGF-1R과 결합 이후에 내재화되는, 두 번째 IGF-1R 항체 또는 그의 항원 결합 단편이고;
L은 링커이고;
D는 약물 분체이고;
n은 1부터 12까지 범위이고;
상기 개체의 IGF-1R(+) 상태는 첫 번째 IGF-1R 항체를 사용하여 개체의 생물학적 시료로부터 결정되었으며,
첫 번째 IGF-1R 항체는 (i) 서열번호 1의 CDR-H1, 서열번호 2의 CDR-H2 및 서열번호 3의 CDR-H3을 가진 중쇄; 및 서열번호 4의 CDR-L1, 서열번호 5의 CDR-L2, 서열번호 6의 CDR-L3를 가진 경쇄를 포함하는, 항체 또는 그의 임의의 항원 결합 단편; 또는 (ii) 서열번호 11의 CDR-H1, 서열번호 12의 CDR-H2 및 서열번호 13의 CDR-H3을 가진 중쇄; 및 서열번호 14의 CDR-L1, 서열번호 15의 CDR-L2, 서열번호 16의 CDR-L3를 가진 경쇄를 포함하는, 항체 또는 그의 임의의 항원 결합 단편:인,
것을 특징으로 하는, 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 개체에서 IGF-1R을 발현하는 암의 치료에 사용하는 항체-약물 컨쥬게이트로서,
상기 치료는 (a) 상기 개체의 IGF-1R(+) 상태를 첫 번째 IGF-1R 항체를 사용하여 개체의 생물학적 시료로부터 결정하는 단계; (b) 개체가 IGF-1R(+) 상태를 제시하는 경우라면 상기 항체-약물 컨쥬게이트를 환자에게 투여하는 단계:
를 포함하고,
상기 첫 번째 IGF-1R 항체는 (i) 서열번호 1의 CDR-H1, 서열번호 2의 CDR-H2 및 서열번호 3의 CDR-H3을 가진 중쇄; 및 서열번호 4의 CDR-L1, 서열번호 5의 CDR-L2, 서열번호 6의 CDR-L3를 가진 경쇄를 포함하는, 항체 또는 그의 임의의 항원 결합 단편; 또는 (ii) 서열번호 11의 CDR-H1, 서열번호 12의 CDR-H2 및 서열번호 13의 CDR-H3을 가진 중쇄; 및 서열번호 14의 CDR-L1, 서열번호 15의 CDR-L2, 서열번호 16의 CDR-L3를 가진 경쇄를 포함하는, 항체 또는 그의 임의의 항원 결합 단편:이고,
상기 항체-약물 컨쥬게이트는 다음의 화학식 (I)
Figure pct00017
(I)
또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 가지고, 여기에서
Ab는 인간 IGF-1R과 결합하고, 그의 IGF-1R과 결합 이후에 내재화되는, 두 번째 IGF-1R 항체 또는 그의 항원 결합 단편이고;
L은 링커이고;
D는 약물 분체이고;
n은 1부터 12까지 범위인,
항체-약물 컨쥬게이트에 관한 것이다.
본 발명은 또한 IGF-1R을 발현하는 암의 치료에 사용하는 키트로서, 적어도
(a) 첫 번째 IGF-1R 항체로서, (i) 서열번호 1의 CDR-H1, 서열번호 2의 CDR-H2 및 서열번호 3의 CDR-H3을 가진 중쇄; 및 서열번호 4의 CDR-L1, 서열번호 5의 CDR-L2, 서열번호 6의 CDR-L3를 가진 경쇄를 포함하는, 항체 또는 그의 임의의 항원 결합 단편; 또는 (ii) 서열번호 11의 CDR-H1, 서열번호 12의 CDR-H2 및 서열번호 13의 CDR-H3을 가진 중쇄; 및 서열번호 14의 CDR-L1, 서열번호 15의 CDR-L2, 서열번호 16의 CDR-L3를 가진 경쇄를 포함하는, 항체 또는 그의 임의의 항원 결합 단편:로 구성되는, 항체; 및
(b) 다음의 화학식 (I)
Figure pct00018
(I)
의 항체-약물 컨쥬게이트 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염으로서,
여기에서 Ab는 (i) 서열번호 21, 22 및 23 서열의 세 개 중쇄 CDR들 및 서열번호 24, 25 및 26 서열의 세 개 경쇄 CDR들을 포함하는 항체; (ii) (i)의 항체와 IGF-1R과 결합을 경쟁하는 항체; 또는 (iii) (i)의 항체와 동일한 IGF-1R 에피토프와 결합하는 항체로부터 선택된, 인간 IGF-1R과 결합할 수 있는 두 번째 IGF-1R 항체 또는 그의 항원 결합 단편이고;
L은 링커이고;
D는 다음의 화학식 (Ⅱ)의 약물 분체이고;
Figure pct00019
(Ⅱ)
여기에서
R2는 COOH, COOCH3 또는 티아졸릴이고;
R3는 H 또는 (C1-C6)알킬이고;
R9는 H 또는 (C1-C6)알킬이고;
m은 1 및 8 사이 범위에 포함된 정수이고;
물결선은 L과 부착점을 표시하고;
n은 1부터 12까지 범위인, 항체-약물 컨쥬게이트:
를 포함하는, 키트에 관한 것이다.
I - 정의들
용어들 "항체", "항체들", "ab", "MAb" 또는 "면역글로불린"은 가장 넓은 의미에서 상호교환적으로 사용되고, 단일클론 항체들, 분리된, 조작된 또는 재조합 항체들 (예로, 전장의 또는 미가공 단일클론 항체들), 다중클론 항체들, 다가의 항체들 또는 다중특이적 항체들 (예로, 이중특이적 항체들) 및 그들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 그들의 항체 단편도 역시 포함한다. 보다 상세하게, 이러한 분자는 디설파이드 결합들에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중쇄들 (H) 및 2개의 경쇄들 (L)을 포함하는 당단백질로 구성된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 부위 (또는 도메인) (본 명세서에서 HCVR 또는 VH라고 약칭됨) 및 중쇄 불변 부위를 포함한다. 중쇄 불변 부위는 세 개의 도메인들, CH1, CH2 및 CH3를 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 부위 (본 명세서에서 LCVR 또는 LH라고 약칭됨) 및 경쇄 불변 부위를 포함한다. 경쇄 불변 부위는 하나의 도메인, CL을 포함한다. VH 및 VL 부위들은 구조틀 부위들 (FR)이라고 명명되는 더욱 보존된 부위들과 함께 산재되는 상보성 결정 부위들 (CDR)이라고 명명되는 과다가변성의 부위들로 더 소분류될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카복시-말단까지 다음의 순서로 배열된 세 개의 CDR들 및 네 개의 FR들로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 부위들은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체들의 불변 부위들은 면역계의 다양한 세포들 (예로, 효과기 세포들) 및 고전적인 보체계의 첫 번째 구성성분 (Clq)을 포함하는 숙주 조직들 또는 인자들과 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바, 용어 표현 "IGF-1R 항체"는 "항-IGF-1R 항체"와 유사한 것으로서 해석되어야 하고, IGF-1R와 결합할 수 있는 항체를 의미한다.
용어 "단일클론 항체" 또는 "Mab"는 본 명세서에서 사용되는 바 실질적으로 균질한 항체들의 집단으로부터 획득된 항체를 말하고, 예로 집단의 개별 항체들은 소량들로 존재할 수 있는 가능한 자연적으로 생기는 돌연변이들을 제외하고는 일치한다. 단일클론 항체들은 매우 특이적이어서, 단일한 에피토프에게로 유도된다. 이러한 단일클론 항체들은 B 세포들 또는 하이브리도마의 단일한 클론에 의해 생산될 수 있다. 단일클론 항체들도 역시 재조합일 수 있고, 예로 단백질 공학 또는 화학적 합성에 의해 생산된다. 단일클론 항체들은 파지 항체 라이브러리들로부터도 역시 분리될 수 있다. 또한, 전형적으로 다양한 결정기들 또는 에피토프들에게로 유도되는 다양한 항체들을 포함하는 다중클론 항체들의 제조들과는 대조적으로, 각각의 단일클론 항체는 항원의 단일한 에피토프에게로 유도된다. 본 명세서에서 단일클론 항체는 이하 기술된 바와 같은 마우스, 키메라 및 인간화 항체를 포함한다.
용어 "재조합 항체"는 살아있는 세포들 내에서 재조합 DNA의 발현으로부터 유도되는 항체를 말한다. 본 발명의 재조합 항체는 당업자에게 잘 숙지되어 있는, 생물학적 유기체들에는 발견될 수 없는 DNA 서열들을 제작하는 유전적 재조합의 연구실 방법들을 사용하여 획득된다.
본 발명에 따른 ADC의 항체의 "항원 결합 단편들" 또는 "IGF-1R 결합 단편"에 의하여, 항체의 표적 (일반적으로 항원이라고도 역시 말함)과 결합하는 능력을 보유하는 임의의 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 가르키도록 의도된다. 일 구현예에서, 이러한 "항원 결합 단편들"은 Fv, scFv (단일 사슬의 sc), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc 단편들 또는 다이아체들, 또는 반감기가 폴리(에틸렌)글리콜 ("PEG화")(Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG 또는 Fab'-PEG라고 불리는 PEG화된 단편들) (폴리(에틸렌)글리콜의 "PEG")과 같은 폴리(알킬렌)글리콜의 첨가와 같은 화학적 변형 또는 리포좀 내로 도입에 의해 증가되었던 임의의 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 상기 단편들은 본 발명에 따른 항체의 특징적인 CDR들 중 적어도 하나를 가진다. 바람직하게, 상기 "항원 결합 단편들"은 그들이 유래한 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 사슬의 부분적 서열로 구성되거나 이를 포함할 것이고, 상기 부분적 서열은 표적의 측면에서 이것이 나온 항체와 동일한 결합 특이성 및 충분한 친화성, 바람직하게 이것이 나온 항체의 친화성의 적어도 동등 내지 1/100, 더욱 바람직한 방식으로 적어도 1/10까지의 친화성을 보유하기에 충분하다. 더욱 바람직하게, 상기 "항원 결합 단편들"은 적어도 그들이 유래한 항체의 중쇄 가변 사슬의 세 개의 CDR들, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 그리고 경쇄 가변 사슬의 세 개의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3로 구성되거나 이를 포함할 것이다.
"결합하는" 또는 "결합하다" 등에 의하여, 항체 또는 그의 임의의 항원-결합 단편은 생리적 조건들 하에서 비교적 안정한 항원과 복합체를 형성하는 것으로 의도된다. 특이적 결합은 적어도 약 1 × 10-6 M의 평형 해리 상수를 특징으로 할 수 있다. 두 분자들이 결합하는지 여부를 결정하는 방법들은 당해 기술분야에 잘 숙지되어 있고, 예를 들면 평형 투석법, 표면 플라스몬 공명법 및 방사선 표지 검정법들 등을 포함한다. 애매함의 회피를 위해, 이것은 상기 항체가 또 다른 항원과 낮은 수준에서 결합 또는 개입할 수 없는 점을 의미하지는 않는다. 그럼에도 불구하고, 일 구현예로서, 상기 항체는 상기 항원과만 결합한다.
CDR 부위들 또는 CDR(들)에 의하여, IMGT에 의해 정의된 바와 같이 면역글로불린들의 중쇄 및 경쇄의 과다가변 부위들을 가르키도록 의도된다. 독특한 IMGT 번호매김 (IMGT unique numbering)은 항원 수용체, 사슬 유형 또는 종들과는 상관없이 가변 도메인들을 비교하도록 정의되어 왔다 [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997); Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M. P., Pommie C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. 독특한 IMGT 번호매김에서, 보존되는 아미노산들은 항상 동일한 위치들, 예를 들면 23번 시스테인 (1번째-CYS), 41번 트립토판 (보존된-TRP), 89번 소수성 아미노산, 104번 시스테인 (2번째-CYS), 118번 페닐알라닌 또는 트립토판 (J-PHE 또는 J-TRP)을 보유한다. 독특한 IMGT 번호매김은 구조틀 부위들 (FR1-IMGT: 1 내지 26번 위치, FR2-IMGT: 39 내지 55번 위치, FR3-IMGT: 66 내지 104번 위치 및 FR4-IMGT: 118 내지 128번 위치) 및 상보성 결정 부위들 (CDR1-IMGT: 27 내지 38번 위치, CDR2-IMGT: 56 내지 65번 위치 및 CDR3-IMGT: 105 내지 117번 위치)의 표준화된 구획을 제공한다. "공간들 (gap)"은 채워지지 않은 위치를 나타내기 때문에, CDR-IMGT 길이들 (괄호들 사이에 나타나고 점들로 분리됨, 예로 [8.8.13])는 결정적인 정보가 된다. 독특한 IMGT 번호매김은 IMGT 진주목걸이라고 명명되는 [Ruiz, M. and Lefranc, M. P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002); Kaas, Q. and Lefranc, M. P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)] 2차원 그래픽 전시들 및 IMGT/3D 구조-DB의 3차원 구조들 [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M. P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)]에 사용된다.
본 명세서에서 반대의 명시가 없는 경우라면, 상보성-결정 부위들 또는 CDR들은 IMGT 번호매김 체계에 따라 정의된 바와 같이 면역글로불린의 중쇄들 및 경쇄들의 과다가변 부위들을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 그럼에도 불구하고, CDR들은 카밧 번호매김 체계에 따라 역시 정의될 수 있다 (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 제 5판, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, 및 나중의 개정판들). 3가지 중쇄 CDR들 및 3가지 경쇄 CDR들이 존재한다. 본 명세서에서, 용어들 "CDR" 및 "CDR들"은 경우에 따라서 그들이 인식하는 항원 또는 에피토프에 대한 항체의 결합 친화성을 부여하는 대부분의 아미노산 잔기들을 포함하는 부위들의 하나 이상 또는 심지어 전부를 가리키는 데 사용된다. 본 출원의 해석을 단순화하기 위하여, 카밧에 따른 CDR들은 정의되지 않는다. 그럼에도 불구하고, 당업자에게는 IMGT에 따른 CDR들의 정의를 사용하여 카밧에 따른 CDR들을 정의하는 것이 자명할 것이다.
용어 최대의 절반 유효 농도 (EC50)는 일정 특정된 노출 시간 이후에 기저값 및 최대값 사이의 절반의 반응을 유도하는 약물, 항체 또는 독물의 농도에 해당한다. 이것은 약물의 효능의 척도로서 보편적으로 사용된다. 따라서 등급화된 용량 반응 곡선의 EC50은 그의 최대 효과의 50%가 관찰되는 화합물의 농도를 나타낸다. 양적 용량 반응 곡선의 EC50은 특정된 노출 지속 이후에 집단의 50%가 반응을 나타내는 화합물의 농도를 나타낸다. 농도 측정들은 전형적으로 S자형 곡선을 따르고, 농도의 비교적 적은 변화를 거쳐서 신속하게 증가한다. 이것은 최고-적정화 선의 유도화에 의해 수학적으로 결정될 수 있다.
용어 "에피토프"는 항체에 의해 결합되는 항원의 부위이다. 에피토프들은 구조적 또는 기능적으로서 정의될 수 있다. 기능적 에피토프들은 일반적으로 구조적 에피토프들의 부분 집합이고, 상호작용의 친화성에 직접적으로 기여하는 잔기들을 포함한다. 에피토프들은 입체형태도 역시 가지고, 즉 비-선형의 아미노산들로 구성될 수 있다. 소정의 구현예들에서, 에피토프들은 아미노산들, 당 측쇄들, 포스포릴 기들, 또는 설포닐 기들과 같은 분자들의 화학적으로 활성을 가진 표면 그룹화가 되는 결정기들을 포함할 수 있고, 소정의 구현예들에서 특이적 삼차원 구조적 특징들 및/또는 특이적 전하 특징들을 가질 수 있다.
본 발명의 의미에서, 두 개의 핵산들 또는 아미노산들의 서열들 간의 "일치도 (identity)" 또는 "일치도 백분율 (percentage identity)"은 최적의 정렬에 따라 획득되어 비교되는 두 개의 서열들 간에 일치하는 뉴클레오타이드들 또는 아미노산 잔기들의 백분율을 의미하고, 이러한 백분율은 순수하게 통계적이고 이 두 서열들 간의 차이들은 그들의 길이를 따라 무작위적으로 분포한다. 두 개의 핵산 또는 아미노산 서열들 간의 서열 비교는 통상적으로 그들을 최적으로 정렬시킨 이후 서열들을 비교하여 수행되고, 상기 비교는 분절마다 또는 "정렬창 (alignment window)"을 사용하여 수행될 수 있다. 비교를 위한 서열들의 최적의 정렬은 수동적인 비교와 더불어 스미스 및 워터맨의 로칼 상동성 알고리즘 [Smith and Waterman (1981) Ad. App. Math. 2:482]에 의해, 네들만 및 운쉬의 로칼 상동성 알고리즘 [Neddleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443]에 의해, 피어슨 및 립만의 유사도 탐색 방법 [Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]에 의해, 또는 이들 알고리즘을 사용하는 컴퓨터 소프트웨어에 의해 (위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지, 유전학 컴퓨터 그룹, 575 Science Dr., Madison, WI에서의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, 또는 비교 소프트웨어 BLAST N 또는 BLAST P에 의해) 수행될 수 있다. 일치도 백분율은 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 두 개 서열들 간에, 바람직하게는 두 개의 완전한 서열들 간에 일치하는 위치들의 수를 결정하고, 동일한 위치들의 수를 정렬창에서의 전체 위치들의 수로 나누고, 결과를 두 개 서열들 간의 일치도 백분율을 획득하도록 100으로 곱하여 계산된다. 예를 들면, 웹 사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html 상에서 입수가능한 BLAST 프로그램 "BLAST 2 서열들" (Tatusova et al., "Blast 2 서열- 단백질 및 뉴클레오타이드 서열들을 비교하기 위한 새로운 도구", FEMS Microbiol., 1999, Lett. 174: 247-250)은 디폴트 매개변수 (명확하게, 매개변수 "오픈 갭 페널티 (open gap penalty)"의 경우: 5, 및 "연장 갭 페널티 (extension gap penalty)": 2; 선택된 매트릭스는 예를 들면 프로그램에 의해 제시되는 "BLOSUM 62" 매트릭스일 수 있음)와 함께 사용될 수 있고, 비교될 두 개 서열들 간의 일치도 백분율은 프로그램에 의해 직접 계산될 수도 있다. 기준 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가지는 아미노산 서열을 위해, 바람직한 예들은 기준 서열, 소정의 변형들 (modification), 명확하게는 적어도 하나의 아미노산의 결실 (deletion), 부가 (addition) 또는 치환 (substituiton), 절단 (truncation) 또는 연장 (extension)을 포함한다. 하나 이상의 연속적 또는 비-연속적 아미노산(들)의 치환들 경우에서, 치환된 아미노산은 "동등한" 아미노산에 의해 대체되는 치환이 바람직하다. 본 명세서에서 용어 표현 "동등한 아미노산들"은 해당하는 항체들의 생물학적 활성들을 변형시키지 않고도 구조적 아미노산들 및 하기 정의된 특정한 예들의 하나로 치환될 수 있는 임의의 아미노산들을 가리키도록 의미한다. 동등한 아미노산들은 치환된 아미노산들과의 그들의 구조적 상동성을 기초로 하거나 생성될 수 있는 다양한 항체들 간의 생물학적 활성의 비교 테스트들의 결과들을 기초로 하여 결정될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 하기 표 1은 해당하는 변형된 항체의 생물학적 활성의 유의한 변형을 유발하지 않고도 수행될 수 있는 가능한 치환들을 정리하고 있고; 역 치환들 (inverse substituiton)도 동일한 조건들 하에서 자연적으로 가능하다. 더욱 바람직한 구현예에서, CDR(들)을 포함하는 항체의 기준 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 나타내는 아미노산 서열을 위해, 바람직한 예들은 적어도 기준 서열에 포함된 미변형된 CDR(들)을 포함한다.
Figure pct00020
발명의 상세한 설명에서 상호교환적으로 사용되는 용어들 "핵산 (nucleic acid)", "핵산 서열 (nucleic sequence)", "핵산 서열 (nucleic acid sequence)", "폴리뉴클레오타이드 (polynucleotide)", "올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide)", "폴리뉴클레오타이드 서열 (polynucleotide sequence)" 및 " 뉴클레오타이드 서열 (nucleotide sequence)"은, 변형 여부와 상관없이 핵산의 단편 또는 부위를 정의하고, 비천연 뉴클레오타이드를 포함하기도 하고, 이중가닥 DNA, 단일가닥 DNA 또는 상기 DNA들의 전사 산물들 중 하나인 뉴클레오타이드들의 정확한 서열을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바, "IGF-1R 치료법의 투여로부터 유익을 얻을 개체" 및 "IGF-1R 치료법으로 치료되도록 감수성을 가진 개체"와 같은 용어들은 예로 IGF-1R의 검출을 위해 (예로, 진단적 절차를 위함) IGF-1R 치료법의 투여로부터 및/또는 IGF-1R과 결합하는 IGF-1R 결합 분자로의 치료, 예로 암과 같은 질환의 완화 또는 예방으로부터 유익을 얻을 포유동물 개체들과 같은 개체들을 포함한다. 본 명세서에서 더욱 자세하게 기술된 바와 같이, IGF-1R 결합 분자는 미결합된 형태로 사용될 수 있거나, 예로 약물, 프로드러그 또는 동위원소와 결합될 수 있다.
"IGF-1R을 발현하는 암들"에 의하여, IGF-1R을 발현하거나, 과다발현하거나, 비정상적으로 발현하는 임의의 암을 의미한다. 소정의 구현예들에서 이것은 전암성 병변, 비정상 세포 성장, 양성 종양 또는 악성 종양을 포함하거나, "암"은 IGF-1R을 발현하거나, 과다발현하거나, 비정상적으로 발현하는 세포들을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 질환을 "진단"하는 것은 IGF-1R의 발현과 연관되거나 이에 의해 매개되는 병리학적 과다증식 종양원성 장애의 존재를 확인하거나 검출하고, 질환의 진행을 모니터링하며, IGF-1R의 발현과 연관된 장애를 지시하는 세포들 또는 시료들을 확인하는 과정을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 바, "예후 판단"은 질환으로부터 회복의 가망성 또는 질환의 가능한 발생 또는 결과의 예측을 의미한다. 예를 들면, 개체로부터 얻은 시료가 IGF-1R 항체로 염색에 대해 음성인 경우라면, 해당 개체의 "예후 판단"은 시료가 IGF-1R 항체로 염색에 대해 양성인 경우보다 낫다. 시료들은 이하 본 명세서에서 더욱 상술될 바와 같이 IGF-1R 발현 수준들에 대하여 적당한 척도로 점수 매겨질 수 있다.
"생물학적 시료"는 개체로부터 채취할 수 있는 임의의 시료일 수 있다. 이러한 시료는 본 발명의 생체마커의 발현 수준들의 결정을 허용해야 한다. 시료의 성질은 이에 따라 종양의 특성에 의존적일 것이다. 바람직한 생물학적 시료들은 암이 액체 종양인 경우라면, 혈액 시료, 혈장 시료 또는 림프 시료와 같은 시료들을 포함한다. 바람직한 생물학적 시료들은 암이 고체 종양인 경우라면,생검 시료 또는 수술적 절제 요법으로부터 채취한 시료와 같은 시료들을 포함한다. 바람직하게, 생물학적 시료는 인간 기원의 혈청, 전혈 세포들, 조직 시료 또는 생검과 같은 생물학적 액체이다. 시료는 예를 들면 생검된 조직을 포함하고, 이는 IGF-1R의 발현과 연관된 병리학적 종양원성 장애의 존재에 대하여 편리하게 검정될 수 있다.
본 발명의 의미 내에서 "IGF-1R 상태"는 면역조직화학법 (IHC), 형광 활성화 세포 선별법 (FACS) 또는 당업자에게 숙지된 기타 방법들과 같은 임의의 방법들에 의해 측정된 바와 같이 IGF-1R의 발현 수준의 결정을 기초로 하는 IGF-1R 양성 [IGF-1R(+)] 또는 IGF-1R 음성 [IGF-1R(-)]으로 종양의 분류에 관한 것이다.
Ⅱ - 첫 번째 IGF -1R 항체
본 발명의 일 구현예에서, 첫 번째 IGF-1R 항체 또는 그의 임의의 항원 결합 단편은
(i) 서열번호 1 서열의 CDR-H1, 서열번호 2 서열의 CDR-H2 및 서열번호 3 서열의 CDR-H3을 가진 중쇄; 및
(ii) 서열번호 4 서열의 CDR-L1, 서열번호 5 서열의 CDR-L2, 서열번호 6 서열의 CDR-L3를 가진 경쇄:
를 포함한다.
첫 번째 IGF-1R 항체는 서열번호 7의 서열 또는 서열번호 7의 서열과 적어도 90%의 상동성을 가진 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 한다.
첫 번째 IGF-1R 항체는 서열번호 8의 서열 또는 서열번호 8의 서열과 적어도 90%의 상동성을 가진 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 구현예에 따르면, 810D12라고 약칭되는 첫 번째 IGF-1R 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 7의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98%의 상동성을 가진 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하고/거나; 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98%의 상동성을 가진 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 첫 번째 IGF-1R 항체 또는 그의 임의의 항원 결합 단편은
(i) 서열번호 11 서열의 CDR-H1, 서열번호 12 서열의 CDR-H2 및 서열번호 13 서열의 CDR-H3을 가진 중쇄; 및
(ii) 서열번호 14 서열의 CDR-L1, 서열번호 15 서열의 CDR-L2, 서열번호 16 서열의 CDR-L3를 가진 경쇄:
를 포함한다.
첫 번째 IGF-1R 항체는 서열번호 7의 서열 또는 서열번호 17의 서열과 적어도 90%의 상동성을 가진 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 한다.
첫 번째 IGF-1R 항체는 서열번호 18의 서열 또는 서열번호 18의 서열과 적어도 90%의 상동성을 가진 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 구현예에 따르면, 810D12라고 약칭되는 첫 번째 IGF-1R 항체는 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98%의 상동성을 가진 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하고/거나; 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 서열번호 18의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98%의 상동성을 가진 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 상세한 관점은 첫 번째 IGF-1R 항체 또는 그의 임의의 항원 결합 단편이 인슐린 수용체 (IR)과 결합하지 않는 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 첫 번째 IGF-1R 항체는 단일클론 항체로 구성된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 첫 번째 IGF-1R 항체는 재조합 항체로 구성된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 화학적으로 합성된 항체로 구성된다.
"IGF-1R 항체"는 (정반대의 명시가 없더라도) 상기 IGF-1R 항체의 마우스, 키메라 및 인간화 버전들을 포함한다.
보다 명확하게, 다음의 표 2는 IMGT에 따라 정의된 항체들 810D12 (표 2a) 및 816C12 (표 2b)의 서열들을 도시한다.
Figure pct00021
Figure pct00022
일 구현예에서, 본 명세서에서의 단일클론 항체는 마우스, 키메라 및 인간화 항체를 포함한다.
첫 번째 IGF-1R 항체는 프랑스 미생물 배양의 기탁기관 (프랑스 파리, 파스퇴르 연구소, CNCM)에 제출된 마우스 기원의 하이브리도마로부터 유래될 수 있고, 상기 하이브리도마는 Balb/C 면역화된 마우스 비장 세포들/림프 세포들 및 골수종 Sp 2/O-Ag 14 세포주의 세포들의 융합에 의해 획득된다. 상기 하이브리도마는 (i) 프랑스 파리, 파스퇴르 연구소, CNCM에 2014년 9월 17일자로 수탁번호 제 I-4893호하에 기탁된 마우스 기원의 하이브리도마; 또는 (ii) 프랑스 파리, 파스퇴르 연구소, CNCM에 2014년 9월 17일자로 수탁번호 제 I-4894호 하에 기탁된 마우스 기원의 하이브리도마:로부터 선택될 수 있다.
본 명세서에서 810D12라고 약칭되는 첫 번째 IGF-1R 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 상기 하이브리도마 I-4893에 의해 분비되고, 명백하게 본 발명에 사용될 수 있다.
본 명세서에서 816C12라고 약칭되는 첫 번째 IGF-1R 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 상기 하이브리도마 I-4894에 의해 분비되고, 명백하게 본 발명에 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 첫 번째 IGF-1R 항체는 다음의 뉴클레오타이드 서열들
(i) 중쇄 가변 도메인을 위한 서열번호 9 및/또는 경쇄 가변 도메인을 위한 서열번호 10;
(ii) 중쇄 가변 도메인을 위한 서열번호 19 및/또는 경쇄 가변 도메인을 위한 서열번호 20:
에 의해 인코딩될 수 있다.
하기 표 3은 항체 810D12 (표 3a) 및 항체 816C12 (표 3b)에 관한 다양한 뉴클레오타이드 서열들을 요약하고 있다.
Figure pct00023
Figure pct00024
본 발명의 항체의 생체마커로서 용도도 역시 개시된다. 본 방법들은 이에 제한되는 것은 아니지만, IGF-1R의 발현과 연관된 전립선암, 골육종, 폐암, 유방암, 자궁내막암, 교모세포종, 결장암, 위암, 신장암, 췌장암, 두경부암 또는 임의의 다른 암으로 대표되는, IGF-1R의 발현과 연관된 다양한 과다증식 종양원성 장애들을 검출하거나 진단하는 데 사용될 수 있다. 당업자에게 인식되고 있을 바와 같이, 특정한 장애와 연관된 항체 발현의 수준은 기존 병태의 특성 및/또는 중증도에 의존하여 변화할 것이다.
IGF-1R 상태 결정은 현재 당업자에게 숙지되거나 사용되는 임의의 방법 또는 기법들에 의해 (일반적으로 IGF-1R의 발현 수준의 결정을 기초로 하여) 시행될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 일정 비제한적인 예들이 하기에 기술된다.
병기 결정은 강력한 예후적 수치를 가지고, 최적의 요법을 설계하기 위한 판단기준을 제공한다 (Simpson et al., J. Clin. Oncology, 18: 2059 (2000)). 예를 들면, 고형 종양들을 위한 치료 선택은 종양 병기 결정을 기초로 하고, 이는 보통 암에 관한 미국 조인트 위원회 (AJCC)로부터 나온 종양/림프절/전이 (TNM) 테스트를 사용하여 수행된다. 이러한 테스트 및 병기 결정 시스템이 고형 암이 환자에서 진단되었던 병기에 관한 일정 소중한 정보를 제공하지만, 이것이 명확하지 않고 불충분한 점은 공통적으로 인식되고 있다. 상세하게, 이것은 종양 진행의 가장 초기 병기들을 확인하는 데 실패하고 있다.
일 구현예에서 개체에서 종양성 세포들의 IGF-1R 점수를 시험관내 또는 생체 외에서 결정하는 방법은
(a) 상기 개체로부터 얻은 생물학적 시료를 상기에 기술된 바와 같은 첫 번째 IGF-1R 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계;
(b) 상기 생물학적 시료에서 상기 첫 번째 IGF-1R 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 IGF-1R과 결합의 수준을 형광 활성화 세포 선별법 (FACS) 또는 면역조직화학법 (IHC)에 의해 정량하는 단계; 및
(c) 단계 (b)에서 획득된 정량된 수준을 양성 세포들의 염색의 강도 및 백분율인 두 개의 매개변수들을 기초로 하는 적당한 척도와 비교하여 종양성 세포들을 점수 매기는 단계:
를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 첫 번째 IGF-1R 항체는 조직 시료들이 포르말린-고정되고/거나, 포몰 치환 고정되고/거나, 글리코-픽스 고정되고/거나, 파라핀 포매되고/거나 냉동될 때, IGF-1R를 결합할 수 있다.
임의의 통상적인 위험 분석 방법은 IGF-1R의 예후적 수치를 추정하는 데 사용될 수 있다. 대표적인 분석 방법들로는 콕스 회귀 분석법을 포함하고, 이는 검열된 사례들의 존재 시 생존 또는 시간-대-사건 데이타를 모델링하는 절반매개변수 방법이다 (Hosmer and Lemeshow, 1999; Cox, 1972). 다른 생존 분석법들 예로 생명 표들 또는 카플란-메이어와는 대조적으로, 콕스는 모델들에서 예측인자 변수들 (공변수들)의 포함을 허용한다. 통상적인 분석 방법 예로 콕스를 사용하여, 질환 재발의 발병까지의 시간 (무-질환 생존 시간 또는 전이성 질환까지의 시간) 또는 질환으로부터 사망까지의 시간 (전반적 생존 시간)과 일차 종양의 IGF-1R 발현 상태의 상관성을 고려하는 가설들을 테스트할 수 있다. 콕스 회귀 분석법은 콕스 비율적 위험 분석법으로도 역시 알려져 있다. 이러한 방법은 환자 생존 기간에 종양 마커의 예후적 수치를 테스트하는 표준이 된다. 다중변수 방식으로 사용될 때, 여러 공변수들의 효과가 동시에 테스트되고, 이로써 독립적인 예후적 수치를 가지는 개별적인 공변수들, 예로 가장 유용한 마커들이 확인될 수 있다. 용어 음성 또는 양성 "IGF-1R 상태"는 [IGF-1R(-)] 또는 [IGF-1R(+)]라고도 역시 약칭될 수 있다.
시료는 암의 진단 또는 모니터링 동안 "점수 매김"될 수 있다. 가장 단순한 형태로인 점수 매김은 면역조직화학법에 의한 시료들의 시각적 조사에 의해 판단되는 바와 같이 분류상 음성 또는 양성일 수 있다. 보다 정량적인 점수 매김에는 2개 매개변수들, 염색의 강도 및 시료화된 염색된 ("양성") 세포들의 비율을 판단하는 단계가 관여한다.
일 구현예에서, 표준화를 입증하도록 시료들은 서로 다른 척도들 상에서 IGF-1R 발현 수준들에 대하여 점수 매겨질 수 있고, 이들 대부분은 반응 산물의 강도 및 양성 세포들의 백분율의 평가를 기초로 한다 (Payne et al., Predictive markers in breast cancer - the present, Histopathology, 2008, 52: 82-90).
또 다른 구현예에서, 상기 점수 매김은 염색의 강도 및 양성 세포들의 백분율을 기초로 하여 적당한 척도를 사용하는 것을 포함한다.
첫 번째 예로서, 에스트로겐 수용체 및 프로게스테론 수용체의 IHC 평가를 위한 퀵 올레드 점수 매김 (Quick Allred scoring)으로의 유추에 의해, 시료들은 반응의 강도 및 염색된 세포들의 비율에 대한 점수들을 조합하는 0부터 8까지의 광범위한 척도 상에 IGF-1R 발현 수준들에 대한 점수가 매겨질 수 있다 (Harvey JM, Clarck GM, Osborne CK, Allred DC, J. Clin. Oncol., 1999, 17: 1474-1481). 보다 상세하게, 반응 강도의 첫 번째 판정 기준은 0부터 3까지의 척도 상에 점수 매겨지고, 0은 "무반응성"에 해당하고 3은 "강한 반응성"에 해당한다. 반응 비율의 두 번째 판정 기준은 0부터 5까지의 척도 상에 점수 매겨지고, 0은 "무반응성"에 해당하고 5는 "67 내지 100%의 반응 비율"에 해당한다. 다음으로 반응 강도의 점수 및 반응 비율 점수는 0 내지 8의 전체 점수를 생성하도록 합산된다. 0 내지 2의 전체 점수는 음성으로서 고려되는 한편 3 내지 8의 전체 점수는 양성으로서 고려된다.
이러한 척도에 따르면, 본 명세서에서 사용되는 종양들의 음성 또는 양성 "IGF-1R 상태" 용어들은 각각 올레드 척도 상에서 점수들 0 내지 2 또는 3 내지 8에 해당하는 IGF-1R의 발현 수준들을 말한다.
본 명세서에서 하기 표 4는 올레드 방법에 따라 IHC 결과들을 해석하는 지침들을 설명한다.
Figure pct00025
본 발명에 따르면, 상기 적당한 척도는 0 내지 8의 척도일 수 있고, 무반응성은 0으로 점수 매겨지고, 67 내지 100% 반응 비율의 비율로의 강한 반응성은 8로 점수 매겨진다.
다른 말로 하면, 개체로부터 얻은 종양의 상태를 시험관내 또는 생체외에서 결정하는 방법으로서, (a) 올레드 척도에 따라 개체로부터 얻은 종양을 점수 매기는 단계; 및 (b) 종양의 상태가 3 내지 8의 올레드 점수로 [IGF-1R(+)]인 것으로 결정하는 단계; 또는 (c) 종양의 상태가 0 내지 2의 올레드 점수로 [IGF-1R(-)]인 것으로 결정하는 단계:를 포함하는, 방법이 기술된다.
본 발명의 상세한 관점에서, 종양은 올레드 점수 3을 가진 [IGF-1R(+)]이다.
본 발명의 상세한 관점에서, 종양은 올레드 점수 4를 가진 [IGF-1R(+)]이다.
본 발명의 상세한 관점에서, 종양은 올레드 점수 5를 가진 [IGF-1R(+)]이다.
본 발명의 상세한 관점에서, 종양은 올레드 점수 6을 가진 [IGF-1R(+)]이다.
본 발명의 상세한 관점에서, 종양은 올레드 점수 7을 가진 [IGF-1R(+)]이다.
본 발명의 상세한 관점에서, 종양은 올레드 점수 8을 가진 [IGF-1R(+)]이다.
본 발명의 상세한 관점에서, 종양은 올레드 점수 3 내지 8을 가진 [IGF-1R(+)]이다.
본 명세서에 기술된 또 다른 상세한, 개체에서 종양성 세포들의 IGF-1R 상태를 시험관내 또는 생체외에서 결정하는 방법은
(a) 상기에 기술된 바와 같이, IGF-1R 종양성 세포들을 점수 매기는 단계; 및
(b) 종양성 세포들의 IGF-1R 상태가 3 내지 8의 점수로 [IGF-1R(+)]인 것으로 결정하는 단계; 또는
(c) 종양성 세포들의 IGF-1R 상태를 0 내지 2의 점수로 [IGF-1R(-)]인 것으로 결정하는 단계:
를 포함하는 것을 특징으로 한다.
두 번째 예로서, 예를 들면 HER-2 수용체의 IHC 평가를 위한 통상적인 점수 매김으로의 유추에 의해, 시료들은 염색의 강도 (바람직하게 막 염색) 및 0부터 3+까지의 조합된 척도 내의 염색을 보여주는 세포들의 비율을 통합하는 약간 더 단순한 점수 매김 방법으로 IGF-1R 발현 수준들에 대하여 점수 매겨질 수 있다.
단순화된 척도라고 말하는 이러한 척도에서, 0 및 1+는 음성인 반면 2+ 및 3+는 양성 염색을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, 점수들 1+ 내지 3+는 각각의 양성 점수가 점수 0 (음성)과 비교할 때 재발 및 치명적 질환에 대한 유의하게 더 높은 위험성과 연관될 수 있지만, 양성 점수들 중에서 증가하는 강도는 추가적인 위험성 감소를 제공할 수 있기 때문에 양성으로서 기록될 수 있다.
일반적으로 말하자면, 본 상세한 설명에서 사용되는 용어들 종양들의 음성 또는 양성 "IGF-1R 상태"는 단순화된 척도 상에서 각각 점수들 0 내지 1+ 또는 2+ 내지 3+에 해당하는 IGF-1R의 발현 수준들을 말한다. 침습성 종양의 완전한 원주형 막 반응성만이 고려되어야 하고, 종종 "닭장 와이어" 모양을 닮아 있다. 현재의 지침들 하에서, IGF-1R에 대한 경계선 (2+ 또는 3+의 점수)으로서 점수 매겨진 시료들은 심화 평가를 거치도록 요구된다. 비제한적인 예로서 대조군들이 예상된 바와 다르고, 인공물들이 대부분의 시료에 포함되며, 시료가 과다한 항원 복구를 제시하는 정상 유방 도관들 (내부 대조군들)의 강한 막 양성을 가지는 경우라면, IHC 분석은 거절되고, 반복되거나 FISH 또는 임의의 다른 방법에 의해 테스트되어야 한다.
보다 명확하게, 본 명세서에서 하기 표 5는 이들 매개변수들을 요약하고 있다.
Figure pct00026
본 발명의 방법은 상기 적당한 척도가 종양 세포들의 막 반응성 없음이 0으로 점수 매겨지고, 10% 이상의 종양 세포들에서 강한 완전한 반응성이 3+으로 점수 매겨지는 0 내지 3+의 척도일 수 있다.
보다 자세하게, 상기에 기술된 바와 같이, 상기 적당한 척도는 종양 세포들의 막 반응성 없음이 0으로 점수 매겨지고; 10% 이상의 종양 세포들에서 희미한 감지가능한 반응성이 1+로 점수 매겨지고; 10% 이상의 종양 세포들에서 약한 내지 적당한 완전한 반응성이 2+로 점수 매겨지고; 10% 이상의 종양 세포들에서 강한 완전한 반응성이 3+로 점수 매겨지는 0 내지 3+의 척도이다.
다른 말로 하면, 개체로부터 얻은 종양의 상태를 시험관내 또는 생체외에서 결정하는 방법으로서, (a) 상기에 기술된 바와 같이 단순화된 척도에 따라 개체로부터 얻은 종양을 점수 매기는 단계; 및 (b) 종양의 상태가 2+ 또는 3+의 점수로 [IGF-1R(+)]인 것으로 결정하는 단계; 또는 (c) 종양의 상태가 0 또는 1+의 점수로 [IGF-1R(-)]인 것으로 결정하는 단계:를 포함하는, 방법이 기술된다.
본 발명의 상세한 관점에서, 종양은 점수 2+를 가진 [IGF-1R(+)]이다.
본 발명의 상세한 관점에서, 종양은 점수 3+를 가진 [IGF-1R(+)]이다.
본 발명의 또 다른 상세한 관점에서, 종양은 점수 2+ 또는 3+의 점수를 가진 [IGF-1R(+)]이다.
또 다른 구현예에서, 개체에서 종양성 세포들의 IGF-1R 상태를 시험관내 또는 생체외에서 결정하는 방법은
(a) 이전에 기술된 본 발명의 방법에 따라 상기 개체로부터 얻은 IGF-1R 종양성 세포들을 점수 매기는 단계; 및
(b) 종양성 세포들의 IGF-1R 상태가 2+ 또는 3+의 점수로 [IGF-1R(+)]인 것으로 결정하는 단계; 또는
(c) 종양성 세포들의 IGF-1R 상태가 0 또는 1+의 점수로 [IGF-1R(-)]인 것으로 결정하는 단계:
를 포함할 수 있다.
일반적으로, 테스트 또는 검정법의 결과들은 임의의 다양한 포맷들로 제시될 수 있다. 결과들은 정량적으로 제시될 수 있다. 예를 들면, 테스트 보고서는 아마도 검출 한계들의 지시와 함께 역시 특정한 폴리펩타이드가 검출되었는지 여부만을 지시할 수 있다. 결과들은 반정량적으로서 제시될 수 있다. 예를 들면, 다양한 범위들이 정의될 수 있고, 범위들은 소정의 정도의 정량적 정보를 제공하는 점수 (예로, 사용된 척도에 의존하여 0 내지 3+ 또는 0 내지 8)로 할당될 수 있다. 이러한 점수는 다양한 요인들, 예로 IGF-1R이 검출된 세포들의 수, (IGF-1R의 발현 또는 IGF-1R-보유 세포들의 수준을 표시할 수 있는) 신호의 강도 등을 반영할 수 있다. 결과들은 정량적인 방식으로, 예로 IGF-1R이 검출되는 세포들의 백분율, 단백질 농도 등으로서 도시될 수 있다.
당업자에게 이해될 바와 같이, 테스트에 의해 제공되는 결과의 유형은 테스트의 기술적인 한계들 및 폴리펩타이드의 검출과 연관된 생물학적 유의성에 의존하여 변화할 것이다. 예를 들면, 소정의 폴리펩타이드들의 경우에 순수하게 정량적인 결과 (예로, 폴리펩타이드가 소정의 검출 수준에서 검출되는지 여부)는 유의한 정보를 제공한다. 다른 경우들에서는 더욱 정량적인 결과 (예로, 테스트된 시료에서 폴리펩타이드의 발현 수준의 정상 수준 대비 비율)가 필요하다.
본 발명의 또 다른 관점에서, IGF-1R 상태 결정은 IGF-1R 경로를 표적하는 치료법의 투여에 반응하여 IGF-1R 발현을 모니터링하기 위해 시행될 수 있다. 이러한 모니터링은 상기 치료법이 IGF-1R의 저하조절 (downregulation) 및/또는 분해를 촉발시킬 때 매우 유용할 수 있다.
본 발명은 목적은 또한 종양원성 장애가 IGF-1R 경로를 표적하는 요법으로의 치료에 감수성을 가지는지 여부를 결정하는 방법으로서,
(a) 상기에 기술된 방법에 따라 개체의 종양성 세포들의 IGF-1R 상태를 시험관내 또는 생체외에서 결정하는 단계; 및
(b) 종양성 세포들의 IGF-1R 상태가 IGF-1R(+)인 경우라면, 종양원성 장애가 IGF-1R 경로를 표적하는 항체 약물로의 치료에 감수성을 가지는 것으로 결정하는 단계:
를 포함하는, 방법을 기술하는 것이다.
상세하게, 세포 표면 상에서 IGF-1R 발현을 모니터링하는 것은 임상 시험들 및 "개인화된" 치료법들 동안 치료의 효능을 평가하는 결정적인 도구일 수 있다.
IGF-1R 수준의 증가 또는 감소는 IGF-1R와 연관된 암의 진화를 지시한다. 따라서, 다양한 조직들 또는 세포들에 존재하는 IGF-1R를 발현하는 세포들의 수에서 증가 또는 IGF-1R의 농도에서 변화들을 측정하여, IGF-1R와 연관된 악성 (malignancy)을 개선하려는 목표를 가진 특정한 치료적 요법이 효과적인지 여부를 결정하는 것이 가능하다.
본 발명의 또 다른 목적은 또한 종양원성 장애로 고생하는 개체에서 IGF-1R과 연관된 상기 장애를 완화하도록 설계된 치료적 요법의 효능을 시험관내 또는 생체외에서 결정하는 방법으로서,
(a) 상기에 기술된 바와 같이 첫 번째 생물학적 시료에서 IGF-1R의 첫 번째 발현 수준을 결정하고, 상기 첫 번째 생물학적 시료는 상기 치료의 첫 번째 시간대에 해당하는 단계;
(b) 상기에 기술된 바와 같이 두 번째 생물학적 시료에서 IGF-1R의 두 번째 발현 수준을 결정하고, 상기 두 번째 생물학적 시료는 상기 치료의 두 번째 이후의 시간대에 해당하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 획득된 상기 두 번째 발현 수준 대비 단계 (a)에서 획득된 상기 첫 번째 발현 수준의 비율을 계산하는 단계; 및
(d) 단계 (c)의 비율이 1 초과일 때, 상기 치료적 요법의 효능이 높은 것으로 결정하거나; 단계 (c)의 비율이 1 이하일 때, 상기 치료적 요법의 효능이 낮은 것으로 결정하는 단계:
를 포함하는, 방법이다.
바람직한 구현예에서, 종양원성 장애로 고생하는 개체에서 IGF-1R과 연관된 상기 장애를 완화하도록 설계된 상기 치료적 요법은 상기 개체에게 IGF-1R 경로를 표적하는 치료법의 투여 단계를 포함한다.
본 발명의 목적은 또한 IGF-1R의 발현과 연관된 종양원성 장애를 촬영하는 생체내 방법을 제공하는 것이다. 이러한 방법은 종양성 세포들을 생체내에 정착시키는 데 뿐만 아니라 그들의 침습성을 모니터링하는 데 유용하다. 마찬가지로, 본 방법은 이전에 IGF-1R-매개성 암으로 진단된 환자들에서 진행 및/또는 치료에 대한 반응을 모니터링하는 데 유용하다.
일 구현예는 개체에서 IGF-1R을 발현하는 종양성 세포들의 위치를 검출하는 방법으로서,
(a) 상기 개체에게 첫 번째 IGF-1R 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 투여하는 단계; 및
(b) 상기 첫 번째 IGF-1R 항체의 결합을 검출하고, 상기 결합이 종양성 세포들의 존재를 지시하는 단계:
를 포함하는, 방법이다.
IGF-1R를 발현하는 종양의 존재의 검출에 관하여, 당업자에게 숙지되어 있는 많은 기법들이 사용될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 바람직한 수단들은 IHC 및 FACS이다.
Ⅲ - 항체 약물 컨쥬게이트 ( ADC )
Ⅲ.1 - 두 번째 IGF -1R 항체 ( Ab )
일 구현예에서, 두 번째 IGF-1R 항체 Ab는 재조합 항체로 구성된다.
또 다른 구현예에서, 두 번째 IGF-1R 항체 Ab는 화학적으로 합성된 항체로 구성된다.
본 출원의 일 구현예에서, 두 번째 IGF-1R 항체 Ab의 에피토프는 인간 IGF-1R의 세포외 도메인 (IGF-1R ECD라고도 역시 약칭됨) 내에 정착된다.
상세한 구현예에서, 두 번째 IGF-1R 항체 Ab 또는 그의 임의의 항원 결합 단편은 10 × 10-10 내지 1 × 10-10 M 사이 범위, 더욱 바람직하게 8 × 10-10 내지 2 × 10-10 M 사이 범위에 포함되는 EC50으로 IGF-1R과 결합할 수 있다.
바람직한 구현예로서, 본 발명에서 결정된 EC50은 인간 종양 세포들 상에 노출된 IGF-1R ECD과 결합하는 항체의 효능을 특성화하였다. EC50 매개변수는 FACS 분석을 사용하여 결정된다. EC50 매개변수는 인간 종양 세포들에서 발현된 인간 IGF-1R과 최대 결합의 50%가 획득되는 항체 농도를 반영한다. 각각의 EC50 수치는 네 개-매개변수 회귀 곡선 적정화 프로그램 (프리즘 소프트웨어)을 사용하여 용량 반응 곡선의 중간점으로서 계산되었다. 이러한 매개변수는 생리학적/병리학적 병태들을 나타내도록 선별되어 왔다.
IGF-1R과 결합을 위한 경쟁은, 이에 제한되는 것은 아니지만 방사능, 비아코아 (Biacore), 엘라이자 (ELISA), 유동세포측정법 등과 같은 당업자에게 숙지된 임의의 방법들 또는 기법들에 의해 결정될 수 있다. "IGF-1R과 결합을 위해 경쟁하는"으로서, 이것은 적어도 20%, 바람직하게 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%의 경쟁을 의미한다.
동일한 에피토프와 결합의 결정은, 이에 제한되는 것은 아니지만 방사능, 비아코아, 엘라이자, 유동세포측정법 등과 같은 당업자에게 숙지된 임의의 방법들 또는 기법들에 의해 결정될 수 있다. "IGF-1R의 동일한 에피토프와 결합하는"으로서, 이것은 적어도 20%, 바람직하게 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%의 경쟁을 의미한다.
상기에 언급된 바와 같이, 그리고 일반 지식과는 반대로, 본 발명은 IGF-1R과 결합 이후에 내재화될 높은 능력을 제시하는 특이적 항체들에 중점을 두고 있다. 본 명세서에서 사용되는 바, "내재화되다" 또는 "내재화된" (두 가지 용어 표현은 유사함) 항체는 포유동물 세포에서 표적과 결합 시 세포에 의해 흡수되는 (이것이 "진입하는" 것을 의미함) 항체이다. 이러한 항체는 ADC의 일부로서 흥미롭고, 이것이 표적화된 암 세포들 내로 연결된 세포독을 어드레싱하거나 인도한다. 일단 내재화되면, 세포독은 암 세포의 사망을 촉발시킨다.
놀랍게도, 본 발명에 따른 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab은 모두 CDR-H2, CDR-H3 및 CDR-L2의 동일한 서열들을 제시하고, 나머지 3개 CDR들은 서로 다르다. 이러한 관찰은 일반 지식의 일부로서, 항체의 결합 특이성에 관하여 CDR-H3가 가장 중요하고 에피토프의 인식과 가장 밀접한 것으로서 기술된 점과 일관성을 가진다.
ADC 치료법으로 성공의 중요한 핵심들은 표적 항원 특이성 및 암 세포들 내로 항원-항체 복합체들의 내재화인 것으로 생각된다. 명백하게, 비-내재화 항원들은 세포독성제제들을 전달하는 데 내재화 항원들보다 덜 효과적이다. 내재화 공정들은 항원들 간에 다양하고 항체들에 의해 영향을 받을 수 있는 다수의 매개변수들에 의존한다.
ADC에서, 세포독은 세포독성 활성을 부여하고, 사용된 항체는 암 세포들에 대한 특이성을 부여할 뿐만 아니라 세포들 내로 진입하는 벡터가 세포독을 정확하게 어드레싱하도록 한다. 따라서 ADC를 개선하기 위하여, 항체는 표적화된 암 세포들 내로 내재화되는 높은 능력을 나타내어야 한다. 항체가 내재화를 매개하는 효율은 표적화된 에피토프에 의존하여 유의하게 달라진다. 강력한 내재화 항체들의 선별은 표적 저하조절 (down-regulation)뿐만 아니라 이어지는 세포들 내로 항체 침투를 연구하는 다양한 실험적 데이타를 요구한다.
일 구현예에서, 두 번째 IGF-1R Ab의 내재화는 (본 출원에서 하기 예시되는 바와 같은) 면역형광법, 또는 FACS (유동세포측정법) 또는 내재화 기작에 특이적인 당업자에게 숙지된 임의의 방법 또는 공정에 의해 측정될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 ADC의 항체는 IGF-1R과 결합 이후에 적어도 30%, 바람직하게 50%, 더욱 바람직하게 80%의 내재화를 유도할 수 있다.
복합체 IGF-1R/두 번째 IGF-1R 항체 Ab는 상기 IGF-1R의 ECD와 두 번째 IGF-1R 항체 Ab의 결합 이후에 내재화되고, 세포들의 표면에서 IGF-1R의 정량의 감소가 유도된다. 이러한 감소는 비제한적인 예들로서 웨스턴-블럿법, FACS, 면역형광법과 같은 당업자에게 숙지된 임의의 방법에 의해 정량화될 수 있다.
일 구현예에서, 이러한 내재화를 반영하는 감소는 바람직하게 FACS에 의해 측정될 수 있고, 두 번째 IGF-1R 항체 Ab와 4시간 배양 이후에 4℃에서 측정된 평균 형광 강도 (MFI) 및 37℃에서 측정된 MFI 간의 차이 또는 델타값으로서 표현된다.
비제한적인 예로서, 이러한 델타값은 미처리된 세포들 및 두 번째 IGF-1R 항체 Ab로 처리된 세포들로 획득된 MFI들을 기초로 하여, (i) 두 번째 IGF-1R 항체 Ab와 4시간 배양 기간 이후에 유방암 세포들 MCF7 및 (ii) 알렉사 488로 표지된 이차 항체를 사용하여 결정된다. 이러한 매개변수는 다음의 공식으로 계산된 바와 같이 정의된다: .
Figure pct00027
.
이러한 MFI들 간의 차이는 MFI들이 세포-표면 상에서 발현된 IGF-1R과 비례하기 때문에 IGF-1R 저하조절을 반영한다.
유리한 관점에서, 항체들은 예로서 MCF-7 상에서 적어도 280, 바람직하게는 적어도 400의
Figure pct00028
를 촉발시키는 항체들로 구성된다.
보다 자세하게, 상기 언급된 델타값은 다음의 공정에 따라 측정될 수 있고, 이는 설명적이고 비제한적인 예로서 고려되어야 한다:
(a) 관심 있는 종양 세포들을 두 번째 IGF-1R 항체 Ab와 함께 차가운 (4℃) 또는 따뜻한 (37℃) 둘 중 하나의 완전 배양 배지로 처리하고 배양하는 단계;
(b) 단계 (a)의 처리된 세포들 및 미처리된 세포들을 동시에 이차 항체로 처리하는 단계;
(c) 처리된 및 미처리된 세포들에 대한 MFI (표면에 제시된 IGF-1R의 정량을 나타냄)를 본 발명의 항체와 결합할 수 있는 이차 표지된 항체로 측정하는 단계; 및
d) 미처리된 세포들로 획득된 MFI로부터 처리된 세포들로 획득된 MFI의 차감으로서 델타값을 계산하는 단계.
이러한 델타값 MFI로부터, 내재화 백분율이 다음과 같이 결정될 수 있다:
Figure pct00029
.
ADC의 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab은 바람직하게 MCF-7 상에서 50% 및 99% 사이, 70% 및 90% 사이 범위, 바람직하게는 75% 및 87% 사이 범위에 포함되는 내재화 백분율을 제시한다.
두 번째 IGF-1R 항체들 Ab의 상세한 장점은 그들의 내재화 속도에 의존한다.
일반적으로 ADC의 경우, 사용된 항체들이 바람직하게 항체의 투여로부터 24시간 이내, 더욱 바람직하게는 12시간 이내, 훨씬 더 바람직하게는 6시간 이내의 신속한 내재화 속도를 나타내는 것이 바람직하다고 알려져 있다.
본 발명에서, 내재화 속도는 세포 표면 결합 항체 감소 또는 세포 표면 항체 붕괴라고도 역시 약칭되며, t1/2 (반감기)로서 표현되고 △MFI의 50% 감소를 획득하는 데 필요한 시간에 해당한다 (이러한 관점은 다음의 실시예들을 고려하여 명백하게 이해될 것이다).
상세한 장점은 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab이 5분 및 25분 사이 범위, 바람직하게는 10분 및 20분 사이 범위에 포함되는 t1/2를 가지는 것이다.
두 번째 IGF-1R 항체 Ab 또는 그의 임의의 항원 결합 단편은 서열번호 22 서열의 CDR-H2 및 서열번호 23 서열의 CDR-H3을 가진 세 개의 중쇄 CDR들 및 서열번호 25 서열의 CDR-L2를 가진 세 개의 경쇄 CDR들을 포함할 수 있다.
두 번째 IGF-1R 항체 Ab 또는 그의 임의의 항원 결합 단편은 서열번호들 21, 22 및 23의 서열들의 세 개 중쇄 CDR들 및 서열번호들 24, 25 및 26의 서열들의 세 개 경쇄 CDR들을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 두 번째 IGF-1R 항체 Ab 또는 그의 임의의 항원 결합 단편은 서열번호들 21, 22 및 23 서열들 또는 서열번호들 21, 22 또는 23과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열을 포함하거나 이로 구성되는 세 개의 중쇄 CDR들; 및 서열번호들 24, 25 및 26 서열들 또는 서열번호들 24, 25 또는 26과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열을 포함하거나 이로 구성되는 세 개의 경쇄 CDR들을 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 두 번째 IGF-1R 항체 Ab 또는 그의 임의의 항원 결합 단편은 서열번호들 21, 22 및 23의 서열들을 포함하는 세 개의 중쇄 CDR들 및 서열번호들 24, 25 및 26의 서열들을 포함하는 세 개의 경쇄 CDR들을 포함한다.
상세한 관점에 따르면, 두 번째 IGF-1R 항체 Ab는 인슐린 수용체 (IR)와 결합하지 않는다. 이러한 관점은 본 명세서에서 기술된 항체가 인슐린 대사를 의미하는 IR에 미치는 임의의 부정적 영향을 가지지 않을 것이기 때문에 흥미롭다.
또 다른 구현예에서, 두 번째 IGF-1R 항체 Ab의 보다 또 다른 유리한 관점은 인간 IGF-1R뿐만 아니라 원숭이 IGF-1R, 보다 상세하게는 머카크 원숭이 (cynomolous) IGF-1R과도 결합할 수 있는 것이다. 이러한 관점은 이것이 임상시험들에 요구되는 독성 평가를 용이하게 할 것이기 때문에 역시 흥미롭다.
보다 또 다른 구현예에서, 두 번째 IGF-1R 항체 Ab는 단일클론 항체로 구성된다.
두 번째 IGF-1R 항체 Ab는 바람직하게 프랑스 미생물 배양들의 기탁기관 (프랑스 파리, 시덱스 15, 75724, 닥터 루 거리 25, 파스퇴르 연구소, CNCM)에 제출된 마우스 기원의 하이브리도마로부터 유래하고, 상기 하이브리도마는 Balb/C 면역화된 마우스 비장세포들/림프세포들 및 골수종 Sp 2/O-Ag 14 세포주의 세포들의 융합에 의해 획득된다.
상기 마우스 하이드리도마는 프랑스 파스퇴르 연구소, CNCM에 각각 2013년 5월 30일, 2013년 6월 26일, 2013년 6월 26일, 2013년 4월 24일 및 2013년 6월 26일에 기탁된 하이브리도마 I-4757, I-4773, I-4775, I-4736 또는 I-4774로부터 선택될 수 있다.
상세한 관점에서 두 번째 IGF-1R 항체 Ab는 (i) 프랑스 파스퇴르 연구소, CNCM에 각각 2013년 5월 30일, 2013년 6월 26일, 2013년 6월 26일, 2013년 4월 24일 및 2013년 6월 26일에 기탁된 하이브리도마 I-4757, I-4773, I-4775, I-4736 또는 I-4774에 의해 생산된 항체; (ii) (i)의 항체와 IGF-1R과 결합을 경쟁하는 항체; 또는 (iii) (i)의 항체가 결합하는 것과 동일한 IGF-1R의 에피토프와 결합하는 항체로부터 선택된 항체일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 두 번째 IGF-1R 항체 Ab는 마우스 항체로 구성되며, 다음으로 m[항체의 명칭]이라고 약칭된다.
일 구현예에서, 본 발명의 두 번째 IGF-1R 항체 Ab는 키메라 항체로 구성되며, 다음으로 c[항체의 명칭]라고 약칭된다.
일 구현예에서, 본 발명의 두 번째 IGF-1R 항체 Ab는 인간화 항체로 구성되며, 다음으로 hz[항체의 명칭]라고 약칭된다.
애매함의 회피를 위해, 다음의 명세서에서 용어 표현들 "IGF-1R 항체" 및 "[항체의 명칭]"은 유사하고 (반대의 명시가 없는 경우라면), 상기 IGF-1R 항체 및 상기 "[항체의 명칭]"의 마우스, 키메라 및 인간화 버전들을 포함한다. 필요할 때, 접두어 m- (마우스), c- (키메라) 또는 hz- (인간화)가 사용된다.
보다 명확하게, 다음의 표 6a는 바람직한 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab를 위한 IMGT에 따라 정의된 CDR 서열들을 도시한다. 동일한 특징들을 제시하는 임의의 다른 항체가 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.
Figure pct00030
상기에 기술된 바와 같은 6개 CDR들의 임의의 조합이 본 발명의 일부로서 고려되어야 하는 점은 당업자에게 자명할 것이다.
이러한 표 6a로부터 관찰될 수 있는 바와 같이, 본 명세서에서 기술된 모든 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab는 CDR-H2, CDR-H3 및 CDR-L2를 위한 동일한 서열들을 가지고, 이러한 성질은 상기에 기술된 바와 같이 매우 흥미롭다.
주어진 관점에서, 두 번째 IGF-1R 항체 Ab는 마우스 (m) 항체이다.
또 다른 관점에서, 두 번째 IGF-1R 항체 Ab는 키메라 (c) 항체이다.
키메라 항체는 주어진 종의 항체로부터 유래한 천연 가변 부위 (경쇄 및 중쇄)를 상기 주어진 종과 이종유래 종의 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변 부위들과 조합하여 포함하는 것이다.
키메라 항체들은 재조합 유전학의 기법들을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 키메라 항체는 프로모터 그리고 비인간 명확하게 마우스 단일클론 항체의 가변 부위를 코딩하는 서열 및 이종유래 종, 바람직하게 인간의 항체 불변 부위를 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 DNA를 클로닝하여 생산될 수 있다. 이러한 재조합 유전자에 의해 코딩되는 본 발명에 따른 ADC의 키메라 항체는 예를 들면, 이러한 항체의 특이성이 마우스 DNA로부터 유래한 가변 부위에 의해 결정되고 그의 이소형이 인간 DNA로부터 유래한 불변 부위에 의해 결정되는, 마우스-인간 키메라일 수 있다.
보다 명확하게, 다음의 표 6b는 키메라 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab의 서로 다른 변형체들을 위한 VH 및 VL (가변 도메인 및 전장)의 서열들의 비제한적인 예들을 도시한다.
Figure pct00031
보다 또 다른 관점에서, 두 번째 IGF-1R 항체 Ab는 인간화 항체이다.
"인간화 항체들"은 비인간 기원의 항체로부터 유래한 CDR 부위들을 포함하고, 항체 분자의 나머지 부분들은 하나의 (또는 여러) 인간 항체들로부터 유래하는 항체를 의미한다. 또한, 일정 골격 분절 잔기들 (FR이라고 불림)은 결합 친화성을 보존하도록 변형될 수 있다.
인간화 항체들 또는 그의 단편들은 당업자에게 숙지된 기법들에 의해 제조될 수 있다. 이러한 인간화 항체들은 시험관내 진단들 또는 생체내 예방적 및/또는 치료적 처치가 관여하는 방법들에서 사용하는 데 바람직하다. 다른 인간화 기법들도 역시, 예를 들면 유럽 특허들 제 EP 0　451 261호, 제 EP 0　682 040호, 제 EP 0　939 127호, 제 EP 0　566 647호 또는 미국 특허들 제 US 5,530,101호, 제 US 6,180,370호, 제 US 5,585,089호 및 제 US 5,693,761호에서 PDL에 의해 기술된 "CDR 접합 (CDR grafting)" 기법과 같은 기술분야의 당업자에게 숙지되어 있다. 미국 특허들 제 5,639,641호 또는 제 6,054,297호, 제 5,886,152호 및 제 5,877,293호도 역시 인용될 수 있다.
본 발명의 상세한 구현예로서, 이에 제한되는 것은 아니지만, 본 명세서에서는 hz208F2로 구성되는 두 번째 IGF-1R 항체 Ab가 기술된다. 이러한 인간화는 본 발명의 다른 항체들 부분에도 역시 적용될 수 있다.
일 구현예에서, 두 번째 IGF-1R 항체 Ab는
(i) 각각 서열번호들 27, 22 및 23의 서열들의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3,
(ii) 인간 생식계열 IGHV1-46*01 (서열번호 86)로부터 유래한 FR1, FR2 및 FR3, 및
(iii) 인간 생식계열 IGHJ4*01 (서열번호 88)로부터 유래한 FR4:
를 가지는 중쇄 가변 도메인 (VH)를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 두 번째 IGF-1R 항체 Ab는
(i) 각각 서열번호 29, 25 및 31의 서열들의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3,
(ii) 인간 생식계열 IGKV1-39*01 (서열번호 87)로부터 유래한 FR1, FR2 및 FR3, 및
(iii) 인간 생식계열 IGKJ4*01 (서열번호 89)로부터 유래한 FR4:
를 가지는 경쇄 가변 도메인 (VL)를 포함한다.
바람직하지만 이에 제한되지는 않는 본 발명의 구현예에서, 두 번째 IGF-1R 항체 Ab는
(a) 각각 서열번호 27, 22 및 23의 서열들의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3, 인간 생식계열 IGHV1-46*01 (서열번호 86)로부터 유래한 FR1, FR2 및 FR3, 및 인간 생식계열 IGHJ4*01 (서열번호 88)로부터 유래한 FR4를 가지는 중쇄; 및
b) 각각 서열번호 29, 25 및 31의 서열들의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3, 인간 생식계열 IGKV1-39*01 (서열번호 87)로부터 유래한 FR1, FR2 및 FR3, 및 인간 생식계열 IGKJ4*01 (서열번호 89)로부터 유래한 FR4를 가지는 경쇄:
를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 두 번째 IGF-1R 항체 Ab는
(a) 서열번호들 33, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 및 59로부터 선택된 서열 또는 서열번호들 33, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 또는 59와 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가진 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인; 및 서열번호들 29, 25 및 31의 서열들의 세 개 경쇄 CDR들을 포함하는, 항체;
(b) 서열번호들 34, 37 및 60으로부터 선택된 서열 또는 서열번호들 34, 37 또는 60과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가진 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인; 및 서열번호들 27, 22 및 23 서열들의 세 개 중쇄 CDR들을 포함하는, 항체; 또는
(c) 서열번호들 33, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 및 59로부터 선택된 서열 또는 서열번호들 33, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 또는 59와 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가진 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인; 및 서열번호들 34, 37 및 60으로부터 선택된 서열 또는 서열번호들 34, 37 또는 60과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가진 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 항체:
로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 두 번째 IGF-1R 항체 Ab는
(a) 서열번호들 33, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55 및 57로부터 선택된 서열 또는 서열번호들 33, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55 또는 57과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄; 및 서열번호 34의 서열 또는 서열번호 34와 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하는, 항체;
(b) 서열번호들 33, 41, 45 및 55로부터 선택된 서열 또는 서열번호들 33, 41, 45 및 55와 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄; 및 서열번호 37의 서열 또는 서열번호 37과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하는, 항체; 및
(c) 서열번호 59의 서열 또는 서열번호 59와 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄; 및 서열번호 60의 서열 또는 서열번호 60과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하는, 항체:
로부터 선택된다.
보다 또 다른 구현예에서, 두 번째 IGF-1R 항체 Ab는
(a) 서열번호 35의 서열 또는 서열번호 35와 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄; 및 서열번호 36의 서열 또는 서열번호 36과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하는, 항체;
(b) 서열번호 35의 서열 또는 서열번호 35와 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄; 및 서열번호 38의 서열 또는 서열번호 38과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하는, 항체;
(c) 서열번호 40의 서열 또는 서열번호 40과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄; 및 서열번호 36의 서열 또는 서열번호 36과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하는, 항체;
(d) 서열번호 42의 서열 또는 서열번호 42와 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄; 및 서열번호 36의 서열 또는 서열번호 36과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하는, 항체;
(e) 서열번호 42의 서열 또는 서열번호 42와 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄; 및 서열번호 38의 서열 또는 서열번호 38과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하는, 항체;
(f) 서열번호 44의 서열 또는 서열번호 44와 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄; 및 서열번호 36의 서열 또는 서열번호 36과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하는, 항체;
(g) 서열번호 46의 서열 또는 서열번호 46과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄; 및 서열번호 36의 서열 또는 서열번호 36과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하는, 항체;
(h) 서열번호 46의 서열 또는 서열번호 46과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄; 및 서열번호 38의 서열 또는 서열번호 38과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하는, 항체;
(i) 서열번호 48의 서열 또는 서열번호 48과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄; 및 서열번호 36의 서열 또는 서열번호 36과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하는, 항체;
(j) 서열번호 50의 서열 또는 서열번호 50과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄; 및 서열번호 36의 서열 또는 서열번호 36과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하는, 항체;
(k) 서열번호 52의 서열 또는 서열번호 52와 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄; 및 서열번호 36의 서열 또는 서열번호 36과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하는, 항체;
(l) 서열번호 54의 서열 또는 서열번호 54와 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄; 및 서열번호 36의 서열 또는 서열번호 36과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하는, 항체;
(m) 서열번호 56의 서열 또는 서열번호 56과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄; 및 서열번호 36의 서열 또는 서열번호 36과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하는, 항체;
(n) 서열번호 56의 서열 또는 서열번호 56과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄; 및 서열번호 38의 서열 또는 서열번호 38과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하는, 항체;
(o) 서열번호 58의 서열 또는 서열번호 58과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄; 및 서열번호 36의 서열 또는 서열번호 36과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하는, 항체; 및
(p) 서열번호 61의 서열 또는 서열번호 61과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄; 및 서열번호 62의 서열 또는 서열번호 62와 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하는, 항체:
로부터 선택된다.
다른 말로 하면, 본 발명은 두 번째 IGF-1R 항체 Ab가
(a) 서열번호들 35, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 및 61로부터 선택된 서열 또는 서열번호들 35, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 및 61과 적어도 80% 일치도를 가진 임의의 서열의 중쇄; 및
(b) 서열번호들 36, 38 및 62로부터 선택된 서열 또는 서열번호들 36, 38 및 62와 적어도 80% 일치도를 가진 임의서열의 경쇄:
를 포함하는 항체인, 방법에 관한 것이다.
보다 명확하게, 다음의 표 6c는 인간화 항체 hz208f2의 서로 다른 변형체들을 위한 VH 및 VL (가변 도메인 및 전장)의 서열들의 비제한적인 예들을 도시한다.
Figure pct00032
Figure pct00033
Ⅲ.2 - 약물 (D)
약물 분체 D는 알킬화제들, 항-대사물들, 항-종양 항생제들, 세포분열 저해제들, 크로마틴 기능 저해제들, 항-혈관형성제들, 항-에스트로겐들, 항-안드로겐들, 킬레이팅제들, 철 흡수 자극제, 사이클로옥시게나제 저해제들, 포스포디에스테라제 저해제들, DNA 저해제들, DNA 합성 저해제들, 세포사멸 자극제들, 티미딜레이트 저해제들, T 세포 저해제들, 인터페론 작동제들, 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 환원효소 저해제들, 아로마타제 저해제들, 에스트로겐 수용체 길항제들, 타이로신 키나제 저해제들, 세포 주기 저해제들, 택산, 튜불린 저해제들, 혈관형성 저해제들, 대식구 자극제들, 뉴로키닌 수용체 길항제들, 카나비노이드 수용체 작동제들, 도파민 수용체 작동제들, 과립구 자극인자 작동제들, 에리트로포이에틴 수용체 작동제들, 소마토스타틴 수용체 작동제들, LHRH 작동제들, 칼슘 민감화제들, VEGF 수용체 길항제들, 인터루킨 수용체 길항제들, 파골세포 저해제들, 라디칼 형성 자극제들, 엔도텔린 수용체 길항제들, 빈카 알칼로이드, 항-호르몬 또는 면역조절인자들 또는 세포독성제 또는 독소의 활성 판정기준을 충족하는 임의의 다른 약물로부터 선택될 수 있고, D는 바람직하게 아우리스타틴, 돌라스타틴 10 또는 그의 유도체이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법 및 조성물에 따른 약물 분체는 다음의 화학식 (Ⅱ)
Figure pct00034
(Ⅱ)
을 가지고, 여기에서
R2는 COOH, COOCH3 또는 (티아졸-2-일과 같은) 티아졸릴이고;
R3는 H 또는 (메틸과 같은) (C1-C6)알킬, 상세하게 (C1-C6)알킬기이고;
R9는 H 또는 (메틸과 같은) (C1-C6)알킬이고;
m은 1 및 8 사이 범위에 포함된 정수이고;
물결선은 L과 부착점을 표시한다.
본 발명에서 "알킬"에 의하여 직쇄 또는 분지쇄, 포화 탄화수소 사슬을 의미한다. 예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 세크-부틸, 터르-부틸, 펜틸 또는 헥실기들이 언급될 수 있다.
본 발명에서 "(Cx-Cy)알킬"에 의하여, 상기에 정의된 바와 같이 x개 내지 y개의 탄소 원자들을 포함하는 알킬 사슬을 의미한다. 따라서, (C1-C6)알킬기는 1개 내지 6개의 탄소 원자들을 가지는 알킬 사슬이다.
(C1-C6)알킬은 유리하게 (C1-C4)알킬이고, 바람직하게 (C1-C2)알킬이다.
본 발명의 화합물들 중에서, 하나의 상세하게 인정된 부류의 약물 분체들은 R2가 COOH기를 나타내는 화학식 (Ⅱ) 약물 분체들에 해당한다.
또 다른 상세하게 인정된 부류의 분체들은 R2가 티아졸 (상세하게 티아졸-2-일 기)인 화학식 (Ⅱ) 분체들에 해당한다.
또 다른 부류의 상세하게 인정된 분체들은 R2가 COOMe인 화학식 (Ⅱ) 분체들에 해당한다.
본 발명의 상세한 일 구현예에 따르면, R2는 보다 상세하게 COOH, COOMe 또는 티아졸-2-일 기이다.
첫 번째 바람직한 구현예에 따르면, R2는 COOH이다.
두 번째 바람직한 구현예에 따르면, R2는 COOMe이다.
R3는 상세하게 (C1-C6)알킬이고, 유리하게 메틸기를 나타낸다.
m은 1 및 8 사이, 상세하게 1 및 6 사이, 유리하게 1 및 4 사이 범위에 포함되는 정수이고, 바람직하게 1 또는 2이다.
바람직한 구현예에서, R2는 COOH이고, R3는 메틸기이고, m은 1 또는 2이다.
본 발명의 약물 분체들 중에서, 하나의 상세하게 인정된 부류의 약물 분체들은 R9가 메틸기 또는 수소인 화학식 (Ⅱ) 약물 분체들에 해당한다.
바람직한 구현예에서,
R2는 COOH이고, R3는 메틸기이고, R9는 메틸기이고, m은 1 또는 2이거나,
R2는 COOH이고, R3는 메틸기이고, R9는 수소이고, m은 1 또는 2이다.
바람직한 구현예에 따르면, NR9 기는 (CH2)m기와 관련하여 파라 위치에서 페닐 고리 상에 위치한다.
유리하게, 약물 분체는 다음의 분체들로부터 선택된다:
Figure pct00035
Figure pct00036
(화학식 DH의 ) 약물의 제조
약물은 선택적으로 필요할 때 문헌에 기술되거나 당업자에게 잘 숙지되어 있는 임의의 표준 작동법에 의해 보완되는 다음의 합성 반응식들에 기술되거나 본 명세서에서 실험적 부분들의 실시예들에 기술된 일반적인 방법들 사용하여 제조될 수 있다.
Figure pct00037
반응식 1
반응식 1은 약물을 제조하는 데 사용될 수 있는 첫 번째 일반적인 방법을 도시한다. 상기 일반 화학식들에서, R1= H, R2 및 R3는 화학식 Ⅱ을 위해 이전에 정의된 바와 같고, R4는
Figure pct00038
를 나타내고, R4a는 선택적으로 보호된 형태로 이전에 정의된 바와 같은 R4 기이고, G는 보호기이다.
첫 번째 단계는 보호기 G에 의해 그의 아민 기능기 위에 보호된 화합물 (Ⅱ)의 화합물 (Ⅲ)과의 응축으로 구성된다. X는 염소와 같은 이탈기를 나타낼 수 있다. 이러한 경우에 첫 번째 단계는 염산 및 아민 간의 반응으로 구성된다. 이러한 반응은 당업자들에게 잘 숙지된 방법들 및 기법들을 사용하여 시행될 수 있다. 한 가지 상세하게 인정된 방법에서, 두 가지 실체들은 THF, 디클로로메탄, DMF, DMSO와 같은 용매에서 유기 또는 무기 염 예로 Et3N, iPr2NEt, 피리딘, NaH, Cs2CO3, K2CO3의 존재 시 온도 명확하게 -20℃ 및 100℃ 사이 범위에서 반응하도록 유도된다. X는 또한 하이드록실 (OH)일 수도 있다. 이러한 경우에, 첫 번째 단계는 카복실산 (Ⅱ) 및 아민 (Ⅲ) 간의 응축 반응이다. 이러한 반응은 당업자들에게 잘 숙지된 다음의 방법들 및 기법들에 따라 수행될 수 있다. 한 가지 상세하게 인정된 방법에서, 이들 두 가지 실체들은 디클로로메탄 또는 DMF와 같은 극성 비양자성 용매에서 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸-카르보이미드 (EDC), 3-하이드록시-1,2,3-벤조트리아진-4(3H)-온, 디이소프로필에틸아민과 같은 삼차 아민과 같은 커플링 제제의 존재 시 온도 명확하게 -15℃ 및 40℃ 사이 범위에서 반응하도록 유도된다. 또 다른 상세하게 인정된 방법에서, 이들 두 가지 실체들은 디클로로메탄 또는 DMF와 같은 극성 비양자성 용매에서 디에틸 포스포로시아니데이트 (DEPC), 트리에틸아민과 같은 삼차 아민의 존재 시 온도 명확하게 -15℃ 및 40℃ 사이 범위에서 반응하도록 유도된다. 또 다른 상세하게 인정된 방법에서, 이들 두 가지 실체들은 디클로로메탄 또는 DMF와 같은 극성 비양자성 용매에서 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸-우로늄헥사플루오로포스페이트 (HATU), 디이소프로필에틸아민과 같은 삼차 아민의 존재 시 온도 명확하게 -15℃ 및 100℃ 사이 범위에서 반응하도록 유도된다.
당업자들에게 잘 숙지된 기법들을 사용한 중간체의 탈보호 이후에 (≪Protective Groups in Organic Synthesis≫, T. W. Greene, John Wiley & Sons, 2006 및 ≪Protecting Groups≫, P. J. Kocienski, Thieme Verlag, 1994), 화합물 (Ⅳ)은 상기에 기술된 방법들 및 기법들에 이어서 화합물 (Ⅴ)와 응축되고 탈보호 단계 이후에 화합물 (Ⅵ)를 유도할 수 있다. 이러한 화합물은 다음으로 중간체 (Ⅶ)와의 응축 및 선택적 탈보호 이후에 약물의 형성을 유도할 수 있다. 화합물 (Ⅵ)도 역시 R'3가 R3의 전구체, 상세하게 보호기에 의해 보호된 R3 기인 화합물 (Ⅶ')와 결합될 수 있다. R3를 유도하도록 R'3기의 탈보호에 이어지는 결합은 이전에 기술된 바와 동일한 과정들에 따라 수행될 수 있다.
Figure pct00039
반응식 2
반응식 2는 약물 제조하는 데 사용될 수 있는 두 번째 일반적인 방법을 도시한다. 상기 일반 화학식들에서, G는 보호기이고, R1= H, R2, R3 및 R4a는 이전에 정의된 바와 같고, R4b는
Figure pct00040
를 나타낸다.
첫 번째 단계에서, 보호기 G에 의해 그의 아민 기능기 위에 보호된 화합물 (Ⅸ)은 화합물 (Ⅵ)과 응축된다. X는 이탈기 예로 염소를 나타낼 수 있다. 이러한 경우에, 첫 번째 단계는 염산 및 아민 간의 반응으로 구성된다. 이러한 반응은 당업자들에게 잘 숙지된 방법들 및 기법들을 사용하여 수행될 수 있다. 한 가지 상세하게 인정된 방법에서, 두 가지 실체들은 THF, 디클로로메탄, DMF, DMSO와 같은 용매에서 Et3N, iPr2NEt, 피리딘, NaH, Cs2CO3, K2CO3와 같은 유기 또는 무기 염의 존재 시 온도 명확하게 -20℃ 및 100℃ 사이 범위에서 반응하도록 유도된다. X는 또한 하이드록실 (OH)일 수도 있다. 이러한 경우에, 첫 번째 단계는 카복실산 (Ⅸ) 및 아민 (Ⅵ) 간의 응축 반응이다. 이러한 반응은 당업자들에게 잘 숙지된 다음의 방법들 및 기법들에 따라 수행될 수 있다. 한 가지 상세하게 인정된 방법에서, 이들 두 가지 실체들은 디클로로메탄 또는 DMF와 같은 극성 비양자성 용매에서 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸-카르보이미드 (EDC), 3-하이드록시-1,2,3-벤조트리아진-4(3H)-온, 디이소프로필에틸아민과 같은 삼차 아민의 존재 시 온도 명확하게 -15℃ 및 40℃ 사이 범위에서 반응하도록 유도된다. 또 다른 상세하게 인정된 방법에서, 이들 두 가지 실체들은 디클로로메탄 또는 DMF와 같은 극성 비양자성 용매에서 디에틸 포스포로시아니데이트 (DEPC), 트리에틸아민과 같은 삼차 아민의 존재 시 온도 명확하게 -15℃ 및 40℃ 사이 범위에서 반응하도록 유도된다.
당업자들에게 잘 숙지된 기법들을 사용한 중간체의 탈보호 이후에, 획득된 화합물 (Ⅷ)은 R4Y와 반응 이후에 약물을 유도할 수 있다. 이러한 경우에, Y는 Cl, Br, I, OSO2CH3, OSO2CF3 또는 O-토실과 같은 이탈기이다. 반응은 디클로로메탄, THF, DMF, DMSO와 같은 극성 비양자성 용매에서 Et3N, iPr2NEt, 피리딘, NaH, Cs2CO3, K2CO3와 같은 유기 또는 무기 염의 존재 시 온도 명확하게 -20℃ 및 100℃ 사이 범위에서 시행된다. 또 다른 상세하게 인정된 방법에서, 화합물 (Ⅷ)은 화학식 R4b-CHO의 알데하이드와 반응하도록 유도되고, 여기에서 R4b는 R4의 전구체에 해당한다. 이러한 경우에, 반응은 1,2-디클로로에탄, 디클로로메탄, THF, DMF, MeOH와 같은 극성 용매에서 선택적인 티타늄 이소프로폭사이드 (Ⅳ)의 존재 시 아세트산과 같은 산의 첨가에 의해 조절될 수 있는 pH로 NaBH4, NaBH3CN, NaBH(OAc)3와 같은 환원제의 존재 시 온도 명확하게 -20℃ 및 100℃ 사이 범위에서 환원적 아민화이다.
전술한 합성 반응식들에서, 약물은 예를 들면 당업자들에게 잘 숙지된 방법들을 사용하는 비누화와 같은 추가적인 반응 단계 이후에 또 다른 약물을 유도할 수 있고, 여기에서 에스테르 (COOMe)를 나타내는 R2기는 카복실산 (COOH)를 나타내는 R2 기로 전환된다.
산 첨가 염의 상태에서 적어도 하나의 염기 기능을 포함하는 약물을 분리하는 것이 바람직한 경우라면, 이것은 (적어도 하나의 염기 기능을 포함하는) 약물의 자유 염기를 적합한 산으로, 바람직하게는 동등한 정량으로 처리하는 것에 의해 가능하다. 적합한 산은 상세하게 트리플루오로아세트산일 수 있다.
Ⅲ.3 - 링커 (L)
본 발명에서 "링커 (linker)", "링커 유닛 (linker unit)", "L" 또는 "링크 (link)"는 항체를 적어도 하나의 약물과 공유적으로 부착시키는 공유 결합 또는 원자들의 사슬을 포함하는 화학적 분체를 의미한다.
링커들은 N-숙시니미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 숙시니미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트 (SMCC), 이미노티오레인 (IT), 이미도에스테르들의 이중기능적 유도체들 (디메틸 아디피미데이트 HCl와 같음), 활성을 가진 에스테르들 (디숙시니미딜 수베레이트와 같음), 알데하이드들 (글루타르알데하이드와 같음), 비스-아지도 화합물들 (비스 (p-아지도벤조일)헥산디아민과 같음), 비스-디아조니움 유도체들 (비스-(p-디아조니움벤조일)-에틸렌디아민와 같음), 디이소시아네이트들 (톨루엔 2,6-디이소시아네이트와 같음), 및 비-활성을 가진 불소 화합물들 (1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠과 같음)과 같은 다양한 이중기능적 단백질 결합 제제들을 사용하여 만들어질 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 테트라아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 어드레싱 시스템과 세포독성 제제들의 결합을 위한 대표적인 킬레이팅 제제이다. 기타 교차-링커 시약들은 시판되고 있는 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, SVSB (숙시니미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트) (예로, 미국 일리노이주 록포드시, 피어스 바이오테크놀로지사 (Pierce Biotechnology, Inc)로부터 나옴)일 수 있다.
링커는 "절단 불가능" 또는 "절단가능"일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 이것은 세포에서 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"로 구성된다. 예를 들면, 산-불안정 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광불안정 링커, 디메틸 링커 또는 디설파이드-포함 링커가 사용될 수 있다. 링커는, 바람직한 구현예에서, 링커의 절단이 세포내 환경에서 항체로부터 약물을 방출하도록 세포내 조건들 하에서 절단가능하다.
예를 들면, 일정 구현예들에서, 링커는 세포내 환경에 (예로, 리소좀 또는 엔도좀 또는 함몰 소포 (caveolea) 내에) 존재하는 절단화 제제에 의해 절단가능하다. 링커는 예를 들면, 이에 제한되는 것은 아니지만 리소좀 또는 엔도좀 프로테아제를 포함하는 세포내 펩티다제 또는 프로테아제 효소에 의해 절단되는 펩티딜 링커일 수 있다. 전형적으로, 펩티딜 링커는 적어도 2개의 연속적 아미노산들 또는 적어도 3개의 연속적 아미노산들을 포함하거나 적어도 2개 아미노산들 길이 또는 적어도 3개 아미노산들의 길이이다. 절단 제제들은 카텝신 B 및 D 그리고 플라스민을 포함할 수 있고, 이들 모두는 디펩타이드 약물을 가수분해하여 표적 세포들 내부에 활성을 가진 약물의 방출을 유도하는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 암성 조직에서 높게 발현되는 티올-의존성 프로테아제 카텝신-B에 의해 절단가능한 펩티딜 링커가 사용될 수 있다 (예로, Phe-Leu 또는 Gly-Phe-Leu-Gly를 포함하거나 이들인 링커). 상세한 구현예들에서, 세포내 프로테아제에 의해 절단가능한 펩티딜 링커는 Val-Cit 또는 Phe-Lys를 포함하거나 이들이다. 약물의 세포내 단백질분해성 방출을 사용하는 한 가지 장점은 약물이 결합될 때 전형적으로 약화되고 컨쥬게이트들의 혈청 안정성들이 전형적으로 높은 것이다.
다른 구현예들에서, 절단가능한 링커는 pH-민감하고, 예로 소정의 pH 수치들에서 가수분해에 대해 민감하다. 전형적으로, pH-민감성 링커는 산성 조건들 하에서 가수분해가능하다. 예를 들면, 리소좀에서 가수분해가능한 산-불안정 링커 (예로, 하이드라존, 세미카바존, 티오세미카바존, 시스-아콘니틱 아미드, 오소에스테르, 아세탈, 케탈 등)이 사용될 수 있다. 이러한 링커들은 혈액에서의 조건들과 같은 중성의 pH 조건들 하에서 비교적 안정하지만, pH 5.5 또는 5.0 미만인 대략적인 리소좀의 pH에서는 불안정하다. 소정의 구현예들에서, 가수분해가능한 링커는 티오에테르 링커 (예로, 아실하이드라존 결합을 통해 약물과 부착된 티오에테르와 같음)이다.
또한 다른 구현예에서, 링커는 환원화 조건들 하에서 절단가능하다 (예로, 디설파이드 링커). 다양한 디설파이드 링커들이, 예를 들면 SATA (N-숙시니미딜-S-아세틸티오아세테이트), SPDP (N-숙시니미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트), SPDB (N-숙시니미딜-3-(2-피리딜디티오)부틸레이트, SMPT (N-숙시니미딜-옥시카보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-디티오)톨루엔)-, SPDB (N-숙시니미딜-3-(2-피리딜티오)부티레이트) 및 SMPT (N-숙시니미딜-옥시카보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-디티오)톨루엔)을 사용하여 형성될 수 있는 것들을 포함하여 당해 기술분야에 숙지되어 있다.
소정의 바람직한 구현예들에서, 링커 유닛은 다음의 일반 공식을 가질 수 있다:
Figure pct00041
여기에서
T는 스트레처 유닛이고;
a는 0 또는 1이고;
W는 아미노산 유닛이고;
w는 0부터 12까지 범위를 가진 정수이고;
Y는 스페이서 유닛이고;
y는 0, 1 또는 2이다.
스트레처 유닛 (T)은 존재 시 두 번째 IGF-1R 항체 Ab를, 존재 시 아미노산 유닛 (W)과, 또는 존재 시 스페이서 유닛과, 또는 직접적으로 약물과 연결시킨다. 두 번째 IGF-1R 항체 Ab 상에 존재할 수 있는 유용한 기능 기들은 자연적으로 또는 화학적 조작을 통해, 설프하이드릴, 아미노, 하이드록실, 탄수화물의 아노머 하이드록실 기 및 카복실을 포함한다. 적합한 기능기들은 설프하이드릴 및 아미노이다. 설프하이드릴기들은 존재 시 두 번째 IGF-1R 항체 Ab의 분자내 디설파이드 결합들의 환원에 의해 생성될 수 있다. 대안적으로, 설프하이드릴기들은 2-이미노티올레인 또는 다른 설프하이드릴을 생성하는 시약들과 두 번째 IGF-1R 항체 Ab의 라이신 분체의 아미노기의 반응에 의해 생성될 수 있다. 상세한 구현예들에서, 두 번째 IGF-1R 항체 Ab는 하나 이상의 라이신들을 보유하도록 조작된다. 더욱 바람직하게, 두 번째 IGF-1R 항체 Ab는 하나 이상의 시스테인들 (참고로 티오 Mab들)을 보유하도록 조작될 수 있다.
소정의 상세한 구현예들에서, 스트레처 유닛은 두 번째 IGF-1R 항체 Ab의 황 원자와 결합을 형성한다. 황 원자는 환원된 항체의 설프하이드릴 (-SH) 기로부터 유래될 수 있다.
소정의 다른 상세한 구현예들에서, 스트레처 유닛은 항체의 황 원자 및 스트레처 유닛의 황 원자 간의 디설파이드 결합을 통해 두 번째 IGF-1R 항체 Ab와 결합된다.
다른 상세한 구현예들에서, 스트레처 유닛의 반응기는 두 번째 IGF-1R 항체 Ab의 아미노기와 반응할 수 있는 반응성 부위를 포함한다. 아미노기는 아르기닌 또는 라이신의 아미노기일 수 있다. 적합한 아민 반응성 부위들은 이에 제한되는 것은 아니지만, 숙시니마이드 에스테르들, 4-니트로페닐 에스테르들, 펜타플루오로페닐 에스테르들, 무수물들, 산 염화물들, 설포닐 염화물들, 이소시아네이트들 및 이소티오시아네이트들과 같은 활성화된 에스테르들을 포함한다.
또한 또 다른 관점에서, 스트레처의 반응성 기능은 두 번째 IGF-1R 항체 Ab 상에 존재할 수 있는 변형된 탄수화물 기와 반응하는 반응성 부위를 포함한다. 상세한 구현예에서, 두 번째 IGF-1R 항체 Ab는 탄수화물 분체를 제공하도록 효소적으로 글리코실화되거나 자연적으로 글리코실화된다. 탄수화물은 소듐 페리오데이트와 같은 시약으로 온화하게 산화될 수 있고, 결과로 나온 산화된 탄수화물의 카보닐 유닛은 하이드라자이드, 옥심, 반응성 아민, 하이드라진, 티오세미카바자이드, 하이드라진 카복실레이트, 또는 아릴하이드라자이드와 같은 기능성을 포함하는 스트레처와 응축될 수 있다.
상세한 구현예에 따르면, 스트레처 유닛은 다음의 화학식을 가진다:
Figure pct00042
여기에서
L2는 (C4-C10)고리알킬-카보닐, (C2-C6)알킬 또는 (C2-C6)알킬-카보닐 (고리알킬 또는 알킬 분체들은 말레이미드 분체의 질소 원자와 연결됨)이고, 별표는 존재하는 경우라면 아미노산 유닛과, 존재하는 경우라면 스페이서 유닛과, 또는 약물 D와 부착점을 가리키고,
물결선은 두 번째 IGF-1R 항체 Ab와 부착점을 가리킨다.
본 발명에서 "(C4-C10)고리알킬"에 의하여 이에 제한되는 것은 아니지만, 고리펜틸 및 고리헥실 등을 포함하는 4개 내지 10개의 탄소 원자들을 가지는 탄화수소 고리를 의미한다.
L2는 유리하게 다음의 화학식의 펜틸-카보닐과 같은 (C2-C6)알킬-카보닐일 수 있다:
Figure pct00043
여기에서
별표는 존재하는 경우라면 아미노산 유닛과, 존재하는 경우라면 스페이서 유닛과, 또는 약물 D와의 부착점을 표시하고;
물결선은 말레이미드 분체의 질소 원자와의 부착점을 표시한다.
아미노산 유닛 (W)은 존재 시 스트레처 유닛 (T)이 존재하는 경우라면 이와 연결시키거나, 달리 두 번째 IGF-1R 항체 Ab는 스페이서 유닛이 존재하는 경우라면 스페이서 유닛 (Y)과, 또는 스페이서 유닛이 부재하는 경우라면 약물과 연결시킨다.
상기에 언급된 바와 같이 (W)w는 부재하거나 (w = 0), 디펩타이드, 트리펩타이드, 테트라펩타이드, 펜타펩타이드, 헥사펩타이드, 헵타펩타이드, 옥타펩타이드, 노나펩타이드, 데카펩타이드, 운데카펩타이드 또는 도데카펩타이드일 수 있고, 여기에서 펩타이드들을 형성하는 아미노산들은 서로 다를 수 있다.
따라서 (W)w는 다음의 화학식: (W1)w1(W2)w2(W3)w3(W4)w4(W5)w5으로 나타낼 수 있고, 여기에서 W1 내지 W5 각각은 서로 독립적으로 아미노산 유닛을 나타내고 w1 내지 w5 각각은 0 또는 1이다.
일정 구현예들에서, 아미노산 유닛 (W)w은 자연적으로 생기는 것들과 같은 아미노산 잔기들, 뿐만 아니라 시트룰린과 같은 소수의 아미노산들 및 비-자연적으로 생기는 아미노산 유사체들을 포함할 수 있다.
아미노산 유닛 (W)w의 아미노산 잔기들은 이에 제한되는 것은 아니지만, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린, 아세틸 또는 포르밀로 보호되거나 보호되지 않는 라이신, 아르기닌, 토실 또는 니트로 기들로 보호되거나 보호되지 않는 아르기닌,히스티딘, 오르니틴, 아세틸 또는 포르밀로 보호되거나 보호되지 않는 오르니틴 및 시트룰린을 포함한다. 대표적인 아미노산 링커 성분들은 바람직하게 디펩타이드, 트리펩타이드, 테트라펩타이드 또는 펜타펩타이드, 명확하게 디펩타이드 또는 트리펩타이드를 포함한다.
대표적인 디펩타이드들은: Val-Cit, Ala-Val, Lys-Lys, Cit-Cit, Val-Lys, Ala-Phe, Phe-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Phe-N9-토실-Arg, Phe-N9-니트로-Arg을 포함한다.
대표적인 트리펩타이드들은: Val-Ala-Val, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Phe-Phe-Lys, Gly-Gly-Gly, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys을 포함한다.
대표적인 테트라펩타이드는: Gly-Phe-Leu-Gly (서열번호 93), Ala-Leu-Ala-Leu (서열번호 54)을 포함한다.
대표적인 펜타펩타이드는: Pro-Val-Gly-Val-Val (서열번호 95)을 포함한다.
상세한 구현예에 따르면, (W)w는 Val-Cit과 같은 디펩타이드 (예로, w = 2)일 수 있거나, 링커가 아미노산 유닛을 결여한다 (w = 0). 링커가 아미노산 유닛을 결여할 때, 바람직하게 이것은 스페이서 유닛도 역시 결여한다.
상세한 구현예에 따르면, w = 0 (예로, (W)w가 단일 결합) 또는 w = 2 (예로, (W)w가 디펩타이드)이고, 이에 따라 (W)w는
Figure pct00044
로부터 선택되고, 상세하게 Val-Cit이며,
여기에서
별표는 존재하는 경우라면 스페이서 유닛 또는 약물 D와의 부착점을 표시하고;
물결선은 L2와 부착점을 표시한다.
아미노산 링커 성분들은 특정한 효소, 예를 들면 종양-연관된 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의한 효소적 절단에 대한 그들의 선택도 (selectivity)로 설계되고 최적화될 수 있다.
링커의 아미노산 유닛은 이에 제한되는 것은 아니지만, 종양-연관된 프로테아제를 포함하는 효소에 의해 약물을 방출하도록 효소적으로 절단될 수 있다.
아미노산 유닛은 특정한 종양-연관된 프로테아제에 의한 효소적 절단에 대한 선택도로 설계되고 최적화될 수 있다. 적합한 유닛들은 절단이 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민에 의해 촉매화되는 것들이다.
스페이서 유닛 (Y)은 존재 시 아미노산 유닛이 존재하는 경우라면 이와, 또는 스트레처 유닛이 존재하는 경우라면 이와 연결시킨다. 스페이서 유닛들은 2가지 일반적인 유형들을 가진다: 자가-희생 (self-immolative) 및 비자가-희생. 비자가-희생 스페이서는 스페이서 유닛의 일부 또는 전부가 항체-약물 컨쥬게이트로부터 아미노산 유닛의 효소적 절단 이후에 약물과 결합 되어 남는다. 비자가-희생 스페이서 유닛의 예들로는 이에 제한되는 것은 아니지만, (글리신-글리신) 스페이서 유닛 및 글리신 스페이서 유닛을 포함한다. 약물을 방출하기 위하여, 독립적인 가수분해 반응이 글리신-약물 유닛 결합을 절단하도록 표적 세포 내에서 일어나야 한다.
상세한 구현예에서, 비자가-희생 스페이서 유닛 (Y)은 Gly이다.
대안적으로, 자가-희생 스페이서 유닛을 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트는 별도의 가수분해 단계를 필요로 하지 않고도 약물을 방출할 수 있다. 이들 구현예들에서, (Y)는 PAB 기의 질소 원자를 통해 (W)w와 결합되고 카보네이트, 카바메이트 또는 에테르 기를 통해 약물과 직접적으로 연결된 p-아미노벤질 알코올 (PAB)의 잔기이다.
자가-희생 스페이서들의 다른 예들로는 이에 제한되는 것은 아니지만, 2-아미노이미다졸-5-메탄올 유도체들 및 오소 또는 파라-아미노벤질아세탈들의 잔기들과 같은 PAB 기와 전자적으로 동등한 방향족 화합물들을 포함한다. 아미드 결합 가수분해 시 용이한 고리화를 거치는 스페이서들이 치환 및 미치환된 4-아미노부틸산 아미드들, 적당하게 치환된 이중고리[2.2.1] 및 이중고리[2.2.2] 고리 시스템들 및 2-아미노페닐프로피온산 아미드들과 같이 사용될 수 있다.
대안의 구현예에서, 스페이서 유닛은 분지된 비스(하이드록시메틸)스티렌 (BHMS) 유닛이고, 이는 추가적인 약물들을 도입하는 데 사용될 수 있다.
상세한 구현예에서, 스페이서 유닛 (Y)은 PAB가
Figure pct00045
인 PAB-카보닐 (PAB 유닛의 산소는 카보닐과 연결됨)이고, y = 1 또는 링커는 스페이서 유닛을 결여한다 (y = 0).
상세한 구현예에서, 링커는 다음의 화학식 (Ⅲ)을 가진다:
Figure pct00046
(Ⅲ)
여기에서
L2는 (C4-C10)고리알킬-카보닐, (C2-C6)알킬 또는 (C2-C6)알킬-카보닐 (이들 분체들의 카보닐은 존재 시 (W)w과 연결됨)이고,
W는 아미노산 유닛을 나타내고, w는 0 및 5 사이 범위에 포함된 정수를 나타내며,
Y는 PAB가
Figure pct00047
인 PAB 카보닐 (PAB 유닛의 산소는 카보닐과 연결됨)이고 y는 0 또는 1이며 (바람직하게 w가 0일 때 Y는 0이고, w가 1 및 5 사이 범위에 포함될 때 y는 0 또는 1이다),
별표는 약물 D와 부착점을 표시하고,
물결선은 항체 Ab와 부착점을 표시한다.
유리하게, L2는 다음의 화학식의 펜틸-카보닐과 같은 (C2-C6)알킬-카보닐이다:
Figure pct00048
여기에서
별표는 (W)w과의 부착점을 표시하고;
물결선은 말레이미드 분체의 질소 원자와의 부착점을 표시한다.
바람직한 구현예에 따르면, 링커 L은
Figure pct00049
으로부터 선택된다:
여기에서 별표는 약물 D와 부착점을 표시하고, 물결선은 두 번째 IGF-1R 항체 Ab와 부착점을 표시한다.
Ⅲ.4 - 항체-약물 컨쥬게이트 ( ADC )
바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법 또는 조성물에서 사용된 항체-약물 컨쥬게이트는 이에 제한되는 것은 아니지만, (i) 두 번째 IGF-1R 항체 Ab의 핵친화기의 이가 링커와 반응에 이어서 약물의 핵친화기와 반응 또는 (ii) 약물의 핵친화기의 이가 링커 시약과 반응에 이어서 두 번째 IGF-1R 항체 Ab의 핵친화기와 반응과 같은 당업자에게 숙지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.
두 번째 IGF-1R 항체 Ab 상의 핵친화기들은 이에 제한되는 것은 아니지만, N-말단 아민기들, 측쇄 아민기들 (예로, 라이신), 측쇄 티올기들, 및 두 번째 IGF-1R 항체 Ab가 글리코실화될 때 당 하이드록실 또는 아미노기들을 포함한다.
약물 상의 핵친화기들은 이에 제한되는 것은 아니지만, 아민, 티올 및 하이드록실 기들, 바람직하게는 아민기들을 포함한다.
아민, 티올 및 하이드록실 기들은 핵친화적이고 이에 제한되는 것은 아니지만, NHS 에스테르들, HOBt 에스테르들, 할로포르메이트들 및 산 할로겐화물들과 같은 활성 에스테르들; 할로아세타마이드들과 같은 알킬 및 벤질 할로겐화물; 알데하이드들; 케톤들; 카복실; 및 말레이미드 기들을 포함하는 링커 분체들 및 링커 시약들 상의 전자친화성 기들과 공유 결합을 형성하도록 반응할 수 있다. 항체는 환원가능한 사슬간 디설파이드들, 예로 시스테인 연결들을 가질 수 있다. 항체는 DTT (디티오트레이톨)와 같은 환원 시약으로 처리에 의해 링커 시약들과 결합을 위한 반응성을 가지도록 만들어질 수 있다. 각각의 시스테인 연결은 이에 따라 이론적으로 두 개의 반응성 티올 친핵체들을 형성할 것이다. 추가적인 핵친화기들이 당업자에게 숙지된 임의의 반응을 통하여 항체 내로 도입될 수 있다. 비제한적인 예로서, 반응성 티올기들이 하나 이상의 시스테인 잔기들을 도입하여 두 번째 IGF-1R 항체 Ab 내로 도입될 수 있다.
ADC는 전자친화성 분체들을 도입하는 두 번째 IGF-1R 항체 Ab의 변형에 의해 생산될 수 있고, 이는 링커 시약에서 핵친화성 치환기들과 반응할 수 있다. 글리코실화 항체의 당들은 링커 시약들 또는 약물의 아민기와 반응할 수 있는 알데하이드 또는 케톤 기들을 형성하도록 산화될 수 있다. 결과로 얻은 이민 쉬프 염기 그룹들은 안정한 연결을 형성할 수 있거나, 안정한 아민 연결들을 형성하도록 환원될 수 있다. 한 가지 구현예에서, 글리코실화 두 번째 IGF-1R 항체 Ab의 탄수화물 부분의 갈락토스 또는 소듐 메타-페리오데이트 둘 중 하나와 반응은 약물 상의 적당한 기들과 반응할 수 있는 단백질에서 카보닐 (알데하이드 및 케톤) 기들을 수득할 수 있다. 또 다른 구현예에서, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기들을 포함하는 단백질들은 소듐 메타-페리오데이트와 반응할 수 있고, 첫 번째 아미노산 대신에 알데하이드의 생산을 가져온다.
바람직한 구현예에서, ADC는 약물-링커 분체의 제조에 의해 제조되고, 항체의 핵친화기 (예를 들면, 시스테인 분체의 SH기) 및 약물-링커 분체의 핵친화기 (예를 들면, 말레이미드) 간의 커플링이 이어진다.
1. 약물-링커
약물-링커 분체는
- 약물과 링커,
- 링커의 합성을 완성하기 이전에 약물과 링커의 일부,
- 약물의 합성을 완성하기 이전에 약물의 일부 또는 전구체와 링커,
- 링커 및 약물의 합성을 완성하기 이전에 약물의 일부 또는 전구체와 링커의 일부:
의 커플링에 의해 제조될 수 있다.
커플링 반응들은 당업자에게 잘 숙지된 핵친화기 및 전자친화기 간의 반응들이다.
핵친화기는 상세하게 아민, 티올 또는 하이드록실기, 명확하게 아민 또는 하이드록실기일 수 있다. 바람직한 구현예에서 이것은 일차 또는 이차 아민기이다.
전자친화기는 선택적으로 활성화 형태 또는 활성화 카보네이트 에스테르 분체에서 카복실산 기 (COOH)일 수 있다.
카복실산의 "활성화 형태"에 의하여 COOH 기능의 OH 분체는 아미드 결합을 형성하여 화합물 LG-H를 방출하기 위하여 아미노기와 활성화 카복실산 기의 커플링을 가능하게 하는 활성화 이탈기 (LG)로 치환되었던 카복실산을 의미한다. 활성화 형태들은 활성화 에스테르들, 활성화 아미드들, 무수화물들 또는 아실 염화물들과 같은 아실 할로겐화물들일 수 있다. 활성화 에스테르들은 카복실산 기의 N-하이드록시벤조트리아졸 또는 N-하이드록시숙시니미드와 반응에 의해 형성된 유도체들을 포함한다.
"활성화 카보네이트 에스테르"에 의하여 OR이 카바메이트 분체를 형성하고 화합물 ROH를 방출하기 위하여 아미노기와 활성화 카보네이트 에스테르의 커플링을 가능하게 하는 좋은 이탈기를 나타내는 -OC(O)OR 분체를 포함하는 카보네이트 에스테르를 의미한다. 활성화 카보네이트 에스테르의 R기는 이에 제한되는 것은 아니지만, p-니트로-페닐, 펜타플루오로페닐, 2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일 및 벤질 기들, 바람직하게 p-니트로-페닐 및 펜타플루오로페닐 기들을 포함한다.
링커가 다음의 화학식 (Ⅲ)을 가질 때:
Figure pct00050
(Ⅲ)
약물-링커 분체는 다음 화학식 (Ⅳ)를 가지고:
Figure pct00051
(Ⅳ)
약물-링커 분체의 합성의 마지막 단계는 일반적으로 다음 화학식 (Ⅴ)의 화합물 간의 커플링이다:
Figure pct00052
(Ⅴ)
여기에서 L2는 이전에 정의된 바와 같고, LG는 이탈기 명확하게 염소와 같은 할로겐화물 또는 N-하이드록시숙시니미드로부터 유래된 기 및 다음 화학식 (Ⅵ)의 화합물을 나타낸다:
Figure pct00053
(Ⅵ).
y = 1이고 Y = PAB-카보닐일 때, 화학식 (Ⅵ)은 약물 (DH) 및 다음 화학식 (Ⅶ)의 화합물, 바람직하게 그의 보호된 형태 간의 커플링에 의해 제조될 수 있다:
Figure pct00054
(Ⅶ)
여기에서 W 및 w는 이전에 정의된 바와 같고, R은 "활성화 카보네이트 에스테르"의 정의에서 정의된 바와 같고, G는 H 또는 보호기이다.
화합물 (Ⅶ)의 화합물이 보호된 기로 존재할 때, 탈보호의 최종 단계가 필요하다.
y = 0일 때, 화합물 (Ⅵ)은 화학식
Figure pct00055
를 가지고, 여기에서 (W)w 및 바람직하게 D는 아미노산 유닛들로 구성된다. 결론적으로, 화합물 (Ⅵ)은 이러한 경우에 당업자에게 잘 숙지된 통상적인 펩타이드 합성 방법에 의해 제조될 수 있다.
2. Ab-링커-약물
본 발명에 따른 일 구현예는 두 번째 IGF-1R 항체 Ab 상에 존재하는 시스테인 및 바람직하게 약물-링커 분체 상에 존재하는 말레이미드 분체를 가진 약물-링커 분체의 전자친화기 간의 커플링으로 구성된다.
말레이미드-시스테인 커플링은 당업자에게 잘 숙지된 방법들에 의해 수행될 수 있다.
일반적으로, 항체들은 약물 분체와 연결될 수 있는 자유 및 반응성 시스테인 티올 기들을 적게는 있을 수 있더라도, 많이 포함하지 않는다. 항체들에서 대부분의 시스테인 티올 잔기들은 디설파이드 연결들로서 존재하고 디티오트레이톨 (DTT) 또는 TCEP와 같은 환원제로 부분적 또는 전체적 환원화 조건들 하에서 환원되어야 한다. ADC의 부하 (약물/항체 비율)는 (i) 항체와 대비한 약물-링커 중간체 (D-L) 또는 링커 시약의 몰 과다를 제한하는 단계, (ii) 결합 반응 시간 또는 온도를 제한하는 단계, 및 (iii) 시스테인 티올 변형을 위한 부분적 또는 제한된 환원화 조건들:을 포함하는 여러 가지 서로 다른 방식들로 조절될 수 있다.
인간 IgG들의 디설파이드 결합 구조는 현재 잘 확립되어 있다 (Liu and May, mAbs 4 (2012): 17-23에 리뷰됨). 사실상 4가지의 인간 IgG 서브클래스들, 즉 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 디설파이드 결합 구조들에 관하여 많은 유사점들 및 일정 차이점들이 존재한다. 모든 IgG 서브클래스들은 일정 불변하게 12개의 사슬내 디설파이드 연결들을 포함하고, 그들의 중쇄 및 경쇄 간에 형성되는 사슬내 디설파이드 결합들에 차이들이 존재한다. 각각의 사슬내 디설파이드 결합은 개별적 IgG 도메인, 예로 가변 (VL 또는 VH) 및 불변 (CL, CH1, CH2 및 CH3) 도메인들과 연관된다. 2개의 중쇄들은 그들의 힌지 부위에서 다양한 수의 디설파이드 연결들 IgG1 및 IgG4의 경우 2개, IgG2의 경우 4개 및 IgG3의 경우 11개:에 의해 연결된다. IgG1의 중쇄 및 경쇄는 경쇄의 마지막 시스테인 잔기 및 중쇄의 다섯 번째 잔기 간의 디설파이드 결합에 의해 연결되는 한편, 다른 서브클래스들, IgG2, IgG3 및 IgG4의 경우는, VH 및 CH1의 경계면에 위치하는 경쇄의 마지막 시스테인 잔기 및 중쇄의 세 번째 시스테인 잔기 간의 디설파이드 결합에 의해 경쇄가 중쇄와 연결된다. 이들 고전적인 구조들이 아닌 디설파이드 결합 구조들은 IgG2 및 IgG4를 위해 기술되어 왔다 (Liu and May, mAbs 4 (2012): 17-23에 리뷰됨). 사슬간 디설파이드 결합들은 높게 용매에 노출되고, 결론적으로 각각의 도메인 내의 엇갈린 베타-시트 구조들에 묻히고 용매에 노출되지 않는 사슬내 디설파이드 결합들보다 훨씬 더 큰 반응성을 가진다. 이들 이유들로, 항체 이소형에 상관없이, 커플링이 온화한 환원 이후에 노출된 사슬간 시스테인 잔기들 상에서 일어날 것이다. 각각의 사슬간 디설파이드 연결은 따라서 이론적으로는 두 개의 결합 부위들을 형성할 수 있다.
추가적인 핵친화기들이 아민의 티올로의 전환을 가져오는 2-이미노티올란 (트라우드 시약)과 라이신의 반응을 통하여 항체들 내로 도입될 수 있다. 반응성 티올기들도 역시 1개, 2개 3개 또는 4개 이상의 시스테인 잔기들을 조작하여 (예로, 하나 이상의 가공된 시스테인 아미노산 잔기들을 포함하는 돌연변이 항체들을 제조하여) 항체 (또는 그의 단편) 내로 도입될 수 있다. 미국 특허 제 US 7521541호는 반응성 시스테인 아미노산들의 도입에 의해 항체들을 조작하는 것을 제시하고 있다.
시스테인 아미노산들은 항체의 반응성 부위들에서 조작될 수 있고, 이는 사슬간 또는 분자간 디설파이드 연결들을 형성하지 않는다 (Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8): 925-932; Dornan et al (2009) Blood 114(13): 2721-2729; 미국 특허 제 US 7521541호; 제 US 7723485호; 국제특허출원 제 20 09/052249호). 조작된 시스테인 티올들은 시스테인 조작된 항체들 및 약물 분체들과 ADC를 형성하도록 말레이미드 또는 알파-할로 아미드들과 같은 티올-반응성 전자친화기들을 가지는 본 발명의 링커 시약들 또는 약물-링커 시약들과 반응할 수 있다. 약물 분체의 위치는 이에 따라 설계되고, 통제되고, 알려질 수 있다. 약물 부하는 조작된 시스테인 티올 기들이 전형적으로 티올-반응성 링커 시약들 또는 약물-링커 시약들과 높은 수율로 반응하기 때문에 통제될 수 있다. 중쇄 또는 경쇄 상의 단일 부위에서 치환에 의해 시스테인 아미노산을 도입하도록 IgG 항체를 조작하는 것은 대칭적인 항체 상에 두 개의 새로운 시스테인들을 준다. 2 근처의 약물 부하는 결합 산물 ADC의 근접한 균질성으로 달성될 수 있다.
항체의 하나 이상의 핵친화기 또는 전자친화기가 약물-링커 중간체 또는 링커 시약, 이어서 약물 분체 시약과 반응하는 곳에서, 그 다음 결과로 얻은 산물은 항체와 부착된 약물 분체들의 분포, 예로 1, 2, 3 등을 가진 ADC 화합물들의 혼합물이다. 중합체성 역상 (PLRP) 및 소수성 상호작용 (HIC)와 같은 액체 크로마토그래피 방법들이 약물 부하 수치에 의해 혼합물에서 화합물들을 분리할 수 있다. 단일한 약물 부하 수치 (p)로 ADC의 조제물들은 분리될 수 있지만, 이들 단일한 부하 수치 ADC들은 여전히 약물 분체들이 링커를 통해 항체 상의 서로 다른 부위들에서 부착될 수 있기 때문에 균질한 혼합물들일 수 있다.
일정 ADC를 위해, 약물 비율은 항체 상에서 부착 부위들의 수에 의해 제한될 수 있다. 높은 약물 부하는, 예로 약물 비율 > 5, 소정의 ADC의 응집, 불용성, 독성 또는 세포 투과성의 손실을 유발할 수 있다. 전형적으로, 이론적인 최대값보다 적은 약물 분체들이 결합 반응 동안 항체와 결합된다.
약물-항체 비율 (DAR)이라도 역시 약칭되는 약물 부하는 세포 결합 제제 당 PBD 약물들의 평균 수이다.
항체 IgG1 및 IgG4 이소형들의 경우, 약물들이 부분적인 항체 환원 이후에 시스테인들과 결합하는 곳에서, 약물 부하는 항체 당 1개부터 8개까지의 약물 (D)의 범위를 가질 수 있고, 예로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 및 8개의 약물 분체들이 항체와 공유적으로 부착된다.
항체 IgG2 이소형의 경우, 약물들이 부분적인 항체 환원 이후에 시스테인들과 결합하는 곳에서, 약물 부하는 항체 당 1개부터 12개까지의 약물 (D)의 범위를 가질 수 있고, 예로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 및 12개의 약물 분체들이 항체와 공유적으로 부착된다.
ADC의 조성물들은 1개 내지 8개 또는 1개 내지 12개로부터 나온 약물들의 범위로 결합된 세포 결합 제제들, 예로 항체들의 집합들을 포함한다.
결합 반응들로부터 나온 ADC의 조제물들에서 항체 당 약물들의 평균 수는 UV, 역상 HPLC, HIC, 질량 분광분석법, 엘라이자 검정법 및 전기영동법과 같은 통상적인 수단에 의해 특성화될 수 있다.
비제한적인 구현예로서, 본 명세서에서 두 번째 IGF-1R 항체 hz208F2와 결합이 제시된다. 이러한 경우에, 약물은 (i) 서열번호 36, 38 또는 62의 서열의 경쇄의 경우, 214번 위치에서 Cys 잔기, 및 (ii) 서열번호 35, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 또는 61의 서열의 중쇄의 경우, 223, 229 및 232번 위치에서 Cys 잔기들로부터 선택되는 적어도 하나의 시스테인과 커플링된다.
비제한적인 구현예로서, 본 명세서에서 두 번째 IGF-1R 항체 hz208F2와 결합이 제시된다. 이러한 경우에, 약물은 (i) 서열번호 36, 38 또는 62의 서열의 경쇄의 경우, 214번 위치에서 Cys 잔기, 및 (ii) 서열번호 35, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 또는 61의 서열의 중쇄의 경우, 223, 229 및 232번 위치에서 Cys 잔기들로부터 선택되는 두 개, 세 개 또는 네 개의 시스테인들과 커플링된다.
대안은 라이신 커플링으로 구성된다. 항체는 예를 들면 약물-링커 중간체 (D-L) 또는 링커 시약과 반응하지 않는 많은 라이신 잔기들을 포함할 수 있다. 대부분의 반응성 라이신 기들만이 아민-반응성 링커 시약과 반응할 수 있다. 또한, 대부분의 반응성 시스테인 티올기들만이 티올-반응성 링커 시약과 반응할 수 있다.
본 발명의 화합물들이 라이신들과 결합하는 곳에서, 약물 부하는 40개, 20개, 10개 또는 8개의 상부 한계가 바람직할 수 있더라도, 세포 항체 당 1개부터 80개까지의 약물들 (D)의 범위를 가질 수 있다. ADC의 조성물들은 1개부터 80개까지, 1개부터 40개까지, 1개부터 20개까지, 1개부터 10개까지 또는 1개부터 8개까지 범위의 약물들과 결합된 세포 결합 제제들, 예로 항체들의 집합들을 포함한다.
본 발명에 따른 화학식 (I)의 ADC는 약제학적으로 허용가능한 염의 형태로 일 수 있다.
본 발명에서 "약제학적으로 허용가능한"에 의하여 일반적으로 안전하고, 비-독성이고 생물학적이거나 달리 바람직하지 않지 않은 약제학적 조성물의 제조에 사용될 수 있고, 수의학적 사용에 뿐만 아니라 인간 약제학적 사용에 허용가능한 것을 의미한다.
화합물의 "약제학적으로 허용가능한 염"에 의하여 본 명세서에서 정의된 바와 같이 약제학적으로 허용가능하고, 모 화합물의 원하는 약학적 활성을 가지는 염을 의미한다.
약제학적으로 허용가능한 염들은 명확하게
(1) 염산, 브롬산, 인산, 황산 및 유사한 산들과 같은 약제학적으로 허용가능한 무기산들로 형성되거나; 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프로피온산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코브산, 말레산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 스테아르산, 락트산 및 유사한 산들과 같은 약제학적으로 허용가능한 유기산들로 형성된 약제학적으로 허용가능한 산의 첨가 염들; 및
(2) 모 화합물에 존재하는 산 양성자가 금속성 이온 예로 알칼리 금속 이온, 알칼리-토금속 이론 또는 알루미늄 이온로 치환되거나; 라이신 및 아르기닌 등과 같은 약제학적으로 허용가능한 유기 염기; 또는 수산화나트륨, 잿물 및 수산화칼슘 등과 같은 약제학적으로 허용가능한 무기 염기와 조화될 때 형성되는 약제학적으로 허용가능한 염기의 첨가 염들:
을 포함한다.
이들 염들은 염기 또는 산 기능을 포함하는 본 발명의 화합물들 및 해당하는 산들 또는 염기들로부터 통상적인 화학적 방법들을 사용하여 제조될 수 있다.
Ⅳ - 치료
본 발명은 또한 상기에 기술된 바와 같은 화학식 (I) 화합물의 유효량의 이를 필요로 하는 사람에게 투여 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
암들은 바람직하게 그들의 표면에서 단백질 IGF-1R의 전부 또는 일부를 발현하거나 과다-발현하는 종양성 세포들을 포함하는 IGF-1R-발현 암들을 통하여 선택될 수 있다.
보다 상세하게, 상기 암들은 유방암, 결장암, 식도암, 간세포암, 위암, 신경아교종, 폐암, 흑색세포종, 골육종, 난소암, 전립선암, 횡문근육종, 신장암, 갑상샘암, 자궁내막암, 신경집종, 신경모세포종, 구강 편평세포암, 중피종, 평활근육종, 카포시 육종, 급성 백혈병, 결장직장 암종, 췌장관 샘암종 및 임의의 약물 저항성 현상들 또는 암들이다.
본 발명에 따른 방법은 환자에서 암, 상세하세 약물 저항성 또는 난치성 암들을 치료하는 데 유용하다. 일정 구현예들에서, 환자는 화학치료제로의 적어도 한 번의 이전 치료를 실패하였던 난치성 또는 약물-저항성 암을 가진다.
애매함의 회피를 위해, 약물 저항성 또는 난치성 암들에 의하여, 이것은 임의의 저항성 IGF-1R-발현 암들, 예로 처음부터 IGF-1R을 발현하는 저항성 암들뿐만 아니라 처음에는 IGF-1R을 발현하거나 과다발현하지 않지만 일단 그들이 이전의 치료에 저항성을 가지게 되면 IGF-1R을 발현하는 암들을 의미한다.
치료될 수 있는 다른 상세한 유형들의 암들은 이에 제한되는 것은 아니지만, 암종들, 림프종들, 모세포종들, 육종들, 백혈병들, 림프성 악성암들 그리고 기타 암들, 세포 증식성 장애들 및 종양들을 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 명세서에서 기술된 바와 같은 ADC를 포함하는 약제학적 조성물이다.
보다 상세하게, 본 발명은 적어도 부형제 및/또는 약제학적으로 허용가능한 운반체와 함께 본 발명의 ADC를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 상세한 설명에서, 용어 표현 "약제학적으로 허용가능한 운반체" 또는 "부형제"는 이차 반응들을 유발하지 않고, 예를 들면 활성을 가진 화합물(들)의 투여의 용이화, 신체에서 그의 수명에서 및/또는 효능에서 증가, 용액에서 그의 용해도의 증가 또는 이외에도 그의 보존에서 개선을 허용하는, 약제학적 조성물 내로 진입하는 화합물 또는 화합물들의 조합을 가리키도록 의도된다. 이들 약제학적으로 허용가능한 운반체들 및 부형제들은 잘 숙지되어 있고, 선택된 활성을 가진 화합물(들)의 성질의 기능 및 투여의 방식으로서 당업자에게 적응될 것이다.
활성 성분은 통상적인 약제학적 담체들과의 혼합물에서 투여의 단위 형태들로 동물들에게 또는 인간들에게 투여될 수 있다. 적합한 투여의 단위 형태들은 경구적 경로를 통한 형태들 및 비경구적 경로 (피하, 피부내, 근육내 또는 정맥내)를 통한 투여를 위한 형태들을 포함한다.
경구적 투여를 위한 고체 조성물들로서, 정제들, 환들, 분말들 (경질 또는 연질 젤라틴 캡슐들) 또는 과립들이 사용될 수 있다. 이들 조성물들에서, 본 발명의 활성 성분은 아르곤 증기에서 전분, 셀룰로스, 슈크로스, 락토스 또는 실리카와 같은 하나 이상의 불활성 희석제들과 혼합된다. 이들 조성물들은 또한 희석제들가 아닌 물질들, 예를 들면 마그네슘 스테아레이트 또는 탈크, 채색제, 코팅제 (코팅된 정제들) 또는 바니쉬와 같은 하나 이상의 활택제들도 포함한다.
비경구적 투여를 위한 무균의 조성물들은 바람직하게 수용성 또는 비-수용성 용액들, 현탁액들 또는 에멀전들일 수 있다. 용매 또는 운반체로서, 물, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일들 상세하게 올리브유, 주사가능한 유기 에스테르들 예로 에틸 올레이트 또는 기타 적합한 유기 용매들이 사용될 수 있다. 이들 조성물들은 아쥬반트들 상세하게 습윤화, 등장성, 에멀전화, 분산화 및 안정화 제제들도 역시 포함할 수 있다. 무균화는 다수의 방식들로, 예를 들면 여과를 위생화하여, 무균화 제제들을 조성물 내로 도입하여, 방사선 조사에 의해 또는 가열에 의해 수행될 수 있다. 그들은 또한 무균의 물 또는 임의의 다른 주사가능한 무균의 배지에서 사용 시점에 용해될 수 있는 고체 무균의 조성물들의 형태로 제조될 수 있다.
바람직하게, 이들 ADC들은 전신적 경로에 의해, 상세하게는 정맥내 경로에 의해, 근육내, 피부내, 복강내 또는 피하 경로에 의해, 또는 경구적 경로에 의해 투여될 것이다. 더욱 바람직한 방식으로, 본 발명에 따른 ADC들을 포함하는 조성물은 연속적 방식으로 여러 번 투여될 것이다.
따라서 본 발명은 또한 (i) 본 발명에 따른 항체-약물-컨쥬게이트 및/또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물 및 (ii) 상기 항체-약물-컨쥬게이트 및/또는 조성물이 배치되는 주사기, 바이알 또는 앰풀을 적어도 포함하는 키트에 관한 것이다.
그들의 투여의 방식들, 용량들 및 최적의 약제학적 형태들은, 예를 들면 환자의 연령 또는 체중, 그/그녀의 일반 병태의 중증도, 치료에 대한 내성 및 주목된 부작용들과 같은 일반적으로 환자에게 적응된 치료의 확립에서 고려되는 판정기준들에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 다른 특징들 및 장점들은 실시예들 및 하기에 간단한 설명이 주어진 도면들과 함께 상세한 설명과 계속하여 기술된다.
도 1a 및 도 1b는 rhIGF1R 엘라이자에서 첫 번째 IGF-1R 항체들 816C12 (A) 및 810D10 (B)로 획득된 OD 수치들의 그래프 재연을 나타낸 것이다. 데이타 적정화 (fitting) 및 EC50 결정은 프리즘 응용을 사용하여 결정된다.
도 2는 파라핀 포매된 종양 MCF-7의 첫 번째 IGF-1R 항체들 816C12 (A), 첫 번째 IGF-1R 항체들 810D12 (B), G11 항-IGF-1R 항체 (로슈 벤타나사) (C) 또는 AF-305 (R & D 시스템사) 항-IGF-1R 항체 (D)로의 면역조직화학 (IHC) 인식 양상들을 나타낸 것이다.
도 3은 MCF-7 이종이식 모델에서 항-IGF-1R ADC의 생체내 활성을 나타낸 것이다.
도 4는 파라핀 포매된 종양 SBC-5의 첫 번째 IGF-1R 항체들 816C12 (A), 첫 번째 IGF-1R 항체들 810D12 (B), G11 항-IGF-1R 항체 (로슈 벤타나사) (C) 또는 AF-305 (R & D 시스템사) 항-IGF-1R 항체 (D)로의 면역조직화학 (IHC) 인식 양상들을 나타낸 것이다.
도 5는 SBC-5 이종이식 모델에서 항-IGF-1R ADC의 생체내 활성을 나타낸 것이다.
도 6은 FACS 분석들에 의해 인간 미가공 IGF-1R과 항체의 결합을 나타낸 것이다. 도 6a는 MCF-7 세포주에서 역가측정 곡선을 나타낸다. MFI는 형광 강도의 평균을 나타낸다. 도 6b는 MCF-7 세포주에서 마우스 및 키메라 항-IGF-1R 항체들 둘 다의 EC50을 나타낸다. 도 6c는 MCF-7 세포주에서 키메라 항-IGF-1R 항체의 B최대를 나타낸다.
도 7은 형질전환 대비 미형질전환된 세포들을 사용한 hIGF-1R 인식의 평가를 나타낸 것이다. 도 7a는 IGF-1R+ 세포주 상에서 키메라 항-IGF-1R Ab의 역가측정 곡선들을 나타낸다. MFI는 형광 강도의 평균을 나타낸다. 도 7b는 IGF-1R- 세포주에서 키메라 항-IGF-1R Ab들의 결합을 나타낸다.
도 8은 형질전환된 세포들을 사용한 Ab들의 IGF-1R 대비 hIR과 특이성의 평가를 나타낸 것이다. 도 8a는 hIR+ 형질전환된 세포주 상에서 마우스 항-IGF-1R Ab의 결합을 나타낸다. 도 8b는 IR+ 세포주 상에서 키메라 항-IGF-1R Ab의 결합을 나타낸다. MFI는 형광 강도의 평균을 나타낸다. GRO5 항-hIR Mab (캘바이오켐사)가 양성 대조군으로서 도입되었다.
도 9는 IM-9 세포주 상에서 마우스 항-IGF-1R Ab의 결합을 나타낸 것이다. MFI는 형광 강도의 평균을 나타낸다. GRO5 항-hIR Mab는 양성 대조군으로서 도입되었다.
도 10은 원숭이 IGF-1R의 인식의 평가를 나타낸 것이다. 도 10a는 COS-7 세포주 상에서 키메라 항-IGF-1R Ab의 역가측정 곡선들을 나타낸다. MFI는 형광 강도의 평균을 나타낸다. 도 10b는 COS-7 세포주 상에서 마우스 및 키메라 항-IGF-1R 항체들 둘 다의 EC50을 나타낸다. 도 10c는 NIH 3T3 형질전환된 세포들 hIGF1R+ 및 COS-7 세포주들 둘 다에서 키메라 항-IGF-1R 항체들의 EC50을 나타낸다.
도 11은 카복시메틸 덱스트란 기질에 화학적으로 이식된 11,000 RU 이상의 마우스 항-태그 His 항체로 활성화된 CM5 칩을 사용하여 SRP 기술학 기초한 비아코아 ×100으로 획득된 센서그램들을 나타낸 것이다. 실험은 전개 및 시료 희석 완충액으로서 HBS-EP+를 사용하여 25℃에서 30 μL/분의 유속으로 전개되었다. 도면은 분석물들의 첫 번째 주입 시작 시에 X-축 그리고 이러한 첫 번째 주입 직전에 정의된 기저선에 의해 y-축 상에 정렬된 4가지 독립적인 센서그램들의 중복을 보여주었다. 재조합 용해성 IGF-1R의 인간 기초한 서열의 포집으로 획득된 센서그램들은 다이아몬드들로 표시된다. 재조합 용해성 IGF-1R의 머카크 원숭이 기초한 서열의 포집으로 획득된 센서그램들은 삼각형들로 표시된다. 흰색 기호들은 공시료 순환들에 해당하고 (전개 완충액의 5번 주입들), 검은색 기호들은 c208F2의 증가하는 농도들 범위 (5, 10, 20, 40 및 80 nM)의 주입에 해당한다.
도 12는 IGF-1과 비교하여 수용체 인산화에 미치는 항-hIGF-1R 항체들의 본질적인 효과의 평가를 나타낸 것이다.
도 13은 마우스 항-hIGF-1R에 의해 IGF-1과 반응한 IGF-1R 인산화의 저해를 나타낸 것이다.
도 14는 항-IGF-1R 항체들의 세포 표면 신호 강도가 37℃에서 세포 배양 이후에 저하-조절되는 것을 나타낸 것이다. MCF-7 세포들은 4℃ 또는 37℃에서 4시간 동안 10 μg/mL의 Ab들과 배양되었다. 도면은 △MFI를 나타낸다.
도 15는 항체 표면 붕괴를 나타낸 것이다. 세포 표면 결합 항체는 37℃에서 10, 20, 30, 60 및 120분 이후에 평가되었다. 도 10a는 4℃에서 측정된 신호 강도와 비교하여 잔여 IGF-1R %를 나타낸다. 도 10b는 프리즘 소프트웨어를 사용하고 지수적 붕괴 적정을 사용하는 반감기 계산을 나타낸다.
도 16은 항-hIGF-1R Ab들이 내재화되는 것을 나타낸 것이다. 세포들은 10 μg/mL의 마우스 Ab들과 37℃에서 0, 30 또는 60분 동안 배양되었다. 세포들은 투과화되는지 여부와 상관없이 이차 항-마우스 IgG-알렉사 488과 배양되었다. 막은 투과화 없는 신호 강도에 해당한다. 전체는 세포 투과화 이후의 신호 강도에 해당하고, 세포질은 내재화된 Ab에 해당한다. 각각의 평가된 항체의 명칭은 각각의 그래프 꼭대기 위에 도시된다.
도 17a 및 도 17b는 Ab 내재화의 영상화를 나타낸 것이다. 도 17a는 MCF-7 세포들이 m208F2와 4℃에서 20분 동안 배양되었고, 배양 이전에 (W) 37℃에서 15분 (X), 30분 (Y) 및 60분 (Z) 동안 세척되었다. 세포들은 고정되고 투과화되었다. m208F2 Ab는 항-마우스 IgG 알렉사 488를 사용하여 시현되었으며, Lamp-1은 토끼 항-Lamp-1 항체 및 이차 항-토끼 IgG 알렉사 555를 사용하여 시현되었다. 도 17b는 MCF-7 세포들이 각각의 테스트될 나머지 항-hIGF-1R 마우스 항체들과 37℃에서 30분 동안 배양되고 상기에 기술된 바와 같이 염색되었다. 공동정착 (colocalization)은 이미지 J 소프트웨어의 공동정착 하이라이터 플러그-인을 사용하여 확인되었다.
도 18은 항체 분해에서 리소좀 경로의 관여를 나타낸 것이다.
도 19는 산성 pH가 다섯 가지의 마우스 항-IGF-1R 항체들의 결합 능력을 감소시키는 점을 나타낸 것이다.
도 20은 c208F2 Mab의 첫 번째 인간화 형태의 결합 특징을 나타낸 것이다. hz208F2 VH3/VL3 mAb의 결합 성질들은 인간 세포주 MCF-7, 원숭이 세포주 COS-7 및 인간 인슐린 수용체를 발현하는 형질전환된 마우스 세포주에서 평가되었다. 마우스 및 키메라 208F2 mAb들 둘 다의 결합은 동시에 평가되었다. 항-hIR 항체 클론 GRO5가 형질전환된 세포주에서 hIR의 발현을 검증하는 데 사용되었다.
도 21은 hz208F2 VH3/VL3 항체 표면 붕괴를 나타낸 것이다.
도 22는 전개 완충액으로서 HBS-EP+를 30 μL/분의 유속으로 사용하고, 카르복시메틸 덱스트란 기질에 화학적으로 이식된 약 12,000 RU의 마우스 항-태그 His 단일클론 항체로 둘 다의 플로우셀들 상에 활성화된 CM5 칩을 사용하는 SRP 기술학 기초한 비아코아 ×100 장치를 사용하여 온도 25℃에서 획득된 센서그램들의 중복을 나타낸 것이다. 각각의 센서그램들 (첫 번째는 삼각형들로 표시되고 두 번째는 다이아몬드들로 표시됨)은 완전한 순환에 해당한다:
1. 두 번째 플로우셀 상에 재조합 h-IGF-1R (10 μg/mL) 용액의 1분 동안 주입,
2. 첫 번째 센서그램을 위해, 각각 90초 동안 전개 완충액의 5번 주입들,
두 번째 센서그램을 위해, 각각 90초 동안 항-IGF-1R c208F2 항체 용액들의 증가하는 농도들 범위로 5번 주입들,
3. 해리 역학적 속도들의 결정을 위한 300초의 지연,
4. 10 mM 글리신, HCl pH 1.5 완충액의 45초 동안 주입에 의한 표면의 재생.
도 23은 공시료 센서그램 대비 항-IGF-1R c208F2 용액들의 증가하는 농도들 범위로 획득된 센서그램의 차감에 해당하는 센서그램을 나타낸 것이다. 이는 회색으로 표현된다. 이론적인 센서그램은 다음의 변수들을 가진 1 : 1 모델에 해당한다: kon = (1.206 ± 0.036) × 106 M- 1.s-1, koff = (7.81 ± 0.18) × 10-5 s-1, R최대 = 307.6 ± 03. RU는 얇은 검은색 선으로 표현된다. c208F2의 계산된 농도들이 그래프 상에서 보고된다: 최고 농도 (24 nM)만이 상수로서 고려된다.
도 24는 해리 상수들이 각각의 항체의 4번 시험들 진행의 평균에 해당하고, pM 단위로 표현되는 비율: koff/kon x 1012에 해당하는 것을 나타낸 것이다. 오차 막대들은 표준 오차 (n = 4)에 해당한다.
도 25는 반감기들이 각각의 항체의 4번 시험들 진행의 평균에 해당하고, 시간 단위로 표현되는 비율: Ln(2)/koff/3600에 해당하는 점을 나타낸 것이다. 오차 막대들은 표준 오차 (n = 4)에 해당한다.
도 26은 세 가지의 서로 다른 화합물들과 결합된 항-IGF-1R의 세포독성을 나타낸 것이다. 다섯 가지의 키메라 항체들 항-IGF-1R이 E-13, G-13 또는 F-63 중 어느 하나와 결합되었다. 부적절한 항체 c9G4도 역시 동일한 화합물들과 결합되었다.
도 27a 내지 27c는 MCF-7 이종이식 모델에서 c208F2-E-13 (도 27a), c208F2-G-13 (도 27b) 및 c208F2-F-63 (도 27c)의 생체내 평가를 나타낸 것이다.
도 28a 및 28b는 MCF-7 이종이식 모델에서 ADC들 대조군 (c9G4-E13 및 c9G4-G-13)과 비교하여 c208F2-E-13 (도 28a) 및 c208F2-G-13 (도 28b) 둘 다의 생체내 평가를 나타낸 것이다.
도 29a 및 29b는 산성 pH가 인간화 hz208F2 H026/L024 (A) 및 hz208F2 H077/L018 (B)의 결합 능력을 감소시키는 점을 나타낸 것이다.
도 30은 정상 세포들 상에서 c208F2-G-13의 세포 독성의 평가를 나타낸 것이다.
도 31은 G-13과 결합된 hz208F2의 인간화 변형체들의 세포 독성을 나타낸 ㄱ것이다. 부적절한 항체 c9G4도 역시 동일한 화합물과 결합되었다.
도 32는 MCF-7 이종이식 모델에서, 208F2-G-13 대비 c208F2-G-13의 인간화 형태들의 생체내 평가를 나타낸 것이다.
도 33a 및 33b는 MCF-7 이종이식 모델에서 한 번 주사와 비교하여 네 번 주사된 c208F2-G-13 (33a) 또는 hz208F2-4-G-13 (33b) 둘 중 하나의 생체내 평가를 나타낸 것이다.
도 34a 및 34b는 CaOV-3 이종이식 모델에서 c208F2-E-13 (34a) 또는 hz208F2-G-13 (34b) 둘 중 하나의 생체내 평가를 나타낸 것이다.
도 35는 카복시메틸 덱스트란 기질과 화학적으로 결합된 12,000 RU 이상의 항-폴리히스티딘 마우스 단일클론 항체에 의해 활성화된 CM5 칩 상에 포집된 용해성 형태의 h-IGF-1R (30 ug/mL)의 포집에 해당하는 센서그램들을 나타낸 것이다. 이러한 주사 이후에 전개 완충액 (HBS-EP+) (A 및 C) 또는 50 ug/mL 농도로 사용된 Hz208F2-4 (B 및 C) 둘 중 하나의 Ac1으로서 주사가 시행되었다. 이러한 주사 이후에 50 ug/mL 농도로 사용된 Ac2 Hz208F2-4 (A 및 B) 또는 역시 50 ug/mL 농도에서 m810C12 (C 및 D)의 주사가 시행되었다. 실험은 비아코아 ×100 상에 25℃에서 30 μL/분의 유속으로 전개되었다.
도 36은 Ac1 (흰색 막대들)의 부재 시 또는 Ac1 (검은색 막대들)의 존재 시 주사 완료 이후 20초에 Ac2의 결합 수준을 나타낸 것이다.
도 37은 2+ NCI-H2122 이종이식 모델에서 G-13 화합물들과 결합된 208F2 항체의 생체내 활성을 나타낸 것이다.
도 38은 208F2-G-13의 주사 이전에 MCF-7 종양에서 IGF-1R 및 Ki67 염색 수준들을 나타낸 것이다.
도 39는 208F2-G-13의 주사 이전에 MCF-7 종양에서 IGF-1R 및 Ki67 염색 수준들을 나타낸 것이다.
실시예 1: 첫 번째 IGF -1R 항체들의 생성 및 선별
Mab들 816C12 및 810D12는 하기에 기술된 바와 같이 생산되어 선별되었다.
암컷 Balb/C 마우스들이 프런드 아쥬반트와 함께 10 ug의 재조합 인간 IGF-1R 단백질 (R & D 시스템사, 391-GR)로의 피하 주사에 의해 면역접종되었다. 면역접종은 2주 간격들로 3번 반복되었다. 네 번째 주사는 아쥬반트의 존재 시 복강내 주사에 의해 이루어졌다.
3일 경과 이후에, 비장 세포들이 50% PEG와 함께 SP2OAg14 골수종 세포들과 융합되었다. 14일의 HAT 대사적 선별 이후에, 하이브리도마 상청액들이 인간 MCF7 유방암 세포들을 사용하는 FACS에 의해 테스트되었다. MCF7 결합 항체들만이 유지되었다.
관심 있는 항체들이 다음으로 제한 희석법에 의해 클론되었다. 클로닝 이후 8일째, 상청액들이 MCF7 세포들을 사용하는 FACS에 의해 다시 한 번 선별되었다. 3개의 양성 클론들이 각각의 하이브리도마를 위해 유지되었다. 분비된 항체들의 이소형 (isotyping)이 서던 바이오테크놀로지사 (카탈로그 번호 5300-05)로부터 얻은 SBA 클론 이소타입핑 시스템-HRP 키트를 사용하여 결정된다. 마지막으로, 1개의 클론이 증식되고 냉동된다.
또한 816C12 및 810D12 항체의 특성화들이 다음으로 rhIGF-1R 또는 rmIGF-1R 또는 rhIR 엘라이자와 같은 하이브리도마 상청액을 사용하여 수행되었다. 모든 직접 엘라이자들에서, 관심 있는 단백질들이 각각의 웰들 바닥에 고정되었다 (1 ug/ml). 포화 과정 이후에, 하이브리도마 상청액들이 웰들에 첨가되었다. 1시간의 배양 기간 및 세척 단계 이후에, 염소 항-마우스 IgG - HRP 표지된 다중클론 항체의 용액이 TMB 기질의 첨가 이전에 검출에 사용되었다. 반응은 OD를 450 nm 파장에서 분광광도계로 해독하기 이전에 1 M H2SO4 용액으로 정지되었다. 데이타는 다음의 표 7에 제시되어 있다.
Figure pct00056
rhIGF-1R 코팅 상에서 두 번째 IGF-1R 항체들의 용량 반응 곡선들이 816C12를 위해 도 1a 및 810D12를 위해 도 1b에 제시되어 있다. EC50 수치들은 프리즘 응용을 사용하여 결정된다.
데이타는 816C12 항체만이 rh IGF-1R을 0.41 nM의 EC50으로 인식하고, 810D12 항체만이 rh IGF-1R을 0.51 nM의 EC50으로 인식하는 것을 보여주었다. 그들은 둘 다 IGF-1R의 마우스 형태 또는 인간 IR 모두와 결합하지 않는다.
실시예 2: MCF -7 이종이식 모델에서 본 발명의 첫 번째 IGF -1R 항체로 병기 결정 및 IGF-1R 표적화 ADC의 활성의 상관성의 평가
약리학과 종양들의 등급 결정을 상호관련하기 위하여, 종양들이 등급화되었고 (섹션 2.1), 다음으로 MCF-7 이종이식 모델 상에서 생체내 실험들이 내재화되는 것으로 알려진 IGF-1R를 표적하는 두 번째 IGF-1R 항체 분체 및 아우리스타틴으로 구성되는 약물 분체를 포함하는 ADC로 시행되었다 (섹션 2.2).
2.1: MCF-7 이종이식 모델 상에서 IGF-1R 발현의 면역조직화학 검출
MCF-7 이종이식편으로부터 얻은 조직의 절편들이 탈파라핀화되었고, 재수화되었으며, 98℃에서 열-유도된 에피토프 복구를 위해 98℃로 미리 가온된 비등하는 수조에서 표적 복구 완충액 1× (다코사 S1699)에 40분 동안, 다음으로 표적 복구 완충액에 추가 20분 동안 놓아두었다. 트리스 완충 식염수 - 0.05% 트윈 20 (TBS-T) (다코사 S3006)에서 3번 세척들 이후에, 내인성 퍼옥시다제 활성이 퍼옥시다제 차단 시약 (다코사 K4007)을 사용하여 차단되었다. 절편들은 TBS-T로 세척되었고, 816C12 단일클론 항체 (5 ug/mL) 또는 음성 대조군으로서 마우스 IgG1/카파 (5 ug/ml, X0931, 다코사) 둘 중 하나와 상온에서 1시간 동안 배양 이전에 차단 시약 (울트라V 블록-TA-125UB- 랩비전사)과 5분 동안 배양되었다. 절편들은 TBS-T로 세척되었고, 엔비전 (다코사)와 30분 동안 배양되었다. 디아미노벤지딘이 갈색 반응 산물 (다코사 K3468)의 현상에 사용되었다. 슬라이드들은 역염색 (다코사 S3309)하도록 헤마톡실린에 2분 동안 침지되었다.
첫 번째 IGF-1R 항체 816C12 및 810D12는 MCF-7의 세포막을 차별적으로 염색한다. 이러한 IHC 과정에서, 갈색 반응 산물은 세포막의 양성 염색과 상관되고, 갈색 반응 산물의 결여는 세포막의 음성 염색 및 미촬영과 상관된다. 막성 알고리즘을 사용하여, MCF-7 종양 세포들의 염색에 대한 점수 매김은 3+이었다 (816C12의 경우 도 2a 및 810D12의 경우 도 2a). G11 항체 (로슈 벤타나사) 또는 AF-305 (R & D 시스템사) 항-IGF-1R 항체들을 사용하여, 동일한 종양의 절편은 2+로 점수 매겨졌다 (각각 도 2c 및 2d).
2.2: MCF -7 이종이식 모델에서 항- IGF -1R ADC의 생체내 활성
두 번째 IGF-1R 분체를 포함하는 항-IGF-1R ADC는 MCF-7 이종이식 모델에서 생체내 평가되었다.
모든 동물 절차들은 과학적 목적들에 사용되는 동물들의 보호에 관한 2010/63/UE 안내서의 지침들에 따라 수행되었다. 프로토콜은 피에르 파브르 연구소의 동물 윤리 위원회에 의해 승인되었다. 5백만 개의 MCF-7 세포들이 7주령의 스위스-누드 마우스 내에 피하로 주사되었다. 세포 주사 이전에 에스트로겐 펠렛들 (아메리카 이노베아타브 리서치사)이 MCF-7 종양들의 생체내 성장에 필요한 에스트로겐들을 방출하도록 마우스의 좌측 옆구리에 이식되었다.
MCF-7 세포 이식 이후 12일째, 종양들이 120 내지 150 mm3의 평균 크기에 도달했을 때, 동물들은 종양 크기 및 관점에 따라 6마리의 그룹들로 나뉘었다. 항-IGF-1R ADC는 6회의 4일마다 주사 주기 동안 복강내 주사에 의해 접종되었다 (Q4d4). 동물들의 건강 상태가 매일 모니터링되었다. 종양 부피는 연구 종결 시까지 전자 칼리퍼로 매주 2번 측정되었다. 종양 부피는 다음의 공식 π/6 × 길이 × 너비 × 높이:로 계산된다. 독성은 동물들의 무게에 따라 매주 3번 평가되었다. 통계학적 분석들은 맨-위트니 테스트를 사용하여 각각의 측정에서 수행되었다.
항-IGF-1R ADC의 주사는 3+ 등급이 매겨진 종양의 경우에 예상되지만 2+ 등급이 매겨진 종양에서는 그렇지 않은 바와 같이, 종양 성장을 유의하게 억제하였고, 심지어 완전한 종양 성장 퇴행를 유도하였다 (도 3).
실시예 3: SBC -5 이종이식 모델에서 본 발명의 첫 번째 IGF -1R 항체로 병기 결정 및 IGF-1R 표적화 ADC의 활성의 상관성의 평가
약리학과 종양들의 등급 결정을 상호관련시키기 위하여, 종양들이 등급화되었고 (섹션 3.1), 다음으로 SBC-5 이종이식 모델 상에서 생체내 실험들이 IGF-1R 표적화 항체 분체 및 아우리스타틴으로 구성된 약물 분체를 포함하는 ADC로 시행되었다 (섹션 3.2).
3.1: SBC -5 이종이식 모델 상에서 IGF -1R 발현의 면역조직화학 검출
IGF-1R의 수준이 이전 실시예 2의 섹션 2.1에서 기술된 동일한 프로토콜을 사용하여 분석되었다.
IGF-1R이 816C12 및 810D12로 검출될 때, 낮은 수준들이 검출되었다 (1+) (816C12의 경우 도 4a 및 810D12의 경우 도 4b). IGF-1R이 G11 항체 (로슈 벤타나사) 또는 AF-305 (R & D 시스템사) 항-IGF-1R 항체들로 검출될 때, 동일한 종양으로부터 얻은 항-IGF-1R 항체들 절편들은 3+ 점수가 매겨졌다 (각각 도 4c 및 4d).
3.2: SBC-5 이종이식 모델에서 항-IGF-1R ADC의 생체내 활성
항-IGF-1R ADC가 SBC-5 이종이식 모델에서 생체내 평가되었다.
모든 동물 절차들은 과학적 목적들에 사용되는 동물들의 보호에 관한 2010/63/UE 안내서의 지침들에 따라 수행되었다. 프로토콜은 피에르 파브르 연구소의 동물 윤리 위원회에 의해 승인되었다. 5백만 개의 MCF-7 세포들이 7주령의 무흉선 마우스 내에 피하로 주사되었다. MCF-7 세포 이식 이후 12일째, 종양들이 150 mm3의 평균 크기에 도달했을 때, 동물들은 종양 크기 및 관점에 따라 6마리의 그룹들로 나뉘었다. 항-IGF-1R ADC는 6회의 4일마다 주사 주기 동안 복강내 주사에 의해 접종되었다 (Q4d6). 동물들의 건강 상태가 매일 모니터링되었다. 종양 부피는 연구 종결 시까지 전자 칼리퍼로 매주 2번 측정되었다. 종양 부피는 다음의 공식 π/6 × 길이 × 너비 × 높이:로 계산된다. 독성은 동물들의 무게에 따라 매주 3번 평가되었다. 통계학적 분석들은 맨-위트니 테스트를 사용하여 각각의 측정에서 수행되었다.
1+ 등급이 매겨진 종양의 경우에 예상되지만 3+ 등급이 매겨진 종양에서는 그렇지 않은 바와 같이, SBC-5 종양성 세포들의 종양 진행은 두 번째 IGF-1R 항체를 포함하는 항-IGF-1R ADC의 주사에 의해 영향을 받지 않았다 (도 5).
실시예 4: IGF -1R ECD에 대해 상승된 마우스 두 번째 IGF -1R 항체들 Ab의 생산
인간 IGF-1 수용체 (hIGF-1R)의 인간 세포외 도메인 (ECD)에 대한 마우스 단일클론 항체들 (Mab들)을 생산하기 위하여, 5마리의 BALB/c 마우스들이 10 μg의 rhIGF-1R 단백질 (R&D 시스템사, 카탈로그 번호 391-GR)로 3번 피하로 (s.c.) 면역접종되었다. 대안으로서, 10 μg의 IGF-1R의 마우스 세포외 도메인 (ECD) (R&D 시스템사, 카탈로그 번호 6630-GR/Fc)의 3번 추가적인 면역접종들이 일정 동물들 상에서 수행되었다. 첫 번째 면역접종은 완전한 프런드 아주반트 (시그마사, 미국 MD 세인트루이스시)의 존재 시 수행되었다. 불완전한 프런드 아주반트 (시그마사)가 면역접종들 이후에 첨가되었다. 융합 이전 3일째, 면역접종된 마우스들은 복강내로 (i.p.) 10 μg의 rhIGF-1R 단백질 (연구실 산물)로 추가자극되었다. 다음으로, 비장세포들 및 림프세포들이 각각 비장의 관류에 의해 그리고 말단 림프절들의 분쇄에 의해 제조되었고, 5마리의 면역접종된 마우스들 중 1마리로부터 (모든 마우스의 혈청들의 역가 측정 이후에 선택됨) 수확되었으며, SP2/0-Ag14 골수종 세포들 (ATCC사, 미국 MD 록빌시)와 융합되었다. 융합 프로토콜은 코흘러 및 밀스타인 (Kohler and Milstein, Nature, 256: 495-497, 1975)에 의해 기술되어 있다. 다음으로 융합된 세포들은 HAT 선별에 착수된다. 일반적으로, 특히 마우스 기원의 단일클론 항체들 또는 그들의 기능적 단편들의 제조를 위해, 상세하게는 "항체들" 매뉴얼 (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 콜드 스프링 하버 연구소, 콜드 스프링 하버 NY, pp. 726, 1988)에서 기술된 기법들을 참조하는 것이 가능하다. 융합 이후 대략 10일째, 하이브리드 세포들의 콜로니들이 검색되었다. 일차 검색을 위해, 인간 유방 MCF7 종양 세포들 (ATCC) 및 원숭이 IGF-1R을 그들의 세포 표면 상에 발현하는 원숭이 COS7 세포들 (아프리카 녹색 원숭이 간-SV40 형질전환됨)을 사용하여 하이브리도마들의 상청액들이 FACS에 의해 rhIGF-1R ECD 단백질에 대해 증가된 Mab들의 분비를 고려하여 평가되었다. 보다 명확하게, 유동세포측정법에 의한 선별을 위해, 105개 세포들 (MCF7 또는 COS7 둘 중 하나)이 4℃에서 1% BSA 및 0.01% 소듐 아자이드를 포함하는 PBS (FACS 완충액)로 96 웰-플레이트의 각 웰에 도말되었다. 2,000 rpm에서 2분 원심분리 이후에, 완충액이 제거되었고 테스트될 하이브리도마 상청액들이 첨가되었다. 4℃에서 20분의 배양 이후에, 세포들은 2번 세척되었으며, FACS 완충액 (#A11017, 몰레귤라 프로브사, 미국 유진시)으로 1/500 희석된 알렉사 488-결합 염소 항-마우스 항체가 첨가되었고, 4℃에서 20분 동안 배양되었다. FACS 완충액으로 최종 세척 이후에, 세포들은 각각의 튜브에 40 ug/mL의 최종 농도로 프로피디움 요오드의 첨가 이후에 FACS (팩스칼리버, 벡튼-디킨슨사)에 의해 분석되었다. 세포들 단독 및 이차 알렉사 488-결합 항체로 배양된 세포들을 포함하는 웰들이 음성 대조군으로서 포함되었다. 이소형 대조군들이 각각의 실험에 사용되었다 (시그마사, 제품 번호 M90351MG). 적어도 5,000개의 세포들이 형광 강도 (MFI)의 평균 수치를 계산하도록 평가되었다.
추가적으로 내재화 검정법이 내재화 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab만을 선별하기 위하여 수행되었다. 본 검정법을 위해, MCF7 종양 세포주가 페놀 레드 없이 1% L-글루타민 및 10% FACS를 가진 RPMI 1640로 실험 전 3일 동안 배양되었다. 다음으로 세포들은 트립신을 사용하여 탈착되었고, 4 ×105개 세포/mL 농도의 100 uL의 세포 현탁액이 페놀 레드 없이 1% L-글루타민 및 5% FBS를 가진 RPMI 1640으로 96 웰 플레이트에 도말된다. 2,000 rpm에서 2분 원심분리 이후에, 세포들은 50 uL의 하이브리도마 상청액 또는 대조군 항체 용액들 (1 ug/mL에서 양성 및 이소형 대조군) 둘 중 하나로 재현탁되었다. 4℃에서 20분 배양 시간 이후에, 세포들은 2,000 rpm에서 2분 원심분리되었고, 차가운 (4℃) 또는 따뜻한 (37℃) 둘 중 하나의 완전 배양 배지에서 재현탁되었다. 다음으로 세포들은 4℃ 또는 37℃ 둘 중 하나에서 2시간 동안 배양되었다. 다음으로 세포들은 FACS 완충액으로 3번 세척되었다. 알렉사 488-표지된 염소 항-마우스 IgG 항체가 20분 동안 배양되었고 세포들은 프로피디움 요오드 음성 세포 집단에 관한 FACS 분석 이전에 3번 세척되었다.
FACS 분석 이후에, 두 가지 변수들이 결정되었다: (i) 37℃에서 하나의 하이브리도마 상청액과 배양된 세포들로 획득된 형광 신호들과 4℃에서 배양된 세포들의 표면 상에서 검출된 형광 신호와의 차이 및 (ii) 세포 표면 상에 잔여 IGF-1R의 백분율.
잔여 hIGF-1R의 백분율이 다음과 같이 계산되었다:
Figure pct00057
또한 3가지의 엘라이자들이 재조합 인간 (hIGF-1R) 및 마우스 (mIGF-1R) 단백질들 상, 및 재조합 인간 인슐린 수용체 (hIR) 단백질 상에 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab의 결합을 연구하도록 수행되었다. rh- 및/또는 rm-IGF-1R 상의 결합 및 rhIR 상의 미결합을 보여주는 항체를 분비하는 하이브리도마가 보유되었다. 간략하게, 96-웰 엘라이자 플레이트들 (코스타 3690, 코닝사, 미국 뉴욕)이 10 uL/웰의 PBS에 넣은 0.6 ug/mL의 rhIGF-1R 단백질 (R & D 시스템사, 카탈로그 번호 391-GR) 또는 1 ug/mL의 rmIGF-1R 단백질 (R & D 시스템사, 카탈로그 번호 6630-GR/Fc) 또는 1 ug/mL의 rhIR 단백질 (R & D 시스템사, 카탈로그 번호 1544-IR/CF) 중 어느 하나와 4℃에서 밤샘 코팅되었다. 다음으로 플레이트들은 0.5% 젤라틴 (#22151, 세르바 전기영동사, 독일 하이델베르그)을 포함하는 PBS로 37℃에서 2시간 동안 차단되었다. 일단 포화 완충액이 플레이트들을 털어 제거되면, 100 uL의 각 상청액 희석물이 각각의 웰로 첨가되었고 (미희석된 하이브리도마 상청액 또는 상청액의 일련 희석물들) 37℃에서 1시간 동안 배양되었다. 3번 세척들 이후에, 100 uL의 호스래디쉬 퍼옥시다제-결합된 다중클론 염소 항-마우스 IgG (#115-035-164, 잭슨 이뮤노-리서치 연구소사, 미국 PA 웨스트그로브)가 0.1% 젤라틴 및 0.05% 트윈 20 (w:w)을 포함하는 PBS로 1/5,000 희석되어 37℃에서 1시간 동안 첨가되었다. 다음으로 엘라이자 플레이트들이 3번 세척되었으며 TMB (#UP664782, 웁티마사, 프랑스 엥테르침) 기질이 첨가되었다. 상온에서 10분 배양 이후에, 반응은 1 M 황산을 사용하여 정지되었고, 450 nm에서 광학 밀도가 측정된다.
관심 있는 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab를 분비하는 하이브리도마는 증식되었고 제한 희석법에 의해 클론되었다. 일단 이소형이 결정되면, 각각의 암호의 한 가지 클론이 증식되었고 냉동되었다. 관심 있는 각각의 두 번째 IGF-1R 항체 Ab는 추가 특성화를 위해 CellLine (인테그라 바이오사이언스사)이라고 명명된 시험관내 생산 시스템에서 생산되었다.
FACS 분석들에 의한 결합 특이도를 어드레싱하는 추가적인 검정법들이 IM9 세포들 (인간 IR을 발현하는 B 림프세포들)뿐만 아니라 hIGF-1R 형질전환된 세포들 대비 미형질전환 세포들 상에서 수행되었다.
선별된 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab에 해당하는 데이타들 모두는 표 8에 요약되어 있고, 다섯 가지의 선별된 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab이 MCF-7 유방암 세포들 또는 형질전환된 세포들 둘 중 하나에서 발현된 미가공 인간 IGF-1R을 강하게 인식하는 점을 확인하였다. 그들은 COS-7 세포들에서 원숭이 IGF-1R도 역시 인식한다. 이들 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab은 IM9 세포들에서 높게 발현된 인간 인슐린 수용체와는 교차반응하지 않는다. 이들 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab이 엘라이자 플레이트들에 직접적으로 코팅될 때 rhIGF-1R ECD를 희미하게 인식하는 점도 주목되어야 한다.
Figure pct00058
실시예 5: FACS 분석들에 의한 인간 미가공 IGF -1R과의 두 번째 IGF -1R 항체 Ab 결합
다섯 가지의 마우스 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab이 키메라화되었다. 마우스 및 키메라 IGF-1R 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab 둘 다의 결합 성질들이 인간 MCF-7 유방 샘암종 세포주 (ATCC#HTB-22)에서 증가하는 항체 농도들을 사용하여 FACS에 의해 평가되었다. 이러한 목적을 위해, 세포들 (1 × 106개 세포들/mL)이 FACS 완충액 (PBS, 0.1% BSA, 0.01% NaN3)에서 IGF-1R 항체들과 4℃로 20분 동안 배양되었다. 다음으로 3번 세척되었으며, FACS 완충액으로 3번 세척되기 이전에 암소에서 4℃로 추가 20분 동안 적당한 알렉사 488과 결합된 이차 항체와 배양되었다. 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab의 결합은 생존가능한 세포들에서 즉시 수행되었고, 이는 프로피디움 요오드 (죽은 세포들을 염색함)를 사용하여 확인되었다. 각각의 항체로 획득된 신호 강도의 최대값은 B최대로서 설계되었고, 형광 강도의 평균 (MFI)으로 표현된다. 몰 농도 (M)로 표현되는 결합의 EC50는 비선형 회귀 분석 (GraphPad 프리즘 4.0)을 사용하여 계산되었다.
각각의 마우스 또는 키메라 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab의 역가측정 곡선은 생산된 항체들 모두가 전형적인 포화 프로파일로 미가공 IGF-1R 형태를 인식할 수 있는 점을 보여주었다 (도 6a). 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab의 순위를 매기고 마우스 및 키메라 Ab들 둘 다의 결합 성질들을 비교하기 위하여, 각각의 화합물의 결합 EC50가 비선형 회귀 분석을 사용하여 결정되었다. 각각의 마우스 Ab의 EC50의 해당하는 키메라 형태와의 비교는 2가지 형태들이 동일한 결합 성질들을 전시하는 점을 확인하였고, 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab 키메라화가 IGF-1R 인식에 영향을 주지 않았던 점을 보여준다 (도 6b 및 6c). EC50 및 B최대 수치들은 표 9에 요약된다.
Figure pct00059
실시예 3: IGF -1R 또는 IR 형질전환된 세포들 또는 유의한 수준들의 IR을 발현하는 IM9 세포들를 사용한 두 번째 IGF-1R 항체 Ab 특이도의 검증
IGF-1R 대비 IR에 대한 생산된 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab의 특이성을 검증하기 위하여, hIGF-1R 또는 hIR 둘 중 하나를 발현하는 안정한 형질전환체들이 FACS 분석들에 의해 평가되었다. 간략하게, 증가하는 농도들의 키메라 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab이 FACS 완충액 (PBS, 0.1% BSA, 0.01% NaN3)에서 세포들과 4℃로 20분 동안 배양되었다. 다음으로 세포들은 3번 세척되었으며, 암소에서 4℃로 추가 20분 동안 배양되기 이전에 알렉사 488과 결합된 이차 항체와 배양되었고, 다음으로 FACS 완충액으로 3번 세척되었다. 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab의 결합은 생존가능한 세포들에서 즉시 수행되었고, 이는 프로피디움 요오드 (죽은 세포들을 염색함)를 사용하여 확인되었다. 몰 농도 (M)로 표현되는 결합 EC50는 비선형 회귀 분석 (GraphPad 프리즘 4.0)을 사용하여 계산되었다.
hIGF-1R 형질전환된 세포주 (도 7a) 대비 미형질전환된 세포들 (도 7b)에서 획득된 역가 측정 곡선들이 인간 IGF-1R에 대한 키메라 Ab들의 결합 특이도를 검증하였다. EC50 및 B최대 수치들은 표 10에 요약되었다.
Figure pct00060
hIR 상에서 마우스 및 키메라 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab 둘 다의 결합 부재를 확인하기 위하여, 인간 IR (hIR)을 발현하는 안정한 세포주가 사용되었다. 마우스 및 키메라 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab 둘 다에 의한 인간 세포 표면 hIR의 인식은 FACS 분석들에 의해 수행되었다. 증가하는 농도의 마우스 또는 키메라 mAb들 둘 중 하나가 FACS 완충액 (PBS, 0.1% BSA, 0.01% NaN3)에서 hIR+ 형질전환된 세포주와 4℃로 20분 동안 배양되었다. 다음으로 세포들은 3번 세척되었으며, 암소에서 4℃로 추가 20분 동안 배양되기 이전에 알렉사 488과 결합된 이차 항체와 배양되었으며, 다음으로 FACS 완충액으로 3번 세척되었다. 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab의 결합은 생존가능한 세포들에서 즉시 수행되었고, 이는 프로피디움 요오드 (죽은 세포들을 염색함)를 사용하여 확인되었다. 몰 농도 (M)로 표현되는 결합 EC50는 비선형 회귀 분석 (GraphPad 프리즘 4.0)을 사용하여 계산되었다. 시판되는 특이적 IGF-1R 항체, 클론 GR11L 및 항-hIR 항체 클론 GRO5은 양성 대조군으로서 사용되었다. 항-hIR 항체 클론 GRO5가 양성 대조군들로서 사용되었다. 마우스 및 키메라 9G4 항체들은 부적절한 항체로서 도입되었다.
형질전환된 세포들의 세포 표면 위에서 hIR의 높은 수준의 발현은 시판되는 항-hIR 항체 GRO5를 사용하여 검증되었다 (도 8a 및 8b). 심지어 높은 농도들의 마우스 (도 8a) 또는 키메라 (도 8b) 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab를 사용하여도, 결합이 hIR+ 형질전환된 세포들의 표면에서는 전혀 관찰되지 않았다. 이들 결과들은 마우스 또는 키메라 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab 모두가 hIR를 인식하지 않는 점을 보여주었다.
IR 대비 hIGF-1R의 이러한 인식의 특이도가 FACS 분석들에 의해 IM9 세포들, hIR을 발현하는 B-림프종 세포주를 사용하여 역시 관찰되었다 (도 9). 이러한 FACS 분석들을 위해 프로토콜은 상기에 기술된 것과 동일하였고, 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab이 이차 항-인간 Ab의 교차 반응성을 방해하기 위하여 사용되었다 (IM9 세포들은 그들의 세포 표면에 인간 Ig를 발현한다). 도 9에 제시된 결과들은 예상된 신호가 GRO5 항-hIR 항체를 사용하여 관찰되었던 한편 평가된 마우스 두 번째 IGF-1R 항체 Ab는 이러한 세포주에서 임의의 유의한 결합 신호를 전혀 전시하지 않았던 점을 다시 한 번 보여주었다.
실시예 7: FACS 및 비아코아 분석들에 의한 원숭이 미가공 IGF -1R과 두 번째 IGF-1R 항체 Ab 결합
조절성 독성학 연구들을 위한 첫 번째 선결조건 중 하나는 선택된 화합물을 평가하기 위하여 적절한 동물 종을 찾는 것이다. 본 명세서에서 기술된 일련의 항체들이 마우스 IGF-1R을 인식할 수 없기 때문에, 독성학적 평가를 위해 가장 가능한 종은 비인간 영장류 (NHP)이다.
원숭이 IGF-1R 상에서 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab의 결합을 평가하기 위하여, 마우스 및 키메라 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab 둘 다의 결합이 증가하는 항체 농도들을 사용하여 COS-7 세포주 상에서 FACS 분석에 의해 처음 평가되었다. 세포들 (1 × 106개 세포들/mL)이 FACS 완충액 (PBS, 0.1% BSA, 0.01% NaN3)에서 항-IGF-1R 항체들과 4℃로 20분 동안 배양되었다. 다음으로 세포들은 3번 세척되었고, 암소에서 4℃로 추가 20분 동안 배양되기 이전에 알렉사 488과 결합된 이차 항체와 배양되었으며, 최종적으로 FACS 완충액으로 3번 세척되었다. 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab의 결합은 생존가능한 세포들에서 즉시 수행되었고, 이는 프로피디움 요오드 (죽은 세포들을 염색함)를 사용하여 확인되었다. 몰 농도 (M)로 표현되는 결합 EC50는 비선형 회귀 분석 (GraphPad 프리즘 4.0)을 사용하여 계산되었다.
COS-7 원숭이 세포주 상에서 획득된 역가측정 곡선들은 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab 모두가 원숭이 세포주의 표면에서 발현되는 IGF-1R를 특이적으로 인식하는 점을 보여주었다 (도 10a). 각각의 마우스 및 키메라 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab의 EC50 결정은 2가지 형태들이 원숭이 IGF-1R 상에서 그들의 결합 성질들에 관하여 잘 대비되는 점을 보여주었다 (도 10b). 이들 결과들은 생성된 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab 모두가 원숭이 IGF-1R를 인식하는 점을 보여주었다.
COS-7 세포들 대비 형질전환된 IGF-1R 세포들에서 결합 EC50의 비교는 인간 대비 원숭이 IGF-1R에서 키메라 항체 인식의 크기를 확인하기 위하여 수행되었다. 도 10c에 나타난 결과들은 모든 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab에 의해 인간 및 원숭이 IGF-1R들의 유사한 인식을 보여주었다.
또 다른 유형의 원숭이에서 인식을 검증하기 위하여, 세포들은 용해성 원숭이 IGF-1R ECD를 생산하도록 머카크 원숭이의 IGF-1R 형태로 형질전환되었고, 비아코아 실험들이 키메라 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab 중 하나 (c208F2)로 hIGF-1R 또는 머커크 IGF-1R 둘 중 하나와 그의 결합 성질들을 비교하기 위하여 수행되었다.
인식 실험들은 항-태그 His 항체 (His 포집 키트, GE 헬스케어사, 카탈로그 번호 28-9950-56)에 의해 활성화된 CM5 센서칩을 사용하여 비아코아 X 장치 위에서 진행되었다. 11,000 RU 이상의 항체들이 아민 키트 화학을 사용하여 카르복시메틸덱스트란 기질 위에 화학적으로 이식되었다. 실험들은 전개 및 시료 희석 완충액으로서 HBS-EP 완충액 (GE 헬스케어사)을 사용하여 25℃에서 30 uL/분의 유속으로 수행되었다. 단일한 순환 역학적 설계가 머커크 IGF-1R과 비교하여 hIGF-1R 상에서 208F2 두 번째 IGF-1R 항체 Ab (c208F2)의 키메라 형태의 결합의 역학적 변수들을 정의하는 데 사용되었다.
인간 (R & D 시스템스사 카탈로그 번호 305-GR-50) 또는 머커크 원숭이 (사육으로 생산됨) 중 하나의 서열을 기초로 하여, 추가적인 c-말단 10개의 His 태그와 함께 발현되는 2개의 α 사슬들 및 2개의 β 사슬들의 세포외 도메인들로 구성되는 IGF-1R 헤테로-사량체의 용해성 재조합 버전의 용액이 약 160 RU의 항원을 포집하도록 정의된 희석으로 두 번째 플로우셀에 1분 주입되었다. 포집 단계 이후에, 전개 완충액 둘 중 하나가 5번 주입되고 (각각의 주입은 90초), 증가하는 5가지 농도들 범위의 c208F2가 플로우셀 둘 다에 주입되었다 (각각의 주입은 90초). 다섯 번째 주입의 마지막에, 전개 완충액이 해리 속도를 정의하기 위하여 통과되었다.
다음으로 표면이 10 mM 글리신, HCl pH 1.5 완충액의 주입으로 30초 동안 재생되었다.
계산된 신호는 (포집된 IGF-1R을 가진) 플로우셀 2의 반응 및 (포집된 IGF-1R 분자들이 없는) 플로우셀 1의 반응 간의 차이에 해당한다 (도 11).
각각의 IGF-1R 분자 (인간 또는 머카크)의 경우, 증가하는 농도들 범위의 c208F2의 주입들로 인한 신호는 완충액의 5번 주입들로 획득된 신호의 차감에 의해 교정되었다 (이중 기준 참조). 결과로 얻은 센서그램들은 1 : 1 모델로 비아코아 평가 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. 역학적 속도들은 독립적으로 (각각의 IGF-1R 상에서 c208F2 결합의 2가지 역학적 속도들) 또는 공통적으로 (인간 및 머커크 원숭이 IGF-1R 상에서 c208F2 결합의 동일한 역학적 속도들) 평가된다. 적정성은 0.05 RU보다 낮은 Chi2/R최대 비율에 의해 평가되었다.
각각의 IGF-1R에 대해 개별적으로 정의되는 결합의 역학 속도들은 밀접하고 (표 11 참조), 동일한 역학 속도들과 센서그램들 둘 다의 적정성은 좋다.
c208F2 항체는 재조합 인간 및 머커크 IGF-1R들을 약 0.2 nM의 해리 상수 (KD)로 동시에 인식한다. 본 연구에서 정의된 친화도들은 약 160 RU의 포집된 인간 및 머카크 IGF-1R의 수준에 대한 항체들의 기능적 친화도들 (또는 결합도들)에 해당한다.
Figure pct00061
실시예 8: IGF -1R 인산화에 미치는 생산된 두 번째 IGF -1R 항체들 Ab의 본질적인 효과
항체들이 타이로신 키나제 수용체들과 결합할 때 작동제 효과를 유도할 수 있는 점은 잘 알려져 있다. 우리는 이러한 작동제 항체들을 선별하도록 원하지 않기 때문에, hIGF-1R 인산화의 평가가 키메라 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab를 사용하여 연구되었다.
이러한 목적을 위해, MCF-7 세포들이 무혈청 배지로 밤샘 동안 배양되었다. 다음으로 테스트될 IGF-1 (100 nM) 또는 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab가 37℃에서 10분 동안 첨가되었다. 배지가 제거되었고, 세포들은 10 mM 트리스 HCl 완충액 (pH 7.5), 15% NaCl (1 M), 10% 계면활성제 믹스 (10 mM 트리스-HCl, 10% Igepal 용출 완충액) (시그마 케미칼사), 5% 소듐 데옥시콜레이트 (시그마 케미칼사), 1가지 프로테아제 저해제 칵테일 완전 TM 정제 (로슈사), 1% 포스파타제 저해제 칵테일 세트 Ⅱ (캘바이오켐)을 포함하는 용출 완충액 (pH 7.5)으로 4℃에서 90분 동안 긁어주었다. 용출물들은 4℃에서 원심분리에 의해 정화되었고, 100℃에서 5분 동안 가열되었으며 -20℃로 보관하거나 4 내지 12% SDS-PAGE 젤들 상에 직접 로딩되었다. 일차 항체의 배양은 상온에서 2시간 동안 수행되었고 다음으로 HRP-결합된 이차 항체들과 배양이 상온에서 1시간 동안 시행되었다. 막들은 ECL로 단백질들의 영상화 이전에 TBST로 세척되었다. 블럿들은 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 정량되었다. 인산화-단백질 수치들은 GAPDH로 정상화되었다. IGF-1과 반응한 hIGF-1R의 인산화는 100%의 자극으로서 고려되었다. hIGF-1R의 인산화에 미치는 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab의 효과는 IGF-1에 의해 유도되는 인산화 %로서 결정되었다.
도 12에 기술된 결과들은 IGF-1과 비교하여 3번의 독립적인 실험들 +/- S.D.에서 키메라 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab과 반응한 pIGF-1R의 평균 %를 나타낸다. 도시된 바와 같이 MCF-7 세포들이 10 ug의 항-IGF-1R Ab들과 배양되었을 때, hIGF-1R의 유의한 또는 소수의 (< 20%) 인산화는 전혀 검출되지 않았다.
실시예 9: 마우스 두 번째 IGF -1R 항체들 Ab에 의한 IGF -1과 반응한 IGF -1R 인산화의 저해
선별된 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab를 특성화하기 위하여, IGF-1R-유도성 인산화를 저해하는 그들의 능력이 연구되었다. 이러한 목적을 위해, MCF-7 세포들이 무혈청 배지로 밤샘 동안 배양되었다. 다음으로 세포들이 2분 동안 IGF-1의 첨가 이전에 마우스 두 번째 IGF-1R 항체들과 37℃에서 5분 동안 배양되었다. 배지가 제거되었고, 세포들은 10 mM 트리스 HCl 완충액 (pH 7.5), 15% NaCl (1 M), 10% 계면활성제 믹스 (10 mM 트리스-HCl, 10% Igepal 용출 완충액) (시그마 케미칼사), 5% 소듐 데옥시콜레이트 (시그마 케미칼사), 1가지 프로테아제 저해제 칵테일 완전 TM 정제 (로슈사), 1% 포스파타제 저해제 칵테일 세트 Ⅱ (캘바이오켐)을 포함하는 용출 완충액 (pH 7.5)으로 4℃에서 90분 동안 긁어주었다. 용출물들은 4℃에서 원심분리에 의해 정화되었고, 100℃에서 5분 동안 가열되었으며, -20℃로 보관하거나 4 내지 12% SDS-PAGE 젤들 상에 직접 로딩되었다. 일차 항체의 배양은 상온에서 2시간 동안 수행되었고, 다음으로 HRP-결합된 이차 항체들과 배양이 상온에서 1시간 동안 시행되었다. 막들은 ECL로 단백질들의 영상화 이전에 TBST로 세척되었다. 블럿들은 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 정량되었다. 인산화-단백질 수치들은 GAPDH로 정상화되었다. IGF-1과 반응한 hIGF-1R의 인산화는 100%의 자극으로서 고려되었다. hIGF-1R의 인산화에 미치는 항-hIGF-1R Ab들의 효과는 IGF-1에 의해 유도되는 인산화 %로서 결정되었다.
두 번째 IGF-1R 항체들 Ab 모두는 IGF-1과 반응한 hIGF-1R 인산화를 강하게 억제하였다 (감소 > 80%) (도 13). IGF-1-유도성 hIGF-1R 인산화의 최고 저해제들은 m208F2, m212A11 및 m214F8 Mab들이다.
실시예 10: FACS 분석들에 의한 생산된 두 번째 IGF -1R 항체들의 결합 이후에 IGF-1R 내재화의 연구
MCF-7 세포들이 10 ug/mL의 키메라 항체들과 4℃에서 20분 동안 배양되었다. 다음으로 세포들이 세척되었으며 4℃ 또는 37℃에서 4시간 동안 배양되었다. 세포-표면 결합된 항체의 정량은 이차 항체를 사용하여 결정되었다. 4시간 배양 시간 이후에 4℃에서 측정된 MFI 및 37℃에서 측정된 MFI 간의 차이로서 정의된 △MFI는 내재화된 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab의 정량에 해당하였다. △MFI가 도 14 및 표 12에 제시되었다. 10 ug/mL의 Ab의 내재화 백분율이 다음과 같이 100 × (4℃에서 MFI - 37℃에서 MFI)/4℃에서 MFI:로 계산되었고, 표 12에 제시되었다.
Figure pct00062
원숭이 IGF-1R도 역시 인식하였던 두 번째 IGF-1R 항체들이 이러한 수용체를 내재화할 수 있는지 여부를 결정하기 위하여, 동일한 내재화 실험이 수행되었다. 표 13에 요약된 결과들은 테스트된 항체들 모두가 원숭이 IGF-1R 내재화를 매개할 수 있는 점을 보여주었다.
Figure pct00063
세포 표면 결합 항체의 역학도 또한 평가되었다. 이러한 목적을 위해, MCF-7 세포들이 96-웰 플레이트들에 접종되었고, 10 ug/mL의 마우스 항체와 4℃에서 20분 동안 배양되었다. 다음으로 세포들이 미결합된 항체를 제거하도록 배지로 37℃에서 10, 20, 30, 60 또는 120분 동안 세척되었다. 각각의 시간대에서, 세포들이 원심분리되었고, 다음으로 세포 표면에 남아있는 항체의 양을 결정하도록 얼음 위에서 이차 항-마우스 IgG-알렉사 488로 표면 표지되었다. 각각의 마우스 Ab 및 각각의 시간대의 형광 강도는 4℃에서 신호에 의해 정상화되었고 (잔여 IGF-1R %), 반감기 (t1/2)를 결정하도록 지수적 붕괴로 적정화되었다. t1/2는 4℃에서 측정된 신호의 50% 감소를 획득하는 데 필요한 시간으로서 고려되었다. 도 15에 도시된 바와 같이, 마우스 Ab들 모두의 표면 수준은 첫 번째 30분 동안 신속하게 강하하였고 감소는 60분 배양 이후에 거의 최대이었다 (도 15a). 계산된 반감기는 마우스 Ab에 대하여 10 내지 18분 사이 범위에 포함되었다 (도 15b).
세포 표면 신호의 감소가 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab 내재화로 인하고 수용체 박리로 인하지 않았던 점을 확인하기 위하여, 세포들이 마우스 Ab들과 37℃에서 0, 30 및 60분 동안 배양되었다 (도 16). 다음으로 세포 표면 결합 항체 (투과화 없음) 및 항체 세포-표면 결합 + 내재화된 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab (투과화 있음)에 해당하는 전체 항체 신호를 결정하도록 투과화되거나 되지 않았다. 내재화된 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab (세포질)의 정량은 다음과 같이 결정되었다: 투과화 이후 MFI - 투과화 없는 MFI. 이러한 실험은 세포-표면 결합된 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab의 감소가 Ab들이 내재화되는 것을 보여주는 세포질 Ab들의 증가로 인하는 점을 관찰하였다 (도 16). 또한, Ab들의 분해는 투과화 (전체) 이후에 신호의 감소로 표시된 바와 같이 배양 1시간 이후에 시작하였다.
실시예 11: 공초점 분석들에 의한 생산된 두 번째 IGF -1R 항체들의 결합 이후에 IGF-1R 내재화의 연구
두 번째 IGF-1R 항체들 Ab 내재화를 더 검증하기 위하여, 공초점 현미경 분석법이 세포의 이동 (trafficking) 이후에 항체들의 세포하 분포를 평가하도록 시행되었다. 세포들은 항-hIGF-1R Ab들과 37℃에서 배양되었고, 고정되었으며, 투과화되었다. 따라서, 세포들이 이차 항체 알렉사-488를 사용하여 염색되었고, 이차 항-토끼 IgG 알렉사 555를 사용하여 토끼 항-Lamp-1 항체가 시현되었다. 37℃에서 배양 이전에, 마우스 208F2 Ab가 MCF-7 세포들의 막 위에 정착되었고 (도 17a), 리소좀 마커 lamp-1과 공동정착은 이미지 J 소프트웨어의 공동정착 하이라이터 플러그-인을 사용하여 확인되었다. 세포 표면 결합 항체는 37℃에서 15분 배양 이후에 극적으로 감소되었다. 세포 표면 결합 항체의 감소와 동시적으로, 세포내 항체가 소포들 내에서 검출되었다. lamp-1과의 공동정착은 거의 관찰될 수 없었다. 30분 배양 이후에, 세포 표면 결합 항체는 검출되지 않았다. 그러나, 리소좀 내에서 Ab의 공동정착이 증가되었다. 1시간 배양 이후에, 세포내 Ab 염색은 lamp-1과의 공동정착의 수와 마찬가지로 감소되었다. 이러한 세포 표면 결합 항체 및 그의 세포내 축적의 역학은 FACS에 의해 측정된 항체 표면 붕괴의 역학과 상관되었다. 또한, 이미 FACS 연구들로 기술된 바와 같이 공초점 현미경 분석법에 의해 마우스 Ab들의 분해가 1시간 배양 이후에 시작하였다.
나머지 hIGF-1R 마우스 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab 모두의 내재화 및 그들의 Lamp-1와 공동정착도 역시 평가되었다 (도 17b). 37℃에서 30분의 배양 이후에, 세포내 항체가 검출되었고 lamp-1과의 공동정착이 관찰되었으며 모든 선별된 항-IGF-1R 항체들이 리소좀들 내로 효과적으로 내재화되는 점을 가리킨다.
실시예 12: 리소좀 저해제, 바필로마이신 A1을 사용한 두 번째 IGF -1R 항체들 Ab들 분해의 저해
두 번째 IGF-1R 항체들 Ab이 리소좀에 도달하고 분해되는 것을 검증하기 위하여, 세포들은 리소좀 기능들의 강력한 저해제인 바필로마이신 A1으로 처리되거나 처리되지 않았다. 다음으로 세포들은 4℃에서 10 ug/mL의 테스트될 Ab와 배양되었고, 세척되었으며, 37℃에서 2시간 동안 배양되었다. 내재화된 Ab가 세포 투과화 이후에 이차 항-마우스 IgG-알렉사 488 Ab를 사용하여 검출되었다. 바필로마이신 A1의 첨가는 세포내 Ab의 분해를 방해하였고 (도 18), 이는 Ab들이 효과적으로 내재화되고 리소좀들 내에서 분해되었던 점을 가리킨다.
실시예 13: 두 번째 IGF -1R 항체 Ab - IGF -1R 결합에 미치는 pH의 효과
두 번째 IGF-1R 항체들 Ab이 그들의 내재화 잠재력을 기초로 하여 선별되고 상기에서 리소좀 구획 내로 진입하기 이전에 초기 엔도좀들과 공동정착하는 것으로 관찰되었기 때문에, 흥미로운 접근법은 Ab-hIGF-1R 결합의 안정성이 pH 환경을 고려하여 조정되는 항체들, 바람직하게는 pH 환경이 산성이 될 때 바람직하게 IGF-1R로부터 해리되는 항체들을 선별하는 단계로 구성되었다. 이에 따라, 초기 엔도좀들 및 리소좀들 간의 일차적인 차이점은 그들의 내부 pH이다: 엔도좀 구획에서 pH는 대략 6인 반면 리소좀 구획에서 pH는 약 4.5이다.
일단 리간드 결합 (IGF-1) 이후에 내재화되면, hIGF-1R은 재생화 경로를 통해 세포 표면으로 다시 돌아간다.
이론으로 결부되지 않더라도, 본 명세서에서 기술된 가설은 산성 pH에서 그들의 표적으로부터 초기에 더욱 방출되는 경향이 있는 항체들이 아마도 막으로 표적 재생을 선호할 것이고 결론적으로 ADC 접근법들을 위한 더 나은 후보들로서 고려될 수 있는 점이다.
생산된 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab의 일부가 이러한 성질을 제시하는지 여부를 조사하고 이러한 성질을 세포독성 활성과 상관시키기 위하여, MCF-7 세포주 상에서 마우스 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab의 결합이 서로 다른 pH의 완충액들에서 시행되었다. 마우스 mAb들의 증가하는 농도들이 MCF-7 세포주 상에서 pH 5부터 8까지의 범위를 가지는 서로 다른 pH로 4℃에서 20분 동안 배양되었다. 다음으로 세포들은 3번 세척되었으며, FACS 완충액에서 알렉사 488과 결합된 적당한 이차 항체와 배양되었다. 세포들은 암소에서 4℃로 추가 20분 동안 배양되었고, 다음으로 FACS 완충액으로 3번 세척되었다. 항-hIGF-1R 항체들의 결합은 생존가능한 세포들에서 즉시 수행되었고, 이는 죽은 세포들을 염색하는 프로피디움 요오드를 사용하여 확인되었다. 몰 농도 (M)로 표현되는 결합 EC50는 비선형 회귀 분석법 (GraphPad 프리즘 4.0)을 사용하여 계산되었다. 선별된 마우스 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab 모두는 도 19에 도시된 바와 같이 산성 pH에서 더 낮은 결합 능력을 보여주었다.
MCF-7 세포주 상에서 인간화 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab의 결합이 서로 다른 pH의 완충액들에서 시행되었다. 인간화 mAb들의 증가하는 농도들이 MCF-7 세포주 상에서 pH 5부터 8까지의 범위를 가지는 서로 다른 pH로 4℃에서 20분 동안 배양되었다. 다음으로 세포들은 3번 세척되었으며, FACS 완충액에서 알렉사 488과 결합된 적당한 이차 항체와 배양되었다. 세포들은 암소에서 4℃로 추가 20분 동안 배양되었고, 다음으로 FACS 완충액으로 3번 세척되었다. 인간화 두 번째 IGF-1R 항체들 Ab의 결합은 생존가능한 세포들에서 즉시 수행되었고, 이는 죽은 세포들을 염색하는 프로피디움 요오드를 사용하여 확인되었다. 몰 농도 (M)로 표현되는 결합 EC50는 비선형 회귀 분석법 (GraphPad 프리즘 4.0)을 사용하여 계산되었다. 인간화 두 번째 IGF-1R 항체들은 도 19에 도시된 바와 같이 산성 pH에서 더 낮은 결합 능력을 보여주었다.
실시예 14: 208F2 Mab의 인간화 형태의 평가
14.1 인간화 형태 hz208F2 H026/L024 (때로 VH3/VL2 또는 변형체 3라고도 역시 약칭됨)의 결합 및 내재화의 평가
첫 번째 인간화 형태 c208F2 mAb의 결합이 MCF-7, COS-7 및 NIH 3T3 IR+ 세포주들에서 평가되었다. m208F2, c208F2 또는 hz208F2 VH3VL3의 증가하는 농도들이 각각의 세포주 상에 4℃로 20분 동안 첨가되었다. 다음으로 세포들이 세척되었으며 테스트된 Ab의 결합이 해당하는 이하 항체를 사용하여 시현되었다. 형질전환된 세포주 상의 인간 IR의 발현을 검증하기 위하여, 시판되는 항-hIR 항체 클론 GRO5가 사용되었고 그의 인식 프로파일이 예시되었다 (도 20d).
MCF-7 (도 20a) 및 원숭이 COS-7 (도 20b) 세포들에서 인간화 형태의 마우스 또는 키메라 둘 중 하나의 형태와 비교는 3가지 테스트된 형태들의 밀접한 프로파일들을 보여주었다. 인간화 공정은 인간 인슐린 수용체 상의 교차 반응성의 부재를 고려하여 마우스 및 키메라 형태들과 완벽하게 비슷한 항체의 인식 특이도를 변형하지 않았다 (도 20c).
인간 세포주 MCF-7 및 원숭이 세포주 COS-7에서 208F2의 첫 번째 인간화 형태의 계산된 EC50은 mAb 208F2의 마우스 또는 키메라 형태 둘 중 하나로 결정된 것과 유사하였다.
mAb hz208F2 H026/L024의 내재화되는 능력은 유동세포측정법에 의해 평가되었다. MCF-7 세포들이 10 ug/mL의 항체들과 4℃에서 20분 동안 배양되었다. 다음으로 세포들이 세척되었으며 4℃ 또는 37℃에서 4시간 동안 배양되었다. 세포-표면 결합된 항체의 정량은 이차 항체를 사용하여 결정되었다. 4시간 배양 시간 이후에 4℃에서 측정된 MFI 및 37℃에서 측정된 MFI 간의 차이로서 정의된 △MFI는 내재화된 Ab의 정량에 해당하였다. △MFI는 도 21 및 표 14a에 제시되었다. 10 ug/mL의 Ab의 내재화 백분율이 다음과 같이 100 × (4℃에서 MFI - 37℃에서 MFI)/4℃에서 MFI:로 계산되었고, 표 14a에 제시되었다. 따라서, 인간화 hz208F2 H026/L024 (다음의 표에서 VH3/VL3 또는 변형체 3라고 약칭됨)는 해당하는 마우스 및 키메라 208F2 항체들로 측정된 것과 유사한 결합 및 내재화 성질들을 가지고 있었다.
Figure pct00064
14.2 후속 hz208F2 인간화 형태들의 결합의 평가
두 번째 IGF-1R 항체 208F2가 인간화되었고, 16개의 인간화 변형체들 (12. 1에 기술된 첫 번째 형태를 포함함)의 결합 성질들이 평가되었다. 인간화 변형체들의 결합 성질들은 인간 MCF-7 유방 샘암종 세포주 및 원숭이 세포주 Cos-7 상에서 증가하는 항체 농도들을 사용하는 FACS 분석법들에 의해 평가되었다. 해당 목적을 위해, 세포들 (1 × 106개 세포들/mL)이 FACS 완충액 (PBS, 0.1% BSA, 0.01% NaN3)에서 항-IGF-1R 항체들과 4℃에서 20분 동안 배양되었다. 다음으로 세포들은 3번 세척되었으며, 알렉사 488과 결합된 적당한 이차 항체와 암소에서 4℃로 추가 20분 동안 배양되었고, 이후 FACS 완충액으로 3번 세척되었다. 항-IGF-1R 항체들의 결합은 생존가능한 세포들에서 즉시 수행되었고, 이는 (죽은 세포들을 염색하는) 프로피디움 요오드를 사용하여 확인되었다. 몰 농도 (M)로 표현되는 결합 EC50는 비선형 회귀 분석법 (GraphPad 프리즘 4.0)을 사용하여 계산되었다.
인간화 변형체들의 EC50은 모든 인간화 변형체들이 인간 및 원숭이 세포주들 둘 다 상에서 동등한 결합 성질들을 나타낸 점을 보여주었다.
인간화 항체들의 EC50은 표 14b에 요약되어 있다.
Figure pct00065
14.3 또 다른 hz208F2 인간화 형태의 내재화의 평가
MCF-7 세포들이 10 ug/mL의 인간화 항체들과 4℃에서 20분 동안 배양되었다. 다음으로 세포들이 세척되었으며, 4℃ 또는 37℃에서 4시간 동안 배양되었다. 세포-표면 결합된 항체의 정량은 팩스칼리버 유동 세포측정기 (벡튼 디킨슨사) 상에서 이차 항체를 사용하여 결정되었다. 4시간 배양 시간 이후에 4℃에서 측정된 MFI 및 37℃에서 측정된 MFI 간의 차이로서 정의된 △MFI는 내재화된 Ab의 정량에 해당하였다. △MFI가 도 14c에 제시되었다. 10 ug/mL의 Ab의 내재화 백분율이 다음과 같이 100 × (4℃에서 MFI - 37℃에서 MFI)/4℃에서 MFI:로 계산되었다. 인간화 두번째 IGF-1R 항체 hz208F2 H077/L018은 IGF-1R의 유의한 내재화를 유도할 수 있다.
Figure pct00066
실시예 15: 용해성 재조합 인간 IGF -1R 상에서 5가지 키메라 항- IGF -1R 항체들 ( c208F2 , c213B10 , c212A11 , c214F8 및 c219D6 ) 및 208F2 항체의 인간화 버전 (H026/L024)의 결합의 해리 상수 (K p )의 정의
재조합 용해성 인간 IGF-1R에서 항체들의 결합의 해리 상수 (Kp)는 해리 속도 (koff) 및 결합 속도 (kon) 간의 비율에 의해 정의되었다. 역학적 실험들은 마우스 항-태그 His 단일클론 항체에 의해 활성화된 CM5 센서칩을 사용하여 비아코아 X100 장치 상에서 진행되었다. 약 12,000 RU의 항체들이 아민 키트 화학을 사용하여 카르복시메틸덱스트란 기질 위에 화학적으로 이식되었다.
실험들은 전개 및 시료 희석 완충액으로서 HBS-EP+ 완충액 (GE 헬스케어사)을 사용하여 25℃에서 30 uL/분의 유속으로 수행되었다.
단일한 순환 역학적 설계가 그의 두 개 C-말단 10개 히스티딘-태그에 의해 포집된 용해성 재조합 인간 IGF-1R 상에서 항-IGF-1R 항체들의 결합의 역학적 변수들을 정의하는 데 사용되었다.
1. 인간 hIGF-1R 헤테로-사량체의 용해성 재조합 버전의 용액: 추가적인 C-말단 10개의 His 태그와 함께 발현되는 2개의 α 사슬들 및 2개의 β 사슬들의 세포외 도메인들 (R & D 시스템사 카탈로그 번호 305-GR-50)이 10 ug/mL의 농도로 두 번째 플로우셀 상에 1분 동안 주입되었다. 평균 587 RU (24 RU의 표준 오차를 가짐)의 용해성 수용체가 본 연구를 위해 실현된 24회 주기들 각각에서 포집되었다.
2. 포집 단계 이후에, 전개 완충액이 플로우셀들 둘 다에 5번 (각각의 주입 90초) 또는 6가지 항체들 중 하나의 5가지 증가하는 농도 범위들로 주입되었다 (각각의 주입 90초). 다섯 번째 주입의 마지막에, 전개 완충액이 해리 속도를 정의하기 위하여 5분 동안 통과되었다.
3. 다음으로 표면은 10 mM 글리신, HCl pH 1.5 완충액의 주입으로 45초 동안 재생되었다.
계산된 신호는 (포집된 IGF-1R을 가진) 플로우셀 2의 반응 및 (포집된 IGF-1R 분자들이 없는) 플로우셀 1의 반응 간의 차이에 해당한다.
각각의 IGF-1R의 경우, 증가하는 농도들 범위의 항체의 주입들로 인한 신호는 완충액의 5번 주입들로 획득된 신호의 차감에 의해 교정되었다 (이중 기준 참조). 도 22 참조.
결과로 얻은 센서그램들은 1 : 1 모델로 비아코아 평가 소프트웨어를 사용하여 분석되었다.
네 번의 경험들이 두 가지 서로 다른 농도들의 범위들을 사용하여 각각의 항체를 위해 전개되었다: 각각의 두 번째 IGF-1R 항체를 위해 두 번의 첫 번째 실험들의 경우 40, 20, 10, 5 및 2.5 nM 그리고 두 번의 나중 실험들 전개의 경우 24, 12, 6, 3 및 1.5 nM.
본 실험에서는 테스트된 6가지 항체들을 위해, 실험적 데이타는 더 높은 농도가 상수로서 정의되고 나머지 다섯 농도들이 계산될 때 유의한 koff 수치들로 1 : 1 모델과 잘 맞추어졌다 (도 23 참조).
비율 koff/kon로서 계산된 해리 상수들 (Kp) 및 비율 Ln(2)/koff로서 계산된 복합체들의 반감기는 도 24 및 25에 나타내었다. 그들은 각각의 두 번째 IGF-1R 항체들을 위한 독립적인 실험들 진행의 평균에 해당한다. 오차 막대들은 수치들의 표준 오차들 (n = 4)에 해당한다.
해리 상수들은 10 내지 100 pM의 범위이다. c208F2 항체는 h-IGF-1R에 대한 약한 친화도를 제시하고 (KD 약 75 pM), 그의 인간화 버전은 적어도 키메라 버전만큼 좋다 (KD 약 60 pM). 4가지의 나머지 항-IGF-1R 키메라 항체들은 hIGF1-R를 위한 매우 유사한 친화도를 제시한다 (약 30 pM의 KD). 친화도들의 차이는 기본적으로 복합체들의 해리 속도 또는 결과로 나온 반감기와 연관되어 있다. 208F2를 사용하여 복합체의 반감기는 두 번째 IGF-1R 키메라 및 인간화 버전들로 2 및 3시간 사이 범위이다. 4가지의 나머지 두 번째 IGF-1R 키메라 항체들의 경우는 평균 반감기들이 7.0 및 9.4시간 사이 범위이다.
이들 매우 느린 해리 역학은 항체들의 Fab 구조들 둘 다 내지 2개 인접한 h-IGF-1R 분자들에 의해 동시적으로 결합할 수 있는 항체들의 이가 구조와 분명하게 연관된다. 이러한 경우에 포집된 h-IGF-1R 분자들의 수준은 해리 속도에 미치는 영향을 가질 수 있다. 본 연구에서 정의된 친화도들은 포집된 h-IGF-1R의 수준 약 600 RU을 위한 기능적 친화도들 (또는 결합도들)에 해당한다. KD의 3배 차이가 상기에 나타낸 데이타 간에 관찰되었고 (표 11), 실시예 13에 제시된 수치들은 포집된 hIGF-1R의 수준의 변화와 연관된다 (실시예 7에서 600 RU 대비 160 RU).
실시예 16: 본 발명의 약물들의 합성
다음의 약어들이 다음의 실시예들에서 사용된다:
aq. 수용성
ee 광학이성질체 초과
equiv 당량
ESI 전자스프레이 이온화
LC/MS 질량 분광분석법과 결합된 액체 크로마토그래피
HLPC 고성능 액체 크로마토그래피
NMR 핵자기 공명
sat. 포화
UV 자외선
기준 화합물 1
(S)-2-((S)-2-((3-아미노프로필)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N-((3R,4S,5S)-3-메톡시-1-((S)-2-((1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-(((S)-2-페닐-1-(티아졸-2-일)에틸)아미노)프로필)피롤리딘-1-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸부탄아미드, 비스 트리플루오로아세트산
Figure pct00067
화합물 1A: (4R, 5S)-4-메틸-5-페닐-3-프로파노일-1,3-옥사졸리딘-2-온
Figure pct00068
(4R, 5S)-4-메틸-5-페닐-1,3-옥사졸리딘-2-온 (5.8 g, 32.7 mmol, 1.00 당량)이 불활성 대기에서 테트라하이드로퓨란 (THF, 120 mL)에 용해되었다. 혼합물은 -78℃로 냉각되었고 n-부틸리튬 (14.4 mL)이 한 방울씩 첨가되었다. -78℃에서 30분 동안의 교반 이후에, 염화 프로판 (5.7 mL)이 첨가되었다. 교반이 -78℃에서 30분 동안 다음으로 상온에서 밤샘 동안 계속되었다. 반응 혼합물은 농축된 다음 200 mL의 물에 재용해되었다. 용액의 pH는 소듐 바이카보네이트 포화된 수용성 용액으로 7로 조정되었다. 이러한 수용성 상은 100 mL의 에틸 아세테이트 (EtOAc)로 3번 추출되었다. 유기상은 조합되었고, 소듐 설페이트 위에서 건조되고, 여과되었으며, 노란생 오일의 형태로 6.8 g (89%)의 화합물 1A를 수득하도록 농축되었다.
화합물 1B: 터르 -부틸 (2S)-2-[(1R,2R)-1-하이드록시-2-메틸-3-[(4R,5S)-4-메틸-2-옥소-5-페닐-1,3-옥사졸리딘-3-일]-3-옥소프로필]피롤리딘-1-카복실레이트
Figure pct00069
화합물 1A (17.6 g, 75.45 mmol, 1.00 당량)은 불활성 대기에서 디클로로메탄 (DCM, 286 mL)에 용해되었다. 이러한 용액은 얼음 수조로 냉각되었다. 트리에틸아민 (TEA, 12.1 mL, 1.15 당량) 및 Bu2BOTf (78.3 mL, 1.04 당량)가 반응 혼합물의 온도를 2℃ 미만으로 유지하면서 한 방울씩 첨가되었다. 교반이 0℃에서 45분 동안 계속되었고, 이후에 반응은 -78℃로 냉각되었다. DCM (42 mL)에 넣은 터르 -부틸 (2S)-2-포르밀피롤리딘-1- 카복실레이트 (8.5 g, 42.66 mmol, 0.57 당량)의 용액이 한 방울씩 첨가되었다. 교반은 -78℃에서 2시간 동안, 다음으로 0℃에서 1시간 동안, 마지막으로 상온에서 1시간 동안 계속되었다. 반응은 72 mL의 포스페이트 완충액 (pH = 7.2 - 7.4) 및 214 mL 메탄올로 중화되었고, 0℃로 냉각되었다. 메탄올 (257 mL)에 넣은 30% 과산화수소의 용액이 10℃ 미만의 온도를 유지하면서 한 방울씩 첨가되었다. 교반이 0℃에서 1시간 동안 계속되었다. 반응은 142　mL의 물로 중화되었고, 다음으로 감압 하에서 농축되었다. 결과로 얻은 수용성 용액은 200 mL EtOAc로 3번 추출되었다. 유기상들은 조합되었고, 소듐 설페이트 위에서 건조되었으며, 여과되어 농축되었다. 잔류물이 EtOAc 및 석유 에테르 (EtOAc:PE = 1:8)의 혼합물로 실리카 컬럼 상에서 무색 오일의 형태로 13.16 g (40%)의 화합물 1B가 수득하도록 정제되었다.
화합물 1C: (2R,3R)-3-[(2S)-1-[(터르 -부톡시)카보닐]피롤리딘-2-일]-3-하이드록시-2-메틸프로파노산
Figure pct00070
화합물 1B (13.16 g, 30.43 mmol, 1.00 당량)가 과산화수소 (물에서 30%, 15.7 mL)의 존재 시 THF (460　mL)에 용해되었고, 다음으로 얼음 수조로 냉각되었다. 수산화리튬 (0.4 mol/L, 152.1 mL)의 수용성 용액이 4℃ 미만의 반응 온도를 유지하면서 한 방울씩 첨가되었다. 반응 혼합물이 0℃에서 2.5시간 동안 교반되었다. Na2SO3 (1 mol/L, 167.3 mL)의 수용성 용액이 0℃에서 온도를 유지하면서 한 방울씩 첨가되었다. 반응 혼합물이 상온에서 14시간 교반되었고, 다음으로 150 mL의 차가운 소듐 바이카보네이트 포화 용액으로 중화되었으며, 50 mL의 DCM으로 3번 세척되었다. 수용성 용액의 pH는 1 M KHSO4의 수용성 용액으로 2 내지 3회 조정되었다. 이러한 수용성 용액은 100 mL의 EtOAc로 3번 세척되었다. 유기상들은 조합되었고, 포화 NaCl 용액으로 한 번 세척되었으며, 소듐 설페이트 위에서 건조되어 여과되었고, 무색 오일의 형태로 7.31 g (88%)의 화합물 1C를 수득하도록 농축되었다.
화합물 1D: (2R,3R)-3-[(2S)-1-[(터르 -부톡시)카보닐]피롤리딘-2-일]-3-메톡시-2-메틸프로파노산
Figure pct00071
화합물 1C (7.31 g, 26.74 mmol, 1.00 당량)가 요오드메탄 (25.3 mL)의 존재 시 불활성 대기에서 THF (135 mL)에 용해되었다. 반응 배지는 얼음 수조로 냉각되었고, 이후에 NaH (오일에서 60%, 4.28 g)가 일정량씩 첨가되었다. 반응은 0℃에서 3일 동안 교반 하에 방치되었고, 다음으로 100 mL의 소듐 바이카보네이트 포화 수용성 용액으로 중화되었으며, 50 mL 에테르로 3번 세척되었다. 수용성 용액의 pH는 1 M 수용성 KHSO4 용액으로 3으로 조정되었다. 이러한 수용성 용액은 100 mL의 EtOAc로 3번 추출되었다. 유기상들은 조합되었고, 100 mL의 Na2S2O3 (물에서 5%)로 한 번, NaCl-포화 용액으로 한 번 세척되었으며, 다음으로 소듐 설페이트 위에서 건조되어 여과되었고, 5.5 g (72%)의 화합물 1D를 수득하도록 농축되었다.
화합물 1E: N-메톡시-N-메틸-2-페닐아세트아미드
Figure pct00072
2-페닐아세트산 (16.2 g, 118.99 mmol, 1.00 당량)이 디메틸포름아미드 (DMF, 130 mL)에 용해되었고, 다음으로 -10℃로 냉각되었다. 디에틸 포스포로시아니데이트 (DEPC, 19.2 mL), 메톡시(메틸)아민 염산 (12.92 g, 133.20 mmol, 1.12　당량) 및 트리에틸아민 (33.6 mL)이 첨가되었다. 반응 혼합물은 -10℃에서 30분 다음으로 상온에서 2.5시간 교반되었다. 다음으로 1 리터의 EtOAc로 두 번 추출되었다. 유기상들은 조합되었고, 500 mL의 NaHCO3 (포화)로 두 번, 400 mL의 물로 한 번 세척되었으며, 다음으로 소듐 설페이트 위에서 여과되어 농축되었다. 잔류물은 노란색 오일의 형태로 20.2 g (95%)의 화합물 1E를 수득하도록 실리카 컬럼 상에서 EtOAc 및 PE의 혼합물 (1:100 내지 1:3)로 정제되었다.
화합물 1F: 2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에탄-1-온
Figure pct00073
테트라메틸에틸렌디아민 (TMEDA, 27.2 mL)이 불활성 대기에서 THF 300 mL에 용해되었고, 다음으로 n-BuLi (67.6 mL, 2.5 M)의 한 방울씩 첨가 이전에 -78℃로 냉각되었다. 2-브로모-1,3-티아졸 (15.2 mL)이 한 방울씩 첨가되었고 교반이 -78℃에서 30분 계속되었다. THF (100 mL)에 용해된 화합물 1E (25 g, 139.50 mmol, 1.00 당량)가 한 방울씩 첨가되었다. 교반이 -78℃에서 30분, 다음으로 -10℃에서 2시간 동안 계속되었다. 반응은 500 mL의 KHSO4 (포화)으로 중화되었고, 1 리터의 EtOAc로 3번 추출되었다. 유기상들이 조합되었고, 400 mL 물로 두 번 그리고 700 mL의 NaCl (포화)로 두 번 세척되었으며, 소듐 설페이트 위에서 건조되었고, 여과되어 농축되었다. 잔류물은 노란색 오일의 형태로 25 g (88%)의 화합물 1F를 수득하도록 실리카 컬럼 상에서 EtOAc 및 PE의 혼합물 (1:100 내지 1:10)로 정제되었다.
화합물 1G: (1R)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에탄-1-올
Figure pct00074
불활성 대기에서, 에테르 (300 mL)에 넣은 화합물 1F (15 g, 73.8 mmol, 1.00 당량)의 용액이 (+)-B-클로로디이소피노캄페닐보레이트 ((+)-Ipc2BCl, 110.8 mL)로 한 방울씩 첨가되었다. 반응 혼합물은 0℃에서 24시간 교반되었고, 다음으로 300 mL의 NaOH (물에서 10%) 및 H2O2 (물에서 30%)의 (1:1) 혼합물로 중화되었으며, 마지막으로 500　mL의 EtOAc로 세 번 추출되었다. 유기상들은 조합되었고, 300 mL의 K2CO3 (포화)로 두 번, 500 mL의 NaCl (포화)로 한 번 세척되었으며, 다음으로 소듐 설페이트 위에서 건조되었고, 여과되어 농축되었다. 잔류물은 흰색 고체의 형태로 6.3 g (42%)의 화합물 1G를 수득하도록 실리카 컬럼 상에서 EtOAc 및 PE의 혼합물 (1:20 내지 1:2)로 정제되었다.
화합물 1H: 2-[(1S)-1-아지도-2-페닐에틸]-1,3-티아졸
Figure pct00075
화합물 1G (6 g, 29.23 mmol, 1.00 당량)이 트리페닐포스파인 (13 g, 49.56 mmol, 1.70 당량)의 존재 시 불활성 대기에서 THF (150 mL)에 용해되었고, 다음으로 0℃로 냉각되었다. 디에틸아조디카복실레이트 (DEAD, 7.6 mL)가 한 방울씩 첨가되었고, 디페닐포스포릴아자이드 (DPPA, 11 mL)가 이어졌으며, 다음으로 차가운 수조가 제거되었고, 용액은 상온에서 48시간 교반 하에 방치되었다. 배지는 감압 하에 농축되었다. 잔류물은 노란색 오일의 형태로 8 g의 부분적으로 정제된 화합물 1H를 수득하도록 실리카 컬럼 상에서 EtOAc 및 PE의 혼합물 (1:100 내지 1:30)로 정제되었다. 화합물 1H는 다음의 단계에서 이와 같이 사용되었다.
화합물 1I: 터르 -부틸 N-[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸] 카바메이트.
Figure pct00076
화합물 1H (6.5 g, 28.2 mmol, 1.00 당량)이 트리페닐포스파인 (6.5 g, 33.9 mmol, 1.20 당량)의 존재 시 불활성 대기에서 THF (100 mL)에 용해되었고, 50℃로 2시간 동안 가열되었다. 다음으로 암모니아 (70 mL)가 첨가되었고 가열이 3시간 동안 계속되었다. 반응은 냉각되었고, 500 mL 물로 중화되었으며, 다음으로 500 mL의 EtOAc로 3번 추출되었다. 유기상들이 조합되었고, 500 mL의 1 N HCl로 두 번 추출되었다. 수용성 상이 조합되었고, 수산화나트륨 용액 (물에서 10%)을 첨가하여 pH 8 내지 9로 가져왔고, 다음으로 500 mL의 DCM로 3번 추출되었다. 유기상들이 조합되었고, 소듐 설페이트 위에거 건조되어 여과되었으며, 노란색 오일의 형태로 4.8 g (83%)의 (1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에탄-1-아민을 수득하도록 농축되었다. 다음으로 본 화합물은 정제될 수 있도록 Boc기 ((터르 -부톡시)카보닐)로 보호되었다. 이것은 불활성 대기에서 1,4-디옥산 (40 mL)에 용해되었고, 다음으로 0℃로 냉각되었다. 20 mL의 1,4-디옥산에 희석된 (Boc)2O (10.26 g, 47.01 mmol, 2.00 당량)가 한 방울씩 첨가되었다. 차가운 수조가 제거되었고, 용액은 300 mL의 물로 중화되기 이전에 상온에서 교반 하에 밤샘 동안 방치되었으며 500 mL의 EtOAc로 두 번 추출되었다. 유기상들이 조합되었고, 소듐 설페이트 위에서 건조되었으며, 여과되어 농축되었다. 잔류물은 EtOAc 및 PE의 혼합물 (1:100 to 1:20, ee = 93%)로 실리카 컬럼 상에서 정제되었다. 다음으로 흰색 고체의 형태로 6 g (84%)의 화합물 1I를 수득하도록 헥산/아세톤 혼합물 (~ 5 내지 10 / 1, 1g / 10 mL)에서 재결정화되었다 (ee > 99%).
화합물 1J: 터르 -부틸 (2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-2-[[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]카바모일]에틸]피롤리딘-1-카복실레이트
Figure pct00077
화합물 1I (3 g, 9.86 mmol, 1.00 당량)이 불활성 대기에서 10 mL DCM에 용해되었다. 트리플루오로아세트산 (TFA, 10 mL)이 첨가되었고, 용액은 교반 하에 상온에서 밤샘 동안 방치되었고, 다음으로 노란색 오일의 형태로 2.0 g (64%)의 (1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에탄-1-아민; 트리플루오로아세트산을 수득하도록 감압 하에 농축되었다. 본 중간체는 20 mL의 DCM에 재용해되었고, 이후에 화합물 1D (1.8 g, 6.26 mmol, 1.05 당량), DEPC (1.1 g, 6.75 mmol, 1.13 당량) 및 디이소프로필에틸아민 (DIEA, 1.64 g, 12.71 mmol, 2.13 당량)이 첨가되었다. 반응 혼합물은 교반 하에 상온에서 밤샘 동안 방치되었고, 다음으로 감압 하에 농축되었다. 잔류물은 흐린 노란색 고체의 형태로 2.3 g (81%)의 화합물 1J를 수득하도록 실리카 컬럼 상에서 EtOAc 및 PE의 혼합물 (1:100 내지 1:3)로 정제되었다.
화합물 1K: (2R,3R)-3-메톡시-2-메틸-N-[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]-3-[(2S)-피롤리딘-2-일]프로판아미드; 트리플루오로아세트산
Figure pct00078
화합물 1J (2.25 g, 4.75 mmol, 1.00 당량)가 불활성 대기에서 10 mL의 DCM에 용해되었다. TFA (10 mL)가 첨가되었고, 용액은 교반 하에 상온에서 밤샘 동안 방치되었고, 다음으로 노란색 오일 형태로 2.18 g (94%)의 화합물 1K를 수득하도록 감압 하에 농축되었다.
화합물 1L: (2S,3S)-2-(벤질아미노)-3-메틸펜타노산
Figure pct00079
(2S,3S)-2-아미노-3-메틸펜타노산 (98.4 g, 750 mmol, 1.00 당량)이 상온에서 일정량씩 2 N 수산화나트륨 용액 (375　mL)에 첨가되었다. 벤질알데하이드 (79.7 g, 751.02 mmol, 1.00 당량)가 신속하게 첨가되었고 결과로 얻은 용액은 30분 교반되었다. 소듐 보로하이드라이드 (10.9 g, 288.17 mmol, 0.38 당량)가 5 및 15℃ 사이 범위에서 온도를 유지하면서 적은 일정량들로 첨가되었다. 교반은 상온에서 4시간 동안 계속되었다. 반응 혼합물은 200 mL의 물로 희석되었고, 다음으로 200 mL의 EtOAc로 두 번 세척되었다. 수용성 용액의 pH는 2 N 염산 용액으로 7로 조정되었다. 형성된 침전물이 여과에 의해 수집되었고, 흰색 고체의 형태로 149.2 g (90%)의 화합물 1L을 주었다.
화합물 1M: (2S,3S)-2-[벤질(메틸)아미노]-3-메틸펜타노산
Figure pct00080
화합물 1L (25 g, 112.97 mmol, 1.00 당량)이 포름알데하이드 (물에서 36.5%, 22.3 g)의 존재 시 불활성 대기에서 포름산에 용해되었다. 용액은 90℃에서 3시간 교반되었고, 다음으로 감압 하에서 농축되었다. 잔류물은 250 mL의 아세톤에서 분쇄된 다음 농축되었다. 이러한 분쇄/증발 작동은 흰색 고체의 형태로 21.6 g (81%)의 화합물 1M을 수득하도록 500 mL의 아세톤으로 두 번 반복되었다.
화합물 1N: (2S,3S)-2-[벤질(메틸)아미노]-3-메틸펜탄-1-올
Figure pct00081
LiAlH4 (0.36 g)이 불활성 대기에서 10 mL의 THF에 0℃에서 현탁되었다. 화합물 1M (1.5 g, 6.37 mmol, 1.00 당량)이 0 및 10℃ 사이 범위에서 온도를 유지하면서 적은 일정량들로 첨가되었다. 반응 혼합물은 65℃에서 2시간 교반된 다음, 360 uL의 물, 1 mL의 15% 수산화나트륨 및 360 uL의 물의 연속적인 첨가들로 중화되기 이전에 다시 0℃로 냉각되었다. 침전된 알루미늄 염들이 여과에 의해 제거되었다. 여과물은 소듐 설페이트 위에서 건조되었고, 여과되어 농축되었다. 잔류물은 흐린 노란색 오일의 형태로 820 mg (58%)의 화합물 1N을 수득하도록 실리카 컬럼 상에서 EtOAc 및 PE의 혼합물 (1:50)로 정제되었다.
화합물 1O: (2S,3S)-2-[벤질(메틸)아미노]-3-메틸펜타날
Figure pct00082
옥사릴 클로라이드 (0.4 mL)가 불활성 대기에서 DCM (15 mL)에 용해되었다. 용액은 -70℃로 냉각되었고, DCM (10 mL)에 넣은 디메틸설폭사이드 용액 (DMSO (0.5 mL)이 한 방울씩 15분 동안 첨가되었다. 반응 혼합물은 30분 교반되었고, 이후에 DCM (10 mL)에 넣은 화합물 1N (820 mg, 3.70 mmol, 1.00 당량)이 15분 동안 한 방울씩 첨가되었다. 반응 혼합물은 낮은 온도에서 30분 더 교반된 다음 트리에틸아민 (2.5 mL)이 천천히 첨가되었다. 반응 혼합물은 -50℃에서 1시간 교반되었고, 다음으로 차가운 수조가 제거되었으며, 반응은 온도가 정상으로 되도록 허용하면서 25 mL의 물로 중화되었다. 용액은 30 mL의 NaCl-포화 수용성 용액으로 한 번 세척된 다음, 소듐 설페이트 위에서 건조되었고, 여과되어 농축되었다. 잔류물은 노란색 오일의 형태로 0.42 g (52%)의 화합물 1O을 수득하도록 실리카 컬럼 상에서 EtOAc 및 PE의 혼합물 (1:200)로 정제되었다.
화합물 1P: (2S,3S)-N-벤질-1,1-디메톡시-N,3-디메틸펜탄-2-아민
Figure pct00083
화합물 1O (4.7 g, 21.43 mmol, 1.00 당량)이 0℃에서 20 mL의 메탄올에 용해되었다. 농축된 황산 (4.3 mL)이 한 방울씩 첨가되었고, 교반이 0℃에서 30분 동안 계속되었다. 트리메틸 오소포르메이트 (21.4 mL)이 첨가되었고, 차가운 수조는 제거되었으며, 반응 배지가 상온에서 3시간 동안 교반 하에 방치되었다. 반응 배지는 200 mL의 EtOAc로 희석되었고, 연속적으로 100 mL의 10% Na2CO3 및 200 mL의 포화 NaCl로 세척되었으며, 다음으로 소듐 설페이트 위에서 건조되어 여과되었으며, 흐린 노란색 오일의 형태로 3.4 g (60%)의 화합물 1P를 수득하도록 감압 하에 농축되었다.
화합물 1Q: [[1-(터르 -부톡시)에테닐]옥시](터르 -부틸)디메틸실란
Figure pct00084
디이소프로필아민 (20 g, 186.71 m mol, 1.08 당량)이 불활성 대기에서 170 mL의 THF에 용해되었고, -78℃로 냉각되었다. nBuLi (2.4 M, 78.8 mL)가 한 방울씩 첨가되었고, 용액은 (LDA-리튬 디이소프로필아미드를 얻도록) 터르 -부틸 아세테이트 (20 g, 172.18 mmol, 1.00 당량)를 첨가하기 이전에 낮은 온도에서 30분 교반되었다. 반응 혼합물이 35 mL의 THF에서 헥사메틸포스포아미드 (HMPA, 25.8 mL) 및 터르-부틸디메틸클로로실란 (TBDMSCl, 28 g, 185.80 mmol, 1.08 당량)를 첨가하기 이전에 -78℃에서 20분 교반되었다. 교반은 낮은 온도에서 추가 20분 동안 계속되었고, 다음으로 차가운 수조가 제거되었다. 용액은 감압 하에 농축되었다. 잔류물은 100 mL의 물에 재용해되었고, 100 mL의 PE로 3번 추출되었다. 유기상들이 조합되었고, 500 mL의 NaCl-포화 수용성 용액으로 한 번 세척되었고, 소듐 설페이트 위에서 건조되었으며, 여과되어 농축되었다. 잔류물은 무색 오일의 형태로 16.6 g (83%)의 화합물 1Q를 수득하도록 증류에 의해 정제되었다.
화합물 1R: 터르 -부틸 (3R,4S,5S)-4-[벤질(메틸)아미노]-3-메톡시-5-메틸 헵타노에이트
Figure pct00085
화합물 1P (2.0 g, 7.54 mmol, 1.00 당량) 및 화합물 1Q (2.6 g, 11.28　mmol, 1.50 당량)가 불활성 대기에서 33 mL의 DCM에 용해되었다. 용액은 0℃로 냉각되었다. DMF (1.2 g)가 7.5 mL의 DCM에 넣은 BF3·Et2O (2.1 g) 용액과 함께 한 방울씩 첨가되었다. 교반이 0℃에서 24시간 동안 계속되었다. 반응 배지는 30 mL의 소듐 카보네이트 (10 %)로 한 번, 50 mL의 NaCl-포화 수용성 용액으로 두 번 세척되었고, 다음으로 소듐 설페이트 위에서 건조되었으며, 여과되어 농축되었다. 잔류물은 노란색 오일의 형태로 1.82 g (91%)의 화합물 1R을 수득하도록 실리카 컬럼 상에서 EtOAc 및 PE의 혼합물 (1:100)로 정제되었다.
화합물 1S: (3R,4S,5S)-3-메톡시-5-메틸-4-(메틸아미노)헵타노에이트 염산
Figure pct00086
화합물 1R (2.4 g, 6.87 mmol, 1.00 당량)이 Pd/C (0.12 g) 및 농축된 염산 (0.63 mL)의 존재 시 불활성 대기에서 35 mL의 에탄올에 용해되었다. 질소 대기가 수소 대기로 교체되었고, 반응 배지는 상온에서 18시간 교반 하에 방치되었다. 반응 배지는 여과되었고 감압 하에 농축되었다. 잔류물은 50 mL의 헥산에서 분쇄되었고, 상청액은 제거되었으며, 이는 감압 하에 건조한 이후에 흰색 고체의 형태로 1.66 g (82%)의 화합물 1S를 주었다.
화합물 1T: 터르 -부틸 (3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-[[(벤질옥시)카보닐]아미노]-N,3-디메틸부탄아미도]-3-메톡시-5- 메틸헵타노에이트
Figure pct00087
(2S)-2-[[(벤질옥시)카보닐]아미노]-3-메틸부탄노산 (15 g, 0.40 mmol, 1.00 당량)가 DIEA (38.3 mL) 및 브로모트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PyBrOP, 32.3g)의 존재 시 300 mL의 DCM에 용해되었다. 용액은 화합물 1S (15.99g, 0.42 mmol, 1.07 당량)를 첨가하기 이전에 상온에서 30분 교반되었다. 반응 배지는 2시간 교반되었고, 다음으로 농축되었다. 잔류물은 무색 오일의 형태로 17 g (58%)의 화합물 1T를 수득하도록 아세토니트릴 (ACN) 및 물의 혼합물 (40분에서 30:70 내지 100:0)로 역상 (C18)에서 정제되었다.
화합물 1U: 터르 -부틸 (3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-아미노-N,3-디메틸부탄아미도]-3-메톡시-5- 메틸헵타노에이트
Figure pct00088
화합물 1T (76 mg, 0.15 mmol, 1.00 당량)이 Pd/C (0.05 g)의 존재 시 불활성 대기에서 10 mL의 에탄올에 용해되었다. 질소 대기가 수소 대기로 교체되었고, 반응은 상온에서 2시간 교반되었다. 반응 배지가 여과되었고, 무색 오일의 형태로 64 mg의 화합물 1U를 수득하도록 감압 하에 농축되었다.
화합물 1V: (3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-[[(9H-플루오렌-9-일-메톡시)카보닐] 아미노]-N,3-디메틸부탄아미도]-3-메톡시-5-메틸헵타노에이트
Figure pct00089
화합물 1U (18.19 g, 50.74 mmol, 1.00 당량)가 소듐 바이카보네이트 (12.78 g, 152 mmol, 3.00 당량) 및 9H-플루오렌-9-일-메틸 클로로포르메이트 (Fmoc-Cl, 19.69 g, 76 mmol, 1.50 당량)의 존재 시 400 mL의 1,4-디옥산/물 혼합물 (1:1)에 용해되었고, 다음으로 상온에서 2시간 교반되었다. 반응 배지가 다음으로 500 mL의 물로 희석되었고, 200 mL의 EtOAc로 3번 추출되었다. 유기상들이 조합되었고, 200 mL의 NaCl-포화 수용성 용액으로 한 번 세척되었으며, 소듐 설페이트 위에서 건조되어 여과되었고, 흐린 노란색 오일의 형태로 40 g의 부분적으로 정제된 화합물 1V를 수득하도록 농축되었다.
화합물 1W: (3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-[[(9H-플루오렌-9-일-메톡시)카보닐] 아미노]-N,3-디메틸부탄아미도]-3-메톡시-5-메틸헵타노산
Figure pct00090
화합물 1V (40 g, 68.88 mmol, 1.00 당량)이 중성 대기에서 600 mL의 DCM에 용해되었다. TFA (300 mL)가 첨가되었다. 용액은 상온에서 2시간 교반되었고, 다음으로 감압 하에 농축되었다. 잔류물이 무색 오일 형태로 23.6 g (65%)의 화합물 1W를 수득하도록 실리카 컬럼 상에서 메탄올 및 DCM의 혼합물 (1:10)로 정제되었다.
화합물 1X: 9H-플루오렌-9-일-메틸 N-[(1S)-1-[[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-2-[[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]카바모일]에틸]피롤리딘-1-일]-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸) 카바모일]-2-메틸프로필]카바메이트
Figure pct00091
화합물 1W (2.53 g, 4.82 mmol, 1.08 당량)가 화합물 1K (2.18 g, 4.47 mmol, 1.00 당량), DEPC (875 mg, 5.37 mmol, 1.20 당량) 및 DIEA (1.25 g, 9.67 mmol, 2.16 당량)의 존재 시 20 mL의 DCM에 용해되었다. 반응 혼합물은 상온에서 밤샘 동안 방치되었고, 다음으로 연속적으로 50 mL의 포화 KHSO4 및 100 mL의 물로 세척되었으며, 소듐 설페이트 위에서 건조되었고, 여과되어 농축되었다. 잔류물은 흐린 노란색 고체의 형태로 2.8 g (71%)의 화합물 1X를 수득하도록 실리카 컬럼 상에서 메탄올 및 DCM의 혼합물 (1:200 내지 1:40)로 정제되었다.
화합물 1Y: (2S)-2-아미노-N-[(3R,5S)-3-메톡시-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-2-[[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]카바모일]에틸] 피롤리딘-1-일]-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N,3-디메틸부탄아미드
Figure pct00092
화합물 1X (2.8 g, 3.18 mmol, 1.00 당량)이 피페리딘 (3 mL)의 존재 시 아세토니트릴 (ACN, 12 mL)에 용해되었고, 상온에서 18시간 교반 하에 방치되었다. 반응은 50 mL의 물로 중화되었고, 다음으로 100 mL의 DCM으로 2번 추출되었다. 유기상들은 조합되었고, 소듐 설페이트 위에서 건조되었으며, 여과되어 농축되었다. 잔류물은 노란색 고체의 형태로 1.2 g (57%)의 화합물 1Y를 수득하도록 실리카 컬럼 상에 메탄올 및 DCM 혼합물 (1:100 내지 1:40)로 정제되었다.
화합물 1ZA: (2S)-2-[[(터르 -부톡시)카보닐](메틸)아미노]-3-메틸 부탄노산
Figure pct00093
(2S)-2-[[(터르 -부톡시)카보닐]아미노]-3-메틸부탄노산 (63 g, 289.97 mmol, 1.00 당량)이 불활성 대기에서 요오드메탄 (181 mL)의 존재 시 THF (1000 mL)에 용해되었다. 용액은 소듐 하이드라이드 (116 g, 4.83 mol, 16.67 당량)를 적은 일정량들로 첨가하기 이전에 0℃로 냉각되었다. 반응 혼합물은 0℃에서 1.5시간 교반되었고, 다음으로 차가운 수조가 제거되었으며, 교반이 18시간 계속되었다. 반응은 200 mL의 물로 중화된 다음 감압 하에서 농축되었다. 잔류물 수용성 상은 4 리터의 물로 희석되었고, 200 mL의 EtOAc로 한 번 세척되었으며, 그의 pH가 1 N의 염산 용액으로 3 및 4 사이 범위로 조정되었다. 혼합물은 1.2 L의 EtOAc로 3번 추출되었다. 유기상들은 조합되었고, 소듐 설페이트 위에서 건조되어 여과되었으며, 노란색 오일의 형태로 60 g (89%)의 화합물 1ZA를 수득하도록 농축되었다.
화합물 1ZB: 벤질 (2S)-2-[[(터르 -부톡시)카보닐](메틸)아미노]-3-메틸부타노에이트
Figure pct00094
화합물 1ZA (47 g, 203.21 mmol, 1.00 당량)이 Li2CO3 (15.8 g, 213.83 mmol, 1.05 당량)의 존재 시 DMF (600 mL)에 용해되었다. 용액은 0℃로 냉각되었고, 벤질 브로마이드 (BnBr 57.9 g, 338.53 mmol, 1.67 당량)가 한 방울씩 첨가되었다. 반응 혼합물은 400 mL의 물로 중화되기 이전에 교반 하에 밤샘 동안 방치되었고, 여과되었다. 용액이 500 mL의 EtOAc로 2번 추출되었다. 유기상들은 조합되었고, 소듐 설페이트 위에서 건조되었으며, 농축되었다. 잔류물은 노란색 오일의 형태로 22.5 g (34%)의 화합물 1ZB를 수득하도록 실리카 컬럼 상에서 EtOAc 및 PE의 혼합물 (1:100 내지 1:20)로 정제되었다.
화합물 1ZC: 벤질 (2S)-3-메틸-2-(메틸아미노)부타노에이트 염산
Figure pct00095
화합물 1ZB (22.5 g, 70.00 mmol, 1.00 당량)가 150 mL의 DCM에 용해되었다. 기체성 염산이 버블화되었다. 반응은 상온에서 1시간 교반된 다음, 노란색 고체의 형태의 17 g (94%)의 화합물 1ZC를 수득하도록 감압 하에 농축되었다.
화합물 1ZD: 터르 -부틸 N-(3,3-디에톡시프로필)카바메이트
Figure pct00096
3,3-디에톡시프로판-1-아민 (6 g, 40.76 mmol, 1.00 당량)이 TEA (4.45 g, 43.98 mmol, 1.08 당량)의 존재 시 1,4-디옥산 (30 mL)에 용해되었고, 다음으로 0℃로 냉각되었다. 20 mL의 디옥산에 희석된 (Boc)2O (9.6 g, 43.99 mmol, 1.08 당량)가 한 방울씩 첨가되었다. 용액은 10 mL의 물로 중화되기 이전에 0℃에서 2시간, 다음으로 상온에서 밤샘 동안 교반되었다. pH가 HCl (1%)로 5로 조정되었다. 용액은 50 mL의 EtOAc로 3번 추출되었다. 유기상들은 조합되었고, 소듐 설페이트 위에서 건조되어 여과되었으며, 흐린 노란색 오일의 형태로 8.21 g (81%)의 화합물 1ZD를 수득하도록 농축되었다.
화합물 1ZE: 터르 -부틸 N-(3-옥소프로필) 카바메이트
Figure pct00097
화합물 1ZD (8.20 g, 33.15 mmol, 1.00 당량)가 18.75 mL의 아세트산에 용해되었고, 상온에서 밤샘 동안 교반 하에 방치되었다. 다음으로 반응 배지는 30 mL의 EtOAc로 3번 추출되었다. 유기상들은 조합되었고, 30 mL의 포화 NaCl로 3번 세척되었으며, 소듐 설페이트 위에서 건조되어 여과되었고, 짙은 적색 오일의 형태로 5 g (87%)의 화합물 1ZE를 수득하도록 농축되었다.
화합물 1ZF: (2S)-2-[(3-[[(터르 -부톡시)카보닐]아미노]프로필)(메틸) 아미노]-3-메틸부탄노산
Figure pct00098
화합물 1ZE (2.4 g, 13.86 mmol, 1.00 당량)가 화합물 1ZC (3.56 g, 13.81 mmol, 1.00 당량) 및 DIEA (9.16　mL, 4.00 당량)의 존재 시 50 mL의 THF에 용해되었다. 반응 혼합물이 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드 (5.87 g, 27.70 mmol, 2.00 당량)를 첨가하기 이전에 상온에서 30분 교반되었다. 교반이 밤샘 동안 계속된 다음, 반응은 100 mL의 물로 중화되었으며, 50 mL의 EtOAc로 3번 추출되었다. 유기상들은 조합되었고, 소듐 설페이트 위에서 건조되어 여과되었으며, 농축되었다. 잔류물은 실리카 컬럼 상에서 EtOAc 및 PE의 혼합물 (1:4)로 부분적으로 정제되었다. 획득된 조산물은 Pd/C (1.2 g)의 존재 시 20 mL의 메탄올에 재용해되었고, 정상 온도 및 압력에서 20분 동안 수소화되었다. 반응 배지는 여과되었고, 흰색 고체의 형태로 200 mg (5%)의 화합물 1ZF를 수득하도록 감압 하에 농축되었다.
화합물 1ZG: 터르 -부틸 N-(3-[[(1S)-1-[[(1S)-1-[[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-2-[[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]카바모일]틸]피롤리딘-1-일]-5-메틸-1-옥소헵탄-4 일](메틸) 카바모일]-2-메틸프로필]카바모일]-2-메틸프로필](메틸)아미노]프로필) 카바메이트
Figure pct00099
화합물 1Y (50 mg, 0.08 mmol, 1.00 당량)가 화합물 1ZF (26.2 mg, 0.09 mmol, 1.20 당량), DIEA (37.7 mL) 및 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 43.3 mg, 0.11 mmol, 1.50 당량)의 존재 시 2 mL의 DMF에 용해되었다. 반응이 상온에서 밤샘 동안 교반 하에 방치되었고, 다음으로 10 mL의 물에 희석되었으며 5 mL의 EtOAc로 3번 추출되었다. 유기상들이 조합되었고, 소듐 설페이트 위에서 건조되어 여과되었으며, 부분적으로 정제된 무색 오일의 형태로 100 mg의 화합물 1ZG를 수득하도록 농축되었다.
화합물 1ZG (90 mg, 0.10 mmol, 1.00 당량)가 중성 대기에서 2 mL의 DCM에 용해되었고, 용액이 얼음 수조에서 냉각되었다. TFA (1 mL)가 첨가되었고, 반응은 상온에서 2시간 동안 교반되었으며, 다음으로 감압 하에 농축되었다. 잔류물이 제조용 HPLC (프리-HPLC-001 SHIMADZU, SunFire 프렙 C18 OBD 컬럼, 5 um, 19 x 150 mm; 용출상: 0.05%의 TFA에 완충된 물 / ACN; 18 내지 31% ACN 7분, 다음으로 31% 내지 100% ACN 2분의 구배; 254 nm 및 220 nm에서의 워터스 2489 UV 검출기)에 의해 정제되었다. 화합물 1은 흰색 고체의 형태로 25% (23 mg)의 수율로 획득되었다.
LC/MS/UV　(애틀란티스 T3 컬럼, 3 um, 4.6 x 100 mm; 35℃; 1 mL /분, 물에서 30% 내지 60% ACN (6분에서 20 mM 암모늄 아세테이트); ESI　(C44H73N7O6S, 정확한 질량 827.53) m/z: 829 (MH+), 5.84분 (93.7%, 254 nm).
1H NMR　(300MHz, CD3OD, ppm): δ (회전이성질체들의 존재) 7.85 - 7.80 (m, 1H); 7.69 - 7.66 (m, 1H), 7.40 - 7.10 (m, 5H), 5.80 - 5.63 (m, 1H), 4.80 - 4.65 (m, 2H), 4.22 -4.00 (m, 1H), 3.89 - 0.74 (m, 58H).
기준 화합물 2
(S)-2-((S)-2-(((2-아미노피리딘-4-일)메틸)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸부탄아미드, 트리플루오로아세트산
Figure pct00100
화합물 2A: 터르 -부틸 (S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-카복실레이트
화합물 1D (2.5 g, 8.70 mmol, 1.00 당량) 및 (1S,2R)-2-아미노-1-페닐프로판-1-올 (1.315 g, 8.70 mmol, 1.00 당량)이 불활성 대기에서 DMF (35 mL)에 용해되었다. 용액은 0℃로 냉각된 다음 DEPC (1.39 mL) 및 TEA (1.82 mL)가 한 방울씩 첨가되었다. 반응 혼합물이 0℃에서 2시간, 상온에서 4시간 교반되었다. 반응 혼합물은 200 mL의 물로 희석되었고, 50 mL의 EtOAc로 3번 추출되었다. 유기상들은 조합되었고, 50 mL의 KHSO4 (1 mol/L)로 한 번, 50 mL의 NaHCO3 (포화)로 한 번, 50 mL의 NaCl (포화)로 한 번 세척되었으며, 다음으로 소듐 설페이트 위에서 건조되어 여과되었고, 노란색 고체의 형태로 3.6 g (98%)의 화합물 2A를 수득하도록 감압 하에 농축되었다.
화합물 2B: (2R,3R)-N-((1S,2R)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일)-3-메톡시-2-메틸-3-((S)-피롤리딘-2-일)프로판아미드-2,2,2-트리플루오로아세테이트
Figure pct00101
화합물 2A (2.7 g, 6.42 mmol, 1.00 당량)이 불활성 대기에서 DCM (40 mL)에 용해되었고, 다음으로 0℃로 냉각되었다. TFA (25 mL)가 첨가되었고, 용액이 0℃에서 2시간 교반되었다. 반응 혼합물은 노란색 오일의 형태로 4.4 g의 화합물 2B를 수득하도록 감압 하에 농축되었다.
화합물 2C: (9H-플루오렌-9-일)메틸 ((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일) (메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카바메이트
Figure pct00102
화합물 2B (4.4 g, 10.13 mmol, 1.00 당량) 및 1W (5.31 g, 10.12 mmol, 1.00 당량)가 불활성 대기에서 DCM (45 mL)에 용해되었다. 용액은 0℃로 냉각되었고, 다음으로 DEPC (1.62 mL) 및 DIEA (8.4 mL)가 한 방울씩 첨가되었다. 반응 혼합물이 0℃에서 2시간, 다음으로 상온에서 밤샘 동안 교반되었다. 반응 혼합물은100 mL의 물로 희석되었고, 50 mL의 DCM으로 3번 추출되었다. 유기상들이 조합되었고, 50 mL의 KHSO4 (1 mol/L)로 한 번, 50 mL의 NaHCO3 (포화)로 한 번, 50 mL의 NaCl (포화)로 한 번 세척되었으며, 다음으로 소듐 설페이트 위에서 건조되었고, 노란색 고체의 형태로 3.3 g (39%)의 화합물 2C를 수득하도록 감압 하에 농축되었다.
화합물 2D: (S)-2-아미노-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸부탄아미드
Figure pct00103
화합물 2C (300 mg, 0.36 mmol, 1.00 eq.)가 불활성 대기에서 ACN (2 mL) 및 피페리딘 (0.5 mL)에 용해되었다. 용액은 상온에서 밤샘 동안 교반 하에 방치되었고, 다음으로 감압 하에 증발되어 건조되었다. 잔류물은 흰색 고체의 형태로 150 mg (68%)의 화합물 2D를 수득하도록 실리카 컬럼 상에서 DCM 및 MeOH의 혼합물 (1:100)로 정제되었다.
화합물 2E: 메틸 2-((터르 -부톡시카보닐)아미노)이소니코티네이트
Figure pct00104
메틸 2-아미노피리딘-4-카복실레이트 (2 g, 13.14 mmol, 1.00 당량)가 터르 -부탄올 (20 mL)에 용해되었고, 이후에 디-터르-부틸 디카보네이트 (4.02 g, 18.42 mmol, 1.40 당량)가 첨가되었다. 반응 혼합물이 60℃에서 밤샘 동안 교반된 다음, 반응이 수용성 1 M NaHCO3 용액 (50 mL)을 첨가하여 정지되었다. 고체가 여과에 의해 회수되었고, 50 mL의 EtOH로 세척된 다음 흰색 고체의 형태로 2.5 g (75%)의 화합물 2E를 수득하도록 진공에서 건조되었다.
화합물 2F: 터르 -부틸 (4-(하이드록시메틸)피리딘-2-일)카바메이트
Figure pct00105
화합물 2E (2.5 g, 9.91 mmol, 1.00 당량) 및 CaCl2 (1.65 g)가 EtOH (30 mL)에 용해되었다. 용액이 0℃로 냉각되었고, 다음으로 NaBH4 (1.13 g, 29.87 mmol, 3.01 당량)가 점차적으로 첨가되었다. 용액은 상온에서 밤샘 동안 교반 하에 방치되었고, 다음으로 반응이 물 (50 mL)의 첨가에 의해 정지되었다. 혼합물은 20 mL의 EtOAc로 3번 추출되었다. 유기상들은 조합되었고, 20 mL의 NaCl (포화)로 두 번 세척되었으며, 다음으로 소듐 설페이트 위에서 건조되어 여과되었고, 무색 고체의 형태로 2.0 g (90%)의 화합물 2F을 수득하도록 감압 하에 농축되었다.
화합물 2G: 터르 -부틸 (4-포르밀피리딘-2-일)카바메이트
Figure pct00106
화합물 2F (2.5 g, 11.15 mmol, 1.00 당량)가 DCE (25 mL)에 용해되었고, 다음으로 19.4 g (223.14 mmol, 20.02 당량)의 MnO2가 첨가되었다. 혼합물은 70℃에서 밤샘 동안 교반 하에 방치되었고, 다음으로 고체들이 여과에 의해 제거되었다. 여과물은 흰색 고체의 형태로 1.4 g (57%)의 화합물 2G를 수득하도록 증발되었다.
화합물 2H: 벤질 (S)-2-(((2-((터르 -부톡시카보닐)아미노)피리딘-4-일)메틸) (메틸)아미노)-3-메틸부타노에이트
Figure pct00107
화합물 2G (2.3 g, 10.35 mmol, 1.00 당량)이 화합물 1ZC (2.93 g, 11.37 mmol, 1.10 당량), DIEA (5.39 g, 41.71 mmol, 4.03 당량) 및 NaBH(OAc)3 (4.39 g, 20.71 mmol, 2.00 당량)의 존재 시 25 mL의 THF에 용해되었다. 반응 혼합물은 상온에서 6시간 교반되었고, 60 mL의 NaHCO3 (포화)로 중화되었으며, 20 mL의 AcOEt로 3번 추출되었다. 유기상들이 20 mL의 NaCl (포화)로 조합되었고, 소듐 설페이트 위에서 건조되었으며, 여과되어 농축되었다. 잔류물은 흰색 고체의 형태로 2.7 g (61%)의 화합물 2H를 실라카 컬럼 상에서 EtOAc 및 PE의 혼합물 (1:15)로 정제되었다.
화합물 2I: (S)-2-(((2-((터르 -부톡시카보닐)아미노)피리딘-4-일)메틸) (메틸)아미노)-3-메틸부탄노산
Figure pct00108
화합물 2H (500 mg, 1.17 mmol, 1.00 당량)가 Pd/C (250 mg)의 존재 시 10 mL의 AcOEt 및 2 mL의 메탄올에 용해되었고, 상온 및 대기압에서 3시간 동안 수소화되었다. 반응 배지는 여과되었고, 무색 오일의 형태로 254 mg (64%)의 화합물 2I를 수득하도록 감압 하에 농축되었다.
화합물 2J: 터르 -부틸 (4-((3S,6S,9S,10R)-9-((S)-세크-부틸)-10-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)-3,6-디이소프로필-2,8-디메틸-4,7-디옥소-11-옥사-2,5,8-트리아자도데실)피리딘-2-일) 카바메이트
Figure pct00109
화합물 2J이 화합물 1ZG와 유사한 방식으로 DMF (3 mL)에서 아민 2D (85.2 mg, 0.14 mmol, 1.50 당량), 산 2I (31.7 mg, 0.09 mmol, 1.00 당량), HATU (42.9 mg, 0.11 mmol, 1.20 당량) 및 DIEA (36.7 mg, 0.28 mmol, 3.02 당량)로부터 제조되었다. 증발하여 건조된 이후, 100 mg의 조산물이 흰색 고체의 형태로 획득되었다.
화합물 2J (100 mg, 0.11 mmol, 1.00 당량)가 2 mL의 DCM 및 1 mL의 TFA에 용해되었다. 반응은 상온에서 1시간 동안 교반되었고, 다음으로 감압 하에 농축되었다. 잔류물 (80 mg)은 제조용 HPLC (프리-HPLC-001 SHIMADZU, SunFire 프렙 C18 OBD 컬럼, 5 um, 19 x 150 mm; 용출상: 0.05 % TFA에 완충된 물 / ACN; 20% 내지 40% ACN 10분, 다음으로 40% 내지 100% ACN 2분의 구배; 254 nm 및 220 nm에서의 워터스 2489 UV 검출기)에 의해 정제되었다. 화합물 2가 흰색 고체의 형태로 6% (6.3 mg)의 수율로 획득되었다.
LC/MS/UV　(아센티스 익스프레스 C18 컬럼, 2.7 um, 4.6 x 100 mm; 40℃; 1.8　mL/분, 물에서 10% 내지 95% ACN (0.05 % TFA) 6분); ESI　(C45H73N7O7, 정확한 질량 823.56) m/z: 824.5 (MH+) 및 412.9 (M.2H+/2, 100 %), 3.21분 (99.2%, 210 nm)1H　NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ (회전이성질체들의 존재) 7.81 - 7.79 (m, 1H); 7.39 - 7.29 (m, 5H); 6.61 - 6.59 (m, 2H); 4.84 - 4.52 (m, 1H); 4.32 - 4.02 (m, 1H); 3.90 - 2.98 (m, 10H); 2.90 - 2.78 (m, 1H); 2.55 - 0.81 (m, 39H).
기준 화합물 3
메틸 ((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸(피리딘-4-일-메틸)아미노)부탄아미도)부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트, 트리플루오로아세트산
Figure pct00110
화합물 3A: 터르 -부틸 (S)-2-((1R,2R)-1-메톡시-3-(((S)-1-메톡시-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-카복실레이트
Figure pct00111
화합물 1D (3 g, 10.44 mmol, 1.00 당량) 및 메틸 (S)-2-아미노-3-페닐프로파노에이트 (2.25 g, 12.55 mmol, 1.20 당량)이 불활성 대기에서 DMF (40 mL)에 용해되었다. 용액은 0℃로 냉각되었고, 다음으로 DEPC (1.67 mL, 1.05 당량) 및 TEA (3.64 mL, 2.50 당량)가 한 방울씩 첨가되었다. 반응 혼합물이 0℃에서 2시간, 다음으로 상온에서 밤샘 동안 교반되었다. 반응 혼합물은 100 mL의 물에 희석되었고, 50 mL EtOAc로 3번 추출되었다. 유기상들은 조합되었고, 100 mL의 KHSO4 (1 mol/L)으로 한 번, 100 mL의 NaHCO3 (포화)으로 한 번, 100 mL의 NaCl (포화)으로 한 번 세척되었으며, 다음으로 소듐 설페이트 위에서 건조되어 여과되었고, 무색 오일의 형태로 4 g (85%)의 화합물 3A를 수득하도록 압력 하에 농축되었다.
화합물 3B: 메틸 (S)-2-((2R,3R)-3-메톡시-2-메틸-3-((S)-피롤리딘-2-일)프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트의 2,2,2-트리플루오로아세테이트
Figure pct00112
화합물 3A (5 g, 11.15 mmol, 1.00 당량)가 불활성 대기에서 DCM (40 mL)에 용해되었다. TFA (25 mL)가 첨가되었고, 용액은 2시간 동안 교반되었다. 반응 혼합물은 노란색 오일의 형태로 8 g의 화합물 3B를 수득하도록 감압 하에서 농축되었다.
화합물 3C: 메틸 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트
Figure pct00113
화합물s 3B (8.03 g, 17.36 mmol, 1.00 당량) 및 1W (9.1 g, 17.34 mmol, 1.00 당량)가 불활성 대기에서 DCM (80 mL)에 용해되었다. 용액은 0℃로 냉각되었고, 다음으로 DEPC (2.8 mL) 및 DIEA (12 mL)가 한 방울씩 첨가되었다. 반응 혼합물은 0℃에서 2시간 동안, 다음으로 상온에서 밤샘 동안 교반되었다. 반응 혼합물이 200 mL의 물에 희석되었고, 50 mL의 DCM로 3번 추출되었다. 유기상들은 조합되었고, 50 mL의 KHSO4 (1 mol/L)로 한 번, 50 mL의 NaHCO3 (포화)로 한 번, 50 mL의 NaCl (포화)로 한 번 세척되었으며, 소듐 설페이트 위에서 건조되어 여과되었고, 노란색 오일 형태로 5 g (34%)의 화합물 3C를 수득하도록 감압 하에서 농축되었다.
화합물 3D: 메틸 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-아미노-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3- 페닐프로파노에이트
Figure pct00114
화합물 3C (5.5 g, 6.43 mmol, 1.00 당량)가 불활성 대기에서 DMF (100 mL)에 넣은 테트라부틸암모늄 플루오라이드 (TBAF, 2.61 g, 9.98 mmol, 1.55 당량)에 용해되었다. 용액은 상온에서 2시간 동안 교반되었고, 다음으로 100 mL의 물에 희석되었으며, 50 mL의 EtOAc로 3번 추출되었다. 유기상들은 조합되었고, 소듐 설페이트 위에서 건조되어 여과되었으며, 노란색 고체의 형태로 3.3 g (81%)의 화합물 3D를 수득하도록 감압 하에서 농축되었다.
화합물 3E: 벤질 (S)-3-메틸-2-(메틸(피리딘-4-일 메틸)아미노) 부타노에이트
Figure pct00115
피리딘-4-카바알데하이드 (1 g, 9.34 mmol, 1.00 당량)가 화합물 1ZC (2.9 g, 11.25 mmol, 1.21 당량) 및 티타늄 이소프로폭사이드 (Ⅳ) (4.19 mL, 1.40 당량)의 존재 시 10 mL의 1,2-디클로로에탄 (DCE)에 용해되었다. 혼합물이 상온에서 30분 동안 교반되었고, 다음으로 2.77 g의 NaBH(OAc)3 (13.07 mmol, 1.40 당량)가 첨가되었다. 반응 배지는 밤샘 동안 교반 하에 방치되었고, 다음으로 100 mL의 물로 중화되었으며, 50 mL의 AcOEt로 3번 추출되었다. 유기상들은 조합되었고, 증발되어 건조되었다. 잔류물은 무색 오일의 형태로 1.3 g (45%)의 화합물 3E를 수득하도록 실리카 컬럼 상에서 EtOHAc 및 PE의 혼합물 (1:20)로 정제되었다.
화합물 3F: (S)-3-메틸-2-(메틸(피리딘-4-일 메틸)아미노)부탄노산
Figure pct00116
화합물 3E (800 mg, 2.56 mmol, 1.00 당량)이 Pd/C (300 mg)의 존재 시 30 mL의 AcOEt에 용해되었고, 상온 및 대기압에서 3시간 동안 수소화되었다. 반응 배지가 여과되었고 감압 하에 농축되었다. 잔류물은 흰색 고체의 형태로 100 mg (18%)의 화합물 3F를 수득하도록 실리카 컬럼 상에서 DCM 및 MeOH의 혼합물 (100:1 내지 5:1)로 정제되었다.
화합물들 3D (50 mg, 0.08 mmol, 1.00 당량) 및 3F (26.34 mg, 0.12 mmol, 1.50 당량)가 3 mL의 DCM에 용해되었다. 용액은 0℃로 냉각되었고, 다음으로 0.018 mL의 DEPC 및 0.0392 mL의 DIEA가 첨가되었다. 반응이 0℃에서 2시간 동안, 다음으로 상온에서 밤샘 동안 교반되었다. 반응 배지가 감압 하에서 농축되었고, 잔류물 (70 mg)이 제조용 HPLC (프리-HPLC-001 SHIMADZU, SunFire 프렙 C18 OBD 컬럼, 5 um, 19 x 150 mm; 용출상: 0.05%의 TFA에 완충된 물 / ACN; 20% 내지 40% ACN 10분, 다음으로 40% 내지 100% ACN 2분의 구배; 254 nm 및 220 nm에서의 워터스 2545 UV 검출기)에 의해 정제되었다. 화합물 3은 흰색 고체의 형태로 27% (20 mg)의 수율로 획득되었다.
LC/MS/UV　(아센티스 익스프레스 C18 컬럼, 2.7 um, 4.6 x 100 mm; 40℃; 1.5　mL/분, 물에서 10% 내지 95% ACN (0.05% TFA) 8분); ESI　(C46H72N6O8, 정확한 질량 836.5) m/z: 837.5 (MH+) 및 419.4 (M.2H+/2 (100%)), 7.04분 (90.0%, 210 nm)
1H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ (회전이성질체들의 존재) 8.76 - 8.74 (m, 2H); 8.53 - 8.48 (m, 0.4H, NHCO 불완전한 교환); 8.29 - 8.15 (m, 0.8H, NHCO 불완전한 교환); 8.01 (s, 2H), 7.31 - 7.22 (m, 5H), 4.88 - 4.68 (m, 3H); 4.31 - 4.07 (m, 2H); 3.94 - 2.90 (m, 18H); 2.55 - 0.86 (m, 38H).
기준 화합물 4
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸(피리딘-4-일 메틸)아미노)부탄아미도)부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노산, 트리플루오로아세트산
Figure pct00117
화합물 3 (100 mg, 0.11 mmol, 1.00 당량)이 물 (5 mL), ACN (5 mL) 및 피페리딘 (2.5 mL)의 혼합물에 용해되었다. 반응 혼합물은 교반 하에 밤샘 동안 방치되었고, 다음으로 감압 하에 농축되었다. 잔류물이 제조용 HPLC (프리-HPLC-001 SHIMADZU, SunFire 프렙 C18 OBD 컬럼, 5 um, 19 x 150 mm; 용출상: 0.05% TFA로 완충된 물 / ACN; 20% 내지 40% ACN 10분, 다음으로 40% 내지 100% ACN 2분의 구배; 254 nm 및 220 nm에서의 워터스 2545 UV 검출기)에 의해 정제되었고, 흰색 고체의 형태로 20 mg (20 %) 의 화합물 4를 수득하였다.
LC/MS/UV　(아센티스 익스프레스 C18 컬럼, 2.7 um, 4.6 x 100 mm; 40℃; 1.5　mL/분, 물 (0.05% TFA)에서 10% 내지 95% ACN 8분; ESI　(C45H70N6O8, 정확한 질량 822.5) m/z: 823.5 (MH+) 및 412.4 (M.2H+/2, 100%), 6.84분 (89.1%, 210 nm).
1H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ (회전이성질체들의 존재) 8.79 - 8.78 (m, 2H); 8.09 (m, 2H); 7.30 - 7.21 (m, 5H); 4.80 - 4.80 (m, 1H), 4.36 - 0.87 (m, 58H).
기준 화합물 6
메틸 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-아미노프로필) (메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3- 페닐프로파노에이트, 비스 트리플루오로아세트산
Figure pct00118
화합물 6A: 메틸 (2S)-2-[(2R)-2-[(R)-[(2S)-1-[(3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(3-[[(터르-부톡시)카보닐]아미노]프로필)(메틸)아미노]-3-메틸 부탄아미도]-N,3-디메틸부탄아미도]-3-메톡시-5-메틸헵타노일]피롤리딘-2-일](메톡시)메틸]프로판아미도]-3-페닐프로파노에이트
Figure pct00119
화합물 3D (157.5 mg, 0.25 mmol, 1.00 당량)이 카복실산 1ZF (78.7 mg, 0.27 mmol, 1.10 당량), DEPC (46 ul) 및 DIEA (124 ul)의 존재 시 불활성 대기에서 0℃로 3 mL의 DCM에 용해되었다. 반응 혼합물이 낮은 온도에서 2시간 교반되었고, 다음으로 차가운 수조가 제거되었으며, 교반이 4시간 동안 계속되었다. 다음으로 이것은 미가공 노란색 오일의 형태로 200 mg의 화합물 6A를 수득하도록 감압 하에 농축되었다. 이것은 이와 같이 다음의 단계에 사용되었다.
화합물 6A (200 mg, 0.22 mmol, 1.00 당량)이 불활성 대기에서 0℃로 2 mL의 DCM에 용해되었다. TFA (1 mL)가 한 방울씩 첨가되었고, 차가운 수조가 제거되었다. 반응 혼합물이 상온에서 1시간 교반되었고, 다음으로 감압 하에 농축되었다. 잔류물은 제조용 HPLC (프리-HPLC-001 SHIMADZU, SunFire 프렙 C18 OBD 컬럼, 5 um, 19 x 150 mm; 용출상: 0.05% TFA에 완충된 물 / ACN; 20% 내지 40% ACN 10분, 다음으로 40% 내지 100% ACN 2분의 구배; 254 nm 및 220 nm에서의 워터스 2489 UV 검출기)에 의해 정제되었고, 흰색 고체의 형태로 60 mg (26%, 2 단계들에서 수율)의 화합물 6를 수득하였다.
LC/MS/UV　(조박스 에클립스 플러스 C8, 3.5 um, 4.6 x 150 mm; 1 mL/분, 40℃, 물 (0.1 % H3PO4)에서 30 내지 80% 메탄올 18분); ESI　(C43H74N6O8, 정확한 질량 802.56) m/z: 804 (MH+); 11.50분 (91.5 %, 210 nm).
1H NMR (300MHz, CD3OD, ppm): δ (회전이성질체들의 존재) 8.52 (d, 0.3H, NHCO 불완전한 교환); 8.25 (d, 0.5H, NHCO 불완전한 교환); 7.30-7.22 (m, 5H); 4.9-4.6 (m, 3H); 4.2-4.0 (m, 1H); 4.0-0.86 (m, 61H).
기준 화합물 7
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-아미노프로필) (메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일) 피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노산, 비스 트리플루오로아세트산
Figure pct00120
화합물 6 (70 mg, 0.08 mmol, 1.00 당량)이 물 (5 mL), ACN (2.5 mL) 및 ㅍ피페리딘 (5 mL)의 혼합물에 용해되었다. 반응 혼합물이 상온에서 밤샘 동안 교반 하에 방치되었고, 다음으로 감압 하에 농축되었다. 잔류물은 제조용 HPLC (프리-HPLC-001 SHIMADZU, SunFire 프렙 C18 OBD 컬럼, 5 um, 19 x 150 mm; 용출상: 0.05% TFA로 완충된 물 / ACN; 20% 내지 40% ACN 10분, 다음으로 40% 내지 100% ACN 2분의 구배; 254 nm 및 220 nm에서의 UV 워터스 2489 UV 검출기)에 의해 정제되었고, 흰색 고체의 형태로 14.6 mg (21%)의 화합물 7를 수득하였다.
LC/MS/UV　(아센티스 익스프레스 C18, 2.7 um, 4.6 x 100 mm; 1.5 mL/분, 40℃, 물 (0.05% TFA)에서 0 내지 80% 메탄올 8분); ESI　(C42H72N6O8, 정확한 질량 788.54) m/z: 790 (MH+), 5.71분 (96.83%, 210 nm).
1H NMR (300MHz, CD3OD, ppm): δ (회전이성질체들의 존재) 8.42 (d, 0.3H, NHCO 불완전한 교환); 8.15 (d, 0.2H, NHCO 불완전한 교환); 7.31-7.21 (m, 5H); 4.9-4.6 (m, 3H); 4.25-4.0 (m, 1H); 4.0-0.86 (m, 59H).
화합물 11
(S)-N-((3R,4S,5S)-3-메톡시-1-((S)-2-((1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-(((S)-2-페닐-1-(티아졸-2-일)에틸)아미노)프로필)피롤리딘-1-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸(4-(메틸아미노)펜에틸)아미노) 부탄아미도)부탄아미드, 트리플루오로아세트산
Figure pct00121
화합물 11A: 터르 -부틸 N-[4-(2-하이드록시에틸)페닐]카바메이트
Figure pct00122
디-터르-부틸 디카보네이트 (16.7 g, 77 mmol, 1.05 eq.)가 THF (200 mL)에 넣은 2-(4-아미노페닐)에탄올 (10 g, 72.9 mmol, 1 eq.)에 용해되었고, 반응은 상온에서 밤샘 동안 교반되었다. 혼합물은 EtOAc (200 mL)로 희석되었고, 물 (200 mL), 다음으로 HCl 1M (100 mL), 다음으로 포화된 수용성 NaHCO3 용액 (100 mL) 다음으로 염수 (100 mL)로 세척되었다. 유기상은 MgSO4 위에서 건조되었고, 감압 하에 증발되어 건조되었다. 조산물은 헵탄 (150 mL)으로 두 번 분쇄되었고, 흰색 고체로서 화합물 11A (14.7 g, 84%)를 공급하도록 진공 하에 건조되었다.
화합물 11B: 터르 -부틸 N-[4-(2-옥소에틸)페닐]카바메이트
Figure pct00123
화합물 11A (2.5 g, 10.5 mmol, 1.00 당량)가 25 mL의 DCM에 용해되었고, 다음으로 -78℃로 냉각되었다. DCM (10 mL)에 넣은 데스-마틴 페리오디난 용액 (DMP, 6.71 g, 15.8 mmol, 1.5 당량)이 한 방울씩 첨가되었다. 차가운 수조가 제거되었고, 교반이 상온에서 1시간 동안 계속되었다. 반응은 60 mL의 소듐 바이카보네이트-포화 수용성 용액 및 Na2S2O3-포화 수용성 용액의 50/50 혼합물로 중화되었다. 결과로 얻은 용액은 30 mL의 EtOAc으로 2번 추출되었다. 유기상들은 조합되었고, NaCl-포화 수용성 용액으로 두 번 세척되었으며, 무수 소듐 설페이트 위에서 건조되었고, 여과되어 감압 하에 농축되었다. 잔류물은 흐린 노란색 고체의 형태로 1.0 g (40%)의 화합물 11B를 수득하도록 실리카겔 (EtOAc/PE 1/15) 상에서 정제되었다.
화합물 11C: 벤질 (2S)-2-[[2-(4-[[(터르 -부톡시)카보닐]아미노]페닐) 에틸](메틸)아미노]-3-메틸부타노에이트.
Figure pct00124
화합물 1ZC (3.5 g, 13.6 mmol, 1.1 당량)가 DIEA (6.4 g, 49.7 mmol, 4.0 당량), 알데하이드 11B (2.9 g, 12.3 mmol, 1.0 당량) 및 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드 (5.23 g, 49.7 mmol, 2.0 당량)의 존재 시 THF (30 mL)에 용해되었다. 반응 혼합물은 상온에서 밤샘 동안 교반 하에 방치되었고, 다음으로 60 mL의 소듐 바이카보네이트-포화 용액으로 중화되었다. 결과로 얻은 용액은 30 mL EtOAc로 3번 추출되었다. 유기상들은 조합되었고 NaCl-포화 수용성 용액으로 두 번 세척되었으며, 무수 소듐 설페이트 위에서 건조되었고, 여과되어 감압 하에 농축되었다. 잔류물은 노란색 오일의 형태로 3.7 g (68%)의 화합물 11C를 수득하도록 실리카겔 (EtOAc/PE 1:20) 상에서 정제되었다.
화합물 11D: (2S)-2-[[2-(4-[[(터르 -부톡시)카보닐]아미노]페닐)에틸] (메틸)아미노]-3-메틸부탄노산
Figure pct00125
화합물 11C (2 g, 4.5 mmol, 1 당량)가 Pd/C (2 g)의 존재 시 10 mL의 메탄올에 용해되었고, 정상 온도 및 압력에서 2시간 동안 수소화되었다. 반응 배지는 여과되어 감압 하에 농축되었고, 노란색 오일의 형태로 1.2 g (75%)의 화합물 11D를 수득하였다.
화합물 11E: (2S)-2-[[2-(4-[[(터르 -부톡시)카보닐](메틸)아미노]페닐) 에틸](메틸) 아미노]-3-메틸부탄노산
Figure pct00126
화합물 11D (1.2 g, 3.4 mmol, 1.00 당량)가 불활성 대기에서 THF (20 mL)에 용해되었다. 반응 혼합물은 얼음 수조로 냉각되었고, 이후에 NaH (오일에서 60%, 549 mg, 13.7 mmol, 4.0 당량)가 일정량씩 첨가되었고, 요오드메탄 (4.9 g, 34 mmol, 10 당량)이 이어졌다. 반응은 상온에서 밤샘 동안 교반 하에 방치되었고, 다음으로 물로 중화되었으며, 100 mL의 EtOAc로 세척되었다. 수용성 용액의 pH는 1 N HCl로 6 내지 7로 조정되었다. 이러한 수용성 용액은 100 mL의 EtOAc로 3번 세척되었다. 유기상들은 조합되었고, 소듐 설페이트 위에서 건조되어 여과되었으며, 노란색 고체의 형태로 800 mg (64%)의 화합물 11E를 수득하도록 농축되었다.
화합물 11F: 터르 -부틸 N-[4-(2-[[(1S)-1-[[(1S)-1-[[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-2-[[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]카바모일]에틸]피롤리딘-1-일]-5-메틸-1-옥소헵탄-4 일] (메틸)카바모일]-2-메틸프로필]카바모일]-2-메틸프로필](메틸)아미노] 에틸)페닐]-N- 메틸카바메이트
Figure pct00127
화합물 11F가 화합물 6A와 유사한 방식으로 아민 1Y (150 mg, 0.22 mmol, 1.2 당량) 및 산 11E (70 mg, 0.19 mmol, 1.0 당량)으로부터 제조되었다. 실리카겔 (EtOAc/PE 1:1) 상의 정제 이후에, 100 mg (52%)의 원하는 산물이 흐린 노란색 고체의 형태로 획득되었다.
화합물 11가 화합물 1과 유사한 방식으로 중간체 11F (100 mg, 0.1 mmol)로부터 제조되었다. 잔류물은 제조용 HPLC (프리-HPLC-001 SHIMADZU, SunFire 프렙 C18 OBD 컬럼, 5 um, 19 x 150 mm; 용출상: 0.05% TFA로 완충된 물 / ACN; 20% 내지 40% ACN 10분, 다음으로 40% 내지 100% ACN 2분의 구배; 254 nm 및 220 nm에서의 UV 워터스 2489 UV 검출기)에 의해 정제되었다. 화합물 11이 흰색 고체의 형태로 39% (39.7 mg)의 수율로 획득되었다.
LC/MS/UV　(에클립스 플러스 C8, 3.5 um, 4.6 x 150 mm; 1 mL/분, 40℃, 물 (0.05 % TFA)에서 50 내지 95% 메탄올 18분); ESI　(C50H77N7O6S, 정확한 질량 903.57) m/z: 904.5 (MH+), 7.53분 (93.68 %, 254 nm).
1H NMR (300MHz, CD3OD, ppm): δ (회전이성질체들의 존재) 8.84 (d, 0.5H, NHCO 불완전한 교환); 8.7-8.5 (m, 0.9H, NHCO 불완전한 교환); 7.76-7.73 (m, 1H); 7.55 - 7.4 (m, 1H); 7.28-7.22 (m, 7H); 7.08-7.05 (m, 2H); 5.51-5.72 (m, 1H); 4.9-4.80 (m, 2H); 4.3-0.7 (m, 60H).
화합물 12
메틸 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸(4-(메틸아미노)펜에틸)아미노)부탄아미도)부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3- 페닐프로파노에이트, 트리플루오로아세트산
Figure pct00128
화합물 1의 합성에서 최종 단계와 동일한 방식으로, 화합물 12가 아민 3D (118 mg, 0.19 mmol) 및 산 11E (82 mg, 0.22 mmol)로부터 두 단계들로 제조되었다. 최종 잔류물은 제조용 잔류물은 제조용 HPLC (프리-HPLC-001 SHIMADZU, SunFire 프렙 C18 OBD 컬럼, 5 um, 19 x 150 mm; 용출상: 0.05% TFA로 완충된 물 / ACN; 20% 내지 40% ACN 10분, 다음으로 40% 내지 100% ACN 2분의 구배; 254 nm 및 220 nm에서의 UV 워터스 2489 UV 검출기)에 의해 정제되었다. 화합물 12가 흰색 고체의 형태로 7% (13.7 mg)의 수율로 획득되었다.
LC/MS/UV　(에클립스 플러스 C8, 3.5 um, 4.6 x 150 mm; 1 mL/분, 40℃, 물 (0.05 % TFA)에서 50 내지 95% 메탄올 18분); ESI　(C49H78N6O8, 정확한 질량 878.59) m/z: 879.7 (MH+), 10.07분 (90.6 %, 254 nm).
1H:NMR (300MHz, CD3OD, ppm): δ (회전이성질체들의 존재) 7.40 (se, 2H); 7.38-7.22 (m, 7H); 4.95-4.7 (m, 3H); 4.2-4.0 (m, 1H); 3.9-0.86 (m, 62H).
화합물 13
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸(4-(메틸아미노)펜에틸)아미노)부탄아미도)부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸 헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노산, 트리플루오로아세트산
Figure pct00129
화합물 13이 화합물 7의 경우와 동일한 방식으로 화합물 12 (100 mg, 0.10 mmol)로부터 제조되었다. 잔류물은 제조용 HPLC (프리-HPLC-001 SHIMADZU, SunFire 프렙 C18 OBD 컬럼, 5 um, 19 x 150 mm; 용출상: 0.05% TFA로 완충된 물 / ACN; 20% 내지 40% ACN 10분, 다음으로 40% 내지 100% ACN 2분의 구배; 254 nm 및 220 nm에서의 UV 워터스 2489 UV 검출기)에 의해 정제되었다. 화합물 13이 흰색 고체의 형태로 20% (20 mg)의 수율로 획득되었다.
LC/MS/UV　(아센티스 익스프레스 C18, 2.7 um, 4.6 x 100 mm; 1.5 mL/분, 40℃, 물 (0.05 % TFA)에서 10 내지 95% 메탄올, 8분); ESI　(C48H76N6O8, 정확한 질량 864.57) m/z: 865.6 (MH+), 6.05분 (90.9%, 210 nm).
1H NMR: (300MHz, CD3OD, ppm): δ (회전이성질체들의 존재) 7.32-7.19 (m, 9H); 4.9-4.65 (m, 3H); 4.2-4.0 (m, 1H); 3.9-0.86 (m, 59H).
화합물 14
(S)-2-((S)-2-((3-아미노벤질)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N-((3R,4S,5S)-3-메톡시-1-((S)-2-((1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-(((S)-2-페닐-1-(티아졸-2-일)에틸)아미노)프로필)피롤리딘-1-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸부탄아미드, 트리플루오로아세트산
Figure pct00130
화합물 14A: 터르 -부틸 (3-(하이드록시메틸)페닐) 카바메이트
Figure pct00131
(3-아미노페닐)메탄올 (3 g, 24.36 mmol, 1.00 당량)이 THF (60 mL)에 용해되었고, 이후에 디-터르-부틸 디카보네이트 (6.38 g, 29.23 mmol, 1.20 당량)가 다음으로 첨가되었다. 반응 혼합물은 상온에서 밤샘 동안 교반 하에 방치되었고, 다음으로 반응이 200 mL의 물을 첨가하여 희석되었다. 산물은 100 mL의 AcOEt로 3번 추출되었고, 유기상들은 조합되었고, 소듐 설페이트 위에서 건조되어 여과되었으며, 노란색 오일의 형태로 조산물 (13.85 g의 화합물 14A)을 수득하도록 감압 하에 농축되었다.
화합물 14B: 터르 -부틸 (3-포르밀페닐)카바메이트
Figure pct00132
화합물 14A (13.8 g, 61.81 mmol, 1.00 당량)이 DCE (400 mL)에 용해되었고, 다음으로 MnO2 (54 g, 621.14 mmol, 10.05 당량)가 첨가되었다. 혼합물은 상온에서 교반 하에 3일 동안 방치되었고, 이후에 고체들이 여과에 의해 제거되었다. 여과물은 증발되어 건조되었고, 잔류물은 흰색 고체의 형태로 3 g (22%)의 화합물 14B를 수득하도록 실리카 컬럼 상에서 EtOAc 및 PE의 혼합물 (1:30)로 정제되었다.
화합물 14C: 벤질 (S)-2-((3-((터르 -부톡시카보닐)아미노)벤질) (메틸)아미노)-3-메틸부타노에이트
Figure pct00133
화합물 14B (1 g, 4.52 mmol, 1.00 당량)이 화합물 1ZC (1.16 g, 4.50 mmol, 1.00 당량), DIEA (3 mL) 및 NaBH(OAc)3 (1.92 g, 9.06 mmol, 2.01 당량)의 존재 시 20 mL의 THF에 용해되었다. 반응 혼합물은 상온에서 교반 하에 밤샘 동안 방치되었고, 다음으로 100 mL의 물로 중화되었으며, 50 mL의 AcOEt로 3번 추출되었다. 유기상들은 조합되었고, 소듐 설페이트 위에서 건조되었으며, 여과되어 농축되었다. 잔류물은 흰색 고체의 형태로 1.9 g (99%)의 화합물 14C를 수득하도록 실리카 컬럼 상에서 EtOAc 및 PE의 혼합물 (1:50)로 정제되었다.
화합물 14D: (S)-2-((3-((터르 -부톡시카보닐)아미노)벤질)(메틸)아미노)-3-메틸부타노산
Figure pct00134
화합물 14C (1 g, 2.34 mmol, 1.00 당량)가 Pd/C (400 mg)의 존재 시 30 mL의 AcOEt 및 4 mL의 메탄올에 용해되었고, 상온 및 대기압에서 1시간 동안 수소화되었다. 반응 배지는 여과되었고, 흰색 고체의 형태로 680 mg (86%)의 화합물 14D를 수득하도록 감압 하에 농축되었다.
화합물 14E: 터르 -부틸 (3-((3S,6S,9S,10R)-9-((S)-s세크-부틸)-3,6-디이소프로필-10-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-(((S)-2-페닐-1-(티아졸-2-일)에틸)아미노)프로필)피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)-2,8-디메틸-4,7-디옥소-11-옥사-2,5,8- 트리아자도데실)페닐) 카바메이트
Figure pct00135
화합물 14E가 화합물 3의 경우와 동일한 방식으로 DCM (3 mL)에서 아민 1Y (100 mg, 0.15 mmol, 1.00 당량), 산 14D (102.27 mg, 0.30 mmol, 2.00 당량), DEPC (0.053 mL) 및 DIEA (0.046 mL)로부터 합성되었다. 조산물 (80 mg)은 흐린 노란색 고체의 형태로 100 mg (67%)의 화합물 14E를 수득하도록 실라카 컬럼 상에서 EtOAc 및 PE의 혼합물 (1:1)로 정제되었다.
화합물 14는 화합물 2의 경우와 동일한 방식으로 중간체 14E (100 mg, 0.10 mmol, 1.00 당량)로부터 합성되었다. 조산물 (80 mg)은 제조용 HPLC (프리-HPLC-001 SHIMADZU, SunFire 프렙 C18 OBD 컬럼, 5 um, 19 x 150 mm; 용출상: 0.05% TFA로 완충된 물 / ACN; 20% 내지 40% ACN 10분, 다음으로 40% 내지 100% ACN 2분의 구배; 254 nm 및 220 nm에서의 UV 워터스 2489 UV 검출기)에 의해 정제되었다. 화합물 14가 흰색 고체의 형태로 10% (10 mg)의 수율로 획득되었다.
LC/MS/UV　(에클립스 플러스 C8 컬럼, 3.5 um, 4.6 x 150 mm; 40℃; 1.0 mL /분, 물 (0.05 % TFA)에서 40% 내지 95% MeOH 18분); ESI　(C48H73N7O6S, 정확한 질량 875.5) m/z: 876.5 (MH+) 및 438.9 (M.2H+/2, 100 %), 11.35분 (95.6 %, 210 nm).
1H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ (회전이성질체들의 존재) 8.92 - 8.86 (m, 0.4H, NH 불완전한 교환); 8.70 - 8.54 (m, 0.6H, NH 불완전한 교환); 7.88 - 7.78 (m, 1H); 7.60 - 7.50 (m, 1H); 7.45 - 6.97 (m, 9H); 5.80 - 5.65 (m, 1H); 4.85 - 4.70 (m, 1H); 4.40 - 0.80 (m, 56H).
화합물 15
메틸 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-아미노벤질) (메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3- 페닐프로파노에이트, 트리플루오로아세트산
Figure pct00136
화합물 15A: 메틸 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-((터르-부톡시카보닐)아미노)벤질)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트
Figure pct00137
화합물 15A가 화합물 3의 경우와 동일한 방식으로 DCM (5 mL)에서 아민 3D (200 mg, 0.32 mmol, 1.00 당량), 산 14D (212.6 mg, 0.63 mmol, 2.00 당량), DEPC (0.1103 mL) 및 DIEA (0.157 mL, 3.00 당량)으로부터 합성되었다. 조산물은 노란색 고체의 형태로 200 mg (67%)의 화합물 15A를 수득하도록 실리카 컬럼 상에서 EtOAc 및 PE의 혼합물 (1:1)로 정제되었다.
화합물 15: 화합물 15가 화합물 2의 경우와 동일한 방식으로 중간체 15A (200 mg, 0.21 mmol, 1.00 당량)로부터 합성되었다. 조산물은 제조용 HPLC (프리-HPLC-001 SHIMADZU, SunFire 프렙 C18 OBD 컬럼, 5 um, 19 x 150 mm; 용출상: 0.05% TFA로 완충된 물 / ACN; 20% 내지 40% ACN 10분, 다음으로 40% 내지 100% ACN 2분의 구배; 254 nm 및 220 nm에서의 UV 워터스 2489 UV 검출기)에 의해 정제되었다. 화합물 15가 흰색 고체의 형태로 19% (38.6 mg)의 수율로 획득되었다.
LC/MS/UV　(아센티스 익스프레스 C18 컬럼, 2.7 um, 4.6 x 100 mm; 40℃; 1.5　mL/분, 물 (0.05 % TFA)에서 10% 내지 95% MeOH 8분); ESI　(C47H74N6O8, 정확한 질량 850.5) m/z: 851.5 (MH+) 및 426.4 (M.2H+/2, 100%), 6.61분 (91.1%, 210 nm).
1H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ (회전이성질체들의 존재) 7.53 - 7.42 (m, 1H); 7.35 - 7.18 (m, 8H); 4.88 - 4.79 (m, 2H); 4.42 - 4.00 (m, 3H); 3.93 - 2.71 (m, 22H); 2.61 - 0.81 (m, 33H).
화합물 20
(S)-2-((S)-2-((4-아미노벤질)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N-((3R,4S,5S)-3-메톡시-1-((S)-2-((1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-(((S)-2-페닐-1-(티아졸-2-일)에틸)아미노)프로필)피롤리딘-1-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸부탄아미드, 트리플루오로아세트산
Figure pct00138
화합물 20은 화합물 1과 동일한 방식으로 아민 1ZC 및 해당하는 알데하이드로부터 제조되었다.
화합물 20의 제조에 관여하는 4-니트로벤즈알데하이드는 시판되고 있다.
화합물 20의 합성은 니트로기를 환원하여 완성되었다. 이것은 다음과 같이 수행되었다: (2S)-N-[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-[[(1S,2R)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카바모일]-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N,3-디메틸-2-[(2S)-3-메틸-2-[메틸[(4-니트로페닐)메틸]아미노]부탄아미도]부탄아미드 (40 mg, 0.05　mmol, 1.0 당량)가 15 mL의 에탄올에 용해되었다. 디하이드레이트화 염화 주석 (Ⅱ) (317 mg, 1.4 mmol, 30 당량)이 첨가되었고, 용액이 상온에서 3시간 동안 교반 하에 방치되었다. 반응이 50 mL의 물로 중화되었고, 다음으로 50 mL의 EtOAc로 3번 추출되었다. 유기상들이 조합되었고, 무수 소듐 설페이트 위에서 건조되어 여과되었으며, 감압 하에 농축되었고, 미가공 형태로 화합물 20을 수득하였다 (순도: 93.2%; 정량: 21.6 mg).
화합물은 제조용 HPLC (프리-HPLC-001 SHIMADZU, SunFire 프렙 C18 OBD 컬럼, 5 um, 19 x 150 mm; 용출상: 0.05% TFA로 완충된 물 / ACN; 20% 내지 40% ACN 10분, 다음으로 40% 내지 100% ACN 2분의 구배; 254 nm 및 220 nm에서의 UV 워터스 2489 UV 검출기)에 의해 정제되었고, 흰색 고체의 형태로 해당하는 TFA 염들을 주었다.
1H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): δ (입체이성질체들의 존재) 7.85-7.80 (m, 1H); 7.6-7.5 (m, 1H); 7.4-7.15 (m, 5H); 7.1-7.05 (m, 2H); 6.73-6.70 (m, 2H); 5.8-5.55 (m, 1H); 5.0-4.7 (m, 2H); 4.25-4.05 (m, 1H); 4.0-0.8 (m, 54H). LC/MS/UV ESI:　(C48H73N7O7S, 정확한 질량 875.53) m/z 876 (MH+), 439 [75%, (M.2H+)/2]; UV: RT = 4.83분 (96.8%, 254 nm). 1H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ (입체이성질체들의 존재) 7.85-7.80 (m, 1H); 7.6-7.5 (m, 1H); 7.4-7.1 (m, 7H); 6.76-6.72 (m, 2H); 5.8-5.55 (m, 1H); 4.9-4.65 (m, 2H); 4.25-4.05 (m, 1H); 4.0-0.8 (m, 54H).
화합물 29
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-아미노벤질) (메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노산, 트리플루오로아세트산
Figure pct00139
화합물 15 (100 mg, 0.10 mmol, 1.00 당량)은 물 (5 mL), ACN (5 mL) 및 피페리딘 (2.5 mL)의 혼합물에 용해되었다. 반응 혼합물은 상온에서 교반 하에 밤샘 동안 방치되었고, 다음으로 감압 하에 농축되었다. 잔류물은 제조용 HPLC (프리-HPLC-001 SHIMADZU, SunFire 프렙 C18 OBD 컬럼, 5 um, 19 x 150 mm; 용출상: 0.05% TFA로 완충된 물 / ACN; 20% 내지 40% ACN 10분, 다음으로 40% 내지 100% ACN 2분의 구배; 254 nm 및 220 nm에서의 UV 워터스 2489 UV 검출기)에 의해 정제되었고, 흰색 고체의 형태로 20 mg (20%)의 화합물 29를 수득하였다.
LC/MS/UV　(에클립스 플러스 C8 컬럼, 3.5 um, 4.6 x 150 mm; 40℃; 1.0 mL /분, 물 (0.05 % TFA)에서 40% 내지 95% MeOH 18분); ESI　(C48H72N6O8, 정확한 질량 836.54) m/z: 837.5 (MH+) 및 419.4 (M.2H+/2, 100%), 10.61분 (92.5%, 210 nm).
1H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): δ (입체이성질체들의 존재) 7.38 - 7.15 (m, 6H); 7.00 - 6.99 (m, 3H); 4.85 - 4.68 (m, 2H); 4.37 - 3.38 (m, 11H); 3.31 - 2.70 (m, 8H); 2.60 - 0.82 (m, 35H).
화합물 61
(S)-2-((S)-2-((4-아미노펜에틸)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N-((3R,4S,5S)-3-메톡시-1-((S)-2-((1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-(((S)-2-페닐-1-(티아졸-2-일)에틸)아미노)프로필)피롤리딘-1-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸부탄아미드
Figure pct00140
화합물 61A: N-(4-아미노펜에틸)-N-메틸-L-발린 디염산
Figure pct00141
화합물 11D (962 mg, 2.75 mmol)은 프로판-2-올 (5 내지 6 M)에서 HCl의 시판되는 용액 10 mL에 용해되었고, 실온에서 2시간 동안 교반되었다. TLC 분석은 시작 물질의 완벽한 소모를 지시하였다. 용매는 감압 하에서 증발되었고, 결과로 얻은 노란색 고체는 Et2O (2 x 10 mL)로 추출되었다. 산물은 진공 하에 건조되었고, 노란색 고체로서 화합물 61A를 공급하였다 (322 mg, 47%).
화합물 61: 카복실산 61A (73 mg, 0.23 mmol, 1 당량) 및 아민 1Y (150 mg, 0.23 mmol, 1 당량)은 건조 DMF (2 ml)에 용해되었다. DIEA (158 μl, 0.90 mmol, 4 당량) 및 DECP (DEPC라고도 역시 불림) (51 μl, 0.34 mmol, 1.5 당량)이 첨가되었고, 반응은 실온에서 4시간 동안 교반되었다. LC-MS에 의한 분석은 시작 물질의 완벽한 소모를 보여주었다. 용매는 감압 하에서 증발되었고, 잔류물은 실리카겔 상에서 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제되었고 (DCM/MeOH), 노란색 고체로서 화합물 61을 공급하였다 (83 mg, 40%).
1H NMR: (500MHz, DMSO-d 6, ppm): δ (입체이성질체들의 존재), 8.86 (d, 0.5H, NHCO); 8.65 (d, 0.5H, NHCO), 8.11-8.05 (m, 1H, NHCO), 7.80 (d, 0.5H, 티아졸), 7.78 (d, 0.5H, 티아졸), 7.65 (d, 0.5H, 티아졸), 7.63 (d, 0.5H, 티아졸), 7.32 - 7.12 (m, 5H), 6.83 (d, J=8.3 Hz, 2H), 6.45 (d, J=8.3 Hz, 2H), 5.56 - 5.49 (m, 0.5 H), 5.42 - 5.35 (m, 0.5H), 4.78 (s, 2H, NH2), 4.74 - 4.46 (m, 2H), 4.01 - 0.66 (m, 57H).
HPLC　(X브리지 쉴드 C18, 3.5 μm, 4.6 x 50 mm　; 3.5 ml/분, 40℃, 물 (0.1% TFA)에서 0 내지 95% MeCN 2.25분, 다음으로 95% MeCN 0.5분, Tr = 1.31분 (96.5%, 220 nm).
m/z (Q-TOF ESI+) 890.5558 (2%, MH+, C49H76N7O6S 890.5572 요구), 445.7834 (100%, (MH2)2+, C49H77N7O6S 445.7823 요구).
화합물 62
메틸((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-아미노펜에틸)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일)-L-페닐알라니네이트
Figure pct00142
화합물 62는 카복실산 61A (69 mg, 0.21 mmol, 1 당량), 아민 3D (135 mg, 0.21 mmol, 1 당량), DIEA (75 μl, 0.43 mmol, 2 당량) 및 DECP (49 μl, 0.32 mmol, 1.5 당량)을 사용하여 화합물 61과 동일한 방식으로 제조되었다. 조산물은 실리카겔 상에서 플라쉬 크로마토그래피에 의해 정제되었고 (DCM/MeOH), 노란색 고체로서 화합물 62를 공급하였다 (82 mg, 45%).
1H NMR: (500MHz, DMSO-d 6, ppm): δ (입체이성질체들의 존재), 8.50 (d, J=8.3, 0.5H, NHCO); 8.27 (d, J=8.0, 0.5H, NHCO), 8.15-8.04 (m, 1H, NHCO), 7.27 - 7.13 (m, 5H), 6.86 - 6.79 (m, 2H), 6.48 - 6.42 (m, 2H), 4.78 (s, 2H, NH2), 4.74 - 4.44 (m, 3H), 4.01 - 3.72 (m, 1.5H), 3.66 (s, 1.5H, CO2Me), 3.63 (s, 1.5H, CO2Me), 3.57 - 0.65 (m, 55.5H).
HPLC　(X브리지 쉴드 C18, 3.5 μm, 4.6 x 50 mm　; 3.5 ml/분, 40℃, 물 (0.1% TFA)에서 0 내지 95% MeCN 2.25분, 다음으로 95% MeCN 0.5분, Tr = 1.29분 (95.3%, 220 nm).
m/z (Q-TOF ESI+) 865.5800 (2%, MH+, C48H77N6O8 865.5797 요구), 433.2937 (100 %, (MH2)2+, C48H78N6O8 433.2935 요구).
화합물 63
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-아미노펜에틸)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일)-L-페닐알라닌 2,2,2-트리플루오로아세테이트
Figure pct00143
화합물 62 (23 mg, 0.03 mmol)은 물 (1 mL) 및 아세토니트릴 (1 mL)의 혼합물에 용해되었다. 피페리딘 (0.75 ml)이 첨가되었고, 혼합물은 실온에서 5시간 동안 교반되었다. TLC 분석은 시작 물질의 완벽한 소모를 지시하였다. 용매는 감압 하에 증발되었고, 잔여물은 제조용 HPLC (SunFire 프렙 C18 OBD, 5 um, 19 x 150 mm; 유동상: 0.05% TFA로 완충된 물 / MeCN; 20% 내지 40% MeCN 10분, 다음으로 40% 내지 100% MeCN 2분의 구배; 254 nm 및 220 nm에서 UV 워터스 2545 검출기)에 의해 정제되었고, 흰색 고체로서 화합물 63을 수득하였다 (14 mg, 66 %).
1H NMR: (500MHz, DMSO-d 6, ppm): δ (입체이성질체들의 존재), 12.7 (s(br), 1H, CO2H), 9.58 (m(br), 1H); 9.04 - 8.89 (m, 1H), 8.41 (d, 0.6H, NHCO), 8.15 (d, 0.4H, NHCO), 7.27 - 7.13 (m, 5H), 7.13 - 6.99 (m(br), 2H), 6.90 - 6.64 (s(br), 2H), 4.77 - 3.40 (m, 10H), 3.34 - 2.75 (m, 20H), 2.34 - 1.94 (m, 4H), 1.90 - 0.7 (m, 25H).
HPLC　(X브리지 쉴드 C18, 3.5 μm, 4.6 x 50 mm　; 3.5 ml/분, 40℃, 물 (0.1% TFA)에서 0 내지 95% MeCN 2.25분, 다음으로 95% MeCN 0.5분, Tr = 1.24분 (100%, 220 nm).
m/z (Q-TOF ESI+) 851.5641 (6%, MH+, C47H75N6O8 851.5641 요구), 426.2854 (100 %, (MH2)2+, C47H76N6O8 426.2857 요구).
실시예 17: 약물들의 항증식 활성
방법:
세포 배양
A549 (비소세포 폐암 - ATCC CCL-185) 및 MDA-MB-231 (유방 샘암종 - ATCC HTB-26) 세포들이 5% 우태아 혈청 (FCS)를 가진 MEM (Minimum Essential Medium Eagle) 및 10% FCS를 가진 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)로 각각 배양되었다. MCF7 (유방 관상 암종 - ATCC HTB-22) 및 SN-12C (신장 암종 - ATCC) 세포들은 10% FCS를 포함하는 RPMI1640 배지 (MCF-7 세포들을 위해 페놀 레드 없음)에서 유지되었다. 모든 배지들은 펀지존 (1.25 ug/mL) 및 페니실린-스트렙토마이신 (100 U / 100 ug/mL)이 보충되었다. 세포들은 표준 조건들 하에, 37℃ 5% CO2 및 95% 대기 습도에서 배양기로 배양되었다.
4가지의 종양성 세포주들에서 항증식 활성
선택된 약물들은 4가지의 세포주들의 포괄적인 패널에서 ATPlite 증식 검정법 (퍼킨 엘머사, 프랑스 빌레본 수르 이베뜨)를 사용하여 그들의 항증식 활성에 대하여 조사되었다. 세포들이 0일째 72시간의 약물 처리 기간 전체를 통하여 지수적 세포 성장기로 유지되는 세포들을 보장하는 농도로 96 웰 플레이트들에 접종되었다 (A549의 경우 103개 세포들/웰, MCF7, MDA-MB-231 및 SN12C의 경우 2 × 103개). 24시간 배양 이후에, 모든 세포들이 테스트된 화합물들의 일련의 희석들 (1% DMSO에 넣은 11 uL의 10× 용액 - 6개 웰들/조건)로 처리되었다. 팁들 위에 화합물들의 부착을 피하기 위하여, 팁들은 두 가지 연속적 희석들 간에 교환되었다. 다음으로 세포들은 37℃, 5% CO2 배양기에 두었다. 4일째, 세포 생존도가 생존가능 세포들에 의해 방출된 ATP를 정량하여 평가되었다. 생존가능 세포들의 수는 용매 처리된 세포들의 수와 비교로 분석되었다. EC50 수치들이 그래프패드 소프트웨어 (그래프패드 소프트웨어사, 미국 CA)에 의해 제공된 알고리즘으로 수행되는 곡선 적정 분석 (S자형 용량 반응을 가진 비선형 회귀 모델, 다양한 경사 기울기 계수)으로 결정되었다.
결과들:
다양한 약물들:
다양한 약물들이 상기-기술된 방법에 따라 MDA-MB-231 세포주에 미치는 그들의 항증식 활성을 결정하도록 테스트되었다. 측정된 활성들은 EC50　< 0.1 uM의 수치들을 주었다.
상기 예시된 약물들 중에서 선택된 소수의 다음의 실시예들이 그들의 전적으로 현저한 항증식 성질들을 설명하고 있다: 실시예 12: EC50 = 5.80 × 10-10 M; 실시예 13: EC50 = 7.95 × 10-8 M; 실시예 15: EC50 = 1.70 × 10-10 M; 실시예 27: EC50 = 1.20 × 10-10 M.
다양한 세포주들:
화합물 15는 상기-기술된 방법에 따라 서로 다른 세포주들 (A549, MDA-MB-231, MCF-7, SN12C)에서 테스트되었다. 측정된 활성들은 모든 테스트된 세포주들에서 EC50　<　 0.1 uM의 수치들을 주었다.
Figure pct00144
비교 실시예들:
페닐 고리에서 치환 (아미노 대비 카복실)이 하기 비교 실시예들에서 연구되었고, 아미노 치환기를 포함하는 본 발명에 따른 약물들의 개선된 항증식 활성을 보여준다.
Figure pct00145
실시예 18: 약물-링커 분체의 합성
화합물 E-11
4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질 (4-((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-세크-부틸)-7,10-디이소프로필-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-(((S)-2-페닐-1-(티아졸-2-일)에틸)아미노)프로필)피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)-5,11-디메틸-6,9-디옥소-2-옥사-5,8,11-트리아자트리데칸-13-일)페닐)(메틸)카바메이트 2,2,2-트리플루오로아세테이트
Figure pct00146
화합물 E-11-1: 메틸 (S)-2-아미노-5-우레이도펜타노에이트 염산
Figure pct00147
아세틸 클로라이드 (10 mL)가 0℃에서 MeOH (120 mL)에 교반하면서 한 방울씩 첨가되었다. 20분 이후에, L-시트룰린 (10 g, 57 mmol, 1.00 당량)이 첨가되었고, 혼합물은 환류로 밤샘 동안 가열되었다. 용매가 감압 하에 증발되었고, 흰색 고체로서 15 g (116%)의 화합물 E-11-1를 수득하였다. 산물은 추가 건조 없이 다음 단계에 사용되었다.
화합물 E-11-2: 메틸 (S)-2-((S)-2-((터르-부톡시카보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜타노에이트
Figure pct00148
화합물 E-11-1 (13 g, 57.6 mmol, 1.1 당량)가 불활성 대기에서 0℃에 DMF (140 mL)에 용해되었다. DIEA (30 mL, 173 mmol, 3.0 당량), 하이드록시벤조트리아졸 (HOBt - 10.59 g, 69.1 mmol, 1.2 당량) 및 Boc-L-발린 하이드록시숙시니미드 에스테르 (Boc-Val-OSu - 18.1 g, 57.6 mmol, 1.0 당량)가 첨가되었다. 반응 혼합물은 상온에서 밤샘 동안 교반되었고, 다음으로 용매가 감압 하에 증발되었다. 잔류물은 물 (100 mL)에 용해되었고, DCM (150 mL)으로 2번 추출되었다. 유기상들은 조합되었고, Na2SO4 위에서 건조되었으며 감압 하에서 농축되었다. 잔류물은 실리카겔 (DCM/MeOH) 상에서 흰색 고체로서 18.8 g (84%)의 화합물 E-11-2를 수득하도록 정제되었다.
화합물 E-11-3: (S)-2-((S)-2-((터르-부톡시카보닐)아미노)-3-메틸 부탄아미도)-5-우레이도펜타노산
Figure pct00149
화합물 E-11-2 (18.8 g, 48.4 mmol, 1 당량)가 0℃에서 MeOH (200 mL)에 용해되었다. NaOH 1 M (72 mL, 72 mmol, 1.5 당량)의 용액이 첨가되었고, 혼합물이 실온에서 2시간 동안 교반되었다. MeOH가 감압 하에 제거되었고, 남은 수용성 용액은 HCl 1 M로 산성화되었다. 수용성 상은 증발되어 건조되었고, 잔류물은 실리카겔 (DCM/MeOH) 상에서 흰색 고체로서 18 g (99%)의 화합물 E-11-3를 수득하도록 정제되었다.
화합물 E-11-4: 터르-부틸 ((S)-1-(((S)-1-((4-(하이드록시메틸)페닐) 아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카바메이트
Figure pct00150
화합물 E-11-3 (5g, 13.4 mmol, 1 당량)가 건조 DCM (65 ml) 및 건조 MeOH (35 ml)의 혼합물에 용해되었다. (4-아미노페닐)메탄올 (1.81 g, 14.7 mmol, 1.1 당량) 및 N-에톡시카보닐-2-에톡시-1,2-디하이드로퀴놀린 (EEDQ - 6.60 g, 26.7 mmol, 2 당량)이 첨가되었고, 혼합물이 암소에서 밤샘 동안 교반되었다. 용매들은 감압 하에 증발되었고, 잔류물은 실리카겔 (DCM/MeOH) 상에서 회백색 고체로서 5.2 g (73%)의 화합물 E-11-4를 수득하도록 정제되었다.
화합물 E-11-5: 터르-부틸 ((S)-3-메틸-1-(((S)-1-((4-((((4-니트로펜옥시)카보닐)옥시)메틸)페닐)아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일)아미노)-1-옥소부탄-2-일)카바메이트
Figure pct00151
화합물 E-11-4 (1.1 g, 2.29 mmol, 1 당량)가 불활성 대기에서 상온으로 건조 DMF (5 ml)에 용해되었다. 비스(4-니트로페닐) 카보네이트 (1.40 g, 4.59 mmol, 2 당량)가 첨가되었고, DIEA (600 uL, 3.44 mmol, 1.5 당량)가 이어졌으며, 결과로 얻은 노란색 용액은 밤샘 동안 교반되었다. DMF는 감압 하에 증발되었고, 잔류물은 실리카겔 (DCM/MeOH) 상에서 회백색 고체로서 1.27 g (84%)의 화합물 E-11-5를 수득하도록 정제되었다.
화합물 E-11- 6: 4-((S)-2-((S)-2-((터르-부톡시카보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질 (4-((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-세크-부틸)-7,10-디이소프로필-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-(((S)-2-페닐-1-(티아졸-2-일)에틸)아미노)프로필)피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)-5,11-디메틸-6,9-디옥소-2-옥사-5,8,11-트리아자트리데칸-13-일)페닐)(메틸)카바메이트 2,2,2-트리플루오로아세테이트
Figure pct00152
카보네이트 E-11-5 (114 mg, 0.177 mmol, 1.2 당량) 및 아닐린 11F (150 mg, 0.147 mmol, 1 당량)이 건조 DMF (4 mL)에 용해되었다. HOBt (38 mg, 0.295 mmol, 2 당량) 및 DIEA (54 uL, 0.295 mmol, 2 당량)가 첨가되었고, 혼합물이 실온에서 한 주 동안 교반되었다. DMF가 감압 하에 증발되었고, 잔류물은 실리카 상에서 DCM로 용출되면서 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 산물은 제조용 HPLC (워터스 600E, SunFire 프렙 C18 OBD 컬럼, 5 um, 19 x 100 mm; 용출상: 0.1% TFA로 완충된 물/MeCN; 5% 내지 100% MeCN의 구배 15분; 2220 nM에서의 워터스 2487 UV 검출기)에 의해 재정제되었다. 선별된 분획들이 조합되었고, 흰색 고체로서 화합물 E-11-6를 공급하도록 동결건조되었다 (89 mg, 39 %).
화합물 E-11:
Figure pct00153
화합물 E-11-6 (21 mg, 0.014 mmol, 1.0 당량)이 DCM (0.25 mL)에 용해되었고, TFA (40 uL)가 첨가되었다. 용액은 실온에서 2시간 교반되었고, 이후에 LC-MS 분석은 시작 물질의 완전한 소모를 가리켰다. 혼합물은 TFA를 중화하기 위하여, DMF (0.5 mL)와 다음으로 DIEA (100 uL)를 동시에 첨가하면서 바로 냉각되었다 (액체 질소의 수조). 다음으로 냉각 수조가 제거되었고, 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (4 mg, 0.012 mmol, 1 당량)가 첨가되었다. 혼합물은 실온에서 48시간 교반되었고, 산물은 제조용 HPLC (워터스 600E, SunFire 프렙 C18 OBD 컬럼, 5 um, 19 x 100 mm; 용출상: 0.1% TFA로 완충된 물/MeCN; 5% 내지 100% MeCN의 구배 15분; 220 nM에서의 워터스 2487 UV 검출기)에 의해 정제되었다. 선별된 분획들은 조합되었고, 흰색 고체로서 화합물 E-11를 공급하도록 동결건조되었다 (11 mg, 54%).
m/z (Q-TOF MS ESI+) 1524.8282 (2%, MNa+, C79H115N13NaO14S 1524.8299), 751.9283 (100%, (MH2)2+, C79H117N13O14S 751.9276 요구).
화합물 E-12
메틸 ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질)옥시)카보닐)(메틸)아미노)펜에틸)(메틸) 아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일)-L-페닐알라니네이트 2,2,2-트리플루오로아세테이트
Figure pct00154
화합물 E-12-1: 터르 --부틸 ((S)-3-메틸-1-옥소-1-(((S)-1-옥소-1-((4-((((퍼플루오로펜옥시)카보닐)옥시)메틸)페닐)아미노)-5-우레이도펜탄-2-일)아미노)부탄-2-일)카바메이트부틸
Figure pct00155
화합물 E-11-4 (670 mg, 1.26 mmol, 1 당량)이 불활성 대기에서 0℃에 건조 DMF (6 ml)에 용해되었다. 비스(퍼플루오로페닐) 카보네이트 (991 mg, 2.51 mmol, 2 당량)가 첨가되었고, DIEA (329 uL, 1.89 mmol, 1.5 당량)가 이어졌으며, 결과로 얻은 무색 용액이 실온에서 30분 동안 교반되었다. DMF가 감압 하에 증발되었고, 잔류물이 실리카겔 (DCM/MeOH) 상에서 회백색 고체로서 836 mg (96%)의 화합물 E-12-1를 수득하도록 정제되었다.
화합물 E-12-2: 메틸 ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-((터르-부톡시카보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질)옥시)카보닐)(메틸)아미노)펜에틸)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일)-L-페닐알라니네이트 2,2,2-트리플루오로아세테이트
Figure pct00156
아닐린 12 (165 mg, 0.189 mmol, 1.0 당량)이 불활성 대기에서 0℃에 DMF (5 mL)에 용해되었다. 카보네이트 E-12-1 (194 mg, 0.282 mmol, 1.5 당량), HOBt (51 mg, 0.375 mmol, 2 당량) 및 DIEA (66 uL, 0.375 mmol, 2 당량)가 첨가되었고, 혼합물이 실온에서 8시간 동안 교반되었다. 용매가 감압 하에 증발되었고, 잔류물은 제조용 HPLC (워터스 600E, SunFire 프렙 C18 OBD 컬럼, 5 um, 19 x 100 mm; 용출상: 0.1% TFA로 완충된 물/MeCN; 5% 내지 100% MeCN의 구배 15분; 220 nM에서의 워터스 2487 UV 검출기)에 의해 정제되었다. 선별된 분획들은 조합되었고, 흰색 고체로서 화합물 E12-7를 공급하도록 동결건조되었다 (247 mg, 77%).
화합물 E-12-3: 메틸 ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질)옥시) 카보닐)(메틸)아미노)펜에틸)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일)-L-페닐알라니네이트 비스(2,2,2-트리플루오로아세테이트)
Figure pct00157
화합물 E-12-2 (5.6 mg, 4.04 umol, 1.0 당량)가 TFA (100 uL)에 용해되었다. 5분 이후에, 2 mL의 물이 첨가되었고, 혼합물이 회백색 고체로서 화합물 E-12-3를 수득하도록 동결건조되었다 (5.6 mg, 98%).
화합물 E-12:
Figure pct00158
화합물 E-12-3 (5.6 mg, 4 umol, 1.0 당량)이 아세토니트릴 (0.5 mL)에 용해되었고, DIEA (5 uL, 7 당량)가 첨가되었고, 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (2.5 mg, 8 umol, 2 당량)가 이어졌다. 혼합물은 실온에서 6시간 동안 교반되었다. LC-MS에 의해 반응을 조절한 이후에, 200 uL의 물이 첨가되었고, 결과로 얻은 용액은 제조용 HPLC (워터스 600E, SunFire 프렙 C18 OBD 컬럼, 5 um, 19 x 100 mm; 용출상: 0.1% TFA로 완충된 물/MeCN; 5% 내지 100% MeCN의 구배 15분; 220 nM에서의 워터스 2487 UV 검출기)에 의해 정제되었다. 선별된 분획들은 조합되었고, 흰색 고체로서 화합물 E-12를 공급하도록 동결건조되었다 (4.6 mg, 70 %).
m/z (Q-TOF MS ESI+) 739.4389 (100%, (MH2)2+, C78H118N12O16 739.4389 요구).
화합물 E-13
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질)옥시)카보닐)(메틸)아미노)펜에틸)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일)-L-페닐알라니네이트 2,2,2-트리플루오로아세테이트
화합물 E-13-1: ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-((터르-부톡시카보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질)옥시)카보닐)(메틸)아미노)펜에틸)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일)-L-페닐알라닌
Figure pct00160
화합물 E-12-2 (185 mg, 0.123 mmol, 1.0 당량)이 실온에서 물 (5 mL) 및 아세토니트릴 (5 mL)에 용해되었다. 피페리딘 (3.67 mL, 300 당량)가 첨가되었고, 혼합물이 실온에서 6시간 동안 교반되었다. 용매들이 감압 하에 증발되었고, 잔류물은 Et2O (60 mL)로 분쇄되었다. 고체는 Et2O (20 mL)로 두 번 세척되었고, 회백색 고체로서 화합물 E-13-1를 수득하도록 진공 하에 건조되었다 (175 mg, 95%).
화합물 E-13-2: ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질)옥시)카보닐)(메틸)아미노)펜에틸)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일)-L-페닐알라닌 비스(2,2,2-트리플루오로아세테이트)
Figure pct00161
화합물 E-13-1 (175 mg, 0.128 mmol, 1.0 당량)이 TFA (200 uL)에 용해되었다. 5분 이후에, 물 (1 mL) 및 아세토니트릴 (1 mL)이 첨가되었고, 용액이 회백색 고체로서 화합물 E-13-2를 수득하도록 밤샘 동안 동결건조되었다 (180 mg, 87%).
화합물 E-13: ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질)옥시)카보닐)(메틸)아미노)펜에틸)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일) 피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일)-L-페닐알라닌, 2,2,2-트리플루오로아세테이트
Figure pct00162
화합물 E-13-2 (80 mg, 0.058 mmol, 1.0 당량)이 아세토니트릴 (1.5 mL) 및 DMF (0.4 mL)에 용해되었다. DIEA (50 uL, 0.289 mmol, 5 당량)가 첨가되었고, 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (36 mg, 0.116 mmol, 2 당량)가 이어졌다. 혼합물은 실온에서 3시간 동안 교반되었다. LC-MS에 의해 반응을 조절한 이후에, 용매가 감압 하에 증발되었고, 잔류물이 제조용 HPLC (워터스 600E, SunFire 프렙 C18 OBD 컬럼, 5 um, 19 x 100 mm; 용출상: 0.1% TFA로 완충된 물/MeCN; 5% 내지 100% MeCN의 구배 15분; 220 nM에서의 워터스 2487 UV 검출기)에 의해 정제되었다. 선별된 분획들이 조합되었고, 흰색 고체로서 화합물 E-13를 공급하도록 동결되었다 (32 mg, 35%).
m/z (Q-TOF MS ESI-) 1461.8336 (100%, (M-H)-, C77H113N12O16 1461.8403 요구). m/z (Q-TOF MS ESI+) 1463.8565 (2%, MH+, C77H115N12O16 1463.8549 요구), 732.4317 (100%, (MH2)2+, C77H116N12O16 732.4311 요구).
화합물 E-15
메틸 ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질)옥시)카보닐)아미노)벤질)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일)-L-페닐알라니네이트 2,2,2-트리플루오로아세테이트
Figure pct00163
화합물 E-15-1: 메틸 ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-((((4-((S)-2-((S)-2-((터르-부톡시카보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질)옥시)카보닐)아미노)벤질)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일)-L-페닐알라니네이트 2,2,2-트리플루오로아세테이트
Figure pct00164
화합물 E-15-1이 화합물 E-11-6의 경우와 동일한 방법에 따라 DMF (2 mL)에서 카보네이트 E-11-5 (28 mg, 0.044 mmol, 1 당량), 아닐린 15 (42 mg, 0.044 mmol, 1 당량), HOBt (3 mg, 0.022 mmol, 0.5 당량) 및 DIEA (15 uL, 0.087 mmol, 2 당량)를 사용하여 제조되었다. 화합물 E-15-1이 흰색 고체로서 분리되었다 (8.2 mg, 13%).
화합물 E-15-2: 메틸 ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-((((4-((S)-2-((S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질)옥시) 카보닐)아미노)벤질)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일)-L-페닐알라니네이트 비스(2,2,2-트리플루오로아세테이트)
Figure pct00165
화합물 E-15-1 (8.2 mg, 5.58 umol, 1.0 당량)가 TFA (200 uL)에 용해되었다. 5분 이후에, 물 (1 mL)이 첨가되었고, 용액은 흰색 고체로서 화합물 E-15-8를 수득하도록 동결건조되었다 (7.6 mg, 99%)
화합물 E-15:
Figure pct00166
화합물 E-15가 화합물 E-12의 경우 동일한 방법에 따라, 아세토니트릴 (0.5 mL)에서 아민 E-15-2 (7.6 mg, 5.55 umol, 1 당량), 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (2 mg, 6.65 umol, 1.2 당량) 및 DIEA (5 uL, 0.028 mmol, 5 당량)를 사용하여 제조되었다. 화합물 E-15은 흰색 고체로서 분리되었다 (4.2 mg, 48%).
m/z (Q-TOF MS ESI+) 1471.8169 (2%, MNa+, C76H112N12NaO16 1471.8211 요구), 725.4223 (100%, (MH2)2+, C76H114N12O16 725.4232 요구), 483.9482 (10 %, (MH3)3+, C76H115N12O16 483.9513 요구).
화합물 F-13
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-N-메틸-5-우레이도펜탄아미도)펜에틸)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일)-L-페닐알라닌 2,2,2-트리플루오로아세테이트
Figure pct00167
화합물 F-13-1: 벤질 N-(4-((터르-부톡시카보닐)(메틸)아미노) 펜에틸)-N-메틸-L-발리네이트
Figure pct00168
화합물 11C (250 mg, 0.567 mmol, 1 당량)이 THF (10 mL)에 용해되었고, NaH (미네랄 오일에서 60%, 68 mg, 1.702 mmol, 3 당량)의 첨가가 이어졌다. 혼합물은 요오드메탄 (106 uL, 1.702 mmol, 3 당량)을 첨가하기 이전에 5분 동안 교반되었다. 반응은 물로 정지시키고, EtOAc (100 mL) 및 물 (50 mL) 사이를 분리하기 이전에 실온에서 2시간 동안 교반되었다. 유기상은 MgSO4 위에서 건조되었고, 노란색 오일로서 화합물 F-13-1을 수득하도록 증발되어 건조되었고 (250 mg, 97%), 이것은 추가 정제 없이 사용되었다.
화합물 F-13-2: 벤질 N-메틸-N-(4-(메틸아미노)펜에틸)-L-발리네이트
Figure pct00169
Boc-보호된 아닐린 F-13-1 (250 mg, 0.550 mmol, 1 당량)이 MeOH (5 mL)에 첨가되었고, iPrOH (5 - 6 M)에 넣은 1 mL의 시판되는 HCl의 용액의 첨가가 이어졌다. 용액은 감압 하에 증발되어 건조되기 이전에 실온에서 2시간 동안 교반되었다. 결과로 얻은 노란색 오일은 Et2O로 분쇄되었고, 노란색 고체로서 화합물 F-13-2가 수득되었다 (202 mg, 94%).
화합물 F-13-3: 벤질 N-(4-((S)-2-((S)-2-((터르 -부톡시카보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N-메틸-5-우레이도펜탄아미도)펜에틸)-N-메틸-L-발리네이트
Figure pct00170
산 E-11-3 (190 mg, 0.508 mmol, 1.5 당량)이 건조 DMF (1 mL)에 용해되었고, DIEA (118 uL, 0.677 mmol, 2 당량), 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PyBOP - 264 mg, 0.508 mmol, 1.5 당량) 및 아닐린 F-13-2 (120 mg, 0.339 mmol, 1 당량)의 첨가가 이어졌다. 혼합물은 실온에서 밤샘 동안 교반되었고, 용매들은 감압 하에 증발되었다. 잔류물은 제조용 HPLC (워터스 600E, SunFire 프렙 C18 OBD 컬럼, 5 um, 19 x 100 mm; 용출상: 0.1% TFA로 완충된 물/MeCN; 5% 내지 100% MeCN의 구배 15분; 220 nM에서의 워터스 2487 UV 검출기)에 의해 정제되었다. 선별된 분획들은 조합되었고, 흰색 고체로서 화합물 F-13-3를 공급하도록 동결건조되었다 (140 mg, 45%).
화합물 F-13-4: N-(4-((S)-2-((S)-2-((터르 -부톡시카보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N-메틸-5-우레이도펜탄아미도)펜에틸)-N-메틸-L-발린
Figure pct00171
화합물 F-13-3 (116 mg, 0.163 mmol, 1 당량)이 Pd/C 10% (30 mg)의 존재 시 MeOH (5 ml)에 용해되었고 산온 및 대기압에서 2시간 동안 수소화되었다. 반응 배지가 여과되었고, 베이지색 고체로서 110 mg (99%)의 화합물 F-13-4를 수득하도록 감압 하에 농축되었다.
화합물 F-13-5: 메틸 ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-((터르-부톡시카보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N-메틸-5-우레이도펜탄아미도)펜에틸)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일)-L-페닐알라니네이트 2,2,2-트리플루오로아세테이트
Figure pct00172
아민 3D (89 mg, 0.140 mmol, 1 당량) 및 산 F-13-4 (145 mg, 0.210 mmol, 1.5 당량)가 건조 DMF (4 mL)에 용해되었고, PyBOP (109 mg, 0.210 mmol, 1.5 당량) 및 DIEA (73 uL, 0.420 mmol, 3 당량)가 첨가되었다. 혼합물은 실온에서 1시간 동안 교반되었고, 용매가 증발되었다. 잔류물은 EtOAc 및 물 사이에서 분리되었고, 유기상은 MgSO4 위에서 건조되었으며, 여과되어 감압 하에 증발되었다. 조산물은 제조용 HPLC (워터스 600E, SunFire 프렙 C18 OBD 컬럼, 5 um, 19 x 100 mm; 용출상: 0.1% TFA로 완충된 물/MeCN; 5% 내지 100% MeCN의 구배 15분; 220 nM에서의 워터스 2487 UV 검출기)에 의해 정제되었다. 선별된 분획들은 조합되었고, 흰색 고체로서 화합물 F-13-5를 공급하도록 동결건조되었다 (140 mg, 73%).
화합물 F-13-6: ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-((터르-부톡시카보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N-메틸-5-우레이도펜탄아미도) 펜에틸)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일)-L-페닐알라닌 2,2,2-트리플루오로아세테이트
Figure pct00173
화합물 F-13-5 (140 mg, 0.104 mmol, 1 당량)가 물 (4 mL), 아세토니트릴 (4 mL) 및 피페리딘 (2 mL)의 혼합물에 용해되었고, 실온에서 4시간 동안 교반되었다. 용매가 갑압 하에 증발되었고, 잔류물은 제조용 HPLC (워터스 600E, SunFire 프렙 C18 OBD 컬럼, 5 um, 19 x 100 mm; 용출상: 0.1% TFA로 완충된 물/MeCN; 5% 내지 100% MeCN의 구배 15분; 220 nM에서의 워터스 2487 UV 검출기)에 의해 정제되었다. 선별된 분획들은 조합되었고, 흰색 고체로서 화합물 F-13-6을 공급하도록 동결건조되었다 (115 mg, 83%).
화합물 F-13:
Figure pct00174
화합물 F-13이 화합물 E-11의 경우와 동일한 방법에 따라 DCM (0.5 mL) 및 TFA (100 L, 30 당량)에 넣은 Boc-보호된 아민 F-13-6 (55 mg, 0.041 mmol, 1.0 당량)을 사용하여 제조되었고, DMF (1 mL)로의 희석, (DIEA (320 uL, 45 당량)으로 반응 정지, 다음으로 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (15 mg, 0.049 mmol, 1.2 당량)과의 반응이 이어졌다. 제조용 HPLC에 의한 정제 및 동결건조 이후에, 화합물 F-13가 흰색 고체로서 획득되었다 (14 mg, 24%).
m/z (Q-TOF MS ESI+) 1314.8067 (2%, MH+, C69H108N11O14 1314.8072 요구), 657.9067 (100%, (MH2)2+, C69H109N11O14 657.9072 요구).
화합물 F-61
N-((S)-1-(((S)-1-((4-((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-세크-부틸)-7,10-디이소프로필-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-(((S)-2-페닐-1-(티아졸-2-일)에틸)아미노)프로필)피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)-5,11-디메틸-6,9-디옥소-2-옥사-5,8,11-트리아자트리데칸-13-일)페닐)아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 2,2,2-트리플루오로아세테이트
Figure pct00175
화합물 F-61-1: 벤질 N-(4-아미노펜에틸)-N-메틸-L-발리네이트 이염산
Figure pct00176
화합물 11C (1.0 g, 2.27 mmol, 1 당량)가 iPrOH (5 - 6 M)에 넣은 8 mL의 시판되는 HCl 용액에 용해되었다. 혼합물은 감압 하에 증발되어 건조되기 이전에 실온에서 2시간 동안 교반되었다. 잔류물은 Et2O (30 mL)로 분쇄되었고, 흰색 고체로서 화합물 F-61-1를 수득하도록 감압 하에 건조되었다 (916 mg, 98%).
화합물 F-61-2: 벤질 N-(4-((S)-2-((S)-2-((터르 -부톡시카보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)펜에틸)-N-메틸-L-발리네이트
Figure pct00177
산 E-11-3 (769 mg, 2.05 mmol, 1.5 당량)이 건조 DMF (2.5 mL)에 용해되었고, DIEA (957 uL, 5.48 mmol, 4 당량) 및 PyBOP (1.07 g, 2.05 mmol, 1.5 당량)의 첨가가 이어졌다. 아닐린 F-61-1 (566 mg, 1.369 mmol, 1 당량)이 첨가되었고, 혼합물은 실온에서 밤샘 동안 교반되었다. 용매들이 감압 하에 증발되었고, 잔류물은 실리카겔 (DCM/MeOH) 상에서 흰색 고체로서 969 mg (102%)의 화합물 F-61-2를 수득하도록 정제되었다.
화합물 F-61-3: N-(4-((S)-2-((S)-2-((터르 -부톡시카보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)펜에틸)-N-메틸-L-발린
Figure pct00178
화합물 F-61-2 (969 mg, 1.28 mmol, 1 당량)가 Pd/C 10% (270 mg)의 존재 시 MeOH (20 mL)에 용해되었고, 상온 및 대기압에서 3시간 동안 수소화되었다. 반응 배지가 여과되었고, 감압 하에 농축되었으며, 잔류물은 실리카겔 (DCM/MeOH/AcOH) 상에서 흰색 고체로서 520 mg (67%)의 화합물 F-61-3를 수득하도록 정제되었다.
화합물 F-61-4: 터르 -부틸 ((S)-1-(((S)-1-((4-((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-세크-부틸)-7,10-디이소프로필-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-(((S)-2-페닐-1-(티아졸-2-일)에틸)아미노)프로필)피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)-5,11-디메틸-6,9-디옥소-2-옥사-5,8,11-트리아자트리데칸-13-일)페닐)아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카바메이트 2,2,2-트리플루오로아세테이트
Figure pct00179
산 F-61-3 (67.5 mg, 0.111 mmol, 1.5 당량)이 건조 DMF (2 mL)에 용해되었고, DECP (17 UL, 0.111 mmol, 1.5 당량) 및 DIEA (39 uL, 0.223 mmol, 3 당량)가 첨가되었다. 실온에서 15분 동안 교반한 이후에, 아민 1Y (50 mg, 0.074 mmol, 1 당량)가 첨가되었고, 용액이 밤샘 동안 교반되었다. 용매가 감압 하에 증발되었고, 잔류물은 제조용 HPLC (워터스 600E, SunFire 프렙 C18 OBD 컬럼, 5 um, 19 x 100 mm; 용출상: 0.1% TFA로 완충된 물/MeCN; 5% 내지 100% MeCN의 구배 15분; 220 nM에서의 워터스 2487 UV 검출기)에 의해 정제되었다. 선별된 분획들은 조합되었고,. 흰색 고체로서 화합물 F61-4를 공급하도록 동결건조되었다 (28 mg, 28%).
화합물 F-61-5: (S)-2-((S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도)-N-(4- ((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-세크-부틸)-7,10-디이소프로필-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-(((S)-2-페닐-1-(티아졸-2-일)에틸)아미노)프로필)피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)-5,11-디메틸-6,9-디옥소-2-옥사-5,8,11-트리아자트리데칸-13-일)페닐)-5-우레이도펜탄아미드 비스 (2,2,2-트리플루오로아세테이트)
Figure pct00180
화합물 F-61-4 (28 mg, 0.021 mmol, 1.0 당량)가 TFA (200 uL)에 용해되었다. 5분 이후에, 물 (2 mL) 및 아세토니트릴 (0.5 mL)이 첨가되었고, 용액은 밤샘 동안 동결건조되어 무색 오일로서 화합물 F-61-5를 수득하였다 (38 mg, 134%).
화합물 F-61:
Figure pct00181
화합물 F-61-5 (28.3 mg, 0.020 mmol, 1 당량)가 아세토니트릴 (0.5 mL)에 용해되었고, 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (9 mg, 0.029 umol, 1.4 당량) 및 DIEA (25 uL, 0.143 mmol, 7 당량)가 이어졌다. 혼합물은 4.5시간 동안 교반되었고, 이후에 HPLC 분석이 시작 물질의 존재가 있지만, 숙시니미드의 완전한 소모를 보여주었다. 따라서 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트가 첨가되었고 (3 mg, 0.01 umol, 0.5 당량), 반응이 1.5시간 동안 교반되었다. HPLC 분석이 시작 물질의 완전한 소모를 보여주었다. 용매가 증발되어 건조되었고, 잔류물은 EtOAc/Et2O의 혼합물 (80/20)로 2회 분쇄되었고, 회백색으로서 화합물 F-61를 수득하였다 (19.4 mg, 70%).
m/z (Q-TOF MS ESI+) 1361.7725 (2%, MNa+, C70H106N12NaO12S 1361.7666 요구), 670.3961 (100%, (MH2)2+, C70H108N12O12S 670.3960 요구).
화합물 F-62:
메틸 ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)펜에틸)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일)-L-페닐알라니네이트 2,2,2-트리플루오로아세테이트
Figure pct00182
화합물 F-62-1: 메틸 ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-((터르-부톡시카보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)펜에틸)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일)-L-페닐알라니네이트 2,2,2-트리플루오로아세테이트
Figure pct00183
화합물 F-62-1가 화합물 F-61-4과 유사한 방식으로 아민 3D (100 mg, 0.158 mmol, 0.9 당량), 산 F-61-3 (108 mg, 0.178 mmol, 1 당량), DECP (41 uL, 0.267 mmol, 1.5 당량) 및 DIEA (93 uL, 0.534 mmol, 3 당량)으로부터 DMF (2 mL)에서 제조되었다. 제조용 HPLC에 의한 정제 이후에, 화합물 F-62-1가 흰색 고체로서 획득되었다 (93 mg, 39%).
화합물 F-62-2: 메틸 ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)펜에틸)(메틸) 아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일) 피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일)-L-페닐알라니네이트 비스(2,2,2-트리플루오로아세테이트)
Figure pct00184
화합물 F-62-1 (35 mg, 0.026 mmol, 1.0 당량)가 TFA (200 uL)에 용해되었다. 10분 이후에, 물 (2 mL) 및 아세토니트릴 (0.5 mL)이 첨가되었고, 용액은 흰색 고체로서 화합물 F-62-2를 수득하도록 밤샘 동안 동결건조되었다 (34 mg, 105%).
화합물 F-62:
Figure pct00185
아민 F-62-2 (34 mg, 5.55 umol, 1 당량)가 아세토니트릴 (3 mL)에 용해되었다. DIEA (5 uL, 0.028 mmol, 5 당량) 및 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (2 mg, 6.65 umol, 1.2 당량)가 첨가되었다. HPLC 분석이 시작 물질의 완전한 소모를 보여주었다. 용매가 증발되어 ㄱ거건조되었고, 잔류물은 EtOAc/Et2O의 혼합물 (80/20)로 분쇄되었다. 조산물은 제조용 HPLC (워터스 600E, SunFire 프렙 C18 OBD 컬럼, 5 um, 19 x 100 mm; 용출상: 0.1% TFA로 완충된 물/MeCN; 5% 내지 100% MeCN의 구배 15분; 220 nM에서의 워터스 2487 UV 검출기)에 의해 정제되었다. 선별된 분획들은 조합되었고, 흰색 고체로서 화합물 F-62를 공급하도록 동결건조되었다 (5.5 mg, 13%).
m/z (Q-TOF MS ESI+) 1336.7859 (2%, MNa+, C69H107N11NaO14 1336.7891 요구), 657.9073 (100%, (MH2)2+, C69H109N11O14 657.9072 요구).
화합물 F-63:
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)펜에틸)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일)-L-페닐알라닌 2,2,2-트리플루오로아세테이트
Figure pct00186
화합물 F-63-1: ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-((터르-부톡시카보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)펜에틸) (메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일)-L-페닐알라닌
Figure pct00187
화합물 F-62-1 (157 mg, 0.118 mmol, 1 당량)이 물 (4.5 mL), 아세토니트릴 (4.5 mL) 및 피페리딘 (3.5 mL)의 혼합물에 용해되었고, 실온에서 5시간 동안 교반되었다. 용매가 감압 하에서 증발되었고, 잔류물은 Et2O (60 mL)로 분쇄되었다. 고체는 여과에 의해 수집되었고, Et2O (10 mL)로 두 번 세척되어 회백색 고체로서 화합물 F-63-1을 수득하였다 (153 mg, 100%).
화합물 F-63-2: ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)펜에틸)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일) 피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일)-L-페닐알라닌 비스 2,2,2-트리플루오로아세테이트
Figure pct00188
화합물 F-63-1 (153 mg, 0.127 mmol, 1.0 당량)이 TFA (200 uL)에 용해되었다. 10분 이후에, 물 (2 mL) 및 아세토니트릴 (0.5 mL)이 첨가되었고, 용액은 밤샘 동결건조되어 흰색 고체로서 화합물 F-63-2가 수득되었다 (34 mg, 105%).
화합물 F-63:
Figure pct00189
아민 F-63-2 (100 mg, 0.082 mmol, 1 당량)이 아세토니트릴 (2 mL) 및 DMF (0.5 mL)의 혼합물에 용해되었고, 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (45 mg, 0.147 mmol, 1.8 당량) 및 DIEA (71 uL, 0.409 mmol, 5 당량)가 첨가되었다. 실온에서 4.5시간 동안 교반한 이후에, 용매가 감압 하에 증발되었다. 조산물은 제조용 HPLC (워터스 600E, SunFire 프렙 C18 OBD 컬럼, 5 um, 19 x 100 mm; 용출상: 0.1% TFA로 완충된 물/MeCN; 5% 내지 100% MeCN의 구배 15분; 220 nM에서의 워터스 2487 UV 검출기)에 의해 정제되었다. 선별된 분획들은 조합되었고, 이후에 흰색 고체로서 화합물 F-63를 수득하도록 동결건조되었다 (42 mg, 36%).
m/z (Q-TOF MS ESI+) 1300.7901 (2%, MH+, C68H106N11O14 1300.7915 요구), 650.8990 (100%, (MH2)2+, C68H107N11O14 650.8994 요구).
화합물 G-12
메틸 ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-(6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)-N-메틸헥산아미도)펜에틸)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일)-L-페닐알라니네이트 2,2,2-트리플루오로아세테이트
Figure pct00190
화합물 G-12-1: 벤질 N-(4-아미노펜에틸)-N-메틸-L-발리네이트 이염산
Figure pct00191
옥사릴 클로라이드 (3 mL)에 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노산 (200 mg, 0.947 mmol, 1 당량)가 용해되었다. 용액은 감압 하에 증발되어 건조되기 이전에 실온에서 5시간 동안 교반되었다. 화합물 G-12-1은 베이지색 고체로서 획득되었고 (217 mg, 100%), 정제 없이 다음 단계에 사용되었다.
화합물 G-12:
Figure pct00192
아닐린 12 (40 mg, 0.045 mmol, 1 당량)가 0℃에서 건조 DCM (1 mL)에 용해되었고, DIEA (8 uL, 0.045 mmol, 1 당량)가 첨가되었다. 30분 동안 교반한 이후에, 건조 DCM (1 mL)에 넣은 화합물 G-12-1 (10 mg, 0.45 mmol, 1 당량)의 용액이 도입되었고, 반응이 0℃에서 1시간 동안 교반되었다. 혼합물은 DCM (25 mL)로 희석되었고, 물 (20 mL)로 두 번, 염수 (10 mL)로 한 번 세척되었다. 유기상은 Na2SO4 위에서 건조되어 여과되었고, 옅은 갈색 고체로서 조산물을 수득하도록 감압 하에서 증발되었다 (54 mg). 이것은 실리카겔 (DCM/MeOH) 상에서 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제되었고, 제조용 HPLC (워터스 600E, SunFire 프렙 C18 OBD 컬럼, 5 um, 19 x 100 mm; 용출상: 0.1% TFA로 완충된 물/MeCN; 5% 내지 100% MeCN의 구배 15분; 220 nM에서의 워터스 2487 UV 검출기)가 이어졌다. 분리된 산물은 흰색 고체를 수득하도록 동결건조되었고 (23 mg), 이는 제조용 HPLC에 의해 재정제되었으며, 선별된 분획들은 조합되었고, 흰색 고체로서 화합물 G-12를 공급하도록 동결건조되었다 (9 mg, 16 %).
m/z (Q-TOF MS ESI+) 1094.6543 (20%, MNa+, C59H89N7NaO11 1094.6512 요구), 1072.6722 (16%, MH+, C59H90N7O11 1072.6693 요구), 536.8358 (100%, (MH2)2+, C59H91N7O11 536.8383 요구).
화합물 G-13
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-(6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)-N-메틸헥산아미도)펜에틸)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일)-L-페닐알라닌 2,2,2-트리플루오로아세테이트
Figure pct00193
화합물 G-13:
Figure pct00194
아닐린 13 (15 mg, 0.015 mmol, 1 당량)이 0℃에서 건조 DCM (1.5 mL)에 용해되었고, DIEA (8 uL, 0.046 mmol, 3 당량)이 첨가되었다. 건조 DCM (0.5 mL)에 넣은 화합물 G-12-1 (3.5 mg, 0.046 mmol, 1 당량)의 용액이 도입되었고, 반응은 0℃에서 1.5시간 동안 교반되었다. 용매가 감압 하에서 증발되었고, 조산물은 제조용 HPLC (워터스 600E, SunFire 프렙 C18 OBD 컬럼, 5 um, 19 x 100 mm; 용출상: 0.1% TFA로 완충된 물/MeCN; 5% 내지 100% MeCN의 구배 15분; 220 nM에서의 워터스 2487 UV 검출기)에 의해 정제되었다. 선별된 분획들은 조합되었고, 흰색 고체로서 화합물 G-13를 공급하도록 동결건조되었다 (11.4 mg, 62%).
m/z (Q-TOF MS ESI+) 1058.6510 (30%, MH+, C58H88N7O11 1058.6536 요구), 529.8285 (100%, (MH2)2+, C58H89N7O11 529.8305 요구).
화합물 G-15
메틸 ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-(6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)벤질)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일)-L-페닐알라니네이트 2,2,2-트리플루오로아세테이트
Figure pct00195
화합물 G-15 :
Figure pct00196
아닐린 15 (40 mg, 0.047 mmol, 1 당량)이 0℃에서 건조 DCM (2 mL)에 용해되었고, DIEA (10 uL, 0.056 mmol, 1.2 당량)가 첨가되었다. 건조 DCM (1 mL)에 넣은 화합물 G-12-1 (108 mg, 0.47 mmol, 10 당량)의 용액이 도입되었고, 반응은 0℃에서 1.5시간 동안 교반되었다. 혼합물은 DCM (10 mL)로 희석되었고, 물 (5 mL)로 두 번 세척되었다. 유기상은 MgSO4 위에서 건조되어 여과되었고, 베이지색 고체로서 조산물을 수득하도록 감압 하에 증발되었다. 이것은 제조용 HPLC (워터스 600E, SunFire 프렙 C18 OBD 컬럼, 5 um, 19 x 100 mm; 용출상: 0.1% TFA로 완충된 물/MeCN; 5% 내지 100% MeCN의 구배 15분; 220 nM에서의 워터스 2487 UV 검출기)에 의해 정제되었다. 선별된 분획들은 조합되었고, 흰색 고체로서 화합물 G15를 수득하도록 동결건조되었다 (27 mg, 50%).
m/z (Q-TOF MS ESI+) 1066.6517 (2%, MNa+, C57H85N7NaO11 1066.6199 요구), 522.8224 (100%, (MH2)2+, C57H87N7O11 522.8226 요구).
실시예 19: ADC 합성, 정제 및 특성화
하기 기술된 절차가 키메라 및 인간화 IgG1형태들에 적용된다. IgG2, IgG4 등과 같은 기타 다른 형태들의 경우, 당업자라면 일반 지식을 사용하여 절차를 적응시킬 수 있을 것으로 이해되어야 한다.
두 번째 IGF-1R 항체들 (1 내지 5 mg/mL)은 150 mM NaCl 및 2 mM EDTA를 포함하는 10 M 보레이트 완충액에서 트리스(2-카르복시에틸)포스파인 염산 (TCEP)으로 37℃에서 2시간 동안 부분적으로 환원되었다. 전형적으로 TCEP의 2.5 내지 3 몰 당량들이 약 4의 약물-대비-항체 비율들 (DAR)를 표적하도록 사용되었다. 부분적인 항체 환원은 SDS-PAGE 분석에 의해 비환원 조건들 하에서 검증되었다. 방출된 사슬간 시스테인 잔기들과 링커-약물 커플링 이전에. 환원 혼합물이 실온으로 냉각되도록 허용되었다. 다음으로 항체 농도가 150 mM NaCl 및 2 mM EDTA를 포함하는 10 mM 보레이트 완충액 pH 8.4로 1 mg/mL로 조정되었고, 약물 대비 항체의 5 몰 과다가 디메틸 설폭사이드 (DMSO)에 넣은 10% 용액으로부터 첨가되었다. 최종 DMSO 농도는 커플링 동안 수용성 용액에서 약물의 용해도를 유지하도록 10%로 조정되었다. 반응은 실온에서 1시간 동안 수행되었다. 약물 과다가 약물의 몰 당 1.5 몰수의 N-아세틸시스테인의 첨가 및 실온에서 1시간 동안 배양에 의해 정지되었다. 4℃에서 밤샘 동안 150 mM NaCl을 포함하는 25 mM His 완충액 pH 6.5을 사용한 투석 이후에, 항체-약물-컨쥬게이트들이 시판되는 크로마토그래피 및 초여과 유닛들을 기초로 하는 당해 기술분야의 당업자에게 숙지된 방법들을 사용하여 정제되었다. 먼저, 미결합된 약물 및 ADC 응집체들이 S200 (GE 라이프 사이언스사) 또는 TSK G3000 SW (토소사) 컬럼 상에서 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 제거되었다. 다음으로 정제된 ADC 단량체들이 30 또는 50 KDa MWCO 상의 초여과에 의해 또는 프로테인 A 상의 친화 크로마토그래피에 의해 2 내지 3 mg/mL로 농축되었다. 정제된 ADC들이 0.2 um 필터 상에서 무균의 여과 이후에 4℃에서 보관된다. 그들은 약물 결합을 검증하도록 환원 및 비환원 조건들 하에서 SDS-PAGE에 의해 그리고 단량체들 및 응집된 형태들의 함량을 결정하도록 분석적 S200 또는 TSK G3000 SWXL 컬럼들에 의해 추가로 분석되었다. 단백질 농도들은 표준으로서 IgG를 가진 비신초닌산 (BCA) 검정법을 사용하여 결정되었다. DAR은 HIC 및 LC-MS에 의해 각각의 정제된 ADC의 경우에 추정되었다. 전형적으로, 응집된 형태들의 함량은 5% 이하이었고, DAR은 3.5 및 5 사이 범위에 포함되었다.
실시예 20: 서로 다른 약물들과 결합된 IGF -1R 항체들의 세포독성 평가
20.1 MCF -7 세포들 상에서 키메라 두 번째 IGF -1R 항체들의 평가
5가지의 두 번째 IGF-1R 항체들이 리소좀들 내로 신속하게 내재화되고 산성 환경 내에서 더 낮은 결합 능력을 가지는 것으로 확인되었다. 해당 관점에서, 이들 두 번째 IGF-1R Ab들은 ADC들로서 사용될 성질들 모두를 가졌다. 따라서, 5가지의 키메라 IGF-1R 항체들이 서로 다른 화합물들 (G-13; E-13 및 F-63)과 결합되었다. 이들 ADC들의 약물 항체 비율은 약 4이었다. 비특이적 세포독성을 평가하기 위하여, 부적절한 키메라 항체 c9G4도 역시 이들 화합물들과 동일한 DAR에서 결합되었다. MCF-7 세포들이 각각의 ADC들의 증가하는 농도들로 완전 배양 배지에 37℃에서 6일 동안 배양되었다. 세포 생존도는 발광 세포 생존도 검정법 (CellTiter-Glo, 프로메가사)를 사용하여 평가되었다. 발광 신호는 미스라스 플레이트 리더 (베르톨드 테크놀로지사)를 사용하여 해석되었다. E-13, G-13 또는 F-63와 결합된 부적절한 키메라 항체 c9G4는 MCF-7 세포들에 미치는 없거나 온화한 세포독성 활성을 보여주었다 (도 26). 역으로, 두 번째 IGF-1R 항체들을 E-13, G-13 또는 F-63 중 어느 하나와 결합시킨 이후에 획득된 나머지 ADC들 모두의 첨가는 MCF-7 세포 생존도를 극적으로 감소시켰다.
20. 2 정상 세포들 상에서 키메라 두 번째 IGF -1R 항체들의 평가
IGF-1R의 발현 수준은 일차 정상 세포들 (프로모셀 GmbH사) 상에서 c208F2 mAb들을 사용하여 평가되었다. 해당 목적을 위해, 세포들 (0.5 × 106개 세포들/mL)이 FACS 완충액 (PBS, 0.1% BSA, 0.01% NaN3)에서 10 ug/mL의 c208F2 항체와 4℃에서 20분 동안 배양되었다. 다음으로 세포들은 3번 세척되었으며, 알렉사 488과 결합된 적당한 이차 항체와 암소에서 4℃로 추가 20분 동안 배양되었고, 이후 FACS 완충액으로 3번 세척되었다. 두 번째 IGF-1R 항체의 결합은 생존가능한 세포들에서 즉시 수행되었고, 이는 (죽은 세포들을 염색하는) 프로피디움 요오드를 사용하여 확인되었다. 발현 수준 (B최대)는 MCF-7 세포들 상에서의 IGF-1R 발현과 비교하여 (실시예 5 참조, 표 9), 정상 세포들 상에서 낮았다 (표 15).
정상 세포 B최대
인간 대동맥 내피세포 (HAoEC) 21
인간 폐 미세관 내피세포 (HPMEC) 33
인간 기관지 평활근 세포 (HBSMC) 26
인간 신장 표피세포 (HREpC) 110
인간 요관 세포 (HUC) 181
ADC c208F2-G-13의 세포독성은 정상 세포들 상에서 평가되었다. 세포들은 완전 배양 배지에서 c208F2-G-13의 증가하는 농도로 37℃에서 6일 동안 배양되었다. 세포 생존도는 발광 세포 생존도 검정법 (CellTiter-Glo, 프로메가사)를 사용하여 측정되었다. 발광 신호는 미스라스 플레이트 리더 (베르톨드 테크놀로지사)를 사용하여 해석되었다. 주요 세포독성 활성은 HBSMC, HPMEC, HAoEC 및 HREpCat 상에서 전혀 관찰되지 않았다 (도 30). 소수의 세포 독성이 HUC 상에서 높은 농도의 c208F2-G-13에서만 측정되었다.
20.3 인간화 변형체들 hz208F2의 평가
열여섯 가지의 208F2의 인간화 변형체들이 화합물 G-13과 결합되었다. 이들 ADC들의 약물 항체 비율은 약 4이었다. 비특이적 세포독성을 평가하기 위하여, 부적절한 키메라 항체 c9G4도 역시 이들 화합물들과 동일한 DAR에서 결합되었다. MCF-7 세포들은 완전 배양 배지에서 각각의 ADC들의 증가하는 농도로 37℃에서 6일 동안 배양되었다. 세포 생존도는 발광 세포 생존도 검정법 (CellTiter-Glo, 프로메가사)를 사용하여 측정되었다. 발광 신호는 미스라스 플레이트 리더 (베르톨드 테크놀로지사)를 사용하여 해석되었다. G-13과 결합된 부적절한 키메라 항체 c9G4도 MCF-7 세포들 상에서 전혀 없거나 약간의 세포독성 활성을 보여주었다 (도 31). 정반대로, 항-IGF-1R 항체들을 G-13과 결합한 이후에 획득된 다른 모든 ADC들의 첨가는 MCF-7 세포 생존도를 극적으로 감소시켰다. 열여섯 가지의 인간화 변형체들의 세포 세포독성을 유도하는 능력은 표 16에서 나타내고, 도 31에서 하나의 인간화 변형체로 도시된 바와 같이 키메라 형태 c208F2-G-13으로 측정된 능력과 적어도 동등하거나 훨씬 더 나았다.
Figure pct00197
실시예 21: MCF -이종이식 모델에서 E-13, G-13 또는 F-63 화합물들 중 하나와 결합된 c208F2 항체의 생체내 활성
G-13, E-13 또는 F-63 화합물들과 결합된 c208F2 항체의 시험관내 효능이 생 체내에서 재연될 수 있는지를 검증하기 위하여, 그들이 MCF-7 이종이식 모델에서 테스트되었다.
모든 동물 절차들은 과학적 목적들에 사용되는 동물들의 보호에 관한 2010/63/UE 지침의 가이드라인들에 따라 수행되었다. 프로토콜은 피에르 파브르 연구소의 동물 윤리 위원회에 의해 승인되었다. 5백만 개의 MCF-7 세포들이 7주령 스위스/누드 마우스들 내로 피하로 주사되었다. 세포 주입 이전에, 에스트로겐 펠렛들 (아메리카의 이노베이티브 리서치사)이 MCF-7 종양들의 생체내 성장에 필요한 에스트로겐들을 방출시키기 위하여 마우스들의 옆구리로 이식되었다.
MCF-7 세포 이식 이후 20일째, 종양들이 120 내지 150 mm3의 평균 크기에 도달했을 때, 동물들은 종양 크기 및 관점에 따라 5마리 마우스들의 그룹으로 나뉘었다. 서로 다른 처리들이 복강내 주사들에 의해 접종되었다. 동물들의 건상 상태가 매일 모니터링되었다. 종양 부피가 전자 캘리퍼로 연구 종결 시까지 매주 두 번 측정되었다. 종양 부피는 다음 공식으로 계산된다: π/6 × 길이 × 너비 × 높이. 독성은 동물들의 무게에 따라 매주 3번 측정되었다. 통계학적 분석들이 만-휘트니 테스트를 사용하여 각각의 척도에서 수행되었다. 모든 화합물들은 복강내로 (i.p.) 주사되었다. 본 실시예에서는, 약 DAR 4에서 E-13, G-13 또는 F-63 화합물들 중 어느 하나와 결합된 c208F2 mAb의 항-종양 활성이 D20 및 D27일째 7 mg/kg 용량의 2회 주사들 이후에 측정되었다 (도 27a, 27b 및 27c). 동일하게, 캡처리-약물 분체들 E-13, F-13 및 F-63가 DAR 4로 7 mg/kg의 c208F2-E-13, c208F2-F-13 및 c208F2-F-63에 해당하는 것과 동등한 용량으로 주입되었다.
c208-E-13 (도 27a), c208F2-G-13 (도 27b) 또는 c208F2-F-63 (도 27c) 중 하나의 주입은 유의하게 억제하였고, 심지어 완전한 종양 성장 퇴보 (대비 해당하는 캡처리-약물, p < 0.05)을 유도하였다. c208-E-13, c208F2-G-13 및 c208F2-F-63 간의 통계학적 활성 차이는 전혀 주목될 수 없었다. 캡처리된 약물들은 MCF-7 종양 성장에 미치는 효과를 전혀 가지지 않았다. (대비 대조군, p > 0.05).
두 번째 세트의 실험들이 이전에 기술된 바와 같이 MCF-7 이종이식 모델들에서 E-13 또는 G-13 둘 중 하나와 결합된 c208F2로 그리고 E-13 또는 G-13 둘 중 하나과 결합된 부적절한 항체 c9G4로 수행되었다. 마우스들이 복강내로 7 mg/kg의 각각의 ADC들을 사용하여 D20 및 D27일째 주사되었다 (도 28a 및 28b).
c9G4-E-13 및 c9G4-F-13 둘 다의 주사는 MCF-7 이종이식 종양들의 성장에 온화하게 및 일시적으로 영향을 주었다. 그러나 이러한 두 번째 실험은 D43일이 이들 ADC들의 높은 항-종양 활성을 보여주기 때문에 c208-E-13 또는 c208F2-G-13 둘 중 하나의 주입들이 완전한 종양 퇴보를 유도하였던 점을 입증하였다.
실시예 22: 3 + MCF -7 이종이식 모델에서 G-13 화합물과 결합된 hz208F2 항체의 생체내 활성
G-13 화합물과 결합된 인간화 형태들의 c208F2가 MCF-7 이종이식 모델에서 생체내 평가되었다.
모든 동물 절차들은 과학적 목적들에 사용되는 동물들의 보호에 관한 2010/63/UE 지침의 가이드라인들에 따라 수행되었다. 프로토콜은 피에르 파브르 연구소의 동물 윤리 위원회에 의해 승인되었다. 5백만 개의 MCF-7 세포들이 7주령 스위스/누드 마우스들 내로 피하로 주사되었다. 세포 주사 이전에, 에스트로겐 펠렛들 (아메리카의 이노베이티브 리서치사)이 MCF-7 종양들의 생체내 성장에 필요한 에스트로겐들을 방출시키기 위하여 마우스들의 옆구리로 이식되었다.
MCF-7 세포 이식 이후 20일째, 종양들이 120 내지 150 mm3의 평균 크기에 도달했을 때, 동물들은 종양 크기 및 관점에 따라 5마리 마우스들의 그룹으로 나뉘었다. 서로 다른 처리들이 4회 주사 프로토콜: 4일마다 1회 주사 (Q4d4)로서 복강내 주사들에 의해 접종되었다. 동물들의 건상 상태는 매일 감시되었다. 종양 부피가 전자 캘리퍼로 연구 종결 시까지 매주 두 번 측정되었다. 종양 부피는 다음 공식으로 계산된다: π/6 × 길이 × 너비 × 높이. 독성은 동물들의 무게에 따라 매주 3회 측정되었다. 통계학적 분석들이 만-휘트니 테스트를 사용하여 각각의 척도에서 수행되었다. 모든 화합물들은 복강내로 (i.p.) 주사되었다. 본 실시예에서는, G-13 화합물과 결합된 c208F2 mAb의 항-종양 활성이 G-13과 역시 결합된 다른 인간화 형태들과 비교되었다 (도 32). 테스트된 인간화 형태들은 하기 표 17에 기술되었다.
Figure pct00198
c208-G-13 또는 c208F2 인간화 형태들 둘 중 하나의 주사는 종양을 유의하게 억제하였고, 심지어 완벽한 종양 퇴행을 유도하였다 (해당하는 캡처리-약물 대비 p < 0.05). c208-E-13 및 테스트된 인간화 형태들 간의 통계학적 활성 차이는 전혀 관찰되지 않았다.
두 번째 세트의 실험들이 이전에 기술된 바와 같이 MCF-7 이종이식 모델들에서 G-13와 결합된 c208F2 또는 hz208F2-4 둘 중 하나로 수행되었다. 마우스들이 3 mg/kg의 각각의 ADC들로 4일마다 4회 주사 (Q4d4)로 또는 단 1회 주사되었다.
동일한 항-종양 활성이 MCF-7 이종이식 모델에서 ADC가 4회 또는 단 1회 주사되었을 때 관찰되었다.
실시예 23: 2 + CaOV -3 이종이식 모델에서 G-13 또는 E-13 화합물들과 결합된 208F2 항체의 생체내 활성
항-종양 활성은 또한 난소 암종 세포주이고 CaOV-3 이종이식 모델인 2+ 발현성 종양에서 연구되었다. 해당 제안을 위해, 마우스는 D0일째 7× 106개 세포들로 피하 주사되었다. 종양들이 대략 120 mm3에 도달했을 때 (종양 세포 주사 이후 19일째), 동물들은 비슷한 종양 크기를 가진 5마리 마우스들의 5개 그룹들로 나뉘었고, E-13 또는 G13 둘 중 하나와 결합된 c208F2 및 E-13 또는 G-13 둘 중 하나와 결합된 부적절한 항체 c9G4로 복강내 처리되었다. 마우스들은 6회 주사들 주기: 4일마다 1회 주사 동안 3 mg/kg의 각각 ADC들로 복강내 주사되었다. 마우스들은 이종이식편 성장 속도의 관찰을 위해 추적되었다. 종양 부피는 다음 공식으로 계산된다: π/6 × 길이 × 너비 × 높이.
약간 및 일시적으로 성장 지연을 유도하였던 c9G4-E-13과 비교하여, c9G4-G-13의 주사는 CaOV-3 이종이식 종양들에 영향을 주지 않았다. 반면, c208F2-E-13 또는 c208F2-G-13의 주사들은 50일째 각각 95% 및 77%의 종양 성장 억제를 유도하였다 (도 34a 및 도 34b).
실시예 24: 첫 번째 ( 810D12 또는 816C12 ) 및 두 번째 (208F2) IGF -1R 항체들 간의 결합 경쟁의 평가
실험의 목표는 마우스 단일클론 항체들 m810D12 및 m816C12 둘 다가 인간화 항체 208F2 (Hz208F2-4 변형체)의 결합 부위와 벗어나는 용해성 형태의 h-IGF-1R의 부위와 결합하는지 여부를 정의하는 것이다.
실험은 표면 플라스몬 공명 기술학을 기초로 하는 비아코아 ×100 장치 상에서 전개되었다. CM5 센서칩은 아민 커플링 화학을 사용하여 카복시메틸덱스트란 기질과 화학적으로 결합된 마우스 항-폴리-히스티딘 IgG1 단일클론 항체로 활성화되었다. 전형적으로 12451 RU 및 12257 RU의 항체들이 각각 플로우셀 1 (FC1) 및 플로우셀 (FC2) 상에 접목되었다. 고전적인 HBS-EP+ 완충액이 전개 완충액으로 사용되었다. 이러한 완충액은 또한 단백질들의 용액들의 제조에도 사용되었다. 실험은 25℃에서 10 ug/mL의 유속으로 수행되었다.
직접 생산한 용해성 형태의 IGF-1R은 두 개의 알파 사슬들 및 C-말단에 6개 히스티딘 서열로 마감된 베타 사슬들의 두 개 세포외 도메인들로 구성되는 헤테로사량체이다. 단백질은 30 ug/mL (약 80 nM)의 농도에서 FC2 상에 1분 동안 주사된다. 항체들은 50 ug/mL (약 330 nM)의 농도에서 주사된다. 첫 번째 항체 용액 (도 35a 및 도 35b) 또는 전개 용액 (도 35a 및 도 35b) 둘 중 하나도 플로우셀들 둘 다 상에 90초 동안 주사된다. 두 번째 항체 용액이 다음으로 플로우셀들 둘 다 상에 주사된다. 첫 번째 항체의 결합 이후에 두 번째 항체의 결합 부재는 항체들 둘 다가 항원 상의 인접 부위와 결합하는 증거이다 (도 35b). 반대로, 첫 번째 항체의 결합 이후에 두 번째 항체의 결합은 항체들 두 번째 항체의 결합 부위가 첫 번째 항체의 결합 부위와 벗어나는 증거이다 (도 35d). 각각의 주기 완료 시, 센서칩 표면은 30초 동안 글리신, HCl 10 mM pH 1.5 완충액의 주사에 의해 재생된다.
Ac1의 부재 (도 35a 및 도 35b) 또는 존재 (도 35c 및 도 35d) 시, Ac2 (화살표들)의 결합 수준들은 주사 완료 이후 20초가 기록되었다. 데이타는 도 36에 막대 그래프 상에 재연된다.
Ac1로서 사용된, Hz208F2-4는 자체 결합을 완벽하게 차단하지만, 실제적으로 마우스 단일클론 항체들 둘 다 (m810D12 및 m816C12)의 결합에 미치는 효과가 세 가지 항체들이 Ac2로서 사용될 때 전혀 없다.
결론적으로, 각각의 마우스 단일클론 항체들 m810D12 및 m816C12는 Hz208F2-4 항체의 결합 부위를 벗어나 충분히 떨어져 있고, Hz208F2-4 항체와 결합된 h-IGF-1R 상에 각각의 마우스 단일클론 항체의 결합을 허용한다.
실시예 25: 2 + NCI-H2122 이종이식 모델에서 G-13 화합물들과 결합된 208F2 항체의 생체내 활성
항-종양 활성은 또한 비-소세포 폐암 세포주이고 NCI-H2122 이종이식 모델인 2+ 발현성 종양에서 연구되었다. 해당 제안을 위해, 마우스는 D0일째 7× 106개 세포들로 피하 주사되었다. 종양들이 대략 170 mm3에 도달했을 때 (종양 세포 주사 이후 13일째), 동물들은 비슷한 종양 크기를 가진 6마리 마우스들의 3개 그룹들로 나뉘었고, G-13과 결합된 c208F2로 복강내 처리되었다. 마우스들은 4회 주사들 주기: 7일마다 1회 주사 동안 5 또는 10 mg/kg의 각각 ADC로 복강내 주사되었다. 마우스들은 이종이식편 성장 속도의 관찰을 위해 추적되었다. 종양 부피는 다음 공식으로 계산된다: π/6 × 길이 × 너비 × 높이.
208F2-G-13의 주사들은 30일 이상 동안 무변화 (stagnant) 종양 성장을 유도하였다 (도 37).
실시예 26: 3 + MCF -7 이종이식 모델에서 G-13 화합물과 결합된 hz208F2 항체의 생체내 활성 및 생체외 분석 ( m810D12 또는 m816C12 둘 중 하나를 사용한 증식 및 표적 강제)
G-13 화합물과 결합된 인간화 형태들의 c208F2가 MCF-7 이종이식 모델에서 생체내 평가되었고, 그의 활성 및 표적 강제를 확인하였다.
모든 동물 절차들은 과학적 목적들에 사용되는 동물들의 보호에 관한 2010/63/UE 지침의 가이드라인들에 따라 수행되었다. 프로토콜은 피에르 파브르 연구소의 동물 윤리 위원회에 의해 승인되었다. 5백만 개의 MCF-7 세포들이 7주령 스위스/누드 마우스들 내로 피하로 주사되었다. 세포 주사 이전에, 에스트로겐 펠렛들 (아메리카의 이노베이티브 리서치사)이 MCF-7 종양들의 생체내 성장에 필요한 에스트로겐들을 방출시키기 위하여 마우스들의 옆구리로 이식되었다.
MCF-7 세포 이식 이후 20일째, 종양들이 120 내지 150 mm3의 평균 크기에 도달했을 때, 동물들은 (i) 종양 크기 및 관점에 따라 6마리 마우스들의 2개 그룹들 및 (ii) IHC 연구들을 위해 3마리 마우스들의 15개 그룹들로 나뉘었다 (T0를 위해 1개 그룹 및 대조군 및 208F2-G-13을 위해 2 × 7개 그룹들). 서로 다른 처리들은 단일 주사 프로토콜들로서 208F2-G-13을 위해 3 mg/kg로 복강내 주사들에 의해 접종되었다. 동물들의 건상 상태는 매일 모니터링되었다. 종양 부피가 전자 캘리퍼로 연구 종결 시까지 매주 두 번 측정되었다. 종양 부피는 다음 공식으로 계산된다: π/6 × 길이 × 너비 × 높이. 독성은 동물들의 무게에 따라 매주 3회 측정되었다. 통계학적 분석들이 만-휘트니 테스트를 사용하여 각각의 척도에서 수행되었다. IHC 분석을 위한 종양 제거가 T0에 (화합물 주사들 이전에 무작위화 일에 해당) 수행되었고, 다음으로 각각의 롯트, 208F2-G-13 및 대조군의 3가지 종양이 주사 이후 6시간, 4일, 7일, 14일 및 26일째 제거되었다. 종양들은 포몰 고정되었고, 파라핀 포매되었으며, 다음으로 증식을 추적하는 Ki67 항체 및 IGF-1R 발현을 추적하는 m810D12 및 m816C12를 사용하여 염색되었다.
대조군 그룹에서 IGF-1R 및 Ki67 발현은 무작위화 이후 T0부터 14일까지 범위에서 확인되었고, IGF-1R 발현 및 증식 둘 중 하나에 주는 종양 성장 효과를 입증하였다. 테스트된 시간과 상관없이, IGF-1R 및 Ki67 염색 수준들은 종양에서 안정적으로 정착되었다 (도 38). IGF-1R은 무작위화 이후 T0부터 14일까지 범위에서 3+로 점수가 매겨졌고, 증식 지수 (Ki67)는 > 80%이었다.
다음으로 종양들은 208F2-G-13의 단일 주사 이후에 분석되었다 (도 39). 마우스에서 관찰된 종양 성장 억제는 T0에서 83%부터 단일 주사 이후 26일째 13%까지 범위에서 종양에서 Ki67 발현의 강한 감소에 의해 전달되었다 (도 39a 패널). IGF-1R 발현은 m810D12 또는 m816C12 둘 중 하나를 사용한 208F2-G-13 단일 주사 이후 26일째 추적되었다 (도 39b). 4일 이후 및 26일째까지, 종양에서 IGF-1R 수준은 (i) 208F2-G-13 이후 전달된 표적 강제 및 (ii) 208F2-G-13 활성을 따르는 m810D12 및 m816C12의 능력을 극적으로 감소시킨다.
실시예 27: m810D12 또는 m816C12로 IGF -1R의 유병율 연구
m810D12 또는 m816C12 둘 중 하나를 사용한 인간 암에서 IGF-1R 유병율이 슈퍼바이오칩사로부터 나온 종양 마이크로어레이 (TMA) 상에서 연구되었다. 슬라이드들은 이전에 기술된 바와 같이 염색되었고, 코아들이 로슈 벤타나 알고리즘을 사용하는 막성 IGF-1R 발현에 대하여 분석되었다 (표 18). IGF-1R은 정상 조직들 (유방 및 폐) 상에서 검출되지 않았던 반면, 높은 수준 (3+)의 IGF-1R이 유방암의 60%에서, 폐 편평세포 암종의 50% 이상에서 및 두경부 암종 (인두, 편평세포 암종)의 30%에서 확인되었다.
Figure pct00199
SEQUENCE LISTING <110> PIERRE FABRE MEDICAMENT <120> COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF IGF-1R EXPRESSING CANCER <130> D35463 <140> PCT/EP2016/075858 <141> 2016-10-26 <150> EP 15306707.9 <151> 2015-10-26 <160> 95 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 810D12 I-4893, heavy chain, CDR-H1 <400> 1 Gly His Thr Phe Thr Ser Tyr Met 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 810D12 I-4893, heavy chain, CDR-H2 <400> 2 Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr 1 5 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 810D12 I-4893, heavy chain, CDR-H3 <400> 3 Val Thr Thr Ala Tyr Tyr Gly Asn Gly Arg Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 810D12 I-4893, light chain, CDR-L1 <400> 4 Gln Asp Ile Thr Asn Tyr 1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 810D12 I-4893, light chain, CDR-L2 <400> 5 Tyr Thr Ser 1 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 810D12 I-4893, light chain, CDR-L3 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tacatcttcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcagttgca gggcaagtca ggacattacc aattatttaa cctggtatca gcagaaacca 120 gatggaactg ttaaagttct gatctactac acatcaagat tatactcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tggatcagat tattctctca ccattaacaa cctggagcaa 240 gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggttattcgc ttccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa a 321 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 816C12 I-4894, heavy chain, CDR-H1 <400> 11 Gly His Thr Phe Thr Ser Tyr Val 1 5 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 816C12 I-4894, heavy chain, CDR-H2 <400> 12 Ile Asn Pro His Asn Asp Val Thr 1 5 <210> 13 <211> 14 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 816C12 I-4894, heavy chain, CDR-H3 <400> 13 Val Ser Thr Ala Tyr Tyr Gly Asn Gly Arg Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 816C12 I-4894, light chain, CDR-L1 <400> 14 Gln Asp Ile Asn Asn Tyr 1 5 <210> 15 <211> 3 <212> PRT <213> artificial <220> <223> 816C12 I-4894, light 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975 Asn Pro Glu Tyr Phe Ser Ala Ala Asp Val Tyr Val Pro Asp Glu Trp 980 985 990 Glu Val Ala Arg Glu Lys Ile Thr Met Ser Arg Glu Leu Gly Gln Gly 995 1000 1005 Ser Phe Gly Met Val Tyr Glu Gly Val Ala Lys Gly Val Val Lys 1010 1015 1020 Asp Glu Pro Glu Thr Arg Val Ala Ile Lys Thr Val Asn Glu Ala 1025 1030 1035 Ala Ser Met Arg Glu Arg Ile Glu Phe Leu Asn Glu Ala Ser Val 1040 1045 1050 Met Lys Glu Phe Asn Cys His His Val Val Arg Leu Leu Gly Val 1055 1060 1065 Val Ser Gln Gly Gln Pro Thr Leu Val Ile Met Glu Leu Met Thr 1070 1075 1080 Arg Gly Asp Leu Lys Ser Tyr Leu Arg Ser Leu Arg Pro Glu Met 1085 1090 1095 Glu Asn Asn Pro Val Leu Ala Pro Pro Ser Leu Ser Lys Met Ile 1100 1105 1110 Gln Met Ala Gly Glu Ile Ala Asp Gly Met Ala Tyr Leu Asn Ala 1115 1120 1125 Asn Lys Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Val 1130 1135 1140 Ala Glu Asp Phe Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Thr Arg 1145 1150 1155 Asp Ile Tyr Glu Thr Asp Tyr Tyr Arg Lys Gly Gly Lys Gly Leu 1160 1165 1170 Leu Pro Val Arg Trp Met Ser Pro Glu Ser Leu Lys Asp Gly Val 1175 1180 1185 Phe Thr Thr Tyr Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Val Leu Trp 1190 1195 1200 Glu Ile Ala Thr Leu Ala Glu Gln Pro Tyr Gln Gly Leu Ser Asn 1205 1210 1215 Glu Gln Val Leu Arg Phe Val Met Glu Gly Gly Leu Leu Asp Lys 1220 1225 1230 Pro Asp Asn Cys Pro Asp Met Leu Phe Glu Leu Met Arg Met Cys 1235 1240 1245 Trp Gln Tyr Asn Pro Lys Met Arg Pro Ser Phe Leu Glu Ile Ile 1250 1255 1260 Ser Ser Ile Lys Glu Glu Met Glu Pro Gly Phe Arg Glu Val Ser 1265 1270 1275 Phe Tyr Tyr Ser Glu Glu Asn Lys Leu Pro Glu Pro Glu Glu Leu 1280 1285 1290 Asp Leu Glu Pro Glu Asn Met Glu Ser Val Pro Leu Asp Pro Ser 1295 1300 1305 Ala Ser Ser Ser Ser Leu Pro Leu Pro Asp Arg His Ser Gly His 1310 1315 1320 Lys Ala Glu Asn Gly Pro Gly Pro Gly Val Leu Val Leu Arg Ala 1325 1330 1335 Ser Phe Asp Glu Arg Gln Pro Tyr Ala His Met Asn Gly Gly Arg 1340 1345 1350 Lys Asn Glu Arg Ala Leu Pro Leu Pro Gln Ser Ser Thr Cys 1355 1360 1365 <210> 91 <211> 932 <212> PRT <213> artificial <220> <223> IGF-1R ECD <400> 91 Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu 1 5 10 15 Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu Ile 20 25 30 Cys Gly Pro Gly Ile Asp Ile Arg Asn Asp Tyr Gln Gln Leu Lys Arg 35 40 45 Leu Glu Asn Cys Thr Val Ile Glu Gly Tyr Leu His Ile Leu Leu Ile 50 55 60 Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Ser Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val 65 70 75 80 Ile Thr Glu Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Ala Gly Leu Glu Ser Leu 85 90 95 Gly Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Trp Lys Leu Phe 100 105 110 Tyr Asn Tyr Ala Leu Val Ile Phe Glu Met Thr Asn Leu Lys Asp Ile 115 120 125 Gly Leu Tyr Asn Leu Arg Asn Ile Thr Arg Gly Ala Ile Arg Ile Glu 130 135 140 Lys Asn Ala Asp Leu Cys Tyr Leu Ser Thr Val Asp Trp Ser Leu Ile 145 150 155 160 Leu Asp Ala Val Ser Asn Asn Tyr Ile Val Gly Asn Lys Pro Pro Lys 165 170 175 Glu Cys Gly Asp Leu Cys Pro Gly Thr Met Glu Glu Lys Pro Met Cys 180 185 190 Glu Lys Thr Thr Ile Asn Asn Glu Tyr Asn Tyr Arg Cys Trp Thr Thr 195 200 205 Asn Arg Cys Gln Lys Met Cys Pro Ser Thr Cys Gly Lys Arg Ala Cys 210 215 220 Thr Glu Asn Asn Glu Cys Cys His Pro Glu Cys Leu Gly Ser Cys Ser 225 230 235 240 Ala Pro Asp Asn Asp Thr Ala Cys Val Ala Cys Arg His Tyr Tyr Tyr 245 250 255 Ala Gly Val Cys Val Pro Ala Cys Pro Pro Asn Thr Tyr Arg Phe Glu 260 265 270 Gly Trp Arg Cys Val Asp Arg Asp Phe Cys Ala Asn Ile Leu Ser Ala 275 280 285 Glu Ser Ser Asp Ser Glu Gly Phe Val Ile His Asp Gly Glu Cys Met 290 295 300 Gln Glu Cys Pro Ser Gly Phe Ile Arg Asn Gly Ser Gln Ser Met Tyr 305 310 315 320 Cys Ile Pro Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Glu Glu Glu Lys 325 330 335 Lys Thr Lys Thr Ile Asp Ser Val Thr Ser Ala Gln Met Leu Gln Gly 340 345 350 Cys Thr Ile Phe Lys Gly Asn Leu Leu Ile Asn Ile Arg Arg Gly Asn 355 360 365 Asn Ile Ala Ser Glu Leu Glu Asn Phe Met Gly Leu Ile Glu Val Val 370 375 380 Thr Gly Tyr Val Lys Ile Arg His Ser His Ala Leu Val Ser Leu Ser 385 390 395 400 Phe Leu Lys Asn Leu Arg Leu Ile Leu Gly Glu Glu Gln Leu Glu Gly 405 410 415 Asn Tyr Ser Phe Tyr Val Leu Asp Asn Gln Asn Leu Gln Gln Leu Trp 420 425 430 Asp Trp Asp His Arg Asn Leu Thr Ile Lys Ala Gly Lys Met Tyr Phe 435 440 445 Ala Phe Asn Pro Lys Leu Cys Val Ser Glu Ile Tyr Arg Met Glu Glu 450 455 460 Val Thr Gly Thr Lys Gly Arg Gln Ser Lys Gly Asp Ile Asn Thr Arg 465 470 475 480 Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Val Leu His Phe Thr 485 490 495 Ser Thr Thr Thr Ser Lys Asn Arg Ile Ile Ile Thr Trp His Arg Tyr 500 505 510 Arg Pro Pro Asp Tyr Arg Asp Leu Ile Ser Phe Thr Val Tyr Tyr Lys 515 520 525 Glu Ala Pro Phe Lys Asn Val Thr Glu Tyr Asp Gly Gln Asp Ala Cys 530 535 540 Gly Ser Asn Ser Trp Asn Met Val Asp Val Asp Leu Pro Pro Asn Lys 545 550 555 560 Asp Val Glu Pro Gly Ile Leu Leu His Gly Leu Lys Pro Trp Thr Gln 565 570 575 Tyr Ala Val Tyr Val Lys Ala Val Thr Leu Thr Met Val Glu Asn Asp 580 585 590 His Ile Arg Gly Ala Lys Ser Glu Ile Leu Tyr Ile Arg Thr Asn Ala 595 600 605 Ser Val Pro Ser Ile Pro Leu Asp Val Leu Ser Ala Ser Asn Ser Ser 610 615 620 Ser Gln Leu Ile Val Lys Trp Asn Pro Pro Ser Leu Pro Asn Gly Asn 625 630 635 640 Leu Ser Tyr Tyr Ile Val Arg Trp Gln Arg Gln Pro Gln Asp Gly Tyr 645 650 655 Leu Tyr Arg His Asn Tyr Cys Ser Lys Asp Lys Ile Pro Ile Arg Lys 660 665 670 Tyr Ala Asp Gly Thr Ile Asp Ile Glu Glu Val Thr Glu Asn Pro Lys 675 680 685 Thr Glu Val Cys Gly Gly Glu Lys Gly Pro Cys Cys Ala Cys Pro Lys 690 695 700 Thr Glu Ala Glu Lys Gln Ala Glu Lys Glu Glu Ala Glu Tyr Arg Lys 705 710 715 720 Val Phe Glu Asn Phe Leu His Asn Ser Ile Phe Val Pro Arg Pro Glu 725 730 735 Arg Lys Arg Arg Asp Val Met Gln Val Ala Asn Thr Thr Met Ser Ser 740 745 750 Arg Ser Arg Asn Thr Thr Ala Ala Asp Thr Tyr Asn Ile Thr Asp Pro 755 760 765 Glu Glu Leu Glu Thr Glu Tyr Pro Phe Phe Glu Ser Arg Val Asp Asn 770 775 780 Lys Glu Arg Thr Val Ile Ser Asn Leu Arg Pro Phe Thr Leu Tyr Arg 785 790 795 800 Ile Asp Ile His Ser Cys Asn His Glu Ala Glu Lys Leu Gly Cys Ser 805 810 815 Ala Ser Asn Phe Val Phe Ala Arg Thr Met Pro Ala Glu Gly Ala Asp 820 825 830 Asp Ile Pro Gly Pro Val Thr Trp Glu Pro Arg Pro Glu Asn Ser Ile 835 840 845 Phe Leu Lys Trp Pro Glu Pro Glu Asn Pro Asn Gly Leu Ile Leu Met 850 855 860 Tyr Glu Ile Lys Tyr Gly Ser Gln Val Glu Asp Gln Arg Glu Cys Val 865 870 875 880 Ser Arg Gln Glu Tyr Arg Lys Tyr Gly Gly Ala Lys Leu Asn Arg Leu 885 890 895 Asn Pro Gly Asn Tyr Thr Ala Arg Ile Gln Ala Thr Ser Leu Ser Gly 900 905 910 Asn Gly Ser Trp Thr Asp Pro Val Phe Phe Tyr Val Gln Ala Lys Thr 915 920 925 Gly Tyr Glu Asn 930 <210> 92 <211> 512 <212> PRT <213> artificial <220> <223> IGF-1R ECD Nterminal <400> 92 Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu 1 5 10 15 Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu Ile 20 25 30 Cys Gly Pro Gly Ile Asp Ile Arg Asn Asp Tyr Gln Gln Leu Lys Arg 35 40 45 Leu Glu Asn Cys Thr Val Ile Glu Gly Tyr Leu His Ile Leu Leu Ile 50 55 60 Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Ser Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val 65 70 75 80 Ile Thr Glu Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Ala Gly Leu Glu Ser Leu 85 90 95 Gly Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Trp Lys Leu Phe 100 105 110 Tyr Asn Tyr Ala Leu Val Ile Phe Glu Met Thr Asn Leu Lys Asp Ile 115 120 125 Gly Leu Tyr Asn Leu Arg Asn Ile Thr Arg Gly Ala Ile Arg Ile Glu 130 135 140 Lys Asn Ala Asp Leu Cys Tyr Leu Ser Thr Val Asp Trp Ser Leu Ile 145 150 155 160 Leu Asp Ala Val Ser Asn Asn Tyr Ile Val Gly Asn Lys Pro Pro Lys 165 170 175 Glu Cys Gly Asp Leu Cys Pro Gly Thr Met Glu Glu Lys Pro Met Cys 180 185 190 Glu Lys Thr Thr Ile Asn Asn Glu Tyr Asn Tyr Arg Cys Trp Thr Thr 195 200 205 Asn Arg Cys Gln Lys Met Cys Pro Ser Thr Cys Gly Lys Arg Ala Cys 210 215 220 Thr Glu Asn Asn Glu Cys Cys His Pro Glu Cys Leu Gly Ser Cys Ser 225 230 235 240 Ala Pro Asp Asn Asp Thr Ala Cys Val Ala Cys Arg His Tyr Tyr Tyr 245 250 255 Ala Gly Val Cys Val Pro Ala Cys Pro Pro Asn Thr Tyr Arg Phe Glu 260 265 270 Gly Trp Arg Cys Val Asp Arg Asp Phe Cys Ala Asn Ile Leu Ser Ala 275 280 285 Glu Ser Ser Asp Ser Glu Gly Phe Val Ile His Asp Gly Glu Cys Met 290 295 300 Gln Glu Cys Pro Ser Gly Phe Ile Arg Asn Gly Ser Gln Ser Met Tyr 305 310 315 320 Cys Ile Pro Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Glu Glu Glu Lys 325 330 335 Lys Thr Lys Thr Ile Asp Ser Val Thr Ser Ala Gln Met Leu Gln Gly 340 345 350 Cys Thr Ile Phe Lys Gly Asn Leu Leu Ile Asn Ile Arg Arg Gly Asn 355 360 365 Asn Ile Ala Ser Glu Leu Glu Asn Phe Met Gly Leu Ile Glu Val Val 370 375 380 Thr Gly Tyr Val Lys Ile Arg His Ser His Ala Leu Val Ser Leu Ser 385 390 395 400 Phe Leu Lys Asn Leu Arg Leu Ile Leu Gly Glu Glu Gln Leu Glu Gly 405 410 415 Asn Tyr Ser Phe Tyr Val Leu Asp Asn Gln Asn Leu Gln Gln Leu Trp 420 425 430 Asp Trp Asp His Arg Asn Leu Thr Ile Lys Ala Gly Lys Met Tyr Phe 435 440 445 Ala Phe Asn Pro Lys Leu Cys Val Ser Glu Ile Tyr Arg Met Glu Glu 450 455 460 Val Thr Gly Thr Lys Gly Arg Gln Ser Lys Gly Asp Ile Asn Thr Arg 465 470 475 480 Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Val Leu His Phe Thr 485 490 495 Ser Thr Thr Thr Ser Lys Asn Arg Ile Ile Ile Thr Trp His Arg Tyr 500 505 510 <210> 93 <211> 4 <212> PRT <213> artificial <220> <223> tetrapeptide (linker) <400> 93 Gly Phe Leu Gly 1 <210> 94 <211> 4 <212> PRT <213> artificial <220> <223> tetrapeptide (linker) <400> 94 Ala Leu Ala Leu 1 <210> 95 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <220> <223> pentapeptide (linker) <400> 95 Pro Val Gly Val Val 1 5

Claims (15)

  1. IGF-1R(+) 상태를 가진 개체에서 암의 치료에 사용하는 조성물로서, 다음의 화학식 (I)
    Figure pct00200
    (I)
    의 항체-약물 컨쥬게이트 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하고,
    여기에서
    Ab는 인간 IGF-1R과 결합하고, 그의 IGF-1R과 결합 이후에 내재화되는, 두 번째 IGF-1R 항체 또는 그의 항원 결합 단편이고;
    L은 링커이고;
    D는 약물 분체이고;
    n은 1부터 12까지 범위이고;
    상기 개체의 IGF-1R(+) 상태는 첫 번째 IGF-1R 항체를 사용하여 개체의 생물학적 시료로부터 결정되었으며,
    상기 첫 번째 IGF-1R 항체는 (i) 서열번호 1의 CDR-H1, 서열번호 2의 CDR-H2 및 서열번호 3의 CDR-H3을 가진 중쇄; 및 서열번호 4의 CDR-L1, 서열번호 5의 CDR-L2, 서열번호 6의 CDR-L3를 가진 경쇄를 포함하는, 항체 또는 그의 임의의 항원 결합 단편; 또는 (ii) 서열번호 11의 CDR-H1, 서열번호 12의 CDR-H2 및 서열번호 13의 CDR-H3을 가진 중쇄; 및 서열번호 14의 CDR-L1, 서열번호 15의 CDR-L2, 서열번호 16의 CDR-L3를 가진 경쇄를 포함하는, 항체 또는 그의 임의의 항원 결합 단편:인, 것을 특징으로 하는, 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    첫 번째 및 두 번째 항체들은 동일한 IGF-1R 에피토프와 결합하지 않는, 조성물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    첫 번째 IGF-1R 항체는
    (i) 서열번호 7의 서열 또는 서열번호 7의 서열과 적어도 90%의 상동성을 가진 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인; 및/또는 서열번호 8의 서열 또는 서열번호 8의 서열과 적어도 90%의 상동성을 가진 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 항체; 또는
    (ii) 서열번호 17의 서열 또는 서열번호 17의 서열과 적어도 90%의 상동성을 가진 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인; 및/또는 서열번호 18의 서열 또는 서열번호 18의 서열과 적어도 90%의 상동성을 가진 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 항체:
    인, 조성물
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    첫 번째 IGF-1R 항체는
    (i) 파리, 파스퇴르 연구소, CNCM에 2014년 9월 17일자로 수탁번호 제 I-4893호하에 기탁된 하이브리도마에 의해 분비된 항체 810D12; 또는
    (ii) 파리, 파스퇴르 연구소, CNCM에 2014년 9월 17일자로 수탁번호 제 I-4894호 하에 기탁된 하이브리도마에 의해 분비된 항체 816C12:
    인, 조성물.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    Ab는 (i) 서열번호 21, 22 및 23 서열의 세 개의 중쇄 CDR들 및 서열번호 24, 25 및 26 서열의 세 개의 경쇄 CDR들을 포함하는 항체; (ii) (i)의 항체와 IGF-1R과 결합을 경쟁하는 항체; 또는 (iii) (i)의 항체와 동일한 IGF-1R 에피토프와 결합하는 항체로부터 선택되는, IGF-1R 항체 또는 그의 항원 결합 단편인, 조성물.
  6. 제' 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    Ab는
    (a) 서열번호 27, 22 및 23의 서열의 세 개 중쇄 CDR들 및 서열번호 29, 25 및 31 서열의 세 개 경쇄 CDR들을 포함하는 항체;
    (b) 서열번호 27, 22 및 23의 서열의 세 개 중쇄 CDR들 및 서열번호 30, 25 및 31의 서열의 세 개 경쇄 CDR들을 포함하는 항체;
    (c) 서열번호 27, 22 및 23의 서열의 세 개 중쇄 CDR들 및 서열번호 29, 25 및 32의 서열의 세 개 경쇄 CDR들을 포함하는 항체; 또는
    (d) 서열번호 28, 22 및 23의 서열의 세 개 중쇄 CDR들 및 서열번호 29, 25 및 31의 서열의 세 개 경쇄 CDR들을 포함하는 항체:
    인, 조성물.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    Ab는
    (a) 서열번호들 33, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 및 59로부터 선택된 서열 또는 서열번호들 33, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 또는 59와 적어도 80% 일치도를 가진 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인; 및 서열번호들 29, 25 및 31의 서열들의 세 개 경쇄 CDR들을 포함하는, 항체;
    (b) 서열번호들 34, 37 및 60으로부터 선택된 서열 또는 서열번호들 34, 37 또는 60과 적어도 80% 일치도를 가진 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인; 및 서열번호들 27, 22 및 23 서열들의 세 개 중쇄 CDR들을 포함하는, 항체; 또는
    (c) 서열번호들 33, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 및 59로부터 선택된 서열 또는 서열번호들 33, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 또는 59와 적어도 80% 일치도를 가진 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인; 및 서열번호들 34, 37 및 60으로부터 선택된 서열 또는 서열번호들 34, 37 또는 60과 적어도 80% 일치도를 가진 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 항체:
    인, 조성물.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
    Ab는
    (a) 서열번호들 35, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 및 61로부터 선택된 서열 또는 서열번호들 35, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 또는 61과 적어도 80%의 상동성을 가진 임의의 서열의 중쇄; 및
    (b) 서열번호들 36, 38 및 62의 서열 또는 서열번호들 36, 38 또는 62과 적어도 80% 상동성을 가진 임의의 서열의 경쇄:
    를 포함하는, 조성물.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
    Ab는 (i) 항체들 208F2, 212A11, 214F8, 219D6 및 213B10, (ii) (i)의 항체들과 IGF-1R과 결합을 경쟁하는 항체들, 또는 (iii) (i)의 항체들과 동일한 IGF-1R 에피토프와 결합하는 항체들인, 조성물.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
    약물 분체 D는 알킬화제들, 항-대사물들, 항-종양 항생제들, 세포분열 저해제들, 크로마틴 기능 저해제들, 항-혈관형성제들, 항-에스트로겐들, 항-안드로겐들, 킬레이팅제들, 철 흡수 자극제, 사이클로옥시게나제 저해제들, 포스포디에스테라제 저해제들, DNA 저해제들, DNA 합성 저해제들, 세포사멸 자극제들, 티미딜레이트 저해제들, T 세포 저해제들, 인터페론 작동제들, 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 환원효소 저해제들, 아로마타제 저해제들, 에스트로겐 수용체 길항제들, 타이로신 키나제 저해제들, 세포 주기 저해제들, 택산, 튜불린 저해제들, 혈관형성 저해제들, 대식구 자극제들, 뉴로키닌 수용체 길항제들, 카나비노이드 수용체 작동제들, 도파민 수용체 작동제들, 과립구 자극인자 작동제들, 에리트로포이에틴 수용체 작동제들, 소마토스타틴 수용체 작동제들, LHRH 작동제들, 칼슘 민감화제들, VEGF 수용체 길항제들, 인터루킨 수용체 길항제들, 파골세포 저해제들, 라디칼 형성 자극제들, 엔도텔린 수용체 길항제들, 빈카 알칼로이드, 항-호르몬 또는 면역조절인자들 또는 세포독성제 또는 독소의 활성 판정기준을 충족하는 임의의 다른 약물로부터 선택되는, 조성물.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서,
    약물 분체 D는 아우리스타틴, 돌라스타틴 10 또는 그의 유도체인, 조성물.
  12. 제 11항에 있어서,
    약물 분체 D는 다음의 화학식 (Ⅱ)
    Figure pct00201

    (Ⅱ)
    을 가지는, 조성물:
    여기에서
    R2는 COOH, COOCH3 또는 티아졸릴이고;
    R3는 H 또는 (C1-C6)알킬이고;
    R9는 H 또는 (C1-C6)알킬이고;
    m은 1 및 8 사이 범위에 포함된 정수이고;
    물결선은 L과 부착점을 표시한다.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,
    L은 다음의 화학식 (Ⅲ)
    Figure pct00202

    (Ⅲ)
    의 링커인, 조성물:
    여기에서
    L2는 (C4-C10)고리알킬-카보닐, (C2-C6)알킬, (C2-C6)알킬-카보닐이고;
    W는 아미노산 유닛이고; w는 0 및 5 사이 범위에 포함된 정수이고;
    Y는 PAB가
    Figure pct00203

    인 PAB-카보닐이고; y는 0 또는 1이고;
    별표는 D와 부착점을 표시하고;
    물결선은 Ab와 부착점을 표시한다.
  14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체-약물 컨쥬게이트는 화학식
    Figure pct00204

    Figure pct00205

    Figure pct00206

    Figure pct00207

    또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 가지고,
    Ab는 (i) 항체들 208F2, 212A11, 214F8, 219D6 및 213B10, (ii) (i)의 항체들과 IGF-1R과 결합을 경쟁하는 항체들, 또는 (iii) (i)의 항체들과 동일한 IGF-1R 에피토프와 결합하는 항체들인, 조성물.
  15. IGF-1R을 발현하는 암의 치료에 사용하는 키트로서, 적어도
    (a) 첫 번째 IGF-1R 항체로서,
    (i) 서열번호 1의 CDR-H1, 서열번호 2의 CDR-H2 및 서열번호 3의 CDR-H3을 가진 중쇄; 및 서열번호 4의 CDR-L1, 서열번호 5의 CDR-L2, 서열번호 6의 CDR-L3를 가진 경쇄를 포함하는, 항체 또는 그의 임의의 항원 결합 단편; 또는
    (ii) 서열번호 11의 CDR-H1, 서열번호 12의 CDR-H2 및 서열번호 13의 CDR-H3을 가진 중쇄; 및 서열번호 14의 CDR-L1, 서열번호 15의 CDR-L2, 서열번호 16의 CDR-L3를 가진 경쇄를 포함하는, 항체 또는 그의 임의의 항원 결합 단편:
    인, 항체; 및
    (b) 다음의 화학식 (I)
    Figure pct00208
    (I)
    또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 항체-약물 컨쥬게이트로서,
    Ab는 (i) 서열번호 21, 22 및 23 서열의 세 개 중쇄 CDR들 및 서열번호 24, 25 및 26의 서열의 세 개 경쇄 CDR들을 포함하는 항체; (ii) (i)의 항체와 IGF-1R과 결합을 경쟁하는 항체; 또는 (iii) (i)의 항체와 동일한 IGF-1R 에피토프와 결합하는 항체로부터 선택되는, 인간 IGF-1R과 결합할 수 있는 두 번째 IGF-1R 항체 또는 그의 항원 결합 단편이고;
    L은 링커이고;
    D는 다음의 화학식 (Ⅱ)의 약물 분체이고;
    Figure pct00209

    (Ⅱ)
    여기에서
    R2는 COOH, COOCH3 또는 티아졸릴이고;
    R3는 H 또는 (C1-C6)알킬이고;
    R9는 H 또는 (C1-C6)알킬이고;
    m은 1 및 8 사이 범위에 포함된 정수이고;
    물결선은 L과 부착점을 표시하고;
    n은 1부터 12까지 범위인, 항체-약물 컨쥬게이트:
    를 포함하는, 키트.
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